TW202320857A - 連接子、藥物連接子及其結合物及其使用方法 - Google Patents

連接子、藥物連接子及其結合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供了極性單元、連接子中間體、連接子、藥物-連接子及其結合物。

Description

連接子、藥物連接子及其結合物及其使用方法
將單株抗體(mAbs)用於將細胞毒性劑以抗體藥物結合物(或ADC)之形式靶向遞送至與疾病相關之細胞，例如癌細胞及其他細胞，引起了極大的興趣。藉由將細胞毒性劑、免疫調節劑或其他試劑(統稱為「藥物」)連接至抗體(通常經由連接子)來設計抗體藥物結合物需要考慮許多因素。此等因素包括用於連接藥物之化學基團之身分及位置，藥物釋放之機制，提供藥物釋放之結構元件(若有的話)，以及釋放之游離藥物(若有的話)之結構修飾。若藥物在細胞外環境中釋放，藥物之釋放形式必須能夠達到其目標。若藥物在抗體內化之後被釋放，則藥物釋放之結構元件及機制必須與結合物之細胞內運輸相一致。
在抗體藥物結合物之設計中之另一個重要因素為各靶向劑可以遞送之藥物之量(亦即，連接至各靶向劑(例如，抗體)之藥物之數量，稱為藥物負載或載藥量)。在歷史上，假定較高之藥物負載優於較低之藥物負載(例如，8個負載與4個負載)。根本邏輯為較高負載之結合物將向目標細胞遞送更多的藥物(例如，細胞毒性劑)。這一根本邏輯得到以下觀測結果之支援：具有較高載藥量之結合物在體外對細胞株更具活性。然而，某些後來的研究表明，這種假設在動物模型中無法得到證實。在小鼠模型中觀測到某些奧瑞他汀之藥物負載為4或8之結合物具有類似的活性。參見，例如Hamblett等，Clinical Cancer Res. 10:7063-70 (2004)。Hamblett等人亦報導了在動物模型中較高負載之ADC更快地自循環中清除。這種更快的清除表明與較低負載之物質相比，較高負載之物質具有PK傾向。參見Hamblett等人。此外，較高負載之結合物在小鼠中具有較低之最大耐受劑量(MTD)，並且因此具有較窄之報導之治療指數。參見同上。相比之下，據報導，在單株抗體中之工程化位點處載藥量為2之ADC與某些4-負載之ADC相比具有相同或更佳的PK及治療指數。例如，參見Junutula等人，Clinical Cancer Res. 16:4769 (2010)。因此，最近之趨勢為開發具有低載藥量之ADC。
因此，需要抗體藥物結合物形式(並且更一般地，其他結合物之形式)，其允許更高的載藥量，但保持較低負載之結合物之其他特性，例如有利的PK性質。令人驚奇地，本發明解決了此等需要。
本文提供了具有親水特性之連接子，其保持了與連接子及藥物結合之抗體之固有性質。特別地，當以較高之載藥量結合及/或與疏水藥物及其他試劑結合時，該連接子有助於保持抗體之親水性。亦提供了包含該連接子之藥物-連接子及結合物，以及使用此類結合物治療癌症及其他疾病之方法。
在一些實施例中，提供了具有以下式(V)之連接子中間體： ~ (AA) s– [L2] ≈ (V) 或其鹽，其中： AA為具有1個至12個胺基酸亞單元之胺基酸單元； s為0或1； L2為具有1個至4個用於藥物單元之連接位點的連接子亞單元；以及 各波形(~)線表示用於擴展單元之連接位點，以及雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點， 其中至少一個極性單元存在於胺基酸單元、連接子亞單元或兩者中，並且其中極性單元選自糖單元、PEG單元、羧基單元及其組合。
在一些實施例中，提供了具有以下式(I)之連接子： ~ L1 – (AA) s– L2 ≈ (I) 或其鹽，其中： L1為具有用於靶向單元之連接位點之擴展單元； AA為具有1個至12個亞單元之胺基酸單元； s為0或1； L2為具有1個至4個用於藥物單元之連接位點的連接子亞單元； 波形(~)線表示用於靶向單元之連接位點，以及雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點； 其中至少一個極性單元存在於胺基酸單元、連接子亞單元或兩者中，並且其中極性單元選自糖單元、PEG單元、羧基單元及其組合。
在一些實施例中，提供了具有以下式(I)之連接子： ~ L1 – (AA) s– L2 ≈ (I) 或其鹽，其中： L1為具有用於靶向單元之連接位點之擴展單元； AA為具有1個至12個亞單元之胺基酸單元； s為0或1； L2為具有1個至4個用於藥物單元之連接位點的連接子亞單元； 波形(~)線表示用於靶向單元之連接位點，以及雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點； 其中至少一個極性單元存在於胺基酸單元、連接子亞單元、擴展單元或其組合中，並且其中極性單元選自糖單元、PEG單元、羧基單元及其組合。
糖單元 在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中糖單元具有下式： L3 - **N(CH 2– (CH(XR)) k– X 1(X 2)) 2(X) 或其鹽，其中： 各X獨立地選自NH或O； 各R獨立地選自氫、乙醯基、單糖、二糖及多糖； 各X 1獨立地選自CH 2及C(O)； 各X 2獨立地選自H、OH及OR； k為1至10；以及 L3具有以下通式(XI)： L3a | *- NH – (CH 2) p– CH - (CH 2) o- C(O) - # (XI) 或其鹽，其中： L3a選自C 1-C 10伸烷基及具有1個至24個乙二醇亞單元之聚乙二醇； p及o獨立地為0至2； 各*及各#表示用於胺基酸單元(AA)之其他亞單元、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之連接位點；以及 L3a共價結合至式(X)中用**標記之N原子。
在一些實施例中，連接子中間體或連接子包括具有選自以下之式之糖單元：
Figure 02_image001
或
Figure 02_image003
或其鹽，其中： 各R獨立地選自氫、單糖、二糖及多糖； p及o獨立地為0至2； m為1至8； n為0至4；以及 各*及各#表示用於胺基酸單元(AA)之其他亞單元、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之連接位點。
PEG單元 在一些實施例中，連接子中間體或連接子包括具有選自以下之式之PEG單元： (a) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-NR 24R 25(XX) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 21及R 22各自獨立地為視情況選用的C 1-C 3伸烷基； R 24及R 25各自獨立地選自H；多羥基基團；經取代之多羥基基團；-C(O)-多羥基基團；經取代之-C(O)-多羥基基團；視情況經取代之C 3-C 10碳環；視情況經取代之C 1-C 3伸烷基C 3-C 10碳環；視情況經取代之雜芳基；視情況經取代之碳環；經取代之-C 1-C 8烷基；經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基；螯合物；-C(O)-R 28，其中R 28為式(XII)或式(XIII)之糖單元；或與-NR 24R 25一起形成C 3-C 8雜環； 波形線(~)表示與R 20之連接位點；以及 n20為1至26； 或 (b) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-NR 24R 25(XX) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 21及R 22各自獨立地為視情況選用的C 1-C 3伸烷基； R 24及R 25中之一者選自H；多羥基基團；經取代之多羥基基團；-C(O)-多羥基基團；經取代之-C(O)-多羥基基團；視情況經取代之C 3-C 10碳環；視情況經取代之C 1-C 3伸烷基C 3-C 10碳環；視情況經取代之雜芳基；視情況經取代之碳環；經取代之-C 1-C 8烷基；經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基；螯合物；-C(O)-R 28，其中R 28為式(XII)或式(XIII)之糖單元；並且R 24及R 25中之另一者為聚乙二醇，視情況具有1個至24個乙二醇亞單元； 波形線(~)表示與R 20之連接位點；以及 n20為1至26； 或 (c) ~R 20-[-R 26-[R 29-[O-CH 2-CH 2-] n20R 29] n21-R 27-] n27-NR 24R 25(XXI) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元及/或該連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 26及R 27各自視情況且獨立地選自C 1-C 12伸烷基、-NH-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-NH-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-NH-C 1-C 12伸烷基-C(O)-及-C(O)-C 1-C 12伸烷基-NH-； R 24及R 25中之一者選自H；多羥基基團；經取代之多羥基基團；-C(O)-多羥基基團；經取代之-C(O)-多羥基基團；視情況經取代之C 3-C 10碳環；視情況經取代之C 1-C 3伸烷基C 3-C 10碳環；視情況經取代之雜芳基；視情況經取代之碳環；經取代之-C 1-C 8烷基；經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基；螯合物；-C(O)-R 28，其中R 28為式(XII)或式(XIII)之糖單元；並且R 24及R 25中之另一者選自H；多羥基基團；經取代之多羥基基團；-C(O)-多羥基基團；經取代之-C(O)-多羥基基團；視情況經取代之C 3-C 10碳環；視情況經取代之C 1-C 3伸烷基C 3-C 10碳環；視情況經取代之雜芳基；視情況經取代之碳環；經取代之-C 1-C 8烷基；經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基；螯合物；-C(O)-R 28，其中R 28為式(XII)或式(XIII)之糖單元；及聚乙二醇，視情況具有1個至24個乙二醇亞單元；或與-NR 24R 25一起形成C 3-C 8雜環； 各R 29為視情況且獨立地選自-C(O)-、-NH-、-C(O)-C 1-C 6伸烯基-、-NH-C 1-C 6伸烯基-、-C 1-C 6伸烯基-NH-、-C 1-C 6伸烯基-C(O)-、-NH(CO)NH-及三唑； 波形線(~)表示與R 20之連接位點； n20為1至26； n21為1至4；以及 n27為1至4。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元之R 24及R 25均不為H。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元之R 24及R 25各自獨立地選自H及多羥基基團，其限制條件為R 24及R 25不都為H。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中多羥基基團為線性單糖，視情況選自C6或C5糖、糖酸或胺基糖。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中： C6或C5糖選自葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脫氧葡萄糖、甘油醛、赤蘚糖、蘇糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、醛糖及酮糖； 糖酸選自葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸及酮糖酸；或 胺基糖選自葡糖胺、N-乙醯葡糖胺、半乳糖胺及N-乙醯半乳糖胺。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image005
其中R 39選自H、直鏈單糖及聚乙二醇，視情況具有1個至24個乙二醇亞單元；並且左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元之R 24及R 25中之一者為線性單糖並且另一者為環狀單糖。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image007
其中R 41為環狀單糖；並且左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元之R 24及R 25獨立地選自環狀單糖、二糖及多糖。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image009
Figure 02_image011
其中各R 45選自H及單糖、二糖或多糖；並且R 46選自環狀單糖、二糖或多糖；並且右側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元之R 24及R 25獨立地選自線性單糖及經取代之線性單糖，其中該經取代之線性單糖被單糖、二糖或多糖取代。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image013
Figure 02_image015
其中R 47為線性單糖；並且各R 49選自單糖、二糖及多糖；並且左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元之R 24及R 25獨立地選自線性單糖及經取代之單糖，其中該經取代之線性單糖被一或多個選自烷基、O-烷基、芳基、O-芳基、羧基、酯或醯胺之取代基取代，並且視情況進一步被單糖、二糖或多糖取代。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image017
其中各R 42獨立地選自線性單糖及經取代之線性單糖；各R 43獨立地選自烷基、O-烷基、芳基、O-芳基、羧基、酯及醯胺；並且左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元之R 24及R 25中之一者為-C(O)-多羥基基團或經取代之-C(O)-多羥基基團，並且R 24及R 25中之另一者為H、-C(O)-多羥基基團、經取代之-C(O)-多羥基基團、多羥基基團或經取代之多羥基基團；其中該經取代之-C(O)-多羥基基團及多羥基基團被單糖、二糖、多糖、烷基、-O-烷基、芳基、羧基、酯或醯胺取代。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image019
其中左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元之R 24及R 25獨立地選自H、經取代之-C 1-C 8烷基、經取代之-C 1-C 4烷基或經取代之-C 1-C 3烷基；其限制條件為R 24及R 25均不為H；其中經取代之-C 1-C 8烷基、-C 1-C 4烷基及-C 1-C 3烷基被羥基及/或羧基取代。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image021
其中R 48選自H、OH、CH 2OH、COOH或被羥基或羧基取代之-C 1-C 6烷基；並且左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元之R 24及R 25中之一者選自H、經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基、經取代之-C(O)-C 1-C 4烷基及經取代之-C(O)-C 1-C 3烷基，並且R 24及R 25中之另一者選自經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基、經取代之-C(O)-C 1-C 4烷基、經取代之-C(O)-C 1-C 3烷基、經取代之-C 1-C 8烷基、經取代之-C 1-C 4烷基及經取代之-C 1-C 3烷基，其中經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基、經取代之-C(O)-C 1-C 4烷基、經取代之-C(O)-C 1-C 3烷基、經取代之-C 1-C 8烷基、-C 1-C 4烷基及-C 1-C 3烷基被羥基及/或羧基取代。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image023
Figure 02_image025
其中左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元之R 24及R 25選自H及視情況經取代之芳基；其限制條件為R 24及R 25均不為H，其中視情況選用的取代基如本文定義，例如在一些實施例中，視情況選用的取代基為鹵素，例如F、Cl或Br。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image027
其中左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25一起形成視情況經取代之C 3-C 8雜環或雜芳基，其中在一些實施例中，C 3-C 8雜環或雜芳基為未取代的。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元為：
Figure 02_image029
， 或其鹽。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元之R 24及R 25獨立地選自H及螯合物，其中該螯合物視情況藉由伸烷基、伸芳基、碳環、雜伸芳基或雜碳環連接至-NR 24R 25之氮；其限制條件為R 24及R 25均不為H。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中螯合物選自乙二胺四乙酸(EDTA)、二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、三伸乙基四胺六乙酸(TTHA)、苄基-DTPA、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N'',N'''-四乙酸(DOTA)、苄基-DOTA、1,4,7-三氮雜環壬烷-N,N',N''-三乙酸(NOTA)、苄基-NOTA、1,4,8,11-四氮雜環十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)及N,N'-二烷基取代之哌𠯤。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image031
其中左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中糖單元或PEG單元之各單糖獨立地選自： C5或C6糖，該C5或C6糖選自葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脫氧葡萄糖、甘油醛、赤蘚糖、蘇糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、醛糖、酮糖、葡糖胺、N-乙醯葡糖胺、半乳糖胺及N-乙醯半乳糖胺； 糖酸，該糖酸選自葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸及酮糖酸；或 胺基糖，該胺基糖選自葡糖胺、N-乙醯葡糖胺、半乳糖胺及N-乙醯半乳糖胺。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中R 20選自羧基、胺基、炔基、疊氮基、羥基、羰基、胺基甲酸酯、脲、硫代胺基甲酸酯、硫脲、磺醯胺、醯基磺醯胺、烷基磺酸酯或其受保護之形式。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中R 20選自鹵基、醛、羧基、胺基、炔基、疊氮基、羥基、羰基、胺基甲酸酯、硫醇、脲、硫代胺基甲酸酯、硫脲、磺醯胺、醯基磺醯胺、烷基磺酸酯、三唑、氮雜二苯并環辛炔、肼、羰基烷基雜芳基或其受保護之形式。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元具有選自以下之式： (a) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-R 30(XXX) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元(若存在)及/或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 21及R 22各自視情況且，若存在，獨立地為C 1-C 3伸烷基基團； R 30選自視情況經取代之C 3-C 10碳環；硫脲；視情況經取代之硫脲；脲；視情況經取代之脲；磺醯胺；烷基磺醯胺；醯基磺醯胺、視情況經取代之烷基磺醯胺；視情況經取代之醯基磺醯胺；磺醯胺；視情況經取代之磺醯胺；胍，包括烷基胍及芳基胍；磷醯胺；或視情況經取代之磷醯胺；或R 30選自疊氮基、炔基、經取代之炔基、-NH-C(O)-炔基、-NH-C(O)-炔基-R 65；環辛炔；-NH-環辛炔、-NH-C(O)-環辛炔或-NH-(環辛炔) 2；其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環或視情況經取代之雜芳基； 波形線(~)表示與R 20之連接位點；以及 n20為1至26； (b) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-NH-C(O)-R 31(XXXI) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元(若存在)或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 21及R 22各自獨立地為視情況選用的C 1-C 3伸烷基基團； R 31為支鏈聚乙二醇鏈，各支鏈具有1個至26個乙二醇亞單元，並且各支鏈在其末端具有R 35； R 35為疊氮基、炔基、炔基-R 65、環辛炔或環辛炔-R 65，其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環或視情況經取代之雜芳基； 波形線(~)表示與R 20之連接位點；以及 n20為1至26； (c) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-C(O)NH-R 31(XXXII) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元(若存在)或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 21及R 22各自視情況且獨立地為C 1-C 3伸烷基基團； R 31為支鏈聚乙二醇鏈，各支鏈獨立地具有1個至26個乙二醇亞單元，並且各支鏈在其末端具有R 35； R 35為疊氮基、炔基、炔基-R 65、環辛炔或環辛炔-R 65，其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環及視情況經取代之雜芳基； 波形線(~)表示與R 20之連接位點；以及 n20為1至26；以及 (d) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-N-(R 33-R 31) 2(XXXIII) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元(若存在)或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 21及R 22各自視情況且為C 1-C 3伸烷基基團； R 31為支鏈聚乙二醇鏈，各支鏈具有1個至26個乙二醇亞單元，並且各支鏈在其末端具有R 35； R 33為C 1-C 3伸烷基、-C 1-C 3伸烷基-C(O)、-C(O)-C 1-C 3伸烷基或-C(O)-C 1-C 3伸烷基-C(O)； R 35為疊氮基、炔基、炔基-R 65、環辛炔或環辛炔-R 65，其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環或視情況經取代之雜芳基； 波形線(~)表示與R 20之連接位點；以及 n20為1至26。 在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下之式，或其鹽： ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-NH-C(O)-R 31(XXXI)， ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-C(O)NH-R 31(XXXII)， 或 ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-N-(R 33-R 31) 2(XXXIII)； 其中R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元(若存在)或連接子亞單元L2之一部分的官能基；R 21及R 22各自視情況且為C 1-C 3伸烷基基團；R 31為支鏈聚乙二醇鏈，各支鏈具有1個至26個乙二醇亞單元，並且各支鏈在其末端具有R 35；R 33為C 1-C 3伸烷基、-C 1-C 3伸烷基-C(O)、-C(O)-C 1-C 3伸烷基或-C(O)-C 1-C 3伸烷基-C(O)；R 35為疊氮基、炔基、炔基-R 65、環辛炔或環辛炔-R 65，其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環或視情況經取代之雜芳基；該波形(~)線表示與R 20之連接位點；以及n20為1至26。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下：
Figure 02_image033
其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環或視情況經取代之雜芳基；並且左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中R 20選自羧基、胺基、炔基、疊氮基、羥基、羰基、胺基甲酸酯、脲、硫代胺基甲酸酯、硫脲、磺醯胺、醯基磺醯胺、烷基磺酸酯或其受保護之形式。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中R 20選自鹵基、醛、羧基、胺基、炔基、疊氮基、羥基、羰基、胺基甲酸酯、硫醇、脲、硫代胺基甲酸酯、硫脲、磺醯胺、醯基磺醯胺、烷基磺酸酯、三唑、氮雜二苯并環辛炔、肼、羰基烷基雜芳基或其受保護之形式。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元： ~R 40-(R 43-R 41-[O-CH 2-CH 2] n40-R 42-R 43-(NR 44R 45) n41) n42(XL) 或其鹽，其中： R 40為用於連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 41及R 42不存在或各自獨立地為C 1-C 6伸烷基； 各R 43獨立地不存在或選自C 1-C 12伸烷基、-NH-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-NH-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-NH-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C(O)-NH-C 1-C 12伸烷基、-雜伸芳基、雜芳基-C 1-C 12伸烷基、雜芳基-C 1-C 12伸烷基-C(O)-或-C(O)NR 46R 47，其中R 46及R 47中之一者為H或C 1-C 12伸烷基並且另一者為C 1-C 12伸烷基； R 44及R 45各自獨立地為H、多羥基基團、經取代之多羥基基團、-C(O)-多羥基基團或經取代之-C(O)-多羥基基團，其中視情況選用的取代基選自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯； 波形線(~)表示與R 40之連接位點； n40為1至26； n41為1至6；以及 n42為1至6。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元： ~R 40-(R 41-[O-CH 2-CH 2] n40-R 42-R 43-(NR 44R 45) n41) n42(XLI) 或其鹽，其中： R 40為用於連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 41及R 42不存在或各自獨立地為C 1-C 6伸烷基； R 43不存在或選自C 1-C 12伸烷基、-NH-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-NH-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-NH-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C 1-C 12伸烷基、C(O)-NH-C 1-C 12伸烷基、-雜伸芳基、雜芳基-C 1-C 12伸烷基、雜芳基-C 1-C 12伸烷基-C(O)-或-C(O)NR 46R 47，其中R 46及R 47中之一者為H或C 1-C 12伸烷基，並且另一者為C 1-C 12伸烷基； R 44及R 45各自獨立地為H、多羥基基團、經取代之多羥基基團、-C(O)-多羥基基團或經取代之-C(O)-多羥基基團，其中視情況選用的取代基選自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯； 波形線(~)表示與R 40之連接位點； n40為1至26； n41為1至6；以及 n42為1至6。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元： ~R 40-(R 41-[O-CH 2-CH 2] n40-R 42-R 43-(NR 44R 45) n41) n42(XLII) 或其鹽，其中： R 40為用於連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 41及R 42不存在或各自獨立地為C 1-C 3伸烷基； R 43不存在或選自C 1-C 6伸烷基、-NH-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 6伸烷基-NH-、-C(O)-C 1-C 6伸烷基、-C 1-C 6伸烷基-C(O)-、-NH-C 1-C 6伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 6伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C 1-C 6伸烷基、-C(O)-NH-C 1-C 12伸烷基、-雜伸芳基、雜芳基-C 1-C 6伸烷基、雜芳基-C 1-C 6伸烷基-C(O)-或-C(O)NR 46R 47，其中R 46及R 47中之一者為H或C 1-C 6伸烷基，並且另一者為C 1-C 12伸烷基； R 44及R 45各自獨立地為H、多羥基基團、經取代之多羥基基團、-C(O)-多羥基基團或經取代之-C(O)-多羥基基團，其中視情況選用的取代基選自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯； 波形線(~)表示與R 40之連接位點； n40為1至16； n41為1至4；以及 n42為1至4。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中R 40選自鹵素、醛、羧基、胺基、炔基、疊氮基、羥基、羰基、胺基甲酸酯、硫醇、脲、硫代胺基甲酸酯、硫脲、磺醯胺、醯基磺醯胺、烷基磺酸酯、三唑、氮雜二苯并環辛炔、肼、羰基烷基雜芳基或其受保護之形式。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中R 40具有以下結構中之一種：
Figure 02_image035
Figure 02_image037
Figure 02_image039
， 其中 R= H或C 1-6烷基；以及 n = 0至12 或其立體異構體，其中(*)表示R 40與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的連接位點，並且(
Figure 02_image041
)表示R 40與PEG單元之其餘部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中R 40具有以下結構中之一種：
Figure 02_image043
Figure 02_image045
Figure 02_image047
， 其中n = 0至12 或其立體異構體，其中(*)表示R 40與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的連接位點，並且(
Figure 02_image041
)表示R 40與PEG單元之其餘部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中R 43-(NR 44R 45) n41當存在R 43時具有以下結構中之一種：
Figure 02_image050
Figure 02_image052
， 其中R= H、C 1-6烷基、多羥基或經取代之多羥基 或其立體異構體，其中(
Figure 02_image041
)表示R 43與PEG單元之其餘部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中R 43-(NR 44R 45) n41當存在R 43時具有以下結構中之一種：
Figure 02_image055
Figure 02_image057
， 或其立體異構體，其中(
Figure 02_image059
)表示R 43與PEG單元之其餘部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中-NR 44R 45具有以下結構中之一種：
Figure 02_image061
Figure 02_image063
， 或其立體異構體，其中(
Figure 02_image065
)表示-NR 44R 45與PEG單元之其餘部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元在連接至胺基酸單元或連接子亞單元L2之一部分之前具有以下結構中之一種：
Figure 02_image067
Figure 02_image069
Figure 02_image071
Figure 02_image073
， 其中R為H或烷基，並且n為1至12。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元： ~R 40-(R 43-R 41--[O-CH 2-CH 2] n40-R 46-[O-CH 2-CH 2] n40-R 42-R 43-(NR 44R 45) n41) n42(XLIII) 或其鹽，其中： R 40為用於連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 41及R 42不存在或各自獨立地為C 1-C 6伸烷基； 各R 43獨立地不存在或選自C 1-C 12伸烷基、-NH-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-NH-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-NH-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C(O)-NH-C 1-C 12伸烷基、-雜伸芳基、雜芳基-C 1-C 12伸烷基、雜芳基-C 1-C 12伸烷基-C(O)-或-C(O)NR 46R 47，其中R 46及R 47中之一者為H或C 1-C 12伸烷基並且另一者為C 1-C 12伸烷基； R 44及R 45各自獨立地為H、多羥基基團、經取代之多羥基基團、-C(O)-多羥基基團或經取代之-C(O)-多羥基基團，其中視情況選用的取代基選自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯； R 46選自胺基、胺基-烷基-胺基或-NH-C(O)-NH-S(O) 2-NH-； 波形線(~)表示與R 40之連接位點； n40為1至26； n41為1至6；以及 n42為1至6。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元在連接至胺基酸單元或連接子亞單元L2之一部分之前具有以下結構中之一種：
Figure 02_image075
Figure 02_image077
， 其中R為H或烷基，並且n為1至12。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元：
Figure 02_image079
Figure 02_image081
或其鹽，其中： 各Y獨立地為R 76或
Figure 02_image083
； 各R 76獨立地為H、乙醯基、-P(=O)(OH) 2或-(CH 2) v-O-S(=O) 2(OH)； 各R a及R b獨立地為H，或者R a及R b與其所連接之碳一起形成側氧基基團； 各q獨立地為1至26； 各m獨立地為1至4； 各n獨立地為1至4； 各v獨立地為1至6；以及 各*表示用於胺基酸單元(AA)之亞單元、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元：
Figure 02_image085
或其鹽，其中： 各R 76獨立地為H、乙醯基、-P(=O)(OH) 2或-(CH 2) vS(=O) 2(OH)； 各q獨立地為1至26； 各m獨立地為1至4； 各n獨立地為1至4； 各v獨立地為1至6；以及 各*表示用於胺基酸單元(AA)之亞單元、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元：
Figure 02_image087
Figure 02_image089
或其鹽，其中： 各q獨立地為1至26； 各m獨立地為1至4； 各n獨立地為1至4；以及 各*表示用於胺基酸單元(AA)之亞單元、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中Y為R 76。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中Y為
Figure 02_image091
。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中各R a及R b獨立地為H。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中R a及R b與其所連接之碳一起形成側氧基基團。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中q為10至20。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中q為12。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image093
Figure 02_image095
Figure 02_image097
Figure 02_image099
Figure 02_image101
Figure 02_image103
Figure 02_image105
Figure 02_image107
Figure 02_image109
Figure 02_image111
Figure 02_image113
； 以及
Figure 02_image115
其中各Z在*處連接並且分別選自：
Figure 02_image117
，
Figure 02_image119
，以及
Figure 02_image121
； 其中各
Figure 02_image123
表示用於胺基酸單元(AA)之其他亞單元、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之連接位點。
羧基單元 在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中羧基單元具有下式： R 70| L 70| ~ NH – (CH 2) p1– CH - (CH 2) o1- C(O) ~ (XXXX) 或其鹽，其中： (a) L 70選自C 1-C 8伸烷基、C 1-C 8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 8伸烷基-及-C(O)-C 1-C 8伸烷基-C(O)-； R 70為~NR 71(R 72-R 73)，其中R 71選自H、C 1-C 12烷基、經取代之C 1-C 12烷基或聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)，R 72不存在或選自視情況經取代之C 1-C 3伸烷基、視情況經取代之醚、視情況經取代之硫醚、視情況經取代之酮、視情況經取代之醯胺、聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基，並且R 73為羧基或多羧基，其中多羧基包含1至10、或1至6、或1至4個羧基基團，其中該等羧基基團藉由烷基、伸烷基、經取代之烷基、經取代之伸烷基、雜烷基、雜伸烷基、胺基及/或醯胺相互連接； 各波形線(~)表示用於胺基酸單元(AA)之其他亞單元、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之連接位點；以及 p1及o1中之各者獨立地選自0至2； 或 (b) L 70選自C 1-C 8伸烷基、C 1-C 8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 8伸烷基-及-C(O)-C 1-C 8伸烷基-C(O)-； R 70為~NR 71(R 75-(R 73) 2)，其中R 71選自H、C 1-C 12烷基、經取代之C 1-C 12烷基或聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)，R 75為支鏈之視情況經取代之C 1-C 3伸烷基、視情況經取代之醚、視情況經取代之硫醚、視情況經取代之酮、視情況經取代之醯胺、聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基，並且各R 73獨立地為羧基或多羧基，其中多羧基包含1至10、或1至6、或1至4個羧基基團，其中該等羧基基團藉由烷基、伸烷基、經取代之烷基、經取代之伸烷基、雜烷基、雜伸烷基、胺基及/或醯胺相互連接； 各波形線(~)表示用於胺基酸單元(AA)之其他亞單元、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之連接位點；以及 p1及o1中之各者獨立地選自0至2； 或 (c) L 70選自C 1-C 8伸烷基、C 1-C 8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 8伸烷基-及-C(O)-C 1-C 8伸烷基-C(O)-； R 70為~N(R 74-R 73)(R 72-R 73)，其中R 72及R 74各自獨立地選自視情況經取代之C 1-C 3伸烷基、視情況經取代之醚、視情況經取代之硫醚、視情況經取代之酮、視情況經取代之醯胺、聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基，並且各R 73獨立地為羧基或多羧基，其中多羧基包含1至10、或1至6、或1至4個羧基基團，其中該等羧基基團藉由烷基、伸烷基、經取代之烷基、經取代之伸烷基、雜烷基、雜伸烷基、胺基及/或醯胺相互連接； 各波形線(~)表示用於胺基酸單元(AA)之其他亞單元、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之連接位點；以及 p1及o1中之各者獨立地選自0至2。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含至少一個糖單元。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含至少一個PEG單元。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含至少一個羧基單元。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含至少兩個極性單元，各極性單元選自糖單元、PEG單元及羧基單元。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含至少一個糖單元及PEG單元或羧基單元。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含至少一個羧基單元及PEG單元。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中存在胺基酸單元(AA) (s=1)。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中胺基酸單元包含至少一個極性單元。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中L2或AA-L2具有以下結構中之一種：
Figure 02_image125
Figure 02_image127
， 其中胺基基團上之波形線表示用於擴展單元之連接位點，並且藥物單元連接至苄醇。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中~AA-L2~具有選自以下之式： ~ [SU – aa] - L2 ≈， ~ [aa 1(PEG) – aa] - L2 ≈，或 ~ [CU – aa] - L2 ≈ 其中中括號表示胺基酸單元，各aa為AA之視情況選用的亞單元，L2為連接子亞單元，各波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點；aa 1(PEG)為連接至AA之胺基酸亞單元之PEG單元，SU為連接至AA之亞單元或連接至L2之糖單元，並且CU為連接至AA之亞單元或連接至L2之羧基單元；並且雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點，其中aa及aa 1獨立地選自α、β及γ胺基酸及其衍生物。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中~AA-L2~具有選自以下之式： ~ [SU-aa] | L2 ≈ ~ [aa 1(PEG)-aa] | L2 ≈，或 ~ [CU-aa] | L2 ≈ 其中中括號表示胺基酸單元，各aa為AA之胺基酸亞單元，L2為連接至aa之側鏈的連接子亞單元，波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點；aa 1(PEG)為連接至aa之PEG單元，SU為連接至aa之糖單元，CU為連接至aa之羧基單元，並且雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點；其中aa及aa 1獨立地選自α、β及γ胺基酸及其衍生物。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中胺基酸單元包括至少兩個極性單元。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中~AA-L2~具有選自以下之式： ~ [SU – aa – SU] – L2 ≈， ~ [aa 1(PEG) – aa – aa 2(PEG)] – L2 ≈，或 ~ [CU – aa – CU] – L2 ≈ 其中中括號表示胺基酸單元，aa為AA之視情況選用的亞單元，L2為連接子亞單元，波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點；aa 1(PEG)及aa 2(PEG)中之各者為連接至aa之PEG單元或連接至其他PEG單元之PEG單元；各SU為連接至aa之糖單元或連接至其他糖單元之糖單元，各CU為連接至aa之羧基單元或連接至其他羧基單元之羧基單元，並且雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點；其中aa、aa 1及aa 2獨立地選自α、β及γ胺基酸及其衍生物。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中~AA-L2~具有選自以下之式： ~ [SU-aa-SU] | L2 ≈ ~ [aa 1(PEG)-aa-aa 2(PEG)] | L2 ≈，或 ~ [CU-aa-CU] | L2 ≈ 其中中括號表示胺基酸單元，aa為AA之胺基酸亞單元，L2為連接至aa之側鏈的連接子亞單元，各波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點；aa 1(PEG)及aa 2(PEG)中之各者為連接至aa之PEG單元，各SU為連接至aa之糖單元；各CU為連接至aa之羧基單元；並且雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點；其中aa、aa 1及aa 2中之各者獨立地選自α、β及γ胺基酸及其衍生物。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中連接子亞單元L2為可裂解的連接子單元。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中連接子亞單元L2包括可被細胞內蛋白酶裂解之肽。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中可裂解的肽包括纈胺酸-瓜胺酸肽、纈胺酸-丙胺酸肽、纈胺酸-離胺酸肽、苯丙胺酸-離胺酸肽或甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸肽。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中連接子亞單元L2包含至少一個極性單元。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中極性單元為糖單元(SU)。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中可裂解的肽包括SU-纈胺酸-瓜胺酸肽、SU-纈胺酸-離胺酸肽、SU-纈胺酸-丙胺酸肽、SU-苯丙胺酸-離胺酸肽或SU-甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸肽。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中極性單元為羧基單元(CU)。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中可裂解的肽包括CU-纈胺酸-瓜胺酸肽、CU-纈胺酸-離胺酸肽、纈胺酸-(CU-離胺酸)肽、CU-纈胺酸-丙胺酸肽、CU-苯丙胺酸-離胺酸肽、苯丙胺酸-(CU-離胺酸)肽或CU-甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸肽，其中CU-離胺酸為包含離胺酸殘基之羧基單元。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中極性單元為PEG單元(PEG)。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中可裂解的肽包括Lys(PEG)-纈胺酸-瓜胺酸肽、纈胺酸-Cit(PEG)肽、Lys(PEG)-纈胺酸-離胺酸肽、纈胺酸-離胺酸(PEG)肽、Lys(PEG)-纈胺酸-丙胺酸肽、Lys(PEG)-苯丙胺酸-離胺酸肽、苯丙胺酸-Lys(PEG))肽或Lys(PEG)-甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸肽，其中Lys(PEG)及Cit(PEG)分別包含連接至離胺酸殘基或瓜胺酸殘基之PEG單元。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中可裂解的肽連接至對胺基苄醇自分解基團(PABA)。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中~AA-L2~具有以下結構中之一種：
Figure 02_image129
Figure 02_image131
Figure 02_image133
Figure 02_image135
Figure 02_image137
Figure 02_image139
Figure 02_image141
Figure 02_image143
Figure 02_image145
Figure 02_image147
Figure 02_image149
Figure 02_image151
Figure 02_image153
Figure 02_image155
Figure 02_image157
Figure 02_image159
Figure 02_image161
其中各Z在*處連接並且分別選自：
Figure 02_image163
，
Figure 02_image165
，以及
Figure 02_image167
； 其中胺基基團上之波形線表示用於擴展單元之連接位點，並且藥物單元連接至苄醇(亦即，苄醇之H被與藥物單元之鍵替代)。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中L2連接至AA之亞單元之側鏈。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中~AA-L2≈具有以下結構中之一種：
Figure 02_image169
Figure 02_image171
其中胺基基團上之波形線表示用於擴展單元之連接位點，並且藥物單元連接至末端酸基團或苄醇(亦即，酸或苄醇之H被與藥物單元之鍵替代)，或者其中波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中胺基酸單元藉由非肽連接基團連接至連接子亞單元L2。在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中非肽連接基團選自C 1-C 10伸烷基、C 2-C 10伸烯基、C 2-C 10亞炔基或聚乙二醇。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，亦包括擴展單元以形成連接子。在一些實施例中，提供了連接子，其中擴展單元選自以下：
Figure 02_image173
Figure 02_image175
Figure 02_image177
； 其中R 17為-C 1-C 10伸烷基-、-C 1-C 10雜伸烷基-、-C 3-C 8碳環-、-O-(C 1-C 8伸烷基)-、-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基- (其中b為1至26)、-伸芳基-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-、-C 3-C 8雜環-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-、-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-、-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、C 1-C 10雜伸烷基-C(=O)-、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C(=O)- (其中b為1至26)、-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 3-C 8碳環-C(=O)-、-O-(C 1-C 8烷基)-C(=O)-、-伸芳基-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-C(=O)-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-C(=O)-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、-C 3-C 8雜環-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-C(=O)-、-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-NH-、-C 1-C 10雜伸烷基-NH-、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-NH- (其中b為1至26)、-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-NH- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-NH- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(C(=O))-NH-(CH 2-O-CH 2) b-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(C(=O))-NH-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-NH-(C(=O))-(CH 2-O-CH 2) b-NH- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-NH-(C(=O))-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-NH- (其中b為1至26)、-C 3-C 8碳環-NH-、-O-(C 1-C 8烷基)-NH-、-伸芳基-NH-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-NH-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-NH-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-NH-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-NH-、-C 3-C 8雜環-NH-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-NH-、-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-NH-、-C 1-C 10伸烷基-S-、C 1-C 10雜伸烷基-S-、-C 3-C 8碳環-S-、-O-(C 1-C 8烷基)-S-、-伸芳基-S-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-S-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-S-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-S-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-S-、-C 3-C 8雜環-S-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-S-或-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-S-；或 其中擴展單元包括順丁烯二醯亞胺基(C 1-C 10伸烷基-C(O)-、順丁烯二醯亞胺基(CH 2OCH 2) p2(C 1-C 10伸烷基)C(O)-、順丁烯二醯亞胺基(C 1-C 10伸烷基)(CH 2OCH 2) p2C(O)-或其開環形式，其中p2為1至26。
在一些實施例中，提供了連接子，其中擴展單元選自以下：
Figure 02_image179
Figure 02_image181
；以及
Figure 02_image183
； 其中波形線
Figure 02_image185
表示擴展單元與胺基酸單元之連接位點，並且與靶向單元之連接位點在順丁烯二醯亞胺、一級胺或炔官能基上。
在一些實施例中，提供了連接子，該連接子具有以下結構中之一種：
Figure 02_image187
Figure 02_image189
Figure 02_image191
Figure 02_image193
Figure 02_image195
Figure 02_image197
Figure 02_image199
Figure 02_image201
Figure 02_image203
Figure 02_image205
Figure 02_image207
Figure 02_image209
Figure 02_image211
Figure 02_image213
Figure 02_image215
Figure 02_image217
Figure 02_image219
其中各Z在*處連接並且分別選自：
Figure 02_image221
，
Figure 02_image223
，以及
Figure 02_image225
； 其中藥物單元視情況連接至末端酸基團或苄醇，或者其中波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子，進一步包含連接至連接子亞單元L2以形成藥物-連接子之至少一個藥物單元。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中藥物單元選自細胞毒性劑、免疫調節劑、核酸、生長抑制劑、PROTAC、毒素、放射性同位素及螯合配體。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中藥物單元為細胞毒性劑。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中細胞毒性劑選自奧瑞他汀、美登素類化合物、喜樹鹼、倍癌黴素及卡奇黴素。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中細胞毒性劑為奧瑞他汀。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中細胞毒性劑為MMAE或MMAF。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中細胞毒性劑為喜樹鹼。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中細胞毒性劑為依喜替康或SN-38。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中細胞毒性劑為依喜替康。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中細胞毒性劑為卡奇黴素。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中細胞毒性劑為美登素類化合物。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中美登素類化合物為美登素、美登醇或安沙黴素-2。
在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中細胞毒性劑為卡奇黴素。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中細胞毒性劑為美登素類化合物。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中美登素類化合物為美登素、美登醇或安沙黴素-2。
在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中藥物單元為免疫調節劑。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中免疫調節劑選自TRL7促效劑、TLR8促效劑、STING促效劑或RIG-I促效劑。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中免疫調節劑為TLR7促效劑。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中TLR7促效劑為咪唑并喹啉、咪唑并喹啉胺、噻唑并喹啉、胺基喹啉、胺基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-胺基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氫吡啶并嘧啶、雜芳并噻二嗪-2,2-二氧化物、苯并萘啶、鳥苷類似物、腺苷類似物、胸苷均聚物、ssRNA、CpG-A、PolyG10或PolyG3。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中免疫調節劑為TLR8促效劑。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中TLR8促效劑選自咪唑并喹啉、噻唑并喹啉、胺基喹啉、胺基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-胺基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氫吡啶并嘧啶或ssRNA。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中免疫調節劑為STING促效劑。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中免疫調節劑為RIG-I促效劑。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中RIG-I促效劑選自KIN1148、SB-9200、KIN700、KIN600、KIN500、KIN100、KIN101、KIN400及KIN2000。
在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中藥物單元為螯合配體。在一些實施例中，提供了藥物-連接子，其中螯合配體選自鉑(Pt)、釕(Ru)、銠(Rh)、金(Au)、銀(Ag)、銅(Cu)、鉬(Mo)、鈦(Ti)或銥(Ir)；放射性同位素，例如釔-88、釔-90、鍀-99、銅-67、錸-188、錸-186、鎵-66、鎵-67、銦-111、銦-114、銦-115、鑥-177、鍶-89、釤-153及鉛-212。
在一些實施例中，提供了藥物-連接子，具有以下結構：
Figure 02_image227
Figure 02_image229
Figure 02_image231
Figure 02_image233
Figure 02_image235
Figure 02_image237
Figure 02_image239
Figure 02_image241
Figure 02_image243
Figure 02_image245
Figure 02_image247
Figure 02_image249
Figure 02_image251
Figure 02_image253
Figure 02_image255
Figure 02_image257
Figure 02_image259
Figure 02_image261
Figure 02_image263
Figure 02_image265
Figure 02_image267
Figure 02_image269
Figure 02_image271
Figure 02_image273
Figure 02_image275
Figure 02_image277
Figure 02_image279
Figure 02_image281
其中各Z在*處連接並且分別選自：
Figure 02_image283
，
Figure 02_image285
，以及
Figure 02_image287
；或
Figure 02_image289
其中各Z在*處連接並且分別選自：
Figure 02_image291
，
Figure 02_image293
，以及
Figure 02_image295
。
在一些實施例中，提供了結合物，包含連接至本文所描述之任何藥物-連接子之靶向單元。在一些實施例中，提供了結合物，其中靶向單元選自抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，提供了結合物，其中靶向單元為單株抗體、Fab、Fab'、F(ab')、Fv、二硫鍵連接之Fc、scFv、單域抗體、雙抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。在一些實施例中，提供了結合物，其中靶向單元為雙抗體、DART、抗運載蛋白、親合體、阿維默、DARPin或阿德內丁蛋白。在一些實施例中，提供了結合物，其中靶向單元為單特異性的。在一些實施例中，提供了結合物，其中靶向單元為二價的。在一些實施例中，提供了結合物，其中靶向單元為雙特異性的。在一些實施例中，提供了結合物，其中結合物之平均載藥量(p load)為約1至約8、約2、約4、約6、約8、約10、約12、約14、約16、約3至約5、約6至約8或約8至約16。
在一些實施例中，提供了選自以下之結合物：
Figure 02_image297
Figure 02_image299
Figure 02_image301
Figure 02_image303
Figure 02_image305
Figure 02_image307
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； 其中各Z在*處連接並且分別選自：
Figure 02_image353
，
Figure 02_image355
，以及
Figure 02_image357
；或
Figure 02_image359
； 其中各Z在*處連接並且分別選自：
Figure 02_image361
，
Figure 02_image363
，以及
Figure 02_image365
； 其中Ab為靶向單元並且n為p load。
在一些實施例中，提供了如以上所描述之結合物，其中靶向單元結合諸如CD19、CD20、CD30、CD33、CD70、LIV-1或EGFRv3之目標分子。
在一些實施例中，提供了如以上所描述之結合物，其中靶向單元選自：scFv1-ScFv2、ScFv12-Fc-scFv22、IgG-scFv、DVD-Ig、triomab/quadroma、二合一IgG、scFv2-Fc、TandAb及scFv-HSA-scFv。
在一些實施例中，提供了如以上所描述之結合物，其中靶向單元為癌症相關抗原，例如CD19、CD20、CD30、CD33、CD38、CA125、MUC-1、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、CD44表面黏附分子、間皮素(MLSN)、癌胚抗原(CEA)、表皮生長因子受體(EGFR)、EGFRvIII、血管內皮生長因子受體-2 (VEGFR2)、高分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA)、MAGE-A1、IL-13R-a2、GD2、1p19q、ABL1、AKT1、ALK、APC、AR、ATM、BRAF、BRCA1、BRCA2、cKIT、cMET、CSF1R、CTNNB1、FGFR1、FGFR2、FLT3、GNA11、GNAQ、GNAS、HRAS、IDH1、IDH2、JAK2、KDR (VEGFR2)、KRAS、MGMT、MGMT-Me、MLH1、MPL、NOTCH1、NRAS、PDGFRA、Pgp、PIK3CA、PR、PTEN、RET、RRM1、SMO、SPARC、TLE3、TOP2A、TOPO1、TP53、TS、TUBB3、VHL、CDH1、ERBB4、FBXW7、HNF1A、JAK3、NPM1、PTPN11、RB1、SMAD4、SMARCB1、STK1、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、ROS1、ERCC1、5T4 (TPBG)、B7-H3、CCR7、CD105、CD22、CD46、CD47、CD56、CD70、CD71、CD79b、CDH6、CLDN6、CLDN18.2、CLEC12A、DLL3、DR5、ERBB3 (HER3)、EPCAM、FOLR1、IGF1R、IL2RA (CD25)、IL3RA、ITGB6、LIV-1、LRRC15、間皮素(MSLN)、NaPi2b (SLC34A2)、黏連蛋白-4、PTK7、ROR1、SEZ6、SLC44A4、SLITRK6、組織因子(TF)、TROP2或B7-H4。
在一些實施例中，提供了如以上所描述之結合物，其中靶向單元為抗體或其片段，包括利妥昔單抗(Rituxan®)、曲妥單抗(Herceptin®)、帕妥珠單抗(Perjeta®))、貝伐單抗(Avastin®)、蘭尼單抗(Lucentis®)、西妥昔單抗(Erbitux®)、阿侖單抗(Campath®)、帕尼單抗(Vectibix®)、替伊莫單抗(Zevalin®)、托西莫單抗(Bexxar®)、伊匹單抗、紮蘆木單抗、達雷妥尤單抗、芬妥木單抗、雷莫蘆單抗、加利昔單抗、法妥組單抗、奧瑞組單抗、奧法木單抗(Arzerra®)、替妥木單抗(tositumumab)、替伊莫單抗、CD20抗體 2F2 (HuMax-CD20)、7D8、IgM2C6、IgG1 2C6、11B8、B1、2H7、LT20、1FS或AT80、達利珠單抗(Zenapax®)，或抗-LHRH受體抗體，例如純系A9E4、F1G4、AT2G7、GNRH03或GNRHR2。
在一些實施例中，提供了如以上所描述之結合物，其中靶向單元為抗體F131並且藥物-連接子為LD038。在具體實施例中，靶向單元為抗體F131 (VH SEQ ID NO: 26及VL SEQ ID NO: 27)。
在一些實施例中，提供了如以上所描述之結合物，其中靶向單元為抗體，該抗體包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH區包含位於重鏈可變區構架區中之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，並且該VL區包含位於輕鏈可變區構架區中之LCDR1、LCDR及LCDR3，該VH及VL CDR具有選自以下列出之胺基酸序列組中之胺基酸序列：(a) 分別為SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34及SEQ ID No:35；以及(b) 分別為SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39及SEQ ID NO:40。在某些實施例中，VH及VL區具有選自以下列出之胺基酸序列對中之胺基酸序列：分別為SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27；以及其中重鏈及輕鏈構架區視情況經由構架區中之1個至8個胺基酸取代、缺失或插入而修飾。在具體實施例中，抗體為F131，並且藥物-連接子為LD038。
在一些實施例中，提供了包含本文所描述之任何結合物及醫藥學上可接受之載體的醫藥組合物。
在一些實施例中，提供了治療有需要之受試者之方法，該方法包含向受試者投與本文所描述之任何結合物或本文所描述之任何醫藥組合物，其中受試者患有癌症或自身免疫性疾病，並且結合物結合與癌症或自身免疫性疾病相關之目標抗原。
藉由參考以下詳細描述，具體實施方案之非限制性實例及附圖，可以更全面地理解本發明之此等及其他態樣。
定義 為了方便，本說明書、實施例及申請專利範圍中之某些術語在本文中定義。除非另外說明或者自上下文中暗示，以下術語及片語具有以下提供之含義。提供此等定義係為了幫助描述具體實施方案，而非為了限制所要求保護之發明，因為本發明之範圍僅由申請專利範圍限定。除非另外定義，本文使用的所有技術術語及科學術語具有與本發明此項技術之普通技術人員通常理解的相同含義。
除非另外說明，本文使用的術語「一(a)」及「一(an)」係指「一個」、「至少一個」或「一或多個」。除非上下文另外要求，本文使用的單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。
除非上下文另外要求，在整個說明書及申請專利範圍中，詞語「包含(comprise)」、「包含(comprising)」等旨在解釋為與排它性或窮盡性含義相反之包含性含義，亦即「包括但不限於」之含義。
術語「減少之」、「降低」、「降低之」、「縮減」、「減少」及「抑制」在本文一般均用於意指相對於參考之統計學上顯著量之減少。
術語「增加之」、「增加」或「增強」或「活化」在本文一般均用於意指相對於參考之統計學上顯著量之增加。
如本文使用，術語「蛋白質」及「多肽」在本文可互換使用來表示一系列胺基酸殘基，各胺基酸殘基藉由相鄰殘基之α-胺基及羧基基團之間之肽鍵彼此連接。術語「蛋白質」及「多肽」亦指胺基酸之聚合物，包括修飾之胺基酸(例如，磷酸化之、糖化之、糖基化之等)及胺基酸類似物，而不管其大小或功能。「蛋白質」及「多肽」常用於指相對大的多肽，而術語「肽」常用於指小之多肽，但此等術語在本領域中之使用有重疊。術語「蛋白質」及「多肽」在本文當涉及編碼之基因產物及其片段時可互換使用。因此，示例性多肽或蛋白質包括基因產物、天然存在之蛋白質、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段及前述之其他等同物、變體、片段及類似物。
如本文使用，「表位」係指通常由免疫球蛋白VH/VL對結合之胺基酸，例如本文所描述之抗體、其抗原結合部分及其他結合劑。其他結合劑包括非抗體支架。表位可在多肽上由連續胺基酸或藉由蛋白質之三級摺疊而並置的非連續胺基酸形成。由連續胺基酸形成之表位通常在暴露於變性溶劑時保留，而藉由三級摺疊形成之表位通常在用變性溶劑處理時丟失。表位通常包含至少3個，更通常至少5個，約9個或約8至10個獨特空間構象之胺基酸。表位限定抗體、其抗原結合部分及其他結合劑之最小結合位點，因此代表抗體、其抗原結合部分或其他基於免疫球蛋白之結合劑之特異性目標。在單域抗體之情況下，表位代表由分離之可變域結合之結構單元。
如本文使用，「特異性結合」係指本文所描述之結合劑(例如抗體或其抗原結合部分)結合目標的能力，其中KD為10 -5M (10000 nM)或更少，例如，10 -6M、10 -7M、10 -8M、10 -9M、10 -10M、10 -11M、10 -12M或更少。如本文所描述之「特異性結合」亦指本文所描述之分子(例如抗體或其抗原結合部分或非抗體支架)結合目標的能力，其中KD為10 -5M (10000 nM)或更少，例如，10 -6M、10 -7M、10 -8M、10 -9M、10 -10M、10 -11M、10 -12M或更少。特異性結合可能受到例如抗體、抗原結合部分或其他結合劑之親和力(affinity)及親合力(avidity)以及目標多肽之濃度之影響。本領域普通技術人員可確定合適之條件，在該條件下，本文所描述之抗體、抗原結合部分及其他結合劑使用任何合適之方法選擇性地結合目標分子，例如在合適之細胞結合測定中滴定抗體或結合劑。與目標分子特異性結合之結合劑不被不相似的競爭劑取代。在某些實施例中，當抗體或其抗原結合部分或其他結合劑優先識別其在蛋白質及/或大分子之複雜混合物中之目標分子時則被稱為特異性結合目標分子。特異性結合可能受到例如抗體、抗原結合部分或非抗體支架之親和力及親合力以及目標多肽之濃度之影響。本領域普通技術人員可確定合適之條件，在該條件下，本文所描述之抗體、抗原結合部分及非抗體支架使用任何合適之方法選擇性地結合目標分子，例如在合適之細胞結合測定中滴定抗體或或非抗體。與目標分子特異性結合之分子不被不相似的競爭劑取代。在某些實施例中，當抗體或其抗原結合部分或非抗體支架優先識別其在蛋白質及/或大分子之複雜混合物中之目標分子時則被稱為特異性結合目標分子。
除非另外說明，術語「烷基」本身或作為其他術語之一部分係指具有指定數量之碳原子之取代或未取代之直鏈或支鏈飽和烴(例如，「-C 1-C 5烷基」、「-C 1-C 8烷基」或「-C 1-C 10烷基」分別係指具有1至5個、1至8個或1至10個碳原子之烷基基團)。實例包括甲基(Me、-CH 3)、乙基(Et、-CH 2CH 3)、1-丙基(n-Pr、n-丙基、-CH 2CH 2CH 3)、2-丙基(i-Pr、i-丙基、-CH(CH 3) 2)、1-丁基(n-Bu、n-丁基、-CH 2CH 2CH 2CH 3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu、i-丁基、-CH 2CH(CH 3) 2)、2-丁基(s-Bu、s-丁基、-CH(CH 3)CH 2CH 3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu、t-丁基、-C(CH 3) 3)、1-戊基(n-戊基、-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 3)、2-戊基(-CH(CH 3)CH 2CH 2CH 3)、3-戊基(--CH(CH 2CH 3) 2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH 3) 2CH 2CH 3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH 3)CH(CH 3) 2)、3-甲基-1-丁基(-CH 2CH 2CH(CH 3) 2)、2-甲基-1-丁基(-CH 2CH(CH 3)CH 2CH 3)、1-己基(-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2CH 3)、2-己基(-CH(CH 3)CH 2CH 2CH 2CH 3)、3-己基(-CH(CH 2CH 3)(CH 2CH 2CH 3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH 3) 2CH 2CH 2CH 3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH 3)CH(CH 3)CH 2CH 3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH 3)CH 2CH(CH 3) 2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH 3)(CH 2CH 3) 2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH 2CH 3)CH(CH 3) 2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH 3) 2CH(CH 3) 2)及3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH 3)C(CH 3) 3。
除非另外說明，「烯基」本身或作為其他術語之一部分係指具有至少一個不飽和位點(亦即，碳-碳sp 2雙鍵)之C 2-C 8取代或未取代之直鏈或支鏈烴。實例包括但不限於：乙烯或乙烯基(-CH=CH 2)、烯丙基(-CH 2CH=CH 2)、環戊烯基(-C 5H 7)及5-己烯基(-CH 2CH 2CH 2CH 2CH=CH 2)。
除非另外說明，「炔基」本身或作為其他術語之一部分係指具有至少一個不飽和位點(亦即，碳-碳sp三鍵)之C 2-C 8取代或未取代之直鏈或支鏈烴。實例包括但不限於：乙炔及炔丙基。
除非另外說明，「伸烷基」係指具有1至8個碳原子並且具有藉由自母體烷烴之相同或兩個不同碳原子上移除兩個氫原子而衍生之兩個單價基團中心之飽和支鏈或直鏈烴基。典型的伸烷基基團包括但不限於：亞甲基(-CH 2-)、1,2-乙基(-CH 2CH 2-)、1,3-丙基(-CH 2CH 2CH 2-)、1,4-丁基(-CH 2CH 2CH 2CH 2-)等。
除非另外說明，「伸烯基」係指具有2至8個碳原子並且具有藉由自母體烯烴之相同或兩個不同碳原子上移除兩個氫原子而衍生之兩個單價基團中心之不飽和支鏈或直鏈烴基。典型的伸烯基基團包括但不限於：1,2-乙烯(-CH=CH-)。
除非另外說明，「亞炔基」係指具有2至8個碳原子並且具有藉由自母體炔烴之相同或兩個不同碳原子上移除兩個氫原子而衍生之兩個單價基團中心之不飽和支鏈或直鏈或環狀烴基。典型的亞炔基基團包括但不限於：乙炔、炔丙基及4-戊炔基。
除非另外說明，術語「雜烷基」本身或與其他術語組合為取代或未取代之穩定的直鏈或支鏈烴，或其組合，其係指飽和的並且有1至10個、較佳1至3個選自O、N、Si及S之雜原子，並且其中氮及硫原子可視情況被氧化並且氮雜原子可視情況被四級銨化。雜原子O、N及S可位於雜烷基基團之任何內部位置(亦即作為主鏈之一部分)處或烷基基團與分子之其餘部分連接之位置處。雜原子Si可位於雜烷基基團之任何位置處，包括烷基基團連接至分子之其餘部分之位置處。雜烷基之實例包括以下：-CH 2CH 2OCH 3、-CH 2CH 2NHCH 3、-CH 2CH 2N(CH 3)CH 3、-CH 2SCH 2CH 3、CH 2CH 2S(O)CH 3、-CH 2CH 2S(O) 2CH 3及-Si(CH 3) 3-。至多兩個雜原子可為連續的，例如-CH 2NHOCH 3及CH 2OSi(CH 3) 3。在一些實施例中，C 1至C 4雜烷基具有1至4個碳原子及1或2個雜原子，並且C 1至C 3雜烷基具有1至3個碳原子及1或2個雜原子。
除非另外說明，術語「雜烯基」及「雜炔基」本身或與其他術語組合係指具有1至10個、較佳1至3個選自O、N、Si及S之雜原子之取代或未取代之穩定的直鏈或支鏈烯基或炔基，並且其中氮及硫原子可視情況被氧化並且氮雜原子可視情況被四級銨化。雜原子O、N及S可位於雜烯基或雜炔基基團之任何內部位置(亦即作為主鏈之一部分)處或烷基基團與分子之其餘部分連接之位置處。雜原子Si可位於雜烯基或雜炔基基團之任何位置處，包括烷基基團連接至分子之其餘部分之位置處。
除非另外說明，「雜伸烷基」本身或作為其他取代基之一部分係指衍生自雜烷基(如上所描述)之取代或未取代之二價基團，例如-CH 2CH 2SCH 2CH 2-及-CH 2SCH 2CH 2NHCH 2-。在一些實施例中，C 1至C 4雜伸烷基具有1至4個碳原子及1或2個雜原子，並且C 1至C 3雜伸烷基具有1至3個碳原子及1或2個雜原子。對於雜伸烷基基團，雜原子亦可佔據鏈末端中之一者或兩者。此外，對於伸烷基及雜伸烷基連接基團，未指明連接基團之取向。
除非另外說明，術語「亞雜烯基」及「亞雜炔基」本身或作為其他取代基之一部分係指衍生自雜烯基或雜炔基(如上所描述)之取代或未取代之二價基團。在一些實施例中，C 2至C 4亞雜烯基或亞雜炔基具有1至4個碳原子。對於亞雜烯基及亞雜炔基基團，雜原子亦可佔據鏈末端中之一者或兩者。此外，對於亞雜烯基及亞雜炔基基團，未指明連接基團之取向。
除非另外說明，「C 3-C 8碳環」本身或作為其他術語之一部分係指藉由自母體環系之環原子中移除一個氫原子而衍生之取代或未取代之3、4、5、6、7或8元單價、取代或未取代之、飽和或不飽和的非芳族單環或雙環之碳環。代表性-C 3-C 8碳環包括但不限於：環丙基、環丁基、環戊基、環戊二烯基、環己基、環己烯基、1,3-環己二烯基、1,4-環己二烯基、環庚基、1,3-環庚二烯基、1,3,5-環庚三烯基、環辛基及環辛二烯基。
除非另外說明，「C 3-C 8碳環基」本身或作為其他術語之一部分係指上文定義之取代或未取代之C 3-C 8碳環基團，其中另一個碳環基團之氫原子被鍵替代(亦即，其為二價的)。
除非另外說明，「C 3-C 10碳環」本身或作為其他術語之一部分係指藉由自母體環系之環原子中移除一個氫原子而衍生之取代或未取代之3、4、5、6、7、8、9或10元單價、取代或未取代之、飽和或不飽和的非芳族單環、雙環或三環之碳環。代表性-C 3-C 10碳環包括但不限於：環丙基、環丁基、環戊基、環戊二烯基、環己基、環己烯基、1,3-環己二烯基、1,4-環己二烯基、環庚基、1,3-環庚二烯基、1,3,5-環庚三烯基、環辛基及環辛二烯基。-C 3-C 10碳環可亦包括稠合之環辛炔碳環，例如在國際公開號WO2011/136645 (其公開內容藉由引用併入本文)中公開之稠合之環辛炔化合物，包括BCN (雙環[6.1.0]壬炔)及DBCO (二苯并環辛炔)。
除非另外說明，「C 3-C 8雜環」本身或作為其他術語之一部分係指具有3至8個碳原子(亦稱為環成員)及1至4個獨立地選自N、O、P或S之雜原子環成員並且藉由自母體環系之環原子中移除一個氫原子而衍生之取代或未取代之單價取代或未取代之芳族或非芳族單環或雙環之環系。雜環中之一者或多個N、C或S原子可被氧化。包含雜原子之環可為芳族或非芳族的。除非另外說明，雜環在產生穩定結構之任何雜原子或碳原子處連接至其側基。C 3-C 8雜環之代表性實例包括但不限於吡咯啶基、氮雜環丁烷基、哌啶基、𠰌啉基、四氫呋喃基、四氫哌喃基、苯并呋喃基、苯并噻吩、吲哚基、苯并吡唑基、吡咯基、噻吩基(噻吩)、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、嘧啶基、吡啶基、吡𠯤基、噠𠯤基、異噻唑基及異㗁唑基。除非另外說明，術語「雜碳環」與如本文所描述之「雜環」或「雜環基」同義。
除非另外說明，「C 3-C 8雜環基」本身或作為其他術語之一部分係指上文定義之取代或未取代之C 3-C 8雜環基團，其中一個雜環基團之氫原子被鍵替代(亦即，其為二價的)。
除非另外說明，「芳基」本身或作為其他術語之一部分係指藉由自母體芳香環系之單個碳原子中移除一個氫原子而衍生之具有6至20個碳(較佳6至14個碳)原子之取代或未取代之單價碳環芳族烴基。一些芳基基團在示例性結構中表示為「AR」。典型的芳基包括但不限於衍生自苯、經取代之苯、萘、蒽、聯苯等之基團。示例性芳基基團為苯基基團。
除非另外說明，「伸芳基」本身或作為其他術語之一部分為如上定義之未取代或經取代之芳基基團，其中一個芳基基團之氫原子被鍵替代(亦即，其為二價的)，並且可處於鄰位、間位或對位取向。
除非另外說明，「雜芳基」及「雜環」係指其中一或多個環原子為雜原子，例如氮、氧及硫之環系。雜環基團包含1至20個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子。雜環可為具有3至7個環成員(2至6個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)之單環或具有7至10個環成員(4至9個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)之雙環，例如：雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]體系。
除非另外說明，「亞雜芳基」本身或作為其他術語之一部分為如上定義之未取代或經取代之雜芳基基團，其中一個雜芳基基團之氫原子被鍵替代(亦即，其為二價的)。
除非另外說明，「羧基」係指COOH或COO-M +，其中M +為陽離子。
除非另外說明，「側氧基」係指(C=O)。
除非另外說明，「取代之烷基」及「取代之芳基」分別係指其中一或多個氫原子各自獨立地被取代基替代之烷基及芳基。典型的取代基包括但不限於-X、-R 10、-O -、-OR 10、-SR 10、-S -、-NR 10 2、-NR 10 3、=NR 10、-CX 3、-CN、-OCN、-SCN、-N=C=O、-NCS、-NO、-NO 2、=N 2、-N 3、-NR 10C(=O)R 10、-C(=O)R 10、-C(=O)NR 10 2、-SO 3 -、-SO 3H、-S(=O) 2R 10、-OS(=O) 2OR 10、-S(=O) 2NR 10、-S(=O)R 10、-OP(=O)(OR 10) 2、-P(=O)(OR 10) 2、-PO - 3、-PO 3H 2、-AsO 2H 2、-C(=O)R 10、-C(=O)X、-C(=S)R 10、-CO 2R 10、-CO 2 -、-C(=S)OR 10、C(=O)SR 10、C(=S)SR 10、C(=O)NR 10 2、C(=S)NR 10 2或C(=NR 10)NR 10 2，其中各X獨立地為鹵素：-F、-Cl、-Br或-I；並且各R 10獨立地-H、-C 1-C 20烷基、-C 6-C 20芳基、-C 3-C 14雜環、保護基團或前藥部分。典型的取代基亦包括(=O)。如以上描述之伸烷基、碳環、碳環基、伸芳基、雜烷基、雜伸烷基、雜環及雜環基基團亦可被類似地取代。
除非另外說明，「多羥基基團」係指碳鏈之碳原子上之氫被兩個以上或三個以上之羥基基團取代之烷基、伸烷基、碳環或碳環基基團。在一些實施例中，多羥基基團包含至少三個羥基基團。在一些實施例中，多羥基基團包含各碳原子僅含有一個羥基基團之碳原子。多羥基基團可含有一或多個未被羥基取代之碳原子。多羥基基團之各碳原子可均被羥基基團取代。多羥基基團之實例包括線性(非環狀)或環狀形式之單糖，例如C6或C5糖，例如葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脫氧葡萄糖、甘油醛、赤蘚糖、蘇糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、醛糖及酮糖；糖酸，例如葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸或酮糖酸；以及胺基糖，例如葡糖胺、N-乙醯葡糖胺、半乳糖胺及N-乙醯半乳糖胺。在一些實施例中，多羥基基團包括線性或環狀形式之二糖及多糖。
除非上下文另外說明，「視情況經取代之」係指烷基、烯基、炔基、烷基芳基、芳基烷基雜環、芳基、雜芳基、烷基雜芳基、雜芳基烷基或如本文所定義或公開之其他取代基、部分或基團，其中該取代基、部分或基團之氫原子視情況被不同的部分或基團替代，或者其中包含此等取代基、部分或基團之一的脂環族碳鏈藉由用不同的部分或基團替代該鏈之碳原子而中斷。在一些態樣，烯烴官能基替代烷基取代基之兩個連續的sp3碳原子，其限制條件為烷基部分之碳基不被替代，使得視情況經取代之烷基為不飽和的烷基取代基。
在前述取代基、部分或基團之任一個中替代氫之視情況選用的取代基獨立地選自芳基、雜芳基、羥基、烷氧基、芳氧基、氰基、鹵素、硝基、氟代烷氧基及胺基(包括單取代、二取代及三取代之胺基基團)及其受保護之衍生物，或選自-X、-OR'、-SR'、-NH 2、-N(R')(R'')、-N(R'') 3、=NR、-CX 3、-CN、-NO 2、- NR'C(=O)H、-NR'C(=O)R、-NR'C(=O)R''、-C(=O)R'、-C(=O)NH 2、-C(=O)N(R')R''、-S(=O) 2R''、-S(=O) 2NH 2、-S(=O) 2N(R')R''、-S(=O) 2NH 2、-S(=O) 2N(R')R''、-S(=O) 2OR'、-S(=O)R''、-OP(=O)(OR')(OR'')、-OP(OH) 3、-P(=O)(OR')(OR'')、-PO 3H 2、-C(=O)R'、-C(=S)R''、-CO 2R'、-C(=S)OR''、-C(=O)SR'、-C(=S)SR'、-C(=S)NH 2、-C(=S)N(R')(R'') 2、-C(=NR')NH 2、-C(=NR')N(R')R''及其鹽，其中各X獨立地選自鹵素：-F、-CI、-Br及-I；並且其中各R''獨立地選自C 1-C 20烷基、C 2-C 20烯基、C 2-C 20炔基、C 6-C 24芳基、C 3-C 24雜環基(包括C 5-C 24雜芳基)、保護基團及前藥部分，或者R''中之兩個與其所連接之雜原子一起限定雜環基；並且R'為氫或R''，其中R''選自C 1-C 20烷基、C 6-C 24芳基、C 3-C 24雜環基(包括C 5-C 24雜芳基)及保護基團。
典型地，視情況選用的取代基選自-X、-OH、-OR''、-SH、-SR''、-NH 2、-NH(R'')、-NR'(R'') 2、-N(R'') 3、=NH、=NR''、-CX 3、-CN、-NO 2、-NR'C(=O)H、NR'C(=O)R''、-CO 2H、-C(=O)H、-C(=O)R''、-C(=O)NH 2、-C(=O)NR'R''- -S(=O) 2R''、-S(=O) 2NH 2、-S(=O) 2N(R')R''、-S(=O) 2NH 2、- S(=O) 2N(R')(R'')、-S(=O) 2OR' 、-S(=O)R''、-C(=S)R''、-C(=S)NH 2、-C(=S)N(R')R''、-C(=NR')N(R'') 2及其鹽，其中各X獨立地選自-F及-Cl，R''典型地選自C 1-C 6烷基、C 6-C 10芳基、C 3-C 10雜環基(包括C 5-C 10雜芳基)及保護基團；並且R'獨立地為氫、C 1-C 6烷基、C 6-C 10芳基、C 3-C 10雜環基(包括C 5-C 10雜芳基)及保護基團(獨立地選自R'')。更典型地，取代基選自-X、-R''、-OH、-OR''、-NH 2、-NH(R'')、-N(R'') 2、-N(R'') 3、-CX 3、-NO 2、-NHC(=O)H、-NHC(=O)R''、-C(=O)NH 2、-C(=O)NHR''、-C(=O)N(R'') 2、-CO 2H、-CO 2R''、-C(=O)H、-C(=O)R''、-C(=O)NH 2、-C(=O)NH(R'')、-C(=O)N(R'') 2、-C(=NR')NH 2、-C(=NR')NH(R'')、-C(=NR')N(R'') 2、保護基團及其鹽，其中各X為-F，R''獨立地選自C 1-C 6烷基、C 6-C 10芳基、C 5-C 10雜芳基及保護基團；並且R'選自氫、C 1-C 6烷基及保護基團(獨立地選自R'')。
如本文使用，片語「醫藥學上可接受之鹽」係指化合物(例如，連接子、藥物連接子或結合物)之醫藥學上可接受之有機或無機鹽。化合物通常含有至少一個胺基基團，因此可與該胺基基團形成酸加成鹽。示例性鹽包括但不限於硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異菸酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、亞麻油酸鹽、龍膽酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、穀胺酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽及雙羥萘酸鹽(亦即，1,1'-亞甲基-雙-(2-羥基-3-萘甲酸)鹽)。醫藥學上可接受之鹽可包括其他分子，例如乙酸根離子、琥珀酸根離子或其他抗衡離子。抗衡離子可為穩定母體化合物上之電荷之任何有機或無機部分。此外，醫藥學上可接受之鹽可在其結構中具有多於一個之帶電原子。其中多個帶電原子為醫藥學上可接受之鹽之一部分之情況可具有多個抗衡離子。因此，醫藥學上可接受之鹽可具有一或多個帶電原子及/或一或多個抗衡離子。
如本文使用，術語「基本上由……組成」係指給定實施例所需之彼等要素。該術語允許存在不會實質上影響該實施例之基本及新穎或功能特性之要素之存在。
如本文使用，術語「由……組成」係指如本文所描述之組合物、方法及其各自之組成部分，其排除在實施方案之該描述中未列出之任何要素。
除了在實施例中或在另外指出之情況下，本文使用的表示成分或反應條件之量之所有數位應理解為在所有情況下由術語「約」修飾。術語「約」當與百分比一起使用時可指+/-1%。
術語「統計學上顯著之」或「顯著地」係指統計學顯著性，並且通常係指高於或低於參考值之兩個標準偏差(2SD)之差異。
在本發明之各個態樣之描述中定義了其他術語。
具體實施方式本文提供了連接子，該連接子包括極性單元，例如糖單元、PEG單元及/或羧基單元。亦提供了靶向單元-連接子、藥物連接子及其結合物，其包含藥物單元，例如細胞毒性劑或免疫調節劑，如本文進一步描述。
在一些實施例中，連接子具有通式(I)，包括直接連接或經由視情況選用的胺基酸單元(AA)連接至連接子亞單元(L2)之擴展單元(L1)，如以下式(I)中所示： ~ L1 – AA s– L2 ≈ (I) 或其鹽，其中s為0或1，並且波形(≈)線表示用於靶向單元(L)或藥物單元(D)之連接位點。連接子在胺基酸單元、連接子亞單元L2或兩者中包含至少一個極性單元。各極性單元可為糖單元、PEG單元或羧基單元。連接子可包含至少一個糖單元、至少一個PEG單元、至少一個羧基單元或其組合。連接子亞單元L2可具有1至4個用於藥物單元之連接位點。在一些實施例中，連接子亞單元L2具有一個用於藥物單元之連接位點。在一些實施例中，連接子亞單元L2具有兩個用於藥物單元之連接位點。
亦提供了連接子之結合物，包含連接至至少一個連接子之靶向單元(L)，各連接子連接至至少一個藥物單元(D)，如以下式(II)中所示： L – [[L1 – AA s– L2] – D t] pload(II) 其中L1、AA及L2構成連接子並且如以上關於式(I)所示，s為0或1，t為1至4，並且p load為1至20。連接子在胺基酸單元、連接子亞單元L2或兩者中包含至少一個極性單元。各極性單元可為糖單元、PEG單元或羧基單元。連接子可包含至少一個糖單元、至少一個PEG單元、至少一個羧基單元或其組合。連接子亞單元L2可具有1至4個用於藥物單元之連接位點。在一些實施例中，連接子亞單元L2具有一個用於藥物單元之連接位點。在一些實施例中，連接子亞單元L2具有兩個用於藥物單元之連接位點。
亦提供了藥物-連接子，如以下式(III)中所示。 ~ [L1 – AA s– L2] – D t(III) 或其鹽，其中L1、AA、L2及D構成連接子並且如以上關於式(II)所示，s為0或1，t為1至4，並且波形線表示用於靶向單元之連接位點。連接子在胺基酸單元、連接子亞單元L2或兩者中包含至少一個極性單元。各極性單元可為糖單元、PEG單元或羧基單元。連接子可包含至少一個糖單元、至少一個PEG單元、至少一個羧基單元或其組合。連接子亞單元L2可具有1至4個用於藥物單元之連接位點。在一些實施例中，連接子亞單元L2具有一個用於藥物單元之連接位點。在一些實施例中，連接子亞單元L2具有兩個用於藥物單元之連接位點。
亦提供了靶向單元-連接子之中間體，如以下式(IV)中所示： L – [ [L1 – AA s– L2≈] ] d(IV) 或其鹽，其中L1、AA及L2構成連接子，L、L1、AA及L2如以上關於式(I)所描述，s為0或1，d為1至20，並且雙波形線(≈)表示用於藥物單元之連接位點。連接子在胺基酸單元、連接子亞單元L2或兩者中包含至少一個極性單元。各極性單元可為糖單元、PEG單元或羧基單元。連接子可包含至少一個糖單元、至少一個PEG單元、至少一個羧基單元或其組合。連接子亞單元L2可具有1至4個用於藥物單元之連接位點。在一些實施例中，連接子亞單元L2具有一個用於藥物單元之連接位點。在一些實施例中，連接子亞單元L2具有兩個用於藥物單元之連接位點。
極性單元 本文提供之極性單元(PU)包括糖單元、PEG單元及羧基單元，如本文進一步描述。
糖單元(SU) 在一些實施例中，糖單元(SU)具有通式(X)： L3 - **N(CH 2– (CH(XR)) k– X 1(X 2)) 2(X) 或其鹽，其中各X獨立地選自NH或O，各R獨立地選自氫、乙醯基、單糖、二糖及多糖，各X 1獨立地選自CH 2及C(O)，各X 2獨立地選自H、OH及OR，並且k為1至10。在一些實施例中，各(CH 2–(CH(XR)) k–X 1(X 2))為單糖。在一些實施例中，單糖為C6或C5糖，例如葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脫氧葡萄糖、甘油醛、赤蘚糖、蘇糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、醛糖、酮糖；糖酸，例如葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸或酮糖酸；或胺基糖，例如葡糖胺、N-乙醯葡糖胺、半乳糖胺及N-乙醯半乳糖胺。合適之二糖包括蔗糖、乳糖及麥芽糖。合適之多糖包括麥芽三糖、棉子糖、蔗果三糖、澱粉、纖維素及糖原。在端基異構C-1位置處之立體化學可為α或β。
L3具有以下通式(XI)： L3a | *- NH – (CH 2) p– CH - (CH 2) o- C(O) - # (XI) 其中L3a選自C 1-C 10伸烷基及聚乙二醇(具有1至26個乙二醇單元)，並且p及o獨立地為0至2，其中L3a共價結合至式(X)中用**標記之N原子。各*及各#表示用於胺基酸單元(AA)之其他亞單元或連接子亞單元L2、擴展單元(L1)或如本文所描述之連接子之其他組分的連接位點。
在一些實施例中，糖單元具有以下式(XII)：
Figure 02_image367
其中R、p及O如上所描述，n為0至4，並且各m獨立地為1至4。
在一些實施例中，糖單元具有以下式(XIII)：
Figure 02_image369
其中n式0至4，並且各m獨立地為1至4。
PEG單元 在一些實施例中，連接子包含PEG單元。PEG單元可連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分。胺基酸單元之亞單元可為，例如，α、β或γ胺基酸，或其衍生物。在一些實施例中，PEG單元可連接至擴展單元。
在一些實施例中，PEG單元具有以下通式–(CH 2CH 2O) n20-R 24，其中R 24為H或C 1-C 6烷基，並且n20為1至26。在一些實施例中，n20為12並且R 24為甲基。
在一些實施例中，PEG單元具有以下通式(XX)： ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-NR 24R 25(XX) 或其鹽，其中R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元及/或連接子亞單元L2之一部分的官能基；R 21及R 22各自獨立地為視情況選用的C 1-C 3伸烷基；R 24及R 25如以下所描述；波形線(~)表示連接位點；並且n20為1至26。在一些實施例中，R 20選自羧基、胺基、炔基、疊氮基、羥基、羰基、胺基甲酸酯、脲、硫代胺基甲酸酯、硫脲、磺醯胺、醯基磺醯胺、烷基磺酸酯或其受保護之形式。合適之保護基團包括本領域通常使用的羧酸保護基團、胺保護基團及磺醯基保護基團。
在一些實施例中，PEG單元具有以下通式(XX)： ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-NR 24R 25(XX) 或其鹽，其中R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元及/或連接子亞單元L2之一部分的官能基；R 21及R 22各自獨立地為視情況選用的C 1-C 3伸烷基；R 24及R 25如以下所描述；波形線(~)表示連接位點；並且n20為1至26。在一些實施例中，R 20選自鹵基、醛、羧基、胺基、炔基、疊氮基、羥基、羰基、胺基甲酸酯、硫醇、脲、硫代胺基甲酸酯、硫脲、磺醯胺、醯基磺醯胺、烷基磺酸酯、三唑、氮雜二苯并環辛炔、肼、羰基烷基雜芳基或其受保護之形式。合適之保護基團包括本領域通常使用的羧酸保護基團、胺保護基團及磺醯基保護基團。
在一些實施例中，PEG單元具有以下通式(XXI)： ~R 20-[-R 26-[R 29-[O-CH 2-CH 2-] n20R 29] n21-R 27-] n27-NR 24R 25(XXI) 或其鹽，其中R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元及/或連接子亞單元L2之一部分的官能基；R 26及R 27各自為視情況選用的C 1-C 12伸烷基、-NH-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-NH-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-NH-C 1-C 12伸烷基-C(O)-或-C(O)-C 1-C 12伸烷基-NH-；R 24及R 25如以下所描述；各R 29為視情況且獨立地選自-C(O)-、-NH-、-C(O)-C 1-C 6伸烯基-、-NH-C 1-C 6伸烯基-、-C 1-C 6伸烯基-NH-及-C 1-C 6伸烯基-C(O)-；波形線(~)表示連接位點；n20為1至26；n21為1至4；並且n27為1至3。在一些實施例中，R 20選自羧基、胺基、炔基、疊氮基、羥基、羰基、胺基甲酸酯、脲、硫代胺基甲酸酯、硫脲、磺醯胺、醯基磺醯胺、烷基磺酸酯或其受保護之形式。合適之保護基團包括本領域通常使用的羧酸保護基團、胺保護基團及磺醯基保護基團。
在一些實施例中，PEG單元具有以下通式(XXI)： ~R 20-[-R 26-[R 29-[O-CH 2-CH 2-] n20R 29] n21-R 27-] n27-NR 24R 25(XXI) 或其鹽，其中R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元及/或連接子亞單元L2之一部分的官能基；R 26及R 27各自為視情況選用的C 1-C 12伸烷基、-NH-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-NH-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-NH-C 1-C 12伸烷基-C(O)-或-C(O)-C 1-C 12伸烷基-NH-；R 24及R 25如以下所描述；各R 29為視情況且獨立地選自-C(O)-、-NH-、-C(O)-C 1-C 6伸烯基-、-NH-C 1-C 6伸烯基-、-C 1-C 6伸烯基-NH-、-C 1-C 6伸烯基-C(O)-、-NH(CO)NH-及三唑；波形線(~)表示連接位點；n20為1至26；n21為1至4；並且n27為1至3。在一些實施例中，R 20選自羧基、胺基、炔基、疊氮基、羥基、羰基、胺基甲酸酯、脲、硫代胺基甲酸酯、硫脲、磺醯胺、醯基磺醯胺、烷基磺酸酯或其受保護之形式。合適之保護基團包括本領域通常使用的羧酸保護基團、胺保護基團及磺醯基保護基團。
在PEG單元具有式(XX)及式(XXI)之一些實施例中，R 24及R 25各自獨立地選自H及多羥基基團；經取代之多羥基基團；-C(O)-多羥基基團；經取代之-C(O)-多羥基基團；視情況經取代之C 3-C 10碳環；視情況經取代之C 1-C 3伸烷基C 3-C 10碳環；視情況經取代之雜芳基；視情況經取代之碳環；經取代之-C 1-C 8烷基；經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基；螯合物；-C(O)-R 28，其中R 28為式(XII)或式(XIII)之糖單元；或與-NR 24R 25一起形成C 3-C 8雜環。
在PEG單元具有式(XX)及式(XXI)之一些實施例中，R 24及R 25中之一者選自H及多羥基基團；經取代之多羥基基團；-C(O)-多羥基基團；經取代之-C(O)-多羥基基團；視情況經取代之C 3-C 10碳環；視情況經取代之C 1-C 3伸烷基C 3-C 10碳環；視情況經取代之雜芳基；視情況經取代之碳環；經取代之-C 1-C 8烷基；經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基；螯合物；-C(O)-R 28，其中R 28為式(XII)或式(XIII)之糖單元；並且R 24及R 25中之另一者為聚乙二醇，視情況具有1個至24個乙二醇亞單元。
在PEG單元具有式(XX)或式(XXI)之一些實施例中，R 24及R 25均不為H。在PEG單元具有式(XX)及式(XXI)之一些實施例中，R 24及R 25中之一者為H。
在PEG單元具有式(XX)及式(XXI)之一些實施例中，R 24及R 25各自獨立地選自H及多羥基基團，其限制條件為R 24及R 25不都為H。多羥基基團可為直鏈或支鏈的。在一些實施例中，多羥基基團包含至少三個羥基基團。在一些實施例中，多羥基基團為線性單糖。如本文使用，線性單糖係指單糖之開環形式。在一些實施例中，線性單糖為C6或C5糖之線性形式，C6或C5糖例如葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脫氧葡萄糖、甘油醛、赤蘚糖、蘇糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、醛糖及酮糖。在一些實施例中，線性單糖可亦包括糖酸，例如葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸或酮糖酸。在一些實施例中，線性單糖可亦包括胺基糖，例如葡糖胺、N-乙醯基葡糖胺、半乳糖胺及N-乙醯基半乳糖胺。
具有線性單糖之PEG單元之實例包括以下：
Figure 02_image371
Figure 02_image373
其中R 39選自H、線性單糖及聚乙二醇。在此等示例性實施例中，當PEG單元連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分時，根據需要將其去保護，並且在PEG單元之左端之羧基或羥基基團與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分上的反應性基團之間形成鍵。
在PEG單元具有式(XX)及式(XXI)之一些實施例中，R 24及R 25各自獨立地選自H及多羥基基團，其限制條件為R 24及R 25不都為H。在PEG單元具有式(XX)及式(XXI)之一些實施例中，R 24及R 25中之一者選自多羥基基團，並且另一者為聚乙二醇。在一些實施例中，各多羥基基團包含至少三個羥基基團。多羥基基團可為直鏈或支鏈或環狀的。在一些實施例中，R 24及R 25中之一者為線性單糖，並且另一者為環狀單糖。在一些實施例中，R 24及R 25中之一者為環狀單糖，並且另一者為線性或環狀單糖。在一些實施例中，線性單糖為C6或C5糖之線性(非環狀)形式，C6或C5糖例如葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脫氧葡萄糖、甘油醛、赤蘚糖、蘇糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、醛糖及酮糖。在一些實施例中，線性單糖可亦包括糖酸，例如葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸或酮糖酸。在一些實施例中，線性單糖可亦包括胺基糖，例如葡糖胺、N-乙醯基葡糖胺、半乳糖胺及N-乙醯基半乳糖胺。在一些實施例中，環狀單糖為C6或C5糖之環狀形式，C6或C5糖例如葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脫氧葡萄糖、甘油醛、赤蘚糖、蘇糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、醛糖及酮糖。在一些實施例中，環狀單糖可亦包括糖酸，例如葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸或酮糖酸。在一些實施例中，環狀單糖可亦包括胺基糖，例如葡糖胺、N-乙醯基葡糖胺、半乳糖胺及N-乙醯基半乳糖胺。在端基異構C-1位置處之立體化學可為α或β。
PEG單元之實例包括以下：
Figure 02_image375
Figure 02_image377
其中R 41為線性單糖、環狀單糖或聚乙二醇。在此等示例性實施例中，當PEG單元連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分時，根據需要將其去保護，並且在PEG單元之左端之羧基或羥基基團與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分上的反應性基團之間形成鍵。
在PEG單元具有式(XX)及式(XXI)之一些實施例中，R 24及R 25各自獨立地選自H及多羥基基團，其限制條件為R 24及R 25不都為H。在一些實施例中，R 24及R 25中之各者為環狀單糖、二糖或多糖。在PEG單元具有式(XX)及式(XXI)之一些實施例中，R 24及R 25中之一者選自環狀單糖、二糖或多糖，並且R 24及R 25中之另一者為聚乙二醇。在一些實施例中，環狀單糖為C6或C5糖之環狀形式，C6或C5糖例如葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脫氧葡萄糖、甘油醛、赤蘚糖、蘇糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、醛糖及酮糖。在一些實施例中，環狀單糖可亦包括糖酸，例如葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸或酮糖酸。在一些實施例中，環狀單糖可亦包括胺基糖，例如葡糖胺、N-乙醯基葡糖胺、半乳糖胺及N-乙醯基半乳糖胺。在端基異構C-1位置處之立體化學可為α或β。
在一些實施例中，二糖包括含有任何上述單糖之彼等。術語二糖可包括二糖之線性形式、環狀形式及線性-環狀形式。示例性二糖包括但不限於蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖及纖維二糖。在一些實施例中，多糖包括含有任何上述單糖之彼等。術語多糖可包括多糖之線性形式、環狀形式及線性-環狀形式。示例性多糖包括但不限於麥芽三糖、棉子糖、蔗果三糖、澱粉、纖維素及糖原。
在示例性實施例中，具有環狀單糖、二糖或多糖之PEG單元包括以下：
Figure 02_image379
Figure 02_image381
在此等實例中之各者中，各R 45選自H、或者單糖、二糖或多糖，包括此等中之任一種之胺基糖；並且R 46選自H、或者單糖、二糖或多糖，包括此等中之任一種之胺基糖，以及聚乙二醇。在此等示例性實施例中，當PEG單元連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分時，根據需要將其去保護，並且在PEG單元之右端(前四個實例)或左端(最後一個實例)之羧基基團與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分上的反應性基團之間形成鍵。
在PEG單元具有式(XX)及式(XXI)之一些實施例中，R 24及R 25各自獨立地選自多羥基基團，該多羥基基團為線性單糖或經取代之線性單糖。在PEG單元具有式(XX)及式(XXI)之一些實施例中，R 24及R 25中之一者選自多羥基基團，該多羥基基團為線性單糖或經取代之線性單糖，並且R 24及R 25中之另一者為聚乙二醇。在一些實施例中，線性單糖為C6或C5糖之線性形式，C6或C5糖例如葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脫氧葡萄糖、甘油醛、赤蘚糖、蘇糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、醛糖及酮糖。在一些實施例中，線性單糖可亦包括糖酸，例如葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸或酮糖酸。在一些實施例中，線性單糖可亦包括胺基糖，例如葡糖胺、N-乙醯基葡糖胺、半乳糖胺及N-乙醯基半乳糖胺。
在一些實施例中，經取代之線性單糖可被單糖、二糖或多糖取代，在各情況下均為線性或環狀的。在一些實施例中，二糖包括含有任何上述單糖之彼等。術語二糖可包括二糖之線性形式、環狀形式及線性-環狀形式。示例性二糖包括但不限於蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖及纖維二糖。在一些實施例中，多糖包括含有任何上述單糖之彼等。術語多糖可包括多糖之線性形式、環狀形式及線性-環狀形式。示例性多糖包括但不限於麥芽三糖、棉子糖、蔗果三糖、澱粉、纖維素及糖原。
視情況被糖取代之含有線性單糖之PEG單元之實例包括以下：
Figure 02_image383
其中R 47選自H、線性單糖及聚乙二醇；並且各R 49選自單糖、二糖及多糖。在此等示例性實施例中，當PEG單元連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分時，根據需要將其去保護，並且在PEG單元之左端之羧基或羥基基團與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分上的反應性基團之間形成鍵。
在PEG單元具有式(XX)及式(XXI)之一些實施例中，R 24及R 25各自獨立地選自多羥基基團，該多羥基基團為線性單糖或經取代之線性單糖，其中經取代之線性單糖被一或多個諸如烷基、O-烷基、芳基、O-芳基、羧基、酯或醯胺之取代基取代。在PEG單元具有式(XX)及式(XXI)之一些實施例中，R 24及R 25中之一者選自多羥基基團，該多羥基基團為線性單糖或經取代之線性單糖，其中經取代之線性單糖被一或多個諸如烷基、O-烷基、芳基、O-芳基、羧基、酯或醯胺之取代基取代；並且R 24及R 25中之另一者為聚乙二醇。這種取代之多羥基基團可視情況進一步被單糖、二糖或多糖取代。
在示例性實施例中，具有包括線性單糖或經取代之線性單糖之多羥基基團的PEG單元包括以下：
Figure 02_image385
在此等實例中之各者中，各R 42獨立地選自H、單糖、二糖或多糖(如以上所描述)、或聚乙二醇；並且各R 43選自烷基、O-烷基、芳基、O-芳基、羧基、酯或醯胺。在此等示例性實施例中，當PEG單元連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分時，將其去保護並且在PEG單元之左端之羧基基團與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分上的反應性基團之間形成鍵。
在PEG單元具有式(XX)及式(XXI)之一些實施例中，R 24及R 25中之至少一者為-C(O)-多羥基基團或經取代之-C(O)-多羥基基團，並且R 24及R 25中之另一者為-C(O)-多羥基基團；經取代之-C(O)-多羥基基團、多羥基基團或經取代之多羥基基團。在一些實施例中，經取代之-C(O)-多羥基基團及多羥基基團可被單糖、二糖或多糖(在各情況下為線性或環狀的)；烷基；O-烷基；芳基；羧基；酯或醯胺取代。在一些實施例中，二糖包括含有任何上述單糖之彼等。術語二糖可包括二糖之線性形式、環狀形式及線性-環狀形式。示例性二糖包括但不限於蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖及纖維二糖。在一些實施例中，多糖包括含有任何上述單糖之彼等。術語多糖可包括多糖之線性形式、環狀形式及線性-環狀形式。示例性多糖包括但不限於麥芽三糖、棉子糖、蔗果三糖、澱粉、纖維素及糖原。
在示例性實施例中，具有-C(O)-多羥基基團或經取代之-C(O)-多羥基基團之PEG單元包括以下：
Figure 02_image387
在此等示例性實施例中，當PEG單元連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分時，將其去保護並且在PEG單元之左端之羧基基團與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分上的反應性基團之間形成鍵。
在PEG單元具有式(XX)及式(XXI)之一些實施例中，R 24及R 25獨立地選自H及經取代之-C 1-C 8烷基；其限制條件為R 24及R 25均不為H。在一些實施例中，R 24及R 25獨立地選自H及經取代之-C 1-C 4烷基；其限制條件為R 24及R 25均不為H。在一些實施例中，R 24及R 25獨立地選自H及經取代之-C 1-C 3烷基；其限制條件為R 24及R 25均不為H。經取代之-C 1-C 8、-C 1-C 4及-C 1-C 3烷基之烷基部分可為直鏈或支鏈的。
經取代之-C 1-C 8、-C 1-C 4或-C 1-C 3烷基可被羥基或羧基取代。在一些實施例中，經取代之-C 1-C 8、-C 1-C 4或-C 1-C 3烷基之各碳原子被羥基或羧基取代。在一些實施例中，經取代之-C 1-C 8、-C 1-C 4或-C 1-C 3烷基之各碳原子被羧基取代。在一些實施例中，經取代之-C 1-C 8、-C 1-C 4或-C 1-C 3烷基之一個或兩個碳原子被羥基或羧基取代。在一些實施例中，經取代之-C 1-C 8、-C 1-C 4或-C 1-C 3烷基之一個或兩個碳原子被羧基取代。在一些實施例中，經取代之-C 1-C 8、-C 1-C 4或-C 1-C 3烷基之末端碳原子被羧基取代。在一些實施例中，經取代之-C 1-C 8、-C 1-C 4或-C 1-C 3烷基之末端碳原子被羥基取代。
具有經取代之-C 1-C 8、-C 1-C 4或-C 1-C 3烷基之PEG單元的示例性實施例如下：
Figure 02_image389
Figure 02_image391
其中R 48可為H、OH、CH 2OH、COOH或被羥基及/或羧基取代之-C 1-C 6烷基。在此等示例性實施例中，當PEG單元連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分時，將其去保護並且在PEG單元之左端之羧基基團與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分上的反應性基團之間形成鍵。
在PEG單元具有式(XX)及式(XXI)之一些實施例中，R 24及R 25中之一者選自H及經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基，並且R 24及R 25中之另一者選自經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基、-C(O)-C 1-C 4烷基及-C(O)-C 1-C 3烷基及經取代之-C 1-C 8烷基、-C 1-C 4烷基及-C 1-C 3烷基(如上所描述)。在一些實施例中，R 24及R 25中之一者獨立地選自H及經取代之-C(O)-C 1-C 4烷基，並且R 24及R 25中之另一者選自經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基、-C(O)-C 1-C 4烷基及-C(O)-C 1-C 3烷基以及經取代之-C 1-C 8烷基、-C 1-C 4烷基及-C 1-C 3烷基(如上所描述)。在一些實施例中，R 24及R 25中之一者選自H及經取代之-C(O)-C 1-C 3烷基，R 24及R 25中之另一者選自經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基、-C(O)-C 1-C 4烷基及-C(O)-C 1-C 3烷基以及經取代之-C 1-C 8烷基、-C 1-C 4烷基及-C 1-C 3烷基(如上所描述)。經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基、-C(O)-C 1-C 8烷基及-C(O)-C 1-C 8烷基之烷基可為直鏈或支鏈的。經取代之-C 1-C 8、-C 1-C 4及-C 1-C 3烷基之烷基部分可為直鏈或支鏈的。
經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基、-C(O)-C 1-C 4烷基及-C(O)-C 1-C 3烷基可被羥基或羧基取代。在一些實施例中，經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基、-C(O)-C 1-C 4烷基及-C(O)-C 1-C 4烷基之各碳原子被羥基或羧基取代。在一些實施例中，經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基、-C(O)-C 1-C 4烷基及-C(O)-C 1-C 3烷基之一個或兩個碳原子被羥基或羧基取代。在一些實施例中，經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基、-C(O)-C 1-C 4烷基及-C(O)-C 1-C 3烷基之一個或兩個碳原子被羧基取代。在一些實施例中，經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基、-C(O)-C 1-C 4烷基及-C(O)-C 1-C 3烷基之末端碳原子被羧基取代。在一些實施例中，經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基、-C(O)-C 1-C 4烷基及-C(O)-C 1-C 3烷基之末端碳原子被羥基取代。
這種PEG單元之示例性實施例包括以下：
Figure 02_image393
在此等示例性實施例中，當PEG單元連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分時，將其去保護並且在PEG單元之左端之羧基基團與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分上的反應性基團之間形成鍵。
在PEG單元具有式(XX)及式(XXI)之一些實施例中，R 24及R 25選自H及視情況經取代之芳基；其限制條件為R 24及R 25均不為H。在一些實施例中，經取代之芳基包括被鹵素(例如氯、氟及溴)取代之芳基。
在示例性實施例中，包含取代之芳基之PEG單元包括以下：
Figure 02_image395
在此等示例性實施例中，當PEG單元連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分時，將其去保護並且在PEG單元之左端之羧基基團與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分上的反應性基團之間形成鍵。
在PEG單元具有式(XX)及式(XXI)之一些實施例中，R 24及R 25一起形成視情況經取代之C 3-C 8雜環或雜芳基。在一些實施例中，視情況選用的取代基包括被鹵素(例如氯、氟及溴)取代之雜環或芳基。
在示例性實施例中，包含視情況經取代之C 3-C 8雜環之PEG單元包括以下：
Figure 02_image397
在該示例性實施例中，當PEG單元連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分時，將其去保護並且在PEG單元之左端之羧基基團與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分上的反應性基團之間形成鍵。
在PEG單元具有式(XX)及式(XXI)之一些實施例中，R 24及R 25獨立地選自H及螯合物；其限制條件為R 24及R 25均不為H。在一些實施例中，螯合物選自乙二胺四乙酸(EDTA)、二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、三伸乙基四胺六乙酸(TTHA)、苄基-DTPA、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N'',N'''-四乙酸(DOTA)、苄基-DOTA、1,4,7-三氮雜環壬烷-N,N',N''-三乙酸(NOTA)、苄基-NOTA、1,4,8,11-四氮雜環十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)及N,N'-二烷基取代之哌𠯤。在一些實施例中，螯合物直接連接至-NR 24R 25之氮。在一些實施例中，螯合物經由伸烷基、伸芳基、碳環、雜伸芳基或雜碳環(在各情況下為取代或未取代的)連接。
在一些示例性實施例中，包含螯合物之PEG單元包括以下：
Figure 02_image399
在此等示例性實施例中，當PEG單元連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分時，將其去保護並且在PEG單元之左端之羧基基團與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分上的反應性基團之間形成鍵。
在PEG單元具有式(XX)、(XXI)、(XXX)、(XXXI)、(XXXII)及(XXXIII)之一些實施例中，螯合物可附接至本文所描述之R 24、R 25及/或R 30基團中之任一個。在一些實施例中，螯合物選自乙二胺四乙酸(EDTA)、二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、三伸乙基四胺六乙酸(TTHA)、苄基-DTPA、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N'',N'''-四乙酸(DOTA)、苄基-DOTA、1,4,7-三氮雜環壬烷-N,N',N''-三乙酸(NOTA)、苄基-NOTA、1,4,8,11-四氮雜環十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)及N,N'-二烷基取代之哌𠯤。在一些實施例中，螯合物直接連接至本文所描述之R 24、R 25或R 30基團。在一些實施例中，螯合物經由伸烷基、伸芳基、碳環、雜芳基或雜碳環(在各情況下為取代或未取代的)連接。
在一些實施例中，PEG單元具有以下通式(XXX)： ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-R 30(XXX) 其中R 20為用於連接胺基酸單元之亞單元及/或連接子亞單元L2之一部分的官能基；R 21及R 22各自為視情況選用的C 1-C 3伸烷基基團；R 30選自視情況經取代之C 3-C 10碳環；硫脲；視情況經取代之硫脲；脲；視情況經取代之脲；磺醯胺；烷基磺醯胺；醯基磺醯胺、視情況經取代之烷基磺醯胺；視情況經取代之醯基磺醯胺；磺醯胺；視情況經取代之磺醯胺；胍，包括烷基胍及芳基胍；磷醯胺；或視情況經取代之磷醯胺；波形線(~)表示連接位點；並且n20為1至26。在一些實施例中，R 20選自羧基、胺基、炔基、疊氮基、羥基、羰基、胺基甲酸酯、脲、硫代胺基甲酸酯、硫脲、磺醯胺、醯基磺醯胺、烷基磺酸酯或其受保護之形式。合適之保護基團包括本領域通常使用的羧酸保護基團、胺保護基團及磺醯基保護基團。
在一些實施例中，PEG單元具有以下通式(XXX)： ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-R 30(XXX) 其中R 20為用於連接胺基酸單元之亞單元及/或連接子亞單元L2之一部分的官能基；R 21及R 22各自為視情況選用的C 1-C 3伸烷基基團；R 30選自視情況經取代之C 3-C 10碳環；硫脲；視情況經取代之硫脲；脲；視情況經取代之脲；磺醯胺；烷基磺醯胺；醯基磺醯胺、視情況經取代之烷基磺醯胺；視情況經取代之醯基磺醯胺；磺醯胺；視情況經取代之磺醯胺；胍，包括烷基胍及芳基胍；磷醯胺；或視情況經取代之磷醯胺；波形線(~)表示連接位點；並且n20為1至26。在一些實施例中，R 20選自鹵基、醛、羧基、胺基、炔基、疊氮基、羥基、羰基、胺基甲酸酯、硫醇、脲、硫代胺基甲酸酯、硫脲、磺醯胺、醯基磺醯胺、烷基磺酸酯、三唑、氮雜二苯并環辛炔或其受保護之形式。合適之保護基團包括本領域通常使用的羧酸保護基團、胺保護基團及磺醯基保護基團。
在PEG單元具有式(XXX)之一些實施例中，R 30為視情況經取代之C 3-C 10碳環。在一些實施例中，視情況經取代之C 3-C 10碳環為如國際公開號WO 2011/136645 (其公開內容藉由引用併入本文)中所公開之稠合環辛炔化合物。具有稠合環辛炔之示例性PEG單元如下所示。
Figure 02_image401
在此等示例性實施例中，當PEG單元連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分時，根據需要將其去保護，並且在PEG單元之左端之羧基或胺基基團與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分上的反應性基團之間形成鍵。
如本領域技術人員將理解的，以上化合物以及國際公開號WO2011/136645中公開之其他化合物可用作用於連接附加化合物之點擊化學之中間體。在一些實施例中，附加化合物為藥物單元。在一些實施例中，附加化合物為如本文所描述之連接子亞單元L2。
在PEG單元具有式(XXX)之一些實施例中，R 30為硫脲、經取代之硫脲、脲或經取代之脲。硫脲及脲基團可被例如視情況經取代之烷基、視情況經取代之碳環或視情況經取代之芳基取代。
包含硫脲；經取代之硫脲；脲；或經取代之脲之示例性PEG單元包括以下：
Figure 02_image403
在此等示例性實施例中，當PEG單元連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分時，將其去保護並且在PEG單元之左端之羧基基團與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分上的反應性基團之間形成鍵。
在PEG單元具有式(XXX)之一些實施例中，R 30為磺醯胺；烷基磺醯胺；醯基磺醯胺、視情況經取代之烷基磺醯胺；視情況經取代之醯基磺醯胺；磺醯胺或視情況經取代之磺醯胺。視情況經取代之烷基磺醯胺；視情況經取代之醯基磺醯胺及視情況經取代之磺醯胺可被增加溶解度，或者在其他實施例中，用於連接附加基團(例如連接子、藥物或其他化合物)之基團取代。
包含磺醯胺；烷基磺醯胺；醯基磺醯胺、視情況經取代之烷基磺醯胺；視情況經取代之醯基磺醯胺；磺醯胺或視情況經取代之磺醯胺之示例性PEG單元包括以下：
Figure 02_image405
在此等實例中，R 50可為例如視情況經取代之烷基、烯基、炔基、碳環、芳基、雜碳環或雜芳基。在此等示例性實施例中，當PEG單元連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分時，將其去保護並且在PEG單元之左端之羧基基團與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分上的反應性基團之間形成鍵。
在PEG單元具有式(XXX)之一些實施例中，R 30為胍或視情況經取代之胍。視情況經取代之胍可被視情況經取代之烷基、烯基、炔基、碳環、芳基、雜碳環或雜芳基取代。
包含胍或視情況經取代之胍之示例性PEG單元包括以下：
Figure 02_image407
在此等實例中，R 55可為例如視情況經取代之烷基、烯基、炔基、碳環、芳基、雜碳環或雜芳基。在此等示例性實施例中，當PEG單元連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分時，根據需要將其去保護，並且在PEG單元之左端之羧基基團與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分上的反應性基團之間形成鍵。
在PEG單元具有式(XXX)之一些實施例中，R 30為磷醯胺或視情況經取代之磷醯胺。視情況經取代之磷醯胺可被視情況經取代之烷基、烯基、炔基、碳環、芳基、雜碳環或雜芳基取代。
包含磷醯胺或視情況經取代之磷醯胺之示例性PEG單元包括以下：
Figure 02_image409
在此等實例中，R 60可為例如視情況經取代之烷基、烯基、炔基、碳環、芳基、雜碳環或雜芳基。R 61可為例如視情況經取代之烷基、烯基、炔基、碳環、芳基、雜碳環或雜芳基。在此等示例性實施例中，當PEG單元連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分時，將其去保護並且在PEG單元之左端之羧基基團與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分上的反應性基團之間形成鍵。
在PEG單元具有式(XXX)之一些實施例中，PEG單元用於連接附加部分之官能基。在PEG單元具有式(XXX)之一些實施例中，R 30選自疊氮基、炔基、經取代之炔基、-NH-C(O)-炔基、-NH-C(O)-炔基-R 65；環辛炔；-NH-環辛炔、-NH-C(O)-環辛炔或-NH-(環辛炔) 2；其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環或視情況經取代之雜芳基。在一些實施例中，此類PEG單元可用作用於連接附加化合物之點擊化學之中間體。在一些實施例中，附加化合物為藥物單元。在一些實施例中，附加化合物為如本文所描述之連接子亞單元L2。在一些實施例中，附加化合物為其他連接子或藥物連接子。
包含疊氮基、炔基或環辛炔基團之示例性PEG單元包括以下：
Figure 02_image411
在此等示例性實施例中，當PEG單元連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分時，將其去保護並且在PEG單元之左端之羧基基團與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分上的反應性基團之間形成鍵。
在一些實施例中，PEG單元具有下式： ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-NH-C(O)-R 31(XXXI) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-C(O)NH-R 31(XXXII) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-N-(R 33-R 31) 2(XXXIII) ~R 20-[-R 26-[R 29-[O-CH 2-CH 2-] n20R 29] n21-R 27-] n27-N-C(O)-R 31(XXXIV) ~R 20-[-R 26-[R 29-[O-CH 2-CH 2-] n20R 29] n21-R 27-] n27-C(O)NH-R 31(XXXV) 或 ~R 20-[-R 26-[R 29-[O-CH 2-CH 2-] n20R 29] n21-R 27-] n27-NR 24R 25(XXXVI) 或其鹽，其中R 20為用於連接胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的官能基；R 21及R 22各自為視情況選用的C 1-C 3伸烷基基團；R 26及R 27各自為視情況選用的C 1-C 12伸烷基、-NH-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-NH-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-NH-C 1-C 12伸烷基-C(O)-或-C(O)-C 1-C 12伸烷基-NH-；R 31為支鏈聚乙二醇鏈，各支鏈具有1至26個乙二醇亞單元並且各支鏈在其末端處具有R 35；R 33為C 1-C 3伸烷基、-C 1-C 3伸烷基-C(O)、-C(O)-C 1-C 3伸烷基或-C(O)-C 1-C 3伸烷基-C(O)；各R 29為視情況且獨立地選自-C(O)-、-NH-、-C(O)-C 1-C 6伸烯基-、-NH-C 1-C 6伸烯基-、-C 1-C 6伸烯基-NH-及-C 1-C 6伸烯基-C(O)-；R 35為疊氮基、炔基、炔基-R 65、環辛炔或環辛炔-R 65，其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環或視情況經取代之雜芳基；波形線(~)表示連接位點；n20為1至26；n21為1至4；並且n27為1至4。在一些實施例中，R 20選自羧基、胺基、炔基、疊氮基、羥基、羰基、胺基甲酸酯、脲、硫代胺基甲酸酯、硫脲、磺醯胺、醯基磺醯胺、烷基磺酸酯或其受保護之形式。合適之保護基團包括本領域通常使用的羧酸保護基團、胺保護基團及磺醯基保護基團。
在一些實施例中，PEG單元具有下式： ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-NH-C(O)-R 31(XXXI) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-C(O)NH-R 31(XXXII) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-N-(R 33-R 31) 2(XXXIII) ~R 20-[-R 26-[R 29-[O-CH 2-CH 2-] n20R 29] n21-R 27-] n27-N-C(O)-R 31(XXXIV) ~R 20-[-R 26-[R 29-[O-CH 2-CH 2-] n20R 29] n21-R 27-] n27-C(O)NH-R 31(XXXV) 或 ~R 20-[-R 26-[R 29-[O-CH 2-CH 2-] n20R 29] n21-R 27-] n27-NR 24R 25(XXXVI) 或其鹽，其中R 20為用於連接胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的官能基；R 21及R 22各自為視情況選用的C 1-C 3伸烷基基團；R 26及R 27各自為視情況選用的C 1-C 12伸烷基、-NH-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-NH-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-NH-C 1-C 12伸烷基-C(O)-或-C(O)-C 1-C 12伸烷基-NH-；R 31為支鏈聚乙二醇鏈，各支鏈具有1至26個乙二醇亞單元並且各支鏈在其末端處具有R 35；R 33為C 1-C 3伸烷基、-C 1-C 3伸烷基-C(O)、-C(O)-C 1-C 3伸烷基或-C(O)-C 1-C 3伸烷基-C(O)；各R 29為視情況且獨立地選自-C(O)-、-NH-、-C(O)-C 1-C 6伸烯基-、-NH-C 1-C 6伸烯基-、-C 1-C 6伸烯基-NH-、-C 1-C 6伸烯基-C(O)-、-NH(CO)NH-及三唑；R 35為疊氮基、炔基、炔基-R 65、環辛炔或環辛炔-R 65，其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環或視情況經取代之雜芳基；波形線(~)表示連接位點；n20為1至26；n21為1至4；並且n27為1至4。在一些實施例中，R 20選自鹵基、醛、羧基、胺基、炔基、疊氮基、羥基、羰基、胺基甲酸酯、硫醇、脲、硫代胺基甲酸酯、硫脲、磺醯胺、醯基磺醯胺、烷基磺酸酯、三唑、氮雜二苯并環辛炔、肼、羰基烷基雜芳基或其受保護之形式。合適之保護基團包括本領域通常使用的羧酸保護基團、胺保護基團及磺醯基保護基團。
如本領域技術人員將理解的，此類PEG單元可用於連接附加化合物。在一些實施例中，附加化合物為藥物單元。在一些實施例中，附加化合物為如本文所描述之連接子亞單元L2。在一些實施例中，附加化合物為連接子或藥物連接子。
包含支鏈聚乙二醇鏈之示例性PEG單元包括以下：
Figure 02_image413
Figure 02_image415
在此等示例性實施例中，當PEG單元連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分時，將其去保護並且在PEG單元之左端之羧基基團與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分上的反應性基團之間形成鍵。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元： ~R 40-(R 43-R 41-[O-CH 2-CH 2] n40-R 42-R 43-(NR 44R 45) n41) n42(XL) 或其鹽，其中： R 40為用於連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 41及R 42不存在或各自獨立地為C 1-C 6伸烷基； 各R 43獨立地不存在或選自C 1-C 12伸烷基、-NH-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-NH-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-NH-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C(O)-NH-C 1-C 12伸烷基、-雜伸芳基、雜芳基-C 1-C 12伸烷基、雜芳基-C 1-C 12伸烷基-C(O)-或-C(O)NR 46R 47，其中R 46及R 47中之一者為H或C 1-C 12伸烷基並且另一者為C 1-C 12伸烷基； R 44及R 45各自獨立地為H、多羥基基團、經取代之多羥基基團、-C(O)-多羥基基團或經取代之-C(O)-多羥基基團，其中視情況選用的取代基選自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯； 波形線(~)表示與R 40之連接位點； n40為1至26； n41為1至6；以及 n42為1至6。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元： ~R 40-(R 41-[O-CH 2-CH 2] n40-R 42-R 43-(NR 44R 45) n41) n42(XLI) 或其鹽，其中： R 40為用於連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 41及R 42不存在或各自獨立地為C 1-C 6伸烷基； R 43不存在或選自C 1-C 12伸烷基、-NH-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-NH-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-NH-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C 1-C 12伸烷基、C(O)-NH-C 1-C 12伸烷基、-雜伸芳基、雜芳基-C 1-C 12伸烷基、雜芳基-C 1-C 12伸烷基-C(O)-或-C(O)NR 46R 47，其中R 46及R 47中之一者為H或C 1-C 12伸烷基，並且另一者為C 1-C 12伸烷基； R 44及R 45各自獨立地為H、多羥基基團、經取代之多羥基基團、-C(O)-多羥基基團或經取代之-C(O)-多羥基基團，其中視情況選用的取代基選自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯； 波形線(~)表示與R 40之連接位點； n40為1至26； n41為1至6；以及 n42為1至6。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元： ~R 40-(R 41-[O-CH 2-CH 2] n40-R 42-R 43-(NR 44R 45) n41) n42(XLII) 或其鹽，其中： R 40為用於連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 41及R 42不存在或各自獨立地為C 1-C 3伸烷基； R 43不存在或選自C 1-C 6伸烷基、-NH-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 6伸烷基-NH-、-C(O)-C 1-C 6伸烷基、-C 1-C 6伸烷基-C(O)-、-NH-C 1-C 6伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 6伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C 1-C 6伸烷基、-C(O)-NH-C 1-C 12伸烷基、-雜伸芳基、雜芳基-C 1-C 6伸烷基、雜芳基-C 1-C 6伸烷基-C(O)-或-C(O)NR 46R 47，其中R 46及R 47中之一者為H或C 1-C 6伸烷基，並且另一者為C 1-C 12伸烷基； R 44及R 45各自獨立地為H、多羥基基團、經取代之多羥基基團、-C(O)-多羥基基團或經取代之-C(O)-多羥基基團，其中視情況選用的取代基選自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯； 波形線(~)表示與R 40之連接位點； n40為1至16； n41為1至4；以及 n42為1至4。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中R 40選自鹵素、醛、羧基、胺基、炔基、疊氮基、羥基、羰基、胺基甲酸酯、硫醇、脲、硫代胺基甲酸酯、硫脲、磺醯胺、醯基磺醯胺、烷基磺酸酯、三唑、氮雜二苯并環辛炔、肼、羰基烷基雜芳基或其受保護之形式。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中R 40具有以下結構中之一種：
Figure 02_image417
Figure 02_image419
， 其中R = H或C 1-6烷基；以及 n = 0至12 或其立體異構體，其中(*)表示R 40與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的連接位點，並且(
Figure 02_image421
)表示R 40與PEG單元之其餘部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中R 40具有以下結構中之一種：
Figure 02_image423
Figure 02_image425
， 其中n = 0至12 或其立體異構體，其中(*)表示R 40與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的連接位點，並且(
Figure 02_image427
)表示R 40與PEG單元之其餘部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中R 43-(NR 44R 45) n41當存在R 43時具有以下結構中之一種：
Figure 02_image429
Figure 02_image431
， 其中R = H、C 1-6烷基、多羥基或經取代之多羥基 或其立體異構體，其中(
Figure 02_image433
)表示R 43與PEG單元之其餘部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中R 43-(NR 44R 45) n41當存在R 43時具有以下結構中之一種：
Figure 02_image435
Figure 02_image437
， 或其立體異構體，其中(
Figure 02_image439
)表示R 43與PEG單元之其餘部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中-NR 44R 45具有以下結構中之一種：
Figure 02_image441
Figure 02_image443
， 或其立體異構體，其中(
Figure 02_image445
)表示-NR 44R 45與PEG單元之其餘部分的連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元在連接至胺基酸單元或連接子亞單元L2之一部分之前具有以下結構中之一種：
Figure 02_image447
Figure 02_image449
Figure 02_image451
， 其中R為H或烷基，並且n為1至12。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元： ~R 40-(R 43-R 41--[O-CH 2-CH 2] n40-R 46-[O-CH 2-CH 2] n40-R 42-R 43-(NR 44R 45) n41) n42(XLIII) 或其鹽，其中： R 40為用於連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 41及R 42不存在或各自獨立地為C 1-C 6伸烷基； 各R 43獨立地不存在或選自C 1-C 12伸烷基、-NH-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-NH-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-NH-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C(O)-NH-C 1-C 12伸烷基、-雜伸芳基、雜芳基-C 1-C 12伸烷基、雜芳基-C 1-C 12伸烷基-C(O)-或-C(O)NR 46R 47，其中R 46及R 47中之一者為H或C 1-C 12伸烷基並且另一者為C 1-C 12伸烷基； R 44及R 45各自獨立地為H、多羥基基團、經取代之多羥基基團、-C(O)-多羥基基團或經取代之-C(O)-多羥基基團，其中視情況選用的取代基選自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯； R 46選自胺基、胺基-烷基-胺基或-NH-C(O)-NH-S(O) 2-NH-； 波形線(~)表示與R 40之連接位點； n40為1至26； n41為1至6；以及 n42為1至6。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元在連接至胺基酸單元或連接子亞單元L2之一部分之前具有以下結構中之一種：
Figure 02_image453
Figure 02_image455
， 其中R為H或烷基，並且n為1至12。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元：
Figure 02_image457
或其鹽，其中： 各Y獨立地為R 76或
Figure 02_image459
； 各R 76獨立地為H、乙醯基、-P(=O)(OH) 2或-(CH 2) v-O-S(=O) 2(OH)； 各R a及R b獨立地為H，或者R a及R b與其所連接之碳一起形成側氧基基團； 各q獨立地為1至26； 各m獨立地為1至4； 各n獨立地為1至4； 各v獨立地為1至6；以及 各*表示用於胺基酸單元(AA)之亞單元、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元：
Figure 02_image461
Figure 02_image463
或其鹽，其中： 各R 76獨立地為H、乙醯基、-P(=O)(OH) 2或-(CH 2) vS(=O) 2(OH)； 各q獨立地為1至26； 各m獨立地為1至4； 各n獨立地為1至4； 各v獨立地為1至6；以及 各*表示用於胺基酸單元(AA)之亞單元、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元：
Figure 02_image465
Figure 02_image467
； 或其鹽，其中： 各q獨立地為1至26； 各m獨立地為1至4； 各n獨立地為1至4；以及 各*表示用於胺基酸單元(AA)之亞單元、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中Y為R 76。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中Y為
Figure 02_image469
。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中各R a及R b獨立地為H。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中R a及R b與其所連接之碳一起形成側氧基基團。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中q為10至20。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中q為12。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image471
Figure 02_image473
Figure 02_image475
Figure 02_image477
Figure 02_image479
Figure 02_image481
Figure 02_image483
Figure 02_image485
Figure 02_image487
Figure 02_image489
； 以及
Figure 02_image491
其中各Z在*處連接並且分別選自：
Figure 02_image493
、
Figure 02_image495
，以及
Figure 02_image497
； 其中各
Figure 02_image499
表示與胺基酸單元(AA)之亞單元、連接子亞單元L2之一部分或擴展單元(L1)之連接位點。
羧基單元 在一些實施例中，連接子包含羧基單元。羧基單元可為胺基酸單元之亞單元或連接至連接子亞單元L2之一部分。在一些實施例中，羧基單元具有以下通式(XXXX)： R 70| L 70| ~ NH – (CH 2) p1– CH - (CH 2) o1- C(O) ~ (XXXX) 或其鹽，其中L 70選自C 1-C 8伸烷基、C 1-C 8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 8伸烷基-及-C(O)-C 1-C 8伸烷基-C(O)-；R 70為~NR 71(R 72R 73)，其中R 71選自H、C 1-C 12烷基、經取代之C 1-C 12烷基或聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)；R 72不存在或選自視情況經取代之C 1-C 3伸烷基、視情況經取代之醚、視情況經取代之硫醚、視情況經取代之酮、視情況經取代之醯胺、聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)、視情況經取代之碳環、視情況經取代之伸芳基或視情況經取代之雜伸芳基；R 73為羧基或多羧基；並且p1及o1中之各者獨立地選自0至2。如本文使用，術語「多羧基」係指含有1至10個、或1至6個、或1至4個羧基基團之基團，其中羧基基團藉由烷基、伸烷基、經取代之烷基、經取代之伸烷基、雜烷基、雜伸烷基、胺基及/或醯胺相互連接。如本文使用，多羧基包括羧基鹽形式。
在一些實施例中，R 70為~NR 71(R 75_(R 73) 2)，其中R 71選自H、C 1-C 12烷基、經取代之C 1-C 12烷基或聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)；R 75為支鏈之視情況經取代之C 1-C 3伸烷基、視情況經取代之醚、視情況經取代之硫醚、視情況經取代之酮、視情況經取代之醯胺、聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)、視情況經取代之碳環、視情況經取代之伸芳基或視情況經取代之雜伸芳基；各R 73為羧基或多羧基；並且p1及o1中之各者獨立地選自0至2。
在一些實施例中，R 70為~N(R 74-R 73)(R 72-R 73)，其中R 72及R 74各自獨立地選自視情況經取代之C 1-C 3伸烷基、視情況經取代之醚、視情況經取代之硫醚、視情況經取代之酮、視情況經取代之醯胺、聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)、視情況經取代之碳環、視情況經取代之伸芳基或視情況經取代之雜伸芳基；各R 73獨立地為羧基或多羧基；並且p1及o1中之各者獨立地選自0至2。
在以上實施例之一些中，R 73可選自：
Figure 02_image501
及~COOH； 其中波形線表示與R 72、R 74或R 75之鍵。
連接子亞單元L2 連接子包含至少一個連接子亞單元L2，各連接子亞單元L2具有用於至少一個藥物單元(D)之連接位點，如本文進一步所描述。在一些實施例中，藥物單元(D)連接至連接子亞單元L2上之各用於藥物單元之連接位點。在各種實施例中，連接子亞單元L2可為可裂解連接子亞單元或不可裂解連接子亞單元。連接子亞單元L2亦具有用於胺基酸單元(AA)或擴展單元(L1)之連接位點。
在一些實施例中，連接子亞單元L2包括極性單元，例如糖單元、PEG單元或羧基單元。在一些實施例中，連接子亞單元L2不包括極性單元，其中胺基酸單元包括極性單元。在一些實施例中，連接子亞單元L2及胺基酸單元(若存在)均包括極性單元。
在一些實施例中，連接子亞單元L2為可裂解連接子亞單元。如本文使用，術語「可裂解的」係指細胞內或細胞外環境中之代謝過程或反應，由此藥物單元(例如，細胞毒性劑)與連接子亞單元L2或其部分之間之共價連接被破壞，導致游離藥物單元或連接子亞單元L2-藥物單元之其他代謝物與連接子亞單元L2之其餘部分解離。
在一些實施例中，連接子亞單元L2包括可蛋白酶裂解之連接子亞單元、可酸裂解之連接子亞單元、二硫鍵連接子亞單元、含二硫鍵之連接子亞單元或在二硫鍵附近具有二甲基基團之含二硫鍵之連接子亞單元(例如，SPDB連接子) (參見，例如，Jain等人，Pharm. Res. 32:3526-3540 (2015)；Chari等人，Cancer Res. 52:127-131 (1992)；U.S專利號5,208,020)、可裂解的自穩定連接子(參見，例如，WO2018/031690及WO2015/095755及Jain等人，Pharm. Res. 32:3526-3540 (2015))及/或可裂解的親水連接子(參見，例如，W02015/123679)。在一些實施例中，連接子亞單元L2包括光不穩定的連接子亞單元。在一些實施例中，連接子亞單元L2具有不可裂解連接子單元(參見，例如，WO2007/008603)。
在一些實施例中，連接子亞單元L2為在細胞內環境下可裂解的可裂解連接子，使得在細胞內環境下連接子亞單元L2之裂解或連接子亞單元L2內之裂解自連接子亞單元L2或連接子亞單元L2之其餘部分釋放藥物單元。例如，在一些實施例中，連接子亞單元L2可被存在於細胞內環境中(例如，在溶酶體或內體或小窩內)之裂解劑裂解。如本文使用，術語「在細胞內環境下可裂解的」、「細胞內裂解之」及「細胞內裂解」係指細胞內之代謝過程或反應，由此藥物單元(例如，細胞毒性劑)與連接子亞單元L2或其部分之間之共價連接被破壞，導致在細胞內游離藥物單元或連接子亞單元L2-藥物單元之其他代謝物與連接子亞單元L2之其餘部分解離。結合物之裂解部分因此為細胞內代謝物。
在一些實施例中，連接子亞單元L2與藥物單元之間之連接可藉由一或多種之酶(包括腫瘤相關蛋白酶)酶促裂解以釋放藥物單元(D)。連接子亞單元L2可為，例如，被細胞內肽酶或蛋白酶裂解之肽基連接子，其包含但不限於溶酶體或內體蛋白酶(參見，例如，WO2004/010957、US20150297748、US2008/0166363、US20120328564及US20200347075)。細胞內裂解劑可包括組織蛋白酶B、C及D及纖溶酶，已知所有此等均水解二肽藥物衍生物，導致活性藥物在目標細胞內之釋放(參見，例如，Dubowchik及Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123)。肽基連接子可被存在於目標抗原表現細胞內之酶裂解。例如，可使用可被在癌組織中高度表現之硫醇依賴性蛋白酶組織蛋白酶-B裂解之肽基連接子亞單元(例如，具有Phe-Leu、Val-Ala、Val-Cit或Gly-Phe-Leu-Gly肽)。
通常，肽基連接子為至少一個胺基酸長或至少兩個胺基酸長。在某些實施例中，肽基連接子二肽、三肽、四肽或五肽。在某些實施例中，肽基連接子亞單元可僅包含天然胺基酸。在一些實施例中，例如，肽基連接子亞單元可具有Phe-Leu、Val-Ala、Val-Cit或Gly-Phe-Leu-Gly肽。其他此類可裂解連接子描述於例如美國專利號6,214,345中。在具體實施例中，可被細胞內蛋白酶裂解之肽基連接子包括Val-Cit肽或Phe-Lys肽(參見，例如，美國專利號6,214,345)或Gly-Gly-Phe-Gly連接子(參見，例如，美國公開申請號2015/0297748)。使用藥物單元之細胞內蛋白水解釋放之一個優點在於藥物單元之活性在結合時通常減弱並且結合物之血清穩定性通常很高。亦參見美國專利9,345,785。
在一些實施例中，肽基連接子亞單元可僅包含非天然胺基酸。在一些實施例中，肽基連接子亞單元可包含連接至非天然胺基酸之天然胺基酸。在一些實施例中，肽基連接子亞單元可包含連接至天然胺基酸之D-異構體之天然胺基酸。在一些實施例中，肽基連接子亞單元之至少一個胺基酸為L-胺基酸。在一些實施例中，至少胺基酸為D-胺基酸。
在一些實施例中，肽基連接子亞單元含有以下中之一或多種：甘胺酸及/或L-胺基酸，例如精胺酸、穀胺醯胺、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、離胺酸、丙胺酸、組胺酸、絲胺酸、脯胺酸、穀胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、亮胺酸、天冬醯胺、異亮胺酸及纈胺酸，以及極性單元(包括連接甘胺酸或L-胺基酸之PEG單元)。在一些實施例中，肽基連接子亞單元含有以下中之一或多種：甘胺酸及/或D-胺基酸，例如精胺酸、穀胺醯胺、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、離胺酸、丙胺酸、組胺酸、絲胺酸、脯胺酸、穀胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、亮胺酸、天冬醯胺、異亮胺酸及纈胺酸，以及極性單元(包括連接至甘胺酸或D-胺基酸之PEG單元)。在一些實施例中，肽基連接子亞單元含有以下中之一或多種：甘胺酸及/或L-胺基酸及D-胺基酸之混合物，例如精胺酸、穀胺醯胺、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、離胺酸、丙胺酸、組胺酸、絲胺酸、脯胺酸、穀胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、亮胺酸、天冬醯胺、異亮胺酸及纈胺酸，以及極性單元(包括連接至甘胺酸或胺基酸之PEG單元)。
在一些實施例中，肽基連接子亞單元含有以下中之一或多種：甘胺酸及/或天然L-胺基酸，例如精胺酸、穀胺醯胺、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、離胺酸、丙胺酸、組胺酸、絲胺酸、脯胺酸、穀胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、亮胺酸、天冬醯胺、異亮胺酸及纈胺酸，以及至少一個極性單元，例如連接至甘胺酸或L-胺基酸之糖單元或羧基單元或PEG單元。在一些實施例中，肽基連接子亞單元含有以下中之一或多種：甘胺酸及/或D-胺基酸，例如精胺酸、穀胺醯胺、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、離胺酸、丙胺酸、組胺酸、絲胺酸、脯胺酸、穀胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、亮胺酸、天冬醯胺、異亮胺酸及纈胺酸，以及至少一個極性單元，例如連接至甘胺酸或D-胺基酸之糖單元或羧基單元或PEG單元。
在一些實施例中，肽基連接子亞單元之胺基酸具有以下中括號中所示之式：
Figure 02_image503
其中R 190為氫、甲基、異丙基、異丁基、第二丁基、苄基、對羥基苄基、-CH 2OH、-CH(OH)CH 3、-CH 2CH 2SCH 3、-CH 2CONH 2、-CH 2COOH -CH 2CH 2CONH 2、-CH 2CH 2COOH、-(CH 2) 3NHC(=NH)NH 2、-(CH 2) 3NH 2、-(CH 2) 3NHCOCH 3、-(CH 2) 3NHCHO、-(CH 2) 4NHC(=NH)NH 2、-(CH 2) 4NH 2、-(CH 2) 4NHCOCH 3、-(CH 2) 4NHCHO、-(CH 2) 3NHCONH 2、-(CH 2) 4NHCONH 2、-CH 2CH 2CH(OH)CH 2NH 2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、環己基。
Figure 02_image505
在一些實施例中，肽基連接子亞單元包括以下L-(天然)胺基酸中之一或多種：丙胺酸、精胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺、組胺酸、甘胺酸、穀胺酸、穀胺醯胺、苯丙胺酸、離胺酸、亮胺酸、絲胺酸、酪胺酸、蘇胺酸、異亮胺酸、色胺酸及纈胺酸；以及至少一個極性單元，例如連接至甘胺酸或天然胺基酸之糖單元或羧基單元或PEG單元。
在一些實施例中，肽基連接子亞單元不包含半胱胺酸。在一些實施例中，肽基連接子不包含脯胺酸。
在一些實施例中，肽基連接子亞單元包含以下此等天然胺基酸之D-異構體中之一或多種：丙胺酸、精胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺、組胺酸、甘胺酸、穀胺酸、穀胺醯胺、苯丙胺酸、離胺酸、亮胺酸、絲胺酸、酪胺酸、蘇胺酸、異亮胺酸、色胺酸及纈胺酸；以及至少一個極性單元，例如連接至甘胺酸或D-胺基酸之糖單元或羧基單元或PEG單元。
在一些實施例中，肽基連接子亞單元包含以下胺基酸中之一或多種：丙胺酸、精胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺、組胺酸、甘胺酸、穀胺酸、穀胺醯胺、苯丙胺酸、離胺酸、亮胺酸、絲胺酸、酪胺酸、蘇胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、色胺酸、纈胺酸、鳥胺酸、青黴胺、β-丙胺酸、胺基烷酸、胺基炔酸、胺基烷二酸、胺基苯甲酸、胺基-雜環-烷酸、雜環-羧酸、瓜胺酸、施德丁(statine)、二胺基烷酸及其衍生物；以及至少一個極性單元，例如連接至胺基酸之糖單元或羧基單元或PEG單元。此類胺基酸衍生物之示例性實例在下文描述胺基酸亞單元之章節中闡述。
在一些實施例中，肽基連接子亞單元含有糖單元作為肽可裂解的一部分。例如，含有離胺酸或瓜胺酸之糖單元作為可裂解的肽之一部分。在一些實施例中，肽基連接子亞單元含有羧基單元作為肽可裂解的一部分。例如，含有離胺酸或瓜胺酸之羧基單元作為可裂解的肽之一部分。
在一些實施例中，可裂解連接子亞單元為pH-敏感的，亦即，敏感於特定pH值下之水解。通常，pH-敏感之連接子亞單元在酸性條件下可水解。例如，可使用在溶酶體中可水解之酸不穩定的連接子亞單元(例如，腙、縮胺基脲、縮胺基硫脲、順式烏頭醯胺、原酸酯、縮醛、縮酮等)。(參見，例如，美國專利號5,122,368；5,824,805；及5,622,929；Dubowchik及Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123；Neville等人，1989，Biol. Chem. 264:14653- 14661。)此類連接子亞單元在中性pH條件下(例如血液中之pH)相對穩定，但在低於pH 5.5或5.0 (溶酶體之近似pH)時不穩定。在某些實施例中，可水解連接子單元為硫醚連接子(例如，經由醯基腙鍵連接至藥物單元之硫醚(參見，例如，美國專利No. 5,622,929))。
在一些實施例中，連接子亞單元L2在還原條件下可裂解(例如，二硫鍵連接子亞單元)。已知各種二硫鍵連接子，其包含例如，可使用SATA (N-琥珀醯亞胺基-5-乙醯基硫代乙酸酯)、SPDP (N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB (N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)及SMPT (N­琥珀醯亞胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)-、SPDB及SMPT形成之彼等(參見，例如，Thorpe等人，1987，Cancer Res. 47:5924-5931；Wawrzynczak等人，In lmmunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel編輯，Oxford U. Press，1987，亦參見美國專利號4,880,935.)。
在一些實施例中，連接子亞單元L2為丙二酸酯連接子(Johnson等人，1995，Anticancer Res.15:1387-93)、順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基連接子(Lau等人，1995，Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304)或3'-N-醯胺類似物(Lau等人，1995，Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12)。在一些實施例中，連接子亞單元L2不可裂解，例如順丁烯二醯亞胺基己醯基連接子，並且藥物單元藉由藥物-連接子之代謝性降解而釋放。(參見，例如，美國公開號2005/0238649。)
在一些實施例中，連接子亞單元L2對細胞外環境基本上不敏感。如本文使用，在連接子亞單元L2之上下文中之「對細胞外環境基本上不敏感」意指當結合物存在於細胞外環境(例如，血漿)中時，在結合物之樣品中連接子亞單元L2之不超過約20%、通常不超過約15%、更通常不超過約10%、甚至更通常不超過約5%、不超過約3%或不超過約1%被裂解。連接子亞單元L2為否對細胞外環境基本上不敏感可以例如藉由以下方法判定：將(a) 結合物(「結合物樣品」)及(b) 等莫耳量之未結合之靶向單元或藥物單元(「對照樣品」)與血漿獨立地培育預定之時間段(例如，2、4、8、16或24小時)，隨後將存在於結合物樣品中之未結合之靶向單元或藥物單元之量與存在於對照樣品中之未結合之靶向單元或藥物單元之量進行比較，例如藉由高效液相層析法量測。
在一些實施例中，連接子或連接子亞單元L2促進細胞內化。在一些實施例中，連接子或連接子亞單元L2當與諸如細胞毒性劑之藥物單元結合時促進細胞內化(亦即，在如本文所描述之結合物之連接子-藥物單元部分之環境中)。在又一些其他實施例中，連接子或連接子亞單元L2當與藥物單元及靶向單元二者結合時促進細胞內化(亦即，在如本文所描述之結合物之背景中)。
可用於本發明組合物及方法之各種連接子亞單元L2描述於例如WO 2004010957中。在一些實施例中，連接子亞單元L2包含包括硫醇-反應性間隔基及二肽之可蛋白酶裂解之連接子(例如，順丁烯二醯亞胺基 己醯基 纈胺酸 丙胺酸)。在一些實施例中，連接子亞單元L2包括包含硫醇-反應性順丁烯二醯亞胺基己醯基間隔基、胺基酸或肽及自分解基團之可蛋白酶裂解之連接子。在一些實施例中，連接子亞單元L2包括包含硫醇-反應性順丁烯二醯亞胺基己醯基間隔基、纈胺酸-瓜胺酸二肽及對胺基苄氧基羰基自分解基團之可蛋白酶裂解之連接子。
在一些實施例中，連接子亞單元L2包括可酸裂解之連接子，例如肼連接子或四級銨連接子(參見，例如，WO2017/096311及WO2016/040684)。
在一些實施例中，連接子亞單元L2包括包含順丁烯二醯亞胺基團之自穩定部分，如WO2013/173337中所描述。
在一些實施例中，連接子亞單元L2包括親水連接子，例如，W02015/123679中之親水肽以及WO2013/012961及WO2019/213046中公開之基於糖醇聚合物之連接子。
在其他實施例中，連接子亞單元L2可使用各種雙官能蛋白質結合劑製備，例如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺基酯之雙官能衍生物(例如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(例如二琥珀醯亞胺辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、雙疊氮基化合物(例如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(例如雙(對重氮苯甲醯基)乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在例如WO94/11026中已經描述了用於結合放射性核苷酸之螯合劑。
在一些實施例中，連接子亞單元L2可用交聯劑製備，包括但不限於BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB及SVSB (琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)，其為可商購的(例如，來自Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A)。
胺基酸單元(AA) 連接子視情況包含胺基酸單元(AA)。當存在於連接子中時，胺基酸單元將擴展單元(L1)連接至連接子亞單元L2。當AA之s為0時，胺基酸單元不存在(例如，在式I至式IV中之任一個中)。在一些實施例中，胺基酸單元包含0至12個亞單元。胺基酸單元之各亞單元選自天然或非天然之α、β或γ胺基酸或極性單元，例如連接至胺基酸單元之亞單元之糖單元(SU)或羧基單元或PEG單元。
在一些實施例中，胺基酸單元為胺基酸或二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽，其中一或多個亞單元視情況被修飾以形成極性單元，例如糖單元、PEG單元或羧基單元。
在一些實施例中，胺基酸單元之亞單元選自甘胺酸及/或L-胺基酸，例如精胺酸、穀胺醯胺、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、離胺酸、丙胺酸、組胺酸、絲胺酸、脯胺酸、穀胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、亮胺酸、天冬醯胺、異亮胺酸及纈胺酸，以及極性單元(包括連接至甘胺酸或L-胺基酸之PEG單元)。在一些實施例中，胺基酸單元之亞單元選自甘胺酸及/或D-胺基酸，例如精胺酸、穀胺醯胺、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、離胺酸、丙胺酸、組胺酸、絲胺酸、脯胺酸、穀胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、亮胺酸、天冬醯胺、異亮胺酸及纈胺酸，以及極性單元。在一些實施例中，胺基酸單元之亞單元選自甘胺酸及/或L-胺基酸及D-胺基酸之混合物，例如精胺酸、穀胺醯胺、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、離胺酸、丙胺酸、組胺酸、絲胺酸、脯胺酸、穀胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、亮胺酸、天冬醯胺、異亮胺酸及纈胺酸，以及極性單元(包括連接至甘胺酸或D-胺基酸之PEG單元)。
在一些實施例中，胺基酸單元之亞單元選自甘胺酸及/或天然L-胺基酸，例如精胺酸、穀胺醯胺、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、離胺酸、丙胺酸、組胺酸、絲胺酸、脯胺酸、穀胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、亮胺酸、天冬醯胺、異亮胺酸及纈胺酸，以及至少一個極性單元，例如連接至甘胺酸或L-胺基酸之糖單元、或羧基單元或PEG單元。在一些實施例中，胺基酸單元之亞單元選自甘胺酸及/或D-胺基酸，例如精胺酸、穀胺醯胺、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、離胺酸、丙胺酸、組胺酸、絲胺酸、脯胺酸、穀胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、亮胺酸、天冬醯胺、異亮胺酸及纈胺酸，以及至少一個極性單元，例如連接至甘胺酸或D-胺基酸之糖單元、或羧基單元或PEG單元。
在一些實施例中，胺基酸單元之亞單元獨立地具有以下中括號中所示之式：
Figure 02_image507
其中R 190為氫、甲基、異丙基、異丁基、第二丁基、苄基、對羥基苄基、-CH 2OH、-CH(OH)CH 3、-CH 2CH 2SCH 3、-CH 2CONH 2、-CH 2COOH -CH 2CH 2CONH 2、-CH 2CH 2COOH、-(CH 2) 3NHC(=NH)NH 2、-(CH 2) 3NH 2、-(CH 2) 3NHCOCH 3、-(CH 2) 3NHCHO、-(CH 2) 4NHC(=NH)NH 2、-(CH 2) 4NH 2、-(CH 2) 4NHCOCH 3、-(CH 2) 4NHCHO、-(CH 2) 3NHCONH 2、-(CH 2) 4NHCONH 2、-CH 2CH 2CH(OH)CH 2NH 2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、環己基。
Figure 02_image509
在一些實施例中，胺基酸單元之各亞單元獨立地選自以下L-(天然)胺基酸：丙胺酸、精胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺、組胺酸、甘胺酸、穀胺酸、穀胺醯胺、苯丙胺酸、離胺酸、亮胺酸、絲胺酸、酪胺酸、蘇胺酸、異亮胺酸、色胺酸及纈胺酸；以及至少一個極性單元，例如連接至天然胺基酸之糖單元、或羧基單元或PEG單元。
在一些實施例中，胺基酸單元之亞單元不為半胱胺酸。在一些實施例中，胺基酸單元之亞單元不為脯胺酸。
在一些實施例中，胺基酸單元之各亞單元獨立地選自以下此等天然胺基酸之D-異構體：丙胺酸、精胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺、組胺酸、甘胺酸、穀胺酸、穀胺醯胺、苯丙胺酸、離胺酸、亮胺酸、絲胺酸、酪胺酸、蘇胺酸、異亮胺酸、色胺酸及纈胺酸；以及至少一個極性單元，例如連接至甘胺酸或L-胺基酸之糖單元、或羧基單元或PEG單元。
在一些實施例中，胺基酸單元之各亞單元獨立地選自丙胺酸、精胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺、組胺酸、甘胺酸、穀胺酸、穀胺醯胺、苯丙胺酸、離胺酸、亮胺酸、絲胺酸、酪胺酸、蘇胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、色胺酸、纈胺酸、鳥胺酸、青黴胺、β-丙胺酸、胺基烷酸、胺基炔酸、胺基烷二酸、胺基苯甲酸、胺基-雜環-烷酸、雜環-羧酸、瓜胺酸、施德丁、二胺基烷酸及其衍生物；以及至少一個極性單元，例如連接至一個亞單元之糖單元、或羧基單元或PEG單元。
丙胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：丙胺酸(Ala)、N-烷基-丙胺酸、脫氫-丙胺酸、4-噻唑基丙胺酸、2-吡啶基丙胺酸、3-吡啶基丙胺酸、4-吡啶基丙胺酸、β-(l-萘基)-丙胺酸、β-(2-萘基)-丙胺酸、α-胺基丁酸、β-氯-丙胺酸、β-氰基-丙胺酸、β-環戊基-丙胺酸、β-環己基-丙胺酸、β-碘-丙胺酸、β-環戊烯基-丙胺酸、β-tBu-丙胺酸、β-環丙基-丙胺酸、β-二苯基-丙胺酸、β-氟-丙胺酸、哌𠯤環受保護之或未受保護之β-哌𠯤基-丙胺酸、β-(2-喹啉基)-丙胺酸、β-(l,2,4-三唑-1-基)-丙胺酸、β-脲基-丙胺酸、H-β-(3-苯并噻吩基)-Ala-OH及H-β-(2-噻吩基)~Ala-OH。
精胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：精胺酸(Arg)、N-烷基-精胺酸、H-Arg(Me)-OH、H-Arg(NH 2)-OH、H-Arg(NO 2)-OH、H-Arg(Ac) 2-OH、H-Arg(Me) 2-OH (不對稱的)、H-Arg(Me) 2-OH (對稱的)、2-胺基-4-(2'-羥基胍基)-丁酸 (N-ω-羥基-正精胺酸)及高精胺酸。
天冬胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：天冬胺酸 (Asp)、N-烷基-天冬胺酸及H-Asp(OtBu)-OH。
天冬醯胺及其衍生物之示例性實例包括但不限於：天冬醯胺(Asn)、N-烷基-天冬醯胺及異天冬醯胺(H-Asp-NH 2)。
半胱胺酸(Cys)及其衍生物(不含游離的SH基團)之示例性實例包括但不限於：H-Cys(Acm)-OH、H-Cys(Trt)-OH、H-Cys(tBu)-OH、H-Cys(Bzl)-OH、H-Cys(Et)-OH、H-Cys(SO 3H)-OH、H-Cys(胺基乙基)- OH、H-Cys(胺基甲醯基)-OH、H-Cys(苯基)-OH、H-Cys(Boc)-OH及H-Cys(羥基乙基)-OH。
組胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：組胺酸(His)、N-烷基-組胺酸、H-His(Boc)-OH、H-His(Bzl)-OH、H-HBs(I-Me)-OH、H-His(l -Tos)-OH、H-2,5-二碘-His-OH及H-His(3-Me)-OH。
甘胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於： 甘胺酸(GIy)、N-烷基-甘胺酸、H-炔丙基甘胺酸(
Figure 02_image511
CH) ；α-胺基甘胺酸(受保護之或未受保護之)、β-環丙基-甘胺酸、環戊基-甘胺酸、環己基-甘胺酸、α-烯丙基甘胺酸、三級丁基-甘胺酸、新戊基甘胺酸及苯基甘胺酸。
穀胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：穀胺酸(GIu)、N-烷基-穀胺酸、H-GIu(OtBu)-OH、H-γ-羥基-Glu-OH、H-γ-亞甲基-Glu-OH、H-γ-羧基-Glu(OtBu) 2-OH及焦穀胺酸。
穀胺醯胺及其衍生物之示例性實例包括但不限於：穀胺醯胺(GIn)、N-烷基-穀胺醯胺、異穀胺醯胺 (H-GIu-NH 2)、H-GIn(Trt)-OH及H-Gln(異丙基)-OH。
苯丙胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：苯丙胺酸(Phe)、N-烷基-苯丙胺酸、H-對胺基-Phe-OH、H-對胺基-Phe(Z)-OH、H-對溴-Phe-OH、H-對苄基-Phe-OH、H-p-tBu-Phe-OH、H-對羧基-Phe(OtBu)-OH、H-對羧基-Phe-OH、H-對氰基-Phe-OH、H-對氟-Phe-OH、H-3,4-二氯-Phe-OH、H-對碘-Phe-OH、H-對硝基-Phe-OH、H-對甲基-Phe-OH、H-五氟-Phe-OH、H-m-氟-Phe-OH、H-α-Me-Phe-OH、H-4-苯基-Phe-OH、高苯丙胺酸、氯-苯丙胺酸及β-高苯丙胺酸。
離胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：離胺酸(Lys)、N-烷基-離胺酸、H-Lys(Boc)-OH、H-Lys(Ac)-OH、H-Lys(甲醯基)-OH、H-Lys(Me) 2-OH、H-Lys(菸醯基)-OH、H-Lys(Me) 3-OH、H-反式-4,5-脫氫-Lys-OH、H-Lys(Aloc)-OH、H-H-δ-羥基-Lys-OH、H-δ-羥基-Lys(Boc)-OH、H-Lys(乙醯胺基)-OH及H-Lys(異丙基)-OH。亮胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：亮胺酸(Leu)、N-烷基-亮胺酸、4,5-脫氫亮胺酸、H-α-Me-Leu-OH、高亮胺酸、正亮胺酸及t-亮胺酸。
甲硫胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：甲硫胺酸(Met)、H-Met(O)-OH及H-Met(O) 2-OH。
絲胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：絲胺酸(Ser)、N-烷基-絲胺酸、H-Ser(Ac)-OH、H-Ser(tBu)-OH、H-Ser(Bzl)-OH、H-Ser(ρ-氯-Bzl)-OH、H-β-(3,4-二羥基苯基)-Ser-OH、H-β-(2-噻吩基)-Ser-OH、異絲胺酸、N-烷基-異絲胺酸及3-苯基異絲胺酸。
酪胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：酪胺酸(Tyr)、N-烷基-酪胺酸、H-3,5-二硝基-Tyr-OH、H-3-胺基-Tyr-OH、H-3,5-二溴-Tyr-OH、H-3,5-二碘-Tyr-OH、H-Tyr(Me)-OH、H-Tyr(tBu)-OH、H-Tyr(Boc)-OH、H-Tyr(Bzl)-OH、H-Tyr(Et)-OH、H-3-碘-Tyr-OH及H-3-硝基-Tyr-OH。
蘇胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：蘇胺酸(Thr)、N-烷基-蘇胺酸、別位蘇胺酸、H-Thr(Ac)-OH、H-Thr(tBu)-OH及H-Thr(Bzl)-OH。
異亮胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：異亮胺酸(He)、N-烷基-異亮胺酸、別位異亮胺酸及正亮胺酸。
色胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：色胺酸(Trp)、N-烷基-色胺酸、H-5-Me-Trp-OH、H-5-羥基-Trp-OH、H-4-Me-Trp-OH、H-α-Me-Trp-OH、H-Trp(Boc)-OH、H-Trp(甲醯基)-OH及H-Trp(均三甲苯基-2-磺醯基)-OH。
脯胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：脯胺酸(Pro)、N-烷基-脯胺酸、高脯胺酸、硫代脯胺酸、羥基脯胺酸(H-Hyp-OH)、H-Hyp(tBu)-OH、H-Hyp(Bzl)-OH、H-3,4-脫氫-Pro-OH、4-酮基-脯胺酸、α-Me-Pro-OH及H-4-氟-Pro-OH。
纈胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：纈胺酸(VaI)、N-烷基-纈胺酸、H-α-Me-Val-OH及正纈胺酸。
鳥胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：鳥胺酸、N-烷基-鳥胺酸、H-Orn(Boc)-OH、H-Om(Z)-OH、H-α-二氟-Me-Orn-OH (依氟鳥胺酸)及H-Orn(Aloc)-OH。
青黴胺及其衍生物之示例性實例包括但不限於：青黴胺、H-青黴胺(Acm)-OH (H-β,β-二甲基半胱胺酸(Acm)-OH)及N-烷基-青黴胺。
β-丙胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：β-丙胺酸、N-烷基-β-丙胺酸及脫氫-丙胺酸。
胺基烷酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：N-烷基胺基烷酸、胺基丁酸、4-(新戊基氧基磺醯基)-胺基丁酸、ε-胺基己酸、α-胺基異丁酸、哌啶基乙酸、3-胺基丙酸、3-胺基-3-(3-吡啶基)-丙酸及5-胺基戊酸(胺基戊酸)。
胺基炔酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：N-烷基胺基炔酸、6-胺基-4-己炔酸、6-(Boc-胺基)-4-己炔酸。
胺基烷二酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：N-烷基胺基烷二酸、2-胺基己二酸、2-胺基庚二酸、2-胺基辛二酸(H-Asu-OH)。
胺基苯甲酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：N-烷基胺基苯甲酸、2-胺基苯甲酸、3-胺基苯甲酸及4-胺基苯甲酸。
胺基-雜環-烷酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：N-烷基胺基-雜環-烷酸、4-胺基-1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸、4-胺基-l-甲基-lH-吡咯-2-羧酸、4-胺基-哌啶-4-羧酸(H-Pip-OH；1-受保護之或未受保護之)、3-胺基-3-(3-吡啶基)-丙酸。
雜環-羧酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：氮雜環丁烷-2-羧酸、氮雜環丁烷-3-羧酸、哌啶-4-羧酸及噻唑烷-4-羧酸。
瓜胺酸及其衍生物之示例性實例包括但不限於：瓜胺酸(cit)、N-烷基-瓜胺酸、硫代瓜胺酸、S-甲基-硫代瓜胺酸及高瓜胺酸。
施德丁及其衍生物之示例性實例包括但不限於：施德丁、N-烷基-施德丁、環己基施德丁及苯基施德丁。
二胺基烷酸(Dab)及其衍生物之示例性實例包括但不限於：N-烷基-二胺基-烷酸、N,N-二烷基胺基-烷酸、α,γ-二胺基丁酸(H-Dab-OH)、H-Dab(Aloc)-OH、H-Dab(Boc)-OH、H-Dab(Z)-OH、α,β-二胺基丙酸及其側鏈受保護之形式。
在一些實施例中，胺基酸單元可用封端基團終止，例如直鏈或支鏈之烷基基團、或聚乙烯鏈(1至30個亞單元)或PEG單元。
胺基酸單元之示例性實施例包括以下，其中SU為糖單元，PEG為PEG單元並且CU為羧基單元：
在一些實施例中，胺基酸單元包含SU。
在一些實施例中，胺基酸單元包含SU-Lys-SU。
在一些實施例中，胺基酸單元包含SU-Lys-SU-三級丁基。
在一些實施例中，胺基酸單元包含SU-Lys。
在一些實施例中，胺基酸單元包含Lys-SU。
在一些實施例中，胺基酸單元包含Lys-SU-Lys(PEG)。
在一些實施例中，胺基酸單元包括SU-Lys(PEG)-SU。
在一些實施例中，胺基酸單元包含SU-Glu-SU。
在一些實施例中，胺基酸單元包含Lys(PEG)。
在一些實施例中，胺基酸單元包含Lys(PEG)-Lys(PEG)。
在一些實施例中，胺基酸單元包含CU。
在一些實施例中，胺基酸單元包含CU-CU。
在一些實施例中，胺基酸單元存在並經由肽鍵連接至連接子亞單元L2之肽。在一些實施例中，此類胺基酸單元–連接子亞單元L2包含SU-Val-Cit~，其中波形線表示與連接子亞單元L2之其餘部分或與藥物單元之鍵。在一些實施例中，此類胺基酸單元–連接子亞單元L2包含SU-Val-Ala~，其中波形線表示與連接子亞單元L2之其餘部分或與藥物單元之鍵。在一些實施例中，此類胺基酸單元–連接子亞單元L2包含SU-Val-Lys~，其中波形線表示與連接子亞單元L2之其餘部分或與藥物單元之鍵。在一些實施例中，此類胺基酸單元–連接子亞單元L2包含SU-Gly-Gly-Phe-Gly ~，其中波形線表示與連接子亞單元L2之其餘部分或與藥物單元之鍵。
在一些實施例中，此類胺基酸單元–連接子亞單元L2包含Val-Lys(PEG)~，其中波形線表示與連接子亞單元L2之其餘部分或與藥物單元之鍵。在一些實施例中，此類胺基酸單元–連接子亞單元L2包含Val-Cit(PEG)~，其中波形線表示與連接子亞單元L2之其餘部分或與藥物單元之鍵。在一些實施例中，此類胺基酸單元–連接子亞單元L2包含Lys(PEG)-Val-Cit~，其中波形線表示與連接子亞單元L2之其餘部分或與藥物單元之鍵。在一些實施例中，此類胺基酸單元–連接子亞單元L2包含Lys(PEG)-Gly-Gly-Phe-Gly~，其中波形線表示與連接子亞單元L2之其餘部分或與藥物單元之鍵。
在一些實施例中，此類胺基酸單元–連接子亞單元L2包含CU-Val-Cit~，其中波形線表示與連接子亞單元L2之其餘部分或與藥物單元之鍵。在一些實施例中，此類胺基酸單元–連接子亞單元L2包含CU-Val-Lys~，其中波形線表示與連接子亞單元L2之其餘部分或與藥物單元之鍵。在一些實施例中，此類胺基酸單元–連接子亞單元L2包含CU-Val-Ala~，其中波形線表示與連接子亞單元L2之其餘部分或與藥物單元之鍵。在一些實施例中，此類胺基酸單元–連接子亞單元L2包含Val-CU~，其中波形線表示與連接子亞單元L2之其餘部分或與藥物單元之鍵，並且其中CU包含離胺酸殘基。在一些實施例中，此類胺基酸單元–連接子亞單元L2包含CU-Gly-Gly-Phe-Gly~，其中波形線表示與連接子亞單元L2之其餘部分或與藥物單元之鍵。
在一些實施例中，胺基酸單元存在並藉由非肽鍵連接至連接子亞單元L2。在一些實施例中，胺基酸單元藉由諸如C 1-C 10伸烷基、C 2-C 10伸烯基、C 2-C 10亞炔基或聚乙二醇之肽連接基團連接至連接子亞單元L2。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中L2或AA-L2具有以下結構中之一種：
Figure 02_image513
Figure 02_image515
Figure 02_image517
， 其中胺基基團上之波形線表示用於擴展單元之連接位點，並且藥物單元連接至苄醇。
擴展單元(L1) 擴展單元(L1)能夠將靶向單元連接至胺基酸單元(AA)或連接子亞單元L2。擴展單元具有可與靶向單元之官能基形成鍵之官能基。在連接子之一些實施例中，擴展單元連接至與連接子亞單元L2連接之胺基酸單元(亦即，當AA之s為1時；參見例如，式(I)至式(IV))。在一些實施例中，擴展單元連接至連接子亞單元L2 (亦即，當AA之s為0時；參見例如，式(I)至式(IV))。在一些實施例中，在形成胺基酸單元-連接子亞單元L2之後，擴展單元連接至胺基酸單元-連接子亞單元L2。在一些實施例中，在形成胺基酸單元-連接子亞單元L2-藥物單元之後，擴展單元連接至胺基酸單元-連接子亞單元L2-藥物單元。在一些實施例中，在形成連接子亞單元L2-藥物單元之後，擴展單元連接至連接子亞單元L2-藥物單元。
用於連接至靶向單元之擴展單元之官能基可包括，例如，順丁烯二醯亞胺、鹵代乙醯胺、巰基、NHS酯、醛、酮、羰基、醯肼、羥胺、胺、胺基、肼、縮胺基硫脲、肼羧基或芳醯肼。
可天然地或藉由化學操作存在於靶向單元上之官能基包括但不限於巰基(-SH)、胺基、羥基、羧基、碳水化合物之異頭羥基，以及羧基。在一個態樣，靶向單元之官能基為巰基及胺基。巰基基團可藉由還原靶向單元之分子內二硫鍵來產生。或者，可藉由使用2-亞胺基硫雜環戊烷(Traut試劑)或其他產生巰基之試劑使靶向單元之離胺酸部分之胺基基團反應來產生巰基基團。
在一些實施例中，擴展單元經由擴展單元之順丁烯二醯亞胺基團與靶向單元之硫原子形成鍵。硫原子可衍生自例如靶向單元之巰基基團(例如，鏈間二硫鍵之硫醇基團)。該實施例之代表性擴展單元描述於以下式100及式101中，其中L為靶向單元，並且波形線表示用於胺基酸單元或連接子亞單元L2之連接位點：
Figure 02_image519
在一些實施例中，提供了連接子，其中擴展單元選自以下：
Figure 02_image521
Figure 02_image523
；以及
Figure 02_image525
； 其中波形線
Figure 02_image527
表示擴展單元與胺基酸單元之連接位點。 在式100及式101中，R 17為-C 1-C 10伸烷基-、-C 1-C 10雜伸烷基-、-C 3-C 8碳環-、-O-(C 1-C 8伸烷基)-、-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基- (其中b為1至26)、-伸芳基-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-、-C 3-C 8雜環-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-、-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-、-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、C 1-C 10雜伸烷基-C(=O)-、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C(=O)- (其中b為1至26)、-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 3-C 8碳環-C(=O)-、-O-(C 1-C 8烷基)-C(=O)-、-伸芳基-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-C(=O)-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-C(=O)-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、-C 3-C 8雜環-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-C(=O)-、-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-NH-、-C 1-C 10雜伸烷基-NH-、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-NH- (其中b為1至26)、-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-NH- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-NH- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(C(=O))-NH-(CH 2-O-CH 2) b-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(C(=O))-NH-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-NH-(C(=O))-(CH 2-O-CH 2) b-NH- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-NH-(C(=O))-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-NH- (其中b為1至26)、-C 3-C 8碳環-NH-、-O-(C 1-C 8烷基)-NH-、-伸芳基-NH-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-NH-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-NH-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-NH-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-NH-、-C 3-C 8雜環-NH-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-NH-、-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-NH-、-C 1-C 10伸烷基-S-、-C 1-C 10雜伸烷基-S-、-C 3-C 8碳環-S-、-O-(C 1-C 8烷基)-S-、-伸芳基-S-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-S-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-S-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-S-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-S-、-C 3-C 8雜環-S-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-S-或-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-S-。R 17取代基中之任一個可為取代或未取代之(亦被稱為非取代之)。在一些態樣，R 17取代基為未取代的。在一些態樣，R 17取代基為視情況經取代的。在一些態樣，R 17基團(參見，例如，WO2013/173337)例如，-(CH 2) xNH 2、-(CH 2) xNHR a及-(CH 2) xNR a 2，其中x為1至4之整數，並且各R a獨立地選自C 1-C 6烷基及C 1-C 6鹵代烷基，或者兩個R a基團與其所連接之氮組合以形成氮雜環丁烷基、吡咯啶基或哌啶基基團。
在式100之一些實施例中，R 17為-C 1-C 6伸烷基-C=O)-。在一些實施例中，R 17為-C 1伸烷基-C(=O)-。
在式100之一些實施例中，R 17為-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C(=O)- (其中b為1至26)、-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-NH- (其中b為1至26)、-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-NH- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-NH- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(C(=O))-NH-(CH 2-O-CH 2) b-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(C(=O))-NH-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-NH-(C(=O))-(CH 2-O-CH 2) b-NH- (其中b為1至26)或-C 1-C 8伸烷基-NH-(C(=O))-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-NH- (其中b為1至26)。
在其他實施例中，擴展單元經由擴展單元之硫原子與靶向單元之硫原子之間之二硫鍵連接至靶向單元。該實施例之代表性擴展單元描述於以下式102中，其中L為靶向單元，波形線表示用於胺基酸單元或連接子亞單元L2之連接位點，並且R 17如以上對於式100及式101所描述。
Figure 02_image529
在又一個實施例中，擴展單元之反應性基團含有可與靶向單元之一級胺基或二級胺基形成鍵之反應性位點。此等反應性位點之實例包括但不限於活性酯，例如琥珀醯亞胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酸酐、醯氯、磺醯氯、異氰酸酯及異硫氰酸酯。該實施例之代表性擴展單元描述於式103、式104及式105中，其中L為靶向單元，波形線表示用於胺基酸單元或連接子亞單元L2之連接位點，並且R 17如以上對於式100及式101所描述。
Figure 02_image531
在又一個實施例中，擴展單元之反應性基團含有對可存在於靶向單元上之修飾碳水化合物之(-CHO)基團有反應性的反應性位點。例如，碳水化合物可使用諸如高碘酸鈉之試劑溫和地氧化，並且氧化之碳水化合物之所得(-CHO)單元可與含有諸如醯肼、肟、一級胺或二級胺、肼、縮胺基硫脲、肼羧基或芳基醯肼之官能基之擴展單元(例如，由Kaneko, T等人，(1991) Bioconjugate Chem. 2:133-41所描述之彼等)縮合。該實施例之代表性擴展單元描述於以下式106、式107及式108中，其中L為靶向單元，波形線表示用於胺基酸單元或連接子亞單元L2之連接位點，並且R 17如以上對於式100及式101所描述。
Figure 02_image533
在一些實施例中，期望延長擴展單元之長度。因此，擴展單元可包含附加組分。該實施例之代表性擴展單元描述於以下式109中，其中L為靶向單元，波形線表示用於胺基酸單元或連接子亞單元L2之連接位點，並且R 17如以上對於式100及式101所描述：
Figure 02_image535
在該實施例之一些態樣，R 17為-C 1-C 5伸烷基-C(=O)-。R 13為-C 1-C 6伸烷基-、-(CH 2-O-CH 2) b- (其中b為1至26)、-C 3-C 8碳環-、-伸芳基-、-C 1-C 10雜伸烷基-、-C 3-C 8雜環-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-或-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-。在較佳實施例中，R 13為-(CH 2-O-CH 2) b-，其中b為1至26。
靶向單元 在一些實施例中，連接子連接至靶向單元以形成靶向單元-連接子。在一些實施例中，連接子經由擴展單元(L1)連接至靶向單元且經由連接子亞單元L2連接至藥物單元以形成結合物。在一些實施例中，連接子經由擴展單元(L1)連接至靶向單元且經由連接子亞單元L2連接至藥物單元以形成結合物。靶向單元可為抗體、其抗原結合部分或非抗體靶向單元。非抗體靶向單元亦可稱為非抗體支架。
在一些實施例中，靶向單元特異性結合目標分子。如本文使用，「特異性結合」係指本文所描述之靶向單元(例如，抗體或其部分)結合目標的能力，其中KD為10 -5M (10000 nM)或更少，例如，10 -6M、10 -7M、10 -8M、10 -9M、10 -10M、10 -11M、10 -12M或更少。特異性結合可能受到例如靶向單元之親和力及親合力以及目標多肽之濃度的影響。本領域普通技術人員可確定合適之條件，在該條件下，本文所描述之抗體、抗體結合部分及非抗體支架使用任何合適之方法(例如在合適之細胞結合測定中滴定結合劑)選擇性地結合目標。特異性結合其目標之靶向單元不被不相似的競爭劑取代。在某些實施例中，當靶向單元優先識別其在蛋白質及/或大分子之複雜混合物中之目標時則被稱為特異性結合其目標。
如本文使用，術語「抗體」係指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，亦即含有特異性結合目標抗原之抗原結合位點之分子。該術語通常係指由兩個免疫球蛋白重鏈可變區及兩個免疫球蛋白輕鏈可變區構成之抗體，包括全長抗體(具有重鏈及輕鏈恆定區)。
各重鏈通常由可變區(縮寫為VH區)及恆定區構成。重鏈恆定區可包括三個域CH1、CH2及CH3以及視情況選用的第四域CH4。各條輕鏈由可變區(縮寫為VL區)及恆定區構成。輕鏈恆定區為CL域。VH及VL區可進一步分成稱為互補決定區(CDR)之高變區，並散佈有稱為構架區(FR)之保守區。因此，各VH及VL區包括三個CDR及四個FR，其按照以下順序自N末端至C末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。這種結構為本領域技術人員公知的。
如本文使用，抗體之「抗原結合部分」係指具有抗體之VH及/或VL序列或抗體之CDR並且特異性結合目標抗原之抗體部分。抗原結合部分之實例包括Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv、scFv、二硫鍵連接之Fv、單域抗體(亦稱為VHH、VNAR、sdAb或奈米抗體)或雙抗體(參見，例如，Huston等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988)及Bird等人，Science 242, 423-426 (1988)，其藉由引用併入本文)。如本文使用，術語Fab、F(ab') 2及Fv係指以下：(i) FAb為由VL、VH、CL及CH1域構成之單價片段；(ii) F(ab') 2為包含兩個Fab片段之二價片段，該兩個Fab片段在鉸鏈區中藉由二硫鍵彼此連接；及(iii) 由VL及VH域構成之Fv。儘管Fv片段之兩個域(亦即VL及VH)由單獨的編碼區編碼，但其亦可使用合成連接子彼此連接，例如，聚-G4S胺基酸序列(`(G 4S) n`公開為SEQ ID NO: 1，其中n =1至5)，使得可將其製備成單個蛋白質鏈，其中VL及VH區域結合以形成單價分子(稱為單鏈Fv或scFv)。術語抗體之「抗原結合部分」亦包括這種單鏈抗體。其他形式之單鏈抗體如「雙抗體」亦同樣包括在本文中。雙抗體為二價雙特異性抗體，其中VH及VL區在單個多肽鏈上表現，但用於連接VH及VL區之連接子太短，以致兩個區不能在同一鏈上結合，從而迫使VH及VL區與不同鏈之互補區配對(分別為VL及VH)，並形成兩個抗原結合位點(參見，例如，Holliger, R等人，(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:64446448； Poljak, R. J等人，(1994) Structure 2:1121-1123)。
單域抗體為包含單個單體可變抗體區之抗體之抗原結合部分。單域抗體可衍生自駱駝科動物之抗體重鏈之可變區(例如，奈米抗體或VHH部分)。此外，術語單域抗體包括自主人類重鏈可變域(AVH)或衍生自鯊魚之VNAR部分(參見，例如，Hasler等人, Mol. Immunol. 75:28-37, 2016)。
用於產生單域抗體(例如，DAB或VHH)之技術為本領域已知的，例如如Cossins等人(2006, Prot Express Purif 51:253-259)及Li等人(Immunol. Lett. 188:89-95, 2017)所公開。單域抗體可藉由標準免疫技術自例如駱駝、羊駝或美洲駝獲得。(參見，例如，Muyldermans等人，TIBS 26:230-235, 2001； Yau等人，J Immunol Methods 281:161-75, 2003；及Maass等人，J Immunol Methods 324:13-25, 2007。)  VHH可具有有效的抗原結合能力，並且可與習知VH-VL對不能接近之新表位相互作用(參見，例如，Muyldermans等人，2001)。羊駝血清IgG僅含有約50%之駱駝科動物重鏈唯一IgG抗體(HCAb) (參見，例如，Maass等人，2007)。可用抗原免疫羊駝，並且可以分離與目標抗原結合並中和目標抗原之VHH (參見，例如，Maass等人，2007)。已經鑑定了擴增羊駝VHH編碼序列之PCR引子，並且可用於構築羊駝VHH噬菌體展示文庫，其可用於藉由本領域熟知之標準生物淘選技術分離抗體片段(參見，例如，Maass等人，2007)。
在一些實施例中，靶向單元為抗體或其抗原結合部分為雙特異性或多特異性結合劑。雙特異性及多特異性抗體包括以下：scFv1-ScFv2、ScFv1 2-Fc-scFv2 2、IgG-scFv、DVD-Ig、triomab/quadroma、二合一IgG、scFv2-Fc、TandAb及scFv-HSA-scFv。在一些實施例中，IgG-scFv為IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、svFc-(L)IgG、2scFV-IgG或IgG-2scFv。參見，例如，Brinkmann and Kontermann, MAbs 9(2):182-212 (2017)；Wang等人，Antibodies, 2019, 8, 43；Dong等人，2011, MAbs 3:273-88；Natsume等人，J. Biochem. 140(3):359-368, 2006； Cheal等人，Mol. Cancer Ther. 13(7):1803-1812, 2014；及Bates and Power, Antibodies, 2019, 8, 28。
在一些實施例中，靶向單元為癌症相關抗原，例如CD19、CD20、CD30、CD33、CD38、CA125、MUC-1、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、CD44表面黏附分子、間皮素(MLSN)、癌胚抗原(CEA)、表皮生長因子受體(EGFR)、EGFRvIII、血管內皮生長因子受體-2 (VEGFR2)、高分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA)、MAGE-A1、IL-13R-a2、GD2、1p19q、ABL1、AKT1、ALK、APC、AR、ATM、BRAF、BRCA1、BRCA2、cKIT、cMET、CSF1R、CTNNB1、FGFR1、FGFR2、FLT3、GNA11、GNAQ、GNAS、HRAS、IDH1、IDH2、JAK2、KDR (VEGFR2)、KRAS、MGMT、MGMT-Me、MLH1、MPL、NOTCH1、NRAS、PDGFRA、Pgp、PIK3CA、PR、PTEN、RET、RRM1、SMO、SPARC、TLE3、TOP2A、TOPO1、TP53、TS、TUBB3、VHL、CDH1、ERBB4、FBXW7、HNF1A、JAK3、NPM1、PTPN11、RB1、SMAD4、SMARCB1、STK1、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、ROS1、ERCC1、5T4 (TPBG)、B7-H3、CCR7、CD105、CD22、CD46、CD47、CD56、CD70、CD71、CD79b、CDH6、CLDN6、CLDN18.2、CLEC12A、DLL3、DR5、ERBB3 (HER3)、EPCAM、FOLR1、IGF1R、IL2RA (CD25)、IL3RA、ITGB6、LIV-1、LRRC15、間皮素(MSLN)、NaPi2b (SLC34A2)、黏連蛋白-4、PTK7、ROR1、SEZ6、SLC44A4、SLITRK6、組織因子(TF)、TROP2或B7-H4。根據本發明，術語「癌症相關抗原」、「腫瘤抗原」、「腫瘤表現抗原」、「癌症抗原」、「癌症相關抗原」及「癌症表現抗原」為等同的，並且在本文中可互換使用。
在一些實施例中，靶向單元特異性結合目標，例如CD19、CD20、CD30、CD33、CD70、LIV-1或EGFRv3。
在一些實施例中，靶向單元為結合具有如Leuschner等人，US 2022/0048951及/或Lerchen等人中所公開之序列之目標之抗體(或其片段)。單株抗體之非限制性實例包括利妥昔單抗(Rituxan®)、曲妥單抗(Herceptin®)、帕妥珠單抗(Perjeta®)、貝伐單抗(Avastin®)、蘭尼單抗(Lucentis®)、西妥昔單抗(Erbitux®)、阿侖單抗(Campath®)、帕尼單抗(Vectibix®)、替伊莫單抗(Zevalin®)、托西莫單抗(Bexxar®)、伊匹單抗、紮蘆木單抗、達雷妥尤單抗、芬妥木單抗、雷莫蘆單抗、加利昔單抗、法妥組單抗、奧瑞組單抗、奧法木單抗(Arzerra®)、CD抗體2F2 (HuMax-CD20)、7D8、IgM2C6、IgG1 2C6、11B8、B1、2H7、LT20、1FS或AT80 (參見Teeling等人，J. Immunol. 177:362-371 (2006))、達利珠單抗(Zenapax®)及抗-LHRH受體抗體，例如純系A9E4、F1G4、AT2G7、GNRH03、GNRHR2等，其尤其可與根據本發明之結合物聯用。
在一些實施例中，提供了FOLR1抗體、其抗原結合部分及其他結合劑以及此等抗體、抗原結合部分及其他結合劑之結合物。亦提供了使用FOLR1抗體、抗原結合部分及其他結合劑及其結合物治療癌症及其他疾病之方法。本文公開之發明部分地基於特異性結合FOLR1並表現出改善之性質的FOLR1抗體、其抗原結合部分及其他結合劑以及結合物。FOLR1為用於治療某些癌症之重要且有利的治療目標。FOLR1抗體、其抗原結合部分、其他結合劑及其結合物提供了基於在治療FOLR1+癌症及其他疾病中使用此等抗體、抗原結合部分及相關結合劑及其結合物之組合物及方法。
在一些實施例中，靶向單元為非抗體支架。在一些實施例中，靶向單元為非抗體蛋白質支架。此類非抗體支架包括，例如，親合體(Affibodies)、Affilins、抗運載蛋白(Anticalins)、Atrimers、阿維默(Avimers)、雙環肽、Cys-knots、DARPins、FN3支架(例如，阿德內丁蛋白(Adnectins)、Centyrins、Pronectins及Tn3)、Fynomers、Kunitz域及OBodies。(參見，例如，Vazquez-Lombardi等人，Drug Discovery Today 20(10):1271 (2015)及其中引用之參考文獻。)此類非抗體蛋白質支架包括，例如，親合體、Affilins、抗運載蛋白、Atrimers、阿維默、雙環肽、Cys-knots、DARPins、FN3支架(例如，阿德內丁蛋白、Centyrins、Pronectins及Tn3)、Fynomers、Kunitz域及OBodies。(參見，例如，Vazquez-Lombardi等人，Drug Discovery Today 20(10):1271 (2015)及其中引用之參考文獻。)非抗體支架可被認為屬於兩個結構類別，域大小之構築體(6至20 kDa之範圍內)及限制性肽(2至4 kDa之範圍內)。域大小之非抗體支架包括，但不限於，親合體、affilins、抗運載蛋白、atrimers、DARPins、FN3支架(例如阿德內丁蛋白及centyrins)、fynomers、Kunitz域、pronectins及OBodies。肽大小之非抗體支架包括，例如，Avimers、雙環肽及半胱胺酸結。非抗體蛋白質支架可被認為屬於兩個結構類別，域大小之構築體(6至20 kDa之範圍內)及限制性肽(2至4 kDa之範圍內)。域大小之非抗體支架包括，但不限於，親合體、affilins、抗運載蛋白、atrimers、DARPins、FN3支架(例如阿德內丁蛋白及centyrins)、fynomers、Kunitz域、pronectins及OBodies。肽大小之非抗體支架包括，例如，Avimers、雙環肽及半胱胺酸結。此等非抗體支架及其所基於之或其所衍生之基礎蛋白質或肽綜述於例如Simeon及Chen, Protein Cell 9(1)：3-14 (2018)； Vazquez-Lombardi等人，Drug Discovery Today 20: 1271-1283 (2015)及Binz等人，Nature Biotechnol. 23: 1257-1268 (2005)，其各自之內容藉由引用整體併入本文。
使用非抗體支架之優點包括增加之親和力、目標中和及穩定性。各種非抗體支架亦可以克服抗體支架之一些侷限性，例如在組織滲透、較小之尺寸及熱穩定性態樣。一些非抗體支架亦可以更容易構築，例如，當需要雙特異性構築體時，不受潛在的輕鏈締合問題之阻礙。在非抗體支架上構築構築體之方法為本領域普通技術人員已知的。
因此，在一些實施例中，靶向單元可包括非抗體支架。因此，在一些實施例中，靶向單元可包含非抗體支架蛋白質。本領域技術人員將理解，在一些實施例中，靶向單元可包括例如阿德內丁蛋白(adnectin)支架或衍生自人第十纖連蛋白III型域(10Fn3)之部分；衍生自人脂質運載蛋白之抗運載蛋白支架(例如，如在例如WO2015/104406中所描述之彼等)；衍生自低密度相關蛋白(LRP)及/或極低密度脂蛋白受體(VLDLR)之A域之avimer支架或蛋白片段；FYN酪胺酸激酶之SH3域之fynomer支架或部分；kunitz域支架或Kunitz型蛋白酶抑制劑之部分，例如人胰蛋白酶抑制劑、抑肽酶(牛胰胰蛋白酶抑制劑)、阿茲海默氏澱粉樣前軀體蛋白及組織因子途徑抑制劑；knottin支架(半胱胺酸結微蛋白)，例如基於來自大腸桿菌之胰蛋白酶抑制劑之支架；金黃色葡萄球菌蛋白A之親合體支架或Z域之全部或部分；β-Hairpin類比支架；基於錨蛋白重複(AR)蛋白之設計之錨蛋白重複蛋白(DARPin)支架或人工蛋白支架；或衍生自或基於人轉鐵蛋白、人CTLA-4、人晶體蛋白及人泛素之任何支架。例如，人轉鐵蛋白對人轉鐵蛋白受體之結合位點可被多樣化以產生轉鐵蛋白變體之多樣化文庫，其中一些轉鐵蛋白變體對不同抗原具有獲得之親和力。參見，例如，Ali等人，(1999)J. Biol. Chem. 274: 24066-24073。不涉及結合受體之人轉鐵蛋白部分保持不變，並且用作支架，如抗體之構架區，以提供變體結合位點。隨後根據本文所描述之方法針對目標目標抗原篩選文庫(如抗體文庫一樣)，以鑑定對目標抗原具有最佳選擇性及親和力之彼等變體。參見，例如，Hey等人，(2005) TRENDS Biotechnol. 23(10):514-522。
FOLR1靶向單元 在一些實施例中，靶向劑為特異性結合FOLR1之抗FOLR1抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，提供了此類抗體及其抗原結合部分之結合物。包含特異性結合FOLR1之靶向劑之結合物可用於癌症及其他疾病之治療方法。當連接於本文所描述之連接物-藥物時，與其他FOLR1結合物相比，FOLR1抗體及其抗原結合部分之此類結合物表現出改善之性質。FOLR1為用於治療某些癌症之重要且有利的治療目標。其FOLR1結合物提供了基於在治療FOLR1+癌症及其他疾病中使用此類結合物之組合物及方法。
在一些實施例中，FOLR1靶向劑包括重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，VH區包含位於重鏈可變區構架區中之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，VL區包含位於輕鏈可變區構架區中之LCDR1、LCDR及LCDR3，VH及VL CDR具有選自以下列出之胺基酸序列組中之胺基酸序列：分別為SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34及SEQ ID NO:35；以及分別為SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39及SEQ ID NO:40。在一些實施例中，VH及VL CDR具有分別在SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34及SEQ ID NO:35中列出之胺基酸序列。在一些實施例中，構架區為人構架區。
在一些實施例中，VH及VL區具有選自以下列出之胺基酸序列對中之胺基酸序列：分別為SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7；分別為SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9；分別為SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11；分別為SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13；分別為SEQ ID NO:14及SEQ ID NO:15；分別為SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17；分別為SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:19；分別為SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21；分別為SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:23；分別為SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:25；分別為SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27；以及分別為SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29；其中重鏈及輕鏈構架區視情況經由構架區中之1至8個胺基酸取代、缺失或插入進行修飾。
在一些實施例中，VH及VL區具有選自以下列出之胺基酸序列對中之胺基酸序列：分別為SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7；分別為SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9；分別為SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11；分別為SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13；分別為SEQ ID NO:14及SEQ ID NO:15；分別為SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17；分別為SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:19；分別為SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21；分別為SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:23；分別為SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:25；分別為SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27；以及分別為SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29。
在一些實施例中，VH及VL區具有選自以下列出之胺基酸序列對中之胺基酸序列：分別為SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9；分別為SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13；分別為SEQ ID NO:14及SEQ ID NO:15；分別為SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17；分別為SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21；分別為SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:23；分別為SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:25；以及分別為SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27。
在一些實施例中，VH及VL區具有選自以下列出之胺基酸序列對中之胺基酸序列：分別為SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9；分別為SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13；以及分別為SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27。在一些實施例中，VH及VL區具有分別在SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9中列出之胺基酸序列。在一些實施例中，VH及VL區具有分別在SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13中列出之胺基酸序列。在一些實施例中，VH及VL區具有分別在SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27中列出之胺基酸序列。
在一些實施例中，重鏈可變區亦包含重鏈恆定區。在一些實施例中，重鏈恆定區為IgG同種型。在一些實施例中，重鏈恆定區為IgG1恆定區。在一些實施例中，IgG1恆定區具有在SEQ ID NO: 41中列出之胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈恆定區為IgG4恆定區。在一些實施例中，重鏈恆定區亦至少包含降低對人FcγRIII之結合親和力之胺基酸修飾。在一些實施例中，輕鏈可變區亦包含輕鏈恆定區。在一些實施例中，輕鏈恆定區為κ同種型。在一些實施例中，輕鏈恆定區具有在SEQ ID NO:42中列出之胺基酸序列。
在一些實施例中，FOLR1結合物為單特異性的。在一些實施例中，FOLR1結合物為二價的。在一些實施例中，FOLR1結合物為雙特異性的。
在一些實施例中，FOLR1結合物包括作為抗體之靶向單元，該抗體包括重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，VH區包含位於重鏈可變區構架區中之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，VL區包含位於輕鏈可變區構架區中之LCDR1、LCDR及LCDR3，VH及VL CDR具有選自以下列出之胺基酸序列組中之胺基酸序列：(a) 分別為SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34及SEQ ID No:35；以及(b) 分別為SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39及SEQ ID NO:40。在某些實施例中，VH及VL區具有選自以下列出之胺基酸序列對中之胺基酸序列：分別為SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27；以及其中重鏈及輕鏈構架區視情況用構架區中之1個至8個胺基酸取代、缺失或插入修飾。在具體實施例中，靶向單元為抗體F131 (VH SEQ ID NO: 26及VL SEQ ID NO: 27)。在具體實施例中，抗體為F131，並且藥物-連接子為LD038。
恆定區 在一些實施例中，靶向單元，例如抗體或其抗原結合部分或其他靶向單元具有抗體恆定區。在一些實施例中，恆定區為完全人類恆定區。在一些實施例中，恆定區為人源化恆定區。在一些實施例中，恆定區為非人類恆定區。免疫球蛋白恆定區係指重鏈或輕鏈恆定區。人類重鏈及輕鏈恆定區胺基酸序列為本領域已知的。恆定區可為任何合適之類型，其可選自免疫球蛋白、IgA、IgD、IgE、IgG及IgM之類別。幾種免疫球蛋白類可進一步分成同種型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA1及IgA2。對應於不同類別的免疫球蛋白之重鏈恆定區(Fc)可分別為α、δ、ε、γ及μ。輕鏈可為κ (或κ)及λ (或λ)中之一種。
在一些實施例中，恆定區可具有IgG同種型。在一些實施例中，恆定區可具有IgG1同種型。在一些實施例中，恆定區可具有IgG2同種型。在一些實施例中，恆定區可具有IgG3同種型。在一些實施例中，恆定區可具有IgG4同種型。在一些實施例中，恆定區可具有包含來自兩種或更多種同種型之恆定區之雜合同種型。在一些實施例中，免疫球蛋白恆定區可為IgG1或IgG4恆定區。在一些實施例中，恆定區具有IgG1同種型並且具有在SEQ ID NO:2中列出之胺基酸序列。在一些實施例中，恆定區具有κ同種型並且具有在SEQ ID NO:3中列出之胺基酸序列。
此外，包含抗體或其抗原結合部分或非抗體支架之靶向單元可為藉由抗體或抗原結合部分與一或多種其他蛋白或肽共價或非共價結合而形成之較大分子之一部分。與此類靶向單元相關的為使用例如鏈黴親和素核心區域來製備四聚體scFv分子(Kipriyanov, S. M.等人，(1995), Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)以及使用半胱胺酸殘基、標誌物肽及C-末端多聚組胺酸肽(例如六組胺酸標籤)(「六組胺酸標籤」公開為SEQ ID NO：4)來製備二價且生物素化之scFv分子(Kipriyanov, S. M.等人，(1994) Mol. Immunol. 31:10471058)。
Fc域修飾以改變效應子功能 在一些實施例中，靶向單元(例如抗體或其抗原結合部分或非抗體支架)之Fc區或Fc域基本上不結合選自FcyRI (CD64)、FcyRIIA (CD32a)、FcyRIIB (CD32b)、FcyRIIIA (CD16a)及FcyRIIIB (CD16b)中之至少一種Fc受體。在一些實施例中，Fc區或域基本上不與選自FcyRI (CD64)、FcyRIIA (CD32a)、FcyRIIB (CD32b)、FcyRIIIA (CD16a)及FcyRIIIB (CD16b)中之任一種Fc受體結合。如本文使用，「基本上不結合」係指與所選Fcγ受體結合弱至不結合。在一些實施例中，「基本上不結合」係指對Fcγ受體之結合親和力降低(亦即，Kd增加)至少1000倍。在一些實施例中，Fc域或區為Fc無效的。如本文使用，「Fc無效之」係指Fc區或Fc域表現出與任一種Fcγ受體結合弱至不結合。在一些實施例中，Fc無效域或區表現出對Fcγ受體之結合親和力降低(亦即，Kd增加)至少1000倍。
在一些實施例中，Fc域具有降低之或基本上無效應子功能活性。如本文使用，「效應子功能活性」係指抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。在一些實施例中，與野生型Fc域相比，Fc域表現出降低之ADCC、ADCP或CDC活性。在一些實施例中，與野生型Fc域相比，Fc域表現出ADCC、ADCP及CDC之降低。在一些實施例中，Fc域基本上不顯示效應子功能(亦即，刺激或影響ADCC、ADCP或CDC的能力)。如本文使用，「基本上無效應子功能」係指與野生型或參比Fc域相比，效應子功能活性降低至少1000倍。
在一些實施例中，Fc域具有降低之或無ADCC活性。如本文使用，降低之或無ADCC活性係指Fc域之ADCC活性降低至少10、至少20、至少30、至少50、至少100或至少500倍。
在一些實施例中，Fc域具有降低之或無CDC活性。如本文使用，降低之或無CDC活性係指Fc域之CDC活性降低至少10、至少20、至少30、至少50、至少100或至少500倍。
可進行體外及/或體內細胞毒性測定以證實ADCC及/或CDC活性之降低/耗盡。例如，可進行Fc受體(FcR)結合測定以確保抗體缺乏Fcγ受體結合(因此可能缺乏ADCC活性)。介導ADCC之原代細胞，NK細胞，僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。在RavetcH及Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)之第464頁之表3中總結了造血細胞上之FCR表現。用於評估目標分子之ADCC活性之體外測定之非限制性實例描述於美國專利號5,500,362(參見，例如，Hellstrom, I等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986))及Hellstrom, I等人, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；美國專利號5,821,337(參見Bruggemann, M.等人, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987))。替代地，可使用非放射性測定方法(參見，例如，用於流式細胞術之ACTI TM非放射性細胞毒性測定(CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif；及CytoTox 96 TM非放射性細胞毒性測定(Promega, Madison, Wis.)。用於這種測定之有用的效應細胞包括外周血單核球(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。替代地或另外地，目標分子之ADCC活性可在體內評估，例如在動物模型中，如Clynes等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)所公開。
亦可進行C1q結合測定以證實抗體或Fc域或區不能結合C1q，因此缺乏CDC活性或具有降低之CDC活性。參見，例如，WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為了評估補體活化，可進行CDC測定(參見，例如，Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M. S.等人，Blood 101: 1045-1052 (2003)；及Cragg, M. S. and M. J. Glennie, Blood 103: 2738-2743 (2004))。
在一些實施例中，Fc域具有降低之或無ADCP活性。如本文使用，降低之或無ADCP活性係指Fc域之ADCP活性降低至少10、至少20、至少30、至少50、至少100或至少500倍。
亦可進行ADCP結合測定以證實抗體或Fc域或區缺乏ADCP活性或具有降低之ADCP活性。參見，例如，US20190079077及US20190048078以及其中公開之參考文獻。
具有降低之效應子功能活性之靶向單元，例如抗體或其抗原結合部分或非抗體支架，包括具有一或多個Fc區殘基(例如，根據Kabat之EU編號之238、265、269、270、297、327及329)之取代之彼等(參見，例如，美國專利號6,737,056)。根據Kabat之EU編號，此類Fc突變體包括在兩個或更多個胺基酸位置265、269、270、297及327處具有經取代之Fc突變體，包括將殘基265及297取代為丙胺酸之所謂的「DANA」Fc突變體(參見美國專利號7,332,581)。與FcR結合減弱之某些抗體變體亦為已知的。(參見，例如，美國專利號6,737,056； WO 2004/056312及Shields等人，J. Biol. Chem. 9(2)：6591-6604 (2001).)  可製備與FcR結合減弱之靶向單元(例如抗體或其抗原結合部分或非抗體支架)，其含有此類胺基酸修飾。
在一些實施例中，靶向單元(例如抗體或其抗原結合部分或非抗體支架)包含具有一或多個胺基酸取代之Fc域或區，該胺基酸取代減少FcγR結合，例如在Fc區之位置234及235處之取代(殘基之EU編號)。在一些實施例中，根據Kabat之EU編號，取代為L234A及L235A (LALA)。在一些實施例中，根據Kabat之EU編號，Fc域在衍生自人類IgG1 Fc區之Fc區中包含D265A及/或P329G。在一些實施例中，根據Kabat之EU編號，取代為衍生自人類IgG1 Fc區之Fc區中之L234A、L235A及P329G (LALA-PG)。(參見，例如，WO 2012/130831)。在一些實施例中，根據Kabat之EU編號，取代在衍生自人類IgG1 Fc區之Fc區中之L234A、L235A及D265A (LALA-DA)。
在一些實施例中，在Fc區中進行改變，導致改變(亦即，減少) C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如，如美國專利號6,194,551、WO 99/51642及Idusogie等人J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)中所描述。
製備抗體及抗原結合部分以及其他靶向單元之方法 在各種實施例中，靶向單位如抗體及其抗原結合部分可在人類、鼠或其他動物來源之細胞株中產生。重組DNA表現可用於產生抗體及其抗原結合部分。這允許在所選擇之宿主物種中產生抗體以及一系列抗原結合部分(包括融合蛋白)。在細菌、酵母、轉基因動物及雞蛋中產生抗體及其抗原結合部分亦係基於細胞之生產系統之替代方案。轉基因動物之主要優點在於來自可再生資源之潛在高產率。
可藉由本領域已知的多種方法製備編碼靶向單元(例如抗體或其抗原結合部分)之胺基酸序列之核酸分子。此等方法包括但不限於製備編碼抗體或抗原結合部分之合成核苷酸序列。此外，寡核苷酸介導之(或定點之)誘變、PCR介導之誘變及盒式誘變可用於製備編碼抗體或抗原結合部分之核苷酸序列。如本文所描述，編碼至少一種抗體或其抗原結合部分或其多肽之核酸序列可根據習知技術與載體DNA重組，該習知技術例如鈍端或錯開端用於連接，限制性酶消化以提供適當之末端，酌情填充內聚端，鹼性磷酸酶處理以避免不希望之連接，以及用適當之連接酶連接或本領域已知的其他技術。用於這種操作之技術例如由Maniatis等人，Molecular Cloning, Lab. Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1982 and 1989), 及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons), 1987-1993公開的，並且可用於構築編碼抗體或其抗原結合部分或其VH或VL多肽之核酸序列及載體。
如本文使用，術語「核酸」或「核酸序列」或「多核苷酸序列」或「核苷酸」係指結合了核糖核酸、脫氧核糖核酸或其類似物之單元的聚合分子。核酸可為單鏈或雙鏈的。單鏈核酸可為變性雙鏈DNA之一條鏈核酸。在一些實施例中，核酸可為cDNA，例如缺乏內含子之核酸。
若核酸分子(例如DNA)包含含有轉錄及轉譯調節資訊之核苷酸序列，並且這種序列與編碼多肽之核苷酸序列「可操作地連接」，則認為其「能夠表現」多肽。可操作的連接為其中調節DNA序列及尋求表現之DNA序列(例如，抗體或其抗原結合部分)以允許可回收量之多肽或抗原結合部分的基因表現之方式連接的連接。基因表現所需之調節區之精確性質可以因生物體而異，這在類似技術中為眾所周知的。參見，例如，Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1987-1993。
因此，靶向單元(例如，抗體或其抗原結合部分)之表現可在原核或真核細胞中發生。合適之宿主包括細菌或真核宿主，包括體內或原位之酵母、昆蟲、真菌、鳥及哺乳動物細胞，或哺乳動物、昆蟲、鳥或酵母來源之宿主細胞。哺乳動物細胞或組織可為人類、靈長類動物、倉鼠、兔、嚙齒類動物、牛、豬、綿羊、馬、山羊、狗或貓來源的，但為亦可使用其他哺乳動物細胞。此外，藉由使用例如酵母泛素水解酶系統，可以實現泛素-跨膜多肽融合蛋白之體內合成。如此產生之融合蛋白可在體內加工或純化及在體外加工，允許合成如本文所描述之具有特定胺基末端序列之抗體或其抗原結合部分。此外，可以避免與在直接酵母(或細菌)表現中保留起始密碼子衍生之甲硫胺酸殘基相關之問題。(參見，例如，Sabin等人, 7 Bio/Technol.705 (1989)；Miller等人, 7 Bio/Technol.698 (1989)。)當酵母在富含葡萄糖之培養基中生長時，可利用包含來自編碼大量產生之糖酵解酶之活性表現基因之啟動子及終止元件之一系列酵母基因表現系統中之任一個來獲得重組抗體或其抗原結合部分。已知的糖酵解基因亦可以提供非常有效的轉錄控制訊號。例如，可利用磷酸甘油酸激酶基因之啟動子及終止子訊號。
在昆蟲中產生抗體或抗原結合部分可藉由，例如，用本領域普通技術人員已知的方法用工程化以表現多肽之桿狀病毒感染昆蟲宿主來實現。參見Ausubel等人，1987-1993。
在一些實施例中，將引入之核酸序列(編碼抗體或其抗原結合部分或其多肽)結合至能夠在受體宿主細胞中自主複製之質體或病毒載體中。為此目的可使用多種載體中之任一種，並且為本領域普通技術人員已知的且可獲得的。參見，例如，Ausubel等人，1987-1993。選擇特定質體或病毒載體之重要因素包括：含有載體之受體細胞可以自不含載體之彼等受體細胞中被識別及選擇之容易程度；特定宿主中所需之載體拷貝數；以及是否需要能夠在不同物種之宿主細胞之間「穿梭」載體。
本領域已知的示例性原核載體包括質體，例如能夠在大腸桿菌中複製之質體。用於表現編碼抗體或其抗原結合部分之DNA之其他基因表現元件包括但不限於(a) 病毒轉錄啟動子及其增強子元件，例如SV40早期啟動子(Okayama等人，3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983))、勞斯肉瘤病毒LTR (Gorman等人，79 PNAS 6777 (1982))及莫洛尼白血病病毒LTR (Grosschedl等人，41 Cell 885 (1985))；(b) 剪接區及多聚腺苷酸化位點，例如源自SV40晚期區之彼等(Okayarea等人，1983)，以及(c) 多聚腺苷酸化位點，例如SV40 (Okayama等人，1983)。編碼免疫球蛋白之DNA基因可以如下文Liu等人類及Weidle等人，51 Gene 21 (1987)所描述之那樣來表現，使用SV40早期啟動子及其增強子、小鼠免疫球蛋白H鏈啟動子增強子、SV40晚期區mRNA剪接、兔S-珠蛋白插入序列、免疫球蛋白及兔S-珠蛋白聚腺苷酸化位點及SV40聚腺苷酸化元件作為表現元件。
對於編碼免疫球蛋白之核苷酸序列，轉錄啟動子可為例如人類巨細胞病毒，啟動子增強子可為巨細胞病毒及小鼠/人類免疫球蛋白。
在一些實施例中，為了在嚙齒動物細胞中表現DNA編碼區，轉錄啟動子可為病毒LTR序列，轉錄啟動子增強子可為小鼠免疫球蛋白重鏈增強子及病毒LTR增強子之一或兩者，以及聚腺苷酸化及轉錄終止區。在其他實施例中，編碼其他蛋白質之DNA序列與上述表現元件組合以在哺乳動物細胞中實現蛋白質之表現。
各編碼區或基因融合體被組裝或插入在表現載體中。隨後用編碼抗體或抗體多肽或其抗原結合部分之核苷酸單獨轉染能夠表現可變區或其抗原結合部分之受體細胞，或者用編碼VH及VL鏈編碼區之多核苷酸共轉染。在允許結合之編碼區表現之條件下培養轉染之受體細胞，並自培養物中回收表現之抗體鏈或完整的抗體或抗原結合部分。
在一些實施例中，將含有編碼抗體或其抗原結合部分之編碼區之核酸組裝在單獨的表現載體中，隨後用於共轉染受體宿主細胞。各載體可含有一或多個可選擇基因。例如，在一些實施例中，使用兩個可選擇基因，設計用於在細菌系統中選擇之第一可選擇基因及設計用於在真核系統中選擇之第二可選擇基因，其中各載體具有一組編碼區。該策略導致首先指導細菌系統中核苷酸序列之產生並允許擴增之載體。隨後將在細菌宿主中如此產生及擴增之DNA載體用於共轉染真核細胞，並允許選擇攜帶所需轉染核酸(例如，含有抗體重鏈及輕鏈)之共轉染細胞。用於細菌系統之可選擇基因之非限制性實例為賦予氨苄青黴素抗性之基因及賦予氯黴素抗性之基因。用於真核轉染子之可選擇基因包括黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因(命名為gpt)及來自Tn5之磷酸轉移酶基因(命名為neo)。替代地，編碼VH及VL鏈之融合核苷酸序列可以組裝在同一表現載體上。
為了轉染表現載體及產生抗體或其抗原結合部分，受體細胞株可為中國倉鼠卵巢細胞株(例如，DG44)或骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞可以合成、組裝及分泌由轉染之免疫球蛋白基因編碼之免疫球蛋白，並且具有免疫球蛋白糖基化之機制。例如，在一些實施例中，受體細胞為產生重組Ig之骨髓瘤細胞SP2/0。Sp2/0細胞僅產生由轉染基因編碼之免疫球蛋白。骨髓瘤細胞可在培養物或小鼠之腹膜腔中生長，其中分泌之免疫球蛋白可以自腹水中獲得。
編碼抗體或其抗原結合部分之表現載體可藉由多種合適之方法中之任一種引入至合適之宿主細胞中，包括生物化學方法如轉化、轉染、原生質體融合、磷酸鈣沈澱及應用聚陽離子如二乙基胺基乙基(DEAE)葡聚糖，以及機械方法如電穿孔、直接顯微注射及微粒轟擊，如本領域普通技術人員已知的。(參見，例如，Johnston等人，240 Science 1538 (1988))。
酵母為免疫球蛋白重鏈及輕鏈之產生提供了優於細菌之某些優點。酵母進行轉譯後肽修飾，包括糖基化。存在許多利用強啟動子序列及高拷貝數質體之重組DNA策略，其可用於在酵母中生產所需之蛋白質。酵母識別純系之哺乳動物基因產物之前導序列並分泌帶有前導序列之多肽(亦即，前多肽)。參見，例如，Hitzman等人，11th Intl. Conf. Yeast, Genetics & Molec. Biol. (Montpelier, France, 1982)。
酵母基因表現系統可以習知地評價抗體及組裝之抗體及其抗原結合部分之生產、分泌及穩定性之含量。當酵母在富含葡萄糖之培養基中生長時，可利用包含來自編碼大量產生之糖酵解酶之活性表現基因之啟動子及終止元件之各種酵母基因表現系統。已知的糖酵解基因亦可以提供非常有效的轉錄控制訊號。例如，可利用磷酸甘油酸激酶(PGK)基因之啟動子及終止子訊號。另一個實例為轉譯延伸因子1α啟動子，例如來自中國倉鼠細胞之啟動子。可以採用多種方法來評價用於在酵母中表現免疫球蛋白之最佳表現質體。參見II DNA Cloning 45, (Glover編輯 IRL Press, 1985)及例如美國公開號US 2006/0270045 A1。
細菌菌株亦可用作產生如本文所描述之抗體分子或其抗原結合部分之宿主。可使用諸如大腸桿菌W3110之大腸桿菌K12菌株、芽孢桿菌屬、諸如鼠傷寒沙門氏菌或黏質沙雷氏菌之腸細菌，以及各種假單胞菌屬。含有來自與宿主細胞相容之物種之複製子及控制序列之質體載體與此等細菌宿主結合使用。載體攜帶複製位點，以及能夠在轉化細胞中提供表型選擇之特定基因。可以採用多種方法來評價表現質體以在細菌中產生抗體及其抗原結合部分(參見Glover, 1985； Ausubel, 1987, 1993；Sambrook, 1989；Colligan, 1992-1996)。
宿主哺乳動物細胞可在體外或體內生長。哺乳動物細胞對免疫球蛋白分子提供轉譯後修飾，包括前導肽移除、VH及VL鏈之摺疊及組裝、抗體分子之糖基化以及功能性抗體及/或其抗原結合部分之分泌。
除了上述淋巴來源之細胞之外，可用作產生抗體蛋白之宿主之哺乳動物細胞包括纖維母細胞來源之細胞，如Vero或CHO-K1細胞。可用於表現免疫球蛋白多肽之示例性真核細胞包括但不限於COS細胞，包括COS 7細胞；293細胞，包括293-6E細胞；CHO細胞，包括CHO--S及DG44細胞；PERC6 TM細胞(Crucell)；及NSO細胞。在一些實施例中，基於特定真核宿主細胞對重鏈及/或輕鏈進行所需之轉譯後修飾的能力來選擇特定的真核宿主細胞。例如，在一些實施例中，CHO細胞產生之多肽具有比293細胞中產生之相同多肽更高含量之唾液酸化。
在一些實施例中，一或多種抗體或其抗原結合部分可以根據任何合適之方法在已經用一或多種編碼多肽之核酸分子工程化或轉染之動物體內產生。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分在無細胞系統中產生。非限制性之示例性無細胞系統描述於，例如，Sitaraman等人，Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009)；Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004)；及Endo等人，Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003)。
許多載體系統可用於在哺乳動物細胞中表現VH及VL鏈(參見Glover，1985)。可以遵循各種方法獲得完整的抗體。如上所描述，可在相同細胞中共表現VH及VL鏈以及視情況選用的相關恆定區，以實現VH及VL鏈在細胞內締合及連接成完整的四聚體H2L2抗體或其抗原結合部分。共表現可藉由在相同之宿主中使用相同或不同的質體來進行。可將編碼VH及VL鏈之核酸或其抗原結合部分置於同一質體中，隨後轉染至細胞中，從而直接選擇表現兩條鏈之細胞。替代地，可首先用編碼一條鏈，例如VL鏈之質體轉染細胞，隨後用含有第二可選擇標誌物之VH鏈質體轉染所得細胞株。藉由任一途徑產生抗體或其抗原結合部分之細胞株可用編碼額外拷貝之肽、VH、VL或VH加VL鏈之質體連同額外的可選擇標誌物一起轉染，以產生具有增強特性之細胞株，該特性例如組裝之抗體或其抗原結合部分之更高的產量或轉染之細胞株之增強的穩定性。
另外，植物已經作為基於微生物或動物細胞之大規模培養之重組抗體生產之方便、安全且經濟之替代表現系統而出現。抗體或其抗原結合部分可在植物細胞培養物或習知生長之植物中表現。植物中之表現可為系統性的、限於亞細胞質體或限於種子(胚乳)。參見，例如，美國專利公開號2003/0167531；美國專利號6,080,560；美國專利號6,512,162；及WO 0129242。幾種植物來源之抗體已經達到了開發之進階階段，包括臨床試驗(參見，例如，Biolex, N.C.)。
對於完整抗體，抗體之可變區(VH及VL區)通常與免疫球蛋白恆定區(Fc)或域(通常為人類免疫球蛋白之)之至少一部分連接。人類恆定區DNA序列可以按照眾所周知之方法自多種人細胞，如永生化之B細胞中分離(WO 87/02671)。抗體可包含輕鏈及重鏈恆定區二者。重鏈恆定區可包括CH1、鉸鏈區、CH2、CH3，以及視情況選用的CH4區。在一些實施例中，CH2域可以缺失或省略。
描述用於生產單鏈抗體之技術(參見，例如，美國專利號4,946,778； Bird, Science 242:423-42 (1988)； Huston等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)；及Ward等人，Nature 334:544-54 (1989)； 其藉由引用整體併入本文)可以適於產生特異性結合目標抗原之單鏈抗體。單鏈抗體藉由經由胺基酸橋連接Fv區之重鏈及輕鏈可變區形成，產生單鏈多肽。亦可使用在大腸桿菌中組裝功能性Fv部分之技術(參見，例如Skerra等人，Science 242:1038-1041 (1988)；其藉由引用整體併入本文)。
在一些實施例中，抗原結合部分包含一或多個scFv。scFv可為，例如，抗體之重鏈(VH)及輕鏈(VL)可變區之可變區的融合蛋白，其與10至約25個胺基酸之短連接子肽連接。連接子通常富含甘胺酸以獲得靈活性，以及富含絲胺酸或蘇胺酸以獲得溶解性，並且可將VH之N-末端與VL之C-末端連接，反之亦然。儘管移除了恆定區並且引入了連接子，但該蛋白質仍保留了原始抗體之特異性。scFv抗體例如描述於Houston, J. S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96。用於製備scFv分子及設計合適之肽連接子之方法描述於，例如，美國專利號4,704,692；美國專利號4,946,778；Raag及Whitlow，FASEB 9:73-80 (1995)以及Bird及Walker，TIBTECH，9: 132-137 (1991)。ScFv-Fc已經由Sokolowska-Wedzina等人，Mol. Cancer Res. 15(8):1040-1050, 2017描述。
在一些實施例中，抗原結合部分為單域抗體，為由單一單體可變抗體域組成之抗體部分。單域抗體可衍生自駱駝科動物之抗體重鏈之可變域(例如，奈米抗體或VHH部分)。此外，單域抗體可為自主人類重鏈可變域(AVH)或衍生自鯊魚之VNAR部分(參見，例如，Hasler等人, Mol. Immunol. 75:28-37, 2016)。
用於產生單域抗體(DAB或VHH)之技術為本領域已知的，例如如Cossins等人(2006, Prot Express Purif 51:253-259)及Li等人(Immunol. Lett. 188:89-95, 2017)所公開。單域抗體可藉由標準免疫技術自例如駱駝、羊駝或美洲駝獲得。(參見，例如，Muyldermans等人，TIBS 26:230-235, 2001；Yau等人，J Immunol Methods 281:161-75, 2003；及Maass等人，J Immunol Methods 324:13-25, 2007。) VHH可具有有效的抗原結合能力，並且可與習知VH-VL對不能接近之表位相互作用(參見，例如，Muyldermans等人，2001)。羊駝血清IgG僅含有約50%之駱駝科動物重鏈唯一IgG抗體(HCAb) (參見，例如，Maass等人，2007)。可用抗原免疫羊駝，並且可以分離與目標抗原結合並中和目標抗原之VHH (參見，例如，Maass等人，2007)。已經鑑定了擴增羊駝VHH編碼序列之PCR引子，並且可用於構築羊駝VHH噬菌體展示文庫，其可用於藉由本領域熟知之標準生物淘選技術分離抗體片段(參見，例如，Maass等人，2007)。
用於製備多特異性抗體之技術包括但不限於具有不同特異性的兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參見，例如，Milstein及Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J. 10: 3655 (1991))以及「knob-in-hole」工程化(參見，例如，美國專利號5,731,168； Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15)。多特異性抗體亦可藉由以下方法製備：工程化用於製備抗體Fc-異二聚體分子之靜電轉向效應(參見，例如，WO 2009/089004A1)；兩種或更多種抗體或其抗原結合部分之交聯(參見，例如，美國專利號4,676,980及Brennan等人，Science，229：81 (1985))；使用亮胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(參見，例如，Kostelny等人，J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992))；使用「雙抗體」技術製備雙特異性抗體部分(參見，例如，Hollinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))；以及使用單鏈Fv (scFv)二聚體(參見，例如，Gruber等人，J. Immunol., 152:5368 (1994))；以及製備三特異性抗體，如例如Tutt等人，J. Immunol. 147: 60 (1991)所描述。
具有三個或更多個功能性抗原結合位點之工程化抗體，包括「章魚抗體」，亦可為靶向單元(參見，例如，US 2006/0025576A1)。
在一些實施例中，靶向單元包含與Fc域之兩個亞單元中之一者或另一個融合之不同的抗原結合位點；因此，Fc域之兩個亞單位可包含在兩個不同的多肽鏈中。此等多肽之重組共表現及隨後之二聚化導致兩種多肽之幾種可能之組合。為了提高重組生產中雙特異性分子之產率及純度，因此在靶向單元之Fc域中引入促進所需多肽結合之修飾為有利的。
通常，該方法包括用帶電荷之胺基酸殘基替換兩個Fc域之界面處之一或多個胺基酸殘基，使得同源二聚體形成變得靜電不利，但異源二聚體靜電有利。
在一些實施例中，靶向單元為「雙特異性T細胞接合子」或BiTE (參見，例如，WO2004/106381、WO2005/061547、WO2007/042261及WO2008/119567)。該方法利用排列在單個多肽上之兩個抗體可變域。例如，單條多肽鏈可包括兩條單鏈Fv (scFv)部分，各條單鏈Fv (scFv)部分具有由多肽連接子分開之可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)域，該多肽連接子之長度足以允許兩個域之間之分子內締合。該單個多肽亦包括在兩個scFv之間之多肽間隔序列。各scFv識別不同的表位，並且此等表位可以對不同的蛋白質為特異性的，使得兩種蛋白質均被BiTE結合。
因為其為單個多肽，所以可使用本領域已知的任何原核或真核細胞表現系統、例如CHO細胞株表現雙特異性T細胞接合子。然而，特定的純化技術(參見，例如，EP1691833)可能為必需的，以將單體雙特異性T細胞接合子與其他多聚體物質分離，該多聚體物質可能具有不同於單體之預期活性之生物活性。在一個示例性純化方案中，首先對含有分泌多肽之溶液進行金屬親和層析，並用咪唑濃度之梯度溶離多肽。使用陰離子交換層析進一步純化該溶離液，並使用氯化鈉濃度之梯度溶離多肽。最後，對該溶離液進行尺寸排阻層析，以自多聚體物質中分離單體。在一些實施例中，靶向單元為由包含藉由肽連接子彼此融合之兩個單鏈FV部分(scFV)之單個多肽鏈組成的雙特異性抗體。
在一些實施例中，靶向單元為多特異性的，例如IgG-scFV。IgG-scFv格式包括IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、svFc-(L)IgG、2scFV-IgG及IgG-2scFv。此等及其他雙特異性抗體格式及其製備方法已經描述於，例如，Brinkmann and Kontermann, MAbs 9(2):182-212 (2017)；Wang等人，Antibodies, 2019, 8, 43；Dong等人，2011, MAbs 3:273-88；Natsume等人，J. Biochem. 140(3):359-368, 2006；Cheal等人，Mol. Cancer Ther. 13(7):1803-1812, 2014；及Bates and Power, Antibodies, 2019, 8, 28。
IgG樣雙可變域抗體(DVD-Ig)已經描述於Wu等人，2007, Nat Biotechnol 25:1290-97；Hasler等人，Mol. Immunol. 75:28-37, 2016以及WO 08/024188及WO 07/024715中。Triomabs已經描述於Chelius等人，MAbs 2(3):309-319，2010。2-in-1-IgG已經描述於Kontermann等人，Drug Discovery Today 20(7):838-847, 2015。Tanden抗體或TandAb已經描述於Kontermann等人，參見上文。ScFv-HSA-scFv抗體亦已經描述於Kontermann等人(參見上文)。
完整的(例如，全部之)抗體、其之二聚體、單獨的輕鏈及重鏈、或其抗原結合部分可藉由已知技術回收及純化，例如免疫吸附或免疫親和層析、層析方法如HPLC (高效液相層析)、硫酸銨沈澱、凝膠電泳或其任意組合。一般參見Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982)。至少約90%至95%均一性之基本上純的抗體或其抗原結合部分為有利的，如具有98%至99%或更高均一性之彼等抗體或其抗原結合部分，特別為對於藥物用途。一旦根據需要部分純化或純化至均一化，完整的抗體或其抗原結合部分就可用於治療或開發及進行分析程式、免疫螢光染色等。一般參見，Vols. I & II Immunol. Meth. (Lefkovits & Pernis編輯，Acad. Press, NY, 1979及1981)。
藥物單元 在一些實施例中，連接子連接至藥物單元、靶向單元及/或連接至靶向單元及藥物單元(後者亦稱為結合物、ADC或抗體藥物結合物)。在一些實施例中，連接子經由連接子亞單元L2連接至至少一個藥物單元。如本文使用，在結合物之上下文中，術語「藥物單元」或藥物係指細胞毒性劑(例如，化學治療劑或藥物)、免疫調節劑、核酸(包括siRNA)、生長抑制劑、毒素(例如，蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段)、放射性同位素、PROTAC及當遞送至目標細胞時對目標細胞具有活性之其他化合物。
細胞毒性劑 在一些實施例中，藥物單元為細胞毒性劑。「細胞毒性劑」係指對細胞具有細胞毒性作用之試劑。「細胞毒性效應」係指目標細胞之耗竭、消除及/或殺死。細胞毒性劑包括，例如，微管蛋白破壞劑、拓樸異構酶抑制劑、DNA小溝結合劑及DNA烷化劑。
微管蛋白破壞劑包括，例如，奧瑞他汀、海兔毒素、微管蛋白抑制劑(tubulysins)、秋水仙鹼、長春花生物鹼、紫杉烷、念珠藻素(cryptophycins)、美登素類化合物、哈米特林(hemiasterlins)、以及其他微管蛋白破壞劑。奧瑞他汀為天然產物海兔毒素10之衍生物。示例性奧瑞他汀包括MMAE (N-甲基纈胺酸-纈胺酸-海兔異亮胺酸-海兔脯胺酸-去甲麻黃鹼)、MMAF (N-甲基纈胺酸-纈胺酸-海兔異亮胺酸-海兔脯胺酸-苯丙胺酸)及AFP (參見WO2004/010957及WO2007/008603)。其他奧瑞他汀類化合物公開於，例如，公佈之美國申請號US2021/0008099、US2017/0121282、US2013/0309192及US2013/0157960中。海兔毒素包括，例如，海兔毒素10及海兔毒素15 (參見，例如，Pettit等人，J. Am. Chem. Soc., 1987, 109, 6883-6885； Pettit等人，Anti-Cancer Drug Des., 1998, 13, 243-277；及公佈之美國申請US2001/0018422)。預期本文使用的其他海兔毒素衍生物公開於美國專利9,345,785，其藉由引用併入本文。
微管蛋白抑制劑包括但不限於微管蛋白抑制劑D、微管蛋白抑制劑M、布他苯丙胺酸(tubuphenylalanine)及微管酪胺酸。WO2017/096311及WO/2016040684描述了包括微管蛋白抑制劑M之微管蛋白抑制劑類似物。
秋水仙鹼包括但不限於秋水仙鹼及CA-4。
長春花生物鹼包括但不限於長春鹼(VBL)、長春瑞濱(VRL)、長春新鹼(VCR)及長春地辛(VOS)。
紫杉烷包括但不限於紫杉醇及多西他賽。
念珠藻素包括但不限於念珠藻素1及念珠藻素52。
美登素類化合物包括但不限於美登素，美登醇，DM1、DM3及DM4之美登素類似物以及安沙黴素-2。示例性美登素類化合物藥物部分包括具有經修飾之芳環之彼等，例如：C-19-脫氯(美國專利號4,256,746) (藉由氫化鋁鋰還原安沙黴素P2製備)；C-20-羥基(或C-20-脫甲基)+/-C-19-脫氯(美國專利號4,361,650及4,307,016) (藉由使用鏈黴菌或放線菌之脫甲基化或使用LAH之脫氯製備)；及C-20-脫甲氧基、C-20-醯氧基(--OCOR)、+/-脫氯(美國專利號4,294,757) (藉由使用醯氯之醯化製備)以及在其他位置具有修飾之彼等。
美登素類化合物藥物部分亦包括具有修飾之彼等，例如：C-9-SH (美國專利號4,424,219) (藉由美登醇與H 2S或P 2S 5之反應製備)；C-14-烷氧基甲基(脫甲氧基/CH 2OR) (參見美國專利號4,331,598)；C-14-羥甲基或醯氧基甲基(CH 2OH或CH 2OAc) (參見美國專利號4,450,254) (由諾卡菌製備)；C-15-羥基/醯氧基(參見美國專利號4,364,866) (藉由鏈黴菌屬轉化美登醇製備)；C-15-甲氧基(參見，美國專利號4,313,946及4,315,929) (分離自滑桃(Trewia nudiflora))；C-18-N-去甲基(參見美國專利號4,362,663及4,322,348) (藉由鏈黴菌屬使美登醇去甲基化製備)；及4,5-脫氧(參見美國專利號4,371,533) (藉由三氯化鈦/美登醇之LAH還原製備)。
哈米特林包括但不限於哈米特林及HTl-286。
其他之微管蛋白破壞劑包括根薯酮內酯A、根薯酮內酯B、根薯酮內酯AF、根薯酮內酯AJ、根薯酮內酯Al-環氧化物、圓皮海綿內酯(discodermolide)、埃博黴素A、埃博黴素B及萊利黴素。
在一些實施例中，細胞毒性劑可為拓樸異構酶抑制劑，例如喜樹鹼。示例性喜樹鹼包括，例如，喜樹鹼、伊立替康(亦稱為CPT-11)、貝洛替康、(7-(2-(N-異丙基胺基)乙基)喜樹鹼)、拓樸替康、10-羥基-CPT、SN-38、依喜替康及依喜替康類似物DXd (參見，US20150297748)。其他喜樹鹼公開於WO1996/021666、WO00/08033、US2016/0229862及WO2020/156189。
在一些實施例中，細胞毒性劑為倍癌黴素，包括合成類似物KW-2189及CBI-TMI。
免疫調節劑 在一些實施例中，藥物單元為免疫調節劑。免疫調節劑可為，例如，TLR7及/或TLR8促效劑、STING促效劑、RIG-I促效劑或其他免疫調節劑。
在一些實施例中，藥物單元為免疫調節劑，例如TLR7及/或TLR8促效劑。在一些實施例中，TLR7促效劑選自咪唑并喹啉、咪唑并喹啉胺、噻唑并喹啉、胺基喹啉、胺基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-胺基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氫吡啶并嘧啶、雜芳并噻二嗪-2,2-二氧化物、苯并萘啶、鳥苷類似物、腺苷類似物、胸苷均聚物、ssRNA、CpG-A、PolyG10及PolyG3。在一些實施例中，TLR7促效劑選自咪唑并喹啉、咪唑并喹啉胺、噻唑并喹啉、胺基喹啉、胺基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-胺基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氫吡啶并嘧啶、雜芳基并噻二嗪-2,2-二氧化物或ssRNA。在一些實施例中，TLR7促效劑為非天然存在之化合物。TLR7調節劑之實例包括GS-9620、GSK-2245035、咪喹莫特、瑞喹莫特、DSR-6434、DSP-3025、IMO-4200、MCT-465、MEDI-9197、3M-051、SB-9922、3M-052、Limtop、TMX-30X、TMX-202、RG- 7863、RG-7795及公開於US20160168164、US 20150299194、US20110098248、US20100143301及US20090047249中之化合物。
在一些實施例中，TLR8促效劑選自苯并吖庚因、咪唑并喹啉、噻唑并喹啉、胺基喹啉、胺基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-胺基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氫吡啶并嘧啶或ssRNA。在一些實施例中，TLR8促效劑選自苯并吖庚因、咪唑并喹啉、噻唑并喹啉、胺基喹啉、胺基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-胺基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺及四氫吡啶并嘧啶。在一些實施例中，TLR8促效劑為非天然存在之化合物。TLR8促效劑之實例包括莫托莫特、瑞喹莫特、3M-051、3M-052、MCT-465、IMO-4200、VTX-763、VTX-1463。
在一些實施例中，TLR8促效劑可為公開於WO2018/170179、WO2020/056198及WO2020056194中之化合物之任一種。
其他TLR7及TLR8促效劑公開於，例如，WO2016142250、WO2017046112、WO2007024612、WO2011022508、WO2011022509、WO2012045090、WO2012097173、WO2012097177、WO2017079283、US20160008374、US20160194350、US20160289229、美國專利號6043238、US20180086755、WO2017216054、WO2017190669、WO2017202704、WO2017202703、WO20170071944、US20140045849、US20140073642、WO2014056953、WO2014076221、WO2014128189、US20140350031、WO2014023813、US20080234251、US20080306050、US20100029585、US20110092485、US20110118235、US20120082658、US20120219615、US20140066432、US20140088085、US20140275167及US20130251673、WO2018198091及US20170131421。
在一些實施例中，免疫調節劑為STING促效劑。STING促效劑之實例包括，例如，WO2020059895、WO2015077354、WO2020227159、WO2020075790、WO2018200812及WO2020074004中公開之彼等。
在一些實施例中，免疫調節劑為RIG-I促效劑。RIG-I促效劑之實例包括KIN1148、SB-9200、KIN700、KIN600、KIN500、KIN100、KIN101、KIN400及KIN2000。
毒素 在一些實施例中，藥物單元為酶活性毒素或其片段，包括但不限於白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚麴黴素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、絲裂吉黴素(mitogellin)、侷限麴黴素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)及單端孢黴烯族化合物(tricoenotes)。
放射性同位素 在一些實施例中，藥物單元為放射性同位素。有多種放射性同位素可用於生產放射性結合物。實例包括釔-88、釔-90、鍀-99、銅-67、錸-188、錸-186、鎵-66、鎵-67、銦-111、銦-114、銦-115、鑥-177、鍶-89、釤-153及鉛-212。
PROTAC 在一些實施例中，藥物單元為蛋白質水解靶向嵌合體(PROTAC)。PROTACs描述於，例如，公開之US申請號20210015942、20210015929、20200392131、20200216507、US20200199247及US20190175612；其公開內容藉由援引併入本文。
配體 在一些實施例中，藥物單元包含可藉由羧基單元結合之配體，該配體例如鉑(Pt)、釕(Ru)、銠(Rh)、金(Au)、銀(Ag)、銅(Cu)、鉬(Mo)、鈦(Ti)或銥(Ir)；放射性同位素，例如釔-88、釔-90、鍀-99、銅-67、錸-188、錸-186、鎵-66、鎵-67、銦-111、銦-114、銦-115、鑥-177、鍶-89、釤-153及鉛-212。
載藥量 結合物可含有一或多個藥物單元/靶向單元。各靶向單元之藥物單元之數量被稱為載藥量。結合物之載藥量由p load表示，p load為結合物中各靶向單位(例如，抗體或抗原結合部分或非抗體支架或非抗體蛋白)之藥物單位(藥物分子(例如，細胞毒性劑))之平均數。例如，若p load為約4，則考慮至組合物中存在之所有靶向單元(例如，抗體或抗原結合部分或非抗體支架或非抗體蛋白)之平均載藥量為約4。在一些實施例中，p load為約3至約5、約3.6至約4.4或約3.8至約4.2。在一些實施例中，p load可為約3、約4或約5。在一些實施例中，p load為約6至約8、較佳更佳約7.5至約8.4。在一些實施例中，p load可為約6、約7或約8。在一些實施例中，p load為約8至約16。
製劑中各靶向單元(例如，抗體或抗原結合部分或非抗體支架)之藥物單元之平均數可藉由習知方法如UV、質譜、毛細管電泳(CE)及HPLC來表徵。亦可確定結合物在p load態樣之定量分佈。在一些情況下，均相結合物之分離、純化及表徵可藉由諸如反相HPLC或疏水相互作用層析(HIC) HPLC之方式實現，其中p load為來自具有其他載藥量之結合物之特定值。
示例性連接子及連接子單元-藥物單元組合 在一些實施例中，連接子中間體~L1-AA ≈具有以下通式： ~ L1 – AA  ≈ [190] 或其鹽，其中AA為具有1至12個亞單元之胺基酸單元，該亞單元選自α、β及γ胺基酸及其衍生物、糖單元、羧基單元及胺基酸亞單元(視情況被至少一個PEG單元取代)，其限制條件為胺基酸單元包含至少一個糖單元、PEG單元或羧基單元；L1為擴展單元；並且波形線(~)表示用於靶向單元之連接位點，以及雙波形(≈)線表示用於連接子亞單元L2之連接位點。在一些實施例中，胺基酸單元包含至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合；
在一些實施例中，連接子中間體~AA-L2≈具有以下通式： ~ AA - L2 ≈ [191] 或其鹽，其中AA為具有1至12個亞單元之胺基酸單元，該亞單元選自α、β及γ胺基酸及其衍生物、糖單元、羧基單元及胺基酸亞單元(視情況被至少一個PEG單元取代)；L2為視情況被至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合取代之連接子亞單元；波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點；以及雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點；其限制條件為~AA-L2≈包含至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合。
在一些實施例中，藥物連接子中間體~AA-L2-D具有以下通式： ~ AA - L2 - D [192] 或其鹽，其中AA為具有1至12個亞單元之胺基酸單元，該亞單元選自α、β及γ胺基酸及其衍生物、糖單元、羧基單元及胺基酸亞單元(視情況被至少一個PEG單元取代)；L2為視情況被至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合取代之連接子亞單元；D為藥物單元；並且波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點，其限制條件為-AA-L2-包含至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合。
在一些實施例中，連接子 ~-L1 - AA-L2 ≈具有以下通式： ~ L1 - AA - L2 ≈ [193] 或其鹽，其中L1為擴展單元；AA為具有1至12個亞單元之胺基酸單元，該亞單元選自α、β及γ胺基酸及其衍生物、糖單元、羧基單元及胺基酸亞單元(視情況被至少一個PEG單元取代)；L2為視情況被至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合取代之連接子亞單元；波形線(~)表示用於靶向單元之連接位點，雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點；其限制條件為-AA-L2≈包含至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合。在一些實施例中，L2連接至AA之亞單元之側鏈。
在一些實施例中，藥物連接子~-L1 - AA-L2 - D具有以下通式： ~ L1 - AA - L2 - D [194] 或其鹽，其中L1為擴展單元；AA為具有1至12個亞單元之胺基酸單元，該亞單元選自α、β及γ胺基酸及其衍生物、糖單元、羧基單元及胺基酸亞單元(視情況被至少一個PEG單元取代)；L2為視情況被至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合取代之連接子亞單元；D為藥物單元；並且波形線(~)表示用於靶向單元之連接位點；其限制條件為-AA-L2-包含至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合。在一些實施例中，L2連接至AA之亞單元之側鏈。
在一些實施例中，連接子中間體~L1-AA ≈具有以下通式： ~ L1 – [SU] ≈ [200] 或其鹽，其中[SU]為胺基酸單元，其中各SU為糖單元，L1為擴展單元，波形線(~)表示用於靶向單元之連接位點及雙波形(≈)線表示用於連接子亞單元L2之連接位點。
這種連接子中間體之示例性實施例包括以下：
Figure 02_image537
或其鹽，其中糖單元之右側之羧基基團為用於連接子亞單元L2之連接位點。
在一些實施例中，連接子中間體~L1-AA≈具有以下通式： ~ L1 – [SU – aa]  ≈ [202] 或其鹽，其中[SU-aa-]為胺基酸單元，其中各SU為糖單元並且aa為選自α、β及γ胺基酸及其衍生物之AA之視情況亞單元，L1為擴展單元、波形線(~)表示用於靶向單元之連接位點；並且雙波形(≈)線表示用於連接子亞單元L2之連接位點。在一些實施例中，aa為選自甘胺酸、賴胺酸及穀胺酸之胺基酸。在一些實施例中，[SU-aa]為[SU-Lys-]。
這種連接子中間體之示例性實施例包括以下：
Figure 02_image539
或其鹽，其中離胺酸之右側之羧基基團為用於連接子亞單元L2之連接位點。
在一些實施例中，連接子中間體~L1-AA≈具有以下通式： ~ L1 – [SU – aa - SU]  ≈ [204] 或其鹽，其中[SU-aa-SU]為胺基酸單元，其中各SU為糖單元並且aa為選自α、β及γ胺基酸及其衍生物之AA之亞單元，L1為擴展單元、波形線(~)表示用於靶向單元之連接位點，並且雙波形(≈)線表示用於連接子亞單元L2之連接位點。在一些實施例中，aa為選自甘胺酸、賴胺酸及穀胺酸之胺基酸。在一些實施例中，[SU-aa-SU]為[SU-Lys-SU]。
這種連接子中間體之示例性實施例包括以下：
Figure 02_image541
或其鹽，其中糖單元之右側之受保護的羧基基團為用於連接子亞單元L2之連接位點。
在一些實施例中，連接子中間體~AA-L2≈具有以下通式： ~ [SU – aa] - L2 ≈ [206] 或其鹽，其中[SU-aa]為胺基酸單元，其中各SU為糖單元並且aa為選自α、β及γ胺基酸及其衍生物之AA之視情況亞單元，L2為視情況被至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合取代之連接子亞單元，波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點，並且雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點。在一些實施例中，aa為選自甘胺酸、賴胺酸及穀胺酸之胺基酸。在一些實施例中，aa為離胺酸。在一些實施例中，[Su-aa]為[Su-Lys]。在一些實施例中，連接子亞單元L2為可裂解連接子亞單元。
這種連接子之示例性實施例包括以下：
Figure 02_image543
或其鹽，其中糖單元之左側之胺基基團為用於擴展單元之連接位點，並且右側之苄醇基團為用於藥物單元之連接位點。
在一些實施例中，連接子中間體~AA-L2≈具有以下通式： ~ [SU-aa-SU] | L2 ≈ [208] 或其鹽，其中[SU-aa-SU]為胺基酸單元，其中各SU為糖單元並且aa為選自α、β及γ胺基酸及其衍生物之AA之亞單元，L2為視情況被至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合取代之連接子亞單元，並且L2連接至aa之位點，波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點，並且雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點。在一些實施例中，aa為選自甘胺酸、賴胺酸及穀胺酸之胺基酸。在一些實施例中，aa為離胺酸。在一些實施例中，[Su-aa-Su]為[Su-Lys-Su]。在一些實施例中，連接子亞單元L2為可裂解連接子亞單元。
這種連接子中間體之示例性實施例包括以下：
Figure 02_image545
或其鹽，其中糖單元之左側之胺基基團為用於擴展單元之連接位點，並且藥物單元連接至末端酸基團或苄醇(亦即，H自苄醇中移除，並且在苄氧與藥物單元之間形成鍵)。
在一些實施例中，連接子具有以下通式： ~ L1 – [SU-aa] – L2 ≈ [210] 或其鹽，其中[SU-aa-SU]為胺基酸單元，其中各SU為糖單元並且aa為選自α、β及γ胺基酸及其衍生物之AA之視情況亞單元，L1為擴展單元，L2為視情況被至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合取代之連接子亞單元，並且L2連接至aa之位點或者連接至SU，波形線(~)表示用於靶向單元之連接位點，雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點。在一些實施例中，aa為選自甘胺酸、賴胺酸及穀胺酸之胺基酸。在一些實施例中，aa存在並且為離胺酸。
這種連接子之示例性實施例包括以下：
Figure 02_image547
或其鹽，其中糖單元之左側之順丁烯二醯亞胺基團為用於靶向單元之連接位點，並且藥物單元連接至苄醇(亦即，H自苄醇中移除，並且在苄氧與藥物單元之間形成鍵)。
在一些實施例中，連接子具有以下通式： ~ L1 – [SU-aa-SU] – L2 ≈ [212] 或其鹽，其中[SU-aa-SU]為胺基酸單元，其中各SU為糖單元並且aa為選自α、β及γ胺基酸及其衍生物之AA之視情況亞單元，L1為擴展單元，L2為視情況被至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合取代之連接子亞單元，並且L2連接至AA，波形線(~)表示用於靶向單元之連接位點，並且雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點。在一些實施例中，aa為選自甘胺酸、賴胺酸及穀胺酸之胺基酸。在一些實施例中，aa存在並且為離胺酸。
這種連接子之示例性實施例包括以下：
Figure 02_image549
或其鹽，其中糖單元之左側之順丁烯二醯亞胺基團為用於靶向單元之連接位點，並且藥物單元連接至苄醇(亦即，H自苄醇中移除，並且在苄氧與藥物單元之間形成鍵)。
在一些實施例中，連接子具有以下通式： ~ L1 – [SU-aa-SU] | L2 ≈ [214] 或其鹽，其中[SU-aa-SU]為胺基酸單元，其中各SU為糖單元並且aa為選自α、β及γ胺基酸及其衍生物之AA之亞單元，L1為擴展單元，L2為視情況被至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合取代之連接子亞單元，L2連接至aa之位點，波形線(~)表示用於靶向單元之連接位點，並且雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點。在一些實施例中，aa為選自甘胺酸、賴胺酸及穀胺酸之胺基酸。在一些實施例中，aa存在並且為離胺酸。
這種連接子之示例性實施例包括以下：
Figure 02_image551
Figure 02_image553
或其鹽，其中糖單元之左側之順丁烯二醯亞胺或溴代乙醯胺基團為用於靶向單元之連接位點，並且藥物單元連接至末端酸基團或苄醇(亦即，H自苄醇中移除，並且在苄氧與藥物單元之間形成鍵)。
在一些實施例中，藥物-連接子中間體~AA-L2-D具有以下通式： ~ [SU – aa] - L2 -D [216] 或其鹽，其中[SU-aa]為胺基酸單元，其中各SU為糖單元並且aa為選自α、β及γ胺基酸及其衍生物之AA之視情況亞單元，L2為視情況被至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合取代之連接子亞單元，D為藥物單元，並且波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點。在一些實施例中，aa為選自甘胺酸、賴胺酸及穀胺酸之胺基酸。在一些實施例中，aa為離胺酸。在一些實施例中，[Su-aa]為[Su-Lys]。在一些實施例中，連接子亞單元L2為可裂解連接子亞單元。
這種藥物-連接子之示例性實施例包括以下：
Figure 02_image555
或其鹽，其中糖單元之左側之胺基基團為用於擴展單元之連接位點。
在一些實施例中，藥物-連接子中間體~AA-L2-D具有以下通式： ~ [SU-aa-SU] | L2 - D [218] 或其鹽，其中[SU-aa-SU]為胺基酸單元，其中各SU為糖單元並且aa為選自α、β及γ胺基酸及其衍生物之AA之亞單元，L2為視情況被至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合取代之連接子亞單元，並且L2連接至aa之位點，D為藥物單元，並且波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點。在一些實施例中，aa為選自甘胺酸、賴胺酸及穀胺酸之胺基酸。在一些實施例中，aa為離胺酸。在一些實施例中，[Su-aa-Su]為[Su-Lys-Su]。在一些實施例中，連接子亞單元L2為可裂解連接子亞單元。
這種藥物-連接子中間體之示例性實施例包括以下：
Figure 02_image557
Figure 02_image559
或其鹽，其中糖單元之左側之胺基基團為用於擴展單元之連接位點。
在一些實施例中，連接子中間體~AA-L2~具有以下通式： ~ [SU - aa(PEG) - SU] – L2 ≈ [220] 或其鹽，其中[SU-aa(PEG)-SU]為胺基酸單元，其中各SU為糖單元並且aa為選自α、β及γ胺基酸及其衍生物之AA之亞單元，PEG為連接至aa之PEG單元，L2為視情況被至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合取代之連接子亞單元，L2連接至AA，波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點，並且雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點。在一些實施例中，aa為選自甘胺酸、賴胺酸及穀胺酸之胺基酸。在一些實施例中，aa為離胺酸。在一些實施例中，連接子亞單元L2為可裂解連接子亞單元。
這種連接子中間體之示例性實施例包括以下：
Figure 02_image561
或其鹽，其中糖單元之左側之胺基基團為用於擴展向單元之連接位點，並且藥物單元連接至苄醇(亦即，H自苄醇中移除，並且在苄氧與藥物單元之間形成鍵)。
在一些實施例中，藥物-連接子中間體~AA-L2-D具有以下通式： ~ [SU - aa(PEG) - SU] – L2 -D [222] 或其鹽，其中[SU-aa(PEG)-SU]為胺基酸單元，其中各SU為糖單元，aa為選自α、β及γ胺基酸及其衍生物之AA之亞單元，PEG為連接至aa之PEG單元，L2為視情況被至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合取代之連接子亞單元，L2連接至AA，D為藥物單元，並且波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點。在一些實施例中，aa為選自甘胺酸、賴胺酸及穀胺酸之胺基酸。在一些實施例中，aa為離胺酸。在一些實施例中，連接子亞單元L2為可裂解連接子亞單元。
這種藥物-連接子中間體之示例性實施例包括以下：
Figure 02_image563
或其鹽，其中糖單元之左側之胺基基團為用於擴展單元之連接位點。
在一些實施例中，連接子中間體~AA-L2≈具有以下通式： ~ [aa(PEG)] – L2 ≈ [224] 或其鹽，其中[aa(PEG)]為胺基酸單元，其中aa為選自α、β及γ胺基酸及其衍生物之AA之亞單元，PEG為連接至aa之PEG單元，L2為視情況被至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合取代之連接子亞單元，L2連接至AA，波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點，並且雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點。在一些實施例中，aa為選自甘胺酸、賴胺酸及穀胺酸之胺基酸。在一些實施例中，aa為離胺酸。在一些實施例中，連接子亞單元L2為可裂解連接子亞單元。
這種連接子中間體之示例性實施例包括以下：
Figure 02_image565
Figure 02_image567
或其鹽，其中分子之左側之胺基基團為用於擴展單元之連接位點。
在一些實施例中，提供了連接子中間體或連接子，其中~AA-L2~具有以下結構中之一種：
Figure 02_image569
Figure 02_image571
Figure 02_image573
Figure 02_image575
Figure 02_image577
Figure 02_image579
Figure 02_image581
Figure 02_image583
Figure 02_image585
Figure 02_image587
Figure 02_image589
Figure 02_image591
Figure 02_image593
Figure 02_image595
Figure 02_image597
Figure 02_image599
Figure 02_image601
其中各Z在*處連接並且分別選自：
Figure 02_image603
，
Figure 02_image605
，以及
Figure 02_image607
； 或其鹽，其中胺基基團上之波形線表示用於擴展單元之連接位點，並且藥物單元連接至苄醇(亦即，苄醇之H被與藥物單元之鍵替代)。
在一些實施例中，藥物-連接子中間體~AA-L2-D具有以下通式： ~ [aa(PEG)] – L2 -D [226] 或其鹽，其中[aa(PEG)]為胺基酸單元，其中aa為選自α、β及γ胺基酸及其衍生物之AA之亞單元，PEG為連接至aa之PEG單元，L2為視情況被至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合取代之連接子亞單元，L2連接至AA，D為藥物單元，並且波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點。在一些實施例中，aa為選自甘胺酸、賴胺酸及穀胺酸之胺基酸。在一些實施例中，aa為離胺酸。在一些實施例中，連接子亞單元L2為可裂解連接子亞單元。
這種藥物-連接子中間體之示例性實施例包括以下：
Figure 02_image609
Figure 02_image611
Figure 02_image613
或其鹽，其中分子之左側之胺基基團為用於擴展單元之連接位點。
在一些實施例中，連接子中間體~ L2 ≈具有以下通式： ~ L2 ≈ | PEG [228] 或其鹽，其中胺基酸單元不存在，L2為連接子亞單元，PEG為連接至L2之PEG單元，波形(~)線表示用於擴展單元之連接位點，並且雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點。在一些實施例中，PEG單元連接至選自離胺酸、穀胺酸及瓜胺酸之胺基酸。在一些實施例中，連接子亞單元L2為可裂解連接子亞單元。
這種連接子中間體之示例性實施例包括以下：
Figure 02_image615
或其鹽，其中分子之左側之胺基基團為用於擴展單元之連接位點。
在一些實施例中，藥物-連接子中間體~ L2-D具有以下通式： ~ L2 -D | PEG [230] 或其鹽，其中胺基酸單元不存在，L2為連接子亞單元，D為藥物單元，PEG為連接至L2之PEG單元，波形線(~)表示用於擴展單元或胺基酸單元之連接位點。在一些實施例中，PEG單元連接至選自離胺酸、穀胺酸及瓜胺酸之胺基酸。在一些實施例中，連接子亞單元L2為可裂解連接子亞單元。
這種藥物-連接子中間體之示例性實施例包括以下：
Figure 02_image617
或其鹽，其中分子之左側之胺基基團為用於擴展單元之連接位點。
在一些實施例中，連接子中間體~AA-L2≈具有以下通式： ~ [CU] – L2 ≈ [232] 或其鹽，其中[CU]為胺基酸單元，其中CU為羧基單元，L2為視情況被至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合取代之連接子亞單元，L2連接至AA，並且波形(~)線表示用於擴展單元之連接位點，並且雙波形線(≈)表示用於藥物單元之連接位點。在一些實施例中，連接子亞單元L2為可裂解連接子亞單元。
這種連接子中間體之示例性實施例包括以下：
Figure 02_image619
或其鹽，其中分子之左側之胺基基團為用於擴展向單元之連接位點，並且藥物單元連接至苄醇(亦即，H自苄醇中移除，並且在苄氧與藥物單元之間形成鍵)。
在一些實施例中，藥物-連接子中間體~AA-L2-D具有以下通式： ~ [CU] – L2 -D [234] 或其鹽，其中[CU]為胺基酸單元，其中CU為羧基單元，L2為視情況被至少一個糖單元、PEG單元、羧基單元或其組合取代之連接子亞單元，L2連接至AA，D為藥物單元，並且波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點。在一些實施例中，連接子亞單元L2為可裂解連接子亞單元。
這種藥物-連接子中間體之示例性實施例包括以下：
Figure 02_image621
或其鹽，其中分子之左側之胺基基團為用於擴展單元之連接位點。
在一些實施例中，藥物-連接子中間體~ L2-D具有以下通式： ~ L2[CU] -D [236] 或其鹽，其中L2為包含羧基單元[CU]之連接子亞單元，D為藥物單元，並且波形線(~)表示用於胺基酸單元或擴展單元之連接位點。在一些實施例中，連接子亞單元L2為可裂解連接子亞單元。
這種藥物-連接子中間體之示例性實施例包括以下
Figure 02_image623
或其鹽，其中分子之左側之胺基基團為用於胺基酸單元或擴展單元之連接位點。
在連接子或連接子中間體具有前述式[190]至式[236]之一些實施例中，連接子亞單元L2為可裂解連接子亞單元。
在連接子或連接子中間體具有前述式[190]至式[236]之一些實施例中，連接子亞單元L2為具有肽之可裂解連接子亞單元，該肽選自纈胺酸-瓜胺酸、苯丙胺酸-離胺酸、丙胺酸-賴胺酸及甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-離胺酸。
藥物-連接子與抗體、抗原結合部分及其他結合劑(包括非抗體支架)之連接 用於藉由連接子將藥物單元連接至靶向單元(例如，抗體或其抗原結合部分或非抗體支架)之技術為本領域熟知的。參見，例如，Alley等人，Current Opinion in Chemical Biology 2010 14:1-9；Senter，Cancer J.，2008，14(3):154-169。在一些實施例中，連接子首先連接至藥物單元(例如，細胞毒性劑、免疫調節劑或其他試劑)，隨後藥物-連接子連接至靶向單元(例如，抗體或其抗原結合部分或非抗體蛋白支架)。在一些實施例中，連接子首先連接至靶向單元(例如，抗體或其抗原結合部分或非抗體蛋白支架)，隨後藥物單元連接至連接子。在以下討論中，術語藥物-連接子用於舉例說明連接子或藥物-連接子與靶向單元之連接；本領域技術人員將理解，所選擇之連接方法可根據連接子及藥物單元來判定。在一些實施例中，藥物單元藉由連接子以降低藥物單元之活性直至其自結合物中釋放(例如，藉由水解、藉由蛋白水解降解或藉由裂解劑)之方式連接至靶向單元。
通常，結合物可藉由使用本領域技術人員已知的有機化學反應、條件及試劑之幾種途徑製備，包括：(1) 使靶向單元(例如，抗體或其抗原結合部分或非抗體蛋白支架)之親核基團與二價連接子反應以經由共價鍵形成靶向單元-連接子中間體，隨後與藥物單元反應；以及(2) 使藥物單元之親核基團與二價連接子反應，以經由共價鍵形成藥物-連接子，隨後與靶向單元之親核基團反應。藉由後一種途徑製備結合物之示例性方法描述於美國專利號7,498,298中，其藉由引用明確地併入本文。
靶向單元(例如，抗體、抗原結合部分及其他結合劑(包括非抗體支架))上之親核基團包括但不限於：(i) N-末端胺基團，(ii) 側鏈胺基團，例如離胺酸，(iii) 側鏈硫醇基團，例如半胱胺酸，以及(iv) 糖羥基或胺基基團，其中抗體被糖基化。胺、硫醇及羥基基團為親核的，並且能夠與連接子上之親電基團反應形成共價鍵，該親電基團包括：(i) 活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯及醯基鹵；(ii) 烷基鹵化物及苄基鹵化物，例如鹵代乙醯胺；及(iii) 醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基團。某些靶向單元(例如抗體(以及抗原結合部分及其他結合劑(包括非抗體支架)))具有可還原的鏈間二硫鍵，亦即半胱胺酸橋。藉由用還原劑如DTT (二硫蘇糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)處理使得抗體被完全或部分還原，可使抗體(以及抗原結合部分及其他結合劑(包括非抗體支架))具有與連接子結合之反應性。因此，理論上，各半胱胺酸橋將形成兩個反應性硫醇親核體。另外之親核基團可藉由離胺酸殘基之修飾，例如藉由離胺酸殘基與2-亞胺基硫雜環戊烷(Traut試劑)反應，導致胺轉化成硫醇而引入至靶向單元(例如，抗體(以及抗原結合部分及其他結合劑(包括非抗體支架)))中。藉由引入一個、兩個、三個、四個或更多個半胱胺酸殘基(例如，藉由製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之抗體、抗原結合部分及其他結合劑(包括非抗體支架))，亦可將反應性硫醇基團引入靶向單元(例如，抗體及抗原結合部分以及其他結合劑(包括非抗體支架))。
結合物亦可藉由靶向單元上之親電基團(例如，醛或酮羰基)與連接子試劑上之親核基團之間之反應來產生。連接子試劑上有用的親核基團包括但不限於醯肼、肟、胺基、肼、縮胺基硫脲、肼羧基及芳醯肼。在實施例中，修飾抗體(或其抗原結合部分或其他結合劑(包括非抗體支架))以引入能夠與連接子上之親核取代基反應的親電部分。在另一個實施例中，糖基化抗體之糖可被氧化，例如用高碘酸鹽氧化試劑，以形成醛基或酮基，其可與連接子之胺基團反應。所得亞胺席夫鹼基團可形成穩定的鍵，或者可以例如藉由硼氫化物試劑還原以形成穩定的胺鍵。在一個實施例中，糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉之反應可在抗體(或其抗原結合部分或其他結合劑(包括非抗體支架))中產生羰基(醛及酮)基團，其可與連接子上之適當基團反應(參見，例如，Hermanson, Bioconjugate Techniques)。在另一個實施例中，靶向單元(例如，含有N-末端絲胺酸或蘇胺酸殘基之抗體)可與偏高碘酸鈉反應，導致產生醛代替第一個胺基酸(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；US 5362852)。這種醛可與連接子反應。
藥物單元(例如，細胞毒性劑)上之示例性親核基團包括但不限於：胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、縮胺基硫脲、肼羧基及芳醯肼基團，其能夠與連接子上之親電基團反應以形成共價鍵，該親電基團包括：(i) 活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯及醯基鹵；(ii) 烷基鹵化物及苄基鹵化物，例如鹵代乙醯胺；(iii) 醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基團。
在一些實施例中，藥物-連接子連接至抗體(或其抗原結合部分或其他結合劑(包括非抗體支架))之鏈間半胱胺酸殘基。參見，例如，WO2004/010957及WO2005/081711。在此類實施例中，連接子通常包含用於連接鏈間二硫鍵之半胱胺酸殘基的順丁烯二醯亞胺基團。在一些實施例中，連接子或藥物-連接子連接至抗體或其抗原結合部分之半胱胺酸殘基，如美國專利號7,585,491或8,080,250中所描述。所得結合物之載藥量通常為1至8或1至16。
在一些實施例中，連接子或藥物-連接子連接至抗體(或其抗原結合部分或其他結合劑之離胺酸或半胱胺酸殘基)，如WO2005/037992或WO2010/141566中所描述。所得結合物之載藥量通常為1至8。
在一些實施例中，工程化之半胱胺酸殘基、聚組胺酸序列、糖工程化標籤或轉穀胺醯胺酶識別序列可用於連接子或藥物-連接子與抗體或其抗原結合部分或其他結合劑(包括非抗體支架)之位點特異性連接。
在一些實施例中，藥物-連接子在Fc殘基處連接至工程化之半胱胺酸殘基，而非鏈間二硫鍵。在一些實施例中，藥物-連接子與在重鏈之位置118、221、224、227、228、230、231、223、233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、249、250、258、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、275、276、278、280、281、283、285、286、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、302、305、313、318、323、324、325、327、328、329、330、331、332、333、335、336、396及/或428處及/或輕鏈之位置106、108、142 (輕鏈)、149 (輕鏈)及/或位置V205處引入至IgG (通常為IgG1)之工程化半胱胺酸連接，根據Kabat之EU編號。使用工程化半胱胺酸之位點特異性結合之示例性替代為S239C (參見，例如，US 20100158909；Fc區之編號根據EU索引)。
在一些實施例中，連接子或藥物-連接子連接至抗體(或其抗原結合部分或其他結合劑(包括非抗體支架))之一或多個引入之半胱胺酸殘基，如WO2006/034488、WO2011/156328及/或WO2016040856中所描述。
在一些實施例中，使用細菌轉穀胺醯胺酶之位點特異性結合之示例性替代為Fc區之N297S或N297Q。在一些實施例中，連接子或藥物-連接子連接至抗體或其抗原結合部分或糖工程化抗體(包括非抗體支架)之聚糖或修飾之聚糖。參見，例如，WO2017/147542、WO2020/123425、WO2020/245229、WO2014/072482；WO2014//065661、WO2015/057066及WO2016/022027；其公開內容藉由引用併入本文。
在一些實施例中，連接子或藥物-連接子經由分選酶A連接子連接至抗體、抗原結合部分或其他結合劑(包括非抗體支架)。分選酶A連接子可藉由分選酶A酶將LPXTG識別基序(SEQ ID NO: 5)與N-末端GGG基序融合以再生天然醯胺鍵來產生。
在一些實施例中，使用SMARTag技術將連接子或藥物-連接子連接至抗體、抗原結合部分或其他結合劑(包括非抗體支架)上，其中藉由包埋在特定肽序列(CxPxR)中之半胱胺酸殘基之氧化將生物正交醛柄引入至攜帶醛之甲醯基甘胺酸(fGly)中。這種酶促修飾藉由產生甲醯基甘胺酸之酶(FGE)進行。參見，例如，Liu等人，Methods Mol. Biol. 2033:131-147 (2019)。
在一些實施例中，使用半胱胺酸與四級銨化乙烯基吡啶及炔基吡啶結合，將連接子或藥物-連接子連接至抗體、抗原結合部分或其他結合劑(包括非抗體支架)。參見，例如，Matos等人，Angew Chem. Int. Ed. Engl. 58:6640-6644 (2019)。
在其他實施例中，使用雙順丁烯二醯亞胺、C-lock或K-lock方法，將連接子或藥物-連接子連接至抗體、抗原結合部分或其他結合劑(包括非抗體支架)。
藥物製劑 結合物之其他態樣涉及包含活性成分之組合物，該活性成分包括本文所描述之任何結合物。在一些實施例中，組合物為醫藥組合物。如本文使用，術語「醫藥組合物」係指活性劑與被接收用於製藥工業之醫藥學上可接受之載體之組合。本文使用的片語「醫藥學上可接受之」係指在合理的醫學判斷範圍內，適合與人類及動物之組織接觸而無過度之毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，符合合理的收益/風險比之彼等化合物、材料、組合物及/或劑型。
含有溶解或分散於其中之活性成分之醫藥組合物的製備為本領域熟知的，並且不需要基於任何特定的製劑來限制。典型地，這種組合物被製備為可注射的液體溶液或懸浮液；然而，亦可製備適於在使用前在液體中再水合之固體形式或懸浮液。製劑亦可被乳化或作為脂質體組合物提供。結合物可與醫藥學上可接受之且與活性成分相容之賦形劑混合，其量適合用於本文所描述之治療方法。合適之賦形劑為，例如，水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等及其組合。此外，若需要，醫藥組合物可含有少量之輔助物質，例如濕潤劑或乳化劑、pH緩衝劑等，其增強或維持活性成分(例如，結合物)之有效性。如本文所描述之醫藥組合物可包含其中組分之醫藥學上可接受之鹽。醫藥學上可接受之鹽包括與無機酸(例如，鹽酸或磷酸)或有機酸(例如，乙酸、酒石酸、扁桃酸等)形成之酸加成鹽(與多肽之游離胺基基團形成)。與游離羧基基團形成之鹽亦可衍生自無機鹼(例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵)及有機鹼(例如，異丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因等)。生理學上可耐受之載體為本領域熟知的。示例性液體載體為無菌水溶液，其含有活性成分(例如，結合物)及水，並且可含有緩衝劑，例如在生理pH值之磷酸鈉、生理鹽水或兩者，例如磷酸鹽緩衝鹽水。此外，水性載體可含有一種以上之緩衝鹽，以及諸如氯化鈉及氯化鉀之鹽、右旋糖、聚乙二醇及其他溶質。除了水之外，液體組合物亦可包含液相。這種附加液相之實例為甘油、諸如棉籽油之植物油及水-油乳液。將有效治療特定病症或病症之活性劑之量將取決於疾患或病症之性質，並且可藉由標準臨床技術來判定。
在一些實施例中，包含結合物之醫藥組合物可為凍乾物。
在一些實施例中，提供了包含治療有效量之結合物之注射器。
癌症治療 在一些實施例中，如本文所描述之結合物可用於包括向有需要之受試者(例如，患有癌症之受試者)投與如本文所描述之結合物之方法。
在一些實施例中，提供了治療癌症之方法，其包括投與結合物。在一些實施例中，受試者需要治療癌症及/或惡性腫瘤。在一些實施例中，該方法用於治療患有癌症或惡性腫瘤之受試者。
本文所描述之方法包括向患有癌症或惡性腫瘤之受試者投與治療有效量之結合物。如本文使用，片語「治療有效量」、「有效量」或「有效劑量」係指在癌症或惡性腫瘤之治療、控制或復發預防中提供治療益處之結合物之量，例如提供腫瘤或惡性腫瘤之至少一種症狀、體徵或標誌物之統計學上顯著降低之量。治療有效量之判定完全在本領域技術人員的能力範圍內。通常，治療有效量可隨受試者之病史、年齡、病症、性別以及受試者之醫學病症之嚴重程度及類型以及其他藥物活性劑之投與而變化。
術語「癌症」及「惡性腫瘤」係指干擾身體器官及系統之正常功能之細胞之不受控制的生長。癌症或惡性腫瘤可為原發性的或轉移性的，亦即其已經變成侵入性的，在遠離原始腫瘤部位之組織中播種腫瘤生長。「腫瘤」係指干擾身體器官及系統之正常功能之細胞之不受控制的生長。患有癌症之受試者為具有存在於受試者體內之可客觀量測之癌細胞之受試者。在該定義中包括良性腫瘤及惡性癌症，以及潛在的休眠腫瘤及微轉移。自其之原始位置遷移並播種其他重要器官之癌症最終可藉由受影響器官之功能退化而導致受試者之死亡。血液系統惡性腫瘤(造血系統癌症)，例如白血病及淋巴瘤，能夠例如使受試者中之正常造血區室失去競爭力，從而導致造血功能衰竭(以貧血、血小板減少症及嗜中性白血球減少症之形式)，最終導致死亡。
癌症之實例包括但不限於癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。此類癌症之更具體之實例包括但不限於基底細胞癌、膽道癌、膀胱癌、骨癌、腦及CNS癌、乳癌(例如，三陰性乳癌)、腹膜癌、宮頸癌；膽管癌、絨毛膜癌、軟骨肉瘤、結腸及直腸癌(大腸直腸癌)、結締組織癌、消化系統癌、子宮內膜癌、食道癌、眼癌、頭頸癌、胃癌(包括胃腸癌及胃癌)、成膠質細胞瘤(GBM)、肝癌、肝細胞瘤、上皮內腫瘤、腎或腎臟癌(例如，透明細胞癌)、喉癌、白血病、肝癌、肺癌(例如，小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀細胞癌)、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤及非霍奇金淋巴瘤)、黑色素瘤、間皮瘤、骨髓瘤、成神經細胞瘤、口腔癌(例如，唇癌、舌癌、嘴癌及咽癌)、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、視網膜細胞瘤、橫紋肌肉瘤、呼吸系統癌、唾液腺癌、肉瘤、皮膚癌、鱗狀細胞癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮或子宮內膜癌、嚴重子宮癌、泌尿系統癌、外陰癌；以及其他癌及肉瘤，以及B細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴細胞(SL)NHL、中級/濾泡性NHL、中級瀰漫性NHL、進階免疫母細胞NHL、進階淋巴母細胞NHL、進階小非裂解細胞NHL、大包塊疾病NHL、套細胞淋巴瘤、AIDS相關淋巴瘤及瓦登斯特陸巨球蛋白血症)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、毛細胞白血病、慢性成髓細胞白血病及移植後淋巴增殖性疾病(PTLD)，以及與母斑細胞病相關之異常血管增殖、水腫(例如與腦腫瘤相關之水腫)及梅格斯症候群。
預期本文之方法減少受試者中之腫瘤大小或腫瘤負荷，及/或減少受試者中之轉移。在各種實施例中，受試者中之腫瘤大小降低約25至50%、約40至70%或約50至90%或更多。在各種實施例中，該方法將腫瘤大小減小10%、20%、30%或更多。在各種實施例中，該方法將腫瘤大小減小10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
在一些實施例中，受試者需要用抗-FOLRI結合物治療癌症及/或惡性腫瘤。在具體實施例中，抗-FOLRI結合物包含抗體F131 (VH SEQ ID NO: 26及VL SEQ ID NO: 27)。在具體實施例中，抗-FOLR1結合物包含F131抗體及LD038連接子-藥物。在一些實施例中，受試者需要治療FOLR1+癌症或FOLR1+惡性腫瘤，例如肺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、乳癌、子宮癌、宮頸癌、子宮內膜癌、胰臟癌及腎細胞癌。在一些實施例中，該方法用於治療患有FOLR1+癌症或惡性腫瘤之受試者。在一些實施例中，該方法用於治療受試者之肺癌。在一些實施例中，該方法用於治療受試者之非小細胞肺癌。在一些實施例中，該方法用於治療受試者之乳癌。在一些實施例中，該方法用於治療受試者之卵巢癌。在一些實施例中，該方法用於治療受試者之宮頸癌。在一些實施例中，該方法用於治療受試者之子宮內膜癌。在一些實施例中，該方法用於治療受試者之腎細胞癌。在一些實施例中，該方法用於治療受試者之子宮癌。在一些實施例中，該方法用於治療受試者之胰臟癌。
如本文使用，「受試者」係指人或動物。通常，該動物為脊椎動物，例如靈長類動物、嚙齒類動物、家畜或狩獵動物。靈長類動物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴及獼猴，例如恆河猴。嚙齒類動物包括小鼠、大鼠、土撥鼠、雪貂、兔及倉鼠。家畜及狩獵動物包括牛、馬、豬、鹿、野牛、水牛，貓科動物(例如家貓)、犬科動物(例如狗、狐、狼)、鳥類(例如雞、鴯鶓、鴕鳥)及魚類(例如鱒魚、鯰魚及鮭魚)。在某些實施例中，受試者為哺乳動物，例如靈長類動物，例如人類。術語「患者」、「個體」及「受試者」在本文中可互換使用。
較佳地，受試者為哺乳動物。哺乳動物可為人類、非人類靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛，但不限於此等實例。除人類以外之哺乳動物可有利地用作例如代表例如各種癌症之動物模型之受試者。此外，本文所描述之方法可用於治療馴養之動物及/或寵物。受試者可為男性或女性。在某些實施例中，受試者為人類。
在一些實施例中，受試者可為先前已診斷患有或鑑定為患有癌症且需要治療之受試者，但不必已經經歷癌症之治療。在一些實施例中，受試者亦可為先前未被診斷為患有需要治療之癌症之受試者。在一些實施例中，受試者可為表現出病症之一或多種風險因素或者與癌症相關之一或多種併發症之受試者，或者未表現出風險因素之受試者。「需要」治療癌症之「受試者」特別可為患有該病症或被診斷為患有該病症之受試者。在其他實施例中，「有風險罹患」癌症之受試者係指被診斷為有風險罹患病症或有風險再次患有病症之受試者。
如本文使用，術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」、「治療(treatment)」或「改善」當用於提及疾病、疾患或醫學病症時，係指對病症之治療性治療，其中該目的在於逆轉、減輕、改善、抑制、減緩或停止症狀或病症之進展或嚴重程度。術語「治療」包括減少或減輕病症之至少一種副作用或症狀。若一或多種症狀或臨床標誌物減少，治療通常為「有效的」。替代地，若病症之進展減少或停止，則治療為「有效的」。換而言之，「治療」不僅包括症狀或標誌物之改善，亦包括停止或至少減緩在未治療之情況下預期之症狀之進展或惡化。有益之或期望之臨床結果包括但不限於受試者之癌細胞之減少、一或多種症狀之減輕、缺陷程度之減少、癌症或惡性腫瘤之穩定(亦即，不惡化)狀態、腫瘤生長及/或轉移之延遲或減慢、以及與未治療之情況下所預期之相比壽命增加。如本文所用，術語「投與」係指藉由導致結合物與癌細胞或惡性細胞結合之方法或途徑向受試者提供如本文所描述之結合物。類似地，包含如本文所描述之結合物之醫藥組合物可藉由產生受試者之有效治療之任何合適之途徑投與。
結合物之用量範圍取決於效力，並且涵蓋足夠大以產生所需效果(例如，腫瘤生長減慢或腫瘤大小減小)之量。用量不應大到引起不可接受之不良副作用。通常，用量將隨受試者之年齡、病症及性別而變化，並且可由本領域技術人員判定。在任何併發症之情況下，用量亦可由單獨的醫師調節。在一些實施例中，用量為0.1 mg/kg體重至10 mg/kg體重。在一些實施例中，用量為0.5 mg/kg體重至15 mg/kg體重。在一些實施例中，用量為0.5 mg/kg體重至5 mg/kg體重。替代地，可滴定以維持血清含量之劑量範圍為1 μg/mL至1000 μg/mL。為了全身投與，可向受試者投與，例如，0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、12 mg/kg或更多的治療量。
可重複上述劑量之投與。在較佳實施例中，上述劑量可每週、每兩週、每三週或每月投與，持續數週或數月。治療之持續時間取決於受試者之臨床進展及對治療之回應。
在一些實施例中，劑量可為約0.1 mg/kg至約100 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約0.1 mg/kg至約25 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約0.1 mg/kg至約20 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約0.1 mg/kg至約15 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約0.1 mg/kg至約12 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約1 mg/kg至約100 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約1 mg/kg至約25 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約1 mg/kg至約20 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約1 mg/kg至約15 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約1 mg/kg至約12 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約1 mg/kg至約10 mg/kg。
在一些實施例中，可靜脈內投與劑量。在一些實施例中，靜脈內投與可為在約10分鐘至約4小時之時間段內進行之輸注。在一些實施例中，靜脈內投與可為在約30分鐘至約90分鐘之時間段內進行之輸注。
在一些實施例中，可每週投與一劑量。在一些實施例中，可每兩週投與一劑量。在一些實施例中，可約每兩週投與一劑量。在一些實施例中，可約每三週投與一劑量。在一些實施例中，可每四週投與一劑量。
在一些實施例中，向受試者投與總共約2至約10個劑量。在一些實施例中，投與總共4個劑量。在一些實施例中，投與總共5個劑量。在一些實施例中，投與總共6個劑量。在一些實施例中，投與總共7個劑量。在一些實施例中，投與總共8個劑量。在一些實施例中，投與總共9個劑量。在一些實施例中，投與總共10個劑量。在一些實施例中，投與總共大於10個劑量。
含有結合物之醫藥組合物可以以單位劑量投與。術語「單位劑量」當使用涉及醫藥組合物時係指適於作為受試者之單位用量之實體上離散之單位，各單位含有預定量之活性物質(例如，結合物)，其經計算與所需生理學上可接受之稀釋劑(亦即，載體或媒介物)結合產生所需之治療效果。
自身免疫性疾病之治療 在一些實施例中，如本文所描述之結合物可用於包括向有需要之受試者(例如，患有自身免疫性疾病之受試者)投與結合物之方法。
在一些實施例中，提供了治療自身免疫性疾病之方法，包括投與如本文所描述之結合物。在一些實施例中，受試者需要治療自身免疫性疾病。本文所描述之方法包括向患有自身免疫性疾病之受試者投與治療有效量之結合物。如本文使用，片語「治療有效量」、「有效量」或「有效劑量」係指在自身免疫性疾病之治療、控制或復發預防中提供治療益處之如本文所描述之結合物之量，例如提供自身免疫性疾病之至少一種症狀、體徵或標誌物之統計學上顯著降低之量。治療有效量之判定完全在本領域技術人員的能力範圍內。通常，治療有效量可隨受試者之病史、年齡、病症、性別以及受試者之醫學病症之嚴重程度及類型以及其他藥物活性劑之投與而變化。
術語「自身免疫性疾病」係指以干擾身體器官及系統之正常功能之免疫細胞(例如，淋巴細胞或樹突細胞)之不適當活化為特徵之免疫疾病。自身免疫性疾病之實例包括但不限於類風濕性關節炎、銀屑病關節炎、自身免疫性脫髓鞘疾病(例如，多發性硬化症、過敏性腦脊髓炎)、內分泌性眼病、葡萄膜視網膜炎、系統性紅斑狼瘡、重症肌無力、格雷夫斯病、腎小球腎炎、自身免疫性肝病、炎性腸病(例如，克羅恩病)、過敏反應、變態反應、乾燥症候群、I型糖尿病、原發性膽汁性肝硬化、韋格納氏肉芽腫病、纖維肌痛、多肌炎、皮肌炎、多發性內分泌衰竭、施密特氏症候群、自身免疫性葡萄膜炎、艾迪生病、腎上腺炎、甲狀腺炎、橋本氏甲狀腺炎、自身免疫性甲狀腺疾病、惡性貧血、胃萎縮、慢性肝炎、狼瘡性肝炎、動脈粥樣硬化、亞急性皮膚紅斑狼瘡、甲狀旁腺功能減退症、德雷斯勒症候群、自身免疫性血小板減少症、特發性血小板減少性紫癜、溶血性貧血、尋常型天疱瘡、天疱瘡、疱疹樣皮炎、斑禿、類天疱瘡、硬皮病、進行性系統性硬化症、CREST症候群(鈣質沉著症、雷諾氏現象、食管運動障礙、硬皮病)及毛細血管擴張症)、男性及女性自身免疫性不孕不育症、強直性脊柱炎、潰瘍性結腸炎、混合性結締組織疾病、結節性多動脈炎、系統性壞死性脈管炎、特應性皮炎、特應性鼻炎、古德帕斯丘症候群、恰加斯病、結節病、風濕熱、哮喘、反覆流產、抗磷脂症候群、農民肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、庫欣症候群、自身免疫性慢性活動性肝炎、鳥類愛好者肺、中毒性表皮壞死鬆解症、阿爾波特症候群、肺泡炎、過敏性肺泡炎、纖維化肺泡炎、間質性肺病、結節性紅斑、壞疽性膿皮病、輸血反應、高安氏動脈炎、風濕性多肌痛、顳動脈炎、血吸蟲病、巨細胞性動脈炎、蛔蟲病、麴黴病、薩姆特症候群、濕疹、淋巴瘤樣肉芽腫病、白塞病、卡普蘭症候群、川崎病、登革熱、腦脊髓炎、心內膜炎、心內膜纖維化、眼內炎、隆起性紅斑、銀屑病、胎兒成紅細胞增多症、嗜酸性筋膜炎、舒爾曼症候群、費爾蒂症候群、絲蟲病、睫狀體炎、慢性睫狀體炎、異慢性睫狀體炎、富赫氏睫狀體炎、IgA腎病、亨-舍二氏紫癜、移植物抗宿主病、移植排斥、心肌病、伊頓-蘭伯特症候群、復發性多軟骨炎、冷球蛋白血症、瓦登斯特陸巨球蛋白血症、伊文症候群及自身免疫性性腺功能衰竭。
在一些實施例中，本文所描述之方法包括治療B淋巴細胞病症(例如，系統性紅斑狼瘡、古德帕斯丘症候群、類風濕性關節炎及I型糖尿病)、Th1淋巴細胞病症(例如，類風濕性關節炎、多發性硬化、銀屑病、乾燥症候群、橋本氏甲狀腺炎、格雷夫斯病、原發性膽汁性肝硬化、韋格納氏肉芽腫病、結核病或移植物抗宿主病)或Th2淋巴細胞病症(例如，特應性皮炎、系統性紅斑狼瘡、特應性哮喘、鼻結膜炎、過敏性鼻炎、歐門氏症候群、系統性硬化症或慢性移植物抗宿主病)。通常，涉及樹突細胞之疾病涉及Th1淋巴細胞或Th2淋巴細胞之疾病。
如本文使用，「受試者」係指人或動物。通常，該動物為脊椎動物，例如靈長類動物、嚙齒類動物、家畜或狩獵動物。靈長類動物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴及獼猴，例如恆河猴。嚙齒類動物包括小鼠、大鼠、土撥鼠、雪貂、兔及倉鼠。家畜及狩獵動物包括牛、馬、豬、鹿、野牛、水牛，貓科動物(例如家貓)、犬科動物(例如狗、狐、狼)、鳥類(例如雞、鴯鶓、鴕鳥)及魚類(例如鱒魚、鯰魚及鮭魚)。在某些實施例中，受試者為哺乳動物，例如靈長類動物，例如人類。術語「患者」、「個體」及「受試者」在本文中可互換使用。
較佳地，受試者為哺乳動物。哺乳動物可為人類、非人類靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛，但不限於此等實例。除人類以外之哺乳動物可有利地用作例如代表例如各種自身免疫性疾病之動物模型之受試者。此外，本文所描述之方法可用於治療馴養之動物及/或寵物。受試者可為男性或女性。在某些實施例中，受試者為人類。
在一些實施例中，受試者可為先前已診斷患有或鑑定為患有自身免疫性疾病且需要治療之受試者，但不必已經經歷自身免疫性疾病之治療。在一些實施例中，受試者亦可為先前未被診斷為患有需要治療之自身免疫性疾病之受試者。在一些實施例中，受試者可為表現出病症之一或多種風險因素或者與自身免疫性疾病相關之一或多種併發症之受試者，或者未表現出風險因素之受試者。「需要」治療自身免疫性疾病之「受試者」特別可為患有該病症或被診斷為患有該病症之受試者。在其他實施例中，「有風險罹患」癌症之受試者係指被診斷為有風險罹患病症或有風險再次患有病症(例如，自身免疫性疾病)之受試者。
如本文使用，術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」、「治療(treatment)」或「改善」當用於提及疾病、疾患或醫學病症時，係指對病症之治療性治療，其中該目的在於逆轉、減輕、改善、抑制、減緩或停止症狀或病症之進展或嚴重程度。術語「治療」包括減少或減輕病症之至少一種副作用或症狀。若一或多種症狀或臨床標誌物減少，治療通常為「有效的」。替代地，若病症之進展減少或停止，則治療為「有效的」。換而言之，「治療」不僅包括症狀或標誌物之改善，亦包括停止或至少減緩在未治療之情況下預期之症狀之進展或惡化。有益之或期望之臨床結果包括但不限於受試者之自身免疫性細胞之減少、一或多種症狀之減輕、缺陷程度之減少、自身免疫性疾病之穩定(亦即，不惡化)狀態、自身免疫性疾病之進展之延遲或減慢、以及與未治療之情況下所預期之相比壽命增加。如本文所用，術語「投與」係指藉由導致結合物與目標自身免疫性細胞結合之方法或途徑向受試者提供如本文所描述之結合物。類似地，包含如本文所描述之結合物之醫藥組合物可藉由產生受試者之有效治療之任何合適之途徑投與。
結合物之用量範圍取決於效力，並且涵蓋足夠大以產生所需效果(例如，自身免疫性疾病之進展減慢或症狀之減少)之量。用量不應大到引起不可接受之不良副作用。通常，用量將隨受試者之年齡、病症及性別而變化，並且可由本領域技術人員判定。在任何併發症之情況下，用量亦可由單獨的醫師調節。在一些實施例中，用量為0.1 mg/kg體重至10 mg/kg體重。在一些實施例中，用量為0.5 mg/kg體重至15 mg/kg體重。在一些實施例中，用量為0.5 mg/kg體重至5 mg/kg體重。替代地，可滴定以維持血清含量之劑量範圍為1 μg/mL至1000 μg/mL。為了全身投與，可向受試者投與，例如，0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、12 mg/kg或更多的治療量。
可重複上述劑量之投與。在較佳實施例中，上述劑量可每週、每兩週、每三週或每月投與，持續數週或數月。治療之持續時間取決於受試者之臨床進展及對治療之回應。
在一些實施例中，劑量可為約0.1 mg/kg至約100 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約0.1 mg/kg至約25 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約0.1 mg/kg至約20 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約0.1 mg/kg至約15 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約0.1 mg/kg至約12 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約1 mg/kg至約100 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約1 mg/kg至約25 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約1 mg/kg至約20 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約1 mg/kg至約15 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約1 mg/kg至約12 mg/kg。在一些實施例中，劑量可為約1 mg/kg至約10 mg/kg。
在一些實施例中，可靜脈內投與劑量。在一些實施例中，靜脈內投與可為在約10分鐘至約4小時之時間段內進行之輸注。在一些實施例中，靜脈內投與可為在約30分鐘至約90分鐘之時間段內進行之輸注。
在一些實施例中，可每週投與一劑量。在一些實施例中，可每兩週投與一劑量。在一些實施例中，可約每兩週投與一劑量。在一些實施例中，可約每三週投與一劑量。在一些實施例中，可每四週投與一劑量。
在一些實施例中，向受試者投與總共約2至約10個劑量。在一些實施例中，投與總共4個劑量。在一些實施例中，投與總共5個劑量。在一些實施例中，投與總共6個劑量。在一些實施例中，投與總共7個劑量。在一些實施例中，投與總共8個劑量。在一些實施例中，投與總共9個劑量。在一些實施例中，投與總共10個劑量。在一些實施例中，投與總共大於10個劑量。
含有結合物之醫藥組合物可以以單位劑量投與。術語「單位劑量」當使用涉及醫藥組合物時係指適於作為受試者之單位用量之實體上離散之單位，各單位含有預定量之活性物質(例如，結合物)，其經計算與所需生理學上可接受之稀釋劑(亦即，載體或媒介物)結合產生所需之治療效果。
在一些實施例中，結合物或任何此等之醫藥組合物與免疫抑制療法一起投與。在一些實施例中，提供了在接受免疫抑制療法之受試者中改善治療結果之方法。該方法通常包括向患有自身免疫性疾病之受試者投與有效量之免疫抑制療法；以及向受試者投與治療有效量之結合物或其醫藥組合物，其中該結合物特異性結合目標自身免疫性細胞；其中與單獨投與免疫療法相比，受試者之治療結果得到改善。在一些實施例中，其結合物如本文所描述。在一些實施例中，改善之治療結果為疾病進展之降低、一或多種症狀之緩解等。
藉由以下實施例進一步說明本發明，但其不應被解釋為限制。 1.   一種具有以下式(V)之連接子中間體： ~ (AA) s– [L2] ≈ (V) 或其鹽，其中： AA為具有1個至12個胺基酸亞單元之胺基酸單元； s為0或1； L2為具有1個至4個用於藥物單元之連接位點的連接子亞單元；以及 各波形(~)線表示用於擴展單元之連接位點，以及雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點， 其中至少一個極性單元存在於胺基酸單元、連接子亞單元或兩者中，並且其中極性單元選自糖單元、PEG單元、羧基單元及其組合。 2.   一種具有以下式(I)之連接子： ~ L1 – (AA) s– L2 ≈ (I) 或其鹽，其中： L1為具有用於靶向單元之連接位點之擴展單元； AA為具有1個至12個亞單元之胺基酸單元； s為0或1； L2為具有1個至4個用於藥物單元之連接位點的連接子亞單元； 波形(~)線表示用於靶向單元之連接位點，以及雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點； 其中至少一個極性單元存在於胺基酸單元、連接子亞單元或兩者中，並且其中極性單元選自糖單元、PEG單元、羧基單元及其組合。 3.   根據前述實施例之連接子中間體或連接子，其中糖單元具有下式： L3 - **N(CH 2– (CH(XR)) k– X 1(X 2)) 2(X) 或其鹽，其中： 各X獨立地選自NH或O； 各R獨立地選自氫、乙醯基、單糖、二糖及多糖； 各X 1獨立地選自CH 2及C(O)； 各X 2獨立地選自H、OH及OR； k為1至10；以及 L3具有以下通式(XI)： L3a | *- NH – (CH 2) p– CH - (CH 2) o- C(O) - # (XI) 或其鹽，其中： L3a選自C 1-C 10伸烷基及具有1個至24個乙二醇亞單元之聚乙二醇； p及o獨立地為0至2； 各*及各#表示用於胺基酸單元(AA)之其他亞單元、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之連接位點；以及 L3a共價結合至式(X)中用**標記之N原子。 4.   根據前述實施例中任一項之連接子中間體或連接子，其中糖單元具有選自以下之式：
Figure 02_image625
或其鹽，其中： 各R獨立地選自氫、單糖、二糖及多糖； p及o獨立地為0至2； m為1至8； n為0至4；以及 各*及各#表示用於胺基酸單元(AA)之其他亞單元、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之連接位點。 5.   根據前述實施例中任一項之連接子中間體或連接子，其中PEG單元具有選自以下之式： (a) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-NR 24R 25(XX) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 21及R 22各自獨立地為視情況選用的C 1-C 3伸烷基； R 24及R 25各自獨立地選自H；多羥基基團；經取代之多羥基基團；-C(O)-多羥基基團；經取代之-C(O)-多羥基基團；視情況經取代之C 3-C 10碳環；視情況經取代之C 1-C 3伸烷基C 3-C 10碳環；視情況經取代之雜芳基；視情況經取代之碳環；經取代之-C 1-C 8烷基；經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基；螯合物；-C(O)-R 28，其中R 28為式(XII)或式(XIII)之糖單元；或與-NR 24R 25一起形成C 3-C 8雜環； 波形線(~)表示與R 20之連接位點；以及 n20為1至26； 或 (b) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-NR 24R 25(XX) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 21及R 22各自獨立地為視情況選用的C 1-C 3伸烷基； R 24及R 25中之一者選自H；多羥基基團；經取代之多羥基基團；-C(O)-多羥基基團；經取代之-C(O)-多羥基基團；視情況經取代之C 3-C 10碳環；視情況經取代之C 1-C 3伸烷基C 3-C 10碳環；視情況經取代之雜芳基；視情況經取代之碳環；經取代之-C 1-C 8烷基；經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基；螯合物；-C(O)-R 28，其中R 28為式(XII)或式(XIII)之糖單元；並且R 24及R 25中之另一者為聚乙二醇，視情況具有1個至24個乙二醇亞單元； 波形線(~)表示與R 20之連接位點；以及 n20為1至26； 或 (c) ~R 20-[-R 26-[R 29-[O-CH 2-CH 2-] n20R 29] n21-R 27-] n27-NR 24R 25(XXI) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元及/或該連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 26及R 27各自視情況且獨立地選自C 1-C 12伸烷基、-NH-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-NH-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-NH-C 1-C 12伸烷基-C(O)-及-C(O)-C 1-C 12伸烷基-NH-； R 24及R 25中之一者選自H；多羥基基團；經取代之多羥基基團；-C(O)-多羥基基團；經取代之-C(O)-多羥基基團；視情況經取代之C 3-C 10碳環；視情況經取代之C 1-C 3伸烷基C 3-C 10碳環；視情況經取代之雜芳基；視情況經取代之碳環；經取代之-C 1-C 8烷基；經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基；螯合物；-C(O)-R 28，其中R 28為式(XII)或式(XIII)之糖單元；並且R 24及R 25中之另一者選自H；多羥基基團；經取代之多羥基基團；-C(O)-多羥基基團；經取代之-C(O)-多羥基基團；視情況經取代之C 3-C 10碳環；視情況經取代之C 1-C 3伸烷基C 3-C 10碳環；視情況經取代之雜芳基；視情況經取代之碳環；經取代之-C 1-C 8烷基；經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基；螯合物；-C(O)-R 28，其中R 28為式(XII)或式(XIII)之糖單元；及聚乙二醇，視情況具有1個至24個乙二醇亞單元；或與-NR 24R 25一起形成C 3-C 8雜環； 波形線(~)表示與R 20之連接位點； n20為1至26； n21為1至4；以及 n27為1至4。 6.   根據實施例5之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25均不為H。 7.   根據實施例5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25各自獨立地選自H及多羥基基團，其限制條件為R 24及R 25不都為H。 8.   根據實施例5至7中任一項之連接子中間體或連接子，其中多羥基基團為線性單糖，視情況選自C6或C5糖、糖酸或胺基糖。 9.   根據實施例方案8之連接子中間體或連接子，其中: C6或C5糖選自葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脫氧葡萄糖、甘油醛、赤蘚糖、蘇糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、醛糖及酮糖； 糖酸選自葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸及酮糖酸；或 胺基糖選自葡糖胺、N-乙醯葡糖胺、半乳糖胺及N-乙醯半乳糖胺。 10.  根據實施例5至9中任一項之連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image627
Figure 02_image629
其中R 39選自H、直鏈單糖及聚乙二醇，視情況具有1個至24個乙二醇亞單元；並且左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。 11. 根據實施例5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25中之一者為線性單糖，並且另一者為環狀單糖。 12. 根據實施例11之連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image631
Figure 02_image633
其中R 41為環狀單糖；並且左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。 13. 根據實施例5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25獨立地選自環狀單糖、二糖及多糖。 14. 根據實施例13之連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image635
Figure 02_image637
其中各R 45選自H及單糖、二糖或多糖；並且R 46選自環狀單糖、二糖或多糖；並且右側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。 15. 根據實施例5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25獨立地選自線性單糖及經取代之線性單糖，其中該經取代之線性單糖被單糖、二糖或多糖取代。 16. 根據實施例15之連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image639
Figure 02_image641
其中R 47為線性單糖；並且各R 49選自單糖、二糖及多糖；並且左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。 17. 根據實施例5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25獨立地選自線性單糖及經取代之單糖，其中該經取代之線性單糖被一或多個選自烷基、O-烷基、芳基、O-芳基、羧基、酯或醯胺之取代基取代，並且視情況進一步被單糖、二糖或多糖取代。 18. 根據實施例17之連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image643
其中各R 42獨立地選自線性單糖及經取代之線性單糖；各R 43獨立地選自烷基、O-烷基、芳基、O-芳基、羧基、酯及醯胺；並且左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。 19. 根據實施例5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25中之為-C(O)-多羥基基團或經取代之-C(O)-多羥基基團，並且R 24及R 25中之另一個H、-C(O)-多羥基基團、經取代之-C(O)-多羥基基團、多羥基基團或經取代之多羥基基團；其中該經取代之-C(O)-多羥基基團及多羥基基團被單糖、二糖、多糖、烷基、-O-烷基、芳基、羧基、酯或醯胺取代。 20. 根據實施例19之連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image645
其中左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。 21. 根據實施例5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25獨立地選自H、經取代之-C 1-C 8烷基、經取代之-C 1-C 4烷基或經取代之-C 1-C 3烷基；其限制條件為R 24及R 25均不為H；其中經取代之-C 1-C 8烷基、-C 1-C 4烷基及-C 1-C 3烷基被羥基及/或羧基取代。 22. 根據實施例21之連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image647
其中R 48選自H、OH、CH 2OH、COOH或被羥基或羧基取代之-C 1-C 6烷基；並且左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。 23. 根據實施例5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25中之一者選自H、經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基、經取代之-C(O)-C 1-C 4及經取代之-C(O)-C 1-C 3烷基，並且R 24及R 25中之另一者選自經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基、經取代之-C(O)-C 1-C 4烷基、經取代之-C(O)-C 1-C 3烷基、經取代之-C 1-C 8烷基、經取代之-C 1-C 4烷基及經取代之-C 1-C 3烷基，其中經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基、經取代之-C(O)-C 1-C 4烷基、經取代之-C(O)-C 1-C 3烷基、經取代之-C 1-C 8烷基、-C 1-C 4烷基及-C 1-C 3烷基被羥基及/或羧基取代。 24. 根據實施例23之連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image649
Figure 02_image651
其中左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。 25. 根據實施例5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25選自H及視情況經取代之芳基；其限制條件為R 24及R 25均不為H。 26. 根據實施例25之連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image653
其中左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。 27. 根據實施例5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25一起形成視情況經取代之C 3-C 8雜環或雜芳基。 28. 根據實施例27之連接子中間體或連接子，其中PEG單元為：
Figure 02_image655
。 29. 根據實施例5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25獨立地選自H及螯合物，其中該螯合物視情況藉由伸烷基、伸芳基、碳環、雜伸芳基或雜碳環連接至-NR 24R 25之氮；其限制條件為R 24及R 25均不為H。 30. 根據實施例29之連接子中間體或連接子，其中螯合物選自乙二胺四乙酸(EDTA)、二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、三伸乙基四胺六乙酸(TTHA)、苄基-DTPA、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N'',N'''-四乙酸(DOTA)、苄基-DOTA、1,4,7-三氮雜環壬烷-N,N',N''-三乙酸(NOTA)、苄基-NOTA、1,4,8,11-四氮雜環十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)及N,N'-二烷基取代之哌𠯤。 31. 根據實施例30之連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下，或其鹽：
Figure 02_image657
其中左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。 32. 根據實施例5至19中任一項之連接子中間體或連接子，其中各單糖獨立地選自： C5或C6糖，該C5或C6糖選自葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脫氧葡萄糖、甘油醛、赤蘚糖、蘇糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、醛糖、酮糖、葡糖胺、N-乙醯葡糖胺、半乳糖胺及N-乙醯半乳糖胺； 糖酸，該糖酸選自葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸及酮糖酸；或 胺基糖，該胺基糖選自葡糖胺、N-乙醯葡糖胺、半乳糖胺及N-乙醯半乳糖胺。 33. 根據實施例5至32中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 20選自羧基、胺基、炔基、疊氮基、羥基、羰基、胺基甲酸酯、脲、硫代胺基甲酸酯、硫脲、磺醯胺、醯基磺醯胺、烷基磺酸酯或其受保護之形式。 34. 根據實施例1至4中任一項之連接子中間體或連接子，其中PEG單元具有選自以下之式： (a) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-R 30(XXX) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元(若存在)及/或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 21及R 22各自視情況且，若存在，獨立地為C 1-C 3伸烷基基團； R 30選自視情況經取代之C 3-C 10碳環；硫脲；視情況經取代之硫脲；脲；視情況經取代之脲；磺醯胺；烷基磺醯胺；醯基磺醯胺、視情況經取代之烷基磺醯胺；視情況經取代之醯基磺醯胺；磺醯胺；視情況經取代之磺醯胺；胍，包括烷基胍及芳基胍；磷醯胺；或視情況經取代之磷醯胺；或R 30選自疊氮基、炔基、經取代之炔基、-NH-C(O)-炔基、-NH-C(O)-炔基-R 65；環辛炔；-NH-環辛炔、-NH-C(O)-環辛炔或-NH-(環辛炔) 2；其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環或視情況經取代之雜芳基； 波形線(~)表示與R 20之連接位點；以及 n20為1至26； (b) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-NH-C(O)-R 31(XXXI) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元(若存在)或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 21及R 22各自獨立地為視情況選用的C 1-C 3伸烷基基團； R 31為支鏈聚乙二醇鏈，各支鏈具有1個至26個乙二醇亞單元，並且各支鏈在其末端具有R 35； R 35為疊氮基、炔基、炔基-R 65、環辛炔或環辛炔-R 65，其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環或視情況經取代之雜芳基； 波形線(~)表示與R 20之連接位點；以及 n20為1至26； (c) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-C(O)NH-R 31(XXXII) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元(若存在)或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 21及R 22各自視情況且獨立地為C 1-C 3伸烷基基團； R 31為支鏈聚乙二醇鏈，各支鏈獨立地具有1個至26個乙二醇亞單元，並且各支鏈在其末端具有R 35； R 35為疊氮基、炔基、炔基-R 65、環辛炔或環辛炔-R 65，其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環及視情況經取代之雜芳基； 波形線(~)表示與R 20之連接位點；以及 n20為1至26；以及 (d) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-N-(R 33-R 31) 2(XXXIII) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元(若存在)或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 21及R 22各自視情況且為C 1-C 3伸烷基基團； R 31為支鏈聚乙二醇鏈，各支鏈具有1個至26個乙二醇亞單元，並且各支鏈在其末端具有R 35； R 33為C 1-C 3伸烷基、-C 1-C 3伸烷基-C(O)、-C(O)-C 1-C 3伸烷基或-C(O)-C 1-C 3伸烷基-C(O)； R 35為疊氮基、炔基、炔基-R 65、環辛炔或環辛炔-R 65，其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環或視情況經取代之雜芳基； 波形線(~)表示與R 20之連接位點；以及 n20為1至26。 35.  根據實施例1至4中任一項之連接子中間體或連接子，其中PEG單元具有選自以下式，或其鹽： ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-NH-C(O)-R 31(XXXI)， ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-C(O)NH-R 31(XXXII)， 或 ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-N-(R 33-R 31) 2(XXXIII)； 其中R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元(若存在)或連接子亞單元L2之一部分的官能基；R 21及R 22各自視情況且為C 1-C 3伸烷基基團；R 31為支鏈聚乙二醇鏈，各支鏈具有1個至26個乙二醇亞單元，並且各支鏈在其末端具有R 35；R 33為C 1-C 3伸烷基、-C 1-C 3伸烷基-C(O)、-C(O)-C 1-C 3伸烷基或-C(O)-C 1-C 3伸烷基-C(O)；R 35為疊氮基、炔基、炔基-R 65、環辛炔或環辛炔-R 65，其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環或視情況經取代之雜芳基；該波形(~)線表示與R 20之連接位點；以及n20為1至26。 36. 根據實施例35之連接子中間體或連接子，其中PEG單元選自以下：
Figure 02_image659
其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環或視情況經取代之雜芳基；並且左側之波形線表示與胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元之一部分的連接位點。 37. 根據實施例34至37中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 20選自羧基、胺基、炔基、疊氮基、羥基、羰基、胺基甲酸酯、脲、硫代胺基甲酸酯、硫脲、磺醯胺、醯基磺醯胺、烷基磺酸酯或其受保護之形式。 38. 根據實施例1至4中任一項之連接子中間體或連接子，其中羧基單元具有下式： R 70| L 70| ~ NH – (CH 2) p1– CH - (CH 2) o1- C(O) ~ (XXXX) 或其鹽，其中： (a) L 70選自C 1-C 8伸烷基、C 1-C 8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 8伸烷基-及-C(O)-C 1-C 8伸烷基-C(O)-； R 70為~NR 71(R 72-R 73)，其中R 71選自H、C 1-C 12烷基、經取代之C 1-C 12烷基或聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)，R 72不存在或選自視情況經取代之C 1-C 3伸烷基、視情況經取代之醚、視情況經取代之硫醚、視情況經取代之酮、視情況經取代之醯胺、聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基，並且R 73為羧基或多羧基，其中多羧基包含1至10、或1至6、或1至4個羧基基團，其中該等羧基基團藉由烷基、伸烷基、經取代之烷基、經取代之伸烷基、雜烷基、雜伸烷基、胺基及/或醯胺相互連接； 各波形線(~)表示用於胺基酸單元(AA)之其他亞單元、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之連接位點；以及 p1及o1中之各者獨立地選自0至2； 或 (b) L 70選自C 1-C 8伸烷基、C 1-C 8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 8伸烷基-及-C(O)-C 1-C 8伸烷基-C(O)-； R 70為~NR 71(R 75-(R 73) 2)，其中R 71選自H、C 1-C 12烷基、經取代之C 1-C 12烷基或聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)，R 75為支鏈之視情況經取代之C 1-C 3伸烷基、視情況經取代之醚、視情況經取代之硫醚、視情況經取代之酮、視情況經取代之醯胺、聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基，並且各R 73獨立地為羧基或多羧基，其中多羧基包含1至10、或1至6、或1至4個羧基基團，其中該等羧基基團藉由烷基、伸烷基、經取代之烷基、經取代之伸烷基、雜烷基、雜伸烷基、胺基及/或醯胺相互連接； 各波形線(~)表示用於胺基酸單元(AA)之其他亞單元、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之連接位點；以及 p1及o1中之各者獨立地選自0至2； 或 (c) L 70選自C 1-C 8伸烷基、C 1-C 8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 8伸烷基-及-C(O)-C 1-C 8伸烷基-C(O)-； R 70為~N(R 74-R 73)(R 72-R 73)，其中R 72及R 74各自獨立地選自視情況經取代之C 1-C 3伸烷基、視情況經取代之醚、視情況經取代之硫醚、視情況經取代之酮、視情況經取代之醯胺、聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基，並且各R 73獨立地為羧基或多羧基，其中多羧基包含1至10、或1至6、或1至4個羧基基團，其中該等羧基基團藉由烷基、伸烷基、經取代之烷基、經取代之伸烷基、雜烷基、雜伸烷基、胺基及/或醯胺相互連接； 各波形線(~)表示用於胺基酸單元(AA)之其他亞單元、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之連接位點；以及 p1及o1中之各者獨立地選自0至2。 39. 根據實施例1至38中任一項之連接子中間體或連接子，其包含至少一個糖單元。 40. 根據實施例1至38中任一項之連接子中間體或連接子，其包含至少一個PEG單元。 41. 根據實施例1至38中任一項之連接子中間體或連接子，其包含至少一個羧基單元。 42. 根據實施例1至38中任一項之連接子中間體或連接子，其包含至少兩個極性單元，各極性單元選自糖單元、PEG單元及羧基單元。 43. 根據實施例1至38中任一項之連接子中間體或連接子，其包含至少一個糖單元及PEG單元或羧基單元。 44. 根據實施例1至38中任一項之連接子中間體或連接子，其包含至少一個羧基單元及PEG單元。 45. 根據實施例1至44中任一項之連接子中間體或連接子，其中存在該胺基酸單元(AA) (s=1)。 46. 根據實施例1至45中任一項之連接子中間體或連接子，其中該胺基酸單元包含至少一個極性單元。 47. 根據實施例1至45中任一項之連接子中間體或連接子，其中~AA-L2~具有選自以下之式： ~ [SU – aa] - L2 ≈， ~ [aa 1(PEG) – aa] - L2 ≈，或 ~ [CU – aa] - L2 ≈ 其中中括號表示胺基酸單元，各aa為AA之視情況選用的亞單元，L2為連接子亞單元，各波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點；aa 1(PEG)為連接至AA之胺基酸亞單元之PEG單元，SU為連接至AA之亞單元之糖單元或連接至L2之糖單元，並且CU為連接至AA之亞單元之羧基單元或連接至L2之羧基單元；並且雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點，其中aa及aa 1獨立地選自α、β及γ胺基酸及其衍生物。 48. 根據實施例1至45中任一項之連接子中間體或連接子，其中 ~AA-L2~具有選自以下之式： ~ [SU-aa] | L2 ≈ ~ [aa 1(PEG)-aa] | L2 ≈，或 ~ [CU-aa] | L2 ≈ 其中中括號表示胺基酸單元，各aa為AA之胺基酸亞單元，L2為連接至aa之側鏈之連接子亞單元，波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點；aa 1(PEG)為連接至aa之PEG單元，SU為連接至aa之糖單元，CU為連接至aa之羧基單元，並且雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點；其中aa及aa 1獨立地選自α、β及γ胺基酸及其衍生物。 49. 根據實施例1至46中任一項之連接子中間體或連接子，其中胺基酸單元包括至少兩個極性單元。 50. 根據實施例49之連接子中間體或連接子，其中~AA-L2~具有選自以下之式： ~ [SU – aa – SU] – L2 ≈， ~ [aa 1(PEG) – aa – aa 2(PEG)] – L2 ≈，或 ~ [CU – aa – CU] – L2 ≈ 其中中括號表示胺基酸單元，aa為AA之視情況選用的亞單元，L2為連接子亞單元，波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點；aa 1(PEG)及aa 2(PEG)中之各者為連接至aa之PEG單元或連接至其他PEG單元之PEG單元；各SU為連接至aa之糖單元或連接至其他糖單元之糖單元，各CU為連接至aa之羧基單元或連接至其他羧基單元之羧基單元，並且雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點；其中aa、aa 1及aa 2獨立地選自α、β及γ胺基酸及其衍生物。 51. 根據實施例49之連接子中間體或連接子，其中~AA-L2~具有選自以下之式： ~ [SU-aa-SU] | L2 ≈ ~ [aa 1(PEG)-aa-aa 2(PEG)] | L2 ≈，或 ~ [CU-aa-CU] | L2 ≈ 其中中括號表示胺基酸單元，aa為AA之胺基酸亞單元，L2為連接至aa之側鏈之連接子亞單元，各波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點；aa 1(PEG)及aa 2(PEG)中之各者為連接至aa之PEG單元，各SU為連接至aa之糖單元；各CU為連接至aa之羧基單元；並且雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點；其中aa、aa 1及aa 2中之各者獨立地選自α、β及γ胺基酸及其衍生物。 52. 根據前述實施例中任一項之連接子中間體或連接子，其中連接子亞單元L2為可裂解之連接子單元。 53. 根據實施例52之連接子中間體或連接子，其中連接子亞單元L2包括可被細胞內蛋白酶裂解之肽。 54. 根據實施例53之連接子中間體或連接子，其中可裂解的肽包括纈胺酸-瓜胺酸肽、纈胺酸-丙胺酸肽、纈胺酸-離胺酸肽、苯丙胺酸-離胺酸肽或甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸肽。 55. 根據前述實施例中任一項之連接子中間體或連接子，其中連接子亞單元L2包含至少一個極性單元。 56. 根據前述實施例中任一項之連接子中間體或連接子，其中該極性單元為糖單元(SU)。 57. 根據實施例56之連接子中間體或連接子，其中可裂解的肽包括SU-纈胺酸-瓜胺酸肽、SU-纈胺酸-離胺酸肽、SU-纈胺酸-丙胺酸肽、SU-苯丙胺酸-離胺酸肽或SU-甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸肽。 58. 根據實施例55之連接子中間體或連接子，其中極性單元為羧基單元(CU)。 59. 根據實施例58之連接子中間體或連接子，其中可裂解的肽包括CU-纈胺酸-瓜胺酸肽、CU-纈胺酸-離胺酸肽、纈胺酸-(CU-離胺酸)肽、CU-纈胺酸-丙胺酸肽、CU-苯丙胺酸-離胺酸肽、苯丙胺酸-(CU-離胺酸)肽或CU-甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸肽，其中CU-離胺酸為包含離胺酸殘基之羧基單元。 60. 根據實施例55之連接子中間體或連接子，其中極性單元為PEG單元(PEG)。 61. 根據實施例60之連接子中間體或連接子，其中可裂解的肽包括Lys(PEG)-纈胺酸-瓜胺酸肽、纈胺酸-Cit(PEG)肽、Lys(PEG)-纈胺酸-離胺酸肽、纈胺酸-離胺酸(PEG)肽、Lys(PEG)-纈胺酸-丙胺酸肽、Lys(PEG)-苯丙胺酸-離胺酸肽、苯丙胺酸-Lys(PEG)肽或Lys(PEG)-甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸肽，其中Lys(PEG)及Cit(PEG)分別包含連接至離胺酸殘基或瓜胺酸殘基之PEG單元。 62. 根據實施例52至61中任一項之連接子中間體或連接子，其中可裂解的肽連接至對胺基苄醇自分解基團(PABA)。 63. 根據實施例62之連接子中間體或連接子，其中~AA-L2~具有以下結構中之一種：
Figure 02_image661
Figure 02_image663
Figure 02_image665
其中胺基基團上之波形線表示用於擴展單元之連接位點。 64. 根據實施例52至62中任一項之連接子中間體或連接子，其中L2連接至AA之亞單元之側鏈。 65.   根據實施例64之連接子中間體或連接子，其中~AA-L2~具有以下結構中之一種：
Figure 02_image667
Figure 02_image669
其中胺基基團上之波形線表示用於擴展單元之連接位點。 66. 根據實施例1至62中任一項之連接子中間體或連接子，其中胺基酸單元藉由非肽連接基團連接至連接子亞單元L2。 67. 根據實施例66之連接子，其中非肽連接基團選自C 1-C 10伸烷基、C 2-C 10伸烯基、C 2-C 10亞炔基或聚乙二醇。 68. 根據前述實施例中任一項之連接子中間體，進一步包含擴展單元。 69. 根據實施例68之連接子，其中擴展單元選自以下：
Figure 02_image671
Figure 02_image673
Figure 02_image675
； 其中R 17為-C 1-C 10伸烷基-、-C 1-C 10雜伸烷基-、-C 3-C 8碳環-、-O-(C 1-C 8伸烷基)-、-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基- (其中b為1至26)、-伸芳基-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-、-C 3-C 8雜環-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-、-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-、-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、C 1-C 10雜伸烷基-C(=O)-、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C(=O)- (其中b為1至26)、-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 3-C 8碳環-C(=O)-、-O-(C 1-C 8烷基)-C(=O)-、-伸芳基-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-C(=O)-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-C(=O)-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、-C 3-C 8雜環-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-C(=O)-、-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-NH-、-C 1-C 10雜伸烷基-NH-、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-NH- (其中b為1至26)、-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-NH- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-NH- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(C(=O))-NH-(CH 2-O-CH 2) b-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(C(=O))-NH-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-NH-(C(=O))-(CH 2-O-CH 2) b-NH- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-NH-(C(=O))-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-NH- (其中b為1至26)、-C 3-C 8碳環-NH-、-O-(C 1-C 8烷基)-NH-、-伸芳基-NH-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-NH-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-NH-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-NH-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-NH-、-C 3-C 8雜環-NH-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-NH-、-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-NH-、-C 1-C 10伸烷基-S-、C 1-C 10雜伸烷基-S-、-C 3-C 8碳環-S-、-O-(C 1-C 8烷基)-S-、-伸芳基-S-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-S-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-S-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-S-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-S-、-C 3-C 8雜環-S-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-S-或-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-S-；或 其中擴展單元包括順丁烯二醯亞胺基(C 1-C 10伸烷基-C(O)-、順丁烯二醯亞胺基(CH 2OCH 2) p2(C 1-C 10伸烷基)C(O)-、順丁烯二醯亞胺基(C 1-C 10伸烷基)(CH 2OCH 2) p2C(O)-或其開環形式，其中p2為1至26。 70. 根據實施例69之連接子，該連接子具有以下結構中之一種：
Figure 02_image677
Figure 02_image679
Figure 02_image681
Figure 02_image683
Figure 02_image685
。 71. 根據前述實施例中任一項之連接子，進一步包含連接至連接子亞單元L2以形成藥物-連接子之至少一個藥物單元。 72. 根據實施例71之藥物-連接子，其中藥物單元選自細胞毒性劑、免疫調節劑、核酸、生長抑制劑、PROTAC、毒素、放射性同位素及螯合配體。 73. 根據實施例72之藥物-連接子，其中藥物單元為細胞毒性劑。 74. 根據實施例73之藥物-連接子，其中細胞毒性劑選自奧瑞他汀、美登素類化合物、喜樹鹼、倍癌黴素及卡奇黴素。 75. 根據實施例74之藥物-連接子，其中細胞毒性劑為奧瑞他汀。 76. 根據實施例75之藥物-連接子，其中細胞毒性劑為MMAE或MMAF。 77. 根據實施例74之藥物-連接子，其中細胞毒性劑為喜樹鹼。 78. 根據實施例77之藥物-連接子，其中細胞毒性劑為依喜替康或SN-38。 79. 根據實施例73之藥物-連接子，其中細胞毒性劑為卡奇黴素。 80. 根據實施例73之藥物-連接子，其中細胞毒性劑為美登素類化合物。 81. 根據實施例80之藥物-連接子，其中美登素類化合物為美登素、美登醇或安沙黴素-2。 82. 根據實施例72之藥物-連接子，其中藥物單元為免疫調節劑。 83. 根據實施例82之藥物-連接子，其中免疫調節劑選自TRL7促效劑、TLR8促效劑、STING促效劑或RIG-I促效劑。 84. 根據實施例83之藥物-連接子，其中免疫調節劑為TLR7促效劑。 85. 根據實施例84之藥物-連接子，其中TLR7促效劑為咪唑并喹啉、咪唑并喹啉胺、噻唑并喹啉、胺基喹啉、胺基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-胺基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氫吡啶并嘧啶、雜芳并噻二嗪-2,2-二氧化物、苯并萘啶、鳥苷類似物、腺苷類似物、胸苷均聚物、ssRNA、CpG-A、PolyG10或PolyG3。 86. 根據實施例83之藥物-連接子，其中免疫調節劑為TLR8促效劑。 87. 根據實施例86之藥物-連接子，其中TLR8促效劑選自咪唑并喹啉、噻唑并喹啉、胺基喹啉、胺基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-胺基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氫吡啶并嘧啶或ssRNA。 88. 根據實施例83之藥物-連接子，其中免疫調節劑為STING促效劑。 89. 根據實施例83之藥物-連接子，其中免疫調節劑為RIG-I促效劑。 90. 根據實施例89之藥物-連接子，其中RIG-I促效劑選自KIN1148、SB-9200、KIN700、KIN600、KIN500、KIN100、KIN101、KIN400及KIN2000。 91. 根據實施例72之藥物-連接子，其中藥物單元為螯合配體。 92. 根據實施例91之藥物-連接子，其中螯合配體選自鉑(Pt)、釕(Ru)、銠(Rh)、金(Au)、銀(Ag)、銅(Cu)、鉬(Mo)、鈦(Ti)或銥(Ir)；放射性同位素，例如釔-88、釔-90、鍀-99、銅-67、錸-188、錸-186、鎵-66、鎵-67、銦-111、銦-114、銦-115、鑥-177、鍶-89、釤-153及鉛-212。 93. 結合物，其包含連接至實施例72至92中任一項之藥物-連接子之靶向單元。 94. 根據實施例93之結合物，其中靶向單元選自抗體或其抗原結合部分。 95. 根據實施例94之藥物-連接子，其中靶向單元為單株抗體、Fab、Fab'、F(ab')、Fv、二硫鍵連接之Fc、scFv、單域抗體、雙抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。 96. 根據實施例93之結合物，其中靶向單元為雙抗體、DART、抗運載蛋白、親合體、阿維默、DARPin或阿德內丁蛋白。 97. 根據實施例93至96中任一項之結合物，其中靶向單元為單特異性的。 98. 根據實施例93至97中任一項之結合物，其中靶向單元為二價的。 99. 根據實施例93至96中任一項之結合物，其中靶向單元為雙特異性的。 100. 根據實施例93至99中任一項之結合物，其中該結合物之平均載藥量(p load)為約1至約8、約2、約4、約6、約8、約10、約12、約14、約16、約3至約5、約6至約8或約8至約16。 101. 根據實施例93至100中任一項之結合物，其選自以下：
Figure 02_image687
Figure 02_image689
Figure 02_image691
Figure 02_image693
其中Ab為靶向單元並且n為p load。 102. 一種醫藥組合物，其包含實施例93至101中任一項之結合物及醫藥學上可接受之載體。 103. 一種治療有需要之受試者之方法，包括向受試者投與實施例93至101中任一項之結合物或實施例102之醫藥組合物，其中受試者患有癌症或自身免疫性疾病，並且結合物結合與癌症或自身免疫性疾病相關之目標抗原。
本公開內容之實施方案之描述並非旨在窮舉或將本公開內容限制於所公開之精確形式。雖然本文出於說明目的描述了本公開內容之具體實施方案及實施例，但如相關領域技術人員將認識到的，在本公開內容之範圍內，各種等同之修改為可行的。視情況而定，本文提供之本公開內容之教導可以適用於其他程式或方法。可將本文描述之各種實施例組合以提供其他實施例。若需要，可以修改本公開內容之態樣，以採用上述參考文獻及申請之組成、功能及構思來提供本公開內容之其他實施例。可根據具體實施方式對本公開內容進行此等及其他之改變。
任何前述實施例之具體要素可以組合或替代其他實施例中之要素。此外，雖然已經在此等實施方案之上下文中描述了與本公開內容之某些實施例相關之優點，但其他實施例亦可以呈現此等優點，並且並非所有實施方案均必須呈現落入本公開內容之範圍內之此等優點。
為了描述及公開例如在可能與本發明結合使用的此類出版物中描述之方法，將所標識之所有專利及其他出版物明確地藉由引入併入本文。提供此等出版物僅由於其之公開內容在本申請之申請日之前。在這點上，不應將其解釋為承認本發明人無權由於先前發明或出於任何其他原因而先於此等公開內容。關於此等文獻之日期或內容之描述之所有陳述均基於申請人可獲得之資訊，且不構成對此等檔案之日期或內容之正確性之任何認可。
實例一般方法 在Bruker AVIII 400或Bruker AVIII 500上記錄 1HNMR及其他NMR光譜。用Nuts軟體或MestReNova軟體處理資料，量測自內標四甲基矽烷低場之以百萬分率(ppm)計之質子位移。
HPLC-MS量測在Agilent 1200 HPLC/6100 SQ系統上使用以下條件進行： 方法 A ：流動相：A：水(0.01%TFA) B：乙腈 (0.01%TFA)；梯度相：在15分鐘內5%之B增加至95%之B；流速：1.0 mL/min；管柱：XBridge C18、4.6*150 mm，3.5 um；管柱溫度：40℃。偵測器：ADC ELSD、DAD (214 nm及254 nm)、ES-API。 方法 B ：流動相：A：水(0.01%TFA) B：乙腈 (0.01%TFA)；梯度相：在15分鐘內5%之B增加至95%之B；流速：1.0 mL/min；管柱：SunFire C18、4.6*150 mm、3.5 µm；管柱溫度：45℃。偵測器：ADC ELSD、DAD (214 nm及254 nm)、ES-API。 方法 C ：流動相：A：水(10 mM NH 4HCO 3) B：乙腈；梯度相：在15分鐘內5%之B至95%之B；流速：1.0 mL/min；管柱：XBridge C18、4.6*150 mm、3.5 µm；管柱溫度：40℃。偵測器：ADC ELSD、DAD (214 nm及254 nm)、MSD (ES-API)。
LCMS量測在Agilent 1200 HPLC/6100 SQ系統上使用以下條件進行： 方法 A ：流動相：A：水(0.01%TFA) B：乙腈(0.01%TFA)；梯度相：在3分鐘內5%之B增加至95%之B；流速：1.8至2.3 mL/min；管柱：SunFire C18、4.6*50 mm、3.5 µm；管柱溫度：50℃。偵測器：ADC ELSD、DAD (214 nm及254 nm)、ES-API。 方法 B ：流動相：A：水(10 mM NH 4HCO 3) B：乙腈；梯度相：在3分鐘內5%之B至95%之B；流速：1.8至2.3 mL/min；管柱：XBridge C18、4.6*50 mm、3.5 µm；管柱溫度：50℃。偵測器：ADC ELSD、DAD (214 nm及254 nm)、MSD (ES-API)。
製備型高壓液相層析(Prep-HPLC)在Gilson 281上使用以下條件進行： 方法 A ：Waters SunFire 10 µm C18管柱(100 Å，250 x 19 mm)。溶劑A為水/0.01%三氟乙酸(TFA)，並且溶劑B為乙腈。溶離條件為溶劑B在20分鐘之時間內以30 mL/min之流速自5%線性梯度增加至100%。 方法 B ：Waters SunFire 10 µm C18管柱(100 Å、250 x 19 mm)。溶劑A為水/0.05%甲酸(FA)，並且溶劑B為乙腈。溶離條件為溶劑B在20分鐘之時間內以30 mL/min之流速自5%線性梯度增加至100%。 方法 C ：Waters Xbridge 10 µm C18管柱(100 Å、250 x 19 mm)。溶劑A為水/10 mM碳酸氫銨(NH 4HCO 3)，並且溶劑B為乙腈。溶離條件為溶劑B在20分鐘之時間內以30 mL/min之流速自5%線性梯度增加至100%。
在Biotage之儀器上進行快速層析，使用Agela快速管柱二氧化矽-CS；在Biotage之儀器上進行反相快速層析，使用Boston ODS或Agela C18。
實例1：糖單元之製備
Figure 02_image695
如下製備糖單元： 步驟1 將化合物L1 (5 g，10.846 mmol)、D-葡萄糖(19.54 g，108.460 mmol)、NaBH 3CN (5.45 g，86.768 mmol)及磷酸二氫鉀(0.379 mL，6.508 mmol)之水(40 mL)及乙醇(65 mL)反應混合物在50℃下在N 2下攪拌36小時，直至藉由LCMS指示反應完成。蒸發溶劑，並且將殘餘物藉由C18反相層析純化，得到所需產物L2 (3.5 g，4.649 mmol，42.86%)。LCMS (M+H) += 753.0； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.90 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.74 – 7.64 (m, 2H), 7.44 - 7.32 (m, 4H), 4.58 - 4.21 (m, 8H), 4.14 - 3.74 (m, 4H), 3.68 - 3.41 (m, 8H), 2.85 - 2.56 (m, 2H), 1.69 - 1.28 (m, 15H)。13C NMR (100 MHz, DMSO) δ 171.53, 156.10, 143.77, 140.70, 127.62, 127.04, 125.24, 120.10, 80.47, 80.42, 71.66, 71.58, 71.34, 70.18, 65.53, 63.51, 63.36, 54.48, 54.41, 46.63, 27.65, 23.14, 22.38。
步驟2 向L2 (200 mg，0.266 mmol)之THF (2 mL)溶液中添加二乙胺(38.86 mg，0.531 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌2小時。自反應混合物中取樣品，並且LCMS結果指示發現所需產物並且起始材料完全消耗。蒸發溶劑，並且將殘餘物藉由C18反相層析純化，得到所需產物L3 (120 mg)，LCMS (M+H) += 531.1。
實例2：PEG單元之製備
Figure 02_image697
如下製備含有線性單糖之PEG單元： 步驟1 將化合物38-1 (260 mg，0.31 mmol)之乙腈(3.0 mL)溶液在室溫下攪拌，並且添加無水二乙胺(0.2 mL，1.941 mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌2小時，直至溶液之LCMS顯示大部分起始材料被消耗。隨後將溶液濃縮至乾燥，並且將殘餘物藉由反相管柱層析純化(12 g C18管柱，用含0.01% TFA之0至50%之乙腈水溶液溶離)，得到為淡黃色油狀物之化合物39-1之預期級分(170 mg，0.28 mmol)。LCMS，ESI m/z = 618.4 (M+H) +；
步驟2 將化合物39-1 (170 mg，0.28 mmol)、39-2 (217.08 mg，1.206 mmol)及乙酸(1.21 mg，0.020 mmol)之甲醇(5 mL)澄清反應溶液在50℃下加熱30分鐘，隨後添加NaCNBH 3(75.98 mg，1.206 mmol)。將反應溶液在50℃下在N 2下攪拌4小時。隨後添加額外的NaCNBH 3(75.98 mg，1.206 mmol)及化合物39-2 (217.08 mg，1.206 mmol)，並在50℃下保持攪拌隔夜。攪拌20小時後，LCMS顯示反應完成。蒸發溶劑，並且將殘餘物藉由C18反相層析純化，得到所需產物39-3 (265 mg，0.24 mmol)。LCMS，ESI m/z = 1122.6 (M+H) +。
步驟3 將化合物39-3 (265 mg，0.24 mmol)之6N HCl /THF水溶液混合物在室溫下攪拌3小時，直至LCMS指示反應完成。將溶劑用NaHCO 3水溶液中和，蒸發，並且將殘餘物藉由C18反相層析純化，得到所需產物39-4 (160 mg，0.17 mmol)。LCMS，ESI m/z = 946.5 (M+H) +。
實例3：含有MMAE之藥物連接子(PB003)的製備
Figure 02_image699
含有兩個糖單元及連接至MMAE之可裂解連接子的藥物連接子(PB003)製備如下：
步驟1 將化合物8-3 (30 mg，0.027 mmol)、DIPEA (10.45 mg，0.081 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加氧雜環戊烷-2,5-二酮(5.40 mg，0.054 mmol)。將所得溶液在室溫(r.t.)下再攪拌1小時，直至液相層析質譜(LCMS)指示反應完成。將混合物直接藉由反相液相層析(40g C18管柱，用含0.01% TFA之0至50%之乙腈水溶液經15分鐘溶離)純化，得到為白色固體之化合物8-3A (25.8 mg，0.021 mmol，78.97%)。LCMS：產物(M/2+H) += 612.5；
步驟2 將化合物3-1 (20.00 g，44.198 mmol)、2-甲基丙-2-醇(12.600 mL，132.594 mmol)、DCC (13.68 g，66.297 mmol)及DMAP (1.62 g，13.259 mmol)之DCM (150 mL)溶液在室溫(r.t.)下在氮氣(N 2)下攪拌12小時。藉由LCMS判斷反應完成後，藉由矽藻土(Celite)墊過濾反應混合物，並且減壓濃縮濾液，得到殘餘物，隨後藉由矽膠快速層析(石油醚: EtOAc = 10:1)純化，得到為無色油狀物之化合物3-2 (11.80 g，23.200 mmol，52.49%)。 LCMS (M-56+H) += 453.1； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ = 7.89 (d, J=7.5, 2H), 7.72 (d, J=7.5, 2H), 7.65 (d, J=7.8, 1H), 7.44 (t, J=7.4, 2H), 7.35 (d, J=7.1, 2H), 7.20 (t, J=5.3, 1H), 5.94 – 5.76 (m, 1H), 5.27 (dd, J=17.2, 1.6, 1H), 5.16 (dd, J=10.5, 1.4, 1H), 4.45 (d, J=5.3, 2H), 4.32 (dd, J=12.3, 4.8, 2H), 4.26 – 4.20 (m, 1H), 3.84 (d, J=4.9, 1H), 2.97 (dd, J=12.6, 6.4, 2H), 1.66-1.53 (m, 2H), 1.38 (s,9H),1.33-1.29 (m,2H), 1.28 – 1.23 (m, 2H)。
步驟3 向化合物3-2 (5 g，9.837 mmol)之DCM (20 mL)溶液中添加Et2NH (4 mL，38.693 mmol)。將反應物在室溫下攪拌2小時。將混合物濃縮並將粗化合物3-3 (2.84 g，9.921 mmol，100%)直接用於下一步驟。ESI m/z：287.3(M+H) +。
步驟4 向化合物3-3 (2.84 g，9.917 mmol)之DMF (15 mL)溶液中添加化合物3-4 (5.58 g，11.901 mmol)、DIPEA (2.56 g，19.834 mmol)及HATU (3.77 g，9.917 mmol)。將反應物在室溫下攪拌1小時。隨後將混合物濃縮並藉由反相分離(C18管柱，用含TFA之0至87%之乙腈水溶液溶離)純化，得到為白色固體之化合物3-5 (5.2 g，7.056 mmol，71.15%)。ESI m/z：759.4(M+Na) +。
步驟5 向化合物3-5 (5.2 g，7.056 mmol)之DCM (12 mL)溶液中添加TFA (12 mL，1199.474 mmol)。將反應物在室溫下攪拌4小時。隨後將混合物濃縮並藉由反相管柱分離(C18管柱，用含TFA之0至44%之乙腈水溶液溶離)純化，得到為白色固體之化合物3-6 (2.4 g，4.133 mmol，58.57%)。ESI m/z：581.3(M+H) +。
步驟6 向化合物3-6 (2.40 g，4.133 mmol)之EtOH (35 mL)及H 2O (5 mL)溶液中添加D-葡萄糖(5.93 g，32.919 mmol)、KH 2PO4 (0.020 mL，0.344 mmol)及NaBH 3CN (2.08 g，33.099 mmol)。將反應物在50℃下攪拌18小時。將反應物在室溫下攪拌4小時。隨後將混合物濃縮並藉由反相管柱分離(C18管柱，用含TFA之0至44%之乙腈水溶液溶離)純化，得到為白色固體之化合物3-7 (2.0 g，2.200 mmol，53.48%)。ESI m/z：910.4(M+H) +。
步驟7 向化合物3-7 (1.00 g，1.100 mmol)之DMF (15 mL)溶液中添加HATU (0.50 g，1.320 mmol)及DIPEA (0.43 g，3.300 mmol)。將混合物攪拌10分鐘，隨後添加化合物3-8 (0.58 g，1.099 mmol)。將反應物在室溫下攪拌1小時。隨後將混合物濃縮並藉由反相管柱分離(C18管柱，用含TFA之0至34%之乙腈水溶液溶離)純化，得到化合物3-9 (0.47 g，0.334 mmol，30.37%)。ESI m/z：711.5(M/2+H) +。
步驟8 將化合物 3-9(10 mg，0.007 mmol)、Pd(PPh3)4 (0.41 mg，0.000 mmol)及無水二乙胺 (0.001 mL，0.014 mmol)之MeCN (0.5 mL)及水(0.1 mL)之澄清溶液在室溫下在N 2下攪拌2小時。LCMS指示所有起始材料被耗盡，並且偵測到所需質量之產物(LCMS中之片段質量669)。將混合物藉由反相液相層析(12g C18管柱，用含0.01% TFA之0至35%之乙腈水溶液溶離)純化，得到為白色固體之產物3-10。LCMS：產物(M/2+H) += 669.5；純度65% (214 nm)。
步驟9 將化合物3-10 (27 mg，0.024 mmol)、8-3A (54.67 mg，0.048 mmol)及DIPEA (3.10 mg，0.024 mmol)之無水DMF (1.8 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加HATU (9.14 mg，0.024 mmol)之無水DMF (0.2 mL)溶液。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應混合物直接藉由反相液相層析(40g C18管柱，用含0.01% TFA之0至70%之乙腈水溶液經15分鐘溶離)純化，得到為白色固體之產物3-11 (40.5 mg，0.016 mmol)。LCMS (M/3+H) += 848.5；
步驟10 將化合物3-11 (45 mg，0.018 mmol)之DMF (0.95 mL)溶液在室溫下攪拌，並且添加無水二乙胺(0.05 mL，0.485 mmol)。添加後，將所得溶液在室溫下再保持攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。蒸發揮發物(特別為DEA)以得到粗產物，將其直接藉由反相液相層析(12g C18管柱，用含0.01% TFA之0至50%之乙腈水溶液經15分鐘溶離)純化，得到預期級分，將其凍乾以得到為白色固體之產物3-12 (30 mg，0.013 mmol，73.05%)。LCMS (M/3+H) += 774.4；
步驟11 將化合物3-12 (20 mg，0.009 mmol)及DIPEA (3.34 mg，0.026 mmol)之無水DMF (0.8 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後逐滴添加2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(4.35 mg，0.017 mmol)之無水DMF (0.2 mL)溶液，歷時2分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌2小時，隨後藉由LCMS監測；所需產物形成為反應產物之大部分。用一滴水淬滅反應，隨後直接藉由製備型HPLC純化(流動相：A：水(0.01%TFA) B：乙腈 (0.01%TFA)；梯度相：在15分鐘內5%之B增加至95%之B；流速：1.0 mL/min；管柱：SunFire C18、4.6*50 mm、3.5 μm；柱溫：50℃。偵測器：ADC ELSD、DAD (214 nm及254 nm)，得到為白色固體之產物 PB003(7 mg，0.003 mmol)。LCMS (M/3+H) += 820.1 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.86-9.78 (m, 1H), 8.49-8.31 (m, 3H), 8.26-8.06 (m, 3H), 8.01-7.83 (m,3H), 7.66-7.59 (m, 2H), 7.32-7.25 (m, 6H), 7.20-7.15 (m, 1H),7.09 (s, 1H), 6.05-5.98 (m, 1H), 5.45-5.35 (m,6H), 5.13-4.95 (m, 2H), 4.87-4.71 (m, 4H), 4.71-4.41 (m, 13H), 4.35-4.13 (m, 7H), 4.10-4.04 (m, 2H), 3.99-3.94 (m, 6H), 3.80-3.77 (m, 1H), 3.73-3.69 (m, 4H), 3.67-3.43 (m, 21H), 3.24-3.17 (m, 17H), 3.12-2.97 (m, 7H), 2.89-2.83 (m, 3H), 2.44-2.24 (m, 7H), 2.16-1.91 (m, 5H), 1.84-1.42 (m, 19H), 1.38 (s, 9H), 1.34-1.24 (m, 9H), 1.06-0.98 (m, 6H), 0.89-0.75 (m, 26H) ppm。包括兩個TFA分子之質子訊號。
實例4：具有兩個糖單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物-連接子(PB004)的製備
Figure 02_image701
含有糖單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物連接子(PB004)製備如下： 步驟1 將化合物8-3A (50 mg，0.041 mmol)及HOSu (7.05 mg，0.061 mmol)之無水DCM (5 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加EDCI (11.75 mg，0.061 mmol)溶液。將所得溶液在室溫下再攪拌1.5小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液用更多的DCM (10 mL)稀釋並用水洗滌。收集有機層，經硫酸鈉乾燥，隨後濃縮至乾燥，得到為白色固體之粗NHS酯4-1 (50 mg，0.038 mmol，92.65%)，其直接用於下一步驟(參見N200897-071)。LCMS (M/2+H) += 661.0；純度= 96% (254 nm)。
步驟2 將來自上一步驟之粗化合物4-1 (50 mg，0.038 mmol)溶解於無水DMF (2 mL)，隨後添加DIPEA (14.65 mg，0.114 mmol)及化合物4-2 (48.52 mg，0.038 mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌2小時，直至LCMS指示所有起始胺被耗盡。將反應溶液直接藉由反相液相層析(40g C18管柱，用含0.01% TFA之0至70%之乙腈水溶液經15分鐘溶離)純化，得到為白色固體之化合物4-3 (50 mg，0.020 mmol，53.10%)。LCMS：m/z = 829.8 (M/3+H) +；
步驟3 將化合物4-3 (50 mg，0.022 mmol)之乙腈(2 mL)懸浮液在室溫下攪拌，並且添加水(0.5 mL)已改善溶解度。將該物質溶解於澄清溶液中。隨後添加無水二乙胺(0.2 mL，1.941 mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS顯示反應完成。隨後將溶液濃縮至乾燥以移除大部分二乙胺，隨後再溶解於乙腈及水中並凍乾，得到為白色固體之粗產物4-4 (48 mg，0.021 mmol，96.94%%)，其直接用於下一步驟。LCMS：m/z = 739.0 (預期包括片段(2263/3) + H =755)；
步驟4 將化合物4-4 (47 mg，0.021 mmol)及DIPEA (8.03 mg，0.062 mmol)之無水DMF (0.8 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(5.23 mg，0.021 mmol)之無水DMF (0.2 mL)溶液。將所得溶液在室溫下再攪拌0.5小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。將所得溶液在室溫下攪拌2小時，直至LCMS指示所有起始胺被耗盡。將反應溶液直接藉由製備型HPLC (用含0.01% TFA之梯度經20分鐘溶離)純化，得到為白色固體之產物PB004 (10 mg，0.004 mmol，20.06%)。LCMS：m/z = 801.4 (M/3+H) +； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.56 (s, 1H), 9.77 (s, 1H), 8.52-8.23 (m, 3H), 8.19-7.84 (m, 6H), 7.67-7.61 (m, 2H), 7.35-7.24 (m, 6H), 7.19-7.13 (m, 1H), 7.09 (s, 2H), 6.05-6.02 (m, 1H), 5.52-5.36 (m, 6H), 5.13-4.94(m,2H), 4.89-4.73 (m, 4H), 4.69-4.36 (m, 13H), 4.29-4.23 (m, 6H), 4.14-4.09 (m, 2H), 4.05-3.93 (m, 6H), 3.79-3.76 (m, 1H), 3.72-3.68 (m, 4H), 3.65-3.43 (m, 21H), 3.24-3.05 (m, 17H), 3.01-2.91 (m, 7H), 2.89-2.83 (m, 3H), 2.44-2.23 (m, 7H), 2.14-1.94 (m, 5H), 1.86-1.41(m, 19H), 1.37-1.20 (m, 9H), 1.05-0.97 (m, 6H), 0.88-0.75 (m, 26H) ppm。包括兩個TFA分子之質子訊號。
實例5：具有一個糖單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物-連接子(PB008)的製備
Figure 02_image703
具有一個糖單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物-連接子(PB008)製備如下： 步驟1 在0℃下，向化合物8-1 (155.50 mg，0.203 mmol)之DMF (10mL)溶液中添加HOBt (26.35 mg，0.195 mmol)及MMAE (140 mg，0.195 mmol)。將反應混合物在0℃下攪拌15分鐘，在0℃下添加吡啶(3 mL)及DIEA乙基二異丙胺(0.039 mL，0.234 mmol)，並且將反應混合物在0℃下攪拌30分鐘。使反應混合物溫熱至室溫。將反應混合物在室溫下攪拌36小時。在移除DIEA及吡啶之後，將殘餘物藉由製備型HPLC純化，得到所需產物8-2 (62 mg，0.045 mmol)。LCMS ((M+2H)/2) += 673.4；
步驟2 向化合物8-2 (60 mg，0.045 mmol)之DMF (0.95 mL)溶液中添加無水二乙胺(0.05 mL，0.485 mmol)。將所得反應溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示完全去保護。將完成的反應溶液藉由反相管柱相層析(C18管柱，用含0.01% TFA之0至70%之乙腈水溶液溶離)純化，得到含有化合物8-3之所需級分，將其凍乾以得到為白色固體之化合物8-3之TFA鹽(40 mg，0.036 mmol，79.85%)。LCMS (M/2+H) += 562.5； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.20 (s, 1H), 8.69 (d, J =7.6 Hz, 1H), 8.30 (brs, 2H), 8.17-8.07 (m, 3H), 7.90 (d, J =8.4Hz, 0.5H), 7.64 (d, J =8.4 Hz, 0.5H), 7.59-7.57 (m, 2H), 7.37-7.24 (m, 6H), 7.20-7.13 (m, 1H), 6.05-6.02 (m, 1H), 5.48 (s, 2H), 5.43-5.34 (m, 1H), 5.12-4.97 (m, 2H), 4.78-4.23 (m, 4H), 4.04-3.93 (m, 2H), 3.80-3.52 (m, 2H), 3.25-3.06 (m, 7H), 2.98-2.83 (m, 10H), 2.43-2.39 (m, 1H), 2.26-2.22(m, 1H), 2.14-1.99(m, 3H), 1.99-1.85 (m, 1H), 1.85-1.67 (m, 4H), 1.67-1.37 (m, 5H), 1.37-1.25 (m, 1H), 1.16 (t, J =7.2 Hz, 3H), 1.05-1.00 (m, 6H), 0.98-0.93 (m, 6H), 0.86-0.73 (m, 17H) ppm。
步驟3 將化合物8-3 (17.96 mg，0.026 mmol)、化合物8-4及DIPEA (9.99 mg，0.077 mmol)之無水DMF (0.8 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加HATU (14.71 mg，0.039 mmol)之無水DMF (0.2 mL)溶液。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析(C18管柱，用含0.01% TFA之0至70%之乙腈水溶液經15分鐘溶離)純化，得到為白色固體之化合物8-5 (36.2 mg，0.020 mmol，77.26%)。LCMS (M/2+H) += 902.1； 1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)
步驟4 將化合物8-5 (50 mg，0.028 mmol)之DMF (0.95 mL)溶液在室溫下攪拌，並且添加DEA (0.05 mL，0.313 mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌2小時。溶液之LCMS顯示反應完成。將完成的反應溶液直接藉由反相液相層析(12 g C18管柱，用含0.01% TFA之0至60%之乙腈水溶液經15分鐘溶離)純化，得到所需級分，將其凍乾以得到為白色固體之產物8-6 (35 mg，0.022 mmol，79.85%)。LCMS (M/2+H) += 790.6；
步驟5 將化合物8-6 (30 mg，0.019 mmol)、DIPEA (7.35 mg，0.057 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加化合物8-7，亦即2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(9.58 mg，0.038 mmol)。將所得溶液再攪拌1小時以實現完全轉化。將完成的反應溶液藉由製備型HPLC純化，流動相：A：水(0.01%TFA) B：乙腈 (0.01%TFA)；梯度相：在15分鐘內5%之B增加至95%之B；流速：1.0 mL/min；管柱：SunFire C18、4.6*50 mm、3.5 μm；管柱溫度：50℃。偵測器：ADC ELSD、DAD (214 nm及254 nm)，得到為白色固體之PB008之TFA鹽(20 mg，0.012 mmol，61.34%)。LCMS (M/2+H) += 859.0； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.03 (s, 1H), 8.42-8.40 (m, 2H), 8.33-8.31 (m, 0.5H), 8.20-8.18 (m, 1H),8.11-8.09 (m, 0.5H), 7.92-7.84 (m,1.5H),7.66-7.63 (m, 0.5H), 7.59-7.56 (m, 2H), 7.36-7.24 (m, 6H), 7.20-7.14 (m,1H),7.10 (s, 2H), 6.06-6.01 (m, 1H), 5.54-5.33 (m, 4H), 5.13-4.95 (m, 2H), 4.87-4.34 (m, 10H), 4.30-4.17 (m,2H), 4.09 (s, 2H), 4.04-3.92 (m, 4H), 3.80-3.77 (m, 0.5H), 3.70-3.65 (m, 2H), 3.61-3.58 (m, 9.5H), 3.33-3.24 (m,2H), 3.23-3.07 (m, 13H), 3.03-2.89 (m, 5H), 2.89-2.83 (m, 3H), 2.44-2.39 (m, 1H), 2.30-2.21 (m, 1H), 2.16-2.05 (m, 2H), 1.99-1.91 (m, 2H), 1.84-1.22 (m, 18H), 1.06-0.97 (m, 6H), 0.89-0.75 (m, 26H) ppm。包括一個TFA分子之質子訊號。
實例6：具有兩個糖單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB026)的製備
Figure 02_image705
具有兩個糖單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB026)製備如下： 步驟1 將化合物26-1 (475 mg，0.447 mmol)之DMF (3.6 mL)溶液在室溫下攪拌，並且添加無水二乙胺(0.4 mL，3.883 mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌1小時。隨後溶液之LCMS顯示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析(120g C18管柱，用含0.01% TFA之0至80%之乙腈水溶液經15分鐘溶離)純化，得到為白色固體之產物26-2 (260 mg，0.309 mmol，69.24%)。LCMS：m/z = 841.1 (M+H) +
步驟2 將化合物26-2 (150 mg，0.178 mmol)及氧雜環戊烷-2,5-二酮(35.70 mg，0.357 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加DIPEA (69.03 mg，0.535 mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺被耗盡。將完成的反應溶液直接藉由反相液相層析(40g C18管柱，用含0.01% TFA之0至70%之乙腈水溶液經15分鐘溶離)純化，得到為白色固體之化合物26-3 (140 mg，0.149 mmol，83.41%)。LCMS：m/z = 963.5(M+Na) +
步驟3 將化合物26-3 (100 mg，0.106 mmol)、DIPEA (41.02 mg，0.318 mmol)及HATU (40.30 mg，0.106 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液在室溫下攪拌10分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物4-2 (271.57 mg，0.212 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液。添加後，將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示起始酸幾乎耗盡且反應完成。將反應溶液藉由反相液相層析(40g C18管柱，用含0.01% TFA之0至70%之乙腈水溶液溶離)純化，得到為白色固體之產物26-4 (100 mg，0.045 mmol，42.64%)。LCMS：ESI m/z = 735.8 (M/2+H) +；
步驟4 向化合物26-4 (100 mg，0.045 mmol)之乙腈 (0.9 mL)懸浮液中添加水(0.9 mL)以幫助溶解大部分物質。隨後向溶液中添加無水二乙胺(0.2 mL，1.941 mmol)，並且在室溫下攪拌2小時。在該過程中，黏稠之油狀物沈澱在燒瓶之底部。藉由LCMS監測反應，起始材料耗盡並且偵測到所需產物為主峰。將溶液濃縮至乾燥，將殘餘物用石油醚洗滌以移除大部分非極性雜質。過濾並收集未溶解之固體，隨後溶解於乙腈及水(1:1)中並在冷凍乾燥器中凍乾，得到為白色固體之化合物26-5 (60 mg，0.030 mmol，66.72%)，其直接用於下一步驟。 LCMS：ESI m/z = 661.5 (M/3+H) +；
步驟5 將化合物26-5 (30 mg，0.015 mmol)及DIPEA (5.86 mg，0.045 mmol)之無水DMF (1 mL)混合物在室溫下攪拌20分鐘，並且觀測到固體懸浮於溶液中，隨後添加額外的DMF (1 mL)，隨後添加化合物26-6 (7.77 mg，0.015 mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌24小時，直至LCMS及HPLC指示起始胺幾乎耗盡。將反應溶液直接藉由製備型HPLC純化，(流動相：A：水(0.01%FA) B：乙腈 (0.01%FA)；梯度相：在15分鐘內5%之B增加至95%之B；流速：1.0 mL/min；管柱：SunFire C18、4.6*50 mm、3.5 μm；管柱溫度：50℃。偵測器：DAD (214 nm及254 nm)，以得到為白色固體之產物PB026 (9.1 mg，0.004 mmol，25.26%)。LCMS：ESI m/z = 794.3 (M/3+H) +； 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9.73 (s, 1H), 8.38-8.31 (m, 1H), 8.20-8.16 (m, 2H), 8.08-8.00 (m, 4H), 7.89-7.82 (m, 1H), 7.78 (d, J= 11.2 Hz, 1H), 7.65 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.41-7.35 (m, 2.6H), 7.31 (s, 1H), 7.01-7.00 (m, 1.4H), 6.52 (brs, 1H), 6.09-6.01 (m, 1H), 5.45 (s, 4H), 5.29 (s, 4H), 5.08 (s, 2H), 4.36-4.27 (m, 2H), 4.15-4.12 (m, 1H), 4.09-4.03 (m, 0.5H),3.96-3.88 (m, 1H), 3.88-3.82 (m, 0.5H),3.77-3.70 (m, 1H),3.64-3.57 (m,12H),3.50-3.47 (m, 17H), 3.43-3.40 (m, 10H),3.40-3.22 (m, 11H), 3.16-3.12 (m, 4H),3.05-2.90 (m, 11H), 2.72-2.50 (m, 3H), 2.38-2.31 (m, 11H), 2.24-2.12 (m, 5H), 2.08-1.98 (m, 2H), 1.93-1.87 (m, 2H), 1.84-1.55 (m, 8H), 1.55-1.23 (m, 18H), 1.13-1.07 (m, 2H), 1.01-0.96 (m, 3H), 0.89-0.85 (m, 9H) ppm。
實例7：含有兩個糖單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB037)的製備
Figure 02_image707
含有兩個糖單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB037)製備如下： 步驟1 將化合物37-1 (200 mg，0.141 mmol)之TFA (2 mL)溶液在室溫下攪拌2小時。混合物之LCMS顯示反應完成並且所有起始材料被耗盡，形成所需產物(質量640=1280/2)。將完成的反應溶液濃縮至乾燥，隨後再溶解於THF (4 mL)及水(1 mL)中，並且用飽和碳酸鈉水溶液處理以調節pH至8-9。將所得溶液在室溫下攪拌1小時以實現完成。隨後將溶液用稀釋之TFA中和並濃縮，並將殘餘物藉由反相液相層析(C18管柱，用含有0.01% TFA之0至30%之乙腈水溶液溶離15分鐘)純化，以在凍乾後得到為白色固體之所需產物37-2 (180 mg，0.132 mmol，93.70%)。LCMS，ESI m/z = 683.4 (M/2+H) +；
步驟2 將化合物37-2 (180 mg，0.132 mmol)、HATU (75.27 mg，0.198 mmol)及DIPEA (51.07 mg，0.396 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，並且添加化合物37-3 (73.86 mg，0.132 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析(40g C18管柱，用含0.01% TFA之0至70%之乙腈水溶液經15分鐘溶離)純化，得到為白色固體之化合物37-3 (220 mg，0.118 mmol，89.48%)。LCMS，ESI m/z = 954.5 (M/2+Na) +；
步驟3 將化合物37-3 (220 mg，0.115 mmol)及Pd(PPh3)4 (133.30 mg，0.115 mmol)之無水乙腈(1 mL)及水(1 mL)之溶液在室溫下攪拌，隨後立即添加無水二乙胺(0.024 mL，0.231 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌2小時，直至LCMS指示所有起始材料已耗盡並且偵測到所需產物之質量。將所得溶液減壓濃縮以移除溶劑及二乙胺。將殘餘物直接藉由製備型HPLC (用含0.01% TFA之梯度經20分鐘溶離)純化，得到為白色固體之化合物37-4 (160 mg，0.088 mmol，76.08%)。LCMS，m/z = 608.6 (M/3+H)，912.2 (M/2+H) +；
步驟4 將化合物37-4 (30.97 mg，0.033 mmol)、HATU (12.51 mg，0.033 mmol)及DIPEA (4.25 mg，0.033 mmol)之無水溶劑之溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加化合物26-1 (60 mg，0.033 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌2小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析(40g C18管柱，用含0.01% TFA之0至70%之乙腈水溶液經15分鐘溶離)純化，得到為白色固體之化合物37-5 (40 mg，0.015 mmol，44.26%)。LCMS，ESI m/z = 916.4(M/3+H) +；
步驟5 將化合物37-5 (40 mg，0.015 mmol)之CH3CN (1.2 mL)及水(0.6 mL)之溶液在室溫下攪拌，隨後添加無水二乙胺(0.2 mL，0.015 mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌隔夜，直至LCMS顯示反應完成。蒸發溶劑及大部分二乙胺，隨後將殘餘物藉由反相液相層析(12g C18管柱，用含有0.01% TFA之乙腈水溶液溶離)純化，得到為白色固體之所需產物37-6 (20 mg，0.008 mmol，54.41%)。LCMS，ESI m/z = 631.8 (M/4+H) +，842.1 (M/3+H) +；2524
步驟6 將化合物37-6 (20 mg，0.008 mmol)及DIPEA (5.03 mg，0.039 mmol)之無水DMF (0.4 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(5.83 mg，0.019 mmol)之無水DMF (0.1 mL)溶液，歷時2分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌8小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。用稀釋之甲酸之乙腈溶液將反應溶液調節至pH6-7，隨後直接藉由製備型HPLC (用含有0.01% FA之梯度經20分鐘溶離)純化，得到為白色固體之PB037 (4.8 mg，0.002 mmol)。LCMS，m/z = 725.8 (M/3+H) +；
實例8：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB038)的製備
Figure 02_image709
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB038或LD038)製備如下： 步驟1： 將化合物38-1 (650 mg，0.774 mmol)及N-羥基琥珀醯亞胺(HOSu) (177.98 mg，1.548 mmol)之無水DCM (8 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加EDCI (296.69 mg，1.548 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物。用水洗滌所得溶液，收集有機層，隨後用DCM (10 mL * 2)萃取水相。將合併之有機層經硫酸鈉乾燥並過濾，濃縮至乾燥，得到為無色油狀物之化合物38-2 (552 mg，0.589 mmol，76.12%)，將其原樣用於下一步驟(參見N200897-136)。LCMS：m/z = 959.4 (M+Na) +；
步驟2： 將化合物38-2 (300 mg，0.357 mmol)及DIPEA (138.22 mg，1.071 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加化合物38-3 (87.97 mg，0.357 mmol)，並且起始胺懸浮於溶液中。將該混合物在室溫下保持再攪拌6小時。在此期間，起始胺逐漸溶解，並且懸浮液變成澄清之淺黃色溶液。將反應溶液終止並直接藉由反相液相層析(40g C18管柱，用含有0.01% TFA之0至100%之乙腈水溶液經15分鐘溶離)純化，得到為淡黃色油狀物之化合物38-4 (260 mg，0.243 mmol，68.14%)，LCMS ((M-100)/2+H) += 484.9；
步驟3： 將化合物38-4 (260 mg，0.243 mmol)之乙腈(1.8 mL)溶液在室溫下攪拌，並且添加無水二乙胺(0.2 mL，1.941 mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌2小時，直至溶液之LCMS顯示大部分起始材料被消耗。隨後將溶液濃縮至乾燥，並且將殘餘物藉由反相管柱層析純化(12 g C18管柱，用含0.01% TFA之0至50%之乙腈水溶液溶離)，得到為淡黃色油狀物之化合物38-5之預期級分(170 mg，0.201 mmol，82.54%)。LCMS，ESI m/z = 846.6 (M+H) +；保留時間(0.01% TFA) = 1.451分鐘；無UV。
步驟4： 將38-5 (170 mg，0.201 mmol)、D-葡萄糖(217.08 mg，1.206 mmol)及乙酸(1.21 mg，0.020 mmol)之甲醇(5 mL)澄清反應溶液在50℃下加熱30分鐘，隨後添加NaCNBH 3(75.98 mg，1.206 mmol)。將反應溶液在50℃下在N 2下攪拌4小時。隨後添加額外的NaCNBH 3(75.98 mg，1.206 mmol)及D-葡萄糖(217.08 mg，1.206 mmol)，並在50℃下保持攪拌隔夜。攪拌20小時後，LCMS指示反應完成。蒸發溶劑，並且將殘餘物藉由C18反相層析純化，得到所需產物38-6 (106 mg，0.090 mmol，44.92%)。LCMS，ESI m/z = 537.9 ((M-100)/2+H) +；
步驟5： 將化合物38-6 (250 mg，0.213 mmol)、HATU (121.45 mg，0.319 mmol)及DIPEA (82.41 mg，0.639 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加化合物38-7 (178.88 mg，0.213 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌2小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析(40g C18管柱，用含0.01% TFA之0至70%之乙腈水溶液經15分鐘溶離)純化，得到為白色固體之化合物38-8 (270 mg，0.135 mmol，63.48%)。LCMS，ESI m/z = 666.6 (M/3+H) +，999.2 (M/2+H) +；
步驟6： 將化合物38-8 (120 mg，0.060 mmol)之TFA (2 mL)溶液在室溫下攪拌1小時。混合物之LCMS顯示反應完成，消耗了所有原料，並且形成了所需產物(m/z= 633 = 1896/3+H，R.T. 1.501分鐘)與糖酯化產物(TFA與糖單元中之羥基基團縮合，單酯，m/z= (1896+96)/2+H=665，R.T. 1.58分鐘)。將完成的反應溶液濃縮至乾燥，隨後再溶解於THF (4 mL)及水(2 mL)中，並且用飽和碳酸鈉水溶液處理以調節pH至8-9。將所得溶液在室溫下攪拌1小時以實現完全水解。隨後將溶液用稀釋之TFA中和並濃縮。將殘餘物藉由反相液相層析(C18管柱，用含有0.01% TFA之0至25%之乙腈水溶液溶離15分鐘)純化，以在凍乾後得到為白色固體之所需產物38-9 (80 mg，0.042 mmol，70.19%)。LCMS，ESI m/z = 633.2 (M/3+H) +，949.2 (M/2+H)；
步驟7： 將化合物38-9 (20 mg，0.011 mmol)及DIPEA (4.08 mg，0.032 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物38-10 (4.88 mg，0.016 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液，歷時2分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌4小時，直至所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。用甲酸中和所得溶液以調節pH6-7。將反應溶液藉由製備型HPLC (用含0.01% TFA之梯度經20分鐘溶離)純化，得到為白色固體之PB038 (11 mg，0.005 mmol，49.91%)。LCMS，m/z = 697.7 (M/3+H) +； 1HNMR (400MHz, DMSO-d6)：δ 10.03 (s, 1H), 8.19-8.11 (m, 2H), 8.07 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.96 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 7.82-7.77 (m, 2H), 7.66 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.60 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H),7.00 (s, 2H), 6.53 (s, 1H), 5.99 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 5.45-5.43 (m, 6H), 5.30-5.24 (m, 3H), 5.08 (s,2H), 4.84-4.74 (m, 2H), 4.65-4.49 (m, 4H), 4.45-4.35 (m, 3H), 4.27-4.17 (m, 2H), 4.04-3.95 (m, 2H), 3.80-3.77 (m, 2H), 3.71-3.67 (m, 2H), 3.62-3.55 (m, 9H), 3.53-3.43 (m, 44H), 3.27-3.21 (m, 2H), 3.16-3.07 (m,2H), 3.07-2.93 (m, 6H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 2.23-2.13 (m, 2H),2 .13-2.08 (m, 2H), 2.00-1.82 (m, 4H), 1.73-1.54(m, 4H), 1.54-1.40 (m, 7H), 1.40-1.30 (m, 4H), 1.30-1.14 (m, 5H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm。
實例9：含有連接至可裂解連接子及依喜替康之PEG單元之藥物-連接子(PB0039)的製備
Figure 02_image711
含有連接至可裂解連接子及依喜替康之PEG單元之藥物-連接子(PB0039)製備如下： 步驟1 將化合物38-1 (260 mg，0.31 mmol)之乙腈(3.0 mL)溶液在室溫下攪拌，並且添加無水二乙胺 (0.2 mL，1.941 mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌2小時，直至溶液之LCMS顯示大部分起始材料被消耗。隨後將溶液濃縮至乾燥，並且將殘餘物藉由反相管柱層析純化(12 g C18管柱，用含0.01% TFA之0至50%乙腈水溶液溶離)，得到為淡黃色油狀物之化合物39-1之預期級分(170 mg，0.28 mmol)。LCMS，ESI m/z = 618.4 (M+H) +；
步驟2 將化合物39-1 (170 mg，0.28 mmol)、39-2 (217.08 mg，1.206 mmol)及乙酸(1.21 mg，0.020 mmol)之甲醇(5 mL)澄清反應溶液在50℃下加熱30分鐘，隨後添加NaCNBH 3(75.98 mg，1.206 mmol)。將反應溶液在50℃下在N 2下攪拌4小時。隨後添加額外的NaCNBH 3(75.98 mg，1.206 mmol)及化合物39-2 (217.08 mg，1.206 mmol)，並在50℃下保持攪拌隔夜。攪拌20小時後，LCMS顯示反應完成。蒸發溶劑，並且將殘餘物藉由C18反相層析純化，得到所需產物39-3 (265 mg，0.24 mmol)。LCMS，ESI m/z = 1122.6 (M+H) +。
步驟3 將化合物39-3 (265 mg，0.24 mmol)之6N HCl /THF水溶液混合物在室溫下攪拌3小時，直至LCMS指示反應完成。將溶劑用NaHCO 3水溶液中和，蒸發，並且將殘餘物藉由C18反相層析純化，得到所需產物39-4 (160 mg，0.17 mmol)。LCMS，ESI m/z = 946.5 (M+H) +。
步驟4 將化合物39-5 (3.3 g，4.905 mmol)及DIPEA (1.90 g，14.714 mmol)之無水DMF (10 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加PNPC (4.47 g，14.714 mmol)。將所得亮黃色溶液在室溫下再攪拌1.5小時以實現完成。將所得溶液用水淬滅，並將溶液直接藉由反相管柱層析法(用0至100%之乙腈水溶液溶離)純化，得到為黃色固體之化合物39-6 (1950 mg，2.327 mmol)。LCMS，m/z = 860.4 (M+ Na) +，738.4 (M-100+H) +；
步驟5 向化合物39-6 (1.2 g，1.432 mmol)之DMF (12 mL)溶液中添加DIPEA (0.56 g，4.296 mmol)、HOBt (0.10 g，0.716 mmol)及依喜替康 (0.69 g，1.575 mmol)。將混合物在室溫下攪拌3小時。將所得溶液藉由反相分離(C18管柱，用含TFA之0至100%甲醇水溶液溶離)純化，得到化合物39-7 (1.2 g，1.058 mmol)，ESI，m/z：1135.5(M+H) +
步驟6 向化合物39-7 (620 mg，0.547 mmol)之DCM (20 mL)溶液中添加TFA (2 mL，0.555 mmol)。將混合物在室溫下攪拌2小時。將所得溶液濃縮並藉由反相分離(C18管柱，用含TFA之0至50%之乙腈水溶液溶離)純化，得到產物化合物39-8 (409 mg，0.395 mmol)。ESI，m/z：517.9(M/2+H) +。
步驟7 向化合物39-3 (600 mg，0.254 mmol)之DMF (5 mL)溶液中添加HATU (97.65 mg，0.254 mmol)及DIPEA (66.26 mg，0.502 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌10分鐘。隨後將混合物與化合物39-8 (550 mg，0.232 mmol)合併。將反應混合物在室溫下攪拌2小時。將所得溶液濃縮並藉由反相分離(C18管柱，用含TFA之0至50%之乙腈水溶液溶離)純化，得到為白色固體之產物39-9 (500 mg)。ESI，m/z：713.5 (M/2+H) +。
步驟8 向化合物39-9 (150 mg，0.070 mmol)之THF (2 mL)溶液中添加HCl (2 mol/L，2 mL)。將反應混合物在室溫下攪拌3小時。將所得溶液濃縮並藉由反相分離(C18管柱，用含TFA之0至50%之乙腈水溶液溶離)純化，得到為白色固體之產物39-10(100 mg，51 mmol)。產率65.69%，純度=90%。ESI，m/z：655.1 (M/3+H) +。
步驟9 向化合物39-10 (350 mg，0.178 mmol)之DMF (2 mL)溶液中添加哌啶(76 mg，0.896 mmol)。隨後將混合物在室溫下攪拌2小時。將所得溶液濃縮並藉由反相分離(C18管柱，用含TFA之0至50%之乙腈水溶液溶離)純化，得到為白色固體之產物39-11 (160 mg，0.092 mmol)，產率=51.55%。ESI，m/z：871.0 (M/2+H) +。
步驟10 向化合物39-11 (160 mg，0.092 mmol)之DMF (2 mL)溶液中添加DIEA (24 mg，0.184 mmol)及MC-OSu (56.64 mg，0.184 mmol)。將反應混合物在室溫攪拌4小時。將所得溶液濃縮並藉由反相分離(C18管柱，用含TFA之0至50%之乙腈水溶液溶離)純化，得到為白色固體之產物PB039 (62 mg)，產率=34.88%。LCMS，m/z = 967.2 (M/2+H) +； 1HNMR (400MHz, DMSO-d6)：δ 9.96 (s, 1H), 8.04-8.07 (m, 2H), 7.75-7.83 (m, 3H), 7.3 (m, 3H), 6.99 (s, 1H), 6.54 (m, 2H), 5.66 (s, 1H), 5.08-5.28 (m, 3H), 4.51 (m, 2H), 4.14-4.50 (m, 9H), 3.45-3.67 (m, 64H), 1.75-2.75 (m, 19H), 1.73-1.30 (m, 12H), 1.40-1.30 (m, 4H), 1.30-1.14 (m, 5H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm。
實例10：含有連接至可裂解連接子及依喜替康之EDTA之藥物-連接子(PB040)的製備
Figure 02_image713
含有連接至可裂解連接子之離胺酸殘基之EDTA之藥物-連接子製備如下： 步驟1 向化合物40-1 (31 mg，0.034 mmol)之DMF (5 mL)溶液中添加DIPEA (13.18 mg，0.102 mmol)及6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(20.96 mg，0.068 mmol)。將混合物在室溫下攪拌2小時。將所得溶液調節至pH 6並藉由反相分離(C18管柱，用含TFA之0至60%之乙腈水溶液溶離)純化，得到產物40-2 (25.4 mg，0.023 mmol，67.61%)，m/z：1106.4(M+H) +。
步驟2 向化合物40-2 (83 mg，0.075 mmol)之DCM (7 mL)溶液中添加TFA (0.5 mL，0.031 mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時。將所得溶液濃縮並藉由反相分離(C18管柱，用含TFA之0至30%之乙腈水溶液溶離)純化，得到化合物40-3 (34 mg，0.034 mmol，45.04%)。 m/z：503.4(M/2+H) +。
步驟3 向4-[2-(2,6-二氧雜𠰌啉-4-基)乙基]𠰌啉-2,6-二酮(0.037 mL，0.209 mmol)之DMF (3 mL)溶液中添加化合物40-3 (21 mg，0.021 mmol)及DIPEA (5.40 mg，0.042 mmol)。將混合物在室溫下攪拌2小時。將所得溶液藉由反相分離(C18管柱，用含TFA之0至45%之乙腈水溶液溶離)純化，得到產物PB040 (10.8 mg，0.008 mmol，40.40%)。 m/z：640.4(M/2+H) +。
實例11：含有兩個糖單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB041)製備如下：
Figure 02_image715
順丁烯二醯亞胺基己醯基擴展單元連接至藥物-連接子中間體，如下： 將化合物26-5 (25 mg，0.013 mmol)及DIPEA (5.03 mg，0.039 mmol)之無水DMF (0.4 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物41-1 (6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (5.83 mg，0.019 mmol)之無水DMF (0.1 mL)溶液，歷時2分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌8小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。用稀釋之甲酸之乙腈溶液將反應溶液調節至pH6-7，隨後直接藉由製備型HPLC (用含有0.01% FA之梯度經20分鐘溶離)純化，得到為白色固體之PB041 (5.8 mg，0.003 mmol，21.14%)。 LCMS，m/z = 725.8 (M/3+H) +； 1H NMR (400MHz, DMSO-d6)：δ 9.72 (s, 1H), 8.31-8.15 (m, 3H), 8.09-8.04 (m, 2H), 7.98-7.96 (m, 1H),7 .96-7.86 (m, 1H), 7.78 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H),7.00 (s,2H), 6.54 (s, 1H), 6.09-6.02 (m, 1H), 5.47-5.45 (m, 4H), 5.30-5.29 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.36-4.23 (m,3H), 4.18-4.13 (m, 1H), 4.13-4.08 (m, 0.5H), 3.92-3.80 (m, 1H), 3.74-3.69 (m, 1H), 3.67-3.56 (m, 10H), 3.05-2.88 (m, 15H), 2.64-2.59 (m, 1H), 2.36-2.33 (m, 12H), 2.24-1.97 (m, 14H), 1.91-1.82 (m, 5H), 1.78-1.61(m,14H), 1.53-1.34 (m, 15H), 1.34-1.11 (m, 17H), 0.89-0.86 (m, 11H) ppm。19F NMR (400MHz, DMSO-d6)：δ -111 ppm。
實例12：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB050)的製備如下：
Figure 02_image717
含有PEG連接子及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB050)製備如下： 步驟1 將化合物50-1 (56.74 mg，0.134 mmol)、HATU (60.99 mg，0.160 mmol)及DIPEA (51.73 mg，0.401 mmol)之無水DMF (1.5 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加化合物39-2 (150 mg，0.134 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析(40g C18管柱，用含0.01% TFA之0至70%之乙腈水溶液經15分鐘溶離)純化，得到為白色固體之化合物50-2 (130 mg，0.085 mmol，產率=63.62%)。LCMS，ESI m/z = 763.8 (M/2+H) +
步驟2 將化合物50-2 (130 mg，0.085 mmol)之DCM (0.7 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加TFA (0.3 mL，4.039 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌2小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液真空濃縮至乾燥，並且將殘餘物直接藉由反相管柱層析(用含有0.01% FA之梯度經20分鐘溶離)純化，得到為白色固體之化合物50-3 (60 mg，0.046 mmol，54.43%)。LCMS，m/z = 725.8 (M/3+H) +； 1H NMR (400MHz, DMSO-d6)：δ 9.72 (s, 1H), 8.31-8.15 (m, 3H), 8.09-8.04 (m, 2H), 7.98-7.96 (m, 1H), 7.96-7.86 (m, 1H), 7.78 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H),7.00 (s,2H), 6.54 (s, 1H), 6.09-6.02 (m, 1H), 5.47-5.45 (m, 4H), 5.30-5.29 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.36-4.23 (m,3H), 4.18-4.13 (m, 1H), 4.13-4.08 (m, 0.5H), 3.92-3.80 (m, 1H), 3.74-3.69 (m, 1H), 3.67-3.56 (m, 10H), 3.05-2.88 (m, 15H), 2.64-2.59 (m, 1H), 2.36-2.33 (m, 12H), 2.24-1.97 (m, 14H), 1.91-1.82 (m, 5H), 1.78-1.61(m,14H), 1.53-1.34 (m, 15H), 1.34-1.11 (m, 17H), 0.89-0.86 (m, 11H) ppm。
步驟3 將化合物50-3 (59 mg，0.046 mmol)、HATU (20.76 mg，0.055 mmol)及DIPEA (17.61 mg，0.137 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加化合物50-4 (41.51 mg，0.046 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析(40g C18管柱，用含0.01% TFA之0至50%之乙腈水溶液經15分鐘溶離)純化，得到為白色固體之化合物50-5 (40 mg，0.018 mmol，40.12%)。LCMS，m/z = 697.6 ((M-100)/2+H) +；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.02 (s, 1H), 8.20-8.14 (m, 1H), 8.14-7.98 (m, 2H), 7.88 (d ,J = 7.6 Hz, 2H), 7.82-7.70 (m, 5H), 7.64-7.52 (m, 4H), 7.43-7.31 (m, 7H), 6.78-6.72 (m, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.45-5.44 (m, 4H), 5.34-5.23 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.82-4.77 (m, 2H), 4.62-4.36 (m, 6H), 4.36-4.16 (m,6H), 4.05-3.95 (m, 3H), 3.81-3.73 (m, 2H), 3.73-3.66 (m, 2H), 3.62-3.56 (m, 9H), 3.56-3.34 (m, 50H), 3.05-3.01(m, 2H), 2.95-2.84 (m, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.19-2.10 (m, 2H), 2.01-1.93 (m,1H), 1.90-1.83 (m, 2H), 1.71-1.48 (m, 4H), 1.40-1.23 (m, 18H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm。包括一個TFA質子訊號。19F NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ TFA 在-73 ppm，Ar-F 在-111 ppm
步驟4 將化合物50-5 (40 mg，0.018 mmol)之CH 3CN (2 mL)及水(1 mL)溶液在室溫下攪拌，並且添加無水二乙胺(0.002 mL，0.018 mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌2小時，直至LCMS顯示反應完成。蒸發所有溶劑，得到粗固體，將其懸浮在另外之乙腈中，並再次蒸發以完全移除二乙胺。隨後將殘餘物溶解於乙腈及水，用甲酸酸化至pH 2-3，靜置1小時；LCMS指示所有內酯環都被關閉。隨後將溶液凍乾隔夜，得到為淡黃色固體之產物化合物50-6 (36 mg，0.018 mmol，100.17%)。該化合物不經任何純化原樣用於下一步驟。LCMS：(粗物質，用甲酸處理，m/z = 656.9 (M/3+H) +，984.6 (M/2+H) +；
步驟5 將化合物50-6 (35.43 mg，0.018 mmol)及DIPEA (6.97 mg，0.054 mmol)之無水DMF (0.8 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(8.32 mg，0.027 mmol)之無水DMF (0.2 mL)溶液。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。將所得溶液用甲酸酸化至pH 3-4，隨後直接藉由反相快速層析(40 g C18管柱，用含0.01% TFA之0至70%之乙腈水溶液經20分鐘溶離)純化，得到所需級分，將其凍乾以得到為白色固體之化合物50-7 (28 mg，0.013 mmol，71.96%)。LCMS，m/z =687.9 ((M-100)/3+H) +；
步驟6 向化合物50-7 (25 mg，0.012 mmol)之DCM (4 mL)溶液中添加TFA (1 mL，13.463 mmol)，隨後在室溫下攪拌2小時，直至LCMS顯示反應完成。減壓蒸發TFA及DCM，隨後藉由製備型HPLC (用含0.01% TFA之0至100%之乙腈水溶液經15分鐘溶離)純化，得到預期之級分，將其凍乾以得到為白色固體之產物PB050。LCMS，ESI m/z = 516.3 (M/4+H) +，687.9 (M/3+H) +； 1H NMR (400MHz，DMSO-d6)： δ 10.06 (s, 1H), 8.16 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.84-7.80 (m, 2H), 7.77 (brs, 3H), 7.66-7.59 (m, 3H), 7.37 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.54 (s, 1H), 6.24 (s,4H), 5.45 (s, 2H), 5.35-5.24 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.86-4.43 (m, 5H), 4.43-4.32 (m, 1H), 4.25-4.12 (m,2H), 4.02-3.94 (m, 2H), 3.79-3.73 (m, 2H), 3.69-3.67 (m, 2H), 3.59-3.58 (m, 1H), 3.57-3.55 (m, 9H),3.55-3.47 (m, 52H), 3.04-2.95 (m, 2H), 2.81-2.73 (m, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.23-2.02 (m,5H), 2.03-1.93 (m, 2H), 1.93-1.83 (m, 3H), 1.76-1.67 (m, 1H), 1.59-1.43 (m, 10H), 1.39-1.24 (m, 6H), 1.24-1.15 (m, 5H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm。19F NMR (400MHz, DMSO-d6)：-111 ppm
實例13：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB082)的製備
Figure 02_image719
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB082)製備如下： 步驟1 將化合物82-1 (173.53 mg，0.242 mmol)、HATU (110.30 mg，0.290 mmol)及DIPEA (93.55 mg，0.725 mmol)之無水DMF (3 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加化合物39-7 (250 mg，0.242 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌2小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析(40g C18管柱，用含0.01% TFA之0至70%之乙腈水溶液經15分鐘溶離)純化，得到為淡黃色固體之化合物82-2 (270 mg，0.156 mmol，64.41%)。
步驟2 將化合物82-2 (870 mg，0.502 mmol)之DCM (4 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加TFA (1 mL，13.463 mmol)，並且將淺黃色溶液攪拌1小時，直至溶液之LCMS顯示完成去保護。蒸發溶劑及TFA，隨後將殘餘物直接藉由反相液相層析(40g C18管柱，用含0.01% TFA之0至20%之乙腈水溶液經10分鐘溶離)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為白色固體之化合物82-3 (650 mg，0.398 mmol，79.29%)。LCMS，m/z = 545.5 (M/3+H) +，817.6 (M/2+H) +；
步驟3 將化合物82-3 (220 mg，0.213 mmol)及(2S,3S,4S,5R)-2,3,4,5-四羥基-6-氧雜己酸(123.90 mg，0.638 mmol)之甲醇(6 mL)混合物在50℃加熱8小時，以實現完成轉化。隨後將懸浮液濃縮以移除甲醇，將殘餘物溶解於DMF並藉由反相管柱層析(40g C18管柱，用含10 mM碳酸氫銨之0至50%之乙腈水溶液經15分鐘溶離)純化，以收集所需級分，將其冷凍乾燥以得到為白色固體之產物82-4。LCMS，m/z= 604.2(M/3+H) +，905.6 (M/2+H) +,
步驟4 將化合物82-4 (100 mg，0.055 mmol)之DMF (0.9 mL)溶液在室溫下攪拌，並且添加無水二乙胺(0.1 mL，0.971 mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌15分鐘。反應混合物之LCMS顯示反應完成。蒸發大部分二乙胺及其他揮發物，隨後用甲酸將殘餘物酸化至pH3-4，隨後藉由反相快速層析(含有0.01% TFA之0至40%之乙腈水溶液)純化，得到為白色固體之預期化合物82-5 (35 mg，0.022 mmol，39.90%)。LCMS，m/z = 794.5 (M/2+H) +，530.2 (M/2+H) +；
步驟5 將化合物82-5 (150 mg，0.083mmol)及DIPEA (8.53 mg，0.066 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加MC-OSu (10.20 mg，0.033 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液。將所得溶液在室溫下再攪拌6小時，直至偵測到所需產物為主要之新峰，以及少量副產物P2。將反應溶液藉由甲酸酸化至pH3-4，隨後直接藉由製備型HPLC (用含0.01% TFA之梯度經20分鐘溶離)純化，得到為白色固體之產物PB082 (10 mg，0.006 mmol，25.52%)。 LCMS，m/z = 594.5(M/3+H) +,891.3(M/2+H) +891.3(M/2+H) +1H NMR: (500 MHz, DMSO-d6)  δ 9.96 (s, 1H), 8.07-8.02 (m, 2H), 7.83-7.81 (m, 2H), 7.77 (d,J = 10.5 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 6.99 (s, 2H), 6.67 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.84-5.79 (m, 1H), 5.45 (s, 2H), 5.33- 5.23 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.35-4.24 (m,2H), 4.18-4.13 (m, 1H), 4.10-4.04 (m, 1H), 3.92-3.91 (m, 1H), 3.73-3.67 (m, 2H), 3.58-3.54 (m, 6H), 3.52-3.45 (m, 44H), 3.21-3.09 (m, 6H), 3.03-2.99 (m, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.28 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.21-2.08 (m, 4H), 2.00-1.90 (m, 1H),1.90-1.82 (m, 2H),1.74-1.65(m, 1H),1.65-1.57 (m,1H),1.52-1.45 (m, 4H), 1.45-1.27 (m, 5H), 1.24-1.15 (m, 2H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm。
實例14：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB083)的製備
Figure 02_image721
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB083)製備如下： 步驟1 將化合物38-3 (0.190 mL，0.499 mmol)、HATU (284.86 mg，0.749 mmol)及DIPEA (193.29 mg，1.498 mmol)之無水DMF (3 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加化合物38-7 (420 mg，0.499 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液。將所得溶液在室溫下再攪拌1.5小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析(40g C18管柱，用含0.01% TFA之0至100%之乙腈水溶液經15分鐘，隨後甲醇經5分鐘溶離)純化，得到為淡黃色固體之化合物83-1 (330 mg，0.256 mmol，51.16%)。LCMS，m/z = 596.4 ((M-100)/2+H。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.05 (s, 1H), 8.14 (d, J = 7.6Hz, 1H), 8.06 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.89 (d, J =7.6 Hz, 2H), 7.78 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 7.73-7.71 (m, 3H), 7.60 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.53(d, J = 8.4 Hz,1H), 7.43-7.31 (m, 8H), 6.81-6.73 (m, 1H), 6.03-5.93 (m, 1H), 5.54-5.37 (m, 3H), 5.37-5.24 (m, 3H), 5.08 (s,2H), 4.44-4.34 (m, 1H), 4.34-4.23 (m, 4H), 4.06-3.97 (m, 1H), 3.29-3.13 (m, 1H), 3.13-2.98 (m, 2H), 2.98-2.81 (m, 3H), 2.38 (s, 3H), 2.26-2.17 (m, 2H), 2.09-1.96 (m, 1H), 1.96-1.73 (m, 2H), 1.67-1.54 (m, 3H), 1.45-1.23 (m,17H), 0.89-0.81 (m, 9H) ppm。
步驟2 向化合物83-1 (330 mg，0.256 mmol)之DCM (4 mL)溶液中添加TFA (1 mL，6.228 mmol)，並且將溶液在室溫下攪拌1小時，直至溶液之LCMS顯示反應完成。減壓蒸發溶劑，隨後將殘餘物藉由反相液相層析(40g C18管柱，用含0.01% TFA之0至40%之乙腈水溶液經10分鐘溶離)純化，得到為淡黃色固體之產物化合物83-2 (300 mg，0.252 mmol，98.55%)。LCMS，m/z = 596.3(M/2+H) +；
步驟3 將化合物82-1 (180.77 mg，0.252 mmol)、HATU (114.90 mg，0.302 mmol)及DIPEA (97.45 mg，0.755 mmol)之無水DMF (1.5 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加化合物83-2 (300 mg，0.252 mmol)之無水DMF (0.5 mL)溶液。將所得溶液在室溫下再攪拌2小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析(40g C18管柱，用含0.01% TFA之0至80%之乙腈水溶液經15分鐘溶離)純化，得到為白色固體之化合物83-3 (270 mg，0.143 mmol，56.70%)。LCMS：m/z= 946.1 (M/2+H) +；
步驟4 將化合物83-3 (450 mg，0.238 mmol)之DCM (8 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後向溶液中添加TFA (2 mL，26.925 mmol)。將所得黃色溶液攪拌1小時以實現完全去保護。將完成的溶液濃縮以移除DCM及TFA，隨後將棕色殘餘物藉由反相液相層析(40g C18管柱，用含有0.01% TFA之0至50%之乙腈水溶液溶離15分鐘)純化，以得到為白色固體之所需產物化合物83-4。LCMS，m/z =597.8 (M/3+H) +，896.6 (M/2+H) +；
步驟5 將化合物83-4 (250 mg，0.140 mmol)、化合物83-5 (81.30 mg，0.419 mmol)、HOAc (0.025 mL，0.140 mmol)之甲醇(5 mL)反應混合物在50℃下在N 2下攪拌18小時。隨後LCMS指示大部分化合物83-5被消耗並且偵測到所需產物。蒸發溶劑，並且將殘餘物藉由C18反相層析純化，得到所需83-6 (100 mg，0.051 mmol，36.42%)。LCMS，m/z =656.3 (M/3+H) +，983.8 (M/2+H) +；
步驟6 將化合物83-6 (100 mg，0.051 mmol)之DMF (0.9 mL)溶液在室溫下攪拌，並且添加無水二乙胺(0.1 mL，0.971 mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌15分鐘，直至LCMS顯示反應完成並且偵測到所需產物之質量。隨後將粗產物藉由反相液相層析(40g C18管柱，用含0.01% TFA之0至50%之乙腈水溶液溶離)純化，得到為白色固體之產物化合物83-7。LCMS，m/z = 582.5 (M/3+H) +；
步驟7 將化合物83-7 (50 mg，0.029 mmol)及DIPEA (11.09 mg，0.086 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加MC-OSu (13.25 mg，0.043 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液。將所得溶液在室溫下再攪拌6小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物。將反應溶液藉由添加甲酸酸化至pH3-4，隨後直接藉由製備型HPLC (用含0.01% TFA之梯度經20分鐘溶離)純化，得到為白色固體之產物PB083 (21 mg，0.011 mmol，37.81%)。LCMS，m/z = 485.7 (M/4+H) +，646.9 (M/3+H) +1H NMR: δ 10.04 (s, 1H), 8.14-8.05 (m, 2H), 7.96 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.83-7.76 (m, 2H), 7.67 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.60(d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 6.99 (s, 2H), 6.53 (brs, 1H), 6.05-5.97 (m, 1H), 5.45-5.43 (m, 4H), 5.34-5.24 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.43-4.32 (m, 1H), 4.27-4.17 (m, 3H), 4.05-4.02 (m, 1H), 3.87-3.80 (m, 1H), 3.71-3.64 (m, 2H), 3.57-3.47 (m, 53H), 3.16-3.06 (m, 2H), 3.06-2.92 (m, 6H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.24-2.11 (m, 4H), 2.03-1.83 (m, 4H),1.74-1.56 (m, 3H),1.50-1.35 (m, 9H), 1.35-1.14 (m, 5H), 0.89-0.81 (m, 9H) ppm。
實例15：含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物連接子(PB084)的製備
Figure 02_image723
含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物-連接子(PB084)製備如下： 步驟1 將化合物84-1 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 84-1，500 mg，0.445 mmol))、化合物84-2 ((2S)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己酸( 84-2，522.71 mg，0.445 mmol))及DIPEA (172.31 mg，1.336 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後藉由注射器逐滴添加HATU (169.29 mg，0.445 mmol)之無水DMF (1 mL)，歷時5分鐘。添加後，將所得溶液再攪拌2小時，直至LCMS指示反應完成。隨後將完成的反應溶液直接藉由反相管柱層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之化合物84-3 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 84-3，600 mg，0.263 mmol，59.11%))。ESI m/z：760.8 (M/3+H) +。
步驟2 向化合物84-3 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 84-3，580 mg，0.254 mmol))之乙醇(3 mL)溶液中添加2M HCl之乙醇(3 mL，0.254 mmol)。隨後將所得淡黃色溶液在室溫下攪拌4小時，直至LCMS顯示起始材料幾乎耗盡。將完成的溶液在冰水中冷卻並用碳酸氫鈉水溶液中和。減壓移除溶劑，並且將水層中之殘餘物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物84-4 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 84-4，300 mg，0.138 mmol，54.20%)。ESI m/z：727.3 (M/3+H) +, 718.3 (片段，MMAE), 473.5 (連接子片段，((2178-717-28-18)/3+H) +). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.11 (s, 1H), 8.97-8.80 (m, 1H), 8.43 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 8.32 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 8.24-8.06 (m, 4H), 7.96-7.86 (m, 1.5H), 7.66 (d, J= 8.8 Hz, 0.5H), 7.58 (d, J= 7.6 Hz, 2H), 7.35-7.24 (m, 6H), 7.18-7.16 (m, 1H), 6.07(s, 1H), 5.55-5.32 (m, 4H), 5.12-4.95 (m, 2H), 4.87-4.37(m, 9H), 4.29-4.23(m, 2H), 4.04-3.93 (m, 4H), 3.88-3.84 (m, 1H), 3.82-3.77 (m, 2H), 3.69-3.67 (m, 2H), 3.62-3.56 (m, 8H), 3.53-3.46 (m, 44H), 3.30-3.12 (m, 14H), 3.03-2.83 (m, 10H), 2.46-2.39 (m, 1H), 2.32-2.23 (m, 3H), 2.15-1.85 (m, 5H), 1.85-1.55 (m, 6H), 1.55-1.24 (m, 11H), 1.06-0.97 (m, 8H), 0.92-0.75 (m, 29H) ppm。揭示了TFA上之兩個羧基質子。
步驟3 將化合物84-4 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 84-4，200 mg，0.092 mmol)及化合物84-5 (6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 84-5，42.39 mg，0.138 mmol))之無水DMF (4 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加DIPEA (23.67 mg，0.184 mmol)之DMF (1 mL)溶液，歷時5分鐘。添加後，將所得溶液再攪拌4小時，直至LCMS指示起始胺幾乎耗盡。隨後將反應溶液藉由製備型HPLC (0.01% FA)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為白色固體之PB084 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-5-(胺基甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯胺基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]戊烷醯胺基]苯基}甲酯(PB084 ，120 mg，0.051 mmol，55.11%))。ESI m/z：1187.2 (M/3+H) +，791.7 (M/3+H) +，718.5 (片段，MMAE)，538.2 (連接子片段，(M-717-28-18)/3+H) +)。保留時間6.558分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.04 (s, 1H), 8.36-8.28 (m, 0.5 H), 8.13 (d, J= 6.8 Hz, 1H), 8.13-8.06 (m, 0.5H), 7.96 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.91 (d, J= 8.4 Hz, 0.5H), 7.84-7.80 (m, 1H), 7.68-7.65 (m, 1.5H), 7.59-7.56 (m, 2H), 7.34-7.24 (m, 6H), 7.20-7.16 (m, 1H), 6.99 (s, 2H), 5.99(d, J= 5.6 Hz, 1H), 5.44-5.43 (m, 3H), 5.37 (d, J= 4.8 Hz, 0.5H), 5.12-4.95 (m, 2H), 4.78-4.40 (m, 12H), 4.35-4.17 (m, 3.5H), 4.04-3.91 (m, 3H), 3.79-3.55 (m, 12H), 3.54-3.46 (m, 48H), 3.35-3.11 (m, 14H), 3.06-2.83 (m, 10H), 2.43-2.39 (m, 1H), 2.31-2.22 (m, 3H), 2.14-1.16 (m, 30H), 1.05-0.97 (m, 6H), 0.89-0.75 (m, 27H) ppm。
實例16：含有PEG單元及連接至SN-38之可裂解連接子之藥物連接子(PB085)的製備
Figure 02_image725
含有PEG單元及連接至SN-38之可裂解連接子之藥物-連接子(PB085)製備如下： 步驟1 將化合物85-1 ((19S)-10,19-二乙基-7,19-二羥基-17-氧雜-3,13-二氮雜五環[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-14,18-二酮(SN-38) ( 85-1，460 mg，1.173 mmol))及DIPEA (302.76 mg，2.347 mmol)之無水DMF (4 mL)之淡黃色混合物在室溫下攪拌，並且逐滴添加碳酸雙(4-硝基苯基)酯(PNPC，356.73 mg，1.173 mmol)之無水DMF (2 mL)，歷時10分鐘。添加後，淡黃色混合物變成淺黃色混合物，隨著反應之進行，物質緩慢溶解。添加後，將所得黃色澄清溶液在室溫下再攪拌30分鐘，隨後藉由LCMS監測。光譜顯示起始材料SN-38之完全消耗，期望之苯酚活化之產物作為主要之新峰與副產物醇活化之碳酸酯一起形成。反應溶液直接用於下一步驟。ESI m/z = 558.2 (M+H) +。
步驟2 用化合物85-3 (N-甲基-N-[2-(甲基胺基)乙基]胺基甲酸三級丁酯( 85-3、264.63 mg，1.408 mmol))及DIPEA (302.63 mg，2.346 mmol)處理來自上一步驟之粗活性碳酸酯之DMF溶液( 85-2 A ， 85-2B ， 85-2C之混合物)。將反應溶液攪拌1小時後，LCMS指示完全轉化。偵測到所需產物85-4及SN-38。將反應溶液藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為淡黃色固體之所需產物85-4 (N-(2-{[(三級丁氧基)羰基](甲基)胺基}乙基)-N-甲基胺基甲酸(19S)-10,19-二乙基-19-羥基-14,18-二氧雜-17-氧雜-3,13-二氮雜五環[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基酯( 85-4，467 mg，0.771 mmol，65.70%))。ESI m/z：607.3 (M+H) +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.10-10.01 (m, 1H), 8.18 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 8.10 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 7.93-7.86 (m, 3H), 7.73 (t, J= 8.0 Hz, 2H), 7.62-7.52 (m,3H), 7.43-7.26 (m,8H), 6.52 (s, 1H), 5.97 (s, 1H), 5.45-5.34 (m, 5H), 5.09-5.00 (m, 2H), 4.44-4.40 (m, 1H), 4.32-4.22 (m, 3H), 3.93 (t, J= 7.6 Hz, 1H), 3.65-3.50 (m, 7H), 3.19-3.12 (m, 2H), 3.04-2.89 (m, 7H), 2.02-1.914 (m, 1H), 1.91-1.74 (m, 2H), 1.74-1.52 (m, 2H), 1.52-1.36 (m, 2H), 1.36-1.26 (m, 2H), 0.91-0.84 (m, 9H) ppm。
步驟3 將化合物85-4 (N-(2-{[(三級丁氧基)羰基](甲基)胺基}乙基)-N-甲基胺基甲酸(19S)-10,19-二乙基-19-羥基-14,18-二氧雜-17-氧雜-3,13-二氮雜五環[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基酯( 85-4，600 mg，0.990 mmol))之DCM (1.8 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加TFA (0.2 mL，2.693 mmol)。將所得溶液在攪拌1小時，直至LCMS顯示反應完成。用旋轉蒸發儀蒸發掉所有溶劑及TFA，隨後將殘餘物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到預期級分，將其凍乾以得到為淡黃色固體之產物85-5 (N-甲基-N-[2-(甲基胺基)乙基]胺基甲酸(19S)-10,19-二乙基-19-羥基-14,18-二氧雜-17-氧雜-3,13-二氮雜五環[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基酯( 85-5，550 mg，0.889 mmol，89.75%))之TFA鹽。ESI m/z：254.3 (M/2+H) +，507.3 (M+H) +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.25 (s, 1H), 9.16 (s, 1H), 8.19 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 8.13 (s, 1H), 7.84-7.80 (m, 1H), 7.35 (s, 1H), 5.45 (s, 2 H), 5.35 (s, 2 H), 3.84-3.82 (m, 1H), 3.67-3.64 (m, 1H), 3.25-3.17 (m, 6H), 3.01 (s, 1H), 2.64-2.57 (m, 3H), 1.92-1.84 (m, 2H), 1.31 (t, J= 7.2 Hz, 3H), 0.89 (t, J= 7.2 Hz, 3H) ppm。揭示了TFA上之一個羧基質子。
步驟4 將HOBt (78.39 mg，0.581 mmol)及化合物85-6 (4-硝基苯基碳酸{4-[(2S)-5-(胺基甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-3-甲基丁醯胺基]戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 85-6，444.77 mg，0.581 mmol))之無水DMF (2 mL)之黃色溶液在室溫下攪拌，隨後藉由注射器逐滴添加DIPEA (224.71 mg，1.742 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液。在加入鹼時，反應溶液之顏色變成棕色。添加後，將所得棕色溶液再攪拌1小時，直至所有起始胺耗盡(藉由LCMS監測)。將反應溶液直接藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為黃色固體之化合物85-7 (N-{2-[({[(19S)-10,19-二乙基-19-羥基-14,18-二氧雜-17-氧雜-3,13-二氮雜五環[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基]氧基}羰基)(甲基)胺基]乙基}-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-5-(胺基甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-3-甲基丁醯胺基]戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 85-7，450 mg，0.397 mmol，68.33%))。ESI m/z：568.4 (M/2+H) +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.10-10.01 (m, 1H), 8.18 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 8.10 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 7.93-7.86 (m, 3H), 7.73 (t, J= 8.0 Hz, 2H), 7.62-7.52 (m,3H), 7.43-7.26 (m,8H), 6.52 (s, 1H), 5.97 (s, 1H), 5.45-5.34 (m, 5H), 5.09-5.00 (m, 2H), 4.44-4.40 (m, 1H), 4.32-4.22 (m, 3H), 3.93 (t, J= 7.6 Hz, 1H), 3.65-3.50 (m, 7H), 3.19-3.12 (m, 2H), 3.04-2.89 (m, 7H), 2.02-1.914 (m, 1H), 1.91-1.74 (m, 2H), 1.74-1.52 (m, 2H), 1.52-1.36 (m, 2H), 1.36-1.26 (m, 2H), 0.91-0.84 (m, 9H) ppm。
步驟5 向化合物85-7 (N-{2-[({[(19S)-10,19-二乙基-19-羥基-14,18-二氧雜-17-氧雜-3,13-二氮雜五環[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基]氧基}羰基)(甲基)胺基]乙基}-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-5-(胺基甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-3-甲基丁醯胺基]戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 85-7，450 mg，0.397 mmol))之無水DMF (1.8 mL)黃色溶液中添加二乙胺(0.2 mL，1.941 mmol)。將溶液再攪拌1小時，直至所有起始材料耗盡(藉由LCMS監測)。隨後用旋轉蒸發儀蒸發反應溶液以移除大部二乙胺，並且將殘餘物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為黃色固體之化合物85-8，VC-PAB-SN-38 TFA鹽(N-{2-[({[(19S)-10,19-二乙基-19-羥基-14,18-二氧雜-17-氧雜-3,13-二氮雜五環[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基]氧基}羰基)(甲基)胺基]乙基}-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 85-8， VC-PAB-SN-38TFA鹽，310 mg，0.340 mmol，85.62%))。ESI m/z：456.9 (M/2+H) +, 912.4 (M+H) +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.18 (s, 0.6H), 10.14 (s, 0.4H), 8.67 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 8.18 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 8.08 (brs, 3H), 7.94 (d J= 7.6 Hz, 1H), 7.58-7.50 (m, 3H), 7.34-7.27 (m,3H), 6.54 (s, 1H), 6.04 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 5.53-5.34 (m, 6H), 5.06-5.00 (m, 2H), 4.55-4.45 (m, 1H), 3.70-3.60 (m, 2H), 3.60-3.50 (m, 1H), 3.50-3.46 (m, 2H), 3.21-3.12 (m, 3H), 3.05-2.89 (m, 8H), 1.93-1.82 (m, 2H), 1.77-1.55 (m, 2H), 1.55-1.38 (m, 2H), 1.38-1.22 (m, 3H), 0.95-0.87 (m, 9H) ppm。TFA上之一個羧基質子與8.08 ppm處之胺基重疊。
步驟6 將化合物85-8 (N-{2-[({[(19S)-10,19-二乙基-19-羥基-14,18-二氧雜-17-氧雜-3,13-二氮雜五環[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基]氧基}羰基)(甲基)胺基]乙基}-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 85-8， VC-PAB-SN-38，240 mg，0.263 mmol))、化合物85-9 ((2S)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己酸( 85-9，308.95 mg，0.263 mmol))及DIPEA (67.89 mg，0.526 mmol)之無水DMF (3 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加HATU (100.06 mg，0.263 mmol)之無水DMF (3 mL)溶液。將所得黃色溶液再攪拌2小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析(0.01% TFA)純化，得到為淡黃色固體之化合物85-10 (N-{2-[({[(19S)-10,19-二乙基-19-羥基-14,18-二氧雜-17-氧雜-3,13-二氮雜五環[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基]氧基}羰基)(甲基)胺基]乙基}-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 85-10，340 mg，0.164 mmol，62.48%))。ESI m/z：690.3 (M/3+H) +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.03 (s, 1H), 8.20-8.10 (m, 3H), 7.94-7.90 (m, 1H), 7.80 (t, J= 13.2 Hz, 1H), 7.59-7.53 (m, 4H), 7.34-7.27 (m,3H), 7.01 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.99 (t, J= 5.2 Hz, 1H), 5.45-5.35 (m, 7H), 5.05-5.00 (m, 2H), 4.84-4.37 (m, 8H), 4.25 (t, J= 7.6 Hz, 1H), 4.04-3.96 (m, 2H), 3.92-3.85(m, 1H), 3.80-3.77 (m, 2H), 3.70-3.67 (m, 3H), 3.63-3.53 (m, 18H), 3.50-3.40 (m, 36H), 3.36-3.27 (m, 11H), 3.09-3.12 (m, 3H), 3.04-2.89 (m, 9H), 2.29 (t, J= 6.0 Hz, 2 H), 1.99-1.83 (m, 3H), 1.69-1.53 (m, 3H), 1.53-1.26 (m, 19H), 0.91-0.81 (m, 9H) ppm。TFA上之一個羧基質子出現在8.20-8.10 ppm之間。
步驟7 向化合物85-10 (N-{2-[({[(19S)-10,19-二乙基-19-羥基-14,18-二氧雜-17-氧雜-3,13-二氮雜五環[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基]氧基}羰基)(甲基)胺基]乙基}-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 85-10，100 mg，0.048 mmol))之甲醇(3 mL)溶液中緩慢添加2M HCl之甲醇(1 mL)，同時在室溫下攪拌。添加後，澄清溶液變成亮黃色。將溶液保持攪拌2小時，直至LCMS指示完全去保護。隨後將溶液冷卻至-20℃並用DIPEA中和，由此，黃色反應溶液變成無色溶液。隨後用旋轉蒸發儀在30℃以下蒸發有機溶劑，得到淡黃色殘餘物，將其溶解於水並藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分(pH3-4，LCMS顯示級分純度為約60%至58%)。凍乾後，獲得黃色固體(~ 100 mg)，純度為63%至64%。隨後藉由反相快速層析(中性溶離劑)再次純化固體，得到具有約48%至51%之純度之所需級分(pH6-7)。將收集之級分凍乾，得到為淡黃色固體之化合物85-11 (N-{2-[({[(19S)-10,19-二乙基-19-羥基-14,18-二氧雜-17-氧雜-3,13-二氮雜五環[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基]氧基}羰基)(甲基)胺基]乙基}-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 85-11，80 mg，0.041 mmol，84.07%))。產物直接作為不純的材料用於下一步驟。ESI m/z：657.0 (M/3+H) +，985.2 (M/2+H) +。
步驟8 向50 mL圓底燒瓶中添加化合物85-11 (N-{2-[({[(19S)-10,19-二乙基-19-羥基-14,18-二側氧基-17-氧雜-3,13-二氮雜五環[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基]氧基}羰基)(甲基)胺基]乙基}-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 85-11，80 mg粗物質，純度45%，0.041 mmol))、化合物85-12 (6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 85-12，12.52 mg，0.041 mmol))及無水DMF (2 mL)。將溶液在室溫下攪拌並藉由注射器逐滴添加DIPEA (7.87 mg，0.061 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液，歷時5分鐘。添加後，將溶液再攪拌4小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡。隨後將完成的反應溶液用TFA中和，並且直接藉由製備型HPLC (0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為白色固體之化合物PB085 (N-{2-[({[(19S)-10,19-二乙基-19-羥基-14,18-二側氧基-17-氧雜-3,13-二氮雜五環[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基]氧基}羰基)(甲基)胺基]乙基}-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-5-(胺基甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯胺基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB085 ，13 mg，0.006 mmol，基於起始胺含量計算產率32%))之TFA鹽。ESI m/z：1081.3 (M/2+H) +, 721.3 (M/3+H) +, 541.5 (M/4+H) +，保留時間5.819分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.00 (s, 0.6 H), 9.98 (s, 0.4 H), 8.20-8.08 (m, 3H), 7.94 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.79 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 7.66-7.52 (m, 4H),7.34-7.26 (m, 3H), 6.99 (s, 2H), 6.53 (s, 1H), 5.98 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 5.45-5.41 (m, 5H), 5.35 (s, 2H), 5.05-4.99 (m, 2H), 4.82-4.73 (m, 2H), 4.59-4.49 (m, 4H), 4.49-4.32 (m, 3H), 4.27-4.15 (m, 2H), 4.04-3.95 (m, 2H), 3.82-3 .75 (m, 2H), 3.69-3.44 (m, 65H), 3.19-3.12 (m, 3H), 3.03-2.89 (m, 11H), 2.29 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 2.14-2.08 (m, 2H), 2.02-1.84 (m, 3H), 1.72-1.60 (m, 3H), 1.55-1.15 (m, 18H), 0.90-0.80 (m, 9H) ppm。TFA上之一個羧基質子出現在8.20-8.08 ppm之間。
實例17：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB086)的製備
Figure 02_image727
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB086)製備如下： 步驟1 將化合物86-1 (1-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸( 86-1，500 mg，0.697 mmol))及HOSu (160.39 mg，1.395 mmol)之無水DCM (14 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加EDCI (267.36 mg，1.395 mmol)。將所得溶液再攪拌1小時，隨後用更多的DCM (20 mL)稀釋，並用水(20 mL)洗滌。收集有機層，並且用更多的DCM(20 mL)萃取水層。將合併之DCM層經硫酸鈉乾燥，隨後過濾並濃縮，得到為無色油狀物之粗物質2,2-二甲基-4-側氧基-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-十三氧雜-5-氮雜四十四烷-44-酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(800 mg，定量產率)。ESI m/z：715.5 (M-100+H) +； 837.5 (M+Na) +。
將得到的活性酯(800 mg粗物質，0.697 mmol)溶解於無水DMF (4 mL)，隨後添加化合物86-2 ((2S)-6-胺基-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸、TFA鹽( 86-2，503.93 mg，1.045 mmol))及DIPEA (179.83 mg，1.394 mmol)。將反應溶液在室溫下攪拌1小時，直至所有活性酯被耗盡(藉由LCMS監測)。隨後將所得溶液直接藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為淡黃色油狀物之化合物86-3 ((2S)-6-(1-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 86-3，600 mg，0.562 mmol，80.58%))。ESI m/z：484.9 ((M-100)/2+H) +, 968.7(M-100+H) +。 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 12.64 (s, 1H), 7.90 (d, J= 7.2 Hz, 2H), 7.82 (t, J=5.6 Hz, 1H), 7.73 (d, J= 7.2 Hz, 2H), 7.62 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.45-7.40 (m, 2H), 7.36-7.31 (m, 2H), 7.76 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 4.29-4.21 (m, 3H), 3.94-3.88 (m, 1H), 3.68-3.56 (m, 4H), 3.51-3.47 (m, 44H), 3.07-3.00 (m, 4H), 2.29 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 1.73-1.60 (m, 2H), 1.52-1.29 (m, 13H) ppm.
步驟2 將化合物86-3 ((2S)-6-(1-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 86-3，600 mg，0.562 mmol))、HATU (256.43 mg，0.674 mmol)及DIPEA (145.00 mg，1.124 mmol)之無水DMF (4 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加化合物86-4 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 86-4，471.91 mg，0.562 mmol))。將所得溶液再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。隨後將溶液直接藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為灰白色固體之化合物86-5 (N-(38-{[(5S)-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)戊基]胺基甲醯基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十八烷-1-基)胺基甲酸三級丁酯( 86-5，750 mg，0.397 mmol，70.60%))。ESI m/z：597.9 ((M-100)/3+H) +，896.1 ((M-100)/2+H) +，946.7 (M/2+H) +。
步驟3 向化合物86-5 (N-(38-{[(5S)-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)戊基]胺基甲醯基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十八烷-1-基)胺基甲酸三級丁酯( 86-5、700 mg，0.370 mmol))之DCM (8 mL)溶液中緩慢添加TFA (2 mL，26.925 mmol)。將所得黃色溶液在室溫下攪拌1小時至完成。用旋轉蒸發儀蒸發TFA及溶劑，並且將殘餘物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到期望級分，將其凍乾以得到為白色固體之產物86-6 (N-[(1S)-5-(1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 86-6，460 mg，0.257 mmol，69.38%))。ESI m/z：896.6 (M/2+H) +, 597.9(M/3+H) +。
步驟4 向CDI (0.029 mL，0.234 mmol)之無水DMF (4 mL)溶液中藉由注射器逐滴添加化合物86-6 (N-[(1S)-5-(1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30, 33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 86-6，350 mg，0.195 mmol))之無水DMF (4 mL)溶液，歷時5分鐘。添加後，將淡黃色溶液在室溫下再攪拌1小時以完成(藉由LCMS監測)。偵測到活性中間體N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-{1-[(1H-咪唑-1-羰基)胺基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基}戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯為主峰。ESI m/z：629.3 (M/3+H) +, 943.3 (M/2+H) +。
向以上活性中間體(0.195 mmol)之DMF (4 mL)反應溶液中添加化合物86-7 ((2R,3R,4R,5S)-6-胺基己烷-1,2,3,4,5-五醇( 86-7，70.59 mg，0.390 mmol))及DIPEA (50.31 mg，0.390 mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌2小時，直至所有物質耗盡。隨後將溶液直接藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為淡黃色固體之化合物86-8 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[1-({[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]胺基甲醯基}胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基]戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 86-8，200 mg，0.100 mmol，51.33%))。ESI m/z：999.8(M/2+H) +, 666.9 (M/3+H) +。
步驟5 將化合物86-8 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[1-({[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]胺基甲醯基}胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基]戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 86-8，200 mg，0.100 mmol))之DMF (3.6 mL)溶液在室溫下攪拌，並且添加二乙胺(0.4 mL，3.883 mmol)。將所得溶液攪拌30分鐘。隨後真空蒸發二乙胺，用甲酸中和DMF中之殘餘物並藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為淡黃色固體之所需產物86-9 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[1-({[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]胺基甲醯基}胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 86-9，130 mg，0.073 mmol，73.14%))。ESI m/z：592.9 (M/3+H) +, 889.0 (M/2+H) +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.09 (s, 1H), 8.42 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 8.31 (d, J= 6.8 Hz, 1H), 8.12-8.04 (m, 4H), 7.85 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 7.78 (d, J= 10.8 Hz, 1H), 7.60 (d, J= 7.6Hz, 2H), 7.37 (d, J= 8.8Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 6.54 (brs, 1H), 6.12 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 6.04 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 5.97 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 5.54-5.45 (m, 3H), 5.40-5.23 (m, 3H), 5.09 (s, 2H), 4.44-4.38 (m, 2H), 4.30-4.27 (m, 1H), 3.89-3.81 (m, 1H), 3.69-3.54 (m, 6H), 3.54-3.45 (m, 48H), 3.26-3.13 (m, 6H), 3.13-3.05 (m, 4H), 3.05-2.98 (m, 3H), 2.98-2.89 (m, 2H), 2.37 (s, 3H), 2.29 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 2.24-2.10 (m, 2H), 2.04-1.93 (m, 1H), 1.93-1.82 (m, 2H), 1.72-1.54 (m, 4H), 1.45-1.23 (m, 6H), 0.92-0.86 (m, 9H) ppm。TFA上之一個羧基質子出現在8.12-8.04 ppm之間。
步驟6 將化合物86-9 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[1-({[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]胺基甲醯基}胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 86-9，60 mg，0.034 mmol))及化合物86-10 (6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 86-10，12.50 mg，0.041 mmol))之無水DMF (1.5 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加DIPEA (6.54 mg，0.051 mmol)。將反應溶液再攪拌2小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡。將所得溶液用甲酸中和，隨後藉由製備型HPLC (0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為白色固體之PB086 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-5-(胺基甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯胺基]-6-[1-({[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]胺基甲醯基}胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB086 ，30 mg，0.015 mmol，45.09%))。ESI m/z：985.1 (M/2+H) +, 657.3 (M/3+H) +, 493.3 (M/4+H) +，保留時間6.424分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.03 (s, 1H), 8.11 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 8.06 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.96 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.82-7.76 (m, 2H), 7.66 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.60 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 6.99 (s, 2H), 6.50 (brs, 1H), 6.11 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 6.00-5.94 (m, 2H), 5.45-5.38 (m, 3H), 5.35-5.24 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.40-4.17 (m, 4H), 3.59-3.45 (m, 54H), 3.24-3.16 (m, 4H), 3.16-3.09 (m, 4H), 3.04-2.90 (m, 7H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.23-2.13 (m, 2H), 2.13-2.06 (m, 2H), 2.01-1.96 (m, 1H), 1.96-1.81 (m, 2H), 1.73-1.54(m, 4H), 1.48-1.29 (m, 10H), 1.24-1.14 (m, 4H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm。
實例18：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB087)的製備
Figure 02_image729
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB087)製備如下： 步驟1及步驟2 將化合物87-1 (1-疊氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸( 87-1，300 mg，0.466 mmol))及HOSu (80.39 mg，0.699 mmol)之無水DCM (10 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後在室溫下添加EDCI (134.01 mg，0.699 mmol)。將所得溶液再攪拌1小時，隨後用更多的DCM (20 mL)稀釋並用水(20 mL)洗滌，分離有機層，並用更多的DCM (20 mL * 2)萃取水層。將合併之DCM層經硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮，得到為無色油狀物之粗物質活性酯(345 mg，定量產率)。ESI m/z：741.5 (M+H) +, 763.4 (M+Na) +。將得到的酯溶解於無水DMF (4 mL)，隨後添加化合物87-3 ((2S)-6-胺基-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}己酸( 87-3，114.78 mg，0.466 mmol))及DIPEA (120.23 mg，0.932 mmol)。將所得混合物在室溫下攪拌隔夜，直至所有起始胺耗盡，並將混合物變成澄清淺黃色溶液。隨後將完成的反應溶液直接藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為無色油狀物之化合物87-4 ((S)-1-疊氮基-45-((三級丁氧基羰基)胺基)-39-側氧基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜-40-氮雜四十六烷-46-酸( 87-4，350 mg，0.401 mmol，86.13%))。ESI m/z：386.8 ((M-100)/2+H) +, 872.6 (M+H) +。
步驟3 將化合物87-4 ((S)-1-疊氮基-45-((三級丁氧基羰基)胺基)-39-側氧基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜-40-氮雜四十六烷-46-酸( 87-4，350 mg，0.401 mmol))及化合物87-5 (2-(丙-2-炔-1-基)丙二酸1,3-二乙酯( 87-5，158.94 mg，0.803 mmol))之DCM (8 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加Cu(CN) 4PF 6(447.94 mg，1.204 mmol)。將所得溶液再攪拌4小時，直至反應完成(藉由LCMS監測)。隨後將反應溶液濃縮並溶解於乙腈，過濾以移除銅催化劑。將濾液藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之1,4-二取代之三唑異構體(2S)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-6-(1-{4-[3-乙氧基-2-(乙氧基羰基)-3-側氧基丙基]-1H-1,2,3-三唑-1-基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)己酸及1,5-二取代之三唑異構體(2S)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-6-(1-{5-[3-乙氧基-2-(乙氧基羰基)-3-側氧基丙基]-1H-1,2,3-三唑-1-基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)己酸之混合物(化合物 87-6a/87-6b，350 mg，0.327 mmol，81.57%)。ESI m/z：485.9 ((M-100)/2+H) +，兩種區域選擇性異構體在LCMS中重疊。
步驟4 將化合物87-6a/87-6b之混合物(350 mg，0.327 mmol之(2S)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-6-(1-{5-[3-乙氧基-2-(乙氧基羰基)-3-側氧基丁基]-1H-1,2,3-三唑-1-基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)己酸及(2S)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-6-(1-{4-[3-乙氧基-2-(乙氧基羰基)-3-側氧基丙基]-1H-1,2,3-三唑-1-基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)己酸)、HATU (149.25 mg，0.393 mmol)及DIPEA (23.99 mg，0.186 mmol)之無水DMF (2 mL)在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加化合物87-7 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 87-7，275.06 mg，0.327 mmol))。將所得溶液再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之化合物87-8a/87-8b之混合物(380 mg，0.201 mmol，61.36%之2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲醯基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十八烷-1-基)-1H-1,2,3-三唑-5-基]甲基}丙二酸1,3-二乙酯及其區域選擇性異構體2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲醯基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十八烷-1-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基}丙二酸1,3-二乙酯)。ESI m/z：449.4((M-100)/4+H) +, 632.1 (M/3+H) +, 947.7(M/2+H) +，保留時間8.205分鐘(HPLC)。兩種異構體在LCMS中重疊為一個峰。 1H NMR (400MHz, DMSO-d6)：δ 10.06 (s, 1H), 8.20 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 8.07 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.84-7.76 (m, 3H), 7.61 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.55 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.36 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 7.02 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 6.63-6.43 (m, 1H), 5.99 (s, 1H), 5.50-5.40 (m, 3H), 5.34-5.23 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.48-4.45 (m, 2H), 4.42-4.36 (m, 1H), 4.27-4.23 (m, 1H), 4.13-4.08 (m, 4H), 3.93-3.86 (m, 1H), 3.82 (t, J= 7.6 Hz, 1H), 3.77 (t, J= 4.2Hz, 2H), 3.58-3.55 (m, 2H), 3.50-3.45 (m, 44H), 3.32-3.21 (m, 2H), 3.13 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 3.04-2.92 (m, 5H), 2.38(s, 3H), 2.29 (d, J= 6.4 Hz, 2H), 2.23-2.10 (m, 2H), 1.99-1.71 (m, 3H), 1.71-1.48 (m, 3H), 1.48-1.21 (m, 16H), 1.15 (t, J= 6.8 Hz, 6H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm。
步驟5 將化合物87-8a/87-8b (2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲醯基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十八烷-1-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基}丙二酸1,3-二乙酯及2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲醯基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十八烷-1-基)-1H-1,2,3-三唑-5-基]甲基}丙二酸1,3-二乙酯)之混合物( 87-8a/87-8b，380 mg，0.201 mmol)之THF (6 mL)在室溫下攪拌，隨後添加氫氧化鋰一水合物(8.87 mg，0.211 mmol)之水(3 mL)。反應溶液變成黃色並保持再攪拌2小時以實現完全水解。用TFA將溶液酸化至pH 6.0，隨後減壓濃縮以移除THF，將水中之殘餘物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之化合物87-9a/87-9b之混合物(250 mg，0.136 mmol，67.80%之1,4-二取代之三唑異構體2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲醯基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十八烷-1-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基}丙二酸及1,5-二取代之三唑異構體2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲醯基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十八烷-1-基)-1H-1,2,3-三唑-5-基]甲基}丙二酸)。在保留時間1.792分鐘下，約30%至44%異構體1，在保留時間1.811分鐘下，40%至52%異構體2，ESI m/z = 613.3 (M/3+H) +；919.1 (M/2+H) +。1H NMR (400MHz, DMSO-d6)：δ 10.05 (s, 1H), 8.19 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 8.07-8.03 (m, 1H), 7.82-7.76 (m, 3H), 7.61 (d, J= 7.2 Hz, 2H), 7.54 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.37 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 7.33 (s, 0.5H), 7.32 (s, 0.5H), 7.01 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 6.54-6.53 (m, 1H), 5.99 (s, 1H), 5.46-5.39 (m, 3H), 5.34-5.23 (m, 3H), 5.09 (s, 2H), 4.48-4.46 (m, 2H), 4.43-4.37 (m, 1H), 4.28-4.23 (m, 1H), 3.91-3.86 (m, 1H), 3.78 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 3.65-3.56 (m, 4H), 3.51-3.45 (m, 46H), 3.15-2.90 (m, 8H), 2.38(s, 3H), 2.29 (d, J= 6.4 Hz, 2H), 2.23-2.11 (m, 2H), 1.99-1.82 (m, 3H), 1.72-1.49 (m, 3H), 1.49-1.22 (m, 17H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm。
步驟6 向圓底燒瓶中添加化合物87-9a/87-9b之混合物(240 mg，0.131 mmol之2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲醯基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十八烷-1-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基}丙二酸及2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲醯基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十八烷-1-基)-1H-1,2,3-三唑-5-基]甲基}丙二酸)，隨後添加化合物87-10 ((2R,3R,4R,5S)-6-胺基己烷-1,2,3,4,5-五醇( 87-10，94.69 mg，0.523 mmol))及DIPEA (50.56 mg，0.392 mmol)之無水DMF (1.5 mL)溶液。將棕色溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後逐滴添加HATU (99.35 mg，0.261 mmol)之無水DMF (1.5 mL)溶液。添加後，將所得溶液再攪拌2小時，直至LCMS指示轉換完成。將反應溶液直接藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到1,4-二取代之三唑及1,5-二取代之三唑之混合物，將其藉由製備型HPLC (0.01% TFA)進一步純化，得到為淡黃色固體之化合物87-11a (1,4-二取代之異構體N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-{1-[4-(2-{[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]胺基甲醯基}乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基}戊基]胺基甲酸三級丁酯( 87-11a ，65 mg，0.033 mmol，25.43%))及為淡黃色固體之化合物87-11b (1,5-二取代之異構體N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-{1-[5-(2-{[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]胺基甲醯基}乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基}戊基]胺基甲酸三級丁酯( 87-11b ，35 mg，0.018 mmol，13.66%))。 87-11a (多數)：ESI m/z：653.0 (M/3+H) +, 979.2 (M/2+H) +。 1H NMR: (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.04 (s, 1H), 8.19 (d, J= 6.8 Hz, 1H), 8.06(d, J= 7.6 Hz, 1H), 7.86-7.77 (m, 4H), 7.60 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 7.54 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.36 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 7.00 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.99 (s, 1H), 5.45-5.35 (m, 3H), 5.35-5.24 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.47-4.44 (m, 2H), 4.41-4.36 (m, 1H), 4.27-4.23 (m, 1H), 3.93-3.86 (m, 1H), 3.79(t, J= 4.2 Hz, 2H), 3.67-3.56 (m, 8H), 3.56-3.46 (m, 44H), 3.16-2.90 (m, 12H), 2.83 (t, J= 7.6Hz, 2H), 2.43 (t, J= 8.0 Hz, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J= 6.4Hz, 2H), 2.23-2.11 (m, 2H), 2.00-1.82 (m, 4H), 1.73-1.57 (m, 3H), 1.50-1.24 (m, 18H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm。揭示了TFA上之一個羧基質子。
87-11b(少數)： ESI m/z：653.0 (M/3+H) +； 979.1 (M/2+H) +。 1H NMR: (400 MHz, DMSO-d6) δ10.04 (s, 1H), 8.18 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 8.04 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.83-7.75 (m, 4H), 7.61 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 7.54 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.36 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 7.33 (s, 1H), 7.00 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.99 (s, 1H), 5.45-5.39 (m, 3H), 5.34-5.23 (m, 3H), 5.09 (s, 2H), 4.46 (t, J= 4.2 Hz, 2H), 4.41-4.36 (m, 1H), 4.27-4.23 (m, 1H), 3.93-3.88 (m, 1H), 3.79(t, J = 4.6 Hz, 2H), 3.67-3.56 (m, 8H), 3.56-3.47 (m, 44H), 3.13-2.90 (m, 12H), 2.83 (t, J= 7.6 Hz, 2H), 2.43 (t, J= 7.6 Hz, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J= 6.4Hz, 2H), 2.22-2.10 (m, 2H), 2.00-1.85 (m, 4H), 1.73-1.55 (m, 3H), 1.48-1.24 (m, 18H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm。揭示了TFA上之一個羧基質子。
步驟7 將化合物87-11a (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-{1-[4-(2-{[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]胺基甲醯基}乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基}戊基]胺基甲酸三級丁酯( 87-11a，60 mg，0.031 mmol))之甲醇(2 mL)在室溫下攪拌，隨後添加2M HCl之甲醇(1 mL)。將溶液攪拌1小時，直至LCMS顯示所有起始材料耗盡。隨後將反應溶液用碳酸氫鈉水溶液中和，用旋轉蒸發儀蒸發掉溶劑甲醇，將殘餘物溶解於水並藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，收集所需級分，將其冷凍乾燥以得到為白色固體之產物87-12a (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-{1-[5-(2-{[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]胺基甲醯基}乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30, 33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基}己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲基酯( 87-12a。20 mg，0.011 mmol))。ESI m/z：928.7 (M/2+H) +, 619.5 (M/3+H) +。 1H NMR: (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.09 (s, 1H), 8.41 (d, J= 8.4Hz, 1H), 8.31 (d, J= 8.0Hz, 1H), 8.08-8.02 (m, 4H), 7.85-7.80 (m, 3H), 7.79 (s, 1H), 7.60 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 7.37 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 6.00 (t, J= 4.0 Hz, 1H), 5.46 (brs, 4H), 5.34-5.25 (m, 3H), 5.09 (s, 2H), 4.47-4.26 (m, 7H), 3.89-3.84 (m, 1H), 3.80-3.76 (m, 2H), 3.60-3.56 (m, 5H), 3.50-3.47 (m, 44H), 3.29-3.22 (m, 2H), 3.16-2.94 (m, 9H), 2.85-2.81 (m, 1H), 2.45-2.41(m, 1H), 2.39 (s, 3H), 2.31 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 2.24-2.11 (m, 4H), 2.02-1.98 (m, 1H), 1.90-1.82 (m, 3H), 1.69-1.64 (m, 3H), 1.60-1.55 (m, 1H), 1.46-1.23 (m, 7H), 0.92-0.86 (m, 9H) ppm。揭示了TFA上之一個羧基質子。
步驟8 將化合物87-12a (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-{1-[4-(2-{[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]胺基甲醯基}乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基}己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 87-12a，20 mg，0.011 mmol))及DIPEA (1.94 mg，0.015 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物87-13 (6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 87-13，3.08 mg，0.010 mmol))之無水DMF (1 mL)溶液。將所得溶液再攪拌4小時，直至LCMS指示所有起始活性酯耗盡並且幾乎無起始胺殘留。隨後用TFA將所得溶液酸化至pH4-5，藉由製備型HPLC (0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為白色固體之PB087 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-5-(胺基甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯胺基]-6-{1-[4-(2-{[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]胺基甲醯基}乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基}己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB087，12 mg，0.006 mmol，58.56%))。ESI m/z：1047.7 (M/2+Na) +, 684.1(M/3+H) +, 513.4 (M/4+H) +，保留時間6.372分鐘(HPLC)。 1H NMR: (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.04 (s, 1H), 8.13 (d, J=6.8Hz, 1H), 8.09-8.05 (m, 1H), 7.97 (d, J= 8.0Hz, 1H), 7.86-7.76 (m, 4H), 7.69-7.66 (m, 1H), 7.60 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 6.99 (s, 2H), 6.55 (s, 1H), 6.05-5.95 (m, 1H), 5.45 (s, 4H), 5.33-5.24 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.47-4.33 (m, 4H), 4.27-4.16(m, 3H), 3.80-3.75 (m, 2H), 3.67-3.55 (m, 12H), 3.50-3.48 (m, 44H), 3.37-3.34 (m, 2H), 3.29-3.22 (m, 2H), 3.13-2.90 (m, 8H), 2.83 (t, J= 7.6Hz, 1H), 2.43 (d, J = 7.60Hz, 1H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.22-2.05 (m, 4H), 2.00-1.83 (m, 3H), 1.73-1.57 (m, 3H), 1.51-1.32 (m, 9H), 1.24-1.14 (m, 4H), 0.90-0.81 (m, 9H)ppm。揭示了TFA上之一個羧基質子。
實例19：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB088)的製備
Figure 02_image731
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB088)製備如下： 步驟1 向化合物88-1 (1-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸( 88-1、500 mg，0.697 mmol))之DCM (4 mL)溶液中添加TFA (1 mL，13.463 mmol)。將混合物在室溫下攪拌2小時。隨後將溶液濃縮，並將粗物質混合物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為無色油狀物之化合物88-2 (1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸( 88-2，420 mg，0.680 mmol，97.59%))。ESI m/z：618.4(M+H) +。
步驟2 將化合物88-3 (N-(2-胺基乙基)胺基甲酸三級丁酯( 88-3，0.335 mL，2.122 mmol))及CDI (0.264 mL，2.121 mmol)之DMF (3 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，以製備活性中間體，隨後添加化合物88-2 (1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸( 88-2，236 mg，0.382 mmol))及DIPEA (197.48 mg，1.528 mmol)。將所得溶液再攪拌1小時，直至所有物質耗盡。將反應混合物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為無色油狀物之化合物88-4 (1-{[(2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}乙基)胺基甲醯基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸( 88-4，230 mg，0.286 mmol，74.89%))。ESI m/z：= 804.5(M+H) +。 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.17 (s, 1H), 6.78 (t, J= 4.8 Hz, 1H), 6.08-5.81 (m, 2H), 3.60 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 3.54-3.48 (m, 44H), 3.37 (t, J= 5.6 Hz, 3H), 3.17-3.12 (m, 2H), 3.05-2.96 (m, 2H), 2.93-2.87 (m, 2H), 2.44 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 1.37 (s, 9H) ppm。
步驟3 向化合物88-4 (1-{[(2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}乙基)胺基甲醯基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸( 88-4，430 mg，0.535 mmol))之DCM (5 mL)溶液中添加TFA (1 mL，13.463 mmol)。將混合物在室溫下攪拌2小時。隨後將溶液濃縮，並將粗物質藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為無色油狀物之化合物88-5 (1-{[(2-胺基乙基)胺基甲醯基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸( 88-5，320 mg，0.455 mmol，85.00%))之TFA鹽。ESI m/z：= 704.5 (M+H) +。
步驟4 向化合物88-5 (1-{[(2-胺基乙基)胺基甲醯基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸( 88-5，163 mg，0.232 mmol))之MeOH (20 mL)溶液中分批添加D-葡萄糖(166.90 mg，0.926 mmol)，將混合物加熱至85℃，同時在N 2氛圍下攪拌30分鐘。隨後添加NaCNBH 3(58.21 mg，0.926 mmol)。將反應混合物在加熱下攪拌18小時至完成。隨後將反應溶液濃縮至乾燥，並藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為無色油狀物之化合物88-6 (1-{[(2-{雙[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]胺基}乙基)胺基甲醯基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸( 88-6，200 mg，0.194 mmol，83.52%))。ESI m/z：1032.5(M+H) +。 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 6.40-6.38 (m, 2H), 4.67 (brs, 8H), 3.70-3.63 (m, 2H), 3.61-3.39 (m, 54H), 3.38-3.37 (m, 6H), 3.22-2.91 (m, 6H), 2.49-2.35 (m, 4H), 2.31 (t, J= 6.4 Hz, 2H) ppm。未顯示羧基之質子。
步驟5 將化合物88-6 (1-{[(2-{雙[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]胺基}乙基)胺基甲醯基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸( 88-6，138.45 mg，0.134mmol))、HATU (50.95 mg，0.134 mmol)及DIPEA (34.61 mg，0.268 mmol)之DMF (3 mL)混合物在室溫下在N 2下攪拌15分鐘。隨後緩慢添加化合物88-7 (N-[(1S)-5-胺基-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 88-7，160 mg，0.134 mmol))，並將反應混合物攪拌2小時。反應完成後(藉由LCMS偵測)，將反應溶液藉由製備型-HPLC (0.01% TFA)純化，得到為淡黃色固體之化合物88-8 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-(1-{[(2-{雙[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]胺基}乙基)胺基甲醯基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 88-8，220 mg，0.100 mmol，74.27%))。ESI m/z：1103.6 (M/2+H) +。
步驟6 向化合物88-8 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-(1-{[(2-{雙[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]胺基}乙基)胺基甲醯基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 88-8，230 mg，0.104 mmol))之DMF (2 mL)溶液中添加二乙胺(30.51 mg，0.417 mmol)。將混合物在室溫下攪拌2小時，隨後將溶液真空濃縮以移除大部分之二乙胺，將粗物質藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為淡黃色固體之化合物88-9 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-(1-{[(2-{雙[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]胺基}乙基)胺基甲醯基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 88-9，150 mg，0.076 mmol，72.53%))之TFA鹽。ESI m/z：992.6 (M/2+H)+。
步驟7 在室溫下，向化合物88-9 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-(1-{[(2-{雙[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]胺基}乙基)胺基甲醯基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 88- 9，TFA鹽、52 mg，0.026 mmol))之DMF (2 mL)溶液中添加化合物88-10 (6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 88-10，16.17 mg，0.052 mmol))及DIPEA (6.78 mg，0.052 mmol)。添加後，將溶液攪拌2小時，直至LCMS顯示反應完成。隨後將反應溶液藉由製備型HPLC (0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為淡黃色固體之PB088 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-(1-{[(2-{雙[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]胺基}乙基)胺基甲醯基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB088，40 mg，0.018 mmol，70.09%))。ESI m/z：1089.6 (M/2+H) +, 726.3 (M/3+H) +，保留時間6.007分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.02 (s, 1H),8.67 (s, 1H), 8.11 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 8.06 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.95 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.79 (dd, J= 11.0, 5.7 Hz, 2H), 7.66 (d, J= 8.9 Hz, 1H), 7.60 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.53 (s, 1H), 6.- 6.23 (m, 2H), 5.99 (dd, J= 9.8, 4.1 Hz, 1H), 5.43 (d, J= 12.1 Hz, 4H), 5.35 (s, 2H), 5.29 (s, 3H), 5.07 (s, 2H), 4.75 – 4.37 (m, 8H), 4.25-4.17 (m, 2H), 4.00 (d, J= 7.6 Hz, 2H), 3.69-3.66 (m, 2H), 3.59-3.54 (m, 5H), 3.52-3.45 (m, 54H), 3.23-3.11 (m, 5H), 3.09-2.85 (m, 5H), 2.38 (s, 3H), 2.35-1.79 (m, 11H), 1.72-1.55 (m, 3H), 1.51-1.42 (m, 6H), 1.42-1.10 (m, 9H), 0.89-0.80 (m, 9H) ppm。
實例20：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB089)的製備
Figure 02_image733
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB089)製備如下： 步驟1 將化合物89-1 (1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-27-酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 89-1，1.83 g，2.405 mmol))、化合物89-2 ((2S)-6-胺基-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}己酸( 89-2，0.59 g，2.405 mmol))及DIPEA (0.62 g，4.811 mmol)之DMF (10 mL)溶液在室溫下攪拌18小時，直至LCMS指示完全轉化。隨後將反應溶液藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為白色固體之化合物89-3 ((2S)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-6-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-27-醯胺基]己酸( 89-3，1.54 g，1.726 mmol，71.77%))。ESI m/z：914.5 (M+Na) +，396.8 (M-100)/2+H) +。
步驟2 向化合物89-3 ((2S)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-6-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-27-醯胺基]己酸( 89-3，1.14 g，1.278 mmol))之DCM (10 mL)溶液中添加二乙胺(0.401 mL，5.112 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌2小時至完成。隨後將混合物藉由反相快速層析純化，得到為無色油狀物之化合物89-4 ((2S)-6-(1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-27-醯胺基)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}己酸( 89-4，800 mg，1.194 mmol，93.46%))。ESI m/z = 670.5 (M+H) +，285.8 ((M-100)/2+H) +。
步驟3 向化合物89-4 ((2S)-6-(1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-27-醯胺基)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}己酸( 89-4，800 mg，1.194 mmol))之MeOH (50 mL)溶液中分批添加D-葡萄糖(860.80 mg，4.778 mmol)，並且將混合物加熱至85℃，同時在N 2氛圍下攪拌30分鐘。隨後添加NaCNBH 3(300.12 mg，4.776 mmol)。添加後，將反應混合物在加熱回流18小時。隨後將反應溶液濃縮，並藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為無色油狀物之化合物89-5 ((2S)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-五羥基-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十四烷醯胺基]己酸( 89-5，966 mg，0.968 mmol，81.06%))。ESI m/z：998.5 (M+H) +，449.8 (M/2+H) +。
步驟4 將化合物89-5 ((2S)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-五羥基-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十四烷醯胺基]己酸( 89-5，275 mg，0.276 mmol))、HATU (91.67 mg，0.241 mmol)及DIPEA (59.33 mg，0.459 mmol)之DMF (5 mL)混合物在室溫下攪拌15分鐘。隨後緩慢添加化合物89-6 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 89-6，193.07 mg，0.230 mmol))，並且將反應混合物攪拌2小時。將反應溶液藉由製備型-HPLC (0.01% TFA)純化，得到為淡黃色固體之化合物89-7 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-五羥基-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十四烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 89-7，347 mg，0.191 mmol，82.99%))。ESI m/z：911.0 (M/2+H) +，607.9 (M/3+H) +。
步驟5 將化合物89-7 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-五羥基-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十四烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 89-7，347 mg，0.191 mmol))之1M HCl之乙酸乙酯(219 mg，6.007 mmol)溶液在室溫下攪拌2小時，直至LCMS顯示反應完成。隨後用旋轉蒸發儀蒸發溶劑，並且將殘餘物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之化合物89-8 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-五羥基-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十四烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 89-8，93 mg，0.054 mmol，28.36%))。ESI = 574.5 (M/3+H) +，861.2 (M/2+H) +。
步驟6 向化合物89-8 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-五羥基-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十四烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 89-8，93 mg，0.054 mmol))之DMF (2 mL)溶液中添加DIPEA (10.48 mg，0.081 mmol)及化合物89-9 (6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 89-9，24.99 mg，0.081 mmol))。添加後，將溶液在室溫下攪拌1小時，直至所有起始胺耗盡(藉由LCMS監測)。隨後將所得溶液調節至pH 6，並且藉由製備型HPLC (0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物PB089 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-5-(胺基甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯胺基]-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-五羥基-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十四烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB089，55 mg，0.029 mmol，53.17%))之TFA鹽。ESI m/z：639.1 (M/3+H) +，保留時間5.799分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.04 (s,1H), 8.14-8.12 (m, 2H), 8.07 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.83 (t, J = 5.6 Hz,1H), 7.76 (d, J =11.2 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 6.99 (s, 2H), 6.548 (s, 1H), 6.02 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.45 (brs, 6H), 5.33-5.21 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.82 (brs, 2H), 4.56 (brs, 4H), 4.40-4.17 (m,5H), 3.99 (brs, 2H), 3.80-3.76 (m, 2H), 3.69-3.67 (m, 2H), 3.62-3.56 (m, 8H), 3.49-3.45 (m, 28H), 3.36-2.90 (m, 16H), 2.37 (s, 3H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.24-2.08 (m, 4H), 2.00-1.81 (m, 3H), 1.69-1.57 (m, 3H), 1.52-1.42 (m, 6H), 1.36-1.29 (m, 3H), 1.22-1.14 (m, 4H), 0.89-0.81 (m, 9H) ppm。
實例21：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB090)的製備
Figure 02_image735
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB090)製備如下： 步驟1 向化合物90-1 (1-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸( 90-1，3.737 mL，11.494 mmol))之DCM (15 mL)溶液中添加HOSu (1.98 g，17.240 mmol)及EDCI (3.30 g，17.240 mmol)。將混合物在室溫下攪拌2小時。隨後將所得溶液用鹽水(20 mL)洗滌並用DCM (20 mL)萃取。將收集之有機層用Na 2SO 4乾燥、過濾並蒸發至乾燥，得到產物90-2 (2,2-二甲基-4-側氧基-3,8,11,14,17-五氧雜-5-氮雜二十烷-20-酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 90-2，5.32 g，11.503 mmol，100%))。ESI m/z：485.3 (M+H) +。
步驟2 向化合物90-2 (2,2-二甲基-4-側氧基-3,8,11,14,17-五氧雜-5-氮雜二十烷-20-酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 90-2，5.32 g，11.503 mmol))之DMF (20 mL)溶液中添加化合物90-3 ((2S)-6-胺基-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 90-3，6.36 g，17.254 mmol))及DIPEA (2.97 g，23.005 mmol)。將混合物在室溫下攪拌3小時。將所得溶液藉由反相分離(0.01% TFA)純化，得到為無色油狀物之產物90-4 ((2S)-6-(1-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 90-4，6.18 g，8.637 mmol，75.12%))。ESI m/z：716.5 (M+H) +。
步驟3 向化合物90-4 ((2S)-6-(1-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 90-4，6.18 g，8.633 mmol))之DCM (20 mL)溶液中添加TFA (4 mL，53.850 mmol)。將混合物在室溫下攪拌2小時。蒸發所得溶液，並且藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為無色油狀物之產物90-5 ((2S)-6-(1-胺基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 90-5，4.2 g，6.821 mmol，79.01%))。ESI m/z：616.4 (M+H) +。
步驟4 向化合物90-5 ((2S)-6-(1-胺基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 90-5，4.2 g，6.821 mmol))之MeOH (25 mL)溶液中添加D-葡萄糖(7.37 g，40.926 mmol)及NaBH3CN (2.57 g，40.926 mmol)。將混合物在60℃下攪拌24小時。濃縮所得溶液，並且藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為無色油狀物之產物90-6 ((2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-6-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-五羥基-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜二十二烷醯胺基]己酸( 90-6，5.16 g，5.466 mmol，80.12%))。ESI m/z：945.6 (M+H) +。
步驟5 向化合物90-6 ((2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-6-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-五羥基-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜二十二烷醯胺基]己酸( 90-6，168 mg，0.178 mmol))之DMF (5 mL)溶液中添加化合物90-7 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18, 20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 90-7，150 mg，0.178 mmol))、DIPEA (27.58 mg，0.214 mmol)及HATU (71.05 mg，0.187 mmol)。將混合物在室溫下攪拌1.5小時。將所得溶液調節至pH 6，並且藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到產物90-8 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-五羥基-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜二十二烷醯胺基]戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 90-8，217 mg，0.123 mmol，69.01%))。ESI m/z：884.1 (M/2+H) +。
步驟6 向化合物90-8 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-五羥基-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜二十二烷醯胺基]戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 90-8，217 mg，0.123 mmol))之DMF (2 mL)溶液中添加二乙胺(0.4 mL，2.501 mmol)。將混合物在室溫下攪拌2小時。將所得溶液調節至pH 6，並且藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物90-9 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18, 20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-五羥基-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜二十二烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 90-9，138 mg，0.089 mmol，72.74%))。ESI m/z：773.5(M/2+H) +。
步驟7 向化合物90-9 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-五羥基-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜二十二烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 90-9，138 mg，0.089 mmol))之DMF (2 mL)溶液中添加DIPEA (17.32 mg，0.134 mmol)及化合物90-10 (6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 90-10，41.31 mg，0.134 mmol))。將混合物在室溫下攪拌2小時。將所得溶液調節至pH 6，並且藉由製備型HPLC (0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物PB090 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18, 20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-5-(胺基甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯胺基]-6-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-五羥基-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜二十二烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB090，32 mg，0.018 mmol，20.61%))之TFA鹽。ESI m/z：580.5 (M/3+H) +，保留時間6.558分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.03 (s,1H), 8.14-8.12 (d, J= 6.8 Hz, 2H), 8.08-8.05 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.98-7.96 (d, J= 8.0 Hz,1H), 7.83-7.81 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 7.78-7.76 (d, J= 10.8 Hz,1H), 7.67-7.64 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.61-7.59 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.37-7.35 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.54 (s, 1H), 6.01 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 5.45 (brs, 6H), 5.29-5.27 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.86-4.74 (m, 2H), 4.65-4.40 (m, 5H), 4.40-4.35 (m, 1H), 4.27-4.17 (m, 2H), 4.04-3.94 (m, 2H), 3.79-3.76 (m, 2H), 3.69-3.67 (m, 2H), 3.67-3.54 (m, 8H), 3.53-3.42 (m, 18H), 3.29-3.27 (m, 4H), 3.20-2.90 (m, 6H), 2.37 (s, 3H), 2.29 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 2.22-2.08 (m, 4H), 2.02-1.81 (m, 3H), 1.71-1.56 (m, 3H), 1.52-1.42 (m, 6H), 1.40-1.14 (m, 8H), 0.89-0.81 (m, 9H) ppm。揭示了TFA上之一個羧基質子。
實例22：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB091)的製備
Figure 02_image737
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB091)製備如下： 步驟1 將化合物91-1 (1-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸( 91-1，560 mg，0.781 mmol))之DCM (10 mL)溶液用TFA (2 mL，26.925 mmol)處理並在室溫下攪拌1小時，直至LCMS顯示反應完成。隨後將溶液濃縮，並將殘餘物懸浮於DCM並再次濃縮，得到為白色固體之粗產物91-2 (1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸、TFA鹽( 91-2，600 mg，0.821 mmol，105.09%))。產物原樣用於下一步驟。ESI m/z = 618.5 (M+H) +。
步驟2 將化合物91-2 (1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸、TFA鹽( 91-2，570.91 mg，0.781 mmol))、化合物91-3 ((3R,4S)-3,4,5-三羥基戊醛( 91-3，0.395 mL，3.124 mmol))及NaCNBH 3(0.121 mL，3.124 mmol)之甲醇(16 mL)反應溶液在N 2下回流攪拌18小時，直至LCMS指示反應完成。蒸發溶劑，將殘餘物溶解於水，隨後藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色泡沫之所需產物91-4 ((43R,44S)-43,44,45-三羥基-40-[(3R,4S)-3,4,5-三羥基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十五烷酸( 91-4，700 mg，0.821 mmol，105.08%))，與過量核糖混合。ESI m/z：427.8 (M/2+H) +，854.6 (M+H) +。
步驟3 將化合物91-4 ((43R,44S)-43,44,45-三羥基-40-[(3R,4S)-3,4,5-三羥基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十五酸( 91-4，214.68 mg，0.252 mmol))、化合物91-5 (N-[(1S)-5-胺基-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 91-5，150 mg，0.126 mmol))及DIPEA (32.47 mg，0.252 mmol)之無水DMF (2.0 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後緩慢添加HATU (47.85 mg，0.126 mmol)之無水DMF (0.5 mL)溶液。添加後，將所得溶液在室溫下再攪拌2小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之化合物91-6 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(43R,44S)-43,44,45-三羥基-40-[(3R,4S)-3,4,5-三羥基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31, 34,37-十二氧雜-40-氮雜四十五烷醯胺基]戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 91-6，160 mg，0.079 mmol，62.72%))。ESI m/z：507.8 (M/4+H) +，676.7 (M/3+H) +。
步驟4 將化合物91-6 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(43R,44S)-43,44,45-三羥基-40-[(3R,4S)-3,4,5-三羥基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25, 28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十五烷醯胺基]戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 91-6，80 mg，0.039 mmol))之DMF (1.5 mL)溶液在室溫下攪拌，並且添加二乙胺(0.08 mL，0.777 mmol)。將所得溶液在再攪拌1小時，直至LCMS顯示反應完成。真空移除二乙胺，並且將DMF中之殘餘物藉由製備型HPLC (10 mM碳酸氫銨)純化，得到為白色固體之所需產物91-7 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(43R,44S)-43,44,45-三羥基-40-[(3R,4S)-3,4,5-三羥基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十五烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 91-7，30 mg，0.017 mmol，42.12%))。ESI m/z：903.7 (M/2+H) +, 602.7 (M/3+H) +。 1H NMR: (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.11 (s, 1H), 8.35-8.31(m, 5H), 8.09-8.06 (m, 2H), 7.83-7.77 (m, 2H), 7.61 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 7.36 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 6.09 (s, 1H), 5.46 (s, 4H), 5.30-5.29 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.41-4.34 (m, 1H), 4.27-4.23 (m, 1H), 3.59-3.56 (m, 4H), 3.50-3.47 (m, 44 H), 3.47-3.46 (m, 2H), 3.36-3.30 (m, 4H), 3.30-3.22 (m, 4H), 3.14-3.08 (m, 2H), 3.03-2.95 (m, 4H), 2.68-2.56 (m, 6H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J= 6.4Hz, 2H), 2.22-2.13 (m, 4H), 2.00-1.84 (m, 4H), 1.76-1.65 (m, 4H), 1.65-1.56 (m, 3H), 1.46-1.28 (m, 10H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm。TFA上之兩個羧基質子出現在8.35-8.31 ppm之間。
步驟5 向化合物91-7 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(43R,44S)-43,44,45-三羥基-40-[(3R,4S)-3,4,5-三羥基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十五烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 91-7，30 mg，0.017 mmol))之DMF (2 mL)溶液中添加DIPEA (3.30 mg，0.026 mmol)及化合物91-8 (6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 91-8，7.86 mg，0.026 mmol))。將混合物在室溫下攪拌2小時。將所得溶液藉由製備型HPLC (0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物PB091 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-5-(胺基甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯胺基]-6-[(43R,44S)-43,44,45-三羥基-40-[(3R,4S)-3,4,5-三羥基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十五烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB091 ，7.5 mg，0.004 mmol，22.58%))。ESI m/z：667.0(M/3+H) +，500.8(M/4+H) +，保留時間5.791分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.03 (s, 1H), 9.10 (brs, 1H), 8.13-8.10 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 8.07-8.05 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.98-7.96 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.83-7.80 (t, J= 5.2Hz, 1H), 7.77-7.74 (d, J= 10.8 Hz, 1H), 7.68-7.65 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.61-7.59 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.38-7.35 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 6.99 (s, 2H), 6.54 (s, 1H), 6.02-6.01 (m, 1H), 5.45 (brs, 4H), 5.29-5.26 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.91 (brs, 2H), 4.76 (brs, 2H), 4.52 (brs, 2H), 4.38-4.36 (m, 1H), 4.25-4.17 (m, 2H), 3.75-3.74 (m, 2H), 3.58-3.52 (m, 6H), 3.51-3.46 (m, 44H), 3.37-2.91 (m, 16H), 2.20 (s, 3H), 2.29 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 2.21-2.08 (m, 4H), 2.01-1.83 (m, 6H), 1.75-1.59 (m, 6H), 1.48-1.36 (m, 6H), 1.29-1.24 (m, 3H), 1.23-1.16 (m, 4H), 0.89-0.81 (m, 9H) ppm。揭示了TFA上之一個羧基質子。
實例23：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB092)的製備
Figure 02_image739
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB092)製備如下： 步驟1 將化合物92-1 (1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸、TFA鹽( 92-1，570.91 mg，0.781 mmol))、化合物92-2 ((2S,3S,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己醛( 92-2，562.32 mg，3.124 mmol))、Na(CN)BH3 (193.69 mg，3.124 mmol)之甲醇(16 mL)反應混合物在N 2下加熱回流18小時，直至LCMS指示反應完成。用旋轉蒸發儀蒸發溶劑，並且將殘餘物溶解於水並藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色泡沫之所需產物92-3 ((42R,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷酸( 92-3，650 mg，0.687 mmol，87.98%))。ESI m/z：473.9 (M/2+H) +。946.6 (M+H) +。
步驟2 將化合物92-3 ((42R,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷酸( 92-3，199.95 mg，0.212 mmol))、化合物92-4 (N-[(1S)-5-胺基-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18, 20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 92-4，210 mg，0.176 mmol))及DIPEA (8.02 mg，0.062 mmol)之無水DMF (4 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後逐滴添加HATU (67.04 mg，0.176 mmol)之無水DMF (4 mL)溶液，歷時5分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌2小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之化合物92-5 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(42R,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 92-5，240 mg，0.113 mmol，64.22%))。ESI m/ z = 707.2 (M/2+H) +，530.9 (M/3+H) +。 1H NMR (400MHz, DMSO-d6)：δ 10.06 (s, 1H), 8.16 (d, J= 6.4 Hz, 1H), 8.07 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.95 (brs, 1H), 7.88 (d, J= 7.6 Hz, 2H), 7.83-7.77 (m, 2H), 7.73-7.70 (m, 3H), 7.60 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.55 (d, J= 3.6Hz, 1H), 7.43-7.31 (m, 7H), 6.54 (s, 1H), 5.99 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.50-5.34 (m, 5H), 5.34-5.24 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.67-4.23 (m, 10H), 4.07-3.96 (m, 1H), 3.96-3.83 (m, 2H), 3.83-3.76 (m, 2H), 3.65-3.44 (m, 62H), 3.24-3.11 (m, 4H), 3.11-2.89 (m, 6H), 2.38(s, 3H), 2.29 (d, J= 6.4 Hz, 2H), 2.22-2.10 (m, 2H), 2.00-1.81 (m, 3H), 1.70-1.48 (m, 4H), 1.48-1.24 (m, 7H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm。揭示了TFA上之一個羧基質子。
步驟3 將化合物92-5 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(42R,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 92-5，230 mg，0.109 mmol))之DMF (1 mL)溶液在室溫下攪拌，並且添加二乙胺(0.11 mL，1.068 mmol)。將所得溶液攪拌30分鐘以完成(藉由LCMS監測)。隨後蒸發掉二乙胺，並且將DMF中之殘餘物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之所需產物92-6 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(42R,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 92-6，130 mg，0.069 mmol，63.13%))。ESI m/z：949.6 (M/2+H) +，633.2 (M/3+H) +。
步驟4 將化合物92-6 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(42R,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 92-6，50 mg，0.026 mmol))及化合物92-7 (6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 92-7，9.74 mg，0.032 mmol))之無水DMF (1 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加DIPEA (5.10 mg，0.040 mmol)。將所得溶液再攪拌3小時，直至LCMS指示起始胺幾乎耗盡。隨後將所得溶液直接藉由製備型HPLC (0.01% TFA)純化，得到為白色固體之PB092 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-5-(胺基甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯胺基]-6-[(42R,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB092 ，20 mg，0.010 mmol，36.31%))之TFA鹽。ESI m/z：697.5 (M/3+H) +，保留時間5.759分鐘(HPLC)。 1H NMR (400MHz，DMSO-d6)：δ 10.03 (s, 1H), 8.12 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 8.06 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.96 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.82-7.77 (m, 2H), 7.66 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.60 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.54 (s, 1H), 5.99 (t, J= 6.0 Hz, 1H), 5.49-5.34 (m, 5H), 5.34-5.24 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.72-4.31 (m, 7H), 4.31-4.17 (m, 2H), 3.95-3.87 (m, 2H), 3.81-3.76 (m, 2H), 3.65-3.46 (m, 6H), 3.26-3.16 (m, 4H), 3.11-2.92 (m, 6H), 2.38(s, 3H), 2.29 (d, J= 6.4 Hz, 2H), 2.24-2.07 (m, 4H), 2.00-1.83 (m, 3H), 1.72-1.56 (m, 3H), 1.48-1.41 (m, 6H), 1.36-1.13 (m, 8H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm。揭示了TFA上之一個羧基質子。
實例24：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB093)的製備
Figure 02_image741
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB093)製備如下： 步驟1 將化合物93-1 (1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸( 93-1，TFA鹽、500 mg，0.684 mmol))之MeOH (8 mL)溶液用化合物93-2 ((2R,3S,4R)-2,3,4,5-四羥基戊醛( 93-2，410.75 mg，2.736 mmol))處理並在室溫下攪拌2小時。隨後添加氰基硼氫化鈉(171.93 mg，2.736 mmol)，並且將混合物溫熱至50℃，持續24小時。將溶液濃縮至半體積並藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物93-3 ((42S,43R,44R)-42,43,44,45-四羥基-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-四羥基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十五烷酸( 93-3，417 mg，0.471 mmol，68.81%))。ESI m/z：886.6 (M+H) +。
步驟2 向化合物93-3 ((42S,43R,44R)-42,43,44,45-四羥基-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-四羥基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十五烷酸( 93-3，200 mg，0.226 mmol))之DMF (2 mL)溶液中添加化合物93-4 (N-[(1S)-5-胺基-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 93-4，228.59 mg，0.192 mmol))及DIPEA (43.76 mg，0.339 mmol)，隨後緩慢添加HATU (85.83 mg，0.226 mmol)之DMF (0.5 mL)。添加後，將反應物在室溫下再攪拌1小時。將混合物濃縮並藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之化合物93-5 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(42S,43R,44R)-42,43,44,45-四羥基-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-四羥基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31, 34,37-十二氧雜-40-氮雜四十五烷醯胺基]戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 93-5，290 mg，0.141 mmol，62.38%))。ESI m/z 1030.7 (M/2+H) +。
步驟3 向化合物93-5 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(42S,43R,44R)-42,43,44,45-四羥基-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-四羥基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十五烷醯胺基]戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 93-5，290 mg，0.141 mmol))之DMF (2 mL)溶液中添加二乙胺(0.2 mL，1.250 mmol)並在室溫下攪拌1小時至完成(藉由LCMS監測)。隨後用旋轉蒸發儀移除二乙胺，並且將殘餘物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物93-6 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(42S,43R,44R)-42,43,44,45-四羥基-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-四羥基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十五烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 93-6，100 mg，0.054 mmol，38.65%))。ESI m/z：919.7 (M/2+H) +。
步驟4 將化合物93-6 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(42S,43R,44R)-42,43,44,45-四羥基-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-四羥基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十五烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 93-6，110 mg，0.060 mmol))之DMF (1.5 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後依次添加DIPEA (0.015 mL，0.090 mmol)及化合物93-7 (6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 93-7，20.14 mg，0.065 mmol))。將所得溶液在再攪拌1小時，直至LCMS顯示反應完成。將完成的反應溶液直接藉由製備型HPLC (0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物PB093 ({N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸4-[(2S)-5-(胺基甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯胺基]-6-[(42S,43R,44R)-42,43,44,45-四羥基-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-四羥基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十五烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB093 ，51.21 mg，0.025 mmol，42.12%))之TFA鹽。ESI m/z：677.5 (M/3+H) +，保留時間5.924分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.02 (s, 1H), 8.19 (brs, 1H), 8.12 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 8.06 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.96 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.82-7.76 (m, 2H), 7.66 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.61 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.53 (s, 1H), 6.00 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 5.46-5.33 (m, 6H), 5.33-5.23 (m, 3H), 5.09 (s, 2H), 4.89-4.59 (m, 6H), 4.41-4.35 (m, 1H), 4.29-4.18 (m, 2H), 4.03-3.94 (m, 2H), 3.79-3.77 (m, 2H), 3.59-3.56 (m, 8H), 3.54-3.37 (m, 52H), 3.28-3.22 (m, 2H), 3.15-2.89 (m, 6H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 2.24-2.08 (m, 4H), 2.01-1.82 (m, 3H), 1.73-1.56 (m, 3H), 1.53-1.43 (m, 6H), 1.43-1.36 (m, 3H), 1.33-1.16 (m, 4H), 0.94-0.74 (m, 9H)。揭示了TFA中之一個羧基質子。
實例25：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB094)的製備
Figure 02_image743
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB094)製備如下： 步驟1 向化合物94-2 ((2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)戊二酸( 94-2，19.39 mg，0.052 mmol))之DMF (5 mL)溶液中添加HATU (59.89 mg，0.158 mmol)及DIPEA (13.57 mg，0.105 mmol)，隨後添加化合物94-1 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 94-1，200 mg，0.105 mmol))。將所得混合物在室溫下攪拌1小時以完成(藉由LCMS監測)隨後將所得溶液藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物94-3 (N-[(1S)-1,3-雙({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊基]胺基甲醯基})丙基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 94-3，108 mg，0.026 mmol，49.84%))。ESI m/z：826.4(M/5+H) +。
步驟2 向化合物94-3 (N-[(1S)-1,3-雙({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊基]胺基甲醯基})丙基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 94-3，108 mg，0.026 mmol))之DMF (3 mL)溶液中添加二乙胺(0.6 mL，3.751 mmol)。將混合物在室溫下攪拌2小時。用TFA將所得溶液調節至pH 6，隨後藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物94-4 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-4-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22, 25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊基]胺基甲醯基}丁醯胺基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 94-4，90 mg，0.023 mmol，88.08%))之TFA鹽。ESI m/z：977.3(M/4+H) +。
步驟3 向化合物94-4 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-4-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊基]胺基甲醯基}丁醯胺基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 94-4，90 mg，0.023 mmol))之DMF (3 mL)溶液中添加DIPEA (5.96 mg，0.046 mmol)及6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(14.21 mg，0.046 mmol)。將混合物在室溫下攪拌2小時。將所得溶液調節至pH 6並且藉由製備型-HPLC (0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物PB094 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-5-(胺基甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊基]胺基甲醯基}-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯胺基]丁醯胺基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16, 19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB094 ，35 mg，0.009 mmol，37.06%))。ESI m/z：820.7(M+H) +, 1025.5(M+H) +，保留時間5.452分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.04 (s, 2H), 8.19-8.15 (m, 4H), 8.14-8.12 (m, 4H), 8.07-8.05 (m, 1H), 7.97 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.89-7.82 (m, 3H), 7.76 (d, J= 10.8 Hz, 2H), 7.62-7.60 (m, 4H), 7.37-7.35 (m, 4H), 7.31 (s, 2H), 7.00 (s, 2H), 6.53 (s, 2H), 6.00 (t, J= 6.6 Hz, 2H), 5.51-5.44 (m, 12H), 5.34-5.21 (m, 6H), 5.08 (s, 4H), 4.88-4.70 (m, 4H), 4.55-4.43 (m, 8H), 4.38-4.33 (m, 3H), 4.29-4.25 (m, 2H), 4.20-4.14 (m, 3H), 4.01-3.99 (m, 4H), 3.79-3.78 (m, 4H), 3.69-3.66 (m, 4H), 3.62-3.56 (m, 18H), 3.53-3.48 (m, 88H), 3.46-3.42 (m, 10H), 3.27-3.12 (m, 7H), 3.12-2.90 (m, 12H), 2.37 (s, 6H), 2.31-2.27 (m, 4H), 2.21-2.01 (m, 8H), 1.95-1.79 (m, 8H), 1.73-1.55 (m, 8H), 1.49-1.40 (m, 8H), 1.40-1.31 (m, 6H), 1.31-1.14 (m, 6H), 0.89-0.82 (m, 18H) ppm。揭示了TFA上之兩個羧基質子。
實例26：含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物連接子(PB095)的製備
Figure 02_image745
含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物-連接子(PB095)製備如下： 步驟1 將化合物95-1 ((2S)-5-(胺基甲醯基胺基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)戊酸( 95-1，6.0 g，15.097 mmol))、化合物95-2 ((4-胺基苯基)甲醇( 95-2，3.72 g，30.195 mmol))及EEDQ (14.93 g，60.390 mmol)之MeOH (25 mL)及DCM (50 mL)溶液在室溫下攪拌18小時，並且LCMS顯示反應完成。將反應溶液濃縮至乾燥，隨後藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為白色固體之化合物95-3 (N-[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-{[4-(羥基甲基)苯基]胺基甲醯基}丁基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 95-3，6.45 g，12.834 mmol，85.01%))。ESI m/z：503.3(M+H) +。
步驟2 向化合物95-3 (N-[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-{[4-(羥基甲基)苯基]胺基甲醯基}丁基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 95-3，6.45 g，12.834 mmol))之MeOH (20 mL)溶液中添加二乙胺(5 mL，31.260 mmol)。將混合物在室溫下攪拌2小時以實現完全去保護。將溶液濃縮並且藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為淡黃色固體之產物95-4 ((2S)-2-胺基-5-(胺基甲醯基胺基)-N-[4-(羥基甲基)苯基]戊烷醯胺( 95-4，3.25 g，11.594 mmol，90.34%))。ESI m/z：281.3(M+H) +。
步驟3 將化合物95-4 ((2S)-2-胺基-5-(胺基甲醯基胺基)-N-[4-(羥基甲基)苯基]戊烷醯胺( 95-4，3.76 g，13.413 mmol))、化合物95-5 ((2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-4-甲基戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 95-5，6.65 g，14.755 mmol))及DIPEA (3.47 g，26.826 mmol)之DMF (10 mL)溶液在室溫下攪拌2小時至完成。將反應混合物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為白色固體之化合物95-6 (N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-{[4-(羥基甲基)苯基]胺基甲醯基}丁基]胺基甲醯基}-3-甲基丁基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 95-6，4.8 g，7.796 mmol，58.12%))。ESI m/z：616.3 (M+H) +。 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.97 (s, 1H), 8.05 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.89 (d, J= 7.2 Hz, 2H), 7.74-7.70 (m, 2H), 7.55-7.51 (m, 3H), 7.44-7.39 (m, 2H), 7.34-7.30 (m, 2H), 7.23 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 5.97 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.10 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 4.43-4.39 (m, 3H), 4.32-4.20 (m, 3H), 4.15-4.05 (m, 1H), 3.07-2.89 (m, 2H), 1.74-1.55 (m, 3H), 1.51-1.32 (m, 4H), 0.90-0.83 (m, 6H) ppm。
步驟4 將化合物95-6 (N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-{[4-(羥基甲基)苯基]胺基甲醯基}丁基]胺基甲醯基}-3-甲基丁基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 95-6，2.0 g，3.248 mmol))、碳酸雙(4-硝基苯基)酯(3.95 g，12.993 mmol)及DMAP (0.40 g，3.248 mmol)之DMF (5 mL)溶液在室溫下攪拌2小時。隨後將反應混合物用水滴淬滅，並藉由反相快速層析(中性溶離劑)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為淡黃色固體之化合物95-7 (4-硝基苯基碳酸{4-[(2S)-5-(胺基甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-4-甲基戊烷醯胺基]戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 95-7，1.33 g，1.703 mmol，52.44%))。ESI m/z：781.3 (M+H) +。
步驟5 將化合物95-7 (碳酸{4-[(2S)-5-(胺基甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-4-甲基戊烷醯胺基]戊烷醯胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯( 95-7，340 mg，0.435 mmol)、化合物9-58 ((2S)-N-[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺( 95-8，312.63 mg，0.435 mmol))及HOBt (58.84 mg，0.435 mmol)之無水DMF (4 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加DIPEA (112.34 mg，0.871 mmol)。將所得黃色溶液攪拌隔夜，直至LCMS指示兩種起始材料幾乎耗盡。將所得溶液直接藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之化合物95-9 (N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基](甲基)胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-3-甲基丁基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 95-9，320 mg，0.235 mmol，54.10%))。ESI m/z：680.6 (M/2+H) +； 718.7 (MMAE之片段)；598.4 (連接子Fmoc-Leu-Cit-PAB之片段)。
步驟6 將化合物95-9 (N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基](甲基)胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-3-甲基丁基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 95-9，320 mg，0.235 mmol))之CH 3CN (10 mL)及水(5 mL)溶液在室溫下攪拌，並且添加二乙胺(0.8 mL，7.766 mmol)。將所得溶液攪拌4小時至完成。真空蒸發掉二乙胺，並且將殘餘物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物95-10 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-4-甲基戊烷醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 95-10，220 mg，0.193 mmol，82.18%))之TFA鹽，並且產物無需任何純化用於下一步驟。ESI m/z：569.5(M/2+H) +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.21 (s, 1H), 8.79 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 8.31-8.06 (m, 4H), 7.91 (d, J= 8.8 Hz, 0.5H), 7.65 (d, J= 8.4Hz, 0.5H), 7.60-7.57 (m, 2H), 7.37-7.24 (m, 6H), 7.20-7.14 (m, 1H), 6.08 (s, 1H), 5.60-5.31 (m, 2H), 5.12-4.98 (m, 2H), 4.74-4.62 (m, 1H), 4.55-4.40 (m, 3H), 4.30-4.23 (m, 1H), 4.05-3.92 (m, 2H), 3.85-3.76 (m, 2H), 3.58-3.55 (m, 2H), 3.32-3.12 (m, 9H), 3.08-2.97 (m, 4H), 2.89-2.83 (m, 3H), 2.44-2.39 (m, 1H), 2.29-2.23 (m, 1H), 2.16-1.92 (m, 3H), 1.84-1.39 (m, 13H), 1.31-1.25 (m, 1H), 1.06-0.97 (m, 6H), 0.92-0.75 (m, 24 H) ppm。揭示了TFA中之一個羧基質子。
步驟7 將化合物95-10 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-4-甲基戊烷醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 95-10，218 mg，0.192 mmol))、化合物95-11 ((2S)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34, 37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己酸( 95-11，247.57 mg，0.211 mmol))及DIPEA (49.45 mg，0.383 mmol)之無水DMF (3 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘以確保起始酸完全溶解，隨後緩慢添加HATU (80.16 mg，0.211 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液。將所得溶液再攪拌2小時，直至LCMS指示反應完成。隨後將反應溶液直接藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之化合物95-12 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-4-甲基戊烷醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 95-12，280 mg，0.122 mmol，63.69%))。ESI m/z：765.5 (M/3+H) +。
步驟8 將化合物95-12 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-4-甲基戊烷醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 95-12，260 mg，0.113 mmol))之甲醇溶液在室溫下攪拌，並且緩慢添加3M HCl之MeOH (2 mL)。將所得淡黃色溶液再保持攪拌4小時，直至實現完全去保護(藉由LCMS監測)。隨後將溶液用旋轉蒸發儀濃縮以移除溶劑，將殘餘物用水溶解並藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之化合物95-13 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-4-甲基戊烷醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 95-13，160 mg，0.073 mmol，64.35%))。ESI m/z：732.2 (M/3+H) +，718.6 (片段MMAE)，478.2 ((連接子 Boc-Lys(PEG12- 糖 )-Leu-Cit-pab-18)/3+H) +。
步驟9 將化合物95-13 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-4-甲基戊烷醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 95-13，80 mg，0.036 mmol))及DIPEA (7.06 mg，0.055 mmol)之無水DMF (1.5 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘以溶解所有材料，隨後藉由注射器逐滴添加化合物95-14 (6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 95-14，12.36 mg，0.040 mmol))之無水DMF (0.5 mL)溶液，歷時5分鐘。添加後，將所得溶液再攪拌4小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡。隨後將所得溶液直接藉由製備型HPLC (0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其由LabConc凍乾以得到為白色固體之PB095 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-5-(胺基甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯胺基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-4-甲基戊烷醯胺基]戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB095 ，50 mg，0.021 mmol，57.44%))之TFA鹽。ESI m/z：542.5 ((連接子片段，(M-717-26-18)3+H) +；796.6 (M/3+H) +。保留時間6.250分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.00 (s, 1H), 8.34-8.07 (m, 1.5 H), 8.00 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 7.93-7.88 (m, 2.5 H), 7.82-7.79 (m, 1H), 7.65-7.57 (m, 2.5 H), 7.35-7.23 (m, 6H), 7.18-7.10 (m, 1.5H), 7.00 (s, 2H), 5.99-5.98 (m, 1H), 5.53-5.25 (m, 4H), 5.14-4.95 (m, 2H), 4.83-4.17 (m, 11H), 4.04-3.92 (m, 4H), 3.79-3.77 (m, 2H), 3.70-3.66 (m, 2H), 3.61-3.56 (m, 8H), 3.53-3.45 (m, 44H), 3.25-3.12 (m, 14H), 3.05-2.83 (m, 14H), 2.44-2.39 (m, 1H), 2.31-2.14 (m, 4H), 2.14-1.96 (m, 6H), 1.85-1.44 (m, 18H), 1.36-1.16 (m, 10H), 1.06-0.97(m, 6H), 0.89-0.75 (m, 27H) ppm。揭示了TFA中之一個羧基質子。
實例27：含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物連接子(PB096)的製備
Figure 02_image747
含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物-連接子(PB096)製備如下： 步驟1 將化合物96-1 (1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸( 96-1，5.00 g，10.267 mmol))及HOSu (1.77 g，15.401 mmol)之乾DCM (40 mL)之澄清溶液在室溫下攪拌，並且添加EDCI (2.95 g，15.401 mmol)。將溶液保持攪拌1小時，直至實現完全轉化。隨後將溶液用更多的DCM (20 mL)稀釋並且用水(50 mL)洗滌，分離有機層並用DCM (50 mL* 2)萃取水層。將合併之收集之DCM相經硫酸鈉乾燥並過濾，隨後減壓濃縮以得到為無色油狀物之粗物質化合物96-2，將其原樣用於下一步驟。ESI m/z = 585.3 (M+H) +。
步驟2 將化合物96-3 (N6-(三級丁氧基羰基)-L-離胺酸( 96-3，2.233 mL，10.267 mmol))之DMF (12 mL)懸浮液在室溫下攪拌(註：材料離胺酸在DMF中溶解不良)，隨後添加碳酸氫鈉(0.86 g，10.267 mmol)之水(3 mL)溶液。將懸浮液攪拌20分鐘直至大部分起始酸溶解在溶劑中。隨後添加化合物96-2 (2,5-二側氧基吡咯啶-1-基1-(9H-茀-9-基)-3-側氧基-2,7,10,13,16-五氧雜-4-氮雜十九烷-19-酸酯( 96-2，6.00 g，10.267 mmol))。將所得溶液在室溫下攪拌2小時。將完成的反應溶液直接藉由反相管柱層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之化合物96-4 (N2-(1-(9H-茀-9-基)-3-側氧基-2,7,10,13,16-五氧雜-4-氮雜十九烷-19-醯基)-N6-(三級丁氧基羰基)-L-離胺酸( 96-4，5.40 g，7.552 mmol，73.56%))。ESI m/z：716.5 (M+H) +, 738.4 (M+Na) +。 1H NMR (400 MHz, 400 MHz) δ 7.89 (d, J= 7.6 Hz, 2H), 7.86-7.77 (m, 1H), 7.69 (d, J= 7.2 Hz, 2H), 7.44-7.38 (m, 2H), 7.37-7.31 (m, 2H),6.75 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 4.30-4.19 (m, 2H), 4.04-3.99 (m, 1H), 3.59-3.54 (m, 2H), 3.50-3.47 (m, 12H), 3.43-3.39 (m, 2H), 3.16-3.11 (m, 2H), 2.88-2.83 (m, 2H), 2.40-2.32 (m, 2H), 1.67-1.63 (m, 1H), 1.55-1.48 (m, 1H), 1.36 (s, 9H), 1.33-1.29 (m, 2H), 1.25-1.20 (m, 2H), 0.99 (d, J= 6.4Hz, 2H) ppm。未揭示羧基。
步驟3 將化合物96-4 ((2S)-6-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-2-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基]己酸( 96-4，5.4 g，7.544 mmol))之DCM (16 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加TFA (4 mL，53.850 mmol)。將所得黃色溶液再攪拌1小時。隨後蒸發TFA及溶劑，將殘餘物再次溶解於DCM並濃縮至乾燥。重複該過程三次，並且獲得為白色固體之產物96-5 ((1-(9H-茀-9-基)-3-側氧基-2,7,10,13,16-五氧雜-4-氮雜十九烷-19-醯基)-L-離胺酸( 96-5))之TFA鹽。ESI m/z：616.4(M+H) +。
步驟4 將1-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸(1.58 g，2.201 mmol)及HOSu (0.53 g，4.597 mmol)之無水DCM (20 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加EDCI (0.63 g，3.302 mmol)。將所得溶液再攪拌1小時，隨後用更多的DCM (20 mL)稀釋，並用水(20 mL)洗滌。收集有機層並且用DCM(40 mL*2)萃取水層。將合併之DCM層經硫酸鈉乾燥、過濾並濃縮濾液，得到為無色油狀物之粗產物96-6 (2,2-二甲基-4-側氧基-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-十三氧雜-5-氮雜四十四烷-44-酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 96-6，2.5 g，3.069 mmol，100.15%))。ESI m/z：715.5 (M-100+H) +，837.5(M+Na) +。 將化合物96-5 ((1-(9H-茀-9-基)-3-側氧基-2,7,10,13,16-五氧雜-4-氮雜十九烷-19-醯基)-L-離胺酸( 96-5，1.55 g，2.514 mmol))及化合物96-6 (2,2-二甲基-4-側氧基-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-十三氧雜-5-氮雜四十四烷-44-酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 96-6，1.8 g，2.211 mmol))之無水DMF (22 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器緩慢添加DIPEA (0.57 g，4.422 mmol)。將反應溶液攪拌2小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡。將所得溶液減壓濃縮並將殘餘物藉由製備型HPLC (0.01% TFA)純化，得到為無色油狀物之化合物96-7 ((2S)-6-(1-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)-2-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基]己酸( 96-7，2.3 g，1.748 mmol，79.04%))。ESI m/z：608.5 ((M-100)/2+H) +。
步驟5 將化合物96-7 ((2S)-6-(1-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)-2-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基]己酸( 96-7，2.3 g，1.748 mmol))之DCM (16 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加TFA (4 mL，53.850 mmol)。將所得溶液攪拌1小時以實現完全去保護。隨後蒸發掉TFA及DCM，將殘餘物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其凍乾以得到為無色油狀物之產物96-8 ((2S)-6-(1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)-2-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基]己酸( 96-8，2.1 g，1.728 mmol，99.06%))。ESI m/z：608.5 (M+H) +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.89 (d, J= 7.6 Hz, 2H), 7.86-7.80 (m, 2H), 7.71-7.61 (m, 1H), 7.44-7.40 (m, 2H), 7.37-7.33 (m, 2H), 6.29 (s, 1H), 4.30-4.21(m, 1H), 4.06-3.95 (m, 2H), 3.68-3.55 (m, 12H), 3.55-3.47 (m, 48H), 3.42-3.38 (m, 2H), 3.38-3.21 (m, 4H), 3.16-3.05 (m, 2H), 3.00-2.94 (m, 4H), 2.43-2.37 (m, 2H), 2.33-2.27 (m, 2H), 1.70-1.57(m, 1H), 1.58-1.44 (m, 1H), 1.38-1.18 (m, 4H) ppm。未顯示胺基中之兩個質子及羧基中之兩個質子。
步驟6 將化合物96-8 ((2S)-6-(1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)-2-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基]己酸( 96-8，2.0 g，1.645 mmol))及D-葡萄糖(1.78 g，9.873 mmol)之甲醇(32 mL)懸浮液在氮氣氛圍下加熱至50℃，隨後添加氰基硼氫化鈉(0.62 g，9.873 mmol)。將所得混合物保持攪拌隔夜(16小時)，直至LCMS指示反應完成。隨後將溶液濃縮至乾燥，並且將殘餘物溶解於水並藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其經LabConco冷凍乾燥以得到為無色油狀物之化合物96-9 ((2S)-2-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己酸( 96-9，2.0 g，1.296 mmol，78.74%))。ESI m/z：515.5 (M/3+H) +, 772.6 (M/2+H) +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.02 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 7.89 (d, J= 7.2 Hz, 2H), 7.83 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 7.69 (d, J= 7.2 Hz, 2H), 7.44-7.39 (m, 2H), 7.35-7.31 (m, 3H), 4.76-4.37 (m, 4H), 4.30-4.28 (m, 2H), 4.23-4.19 (m, 1H), 4.15-4.09 (m, 1H), 4.03-3.91 (m, 1H), 3.75-3.64 (m, 2H), 3.59-3.56 (m, 6H), 3.56-3.46 (m, 56H), 3.41-3.17 (m, 18H), 3.17-3.12 (m, 2H), 3.03-2.97 (m, 2H), 2.97-2.54 (m, 5H), 2.41-2.34 (m, 2H), 2.29 (t, J= 6.4Hz, 2H), 1.71-1.65 (m, 1H), 1.60-1.51 (m, 1H), 1.38-1.31 (m, 2H), 1.31-1.24 (m, 2H) ppm。未揭示一個羧基質子。
步驟7 將化合物96-9 ((2S)-2-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己酸( 96-9，125 mg，0.081 mmol))、化合物96-10 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 96-10，90.97 mg，0.081 mmol))及DIPEA (20.89 mg，0.162 mmol)之無水DMF (1.5 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加HATU (30.79 mg，0.081 mmol)之無水水溶液，例示5分鐘。添加後，將所得溶液再攪拌1小時，直至所有起始胺被耗盡(藉由LCMS監測)。隨後將反應溶液直接藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之與起始酸混合之化合物96-11 (N-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基](甲基)胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊基]胺基甲醯基}-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 96-11，100 mg，0.038 mmol，46.62%))。ESI m/z：883.9 (M/3+H) +，630.0 (連接子片段，(M-717-26-18)/3+H) +，純度60%-66%。雜質酸ESI m/z：515.5 (M/3+H) +,772.6 (M/2+H) +，含量35%-29%。
步驟8 將化合物96-11 (N-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基](甲基)胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊基]胺基甲醯基}-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 96-11，100 mg，0.038 mmol))之DMF (1.8 mL)溶液在室溫下攪拌，並且添加二乙胺(0.2 mL，1.941 mmol)。將所得溶液攪拌1小時至完成。真空蒸發掉揮發物，並且將DMF中之殘餘物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其藉由LabConco凍乾以得到為白色固體之產物96-12 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-(1-胺基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 96-12，75 mg，0.031 mmol，81.32%))。ESI m/z：809.9 (M/3+H) +，718.6 (片段，MMAE)，555.9 (連接子片段，(M-717-26-18)/3+H) +。
步驟9 將4-{2-氮雜三環[10.4.0.0^{4,9}]十六烷-1(16),4(9),5,7,12,14-己-10-炔-2-基}-4-側氧基丁酸(DBCO-酸、710 mg，2.328 mmol)及HOSu (401.56 mg，3.492 mmol)之無水DCM (23 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加EDCI (669.38 mg，3.492 mmol)。將所得溶液再攪拌1.5小時。隨後將所得溶液用水(10 mL)洗滌，分離DCM層並用更多的DCM (20 mL*2)萃取水層。將合併之DCM相濃縮至乾燥，並且將殘餘物藉由反相快速層析(中性溶離劑)純化，得到為白色固體之化合物96-13 (4-{2-氮雜三環[10.4.0.0^{4,9}]十六烷-1(12),4(9),5,7,13,15-己-10-炔-2-基}-4-側氧基丁酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 96-13，850 mg，2.114 mmol，90.83%))。ESI m/z：403.2 (M+H) +，425.2 (M+Na) +。
步驟10 將化合物96-12 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-(1-胺基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 96-12，65 mg，0.027 mmol))及DIPEA (6.91 mg，0.054 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加DBCO NHS酯(化合物 96-13，10.78 mg，0.027 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液。將反應溶液再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡。隨後將所得溶液直接藉由製備型HPLC (10 mM碳酸氫銨)純化，得到為白色固體之PB096 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-氮雜三環[10.4.0.0^{4,9}]十六烷-1(12),4(9),5,7,13,15-己-10-炔-2-基}-4-側氧基丁醯胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB096，45 mg，0.017 mmol，61.90%))。ESI m/z：905.3 (M/3+H) +, 679.2 (M/4+H) +，保留時間5.577分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.05 (s, 1H), 8.37-8.10 (m, 2H), 8.05-8.03 (m, 1H), 7.93-7.90 (m, 1H), 7.83-7.77 (m, 2H), 7.77-7.67 (m, 2H), 7.63-7.57 (m, 3H), 7.51-7.45 (m, 3H), 7.38-7.26 (m, 9H), 7.20-7.14 (m, 1H), 6.00-5.97 (m, 1H), 5.43-5.36 (m, 3H), 5.11-4.94 (m, 3H), 4.76-4.17 (m, 16H), 4.04-3.92 (m, 2H), 3.79-3.57 (m, 12H), 3.50-3.41 (m, 56H), 3.36-3.17 (m, 19H), 3.12-2.85 (m, 15H), 2.60-2.56 (m, 2H), 2.43-2.36 (m, 3H), 2.30-2.22 (m, 4H), 2.15-1.96 (m, 6H), 1.78-1.21(m, 20H), 1.05-0.97 (m, 6H), 0.89-0.77 (m, 24H) ppm。
實例28：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB097)的製備
Figure 02_image749
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB097)製備如下： 步驟1 將化合物97-1 ((2S)-2-(1-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己酸( 97-1，200 mg，0.130 mmol))、化合物97-2 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0 2, 1 4.0 4, 13.0 6, 11.0 20, 2 4]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 97-2，108.83 mg，0.129 mmol))及HATU (49.43 mg，0.130 mmol)、DIPEA (33.59 mg，0.260 mmol)之DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌2小時，並且LCMS顯示反應完成。隨後將反應混合物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為淡黃色固體之化合物97-3 (N-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0 2, 1 4.0 4, 13.0 6, 11.0 20, 2 4]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊基]胺基甲醯基}-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基)胺基甲酸9H-茀-9-基甲酯( 97-3，262 mg，0.111 mmol，85.16%))。ESI m/z：789.7 (M/3+H) +。
步驟2 向化合物97-3 (N-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊基]胺基甲醯基}-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 97-3，162 mg，0.068 mmol))之DMF (2 mL)溶液中添加二乙胺(0.2 mL，0.2720 mmol)。將混合物在室溫下攪拌2小時。隨後將粗混合物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為白色固體之化合物97-4 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-(1-胺基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 97-4，78 mg，0.036 mmol，53.49%))。ESI m/z：715.7(M/3+H) +。
步驟3 將化合物97-4 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-(1-胺基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 97-4，78 mg，0.036 mmol))、化合物97-5 (4-{2-氮雜三環[10.4.0.0 4, 9]十六烷-1(12),4(9),5,7,13,15-己-10-炔-2-基}-4-側氧基丁酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 97-5，29.27 mg，0.073 mmol))及DIPEA (9.40 mg，0.073 mmol)之DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌2小時以實現完全轉化。隨後將反應混合物藉由製備型HPLC (10mM NH 4HCO 3)純化，得到所需級分，將其藉由LabConco凍乾以得到為白色固體之PB097 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-氮雜三環[10.4.0.0^{4,9}]十六烷-1(12),4(9),5,7,13,15-己-10-炔-2-基}-4-側氧基丁醯胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB097，55 mg，0.023 mmol，62.18%))。ESI m/z：811.5 (M/3+H) +。[註：產物在醯胺鍵上部分裂解，在酸性LCMS中釋放DBCO片段，因此用m/z 206偵測DBCO單元，並用m/z 749 ((M-205+17)/3+H) +偵測到相應之對應物。在鹼性LCMS之情況下，依喜替康內酯環部分打開，並且用m/z 817 ((M+18)/3+H) +]偵測片段離子。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.04 (s, 1H), 8.13 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.09-8.02 (m, 2H), 7.84-7.76 (m, 3H), 7.74-7.66 (m, 2H), 7.62-7.59 (m, 3H), 7.52- 7.42 (m, 3H), 7.40-7.27 (m, 6H), 6.54 (s, 1H), 5.99 (t, J= 6.4 Hz, 1H), 5.45-5.43 (m, 4H), 5.34-5.23 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 5.02 (d, J= 14.0 Hz, 1H), 4.60- 4.15 (m, 12H), 3.71-3.67 (m, 1H), 3.64-3.55 (m, 9H), 3.50-3.40 (m, 62H), 3.40-3.39 (m, 4H), 3.32-3.18 (m, 4H), 3.18-2.90 (m, 8H), 2.60-2.51 (m, 1H), 2.42-2.36 (m, 6H), 2.29 (t, J= 6.0 Hz, 2H), 2.24-2.09 (m, 4H), 2.03-1.93 (m, 2H), 1.91-1.80 (m, 2H), 1.80-1.52 (m, 5H), 1.49-1.19 (m, 8H), 0.89- 0.80 (m, 9H) ppm。
實例29：含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物連接子(PB098)的製備
Figure 02_image751
Figure 02_image753
含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物-連接子(PB098)製備如下： 步驟1 向化合物98-1 ((2S)-2-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己酸( 98-1，3.0 g，1.943 mmol))之DMF (10 mL)溶液中添加二乙胺(1.1 mL，14.032 mmol)。將混合物在室溫下攪拌2小時以實現完全去保護。隨後將所得溶液直接藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物98-2 ((2S)-2-(1-胺基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己酸( 98-2，2.1 g，1.589 mmol，81.71%))。ESI m/z：661.6 (M/2+H) +。
步驟2 向化合物98-2 ((2S)-2-(1-胺基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己酸( 98-2，2.1 g，1.589 mmol))之DMF (10 mL)溶液中添加化合物98-3 (2-{2-[2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)乙醯胺基]乙醯胺基}乙酸五氟苯基酯( 98-3，0.92 g，1.589 mmol))及DIPEA (0.21 g，1.589 mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時。將所得溶液藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物98-4 ((2S)-2-[1-(2-{2-[2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)乙醯胺基]乙醯胺基}乙醯胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己酸( 98-4，2.2 g，1.283 mmol，80.59%))。ESI m/z：858.2(M/2+H) +。
步驟3 向化合物98-4 ((2S)-2-[1-(2-{2-[2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)乙醯胺基]乙醯胺基}乙醯胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己酸( 98-4，2.2 g，1.283 mmol))之MeCN (10 mL)及H 2O (6 mL)溶液中添加二乙胺(4 mL，2.840 mmol)。將混合物在室溫下攪拌2小時至完成。將所得溶液濃縮至乾燥並藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色膠狀物之產物98-5 ((2S)-2-(1-{2-[2-(2-胺基乙醯胺基)乙醯胺基]乙醯胺基}-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己酸( 98-5，1.55 g，1.038 mmol，81.15%))。ESI m/z：747.1 (M/2+H) +，498.5 (M/3+H) +。
步驟4 向化合物98-5 ((2S)-2-(1-{2-[2-(2-胺基乙醯胺基)乙醯胺基]乙醯胺基}-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己酸( 98-5，1.55 g，1.038 mmol))之DMF (10 mL)溶液中添加化合物98-6 (2-[2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)乙醯胺基]乙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 98-6，0.47 g，1.038 mmol))及DIPEA (0.13 g，1.038 mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時。將所得溶液藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物98-7 ((2S)-2-(1-{2-[2-(2-{2-[2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)乙醯胺基]乙醯胺基}乙醯胺基)乙醯胺基]乙醯胺基}-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己酸( 98-7，1.4 g，0.765 mmol，73.68%))。ESI m/z：915.2 (M/2+H) +, 610.7 (M/3+H) +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.22-8.15 (m, 4H), 8.11-8.08 (m, 2H), 7.91-7.86 (m, 3H), 7.82 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 7.72 (d, J= 7.6 Hz, 2H), 7.59 (t, J= 6.0 Hz, 1H), 7.44-7.40 (m, 2H), 67.36-7.31 (m, 2H), 4.55-4.12 (m, 10H), 3.80-3.72 (m, 8H), 3.69-3.66 (m, 4H), 3.62-3.56 (m, 10H), 3.53-3.47 (m, 60H), 3.42-3.38 (m, 5H), 3.32-3.19 (m, 2H), 3.03-2.92 (m, 8H), 2.50-2.36 (m, 2H), 2.29 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 1.72-1.63 (m, 1H), 1.59-1.50 (m, 1H), 11.41-1.35 (m, 2H), 1.31-1.16 (m, 5H) ppm。
步驟5 向化合物98-7 ((2S)-2-(1-{2-[2-(2-{2-[2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)乙醯胺基]乙醯胺基}乙醯胺基)乙醯胺基]乙醯胺基}-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己酸( 98-7，200 mg，0.109 mmol))及化合物98-8 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 98-8，122.85 mg，0.109 mmol))之乾DMF (5 mL)溶液中依次添加HATU (41.58 mg，0.109 mmol)及DIPEA (14.13 mg，0.109 mmol)。添加後，將混合物在室溫下攪拌1小時，直至所有起始胺耗盡(藉由LCMS監測)。隨後將所得溶液藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其凍乾以得到為白色固體之產物98-9 (N-[({[({[({[(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基](甲基)胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25, 28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊基]胺基甲醯基}-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基)胺基甲醯基]甲基}胺基甲醯基)甲基]胺基甲醯基}甲基)胺基甲醯基]甲基}胺基甲醯基)甲基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 98-9，210 mg，0.072 mmol，65.65%))。ESI m/z：979.0(M/3+H) +。
步驟6 向化合物98-9 (N-[({[({[({[(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基](甲基)胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊基]胺基甲醯基}-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基)胺基甲醯基]甲基}胺基甲醯基)甲基]胺基甲醯基}甲基)胺基甲醯基]甲基}胺基甲醯基)甲基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 98-9，210 mg，0.072 mmol))之無水DMF (1.9 mL)溶液中添加二乙胺(0.1 mL，0.971 mmol)。將溶液在室溫下攪拌1小時至完成。將所得溶液直接藉由製備型HPLC (0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物PB098 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{1-[2-(2-{2-[2-(2-胺基乙醯胺基)乙醯胺基]乙醯胺基}乙醯胺基)乙醯胺基]-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB098，125 mg，0.046 mmol，64.40%))之TFA鹽。ESI m/z：905.0(M/3+H) +，保留時間5.432分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.05 (s, 1H), 8.64 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 8.36-8.01 (m, 9H), 7.93-7.91 (m, 1.5H), 7.84-7.81 (m, 1H), 7.73 (d, J= 8.4 Hz, 0.5H), 7.58 (d, J= 7.6 Hz, 2H), 7.35-7.24 (m, 6H), 7.20-7.14 (m, 1H), 6.05-5.96 (m, 1H), 5.44 (brs, 4H), 5.13-4.94 (m, 2H), 4.82-4.38 (m, 10H), 4.30-4.17 (m, 4H), 4.04-3.93 (m, 4H), 3.86 (d, J= 5.6 Hz, 2H), 3.78-3.74 (m, 7H), 3.69-3.67 (m, 5H), 3.62-3.55 (m, 14H), 3.55-3.39 (m, 56H), 3.39-3.30 (m, 5H), 3.25-3.04 (m, 11H), 3.05-2.83 (m, 10H), 2.41-2.36 (m, 3H), 2.33-2.27 (m, 3H), 2.16-1.93 (m, 4H), 1.81-1.21 (m, 18H), 1.05-0.97 (m, 6H), 0.89-0.73 (m, 27H) ppm。揭示了TFA上之一個羧基質子。
實例30：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB099)的製備
Figure 02_image755
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB099)製備如下： 步驟1 向化合物99-1 ((2S)-2-(1-{2-[2-(2-{2-[2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)乙醯胺基]乙醯胺基}乙醯胺基)乙醯胺基]乙醯胺基}-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己酸( 99-1，190 mg，0.104 mmol))之DMF (4 mL)溶液中添加化合物99-2 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 99-2，88 mg，0.105 mmol))、HATU (41.47 mg，0.109 mmol)及DIPEA (0.207 mL，0.156 mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時以完成(藉由LCMS監測)。隨後將所得溶液藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為黃色固體之產物99-3 (N-[({[({[({[(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊基]胺基甲醯基}-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基)胺基甲醯基]甲基}胺基甲醯基)甲基]胺基甲醯基}甲基)胺基甲醯基]甲基}胺基甲醯基)甲基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 99-3，190 mg，0.072 mmol，68.97%))。ESI m/z：885.0(M/3+H) +,663.9(M/4+H) +。
步驟2 向化合物99-3 (N-[({[({[({[(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊基]胺基甲醯基}-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基)胺基甲醯基]甲基}胺基甲醯基)甲基]胺基甲醯基}甲基)胺基甲醯基]甲基}胺基甲醯基)甲基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 99-3，102 mg，0.038 mmol))之DMF (1.9 mL)溶液中添加二乙胺(0.1 mL，0.971 mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時至完成。將所得溶液藉由反相分離(0.01% TFA)純化，得到為黃色固體之產物PB099 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{1-[2-(2-{2-[2-(2-胺基乙醯胺基)乙醯胺基]乙醯胺基}乙醯胺基)乙醯胺基]-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB099，40 mg，0.016 mmol，42.80%))之TFA鹽。ESI m/z：810.8 (M/3+H) +，608.3 (M/4+H) +，保留時間5.077分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.05 (s, 1H), 8.64 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 8.32 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 8.21-8.01 (m, 9H), 7.92 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 7.85-7.72 (m, 3H), 7.60 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 6.02 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 5.46 (brs, 6H), 5.34-5.23 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.83 (brs, 2H), 4.56 (brs, 4H), 4.41-4.25 (m, 3H), 4.21-4.17 (m, 1H), 3.99 (brs, 2H), 3.86 (d, J= 5.2 Hz, 2H), 3.78-3.73 (m, 6H), 3.69-3.67 (m, 4H), 3.62-3.54 (m, 14H), 3.52-3.47 (m, 60H), 3.29-3.20 (m, 6H), 3.14-2.90 (m, 6H), 2.41-2.37 (m, 5H), 2.29 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 2.24-2.13 (m, 2H), 1.99-1.81 (m, 3H), 1.70-1.58 (m, 3H), 1.50-1.20 (m, 8H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm。揭示了TFA上之兩個羧基質子。
實例31：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB100或「LD100」)的製備
Figure 02_image757
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB100或「LD100」)製備如下： 步驟1 將化合物100-1 (2,3-雙({[(三級丁氧基)羰基]胺基})丙酸( 100-1，1.52 g，5.000 mmol))及HOSu (0.86 g，7.500 mmol)之無水DCM (20 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後分批添加EDCI (1.44 g，7.500 mmol)，歷時5分鐘。將所得溶液再攪拌1小時，直至起始酸耗盡(藉由LCMS監測)。隨後將反應溶液用更多的DCM (20 mL)稀釋並且用水(40 mL)洗滌，分離有機層並用DCM (2*40 mL)萃取水層。將收集之DCM層經硫酸鈉乾燥、過濾並濃縮濾液，得到為白色泡沫之粗化合物100-2 (2,3-雙((三級丁氧基羰基)胺基)丙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 100-2，2.0 g，4.988 mmol，99.75%))，在靜置幾分鐘後變成無色油狀物。化合物原樣用於下一步驟。ESI m/z：424.2 (M+Na) +。
步驟2 將化合物100-3 ((2S)-6-胺基-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 100-3，1.84 g，4.988 mmol))及DIPEA (0.64 g，4.988 mmol)之乾DMF (10 mL)溶液在室溫下攪拌10分鐘，隨後緩慢添加化合物100-2 (2,3-雙({[(三級丁氧基)羰基]胺基})丙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 100-2，2.0 g，4.988 mmol))之無水DMF (10 mL)溶液，歷時5分鐘。添加後，將所得懸浮液攪拌2小時，直至所有起始材料耗盡。將所得溶液直接藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之化合物100-4 (((2S)-6-[2,3-雙({[(三級丁氧基)羰基]胺基})丙烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 100-4，2.0 g，3.055 mmol，61.16%))。ESI m/z：555.3 (M-100+H) +，678.4 (M+Na) +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.55 (s, 1H), 7.90 (d, J= 7.6 Hz, 2H), 7.84 (t, J= 4.8 Hz, 1H), 7.73 (d, J= 7.2 Hz, 2H), 7.62 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.44-7.40 (m, 2H), 7.36-7.31 (m, 2H), 6.73 (m, 1H), 6.61 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 4.29-4.21 (m, 3H), 3.98-3.87 (m, 2H), 3.21-3.16 (m, 2H), 3.11-2.94 (m, 2H), 1.74-1.55 (m , 2H), 1.39-1.26 (m, 22H) ppm。
步驟3 將化合物100-4 ((2S)-6-[2,3-雙({[(三級丁氧基)羰基]胺基})丙烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 100-4，1.0 g，1.527 mmol))之DCM (8 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後緩慢添加TFA (2 mL，26.925 mmol)。將溶液再攪拌1小時，隨後將溶液蒸發至乾燥。將殘餘物再次用DCM (20 mL)溶解並濃縮。重複該過程兩次，得到為淡黃色油狀物之粗產物100-5 ((2S)-6-(2,3-二胺基丙烷醯胺基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 100-5，1.0 g，2.200 mmol，144.05%))，原樣用於下一步驟。ESI m/z：455.3 (M+H) +。
步驟4 將1-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸(2.2 g，3.065 mmol)及HOSu (0.53 g，4.597 mmol)之無水DCM (10 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加EDCI (0.88 g，4.597 mmol)。將所得溶液再攪拌1小時，直至所有酸消轉化成活性酯。隨後將溶液用更多的DCM (20 mL)稀釋並且用水(20 mL)洗滌，收集有機層並用DCM (20 mL*2)萃取水層。合併DCM層並經硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮濾液，得到為無色油狀物之粗活性酯。將活性酯溶解於無水DMF (5 mL)，緩慢添加至化合物100-5 ((2S)-6-(2,3-二胺基丙烷醯胺基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 100-5，0.63 g，1.390 mmol))及DIPEA (0.36 g，2.780 mmol)之無水DMF (5 mL)溶液中。添加後，將所得淡黃色溶液在室溫下攪拌2小時至完成。隨後將反應溶液藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為無色油狀物之化合物100-6 ((2S)-6-[2,3-雙(1-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)丙烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 100-6))。ESI m/z：551.3 ((M-100)/3+H) +, 827.7 (M-100)/2+H) +。
步驟5 將化合物100-6 ((2S)-6-[2,3-雙(1-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)丙烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 100-6，1.8 g，0.971 mmol))之DCM (8 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加TFA (2 mL，26.925 mmol)。將所得溶液攪拌1小時。隨後將溶液濃縮至乾燥，並且將殘餘物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其凍乾以得到為無色油狀物之產物100-7 ((2S)-6-[2,3-雙(1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)丙烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 100-7，1.0 g，0.605 mmol，62.28%))。ESI m/z：552.3 (M/3+H) +，828.1 (M/2+H) +。 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.95-7.89 (m, 3H), 7.85-7.72 (m, 9H), 7.63 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.45-7.41 (m, 2H), 7.36-7.31 (m, 2H), 4.29-4.20 (m, 4H), 3.94-3.88 (m, 1H), 3.68-3.66 (m, 1H), 3.61-3.57 (m, 18H), 3.57-3.47 (m, 76H), 3.34-3.29 (m , 2H), 3.26-3.21 (m, 1H), 3.05-2.97 (m, 6H), 2.39 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 2.31 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 1.74-1.55 (m, 2H), 1.44- 1.25 (m 4H) ppm。
步驟6 將化合物100-7 ((2S)-6-[2,3-雙(1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)丙烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 100-7，850 mg，0.514 mmol))及D-葡萄糖(555.03 mg，3.084 mmol)之甲醇(20 mL)懸浮液在氮氣氛圍下加熱至50℃，隨後添加氰基硼氫化鈉(193.77 mg，3.084 mmol)。將所得混合物保持加熱隔夜(18小時)並完成。隨後將溶液濃縮至乾燥，將殘餘物溶解於DMF並藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為無色油狀物之化合物100-8 ((2S)-6-{2,3-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]丙烷醯胺基}-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 100-8 ，640 mg，0.173 mmol，53.9%))。ESI m/z = 771.0 (M/3+H) +。 1H NMR (400 MHz，DMSO-d6) δ 12.47 (s, 1H), 8.16 (brs, 2H), 7.95-7.80 (m, 5H), 7.73 (d, J= 7.6 Hz, 2H), 7.63 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.45-7.40 (m, 2H), 7.35-7.31 (m, 2H), 5.48-5.41 (m, 4H), 4.85-4.76 (m, 4H), 4.64-4.41 (m, 12H), 4.31-4.20 (m, 4H), 4.04-3.95 (m, 4H), 3.95-3.87 (m, 1H), 3.79-3.76 (m, 5H), 3.72-3.61 (m, 5H), 3.59-3.55 (m, 20H), 3.55-3.40 (m, 98H), 3.29-3.21 (m, 2H), 3.11-2.97 (m, 2H), 2.38 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 2.31(t, J= 6.4 Hz, 2H), 1.74-1.56 (m, 2H), 1.43-1.26 (m, 4H) ppm。亦揭示了TFA上之兩個羧基質子。
步驟7 將化合物100-8 ((2S)-6-{2,3-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]丙烷醯胺基}-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 100-8，150 mg，0.065 mmol))、化合物100-9 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 100-9，54.59 mg，0.065 mmol))及DIPEA (16.75 mg，0.130 mmol)之無水DMF (1.5 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘以允許起始材料充分溶解於溶劑，隨後添加HATU (24.68 mg，0.065 mmol)之無水DMF (0.5 mL)溶液。將所得溶液再攪拌2小時，直至LCMS指示反應完成。將完成的反應溶液直接藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之化合物100-10 (N-[(1S)-5-{2,3-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]丙烷醯胺基}-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 100-10，103 mg，0.033 mmol，50.63%))。ESI m/z：784.2 (M/4+H) +。
步驟8 將化合物100-10 (((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲哚林并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基甲酸4-((2S,5S,8S,59S,60R,61R,62R)-8-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-59,60,61,62,63-五羥基-5-異丙基-4,7,14,18-四氧雜-15-((42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基)-57-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基)-2-(3-脲基丙基)-21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54-十二氧雜-3,6,13,17,57-五氮雜六十三烷醯胺基)苄基酯( 100-10，100 mg，0.032 mmol))之DMF (1.8 mL)溶液在室溫下攪拌，並且添加二乙胺(0.2 mL，1.941 mmol)。將反應溶液攪拌1小時並完成。用旋轉蒸發儀蒸發大部分二乙胺，隨後將殘餘物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為淡黃色固體之所需產物100-11 (((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲哚林并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基甲酸4-((2S,5S,8S,59S,60R,61R,62R)-8-胺基-59,60,61,62,63-五羥基-5-異丙基-4,7,14,18-四氧雜-15-((42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基)-57-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基)-2-(3-脲基丙基)-21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54-十二氧雜-3,6,13,17,57-五氮雜六十三烷醯胺基)苄基酯( 100-11，50 mg，0.017 mmol，53.82%))。ESI m/z：971.5 (M/3+H) +，728.9 (M/4+H) +。
步驟9 將化合物100-11 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-{2,3-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]丙烷醯胺基}己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 100-11，50 mg，0.017 mmol))及DIPEA (3.32 mg，0.026 mmol)之無水DMF (1.5 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物100-12 (6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 100-12，6.35 mg，0.021 mmol))之無水DMF (0.5 mL)，歷時5分鐘。將反應溶液再攪拌4小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡。隨後將反應溶液直接藉由製備型HPLC (0.01% TFA)純化，得到為白色固體之PB100 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-{2,3-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]丙烷醯胺基}-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB100，35 mg，0.011 mmol，65.64%))。ESI m/z：621.9 (M/5+H) +，777.0 (M/4+H) +，1035.7 (M/3+H) +。保留時間5.642分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.04 (s, 1H), 8.15-8.13 (m, 3H), 8.07 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 7.99-7.91 (m, 2H), 7.86-7.77 (m, 3H), 7.64 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.60 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.54 (s, 1H), 6.01 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 5.49-5.39 (m, 7H), 5.39-5.24 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.83-4.79 (m, 4H), 4.65-4.46 (m, 11H), 4.40-4.35 (m, 1H), 4.30-4.18 (m, 3H), 4.03-3.94 (m, 4H), 3.81-3.74 (m, 4H), 3.74-3.61 (m, 4H), 3.61-3.52 (m, 16H), 3.52-3.40 (m, 98H), 3.29-3.13 (m, 8H), 3.13-2.90 (m, 7H), 2.40-2.36 (m, 5H), 2.30 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 2.24-2.08 (m, 4H), 2.00-1.71 (m, 4H), 1.71-1.51(m, 3H), 1.51-1.14 (m, 15H), 0.90-0.80 (m, 9H) ppm。揭示了TFA中兩個羧基質子訊號。
實例32：含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物-連接子(PB101或「LD101」)的製備
Figure 02_image759
含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物-連接子(PB101或「LD101」)製備如下： 步驟1 將化合物101-1 (N-[(1S)-5-{2,3-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]丙烷醯胺基}-1-胺基甲醯基戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 101-1，250 mg，0.108 mmol))、化合物101-2 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 101-2，121.64 mg，0.108 mmol))及DIPEA (27.95 mg，0.217 mmol)之無水DMF (4 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加HATU (41.19 mg，0.108 mmol)之無水DMF (4 mL)溶液。將所得溶液再攪拌2小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之化合物101-3 (N-[(1S)-5-{2,3-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]丙烷醯胺基}-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基](甲基)胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 101-3，210 mg，0.061 mmol，56.75%))。ESI m/z：854.9 (M/4+H) +。
步驟2 將化合物101-3 (N-[(1S)-5-{2,3-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]丙烷醯胺基}-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基](甲基)胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 101-3，200 mg，0.059 mmol))之DMF (3.6 mL)溶液在室溫下攪拌，並且添加二乙胺(0.4 mL，3.883 mmol)。將所得溶液攪拌1小時至完成。隨後用旋轉蒸發儀蒸發二乙胺，並且將DMF中之殘餘物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之所需產物化合物101-4 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-{2,3-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]丙烷醯胺基}己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 101-4，100 mg，0.031 mmol，53.48%))。ESI m/z：799.5(M/4+H) +。
步驟3 將化合物101-4 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-{3-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]-2-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(3R,4S,5R)-3,4,5,6-四羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]丙烷醯胺基}己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 101-4，30 mg，0.009 mmol))及化合物101-5 (6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 101-5，3.47 mg，0.011 mmol))之無水DMF (1.5 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加DIPEA (1.74 mg，0.013 mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌2小時以實現完全轉化(藉由LCMS監測)。隨後將完成的反應溶液直接藉由製備型HPLC (0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其凍乾以得到為白色固體之PB101 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-{2,3-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]丙烷醯胺基}-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB101 ，21 mg，0.006 mmol，66.02%))。ESI m/z：847.5 (M/ 4+H) +，1129.6 (M/3+H) +。保留時間6.016分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.03 (s, 1H), 8.34-8.10 (m, 4H), 8.06-7.89 (m, 2H), 7.89-7.79 (m, 2H), 7.66-7.62 (m, 1H), 7.59-7.57 (m, 2H), 7.34-7.24 (m, 6H), 7.20-7.13 (m, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.02-5.98 (m, 1H), 5.50-5.35 (m, 7H), 5.13-4.78 (m, 8H), 4.70-4.34 (m, 15H), 4.34-4.18 (m, 5H), 4.05-3.93 (m, 6H), 3.83-3.74 (m, 6H), 3.74-3.68 (m, 7H), 3.61-3.40 (m, 116 H), 3.26-3.12 (m, 11H), 3.12-2.80 (m, 10H), 2.43-2.36 (m, 3H), 2.32-2.26 (m, 3H), 2.15-1.84 (m, 6H), 1.84-1.45 (m, 15H), 1.45-1.16 (m, 8H), 1.06-0.97 (m, 6H), 0.89-0.73 (m, 24H) ppm。揭示了TFA中之一個羧基質子。
實例33：含有PEG單元及連接至6-胺基-9-{[4-(胺基甲基)苯基]甲基}-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-8-醇之可裂解連接子之藥物-連接子(PB102)的製備
Figure 02_image761
Figure 02_image763
含有PEG單元及連接至6-胺基-9-{[4-(胺基甲基)苯基]甲基}-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-8-醇之可裂解連接子之藥物-連接子(PB102)製備如下： 步驟1 將化合物102-1 (2-氯-9H-嘌呤-6-胺) (1當量)及K 2CO 3(3當量)溶解於DMSP並且攪拌反應混合物。添加4-(溴甲基)苄腈(1.4當量)，並且將反應混合物在室溫下攪拌16小時。過濾反應混合物以移除不溶性鹽並倒入水中。水相用EtOAc萃取。將合併之有機相經Mg2SO4乾燥並真空濃縮，得到產物102-3 (4-((6-胺基-2-氯-9H-嘌呤-9-基)甲基)苄腈( 102-3))。
步驟2 向NaH (1.24 g，51.631 mmol)之2-甲氧基乙-1-醇(1.364 mL，17.210 mmol)溶液中添加化合物102-3 (4-[(6-胺基-2-氯-9H-嘌呤-9-基)甲基]苄腈( 102-3，4.9 g，17.210 mmol))。將混合物在80℃下攪拌2小時。將所得溶液濃縮並藉由Biotage 快速層析(矽膠，用0至10% MeOH/DCM溶離)純化，得到為淡黃色固體之產物102-4 (4-{[6-胺基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苄腈( 102-4，4.02 g，12.394 mmol，72.04%))。ESI m/z：325.0(M+H) +。
步驟3 向化合物102-4 (4-{[6-胺基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苄腈( 102-4，4.02 g，12.394 mmol))之1,4-二氧雜環己烷(50 mL)溶液中添加亞硫烷基-λ^4-硼亞胺(2.65 g，14.873 mmol)及AIBN (0.183 mL，1.239 mmol)。將混合物在室溫下攪拌3小時。將所得溶液濃縮並藉由快速層析(矽膠，用0至10% MeOH/DCM溶離)純化，得到為淡黃色固體之產物102-5 (4-{[6-胺基-8-溴-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苄腈( 102-5，4.90 g，12.152 mmol，98%))。ESI m/z：404.1(M+H) +。
步驟4 向NaOMe (7.37 g，136.395 mmol)之MeOH (50 mL)溶液中添加化合物102-5 (4-{[6-胺基-8-溴-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苄腈( 102-5，5.5 g，13.640 mmol))。將混合物回流攪拌3小時。將所得溶液用鹽水洗滌並用DCM (50 mL*3)萃取。將有機層經Na 2SO 4乾燥並蒸發，得到產物102-6 (4-{[6-胺基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苄腈( 102-6，3.5 g，9.877 mmol，72.46%))。ESI m/z：355.3(M+H) +。
步驟5 向化合物102-6 (4-{[6-胺基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苄腈( 102-6，3.5 g，9.877 mmol))之MeOH (50 mL)溶液中添加NaBH 4(2.258 mL，69.137 mmol)及NiCl 2(H 2O) 6(0.24 g，0.988 mmol)。將混合物在室溫下攪拌3小時以完成(藉由LCMS監測)。將所得溶液用水淬滅並用DCM (50 mL*3)萃取。將收集之有機層經Na 2SO 4乾燥及蒸發，得到為淡黃色固體之粗產物102-7 (9-{[4-(胺基甲基)苯基]甲基}-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-6-胺( 102-7，3.6 g，10.045 mmol，101.70%))，將其直接用於下一步驟。ESI m/z：359.3(M+H) +。
步驟6 向化合物102-7 (9-{[4-(胺基甲基)苯基]甲基}-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-6-胺( 102-7，3.5 g，9.766 mmol))之MeCN (20 mL)溶液中添加ClSiMe3 (1.06 g，9.766 mmol)及NaI (0.400 mL，9.766 mmol)。將混合物在室溫下攪拌3小時。將所得溶液濃縮並藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為淡黃色固體之產物102-8 (6-胺基-9-{[4-(胺基甲基)苯基]甲基}-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-8-醇( 102-8，1.75 g，5.082 mmol，52.08%))。ESI m/z：345.3(M+H) +，保留時間4.359分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.131 (s, 1H), 8.141 (s, 3H), 7.413-7.393 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.340-7.319(d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.560 (s, 2H), 4.872 (s, 2H), 4.259-4.235 (t, J=4.8Hz, 2H), 4.005-3.992 (d, J= 5.2Hz, 2H), 3.593-3.570(t, J= 4.6Hz, 2H),3.265(s, 3H) ppm。揭示了TFA中之一個羧基質子。
步驟7 向化合物102-8 (6-胺基-9-{[4-(胺基甲基)苯基]甲基}-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-8-醇( 102-8，800 mg，2.323 mmol))之DMF (5 mL)溶液中添加化合物102-9 (4-硝基苯基碳酸{4-[(2S)-5-(胺基甲醯基胺基)-2-[(2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)-3-甲基丁醯胺基]戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 102-9，1781.31 mg，2.323 mmol))、HOBt (313.89 mg，2.323 mmol)及DIPEA (300.25 mg，2.323 mmol)。將混合物在室溫下攪拌2小時。將所得溶液藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為淡黃色固體之產物102-10 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[({[(4-{[6-胺基-8-羥基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苯基)甲基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)-4-(胺基甲醯基胺基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 102-10，450 mg，0.463 mmol，19.93%))。ESI m/z：972.5(M+H) +。
步驟8 向化合物102-10 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[({[(4-{[6-胺基-8-羥基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苯基)甲基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)-4-(胺基甲醯基胺基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 102-10，450 mg，0.463 mmol))之DMF (2 mL)溶液中添加二乙胺(0.1 mL，1.276 mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時。隨後將所得溶液藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化以收集所需級分，將其凍乾以得到不純的產物。將粗產物在乙腈中研磨並過濾，得到為淡黃色固體之餅狀物102-11 (N-[(4-{[6-胺基-8-羥基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苯基)甲基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 102-11，70 mg，0.093 mmol，20.17%))。ESI m/z：375.8(M/2+H) +。
步驟9 向化合物102-11 (N-[(4-{[6-胺基-8-羥基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苯基)甲基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 102-11，58 mg，0.077 mmol))之DMF (4 mL)溶液中添加化合物102-12 ((2S)-6-{2,3-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]丙烷醯胺基}-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 102-12，178.73 mg，0.077 mmol))、HATU (29.28 mg，0.077 mmol)及DIPEA (9.95 mg，0.077 mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌1小時，隨後藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為白色固體之化合物102-13 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[({[(4-{[6-胺基-8-羥基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苯基)甲基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)-4-(胺基甲醯基胺基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-{2,3-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]丙烷醯胺基}戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 102-13，120 mg，0.040 mmol，51.30%))。ESI m/z：761.3(M/4+H) +。
步驟10 向化合物102-13 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[({[(4-{[6-胺基-8-羥基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苯基)甲基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)-4-(胺基甲醯基胺基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-5-{2,3-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]丙烷醯胺基}戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 102-13，120 mg，0.039 mmol))之DMF (2 mL)溶液中添加二乙胺(0.1 mL，1.276 mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時。將所得溶液藉由反相分離(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物102-14 (N-[(4-{[6-胺基-8-羥基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苯基)甲基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-{2,3-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]丙烷醯胺基}己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 102-14，50 mg，0.018 mmol，44.95%))。ESI m/z：706.0(M/4+H) +。
步驟11 向化合物102-14 (N-[(4-{[6-胺基-8-羥基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苯基)甲基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-{2,3-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]丙烷醯胺基}己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 102-14，50 mg，0.018 mmol))之DMF (1 mL)溶液中添加化合物102-15 (6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 102-15，6.56 mg，0.021 mmol))及DIPEA (3.44 mg，0.027 mmol)。將溶液在室溫下攪拌2小時，直至所有起始胺耗盡。隨後將所得溶液直接藉由製備型HPLC (0.01% TFA)純化，得到產物級分，將其凍乾以得到為白色固體之PB102 (N-[(4-{[6-胺基-8-羥基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苯基)甲基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-{2,3-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28, 31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]丙烷醯胺基}-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB102 ，20 mg，0.007 mmol，37.43%))。ESI m/z：754.5 (M/4+H) +，1005.1 (M/3+H) +，保留時間5.190分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.03 (s, 1H), 10.01 (s, 1H), 8.15-8.13 (m, 3H), 7.97 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.94 (d, J= 4.0 Hz, 1H), 7.87-7.85 (m, 2H), 7.81-7.75 (m, 1H) 7.66 (d, J= 12.0 Hz, 1H), 7.58 (d, J= 4.0 Hz, 2H), 7.29-7.19 (m, 6H), 7.00 (s, 2H), 6.50 (s, 2H), 6.01 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 5.44 (brs, 4H), 4.95 (brs, 2H), 4.82 (brs, 2H), 4.57-4.39 (m, 12H), 4.26-4.14 (m, 8H), 4.05-3.95 (m, 4H), 3.80-3.76 (m, 4H), 3.68-3.61 (m, 4H), 3.58-3.56 (m, 18H), 3.52-3.36 (m, 98H), 3.35-3.29 (m, 12H), 3.26-3.17 (m, 7H), 3.01-2.92 (m, 4H), 2.68-2.66 (m, 1H), 2.39 (t, J= 6 Hz, 2H), 2.33-2.29 (m, 2H), 2.20-2.10 (m, 2H), 1.99-1.95 (m, 1H), 1.74-1.55 (m, 3H), 1.46-1.31 (m, 8H),1.25-1.10 (m, 4H), 0.85-0.81 (m, 6H) ppm。揭示了TFA上之兩個羧基質子。
實例34：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB103)的製備
Figure 02_image765
Figure 02_image767
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB103)製備如下： 步驟1 向化合物103-1 ((2S)-2,5-雙({[(三級丁氧基)羰基]胺基})戊酸( 103-1，4.5 g，13.538 mmol))之DCM (20 mL)溶液中添加HOSu (3.12 g，27.076 mmol)及EDCI (5.19 g，27.076 mmol)。將混合物在室溫下攪拌3小時。將所得溶液用水淬滅並用DCM萃取。將有機層經Na 2SO 4乾燥並蒸發，得到粗產物103-2 ((S)-2,5-雙((三級丁氧基羰基)胺基)戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 103-2，6.0 g，13.971 mmol，103.27%))。ESI m/z：452.3(M+Na) +。
步驟2 向化合物103-2 ((S)-2,5-雙((三級丁氧基羰基)胺基)戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 103-2，5.81 g，13.528 mmol))之DMF (20 mL)溶液中添加化合物103-3 ((2S)-6-胺基-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 103-3，5.98 g，16.234 mmol))及DIPEA (1.75 g，13.528 mmol)。將混合物在室溫下攪拌2小時。將所得溶液藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物103-4 ((2S)-6-[(2S)-2,5-雙({[(三級丁氧基)羰基]胺基})戊烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 103-4，8.5 g，12.448 mmol，91.99%))。ESI m/z：683.5(M+H) +。
步驟3 向化合物103-4 ((2S)-6-[(2S)-2,5-雙({[(三級丁氧基)羰基]胺基})戊烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 103-4，8.5 g，12.448 mmol))之DCM (20 mL)溶液中添加TFA (10 mL，134.626 mmol)。將混合物在室溫下攪拌3小時。將所得溶液蒸發並藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物103-5 ((2S)-6-[(2S)-2,5-二胺基戊烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 103-5，5.7 g，11.812 mmol，94.84%))。ESI m/z：483.4(M+H) +。
步驟4 向2,2-二甲基-4-側氧基-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-十三氧雜-5-氮雜四十四烷-44-酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(5.68 g，6.970 mmol)之DMF (15 mL)溶液中添加DIPEA (0.90 g，6.970 mmol)及化合物103-5 ((2S)-6-[(2S)-2,5-二胺基戊烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 103-5，1.68 g，3.485 mmol))。將混合物在室溫下攪拌1小時。將所得溶液藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為透明油狀物之產物103-6 ((2S)-6-[(2S)-2,5-雙(1-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)戊烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 103-6，5.9 g，3.135 mmol，89.94%))。ESI m/z：561.2((M-200)/3+H) +。
步驟5 向化合物103-6 ((2S)-6-[(2S)-2,5-雙(1-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)戊烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 103-6，5.9 g，3.135 mmol))之DCM (10 mL)溶液中添加TFA (5 mL，67.313 mmol)。將混合物在室溫下攪拌隔夜。將所得溶液濃縮並藉由藉由反相分離(C18管柱，用含有TFA之0至40%之乙腈水溶液溶離)純化，得到為透明油狀物之產物103-7 ((2S)-6-[(2S)-2,5-雙(1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)戊烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 103-7，4.5 g，2.675 mmol，85.39%))。ESI m/z：561.6(M/3+H) +。
步驟6 向化合物103-7 ((2S)-6-[(2S)-2,5-雙(1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24, 27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)戊烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 103-7，4.5 g，2.675 mmol))之MeOH (30 mL)溶液中添加D-葡萄糖(5.78 g，32.104 mmol)及NaBH 3CN (1.949 mL，32.104 mmol)。將混合物在60℃下攪拌持續週末。將所得溶液藉由反相快速層析(0.01%TFA)純化，得到為白色膠狀物之產物103-8 ((2S)-6-[(2S)-2,5-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 103-8，4.53 g，1.937 mmol，72.36%))。ESI m/z：780.4(M/3+H) +。
步驟7 向化合物103-8 ((2S)-6-[(2S)-2,5-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 103-8，330 mg，0.141 mmol))之DMF (5 mL)溶液中添加化合物103-9 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 103-9，118.66 mg，0.141 mmol))、HATU (53.65 mg，0.141 mmol)及DIPEA (36.47 mg，0.282 mmol)。將混合物在室溫下攪拌1.5小時。將所得溶液調節至pH 6並藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為淡黃色固體之產物103-10 (N-[(1S)-5-[(2S)-2,5-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34, 37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊烷醯胺基]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 103-10，273 mg，0.086 mmol，61.19%))。ESI m/z：790.9(M/4+H) +。
步驟8 向化合物103-10 (N-[(1S)-5-[(2S)-2,5-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊烷醯胺基]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 103-10，273 mg，0.086 mmol))之DMF (2.5 mL)溶液中添加二乙胺(0.5 mL，6.378 mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時。將所得溶液藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為淡黃色固體之產物103-11 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(2S)-2,5-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31, 34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 103-11，123 mg，0.042 mmol，48.46%))。ESI m/z：735.7(M/4+H) +，980.7(M/3+H) +。
步驟9 向化合物103-11 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(2S)-2,5-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 103-11，123 mg，0.042 mmol))之DMF (3 mL)溶液中添加化合物103-12 (6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 103-12，19.35 mg，0.063 mmol))及DIPEA (8.11 mg，0.063 mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時。將所得溶液調節至pH 6並藉由製備型HPLC (0.01%TFA)純化，得到為淡黃色固體之產物PB103 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-[(2S)-2,5-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊烷醯胺基]-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB103 ，80 mg，0.026 mmol，61.03%))。ESI m/z：627.7(M/5+H) +，784.0(M/4+H) +，1044.9(M/3+H) +，保留時間5.614分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.05 (s, 1H), 8.16-8.14 (m, 3H), 8.09-8.07 (d, J =8.8Hz, 1H), 7.99-7.98 (d, J =7.2 Hz, 2H), 7.86-7.83 (m, 2H), 7.80-7.77 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 7.67-7.65 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.61-7.59 (d, J =8.4 Hz, 2H), 7.37-7.35 (d, J = 8.8Hz, 2H), 7.311(s, 1H), 7.00(s, 2H), 6.55 (s, 1H), 6.03-6.01(t, J = 5.2 Hz, 1H), 5.45 (brs, 8H), 5.29-5.23 (m, 3H), 5.07 (s, 2H), 4.82(brs,4H ), 4.62-4.37 (m,12H ), 4.24-4.16 (m,3H ), 3.98 (brs, 4H), 3.78-3.77 (m, 4H ), 3.677(brs, 4H ), 3.61-3.54(m, 18H), 3.50-3.43 (m, 98H), 3.29-3.23 (m, 7H), 3.17-2.94 (m, 6H), 2.43-2.41(m, 5H), 2.30-2.26 (m, 3H), 2.24-2.08 (m, 4H), 2.00-1.83 (m, 3H), 1.66-1.59 (m, 4H ), 1.49-1.42 (m, 7H ), 1.36-1.45 (m, 6H ), 1.29-1.14 (m, 4H), 0.89-0.80(m, 9H) ppm。
實例35：含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物連接子(PB104)的製備
Figure 02_image769
含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物-連接子(PB104)製備如下： 步驟1 將化合物104-1 ((2S)-6-[(2S)-2,5-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 104-1，300 mg，0.128 mmol))、化合物104-2 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 104-2，144.10 mg，0.128 mmol))及DIPEA (33.02 mg，0.256 mmol)之無水DMF (3 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後緩慢添加HATU (48.79 mg，0.128 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液。將所得溶液再攪拌1小時，直至LCMS指示完全耗盡起始胺。隨後將所得溶液藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之化合物104-3 (N-[(1S)-5-[(2S)-2,5-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊烷醯胺基]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基](甲基)胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 104-3，280 mg，0.081 mmol，63.51%))。ESI m/z：671.5 ((M-717-26-18)/4+H) +，862.0 (M/4+H) +。
步驟2 將化合物104-3 (N-[(1S)-5-[(2S)-2,5-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊烷醯胺基]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基](甲基)胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 104-3，260 mg，0.075 mmol))之DMF (3.6 mL)溶液在室溫下攪拌，並且添加二乙胺(0.4 mL，3.883 mmol)。將所得溶液在再攪拌1小時，直至LCMS顯示反應完成。真空蒸發掉揮發物(特別為二乙胺)，並且將殘餘物藉由反相管柱層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之產物104-4 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(2S)-2,5-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 104-4，160 mg，0.050 mmol，65.78%))。ESI m/z = 615.8 ((M-717-26-18)/4+H) +，806.3 (M/4+H) +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.10 (s, 1H), 8.43 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 8.35-8.33 (m, 1.5H), 8.17-8.09 (m, 5H), 8.03 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 7.97-7.78 (m, 3H), 7.66 (d, J= 9.2 Hz, 0.5H), 7.59-7.57 (m, 2H), 7.49-7.40 (m, 1H), 7.32-7.24 ((m, 6H), 7.20-7.13 ((m, 1H), 6.04 (d, J= 4.2 Hz, 1H), 5.52-5.36 ((m, 7H), 5.11-4.94 ((m, 3H), 4.89-4.69 ((m, 5H), 4.69-4.39 ((m, 16H), 4.30-4.17 (m, 4H), 4.04-3.93 (m, 7H), 3.88-3.81 (m, 2H), 3.79-3.76 (m, 5H), 3.72-3.62 (m, 6H), 3.62-3.49 (m, 88H), 3.43-3.25 (m, 20H), 3.25-3.06 (m, 12H), 3.06-2.83 (m, 11H), 2.40-2.38 (m, 2H), 2.30-2.22 (m, 3H), 2.14-1.92 (m, 4H), 1.84-1.62 (m, 6H), 1.62-1.21 (m, 16H), 1.05-0.97 (m, 6H), 0.97-0.75 (m, 26H) ppm。揭示了TFA上之三個羧基質子。
步驟3 將化合物104-4 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(2S)-2,5-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25, 28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 104-4，100 mg，0.029 mmol))及DIPEA (5.65 mg，0.044 mmol)之無水DMF (1.5 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物104-5 (6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 104-5，10.80 mg，0.035 mmol))之無水DMF (0.5 mL)溶液。添加後，出於方便，將所得溶液在室溫下攪拌隔夜，並且LCMS指示在早晨完全反應。將所得溶液直接藉由製備型HPLC (0.01% TFA)純化，得到為白色固體之PB104 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-[(2S)-2,5-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44, 45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22, 25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]戊烷醯胺基]-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB104 ，55 mg，0.016 mmol，55.11%))。ESI m/z：854.5 (M/4+H) +； 保留時間5.614分鐘(HPLC)。 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 10.03 (s, 1H), 8.34-8.10 (m, 4H), 8.00-7.97 (m, 2H), 7.93-7.83 (m, 2.5H), 7.67-7.64 (m, 1.5H), 7.58 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.34-7.25 (m, 6H), 7.19-7.13 (m, 1H), 7.00 ((s, 2H), 6.02-5.99 ((m, 1H), 5.52-5.38 ((m, 7H), 5.14-4.94 ((m, 3H), 4.94-4.18 ((m, 25H), 4.04-3.93 (m, 7H), 3.79-3.77 (m, 5H), 3.69-3.66 (m, 5H), 3.62-3.56 (m, 20H), 3.52-3.47 (m, 88H), 3.36-3.12 (m, 15H), 3.03-2.83 (m, 13H), 2.43-2.37 (m, 3H), 2.30-2.27 (m, 3H), 2.15-2.06 (m, 4H), 2.01-1.94 (m, 2H), 1.81-1.50 (m, 8H), 1.50-1.17 (m, 20H), 1.05-0.97 (m, 6H), 0.89-0.75 (m, 26H) ppm。揭示了TFA上之兩個羧基質子。
實例36：含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物連接子(PB105)的製備
Figure 02_image771
Figure 02_image773
含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物-連接子(PB105)製備如下： 步驟1 將化合物105-1 ((2S)-2,6-雙({[(三級丁氧基)羰基]胺基})己酸( 105-1，5.0 g，14.433 mmol))、1-羥基吡咯啶-2,5-二酮(2.249 mL，28.867 mmol)及EDCI (5.53 g，28.867 mmol)之DCM (50 mL)溶液在室溫下攪拌2小時。隨後將反應溶液用DCM (50 mL)稀釋並用水(50 mL*2)洗滌。收集有機層並經硫酸鈉乾燥、過濾，並且真空濃縮濾液至乾燥，得到粗化合物105-2 (2,6-雙(三級丁氧基羰基胺基)己酸(S)-2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 105-2，6.35 g，14.318 mmol，99.20%))，將其直接用於下一步驟。ESI m/z：466.3 (M+Na) +。
步驟2 將化合物105-2 (2,6-雙(三級丁氧基羰基胺基)己酸(S)-2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 105-2，6.40 g，14.44 mmol))、化合物105-3 ((2S)-6-胺基-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 105-3，5.32 g，14.440 mmol))及DIPEA (3.73 g，28.880 mmol)之DMF (10 mL)溶液在室溫下攪拌2小時。隨後將反應混合物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為白色固體之化合物105-4 ((2S)-6-[(2S)-2,6-雙({[(三級丁氧基)羰基]胺基})己烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 105-4，7.9 g，11.337 mmol，78.51%))。ESI m/z：719.4(M+Na) +。
步驟3 向化合物105-4 ((2S)-6-[(2S)-2,6-雙({[(三級丁氧基)羰基]胺基})己烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 105-4，4.53 g，6.501 mmol))之DCM (20 mL)溶液中緩慢添加TFA (10 mL，134.626 mmol)。將混合物在室溫下攪拌2小時。隨後將反應溶液濃縮，並將粗混合物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為無色油狀物之化合物105-5 ((2S)-6-[(2S)-2,6-二胺基己烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 105-5，2.5 g，5.034 mmol，77.44%))。ESI m/z：497.3 (M+H) +。
步驟4 將粗化合物105-5 ((2S)-6-[(2S)-2,6-二胺基己烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 105-5，1.94 g，3.907 mmol))之DMF (5 mL)溶液逐滴添加至1-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21, 24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(5.7 g，6.995 mmol)及DIPEA (1.01 g，7.813 mmol)之DMF (10 mL)之溶液中。將所得溶液在室溫下攪拌2小時並完成。將所得混合物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為白色固體之化合物105-6 ( (2S)-6-[(2S)-2,6-雙(1-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)己烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 105-6，4.75 g，2.505 mmol，64.12%))。ESI m/z：566.2 (M-200)/3+H) +、970.6 (M/2+Na) +。
步驟5 向化合物105-6 ((2S)-6-[(2S)-2,6-雙(1-{[(三級丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)己烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 105-6，4.75 g，2.505 mmol))之DCM (10 mL)溶液中添加TFA (5 mL，67.313 mmol)。隨後將溶液在室溫下攪拌2小時、濃縮以移除有機溶劑，將粗殘餘物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為無色油狀物之化合物105-7 ((2S)-6-[(2S)-2,6-雙(1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)己烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 105-7，3.95 g，2.329 mmol，92.97%))。ESI m/z：566.3 (M/3+H) +。
步驟6 向化合物105-7 ((2S)-6-{[(2S)-2,6-雙(1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24, 27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺基)己基]胺基}-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 105-7，3.95 g，2.329 mmol))之MeOH (90 mL)溶液中分批添加D-葡萄糖(5.04 g，27.948 mmol)，並將混合物加熱至回流，同時在N 2氛圍下攪拌30分鐘。隨後逐滴添加NaCNBH 3(1.76 g，27.948 mmol)之MeOH (10 mL)溶液。將反應混合物在該溫度下攪拌18小時。隨後將反應溶液藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為無色油狀物之化合物105-8 ((2S)-6-[(2S)-2,6-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 105-8，4.13 g，1.755 mmol，75.36%))。ESI m/z：785.0(M/3+H) +。
步驟7 將化合物105-8 ((2S)-6-[(2S)-2,6-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44, 45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19, 22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 105-8，226.17 mg，0.096 mmol))、化合物105-9 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 105-9，90 mg，0.080 mmol))及DIPEA (20.64 mg，0.160 mmol)之無水DMF (3 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘以允許起始酸充分溶解於溶劑，隨後藉由注射器逐滴添加HATU (36.55 mg，0.096 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液，歷時10分鐘。添加後，將所得溶液再攪拌2小時以實現完全反應。隨後將反應溶液直接藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其藉由LabConc凍乾以得到為白色固體之化合物105-10 (N-[(1S)-5-[(2S)-2,6-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6 -五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基](甲基)胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 105-10，180 mg，0.052 mmol，65.06%))之TFA鹽。ESI m/z：865.5 (M/4+H) +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.07 (s, 1H), 8.36-8.08 (m, 4H), 7.98-7.88 (m, 5H), 7.83-7.79 (m, 1H), 7.74-7.65 (m, 3H), 7.58-7.56 (m, 3H), 7.43-7.39 (m, 2H), 7.34-7.24 (m, 8H), 7.20-7.13 (m, 1H), 6.00 (t, J= 5.2 Hz, 1H), 5.51-5.36 (m, 6H), 5.09-4.94 (m, 2H), 4.94-4.70 (m, 4H), 4.70-4.38 (m, 14H), 4.33-4.14 (m, 7H), 4.04- 3.93 (m, 6H), 3.79-3.73 (m, 4H), 3.68-3.64 (m, 4H), 3.61-3.55 (m, 18H), 3.52-3.46 (m, 96H), 3.25-3.12 (m, 13H), 3.06-2.83 (m, 13H), 2.43-2.37 (m, 3H), 2.30-2.26 (m, 3H), 2.16-2.04(m, 2H), 2.04-1.91 (m, 2H), 1.83-1.15 (m, 25H), 1..05-0.97 (m, 6H), 0.97-0.73 (m, 26H) ppm。揭示了TFA中之一個羧基質子。
步驟8 將化合物105-10 (((S)-1-(((S)-1-(((3S,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-氧雜丁-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧雜丁-2-基)(甲基)胺基甲酸4-((2S,5S,8S,15S,62S,63R,64R,65R)-8-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-62,63,64,65,66-五羥基-5-異丙基-4,7,14,21-四側氧基-15-((42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基)-60-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基)-2-(3-脲基丙基)-24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57-十二氧雜-3,6,13,20,60-五氮雜六十六烷醯胺基)苄基酯( 105-10，180 mg，0.052 mmol))之DMF (1.8 mL)溶液在室溫下攪拌，並且添加二乙胺(0.2 mL，1.941 mmol)。將所得溶液攪拌1小時，直至反應完成。真空蒸發掉大部分二乙胺，並且將殘餘物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其凍乾以得到為白色固體之化合物105-11 (((S)-1-(((S)-1-(((3S,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-氧雜丁-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧雜丁-2-基)(甲基)胺基甲酸4-((2S,5S,8S,15S,62S,63R,64R,65R)-8-胺基-62,63,64,65,66-五羥基-5-異丙基-4,7,14,21-四側氧基-15-((42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31, 34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基)-60-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基)-2-(3-脲基丙基)-24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57-十二氧雜-3,6,13,20,60-五氮雜六十六烷醯胺基)苄基酯( 105-11，110 mg，0.034 mmol，65.31%))之TFA鹽。ESI m/z：619.1(連接子片段，(M-717-26-18)/4+H)) +, 809.9 (M/4+H) +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ  10.10 (s, 1H), 8.43 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 8.36-8.33 (m, 1H), 8.15-8.10 (m, 5H), 8.01 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 7.94-7.91 (m, 1.5H), 7.85-7.83 (m, 1H), 7.67(d, J= 8.4 Hz, 0.5H), 7.59-7.57 (m, 2H), 7.35-7.24 (m, 6H), 7.20-7.13 (m, 1H), 6.07-6.05 (m, 1H), 5.53-5.38 (m, 6H), 5.09-4.94 (m, 2H), 4.94-4.42 (m, 18H), 4.30-4.13 (m, 4H), 4.04-3.93 (m, 6H), 3.85-3.81 (m, 1H), 3.81-3.73 (m, 5H), 3.73-3.64 (m, 5H), 3.61-3.55 (m, 18H), 3.55-3.48 (m, 88H), 3.39-3.29 (m, 10H), 3.24-3.12 (m, 12H), 3.06-2.83 (m, 11H), 2.44-2.38 (m, 3H), 2.38-2.22 (m, 4H), 2.15-2.05 (m, 2H), 2.05-1.94 (m, 2H), 1.85-1.64 (m, 6H), 1.64-1.41 (m, 6H), 1.41-1.16 (m, 12H), 1.05-0.97 (m, 6H), 0.97-0.75 (m, 26H) ppm。揭示了TFA上之三個羧基質子。
步驟9 將化合物105-11 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(2S)-2,6-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25, 28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 105-11，100 mg，0.031 mmol))及DIPEA (7.97 mg，0.062 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後藉由注射器逐滴添加6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(11.43 mg，0.037 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液，歷時5分鐘。添加後，將所得溶液再攪拌6小時，直至起始胺幾乎耗盡。隨後將所得溶液直接藉由製備型HPLC (0.01% TFA)純化，得到為白色固體之PB105 (N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基甲醯基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基](甲基)胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]-N-甲基胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-[(2S)-2,6-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB105 ，65 mg，0.019 mmol，61.34%))之TFA鹽。ESI m/z：667.8 (連接子片段，(M-717-26-18)/4+H) +； 858.3 (M/4+H) +。保留時間6.042分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.05 (s, 1H), 8.38-8.30 (m, 0.5H), 8.17-8.10 (m, 3.5H), 7.99-7.91 (m, 2.5H), 7.91-7.82 (m, 2H), 7.68-7.65 (m, 1.5H), 7.59-7.57 (m, 2H), 7.34-7.24 (m, 6H), 7.19-7.15 (m, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.08-5.96 (m, 1H), 5.53-5.37 (m, 6H), 5.14-4.36 (m, 22H), 4.29-4.13 (m, 5H), 4.04-3.93 (m, 7H), 3.82-3.73 (m, 5H), 3.73-3.66 (m, 5H), 3.62-3.55 (m, 20H), 3.52-3.41 (m, 88H), 3.36-3.24 (m, 10H), 3.24-3.12 (m, 12H), 3.12-2.83 (m, 11H), 2.43-2.35 (m, 3H), 2.29 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.14-1.92 (m, 6H), 1.83-1.46 (m, 16H), 1.46-1.16 (m, 12H), 1.05-0.97 (m, 6H), 0.89-0.75 (m, 26H) ppm。揭示了TFA上之兩個羧基質子。
實例37：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB106)的製備
Figure 02_image775
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB106)製備如下： 步驟1 將化合物106-1 ((2S)-6-[(2S)-2,6-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44, 45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16, 19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}胺基)己酸( 106-1，200 mg，0.085 mmol))、化合物106-2 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 106-2，71.49 mg，0.085 mmol))及HATU (32.32 mg，0.085 mmol)、DIPEA (21.97 mg，0.170 mmol)之DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌2小時至完成。將反應混合物藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其冷凍乾燥以得到為白色固體之化合物106-3 (N-[(1S)-5-[(2S)-2,6-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯( 106-3，144 mg，0.045 mmol，53.35%))。ESI m/z：794.8 (M/4+H) +，1059.3 (M/3+H) +。
步驟2 將化合物106-3 (N-[(1S)-5-[(2S)-2,6-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(胺基甲醯基胺基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基甲醯基)丁基]胺基甲醯基}-2-甲基丙基]胺基甲醯基}戊基]胺基甲酸化合物(9H-茀-9-基)甲酯( 106-3，144 mg，0.045 mmol))及二乙胺(0.2 mL，0.180 mmol)之DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌2小時。隨後將溶液藉由反相快速層析(0.01% TFA)純化，得到為白色固體之化合物106-4 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(2S)-2,6-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34, 37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 106-4，70 mg，0.024 mmol，52.29%))。ESI m/z：985.3(M/3+H) +。
步驟3 將化合物106-4 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-胺基-6-[(2S)-2,6-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( 106-4，40 mg，0.014 mmol))、化合物106-5 (6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯( 106-5，17.26 mg，0.056 mmol))及DIPEA (7.24 mg，0.056 mmol)之DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌2小時至完成。隨後將反應混合物藉由製備型HPLC (0.01% TFA)純化，得到所需級分，將其藉由LabConc冷凍乾燥以得到為淡黃色固體之PB106 (N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羥基-19-甲基-5,9-二側氧基-8-氧雜-4,15-二氮雜六環[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14, 16,18,20(24)-庚烯-23-基]胺基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-[(2S)-2,6-雙[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羥基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧雜-40-氮雜四十六烷醯胺基]己烷醯胺基]-2-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷醯胺基]己烷醯胺基]-3-甲基丁醯胺基]-5-(胺基甲醯基胺基)戊烷醯胺基]苯基}甲酯( PB106，26 mg，0.008 mmol，59.02%))。ESI m/z：787.5 (M/4+H) +，1049.9 (M/3+H) +。保留時間5.626分鐘(HPLC)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.05 (s, 1H), 8.22-8.05 (m, 4H), 8.01-7.93 (m, 2H), 7.89-7.77 (m, 3H), 7.66 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.60 (d, J= 8.2 Hz, 2H), 7.36 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.56 (s, 1H), 6.01 (d, J= 14.8 Hz, 1H), 5.50-5.39 (m, 8H), 5.33-5.24 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.88-4.67 (m, 4H), 4.67-4.38 (m, 12H), 4.38-4.13 (m, 4H), 4.00-3.94 (m, 4H), 3.83-3.77 (m, 4H), 3.72-3.63 (m, 4H), 3.63-3.56 (m, 18H), 3.55-3.46 (m, 88H), 3.38 – 3.14 (m, 9H), 3.14-2.91 (m, 10H), 2.38-2.30 (m, 5H), 2.28 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 2.23-2.08 (m, 5H), 2.02-1.83 (m, 4H), 1.72-1.53(m, 5H), 1.46-1.28 (m, 13H), 1.28-1.12 (m, 7H), 0.90-0.80 (m, 9H) ppm。亦揭示了TFA上之兩個羧基質子。
實例38：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB107)的製備
Figure 02_image777
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB107)製備如下： 步驟1 將化合物107-1 (0.5 g，0.536 mmol)及D-葡萄糖(0.77 g，4.291 mmol)之無水甲醇(50 mL)溶液在50℃下加熱30分鐘，隨後添加NaCNBH 3(0.27 g，4.291 mmol)。將所得溶液在70℃下再攪拌4天，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。隨後將反應溶液濃縮並藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物107-2 (0.3 g，0.189 mmol，35.29%)。純度= 85%-90%。
步驟2 將化合物107-3 (0.16 g，0.189 mmol)、化合物107-2 (0.3 g，0.189 mmol)及HATU (72 mg，0.189 mmol)之無水DMF (4 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加DIPEA (74 mg，0.567 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物107-4 (140 mg，0.058 mmol，30.50%)。純度= 90%-95%。
步驟3 將化合物107-4 (140 mg，0.058 mmol)及TFA (1 mL)之無水DCM (4 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且形成所需產物(m/z= 1156 = 2311/2+H)以及糖酯化產物(TFA與糖單元中之羥基基團稠合，單酯，m/z= (2311+96)/3+H=803)。將完成的反應溶液濃縮至乾燥，隨後再溶解於THF (4 mL)及水(2 mL)中，用飽和碳酸鈉水溶液處理以調節pH至8-9。將所得溶液在室溫下攪拌30分鐘以實現完全水解。隨後將溶液用稀釋之HCl調節至pH至2-3並濃縮，將殘餘物藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物107-5 (113 mg，0.049 mmol，84.32%)。純度= 90%-95%。
步驟4 將化合物107-5 (113 mg，0.049 mmol)及DIPEA (19 mg，0.147 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物107-6 (23 mg，0.074 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液，歷時5分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。隨後將反應溶液藉由製備型HPLC純化，得到為白色固體之PB107 (12 mg，0.005 mmol，9.84%)。LCMS，m/z = 835.93(M/3+H) +。
實例39：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB108)的製備
Figure 02_image779
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB107)製備如下： 步驟1 將化合物108-1 (2 g，3.646 mmol)及HOSu (0.84 g，7.291 mmol)之無水DCM (30 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加EDCI (1.4 g，7.291 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物。用水洗滌所得溶液，收集有機層，隨後用DCM (40 mL * 2)萃取水相。將合併之有機層經硫酸鈉乾燥並過濾、濃縮至乾燥，得到為白色固體之化合物108-2 (1.8 g，2.788 mmol，76.60%)，將其原樣用於下一步驟。純度= 85%-90%。
步驟2 將化合物108-2 (0.76 g，1.182 mmol)及化合物108-3 (1 g，1.182 mmol)之無水DMF (5 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加DIPEA (0.3 g，2.364 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物。將反應溶液終止並直接藉由反相液相層析終止純化，得到為白色固體之化合物108-4 (1.4 g，1.017 mmol，85.89%)。純度= 90%-95%。
步驟3 將化合物108-4 (1.4 g，1.017 mmol)及DEA (5 mL)之無水DMF (20 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。隨後將溶液濃縮至乾燥，得到為黃色油狀物之化合物108-5 (0.9 g，0.966 mmol，94.74%)，將其原樣用於下一步驟。純度= 90%-95%。
步驟4 將化合物108-5 (0.9 g，0.966 mmol)及D-葡萄糖(1.04 g，5.793 mmol)之無水甲醇(50 mL)溶液在50℃下加熱30分鐘，隨後添加NaCNBH 3(0.36 g，5.793 mmol)。將所得溶液在70℃下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。隨後將反應溶液濃縮並藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物108-6 (0.7 g，0.492 mmol，50.72%)。純度= 85%-90%。
步驟5 將化合物108-7 (0.21 g，0.250 mmol)、化合物108-6 (0.36 g，0.250 mmol)及HATU (93 mg，0.250 mmol)之無水DMF (4 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加DIPEA (95 mg，0.750 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物108-8 (0.21 g，0.093 mmol，37.50%)。純度= 90%-95%。
步驟6 將化合物108-8 (0.21 g，0.093 mmol)及TFA (1 mL)之無水DCM (4 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且形成所需產物(m/z= 1074 = 2147/2+H)以及糖酯化產物(TFA與糖單元中之羥基基團稠合，單酯，m/z= (2147+96)/2+H=1122)。將完成的反應溶液濃縮至乾燥，隨後再溶解於THF (4 mL)及水(2 mL)中，用飽和碳酸鈉水溶液處理以調節pH至8-9。將所得溶液在室溫下攪拌30分鐘以實現完全水解。隨後將溶液用稀釋之HCl調節至pH至2-3並濃縮，將殘餘物藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物108-9 (160 mg，0.075 mmol，80.65%)。純度= 90%-95%。
步驟7 將化合物108-9 (160 mg，0.075 mmol)及DIPEA (28.8 mg，0.224 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物108-10 (34.4 mg，0.113 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液，歷時5分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。隨後將反應溶液藉由製備型HPLC純化，得到為白色固體之PB108 (15 mg，0.006 mmol，8.62%)。LCMS，m/z = 1171.24(M/2+H) +。
實例40：含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物連接子(PB109)的製備
Figure 02_image781
含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物-連接子(PB109)製備如下： 步驟1 將化合物109-1 (170 mg，0.107 mmol)、化合物109-2 (120 mg，0.107 mmol)及HATU (41 mg，0.107 mmol)之無水DMF (4 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加DIPEA (41.4 mg，0.321 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物109-3 (103 mg，0.038 mmol，35.76%)。純度= 90%-95%。
步驟2 將化合物109-3 (103 mg，0.038 mmol)及TFA (1 mL)之無水DCM (4 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且形成所需產物(m/z= 865 = 2594/3+H)以及糖酯化產物(TFA與糖單元中之羥基基團稠合，單酯，m/z= (2594+96)/3+H=897)。將完成的反應溶液濃縮至乾燥，隨後再溶解於THF (4 mL)及水(2 mL)中，用飽和碳酸鈉水溶液處理以調節pH至8-9。將所得溶液在室溫下攪拌30分鐘以實現完全水解。隨後將溶液用稀釋之HCl調節至pH至6-7並濃縮，將殘餘物藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物109-4 (45 mg，0.017 mmol，45.45%)。純度= 90%-95%。
步驟3 將化合物109-4 (45 mg，0.017 mmol)及DIPEA (6.7 mg，0.052 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物109-5 (8.0 mg，0.026 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液，歷時5分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。隨後將反應溶液藉由製備型HPLC純化，得到為白色固體之PB109 (6 mg，0.002 mmol，12.41%)。LCMS，m/z = 930.16(M/3+H) +。
實例41：含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物-連接子(PB110或LD110)的製備
Figure 02_image783
含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物-連接子(PB110或LD110)製備如下： 步驟1 將化合物110-1 (5 g，8.671 mmol)及HOSu (2.0 g，17.342 mmol)之無水DCM (150 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加EDCI (3.3 g，17.342 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物。用水洗滌所得溶液，收集有機層，隨後用DCM (100 mL * 2)萃取水相。將合併之有機層經硫酸鈉乾燥並過濾、濃縮至乾燥，得到為白色固體之化合物110-2 (4.7 g，6.976 mmol，80.48%)，將其原樣用於下一步驟。純度= 85%-90%。
步驟2 將化合物110-3 (5 g，5.953 mmol)及DEA (5 mL)之無水DMF (20 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。隨後將溶液濃縮至乾燥，得到為無色油狀物之化合物110-4 (3.4 g，5.504 mmol，92.39%)，將其原樣用於下一步驟。純度= 90%-95%。
步驟3 將化合物110-2 (1 g，2.491 mmol)及化合物110-4 (1.5 g，2.491 mmol)之無水DMF (10 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加DIPEA (0.64 g，4.982 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物。將反應溶液終止並直接藉由反相液相層析終止純化，得到為無色油狀物之化合物110-5 (1.3 g，1.438 mmol，57.78%)。純度= 90%-95%。
步驟4 將化合物110-5 (1.3 g，1.438 mmol)及TFA (4 mL)之無水DCM (16 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。隨後將溶液濃縮至乾燥，得到為黃色油狀物之化合物110-6 (910 mg，1.293 mmol，89.92%)，將其原樣用於下一步驟。純度= 85%-90%。
步驟5 將化合物110-6 (910 mg，1.293 mmol)及D-葡萄糖(1.4 g，7.771 mmol)之無水甲醇(40 mL)溶液在50℃下加熱30分鐘，隨後添加NaCNBH 3(488 mg，7.766 mmol)。將所得溶液在70℃下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。隨後將反應溶液濃縮並藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物110-7 (320 mg，0.268 mmol，20.70%)。純度= 85%-90%。
步驟6 將化合物110-2 (1 g，2.491 mmol)及化合物110-8 (0.92 g，2.491 mmol)之無水DMF (10 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加DIPEA (0.64 g，4.982 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物。將反應溶液終止並直接藉由反相液相層析終止純化，得到為白色固體之化合物110-9 (1.4 g，2.138 mmol，85.89%)。純度= 90%-95%。
步驟7 將化合物110-9 (0.58 g，0.886 mmol)、化合物110-10 (1 g，0.890 mmol)及HATU (0.34 g，0.894 mmol)之無水DMF (10 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加DIPEA (0.35 g，2.708 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物110-11 (240 mg，0.136 mmol，15.29%)。純度= 90%-95%。
步驟8 將化合物110-11 (240 mg，0.136 mmol)及TFA (1 mL)之無水DCM (4 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。隨後將溶液濃縮至乾燥，得到為黃色油狀物之化合物110-12 (195 mg，0.125 mmol，91.68%)，將其原樣用於下一步驟。純度= 85%-90%。
步驟9 將化合物110-12 (195 mg，0.125 mmol)、化合物110-13 (299 mg，0.250 mmol)及HATU (95 mg，0.250 mmol)之無水DMF (5 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加DIPEA (97 mg，0.751 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物110-14 (210 mg，0.053 mmol，42.89%)。純度= 90%-95%。
步驟10 將化合物110-14 (210 mg，0.053 mmol)及DEA (1 mL)之無水DMF (4 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。隨後將溶液濃縮至乾燥，得到為無色油狀物之化合物110-15 (175 mg，0.047 mmol，88.38%)，將其原樣用於下一步驟。純度= 90%-95%。
步驟11 將化合物110-15 (175 mg，0.047 mmol)及DIPEA (12.2 mg，0.094 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物110-16 (21.9 mg，0.071 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液，歷時5分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。隨後將反應溶液藉由製備型HPLC純化，得到為白色固體之PB110 (73 mg，0.019 mmol，39.63%)。LCMS，m/z = 972.82(M/4+H) +。
實例42：含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物連接子(PB111或LD111)的製備
Figure 02_image785
含有PEG單元及連接至依喜替康之可裂解連接子之藥物-連接子(PB111或LD111)製備如下： 步驟1 將化合物111-1 (5 g，14.433 mmol)及HOSu (3.3 g，28.673 mmol)之無水DCM (60 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加EDCI (5.5 g，28.690 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物。用水洗滌所得溶液，收集有機層，隨後用DCM (50 mL * 2)萃取水相。將合併之有機層經硫酸鈉乾燥並過濾、濃縮至乾燥，得到為白色固體之化合物111-2 (4.8 g，10.823 mmol，75.00%)，將其原樣用於下一步驟。純度= 85%-90%。
步驟2 將化合物111-2 (4.8 g，10.823 mmol)及化合物111-3 (3.99 g，10.829 mmol)之無水DMF (20 mL)溶液在室溫下攪拌，隨後添加DIPEA (2.8 g，21.665 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物。將反應溶液終止並直接藉由反相液相層析終止純化，得到為白色固體之化合物111-4 (5.1 g，7.319 mmol，67.64%)。純度= 90%-95%。
步驟3 將化合物111-4 (0.83 g，1.191 mmol)、化合物111-5 (1 g，1.189 mmol)及HATU (0.45 g，1.183 mmol)之無水DMF (10 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加DIPEA (0.46 g，3.559 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物111-6 (1.1 g，0.724 mmol，61.11%)。純度= 90%-95%。
步驟4 將化合物111-6 (1.1 g，0.724 mmol)及TFA (2 mL)之無水DCM (8 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。隨後將溶液濃縮至乾燥，得到為黃色油狀物之化合物111-7 (0.9 g，0.682 mmol，94.24%)，將其原樣用於下一步驟。純度= 85%-90%。
步驟5 將化合物111-7 (150 mg，0.114 mmol)、化合物111-8 (272 mg，0.227 mmol)及HATU (87 mg，0.229 mmol)之無水DMF (5 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加DIPEA (89 mg，0.689 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物111-9 (110 mg，0.030mmol，26.38%)。純度= 90%-95%。
步驟6 將化合物111-9 (110 mg，0.030 mmol)及DEA (1 mL)之無水DMF (4 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。隨後將溶液濃縮至乾燥，得到為無色油狀物之化合物111-10 (75 mg，0.022 mmol，72.82%)，將其原樣用於下一步驟。純度= 90%-95%。
步驟7 將化合物111-10 (75 mg，0.022 mmol)及DIPEA (5.6 mg，0.043 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物111-11 (10 mg，0.032 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液，歷時5分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。隨後將反應溶液藉由製備型HPLC純化，得到為白色固體之PB111 (22 mg，0.006 mmol，27.78%)。LCMS，m/z = 912.79(M/4+H) +。
實例43：含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物連接子(PB112)的製備
Figure 02_image787
含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物-連接子(PB112)製備如下： 步驟1 將化合物112-1 (100 mg，0.046 mmol)、化合物112-2 (25.2 mg，0.046 mmol)及HATU (17.5 mg，0.046 mmol)之無水DMF (3 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加DIPEA (17.8 mg，0.138 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物112-3 (85mg，0.031 mmol，68.55%)。純度= 90%-95%。
步驟2 將化合物112-3 (85 mg，0.031 mmol)及DEA (1 mL)之無水DMF (4 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。隨後將溶液濃縮至乾燥，得到為無色油狀物之化合物112-4 (65 mg，0.029 mmol，91.47%)，將其原樣用於下一步驟。純度= 90%-95%。
步驟3 將化合物112-4 (65 mg，0.029 mmol)及DIPEA (14.8 mg，0.116 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物112-5 (26.5 mg，0.087 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液，歷時5分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。隨後將反應溶液藉由製備型HPLC純化，得到為白色固體之PB112 (11 mg，0.004 mmol，14.47%)。LCMS，m/z = 885.71 (M/3+H) +。
實例44：含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物連接子(PB113)的製備
Figure 02_image789
含有PEG單元及連接至MMAE之可裂解連接子之藥物-連接子(PB113)製備如下： 步驟1 將化合物113-1 (20 g，0.078 mol)及RuCl 3(0.4 g，2%)之MeCN (100 mL)及H 2O (200 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後分幾批添加NaIO 4(66.52 g，0.311 mol)溶液。將所得溶液在50℃下再攪拌2小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。添加甲醇(20 mL)，蒸發溶液並將殘餘物在乙腈(100 ml)中在5℃下洗滌30分鐘。過濾溶液並將濾液濃縮至乾燥，以得到為白色固體之化合物113-2 (9.5 g，0.039 mol，50.67%)。純度= 50%-60%。
步驟2 將化合物113-2 (5 g，0.021 mol)、化合物113-3 (1 g，1.95 mmol)及HATU (0.74 g，1.95 mmol)之無水DMF (20 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加DIPEA (0.75 g，5.85 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物113-4 (410 mg，0.556 mmol，28.67%)。純度= 90%-95%。
步驟3 將化合物113-4 (20.6 mg，0.028 mol)、化合物113-5 (60 mg，0.028 mmol)及HATU (10.5 mg，0.028 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加DIPEA (10.7 mg，0.084 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物113-6 (41 mg，0.014 mmol，51.38%)。純度= 90%-95%。
步驟4 將化合物113-6 (41 mg，0.014 mmol)及DEA (1 mL)之無水DMF (4 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。隨後將溶液濃縮至乾燥，得到為黃色油狀物之化合物113-7 (31 mg，0.012 mmol，81.79%)，將其原樣用於下一步驟。純度= 90%-95%。
步驟5 將化合物113-7 (31 mg，0.012 mmol)及DIPEA (4.5 mg，0.035 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物113-8 (5.4 mg，0.017 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液，歷時2分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。用甲酸中和所得溶液以調節pH至6-7。隨後將反應溶液藉由製備型HPLC純化，得到為白色固體之PB113 (21 mg，0.007 mmol，63.25%)。LCMS，m/z = 957.42 (M/3+H) +。
實例45：連接至依喜替康之藥物-連接子(PB114)的製備
Figure 02_image791
連接至依喜替康之藥物-連接子(PB114)製備如下： 步驟1 將化合物114-1 (5.8 g，5.431 mmol)及DIPEA (2.1 g，16.249 mmol)之無水DMF (30 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物114-2 (2.5 g，8.109 mmol)之無水DMF (10 mL)溶液，歷時5分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。隨後蒸發大部分之DMF及DIPEA，並且將殘餘物在乙腈(150 ml)中在5℃下洗滌30分鐘。過濾溶液，用乙腈洗滌濾餅，得到為黃色固體之化合物114-3 (5.2 g，4.122 mmol，75.91%)。純度= 85%-95%。
步驟2 將化合物114-3 (5.2 g，4.122 mmol)及DCA (10 mL)之無水DCM (90 mL)溶液在室溫下攪拌2小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。將反應溶液濃縮至乾燥並且直接藉由反相液相層析純化，得到為黃色固體之化合物114-4 (2.5 g，2.488 mmol，60.24%)。純度= 85%-95%。
步驟3 將化合物114-4 (500 mg，0.497mmol)、化合物114-5 (131 mg，0.498 mmol)及HATU (189 mg，0.497 mmol)之無水DMF (5 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加DIPEA (193 mg，1.493 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析純化，得到為黃色固體之化合物114-6 (160 mg，0.128 mmol，25.72%)。純度= 85%-95%。
步驟4 將化合物114-6 (160 mg，0.128 mmol)及TFA (1 mL)之無水DCM (4 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。將反應溶液直接藉由反相液相層析純化，得到為黃色固體之化合物114-7 (50 mg，0.043 mmol，33.97%)。純度= 85%-95%。
步驟5 將化合物114-8 (16.7 mg，0.065 mmol)及DIPEA (22.5 mg，0.174 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌10分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物114-7 (50 mg，0.043 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液，歷時5分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。隨後將反應溶液藉由製備型HPLC純化，得到為黃色固體之PB114 (20 mg，0.014 mmol，32.31%)。LCMS，m/z = 713.19 (M/2+H) +。
實例46：連接至依喜替康之藥物-連接子(PB115)的製備
Figure 02_image793
連接至依喜替康之藥物-連接子(PB115)製備如下： 步驟1 將化合物115-1 (10 g，0.012 mol)及DIPEA (4.6 g，0.036 mol)之無水DMF (60 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加PNPC (3.67 g，0.012 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物。隨後蒸發大部分之DMF及DIPEA，並且將殘餘物在乙腈(200 ml)中在5℃下洗滌30分鐘。過濾溶液，用乙腈洗滌濾餅，得到為灰色固體之化合物115-2 (8.4 g，8.449 mmol，70.06%)。純度= 85%-95%。
步驟2 將化合物115-2 (8.4 g，8.449 mmol)、依喜替康(4.5 g，8.449 mmol)及HOBT (1.1 g，8.449 mmol)之無水DMF (50 mL)之溶液在室溫下攪拌，隨後添加DIPEA (3.3 g，25.347 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物。隨後蒸發大部分之DMF及DIPEA，並且將殘餘物在乙腈(100 ml)中在5℃下洗滌30分鐘。過濾溶液，用乙腈洗滌濾餅，得到為灰色固體之化合物115-3 (9.3 g，7.207 mmol，85.32%)。純度= 85%-95%。
步驟3 將化合物115-3 (9.3 g，7.207 mmol)及DEA (10 mL)之無水DMF (40 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。隨後蒸發大部分之DMF及DEA，並且將殘餘物在乙腈(200 ml)中在5℃下洗滌30分鐘。過濾溶液，用乙腈洗滌濾餅，得到為灰色固體之化合物115-4 (5.8 g，5.429 mmol，75.32%)。純度= 85%-95%。
步驟4 將化合物115-4 (1.6 g，1.498 mmol)、化合物115-5 (0.53 g，1.498 mmol)及HATU (0.57 g，1.498 mmol)之無水DMF (10 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加DIPEA (0.58 g，4.494 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。隨後蒸發大部分之DMF及DIPEA，並且將殘餘物在乙腈(50 ml)中在5℃下洗滌30分鐘。過濾溶液，用乙腈洗滌濾餅，得到為灰色固體之化合物115-6 (1.7 g，1.210 mmol，80.95%)。純度= 85%-95%。
步驟5 將化合物115-6 (1.7 g，1.210 mmol)及DEA (2 mL)之無水DMF (8 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。隨後蒸發大部分之DMF及DEA，並且將殘餘物在乙腈(50 ml)中在5℃下洗滌30分鐘。過濾溶液，用乙腈洗滌濾餅，得到為灰色固體之化合物115-7 (1.1 g，0.930 mmol，76.92%)。純度= 85%-95%。
步驟6 將化合物115-7 (1.1 g，0.930 mmol)及DIPEA (0.36 g，2.791 mmol)之無水DMF (5 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物115-8 (0.43 g，1.396 mmol)之無水DMF (5 mL)溶液，歷時2分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。隨後蒸發大部分之DMF及DIPEA，並且將殘餘物在乙腈(30 ml)中在5℃下洗滌30分鐘。過濾溶液，用乙腈洗滌濾餅，得到為灰色固體之化合物115-9 (1.1 g，0.800 mmol，85.94%)。純度= 80%-90%。
步驟7 將化合物115-9 (1.1 g，0.800 mmol)及DCA (2 mL)之無水DCM (18 mL)溶液在室溫下攪拌2小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。將反應溶液濃縮至乾燥並且直接藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物115-10 (310 mg，0.277 mmol，34.64%)。純度= 85%-95%。
步驟8 將化合物115-10 (141.9 mg，0.554 mmol)及DIPEA (143.2 mg，1.108 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌20鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物115-11 (310 mg，0.277 mmol)之無水DMF (5 mL)溶液，歷時5分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。隨後將反應溶液藉由製備型HPLC純化，得到為白色固體之PB115 (50 mg，0.036 mmol，12.95%)。LCMS，m/z = 697.66 (M/2+H) +。
實例47：連接至帕博西尼之藥物-連接子(PB116)的製備
Figure 02_image795
連接至帕博西尼之藥物-連接子(PB116)製備如下： 步驟1 將化合物116-1 (685.4 mg，0.894 mmol)、帕博西尼(400 mg，0.894 mmol)及HOBT (120.8 mg，0.894 mmol)之無水DMF (60 mL)之溶液在室溫下攪拌，隨後添加DIPEA (231 mg，1.787 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物。隨後蒸發大部分之DMF及DIPEA ，並且將殘餘物在乙腈(20 ml)中在5℃下洗滌30分鐘。過濾溶液，用乙腈洗滌濾餅，得到為黃色固體之化合物116-2 (720 mg，0.670 mmol，74.92%)。純度= 90%-95%。
步驟2 將化合物116-2 (720 mg，0.670 mmol)及DEA (1 mL)之無水DMF (4 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。隨後蒸發大部分之DMF及DEA，並且將殘餘物在乙腈(50 ml)中在5℃下洗滌30分鐘。過濾溶液，用乙腈洗滌濾餅，得到為黃色固體之化合物116-3 (510 mg，0.598 mmol，89.32%)。純度= 95%-95%。
步驟3 將化合物116-3 (300 mg，0.352 mmol)及DIPEA (136.5 mg，1.056 mmol)之無水DMF (3 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物116-4 (162.5 mg，0.527 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液，歷時5分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。隨後將反應溶液藉由製備型HPLC純化，得到為黃色固體之化合物PB116 (210 mg，0.201 mmol，57.08%)。LCMS，m/z = 1046.59 (M+H) +。
實例48：含有PEG單元及連接至帕博西尼之可裂解連接子之藥物連接子(PB117)的製備
Figure 02_image797
含有PEG單元及連接至帕博西尼之可裂解連接子之藥物-連接子(PB117)製備如下： 步驟1 將化合物117-1 (207 mg，0.176 mmol)、化合物117-2 (150 mg，0.176 mmol)及HATU (66.8 mg，0.176 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加DIPEA (68.1 mg，0.527 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析純化，得到為黃色固體之化合物117-3 (210 mg，0.105 mmol，59.49%)。純度= 90%-95%。
步驟2 將化合物117-3 (210 mg，0.105 mmol)及TFA (2 mL)之無水DCM (8 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且形成所需產物(m/z= 637 = 1909/3+H)以及糖酯化產物(TFA與糖單元中之羥基基團稠合，單酯，m/z= (1909+96)/3+H=669)。將完成的反應溶液濃縮至乾燥，隨後再溶解於THF (4 mL)及水(2 mL)中，用飽和碳酸鈉水溶液處理以調節pH至8-9。將所得溶液在室溫下攪拌30分鐘以實現完全水解。隨後將溶液用稀釋之TFA中和並濃縮，將殘餘物藉由反相液相層析純化，得到為黃色固體之化合物117-4 (120 mg，0.063 mmol，60.15%)。純度= 90%-95%。
步驟3 將化合物117-4 (120 mg，0.063 mmol)及DIPEA (24.3 mg，0.189 mmol)之無水DMF (3 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物117-5 (29.0 mg，0.094 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液，歷時5分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。隨後將反應溶液藉由製備型HPLC純化，得到為黃色固體之PB117 (40 mg，0.019 mmol，30.30%)。LCMS，m/z = 1052.11 (M/2+H) +。
實例49：連接至T7-2之藥物-連接子(PB118)的製備
Figure 02_image799
連接至T7-2之藥物-連接子(PB118)製備如下： 步驟1 將T7-2 (300 mg，0.951 mmol)及DIPEA (737.8 mg，5.706 mmol)之無水DMF (6 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加PNPC (868.26 mg，2.853 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物。隨後蒸發大部分之DMF及DIPEA，並且將殘餘物在乙腈(50 ml)中在5℃下洗滌30分鐘。過濾溶液，用乙腈洗滌濾餅，得到為白色固體之化合物118-1 (270 mg，0.562 mmol，59.08%)。純度= 90%-93%。
步驟2 將化合物118-1 (270 mg，0.562 mmol)、N-Boc-N,N'-二甲基乙二胺(105.80 mg，0.562 mmol)及HOBT (75.94 mg，0.562 mmol)之無水DMF (5 mL)之溶液在室溫下攪拌，隨後添加DIPEA (217.90 mg，1.686 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物。將反應溶液終止並直接藉由反相液相層析終止純化，得到為白色固體之化合物118-2 (210 mg，0.397 mmol，70.71%)。純度= 90%-95%。
步驟3 將化合物118-2 (210 mg，0.397 mmol)及TFA (1 mL)之無水DCM (4 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。隨後將溶液濃縮至乾燥，得到為黃色油狀物之化合物118-3 (170 mg，0.397 mmol，100%)，將其原樣用於下一步驟。純度= 85%-90%。
步驟4 將化合物118-3 (170 mg，0.396 mmol)、化合物118-4 (303.65 mg，0.396 mmol)及HOBT (53.51 mg，0.396 mmol)之無水DMF (5 mL)之溶液在室溫下攪拌，隨後添加DIPEA (153.54 mg，1.188 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物。將反應溶液終止並直接藉由反相液相層析終止純化，得到為白色固體之化合物118-5 (95 mg，0.090 mmol，22.73%)。純度= 80%-90%。
步驟5 將化合物118-5 (95 mg，0.090 mmol)及DEA (1 mL)之無水DMF (4 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。隨後將溶液濃縮至乾燥，得到為無色油狀物之化合物118-6 (75 mg，0.090 mmol，100%)，將其原樣用於下一步驟。純度= 80%-90%。
步驟6 將化合物118-6 (75 mg，0.090 mmol)及DIPEA (34.83 mg，0.270 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液在室溫下攪拌1分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物118-7 (41.54 mg，0.135 mmol)之無水DMF (5 mL)溶液，歷時2分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。用甲酸中和所得溶液以調節pH至6-7。隨後將反應溶液藉由製備型HPLC純化，得到為白色固體之化合物PB118 (10 mg，0.001 mmol，10.87%)。LCMS，m/z = 1028.55 (M+H) +。
實例50：含有PEG單元及連接至T7-2之可裂解連接子之藥物連接子(PB119)的製備
Figure 02_image801
含有PEG單元及連接至T7-2之可裂解連接子之藥物-連接子(PB119)製備如下： 步驟1 將化合物119-1 (154.7 mg，0.132 mmol)、化合物119-2 (110 mg，0.132 mmol)及HATU (50.1 mg，0.132 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加DIPEA (51.1 mg，0.395 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物119-3 (75 mg，0.038 mmol，28.63%)。純度= 90%-95%。
步驟2 將化合物119-3 (75 mg，0.038 mmol)及TFA (1 mL)之無水DCM (4 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且形成所需產物(m/z= 631 = 1891/3+H)以及糖酯化產物(TFA與糖單元中之羥基基團稠合，單酯，m/z= (1891+96)/3+H=663)。將完成的反應溶液濃縮至乾燥，隨後再溶解於THF (4 mL)及水(2 mL)中，用飽和碳酸鈉水溶液處理以調節pH至8-9。將所得溶液在室溫下攪拌30分鐘以實現完全水解。隨後將溶液用稀釋之TFA中和並濃縮，將殘餘物藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物119-4 (41 mg，0.022 mmol，57.75%)。純度= 80%-85%。
步驟3 將化合物119-4 (41 mg，0.022 mmol)及DIPEA (8.5 mg，0.066 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物119-5 (10.0 mg，0.033 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液，歷時5分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。隨後將反應溶液藉由製備型HPLC純化，得到為白色固體之化合物PB119 (9 mg，0.004 mmol，19.92%)。LCMS，m/z = 1043.05 (M/2+H) +。
實例51：含有PEG單元及連接至T7-1之可裂解連接子之藥物連接子(PB120)的製備
Figure 02_image803
含有PEG單元及連接至T7-1之可裂解連接子之藥物-連接子(PB120)製備如下： 步驟1 將T7-1 (3 g，9.574 mmol)及DIPEA (7.4 g，57.444 mmol)之無水DMF (30 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加PNPC (8.7 g，28.722 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物。隨後蒸發大部分之DMF及DIPEA，並且將殘餘物在乙腈(50 ml)中在5℃下洗滌30分鐘。過濾溶液，用乙腈洗滌濾餅，得到為白色固體之化合物120-1 (4.1 g，8.569 mmol，89.52%)。純度= 90%-95%。
步驟2 將化合物120-1 (4.1 g，8.569 mmol)、N-Boc-N,N'-二甲基乙二胺(1.61 g，8.569 mmol)及HOBT (1.16 g，8.569 mmol)之無水DMF (10 mL)之溶液在室溫下攪拌，隨後添加DIPEA (3.3 g，25.707 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物。將反應溶液終止並直接藉由反相液相層析終止純化，得到為白色固體之化合物120-2 (2.3 g，4.359 mmol，50.88%)。純度= 90%-95%。
步驟3 將化合物120-2 (2.3 g，4.359 mmol)及TFA (4 mL)之無水DCM (16 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。隨後將溶液濃縮至乾燥，得到為黃色油狀物之化合物120-3 (1.8 g，4.210 mmol，96.77%)，將其原樣用於下一步驟。純度= 85%-90%。
步驟4 將化合物120-3 (1.8 g，4.210 mmol)、120-4 (3.2 g，4.210 mmol)及HOBT (0.57 g，4.210 mmol)之無水DMF (15 mL)之溶液在室溫下攪拌，隨後添加DIPEA (1.6 g，12.630 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物。將反應溶液終止並直接藉由反相液相層析終止純化，得到為白色固體之化合物120-5 (270 mg，0.256 mmol，6.14%)。純度= 85%-90%。
步驟5 將化合物120-5 (270 mg，0.256 mmol)及DEA (1 mL)之無水DMF (4 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且偵測到所需產物。隨後將溶液濃縮至乾燥，得到為無色油狀物之化合物120-6 (210 mg，0.252 mmol，98.59%)，將其原樣用於下一步驟。純度= 85%-90%。
步驟6 將化合物120-7 (296 mg，0.252 mmol)、120-6 (210 mg，0.252 mmol)及HATU (95.9 mg，0.252 mmol)之無水DMF (5 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後添加DIPEA (97.8 mg，0.756 mmol)。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至LCMS指示反應完成。將反應溶液直接藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物120-8 (120 mg，0.060 mmol，23.95%)。純度= 90%-95%。
步驟7 將化合物120-8 (120 mg，0.060 mmol)及TFA (1 mL)之無水DCM (4 mL)溶液在室溫下攪拌1小時，直至LCMS指示所有起始胺耗盡並且形成所需產物(m/z= 630 = 1889/3+H)以及糖酯化產物(TFA與糖單元中之羥基基團稠合，單酯，m/z= (1889+96)/3+H=662)。將完成的反應溶液濃縮至乾燥，隨後再溶解於THF (4 mL)及水(2 mL)中，用飽和碳酸鈉水溶液處理以調節pH至8-9。將所得溶液在室溫下攪拌30分鐘以實現完全水解。隨後將溶液用稀釋之TFA中和並濃縮，將殘餘物藉由反相液相層析純化，得到為白色固體之化合物120-9 (45 mg，0.024 mmol，39.47%)。純度= 90%-95%。
步驟8 將化合物120-9 (45 mg，0.024 mmol)及DIPEA (9.2 mg，0.072 mmol)之無水DMF (2 mL)溶液在室溫下攪拌5分鐘，隨後藉由注射器逐滴添加化合物120-10 (11.0 mg，0.036 mmol)之無水DMF (1 mL)溶液，歷時5分鐘。將所得溶液在室溫下再攪拌1小時，直至指示所有起始胺已耗盡並且偵測到所需產物之質量。隨後將反應溶液藉由製備型HPLC純化，得到為白色固體之PB120 (15 mg，0.007 mmol，30.24%)。LCMS，m/z = 1042.19 (M/2+H) +。
實例52：藥物-連接子PB003及抗體之結合物(PA003)的製備 將10 mg/mL之抗體之pH 7.1 PB 5 mM EDTA緩衝液在25℃藉由10 mM TCEP還原120分鐘。向還原的抗體溶液中添加6.5當量之5 mM PB03之DMA溶液，將所得混合物在25℃下攪拌120分鐘。用PD-10管柱純化ADC，將ADC命名為PA003。
Figure 02_image805
實例53：藥物-連接子PB004及抗體之結合物(PA004)的製備 將10 g/mL之抗體之pH 7.1 PB 5 mM EDTA緩衝液在25℃藉由10 mM TCEP還原120分鐘。向還原的抗體溶液中添加6.5當量之5 mM PB004之DMA溶液，將所得混合物在25℃下攪拌120分鐘。用PD-10管柱純化ADC，將ADC命名為PA004。
Figure 02_image807
實例54：藥物-連接子PB008及抗體之結合物(PA008)的製備 將10 mg/mL之抗體之pH 7.1 PB 5 mM EDTA緩衝液在25℃藉由10 mM TCEP還原120分鐘。向還原的抗體溶液中添加6.5當量之5 mM PB08之DMA溶液，將所得混合物在25℃下攪拌120分鐘。用PD-10管柱純化ADC，將ADC命名為PA008。
Figure 02_image809
實例55：藥物-連接子PB0038及抗體之結合物(PA038)的製備 將10 g/mL之抗體之pH 7.1 PB 5 mM EDTA緩衝液在25℃藉由10 mM TCEP還原120分鐘。用PD-10管柱移除TCEP。向還原的抗體溶液中添加15當量之5 mM PB038之DMA溶液，將所得混合物在25℃下攪拌120分鐘。用PD-10管柱純化ADC。將ADC命名為PA038。
Figure 02_image811
藉由HIC-HPLC及SEC-HPLC分析ADC PA0038。 實例56：藥物-連接子PB039及抗體之結合物(PA039)的製備 將10 g/mL之抗體之pH 7.1 PB 5 mM EDTA緩衝液在25℃藉由10 mM TCEP還原120分鐘。用PD-10管柱移除TCEP。向還原的抗體溶液中添加15當量之5 mM PB039之DMA溶液，將所得混合物在25℃下攪拌120分鐘。用PD-10管柱純化ADC。將ADC命名為PA039。
Figure 02_image813
藉由HIC-HPLC及SEC-HPLC分析ADC PA0039。 實例57：藥物-連接子PB040及抗體之結合物(PA040)的製備 將10 g/mL之抗體之pH 7.1 PB 5 mM EDTA緩衝液在25℃藉由10 mM TCEP還原120分鐘。用PD-10管柱移除TCEP。向還原的抗體溶液中添加15當量之5 mM PB040之DMA溶液，將所得混合物在25℃下攪拌120分鐘。用PD-10管柱純化ADC。將ADC命名為PA040。
Figure 02_image815
實例58：藥物-連接子PB082及抗體之結合物(PA082)的製備 將10 mg/mL之抗體之PH7.1 PB 5 mM EDTA緩衝液在25℃藉由10 mM TCEP還原120分鐘。用PD-10管柱移除TCEP。向還原的抗體溶液中添加15當量之5 mM PB082之DMA溶液，將所得混合物在25℃下攪拌120分鐘。用PD-10管柱純化ADC。將ADC命名為PA082。
Figure 02_image817
實例59：藥物-連接子PB083及抗體之結合物(PA082)的製備 將10 mg/mL之抗體之pH 7.1 PB 5 mM EDTA緩衝液在25℃藉由10 mM TCEP還原120分鐘。用PD-10管柱移除TCEP。向還原的抗體溶液中添加15當量之5 mM PB083之DMA溶液，將所得混合物在25℃下攪拌120分鐘。用PD-10管柱純化ADC。將ADC命名為PA083。
Figure 02_image819
實例60：ADC PA038之穩定性測試 當在37℃下儲存長達15天或經歷5個凍融循環時，ADC PA038似乎藉由HIC及SEC均為穩定的。在37℃或多次凍融循環下隨時間未觀測到聚集之顯著增加。在100 mg/mL下，發現PA038為穩定的，無聚集(藉由SEC)或沈澱。
實例61：藉由HIC-HPLC量測之保留時間 在DAR8下之ADC PA038及ADC PA039之相對保留時間比相應之基於MC-VC-PAB-MMAE之ADC之DAR2物質的相對保留時間更短。 HIC-HPLC條件：管柱：TSKgel丁基-NPR、2.5μm、4.6 mm x 100 mm (PN: 42168)；管柱溫度：30℃；UV: 280 nm；流動相：A：50 mM PB、1.5M (NH 4) 2SO 4、pH=7.0；B：50 mM PB(pH=7.0):IPA=75:25(v:v) 流速：0.5 mL/min；梯度溶離：0分鐘→20分鐘(0%B→100%B)、20分鐘→21分鐘(100%B→0%B)、21分鐘→32分鐘(0%B)。
實例62：抗-FOLR1免疫結合物之體外細胞毒性測定 使用體外細胞毒性測定量測抗-FOLR1結合物抑制細胞生長的能力。測定方法如下：收集OV90、OVCAR-3及NCI-H292細胞，並且在添加抗-FOLR1結合物之前以指定量(根據細胞生長速率)接種至純白色平底96孔板中。第二天，將細胞暴露於30 μg/ml至0.37 μg/ml或100 μg/ml至0.015 μg/ml之藥物濃度範圍之結合物，其中1:3連續稀釋且對孔一式雙份。將板在37℃下培育120小時。培育後，將40 μL CTG (Promega，G7572)/孔添加至板中，培育5分鐘後在MD SpectraMax I3X上讀板。使用Microsoft Excel及Prism軟體將生長抑制計算為相對於未處理細胞之生長百分比。
藉由將藥物-連接子PA038與抗體F131結合以製得結合物F131-LD038來製備抗-FOLR1結合物。將在含有5 mM EDTA之50 mM磷酸鈉緩衝液(pH = 6.9)中之2 mL抗體(F131,10 mg/mL)以TCEP:mAb = 8.0之莫耳比添加至10 mM TCEP HCl (三(2-羧乙基)膦HCl)之水溶液中。還原反應在25℃下進行2小時。藉由用50 mM磷酸鈉緩衝液(pH = 6.9)超濾除去過量之TCEP及其副產物。將LD038 (TFA之鹽)以20 mg/mL之濃度溶解在水中並以7.7 (LD038:F131)之莫耳比添加至還原的mAb (F131)中。將結合反應在25℃下攪拌2小時。用50 mM磷酸鈉緩衝液藉由超濾移除過量之LD038及其雜質。將ADC儲存在20 mM組胺酸緩衝液中，該緩衝液含有6%蔗糖及0.02% (w/V) Tween 20(由UFDF製造)。藉由SEC-HPLC判定之ADC純度為97.5%，並且藉由LC-MS判定之DAR值為7.6。載藥量為約8。
結果如圖1A、圖1B及圖1C中所示。與裸(未結合)抗體(F131 Ab)相比，抗-FOLR1結合物對OV90、OVCAR-3及NCI-H292細胞具有顯著更佳的細胞毒性。
實例63. 抗-FOLR1結合物在OV90異種移植模型中之體內功效 在雌性BALB/c裸鼠之皮下OV90人類卵巢癌異種移植模型中評價抗-FOLR1結合物之體內抗腫瘤功效。在37℃下、在5% CO 2之空氣氛圍中，將OV90腫瘤細胞(ATCC，Manassas，VA，cat # CRL-11732)在體外保持為在補充有10%熱滅活胎牛血清之RPMI 1640培養基中之單層培養物。將腫瘤細胞藉由胰蛋白酶-EDTA處理每週兩次習知傳代培養。收集在指數生長階段生長之細胞並計數腫瘤細胞接種。
藉由將藥物-連接子PA038與抗體F131結合以製得結合物F131-LD038 (如上所描述)來製備抗-FOLR1結合物。載藥量為約8。
在各小鼠之右側皮下接種在0.1 mL之補充有用於腫瘤發育之Matrigel (1:1)之1640中之OV90腫瘤細胞(2 × 10 6)。在腫瘤細胞接種後第8天，當平均腫瘤大小達到約117 mm 3時，開始治療。使用基於Excel之隨機化軟體程式將動物分配至2個組中之一個，根據其之腫瘤體積進行分層隨機化。每組由7隻荷瘤小鼠組成。
將抗-FOLR1免疫結合物以5 mg/kg分4個劑量投與小鼠；在分組後之第0、3、7及10天進行給藥。
在習知監測期間，每週檢查動物對腫瘤生長及正常行為之任何影響，例如活動能力、食物及水消耗(僅藉由觀測)、體重增加/減輕(每隔一天量測體重)、眼睛/毛髮消光及如方案中所描述之任何其他異常影響。根據各亞組內動物之數量記錄死亡及觀測到的臨床表現。使用卡尺在兩個維度上每週兩次量測腫瘤大小，並且使用以下公式以mm 3表示體積：V = 0.5a x b 2，其中a及b分別為腫瘤之長徑及短徑。
不同治療組之中值腫瘤體積繪製在圖2中。與PBS對照組相比，用結合物F131-LD038治療導致中值腫瘤體積之顯著減少。
實例64. 抗-FOLR1結合物在NCI-H292異種移植模型中之體內功效 在雌性BALB/c裸鼠之皮下NCI-H292人類肺癌異種移植模型中評價抗-FOLR1結合物之體內抗腫瘤功效。在37℃下、在5% CO 2之空氣氛圍中，將NCI-H292腫瘤細胞(ATCC，Manassas，VA，cat # CRL-1848)在體外保持為在補充有10%熱滅活胎牛血清之RPMI1640培養基中的單層培養物。將腫瘤細胞藉由胰蛋白酶-EDTA處理每週兩次習知傳代培養。收集在指數生長階段生長之細胞並計數腫瘤細胞接種。
藉由將藥物-連接子PA038與抗體F131結合以製得結合物F131-LD038 (如上所描述)來製備抗-FOLR1結合物。載藥量為約8。
在各小鼠之右側皮下接種在用於腫瘤生長之0.1 mL之RPMI 1640中之NCI-H292腫瘤細胞(10 × 10 6)。在腫瘤細胞接種後第11天，當平均腫瘤大小達到約123 mm 3時，開始治療。使用基於Excel之隨機化軟體程式將動物分配至2個組中之一個，根據其之腫瘤體積進行分層隨機化。每組由6隻荷瘤小鼠組成。
將抗-FOLR1免疫結合物以5 mg/kg分4個劑量投與小鼠；在分組後之第0、3、7及10天進行給藥。
不同治療組之中值腫瘤體積繪製在圖3中。與PBS對照組相比，用F131-LD038結合物治療導致中值腫瘤體積之顯著減少。
實例65. 抗-FOLR1結合物在NCI-H292異種移植模型中之體內功效 在雌性BALB/c裸鼠皮下KB (人口腔表皮樣癌細胞)異種移植模型中評價抗-FOLR1結合物之體內抗腫瘤功效。在37℃下、在5% CO 2之空氣氛圍中，將KB腫瘤細胞(ATCC，CCL-17)在體外保持為在補充有10%熱滅活胎牛血清之MEM培養基中之單層培養物。將腫瘤細胞藉由胰蛋白酶-EDTA處理每週兩次習知傳代培養。收集在指數生長階段生長之細胞並計數腫瘤細胞接種。
藉由將藥物-連接子PA038與抗體F131結合以製得結合物F131-LD038 (如上所描述)來製備抗-FOLR1結合物。載藥量為約8。
在各小鼠之右側皮下接種在用於腫瘤生長之0.1 mL之RPMI 1640中之KB腫瘤細胞(1 × 10 6)。在腫瘤細胞接種後第13天，當平均腫瘤大小達到約110 mm 3時，開始治療。使用基於Excel之隨機化軟體程式將動物分配至2個組中之一個，根據其之腫瘤體積進行分層隨機化。每組由6隻荷瘤小鼠組成。
將抗-FOLR1免疫結合物以5 mg/kg分4個劑量投與小鼠；在分組後之第0、3、7及10天進行給藥。
不同治療組之中值腫瘤體積繪製在圖4中。與PBS對照組相比，用F131-LD038結合物治療導致中值腫瘤體積之顯著減少。治療20天後，所有6隻小鼠均有完全反應。
實例66. 抗-FOLR-1結合物在大鼠中之藥物動力學(PK) 大鼠購自VR並且在飼養後1週使用。將大鼠分組飼養在無菌籠中並維持在特定的無病原體條件下。在實驗室內，環境條件為：溫度20℃ ~ 22℃，濕度59%~78%，人工光照12小時。大鼠籠為聚碸盒，經高壓滅菌後使用，規格為325 mm × 210 mm × 180 mm，每盒至多飼養3隻動物。在籠卡上標明了實驗編號、實驗開始時間、項目負責人、實驗員、動物來源、組別及動物數量。實驗動物用耳標標記。給大鼠餵食FR-2飲食並提供自來水(在高壓滅菌後使用)。其之體重在給藥時為約290 g。
用單劑量之F131-LD038免疫結合物(如上所描述製備)或3 mg/kg之裸抗體F131靜脈內(IV)處理每組3隻大鼠之2組。在投與後10分鐘、4小時、1天、4天、7天、10天、14天及21天收集血樣，隨後離心(4℃，10000×g，3分鐘)以分離血漿。藉由ELISA偵測血清中各結合物或mAb之總抗體濃度，並藉由GraphPad Prism軟體分析。
將山羊抗-人類IgG Fc (Invitrogen，31125)以2μg/ml之PBS，100μL每孔包被在96孔微孔板(Thermo，cat: 468667)上，在4℃隔夜。第二天，移除溶液，用350 μL/孔 TBST洗滌板兩次。藉由添加200 μL/孔封閉緩衝液(3% BSA/TBST)封閉板。將板在37℃置放2小時，隨後用350 μL/孔 TBST洗滌兩次。向各孔中添加一系列濃度之標準物及樣品。將板在室溫下置放2小時。移除溶液，用350 μL/孔 TBST洗滌板兩次。用封閉緩衝液稀釋山羊抗-人類κ輕鏈(HRP) (abcam，ab202549)，並以每孔100 μL添加。將板在室溫下培育1小時。隨後將板用350 μL/孔 TBST洗滌4次。在各孔中添加100 μL之TMB溶液A：溶液B，1:1溶液，並將反應物置於黑暗中3至10分鐘。添加50 μL終止溶液(2M H 2SO 4)，並讀取450 nm及630 nm處之光密度。用GraphPadPrism5軟體分析資料。
在單次靜脈內投與3 mg/kg之抗-huFOLR-1結合物F131-LD038或裸抗體F131後，抗-huFOLR-1結合物F131-LD038之PK曲線類似於裸抗體F131之PK曲線。結果顯示於圖5中。
實例67. 產生抗人類FOLR1之人類抗體 使用完全人類抗體文庫篩選靶向人類FOLR-1之抗體。該文庫為半合成之人類抗體文庫，其中Fab展示在噬菌體表面上。
遵循標準方案進行文庫淘選。具體而言，以6 μg/ml用0.5 ml人類FOLR1 (ACRO-FO1-H52H1)抗原包被PolySorp或MaxiSorp Nunc-Immuno Tubes (Nunc-MG Scientific) (參見淘選概述，表1)，並置於冰箱中隔夜。將管用PBS洗滌一次，用1% BSA/PBS封閉，並在RT (室溫)下置放1小時。將管與指示量(CFU，參見淘選概述，表1)之文庫噬菌體樣品在RT下培育1小時。將管用PBST緩衝液洗滌10次。為了溶離結合之噬菌體，添加0.5 ml之100 mM TEA (三乙胺)，在室溫下培育2分鐘，並將溶離物轉移至新的管中，並立即藉由在混合中添加0.25 ml之1.0 M Tris-HCL (pH8.0)來中和。將溶離液(0.75 ml)添加至10 ml指數生長之大腸桿菌TG1 (OD600～0.5)中，充分混合，並在37℃ (水浴)下不搖動地培育30分鐘。在2xTY培養基中製備培養物之10倍稀釋液，並將10 μl之每種稀釋液鋪板在TYE/amp/glu板上，並在30℃下培育隔夜。第二天，計數每種稀釋液之菌落數，並計算淘選輸出之CFU (菌落形成單位)。將剩餘之培養物在2,800 g下離心15分鐘，重懸於0.5 ml 2xTY培養基中，鋪板在兩個150 mm TYE/amp/glu板上，並在30℃下培育隔夜。第二天，將3至5 ml之2xTY /amp/glu培養基添加至各板中，並用細胞鋪展器將細菌自板上刮下。藉由混合1.5 ml細菌及0.5 ml 80%甘油製備甘油儲備液，並將儲備液置於-80℃。
為了製備用於下一輪選擇之噬菌體顆粒，將甘油儲備液接種至40 ml之2xTY /amp/glu培養基中，自OD600~0.01-0.05開始。使培養物在37℃下在搖動(300 rpm)下生長直至OD600達到0.4-0.6。藉由將輔助噬菌體CM13以5-10:1之輔助噬菌體細菌比率添加至培養物中來感染培養物。將培養物在37℃下培育30分鐘，同時在水浴中靜置，偶爾混合，隨後在37℃下搖動30分鐘。將細菌培養物以3000 rpm離心20分鐘，移除上清液。將沈澱物重懸於100 mL之2xTY /amp/kan中，隨後在30℃下搖動地生長隔夜。藉由以6,000 g離心30分鐘收集培養物。藉由將1/5體積之PEG溶液添加至上清液中，隨後在冰上培育1小時，隨後在4℃下以4,000 g離心20分鐘來沈澱噬菌體顆粒。徹底棄去上清液。將噬菌體沈澱物重懸於1至2 ml之冷PBS中。藉由在4℃下以最高速度微離心5分鐘來移除殘留之細菌。以此方式製備之噬菌體可以立即用於選擇，或在-80℃下以10%甘油之等分試樣儲存。藉由用10倍稀釋之噬菌體溶液(在2xTY中，低至10-11)感染100 μl指數生長之大腸桿菌TG1來判定噬菌體製劑之滴度。自步驟1開始重複選擇，總輪數為3~4輪。
總共進行4輪淘洗。第2、第3及第4輪中之洗滌緩衝液PBS-Tween20之濃度分別逐漸增加至0.2%、0.3%及0.4%。
經過4輪篩選後，目標陽性富集率達到1.5 × 10 4，與空白對照有顯著差異，如表1中所示。挑選來自兩個96孔板之純系用於噬菌體ELISA驗證；選擇彼等與FOLR-1具有高結合之純系進行定序。
總共定序了69個純系，獲得了12個獨特的VH序列。分析這12個VH序列並具有2組獨特的HCDR3，如表2及表4中所示。對於具有12個獨特VH序列之純系，隨後測定VL序列。用兩組獨特的LCDR3獲得兩個獨特的VL序列，如表3及表4中所示。
使用CDR區之Kabat系統對純系序列之進一步分析顯示純系F1/8/9/26/48/50/100/112/123/131/138具有相同之HCDR及LCDR，但具有不同的重鏈框架(HFR)及輕鏈框架(LFR)序列，如表5中所示。純系F40具有不同的HCDR及LCDR，並且具有不同的HFR及LFR，如表5中所示。
表1. 四輪淘洗之過程監測
輪 條件 輸入 輸出 富集因子
1 st 目標蛋白：200nM (~6ug/ml)人類FOLR1 封閉：2%M-PBS 洗滌：0.1% Tween20 PBST、9次 溶離：TEA 預計數器選擇：2% M-PBS 1.0×10 13 2.5×10 5 4.0×10 7
2 nd-陽性篩選 目標蛋白：200nM (~6ug/ml)人類FOLR1 封閉：2%M-PBS 洗滌：0.2% Tween20 PBST、9次 溶離：TEA 預計數器選擇：2% M-PBS 5.3×10 12 9.6×10 4 5.5×10 7
2 nd-陰性篩選 目標蛋白：無包被 封閉：2%M-PBS 洗滌：0.2% Tween20 PBST、9次 溶離：TEA 預計數器選擇：2% M-PBS 6.7×10 11 3.0×10 4 2.2×10 7
3 rd-陽性篩選 目標蛋白：200nM (~6ug/ml)人類FOLR1 封閉：2%M-PBS 洗滌：0.3 % Tween20 PBST、9次 溶離：TEA 預計數器選擇：2% M-PBS 5.3×10 12 3.0×10 7 1.8×10 5
3 rd-陰性篩選 目標蛋白：無包被 封閉：2%M-PBS 洗滌：0.3 % Tween20 PBST、9次 溶離：TEA 預計數器選擇：2% M-PBS 6.7×10 11 2.1×10 5 3.2×10 6
4 th-陽性篩選 目標蛋白：200nM (~6ug/ml)人類FOLR1 封閉：2%M-PBS 洗滌：0.4 % Tween20 PBST、9次 溶離：TEA 預計數器選擇：2% M-PBS 5.1×10 12 3.3×10 8 1.5×10 4
4 th-陰性篩選 目標蛋白：無包被 封閉：2%M-PBS 洗滌：0.4 % Tween20 PBST、9次 溶離：TEA 預計數器選擇：2% M-PBS 6.4×10 11 1.4×10 5 4.6×10 6
表2.VL分組及排序
純系 VL分組 HCDR3分組
F8,24 VH-1 HCDR3-A
F9 VH-2
F26 VH-3
F48 VH-4
F50 VH-5
F100 VH-6
F112 VH-7
F123 VH-8
F131、139 VH-9
F138 VH-10
F1,14,16,30,31,32,37,45,58,74,75,76,77,78,81,82,86,87,88, 89,92,93,95,96,97,98,99,103,105,106,108,111,113,114,115, 124,130,140,146,147,148,153,154,162,163,164,169,170 VH-11
F40 VH-12 HCDR3-B
表3.VL分組及排序
純系 VL分組 LCDR3分組
F1,8,9,26,48,50,100,112,123,131,138 VL-1 LCDR3-A
F40 VL-2 LCDR3-B
表4. 抗-FOLR-1抗體可變區序列
純系序列 VH VL
F1 EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPRAYYGAYGSSFDYWGQGTQVTVSS (SEQ 6) EIVMTQSPSSVSASVGDRVAITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIK (SEQ 7)
F8 EVQLLESGGGVVQHGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPRAYYGAYGSSFDYWGQGTQVTVSS (SEQ 8) EIVMTQSPSSVSASVGDRVAITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIK (SEQ 9)
F9 EVQLLESGGGVVQLGGPDSPVQPLDSPFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPRAYYGAYGSSFDYWGQGTQVTVSS (SEQ 10) EIVMTQSPSSVSASVGDRVAITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIK (SEQ 11)
F26 EVQLLESGGGVVQRGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLPMNSLRAEDTAVYYCARPRAYYGAYGSSFDYWGQGTQVTVSS (SEQ 12) EIVMTQSPSSVSASVGDRVAITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIK (SEQ 13)
F40 EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFIISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARPTYVFTYTGSSFDYWGQGTQVTVSS (SEQ 14) DIQVTQSPSSLSASLGDTVSITCRASRGLTDSVAWYQQKPGQAPKLLIYAASTLQSGVPSRFGGSGSGSYFTLTITSLQPEDVATYYCQNYKSAPWTFGQGTKVEIK (SEQ 15)
F48 EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLHMNSLRAEDTAVYYCARPRAYYGAYGSSFDYWGQGTQVTVSS (SEQ 16) EIVMTQSPSSVSASVGDRVAITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIK (SEQ 17)
F50 EVQLLESGGGVVQRGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPRAYYGAYGSSFDYWGQGTQVTVSS (SEQ 18) EIVMTQSPSSVSASVGDRVAITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIK (SEQ 19)
F100 EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRPNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPRAYYGAYGSSFDYWGQGTQVTVSS (SEQ 20) EIVMTQSPSSVSASVGDRVAITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIK (SEQ 21)
F112 EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRHNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPRAYYGAYGSSFDYWGQGTQVTVSS (SEQ 22) EIVMTQSPSSVSASVGDRVAITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIK (SEQ 23)
F123 EVQLLESGGGVVQPERSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRANSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPRAYYGAYGSSFDYWGQGTQVTVSS (SEQ 24) EIVMTQSPSSVSASVGDRVAITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIK (SEQ 25)
F131 EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRANSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPRAYYGAYGSSFDYWGQGTQVTVSS (SEQ 26) EIVMTQSPSSVSASVGDRVAITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIK (SEQ 27)
F138 EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISTHNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPRAYYGAYGSSFDYWGQGTQVTVSS (SEQ 28) EIVMTQSPSSVSASVGDRVAITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIK (SEQ 29)
表5. 本發明之抗FOLR-1抗體之CDR序列
純系序列 HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
F1 SYGMH (SEQ 30) VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ 31) PRAYYGAYGSSFDY (SEQ 32) RASQGISSWLA (SEQ 33) AASSLQS (SEQ 34) QQSYSTPLT (SEQ 35)
F8 SYGMH (SEQ 30) VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ 31) PRAYYGAYGSSFDY (SEQ 32) RASQGISSWLA (SEQ 33) AASSLQS (SEQ 34) QQSYSTPLT (SEQ 35)
F9 SYGMH (SEQ 30) VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ 31) PRAYYGAYGSSFDY (SEQ 32) RASQGISSWLA (SEQ 33) AASSLQS (SEQ 34) QQSYSTPLT (SEQ 35)
F26 SYGMH (SEQ 30) VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ 31) PRAYYGAYGSSFDY (SEQ 32) RASQGISSWLA (SEQ 33) AASSLQS (SEQ 34) QQSYSTPLT (SEQ 35)
F40 SYAMH (SEQ 36) VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ 31) PTYVFTYTGSSFDY (SEQ 37) RASRGLTDSVA (SEQ 38) AASTLQS (SEQ 39) QNYKSAPW (SEQ 40)
F48 SYGMH (SEQ 30) VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ 31) PRAYYGAYGSSFDY (SEQ 32) RASQGISSWLA (SEQ 33) AASSLQS (SEQ 34) QQSYSTPLT (SEQ 35)
F50 SYGMH (SEQ 30) VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ 31) PRAYYGAYGSSFDY (SEQ 32) RASQGISSWLA (SEQ 33) AASSLQS (SEQ 34) QQSYSTPLT (SEQ 35)
F100 SYGMH (SEQ 30) VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ 31) PRAYYGAYGSSFDY (SEQ 32) RASQGISSWLA (SEQ 33) AASSLQS (SEQ 34) QQSYSTPLT (SEQ 35)
F112 SYGMH (SEQ 30) VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ 31) PRAYYGAYGSSFDY (SEQ 32) RASQGISSWLA (SEQ 33) AASSLQS (SEQ 34) QQSYSTPLT (SEQ 35)
F123 SYGMH (SEQ 30) VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ 31) PRAYYGAYGSSFDY (SEQ 32) RASQGISSWLA (SEQ 33) AASSLQS (SEQ 34) QQSYSTPLT (SEQ 35)
F131 SYGMH (SEQ 30) VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ 31) PRAYYGAYGSSFDY (SEQ 32) RASQGISSWLA (SEQ 33) AASSLQS (SEQ 34) QQSYSTPLT (SEQ 35)
F138 SYGMH (SEQ 30) VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ 31) PRAYYGAYGSSFDY (SEQ 32) RASQGISSWLA (SEQ 33) AASSLQS (SEQ 34) QQSYSTPLT (SEQ 35)
實例68. 由HEK293細胞產生之抗體之驗證 在獲得抗體純系之序列之後(如上所描述)，使用抗體純系之完整IgG分子進行進一步分析。首先，在48孔或96孔微孔板中進行具有IgG1 Fc之全長抗體分子之表現，收集上清液用於偵測表現量及抗原或細胞結合能力。
68.1 抗體在48或96孔板中之表現。 將編碼抗體F1、F8、F26、F40、F48、F50、F100、F112、F123、F131及F138之重鏈及輕鏈之cDNA序列構築至載體pTT5中。收集HEK293細胞，調整細胞密度至1 × 10 6/ml，並以200或400 μL/孔接種於48/96-孔細胞培養板，置於5% CO 2之37℃培養箱中以備後用。為了在96孔板中轉染，將0.5 μg質體稀釋在20μL OPTI培養基中，混合均勻，將2.5 μL轉染劑DT1 (質體:T1 = 1:5)稀釋在20μL OPTI培養基中，混合均勻，在室溫下培育5分鐘。將轉染劑DT1稀釋液添加至DNA中，充分混合，並在室溫下培育30分鐘。在培育期間形成轉染複合物。將轉染複合物添加至細胞中，充分混合，並在37℃下在5% CO 2培養箱中培育48小時。當在48孔板中轉染時，質體及轉染劑之量加倍。在轉染後之第二天，收集上清液，用ELISA或FACS偵測抗體生物活性。
68.2 IgG表現量。 藉由標準ELISA測試96孔中之抗體表現量。簡而言之，將抗人類IgG Fc抗體(Sigma，18885-2ML)用pH 9.6之碳酸包被溶液稀釋至5 μg/ml，並在4℃下將100 μL包被在96孔微量滴定盤之各孔中，隔夜。棄去孔內液體，用PBST洗滌孔三次，用4%脫脂奶粉-PBS (Sigma，D5652-1L)封閉，每孔300 μL，並在37℃下培育1小時。棄去孔內液體，隨後用PBS洗滌孔三次。利用100 μ L/孔將樣品添加至96孔微量滴定盤中。向對照組添加PBS。將板在37℃下培育1小時，隨後棄去液體，並用PBST洗滌孔三次。利用100 μL/孔添加HRP-山羊抗人類IgG (Sigma，I18885-2ML) (1:5000稀釋)，並將板在37℃下培育1小時。隨後棄去孔內液體，以及用PBST洗滌板五次。利用100 μL/孔添加TMB溶液。隨後向各孔中添加2M H 2SO 4，各孔使用50 μL以在10～15分鐘後終止反應。使用酶標儀讀取A450值。結果顯示在表6中。除純系F50之外，所有抗體均具有正常表現。
68.3 與人類及獼猴FOLR1蛋白結合之抗體。 藉由標準ELISA測試抗體與人類FOLR1蛋白結合或與獼猴FOLR1蛋白交叉結合的能力。簡而言之，將具有His標籤之人類FOLR1 (ACRO-FO1-H52H1)或獼猴FOLR1蛋白(ACRO，F01-C52H8)用pH 9.6之碳酸包被溶液稀釋至5 μg/ml，並在4℃下將100 μL抗原包被在96孔微量滴定盤之各孔中，隔夜。棄去孔內液體，以及用PBST洗滌孔三次。隨後用4%脫脂奶粉-PBS (Sigma，D5652-1L)利用300 μL/孔封閉孔，並將板在37℃下培育1小時。棄去孔內液體，以及用PBS洗滌孔三次。利用100 μL/孔添加樣品；向對照組添加PBS。將板在37℃下培育1小時。棄去孔內液體，以及用PBST洗滌孔三次。添加HRP-山羊抗人類IgG (Sigma，I18885-2ML) (1:5000稀釋，100 μL/孔)，並將板在37℃下培育1小時。隨後棄去孔內液體，以及用PBST洗滌孔五次。利用100 μL/孔添加TMB溶液。使用50 μL向各孔中添加2M H 2SO 4，以在10～15分鐘後終止反應。使用酶標儀讀取A450值。
表6示出了IgG在微量滴定盤中之表現量及與人類FOLR1蛋白之結合。除純系F50之外，所有抗體均與人類FOLR1蛋白正常結合。
抗-FOLR1抗體與獼猴FOLR1蛋白交叉結合之結果示於表7中。除純系F50之外，所有抗體均與獼猴FOLR1蛋白具有良好之交叉結合。
68.4 與表現高FOLR1之腫瘤細胞株結合的抗體。 使用轉染上清液藉由流式細胞術測試抗體與Hela細胞(ATCC® CCL-2，由COBIOER提供)及RPTEC/TERT1細胞(ATCC® CRL-4031，由COBIOER提供)之結合活性。簡而言之，用0.02% EDTA-2Na消化目標細胞，以1500 rpm離心3分鐘，並用PBS重懸。計數後，將細胞以每管1 × 10 6個細胞添加至1.5 ml離心管中，以1500 rpm離心5分鐘，棄去上清液。隨後在冰浴上進行所有操作。向各1.5 ml離心管中添加100 μL之轉染上清液。將空白細胞、空白細胞加二級抗體、培養基及HEK293上清液設為對照。反應在冰浴上進行1小時。隨後將細胞成團並用PBS洗滌兩次。稀釋(1:200)二級抗體山羊抗-人類IgG (PE，abcam，ab98596)，每管添加100 μL。反應在黑暗中在冰浴上進行1小時。將細胞再次成團並用PBS洗滌兩次，重懸於300 μL PBS中，並藉由細胞計量術量測FL2螢光讀數。藉由FlowJoTM10軟體分析結果。
抗-FOLR1抗體與Hela細胞結合之結果示於圖6中。結果表明純系F50對Hela細胞結合呈陰性。純系F40及F138對Hela細胞結合呈弱陽性。其餘八個純系對Hela細胞結合呈陽性。
抗-FOLR1抗體與RPTEC/TERT1細胞結合之結果示於圖7中。結果表明純系F50對RPTEC/TERT1細胞結合呈陰性。純系F138對RPTEC/TERT1細胞結合呈弱陽性。剩餘之 9 個純系對 RPTEC/TERT1 細胞結合呈陽性。 表6. 抗體含量及與人類FOLR1蛋白結合之比較
樣品 OD450值
目標結合，用人類FOLR1蛋白包被 IgG含量，包被抗-人類IgG Fc 目標結合/IgG含量
F40 2.3860 2.3350 1.022
F123 2.3160 2.1930 1.056
F1 2.4330 2.2540 1.079
F8 2.4540 2.1900 1.121
F131 2.3470 2.3090 1.016
F50 0.1300 0.4930 0.264
F112 2.3530 2.1010 1.120
F48 2.5450 2.2740 1.119
F26 2.4310 2.0100 1.209
F100 2.2980 1.5550 1.478
F138 2.4080 2.0060 1.200
培養基 0.0920 0.1050 0.876
PBS 0.0920 0.1430 0.643
表7. 與獼猴FOLR1蛋白抗體交叉結合能力之比較
樣品 OD450
目標：人類FOLR1蛋白質His標籤 目標：獼猴FOLR1、蛋白質、His標籤
稀釋1倍 稀釋5倍 稀釋25倍 稀釋1倍 稀釋5倍 稀釋25倍
F40 0.811 0.382 0.163 1.354 1.111 0.924
F123 1.715 1.468 1.328 1.363 1.301 1.074
F1 1.660 1.445 1.177 1.384 1.256 0.994
F8 1.672 1.645 1.315 0.896 1.285 1.059
F131 1.609 1.522 1.384 1.203 1.270 1.088
F50 0.094 0.129 0.098 0.093 0.107 0.066
F112 1.556 1.421 1.174 1.257 1.212 0.933
F48 1.557 1.590 1.290 1.148 1.040 0.908
F26 1.638 1.515 1.475 1.237 1.207 1.018
F100 1.609 1.528 1.180 1.163 1.034 0.875
F138 1.636 1.692 0.827 1.140 1.142 1.173
培養基 0.085 0.092 0.081 0.170 0.151 0.096
PBS 0.082 0.081
實例69. 搖瓶中由HEK293細胞表現產生之抗-人類FOLR1抗體之表徵 藉由在懸浮細胞中表現抗體獲得足夠量之蛋白質，定量研究抗-FOLR1抗體之結合。將質體轉染至懸浮細胞中進行表現。收集上清液進行抗體純化。使用高純度抗體，以定量偵測抗體與具有高FOLR1蛋白量之腫瘤細胞之結合及內化。
69.1 抗體表現及純化。 將編碼抗體F8、F26、F40、F48、F100、F112、F123及F131之質體轉染至HEK293細胞中。簡而言之，收集HEK293細胞，調整細胞密度至1 × 10 6/ml並在125 mL搖瓶中在5% CO 2之37℃搖床上用30 mL培養基培養以備後用。轉染時，將30 μg質體稀釋在1500 μl KPM培養基中，混合均勻，並將150 μL轉染劑T1 (質體:T1 = 1:5)稀釋在1500 μl KPM培養基中，混合均勻，並在室溫下培育5分鐘。將轉染劑T1稀釋液添加至DNA中，充分混合，並在室溫下培育30分鐘以形成轉染複合物。將轉染複合物添加至細胞中，充分混合，並在37℃下在5% CO 2搖床中培育48小時。24小時後添加TN1溶液至最終濃度為0.5%。在轉染後第六天，收集上清液並純化。
使用蛋白A或蛋白G藉由標準方法進行抗體純化。簡而言之，各上清液藉由0.22 μm濾膜過濾，並上樣至用結合緩衝液(PB，pH7.2)平衡之柱上。用結合緩衝液洗滌柱直至獲得穩定基線，其中在280 nm處無吸光度。用含有0.15M NaCl，pH3.4之0.1M檸檬酸緩衝液溶離抗體，流速為1 ml/min。收集約1.5~3.5 ml之級分並藉由添加10%體積之1M Tris-HCl，pH9.0進行中和。隨後將抗體樣品針對1xPBS透析隔夜兩次並藉由0.2 μm濾膜過濾滅菌。使用12% SDS-PAGE測試純度。
表現量及純化結果示於表8中。抗體F8、F26及F131具有較高之表現量，而抗體F100具有最低之表現量。所有抗體均具有高純度(資料未示出)。 表8. 抗體表現量之比較
宿主細胞 純系 濃度(ug/ml) 體積(ml) 定量(mg)
HEK293 F8 387.6 4.00 1.55
HEK293 F26 396.6 3.50 1.39
HEK293 F40 182.1 4.01 0.73
HEK293 F48 131.1 2.97 0.39
HEK293 F100 60.6 1.98 0.12
HEK293 F112 129.6 4.01 0.52
HEK293 F123 171.6 2.97 0.51
HEK293 F131 359.1 3.51 1.26
69.2 與具有高FOLR1含量之腫瘤細胞株結合之抗體。 藉由FACS測試抗-FOLR1抗體與Hela及RPTEC/TERT1細胞之結合。如以上所描述進行研究。在圖8及圖9中示出結果。所有抗體以劑量依賴性方式結合Hela及RPTEC/TERT1細胞。
69.3 內化率表徵。 使用pHAb測定測試抗-FOLR1抗體F8、F26、F40、F48、F100、F112、F123及F131內化至表現FOLR-1之腫瘤細胞株Hela及RPTEC/TERT1的能力，其中抗體用pHAb螢光染料標記。根據套組中之說明進行抗體標記。具體地，將50 μL磁珠添加至1.5 ml EP管中。將EP管置放在磁性架上10秒，移除磁珠上之保護溶液。用250 μL PB洗滌每管磁珠，並將100 μg抗體添加至磁珠之各管中(緩衝系統：檸檬酸/Tris-HCl鈉(pH6.0))。用PB將體積補足至1 ml，並且將反應溶液混合並在室溫下旋轉1小時。隨後用250 μL PB洗滌磁珠，用250 μL NaHCO 3平衡。將100 μL NaHCO 3及1.2 μL製備之pHAb染料(在使用前製備)添加至各管中，並將反應物在黑暗中置放1小時。用250 μL PB洗滌各管兩次。在室溫下使用100 μL將50 mM甘胺酸添加至各管中5分鐘，隨後溶離標記之抗體。隨後向溶離物中添加2M Tris緩衝液進行中和。將最終之標記抗體儲存在黑暗中以備後用。
Hela或RPTEC/TERT1細胞以15,000個細胞/孔接種100 μL並在5% CO 2培養箱中在37℃下培養20至24小時。將pHAb-標記之測試抗體以10 μg/ml之濃度添加至孔中。隨後分別在0小時、1小時、4小時、6小時及23小時時，在具有520 nm之激發波長及570 nm之吸收波長之Thermo VARIOSKAN FLASH上讀板。
結果示於圖10及圖11中。所有測試之抗-FOLR1抗體在表現FOLR1之Hela及RPTEC/TERT1細胞中均顯示出pHAb螢光之時間依賴性增加。該結果表明每種抗體均內化至Hela及RPTEC/TERT1細胞中，其中抗體F8及F131具有最強之內化率。
實例70. 抗-FOLR-1免疫結合物之表徵 進行作為免疫結合物之抗-FOLR-1抗體之進一步表徵。
70.1    參考抗體及抗體F8、F26及F131之表現 使用ImmunoGen Inc.之抗-FOLR-1抗體米妥昔單抗(huFR107)作為對照。huFR107之VH及VL區之胺基酸序列得自美國專利號8,557,966 (分別為SEQ ID NO：36及37)，並進行密碼子最佳化。在載體pcDNA3.4中構築編碼huFR107及編碼抗體F8、F26及F131之最佳化cDNA。隨後使用標準ExpiFectamine CHO轉染程式(Gibco，A29129)在錐形瓶中將質體瞬時轉染至ExpiCHO-S細胞中。將懸浮之瞬時轉染物培育10天，隨後藉由蛋白A柱純化澄清之上清液，隨後如上所描述進行SDS-PAGE。
70.2 抗-FOLR-1免疫結合物之製備 藉由添加0.5M磷酸氫二鈉將抗體溶液之pH調節在pH7.0~7.5之範圍內。添加指定量之0.5M EDTA以在抗體溶液中達到5 mM之最終EDTA濃度。添加指定量之10 mM TCEP (三(2-氯乙基)磷酸酯)溶液以實現所需之TCEP/mAb莫耳比。還原反應置於室溫下90分鐘。隨後添加DMSO以達到10% v/v。將藥物-連接子mc-VC-PAB-MMAE溶解在DMSO中以實現10 mM之最終濃度，並且與可獲得之半胱胺酸硫醇之莫耳數相比，以30%至50%之莫耳過量將指定量添加至反應溶液中。結合反應置於室溫下30分鐘。添加NAC (N-乙醯基-L-半胱胺酸)儲備溶液以獲得5之NAC/Mc-VC-PAB-MMAE莫耳比。淬滅反應置於室溫下15分鐘。藉由PD10柱進行純化。
使用Waters HPLC E2695&2489系統在TSK凝膠G3000SWXL，7.8x300 mm管柱(Tosoh Bioscience)上用尺寸排阻層析法(SEC)評價抗-FOLR-1免疫結合物之純度。在25℃下使用50 mM Na 2PO4 (pH6.7)及10% IPA之流動相進行操作，以0.8 mL/min之流速運行20分鐘。參考表9，所有四個ADC均具有高純度。
使用Waters HPLC E2695&2489系統，在疏水作用TosoHaas TSK凝膠丁基-NPR管柱(4.6 mm ID × 3.5 cm，粒徑2.5μm)上，用疏水作用層析法(HIC)評價抗-FOLR-1免疫結合物之疏水性。簡而言之，HPLC系統在25℃下運行，流動相A：50 mM Na 2PO 4/1.5 M (NH 4) 2SO 4pH 7.0，及流動相B：50 mM Na 2PO 4/25% IPA，pH 7.0。將流動相藉由0.22 μm濾膜(Millipore)過濾，以0.5 mL之流速運行30分鐘。線性梯度之參數示於表10中。根據HIC資料測定抗-FOLR-1免疫結合物之DAR (藥物抗體比率)，並且在3～4之範圍內(資料未示出)。 表9. 抗-FOLR1免疫結合物之純度
   F8-ADC F26-ADC F131-ADC FR107-ADC
純度(%) 98% 100% 100% 100%
表10. 線性梯度之過程
時間/分鐘 B/100%
0.0 0
12.0 100
12.1 0
18.0 0
實例71. 藉由BLI測試F131及F131-LD038對FOLR家族蛋白之親和力資料 由連接至His標籤之FOLR家族蛋白之胞外域組成的重組蛋白係購買的(來自ACRO系統)或內部合成的。為了藉由生物層干涉法(BLI)進行結合研究，將F131 (以16.67 nM)固定在抗-人類IgG Fc生物感測器尖端(Fortebio)上。使用Octet RED (Fortebio)進行利用不同濃度(自500 nM降至7.8 nM)之重組抗原蛋白溶液之結合測定。締合時間設定為180秒，並且解離時間設定為300秒。使用ForteBio Data Acquisition 6.3軟體(ForteBio)計算結合親和力，並且藉由利用全局擬合演算法將動力學資料擬合至1:1朗繆爾結合模型來導出親和力。F131對人類FOLR1顯示出高親和力，而對人類FOLR2具有低回應，並且對人類FOLR3無回應，證明了F131之結合特異性(表11)。F131表明對人類及獼猴FOLR1之高結合親和力，平衡解離常數(KD)分別為1.5及8.1 nM。F131顯示對大鼠FOLR1無交叉反應性，並且對小鼠FOLR1具有低交叉反應性(KD = 2.9 μM)。 表11. 藉由BLI測試F131及F131-LD038對FOLR家族蛋白之親和力資料
Ag 上樣樣品ID 上樣濃度(ug/ml) 濃度(nM) 回應 KD (M) ka (1/Ms) kdis (1/s) Full R^2
Hu-FRα F131 mAb 2.5 500. 0.1924 5.296E-09 2.261E05 1.198E-03 0.9978
Hu-FRα F131-LD038 2.5 500. 0.2224 4.792E-09 2.519E05 1.207E-03 0.9977
Hu-FRα F131 mAb 2.5 250. 0.1782 5.296E-09 2.261E05 1.198E-03 0.9978
Hu-FRα F131-LD038 2.5 250. 0.2008 4.792E-09 2.519E05 1.207E-03 0.9977
Hu-FRα F131 mAb 2.5 125. 0.1444 5.296E-09 2.261E05 1.198E-03 0.9978
Hu-FRα F131-LD038 2.5 125. 0.176 4.792E-09 2.519E05 1.207E-03 0.9977
Hu-FRα F131 mAb 2.5 62.5 0.1172 5.296E-09 2.261E05 1.198E-03 0.9978
Hu-FRα F131-LD038 2.5 62.5 0.1378 4.792E-09 2.519E05 1.207E-03 0.9977
Hu-FRα F131 mAb 2.5 31.3 0.0766 5.296E-09 2.261E05 1.198E-03 0.9978
Hu-FRα F131-LD038 2.5 31.3 0.092 4.792E-09 2.519E05 1.207E-03 0.9977
Hu-FRα F131 mAb 2.5 15.6 0.0447 5.296E-09 2.261E05 1.198E-03 0.9978
Hu-FRα F131-LD038 2.5 15.6 0.0564 4.792E-09 2.519E05 1.207E-03 0.9977
Hu-FRα F131 mAb 2.5 7.82 0.0259 5.296E-09 2.261E05 1.198E-03 0.9978
Hu-FRα F131-LD038 2.5 7.82 0.0267 4.792E-09 2.519E05 1.207E-03 0.9977
Hu-FRb F131 mAb 2.5 500. 0.037 1.420E-07 5.524E05 7.843E-02 0.9083
Hu-FRb F131-LD038 2.5 500. 0.0427 8.442E-08 9.631E05 8.130E-02 0.9153
Hu-FRb F131 mAb 2.5 250. 0.0207 1.420E-07 5.524E05 7.843E-02 0.9083
Hu-FRb F131-LD038 2.5 250. 0.0243 8.442E-08 9.631E05 8.130E-02 0.9153
Hu-FRb F131 mAb 2.5 125. 0.0188 1.420E-07 5.524E05 7.843E-02 0.9083
Hu-FRb F131-LD038 2.5 125. 0.0161 8.442E-08 9.631E05 8.130E-02 0.9153
Hu-FRb F131 mAb 2.5 62.5 0.0356 1.420E-07 5.524E05 7.843E-02 0.9083
Hu-FRb F131-LD038 2.5 62.5 0.0379 8.442E-08 9.631E05 8.130E-02 0.9153
Hu-FRb F131 mAb 2.5 31.3 *0.0068 1.420E-07 5.524E05 7.843E-02 0.9083
Hu-FRb F131-LD038 2.5 31.3 *0.0076 8.442E-08 9.631E05 8.130E-02 0.9153
Hu-FRb F131 mAb 2.5 15.6 *0.002 1.420E-07 5.524E05 7.843E-02 0.9083
Hu-FRb F131-LD038 2.5 15.6 *0.0041 8.442E-08 9.631E05 8.130E-02 0.9153
Hu-FRb F131 mAb 2.5 7.82 *0.0011 1.420E-07 5.524E05 7.843E-02 0.9083
Hu-FRb F131-LD038 2.5 7.82 *0.002 8.442E-08 9.631E05 8.130E-02 0.9153
Hu-FRg F131 mAb 2.5 500. *0.0024 1.306E-04 1.663E03 2.173E-01 0.1554
Hu-FRg F131-LD038 2.5 500. *0.0096 3.284E-11 7.096E09 2.330E-01 0.7567
Hu-FRg F131 mAb 2.5 250. *0.0003 1.306E-04 1.663E03 2.173E-01 0.1554
Hu-FRg F131-LD038 2.5 250. *0.0051 3.284E-11 7.096E09 2.330E-01 0.7567
Hu-FRg F131 mAb 2.5 125. *0.0051 1.306E-04 1.663E03 2.173E-01 0.1554
Hu-FRg F131-LD038 2.5 125. *0.009 3.284E-11 7.096E09 2.330E-01 0.7567
Hu-FRg F131 mAb 2.5 62.5 *-2.028E-03 1.306E-04 1.663E03 2.173E-01 0.1554
Hu-FRg F131-LD038 2.5 62.5 *0.007 3.284E-11 7.096E09 2.330E-01 0.7567
Hu-FRg F131 mAb 2.5 31.3 *0.0028 1.306E-04 1.663E03 2.173E-01 0.1554
Hu-FRg F131-LD038 2.5 31.3 *0.0079 3.284E-11 7.096E09 2.330E-01 0.7567
Hu-FRg F131 mAb 2.5 15.6 *-2.611E-03 1.306E-04 1.663E03 2.173E-01 0.1554
Hu-FRg F131-LD038 2.5 15.6 *0.0084 3.284E-11 7.096E09 2.330E-01 0.7567
Hu-FRg F131 mAb 2.5 7.82 *1.025E-03 1.306E-04 1.663E03 2.173E-01 0.1554
Hu-FRg F131-LD038 2.5 7.82 *0.0004 3.284E-11 7.096E09 2.330E-01 0.7567
*低於定量範圍之回應 表12. 藉由BLI測試F131及F131-LD038對物質FOLRα蛋白之親和力資料
Ag 上樣樣品ID 上樣濃度(ug/ml) 濃度(nM) 回應 KD (M) ka (1/Ms) kdis (1/s) Full R^2
Hu-Ag F131 mAb 2.5 500. 0.181 1.528E-09 2.210E05 3.377E-04 0.9875
Hu-Ag F131-LD038 2.5 500. 0.2049 4.801E-09 2.236E05 1.073E-03 0.9488
Hu-Ag F131 mAb 2.5 250. 0.1617 1.528E-09 2.210E05 3.377E-04 0.9875
Hu-Ag F131-LD038 2.5 250. 0.1843 4.801E-09 2.236E05 1.073E-03 0.9488
Hu-Ag F131 mAb 2.5 125. 0.1458 1.528E-09 2.210E05 3.377E-04 0.9875
Hu-Ag F131-LD038 2.5 125. 0.1577 4.801E-09 2.236E05 1.073E-03 0.9488
Hu-Ag F131 mAb 2.5 62.5 0.1202 1.528E-09 2.210E05 3.377E-04 0.9875
Hu-Ag F131-LD038 2.5 62.5 0.1292 4.801E-09 2.236E05 1.073E-03 0.9488
Hu-Ag F131 mAb 2.5 31.3 0.0869 1.528E-09 2.210E05 3.377E-04 0.9875
Hu-Ag F131-LD038 2.5 31.3 0.0866 4.801E-09 2.236E05 1.073E-03 0.9488
Hu-Ag F131 mAb 2.5 15.6 0.0503 1.528E-09 2.210E05 3.377E-04 0.9875
Hu-Ag F131-LD038 2.5 15.6 0.0447 4.801E-09 2.236E05 1.073E-03 0.9488
Hu-Ag F131 mAb 2.5 7.82 0.04 1.528E-09 2.210E05 3.377E-04 0.9875
Hu-Ag F131-LD038 2.5 7.82 0.0342 4.801E-09 2.236E05 1.073E-03 0.9488
Cyno-Ag F131 mAb 2.5 500. 0.2191 8.148E-09 1.929E05 1.572E-03 0.9864
Cyno-Ag F131-LD038 2.5 500. 0.1858 8.823E-09 1.810E05 1.597E-03 0.993
Cyno-Ag F131 mAb 2.5 250. 0.209 8.148E-09 1.929E05 1.572E-03 0.9864
Cyno-Ag F131-LD038 2.5 250. 0.1799 8.823E-09 1.810E05 1.597E-03 0.993
Cyno-Ag F131 mAb 2.5 125. 0.1775 8.148E-09 1.929E05 1.572E-03 0.9864
Cyno-Ag F131-LD038 2.5 125. 0.152 8.823E-09 1.810E05 1.597E-03 0.993
Cyno-Ag F131 mAb 2.5 62.5 0.14 8.148E-09 1.929E05 1.572E-03 0.9864
Cyno-Ag F131-LD038 2.5 62.5 0.1211 8.823E-09 1.810E05 1.597E-03 0.993
Cyno-Ag F131 mAb 2.5 31.3 0.084 8.148E-09 1.929E05 1.572E-03 0.9864
Cyno-Ag F131-LD038 2.5 31.3 0.0702 8.823E-09 1.810E05 1.597E-03 0.993
Cyno-Ag F131 mAb 2.5 15.6 0.0485 8.148E-09 1.929E05 1.572E-03 0.9864
Cyno-Ag F131-LD038 2.5 15.6 0.0384 8.823E-09 1.810E05 1.597E-03 0.993
Cyno-Ag F131 mAb 2.5 7.82 0.0537 8.148E-09 1.929E05 1.572E-03 0.9864
Cyno-Ag F131-LD038 2.5 7.82 0.0225 8.823E-09 1.810E05 1.597E-03 0.993
Rat-Ag F131 mAb 2.5 500. *0.0037 1.874E-04 5.494E03 1.030E00   
Rat-Ag F131-LD038 2.5 500. *0.0036 8.481E-08 2.635E06 2.235E-01   
Rat-Ag F131 mAb 2.5 250. *-9.448E-04 1.874E-04 5.494E03 1.030E00   
Rat-Ag F131-LD038 2.5 250. *-1.028E-03 8.481E-08 2.635E06 2.235E-01   
Rat-Ag F131 mAb 2.5 125. *-4.774E-03 1.874E-04 5.494E03 1.030E00   
Rat-Ag F131-LD038 2.5 125. *0.0007 8.481E-08 2.635E06 2.235E-01   
Rat-Ag F131 mAb 2.5 62.5 *-6.060E-03 1.874E-04 5.494E03 1.030E00   
Rat-Ag F131-LD038 2.5 62.5 *-3.930E-03 8.481E-08 2.635E06 2.235E-01   
Rat-Ag F131 mAb 2.5 31.3 *-5.315E-03 1.874E-04 5.494E03 1.030E00   
Rat-Ag F131-LD038 2.5 31.3 *-4.536E-03 8.481E-08 2.635E06 2.235E-01   
Rat-Ag F131 mAb 2.5 15.6 *-3.949E-03 1.874E-04 5.494E03 1.030E00   
Rat-Ag F131-LD038 2.5 15.6 *-2.122E-03 8.481E-08 2.635E06 2.235E-01   
Rat-Ag F131 mAb 2.5 7.82 *-5.629E-03 1.874E-04 5.494E03 1.030E00   
Rat-Ag F131-LD038 2.5 7.82 *-4.383E-03 8.481E-08 2.635E06 2.235E-01   
小鼠-Ag F131 mAb 2.5 500. 0.0167 2.957E-06 1.019E05 3.012E-01 0.6807
小鼠-Ag F131-LD038 2.5 500. 0.0125 2.872E-06 9.263E04 2.660E-01 0.4778
小鼠-Ag F131 mAb 2.5 250. *0.008 2.957E-06 1.019E05 3.012E-01 0.6807
小鼠-Ag F131-LD038 2.5 250. *0.0013 2.872E-06 9.263E04 2.660E-01 0.4778
小鼠-Ag F131 mAb 2.5 125. *-5.791E-04 2.957E-06 1.019E05 3.012E-01 0.6807
小鼠-Ag F131-LD038 2.5 125. *0.0008 2.872E-06 9.263E04 2.660E-01 0.4778
小鼠-Ag F131 mAb 2.5 62.5 *-1.782E-03 2.957E-06 1.019E05 3.012E-01 0.6807
小鼠-Ag F131-LD038 2.5 62.5 *-2.420E-04 2.872E-06 9.263E04 2.660E-01 0.4778
小鼠-Ag F131 mAb 2.5 31.3 *-2.515E-03 2.957E-06 1.019E05 3.012E-01 0.6807
小鼠-Ag F131-LD038 2.5 31.3 *-1.320E-03 2.872E-06 9.263E04 2.660E-01 0.4778
小鼠-Ag F131 mAb 2.5 15.6 *-5.099E-03 2.957E-06 1.019E05 3.012E-01 0.6807
小鼠-Ag F131-LD038 2.5 15.6 *-3.244E-03 2.872E-06 9.263E04 2.660E-01 0.4778
小鼠-Ag F131 mAb 2.5 7.82 *0.0027 2.957E-06 1.019E05 3.012E-01 0.6807
小鼠-Ag F131-LD038 2.5 7.82 *-4.834E-03 2.872E-06 9.263E04 2.660E-01 0.4778
*低於定量範圍之回應
實例72. 腫瘤細胞株中之F131及F131-LD038內化 內化測定以時序進行。將3 × 10 5個細胞與10 μg/ml之F131或F131-LD038之FACS緩衝液(含有0.1% BSA之1 × PBS)在4℃下培育30分鐘。將細胞在4℃下洗滌以移除未結合之材料並根據需要保持在冰上或轉移至37℃。在漸進時間點(0、0.5、1、2、3、4小時)，細胞用PE-結合之抗-人Fc在4℃下染色30分鐘，並藉由流式細胞術分析。藉由自在時間0時在4℃下細胞表面結合抗體之平均螢光強度(MFI)減去在各時間點時在37℃下細胞表面結合抗體之MFI，隨後除以在時間0時在4℃下細胞表面結合抗體之MFI來計算內化率。
F131及F131-LD038在多個表現FOLRα之細胞株(OVCAR3、KB、JEG-3、NCI-H441)上顯示出快速內化，而在非表現FOLRα之細胞(PC-3，對照)上未觀測到內化(圖12A及圖12B)。
實例73. F131及F131-LD038在三種選擇細胞株中之細胞毒性 在添加測試製品(F131或F131-LD038或依喜替康)前一天，收集細胞並鋪板至96-孔純白色平底板中。第二天，將細胞暴露於濃度為2000至0.305 nM之F131及F131-LD038或100 nM至1 μM之依喜替康之測試製品。將板在37℃下培育96小時。隨後，將每孔40 μl Cell-titre Glo (CTG)添加至板中，在5分鐘後收集螢光素酶讀數，並藉由酶標儀分析。將所有讀數歸一化為未處理之對照孔中活細胞之百分比，並藉由Prism軟體計算IC50值。
F131-LD038對表現FOLRα之KB、OVCAR3及JEG-3細胞產生強之細胞毒性，而裸抗體F131對此等目標腫瘤細胞無細胞毒性。F131-LD038之有效載荷(依喜替康)在對此等細胞之細胞毒性作用中似乎比F131-LD038更有效(圖13A至圖13C)。
實例74. F131-LD038在CDX中之體內功效 在具有一系列目標表現量之細胞株(例如NCI-H441、HCC827、OVCAR3、KB及OV90)中評價F131-LD038 ADC之體內抗腫瘤活性(圖14A至圖14E)。
NCI-H441 (ATCC，HTB-174，NSCLC，47×10 3複製/細胞)腫瘤模型藉由注射懸浮在Matrigel/培養基(1:1)中之5×10 6個細胞來建立；HCC827 (ATCC，Cat # CRL-2868™，NSCLC，41×10 3個複製/細胞)腫瘤模型藉由注射懸浮在Matrigel/培養基(1:1)中之4×10 6個細胞來建立；OVCAR3 (ATCC，HTB-161，卵巢，290×10 3複製/細胞)腫瘤模型藉由注射懸浮在Matrigel/培養基(1:1)中之1×10 7個細胞來建立；KB (Co-bioer，口腔上皮，341*10 3複製/細胞)腫瘤模型藉由注射懸浮在0.1 mL培養基中之1×10 7個細胞來建立；OV90 (Truway-bio，卵巢，0.38 *10 3複製/細胞)腫瘤模型藉由注射懸浮在Matrigel/培養基(1:1)中之2×10 6個細胞來建立。
在腫瘤接種後6至26天，選擇平均腫瘤大小為110至180 mm 3之小鼠，並根據其腫瘤體積使用分層隨機化將各模型分為2組或3組(每組n = 6-9)。在隨機化(隨機化日定義為D0)後一天開始治療，並且採用單劑量(在第1天)或多劑量(在第1天/第4天/第8天/第11天)方案，藉由靜脈內注射5 mg/kg之F131-LD038。
使用卡尺在兩個維度上每週兩次量測腫瘤大小及體重，並且使用以下公式以mm 3表示體積：V = 0.5a x b 2，其中a及b分別為腫瘤之長徑及短徑。腫瘤體積超過2000 mm 3被定義為實驗結束。監測動物體重作為耐受性之間接量度。在任何治療組中都無小鼠顯示顯著之體重減輕。在治療期間無發病率及死亡。
與媒介物對照組相比，在NCI-H441、HCC827、OVCAR3、KB腫瘤模型中，用單劑量及多劑量之F131-LD038之所有治療組均產生顯著之抗腫瘤活性，而在OV90腫瘤模型中，F131-LD038表現出中等至弱之抗腫瘤活性，在OV90腫瘤模型中，目標密度低於其他腫瘤。
藉由QIFKIT (DAKO，K0078)測試目標拷貝數。簡而言之，用針對目標抗原之初級小鼠單株抗體標記細胞。隨後用螢光素結合之抗小鼠二級抗體平行標記套組之細胞、設置珠及校準珠。螢光與在細胞及珠粒上結合之一級抗體分子之數量相關。隨後在流式細胞儀上分析樣品，並基於自校準曲線得到的方程計算拷貝數(表13)。 表13
細胞株 腫瘤類型 複製數
OVCAR-3 卵巢 290291
KB 口腔上皮 341364
HCC827 NSCLC 40919
NCI-H441 NSCLC 46889
OV90 卵巢 380
實例75. F131-LD038及其他F131-結合物之體內效力 75.1 F131-LD100、F131-LD111、F131-LD101、F131-LD110之產生： F131-LD100將在含有5 mM EDTA之50 mM磷酸鈉緩衝液(pH = 6.9)中之2 mL之抗體(10 mg/mL)添加至10 mM TCEP HCl (三(2-羧乙基)膦HCl)之水溶液中，TCEP與mAb之莫耳比為8.0。還原反應在25℃下進行2小時。藉由用pH = 6.9之50 mM磷酸鈉緩衝液超濾移除過量之TCEP及其副產物。將藥物連接子LD100 (TFA之鹽)以20 mg/mL之濃度溶解在水中並以8.5 (LD100/ mAb)之莫耳比添加至還原的mAb中。將結合反應在25℃下攪拌2小時。用50 mM磷酸鈉緩衝液藉由超濾移除過量之LD100及其雜質。將ADC儲存在20 mM組胺酸緩衝液中，該緩衝液含有6%蔗糖及0.02% (w/V) Tween 20 (由UFDF製造)。藉由SEC-HPLC判定之ADC純度為97.1%，並且藉由LC-MS判定之DAR值為7.9。
F131-LD111將在含有5 mM EDTA之50 mM磷酸鈉緩衝液(pH = 6.9)中之2 mL之抗體(10 mg/mL)添加至10 mM TCEP HCl(三(2-羧乙基)膦HCl)之水溶液中，TCEP與mAb之莫耳比為8.0。還原反應在25℃下進行2小時。藉由用pH = 6.9之50 mM磷酸鈉緩衝液超濾移除過量之TCEP及其副產物。將藥物連接子LD111 (TFA之鹽)以20 mg/mL之濃度溶解在水中並以8.5 (LD111/ mAb)之莫耳比添加至還原的mAb中。將結合反應在25℃下攪拌2小時。用50 mM磷酸鈉緩衝液藉由超濾移除過量之LD111及其雜質。將ADC儲存在20 mM組胺酸緩衝液中，該緩衝液含有6%蔗糖及0.02% (w/V) Tween 20 (由UFDF製造)。藉由SEC-HPLC判定之ADC純度為97.5%，並且藉由LC-MS判定之DAR值為7.8。
F131-LD101將在含有5 mM EDTA之50 mM磷酸鈉緩衝液(pH = 6.9)中之2 mL之抗體(10 mg/mL)添加至10 mM TCEP HCl(三(2-羧乙基)膦HCl)之水溶液中，TCEP與mAb之莫耳比為8.0。還原反應在25℃下進行2小時。藉由用pH = 6.9之50 mM磷酸鈉緩衝液超濾移除過量之TCEP及其副產物。將藥物連接子LD101 (TFA之鹽)以20 mg/mL之濃度溶解在水中並以8.5 (LD101/ mAb)之莫耳比添加至還原的mAb中。將結合反應在25℃下攪拌2小時。用50 mM磷酸鈉緩衝液藉由超濾移除過量之LD101及其雜質。將ADC儲存在20 mM組胺酸緩衝液中，該緩衝液含有6%蔗糖及0.02% (w/V) Tween 20 (由UFDF製造)。藉由SEC-HPLC判定之ADC純度為98.0%，並且藉由LC-MS判定之DAR值為7.5。
F131-LD110將在含有5 mM EDTA之50 mM磷酸鈉緩衝液(pH = 6.9)中之2 mL之抗體(10 mg/mL)添加至10 mM TCEP HCl(三(2-羧乙基)膦HCl)之水溶液中，TCEP與mAb之莫耳比為8.0。還原反應在25℃下進行2小時。藉由用pH = 6.9之50 mM磷酸鈉緩衝液超濾移除過量之TCEP及其副產物。將LD110 (TFA之鹽)以20 mg/mL之濃度溶解在水中並以7.7 (LD110/ mAb)之莫耳比添加至還原的mAb中。將結合反應在25℃下攪拌2小時。用50 mM磷酸鈉緩衝液藉由超濾移除過量之LD110及其雜質。將ADC儲存在20 mM組胺酸緩衝液中，該緩衝液含有6%蔗糖及0.02% (w/V) Tween 20(由UFDF製造)。藉由SEC-HPLC判定之ADC純度為97.8%，並且藉由LC-MS判定之DAR值為7.5。
75.2 在腫瘤細胞株KB中評價另外之F131結合物(F131-LD100、F131-LD111、F131-LD101、F131-LD110)之體內抗腫瘤活性(圖15A及圖15B)。 KB (Co-bioer)腫瘤模型藉由注射懸浮在0.1 mL培養基中之1×10 7個細胞來建立。在腫瘤接種後12天，選擇平均腫瘤大小為約137 mm 3之小鼠，並根據其腫瘤體積使用分層隨機化分為8組(每組n = 8)。在隨機化(隨機化日定義為D0)後一天開始治療，用單次(在第1天)靜脈內注射3 mg/kg之F131-LD100，或3 mg/kg之F131-LD111，或1.5或3 mg/kg之F131-LD101，或1.5或3 mg/kg之F131-LD110治療小鼠。
如前所描述量測腫瘤大小及體重。監測動物體重作為耐受性之間接量度。在任何治療組中都無小鼠顯示顯著之體重減輕。在治療期間無發病率及死亡。
與媒介物對照組相比，用1.5或3 mg/kg之F131-LD101及F131-LD110治療在KB腫瘤模型中產生了顯著之抗腫瘤活性(圖15B)。F131-LD110之腫瘤生長抑制與劑量相關。用3 mg/kg之F131-LD100、F131-LD111或F131-LD038治療在KB腫瘤中產生中等抗腫瘤活性(圖15A)。 表14
藥物 LD ADC (DAR)
依喜替康 LD038 (「PB038」) F131-LD038(8)
依喜替康 LD100 (「PB100」) F131-LD100(8)
依喜替康 LD111 (「PB111」) F131-LD111(8)
MMAE LD101 (「PB101」) F131-LD101(8)
MMAE LD110 (「PB110」) F131-LD110(8)
實例76. F131-LD038  F131、F131-LD038及其他結合物之大鼠模型的PK研究 將F131及其結合物(F131-LD038、F131-LD101、F131-LD110、F131-LD100、F131-LD111)以3 mg/kg靜脈內投與雄性Sprague Dawley大鼠(每組n = 3)。在給藥後10分鐘、4小時、1天、4天、7天、10天、14天及21天自各大鼠交叉取樣眼眶血。血清中之總Ab濃度(代表F131及其結合物)由Genscript製造之ELISA套組偵測，並使用Winnonlin 8.2軟體計算。
所有測試之F131-結合物均表現出與未結合之親本mAb，F131相當之優異PK特性(圖16A至圖16C)。
實例77. F131-LD038之小規模獼猴毒性研究中之PK及耐受性 為了評價F131-LD038之毒性作用及毒代動力學特性，將F131-LD038以60 mg/kg之單劑量靜脈內投與一隻雄性(M)及一隻雌性(F)獼猴。在整個研究中監測臨床表現、體重、食物消耗及臨床病理學(表15)。在給藥後第22天將動物安樂死，在此期間進行完全屍檢。在給藥後0小時、24小時、72小時、120小時、336小時及504小時自各動物收集毒代動力學樣品。血清中之總Ab濃度(代表F131及其結合物)由Genscript製造之ELISA套組偵測，並使用Winnonlin 8.2軟體計算。觀測到ALT之瞬時升高(圖17A)及嗜中性白血球之瞬時降低(圖17B)。F131-LD038在獼猴中顯示出穩定及優異之血漿PK分佈(圖18)。 表15
測試製品 臨床觀測 血液學 臨床化學
F131-LD038 (60 mg/kg) (一個雄性；一個雌性) 糞便柔軟 食慾減退 ↓:WBC；NEUT；RET/RET% ↑:ALT；AST ↓:TG
本發明不限於本文描述之具體實施方案之範圍。實際上，除了本文描述之彼等之外，本發明之各種修改對於本領域之技術人員而言根據前述描述及附圖將變得顯而易見。此類修改旨在落入在所附申請專利範圍之範圍內。
本文引用了各種出版物，包括專利、專利申請公開及科學文獻，其之公開內容出於所有目的藉由引入整體併入。
序列表 SEQ ID NO: 1 (GGGGS)n，其中 n = 1至5 SEQ ID NO: 2人類IgG1重鏈UniProt P01857-1
Figure 02_image821
SEQ ID NO: 3人類κ輕鏈UniProt P01834-1
Figure 02_image823
SEQ ID NO: 4 六-組胺酸
Figure 02_image825
SEQ ID NO: 5
Figure 02_image827
SEQ ID NO: 6 F1 VH胺基酸序列
Figure 02_image829
SEQ ID NO: 7 F1 VL胺基酸序列
Figure 02_image831
SEQ ID NO: 8 F8 VH胺基酸序列
Figure 02_image833
SEQ ID NO: 9 F8 VL胺基酸序列
Figure 02_image835
SEQ ID NO: 10 F9 VH胺基酸序列
Figure 02_image837
SEQ ID NO: 11 F9 VL胺基酸序列
Figure 02_image839
Figure 02_image841
SEQ ID NO: 12 F26 VH胺基酸序列
Figure 02_image843
SEQ ID NO: 13 F26 VL胺基酸序列
Figure 02_image845
SEQ ID NO: 14 F40 VH胺基酸序列
Figure 02_image847
SEQ ID NO: 15 F40 VL胺基酸序列
Figure 02_image849
SEQ ID NO: 16 F48 VH胺基酸序列
Figure 02_image851
SEQ ID NO: 17 F48 VL胺基酸序列
Figure 02_image853
Figure 02_image855
SEQ ID NO: 18 F50 VH胺基酸序列
Figure 02_image857
SEQ ID NO: 19 – F50 VL胺基酸序列
Figure 02_image859
SEQ ID NO: 20 F100 VH胺基酸序列
Figure 02_image861
SEQ ID NO: 21 F100 VL胺基酸序列
Figure 02_image863
SEQ ID NO: 22 F112 VH胺基酸序列
Figure 02_image865
SEQ ID NO: 23 F112 VL胺基酸序列
Figure 02_image867
Figure 02_image869
SEQ ID NO: 24 F123 VH胺基酸序列
Figure 02_image871
SEQ ID NO: 25 F123 VL胺基酸序列
Figure 02_image873
SEQ ID NO: 26 F131 VH胺基酸序列
Figure 02_image875
SEQ ID NO: 27 F131 VL胺基酸序列
Figure 02_image877
SEQ ID NO: 28 F138 VH胺基酸序列
Figure 02_image879
SEQ ID NO: 29 F138 VL胺基酸序列
Figure 02_image881
Figure 02_image883
SEQ ID NO: 30 HCDR1胺基酸序列
Figure 02_image885
SEQ ID NO: 31 HCDR2胺基酸序列
Figure 02_image887
SEQ ID NO: 32 HCDR3胺基酸序列
Figure 02_image889
SEQ ID NO: 33 LCDR1胺基酸序列
Figure 02_image891
SEQ ID NO: 34 LCDR2胺基酸序列
Figure 02_image893
SEQ ID NO: 35 LCDR3胺基酸序列
Figure 02_image895
SEQ ID NO: 36 HCDR1胺基酸序列
Figure 02_image897
SEQ ID NO: 37 HCDR3胺基酸序列
Figure 02_image899
SEQ ID NO: 38 LCDR1胺基酸序列
Figure 02_image901
SEQ ID NO: 39 LCDR2胺基酸序列
Figure 02_image903
SEQ ID NO: 40 LCDR3胺基酸序列
Figure 02_image905
SEQ ID NO: 41人類IgG1重鏈UniProt P01857-1
Figure 02_image907
SEQ ID NO: 42人類κ輕鏈UniProt P01834-1
Figure 02_image909
圖1A.抗-huFOLR-1結合物對OV90細胞之體外細胞毒性。
圖1B.抗-huFOLR-1結合物對OVCAR-3細胞之體外細胞毒性。
圖1C.抗-huFOLR-1結合物對NCI-H292細胞之體外細胞毒性。
圖2.測試人類抗-huFOLR1抗體之PA038結合物的體內活性。在腫瘤細胞接種後第8天開始，藉由靜脈內注射5 mg/kg之結合物或PBS，在2週內對具有約117 mm 3之已建立OV90異種移植物之小鼠給藥4次。繪製細胞接種後以mm 3計之平均腫瘤體積與時間(以天計)之圖。(N=6，平均值±SEM)
圖3.測試人類抗-huFOLR1抗體之PA038結合物的體內活性。在細胞接種後第11天開始，藉由靜脈內注射5 mg/kg之結合物或PBS，在2週內對具有約123 mm 3之已建立NCI-H292異種移植物之小鼠給藥4次。繪製細胞接種後以mm 3計之平均腫瘤體積與時間(以天計)之圖。(N=6，平均值±SEM)
圖4.測試人類抗-huFOLR1抗體之PA038結合物之體內活性。在細胞接種後第13天開始，藉由靜脈內注射5 mg/kg之結合物或PBS，在2週內對具有約110 mm 3之已建立OV90異種移植物之小鼠給藥4次。繪製細胞接種後以mm 3計之平均腫瘤體積與時間(以天計)之圖。(N=6，平均值±SEM)
圖5.在3 mg/kg (N=3；平均值±SD)下評估抗-huFOLR-1結合物F131-LD038及裸Ab F131之PK分佈。
圖6.抗-FOLR1抗體結合Hela細胞之比較。
圖7.抗-FOLR1抗體與RPTEC/TERT1細胞之結合能力之比較。
圖8.抗-FOLR1抗體與Hela細胞之劑量依賴性結合。
圖9.抗-FOLR1抗體與RPTEC/TERT1細胞之劑量依賴性結合。
圖10.抗-FOLR1抗體內化至Hela細胞中。
圖11.抗體-FOLR1抗體內化至RPTEC/TERT1細胞中。
圖12A. F131內化至腫瘤細胞株中。
圖12B. F131-LD038內化至腫瘤細胞株中。
圖13A.對KB之體外細胞毒性。
圖13B.對OVCAR3之體外細胞毒性。
圖13C.對JEG-3之體外細胞毒性。
圖14A. F131及F131-LD038在CDX中對OVCAR-3之體內功效。
圖14B. F131及F131-LD038在CDX中對KB之體內效力。
圖14C. F131及F131-LD038在CDX中對HCC827之體內功效。
圖14D. F131及F131-LD038在CDX中對H441之體內功效。
圖14E. F131及F131-LD038在CDX中對OV90之體內功效。
圖15A. F131-038及其他結合物在CDX中對KB之體內效力。
圖15B. F131結合物在CDX中對KB之體內效力。
圖16A. F131及結合物之大鼠模型之PK研究。
圖16B. F131及結合物之大鼠模型之PK研究。
圖16C. F131及結合物之大鼠模型之PK研究。
圖17A.小規模獼猴毒性研究中之F131-德盧替康(deruxtecan)及F131-LD038耐受性。
圖17B.小規模獼猴毒性研究中之F131-德盧替康及F131-LD038耐受性。
圖18.小規模獼猴毒性研究中之F131-德盧替康及F131-LD038 PK。
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Claims (142)

  1. 一種具有以下式(V)之連接子中間體， ~ (AA) s– [L2] ≈ (V) 或其鹽，其中： AA為具有1個至12個胺基酸亞單元之胺基酸單元； s為0或1； L2為具有1個至4個用於藥物單元之連接位點的連接子亞單元；以及 各波形(~)線表示用於擴展單元之連接位點；以及 雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點， 其中至少一個極性單元存在於該胺基酸單元、該連接子亞單元或兩者中，並且其中該極性單元選自糖單元、PEG單元、羧基單元及其組合。
  2. 一種具有以下式(I)之連接子， ~ L1 – (AA) s– L2 ≈ (I) 或其鹽，其中： L1為具有用於靶向單元之連接位點之擴展單元； AA為具有1個至12個亞單元之胺基酸單元； s為0或1； L2為具有1個至4個用於藥物單元之連接位點的連接子亞單元； 該波形(~)線表示用於該靶向單元之連接位點；以及 該雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點； 其中至少一個極性單元存在於該胺基酸單元、該連接子亞單元、該擴展單元或其組合中，並且其中該極性單元選自糖單元、PEG單元、羧基單元及其組合。
  3. 如前述請求項之連接子中間體或連接子，其中該糖單元具有下式： L3 - **N(CH 2– (CH(XR)) k– X 1(X 2)) 2(X) 或其鹽，其中： 各X獨立地選自NH或O； 各R獨立地選自氫、乙醯基、單糖、二糖及多糖； 各X 1獨立地選自CH 2及C(O)； 各X 2獨立地選自H、OH及OR； k為1至10；以及 L3具有以下通式(XI)： L3a | *- NH – (CH 2) p– CH - (CH 2) o- C(O) - # (XI) 或其鹽，其中： L3a選自C 1-C 10伸烷基及具有1個至24個乙二醇亞單元之聚乙二醇； p及o獨立地為0至2； 各*及各#表示用於胺基酸單元(AA)、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之其他亞單元的連接位點；以及 L3a共價結合至式(X)中用**標記之N原子。
  4. 如前述請求項中任一項之連接子中間體或連接子，其中該糖單元具有選自以下之式：
    Figure 03_image911
    或其鹽，其中： 各R獨立地選自氫、單糖、二糖及多糖； p及o獨立地為0至2； m為1至8； n為0至4；以及 各*及各#表示用於該胺基酸單元(AA)、該連接子亞單元L2或該擴展單元(L1)之其他亞單元的連接位點。
  5. 如前述請求項中任一項之連接子中間體或連接子，其中該PEG單元具有選自以下之式： (a) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-NR 24R 25(XX) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至該胺基酸單元之亞單元或該連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 21及R 22各自獨立地為視情況選用的C 1-C 3伸烷基； R 24及R 25各自獨立地選自H；多羥基基團；經取代之多羥基基團；-C(O)-多羥基基團；經取代之-C(O)-多羥基基團；視情況經取代之C 3-C 10碳環；視情況經取代之C 1-C 3伸烷基C 3-C 10碳環；視情況經取代之雜芳基；視情況經取代之碳環；經取代之-C 1-C 8烷基；經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基；螯合物；-C(O)-R 28，其中R 28為式(XII)或式(XIII)之糖單元；或與-NR 24R 25一起形成C 3-C 8雜環； 該波形線(~)表示與R 20之連接位點；以及 n20為1至26； 或 (b) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-NR 24R 25(XX) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至該胺基酸單元之亞單元或該連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 21及R 22各自獨立地為視情況選用的C 1-C 3伸烷基； R 24及R 25中之一者選自H；多羥基基團；經取代之多羥基基團；-C(O)-多羥基基團；經取代之-C(O)-多羥基基團；視情況經取代之C 3-C 10碳環；視情況經取代之C 1-C 3伸烷基C 3-C 10碳環；視情況經取代之雜芳基；視情況經取代之碳環；經取代之-C 1-C 8烷基；經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基；螯合物；-C(O)-R 28，其中R 28為式(XII)或式(XIII)之糖單元；並且R 24及R 25中之另一者為聚乙二醇，視情況具有1個至24個乙二醇亞單元； 該波形線(~)表示與R 20之連接位點；以及 n20為1至26； 或 (c) ~R 20-[-R 26-[R 29-[O-CH 2-CH 2-] n20R 29] n21-R 27-] n27-NR 24R 25(XXI) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至胺基酸單元之亞單元及/或該連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 26及R 27各自視情況且獨立地選自C 1-C 12伸烷基、-NH-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-NH-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-NH-C 1-C 12伸烷基-C(O)-及-C(O)-C 1-C 12伸烷基-NH-； R 24及R 25中之一者選自H；多羥基基團；經取代之多羥基基團；-C(O)-多羥基基團；經取代之-C(O)-多羥基基團；視情況經取代之C 3-C 10碳環；視情況經取代之C 1-C 3伸烷基C 3-C 10碳環；視情況經取代之雜芳基；視情況經取代之碳環；經取代之-C 1-C 8烷基；經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基；螯合物；-C(O)-R 28，其中R 28為式(XII)或式(XIII)之糖單元；並且R 24及R 25中之另一者選自H；多羥基基團；經取代之多羥基基團；-C(O)-多羥基基團；經取代之-C(O)-多羥基基團；視情況經取代之C 3-C 10碳環；視情況經取代之C 1-C 3伸烷基C 3-C 10碳環；視情況經取代之雜芳基；視情況經取代之碳環；經取代之-C 1-C 8烷基；經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基；螯合物；-C(O)-R 28，其中R 28為式(XII)或式(XIII)之糖單元；及聚乙二醇，視情況具有1個至24個乙二醇亞單元；或與-NR 24R 25一起形成C 3-C 8雜環； 各R 29視情況且獨立地選自-C(O)-、-NH-、-C(O)-C 1-C 6伸烯基-、-NH-C 1-C 6伸烯基-、-C 1-C 6伸烯基-NH-、-C 1-C 6伸烯基-C(O)-、-NH(CO)NH-及三唑； 該波形線(~)表示與R 20之連接位點； n20為1至26； n21為1至4；以及 n27為1至4。
  6. 如請求項5之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25均不為H。
  7. 如請求項5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25各自獨立地選自H及多羥基基團，其限制條件為R 24及R 25不均為H。
  8. 如請求項5至7中任一項之連接子中間體或連接子，其中該多羥基基團為線性單糖，視情況選自C6或C5糖、糖酸或胺基糖。
  9. 如請求項8之連接子中間體或連接子，其中: 該C6或C5糖選自葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脫氧葡萄糖、甘油醛、赤蘚糖、蘇糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、醛糖及酮糖； 該糖酸選自葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸及酮糖酸(ulosonic acid)；或 該胺基糖選自葡糖胺、N-乙醯葡糖胺、半乳糖胺及N-乙醯半乳糖胺。
  10. 如請求項5至9中任一項之連接子中間體或連接子，其中該PEG單元選自以下，或其鹽：
    Figure 03_image913
    Figure 03_image915
    其中R 39選自H、直鏈單糖及聚乙二醇，視情況具有1個至24個乙二醇亞單元；並且左側之波形線表示與該胺基酸單元之亞單元或該連接子亞單元之一部分的連接位點。
  11. 如請求項5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25中之一者為線性單糖，並且另一者為環狀單糖。
  12. 如請求項11之連接子中間體或連接子，其中該PEG單元選自以下，或其鹽：
    Figure 03_image917
    Figure 03_image919
    其中R 41為環狀單糖；並且左側之波形線表示與該胺基酸單元之亞單元或該連接子亞單元之一部分的連接位點。
  13. 如請求項5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25獨立地選自環狀單糖、二糖及多糖。
  14. 如請求項13之連接子中間體或連接子，其中該PEG單元選自以下，或其鹽：
    Figure 03_image921
    Figure 03_image923
    其中各R 45選自H及單糖、二糖或多糖；並且R 46選自環狀單糖、二糖或多糖；並且右側之波形線表示與該胺基酸單元之亞單元或該連接子亞單元之一部分的連接位點。
  15. 如請求項5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25獨立地選自線性單糖及經取代之線性單糖，其中該經取代之線性單糖被單糖、二糖或多糖取代。
  16. 如請求項15之連接子中間體或連接子，其中該PEG單元選自以下，或其鹽：
    Figure 03_image925
    Figure 03_image927
    其中R 47為線性單糖；並且各R 49選自單糖、二糖及多糖；並且左側之波形線表示與該胺基酸單元之亞單元或該連接子亞單元之一部分的連接位點。
  17. 如請求項5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25獨立地選自線性單糖及經取代之單糖，其中該經取代之線性單糖被一或多個選自烷基、O-烷基、芳基、O-芳基、羧基、酯或醯胺之取代基取代，並且視情況進一步被單糖、二糖或多糖取代。
  18. 如請求項17之連接子中間體或連接子，其中該PEG單元選自以下，或其鹽：
    Figure 03_image929
    其中各R 42獨立地選自線性單糖及經取代之線性單糖；各R 43獨立地選自烷基、O-烷基、芳基、O-芳基、羧基、酯及醯胺；並且左側之波形線表示與該胺基酸單元之亞單元或該連接子亞單元之一部分的連接位點。
  19. 如請求項5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25中之一者為-C(O)-多羥基基團或經取代之-C(O)-多羥基基團，並且R 24及R 25中之另一者為H、-C(O)-多羥基基團、經取代之-C(O)-多羥基基團、多羥基基團或經取代之多羥基基團；其中該經取代之-C(O)-多羥基基團及多羥基基團被單糖、二糖、多糖、烷基、-O-烷基、芳基、羧基、酯或醯胺取代。
  20. 如請求項19之連接子中間體或連接子，其中該PEG單元選自以下，或其鹽：
    Figure 03_image931
    其中左側之波形線表示與該胺基酸單元之亞單元或該連接子亞單元之一部分的連接位點。
  21. 如請求項5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25獨立地選自H、經取代之-C 1-C 8烷基、經取代之-C 1-C 4烷基或經取代之-C 1-C 3烷基；其限制條件為R 24及R 25均不為H；其中經取代之-C 1-C 8烷基、-C 1-C 4烷基及-C 1-C 3烷基被羥基及/或羧基取代。
  22. 如請求項21之連接子中間體或連接子，其中該PEG單元選自以下，或其鹽：
    Figure 03_image933
    其中R 48選自H、OH、CH 2OH、COOH或被羥基或羧基取代之-C 1-C 6烷基；並且左側之波形線表示與該胺基酸單元之亞單元或該連接子亞單元之一部分的連接位點。
  23. 如請求項5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25中之一者選自H、經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基、經取代之-C(O)-C 1-C 4烷基及經取代之-C(O)-C 1-C 3烷基，並且R 24及R 25中之另一者選自經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基、經取代之-C(O)-C 1-C 4烷基、經取代之-C(O)-C 1-C 3烷基、經取代之-C 1-C 8烷基、經取代之-C 1-C 4烷基及經取代之-C 1-C 3烷基，其中經取代之-C(O)-C 1-C 8烷基、經取代之-C(O)-C 1-C 4烷基、經取代之-C(O)-C 1-C 3烷基、經取代之-C 1-C 8烷基、-C 1-C 4烷基及-C 1-C 3烷基被羥基及/或羧基取代。
  24. 如請求項23之連接子中間體或連接子，其中該PEG單元選自以下，或其鹽：
    Figure 03_image935
    Figure 03_image937
    其中左側之波形線表示與該胺基酸單元之亞單元或該連接子亞單元之一部分的連接位點。
  25. 如請求項5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25選自H及視情況經取代之芳基；其限制條件為R 24及R 25均不為H。
  26. 如請求項25之連接子中間體或連接子，其中該PEG單元選自以下，或其鹽：
    Figure 03_image939
    其中左側之波形線表示用於該胺基酸單元之亞單元或該連接子亞單元之一部分的連接位點。
  27. 如請求項5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25一起形成視情況經取代之C 3-C 8雜環或雜芳基。
  28. 如請求項27之連接子中間體或連接子，其中該PEG單元為：
    Figure 03_image941
    ， 或其鹽。
  29. 如請求項5至6中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 24及R 25獨立地選自H及螯合物，其中該螯合物視情況藉由伸烷基、伸芳基、碳環、雜伸芳基或雜碳環連接至-NR 24R 25之氮；其限制條件為R 24及R 25均不為H。
  30. 如請求項29之連接子中間體或連接子，其中該螯合物選自乙二胺四乙酸(EDTA)、二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、三伸乙基四胺六乙酸(TTHA)、苄基-DTPA、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N'',N'''-四乙酸(DOTA)、苄基-DOTA、1,4,7-三氮雜環壬烷-N,N',N''-三乙酸(NOTA)、苄基-NOTA、1,4,8,11-四氮雜環十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)及N,N'-二烷基取代之哌𠯤。
  31. 如請求項30之連接子中間體或連接子，其中該PEG單元選自以下，或其鹽：
    Figure 03_image943
    Figure 03_image945
    其中左側之波形線表示與該胺基酸單元之亞單元或該連接子亞單元之一部分的連接位點。
  32. 如請求項5至19中任一項之連接子中間體或連接子，其中各單糖獨立地選自： C5或C6糖，該C5或C6糖選自葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脫氧葡萄糖、甘油醛、赤蘚糖、蘇糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、醛糖、酮糖、葡糖胺、N-乙醯葡糖胺、半乳糖胺及N-乙醯半乳糖胺； 糖酸，該糖酸選自葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸及酮糖酸；或 胺基糖，該胺基糖選自葡糖胺、N-乙醯葡糖胺、半乳糖胺及N-乙醯半乳糖胺。
  33. 如請求項5至32中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 20選自鹵基、醛、羧基、胺基、炔基、疊氮基、羥基、羰基、胺基甲酸酯、硫醇、脲、硫代胺基甲酸酯、硫脲、磺醯胺、醯基磺醯胺、烷基磺酸酯、三唑、氮雜二苯并環辛炔、肼、羰基烷基雜芳基或其受保護之形式。
  34. 如請求項1至4中任一項之連接子中間體或連接子，其中該PEG單元具有選自以下之式： (a) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-R 30(XXX) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至該胺基酸單元之亞單元(若存在)及/或連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 21及R 22各自視情況且，若存在，獨立地為C 1-C 3伸烷基基團； R 30選自視情況經取代之C 3-C 10碳環；硫脲；視情況經取代之硫脲；脲；視情況經取代之脲；磺醯胺；烷基磺醯胺；醯基磺醯胺、視情況經取代之烷基磺醯胺；視情況經取代之醯基磺醯胺；磺醯胺；視情況經取代之磺醯胺；胍，包括烷基胍及芳基胍；磷醯胺；或視情況經取代之磷醯胺；或R 30選自疊氮基、炔基、經取代之炔基、-NH-C(O)-炔基、-NH-C(O)-炔基-R 65；環辛炔；-NH-環辛炔、-NH-C(O)-環辛炔或-NH-(環辛炔) 2；其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環或視情況經取代之雜芳基； 該波形線(~)表示與R 20之連接位點；以及 n20為1至26； (b) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-NH-C(O)-R 31(XXXI) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至該胺基酸單元之亞單元(若存在)或該連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 21及R 22各自獨立地為視情況選用的C 1-C 3伸烷基基團； R 31為支鏈聚乙二醇鏈，各支鏈具有1個至26個乙二醇亞單元，並且各支鏈在其末端具有R 35； R 35為疊氮基、炔基、炔基-R 65、環辛炔或環辛炔-R 65，其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環或視情況經取代之雜芳基； 該波形線(~)表示與R 20之連接位點；以及 n20為1至26； (c) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-C(O)NH-R 31(XXXII) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至該胺基酸單元之亞單元(若存在)或該連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 21及R 22各自視情況且獨立地為C 1-C 3伸烷基基團； R 31為支鏈聚乙二醇鏈，各支鏈獨立地具有1個至26個乙二醇亞單元，並且各支鏈在其末端具有R 35； R 35為疊氮基、炔基、炔基-R 65、環辛炔或環辛炔-R 65，其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環及視情況經取代之雜芳基； 該波形線(~)表示與R 20之連接位點；以及 n20為1至26；以及 (d) ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-N-(R 33-R 31) 2(XXXIII) 或其鹽，其中： R 20為用於連接至該胺基酸單元之亞單元(若存在)或該連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 21及R 22各自視情況且為C 1-C 3伸烷基基團； R 31為支鏈聚乙二醇鏈，各支鏈具有1個至26個乙二醇亞單元，並且各支鏈在其末端具有R 35； R 33為C 1-C 3伸烷基、-C 1-C 3伸烷基-C(O)、-C(O)-C 1-C 3伸烷基或-C(O)-C 1-C 3伸烷基-C(O)； R 35為疊氮基、炔基、炔基-R 65、環辛炔或環辛炔-R 65，其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環或視情況經取代之雜芳基； 該波形線(~)表示與R 20之連接位點；以及 n20為1至26。
  35. 如請求項1至4中任一項之連接子中間體或連接子，其中該PEG單元具有選自以下式，或其鹽： ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-NH-C(O)-R 31(XXXI)， ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-C(O)NH-R 31(XXXII)， 或 ~R 20-R 21-[O-CH 2-CH 2] n20-R 22-N-(R 33-R 31) 2(XXXIII)； 其中R 20為用於連接至該胺基酸單元之亞單元(若存在)或該連接子亞單元L2之一部分的官能基；R 21及R 22各自視情況且為C 1-C 3伸烷基基團；R 31為支鏈聚乙二醇鏈，各支鏈具有1個至26個乙二醇亞單元，並且各支鏈在其末端具有R 35；R 33為C 1-C 3伸烷基、-C 1-C 3伸烷基-C(O)、-C(O)-C 1-C 3伸烷基或-C(O)-C 1-C 3伸烷基-C(O)；R 35為疊氮基、炔基、炔基-R 65、環辛炔或環辛炔-R 65，其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環或視情況經取代之雜芳基；該波形(~)線表示與R 20之連接位點；以及n20為1至26。
  36. 如請求項35之連接子中間體或連接子，其中該PEG單元選自以下：
    Figure 03_image947
    其中R 65選自視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜碳環或視情況經取代之雜芳基；並且左側之波形線表示與該胺基酸單元之亞單元或該連接子亞單元之一部分的連接位點。
  37. 如請求項34至36中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 20選自鹵基、醛、羧基、胺基、炔基、疊氮基、羥基、羰基、胺基甲酸酯、硫醇、脲、硫代胺基甲酸酯、硫脲、磺醯胺、醯基磺醯胺、烷基磺酸酯、三唑、氮雜二苯并環辛炔、肼、羰基烷基雜芳基或其受保護之形式。
  38. 如請求項1至4之連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元： ~R 40-(R 43-R 41-[O-CH 2-CH 2] n40-R 42-R 43-(NR 44R 45) n41) n42(XL) 或其鹽，其中： R 40為用於連接至該胺基酸單元之亞單元或該連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 41及R 42不存在或各自獨立地為C 1-C 6伸烷基； 各R 43獨立地不存在或選自C 1-C 12伸烷基、-NH-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-NH-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-NH-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C(O)-NH-C 1-C 12伸烷基、-雜伸芳基、雜芳基-C 1-C 12伸烷基、雜芳基-C 1-C 12伸烷基-C(O)-或-C(O)NR 46R 47，其中R 46及R 47中之一者為H或C 1-C 12伸烷基並且另一者為C 1-C 12伸烷基； R 44及R 45各自獨立地為H、多羥基基團、經取代之多羥基基團、-C(O)-多羥基基團或經取代之-C(O)-多羥基基團，其中視情況選用的取代基選自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯； 該波形線(~)表示與R 40之連接位點； n40為1至26； n41為1至6；以及 n42為1至6。
  39. 如請求項1至4之連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元： ~R 40-(R 41-[O-CH 2-CH 2] n40-R 42-R 43-(NR 44R 45) n41) n42(XLI) 或其鹽，其中： R 40為用於連接至該胺基酸單元之亞單元或該連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 41及R 42不存在或各自獨立地為C 1-C 6伸烷基； R 43不存在或選自C 1-C 12伸烷基、-NH-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-NH-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-NH-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C 1-C 12伸烷基、C(O)-NH-C 1-C 12伸烷基、-雜伸芳基、雜芳基-C 1-C 12伸烷基、雜芳基-C 1-C 12伸烷基-C(O)-或-C(O)NR 46R 47，其中R 46及R 47中之一者為H或C 1-C 12伸烷基，並且另一者為C 1-C 12伸烷基； R 44及R 45各自獨立地為H、多羥基基團、經取代之多羥基基團、-C(O)-多羥基基團或經取代之-C(O)-多羥基基團，其中視情況選用的取代基選自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯； 該波形線(~)表示與R 40之連接位點； n40為1至26； n41為1至6；以及 n42為1至6。
  40. 如請求項1至4之連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元： ~R 40-(R 41-[O-CH 2-CH 2] n40-R 42-R 43-(NR 44R 45) n41) n42(XLII) 或其鹽，其中： R 40為用於連接至該胺基酸單元之亞單元或該連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 41及R 42不存在或各自獨立地為C 1-C 3伸烷基； R 43不存在或選自C 1-C 6伸烷基、-NH-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 6伸烷基-NH-、-C(O)-C 1-C 6伸烷基、-C 1-C 6伸烷基-C(O)-、-NH-C 1-C 6伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 6伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C 1-C 6伸烷基、-C(O)-NH-C 1-C 12伸烷基、-雜伸芳基、雜芳基-C 1-C 6伸烷基、雜芳基-C 1-C 6伸烷基-C(O)-或-C(O)NR 46R 47，其中R 46及R 47中之一者為H或C 1-C 6伸烷基，並且另一者為C 1-C 12伸烷基； R 44及R 45各自獨立地為H、多羥基基團、經取代之多羥基基團、-C(O)-多羥基基團或經取代之-C(O)-多羥基基團，其中視情況選用的取代基選自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯； 該波形線(~)表示與R 40之連接位點； n40為1至16； n41為1至4；以及 n42為1至4。
  41. 如請求項38至40中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 40選自鹵素、醛、羧基、胺基、炔基、疊氮基、羥基、羰基、胺基甲酸酯、硫醇、脲、硫代胺基甲酸酯、硫脲、磺醯胺、醯基磺醯胺、烷基磺酸酯、三唑、氮雜二苯并環辛炔、肼、羰基烷基雜芳基或其受保護之形式。
  42. 如請求項38至40中任一項之連接子中間體或連接子，其中R 40具有以下結構中之一種：
    Figure 03_image949
    Figure 03_image951
    Figure 03_image953
    ， 其中R = H或C 1-6烷基；並且n = 0至12 或其立體異構體，其中(*)表示R 40與該胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的連接位點，並且(
    Figure 03_image955
    )表示R 40與該PEG單元之其餘部分的連接位點。
  43. 如請求項至42之連接子中間體或連接子，其中R 40具有以下結構中之一種：
    Figure 03_image957
    Figure 03_image959
    Figure 03_image961
    ， 其中n = 0至12 或其立體異構體，其中(*)表示R 40與該胺基酸單元之亞單元或連接子亞單元L2之一部分的連接位點，並且(
    Figure 03_image963
    )表示R 40與該PEG單元之其餘部分的連接位點。
  44. 如請求項38至40之連接子中間體或連接子，其中R 43-(NR 44R 45) n41當存在NR 43時具有以下結構中之一種：
    Figure 03_image965
    Figure 03_image967
    Figure 03_image969
    ， 其中R = H、C 1-6烷基、多羥基或經取代之多羥基 或其立體異構體，其中(
    Figure 03_image971
    )表示R 43與該PEG單元之其餘部分的連接位點。
  45. 如請求項44之連接子中間體或連接子，其中R 43-(NR 44R 45) n41當存在NR 43時具有以下結構中之一種：
    Figure 03_image973
    Figure 03_image975
    ， 或其立體異構體，其中(
    Figure 03_image977
    )表示R 43與該PEG單元之其餘部分的連接位點。
  46. 如請求項38至44中任一項之連接子中間體或連接子，其中-NR 44R 45具有以下結構中之一種：
    Figure 03_image979
    Figure 03_image981
    ， 或其立體異構體，其中(
    Figure 03_image983
    )表示-NR 44R 45與該PEG單元之其餘部分的連接位點。
  47. 如前述請求項中任一項之連接子中間體或連接子，其中該PEG單元在連接至該胺基酸單元或該連接子亞單元L2之一部分之前具有以下結構中之一種：
    Figure 03_image985
    Figure 03_image987
    Figure 03_image989
    ， 其中R為H或烷基，並且n為1至12。
  48. 如請求項1至4之連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元： ~R 40-(R 43-R 41--[O-CH 2-CH 2] n40-R 46-[O-CH 2-CH 2] n40-R 42-R 43-(NR 44R 45) n41) n42(XLIII) 或其鹽，其中： R 40為用於連接至該胺基酸單元之亞單元或該連接子亞單元L2之一部分的官能基； R 41及R 42不存在或各自獨立地為C 1-C 6伸烷基； 各R 43獨立地不存在或選自C 1-C 12伸烷基、-NH-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-NH-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-NH-C 1-C 12伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 12伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C 1-C 12伸烷基、-C(O)-NH-C 1-C 12伸烷基、-雜伸芳基、雜芳基-C 1-C 12伸烷基、雜芳基-C 1-C 12伸烷基-C(O)-或-C(O)NR 46R 47，其中R 46及R 47中之一者為H或C 1-C 12伸烷基並且另一者為C 1-C 12伸烷基； R 44及R 45各自獨立地為H、多羥基基團、經取代之多羥基基團、-C(O)-多羥基基團或經取代之-C(O)-多羥基基團，其中視情況選用的取代基選自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯； R 46選自胺基、胺基-烷基-胺基或-NH-C(O)-NH-S(O) 2-NH-； 該波形線(~)表示與R 40之連接位點； n40為1至26； n41為1至6；以及 n42為1至6。
  49. 如請求項48之連接子中間體或連接子，其中該PEG單元在連接至該胺基酸單元或該連接子亞單元L2之一部分之前具有以下結構中之一種：
    Figure 03_image991
    Figure 03_image993
    。 其中R為H或烷基，並且n為1至12。
  50. 如請求項1至4之連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元：
    Figure 03_image995
    ； 或其鹽，其中： 各Y獨立地為R 76或
    Figure 03_image997
    ； 各R 76獨立地為H、乙醯基、-P(=O)(OH) 2或-(CH 2) v-O-S(=O) 2(OH)； 各R a及R b獨立地為H，或者R a及R b與其所連接之碳一起形成側氧基基團； 各q獨立地為1至26； 各m獨立地為1至4； 各n獨立地為1至4； 各v獨立地為1至6；以及 各*表示用於該胺基酸單元(AA)、該連接子亞單元L2或該擴展單元(L1)之亞單元之連接位點。
  51. 如請求項50之連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元：
    Figure 03_image999
    Figure 03_image1001
    或其鹽，其中： 各R 76獨立地為H、乙醯基、-P(=O)(OH) 2或-(CH 2) vS(=O) 2(OH)； 各q獨立地為1至26； 各m獨立地為1至4； 各n獨立地為1至4； 各v獨立地為1至6；以及 各*表示用於該胺基酸單元(AA)、該連接子亞單元L2或該擴展單元(L1)之亞單元之連接位點。
  52. 如請求項50或51之連接子中間體或連接子，其包含具有選自以下之式的PEG單元：
    Figure 03_image1003
    Figure 03_image1005
    ; 或其鹽，其中： 各q獨立地為1至26； 各m獨立地為1至4； 各n獨立地為1至4；以及 各*表示用於該胺基酸單元(AA)、該連接子亞單元L2或該擴展單元(L1)之亞單元之連接位點。
  53. 如請求項50之連接子中間體或連接子，其中Y為R 76。
  54. 如請求項50之連接子中間體或連接子，其中Y為
    Figure 03_image1007
    。
  55. 如請求項50之連接子中間體或連接子，其中各R a及R b獨立地為H。
  56. 如請求項50之連接子中間體或連接子，其中R a及R b與其所連接之碳一起形成側氧基基團。
  57. 如請求項50至52中任一項之連接子中間體或連接子，其中q為10至20。
  58. 如請求項50至52中任一項之連接子中間體或連接子，其中q為12。
  59. 如請求項1至4、38至40或50至52中任一項之連接子中間體或連接子，其中該PEG單元選自以下，或其鹽：
    Figure 03_image1009
    Figure 03_image1011
    Figure 03_image1013
    Figure 03_image1015
    Figure 03_image1017
    Figure 03_image1019
    Figure 03_image1021
    Figure 03_image1023
    Figure 03_image1025
    Figure 03_image1027
    Figure 03_image1029
    ； 以及
    Figure 03_image1031
    其中各Z在*處連接並且分別選自：
    Figure 03_image1033
    、
    Figure 03_image1035
    ，以及
    Figure 03_image1037
    ； 其中各
    Figure 03_image1039
    表示用於該胺基酸單元(AA)、該連接子亞單元L2或該擴展單元(L1)之其他亞單元的連接位點。
  60. 如請求項1至4中任一項之連接子中間體或連接子，其中該羧基單元具有下式： R 70| L 70| ~ NH – (CH 2) p1– CH - (CH 2) o1- C(O) ~ (XXXX) 或其鹽，其中： (a) L 70選自C 1-C 8伸烷基、C 1-C 8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 8伸烷基-及-C(O)-C 1-C 8伸烷基-C(O)-； R 70為~NR 71(R 72-R 73)，其中R 71選自H、C 1-C 12烷基、經取代之C 1-C 12烷基或聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)，R 72不存在或選自視情況經取代之C 1-C 3伸烷基、視情況經取代之醚、視情況經取代之硫醚、視情況經取代之酮、視情況經取代之醯胺、聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基，並且R 73為羧基或多羧基，其中多羧基包含1至10、或1至6、或1至4個羧基基團，其中該等羧基基團藉由烷基、伸烷基、經取代之烷基、經取代之伸烷基、雜烷基、雜伸烷基、胺基及/或醯胺相互連接； 各波形線(~)表示用於該胺基酸單元(AA)、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之其他亞單元的連接位點；以及 p1及o1中之各者獨立地選自0至2； 或 (b) L 70選自C 1-C 8伸烷基、C 1-C 8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 8伸烷基-及-C(O)-C 1-C 8伸烷基-C(O)-； R 70為~NR 71(R 75-(R 73) 2)，其中R 71選自H、C 1-C 12烷基、經取代之C 1-C 12烷基或聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)，R 75為支鏈之視情況經取代之C 1-C 3伸烷基、視情況經取代之醚、視情況經取代之硫醚、視情況經取代之酮、視情況經取代之醯胺、聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基，並且各R 73獨立地為羧基或多羧基，其中多羧基包含1至10、或1至6、或1至4個羧基基團，其中該等羧基基團藉由烷基、伸烷基、經取代之烷基、經取代之伸烷基、雜烷基、雜伸烷基、胺基及/或醯胺相互連接； 各波形線(~)表示用於該胺基酸單元(AA)、連接子亞單元L2或擴展單元(L1)之其他亞單元的連接位點；以及 p1及o1中之每一者獨立地選自0至2； 或 (c) L 70選自C 1-C 8伸烷基、C 1-C 8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C 1-C 8伸烷基-及-C(O)-C 1-C 8伸烷基-C(O)-； R 70為~N(R 74-R 73)(R 72-R 73)，其中R 72及R 74各自獨立地選自視情況經取代之C 1-C 3伸烷基、視情況經取代之醚、視情況經取代之硫醚、視情況經取代之酮、視情況經取代之醯胺、聚乙二醇(視情況具有1個至12個乙二醇亞單元)、視情況經取代之碳環、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基，並且各R 73獨立地為羧基或多羧基，其中包含1至10、或1至6、或1至4個羧基基團，其中該等羧基基團藉由烷基、伸烷基、經取代之烷基、經取代之伸烷基、雜烷基、雜伸烷基、胺基及/或醯胺相互連接； 各波形線(~)表示用於胺基酸單元(AA)、該連接子亞單元L2或該擴展單元(L1)之其他亞單元的連接位點；以及 p1及o1中之各者獨立地選自0至2。
  61. 如請求項1至60中任一項之連接子中間體或連接子，其包含至少一個糖單元。
  62. 如請求項1至60中任一項之連接子中間體或連接子，其包含至少一個PEG單元。
  63. 如請求項1至60中任一項之連接子中間體或連接子，其包含至少一個羧基單元。
  64. 如請求項1至60中任一項之連接子中間體或連接子，其包含至少兩個極性單元，各極性單元選自糖單元、PEG單元及羧基單元。
  65. 如請求項1至60中任一項之連接子中間體或連接子，其包含至少一個糖單元及PEG單元或羧基單元。
  66. 如請求項1至60中任一項之連接子中間體或連接子，其包含至少一個羧基單元及PEG單元。
  67. 如請求項1至60中任一項之連接子中間體或連接子，其中存在該胺基酸單元(AA) (s=1)。
  68. 如請求項1至67中任一項之連接子中間體或連接子，其中該胺基酸單元包含至少一個極性單元。
  69. 如請求項1至68中任一項之連接子中間體或連接子，其中L2或AA-L2具有以下結構中之一種：
    Figure 03_image1041
    Figure 03_image1043
    ， 其中該胺基基團上之波形線表示用於擴展單元之連接位點，並且該藥物單元連接至苄醇。
  70. 如請求項1至67中任一項之連接子中間體或連接子，其中~AA-L2~具有選自以下之式： ~ [SU – aa] - L2 ≈， ~ [aa 1(PEG) – aa] - L2 ≈，或 ~ [CU – aa] - L2 ≈ 其中中括號表示該胺基酸單元，各aa為AA之視情況選用的亞單元，L2為該連接子亞單元，各波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點；aa 1(PEG)為連接至AA之胺基酸亞單元之PEG單元，SU為連接至AA之亞單元之糖單元或連接至L2之糖單元，並且CU為連接至AA之亞單元之羧基單元或連接至L2之羧基單元；並且雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點，其中aa及aa 1獨立地選自α、β及γ胺基酸及其衍生物。
  71. 如請求項1至67中任一項之連接子中間體或連接子，其中~AA-L2~具有選自以下之式： ~ [SU-aa] | L2 ≈ ~ [aa 1(PEG)-aa] | L2 ≈，或 ~ [CU-aa] | L2 ≈ 其中中括號表示該胺基酸單元，各aa為AA之胺基酸亞單元，L2為連接至aa之側鏈之該連接子亞單元，波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點；aa 1(PEG)為連接至aa之PEG單元，SU為連接至aa之糖單元，CU為連接至aa之羧基單元，並且雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點；其中aa及aa 1獨立地選自α、β及γ胺基酸及其衍生物。
  72. 如請求項1至68中任一項之連接子中間體或連接子，其中該胺基酸單元包括至少兩個極性單元。
  73. 如請求項72之連接子中間體或連接子，其中~AA-L2 ~具有選自以下之式： ~ [SU – aa – SU] – L2 ≈， ~ [aa 1(PEG) – aa – aa 2(PEG)] – L2 ≈，或 ~ [CU – aa – CU] – L2 ≈ 其中中括號表示該胺基酸單元，aa為AA之視情況選用的亞單元，L2為該連接子亞單元，波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點；aa 1(PEG)及aa 2(PEG)中之各者為連接至aa之PEG單元或連接至其他PEG單元之PEG單元；各SU為連接至aa之糖單元或連接至其他糖單元之糖單元，各CU為連接至aa之羧基單元或連接至其他羧基單元之羧基單元，並且雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點；其中aa、aa 1及aa 2獨立地選自α、β及γ胺基酸及其衍生物。
  74. 如請求項72之連接子中間體或連接子，其中~AA-L2~具有選自以下之式： ~ [SU-aa-SU] | L2 ≈ ~ [aa 1(PEG)-aa-aa 2(PEG)] | L2 ≈，或 ~ [CU-aa-CU] | L2 ≈ 其中中括號表示該胺基酸單元，aa為AA之胺基酸亞單元，L2為連接至aa之側鏈之該連接子亞單元，各波形線(~)表示用於擴展單元之連接位點；aa 1(PEG)及aa 2(PEG)中之各者為連接至aa之PEG單元，各SU為連接至aa之糖單元；各CU為連接至aa之羧基單元；並且雙波形(≈)線表示用於藥物單元之連接位點；其中aa、aa 1及aa 2中之各者獨立地選自α、β及γ胺基酸及其衍生物。
  75. 如前述請求項中任一項之連接子中間體或連接子，其中連接子亞單元L2為可裂解之連接子單元。
  76. 如請求項75之連接子中間體或連接子，其中連接子亞單元L2包括可被細胞內蛋白酶裂解之肽。
  77. 如請求項76之連接子中間體或連接子，其中可裂解的肽包括纈胺酸-瓜胺酸肽、纈胺酸-丙胺酸肽、纈胺酸-離胺酸肽、苯丙胺酸-離胺酸肽或甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸肽。
  78. 如前述請求項中任一項之連接子中間體或連接子，其中連接子亞單元L2包含至少一個極性單元。
  79. 如前述請求項中任一項之連接子中間體或連接子，其中該極性單元為糖單元(SU)。
  80. 如請求項79之連接子中間體或連接子，其中該可裂解之肽包含SU-纈胺酸-瓜胺酸肽、SU-纈胺酸-離胺酸肽、SU-纈胺酸-丙胺酸肽、SU-苯丙胺酸-離胺酸肽或SU-甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸肽。
  81. 如請求項78之連接子中間體或連接子，其中該極性單元為羧基單元(CU)。
  82. 如請求項81之連接子中間體或連接子，其中該可裂解的肽包含CU-纈胺酸-瓜胺酸肽、CU-纈胺酸-離胺酸肽、纈胺酸-(CU-離胺酸)肽、CU-纈胺酸-丙胺酸肽、CU-苯丙胺酸-離胺酸肽、苯丙胺酸-(CU-離胺酸)肽或CU-甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸肽，其中CU-離胺酸為包含離胺酸殘基之羧基單元。
  83. 如請求項78之連接子中間體或連接子，其中該極性單元為PEG單元(PEG)。
  84. 如請求項83之連接子中間體或連接子，其中該可裂解之肽包含Lys(PEG)-纈胺酸-瓜胺酸肽、纈胺酸-Cit(PEG)肽、Lys(PEG)-纈胺酸-離胺酸肽、纈胺酸-離胺酸(PEG)肽、Lys(PEG)-纈胺酸-丙胺酸肽、Lys(PEG)-苯丙胺酸-離胺酸肽、苯丙胺酸-Lys(PEG))肽或Lys(PEG)-甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸肽，其中Lys(PEG)及Cit(PEG)分別包含連接至離胺酸殘基或瓜胺酸殘基之PEG單元。
  85. 如請求項75至84中任一項之連接子中間體或連接子，其中該可裂解的肽連接至對胺基苄醇自分解(self immolative)基團(PABA)。
  86. 如請求項85之連接子中間體或連接子，其中~AA-L2≈具有以下結構中之一種：
    Figure 03_image1045
    Figure 03_image1047
    Figure 03_image1049
    其中該胺基基團上之波形線表示用於擴展單元之連接位點，並且該藥物單元連接至苄醇。
  87. 如請求項1至2中任一項之連接子中間體或連接子，其中~AA-L2~具有以下結構中之一種：
    Figure 03_image1051
    Figure 03_image1053
    Figure 03_image1055
    Figure 03_image1057
    Figure 03_image1059
    Figure 03_image1061
    Figure 03_image1063
    Figure 03_image1065
    Figure 03_image1067
    Figure 03_image1069
    Figure 03_image1071
    Figure 03_image1073
    Figure 03_image1075
    Figure 03_image1077
    Figure 03_image1079
    Figure 03_image1081
    Figure 03_image1083
    其中各Z在*處連接並且分別選自：
    Figure 03_image1085
    ，
    Figure 03_image1087
    ，以及
    Figure 03_image1089
    ； 其中該胺基基團上之波形線表示用於擴展單元之連接位點，並且該藥物單元連接至苄醇(亦即，苄醇之H被與該藥物單元之鍵替代)。
  88. 如請求項75至85中任一項之連接子中間體或連接子，其中L2連接至AA之亞單元之側鏈。
  89. 如請求項88之連接子中間體或連接子，其中~AA-L2≈具有以下結構中之一種：
    Figure 03_image1091
    Figure 03_image1093
    其中該胺基基團上之波形線表示用於擴展單元之連接位點，並且該藥物單元連接至末端酸基團、該苄醇，或者其中該波形(≈)線表示用於該藥物單元之連接位點。
  90. 如請求項1至85中任一項之連接子中間體或連接子，其中該胺基酸單元藉由非肽連接基團連接至連接子亞單元L2。
  91. 如請求項90之連接子中間體或連接子，其中該非肽連接基團選自C 1-C 10伸烷基、C 2-C 10伸烯基、C 2-C 10亞炔基或聚乙二醇。
  92. 如前述請求項中任一項之連接子中間體，進一步包含擴展單元。
  93. 如請求項92之連接子，其中該擴展單元選自以下：
    Figure 03_image1095
    Figure 03_image1097
    Figure 03_image1099
    ； 其中R 17為-C 1-C 10伸烷基-、-C 1-C 10雜伸烷基-、-C 3-C 8碳環-、-O-(C 1-C 8伸烷基)-、-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基- (其中b為1至26)、-伸芳基-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-、-C 3-C 8雜環-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-、-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-、-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、C 1-C 10雜伸烷基-C(=O)-、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C(=O)- (其中b為1至26)、-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 3-C 8碳環-C(=O)-、-O-(C 1-C 8烷基)-C(=O)-、-伸芳基-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-C(=O)-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-C(=O)-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、-C 3-C 8雜環-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-C(=O)-、-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-NH-、C 1-C 10雜伸烷基-NH-、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-NH- (其中b為1至26)、-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-NH- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-NH- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(C(=O))-NH-(CH 2-O-CH 2) b-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-(C(=O))-NH-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-C(=O)- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-NH-(C(=O))-(CH 2-O-CH 2) b-NH- (其中b為1至26)、-C 1-C 8伸烷基-NH-(C(=O))-(CH 2-O-CH 2) b-C 1-C 8伸烷基-NH- (其中b為1至26)、-C 3-C 8碳環-NH-、-O-(C 1-C 8烷基)-NH-、-伸芳基-NH-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-NH-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-NH-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-NH-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-NH-、-C 3-C 8雜環-NH-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-NH-、-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-NH-、-C 1-C 10伸烷基-S-、C 1-C 10雜伸烷基-S-、-C 3-C 8碳環-S-、-O-(C 1-C 8烷基)-S-、-伸芳基-S-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-S-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-S-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-S-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-S-、-C 3-C 8雜環-S-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-S-或-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-S-；或 其中該擴展單元包含順丁烯二醯亞胺基(C 1-C 10伸烷基-C(O)-、順丁烯二醯亞胺基(CH 2OCH 2) p2(C 1-C 10伸烷基)C(O)-、順丁烯二醯亞胺基(C 1-C 10伸烷基)(CH 2OCH 2) p2C(O)-或其開環形式，其中p2為1至26。
  94. 如請求項92之連接子中間體或連接子，其中該擴展單元選自以下：
    Figure 03_image1101
    Figure 03_image1103
    ；以及
    Figure 03_image1105
    ； 其中該波形線
    Figure 03_image1107
    表示該擴展單元與胺基酸單元之連接位點，並且與該靶向單元之連接位點在順丁烯二醯亞胺、一級胺或炔官能基上。
  95. 如請求項93之連接子，其具有以下結構中之一種：
    Figure 03_image1109
    Figure 03_image1111
    Figure 03_image1113
    Figure 03_image1115
    其中該藥物單元連接至末端酸基團、苄醇，或者其中該波形(≈)線表示用於該藥物單元之連接位點。
  96. 如請求項92之連接子，其具有以下結構中之一種：
    Figure 03_image1117
    Figure 03_image1119
    Figure 03_image1121
    Figure 03_image1123
    Figure 03_image1125
    Figure 03_image1127
    Figure 03_image1129
    Figure 03_image1131
    Figure 03_image1133
    Figure 03_image1135
    Figure 03_image1137
    Figure 03_image1139
    Figure 03_image1141
    Figure 03_image1143
    Figure 03_image1145
    Figure 03_image1147
    Figure 03_image1149
    Figure 03_image1151
    其中各Z在*處連接並且分別選自：
    Figure 03_image1153
    、
    Figure 03_image1155
    ,以及
    Figure 03_image1157
    ； 其中藥物單元視情況連接至末端酸基團、苄醇，或者其中該波形(≈)線表示用於該藥物單元之連接位點。
  97. 如前述請求項中任一項之連接子，其進一步包含連接至連接子亞單元L2以形成藥物-連接子之至少一個藥物單元。
  98. 如請求項97之藥物-連接子，其中該藥物單元選自細胞毒性劑、免疫調節劑、核酸、生長抑制劑、PROTAC、毒素、放射性同位素及螯合配體。
  99. 如請求項98之藥物-連接子，其中該藥物單元為細胞毒性劑。
  100. 如請求項99之藥物-連接子，其中該細胞毒性劑選自奧瑞他汀、美登素類化合物(maytansinoid)、喜樹鹼、倍癌黴素及卡奇黴素。
  101. 如請求項100之藥物-連接子，其中該細胞毒性劑為奧瑞他汀。
  102. 如請求項101之藥物-連接子，其中該細胞毒性劑為MMAE或MMAF。
  103. 如請求項100之藥物-連接子，其中該細胞毒性劑為喜樹鹼。
  104. 如請求項103之藥物-連接子，其中該細胞毒性劑為依喜替康或SN-38。
  105. 如請求項104之藥物-連接子，其中該細胞毒性劑為依喜替康。
  106. 如請求項99之藥物-連接子，其中該細胞毒性劑為卡奇黴素。
  107. 如請求項99之藥物-連接子，其中該細胞毒性劑為美登素類化合物。
  108. 如請求項107之藥物-連接子，其中該美登素類化合物為美登素、美登醇或安沙黴素-2。
  109. 如請求項98之藥物-連接子，其中該藥物單元為免疫調節劑。
  110. 如請求項109之藥物-連接子，其中該免疫調節劑選自TRL7促效劑、TLR8促效劑、STING促效劑或RIG-I促效劑。
  111. 如請求項110之藥物-連接子，其中該免疫調節劑為TLR7促效劑。
  112. 如請求項111之藥物-連接子，其中該TLR7促效劑為咪唑并喹啉、咪唑并喹啉胺、噻唑并喹啉、胺基喹啉、胺基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-胺基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氫吡啶并嘧啶、雜芳并噻二嗪(heteroarothiadiazide) -2,2-二氧化物、苯并萘啶、鳥苷類似物、腺苷類似物、胸苷均聚物、ssRNA、CpG-A、PolyG10或PolyG3。
  113. 如請求項110之藥物-連接子，其中該免疫調節劑為TLR8促效劑。
  114. 如請求項113之藥物-連接子，其中該TLR8促效劑選自咪唑并喹啉、噻唑并喹啉、胺基喹啉、胺基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-胺基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氫吡啶并嘧啶或ssRNA。
  115. 如請求項110之藥物-連接子，其中該免疫調節劑為STING促效劑。
  116. 如請求項110之藥物-連接子，其中該免疫調節劑為RIG-I促效劑。
  117. 如請求項116之藥物-連接子，其中該RIG-I促效劑選自KIN1148、SB-9200、KIN700、KIN600、KIN500、KIN100、KIN101、KIN400及KIN2000。
  118. 如請求項98之藥物-連接子，其中該藥物單元為螯合配體。
  119. 如請求項118之藥物-連接子，其中該螯合配體選自鉑(Pt)、釕(Ru)、銠(Rh)、金(Au)、銀(Ag)、銅(Cu)、鉬(Mo)、鈦(Ti)或銥(Ir)；放射性同位素，例如釔-88、釔-90、鍀-99、銅-67、錸-188、錸-186、鎵-66、鎵-67、銦-111、銦-114、銦-115、鑥-177、鍶-89、釤-153及鉛-212。
  120. 如請求項97之藥物-連接子，其具有以下結構：
    Figure 03_image1159
    Figure 03_image1161
    Figure 03_image1163
    Figure 03_image1165
    Figure 03_image1167
    Figure 03_image1169
    Figure 03_image1171
    Figure 03_image1173
    Figure 03_image1175
    Figure 03_image1177
    Figure 03_image1179
    Figure 03_image1181
    Figure 03_image1183
    Figure 03_image1185
    Figure 03_image1187
    Figure 03_image1189
    Figure 03_image1191
    Figure 03_image1193
    Figure 03_image1195
    Figure 03_image1197
    Figure 03_image1199
    Figure 03_image1201
    Figure 03_image1203
    Figure 03_image1205
    Figure 03_image1207
    Figure 03_image1209
    其中各Z在*處連接並且分別選自：
    Figure 03_image1211
    、
    Figure 03_image1213
    ，以及
    Figure 03_image1215
    ；或
    Figure 03_image1217
    其中各Z在*處連接並且分別選自：
    Figure 03_image1219
    、
    Figure 03_image1221
    ，以及
    Figure 03_image1223
    。
  121. 一種結合物，包含連接至請求項97至120中任一項之藥物-連接子之靶向單元。
  122. 如請求項121之結合物，其中該靶向單元選自抗體或其抗原結合部分。
  123. 如請求項122之結合物，其中該靶向單元為單株抗體、Fab、Fab'、F(ab')、Fv、二硫鍵連接之Fc、scFv、單域抗體、雙抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。
  124. 如請求項121之結合物，其中該靶向單元為雙抗體、DART、抗運載蛋白、親合體、阿維默(avimer)、DARPin或阿德內丁蛋白(adnectin)。
  125. 如請求項121至124中任一項之結合物，其中該靶向單元為單特異性的。
  126. 如請求項121至125中任一項之結合物，其中該靶向單元為二價的。
  127. 如請求項121至124中任一項之結合物，其中該靶向單元為雙特異性的。
  128. 如請求項121至127中任一項之結合物，其中該結合物之平均載藥量(p load)為約1至約8、約2、約4、約6、約8、約10、約12、約14、約16、約3至約5、約6至約8或約8至約16。
  129. 如請求項121至128中任一項之結合物，其選自以下：
    Figure 03_image1225
    Figure 03_image1227
    Figure 03_image1229
    Figure 03_image1231
    Figure 03_image1233
    Figure 03_image1235
    Figure 03_image1237
    Figure 03_image1239
    Figure 03_image1241
    Figure 03_image1243
    Figure 03_image1245
    Figure 03_image1247
    Figure 03_image1249
    Figure 03_image1251
    Figure 03_image1253
    Figure 03_image1255
    Figure 03_image1257
    Figure 03_image1259
    Figure 03_image1261
    Figure 03_image1263
    Figure 03_image1265
    Figure 03_image1267
    Figure 03_image1269
    Figure 03_image1271
    Figure 03_image1273
    Figure 03_image1275
    Figure 03_image1277
    ； 其中各Z在*處連接並且分別選自：
    Figure 03_image1279
    ，
    Figure 03_image1281
    ，以及
    Figure 03_image1283
    ；或
    Figure 03_image1285
    ； 其中各Z在*處連接並且分別選自：
    Figure 03_image1287
    ，
    Figure 03_image1289
    ，以及
    Figure 03_image1291
    ； 其中Ab為靶向單元並且n為p load。
  130. 如請求項121、128或129中任一項之結合物，其中該靶向單元結合目標分子。
  131. 如請求項130之結合物，其中該目標分子為CD19、CD20、CD30、CD33、CD70、LIV-1或EGFRv3。
  132. 如請求項121、128或129中任一項之結合物，其中該靶向單元選自：scFv1-ScFv2、ScFv12-Fc-scFv22、IgG-scFv、DVD-Ig、triomab/quadroma、二合一IgG、scFv2-Fc、TandAb及scFv-HSA-scFv。
  133. 如請求項121、128或129中任一項之結合物，其中該靶向單元為癌症相關抗原。
  134. 如請求項121、128或129中任一項之結合物，其中該靶向單元為CD19、CD20、CD30、CD33、CD38、CA125、MUC-1、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、CD44表面黏附分子、間皮素(MLSN)、癌胚抗原(CEA)、表皮生長因子受體(EGFR)、EGFRvIII、血管內皮生長因子受體-2 (VEGFR2)、高分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA)、MAGE-A1、IL-13R-a2、GD2、1p19q、ABL1、AKT1、ALK、APC、AR、ATM、BRAF、BRCA1、BRCA2、cKIT、cMET、CSF1R、CTNNB1、FGFR1、FGFR2、FLT3、GNA11、GNAQ、GNAS、HRAS、IDH1、IDH2、JAK2、KDR (VEGFR2)、KRAS、MGMT、MGMT-Me、MLH1、MPL、NOTCH1、NRAS、PDGFRA、Pgp、PIK3CA、PR、PTEN、RET、RRM1、SMO、SPARC、TLE3、TOP2A、TOPO1、TP53、TS、TUBB3、VHL、CDH1、ERBB4、FBXW7、HNF1A、JAK3、NPM1、PTPN11、RB1、SMAD4、SMARCB1、STK1、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、ROS1、ERCC1、5T4 (TPBG)、B7-H3、CCR7、CD105、CD22、CD46、CD47、CD56、CD70、CD71、CD79b、CDH6、CLDN6、CLDN18.2、CLEC12A、DLL3、DR5、ERBB3 (HER3)、EPCAM、FOLR1、IGF1R、IL2RA (CD25)、IL3RA、ITGB6、LIV-1、LRRC15、間皮素(MSLN)、NaPi2b (SLC34A2)、黏連蛋白-4、PTK7、ROR1、SEZ6、SLC44A4、SLITRK6、組織因子(TF)、TROP2或B7-H4。
  135. 如請求項121、128或129中任一項之結合物，其中該靶向單元為抗體或其片段，包括利妥昔單抗(Rituxan®)、曲妥單抗(Herceptin®)、帕妥珠單抗(Perjeta®)、貝伐單抗(Avastin®)、蘭尼單抗(Lucentis®)、西妥昔單抗(Erbitux®)、阿侖單抗(Campath®)、帕尼單抗(Vectibix®)、替伊莫單抗(Zevalin®)、托西莫單抗(Bexxar®)、伊匹單抗、紮蘆木單抗、達雷妥尤單抗、芬妥木單抗、雷莫蘆單抗、加利昔單抗、法妥組單抗、奧瑞組單抗、奧法木單抗(Arzerra®)、替妥木單抗(tositumumab)、替伊莫單抗、CD20抗體2F2 (HuMax-CD20)、7D8、IgM2C6、IgG1 2C6、11B8、B1、2H7、LT20、1FS或AT80、達利珠單抗(Zenapax®)，或抗-LHRH受體抗體，包括純系A9E4、F1G4、AT2G7、GNRH03或GNRHR2。
  136. 如請求項121之結合物，其中該靶向單元為抗體F131並且該藥物-連接子為LD038。
  137. 如請求項121、128或129中任一項之結合物，其中該靶向單元為抗體，包括： 重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該VH區包含位於重鏈可變區構架區中之互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，該VL區包含位於輕鏈可變區構架區中之LCDR1、LCDR及LCDR3，該VH及VL CDR具有選自以下列出之胺基酸序列組中之胺基酸序列： (a) 分別為SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34及SEQ ID NO:35；以及 (b) 分別為SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39及SEQ ID NO:40。
  138. 如請求項137之結合物，其中該VH及VL區具有選自以下列出之胺基酸序列對中之胺基酸序列： 分別為SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27；以及 其中該重鏈及輕鏈構架區視情況經由該構架區中之1個至8個胺基酸取代、缺失或插入來修飾。
  139. 如請求項137之結合物，其中該抗體為F131並且該藥物-連接子為LD038。
  140. 一種結合物，該包含連接至藥物-連接子之靶向單元，其中該靶向單元為抗體F131，並且該藥物-連接子為LD038。
  141. 一種醫藥組合物，該包含請求項121至140中任一項之結合物及醫藥學上可接受之載體。
  142. 一種請求項121至140中任一項之結合物或請求項141之醫藥組合物之用途，其係製備用於治療患有癌症或自身免疫性疾病之受試者之藥劑，其中該結合物結合與該癌症或自身免疫性疾病相關之目標抗原。
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