KR20240043823A - 링커, 약물 링커 및 그의 접합체, 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 극성 유닛, 링커 중간체, 링커, 약물-링커 및 이들의 접합체를 제공한다.

Description

링커, 약물 링커 및 그의 접합체, 및 그의 사용 방법
전자 서열목록에 대한 참조
전자 서열목록의 내용(760270_40201WO_SEQUENCE_LISTING.xml, 크기: 40657바이트, 생성일: 2022년 6월 30일)이 본원에 참조로서 전부 포함되어 있다.
암세포 및 기타 세포와 같은 질병과 관련된 세포에 세포독성 제제를 항체 약물 접합체(또는 ADC) 형태로 표적 전달하기 위해 단일클론 항체(mAb)를 사용하는 것에 대해 많은 관심이 쏠리고 있다. 일반적으로 링커를 통해 세포독성 제제, 면역조절제 또는 기타 제제(총칭하여 "약물")를 항체에 부착하는 항체 약물 접합체의 설계에는 다양한 요인을 고려해야 한다. 이러한 요소에는 약물의 부착을 위한 화학기의 정체(identity)와 위치, 약물 방출 메커니즘, 약물 방출을 제공하는(있는 경우) 구조적 요소, 방출된 유리 약물의 구조적 변형이 (있는 경우) 포함된다. 약물이 세포 외 환경에서 방출되는 경우, 방출된 약물 형태가 표적에 도달할 수 있어야 한다. 항체 내재화 후 약물이 방출되는 경우, 약물 방출의 구조적 요소와 메커니즘이 접합체(conjugate)의 세포 내 이동(trafficking)과 일치해야 한다.
항체 약물 접합체 설계에서 또 다른 중요한 요소는 표적 물질당 전달할 수 있는 약물의 양이다 (즉, 각 표적 물질(예: 항체)에 부착된 약물의 수, 이를 약물 부하 또는 약물 로딩이라고 한다). 과거에는 약물 부하가 높을수록 낮은 약물 부하보다 우수하다고 가정했다(예: 8-부하 vs. 4-부하). 그 근거는 약물 부하가 높은 접합체가 표적 세포에 더 많은 약물(예: 세포독성 제제)을 전달할 수 있다는 것이었다. 이러한 근거는 약물 로딩이 높은 접합체가 시험관 내 세포주에 대해 더 활성적이라는 관찰에 의해 뒷받침되었다. 그러나 이후 일부 연구에서 이러한 가정이 동물 모델에서 확인되지 않았다는 사실이 밝혀졌다. 특정 오리스타틴(auristatin)의 약물 부하가 4 또는 8인 접합체는 마우스 모델에서 유사한 활성을 갖는 것으로 관찰되었다. 예를 들어, 문헌 [Hamblett et al., Clinical Cancer Res. 10:7063-70 (2004)] 참조. 또한 Hamblett 등은 동물 모델에서 더 많이 부하된 ADC가 순환계에서 더 빨리 제거되었다고 보고했다. 이러한 빠른 제거는 더 적게 부하된 종에 비해 더 많이 부하된 종에 대한 PK 책임(liability)을 시사한다. 문헌(Hamblett et al) 참조. 또한, 부하량이 높은 접합체는 마우스에서 최대 내약 용량(MTD)이 낮았으며, 그 결과 보고된 치료 지표가 더 좁게 나타났다. Id. 이와 대조적으로, 단일클론 항체의 조작된 부위에 약물 로딩이 2인 ADC는 특정 4-부하된 ADC와 비교했을 때 PK 및 치료 지표가 동일하거나 더 나은 것으로 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [Junutula et al., Clinical Cancer Res. 16:4769 (2010)] 참조. 따라서 최근의 추세는 약물 로딩이 낮은 ADC를 개발하는 것이다.
따라서 더 높은 약물 로딩을 허용하면서도 유리한 PK 특성과 같은 더 적게 로딩된 접합체의 다른 특성을 유지하는 항체 약물 접합체 포맷 (및 더 일반적으로 다른 접합체의 포맷)이 필요하다. 놀랍게도, 본 발명은 이러한 요구를 해결한다.
발명의 요약
본원은 링커 및 약물과 접합된 항체의 고유한 특성을 유지하는 친수성 특성을 갖는 링커를 제공한다. 특히, 링커는 더 높은 약물 로딩에서 및/또는 소수성 약물 및 기타 제제에 접합될 때 항체의 친수성 특성을 유지하는 데 도움이 된다. 또한 약물-링커 및 링커를 포함하는 접합체와, 암 및 기타 질병의 치료를 위해 이러한 접합체를 사용하는 방법도 제공된다.
일부 양태에서, 하기 화학식(V)을 갖는 링커 중간체 또는 그의 염이 제공된다:
Figure pct00001
;
여기서,
AA는 1 내지 12 개의 아미노산 서브유닛을 갖는 아미노산 유닛이고;
s는 0 또는 1이고;
L2는 약물 유닛에 대하여 1 내지 4개의 부착 부위를 갖는 링커 서브유닛이고;
각 물결(~) 선은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고 이중 물결() 선은 약물 유닛의 부착 부위를 나타내고,
여기서, 적어도 하나의 극성 유닛은 아미노산 유닛, 링커 서브유닛 또는 둘 다에 존재하며, 극성 유닛(들)은 당 유닛, PEG 유닛, 카르복실 유닛 및 이들의 조합들로부터 선택된다.
일부 양태에서, 다음 화학식 (I)를 갖는 링커 또는 그의 염이 제공된다:
Figure pct00003
;
여기서,
L1은 표적 유닛에 대한 부착 부위를 갖는 스트레처 유닛이고;
AA는 1 내지 12 개의 아미노산 서브유닛을 갖는 아미노산 유닛이고;
s는 0 또는 1이고;
L2는 약물 유닛에 대하여 1 내지 4개의 부착 부위를 갖는 링커 서브유닛이고;
물결(~) 선은 표적 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 이중 물결() 선은 약물 유닛의 부착 부위를 나타내고,
여기서, 적어도 하나의 극성 유닛은 아미노산 유닛, 링커 서브유닛 또는 둘 다에 존재하며, 극성 유닛(들)은 당 유닛, PEG 유닛, 카르복실 유닛 및 이들의 조합들로부터 선택된다.
일부 양태에서, 다음 화학식 (I)를 갖는 링커 또는 그의 염이 제공된다:
Figure pct00005
;
여기서,
L1은 표적 유닛에 대한 부착 부위를 갖는 스트레처 유닛이고;
AA는 1 내지 12 개의 아미노산 서브유닛을 갖는 아미노산 유닛이고;
s는 0 또는 1이고;
L2는 약물 유닛에 대하여 1 내지 4개의 부착 부위를 갖는 링커 서브유닛이고;
물결(~) 선은 표적 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 이중 물결() 선은 약물 유닛의 부착 부위를 나타내고;
여기서, 적어도 하나의 극성 유닛은 아미노산 유닛, 링커 서브유닛, 스트레처 유닛, 또는 이의 조합들에 존재하며, 극성 유닛(들)은 당 유닛, PEG 유닛, 카르복실 유닛, 및 이의 조합들로부터 선택된다.
당 유닛
일부 양태에서, 당 유닛이 하기 식을 갖는, 링커 중간체 또는 링커, 또는 그의 염이 제공된다:
Figure pct00007
;
여기서,
X 각각은 독립적으로 NH 또는 O로부터 선택되고;
R 각각은 독립적으로 수소, 아세틸, 단당류, 이당류 및 다당류로부터 선택되고;
X1 각각은 독립적으로 CH2 및 C(O)로부터 선택되고;
X2 각각은 독립적으로 H, OH 및 OR로부터 선택되고;
k는 1 내지 10이고;
L3은 하기 일반 화학식 (XI) 또는 그의 염을 가지며
Figure pct00008
;
여기서,
L3a는 C1-C10 알킬렌 및 1 내지 24개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖는 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택되고;
p와 o는 독립적으로 0 내지 2이고;
각 * 및 각 #은 아미노산 유닛(AA)의 다른 서브유닛, 링커 서브유닛 L2, 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타내고;
L3a는 화학식 (X)에서 **로 표시된 N 원자에 공유 결합되어 있다.
일부 양태에서, 상기 링커 중간체 및 링커는 하기로부터 선택되는 화학식을 갖는 당 유닛 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00010
여기서,
R 각각은 독립적으로 수소, 단당류, 이당류, 및 다당류로부터 선택되고;
p 및 o 는 독립적으로 0 내지 2이고;
m은 1 내지 8이고;
n은 0 내지 4이고;
각 * 및 각 #은 아미노산 유닛(AA)의 다른 서브유닛, 링커 서브유닛 L2, 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타낸디.
PEG 유닛
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커는 하기로부터 선택되는 화학식을 갖는 PEG 유닛 또는 그의 염을 포함한다:
(a)
Figure pct00011
(여기서,
R20은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
R21 및 R22는 각각 독립적으로 선택적 C1-C3 알킬렌이고;
R24 및 R25는 각각 독립적으로 H; 폴리하이드록실기; 치환된 폴리하이드록실기; -C(O)-폴리하이드록실기; 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기; 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 헤테로아릴; 선택적으로 치환된 카르보사이클; 치환된 -C1-C8 알킬; 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬; 킬레이트제; -C(O)-R28(여기서 R28은 화학식 XII 또는 XIII의 당 유닛임); 또는 C3-C8 헤테로사이클로부터 함께 -NR24R25로부터 선택되고;
물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
n20은 1 내지 26이다);
또는
(b)
Figure pct00012
(여기서,
R20은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
R21 및 R22는 각각 독립적으로 선택적 C1-C3 알킬렌이고;
R24 및 R25 중 하나는 H; 폴리하이드록실기; 치환된 폴리하이드록실기; -C(O)-폴리하이드록실기; 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기; 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 헤테로아릴; 선택적으로 치환된 카르보사이클; 치환된 -C1-C8 알킬; 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬; 킬레이트제; -C(O)-R28(여기서 R28은 화학식 XII 또는 XIII의 당 유닛임)로부터 선택되고; R24 및 R25 중 다른 하나는 선택적으로 1 내지 24개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖는 폴리에틸렌 글리콜이고;
물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
n20은 1 내지 26이다);
또는
(c)
Figure pct00013
(여기서,
R20은 아미노산 유닛의 서브유닛 및/또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
R26 및 R27은 각각 선택적이고 그리고 독립적으로 C1-C12 알킬렌, -NH-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-NH-, -C(O)-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-C(O)-, -NH-C1-C12 알킬렌-C(O)- 및 -C(O)-C1-C12 알킬렌-NH-로부터 선택되고;
R24 및 R25 중 하나는 H; 폴리하이드록실기; 치환된 폴리하이드록실기; -C(O)-폴리하이드록실기; 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기; 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 헤테로아릴; 선택적으로 치환된 카르보사이클; 치환된 -C1-C8 알킬; 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬; 킬레이트제; -C(O)-R28(여기서 R28은 화학식 XII 또는 XIII의 당 유닛임)로부터 선택되고; R24 및 R25 중 다른 하나는 H; 폴리하이드록실기; 치환된 폴리하이드록실기; -C(O)-폴리하이드록실기; 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기; 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 헤테로아릴; 선택적으로 치환된 카르보사이클; 치환된 -C1-C8 알킬; 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬; 킬레이트제; -C(O)-R28 (여기서 R28은 화학식 XII 또는 XIII의 당 유닛임); 및 선택적으로 1 내지 24개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖는 폴리에틸렌 글리콜; 또는 C3-C8 헤테로사이클로부터 함께 -NR24R25로부터 선택되고;
R29 각각은 선택적으로 그리고 독립적으로 -C(O)-, -NH-, -C(O)-C1-C6 알케닐렌-, -NH-C1-C6 알케닐렌-, -C1-C6 알케닐렌-NH-, -C1-C6 알케닐렌-C(O)-, -NH(CO)NH-, 및 트리아졸로부터 선택되고;
물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
n20은 1 내지 26이고;
n21은 1 내지 4이고;
n27은 1 내지 4이다);
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛의 R24 및 R25 둘 모두가 H는 아니다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛의 R24 및 R25는 H 및 폴리하이드록실기로부터 각각 독립적으로 선택되며, 단 R24 및 R25는 둘 모두는 H가 아니다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 폴리하이드록실기는 선택적으로 C6 또는 C5 당, 당 산(sugar acid) 또는 아미노당으로부터 선택된 선형 단당류이다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서:
C6 또는 C5 당은 글루코스, 리보스, 갈락토스, 만노스, 아라비노스, 2-데옥시글루코스, 글리세르알데하이드,에리트로스, 트레오스, 자일로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 알도스 및 케토스로부터 선택되고;
당 산은 글루콘산, 알돈산, 우론산 및 울로손산으로부터 선택되며; 또는
아미노당은 글루코사민, N-아세틸 글루코사민, 갈락토사민 및 N-아세틸 갈락토사민으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00014
여기서,
R39는 H, 선형 단당류 및 선택적으로 1 내지 24개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖는 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택되고; 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, PEG 유닛의 R24 및 R25 중 하나는 선형 단당류이고 다른 하나는 환형 단당류인 링커 중간체 또는 링커가 제공된다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00015
여기서,
R41은 환형 단당류이고; 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛의 R24 및 R25는 환형 단당류, 이당류 및 다당류로부터 독립적으로 선택된다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00016
여기서,
R45는 H 및 단당류, 이당류 또는 다당류로부터 선택되고; R46은 환형 단당류, 이당류 또는 다당류로부터 선택되고; 우측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛의 R24 및 R25는 선형 단당류 및 치환된 선형 단당류로부터 독립적으로 선택되고, 상기 치환된 선형 단당류는 단당류, 이당류 또는 다당류로 치환된다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00017
여기서,
R47은 선형 단당류이고; R49는 단당류, 이당류 및 다당류로부터 선택되고; 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛의 R24 및 R25는 선형 단당류 및 치환된 단당류로부터 독립적으로 선택되고, 상기 치환된 선형 단당류는 알킬, O-알킬, 아릴, O-아릴, 카르복실, 에스테르 또는 아미드로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되고, 선택적으로 단당류, 이당류 또는 다당류로 추가로 치환된다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택된다:
여기서, R42 각각은 선형 단당류 및 치환된 선형 단당류로부터 독립적으로 선택되고; R43 각각은 알킬, O-알킬, 아릴, O-아릴, 카르복실, 에스테르 및 아미드로부터 독립적으로 선택되고; 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛의 R24 및 R25 중 하나는 -C(O)-폴리하이드록실기 또는 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기이고, R24 및 R25 중 다른 하나는 H, -C(O)-폴리하이드록실기, 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기, 폴리하이드록실기 또는 치환된 폴리하이드록실기이고; 여기서 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기 및 폴리하이드록실기는 단당류, 이당류, 다당류, 알킬, -O-알킬, 아릴, 카르복실, 에스테르 또는 아미드로 치환된다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00019
여기서, 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛의 R24 및 R25는 H, 치환된 -C1-C8 알킬, 치환된 -C1-C4 알킬 또는 치환된 -C1-C3 알킬로부터 독립적으로 선택되며; 단, R24 및 R25 둘 다는 H가 아니고; 여기서 치환된 -C1-C8 알킬, -C1-C4 알킬 및 -C1-C3 알킬은 하이드록실 및/또는 카르복실로 치환된다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00020
Figure pct00021
여기서, R48은 H, OH, CH2OH, COOH, 또는 하이드록실 또는 카르복실로 치환된 -C1-C6 알킬로부터 선택되고; 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛의 R24 및 R25 중 하나는 H, 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬, 치환된 -C(O)-C1-C4 알킬, 및 치환된 -C(O)-C1-C3 알킬로부터 선택되고, R24 및 R25 중 다른 하나는 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬, 치환된 -C(O)-C1-C4 알킬, 치환된 -C(O)-C1-C3 알킬, 치환된 -C1-C8 알킬, 치환된 -C1-C4 알킬, 및 치환된 -C1-C3 알킬로부터 선택되고, 여기서 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬, 치환된 -C(O)-C1-C4 알킬, 치환된 -C(O)-C1-C3 알킬, 치환된 -C1-C8 알킬, -C1-C4 알킬 및 -C1-C3 알킬은 하이드록실 및/또는 카르복실로 치환된다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식, 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00022
Figure pct00023
여기서, 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛의 R24 및 R25는 H 및 선택적으로 치환된 아릴로부터 선택되고; 단 R24 및 R25가 둘 다 H는 아니며, 상기 선택적 치환체는 본원에 정의된 바와 같고, 예를 들어 일부 양태에서 선택적 치환체는 F, Cl 또는 Br과 같은 할로이다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식, 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00024
여기서, 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 R24 및 R25는 함께 선택적으로 치환된 C3-C8 헤테로사이클 또는 헤테로아릴을 형성하고, 여기서 일부 양태에서 C3-C8 헤테로사이클 또는 헤테로아릴은 치환되지 않았다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식, 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00025
.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛의 R24 및 R25는 H 및 킬레이트제로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 킬레이트제는 선택적으로 알킬렌, 아릴렌, 카르보사이클로, 헤테로아릴렌 또는 헤테로카르보사이클로에 의해 -NR24R25의 질소에 부착되고; 단, R24 및 R25는 둘 다 H는 아니다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 킬레이트제는에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 트리에틸렌테트라민헥사아세트산(TTHA), 벤질-DTPA, 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N'',N'''-테트라아세트산(DOTA), 벤질-DOTA, 1,4,7-트리아자사이클로노난-N,N',N''-트리아세트산(NOTA), 벤질-NOTA, 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA) 및 N,N'-디알킬 치환된 피페라진으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식, 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00026
여기서, 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 당 유닛 또는 PEG 유닛의 각 단당류는
글루코스, 리보스, 갈락토스, 만노스, 아라비노스, 2-데옥시글루코스, 글리세르알데하이드,에리트로스, 트레오스, 자일로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 알도스, 케토스, 글루코사민, N-아세틸 글루코사민, 갈락토사민 및 N-아세틸 갈락토사민으로부터 선택된 C5 또는 C6 당;
글루콘산, 알돈산, 우론산 및 울로손산으로부터 선택되는 당 산; 또는
글루코사민, N-아세틸 글루코사민, 갈락토사민 및 N-아세틸 갈락토사민으로부터 선택된 아미노 당으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 R20이 카르복실, 아미노, 알키닐, 아지도, 하이드록실, 카르보닐, 카르바메이트, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 설폰아미드, 아실 설폰아미드, 알킬 설포네이트 또는 이들의 보호된 형태로부터 선택된다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 R20이 할로, 알데하이드, 카르복실, 아미노, 알키닐, 아지도, 하이드록실, 카르보닐, 카르바메이트, 티올, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 설폰아미드, 아실 설폰아미, 알킬 설포네이트, 트리아졸, 아자디벤조사이클로옥틴, 히드라진, 카르보닐알킬헤테로아릴, 또는 이들의 보호된 형태로부터 선택된다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
(a)
Figure pct00027
(여기서,
R20은 (존재하는 경우)아미노산 유닛의 서브유닛, 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
R21 및 R22는 각각 선택적으로, 그리고 (존재하는 경우) 독립적으로 C1-C3 알킬렌기이고;
R30은 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클; 티오우레아; 선택적으로 치환된 티오우레아; 우레아; 선택적으로 치환된 우레아; 설파미드; 알킬 설파미드; 아실 설파미드; 선택적으로 치환된 알킬 설파미드; 선택적으로 치환된 아실 설파미드; 설폰아미드; 선택적으로 치환된 설폰아미드; 알킬 및 아릴 구아니딘을 포함하는 구아니딘; 포스포르아미드; 또는 선택적으로 치환된 포스포아미드로부터 선택되거나; 또는
R30은 아지도, 알키닐, 치환된 알키닐, -NH-C(O)-알키닐, -NH-C(O)-알키닐-R65; 사이클로옥틴; -NH-사이클로옥틴, -NH-C(O)-사이클로옥틴, 또는 -NH-(사이클로옥틴)2로부터 선택되고; 여기서 R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고;
물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
n20은 1 내지 26이다);
(b)
Figure pct00028
(여기서,
R20은 (존재하는 경우)아미노산 유닛의 서브유닛, 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
R21 및 R22는 각각 독립적으로 선택적 C1-C3 알킬렌기이고;
R31은 분지형 폴리에틸렌 글리콜 쇄로서, 각 분지는 1 내지 26개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖고, 각 분지는 그의 말단에 R35를 가지고;
R35는 아지도, 알키닐, 알키닐-R65, 사이클로옥틴 또는 사이클로옥틴-R65이고, 여기서 R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고;
물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
n20은 1 내지 26이다);
(c)
Figure pct00029
(여기서,
R20은 (존재하는 경우)아미노산 유닛의 서브유닛, 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
R21 및 R22는 각각 선택적으로, 그리고 독립적으로 C1-C3 알킬렌기이고;
R31은 분지형 폴리에틸렌 글리콜 쇄로서, 각 분지는 독립적으로 1 내지 26개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖고, 각 분지는 그의 말단에 R35를 가지고;
R35는 아지도, 알키닐, 알키닐-R65, 사이클로옥틴 또는 사이클로옥틴-R65이고, 여기서 R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고;
물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
n20은 1 내지 26이다);
(d)
Figure pct00030
(여기서,
R20은 (존재하는 경우)아미노산 유닛의 서브유닛, 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
R21 및 R22는 각각 선택적으로 C1-C3 알킬렌기이고;
R31은 분지형 폴리에틸렌 글리콜 쇄로서, 각 분지는 1 내지 26개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖고, 각 분지는 그의 말단에 R35를 가지고;
R33은 C1-C3 알킬렌, C1-C3 알킬렌-C(O), -C(O)-C1-C3 알킬렌, 또는 -C(O)-C1-C3 알킬렌-C(O)이고;
R35는 아지도, 알키닐, 알키닐-R65, 사이클로옥틴 또는 사이클로옥틴-R65이고, 여기서 R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고;
물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
n20은 1 내지 26이다).
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 다음으로부터 선택된 화학식 또는 그의 염을 갖는다:
Figure pct00031
여기서,
R20은 (존재하는 경우)아미노산 유닛의 서브유닛, 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고; R21 및 R22는 각각 선택적으로 C1-C3 알킬렌기이고; R31은 분지형 폴리에틸렌 글리콜 쇄로서, 각 분지는 1 내지 26개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖고, 각 분지는 그의 말단에 R35를 가지고; R33은 C1-C3 알킬렌, C1-C3 알킬렌-C(O), -C(O)-C1-C3 알킬렌, 또는 -C(O)-C1-C3 알킬렌-C(O)이고; R35는 아지도, 알키닐, 알키닐-R65, 사이클로옥틴 또는 사이클로옥틴-R65이고, 여기서 R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고; 상기 물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고; n20은 1 내지 26이다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 다음으로부터 선택된다:
Figure pct00032
Figure pct00033
여기서, R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고; 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, R20이 카르복실, 아미노, 알키닐, 아지도, 하이드록실, 카르보닐, 카르바메이트, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 설폰아미드, 아실 설폰아미드, 알킬 설포네이트 또는 이들의 보호된 형태로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다.
일부 양태에서, R20이 할로, 알데하이드, 카르복실, 아미노, 알키닐, 아지도, 하이드록실, 카르보닐, 카르바메이트, 티올, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 설폰아미드, 아실 설폰아미드, 알킬 설포네이트, 트리아졸, 아자디벤조사이클로옥틴, 히드라진, 카르보닐알킬헤테로아릴, 또는 이들의 보호된 형태로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다.
일부 양태에서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다:
Figure pct00034
여기서,
R40은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이며;
R41 및 R42는 존재하지 않거나, 또는 각각 독립적으로 C1-C6 알킬렌이고;
R43 각각은, 독립적으로, 존재하지 않거나, 또는 C1-C12 알킬렌, -NH-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-NH-, -C(O)-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-C(O)-, -NH-C1-C12 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C12 알킬렌-NH-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-C1-C12 알킬렌, -C(O)-NH-C1-C12 알킬렌, -헤테로아릴렌, 헤테로아릴-C1-C12 알킬렌, 헤테로아릴-C1-C12 알킬렌-C(O)-, 또는 -C(O)NR46R47로부터 선택되고, 여기서, R46 및 R47 중 하나는 H 또는 C1-C12 알킬렌이고, 다른 하나는 C1-C12 알킬렌이고;
R44 및 R45는 각각 독립적으로 H, 폴리하이드록실기, 치환된 폴리하이드록실기, -C(O)-폴리하이드록실기, 또는 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기이며, 여기서 선택적 치환체는 설페이트, 포스페이트, 알킬 설페이트, 및 알킬 포스페이트로부터 선택되고;
물결선(~)은 R40에 대한 부착 부위를 나타내고;
n40은 1 내지 26이고;
n41은 1 내지 6이고;
n42는 1 내지 6이다.
일부 양태에서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다:
Figure pct00035
여기서,
R40은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이며;
R41 및 R42는 존재하지 않거나, 또는 각각 독립적으로 C1-C6 알킬렌이고;
R43은 존재하지 않거나, 또는 C1-C12 알킬렌, -NH-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-NH-, -C(O)-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-C(O)-, -NH-C1-C12 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C12 알킬렌-NH-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-C1-C12 알킬렌, -C(O)-NH-C1-C12 알킬렌, -헤테로아릴렌, 헤테로아릴-C1-C12 알킬렌, 헤테로아릴-C1-C12 알킬렌-C(O)-, 또는 -C(O)NR46R47로부터 선택되고, 여기서, R46 및 R47 중 하나는 H 또는 C1-C12 알킬렌이고, 다른 하나는 C1-C12 알킬렌이고;
R44 및 R45는 각각 독립적으로 H, 폴리하이드록실기, 치환된 폴리하이드록실기, -C(O)-폴리하이드록실기, 또는 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기이며, 여기서 선택적 치환체는 설페이트, 포스페이트, 알킬 설페이트, 및 알킬 포스페이트로부터 선택되고;
물결선(~)은 R40에 대한 부착 부위를 나타내고;
n40은 1 내지 26이고;
n41은 1 내지 6이고;
n42는 1 내지 6이다.
일부 양태에서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다:
Figure pct00036
여기서,
R40은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이며;
R41 및 R42는 존재하지 않거나, 또는 각각 독립적으로 C1-C3 알킬렌이고;
R43은 존재하지 않거나, 또는 C1-C6 알킬렌, -NH-C1-C12 알킬렌, -C1-C6 알킬렌-NH-, -C(O)-C1-C6 알킬렌, -C1-C6 알킬렌-C(O)-, -NH-C1-C6 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C6 알킬렌-NH-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-C1-C6 알킬렌, -C(O)-NH-C1-C12 알킬렌, -헤테로아릴렌, 헤테로아릴-C1-C6 알킬렌, 헤테로아릴-C1-C6 알킬렌-C(O)-, 또는 -C(O)NR46R47로부터 선택되고, 여기서, R46 및 R47 중 하나는 H 또는 C1-C6 알킬렌이고, 다른 하나는 C1-C12 알킬렌이고;
R44 및 R45는 각각 독립적으로 H, 폴리하이드록실기, 치환된 폴리하이드록실기, -C(O)-폴리하이드록실기, 또는 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기이며, 여기서 선택적 치환체는 설페이트, 포스페이트, 알킬 설페이트, 및 알킬 포스페이트로부터 선택되고;
물결선(~)은 R40에 대한 부착 부위를 나타내고;
n40은 1 내지 16이고;
n41은 1 내지 4이고;
n42는 1 내지 4이다.
일부 양태에서, R40이 할로, 알데하이드, 카르복실, 아미노, 알키닐, 아지도, 하이드록실, 카르보닐, 카르바메이트, 티올, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 설폰아미드, 아실 설폰아미드, 알킬 설포네이트, 트리아졸, 아자디벤조사이클로옥틴, 히드라진, 카르보닐알킬헤테로아릴, 또는 이들의 보호된 형태로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 R40은 하기 구조, 또는 그의 입체 이성질체 중 하나를 갖는다:
Figure pct00037
(여기서, R = H 또는 C1-6 알킬이고;
n = 0 내지 12임)
여기서, (*)는 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 대한 R40의 부착 부위를 나타내고, ()는 PEG 유닛의 나머지 부분에 대한 R40의 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 R40은 하기 구조, 또는 그의 입체 이성질체 중 하나를 갖는다:
Figure pct00039
(여기서, n = 0 내지 12임)
여기서, (*)는 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 대한 R40의 부착 부위를 나타내고, ()는 PEG 유닛의 나머지 부분에 대한 R40의 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 R43이 존재 시, R43-(NR44R45)n41은 하기 구조, 또는 그의 입체 이성질체 중 하나를 갖는다:
Figure pct00041
(여기서, R = H, C1-6 알킬, 폴리하이드록실, 또는 치환된 폴리하이드록실)
여기서, ()는 PEG 유닛의 나머지 부분에 대한 R43의 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 R43이 존재 시, R43-(NR44R45)n41은 하기 구조, 또는 그의 입체 이성질체 중 하나를 갖는다:
Figure pct00043
여기서, ()는 PEG 유닛의 나머지 부분에 대한 R43의 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 -NR44R45는 하기 구조, 또는 그의 입체 이성질체 중 하나를 갖는다:
Figure pct00045
여기서, ()는 PEG 유닛의 나머지 부분에 대한 -NR44R45의 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 아미노산 유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되기 전에 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
여기서, R은 H 또는 알킬이고, n은 1 내지 12이다.
일부 양태에서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다:
Figure pct00051
여기서,
R40은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이며;
R41 및 R42는 존재하지 않거나, 또는 각각 독립적으로 C1-C6 알킬렌이고;
R43 각각은, 독립적으로, 존재하지 않거나, 또는 C1-C12 알킬렌, -NH-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-NH-, -C(O)-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-C(O)-, -NH-C1-C12 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C12 알킬렌-NH-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-C1-C12 알킬렌, -C(O)-NH-C1-C12 알킬렌, -헤테로아릴렌, 헤테로아릴-C1-C12 알킬렌, 헤테로아릴-C1-C12 알킬렌-C(O)-, 또는 -C(O)NR46R47로부터 선택되고, 여기서, R46 및 R47 중 하나는 H 또는 C1-C12 알킬렌이고, 다른 하나는 C1-C12 알킬렌이고;
R44 및 R45는 각각 독립적으로 H, 폴리하이드록실기, 치환된 폴리하이드록실기, -C(O)-폴리하이드록실기, 또는 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기이며, 여기서 선택적 치환체는 설페이트, 포스페이트, 알킬 설페이트, 및 알킬 포스페이트로부터 선택되고;
R46은 아미노, 아미노-알킬-아미노 또는 -NH-C(O)-NH-S(O)2-NH-로부터 선택되고;
물결선(~)은 R40에 대한 부착 부위를 나타내고;
n40은 1 내지 26이고;
n41은 1 내지 6이고;
n42는 1 내지 6이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 아미노산 유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되기 전에 하기 구조 중 하나를 갖는다:
여기서, R은 H 또는 알킬이고, n은 1 내지 12이다.
일부 양태에서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다:
Figure pct00053
Figure pct00054
여기서,
Y 각각은 독립적으로 R76 또는
Figure pct00055
이고;
R76 각각은 독립적으로 H, 아세틸, -P(=O)(OH)2, 또는 -(CH2)v-O-S(=O)2(OH)이고;
Ra 및 Rb 각각은 독립적으로 H이거나, 또는 Ra 및 Rb는 이들이 부착된 탄소와 함께 결합하여 옥소기를 형성하고;
각 q는 독립적으로 1 내지 26이고;
각 m은 독립적으로 1 내지 4이고;
각 n은 독립적으로 1 내지 4이고;
각 v는 독립적으로 1 내지 6이고;
각 *는 아미노산 유닛(AA)의 서브유닛, 링커 서브유닛 L2 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다:
Figure pct00056
여기서,
R76 각각은 독립적으로 H, 아세틸, -P(=O)(OH)2, 또는 -(CH2)vS(=O)2(OH)이고;
각 q는 독립적으로 1 내지 26이고;
각 m은 독립적으로 1 내지 4이고;
각 n은 독립적으로 1 내지 4이고;
각 v는 독립적으로 1 내지 6이고;
각 *는 아미노산 유닛(AA)의 서브유닛, 링커 서브유닛 L2 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다:
Figure pct00057
Figure pct00058
여기서,
각 q는 독립적으로 1 내지 26이고;
각 m은 독립적으로 1 내지 4이고;
각 n은 독립적으로 1 내지 4이고;
각 *는 아미노산 유닛(AA)의 서브유닛, 링커 서브유닛 L2 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 Y는 R76이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 Y는
Figure pct00059
이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 Ra 및 Rb 각각은 독립적으로 H이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 Ra 및 Rb는 이들이 부착된 탄소와 함께 결합하여 옥소기를 형성한다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 q는 10 내지 20이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 q는 12이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식, 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
여기서, 각 Z는 *에 부착되고, 개별적으로 하기로부터 선택된다:
Figure pct00072
Figure pct00073
여기서, 각 는 아미노산 유닛(AA)의 다른 서브유닛, 링커 서브유닛 L2, 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타낸다.
카르복실 유닛
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 카르복실 유닛은 하기 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
Figure pct00075
여기서,
(a)
L70은 C1-C8 알킬렌, C1-C8 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C8 알킬렌-, 및 -C(O)-C1-C8 알킬렌-C(O)-로부터 선택되고;
R70은 ~NR71(R72-R73)이고, 여기서 R71은 H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, 또는 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐)로부터 선택되고, R72는 존재하지 않거나, 또는 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌, 선택적으로 치환된 에테르, 선택적으로 치환된 티오에테르, 선택적으로 치환된 케톤, 선택적으로 치환된 아미드, 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐), 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, R73은 카르복실 또는 폴리카르복실이고, 여기서 폴리카르복실은 1 내지 10개, 또는 1 내지 6개, 또는 1 내지 4개의 카르복실기를 포함하고, 여기서 상기 카르복실기는 알킬, 알킬렌, 치환된 알킬, 치환된 알킬렌, 헤테로알킬, 헤테로알킬렌, 아미노 및/또는 아미드에 의해 상호 연결되고;
각 물결선(~)은 아미노산 유닛(AA)의 또 다른 서브유닛, 링커 서브유닛 L2 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타내고;
p1과 o1은 각각 독립적으로 0 내지 2로부터 선택되고,
또는
(b)
L70은 C1-C8 알킬렌, C1-C8 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C8 알킬렌-, 및 -C(O)-C1-C8 알킬렌-C(O)-로부터 선택되고;
R70은 ~NR71(R75-(R73)2)이고, 여기서 R71은 H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, 또는 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐)로부터 선택되고, R75는 선택적으로 분지화되어 치환된 C1-C3 알킬렌, 선택적으로 치환된 에테르, 선택적으로 치환된 티오에테르, 선택적으로 치환된 케톤, 선택적으로 치환된 아미드, 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐), 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고, 각각의 R73은 독립적으로 카르복실 또는 폴리카르복실이고, 여기서 폴리카르복실은 1 내지 10개, 또는 1 내지 6개, 또는 1 내지 4개의 카르복실기를 포함하고, 여기서 상기 카르복실기는 알킬, 알킬렌, 치환된 알킬, 치환된 알킬렌, 헤테로알킬, 헤테로알킬렌, 아미노 및/또는 아미드에 의해 상호 연결되고;
각 물결선(~)은 아미노산 유닛(AA)의 또 다른 서브유닛, 링커 서브유닛 L2, 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타내고;
p1과 o1은 각각 독립적으로 0 내지 2로부터 선택되고,
또는
(c)
L70은 C1-C8 알킬렌, C1-C8 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C8 알킬렌-, 및 -C(O)-C1-C8 알킬렌-C(O)-로부터 선택되고;
R70은 ~N(R74-R73)(R72 -R73)이고, 여기서 R72 및 R74는 각각 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌, 선택적으로 치환된 에테르, 선택적으로 치환된 티오에테르, 선택적으로 치환된 케톤, 선택적으로 치환된 아미드, 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐), 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, 각각의 R73은 독립적으로 카르복실 또는 폴리카르복실이고, 여기서 1 내지 10개, 또는 1 내지 6개, 또는 1 내지 4개의 카르복실기를 포함하고, 여기서 상기 카르복실기는 알킬, 알킬렌, 치환된 알킬, 치환된 알킬렌, 헤테로알킬, 헤테로알킬렌, 아미노 및/또는 아미드에 의해 상호 연결되고;
각 물결선(~)은 아미노산 유닛(AA)의 또 다른 서브유닛, 링커 서브유닛 L2, 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타내고;
p1과 o1은 각각 독립적으로 0 내지 2로부터 선택된다.
일부 양태에서, 적어도 하나의 당 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 카르복실 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다. 일부 양태에서, 적어도 2개의 극성 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 각각의 극성 유닛은 당 유닛, PEG 유닛 및 카르복실 유닛으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 당 유닛 및 PEG 유닛 또는 카르복실 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 카르복실 유닛, 및 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 아미노산 유닛(AA)이 존재한다(s=1). 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 아미노산 유닛은 적어도 하나의 극성 유닛을 포함한다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 L2 또는 AA-L2는 다음 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00076
여기서, 아미노기 상의 물결선은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 약물 유닛은 벤질 알콜에 부착된다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 ~AA-L2~는 하기로부터 선택되는 화학식을 갖는다:
Figure pct00077
여기서, 대괄호는 아미노산 유닛을 나타내고, 각 aa는 AA의 선택적 서브유닛이고, L2는 링커 서브유닛이고, 각 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내며; aa1(PEG)는 AA의 아미노산 서브유닛에 부착된 PEG 유닛이고, SU는 AA의 서브유닛 또는 L2에 부착된 당 유닛이고, CU는 AA의 서브유닛 또는 L2에 부착된 카르복실 유닛이고; 이중 물결() 선은 약물 유닛의 부착 부위를 나타내고, 여기서 aa 및 aa1은 독립적으로 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 ~AA-L2~는 하기로부터 선택되는 화학식을 갖는다:
Figure pct00079
여기서, 대괄호는 아미노산 유닛을 나타내고, 각 aa는 AA의 아미노산 서브유닛이고, L2는 aa의 측쇄에 부착된 링커 서브유닛이고, 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내며; aa1(PEG)는 aa에 부착된 PEG 유닛이고, SU는 aa에 부착된 당 유닛이고, CU는 aa에 부착된 카르복실 유닛이고; 이중 물결() 선은 약물 유닛의 부착 부위를 나타내고; 여기서 aa 및 aa1은 독립적으로 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 아미노산 유닛은 적어도 두개의 극성 유닛을 포함한다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 ~AA-L2~는 하기로부터 선택되는 화학식을 갖는다:
Figure pct00081
여기서, 대괄호는 아미노산 유닛을 나타내고, aa는 AA의 선택적 서브유닛이고, L2는 링커 서브유닛이고, 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내며; aa1(PEG) 및 aa2(PEG) 각각은 aa 또는 다른 PEG 유닛에 부착된 PEG 유닛이고; SU 각각은 aa 또는 다른 당 유닛에 부착된 당 유닛이고, CU 각각은 aa 또는 다른 카르복실 유닛에 부착된 카르복실 유닛이고, 이중 물결() 선은 약물 유닛의 부착 부위를 나타내고; 여기서 aa, aa1 및 aa2는 독립적으로 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 ~AA-L2~는 하기로부터 선택되는 화학식을 갖는다:
Figure pct00083
여기서, 대괄호는 아미노산 유닛을 나타내고, aa는 AA의 아미노산 서브유닛이고, L2는 aa의 측쇄에 부착된 링커 서브유닛이고, 각 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내며; aa1(PEG) 및 aa2(PEG) 각각은 aa에 부착된 PEG 유닛이고; SU 각각은 aa에 부착된 당 유닛이고, CU 각각은 aa에 부착된 카르복실 유닛이고; 이중 물결() 선은 약물 유닛의 부착 부위를 나타내고; 여기서 aa, aa1 및 aa2는 독립적으로 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 링커 서브유닛 L2는 절단 가능한 링커 유닛이다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 링커 서브유닛 L2는 세포내 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩타이드를 포함한다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 절단 가능한 펩타이드는 발린-시트룰린 펩타이드, 발린-알라닌 펩타이드, 발린-리신 펩타이드, 페닐알라닌-리신 펩타이드, 또는 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신 펩타이드를 포함한다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 링커 서브유닛 L2는 하나 이상의 극성 유닛을 포함한다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 극성 유닛은 당 유닛(SU)이다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 절단 가능한 펩타이드는 SU-발린-시트룰린 펩타이드, SU-발린-리신 펩타이드, SU-발린-알라닌 펩타이드, SU-페닐알라닌-리신 펩타이드, 또는 SU-글리신-글리신-페닐알라닌-글리신 펩타이드를 포함한다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 극성 유닛은 카르복실 유닛(CU)이다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 절단 가능한 펩타이드는 CU-발린-시트룰린 펩타이드, CU-발린-리신 펩타이드, 발린-(CU-리신) 펩타이드, CU-발린-알라닌 펩타이드, CU-페닐알라닌-리신 펩타이드, 페닐알라닌-(CU-리신) 펩타이드 또는 CU-글리신-글리신-페닐알라닌-글리신 펩타이드를 포함하고, 여기서, CU-리신은 리신 잔기를 포함하는 카르복실 유닛이다.
일부 양태에서, 극성 유닛이 PEG 유닛(PEG)인 링커 중간체 또는 링커가 제공된다. 일부 양태에서, 절단 가능한 펩타이드가 Lys(PEG)-발린-시트룰린 펩타이드, 발린-Cit(PEG) 펩타이드, Lys(PEG)-발린-리신 펩타이드, 발린-리신(PEG) 펩타이드, Lys(PEG)-발린-알라닌 펩타이드, Lys(PEG)-페닐알라닌-리신 펩타이드, 페닐알라닌-Lys(PEG) 펩타이드 또는 Lys(PEG)-글리신-글리신-페닐알라닌-글리신 펩타이드를 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 Lys(PEG) 및 Cit(PEG)는 각각 리신 잔기 또는 시트룰린 잔기에 부착된 PEG 유닛을 포함한다.
일부 양태에서, 절단 가능한 펩타이드가 파라-아미노벤질 알코올 자가 희생기(para-aminobenzyl alcohol self immolative group, PABA)에 부착되는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 ~AA-L2~는 하기구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
Figure pct00100
Figure pct00101
Figure pct00102
여기서, 각 Z는 *에 부착되고, 개별적으로 하기로부터 선택된다:
Figure pct00104
여기서, 아미노기 상의 물결선은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 약물 유닛은 벤질 알콜에 부착된다 (즉, 벤질 알코올의 H가 약물 유닛에 대한 결합으로 치환된다).
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 L2는 AA의 서브유닛의 측쇄에 부착된다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 ~AA-L2는 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00106
여기서, 아미노기 상의 물결선은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 약물 유닛은 말단 산 기 또는 벤질 알콜에 부착(즉, 벤질 알코올의 H가 약물 유닛에 대한 결합으로 치환된다)되거나, 또는 여기서 물결() 선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 아미노산 유닛은 비펩타이드 연결기에 의해 링커 서브유닛 L2에 연결된다. 일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 상기 비-펩타이드 연결기는 C1-C10 알킬렌, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택된다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 이는 링커로부터의 스트레처 유닛을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 링커가 제공되며, 여기서 스트레처 유닛은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00108
Figure pct00109
여기서, R17은 -C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 헤테로알킬렌-, -C3-C8 카르보사이클로-, -O-(C1-C8 알킬렌)-, -(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌- (여기서 b는 1 내지 26임), -아릴렌-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보사이클로)-, -(C3-C8 카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-, -C3-C8 헤테로사이클로-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로사이클로)-, -(C3-C8 헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-C(=O)-, C1-C10 헤테로알킬렌-C(=O)-, -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C3-C8 카르보사이클로-C(=O)-, -O-(C1-C8 알킬)-C(=O)-, -아릴렌-C(=O)-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-C(=O)-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-C(=O)-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보사이클로)-C(=O)-, -(C3-C8 카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-C(=O)-, -C3-C8 헤테로사이클로-C(=O)-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로사이클로)-C(=O)-, -(C3-C8 헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-C(=O)-, -C1-C10 알킬렌-NH-, -C1-C10 헤테로알킬렌-NH-, -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(C(=O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(C(=O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-NH-(C(=O))-(CH2-O-CH2)b-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-NH-(C(=O))-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -C3-C8 카르보사이클로-NH-, -O-(C1-C8 alkyl)-NH-, -아릴렌-NH-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-NH-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-NH-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보사이클로)-NH-, -(C3-C8 카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-NH-, -C3-C8 헤테로사이클로-NH-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로사이클로)-NH-, -(C3-C8 헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-NH-, -C1-C10 알킬렌-S-, C1-C10 헤테로알킬렌-S-, -C3-C8 카르보사이클로-S-, -O-(C1-C8 알킬)-S-, -아릴렌-S-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-S-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-S-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보사이클로)-S-, -(C3-C8 카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-S-, -C3-C8 헤테로사이클로-S-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로사이클로)-S-, 또는 -(C3-C8 헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-S-이거나; 또는
여기서 스트레처 유닛은 말레이미도(C1-C10알킬렌-C(O)-, 말레이미도(CH2OCH2)p2(C1-C10알킨)C(O)-, 말레이미도(C1-C10알킨)(CH2OCH2)p2C(O)-, 또는 그의 개환 형태를 포함하고, 여기서 p2는 1 내지 26이다.
일부 양태에서, 링커가 제공되며, 여기서 스트레처 유닛은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00110
여기서, 물결선 은 아미노산 유닛에 대한 스트레처 유닛의 부착 부위를 나타내고, 표적화 유닛에 대한 부착 부위는 말레이미드, 1차 아민 또는 알킨 작용기에 있다.
일부 양태에서, 하기 구조 중 하나를 갖는 링커가 제공된다:
Figure pct00112
Figure pct00113
Figure pct00114
Figure pct00115
Figure pct00116
Figure pct00117
Figure pct00118
Figure pct00119
Figure pct00120
Figure pct00121
Figure pct00122
Figure pct00123
Figure pct00124
Figure pct00125
Figure pct00126
Figure pct00127
Figure pct00128
Figure pct00129
여기서, Z 각각은 *에 부착되고 하기로부터 개별적으로 선택된다:
Figure pct00131
Figure pct00132
여기서, 약물 유닛은 선택적으로 말단 산 기 또는 벤질 알코올에 부착되거나, 또는 물결() 선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2에 부착되어 약물-링커를 형성하는 적어도 하나의 약물 유닛을 추가로 포함하는, 링커가 제공된다. 일부 양태에서, 약물-링커가 제공되며, 여기서 약물 유닛은 세포독성제, 면역 조절제, 핵산, 성장 억제제, PROTAC, 독소, 방사성 동위원소 및 킬레이트 리간드로부터 선택된다. 일부 양태에서, 약물-링커가 제공되며, 여기서 약물 유닛은 세포독성제이다. 일부 양태에서, 세포독성제가 아우리스타틴(auristatin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 캄프토테신(camptothecin), 듀오카르마이신(duocarmycin) 및 칼리케아미신(calicheamicin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약물-링커가 제공된다. 일부 양태에서, 세포독성제가 아우리스타틴인 약물-링커가 제공된다. 일부 양태에서, 세포독성제가 MMAE 또는 MMAF인 약물-링커가 제공된다. 일부 양태에서, 세포독성제가 캄프토테신인 약물-링커가 제공된다. 일부 양태에서, 세포독성제가 엑사테칸(exatecan) 또는 SN-38인 약물-링커가 제공된다. 일부 양태에서, 세포독성제가 엑사테칸인 약물-링커가 제공된다. 일부 양태에서, 세포독성제가 칼리케아미신인 약물-링커가 제공된다. 일부 양태에서, 세포독성제가 메이탄시노이드인 약물-링커가 제공된다. 일부 양태에서, 메이탄시노이드가 메이탄신(maytansine), 메이탄시놀(maytansinol) 또는 안사마토신-2(ansamatocin-2)인 약물-링커가 제공된다.
일부 양태에서, 세포독성제가 칼리케아미신인 약물-링커가 제공된다. 일부 양태에서, 세포독성제가 메이탄시노이드인 약물-링커가 제공된다. 일부 양태에서, 메이탄시노이드가 메이탄신, 메이탄시놀 또는 안사마토신-2인 약물-링커가 제공된다.
일부 양태에서, 약물-링커가 제공되며, 여기서 약물 유닛은 면역 조절제이다. 일부 양태에서, 약물-링커가 제공되며, 여기서 면역 조절제는 TRL7 작용제, TLR8 작용제, STING 작용제 또는 RIG-I 작용제로부터 선택된다. 일부 양태에서, 면역 조절제가 TLR7 작용제인 약물-링커가 제공된다. 일부 양태에서, TLR7 작용제가 이미다조퀴놀린, 이미다조퀴놀린 아민, 티아조퀴놀린, 아미노퀴놀린, 아미노퀴나졸린, 피리도[3,2-d]피리미딘-2,4-디아민, 피리미딘-2,4-디아민, 2-아미노이미다졸, 1-알킬-1H-벤즈이미다졸-2-아민, 테트라하이드로피리도피리미딘, 헤테로아로티아디아지드-2,2-디옥사이드, 벤조나프티리딘, 구아노신 유사체, 아데노신 유사체, 티미딘 동종중합체, ssRNA, CpG-A, PolyG10 또는 PolyG3인 약물-링커가 제공된다. 일부 양태에서, 면역 조절제가 TLR8 작용제인 약물-링커가 제공된다. 일부 양태에서, TLR8 작용제가 이미다조퀴놀린, 티아졸로퀴놀린, 아미노퀴놀린, 아미노퀴나졸린, 피리도[3,2-d]피리미딘-2,4-디아민, 피리미딘-2,4-디아민, 2-아미노이미다졸, 1-알킬-1H-벤즈이미다졸-2-아민, 테트라하이드로피리도피리미딘 또는 ssRNA로부터 선택되는 약물-링커가 제공된다. 일부 양태에서, 면역 조절제가 STING 작용제인 약물-링커가 제공된다. 일부 양태에서, 면역 조절제가 RIG-I 작용제인 약물-링커가 제공된다. 일부 양태에서, RIG-I 작용제가 KIN1148, SB-9200, KIN700, KIN600, KIN500, KIN100, KIN101, KIN400 및 KIN2000으로부터 선택되는 약물-링커가 제공된다.
일부 양태에서, 약물-링커가 제공되며, 여기서 약물 유닛은 킬레이트화 리간드이다. 일부 양태에서, 킬레이트화 리간드가 백금(Pt), 루테늄(Ru), 로듐(Rh), 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 몰리브덴(Mo), 티타늄(Ti), 또는 이리듐(Ir); 이트륨-88, 이트륨-90, 테크네튬-99, 구리-67, 레늄-188, 레늄-186, 갈륨-66, 갈륨-67, 인듐-111, 인듐-114, 인듐-115, 루테튬-177, 스트론튬-89, 사라륨-153, 및 납-212와 같은 방사성 동위원소로부터 선택된다.
일부 양태에서, 다음 구조를 갖는 약물-링커가 제공된다:
Figure pct00134
Figure pct00135
Figure pct00136
Figure pct00137
Figure pct00138
Figure pct00139
Figure pct00140
Figure pct00141
Figure pct00142
Figure pct00143
Figure pct00144
Figure pct00145
Figure pct00146
Figure pct00147
Figure pct00148
Figure pct00149
Figure pct00150
Figure pct00151
Figure pct00152
Figure pct00153
Figure pct00154
Figure pct00155
Figure pct00156
Figure pct00157
Figure pct00158
Figure pct00159
Figure pct00160
Figure pct00161
Figure pct00162
여기서, Z 각각은 *에 부착되며 하기로부터 개별적으로 선택된다:
Figure pct00163
Figure pct00164
여기서, Z 각각은 *에 부착되며 하기로부터 개별적으로 선택된다:
Figure pct00165
.
일부 양태에서, 본원에 기재된 임의의 약물-링커에 부착된 표적화 유닛을 포함하는, 접합체가 제공된다. 일부 양태에서, 표적화 유닛이 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로부터 선택되는, 접합체가 제공된다. 일부 양태에서, 표적화 유닛이 단일클론 항체, Fab, Fab', F(ab'), Fv, 이황화물 링크된 Fc, scFv, 단일 도메인 항체, 디아바디, 이중특이적 항체, 또는 다중특이적 항체인, 접합체가 제공된다. 일부 양태에서, 표적화 유닛이 디아바디, DART, 안티칼린, 아피바디, 아비머, DARPin 또는 애드넥틴인, 접합체가 제공된다. 일부 양태에서, 표적화 유닛이 단일특이적인, 접합체가 제공된다. 일부 양태에서, 표적화 유닛이 2가인, 접합체가 제공된다. 일부 양태에서, 표적화 유닛이 이중특이적인, 접합체가 제공된다. 일부 양태에서, 접합체의 평균 약물 로딩(p로드)이 약 1 내지 약 8, 약 2, 약 4, 약 6, 약 8, 약 10, 약 12, 약 14, 약 16, 약 3 내지 약 5, 약 6 내지 약 8, 또는 약 8 내지 약 16인, 접합체가 제공된다.
일부 양태에서, 다음으로부터 선택된 접합체가 제공된다:
Figure pct00167
Figure pct00168
Figure pct00169
Figure pct00170
Figure pct00171
Figure pct00172
Figure pct00173
Figure pct00174
Figure pct00175
Figure pct00176
Figure pct00177
Figure pct00178
Figure pct00179
Figure pct00180
Figure pct00181
Figure pct00182
Figure pct00183
Figure pct00184
Figure pct00185
Figure pct00186
Figure pct00187
Figure pct00188
Figure pct00189
Figure pct00190
Figure pct00191
Figure pct00192
Figure pct00193
Figure pct00194
Figure pct00195
여기서, Z 각각은 *에 부착되며 하기로부터 개별적으로 선택된다:
Figure pct00196
Figure pct00197
여기서, Z 각각은 *에 부착되며 하기로부터 개별적으로 선택된다:
Figure pct00198
Figure pct00199
여기서 Ab는 표적화 유닛이고 n은 p로드이다.
일부 양태에서, 상술한 바와 같은 접합체가 제공되며, 여기서 표적화 유닛은 CD19, CD20, CD30, CD33, CD70, LIV-1 또는 EGFRv3과 같은 표적 분자에 결합한다.
일부 양태에서, 상술한 바와 같은 접합체가 제공되며, 여기서 표적화 유닛은 scFv1-ScFv2, ScFv12-Fc-scFv22, IgG-scFv, DVD-Ig, 트리오맙/쿼드로마, 투-인-원 IgG, scFv2-Fc, TandAb 및 scFv-HSA-scFv로부터 선택된다.
일부 양태에서, 상술한 바와 같은 접합체가 제공되며, 여기서 표적화 유닛은 암 관련 항원, 예컨대 CD19, CD20, CD30, CD33, CD38, CA125, MUC-1, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), CD44 표면 부착 분자, 메조텔린(MLSN), 암배아 항원(CEA), 표피 성장 인자 수용체(EGFR), EGFRvIII, 혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VEGFR2), 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), MAGE-A1, IL-13R-a2, GD2, 1p19q, ABL1, AKT1, ALK, APC, AR, ATM, BRAF, BRCA1, BRCA2, cKIT, cMET, CSF1R, CTNNB1, FGFR1, FGFR2, FLT3, GNA11, GNAQ, GNAS, HRAS, IDH1, IDH2, JAK2, KDR (VEGFR2), KRAS, MGMT, MGMT-Me, MLH1, MPL, NOTCH1, NRAS, PDGFRA, Pgp, PIK3CA, PR, PTEN, RET, RRM1, SMO, SPARC, TLE3, TOP2A, TOPO1, TP53, TS, TUBB3, VHL, CDH1, ERBB4, FBXW7, HNF1A, JAK3, NPM1, PTPN11, RB1, SMAD4, SMARCB1, STK1, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, ROS1, ERCC1, 5T4 (TPBG), B7-H3, CCR7, CD105, CD22, CD46, CD47, CD56, CD70, CD71, CD79b, CDH6, CLDN6, CLDN18.2, CLEC12A, DLL3, DR5, ERBB3 (HER3), EPCAM, FOLR1, IGF1R, IL2RA (CD25), IL3RA, ITGB6, LIV-1, LRRC15, 메조텔린(MSLN), NaPi2b(SLC34A2), 넥틴-4, PTK7, ROR1, SEZ6, SLC44A4, SLITRK6, 조직 인자(TF), TROP2 또는 B7-H4이다
일부 양태에서, 상술한 바와 같은 접합체가 제공되며, 여기서 표적화 유닛은 리툭시맙(Rituxan®), 트라스투주맙(Herceptin®), 페르투주맙(Perjeta®), 베바시주맙(Avastin®), 라니비주맙(Lucentis®), 세툭시맙(Erbitux®), 알렘투주맙(Campath®), 파니투무맙(Vectibix®), 이브리투모맙 티욱세탄(Zevalin®), 토시투모맙(Bexxar®), 이필리무맙, 잘루투무맙, 달로투주맙, 피기투무맙, 라무시루맙, 갈릭시맙, 팔레투주맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙(Arzerra®), 토시투무맙, 이브리투모맙, CD20 항체 2F2(HuMax-CD20), 7D8, IgM2C6, IgG1 2C6, 11B8, B1, 2H7, LT20, 1FS 또는 AT80, 다클리주맙(Zenapax®); 또는 클론 A9E4, F1G4, AT2G7, GNRH03 또는 GNRHR2와 같은 항-LHRH 수용체 항체를 포함하는, 항체 또는 이의 단편이다.
일부 양태에서, 상술한 바와 같은 접합체가 제공되며, 여기서 표적화 유닛은 항체 F131이고 약물-링커는 LD038이다. 특정 양태에서, 표적화 유닛은 항체 F131(VH 서열 번호: 26 및 VL 서열 번호: 27)이다.
일부 양태에서, 상술한 바와 같은 접합체가 제공되며, 여기서 표적화 유닛은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는 항체이고, VH 영역은 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역에 배치된 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, VL 영역은 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역에 배치된 LCDR1, LCDR 및 LCDR3을 포함하고, VH 및 VL CDR은 하기로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열 세트로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다: (a) 각각, 서열 번호:30, 서열 번호:31, 서열 번호:32, 서열 번호:33, 서열 번호:34 및 서열 번호:35; 및 (b) 각각, 서열 번호:36, 서열 번호:31, 서열 번호:37, 서열 번호:38, 서열 번호:39 및 서열 번호:40. 특정 양태에서, VH 및 VL 영역은 각각 서열 번호:26 및 서열 번호:27로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열 쌍으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고; 여기서 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역은 프레임워크 영역에서 1 내지 8개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 선택적으로 변형된다. 특정 양태에서, 항체는 F131이고 약물-링커는 LD038이다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 임의의 접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물이 제공된다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 임의의 접합체 또는 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 대상체는 암 또는 자가면역 질환을 앓고 있고, 접합체는 암 또는 자가면역 질환과 관련된 표적 항원에 결합한다.
본 발명의 이러한 측면 및 기타 측면은 다음의 상세한 설명, 특정 양태의 비제한적인 예 및 첨부된 도면을 참조하여 더 완전히 이해될 수 있다.
도 1a. OV90 세포에 대한 항-huFOLR-1 접합체의 시험관내 세포독성.
도 1b. OVCAR-3 세포에 대한 항-huFOLR-1 접합체의 시험관내 세포독성.
도 1c. NCI-H292 세포에 대한 항-huFOLR-1 접합체의 시험관내 세포독성.
도 2. 인간 항-huFOLR1 항체의 PA038 접합체의 생체내 활성을 테스트하였다. 약 117mm3의 OV90 이종이식편이 확립된 마우스에게 종양 세포 접종 후 8일째부터 접합체 또는 PBS를 kg당 5mg 정맥 주사하여 2주 동안 4회 투여했다. 세포 접종 후 시간(일)에 대한 mm3 단위의 평균 종양 부피를 플롯팅했다. (N=6, 평균 ± SEM)
도 3. 인간 항-huFOLR1 항체의 PA038 접합체의 생체내 활성을 테스트하였다. 약 123mm3의 NCI-H292 이종이식편이 확립된 마우스에게 세포 접종 후 11일째부터 접합체 또는 PBS를 kg당 5mg 정맥 주사하여 2주 동안 4회 투여했다. 세포 접종 후 시간(일)에 대한 mm3 단위의 평균 종양 부피를 플롯팅했다. (N=6, 평균 ± SEM)
도 4. 인간 항-huFOLR1 항체의 PA038 접합체의 생체내 활성을 테스트하였다. 약 110mm3의 OV90 이종이식편이 확립된 마우스에게 세포 접종 후 13일째부터 접합체 또는 PBS를 kg당 5mg 정맥 주사하여 2주 동안 4회 투여했다. 세포 접종 후 시간(일)에 대한 mm3 단위의 평균 종양 부피를 플롯팅했다. (N=6, 평균 ± SEM)
도 5. 항-huFOLR-1 접합체 F131-LD038 및 네이키드(naked) Ab F131의 PK 프로파일을 3 mg/kg(N = 3; 평균 ± SD)에서 평가했다.
도 6. Hela 세포에 대한 항-FOLR1 항체 결합의 비교.
도 7. RPTEC/TERT1 세포에 대한 항-FOLR1 항체 결합 능력의 비교.
도 8. Hela 세포에 대한 항-FOLR1 항체의 용량 의존적 결합.
도 9. RPTEC/TERT1 세포에 대한 항-FOLR1 항체의 용량 의존적 결합.
도 10. Hela 세포로의 항-FOLR1 항체의 내재화.
도 11. RPTEC/TERT1 세포로의 항-FOLR1 항체의 내재화.
도 12a. 종양 세포주에서 F131 내재화.
도 12b. 종양 세포주에서 F131-LD038 내재화.
도 13a. KB에 대한 시험관내 세포 독성.
도 13b. OVCAR3에 대한 시험관내 세포 독성.
도 13c. JEG-3에 대한 시험관내 세포 독성.
도 14a. OVCAR-3에 대한 CDX에서 F131 및 F131-LD038의 생체내 효능.
도 14b. KB에 대한 CDX에서 F131 및 F131-LD038의 생체내 효능.
도 14c. HCC827에 대한 CDX에서 F131 및 F131-LD038의 생체내 효능.
도 14d. H441에 대한 CDX에서 F131 및 F131-LD038의 생체내 효능.
도 14e. OV90에 대한 CDX에서 F131 및 F131-LD038의 생체내 효능.
도 15a. KB에 대한 CDX에서 F131-038 및 기타 접합체의 생체내 효능.
도 15b. KB에 대한 CDX에서 F131 접합체의 생체내 효능.
도 16a. F131 및 접합체의 쥐 모델에서의 PK 연구.
도 16b. F131 및 접합체의 쥐 모델에서의 PK 연구.
도 16c. F131 및 접합체의 쥐 모델에서의 PK 연구.
도 17a. 파일럿 시노몰구스 독성 연구에서 F131-데룩스테칸(F131-deruxtecan) 및 F131-LD038 내약성.
도 17b. 파일럿 시노몰구스 독성 연구에서 F131-데룩스테칸 및 F131-LD038 내약성.
도 18. 파일럿 시노몰구스 독성 연구에서의 F131-데룩스테칸 및 F131-LD038 PK.
정의
편의를 위해, 명세서, 실시예 및 청구범위에서의 특정 용어가 여기에 정의된다. 달리 명시되지 않거나 문맥에서 암시되지 않는 한, 다음 용어 및 문구는 아래 제공된 의미를 갖는다. 정의는 특정 양태를 설명하는 데 도움을 주기 위해 제공되었으며 청구된 발명을 제한하려는 의도는 없다. 왜냐하면 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 제한되기 때문이다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 달리 표시되지 않는 한, 용어 단수 관사["a" 및 "an"]는 "하나", "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 간주된다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 본원에서 사용되는 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함한다.
문맥상 달리 요구하지 않는 한, 설명 및 청구범위 전반에 걸쳐, "포함하다", "포함하는" 등의 용어는 배타적이거나 총체적인 의미가 아닌 포괄적인 의미로 해석되어야 한다; 즉, "포함하지만, 이에 국한되지는 않는다"는 의미이다.
용어 "감소된(decreased)", "감소하다(reduce)", "감소된(reduced)", "감소", "감소(decrease)" 및 "억제하다"는 모두 기준에 비해 통계적으로 유의미한 양만큼의 감소를 의미하기 위해 일반적으로 본원에서 사용된다.
용어 "증가된", "증가하다" 또는 "강화하다" 또는 "활성화하다"는 모두 일반적으로 기준에 비해 정적으로 유의미한 양만큼의 증가를 의미하기 위해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 인접한 잔기의 알파-아미노 및 카르복실기 사이의 펩타이드 결합에 의해 각각 서로 연결된 일련의 아미노산 잔기를 지정하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "단백질" 및 "폴리펩타이드"라는 용어는 또한 크기나 기능에 관계없이 변형된 아미노산(예: 인산화, 당화, 글리코실화 등) 및 아미노산 유사체를 포함하는 아미노산의 중합체를 의미한다. "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 상대적으로 큰 폴리펩타이드와 관련하여 종종 사용되는 반면, "펩타이드"라는 용어는 작은 폴리펩타이드와 관련하여 종종 사용되지만, 당해 분야에서 이들 용어의 용법은 중복된다. "단백질" 및 "폴리펩타이드"라는 용어는 코딩된 유전자 생성물 및 이의 단편을 언급할 때 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 예시적인 폴리펩타이드 또는 단백질에는 유전자 생성물, 자연 발생 단백질, 상동체, 오르토로그, 파라로그, 단편 및 전술한 것의 기타 균등물, 변이체, 단편 및 유사체가 포함된다.
본원에 사용된 "에피토프"는 면역글로불린 VH/VL 쌍에 의해 통상적으로 결합되는 아미노산, 예를 들어 항체, 이의 항원 결합 부분 및 본원에 기재된 기타 결합제를 지칭한다. 다른 결합제는 비항체 스캐폴드(scaffold)를 포함한다.에피토프는 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 연속적인 아미노산 또는 비연속 아미노산으로부터 폴리펩타이드 상에 형성될 수 있다. 연속적 아미노산으로부터 형성된에피토프는 일반적으로 변성 용매에 노출되면 유지되는 반면, 3차 접힘에 의해 형성된에피토프는 일반적으로 변성 용매로 처리하면 손실된다.에피토프는 전형적으로 독특한 공간 형태로 적어도 3개, 더 일반적으로는 적어도 5개, 약 9개, 또는 약 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다.에피토프는 항체, 이의 항원 결합 부분 및 기타 결합제에 대한 최소 결합 부위를 정의하며, 따라서 항체, 이의 항원 결합 부분 또는 기타 면역글로불린 기반 결합제의 특이성의 표적을 나타낸다. 단일 도메인 항체의 경우,에피토프는 분리된 가변 도메인에 의해 결합된 구조 유닛을 나타낸다.
본원에 사용된 "특이적으로 결합하다"는 본원에 기재된 결합제(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 부분)가 10-5 M(10000 nM)의 KD 또는 그 이하, 예를 들어 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M 또는 그 이하로 표적에 결합하는 능력을 의미한다. 본원에 언급된 "특이적으로 결합하다"는 또한 본원에 기재된 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 비항체 스캐폴드)가 10-5 M(10000 nM)의 KD 또는 그 이하, 예를 들어 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M 또는 그 이하로 표적에 결합하는 능력을 의미한다. 특이적 결합은 예를 들어 항체, 항원 결합 부분 또는 다른 결합제의 친화도 및 결합력, 그리고 표적 폴리펩타이드의 농도에 의해 영향을 받을 수 있다. 당업자는 적합한 세포 결합 분석에서 항체 또는 결합제의 적정과 같은, 임의의 적합한 방법을 사용하여 본원에 기재된 항체, 항원 결합 부분 및 기타 결합제가 표적 분자에 선택적으로 결합하는 적절한 조건을 결정할 수 있다. 표적 분자에 특이적으로 결합된 결합제는 비유사 경쟁자에 의해 대체되지 않는다. 특정 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 다른 결합제는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 표적 분자를 우선적으로 인식할 때 표적 분자에 특이적으로 결합한다고 말한다. 특이적 결합은 예를 들어 항체, 항원 결합 부분 또는 비항체 스캐폴드의 친화도 및 결합력, 그리고 표적 폴리펩타이드의 농도에 의해 영향을 받을 수 있다. 당업자는 적합한 세포 결합 분석에서 항체 또는 비항체 스캐폴드의 적정과 같은, 임의의 적합한 방법을 사용하여 본원에 기재된 항체, 항원 결합 부분 및 비항체 스캐폴드가 표적 분자에 선택적으로 결합하는 적절한 조건을 결정할 수 있다. 표적 분자에 특이적으로 결합된 분자는 비유사 경쟁자에 의해 대체되지 않는다. 특정 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 비항체 스캐폴드는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 표적 분자를 우선적으로 인식할 때 표적 분자에 특이적으로 결합한다고 말한다.
달리 표시되지 않는 한, 용어 "알킬"은 그 자체로 또는 다른 용어의 일부로서, 표시된 수의 탄소 원자를 갖는 치환되거나 치환되지 않은, 직쇄 또는 분지형의 포화 탄화수소를 의미한다 (예를 들어, "C1-C5 알킬", "-C1-C8 알킬" 또는 "-C1-C10" 알킬은 각각 탄소수 1 내지 5, 1 내지 8, 또는 1 내지 10을 갖는 알킬기를 의미한다). 예에는 메틸(Me, -CH3),에틸(Et, -CH2CH3), 1-프로필(n-Pr, n-프로필, -CH2CH2CH3), 2-프로필(i-Pr, i-프로필, -CH(CH3))2), 1-부틸(n-Bu, n-부틸, -CH2CH2CH2CH3), 2-메틸-1-프로필(i-Bu, i-부틸, -CH2CH(CH3)2), 2-부틸(s-Bu, s-부틸, -CH(CH3)CH2CH3), 2-메틸-2-프로필(t-Bu, t-부틸, -C(CH3)3), 1-펜틸(n-펜틸, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-펜틸(-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-펜틸(--CH(CH2CH3)2), 2-메틸-2-부틸(-C(CH3)2CH2CH3), 3-메틸-2-부틸(-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-메틸-1-부틸(-CH2CH2CH(CH3)2), 2-메틸-1-부틸(-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-헥실(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-헥실(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-헥실(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-메틸-2-펜틸(-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-메틸-2-펜틸(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-메틸-3-펜틸(-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-메틸-3-펜틸(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-디메틸-2-부틸(-C(CH3)2CH(CH3)2) 및 3,3-디메틸-2-부틸(-CH(CH3)C(CH3)3)이 포함된다.
달리 명시하지 않는 한, "알케닐"은 그 자체로 또는 다른 용어의 일부로서 하나 이상의 불포화 부위(즉, 탄소-탄소, sp2 이중 결합)를 갖는 C2-C8 치환되거나 비치환된 직쇄 또는 분지형 탄화수소를 지칭한다. 예에는에틸렌 또는 비닐(-CH=CH2), 알릴(-CH2CH=CH2), 사이클로펜테닐(-C5H7) 및 5-헥세닐(-CH2CH2CH2CH2CH=CH2)이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
달리 명시되지 않는 한, "알키닐"은 그 자체로 또는 다른 용어의 일부로서 하나 이상의 불포화 부위(즉, 탄소-탄소, sp 삼중 결합)를 갖는 C2-C8, 치환되거나 비치환된 직쇄 또는 분지형 탄화수소를 지칭한다. 예에는 아세틸레닉 및 프로파길이 포함되지만, 이에 국한되지는 않는다.
달리 명시하지 않는 한, "알킬렌"은 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖고, 모 알칸의 동일하거나 2개의 다른 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자를 제거하여 유도된 2개의 1가 라디칼 중심을 갖는 포화된, 분지형 또는 직쇄 또는 탄화수소 라디칼을 의미한다. 일반적인 알킬렌 라디칼에는 메틸렌(-CH2-), 1,2-에틸(-CH2CH2-), 1,3-프로필(-CH2CH2CH2-), 1,4-부틸(-CH2CH2CH2CH2-) 등이 포함되지만, 이에 국한되지 않는다.
달리 명시하지 않는 한, "알케닐렌"은 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖고, 모 알켄의 동일하거나 두 개의 다른 탄소 원자로부터 두 개의 수소 원자를 제거하여 유도된 2개의 1가 라디칼 중심을 갖는 불포화된, 분지형 또는 직쇄 탄화수소 라디칼을 의미한다. 전형적인 알케닐렌 라디칼에는 1,2-에틸렌(-CH=CH-)이 포함되지만, 이에 국한되지는 않는다.
달리 명시하지 않는 한, "알키닐렌"은 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖고, 모 알킨의 동일하거나 두 개의 다른 탄소 원자로부터 두 개의 수소 원자를 제거하여 유도된 2개의 1가 라디칼 중심을 갖는 불포화된, 분지형 또는 직쇄 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 의미한다. 전형적인 알키닐렌 라디칼에는 아세틸렌, 프로파르길 및 4-펜티닐이 포함되지만, 이에 국한되지는 않는다.
달리 명시하지 않는 한, 용어 "헤테로알킬"은 단독으로 또는 다른 용어와 조합하여 치환되거나 치환되지 않은 안정한 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소, 또는 이들의 조합, 포화된 그리고 1 내지 10개의, 바람직하게는 1 내지 3개의 O, N, Si 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자이고, 여기서 질소 및 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 선택적으로 4급화될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N 및 S는 헤테로알킬기의 임의의 내부 위치(즉, 주 쇄의 일부로서) 또는 알킬기가 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치에 위치할 수 있다. 헤테로원자 Si는 알킬기가 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치를 포함하여 헤테로알킬기의 임의의 위치에 위치할 수 있다. 헤테로알킬의 예는 하기를 포함한다: -CH2CH2OCH3, -CH2CH2NHCH3, -CH2CH2N(CH3)CH3, -CH2SCH2CH3, CH2CH2S(O)CH3, -CH2CH2S(O)2CH3, 및 -Si(CH3)3-. 최대 2개의 헤테로원자가 연속적일 수 있다(예: CH2NHOCH3 및 CH2OSi(CH3)3). 일부 양태에서, C1 내지 C4 헤테로알킬은 1 내지 4개의 탄소 원자 및 1 또는 2개의 헤테로원자를 갖고, C1 내지 C3 헤테로알킬은 1 내지 3개의 탄소 원자 및 1 또는 2개의 헤테로원자를 갖는다.
달리 명시하지 않는 한, 용어 "헤테로알케닐" 및 "헤테로알키닐"은 단독으로 또는 다른 용어와 조합되어, 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 3개의 O, N, Si 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤테로원자를 갖는 치환 또는 비치환된 안정한 직쇄 또는 분지쇄 알케닐 또는 알키닐을 의미한다. 여기서 질소 및 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 선택적으로 4차화될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N 및 S는 헤테로알케닐 또는 헤테로알키닐 기의 임의의 내부 위치(즉, 주쇄의 일부로서)에 위치하거나 알킬 기가 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치에 위치할 수 있다. 헤테로원자 Si는 알킬기가 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치를 포함하여 헤테로알케닐 또는 헤테로알키닐 기의 임의의 위치에 위치할 수 있다.
달리 명시하지 않는 한, 용어 "헤테로알킬렌"은 그 자체로 또는 다른 치환체의 일부로서 (상기 논의된 바와 같이) 헤테로알킬로부터 유도된 치환 또는 비치환 2가 기를 의미하고, -CH2CH2SCH2CH2- 및 -CH2SCH2CH2NHCH2-로 예시된다. 일부 양태에서, C1 내지 C4 헤테로알킬렌은 1 내지 4개의 탄소 원자 및 1 또는 2개의 헤테로원자를 갖고, C1 내지 C3 헤테로알킬렌은 1 내지 3개의 탄소 원자 및 1 또는 2개의 헤테로원자를 갖는다. 헤테로알킬렌기의 경우, 헤테로원자는 쇄 말단 중 하나 또는 둘 다를 차지할 수도 있다. 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 연결기의 경우, 연결기의 배향이 암시되지 않는다.
달리 명시하지 않는 한, 용어 "헤테로알케닐렌" 및 "헤테로알키닐렌"은 그 자체로서 또는 다른 치환체의 일부로서 (상기 논의된 바와 같은) 헤테로알케닐 또는 헤테로알키닐로부터 유도된 치환되거나 또는 비치환된 2가 기를 지칭한다. 일부 양태에서, C2 내지 C4 헤테로알케닐렌 또는 헤테로알키닐렌은 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다. 헤테로알케닐렌 및 헤테로알키닐렌 기의 경우, 헤테로원자가 쇄 말단 중 하나 또는 둘 모두를 차지할 수 있다. 더욱이, 알킬렌 및 헤테로알케닐렌 및 헤테로알키닐렌 연결기의 경우, 연결기의 배향이 표시되지 않는다.
달리 표시되지 않는 한, "C3-C8 카르보사이클"은 그 자체로 또는 다른 용어의 일부로서, 모 환 계(parent ring system)의 환 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도된, 치환되거나 또는 비치환된 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-원의 1가, 치환 또는 비치환, 포화 또는 불포화의 비방향족 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 카르보사이클릭 환을 의미한다. 대표적인 -C3-C8 카르보사이클에는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜타디에닐, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 1,3-사이클로헥사디에닐, 1,4-사이클로헥사디에닐, 사이클로헵틸, 1,3-사이클로헵타디에닐, 1,3,5-사이클로헵타트리에닐, 사이클로옥틸 및 사이클로옥타디에닐이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
달리 명시하지 않는 한, "C3-C8 카르보사이클로"는 그 자체로 또는 다른 용어의 일부로서 상기 정의된 치환되거나 또는 비치환된 C3-C8 카르보사이클기를 지칭하며, 여기서 카르보사이클 기의 또 다른 수소 원자는 결합(즉, 2가)으로 대체된다.
달리 명시되지 않는 한, "C3-C10 카르보사이클"은 그 자체로 또는 다른 용어의 일부로서, 모 환 계의 환 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도된, 치환되거나 또는 비치환된 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 또는 10-원의 1가, 치환 또는 비치환, 포화 또는 불포화 비방향족 모노사이클릭, 바이사이클릭, 또는 트리사이클릭 카르보사이클릭 환을 의미한다. 대표적인 -C3-C10 카르보사이클에는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜타디에닐, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 1,3-사이클로헥사디에닐, 1,4-사이클로헥사디에닐, 사이클로헵틸, 1,3-사이클로헵타디에닐, 1,3,5-사이클로헵타트리에닐, 사이클로옥틸 및 사이클로옥타디에닐이 포함되나 이에 제한되지 않는다. -C3-C10 카르보사이클은 BCN(바이사이클로[6.1.0]노닌) 및 DBCO(디벤조사이클로옥틴)를 포함하여, 국제공개번호 WO2011/136645(본 명세서에 참조로 통합됨)에 개시된 융합된 사이클로옥틴 화합물과 같은 융합된 사이클로옥틴 카르보사이클을 더 포함할 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, "C3-C8 헤테로사이클"은 그 자체로 또는 다른 용어의 일부로서, 3 내지 8개의 탄소 원자(환 구성원이라고도 함) 및 N, O, P 또는 S로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자 환 구성원을 가지며, 모 환 계의 환 원자에서 1개의 수소 원자를 제거하여 유도된, 치환되거나 또는 비치환된 1가의, 치환되거나 또는 비치환된 방향족 또는 비방향족 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 환 계를 의미한다. 헤테로사이클의 하나 이상의 N, C 또는 S 원자는 산화될 수 있다. 헤테로원자를 포함하는 환은 방향족이거나 비방향족일 수 있다. 달리 명시하지 않는 한, 헤테로사이클은 안정한 구조를 초래하는 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에서 그의 펜던트 기에 부착된다. C3-C8 헤테로사이클의 대표적인 예는 피롤리디닐, 아제티디닐, 피페리디닐, 모르폴리닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 벤조푸라닐, 벤조티오펜, 인돌릴, 벤조피라졸릴, 피롤릴, 티오페닐(티오펜), 푸라닐, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리미디닐, 피리디닐, 피라지닐, 피리다지닐, 이소티아졸릴 및 이속사졸릴을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 달리 명시하지 않는 한, 용어 "헤테로카르보사이클"은 본원에 기재된 용어 "헤테로사이클" 또는 "헤테로사이클로"와 동의어이다.
달리 명시하지 않는 한, "C3-C8 헤테로사이클로"는 그 자체로 또는 다른 용어의 일부로서, 상기 정의된 치환되거나 또는 치환되지 않은 C3-C8 헤테로사이클기를 지칭하고, 여기서 헤테로사이클기의 수소 원자 중 하나가 결합(즉, 2가)으로 대체된다.
달리 명시하지 않는 한, "아릴"은 그 자체로 또는 다른 용어의 일부로서, 모 방향족 환 계의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거하여 유도된 6 내지 20개 탄소(바람직하게는 6 내지 14개 탄소) 원자의 치환되거나 또는 비치환된 1가 카르보사이클릭 방향족 탄화수소 라디칼을 의미한. 일부 아릴 기는 예시적인 구조에서 "Ar"로 표시된다. 전형적인 아릴 기는, 벤젠, 치환된 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 바이페닐 등으로부터 유도된 라디칼을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 아릴 기는 페닐 기이다.
달리 명시하지 않는 한, "아릴렌"은 그 자체로 또는 다른 용어의 일부로서, 상기 정의된 바와 같이 비치환되거나 또는 치환된 아릴 기이고, 여기서 아릴 기의 수소 원자 중 하나가 결합(즉, 2가)으로 대체되고, 오르토, 메타 또는 파라 배향일 수 있다.
달리 명시하지 않는 한, "헤테로아릴" 및 "헤테로사이클"은 하나 이상의 환 원자가 헤테로원자, 예를 들어, 질소, 산소 및 황인, 환 계를 지칭한다. 헤테로사이클 라디칼은 1 내지 20개의 탄소 원자, 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함한다. 헤테로사이클은 3 내지 7개의 환 구성원(2 내지 6개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자)을 갖는 모노사이클일 수 있거나, 또는 7 내지 10개의 환 구성원(4 내지 9개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자)을 갖는 바이사이클, 예를 들어, 바이사이클로 [4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템일 수 있다.
달리 명시하지 않는 한, "헤테로아릴렌"은 그 자체로 또는 다른 용어의 일부로서, 상기 정의된 바와 같이 비치환되거나 또는 치환된 헤테로아릴 기이고, 여기서 헤테로아릴 기의 수소 원자 중 하나가 결합(즉, 2가)으로 대체된다.
달리 명시되지 않는 한, "카르복실"은 COOH 또는 COO-M+를 의미하며, 여기서 M+는 양이온이다.
달리 명시하지 않는 한, "옥소"는 (C=O)를 의미한다.
달리 명시하지 않는 한, "치환된 알킬" 및 "치환된 아릴"은 각각 하나 이상의 수소 원자가 각각 독립적으로 치환체로 대체된 알킬 및 아릴을 의미한다. 일반적인 치환체에는 -X, -R10, -O-, -OR10, -SR10, -S-, -NR10 2, -NR10 3, =NR10, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -NR10C(=O)R10, -C(=O)R10, -C(=O)NR10 2, -SO3 -, -SO3H, -S(=O)2R10, -OS(=O)2OR10, -S(=O)2NR10, -S(=O)R10, -OP(=O)(OR10)2, -P(=O)(OR10)2, -PO- 3, -PO3H2, -AsO2H2, -C(=O)R10, -C(=O)X, -C(=S)R10, -CO2R10, -CO2 -, -C(=S)OR10, C(=O)SR10, C(=S)SR10, C(=O)NR10 2, C(=S)NR10 2, 또는 C(=NR10)NR10 2가 포함되나 이에 제한되지 않으며, 여기서 각 X는 독립적으로 할로겐(-F, -Cl, -Br 또는 -I)이고, 각각의 R10은 독립적으로 -H, -C1-C20 알킬, -C6-C20 아릴, -C3-C14 헤테로사이클, 보호기 또는 전구약물 모이어티이다. 일반적인 치환체에는 (=O)도 포함된다. 상기 기재된 바와 같은 알킬렌, 카르보사이클, 카르보사이클로, 아릴렌, 헤테로알킬, 헤테로알킬렌, 헤테로사이클 및 헤테로사이클 기는 또한 유사하게 치환될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, "폴리하이드록실 기"는 탄소 쇄의 탄소 원자 상의 수소에 대한 하이드록실 기의 치환을 2개 이상, 또는 3개 이상 포함하는 알킬, 알킬렌, 카르보사이클 또는 카르보사이클로 기를 지칭한다. 일부 양태에서, 폴리하이드록실 기는 적어도 3개의 하이드록실 기를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리하이드록실 기는 탄소 원자당 단 하나의 하이드록실 기만을 함유하는 탄소 원자를 포함한다. 폴리하이드록실 기는 하이드록실로 치환되지 않은 하나 이상의 탄소 원자를 함유할 수 있다. 폴리하이드록실 기는 각각의 탄소 원자가 하이드록실 기로 치환될 수 있다. 폴리하이드록실 기의 예에는 C6 또는 C5 당, 예를 들어 글루코스, 리보스, 갈락토스, 만노스, 아라비노스, 2-데옥시글루코스, 글리세르알데하이드,에리트로스, 트레오스, 자일로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 알도스 및 케토스; 당 산, 예를 들어 글루콘산, 알돈산, 우론산 또는 울로손산; 및 아미노 당, 예를 들어 글루코사민, N-아세틸글루코사민, 갈락토사민 및 N-아세틸갈락토사민과 같은 단당류의 선형(비환형) 또는 환형 형태을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리하이드록실 기는 이당류 및 다당류의 선형 또는 환형 형태를 포함한다.
문맥상 달리 나타내지 않는 한, "선택적으로 치환된"은 본원에 정의되거나 개시된 바와 같은 알킬, 알케닐, 알키닐, 알킬아릴, 아릴알킬 헤테로사이클, 아릴, 헤테로아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 또는 기타 치환체, 모이어티 또는 기를 지칭하며, 여기서 치환체, 모이어티 또는 기의 해당 수소 원자(들)는 선택적으로 상이한 모이어티(들) 또는 기(들)로 대체되었거나, 또는 이러한 치환체, 모이어티 또는 기 중 하나를 포함하는 지환식 탄소 쇄는 해당 쇄의 탄소 원자(들)를 상이한 모이어티(들) 또는 기(들)로 대체함으로써 중단된다. 일부 측면에서, 알켄 작용기는 알킬 치환체의 2개의 인접한 sp3 탄소 원자를 대체하며, 단, 알킬 모이어티의 라디칼 탄소는 치환되지 않으므로 선택적으로 치환된 알킬은 불포화 알킬 치환체다.
전술한 치환체, 모이어티 또는 기 중 어느 하나에서 수소(들)를 대체하는 선택적 치환체는 아릴, 헤테로아릴, 하이드록실, 알콕시, 아릴옥시, 시아노, 할로겐, 니트로, 플루오로알콕시, 및 일치환, 이치환 및 삼치환된 아미노기를 포함하는 아미노, 및 이들의 보호된 유도체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 -X, -OR', -SR', -NH2, -N(R')(R"), -N(R")3, =NR, -CX3, -CN, -NO2, - NR'C(=O)H, -NR'C(=O)R, -NR'C(=O)R", -C(=O)R', -C(=O)NH2, -C(=O)N(R')R", -S(=O)2R", -S(=O)2NH2, -S(=O)2N(R')R", -S(=O)2NH2, -S(=O)2N(R')R", -S(=O)2OR', -S(=O)R", -OP(=O)(OR')(OR"), -OP(OH)3, -P(=O)(OR')(OR"), -PO3H2, -C(=O)R', -C(=S)R", -CO2R', -C(=S)OR", -C(=O)SR', -C(=S)SR', -C(=S)NH2, -C(=S)N(R')(R")2, -C(=NR')NH2, -C(=NR')N(R')R" 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 각각의 X는 할로겐: -F, -Cl, -Br 및 -I로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 각각의 R"은 독립적으로 C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐, C2-C20 알키닐, C6-C24 아릴, C3-C24 헤테로사이클릴(C5-C24 헤테로아릴 포함), 보호기, 및 전구약물 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 두 개의 R"은 이들이 부착된 헤테로원자와 함께 헤테로사이클릴을 정의하고; R'는 수소 또는 R"이고, 여기서 R"은 C1-C20 알킬, C6-C24 아릴, C3-C24 헤테로사이클릴(C5-C24 헤테로아릴 포함) 및 보호기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
전형적으로, 선택적 치환체는 -X, -OH, -OR", -SH, -SR", -NH2, -NH(R"), -NR'(R")2, -N(R")3, =NH, =NR", -CX3, -CN, -NO2, -NR'C(=O)H, NR'C(=O)R", -CO2H, -C(=O)H, -C(=O)R", -C(=O)NH2, -C(=O)NR'R"- -S(=O)2R", -S(=O)2NH2, -S(=O)2N(R')R", -S(=O)2NH2, -S(=O)2N(R')(R"), -S(=O)2OR', -S(=O)R", -C(=S)R", -C(=S)NH2, -C(=S)N(R')R", -C(=NR')N(R")2 및 이의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 각각의 X는 독립적으로 -F 및 -Cl로 이루어진 군에서 선택되고, R"은 일반적으로 C1-C6 알킬, C6-C10 아릴, C3-C10 헤테로사이클릴(C5-C10 헤테로아릴 포함) 및 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되고; R'은 독립적으로 수소, C1-C6 알킬, C6-C10 아릴, C3-C10 헤테로사이클릴(C5-C10 헤테로아릴 포함), 및 R"로부터 독립적으로 선택된 보호기이다. 더욱 일반적으로, 치환체는 -X, -R", -OH, -OR", -NH, -NH(R"), -N(R")2, -N(R")3, -CX3, -NO2, -NHC(=O)H, -NHC(=O)R", -C(=O)NH2, -C(=O)NHR", -C(=O)N(R")2, -CO2H, -CO2R", -C(=O)H, -C(=O)R", -C(=O)NH2, -C(=O)NH(R"), -C (=O)N(R")2, -C(=NR')NH2, -C(=NR')NH(R"), -C(=NR')N(R")2, 보호기 및 이의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 각각의 X는 -F이고, R"은 C1-C6 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴 및 보호기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; R'은 수소, C1-C6 알킬 및 R"로부터 독립적으로 선택된 보호기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 사용된 어구 "약제학적으로 허용되는 염"은 화합물(예를 들어, 링커, 약물 링커 또는 접합체)의 약제학적적으로 허용되는 유기 또는 무기 염을 의미한다. 화합물은 전형적으로 적어도 하나의 아미노기를 함유하며, 이에 따라 이 아미노기와 함께 산 부가 염이 형성될 수 있다. 예시적인 염에는 황산염, 구연산염, 아세트산염, 옥살산염, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 질산염, 중황산염, 인산염, 산성 인산염, 이소니코틴산염, 젖산염, 살리실산염, 산성 구연산염, 주석산염, 올레산염, 타닌산염, 판토텐산염, 산성주석산염, 아스코브산염, 숙신산염, 린레산염, 젠티시네이트(gentisinate), 푸마르산염, 글루콘산염, 글루쿠론산염, 당산염, 포름산염, 벤조산염, 글루탐산염, 메탄설폰산염, 에탄설폰산염, 벤젠설폰산염, 톨루엔설폰산염 및 파모에이트(즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-하이드록시)-3-나프토에이트)) 염을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용되는 염은 아세테이트 이온, 숙시네이트 이온 또는 기타 반대이온과 같은 또 다른 분자의 포함을 포함할 수 있다. 반대이온은 모 화합물의 전하를 안정화시키는 임의의 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 또한, 약제학적으로 허용되는 염은 그 구조에 하나 이상의 하전된 원자를 가질 수 있다. 다수의 하전된 원자가 약제학적으로 허용되는 염의 일부인 경우에는 다수의 반대이온을 가질 수 있다. 따라서, 약제학적으로 허용되는 염은 하나 이상의 하전된 원자 및/또는 하나 이상의 반대이온을 가질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "~로 본질적으로 이루어지는"은 주어진 양태에 필요한 요소들을 지칭한다. 이 용어는 해당 양태의 기본적이고 새로운 또는 기능적 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 요소의 존재를 허용한다.
본원에 사용된 용어 "~로 이루어진"은 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 방법 및 이들의 각각의 구성요소를 의미하며, 이는 양태의 설명에서 언급되지 않은 임의의 요소를 제외한다.
예시, 또는 달리 명시된 경우를 제외하고, 본원에 사용된 성분 또는 반응 조건의 양을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 "약"이라는 용어로 수정된 것으로 이해해야 한다. 백분율과 관련하여 사용될 때 "약"이라는 용어는 +/-1%를 의미할 수 있다.
"통계적으로 유의미한" 또는 "유의하게"라는 용어는 통계적 유의성을 나타내며 일반적으로 기준 값 위 또는 아래의 2 표준 편차(2SD) 차이를 의미한다.
본 발명의 다양한 측면의 설명 내에서 기타 용어가 본원에서 정의된다.
상세한 설명
본원에 제공된 링커는, 당 유닛, PEG 유닛 및/또는 카르복실 유닛과 같은 극성 유닛을 포함하는 링커이다. 또한, 본원에 추가로 설명된 바와 같이, 세포독성제 또는 면역 조절제와 같은 약물 유닛을 포함하는 표적 유닛-링커, 약물 링커 및 이들의 접합체가 제공된다.
일부 양태에서, 하기 화학식 (I)에 도시된 바와 같이, 링커는 직접적으로 또는 선택적 아미노산 유닛(AA)을 통해 링커 서브유닛(L2)에 부착된 스트레처 유닛(L1)을 포함하는 일반 화학식 (I) 또는 그의 염을 갖는다:
여기서, s는 0 또는 1이고, 물결()선은 표적 유닛(L) 도는 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다. 상기 링커는 적어도 하나의 극성 유닛과 함께 아미노산 유닛, 링커 서브유닛 L2 또는 둘 다를 포함한다. 각 극성 유닛은 당 유닛, PEG 유닛 또는 카르복실 유닛일 수 있다. 링커는 적어도 하나의 당 유닛, 적어도 하나의 PEG 유닛, 적어도 하나의 카르복실 유닛 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 링커 서브유닛 L2는 약물 유닛을 위한 1 내지 4개의 부착 부위를 가질 수 있다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 약물 유닛을 위한 하나의 부착 부위를 갖는다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 약물 유닛을 위한 2개의 부착 부위를 갖는다.
또한, 링커 접합체가 제공되며, 이는 하기 화학식(II)에 도시된 바와 같이 적어도 하나의 링커에 부착된 표적 링커(L)를 포함하고, 각각의 링커는 적어도 하나의 약물 링커(D)에 부착된다:
여기서, L1, AA 및 L2는 링커를 포함하며 화학식 (I)과 관련하여 상술한 바와 같고, s는 0 또는 1이고, t는 1 내지 4이고, p로드는 1 내지 20이다. 상기 링커는 적어도 하나의 극성 유닛과 함께 아미노산 유닛, 링커 서브유닛 L2 또는 둘 다를 포함한다. 각 극성 유닛은 당 유닛, PEG 유닛 또는 카르복실 유닛일 수 있다. 링커는 적어도 하나의 당 유닛, 적어도 하나의 PEG 유닛, 적어도 하나의 카르복실 유닛 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 링커 서브유닛 L2는 약물 유닛을 위한 1 내지 4개의 부착 부위를 가질 수 있다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 약물 유닛을 위한 하나의 부착 부위를 갖는다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 약물 유닛을 위한 2개의 부착 부위를 갖는다.
또한, 하기 화학식(III)에 도시된 바와 같은 약물-링커 또는 그의 염이 제공된다.
여기서, L1, AA, L2 및 D는 링커를 포함하며 화학식 (II)와 관련하여 상술한 바와 같고, s는 0 또는 1이고, t는 1 내지 4이고, 물결선은 타겟 유닛을 위한 부착 부위를 나타낸다. 상기 링커는 적어도 하나의 극성 유닛과 함께 아미노산 유닛, 링커 서브유닛 L2, 또는 둘 다를 포함한다. 각 극성 유닛은 당 유닛, PEG 유닛 또는 카르복실 유닛일 수 있다. 링커는 적어도 하나의 당 유닛, 적어도 하나의 PEG 유닛, 적어도 하나의 카르복실 유닛 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 링커 서브유닛 L2는 약물 유닛을 위한 1 내지 4개의 부착 부위를 가질 수 있다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 약물 유닛을 위한 하나의 부착 부위를 갖는다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 약물 유닛을 위한 2개의 부착 부위를 갖는다.
하기 화학식 (IV)에 도시된 바와 같은, 타겟 유닛-링커의 중간체 또는 그의 염이 추가로 제공된다:
여기서, L1, AA, 및 L2는 링커를 포함하며, L, L1, AA 및 L2는 화학식 (I)과 관련하여 상술한 바와 같고, s는 0 또는 1이고, d는 1 내지 20이고, 이중 물결선()은 약물 유닛을 위한 부착 부위를 나타낸다. 상기 링커는 적어도 하나의 극성 유닛과 함께 아미노산 유닛, 링커 서브유닛 L2, 또는 둘 다를 포함한다. 각 극성 유닛은 당 유닛, PEG 유닛 또는 카르복실 유닛일 수 있다. 링커는 적어도 하나의 당 유닛, 적어도 하나의 PEG 유닛, 적어도 하나의 카르복실 유닛 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 링커 서브유닛 L2는 약물 유닛을 위한 1 내지 4개의 부착 부위를 가질 수 있다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 약물 유닛을 위한 하나의 부착 부위를 갖는다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 약물 유닛을 위한 2개의 부착 부위를 갖는다.
극성 유닛
본원에 제공된 극성 유닛(PU)은 본원에 추가로 설명된 바와 같이 당 유닛, PEG 유닛 및 카르복실 유닛을 포함한다.
당 유닛(SU)
일부 양태에서, 당 유닛(SU)은 일반 화학식 (X), 또는 그의 염을 갖는다:
여기서, 각 X는 NH 또는 O로부터 독립적으로 선택되고, 각 R은 수소, 아세틸, 단당류, 이당류 및 다당류로부터 독립적으로 선택되고, 각 X1은 CH2 및 C(O)로부터 독립적으로 선택되고, 각 X2는 H, OH 및 OR로부터 독립적으로 선택되고, k는 1 내지 10이다. 일부 양태에서, 각각의 (CH2 - (CH(XR))k - X1(X2))는 단당류이다. 일부 양태에서, 단당류는 포도당, 리보스, 갈락토스, 만노스, 아라비노스, 2-데옥시글루코스, 글리세랄데하이드,에리스로스, 트레오스, 자일로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 알도스, 케토스와 같은 C6 또는 C5 당, 글루콘산, 알돈산, 우론산 또는 울로소닉산과 같은 당 산, 또는 글루코사민, N-아세틸 글루코사민, 갈락토사민 및 N-아세틸 갈락토사민과 같은 아미노당이다. 적합한 이당류로는 수크로스, 락코스, 및 말토스가 포함된다. 적합한 다당류로는 말토트리오스, 라피노스, 케스토스, 전분, 셀룰로오스, 및 글리코겐이 포함된다. 아노머 C-1 위치의 입체화학은 알파 또는 베타일 수 있다.
L3는 다음과 같은 일반 화학식 (XI)을 갖는다:
Figure pct00207
여기서, L3a는 C1-C10 알킬렌 및 폴리에틸렌 글리콜(1 내지 26개의 에틸렌 글리콜 유닛을 가짐)로부터 선택되고, p 및 o는 독립적으로 0 내지 2이며, 여기서 L3a는 화학식 (X)에서 **로 표시된 N 원자에 공유 결합되어 있다. 각각의 * 및 각각의 #은, 본원에 기재된 바와 같이, 아미노산 유닛(AA)의 또 다른 서브유닛 또는 링커 서브유닛(L2), 스트레처 유닛(L1) 또는 링커의 다른 성분에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 당 유닛은 다음 화학식 (XII)를 갖는다:
여기서, R, p 및 o는 전술한 바와 같으며, n은 0 내지 4이고, 각각의 m은 독립적으로 1 내지 4이다.
일부 양태에서, 당 유닛은 다음 화학식 (XIII)을 갖는다:
여기서, n은 0 내지 4이고, 각각의 m은 독립적으로 1 내지 4이다.
PEG 유닛
일부 양태에서, 링커는 PEG 유닛을 포함한다. PEG 유닛은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착될 수 있다. 아미노산 유닛의 서브유닛은 예를 들어 알파, 베타 또는 감마 아미노산 또는 이들의 유도체일 수 있다. 일부 양태에서, PEG 유닛은 스트레처 유닛에 부착될 수 있다.
일부 양태에서, PEG 유닛은 다음 일반 화학식 -(CH2CH2O)n20-R24를 가지며, 여기서 R24는 H 또는 C1-C6 알킬이고 n20은 1 내지 26이다. 일부에서 n20은 12이고 R24는 메틸이다.
일부 양태에서, PEG 유닛은 다음 일반 화학식 (XX) 또는 그의 염을 갖는다:
여기서, R20은 아미노산 유닛의 서브유닛 및/또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고; R21 및 R22는 각각 독립적으로 선택적인 C1-C3 알킬렌이고; R24 및 R25는 하기 제시된 바와 같고; 물결선(~)은 부착 부위를 나타내고; n20은 1 내지 26이다. 일부 양태에서, R20은 카르복실, 아미노, 알키닐, 아지도, 하이드록실, 카르보닐, 카르바메이트, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 설폰아미드, 아실 설폰아미드, 알킬 설포네이트, 또는 이들의 보호된 형태로부터 선택된다. 적합한 보호기로는 당업계에서 일반적으로 사용되는 카르복실산 보호기, 아민 보호기 및 설포닐 보호기가 포함된다.
일부 양태에서, PEG 유닛은 다음 일반 화학식 (XX) 또는 그의 염을 갖는다:
여기서, R20은 아미노산 유닛의 서브유닛 및/또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고; R21 및 R22는 각각 독립적으로 선택적인 C1-C3 알킬렌이고; R24 및 R25는 하기 제시된 바와 같고; 물결선(~)은 부착 부위를 나타내고; n20은 1 내지 26이다. 일부 양태에서, R20은 할로, 알데하이드, 카르복실, 아미노, 알키닐, 아지도, 하이드록실, 카르보닐, 카르바메이트, 티올, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 설폰아미드, 아실 설폰아미드, 알킬 설포네이트, 티아졸, 아자디벤조사이클로옥틴, 히드라진, 카르보닐알킬헤테로아릴, 또는 이들의 보호된 형태로부터 선택된다. 적합한 보호기로는 당업계에서 일반적으로 사용되는 카르복실산 보호기, 아민 보호기 및 설포닐 보호기가 포함된다.
일부 양태에서, PEG 유닛은 다음 일반 화학식 (XXI) 또는 그의 염을 갖는다:
여기서, R20은 아미노산 유닛의 서브유닛 및/또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고; R26 및 R27은 각각 선택적인 C1-C12 알킬렌, -NH-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-NH-, -C(O)-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-C(O)-, -NH-C1-C12 알킬렌-C(O)- 또는 -C(O)-C1-C12 알킬렌-NH-이고; R24 및 R25는 하기 제시된 바와 같고; R29 각각은 선택적이고 -C(O)-, -NH-, -C(O)-C1-C6 알케닐렌-, -NH-C1-C6 알케닐렌-, -C1-C6 알케닐렌-NH- 및 -C1-C6 알케닐렌-C(O)-로부터 독립적으로 선택되고; 물결선(~)은 부착 부위를 나타내고; n20은 1 내지 26이고; n21은 1 내지 4이고; n27은 1 내지 3이다. 일부 양태에서, R20은 카르복실, 아미노, 알키닐, 아지도, 하이드록실, 카르보닐, 카르바메이트, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 설폰아미드, 아실 설폰아미드, 알킬 설포네이트, 또는 이들의 보호된 형태로부터 선택된다. 적합한 보호기로는 당업계에서 일반적으로 사용되는 카르복실산 보호기, 아민 보호기 및 설포닐 보호기가 포함된다.
일부 양태에서, PEG 유닛은 다음 일반 화학식 (XXI) 또는 그의 염을 갖는다:
여기서, R20은 아미노산 유닛의 서브유닛 및/또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고; R26 및 R27은 각각 선택적인 C1-C12 알킬렌, -NH-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-NH-, -C(O)-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-C(O)-, -NH-C1-C12 알킬렌-C(O)- 또는 -C(O)-C1-C12 알킬렌-NH-이고; R24 및 R25는 하기 제시된 바와 같고; R29 각각은 선택적이고 -C(O)-, -NH-, -C(O)-C1-C6 알케닐렌-, -NH-C1-C6 알케닐렌-, -C1-C6 알케닐렌-NH-, -C1-C6 알케닐렌-C(O)-, -NH(CO)NH-, 및 트리아졸로부터 독립적으로 선택되고; 물결선(~)은 부착 부위를 나타내고; n20은 1 내지 26이고; n21은 1 내지 4이고; n27은 1 내지 3이다. 일부 양태에서, R20은 카르복실, 아미노, 알키닐, 아지도, 하이드록실, 카르보닐, 카르바메이트, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 설폰아미드, 아실 설폰아미드, 알킬 설포네이트, 또는 이들의 보호된 형태로부터 선택된다. 적합한 보호기로는 당업계에서 일반적으로 사용되는 카르복실산 보호기, 아민 보호기 및 설포닐 보호기가 포함된다.
화학식 (XX) 및 (XXI)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R24 및 R25는 각각 H 및 폴리하이드록실기; 치환된 폴리하이드록실기; -C(O)-폴리하이드록실기; 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기; 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 헤테로아릴; 선택적으로 치환된 카르보사이클; 치환된 -C1-C8 알킬; 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬; 킬레이트제; -C(O)-R28(여기서 R28은 화학식 (XII) 또는 (XIII)의 당 유닛임); 또는 C3-C8 헤테로사이클로부터 함께 -NR24R25로부터 독립적으로 선택된다.
화학식 (XX) 및 (XXI)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R24 및 R25 중 하나는 H 및 폴리하이드록실기; 치환된 폴리하이드록실기; -C(O)-폴리하이드록실기; 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기; 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 헤테로아릴; 선택적으로 치환된 카르보사이클; 치환된 -C1-C8 알킬; 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬; 킬레이트제; -C(O)-R28(여기서 R28은 화학식 (XII) 또는 (XIII)의 당 유닛임)로부터 선택되고; R24 및 R25 중 다른 하나는 선택적으로 1 내지 24개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖는 폴리에틸렌 글리콜이다.
화학식 (XX) 및 (XXI)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R24 및 R25 둘 다는 H가 아니다. 화학식 (XX) 및 (XXI)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R24 및 R25 중 하나는 H이다.
화학식 (XX) 및 (XXI)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R24 및 R25는 각각 독립적으로 H 및 폴리하이드록실기로부터 선택되고, 단 R24 및 R25 둘 다 H는 아니다. 폴리하이드록실기는 선형 또는 분지형일 수 있다. 일부 양태에서, 폴리하이드록실기는 적어도 3개의 하이드록실기를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리하이드록실기는 선형 단당류이다. 본원에 사용된, 선형 단당류는 개환 형태의 단당류를 의미한다. 일부 양태에서, 선형 단당류는 C6 또는 C5 당의 선형 형태, 예를 들어 글루코스, 리보스, 갈락토스, 만노스, 아라비노스, 2-데옥시글루코스, 글리세르알데하이드,에리트로스, 트레오스, 자일로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 알도스, 및 케토스이다. 일부 양태에서, 선형 단당류는 글루콘산, 알돈산, 우론산 또는 울로손산과 같은 당 산을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 선형 단당류는 글루코사민, N-아세틸 글루코사민, 갈락토사민 및 N-아세틸 갈락토사민과 같은 아미노 당을 추가로 포함할 수 있다.
선형 단당류를 갖는 PEG 유닛의 예시는 다음을 포함한다:
Figure pct00214
Figure pct00215
여기서, R39는 H, 선형 단당류 및 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택된다. 이들 예시적 양태에서, PEG 유닛이 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되는 경우, 필요에 따라 탈보호되고, PEG 유닛의 좌측 말단의 카르복실기 또는 하이드록실기 및 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부 상의 반응성 기 사이에 결합이 형성된다.
화학식 (XX) 및 (XXI)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R24 및 R25는 각각 독립적으로 H 및 폴리하이드록실기로부터 선택되고, 단 R24 및 R25 둘 다 H는 아니다. 폴리하이드록실기는 선형 또는 분지형일 수 있다. 화학식 (XX) 및 (XXI)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R24 및 R25 중 하나는 폴리하이드록실기로부터 선택되고, 다른 하나는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 양태에서, 각각의 폴리하이드록실기는 적어도 3개의 하이드록실기를 포함한다. 폴리하이드록실기는 선형 또는 분지형 또는 환형일 수 있다. 일부 양태에서, R24 및 R25 중 하나는 선형 단당류이고, 다른 하나는 환형 단당류이다. 일부 양태에서, R24 및 R25 중 하나는 환형 단당류이고, 다른 하나는 선형 또는 환형 단당류이다. 일부 양태에서, 선형 단당류는 선형 (비환형) 형태의 C6 또는 C5 당, 예를 들어 글루코스, 리보스, 갈락토스, 만노스, 아라비노스, 2-데옥시글루코스, 글리세르알데하이드,에리트로스, 트레오스, 자일로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 알도스, 및 케토스이다. 일부 양태에서, 선형 단당류는 글루콘산, 알돈산, 우론산 또는 울로손산과 같은 당 산을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 선형 단당류는 글루코사민, N-아세틸 글루코사민, 갈락토사민 및 N-아세틸 갈락토사민과 같은 아미노 당을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 환형 단당류는 환형 형태의 C6 또는 C5 당, 예컨대 글루코스, 리보스, 갈락토스, 만노스, 아라비노스, 2-데옥시글루코스, 글리세르알데하이드,에리트로스, 트레오스, 자일로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 알도스, 및 케토스이다. 일부 양태에서, 환형 단당류는 글루콘산, 알돈산, 우론산 또는 울로손산과 같은 당 산을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 환형 단당류는 글루코사민, N-아세틸 글루코사민, 갈락토사민 및 N-아세틸 갈락토사민과 같은 아미노 당을 추가로 포함할 수 있다. 아노머 C-1 위치의 입체화학은 알파 또는 베타일 수 있다.
PEG 유닛의 예시는 다음을 포함한다:
Figure pct00216
Figure pct00217
여기서, R41은 선형 단당류, 환형 단당류 또는 폴리에틸렌 글리콜이다. 이들 예시적 양태에서, PEG 유닛이 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되는 경우, 필요에 따라 탈보호되고, PEG 유닛의 좌측 말단의 카르복실기 또는 하이드록실기 및 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부 상의 반응성 기 사이에 결합이 형성된다.
화학식 (XX) 및 (XXI)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R24 및 R25는 각각 독립적으로 H 및 폴리하이드록실기로부터 선택되고, 단 R24 및 R25 둘 다 H는 아니다. 일부 양태에서, R24 및 R25는 각각 환형 단당류, 이당류 또는 다당류일 수 있다. 화학식 (XX) 및 (XXI)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R24 및 R25 중 하나는 환형 단당류, 이당류 또는 다당류로부터 선택되고, R24 및 R25 중 다른 하나는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 양태에서, 환형 단당류는 환형 형태의 C6 또는 C5 당, 예를 들어 글루코스, 리보스, 갈락토스, 만노스, 아라비노스, 2-데옥시글루코스, 글리세르알데하이드,에리트로스, 트레오스, 자일로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 알도스, 및 케토스이다. 일부 양태에서, 환형 단당류는 글루콘산, 알돈산, 우론산 또는 울로손산과 같은 당 산을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 환형 단당류는 글루코사민, N-아세틸 글루코사민, 갈락토사민 및 N-아세틸 갈락토사민과 같은 아미노 당을 추가로 포함할 수 있다. 아노머 C-1 위치의 입체화학은 알파 또는 베타일 수 있다.
일부 양태에서, 이당류는 상기 기재된 임의의 단당류를 함유하는 것들을 포함한다. 이당류라는 용어는 이당류의 선형 형태, 환형 형태 및 선형-환형 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 이당류는 수크로스, 락토스, 말토스, 트레할로스 및 셀로비오스를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 양태에서, 다당류는 상기 기재된 임의의 단당류를 함유하는 것들을 포함한다. 다당류라는 용어는 다당류의 선형 형태, 환형 형태 및 선형-환형 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 다당류에는 말토트리오스, 라피노스, 케스토스, 전분, 셀룰로오스 및 글리코겐이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
예시적인 양태에서, 환형 단당류, 이당류 또는 다당류를 갖는 PEG 유닛은 다음을 포함한다:
Figure pct00218
Figure pct00219
각각의 이들 예시에서, 각각의 R45는 H, 또는 단당류, 이당류, 또는 이들 중 임의의 아미노당을 포함하는 다당류로부터 선택되고; R46은 H, 또는 단당류, 이당류, 이들 중 임의의 아미노당을 포함하는 다당류 및 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택된다. 이들 예시적 양태에서, PEG 유닛이 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되는 경우, 필요에 따라 탈보호되고, PEG 유닛의 우측 말단(첫 번째 네 가지 예시) 또는 좌측 말단(마지막 예시)의 카르복실기 및 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부 상의 반응성 기 사이에 결합이 형성된다.
화학식 (XX) 및 (XXI)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R24 및 R25는 각각 독립적으로 폴리하이드록실기로부터 선택되고, 이는 선형 단당류 또는 치환된 선형 단당류이다. 화학식 (XX) 및 (XXI)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R24 및 R25 중 하나는 선형 단당류 또는 치환된 선형 단당류인 폴리하이드록실기로부터 선택되고, R24 및 R25 중 다른 하나는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 양태에서, 선형 단당류는 선형 형태의 C6 또는 C5 당, 예를 들어 글루코스, 리보스, 갈락토스, 만노스, 아라비노스, 2-데옥시글루코스, 글리세르알데하이드,에리트로스, 트레오스, 자일로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 알도스, 및 케토스이다. 일부 양태에서, 선형 단당류는 글루콘산, 알돈산, 우론산 또는 울로손산과 같은 당 산을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 선형 단당류는 글루코사민, N-아세틸 글루코사민, 갈락토사민 및 N-아세틸 갈락토사민과 같은 아미노 당을 추가로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 치환된 선형 단당류는 단당류, 이당류, 또는 다당류로 치환될 수 있다. 일부 양태에서, 이당류는 상기 기재된 임의의 단당류를 함유하는 것들을 포함한다. 이당류라는 용어는 이당류의 선형 형태, 환형 형태 및 선형-환형 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 이당류는 수크로스, 락토스, 말토스, 트레할로스 및 셀로비오스를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 양태에서, 다당류는 상기 기재된 임의의 단당류를 함유하는 것들을 포함한다. 다당류라는 용어는 다당류의 선형 형태, 환형 형태 및 선형-환형 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 다당류에는 말토트리오스, 라피노스, 케스토스, 전분, 셀룰로오스 및 글리코겐이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
선택적으로 당류로 치환된 선형 단당류를 포함하는 PEG 유닛의 예는 다음을 포함한다:
Figure pct00220
Figure pct00221
여기서, R47은 H, 선형 단당류, 및 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택되고; R49는 단당류, 이당류, 및 다당류로부터 선택된다. 이들 예시적 양태에서, PEG 유닛이 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되는 경우, 필요에 따라 탈보호되고, PEG 유닛의 좌측 말단의 카르복실 또는 하이드록시 기 및 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부 상의 반응성 기 사이에 결합이 형성된다.
화학식 (XX) 및 (XXI)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R24 및 R25는 각각 독립적으로 폴리하이드록실기로부터 선택되고, 이는 선형 단당류 또는 치환된 선형 단당류이고, 여기서 치환된 선형 단당류는 알킬, O-알킬, 아릴, O-아릴, 카르복실, 에스테르 또는 아미드와 같은 하나 이상의 치환체로 치환된다. 화학식 (XX) 및 (XXI)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R24 및 R25 중 하나는 선형 단당류 또는 치환된 선형 단당류인 폴리하이드록실기로부터 선택되고, 여기서, 치환된 선형 단당류는 알킬, O-알킬, 아릴, O-아릴, 카르복실, 에스테르 또는 아미드와 같은 하나 이상의 치환체로 치환되고; R24 및 R25 중 다른 하나는 폴리에틸렌 글리콜이다. 이러한 치환된 폴리하이드록실기는 선택적으로 단당류, 이당류 또는 다당류로 추가 치환될 수 있다.
예시적인 양태에서, 선형 단당류 또는 치환된 선형 단당류를 포함하는 폴리하이드록실기를 갖는 PEG 유닛은 다음을 포함한다:
Figure pct00222
이 예들 각각에서, R42 각각은 본원에 기재된 바와 같이 H, 단당류, 이당류, 및 다당류로부터, 또는 폴리에틸렌 글리콜로부터 독립적으로 선택되고; R43 각각은 알킬, O-알킬, 아릴, O-아릴, 카르복실, 에스테르 또는 아미드로부터 선택된다. 이들 예시적 양태에서, PEG 유닛이 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되는 경우, 탈보호되고, PEG 유닛의 좌측 말단의 카르복실기 및 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부 상의 반응성 기 사이에 결합이 형성된다.
화학식 (XX) 및 (XXI)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R24 및 R25 중 적어도 하나는 -C(O)-폴리하이드록실기 또는 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기이고, R24 및 R25 중 다른 하나는 -C(O)-폴리하이드록실기; 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기, 폴리하이드록실기 또는 치환된 폴리하이드록실기이다. 일부 양태에서, 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기 및 폴리하이드록실기는 단당류, 이당류, 또는 다당류(각각의 경우 선형 또는 환형); 알킬; O-알킬; 아릴; 카르복실;에스테르; 또는 아미드로 치환될 수 있다. 일부 양태에서, 이당류는 상기 기재된 임의의 단당류를 함유하는 것들을 포함한다. 이당류라는 용어는 이당류의 선형 형태, 환형 형태 및 선형-환형 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 이당류는 수크로스, 락토스, 말토스, 트레할로스 및 셀로비오스를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 양태에서, 다당류는 상기 기재된 임의의 단당류를 함유하는 것들을 포함한다. 다당류라는 용어는 다당류의 선형 형태, 환형 형태 및 선형-환형 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 다당류에는 말토트리오스, 라피노스, 케스토스, 전분, 셀룰로오스 및 글리코겐이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
예시적인 양태에서, -C(O)-폴리하이드록실기 또는 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기를 갖는 PEG 유닛은 다음을 포함한다:
이들 예시적 양태에서, PEG 유닛이 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되는 경우, 탈보호되고, PEG 유닛의 좌측 말단의 카르복실기 및 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부 상의 반응성 기 사이에 결합이 형성된다.
화학식 (XX) 및 (XXI)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R24 및 R25는 H 및 치환된 -C1-C8 알킬로부터 독립적으로 선택되고, 단 R24 및 R25 둘 다 H는 아니다. 일부 양태에서, R24 및 R25는 H 및 치환된 -C1-C4 알킬로부터 독립적으로 선택되고, 단 R24 및 R25 둘 다 H는 아니다. 일부 양태에서, R24 및 R25는 H 및 치환된 -C1-C3 알킬로부터 독립적으로 선택되고, 단 R24 및 R25 둘 다 H는 아니다. 치환된 -C1-C8, -C1-C4, 및 -C1-C3 알킬의 알킬 부분은 직쇄 또는 분지형일 수 있다.
치환된 -C1-C8, -C1-C4, 또는 -C1-C3 알킬은 하이드록실 또는 카르복실로 치환될 수 있다. 일부 양태에서, 치환된 -C1-C8, -C1-C4, 또는 -C1-C3 알킬의 각각의 탄소 원자는 하이드록실 또는 카르복실로 치환될 수 있다. 일부 양태에서, 치환된 -C1-C8, -C1-C4, 또는 -C1-C3 알킬의 각각의 탄소 원자는 카르복실로 치환될 수 있다. 일부 양태에서, 치환된 -C1-C8, -C1-C4, 또는 -C1-C3 알킬의 하나 또는 두개의 탄소 원자는 하이드록실 또는 카르복실로 치환될 수 있다. 일부 양태에서, 치환된 -C1-C8, -C1-C4, 또는 -C1-C3 알킬의 하나 또는 두개의 탄소 원자는 카르복실로 치환될 수 있다. 일부 양태에서, 치환된 -C1-C8, -C1-C4, 또는 -C1-C3 알킬의 말단 탄소 원자는 카르복실로 치환될 수 있다. 일부 양태에서, 치환된 -C1-C8, -C1-C4, 또는 -C1-C3 알킬의 말단 탄소 원자는 하이드록실로 치환될 수 있다.
치환된 -C1-C8, -C1-C4, 또는 -C1-C3 알킬을 갖는 PEG 유닛의 예시적인 양태는 다음과 같다:
Figure pct00224
Figure pct00225
여기서, R48은 H, OH, CH2OH, COOH, 또는 하이드록실 및/또는 카르복실로 치환된 -C1-C6 알킬일 수 있다. 이들 예시적 양태에서, PEG 유닛이 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되는 경우, 탈보호되고, PEG 유닛의 좌측 말단의 카르복실기 및 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부 상의 반응성 기 사이에 결합이 형성된다.
화학식 (XX) 및 (XXI)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R24 및 R25 중 하나는 H 및 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬로부터 선택되고, R24 및 R25 중 다른 하나는 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬, 치환된 -C(O)-C1-C4 알킬, 및 치환된 -C(O)-C1-C3 알킬 및 (상기 기재되 바와 같은) 치환된 -C1-C8 알킬, -C1-C4 알킬, 및 -C1-C3 알킬로부터 선택될 수 있다. 일부 양태에서, R24 및 R25 중 하나는 H 및 치환된 -C(O)-C1-C4 알킬로부터 독립적으로 선택되고, R24 및 R25 중 다른 하나는 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬, 치환된 -C(O)-C1-C4 알킬, 및 치환된 -C(O)-C1-C3 알킬 및 (상기 기재되 바와 같은) 치환된 -C1-C8 알킬, -C1-C4 알킬, 및 -C1-C3 알킬로부터 선택될 수 있다. 일부 양태에서, R24 및 R25 중 하나는 H 및 치환된 -C(O)-C1-C3 알킬로부터 선택되고, R24 및 R25 중 다른 하나는 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬, 치환된 -C(O)-C1-C4 알킬, 및 치환된 -C(O)-C1-C3 알킬 및 (상기 기재되 바와 같은) 치환된 -C1-C8 알킬, -C1-C4 알킬, 및 -C1-C3 알킬로부터 선택될 수 있다. 치환된 -C1-C8, -C1-C4, 및 -C1-C3 알킬의 알킬 부분은 직쇄 또는 분지형일 수 있다.
치환된 -C(O)-C1-C8 알킬, -C(O)-C1-C4 알킬, 및 -C(O)-C1-C3 알킬은 하이드록실 또는 카르복실로 치환될 수 있다. 일부 양태에서, 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬, -C(O)-C1-C4 알킬, 및 -C(O)-C1-C3 알킬의 각각의 탄소 원자는 하이드록실 또는 카르복실로 치환될 수 있다. 일부 양태에서, 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬, -C(O)-C1-C4 알킬, 및 -C(O)-C1-C3 알킬의 하나 또는 두개의 탄소 원자는 하이드록실 또는 카르복실로 치환될 수 있다. 일부 양태에서, 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬, -C(O)-C1-C4 알킬, 및 -C(O)-C1-C3 알킬의 하나 또는 두개의 탄소 원자는 카르복실로 치환될 수 있다. 일부 양태에서, 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬, -C(O)-C1-C4 알킬, 및 -C(O)-C1-C3 알킬의 말단 탄소 원자는 카르복실로 치환될 수 있다. 일부 양태에서, 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬, -C(O)-C1-C4 알킬, 및 -C(O)-C1-C3 알킬의 말단 탄소 원자는 하이드록실로 치환될 수 있다.
이러한 PEG 유닛의 예시적인 양태는 다음을 포함한다:
Figure pct00226
Figure pct00227
이들 예시적 양태에서, PEG 유닛이 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되는 경우, 탈보호되고, PEG 유닛의 좌측 말단의 카르복실기 및 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부 상의 반응성 기 사이에 결합이 형성된다.
화학식 (XX) 및 (XXI)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R24 및 R25는 H 및 선택적으로 치환된 아릴로부터 독립적으로 선택되고, 단 R24 및 R25 둘 다 H는 아니다. 일부 양태에서, 치환된 아릴은 할로겐(예: 클로로, 플루오로 및 브로모)으로 치환된 아릴을 포함한다.
예시적 양태에서, 치환된 아릴을 포함하는 PEG 유닛은 하기를 포함한다:
Figure pct00228
이들 예시적 양태에서, PEG 유닛이 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되는 경우, 탈보호되고, PEG 유닛의 좌측 말단의 카르복실기 및 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부 상의 반응성 기 사이에 결합이 형성된다.
화학식 (XX) 및 (XXI)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R24 및 R25는 함께 선택적으로 치환된 C3-C8 헤테로사이클 또는 헤테로아릴을 형성한다. 일부 양태에서, 선택적 치환체는 할로겐(예: 클로로, 플루오로 및 브로모)으로 치환된 헤테로사이클 또는 아릴을 포함한다.
예시적인 양태에서, 선택적으로 치환된 C3-C8 헤테로사이클을 포함하는 PEG 유닛은 다음을 포함한다:
Figure pct00229
이 예시적 양태에서, PEG 유닛이 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되는 경우, 탈보호되고, PEG 유닛의 좌측 말단의 카르복실기 및 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부 상의 반응성 기 사이에 결합이 형성된다.
화학식 (XX) 및 (XXI)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R24 및 R25는 H 및 킬레이트제로부터 독립적으로 선택되고, 단 R24 및 R25 둘 다 H는 아니다. 일부 양태에서, 킬레이트제는에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 트리에틸렌테트라아민헥사아세트산 (TTHA), 벤질-DTPA, 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-,N,N',N",N'''-테트라아세트산(DOTA), 벤질-DOTA, 1,4,7-트리아자사이클로노난-N,N',N"-트리아세트산(NOTA), 벤질-NOTA, 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA) 및 N,N'-디알킬 치환된 피페라진으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 킬레이트제는 -NR24R25의 질소에 직접 부착된다. 일부 양태에서, 킬레이트제는 알킬렌, 아릴렌, 카르보사이클로, 헤테로아릴렌 또는 헤테로카르보사이클로(각각의 경우에 치환되거나 치환되지 않음)를 통해 부착된다.
일부 예시적인 양태에서, 킬레이트제를 포함하는 PEG 유닛은 다음을 포함한다:
Figure pct00230
이들 예시적 양태에서, PEG 유닛이 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되는 경우, 탈보호되고, PEG 유닛의 좌측 말단의 카르복실기 및 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부 상의 반응성 기 사이에 결합이 형성된다.
화학식 (XX), (XXI), (XXX), (XXXI), (XXXII) 및 (XXXIII)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, 킬레이트제는 본원에 기재된 R24, R25 및/또는 R30 기 중 임의의 것에 첨가될 수 있다. 일부 양태에서, 킬레이트제는에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 트리에틸렌테트라아민헥사아세트산 (TTHA), 벤질-DTPA, 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-,N,N',N",N'''-테트라아세트산 (DOTA), 벤질-DOTA, 1,4,7-트리아자사이클로노난-N,N',N"-트리아세트산 (NOTA), 벤질-NOTA, 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산 (TETA) 및 N,N'-디알킬 치환된 피페라진으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 킬레이트제는 본원에 기재된 R24, R25 또는 R30 기에 직접 부착된다. 일부 양태에서, 킬레이트제는 알킬렌, 아릴렌, 카르보사이클, 헤테로아릴렌 또는 헤테로카르보사이클(각각의 경우에 치환되거나 치환되지 않음)을 통해 부착된다.
일부 양태에서, PEG 유닛은 하기 일반 화학식 (XXX)를 갖는다:
여기서, R20은 아미노산 유닛의 서브유닛 및/또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고; R21 및 R22는 각각 선택적 C1-C3 알킬렌기이고; R30은 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클; 티오우레아; 선택적으로 치환된 티오우레아; 우레아; 선택적으로 치환된 우레아; 설파미드; 알킬 설파미드; 아실 설파미드; 선택적으로 치환된 알킬 설파미드; 선택적으로 치환된 아실 설파미드; 설폰아미드; 선택적으로 치환된 설폰아미드; 알킬 및 아릴 구아니딘을 포함하는 구아니딘; 포스포르아미드; 또는 선택적으로 치환된 포스포아미드로부터 선택되고; 물결선(~)은 부착 부위를 나타내고; n20은 1 내지 26이다. 일부 양태에서, R20은 카르복실, 아미노, 알키닐, 아지도, 하이드록실, 카르보닐, 카르바메이트, 우레아, 티오 카르바메이트, 티오우레아, 설폰아미드, 아실 설폰아미드, 알킬 설포네이트 또는 이들의 보호 형태 중에서 선택된다. 적합한 보호기에는당업에서 일반적으로 사용되는 카복실산 보호기, 아민 보호기 및 설포닐 보호기가 포함된다.
일부 양태에서, PEG 유닛은 하기 일반 화학식 (XXX)를 갖는다:
여기서, R20은 아미노산 유닛의 서브유닛 및/또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고; R21 및 R22는 각각 선택적 C1-C3 알킬렌기이고; R30은 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클; 티오우레아; 선택적으로 치환된 티오우레아; 우레아; 선택적으로 치환된 우레아; 설파미드; 알킬 설파미드; 아실 설파미드; 선택적으로 치환된 알킬 설파미드; 선택적으로 치환된 아실 설파미드; 설폰아미드; 선택적으로 치환된 설폰아미드; 알킬 및 아릴 구아니딘을 포함하는 구아니딘; 포스포르아미드; 또는 선택적으로 치환된 포스포아미드로부터 선택되고; 물결선(~)은 부착 부위를 나타내고; n20은 1 내지 26이다. 일부 양태에서, R20은 할로, 알데하이드, 카르복실, 아미노, 알키닐, 아지도, 하이드록실, 카르보닐, 카르바메이트, 티올, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 설폰아미드, 아실 설폰아미드, 알킬 설포네이트, 트리아졸, 아자디벤조사이클로옥틴, 또는 이들의 보호 형태 중에서 선택된다. 적합한 보호기에는당업에서 일반적으로 사용되는 카복실산 보호기, 아민 보호기 및 설포닐 보호기가 포함된다.
화학식 (XXX)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R30은 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클이다. 일부 양태에서, 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클은 국제출원번호 WO 2011/136645 (그 개시내용은 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같이 융합된 사이클로옥틴 화합물이다. 융합된 사이클로옥틴이 포함된 예시적인 PEG 유닛은 아래와 같다.
Figure pct00233
Figure pct00234
이들 예시적 양태에서, PEG 유닛이 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되는 경우, 필요에 따라 탈보호되고, PEG 유닛의 좌측 말단의 카르복실 또는 아미노 기 및 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부 상의 반응성 기 사이에 결합이 형성된다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 상기 화합물뿐만 아니라 국제공개번호 WO 2011/136645에 개시된 다른 화합물도 부가 화합물의 부착을 위한 클릭 화학의 중간체로서 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 부가 화합물은 약물 유닛이다. 일부 양태에서, 부가 화합물은 본원에 설명된 바와 같이 링커 서브유닛 L2이다.
화학식(XXX)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R30은 티오우레아; 치환된 티오우레아; 우레아 또는 치환된 우레아이다. 티오우레아 및 우레아 기는, 예를 들어, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 아릴로 치환될 수 있다.
티오우레아; 치환된 티오우레아; 우레아; 또는 치환된 우레아를 포함하는 예시적인 PEG 유닛은 다음을 포함한다:
Figure pct00235
Figure pct00236
이들 예시적 양태에서, PEG 유닛이 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되는 경우, 탈보호되고, PEG 유닛의 좌측 말단의 카르복실기 및 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부 상의 반응성 기 사이에 결합이 형성된다.
화학식(XXX)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R30은 설파미드; 알킬 설파미드; 아실 설파미드, 선택적으로 치환된 알킬 설파미드; 선택적으로 치환된 아실 설파미드; 설폰 아미드; 또는 선택적으로 치환된 설폰 아미드이다. 선택적으로 치환된 알킬 설파미드; 선택적으로 치환된 아실 설파미드; 및 선택적으로 치환된 설폰아미드는 용해도를 증가시키기 위해, 또는 다른 양태에서 링커, 약물 또는 다른 화합물과 같은 추가 기의 부착을 위해 기로 치환될 수 있다.
설파미드; 알킬 설파미드; 아실 설파미드, 선택적으로 치환된 알킬 설파미드; 선택적으로 치환된 아실 설파미드; 설폰아미드; 또는 선택적으로 치환된 설폰 아미드를 포함하는 예시적인 PEG 유닛은 다음을 포함한다:
Figure pct00237
이들 예시에서, R50은, 예를 들어, 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보사이클, 아릴, 헤테로카르보사이클 또는 헤테로아릴일 수 있다. 이들 예시적 양태에서, PEG 유닛이 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되는 경우, 탈보호되고, PEG 유닛의 좌측 말단의 카르복실기 및 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부 상의 반응성 기 사이에 결합이 형성된다.
화학식(XXX)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R30은 구아니딘 또는 선택적으로 치환된 구아니딘이다. 선택적으로 치환된 구아니딘은 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보사이클, 아릴, 헤테로카르보사이클 또는 헤테로아릴로 치환될 수 있다.
구아니딘 또는 선택적으로 치환된 구아니딘을 포함하는 예시적인 PEG 유닛은 다음을 포함한다:
Figure pct00238
이들 예시에서, R55는, 예를 들어, 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보사이클, 아릴, 헤테로카르보사이클 또는 헤테로아릴일 수 있다. 이들 예시적 양태에서, PEG 유닛이 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되는 경우, 필요에 따라 탈보호되고, PEG 유닛의 좌측 말단의 카르복실기 및 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부 상의 반응성 기 사이에 결합이 형성된다.
화학식(XXX)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R30은 포스포르아마이드 또는 선택적으로 치환된 포스포르아마이드이다. 선택적으로 치환된 포스포르아마이드는 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보사이클, 아릴, 헤테로카르보사이클 또는 헤테로아릴로 치환될 수 있다.
포스포르아마이드 또는 선택적으로 치환된 포스포르아마이드를 포함하는 예시적인 PEG 유닛은 다음을 포함한다:
Figure pct00239
이들 예시에서, R60은, 예를 들어, 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보사이클, 아릴, 헤테로카르보사이클 또는 헤테로아릴일 수 있다. R61은, 예를 들어, 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보사이클, 아릴, 헤테로카르보사이클 또는 헤테로아릴일 수 있다. 이들 예시적 양태에서, PEG 유닛이 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되는 경우, 탈보호되고, PEG 유닛의 좌측 말단의 카르복실기 및 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부 상의 반응성 기 사이에 결합이 형성된다.
화학식(XXX)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, PEG 유닛은 추가 모이어티를 부착하기 위한 작용기를 포함한다. 화학식(XXX)의 PEG 유닛의 일부 양태에서, R30은 아지도, 알키닐, 치환된 알키닐, -NH-C(O)-알키닐, -NH-C(O)-알키닐-R65; 사이클로옥틴; -NH-사이클로옥틴, -NH-C(O)-사이클로옥틴, 또는 -NH-(사이클로옥틴)2로부터 선택되고; 여기서 R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택된다. 일부 양태에서, 이러한 PEG 유닛은 부가 화합물의 부착을 위한 클릭 화학(click chemistry)의 중간체로서 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 부가 화합물은 약물 유닛이다. 일부 양태에서, 부가 화합물은 본원에 설명된 바와 같이 링커 서브유닛 L2이다. 일부 양태에서, 부가 화합물은 또 다른 링커 또는 약물 링커이다.
아지도, 알키닐, 또는 사이클로옥틴 기를 포함하는 예시적인 PEG 유닛은 다음을 포함한다:
Figure pct00240
이들 예시적 양태에서, PEG 유닛이 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되는 경우, 탈보호되고, PEG 유닛의 좌측 말단의 카르복실기 및 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부 상의 반응성 기 사이에 결합이 형성된다.
일부 양태에서, PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염을 갖는다:
Figure pct00242
여기서, R20은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고; R21 및 R22는 각각 선택적 C1-C3 알킬렌기이고; R26 및 R27은 각각 선택적인 C1-C12 알킬렌, -NH-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-NH-, -C(O)-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-C(O)-, -NH-C1-C12 알킬렌-C(O)- 또는 -C(O)-C1-C12 알킬렌-NH-이고; R31은 분지형 폴리에틸렌 글리콜 쇄로서, 각 분지는 1 내지 26개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가지며 각 분지는 말단에 R35를 가지며; R33은 C1-C3 알킬렌, C1-C3 알킬렌-C(O), -C(O)-C1-C3 알킬렌 또는 -C(O)-C1-C3 알킬렌-C(O)이고; R29 각각은 선택적이고 -C(O)-, -NH-, -C(O)-C1-C6 알케닐렌-, -NH-C1-C6 알케닐렌-, -C1-C6 알케닐렌-NH-, 및 -C1-C6 알케닐렌-C(O)-로부터 독립적으로 선택되고; R35는 아지도, 알키닐, 알키닐-R65, 사이클로옥틴 또는 사이클로옥틴-R65이고, 여기서 R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고; 물결선(~)은 부착 부위를 나타내고; n20은 1 내지 26이고; n21은 1 내지 4이고; n27은 1 내지 4이다. 일부 양태에서, R20은 카르복실, 아미노, 알키닐, 아지도, 하이드록실, 카르보닐, 카르바메이트, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 설폰아미드, 아실 설폰아미드, 알킬 설포네이트, 또는 이들의 보호된 형태로부터 선택된다. 적합한 보호기로는 당업계에서 일반적으로 사용되는 카르복실산 보호기, 아민 보호기 및 설포닐 보호기가 포함된다.
일부 양태에서, PEG 유닛은 하기 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
여기서, R20은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고; R21 및 R22는 각각 선택적 C1-C3 알킬렌기이고; R26 및 R27은 각각 선택적인 C1-C12 알킬렌, -NH-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-NH-, -C(O)-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-C(O)-, -NH-C1-C12 알킬렌-C(O)- 또는 -C(O)-C1-C12 알킬렌-NH-이고; R31은 분지형 폴리에틸렌 글리콜 쇄로서, 각 분지는 1 내지 26개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가지며 각 분지는 말단에 R35를 가지며; R33은 C1-C3 알킬렌, C1-C3 알킬렌-C(O), -C(O)-C1-C3 알킬렌 또는 -C(O)-C1-C3 알킬렌-C(O)이고; R29 각각은 선택적이고 -C(O)-, -NH-, -C(O)-C1-C6 알케닐렌-, -NH-C1-C6 알케닐렌-, -C1-C6 알케닐렌-NH-, -C1-C6 알케닐렌-C(O)-, -NH(CO)NH-, 및 트리아졸로부터 독립적으로 선택되고; R35는 아지도, 알키닐, 알키닐-R65, 사이클로옥틴 또는 사이클로옥틴-R65이고, 여기서 R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고; 물결선(~)은 부착 부위를 나타내고; n20은 1 내지 26이고; n21은 1 내지 4이고; n27은 1 내지 4이다. 일부 양태에서, R20은 할로, 알데하이드, 카르복실, 아미노, 알키닐, 아지도, 하이드록실, 카르보닐, 카르바메이트, 티올, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 설폰아미드, 아실 설폰아미드, 알킬 설포네이트 트리아졸, 아자디벤조사이클로옥틴, 히드라진, 카르보닐알킬헤테로아릴, 또는 이들의 보호된 형태로부터 선택된다. 적합한 보호기로는 당업계에서 일반적으로 사용되는 카르복실산 보호기, 아민 보호기 및 설포닐 보호기가 포함된다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 이러한 PEG 유닛은 부가 화합물의 부착을 위해 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 부가 화합물은 약물 유닛이다. 일부 양태에서, 부가 화합물은 본원에 설명된 바와 같이 링커 서브유닛 L2이다. 일부 양태에서, 부가 화합물은 링커 또는 약물 링커이다.
분지화 폴리에틸렌 글리콜 쇄를 포함하는 예시적인 PEG 유닛은 하기를 포함한다:
Figure pct00244
Figure pct00245
이들 예시적 양태에서, PEG 유닛이 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되는 경우, 탈보호되고, PEG 유닛의 좌측 말단의 카르복실기 및 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부 상의 반응성 기 사이에 결합이 형성된다.
일부 양태에서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다:
여기서,
R40은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이며;
R41 및 R42는 존재하지 않거나, 또는 각각 독립적으로 C1-C6 알킬렌이고;
R43 각각은, 독립적으로, 존재하지 않거나, 또는 C1-C12 알킬렌, -NH-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-NH-, -C(O)-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-C(O)-, -NH-C1-C12 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C12 알킬렌-NH-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-C1-C12 알킬렌, -C(O)-NH-C1-C12 알킬렌, -헤테로아릴렌, 헤테로아릴-C1-C12 알킬렌, 헤테로아릴-C1-C12 알킬렌-C(O)-, 또는 -C(O)NR46R47로부터 선택되고, 여기서, R46 및 R47 중 하나는 H 또는 C1-C12 알킬렌이고, 다른 하나는 C1-C12 알킬렌이고;
R44 및 R45는 각각 독립적으로 H, 폴리하이드록실기, 치환된 폴리하이드록실기, -C(O)-폴리하이드록실기, 또는 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기이며, 여기서 선택적 치환체는 설페이트, 포스페이트, 알킬 설페이트, 및 알킬 포스페이트로부터 선택되고;
물결선(~)은 R40에 대한 부착 부위를 나타내고;
n40은 1 내지 26이고;
n41은 1 내지 6이고;
n42는 1 내지 6이다.
일부 양태에서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다:
여기서,
R40은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이며;
R41 및 R42는 존재하지 않거나, 또는 각각 독립적으로 C1-C6 알킬렌이고;
R43은 존재하지 않거나, 또는 C1-C12 알킬렌, -NH-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-NH-, -C(O)-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-C(O)-, -NH-C1-C12 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C12 알킬렌-NH-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-C1-C12 알킬렌, -C(O)-NH-C1-C12 알킬렌, -헤테로아릴렌, 헤테로아릴-C1-C12 알킬렌, 헤테로아릴-C1-C12 알킬렌-C(O)-, 또는 -C(O)NR46R47로부터 선택되고, 여기서, R46 및 R47 중 하나는 H 또는 C1-C12 알킬렌이고, 다른 하나는 C1-C12 알킬렌이고;
R44 및 R45는 각각 독립적으로 H, 폴리하이드록실기, 치환된 폴리하이드록실기, -C(O)-폴리하이드록실기, 또는 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기이며, 여기서 선택적 치환체는 설페이트, 포스페이트, 알킬 설페이트, 및 알킬 포스페이트로부터 선택되고;
물결선(~)은 R40에 대한 부착 부위를 나타내고;
n40은 1 내지 26이고;
n41은 1 내지 6이고;
n42는 1 내지 6이다.
일부 양태에서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다:
여기서,
R40은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이며;
R41 및 R42는 존재하지 않거나, 또는 각각 독립적으로 C1-C3 알킬렌이고;
R43은 존재하지 않거나, 또는 C1-C6 알킬렌, -NH-C1-C12 알킬렌, -C1-C6 알킬렌-NH-, -C(O)-C1-C6 알킬렌, -C1-C6 알킬렌-C(O)-, -NH-C1-C6 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C6 알킬렌-NH-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-C1-C6 알킬렌, -C(O)-NH-C1-C12 알킬렌, -헤테로아릴렌, 헤테로아릴-C1-C6 알킬렌, 헤테로아릴-C1-C6 알킬렌-C(O)-, 또는 -C(O)NR46R47로부터 선택되고, 여기서, R46 및 R47 중 하나는 H 또는 C1-C6 알킬렌이고, 다른 하나는 C1-C12 알킬렌이고;
R44 및 R45는 각각 독립적으로 H, 폴리하이드록실기, 치환된 폴리하이드록실기, -C(O)-폴리하이드록실기, 또는 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기이며, 여기서 선택적 치환체는 설페이트, 포스페이트, 알킬 설페이트, 및 알킬 포스페이트로부터 선택되고;
물결선(~)은 R40에 대한 부착 부위를 나타내고;
n40은 1 내지 16이고;
n41은 1 내지 6이고;
n42는 1 내지 6이다.
일부 양태에서, R40이 할로, 알데하이드, 카르복실, 아미노, 알키닐, 아지도, 하이드록실, 카르보닐, 카르바메이트, 티올, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 설폰아미드, 아실 설폰아미드, 알킬 설포네이트, 트리아졸, 아자디벤조사이클로옥틴, 히드라진, 카르보닐알킬헤테로아릴, 또는 이들의 보호된 형태로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 R40은 하기 구조, 또는 그의 입체 이성질체 중 하나를 갖는다:
Figure pct00249
Figure pct00250
(여기서, R = H 또는 C1-6 알킬이고;
n = 0 내지 12임),
여기서, (*)는 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 대한 R40의 부착 부위를 나타내고, ()는 PEG 유닛의 나머지 부분에 대한 R40의 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 R40은 하기 구조, 또는 그의 입체 이성질체 중 하나를 갖는다:
Figure pct00252
Figure pct00253
(여기서, n = 0 내지 12임),
여기서, (*)는 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 대한 R40의 부착 부위를 나타내고, ()는 PEG 유닛의 나머지 부분에 대한 R40의 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 R43이 존재 시, R43-(NR44R45)n41은 하기 구조, 또는 그의 입체 이성질체 중 하나를 갖는다:
Figure pct00255
(여기서, R = H, C1-6 알킬, 폴리하이드록실, 또는 치환된 폴리하이드록실),
여기서, ()는 PEG 유닛의 나머지 부분에 대한 R43의 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 R43이 존재 시, R43-(NR44R45)n41은 하기 구조, 또는 그의 입체 이성질체 중 하나를 갖는다:
Figure pct00257
Figure pct00258
여기서, ()는 PEG 유닛의 나머지 부분에 대한 R43의 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 -NR44R45는 하기 구조, 또는 그의 입체 이성질체 중 하나를 갖는다:
Figure pct00260
Figure pct00261
여기서, ()는 PEG 유닛의 나머지 부분에 대한 -NR44R45의 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 아미노산 유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되기 전에 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00263
Figure pct00264
Figure pct00265
Figure pct00266
여기서, R은 H 또는 알킬이고, n은 1 내지 12이다.
일부 양태에서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다:
여기서,
R40은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이며;
R41 및 R42는 존재하지 않거나, 또는 각각 독립적으로 C1-C6 알킬렌이고;
R43 각각은, 독립적으로, 존재하지 않거나, 또는 C1-C12 알킬렌, -NH-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-NH-, -C(O)-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-C(O)-, -NH-C1-C12 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C12 알킬렌-NH-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-C1-C12 알킬렌, -C(O)-NH-C1-C12 알킬렌, -헤테로아릴렌, 헤테로아릴-C1-C12 알킬렌, 헤테로아릴-C1-C12 알킬렌-C(O)-, 또는 -C(O)NR46R47로부터 선택되고, 여기서, R46 및 R47 중 하나는 H 또는 C1-C12 알킬렌이고, 다른 하나는 C1-C12 알킬렌이고;
R44 및 R45는 각각 독립적으로 H, 폴리하이드록실기, 치환된 폴리하이드록실기, -C(O)-폴리하이드록실기, 또는 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기이며, 여기서 선택적 치환체는 설페이트, 포스페이트, 알킬 설페이트, 및 알킬 포스페이트로부터 선택되고;
R46은 아미노, 아미노-알킬-아미노 또는 -NH-C(O)-NH-S(O)2-NH-로부터 선택되고;
물결선(~)은 R40에 대한 부착 부위를 나타내고;
n40은 1 내지 26이고;
n41은 1 내지 6이고;
n42는 1 내지 6이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 아미노산 유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되기 전에 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00268
여기서, R은 H 또는 알킬이고, n은 1 내지 12이다.
일부 양태에서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다:
Figure pct00269
Figure pct00270
여기서,
Y 각각은 독립적으로 R76 또는
Figure pct00271
이고;
R76 각각은 독립적으로 H, 아세틸, -P(=O)(OH)2, 또는 -(CH2)v-O-S(=O)2(OH)이고;
Ra 및 Rb 각각은 독립적으로 H이거나, 또는 Ra 및 Rb는 이들이 부착된 탄소와 함께 결합하여 옥소기를 형성하고;
각 q는 독립적으로 1 내지 26이고;
각 m은 독립적으로 1 내지 4이고;
각 n은 독립적으로 1 내지 4이고;
각 v는 독립적으로 1 내지 6이고;
각 *는 아미노산 유닛(AA)의 서브유닛, 링커 서브유닛 L2 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다:
Figure pct00272
Figure pct00273
여기서,
R76 각각은 독립적으로 H, 아세틸, -P(=O)(OH)2, 또는 -(CH2)vS(=O)2(OH)이고;
각 q는 독립적으로 1 내지 26이고;
각 m은 독립적으로 1 내지 4이고;
각 n은 독립적으로 1 내지 4이고;
각 v는 독립적으로 1 내지 6이고;
각 *는 아미노산 유닛(AA)의 서브유닛, 링커 서브유닛 L2 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커가 제공된다:
Figure pct00274
Figure pct00275
여기서,
각 q는 독립적으로 1 내지 26이고;
각 m은 독립적으로 1 내지 4이고;
각 n은 독립적으로 1 내지 4이고;
각 *는 아미노산 유닛(AA)의 서브유닛, 링커 서브유닛 L2 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타낸다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 Y는 R76이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 Y는
Figure pct00276
이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 Ra 및 Rb 각각은 독립적으로 H이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 Ra 및 Rb는 이들이 부착된 탄소와 함께 결합하여 옥소기를 형성한다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 q는 10 내지 20이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 q는 12이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식, 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00277
Figure pct00278
Figure pct00279
Figure pct00280
Figure pct00281
Figure pct00282
Figure pct00283
Figure pct00284
Figure pct00285
Figure pct00286
Figure pct00287
여기서, 각 Z는 *에 부착되고, 개별적으로 하기로부터 선택된다:
Figure pct00288
Figure pct00289
여기서, 각 는 아미노산 유닛(AA)의 다른 서브유닛, 링커 서브유닛 L2, 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타낸다.
카르복실 유닛
일부 양태에서, 링커는 카르복실 유닛을 포함한다. 카르복실 유닛은 아미노산 유닛의 서브유닛이거나 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착될 수 있다. 일부 양태에서, 카르복실 유닛은 다음과 같은 일반 화학식(XXXX), 또는 그의 염을 갖는다:
L70은 C1-C8 알킬렌, C1-C8 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C8 알킬렌-, 및 -C(O)-C1-C8 알킬렌-C(O)-로부터 선택되고; R70은 ~NR71(R72R73)이고, 여기서 R71은 H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, 또는 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐)로부터 선택되고; R72는 존재하지 않거나, 또는 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌, 선택적으로 치환된 에테르, 선택적으로 치환된 티오에테르, 선택적으로 치환된 케톤, 선택적으로 치환된 아미드, 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐), 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴렌 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴렌으로부터 선택되고; R73은 카르복실 또는 폴리카르복실이고; p1 및 o1 각각은 0 내지 2로부터 독립적으로 선택된다. 본원에 사용되는 "폴리카르복실"이라는 용어는 1 내지 10개, 1 내지 6개 또는 1 내지 4개의 카르복실기를 포함하는 기를 의미하며, 여기서 카르복실기는 알킬, 알킬렌, 치환된 알킬, 치환된 알킬렌, 헤테로알킬, 헤테로알킬렌, 아미노 및/또는 아미드에 의해 상호연결되는 기를 지칭한다. 본원에서 사용되는 폴리카복실은 카르복실레이트 형태를 포함한다.
일부 양태에서, R70은 ~NR71(R75-(R73)2)이고, 여기서 R71은 H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, 또는 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐)로부터 선택되고; R75는 분지형의 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌, 선택적으로 치환된 에테르, 선택적으로 치환된 티오에테르, 선택적으로 치환된 케톤, 선택적으로 치환된 아미드, 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐), 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴렌 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴렌으로부터 선택되고; 각각의 R73은 카르복실 또는 폴리카르복실이고; p1 및 o1 각각은 0 내지 2로부터 독립적으로 선택된다.
일부 양태에서, R70은 ~N(R74-R73)(R72-R73)이고, 여기서 R72 및 R74는 각각 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌, 선택적으로 치환된 에테르, 선택적으로 치환된 티오에테르, 선택적으로 치환된 케톤, 선택적으로 치환된 아미드, 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐), 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴렌 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴렌으로부터 선택되고; 각각의 R73은 독립적으로 카르복실 또는 폴리카르복실이고; p1 및 o1 각각은 0 내지 2로부터 독립적으로 선택된다.
일부 양태에서, R73은 하기로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00292
여기서, 물결선은 R72, R74 또는 R75에 대한 결합을 나타낸다.
링커 서브유닛 L2
링커는 적어도 하나의 링커 서브유닛 L2를 포함하며, 각각의 링커 서브유닛 L2는 본원에 추가로 기재된 바와 같이 적어도 하나의 약물 유닛(D)에 대한 부착 부위를 갖는다. 일부 양태에서, 약물 유닛(D)은 링커 서브유닛 L2 상의 약물 유닛에 대한 각 부착 부위에 부착된다. 다양한 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 절단 가능한 링커 서브유닛 또는 절단불가능한 링커 서브유닛일 수 있다. 링커 서브유닛 L2는 또한 아미노산 유닛(AA) 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 갖는다.
일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 극성 유닛, 예컨대 당 유닛, PEG 유닛 또는 카르복실 유닛을 포함한다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 극성 유닛을 포함하지 않으며, 여기서 아미노산 유닛은 극성 유닛을 포함한다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2 및 아미노산 유닛(존재하는 경우) 둘 다 극성 유닛을 포함한다.
일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 절단 가능한 링커 서브유닛이다. 본원에 사용된 용어 "절단 가능한"은 세포 내부 또는 세포외 환경에서의 대사 과정 또는 반응을 의미하며, 이로 인해 약물 유닛(예: 세포독성제)과 링커 서브유닛 L2 또는 이의 일부 사이의 공유 부착이 끊어져 유리 약물 유닛, 또는 링커 서브유닛 L2의 나머지 부분에서 분리된 링커 서브유닛 L2-약물 유닛의 다른 대사산물을 생성한다.
일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 프로테아제 절단 가능한 링커 서브유닛, 산-절단 가능한 링커 서브유닛, 디설파이드 링커 서브유닛, 디설파이드 함유 링커 서브유닛, 또는 디설파이드 결합 (예를 들어, SPDB 링커)에 인접한 디메틸기를 갖는 디설파이드 함유 링커 서브유닛 (예를 들어, 문헌 [Jain et al., Pharm. Res. 32:3526-3540 (2015); Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); U.S. Patent No. 5,208,020] 참조), 절단 가능한 자가 안정화 링커 (예를 들어, 문헌 [WO2018/031690 및 WO2015/09575]; 및 문헌[Jain et al., Pharm. Res. 32:3526-3540 (2015)] 참조), 및/또는 절단 가능한 친수성 링커(예를 들어, 문헌 [W02015/123679] 참조)를 포함한다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 광분해성(photolabile) 링커 서브유닛을 포함한다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 절단 불가능한 링커 유닛을 갖는다 (예를 들어, 문헌 [WO2007/008603] 참조).
일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 링커 서브유닛 L2의 절단 또는 링커 서브유닛 L2 내의 절단이 세포내 환경에서 링커 서브유닛 L2 또는 링커 서브유닛 L2의 나머지로부터 약물 유닛을 방출하도록 세포내 조건 하에서 절단 가능한 절단 가능한 링커이다. 예를 들어, 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 세포내 환경(예를 들어, 리소좀 또는 엔도솜 또는 섬모 내)에 존재하는 절단제에 의해 절단 가능하다. 본원에 사용된 용어 "세포내 조건 하에서 절단 가능한", "세포내에서 절단되는" 및 "세포내 절단"은 세포 내부의 대사 과정 또는 반응을 지칭하며, 이에 따라 약물 유닛(예: 세포독성제)과 링커 서브유닛 L2 또는 그 일부 사이의 공유 부착이 파손되어, 유리 약물 유닛 또는 세포 내부의 링커 서브유닛 L2의 나머지 부분으로부터 분리된 링커 서브유닛 L2-약물 유닛의 다른 대사산물이 생성된다. 따라서 접합체의 절단된 모이어티는 세포내 대사산물이다.
일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2와 약물 유닛 사이의 결합은 종양 관련 프로테아제를 포함하여 하나 이상의 효소에 의해 효소적으로 절단되어 약물 유닛(D)을 유리시킬 수 있다. 링커 서브유닛 L2는 예를 들어 리소좀 또는 엔도솜 프로테아제 (예를 들어, 문헌 [WO2004/010957, US20150297748, US2008/0166363, US20120328564 및 US20200347075] 참조)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 세포내 절단제는 카텝신 B, C 및 D 및 플라스민을 포함할 수 있으며, 이들 모두는 디펩타이드 약물 유도체를 가수분해하여 표적 세포 내부에 활성 약물을 방출하는 것으로 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123] 참조). 펩티딜 링커는 표적 항원-발현 세포에 존재하는 효소에 의해 절단될 수 있다. 예를 들어, 암성 조직에서 고도로 발현되는 티올 의존성 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단 가능한 펩티딜 링커 서브유닛이 사용될 수 있다 (예를 들어, Phe-Leu, Val-Ala, Val-Cit 또는 Gly- Phe-Leu-Gly 펩타이드를 가짐).
전형적으로, 펩티딜 링커는 적어도 하나의 아미노산 길이 또는 적어도 2개의 아미노산 길이이다. 특정 양태에서, 펩티딜 링커는 디펩타이드, 트리펩타이드, 테트라펩타이드 또는 펜타펩타이드이다. 특정 양태에서, 펩티딜 링커 서브유닛은 천연 아미노산만을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 예를 들어, 펩티딜 링커 서브유닛은 Phe-Leu, Val-Ala, Val-Cit 또는 Gly-Phe-Leu-Gly 펩타이드를 가질 수 있다. 다른 그러한 절단 가능한 링커는 예를 들어 미국 특허번호 6,214,345에 기재되어 있다. 특정 양태에서, 세포내 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩티딜 링커는 Val-Cit 펩타이드 또는 Phe-Lys 펩타이드(예를 들어, 미국 특허번호 6,214,345 참조) 또는 Gly-Gly-Phe-Gly 링커(예를 들어, 미국 공개번호 2015/0297748 참조)를 포함한다. 약물 유닛의 세포내 단백질 분해 방출을 사용하는 한 가지 이점은 접합 시 약물 유닛의 활성이 일반적으로 약화되고 접합체의 혈청 안정성이 일반적으로 높다는 점이다. 미국 특허 9,345,785 참조.
일부 양태에서, 펩티딜 링커 서브유닛은 비천연 아미노산만을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 펩티딜 링커 서브유닛은 비천연 아미노산에 연결된 천연 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 펩티딜 링커 서브유닛은 천연 아미노산의 D-이성질체에 연결된 천연 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 펩티딜 링커 서브유닛의 적어도 하나의 아미노산은 L-아미노산이다. 일부 양태에서, 적어도 아미노산은 D-아미노산이다.
일부 양태에서, 펩티딜 링커 서브유닛은 다음 중 하나 이상을 함유한다: 글리신 및/또는 L-아미노산, 예컨대 아르기닌, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 알라닌, 히스티딘, 세린, 프롤린, 글루탐산, 아스파르트산, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 류신, 아스파라긴, 이소류신 및 발린, 및 극성 유닛(글리신 또는 L-아미노산에 부착된 PEG 유닛 포함). 일부 양태에서, 펩티딜 링커 서브유닛은 다음 중 하나 이상을 함유한다: 글리신 및/또는 D-아미노산, 예컨대 아르기닌, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 알라닌, 히스티딘, 세린, 프롤린, 글루탐산, 아스파르트산, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 류신, 아스파라긴, 이소류신 및 발린, 및 극성 유닛(글리신 또는 D-아미노산에 부착된 PEG 유닛 포함). 일부 양태에서, 펩티딜 링커 서브유닛은 다음 중 하나 이상을 함유한다: 글리신 및/또는 L-아미노산과 D-아미노산의 혼합물, 예를 들어 아르기닌, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 알라닌, 히스티딘, 세린, 프롤린, 글루탐산, 아스파르트산, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 류신, 아스파라긴, 이소류신, 발린 및 극성 유닛(글리신 또는 아미노산에 부착된 PEG 유닛 포함).
일부 양태에서, 펩티딜 링커 서브유닛은 다음 중 하나 이상을 함유한다: 글리신 및/또는 천연 L-아미노산, 예컨대 아르기닌, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 알라닌, 히스티딘, 세린, 프롤린, 글루탐산, 아스파르트산, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 류신, 아스파라긴, 이소류신, 발린, 및 적어도 하나의 극성 유닛, 예컨대 당 유닛, 카르복실 유닛, 또는 글리신 또는 L-아미노산에 부착된 PEG 유닛. 일부 양태에서, 펩티딜 링커 서브유닛은 다음 중 하나 이상을 함유한다: 글리신 및/또는 D-아미노산, 예컨대 아르기닌, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 알라닌, 히스티딘, 세린, 프롤린, 글루탐산, 아스파르트산, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 류신, 아스파라긴, 이소류신 및 발린, 및 적어도 하나의 극성 유닛, 예컨대 당 유닛, 카르복실 유닛, 또는 글리신 또는 D-아미노산에 부착된 PEG 유닛.
일부 양태에서, 펩티딜 링커 서브유닛의 아미노산은 아래 대괄호 안에 표시된 화학식을 갖는다:
Figure pct00293
여기서, R190은 수소, 메틸, 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸, 벤질, p-하이드록시벤질, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH　-CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-피리딜메틸-, 3-피리딜메틸-, 4-피리딜메틸-, 페닐, 사이클로헥실,
Figure pct00294
이다.
일부 양태에서, 펩티딜 링커 서브유닛은 이하 L-(천연) 아미노산 중 하나 이상을 포함한다: 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 히스티딘, 글리신, 글루탐산, 글루타민, 페닐알라닌, 리신, 류신, 세린, 티로신, 트레오닌, 이소류신, 트립토판 및 발린; 및 당 유닛, 카르복실 유닛, 또는 글리신 또는 천연 아미노산에 부착된 PEG 유닛과 같은 적어도 하나의 극성 유닛.
일부 양태에서, 펩티딜 링커 서브유닛은 시스테인을 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 펩티딜 링커는 프롤린을 함유하지 않는다.
일부 양태에서, 펩티딜 링커 서브유닛은 하기의 이들 천연 아미노산의 D-이성질체 중 하나 이상을 포함한다: 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 히스티딘, 글리신, 글루탐산, 글루타민, 페닐알라닌, 리신, 류신, 세린, 티로신, 트레오닌, 이소류신, 트립토판 및 발린; 및 당 유닛, 카르복실 유닛, 또는 글리신 또는 D-아미노산에 부착된 PEG 유닛과 같은 적어도 하나의 극성 유닛.
일부 양태에서, 펩티딜 링커 서브유닛은 하기 아미노산 중 하나 이상을 포함한다: 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 히스티딘, 글리신, 글루탐산, 글루타민, 페닐알라닌, 리신, 류신, 세린, 티로신, 트레오닌, 이소류신, 프롤린, 트립토판, 발린, 오르니틴, 페니실라민, β-알라닌, 아미노알칸산, 아미노알킨산, 아미노알칸디오산, 아미노벤조산, 아미노-헤테로사이클로-알칸산, 헤테로사이클로-카르복실산, 시트룰린, 스타틴, 디아미노알칸산, 및 그 유도체; 및 당 유닛, 카르복실 유닛, 또는 아미노산(들)에 부착된 PEG 유닛과 같은 적어도 하나의 극성 유닛. 이러한 아미노산의 유도체의 예시는 아래 아미노산 서브유닛을 설명하는 섹션에 제시되어 있다.
일부 양태에서, 펩티딜 링커 서브유닛은 절단 가능한 펩타이드의 일부로서 당 유닛을 함유한다. 예를 들어, 절단 가능한 펩타이드의 일부로 리신이나 시트룰린을 포함하는 당 유닛. 일부 양태에서, 펩티딜 링커 서브유닛은 절단 가능한 펩타이드의 일부로서 카르복실 유닛을 함유한다. 예를 들어, 절단 가능한 펩타이드의 일부로서 리신 또는 시트룰린을 함유하는 카르복실 유닛.
일부 양태에서, 절단 가능한 링커 서브유닛은 pH에 민감하다, 즉 특정 pH 값에서 가수분해에 민감하다. 일반적으로 pH 민감성 링커 서브유닛은 산성 조건 하에서 가수분해 가능하다. 예를 들어, 리소좀에서 가수분해 가능한 산-불안정성 링커 서브유닛(예를 들어, 하이드라존, 세미카르바존, 티오세미카르바존, 시스-아코니틱 아미드, 오르토에스테르, 아세탈, 케탈 등)이 사용될 수 있다. (예를 들어, 문헌 [미국 특허 번호 5,122,368; 5,824,805 및 5,622,929; Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661] 참조). 이러한 링커 서브유닛은 혈액 내 조건과 같은 중성 pH 조건에서는 상대적으로 안정적이지만, 리소좀의 대략적인 pH인 pH 5.5 또는 5.0 미만에서는 불안정하다. 특정 양태에서, 가수분해성 링커 유닛은 티오에테르 링커 (예를 들어, 아실하이드라존 결합을 통해 약물 유닛에 부착된 티오에테르 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,622,929 참조))이다.
일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 환원 조건 하에서 절단가능하다 (예를 들어, 이황화 링커 서브유닛). 예를 들어, SATA(N-숙신이미딜-5-아세틸티오아세테이트), SPDP(N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SPDB((N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트) 및 SMPT(N숙신이미딜-옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔)-, SPDB 및 SMPT (예를 들어, 문헌 [Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In lmmunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987] 참조. 또한, 미국 특허번호 4,880,935 참조.)를 사용하여 형성될 수 있는 이황화 링커를 포함하여 다양한 이황화 링커가 알려져 있다.
일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 말로네이트 링커 (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), 말레이미도벤조일 링커 (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), 또는 3'-N-아미드 유사체 (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12)이다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 말레이미도카프로일 링커와 같이 절단가능하지 않으며, 약물 유닛은 약물-링커의 대사 분해에 의해 방출된다. (예를 들어, 미국 공개 번호 2005/0238649 참조)
일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 세포외 환경에 실질적으로 민감하지 않다. 본원에 사용된 바와 같이, 링커 서브유닛 L2의 문맥과 관련하여 "세포외 환경에 실질적으로 민감하지 않은"은 접합체가 세포외 환경(예를 들어, 혈장)에 존재할 때 접합체 샘플 내 링커 서브유닛 L2의 약 20% 이하, 전형적으로 약 15% 이하, 보다 전형적으로 약 10% 이하, 및 훨씬 더 전형적으로는 약 5% 이하, 약 3% 이하, 또는 약 1% 이하가 절단됨을 의미한다. 링커 서브유닛 L2가 세포외 환경에 실질적으로 민감하지 않은지 여부는, 예를 들어 (a) 접합체("접합체 샘플") 및 (b) 동 몰량의 비접합 표적화 유닛 또는 약물 유닛 ("대조 샘플") 둘 모두를 소정의 기간(예: 2, 4, 8, 16 또는 24시간) 동안 혈장과 함께 독립적으로 배양하고 그 다음, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정된 바와 같이, 접합체 샘플에 존재하는 비접합 표적화 유닛 또는 약물 유닛의 양을 대조 샘플에 존재하는 양과 비교함으로써 결정될 수 있다.
일부 양태에서, 링커 또는 링커 서브유닛 L2는 세포 내재화를 촉진한다. 일부 양태에서, 링커 또는 링커 서브유닛 L2는 세포독성제와 같은 약물 유닛에 접합될 때(즉, 본원에 기재된 접합체의 링커-약물 유닛 모이어티의 환경에서) 세포 내재화를 촉진한다. 또 다른 양태에서, 링커 또는 링커 서브유닛 L2는 약물 유닛 및 표적화 유닛 둘 모두에 접합될 때(즉, 본원에 기재된 접합체의 환경에서) 세포 내재화를 촉진한다.
본 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 다양한 링커 서브유닛 L2는 예를 들어 WO 2004010957에 기재되어 있다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 티올-반응성 스페이서 및 디펩타이드(예: 말레이미딜 카프로일 발린 알라닌)를 포함하는 프로테아제 절단성 링커를 포함한다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 티올-반응성 말레이미도카프로일 스페이서, 아미노산 또는 펩타이드 및 자가 희생 기를 포함하는 프로테아제 절단성 링커를 포함한다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 티올-반응성 말레이미도카프로일 스페이서, 발린-시트룰린 디펩타이드 및 p-아미노벤질옥시카르보닐 자가 희생(self immolative) 기를 포함하는 프로테아제 절단성 링커를 포함한다.
일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 히드라진 링커 또는 4차 암모늄 링커와 같은 산 절단성 링커를 포함한다(예를 들어, WO2017/096311 및 WO2016/040684 참조).
일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 WO2013/173337에 기재된 바와 같은 말레이미드 기를 포함하는 자가 안정화 모이어티를 포함한다.
일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 친수성 링커, 예를 들어 WO2015/123679의 친수성 펩타이드 및 WO2013/012961 및 WO2019/213046에 개시된 당 알코올 중합체 기반 링커를 포함한다.
다른 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예: 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성에스테르(예: 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예: 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예: 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예: 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물(예: 1,5- 디플루오로-2,4-디니트로벤젠)과 같은 다양한 이관능성 단백질 커플링제를 사용하여 제조될 수 있다. 방사성뉴클레오티드(들)의 접합을 위한 킬레이트제는 예를 들어 WO94/11026에 기재되어 있다.
일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC 및 설포-SMPB, 및 SVSB(숙신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)(예를 들어, 미국 일리노이주 록퍼드 소재의 Pierce Biotechnology, Inc.로부터 상업적으로 입수 가능)를 포함하나 이에 제한되지 않는 가교제를 사용하여 제조될 수 있다.
아미노산(AA) 유닛
링커는 선택적으로 아미노산 유닛(AA)을 포함한다. 링커에 존재하는 경우, 아미노산 유닛은 스트레처 유닛(L1)을 링커 서브유닛 L2에 연결한다. AA의 s가 0인 경우, 아미노산 유닛은 존재하지 않는다 (예를 들어, 화학식 I 내지 IV 중 임의의 것에서). 일부 양태에서, 아미노산 유닛은 0 내지 12개의 서브유닛을 포함한다. 아미노산 유닛의 각 서브유닛은 천연 또는 비천연 알파, 베타 또는 감마 아미노산이나 극성 유닛, 예를 들어 당 유닛(SU), 카르복실 유닛 또는 아미노산 유닛의 서브유닛에 부착된 PEG 유닛으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 아미노산 유닛은 아미노산 또는 디펩타이드, 트리펩타이드, 테트라펩타이드, 펜타펩타이드, 헥사펩타이드, 헵타펩타이드, 옥타펩타이드, 노나펩타이드, 데카펩타이드, 운데카펩타이드 또는 도데카펩타이드이고, 여기서 하나 이상의 서브유닛은 선택적으로 변형되어 당 유닛, PEG 유닛 또는 카르복실 유닛과 같은 극성 유닛을 형성한다.
일부 양태에서, 아미노산 유닛의 서브유닛은 글리신 및/또는 L-아미노산, 예컨대 아르기닌, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 알라닌, 히스티딘, 세린, 프롤린, 글루탐산, 아스파르트산, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 류신, 아스파라긴, 이소류신 및 발린, 및 극성 유닛(글리신 또는 L-아미노산에 부착된 PEG 유닛 포함)으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 아미노산 유닛의 서브유닛은 글리신 및/또는 D-아미노산, 예컨대 아르기닌, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 알라닌, 히스티딘, 세린, 프롤린, 글루탐산, 아스파르트산, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 류신, 아스파라긴, 이소류신, 및 발린, 및 극성 유닛으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 아미노산 유닛의 서브유닛은 글리신 및/또는 L-아미노산과 D-아미노산의 혼합물, 예를 들어 아르기닌, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 알라닌, 히스티딘, 세린, 프롤린, 글루탐산, 아스파르트산, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 류신, 아스파라긴, 이소류신, 및 발린, 및 극성 유닛(글리신 또는 D-아미노산에 부착된 PEG 유닛 포함)으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 아미노산 유닛의 서브유닛은 글리신 및/또는 천연 L-아미노산, 예를 들어 아르기닌, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 알라닌, 히스티딘, 세린, 프롤린, 글루탐산, 아스파르트산, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 류신, 아스파라긴, 이소류신, 및 발린, 및 하나 이상의 극성 유닛(예: 당 유닛, 카르복실 유닛 또는 글리신 또는 L-아미노산에 부착된 PEG 유닛)으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 아미노산 유닛의 서브유닛은 글리신 및/또는 D-아미노산, 예컨대 아르기닌, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 알라닌, 히스티딘, 세린, 프롤린, 글루탐산, 아스파르트산, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 류신, 아스파라긴, 이소류신 및 발린, 및 적어도 하나의 극성 유닛(예: 당 유닛, 카르복실 유닛, 또는 글리신 또는 D-아미노산에 부착된 PEG 유닛)으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 아미노산 유닛의 서브유닛은 독립적으로 아래 대괄호 안에 표시된 화학식을 갖는다:
Figure pct00295
여기서, R190은 수소, 메틸, 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸, 벤질, p-하이드록시벤질, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH　-CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-피리딜메틸-, 3-피리딜메틸-, 4-피리딜메틸-, 페닐, 사이클로헥실,
Figure pct00296
이다.
일부 양태에서, 아미노산 유닛의 서브유닛 각각은 하기 L-(천연) 아미노산으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다: 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 히스티딘, 글리신, 글루탐산, 글루타민, 페닐알라닌, 리신, 류신, 세린, 티로신, 트레오닌, 이소류신, 트립토판 및 발린; 및 당 유닛, 카르복실 유닛, 또는 글리신 또는 천연 아미노산에 부착된 PEG 유닛과 같은 적어도 하나의 극성 유닛.
일부 양태에서, 아미노산 유닛의 서브유닛은 시스테인이 아니다. 일부 양태에서, 아미노산 유닛의 서브유닛은 프롤린이 아니다.
일부 양태에서, 아미노산 유닛의 서브유닛 각각은 하기의 이들 천연 아미노산의 D-이성질체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다: 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 히스티딘, 글리신, 글루탐산, 글루타민, 페닐알라닌, 리신, 류신, 세린, 티로신, 트레오닌, 이소류신, 트립토판 및 발린; 및 당 유닛, 카르복실 유닛, 또는 글리신 또는 L-아미노산에 부착된 PEG 유닛과 같은 적어도 하나의 극성 유닛.
일부 양태에서, 아미노산 유닛의 서브유닛 각각은 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 히스티딘, 글리신, 글루탐산, 글루타민, 페닐알라닌, 리신, 류신, 세린, 티로신, 트레오닌, 이소류신, 프롤린, 트립토판, 발린, 오르니틴, 페니실라민, β-알라닌, 아미노알칸산, 아미노알킨산, 아미노알칸디오산, 아미노벤조산, 아미노-헤테로사이클로-알칸산, 헤테로사이클로-카르복실산, 시트룰린, 스타틴, 디아미노알칸산, 및 그 유도체; 및 당 유닛, 카르복실 유닛, 또는 서브유닛 중 하나에 부착된 PEG 유닛과 같은 적어도 하나의 극성 유닛으로부터 독립적으로 선택된다.
알라닌 및 그 유도체의 예시에는 알라닌(Ala), N-알킬-알라닌, 데하이드로-알라닌, 4-티아졸릴알라닌, 2-피리딜알라닌, 3-피리딜알라닌, 4-피리딜알라닌, β-(1-나프틸)-알라닌, β-(2-나프틸)-알라닌, α-아미노부티르산, β-클로로-알라닌, β-시아노-알라닌, β-사이클로펜틸-알라닌, β-사이클로헥실-알라닌, β-요오도-알라닌, β-사이클로펜테닐-알라닌, β-tBu-알라닌, β-사이클로프로필-알라닌, β-다이페닐-알라닌, β-플루오로-알라닌, 피페라진 환이 보호되거나 보호되지 않은 β-피페라지닐-알라닌, β-(2-퀴놀릴)-알라닌, β-(1,2,4-트리아졸-1-일)-알라닌, β-우레이도-알라닌, H-β-(3-벤조티에닐)-Ala-OH 및 H-β-(2-티에닐)~Ala-OH가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
아르기닌 및 그 유도체의 예시에는 아르기닌(Arg), N-알킬-아르기닌, H-Arg(Me)-OH, H-Arg(NH2)-OH, H-Arg(NO2)-OH, H-Arg(Ac)2-OH, H-Arg(Me)2-OH(비대칭), H-Arg(Me)2-OH(대칭), 2-아미노-4-(2'-하이드록시구아니디노)-부티르산(N-ω-하이드록시-노르-아르기닌) 및 호모아르기닌이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
아스파르트산 및 그 유도체의 예시에는 아스파르트산(Asp), N-알킬-아스파르트산 및 H-Asp(OtBu)-OH가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
아스파라긴 및 그 유도체의 예시에는 아스파라긴(Asn), N-알킬-아스파라긴 및 이소아스파라긴(H-Asp-NH2)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
시스테인(Cys) 유도체(유리 SH 기를 함유하지 않음)의 예시에는 H-Cys(Acm)-OH, H-Cys(Trt)-OH, H-Cys(tBu)-OH, H-Cys(Bzl)-OH, H-Cys(Et)-OH, H-Cys(SO3H)-OH, H-Cys(아미노에틸)-OH, H-Cys(카르바모일)-OH, H-Cys(페닐)-0H, H-Cys(Boc)-OH, 및 H-Cys(하이드록시에틸)-OH가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
히스티딘 및 그 유도체의 예시에는 히스티딘(His), N-알킬-히스티딘, H-His(Boc)-OH, H-His(Bzl)-OH, H-HBs(I-Me)-OH, H-His(1-Tos)-OH, H-2,5-디요오도-His-OH, 및 H-His(3-Me)-OH가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
글리신 및 그 유도체들의 예시에는 글리신(GIy), N-알킬-글리신, H-프로파르길글리신(
Figure pct00297
);α_아미노글리신(보호 또는 비보호), β-사이클로프로필-글리신, 사이클로펜틸-글리신, 사이클로헥실-글리신, α-알릴글리신, t-부틸-글리신, 네오펜틸글리신 및 페닐글리신이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
글루탐산 및 그 유도체의 예시에는 글루탐산(GIu), N-알킬-글루탐산, H-GIu(OtBu)-OH, H-γ-하이드록시-Glu-OH, H-γ-메틸렌-Glu-OH, H-γ-카르복시-Glu(OtBu)2-OH 및 파이로글루탐산이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
글루타민 및 그 유도체의 예시에는 글루타민(GIn), N-알킬-글루타민, 이소글루타민(H-GIu-NH2), H-GIn(Trt)-OH 및 H-Gln(이소프로필)-OH가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
페닐알라닌 및 그 유도체의 예시에는 페닐알라닌(Phe), N-알킬-페닐알라닌, H-p-아미노-Phe-OH, H-p-아미노-Phe(Z)-OH, H-p-브로모-Phe-OH, H-p-벤질-Phe-OH, H-p-tBu-Phe-OH, H-p-카르복시-Phe(OtBu)-OH, H-p-카르복시-Phe-OH, H-p-시아노-Phe-OH, H-p-플루오로-Phe-OH, H-3,4-디클로로-Phe-OH, H-p-아이오도-Phe-OH, H-p-니트로-Phe-OH, H-p-메틸-Phe-OH, H-펜타플루오로-Phe-OH, H-m-플루오로-Phe-OH, H-α-Me-Phe-OH, H-4-페닐-Phe-OH, 호모페닐알라닌, 클로로-페닐알라닌 및 β-호모페닐알라닌이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
리신 및 그 유도체의 예시에는 리신(Lys), N-알킬-리신리신, H-Lys(Boc)-OH, H-Lys(Ac)-OH, H-Lys(포르밀)-OH, H-Lys(Me)2-OH, H-Lys(니코티노일)-OH, H-Lys(Me)3-OH, H-트랜스-4,5-디하이드로-Lys-OH, H-Lys(Aloc)-OH, H- H-δ-하이드록시-Lys-OH, H-δ-하이드록시-Lys(Boc)-OH, H-Lys(아세트아미도일)-OH 및 H-Lys(이소프로필)-OH이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 류신 및 그 유도체의 예시에는 류신(Leu), N-알킬-류신, 4,5-데하이드로류신, H-α-Me-Leu-OH, 호모류신, 노르류신, 및 t-류신이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
메티오닌 및 그 유도체의 예시에는 메티오닌(Met), H-Met(O)-OH, 및 H-Met(O)2-OH가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
세린 및 그 유도체의 예시에는 세린(Ser), N-알킬-세린, H-Ser(Ac)-OH, H-Ser(tBu)-OH, H-Ser(Bzl)-OH, H-Ser(ρ-클로로-Bzl)-OH, H-β-(3,4-디하이드록시페닐)-Ser-OH, H-β-(2-티에닐)-Ser-OH, 이소세린 N-알킬-이소세린 및 3-페닐이소 세린이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
티로신 및 그 유도체의 예시에는 티로신(Tyr), N-알킬-티로신, H-3,5-디니트로-Tyr-OH, H-3-아미노-Tyr-OH, H-3,5-디브로모-Tyr-OH, H-3,5-디요오도-Tyr-OH, H-Tyr(Me)-OH, H-Tyr(tBu)-OH, H-Tyr(Boc)-OH, H-Tyr(Bzl)-OH, H-Tyr(Et)-OH, H-3-요오도-Tyr-OH 및 H-3-니트로-Tyr-OH가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
트레오닌 및 그 유도체의 예시에는 트레오닌(Thr), N-알킬-트레오닌, 알로-트레오닌, H-Thr(Ac)-OH, H-Thr(tBu)-OH 및 H-Thr(Bzl)-OH가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
이소류신 및 그 유도체의 예시에는 이소류신(He), N-알킬-이소류신, 알로-이소류신 및 노르류신이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
트립토판 및 그 유도체의 예시에는 트립토판(Tip), N-알킬-트립토판, H-5-Me-Trp-OH, H-5-하이드록시-Trp-OH, H-4-Me-Trp-OH, H-α-Me-Trp-OH, H-Trp(Boc)-OH, H-Trp(포르밀)-OH 및 H-Trp(메시틸렌-2-설포닐)-OH가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
프롤린 및 그 유도체의 예시에는 프롤린(Pro), N-알킬-프롤린, 호모프롤린, 티오프롤린, 하이드록시프롤린(H-Hyp-OH), H-Hyp(tBu)-OH, H-Hyp(Bzl)-OH, H-3,4-데하이드로-Pro-OH, 4-케토-프롤린, α-Me-Pro-OH 및 H-4-피우오로-Pro-OH(H-4-fiuoro-Pro-OH)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
발린 및 그 유도체의 예시에는 발린(VaI), N-알킬-발린, H-α-Me-Val-OH 및 노르발린이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
오르니틴 및 그 유도체의 예시에는 오르니틴, N-알킬-오르니틴, H-Orn(Boc)-OH, H-Om(Z)-OH, H-α-디플루오로-Me-Orn-OH(에플로르니틴(Eflornitine)) 및 H-Orn(Aloc)-OH가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
페니실라민 및 그 유도체의 예시에는 페니실라민, H-페니실라민(Acm)-OH(H-β,β-디메틸시스(Acm)-OH) 및 N-알킬-페니실라민이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
β-알라닌 및 그 유도체의 예시에는 β-알라닌, N-알킬-β-알라닌 및 데하이드로-알라닌이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
아미노알칸산 및 그 유도체의 예시에는 N-알킬아미노알칸산, 아미노부티르산, 4-(네오펜틸옥시설포닐)-아미노부티르산, ε-아미노카프로산, α-아미노이소부티르산, 피페리딜아세트산, 3-암노프로피온산, 3-아미노-3-(3-피리딜)-프로피온산, 및 5-아미노펜탄산(아미노발레르산)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
아미노알킨산 및 그 유도체의 예시에는 N-알킬아미노알킨산, 6-아미노-4-헥신산, 6-(Boc-아미노)-4-헥신산이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
아미노알칸이산(aminoalkanedioic acid) 및 그 유도체의 예시에는 N-알킬아미노알칸이산, 2-아미노헥산이산, 2-아미노헵탄이산, 2-아미노옥탄이산(H-Asu-OH)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
아미노벤조산 및 그 유도체의 예시에는 N-알킬아미노벤조산, 2-아미노벤조산, 3-아미노벤조산 및 4-아미노벤조산이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
아미노-헤테로사이클로알칸산 및 그 유도체의 예시에는 N-알킬아미노-헤테로사이클로-알칸산, 4-아미노-1-메틸-1H-이미다졸-2-카르복실산, 4-아미노-1-메틸-1H-피롤-2-카르복실산, 4-아미노-피페리딘-4-카르복실산(H-Pip-OH; 1-보호되거나 보호되지 않음), 3-아미노-3-(3-피리딜)-프로피온산이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
헤테로사이클로-카복실산 및 그 유도체의 예시에는 아제티딘-2-카르복실산, 아제티딘-3-카르복실산, 피페리딘-4-카르복실산 및 티아졸리딘-4-카르복실산이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
시트룰린 및 그 유도체의 예시에는 시트룰린(cit), N-알킬-시트룰린, 티오 시트룰린, S-메틸-티오시트룰린 및 호모시트룰린이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
스타틴 및 그 유도체의 예시에는 스타틴, N-알킬-스타틴, 사이클로헥실스타틴 및 페닐스타틴이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
디아미노알칸산(Dab) 및 그 유도체의 예시에는 N-알킬-디아미노-알칸산, N,N-디알킬아미노-알칸산, α,γ-디아미노부티르산(H-Dab-OH), H-Dab(Aloc)-OH, H-Dab(Boc)-OH, H-Dab(Z)-OH, α,β-디아미노프로피온산 및 그 측쇄가 보호된 버전이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 양태에서, 아미노산 유닛은 직쇄 또는 분지형 알킬기, 폴리에틸렌 쇄(1 내지 30개 서브유닛) 또는 PEG 유닛과 같은 캡핑 기로 종결될 수 있다.
아미노산 유닛의 예시적 양태는 하기를 포함하며, 여기서 SU는 당 유닛이고, PEG는 PEG 유닛이고, CU는 카르복실 유닛이다:
일부 양태에서, 아미노산 유닛은 SU를 포함한다.
일부 양태에서, 아미노산 유닛은 SU-Lys-SU를 포함한다.
일부 양태에서, 아미노산 유닛은 SU-Lys-SU-tert-부틸을 포함한다.
일부 양태에서, 아미노산 유닛은 SU-Lys를 포함한다.
일부 양태에서, 아미노산 유닛은 Lys-SU를 포함한다.
일부 양태에서, 아미노산 유닛은 Lys-SU-Lys(PEG)를 포함한다.
일부 양태에서, 아미노산 유닛은 SU-Lys(PEG)-SU를 포함한다.
일부 양태에서, 아미노산 유닛은 SU-Glu-SU를 포함한다.
일부 양태에서, 아미노산 유닛은 Lys(PEG)를 포함한다.
일부 양태에서, 아미노산 유닛은 Lys(PEG)-Lys(PEG)를 포함한다
일부 양태에서, 아미노산 유닛은 CU를 포함한다.
일부 양태에서, 아미노산 유닛은 CU-CU를 포함한다.
일부 양태에서 아미노산 유닛이 존재하고 펩타이드 결합을 통해 링커 서브유닛 L2의 펩타이드에 연결된다. 일부 양태에서, 이러한 아미노산 유닛-링커 서브유닛 L2는 SU-Val-Cit~를 포함하며, 여기서 물결선은 링커 서브유닛 L2의 나머지 부분 또는 약물 유닛에 대한 결합을 나타낸다. 일부 양태에서, 이러한 아미노산 유닛-링커 서브유닛 L2는 SU-Val-Ala~를 포함하며, 여기서 물결선은 링커 서브유닛 L2의 나머지 부분 또는 약물 유닛에 대한 결합을 나타낸다. 일부 양태에서, 이러한 아미노산 유닛-링커 서브유닛 L2는 SU-Val-Lys~를 포함하며, 여기서 물결선은 링커 서브유닛 L2의 나머지 부분 또는 약물 유닛에 대한 결합을 나타낸다. 일부 양태에서, 이러한 아미노산 유닛-링커 서브유닛 L2는 SU-Gly-Gly-Phe-Gly~를 포함하며, 여기서 물결선은 링커 서브유닛 L2의 나머지 부분 또는 약물 유닛에 대한 결합을 나타낸다.
일부 양태에서, 이러한 아미노산 유닛-링커 서브유닛 L2는 Val-Lys(PEG)~를 포함하며, 여기서 물결선은 링커 서브유닛 L2의 나머지 부분 또는 약물 유닛에 대한 결합을 나타낸다. 일부 양태에서, 이러한 아미노산 유닛-링커 서브유닛 L2는 Val-Cit(PEG)~를 포함하며, 여기서 물결선은 링커 서브유닛 L2의 나머지 부분 또는 약물 유닛에 대한 결합을 나타낸다. 일부 양태에서, 이러한 아미노산 유닛-링커 서브유닛 L2는 Lys(PEG)-Val-Cit~를 포함하며, 여기서 물결선은 링커 서브유닛 L2의 나머지 부분 또는 약물 유닛에 대한 결합을 나타낸다. 일부 양태에서, 이러한 아미노산 유닛-링커 서브유닛 L2는 Lys(PEG)-Gly-Gly-Phe-Gly~를 포함하며, 여기서 물결선은 링커 서브유닛 L2의 나머지 부분 또는 약물 유닛에 대한 결합을 나타낸다.
일부 양태에서, 이러한 아미노산 유닛-링커 서브유닛 L2는 CU-Val-Cit~를 포함하며, 여기서 물결선은 링커 서브유닛 L2의 나머지 부분 또는 약물 유닛에 대한 결합을 나타낸다. 일부 양태에서, 이러한 아미노산 유닛-링커 서브유닛 L2는 CU-Val-Lys~를 포함하며, 여기서 물결선은 링커 서브유닛 L2의 나머지 부분 또는 약물 유닛에 대한 결합을 나타낸다. 일부 양태에서, 이러한 아미노산 유닛-링커 서브유닛 L2는 CU-Val-Ala~를 포함하며, 여기서 물결선은 링커 서브유닛 L2의 나머지 부분 또는 약물 유닛에 대한 결합을 나타낸다. 일부 양태에서, 이러한 아미노산 유닛-링커 서브유닛 L2는 Val-CU~를 포함하며, 여기서 물결선은 링커 서브유닛 L2의 나머지 부분 또는 약물 유닛에 대한 결합을 나타내고, CU는 리신 잔기를 포함한다. 일부 양태에서, 이러한 아미노산 유닛-링커 서브유닛 L2는 CU-Gly-Gly-Phe-Gly~를 포함하며, 여기서 물결선은 링커 서브유닛 L2의 나머지 부분 또는 약물 유닛에 대한 결합을 나타낸다.
일부 양태에서, 아미노산 유닛이 존재하고 비펩타이드 결합에 의해 링커 서브유닛 L2에 부착된다. 일부 양태에서, 아미노산 유닛은 C1-C10 알킬렌, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 펩타이드 연결기에 의해 링커 서브유닛 L2에 부착된다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 L2 또는 AA-L2는 다음 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00298
여기서, 아미노기 상의 물결선은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 약물 유닛은 벤질 알콜에 부착된다.
스트레처 유닛(L1)
스트레처 유닛(L1)은 표적화 유닛을 아미노산 유닛(AA) 또는 링커 서브유닛 L2에 연결할 수 있다. 스트레처 유닛은 표적화 유닛의 작용기와 결합을 형성할 수 있는 작용기를 가지고 있다. 링커의 일부 양태에서, 스트레처 유닛은 링커 서브유닛 L2에 부착되는 아미노산 유닛에 부착된다(즉, AA의 s가 1인 경우; 예를 들어, 화학식 (I) 내지 (IV) 참조). 일부 양태에서, 스트레처 유닛은 링커 서브유닛 L2에 부착된다(즉, AA의 s가 0인 경우; 예를 들어, 화학식 (I) 내지 (IV) 참조). 일부 실시양태에서, 아미노산 유닛-링커 서브유닛 L2가 형성된 후에 스트레처 유닛이 아미노산 유닛-링커 서브유닛 L2에 부착된다. 일부 양태에서, 아미노산 유닛-링커 서브유닛 L2-약물 유닛이 형성된 후에 스트레처 유닛이 아미노산 유닛-링커 서브유닛 L2-약물 유닛에 부착된다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2-약물 유닛이 형성된 후에 스트레처 유닛이 링커 서브유닛 L2-약물 유닛에 부착된다.
표적화 유닛에 부착하기 위한 스트레처 유닛의 작용기는 예를 들어 말레이미드, 할로아세트아미드, 설프하이드릴기, NHS에스테르, 알데하이드, 케톤, 카르보닐, 하이드라지드, 하이드록실아민, 아민, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실 또는 아릴하이드라지드를 포함할 수 있다.
자연적으로 또는 화학적 조작을 통해 표적화 유닛에 존재할 수 있는 작용기는 설프하이드릴(-SH), 아미노, 하이드록실, 카르복시, 탄수화물의 아노머 하이드록실기 및 카르복실기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일 측면에서, 표적화 유닛의 작용기는 설프하이드릴 및 아미노이다. 설프하이드릴기는 표적화 유닛의 분자내 디설파이드 결합의 환원에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 설프하이드릴 기는 2-이미노티올란(트라우트(Traut) 시약) 또는 다른 설프하이드릴 생성 시약을 사용하여 표적화 유닛의 리신 모이어티의 아미노기의 반응에 의해 생성될 수 있다.
일부 양태에서, 스트레처 유닛은 스트레처 유닛의 말레이미드기를 통해 표적화 유닛의 황 원자와 결합을 형성한다. 황 원자는 예를 들어 표적화 유닛의 설프하이드릴기(예를 들어, 쇄 간(interchain) 디설파이드 결합의 티올기)로부터 유래될 수 있다. 본 양태의 대표적인 스트레처 유닛은 하기 화학식 100 및 101로 표시되며, 여기서 L은 표적화 유닛이고 물결선은 아미노산 유닛 또는 링커 서브유닛 L2에 대한 부착 부위를 나타낸다.
Figure pct00299
일부 양태에서, 링커가 제공되며, 여기서 스트레처 유닛은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00300
Figure pct00301
여기서, 물결선 은 아미노산 유닛에 대한 스트레처 유닛의 부착 부위를 나타낸다.
화학식 100 및 101에서, R17은 -C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 헤테로알킬렌-, -C3-C8 카르보사이클로-, -O-(C1-C8 알킬렌)-, -(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌- (여기서 b는 1 내지 26임), -아릴렌-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보사이클로)-, -(C3-C8 카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-, -C3-C8 헤테로사이클로-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로사이클로)-, -(C3-C8 헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-C(=O)-, C1-C10 헤테로알킬렌-C(=O)-, -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C3-C8 카르보사이클로-C(=O)-, -O-(C1-C8 알킬)-C(=O)-, -아릴렌-C(=O)-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-C(=O)-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-C(=O)-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보사이클로)-C(=O)-, -(C3-C8 카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-C(=O)-, -C3-C8 헤테로사이클로-C(=O)-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로사이클로)-C(=O)-, -(C3-C8 헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-C(=O)-, -C1-C10 알킬렌-NH-, -C1-C10 헤테로알킬렌-NH-, -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(C(=O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(C(=O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-NH-(C(=O))-(CH2-O-CH2)b-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-NH-(C(=O))-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -C3-C8 카르보사이클로-NH-, -O-(C1-C8 alkyl)-NH-, -아릴렌-NH-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-NH-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-NH-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보사이클로)-NH-, -(C3-C8 카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-NH-, -C3-C8 헤테로사이클로-NH-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로사이클로)-NH-, -(C3-C8 헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-NH-, -C1-C10 알킬렌-S-, C1-C10 헤테로알킬렌-S-, -C3-C8 카르보사이클로-S-, -O-(C1-C8 알킬)-S-, -아릴렌-S-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-S-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-S-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보사이클로)-S-, -(C3-C8 카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-S-, -C3-C8 헤테로사이클로-S-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로사이클로)-S-, 또는 -(C3-C8 헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-S-이다. 임의의 R17 치환체는 치환되거나 치환되지 않을 수 있다(비치환이라고도 함). 일부 측면에서, R17 치환체는 치환되지 않는다. 일부 측면에서, R17 치환체는 선택적으로 치환된다. 일부 측면에서, R17 기(예를 들어, WO2013/173337 참조), 예를 들어, -(CH2)xNH2, -(CH2)xNHRa 및 -(CH2)xNRa 2 (여기서 x는 1 내지 4의 정수이고 각각의 Ra는 C1-C6 알킬 및 C1-C6 할로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 2개의 Ra 기는 이들이 부착된 질소와 결합하여 아제티디닐, 피롤리디닐 또는 피페리디닐 기를 형성한다.
화학식 100의 일부 양태에서, R17은 -C1-C6 알킬렌-C=O)-이다. 일부 양태에서, R17은 -C1 알킬렌-C(=O)-이다.
화학식 100의 일부 양태에서, R17은 -(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -(CH2-O-CH2)b-C1-C8 alkylene-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(C(=O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(C(=O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-NH-(C(=O))-(CH2-O-CH2)b-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), 또는 -C1-C8 알킬렌-NH-(C(=O))-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-NH- (여기서 b는 1 내지 26임)이다.
다른 양태에서, 스트레처 유닛은 스트레처 유닛의 황 원자와 표적화 유닛의 황 원자 사이의 디설파이드 결합을 통해 표적화 유닛에 연결된다. 본 양태의 대표적인 스트레처 유닛은 하기 화학식 102로 도시되며, 여기서 L은 표적화 유닛이고, 물결선은 아미노산 유닛 또는 링커 서브유닛 L2에 대한 부착 부위를 나타내고 R17은 화학식 100 및 101에 대해 상술한 바와 같다.
Figure pct00303
또 다른 양태에서, 스트레처 유닛의 반응성 기는 표적화 유닛의 1차 또는 2차 아미노 기와 결합을 형성할 수 있는 반응성 부위를 함유한다. 이러한 반응성 부위의 예에는 석신이미드에스테르, 4-니트로페닐에스테르, 펜타플루오로페닐에스테르, 테트라플루오로페닐에스테르, 무수물, 산 염화물, 설포닐 염화물, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트와 같은 활성화된에스테르가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 본 양태의 대표적인 스트레처 유닛은 화학식 103, 104 및 105에 도시되어 있으며, 여기서 L은 표적화 유닛이고, 물결선은 아미노산 유닛 또는 링커 서브유닛 L2에 대한 부착 부위를 나타내고 R17은 화학식 100 및 101에 대해 상술한 바와 같다.
Figure pct00304
또 다른 양태에서, 스트레쳐 유닛의 반응성 기는 표적화 유닛 상에 존재할 수 있는 변형된 탄수화물(-CHO) 기에 반응성인 반응성 부위를 함유한다. 예를 들어, 탄수화물은 과요오드산 나트륨과 같은 시약을 사용하여 약하게 산화될 수 있으며 산화된 탄수화물의 생성된 (-CHO) 유닛은 하이드라지드, 옥심, 1차 또는 2차 아민, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실, 또는 아릴하이드라지드(문헌 [Kaneko, T. et al. (1991) Bioconjugate Chem. 2:133-41.]에 기재된 것과 같음)와 같은 작용성을 함유하는 스트레처 유닛과 함께 응축될 수 있다. 이 양태의 대표적인 스트레처 유닛이 하기 화학식 106, 107 및 108에 도시되어 있으며, 여기서 L은 표적화 유닛이고, 물결선은 아미노산 유닛 또는 링커 서브유닛 L2에 대한 부착 부위를 나타내고 R17은 화학식 100 및 101에 대해 상술한 바와 같다.
Figure pct00305
일부 양태에서, 스트레처 유닛의 길이를 연장하는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 스트레처 유닛은 추가 구성요소를 포함할 수 있다. 본 양태의 대표적인 스트레처 유닛은 하기 화학식 109로 도시되며, 여기서 L은 표적화 유닛이고, 물결선은 아미노산 유닛 또는 링커 서브유닛 L2에 대한 부착 부위를 나타내고 R17은 화학식 100 및 101에 대해 상술한 바와 같다.
Figure pct00306
본 양태의 일부 측면에서, R17은 -C1-C5 알킬렌-C(=O)-이다. R13은 -C1-C6 알킬렌-, -(CH2-O-CH2)b- (여기서 b는 1 내지 26임), -C3-C8 카르보사이클로-, -아릴렌-, -C1-C10 헤테로알킬렌-, -C3-C8 헤테로사이클로-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보사이클로)-, -(C3-C8 카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로사이클로)-, 또는 -(C3-C8 헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-이다. 바람직한 양태에서, R13은 -(CH2-O-CH2)b-이고, 여기서 b는 1 내지 26이다.
표적화 유닛
일부 양태에서, 링커는 표적화 유닛에 부착되어 표적화 유닛-링커를 형성한다. 일부 양태에서, 링커는 스트레처 유닛(L1)을 통해 표적화 유닛에 부착되고 링커 서브유닛 L2를 통해 약물 유닛(들)에 부착되어 접합체를 형성한다. 일부 양태에서, 링커는 접합체를 형성하기 위해 스트레처 유닛(L1)을 통해 표적화 유닛(들)에 부착되고 링커 서브유닛 L2를 통해 약물 유닛(들)에 부착된다. 표적화 유닛은 항체, 이의 항원 결합 부분 또는 비항체 표적화 유닛일 수 있다. 비항체 표적화 유닛은 비항체 스캐폴드로도 지칭될 수 있다.
일부 양태에서, 표적화 유닛은 표적 분자에 특이적으로 결합한다. 본원에 사용된 "특이적으로 결합하다"는 본원에 기재된 표적화 유닛(예를 들어, 항체 또는 그 일부)이 10-5 M(10000 nM)의 KD 또는 그 이하, 예를 들어 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M 또는 그 이하로 표적에 결합하는 능력을 의미한다. 특이적 결합은 예를 들어 항체, 표적화 유닛의 친화도 및 결합력, 그리고 표적 폴리펩타이드의 농도에 의해 영향을 받을 수 있다. 당업자는 적합한 세포 결합 분석에서 결합제의 적정과 같은, 임의의 적합한 방법을 사용하여 본원에 기재된 항체, 항원 결합 부분 및 비항체 스캐폴드가 표적에 선택적으로 결합하는 적절한 조건을 결정할 수 있다. 표적에 특이적으로 결합된 표적화 유닛은 비유사 경쟁자에 의해 대체되지 않는다. 특정 양태에서, 표적화 유닛은 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 그의 표적을 우선적으로 인식할 때 그 표적에 특이적으로 결합한다고 말한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위(들)를 함유하는 분자를 의미한다. 이 용어는 일반적으로 전장 항체(중쇄 및 경쇄 불변 영역을 가짐)를 포함하는 2개의 면역글로불린 중쇄 가변 영역과 2개의 면역글로불린 경쇄 가변 영역으로 구성된 항체를 의미한다.
각각의 중쇄는 전형적으로 가변 영역(VH 영역으로 약칭됨) 및 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3 및 선택적으로 제4 도메인 CH4를 포함할 수 있다. 각 경쇄는 가변 영역(VL 영역으로 약칭됨)과 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 CL 도메인이다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변 영역으로 추가로 분할될 수 있고 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 보존 영역이 산재해 있을 수 있다. 따라서 각 VH 및 VL 영역은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 N 말단에서 C 말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다. 이 구조는 당업자에게 잘 알려져 있다.
본원에 사용된 항체의 "항원-결합 부분"은 항체의 VH 및/또는 VL 서열을 갖는 항체의 부분 또는 항체의 CDR을 의미하고 이는 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 항원 결합 부분의 예시에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, 디설파이드 연결된 Fv, 단일 도메인 항체(VHH, VNAR, sdAb 또는 나노바디라고도 함) 또는 디아바디(예를 들어, 본원에 참조로서 포함된 문헌 [Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883(1988) 및 Bird et al., Science 242, 423-426(1988)] 참조)가 포함된다. 본원에 사용된 용어 Fab, F(ab')2, 및 Fv는 하기를 의미한다: (i) Fab는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편이고; (ii) F(ab')2는 디설파이드 가교를 통해 힌지 영역에서 서로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편이고; 및 (iii) Fv는 VL 및 VH 도메인으로 구성됨. Fv 단편의 두 도메인, 즉 VL 및 VH는 별도의 코딩 영역에 의해 인코딩되지만, 이들은 합성 링커, 예를 들어, 폴리-G4S 아미노산 서열(서열 번호: 1로 개시된 '(G4S)n', 여기서 n= 1 내지 5)을 사용하여 추가로 서로 연결될 수 있어, VL과 VH 영역이 결합하여 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄(단일 쇄 Fv 또는 scFv로 알려짐)로서 이들을 제조할 수 있다. 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어는 또한 이러한 단일 쇄 항체를 포함하도록 의도된다. "디아바디"와 같은 다른 형태의 단일 쇄 항체도 여기에 포함된다. 디아바디는 2가 이중 특이성 항체로, 단일 폴리펩타이드 쇄에서 VH 및 VL 영역이 발현되지만 두 영역이 같은 쇄에서 결합하기에는 너무 짧은, VH 및 VL 영역을 연결하는 링커를 사용하여, VH 및 VL 영역이 다른 쇄의 상보적인 영역(각각 VL 및 VH)과 짝을 이루고 두 개의 항원 결합 부위를 형성하도록 한다 (예를 들어 문헌 [Holliger, R, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:64446448; Poljak, R. J, et al. (1994) Structure 2:1121-1123] 참조).
단일 도메인 항체는 단일 단량체 가변 항체 영역을 함유하는 항체의 항원 결합 부분이다. 단일 도메인 항체는 낙타과의 항체 중쇄의 가변 영역(예를 들어, 나노바디 또는 VHH 부분)에서 유래될 수 있다. 또한, 단일 도메인 항체라는 용어는 자율적 인간 중쇄 가변 도메인(aVH) 또는 상어로부터 유래된 VNAR 부분을 포함한다(예를 들어, 문헌 [Hasler et al., Mol. Immunol. 75:28-37, 2016] 참조).
단일 도메인 항체(예컨대, DAB 또는 VHH)를 제조하는 기술은 예를 들어, 코신스 등(2006, Prot Express Purif 51:253-259) 및 리 등(Immunol. Lett. 188:89-95, 2017)에 개시된 바와 같이 당업자에게 공지되어 있다. 단일 도메인 항체는 예를 들어 낙타, 알파카 또는 라마에서 표준 면역 기술을 사용하여 얻을 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Muyldermans et al., TIBS 26:230-235, 2001; Yau et al., J Immunol Methods 281:161-75, 2003; and Maass et al., J Immunol Methods 324:13-25, 2007.] 참조). VHH는 강력한 항원 결합 능력을 가질 수 있으며 기존의 VH-VL 쌍에 접근 할 수없는 새로운에피토프와 상호 작용할 수 있다 (예를 들어, Muyldermans 등(2001) 참조). 알파카 혈청 IgG는 약 50%의 카멜리드 중쇄 전용 IgG 항체(HCAb)를 함유하고 있다(예: Maass 등(2007) 참조). 알파카에 항원을 접종하면 표적 항원에 결합하여 중화시키는 VHH를 분리할 수 있다(예: Maass 등(2007) 참조). 알파카 VHH 코딩 서열을 증폭시키는 PCR 프라이머가 확인되었고, 당업자에게 잘 알려진 표준 바이오패닝 기법에 의해 항체 단편 분리에 사용될 수 있는 알파카 VHH 파지 디스플레이 라이브러리를 구성하는 데 사용될 수 있다(예: Maass 등(2007) 참조).
일부 양태에서, 표적화 유닛은 항체 또는 그의 항원 결합 부분으로서 이중특이적 또는 다중특이적 결합제이다. 이중 특이적 및 다중특이적 항체는 다음과 같은 것을 포함한다: scFv1-ScFv2, ScFv12-Fc-scFv22, IgG-scFv, DVD-Ig 트리오맙/쿼드로마, 2-in-1 IgG, scFv2-Fc, TandAb, 및 scFv-HSA-scFv. 일부 양태에서, IgG-scFv는 IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, svFc-(L)IgG, 2scFV-IgG 또는 IgG-2scFv이다. 예를 들어, 문헌 [Brinkmann and Kontermann, MAbs 9(2):182-212 (2017); Wang et al., Antibodies, 2019, 8, 43; Dong et al., 2011, MAbs 3:273-88; Natsume et al., J. Biochem. 140(3):359-368, 2006; Cheal et al., Mol. Cancer Ther. 13(7):1803-1812, 2014; 및 Bates and Power, Antibodies, 2019, 8, 28.] 참조.
일부 양태에서, 표적화 유닛은 암 관련 항원, 예컨대, CD19, CD20, CD30, CD33, CD38, CA125, MUC-1, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), CD44 표면 부착 분자, 메소텔린(MLSN), 암세포배아 항원(CEA), 표피세포 성장 인자 수용체(EGFR), EGFRvIII, 혈관내피세포 성장인자수용체-2(VEGFR2), 고분자량-흑색종 관련 항원(HMW-MAA), MAGE-A1, IL-13R-a2, GD2, 1p19q, ABL1, AKT1, ALK, APC, AR, ATM, BRAF, BRCA1, BRCA2, cKIT, cMET, CSF1R, CTNNB1, FGFR1, FGFR2, FLT3, GNA11, GNAQ, GNAS, HRAS, IDH1, IDH2, JAK2, KDR(VEGFR2), KRAS, MGMT, MGMT-Me, MLH1, MPL, NOTCH1, NRAS, PDGFRA, Pgp, PIK3CA, PR, PTEN, RET, RRM1, SMO, SPARC, TLE3, TOP2A, TOPO1, TP53, TS, TUBB3, VHL, CDH1, ERBB4, FBXW7, HNF1A, JAK3, NPM1, PTPN11, RB1, SMAD4, SMARCB1, STK1, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, ROS1, ERCC1, 5T4(TPBG), B7-H3, CCR7, CD105, CD22, CD46, CD47, CD56, CD70, CD71, CD79b, CDH6, CLDN6, CLDN18. 2, CLEC12A, DLL3, DR5, ERBB3(HER3), EPCAM, FOLR1, IGF1R, IL2RA(CD25), IL3RA, ITGB6, LIV-1, LRRC15, 메소텔린(MSLN), NaPi2b(SLC34A2), 넥틴-4, PTK7, ROR1, SEZ6, SLC44A4, SLITRK6, 조직 인자(TF), TROP2 또는 B7-H4이다. 본 발명에 따르면, "암 관련 항원", "종양 항원", "종양 발현 항원", "암 항원", "암 관련 항원" 및 "암 발현 항원"이라는 용어는 균등하며, 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.
일부 양태에서, 표적화 유닛은 CD19, CD20, CD30, CD33, CD70, LIV-1 또는 EGFRv3와 같은 표적에 특이적으로 결합한다.
일부 양태에서, 표적화 유닛은, 문헌[Leuschner et al., US 2022/0048951 and/or Lerchen et al., US 2022/0016258]에 개시된 서열을 갖는 표적에 결합하는 항체(또는 그 단편)이다. 단일클론 항체의 비제한적인 예로는 리툭시맙((Rituxan®), 트라스투주맙(Herceptin®), 퍼투주맙(Perjeta®), 베바시주맙(Avastin®), 라니비주맙(Lucentis®), 세툭시맙(Erbitux®), 알렘투주맙(Campath®), 파니투맙(Vectibix®), 이브리투맙(Zevalin®), 토시투무맙(Bexxar®), 이필리무맙, 잘루투무맙, 달로투무맙, 피기투무맙, 라무시루맙, 갈릭시맙, 팔레투주맙, 오크레리주맙, 오브아투무맙(Arzerra®), CD20 항체 2F2(HuMax-CD20), 7D8, IgM2C6, IgG1 2C6, 11B8, B1, 2H7, LT20, 1FS 또는 AT80 (문헌[Teeling et al., J. Immunol. 177:362-371 (2006)] 참조), 다클리주맙(Zenapax®) 및 특히 본 발명에 따른 접합체와 함께 조합하여 사용할 수 있는 클론 A9E4, F1G4, AT2G7, GNRH03, GNRHR2 등과 같은 항-LHRH 수용체 항체가 포함된다.
일부 양태에서, FOLR1 항체, 이의 항원 결합 부분 및 기타 결합제뿐만 아니라 이러한 항체, 항원 결합 부분 및 기타 결합제의 접합체가 제공된다. 또한 암 및 기타 질환의 치료를 위해 FOLR1 항체, 항원 결합 부분 및 기타 결합제 및 이의 접합체를 사용하는 방법이 제공된다. 본원에 개시된 발명은 FOLR1에 특이적으로 결합하고 개선된 특성을 나타내는 FOLR1 항체, 이의 항원 결합 부분 및 기타 결합제뿐만 아니라 이의 접합체에 부분적으로 기초한다. FOLR1은 특정 암 치료에 중요하고 유리한 치료 표적이다. FOLR1 항체, 이의 항원 결합 부분, 이의 다른 결합제 및 접합체는 FOLR1+ 암 및 기타 질환의 치료에서 이러한 항체, 항원 결합 부분 및 관련 결합제, 및 이의 접합체의 사용을 기반으로 하는 조성물 및 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 표적화 유닛은 비항체 스캐폴드이다. 일부 양태에서, 표적화 유닛은 비항체 단백질 스캐폴드이다. 이러한 비항체 스캐폴드에는 예를 들어 아피바디(Affibody), 아필린(Affilin), 알티칼린(Anticalin), 아티머(Atrimer), 아비머(Avimer), 바이사이클릭 펩타이드, 시스-노트(Cys-knot), DARPins, FN3 스캐폴드[예: 아넥틴(Adnectin), 센티린(Centyrin), 프로넥틴(Pronectin) 및 Tn3], 피노머(Fynomer), 쿠니츠(Kunitz) 도메인 및 오바디(OBody)가 포함된다. (예를 들어, 문헌[Vazquez-Lombardi et al., Drug Discovery Today 20(10):1271 (2015)] 및 여기에 인용된 참고문헌을 참조.) 이러한 비항체 단백질 스캐폴드에는 예를 들어 아피바디, 아필린, 알티칼린, 아티머, 아비머, 바이사이클릭 펩타이드, 시스-노트, DARPins, FN3 스캐폴드(예: 아넥틴, 센티린, 프로넥틴 및 Tn3), 피노머, 쿠니츠 도메인 및 OBody가 포함된다. (예를 들어, 문헌[Vazquez-Lombardi et al., Drug Discovery Today 20(10):1271 (2015)] 및 여기에 인용된 참고문헌을 참조.) 비항체 스캐폴드는 두 가지 구조적 범주, 즉 도메인 크기 구조체 (6~20kDa 범위) 및 제한된 펩타이드(2~4kDa 범위)로 분류되는 것으로 간주될 수 있다. 도메인 크기의 비항체 스캐폴드에는 아피바디, 아필린, 안티칼린, 아트리머, DARPins, FN3 스캐폴드(예: 애드넥틴 및 센티린), 피노머, 쿠니츠 도메인, 프로넥틴 및 오바디가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 펩타이드 크기의 비항체 스캐폴드에는 예를 들어 아비머, 바이사이클릭 펩타이드 및 시스테인 노트가 포함된다. 비항체 단백질 스캐폴드는 두 가지 구조적 범주, 즉 도메인 크기 구성(6~20kDa 범위)과 제한된 펩타이드(2~4kDa 범위)로 분류되는 것으로 간주될 수 있다. 도메인 크기의 비항체 스캐폴드에는 아피바디, 아필린, 안티칼린, 아트리머, DARPins, FN3 스캐폴드(예: 애드넥틴 및 센티린), 피노머, 쿠니츠 도메인, 프로넥틴 및 OBody가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 펩타이드 크기의 비항체 스캐폴드에는 예를 들어 아비머, 바이사이클릭 펩타이드 및 시스테인 노트가 포함된다. 이들 비항체 스캐폴드 및 이들을 기반으로 하거나 이로부터 유래된 기본 단백질 또는 펩타이드는 예를 들어 문헌 [Simeon and Chen, Protein Cell 9(1): 3-14 (2018); Vazquez-Lombardi et al., Drug Discovery Today 20: 1271-1283 (2015) 및 Binz et al., Nature Biotechnol. 23: 1257-1268 (2005)]에서 리뷰되었고, 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
비항체 스캐폴드 사용의 이점은 친화력 증가, 표적 중화 및 안정성을 포함한다. 다양한 비항체 스캐폴드는 또한 예를 들어 조직 침투, 더 작은 크기 및 열안정성 측면에서 항체 스캐폴드의 일부 한계를 극복할 수 있다. 일부 비항체 스캐폴드는 또한 예를 들어 이중특이적 구조체가 필요할 때 잠재적인 경쇄 결합 문제로 인해 방해받지 않고 더 쉬운 구성을 허용할 수 있다. 비항체 스캐폴드에 구조체를 구축하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
따라서, 일부 양태에서, 표적화 유닛은 비항체 스캐폴드를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 표적화 유닛은 비항체 스캐폴드 단백질을 포함할 수 있다. 표적화 유닛이, 일부 양태에서, 예를 들어 애드넥틴 스캐폴드 또는 인간 10번째 피브로넥틴 유형 III 도메인(10Fn3)으로부터 유래된 부분; 인간 리포칼린으로부터 유래된 안티칼린 스캐폴드(예를 들어 WO2015/104406에 기재된 것과 같은 것); 저밀도 관련 단백질(LRP) 및/또는 초저밀도 지질단백질 수용체(VLDLR)의 A-도메인으로부터 유래된 아비머 스캐폴드 또는 단백질 단편; FYN 티로신 키나제의 SH3 도메인의 피노머 스캐폴드 또는 부분; 쿠니츠 도메인 스캐폴드 또는 쿠니츠형 프로테아제 억제제의 일부, 예컨대 인간 트립신 억제제, 아프로티닌(소 췌장 트립신 억제제), 알츠하이머 아밀로이드 전구체 단백질, 및 조직 인자 경로 억제제; E. 엘라테리움(E. elaterium)의 트립신 억제제에 기초한 것과 같은 노틴 스캐폴드(시스테인 노트 미니단백질); S. 아우레우스(S. aureus) 단백질 A의 Z 도메인의 전부 또는 일부 또는 아피바디 스캐폴드; β-헤어핀 모방 스캐폴드; 설계된 안키린(ankyrin) 반복 단백질(DARPin) 스캐폴드 또는 안키린 반복(AR) 단백질을 기반으로 하는 인공 단백질 스캐폴드; 또는 인간 트랜스페린, 인간 CTLA-4, 인간 크리스탈린 및 인간 유비퀴틴을 기반으로 하거나 파생된 모든 스캐폴드를 포함할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 수 있다. 예를 들어, 인간 트랜스페린 수용체에 대한 인간 트랜스페린의 결합 부위는 다양화되어 트랜스페린 변이체의 다양한 라이브러리를 생성할 수 있으며, 그 중 일부는 다른 항원에 대한 친화성을 획득했다. 예를 들어, 문헌 [Ali et al. (1999)J. Biol. Chem. 274:24066-24073] 참조. 수용체 결합에 관여하지 않는 인간 트랜스페린 부분은 변하지 않고 그대로 남아 있으며 항체의 프레임워크 영역과 같은 스캐폴드 역할을 하여 변이체 결합 부위를 제시한다. 그 다음, 라이브러리는 항체 라이브러리로서 본원에 기재된 방법에 따라 관심 표적 항원에 대해 스크리닝되어 표적 항원에 대한 최적의 선택성 및 친화도를 갖는 변이체를 확인한다. 예를 들어, 문헌 [Hey et al. (2005) TRENDS Biotechnol. 23(10):514-522] 참조.
FOLR1 표적화 유닛
일부 양태에서, 표적화제는 FOLR1에 특이적으로 결합하는 항-FOLR1 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 양태에서는 이러한 항체와 이의 항원 결합 부분의 접합체가 제공된다. FOLR1에 특이적으로 결합하는 표적화제를 포함하는 접합체는 암 및 기타 질환의 치료 방법에 유용하다. FOLR1 항체의 이러한 접합체 및 이의 항원 결합 부분은 본원에 기재된 링커-약물에 부착될 때 다른 FOLR1 접합체와 비교하여 개선된 특성을 나타낸다. FOLR1은 특정 암 치료에 중요하고 유리한 치료 표적이다. FOLR1 접합체는 FOLR1+암 및 기타 질환의 치료에 있어 이러한 접합체의 사용을 기반으로 하는 조성물 및 방법을 제공한다.
일부 양태에서, FOLR1 표적화제는 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하며, VH 영역은 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역에 배치된 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, VL 영역은 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역에 배치된 LCDR1, LCDR 및 LCDR3을 포함하고, VH 및 VL CDR은 각각 서열 번호:30, 서열 번호:31, 서열 번호:32, 서열 번호:33, 서열 번호:34 및 서열 번호:35; 및 각각 서열 번호:36, 서열 번호:31, 서열 번호:37, 서열 번호:38, 서열 번호:39 및 서열 번호:40으로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열 세트로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 양태에서, VH 및 VL CDR은 각각 서열 번호:30, 서열 번호:31, 서열 번호:32, 서열 번호:33, 서열 번호:34 및 서열 번호:35에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 양태에서, 프레임워크 영역은 인간 프레임워크 영역이다.
일부 양태에서, VH 및 VL 영역은, 각각 서열 번호:6 및 서열 번호:7; 각각 서열 번호:8 및 서열 번호:9; 각각 서열 번호:10 및 서열 번호:11; 각각 서열 번호:12 및 서열 번호:13; 각각 서열 번호:14 및 서열 번호:15; 각각 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17; 각각 서열 번호: 18 및 서열 번호: 19; 각각 서열 번호:20 및 서열 번호:21; 각각 서열 번호:22 및 서열 번호:23; 각각 서열 번호:24 및 서열 번호:25; 각각 서열 번호:26 및 서열 번호:27; 각각 서열번호:28 및 서열번호:29(여기서 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역은 프레임워크 영역에서 1 내지 8개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 선택적으로 변형된다)로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열 세트의 쌍으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 양태에서, VH 및 VL 영역은, 각각 서열 번호: 6 및 서열번호: 7; 각각 서열 번호:8 및 서열 번호:9; 각각 서열 번호:10 및 서열 번호:11; 각각 서열 번호:12 및 서열 번호:13; 각각 서열 번호:14 및 서열 번호:15; 각각 서열 번호:16 및 서열 번호:17; 각각 서열 번호:18 및 서열 번호:19; 각각 서열 번호:20 및 서열 번호:21; 각각 서열 번호:22 및 서열 번호:23; 각각 서열 번호:24 및 서열 번호:25; 각각 서열 번호:26 및 서열 번호:27; 및 각각 서열 번호:28 및 서열 번호:29로 이루어진 군에서 제시된 아미노산 서열 세트의 쌍으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 양태에서, VH 및 VL 영역은, 각각 서열 번호: 8 및 서열 번호: 9; 각각 서열 번호:12 및 서열 번호:13; 각각 서열 번호:14 및 서열 번호:15; 각각 서열 번호 16 및 서열 번호 17; 각각 서열 번호:20 및 서열 번호:21; 각각 서열 번호:22 및 서열 번호:23; 각각 서열 번호:24 및 서열 번호:25; 및 각각 서열 번호:26 및 서열 번호:27로 이루어진 군에서 제시된 아미노산 서열 세트의 쌍으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 양태에서, VH 및 VL 영역은, 각각 서열 번호: 8 및 서열 번호: 9; 각각 서열 번호:12 및 서열 번호:13; 및 각각 서열 번호:26 및 서열 번호:27로 이루어진 군에서 제시된 아미노산 서열 세트의 쌍으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 양태에서, VH 및 VL 영역은, 각각 서열 번호:8 및 서열 번호:9에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 양태에서, VH 및 VL 영역은 각각 서열 번호:12 및 서열 번호:13에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 양태에서, VH 및 VL 영역은 각각 서열 번호:26 및 서열 번호:27에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 양태에서, 중쇄 가변 영역은 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 중쇄 불변 영역은 IgG 이소형이다. 일부 양태에서, 중쇄 불변 영역은 IgG1 불변 영역이다. 일부 양태에서, IgG1 불변 영역은 서열 번호:41에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 양태에서, 중쇄 불변 영역은 IgG4 불변 영역이다. 일부 양태에서, 중쇄 불변 영역은 인간 Fc감마RIII에 대한 결합 친화도를 감소시키는 적어도 아미노산 변형을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 경쇄 가변 영역은 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 경쇄 불변 영역은 카파(kappa) 이소형이다. 일부 양태에서, 경쇄 불변 영역은 서열 번호:42에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 양태에서, FOLR1 접합체는 단일특이적이다. 일부 양태에서, FOLR1 접합체는 2가이다. 일부 양태에서, FOLR1 접합체는 이중특이적이다.
일부 양태에서, FOLR1 접합체는 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는 항체인 표적화 유닛을 포함하며, VH 영역은 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역에 배치된 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, VL 영역은 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역에 배치된 LCDR1, LCDR 및 LCDR3을 포함하며, VH 및 VL CDR은 하기로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열 세트로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다: (a) 각각 서열 번호:30, 서열 번호:31, 서열 번호:32, 서열 번호:33, 서열 번호:34 및 서열 번호:35; 및 (b) 각각 서열 번호:36, 서열 번호:31, 서열 번호:37, 서열 번호:38, 서열 번호:39 및 서열 번호:40. 특정 양태에서, VH 및 VL 영역은 각각 서열 번호:26 및 서열 번호:27로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열 세트의 쌍으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지며; 여기서 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역은 프레임워크 영역에서 1 내지 8개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 선택적으로 변형된다. 특정 양태에서, 표적화 유닛은 항체 F131(VH 서열 번호:26 및 VL 서열 번호:27)이다. 특정 양태에서, 항체는 F131 이고 약물-링커는 LD038이다.
불변 영역
일부 양태에서, 표적화 유닛, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 다른 표적화 유닛은 항체 불변 영역(들)을 갖는다. 일부 양태에서, 불변 영역은 완전한 인간 불변 영역(들)이다. 일부 양태에서, 불변 영역은 인간화 불변 영역(들)이다. 일부 양태에서, 불변 영역은 비인간 불변 영역(들)이다. 면역글로불린 불변 영역은 중쇄 또는 경쇄 불변 영역을 의미합니다. 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 불변 영역은 면역글로불린, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 부류로부터 선택될 수 있는 임의의 적합한 유형일 수 있다. 몇몇 면역글로불린 부류는 아이소타입, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgAl, 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 다양한 부류의 면역글로불린에 해당하는 중쇄 불변 영역(Fc)은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ일 수 있다. 경쇄는 카파(또는 κ) 및 람다(또는 λ) 중 하나일 수 있다.
일부 양태에서, 불변 영역은 IgG 이소형을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 불변 영역은 IgG1 이소형을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 불변 영역은 IgG2 이소형을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 불변 영역은 IgG3 이소형을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 불변 영역은 IgG4 이소형을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 불변 영역은 2개 이상의 이소형으로부터의 불변 영역을 포함하는 혼성 이소형을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 면역글로불린 불변 영역은 IgG1 또는 IgG4 불변 영역일 수 있다. 일부 양태에서, 불변 영역은 IgG1 이소형이고 서열 번호:2에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 양태에서, 불변 영역은 카파 이소형이고 서열 번호:3에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
또한, 항체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 비항체 스캐폴드를 포함하는 표적화 유닛은 항체 또는 항원 결합 부분과 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드의 공유 또는 비공유 결합에 의해 형성된 더 큰 분자의 일부일 수 있다. 이러한 표적화 유닛과 관련된 것은, 예를 들어, 사량체 scFv 분자를 제조하기 위한 스트렙타비딘 코어 영역의 사용(Kipriyanov, SM, et al. (1995), Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) 및 2가 및 비오티닐화된 scFv 분자를 생성하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티디닐 펩타이드, 예를 들어 헥사히스티디닐 태그(서열 번호:4로 개시된 '헥사히스티디닐 태그')의 사용이다 (Kipriyanov, SM, et al. (1994) Mol.Immunol.31:10471058).
이펙터 기능을 변경하기 위한 Fc 도메인 변형
일부 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 비항체 스캐폴드와 같은 표적화 유닛의 Fc 영역 또는 Fc 도메인은 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32a), FcγRIIB(CD32b), FcγRIIIA(CD16a) 및 FcγRIIIB(CD16b)로부터 선택되는 적어도 하나의 Fc 수용체에 실질적으로 결합하지 않는다. 일부 양태에서, Fc 영역 또는 도메인은 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32a), FcγRIIB(CD32b), FcγRIIIA(CD16a) 및 FcγRIIIB(CD16b)로부터 선택된 Fc 수용체 중 임의의 것에 대한 결합을 실질적으로 나타내지 않는다. 본원에 사용된 "실질적으로 결합하지 않음 (substantially no binding)"은 선택된 Fc감마 수용체 또는 수용체들에 대한 결합이 약하거나 전혀 없음을 의미한다. 일부 양태에서, " 실질적으로 결합하지 않음"은 Fc 감마 수용체에 대한 결합 친화도가 1000배 이상 감소(즉, Kd의 증가)함을 의미한다. 일부 양태에서, Fc 도메인 또는 영역은 Fc 눌(null)이다. 본원에 사용된 "Fc 눌(null)"은 임의의 Fc감마 수용체에 대한 결합이 약하거나 전혀 없는 Fc 영역 또는 Fc 도메인을 의미한다. 일부 양태에서, Fc 눌 도메인 또는 영역은 Fc 감마 수용체에 대한 결합 친화도의 감소(즉, Kd의 증가)를 적어도 1000배 나타낸다.
일부 양태에서, Fc 도메인의 이펙터 기능 활성은 감소되거나 실질적으로 존재하지 않는다. 본원에 사용된 "이펙터 기능 활성"은 항체 의존성 세포 독성(ADCC), 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP) 및/또는 보체 의존성 세포 독성(CDC)을 의미한다. 일부 양태에서, Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 감소된 ADCC, ADCP 또는 CDC 활성을 나타낸다. 일부 양태에서, Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 ADCC, ADCP 및 CDC의 감소를 나타낸다. 일부 양태에서, Fc 도메인은 이펙터 기능(즉, ADCC, ADCP 또는 CDC를 자극하거나 효과를 주는 능력)을 실질적으로 나타내지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, "실질적으로 이펙터 기능이 없음"은 야생형 또는 레퍼런스 Fc 도메인과 비교하여 이펙터 기능 활성이 적어도 1000배 감소함을 의미한다.
일부 양태에서, Fc 도메인의 ADCC 활성은 감소되거나 존재하지 않는다. 본원에 사용된 ADCC 활성이 감소되거나 존재하지 않는다는 것은 Fc 도메인의 ADCC 활성이 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 100배 이상 또는 500배 이상 감소한 것을 의미한다.
일부 양태에서, Fc 도메인의 CDC 활성은 감소되거나 존재하지 않는다. 본원에 사용된 CDC 활성이 감소되거나 존재하지 않는다는 것은 Fc 도메인의 CDC 활성이 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 100배 이상 또는 500배 이상 감소한 것을 의미한다.
ADCC 및/또는 CDC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관 내 및/또는 생체 내 세포독성 분석을 수행할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 분석을 수행하여 항체에 Fc감마 수용체 결합이 결여되어 있음(따라서 ADCC 활성이 결여될 가능성이 있음)을 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcgammaRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcgammaRI, FcgammaRII 및 FcgammaRIII를 발현한다. 조혈 세포에서의 FcR 발현은 Ravetch와 Kinet의 문헌[Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 464페이지 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적 예는 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)] 참조]; 미국 특허 번호 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비방사성 검정 방법이 사용될 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법에 대한 ACTITM 비방사성 세포독성 검정(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96TM 비방사성 세포독성 검정(Promega, Madison, Wis.) 참조). 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포에는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포가 포함된다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내, 예를 들어, 문헌 [Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656(1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
C1q 결합 검정은 또한 항체 또는 Fc 도메인 또는 영역이 C1q에 결합할 수 없어 CDC 활성이 부족하거나 CDC 활성이 감소되었음을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M. S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M. S. and M. J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004) 참조).
일부 양태에서, Fc 도메인의 ADCP 활성은 감소되거나 존재하지 않는다. 본원에 사용된 ADCP 활성이 감소되거나 존재하지 않는다는 것은 Fc 도메인의 ADCP 활성이 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 100배 이상 또는 500배 이상 감소한 것을 의미한다.
ADCP 결합 검정은 또한 항체 또는 Fc 도메인 또는 영역에 ADCP 활성이 결여되어 있거나 ADCP 활성이 감소되어 있음을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, US20079077 및 US20048078 및 본원에 개시된 참고문헌 참조.
이펙터 기능 활성이 감소된 항체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 비항체 스캐폴드와 같은 표적화 유닛에는 하나 이상의 Fc 영역 잔기, 예를 들어, Kabat의 EU 넘버에 따른 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329의 치환을 갖는 것들이 포함된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056 참조). 이러한 Fc 돌연변이에는 Kabat의 EU넘버링에 따른 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이를 포함하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환이 있는 Fc 돌연변이가 포함된다 (미국 특허 번호 7,332,581 참조). FcR에 대한 결합이 감소된 특정 항체 변이체도 알려져 있다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조). 항체, 이의 항원 결합 부분 또는 비항체 스캐폴드와 같은, FcR에 대한 결합이 감소된 표적화 유닛은 이러한 아미노산 변형을 함유하여 제조될 수 있다.
일부 양태에서, 표적화 유닛, 예컨대 항체 또는 그의 항원 결합 부분 또는 비항체 스캐폴드는 Fc감마R 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc 영역에서 위치 234 및 235(잔기의 EU 넘버링)의 치환을 갖는 Fc 도메인 또는 영역을 포함한다. 일부 양태에서, Kabat의 EU 넘버링에 따른 치환은 L234A 및 L235A(LALA)이다. 일부 양태에서, Fc 도메인은 Kabat의 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에 D265A 및/또는 P329G를 포함한다. 일부 양태에서, 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서 Kabat의 EU 넘버링에 따른 L234A, L235A 및 P329G(LALA-PG)이다. (예를 들어, WO 2012/130831 참조). 일부 양태에서, 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서의 Kabat의 EU 넘버링에 따른 L234A, L235A 및 D265A(LALA-DA)이다.
일부 양태에서, 예를 들어, 문헌 [미국 특허 6,194,551, WO 99/51642, 및 Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184(2000)]에 기재된 바와 같이, C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)의 변경(즉, 감소)을 초래하는 변경이 Fc 영역에서 이루어진다.
항체 및 항원 결합 부분 및 기타 표적화 유닛의 제조 방법
다양한 양태에서, 항체 및 그의 항원 결합 부분과 같은 표적화 유닛은 인간, 쥐 또는 다른 동물 유래 세포주에서 생산될 수 있다. 재조합 DNA 발현을 사용하여 항체 및 이의 항원 결합 부분을 생산할 수 있다. 이는 선택된 숙주 종에서 항체뿐만 아니라 다양한 항원 결합 부분(융합 단백질 포함)의 생산을 허용한다. 박테리아, 효모, 유전자 변형 동물 및 계란에서 항체 및 이의 항원 결합 부분을 생산하는 것도 세포 기반 생산 시스템의 대안이다. 유전자 변형 동물의 주요 이점은 재생 가능한 자원으로부터 높은 수확량을 얻을 수 있다는 점이다.
항체 또는 이의 항원 결합 부분과 같은 표적화 유닛의 아미노산 서열(들)을 인코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법에는 항체 또는 항원 결합 부분을 인코딩하는 합성 뉴클레오티드 서열의 제조가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 또한, 올리고뉴클레오티드 매개(또는 부위 지정) 돌연변이 유발, PCR 매개 돌연변이 유발 및 카세트 돌연변이 유발을 사용하여 항체 또는 항원 결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제조할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 적어도 항체 또는 그의 항원 결합 부분 또는 그의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은, 예를 들어, 결찰을 위한 무딘 말단 또는 엇갈린 말단, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 분해, 적절하게 응집성 말단 채우기, 바람직하지 않은 연결을 피하기 위한 알칼리성 포스파타제 처리, 적절한 리가제를 사용한 결찰 또는 당업계에 알려진 다른 기술에 따라 벡터 DNA와 재조합될 수 있다. 그러한 조작을 위한 기술은 예를 들어 문헌 [Maniatis et al., Molecular Cloning, Lab. Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1982 and 1989), 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons), 1987-1993]에 개시되어 있으며, 항체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 이의 VH 또는 VL 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열 및 벡터를 구축하는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열" 또는 "폴리뉴클레오티드 서열" 또는 "뉴클레오티드"는 리보핵산, 데옥시리보핵산 또는 이들의 유사체의 유닛을 포함하는 중합체 분자를 의미한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 단일 가닥 핵산은 변성 이중 가닥 DNA의 한 가닥 핵산일 수 있다. 일부 양태에서, 핵산은 cDNA, 예를 들어, 인트론이 결여된 핵산일 수 있다.
DNA와 같은 핵산 분자는 그것이 전사 및 번역 조절 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 함유하고 이러한 서열이 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 "작동 가능하게 연결"되어 있는 경우 폴리펩타이드를 "발현할 수 있다"고 말한다. 작동 가능한 연결은 조절 DNA 서열과 발현시키려는 DNA 서열(예: 항체 또는 이의 항원 결합 부분)이 회수 가능한 양의 폴리펩타이드(들) 또는 항원 결합 부분의 유전자 발현을 허용하는 방식으로 연결되는 연결이다. 유전자 발현에 필요한 조절 영역의 정확한 특성은 유사한 분야에 잘 알려진 바와 같이 유기체마다 다를 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989; Ausubelet al., 1987-1993] 참조.
따라서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분과 같은 표적화 유닛의 발현은 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 발생할 수 있다. 적합한 숙주에는 생체 내 또는 인시츄에서 효모, 곤충, 진균, 조류 및 포유동물 세포를 포함하는 박테리아 또는 진핵생물 숙주, 또는 포유동물, 곤충, 조류 또는 효모 기원의 숙주 세포가 포함된다. 포유동물 세포 또는 조직은 인간, 영장류, 햄스터, 토끼, 설치류, 소, 돼지, 양, 말, 염소, 개 또는 고양이 기원일 수 있지만, 다른 포유동물 세포도 사용될 수 있다. 또한, 예를 들어, 효모 유비퀴틴 가수분해효소 시스템을 사용하여 유비퀴틴-막횡단 폴리펩타이드 융합 단백질의 생체내 합성이 달성될 수 있다. 이렇게 생성된 융합 단백질은 생체내에서 가공되거나 시험관내에서 정제 및 가공될 수 있으며, 이로써 특정 아미노 말단 서열을 갖는 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 합성될 수 있다. 더욱이, 직접적인 효모(또는 박테리아) 발현에서 개시 코돈-유래 메티오닌 잔기의 보유와 관련된 문제는 피할 수 있다. (예를 들어, 문헌 [Sabin et al., 7 Bio/Technol. 705 (1989); Miller et al., 7 Bio/Technol. 698 (1989)] 참조.) 효모가 포도당이 풍부한 배지에서 성장할 때 대량으로 생산되는 해당(glycolytic) 효소를 코딩하는 활성 발현 유전자로부터의 프로모터 및 종결 요소를 포함하는 임의의 일련의 효모 유전자 발현 시스템이 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 얻기 위해 활용될 수 있다. 알려진 해당 유전자는 또한 매우 효율적인 전사 제어 신호를 제공할 수 있다. 예를 들어, 포스포글리세레이트 키나아제 유전자의 프로모터 및 터미네이터 신호가 활용될 수 있다.
곤충에서 항체 또는 항원 결합 부분의 생산은, 예를 들어, 당업자에게 공지된 방법에 의해 폴리펩타이드를 발현하도록 유전자 조작된 바쿨로바이러스로 곤충 숙주를 감염시킴으로써 달성될 수 있다. 문헌 [Ausubel et al., 1987-1993] 참조.
일부 양태에서, (항체 또는 그의 항원 결합 부분 또는 그의 폴리펩타이드를 코딩하는) 도입된 핵산 서열(들)은 수용자 숙주 세포에서 자율 복제가 가능한 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 통합된다. 다양한 벡터 중 임의의 것이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있으며 이는 당업자에게 공지되어 있고 이용 가능하다. 예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., 1987-1993] 참조. 특정 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 선택할 때 중요한 요소는 다음과 같다: 벡터를 포함하는 수용자 세포가 벡터를 포함하지 않는 수용자 세포로부터 인식되고 선택될 수 있는 용이성; 특정 숙주에서 원하는 벡터의 복사본 수; 및 다른 종의 숙주 세포 사이에서 벡터를 "셔틀(shuttle)"할 수 있는 것이 바람직한지 여부.
당업계에 공지된 예시적인 원핵생물 벡터에는 E. coli에서 복제할 수 있는 것과 같은 플라스미드가 포함된다. 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 인코딩하는 DNA 의 발현에 유용한 다른 유전자 발현 요소에는 하기가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다: (a) 바이러스 전사 프로모터 및 그의 인핸서 요소, 예를 들어, SV40 초기 프로모터 (Okayama et al., 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983)), Rous 육종 바이러스 LTR (Gorman et al., 79 PNAS 6777 (1982)), 및 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스 LTR (Grosschedl et al., 41 셀 885(1985)); (b) SV40 후기 영역에서 유래된 것과 같은 스플라이스 영역 및 폴리아데닐화 부위 (Okayarea et al., 1983), 및 (c) SV40내에서와 같은 폴리아데닐화 부위(Okayama et al., 1983). 면역글로불린 인코딩 DNA 유전자는 발현 요소로서 SV40 초기 프로모터 및 그의 인핸서, 마우스 면역글로불린 H 쇄 프로모터 인핸서, SV40 후기 영역 mRNA 스플라이싱, 토끼 S-글로빈 개입 서열, 면역글로불린 및 토끼 S-글로빈 폴리아데닐화 부위 및 SV40 폴리아데닐화 요소를 사용하여 문헌 [Liu et al., infra, and Weidle et al., 51 Gene 21 (1987)]에 기재된 바와 같이 발현될 수 있다.
면역글로불린 인코딩 뉴클레오티드 서열의 경우, 전사 프로모터는 예를 들어 인간 거대세포바이러스일 수 있고, 프로모터 인핸서는 거대세포바이러스 및 마우스/인간 면역글로불린일 수 있다.
일부 양태에서, 설치류 세포에서 DNA 인코딩 영역의 발현을 위해, 전사 프로모터는 바이러스 LTR 서열일 수 있고, 전사 프로모터 인핸서는 마우스 면역글로불린 중쇄 인핸서 및 바이러스 LTR 인핸서 중 하나 또는 둘 다일 수 있으며, 폴리아데닐화 및 전사 종료 영역일 수 있다. 다른 양태에서, 다른 단백질을 인코딩하는 DNA 서열은 상기 언급된 발현 요소와 조합되어 포유동물 세포에서 단백질의 발현을 달성한다.
각 코딩 영역 또는 유전자 융합은 발현 벡터에 조립되거나 삽입된다. 가변 영역(들) 또는 이의 항원 결합 부분을 발현할 수 있는 수용 세포는 항체 또는 항체 폴리펩타이드 또는 이의 항원 결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드로 단독으로 형질감염되거나, 또는 VH 및 VL 쇄 코딩 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)로 공동 형질감염된다. 형질감염된 수용 세포는 통합된 코딩 영역의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양되고, 발현된 항체 쇄 또는 온전한 항체 또는 항원 결합 부분이 배양물로부터 회수된다.
일부 양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 인코딩하는 코딩 영역을 함유하는 핵산은 별도의 발현 벡터에 조립되어 수용자 숙주 세포를 공동 형질감염시키는데 사용된다. 각 벡터에는 하나 이상의 선택 가능한 유전자가 포함될 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 2개의 선택가능 유전자, 즉 박테리아 시스템에서의 선택을 위해 설계된 제1 선택가능 유전자 및 진핵생물 시스템에서의 선택을 위해 설계된 제2 선택가능 유전자가 사용되며, 여기서 각각의 벡터는 코딩 영역 세트를 갖는다. 이 전략은 먼저 박테리아 시스템에서 뉴클레오티드 서열의 생산을 지시하고 증폭을 허용하는 벡터를 생성한다. 박테리아 숙주에서 이렇게 생산되고 증폭된 DNA 벡터는 이후 진핵 세포를 공동 형질감염시키는 데 사용되며, 원하는 형질감염된 핵산(예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄 함유)을 운반하는 공동 형질감염된 세포를 선택할 수 있게 해준다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 선택 가능한 유전자의 비제한적 예는 암피실린에 대한 내성을 부여하는 유전자 및 클로람페니콜에 대한 내성을 부여하는 유전자이다. 진핵 형질감염체에 사용하기 위한 선택 가능한 유전자에는 크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자(gpt로 지정됨) 및 Tn5의 포스포트랜스퍼라제 유전자(neo로 지정됨)가 포함된다. 대안적으로, VH 및 VL 쇄를 인코딩하는 융합된 뉴클레오티드 서열은 동일한 발현 벡터 상에서 조립될 수 있다.
발현 벡터의 형질감염 및 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 생산을 위해, 수용자 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 세포주(예를 들어, DG44) 또는 골수종 세포일 수 있다. 골수종 세포는 형질감염된 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 면역글로불린을 합성, 조립 및 분비할 수 있으며, 면역글로불린의 글리코실화 메커니즘을 보유한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 수용자 세포는 재조합 Ig-생성 골수종 세포 SP2/0이다. SP2/0 세포는 형질감염된 유전자에 의해 인코딩된 면역글로불린만 생산한다. 골수종 세포는 배양액이나 마우스의 복막강에서 성장할 수 있으며, 분비된 면역글로불린은 복수액에서 얻을 수 있다.
항체 또는 이의 항원 결합 부분을 인코딩하는 발현 벡터는, 당업자에게 공지된 바와 같이, 형질전환, 형질감염, 원형질체 융합, 인산칼슘 침전 및 다중양이온(예: 디에틸아미노에틸(DEAE) 덱스트란) 적용과 같은 생화학적 수단, 및 전기천공, 직접 미세주입 및 미세발사체 충격과 같은 기계적 수단을 포함하는 다양한 적합한 수단 중 임의의 수단에 의해 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. (예를 들어, 문헌 [Johnston et al., 240 Science 1538 (1988)] 참조).
효모는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 제조에 있어 박테리아에 비해 특정 이점을 제공한다. 효모는 글리코실화를 포함하여 번역 후 펩타이드 변형을 수행한다. 효모에서 원하는 단백질을 생산하는 데 사용할 수 있는 강력한 프로모터 서열과 높은 복제수 플라스미드를 활용하는 수많은 재조합 DNA 전략이 존재한다. 효모는 복제된 포유동물 유전자 산물의 리더 서열을 인식하고 리더 서열을 포함하는 폴리펩타이드(즉, 프리폴리펩타이드)를 분비한다. 예를 들어, 문헌 [Hitzman et al., 11th Intl. Conf. Yeast, Genetics & Molec. Biol. (Montpelier, France, 1982)] 참조.
효모 유전자 발현 시스템은 항체, 조립된 항체 및 이의 항원 결합 부분의 생산, 분비 및 안정성 수준에 대해 일상적으로 평가될 수 있다. 효모가 포도당이 풍부한 배지에서 성장할 때 대량으로 생산되는 해당효소를 코딩하는 활성 발현 유전자의 프로모터 및 종결 요소를 포함하는 다양한 효모 유전자 발현 시스템이 활용될 수 있다. 알려진 해당 유전자는 또한 매우 효율적인 전사 제어 신호를 제공할 수 있다. 예를 들어, 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 유전자의 프로모터 및 터미네이터 신호가 활용될 수 있다. 또 다른 예는 차이니즈 햄스터 세포와 같은 번역 연장 인자 1알파 프로모터이다. 효모에서 면역글로불린의 발현을 위한 최적의 발현 플라스미드를 평가하기 위해 다양한 접근법을 취할 수 있다. II DNA Cloning 45, (Glover, ed., IRL Press, 1985), 및 예를 들어, 미국 공개 번호 US 2006/0270045 A1 참조.
박테리아 균주는 본원에 기재된 항체 분자 또는 이의 항원 결합 부분의 제조를 위한 숙주로서 활용될 수 있다. E. coli W3110과 같은 E. coli K12 균주, 바실루스(Bacillus) 종, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)와 같은 장내세균, 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 사용할 수 있다. 숙주 세포와 호환되는 종으로부터 유래된 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터는 이들 박테리아 숙주와 관련하여 사용된다. 벡터는 복제 부위뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 특정 유전자도 가지고 있다. 박테리아에서 항체 및 그의 항원 결합 부분을 생산하기 위한 발현 플라스미드를 평가하기 위해 다양한 접근법이 취해질 수 있다 (문헌 [Glorer, 1985; Ausubel, 1987, 1993; Sambrook, 1989; Colligan, 1992-1996] 참조).
숙주 포유동물 세포는 시험관 내 또는 생체 내에서 성장할 수 있다. 포유동물 세포는 리더 펩타이드 제거, VH 및 VL 쇄의 접힘 및 조립, 항체 분자의 글리코실화, 기능성 항체 및/또는 그의 항원 결합 부분의 분비를 포함하여 면역글로불린 분자에 번역 후 변형을 제공한다.
항체 단백질의 생산을 위한 숙주로서 유용할 수 있는 포유동물 세포에는 위에서 설명한 림프계 기원 세포 외에 Vero 또는 CHO-K1 세포와 같은 섬유아세포 기원 세포가 포함된다. 면역글로불린 폴리펩타이드를 발현하는데 사용될 수 있는 예시적인 진핵 세포에는 COS 7 세포를 비롯한 COS 세포; 293-6E 세포를 포함하는 293 세포; CHO--S 및 DG44 세포를 포함하는 CHO 세포; PERC6TM 세포(Crucell); 및 NSO 세포가 포함되나 이에 제하되지 않는다. 일부 양태에서, 특정 진핵 숙주 세포는 중쇄 및/또는 경쇄에 원하는 번역 후 변형을 만드는 능력에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 일부 양태에서, CHO 세포는 293 세포에서 생산된 동일한 폴리펩타이드보다 더 높은 수준의 시알릴화를 갖는 폴리펩타이드를 생산한다.
일부 양태에서, 하나 이상의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 임의의 적합한 방법에 따라 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자로 조작되거나 형질감염된 동물의 생체 내에서 생산될 수 있다.
일부 양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 무세포(cell-free) 시스템에서 생산된다. 비제한적인 예시적 무세포 시스템은 예를 들어 문헌 [Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004); 및 Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003)]에 기재되어 있다.
포유동물 세포에서 VH 및 VL 쇄의 발현을 위해 많은 벡터 시스템이 이용 가능하다(문헌 [Glover, 1985] 참조). 온전한 항체를 얻기 위해 다양한 접근법을 따를 수 있다. 위에서 논의한 바와 같이, 동일한 세포에서 VH 및 VL 쇄 및 선택적으로 연관된 불변 영역을 공동 발현하여 세포내 결합 및 VH 및 VL 쇄의 완전한 사량체 H2L2 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로의 연결을 달성하는 것이 가능하다. 공동 발현은 동일한 숙주에서 같거나 다른 플라스미드를 사용하여 발생할 수 있다. VH 및 VL 쇄 또는 이의 항원 결합 부분을 인코딩하는 핵산을 동일한 플라스미드에 넣은 다음, 세포에 형질감염시켜 두 쇄를 모두 발현하는 세포를 직접 선택할 수 있다. 대안적으로, 세포는 먼저 하나의 쇄, 예를 들어, VL 쇄를 인코딩하는 플라스미드로 형질감염될 수 있고, 이어서 생성된 세포주를 두 번째 선택 마커를 함유하는 VH 쇄 플라스미드로 형질감염시킬 수 있다. 어느 하나의 경로를 통해 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 생성하는 세포주는 추가 선택 마커와 함께 펩타이드, VH, VL 또는 VH +VL 쇄의 추가 복사본을 인코딩하는 플라스미드로 형질감염되어 조립된 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 높은 생산 또는 형질감염된 세포주의 향상된 안정성과 같은 향상된 특성을 가진 세포주를 생성할 수 있다.
또한, 식물은 미생물 또는 동물 세포의 대규모 배양을 기반으로 하는 재조합 항체 생산을 위한 편리하고 안전하며 경제적인 대체 발현 시스템으로 부상하고 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 식물 세포 배양물 또는 통상적으로 재배되는 식물에서 발현될 수 있다. 식물에서의 발현은 전신적이거나 세포내 색소체로 제한되거나 종자(배유)로 제한될 수 있다. 예를 들어, US 특허 공보 2003/0167531; 미국 특허 번호 6,080,560; 미국 특허 번호 6,512,162; 및 WO 0129242 참조. 몇몇 식물 유래 항체는 임상 시험을 포함하여 발전된 개발 단계에 도달했다(예를 들어 Biolex, NC 참조).
온전한(intact) 항체의 경우, 항체의 가변 영역(VH 및 VL 영역)은 일반적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc) 또는 도메인, 일반적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부에 연결된다. 인간 불변 영역 DNA 서열은 불멸화 B 세포(WO 87/02671)와 같은 다양한 인간 세포로부터 널리 공지된 절차에 따라 단리될 수 있다. 항체는 경쇄와 중쇄 불변 영역을 둘 모두 포함할 수 있다. 중쇄 불변 영역에는 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 선택적으로 CH4 영역이 포함될 수 있다. 일부 양태에서, CH2 도메인은 삭제되거나 생략될 수 있다.
단일 쇄 항체의 생산을 위해 기재된 기술 (예를 들어, 문헌 [US 특허 번호 4,946,778; Bird, Science 242:423-42 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988); 및 Ward et al., Nature 334:544-54(1989)](이들 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨) 참조)은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 단일 쇄 항체를 생성하도록 적응될 수 있다. 단일 쇄 항체는 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 아미노산 가교를 통해 연결하여 형성되어 단일 쇄 폴리펩타이드를 생성한다. E. coli에서 기능적 Fv 부분의 조립 기술도 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Skerra et al., Science 242:1038-1041(1988)] 참조, 이는 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨).
일부 양태에서, 항원 결합 부분은 하나 이상의 scFv를 포함한다. scFv는, 예를 들어, 10개 내지 약 25개 아미노산의 짧은 링커 펩타이드로 연결된, 항체의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 가변 영역의 융합 단백질일 수 있다. 링커는 일반적으로 유연성을 위한 글리신과 용해성을 위한 세린 또는 트레오닌이 풍부하며, VH의 N 말단을 VL의 C 말단과 연결하거나 그 반대로 연결할 수 있다. 이 단백질은 불변 영역이 제거되고 링커가 도입되었음에도 불구하고 원래 항체의 특이성을 유지한다. scFv 항체는 예를 들어 문헌 [Houston, JS, Methods in Enzymol. 203(1991) 46-96]에 기재되어 있다. scFv 분자를 제조하고 적합한 펩타이드 링커를 설계하는 방법은 예를 들어 문헌 [US 특허 번호 4,704,692; 미국 특허 번호 4,946,778; Raag and Whitlow, FASEB 9:73-80(1995) 및 Bird and Walker, TIBTECH, 9: 132-137(1991)]에 기재되어 있다. scFv-Fcs는 문헌 [Sokolowska-Wedzina et al., Mol. Cancer Res. 15(8):1040-1050, 2017]에 기재되어 있다.
일부 양태에서, 항원 결합 부분은 단일 도메인 항체이며, 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 이루어진 항체 부분이다. 단일 도메인 항체는 낙타류(예를 들어, 나노바디 또는 VHH 부분)로부터의 항체 중쇄의 가변 도메인으로부터 유래될 수 있다. 더욱이, 단일 도메인 항체는 자율적 인간 중쇄 가변 도메인(aVH) 또는 상어로부터 유래된 VNAR 부분일 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hasler et al., Mol. Immunol. 75:28-37, 2016] 참조).
단일 도메인 항체(DAB 또는 VHH)를 생산하는 기술은 예를 들어 문헌 [Cossins et al. (2006, Prot Express Purif 51:253-259) 및 Li et al. (Immunol. Lett. 188:89-95, 2017)]에 개시된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다. 단일 도메인 항체는 예를 들어 표준 면역화 기술을 통해 낙타, 알파카 또는 라마로부터 얻을 수 있다. (예를 들어, 문헌 [Muyldermans et al., TIBS 26:230-235, 2001; Yau et al., J Immunol Methods 281:161-75, 2003; 및 Maass et al., J Immunol Methods 324:13-25, 2007] 참조.) VHH는 강력한 항원 결합 능력을 가질 수 있으며 기존의 VH-VL 쌍이 접근할 수 없는에피토프와 상호작용할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Muyldermans et al., 2001] 참조). 알파카 혈청 IgG는 약 50%의 낙타류 중쇄 단독 IgG 항체(HCAbs)를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Maass et al., 2007] 참조). 알파카는 항원으로 면역화될 수 있으며 표적 항원에 결합하여 이를 중화시키는 VHH는 분리될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Maass et al., 2007] 참조). 알파카 VHH 코딩 서열을 증폭시키는 PCR 프라이머가 확인되었으며 알파카 VHH 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하는 데 사용될 수 있으며, 이는 당업계에 잘 알려진 표준 바이오패닝 기술에 의한 항체 단편 분리에 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Maass et al., 2007] 참조).
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술에는 서로 다른 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동발현 (예를 들어, 문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983), WO 93/ 08829, 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "놉-인-홀(knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, 문헌 [미국 특허 번호 5,731,168; Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15] 참조)이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자의 제조 (예를 들어, WO 2009/089004A1 참조); 2개 이상의 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 가교결합 (예를 들어, 문헌 [미국 특허 번호 4,676,980 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생성하기 위한 류신 지퍼 사용 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 부분을 제조하기 위한 "디아바디(diabody)" 기술 사용 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일쇄 Fv(scFv) 이량체의 사용 (예를 들어 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368(1994)] 참조); 및 예를 들어, 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147:60(1991)]에 기재된 바와 같이 삼중 특이 항체의 제조를 위해 정전기 조정 효과를 조작함으로써 제조될 수 있다.
"옥토퍼스(Octopus) 항체"를 포함하여 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체도 표적화 유닛일 수 있다 (예를 들어 US 2006/0025576A1 참조).
일부 양태에서, 표적화 유닛은 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 하나 또는 다른 하나에 융합된 상이한 항원-결합 부위를 포함하고; 따라서 Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 2 개의 동일하지 않은 폴리펩타이드 쇄에 포함될 수 있다. 이들 폴리펩타이드의 재조합 공동발현 및 후속 이량체화는 2개의 폴리펩타이드의 여러 가능한 조합을 유도한다. 따라서 재조합 생산에서 이중특이적 분자의 수율과 순도를 향상시키기 위해, 표적화 유닛의 Fc 도메인에 원하는 폴리펩타이드의 결합을 촉진하는 변형을 도입하는 것이 유리할 것이다.
일반적으로, 이 방법은 2개의 Fc 도메인의 경계면에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기를 하전된 아미노산 잔기로 대체하는 것을 포함하며, 동종이량체 형성은 정전기적으로 바람직하지 않게 되지만 이종이량체화는 정전기적으로 유리하게 된다.
일부 양태에서, 표적화 유닛은 "이중특이적 T 세포 인게이저(engager)" 또는 BiTE이다 (예를 들어, WO2004/106381, WO2005/061547, WO2007/042261 및 WO2008/119567 참조). 이 접근법은 단일 폴리펩타이드에 배열된 두 개의 항체 가변 도메인을 활용한다. 예를 들어, 단일 폴리펩타이드 쇄는 두 개의 단일 쇄 Fv(scFv) 부분을 포함할 수 있으며, 각각은 두 도메인 사이의 분자내 결합을 허용하기에 충분한 길이의 폴리펩타이드 링커에 의해 분리된 가변 중쇄(VH)와 가변 경쇄(VL) 도메인을 갖는다. 이 단일 폴리펩타이드는 2개의 scFv 사이에 폴리펩타이드 스페이서 서열을 추가로 포함합니다. 각 scFv는 서로 다른에피토프를 인식하며, 이러한에피토프는 서로 다른 단백질에 특이적일 수 있고, 이러한 두 단백질은 모두 BiTE에 의해 결합된다.
단일 폴리펩타이드이기 때문에, 이중특이적 T 세포 인게이저는 당업계에 공지된 임의의 원핵 또는 진핵 세포 발현 시스템, 예를 들어 CHO 세포주를 사용하여 발현될 수 있다. 그러나 단량체의 의도된 활성 이외의 생물학적 활성을 가질 수 있는 다른 다량체 종으로부터 단량체 이중특이적 T 세포 인게이저를 분리하려면 특정 정제 기술(예: EP1691833 참조)이 필요할 수 있다. 하나의 예시적인 정제 방법에서, 분비된 폴리펩타이드를 함유하는 용액을 먼저 금속 친화성 크로마토그래피에 적용하고, 이미다졸 농도 구배를 사용하여 폴리펩타이드를 용출시킨다. 이 용출액은 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제되고, 염화나트륨 농도 구배를 사용하여 폴리펩타이드가 용출된다. 마지막으로, 이 용출액은 크기 배제 크로마토그래피를 거쳐 다량체 종으로부터 단량체를 분리한다. 일부 양태에서, 표적화 유닛은 펩타이드 링커에 의해 서로 융합된 2개의 단일 쇄 FV 부분(scFV)을 포함하는 단일 폴리펩타이드 쇄로 구성된 이중특이적 항체이다.
일부 양태에서, 표적화 유닛은 IgG-scFV와 같이 다중특이적이다. IgG-scFv 포맷에는 IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, svFc-(L)IgG, 2scFV-IgG 및 IgG-2scFv가 포함된다. 이들 및 기타 이중특이적 항체 포맷 및 이를 제조하는 방법은 예를 들어, 문헌 [Brinkmann and Kontermann, MAbs 9(2):182-212 (2017); Wang et al., Antibodies, 2019, 8, 43; Dong et al., 2011, MAbs 3:273-88; Natsume et al., J. Biochem. 140(3):359-368, 2006; Cheal et al., Mol. Cancer Ther. 13(7):1803-1812, 2014; and Bates 및 Power, Antibodies, 2019, 8, 28]에 기재되어 있다.
Igg 유사 이중 가변 도메인 항체(DVD-Ig)는 문헌 [Wu et al., 2007, Nat Biotechnol 25:1290-97; Hasler et al., Mol. Immunol. 75:28-37, 2016, 및 WO 08/024188 및 WO 07/024715]에 기재되어 있다. 트리오맙은 문헌 [Chelius et al., MAbs 2(3):309-319, 201]에 기재되어 있다. 2-in-1-IgG는 문헌 [Kontermann et al., Drug Discovery Today 20(7):838-847, 2015]에 기재되어 있다. Tanden 항체 또는 TandAb는 문헌 [Kontermann et al., id]에 기재되어 있다. ScFv-HSA-scFv 항체는 또한 문헌 [Kontermann et al. (id.)]에 기재되어 있다.
온전한(예를 들어, 전체) 항체, 이들의 이량체, 개별적인 경쇄 및 중쇄, 또는 이들의 항원 결합 부분은 공지된 기술, 예를 들어, 면역흡착 또는 면역친화성 크로마토그래피, HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)와 같은 크로마토그래피 방법, 황산암모늄 침전, 겔 전기영동 또는 이들의 임의의 조합에 의해 회수되고 정제될 수 있다. 일반적으로 문헌 [Scopes, Protein Purification(Springer-Verlag, NY, 1982)] 참조. 적어도 약 90% 내지 95% 균질성의 실질적으로 순수한 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 유리하며, 특히 제약 용도의 경우 98% 내지 99% 이상의 균질성을 갖는 것이 유리하다. 일단 부분적으로 또는 원하는 대로 균질하게 정제되면, 온전한 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 치료적으로 사용될 수 있거나 분석 절차, 면역형광 염색 등의 개발 및 수행에 사용될 수 있다. 일반적으로 문헌 [Vols. I & II Immunol. Meth. (Lefkovits & Pernis, eds., Acad. Press, NY, 1979 및 1981)] 참조.
약물 유닛
일부 양태에서, 링커는 약물 유닛(들), 표적화 유닛에, 및/또는 표적화 유닛에, 그리고 약물 유닛(들)에 부착된다 (후자는 또한 접합체, ADC 또는 항체 약물 접합체라고도 함). 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2를 통한 링커는 적어도 하나의 약물 유닛에 부착된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 접합체와 관련하여 용어 "약물 유닛" 또는 약물은 세포독성제 (예: 화학요법제 또는 약물), 면역조절제, 핵산(siRNA 포함), 성장 억제제, 독소(예: 단백질 독소; 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 이의 단편), 방사성 동위원소, PROTAC 및 표적 세포에 전달될 때 표적 세포에 대해 활성을 갖는 기타 화합물을 지칭한다.
세포독성제
일부 양태에서, 약물 유닛은 세포독성제이다. "세포독성제"는 세포 상에서 세포독성 효과를 갖는 제제를 의미한다. "세포독성 효과"는 표적 세포(들)의 고갈, 제거 및/또는 사멸을 의미한다. 세포독성제는 예를 들어 튜불린 파괴제, 토포이소머라제 억제제, DNA 마이너 그루브 결합제 및 DNA 알킬화제를 포함한다.
튜불린 파괴제는 예를 들어 아우리스타틴(auristatin), 돌라스타틴(dolastatin), 튜부리신(tubulysin), 콜히신(colchicines), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 탁산(taxane), 크립토피신(cryptophycin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 헤미아스테르린(hemiasterlin) 및 기타 튜불린 파괴제를 포함한다. 아우리스타틴은 천연 생성물 돌라스타틴 10의 유도체이다. 예시적인 아우리스타틴에는 MMAE(N-메틸발린-발린-돌라이솔류인-돌라프로인-노르에페드린), MMAF(N-메틸발린-발린-돌라이솔류인-돌라프로인-페닐알라닌) 및 AFP(WO2004/010957 및 WO2007/008603)이 포함된다. 다른 아우리스타틴 유사 화합물은 예를 들어 공개된 미국 출원 번호 US2021/0008099, US2017/0121282, US2013/0309192 및 US2013/0157960에 개시되어 있다. 돌라스타틴은 예를 들어 돌라스타틴 10 및 돌라스타틴 15를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Pettit et al., J. Am. Chem. Soc., 1987, 109, 6883-6885; Pettit et al., Anti-Cancer Drug Des., 1998, 13, 243-277 및 공개된 미국 출원 US2001/0018422] 참조). 본원에서 사용하기 위해 고려되는 추가적인 돌라스타틴 유도체는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 9,345,785에 개시되어 있다.
튜부리신에는 튜부리신 D, 튜부리신 M, 튜부페닐알라닌 및 튜부티로신이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. WO2017/096311 및 WO/2016-040684에는 튜부리신 M을 포함한 튜부리신 유사체가 기재되어 있다.
콜히친에는 콜히친과 CA-4가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
빈카 알칼로이드에는 빈블라스틴(vinblastine, VBL), 비노렐빈(vinorelbine, VRL), 빈크리스틴(vincristine, VCR) 및 빈데신(vindesine, VOS)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
탁산에는 파클리탁셀 및 도세탁셀이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
크립토피신에는 크립토피신-1 및 크립토피신-52가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
메이탄시노이드는 메이탄신(maytansine), 메이탄시놀(maytansinol), DM1, DM3 및 DM4의 메이탄신 유사체, 그리고 안사마토신-2(ansamatocin-2)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티에는 변형된 방향족 고리, 예컨대 C-19-데클로로 (미국 특허 번호 4,256,746)(안사미토신 P2의 수소화리튬 알루미늄 환원에 의해 제조됨); C-20-하이드록시(또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로 (미국 특허 번호 4,361,650 및 4,307,016)(스트렙토마이세스 또는 악티노마이세스를 사용한 탈메틸화 또는 LAH를 사용한 탈염소화에 의해 제조됨); 및 C-20-데메톡시, C-20-아실옥시(--OCOR), +/-데클로로(미국 특허 번호 4,294,757)(아실 클로라이드를 사용한 아실화에 의해 제조됨), 및 다른 위치에 변형이 있는 것들을 갖는 것들이 포함된다.
메이탄시노이드 약물 모이어티에는 또한 C-9-SH(미국 특허 번호 4,424,219)(메이탄시놀과 H2S 또는 P2S5의 반응에 의해 제조됨); C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2OR)(미국 특허 번호 4,331,598 참조); C-14-하이드록시메틸 또는 아실옥시메틸(CH2OH 또는 CH2OAc)(미국 특허 번호 4,450,254 참조)(Nocardia로부터 제조됨); C-15-하이드록시/아실옥시(미국 특허 번호 4,364,866 참조)(스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 전환에 의해 제조됨); C-15-메톡시(미국 특허 번호 4,313,946 및 4,315,929 참조)(Trewia nudiflora로부터 분리됨); C-18-N-데메틸(미국 특허 번호 4,362,663 및 4,322,348 참조)(스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조됨); 및 4,5-데옥시(미국 특허 번호 4,371,533 참조)(메이탄시놀의 삼염화티타늄/LAH 환원에 의해 제조됨)와 같은 변형을 같은 것들이 포함된다.
헤미아스테린에는 헤미아스테린 및 HT1-286이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
다른 튜불린 파괴제에는 타칼로놀리드(taccalonolide) A, 타칼로놀리드 B, 타칼로놀리드 AF, 타칼로놀리드 AJ, 타칼로놀리드 Al-에폭사이드, 디스코더몰리드(discodermolide),에포틸론(epothilone) A,에포틸론 B 및 라우리말리드(laulimalide)가 포함된다.
일부 양태에서, 세포독성제는 캄프토테신과 같은 토포이소머라제 억제제일 수 있다. 예시적인 캄프토테신에는 예를 들어 캄프토테신, 이리노테칸(CPT-11로도 지칭됨), 벨로테칸, (7-(2-(N-이소프로필아미노)에틸)캄프토테신), 토포테칸, 10-하이드록시-CPT, SN-38, 엑사테칸 및 엑사테칸 유사체 DXd (US20150297748 참조)가 포함된다. 다른 캄프토테신은 WO1996/021666, WO00/08033, US2016/0229862 및 WO2020/156189에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 세포독성제는 합성 유사체 KW-2189 및 CBI-TMI를 포함하는 듀오캄시신(duocarmcycin)이다.
면역 조절제
일부 양태에서, 약물 유닛은 면역 조절제이다. 면역 조절제는, 예를 들어, TLR7 및/또는 TLR8 작용제, STING 작용제, RIG-I 작용제 또는 기타 면역 조절제일 수 있다.
일부 양태에서, 약물 유닛은 TLR7 및/또는 TLR8 작용제와 같은 면역 조절제이다. 일부 양태에서, TLR7 작용제는 이미다조퀴놀린, 이미다조퀴놀린 아민, 티아조퀴놀린, 아미노퀴놀린, 아미노퀴나졸린, 피리도[3,2-d]피리미딘-2,4-디아민, 피리미딘-2,4-디아민, 2-아미노이미다졸, 1-알킬-1H-벤즈이미다졸-2-아민, 테트라하이드로피리도피리미딘, 헤테로아로티아디아지드-2,2-디옥사이드, 벤조나프티리딘, 구아노신 유사체, 아데노신 유사체, 티미딘 동종중합체, ssRNA, CpG-A, PolyG10, 및 폴리G3으로부터 선택된다. 일부 양태에서, TLR7 작용제는 이미다조퀴놀린, 이미다조퀴놀린 아민, 티아조퀴놀린, 아미노퀴놀린, 아미노퀴나졸린, 피리도[3,2-d]피리미딘-2,4-디아민, 피리미딘-2,4-디아민, 2-아미노이미다졸, 1-알킬-1H-벤즈이미다졸-2-아민, 테트라하이드로피리도피리미딘, 헤테로아로티아디아지드-2,2-디옥사이드 또는 벤조나프티리딘으로부터 선택된다. 일부 양태에서, TLR7 작용제는 비-천연 발생 화합물이다. TLR7 조절제의 예로는 GS-9620, GSK-2245035, 이미퀴모드, 레시퀴모드, DSR-6434, DSP-3025, IMO-4200, MCT-465, MEDI-9197, 3M-051, SB-9922, 3M-052, 림토프(Limtop), TMX-30X, TMX-202, RG-7863, RG-7795, 및 US20160168164, US 20150299194, US20110098248, US20100143301 및 US20090047249에 개시된 화합물이 포함된다.
일부 양태에서, TLR8 작용제는 벤즈아제핀, 이미다조퀴놀린, 티아졸로퀴놀린, 아미노퀴놀린, 아미노퀴나졸린, 피리도[3,2-d]피리미딘-2,4-디아민, 피리미딘-2,4-디아민, 2-아미노이미다졸, 1-알킬-1H-벤즈이미다졸-2-아민, 테트라하이드로피리도피리미딘 또는 ssRNA로부터 선택된다. 일부 양태에서, TLR8 작용제는 벤즈아제핀, 이미다조퀴놀린, 티아졸로퀴놀린, 아미노퀴놀린, 아미노퀴나졸린, 피리도[3,2-d]피리미딘-2,4-디아민, 피리미딘-2,4-디아민, 2-아미노이미다졸, 1-알킬-1H-벤즈이미다졸-2-아민 및 테트라하이드로피리도피리미딘으로부터 선택된다. 일부 양태에서, TLR8 작용제는 비-천연 발생 화합물이다. TLR8 작용제의 예에는 모토리모드, 레시퀴모드, 3M-051, 3M-052, MCT-465, IMO-4200, VTX-763, VTX-1463이 포함된다.
일부 양태에서, TLR8 작용제는 WO2018/170179, WO2020/056198 및 WO2020056194에 기재된 화합물 중 임의의 것일 수 있다.
다른 TLR7 및 TLR8 작용제는, 예를 들어, WO2016142250, WO2017046112, WO2007024612, WO2011022508, WO2011022509, WO2012045090, WO2012097173, WO2012097177, WO2017079283, US20160008374, US20160194350, US20160289229, US 특허 번호 6043238, US20180086755, WO2017216054, WO2017669, WO2017202704, WO2017202703, WO20170071944, US20140045849, US20140073642, WO2014056953, WO2014076221, WO2014128189, US20140350031, WO2014023813, US20080234251, US20080306050, US20100029585, US20110092485, US20110118235, US20120082658, US20120219615, US20140066432, US20140088085, US20140275167, 및 US20130251673, WO2018198091, 및 US20170131421에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 면역 조절제는 STING 작용제다. STING 작용제의 예는 예를 들어 WO2020059895, WO2015077354, WO2020227159, WO2020075790, WO2018200812 및 WO2020074004에 개시된 것들을 포함한다.
일부 양태에서, 면역 조절제는 RIG-I 작용제이다. RIG-I 작용제의 예에는 KIN1148, SB-9200, KIN700, KIN600, KIN500, KIN100, KIN101, KIN400 및 KIN2000이 포함된다.
독소
일부 양태에서, 약물 유닛은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 엑소톡신 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아(momordica charantia) 억제제, 커신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신,에노마이신, 및 트리코테센을 포함하되 이에 제한되지 않는 효소 활성 독소 또는 그 단편이다.
방사성 동위원소
일부 양태에서, 약물 유닛은 방사성 원자이다. 방사성접합체 생산에는 다양한 방사성 동위원소가 이용 가능하다. 예에는 이트륨-88, 이트륨-90, 테크네튬-99, 구리-67, 레늄-188, 레늄-186, 갈륨-66, 갈륨-67, 인듐-111, 인듐-114, 인듐-115, 루테튬-177, 스트론튬-89, 사라륨-153 및 납-212가 포함된다.
PROTAC
일부 양태에서, 약물 유닛은 단백질분해 표적화 키메라(PROTAC)이다. PROTAC는 예를 들어 공개된 미국 출원 번호 20210015942, 20210015929, 20200392131, 20200216507, US20200199247 및 US20175612에 설명되어 있으며; 그 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
리간드
일부 양태에서, 약물 유닛은 카르복실 유닛, 예컨대 백금(Pt), 루테늄(Ru), 로듐(Rh), 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 몰리브덴(Mo), 티타늄(Ti) 또는 이리듐(Ir); 방사성 동위원소, 예컨대 이트륨-88, 이트륨-90, 테크네튬-99, 구리-67, 레늄-188, 레늄-186, 갈륨-66, 갈륨-67, 인듐-111, 인듐-114, 인듐-115, 루테튬-177, 스트론튬-89, 사라륨-153, 및 납-212에 의해 결합될 수 있는 리간드를 포함한다.
약물 로딩
접합체에는 표적화 유닛 당 하나 이상의 약물 유닛이 포함될 수 있다. 표적화 유닛 당 약물 유닛의 수를 약물 로딩이라고 한다. 접합체의 약물 로딩은 p로드로 표시되며, 이는 접합체에서 표적화 유닛(예: 항체 또는 항원 결합 부분 또는 비항체 스캐폴드 또는 비항체 단백질) 당 약물 유닛(약물 분자(예: 세포독성제))의 평균 수이다. 예를 들어, p로드가 약 4인 경우, 조성물에 존재하는 모든 표적화 유닛(예: 항체 또는 항원 결합 부분 또는 비항체 스캐폴드 또는 비항체 단백질)을 고려한 평균 약물 로딩이 약 4이다. 일부 양태에서, p로드 범위는 약 3 내지 약 5, 약 3.6 내지 약 4.4, 또는 약 3.8 내지 약 4.2이다. 일부 양태에서, p로드는 약 3, 약 4, 또는 약 5일 수 있다. 일부 양태에서, p로드는 약 6 내지 약 8, 보다 바람직하게는 약 7.5 내지 약 8.4 범위이다. 일부 양태에서, p로드는 약 6, 약 7, 또는 약 8일 수 있다. 일부 양태에서, p로드는 약 8 내지 약 16 범위이다.
제제 내 표적화 유닛(예: 항체 또는 항원 결합 부분 또는 비항체 스캐폴드) 당 약물 유닛의 평균 수는 통상적인 수단, 예컨대 UV, 질량 분광학, 모세관 전기영동(CE) 및 HPLC을 통해 특성화될 수 있다. p로드 측면에서 접합체의 정량적 분포도 결정할 수 있다. 어떤 경우에는, 다른 약물 로딩을 갖는 접합체로부터 p로드가 특정 값인 균질 접합체의 분리, 정제 및 특성화는 역상 HPLC 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) HPLC와 같은 수단에 의해 달성될 수 있다.
예시적인 링커 및 링커 유닛-약물 유닛 조합
일부 양태에서, 링커 중간체 ~L1-AA는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
~L1-AA
[190]
여기서, AA는 알파, 베타 및 감마 아미노산과 그 유도체, 당 유닛, 카르복실 유닛, 및 선택적으로 적어도 하나의 PEG 유닛으로 치환된 아미노산 서브유닛으로부터 선택된 1 내지 12개 서브유닛을 갖는 아미노산 유닛이고, 단, 아미노산 유닛은 적어도 하나의 당 유닛, PEG 유닛 또는 카르복실 유닛을 포함하고; L1은 스트레처 유닛이고; 물결선(~)은 표적화 유닛의 부착 부위를 나타내고, 이중 물결선()은 링커 서브유닛 L2의 부착 부위를 나타낸다. 일부 양태에서, 아미노산 유닛은 적어도 하나의 당 유닛, PEG 유닛, 카르복실 유닛 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 링커 중간체 ~AA-L2는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
~AA-L2
[191]
여기서, AA는 알파, 베타 및 감마 아미노산과 그 유도체, 당 유닛, 카르복실 유닛, 및 선택적으로 적어도 하나의 PEG 유닛으로 치환된 아미노산 서브유닛으로부터 선택된 1 내지 12개 서브유닛을 갖는 아미노산 유닛이고; L2는 적어도 하나의 당 유닛, PEG 유닛 또는 카르복실 유닛 또는 이들의 조합으로 선택적으로 치환된 링커 서브유닛이고; 물결선(~)은 스트레처 유닛의 부착 부위를 나타내고; 이중 물결()선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 단, ~AA-L2는 적어도 하나의 당 유닛, PEG 유닛 또는 카르복실 유닛 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 약물 링커 중간체 ~AA-L2-D는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
~AA-L2-D
[192]
여기서, AA는 알파, 베타 및 감마 아미노산과 그 유도체, 당 유닛, 카르복실 유닛, 및 선택적으로 적어도 하나의 PEG 유닛으로 치환된 아미노산 서브유닛으로부터 선택된 1 내지 12개 서브유닛을 갖는 아미노산 유닛이고; L2는 적어도 하나의 당 유닛, PEG 유닛 또는 카르복실 유닛 또는 이들의 조합으로 선택적으로 치환된 링커 서브유닛이고; D는 약물 유닛이고; 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고; 단, -AA-L2-는 적어도 하나의 당 유닛, PEG 유닛 또는 카르복실 유닛 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 링커 중간체 ~L1-AA-L2는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
~L1-AA-L2
[193]
여기서, L1은 스트레처 유닛이고; AA는 알파, 베타 및 감마 아미노산과 그 유도체, 당 유닛, 카르복실 유닛, 및 선택적으로 적어도 하나의 PEG 유닛으로 치환된 아미노산 서브유닛으로부터 선택된 1 내지 12개 서브유닛을 갖는 아미노산 유닛이고; L2는 적어도 하나의 당 유닛, PEG 유닛 또는 카르복실 유닛 또는 이들의 조합으로 선택적으로 치환된 링커 서브유닛이고; 물결선(~)은 표적화 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고; 이중 물결()선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고; 단, ~AA-L2는 적어도 하나의 당 유닛, PEG 유닛 또는 카르복실 유닛 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, L2는 AA의 서브유닛의 측쇄에 부착된다.
일부 양태에서, 약물 링커 중간체 ~L1-AA-L2-D는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
~L1-AA-L2-D
[194]
여기서, L1은 스트레처 유닛이고; AA는 알파, 베타 및 감마 아미노산과 그 유도체, 당 유닛, 카르복실 유닛, 및 선택적으로 적어도 하나의 PEG 유닛으로 치환된 아미노산 서브유닛으로부터 선택된 1 내지 12개 서브유닛을 갖는 아미노산 유닛이고; L2는 적어도 하나의 당 유닛, PEG 유닛 또는 카르복실 유닛 또는 이들의 조합으로 선택적으로 치환된 링커 서브유닛이고; D는 약물 유닛이고; 물결선(~)은 표적화 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고; 단, -AA-L2-는 적어도 하나의 당 유닛, PEG 유닛 또는 카르복실 유닛 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, L2는 AA의 서브유닛의 측쇄에 부착된다.
일부 양태에서, 링커 중간체 ~L1-AA는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
~L1-[SU]
[200]
여기서, [SU]는 각각의 [SU]가 당 유닛인 아미노산 유닛이고, L1은 스트레처 유닛이고, 물결선(~)은 표적화 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고; 이중 물결()선은 링커 서브유닛 L2에 대한 부착 부위를 나타낸다.
이러한 링커 중간체의 예시적인 양태는 하기 화학식 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00321
여기서, 당 유닛의 우측 쇄 상의 카르복실기는 링커 서브유닛 L2에 대한 부착 부위이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 ~L1-AA는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
~L1-[SU-aa]
[202]
여기서, [SU-aa-]는, 각각의 [SU]가 당 유닛이고 aa가 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된 AA의 선택적 서브유닛인, 아미노산 유닛이고, L1은 스트레처 유닛이고, 물결선(~)은 표적화 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고; 이중 물결()선은 링커 서브유닛 L2에 대한 부착 부위를 나타낸다. 일부 양태에서, aa는 글리신, 리신 및 글루타메이트로부터 선택된 아미노산이다. 일부 양태에서, [SU-aa]는 [SU-Lys-]이다.
이러한 링커 중간체의 예시적인 양태는 하기 화학식 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00325
여기서, 리신의 우측 상의 카르복실기는 링커 서브유닛 L2에 대한 부착 부위이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 ~L1-AA는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
~L1-[SU-aa-SU]
[204]
여기서, [SU-aa-SU]는, 각각의 [SU]가 당 유닛이고 aa가 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된 AA의 선택적 서브유닛인, 아미노산 유닛이고, L1은 스트레처 유닛이고, 물결선(~)은 표적화 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 이중 물결()선은 링커 서브유닛 L2에 대한 부착 부위를 나타낸다. 일부 양태에서, aa는 글리신, 리신 및 글루타메이트로부터 선택된 아미노산이다. 일부 양태에서, [SU-aa-SU]는 [SU-Lys-SU]이다.
이러한 링커 중간체의 예시적인 양태는 하기 화학식 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00329
여기서, 당 유닛의 우측 상의 보호된 카르복실기는 링커 서브유닛 L2에 대한 부착 부위이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 ~AA-L2는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
~[SU-aa]-L2
[206]
여기서, [SU-aa]는, 각각의 [SU]가 당 유닛이고 aa가 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된 AA의 선택적 서브유닛인, 아미노산 유닛이고, L2는 당 유닛, PEG 유닛, 카르복실 유닛 또는 이들의 조합 중 적어도 하나로 선택적으로 치환된 링커 서브유닛이고, 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 이중 물결()선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다. 일부 양태에서, aa는 글리신, 리신 및 글루타메이트로부터 선택된 아미노산이다. 일부 양태에서, [SU-aa]는 [SU-Lys]이다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 절단 가능한 링커 서브유닛이다.
이러한 링커의 예시적인 양태는 하기 화학식 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00333
여기서, 당 유닛의 좌측 상의 아미노기는 스트레처 유닛에 대한 부착 부위이고 우측 상의 벤질 알코올 기는 약물 유닛에 대한 부착 부위이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 ~AA-L2는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
Figure pct00335
여기서, [SU-aa-SU]는, 각각의 [SU]가 당 유닛이고 aa가 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된 AA의 선택적 서브유닛인, 아미노산 유닛이고, L2는 당 유닛, PEG 유닛, 카르복실 유닛 또는 이들의 조합 중 적어도 하나로 선택적으로 치환된 링커 서브유닛이고, L2는 aa 상의 부위에 부착되고, 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 이중 물결()선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다. 일부 양태에서, aa는 글리신, 리신 및 글루타메이트로부터 선택된 아미노산이다. 일부 양태에서, [SU-aa-SU]는 [SU-Lys-SU]이다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 절단 가능한 링커 서브유닛이다.
이러한 링커 중간체의 예시적인 양태는 하기 화학식 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00337
여기서, 당 유닛의 좌측 상의 아미노기는 스트레처 유닛에 대한 부착 부위이고, 약물 유닛은 말단 산 기 또는 벤질 알코올에 부착된다 (즉, 벤질 알코올에서 H가 제거되고 벤질 산소와 약물 유닛 사이에 결합이 형성된다).
일부 양태에서, 링커는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
~L1-[SU-aa]-L2
[210]
여기서, [SU-aa]는, 각각의 [SU]가 당 유닛이고 aa가 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된 AA의 선택적 서브유닛인, 아미노산 유닛이고, L1은 스트레처 유닛이고, L2는 당 유닛, PEG 유닛, 카르복실 유닛 또는 이들의 조합 중 적어도 하나로 선택적으로 치환된 링커 서브유닛이고, L2는 aa 상의 부위 또는 SU에 부착되고, 물결선(~)은 표적화 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 이중 물결()선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다. 일부 양태에서, aa는 글리신, 리신 및 글루타메이트로부터 선택된 아미노산이다. 일부 양태에서, aa는 존재하며, 리신이다.
이러한 링커의 예시적인 양태는 하기 화학식 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00340
Figure pct00341
여기서, 당 유닛의 좌측 상의 말레이미드 기는 표적화 유닛에 대한 부착 부위이고, 약물 유닛은 벤질 알코올에 부착된다 (즉, 벤질 알코올에서 H가 제거되고 벤질 산소와 약물 유닛 사이에 결합이 형성된다).
일부 양태에서, 링커는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
~L1-[SU-aa-SU]-L2
[212]
여기서, [SU-aa-SU]는, 각각의 [SU]가 당 유닛이고 aa가 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된 AA의 선택적 서브유닛인, 아미노산 유닛이고, L1은 스트레처 유닛이고, L2는 당 유닛, PEG 유닛, 카르복실 유닛 또는 이들의 조합 중 적어도 하나로 선택적으로 치환된 링커 서브유닛이고, L2는 AA에 부착되고, 물결선(~)은 표적화 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 이중 물결()선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다. 일부 양태에서, aa는 글리신, 리신 및 글루타메이트로부터 선택된 아미노산이다. 일부 양태에서, aa는 존재하며, 리신이다.
이러한 링커의 예시적인 양태는 하기 화학식 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00344
Figure pct00345
여기서, 당 유닛의 좌측 상의 말레이미드 기는 표적화 유닛에 대한 부착 부위이고, 약물 유닛은 벤질 알코올에 부착된다 (즉, 벤질 알코올에서 H가 제거되고 벤질 산소와 약물 유닛 사이에 결합이 형성된다).
일부 양태에서, 링커는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
Figure pct00346
여기서, [SU-aa-SU]는, 각각의 [SU]가 당 유닛이고 aa가 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된 AA의 선택적 서브유닛인, 아미노산 유닛이고, L1은 스트레처 유닛이고, L2는 당 유닛, PEG 유닛, 카르복실 유닛 또는 이들의 조합 중 적어도 하나로 선택적으로 치환된 링커 서브유닛이고, L2는 aa 상의 부위에 부착되고, 물결선(~)은 표적화 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 이중 물결()선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다. 일부 양태에서, aa는 글리신, 리신 및 글루타메이트로부터 선택된 아미노산이다. 일부 양태에서, aa는 존재하며, 리신이다.
이러한 링커의 예시적인 양태는 하기 화학식 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00348
Figure pct00349
여기서, 당 유닛의 좌측 상의 말레이미드 또는 브로모아세트아미드 기는 표적화 유닛에 대한 부착 부위이고, 약물 유닛은 말단 산 기 또는 벤질 알코올에 부착된다 (즉, 벤질 알코올에서 H가 제거되고 벤질 산소와 약물 유닛 사이에 결합이 형성된다).
일부 양태에서, 약물-링커 중간체 ~AA-L2-D 는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
~[SU-aa]-L2-D
[216]
여기서, [SU-aa]는, 각각의 [SU]가 당 유닛이고 aa가 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된 AA의 선택적 서브유닛인, 아미노산 유닛이고, L2는 당 유닛, PEG 유닛, 카르복실 유닛 또는 이들의 조합 중 적어도 하나로 선택적으로 치환된 링커 서브유닛이고, D는 약물 유닛이고, 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다. 일부 양태에서, aa는 글리신, 리신 및 글루타메이트로부터 선택된 아미노산이다. 일부 양태에서, aa는 리신이다. 일부 양태에서, [SU-aa]는 [SU-Lys]이다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 절단 가능한 링커 서브유닛이다.
이러한 약물-링커의 예시적인 양태는 하기 화학식 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00350
여기서, 당 유닛의 좌측 상의 아미노 기는 스트레처 유닛에 대한 부착 부위이다.
일부 양태에서, 약물-링커 중간체 ~AA-L2-D는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
Figure pct00351
여기서, [SU-aa-SU]는, 각각의 [SU]가 당 유닛이고 aa가 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된 AA의 선택적 서브유닛인, 아미노산 유닛이고, L2는 당 유닛, PEG 유닛, 카르복실 유닛 또는 이들의 조합 중 적어도 하나로 선택적으로 치환된 링커 서브유닛이고, L2는 aa 상의 부위에 부착되고, D는 약물 유닛이고, 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다. 일부 양태에서, aa는 글리신, 리신 및 글루타메이트로부터 선택된 아미노산이다. 일부 양태에서, aa는 리신이다. 일부 양태에서, [SU-aa-SU]는 [SU-Lys-SU]이다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 절단 가능한 링커 서브유닛이다.
이러한 약물-링커 중간체의 예시적인 양태는 하기 화학식 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00352
여기서, 당 유닛의 좌측 상의 아미노 기는 스트레처 유닛에 대한 부착 부위이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 ~AA-L2~는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
~[SU-aa(PEG)-SU]-L2
[220]
여기서, [SU-aa(PEG)-SU]는, 각각의 [SU]가 당 유닛이고 aa가 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된 AA의 선택적 서브유닛인, 아미노산 유닛이고, PEG는 aa에 부착된 PEG 유닛이고, L2는 당 유닛, PEG 유닛, 카르복실 유닛 또는 이들의 조합 중 적어도 하나로 선택적으로 치환된 링커 서브유닛이고, L2는 AA에 부착되고, 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 이중 물결()선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다. 일부 양태에서, aa는 글리신, 리신 및 글루타메이트로부터 선택된 아미노산이다. 일부 양태에서, aa는 리신이다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 절단 가능한 링커 서브유닛이다.
이러한 링커 중간체의 예시적인 양태는 하기 화학식 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00355
여기서, 당 유닛의 좌측 상의 아미노 기는 스트레처 유닛에 대한 부착 부위이고, 약물 유닛은 벤질 알코올에 부착된다 (즉, 벤질 알코올에서 H가 제거되고 벤질 산소와 약물 유닛 사이에 결합이 형성된다).
일부 양태에서, 약물-링커 중간체 ~AA-L2-D는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
~ [SU-aa(PEG)-SU]-L2-D
[222]
여기서, [SU-aa(PEG)-SU]는, 각각의 [SU]가 당 유닛이고 aa가 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된 AA의 선택적 서브유닛인, 아미노산 유닛이고, PEG는 aa에 부착된 PEG 유닛이고, L2는 당 유닛, PEG 유닛, 카르복실 유닛 또는 이들의 조합 중 적어도 하나로 선택적으로 치환된 링커 서브유닛이고, L2는 AA에 부착되고, D는 약물 유닛이고, 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다. 일부 양태에서, aa는 글리신, 리신 및 글루타메이트로부터 선택된 아미노산이다. 일부 양태에서, aa는 리신이다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 절단 가능한 링커 서브유닛이다.
이러한 약물-링커 중간체의 예시적인 양태는 하기 화학식 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00356
여기서, 당 유닛의 좌측 상의 아미노 기는 스트레처 유닛에 대한 부착 부위이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 ~AA-L2는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
~[aa(PEG)]-L2
[224]
여기서, [aa(PEG)]는, aa가 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된 AA의 선택적 서브유닛인, 아미노산 유닛이고, PEG는 aa에 부착된 PEG 유닛이고, L2는 당 유닛, PEG 유닛, 카르복실 유닛 또는 이들의 조합 중 적어도 하나로 선택적으로 치환된 링커 서브유닛이고, L2는 AA에 부착되고, 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 이중 물결()선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다. 일부 양태에서, aa는 글리신, 리신 및 글루타메이트로부터 선택된 아미노산이다. 일부 양태에서, aa는 리신이다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 절단 가능한 링커 서브유닛이다.
이러한 링커 중간체의 예시적인 양태는 하기 화학식 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00360
Figure pct00361
여기서, 분자의 좌측 상의 아미노 기는 스트레처 유닛에 대한 부착 부위이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 또는 링커가 제공되며, 여기서 ~AA-L2~는 하기 구조 또는 그의 염 중 하나를 갖는다:
Figure pct00362
Figure pct00363
Figure pct00364
Figure pct00365
Figure pct00366
Figure pct00367
Figure pct00368
Figure pct00369
Figure pct00370
Figure pct00371
Figure pct00372
Figure pct00373
Figure pct00374
Figure pct00375
Figure pct00376
Figure pct00377
Figure pct00378
Figure pct00379
Figure pct00380
여기서, 각각의 Z는 *에 부착되고 하기로부터 개별적으로 선택된다:
Figure pct00381
여기서, 아미노기 상의 물결선은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 약물 유닛은 벤질 알코올에 부착된다 (즉, 벤질 알코올의 H가 약물 유닛의 결합으로 대체된다).
일부 양태에서, 약물-링커 중간체 ~AA-L2-D는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
~ [aa(PEG)]-L2-D
[226]
여기서, [aa(PEG)]는, aa가 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된 AA의 선택적 서브유닛인, 아미노산 유닛이고, PEG는 aa에 부착된 PEG 유닛이고, L2는 당 유닛, PEG 유닛, 카르복실 유닛 또는 이들의 조합 중 적어도 하나로 선택적으로 치환된 링커 서브유닛이고, L2는 AA에 부착되고, D는 약물 유닛이고, 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다. 일부 양태에서, aa는 글리신, 리신 및 글루타메이트로부터 선택된 아미노산이다. 일부 양태에서, aa는 리신이다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 절단 가능한 링커 서브유닛이다.
이러한 약물-링커 중간체의 예시적인 양태는 하기 화학식 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00382
Figure pct00383
Figure pct00384
여기서, 분자의 좌측 상의 아미노 기는 스트레처 유닛에 대한 부착 부위이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 ~L2는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
Figure pct00386
여기서, 아미노산 유닛은 존재하지 않고, L2는 링커 서브유닛이고, PEG는 L2에 부착된 PEG 유닛이고, 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 이중 물결()선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다. 일부 양태에서, PEG 유닛은 리신, 글루타메이트, 및 시트룰린으로부터 선택된 아미노산에 부착된다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 절단 가능한 링커 서브유닛이다.
이러한 링커 중간체의 예시적인 양태는 하기 화학식 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00388
여기서, 분자의 좌측 상의 아미노 기는 스트레처 유닛에 대한 부착 부위이다.
일부 양태에서, 약물-링커 중간체 ~L2-D는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
Figure pct00389
여기서, 아미노산 유닛은 존재하지 않고, L2는 링커 서브유닛이고, D는 약물 유닛이고, PEG는 L2에 부착된 PEG 유닛이고, 물결선(~)은 스트레처 유닛 또는 아미노산 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다. 일부 양태에서, PEG 유닛은 리신, 글루타메이트, 및 시트룰린으로부터 선택된 아미노산에 부착된다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 절단 가능한 링커 서브유닛이다.
이러한 약물-링커 중간체의 예시적인 양태는 하기 화학식 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00390
여기서, 분자의 좌측 상의 아미노 기는 스트레처 유닛에 대한 부착 부위이다.
일부 양태에서, 링커 중간체 ~AA-L2는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
~[CU]-L2
[232]
여기서, [CU]는, CU가 카르복실 유닛인, 아미노산 유닛이고, L2는 당 유닛, PEg 유닛, 카르복실 유닛 또는 이들의 조합 중 적어도 하나로 선택적으로 치환된 링커 서브유닛이고, L2는 AA에 부착되고, 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 이중 물결()선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 절단 가능한 링커 서브유닛이다.
이러한 링커 중간체의 예시적인 양태는 하기 화학식 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00394
여기서, 분자의 좌측 상의 아미노 기는 스트레처 유닛에 대한 부착 부위이ㄱ고, 약물 유닛은 벤질 알코올에 부탁된다 (즉 벤질 알코올로부터 H가 제거되고 벤질 산소 및 약물 유닛 사이에 결합이 형성된다).
일부 양태에서, 약물-링커 중간체 ~AA-L2-D는 하기 일반 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
~[CU]-L2-D
[234]
여기서, [CU]는, CU가 카르복실 유닛인, 아미노산 유닛이고, L2는 당 유닛, PEg 유닛, 카르복실 유닛 또는 이들의 조합 중 적어도 하나로 선택적으로 치환된 링커 서브유닛이고, L2는 AA에 부착되고, D는 약물 유닛이고, 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 절단 가능한 링커 서브유닛이다.
이러한 약물-링커 중간체의 예시적인 양태는 하기 화학식 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00395
여기서, 분자의 좌측 상의 아미노 기는 스트레처 유닛에 대한 부착 부위이다.
일부 양태에서, 약물-링커 중간체 ~L2-D는 하기 화학식 그의 염을 갖는다:
~L2[CU]-D
[236]
여기서, L2는 카르복실 유닛[CU]를 포함하는 링커 서브유닛이고, D는 약물 유닛이고, 물결선(~)은 아미노산 유닛 또는 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다. 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 절단 가능한 링커 서브유닛이다.
이러한 약물-링커 중간체의 예시적인 양태는 하기 화학식 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00396
여기서, 분자의 좌측 상의 아미노 기는 아미노산 유닛 또는 스트레처 유닛에 대한 부착 부위이다.
이전 화학식 [190] 내지 [236]의 링커 또는 링커 중간체의 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 절단 가능한 링커 서브유닛이다.
이전 화학식 (190) 내지 [236]의 링커 또는 링커 중간체의 일부 양태에서, 링커 서브유닛 L2는 발린-시트룰린, 페닐알라닌-리신, 알라닌-리신 및 글리신-글리신-페닐알라닌-리신으로부터 선택된 펩타이드를 갖는 절단 가능한 링커 서브유닛이다.
항체, 항원 결합 부분 및 기타 결합제(비항체 스캐폴드 포함)에 약물 링커의 부착
링커를 통해 약물 유닛(들)을 표적화 유닛(예: 항체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 비항체 스캐폴드)에 부착하는 기술은 해당 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Alley et al., Current Opinion in Chemical Biology 2010 14:1-9; Senter, Cancer J., 2008, 14(3):154-169] 참조. 일부 구현예에서, 링커는 먼저 약물 유닛(예를 들어, 세포독성제(들), 면역 조절제 또는 기타 제제)에 부착된 다음, 약물-링커(들)가 표적화 유닛(예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 부분 또는 비항체 단백질 스캐폴드)에 부착된다. 일부 양태에서, 링커(들)는 먼저 표적화 유닛(예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 부분 또는 비항체 단백질 스캐폴드)에 부착되고, 이어서 약물 유닛이 링커에 부착된다. 이하 논의에서, 약물-링커라는 용어는 표적화 유닛에 대한 링커 또는 약물-링커의 부착을 예시하기 위해 사용된다; 당업자는 선택된 부착 방법이 링커 및 약물 유닛에 따라 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 양태에서, 약물 유닛은 접합체로부터 방출될 때까지(예를 들어, 가수분해, 단백질 분해 또는 절단제에 의해) 약물 유닛의 활성을 감소시키는 방식으로 링커를 통해 표적화 유닛에 부착된다.
일반적으로, 접합체는 다음을 포함하여 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 사용하는 여러 경로에 의해 제조될 수 있다: (1) 표적화 유닛 (예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 또는 비항체 단백질 스캐폴드)의 친핵성 기와 2가 링커가 반응하여 공유결합을 통해 표적화 유닛-링커 중간체를 형성한 후, 약물 유닛과 반응시키는 단계; 및 (2) 약물 유닛의 친핵성 기와 2가 링커가 반응하여 공유 결합을 통해 약물-링커를 형성하고, 이어서 표적화 유닛의 친핵성 기와의 반응시키는 단계. 후자의 경로를 통해 접합체를 제조하는 예시적인 방법은 미국 특허번호 7,498,298에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로서 명시적으로 포함되어 있다.
표적화 유닛, 예컨대 항체, 항원 결합 부분 또는 다른 결합제 (비항체 스캐폴드 포함) 상의 친핵성 기에는 (i) N-말단 아민 기, (ii) 측쇄 아민 기(예: 리신), (iii) 측쇄 티올 기, 예를 들어, 시스테인, 및 (iv) 항체가 글리코실화된 당 하이드록실 또는 아미노기가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 아민, 티올 및 하이드록실 기는 친핵성이며 하기를 포함하는 링커 상의 친전자성 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있다: (i) NHS에스테르, HOBt에스테르, 할로포르메이트 및 산 할로겐화물과 같은 활성에스테르; (ii) 할로아세트아미드와 같은 알킬 및 벤질 할라이드; 및 (iii) 알데하이드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 기. 항체(및 항원 결합 부분 및 기타 결합제(비항체 스캐폴드 포함))와 같은 특정 표적화 유닛은 환원 가능한 쇄 간 디설파이드, 즉 시스테인 가교를 갖는다. 항체(및 항원 결합 부분 및 기타 결합제(비항체 스캐폴드 포함))를 DTT(디티오트레이톨) 또는 트리카르보닐에틸포스핀(TCEP)과 같은 환원제로 처리하여 링커와의 접합을 위해 반응하도록 하여 항체가 완전히 또는 부분적으로 환원된다. 따라서 각 시스테인 브릿지는 이론적으로 두 개의 반응성 티올 친핵체를 형성한다. 추가의 친핵성 기는 리신 잔기의 변형을 통해, 예를 들어 리신 잔기를 2-이미노티올란(트라우트 시약)과 반응시킴으로써, 항체(및 항원 결합 부분 및 기타 결합제(비항체 스캐폴드 포함))와 같은 표적화 유닛에 도입될 수 있고, 결과적으로 아민이 티올로 전환된다. 반응성 티올 기는 또한 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 시스테인 잔기(예를 들어, 하나 이상의 비천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 항체, 항원 결합 부분 및 기타 결합제(비항체 스캐폴드 포함)를 제조함으로써)를 도립함으로써 표적화 유닛(예컨대 항체 및 항원 결합 부분 및 기타 결합제(비항체 스캐폴드 포함))에 도입될 수 있다.
접합체는 알데하이드 또는 케톤 카르보닐 기와 같은 표적화 유닛 상의 친전자성 기와 링커 시약 상의 친핵성 기 사이의 반응에 의해 제조될 수 있다. 링커 시약 상의 유용한 친핵성 기에는 하이드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실 및 아릴하이드라지드가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 일 양태에서, 항체(또는 이의 항원 결합 부분 또는 기타 결합제(비항체 스캐폴드 포함))는 링커 상의 친핵성 치환체와 반응할 수 있는 친전자성 모이어티를 도입하도록 변형된다. 또 다른 양태에서, 글리코실화된 항체의 당은, 예를 들어, 페리오데이트(periodate) 산화 시약을 사용하여 산화되어, 링커의 아민 기와 반응할 수 있는 알데하이드 또는 케톤 기를 형성 할 수 있다. 생성된 이민 쉬프(Schiff) 염기성 기는 안정한 결합을 형성할 수 있거나, 또는 예를 들어 보로하이드라이드 시약에 의해 환원되어 안정한 아민 결합을 형성할 수 있다. 일 양태에서, 글리코실화된 항체의 탄수화물 부분과 갈락토스 산화효소 또는 메타 페리오데이트 나트륨의 반응은 링커의 적절한 기와 반응할 수 있는 항체(또는 이의 항원 결합 부분 또는 기타 결합제(비항체 스캐폴드 포함))에서 카르보닐 (알데하이드 및 케톤) 기를 생성할 수 있다 (예를 들어, 문헌[Hermanson, Bioconjugate Techniques] 참조). 또 다른 양태에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 항체와 같은 표적화 유닛은 메타 페리오데이트 나트륨과 반응하여 첫 번째 아미노산 대신 알데하이드를 생성할 수 있다(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3 :138-146, US 5362852). 이러한 알데하이드는 링커와 반응할 수 있다.
세포독성제와 같은 약물 유닛 상의 예시적인 친핵성 기에는 아민, 티올, 하이드 록실, 하이드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실 및 아릴하이드라지드 기가 포함되지만 이에 제한되지는 않으며, 이는 하기를 포함하는 링커 상의 친전자성 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있다: (i) NHS에스테르, HOBt에스테르, 할로포르메이트 및 산 할로겐화물과 같은 활성에스테르; (ii) 할로아세트아미드와 같은 알킬 및 벤질 할라이드; (iii) 알데하이드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 기.
일부 양태에서, 약물-링커는 항체(또는 이의 항원 결합 부분 또는 기타 결합제(비항체 스캐폴드 포함))의 쇄 간 시스테인 잔기(들)에 부착된다. 예를 들어, 문헌 [WO2004/010957 및 WO2005/081711] 참조. 이러한 양태에서, 링커는 전형적으로 쇄 간 디설파이드의 시스테인 잔기에 부착하기 위한 말레이미드 기를 포함한다. 일부 양태에서, 링커 또는 약물-링커는 미국 특허번호 7,585,491 또는 8,080,250에 기재된 바와 같이 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 시스테인 잔기(들)에 부착된다. 생성된 접합체의 약물 로딩은 일반적으로 1 내지 8 또는 1 내지 16 범위이다.
일부 양태에서, 링커 또는 약물-링커는 WO2005/037992 또는 WO2010/141566에 기재된 바와 같이 항체(또는 이의 항원 결합 부분 또는 다른 결합제)의 리신 또는 시스테인 잔기에 부착된다. 생성된 접합체의 약물 로딩 범위는 일반적으로 1 내지 8이다.
일부 양태에서, 조작된 시스테인 잔기, 폴리 히스티딘 서열, 글리코 엔지니어링 태그 또는 트랜스글루타미나제 인식 서열은 링커 또는 약물-링커의 항체 또는 그의 항원 결합 부분 또는 다른 결합제 (비항체 스캐폴드 포함)로의 부위-특이적 부착을 위해 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 약물-링커(들)는 쇄 간 디설파이드 이외의 Fc 잔기에서 조작된 시스테인 잔기에 부착된다. 일부 양태에서, 약물-링커(들)는 118, 221, 224, 227, 228, 230, 231, 223, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 249, 250, 258, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 275, 276, 278, 280, 281, 283, 285, 286, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 302, 305, 313, 318, 323, 324, 325, 중쇄의 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 335, 336, 396 및/또는 428 위치, 및/또는 106, 108 위치의 중쇄 및/또는 경쇄, 142(경쇄), 149(경쇄) 및/또는 Kabat의 EU 넘버링에 따른 V205 위치에서 IgG(일반적으로 IgG1)에 도입된 조작된 시스테인에 부착된다. 조작된 시스테인을 사용하는 부위 특이적 접합에 대한 예시적인 치환은 S239C이다 (예를 들어, 문헌[US 20100158909] 참조; Fc 영역의 넘버링은 EU 색인에 따른다).
일부 양태에서, 링커 또는 약물-링커(들)는 WO2006/034488, WO2011/156328 및/또는 WO2016040856에 기재된 바와 같이 항체(또는 그의 항원 결합 부분 또는 다른 결합제(비항체 스캐폴드 포함))의 하나 이상의 도입된 시스테인 잔기에 부착된다.
일부 양태에서, 박테리아 트랜스글루타미나제를 이용한 부위 특이적 접합에 대한 예시적인 치환은 Fc 영역의 N297S 또는 N297Q이다. 일부 양태에서, 링커 또는 약물-링커(들)는 항체 또는 항원 결합 부분 또는 글리코 조작된 항체(또는 다른 결합제(비항체 스캐폴드 포함))의 글리칸 또는 변형된 글리칸에 부착된다. 예를 들어, 문헌[WO2017/147542, WO2020/123425, WO2020/245229, WO2014/072482; WO2014//065661, WO2015/057066 및 WO2016/022027] 참조; 이들 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 양태에서, 링커 또는 약물-링커는 소르타제 A(Sortase A) 링커를 통해 항체, 항원 결합 부분 또는 다른 결합제(비항체 스캐폴드를 포함)에 부착된다. 소르타제 A 링커는 소트타제 A 효소가 LPXTG 인식 모티프(서열 번호:5)를 N-말단 GGG 모티프에 융합하여 네이티브 아미드 결합을 재생성함으로써 생성될 수 있다.
일부 양태에서, 링커 또는 약물-링커는, 특정 펩타이드 서열(CxPxR)에 내재된 시스테인 잔기의 산화를 통해 알데하이드-베어링 포밀글리신(fGly)에 생체 직교 알데하이드 핸들이 도입되는 SMARTag 기술을 사용하여 항체, 항원 결합 부분 또는 다른 결합제(비항체 스캐폴드를 포함)에 부착된다. 이 효소적 변형은 포밀글리신 생성 효소(FGE)에 의해 수행된다. 예를 들어, 문헌[Liu et al., Methods Mol. Biol. 2033:131-147 (2019)] 참조.
일부 양태에서, 링커 또는 약물-링커는 4차화된 비닐- 및 알키닐-피리딘 시약 과의 시스테인 접합을 사용하여 항체, 항원 결합 부분 또는 기타 결합제(비항체 스캐폴드 포함)에 부착된다. 예를 들어, 문헌 [Matos et al., Angew Chem. Int. Ed. Engl. 58:6640-6644 (2019)] 참조.
또 다른 양태에서, 링커 또는 약물-링커는 비스-말레이미드, C-잠금 또는 K-잠금 방법을 사용하여 항체, 항원 결합 부분 또는 다른 결합제(비항체 스캐폴드 포함)에 부착된다.
약제학적 제형
접합체의 다른 측면은 본원에 기재된 임의의 접합체를 포함하여 활성 성분을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 조성물은 약제학적 조성물이다. 본원에 사용된 용어 "약제학적 조성물"은 약제 산업에서 사용하도록 허용되는 약제학적적으로 허용되는 담체와 조합된 활성제를 의미한다. "약제학적적으로 허용되는"이라는 문구는 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제나 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 화합물, 재료, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
그 안에 용해되거나 분산된 활성 성분을 함유하는 약리학적 조성물의 제조는 당업계에 잘 알려져 있으며 임의의 특정 제형에 기초하여 제한될 필요는 없다. 전형적으로 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사 가능한 것으로 제조되며; 그러나 사용 전 액체에서 재수화하거나 현탁시키는 데 적합한 고체 형태로도 제조될 수 있다. 제조는 유화되거나 리포솜 조성물로 제시될 수도 있다. 접합체는 약제학적으로 허용가능하고 활성 성분과 상용성인 부형제와 함께 본원에 기재된 치료 방법에 사용하기에 적합한 양으로 혼합될 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 포도당, 글리세롤,에탄올 등 및 이들의 조합이다. 또한, 원할 경우, 약제학적 조성물은 활성 성분(예: 접합체)의 효과를 향상시키거나 유지하는 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 등과 같은 소량의 보조 물질을 함유할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 약제학적 조성물은 그 안의 성분의 약제학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염에는 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된 산 부가염(폴리펩타이드의 유리 아미노기와 함께 형성됨)이 포함된다. 유리 카르복실기와 함께 형성된 염은 또한 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 생리학적으로 허용되는 담체는 해당 분야에 잘 알려져 있다. 예시적인 액체 담체는 활성 성분(예를 들어, 접합체) 및 물을 함유하는 멸균 수용액이고, 생리학적 pH 값의 인산나트륨, 생리 식염수 또는 둘 모두, 예컨대 인산염 완충 식염수와 같은 완충제를 함유할 수 있다. 또한, 수성 담체는 하나 이상의 완충 염뿐만 아니라 염화나트륨 및 염화칼륨, 포도당, 폴리에틸렌 글리콜 및 기타 용질과 같은 염을 함유할 수 있다. 액체 조성물은 또한 물 이외에 액체상 및 물이 제외된 액체상을 함유할 수 있다. 이러한 추가 액체상의 예로는 글리세린, 목화씨유와 같은 식물성 오일 및 물-오일에멀젼이 있다. 특정 장애 또는 병태의 치료에 효과적인 활성제의 양은 장애 또는 병태의 특성에 따라 달라지며 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다.
일부 양태에서, 접합체를 포함하는 약제학적 조성물은 동결건조물 일 수 있다.
일부 양태에서, 치료 유효량의 접합체를 포함하는 주사기가 제공된다.
암 치료
일부 양태에서, 본원에 기재된 접합체는 암을 앓고 있는 대상체와 같이 이를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 접합체를 투여하는 것을 포함하는 방법(들)에 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 접합체를 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 대상체는 암 및/또는 악성종양에 대한 치료가 필요하다. 일부 양태에서, 상기 방법은 암 또는 악성종양을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 것이다.
본원에 기제된 상기 방법은 암 또는 악성종양을 앓고 있는 대상체에게 치료 유효량의 접합체를 투여하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 "치료 유효량", "유효량" 또는 "유효 용량"이라는 표현은 암 또는 악성종양의 치료, 관리 또는 재발 예방에 치료적 이점을 제공하는 접합체의 양, 예를 들어, 종양 또는 악성 종양의 적어도 하나의 증상, 징후 또는 마커를 통계적으로 유의하게 감소시키는 양을 의미한다. 치료 유효량의 결정은 당업자의 능력 내에 있다. 일반적으로, 치료 유효량은 대상체의 병력, 연령, 병태, 성별뿐만 아니라 대상체의 의학적 상태의 중증도 및 유형, 기타 약제학적적 활성 제제의 투여에 따라 달라질 수 있다.
"암" 및 "악성 종양"이라는 용어는 신체 기관 및 시스템의 정상적인 기능을 방해하는 세포의 통제되지 않은 성장을 지칭한다. 암 또는 악성 종양은 원발성 또는 전이성, 즉 원래 종양 부위에서 멀리 떨어진 조직에 종양 성장을 퍼뜨리는 침습성일 수 있다. "종양"은 신체 기관 및 시스템의 정상적인 기능을 방해하는, 세포의 통제되지 않은 성장을 의미한다. 암을 가진 대상체는 대상체의 신체에 객관적으로 측정 가능한 암세포가 존재하는 대상체이다. 이 정의에는 양성 종양과 악성 암뿐만 아니라 잠재적으로 휴면 상태인 종양과 미세 전이도 포함된다. 원래 위치에서 이동하여 다른 중요한 장기에 퍼진 암은 결국 영향을 받은 장기의 기능 저하를 통해 대상체의 사망을 초래할 수 있다. 백혈병 및 림프종과 같은 혈액 악성 종양(조혈 암)은 예를 들어 대상체의 정상적인 조혈 구획을 능가할 수 있어 조혈 부전(빈혈, 혈소판 감소증 및 호중구 감소증의 형태)을 일으키고 궁극적으로 사망을 초래한다.
암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 구체적인 예에는 기저 세포암, 담도 암, 방광암, 골암, 뇌암 및 CNS 암, 유방암(예: 삼중 음성 유방암), 복막암, 자궁경부암; 담관암종, 융모막암종, 연골육종, 결장직장암(대장암), 결합조직암, 소화기암, 자궁내막암, 식도암, 눈암, 두경부암, 위암(위장암, 위암 포함)), 교모세포종 (GBM), 간암, 간 종양, 상피내 종양, 신장 또는 신장암(예: 투명세포암), 후두암, 백혈병, 간암, 폐암(예: 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐 선암, 폐 편평상피암), 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종을 포함한 림프종, 흑색종, 중피종, 골수종, 신경 모세포종, 구강암(예: 입술, 혀, 구강 및 인두), 난소암, 췌장암, 전립선암, 망막모세포종, 횡문근 육종, 호흡기계암, 타액선암, 육종, 피부암, 편평 세포암, 고환암, 갑상선암, 자궁 또는 자궁내막암, 중증 자궁암, 다음의 암 비뇨기계, 외음부 암; 뿐만 아니라 기타 암종 및 육종, B 세포 림프종(저등급/여포성 비호지킨 림프종(NHL), 소림프구(SL) NHL, 중간 등급/여포성 NHL, 중간 등급 미만성 NHL, 고등급 면역모세포성 NHL, 고등급 림프모세포성 NHL, 고등급 비소세포성 NHL, 거대세포성 NHL, 맨틀세포 림프종,에이즈 관련 림프종, 발덴스톰(Waldenstrom's) 거대글로불린혈증), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프모세포성 백혈병(ALL), 모발 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 이식 후 림프 증식성 장애(PTLD), 그리고 유피증과 관련된 비정상적인 혈관 증식, 부종(예: 뇌종양과 관련된 부종) 및 마이그 증후군(Meigs' Syndrome)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
본원의 방법은 대상체에서 종양 크기 또는 종양 부담을 감소시키고/시키거나 대상체에서 전이를 감소시키는 것으로 고려된다. 다양한 양태에서, 대상체의 종양 크기는 약 25 내지 50%, 약 40 내지 70% 또는 약 50 내지 90% 또는 그 이상 감소된다. 다양한 양태에서, 상기 방법은 종양 크기를 10%, 20%, 30% 이상 감소시킨다. 다양한 양태에서, 상기 방법은 종양 크기를 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 감소시킨다.
일부 양태에서, 대상체는 항-FOLRI 접합체를 사용한 암 및/또는 악성 종양의 치료가 필요하다. 특정 양태에서, 항-FOLRI 접합체는 항체 F131(VH 서열 번호:26 및 VL 서열 번호:27)을 함유한다. 특정 양태에서, 항-FOLR1 접합체는 F131 항체 및 LD038 링커-약물을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체는 FOLR1+암 또는 FOLR1+악성 종양, 예를 들어. 폐암, 비소세포폐암, 난소암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 췌장암, 신장세포암의 치료를 필요로 한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 FOLR1+암 또는 악성 종양을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 대상체에서 폐암을 치료하기 위한 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 대상체에서 비소세포폐암을 치료하기 위한 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 대상체에서 유방암을 치료하기 위한 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 대상체에서 난소암을 치료하기 위한 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 대상체에서 자궁경부암을 치료하기 위한 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 대상체에서 자궁내막암을 치료하기 위한 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 대상체에서 신장세포암을 치료하기 위한 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 대상체에서 자궁암을 치료하기 위한 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 대상체에서 췌장암을 치료하기 위한 것이다.
본 명세서에서 사용된 "대상체"는 인간 또는 동물을 의미한다. 일반적으로 동물은 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥감 동물과 같은 척추동물이다. 영장류에는 침팬지, 시노몰구스 원숭이, 거미원숭이, 원숭이(macaque)(예: 붉은털원숭이(Rhesus))가 포함된다. 설치류에는 마우스, 래트, 우드척, 흰족제비, 토끼 및 햄스터가 포함된다. 가축 및 사냥감 동물에는 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이과 종, 예를 들어 집고양이, 개과 동물, 예를 들어 개, 여우, 늑대, 조류 종, 예를 들어 닭,에뮤, 타조, 및 물고기, 예를 들어 송어, 메기, 및 연어가 포함된다. 특정 양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 영장류, 예를 들어 인간이다. "환자", "개체" 및 "대상체"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
바람직하게는, 대상체는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있으나 이들 예로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 인간 이외의 포유동물을, 예컨대 각종 암의 동물 모델을 대표하는 대상체로서 유리하게 사용할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 방법은 가축 및/또는 애완동물을 치료하는 데 사용될 수 있다. 대상체는 남성일 수도 있고 여성일 수도 있다. 특정 양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 양태에서, 대상체는 이전에 암 진단을 받았거나 암을 앓고 있는 것으로 확인되었으며 치료가 필요하지만 이미 암 치료를 받았을 필요는 없는 개체이다. 일부 양태에서, 대상체는 또한 이전에 치료가 필요한 암을 갖는 것으로 진단되지 않은 대상체일 수도 있다. 일부 양태에서, 대상체는 암과 관련된 병태 또는 하나 이상의 합병증에 대한 하나 이상의 위험 인자를 나타내는 개체 또는 위험 인자를 나타내지 않는 대상체일 수 있다. 특정 암에 대한 치료가 "필요한 대상체"는 해당 병태를 갖거나 해당 병태를 갖는 것으로 진단된 대상체일 수 있다. 다른 양태에서, 병태가 "발생할 위험이 있는" 대상체는 병태가 발생할 위험이 있거나 병태가 다시 발생할 위험이 있는 것으로 진단된 대상체를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료", "치료하는" 또는 "완화"는 질환, 장애 또는 의학적 병태와 관련하여 사용될 때 병태에 대한 치료학적 치료를 의미하며, 여기서 목적은 증상이나 병태의 진행이나 중증도를 되돌리거나 완화, 개선, 억제, 둔화 또는 중지하는 것이다. "치료하다"라는 용어는 병태의 적어도 하나의 부작용 또는 증상을 감소시키거나 완화시키는 것을 포함한다. 하나 이상의 증상이나 임상 지표가 감소하면 치료는 일반적으로 "효과적"이다. 또는 병태의 진행이 감소되거나 중단되면 치료는 "효과적"이다. 즉, "치료"에는 증상이나 지표의 개선뿐 아니라, 치료가 없을 경우 예상되는 증상의 중단, 적어도 진행 또는 악화의 둔화도 포함된다. 유익하거나 원하는 임상 결과에는 대상체에서 암세포의 감소, 하나 이상의 증상(들)의 완화, 결핍 정도의 감소, 암 또는 악성 종양의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 종양 성장 및/또는 전이의 지연 또는 둔화, 치료가 없을 때 예상되는 수명과 비교하여 증가된 수명이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 용어 "투여하는"은 접합체를 암 세포 또는 악성 세포에 결합시키는 방법 또는 경로에 의해 대상체에게 본원에 기재된 접합체를 제공하는 것을 의미한다. 유사하게, 본원에 기재된 바와 같은 접합체를 포함하는 약제학적 조성물은 대상체에서 효과적인 치료를 초래하는 임의의 적절한 경로로 투여될 수 있다.
접합체의 투여량 범위는 효능에 따라 달라지며, 원하는 효과(예: 종양 성장 지연 또는 종양 크기 감소)를 생성하기에 충분히 많은 양을 포함한다. 투여량은 허용할 수 없는 부작용을 일으킬 정도로 너무 커서는 안 된다. 일반적으로, 투여량은 대상체의 연령, 병태 및 성별에 따라 달라질 것이며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 임의의 합병증이 발생할 경우 개별 의사가 복용량을 조정할 수도 있다. 일부 양태에서, 투여량은 체중 1kg 당 0.1 mg 내지 10 mg 범위이다. 일부 양태에서, 투여량은 체중 1kg 당 0.5 mg 내지 15 mg 범위이다. 일부 양태에서, 용량 범위는 체중 1kg 당 0.5 mg 내지 5 mg이다. 대안적으로, 투여량 범위를 적정하여 혈청 수준을 1 ug/mL 내지 1000 ug/mL 사이로 유지할 수 있다. 전신 투여를 위해, 대상체에게 치료량을, 예를 들어 체중 1kg 당 0.1 mg, 0.5 mg, 1.0 mg, 2.0 mg, 2.5 mg, 5 mg, 10 mg, 12 mg 또는 그 이상을 투여할 수 있다.
위에 언급된 용량을 반복 투여할 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 언급된 용량은 몇 주 또는 몇 달 동안 매주, 격주로, 3주마다 또는 매달 투여된다. 치료 기간은 대상체의 임상 경과 및 치료에 대한 반응성에 따라 달라진다.
일부 양태에서, 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 15 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 12 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 1 mg/kg 내지 약 15 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 1 mg/kg 내지 약 12 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg일 수 있다.
일부 양태에서, 용량은 정맥내로 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 정맥내 투여는 약 10분 내지 약 4시간의 기간에 걸쳐 발생하는 주입일 수 있다. 일부 양태에서, 정맥내 투여는 약 30분 내지 약 90분의 기간에 걸쳐 발생하는 주입일 수 있다.
일부 양태에서, 용량은 매주 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 격주로 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 2주마다 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 3주마다 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 4주마다 투여될 수 있다.
일부 양태에서, 총 약 2 내지 약 10회 용량이 대상체에게 투여된다. 일부 양태에서, 총 4회 용량이 투여된다. 일부 양태에서, 총 5회 용량이 투여된다. 일부 양태에서, 총 6회 용량이 투여된다. 일부 양태에서, 총 7회 용량이 투여된다. 일부 양태에서, 총 8회 용량이 투여된다. 일부 양태에서, 총 9회 용량이 투여된다. 일부 양태에서, 총 10회 용량이 투여된다. 일부 양태에서, 총 10회 초과의 용량이 투여된다.
접합체를 함유하는 약제학적 조성물은 유닛 용량으로 투여될 수 있다. 약제학적 조성물과 관련하여 사용될 때 용어 "유닛 용량"은 대상체에 대한 유닛 투여량으로서 적합하도록 물리적으로 분리된 유닛을 의미하며, 각 유닛은 필요한 생리학적으로 허용되는 희석제, 즉 담체 또는 운반체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된, 소정의 양의 활성 물질(예: 접합체)을 함유한다.
자가면역 질환의 치료
일부 양태에서, 본원에 기재된 접합체는 자가면역 질환을 갖는 대상체와 같이 이를 필요로 하는 대상체에게 접합체를 투여하는 것을 포함하는 방법(들)에 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 접합체를 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 대상체는 자가면역 질환에 대한 치료가 필요하다. 본원에 기재된 방법은 자가면역 질환을 앓고 있는 대상체에게 치료 유효량의 접합체를 투여하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 어구 "치료 유효량", "유효량" 또는 "유효 용량"은 자가면역 질환의 치료, 관리 또는 재발 예방에 치료적 이점을 제공하는 본원에 기재된 접합체의 양을 의미하며, 예를 들어, 자가면역 질환의 적어도 하나의 증상, 징후 또는 지표의 통계적으로 유의미한 감소를 제공하는 양이다. 치료 유효량의 결정은 당업자의 능력 내에 있다. 일반적으로, 치료 유효량은 대상체의 병력, 연령, 병태, 성별뿐만 아니라 대상체의 의학적 상태의 중증도 및 유형, 기타 약제학적적 활성 제제의 투여에 따라 달라질 수 있다.
"자가면역 질환"이라는 용어는 면역 세포(예컨대, 림프구 또는 수지상 세포)의 부적절한 활성화를 특징으로 하는 면역 장애를 의미하며. 이는 신체 기관 및 시스템의 정상적인 기능을 방해한다. 자가면역 질환의 예로는 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 자가면역 탈수 초성 질환(예: 다발성 경화증, 알레르기성 뇌척수염), 내분비 안 병증, 포도막염, 전신성 홍반 루푸스, 중증근육무력증, 그레이브병, 사구체 신염, 자가면역 간 질환, 염증성 장질환(예: 크론 병), 아나필락시스, 알레르기 반응, 쇼그렌 증후군, 제1형 당뇨병, 원발성 담즙성 간경변증, 베게너 육아 종증, 섬유근통, 다발성 근염, 피부근염, 다발성 내분비 부전, 슈미트 증후군, 자가면역 포도막염, 애디슨병, 부신염, 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 자가면역 갑상선 질환, 악성빈혈, 위위축증, 만성간염, 루포이드 간염, 죽상동맥경화증, 아급성 피부 홍반 루푸스, 부갑상선 기능 저하증, 드레슬러 증후군, 자가면역성 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 용혈성 빈혈, 천포창 심상성, 천포창, 포진성 피부염, 원형 탈모증, 유천포창, 경피증, 진행성 전신 경화증, CREST 증후군(칼시노시스, 레이노 현상, 식도 운동 장애, 경화증), 모세 혈관 확장증, 남성 및 여성 자가면역 불임, 강직증 척추용해증, 궤양성대장염, 혼합결합조직질환, 다발동맥염 노도사, 전신괴사성 혈관염, 아토피성 피부염, 아토피성 비염, 굿파스처 증후군, 샤가스병, 유육종증, 류마티스 열, 천식, 재발성 유산, 항 인지질 증후군, 농부폐, 홍반 다형성, 심장 절개 후 증후군, 쿠싱 증후군, 자가면역 만성 활동성 간염, 조류 애호가 폐, 독성 표피 괴사 용해, 알포트 증후군, 폐포염, 알레르기성 폐포염, 섬유화 폐포염, 간질성 폐질환, 홍반 결절, 농피증 괴저종, 수혈반응, 다카야스 동맥염, 다발근육통 류마티스, 측두 동맥염, 주혈흡충증, 거대세포 동맥염, 회충증, 아스페르 길루스증, 삼터 증후군, 습진, 림프종양 육아종증, 베체트병, 카플란 증후군, 가와사키병, 뎅기열, 뇌척수염, 심내막염, 심내막 섬유증, 안내염, 지구성융기성홍반, 건선, 태아 적혈구모세포증, 호산구성 근막염, 슐만 증후군, 펠티 증후군, 필라리아증, 모양체염, 만성 모양체염, 이종만성 모양체염, 푸크 모양체염, IgA 신장병, 헤노흐-숀라인(Henoch-Schonlein) 자반증, 이식편대숙주병, 이식 거부, 심근병증, 이튼-람베르트 증후군, 재발성 다발연골염, 한랭글로불린혈증, 발덴스톰 거대글로불린혈증,에반 증후군 및 자가면역 성선 부전이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 방법은 B 림프구 장애(예를 들어, 전신 홍반 루푸스, 굿패스처 증후군, 류마티스 관절염 및 제I형 당뇨병), Th1-림프구(예를 들어, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 건선, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 그레이브병, 원발성 담즙성 간경변, 베게너 육아 종증, 결핵 또는 이식편대숙주병) 또는 Th2-림프구(예: 아토피성 피부염, 전신홍반루푸스, 아토피성 천식, 비결막염, 알레르기성 비염, 오멘 증후군, 전신경화증, 또는 만성 이식편대숙주병)의 질환의 치료를 포함한다. 일반적으로 수지상 세포와 관련된 장애에는 Th1-림프구 또는 Th2-림프구의 장애가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 "대상체"는 인간 또는 동물을 의미한다. 일반적으로 동물은 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥감 동물과 같은 척추동물이다. 영장류에는 침팬지, 시노몰구스 원숭이, 거미원숭이, 원숭이(macaque)(예: 붉은털원숭이(Rhesus))가 포함된다. 설치류에는 마우스, 래트, 우드척, 흰족제비, 토끼 및 햄스터가 포함된다. 가축 및 사냥감 동물에는 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이과 종, 예를 들어 집고양이, 개과 동물, 예를 들어 개, 여우, 늑대, 조류 종, 예를 들어 닭,에뮤, 타조, 및 물고기, 예를 들어 송어, 메기, 및 연어가 포함된다. 특정 양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 영장류, 예를 들어 인간이다. "환자", "개체" 및 "대상체"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
바람직하게는, 대상체는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있으나 이들 예로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 인간 이외의 포유동물을, 예컨대 각종 자가면역 질환의 동물 모델을 대표하는 대상체로서 유리하게 사용할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 방법은 가축 및/또는 애완동물을 치료하는 데 사용될 수 있다. 대상체는 남성일 수도 있고 여성일 수도 있다. 특정 양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 양태에서, 대상체는 이전에 자가면역 질환 진단을 받았거나 자가면역 질환을 앓고 있는 것으로 확인되었으며 치료가 필요하지만 이미 자가면역 질환 치료를 받았을 필요는 없는 개체이다. 일부 양태에서, 대상체는 또한 이전에 치료가 필요한 자가면역 질환을 갖는 것으로 진단되지 않은 대상체일 수도 있다. 일부 양태에서, 대상체는 자가면역 질환과 관련된 병태 또는 하나 이상의 합병증에 대한 하나 이상의 위험 인자를 나타내는 개체 또는 위험 인자를 나타내지 않는 대상체일 수 있다. 특정 자가면역 질환에 대한 치료가 "필요한 대상체"는 해당 병태를 갖거나 해당 병태를 갖는 것으로 진단된 대상체일 수 있다. 다른 양태에서, 병태가 "발생할 위험이 있는" 대상체는 병태(예: 자가면역 질환)가 발생할 위험이 있거나 병태가 다시 발생할 위험이 있는 것으로 진단된 대상체를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료", "치료하는" 또는 "완화"는 질환, 장애 또는 의학적 병태와 관련하여 사용될 때 병태에 대한 치료학적 치료를 의미하며, 여기서 목적은 증상이나 병태의 진행이나 중증도를 되돌리거나 완화, 개선, 억제, 둔화 또는 중지하는 것이다. "치료하다"라는 용어는 병태의 적어도 하나의 부작용 또는 증상을 감소시키거나 완화시키는 것을 포함한다. 하나 이상의 증상이나 임상 지표가 감소하면 치료는 일반적으로 "효과적"이다. 또는 병태의 진행이 감소되거나 중단되면 치료는 "효과적"이다. 즉, "치료"에는 증상이나 지표의 개선뿐 아니라, 치료가 없을 경우 예상되는 증상의 중단, 또는 적어도 진행 또는 악화의 둔화도 포함된다. 유익하거나 원하는 임상 결과에는 대상체에서 자가면역 세포의 감소, 하나 이상의 증상(들)의 완화, 결핍 정도의 감소, 자가면역 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 자가면역 질환 진행의 지연 또는 둔화, 치료가 없을 때 예상되는 수명과 비교하여 증가된 수명이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 용어 "투여하는"은 접합체가 표적 자가면역 세포에 결합하도록 하는 방법 또는 경로에 의해 대상체에게 본원에 기재된 접합체를 제공하는 것을 의미한다. 유사하게, 본원에 기재된 바와 같은 접합체를 포함하는 약제학적 조성물은 대상체에서 효과적인 치료를 초래하는 임의의 적절한 경로로 투여될 수 있다.
접합체의 투여량 범위는 효능에 따라 달라지며, 원하는 효과(예: 자가면역 질환 진행의 지연 또는 증상의 감소)를 생성하기에 충분히 많은 양을 포함한다. 투여량은 허용할 수 없는 부작용을 일으킬 정도로 너무 커서는 안 된다. 일반적으로, 투여량은 대상체의 연령, 병태 및 성별에 따라 달라질 것이며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 임의의 합병증이 발생할 경우 개별 의사가 복용량을 조정할 수도 있다. 일부 양태에서, 투여량은 체중 1kg 당 0.1 mg 내지 10 mg 범위이다. 일부 양태에서, 투여량은 체중 1kg 당 0.5 mg 내지 15 mg 범위이다. 일부 양태에서, 용량 범위는 체중 1kg 당 0.5 mg 내지 5 mg이다. 대안적으로, 투여량 범위를 적정하여 혈청 수준을 1 ug/mL 내지 1000 ug/mL 사이로 유지할 수 있다. 전신 투여를 위해, 대상체에게 치료량을, 예를 들어 체중 1kg 당 0.1 mg, 0.5 mg, 1.0 mg, 2.0 mg, 2.5 mg, 5 mg, 10 mg, 12 mg 또는 그 이상을 투여할 수 있다.
위에 언급된 용량을 반복 투여할 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 언급된 용량은 몇 주 또는 몇 달 동안 매주, 격주로, 3주마다 또는 매달 투여된다. 치료 기간은 대상체의 임상 경과 및 치료에 대한 반응성에 따라 달라진다.
일부 양태에서, 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 15 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 12 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 1 mg/kg 내지 약 15 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 1 mg/kg 내지 약 12 mg/kg일 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg일 수 있다.
일부 양태에서, 용량은 정맥내로 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 정맥내 투여는 약 10분 내지 약 4시간의 기간에 걸쳐 발생하는 주입일 수 있다. 일부 양태에서, 정맥내 투여는 약 30분 내지 약 90분의 기간에 걸쳐 발생하는 주입일 수 있다.
일부 양태에서, 용량은 매주 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 격주로 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 2주마다 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 약 3주마다 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 용량은 4주마다 투여될 수 있다.
일부 양태에서, 총 약 2 내지 약 10회 용량이 대상체에게 투여된다. 일부 양태에서, 총 4회 용량이 투여된다. 일부 양태에서, 총 5회 용량이 투여된다. 일부 양태에서, 총 6회 용량이 투여된다. 일부 양태에서, 총 7회 용량이 투여된다. 일부 양태에서, 총 8회 용량이 투여된다. 일부 양태에서, 총 9회 용량이 투여된다. 일부 양태에서, 총 10회 용량이 투여된다. 일부 양태에서, 총 10회 초과의 용량이 투여된다.
접합체를 함유하는 약제학적 조성물은 유닛 용량으로 투여될 수 있다. 약제학적 조성물과 관련하여 사용될 때 용어 "유닛 용량"은 대상체에 대한 유닛 투여량으로서 적합하도록 물리적으로 분리된 유닛을 의미하며, 각 유닛은 필요한 생리학적으로 허용되는 희석제, 즉 담체 또는 운반체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된, 소정의 양의 활성 물질(예: 접합체)을 함유한다.
일부 양태에서, 이들 중 임의의 것의 접합체 또는 약제학적 조성물은 면역억제 요법과 병용하여 투여된다. 일부 양태에서, 면역억제 요법을 받는 대상체에서 치료 결과를 개선하는 방법이 제공된다. 방법은 일반적으로 자가면역 장애를 앓고 있는 대상체에게 유효량의 면역억제 요법을 제공하는 단계; 및 치료 유효량의 접합체 또는 이의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 접합체는 표적 자가면역 세포에 특이적으로 결합하고; 대상체의 치료 결과는 면역요법의 단독 실행과 비교하여 개선된다. 일부 양태에서, 접합체는 본원에 기재된 바와 같다. 일부 양태에서, 개선된 치료 결과는 질환 진행의 감소, 하나 이상의 증상의 완화 등이다.
본 발명은 하기 양태에 의해 추가로 예시되며, 이는 제한적인 것으로 해석되어서는 안 된다.
1. 하기 화학식(V)을 갖는 링커 중간체, 또는 그의 염:
Figure pct00397
여기서,
AA는 1 내지 12 개의 아미노산 서브유닛을 갖는 아미노산 유닛이고;
s는 0 또는 1이고;
L2는 약물 유닛에 대하여 1 내지 4개의 부착 부위를 갖는 링커 서브유닛이고;
각 물결(~) 선은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 이중 물결() 선은 약물 유닛의 부착 부위를 나타내고,
여기서, 적어도 하나의 극성 유닛은 아미노산 유닛, 링커 서브유닛 또는 둘 다에 존재하며, 극성 유닛(들)은 당 유닛, PEG 유닛, 카르복실 유닛 및 이들의 조합들로부터 선택된다.
2. 하기 화학식 (I)를 갖는 링커, 또는 그의 염:
Figure pct00399
여기서,
L1은 표적화 유닛에 대한 부착 부위를 갖는 스트레처 유닛이고;
AA는 1 내지 12 개의 아미노산 서브유닛을 갖는 아미노산 유닛이고;
s는 0 또는 1이고;
L2는 약물 유닛에 대하여 1 내지 4개의 부착 부위를 갖는 링커 서브유닛이고;
물결(~) 선은 표적화 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 이중 물결() 선은 약물 유닛의 부착 부위를 나타내고,
여기서, 적어도 하나의 극성 유닛은 아미노산 유닛, 링커 서브유닛 또는 둘 다에 존재하며, 극성 유닛(들)은 당 유닛, PEG 유닛, 카르복실 유닛 및 이들의 조합들로부터 선택된다.
3. 이전 양태의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 당 유닛은 하기 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
Figure pct00401
여기서,
X 각각은 독립적으로 NH 또는 O로부터 선택되고;
R 각각은 독립적으로 수소, 아세틸, 단당류, 이당류 및 다당류로부터 선택되고;
X1 각각은 독립적으로 CH2 및 C(O)로부터 선택되고;
X2 각각은 독립적으로 H, OH 및 OR로부터 선택되고;
k는 1 내지 10이고;
L3은 하기 일반 화학식 (XI) 또는 그의 염을 갖는다:
Figure pct00402
여기서,
L3a는 C1-C10 알킬렌 및 1 내지 24개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖는 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택되고;
p와 o는 독립적으로 0 내지 2이고;
각 * 및 각 #은 아미노산 유닛(AA)의 다른 서브유닛, 링커 서브유닛 L2, 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타내고;
L3a는 화학식 (X)에서 **로 표시된 N 원자에 공유 결합되어 있다.
4. 이전 양태 중 임의의 링커 중간체 및 링커로서, 여기서 당 유닛은 하기로부터 선택되는 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
Figure pct00403
여기서,
R 각각은 독립적으로 수소, 단당류, 이당류, 및 다당류로부터 선택되고;
p 및 o 는 독립적으로 0 내지 2이고;
m은 1 내지 8이고;
n은 0 내지 4이고;
각 * 및 각 #은 아미노산 유닛(AA)의 다른 서브유닛, 링커 서브유닛 L2, 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타낸다.
5. 이전 양태 중 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 PEG 유닛은 하기로부터 선택되는 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
(a)
Figure pct00404
여기서,
R20은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
R21 및 R22는 각각 독립적으로 선택적 C1-C3 알킬렌이고;
R24 및 R25는 각각 독립적으로 H; 폴리하이드록실기; 치환된 폴리하이드록실기; -C(O)-폴리하이드록실기; 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기; 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 헤테로아릴; 선택적으로 치환된 카르보사이클; 치환된 -C1-C8 알킬; 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬; 킬레이트제; -C(O)-R28 (여기서 R28은 화학식 (XII) 또는 (XIII)의 당 유닛임); 또는 C3-C8 헤테로사이클로부터 함께 -NR24R25로부터 선택되고;
물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
n20은 1 내지 26임;
또는
(b)
Figure pct00405
여기서,
R20은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
R21 및 R22는 각각 독립적으로 선택적 C1-C3 알킬렌이고;
R24 및 R25 중 하나는 H; 폴리하이드록실기; 치환된 폴리하이드록실기; -C(O)-폴리하이드록실기; 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기; 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 헤테로아릴; 선택적으로 치환된 카르보사이클; 치환된 -C1-C8 알킬; 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬; 킬레이트제; -C(O)-R28(여기서 R28은 화학식 XII 또는 XIII의 당 유닛임)로부터 선택되고; R24 및 R25 중 다른 하나는 선택적으로 1 내지 24개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖는 폴리에틸렌 글리콜이고;
물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
n20은 1 내지 26임;
또는
(c)
Figure pct00406
여기서,
R20은 아미노산 유닛의 서브유닛 및/또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
R26 및 R27은 각각 선택적이고 그리고 독립적으로 C1-C12 알킬렌, -NH-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-NH-, -C(O)-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-C(O)-, -NH-C1-C12 알킬렌-C(O)- 및 -C(O)-C1-C12 알킬렌-NH-로부터 선택되고;
R24 및 R25 중 하나는 H; 폴리하이드록실기; 치환된 폴리하이드록실기; -C(O)-폴리하이드록실기; 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기; 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 헤테로아릴; 선택적으로 치환된 카르보사이클; 치환된 -C1-C8 알킬; 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬; 킬레이트제; -C(O)-R28(여기서 R28은 화학식 (XII) 또는 (XIII)의 당 유닛임)로부터 선택되고; R24 및 R25 중 다른 하나는 H; 폴리하이드록실기; 치환된 폴리하이드록실기; -C(O)-폴리하이드록실기; 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기; 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 헤테로아릴; 선택적으로 치환된 카르보사이클; 치환된 -C1-C8 알킬; 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬; 킬레이트제; -C(O)-R28(여기서 R28은 화학식 (XII) 또는 (XIII)의 당 유닛임); 및 선택적으로 1 내지 24개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖는 폴리에틸렌 글리콜; 또는 C3-C8 헤테로사이클로부터 함께 -NR24R25로부터 선택되고;
물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
n20은 1 내지 26이고;
n21은 1 내지 4이고;
n27은 1 내지 4임.
6. 양태 5의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 R24 및 R25 둘 다 H는 아니다.
7. 양태 5 내지 6 중 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 R24 및 R25는 각각 H 및 폴리하이드록실기로부터 독립적으로 선택되며, 단 R24 및 R25는 둘 다 H는 아니다.
8. 양태 5 내지 7 중 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 폴리하이드록실기는 선택적으로 C6 또는 C5 당, 당 산(sugar acid) 또는 아미노당으로부터 선택된 선형 단당류이다.
9. 양태 8의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서:
C6 또는 C5 당은 글루코스, 리보스, 갈락토스, 만노스, 아라비노스, 2-데옥시글루코스, 글리세르알데하이드,에리트로스, 트레오스, 자일로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 알도스 및 케토스로부터 선택되고;
당 산은 글루콘산, 알돈산, 우론산 및 울로손산으로부터 선택되며; 또는
아미노당은 글루코사민, N-아세틸 글루코사민, 갈락토사민 및 N-아세틸 갈락토사민으로부터 선택된다.
10. 양태 5 내지 9 중 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00407
Figure pct00408
여기서,
R39는 H, 선형 단당류 및 선택적으로 1 내지 24개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖는 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택되고; 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
11. 양태 5 내지 6 중 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 R24 및 R25 중 하나는 선형 단당류이고 다른 하나는 환형 단당류이다.
12. 양태 11의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00409
여기서,
R41은 환형 단당류이고; 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
13. 양태 5 내지 6 중 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 R24 및 R25는 환형 단당류, 이당류 및 다당류로부터 독립적으로 선택된다.
14. 양태 13의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00410
여기서,
R45는 H 및 단당류, 이당류 또는 다당류로부터 선택되고; R46은 환형 단당류, 이당류 또는 다당류로부터 선택되고; 우측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
15. 양태 5 내지 6 중 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 R24 및 R25는 선형 단당류 및 치환된 선형 단당류로부터 독립적으로 선택되고, 상기 치환된 선형 단당류는 단당류, 이당류 또는 다당류로 치환된다.
16. 양태 15의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00411
여기서,
R47은 선형 단당류이고; R49는 단당류, 이당류 및 다당류로부터 선택되고; 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
17. 양태 5 내지 6 중 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 R24 및 R25는 선형 단당류 및 치환된 단당류로부터 독립적으로 선택되고, 상기 치환된 선형 단당류는 알킬, O-알킬, 아릴, O-아릴, 카르복실, 에스테르 또는 아미드로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환되고, 선택적으로 단당류, 이당류 또는 다당류로 추가로 치환된다.
18. 양태 17의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00412
여기서, R42 각각은 선형 단당류 및 치환된 선형 단당류로부터 독립적으로 선택되고; R43 각각은 알킬, O-알킬, 아릴, O-아릴, 카르복실, 에스테르 및 아미드로부터 독립적으로 선택되고; 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
19. 양태 5 내지 6 중 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 R24 및 R25 중 하나는 -C(O)-폴리하이드록실기 또는 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기이고, R24 및 R25 중 다른 하나는 H, -C(O)-폴리하이드록실기, 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기, 폴리하이드록실기 또는 치환된 폴리하이드록실기이고; 여기서 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기 및 폴리하이드록실기는 단당류, 이당류, 다당류, 알킬, -O-알킬, 아릴, 카르복실, 에스테르 또는 아미드로 치환된다.
20. 양태 19의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00413
여기서, 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
21. 양태 5 내지 6 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 R24 및 R25는 H, 치환된 -C1-C8 알킬, 치환된 -C1-C4 알킬 또는 치환된 -C1-C3 알킬로부터 독립적으로 선택되며; 단, R24 및 R25 둘 다 H는 아니고; 여기서, 치환된 -C1-C8 알킬, -C1-C4 알킬 및 -C1-C3 알킬은 하이드록실 및/또는 카르복실로 치환된다.
22. 양태 21의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00414
Figure pct00415
여기서, R48은 H, OH, CH2OH, COOH, 또는 하이드록실 또는 카르복실로 치환된 -C1-C6 알킬로부터 선택되고; 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
23. 양태 5 내지 6 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 R24 및 R25 중 하나는 H, 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬, 치환된 -C(O)-C1-C4 알킬, 및 치환된 -C(O)-C1-C3 알킬로부터 선택되고, R24 및 R25 중 다른 하나는 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬, 치환된 -C(O)-C1-C4 알킬, 치환된 -C(O)-C1-C3 알킬, 치환된 -C1-C8 알킬, 치환된 -C1-C4 알킬, 및 치환된 -C1-C3 알킬로부터 선택되고, 여기서 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬, 치환된 -C(O)-C1-C4 알킬, 치환된 -C(O)-C1-C3 알킬, 치환된 -C1-C8 알킬, -C1-C4 알킬 및 -C1-C3 알킬은 하이드록실 및/또는 카르복실로 치환된다.
24. 양태 23의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식, 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00416
Figure pct00417
여기서, 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
25. 양태 5 내지 6 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 R24 및 R25는 H 및 선택적으로 치환된 아릴로부터 선택되고; 단 R24 및 R25가 둘 다 H는 아니다.
26. 양태 25의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식, 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00418
여기서, 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
27. 양태 5 내지 6 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 R24 및 R25는 함께 선택적으로 치환된 C3-C8 헤테로사이클 또는 헤테로아릴을 형성한다.
28. 양태 27의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염이다:
Figure pct00419
.
29. 양태 5 내지 6 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 R24 및 R25는 H 및 킬레이트제로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 킬레이트제는 선택적으로 알킬렌, 아릴렌, 카르보사이클로, 헤테로아릴렌 또는 헤테로카르보사이클로에 의해 -NR24R25의 질소에 부착되고; 단, R24 및 R25는 둘 다 H는 아니다.
30. 양태 29의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 킬레이트제는에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 트리에틸렌테트라민헥사아세트산(TTHA), 벤질-DTPA, 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N",N'''-테트라아세트산(DOTA), 벤질-DOTA, 1,4,7-트리아자사이클로노난-N,N',N"-트리아세트산(NOTA), 벤질-NOTA, 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA) 및 N,N'-디알킬 치환된 피페라진으로부터 선택된다.
31. 양태 30의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 PEG 유닛은 하기 화학식, 또는 그의 염으로부터 선택된다:
Figure pct00420
여기서, 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
32. 양태 5 내지 19 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 각 단당류는 독립적으로
글루코스, 리보스, 갈락토스, 만노스, 아라비노스, 2-데옥시글루코스, 글리세르알데하이드,에리트로스, 트레오스, 자일로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 알도스, 케토스, 글루코사민, N-아세틸 글루코사민, 갈락토사민 및 N-아세틸 갈락토사민으로부터 선택되는 C5 또는 C6 당;
글루콘산, 알돈산, 우론산 및 울로손산으로부터 선택되는 당 산; 또는
글루코사민, N-아세틸 글루코사민, 갈락토사민 및 N-아세틸 갈락토사민으로부터 선택되는 아미노 당으로부터 선택된다.
33. 양태 5 내지 32 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 R20은 카르복실, 아미노, 알키닐, 아지도, 하이드록실, 카르보닐, 카르바메이트, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 설폰아미드, 아실 설폰아미드, 알킬 설포네이트 또는 이들의 보호된 형태로부터 선택된다.
34. 양태 1 내지 4 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 PEG 유닛은 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
(a)
Figure pct00421
여기서,
R20은 (존재하는 경우) 아미노산 유닛의 서브유닛 및/또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
R21 및 R22는 각각 선택적으로, 그리고 (존재하는 경우) 독립적으로 C1-C3 알킬렌기이고;
R30은 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클; 티오우레아; 선택적으로 치환된 티오우레아; 우레아; 선택적으로 치환된 우레아; 설파미드; 알킬 설파미드; 아실 설파미드; 선택적으로 치환된 알킬 설파미드; 선택적으로 치환된 아실 설파미드; 설폰아미드; 선택적으로 치환된 설폰아미드; 알킬 및 아릴 구아니딘을 포함하는 구아니딘; 포스포르아미드; 또는 선택적으로 치환된 포스포아미드로부터 선택되거나; 또는
R30은 아지도, 알키닐, 치환된 알키닐, -NH-C(O)-알키닐, -NH-C(O)-알키닐-R65; 사이클로옥틴; -NH-사이클로옥틴, -NH-C(O)-사이클로옥틴, 또는 -NH-(사이클로옥틴)2로부터 선택되고; 여기서 R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고;
물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
n20은 1 내지 26임;
(b)
Figure pct00422
여기서,
R20은 (존재하는 경우) 아미노산 유닛의 서브유닛, 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
R21 및 R22는 각각 독립적으로 선택적 C1-C3 알킬렌기이고;
R31은 분지형 폴리에틸렌 글리콜 쇄로서, 각 분지는 1 내지 26개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖고, 각 분지는 그의 말단에 R35를 가지며;
R35는 아지도, 알키닐, 알키닐-R65, 사이클로옥틴 또는 사이클로옥틴-R65이고, 여기서 R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고;
물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
n20은 1 내지 26임;
(c)
Figure pct00423
여기서,
R20은 (존재하는 경우) 아미노산 유닛의 서브유닛, 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
R21 및 R22는 각각 선택적이고, 독립적으로 C1-C3 알킬렌기이고;
R31은 분지형 폴리에틸렌 글리콜 쇄로서, 각 분지는 독립적으로 1 내지 26개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖고, 각 분지는 그의 말단에 R35를 가지고;
R35는 아지도, 알키닐, 알키닐-R65, 사이클로옥틴 또는 사이클로옥틴-R65이고, 여기서 R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고;
물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
n20은 1 내지 26임;
(d)
Figure pct00424
여기서,
R20은 (존재하는 경우) 아미노산 유닛의 서브유닛, 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
R21 및 R22는 각각 선택적이고, C1-C3 알킬렌기이고;
R31은 분지형 폴리에틸렌 글리콜 쇄로서, 각 분지는 1 내지 26개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖고, 각 분지는 그의 말단에 R35를 가지고;
R33은 C1-C3 알킬렌, C1-C3 알킬렌-C(O), C(O)-C1-C3 알킬렌, 또는 -C(O)-C1-C3 알킬렌-C(O)이고;
R35는 아지도, 알키닐, 알키닐-R65, 사이클로옥틴 또는 사이클로옥틴-R65이고, 여기서 R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고;
물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
n20은 1 내지 26임.
35. 양태 1 내지 4 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 PEG 유닛은 다음으로부터 선택된 화학식 또는 그의 염을 갖는다:
Figure pct00425
여기서,
R20은 (존재하는 경우) 아미노산 유닛의 서브유닛, 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고; R21 및 R22는 각각 선택적이고, 그리고 C1-C3 알킬렌기이고; R31은 분지형 폴리에틸렌 글리콜 쇄로서, 각 분지는 1 내지 26개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖고, 각 분지는 그의 말단에 R35를 가지고; R33은 C1-C3 알킬렌, -C1-C3 알킬렌-C(O), -C(O)-C1-C3 알킬렌, 또는 -C(O)-C1-C3 알킬렌-C(O)이고; R35는 아지도, 알키닐, 알키닐-R65, 사이클로옥틴 또는 사이클로옥틴-R65이고, 여기서 R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고; 상기 물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고; n20은 1 내지 26이다.
36. 양태 35의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 PEG 유닛은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00426
Figure pct00427
여기서, R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고; 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
37. 양태 34 내지 37 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 R20은 카르복실, 아미노, 알키닐, 아지도, 하이드록실, 카르보닐, 카르바메이트, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 설폰아미드, 아실 설폰아미드, 알킬 설포네이트 또는 이들의 보호된 형태로부터 선택된다.
38. 양태 1 내지 4 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 카르복실 유닛은 하기 화학식, 또는 그의 염을 갖는다:
Figure pct00428
여기서,
(a)
L70은 C1-C8 알킬렌, C1-C8 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C8 알킬렌-, 및 -C(O)-C1-C8 알킬렌-C(O)-로부터 선택되고;
R70은 ~NR71(R72R73)이고, 여기서 R71은 H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, 또는 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐)로부터 선택되고; R72는 존재하지 않거나, 또는 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌, 선택적으로 치환된 에테르, 선택적으로 치환된 티오에테르, 선택적으로 치환된 케톤, 선택적으로 치환된 아미드, 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐), 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고; R73은 카르복실 또는 폴리카르복실이고; 여기서 폴리카르복실은 1 내지 10개, 또는 1 내지 6개, 또는 1 내지 4개의 카르복실기를 포함하고, 여기서 카르복실기는 알킬, 알킬렌, 치환된 알킬, 치환된 알킬렌, 헤테로알킬, 헤테로알킬렌, 아미노 및/또는 아미드에 의해 상호 연결되고;
각각의 물결선(~)은 아미노산 유닛(AA)의 다른 서브유닛, 링커 서브유닛 L2, 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타내고,
p1 및 o1 각각은 0 내지 2로부터 독립적으로 선택되거나;
또는
(b)
L70은 C1-C8 알킬렌, C1-C8 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C8 알킬렌-, 및 -C(O)-C1-C8 알킬렌-C(O)-로부터 선택되고;
R70은 ~NR71(R75-(R73)2)이고, 여기서 R71은 H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, 또는 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐)로부터 선택되고, R75는 분지화된, 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌, 선택적으로 치환된 에테르, 선택적으로 치환된 티오에테르, 선택적으로 치환된 케톤, 선택적으로 치환된 아미드, 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐), 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고, 각각의 R73은 독립적으로 카르복실 또는 폴리카르복실이고, 여기서 폴리카르복실은 1 내지 10개, 또는 1 내지 6개, 또는 1 내지 4개의 카르복실기를 포함하고, 여기서 상기 카르복실기는 알킬, 알킬렌, 치환된 알킬, 치환된 알킬렌, 헤테로알킬, 헤테로알킬렌, 아미노 및/또는 아미드에 의해 상호 연결되고;
각 물결선(~)은 아미노산 유닛(AA)의 또 다른 서브유닛, 링커 서브유닛 L2, 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타내고;
p1과 o1은 각각 독립적으로 0 내지 2로부터 선택되거나;
또는
(c)
L70은 C1-C8 알킬렌, C1-C8 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C8 알킬렌-, 및 -C(O)-C1-C8 알킬렌-C(O)-로부터 선택되고;
R70은 ~N(R74-R73)(R72-R73)이고, 여기서 R72 및 R74는 각각 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌, 선택적으로 치환된 에테르, 선택적으로 치환된 티오에테르, 선택적으로 치환된 케톤, 선택적으로 치환된 아미드, 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐), 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, 각각의 R73은 독립적으로 카르복실 또는 폴리카르복실이고, 여기서 1 내지 10개, 또는 1 내지 6개, 또는 1 내지 4개의 카르복실기를 포함하고, 여기서 상기 카르복실기는 알킬, 알킬렌, 치환된 알킬, 치환된 알킬렌, 헤테로알킬, 헤테로알킬렌, 아미노 및/또는 아미드에 의해 상호 연결되고;
각 물결선(~)은 아미노산 유닛(AA)의 또 다른 서브유닛, 링커 서브유닛 L2, 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타내고;
p1과 o1은 각각 독립적으로 0 내지 2로부터 선택된다.
39. 양태 1 내지 38 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 이는 적어도 하나의 당 유닛을 포함한다.
40. 양태 1 내지 38 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 이는 적어도 하나의 PEG 유닛을 포함한다.
41. 양태 1 내지 38 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 이는 적어도 하나의 카르복실 유닛을 포함한다.
42. 양태 1 내지 38 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 이는 적어도 2개의 극성 유닛을 포함하며, 각각의 극성 유닛은 당 유닛, PEG 유닛 및 카르복실 유닛으로부터 선택된다.
43. 양태 1 내지 38 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 이는 적어도 하나의 당 유닛, 및 PEG 유닛 또는 카르복실 유닛을 포함한다.
44. 양태 1 내지 38 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 이는 적어도 하나의 카르복실 유닛, 및 PEG 유닛을 포함한다.
45. 양태 1 내지 44 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 아미노산 유닛(AA)이 존재한다(s=1).
46. 양태 1 내지 45 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 아미노산 유닛은 적어도 하나의 극성 유닛을 포함한다.
47. 양태 1 내지 45 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 ~AA-L2~는 하기로부터 선택되는 화학식을 갖는다:
Figure pct00429
여기서, 대괄호는 아미노산 유닛을 나타내고, 각 aa는 AA의 선택적 서브유닛이고, L2는 링커 서브유닛이고, 각 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내며; aa1(PEG)는 AA의 아미노산 서브유닛에 부착된 PEG 유닛이고, SU는 AA의 서브유닛 또는 L2에 부착된 당 유닛이고, CU는 AA의 서브유닛 또는 L2에 부착된 카르복실 유닛이고; 이중 물결() 선은 약물 유닛의 부착 부위를 나타내고, 여기서 aa 및 aa1은 독립적으로 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된다.
48. 양태 1 내지 45 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 ~AA-L2~는 하기로부터 선택되는 화학식을 갖는다:
Figure pct00431
여기서, 대괄호는 아미노산 유닛을 나타내고, 각 aa는 AA의 아미노산 서브유닛이고, L2는 aa의 측쇄에 부착된 링커 서브유닛이고, 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내며; aa1(PEG)는 aa에 부착된 PEG 유닛이고, SU는 aa에 부착된 당 유닛이고, CU는 aa에 부착된 카르복실 유닛이고; 이중 물결() 선은 약물 유닛의 부착 부위를 나타내고; 여기서 aa 및 aa1은 독립적으로 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된다.
49. 양태 1 내지 46 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 아미노산 유닛은 적어도 두개의 극성 유닛을 포함한다.
50. 양태 49의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 ~AA-L2~는 하기로부터 선택되는 화학식을 갖는다:
Figure pct00433
여기서, 대괄호는 아미노산 유닛을 나타내고, aa는 AA의 선택적 서브유닛이고, L2는 링커 서브유닛이고, 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내며; aa1(PEG) 및 aa2(PEG) 각각은 aa 또는 다른 PEG 유닛에 부착된 PEG 유닛이고; SU 각각은 aa 또는 다른 당 유닛에 부착된 당 유닛이고, CU 각각은 aa 또는 다른 카르복실 유닛에 부착된 카르복실 유닛이고, 이중 물결() 선은 약물 유닛의 부착 부위를 나타내고; 여기서 aa, aa1 및 aa2는 독립적으로 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된다.
51. 양태 49의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 ~AA-L2~는 하기로부터 선택되는 화학식을 갖는다:
Figure pct00435
여기서, 대괄호는 아미노산 유닛을 나타내고, aa는 AA의 아미노산 서브유닛이고, L2는 aa의 측쇄에 부착된 링커 서브유닛이고, 각 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내며; aa1(PEG) 및 aa2(PEG) 각각은 aa에 부착된 PEG 유닛이고; SU 각각은 aa에 부착된 당 유닛이고, CU 각각은 aa에 부착된 카르복실 유닛이고; 이중 물결() 선은 약물 유닛의 부착 부위를 나타내고; 여기서 aa, aa1 및 aa2는 독립적으로 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된다.
52. 이전 양태들 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 링커 서브유닛 L2는 절단 가능한 링커 유닛이다.
53. 양태 52의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 링커 서브유닛 L2는 세포내 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩타이드를 포함한다.
54. 양태 53의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 절단 가능한 펩타이드는 발린-시트룰린 펩타이드, 발린-알라닌 펩타이드, 발린-리신 펩타이드, 페닐알라닌-리신 펩타이드, 또는 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신 펩타이드를 포함한다.
55. 이전 양태들 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 링커 서브유닛 L2는 적어도 하나의 극성 유닛을 포함한다.
56. 이전 양태들 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 극성 유닛은 당 유닛(SU)이다.
57. 양태 56의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 절단 가능한 펩타이드는 SU-발린-시트룰린 펩타이드, SU-발린-리신 펩타이드, SU-발린-알라닌 펩타이드, SU-페닐알라닌-리신 펩타이드, 또는 SU-글리신-글리신-페닐알라닌-글리신 펩타이드를 포함한다.
58. 양태 55의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 극성 유닛은 카르복실 유닛(CU)이다.
59. 양태 58의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 절단 가능한 펩타이드는 CU-발린-시트룰린 펩타이드, CU-발린-리신 펩타이드, 발린-(CU-리신) 펩타이드, CU-발린-알라닌 펩타이드, CU-페닐알라닌-리신 펩타이드, 페닐알라닌-(CU-리신) 펩타이드 또는 CU-글리신-글리신-페닐알라닌-글리신 펩타이드를 포함하고, 여기서, CU-리신은 리신 잔기를 포함하는 카르복실 유닛이다.
60. 양태 55의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 극성 유닛은 PEG 유닛(PEG)이다.
61. 양태 60의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 절단 가능한 펩타이드는 Lys(PEG)-발린-시트룰린 펩타이드, 발린-Cit(PEG) 펩타이드, Lys(PEG)-발린-리신 펩타이드, 발린-리신(PEG) 펩타이드, Lys(PEG)-발린-알라닌 펩타이드, Lys(PEG)-페닐알라닌-리신 펩타이드, 페닐알라닌-Lys(PEG) 펩타이드 또는 Lys(PEG)-글리신-글리신-페닐알라닌-글리신 펩타이드를 포함하며, 여기서 Lys(PEG) 및 Cit(PEG)는 각각 리신 잔기 또는 시트룰린 잔기에 부착된 PEG 유닛을 포함한다.
62. 양태 52 내지 61 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 절단 가능한 펩타이드는 파라-아미노벤질 알코올 자가 희생기(para-aminobenzyl alcohol self immolative group, PABA)에 부착된다.
63. 양태 62의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 ~AA-L2~는 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00437
Figure pct00438
Figure pct00439
여기서, 아미노기 상의 물결선은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다.
64. 양태 52 내지 62 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 L2는 AA의 서브유닛의 측쇄에 부착된다.
65. 양태 64의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 ~AA-L2~는 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00440
Figure pct00441
여기서, 아미노기 상의 물결선은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다.
66. 양태 1 내지 62 중의 임의의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 아미노산 유닛은 비펩타이드 연결기에 의해 링커 서브유닛 L2에 연결된다.
67. 양태 66의 링커 중간체 또는 링커로서, 여기서 비-펩타이드 연결기는 C1-C10 알킬렌, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택된다.
68. 이전 양태들 중의 임의의 링커 중간체로서, 이는 스트레처 유닛을 추가로 포함한다.
69. 양태 68의 링커로서, 여기서 스트레처 유닛은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00442
Figure pct00443
Figure pct00444
여기서, R17은 -C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 헤테로알킬렌-, -C3-C8 카르보사이클로-, -O-(C1-C8 알킬렌)-, -(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌- (여기서 b는 1 내지 26임), -아릴렌-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보사이클로)-, -(C3-C8 카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-, -C3-C8 헤테로사이클로-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로사이클로)-, -(C3-C8 헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-C(=O)-, C1-C10 헤테로알킬렌-C(=O)-, -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C3-C8 카르보사이클로-C(=O)-, -O-(C1-C8 알킬)-C(=O)-, -아릴렌-C(=O)-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-C(=O)-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-C(=O)-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보사이클로)-C(=O)-, -(C3-C8 카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-C(=O)-, -C3-C8 헤테로사이클로-C(=O)-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로사이클로)-C(=O)-, -(C3-C8 헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-C(=O)-, -C1-C10 알킬렌-NH-, -C1-C10 헤테로알킬렌-NH-, -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(C(=O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(C(=O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-NH-(C(=O))-(CH2-O-CH2)b-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-NH-(C(=O))-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -C3-C8 카르보사이클로-NH-, -O-(C1-C8 alkyl)-NH-, -아릴렌-NH-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-NH-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-NH-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보사이클로)-NH-, -(C3-C8 카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-NH-, -C3-C8 헤테로사이클로-NH-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로사이클로)-NH-, -(C3-C8 헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-NH-, -C1-C10 알킬렌-S-, C1-C10 헤테로알킬렌-S-, -C3-C8 카르보사이클로-S-, -O-(C1-C8 알킬)-S-, -아릴렌-S-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-S-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-S-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보사이클로)-S-, -(C3-C8 카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-S-, -C3-C8 헤테로사이클로-S-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로사이클로)-S-, 또는 -(C3-C8 헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-S-이거나; 또는
여기서 스트레처 유닛은 말레이미도(C1-C10알킬렌-C(O)-, 말레이미도(CH2OCH2)p2(C1-C10알킨)C(O)-, 말레이미도(C1-C10알킨)(CH2OCH2)p2C(O)-, 또는 그의 개환 형태를 포함하고, 여기서 p2는 1 내지 26이다.
70. 양태 69의 링커로서, 이는 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00445
Figure pct00446
Figure pct00447
Figure pct00448
.
71. 이전 양태들 중의 임의의 링커로서, 이는 링커 서브유닛 L2에 부착되어 약물-링커를 형성하는 적어도 하나의 약물 유닛을 추가로 포함한다.
72. 양태 71의 약물-링커로서, 여기서 약물 유닛은 세포독성제, 면역 조절제, 핵산, 성장 억제제, PROTAC, 독소, 방사성 동위원소 및 킬레이트 리간드로부터 선택된다.
73. 양태 72의 약물-링커로서, 여기서 약물 유닛은 세포독성제이다.
74. 양태 73의 약물-링커로서, 여기서 세포독성제는 아우리스타틴(auristatin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 캄프토테신(camptothecin), 듀오카르마이신(duocarmycin) 및 칼리케아미신(calicheamicin)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
75. 양태 74의 약물-링커로서, 상기 세포독성제는 아우리스타틴이다.
76. 양태 75의 약물-링커로서, 상기 세포독성제는 MMAE 또는 MMAF이다.
77. 양태 74의 약물-링커로서, 상기 세포독성제가 캄프토테신이다.
78. 양태 77의 약물-링커로서, 상기 세포독성제가 엑사테칸(exatecan) 또는 SN-38이다.
79. 양태 73의 약물-링커로서, 상기 세포독성제가 칼리케아미신이다.
80. 양태 73의 약물-링커로서, 상기 세포독성제가 메이탄시노이드이다.
81. 양태 80의 약물-링커로서, 상기 메이탄시노이드가 메이탄신(maytansine), 메이탄시놀(maytansinol) 또는 안사마토신-2(ansamatocin-2)이다.
82. 양태 72의 약물-링커로서, 상기 약물 유닛은 면역 조절제이다.
83. 양태 82의 약물-링커로서, 상기 면역 조절제는 TRL7 작용제, TLR8 작용제, STING 작용제 또는 RIG-I 작용제로부터 선택된다.
84. 양태 83의 약물-링커로서, 상기 면역 조절제가 TLR7 작용제이다.
85. 양태 84의 약물-링커로서, 상기 TLR7 작용제가 이미다조퀴놀린, 이미다조퀴놀린 아민, 티아조퀴놀린, 아미노퀴놀린, 아미노퀴나졸린, 피리도[3,2-d]피리미딘-2,4-디아민, 피리미딘-2,4-디아민, 2-아미노이미다졸, 1-알킬-1H-벤즈이미다졸-2-아민, 테트라하이드로피리도피리미딘, 헤테로아로티아디아지드-2,2-디옥사이드, 벤조나프티리딘, 구아노신 유사체, 아데노신 유사체, 티미딘 동종중합체, ssRNA, CpG-A, PolyG10 또는 PolyG3이다.
86. 양태 83의 약물-링커로서, 상기 면역 조절제가 TLR8 작용제이다.
87. 양태 86의 약물-링커로서, 상기 TLR8 작용제가 이미다조퀴놀린, 티아졸로퀴놀린, 아미노퀴놀린, 아미노퀴나졸린, 피리도[3,2-d]피리미딘-2,4-디아민, 피리미딘-2,4-디아민, 2-아미노이미다졸, 1-알킬-1H-벤즈이미다졸-2-아민, 테트라하이드로피리도피리미딘 또는 ssRNA로부터 선택된다.
88. 양태 83의 약물-링커로서, 상기 면역 조절제가 STING 작용제이다.
89. 양태 83의 약물-링커로서, 상기 면역 조절제가 RIG-I 작용제이다.
90. 양태 89의 약물-링커로서, 상기 RIG-I 작용제가 KIN1148, SB-9200, KIN700, KIN600, KIN500, KIN100, KIN101, KIN400 및 KIN2000으로부터 선택된다.
91. 양태 72의 약물-링커로서, 여기서 약물 유닛은 킬레이트화 리간드이다.
92. 양태 71의 약물-링커로서, 상기 킬레이트화 리간드는 백금(Pt), 루테늄(Ru), 로듐(Rh), 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 몰리브덴(Mo), 티타늄(Ti), 또는 이리듐(Ir); 이트륨-88, 이트륨-90, 테크네튬-99, 구리-67, 레늄-188, 레늄-186, 갈륨-66, 갈륨-67, 인듐-111, 인듐-114, 인듐-115, 루테튬-177, 스트론튬-89, 사라륨-153, 및 납-212와 같은 방사성 동위원소로부터 선택된다.
93. 접합체로서, 이는 양태 72 내지 92 중의 임의의 약물-링커에 부착된 표적화 유닛을 포함한다.
94. 양태 93의 접합체로서, 상기 표적화 유닛은 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로부터 선택된다.
95. 양태 94의 접합체로서, 상기 표적화 유닛은 단일클론 항체, Fab, Fab', F(ab'), Fv, 디설파이드 연결된 Fc, scFv, 단일 도메인 항체, 디아바디, 이중특이적 항체, 또는 다중특이적 항체이다.
96. 양태 93의 접합체로서, 상기 표적화 유닛은 디아바디, DART, 안티칼린, 아피바디, 아비머, DARPin 또는 애드넥틴이다.
97. 양태 93 내지 96 중의 임의의 접합체로서, 상기 표적화 유닛은 단일특이적이다.
98. 양태 93 내지 97 중의 임의의 접합체로서, 상기 표적화 유닛은 2가이다.
99. 양태 93 내지 96 중의 임의의 접합체로서, 상기 표적화 유닛은 이중특이적이다.
100. 양태 93 내지 99 중의 임의의 접합체로서, 상기 접합체의 평균 약물 로딩(p로드)은 약 1 내지 약 8, 약 2, 약 4, 약 6, 약 8, 약 10, 약 12, 약 14, 약 16, 약 3 내지 약 5, 약 6 내지 약 8, 또는 약 8 내지 약 16이다.
101. 양태 93 내지 100 중의 임의의 접합체로서, 이는 하기로부터 선택된다:
Figure pct00449
Figure pct00450
Figure pct00451
Figure pct00452
여기서 Ab는 표적화 유닛이고 n은 p로드이다.
102. 양태 93 내지 101 중의 임의의 접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
103. 양태 93 내지 101 주의 임의의 접합체 또는 양태 102의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 여기서 대상체는 암 또는 자가면역 질환을 앓고 있고, 상기 접합체는 암 또는 자가면역 질환과 관련된 표적 항원에 결합한다.
본 개시의 양태에 대한 설명은 본 개시를 개시된 정확한 형태로 완전하게 하거나 제한하기 위한 것이 아니다. 본 개시의 구체적인 양태 및 실시예들이 예시적인 목적으로 본원에 설명되어 있지만, 관련 기술의 당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, 본 개시의 범위 내에서 다양한 균등한 변형이 가능하다. 본원에 제공된 본 개시의 교시는 적절하게 다른 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본원에 설명된 다양한 양태들은 결합되어 추가적인 양태를 제공할 수 있다. 본 개시의 측면은, 필요한 경우, 본 개시의 추가 양태를 제공하기 위해 상기 참조 및 적용의 구성, 기능 및 개념을 이용하기 위해 변형될 수 있다. 이러한 변경 및 기타 변경은 상세한 설명에 비추어 본 개시에 이루어질 수 있다.
전술한 양태의 임의의 특정 요소들은 결합되거나 다른 실시예의 요소들로 대체될 수 있다. 또한, 본 개시의 특정 양태와 관련된 이점들이 이들 양태의 맥락에서 설명되었지만, 다른 양태들도 그러한 이점들을 나타낼 수 있으며, 모든 양태들이 반드시 그러한 이점들을 나타내야만 본 개시의 범위 내에 속하는 것은 아니다.
확인된 모든 특허 및 기타 개시물은, 예를 들어, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 그러한 개시물에 기재된 방법론을 설명 및 개시하기 위한 목적으로 본원에 참조로서 명시적으로 통합되어 있다. 이러한 개시들은 본 출원의 출원일 이전 개시된 것만 제공된다. 이와 관련하여 어떠한 내용도 발명자들이 선행 발명 또는 다른 이유로 인해 그러한 개시에 대항할 권리가 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이러한 문서의 날짜 또는 내용에 대한 모든 진술은 출원인이 이용할 수 있는 정보를 기반으로 하며, 이러한 문서의 날짜 또는 내용의 정확성을 인정하는 것으로 간주되지 않는다.
실시예
일반적인 방법
1H NMR 및 기타 NMR 스펙트럼은 Bruker AVIII 400 또는 Bruker AVIII 500에서 기록되었다. 데이터는 Nuts 소프트웨어 또는 MestReNova 소프트웨어로 처리되어 내부 표준 테트라메틸 실란으로부터 다운필드의 양성자 이동을 백만분율(ppm) 단위로 측정했다.
HPLC-MS 측정은 다음 조건을 사용하여 Agilent 1200 HPLC/6100 SQ 시스템에서 실행되었다:
방법 A: 이동상: A: 물(0.01%TFA) B: 아세토니트릴(0.01%TFA); 구배 상: 15분 내에 B의 5%에서 B의 95%로 증가; 유속: 1.0 mL/분; 컬럼: XBridge C18, 4.6*150mm, 3.5um; 컬럼 온도: 40℃. 검출기: ADC ELSD, DAD(214nm 및 254nm), ES-API.
방법 B: 이동상: A: 물(0.01%TFA) B: 아세토니트릴(0.01%TFA); 구배 상: 15분 내에 B의 5%에서 B의 95%로 증가; 유속: 1.0 mL/분; 컬럼: SunFire C18, 4.6*150mm, 3.5μm; 컬럼 온도: 45℃. 검출기: ADC ELSD, DAD(214nm 및 254nm), ES-API.
방법 C: 이동상: A: 물(10mM NH4HCO3) B: 아세토니트릴; 구배 상: 15분 내에 B의 5%에서 95%; 유속: 1.0mL/분; 컬럼: XBridge C18, 4.6*150mm, 3.5μm; 컬럼 온도: 40℃. 검출기: ADC ELSD, DAD(214nm 및 254nm), MSD(ES-API).
LCMS 측정은 다음 조건을 사용하여 Agilent 1200 HPLC/6100 SQ 시스템에서 실행되었다:
방법 A: 이동상: A: 물(0.01%TFA) B: 아세토니트릴(0.01%TFA); 구배 상: 3분 내에 B의 5%에서 B의 95%로 증가; 유속: 1.8 내지 2.3 mL/분; 컬럼: SunFire C18, 4.6*50mm, 3.5μm; 컬럼 온도: 50℃. 검출기: ADC ELSD, DAD(214nm 및 254nm), ES-API.
방법 B: 이동상: A: 물(10mM NH4HCO3) B: 아세토니트릴; 구배 상: 3분 내에 B의 5%에서 95%; 유속: 1.8 내지 2.3 mL/분; 컬럼: XBridge C18, 4.6*50mm, 3.5μm; 컬럼 온도: 50℃. 검출기: ADC ELSD, DAD(214nm 및 254nm), MSD(ES-API).
제조용 고압 액체 크로마토그래피(Prep-HPLC)는 다음 조건을 사용하여 Gilson 281에서 실행되었다:
방법 A: Waters SunFire 10 μm C18 컬럼(100Å, 250 x 19 mm). 용매 A는 물/0.01% 트리플루오로아세트산(TFA)이었고 용매 B는 아세토니트릴이었다. 용출 조건은 30mL/분의 유속으로 20분 동안 용매 B를 5%에서 100%까지 선형 구배 증가시키는 것이었다.
방법 B: Waters SunFire 10 μm C18 컬럼(100Å, 250 x 19 mm). 용매 A는 물/0.05% 포름산(FA)이었고 용매 B는 아세토니트릴이었다. 용출 조건은 30mL/분의 유속으로 20분 동안 용매 B를 5%에서 100%까지 선형 구배 증가시키는 것이었다.
방법 C: Waters Xbridge 10 μm C18 컬럼(100Å, 250 x 19 mm). 용매 A는 물/10 mM 중탄산암모늄(NH4HCO3)이었고 용매 B는 아세토니트릴이었다. 용출 조건은 30mL/분의 유속으로 20분 동안 용매 B를 5%에서 100%까지 선형 구배 증가시키는 것이었다.
Agela 플래시 컬럼 실리카-CS를 사용하여 Biotage 기기에서 플래시 크로마토그래피가 수행되었다; 역상 플래시 크로마토그래피는 Boston ODS 또는 Agela C18을 사용하여 Biotage 기기에서 수행되었다.
실시예 1: 당 유닛의 제조
Figure pct00453
당 유닛은 다음과 같이 제조되었다:
단계 1 물(40 mL) 및에탄올(65 mL) 중의 화합물 L1 (5g, 10.846mmol), D-글루코스(19.54g, 108.460mmol), NaBH3CN(5.45g, 86.768mmol) 및 인산 이수소칼륨(0.379mL, 6.508mmol)의 반응 혼합물을 LCMS에 의해 지시된 바와 같이 반응이 완료될 때까지 N2 하에 50℃에서 36 시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물 L2 (3.5g, 4.649mmol, 42.86%)를 얻었다. LCMS(M+H)+= 753.0;
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.90 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.74 - 7.64 (m, 2H), 7.44 - 7.32 (m, 4H), 4.58 - 4.21 (m, 8H), 4.14 - 3.74 (m, 4H), 3.68 - 3.41 (m, 8H), 2.85 - 2.56 (m, 2H), 1.69 - 1.28 (m, 15H). 13C NMR (100 MHz, DMSO) δ 171.53, 156.10, 143.77, 140.70, 127.62, 127.04, 125.24, 120.10, 80.47, 80.42, 71.66, 71.58, 71.34, 70.18, 65.53, 63.51, 63.36, 54.48, 54.41, 46.63, 27.65, 23.14, 22.38.
단계 2 THF(2 mL) 중의 L2 (200 mg, 0.266 mmol) 용액에 디에틸아민 (38.86 mg, 0.531 mmol)을 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물로부터 샘플을 채취하였고, LCMS 결과는 원하는 생성물이 발견되었고 출발 물질이 완전히 소모되었음을 보여주었다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물 L3 (120mg)을 얻었다. LCMS (M+H)+= 531.1.
실시예 2: PEG 유닛의 제조
Figure pct00454
선형 단당류를 포함하는 PEG 유닛을 다음과 같이 제조했다:
단계 1
아세토니트릴(3.0 mL) 중 화합물 38-1 (260mg, 0.31mmol)의 용액을 실온에서 교반하고 무수 디에틸 아민(0.2mL, 1.941mmol)을 첨가하였다. 용액의 LCMS가 대부분의 출발 물질이 소비되었음을 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축하여 건조시키고 잔류물을 역상 컬럼 크로마토그래피(12g C18 컬럼, 0.01% TFA를 함유한 물 중 0 내지 50% 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 화합물 39-1(170mg, 0.28mmol)의 예상 분획물을 담황색 오일로 얻었다. LCMS, ESI m/z = 618.4 (M+H)+;
단계 2
메탄올(5mL) 중 화합물 39-1 (170mg, 0.28mmol), 39-2(217.08mg, 1.206mmol) 및 아세트산(1.21mg, 0.020mmol)의 투명한 반응 용액을 50℃에서 30분간 가열한 후, NaCNBH3 (75.98 mg, 1.206 mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 N2 하에 50℃에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서, 추가의 NaCNBH3 (75.98 mg, 1.206 mmol) 및 화합물 39-2 (217.08 mg, 1.206 mmol)를 첨가하고 50℃에서 밤새 계속 교반하였다. 20 시간 동안 교반한 후, LCMS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물 39-3 (265 mg, 0.24 mmol)을 얻었다. LCMS, ESI m/z = 1122.6(M+H)+.
단계 3
수성 6N HCl/THF 중 화합물 39-3 (265mg, 0.24mmol)의 혼합물을 LCMS가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 용매를 NaHCO3 수성으로 중화하고, 증발시키고, 그 잔류물을 C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물 39-4 (160mg, 0.17mmol)를 얻었다. LCMS, ESI m/z = 946.5(M+H)+.
실시예 3: MMAE를 함유하는 약물 링커(PB003)의 제조
Figure pct00455
두 개의 당 유닛과 MMAE에 부착된 절단 가능한 링커를 포함하는 약물 링커 (PB003)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
무수 DMF (2 mL) 중의 화합물 8-3 (30 mg, 0.027 mmol), DIPEA(10.45 mg, 0.081 mmol) 용액을 실온에서 교반한 후, 옥솔란-2,5-디온(5.40 mg, 0.054 mmol)을 첨가하였다. 액체 크로마토그래피 질량 분석기(LCMS)가 완전한 반응을 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온(r.t.)에서 추가로 1 시간 동안 교반했다. 혼합물을 역상 액체 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 0.01% TFA를 포함하는 물 중 0 내지 50% 아세토니트릴로 15분에 걸쳐 용출)로 직접 정제하여 화합물 8-3A (25.8mg, 0.021mmol, 78.97%)를 백색 고체로 얻었다. LCMS: 생성물(M/2+H)+= 612.5;
단계 2
DCM (150mL) 중의 화합물 3-1(20.00g, 44.198mmol), 2-메틸프로판-2-올(12.600mL, 132.594mmol), DCC(13.68g, 66.297mmol) 및 DMAP(1.62g, 13.259mmol)의 혼합물을 질소(N2) 하에 실온(r.t.)에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 판단하여 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여액을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻은 후, 이를 실리콘-겔 플래쉬 크로마토그래피(석유에테르: EtOAc = 10:1)로 정제하여 화합물 3-2 (11.80g, 23.200mmol, 52.49%)를 무색 오일로 얻었다.
LCMS (M-56+H)+= 453.1;
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ = 7.89 (d, J=7.5, 2H), 7.72 (d, J=7.5, 2H), 7.65 (d, J=7.8, 1H), 7.44 (t, J=7.4, 2H), 7.35 (d, J=7.1, 2H), 7.20 (t, J=5.3, 1H), 5.94 - 5.76 (m, 1H), 5.27 (dd, J=17.2, 1.6, 1H), 5.16 (dd, J=10.5, 1.4, 1H), 4.45 (d, J=5.3, 2H), 4.32 (dd, J=12.3, 4.8, 2H), 4.26 - 4.20 (m, 1H), 3.84 (d, J=4.9, 1H), 2.97 (dd, J=12.6, 6.4, 2H), 1.66-1.53 (m, 2H), 1.38 (s,9H),1.33-1.29 (m,2H), 1.28 - 1.23 (m, 2H).
단계 3
DCM (20mL) 중 화합물 3-2 (5g, 9.837mmol)의 용액에 Et2NH(4mL, 38.693mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축하고 미정제 화합물 3-3 (2.84g, 9.921mmol, 100%)을 다음 단계에 직접 사용하였다. ESI m/z: 287.3(M+H)+.
단계 4
DMF(15mL) 중 화합물 3-3 (2.84g, 9.917mmol)의 용액에 화합물 3-4 (5.58g, 11.901mmol), DIPEA(2.56g, 19.834mmol) 및 HATU(3.77g, 9.917 mmol)를 첨가하였다. 그 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 농축하고 역상 분리(C18 컬럼, TFA를 포함하는 물 중 0 내지 87% 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 화합물 3-5 (5.2g, 7.056mmol,71.15%)를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 759.4(M+Na)+.
단계 5
DCM (12 mL) 중 화합물 3-5 (5.2g, 7.056mmol)의 용액에 TFA(12mL, 1199.474mmol)를 첨가하였다. 그 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 농축하고 역 컬럼 분리(C18 컬럼, TFA를 포함하는 물 중 0 내지 44% 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 화합물 3-6 (2.4g, 4.133mmol, 58.57%)을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 581.3(M+H)+.
단계 6
EtOH (35 mL) 및 H2O (5 mL) 중의 화합물 3-6 (2.40g, 4.133mmol)의 용액에 D-글루코스(5.93g, 32.919mmol), KH2PO4(0.020mL, 0.344mmol) 및 NaBH3CN(2.08g, 33.099mmol)를 첨가하였다. 그 반응물을 50℃에서 18시간 동안 교반하였다. 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 농축하고 역 컬럼 분리(C18 컬럼, TFA를 포함하는 물 중 0 내지 44% 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 화합물 3-7 (2.0g, 2.200mmol, 53.48%)을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 910.4(M+H)+.
단계 7
DMF(15mL) 중 화합물 3-7 (1.00g, 1.100mmol)의 용액에 HATU(0.50g, 1.320mmol) 및 DIPEA(0.43g, 3.300mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 10분 동안 교반한 후, 화합물 3-8 (0.58g, 1.099mmol)을 첨가하였다. 그 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 농축하고 역상 컬럼 분리(C18 컬럼, TFA를 포함하는 물 중 0 내지 34% 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 화합물 3-9 (0.47g, 0.334mmol, 30.37%)를 얻었다. ESI m/z: 711.5(M/2+H)+.
단계 8
MeCN (0.5mL) 및 물(0.1mL) 중 화합물 3-9 (10mg, 0.007mmol), Pd(PPh3)4(0.41mg, 0.000mmol) 및 디에틸 아민 무수물(0.001mL, 0.014mmol)의 투명한 용액을 N2 하에 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. LCMS는 모든 출발 물질이 소비되었으며 원하는 생성물 질량(LCMS의 단편 질량 669)이 검출되었음을 나타내었다. 혼합물을 역상 액체 크로마토그래피(12g C18 컬럼, 0.01% TFA를 포함하는 물 중 0 내지 35% 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 생성물 3-10을 백색 고체로 산출했다. LCMS: 생성물(M/2+H)+= 669.5; 순도 65%(214nm).
단계 9
무수 DMF (1.8 mL) 중의 화합물 3-10 (27mg, 0.024mmol), 8-3A(54.67mg, 0.048mmol) 및 DIPEA(3.10mg, 0.024mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반하고, 무수 DMF(0.2 mL) 중의 HATU(9.14 mg, 0.024 mmol) 용액을 첨가하였다. LCMS가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 역상 액체 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 0.01% TFA를 포함하는 물 중 0 내지 70% 아세토니트릴로 15분에 걸쳐 용출)로 직접 정제하여 생성물 3-11 (40.5mg, 0.016mmol)을 백색 고체로 산출했다. LCMS(M/3+H)+= 848.5;
단계 10
DMF (0.95 mL) 중 화합물 3-11 (45mg, 0.018mmol) 의 용액을 실온에서 교반하고 디에틸 아민 무수물(0.05mL, 0.485mmol)을 첨가하였다. 첨가 후, 생성된 용액을 실온에서 LCMS가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지 추가로 1시간 동안 계속 교반하였다. 휘발성 물질(특히 DEA)을 증발시켜 미정제 생성물을 얻었고, 역상 액체 크로마토그래피(12g C18 컬럼, 0.01% TFA를 포함하는 물 중 0 내지 50% 아세토니트릴로 15분에 걸쳐 용출)로 직접 정제하여 예상 분획물을 얻었고, 이는 동결건조되여 생성물 3-12 (30mg, 0.013mmol, 73.05%)를 백색 고체로서 얻었다. LCMS(M/3+H)+= 774.4;
단계 11
무수 DMF (0.8 mL) 중의 화합물 3-12 (20 mg, 0.009 mmol) 및 DIPEA(3.34 mg, 0.026 mmol) 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, 무수 DMF(0.2 mL) 중 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)아세테이트 (4.35 mg, 0.017 mmol) 용액을 2분에 걸쳐 적가하였다. 생성된 용액을 추가로 2 시간 동안 실온에서 교반한 다음, LCMS로 모니터링하였다; 원하는 생성물이 반응 생성물의 대부분으로 형성되었다. 반응물을 물 한 방울로 켄칭한 다음 Prep-HPLC(이동상: A: 물(0.01%TFA) B: 아세토니트릴(0.01%TFA); 구배 상: 15분 내에 5% B에서 95%로 증가; 유속: 1.0mL/분, 컬럼: SunFire C18, 4.6*50mm, 3.5μm, 컬럼 온도: 50℃. 검출기: ADC ELSD, DAD(214nm 및 254nm))로 직접 정제하여 생성물 PB003 (7mg, 0.003mmol)을 백색 고체로 얻었다. LCMS(M/3+H)+= 820.1
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.86-9.78 (m, 1H), 8.49-8.31 (m, 3H), 8.26-8.06 (m, 3H), 8.01-7.83 (m,3H), 7.66-7.59 (m, 2H), 7.32-7.25 (m, 6H), 7.20-7.15 (m, 1H),7.09 (s, 1H), 6.05-5.98 (m, 1H), 5.45-5.35 (m,6H), 5.13-4.95 (m, 2H), 4.87-4.71 (m, 4H), 4.71-4.41 (m, 13H), 4.35-4.13 (m, 7H), 4.10-4.04 (m, 2H), 3.99-3.94 (m, 6H), 3.80-3.77 (m, 1H), 3.73-3.69 (m, 4H), 3.67-3.43 (m, 21H), 3.24-3.17 (m, 17H), 3.12-2.97 (m, 7H), 2.89-2.83 (m, 3H), 2.44-2.24 (m, 7H), 2.16-1.91 (m, 5H), 1.84-1.42 (m, 19H), 1.38 (s, 9H), 1.34-1.24 (m, 9H), 1.06-0.98 (m, 6H), 0.89-0.75 (m, 26H) ppm. TFA 두 분자의 양성자 신호가 포함되었다.
실시예 4: 두 개의 당 유닛과 MMAE에 부착된 절단 가능한 링커를 갖는 약물-링커 (PB004)의 제조.
Figure pct00456
당 유닛과 MMAE에 부착된 절단 가능한 링커(PB004)를 포함하는 약물 링커를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
무수 DCM (5 mL) 중의 화합물 8-3A (50mg, 0.041mmol) 및 HOSu(7.05mg, 0.061mmol)의 용액을 상온에서 교반한 후, EDCI(11.75mg, 0.061mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 LCMS가 완전한 반응을 나타낼 때까지 실온에서 추가로 1.5 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 추가의 DCM(10mL)으로 희석하고 물로 세척하였다. 유기층을 수집하고 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 농축하여 건조하여 미정제 NHS에스테르 4-1 (50mg, 0.038mmol, 92.65%)을 백색 고체로 얻었고, 이를 다음 단계에서 직접 사용했다(N200897-071 참조). LCMS(M/2+H)+= 661.0; 순도 = 96%(254nm).
단계 2
이전 단계에서의 미정제 화합물 4-1 (50mg, 0.038mmol)을 무수 DMF(2mL)에 용해시킨 후, DIPEA(14.65mg, 0.114mmol) 및 화합물 4-2 (48.52mg, 0.038mmol)를 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었음을 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 15분에 걸쳐 0.01% TFA를 포함하는 물 중 0 내지 70% 아세토니트릴로 용출)로 직접 정제하여 화합물 4-3 (50mg, 0.020mmol, 53.10%)을 백색 고체로 얻었다. LCMS: m/z = 829.8 (M/3+H)+;
단계 3
아세토니트릴(2mL) 중 화합물 4-3 (50mg, 0.022mmol)의 현탁액을 실온에서 교반하고 물(0.5mL)을 첨가하여 용해도를 개선시켰다. 물질을 투명한 용액에 용해시켰다. 이어서, 디에틸 아민 무수물(0.2 mL, 1.941 mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 LCMS가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음 용액을 농축하여 건조하고 대부분의 디에틸 아민을 제거한 다음 아세토니트릴과 물에 재용해하고 동결 건조하여 미정제 생성물 4-4 (48 mg, 0.021 mmol, 96.94%)를 백색 고체로 얻었으며, 이를 다음 단계에서 직접 사용했다. LCMS: m/z = 739.0(단편 조각 포함, (2263/3) +H =755가 예상됨);
단계 4
무수 DMF (0.8 mL) 중의 화합물 4-4 (47 mg, 0.021 mmol) 및 DIPEA(8.03 mg, 0.062 mmol) 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, 무수 DMF(0.2 mL) 중의 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)아세테이트 (5.23 mg, 0.021 mmol)의 용액을 주사기로 적가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었음을 나타내고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 0.5시간 동안 교반하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었음을 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 Prep-HPLC (20분에 걸쳐 0.01% TFA의 구배로 용출)로 직접 정제하여 생성물 PB004 (10mg, 0.004mmol, 20.06%)를 백색 고체로 얻었다. LCMS: m/z = 801.4 (M/3+H)+;
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.56 (s, 1H), 9.77 (s, 1H), 8.52-8.23 (m, 3H), 8.19-7.84 (m, 6H), 7.67-7.61 (m, 2H), 7.35-7.24 (m, 6H), 7.19-7.13 (m, 1H), 7.09 (s, 2H), 6.05-6.02 (m, 1H), 5.52-5.36 (m, 6H), 5.13-4.94(m,2H), 4.89-4.73 (m, 4H), 4.69-4.36 (m, 13H), 4.29-4.23 (m, 6H), 4.14-4.09 (m, 2H), 4.05-3.93 (m, 6H), 3.79-3.76 (m, 1H), 3.72-3.68 (m, 4H), 3.65-3.43 (m, 21H), 3.24-3.05 (m, 17H), 3.01-2.91 (m, 7H), 2.89-2.83 (m, 3H), 2.44-2.23 (m, 7H), 2.14-1.94 (m, 5H), 1.86-1.41(m, 19H), 1.37-1.20 (m, 9H), 1.05-0.97 (m, 6H), 0.88-0.75 (m, 26H) ppm. TFA 두 분자의 양성자 신호가 포함되었다.
실시예 5: 하나의 당 유닛과 MMAE에 부착된 절단 가능한 링커를 갖는 약물-링커 (PB008)의 제조
Figure pct00457
하나의 당 유닛과 MMAE에 부착된 절단 가능한 링커를 갖는 약물-링커 (PB008)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
DMF (10mL) 중의 화합물 8-1 (155.50mg, 0.203mmol) 의 용액에 HOBt (26.35mg, 0.195mmol) 및 MMAE(140mg, 0.195mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하고, 피리딘(3mL) 및 DIEA 에틸디이소프로필아민 (0.039mL, 0.234mmol)을 0℃에서 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온되도록 하였다. 반응 혼합물을 실온에서 36시간 동안 교반하였다. DIEA와 피리딘을 제거한 후, 잔류물을 Prep-HPLC로 정제하여 원하는 생성물 8-2 (62 mg, 0.045mmol)를 얻었다. LCMS((M+2H)/2)+= 673.4;
단계 2
DMF(0.95mL) 중의 화합물 8-2 (60mg, 0.045mmol)의 용액에 디에틸 아민 무수물(0.05mL, 0.485mmol)을 첨가하였다. 이어서, LCMS가 완전한 탈보호를 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 완성된 반응 용액을 역상 컬럼 크로마토그래피(C18 컬럼, 0.01% TFA를 포함하는 물 중 0 내지 70% 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 화합물 8-3을 함유하는 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결건조하여 화합물 8-3(40mg, 0.036mmol, 79.85%)의 TFA 염을 백색 고체로 얻었다. LCMS(M/2+H)+= 562.5;
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.20 (s, 1H), 8.69 (d, J =7.6 Hz, 1H), 8.30 (brs, 2H), 8.17-8.07 (m, 3H), 7.90 (d, J =8.4Hz, 0.5H), 7.64 (d, J =8.4 Hz, 0.5H), 7.59-7.57 (m, 2H), 7.37-7.24 (m, 6H), 7.20-7.13 (m, 1H), 6.05-6.02 (m, 1H), 5.48 (s, 2H), 5.43-5.34 (m, 1H), 5.12-4.97 (m, 2H), 4.78-4.23 (m, 4H), 4.04-3.93 (m, 2H), 3.80-3.52 (m, 2H), 3.25-3.06 (m, 7H), 2.98-2.83 (m, 10H), 2.43-2.39 (m, 1H), 2.26-2.22(m, 1H), 2.14-1.99(m, 3H), 1.99-1.85 (m, 1H), 1.85-1.67 (m, 4H), 1.67-1.37 (m, 5H), 1.37-1.25 (m, 1H), 1.16 (t, J =7.2 Hz, 3H), 1.05-1.00 (m, 6H), 0.98-0.93 (m, 6H), 0.86-0.73 (m, 17H) ppm.
단계 3
무수 DMF(0.8mL) 중의 화합물 8-3 (17.96mg, 0.026mmol), 화합물 8-4 및 DIPEA(9.99mg, 0.077mmol) 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, 무수 DMF(0.2 mL) 중 HATU(14.71 mg, 0.039 mmol) 용액을 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피(C18 컬럼, 15분에 걸쳐 0.01% TFA를 포함하는 물 중 0 내지 70% 아세토니트릴로 용출)로 직접 정제하여 화합물 8-5 (36.2mg, 0.020mmol, 77.26%)를 백색 고체로서 얻었다. LCMS(M/2+H)+= 902.1; 1H NMR(400MHz, DMSO-d6)
단계 4
DMF (0.95 mL) 중의 화합물 8-5 (50mg, 0.028mmol)의 용액을 실온에서 교반하고 DEA(0.05mL, 0.313mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용액의 LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 완성된 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피(12g C18 컬럼, 15분에 걸쳐 0.01% TFA를 포함하는 물 중 0 내지 60% 아세토니트릴로 용출)로 직접 정제하여 예상 분획물을 얻었고, 이를 동결건조하여 생성물 8-6(35 mg, 0.022 mmol, 79.85%)을 백색 고체로 얻었다. LCMS(M/2+H)+= 790.6;
단계 5
무수 DMF (2 mL) 중의 화합물 8-6 (30 mg, 0.019 mmol), DIPEA(7.35 mg, 0.057 mmol) 용액을 실온에서 교반한 후, 화합물 8-7 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)아세테이트)(9.58 mg, 0.038 mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 추가로 1시간 동안 교반하여 완전한 전환을 달성하였다. 완성된 반응 용액을 Prep-HPLC(이동상: A: 물(0.01%TFA) B: 아세토니트릴(0.01%TFA); 구배 상: 15분 내 5% B가 95% B로 증가; 유속: 1.0mL/분; 컬럼: SunFire C18, 4.6*50mm, 3.5μm; 컬럼 온도: 50℃. 검출기: ADC ELSD, DAD(214nm 및 254nm))로 정제하여 PB008의 TFA 염 (20mg, 0.012mmol, 61.34%)을 백색 고체로 얻었다. LCMS(M/2+H)+= 859.0;
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.03 (s, 1H), 8.42-8.40 (m, 2H), 8.33-8.31 (m, 0.5H), 8.20-8.18 (m, 1H),8.11-8.09 (m, 0.5H), 7.92-7.84 (m,1.5H),7.66-7.63 (m, 0.5H), 7.59-7.56 (m, 2H), 7.36-7.24 (m, 6H), 7.20-7.14 (m,1H),7.10 (s, 2H), 6.06-6.01 (m, 1H), 5.54-5.33 (m, 4H), 5.13-4.95 (m, 2H), 4.87-4.34 (m, 10H), 4.30-4.17 (m,2H), 4.09 (s, 2H), 4.04-3.92 (m, 4H), 3.80-3.77 (m, 0.5H), 3.70-3.65 (m, 2H), 3.61-3.58 (m, 9.5H), 3.33-3.24 (m,2H), 3.23-3.07 (m, 13H), 3.03-2.89 (m, 5H), 2.89-2.83 (m, 3H), 2.44-2.39 (m, 1H), 2.30-2.21 (m, 1H), 2.16-2.05 (m, 2H), 1.99-1.91 (m, 2H), 1.84-1.22 (m, 18H), 1.06-0.97 (m, 6H), 0.89-0.75 (m, 26H) ppm. TFA 한 분자의 양성자 신호가 포함되었다.
실시예 6: 두 개의 당 유닛과 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커를 갖는 약물-링커 (PB026)의 제조
Figure pct00458
두 개의 당 유닛과 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커를 갖는 약물-링커 (PB026)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
DMF (3.6 mL) 중의 화합물 26-1 (475mg, 0.447mmol)의 용액을 실온에서 교반하고 디에틸 아민 무수물(0.4mL, 3.883mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음 용액의 LCMS를 통해 반응이 완료되었음을 확인했다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피(120g C18 컬럼, 0.01% TFA를 포함하는 물 중의 0 내지 80% 아세토니트릴로 15분에 걸쳐 용출)로 직접 정제하여 생성물 26-2 (260mg, 0.309mmol, 69.24%)를 백색 고체로 얻었다. LCMS: m/z = 841.1 (M+H)+
단계 2
무수 DMF(2mL) 중의 화합물 26-2 (150mg, 0.178mmol) 및 옥솔란-2,5-디온(35.70mg, 0.357mmol)의 용액을 실온에서 교반한 후, DIPEA(69.03mg, 0.535) mmol)을 첨가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 완성된 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 0.01% TFA를 포함하는 물 중 0 내지 70% 아세토니트릴로 15분에 걸쳐 용출)로 직접 정제하여 화합물 26-3 (140mg, 0.149mmol, 83.41%)을 백색 고체로 얻었다. LCMS: m/z = 963.5(M+Na)+
단계 3
무수 DMF(1mL) 중의 화합물 26-3 (100mg, 0.106mmol), DIPEA(41.02mg, 0.318mmol) 및 HATU(40.30mg, 0.106mmol)의 용액을 실온에서 10분간 교반한 후, 무수 DMF(1 mL)에 용해된 화합물 4-2 (271.57 mg, 0.212 mmol)의 용액을 주사기로 적가하였다. 첨가 후, 생성된 용액을, LCMS가 출발 산이 거의 소모되고 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 0.01% TFA를 포함하는 물 중 0 내지 70% 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 생성물 26-4 (100mg, 0.045mmol, 42.64%)를 백색 고체로 얻었다. LCMS: ESI m/z = 735.8 (M/2+H)+;
단계 4
아세토니트릴(0.9mL) 중의 화합물 26-4 (100mg, 0.045mmol)의 현탁액에 물(0.9mL)을 첨가하여 대부분의 물질의 용해를 도왔다. 이어서, 디에틸 아민 무수물(0.2mL, 1.941 mmol)을 용액에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이 과정에서, 플라스크 바닥에 끈끈한 기름이 침전되었다. 반응을 LCMS로 모니터링하고 출발 물질이 소비되었으며 원하는 생성물이 주요 피크로 검출되었다. 용액을 농축하여 건조시키고 잔류물을 석유에테르로 세척하여 대부분의 비극성 불순물을 제거하였다. 용해되지 않은 고체를 여과하여 모은 후 아세토니트릴과 물(1:1)에 용해시킨 후 동결건조기에서 동결건조하여 백색 고체로서 화합물 26-5 (60mg, 0.030mmol, 66.72%)를 얻었고 이를 그대로 다음 단계에서 사용하였다.
LCMS: ESI m/z = 661.5(M/3+H)+;
단계 5
무수 DMF(1 mL) 중의 화합물 26-5 (30 mg, 0.015 mmol)와 DIPEA(5.86 mg, 0.045 mmol)의 혼합물을 실온에서 20분간 교반한 후, 고체가 용액에 현탁된 것을 관찰하고, 이후 추가로 DMF(1 mL)를 첨가한 후, 화합물 26-6(7.77 mg, 0.015 mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을, LCMS 및 HPLC에서 출발 아민이 실질적으로 소비되었음을 나타낼 때까지, 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 Prep-HPLC(이동상: A: 물(0.01%FA) B: 아세토니트릴(0.01%FA); 구배 상: 15분 동안 B의 5%에서 B의 95%로 증가; 유속: 1.0 mL/분, 컬럼: SunFire C18, 4.6*50 mm, 3.5 μm, 컬럼 온도: 50℃. 검출기: DAD(214 nm 및 254 nm))로 직접 정제하여 원하는 생성물 PB026 (9.1 mg, 0.004 mmol, 25.26%)을 백색 고체로서 얻었다. LCMS: ESI m/z = 794.3 (M/3+H)+;
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9.73 (s, 1H), 8.38-8.31 (m, 1H), 8.20-8.16 (m, 2H), 8.08-8.00 (m, 4H), 7.89-7.82 (m, 1H), 7.78 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.41-7.35 (m, 2.6H), 7.31 (s, 1H), 7.01-7.00 (m, 1.4H), 6.52 (brs, 1H), 6.09-6.01 (m, 1H), 5.45 (s, 4H), 5.29 (s, 4H), 5.08 (s, 2H), 4.36-4.27 (m, 2H), 4.15-4.12 (m, 1H), 4.09-4.03 (m, 0.5H),3.96-3.88 (m, 1H), 3.88-3.82 (m, 0.5H),3.77-3.70 (m, 1H),3.64-3.57 (m,12H),3.50-3.47 (m, 17H), 3.43-3.40 (m, 10H),3.40-3.22 (m, 11H), 3.16-3.12 (m, 4H),3.05-2.90 (m, 11H), 2.72-2.50 (m, 3H), 2.38-2.31 (m, 11H), 2.24-2.12 (m, 5H), 2.08-1.98 (m, 2H), 1.93-1.87 (m, 2H), 1.84-1.55 (m, 8H), 1.55-1.23 (m, 18H), 1.13-1.07 (m, 2H), 1.01-0.96 (m, 3H), 0.89-0.85 (m, 9H) ppm.
실시예 7: 두 개의 당 유닛과 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커를 포함하는 약물 링커 (PB037)의 제조
Figure pct00459
두 개의 당 유닛과 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커를 포함하는 약물-링커 (PB037)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
TFA (2 mL) 중의 화합물 37-1 (200mg, 0.141mmol)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물의 LCMS는 반응이 완료 되었고 모든 출발 물질이 소비되었으며 원하는 생성물(질량 640 = 1280/2)이 형성되었음을 보여주었다. 반응이 완료된 용액을 농축시켜 건조시킨 후 THF(4 mL)와 물(1 mL)에 재용해시키고, 포화탄산나트륨 수용액으로 처리하여 pH를 8~9로 조절하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하여 완료하였다. 이어서, 용액을 희석된 TFA로 중화시키고 응축시키고, 잔류물을 역상 액체 크로마토그래피(C18 컬럼, 0.01% TFA를 함유한 물 중 0 내지 30% 아세토니트릴로 15분 동안 용출)로 정제하여 예상 생성물 37-2 (180 mg, 0.132 mmol, 93.70%)를 동결건조 후 백색 고체로 얻었다. LCMS, ESI m/z = 683.4 (M/2+H)+;
단계 2
무수 DMF (2 mL) 중의 화합물 37-2 (180 mg, 0.132 mmol), HATU(75.27 mg, 0.198 mmol) 및 DIPEA(51.07 mg, 0.396 mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반하였고, 화합물 37-3(73.86mg, 0.132mmol)을 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 15분에 걸쳐 0.01% TFA를 포함하는 물 중 0-70% 아세토니트릴로 용출)로 직접 정제하여 화합물 37-3 (220mg, 0.118mmol, 89.48%)을 백색 고체로 얻었다. LCMS, ESI m/z = 954.5(M/2+Na)+;
단계 3
무수 아세토니트릴(1 mL) 및 물(1 mL) 중의 화합물 37-3 (220mg, 0.115mmol) 및 Pd(PPh3)4(133.30mg, 0.115mmol)의 용액을 실온에서 교반한 후, 디에틸 아민 무수물(0.024mL, 0.231mmol)을 즉시 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 물질이 소비되었고 원하는 생성물의 질량이 검출됨을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 2시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 감압 하에 농축하여 용매 및 디에틸 아민을 제거하였다. 이어서, 잔류물을 Prep-HPLC(20분에 걸쳐 0.01% TFA의 구배로 용출)로 직접 정제하여 화합물 37-4 (160mg, 0.088mmol, 76.08%)를 백색 고체로 얻었다. LCMS, m/z = 608.6(M/3+H), 912.2(M/2+H)+;
단계 4
무수 용매에 용해된 화합물 37-4 (30.97mg, 0.033mmol), HATU(12.51mg, 0.033mmol) 및 DIPEA(4.25mg, 0.033mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, 화합물 26-1(60mg, 0.033mmol)을 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 0.01% TFA를 함유한 물 중 0 내지 70% 아세토니트릴로 15분에 걸쳐 용출)로 직접 정제하여 화합물 37-5 (40mg, 0.015mmol, 44.26%)를 백색 고체로 얻었다. LCMS, ESI m/z = 916.4(M/3+H)+;
단계 5
CH3CN (1.2 mL) 및 물(0.6 mL) 중의 화합물 37-5 (40mg, 0.015mmol)의 용액을 실온에서 교반한 후, 디에틸 아민 무수물(0.2mL, 0.015mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 LCMS가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지 실온에서 밤새 교반하였다. 용매 및 대부분의 디에틸 아민을 증발시킨 후, 잔류물을 역상 액체 크로마토그래피(12g C18 컬럼, 0.01% TFA를 함유한 물 중의 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 예상 생성물 37-6 (20mg, 0.008mmol, 54.41%)을 백색 고체로 얻었다. LCMS, ESI m/z = 631.8(M/4+H)+, 842.1(M/3+H)+;2524
단계 6
무수 DMF (0.4 mL) 중의 화합물 37-6 (20 mg, 0.008 mmol)과 DIPEA(5.03 mg, 0.039 mmol) 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, 무수 DMF(0.1 mL) 중의 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (5.83 mg, 0.019 mmol)를 주사기로 2분에 걸쳐 적가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 표시할 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 8 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 아세토니트릴에 희석된 포름산을 사용하여 pH 6 내지 7로 조정한 다음, Prep-HPLC(20분에 걸쳐 0.01% FA 구배로 용출)로 직접 정제하여 PB037 (4.8mg, 0.002mmol)을 백색 고체로 생성했다. LCMS, m/z = 725.8 (M/3+H)+;
실시예 8: 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 포함하는 약물-링커 (PB038)의 제조.
Figure pct00460
PEG 유닛 및 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커를 포함하는 약물-링커 (PB038 또는 LD038)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1:
무수 DCM (8 mL) 중의 화합물 38-1 (650mg, 0.774mmol) 및 N-하이드록실석신이미드(HOSu)(177.98mg, 1.548mmol)의 용액을 실온에서 교반한 후, EDCI(296.69mg, 1.548mmol)를 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 물로 세척하고, 유기층을 수집한 후, 수성 상을 DCM(10 mL*2)으로 추출하였다. 조합된 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 여과하고 농축하여 건조시켜 화합물 38-2 (552mg, 0.589mmol, 76.12%)를 무색 오일로 생성하고 그대로 다음 단계에 사용하였다(N200897-136 참조). LCMS: m/z = 959.4(M+Na)+;
단계 2:
무수 DMF(2mL) 중의 화합물 38-2 (300mg, 0.357mmol)과 DIPEA(138.22mg, 1.071mmol)의 용액을 상온에서 교반한 후, 화합물 38-3 (87.97mg, 0.357mmol)을 첨가하고, 출발 아민을 그 용액에 현탁시켰다. 생성된 혼합물을 실온에서 추가로 6시간 동안 계속 교반하였다. 이 기간 동안 출발 아민이 점차적으로 용해되었으며, 현탁액은 투명한 담황색 용액으로 변했다. 반응 용액을 종결시키고 역상 액체 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 0.01% TFA를 포함하는 물 중 0 내지 100% 아세토니트릴로 15분에 걸쳐 용출)로 직접 정제하여 화합물 38-4 (260mg, 0.243mmol, 68.14%)를 담황색 오일로서 얻었다, LCMS ((M-100)/2+H)+= 484.9;
단계 3:
아세토니트릴(1.8mL) 중의 화합물 38-4 (260mg, 0.243mmol)의 용액을 실온에서 교반하고 디에틸 아민 무수물(0.2mL, 1.941mmol)을 첨가하였다. 용액의 LCMS가 대부분의 출발 물질이 소비되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축하여 건조시키고 잔류물을 역상 컬럼 크로마토그래피(12g C18 컬럼, 0.01% TFA를 함유한 물 중 0 내지 50% 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 화합물 38-5 (170mg, 0.201 mmol, 82.54%)의 예상 분획물을 연한 황색 오일로 얻었다. LCMS, ESI m/z = 846.6(M+H)+; 체류 시간(0.01% TFA) = 1.451분; UV 없음.
단계 4:
메탄올(5mL)에 용해된 38-5 (170mg, 0.201mmol), D-글루코스(217.08mg, 1.206mmol) 및 아세트산(1.21mg, 0.020mmol)의 투명한 반응 용액을 50℃에서 30분간 가열한 후, NaCNBH3 (75.98 mg, 1.206 mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 N2 하에 50℃에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서, 추가의 NaCNBH3(75.98 mg, 1.206 mmol) 및 D-글루코스(217.08 mg, 1.206 mmol)를 첨가하고 50℃에서 밤새 계속 교반하였다. 20시간 동안 교반한 후, LCMS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물 38-6 (106mg, 0.090mmol, 44.92%)을 얻었다. LCMS, ESI m/z = 537.9 ((M-100)/2+H)+;
단계 5:
무수 DMF (2 mL) 중의 화합물 38-6 (250mg, 0.213mmol), HATU(121.45mg, 0.319mmol) 및 DIPEA(82.41mg, 0.639mmol)의 용액을 상온에서 5분간 교반한 후, 화합물 38-7 (178.88mg, 0.213mmol)을 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 0.01% TFA를 함유한 물 중의 0 내지 70% 아세토니트릴로 15분에 걸쳐 용출)로 직접 정제하여 화합물 38-8 (270mg, 0.135mmol, 63.48%)을 백색 고체로 얻었다. LCMS, ESI m/z = 666.6(M/3+H)+, 999.2(M/2+H)+;
단계 6:
TFA(2 mL) 중의 화합물 38-8 (120mg, 0.060mmol)의 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물의 LCMS는 반응이 완료되었고 모든 출발 물질이 소비되었음을 나타내었고, 당-에스테르화 생성물 [TFA는 당 유닛의 하이드록시기, 모노에스테르(m/z= (1896+96)/2+H=665, R.T. 1.58분)와 함께 응축되었다]과 함께 원하는 생성물(m/z= 633 = 1896/3+H, R.T. 1.501분)이 형성되었다. 반응이 완료된 용액을 농축하여 건조시킨 후 THF(4 mL)와 물(2 mL)에 재용해시키고 포화탄산나트륨 수용액으로 처리하여 pH를 8~9로 조절하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하여 완전한 가수분해를 달성하였다. 이어서, 용액을 희석된 TFA로 중화시키고 응축시켰다. 잔류물을 역상 액체 크로마토그래피(C18 컬럼, 15분 동안 0.01% TFA를 포함하는 물 중 0 내지 25% 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 예상 생성물 38-9 (80mg, 0.042mmol, 70.19%)를 동결건조 후 백색 고체로 얻었다. LCMS, ESI m/z = 633.2(M/3+H)+, 949.2(M/2+H);
단계 7:
무수 DMF (1 mL) 중의 화합물 38-9 (20mg, 0.011mmol) 및 DIPEA(4.08mg, 0.032mmol)의 용액을 상온에서 5분간 교반한 후, 무수 DMF (1 mL) 중의 화합물 38-10(4.88mg, 0.016 mmol) 용액울 주사기로 2분에 걸쳐 적가했다. 모든 출발 아민이 소비되고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 4시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 포름산으로 중화하여 pH를 6~7로 조정하였다. 이어서, 반응 용액을 Prep-HPLC (20분에 걸쳐 0.01% TFA의 구배로 용출)로 정제하여 PB038 (11mg, 0.005mmol, 49.91%)을 백색 고체로 생성하였다. LCMS, m/z = 697.7 (M/3+H)+;
1HNMR (400MHz, DMSO-d6): δ 10.03 (s, 1H), 8.19-8.11 (m, 2H), 8.07 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.82-7.77 (m, 2H), 7.66 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H),7.00 (s, 2H), 6.53 (s, 1H), 5.99 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.45-5.43 (m, 6H), 5.30-5.24 (m, 3H), 5.08 (s,2H), 4.84-4.74 (m, 2H), 4.65-4.49 (m, 4H), 4.45-4.35 (m, 3H), 4.27-4.17 (m, 2H), 4.04-3.95 (m, 2H), 3.80-3.77 (m, 2H), 3.71-3.67 (m, 2H), 3.62-3.55 (m, 9H), 3.53-3.43 (m, 44H), 3.27-3.21 (m, 2H), 3.16-3.07 (m,2H), 3.07-2.93 (m, 6H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 2.23-2.13 (m, 2H),2.13-2.08 (m, 2H), 2.00-1.82 (m, 4H), 1.73-1.54(m, 4H), 1.54-1.40 (m, 7H), 1.40-1.30 (m, 4H), 1.30-1.14 (m, 5H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm.
실시예 9: 절단 가능한 링커에 부착된 PEG 유닛과 엑사테칸을 함유하는 약물-링커 (PB039)의 제조
Figure pct00461
Figure pct00462
절단 가능한 링커에 부착된 PEG 유닛과 엑사테칸을 함유하는 약물-링커 (PB039)는 다음과 같이 제조되었다:
단계 1
아세토니트릴(3.0mL) 중의 화합물 38-1 (260mg, 0.31mmol)의 용액을 실온에서 교반하고 디에틸 아민 무수물(0.2mL, 1.941mmol)을 첨가하였다. 용액의 LCMS가 대부분의 출발 물질이 소비되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축하여 건조시키고 잔류물을 역상 컬럼 크로마토그래피(12g C18 컬럼, 0.01% TFA를 함유한 물 중 0 내지 50% 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 화합물 39-1 (170mg, 0.28mmol)의 예상 분획물을 담황색 오일로 얻었다. LCMS, ESI m/z = 618.4 (M+H)+;
단계 2
메탄올 (5 mL) 중의 화합물 39-1 (170mg, 0.28mmol), 39-2(217.08mg, 1.206mmol) 및 아세트산(1.21mg, 0.020mmol)의 투명한 반응 용액을 50℃에서 30분간 가열한 후 NaCNBH3 (75.98 mg, 1.206 mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 N2 하에 50℃에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서, 추가의 NaCNBH3 (75.98mg, 1.206mmol) 및 화합물 39-2 (217.08mg, 1.206mmol)를 첨가하고 50℃에서 밤새 계속 교반하였다. 20시간 동안 교반한 후, LCMS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물 39-3 (265mg, 0.24mmol)을 얻었다. LCMS, ESI m/z = 1122.6(M+H)+.
단계 3
수성 6N HCl /THF 중의 화합물 39-3 (265mg, 0.24mmol)의 혼합물을, LCMS가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 용매를 수성 NaHCO3로 중화하고, 증발시키고, 잔류물을 C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물 39-4 (160mg, 0.17mmol)를 얻었다. LCMS, ESI m/z = 946.5(M+H)+.
단계 4
무수 DMF (10 mL) 중의 화합물 39-5 (3.3 g, 4.905 mmol)와 DIPEA(1.90 g, 14.714 mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, PNPC(4.47 g, 14.714 mmol)를 첨가하였다. 생성된 밝은 황색 용액을 실온에서 추가로 1.5시간 동안 교반하여 완료하였다. 생성된 용액을 물로 켄칭하고 용액을 역상 컬럼 크로마토그래피(물 중 0 내지 100% 아세토니트릴로 용출)로 직접 정제하여 화합물 39-6 (1950mg, 2.327mmol)을 황색 고체로 얻었다. LCMS, m/z = 860.4(M+Na)+, 738.4(M-100+H)+;
단계 5
DMF (12 mL) 중의 화합물 39-6 (1.2g, 1.432mmol)의 용액에 DIPEA(0.56g, 4.296mmol), HOBt (0.10g, 0.716mmol) 및 엑사테칸 (0.69g, 1.575mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 역상 분리(C18 컬럼, TFA를 포함하는 물 내에서 0 내지 100% 메탄올로 용출)로 정제하여 화합물 39-7 (1.2g, 1.058mmol)을 얻었다, ESI, m/z: 1135.5(M+H)+
단계 6
DCM (20 mL) 중의 화합물 39-7 (620mg, 0.547mmol)의 용액에 TFA(2mL, 0.555mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 농축하고 역상 분리(C18 컬럼, TFA를 포함하는 물 중 0 내지 50% 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 생성물 화합물 39-8 (409mg, 0.395mmol)을 얻었다. ESI, m/z: 517.9(M/2+H)+.
단계 7
DMF (5 mL) 중의 화합물 39-3 (600mg, 0.254mmol)의 용액에 HATU(97.65mg, 0.254mmol) 및 DIPEA(66.26mg, 0.502mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 그 다음 혼합물을 화합물 39-8 (550mg, 0.232mmol)과 조합하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 농축하고 역상 분리(C18 컬럼, TFA를 포함하는 물 중 0 내지 50% 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 생성물 39-9 (500mg)를 백색 고체로 얻었다. ESI, m/z: 713.5 (M/2+H)+.
단계 8
THF(2 mL) 중의 화합물 39-9 (150mg, 0.070mmol)의 용액에 HCl(2mol/L, 2mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 농축하고 역상 분리(C18 컬럼, TFA를 포함하는 물 중 0 내지 50% 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 생성물 39-10 (100mg, 51mmol)을 백색 고체로 얻었다. 수율 65.69%, 순도=90%. ESI, m/z: 655.1 (M/3+H)+.
단계 9
DMF (2 mL) 중의 화합물 39-10 (350 mg, 0.178 mmol)의 용액에 피페리딘(76 mg, 0.896 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 농축하고 역상 분리(C18 컬럼, TFA를 포함하는 물 중 0 내지 50% 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 생성물 39-11 (160mg, 0.092mmol)을 백색 고체로 얻었다. 수율 = 51.55%. ESI, m/z: 871.0 (M/2+H)+.
단계 10
DMF (2 mL) 중의 화합물 39-11 (160mg, 0.092mmol)의 용액에 DIEA(24mg, 0.184mmol) 및 MC-OSu (56.64mg, 0.184mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 농축하고 역상 분리(C18 컬럼, TFA를 포함하는 물 중 0 내지 50% 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 생성물 PB039 (62 mg)를 백색 고체로 얻었다. 수율=34.88%. LCMS, m/z = 967.2 (M/2+H)+;
1HNMR (400MHz, DMSO-d6): δ 9.96 (s, 1H), 8.04-8.07 (m, 2H), 7.75-7.83 (m, 3H), 7.3 (m, 3H), 6.99 (s, 1H), 6.54 (m, 2H), 5.66 (s, 1H), 5.08-5.28 (m, 3H), 4.51 (m, 2H), 4.14-4.50 (m, 9H), 3.45-3.67 (m, 64H), 1.75-2.75 (m, 19H), 1.73-1.30 (m, 12H), 1.40-1.30 (m, 4H), 1.30-1.14 (m, 5H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm.
실시예 10: 절단 가능한 링커에 부착된 EDTA 및 엑사테칸을 포함하는 약물-링커 (PB040)의 제조
Figure pct00463
절단 가능한 링커의 라이신 잔기에 부착된 EDTA를 함유하는 약물-링커를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
DMF (5 mL) 중의 화합물 40-1 (31 mg, 0.034 mmol)의 용액에 DIPEA(13.18 mg, 0.102 mmol) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (20.96mg, 0.068mmol)를 첨가했다. 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 pH 6으로 조정하고 역상 분리(C18 컬럼, TFA를 포함하는 물 중 0 내지 60% 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 생성물 40-2 (25.4mg, 0.023mmol, 67.61%)를 얻었다, m/z: 1106.4(M+H)+.
단계 2
DCM (7 mL) 중의 화합물 40-2 (83 mg, 0.075 mmol)의 용액에 TFA(0.5 mL, 0.031 mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 농축하고 역상 분리(C18 컬럼, TFA를 포함하는 물 중 0 내지 30% 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 화합물 40-3 (34mg, 0.034mmol, 45.04%)을 얻었다. m/z: 503.4(M/2+H)+.
단계 3
DMF(3 mL) 중 4-[2-(2,6-디옥소모르폴린-4-일)에틸]모르폴린-2,6-디온(0.037 mL, 0.209 mmol)의 용액에 화합물 40-3 (21mg, 0.021mmol) 및 DIPEA(5.40mg, 0.042mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 역상 분리(C18 컬럼, TFA를 포함하는 물 중 0 내지 45% 아세토니트릴로 용출)로 정제하여 생성물 PB040 (10.8mg, 0.008mmol, 40.40%)을 얻었다. m/z: 640.4(M/2+H)+.
실시예 11: 두 개의 당 유닛 및 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커를 포함하는 약물-링커 (PB041)를 다음과 같이 제조했다:
Figure pct00464
말레이미딜카프로일 스트레처 유닛은 다음과 같이 약물-링커 중간체에 부착되었다:
무수 DMF (0.4mL) 중의 화합물 26-5 (25 mg, 0.013 mmol) 및 DIPEA(5.03 mg, 0.039 mmol) 용액을 실온에서 5분간 교반한 다음, 무수 DMF (0.1mL) 중의 화합물 41-1 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트)(5.83mg, 0.019mmol)의 용액을 2분에 걸쳐 주사기에 의해 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 8시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 아세토니트릴 중 희석된 포름산을 사용하여 pH 6~7로 조정한 다음, Prep-HPLC (20분에 걸쳐 0.01% FA 구배로 용출)로 직접 정제하여 PB041 (5.8mg, 0.003mmol, 21.14%)을 백색 고체로 얻었다.
LCMS, m/z = 725.8 (M/3+H)+;
1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 9.72 (s, 1H), 8.31-8.15 (m, 3H), 8.09-8.04 (m, 2H), 7.98-7.96 (m, 1H),7.96-7.86 (m, 1H), 7.78 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H),7.00 (s,2H), 6.54 (s, 1H), 6.09-6.02 (m, 1H), 5.47-5.45 (m, 4H), 5.30-5.29 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.36-4.23 (m,3H), 4.18-4.13 (m, 1H), 4.13-4.08 (m, 0.5H), 3.92-3.80 (m, 1H), 3.74-3.69 (m, 1H), 3.67-3.56 (m, 10H), 3.05-2.88 (m, 15H), 2.64-2.59 (m, 1H), 2.36-2.33 (m, 12H), 2.24-1.97 (m, 14H), 1.91-1.82 (m, 5H), 1.78-1.61(m,14H), 1.53-1.34 (m, 15H), 1.34-1.11 (m, 17H), 0.89-0.86 (m, 11H) ppm. 19F NMR (400MHz, DMSO-d6): δ -111 ppm.
실시예 12: 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 포함하는 약물-링커 (PB050)의 제조는 다음과 같이 제조되었다:
Figure pct00465
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 포함하는 약물-링커 (PB050)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
무수 DMF (1.5 mL) 중의 화합물 50-1 (56.74 mg, 0.134 mmol), HATU(60.99 mg, 0.160 mmol) 및 DIPEA(51.73 mg, 0.401 mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 후, 화합물 39-2 (150mg, 0.134mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을, LCMS가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지, 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 15분에 걸쳐 0.01% TFA를 포함하는 물 중 0 내지 70% 아세토니트릴로 용출)로 직접 정제하여 화합물 50-2 (130mg, 0.085mmol, 수율=63.62%)를 백색 고체로 얻었다. LCMS, ESI m/z = 763.8 (M/2+H)+
단계 2
DCM(0.7mL) 중의 화합물 50-2 (130mg, 0.085mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 후, TFA(0.3mL, 4.039mmol)를 첨가하였다. LCMS가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 진공 하에 농축하여 건조시킨 후, 잔류물을 역상 컬럼 크로마토그래피(20분에 걸쳐 0.01% FA 구배로 용출)로 직접 정제하여 화합물 50-3 (60mg, 0.046mmol, 54.43%)을 백색 고체로 얻었다. LCMS, m/z = 725.8 (M/3+H)+;
1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 9.72 (s, 1H), 8.31-8.15 (m, 3H), 8.09-8.04 (m, 2H), 7.98-7.96 (m, 1H), 7.96-7.86 (m, 1H), 7.78 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H),7.00 (s,2H), 6.54 (s, 1H), 6.09-6.02 (m, 1H), 5.47-5.45 (m, 4H), 5.30-5.29 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.36-4.23 (m,3H), 4.18-4.13 (m, 1H), 4.13-4.08 (m, 0.5H), 3.92-3.80 (m, 1H), 3.74-3.69 (m, 1H), 3.67-3.56 (m, 10H), 3.05-2.88 (m, 15H), 2.64-2.59 (m, 1H), 2.36-2.33 (m, 12H), 2.24-1.97 (m, 14H), 1.91-1.82 (m, 5H), 1.78-1.61(m,14H), 1.53-1.34 (m, 15H), 1.34-1.11 (m, 17H), 0.89-0.86 (m, 11H) ppm.
단계 3
무수 DMF(1mL) 중의 화합물 50-3 (59mg, 0.046mmol), HATU(20.76mg, 0.055mmol) 및 DIPEA(17.61mg, 0.137mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, 화합물 50-4 (41.51 mg, 0.046 mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을, LCMS가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지, 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 15분에 걸쳐 0.01% TFA를 포함하는 물 내에서 0 내지 50% 아세토니트릴로 용출)로 직접 정제하여 화합물 50-5 (40mg, 0.018mmol, 40.12%)를 백색 고체로 얻었다. LCMS, m/z = 697.6 ((M-100)/2+H)+; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.02 (s, 1H), 8.20-8.14 (m, 1H), 8.14-7.98 (m, 2H), 7.88 (d,J = 7.6 Hz, 2H), 7.82-7.70 (m, 5H), 7.64-7.52 (m, 4H), 7.43-7.31 (m, 7H), 6.78-6.72 (m, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.45-5.44 (m, 4H), 5.34-5.23 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.82-4.77 (m, 2H), 4.62-4.36 (m, 6H), 4.36-4.16 (m,6H), 4.05-3.95 (m, 3H), 3.81-3.73 (m, 2H), 3.73-3.66 (m, 2H), 3.62-3.56 (m, 9H), 3.56-3.34 (m, 50H), 3.05-3.01(m, 2H), 2.95-2.84 (m, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.19-2.10 (m, 2H), 2.01-1.93 (m,1H), 1.90-1.83 (m, 2H), 1.71-1.48 (m, 4H), 1.40-1.23 (m, 18H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm. TFA의 양성자 신호 1개가 포함되어 있다. 19F NMR (400 MHz, DMSO-d6), -73 ppm에서 δ TFA, -111 ppm에서 Ar-F
단계 4
CH3CN(2mL) 및 물(1mL) 중의 화합물 50-5 (40mg, 0.018mmol)의 용액을 실온에서 교반하고, 디에틸 아민 무수물(0.002mL, 0.018mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을, LCMS가 완전한 반응을 나타낼 때까지, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 모든 용매를 증발시켜 미정제 고체를 얻었고, 이를 추가 아세토니트릴에 현탁시키고 다시 증발시켜 디에틸 아민을 완전히 제거했다. 이어서, 잔류물을 아세토니트릴 및 물에 용해시키고, 포름산을 사용하여 pH 2~3으로 산성화시키고 1시간 동안 방치하였다; LCMS는 모든 락톤 고리가 다시 닫혔음을 나타내었다. 이어서, 용액을 밤새 동결건조시켜 생성물 화합물 50-6 (36mg, 0.018mmol, 100.17%)을 담황색 고체로서 얻었다. 이 화합물을 어떠한 정제도 없이 다음 단계에 그대로 사용하였다. LCMS: (미정제, 포름산 처리, m/z = 656.9(M/3+H)+, 984.6(M/2+H)+;
단계 5
무수 DMF(0.8 mL) 중의 화합물 50-6 (35.43 mg, 0.018 mmol) 및 DIPEA(6.97 mg, 0.054 mmol) 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, 무수 DMF(0.2 mL) 중의 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트(8.32 mg, 0.027 mmol)의 용액을 주사기로 적가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었음을 나타내고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 포름산을 사용하여 pH 3~4로 산성화한 후 역상 플래쉬 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 20분에 걸쳐 0.01% TFA를 포함하는 물 중에서 0 내지 70% 아세토니트릴로 용출)로 직접 정제하여 원하는 분획물을 얻었으며, 이를 동결건조하여 백색 고체의 화합물 50-7 (28mg, 0.013mmol, 71.96%)을 얻었다. LCMS, m/z =687.9 ((M-100)/3+H)+;
단계 6
DCM (4 mL) 중의 화합물 50-7 (25mg, 0.012mmol)의 용액에 TFA(1mL, 13.463mmol)를 첨가한 후, LCMS가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TFA 및 DCM을 감압 하에 증발시킨 다음, 잔류물을 Prep-HPLC (15분에 걸쳐 0.01% TFA를 포함하는 물 중 0 내지 100% 아세토니트릴로 용출)로 정제하였고 예상 분획물을 동결건조하여 생성물 PB050을 백색 고체로 얻었다. LCMS, ESI m/z = 516.3(M/4+H)+, 687.9(M/3+H)+; 1H NMR(400MHz, DMSO-d6):
δ 10.06 (s, 1H), 8.16 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.84-7.80 (m, 2H), 7.77 (brs, 3H), 7.66-7.59 (m, 3H), 7.37 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.54 (s, 1H), 6.24 (s,4H), 5.45 (s, 2H), 5.35-5.24 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.86-4.43 (m, 5H), 4.43-4.32 (m, 1H), 4.25-4.12 (m,2H), 4.02-3.94 (m, 2H), 3.79-3.73 (m, 2H), 3.69-3.67 (m, 2H), 3.59-3.58 (m, 1H), 3.57-3.55 (m, 9H),3.55-3.47 (m, 52H), 3.04-2.95 (m, 2H), 2.81-2.73 (m, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.23-2.02 (m,5H), 2.03-1.93 (m, 2H), 1.93-1.83 (m, 3H), 1.76-1.67 (m, 1H), 1.59-1.43 (m, 10H), 1.39-1.24 (m, 6H), 1.24-1.15 (m, 5H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm. 19F NMR (400MHz, DMSO-d6): -111 ppm
실시예 13: 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 포함하는 약물-링커 (PB082)의 제조.
Figure pct00466
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 포함하는 약물-링커 (PB082)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
무수 DMF (3 mL) 중의 화합물 82-1 (173.53 mg, 0.242 mmol), HATU(110.30 mg, 0.290 mmol) 및 DIPEA(93.55 mg, 0.725 mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 후, 화합물 39-7(250mg, 0.242mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을, LCMS가 반응 완료를 나타낼 때까지, 실온에서 추가로 2 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 15분에 걸쳐 0.01% TFA를 포함하는 물 중 0 ㄴ내지 70% 아세토니트릴로 용출)로 직접 정제하여 화합물 82-2 (270mg, 0.156mmol, 64.41%)를 연한 황색 고체로 얻었다.
단계 2
DCM (4 mL) 중의 화합물 82-2 (870mg, 0.502mmol)의 용액을 실온에서 교반한 후, TFA(1mL, 13.463mmol)를 첨가하고, 그 연황색 용액을 용액의 LCMS가 탈보호가 완료되었음을 나타낼 때까지 1시간 동안 교반하였다. 용매 및 TFA를 증발시킨 후, 잔류물을 역상 액체 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 0.01% TFA를 포함하는 물 중 0 os지20% 아세토니트릴로 10분 동안 용출)로 직접 정제하여 예상 분획물을 얻었으며, 이를 동결-건조하여 화합물 82-3 (650mg, 0.398mmol, 79.29%)을 백색 고체로서 얻었다. LCMS, m/z = 545.5(M/3+H)+, 817.6(M/2+H)+;
단계 3
메탄올(6 mL) 중의 화합물 82-3 (220mg, 0.213mmol) 및 (2S,3S,4S,5R)-2,3,4,5-테트라하이드록시-6-옥소헥산 산(123.90mg, 0.638mmol)의 혼합물을 50℃에서 8 시간 동안 가열하여 완전한 전환을 달성하였다. 이어서, 현탁액을 농축하여 메탄올을 제거하고, 잔류물을 DMF에 용해시키고, 역상 컬럼 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 10mM 중탄산암모늄이 함유된 물 중에서 0 내지 50% 아세토니트릴로 15분에 걸쳐 용출)로 정제하여 원하는 분획물을 수집하고, 이를 동결건조하여 백색 고체로서 생성물 82-4를 얻었다. LCMS, m/z= 604.2(M/3+H)+, 905.6 (M/2+H)+,
단계 4
DMF (0.9 mL) 중의 화합물 82-4 (100mg, 0.055mmol)의 용액을 실온에서 교반하고 무수 디에틸 아민(0.1mL, 0.971mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 대부분의 디에틸 아민 및 기타 휘발성 물질을 증발시킨 다음, 잔류물을 포름산을 사용하여 pH 3~4로 산성화하고, 이후 역상 플래시 크로마토그래피(0.01% TFA를 포함하는 물 중의 0 내지 40% 아세토니트릴)로 정제하여 예상 화합물 82-5 (35mg, 0.022mmol, 39.90%)를 백색 고체로서 얻었다. LCMS, m/z = 794.5(M/2+H)+, 530.2(M/2+H)+;
단계 5
무수 DMF (1 mL) 중의 화합물 82-5 (150mg, 0.083mmol) 및 DIPEA(8.53mg, 0.066mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, 무수 DMF(1 mL) 중의 MC-OSu (10.20mg, 0.033mmol)의 용액을 주사기로 적가했다. 생성된 용액을, 약간의 부산물과 함께 원하는 생성물이 새로운 주요 피크로 검출되었음을 나타낼 때까지, 실온에서 추가로 6시간 동안 교반했다. 생성된 용액을 포름산에 의해 pH 3~4로 산성화한 후 Prep-HPLC (20분에 걸쳐 0.01% TFA의 구배로 용출)로 직접 정제하여 생성물 PB082 (10mg, 0.006mmol, 25.52%)를 백색 고체로 얻었다.
LCMS, m/z = 594.5(M/3+H)+,891.3(M/2+H)+891.3(M/2+H)+
1H NMR: (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.96 (s, 1H), 8.07-8.02 (m, 2H), 7.83-7.81 (m, 2H), 7.77 (d,J = 10.5 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 6.99 (s, 2H), 6.67 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.84-5.79 (m, 1H), 5.45 (s, 2H), 5.33- 5.23 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.35-4.24 (m,2H), 4.18-4.13 (m, 1H), 4.10-4.04 (m, 1H), 3.92-3.91 (m, 1H), 3.73-3.67 (m, 2H), 3.58-3.54 (m, 6H), 3.52-3.45 (m, 44H), 3.21-3.09 (m, 6H), 3.03-2.99 (m, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.28 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.21-2.08 (m, 4H), 2.00-1.90 (m, 1H),1.90-1.82 (m, 2H),1.74-1.65(m, 1H),1.65-1.57 (m,1H),1.52-1.45 (m, 4H), 1.45-1.27 (m, 5H), 1.24-1.15 (m, 2H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm.
실시예 14: 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 포함하는 약물-링커 (PB083)의 제조.
Figure pct00467
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 포함하는 약물-링커 (PB083)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
무수 DMF (3 mL) 중의 화합물 38-3 (0.190 mL, 0.499 mmol), HATU(284.86 mg, 0.749 mmol) 및 DIPEA(193.29 mg, 1.498 mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, 무수 DMF(2 mL) 중의 화합물 38-7 (420 mg, 0.499 mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을, LCMS가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지, 실온에서 추가로 1.5 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 15분에 걸쳐 0.01% TFA 포함하는 물 중에서 0 내지 100% 아세토니트릴로, 이어서 5분 동안 100% 메탄올로 용출)로 직접 정제하여 화합물 83-1 (330mg, 0.256mmol, 51.16%)을 연한 황색 고체로 얻었다. LCMS, m/z = 596.4 ((M-100)/2+H.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.05 (s, 1H), 8.14 (d, J = 7.6Hz, 1H), 8.06 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.89 (d, J =7.6 Hz, 2H), 7.78 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 7.73-7.71 (m, 3H), 7.60 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.53(d, J = 8.4 Hz,1H), 7.43-7.31 (m, 8H), 6.81-6.73 (m, 1H), 6.03-5.93 (m, 1H), 5.54-5.37 (m, 3H), 5.37-5.24 (m, 3H), 5.08 (s,2H), 4.44-4.34 (m, 1H), 4.34-4.23 (m, 4H), 4.06-3.97 (m, 1H), 3.29-3.13 (m, 1H), 3.13-2.98 (m, 2H), 2.98-2.81 (m, 3H), 2.38 (s, 3H), 2.26-2.17 (m, 2H), 2.09-1.96 (m, 1H), 1.96-1.73 (m, 2H), 1.67-1.54 (m, 3H), 1.45-1.23 (m,17H), 0.89-0.81 (m, 9H) ppm.
단계 2
DCM (4 mL) 중의 화합물 83-1 (330mg, 0.256mmol)의 용액에 TFA(1mL, 6.228mmol)를 첨가하고, 용액의 LCMS가 반응이 완료되었음을 나타날 때까지 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 증발시킨 후, 잔류물을 역상 액체 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 0.01% TFA를 포함하는 물 중 0 내지 40% 아세토니트릴로 10분 동안 용출)로 정제하여 생성물 화합물 83-2 (300mg, 0.252mmol, 98.55%)을 연한 황색 고체로 얻었다. LCMS, m/z = 596.3(M/2+H)+;
단계 3
무수 DMF (1.5 mL) 중의 화합물 82-1 (180.77mg, 0.252mmol), HATU(114.90mg, 0.302mmol) 및 DIPEA(97.45mg, 0.755mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, 무수 DMF(0.5 mL) 중의 화합물 83-2 (300 mg, 0.252 mmol)의 용액을 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 0.01% TFA를 포함하는 물 내에서 0 내지 80% 아세토니트릴로 15분에 걸쳐 용출)로 직접 정제하여 화합물 83-3 (270mg, 0.143mmol, 56.70%)을 백색 고체로 얻었다. LCMS: m/z= 946.1 (M/2+H)+;
단계 4
DCM (8 mL) 중의 화합물 83-3 (450 mg, 0.238 mmol)의 용액을 실온에서 교반한 다음, TFA(2 mL, 26.925 mmol)를 그 용액에 첨가하였다. 생성된 황색 용액을 1시간 동안 교반하여 완전한 탈보호를 달성하였다. 완성된 용액을 농축하여 DCM 및 TFA를 제거한 후, 갈색 잔류물을 역상 액체 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 0.01% TFA가 포함된 물 중에서 0 내지 50% 아세토니트릴로 15분 동안 용출)로 정제하여 예상 생성물 화합물 83-4를 백색 고체로 얻었다. LCMS, m/z =597.8(M/3+H)+, 896.6(M/2+H)+;
단계 5
메탄올(5 mL) 중의 화합물 83-4 (250 mg, 0.140 mmol), 화합물 83-5 (81.30 mg, 0.419 mmol), HOAc(0.025 mL, 0.140 mmol)의 반응 혼합물을 N2 하에서 50℃에서 18시간 동안 교반하였다. 그런 다음 LCMS는 대부분의 화합물 83-5가 소비되었으며 원하는 생성물이 검출되었음을 나타내었다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 원하는 화합물 83-6 (100mg, 0.051mmol, 36.42%)을 얻었다. LCMS, m/z =656.3(M/3+H)+, 983.8(M/2+H)+;
단계 6
DMF (0.9 mL) 중의 화합물 83-6 (100mg, 0.051mmol)의 용액을 실온에서 교반하고 무수 디에틸 아민(0.1mL, 0.971mmol)을 첨가하였다. LCMS가 반응이 완료되고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, 미정제 생성물을 역상 액체 크로마토그래피(40g C18 컬럼, 0.01% TFA를 함유한 물 중에서 0 내지 50% 아세토니트릴로 15분 동안 용출)로 정제하여 예상 생성물 화합물 83-7을 백색 고체로 얻었다. LCMS, m/z=582.5 (M/3+H)+;
단계 7
무수 DMF (2 mL) 중의 화합물 83-7 (50 mg, 0.029 mmol) 및 DIPEA(11.09 mg, 0.086 mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, 무수 DMF (2 mL) 중의 MC-OSu (13.25 mg, 0.043 mmol)을 주사기로 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 6 시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 포름산을 첨가하여 pH 3~4로 산성화시킨 후, Prep-HPLC (20분에 걸쳐 0.01% TFA의 구배로 용출)로 직접 정제하여 생성물 PB083 (21mg, 0.011mmol, 37.81%)을 백색 고체로 얻었다. 단단한. LCMS, m/z = 485.7(M/4+H)+, 646.9(M/3+H)+
1H NMR: δ 10.04 (s, 1H), 8.14-8.05 (m, 2H), 7.96 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.83-7.76 (m, 2H), 7.67 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.60(d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 6.99 (s, 2H), 6.53 (brs, 1H), 6.05-5.97 (m, 1H), 5.45-5.43 (m, 4H), 5.34-5.24 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.43-4.32 (m, 1H), 4.27-4.17 (m, 3H), 4.05-4.02 (m, 1H), 3.87-3.80 (m, 1H), 3.71-3.64 (m, 2H), 3.57-3.47 (m, 53H), 3.16-3.06 (m, 2H), 3.06-2.92 (m, 6H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.24-2.11 (m, 4H), 2.03-1.83 (m, 4H),1.74-1.56 (m, 3H),1.50-1.35 (m, 9H), 1.35-1.14 (m, 5H), 0.89-0.81 (m, 9H) ppm.
실시예 15: MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 포함하는 약물-링커 (PB084)의 제조.
Figure pct00468
MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 포함하는 약물-링커 (PB084)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
무수 DMF(1 mL) 중의 화합물 84-1 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트(84-1, 500mg, 0.445mmol)), 화합물 84-2 ((2S)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산 산 (84-2, 522.71mg, 0.445mmol)) 및 DIPEA(172.31mg, 1.336)의 용액을 실혼에서 교반한 후, 무수 DMF(1 mL) 중의 HATU (169.29 mg, 0.445 mmol)의 용액을 주사기로 5분에 걸쳐 적가하였다. 첨가 후, 생성된 용액을, LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지, 추가로 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 완성된 반응 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 화합물 84-3 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (84-3, 600mg, 0.263mmol, 59.11%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 760.8 (M/3+H)+.
단계 2
에탄올 (3 mL) 중의 화합물 84-3 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S) -1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (84-3, 580mg, 0.254mmol))의 용액에에탄올 (3mL, 0.254mmol) 중의 2M HCl을 첨가하였다. 이어서, 생성된 담황색 용액을, LCMS가 출발 물질이 실질적으로 소비되었음을 나타낼 때까지, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 완성된 용액을 얼음물에서 냉각시키고 중탄산나트륨 수용액으로 중화시켰다. 용매를 감압 하에 제거하고 물 층의 잔류물을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 84-4 {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (84-4, 300mg, 0.138mmol, 54.20%)를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 727.3 (M/3+H)+, 718.3 (단편 조각, MMAE), 473.5 (링커 단편, ((2178-717-28-18)/3+H)+). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.11 (s, 1H), 8.97-8.80 (m, 1H), 8.43 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.32 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.24-8.06 (m, 4H), 7.96-7.86 (m, 1.5H), 7.66 (d, J = 8.8 Hz, 0.5H), 7.58 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.35-7.24 (m, 6H), 7.18-7.16 (m, 1H), 6.07(s, 1H), 5.55-5.32 (m, 4H), 5.12-4.95 (m, 2H), 4.87-4.37(m, 9H), 4.29-4.23(m, 2H), 4.04-3.93 (m, 4H), 3.88-3.84 (m, 1H), 3.82-3.77 (m, 2H), 3.69-3.67 (m, 2H), 3.62-3.56 (m, 8H), 3.53-3.46 (m, 44H), 3.30-3.12 (m, 14H), 3.03-2.83 (m, 10H), 2.46-2.39 (m, 1H), 2.32-2.23 (m, 3H), 2.15-1.85 (m, 5H), 1.85-1.55 (m, 6H), 1.55-1.24 (m, 11H), 1.06-0.97 (m, 8H), 0.92-0.75 (m, 29H) ppm. TFA 상의 카르복실기의 두 양성자가 밝혀졌다.
단계 3
무수 DMF(4 mL) 중의 화합물 84-4 {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트(84-4, 200mg, 0.092mmol) 및 화합물 84-5 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (84-5, 42.39 mg, 0.138 mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, DMF(1 mL) 중의 DIPEA(23.67 mg, 0.184 mmol)의 용액을 주사기로 5분에 걸쳐 적가했다. 첨가 후, 생성된 용액을 LCMS가 출발 아민이 실질적으로 소모되었음을 나타낼 때까지 추가로 4시간 동안 교반하였다. 그런 다음 반응 용액을 Prep-HPLC(0.01% FA)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 PB084 ({4-[(2S)-5-(카르바모일아미노)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (PB084, 120mg, 0.051mmol, 55.11%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 1187.2 (M/3+H)+, 791.7 (M/3+H)+, 718.5 (단편 조각, MMAE), 538.2 (링커 단편, (M-717-28-18)/3+H)+). 체류 시간 6.558 분 (HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.04 (s, 1H), 8.36-8.28 (m, 0.5 H), 8.13 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 8.13-8.06 (m, 0.5H), 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.4 Hz, 0.5H), 7.84-7.80 (m, 1H), 7.68-7.65 (m, 1.5H),　7.59-7.56 (m, 2H), 7.34-7.24 (m, 6H), 7.20-7.16 (m, 1H), 6.99 (s, 2H), 5.99(d, J = 5.6 Hz, 1H), 5.44-5.43 (m, 3H), 5.37 (d, J = 4.8 Hz, 0.5H), 5.12-4.95 (m, 2H), 4.78-4.40 (m, 12H), 4.35-4.17 (m, 3.5H), 4.04-3.91 (m, 3H), 3.79-3.55 (m, 12H), 3.54-3.46 (m, 48H), 3.35-3.11 (m, 14H), 3.06-2.83 (m, 10H), 2.43-2.39 (m, 1H), 2.31-2.22 (m, 3H), 2.14-1.16　(m, 30H), 1.05-0.97 (m, 6H), 0.89-0.75 (m, 27H) ppm.
실시예 16 : SN-38에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 포함하는 약물-링커 (PB085)의 제조.
Figure pct00469
SN-38에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 포함하는 약물-링커 (PB085)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
무수 DMF(4mL) 중의 화합물 85-1 ((19S)-10,19-디에틸-7,19-디하이드록시-17-옥사-3,13-디아자펜타사이클로[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]헤니코사-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-헵타엔-14,18-디온(SN-38)(85-1, 460mg, 1.173mmol)) 및 DIPEA(302.76mg, 2.347mmol)의 연한 황색 혼합물을 실온에서 교반하고, 무수 DMF(2mL) 중의 비스(4-니트로페닐)카르보네이트(PNPC, 356.73mg, 1.173mmol)의 용액을 10분에 걸쳐 적가했다. 첨가 시, 담황색(pale yellow) 혼합물이 밝은 황색(light yellow) 혼합물로 변하였고, 반응이 진행됨에 따라 물질은 천천히 용해되었다. 첨가 후, 생성된 황색 투명 용액을 실온에서 추가로 30분 동안 교반한 다음 LCMS로 모니터링했다. 스펙트럼은 출발 물질 SN-38의 완전한 소비를 나타냈으며, 원하는 페놀 활성화 생성물이 부산물인 알코올 활성화 탄산염과 함께 새로운 주요 피크로 형성되었다. 반응 용액은 다음 단계에 직접 사용되었다. ESI m/z = 558.2(M+H)+.
단계 2
이전 단계의 미정제 활성화 카르보네이트(85-2A, 85-2B, 85-2C의 혼합물)의 DMF 용액을 화합물 85-3 (tert-부틸 N-메틸-N-[2-(메틸아미노)에틸]카르바메이트 (85-3, 264.63mg, 1.408mmol)) 및 DIPEA(302.63mg, 2.346mmol)로 처리했다. 반응 용액을 1시간 동안 교반한 후, LCMS는 완전한 전환을 나타내었다. 원하는 생성물 85-4와 SN-38이 모두 감지되었다. 반응 용액을 역상 플래시 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 생성물 85-4 ((19S)-10,19-디에틸-19-하이드록시-14,18-디옥소-17-옥사-3,13-디아자펜타사이클로[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]헤니코사-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-헵타엔-7-일 N-(2-{[(tert-부톡시)카르보닐](메틸)아미노}에틸)-N-메틸카르바메이트 (85-4, 467 mg, 0.771 mmol, 65.70%))를 담황색 고체로 얻었다. ESI m/z : 607.3 (M+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.10-10.01 (m, 1H), 8.18 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.10 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.93-7.86 (m, 3H), 7.73 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.62-7.52 (m,3H), 7.43-7.26 (m,8H), 6.52 (s, 1H), 5.97 (s, 1H), 5.45-5.34 (m, 5H), 5.09-5.00 (m, 2H), 4.44-4.40 (m, 1H), 4.32-4.22 (m, 3H), 3.93 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 3.65-3.50 (m, 7H), 3.19-3.12 (m, 2H), 3.04-2.89 (m, 7H), 2.02-1.914 (m, 1H), 1.91-1.74 (m, 2H), 1.74-1.52 (m, 2H), 1.52-1.36 (m, 2H), 1.36-1.26 (m, 2H), 0.91-0.84 (m, 9H) ppm.
단계 3
DCM(1.8mL) 중 화합물 85-4 ((19S)-10,19-디에틸-19-하이드록시-14,18-디옥소-17-옥사-3,13-디아자펜타사이클로[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]헤니코사-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-헵타엔-7-일 N-(2-{[(tert-부톡시)카르보닐](메틸)아미노}에틸)-N-메틸카르바메이트(85-4, 600mg, 0.990mmol))를 실온에서 교반한 후, TFA(0.2mL, 2.693mmol)를 첨가하였다. LCMS가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 1시간 동안 교반하였다. 모든 용매 및 TFA를 회전 증발기로 증발시킨 후, 잔류물을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 예상 분획물을 얻었고, 이를 동결건조하여 생성물 85-5 ((19S)-10,19-디에틸-19-하이드록시-14,18-디옥소-17-옥사-3,13-디아자펜타사이클로[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]헤니코사-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-헵타엔-7-일 N-메틸-N-[2-(메틸아미노)에틸]카르바메이트 (85-5, 550mg, 0.889mmol, 89.75%))의 TFA 염을 연한 황색 고체로 얻었다. ESI m/z : 254.3 (M/2+H)+, 507.3 (M+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.25 (s, 1H), 9.16 (s, 1H), 8.19 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.13 (s, 1H), 7.84-7.80 (m, 1H), 7.35 (s, 1H), 5.45 (s, 2 H), 5.35 (s, 2 H), 3.84-3.82 (m, 1H), 3.67-3.64 (m, 1H), 3.25-3.17 (m, 6H), 3.01 (s, 1H), 2.64-2.57 (m, 3H), 1.92-1.84 (m, 2H), 1.31 (t, J = 7.2 Hz, 3H),　0.89 (t, J = 7.2 Hz, 3H) ppm. TFA 상의 카르복실기의 양성자 하나가 밝혀졌다.
단계 4
무수 DMF(2mL) 중의 HOBt (78.39mg, 0.581mmol) 및 화합물 85-6 ({4-[(2S)-5-(카르바모일아미노)-2-[(2S)-2-({[(9H-플루오렌-9)-일)메톡시]카르보닐}아미노)-3-메틸부탄아미도]펜탄아미도]페닐}메틸 4-니트로페닐 카르보네이트 (85-6, 444.77mg, 0.581mmol))의 황색 용액을 실온에서 교반한 후, 무수 DMF(2 mL)에 용해된 DIPEA(224.71 mg, 1.742 mmol의) 용액을 주사기로 적가하였다. 염기를 첨가하자 반응액의 색은 갈색으로 변하였다. 첨가 후, 생성된 갈색 용액을 모든 출발 아민이 소모될 때까지(LCMS로 모니터링함) 추가 1시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 화합물 85-7 ({4-[(2S)-5-(카르바모일아미노)-2-[(2S)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-3-메틸부탄아미도]펜탄아미도]페닐}메틸 N-{2-[({[(19S)-10,19-디에틸-19-하이드록시-14,18-디옥소-17-옥사-3,13-디아자펜타사이클로[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]헤니코사-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-헵타엔-7-일]옥시}카르보닐)(메틸)아미노]에틸}-N-메틸카르바메이트 (85-7, 450mg, 0.397mmol, 68.33%))을 황색 고체로 얻었다. ESI m/z: 568.4 (M/2+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.10-10.01 (m, 1H), 8.18 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.10 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.93-7.86 (m, 3H), 7.73 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.62-7.52 (m,3H), 7.43-7.26 (m,8H), 6.52 (s, 1H), 5.97 (s, 1H), 5.45-5.34 (m, 5H), 5.09-5.00 (m, 2H), 4.44-4.40 (m, 1H), 4.32-4.22 (m, 3H), 3.93 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 3.65-3.50 (m, 7H), 3.19-3.12 (m, 2H), 3.04-2.89 (m, 7H), 2.02-1.914 (m, 1H), 1.91-1.74 (m, 2H), 1.74-1.52 (m, 2H), 1.52-1.36 (m, 2H), 1.36-1.26 (m, 2H), 0.91-0.84 (m, 9H) ppm.
단계 5
무수 DMF(1.8mL) 중의 화합물 85-7 ({4-[(2S)-5-(카르바모일아미노)-2-[(2S)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-3-메틸부탄아미도]펜탄아미도]페닐}메틸 N-{2-[({[(19S)-10,19-디에틸-19-하이드록시-14,18-디옥소-17-옥사-3,13-디아자펜타사이클로[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]헤니코사-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-헵타엔-7-일]옥시}카르보닐)(메틸)아미노]에틸}-N-메틸카르바메이트(85-7, 450mg, 0.397mmol))의 황색 용액에 디에틸 아민(0.2mL, 1.941mmol)을 첨가하였다. 모든 출발 물질이 소모될 때까지(LCMS에 의해 모니터링됨) 용액을 추가로 1시간 동안 교반하였다. 그 후 반응 용액을 회전 증발기로 증발시켜 디에틸 아민을 대부분 제거하고, 그 잔류물을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 화합물 85-8, VC-PAB-SN-38 TFA 염({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-{2-[({[(19S)-10,19-디에틸-19-하이드록시-14,18-디옥소-17-옥사-3,13-디아자펜타사이클로[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]헤니코사-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-헵타엔-7-일]옥시}카르보닐)(메틸)아미노]에틸}-N-메틸카르바메이트(85-8, VC-PAB-SN-38 TFA 염, 310mg, 0.340mmol, 85.62%))을 황색 고체로 얻었다. ESI m/z: 456.9 (M/2+H)+, 912.4 (M+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.18 (s, 0.6H), 10.14 (s, 0.4H), 8.67 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.18 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.08 (brs, 3H), 7.94 (d J = 7.6 Hz, 1H), 7.58-7.50 (m, 3H), 7.34-7.27 (m,3H), 6.54 (s, 1H), 6.04 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.53-5.34 (m, 6H), 5.06-5.00 (m, 2H), 4.55-4.45 (m, 1H), 3.70-3.60 (m, 2H), 3.60-3.50 (m, 1H), 3.50-3.46 (m, 2H), 3.21-3.12 (m, 3H), 3.05-2.89 (m, 8H), 1.93-1.82 (m, 2H), 1.77-1.55 (m, 2H), 1.55-1.38 (m, 2H), 1.38-1.22 (m, 3H), 0.95-0.87 (m, 9H) ppm. TFA의 카르복실기 중 하나의 양성자가 8.08 ppm에서 아미노기와 중첩되었다.
단계 6
DMF(3 mL) 중의 화합물 85-8 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-{2-[({[(19S)-10,19-디에틸-19-하이드록시-14,18-디옥소-17-옥사-3,13-디아자펜타사이클로[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]헤니코사-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-헵타엔-7-일]옥시}카르보닐)(메틸)아미노]에틸}-N-메틸카르바메이트(85-8, VC-PAB-SN-38, 240mg, 0.263mmol)), 화합물 85-9 ((2S)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산 산 (85-9, 308.95mg, 0.263mmol)) 및 DIPEA(67.89mg, 0.526mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, 무수 DMF(3 mL)에 용해된 HATU(100.06 mg, 0.263 mmol) 용액을 주사기로 적가하였다. 생성된 황색 용액을 LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 추가로 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 화합물 85-10 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-{2-[({[(19S)-10,19-디에틸-19-하이드록시-14,18-디옥소-17-옥사-3,13-디아자펜타사이클로[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]헤니코사-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-헵타엔-7-일]옥시}카르보닐)(메틸)아미노]에틸}-N-메틸카르바메이트 (85-10, 340mg, 0.164mmol, 62.48%))을 담황색 고체로 얻었다. ESI m/z : 690.3 (M/3+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.03 (s, 1H), 8.20-8.10 (m, 3H), 7.94-7.90 (m, 1H), 7.80 (t, J = 13.2 Hz, 1H), 7.59-7.53 (m, 4H), 7.34-7.27 (m,3H), 7.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.99 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 5.45-5.35 (m, 7H), 5.05-5.00 (m, 2H), 4.84-4.37 (m, 8H), 4.25 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 4.04-3.96 (m, 2H), 3.92-3.85(m, 1H), 3.80-3.77 (m, 2H), 3.70-3.67 (m, 3H), 3.63-3.53 (m, 18H), 3.50-3.40 (m, 36H), 3.36-3.27 (m, 11H), 3.09-3.12 (m, 3H), 3.04-2.89 (m, 9H), 2.29 (t, J = 6.0 Hz, 2 H), 1.99-1.83 (m, 3H), 1.69-1.53 (m, 3H), 1.53-1.26 (m, 19H), 0.91-0.81 (m, 9H) ppm. TFA에 있는 카르복실기의 양성자 1개는 8.20-8.10ppm 사이에서 나타났다.
단계 7
메탄올(3mL) 중 85-10 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-{2-[({[(19S)-10,19-디에틸-19-하이드록시-14,18-디옥소-17-옥사-3,13-디아자펜타사이클로[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]헤니코사-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-헵타엔-7-일]옥시}카르보닐)(메틸)아미노]에틸}-N-메틸카르바메이트 (85-10, 100mg, 0.048mmol))의 용액을 실온 하에서 교반하면서 메탄올(1mL) 중 2M HCl을 천천히 첨가하였다. 첨가하자 투명한 용액은 밝은 황색으로 변했다. LCMS가 완전한 탈보호를 나타낼 때까지, 용액을 2시간 동안 계속 교반하였다. 그런 다음 용액을 -20℃로 냉각하고 DIPEA로 중화했다; 그 결과, 황색 반응 용액은 무색 용액으로 변했다. 그런 다음 유기 용매를 회전 증발기로 30℃이하에서 증발시켜 담황색 잔류물을 얻었고, 이를 물에 용해시킨 후 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물(pH 3~4, LCMS은 분획물의 순도가 약 60% 내지 58%임을 나타냄)을 얻었다. 동결건조 후, 순도 63% 내지 64%의 황색 고체(~100mg)를 얻었다. 그런 다음 고체를 역상 플래쉬 크로마토그래피(중성 용출액)로 다시 정제하여 순도 약 48% 내지 51%의 원하는 분획물(pH 6~7)을 얻었다. 수집된 분획물을 동결건조하여 화합물 85-11 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥사아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-{2-[({[(19S)-10,19-디에틸-19-하이드록시-14,18-디옥소-17-옥사-3,13-디아자펜타사이클로[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]헤니코사-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-헵타엔-7-일]옥시}카르보닐)(메틸)아미노]에틸}-N-메틸카르바메이트(85-11, 80 mg, 0.041 mmol, 84.07%))을 연한 황색 고체로 얻었다. 생성물은 불순한 물질로서 다음 단계에서 직접 사용되었다. ESI m/z : 657.0 (M/3+H)+, 985.2 (M/2+H)+.
단계 8
50 mL 둥근바닥 플라스크에 화합물 85-11 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥사아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-{2-[({[(19S)-10,19-디에틸-19-하이드록시-14,18-디옥소-17-옥사-3,13-디아자펜타사이클로[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]헤니코사-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-헵타엔-7-일]옥시}카르보닐)(메틸)아미노]에틸}-N-메틸카르바메이트(85-11, 순도 45%의 미정제 물질 80mg, 0.041mmol)), 화합물 85-12 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1)-일)헥사노에이트(85-12, 12.52mg, 0.041mmol)) 및 무수 DMF(2mL)를 첨가하였다. 용액을 실온에서 교반하고 무수 DMF(2 mL) 중의 DIPEA(7.87 mg, 0.061 mmol) 용액을 주사기로 5분에 걸쳐 적가하였다. 첨가 후, LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었음을 나타낼 때까지 용액을 추가 4시간 동안 교반하였다. 그런 다음 완성된 반응 용액을 TFA로 중화하고 Prep-HPLC(0.01% TFA)로 직접 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 화합물 PB085 ({4-[(2S)-5-(카르바모일아미노)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]펜탄아미도]페닐}메틸 N-{2-[({[(19S)-10,19-디에틸-19-하이드록시-14,18-디옥소-17-옥사-3,13-디아자펜타사이클로[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]헤니코사-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-헵타엔-7-일]옥시}카르보닐)(메틸)아미노]에틸}-N-메틸카르바메이트 (PB085, 13mg, 0.006mmol, 출발 아민 함량 기준으로 계산하여 수율 32%))의 TFA 염을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 1081.3 (M/2+H)+, 721.3 (M/3+H)+, 541.5 (M/4+H)+, retention time 5.819 min (HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.00 (s, 0.6 H), 9.98 (s, 0.4 H), 8.20-8.08 (m, 3H), 7.94 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.79 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.66-7.52 (m, 4H),7.34-7.26 (m, 3H), 6.99 (s, 2H), 6.53 (s, 1H), 5.98 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.45-5.41 (m, 5H), 5.35 (s, 2H), 5.05-4.99 (m, 2H), 4.82-4.73 (m, 2H), 4.59-4.49 (m, 4H), 4.49-4.32 (m, 3H), 4.27-4.15 (m, 2H), 4.04-3.95 (m, 2H), 3.82-3.75 (m, 2H), 3.69-3.44 (m, 65H), 3.19-3.12 (m, 3H), 3.03-2.89 (m, 11H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.14-2.08 (m, 2H), 2.02-1.84 (m, 3H), 1.72-1.60 (m, 3H), 1.55-1.15 (m, 18H), 0.90-0.80 (m, 9H) ppm. TFA에 있는 카르복실기의 양성자 1개가 8.20-8.08ppm 사이에서 나타났다.
실시예 17 : 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB086)의 제조.
Figure pct00470
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB086)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
무수 DCM(14 mL) 중의 화합물 86-1 (1-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-온 산(86-1, 500 mg, 0.697 mmol)) 및 HOSu (160.39 mg, 1.395 mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, EDCI(267.36 mg, 1.395 mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 추가로 1시간 동안 교반한 다음, 추가 DCM(20mL)으로 희석하고 물(20mL)로 세척했다. 유기층을 수집하고, 물 층을 추가 DCM(20 mL)으로 추출하였다. 조합된 DCM 층을 황산나트륨 상에서 건조시킨 후, 여과하고 농축하여 미정제의 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2,2-디메틸-4-옥소-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-트리데카옥사-5-아자테트라테트라콘탄-44-오에이트(800mg, 정량적 수율)을 무색 오일로 얻었다. ESI m/z : 715.5 (M-100+H)+; 837.5 (M+Na)+.
활성화된에스테르(800 mg 미정제 물질, 0.697 mmol)를 무수 DMF(4 mL)에 용해시킨 후, 화합물 86-2 ((2S)-6-아미노-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산, TFA 염 (86-2, 503.93mg, 1.045mmol)) 및 DIPEA(179.83mg, 1.394mmol)를 첨가하였다. 활성화된에스테르가 모두 소모될 때까지(LCMS로 모니터링함), 반응 용액을 실온에서 1시간 동안 교반했다. 이어서, 생성된 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 화합물 86-3 ((2S)-6-(1-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산(86-3, 600mg, 0.562mmol, 80.58%))을 연한 황색 오일로 얻었다. ESI m/z : 484.9 ((M-100)/2+H)+, 968.7(M-100+H)+. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 12.64 (s, 1H), 7.90 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.82 (t, J =5.6 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.45-7.40 (m, 2H), 7.36-7.31 (m, 2H), 7.76 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.29-4.21 (m, 3H), 3.94-3.88 (m, 1H), 3.68-3.56 (m, 4H), 3.51-3.47 (m, 44H), 3.07-3.00 (m, 4H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.73-1.60 (m, 2H), 1.52-1.29 (m, 13H) ppm.
단계 2
무수 DMF(4 mL) 중의 화합물 86-3 ((2S)-6-(1-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산(86-3, 600mg, 0.562mmol)), HATU(256.43mg, 0.674 mmol) 및 DIPEA(145.00 mg, 1.124 mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, 화합물 86-4 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (86-4, 471.91mg, 0.562mmol))를 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지, 생성된 용액을 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 화합물 86-5 (tert-부틸 N-(38-{[(5S)-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)펜틸]카르바모일}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사옥타트리아콘탄-1-일)카르바메이트(86-5, 750 mg, 0.397 mmol, 70.60%))를 회백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 597.9 ((M-100)/3+H)+, 896.1 ((M-100)/2+H)+, 946.7 (M/2+H)+.
단계 3
DCM (8mL) 중의 화합물 86-5 (tert-부틸 N-(38-{[(5S)-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)펜틸]카르바모일}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사옥타트리아콘탄-1-일)카르바메이트(86-5, 700mg, 0.370mmol))의 용액에 TFA(2 mL, 26.925 mmol)를 천천히 첨가하였다. 생성된 황색 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하여 완료하였다. TFA 및 용매를 회전 증발기로 증발시키고, 잔류물을 역상 플래시 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 예상 분획물을 얻었고, 이를 동결건조하여 생성물 86-6 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-5-(1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바메이트 (86-6, 460mg, 0.257mmol, 69.38%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 896.6 (M/2+H)+, 597.9(M/3+H)+.
단계 4
무수 DMF(4 mL) 중의 CDI(0.029 mL, 0.234 mmol)의 용액에 무수 DMF(4 mL) 중의 화합물 86-6 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-5-(1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바메이트 (86-6, 350mg, 0.195mmol))의 용액을 주사기로 5분에 걸쳐 적가하였다. 첨가 후, 담황색 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하여 완료하였다 (LCMS로 모니터링함). 활성화된 중간체 (9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-{1-[(1H-이미다졸-1-카르보닐)아미노]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도}펜틸]카르바메이트가 주요 피크로 검출되었다. ESI m/z : 629.3 (M/3+H)+, 943.3 (M/2+H)+.
상기 DMF(4 mL) 중의 활성화된 중간체(0.195 mmol)의 반응 용액에 화합물 86-7 ((2R,3R,4R,5S)-6-아미노헥산-1,2,3,4,5-펜톨(86-7, 70.59mg, 0.390mmol)) 및 DIPEA(50.31mg, 0.390mmol)을 첨가했다. 생성된 용액을 모든 물질이 소모될 때까지 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 화합물 86-8 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[1-({[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]카르바모일}아미노)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도]펜틸]카르바메이트(86-8, 200mg, 0.100mmol, 51.33%))을 연한 황색 고체로 얻었다. ESI m/z : 999.8(M/2+H)+, 666.9 (M/3+H)+.
단계 5
DMF(3.6mL) 중의 화합물 86-8 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[1-({[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]카르바모일}아미노)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도]펜틸]카르바메이트(86-8, 200mg, 0.100mmol))의 용액을 실온에서 교반하고 디에틸 아민(0.4mL, 3.883mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 30분 동안 교반하였다. 이어서, 디에틸 아민을 진공 하에 증발시키고, DMF 중의 잔류물을 포름산으로 중화시키고, 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 예측 생성물 86-9 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[1-({[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]카르바모일}아미노)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트(86-9, 130mg, 0.073mmol, 73.14%))를 연한 황색 고체로 얻었다. ESI m/z: 592.9 (M/3+H)+, 889.0 (M/2+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.09 (s, 1H), 8.42 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.31 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 8.12-8.04 (m, 4H), 7.85 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 7.6Hz, 2H), 7.37 (d, J = 8.8Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 6.54 (brs, 1H), 6.12 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 6.04 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.97 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.54-5.45 (m, 3H), 5.40-5.23 (m, 3H), 5.09 (s, 2H), 4.44-4.38 (m, 2H), 4.30-4.27 (m, 1H), 3.89-3.81 (m, 1H), 3.69-3.54 (m, 6H), 3.54-3.45 (m, 48H), 3.26-3.13 (m, 6H), 3.13-3.05 (m, 4H), 3.05-2.98 (m, 3H), 2.98-2.89 (m, 2H), 2.37 (s, 3H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.24-2.10 (m, 2H), 2.04-1.93 (m, 1H), 1.93-1.82 (m, 2H), 1.72-1.54 (m, 4H), 1.45-1.23 (m, 6H), 0.92-0.86 (m, 9H) ppm. TFA에 있는 카르복실기의 양성자 1개가 8.12-8.04ppm 사이에서 나타났다.
단계 6
무수 DMF(1.5mL) 중의 화합물 86-9 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[1-({[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]카르바모일}아미노)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트(86-9, 60mg, 0.034mmol)) 및 화합물 86-10 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트(86-10, 12.50mg, 0.041mmol))의 용액을 실온에서 교반한 후, DIPEA(6.54mg, 0.051mmol)을 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었음을 나타낼 때까지 생성된 용액을 추가로 2시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 포름산으로 중화시킨 다음 Prep-HPLC(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 PB086 ({4-[(2S)-5-(카르바모일아미노)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도]-6-[1-({[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]카르바모일}아미노)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (PB086, 30mg, 0.015mmol, 45.09%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 985.1 (M/2+H)+, 657.3 (M/3+H)+, 493.3 (M/4+H)+, retention time 6.424 min (HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.03 (s, 1H), 8.11 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.82-7.76 (m, 2H), 7.66 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 6.99 (s, 2H), 6.50 (brs, 1H), 6.11 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 6.00-5.94 (m, 2H), 5.45-5.38 (m, 3H), 5.35-5.24 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.40-4.17 (m, 4H), 3.59-3.45 (m, 54H), 3.24-3.16 (m, 4H), 3.16-3.09 (m, 4H), 3.04-2.90 (m, 7H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.23-2.13 (m, 2H), 2.13-2.06 (m, 2H), 2.01-1.96 (m, 1H), 1.96-1.81 (m, 2H), 1.73-1.54(m, 4H), 1.48-1.29 (m, 10H), 1.24-1.14 (m, 4H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm.
실시예 18: 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB087)의 제조.
Figure pct00471
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB087)를 다음과 같이 제조하였다:
단계 1 및 2
무수 DCM(10 mL) 중의 화합물 87-1 (1-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-온 산 (87-1, 300 mg, 0.466mmol)) 및 HOSu (80.39mg, 0.699mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 후, EDCI(134.01mg, 0.699mmol)를 실온에서 첨가하였다. 생성된 용액을 추가로 1시간 동안 교반한 다음, 추가 DCM(20 mL)으로 희석하고 물(20 mL)로 세척하고, 유기층을 분리하고 물 층을 추가 DCM(20 mL*2)으로 추출했다. 조합된 DCM 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여 미정제 활성화에스테르(345 mg, 정량적 수율)를 무색 오일로서 생성하였다. ESI m/z: 741.5(M+H)+, 763.4(M+Na)+.에스테르를 무수 DMF(4 mL)에 용해시킨 후, 화합물 87-3 ((2S)-6-아미노-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}헥산 산 (87-3, 114.78 mg, 0.466 mmol)) 및 DIPEA(120.23mg, 0.932mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 모든 출발 아민이 소모될 때까지 실온에서 밤새 교반하였고, 그 혼합물은 투명한 담황색 용액으로 변했다. 이어서, 완성된 반응 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 화합물 87-4 ((S)-1-아지도-45-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-39-옥소-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄-46-온 산 (87-4, 350mg, 0.401mmol, 86.13%))을 무색 오일로 얻었다. ESI m/z : 386.8 ((M-100)/2+H)+, 872.6 (M+H)+.
단계 3
DCM(8 mL) 중의 화합물 87-4 ((S)-1-아지도-45-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-39-옥소-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄-46-온 산 (87-4, 350mg, 0.401mmol)) 및 화합물 87-5 (1,3-디에틸 2-(프로프-2-인-1-일))프로판디오에이트 (87-5, 158.94 mg, 0.803 mmol))의 용액을 실온에서 교반한 후, Cu(CN)4PF6 (447.94 mg, 1.204 mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 반응이 완료될 때까지(LCMS에 의해 모니터링됨) 추가 4시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 아세토니트릴에 용해시킨 후 여과하여 구리 촉매를 제거하였다. 여액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 1,4-이치환 트리아졸 이성질체 (2S)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-6-(1-{4-[3-에톡시-2-(에톡시카르보닐)-3-옥소프로필]-1H-1,2,3-트리아졸-1-일}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)헥산 산 및 1,5-이치환 트리아졸 이성질체 (2S)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-6-(1-{5-[3-에톡시-2-(에톡시카르보닐)-3-옥소프로필]-1H-1,2,3-트리아졸-1-일}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)헥산 산의 혼합물 (화합물 87-6a/87-6b, 350mg, 0.327mmol, 81.57%)을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 485.9 ((M-100)/2+H)+, 두 위치선택성 이성질체가 LCMS에서 중첩되었다.
단계 4
무수 DMF(2 mL) 중의 화합물 87-6a/87-6b (350mg, 0.327mmol, (2S)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-6-(1-{4-[3-에톡시-2-(에톡시카르보닐)-3-옥소프로필]-1H-1,2,3-트리아졸-1-일}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)헥산 산 및 (2S)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-6-(1-{5-[3-에톡시-2-(에톡시카르보닐)-3-옥소프로필]-1H-1,2,3-트리아졸-1-일}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)헥산 산), HATU (149.25 mg, 0.393 mmol) 및 DIPEA(23.99 mg, 0.186 mmol)의 혼합물을 실온에서 5분간 교반한 후, 화합물 87-7 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-다이옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (87-7, 275.06mg, 0.327mmol))를 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지, 생성된 용액을 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 화합물 87-8a/87-8b (380mg, 0.201mmol, 61.36%, 1,3-디에틸 2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바모일}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사옥타트리아콘탄-1-일)-1H-1,2,3-트리아졸-5-일]메틸}프로판디오에이트 및 그의 위치선택적 이성질체 1,3-디에틸 2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바모일}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사옥타트리아콘탄-1-일)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일]메틸}프로판디오에이트)의 혼합물을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 449.4((M-100)/4+H)+, 632.1 (M/3+H)+, 947.7(M/2+H)+, 체류 시간 8.205분(HPLC). 두 이성질체는 LCMS에서 하나의 피크로 겹쳐졌다. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 10.06 (s, 1H), 8.20 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.84-7.76 (m, 3H), 7.61 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 7.02 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.63-6.43 (m, 1H), 5.99 (s, 1H), 5.50-5.40 (m, 3H), 5.34-5.23 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.48-4.45 (m, 2H), 4.42-4.36 (m, 1H), 4.27-4.23 (m, 1H), 4.13-4.08 (m, 4H), 3.93-3.86 (m, 1H), 3.82 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 3.77 (t, J = 4.2Hz, 2H), 3.58-3.55 (m, 2H), 3.50-3.45 (m, 44H), 3.32-3.21 (m, 2H), 3.13 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.04-2.92 (m, 5H), 2.38(s, 3H), 2.29 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 2.23-2.10 (m, 2H), 1.99-1.71 (m, 3H), 1.71-1.48 (m, 3H), 1.48-1.21 (m, 16H), 1.15 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm.
단계 5
THF(6 mL) 중의 화합물 87-8a/87-8b (1,3-디에틸 2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바모일}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사옥타트리아콘탄-1-일)-1H-1,2,3-트리아졸-5-일]메틸}프로판디오에이트 (87-8a/87-8b, 380 mg, 0.201 mmol) 및 1,3-디에틸 2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바모일}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사옥타트리아콘탄-1-일)-1H-1,2,3-트리아졸-5-일]메틸}프로판디오에이트)의 혼합물을 실온에서 교반한 후, 물(3 mL) 중의 수산화리튬 일수화물(8.87 mg, 0.211 mmol)을 첨가했다. 반응 용액은 황색으로 변했고, 완전한 가수분해를 달성하기 위해 추가로 2시간 동안 교반했다. 용액을 TFA를 사용하여 pH 6.0으로 산성화한 후, 감압 하에 농축하여 THF를 제거하고, 물 중의 잔류물을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 화합물 87-9a/87-9b (250 mg, 0.136 mmol, 67.80%, 1,4-이치환된 트리아졸 이성질체 2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바모일}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사옥타트리아콘탄-1-일)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일]메틸}프로판디온 산 및 1,5-이치환된 트리아졸 이성질체 2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바모일}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사옥타트리아콘탄-1-일)-1H-1,2,3-트리아졸-5-일]메틸}프로판디온 산)의 혼합물을 백색 고체로서 얻었다. 체류 시간 1.792분에서 약 30% 내지 44% 이성질체 1, 체류 시간 1.811분에서 40% 내지 52% 이성질체 2, ESI m/z = 613.3 (M/3+H)+; 919.1 (M/2+H)+. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 10.05 (s, 1H), 8.19 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.07-8.03 (m, 1H), 7.82-7.76 (m, 3H), 7.61 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.33 (s, 0.5H), 7.32 (s, 0.5H), 7.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.54-6.53 (m, 1H), 5.99 (s, 1H), 5.46-5.39 (m, 3H), 5.34-5.23 (m, 3H), 5.09 (s, 2H), 4.48-4.46 (m, 2H), 4.43-4.37 (m, 1H), 4.28-4.23 (m, 1H), 3.91-3.86 (m, 1H), 3.78 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.65-3.56 (m, 4H), 3.51-3.45 (m, 46H), 3.15-2.90 (m, 8H), 2.38(s, 3H), 2.29 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 2.23-2.11 (m, 2H), 1.99-1.82 (m, 3H), 1.72-1.49 (m, 3H), 1.49-1.22 (m, 17H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm.
단계 6
둥근 바닥 플라스크에 화합물 87-9a/87-9b (240 mg, 0.131 mmol, 2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바모일}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사옥타트리아콘탄-1-일)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일]메틸}프로판디온 산 및 2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바모일}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사옥타트리아콘탄-1-일)-1H-1,2,3-트리아졸-5-일]메틸}프로판디온 산)의 혼합물을 첨가하고, 이어서 무수 DMF(1.5mL) 중의 화합물 87-10 ((2R,3R,4R,5S)-6-아미노헥산-1,2,3,4,5-펜톨(87-10, 94.69mg, 0.523mmol)) 및 DIPEA (50.56mg, 0.392mmol)의 용액을 첨가하였다. 갈색 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, 무수 DMF(1.5mL)에 용해된 HATU(99.35mg, 0.261mmol)의 용액을 적가하였다. 첨가 후, 생성된 용액을 LCMS가 완전한 전환을 나타낼 때까지 추가로 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 플래시 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 1,4-이치환 트리아졸 및 1,5-이치환 트리아졸의 혼합물을 얻었고, 이를 Prep-HPLC(0.01% TFA)로 추가로 정제하여 담황색 고체의 화합물 87-11a (1,4-이치환 이성질체 tert-부틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-{1-[4-(2-{[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]카르바모일}에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도}펜틸]카르바메이트 (87-11a, 65 mg, 0.033 mmol, 25.43%))를 얻고, 이어서 담황색 고체의 화합물 87-11b (1,5-이치환 이성질체 tert-부틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-{1-[5-(2-{[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]카르바모일}에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도}펜틸]카르바메이트 (87-11b, 35mg, 0.018mmol, 13.66%))를 얻었다.
87-11a(대부분): ESI m/z : 653.0 (M/3+H)+, 979.2 (M/2+H)+. 1H NMR: (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.04 (s, 1H), 8.19 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 8.06(d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.86-7.77 (m, 4H), 7.60 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 7.00 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.99 (s, 1H), 5.45-5.35 (m, 3H), 5.35-5.24 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.47-4.44 (m, 2H), 4.41-4.36 (m, 1H), 4.27-4.23 (m, 1H), 3.93-3.86 (m, 1H), 3.79(t, J = 4.2 Hz, 2H), 3.67-3.56 (m, 8H), 3.56-3.46 (m, 44H), 3.16-2.90 (m, 12H), 2.83 (t, J = 7.6Hz, 2H), 2.43 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J = 6.4Hz, 2H), 2.23-2.11 (m, 2H), 2.00-1.82 (m, 4H), 1.73-1.57 (m, 3H), 1.50-1.24 (m, 18H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm. TFA 상의 카르복실기의 양성자 하나가 밝혀졌다.
87-11b (소수):
ESI m/z : 653.0 (M/3+H)+; 979.1 (M/2+H)+. 1H NMR: (400 MHz, DMSO-d6) δ10.04 (s, 1H), 8.18 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.83-7.75 (m, 4H), 7.61 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.33 (s, 1H), 7.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.99 (s, 1H), 5.45-5.39 (m, 3H), 5.34-5.23 (m, 3H), 5.09 (s, 2H), 4.46 (t, J = 4.2 Hz, 2H), 4.41-4.36 (m, 1H), 4.27-4.23 (m, 1H), 3.93-3.88 (m, 1H), 3.79(t, J = 4.6 Hz, 2H), 3.67-3.56 (m, 8H), 3.56-3.47 (m, 44H), 3.13-2.90 (m, 12H), 2.83 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.43 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J = 6.4Hz, 2H), 2.22-2.10 (m, 2H), 2.00-1.85 (m, 4H), 1.73-1.55 (m, 3H), 1.48-1.24 (m, 18H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm. TFA 상의 카르복실기의 양성자 하나가 밝혀졌다.
단계 7
메탄올(2 mL) 중의 화합물 87-11a (tert-부틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-{1-[4-(2-{[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]카르바모일}에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도}펜틸]카르바메이트(87-11a, 60mg, 0.031mmol))를 실온에서 교반한 후, 메탄올(1 mL) 중의 2M HCl을 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 물질이 소모되었음을 나타낼 때까지, 용액을 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음 반응 용액을 수성 중탄산나트륨 용액으로 중화하고, 용매 메탄올을 회전식 증발기로 증발시키고, 잔류물을 물에 용해시키고 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 수집하고, 이를 동결건조하여 생성물 87-12a ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-{1-[5-(2-{[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]카르바모일}에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도}헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (87-12a, 20mg, 0.011mmol))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 928.7 (M/2+H)+, 619.5 (M/3+H)+. 1H NMR: (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.09 (s, 1H), 8.41 (d, J = 8.4Hz, 1H), 8.31 (d, J = 8.0Hz, 1H), 8.08-8.02 (m, 4H), 7.85-7.80 (m, 3H), 7.79 (s, 1H), 7.60 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 6.00 (t, J = 4.0 Hz, 1H), 5.46 (brs, 4H), 5.34-5.25 (m, 3H), 5.09 (s, 2H), 4.47-4.26 (m, 7H), 3.89-3.84 (m, 1H), 3.80-3.76 (m, 2H), 3.60-3.56 (m, 5H), 3.50-3.47 (m, 44H), 3.29-3.22 (m, 2H), 3.16-2.94 (m, 9H), 2.85-2.81 (m, 1H), 2.45-2.41(m, 1H), 2.39 (s, 3H), 2.31 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.24-2.11 (m, 4H), 2.02-1.98 (m, 1H), 1.90-1.82 (m, 3H), 1.69-1.64 (m, 3H), 1.60-1.55 (m, 1H), 1.46-1.23 (m, 7H), 0.92-0.86 (m, 9H) ppm. TFA 상의 카르복실기의 양성자 하나가 밝혀졌다.
단계 8
무수 DMF(1 mL) 중의 화합물 87-12a ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-{1-[5-(2-{[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]카르바모일}에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도}헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (87-12a, 20 mg, 0.011 mmol)) 및 DIPEA(1.94 mg, 0.015 mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, 무수 DMF(1 mL) 중의 화합물 87-13 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (87-13, 3.08 mg, 0.010 mmol)) 용액을 주사기로 적가하였다. LCMS가 모든 출발 활성화에스테르가 소비되고 출발 아민이 거의 남지 않음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 추가 4시간 동안 교반하였다. 이어서 생성된 용액을 TFA를 사용하여 pH 4~5로 산성화하고, Prep-HPLC(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 PB087 ({4-[(2S)-5-(카르바모일아미노))-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도]-6-{1-[4-(2-{[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]카르바모일}에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도}헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (PB087, 12mg, 0.006mmol, 58.56%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 1047.7 (M/2+Na)+, 684.1(M/3+H)+, 513.4 (M/4+H)+, retention time 6.372 min (HPLC). 1H NMR: (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.04 (s, 1H), 8.13 (d, J =6.8Hz, 1H), 8.09-8.05 (m, 1H), 7.97 (d, J = 8.0Hz, 1H), 7.86-7.76 (m, 4H), 7.69-7.66 (m, 1H), 7.60 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 6.99 (s, 2H), 6.55 (s, 1H), 6.05-5.95 (m, 1H), 5.45 (s, 4H), 5.33-5.24 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.47-4.33 (m, 4H), 4.27-4.16(m, 3H), 3.80-3.75 (m, 2H), 3.67-3.55 (m, 12H), 3.50-3.48 (m, 44H), 3.37-3.34 (m, 2H), 3.29-3.22 (m, 2H), 3.13-2.90 (m, 8H), 2.83 (t, J = 7.6Hz, 1H), 2.43 (d, J = 7.60Hz, 1H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H),　2.22-2.05 (m, 4H), 2.00-1.83 (m, 3H), 1.73-1.57 (m, 3H), 1.51-1.32 (m, 9H), 1.24-1.14 (m, 4H), 0.90-0.81 (m, 9H)ppm. TFA 상의 카르복실기의 양성자 하나가 밝혀졌다.
실시예 19 : 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB088)의 제조.
Figure pct00472
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB088)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
DCM(4 mL) 중의 화합물 88-1 (1-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-온 산(88-1, 500 mg, 0.697 mmol))의 용액에 TFA(1 mL, 13.463 mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축하고 미정제 혼합물을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 화합물 88-2 (1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-온 산 (88-2, 420mg, 0.680mmol, 97.59%))를 무색 오일로 얻었다. ESI m/z: 618.4(M+H)+.
단계 2
DMF(3 mL) 중의 화합물 88-3 (tert-부틸 N-(2-아미노에틸) 카르바메이트 (88-3, 0.335 mL, 2.122 mmol)) 및 CDI(0.264 mL, 2.121 mmol)의 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하여 활성화된 중간체를 제조한 후, 화합물 88-2 (1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-온 산 (88-2, 236mg, 0.382mmol)) 및 DIPEA(197.48mg, 1.528mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 모든 출발 물질이 소모될 때까지 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 역상 플래시 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 화합물 88-4 (1-{[(2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}에틸)카르바모일]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-온 산 (88-4, 230mg, 0.286mmol, 74.89 %))을 무색 오일로 얻었다. ESI m/z : = 804.5(M+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.17 (s, 1H), 6.78 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 6.08-5.81 (m, 2H), 3.60 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.54-3.48 (m, 44H), 3.37 (t, J = 5.6 Hz, 3H), 3.17-3.12 (m, 2H), 3.05-2.96 (m, 2H), 2.93-2.87 (m, 2H), 2.44 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.37 (s, 9H) ppm.
단계 3
DCM(5 mL) 중의 화합물 88-4 (1-{[(2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}에틸)카르바모일]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-온 산 (88-4, 430 mg, 0.535 mmol))의 용액에 TFA(1 mL, 13.463 mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축시키고, 미정제 물질을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 화합물 88-5 (1-{[(2-아미노에틸)카르바모일]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-온 산 (88-5, 320mg, 0.455mmol, 85.00%))의 TFA 염을 무색 오일로 얻었다. ESI m/z : = 704.5 (M+H)+.
단계 4
MeOH (20mL) 중의 화합물 88-5 (1-{[(2-아미노에틸)카르바모일]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-온 산 (88-5, 163mg, 0.232mmol))의 용액에 D-글루코스(166.90mg, 0.926mmol)를 나누어(in portions) 첨가하고, 그 혼합물을 N2 분위기 하에 30분 동안 교반하면서 85℃로 가열하였다. 이어서 NaCNBH3 (58.21 mg, 0.926 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 18시간 동안 가열하면서 교반하여 반응을 완료하였다. 이어서, 반응 용액을 농축하여 건조시키고 역상 플래시 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조시켜 화합물 88-6 (1-{[(2-{비스[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]아미노}에틸)카르바모일]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-온 산 (88-6, 200mg, 0.194mmol, 83.52%))을 무색 오일로 얻었다. ESI m/z: 1032.5(M+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 6.40-6.38 (m, 2H), 4.67 (brs, 8H), 3.70-3.63 (m, 2H), 3.61-3.39 (m, 54H), 3.38-3.37 (m, 6H), 3.22-2.91 (m, 6H), 2.49-2.35 (m, 4H), 2.31 (t, J = 6.4 Hz, 2H) ppm. 카르복실기의 양성자는 밝혀지지 않았다.
단계 5
DMF(3 mL) 중의 화합물 88-6 (1-{[(2-{비스[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6- 펜타하이드록시헥실]아미노}에틸)카르바모일]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-온 산 (88-6, 138.45mg, 0.134mmol)), HATU(50.95mg, 0.134mmol) 및 DIPEA(34.61 mg, 0.268 mmol)의 혼합물을 N2 하에 실온에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, 화합물 88-7 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-5-아미노-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바메이트 (88-7, 160mg, 0.134mmol))을 천천히 첨가하고, 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후(LCMS로 모니터링), 반응 용액을 prep-HPLC(0.01% TFA)로 정제하여 화합물 88-8 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-(1-{[(2-{비스[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]아미노}에틸)카르바모일]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (88-8, 220mg, 0.100mmol, 74.27%))을 담황색 고체로 얻었다. ESI m/z: 1103.6(M/2+H)+.
단계 6
DMF(2 mL) 중의 화합물 88-8 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-(1-{[(2-{비스[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]아미노}에틸)카르바모일]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (88-8, 230 mg, 0.104 mmol))의 용액에 디에틸 아민(30.51 mg, 0.417 mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 용액을 진공 하에 농축하여 대부분의 디에틸 아민을 제거하고, 미정제 물질을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 화합물 88-9 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-(1-{[(2-{비스[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]아미노}에틸)카르바모일]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (88-9, 150mg, 0.076mmol, 72.53%))의 TFA 염을 연한 황색 고체로 얻었다. ESI m/z: 992.6(M/2+H)+.
단계 7
DMF(2 mL) 중의 화합물 88-9 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-(1-{[(2-{비스[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]아미노}에틸)카르바모일]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (88-9, TFA 염, 52mg, 0.026mmol))의 용액에 화합물 88-10 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (88-10, 16.17mg, 0.052mmol)) 및 DIPEA(6.78mg, 0.052mmol)를 실온에서 첨가하였다. 첨가 후, 용액을 LCMS가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지 2시간 동안 교반하였다. 그런 다음 반응 용액을 Prep-HPLC(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 PB088 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S))-6-(1-{[(2-{비스[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]아미노}에틸)카르바모일]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)-2-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (PB088, 40mg, 0.018mmol, 70.09%))를 담황색 고체로 얻었다. ESI m/z: 1089.6(M/2+H)+, 726.3(M/3+H)+, 체류 시간 6.007분(HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.02 (s, 1H),8.67 (s, 1H), 8.11 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.79 (dd, J = 11.0, 5.7 Hz, 2H), 7.66 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.53 (s, 1H), 6.- 6.23 (m, 2H), 5.99 (dd, J = 9.8, 4.1 Hz, 1H), 5.43 (d, J = 12.1 Hz, 4H), 5.35 (s, 2H), 5.29 (s, 3H), 5.07 (s, 2H), 4.75 - 4.37 (m, 8H), 4.25-4.17 (m, 2H), 4.00 (d,　J　= 7.6 Hz, 2H), 3.69-3.66 (m, 2H), 3.59-3.54 (m, 5H), 3.52-3.45 (m, 54H), 3.23-3.11 (m, 5H), 3.09-2.85 (m, 5H), 2.38 (s, 3H), 2.35-1.79 (m, 11H), 1.72-1.55 (m, 3H), 1.51-1.42 (m, 6H), 1.42-1.10 (m, 9H), 0.89-0.80 (m, 9H) ppm.
실시예 20 : 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB089)의 제조.
Figure pct00473
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB089)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
DMF(10 mL) 중의 화합물 89-1 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헵타코산-27-오에이트 (89-1, 1.83g, 2.405mmol)), 화합물 89-2 ((2S)-6-아미노-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}헥산 산 (89-2, 0.59 g, 2.405 mmol)) 및 DIPEA(0.62 g, 4.811 mmol)의 용액을 LCMS가 완전한 전환을 나타낼 때까지 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 그런 다음 반응 용액을 역상 플래시 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 화합물 89-3 ((2S)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-6-[1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헵타코산-27-아미도]헥산 산 (89-3, 1.54g, 1.726mmol, 71.77%))을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 914.5 (M+Na)+, 396.8 (M-100)/2+H)+.
단계 2
DCM (10mL) 중의 화합물 89-3 ((2S)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-6-[1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헵타코산-27-아미도]헥산 산 (89-3, 1.14g, 1.278mmol))의 용액에 디에틸 아민(0.401mL, 5.112mmol)을 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하여 완료하였다. 이어서, 혼합물을 역상 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 화합물 89-4 ((2S)-6-(1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헵타코산-27-아미도)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}헥산 산 (89-4, 800mg, 1.194mmol, 93.46%))을 무색 오일로 얻었다. ESI m/z = 670.5 (M+H)+, 285.8 ((M-100)/2+H)+.
단계 3
MeOH (50mL) 중의 화합물 89-4 ((2S)-6-(1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헵타코산-27-아미도)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}헥산 산 (89-4, 800mg, 1.194mmol))의 용액에 D-글루코스(860.80mg, 4.778mmol)를 나누어 첨가하고, 그 혼합물을 N2 분위기 하에서 30분간 교반하면서 85℃로 가열했다. 이어서, NaCNBH3 (300.12mg, 4.776mmol)을 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 18시간 동안 환류 하에 가열하였다. 그런 다음 반응 용액을 농축하고 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 화합물 89-5 ((2S)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-펜타하이드록시-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25-옥타옥사-28-아자테트라트리아콘탄아미도]헥산 산 (89-5, 966mg, 0.968mmol, 81.06%))을 무색 오일로 얻었다. ESI m/z: 998.5 (M+H)+, 449.8 (M/2+H)+.
단계 4
DMF(5 mL) 중의 화합물 89-5 ((2S)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-펜타하이드록시-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25-옥타옥사-28-아자테트라트리아콘탄아미도]헥산 산 (89-5, 275mg, 0.276mmol)), HATU(91.67mg, 0.241mmol) 및 DIPEA(59.33mg, 0.459mmol)의 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, 화합물 89-6 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (89-6, 193.07 mg, 0.230 mmol))를 천천히 첨가하고, 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 Prep-HPLC(0.01% TFA)로 정제하여 화합물 89-7 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-펜타하이드록시-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25-옥타옥사-28-아자테트라트리아콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (89-7, 347mg, 0.191mmol, 82.99%))을 담황색 고체로 얻었다. ESI m/z: 911.0 (M/2+H)+, 607.9 (M/3+H)+.
단계 5
에틸 아세테이트 중 1M HCl (219mg, 6.007mmol) 중의 화합물 89-7 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-펜타하이드록시-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25-옥타옥사-28-아자테트라트리아콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (89-7, 347 mg, 0.191 mmol))의 용액을 LCMS가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지 실온에서 2시간 동안 교반했다. 이어서, 회전 증발기로 용매를 증발시키고 잔류물을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 화합물 89-8 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S))-2-아미노-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-펜타하이드록시-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25-옥타옥사-28-아자테트라트리아콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (89-8, 93mg, 0.054mmol, 28.36%))을 백색 고체로 얻었다. ESI = 574.5 (M/3+H)+, 861.2 (M/2+H)+.
단계 6
DMF(2 mL) 중의 화합물 89-8 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S))-2-아미노-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-펜타하이드록시-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25-옥타옥사-28-아자테트라트리아콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (89-8, 93 mg, 0.054 mmol))의 용액에 DIPEA(10.48mg, 0.081mmol) 및 화합물 89-9 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (89-9, 24.99mg, 0.081mmol))를 첨가하였다. 첨가 후, 모든 출발 아민이 소모될 때까지(LMCS에 의해 모니터링됨) 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서 생성된 용액을 pH 6으로 조정하고 Prep-HPLC(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 PB089 ({4-[(2S)-5-(카르바모일아미노)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도]-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-펜타하이드록시-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25-옥타옥사-28-아자테트라트리아콘탄아미도]헥사아미도]-3-메틸부탄아미도]펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (PB089, 55mg, 0.029mmol, 53.17%))의 TFA 염을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 639.1(M/3+H)+, 체류 시간 5.799분(HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.04 (s,1H), 8.14-8.12 (m, 2H), 8.07 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.83 (t, J = 5.6 Hz,1H), 7.76 (d, J =11.2 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 6.99 (s, 2H), 6.548 (s, 1H), 6.02 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.45 (brs, 6H), 5.33-5.21 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.82 (brs, 2H), 4.56 (brs, 4H), 4.40-4.17 (m,5H), 3.99 (brs, 2H), 3.80-3.76 (m, 2H), 3.69-3.67 (m, 2H), 3.62-3.56 (m, 8H), 3.49-3.45 (m, 28H), 3.36-2.90 (m, 16H), 2.37 (s, 3H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.24-2.08 (m, 4H), 2.00-1.81 (m, 3H), 1.69-1.57 (m, 3H), 1.52-1.42 (m, 6H), 1.36-1.29 (m, 3H), 1.22-1.14 (m, 4H), 0.89-0.81 (m, 9H) ppm.
실시예 21 : 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB090)의 제조.
Figure pct00474
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB090)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
DCM(15 mL) 중의 화합물 90-1 (1-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-온 산 (90-1, 3.737mL, 11.494mmol))의 용액에 HOSu (1.98g, 17.240mmol) 및 EDCI(3.30g, 17.240mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 그 다음 생성된 용액을 염수(20mL)로 세척하고 DCM(20mL)으로 추출하였다. 수집된 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 여액을 증발하여 건조시켜 생성물 90-2 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2,2-디메틸-4-옥소-3,8,11,14,17-펜타옥사-5-아자이코산-20-오에이트 (90-2, 5.32g, 11.503mmol, 100%))을 얻었다. ESI m/z : 485.3 (M+H)+.
단계 2
DMF(20 mL) 중의 화합물 90-2 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2,2-디메틸-4-옥소-3,8,11,14,17-펜타옥사-5-아자이코산-20-오에이트(90-2, 5.32 g, 11.503 mmol))의 용액에 화합물 90-3 ((2S)-6-아미노-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산(90-3, 6.36g, 17.254mmol)) 및 DIPEA(2.97g, 23.005mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 역상 분리(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 90-4 ((2S)-6-(1-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (90-4, 6.18g, 8.637mmol, 75.12%))를 무색 오일로 얻었다. ESI m/z: 716.5(M+H)+.
단계 3
DCM(20 mL) 중의 화합물 90-4 ((2S)-6-(1-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (90-4, 6.18 g, 8.633 mmol))의 용액에 TFA(4 mL, 53.850 mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 증발시키고 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 90-5 ((2S)-6-(1-아미노-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (90-5, 4.2 g, 6.821 mmol, 79.01%))을 무색 오일로 얻었다. ESI m/z: 616.4(M+H)+.
단계 4
MeOH (25mL) 중의 화합물 90-5 ((2S)-6-(1-아미노-3,6,9,12- 테트라옥사펜타데칸-15-아미도)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (90-5, 4.2g, 6.821mmol))의 용액에 D-글루코스(7.37g, 40.926mmol) 및 NaBH3CN(2.57g, 40.926mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 60℃에서 24시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 농축하고 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 화합물 90-6 (생성물 (2S)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-6-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-펜타하이드록시-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자도코산아미도]헥산 산 (90-6, 5.16g, 5.466mmol, 80.12%))을 무색 오일로 얻었다. ESI m/z: 945.6(M+H)+.
단계 5
DMF(5 mL) 중의 화합물 90-6 ((2S)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-6-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-펜타하이드록시-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자도코산아미도]헥산 산 (90-6, 168 mg, 0.178 mmol))의 용액에 화합물 90-7 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (90-7, 150mg, 0.178mmol)), DIPEA(27.58mg, 0.214mmol) 및 HATU(71.05mg, 0.187mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 pH 6으로 조정하고 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 90-8 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-펜타하이드록시-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자도코산아미도]펜틸]카르바메이트 (90-8, 217mg, 0.123mmol, 69.01%))를 얻었다. ESI m/z : 884.1 (M/2+H)+.
단계 6
DMF(2mL) 중의 화합물 90-8 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-펜타하이드록시-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자도코산아미도]펜틸]카르바메이트 (90-8, 217mg, 0.123mmol))의 용액에 디에틸 아민 (0.4mL, 2.501mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 pH 6으로 조정하고 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 90-9 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-펜타하이드록시-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자도코산아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (90-9, 138 mg, 0.089 mmol, 72.74%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 773.5(M/2+H)+.
단계 7
DMF(2mL) 중의 화합물 90-9 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-펜타하이드록시-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자도코산아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (90-9, 138mg, 0.089mmol))의 용액에 DIPEA(17.32mg, 0.134mmol) 및 화합물 90-10 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (90-10, 41.31mg, 0.134mmol))를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 pH 6으로 조정하고 Prep-HPLC(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 PB090 ({4-[(2S)-5-(카르바모일아미노)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도]-6-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-펜타하이드록시-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자도코사나미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (PB090, 32mg, 0.018mmol, 20.61%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 580.5(M/3+H)+, 체류 시간 6.558 분(HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.03 (s,1H), 8.14-8.12 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 8.08-8.05 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.98-7.96 (d, J = 8.0 Hz,1H), 7.83-7.81 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.78-7.76 (d, J = 10.8 Hz,1H), 7.67-7.64 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.61-7.59 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.37-7.35 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.54 (s, 1H), 6.01 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.45 (brs, 6H), 5.29-5.27 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.86-4.74 (m, 2H), 4.65-4.40 (m, 5H), 4.40-4.35 (m, 1H), 4.27-4.17 (m, 2H), 4.04-3.94 (m, 2H), 3.79-3.76 (m, 2H), 3.69-3.67 (m, 2H), 3.67-3.54 (m, 8H), 3.53-3.42 (m, 18H), 3.29-3.27 (m, 4H), 3.20-2.90 (m, 6H), 2.37 (s, 3H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.22-2.08 (m, 4H), 2.02-1.81 (m, 3H), 1.71-1.56 (m, 3H), 1.52-1.42 (m, 6H), 1.40-1.14 (m, 8H), 0.89-0.81 (m, 9H) ppm. TFA 상의 카르복실기의 양성자 하나가 밝혀졌다.
실시예 22 : 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB091)의 제조.
Figure pct00475
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB091)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
DCM(10mL) 중의 화합물 91-1 (1-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-온 산 (91-1, 560mg, 0.781mmol))의 용액을 TFA(2mL, 26.925mmol)로 처리하고, LCMS가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축하고, 잔류물을 DCM에 현탁시키고 다시 농축하여 미정제 생성물 91-2 (1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-온 산, TFA 염 (91-2, 600mg, 0.821mmol, 105.09%))을 백색 고체로 얻었다. 그 생성물을 다음 단계에서 그대로 사용하였다. ESI m/z = 618.5 (M+H)+.
단계 2
메탄올(16 mL) 중의 화합물 91-2 (1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-온 산, TFA 염 (91-2, 570.91mg, 0.781mmol)), 화합물 91-3 ((3R,4S)-3,4,5-트리하이드록시펜타날 (91-3, 0.395mL, 3.124mmol)) 및 NaCNBH3 (0.121mL, 3.124mmol)의 반응 용액을 LCMS에 의해 표시된 바와 같이 반응이 완료될 때까지 N2 하에 환류 하에 18시간 동안 가열하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 물에 용해시킨 후 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 생성물 91-4 ((43R,44S)-43,44,45-트리하이드록시-40)-[(3R,4S)-3,4,5-트리하이드록시펜틸]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자펜타테트라콘타노익 산 (91-4, 700mg, 0.821mmol, 105.08%))를 과량의 리보스와 혼합된 백색 폼(foam)으로 었얻다. ESI m/z : 427.8 (M/2+H)+, 854.6 (M+H)+.
단계 3
무수 DMF(2.0mL) 중의 화합물 91-4 ((43R,44S)-43,44,45-트리하이드록시-40-[(3R,4S)-3,4,5-트리하이드록시펜틸]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자펜타테트라콘타노익 산 (91-4, 214.68mg, 0.252mmol)), 화합물 91-5 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-5-아미노-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바메이트 (91-5, 150mg, 0.126mmol)) 및 DIPEA(32.47mg, 0.252mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, 무수 DMF(0.5 mL)에 용해된 HATU(47.85 mg, 0.126 mmol) 용액을 천천히 첨가하였다. 첨가 후, 생성된 용액을 LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 실온에서 추가 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 화합물 91-6 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(43R,44S)-43,44,45-트리하이드록시-40-[(3R,4S)-3,4,5-트리하이드록시펜틸]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자펜타테트라콘탄아미도]펜틸]카르바메이트 (91-6, 160mg, 0.079mmol, 62.72%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 507.8 (M/4+H)+, 676.7 (M/3+H)+.
단계 4
DMF(1.5mL) 중의 화합물 91-6 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(43R,44S)-43,44,45-트리하이드록시-40-[(3R,4S)-3,4,5-트리하이드록시펜틸]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자펜타테트라콘탄아미도]펜틸]카르바메이트 (91-6, 80mg, 0.039mmol))의 용액을 실온에서 교반하고 디에틸 아민(0.08mL, 0.777mmol)을 첨가하였다. LCMS가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지 생성된 용액을 추가로 1시간 동안 교반하였다. 디에틸 아민을 진공 하에 제거하고 DMF 중 잔류물을 Prep-HPLC (10mM 암모니아 중탄산염)로 정제하여 예상 생성물 91-7 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(43R,44S)-43,44,45-트리하이드록시-40-[(3R,4S)-3,4,5-트리하이드록시펜틸]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자펜타테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (91-7, 30mg, 0.017mmol, 42.12%))를 백색 고체로 얻었다. SI m/z : 903.7 (M/2+H)+, 602.7 (M/3+H)+. 1H NMR: (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.11 (s, 1H), 8.35-8.31(m, 5H), 8.09-8.06 (m, 2H), 7.83-7.77 (m, 2H), 7.61 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 6.09 (s, 1H), 5.46 (s, 4H), 5.30-5.29 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.41-4.34 (m, 1H), 4.27-4.23 (m, 1H), 3.59-3.56 (m, 4H), 3.50-3.47 (m, 44 H), 3.47-3.46 (m, 2H), 3.36-3.30 (m, 4H), 3.30-3.22 (m, 4H), 3.14-3.08 (m, 2H), 3.03-2.95 (m, 4H), 2.68-2.56 (m, 6H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J = 6.4Hz, 2H), 2.22-2.13 (m, 4H), 2.00-1.84 (m, 4H), 1.76-1.65 (m, 4H), 1.65-1.56 (m, 3H), 1.46-1.28 (m, 10H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm. TFA 상의 카르복실기의 두 양성자는 8.35-8.31ppm 사이에서 나타났다.
단계 5
DMF(2mL) 중의 화합물 91-7 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(43R,44S)-43,44,45-트리하이드록시-40-[(3R,4S)-3,4,5-트리하이드록시펜틸]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자펜타테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (91-7, 30mg, 0.017mmol))의 용액에 DIPEA(3.30mg, 0.026mmol) 및 화합물 91-8 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (91-8, 7.86mg, 0.026mmol))를 첨가했다. 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 Prep-HPLC (0.01% TFA)로 정제하여 생성물 PB091 ({4-[(2S)-5-(카르바모일아미노)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도]-6-[(43R,44S)-43,44,45-트리하이드록시-40-[(3R,4S)-3,4,5-트리하이드록시펜틸]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자펜타테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (PB091, 7.5mg, 0.004mmol, 22.58%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 667.0(M/3+H)+, 500.8(M/4+H)+, 체류 시간 5.791분(HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.03 (s, 1H), 9.10 (brs, 1H), 8.13-8.10 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.07-8.05 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.98-7.96 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.83-7.80 (t, J = 5.2Hz, 1H), 7.77-7.74 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 7.68-7.65 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.61-7.59 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.38-7.35 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 6.99 (s, 2H), 6.54 (s, 1H), 6.02-6.01 (m, 1H), 5.45 (brs, 4H), 5.29-5.26 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.91 (brs, 2H), 4.76 (brs, 2H), 4.52 (brs, 2H), 4.38-4.36 (m, 1H), 4.25-4.17 (m, 2H), 3.75-3.74 (m, 2H), 3.58-3.52 (m, 6H), 3.51-3.46 (m, 44H), 3.37-2.91 (m, 16H), 2.20 (s, 3H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.21-2.08 (m, 4H), 2.01-1.83 (m, 6H), 1.75-1.59 (m, 6H), 1.48-1.36 (m, 6H), 1.29-1.24 (m, 3H), 1.23-1.16 (m, 4H), 0.89-0.81 (m, 9H) ppm. TFA 상의 카르복실기의 양성자 하나가 밝혀졌다.
실시예 23: 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB092)의 제조.
Figure pct00476
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 포함하는 약물-링커 (PB092)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
메탄올(16 mL) 중의 화합물 92-1 (1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-온 산, TFA 염 (92-1, 570.91 mg, 0.781 mmol)), 화합물 92-2 ((2S,3S,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥산알(92-2, 562.32 mg, 3.124 mmol)) 및 Na(CN)BH3 (193.69 mg, 3.124 mmol)의 반응 혼합물을 N2 하에서 환류 하에 LCMS에 의해 표시된 바와 같이 반응이 완료될 때까지 18시간 동안 가열하였다. 회전 증발기로 용매를 증발시키고, 잔류물을 물에 용해시키고 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 생성물 92-3 ((42R,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘타노익 산 (92-3, 650mg, 0.687mmol, 87.98%))을 백색 폼으로 얻었다. ESI m/z : 473.9 (M/2+H)+. 946.6 (M+H)+.
단계 2
무수 DMF(4 mL) 중의 화합물 92-3 ((42R,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘타노익 산 (92-3, 199.95mg, 0.212mmol)), 화합물 92-4 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-5-아미노-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바메이트 (92-4, 210mg, 0.176mmol)) 및 DIPEA(8.02mg, 0.062)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, 무수 DMF(4 mL)에 녹인 HATU(67.04 mg, 0.176 mmol)의 용액을 5분에 걸쳐 적가했다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 화합물 92-5 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(42R,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜틸]카르바메이트 (92-5, 240mg, 0.113mmol, 64.22%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z = 707.2 (M/2+H)+, 530.9 (M/3+H)+. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 10.06 (s, 1H), 8.16 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.95 (brs, 1H), 7.88 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.83-7.77 (m, 2H), 7.73-7.70 (m, 3H), 7.60 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 3.6Hz, 1H), 7.43-7.31 (m, 7H), 6.54 (s, 1H), 5.99 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.50-5.34 (m, 5H), 5.34-5.24 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.67-4.23 (m, 10H), 4.07-3.96 (m, 1H), 3.96-3.83 (m, 2H), 3.83-3.76 (m, 2H), 3.65-3.44 (m, 62H), 3.24-3.11 (m, 4H), 3.11-2.89 (m, 6H), 2.38(s, 3H), 2.29 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 2.22-2.10 (m, 2H), 2.00-1.81 (m, 3H), 1.70-1.48 (m, 4H), 1.48-1.24 (m, 7H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm. TFA 상의 카르복실기의 양성자 하나가 밝혀졌다.
단계 3
DMF(1mL) 중의 화합물 92-5 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(42R,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜틸]카르바메이트(92-5, 230 mg, 0.109 mmol))의 용액을 실온에서 교반하고, 디에틸 아민(0.11 mL, 1.068 mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 완료될 때까지 30분 동안 교반하였다(LCMS로 모니터링함). 이어서, 디에틸 아민을 증발시키고 DMF 중의 잔류물을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 예상 생성물 92-6 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(42R,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (92-6, 130mg, 0.069mmol, 63.13%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 949.6 (M/2+H)+, 633.2 (M/3+H)+.
단계 4
무수 DMF(1 mL) 중의 화합물 92-6 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(42R,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (92-6, 50mg, 0.026mmol)) 및 화합물 92-7 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (92-7, 9.74mg, 0.032mmol))의 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, DIPEA(5.10 mg, 0.040 mmol)를 첨가했다. LCMS가 출발 아민이 실질적으로 소모되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 추가로 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 생성된 용액을 PrepHPLC (0.01% TFA)로 직접 정제하여 PB092 ({4-[(2S)-5-(카르바모일아미노)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도]-6-[(42R,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥사아미도]-3-메틸부탄아미도]펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (PB092, 20mg, 0.010mmol, 36.31%))의 TFA 염을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 697.5(M/3+H)+, 체류 시간 5.759분(HPLC). 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 10.03 (s, 1H), 8.12 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.82-7.77 (m, 2H), 7.66 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.54 (s, 1H), 5.99 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 5.49-5.34 (m, 5H), 5.34-5.24 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.72-4.31 (m, 7H), 4.31-4.17 (m, 2H), 3.95-3.87 (m, 2H), 3.81-3.76 (m, 2H), 3.65-3.46 (m, 6H), 3.26-3.16 (m, 4H), 3.11-2.92 (m, 6H), 2.38(s, 3H), 2.29 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 2.24-2.07 (m, 4H), 2.00-1.83 (m, 3H), 1.72-1.56 (m, 3H), 1.48-1.41 (m, 6H), 1.36-1.13 (m, 8H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm. TFA 상의 카르복실기의 양성자 하나가 밝혀졌다.
실시예 24 : 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB093)의 제조.
Figure pct00477
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB093)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
MeOH(8mL) 중의 화합물 93-1 (1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-온 산 (93-1, TFA 염, 500mg, 0.684mmol))의 용액을 화합물 93-2 ((2R,3S,4R)-2,3,4,5-테트라하이드록시펜타날 (93-2, 410.75mg, 2.736mmol))로 처리하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서 나트륨 시아노보로하이드라이드(171.93 mg, 2.736 mmol)를 첨가하고, 그 혼합물을 24시간 동안 50℃로 가온하였다. 용액을 절반 부피로 농축하고 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 93-3 ((42S,43R,44R)-42,43,44,45-테트라하이드록시-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-테트라하이드록시펜틸]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자펜타테트라콘타노익 산(93-3, 417 mg, 0.471 mmol, 68.81%))을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 886.6(M+H)+.
단계 2
DMF(2 mL) 중의 화합물 93-3 ((42S,43R,44R)-42,43,44,45-테트라하이드록시-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-테트라하이드록시펜틸]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자펜타테트라콘타노익 산 (93-3, 200 mg, 0.226 mmol))의 용액에 화합물 93-4 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-5-아미노-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바메이트 (93-4, 228.59mg, 0.192mmol)) 및 DIPEA(43.76mg, 0.339) mmol)를 첨가하고, 이어서 DMF(0.5 mL) 중의 HATU(85.83 mg, 0.226 mmol) 용액을 천천히 첨가하였다. 첨가 후, 반응물을 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축하고 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 화합물 93-5 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(42S,43R,44R)-42,43,44,45-테트라하이드록시-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-테트라하이드록시펜틸]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자펜타테트라콘탄아미도]펜틸]카르바메이트 (93-5, 290mg, 0.141mmol, 62.38%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z 1030.7(M/2+H)+.
단계 3
DMF(2mL) 중의 화합물 93-5 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(42S,43R,44R)-42,43,44,45-테트라하이드록시-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-테트라하이드록시펜틸]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자펜타테트라콘탄아미도]펜틸]카르바메이트 (93-5, 290mg, 0.141mmol))의 용액을 디에틸 아민(0.2mL, 1.250mmol)과 조합하고 실온에서 완료될 때까지 1시간 동안 교반했다 (LCMS로 모니터링). 그런 다음 회전 증발기로 디에틸 아민을 제거하고 잔류물을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 93-6 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(42S,43R,44R)-42,43,44,45-테트라하이드록시-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-테트라하이드록시펜틸]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자펜타테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (93-6, 100mg, 0.054mmol, 38.65%))을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 919.7 (M/2+H)+.
단계 4
DMF(1.5mL) 중의 화합물 93-6 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(42S,43R,44R)-42,43,44,45-테트라하이드록시-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-테트라하이드록시펜틸]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자펜타테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (93-6, 110mg, 0.060mmol))의 용액을 실온에서 교반하고, 이어서 DIPEA(0.015 mL, 0.090 mmol) 및 화합물 93-7 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (93-7, 20.14mg, 0.065mmol))를 순차적으로 첨가하였다. LCMS가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지 생성된 용액을 추가로 1시간 동안 교반하였다. 완성된 반응 용액을 Prep-HPLC(0.01% TFA)로 직접 정제하여 생성물 PB093 ({4-[(2S)-5-(카르바모일아미노)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도]-6-[(42S,43R,44R)-42,43,44,45-테트라하이드록시-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-테트라하이드록시펜틸]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자펜타테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (PB093, 51.21mg, 0.025mmol, 42.12%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 677.5(M/3+H)+, 체류 시간 5.924분(HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.02 (s, 1H), 8.19 (brs, 1H), 8.12 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.82-7.76 (m, 2H), 7.66 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.53 (s, 1H), 6.00 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.46-5.33 (m, 6H), 5.33-5.23 (m, 3H), 5.09 (s, 2H), 4.89-4.59 (m, 6H), 4.41-4.35 (m, 1H), 4.29-4.18 (m, 2H), 4.03-3.94 (m, 2H), 3.79-3.77 (m, 2H), 3.59-3.56 (m, 8H), 3.54-3.37 (m, 52H), 3.28-3.22 (m, 2H), 3.15-2.89 (m, 6H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.24-2.08 (m, 4H), 2.01-1.82 (m, 3H), 1.73-1.56 (m, 3H), 1.53-1.43 (m, 6H), 1.43-1.36 (m, 3H), 1.33-1.16 (m, 4H), 0.94-0.74 (m, 9H). TFA에서 카르복실기의 양성자 하나가 밝혀졌다.
실시예 25 : 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB094)의 제조.
Figure pct00478
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB094)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
DMF (5 mL) 중의 화합물 94-2 ((2S)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)펜탄디온 산 (94-2, 19.39 mg, 0.052 mmol))의 용액에 HATU (59.89 mg, 0.158 mmol) 및 DIPEA(13.57 mg, 0.105 mmol)를 첨가한 후, 화합물 94-1 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S))-2-아미노-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사시클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (94-1, 200mg, 0.105mmol))를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하여 완료하였다 (LCMS로 모니터링함). 이어서, 생성된 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 94-3 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1,3-비스({[(1S))-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜틸]카르바모일})프로필]카르바메이트 (94-3, 108mg, 0.026mmol, 49.84%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 826.4(M/5+H)+.
단계 2
DMF (3 mL) 중의 화합물 94-3 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1,3-비스({[(1S))-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜틸]카르바모일})프로필]카르바메이트 (94-3, 108mg, 0.026mmol))의 용액에 디에틸 아민 (0.6 mL, 3.751 mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 TFA를 사용하여 pH 6으로 조정한 후 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 94-4({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-4-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜틸]카르바모일}부탄아미도]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R),5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (94-4, 90mg, 0.023mmol, 88.08%))의 TFA 염을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 977.3(M/4+H)+.
단계 3
DMF (3 mL) 중의 화합물 94-4 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-4-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜틸]카르바모일}부탄아미도]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R),5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (94-4, 90 mg, 0.023 mmol))의 용액에 DIPEA(5.96 mg, 0.046 mmol) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (14.21mg, 0.046mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 pH 6으로 조정하고 Prep-HPLC(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 PB094 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (PB094, 35mg, 0.009mmol, 37.06%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 820.7(M+H)+, 1025.5(M+H)+, 체류 시간 5.452분(HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.04 (s, 2H), 8.19-8.15 (m, 4H), 8.14-8.12 (m, 4H), 8.07-8.05 (m, 1H), 7.97 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.89-7.82 (m, 3H), 7.76 (d, J = 10.8 Hz, 2H), 7.62-7.60 (m, 4H), 7.37-7.35 (m, 4H), 7.31 (s, 2H), 7.00 (s, 2H), 6.53 (s, 2H), 6.00 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 5.51-5.44 (m, 12H), 5.34-5.21 (m, 6H), 5.08 (s, 4H), 4.88-4.70 (m, 4H), 4.55-4.43 (m, 8H), 4.38-4.33 (m, 3H), 4.29-4.25 (m, 2H), 4.20-4.14 (m, 3H), 4.01-3.99 (m, 4H), 3.79-3.78 (m, 4H), 3.69-3.66 (m, 4H), 3.62-3.56 (m, 18H), 3.53-3.48 (m, 88H), 3.46-3.42 (m, 10H), 3.27-3.12 (m, 7H), 3.12-2.90 (m, 12H), 2.37 (s, 6H), 2.31-2.27 (m, 4H), 2.21-2.01 (m, 8H), 1.95-1.79 (m, 8H), 1.73-1.55 (m, 8H), 1.49-1.40 (m, 8H), 1.40-1.31 (m, 6H), 1.31-1.14 (m, 6H), 0.89-0.82 (m, 18H) ppm. TFA에서 카르복실기의 두 양성자가 밝혀졌다.
실시예 26 : MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB095)의 제조.
Figure pct00479
MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB095)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
MeOH(25mL) 및 DCM(50mL) 중의 화합물 95-1 ((2S)-5-(카르바모일아미노)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)펜탄산 (95-1, 6.0 g, 15.097 mmol)), 화합물 95-2 ((4-아미노페닐)메탄올 (95-2, 3.72g, 30.195mmol)) 및 EEDQ(14.93g, 60.390mmol)의 용액을 실온에서 18시간 동안 교반하였고, LCMS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 반응 용액을 농축하여 건조시킨 후 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 화합물 95-3 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-{[4-(하이드록시메틸)페닐]카르바모일}부틸]카르바메이트 (95-3, 6.45 g, 12.834 mmol, 85.01%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 503.3(M+H)+.
단계 2
MeOH(20mL) 중의 화합물 95-3 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-{[4-(하이드록시메틸)페닐]카르바모일}부틸]카르바메이트 (95-3, 6.45g, 12.834mmol))의 용액에 디에틸 아민(5mL, 31.260mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하여 완전한 탈보호를 달성하였다. 용액을 농축하고 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 95-4 ((2S)-2-아미노-5-(카르바모일아미노)-N-[4-(하이드록시메틸)페닐]펜탄아미드 (95-4, 3.25g, 11.594 mmol, 90.34%))를 연한 황색 고체로 얻었다. ESI m/z : 281.3(M+H)+.
단계 3
DMF(10 mL) 중의 화합물 95-4 ((2S)-2-아미노-5-(카르바모일아미노)-N-[4-(하이드록시메틸)페닐]펜탄아미드 (95-4, 3.76 g, 13.413 mmol)), 화합물 95-5 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일(2S)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-4-메틸펜타노에이트 (95-5, 6.65 g, 14.755 mmol)) 및 DIPEA(3.47 g, 26.826 mmol)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하여 완료하였다. 반응 혼합물을 역상 플래시 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 화합물 95-6 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-{[4-(하이드록시메틸)페닐]카르바모일}부틸]카르바모일}-3-메틸부틸]카르바메이트 (95-6, 4.8 g, 7.796 mmol, 58.12%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 616.3 (M+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.97 (s, 1H), 8.05 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.74-7.70 (m, 2H), 7.55-7.51 (m, 3H), 7.44-7.39 (m, 2H), 7.34-7.30 (m, 2H), 7.23 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.97 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.10 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.43-4.39 (m, 3H), 4.32-4.20 (m, 3H), 4.15-4.05 (m, 1H), 3.07-2.89 (m, 2H), 1.74-1.55 (m, 3H), 1.51-1.32 (m, 4H), 0.90-0.83 (m, 6H) ppm.
단계 4
DMF(5 mL) 중의 95-6 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-{[4-(하이드록시메틸)페닐]카르바모일}부틸]카르바모일}-3-메틸부틸]카르바메이트 (95-6, 2.0g, 3.248mmol)), 비스(4-니트로페닐) 카르보네이트 (3.95g, 12.993mmol) 및 DMAP(0.40g, 3.248mmol)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 그런 다음 반응 혼합물을 물 방울로 켄칭하고 역상 플래시 크로마토그래피(중성 용출액)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 화합물 95-7 ({4-[(2S)-5-(카르바모일아미노)-2-[(2S)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-4-메틸펜탄아미도]펜탄아미도]페닐}메틸 4-니트로페닐 카르보네이트 (95-7, 1.33 g, 1.703 mmol, 52.44%))를 연한 황색 고체로 얻었다. ESI m/z : 781.3 (M+H)+.
단계 5
무수 DMF(4 mL) 중의 화합물 95-7 ({4-[(2S)-5-(카르바모일아미노)-2-[(2S)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-4-메틸펜탄아미도]펜탄아미도]페닐}메틸 4-니트로페닐 카르보네이트 (95-7, 340mg, 0.435mmol)), 화합물 95-8 ((2S)-N-[(1S)-1-{[(3S,4S),5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미드 (95-8, 312.63 mg, 0.435 mmol)) 및 HOBt (58.84 mg, 0.435 mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 후, DIPEA(112.34 mg, 0.871 mmol)를 첨가하였다. 생성된 황색 용액을 LCMS가 두 출발 물질 모두가 실질적으로 소모되었음을 나타낼 때까지 밤새 교반하였다. 생성된 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 화합물 95-9 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필](메틸)카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-3-메틸부틸]카르바메이트 (95-9, 320mg, 0.235mmol, 54.10%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 680.6 (M/2+H)+; 718.7(MMAE의 단편 조각); 598.4(링커 Fmoc-Leu-Cit-PAB의 단편 조각).
단계 6
CH3CN(10 mL) 및 물(5 mL) 중의 화합물 95-9 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필](메틸)카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-3-메틸부틸]카르바메이트 (95-9, 320mg, 0.235mmol))의 용액을 실온에서 교반하고 디에틸 아민(0.8 mL, 7.766 mmol)을 첨가하였다. 생성 된 용액을 4시간 동안 교반하여 완료하였다. 디에틸 아민을 진공 하에 증발시키고 잔류물을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 95-10 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-4-메틸펜탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (95-10, 220mg, 0.193mmol, 82.18%))의 TFA 염을 백색 고체로서 얻었고 그 생성물을 어떠한 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. ESI m/z : 569.5(M/2+H)+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.21 (s, 1H), 8.79 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.31-8.06 (m, 4H), 7.91 (d, J = 8.8 Hz, 0.5H), 7.65 (d, J = 8.4Hz, 0.5H), 7.60-7.57 (m, 2H), 7.37-7.24 (m, 6H), 7.20-7.14 (m, 1H), 6.08 (s, 1H), 5.60-5.31 (m, 2H), 5.12-4.98 (m, 2H), 4.74-4.62 (m, 1H), 4.55-4.40 (m, 3H), 4.30-4.23 (m, 1H), 4.05-3.92 (m, 2H), 3.85-3.76 (m, 2H), 3.58-3.55 (m, 2H), 3.32-3.12 (m, 9H), 3.08-2.97 (m, 4H), 2.89-2.83 (m, 3H), 2.44-2.39 (m, 1H), 2.29-2.23 (m, 1H), 2.16-1.92 (m, 3H), 1.84-1.39 (m, 13H), 1.31-1.25 (m, 1H), 1.06-0.97 (m, 6H), 0.92-0.75 (m, 24 H) ppm. TFA에서 카르복실기의 양성자 하나가 밝혀졌다.
단계 7
무수 DMF(3 mL) 중의 화합물 95-10 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-4-메틸펜탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (95-10, 218mg, 0.192mmol)), 화합물 95-11 ((2S)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산 산 (95-11, 247.57mg, 0.211mmol)) 및 DIPEA(49.45mg, 0.383mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반하여 출발 산이 완전히 용해되도록 한 다음, 무수 DMF(1 mL)에 녹인 HATU(80.16 mg, 0.211 mmol) 용액을 천천히 첨가했다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 생성된 용액을 추가로 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 화합물 95-12 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-4-메틸펜탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (95-12, 280mg, 0.122mmol, 63.69%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 765.5 (M/3+H)+.
단계 8
메탄올 중의 화합물 95-12 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-4-메틸펜탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (95-12, 260 mg, 0.113 mmol))의 용액을 실온에서 교반하고, MeOH(2 mL) 중의 3M HCl을 천천히 첨가하였다. 생성된 담황색 용액을 완전한 탈보호가 달성될 때까지(LCMS에 의해 모니터링됨) 추가 4시간 동안 계속 교반하였다. 그런 다음 용액을 회전 증발기로 농축하여 용매를 제거하고 잔류물을 물로 용해시킨 후 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 화합물 95-13 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-4-메틸펜탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (95-13, 160mg, 0.073mmol, 64.35%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 732.2 (M/3+H)+, 718.6 (단편 MMAE), 478.2 ((링커Boc-Lys(PEG12-당)-Leu-Cit-pab -18) /3+H)+.
단계 9
무수 DMF (1.5 mL) 중의 화합물 95-13 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-4-메틸펜탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (95-13, 80mg, 0.036mmol)) 및 DIPEA(7.06mg, 0.055mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반하여 모든 물질을 용해시켰다. 그런 다음 무수 DMF(0.5mL) 중의 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (95-14, 12.36mg, 0.040mmol)의 용액을 주사기로 5분에 걸쳐 적가했다. 첨가 후, 생성된 용액을 LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었음을 나타낼 때까지 추가로 4시간 동안 교반하였다. 이어서 생성된 용액을 Prep-HPLC(0.01% TFA)로 직접 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 LabConc로 동결건조하여 PB095 ({4-[(2S)-5-(카르바모일아미노)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-4-메틸펜탄아미도]펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (PB095, 50mg, 0.021mmol, 57.44%))의 TFA 염을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 542.5 ((링커 단편, (M-717-26-18)3+H)+; 796.6 (M/3+H)+. 체류 시간 6.250분(HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.00 (s, 1H), 8.34-8.07 (m, 1.5 H), 8.00 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.93-7.88 (m, 2.5 H), 7.82-7.79 (m, 1H), 7.65-7.57 (m, 2.5 H), 7.35-7.23 (m, 6H), 7.18-7.10 (m, 1.5H), 7.00 (s, 2H), 5.99-5.98 (m, 1H), 5.53-5.25 (m, 4H), 5.14-4.95 (m, 2H), 4.83-4.17 (m, 11H), 4.04-3.92 (m, 4H), 3.79-3.77 (m, 2H), 3.70-3.66 (m, 2H), 3.61-3.56 (m, 8H), 3.53-3.45 (m, 44H), 3.25-3.12 (m, 14H), 3.05-2.83 (m, 14H), 2.44-2.39 (m, 1H), 2.31-2.14 (m, 4H), 2.14-1.96 (m, 6H), 1.85-1.44 (m, 18H), 1.36-1.16 (m, 10H), 1.06-0.97(m, 6H), 0.89-0.75 (m, 27H) ppm. TFA에서 카르복실기의 한 개의 양성자가 밝혀졌다.
실시예 27: MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB096)의 제조.
Figure pct00480
MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB096)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
건조 DCM(40 mL) 중의 화합물 96-1 (1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-온 산 (96-1, 5.00 g, 10.267mmol)) 및 HOSu(1.77g, 15.401mmol)의 투명한 용액을 실온에서 교반하고 EDCI(2.95g, 15.401mmol)를 첨가하였다. 완전한 전환이 달성될 때까지 그 용액을 1시간 동안 계속 교반하였다. 이어서, 용액을 추가의 DCM(20 mL)으로 희석하고 물(50 mL)로 세척하고, 유기층을 분리하고 물 층을 DCM(50 mL* 2)으로 추출하였다. 조합된 수집된 DCM 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과한 다음, 감압 하에 농축하여 미정제 물질을 무색 오일 화합물 96-2로 얻었고, 이는 다음 단계에서 그대로 사용 되었다. ESI m/z = 585.3 (M+H)+.
단계 2
DMF(12mL) 중의 화합물 96-3 (N6-(tert-부톡시카르보닐)-L-리신 (96-3, 2.233mL, 10.267mmol))의 현탁액을 실온에서 교반한 후, 물(3 mL) 중의 중탄산나트륨(0.86 g, 10.267 mmol)의 용액을 첨가하였다. 대부분의 출발 산이 용매에 용해될 때까지 현탁액을 20분 동안 교반하였다. 그런 다음 화합물 96-2 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 1-(9H-플루오렌-9-일)-3-옥소-2,7,10,13,16-펜타옥사-4-아자노나데칸-19-오에이트 (96-2, 6.00g, 10.267mmol))을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 완성된 반응 용액을 역상 컬럼 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 화합물 96-4 (N2-(1-(9H-플루오렌-9-일)-3-옥소-2,7,10,13,16-펜타옥사-4-아자노나데칸-19-오일)-N6-(tert-부톡시카르보닐)-L-리신 (96-4, 5.40g, 7.552mmol, 73.56%))을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 716.5 (M+H)+, 738.4 (M+Na)+. 1H NMR (400 MHz, 400 MHz) δ 7.89 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.86-7.77 (m, 1H), 7.69 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.44-7.38 (m, 2H), 7.37-7.31 (m, 2H),6.75 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.30-4.19 (m, 2H), 4.04-3.99 (m, 1H), 3.59-3.54 (m, 2H), 3.50-3.47 (m, 12H), 3.43-3.39 (m, 2H), 3.16-3.11 (m, 2H), 2.88-2.83 (m, 2H), 2.40-2.32 (m, 2H), 1.67-1.63 (m, 1H), 1.55-1.48 (m, 1H), 1.36 (s, 9H), 1.33-1.29 (m, 2H), 1.25-1.20 (m, 2H), 0.99 (d, J= 6.4Hz, 2H) ppm. 카르복실기는 밝혀지지 않았다.
단계 3
DCM(16mL) 중의 화합물 96-4 ((2S)-6-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-2-[1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도]헥산 산 (96-4, 5.4g, 7.544mmol))의 용액을 실온에서 교반한 후 TFA(4mL, 53.850mmol)를 첨가하였다. 생성된 황색 용액을 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서 TFA 및 용매를 증발시키고, 잔류물을 다시 DCM에 용해시키고 농축하여 건조시켰다. 이 과정은 3 회 반복되었으며, 생성물 96-5 ((1-(9H-플루오렌-9-일)-3-옥소-2,7,10,13,16-펜타옥사-4-아자노나데칸-19-오일)-L-리신 (96-5))의 미정제 TFA 염을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 616.4(M+H)+.
단계 4
무수 DCM (20mL) 중의 1-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-온 산 (1.58 g, 2.201mmol) 및 HOSu(0.53g, 4.597mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 후 EDCI (0.63g, 3.302mmol) 첨가하였다. 생성된 용액을 추가로 1시간 동안 교반한 다음, 추가 DCM(20mL)으로 희석하고 물(20mL)로 세척했다. 유기층을 수집하고 물 층을 DCM(40 mL*2)으로 추출하였다. 조합된 DCM 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 농축하여 미정제 생성물 96-6 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2,2-디메틸-4-옥소-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-트리데카옥사-5-아자테트라테트라콘탄-44-오에이트 (96-6, 2.5g, 3.069mmol, 100.15%))를 무색 오일로 얻었다. ESI m/z : 715.5 (M-100+H)+, 837.5(M+Na)+.
무수 DMF (22 mL) 중의 화합물 96-5 ((1-(9H-플루오렌-9-일)-3-옥소-2,7,10,13,16-펜타옥사-4-아자노나데칸-19-오일)-L-리신 (96-5, 1.55 g, 2.514 mmol)) 및 화합물 96-6 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2,2-디메틸-4-옥소-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-트리데카옥사-5-아자테트라테트라콘탄-44-오에이트 (96-6, 1.8g, 2.211mmol))의 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, DIPEA (0.57g, 4.422mmol) 주사기로 천천히 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었음을 나타낼 때까지 생성된 용액을 2시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 감압하에 농축하고 잔류물을 Prep-HPLC(0.01% TFA)로 직접 정제하여 화합물 96-7 ((2S)-6-(1-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)-2-[1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도]헥산 산 (96-7, 2.3g, 1.748mmol, 79.04%))을 무색 오일로 얻었다. ESI m/z : 608.5 ((M-100)/2+H)+.
단계 5
DCM (16mL) 중의 화합물 96-7 ((2S)-6-(1-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)-2-[1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도]헥산 산 (96-7, 2.3g, 1.748mmol))의 용액을 실온에서 교반한 후, TFA(4mL, 53.850mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 교반하여 완전한 탈보호를 달성하였다. 이어서, TFA 및 DCM을 증발시키고, 잔류물을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 예상 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조시켜 생성물 96-8 ((2S)-6-(1-아미노)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)-2-[1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도]헥산 산 (96-8, 2.1g, 1.728mmol, 99.06%))을 무색 오일로 얻었다. ESI m/z: 608.5　(M+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.89 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.86-7.80 (m, 2H), 7.71-7.61 (m, 1H), 7.44-7.40 (m, 2H), 7.37-7.33 (m, 2H), 6.29 (s, 1H), 4.30-4.21(m, 1H), 4.06-3.95 (m, 2H), 3.68-3.55 (m, 12H), 3.55-3.47 (m, 48H), 3.42-3.38 (m, 2H), 3.38-3.21 (m, 4H), 3.16-3.05 (m, 2H), 3.00-2.94 (m, 4H), 2.43-2.37 (m, 2H), 2.33-2.27 (m, 2H), 1.70-1.57(m, 1H), 1.58-1.44 (m, 1H), 1.38-1.18 (m, 4H) ppm. 아미노 그룹의 양성자 2개와 카르복실 그룹의 양성자 2개는 밝혀지지 않았다.
단계 6
메탄올 (32 mL) 상의 화합물 96-8 (((2S)-6-(1-아미노)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)-2-[1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도]헥산 산 (96-8, 2.0 g, 1.645 mmol)) 및 D-글루코스 (1.78g, 9.873mmol)의 현탁액을 질소 분위기 하에서 50℃로 가열한 다음 나트륨 시아노보로하이드라이드(0.62g, 9.873mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 밤새 (16 시간) 가열하였다. 이어서, 용액을 농축하여 건조시키고, 잔류 물을 물에 용해 시키고 역상 플래쉬 크로마토그래피 (0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 LabConco 상에서 동결 건조시켜 화합물 96-9 ((2S)-2-[1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산 산 (96-9, 2.0g, 1.296mmol, 78.74%))을 무색 오일로 얻었다. ESI m/z: 515.5 (M/3+H)+, 772.6 (M/2+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.02 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.83 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.44-7.39 (m, 2H), 7.35-7.31 (m, 3H), 4.76-4.37 (m, 4H), 4.30-4.28 (m, 2H), 4.23-4.19 (m, 1H), 4.15-4.09 (m, 1H),　4.03-3.91 (m, 1H), 3.75-3.64 (m, 2H), 3.59-3.56 (m, 6H), 3.56-3.46 (m, 56H), 3.41-3.17 (m, 18H), 3.17-3.12 (m, 2H), 3.03-2.97 (m, 2H), 2.97-2.54 (m, 5H), 2.41-2.34 (m, 2H), 2.29 (t, J = 6.4Hz, 2H), 1.71-1.65 (m, 1H), 1.60-1.51 (m, 1H), 1.38-1.31 (m, 2H), 1.31-1.24 (m, 2H) ppm. 카르복실기의 양성자 하나는 밝혀지지 않았다.
단계 7
무수 DMF(1.5 mL) 중의 화합물 96-9 ((2S)-2-[1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산 산 (96-9, 125mg, 0.081mmol)), 화합물 96-10 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (96-10, 90.97mg, 0.081mmol)) 및 DIPEA(20.89 mg, 0.162 mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 다음, 무수 DMF 중 HATU(30.79 mg, 0.081 mmol)를 주사기로 5분에 걸쳐 적가했다. 첨가 후, 생성된 용액을 모든 출발 아민이 소모될 때까지(LCMS로 모니터링함) 추가 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 화합물 96-11 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필](메틸)카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜틸]카르바모일}-3,6,9,12-테트라옥사테트라데칸-1-일)카르바메이트 (96-11, 100mg, 0.038mmol, 46.62%))를 출발 산과 혼합된 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 883.9 (M/3+H)+, 630.0 (링커 단편, (M-717-26-18)/3+H)+, 순도 60% 내지 66%. 불순물 산 ESI m/z : 515.5 (M/3+H)+,772.6 (M/2+H)+, 함량 35% 내지 29%.
단계 8
DMF(1.8 mL) 중의 화합물 96-11 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필](메틸)카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜틸]카르바모일}-3,6,9,12-테트라옥사테트라데칸-1-일)카르바메이트 (96-11, 100 mg, 0.038 mmol))의 용액을 실온에서 교반하고 디에틸 아민(0.2 mL, 1.941 mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 완료될 때까지 1시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 진공 하에서 증발시키고, DMF 중의 잔류물을 역상 플래시 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 예상 분획물을 얻었고, 이를 LabConco로 동결건조하여 생성물 96-12 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-(1-아미노-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (96-12, 75mg, 0.031mmol, 81.32%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 809.9 (M/3+H)+, 718.6 (단편, MMAE), 555.9 (링커 단편, (M-717-26-18)/3+H)+.
단계 9
무수 DCM(23 mL) 중의 4-{2-아자트리사이클로[10.4.0.0^{4,9}]헥사데카-1(16),4(9),5,7,12,14-헥사엔-10-인-2-일}-4-옥소부탄산 (DBCO-산, 710 mg, 2.328 mmol) 및 HOSu (401.56 mg, 3.492 mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, EDCI(669.38mg, 3.492mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 추가로 1.5시간 동안 교반하였다. 그 후 생성된 용액을 물(10 mL)로 세척하고, DCM 층을 분리하고 물 층을 추가 DCM(20 mL*2)으로 추출했다. 조합된 DCM 상을 농축하여 건조시키고 잔류물을 역상 플래쉬 크로마토그래피(중성 용출액)로 정제하여 화합물 96-13 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 4-{2-아자트리사이클로[10.4.0.0^{4,9}]헥사데카-1(12),4(9),5,7,13,15-헥사엔-10-인-2-일}-4-옥소부타노에이트 (96-13, 850mg, 2.114mmol, 90.83%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 403.2(M+H)+, 425.2(M+Na)+.
단계 10
무수 DMF(2mL) 중의 화합물 96-12 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-(1-아미노-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (96-12, 65mg, 0.027mmol)) 및 DIPEA (6.91mg, 0.054mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 후, 무수 DMF(2 mL) 중의 DBCO NHS에스테르(화합물 96-13, 10.78 mg, 0.027 mmol)의 용액을 주사기로 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었음을 나타낼 때까지 생성된 용액을 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서 생성된 용액을 Prep-HPLC(10 mM 중탄산암모늄)로 직접 정제하여 PB096 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-아자트리사이클로[10.4.0.0^{4,9}]헥사데카-1(12),4(9),5,7,13,15-헥사엔-10-인-2-일}-4-옥소부탄아미도)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (PB096, 45mg, 0.017mmol, 61.90%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 905.3 (M/3+H)+, 679.2 (M/4+H)+, 체류 시간 5.577 분 (HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.05 (s, 1H), 8.37-8.10 (m, 2H), 8.05-8.03 (m, 1H), 7.93-7.90 (m, 1H), 7.83-7.77 (m, 2H), 7.77-7.67 (m, 2H), 7.63-7.57 (m, 3H), 7.51-7.45 (m, 3H), 7.38-7.26 (m, 9H), 7.20-7.14 (m, 1H), 6.00-5.97 (m, 1H), 5.43-5.36 (m, 3H), 5.11-4.94 (m, 3H), 4.76-4.17 (m, 16H), 4.04-3.92 (m, 2H), 3.79-3.57 (m, 12H), 3.50-3.41 (m, 56H), 3.36-3.17 (m, 19H), 3.12-2.85 (m, 15H), 2.60-2.56 (m, 2H), 2.43-2.36 (m, 3H), 2.30-2.22 (m, 4H), 2.15-1.96 (m, 6H), 1.78-1.21(m, 20H), 1.05-0.97 (m, 6H), 0.89-0.77 (m, 24H) ppm.
실시예 28 : 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB097)의 제조.
Figure pct00481
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB097)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
DMF(2mL) 중의 화합물 97-1 ((2S)-2-(1-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산 산 (97-1, 200mg, 0.130mmol)), 화합물 97-2 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (97-2, 108.83 mg, 0.129 mmol)) 및 HATU(49.43 mg, 0.130 mmol), DIPEA(33.59 mg, 0.260 mmol)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였고 LCMS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 이어서, 반응 혼합물을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 화합물 97-3 (9H-플루오렌-9-일메틸 N-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜틸]카르바모일}-3,6,9,12-테트라옥사테트라데칸-1-일)카르바메이트 (97-3, 262mg, 0.111 mmol, 85.16%))를 연한 황색 고체로 얻었다. ESI m/z: 789.7 (M/3+H)+.
단계 2
DMF (2 mL) 중의 화합물 97-3 ((9H-플루오렌-9-일메틸 N-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜틸]카르바모일}-3,6,9,12-테트라옥사테트라데칸-1-일)카르바메이트 (97-3, 162mg, 0.068mmol))의 용액에 디에틸 아민(0.2mL, 0.2720mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 그런 다음 미정제 혼합물을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 화합물 97-4 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-(1-아미노-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (97-4, 78mg, 0.036mmol, 53.49%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 715.7(M/3+H)+.
단계 3
DMF(2 mL) 중의 화합물 97-4 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-(1-아미노-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (97-4, 78mg, 0.036mmol)), 화합물 97-5 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 4-{2-아자트리사이클로[10.4.0.04,9]헥사데카-1(12),4(9),5,7,13,15-헥사엔-10-인-2-일}-4-옥소부타노에이트 (97-5, 29.27mg, 0.073mmol) 및 DIPEA(9.40mg, 0.073mmol))의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하여 완전한 전환을 달성했다. 그런 다음 반응 혼합물을 Prep-HPLC(10mM NH4HCO3)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 LabConco로 동결건조 하여 PB097 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-아자트리사이클로[10.4.0.0^{4,9}]헥사데카-1(12),4(9),5,7,13,15-헥사엔-10-인-2-일}-4-옥소부탄아미도)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥사아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (PB097, 55mg, 0.023mmol, 62.18%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 811.5 (M/3+H)+. [참고: 생성물은 아미드 결합에서 부분적으로 절단되었고 DBCO 단편은 산성 LCMS에서 방출되었으므로, DBCO 유닛은 m/z 206으로 검출되었고 상응하는 대응 부분은 m/z 749((M-205+17)/3+H)+로 검출되었다. 기본 LCMS의 경우 엑사테칸 락톤 고리가 부분적으로 개방되었으며, 단편 이온이 m/z 817((M+18)/3+H)+로 검출되었다]. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.04 (s, 1H), 8.13 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.09-8.02 (m, 2H), 7.84-7.76 (m, 3H), 7.74-7.66 (m, 2H), 7.62-7.59 (m, 3H), 7.52- 7.42 (m, 3H), 7.40-7.27 (m, 6H), 6.54 (s, 1H), 5.99 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 5.45-5.43 (m, 4H), 5.34-5.23 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 5.02 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 4.60- 4.15 (m, 12H), 3.71-3.67 (m, 1H), 3.64-3.55 (m, 9H), 3.50-3.40 (m, 62H), 3.40-3.39 (m, 4H), 3.32-3.18 (m, 4H), 3.18-2.90 (m, 8H), 2.60-2.51 (m, 1H), 2.42-2.36 (m, 6H), 2.29 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.24-2.09 (m, 4H), 2.03-1.93 (m, 2H), 1.91-1.80 (m, 2H), 1.80-1.52 (m, 5H), 1.49-1.19 (m, 8H), 0.89- 0.80 (m, 9H) ppm.
실시예 29: MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB098)의 제조.
Figure pct00482
MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB098)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
DMF(10 mL) 중의 화합물 98-1 ((2S)-2-[1-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산 산(98-1, 3.0g, 1.943mmol))의 용액에 디에틸 아민 (1.1mL, 14.032mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하여 완전한 탈보호를 달성하였다. 이어서, 생성된 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 생성물 98-2 ((2S)-2-(1-아미노-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산 산 (98-2, 2.1g, 1.589mmol, 81.71%))을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 661.6 (M/2+H)+.
단계 2
DMF(10 mL) 중의 화합물 98-2 ((2S)-2-(1-아미노-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산산 (98-2, 2.1 g, 1.589 mmol))의 용액에 화합물 98-3 (펜타플루오로페닐 2-{2-[2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)아세트아미도]아세트아미도}아세테이트 (98-3, 0.92g, 1.589mmol)) 및 DIPEA(0.21g, 1.589mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 98-4 ((2S)-2-[1-(2-{2-[2-({[(9H-플루오렌-9)-일)메톡시]카르보닐}아미노)아세트아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산 산 (98-4, 2.2g, 1.283mmol, 80.59%))을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 858.2(M/2+H)+.
단계 3
MeCN(10 mL) 및 H2 O(6 mL) 중의 화합물 98-4 (2S)-2-[1-(2-{2-[2-({[(9H-플루오렌-9)-일)메톡시]카르보닐}아미노)아세트아미도]아세트아미도}아세트아미도)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산 산 (98-4, 2.2 g, 1.283 mmol))의 용액에 디에틸 아민(4 mL, 2.840 mmol)을 첨가하였다. rm 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하여 완료하였다. 생성된 용액을 농축하여 건조시키고 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 98-5 ((2S)-2-(1-{2-[2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도]아세트아미도)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산 산 (98-5, 1.55 g, 1.038 mmol, 81.15%))을 백색 겔로서 얻었다. ESI m/z: 747.1 (M/2+H)+, 498.5 (M/3+H)+.
단계 4
DMF (10 mL) 중의 화합물 98-5 ((2S)-2-(1-{2-[2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도]아세트아미도)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산 산 (98-5, 1.55g, 1.038mmol))의 용액에 화합물 98-6 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2-[2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)아세트아미도]아세테이트 (98-6, 0.47 g, 1.038mmol)) 및 DIPEA(0.13g, 1.038mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 98-7 ((2S)-2-(1-{2-[2-(2-{2-[2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)아세트아미도]아세트아미도}아세트아미도)아세트아미도]아세트아미도}-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산 산 (98-7, 1.4g, 0.765mmol, 73.68%))을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 915.2 (M/2+H)+, 610.7 (M/3+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.22-8.15 (m, 4H), 8.11-8.08 (m, 2H), 7.91-7.86 (m, 3H), 7.82 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.59 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.44-7.40 (m, 2H), 67.36-7.31 (m, 2H), 4.55-4.12 (m, 10H), 3.80-3.72 (m, 8H), 3.69-3.66 (m, 4H), 3.62-3.56 (m, 10H), 3.53-3.47 (m, 60H), 3.42-3.38 (m, 5H), 3.32-3.19 (m, 2H), 3.03-2.92 (m, 8H), 2.50-2.36 (m, 2H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.72-1.63 (m, 1H), 1.59-1.50 (m, 1H), 11.41-1.35 (m, 2H), 1.31-1.16 (m, 5H) ppm.
단계 5
건조 DMF(5 mL) 중의 화합물 98-7 (2S)-2-(1-{2-[2-(2-{2-[2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)아세트아미도]아세트아미도}아세트아미도)아세트아미도]아세트아미도}-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산 산 (98-7, 200mg, 0.109mmol)) 및 화합물 98-8 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (98-8, 122.85 mg, 0.109 mmol))의 용액에 HATU(41.58mg, 0.109mmol) 및 DIPEA(14.13mg, 0.109mmol)를 순차적으로 첨가하였다. 첨가 후, 모든 출발 아민이 소모될 때까지(LCMS에 의해 모니터링됨) 그 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 생성된 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결건조하여 생성물 98-9 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[({[({[({[(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필](메틸)카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜틸]카르바모일}-3,6,9,12-테트라옥사테트라데칸-1-일)카르바모일]메틸}카르바모일)메틸]카르바모일}메틸)카르바모일]메틸}카르바모일)메틸]카르바메이트 (98-9, 210mg, 0.072mmol, 65.65%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 979.0(M/3+H)+.
단계 6
무수 DMF(1.9mL) 중의 화합물 98-9 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[({[({[({[(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필](메틸)카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜틸]카르바모일}-3,6,9,12-테트라옥사테트라데칸-1-일)카르바모일]메틸}카르바모일)메틸]카르바모일}메틸)카르바모일]메틸}카르바모일)메틸]카르바메이트 (98-9, 210mg, 0.072mmol))의 용액에 디에틸 아민 (0.1 mL, 0.971 mmol) 을 첨가하였다. 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하여 완료하였다. 생성된 용액을 Prep-HPLC(0.01% TFA)로 직접 정제하여 생성물 PB098 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{1-[2-(2-{2-[2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도]아세트아미도}아세트아미도)아세트아미도]-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (PB098, 125mg, 0.046mmol, 64.40%))의 TFA 염을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 905.0(M/3+H)+, 체류 시간 5.432분 (HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.05 (s, 1H), 8.64 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.36-8.01 (m, 9H), 7.93-7.91 (m, 1.5H), 7.84-7.81 (m, 1H), 7.73 (d, J = 8.4 Hz, 0.5H), 7.58 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.35-7.24 (m, 6H), 7.20-7.14 (m, 1H), 6.05-5.96 (m, 1H), 5.44 (brs, 4H), 5.13-4.94 (m, 2H), 4.82-4.38 (m, 10H), 4.30-4.17 (m, 4H), 4.04-3.93 (m, 4H), 3.86 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 3.78-3.74 (m, 7H), 3.69-3.67 (m, 5H), 3.62-3.55 (m, 14H), 3.55-3.39 (m, 56H), 3.39-3.30 (m, 5H), 3.25-3.04 (m, 11H), 3.05-2.83 (m, 10H), 2.41-2.36 (m, 3H), 2.33-2.27 (m, 3H), 2.16-1.93 (m, 4H), 1.81-1.21 (m, 18H), 1.05-0.97 (m, 6H), 0.89-0.73 (m, 27H) ppm. TFA 상의 카르복실기의 양성자 하나가 밝혀졌다.
실시예 30: 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB099)의 제조.
Figure pct00483
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB099)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
DMF(4 mL) 중의 화합물 99-1 ((2S)-2-(1-{2-[2-(2-{2-[2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)아세트아미도]아세트아미도}아세트아미도)아세트아미도]아세트아미도}-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산 산 (99-1, 190 mg, 0.104 mmol))의 용액에 화합물 99-2 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (99-2, 88mg, 0.105mmol)), HATU(41.47mg, 0.109mmol) 및 DIPEA(0.207mL, 0.156mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하여 완료하였다 (LCMS로 모니터링함). 이어서 생성된 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 99-3 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[({[({[({[(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜틸]카르바모일}-3,6,9,12-테트라옥사테트라데칸-1-일)카르바모일]메틸}카르바모일)메틸]카르바모일}메틸)카르바모일]메틸}카르바모일)메틸]카르바메이트 (99-3, 190mg, 0.072mmol, 68.97%))를 황색 고체로 얻었다. ESI m/z : 885.0(M/3+H)+,663.9(M/4+H)+.
단계 2
DMF(1.9 mL) 중의 화합물 99-3 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[({[({[({[(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜틸]카르바모일}-3,6,9,12-테트라옥사테트라데칸-1-일)카르바모일]메틸}카르바모일)메틸]카르바모일}메틸)카르바모일]메틸}카르바모일)메틸]카르바메이트 (99-3, 102 mg, 0.038 mmol))의 용액에 디에틸 아민(0.1 mL, 0.971 mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하여 완료하였다. 생성된 용액을 역상 분리(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 PB099 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{1-[2-(2-{2-[2-(2-아미노아세트아미도)아세트아미도]아세트아미도}아세트아미도)아세트아미도]-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미도}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (PB099, 40mg, 0.016mmol, 42.80%))를 황색 고체로 나타냅니다. ESI m/z: 810.8 (M/3+H)+, 608.3 (M/4+H)+, 체류 시간 5.077분 (HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.05 (s, 1H), 8.64 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.32 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.21-8.01 (m, 9H), 7.92 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.85-7.72 (m, 3H), 7.60 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 6.02 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.46 (brs, 6H), 5.34-5.23 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.83 (brs, 2H), 4.56 (brs, 4H), 4.41-4.25 (m, 3H), 4.21-4.17 (m, 1H), 3.99 (brs, 2H), 3.86 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 3.78-3.73 (m, 6H), 3.69-3.67 (m, 4H), 3.62-3.54 (m, 14H), 3.52-3.47 (m, 60H), 3.29-3.20 (m, 6H), 3.14-2.90 (m, 6H), 2.41-2.37 (m, 5H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.24-2.13 (m, 2H), 1.99-1.81 (m, 3H), 1.70-1.58 (m, 3H), 1.50-1.20 (m, 8H), 0.90-0.81 (m, 9H) ppm. TFA 상의 카르복실기의 두 양성자가 밝혀졌다.
실시예 31: 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB100 또는 "LD100")의 제조.
Figure pct00484
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB100 또는 "LD100")를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
무수 DCM(20 mL) 중의 화합물 100-1 (2,3-비스({[(tert-부톡시)카르보닐]아미노})프로판산(100-1, 1.52 g, 5.000 mmol)) 및 HOSu(0.86g, 7.500mmol)의 용액을 실온에서 교반한 다음 EDCI(1.44g, 7.500mmol)를 5분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 출발 산이 소모될 때까지 (LCMS에 의해 모니터링됨) 생성된 용액을 추가로 1시간 동안 교반하였다. 그 후 반응 용액을 추가 DCM(20mL)으로 희석하고 물(40 mL)로 세척하고, 유기층을 분리하고 물 상을 추가 DCM(2*40 mL)으로 추출하였다. 수집된 DCM 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 농축하여 미정제 화합물 100-2 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2,3-비스((tert-부톡시카르보닐)아미노)프로파노에이트 (100-2, 2.0g, 4.988mmol, 99.75%))를 백색 폼으로 얻었으며, 이는 몇 분 동안 방치 후 무색 오일로 변했다. 그 화합물은 다음 단계에서 그대로 사용되었다. ESI m/z: 424.2 (M+Na)+.
단계 2
건조 DMF(10 mL) 중의 화합물 100-3 ((2S)-6-아미노-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (100-3, 1.84 g, 4.988 mmol)) 및 DIPEA(0.64g, 4.988mmol)의 용액을 실온에서 10분간 교반한 후, 무수 DMF(10mL) 중의 화합물 100-2 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2,3-비스({[(tert-부톡시)카르보닐]아미노})프로파노에이트(100-2, 2.0 g, 4.988 mmol))의 용액을 5분에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 첨가 후, 생성된 현탁액을 모든 출발 물질이 소모될 때까지 2시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 화합물 100-4 ((2S)-6-[2,3-비스({[(tert-부톡시)카르보닐]아미노})프로판아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (100-4, 2.0g, 3.055mmol, 61.16%))을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 555.3 (M-100+H)+, 678.4 (M+Na)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.55 (s, 1H), 7.90 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.84 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.44-7.40 (m, 2H), 7.36-7.31 (m, 2H), 6.73 (m, 1H), 6.61 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.29-4.21 (m, 3H), 3.98-3.87 (m, 2H), 3.21-3.16 (m, 2H), 3.11-2.94 (m, 2H), 1.74-1.55 (m, 2H), 1.39-1.26 (m, 22H) ppm.
단계 3
DCM(8mL) 중의 화합물 100-4 ((2S)-6-[2,3-비스({[(tert-부톡시)카르보닐]아미노})프로판아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (100-4, 1.0g, 1.527mmol))의 용액을 실온에서 교반한 후, TFA(2 mL, 26.925 mmol)를 천천히 첨가하였다. 그 용액을 추가로 1시간 동안 교반한 후, 용액을 증발시켜 건조시켰다. 잔류물을 다시 DCM(20 mL)에 용해시키고 농축시켰다. 이 과정을 두 번 반복하여 미정제 생성물 100-5 ((2S)-6-(2,3-디아미노프로판아미도)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (100-5, 1.0 g, 2.200 mmol, 144.05%))을 담황색 오일로서 얻었으며, 이는 다음 단계에서 그래도 사용되었다. ESI m/z: 455.3 (M+H)+.
단계 4
무수 DCM (10 mL) 중의 1-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-온 산 (2.2 g, 3.065mmol) 및 HOSu(0.53g, 4.597mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 후 EDCI(0.88g, 4.597mmol)를 첨가하였다. 모든 산이 활성화된에스테르로 전환될 때까지 생성된 용액을 추가로 1시간 동안 교반하였다. 그 후 용액을 추가 DCM(20mL)으로 희석하고 물(20mL)로 세척하고, 유기층을 수집하고 물 층을 추가 DCM(20mL*2)으로 추출했다. DCM 층을 조합하고 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과물을 농축하여 미정제 활성에스테르를 무색 오일로서 얻었다. 활성화된에스테르를 무수 DMF(5 mL)에 용해시키고, 무수 DMF(5mL) 중의 화합물 100-5 ((2S)-6-(2,3-디아미노프로판아미도)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산(100-5, 0.63g, 1.390mmol)) 및 DIPEA(0.36g, 2.780mmol)의 용액에 천천히 첨가하였다. 첨가 후, 생성된 담황색 용액을 실온에서 2시간 동안 교반시켜 완료하였다. 이어서, 반응 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 무색 오일의 화합물 100-6 ((2S)-6-[2,3-비스(1-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)프로판아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산(100-6))을 얻었다. ESI m/z: 551.3 ((M-100)/3+H)+, 827.7 (M-100)/2+H)+.
단계 5
DCM(8mL) 중의 화합물 100-6 ((2S)-6-[2,3-비스(1-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)프로판아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산(100-6, 1.8 g, 0.971 mmol))의 용액을 실온에서 교반한 후, TFA(2 mL, 26.925 mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축하여 건조시키고 잔류물을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 예상 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 생성물 100-7 ((2S)-6-[2,3-비스(1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)프로판아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (100-7, 1.0 g, 0.605 mmol, 62.28%))을 무색 오일로 얻었다. ESI m/z : 552.3 (M/3+H)+, 828.1 (M/2+H)+. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.95-7.89 (m, 3H), 7.85-7.72 (m, 9H), 7.63 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.45-7.41 (m, 2H), 7.36-7.31 (m, 2H), 4.29-4.20 (m, 4H), 3.94-3.88 (m, 1H), 3.68-3.66 (m, 1H), 3.61-3.57 (m, 18H), 3.57-3.47 (m, 76H), 3.34-3.29 (m, 2H), 3.26-3.21 (m, 1H), 3.05-2.97 (m, 6H), 2.39 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.31 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.74-1.55 (m, 2H), 1.44- 1.25 (m 4H) ppm.
단계 6
메탄올(20 mL) 중의 화합물 100-7 ((2S)-6-[2,3-비스(1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)프로판아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (100-7, 850mg, 0.514mmol)) 및 D-글루코스(555.03mg, 3.084 mmol)의 현탁액을 질소 분위기 하에 50℃로 가열한 후 나트륨 시아노수소화붕소(193.77 mg, 3.084 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 밤새(18시간) 가열하고 완료하였다. 이어서, 용액을 농축하여 건조시키고, 잔류물을 DMF에 용해시키고 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 화합물 100-8 ((2S)-6-{2,3-비스[(42S,43R),44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]프로판아미도}-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산(100-8, 640mg, 0.173mmol, 53.9%))을 무색 오일로 얻었다. ESI m/z = 771.0 (M/3+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.47 (s, 1H), 8.16 (brs, 2H), 7.95-7.80 (m, 5H), 7.73 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.63 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.45-7.40 (m, 2H), 7.35-7.31 (m, 2H), 5.48-5.41 (m, 4H), 4.85-4.76 (m, 4H), 4.64-4.41 (m, 12H), 4.31-4.20 (m, 4H), 4.04-3.95 (m, 4H), 3.95-3.87 (m, 1H), 3.79-3.76 (m, 5H), 3.72-3.61 (m, 5H), 3.59-3.55 (m, 20H), 3.55-3.40 (m, 98H), 3.29-3.21 (m, 2H), 3.11-2.97 (m, 2H), 2.38 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.31(t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.74-1.56 (m, 2H), 1.43-1.26 (m, 4H) ppm. TFA의 카르복실기의 두 양성자가 또한 밝혀졌다.
단계 7
무수 DMF(1.5 mL) 중의 화합물 100-8 ((2S)-6-{2,3-비스[(42S,43R),44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]프로판아미도}-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (100-8, 150mg, 0.065mmol)), 화합물 100-9 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (100-9, 54.59 mg, 0.065 mmol)) 및 DIPEA(16.75 mg, 0.130 mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반하여 출발 물질이 용매에 완전히 용해되도록 한 다음, 무수 DMF(0.5mL) 중의 HATU(24.68mg, 0.065mmol) 용액을 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 생성된 용액을 추가로 2시간 동안 교반하였다. 완성된 반응 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 화합물 100-10 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-5-{2,3-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]프로판아미도}-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바메이트 (100-10, 103 mg, 0.033 mmol, 50.63%))을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 784.2 (M/4+H)+.
단계 8
DMF(1.8mL) 중의 화합물 100-10 (4-((2S,5S,8S,59S,60R,61R,62R)-8-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)-59,60,61,62,63-펜타하이드록시-5-이소프로필-4,7,14,18-테트라옥소-15-((42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도)-57-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실)-2-(3-우레이도프로필)-21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54-도데카옥사-3,6,13,17,57-펜타아자트리헥사콘탄아미도)벤질((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[드]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b] 퀴놀린-1-일)카르바메이트(100-10, 100mg, 0.032mmol))의 용액을 실온에서 교반하고 디에틸 아민 (0.2mL, 1.941mmol)을 첨가하였다. 반응 용액을 1시간 동안 교반 하고 완료하였다. 대부분의 디에틸 아민을 회전 증발기로 증발시킨 후, 잔류물을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 예상 생성물 100-11 (4-((2S,5S,8S,59S,60R,61R,62R)-8-아미노-59,60,61,62,63-펜타하이드록시-5-이소프로필-4,7,14,18-테트라옥소-15-((42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도)-57-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실)-2-(3-우레이도프로필)-21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54-도데카옥사-3,6,13,17,57-펜타아자트리헥사콘탄아미도)벤질((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[드]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)카르바메이트(100-11, 50mg, 0.017mmol, 53.82%))를 연한 황색 고체로 얻었다. ESI m/z: 971.5 (M/3+H)+, 728.9 (M/4+H)+.
단계 9
무수 DMF(1.5 mL) 중의 화합물 100-11 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-{2,3-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]프로판아미도}헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (100-11, 50mg, 0.017mmol)) 및 DIPEA(3.32 mg, 0.026 mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 다음, 무수 DMF(0.5mL) 중의 화합물 100-12 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소)-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트(100-12, 6.35mg, 0.021mmol))의 용액을 주사기로 5분에 걸쳐 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었음을 나타낼 때까지 생성된 용액을 추가로 4시간 동안 교반하였다. 그 후 반응 용액을 Prep-HPLC(0.01% TFA)로 직접 정제하여 PB100 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-{2,3-비스[(42S,43R),44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]프로판아미도}-2-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (PB100, 35mg, 0.011mmol, 65.64%))을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 621.9 (M/5+H)+, 777.0 (M/4+H)+, 1035.7 (M/3+H)+. 체류 시간 5.642 분 (HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.04 (s, 1H), 8.15-8.13 (m, 3H), 8.07 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.99-7.91 (m, 2H), 7.86-7.77 (m, 3H), 7.64 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.54 (s, 1H), 6.01 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.49-5.39 (m, 7H), 5.39-5.24 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.83-4.79 (m, 4H), 4.65-4.46 (m, 11H), 4.40-4.35 (m, 1H), 4.30-4.18 (m, 3H), 4.03-3.94 (m, 4H), 3.81-3.74 (m, 4H), 3.74-3.61 (m, 4H), 3.61-3.52 (m, 16H), 3.52-3.40 (m, 98H), 3.29-3.13 (m, 8H), 3.13-2.90 (m, 7H), 2.40-2.36 (m, 5H), 2.30 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.24-2.08 (m, 4H), 2.00-1.71 (m, 4H), 1.71-1.51(m, 3H), 1.51-1.14 (m, 15H), 0.90-0.80 (m, 9H) ppm. TFA에서 카르복실기의 두 양성자 신호가 밝혀졌다.
실시예 32 : MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB101 또는 "LD101")의 제조.
Figure pct00485
MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB101 또는 "LD101")를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
무수 DMF(4 mL) 중의 화합물 101-1 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-5-{2,3-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]프로판아미도}-1-카르바모일펜틸]카르바메이트 (101-1, 250mg, 0.108mmol)), 화합물 100-2 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트(101-2, 121.64mg, 0.108 mmol)) 및 DIPEA(27.95 mg, 0.217 mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, 무수 DMF(4 mL)에 녹인 HATU(41.19 mg, 0.108 mmol) 용액을 첨가했다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 생성된 용액을 추가로 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 화합물 101-3 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-5-{2,3-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]프로판아미도}-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필](메틸)카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바메이트(101-3, 210mg, 0.061mmol, 56.75%))을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 854.9 (M/4+H)+.
단계 2
DMF(3.6mL) 중의 화합물 101-3 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-5-{2,3-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]프로판아미도}-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필](메틸)카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바메이트 (101-3, 200mg, 0.059mmol))의 용액을 실온에서 교반하고 디에틸 아민 (0.4 mL, 3.883 mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 교반하여 완료하였다. 그런 다음 회전 증발기로 디에틸 아민을 증발시키고 DMF 중의 잔류물을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 예상 생성물 101-4 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-{2,3-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]프로판아미도}헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (101-4, 100mg, 0.031mmol, 53.48%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 799.5(M/4+H)+.
단계 3
무수 DMF(1.5 mL) 중의 화합물 101-4 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-{3-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]-2-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(3R,4S,5R)-3,4,5,6-테트라하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]프로판아미도}헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (101-4, 30mg, 0.009mmol)) 및 화합물 101-5 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (101-5, 3.47mg, 0.011mmol))의 용액을 실온에서 교반한 다음, DIPEA (1.74mg, 0.013mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하여 완전한 전환(LCMS에 의해 모니터링됨)을 달성하였다. 그런 다음 완성된 반응 용액을 Prep-HPLC(0.01 % TFA)로 직접 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결건조하여 PB101 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-{2,3-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]프로판아미도}-2-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (PB101, 21mg, 0.006mmol, 66.02%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 847.5 (M/ 4+H)+, 1129.6 (M/3+H)+. 체류 시간 6.016분 (HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.03 (s, 1H), 8.34-8.10 (m, 4H), 8.06-7.89 (m, 2H), 7.89-7.79 (m, 2H), 7.66-7.62 (m, 1H), 7.59-7.57 (m, 2H), 7.34-7.24 (m, 6H), 7.20-7.13 (m, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.02-5.98 (m, 1H), 5.50-5.35 (m, 7H), 5.13-4.78 (m, 8H), 4.70-4.34 (m, 15H), 4.34-4.18 (m, 5H), 4.05-3.93 (m, 6H), 3.83-3.74 (m, 6H), 3.74-3.68 (m, 7H), 3.61-3.40 (m, 116 H), 3.26-3.12 (m, 11H), 3.12-2.80 (m, 10H), 2.43-2.36 (m, 3H), 2.32-2.26 (m, 3H), 2.15-1.84 (m, 6H), 1.84-1.45 (m, 15H), 1.45-1.16 (m, 8H), 1.06-0.97 (m, 6H), 0.89-0.73 (m, 24H) ppm. TFA에서 카르복실기의 양성자 1개가 밝혀졌다.
실시예 33: 6-아미노-9-{[4-(아미노메틸)페닐]메틸}-2-(2-메톡시에톡시)-9H-퓨린-8-올에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB102)의 제조.
Figure pct00486
6-아미노-9-{[4-(아미노메틸)페닐]메틸}-2-(2-메톡시에톡시)-9H-퓨린-8-올에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB102)를 다음과 같이 제조하였다:
단계 1
화합물 102-1 (2-클로로-9H-퓨린-6-아민)(1 eq) 및 K2CO3 (3 eq)를 DMSP에 용해시키고 반응 혼합물을 교반하였다. 4-(브로모메틸)벤조니트릴(1.4 eq)을 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하여 불용성 염을 제거하고 물에 부었다. 수성상을 EtOAc로 추출하였다. 조합된 유기상을 Mg2SO4로 건조시키고 진공에서 농축하여 생성물 102-3 (4-((6-아미노-2-클로로-9H-퓨린-9- 일)메틸)벤조니트릴(102-3))을 수득하였다.
단계 2
2-메톡시에탄-1-올(1.364 mL, 17.210 mmol) 중의 NaH (1.24g, 51.631mmol) 용액에 화합물 102-3 (4-[(6-아미노-2-클로로-9H-퓨린-9-일)메틸]벤조니트릴 (102-3, 4.9g, 17.210mmol))을 첨가하였다. 그 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 농축하고 Biotage 플래시 크로마토그래피 (실리카겔, DCM 중 0-10% MeOH로 용출)로 정제하여 생성물 102-4 (4-{[6-아미노-2-(2-메톡시에톡시)-9H-퓨린-9-일]메틸}벤조니트릴 (102-4, 4.02 g, 12.394 mmol, 72.04%))을 담황색 고체로 얻었다. ESI m/z: 325.0(M+H)+.
단계 3
디옥산 (50mL) 중의 화합물 102-4 (4-{[6-아미노-2-(2-메톡시에톡시)-9H-퓨린-9-일]메틸}벤조니트릴 (102-4, 4.02 g, 12.394 mmol))의 용액에 설파닐리덴-λ^4-보란이민(2.65g, 14.873mmol) 및 AIBN(0.183mL, 1.239mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 농축하고 플래쉬 크로마토그래피 (실리카겔, DCM 중 0-10% MeOH로 용출)로 정제하여 생성물 102-5 (4-{[6-아미노-8-브로모-2-(2-메톡시에톡시)-9H-퓨린-9-일]메틸}벤조니트릴(102-5, 4.90g, 12.152mmol, 98%))를 담황색 고체로 얻었다. ESI m/z: 404.1(M+H)+.
단계 4
MeOH(50mL) 중의 NaOMe(7.37g, 136.395mmol)의 용액에 화합물 102-5 (4-{[6-아미노-8-브로모-2-(2-메톡시에톡시)-9H-퓨린-9-일]메틸}벤조니트릴 (102-5, 5.5 g, 13.640 mmol))을 첨가하였다. 그 혼합물을 환류 하에 3시간 동안 가열하였다. 생성된 용액을 염수로 세척하고 DCM (50 mL*3)으로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 증발시켜 생성물 102-6 (4-{[6-아미노-8-메톡시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-퓨린-9-일]메틸}벤조니트릴 (102-6, 3.5g, 9.877mmol, 72.46%)을 얻었다. ESI m/z: 355.3(M+H)+).
단계 5
MeOH(50mL) 중의 화합물 102-6 (4-{[6-아미노-8-메톡시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-퓨린-9-일]메틸}벤조니트릴(102-6, 3.5 g, 9.877 mmol))의 용액에 NaBH4 (2.258mL, 69.137mmol) 및 NiCl2(H2O)6 (0.24 g, 0.988 mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하여 완료하였다(LCMS로 모니터링함). 생성된 용액을 물로 켄칭하고 DCM (50 mL*3)으로 추출하였다. 수집된 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 증발시켜 미정제 생성물 102-7 (9-{[4-(아미노메틸)페닐 ]메틸}-8-메톡시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-퓨린-6-아민 (102-7, 3.6 g, 10.045 mmol, 101.70%))을 담황색 고체로서 얻었으며, 이는 다음 단계에서 직접 사용되었다. ESI m/z: 359.3(M+H)+.
단계 6
MeCN (20mL) 중의 화합물 102-7 (9-{[4-(아미노메틸)페닐 ]메틸}-8-메톡시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-퓨린-6-아민 (102-7, 3.5 g, 9.766mmol))의 용액에 ClSiMe3 (1.06g, 9.766mmol) 및 NaI (0.400mL, 9.766mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 농축하고 역상 플래쉬 크로마토그래피 (0.01% TFA)로 정제하여 생성물 102-8 (6-아미노-9-{[4-(아미노메틸)페닐 ]메틸}-2-(2-메톡시에톡시)-9H-푸린-8-올 (102-8, 1.75 g, 5.082 mmol, 52.08%))을 담황색 고체로 얻었다. ESI m/z : 345.3(M+H)+, 체류 시간 4.359분 (HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.131 (s, 1H), 8.141 (s, 3H), 7.413-7.393 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.340-7.319(d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.560 (s, 2H), 4.872 (s, 2H), 4.259-4.235 (t, J =4.8Hz, 2H), 4.005-3.992 (d, J = 5.2Hz, 2H), 3.593-3.570(t, J = 4.6Hz, 2H),3.265(s, 3H) ppm. TFA에서 카르복실기의 양성자 하나가 밝혀졌다.
단계 7
DMF(5mL) 중의 화합물 102-8 (6-아미노-9-{[4-(아미노메틸)페닐]메틸}-2-(2-메톡시에톡시)-9H-퓨린-8-올(102-8, 800 mg, 2.323mmol))의 용액에 화합물 102-9 ({4-[(2S)-5-(카르바모일아미노)-2-[(2S)-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)-3-메틸부탄아미도]펜탄아미도]페닐}메틸 4-니트로페닐 카르보네이트 (102-9, 1781.31mg, 2.323mmol), HOBt (313.89mg, 2.323mmol) 및 DIPEA(300.25mg, 2.323mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피 (0.01% TFA)로 정제하여 생성물 102-10 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[({[(4-{[6-아미노-8-하이드록시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-퓨린-9-일]메틸}페닐)메틸]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)-4-(카르바모일아미노)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바메이트 (102-10, 450mg, 0.463mmol, 19.93%))를 담황색 고체로 얻었다. ESI m/z: 972.5(M+H)+.
단계 8
DMF(2mL) 중의 화합물 102-10 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[({[(4-{[6-아미노-8-하이드록시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-퓨린-9-일]메틸}페닐)메틸]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)-4-(카르바모일아미노)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바메이트(102-10, 450mg, 0.463mmol))의 용액에 디에틸아민 (0.1mL, 1.276mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 생성된 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피 (0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 수집하고, 이를 동결건조하여 불순한 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 아세토니트릴에서 연화하고(triturate) 여과하여 케이크 화합물 102-11 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(4-{[6-아미노-8-하이드록시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-퓨린-9-일]메틸}페닐)메틸]카르바메이트(102-11, 70mg, 0.093mmol, 20.17%))을 담황색 고체로 얻었다. ESI m/z: 375.8(M/2+H)+.
단계 9
DMF(4mL) 중의 화합물 102-11 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(4-{[6-아미노-8-하이드록시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-퓨린-9-일]메틸}페닐)메틸]카르바메이트(102-11, 58 mg, 0.077 mmol))의 용액에 화합물 102-12 ((2S)-6-{2,3-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]프로판아미도}-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산(102-12, 178.73mg, 0.077mmol)), HATU (29.28mg, 0.077mmol) 및 DIPEA(9.95mg, 0.077mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반한 후 역상 플래쉬 크로마토그래피 (0.01% TFA)로 정제하여 생성물 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 화합물 102-13 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[({[(4-{[6-아미노-8-하이드록시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-푸린-9-일]메틸}페닐)메틸]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)-4-(카르바모일아미노)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-{2,3-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]프로판아미도}펜틸]카르바메이트(102-13, 120 mg, 0.040 mmol, 51.30%))를 백색 고체 로 얻었다. ESI m/z: 761.3(M/4+H)+.
단계 10
DMF(2mL) 중의 화합물 102-13 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[({[(4-{[6-아미노-8-하이드록시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-푸린-9-일]메틸}페닐)메틸]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)-4-(카르바모일아미노)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-5-{2,3-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]프로판아미도}펜틸]카르바메이트 (102-13, 120mg, 0.039mmol))의 용액에 디에틸아민 (0.1mL, 1.276mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 역상 분리(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 102-14 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-{2,3-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]프로판아미도}헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(4-{[6-아미노-8-하이드록시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-퓨린-9-일]메틸}페닐)메틸]카르바메이트(102-14, 50mg, 0.018mmol, 44.95%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 706.0(M/4+H)+.
단계 11
DMF(1mL) 중의 화합물 102-14 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-{2,3-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]프로판아미도}헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(4-{[6-아미노-8-하이드록시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-퓨린-9-일]메틸}페닐)메틸]카르바메이트(102-14, 50mg, 0.018mmol))의 용액에 화합물 102-15 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트(102-15, 6.56 mg, 0.021 mmol)) 및 DIPEA(3.44mg, 0.027mmol)를 첨가하였다. 모든 출발 아민이 소모될 때까지 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 그 후 생성된 용액을 Prep-HPLC (0.01% TFA)로 직접 정제하여 생성물 분획을 얻었고, 이를 동결 건조하여 PB102 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-{2,3-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]프로판아미도}-2-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(4-{[6-아미노-8-하이드록시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-퓨린-9- 일]메틸}페닐)메틸]카르바메이트(PB102, 20mg, 0.007mmol, 37.43%))를 백색 고체 로 얻었다. ESI m/z: 754.5 (M/4+H)+, 1005.1 (M/3+H)+, 체류 시간 5.190 분 (HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.03 (s, 1H), 10.01 (s, 1H), 8.15-8.13 (m, 3H), 7.97 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.87-7.85 (m, 2H), 7.81-7.75 (m, 1H) 7.66 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 7.29-7.19 (m, 6H), 7.00 (s, 2H), 6.50 (s, 2H), 6.01 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.44 (brs, 4H), 4.95 (brs, 2H), 4.82 (brs, 2H), 4.57-4.39 (m, 12H), 4.26-4.14 (m, 8H), 4.05-3.95 (m, 4H), 3.80-3.76 (m, 4H), 3.68-3.61 (m, 4H), 3.58-3.56 (m, 18H), 3.52-3.36 (m, 98H), 3.35-3.29 (m, 12H), 3.26-3.17 (m, 7H), 3.01-2.92 (m, 4H), 2.68-2.66 (m, 1H), 2.39 (t, J = 6 Hz, 2H), 2.33-2.29 (m, 2H), 2.20-2.10 (m, 2H), 1.99-1.95 (m, 1H), 1.74-1.55 (m, 3H), 1.46-1.31 (m, 8H),1.25-1.10 (m, 4H), 0.85-0.81 (m, 6H) ppm. TFA에서 카르복실기의 두 양성자가 밝혀졌다.
실시예 34: 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB103)의 제조.
Figure pct00487
Figure pct00488
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB103)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
DCM(20mL) 중의 화합물 103-1 ((2S)-2,5-비스({[(tert-부톡시)카르보닐]아미노})펜탄 산 (103-1, 4.5 g, 13.538 mmol))의 용액에 HOSu(3.12g, 27.076mmol) 및 EDCI(5.19g, 27.076mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 물로 세척하고 DCM으로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 증발시켜 미정제 생성물 103-2 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일(S)-2,5-비스((tert-부톡시카르보닐)아미노)펜타노에이트(103-2, 6.0g, 13.971mmol, 103.27%))를 얻었다. ESI m/z : 452.3(M+Na)+.
단계 2
DMF(20mL) 중의 화합물 103-2 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일(S)-2,5-비스((tert-부톡시카르보닐)아미노)펜타노에이트(103-2, 5.81g, 13.528mmol))의 용액에 화합물 103-3 ((2S)-6-아미노-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산(103-3, 5.98 g, 16.234 mmol)) 및 DIPEA(1.75g, 13.528mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피 (0.01% TFA)로 정제하여 생성물 103-4 ((2S)-6-[(2S)-2,5-비스({[(tert-부톡시)카르보닐]아미노})펜탄아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산(103-4, 8.5g, 12.448mmol, 91.99%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 683.5(M+H)+.
단계 3
DCM(20mL) 중의 화합물 103-4 ((2S)-6-[(2S)-2,5-비스({[(tert-부톡시)카르보닐]아미노})펜탄아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산(103-4, 8.5g, 12.448mmol))의 용액에 TFA(10mL, 134.626mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 증발시키고 역상 플래쉬 크로마토그래피 (0.01% TFA)로 정제하여 생성물 103-5 ((2S)-6-[(2S)-2,5-디아미노펜탄아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (103-5, 5.7 g, 11.812mmol, 94.84%))을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 483.4(M+H)+.
단계 4
DMF(15mL) 중의 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2,2-디메틸-4-옥소-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-트리데카옥사-5-아자테트라테트라콘탄-44-오에이트(5.68g, 6.970mmol)의 용액에 DIPEA (0.90g, 6.970mmol) 및 화합물 103-5 ((2S)-6-[(2S)-2,5-디아미노펜탄아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (103-5, 1.68g, 3.485mmol))을 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피 (0.01% TFA)로 정제하여 생성물 103-6 ((2S)-6-[(2S)-2,5-비스(1-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)펜탄아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (103-6, 5.9 g, 3.135 mmol, 89.94%)을) 투명한 오일로 얻었다. ESI m/z : 561.2((M-200)/3+H)+.
단계 5
DCM(10mL) 중의 화합물 103-6 ((2S)-6-[(2S)-2,5-비스(1-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)펜탄아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산(103-6, 5.9g, 3.135mmol))의 용액에 TFA(5mL, 67.313mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 생성된 용액을 농축하고 역상 분리(C18 컬럼, TFA가 포함된 물 중의 0-40% 아세토니트릴로 용출)를 통해 정제하여 생성물 103-7 ((2S)-6-[(2S)-2,5-비스(1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)펜탄아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산(103-7, 4.5g, 2.675mmol, 85.39%))을 투명한 오일로 얻었다. ESI m/z : 561.6(M/3+H)+.
단계 6
MeOH(30mL) 중의 화합물 103-7 ((2S)-6-[(2S)-2,5-비스(1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)펜탄아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (103-7, 4.5 g, 2.675 mmol))의 용액에 D-글루코스(5.78g, 32.104mmol) 및 NaBH3CN (1.949mL, 32.104mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물 60℃에서 주말 동안 교반하였다. 생성된 용액을 역상 플래시 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 생성물 103-8 ((2S)-6-[(2S)-2,5-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜탄아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산(103-8, 4.53 g, 1.937 mmol, 72.36%))을 백색 겔로 얻었다. ESI m/z : 780.4(M/3+H)+.
단계 7
DMF(5mL) 중의 화합물 103-8 ((2S)-6-[(2S)-2,5-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜탄아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산(103-8, 330mg, 0.141mmol))의 용액에 화합물 103-9 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트(103-9, 118.66mg, 0.141mmol)), HATU (53.65mg, 0.141mmol) 및 DIPEA(36.47mg, 0.282mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 pH 6으로 조정하고 역상 플래쉬 크로마토그래피 (0.01% TFA)로 정제하여 생성물 103-10 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-5-[(2S)-2,5-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜탄아미도]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바메이트(103-10, 273mg, 0.086mmol, 61.19%))를 담황색 고체로 얻었다. ESI m/z: 790.9(M/4+H)+.
단계 8
DMF(2.5mL) 중의 화합물 103-10 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-5-[(2S)-2,5-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜탄아미도]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바메이트(103-10, 273mg, 0.086mmol))의 용액에 디에틸 아민(0.5 mL, 6.378 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피 (0.01% TFA)로 정제하여 생성물 103-11 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(2S)-2,5-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (103-11, 123 mg, 0.042 mmol, 48.46%))를 담황색 고체로 얻었다. ESI m/z: 735.7(M/4+H)+, 980.7(M/3+H)+.
단계 9
DMF(3mL) 중의 화합물 103-11 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(2S)-2,5-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (103-11, 123mg, 0.042mmol))의 용액에 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (103-12, 19.35mg, 0.063mmol)) 및 DIPEA(8.11mg, 0.063mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 pH 6으로 조정하고 Prep-HPLC(0.01%TFA)로 정제하여 생성물 PB103 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-[(2S)-2,5-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜탄아미도]-2-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (PB103, 80mg, 0.026mmol, 61.03%))를 담황색 고체로 얻었다. ESI m/z: 627.7(M/5+H)+, 784.0(M/4+H)+, 1044.9(M/3+H)+, 체류 시간 5.614분 (HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.05 (s, 1H), 8.16-8.14 (m, 3H), 8.09-8.07 (d, J =8.8Hz, 1H), 7.99-7.98 (d, J =7.2 Hz, 2H), 7.86-7.83 (m, 2H), 7.80-7.77 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 7.67-7.65 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.61-7.59 (d, J =8.4 Hz, 2H), 7.37-7.35 (d, J = 8.8Hz, 2H), 7.311(s, 1H), 7.00(s, 2H), 6.55 (s, 1H), 6.03-6.01(t, J = 5.2 Hz, 1H), 5.45 (brs, 8H), 5.29-5.23 (m, 3H), 5.07 (s, 2H), 4.82(brs,4H), 4.62-4.37 (m,12H), 4.24-4.16 (m,3H), 3.98 (brs, 4H), 3.78-3.77 (m, 4H), 3.677(brs, 4H), 3.61-3.54(m, 18H), 3.50-3.43 (m, 98H), 3.29-3.23 (m, 7H), 3.17-2.94 (m, 6H), 2.43-2.41(m, 5H), 2.30-2.26 (m, 3H), 2.24-2.08 (m, 4H), 2.00-1.83 (m, 3H), 1.66-1.59 (m, 4H), 1.49-1.42 (m, 7H), 1.36-1.45 (m, 6H), 1.29-1.14 (m, 4H), 0.89-0.80(m, 9H) ppm.
실시예 35: MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB104)의 제조.
Figure pct00489
MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB104)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
무수 DMF(3 mL) 중의 화합물 104-1 ((2S)-6-[(2S)-2,5-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜탄아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산(104-1, 300mg, 0.128mmol)), 화합물 104-2 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (104-2, 144.10mg, 0.128mmol)) 및 DIPEA(33.02 mg, 0.256 mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 다음, 무수 DMF(1 mL) 중의 HATU(48.79 mg, 0.128 mmol) 용액을 천천히 첨가하였다. LCMS가 출발 아민의 완전한 소모를 나타낼 때까지 생성된 용액을 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이후 반응 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 화합물 104-3 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-5-[(2S)-2,5-비스[(42S,43R),44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜탄아미도]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필](메틸)카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바메이트(104-3, 280mg, 0.081mmol, 63.51%))을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 671.5 ((M-717-26-18)/4+H)+, 862.0 (M/4+H)+.
단계 2
DMF(3.6 mL) 중의 화합물 104-3 (((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-5-[(2S)-2,5-비스[(42S,43R),44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜탄아미도]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필](메틸)카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바메이트 (104-3, 260mg, 0.075 mmol))의 용액을 실온에서 교반하고 디에틸 아민 (0.4 mL, 3.883 mmol)을 첨가했다. LCMS가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 추가로 1시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질 (특히 디에틸 아민)을 진공 하에 증발시키고 잔류물을 역상 컬럼 크로마토그라피 (0.01 % TFA)로 정제하여 생성물 104-4 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(2S)-2,5-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (104-4, 160mg, 0.050mmol, 65.78%))을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z = 615.8 ((M-717-26-18)/4+H)+, 806.3 (M/4+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.10 (s, 1H), 8.43 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.35-8.33 (m, 1.5H), 8.17-8.09 (m, 5H), 8.03 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.97-7.78 (m, 3H), 7.66 (d, J = 9.2 Hz, 0.5H), 7.59-7.57 (m, 2H), 7.49-7.40 (m, 1H), 7.32-7.24 ((m, 6H), 7.20-7.13 ((m, 1H), 6.04 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 5.52-5.36 ((m, 7H), 5.11-4.94 ((m, 3H), 4.89-4.69 ((m, 5H), 4.69-4.39 ((m, 16H), 4.30-4.17 (m, 4H), 4.04-3.93 (m, 7H), 3.88-3.81 (m, 2H), 3.79-3.76 (m, 5H), 3.72-3.62 (m, 6H), 3.62-3.49 (m, 88H), 3.43-3.25 (m, 20H), 3.25-3.06 (m, 12H), 3.06-2.83 (m, 11H), 2.40-2.38 (m, 2H), 2.30-2.22 (m, 3H), 2.14-1.92 (m, 4H), 1.84-1.62 (m, 6H), 1.62-1.21 (m, 16H), 1.05-0.97 (m, 6H), 0.97-0.75 (m, 26H) ppm. TFA에서 카르복실기의 3개 양성자가 밝혀졌다.
단계 3
무수 DMF(1.5mL) 중의 화합물 104-4 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(2S)-2,5-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜탄아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (104-4, 100mg, 0.029mmol) 및 DIPEA(5.65mg, 0.044mmol))의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 후, 무수 DMF(0.5mL) 중의 화합물 104-5 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트(104-5, 10.80mg, 0.035mmol))의 용액을 5분에 걸쳐 주사기로 적가하였다. 첨가 후, 생성된 용액을 편의상 실온에서 밤새 교반하였고, LCMS는 아침에 완전한 반응을 나타내었다. 생성된 용액을 Prep-HPLC(0.01% TFA)로 직접 정제하여 PB104 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-[(2S)-2,5-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]펜탄아미도]-2-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (PB104, 55mg, 0.016mmol, 55.11%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 854.5 (M/4+H)+; 체류 시간 5.614 분 (HPLC). 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 10.03 (s, 1H), 8.34-8.10 (m, 4H), 8.00-7.97 (m, 2H), 7.93-7.83 (m, 2.5H), 7.67-7.64 (m, 1.5H), 7.58 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.34-7.25 (m, 6H), 7.19-7.13 (m, 1H), 7.00 ((s, 2H), 6.02-5.99 ((m, 1H), 5.52-5.38 ((m, 7H), 5.14-4.94 ((m, 3H), 4.94-4.18 ((m, 25H), 4.04-3.93 (m, 7H), 3.79-3.77 (m, 5H), 3.69-3.66 (m, 5H), 3.62-3.56 (m, 20H), 3.52-3.47 (m, 88H), 3.36-3.12 (m, 15H), 3.03-2.83 (m, 13H), 2.43-2.37 (m, 3H), 2.30-2.27 (m, 3H), 2.15-2.06 (m, 4H), 2.01-1.94 (m, 2H), 1.81-1.50 (m, 8H), 1.50-1.17 (m, 20H), 1.05-0.97 (m, 6H), 0.89-0.75 (m, 26H) ppm. TFA에서 카르복실기의 두 양성자가 밝혀졌다.
실시예 36: MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB105)의 제조.
Figure pct00490
MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB105)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
DCM(50 mL) 중의 화합물 105-1 ((2S)-2,6-비스({[(tert-부톡시)카르보닐 ]아미노})헥산 산 (105-1, 5.0 g, 14.433 mmol)), 1-하이드록시피롤리딘-2,5-디온(2.249 mL, 28.867 mmol) 및 EDCI(5.53 g, 28.867 mmol)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 용액을 DCM(50 mL)으로 희석하고 물(50 mL*2)로 세척하였다. 유기층을 수집하고 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 진공하에 농축하여 건조시켜 미정제 화합물 105-2 ((S)-2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2,6-비스(tert-부톡시 카르보닐아미노)헥사노에이트 (105-2, 6.35g, 14.318mmol, 99.20%))를 얻었고, 이는 다음 단계에 직접 사용되었다. ESI m/z: 466.3(M+Na)+.
단계 2
DMF(10 mL) 중의 화합물 105-2 ((S)-2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2,6-비스(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노에이트(105-2, 6.40g, 14.44mmol)), 화합물 105-3 ((2S)-6-아미노-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (105-3, 5.32 g, 14.440 mmol)) 및 DIPEA(3.73g, 28.880mmol)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 화합물 105-4 ((2S)-6-[(2S)-2,6-비스({[(tert-부톡시)카르보닐]아미노})헥사미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (105-4, 7.9 g, 11.337 mmol, 78.51%))을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 719.4(M+Na)+.
단계 3
DCM(20 mL) 중의 화합물 105-4 ((2S)-6-[(2S)-2,6-비스({[(tert-부톡시)카르보닐]아미노})헥사미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (105-4, 4.53 g, 6.501 mmol))의 용액에 TFA(10 mL, 134.626 mmol)를 천천히 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 용액을 농축시키고 미정제 혼합물을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 화합물 105-5 ((2S)-6-[(2S)-2,6-디아미노헥산아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산(105-5, 2.5g, 5.034mmol, 77.44%))을 무색 오일로 얻었다. ESI m/z: 497.3(M+H)+.
단계 4
DMF(5 mL) 중의 미정제 화합물 105-5 ((2S)-6-[(2S)-2,6-디아미노헥산아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (105-5, 1.94 g, 3.907 mmol))의 용액을 DMF(10mL) 중의 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 1-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-오에이트(5.7g, 6.995mmol) 및 DIPEA(1.01g, 7.813mmol)의 용액에 적가하였다. 생성된 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하여 완료하였다. 반응 혼합물을 역상 플래시 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 화합물 105-6 ((2S)-6-[(2S)-2,6-비스(1-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)헥산아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (105-6, 4.75g, 2.505mmol, 64.12%))을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 566.2 (M-200)/3+H)+, 970.6 (M/2+Na)+.
단계 5
DCM(10 mL) 중의 화합물 105-6 ((2S)-6-[(2S)-2,6-비스(1-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)헥산아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산(105-6, 4.75 g, 2.505 mmol))의 용액에 TFA(5 mL, 67.313 mmol)를 첨가하였다. 이어서, 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 농축하여 유기 용매를 제거하고, 미정제 잔류물을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 화합물 105-7 ((2S)-6-[(2S))-2,6-비스(1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)헥산아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (105-7, 3.95g, 2.329mmol, 92.97%))을 무색 오일로 얻었다. ESI m/z : 566.3 (M/3+H)+.
단계 6
MeOH(90mL) 중의 화합물 105-7 ((2S)-6-{[(2S)-2,6-비스(1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-아미도)헥실]아미노}-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (105-7, 3.95 g, 2.329 mmol))의 용액에 D-글루코스(5.04g, 27.948mmol)를 나누어서 첨가하고, 그 혼합물을 N2 분위기 하에 30분 동안 환류 하에 가열하였다. 그런 다음 MeOH(10mL) 중의 NaCNBH3 (1.76g, 27.948mmol)의 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 이 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 그런 다음 반응 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 화합물 105-8 ((2S)-6-[(2S)-2,6-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (105-8, 4.13g, 1.755mmol, 75.36%))을 무색 오일로 얻었다. ESI m/z: 785.0(M/3+H)+.
단계 7
무수 DMF(3 mL) 중의 화합물 105-8 ((2S)-6-[(2S)-2,6-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산 (105-8, 226.17mg, 0.096mmol)), 화합물 105-9 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (105-9, 90mg, 0.080mmol)) 및 DIPEA(20.64 mg, 0.160 mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반하여 출발 산이 용매에 완전히 용해되도록 한 다음, 무수 DMF(1mL) 중 HATU(36.55mg, 0.096mmol) 용액을 10분에 걸쳐 주사기로 한 방울씩 첨가했다. 첨가 후, 생성된 용액을 추가로 2시간 동안 교반하여 반응을 완료하였다. 이어서 반응 용액을 역상 플래시 크로마토그래피(0.01% TFA)로 직접 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 LabConc로 동결건조하여 화합물 105-10 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-5-[(2S)-2,6-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필](메틸)카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바메이트 (105-10, 180mg, 0.052mmol, 65.06%))의 TFA 염을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 865.5 (M/4+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.07 (s, 1H), 8.36-8.08 (m, 4H), 7.98-7.88 (m, 5H), 7.83-7.79 (m, 1H), 7.74-7.65 (m, 3H), 7.58-7.56 (m, 3H), 7.43-7.39 (m, 2H), 7.34-7.24 (m, 8H), 7.20-7.13 (m, 1H), 6.00 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 5.51-5.36 (m, 6H), 5.09-4.94 (m, 2H), 4.94-4.70 (m, 4H), 4.70-4.38 (m, 14H), 4.33-4.14 (m, 7H), 4.04- 3.93 (m, 6H), 3.79-3.73 (m, 4H), 3.68-3.64 (m, 4H), 3.61-3.55 (m, 18H), 3.52-3.46 (m, 96H), 3.25-3.12 (m, 13H), 3.06-2.83 (m, 13H), 2.43-2.37 (m, 3H), 2.30-2.26 (m, 3H), 2.16-2.04(m, 2H), 2.04-1.91 (m, 2H), 1.83-1.15 (m, 25H), 1.05-0.97 (m, 6H), 0.97-0.73 (m, 26H) ppm. TFA에서 카르복실기의 양성자 하나가 밝혀졌다.
단계 8
DMF(1.8 mL) 중의 화합물 105-10 (4-((2S,5S,8S,15S,62S,63R,64R,65R)-8-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)-62,63,64,65,66-펜타하이드록시-5-이소프로필-4,7,14,21-테트라옥소-15-((42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도)-60-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실)-2-(3-우레이도프로필)-24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57-도데카옥사-3,6,13,20,60-펜타아자헥사헥사콘탄아미도)벤질((S)-1-(((S)-1-(((3S),4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)(메틸)카르바메이트(105-10, 180 mg, 0.052 mmol))의 용액을 실온에서 교반하고 디에틸 아민 (0.2 mL, 1.941mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 반응이 완료될 때 까지 1시간 동안 교반하였다. 대부분의 디에틸 아민을 진공 하에서 증발시키고 잔류물을 역상 플래쉬 크로마토그래피 (0.01% TFA)로 정제하여 예상 분획물을 얻었으며, 이를 동결 건조하여 화합물 105-11 (4-((2S,5S,8S,15S,62S,63R,64R,65R)-8-아미노-62,63,64,65,66-펜타하이드록시-5-이소프로필-4,7,14,21-테트라옥소-15-((42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도)-60-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실)-2-(3-우레이도프로필)-24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57-도데카옥사-3,6,13,20,60-펜타아자헥사헥사콘탄아미도)벤질 ((S)-1-(((S)-1-(((3S,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1 -일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)(메틸)카르바메이트(105-11, 110mg, 0.034mmol, 65.31%))의 TFA 염을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z : 619.1(링커 단편, (M-717-26-18)/4+H))+, 809.9 (M/4+H)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.10 (s, 1H), 8.43 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.36-8.33 (m, 1H), 8.15-8.10 (m, 5H), 8.01 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.94-7.91 (m, 1.5H), 7.85-7.83 (m, 1H), 7.67(d, J = 8.4 Hz, 0.5H), 7.59-7.57 (m, 2H), 7.35-7.24 (m, 6H), 7.20-7.13 (m, 1H), 6.07-6.05 (m, 1H), 5.53-5.38 (m, 6H), 5.09-4.94 (m, 2H), 4.94-4.42 (m, 18H), 4.30-4.13 (m, 4H), 4.04-3.93 (m, 6H), 3.85-3.81 (m, 1H), 3.81-3.73 (m, 5H), 3.73-3.64 (m, 5H), 3.61-3.55 (m, 18H), 3.55-3.48 (m, 88H), 3.39-3.29 (m, 10H), 3.24-3.12 (m, 12H), 3.06-2.83 (m, 11H), 2.44-2.38 (m, 3H), 2.38-2.22 (m, 4H), 2.15-2.05 (m, 2H), 2.05-1.94 (m, 2H), 1.85-1.64 (m, 6H), 1.64-1.41 (m, 6H), 1.41-1.16 (m, 12H), 1.05-0.97 (m, 6H), 0.97-0.75 (m, 26H) ppm. TFA에서 카르복실기의 3개 양성자가 밝혀졌다.
단계 9
무수 DMF(2mL) 중의 화합물 105-11 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(2S)-2,6-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]헥사아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2-메틸프로필]-N-메틸카르바메이트(105-11, 100mg, 0.031mmol)) 및 DIPEA (7.97mg, 0.062mmol)의 용액을 실온에서 교반한 후, 무수 DMF(2mL) 중의 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (11.43 mg, 0.037 mmol) 용액을 5분에 걸쳐 주사기로 적가했다. 첨가 후, 생성된 용액을 출발 아민이 실질적으로 소모될 때까지 추가로 6시간 동안 교반하였다. 그 후 생성된 용액을 Prep-HPLC(0.01% TFA)로 직접 정제하여 PB105 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-[(2S)-2,6-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-2-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]카르바모일}-1-메톡시-2-메틸에틸]피롤리딘-1-일]-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일](메틸)카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}-2 -메틸프로필]-N-메틸카르바메이트 (PB105, 65mg, 0.019mmol, 61.34%))의 TFA 염을 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 667.8(링커 단편, (M-717-26-18)/4+H)+; 858.3(M/4+H)+. 체류 시간 6.042분 (HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.05 (s, 1H), 8.38-8.30 (m, 0.5H), 8.17-8.10 (m, 3.5H), 7.99-7.91 (m, 2.5H), 7.91-7.82 (m, 2H), 7.68-7.65 (m, 1.5H), 7.59-7.57 (m, 2H), 7.34-7.24 (m, 6H), 7.19-7.15 (m, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.08-5.96 (m, 1H), 5.53-5.37 (m, 6H), 5.14-4.36 (m, 22H), 4.29-4.13 (m, 5H), 4.04-3.93 (m, 7H), 3.82-3.73 (m, 5H), 3.73-3.66 (m, 5H), 3.62-3.55 (m, 20H), 3.52-3.41 (m, 88H), 3.36-3.24 (m, 10H), 3.24-3.12 (m, 12H), 3.12-2.83 (m, 11H), 2.43-2.35 (m, 3H), 2.29 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.14-1.92 (m, 6H), 1.83-1.46 (m, 16H), 1.46-1.16 (m, 12H), 1.05-0.97 (m, 6H), 0.89-0.75 (m, 26H) ppm. TFA에서 카르복실기의 두 개의 양성자가 밝혀졌다.
실시예 37: 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB106)의 제조.
Figure pct00491
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB106)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
DMF(2mL) 중의 화합물 106-1 ((2S)-6-[(2S)-2,6-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥ㅅ산미도]-2-({[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}아미노)헥산 산(106-1, 200mg, 0.085mmol)), 화합물 106-2 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트(106-2, 71.49mg, 0.085mmol)) 및 HATU(32.32mg, 0.085mmol), DIPEA (21.97mg, 0.170mmol)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하여 완료시켰다. 반응 혼합물 역상 플래시 크로마토그래피(0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었고, 이를 동결 건조하여 화합물 106-3 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-5-[(2S)-2,6-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바메이트(106-3, 144mg, 0.045mmol, 53.35%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 794.8 (M/4+H)+, 1059.3 (M/3+H)+.
단계 2
DMF(2 mL) 중의 화합물 106-3 ((9H-플루오렌-9-일)메틸 N-[(1S)-5-[(2S)-2,6-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(카르바모일아미노)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바모일}옥시)메틸]페닐}카르바모일)부틸]카르바모일}-2-메틸프로필]카르바모일}펜틸]카르바메이트(106-3, 144mg, 0.045mmol)) 및 디에틸아민 (0.2mL, 0.180mmol)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 역상 플래쉬 크로마토그래피 (0.01% TFA)로 정제하여 화합물 106-4 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(2S)-2,6-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트(106-4, 70mg, 0.024mmol, 52.29%))를 백색 고체로 얻었다. ESI m/z: 985.3(M/3+H)+.
단계 3
DMF(2mL) 중의 화합물 106-4 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-아미노-6-[(2S)-2,6-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트 (106-4, 40mg, 0.014mmol), 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트(106-5, 17.26 mg, 0.056mmol)) 및 DIPEA(7.24mg, 0.056mmol)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하여 완료하였다. 이어서 반응 혼합물을 Prep-HPLC (0.01% TFA)로 정제하여 원하는 분획물을 얻었으며, 이를 LabConc로 동결 건조하여 PB106-6 ({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-[(2S)-2,6-비스[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-펜타하이드록시-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥실]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-40-아자헥사테트라콘탄아미도]헥산아미도]-2-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도]헥산아미도]-3-메틸부탄아미도]-5-(카르바모일아미노)펜탄아미도]페닐}메틸 N-[(10S,23S)-10-에틸-18-플루오로-10-하이드록시-19-메틸-5,9-디옥소-8-옥사-4,15-디아자헥사사이클로[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]테트라코사-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-헵타엔-23-일]카르바메이트(PB106, 26mg, 0.008mmol, 59.02%))를 담황색 고체로 얻었다. ESI m/z : 787.5 (M/4+H)+, 1049.9 (M/3+H)+. 체류 시간 5.626 분 (HPLC). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.05 (s, 1H), 8.22-8.05 (m, 4H), 8.01-7.93 (m, 2H), 7.89-7.77 (m, 3H), 7.66 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.32 (s, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.56 (s, 1H), 6.01 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 5.50-5.39 (m, 8H), 5.33-5.24 (m, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.88-4.67 (m, 4H), 4.67-4.38 (m, 12H), 4.38-4.13 (m, 4H), 4.00-3.94 (m, 4H), 3.83-3.77 (m, 4H), 3.72-3.63 (m, 4H), 3.63-3.56 (m, 18H), 3.55-3.46 (m, 88H), 3.38 - 3.14 (m, 9H), 3.14-2.91 (m, 10H), 2.38-2.30 (m, 5H), 2.28 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.23-2.08 (m, 5H), 2.02-1.83 (m, 4H), 1.72-1.53(m, 5H), 1.46-1.28 (m, 13H), 1.28-1.12 (m, 7H), 0.90-0.80 (m, 9H) ppm. TFA로부터의 카르복실기의 두 양성자가 또한 밝혀졌다.
실시예 38: 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB107)의 제조.
Figure pct00492
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB107)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
무수 메탄올(50 mL) 중의 화합물 107-1 (0.5 g, 0.536 mmol) 및 D-글루코스(0.77 g, 4.291 mmol)의 용액을 50℃에서 30분간 가열한 후, NaCNBH3 (0.27 g, 4.291 mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었음을 나타내고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지 70℃에서 추가 4일 동안 교반하였다. 반응액을 농축한 후 역상 액체 크로마토그래피로 정제하여 화합물 107-2 (0.3g, 0.189mmol, 35.29%)을 백색 고체로 얻었다. 순도 = 85% 내지 90%.
단계 2
무수 DMF(4 mL) 중의 화합물 107-3 (0.16 g, 0.189 mmol), 화합물 107-2 (0.3 g, 0.189 mmol) 및 HATU(72 mg, 0.189 mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(74mg, 0.567mmol)를 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 107-4 (140mg, 0.058mmol, 30.50%)를 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 3
무수 DCM(4 mL) 중의 화합물 107-4 (140mg, 0.058mmol) 및 TFA(1mL)의 용액을 LCMS가 모든 출발 아민이 소모되고 원하는 생성물(m/z = 1156 = 2311/2+H)과 함께 당-에스테르화 생성물(TFA는 m/z=(2311+96)/3+H=803인 모노에스테르인 당 유닛에서 하이드록시 기와 축합됨)이 형성되었음을 나타날 때까지 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 완성된 반응 용액을 농축하여 건조시킨 후 THF(4 mL) 및 물(2 mL)에 재용해시키고, 포화 탄산나트륨 수용액으로 처리하여 pH를 8~9로 조정하였다. 생성된 용액을 실온에서 30분 동안 교반하여 완전한 가수분해를 달성하였다. 이어서, 용액을 희석된 HCl로 처리하여 pH를 2~3으로 조정하고 응축시키고, 잔류물을 역상 액체 크로마토그래피로 정제하여 화합물 107-5 (113 mg, 0.049 mmol, 84.32%)를 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 4
무수 DMF(2 mL) 중의 화합물 107-5 (113 mg, 0.049 mmol) 및 DIPEA(19 mg, 0.147 mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, 무수 DMF(1 mL) 중의 화합물 107-6 (23 mg, 0.074 mmol)의 용액을 주사기로 5분에 걸쳐 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 용액을 Prep-HPLC로 정제하여 PB107 (12mg, 0.005mmol, 9.84%)을 백색 고체로 얻었다. LCMS, m/z = 835.93(M/3+H)+.
실시예 39: 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB108)의 제조.
Figure pct00493
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB108)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
무수 DCM(30 mL) 중의 화합물 108-1 (2 g, 3.646 mmol) 및 HOSu(0.84 g, 7.291 mmol)의 용액을 실온에서 교반한 후, EDCI(1.4 g, 7.291 mmol)를 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 물로 세척하고, 유기층을 수집한 후, 수상을 DCM(40 mL *2)으로 추출하였다. 조합된 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여 건조시켜 화합물 108-2 (1.8 g, 2.788 mmol, 76.60%)를 백색 고체로서 산출하였고, 이를 다음 단계에서 그대로 사용하였다. 순도 = 85% 내지 90%.
단계 2
무수 DMF (5 mL) 중의 화합물 108-2 (0.76 g, 1.182 mmol) 및 화합물 108-3 (1 g, 1.182 mmol)의 용액을 실온에서 교반한 후, DIPEA(0.3 g, 2.364 mmol)를 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 종결시키고 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 108-4 (1.4g, 1.017mmol, 85.89%)를 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 3
무수 DMF(20 mL) 중의 화합물 108-4 (1.4 g, 1.017 mmol) 및 DEA(5 mL)의 용액을 LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 농축하여 건조시켜 화합물 108-5 (0.9 g, 0.966 mmol, 94.74%)를 황색 오일로 얻었고, 이는 다음 단계에서 그대로 사용되었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 4
무수 메탄올(50 mL) 중의 화합물 108-5 (0.9g, 0.966mmol) 및 D-글루코스(1.04g, 5.793mmol)의 용액을 50℃에서 30분 동안 가열한 후, NaCNBH3 (0.36g, 5.793mmol))을 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 70℃에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 그 다음, 반응 용액을 농축하고 역상 액체 크로마토그래피로 정제하여 화합물 108-6 (0.7g, 0.492mmol, 50.72%)을 백색 고체로 얻었다. 순도 = 85% 내지 90%.
단계 5
무수 DMF(4 mL) 중의 화합물 108-7 (0.21 g, 0.250 mmol), 화합물 108-6 (0.36 g, 0.250 mmol) 및 HATU(93 mg, 0.250 mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(95mg, 0.750mmol)를 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 108-8 (0.21g, 0.093mmol, 37.50%)를 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 6
무수 DCM(4mL) 중의 화합물 108-8 (0.21 g, 0.093 mmol) 및 TFA(1 mL)의 용액을 LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물(m/z= 1074 = 2147/2+H)이 당에스테르화 생성물(TFA는 m/z=(2147+96)/2+H=1122를 갖는 모노에스테르인 당 유닛에서 하이드록시기로 축합됨)과 함께 형성되었음을 나타낼 때까지 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 완성된 반응 용액을 농축하여 건조시킨 후 THF(4 mL) 및 물(2 mL)에 재용해시키고 포화 탄산나트륨 수용액으로 처리하여 pH를 8~9로 조정하였다. 생성된 용액을 실온에서 30분 동안 교반하여 완전한 가수분해를 달성하였다. 이어서, 용액을 희석된 HCl로 처리하여 pH를 2~3으로 조정하고 응축시켰으며, 잔류물을 역상 액체 크로마토그래피로 정제하여 화합물 108-9 (160mg, 0.075mmol, 80.65%)을 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 7
무수 DMF(2 mL) 중의 화합물 108-9 (160mg, 0.075mmol) 및 DIPEA(28.8mg, 0.224mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, 무수 DMF(1 mL) 중의 화합물 108-10 (34.4mg, 0.113 mmol)의 용액을 주사기로 5분에 걸쳐 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 용액을 Prep-HPLC로 정제하여 PB108 (15mg, 0.006mmol, 8.62%)을 백색 고체로서 얻었다. LCMS, m/z = 1171.24(M/2+H)+.
실시예 40: MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB109)의 제조.
Figure pct00494
MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB109)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
무수 DMF(4mL) 중의 화합물 109-1 (170mg, 0.107mmol), 화합물 109-2 (120mg, 0.107mmol) 및 HATU(41mg, 0.107mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(41.4mg, 0.321mmol)를 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 109-3 (103mg, 0.038mmol, 35.76%)을 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 2
무수 DCM (4 mL) 중의 화합물 109-3 (103 mg, 0.038 mmol) 및 TFA(1 mL)의 용액을, LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물(m/z= 865 = 2594/3+H)이 당에스테르화 생성물(TFA는 m/z=(2594+96)/3+H=897를 갖는 모노에스테르인, 당 유닛에서 하이드록시기와 축합됨)과 함께 형성되었음을 나타날 때까지, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 용액을 농축하여 건조시킨 후 THF(4 mL)와 물(2 mL)에 재용해시키고, 포화탄산나트륨 수용액으로 처리하여 pH를 8~9로 조절하였다. 생성된 용액을 실온에서 30분 동안 교반하여 완전한 가수분해를 달성하였다. 이어서, 용액을 희석된 HCl로 처리하여 pH를 6~7로 조정하고 응축시켰다; 잔류물을 역상 액체 크로마토그래피로 정제하여 화합물 109-4 (45mg, 0.017mmol, 45.45%)를 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 3
무수 DMF (2 mL) 중의 화합물 109-4 (45 mg, 0.017 mmol) 및 DIPEA(6.7 mg, 0.052 mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 후, 무수 DMF(1 mL) 중의 109-5 (8.0 mg, 0.026 mmol)의 용액을 주사기로 5분에 걸쳐 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 용액을 Prep-HPLC로 정제하여 PB109 (6mg, 0.002mmol, 12.41%)를 백색 고체로 얻었다. LCMS, m/z = 930.16(M/3+H)+.
실시예 41: MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB110 또는 LD110)의 제조.
Figure pct00495
MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB110 또는 LD110)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
무수 DCM(150 mL) 중의 화합물 110-1 (5 g, 8.671 mmol) 및 HOSu(2.0 g, 17.342 mmol)의 용액을 실온에서 교반한 후, EDCI(3.3 g, 17.342 mmol)를 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 물로 세척하고, 유기층을 수집한 후, 수상을 DCM(100 mL*2)으로 추출하였다. 조합된 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축하여 건조시켜 화합물 110-2 (4.7g, 6.976mmol, 80.48%)를 백색 고체로서 산출하였고, 이를 다음 단계에서 그대로 사용하였다. 순도 = 85% 내지 90%.
단계 2
무수 DMF(20 mL) 중의 화합물 110-3 (5 g, 5.953 mmol) 및 DEA(5 mL)의 용액을, LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 농축하여 건조시켜 무색 오일로서 화합물 110-4 (3.4 g, 5.504 mmol, 92.39%)를 얻었고, 이는 다음 단계에서 그대로 사용되었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 3
무수 DMF(10 mL) 중의 화합물 110-2 (1g, 2.491mmol) 및 화합물 110-4 (1.5g, 2.491mmol)의 용액을 실온에서 교반한 후, DIPEA(0.64g, 4.982mmol)를 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 종결시키고 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 110-5 (1.3g, 1.438mmol, 57.78%)을 무색 오일로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 4
무수 DCM (16 mL) 중의 화합물 110-5 (1.3g, 1.438mmol) 및 TFA(4mL)의 용액을, LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음으로 나타낼 때까지, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 농축하여 건조시켜 화합물 110-6 (910 mg, 1.293 mmol, 89.92%)을 황색 오일로 얻었고, 이는 다음 단계에서 그대로 사용되었다. 순도 = 85% 내지 90%.
단계 5
무수 메탄올(40 mL) 중의 화합물 110-6 (910mg, 1.293mmol) 및 D-글루코스(1.4g, 7.771mmol)의 용액을 50℃에서 30분 동안 가열한 다음, NaCNBH3 (488mg, 7.766mmol))을 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 70℃에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하고 역상 액체 크로마토그래피로 정제하여 화합물 110-7 (320mg, 0.268mmol, 20.70%)을 백색 고체로 얻었다. 순도 = 85% 내지 90%.
단계 6
무수 DMF(10 mL) 중의 화합물 110-2 (1g, 2.491mmol) 및 화합물 110-8 (0.92g, 2.491mmol)의 용액을 실온에서 교반한 후, DIPEA(0.64g, 4.982mmol)를 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 종결시키고 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 110-9 (1.4 g, 2.138 mmol, 85.89%)을 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 7
무수 DMF(10 mL) 중의 화합물 110-9 (0.58g, 0.886mmol), 화합물 110-10 (1g, 0.890mmol) 및 HATU(0.34g, 0.894mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.35g, 2.708mmol)를 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 110-11 (240mg, 0.136mmol, 15.29%)을 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 8
무수 DCM (4 mL) 중의 화합물 110-11 (240 mg, 0.136 mmol) 및 TFA(1 mL)의 용액을, LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 농축하여 건조시켜 화합물 110-12 (195 mg, 0.125 mmol, 91.68%)를 황색 오일로 얻었고, 이는 다음 단계에서 그대로 사용되었다. 순도 = 85% 내지 90%.
단계 9
무수 DMF(5 mL) 중의 화합물 110-12 (195mg, 0.125mmol), 화합물 110-13 (299mg, 0.250mmol) 및 HATU(95mg, 0.250mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(97mg, 0.751mmol)를 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 110-14 (210mg, 0.053mmol, 42.89%)를 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 10
무수 DMF (4 mL) 중의 화합물 110-14 (210 mg, 0.053 mmol) 및 DEA(1 mL)의 용액을, LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 농축하여 건조시켜 화합물 110-15 (175mg, 0.047mmol, 88.38%)를 무색 오일로 얻었고, 이는 다음 단계에서 그대로 사용되었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 11
무수 DMF(2mL) 중의 화합물 110-15 (175mg, 0.047mmol) 및 DIPEA(12.2mg, 0.094mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, 무수 DMF(1 mL) 중의 화합물 110-16 (21.9mg, 0.071 mmol)의 용액을 주사기로 5분에 걸쳐 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 용액을 Prep-HPLC로 정제하여 PB110 (73mg, 0.019mmol, 39.63%)을 백색 고체로 얻었다. LCMS, m/z = 972.82(M/4+H)+.
실시예 42: 엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB111 또는 LD111)의 제조.
Figure pct00496
엑사테칸에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB111 또는 LD111)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
무수 DCM(60 mL) 중의 화합물 111-1 (5 g, 14.433 mmol) 및 HOSu(3.3 g, 28.673 mmol)의 용액을 실온에서 교반한 후, EDCI(5.5 g, 28.690 mmol)를 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 물로 세척하고, 유기층을 수집한 후, 수상을 DCM(50 mL *2)으로 추출하였다. 조합된 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축하여 건조시켜 화합물 111-2 (4.8 g, 10.823 mmol, 75.00%)를 백색 고체로서 산출하였고, 이를 다음 단계에서 그대로 사용하였다. 순도 = 85% 내지 90%.
단계 2
무수 DMF(20 mL) 중의 화합물 111-2 (4.8 g, 10.823 mmol) 및 화합물 111-3 (3.99 g, 10.829 mmol)의 용액을 실온에서 교반한 후, DIPEA (2.8 g, 21.665 mmol)를 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 종결시키고 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 111-4 (5.1g, 7.319mmol, 67.64%)를 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 3
무수 DMF(10 mL) 중의 화합물 111-4 (0.83 g, 1.191 mmol), 화합물 111-5 (1 g, 1.189 mmol) 및 HATU(0.45 g, 1.183 mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.46g, 3.559mmol)를 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 111-6 (1.1g, 0.724mmol, 61.11%)을 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 4
무수 DCM(8 mL) 중의 화합물 111-6 (1.1 g, 0.724 mmol) 및 TFA(2 mL)의 용액을, LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 농축하여 건조시켜 화합물 111-7 (0.9 g, 0.682 mmol, 94.24%)을 황색 오일로 얻었고, 이는 다음 단계에서 그대로 사용되었다. 순도 = 85% 내지 90%.
단계 5
무수 DMF(5 mL) 중의 화합물 111-7 (150mg, 0.114mmol), 화합물 111-8 (272mg, 0.227mmol) 및 HATU(87mg, 0.229mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(89mg, 0.689mmol)를 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 111-9 (110mg, 0.030mmol, 26.38%)를 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 6
무수 DMF(4 mL) 중의 화합물 111-9 (110mg, 0.030mmol) 및 DEA(1mL)의 용액을, LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축하여 건조시켜 무색 오일로서 화합물 111-10 (75 mg, 0.022 mmol, 72.82%)을 얻었고, 이는 다음 단계에서 그대로 사용되었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 7
무수 DMF(2 mL) 중의 화합물 111-10 (75mg, 0.022mmol) 및 DIPEA(5.6mg, 0.043mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 다음, 무수 DMF(1 mL) 중의 화합물 111-11 (10mg, 0.032 mmol)의 용액을 주사기로 5분에 걸쳐 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 용액을 Prep-HPLC로 정제하여 PB111 (22mg, 0.006mmol, 27.78%)을 백색 고체로 얻었다. LCMS, m/z = 912.79(M/4+H)+.
실시예 43: MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB112)의 제조.
Figure pct00497
MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB112)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
무수 DMF(3 mL) 중의 화합물 112-1 (100mg, 0.046mmol), 화합물 112-2 (25.2mg, 0.046mmol) 및 HATU(17.5mg, 0.046mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(17.8mg, 0.138mmol)를 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 112-3 (85mg, 0.031mmol, 68.55%)을 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 2
무수 DMF(3 mL) 중의 화합물 112-3 (85mg, 0.031mmol) 및 DEA(1mL)의 용액을, LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 농축하여 건조시켜 무색 오일로서 화합물 112-4 (65 mg, 0.029 mmol, 91.47%)를 얻었고, 이는 다음 단계에서 그대로 사용되었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 3
무수 DMF(2 mL) 중의 화합물 112-4 (65mg, 0.029mmol) 및 DIPEA(14.8mg, 0.116mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, 무수 DMF(1 mL) 중의 화합물 112-5 (26.5mg, 0.087 mmol)의 용액을 주사기로 5분에 걸쳐 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 용액을 Prep-HPLC로 정제하여 PB112 (11mg, 0.004mmol, 14.47%)를 백색 고체로 얻었다. LCMS, m/z = 885.71 (M/3+H)+.
실시예 44: MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB113)의 제조.
Figure pct00498
MMAE에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커 (PB113)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
MeCN(100 mL) 및 H2O(200 mL) 중의 화합물 113-1 (20 g, 0.078 mol) 및 RuCl3 (0.4 g, 2%)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 후 NaIO4 (66.52 g, 0.311 mol)을 몇 부분으로 나누어 첨가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 50℃에서 추가로 2시간 동안 교반하였다. 메탄올(20 mL)을 첨가하고, 용액을 증발시키고, 잔류물을 아세토니트릴(100ml)에서 5℃에서 30분 동안 세척하였다. 용액을 여과하고 여액을 농축하여 건조하여 화합물 113-2 (9.5g, 0.039mol, 50.67%)를 백색 고체로 얻었다. 순도 = 50% 내지 60%.
단계 2
무수 DMF(20 mL) 중의 화합물 113-2 (5 g, 0.021 mol), 화합물 113-3 (1 g, 1.95 mmol) 및 HATU(0.74 g, 1.95 mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반하고, 이어서 DIPEA(0.75g, 5.85mmol)를 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 113-4 (410mg, 0.556mmol, 28.67%)를 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 3
무수 DMF(2 mL) 중의 화합물 113-4 (20.6mg, 0.028mol), 화합물 113-5 (60mg, 0.028mmol) 및 HATU(10.5mg, 0.028mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(10.7mg, 0.084mmol)를 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 113-6 (41mg, 0.014mmol, 51.38%)을 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 4
무수 DMF(4mL) 중의 화합물 113-6 (41mg, 0.014mmol) 및 DEA(1mL)의 용액을, LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 농축하여 건조시켜 화합물 113-7 (31 mg, 0.012 mmol, 81.79%)을 황색 오일로 얻었고, 이는 다음 단계에서 그대로 사용되었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 5
무수 DMF(1 mL) 중의 화합물 113-7 (31mg, 0.012mmol) 및 DIPEA(4.5mg, 0.035mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, 무수 DMF(1 mL) 중의 화합물 113-8 (5.4mg, 0.017 mmol)의 용액 주사기로 2분에 걸쳐 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 포름산으로 중화하여 pH를 6~7로 조정하였다. 이어서, 반응 용액을 Prep-HPLC로 정제하여 PB113 (21mg, 0.007mmol, 63.25%)을 백색 고체로 얻었다. LCMS, m/z = 957.42 (M/3+H)+.
실시예 45 : 엑사테칸에 부착된 약물-링커(PB114)의 제조.
Figure pct00499
엑사테칸에 부착된 약물-링커(PB114)는 다음과 같이 제조되었다:
단계 1
무수 DMF(30 mL) 중의 화합물 114-1 (5.8 g, 5.431 mmol) 및 DIPEA(2.1 g, 16.249 mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, 무수 DMF(10 mL) 중의 화합물 114-2 (2.5 g, 8.109 mmol)의 용액을 주사기로 5분에 걸쳐 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음 대부분의 DMF와 DIPEA를 증발시키고 잔류물을 아세토니트릴(150ml)에서 5℃에서 30분간 세척했다. 용액을 여과하고 필터 케이크를 아세토니트릴로 세척하여 화합물 114-3 (5.2g, 4.122mmol, 75.91%)을 황색 고체로 얻었다. 순도 = 85% 내지 95%.
단계 2
무수 DCM(90 mL) 중의 화합물 114-3 (5.2 g, 4.122 mmol) 및 DCA(10 mL)의 용액을 LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 건조시키고 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 114-4 (2.5 g, 2.488 mmol, 60.24%)를 황색 고체로 얻었다. 순도 = 85% 내지 95%.
단계 3
무수 DMF(5 mL) 중의 화합물 114-4 (500mg, 0.497mmol), 화합물 114-5 (131mg, 0.498mmol) 및 HATU(189mg, 0.497mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(193mg, 1.493mmol)를 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 114-6 (160mg, 0.128mmol, 25.72%)을 황색 고체로 얻었다. 순도 = 85% 내지 95%.
단계 4
무수 DCM(4 mL) 중의 화합물 114-6 (160mg, 0.128mmol) 및 TFA(1mL)의 용액을, LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 114-7 (50mg, 0.043mmol, 33.97%)을 황색 고체로 얻었다. 순도 = 85% 내지 95%.
단계 5
무수 DMF(2 mL) 중의 화합물 114-8 (16.7mg, 0.065mmol) 및 DIPEA(22.5mg, 0.174mmol)의 용액을 실온에서 10분 동안 교반한 다음, 무수 DMF(2 mL) 중의 화합물 114-7 (50mg, 0.043 mmol)의 용액을 주사기로 5분에 걸쳐 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 용액을 Prep-HPLC로 정제하여 PB114 (20mg, 0.014mmol, 32.31%)를 황색 고체로 얻었다. LCMS, m/z = 713.19 (M/2+H)+.
실시예 46: 엑사테칸에 부착된 약물-링커(PB115)의 제조.
Figure pct00500
엑사테칸에 부착된 약물-링커(PB115)는 다음과 같이 제조되었다:
단계 1
무수 DMF(60 mL) 중의 화합물 115-1 (10 g, 0.012 mol) 및 DIPEA(4.6 g, 0.036 mol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, PNPC(3.67 g, 0.012 mmol)를 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음 대부분의 DMF와 DIPEA를 증발시키고 잔류물을 아세토니트릴(200 ml)에서 5℃에서 30분간 세척했다. 용액을 여과하고 필터 케이크를 아세토니트릴로 세척하여 화합물 115-2 (8.4g, 8.449mmol, 70.06%)를 회색 고체로 생성하였다. 순도 = 85% 내지 95%.
단계 2
무수 DMF(50 mL) 중의 화합물 115-2 (8.4g, 8.449mmol), 엑사테칸 (4.5g, 8.449mmol) 및 HOBT(1.1g, 8.449mmol)의 용액을 실온에서 교반한 후, DIPEA(3.3g, 25.347mmol)을 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모었되고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음 대부분의 DMF와 DIPEA를 증발시키고 잔류물을 아세토니트릴(100ml)에서 5℃에서 30분간 세척했다. 용액을 여과하고 필터 케이크를 아세토니트릴로 세척하여 화합물 115-3 (9.3g, 7.207mmol, 85.32%)을 회색 고체로 얻었다. 순도 = 85% 내지 95%.
단계 3
무수 DMF(40 mL) 중의 화합물 115-3 (9.3g, 7.207mmol) 및 DEA(10mL)의 용액을 LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음 대부분의 DMF와 DEA를 증발시키고 잔류물을 아세토니트릴(200ml)에서 5℃에서 30분간 세척했다. 용액을 여과하고 필터 케이크를 아세토니트릴로 세척하여 화합물 115-4 (5.8g, 5.429mmol, 75.32%)를 회색 고체로 얻었다. 순도 = 85% 내지 95%.
단계 4
무수 DMF(10 mL) 중의 화합물 115-4 (1.6 g, 1.498 mmol), 화합물 115-5 (0.53 g, 1.498 mmol) 및 HATU(0.57 g, 1.498 mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.58g, 4.494mmol)를 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 그런 다음 대부분의 DMF와 DIPEA를 증발시키고 잔류물을 아세토니트릴(50ml)에서 5℃에서 30분간 세척했다. 용액을 여과하고 필터 케이크를 아세토니트릴로 세척하여 화합물 115-6 (1.7g, 1.210mmol, 80.95%)을 회색 고체로 얻었다. 순도 = 85% 내지 95%.
단계 5
무수 DMF(8 mL) 중의 화합물 115-6 (1.7 g, 1.210 mmol) 및 DEA(2 mL)의 용액을, LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음 대부분의 DMF와 DEA를 증발시키고 잔류물을 아세토니트릴(50ml)에서 5℃에서 30분간 세척했다. 용액을 여과하고 필터 케이크를 아세토니트릴로 세척하여 화합물 115-7 (1.1g, 0.930mmol, 76.92%)을 회색 고체로 얻었다. 순도 = 85% 내지 95%.
단계 6
무수 DMF(5 mL) 중의 화합물 115-7 (1.1 g, 0.930 mmol) 및 DIPEA(0.36 g, 2.791 mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, 무수 DMF(5 mL) 중의 화합물 115-8 (0.43 g, 1.396 mmol)의 용액을 주사기로 2분에 걸쳐 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음 대부분의 DMF와 DIPEA를 증발시키고 잔류물을 아세토니트릴(30ml)에서 5℃에서 30분간 세척했다. 용액을 여과하고 필터 케이크를 아세토니트릴로 세척하여 화합물 115-9 (1.1g, 0.800mmol, 85.94%)를 회색 고체로 얻었다. 순도 = 80% 내지 90%.
단계 7
무수 DCM(18 mL) 중의 화합물 115-9 (1.1g, 0.800mmol) 및 DCA(2mL)의 용액을, LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 건조시키고 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 115-10 (310mg, 0.277mmol, 34.64%)을 백색 고체로 얻었다. 순도 = 85% 내지 95%.
단계 8
무수 DMF(2 mL) 중의 화합물 115-10 (141.9mg, 0.554mmol) 및 DIPEA(143.2mg, 1.108mmol)의 용액을 실온에서 20분 동안 교반한 후, 무수 DMF(2 mL) 중의 115-11(310mg, 0.277 mmol)의 용액을 주사기로 5분에 걸쳐 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 용액을 Prep-HPLC로 정제하여 PB115 (50mg, 0.036mmol, 12.95%)를 백색 고체로 얻었다. LCMS, m/z = 697.66 (M/2+H)+.
실시예 47 : 팔보시클립에 부착된 약물-링커(PB116)의 제조.
Figure pct00501
팔보시클립에 부착된 약물-링커(PB116)는 다음과 같이 제조되었다:
단계 1
무수 DMF(60 mL) 중의 화합물 116-1 (685.4 mg, 0.894 mmol), 팔보시클립(palbociclib)(400 mg, 0.894 mmol) 및 HOBT(120.8 mg, 0.894 mmol)의 용액을 실온에서 교반한 다음, DIPEA(231 mg, 1.787mmol)을 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음 대부분의 DMF와 DIPEA를 증발시키고 잔류물을 아세토니트릴(20ml)에서 5℃에서 30분간 세척했다. 용액을 여과하고 필터 케이크를 아세토니트릴로 세척하여 화합물 116-2 (720mg, 0.670mmol, 74.92%)를 황색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 2
무수 DMF(4 mL) 중의 화합물 116-2 (720 mg, 0.670 mmol) 및 DEA(1 mL)의 용액을, LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음 대부분의 DMF와 DEA를 증발시키고 잔류물을 아세토니트릴(50ml)에서 5℃에서 30분간 세척했다. 용액을 여과하고 필터 케이크를 아세토니트릴로 세척하여 화합물 116-3 (510mg, 0.598mmol, 89.32%)을 황색 고체로 얻었다. 순도 = 95% 내지 95%.
단계 3
무수 DMF(3 mL) 중의 화합물 116-3 (300 mg, 0.352 mmol) 및 DIPEA(136.5 mg, 1.056 mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, 무수 DMF(2 mL) 중의 화합물 116-4 (162.5 mg, 0.527 mmol)의 용액을 주사기로 5분에 걸쳐 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음 반응 용액을 Prep-HPLC로 정제하여 화합물 PB116 (210mg, 0.201mmol, 57.08%)을 황색 고체로 얻었다. LCMS, m/z = 1046.59(M+H)+.
실시예 48: 팔보시클립에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커(PB117)의 제조.
Figure pct00502
팔보시클립에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커(PB117)는 다음과 같이 제조되었다:
단계 1
무수 DMF(2 mL) 중의 화합물 117-1 (207mg, 0.176mmol), 화합물 117-2 (150mg, 0.176mmol) 및 HATU(66.8mg, 0.176mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(68.1mg, 0.527mmol)를 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 117-3 (210mg, 0.105mmol, 59.49%)을 황색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 2
무수 DCM(8 mL) 중의 화합물 117-3 (210 mg, 0.105 mmol) 및 TFA(2 mL)의 용액을, LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 당 에스테르화 생성물 (TFA는 m/z=(1909+96)/3+H=669를 갖는 모노에스테르인 당 유닛에서 하이드록시기와 축합됨)과 함께 원하는 생성물(m/z= 637 = 1909/3+H)이 형성되었음을 나타낼 때까지 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 완성된 반응 용액을 농축하여 건조시킨 후 THF(4 mL)와 물(2 mL)에 재용해시키고 포화 탄산나트륨 수용액으로 처리하여 pH를 8~9로 조절하였다. 생성된 용액을 실온에서 30분 동안 교반하여 완전한 가수분해를 달성하였다. 이어서, 용액을 희석된 TFA로 중화시키고 응축시키고, 잔류물을 역상 액체 크로마토그래피로 정제하여 화합물 117-4 (120mg, 0.063mmol, 60.15%)를 황색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 3
무수 DMF(3 mL) 중의 화합물 117-4 (120 mg, 0.063 mmol) 및 DIPEA(24.3 mg, 0.189 mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, 무수 DMF(2 mL) 중의 화합물 117-5 (29.0 mg, 0.094 mmol)의 용액을 주사기로 5분에 걸쳐 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 용액을 Prep-HPLC로 정제하여 PB117 (40mg, 0.019mmol, 30.30%)을 황색 고체로 얻었다. LCMS, m/z = 1052.11 (M/2+H)+.
실시예 49: T7-2에 부착된 약물-링커 (PB118)의 제조.
Figure pct00503
T7-2에 부착된 약물-링커 (PB118)는 다음과 같이 제조되었다:
단계 1
무수 DMF(6 mL) 중의 T7-2(300 mg, 0.951 mmol) 및 DIPEA(737.8 mg, 5.706 mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 후, PNPC(868.26 mg, 2.853 mmol)를 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음 대부분의 DMF와 DIPEA를 증발시키고 잔류물을 아세토니트릴(50ml)에서 5℃에서 30분간 세척했다. 용액을 여과하고 필터 케이크를 아세토니트릴로 세척하여 화합물 118-1 (270mg, 0.562mmol, 59.08%)을 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 93%.
단계 2
무수 DMF(5 mL) 중의 화합물 118-1 (270 mg, 0.562 mmol), N-Boc-N,N'-디메틸에틸렌디아민 (105.80 mg, 0.562 mmol) 및 HOBT(75.94 mg, 0.562 mmol)의 용액을 실온에서 교반한 후 DIPEA(217.90mg, 1.686mmol)를 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 종결시키고 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 118-2 (210mg, 0.397mmol, 70.71%)을 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 3
무수 DCM(4 mL) 중의 화합물 118-2 (210 mg, 0.397 mmol) 및 TFA(1 mL)의 용액을 LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 농축하여 건조시켜 화합물 118-3 (170 mg, 0.397 mmol, 100%)을 황색 오일로 얻었고, 이는 다음 단계에서 그대로 사용되었다. 순도 = 85% 내지 90%.
단계 4
무수 DMF(5 mL) 중의 화합물 118-3 (170mg, 0.396mmol), 화합물 118-4 (303.65mg, 0.396mmol) 및 HOBT(53.51mg, 0.396mmol)의 용액을 실온에서 교반한 후, DIPEA (153.54mg, 1.188mmol)을 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 종결시키고 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 118-5 (95mg, 0.090mmol, 22.73%)를 백색 고체로 얻었다. 순도 = 80% 내지 90%.
단계 5
무수 DMF(4 mL) 중의 화합물 118-5 (95 mg, 0.090 mmol) 및 DEA(1 mL)의 용액을 LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 농축하여 건조시켜 화합물 118-6 (75mg, 0.090mmol, 100%)을 무색 오일로 얻었고, 이는 다음 단계에서 그대로 사용되었다. 순도 = 80% 내지 90%.
단계 6
무수 DMF(1 mL) 중의 화합물 118-6 (75mg, 0.090mmol) 및 DIPEA(34.83mg, 0.270mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 후, 무수 DMF(1 mL) 중의 화합물 118-7 (41.54mg, 0.135 mmol)의 용액을 주사기로 2분에 걸쳐 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 포름산으로 중화하여 pH를 6~7로 조정하였다. 그런 다음 반응 용액을 Prep-HPLC로 정제하여 화합물 PB118 (10mg, 0.001mmol, 10.87%)를 백색 고체로 얻었다. LCMS, m/z = 1028.55(M+H)+.
실시예 50: T7-2에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커(PB119)의 제조.
Figure pct00504
T7-2에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커(PB119)를 다음과 같이 제조했다.
단계 1
무수 DMF(2 mL) 중의 화합물 119-1 (154.7mg, 0.132mmol), 화합물 119-2 (110mg, 0.132mmol) 및 HATU(50.1mg, 0.132mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(51.1mg, 0.395mmol)를 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 119-3 (75mg, 0.038mmol, 28.63%)를 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 2
무수 DCM(4 mL) 중의 화합물 119-3 (75 mg, 0.038 mmol) 및 TFA(1 mL)의 용액을, LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 당 에스테르화 생성물 (TFA는 m/z= (1891+96)/3+H=663를 갖는 모노에스테르인 당 유닛에서 하이드록시기와 축합됨)과 함께 원하는 생성물(m/z= 631 = 1891/3+H)이 형성되었음을 나타낼 때까지 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 완성된 반응 용액을 농축하여 건조시킨 후 THF(4 mL)와 물(2 mL)에 재용해시키고 수성 포화 탄산나트륨 용액으로 처리하여 pH를 8~9로 조절하였다. 생성된 용액을 실온에서 30분 동안 교반하여 완전한 가수분해를 달성하였다. 이어서, 용액을 희석된 TFA로 중화시키고 응축시키고, 잔류물을 역상 액체 크로마토그래피로 정제하여 화합물 119-4 (41mg, 0.022mmol, 57.75%)를 백색 고체로 얻었다. 순도 = 80% 내지 85%.
단계 3
무수 DMF(2 mL) 중의 화합물 119-4 (41mg, 0.022mmol) 및 DIPEA(8.5mg, 0.066mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, 무수 DMF(1 mL) 중의 화합물 119-5 (10.0mg, 0.033 mmol)의 용액을 주사기로 5분에 걸쳐 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음 반응 용액을 Prep-HPLC로 정제하여 화합물 PB119 (9mg, 0.004mmol, 19.92%)을 백색 고체로 얻었다. LCMS, m/z = 1043.05 (M/2+H)+.
실시예 51: T7-1에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커(PB120)의 제조.
Figure pct00505
T7-1에 부착된 절단 가능한 링커 및 PEG 유닛을 함유하는 약물-링커(PB120)를 다음과 같이 제조했다:
단계 1
무수 DMF(30 mL) 중의 T7-1 (3 g, 9.574 mmol) 및 DIPEA(7.4 g, 57.444 mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, PNPC(8.7 g, 28.722 mmol)를 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음 대부분의 DMF와 DIPEA를 증발시키고 잔류물을 아세토니트릴(50ml)에서 5℃에서 30 분간 세척했다. 용액을 여과하고 필터 케이크를 아세토니트릴로 세척하여 화합물 120-1 (4.1g, 8.569mmol, 89.52%)을 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 2
무수 DMF(10 mL) 중의 화합물 120-1 (4.1 g, 8.569 mmol), N-Boc-N,N'-디메틸에틸렌디아민 (1.61 g, 8.569 mmol) 및 HOBT(1.16 g, 8.569 mmol)의 용액을 실온에서 교반한 후, DIPEA(3.3g, 25.707mmol)를 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 종결시키고 직접 역상 액체 크로마토그래피로 정제하여 화합물 120-2 (2.3g, 4.359mmol, 50.88%)을 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 3
무수 DCM(16 mL) 중의 화합물 120-2 (2.3g, 4.359mmol) 및 TFA(4mL)의 용액을, LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 농축하여 건조시켜 화합물 120-3 (1.8 g, 4.210 mmol, 96.77%)을 황색 오일로 얻었고, 이는 다음 단계에서 그대로 사용되었다. 순도 = 85% 내지 90%.
단계 4
무수 DMF(15 mL) 중의 화합물 120-3 (1.8 g, 4.210 mmol), 화합물 120-4 (3.2 g, 4.210 mmol) 및 HOBT(0.57 g, 4.210 mmol)의 용액을 실온에서 교반한 후 DIPEA (1.6 g, 12.630 mmol)을 첨가하였다. LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 종결시키고 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 120-5 (270mg, 0.256mmol, 6.14%)을 백색 고체로 얻었다. 순도 = 85% 내지 90%.
단계 5
무수 DMF(4 mL) 중의 화합물 120-5 (270mg, 0.256mmol) 및 DEA(1mL)의 용액을 LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 원하는 생성물이 검출되었음을 나타낼 때까지 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 다음, 용액을 농축하여 건조시켜 화합물 120-6 (210 mg, 0.252 mmol, 98.59%)을 무색 오일로 얻었고, 이는 다음 단계에서 그대로 사용되었다. 순도 = 85% 내지 90%.
단계 6
무수 DMF(5 mL) 중의 화합물 120-7 (296mg, 0.252mmol), 화합물 120-6 (210mg, 0.252mmol) 및 HATU(95.9mg, 0.252mmol)의 용액을 실온에서 5분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(97.8mg, 0.756mmol)를 첨가하였다. LCMS가 반응의 완료를 나타낼 때까지 생성된 용액을 실온에서 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 역상 액체 크로마토그래피로 직접 정제하여 화합물 120-8 (120mg, 0.060mmol, 23.95%)을 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 7
무수 DCM(4 mL) 중의 화합물 120-8 (120mg, 0.060mmol) 및 TFA(1mL)의 용액을, LCMS가 모든 출발 아민이 소모되었고 당 에스테르화 생성물 (TFA는 m/z= (1889+96)/3+H=662를 갖는 모노에스테르인 당 유닛에서 하이드록시기와 축합됨)과 함께 원하는 생성물(m/z= 630 = 1889/3+H)이 형성되었음을 나타낼 때까지 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 완성된 반응 용액을 농축하여 건조시킨 후 THF(4 mL)와 물(2 mL)에 재용해시키고, 수성 포화 탄산나트륨 용액으로 처리하여 pH를 8~9로 조절하였다. 생성된 용액을 실온에서 30분 동안 교반하여 완전한 가수분해를 달성하였다. 이어서, 용액을 희석된 TFA로 중화시키고 응축시키고, 잔류물을 역상 액체 크로마토그래피로 정제하여 화합물 120-9 (45mg, 0.024mmol, 39.47%)를 백색 고체로 얻었다. 순도 = 90% 내지 95%.
단계 8
무수 DMF(2 mL) 중의 화합물 120-9 (45mg, 0.024mmol) 및 DIPEA(9.2mg, 0.072mmol)의 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, 무수 DMF(1 mL) 중의 화합물 120-10 (11.0mg, 0.036 mmol)의 용액을 주사기로 5분에 걸쳐 적가했다. LCMS가 모든 출발 아민이 소비되었고 원하는 생성물의 질량이 검출되었음을 나타낼 때까지, 생성된 용액을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 용액을 Prep-HPLC로 정제하여 PB120 (15mg, 0.007mmol, 30.24%)을 백색 고체로 얻었다. LCMS, m/z = 1042.19 (M/2+H)+.
실시예 52: 약물-링커 PB003과 항체의 접합체(PA003)의 제조
pH 7.1 PB 5mM EDTA 완충액 중의 10mg/mL의 항체 용액을 25℃에서 120분간 10mM TCEP로 환원시켰다. 환원된 항체 용액에 DMA 중의 6.5eq의 5mM PB03를 첨가하고, 생성된 혼합물을 25℃에서 120분 동안 교반하였다. ADC는 PD-10 컬럼으로 정제되었다. ADC의 명칭은 PA003이다.
Figure pct00506
실시예 53: 약물-링커 PB004와 항체의 접합체(PA004)의 제조
pH 7.1 PB 5mM EDTA 완충액 중의 10mg/mL의 항체 용액을 25℃에서 120분간 10mM TCEP로 환원시켰다. 환원된 항체 용액에 DMA 중의 6.5eq의 5mM PB004를 첨가하고, 생성된 혼합물을 25℃에서 120분 동안 교반하였다. ADC는 PD-10 컬럼으로 정제되었다. ADC의 명칭은 PA004이다.
실시예 54: 약물-링커 PB008 및 항체의 접합체(PA008)의 제조
pH 7.1 PB 5mM EDTA 완충액 중의 10mg/mL의 항체 용액을 25℃에서 120분간 10mM TCEP로 환원시켰다. 환원된 항체 용액에 DMA 중의 6.5eq의 5mM PB08를 첨가하고, 생성된 혼합물을 25℃에서 120분 동안 교반하였다. ADC는 PD-10 컬럼으로 정제되었다. ADC의 명칭은 PA008이다.
Figure pct00508
실시예 55: 약물-링커 PB0038 및 항체의 접합체(PA038)의 제조
pH 7.1 PB 5mM EDTA 완충액 중의 10mg/mL 항체 용액을 25℃에서 120분간 10mM TCEP로 환원시켰다. TCEP는 PD-10 컬럼으로 제거되었다. 환원된 항체 용액에 DMA 중의 5mM PB038 15eq를 첨가하고, 생성된 혼합물을 25℃에서 120분 동안 교반하였다. ADC는 PD-10 컬럼으로 정제되었다. ADC 이름은 PA038이다.
Figure pct00509
ADC PA0038은 HIC-HPLC와 SEC-HPLC로 분석되었다.
실시예 56: 약물-링커 PB039와 항체의 접합체(PA039)의 제조
pH 7.1 PB 5mM EDTA 완충액 중의 10mg/mL 항체 용액을 25℃에서 120분간 10mM TCEP로 환원시켰다. TCEP는 PD-10 컬럼으로 제거되었다. DMA 중의 5mM PB039 15eq를 환원된 항체 용액에 첨가하고 생성된 혼합물을 25℃에서 120분 동안 교반하였다. ADC는 PD-10 컬럼으로 정제되었다. ADC 이름은 PA039이다.
Figure pct00510
ADC PA0039는 HIC-HPLC와 SEC-HPLC로 분석되었다.
실시예 57: 약물-링커 PB040과 항체의 접합체(PA040)의 제조
pH 7.1 PB 5mM EDTA 완충액 중의 10mg/mL 항체의 용액을 25℃에서 120분간 10mM TCEP로 환원시켰다. TCEP는 PD-10 컬럼으로 제거되었다. 환원된 항체 용액에 DMA 중의 5mM PB040 15eq를 첨가하고생성된 혼합물을 25℃에서 120분 동안 교반하였다. ADC는 PD-10 컬럼으로 정제되었다. ADC 이름은 PA040이다.
Figure pct00511
실시예 58: 약물-링커 PB082와 항체의 접합체(PA082)의 제조
pH 7.1 PB 5mM EDTA 완충액 중의 10mg/mL 항체의 용액을 25℃에서 120분 동안 10mM TCEP로 환원시켰다. TCEP는 PD-10 컬럼으로 제거되었다. 환원된 항체 용액에 DMA 중의 5mM PB082 15eq를 첨가하고 25℃에서 120분 동안 교반하였다. ADC는 PD-10 컬럼으로 정제되었다. ADC의 이름은 PA082이다.
Figure pct00512
실시예 59: 약물-링커 PB083과 항체의 접합체(PA083)의 제조
pH 7.1 PB 5mM EDTA 완충액 중의 10mg/mL 항체의 용액을 25℃에서 120분간 10mM TCEP로 환원시켰다. TCEP는 PD-10 컬럼으로 제거되었다. 환원된 항체 용액에 DMA 중의 5mM PB083 15eq를 첨가하고, 생성된 혼합물을 25℃에서 120분 동안 교반하였다. ADC는 PD-10 컬럼으로 정제되었다. ADC 이름은 PA083이다.
Figure pct00513
실시예 60: ADC PA038의 안정성 테스트
37℃에서 최대 15일 동안 보관하거나 또는 다섯번의 주기의 동결-해동을 겪을 때, ADC PA038은 HIC와 SEC 모두에서 안정적인 것으로 나타났다. 37℃ 또는 여러 번의 동결-해동 주기에서 시간 경과에 따른 응집의 유의한 증가는 관찰되지 않았다. 100mg/mL에서, PA038은 (SEC에 의한) 응집이나 침전 없이 안정적인 것으로 확인되었다.
실시예 61: HIC-HPLC에 의해 측정된 체류 시간
DAR8에서 ADC PA038 및 PA039의 상대 체류 시간은 해당 MC-VC-PAB-MMAE 기반 ADC의 DAR2 종보다 짧았다.
HIC-HPLC 조건: 컬럼: TSKgel 부틸-NPR, 2.5μm, 4.6mm x 100mm (PN: 42168); 컬럼 온도: 30℃; UV: 280nm; 이동 상: A: 50mM PB, 1.5M (NH4)2SO4, pH=7.0; B: 50mM PB(pH=7.0):IPA=75:25(v:v) 유속: 0.5mL/분; 구배 용출: 0분 → 20분(0% B → 100% B), 20분 → 21분(100% B → 0% B), 21분 → 32분(0%B).
실시예 62: 항-FOLR1 면역접합체의 시험관내 세포독성 검정
세포 성장을 억제하는 항-FOLR1 접합체의 능력을 시험관내 세포독성 검정을 사용하여 측정하였다. 분석 방법은 다음과 같다: OV90, OVCAR-3 및 NCI-H292 세포를 수확하고 항-FOLR1 접합체를 첨가하기 전에 표시된 양(세포 성장 속도에 따라)으로 고체 백색의 평평한 바닥 96-웰 플레이트에 접종했다. 다음날 세포를 1:3 연속 희석 및 이중 웰을 사용하여 30μg/ml 내지 0.37μg/ml 또는 100μg/ml 내지 0.015μg/ml의 약물 농도 범위에서 접합체에 노출시켰다. 플레이트를 37℃에서 120시간 동안 배양하였다. 배양 후 웰당 40μL의 CTG(Promega, G7572)를 플레이트에 첨가하고 5분 배양 후 MD SpectraMax I3X에서 플레이트를 판독했다. 성장 억제는 Microsoft Excel 및 Prism 소프트웨어를 사용하여 처리되지 않은 세포에 대한 성장 백분율로 계산되었다.
항-FOLR1 접합체는 약물-링커 PA038을 항체 F131에 접합시켜 접합체 F131-LD038을 생성함으로써 제조되었다. 5mM EDTA(pH = 6.9)를 함유한 50mM 인산나트륨 완충액에 용해된 2mL의 항체(F131, 10mg/mL)를 10mM TCEP HCl(트리스(2-카르복시에틸) 포스핀 HCl) 수용액에 TCEP:mAb의 몰비 = 8.0으로 첨가하였다. 환원 반응은 25℃에서 2시간 동안 진행되었다. 50mM 인산나트륨 완충액(pH = 6.9)을 사용하여 한외여과를 통해 과잉 TCEP와 그 부산물을 제거했다. LD038(TFA의 염)을 20mg/mL의 농도로 물에 용해시키고, 환원된 mAb (F131)에 몰비 7.7(LD038:F131)로 첨가했다. 커플링 반응물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 50mM 인산나트륨 완충액을 사용하여 한외여과를 통해 과잉 LD038 및 이의 불순물을 제거했다. ADC를 UFDF에 의해 6% 수크로스와 0.02%(w/V) Tween 20을 함유하는 20mM 히스티딘 완충액에 보관했다. SEC-HPLC로 측정한 ADC의 순도는 97.5%였으며, LC-MS로 측정한 DAR 값은 7.6이었다. 약물 로딩량은 대략 8이었다.
결과는 도 1a, 1b 및 1c에 나타내었다. 항-FOLR1 접합체는 네이키드(비접합) 항체(F131 Ab)와 비교하여 OV90, OVCAR-3 및 NCI-H292 세포에 대해 상당히 더 나은 세포독성을 나타냈다.
실시예 63. OV90 이종이식편 모델에서 항-FOLR1 접합체의 생체내 효능
항-FOLR1 접합체의 생체내 항종양 효능을 암컷 BALB/c 누드 마우스의 피하 OV90 인간 난소암 이종이식 모델에서 평가하였다. OV90 종양 세포(ATCC, Manassas, VA, cat # CRL-11732)는 10% 열 불활성화 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에서 단층 배양으로 시험관 내에서 공기 중 5% CO2 대기의 37℃에서 유지되었다. 종양 세포는 트립신-EDTA 처리에 의해 매주 2회 정기적으로 계대배양되었다. 기하급수적으로 성장하는 세포를 채취하여 종양 세포 접종을 위해 계수했다.
항-FOLR1 접합체는 약물-링커 PA038을 항체 F131에 접합시켜 접합체 F131-LD038을 생성함으로써 제조되었다(상술한 바와 같음). 약물 로딩량은 대략 8이었다.
각 마우스에 종양 발생을 위해 매트리겔(1:1)이 보충된 1640 0.1mL 내의 OV90 종양 세포(2 x 106)를 우측 옆구리에 피하 접종했다. 평균 종양 크기가 대략 117 mm3에 도달했을 때 종양 세포 접종 후 8일째에 치료를 시작했다. 동물의 종양 부피에 기초하여 계층화된 무작위화를 수행하는 Excel 기반 무작위화 소프트웨어 프로그램을 사용하여 동물을 2개 그룹 중 하나로 배정했다. 각 그룹은 7마리의 종양 보유 마우스로 구성되었다.
항-FOLR1 면역접합체를 5mg/kg의 4회 용량으로 마우스에 투여하였고; 투여는 그룹화 후 0, 3, 7 및 10일에 수행되었다.
일상적인 모니터링 동안, 동물들은 종양 성장, 및 이동성, 음식 및 물 소비(관찰에 의해서만)와 같은 정상적인 행동, 체중 증가/감소(체중은 격일로 측정), 눈/모발 매팅(matting)에 대한 임의의 영향 및 프로토콜에 명시된 임의의 기타 비정상적인 영향에 대하여 주 3회 확인받았다. 각 하위 집합 내의 동물 수를 기준으로 사망 및 관찰된 임상 징후를 기록했다. 종양 크기는 캘리퍼를 사용하여 2차원으로 매주 2회 측정되었으며, 부피는 식 V = 0.5a × b2를 사용하여 mm3로 표시되었으며, 여기서 a와 b는 각각 종양의 긴 직경과 짧은 직경이다.
다양한 치료 그룹의 중앙 종양 부피가 도 2에 플롯되어 있다. 접합체 F131-LD038을 사용한 치료는 PBS 대조군과 비교하여 중앙 종양 부피의 유의한 감소를 초래했다.
실시예 64. NCI-H292 이종이식편 모델에서 항-FOLR1 접합체의 생체내 효능
항-FOLR1 접합체의 생체내 항종양 효능을 암컷 BALB/c 누드 마우스의 피하 NCI-H292 인간 폐암 이종이식 모델에서 평가하였다. NCI-H292 종양 세포(ATCC, Manassas, VA, cat# CRL-1848)는 10% 열 불활성화 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에서 단층 배양으로 시험관 내에서 공기 중 5% CO2 대기의 37℃에서 유지되었다. 종양 세포는 트립신-EDTA 처리에 의해 매주 2회 정기적으로 계대배양되었다. 기하급수적으로 성장하는 세포를 채취하여 종양 세포 접종을 위해 계수했다.
항-FOLR1 접합체는 약물-링커 PA038을 항체 F131에 접합시켜 접합체 F131-LD038을 생성함으로써 제조되었다(상술한 바와 같음). 약물 로딩량은 대략 8이었다.
각 마우스에 종양 발생을 위해 RPMI 1640 0.1mL 내의 NCI-H292 종양 세포(10 × 106)를 우측 옆구리에 피하 접종했다. 평균 종양 크기가 대략 123 mm3에 도달했을 때 종양 세포 접종 후 11일째에 치료를 시작했다. 동물의 종양 부피에 기초하여 계층화된 무작위화를 수행하는 Excel 기반 무작위화 소프트웨어 프로그램을 사용하여 동물을 2개 그룹 중 하나로 배정했다. 각 그룹은 6마리의 종양 보유 마우스로 구성되었다.
항-FOLR1 면역접합체를 5mg/kg의 4회 용량으로 마우스에 투여하였고; 투여는 그룹화 후 0, 3, 7 및 10일에 수행되었다.
다양한 치료 그룹의 중앙 종양 부피가 도 3에 플롯되어 있다. F131-LD038 접합체를 사용한 치료는 PBS 대조군과 비교하여 중앙 종양 부피의 유의한 감소를 초래했다.
실시예 65. NCI-H292 이종이식 모델에서 항-FOLR1 접합체의 생체내 효능
항-FOLR1 접합체의 생체내 항종양 효능을 암컷 BALB/c 누드 마우스의 피하 KB (인간 구강 표피 암종 세포) 이종이식 모델에서 평가하였다. KB 종양 세포(ATCC, CCL-17)는 10% 열 불활성화 소 태아 혈청이 보충된 MEM 배지에서 단층 배양으로 시험관 내에서 공기 중 5% CO2 대기의 37℃에서 유지되었다. 종양 세포는 트립신-EDTA 처리에 의해 매주 2회 정기적으로 계대배양되었다. 기하급수적으로 성장하는 세포를 채취하여 종양 세포 접종을 위해 계수했다.
항-FOLR1 접합체는 약물-링커 PA038을 항체 F131에 접합시켜 접합체 F131-LD038을 생성함으로써 제조되었다(상술한 바와 같음). 약물 로딩량은 대략 8이었다.
각 마우스에 종양 발생을 위해 RPMI 1640 0.1mL 내의 KB 종양 세포(1 × 106)를 우측 옆구리에 피하 접종했다. 평균 종양 크기가 대략 110 mm3에 도달했을 때 종양 세포 접종 후 13일째에 치료를 시작했다. 동물의 종양 부피에 기초하여 계층화된 무작위화를 수행하는 Excel 기반 무작위화 소프트웨어 프로그램을 사용하여 동물을 2개 그룹 중 하나로 배정했다. 각 그룹은 6마리의 종양 보유 마우스로 구성되었다.
항-FOLR1 면역접합체를 5mg/kg의 4회 용량으로 마우스에 투여하였고; 투여는 그룹화 후 0, 3, 7 및 10일에 수행되었다.
다양한 치료 그룹의 중앙 종양 부피가 도 4에 플롯되어 있다. F131-LD038 접합체를 사용한 치료는 PBS 대조군과 비교하여 중앙 종양 부피의 유의한 감소를 초래했다. 6 마리의 마우스 모두 치료 20일 후에 완전한 반응을 보였다.
실시예 66. 래트에서 항-FOLR-1 접합체의 약동학(PK)
래트는 VR에서 구입하여 수용 후 1주일 동안 사용했다. 래트를 멸균된 케이지에 집단 수용하고 특정 병원균이 없는 조건에서 유지했다. 실험 공간에서, 환경 조건은 다음과 같다: 온도 20℃~22℃, 습도 59%~78%, 인공 조명 12시간. 래트 케이지는 폴리설폰 박스를 사용하였으며, 오토클레이빙 후 사용하였으며, 규격은 325mm×210mm×180mm이며, 각 박스에는 최대 3마리의 동물을 사육하였다. 케이지 카드에는 실험 번호, 실험 시작 시간, 프로젝트 리더, 실험 인력, 동물 출처, 그룹 및 동물 번호가 표시되었다. 실험 동물은 귀에 표시되었다. 래트에게 FR-2 식이를 먹이고 수돗물(오토클레이빙 후 사용)을 제공했다. 그들의 체중은 투여 당시 약 290g이었다.
그룹당 3마리의 래트로 구성된 2개 그룹을 단일 용량의 F131-LD038 면역접합체(상기 설명된 대로 제조됨) 또는 네이키드(naked) 항체 F131으로 3mg/kg으로 정맥 내(IV) 처리했다. 투여 후 10분, 4시간, 1일, 4일, 7일, 10일, 14일, 21일에 혈액샘플을 채취한 후, 원심분리(4℃, 10000×g, 3분)하여 혈장을 분리하였다. 혈청 내 각 접합체 또는 mAb의 총 항체 농도를 ELISA로 검출하고 GraphPad Prism 소프트웨어로 분석했다.
염소 항-인간 IgG Fc(Invitrogen, 31125)를 96-웰 마이크로플레이트(Thermo, cat:468667)에서 2μg/ml의 PBS, 웰당 100μL로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 다음날 용액을 제거하고 플레이트를 350μL/웰 TBST로 2회 세척했다. 200μL/웰 차단 완충액(3% BSA/TBST)을 첨가하여 플레이트를 차단했다. 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 방치한 후, 350 μL/웰 TBST로 2회 세척하였다. 일련의 농도의 표준물질과 샘플을 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 실온에 2시간 동안 두었다. 용액을 제거 하고 플레이트를 350μL/웰 TBST로 두 번 세척했다. 염소 항-인간 카파 경쇄(HRP)(abcam, ab202549)를 차단 완충액으로 희석하고 웰당 100μL로 첨가했다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 다음 플레이트를 350μL/웰 TBST로 4회 세척했다. 100μL의 TMB 용액 A: 용액 B, 1:1) 용액을 각 웰에 첨가하고 반응물을 어두운 곳에 3-10분 동안 두었다. 50μL의 정지 용액(2M H2SO4)을 첨가하고 450 nm 및 630 nm에서 광학 밀도를 판독했다. 데이터는 GraphPadPrism5 소프트웨어로 분석했다.
3 mg/kg의 항-huFOLR-1 접합체 F131-LD038 또는 네이키드 항체 F131의 단일 iv 투여 후, 항-huFOLR-1 접합체 F131-LD038의 PK 프로파일은 네이키드 항체 F131의 PK 프로필과 유사했다. 결과는 도 5에 나와 있다.
실시예 67. 인간 FOLR1에 대한 인간 항체의 생성
인간 FOLR-1을 표적으로 하는 항체는 완전한 인간 항체 라이브러리를 사용하여 스크리닝되었다. 이 라이브러리는 Fab가 파지 표면에 표시되어 있는 반합성 인간 항체 라이브러리이다.
라이브러리 패닝에 대하여는 표준 프로토콜을 따랐다. 구체적으로, PolySorp 또는 MaxiSorp Nunc-면역 튜브(Nunc-MG Scientific)를 6μg/ml의 인간 FOLR1(ACRO-FO1-H52H1) 항원 0.5 ml로 코팅하고(패닝 요약, 표 1 참조), 밤새 냉장고에 방치했다. 튜브를 PBS로 1회 세척하고, 1% BSA/PBS로 차단한 후 RT(실온)에 1시간 동안 두었다. 튜브를 표시된 양(CFU, 패닝 요약, 표 1 참조)의 라이브러리 파지 샘플과 함께 실온에서 1시간 동안 배양했다. 튜브를 PBST 완충액으로 10회 세척하였다. 결합된 파지를 용출시키기 위해, 0.5ml의 100mM TEA(트리에틸아민)를 첨가하고 실온에서 2분간 배양한 후 용출액을 새로운 튜브로 옮기고 0.25ml의 1.0M Tris-HCL, pH 8.0을 첨가하여 혼합하여 즉시 중화시켰다. 용출액(0.75ml)을 기하급수적으로 성장하는 E. coli TG1(OD600~0.5) 10ml에 첨가하고, 잘 혼합한 후 37℃(수조)에서 30분간 진탕하지 않고 배양하였다. 배양액의 10배 희석액은 2xTY 배지에서 만들고 각 희석액 10μl를 TYE/amp/glu 플레이트에 배치하고 30℃에서 밤새 배양했다. 다음날 각 희석액에 대한 콜로니 수를 세고, 패닝 결과물에 대한 CFU(콜로니 형태 단위)를 계산했다. 남은 배양물을 2,800g에서 15분 동안 원심분리하고, 0.5ml의 2xTY 배지에 재현탁하고, 2개의 150mm TYE/amp/glu 플레이트에 배치하고, 30℃에서 밤새 배양했다. 다음날, 3~5 ml의 2xTY/amp/glu 배지를 각 플레이트에 첨가하고 세포 스프레더를 사용하여 플레이트에서 박테리아를 긁어냈다. 글리세롤 스톡은 박테리아 1.5ml와 80% 글리세롤 0.5ml를 혼합하여 만들고 그 스톡을 -80℃에 두었다.
다음 선별 라운드를 위한 파지 입자를 준비하기 위해, 글리세롤 스톡을 OD600~0.01-0.05에서 시작하여 40ml의 2xTY/amp/glu 배지에 접종했다. OD600이 0.4~0.6에 도달할 때까지 배양물을 진탕하면서(300rpm) 37℃에서 성장시켰다. 헬퍼 파지 CM13을 배양물에 헬퍼 파지:박테리아 비율 5~10:1로 첨가하여 배양물을 감염시켰다. 배양물을 가끔 혼합하면서 수조에 방치하면서 37℃에서 30분 동안 배양하였고 이후 37℃에서 30분 동안 진탕하였다. 박테리아 배양물을 3000rpm에서 20분간 원심분리하고 상청액을 제거했다. 펠릿을 100 mL의 2xTY/amp/kan에 재현탁시킨 후 밤새 30℃에서 진탕하면서 성장시켰다. 배양물을 6,000g에서 30분 동안 원심분리하여 수확했다. 파지 입자는 상청액에 1/5 부피의 PEG 용액을 첨가한 후 얼음 위에서 1시간 동안 배양한 후 4℃에서 20분간 4,000g에서 원심분리하여 침전시켰다. 상청액을 철저히 폐기하였다. 파지 펠렛을 1~2 ml의 차가운 PBS에 재현탁시켰다. 잔류 박테리아는 4℃에서 5분간 최고 속도로 마이크로-원심분리하여 제거했다. 이러한 방식으로 준비된 파지는 선별을 위해 즉시 사용하거나, 또는 10% 글리세롤과 함께 -80℃에서 분취량으로 보관할 수 있다. 파지 제제의 역가는 기하 급수적으로 성장하는 E. coli TG1 100ul를 파지 용액의 10배 희석액(2xTY에서 10~11까지 다운)으로 감염시켜 측정했다. 단계 1부터 시작하여 총 3~4 라운드까지 선별을 반복했다.
패닝은 총 4 라운드가 진행되었다. 2차, 3차, 4차 라운드에서 세척 완충액 PBS-Tween20의 농도를 각각 0.2%, 0.3%, 0.4%로 점차 증가시켰다.
4 라운드의 스크리닝 후, 표적 양성 농축율은 1.5 x 104에 도달했으며, 이는 표 1에 나타난 바와 같이 블랭크 대조군과 상당한 차이가 있었다. 두 개의 96-웰 플레이트로부터의 클론을 파지 ELISA 검증을 위해 선별했다; FOLR-1과의 높은 결합을 갖는 클론을 선별하여 시퀀싱하였다.
전체적으로, 69개의 클론을 시퀀싱하였고 12개의 고유한 VH 서열이 얻어졌다. 이들 12개의 VH 서열을 분석하였고 표 2 및 4에 나타낸 바와 같이 2개의 고유한 HCDR3 세트를 가졌다. 이어서 12개의 고유한 VH 서열을 갖는 클론에 대해, VL 서열을 결정하였다. 표 3과 4에 표시된 대로 두 개의 고유한 LCDR3 그룹을 사용하여 두 개의 고유한 VL 시퀀스를 얻었다.
CDR 영역의 Kabat 시스템을 사용한 클론 서열의 추가 분석은 표 5에 표시된 것과 같이 클론 F1/8/9/26/48/50/100/112/123/131/138이 동일한 HCDR 및 LCDR을 갖지만 중쇄 프레임 워크(HFR) 및 경쇄 프레임 워크(LFR) 서열은 상이한 것으로 나타났다. 클론 F40은 표 5에 표시된 대로 서로 다른 HCDR과 LCDR 가지며, 그리고 서로 다른 HFR과 LFR을 갖는다.
Figure pct00514
Figure pct00515
Figure pct00516
Figure pct00517
Figure pct00518
Figure pct00519
Figure pct00520
실시예 68. HEK293 세포에 의해 생산된 항체의 검증
(상기 설명된 바와 같이) 항체 클론의 서열을 획득한 후, 전체 IgG 분자를 사용하여 추가 분석을 수행하였다. 먼저, IgG1 Fc를 갖는 전장 항체 분자의 발현을 48-웰 또는 96-웰 마이크로플레이트에서 수행하고, 발현 수준 및 항원 또는 세포 결합 능력의 검출을 위해 상청액을 수집하였다.
68.1 48 또는 96웰 플레이트에서의 항체 발현.
항체 F1, F8, F26, F40, F48, F50, F100, F112, F123, F131 및 F138의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 cDNA 서열을 벡터 PTT5에 구축하였다. HEK293 세포를 수집하고 1×106 /ml의 세포 밀도로 조정한 후, 나중에 사용하기 위해 5% CO2가 있는 37℃ 인큐베이터에서 웰 당 200 또는 400μL로 48/96-웰 세포 배양 플레이트에 배치했다. 96-웰 플레이트에서의 형질감염을 위해, 0.5ug의 플라스미드를 20μL OPTI 배지에 희석하여 잘 혼합 하고, 2.5μL의 형질감염 시약 T1(플라스미드: T1 = 1:5)을 20μL OPTI 배지에 희석하여 잘 혼합하고, 실온에서 5분 동안 배양하였다. 형질감염 시약 T1 희석액을 DNA에 첨가하고 잘 혼합한 후, 실온에서 30분간 배양하였다. 배양 중에 형질감염 복합체가 형성되었다. 형질감염 복합체를 세포에 첨가하고 잘 혼합한 후, 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하였다. 48-웰 플레이트에서 형질감염할 때, 플라스미드와 형질감염 시약의 양이 두 배로 늘어났다. 형질감염 후 2일째에, 상청액을 수집하여 ELISA 또는 FACS로 항체 바이오-활성을 검출했다.
68.2 IgG 발현 수준.
96-웰의 항체 발현 수준은 표준 ELISA로 테스트되었다. 간략히, 항-인간 IgG Fc 항체(Sigma, 18885-2ML)를 탄산 코팅 용액으로 pH 9.6에서 5μg/ml로 희석하고 100μL를 96-웰 미량정량(microtiter) 플레이트의 각 웰에 4℃에서 밤새 코팅하였다. 웰 안의 액체를 버리고 PBST로 3회 세척한 후, 4% 탈지분유-PBS(Sigma, D5652-1L), 300 μL/웰로 차단하고, 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 웰 내의 액체를 버린 후, 웰을 PBS로 3회 세척하였다. 100μL/웰을 사용하여 샘플을 96-웰 미량정량 플레이트에 첨가했다. 대조군에는 PBS를 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 액체를 버리고 웰을 PBST로 3회 세척하였다. HRP-염소 항-인간 IgG(Sigma, I18885-2ML)를 100μL/웰을 사용하여 첨가했다(1:5000 희석)하고 플레이트를 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 그런 다음 플레이트의 액체를 버리고 플레이트를 PBST로 5회 세척했다. 100μL/웰을 사용하여 TMB 용액을 첨가했다. 그런 다음 웰 당 50μL를 사용하여 각 웰에 2M H2SO4를 첨가하여 10~15분 후에 반응을 종료했다. A450 값은 마이크로플레이트 리더를 사용하여 판독되었다. 결과를 표 6에 나타내었다. 클론 F50을 제외하고 모든 항체는 정상 발현을 나타내었다.
68.3 인간 및 시노몰구스 FOLR1 단백질에 결합하는 항체.
인간 FOLR1 단백질에 결합하거나 시노몰구스 FOLR1 단백질에 교차 결합하는 항체의 능력을 표준 ELISA로 테스트했다. 간단히 말하면, His 태그가 있는 인간 FOLR1(ACRO-FO1-H52H1) 또는 시노몰구스 FOLR1 단백질(ACRO, F01-C52H8)을 pH 9.6에서 탄산 코팅 용액을 사용하여 5μg /ml로 희석하고 100μL 항원이 96-웰 미량정량 플레이트의 각 웰에서 밤새 4℃에서 코팅되었다. 웰 내의 액체를 버리고 웰을 PBST로 3회 세척하였다. 그런 다음 웰을 300μL/웰을 사용하여 4% 탈지분유-PBS(Sigma, D5652-1L)로 차단하고 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 웰 안의 액체를 버리고, 웰을 PBS로 3회 세척하였다. 샘플은 100μL/웰로 추가되었다. 대조군에는 PBS를 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 웰 내의 액체를 버리고 웰을 PBST로 3회 세척하였다. HRP-염소 항-인간 IgG(Sigma, I18885-2ML)를 첨가하고(1:5000 희석, 100μL/웰) 플레이트를 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 그런 다음 웰 안의 액체를 버리고 웰을 PBST로 5회 세척했다. TMB 용액을 100μL/웰을 사용하여 첨가했다. 2M H2SO4를 각 웰에 50μL씩 첨가하여 10~15분 후에 반응을 종료시켰다. A450 값은 마이크로플레이트 리더를 사용하여 판독되었다.
미량정량 플레이트에서 IgG의 발현 수준 및 인간 FOLR1 단백질에 대한 결합을 표 6에 나타내었다. 클론 F50을 제외하고 모든 항체는 인간 FOLR1 단백질에 대한 정상적인 결합을 가졌다.
시노몰구스 FOLR1 단백질에 대한 항-FOLR1 항체 교차 결합의 결과를 표 7에 나타내었다. 클론 F50을 제외하고 모든 항체는 시노몰구스 FOLR1 단백질에 대해 양호한 교차 결합을 가졌다.
68.4 높은 FOLR1을 발현하는 종양 세포주에 결합하는 항체.
Hela 세포(ATCC® CCL-2, COBIOER 제공) 및 RPTEC/TERT1 세포(ATCC® CRL-4031, COBIOER 제공)에 대한 항체의 결합 활성을 형질감염 상청액을 사용하여 유세포 분석법으로 테스트했다. 간략하게, 표적 세포를 0.02% EDTA-2Na로 분해하고, 1500rpm에서 3분간 원심분리하고, PBS로 재현탁시켰다. 계수 후, 세포를 튜브 당 1×106개의 세포가 들어있는 1.5 ml 원심분리 튜브에 첨가하고, 1500 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 버렸다. 그런 다음 모든 작업은 얼음 욕조에서 수행되었다. 100μL의 형질감염 상청액을 각 1.5ml 원심분리 튜브에 첨가했다. 빈(blank) 세포, 빈 세포 + 2차 항체, 배지 및 HEK293 상청액을 대조군으로 설정했다. 반응은 얼음조에서 1시간 동안 진행되었다. 그런 다음 세포를 펠렛화하고 PBS로 2회 세척했다. 2차 항체인 염소 항-인간 IgG(PE, abcam, ab98596)를 희석하고(1:200) 튜브 당 100μL를 사용하여 첨가했다. 반응은 얼음조에서 1시간 동안 암실에서 수행되었다. 세포를 다시 펠렛화하고 PBS로 2회 세척하고 300 μL PBS에 재현탁한 다음, FL2 형광 판독값을 세포 계측법으로 측정했다. 결과는 FlowJoTM10 소프트웨어로 분석되었다.
Hela 세포에 대한 항-FOLR1 항체 결합에 대한 결과를 도 6에 나타내었다. 결과는 클론 F50이 Hela 세포 결합에 대해 음성임을 입증한다. 클론 F40 및 F138은 Hela 세포 결합에 대해 약하게 양성이었다. 나머지 8개 클론은 Hela 세포 결합에 대해 양성이었다.
RPTEC/TERT1 세포에 대한 항-FOLR1 항체 결합의 결과는 도 7에 나타나 있다. 결과는 클론 F50이 RPTEC/TERT1 세포 결합에 대해 음성임을 입증한다. 클론 F138은 RPTEC/TERT1 세포 결합에 대해 약하게 양성이었다. 나머지 9개의 클론은 RPTEC/TERT1 세포 결합에 대해 양성이었다.
Figure pct00521
Figure pct00522
실시예 69. 진탕 플라스크에서 HEK293 세포 발현에 의해 생성된 항-인간 FOLR1 항체의 특성화
현탁액 세포에서 항체를 발현시켜 충분한 양의 단백질을 얻음으로써 항-FOLR1 항체의 결합을 정량적으로 연구하였다. 발현을 위해 플라스미드를 현탁액 세포에 형질감염시켰다. 항체 정제를 위해 상청액을 수집하였다. FOLR1 단백질 수준이 높은 종양 세포에 대한 항체의 결합 및 내재화를 정량적으로 검출하기 위해 고순도 항체를 사용했다.
69.1 항체 발현 및 정제.
항체 F8, F26, F40, F48, F100, F112, F123 및 F131을 인코딩하는 플라스미드를 HEK293 세포에 형질감염시켰다. 간략하게, HEK293 세포를 수집하고, 1×106 /ml의 세포 밀도로 조정하고, 나중에 사용하기 위해 5% CO2가 포함된 37℃ 진탕기에서 125mL 진탕 플라스크에 있는 30mL 배지와 함께 배양했다. 형질감염을 위해 30 μg의 플라스미드를 1500ul KPM 배지에 희석하여 잘 혼합하고, 150 μL의 형질감염 시약 T1(플라스미드:T 1 = 1:5)을 1500 μL KPM 배지에 희석하여 잘 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양했다. 형질감염 시약 T1 희석액을 DNA에 첨가하고 잘 혼합한 후 실온에서 30분 동안 배양하여 형질감염 복합체를 형성하였다. 형질감염 복합체를 세포에 첨가하고 잘 혼합한 후 37℃의, 5% CO2 진탕기, 120rpm에서 48시간 동안 배양했다. 24시간 후에 TN1 용액을 최종 농도 0.5%로 첨가했다. 형질감염 후 6일째에 상청액을 수집하여 정제하였다.
항체 정제는 단백질 A 또는 단백질 G를 사용하여 표준 공정에 의해 수행되었다. 간단히, 각 상청액을 0.22 μm 필터 막을 통해 여과하고 결합 완충액(PB, pH7.2)으로 평형화된 컬럼에 로딩했다. 280nm에서 흡광도가 없는 안정적인 기준선을 얻을 때까지 컬럼을 결합 완충액으로 세척했다. 0.15M NaCl을 함유한 0.1M 구연산 완충액(pH 3.4)을 사용하여 1ml/분의 유속으로 항체를 용출시켰다. 약 1.5~3.5ml의 분획물을 수집하고 10% 부피의 1M Tris-HCl(pH 9.0)을 첨가하여 중화했다. 그런 다음 항체 샘플을 1 x PBS에 대해 밤새 두 번 투석하고 0.2μm 필터 막을 통해 여과하여 멸균했다. 순도는 12% SDS-PAGE를 사용하여 테스트되었다.
발현 수준 및 정제 결과를 표 8에 나타내었다. 항체 F8, F26 및 F131의 발현 수준이 더 높은 반면, 항체 F100의 발현 수준은 가장 낮았다. 모든 항체는 높은 순도를 가졌다(데이터는 표시되지 않음).
Figure pct00523
69.2 높은 FOLR1 수준을 갖는 종양 세포주에 결합하는 항체.
Hela 및 RPTEC/TERT1 세포에 대한 항-FOLR1 항체 결합을 FACS로 테스트했다. 연구는 위에서 설명한 대로 수행되었다. 결과는 도 8과 도 9에 나와 있다. 모든 항체는 용량 의존적으로 Hela 및 RPTEC/TERT1 세포에 결합한다.
69.3 내재화 속도 특성화.
항-FOLR1 항체 F8, F26, F40, F48, F100, F112, F123, 및 F131은 항체를 pHAb 형광 염료로 라벨화하는 pHAb 분석법을 사용하여 FOLR-1 발현 종양 세포주 Hela 및 RPTEC/TERT1에 내재화되는 능력을 테스트하였다. 키트의 지시에 따라 항체 라벨링을 수행했다. 구체적으로, 50 μL의 자기 비드를 1.5 ml EP 튜브에 첨가했다. EP 튜브를 자기 스탠드 상에 10초 동안 놓고, 자기 비드 상의 보호 용액을 제거했다. 각 자기 비드 튜브를 250μL PB로 세척하고 100ug 항체를 각 자기 비드 튜브에 첨가했다(완충 시스템: 구연산/나트륨 Tris-HCl(pH 6.0)). PB를 넣어 부피를 최대 1 ml로 만든 후 반응 용액을 혼합하고 상온에서 1시간 동안 회전시켰다. 그런 다음 자기 비드를 250μL PB로 세척하고 250μL NaHCO3로 평형화했다. 100μL NaHCO3 및 1.2μL 의 준비된 pHAb 염료(사용 전에 준비됨)를 각 튜브에 첨가하고 반응물을 암실에 1시간 동안 두었다. 각 튜브를 250μL PB 로 두 번 세척했다. 50 mM 글리신을 100μL를 사용하여 실온에서 5분간 각 튜브에 첨가한 후 라벨링된 항체를 용출했다. 그런 다음 중화를 위해 용출액에 2M Tris 완충액을 첨가했다. 최종 라벨링된 항체는 나중에 사용하기 위해 암실에 보관되었다.
Hela 또는 RPTEC/TERT1 세포를 100μL로 웰 당 15,000개 세포로 시딩하고 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 20~24 시간 동안 배양했다. pHAb 라벨링된 테스트 항체를 10μg/ml의 농도로 웰에 첨가했다. 그런 다음 플레이트를 각각 0시간, 1시간, 4시간, 6시간 및 23시간에 여기 파장 520 nm 및 흡수 파장 570 nm를 사용하여 Thermo VARIOSKAN FLASH에서 판독했다.
결과는 도 10 및 도 11에 제시되어 있다. 테스트된 모든 항-FOLR1 항체는 FOLR1-발현 Hela 및 RPTEC/TERT1 세포에서 pHAb 형광의 시간 의존적 증가를 나타내었다. 이 결과는 각 항체가 Hela 및 RPTEC/TERT1 세포에 내재화되었으며, 항체 F8 및 F131이 가장 강력한 내재화 속도를 가짐을 나타낸다.
실시예 70. 항-FOLR-1 면역접합체의 특성화
면역접합체로서 항-FOLR-1 항체의 추가 특성화가 수행되었다.
70.1 레퍼런스 항체 및 항체 F8, F26 및 F131의 발현
ImmunoGen Inc. 항-FOLR-1 항체 미르베툭시맙 (huFR107)을 대조군으로 사용했다. huFR107의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 미국 특허번호 8,557,966 (각각 서열 번호 36 및 37)로부터 얻었고 코돈-최적화되었다. huFR107을 인코딩하고 항체 F8, F26 및 F131을 인코딩하는 최적화된 cDNA를 벡터 pcDNA3.4에서 구축하였다. 그런 다음 플라스미드를 Erlenmeyer 플라스크에서 표준 ExpiFectamine CHO 형질감염 절차(Gibco, A29129)를 사용하여 ExpiCHO-S 세포로 일시적으로 형질전환(transect)시켰다. 현탁된 일시적 형질감염을 10일 동안 배양한 다음, 정제된 상청액을 위에서 설명한 대로 단백질 A 컬럼으로 정제한 다음 SDS-PAGE를 수행했다.
70.2 항-FOLR-1 면역접합체의 제조
항체 용액의 pH는 0.5M 이염기인산나트륨을 첨가하여 pH 7.0~7.5 범위로 조정하였다. 표시된 양의 0.5M EDTA를 첨가하여 항체 용액에서 최종 EDTA 농도가 5mM이 되도록 했다. 표시된 양의 10mM TCEP(트리스(2-클로로에틸) 인산염) 용액을 첨가하여 원하는 TCEP/ mAb 몰비를 달성했다. 환원 반응물을 실온에서 90분 동안 두었다. 그런 다음 DMSO를 첨가하여 10% v/v를 달성했다. 약물-링커 mc-VC-PAB-MMAE를 DMSO에 용해시켜 10mM의 최종 농도를 달성하고, 표시된 양을 이용 가능한 시스테인 티올의 몰수와 비교하여 30~50%의 몰 과량인 반응 용액에 첨가했다. 접합 반응물을 실온에서 30분 동안 두었다. NAC(N-아세틸-L-시스테인) 스톡 용액을 첨가하여 NAC/Mc-VC-PAB-MMAE 몰비 5를 달성했다. 켄칭된 반응물을 실온에서 15분 동안 두었다. 정제는 PD10 컬럼을 이용하여 진행하였다.
항-FOLR-1 면역접합체의 순도는 Waters HPLC E2695&2489 시스템을 사용하여 TSK 겔 G3000SWXL, 7.8x300mm 컬럼(Tosoh Bioscience)에서 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 평가되었다. 작동은 50mM Na2PO4 (pH 6.7) 및 10% IPA의 이동 상을 사용하여 25℃에서 수행되었으며, 20분에 걸쳐 0.8mL/분의 유속으로 실행되었다. 표 9를 참조하면, 4개의 ADC 모두 높은 순도를 나타냈다.
항-FOLR-1 면역접합체의 소수성은 Waters HPLC E2695&2489 시스템을 사용하여 소수성 상호작용 TosoHaas TSK 겔 부틸-NPR 컬럼(4.6mm ID x 3.5cm, 입자 크기 2.5μm)에서 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로 평가되었다. 간단히 말하면, HPLC 시스템은 25℃에서 이동상 A: 50mM Na2PO4 /1.5 M(NH4)2SO4 (pH 7.0) 및 이동상 B: 50mM Na2PO4 /25% IPA (pH 7.0)을 사용하여 작동된다. 이동상은 0.22μm 막 필터(Millipore)를 통해 여과되며 30분 동안 0.5mL의 유속으로 실행되었다. 선형 구배의 매개변수를 표 10에 나타내었다. 항-FOLR-1 면역접합체의 DAR(약물 항체 비율)은 HIC 데이터에 따라 결정되었으며 3~4의 범위 내에 있었다(데이터는 표시되지 않음).
Figure pct00524
Figure pct00525
실시예 71. BLI에 의해 테스트된 FOLR 계열 단백질에 대한 F131 및 F131-LD038의 친화성 데이터
His 태그에 연결된 FOLR 계열 단백질의 세포외 도메인으로 구성된 재조합 단백질을 구입하거나(ACRO 시스템) 사내에서 합성했다. 바이오층 간섭계(BLI)를 통한 결합 연구를 위해, F131(16.67nM)을 항-인간 IgG Fc 바이오센서 팁(Fortebio)에 고정시켰다. 용액 내 다양한 농도(500nM 내지 7.8nM)의 재조합 항원 단백질을 사용하는 결합 분석을 Octet RED(Fortebio)를 사용하여 수행했다. 결합 시간은 180초, 해리 시간은 300초로 설정되었다. 결합 친화도는 ForteBio Data Acquisition 6.3 소프트웨어(ForteBio)를 사용하여 계산되었으며, 글로벌 피팅 알고리즘을 사용하여 운동 데이터를 1:1 Langmuir 결합 모델에 피팅하여 친화도를 도출했다. F131은 인간 FOLR1에 대해 높은 친화도를 나타낸 반면, 인간 FOLR2에 대해서는 낮은 반응을 나타내고, 인간 FOLR3에 대해서는 무반응을 나타내어, F131의 결합 특이성을 입증했다(표 11). F131은 각각 1.5 및 8.1 nM 의 평형 해리 상수(KD)로 인간 및 시노몰구스 원숭이 FOLR1에 대해 높은 결합 친화도을 입증했다. F131은 래트 FOLR1에 대해 교차 반응성을 나타내지 않았고, 마우스 FOLR1에 대해 낮은 교차 반응성을 나타냈다 (KD= 2.9μM).
Figure pct00526
Figure pct00527
Figure pct00528
Figure pct00529
Figure pct00530
Figure pct00531
Figure pct00532
실시예 72. 종양 세포주에서의 F131 및 F131-LD038 내재화
내재화 분석은 시간 경과에 따라 수행되었다. 3×105 개의 세포를 FACS 완충액(0.1% BSA를 함유하는 1×PBS) 중 10ug/ml의 F131 또는 F131-LD038과 함께 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 4℃에서 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거하고 필요에 따라 얼음 위에 보관하거나 37℃로 옮겼다. 진행 시점(0, 0.5, 1, 2, 3, 4 시간)에서, 세포를 4℃에서 30분 동안 PE-접합 항-인간 Fc로 염색하고 유세포 분석으로 분석했다. 내재화율은 각 시점 37℃에서 세포 표면 결합 항체의 평균 형광 강도(MFI)를 0시간 4℃에서 세포 표면 결합 항체의 MFI로부터 뺀 다음, 0시간 4℃에서 세포 표면 결합 항체의 MFI로 나누어 계산했다.
F131 및 F131-LD038은 다중 FOLRα 발현 세포주(OVCAR3, KB, JEG-3, NCI-H441)에서 빠른 내재화를 나타낸 반면, FOLRα 비발현 세포(PC-3, 대조군)에서는 내재화가 관찰되지 않았다(도 12a 및 도 12b).
실시예 73. 3개의 선별 세포주에서의 F131 및 F131-LD038 세포독성
시험물질(F131 또는 F131-LD038 또는 엑사테칸)을 첨가하기 하루 전에, 세포를 수확하고 96-웰 고체 백색 편평 바닥 플레이트에 배치했다. 다음날 세포를 F131 및 F131-LD038의 경우 2000~0.305nM, 또는 엑사테칸의 경우 100nM~1μM의 농도로 시험물질에 노출시켰다. 플레이트를 37℃에서 96시간 동안 배양하였다. 그 후, 웰당 40μl Cell-tire Glo(CTG)를 플레이트에 첨가하고 5분 후에 루시퍼라제 판독값을 수집하여 Microplate reader로 분석하였다. 모든 판독값은 처리되지 않은 대조 웰의 생존 세포 백분율로 정규화되었으며 IC50 값은 Prism 소프트웨어로 계산되었다.
F131-LD038은 인간 FOLRα 발현 KB, OVCAR3 및 JEG-3 세포에 대해 강력한 세포독성을 나타내는 반면, 네이키드 항체 F131은 이들 표적 종양 세포에 대해 세포독성을 나타내지 않았다. F131-LD038의 페이로드(엑사테칸)는 이들 세포에 대한 세포독성 효과에서 F131-LD038보다 더 강력한 것으로 나타났다 (도 13a 내지 13c).
실시예 74. F131-LD038의 CDX에서의 생체내 효능
F131-LD038 ADC의 생체내 항종양 활성이 NCI-H441, HCC827, OVCAR3, KB 및 OV90과 같은 다양한 표적 발현 수준을 갖는 세포주에서 평가되었다(도 14a 내지 14e).
NCI-H441(ATCC, HTB-174, NSCLC, 세포당 47*103 복제) 종양 모델을 Matrigel/배지(1:1)에 현탁된 5x106개 세포를 주입하여 확립했다; HCC827(ATCC, Cat# CRL-2868™, NSCLC, 세포당 41*103 복제) 종양 모델을 Matrigel/배지(1:1)에 현탁된 4x106개 세포를 주입하여 확립했다; OVCAR3(ATCC, HTB-161, Ovarian, 세포당 290*103 복제) 종양 모델을 Matrigel/배지(1:1)에 현탁된 1x107개 세포를 주입하여 확립했다; KB(Co-bioer, 구강 상피, 세포당 341*103 복제) 종양 모델을 0.1 mL 배지에 현탁된 1x107개 세포를 주입하여 확립했다; OV90(Truway-bio, Ovarian, 세포당 0.38*103 복제) 종양 모델을 Matrigel/배지(1:1)에 현탁된 2x106개 세포를 주입하여 확립했다.
종양 접종 후 6 내지 26일에 평균 종양 크기가 110~180 mm3 인 마우스 를 선별하고 종양 부피에 따라 계층화된 무작위화(그룹당 n= 6~9)를 사용하여 각 모델에 대해 2 또는 3개의 그룹으로 할당했다. 치료는 무작위화(D0으로 정의된 무작위화일) 1일 후 시작되었으며, F131-LD038 5mg/kg의 정맥 주사를 통해 단일 용량(1일차) 또는 다회 용량(1일/4일/8일/11일차) 요법으로 이루어졌다.
종양 크기와 체중은 캘리퍼를 사용하여 일주일에 두 번 2차원으로 측정되었으며 부피는 다음 공식을 사용하여 mm3 단위로 표시되었다: V = 0.5a x b2, 여기서 a와 b는 각각 종양의 긴 직경과 짧은 직경이다. 2000 mm3를 초과하는 종양 부피는 실험 종료에 도달한 것으로 정의되었다. 내약성의 간접적 측정으로서 동물 체중을 모니터링하였다. 어느 치료군에서도 유의미한 체중 감소를 보인 마우스는 없었다. 치료 기간 동안 질병 및 사망은 발생하지 않았다.
비히클 대조군과 비교하여, F131-LD038을 단일 및 다중 용량으로 투여한 모든 치료군은 NCI-H441, HCC827, OVCAR3, KB 종양 모델에서 유의미한 항종양 활성을 나타낸 반면, 다른 종양에 비해 표적 밀도가 낮은 OV90 종양 모델에서는 중간 내지 약한 항종양 활성을 나타냈다.
표적 복제 수는 QIFKIT(DAKO, K0078)에 의해 테스트되었다. 간략하게, 세포는 관심 항원에 대한 1차 마우스 단일클론 항체로 라벨링되었다. 그런 다음 키트의 세포, 셋-업 비드 및 보정 비드를 형광 접합 항-마우스 2차 항체와 병행하여 라벨링했다. 형광은 세포 및 비드 상의 결합된 1차 항체 분자의 수와 상관관계가 있었다. 그런 다음 샘플을 유세포 분석기에서 분석하고 보정 곡선에서 유래된 방정식을 기반으로 복제 수를 계산했다(표 13).
Figure pct00533
실시예 75. F131-LD038 및 기타 F131-접합체의 생체내 효능
75.1 F131-LD100, F131-LD111, F131-LD101, F131-LD110의 세대:
F131-LD100
5mM EDTA(pH=6.9)를 함유한 50mM 인산나트륨 완충액 중의 2mL의 항체(10mg/mL)를 TCEP 대 mAb의 몰비 8.0의 10mM TCEP HCl(트리스(2-카르복시에틸)포스핀 HCl) 수용액에 첨가했다. 환원 반응은 25℃에서 2시간 동안 진행하였다. 과량의 TCEP 및 이의 부산물을 pH=6.9, 50mM 인산나트륨 완충액을 사용하여 한외여과하여 제거했다. 약물 링커 LD100(TFA의 염)을 20mg/mL의 농도로 물에 용해시키고 8.5(LD100/mAb)의 몰비로 환원된 mAb에 첨가했다. 커플링 반응물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 과량의 LD100 및 이의 불순물을 50mM 인산나트륨 완충액으로 한외여과하여 제거하였다. ADC를 UFDF의 6% 수크로스 및 0.02%(w/V) Tween 20을 함유하는 20mM 히스티딘 완충액에 보관했다. SEC-HPLC로 측정한 ADC의 순도는 97.1%였고, LC-MS로 측정한 DAR 값은 7.9였다.
F131-LD111
5mM EDTA(pH=6.9)를 함유한 50mM 인산나트륨 완충액 중의 2mL의 항체(10mg/mL)를 TCEP 대 mAb의 몰비 8.0의 10mM TCEP HCl(트리스(2-카르복시에틸)포스핀 HCl) 수용액에 첨가했다. 환원 반응은 25℃에서 2시간 동안 진행하였다. 과량의 TCEP 및 이의 부산물을 pH=6.9, 50mM 인산나트륨 완충액을 사용하여 한외여과하여 제거했다. 약물 링커 LD111(TFA의 염)을 20mg/mL의 농도로 물에 용해시키고 8.5(LD111/mAb)의 몰비로 환원된 mAb에 첨가했다. 커플링 반응물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 과량의 LD111 및 이의 불순물을 50mM 인산나트륨 완충액으로 한외여과하여 제거하였다. ADC를 UFDF의 6% 수크로스 및 0.02%(w/V) Tween 20을 함유하는 20mM 히스티딘 완충액에 보관했다. SEC-HPLC로 측정한 ADC의 순도는 97.5%였고, LC-MS로 측정한 DAR 값은 7.8이었다.
F131-LD101
5mM EDTA(pH=6.9)를 함유한 50mM 인산나트륨 완충액 중의 2mL의 항체(10mg/mL)를 TCEP 대 mAb의 몰비 8.0의 10mM TCEP HCl(트리스(2-카르복시에틸)포스핀 HCl) 수용액에 첨가했다. 환원 반응은 25℃에서 2시간 동안 진행하였다. 과량의 TCEP 및 이의 부산물을 pH=6.9, 50mM 인산나트륨 완충액을 사용하여 한외여과하여 제거했다. 약물 링커 LD101(TFA의 염)을 20mg/mL의 농도로 물에 용해시키고 8.5(LD101/mAb)의 몰비로 환원된 mAb에 첨가했다. 커플링 반응물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 과량의 LD101 및 이의 불순물을 50mM 인산나트륨 완충액으로 한외여과하여 제거하였다. ADC를 UFDF의 6% 수크로스 및 0.02%(w/V) Tween 20을 함유하는 20mM 히스티딘 완충액에 보관했다. SEC-HPLC로 측정한 ADC의 순도는 98.0%이었고, LC-MS로 측정한 DAR 값은 7.5였다.
F131-LD110
5mM EDTA(pH=6.9)를 함유한 50mM 인산나트륨 완충액 중의 2mL의 항체(10mg/mL)를 TCEP 대 mAb의 몰비 8.0의 10mM TCEP HCl(트리스(2-카르복시에틸)포스핀 HCl) 수용액에 첨가했다. 환원 반응은 25℃에서 2시간 동안 진행하였다. 과량의 TCEP 및 이의 부산물을 pH=6.9, 50mM 인산나트륨 완충액을 사용하여 한외여과하여 제거했다. 약물 링커 LD110(TFA의 염)을 20mg/mL의 농도로 물에 용해시키고 7.7(LD110/mAb)의 몰비로 환원된 mAb에 첨가했다. 커플링 반응물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 과량의 LD110 및 이의 불순물을 50mM 인산나트륨 완충액으로 한외여과하여 제거하였다. ADC를 UFDF의 6% 수크로스 및 0.02%(w/V) Tween 20을 함유하는 20mM 히스티딘 완충액에 보관했다. SEC-HPLC로 측정한 ADC의 순도는 97.8%이었고, LC-MS로 측정한 DAR 값은 7.5였다.
75.2 종양 세포주 KB에서 추가 F131 접합체(F131-LD100, F131-LD111, F131-LD101, F131-LD110)의 생체내 항종양 활성을 평가했다 (도 15a 및 15b).
0.1 mL 배지에 현탁된 1×107개 세포를 주입하여 KB(Co-bioer) 종양 모델을 확립하였다. 종양 접종 12일 후, 평균 종양 크기가 ~137 mm3 인 마우스를 선별하고 종양 부피에 기초한 계층화된 무작위화(그룹당 n=8)를 사용하여 8개 그룹으로 할당했다. 치료는 무작위화(D0으로 정의된 무작위화 일) 1일 후에 시작되었으며 마우스는 F131-LD100 3mg/kg, 또는 F131-LD111 3mg/kg, 또는 F131-LD101 1.5 또는 3mg/kg, 또는 F131-LD110 1.5 또는 3mg/kg의 단일(1일차) 정맥 주사로 치료되었다.
종양 크기와 체중은 이전에 설명한 대로 측정되었다. 내약성의 간접적 측정으로서 동물 체중을 모니터링하였다. 어느 치료군에서도 유의미한 체중 감소를 보인 마우스는 없었다. 치료 기간 동안 질병 및 사망은 발생하지 않았다.
비히클 대조군과 비교하여, F131-LD101 및 F131-LD110을 1.5 또는 3mg/kg으로 처리하면 KB 종양 모델에서 상당한 항종양 활성이 나타났다(도 15b). F131-LD110에 의한 종양 성장 억제는 용량과 관련이 있었다. 3mg/kg의 F131-LD100, F131-LD111 또는 F131-LD038을 사용한 치료는 KB 종양에서 중간 정도의 항종양 활성을 나타냈다(도 15a).
Figure pct00534
실시예 76. F131, F131-LD038 및 기타 접합체의 래트 모델에서의 F131-LD038 PK 연구
F131 및 그 접합체(F131-LD038, F131-LD101, F131-LD110, F131-LD100, F131-LD111)를 수컷 스프래그 다우리(Sprague Dawley) 래트 (그룹당 n=3)에 3 mg/kg으로 정맥 투여했다. 투여 후 10분, 4시간, 1일, 4일, 7일, 10일, 14일, 21일에 각 래트의 안와 혈액을 교차 샘플링했다. 혈청 내 총 Ab 농도(F131 및 그 접합체를 나타냄)는 젠스크립트(Genscript)에 의해 생성된 ELISA 키트에 의해 검출되었고 Winnonlin 8.2 소프트웨어를 사용하여 계산되었다.
테스트된 모든 F131-접합체는 비접합 모체 mAb인 F131과 비교할 수 있는 우수한 PK 특성을 나타냈다 (도 16a 내지 16c).
실시예 77. 파일럿 시노몰거스 독성 연구에서 F131-LD038 PK 및 내약성
F131-LD038의 독성 효과 및 독성동력학적 특성을 평가하기 위해, F131-LD038을 수컷(M) 및 암컷(F) 시노몰구스 원숭이 각각 한 마리에게 60mg/kg의 단일 용량으로 정맥 투여했다. 임상 징후, 체중, 음식 섭취, 임상 병리를 연구 기간 내내 모니터링했다(표 15). 동물은 투여 후 22일째 되는 날 안락사되었고, 이후 완전한 부검을 실시했다. 투여 후 0시간, 24시간, 72시간, 120시간, 336시간, 504시간에 각 동물에서 독성동력학 샘플을 수집했다. 혈청 내 총 Ab 농도(F131 및 그 접합체를 나타냄)는 Genscript에서 생성한 ELISA 키트로 검출하고 Winnonlin 8.2 소프트웨어를 사용하여 계산했다. ALT의 일시적 증가(도 17a)와 호중구의 일시적 감소(도 17b)가 관찰되었다. F131-LD038은 시노(cyno)에서 안정적이고 우수한 혈장 PK 프로파일을 보였다(도 18).
Figure pct00535
본 발명은 본원에 기재된 특정 양태에 의해 그 범위가 한정되어서는 안 된다. 실제로, 본원에 기재된 것들 이외에 본 발명의 다양한 변경들이 전술한 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변경은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되도록 의도되었다.
상술한 다양한 양태들이 결합되어 추가적인 양태를 제공할 수 있다. 2021년 7월 6일 출원된 국제 특허 출원번호 PCT/CN2021/104618 및 2022년 7월 4일 출원된 중국 특허 출원번호 202210777240.7을 포함하여, 본 명세서에 언급되고/거나 출원 데이터 시트에 기재된 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 공개는 그 전체가 참조로서 본원에 통합되어 있다. 다양한 특허, 출원 및 공개물의 개념을 사용하여 더 많은 양태를 제공하기 위해 필요한 경우, 양태의 측면은 수정될 수 있다.
특허, 특허 출원 공개물 및 과학 문헌을 포함한 다양한 공개물이 본원에 인용되어 있으며, 이러한 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로서 통합되어 있다.
서열목록
Figure pct00536
Figure pct00537
Figure pct00538
Figure pct00539
Figure pct00540

Claims (142)

  1. 하기 화학식 (V)을 갖는 링커 중간체, 또는 그의 염:
    Figure pct00541

    여기서,
    AA는 1 내지 12 개의 아미노산 서브유닛을 갖는 아미노산 유닛이고;
    s는 0 또는 1이고;
    L2는 약물 유닛에 대하여 1 내지 4개의 부착 부위를 갖는 링커 서브유닛이고;
    각 물결(~) 선은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고;
    이중 물결() 선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고,
    여기서, 적어도 하나의 극성 유닛은 아미노산 유닛, 링커 서브유닛 또는 둘 다에 존재하며, 극성 유닛(들)은 당 유닛, PEG 유닛, 카르복실 유닛 및 이들의 조합들로부터 선택된다.
  2. 하기 화학식 (I)를 갖는 링커, 또는 그의 염:
    Figure pct00543

    여기서,
    L1은 표적 유닛에 대한 부착 부위를 갖는 스트레처 유닛이고;
    AA는 1 내지 12 개의 아미노산 서브유닛을 갖는 아미노산 유닛이고;
    s는 0 또는 1이고;
    L2는 약물 유닛에 대하여 1 내지 4개의 부착 부위를 갖는 링커 서브유닛이고;
    물결(~) 선은 표적화 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고;
    이중 물결() 선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고,
    여기서, 적어도 하나의 극성 유닛은 아미노산 유닛, 링커 서브유닛, 스트레처 유닛, 또는 이들의 조합에 존재하며, 극성 유닛(들)은 당 유닛, PEG 유닛, 카르복실 유닛 및 이들의 조합들로부터 선택된다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 당 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염을 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00545

    여기서,
    X 각각은 독립적으로 NH 또는 O로부터 선택되고;
    R 각각은 독립적으로 수소, 아세틸, 단당류, 이당류 및 다당류로부터 선택되고;
    X1 각각은 독립적으로 CH2 및 C(O)로부터 선택되고;
    X2 각각은 독립적으로 H, OH 및 OR로부터 선택되고;
    k는 1 내지 10이고;
    L3은 하기 일반 화학식 (XI) 또는 그의 염을 갖는다:
    Figure pct00546

    여기서,
    L3a는 C1-C10 알킬렌 및 1 내지 24개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖는 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택되고;
    p와 o는 독립적으로 0 내지 2이고;
    각 * 및 각 #은 아미노산 유닛(AA)의 다른 서브유닛, 링커 서브유닛 L2, 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타내고;
    L3a는 화학식 (X)에서 **로 표시된 N 원자에 공유 결합되어 있다.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 당 유닛은 하기로부터 선택되는 화학식, 또는 그의 염을 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00547

    여기서,
    R 각각은 독립적으로 수소, 단당류, 이당류, 및 다당류로부터 선택되고;
    p 및 o 는 독립적으로 0 내지 2이고;
    m은 1 내지 8이고;
    n은 0 내지 4이고;
    각 * 및 각 #은 아미노산 유닛(AA)의 다른 서브유닛, 링커 서브유닛 L2, 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 유닛은 하기로부터 선택되는 화학식, 또는 그의 염을 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    (a)
    Figure pct00548

    여기서,
    R20은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
    R21 및 R22는 각각 독립적으로 선택적 C1-C3 알킬렌이고;
    R24 및 R25는 각각 독립적으로 H; 폴리하이드록실기; 치환된 폴리하이드록실기; -C(O)-폴리하이드록실기; 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기; 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 헤테로아릴; 선택적으로 치환된 카르보사이클; 치환된 -C1-C8 알킬; 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬; 킬레이트제; -C(O)-R28 (여기서 R28은 화학식 (XII) 또는 (XIII)의 당 유닛임); 또는 C3-C8 헤테로사이클로부터 함께 -NR24R25로부터 선택되고;
    물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
    n20은 1 내지 26임;
    또는
    (b)
    Figure pct00549

    여기서,
    R20은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
    R21 및 R22는 각각 독립적으로 선택적 C1-C3 알킬렌이고;
    R24 및 R25 중 하나는 H; 폴리하이드록실기; 치환된 폴리하이드록실기; -C(O)-폴리하이드록실기; 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기; 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 헤테로아릴; 선택적으로 치환된 카르보사이클; 치환된 -C1-C8 알킬; 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬; 킬레이트제; -C(O)-R28(여기서 R28은 화학식 (XII) 또는 (XIII)의 당 유닛임)로부터 선택되고; R24 및 R25 중 다른 하나는 선택적으로 1 내지 24개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖는 폴리에틸렌 글리콜이고;
    물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
    n20은 1 내지 26임;
    또는
    (c)
    Figure pct00550

    여기서,
    R20은 아미노산 유닛의 서브유닛 및/또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
    R26 및 R27은 각각 선택적이고, 그리고 독립적으로 C1-C12 알킬렌, -NH-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-NH-, -C(O)-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-C(O)-, -NH-C1-C12 알킬렌-C(O)- 및 -C(O)-C1-C12 알킬렌-NH-로부터 선택되고;
    R24 및 R25 중 하나는 H; 폴리하이드록실기; 치환된 폴리하이드록실기; -C(O)-폴리하이드록실기; 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기; 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 헤테로아릴; 선택적으로 치환된 카르보사이클; 치환된 -C1-C8 알킬; 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬; 킬레이트제; -C(O)-R28 (여기서 R28은 화학식 (XII) 또는 (XIII)의 당 유닛임)로부터 선택되고; R24 및 R25 중 다른 하나는 H; 폴리하이드록실기; 치환된 폴리하이드록실기; -C(O)-폴리하이드록실기; 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기; 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌 C3-C10 카르보사이클; 선택적으로 치환된 헤테로아릴; 선택적으로 치환된 카르보사이클; 치환된 -C1-C8 알킬; 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬; 킬레이트제; -C(O)-R28 (여기서 R28은 화학식 (XII) 또는 (XIII)의 당 유닛임); 및 선택적으로 1 내지 24개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖는 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택되고; 또는 C3-C8 헤테로사이클로부터 함께 -NR24R25로부터 선택되고;
    R29 각각은 선택적이고, 그리고 독립적으로 -C(O)-, -NH-, -C(O)-C1-C6 알케닐렌-, -NH-C1-C6 알케닐렌-, -C1-C6 알케닐렌-NH-, -C1-C6 알케닐렌-C(O)-, -NH(CO)NH-, 및 트리아졸로부터 선택되고;
    물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
    n20은 1 내지 26이고;
    n21은 1 내지 4이고;
    n27은 1 내지 4임.
  6. 제5항에 있어서, R24 및 R25 둘 모두가 H는 아닌, 링커 중간체 또는 링커.
  7. 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R24 및 R25는 각각 H 및 폴리하이드록실기로부터 독립적으로 선택되며, 단 R24 및 R25 둘 모두가 H는 아닌, 링커 중간체 또는 링커.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리하이드록실기는 선택적으로 C6 또는 C5 당, 당 산(sugar acid) 또는 아미노당으로부터 선택된 선형 단당류인, 링커 중간체 또는 링커.
  9. 제8항에 있어서,
    C6 또는 C5 당은 글루코스, 리보스, 갈락토스, 만노스, 아라비노스, 2-데옥시글루코스, 글리세르알데하이드, 에리트로스, 트레오스, 자일로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 알도스 및 케토스로부터 선택되고;
    당 산은 글루콘산, 알돈산, 우론산 및 울로손산으로부터 선택되거나; 또는
    아미노당은 글루코사민, N-아세틸 글루코사민, 갈락토사민 및 N-아세틸 갈락토사민으로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00551

    여기서,
    R39는 H, 선형 단당류 및 선택적으로 1 내지 24개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖는 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택되고; 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  11. 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R24 및 R25 중 하나는 선형 단당류이고 다른 하나는 환형 단당류인, 링커 중간체 또는 링커.
  12. 제11항에 있어서, PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00552

    여기서,
    R41은 환형 단당류이고; 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  13. 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R24 및 R25는 환형 단당류, 이당류 및 다당류로부터 독립적으로 선택되는, 링커 중간체 또는 링커.
  14. 제13항에 있어서, PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00553

    여기서,
    각각의 R45는 H 및 단당류, 이당류 또는 다당류로부터 선택되고; R46은 환형 단당류, 이당류 또는 다당류로부터 선택되고; 우측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  15. 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R24 및 R25는 선형 단당류 및 치환된 선형 단당류로부터 독립적으로 선택되고, 상기 치환된 선형 단당류는 단당류, 이당류 또는 다당류로 치환되는, 링커 중간체 또는 링커.
  16. 제15항에 있어서, PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00554

    여기서,
    R47은 선형 단당류이고; 각각의 R49는 단당류, 이당류 및 다당류로부터 선택되고; 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  17. 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R24 및 R25는 선형 단당류 및 치환된 단당류로부터 독립적으로 선택되고, 상기 치환된 선형 단당류는 알킬, O-알킬, 아릴, O-아릴, 카르복실, 에스테르 또는 아미드로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환되고, 선택적으로 단당류, 이당류 또는 다당류로 추가로 치환되는, 링커 중간체 또는 링커.
  18. 제17항에 있어서, PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00555

    여기서, R42 각각은 선형 단당류 및 치환된 선형 단당류로부터 독립적으로 선택되고; R43 각각은 알킬, O-알킬, 아릴, O-아릴, 카르복실, 에스테르 및 아미드로부터 독립적으로 선택되고; 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  19. 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R24 및 R25 중 하나는 -C(O)-폴리하이드록실기 또는 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기이고, R24 및 R25 중 다른 하나는 H, -C(O)-폴리하이드록실기, 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기, 폴리하이드록실기 또는 치환된 폴리하이드록실기이고; 여기서 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기 및 폴리하이드록실기는 단당류, 이당류, 다당류, 알킬, -O-알킬, 아릴, 카르복실, 에스테르 또는 아미드로 치환되는, 링커 중간체 또는 링커.
  20. 제19항에 있어서, PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00556


    여기서, 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  21. 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R24 및 R25는 H, 치환된 -C1-C8 알킬, 치환된 -C1-C4 알킬 또는 치환된 -C1-C3 알킬로부터 독립적으로 선택되며; 단, R24 및 R25 둘 모두가 H는 아니고; 여기서, 치환된 -C1-C8 알킬, -C1-C4 알킬 및 -C1-C3 알킬은 하이드록실 및/또는 카르복실로 치환되는, 링커 중간체 또는 링커.
  22. 제21항에 있어서, PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염으로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커:

    Figure pct00558

    여기서, R48은 H, OH, CH2OH, COOH, 또는 하이드록실 또는 카르복실로 치환된 -C1-C6 알킬로부터 선택되고; 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  23. 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R24 및 R25 중 하나는 H, 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬, 치환된 -C(O)-C1-C4 알킬, 및 치환된 -C(O)-C1-C3 알킬로부터 선택되고, R24 및 R25 중 다른 하나는 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬, 치환된 -C(O)-C1-C4 알킬, 치환된 -C(O)-C1-C3 알킬, 치환된 -C1-C8 알킬, 치환된 -C1-C4 알킬, 및 치환된 -C1-C3 알킬로부터 선택되고, 여기서 치환된 -C(O)-C1-C8 알킬, 치환된 -C(O)-C1-C4 알킬, 치환된 -C(O)-C1-C3 알킬, 치환된 -C1-C8 알킬, -C1-C4 알킬 및 -C1-C3 알킬은 하이드록실 및/또는 카르복실로 치환되는, 링커 중간체 또는 링커.
  24. 제23항에 있어서, PEG 유닛은 하기 화학식, 또는 그의 염으로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00559

    Figure pct00560

    여기서, 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  25. 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R24 및 R25는 H 및 선택적으로 치환된 아릴로부터 선택되고; 단 R24 및 R25 둘 모두가 H는 아닌, 링커 중간체 또는 링커.
  26. 제25항에 있어서, PEG 유닛은 하기 화학식, 또는 그의 염으로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00561

    여기서, 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  27. 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R24 및 R25는 함께 선택적으로 치환된 C3-C8 헤테로사이클 또는 헤테로아릴을 형성하는, 링커 중간체 또는 링커.
  28. 제27항에 있어서, PEG 유닛은 하기 화학식 또는 그의 염인, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00562
    .
  29. 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R24 및 R25는 H 및 킬레이트제로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 킬레이트제는 선택적으로 알킬렌, 아릴렌, 카르보사이클로, 헤테로아릴렌 또는 헤테로카르보사이클로에 의해 -NR24R25의 질소에 부착되고; 단, R24 및 R25 둘 모두가 H는 아닌, 링커 중간체 또는 링커.
  30. 제29항에 있어서, 상기 킬레이트제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 트리에틸렌테트라민헥사아세트산(TTHA), 벤질-DTPA, 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N",N'''-테트라아세트산(DOTA), 벤질-DOTA, 1,4,7-트리아자사이클로노난-N,N',N"-트리아세트산(NOTA), 벤질-NOTA, 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA) 및 N,N'-디알킬 치환된 피페라진으로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커.
  31. 제30항에 있어서, PEG 유닛은 하기 화학식, 또는 그의 염으로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00563

    여기서, 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  32. 제5항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 각 단당류는 독립적으로
    글루코스, 리보스, 갈락토스, 만노스, 아라비노스, 2-데옥시글루코스, 글리세르알데하이드, 에리트로스, 트레오스, 자일로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 알도스, 케토스, 글루코사민, N-아세틸 글루코사민, 갈락토사민 및 N-아세틸 갈락토사민으로부터 선택된 C5 또는 C6 당;
    글루콘산, 알돈산, 우론산 및 울로손산으로부터 선택되는 당 산; 또는
    글루코사민, N-아세틸 글루코사민, 갈락토사민 및 N-아세틸 갈락토사민으로부터 선택된 아미노 당
    으로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커.
  33. 제5항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, R20은 할로, 알데하이드, 카르복실, 아미노, 알키닐, 아지도, 하이드록실, 카르보닐, 카르바메이트, 티올, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 설폰아미드, 아실 설폰아미드, 알킬 설포네이트, 트리아졸, 아자디벤조사이클로옥틴, 히드라진, 카보닐알킬헤테로아릴, 또는 이들의 보호된 형태로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커.
  34. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 유닛은 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    (a)
    Figure pct00564

    여기서,
    R20은 (존재하는 경우) 아미노산 유닛의 서브유닛 및/또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
    R21 및 R22는 각각 선택적이고, 존재하는 경우, 독립적으로 C1-C3 알킬렌기이고;
    R30은 선택적으로 치환된 C3-C10 카르보사이클; 티오우레아; 선택적으로 치환된 티오우레아; 우레아; 선택적으로 치환된 우레아; 설파미드; 알킬 설파미드; 아실 설파미드; 선택적으로 치환된 알킬 설파미드; 선택적으로 치환된 아실 설파미드; 설폰아미드; 선택적으로 치환된 설폰아미드; 알킬 및 아릴 구아니딘을 포함하는 구아니딘; 포스포르아미드; 또는 선택적으로 치환된 포스포르아미드로부터 선택되거나; 또는 R30은 아지도, 알키닐, 치환된 알키닐, -NH-C(O)-알키닐, -NH-C(O)-알키닐-R65; 사이클로옥틴; -NH-사이클로옥틴, -NH-C(O)-사이클로옥틴, 또는 -NH-(사이클로옥틴)2로부터 선택되고; 여기서 R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고;
    물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
    n20은 1 내지 26임;
    (b)
    Figure pct00565

    여기서,
    R20은 (존재하는 경우) 아미노산 유닛의 서브유닛, 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
    R21 및 R22는 각각 독립적으로 선택적 C1-C3 알킬렌기이고;
    R31은 분지형 폴리에틸렌 글리콜 쇄로서, 각 분지는 1 내지 26개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖고, 각 분지는 그의 말단에 R35를 가지며;
    R35는 아지도, 알키닐, 알키닐-R65, 사이클로옥틴 또는 사이클로옥틴-R65이고, 여기서 R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고;
    물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
    n20은 1 내지 26임;
    (c)
    Figure pct00566

    여기서,
    R20은 (존재하는 경우) 아미노산 유닛의 서브유닛, 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
    R21 및 R22는 각각 선택적이고, 독립적으로 C1-C3 알킬렌기이고;
    R31은 분지형 폴리에틸렌 글리콜 쇄로서, 각 분지는 독립적으로 1 내지 26개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖고, 각 분지는 그의 말단에 R35를 갖고;
    R35는 아지도, 알키닐, 알키닐-R65, 사이클로옥틴 또는 사이클로옥틴-R65이고, 여기서 R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고;
    물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
    n20은 1 내지 26임; 및
    (d)
    Figure pct00567

    여기서,
    R20은 (존재하는 경우) 아미노산 유닛의 서브유닛, 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고;
    R21 및 R22는 각각 선택적이고, C1-C3 알킬렌기이고;
    R31은 분지형 폴리에틸렌 글리콜 쇄로서, 각 분지는 1 내지 26개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖고, 각 분지는 그의 말단에 R35를 갖고;
    R33은 C1-C3 알킬렌, C1-C3 알킬렌-C(O), -C(O)-C1-C3 알킬렌, 또는 -C(O)-C1-C3 알킬렌-C(O)이고;
    R35는 아지도, 알키닐, 알키닐-R65, 사이클로옥틴 또는 사이클로옥틴-R65이고, 여기서 R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고;
    물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고;
    n20은 1 내지 26임.
  35. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 유닛은 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00568

    여기서,
    R20은 (존재하는 경우) 아미노산 유닛의 서브유닛, 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이고; R21 및 R22는 각각 선택적이고, C1-C3 알킬렌기이고; R31은 분지형 폴리에틸렌 글리콜 쇄로서, 각 분지는 1 내지 26개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 갖고, 각 분지는 그의 말단에 R35를 갖고; R33은 C1-C3 알킬렌, -C1-C3 알킬렌-C(O), -C(O)-C1-C3 알킬렌, 또는 -C(O)-C1-C3 알킬렌-C(O)이고; R35는 아지도, 알키닐, 알키닐-R65, 사이클로옥틴 또는 사이클로옥틴-R65이고, 여기서 R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고; 상기 물결선(~)은 R20에 대한 부착 부위를 나타내고; n20은 1 내지 26이다.
  36. 제35항에 있어서, PEG 유닛은 하기로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00569

    Figure pct00570

    여기서, R65는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로카르보사이클 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고; 좌측의 물결선은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛의 일부에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, R20은 할로, 알데하이드, 카르복실, 아미노, 알키닐, 아지도, 하이드록실, 카르보닐, 카르바메이트, 티올, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 설폰아미드, 아실 설폰아미드, 알킬 설포네이트, 트리아졸, 아자디벤조사이클로옥틴, 히드라진, 카보닐알킬헤테로아릴 또는 이들의 보호된 형태로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커.
  38. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00571

    여기서,
    R40은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이며;
    R41 및 R42는 존재하지 않거나, 또는 각각 독립적으로 C1-C6 알킬렌이고;
    R43 각각은 존재하지 않거나, 또는 C1-C12 알킬렌, -NH-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-NH-, -C(O)-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-C(O)-, -NH-C1-C12 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C12 알킬렌-NH-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-C1-C12 알킬렌, -C(O)-NH-C1-C12 알킬렌, -헤테로아릴렌, 헤테로아릴-C1-C12 알킬렌, 헤테로아릴-C1-C12 알킬렌-C(O)-, 또는 -C(O)NR46R47로부터 선택되고, 여기서, R46 및 R47 중 하나는 H 또는 C1-C12 알킬렌이고, 다른 하나는 C1-C12 알킬렌이고;
    R44 및 R45는 각각 독립적으로 H, 폴리하이드록실기, 치환된 폴리하이드록실기, -C(O)-폴리하이드록실기, 또는 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기이며, 여기서 선택적 치환체는 설페이트, 포스페이트, 알킬 설페이트, 및 알킬 포스페이트로부터 선택되고;
    물결선(~)은 R40에 대한 부착 부위를 나타내고;
    n40은 1 내지 26이고;
    n41은 1 내지 6이고;
    n42는 1 내지 6이다.
  39. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00572

    여기서,
    R40은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이며;
    R41 및 R42는 존재하지 않거나, 또는 각각 독립적으로 C1-C6 알킬렌이고;
    R43은 존재하지 않거나, 또는 C1-C12 알킬렌, -NH-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-NH-, -C(O)-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-C(O)-, -NH-C1-C12 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C12 알킬렌-NH-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-C1-C12 알킬렌, -C(O)-NH-C1-C12 알킬렌, -헤테로아릴렌, 헤테로아릴-C1-C12 알킬렌, 헤테로아릴-C1-C12 알킬렌-C(O)-, 또는 -C(O)NR46R47로부터 선택되고, 여기서, R46 및 R47 중 하나는 H 또는 C1-C12 알킬렌이고, 다른 하나는 C1-C12 알킬렌이고;
    R44 및 R45는 각각 독립적으로 H, 폴리하이드록실기, 치환된 폴리하이드록실기, -C(O)-폴리하이드록실기, 또는 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기이며, 여기서 선택적 치환체는 설페이트, 포스페이트, 알킬 설페이트, 및 알킬 포스페이트로부터 선택되고;
    물결선(~)은 R40에 대한 부착 부위를 나타내고;
    n40은 1 내지 26이고;
    n41은 1 내지 6이고;
    n42는 1 내지 6이다.
  40. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00573

    여기서,
    R40은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이며;
    R41 및 R42는 존재하지 않거나, 또는 각각 독립적으로 C1-C3 알킬렌이고;
    R43은 존재하지 않거나, 또는 C1-C6 알킬렌, -NH-C1-C12 알킬렌, -C1-C6 알킬렌-NH-, -C(O)-C1-C6 알킬렌, -C1-C6 알킬렌-C(O)-, -NH-C1-C6 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C6 알킬렌-NH-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-C1-C6 알킬렌, -C(O)-NH-C1-C12 알킬렌, -헤테로아릴렌, 헤테로아릴-C1-C6 알킬렌, 헤테로아릴-C1-C6 알킬렌-C(O)-, 또는 -C(O)NR46R47로부터 선택되고, 여기서, R46 및 R47 중 하나는 H 또는 C1-C6 알킬렌이고, 다른 하나는 C1-C12 알킬렌이고;
    R44 및 R45는 각각 독립적으로 H, 폴리하이드록실기, 치환된 폴리하이드록실기, -C(O)-폴리하이드록실기, 또는 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기이며, 여기서 선택적 치환체는 설페이트, 포스페이트, 알킬 설페이트, 및 알킬 포스페이트로부터 선택되고;
    물결선(~)은 R40에 대한 부착 부위를 나타내고;
    n40은 1 내지 16이고;
    n41은 1 내지 4이고;
    n42는 1 내지 4이다.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, R40은 할로, 알데하이드, 카르복실, 아미노, 알키닐, 아지도, 하이드록실, 카르보닐, 카르바메이트, 티올, 우레아, 티오카르바메이트, 티오우레아, 설폰아미드, 아실 설폰아미드, 알킬 설포네이트, 트리아졸, 아자디벤조사이클로옥틴, 히드라진, 카르보닐알킬헤테로아릴, 또는 이들의 보호된 형태로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커.
  42. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, R40은 하기 구조, 또는 그의 입체 이성질체 중 하나를 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00574

    Figure pct00575

    (여기서, R = H 또는 C1-6 알킬이고;
    n = 0 내지 12임),
    여기서, (*)는 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 대한 R40의 부착 부위를 나타내고, ()는 PEG 유닛의 나머지 부분에 대한 R40의 부착 부위를 나타낸다.
  43. 제42항에 있어서, R40은 하기 구조, 또는 그의 입체 이성질체 중 하나를 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00577

    Figure pct00578

    (여기서, n = 0 내지 12임),
    여기서, (*)는 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 대한 R40의 부착 부위를 나타내고, ()는 PEG 유닛의 나머지 부분에 대한 R40의 부착 부위를 나타낸다.
  44. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, R43이 존재 시, R43-(NR44R45)n41은 하기 구조, 또는 그의 입체 이성질체 중 하나를 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00580

    (여기서, R = H, C1-6 알킬, 폴리하이드록실, 또는 치환된 폴리하이드록실),
    여기서, ()는 PEG 유닛의 나머지 부분에 대한 R43의 부착 부위를 나타낸다.
  45. 제44항에 있어서, R43이 존재 시, R43-(NR44R45)n41은 하기 구조, 또는 그의 입체 이성질체 중 하나를 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00582

    여기서, ()는 PEG 유닛의 나머지 부분에 대한 R43의 부착 부위를 나타낸다.
  46. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, -NR44R45는 하기 구조, 또는 그의 입체 이성질체 중 하나를 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00584

    Figure pct00585

    여기서, ()는 PEG 유닛의 나머지 부분에 대한 -NR44R45의 부착 부위를 나타낸다.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 유닛은 아미노산 유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되기 전에 하기 구조 중 하나를 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00587

    Figure pct00588

    Figure pct00589

    Figure pct00590

    여기서, R은 H 또는 알킬이고, n은 1 내지 12이다.
  48. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00591

    여기서,
    R40은 아미노산 유닛의 서브유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착하기 위한 작용기이며;
    R41 및 R42는 존재하지 않거나, 또는 각각 독립적으로 C1-C6 알킬렌이고;
    R43 각각은, 독립적으로, 존재하지 않거나, 또는 C1-C12 알킬렌, -NH-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-NH-, -C(O)-C1-C12 알킬렌, -C1-C12 알킬렌-C(O)-, -NH-C1-C12 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C12 알킬렌-NH-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)-C1-C12 알킬렌, -C(O)-NH-C1-C12 알킬렌, -헤테로아릴렌, 헤테로아릴-C1-C12 알킬렌, 헤테로아릴-C1-C12 알킬렌-C(O)-, 또는 -C(O)NR46R47로부터 선택되고, 여기서, R46 및 R47 중 하나는 H 또는 C1-C12 알킬렌이고, 다른 하나는 C1-C12 알킬렌이고;
    R44 및 R45는 각각 독립적으로 H, 폴리하이드록실기, 치환된 폴리하이드록실기, -C(O)-폴리하이드록실기, 또는 치환된 -C(O)-폴리하이드록실기이며, 여기서 선택적 치환체는 설페이트, 포스페이트, 알킬 설페이트, 및 알킬 포스페이트로부터 선택되고;
    R46은 아미노, 아미노-알킬-아미노 또는 -NH-C(O)-NH-S(O)2-NH-로부터 선택되고;
    물결선(~)은 R40에 대한 부착 부위를 나타내고;
    n40은 1 내지 26이고;
    n41은 1 내지 6이고;
    n42는 1 내지 6이다.
  49. 제48항에 있어서, PEG 유닛은 아미노산 유닛 또는 링커 서브유닛 L2의 일부에 부착되기 전에 하기 구조 중 하나를 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00592

    여기서, R은 H 또는 알킬이고, n은 1 내지 12이다.
  50. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00593

    Figure pct00594

    여기서,
    Y 각각은 독립적으로 R76 또는
    Figure pct00595
    이고;
    R76 각각은 독립적으로 H, 아세틸, -P(=O)(OH)2, 또는 -(CH2)v-O-S(=O)2(OH)이고;
    Ra 및 Rb 각각은 독립적으로 H이거나, 또는 Ra 및 Rb는 이들이 부착된 탄소와 함께 결합하여 옥소기를 형성하고;
    각 q는 독립적으로 1 내지 26이고;
    각 m은 독립적으로 1 내지 4이고;
    각 n은 독립적으로 1 내지 4이고;
    각 v는 독립적으로 1 내지 6이고;
    각 *는 아미노산 유닛(AA)의 서브유닛, 링커 서브유닛 L2 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  51. 제50항에 있어서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00596

    Figure pct00597

    여기서,
    R76 각각은 독립적으로 H, 아세틸, -P(=O)(OH)2, 또는 -(CH2)vS(=O)2(OH)이고;
    각 q는 독립적으로 1 내지 26이고;
    각 m은 독립적으로 1 내지 4이고;
    각 n은 독립적으로 1 내지 4이고;
    각 v는 독립적으로 1 내지 6이고;
    각 *는 아미노산 유닛(AA)의 서브유닛, 링커 서브유닛 L2 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 하기로부터 선택된 화학식, 또는 그의 염을 갖는 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00598

    Figure pct00599

    여기서,
    각 q는 독립적으로 1 내지 26이고;
    각 m은 독립적으로 1 내지 4이고;
    각 n은 독립적으로 1 내지 4이고;
    각 *는 아미노산 유닛(AA)의 서브유닛, 링커 서브유닛 L2 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  53. 제50항에 있어서, Y는 R76인, 링커 중간체 또는 링커.
  54. 제50항에 있어서, Y는 인, 링커 중간체 또는 링커.
  55. 제50항에 있어서, Ra 및 Rb 각각은 독립적으로 H인, 링커 중간체 또는 링커.
  56. 제50항에 있어서, Ra 및 Rb는 이들이 부착된 탄소와 함께 결합하여 옥소기를 형성하는 것인, 링커 중간체 또는 링커.
  57. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, q는 10 내지 20인, 링커 중간체 또는 링커.
  58. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, q는 12인, 링커 중간체 또는 링커.
  59. 제1항 내지 제4항, 제38항 내지 제40항, 또는 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 유닛은 하기 화학식, 또는 그의 염으로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00601

    Figure pct00602

    Figure pct00603

    Figure pct00604

    Figure pct00605

    Figure pct00606

    Figure pct00607

    Figure pct00608

    Figure pct00609

    Figure pct00610

    Figure pct00611

    여기서, 각 Z는 *에 부착되고, 개별적으로 하기로부터 선택된다:
    Figure pct00612

    여기서, 각 는 아미노산 유닛(AA)의 다른 서브유닛, 링커 서브유닛 L2, 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  60. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 카르복실 유닛은 하기 화학식, 또는 그의 염을 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00614

    여기서,
    (a)
    L70은 C1-C8 알킬렌, C1-C8 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C8 알킬렌-, 및 -C(O)-C1-C8 알킬렌-C(O)-로부터 선택되고;
    R70은 ~NR71(R72-R73)이고, 여기서 R71은 H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, 또는 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐)로부터 선택되고; R72는 존재하지 않거나, 또는 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌, 선택적으로 치환된 에테르, 선택적으로 치환된 티오에테르, 선택적으로 치환된 케톤, 선택적으로 치환된 아미드, 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐), 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고; R73은 카르복실 또는 폴리카르복실이고; 여기서 폴리카르복실은 1 내지 10개, 또는 1 내지 6개, 또는 1 내지 4개의 카르복실기를 포함하고, 여기서 카르복실기는 알킬, 알킬렌, 치환된 알킬, 치환된 알킬렌, 헤테로알킬, 헤테로알킬렌, 아미노 및/또는 아미드에 의해 상호 연결되고;
    각각의 물결선(~)은 아미노산 유닛(AA)의 다른 서브유닛, 링커 서브유닛 L2, 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타내고,
    p1 및 o1 각각은 0 내지 2로부터 독립적으로 선택됨;
    또는
    (b)
    L70은 C1-C8 알킬렌, C1-C8 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C8 알킬렌-, 및 -C(O)-C1-C8 알킬렌-C(O)-로부터 선택되고;
    R70은 ~NR71(R75-(R73)2)이고, 여기서 R71은 H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, 또는 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐)로부터 선택되고, R75는 분지화된, 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌, 선택적으로 치환된 에테르, 선택적으로 치환된 티오에테르, 선택적으로 치환된 케톤, 선택적으로 치환된 아미드, 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐), 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고, 각각의 R73은 독립적으로 카르복실 또는 폴리카르복실이고, 여기서 폴리카르복실은 1 내지 10개, 또는 1 내지 6개, 또는 1 내지 4개의 카르복실기를 포함하고, 여기서 상기 카르복실기는 알킬, 알킬렌, 치환된 알킬, 치환된 알킬렌, 헤테로알킬, 헤테로알킬렌, 아미노 및/또는 아미드에 의해 상호 연결되고;
    각 물결선(~)은 아미노산 유닛(AA)의 또 다른 서브유닛, 링커 서브유닛 L2, 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타내고;
    p1과 o1은 각각 독립적으로 0 내지 2로부터 선택됨;
    또는
    (c)
    L70은 C1-C8 알킬렌, C1-C8 알킬렌-C(O)-, -C(O)-C1-C8 알킬렌-, 및 -C(O)-C1-C8 알킬렌-C(O)-로부터 선택되고;
    R70은 ~N(R74-R73)(R72-R73)이고, 여기서 R72 및 R74는 각각 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌, 선택적으로 치환된 에테르, 선택적으로 치환된 티오에테르, 선택적으로 치환된 케톤, 선택적으로 치환된 아미드, 폴리에틸렌 글리콜(선택적으로 1 내지 12개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 가짐), 선택적으로 치환된 카르보사이클, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴로부터 선택되고, 각각의 R73은 독립적으로 카르복실 또는 폴리카르복실이고, 여기서 1 내지 10개, 또는 1 내지 6개, 또는 1 내지 4개의 카르복실기를 포함하고, 여기서 상기 카르복실기는 알킬, 알킬렌, 치환된 알킬, 치환된 알킬렌, 헤테로알킬, 헤테로알킬렌, 아미노 및/또는 아미드에 의해 상호 연결되고;
    각 물결선(~)은 아미노산 유닛(AA)의 또 다른 서브유닛, 링커 서브유닛 L2, 또는 스트레처 유닛(L1)에 대한 부착 부위를 나타내고;
    p1과 o1은 각각 독립적으로 0 내지 2로부터 선택됨.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 당 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커.
  62. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커.
  63. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 카르복실 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커.
  64. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 극성 유닛을 포함하며, 각각의 극성 유닛은 당 유닛, PEG 유닛 및 카르복실 유닛으로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커.
  65. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 당 유닛, 및 PEG 유닛 또는 카르복실 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커.
  66. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 카르복실 유닛, 및 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커.
  67. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 유닛(AA)이 존재하는(s=1), 링커 중간체 또는 링커.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 유닛은 적어도 하나의 극성 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, L2 또는 AA-L2는 하기 구조들 중 하나를 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00615

    여기서, 아미노기의 물결선은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내며, 약물 유닛은 벤질 알코올에 부착된다.
  70. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, ~AA-L2~는 하기로부터 선택되는 화학식을 갖는, 링커 중간체 또는 링커:

    Figure pct00617

    여기서, 대괄호는 아미노산 유닛을 나타내고, 각 aa는 AA의 선택적 서브유닛이고, L2는 링커 서브유닛이고, 각 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내며; aa1(PEG)는 AA의 아미노산 서브유닛에 부착된 PEG 유닛이고, SU는 AA의 서브유닛 또는 L2에 부착된 당 유닛이고, CU는 AA의 서브유닛 또는 L2에 부착된 카르복실 유닛이고; 이중 물결() 선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고, 여기서 aa 및 aa1은 독립적으로 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된다.
  71. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, ~AA-L2~는 하기로부터 선택되는 화학식을 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00619

    여기서, 대괄호는 아미노산 유닛을 나타내고, 각 aa는 AA의 아미노산 서브유닛이고, L2는 aa의 측쇄에 부착된 링커 서브유닛이고, 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내며; aa1(PEG)는 aa에 부착된 PEG 유닛이고, SU는 aa에 부착된 당 유닛이고, CU는 aa에 부착된 카르복실 유닛이고; 이중 물결() 선은 약물 유닛의 부착 부위를 나타내고; 여기서 aa 및 aa1은 독립적으로 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된다.
  72. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 유닛은 적어도 두 개의 극성 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커.
  73. 제72항에 있어서, ~AA-L2~는 하기로부터 선택되는 화학식을 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00621

    여기서, 대괄호는 아미노산 유닛을 나타내고, aa는 AA의 선택적 서브유닛이고, L2는 링커 서브유닛이고, 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내며; aa1(PEG) 및 aa2(PEG) 각각은 aa 또는 다른 PEG 유닛에 부착된 PEG 유닛이고; SU 각각은 aa 또는 다른 당 유닛에 부착된 당 유닛이고, CU 각각은 aa 또는 다른 카르복실 유닛에 부착된 카르복실 유닛이고, 이중 물결() 선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고; 여기서 aa, aa1 및 aa2는 독립적으로 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된다.
  74. 제72항에 있어서, ~AA-L2~는 하기로부터 선택되는 화학식을 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00623

    여기서, 대괄호는 아미노산 유닛을 나타내고, aa는 AA의 아미노산 서브유닛이고, L2는 aa의 측쇄에 부착된 링커 서브유닛이고, 각 물결선(~)은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내며; aa1(PEG) 및 aa2(PEG) 각각은 aa에 부착된 PEG 유닛이고; SU 각각은 aa에 부착된 당 유닛이고, CU 각각은 aa에 부착된 카르복실 유닛이고; 이중 물결() 선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타내고; 여기서 aa, aa1 및 aa2는 독립적으로 알파, 베타 및 감마 아미노산 및 그의 유도체로부터 선택된다.
  75. 제1항 및 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 서브유닛 L2는 절단 가능한 링커 유닛인, 링커 중간체 또는 링커.
  76. 제75항에 있어서, 링커 서브유닛 L2는 세포내 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩타이드를 포함하는, 링커 중간체 또는 링커.
  77. 제76항에 있어서, 절단 가능한 펩타이드는 발린-시트룰린 펩타이드, 발린-알라닌 펩타이드, 발린-리신 펩타이드, 페닐알라닌-리신 펩타이드, 또는 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신 펩타이드를 포함하는, 링커 중간체 또는 링커.
  78. 제1항 및 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 서브유닛 L2는 적어도 하나의 극성 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커.
  79. 제1항 및 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 극성 유닛은 당 유닛(SU)인, 링커 중간체 또는 링커.
  80. 제79항에 있어서, 절단 가능한 펩타이드는 SU-발린-시트룰린 펩타이드, SU-발린-리신 펩타이드, SU-발린-알라닌 펩타이드, SU-페닐알라닌-리신 펩타이드, 또는 SU-글리신-글리신-페닐알라닌-글리신 펩타이드를 포함하는, 링커 중간체 또는 링커.
  81. 제78항에 있어서, 극성 유닛은 카르복실 유닛(CU)인, 링커 중간체 또는 링커.
  82. 제81항에 있어서, 절단 가능한 펩타이드는 CU-발린-시트룰린 펩타이드, CU-발린-리신 펩타이드, 발린-(CU-리신) 펩타이드, CU-발린-알라닌 펩타이드, CU-페닐알라닌-리신 펩타이드, 페닐알라닌-(CU-리신) 펩타이드 또는 CU-글리신-글리신-페닐알라닌-글리신 펩타이드를 포함하고, 여기서, CU-리신은 리신 잔기를 포함하는 카르복실 유닛인, 링커 중간체 또는 링커.
  83. 제78항에 있어서, 극성 유닛은 PEG 유닛(PEG)인, 링커 중간체 또는 링커.
  84. 제83항에 있어서, 절단 가능한 펩타이드는 Lys(PEG)-발린-시트룰린 펩타이드, 발린-Cit(PEG) 펩타이드, Lys(PEG)-발린-리신 펩타이드, 발린-리신(PEG) 펩타이드, Lys(PEG)-발린-알라닌 펩타이드, Lys(PEG)-페닐알라닌-리신 펩타이드, 페닐알라닌-Lys(PEG) 펩타이드 또는 Lys(PEG)-글리신-글리신-페닐알라닌-글리신 펩타이드를 포함하며, 여기서 Lys(PEG) 및 Cit(PEG)는 각각 리신 잔기 또는 시트룰린 잔기에 부착된 PEG 유닛을 포함하는, 링커 중간체 또는 링커.
  85. 제75항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 가능한 펩타이드는 파라-아미노벤질 알코올 자가 희생기(para-aminobenzyl alcohol self immolative group, PABA)에 부착되는, 링커 중간체 또는 링커.
  86. 제85항에 있어서, ~AA-L2는 하기 구조 중 하나를 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00626


    Figure pct00628

    여기서, 아미노기 상의 물결선은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내며, 약물 유닛은 벤질 알코올에 부착된다.
  87. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, ~AA-L2~는 하기 구조 중 하나를 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00629

    Figure pct00630

    Figure pct00631

    Figure pct00632

    Figure pct00633

    Figure pct00634

    Figure pct00635

    Figure pct00636

    Figure pct00637

    Figure pct00638

    Figure pct00639

    Figure pct00640

    Figure pct00641

    Figure pct00642

    Figure pct00643

    Figure pct00644

    Figure pct00645

    여기서, 각 Z는 *에 부착되고, 개별적으로 하기로부터 선택된다:
    Figure pct00646

    여기서, 아미노기 상의 물결선은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내며, 약물 유닛은 벤질 알코올에 부착된다 (즉, 벤질 알코올의 H가 약물 유닛에 대한 결합으로 치환된다).
  88. 제75항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, L2는 AA의 서브유닛 측쇄에 부착되는, 링커 중간체 또는 링커.
  89. 제88항에 있어서, ~AA-L2는 하기 구조 중 하나를 갖는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00648

    Figure pct00649

    여기서, 아미노기 상의 물결선은 스트레처 유닛에 대한 부착 부위를 나타내며, 약물 유닛은 말단 산기인 벤질 알코올에 부착되거나, 또는 물결() 선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  90. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 유닛은 비-펩타이드 연결기에 의해 링커 서브유닛 L2에 연결되는, 링커 중간체 또는 링커.
  91. 제90항에 있어서, 비-펩타이드 연결기는 C1-C10 알킬렌, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커.
  92. 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 스트레처 유닛을 추가로 포함하는, 링커 중간체.
  93. 제92항에 있어서, 스트레처 유닛은 하기로부터 선택되는, 링커:
    Figure pct00651

    Figure pct00652

    Figure pct00653

    여기서, R17은 -C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 헤테로알킬렌-, -C3-C8 카르보사이클로-, -O-(C1-C8 알킬렌)-, -(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌- (여기서 b는 1 내지 26임), -아릴렌-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보사이클로)-, -(C3-C8 카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-, -C3-C8 헤테로사이클로-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로사이클로)-, -(C3-C8 헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-C(=O)-, C1-C10 헤테로알킬렌-C(=O)-, -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C3-C8 카르보사이클로-C(=O)-, -O-(C1-C8 알킬)-C(=O)-, -아릴렌-C(=O)-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-C(=O)-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-C(=O)-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보사이클로)-C(=O)-, -(C3-C8 카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-C(=O)-, -C3-C8 헤테로사이클로-C(=O)-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로사이클로)-C(=O)-, -(C3-C8 헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-C(=O)-, -C1-C10 알킬렌-NH-, -C1-C10 헤테로알킬렌-NH-, -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(C(=O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-(C(=O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-C(=O)- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-NH-(C(=O))-(CH2-O-CH2)b-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -C1-C8 알킬렌-NH-(C(=O))-(CH2-O-CH2)b-C1-C8 알킬렌-NH- (여기서 b는 1 내지 26임), -C3-C8 카르보사이클로-NH-, -O-(C1-C8 알킬)-NH-, -아릴렌-NH-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-NH-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-NH-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보사이클로)-NH-, -(C3-C8 카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-NH-, -C3-C8 헤테로사이클로-NH-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로사이클로)-NH-, -(C3-C8 헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-NH-, -C1-C10 알킬렌-S-, C1-C10 헤테로알킬렌-S-, -C3-C8 카르보사이클로-S-, -O-(C1-C8 알킬)-S-, -아릴렌-S-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-S-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-S-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보사이클로)-S-, -(C3-C8 카르보사이클로)-C1-C10 알킬렌-S-, -C3-C8 헤테로사이클로-S-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로사이클로)-S-, 또는 -(C3-C8 헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-S-이거나; 또는
    여기서 스트레처 유닛은 말레이미도(C1-C10알킬렌-C(O)-, 말레이미도(CH2OCH2)p2(C1-C10알킨)C(O)-, 말레이미도(C1-C10알킨)(CH2OCH2)p2C(O)-, 또는 그의 개환 형태를 포함하고, 여기서 p2는 1 내지 26이다.
  94. 제92항에 있어서, 스트레처 유닛은 하기로부터 선택되는, 링커 중간체 또는 링커:
    Figure pct00654

    여기서, 물결 선 은 스트레처 유닛의 아미노산 유닛에 대한 부착 부위를 나타내며, 표적화 유닛의 부착 부위는 말레이미드, 일차 아민 또는 알킨 작용기 상에 있다.
  95. 제93항에 있어서, 하기 구조들 중 하나를 갖는, 링커:
    Figure pct00656

    Figure pct00657

    Figure pct00658

    Figure pct00659

    Figure pct00660

    여기서, 약물 유닛은 말단 산 기인 벤질 알코올에 부착되거나, 또는 여기서 물결() 선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  96. 제92항에 있어서, 하기 구조들 중 하나를 갖는, 링커:
    Figure pct00662

    Figure pct00663


    Figure pct00665

    Figure pct00666

    Figure pct00667

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    Figure pct00669

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    Figure pct00677

    Figure pct00678

    Figure pct00679

    Figure pct00680

    여기서, 각 Z는 *에 부착되고, 개별적으로 하기로부터 선택된다:
    Figure pct00681

    여기서, 약물 유닛은 선택적으로 말단 산 기인 벤질 알코올에 부착되거나, 또는 여기서 물결() 선은 약물 유닛에 대한 부착 부위를 나타낸다.
  97. 제1항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 서브유닛 L2에 부착되어 약물-링커를 형성하는 적어도 하나의 약물 유닛을 추가로 포함하는, 링커.
  98. 제97항에 있어서, 약물 유닛은 세포독성제, 면역 조절제, 핵산, 성장 억제제, PROTAC, 독소, 방사성 동위원소 및 킬레이트 리간드로부터 선택되는, 약물-링커.
  99. 제98항에 있어서, 약물 유닛은 세포독성제인, 약물-링커.
  100. 제99항에 있어서, 세포독성제는 아우리스타틴(auristatin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 캄프토테신(camptothecin), 듀오카르마이신(duocarmycin) 및 칼리케아미신(calicheamicin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약물-링커.
  101. 제100항에 있어서, 세포독성제는 아우리스타틴인, 약물-링커.
  102. 제101항에 있어서, 세포독성제는 MMAE 또는 MMAF인, 약물-링커.
  103. 제100항에 있어서, 세포독성제가 캄프토테신인, 약물-링커.
  104. 제103항에 있어서, 세포독성제가 엑사테칸(exatecan) 또는 SN-38인, 약물-링커.
  105. 제104항에 있어서, 세포독성제가 엑사테칸(exatecan)인, 약물-링커.
  106. 제99항에 있어서, 세포독성제가 칼리케아미신인, 약물-링커.
  107. 제99항에 있어서, 세포독성제가 메이탄시노이드인, 약물-링커.
  108. 제107항에 있어서, 메이탄시노이드는 메이탄신(maytansine), 메이탄시놀(maytansinol) 또는 안사마토신-2(ansamatocin-2)인, 약물-링커.
  109. 제98항에 있어서, 약물 유닛은 면역 조절제인, 약물-링커.
  110. 제109항에 있어서, 상기 면역 조절제는 TRL7 작용제, TLR8 작용제, STING 작용제 또는 RIG-I 작용제로부터 선택되는, 약물-링커.
  111. 제110항에 있어서, 면역 조절제는 TLR7 작용제인, 약물-링커.
  112. 제111항에 있어서, TLR7 작용제는 이미다조퀴놀린, 이미다조퀴놀린 아민, 티아조퀴놀린, 아미노퀴놀린, 아미노퀴나졸린, 피리도[3,2-d]피리미딘-2,4-디아민, 피리미딘-2,4-디아민, 2-아미노이미다졸, 1-알킬-1H-벤즈이미다졸-2-아민, 테트라하이드로피리도피리미딘, 헤테로아로티아디아지드-2,2-디옥사이드, 벤조나프티리딘, 구아노신 유사체, 아데노신 유사체, 티미딘 동종중합체, ssRNA, CpG-A, PolyG10 또는 PolyG3인, 약물-링커.
  113. 제110항에 있어서, 면역 조절제는 TLR8 작용제인, 약물-링커.
  114. 제113에 있어서, TLR8 작용제는 이미다조퀴놀린, 티아졸로퀴놀린, 아미노퀴놀린, 아미노퀴나졸린, 피리도[3,2-d]피리미딘-2,4-디아민, 피리미딘-2,4-디아민, 2-아미노이미다졸, 1-알킬-1H-벤즈이미다졸-2-아민, 테트라하이드로피리도피리미딘 또는 ssRNA로부터 선택되는, 약물-링커.
  115. 제110항에 있어서, 면역 조절제가 STING 작용제인, 약물-링커.
  116. 제110항에 있어서, 면역 조절제가 RIG-I 작용제인, 약물-링커.
  117. 제116항에 있어서, RIG-I 작용제는 KIN1148, SB-9200, KIN700, KIN600, KIN500, KIN100, KIN101, KIN400 및 KIN2000으로부터 선택되는, 약물-링커.
  118. 제98항에 있어서, 약물 유닛은 킬레이트화 리간드인, 약물-링커.
  119. 제118항에 있어서, 킬레이트화 리간드는 백금(Pt), 루테늄(Ru), 로듐(Rh), 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 몰리브덴(Mo), 티타늄(Ti), 또는 이리듐(Ir); 이트륨-88, 이트륨-90, 테크네튬-99, 구리-67, 레늄-188, 레늄-186, 갈륨-66, 갈륨-67, 인듐-111, 인듐-114, 인듐-115, 루테튬-177, 스트론튬-89, 사라륨-153, 및 납-212와 같은 방사성 동위원소로부터 선택되는, 약물-링커.
  120. 제97항에 있어서, 하기 구조를 갖는, 약물-링커:
    Figure pct00683

    Figure pct00684

    Figure pct00685

    Figure pct00686

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    Figure pct00707


    Figure pct00708

    Figure pct00709

    여기서, 각 Z는 *에 부착되고, 개별적으로 하기로부터 선택된다:
    Figure pct00710

    여기서, 각 Z는 *에 부착되고, 개별적으로 하기로부터 선택된다:
    Figure pct00711

  121. 제97항 내지 제120항 중의 어느 한 항의 약물-링커에 부착된 표적화 유닛을 포함하는, 접합체.
  122. 제121항에 있어서, 표적화 유닛은 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로부터 선택되는, 접합체.
  123. 제122항에 있어서, 표적화 유닛은 단일클론 항체, Fab, Fab', F(ab'), Fv, 디설파이드 연결된 Fc, scFv, 단일 도메인 항체, 디아바디, 이중특이적 항체, 또는 다중특이적 항체인, 접합체.
  124. 제121항에 있어서, 표적화 유닛은 디아바디, DART, 안티칼린, 아피바디, 아비머, DARPin 또는 애드넥틴인, 접합체.
  125. 제121항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 유닛은 단일특이적인, 접합체.
  126. 제121항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 유닛은 2가인, 접합체.
  127. 제121항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 유닛은 이중특이적인, 접합체.
  128. 제121항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체의 평균 약물 로딩(p로드)은 약 1 내지 약 8, 약 2, 약 4, 약 6, 약 8, 약 10, 약 12, 약 14, 약 16, 약 3 내지 약 5, 약 6 내지 약 8, 또는 약 8 내지 약 16인, 접합체.
  129. 제121항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로부터 선택되는, 접합체:
    Figure pct00712

    Figure pct00713

    Figure pct00714

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    Figure pct00739

    여기서, 각 Z는 *에 부착되고, 개별적으로 하기로부터 선택된다:
    Figure pct00740

    여기서, 각 Z는 *에 부착되고, 개별적으로 하기로부터 선택된다:
    Figure pct00741

    여기서, Ab는 표적화 유닛이고 n은 p로드이다.
  130. 제121항, 제128항 또는 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 유닛은 표적 분자에 결합하는, 접합체.
  131. 제130항에 있어서, 표적 분자는 CD19, CD20, CD30, CD33, CD70, LIV-1 또는 EGFRv3인, 접합체.
  132. 제121항, 제128항 또는 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 유닛은 scFv1-ScFv2, ScFv12-Fc-scFv22, IgG-scFv, DVD-Ig, 트리오맙/쿼드로마, 2-인-1 IgG, scFv2-Fc, TandAb, 및 scFv-HSA-scFv로부터 선택되는, 접합체.
  133. 제121항, 제128항 또는 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 유닛은 암 관련 항원인, 접합체.
  134. 제121항, 제128항 또는 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 유닛은 CD19, CD20, CD30, CD33, CD38, CA125, MUC-1, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), CD44 표면 부착 분자, 메조텔린(MLSN), 암배아 항원(CEA), 표피 성장 인자 수용체(EGFR), EGFRvIII, 혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VEGFR2), 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), MAGE-A1, IL-13R-a2, GD2, 1p19q, ABL1, AKT1, ALK, APC, AR, ATM, BRAF, BRCA1, BRCA2, cKIT, cMET, CSF1R, CTNNB1, FGFR1, FGFR2, FLT3, GNA11, GNAQ, GNAS, HRAS, IDH1, IDH2, JAK2, KDR (VEGFR2), KRAS, MGMT, MGMT-Me, MLH1, MPL, NOTCH1, NRAS, PDGFRA, Pgp, PIK3CA, PR, PTEN, RET, RRM1, SMO, SPARC, TLE3, TOP2A, TOPO1, TP53, TS, TUBB3, VHL, CDH1, ERBB4, FBXW7, HNF1A, JAK3, NPM1, PTPN11, RB1, SMAD4, SMARCB1, STK1, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, ROS1, ERCC1, 5T4 (TPBG), B7-H3, CCR7, CD105, CD22, CD46, CD47, CD56, CD70, CD71, CD79b, CDH6, CLDN6, CLDN18.2, CLEC12A, DLL3, DR5, ERBB3 (HER3), EPCAM, FOLR1, IGF1R, IL2RA (CD25), IL3RA, ITGB6, LIV-1, LRRC15, 메조텔린(MSLN), NaPi2b(SLC34A2), 넥틴-4, PTK7, ROR1, SEZ6, SLC44A4, SLITRK6, 조직 인자(TF), TROP2 또는 B7-H4인, 접합체.
  135. 제121항, 제128항 또는 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 유닛은 리툭시맙(Rituxan®), 트라스투주맙(Herceptin®), 페르투주맙(Perjeta®), 베바시주맙(Avastin®), 라니비주맙(Lucentis®), 세툭시맙(Erbitux®), 알렘투주맙(Campath®), 파니투무맙(Vectibix®), 이브리투모맙 티욱세탄(Zevalin®), 토시투모맙(Bexxar®), 이필리무맙, 잘루투무맙, 달로투주맙, 피기투무맙, 라무시루맙, 갈릭시맙, 팔레투주맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙(Arzerra®), 토시투무맙, 이브리투모맙, CD20 항체 2F2(HuMax-CD20), 7D8, IgM2C6, IgG1 2C6, 11B8, B1, 2H7, LT20, 1FS 또는 AT80, 다클리주맙(Zenapax®); 또는 클론 A9E4, F1G4, AT2G7, GNRH03 또는 GNRHR2를 포함하는 항-LHRH 수용체 항체를 포함하는 항체 또는 이의 단편인, 접합체.
  136. 제121항에 있어서, 표적화 유닛은 항체 F131이고 약물-링커는 LD038인, 접합체.
  137. 제121항, 제128항 또는 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 유닛은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는 항체이고, VH 영역은 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역에 배치된 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, VL 영역은 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역에 배치된 LCDR1, LCDR 및 LCDR3을 포함하고, VH 및 VL CDR은 하기로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열 세트로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 접합체:
    (a) 각각, 서열 번호:30, 서열 번호:31, 서열 번호:32, 서열 번호:33, 서열 번호:34 및 서열 번호:35; 및
    (b) 각각, 서열 번호:36, 서열 번호:31, 서열 번호:37, 서열 번호:38, 서열 번호:39 및 서열 번호:40.
  138. 제137항에 있어서, VH 및 VL 영역은 각각 서열 번호:26 및 서열 번호:27로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열 쌍으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고;
    여기서 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역은 프레임워크 영역에서 1 내지 8개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 선택적으로 변형된 것인, 접합체.
  139. 제137항에 있어서, 항체는 F131이고 약물-링커는 LD038인, 접합체.
  140. 약물-링커에 부책된 표적화 유닛을 포함하는 접합체로서, 여기서 상기 표적화 유닛은 항체 F131이고 약물-링커는 LD038인, 접합체.
  141. 제121항 내지 제140항 중 어느 한 항의 접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  142. 제121항 내지 제140항 중 어느 한 항의 접합체 또는 제141항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 여기서 대상체는 암 또는 자가면역 질환을 앓고 있고, 상기 접합체는 암 또는 자가면역 질환과 관련된 표적 항원에 결합하는, 방법.
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