ES2630224T3 - Métodos para sintetizar polipéptidos heteromultiméricos en levadura con el uso de una estrategia de apareamiento haploide - Google Patents

Métodos para sintetizar polipéptidos heteromultiméricos en levadura con el uso de una estrategia de apareamiento haploide Download PDF

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Abstract

Un método para la síntesis y la recuperación, a partir de una levadura Pichia pastoris, de una proteína de inmunoglobulina heteromultimérica secretada, biológicamente activa, heteróloga (no es de levadura) que se compone de al menos dos cadenas de polipéptidos de subunidades no idénticas; el método se caracteriza por las siguientes etapas: (i) producir una célula o células estables diploides de levadura Pichia pastoris mediante apareamiento o fusión de esferoplastos de células haploides de levadura Pichia pastoris en condiciones de manera que dichos eventos de apareamiento o fusión de esferoplastos resulten en la producción de una célula o células diploides de levadura Pichia pastoris, en donde dicha célula o células diploides de levadura Pichia pastoris después de dicho apareamiento o fusión comprenden constructos de expresión que proporcionan la expresión y secreción de al menos dos cadenas polipeptídicas no idénticas que constituyen dicha proteína de inmunoglobulina heteromultimérica completa, y cuyas células estables diploides de levadura Pichia pastoris son capaces del ensamblaje y expresión y secreción prolongadas de dicha proteína de inmunoglobulina heteromultimérica completa en un medio de cultivo que contiene dicha(s) célula(s) de Pichia pastoris cuando dicha célula o células diploides de Pichia pastoris se cultivan bajo condiciones de cultivo adecuadas; (ii) después de efectuar dicho apareamiento o fusión de esferoplastos, identificar y aislar la célula o células diploides de Pichia pastoris que contienen constructos de expresión que proporcionan la expresión y secreción estables de al menos dos cadenas polipeptídicas no idénticas que constituyen dicha proteína de inmunoglobulina heteromultimérica completa cuando dicha célula o células diploides de levadura Pichia pastoris se cultivan bajo condiciones de cultivo adecuadas; (iii) cultivar dicha célula o células diploides de Pichia pastoris o su progenie diploide en un medio de cultivo bajo condiciones que resulten en la expresión, ensamblaje y secreción de dicha proteína de inmunoglobulina heteromultimérica biológicamente activa en el medio de cultivo; y (iv) recuperar la proteína heteromultimérica resultante del medio de cultivo; en donde dicho apareamiento o fusión de esferoplastos se efectúa mediante el apareamiento o la fusión de una primera célula haploide de levadura Pichia pastoris que contiene un primer constructo de expresión, dicho primer constructo de expresión contiene secuencias de ácidos nucleicos que codifican para la expresión de al menos una subunidad de dicha proteína de inmunoglobulina heteromultimérica completa (intacta), unidas operativamente a un primer promotor de levadura; y una segunda célula haploide de Pichia pastoris que contiene un segundo constructo de expresión, dicho segundo constructo de expresión comprende secuencias de ácidos nucleicos que codifican para la(s) subunidad(es) restante(s) de dicha proteína de inmunoglobulina heteromultimérica, unidas operativamente a un segundo promotor de levadura.

Description

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DESCRIPCION
Metodos para sintetizar polipeptidos heteromultimericos en levadura con el uso de una estrategia de apareamiento haploide
Antecedentes de la invencion
La produccion de protemas recombinantes es una actividad esencial para la seleccion de alto rendimiento, la validacion funcional, la biologfa estructural, y la produccion de polipeptidos farmaceuticos. Escherichia coli es un organismo ampliamente usado para la expresion de protemas heterologas debido a que crece facilmente a una alta densidad celular en sustratos economicos, y tiene tecnicas geneticas y vectores de expresion bien establecidos. Sin embargo, esto no siempre es suficiente para la produccion efectiva de biomoleculas activas. Las cadenas polipeptfdicas para ser biologicamente activas, tienen que plegarse en la estructura tridimensional nativa correcta, que incluye la formacion apropiada de enlaces disulfuro, y pueden requerir adicionalmente la asociacion correcta de multiples cadenas.
Aunque el estado activo de la protema puede favorecerse termodinamicamente, la escala de tiempo para el plegamiento puede variar desde milisegundos a dfas. Las barreras cineticas se introducen, por ejemplo, por la necesidad para el alineamiento de subunidades y subdominios. Y particularmente con protemas eucariotas, las reacciones covalentes deben tener lugar para que se forme la protema correctamente plegada. Los ultimos tipos de reaccion incluyen la formacion de enlaces disulfuro, la isomerizacion cis/trans de la cadena polipeptfdica alrededor de los enlaces peptfdicos de prolina, el procesamiento de preprotemas y la ligacion de grupos prosteticos. Estas limitaciones cineticas pueden resultar en la acumulacion de intermediarios parcialmente plegados que contienen superficies hidrofobicas 'pegajosas' expuestas, que promueven la autoasociacion y formacion de agregados.
Los anticuerpos son protemas tetramericas, que tienen muchos usos en el diagnostico clmico y la terapia. Cada tetramero de anticuerpo se compone de dos cadenas ligeras identicas y dos cadenas pesadas identicas. Los anticuerpos humanos o humanizados puros de un tipo espedfico son diffciles o imposibles de purificar de fuentes naturales, en cantidades suficientes para muchos propositos. Como consecuencia de ello, las empresas farmaceuticas y de biotecnologfa han recurrido a metodos basados en ADN recombinante para prepararlos a gran escala. La produccion de anticuerpos funcionales requiere no solo la smtesis de los dos polipeptidos, sino ademas un numero de modificaciones postraduccionales, que incluyen el procesamiento proteolftico de la secuencia senal de secrecion N- terminal; el plegamiento y ensamblaje adecuados de los polipeptidos en tetrameros; la formacion de enlaces disulfuro; y la glicosilacion espedfica a enlace N. Todos estos eventos tienen lugar en la via secretora de celulas eucariotas, un complejo de organulos unico para las celulas eucariotas.
La smtesis recombinante de tales protemas complejas ha tenido que depender de los sistemas basados en cultivos de tejidos de eucariotas superiores para el material biologicamente activo. Sin embargo, los sistemas de produccion basados en el cultivo de tejidos de marnfferos son significativamente mas caros y complicados que los metodos de fermentacion microbiana. Adicionalmente, continuan cuestionandose los productos terapeuticos producidos con el uso de materiales derivados de subproductos animales.
Como eucariota, Pichia pastoris tiene muchas de las ventajas de los sistemas de expresion de eucariotas superiores, tales como el procesamiento de protemas, el plegamiento de protemas, y la modificacion postraduccional, a la misma vez que es tan facil de manipular como E. coli o Saccharomyces cerevisiae. Es mas rapido, mas facil y menos costoso de usar que otros sistemas de expresion eucariotas, tales como baculovirus o de cultivo de tejidos de mairnferos, y generalmente da mayores niveles de expresion. Como una levadura, comparte las ventajas de las manipulaciones moleculares y geneticas con Saccharomyces. Estas caractensticas hacen de Pichia muy util como sistema de expresion de protemas.
Muchas de las tecnicas desarrolladas para Saccharomyces pueden aplicarse a Pichia. Estos incluyen la transformacion por complementacion; la interrupcion genica y la sustitucion genica. Adicionalmente, la nomenclatura genetica usada para Saccharomyces se ha aplicado a Pichia. Existe, ademas, complementacion cruzada entre productos genicos tanto en Saccharomyces como en Pichia. Varios genes silvestres de Saccharomyces complementan genes mutantes comparables en Pichia.
La expresion heterologa en Pichia pastoris puede ser lo mismo intracelular como secretada. La secrecion requiere la presencia de una secuencia senal en la protema expresada para orientarla hacia la via secretora. Aunque varias secuencias senal de secrecion diferentes se han usado exitosamente, que incluyen la senal de secrecion nativa presente en algunas protemas heterologas, el exito ha sido variable. Una ventaja potencial de secrecion de protemas heterologas es que Pichia pastoris secreta bajos niveles de protemas nativas. Eso, combinado con la muy baja cantidad de protema en el medio mmimo de crecimiento de Pichia, significa que la protema heterologa secretada comprende la gran mayona de la protema total en el medio y sirve como la primera etapa en la purificacion de la protema.
Muchas especies de levaduras, que incluye Pichia, se cruzan competente. Esto permite que dos cepas haploides distintas se apareen naturalmente y generen una especie diploide que poseen dos copias cromosomicas.
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Aunque P. pastoris se ha usado exitosamente para la produccion de varias protemas heterologas, por ejemplo, el antigeno de superficie de hepatitis B (Cregg y otros (1987) Bio/Technology 5:479), lisozima e invertasa (Digan y otros (1988) Dev. Indust. Micro. 29:59; Tschopp y otros (1987) Bio/Technology 5:1305), los esfuerzos para producir otros productos de genes heterologos en Pichia, especialmente mediante secrecion, han dado resultados mixtos. En el nivel actual de entendimiento del sistema de expresion de P. pastoris, es impredecible si un gen dado pueda expresarse a un nivel apreciable en esta levadura o si Pichia tolerara la presencia del producto genico recombinante en sus celulas. Ademas, es especialmente diffcil prever si una protema particular sera secretada por P. pastoris, y si lo es, a que eficiencia.
El documento num. WO 00/23579 describe la produccion de anticuerpos monoclonales recombinantes mediante transformacion de una sola cepa haploide de levadura de P. pastoris con genes de inmunoglobulinas de raton/humano que codifican las cadenas pesadas y ligeras.
El documento num. US-A-6,204,023 describe huespedes de levadura transformados para la produccion de moleculas o fragmentos de inmunoglobulinas quimericas o derivados de estos.
La presente invencion proporciona metodos mejorados para la secrecion de heteromultfmeros heterologos a partir de levadura de apareamiento competente, que incluye la especie de Pichia pastoris.
Resumen de la invencion:
Se proporcionan metodos para la smtesis y secrecion de protemas de inmunoglobinas heteromultimericas recombinantes en la levadura Pichia pastoris competente. Las protemas heteromultimericas de interes comprenden al menos dos cadenas polipeptfdicas no identicas, por ejemplo, las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos, las cadenas alfa y beta del MHC; y similares. Se proporciona un vector de expresion para cada cadena de polipeptido no identica.
Cada vector de expresion se transforma en una celula de levadura haploide de Pichia pastoris. En algunas modalidades de la invencion, la celula haploide de levadura esta marcada geneticamente, donde la celula haploide de levadura es una de un par complementario. Un primer vector de expresion se transforma en una celula haploide y un segundo vector de expresion se transforma en una segunda celula haploide. Cuando las celulas haploides tienen que cruzarse, esto sera a traves de fusion genetica directa, o se induce un evento similar con fusion de esferoplastos.
Los niveles de expresion de los polipeptidos no identicos en las celulas haploides pueden calibrarse individualmente, y ajustarse a traves de la seleccion apropiada, el numero de copias del vector, la fuerza y/o la induccion del promotor y similares. En una modalidad de la invencion, el promotor cada vector de expresion es diferente. En otra modalidad de la invencion, se proporciona el mismo promotor para cada uno. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles.
Las celulas haploides transformadas, que cada una sintetiza individualmente un polipeptido no identico, se identifican y despues se cruzan o fusionan geneticamente. Las cepas diploides resultantes se utilizan para producir y secretar protemas de inmunoglobulinas heteromultimericas, completamente ensambladas y biologicamente funcionales. La metodologfa diploide permite que el apareamiento de subunidades optimizadas mejoren la generacion y secrecion de productos de longitud completa.
La presente invencion se define en las reivindicaciones anexas.
Breve descripcion de los dibujos
Figuras 1A-1D. Generacion de anticuerpo recombinante de longitud completa ensamblado. La metodologfa de deteccion por inmunotransferencia se uso para caracterizar las cepas de Pichia haploides parentales, que cada una produce una subunidad del anticuerpo y para la cepa diploide objetivo que produce ambas subunidades que forman el anticuerpo totalmente ensamblado. Las cepas de levadura que se muestran en la Figura 1A muestran un cultivo estatico de cada una de las cepas representativas, donde la parte superior es la de cepas haploides distintas que contienen subunidades de cadena pesadas (H) y ligera (L), respectivamente; la parte inferior, del diploide estable cruzado que produce ambas subunidades. La Figura 1B muestra la deteccion selectiva de la cadena H, que se encuentra solo en el haploide de cadena H parental, y el diploide cruzado que contiene tanto H como L. La Figura 1C muestra la deteccion general de las cadenas H y L, que establece que la produccion proteica es activa en las tres cepas. La Figura 1D muestra la deteccion selectiva en la cepa diploide del anticuerpo completo ensamblado correctamente, lo que confirma que solo el sistema diploide es capaz de generar anticuerpos completamente ensamblados.
Figura 2. Produccion de anticuerpos de longitud completa en Picchia pastoris. La expresion heterologa de anticuerpos de longitud completa se llevo a cabo mediante el uso de una cepa diploide de Pichia pastoris. La protema de anticuerpo exportado se aislo de medios acondicionados mediante el uso de la cromatograffa de afinidad con protema A. Se muestra una almuota de la fraccion maxima. El estandar de IgG humana se derivo de IgG humana purificada de reserva.
Figura 3. El anticuerpo ensamblado se detecto y se caracterizo a partir de los sobrenadantes de los medios de subclones de cepas diploides de Pichia pastoris, que se modificaron geneticamente para producir anticuerpos
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quimericos de raton/humano de longitud completa. Las placas de microtitulacion se recubrieron con anticuerpos anti- humanos selectivos para Fc para capturar el anticuerpo del medio de cultivo. Se detecto el anticuerpo ensamblado correctamente a traves del uso de un (Fab')2 humano selectivo, que reconoce las regiones constantes de la cadena ligera k y de la pesada CH1 apareadas. Se aplicaron diluciones en serie de medios clarificados a la placa. El desarrollo fue a traves de metodos de visualizacion estandar de ELISA. La deteccion es selectiva, como se muestra por la falta de cualquier senal detectable en el patron mlgG.
Figura 4. Manchas de anticuerpos anti-CD3 recombinantes generados de Pichia que contienen celulas T Jurkat, asf como tambien, anticuerpos tradicionales derivados de mairnferos. Las celulas T Jurkat se inmovilizaron en portaobjetos de vidrio y la tincion se llevo a cabo mediante el uso del anticuerpo anti-CD3 generado en levaduras y celulas de marnfferos. La deteccion se realizo mediante el uso de un anticuerpo secundario anti-roedor conjugado biotinilado, y se desarrollo con un derivado de HRP-estreptavidina. Las imagenes son campos representativos de los portaobjetos tratados con cada anticuerpo recombinante. El fondo es el control para el desarrollo y llevado a cabo en ausencia del anticuerpo anti-CD3 primario.
Descripcion detallada de las modalidades
Las protemas de inmunoglobulinas heteromultimericas recombinantes se secretan a partir de cepas diploides de levaduras Pichia de apareamiento competente. Un par de celulas haploides marcadas geneticamente de levadura Pichia pastoris se transforman con vectores de expresion que comprenden subunidades de la protema de inmunoglobulina heteromultimerica. Una celula haploide comprende un primer vector de expresion, y una segunda celula haploide comprende un segundo vector de expresion. Opcionalmente, los vectores de expresion adicionales pueden introducirse en las celulas haploides o diploides; o el primer o segundo de los vectores de expresion pueden comprender secuencias codificantes adicionales para la smtesis de heterotnmeros; heterotetrameros; etcetera. Los niveles de expresion de los polipeptidos no identicos pueden calibrarse individualmente, y ajustarse a traves de la seleccion apropiada, el numero de copias del vector, la fuerza y/o la induccion del promotor y similares. Las celulas haploides transformadas se cruzan o fusionan geneticamente. Las cepas diploides o tetraploides resultantes se utilizan para producir y secretar protemas de inmunoglobulinas heteromultimericas, completamente ensambladas y biologicamente funcionales.
El uso de celulas diploides o tetraploides para la produccion de protemas proporciona beneficios inesperados. Las celulas pueden cultivarse para propositos de produccion, es decir, escalarse, y por penodos de tiempo prolongados, en condiciones que pueden ser perjudiciales para el crecimiento de las celulas haploides, cuyas condiciones pueden incluir una alta densidad celular; crecimiento en medio mmimo; crecimiento a bajas temperaturas; crecimiento estable en ausencia de presion selectiva; y que pueden proporcionar un mantenimiento de la integridad de secuencia de los genes heterologos y el mantenimiento de la expresion de alto nivel con el tiempo. Estos beneficios pueden surgir, al menos en parte, de la creacion de cepas diploides a partir de dos cepas haploides parentales distintas. Tales cepas haploides pueden comprender numerosas mutaciones autotroficas menores, cuyas mutaciones se complementan en los diploides o tetraploides, lo que permite el crecimiento bajo condiciones altamente selectivas.
Definiciones
Debe entenderse que esta invencion no se limita a la metodologfa, protocolos, lmeas celulares, especies o generos de animales, y reactivos particulares, descritos y como tal pueden variar. Se debera entender, ademas, que la terminologfa que se usa en la presente descripcion es para el proposito de describir modalidades particulares solamente, y no pretende ser limitante del alcance de la presente invencion la cual se limitara solamente por las reivindicaciones anexas.
Como se usan en la presente descripcion, las formas singulares "un", "uno/una", y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asf, por ejemplo, la referencia a "una celula" incluye una pluralidad de tales celulas y la referencia a "la protema" incluye la referencia a una o mas protemas y equivalentes de estas conocidos por los expertos en la tecnica, etcetera. A menos que se especifique lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en la presente descripcion tienen el mismo significado que el conocido comunmente por el experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion.
Especies de levaduras de apareamiento competente. Existen tales especies de levaduras en una forma haploide y diploide. Las celulas diploides pueden, bajo condiciones apropiadas, proliferar por numero indefinido de generaciones en la forma diploide. Las celulas diploides pueden, ademas, producir esporas para formar celulas haploides. Adicionalmente, el apareamiento secuencial puede resultar en cepas tetraploides a traves de apareamiento adicional de los diploides auxotroficos.
De acuerdo con la invencion, la levadura de apareamiento competente es un miembro de las especies de Pichia pastoris.
Celula Haploide de Levadura: Una celula que tiene una unica copia de cada gen de su complemento (cromosomico) genomico normal.
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Celula Diploide de Levadura: Una celula que tiene dos copias (alelos) de cada gen de su complemento genomico normal, tipicamente, formado por el proceso de fusion (apareamiento) de dos celulas haploides.
Celula Tetraploide de Levadura. Una celula que tiene cuatro copias (alelos) de cada gen de su complemento genomico normal, tipicamente, formado por el proceso de fusion (apareamiento) de dos celulas haploides. Los tetraploides pueden llevar dos, tres, o cuatro casetes diferentes. Tales tetraploides pudieran obtenerse en Pichia pastoris mediante apareamiento secuencial de haploides para obtener diploides auxotroficos. Por ejemplo, un haploide [met his] puede aparease con el haploide [ade his] para obtener el diploide [his]; y un haploide [met arg] puede aparearse con el haploide [ade arg] para obtener el diploide [arg]; entonces el diploide [his] x diploide [arg] se obtiene un tetraploide prototrofico. Se entendera por los expertos en la tecnica que la referencia a los beneficios y usos de celulas diploides puede aplicarse, ademas, a celulas tetraploides.
Apareamiento de levaduras: El proceso por el cual dos celulas haploides de levadura, se fusionan naturalmente para formar una celula de levadura diploide.
Meiosis: El proceso por el cual una celula de levadura diploide experimenta division reductiva para formar cuatro productos de esporas haploides. Cada espora puede despues germinar y formar una lmea celular de crecimiento vegetativamente haploide.
Marcador seleccionable: Un marcador seleccionable es un gen o fragmento de gen que confiere un fenotipo de crecimiento (caractenstica de crecimiento ffsico) en una celula que recibe ese gen como, por ejemplo a traves de un evento de transformacion. El marcador seleccionable permite a esa celula sobrevivir y crecer en un medio de crecimiento selectivo, bajo condiciones en las que las celulas que no reciben ese gen marcador seleccionable, no puedan crecer. Los genes marcadores seleccionables generalmente se dividen en varios tipos, que incluyen los genes marcadores seleccionables positivos, tal como un gen que confiere a una celula resistencia a un antibiotico u otro farmaco, temperatura cuando dos mutantes ts se cruzan o un mutante ts se transforma; genes marcadores de seleccion negativos, tal como un gen de biosmtesis que confiere a una celula la capacidad de crecer en un medio sin un nutriente espedfico necesario por todas las celulas que no tienen ese gen biosintetico, o un gen biosintetico mutagenizado que confiere a una celula la incapacidad para crecer por las celulas que no tienen el gen silvestre; y similares. Los marcadores adecuados incluyen, pero sin limitarse a: ZEO; G418; HlS 5; LYS3; MET1; MET3a; ADE1; ADE3; URA3; y similares.
Vector de expresion: Estas especies de ADN que contienen elementos que facilitan la manipulacion para la expresion de una protema extrana dentro de la celula huesped objetivo. Convenientemente, la manipulacion de secuencias y produccion de ADN para la transformacion se lleva a cabo primero en un huesped bacteriano, por ejemplo, E. coli, y usualmente los vectores incluiran secuencias para facilitar tales manipulaciones, lo que incluye un origen bacteriano de replicacion y un marcador de seleccion bacteriana apropiado. Los marcadores seleccionables codifican protemas necesarias para la supervivencia o crecimiento de celulas huesped transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las celulas huesped no transformadas con el vector que contiene el gen de seleccion no sobreviviran en el medio de cultivo. Los genes de seleccion tfpicos codifican protemas que (a) confieren resistencia a antibioticos u otras toxinas, (b) complementan deficiencias auxotroficas, o (c) suministran nutrientes cnticos no disponibles en los medios complejos.
Los vectores de expresion para uso en los metodos de la invencion incluiran ademas secuencias espedficas de levadura, lo que incluye un marcador auxotrofico o de farmaco, seleccionable para la identificacion de cepas de levadura transformadas. Un marcador de farmaco puede, ademas, usarse para amplificar el numero de copias del vector en una celula huesped de levadura.
La secuencia codificante del polipeptido de interes esta unida operativamente a secuencias transcripcionales y traduccionales que tienen en cuenta la expresion del polipeptido en celulas de levadura. Estos componentes del vector pueden incluir, pero sin limitarse a, uno o mas de los siguientes: un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminacion de la transcripcion. Las secuencias para la secrecion del polipeptido pueden, ademas, incluir, por ejemplo, una secuencia senal, y similares. Un origen de levadura de replicacion es opcional, como vectores de expresion frecuentemente se integran en el genoma de la levadura.
En una modalidad de la invencion, el polipeptido de interes esta unido operativamente, o fusionado, a las secuencias que proporcionan la secrecion optimizada del polipeptido a partir de celulas diploides de levadura Pichia pastoris.
Los acidos nucleicos estan "unidos operativamente" cuando se colocan en una relacion funcional con otra secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una secuencia senal esta unido operativamente al ADN para un polipeptido si este se expresa como una preprotema que participa en la secrecion del polipeptido; un promotor o potenciador esta unido operativamente a una secuencia codificante si este afecta la transcripcion de la secuencia. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas, y, en el caso de un lfder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La union se consigue mediante ligacion en sitios de restriccion convenientes o, alternativamente, a traves de un metodo de PCR/recombinacion familiar para los expertos en la tecnica (GatewayR Technology; Invitrogen, Carlsbad California). Si
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esos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores sinteticos del oligonucleotido se usan de acuerdo con la practica convencional.
Los promotores son secuencias no traducidas localizadas aguas arriba (5') al codon de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 pb) que controlan la transcripcion y traduccion de la secuencia de acido nucleico particular a la que esta unida operativamente. Tales promotores se dividen en varias clases: promotores inducibles, constitutivos, y reprimibles, que aumentan los niveles de la transcripcion en respuesta a la ausencia de un represor. Los promotores inducibles pueden iniciar niveles aumentados de transcripcion del ADN bajo su control en respuesta a algun cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura.
El fragmento promotor de levadura puede servir, ademas, como el sitio para la recombinacion homologa y la integracion del vector de expresion en el mismo sitio en el genoma de la levadura; alternativamente, un marcador seleccionable se usa como el sitio para la recombinacion homologa. La transformacion de Pichia se describe en Cregg y otros, (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385.
Ejemplos de promotores adecuados de Pichia incluyen el promotor AOX1 y (Cregg y otros (1989) Mol. Cell. Biol. 9:13161323); el promotor ICL1 (Menendez y otros (2003) Yeast 20(13):1097-108); el promotor de gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) (Waterham y otros (1997) Gene 186(1):37-44); y el promotor FLD1 (Shen y otros (1998) Gene 216(1):93-102). El promotor GAP es un promotor constitutivo fuerte y los promotores AOX y FLD1 son inducibles.
Los polipeptidos de interes pueden producirse de forma recombinante no solo directamente, sino tambien como un polipeptido de fusion con un polipeptido heterologo, por ejemplo, una secuencia senal u otro polipeptido que tiene un sitio de escision espedfico en el extremo N-terminal del polipeptido o protema madura. Generalmente, la secuencia senal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte de la secuencia codificante del polipeptido que se inserta en el vector. La secuencia senal heterologa seleccionada preferentemente es una que se reconoce y se procesa a traves de una de las vfas estandar disponibles dentro de la celula huesped. El factor alfa pre-pro senal de S. cerevisiae ha demostrado ser efectivo en la secrecion de una variedad de protemas recombinantes de P. pastoris. Las senales de secrecion de interes incluyen, ademas, secuencias senal de mairnferos, que pueden ser heterologas para la protema que es secretada, o puede ser una secuencia nativa para la protema que es secretada. Las secuencias senal incluyen secuencias de prepeptidos, y en algunos casos pueden incluir secuencias de propeptidos. Muchas de estas secuencias senal se conocen en la tecnica, que incluyen las secuencias senal encontradas en cadenas de inmunoglobulinas, por ejemplo, la secuencia de preprotoxina K28, PHA-E, FACE, MCP-1 humana, las secuencias senal de albumina serica humana, la cadena pesada de Ig humana, la cadena ligera de Ig humana, y similares. Por ejemplo, ver Hashimoto y otros, Protein Eng 11(2) 75 (1998); y Kobayashi y otros, Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998).
La transcripcion puede aumentarse mediante insercion de una secuencia activadora de la transcripcion en el vector. Estos activadores son elementos que actuan en cis del ADN, usualmente aproximadamente de 10 a 300 pb, que actuan sobre un promotor para aumentar su transcripcion. Los potenciadores de la transcripcion son relativamente independientes de la orientacion y posicion, se han encontrado 5' y 3' en la unidad de transcripcion, dentro de un intron, asf como tambien dentro de la propia secuencia codificante. El potenciador puede empalmarse en el vector de expresion en una posicion 5' o 3' en la secuencia codificante, pero se localiza preferentemente en un sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresion usados en las celulas huesped eucariotas pueden contener, ademas, secuencias necesarias para la terminacion de la transcripcion y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias estan comunmente disponibles a partir de 3' hacia el codon de terminacion de la traduccion, en las regiones no traducidas de ADN o ADNc de eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleotidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porcion no traducida del ARNm.
La construccion de vectores adecuados que contienen uno o mas de los componentes anteriormente enumerados, emplea tecnicas estandar de ligacion o metodos de PCR/recombinacion. Los plasmidos aislados o fragmentos de ADN se escinden, se adaptan, y se ligan de nuevo en la forma deseada para generar los plasmidos requeridos, o a traves de metodos de recombinacion. Para el analisis para confirmar las secuencias correctas en los plasmidos construidos, las mezclas de ligacion se usan para para transformar celulas huesped, y los transformantes exitosos se seleccionan mediante resistencia a antibioticos (por ejemplo ampicilina o Zeocin) segun sea apropiado. Los plasmidos de los transformantes se preparan, analizan mediante digestion con endonucleasas de restriccion y/o se secuencian.
Como alternativa a la restriccion y la ligacion de fragmentos, los metodos de recombinacion basados en sitios att y enzimas de recombinacion pueden usarse para insertar secuencias de ADN en un vector. Tales metodos se describen, por ejemplo, por Landy (1989) Ann.Rev.Biochem. 58:913-949; y son conocidos por los expertos en la tecnica. Tales metodos utilizan la recombinacion del ADN intermolecular que esta mediada por una mezcla de protemas de recombinacion codificadas por lambda y E. coli. La recombinacion ocurre entre sitios espedficos de union (att) en las moleculas de ADN que interactuan. Para una descripcion de los sitios att ver Weisberg y Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, en Lambda II, Weisberg, ed. (Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Press), pp.211-250. Los segmentos de ADN que flanquean los sitios de recombinacion se conmutan, de manera que despues
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de la recombinacion, los sitios att son secuencias hftbridas que constan de secuencias donadas por cada vector parental. La recombinacion puede ocurrirentre los ADN de cualquiertopologfa.
Los sitios att pueden introducirse en una secuencia de interes mediante ligacion de la secuencia de interes en un vector apropiado; lo que genera un producto de PCR que contiene sitios B att a traves del uso de cebadores espedficos; lo que genera una genoteca de ADNc clonado en un vector apropiado que contiene sitios att; y similares.
El plegado, como se usa en la presente descripcion, se refiere a la estructura tridimensional de polipeptidos y protemas, donde las interacciones entre los residuos de aminoacidos actuan para estabilizar la estructura. Mientras que las interacciones no covalentes son importantes en la determinacion de la estructura, usualmente las protemas de interes tendran enlaces disulfuro covalentes intra e/o intermoleculares formados por dos residuos de cistema. Para protemas y polipeptidos o derivados de origen natural y variantes de estos, el plegado correcto es tfpicamente la disposicion que resulta en una actividad biologica optima, y puede, convenientemente, monitorearse mediante ensayos de actividad, por ejemplo, por union de ligandos, por actividad enzimatica, etcetera.
En algunos casos, por ejemplo cuando el producto deseado es de origen sintetico, los ensayos basados en actividad biologica seran menos significativos. El plegado correcto de tales moleculas puede determinarse sobre la base de las propiedades ffsicas, consideraciones energeticas, estudios de modelacion, y similares.
El huesped de expresion puede modificarse aun mas mediante la introduccion de secuencias que codifican una o mas enzimas que mejoran el plegado y formacion de enlaces disulfuro, es decir, foldasas, chaperoninas, etcetera. Tales secuencias pueden expresarse de forma constitutiva o inducible en la celula huesped de levadura, mediante el uso de vectores, marcadores, etcetera, como se conoce en la tecnica. Preferentemente, las secuencias, que incluyen los elementos reguladores de la transcripcion suficientes para el patron deseado de expresion, se integran de forma estable en el genoma de la levadura a traves de una metodologfa espedfica.
Por ejemplo, el PDI eucariota no es solo un catalizador eficiente de la oxidacion de cistema de protemas e isomerizacion de enlaces disulfuro, sino que tambien muestra actividad chaperona. La coexpresion de PDI puede facilitar la produccion de protemas activas que tienen multiples enlaces disulfuro. Ademas es de interes la expresion de BIP (protema de union a la cadena pesada de inmunoglobulinas); ciclofilina; y similares. En una modalidad de la invencion, cada una de las cepas parentales haploides expresa una enzima de plegado distinta, por ejemplo, una cepa puede expresar BIP, y la otra cepa puede expresar PDI.
Los terminos "protema deseada" o "protema objetivo" se usan indistintamente, y se refieren generalmente a cualquier protema secretada que tiene 2 o mas cadenas polipeptfdicas no identicas, donde tales cadenas se sintetizan independientemente, es decir, no resultan de la escision postraduccional de una unica cadena polipeptfdica. Los polipeptidos son heterologos, es decir, extranos, para la levadura. Preferentemente, se usan polipeptidos de mamferos, es decir, polipeptidos codificados en un genoma de mamfero.
En una modalidad preferida, la protema es un anticuerpo. El termino "anticuerpo" pretende incluir cualquier estructura molecular que contiene cadenas polipeptfdicas con una forma espedfica que se adapte a y reconoce un epftopo, donde una o mas interacciones de union no covalentes estabilizan el complejo entre la estructura molecular y el epftopo. La molecula de anticuerpo arquetfpica es la inmunoglobulina, y todos los tipos de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etcetera, de todas las fuentes, por ejemplo, de humanos, de roedor, de conejo, de vaca, de oveja, de cerdo, de perro, de otros mairftferos, de pollo, de otras aves, etcetera, se consideran que son "anticuerpos". Numerosas secuencias codificantes de anticuerpos se han descrito; y otras pueden originarse por metodos bien conocidos en la tecnica.
Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de union a antfgenos pueden producirse por ingeniena genetica. En esta tecnica, como con otros metodos, las celulas productoras de anticuerpos se sensibilizan al antfgeno o inmunogeno deseado. El ARN mensajero aislado de celulas productoras de anticuerpos se usa como un molde para hacer ADNc mediante el uso de la amplificacion por PCR. Una genoteca de vectores, que cada uno contiene un gen de la cadena pesada y un gen de cadena ligera, que retienen la especificidad inicial por el antfgeno, se produce mediante la insercion de secciones apropiadas del ADNc amplificado de inmunoglobulina en los vectores de expresion. Una genoteca combinatoria se construye mediante combinacion de la genoteca de los genes de la cadena pesada con la genoteca de genes de la cadena ligera. Esto resulta en una genoteca de clones que coexpresan una cadena pesada y una ligera (que se asemeja el fragmento Fab o fragmento de union al antfgeno o a una molecula de anticuerpo). Los vectores que llevan estos genes son cotransfectados en una celula huesped. Cuando se induce la smtesis de genes de anticuerpos en el huesped transfectado, las protemas de cadena pesada y ligera se autoensamblan para producir anticuerpos activos que pueden detectarse mediante la seleccion con el antfgeno o inmunogeno.
Las secuencias codificantes de anticuerpos de interes incluyen las codificadas por secuencias nativas, asf como tambien acidos nucleicos que, en virtud de la redundancia del codigo genetico, no son identicas en secuencia a los acidos nucleicos descritos, y variantes de estos. Las variantes de polipeptidos pueden incluir sustituciones, adiciones o deleciones de aminoacidos (aa). Las sustituciones de aminoacidos pueden ser sustituciones de aminoacidos conservativas o sustituciones para eliminar aminoacidos no esenciales, tales como para alterar un sitio de glicosilacion,
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o para minimizar el plegado incorrecto por sustitucion o delecion de uno o mas residuos de cistema que no son necesarios para la funcion. Las variantes pueden disenarse con el fin de retener o tener actividad biologica potenciada de una region particular de la protema (por ejemplo, un dominio funcional, los residuos aminoacidos catalfticos, etcetera). Las variantes incluyen, ademas, fragmentos de los polipeptidos descritos en la presente descripcion, particularmente fragmentos biologicamente activos y/o fragmentos correspondientes a dominios funcionales. Se conocen tecnicas para mutagenesis in vitro de genes clonados. En la materia de la invencion se incluyen, ademas, polipeptidos que han sido modificados mediante el uso de tecnicas biologicas moleculares normales a fin de mejorar su resistencia a la degradacion proteolftica o para optimizar las propiedades de solubilidad o para hacerlos mas adecuados como un agente terapeutico.
Los anticuerpos quimericos pueden prepararse por medios recombinantes mediante la combinacion de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada (VK y VH), obtenidas a partir de celulas productoras de anticuerpos de una especie con regiones constantes de las cadenas ligera y pesada de otra. Tfpicamente, los anticuerpos quimericos utilizan regiones variables de roedores o de conejo y regiones constantes de humanos, con para producir un anticuerpo con dominios predominantemente humanos. La produccion de tales protemas quimericas se conocen en la tecnica, y pueden lograrse por medios estandar (como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos num. 5,624,659).
Los anticuerpos humanizados se disenan para contener aun mas dominios de inmunoglobulinas semejantes a las humanas, e incorporar solo las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo derivado de un animal. Esto se logra mediante el examen cuidadoso de la secuencia de los lazos hipervariables de las regiones variables del anticuerpo monoclonal, y ajuste de ellos a la estructura de las cadenas de anticuerpos humanos. Aunque facialmente complejo, el proceso es sencillo en la practica. Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos num. 6,187,287.
Adicionalmente a las inmunoglobulinas enteras (o sus homologos recombinantes), pueden sintetizarse los fragmentos de inmunoglobulinas que comprenden el sitio de union al epttopo (por ejemplo, Fab', F(ab')2, u otros fragmentos). Las inmunoglobulinas mmimas o "fragmento", pueden disenarse mediante la utilizacion de tecnicas de inmunoglobulinas recombinantes. Por ejemplo las inmunoglobulinas "Fv" para uso en la presente invencion pueden producirse mediante la smtesis de una region variable de la cadena ligera y una region variable de la cadena pesada. Las combinaciones de anticuerpos son ademas de interes, por ejemplo, diacuerpos, que comprenden dos especificidades Fv distintas.
Las inmunoglobulinas pueden modificarse postraduccionalmente, por ejemplo, para anadir enlazadores qmmicos, porciones detectables, tales como colorantes fluorescentes, enzimas, sustratos, porciones quimioluminiscentes y similares, o porciones de union espedfica, tales como estreptavidina, avidina, o biotina, y similares pueden utilizarse en los metodos y composiciones de la presente invencion.
Metodos de smtesis de polipeptidos
Las celulas de levadura haploides de apareamiento competente transformadas proporcionan un metodo genetico que permite el apareamiento de subunidades de una protema deseada. Las cepas haploides de levadura Pichia pastoris se transforman con cada uno de dos vectores de expresion, un primer vector para dirigir la smtesis de una cadena polipeptfdica y un segundo vector para dirigir la smtesis de una segunda cadena polipeptfdica, no identica. Las dos cepas haploides de Pichia pastoris se aparean para proporcionar un huesped diploide donde puede obtenerse la produccion optimizada de protema objetivo.
Opcionalmente, se proporciona(n) secuencia(s) codificante(s) no identica(s) adicional(es). Tales secuencias pueden estar presentes en vectores de expresion adicionales o en el primer o el segundo de los vectores de expresion. Como se conoce en la tecnica, multiples secuencias codificantes pueden expresarse de forma independiente a partir de promotores individuales; o pueden expresarse de forma coordinada a traves de la inclusion de un "sitio de entrada al ribosoma interno" o "IRES", que es un elemento que promueve el acceso directo al ribosoma interno, al codon de iniciacion, tal como ATG, de un cistron (una region que codifica la protema), lo que conduce, de esta manera, a la traduccion del gen independiente de la caperuza. Los elementos IRES funcionales en levadura se describen por Thompson y otros, (2001) P.N.A.S. 98:12866-12868.
En una modalidad de la invencion, las secuencias de anticuerpos se producen en combinacion con una cadena secretora J, que tiene en cuenta la estabilidad mejorada de IgA (ver patentes de Estados Unidos nums. 5,959,177; y 5,202,422).
Las dos cepas haploides de levadura son cada una auxotrofa, y requieren la suplementacion de los medios para el crecimiento de las celulas haploides. El par de auxotrofos son complementarios, de manera que el producto diploide crecera en ausencia de los suplementos necesarios para las celulas haploides. Muchos de estos marcadores geneticos se conocen en la levadura, lo que incluyen los requerimientos para los aminoacidos (por ejemplo, met, lys, his, arg, etcetera), nucleosidos (por ejemplo ura3, ade1, etcetera); y similares. Los marcadores de aminoacidos pueden ser preferidos para los metodos de la invencion.
Las dos celulas haploides transformadas pueden cruzarse geneticamente y las cepas diploides que se originan de este
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evento de apareamiento, se seleccionaron por sus requerimientos nutricionales hforidos. Alternativamente, las poblaciones de las dos cepas haploides transformadas se convierten en esferoplastos y se fusionan, y la progenie diploide se regenero y selecciono. Por cualquier metodo, las cepas diploides pueden identificarse y cultivarse de forma selectiva, ya que, a diferencia de sus parentales haploides, ellas no tienen las mismas necesidades nutricionales. Por ejemplo, las celulas diploides pueden cultivarse en medio mmimo. La estrategia de smtesis diploide tiene ciertas ventajas. Las cepas diploides tienen el potencial para producir niveles mejorados de protemas heterologas a traves de la complementacion mas amplia con mutaciones subyacentes, que pueden afectar la produccion y/o secrecion de la protema recombinante.
En una modalidad de la invencion, cada una de las cepas haploides de Pichia pastoris se transforma con una biblioteca de polipeptidos, por ejemplo, una biblioteca de cadenas pesadas o ligeras de anticuerpos. Las celulas haploides transformadas que sintetizan los polipeptidos se aparean con las celulas haploides complementarias. Las celulas diploides resultantes se seleccionan para la protema funcional. Las celulas diploides proporcionan un medio de llevar rapido, conveniente y economicamente, de forma simultanea a un gran numero de combinaciones de polipeptidos para las pruebas funcionales. Esta tecnologfa es especialmente aplicable para la generacion de productos de protemas heterodimericas, donde los niveles de smtesis optimizada de subunidades son cnticos para la expresion y la secrecion de la protema funcional.
En otra modalidad de la invencion, la relacion del nivel de expresion de las dos subunidades se regula para maximizar la generacion de productos. Los niveles de protema de la subunidad del heterodfmero se ha demostrado previamente que afectan la generacion del producto final (Simmons LC, J Immunol Methods. 2002 May 1;263(1-2):133-47). La regulacion puede lograrse antes de la etapa de apareamiento, mediante la seleccion para un marcador presente en el vector de expresion. Al aumentar de forma estable el numero de copias del vector, el nivel de expresion puede aumentarse. En algunos casos, puede ser deseable aumentar el nivel de una cadena con relacion a la otra, para alcanzar una proporcion equilibrada entre las subunidades del polipeptido. Los marcadores de resistencia a antibioticos son utiles para este proposito, por ejemplo, el marcador de resistencia a Zeocin, resistencia a G418, etcetera, y proporcionar un medio de enriquecimiento para las cepas que contienen multiples copias integradas de un vector de expresion en una cepa mediante la seleccion de los transformantes que son resistentes a niveles superiores de Zeocin o G418. La relacion adecuada, por ejemplo 1:1; 1:2; etcetera, de los genes de las subunidades puede ser importante para la produccion de protemas eficientes. Aun cuando el mismo promotor se usa para transcribir ambas subunidades, muchos otros factores contribuyen al nivel final de protema expresada y, portanto, puede ser util aumentar el numero de copias de un gen codificado con relacion al otro. Alternativamente, las cepas diploides que producen niveles mas altos de un polipeptido, con relacion a cepas con una sola copia del vector, se crean mediante apareamiento de dos cepas haploides, ambas de las cuales tienen multiples copias de los vectores de expresion.
Las celulas huesped se transforman con los vectores de expresion descritos anteriormente, se aparean para formar cepas diploides, y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados segun sea apropiado, para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Se conocen en la tecnica un numero de medios mmimos adecuados para el crecimiento de la levadura. Cualquiera de estos medios puede suplementarse segun sea necesario con sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleosidos (tales como adenosina y timidina), antibioticos, elementos traza, y glucosa o una fuente de energfa equivalente. Ademas pueden incluirse cualquiera de otros suplementos necesarios, a concentraciones adecuadas que pudieran ser conocidas para los expertos en la tecnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, y similares, son aquellas previamente usadas con la celula huesped seleccionada para la expresion, y resultaran evidentes para el experto en la tecnica.
Las protemas secretadas se recuperan del medio de cultivo. Un inhibidor de proteasas, tal como fluoruro de fenil metil sulfonilo (PMSF) puede ser util para inhibir la degradacion proteolftica durante la purificacion, y pueden incluirse antibioticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios. La composicion puede concentrarse, filtrarse, dializarse, etcetera, mediante el uso de metodos conocidos en la tecnica.
Las celulas diploides de Pichia pastoris de la invencion se cultivan con fines de produccion. Tales fines de produccion incluyen convenientemente el crecimiento en medio mmimo, cuyo medio carece de aminoacidos preformados y otras biomoleculas complejas, por ejemplo, el medios que comprende amoniaco como fuente de nitrogeno y glucosa como fuente de energfa y carbono, y sales como una fuente de fosfato, calcio y similares. Preferentemente tal medio de produccion carece de agentes selectivos tales como antibioticos, aminoacidos, purinas, pirimidinas, etcetera. Las celulas diploides pueden cultivarse para una alta densidad celular, por ejemplo al menos aproximadamente 50 g/L; mas usualmente al menos aproximadamente 100 g/L; y puede ser al menos aproximadamente 300, aproximadamente 400, aproximadamente 500 g/L o mas.
En una modalidad de la invencion, el crecimiento de las celulas en cuestion para fines de produccion se realiza a temperaturas bajas, cuyas temperaturas pueden disminuirse durante la fase logantmica, durante la fase estacionaria, o ambas. El termino "temperatura baja" se refiere a temperaturas de al menos aproximadamente 15 °C, mas usualmente al menos aproximadamente 17 °C, y puede ser de aproximadamente 20 °C, y es usualmente de no mas de aproximadamente 25 °C, mas usualmente no mas de aproximadamente 22 °C. La temperatura de crecimiento puede afectar la produccion de protemas secretadas de longitud completa en cultivos de produccion, y la disminucion de la
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temperatura de crecimiento del cultivo puede incrementar fuertemente el rendimiento del producto intacto. La temperatura disminuida parece ayudar a la circulacion intracelular a traves de las v^as de procesamiento de plegado y postraduccionales, usadas por el huesped para generar el producto objetivo, junto con la reduccion de la degradacion de proteasas celulares.
Los metodos de la invencion tienen en cuenta la expresion de la protema activa, secretada, particularmente, anticuerpos activos, secretados, donde "anticuerpos activos", como se usa en la presente descripcion, se refiere a un multimero correctamente plegado de al menos dos cadenas correctamente apareadas, que se une con precision a su antigeno cognado. Los niveles de expresion de protema activa son usualmente al menos aproximadamente 50 mg/litro de cultivo, mas usualmente al menos aproximadamente 100 mg/litro, preferentemente al menos aproximadamente 500 mg/litro, y puede ser de 1000 mg/litro o mas.
Los metodos de la invencion pueden proporcionar una mayor estabilidad del huesped de Pichia pastoris y de las secuencias codificantes heterologas durante la produccion. La estabilidad se evidencia, por ejemplo, mediante el mantenimiento de altos niveles de expresion de tiempo, donde el nivel de partida de la expresion se reduce en no mas de aproximadamente 20 %, usualmente no mas de 10 %, y puede disminuirse por no mas de aproximadamente 5 % durante aproximadamente 20 duplicaciones, 50 duplicaciones, 100 duplicaciones, o mas.
La estabilidad de la cepa de Pichia pastoris considera, ademas, el mantenimiento de la integridad de la secuencia genica heterologa con el tiempo, donde la secuencia de la secuencia codificante activa y de los elementos reguladores de la transcripcion esenciales se mantienen en al menos aproximadamente el 99 % de las celulas diploides, normalmente en al menos aproximadamente 99.9% de la celulas diploides, y preferentemente, en al menos aproximadamente 99.99 % de las celulas diploides durante aproximadamente 20 duplicaciones, 50 duplicaciones, 100 duplicaciones, o mas. Preferentemente, sustancialmente todas las celulas diploides mantienen la secuencia de la secuencia codificante activa y de los elementos reguladores transcripcionales esenciales.
Debe entenderse que esta invencion no se limita a la metodologfa, protocolos, lmeas celulares, especies o generos animales, construcciones y reactivos particulares descritos, ya que esos, por supuesto, pueden variar. Debe entenderse, ademas, que la terminologfa que se usa en la presente descripcion es para el proposito de describir modalidades particulares solamente, y no pretende ser limitante del alcance de la presente invencion la cual se limitara solamente por las reivindicaciones anexas.
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en la presente descripcion tienen el mismo significado que el conocido comunmente por el experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Aunque puede usarse cualquier metodo, dispositivo, y material similar o equivalente a los descritos en la presente descripcion al llevar a la practica o probar la invencion, los metodos, dispositivos y materiales preferidos se describen ahora.
Todas las publicaciones mencionadas en la presente descripcion son para el proposito de describir, por ejemplo, las lmeas celulares, construcciones y metodologfas que se describen en las publicaciones, que pudieran usarse en relacion con la invencion descrita en la presente. Las publicaciones discutidas anteriormente y a lo largo del texto se proporcionan solamente para su descripcion previa a la fecha de presentacion de la presente solicitud. Nada de la presente invencion debe interpretarse como una aceptacion de que los inventores no tienen derecho a antedatar dicha descripcion en virtud de invencion previa.
Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos en la tecnica una divulgacion y descripcion completas de como hacer y usar la invencion en cuestion, y no pretenden limitar el alcance de lo que se considera como la invencion segun se define en las reivindicaciones. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los numeros usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, concentraciones, etcetera), pero deben tomarse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otra forma, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura es en grados centfgrados, y la presion es a, o cerca de, la atmosferica.
Experimentos
Ejemplo 1
Para demostrar la eficacia del metodo de produccion de anticuerpos de diploides se prepararon los siguientes reactivos.
Genes de anticuerpos: Los genes se clonaron y construyeron de manera que dirigieron la smtesis de tres formas de un anticuerpo monoclonal OKT3 de raton humanizado quimerico. Las fuentes de las regiones variables para su uso en estas construcciones pueden encontrarse en Genbank. Numero de acceso A22261; cadena pesada OKT3 de raton (solicitud de patente Internacional num. WO 9109967-A3 11-JUL-1991). Numero de acceso A22259; cadena ligera OKT3 de raton (solicitud de patente internacional num. WO 9109967-A3 11-JUL-1991).
Las tres formas utilizaron el gen de cadena ligera VkCk identico (sec. con num. de ident. 10). Para los tres genes de
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cadena pesada, todos codificaron la region variable de raton identica (Vh) pero se diferenciaron entre s^ en la secuencia de aminoacidos de las regiones constantes de la cadena pesada humana. El primer constructo dirigio la smtesis de una cadena pesada silvestre de longitud completa (Cy1) con su sitio de glicosilacion normal con enlace a N presente (cadena pesada glicosilada de longitud completa (sec. con num. de ident. 13 y num. 14). El segundo gen dirigio la smtesis de una cadena pesada no glicosilada creado por la mutacion de un nucleotido en la secuencia, de modo que una treonina en la posicion 301 se cambio a una alanina en la secuencia de reconocimiento del sitio de glicosilacion (ASN-X-Thr/Ser) (cadena pesada no glicosilada de longitud completa) (sec. con num. de ident. 15). El tercer constructo genico dirigio la smtesis de una cadena pesada en la que se elimino la mayor parte de la region constante despues de la region bisagra (Fab de cadena pesada) (sec. con num. de ident.: 16).
Vector de expresion: El vector contiene los siguientes componentes funcionales: 1) un origen de replicacion ColE1 mutante, que facilita la replicacion del vector plasmfdico en las celulas de la bacteria Escherichia coli; 2) un gen Sh ble bacteriano, que confiere resistencia al antibiotico Zeocin y sirve como el marcador seleccionable para transformaciones tanto de E. coli como de P. pastoris; 3) un casete de expresion compuesto por el promotor del gen de gliceraldetudo deshidrogenasa (gen GAP), fusionado a secuencias que codifican la secuencia lfder de pre prosecrecion del factor de apareamiento alfa de Saccharomyces cerevisiae, seguido por las secuencias que codifican una senal de terminacion transcripcional de P. pastoris del gen de alcohol oxidasa I (AOX1) de P. pastoris. El gen marcador de resistencia a Zeocin proporciona un medio de enriquecimiento para las cepas que contienen multiples copias integradas de un vector de expresion en una cepa mediante la seleccion de los transformantes que son resistentes a mayores niveles de Zeocin.
Cepas de P. pastoris: Las cepas auxotroficas usadas para este ejemplo son las cepas ade1 y ura3 de P. pastoris, que requieren la suplementacion con adenina y uracilo, respectivamente, para el crecimiento. Se han usado, ademas, las cepas met1 y lys3. Aunque cualquiera de los dos conjuntos de complementacion de cepas auxotroficas de Pichia pastoris podnan usarse para la construccion y mantenimiento de cepas diploides, estas dos cepas se adaptan especialmente para este metodo por dos razones. En primer lugar, crecen mas lentamente que las cepas diploides que son el resultado de su apareamiento o fusion. Asf, si un pequeno numero de celulas haploides ade1 o ura3 permanecen presentes en un cultivo o se originan a traves de meiosis u otro mecanismo, la cepa diploide debe superarlas en cultivo.
En segundo lugar es facil de controlar el estado sexual de estas cepas ya que las colonias del producto diploide de su apareamiento son de un color blanco o crema normal, mientras que las celulas de cualquiera de las cepas que son mutantes ade1 haploides en un cultivo forman una colonia con distinto color rosado. Adicionalmente, cualquiera de las cepas que son mutantes ura3 haploides son resistentes al farmaco acido 5-fluoro-orotico (FOA) y pueden identificarse con sensibilidad mediante la siembra en placas de muestras de un cultivo de medio mmimo + uracilo con FOA. En estas placas, solamente las cepas mutantes ura3 que requieren uracilo (presumiblemente haploides) pueden crecer y formar colonias. Asf, con cepas parentales haploides marcadas con ade1 y ura3, una puede controlar facilmente el estado sexual de las cepas diploides productoras de anticuerpos resultantes (haploides frente a diploides).
Metodos
Construccion de vectores de expresion pGAPZ-alfa para la transcripcion de genes de la cadena pesada y ligera de anticuerpos. Para la clonacion de las regiones variables, tanto de la cadena ligera como de la pesada, las celulas de una lmea celular de hibridoma de raton OKT3 CD3 se cultivaron y se extrajo el ARN total. Se realizaron despues dos reacciones de RT-PCR, una espedfica para la cadena ligera y una espedfica para la cadena pesada de las secuencias que codifican la region variable de los genes de anticuerpos OKT3. Los cebadores empleados para amplificar la region variable de cadena pesada y ligera fueron (sec. con num. de ident.:1) 5'- CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCAGGTCCAGCTGCAGCAGTC-3' y (sec. con num. de ident.:3) 5'- CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCC-3' junto con (sec. con num. de ident.:2) 5'-TGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGC-3' y (sec. con num. de ident.:4) 5'-
GACAGATGGTGCAGCCACAGCCCGG TTTATTTCCAACTTTGTCC-3' para las respectivas regiones variables.

Para los genes humanos de la region constante de la cadena pesada y ligera, se adquirio una extension 5' mas
genoteca de ADNc de leucocitos humanos de Clontech (HL 5019t). Dos reacciones de PCR se realizaron en esta

genoteca mediante el uso de cebadores espedficos para las regiones constantes de la cadena pesada y ligera, respectivamente (cadena pesada: (sec. con num. de ident.:6) 5'-

GCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCA-3 and (sec. con num. de ident.:5) 5'-
ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3' para la longitud completa junto con (sec. con num. de ident.:7) 5'-TGCGGCCGCTCATGGGCACGGTGGGCATGTGT-3' para la generacion de Fab'; cadena ligera: (sec. con num. de ident.:9) 5'-GGACAAAGTTGGAAATAAACCGGGCTGTGGCTGCACCATCTGTC-3' and (sec. con num. de ident.:8) 5'-ATAAGAATGCGGCCGCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCT-3'.
Una secuencia de ADN que codifica la region variable de la cadena ligera de raton se fusiono en el marco a una secuencia que codifica la region constante de la cadena ligera humana (sec. con num. de ident.: 11 y sec. con num. de ident.:12). Un fragmento que codifica el constructo de fusion final se inserto en el vector de expresion pGAPZ-alfa de P. pastoris, a traves de la ligacion de los sitios 5'-Xhol y 3'-Notl en pGAPZ-alfa. La secuencia de ADN que codifica la region variable pesada de raton se fusiono en marco a secuencias que codifican cada una de las tres regiones constantes de la cadena pesada humana. Estos productos de fusion se insertaron despues mediante el uso de una estrategia similar de 5'-Xhol y 3'-Notl en pGAPZ-alfa. (sec. con num. de ident.:13 y sec. con num. de ident.: 14 para la version glicosilada;
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sec. con num. de ident.: 15 para la version aglicosilada; sec. con num. de ident.: 16 para el fragmento Fab). Las secuencias de ADN de genes de anticuerpos adecuados en todos los vectores se confirmaron mediante secuenciacion directa del ADN antes de continuar el trabajo.
Transformacion de los vectores de expresion en cepas de P. pastoris haploides adel ura3, metl y lys3. Todos los metodos usados para la transformacion de cepas haploides de P. pastoris y la manipulacion genetica del ciclo sexual de P. pastoris fueron como se describe en Higgins, D. R., y Cregg, J. M., Eds. 1998. Pichia Protocols. Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ.
Antes de la transformacion, cada vector de expresion se linealizo dentro de las secuencias promotoras de GAP con AvrII para dirigir la integracion de los vectores en el locus del promotor de GAP del genoma de P. pastoris. Las muestras de cada vector se transformaron individualmente en cultivos electrocompetentes de las cepas adel, ura3, metl y lys3 por electroporacion y los transformantes exitosos se seleccionaron en placas YPD Zeocin por su resistencia a este antibiotico. Se seleccionaron las colonias resultantes, se aplicaron por rayado a partir de colonias individuales sobre placas de YPD Zeocin y despues se examinaron para la presencia del inserto del gen de anticuerpo mediante un ensayo de PCR en el aDn genomico extrafdo de cada cepa, para el inserto del gen de anticuerpo apropiado y/o por la capacidad de cada cepa para sintetizar una cadena de anticuerpo mediante un metodo de inmunotransferencia/elevacion de colonias (Wung y otros, Biotechniques 21 808-812 (1996). Las cepas haploides adel, metl y lys3 que expresan uno de los tres constructos de cadena pesada se recogieron para las construcciones diploides junto con la cepa haploide ura3 que expresa el gen de la cadena ligera. Los haploides que expresan los genes de la cadena pesada se aparearon con los haploides apropiados ura3 de la cadena ligera para generar diploide que secreta protemas.
Apareamiento de cepas haploides que sintetizan una sola cadena de anticuerpo y seleccion de derivados diploides que sintetizan anticuerpos funcionales tetramericos. Para aparear cepas haploides de P. pastoris, cada cepa ade1 (o met1 o lys3) que produce la cadena pesada para ser cruzada, se aplico mediante rayado de un lado a otro de una placa rica en YPD y la cepa ura3 que produce la cadena ligera se aplico mediante rayado de un lado a otro de una segunda placa de YPD (~10 rayas por placa). Despues de uno o dos dfas de incubacion a 30 °C, las celulas de una placa que contiene cepas de la cadena pesada y un placa que contiene cepas ura3 de cadena ligera, se transfirieron a una tela de terciopelo esteril en un bloque de replica en placas en un patron de rayado cruzado de manera que cada cepa de cadena pesada contema un parche de celulas mezcladas con cada cepa de la cadena ligera. Las celulas de la replica en placas con rayas cruzadas se transfirieron despues a una placa de apareamiento y se incubaron a 25 °C para estimular el inicio del apareamiento entre las cepas. Despues de dos dfas, las celulas en las placas de apareamiento se transfirieron de nuevo a una tela de terciopelo esteril en un bloque de replica en placas y despues se transfirieron a placas de medio mmimo. Estas placas se incubaron a 30 °C durante tres dfas para permitir el crecimiento selectivo de colonias de cepas diploides prototroficas. Las colonias que se originaron se seleccionaron y se aplicaron mediante rayado en una segunda placa de medio mmimo para aislar colonias individuales y purificar cada cepa diploide. Las lmeas celulares diploides resultantes se examinaron despues para la produccion de anticuerpos.
Las cepas diploides putativas se probaron para demostrar que eran diploides y conteman ambos vectores de expresion para la produccion de anticuerpos. Para la diploidfa, las muestras de una cepa se extendieron sobre placas de apareamiento para estimularlas a pasar por la meiosis y formar esporas. Los productos de esporas haploides se recogieron y se ensayaron para el fenotipo. Si un porcentaje significativo de los productos de esporas resultantes fueron auxotrofos simples o dobles concluimos que la cepa original debe haber sido diploide. Las cepas diploides se examinaron para la presencia de ambos genes de anticuerpos mediante la extraccion de ADN genomico de cada una y la utilizacion de este ADN en las reacciones de PCR espedficas para cada gen.
Fusion de cepas haploides que sintetizan una sola cadena de anticuerpo y seleccion de derivados diploides que sintetizan anticuerpos funcionales tetramericos. Como una alternativa al procedimiento de apareamiento descrito anteriormente, los cultivos individuales de cepas haploides ade1 y ura3 que producen una sola cadena de anticuerpo se convirtieron en esferoplastos, y sus esferoplastos resultantes se fusionaron mediante el uso polietilenglicol/CaCl2. Las cepas haploides fusionadas se incrustaron despues en agar que contiene sorbitol 1 M y medio mmimo para permitir que las cepas diploides regeneren su pared celulary crezcan en colonias visibles. Las colonias resultantes se recogieron del agar, se aplicaron mediante rayado sobre una placa de medio mmimo, y las placas se incubaron durante dos dfas a 30 °C para generar colonias de celulas individuales de lmeas de celulas diploides. Las lmeas celulares diploides putativas resultantes se examinaron despues para la diploidfa y la produccion de anticuerpos, como se describio anteriormente.
Purificacion y analisis de anticuerpos. Una cepa diploide para la produccion de anticuerpos de longitud completa se derivo a traves del apareamiento de la cepa 2252 ura3 de cadena ligera y la cepa 2254 lys3 de cadena pesada mediante el uso de los metodos descritos anteriormente. Los medios de cultivo del frasco de agitacion o cultivos del fermentador de cepas de expresion diploides de P. pastoris se recogieron y se examinaron para la presencia de protema de anticuerpo a traves de SDS-PAGE e inmunotransferencia mediante el uso de anticuerpos dirigidos contra las cadenas pesada y ligera de IgG humana, o espedficamente contra la cadena pesada de IgG. Los datos se muestran en la Figura 2.
Para purificar los anticuerpos de levadura secretados, el medio clarificado de cultivos que producen anticuerpos se
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pasaron a traves de una columna de protema A y despues mediante lavado con fosfato de sodio 20 mM, pH 7.0, tampon de union, la protema unida a la protema A se eluyo mediante el uso de 0.1 M de tampon glicina HCl, pH 3.0. Las fracciones que conteman la mayor parte de la protema total se examinaron mediante SDS-PAGE tenido con Coomasie azul e inmunotransferencia para la protema del anticuerpo. Las fracciones se examinaron, ademas, mediante un ensayo ELISA en el que las placas de microtitulacion se recubrieron primero con anti-IgG humana F(ab')2 de cabra, Fcy (Jackson Immuno, num. Cat. 109-006-008). A continuacion las placas se hicieron reaccionar con diluciones seleccionadas de anticuerpos producidos por levaduras. Finalmente, las placas se hicieron reaccionar con anticuerpo de cabra anti-fragmento F(ab')2 humano conjugado con HRP de IgG F(ab')2 (Jackson Immuno, num. Cat. 109-036-097). Despues las placas se desarrollaron con sustrato de TMP (Sigma Chemical) y las reacciones se inactivaron con 0.5 M de HCl. Los resultados se cuantificaron en un lector de placas de microtitulacion de BioRad a 415 nm. El dato se ilustra en la Figura 3.
Ensayo para la actividad de anticuerpos. El anticuerpo quimerico derivado de levadura recombinante se evaluo para la actividad funcional a traves de la tincion inmunohistoqmmica de celulas que contienen el antfgeno objetivo. El anticuerpo quimerico reconoce selectivamente el complejo CD3 encontrado en las celulas T. Se emplearon celulas Jurkat T como fuente de antfgeno y de la superficie celular de tincion se llevo a cabo utilizando procedimientos descritos en Andersson y Sander (Immunol Lett. 1989 Jan 31;20(2):115-20) o Andersson y otros, (Eur J Immunol. 1988 Dec;18(12):2081-4).
Las celulas T Jurkat se inmovilizaron en portaobjetos de vidrio, se bloquearon con el suero de bloqueo apropiado y se tineron con anticuerpo primario recombinante generado de mairnfero y levadura durante 1 hora. Las muestras inmovilizadas se trataron despues con agente de bloqueo de peroxidasa seguido de tincion con un anticuerpo secundario selectivo para Fc biotinilado que es espedfico para cada forma de anticuerpo (anti-raton para el de mamffero y anti-humano para la levadura). La deteccion se realizo mediante el uso de un sistema de HRP-estreptavidina. La obtencion de la imagen digital se realizo para recopilar los datos para cada muestra tenida. Se detecta la senal positiva en las muestras a traves de una tincion oscura de las celulas observadas en los paneles para OKT-3 derivado de mamfferos y derivado de levadura. Estos datos se muestran en la Figura 4.
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LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Cregg, James M.
Latham, John Litton, Mark Schatzman, Randall Tolstorukov, Ilya
<120> Metodos para sintetizar polipeptidos heteromultimericos en levadura con el uso de una estrategia de apareamiento haploide
<130> P12306.EP-DIV
<140> 04796313.7 <141> 2004-10-22
<150> 60/513,876 <151> 2003-10-22
<160> 16
<170> FastSEQ para version de windows 4.0
<210> 1 <211> 47 <212> ADN <213> raton
<400> 1
ccgctcgaga aaagagaggc tgaagctcag gtccagctgc agcagtc 47
<210> 2 <211> 41 <212> ADN <213> raton
<400> 2
tgggcccttg gtggaggctg aggagactgt gagagtggtg c 41
<210> 3 <211> 50 <212> ADN <213> raton
<400> 3
ccgctcgaga aaagagaggc tgaagctcaa attgttctca cccagtctcc 50
<210> 4 <211> 44 <212> ADN <213> raton
<400> 4
gacagatggt gcagccacag cccggtttat ttccaacttt gtcc 44
<210> 5 <211> 38 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 5
ataagaatgc ggccgctcat ttacccggag acagggag 38
<210> 6 <211> 41
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<212> ADN <213> Homo sapiens
<400>6
gcaccactct cacagtctcc tcagcctcca ccaagggccc a 41
<210>7 <211> 32 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 7
tgcggccgct catgggcacg gtgggcatgt gt 32
<210>8 <211> 39 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 8
ataagaatgc ggccgctaac actctcccct gttgaagct 39
<210> 9 <211> 44 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 9
ggacaaagtt ggaaataaac cgggctgtgg ctgcaccatc tgtc 44
<210> 10
<211>212
<212>PRT
<213> Homo sapiens
<400>10
II e
1
Lys
Trp
Thr
ser
65
Ala
Gly
Val
Ser
Gin
145
val
Leu
Glu
Arg
Val
Leu Thr Gin 5 ser Pro Ala lie Met 10 ser Ala ser Pro Gly 15 Glu
Val
Thr Met 20 Thr cys ser Ala ser 25 ser Ser val Ser Tyr 30 Met Asn
Tyr
Gin 35 Gin Lys Ser Gly Thr 40 Ser pro Lys Arg Trp 45 lie Tyr Asp
Ser 50
Lys Leu Ala Ser Gly 55 val Pro Ala Hi s phe 60 Arg Gly Ser Gly
Gly
Thr Ser Tyr ser 70 Leu Thr He ser Gly 75 Met Gl u Al a Glu ASp 80
Ala
Th r Tyr Tyr 85 Cys Gl n Gin Trp Ser 90 Ser Asn Pro Phe Thr 95 Phe
Ser
Gly Thr 100 Lys Leu Glu lie Asn 105 Arg Ala Val Ala Al a 110 Pro
Ser
Phe
lie 115 Phe Pro Pro Ser Asp 120 Glu Gin Leu Lys ser 12 5 Gly Thr Ala
Val 130
Val Cys Leu Leu Asn 135 Asn Phe Tyr Pro Arg 140 Gl u Ala Lys val
Trp
Lys Val Asp Asn 150 Ala Leu Gin Ser Gly 155 Asn Ser Gin Glu ser 160
Thr
Glu Gin Asp 165 Ser Lys ASp Ser Thr 170 Tyr Ser Leu Ser Ser 175
Thr
Thr
Leu Ser 180 Lys Ala Asp Tyr Glu 18 5 Lys Hi s Lys Val Tyr 190 Ala Cys
Val Gly 210
Thr 195 Glu Hi s Cys Gin Gly Leu Ser 200 Ser pro val Thr Lys 205 Ser Phe Asn
<210>11 <211>321 <212>ADN <213> raton
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<400>11

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgaact ggtaccagca gaagtcaggc 120

acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcac 180

ttcaggggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcggcat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cattcacgtt cggctcgggg 300

acaaagttgg aaataaaccg g 321
<210> 12 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 12

gctgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60

actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120

aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240

cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300

ttcaacaggg gagagtgtta g 321
<210> 13 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 13
Gin
val Gin Leu Gin Gin ser Gly Al a Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1
5 10 15
Ser
Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr
Met Hi s Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie
35 40 45
Gly
Tyr lie Asn pro ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe
50 55 60
Lys
ASp Lys Al a Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser ser ser Thr Ala Tyr
65
70 75 80
Met
Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala
Arg Tyr Tyr Asp Asp Hi s Tyr cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr
Thr
Leu Thr val Ser Ser Ala ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro
Leu Ala Pro ser ser Lys ser Thr ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly
cys Leu val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val ser Trp
145
150 155 160
Asn
Ser Gly Al a Leu Thr Ser Gly val Hi s Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gin
ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser val val Thr val Pro Ser
180 185 190
Ser
Ser
Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro
195 200 205
ser
Asn Thr Lys val Asp Lys Lys val GlU pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr
Hi s Th r cys Pro Pro Cys Pro Al a pro Glu Leu Leu Gly Gly pro
225
230 235 240
Ser
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie
Ser
245 250 255
Arg
Thr Pro Glu val Thr Cys val val val Asp Val Ser Hi s Glu Asp
260 265 270
Pro
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly Val Glu Val Hi s Asn
275 280 285
Al a
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val
290 295 300
val
Ser Val Leu Thr val Leu Hi s Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
5
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65
305
310 315 320
Tyr
Lys Cys Lys val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys
325 330 335
Thr
He Ser Lys Al a Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr
Thr
340 345 350
Leu
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin val ser Leu Thr
355 360 365
Cys
Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
ser
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro pro val Leu
385
390 395 400
Asp
Ser Asp Gly Ser phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr val Asp Lys
405 410 415
Ser
Arg Trp Gin Gin Gly Asn val phe ser Cys ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 14 <211> 1350 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 14

caggtccagc tgcagcagtc tggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaaacagagg 120

cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180

aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat 300

gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc 360

tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ctccatcccg ggatgagctg 1080

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200

gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1350
<210> 15 <211> 1350 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 15

caggtccagc tgcagcagtc tggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaaacagagg 120

cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180

aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat 300

gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc 360

tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660
10
15
20
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900 gcctaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1350
<210> 16 <211> 699 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 16
caggtccagc tgcagcagtc tcctgcaagg cttctggcta cctggacagg gtctggaatg aatcagaagt tcaaggacaa atgcaactga gcagcctgac gatgatcatt actgccttga tccaccaagg gcccatcggt acagcggccc tgggctgcct aactcaggcg ccctgaccag ctctactccc tcagcagcgt atctgcaacg tgaatcacaa tcttgtgaca aaactcacac
tggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg 60 cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaaacagagg 120 gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180 ggccacattg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat 300 ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc 360 cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420 ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540 ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600 gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660 atgcccaccg tgcccatga 699

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    Reivindicaciones
    1. Un metodo para la smtesis y la recuperacion, a partir de una levadura Pichia pastoris, de una protema de inmunoglobulina heteromultimerica secretada, biologicamente activa, heterologa (no es de levadura) que se compone de al menos dos cadenas de polipeptidos de subunidades no identicas; el metodo se caracteriza por las siguientes etapas:
    (i) producir una celula o celulas estables diploides de levadura Pichia pastoris mediante apareamiento o fusion de esferoplastos de celulas haploides de levadura Pichia pastoris en condiciones de manera que dichos eventos de apareamiento o fusion de esferoplastos resulten en la produccion de una celula o celulas diploides de levadura Pichia pastoris, en donde dicha celula o celulas diploides de levadura Pichia pastoris despues de dicho apareamiento o fusion comprenden constructos de expresion que proporcionan la expresion y secrecion de al menos dos cadenas polipeptfdicas no identicas que constituyen dicha protema de inmunoglobulina heteromultimerica completa, y cuyas celulas estables diploides de levadura Pichia pastoris son capaces del ensamblaje y expresion y secrecion prolongadas de dicha protema de inmunoglobulina heteromultimerica completa en un medio de cultivo que contiene dicha(s) celula(s) de Pichia pastoris cuando dicha celula o celulas diploides de Pichia pastoris se cultivan bajo condiciones de cultivo adecuadas;
    (ii) despues de efectuar dicho apareamiento o fusion de esferoplastos, identificar y aislar la celula o celulas diploides de Pichia pastoris que contienen constructos de expresion que proporcionan la expresion y secrecion estables de al menos dos cadenas polipeptfdicas no identicas que constituyen dicha protema de inmunoglobulina heteromultimerica completa cuando dicha celula o celulas diploides de levadura Pichia pastoris se cultivan bajo condiciones de cultivo adecuadas;
    (iii) cultivar dicha celula o celulas diploides de Pichia pastoris o su progenie diploide en un medio de cultivo bajo condiciones que resulten en la expresion, ensamblaje y secrecion de dicha protema de inmunoglobulina heteromultimerica biologicamente activa en el medio de cultivo; y
    (iv) recuperar la protema heteromultimerica resultante del medio de cultivo;
    en donde dicho apareamiento o fusion de esferoplastos se efectua mediante el apareamiento o la fusion de una primera celula haploide de levadura Pichia pastoris que contiene un primer constructo de expresion, dicho primer constructo de expresion contiene secuencias de acidos nucleicos que codifican para la expresion de al menos una subunidad de dicha protema de inmunoglobulina heteromultimerica completa (intacta), unidas operativamente a un primer promotor de levadura; y una segunda celula haploide de Pichia pastoris que contiene un segundo constructo de expresion, dicho segundo constructo de expresion comprende secuencias de acidos nucleicos que codifican para la(s) subunidad(es) restante(s) de dicha protema de inmunoglobulina heteromultimerica, unidas operativamente a un segundo promotor de levadura.
  2. 2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en donde la protema de inmunoglobulina heteromultimerica es un anticuerpo quimerico o humanizado.
  3. 3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en donde dichos constructos geneticos se integran en el genoma de dichas celulas de levadura Pichia pastoris.
  4. 4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en donde dichos constructos geneticos estan contenidos en el elemento extracromosomico (plasmido).
  5. 5. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en donde el primero o segundo de los promotores son constitutivos.
  6. 6. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en donde el primero o segundo de los promotores son inducibles.
  7. 7. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en donde las celulas diploides de levadura Pichia pastoris se
    cultivan en un medio de produccion.
  8. 8. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 7 en donde dicho medio de produccion es un medio mmimo que carece de agentes selectivos tales como aminoacidos preformados u otras biomoleculas complejas.
  9. 9. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en donde dichas celulas diploides de levadura Pichia pastoris se cultivan a una alta densidad celular.
  10. 10. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 9 en donde dicha alta densidad celular es de al menos 50, 100, 300, 400 o 500 g/L.
  11. 11. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en donde dichas celulas diploides de levadura Pichia pastoris se
    cultivan bajo condiciones que resultan en niveles de dicha protema de inmunoglobulina heteromultimerica
    biologicamente activa que son al menos 50, 100, 500 o 1000 mg/L.
    10
    15
  12. 12. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en donde las celulas diploides de levadura Pichia pastoris se cultivan durante al menos 20, 50 o 100 duplicaciones y mantienen altos niveles de expresion de dicha protema de inmunoglobulina heteromultimerica despues de dichas al menos 20, 50 o 100 duplicaciones y en donde despues de dicha al menos 20, 50 o 100 duplicaciones, al menos el 99 % de dichas celulas diploides de Pichia pastoris comprenden dichos constructos de expresion que proporcionan la expresion de dichas cadenas que constituyen dicha protema de inmunoglobulina heteromultimerica.
  13. 13. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en donde las celulas diploides de levadura Pichia pastoris se cultivan durante al menos 20, 50 o 100 duplicaciones y despues de dichas al menos 20, 50 o 100 duplicaciones expresan la protema de inmunoglobulina heteromultimerica en un nivel de expresion que se reduce por no mas de 20 %, 10 % o 5 % con relacion al nivel inicial de expresion.
  14. 14. Un medio de cultivo que contiene un cultivo estable de levadura Pichia pastoris diploide de acuerdo con la reivindicacion 1 en donde el medio de cultivo comprende los niveles de expresion de dicha protema de inmunoglobulina heteromultimerica biologicamente activa que son al menos aproximadamente 50 mg/litro, 100 mg/litro, 500 mg/litro o 1000 mg/litro o mas y en donde la densidad celular de dichas celulas diploides de Pichia pastoris en dicho cultivo son de al menos aproximadamente 50 g/L, 100 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L o mas.
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