JP6621252B2 - 治療耐性がんに対する治療耐性低減剤 - Google Patents

Description

本発明は、インターロイキン−３４（ＩＬ−３４）とコロニー刺激因子−１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）との結合を阻害する物質及び／又はがん細胞におけるＩＬ−３４の発現を抑制する物質を有効成分とする、治療耐性がんに対する治療耐性低減剤に関する。

がんの治療法には、がん組織を摘出する外科的療法、抗がん剤を投与する化学療法、放射線を照射する放射線療法及びがんに対する免疫を誘導するがん免疫療法などがある。これらのうち、外科的治療法を除く他の治療法において、治療を実行することによってがんがその治療に対して耐性を示す治療耐性がんとなるという問題を抱えている。

特に、化学療法及び放射線療法において治療耐性がんの出現は深刻な問題である。化学療法及び放射線療法は、その性質上、がん組織と正常組織とを厳格に区別して治療を行うことが元々困難な方法であり、例えば化学療法では薬効と毒性との差が小さいため副作用が発生し易く、また放射線療法はがん周辺の正常組織にも放射線を照射せざるを得ないという問題を抱えている。そのため、がんが治療耐性を獲得してしまうと、より多量の抗がん剤の投与又はより多量若しくは高強度の放射線照射が必要となるが、副作用が耐えがたいものとなったり正常組織の被曝量が高くなり過ぎたりすることで、がん治療を中止せざるを得なくこともしばしばである。

特に、抗がん剤の投与という最も一般的な化学療法は、同時に多くの治療耐性がん、すなわち薬剤耐性がんを生み出している。薬剤耐性がんが現実問題となっている抗がん剤の例としては、乳がん及び卵巣癌に対するドキソルビシンン、タモキシフェン、シスプラチン、ドセタキセルなど、非小細胞肺癌の治療薬であるイレッサやタルセバなどが挙げられる。

がんが治療耐性を獲得する又は治療耐性を発揮する機構及びこれに関与する分子の同定、さらには当該分子の関与を抑制する技術の開発は、がんの治療耐性という問題を解消し、既存の治療法の有効性を高めるためにも有益である。

また、治療耐性がんに対しても薬効が期待できる新たながん治療法の開発にも注目が集まっている。特に、がん細胞による免疫抑制作用の阻害は有望な治療標的であり、例えば、宿主側の免疫細胞の活性を抑制する機能を持つ免疫チェックポイント分子の阻害薬は、がん細胞による免疫抑制を解除し、宿主側の免疫応答を活性化させる新たな抗がん剤として精力的な開発が進められている。

一方、ＣＳＦ−１Ｒ（Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ−１ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｍ−ＣＳＦＲ、ＣＤ−１１５又はｃ−ｆｍｓとも呼ばれる）は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ０７３３３として登録されている、細胞外ドメインに免疫グロブリン（Ｉｇ）モチーフを有する一本鎖膜貫通受容体型チロシンキナーゼである。

ＣＳＦ−１Ｒの特異的リガンドとして、Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子、ＣＳＦ−１とも呼ばれる）及びＩＬ−３４が知られている（非特許文献１）。ＩＬ−３４はＵｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ６ＺＭＪ４として登録されているヒトのサイトカインであり、これをコードする遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）にＧｅｎｅ ＩＤ：１４６４３３として登録されている。

Ｍ−ＣＳＦ及びＩＬ−３４は、ＣＳＦ−１Ｒのチロシンキナーゼ活性を通じた細胞の分化、増殖、移動及び単球系列に由来する前駆体マクロファージ及び破骨細胞の生存に関連することが確認されているが、一方で前記２つのリガンドは、初代マクロファージにおけるＭＣＰ−１及びエオタクシン２などのケモカインの産生、ＴＦ−１−ｆｍｓ細胞における形態変化、及びＪ７７４Ａ．１細胞の遊走を誘導する能力等において異なると考えられている（非特許文献２）。

ＩＬ−３４及び／又はＣＳＦ−１Ｒを標的とした医薬としては、ＩＬ−３４に結合することでＣＳＦ−１ＲとＩＬ−３４との結合を阻害することのできる単離抗体を関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）、円板状ループス、サルコイドーシス、血管炎、及び移植片対宿主病などの骨髄病原性免疫疾患の治療に用いることが報告されている（特許文献１）。また、ＣＳＦ−１Ｒに結合してＣＳＦ−１ＲとＩＬ−３４との結合を阻害することのできる抗体を白血病、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、腎臓癌、多発性骨髄腫などの治療に用いることも報告されている（特許文献２）。

しかし、ＩＬ−３４とがんの治療耐性との関連性は未だ確認されていない。

特表２０１５−５１０５１０号公報 特表２０１３−５２９１８３号公報

Ｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００８年、第３２０巻、第８０７−８１１ページ Ｃｈｉｈａｒａら、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｏｎ、２０１０年、第１７巻、第１９１７−１９２７ページ

本発明は、がんの治療耐性、特に薬剤耐性を解消又は低減することができ、がん治療の有効性を高めることができる、治療耐性がんに対する治療耐性低減剤を提供することを目的とするものである。

本発明者らは、がんの治療耐性の一種である薬剤耐性に関するメカニズムを研究する過程で、ＩＬ−３４が薬剤耐性に関与していることを実験的に見いだし、下記の各発明を完成させた。

（１）ＩＬ−３４とＣＳＦ−１Ｒとの結合を特異的に阻害する物質及び／又はがん細胞におけるＩＬ−３４の発現を抑制する物質を有効成分とする、治療耐性がんに対する治療耐性低減剤。
（２）ＩＬ−３４に結合することでＩＬ−３４とＣＳＦ−１Ｒとの結合を特異的に阻害する物質を有効成分とする、（１）に記載の治療耐性低減剤。
（３）ＩＬ−３４に対する特異抗体を有効成分とする、（１）又は（２）に記載の治療耐性低減剤。
（４）抗がん剤投与治療又は放射線照射治療において併用するための、（１）〜（３）のいずれかに記載の治療耐性低減剤。

本発明によれば、抗がん剤投与又は放射線照射などの治療法に対して耐性を示すがんの治療耐性を低減させることができ、がん治療の有効性を高め、副作用等の発生を抑えることができる。

ヒト健常ドナー由来末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をドキソルビシン（ＤＯＸ）感受性ヒト肺腺がん細胞株Ａ５４９細胞株（Ａ５４９−ＤＳ）の培養上清又はＤＯＸ耐性Ａ５４９細胞株（Ａ５４９−ＤＲ）の培養上清で刺激した後のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。図１上段は刺激後の細胞のＣＤ１４及びＣＤ１１ｂについてのドットプロットであり、図１下段はＣＤ１４^＋ＣＤ１１ｂ^＋細胞（上段図の太枠内に存在する細胞）の比率を示すグラフである。 ヒト健常ドナー由来単球をＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ａ５４９−ＤＳ培養上清又はＡ５４９−ＤＲ細胞培養上清で刺激した後の顕微鏡観察像である。 ヒト健常ドナー由来単球をＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ａ５４９−ＤＳ細胞培養上清又はＡ５４９−ＤＲ細胞培養上清で刺激した後の、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８及びＣＤ１６３のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。グラフの横軸は、対照（ＤＭＥＭのみで培養した単球）における発現レベルと比較した相対値である。 Ａ５４９−ＤＲ細胞におけるＭ−ＣＳＦ ｍＲＮＡの発現量を、Ａ５４９−ＤＳにおける発現量に対する相対値で示したグラフである。 Ａ５４９−ＤＳ細胞培養上清又はＡ５４９−ＤＲ細胞培養上清中のＩＬ−３４濃度を示すグラフである。 ヒト健常ドナー由来単球を、Ａ５４９−ＤＲ細胞培養上清、抗ＩＬ−３４中和抗体処理後のＡ５４９−ＤＲ細胞培養上清、又はＡ５４９−ＤＲ−ＩＬ−３４−ＫＯ細胞の培養上清で刺激した後の、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８及びＣＤ１６３のｍＲＮＡ発現レベルを示す図である。グラフの縦軸は、対照（ＤＭＥＭのみで培養した単球）における発現レベルと比較した相対値である。 Ａ５４９−ＤＳ細胞、Ａ５４９−ＤＲ細胞、Ａ５４９−ＤＲ−ＩＬ−３４−ＫＯ細胞（図７上段）及び抗ＩＬ−３４抗体で中和したＡ５４９−ＤＲ細胞（図７下段）を、ＤＯＸ存在下又は非存在下で培養した場合の細胞生存率を示すグラフである。 Ａ５４９−ＤＳ細胞、Ａ５４９−ＤＲ細胞又はＡ５４９−ＤＲ−ＩＬ−３４−ＫＯ細胞を接種したヒト化マウスにおける、ＤＯＸ又はＰＢＳ投与による腫瘍サイズの変化を示す図である。図８左側のグラフの横軸は、各がん細胞を接種してからの日数を表す。 Ａ５４９−ＤＳ細胞、Ａ５４９−ＤＲ細胞又はＡ５４９−ＤＲ−ＩＬ−３４−ＫＯ細胞を接種したヒト化マウスの腫瘍中のＣＤ６８^＋ＣＤ１６３^＋細胞の数を示すグラフである。

本発明者らは、以下の１）〜５）に示される各実験を通じて、がん細胞株において発現しているＩＬ−３４が、がんの治療耐性に関与していることを見いだした。

１）薬剤耐性がん細胞の作製
ヒト肺腺がん細胞株Ａ５４９は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）から入手した。細胞培養は、ウシ胎児血清（終濃度１０％）、ペニシリン（終濃度１００Ｕ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（終濃度１００μｇ／ｍＬ）を加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＳＩＧＭＡ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２下で行った。ＤＯＸ濃度を０．０１〜１μＭまで段階的に上昇させたＤＭＥＭ中でＡ５４９細胞を３７℃、５％ＣＯ_２下で培養し、ＤＯＸ耐性を獲得した細胞を選抜することにより、ＤＯＸ耐性Ａ５４９細胞株（Ａ５４９−ＤＲ）を作製した。得られたＡ５４９−ＤＲ細胞は、１μＭ ＤＯＸに曝露することで、その薬剤耐性を維持した。

２）Ａ５４９−ＤＲ細胞の培養上清が単球の分化に対して及ぼす効果
上記１）で作製したＡ５４９−ＤＲ細胞を滅菌ＰＢＳで５回洗浄し、ＤＯＸ非添加ＤＭＥＭ１０ｍＬを予め分注した細胞培養プレートに１×１０^６個／ｍＬとなるように播種し、７２時間培養した後、培養上清を回収した。薬剤耐性を誘導していないＡ５４９細胞（Ａ５４９−ＤＳ）の培養上清も同様に調製した。

ヒト健常ドナーの末梢血から常法に従って末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を調製し、これをＤＭＥＭ、Ａ５４９−ＤＳ培養上清又はＡ５４９−ＤＲ細胞培養上清５０％を添加したＤＭＥＭ中で培養することにより、ＰＢＬを刺激した。１週間後、浮遊細胞を回収し、単球及びマクロファージが発現する細胞表面抗原であるＣＤ１４及びＣＤ１１ｂについて、フローサイトメーター（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ）を用いてＦＡＣＳ解析を行った（モノクローナル抗体試薬：Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ ＣＤ１４、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ ＣＤ１１ｂ（いずれもＢｉｏｌｅｇｅｎｄ））。結果を図１に示す。

Ａ５４９−ＤＲ細胞培養上清で刺激した場合、培地又はＡ５４９−ＤＳ細胞培養上清で刺激した場合と比べ、ＣＤ１４^＋ＣＤ１１ｂ^＋細胞数の増加が認められた。この結果から、Ａ５４９−ＤＲ細胞上清中には単球の分化に影響を与える因子が存在することが示唆された。

３）Ａ５４９−ＤＲ細胞培養上清に含まれる単球分化誘導因子の検討
マグネティックセルソーティングシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてヒト健常ドナーからＣＤ１４^＋単球を分離し、これを上記２）と同様にＡ５４９−ＤＳ又はＡ５４９−ＤＲ細胞の培養上清で刺激した。６〜７日後に単球を回収し、Ｓｅｐａｚｏｌ（ｎａｃａｌａｉ）で全ＲＮＡを抽出して、マクロファージマーカーとして知られるＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８及びＣＤ１６３の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲで測定した。ＲＴ−ＰＣＲは、表１に記載のプライマーセットを用いて、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、製造業者のプロトコールに従って実施した。

また、比較のため、ＧＭ−ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）又はＭ−ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）で刺激して単球を分化させ、同様の評価を行った。単球は、ＧＭ−ＣＳＦによる刺激でＭ１マクロファージに、Ｍ−ＣＳＦによる刺激でＭ２マクロファージに分化することが知られている。

刺激後の細胞の形態観察の結果を図２に、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８及びＣＤ１６３の発現レベルの比較を図３に示す。Ａ５４９−ＤＲ細胞培養上清の存在下で単球はマクロファージへと分化し、その形態はＭ−ＣＳＦにより誘導されるマクロファージと類似していることが確認された。

４）Ａ５４９−ＤＲ細胞におけるＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３４の発現解析
上記３）の結果から、Ａ５４９−ＤＲ細胞はＭ−ＣＳＦの分泌を介して単球をＭ２マクロファージに分化させるという仮説を立て、Ａ５４９−ＤＲ細胞におけるＭ−ＣＳＦ ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにより測定した。ＲＴ−ＰＣＲは、表１に記載のプライマーセットを用いて、上記３）と同様の方法で実施した。結果を図４に示す。仮説に反し、Ｍ−ＣＳＦのｍＲＮＡ発現量は、Ａ５４９−ＤＳと比較してＡ５４９−ＤＲ細胞で低下していた。

Ａ５４９−ＤＲ細胞培養上清により誘導されたマクロファージはＭ−ＣＳＦ誘導マクロファージと同様の形態及び表現型を持つことから、Ａ５４９−ＤＲ細胞はＭ−ＣＳＦの受容体であるＣＳＦ−１Ｒの別のリガンドを産生している可能性があると考え、ＣＳＦ−１Ｒのリガンドとして知られるＩＬ−３４に着目した。Ａ５４９−ＤＳ細胞及びＡ５４９−ＤＲ細胞の培養上清中のＩＬ−３４をＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて測定した結果を図５に示す。Ａ５４９−ＤＳ培養上清中でＩＬ−３４は検出されなかった一方、Ａ５４９−ＤＲ細胞培養上清中には多量のＩＬ−３４が確認された。

５）ＩＬ−３４欠失がＡ５４９−ＤＲ細胞培養上清の単球分化能に及ぼす効果
薬剤耐性におけるＩＬ−３４の役割を解明するため、ＣＲＩＳＰＲシステムを利用してＩＬ−３４ノックアウトＡ５４９−ＤＲ細胞株（Ａ５４９−ＤＲ−ＩＬ−３４−ＫＯ）を作製した。具体的には、ｐＣａｓ−ガイドベクター中にＩＬ−３４のガイドＲＮＡを組み込んだＩＬ３４−ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｋｉｔ ｖｉａ ＣＲＩＳＰＲ，Ｈｕｍａｎ（−）（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を、トランスフェクション試薬としてＦｕＧＥＮＥ（登録商標） ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、Ａ５４９−ＤＲ細胞にトランスフェクトした。ＩＬ−３４遺伝子のノックアウトは、ＲＴ−ＰＣＲ及びＥＬＩＳＡによりＩＬ−３４のｍＲＮＡ及びタンパク質が検出されないことで確認した。

作製したＡ５４９−ＤＲ−ＩＬ−３４−ＫＯ細胞の培養上清を上記２）と同様に調製し、単球の分化に与える影響を評価した。また、上記２）で得たＡ５４９−ＤＲ細胞の培養上清に抗ＩＬ−３４中和抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ５２６５、１０μｇ／ｍＬ）を加えて６０分間反応させることでＩＬ−３４の中和処理を行い、中和後の上清を同様に評価した。

ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８及びＣＤ１６３の発現レベルの比較を図６に示す。Ａ５４９−ＤＲ細胞培養上清刺激細胞において認められた細胞表面抗原の発現レベルの増加は、ＩＬ−３４の中和又はノックアウトにより減少した。したがって、ＩＬ−３４を欠失させることにより、Ａ５４９−ＤＲ細胞培養上清は、単球をＭ２マクロファージに分化させる能力を失うことが確認された。

以上の結果及び後述の実施例から、薬剤耐性がん細胞であるＡ５４９−ＤＲ細胞は、産生するＩＬ−３４分泌を介して自身の薬剤耐性を維持すると共に、単球の免疫抑制性Ｍ２マクロファージへの分化を促進することが示された。腫瘍内又はその近傍に存在するＭ２マクロファージは腫瘍関連マクロファージ（Ｔｕｍｏｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ、ＴＡＭｓ）としても知られ、腫瘍におけるＴＡＭｓの集積が化学療法又は放射線療法の有効性を損なう原因の一つであることが報告されている（Ｔａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１２年、第１３８巻、第９３−１０４ページ）。また、ＩＬ−３４はＣＳＦ−１Ｒのリガンドとしてこれに結合することで単球の免疫抑制性Ｍ２マクロファージへの分化を促進することが知られている。したがって、がん細胞におけるＩＬ−３４の発現を抑制するか、又はＩＬ−３４とＣＳＦ−１Ｒとの結合を阻害することにより、がんがＩＬ−３４によって治療耐性を獲得することを妨げることができると期待される。

本発明の治療耐性低減剤は、ＩＬ−３４とヒトＣＳＦ−１Ｒとの結合を特異的に阻害する物質及び／又はがん細胞におけるＩＬ−３４の発現を抑制する物質を有効成分とするものである。本発明の治療耐性低減剤は、治療に元々耐性を示す耐性がん、及び治療を行うことでその治療に対する耐性を獲得するに至った獲得性治療耐性がんのいずれにも適用することができるが、後者の獲得性治療耐性がんへの適用が好ましい。

ＩＬ−３４の発現を抑制する物質としては、ＩＬ−３４をコードしている遺伝子からのＲＮＡ転写及びタンパク質翻訳を抑制することのできる物質を挙げることができる。そのような物質の例としては、前記ＮＣＢＩにＧｅｎｅ ＩＤ：１４６４３３として登録されているＩＬ−３４をコードしている遺伝子の塩基配列を基にして当業者が設計、作製することができるアンチセンスＲＮＡ又はｓｉＲＮＡなどの阻害性核酸である。

前記阻害性核酸は、塩基配列の一部がヌクレアーゼによる分解に対する安定性を向上させることのできる修飾を受けたＲＮＡ、又は塩基配列の一部がヌクレアーゼによる分解に耐性を示す非天然塩基に置換されたＲＮＡであってもよい。修飾される又は置換される塩基の種類又は個数は、ＩＬ−３４をコードしている遺伝子からのＲＮＡ転写及びタンパク質翻訳を抑制する能力を失わない限り、特に制限は無い。

前記阻害性核酸は、遺伝子組み換え技術又は化学合成技術を利用して人工的に合成することができる。遺伝子組み換え方法、核酸の化学合成方法、また非天然型の塩基の合成手法又はこれを含む核酸の合成手法としては、当業者に知られ又は周知である方法を採用することができる。またいわゆるＤＮＡシンセサイザーなどの機器を用いることで、核酸を合成してもよい。

前記阻害性核酸はそのまま生体に投与されてもよいが、がん組織に対して選択的に投与される方法、特にがん細胞内に導入することができる方法により投与されることが好ましい。かかる目的において、前記阻害性核酸は核酸導入用試薬と組み合わせて使用されることが好ましい。該核酸導入用試薬の例としては、アテロコラーゲン、リポソーム、ナノパーティクル、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質等を挙げることができる。また、適当なウイルスベクターを用いて腫瘍組織中の細胞内に導入してもよい。

ＩＬ−３４とヒトＣＳＦ−１Ｒとの結合を特異的に阻害する物質としては、ＣＳＦ−１Ｒ又はＩＬ−３４に、特にＩＬ−３４に特異的に結合することで、ＩＬ−３４とヒトＣＳＦ−１Ｒとの結合を阻害する物質を有効成分とするものが好ましい。そのような物質の例は、ＣＳＦ−１Ｒ上のＩＬ−３４結合部位をブロックすることでＩＬ−３４とＣＳＦ−１Ｒとの結合を阻害する抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体、前記結合部位とは異なる部位でＣＳＦ−１Ｒに結合するが立体障害的にＩＬ−３４とＣＳＦ−１Ｒとの結合を阻害する抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体、ＩＬ−３４上のＣＳＦ−１Ｒ結合部位をブロックすることでＩＬ−３４とＣＳＦ−１Ｒとの結合を阻害する抗ＩＬ−３４抗体、又は前記結合部位とは異なる部位でＩＬ−３４に結合するが立体障害的にＩＬ−３４とＣＳＦ−１Ｒとの結合を阻害する抗ＩＬ−３４抗体などを挙げることができる。ＣＳＦ−１ＲはＩＬ−３４の他にＭ−ＣＳＦとも結合することから、本発明においてはＭ−ＣＳＦとＣＳＦ−１Ｒとの結合に影響を与えないという点で、ＩＬ−３４に結合する抗体の利用が好ましい。

本発明において利用される前記抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体であり得、また当該抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’若しくはＦ（ａｂ’）２などの抗体断片も本発明において利用することができる。

抗体は、好ましくは遺伝子組換え手法で作製された組換えヒトＩＬ−３４を抗原としてウサギ、マウス、ラットなどの適当な実験動物を免疫することを含む、一般的な抗体作製方法によって調製することができる。あるいは、前掲特許文献１に記載されている抗ＩＬ−３４抗体、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから市販されている抗ＩＬ−３４抗体であるＭＡＢ５２６５、その他の既存の抗ＩＬ−３４抗体を使用してもよい。

上記抗体を有効成分とする本発明の治療耐性低減剤は、抗体を含有する医薬製剤に用いられる一般的な担体を用いて凍結乾燥製剤又は水溶液の形態に調製されて使用されることが好ましい。担体の例としては、緩衝剤、抗酸化剤、保存剤、タンパク質、親水性ポリマー、アミノ酸、キレート化剤及び非イオン性界面活性剤などを挙げることができるが、これらには限定されない。

本発明の治療耐性低減剤は、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒに結合してＩＬ−３４の機能を阻害することのできる、前記阻害性核酸又は抗体以外の化合物であってもよい。そのような化合物は、ＣＳＦ−１Ｒを発現している適当な細胞とＩＬ−３４を用いた結合阻害活性のスクリーニングを通じて探索することができる。

本発明の治療耐性低減剤は、先に例示されるもの以外の薬学的に許容される賦形剤、担体、医薬などと医薬組成物を形成し又は製剤化して使用することができる。薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十六改正日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。

本発明の治療耐性低減剤は、筋内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与又はがん組織への直接投与など非経口的に投与されることが好ましく、そのような投与経路に適した製剤、例えば注射剤又は点滴剤などであることが好ましい。

本発明における治療耐性低減剤は、抗がん剤投与による化学療法、放射線療法及び／又は免疫療法の実施において併用されることが好ましい。特に抗がん剤投与による化学療法における併用が好ましい。本発明の治療耐性軽減剤の併用が有効な抗がん剤としては、ドキソルビシンン、タモキシフェン、シスプラチン及びドセタキセルなどを挙げることができるが、これらには限定されない。

以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。

＜実施例１＞インビトロでのＤＯＸ耐性低減効果の確認
Ａ５４９−ＤＳ細胞、Ａ５４９−ＤＲ細胞、Ａ５４９−ＤＲ−ＩＬ−３４−ＫＯ細胞をＤＯＸ添加（終濃度１μＭ）ＤＭＥＭ培地又はＤＯＸ非添加ＤＭＥＭ培地で培養し、７２時間後、ＭＴＴアッセイ（細胞増殖測定キット、ロシュアプライド）を行って細胞生存率を測定した。同様に、Ａ５４９−ＤＲ細胞を、抗ＩＬ−３４中和抗体を終濃度０．０１〜１０μｇ／ｍＬで添加したＤＯＸ添加又は非添加培地で培養し、細胞生存率を同様に測定した。結果を図７に示す。

Ａ５４９−ＤＲ細胞はＤＯＸ存在下でも生存率が低下せず、ＤＯＸ耐性を示した。一方、Ａ５４９−ＤＲ−ＩＬ−３４−ＫＯ細胞及び抗ＩＬ−３４抗体で中和したＡ５４９−ＤＲ細胞はＤＯＸへの感受性を回復しており、ＩＬ−３４の欠失によるＤＯＸ耐性の低減が認められた。

＜実施例２＞インビボでのＤＯＸ耐性低減効果の確認
ＮＯＧマウス（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−Ｓｃｉｄ ＩＬ−２ＲγＫＯ Ｊｉｃ、雌性、６週齢）にＸ線（２．５Ｇ）を照射し、２４時間後にヒト骨髄細胞２００万個（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を移植した。３週間後、マウスに１×１０^６個のＡ５４９−ＤＳ細胞、Ａ５４９−ＤＲ細胞、Ａ５４９−ＤＲ−ＩＬ−３４−ＫＯ細胞を接種し、腫瘍サイズが５ｍｍに達したら（がん細胞接種から１週間後）、ＤＯＸを１０ｍｇ／ｋｇ／マウスの用量で週に２回、合計４回、静脈内投与した。対照群には、ＤＯＸの代わりにＰＢＳを同量投与した。試験終了後、摘出した腫瘍から単細胞懸濁液を調製し、これをａｎｔｉ−ＣＤ６８、ａｎｔｉ−ＣＤ１６３（メーカー名Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、ＦＡＣＳ解析によりＣＤ６８^＋ＣＤ１６３^＋細胞の数を評価した。

腫瘍サイズの推移を図８左に、試験終了時の腫瘍サイズを図８右に示す。Ａ５４９−ＤＲ腫瘍のサイズはＤＯＸ投与により大きく変動しなかったが、Ａ５４９−ＤＲ−ＩＬ−３４−ＫＯ腫瘍のサイズはＤＯＸ投与により有意に減少した。

腫瘍中のＣＤ６８^＋ＣＤ１６３^＋細胞、すなわちＭ２マクロファージの数を図９に示す。Ａ５４９−ＤＲ腫瘍に浸潤したＭ２マクロファージの数は、Ａ５４９−ＤＳ腫瘍のそれよりも多かった。他方、ＩＬ−３４をノックアウトしたＡ５４９−ＤＲ腫瘍においては、Ｍ２マクロファージ数は低下した。

本発明の治療耐性がんに対する治療耐性低減剤は、がんに対して化学療法、放射線療法又は免疫療法を行う際に併用することで各治療法の有効性を維持することができる医薬としての産業上の利用可能性を有する。

Claims (3)

1. インターロイキン−３４に結合することでインターロイキン−３４とコロニー刺激因子−１受容体との結合を特異的に阻害するインターロイキン−３４に対する特異抗体、又は当該特異抗体のインターロイキン−３４への特異的結合能を有する断片を有効成分とする、治療耐性がんに対する治療耐性低減剤。
2. がん細胞におけるインターロイキン−３４の発現を抑制する阻害性核酸を有効成分とする、治療耐性がんに対する治療耐性低減剤。
3. 化学療法、放射線療法及び／又は免疫療法において併用するための、請求項１又は２に記載の治療耐性低減剤。

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