JP7191087B2 - 血清中半減期の増強のための操作された抗体fcバリアント - Google Patents
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Description
ヒト血清タンパク質の中で、アルブミンおよび免疫グロブリンG(IgG)は、ヒトにおける他の血清タンパク質よりも長い血清中半減期(約3週間)を有する。新生児Fc受容体(FcRn)は、リサイクリングおよびトランスサイトーシスプロセス等の多数の重要な生物学的機能を果たし、それにより、ヒトにおけるIgGの異常に長い約21日間の血清中持続を導くことが公知である(Challa et al., 2014)。かかるIgGの細胞間輸送によりその恒常性が調節され得、その結果、IgG細胞内分解が防止されることによってクリアランスの低減およびin vivo半減期の増大がもたらされる(Oberet al., 2004; Ward et al., 2015)。ほとんど全ての細胞型において、FcRnは、主に初期およびリサイクリングエンドソーム等の細胞内小胞ならびに選別細管(sorting tubule)に局在しており、FcRnの発現レベルは細胞表面上に限定される(Oberet al., 2004)。さらに、IgG-FcRn相互作用は酸性pHでは最適であるが、中性pHでは失われる。したがって、一般に認められているFcRn媒介性IgGリサイクリングモデルは、血液中でIgGの高い血清中レベルが維持されるように、IgGが非特異的ピノサイトーシスによって内部移行し、酸性エンドソーム(約pH6.0)においてIgGがFcRnに結合し、回収されて細胞表面(生理的pH7.4)に戻るというものである(Ghetieet al., 1996; Ghetie and Ward, 2000; Israel et al., 1996; Kim et al., 1999;Martin et al., 2001; Roopenian and Akilesh, 2007; Roopenian et al., 2003)。しかし、細胞表面においてFcRnから解離しないIgGは、輸送からリソソームに回収されるかまたは受容体ターンオーバーの間に異化されるので、リソソーム分解されることになる(Ganet al., 2009)。
FcRnへのFc結合の生理的重要性および治療抗体を用いたFcRnへのFc結合の重要性に起因して、FcRnへのpH依存性結合の増強によって血清中半減期が増大した新しいFcドメインの明白な必要性がある。
本発明の他の目的、特色および利点は、次の詳細な説明から明らかである。しかし、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正が、この詳細な説明から当業者に明らかであり得るため、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、単なる例示として提示されていることを理解されたい。
以下の図は本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図の1つまたは複数を本明細書で提示されている特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、よりよく理解することができる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
酸性pHにおいてヒトFcRnに結合することができる変異体またはバリアントヒトIgG Fcドメインを含むポリペプチドであって、前記Fcドメインが、
(i)309位におけるアスパラギン酸(L/V309D);
(ii)311位におけるヒスチジン(Q311H);および
(iii)434位における置換変異(N434)
の置換変異を有する、ポリペプチド。
(項目2)
前記434位における置換変異が、セリン(N434S)またはチロシン(N434Y)である、項目1に記載のポリペプチド。
(項目3)
前記434位における置換変異が、セリン(N434S)である、項目2に記載のポリペプチド。
(項目4)
前記434位における置換変異が、チロシン(N434Y)である、項目2に記載のポリペプチド。
(項目5)
前記Fcドメインが、グリコシル化されている、項目1~4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目6)
前記Fcドメインが、野生型と比較して実質的に等しい、基本的に同じ、ほぼ同じ、または同じであるFcγRへの結合を有する、項目5に記載のポリペプチド。
(項目7)
前記Fcドメインが、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIのうちの1つ、2つ、または全てに対して野生型と比較して実質的に等しい、基本的に同じである、ほぼ同じである、同じである、または等しい結合能を有する、項目5に記載のポリペプチド。
(項目8)
前記Fcドメインが、FcRnに酸性pHにおいて野生型よりも高い親和性で結合する、項目1~7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目9)
前記Fcドメインが、中性pHではFcRnに検出可能もしくは選択的には結合しない、またはFcRnへの結合を示さないもしくは基本的に示さない、項目8に記載のポリペプチド。
(項目10)
前記Fcドメインが、FcRnに対して、野生型と比較して、(i)pH5.8では結合の増強を示し、かつ(ii)pH7.4では結合の低減を示すまたは検出可能な結合を示さない、項目9に記載のポリペプチド。
(項目11)
前記Fcドメインが、非グリコシル化されている、項目1~4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目12)
前記Fcドメインが、264位におけるグルタミン酸の置換変異(V264E)を有する、項目11に記載のポリペプチド。
(項目13)
前記IgGが、IgG1である、項目1~12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目14)
前記IgGが、IgG2である、項目1~12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目15)
前記IgGが、IgG3である、項目1~12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目16)
前記IgGが、IgG4である、項目1~12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目17)
前記Fcドメインが、以下:
EDHS(配列番号5;V264E;L309D;Q311H;N434S)、
EDHY(配列番号6;V264E;L309D;Q311H;N434Y)、
DHS(配列番号7;L309D;Q311H;N434S)、
DHY(配列番号8;L309D;Q311H;N434Y)、
IgG2-DHS(配列番号9;V309D;Q311H;N434S)、
IgG3-DHS(配列番号10;L309D;Q311H;N434S)、または
IgG4-DHS(配列番号11;L309D;Q311H;N434S)
を含む、またはそれからなる、項目1~12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目18)
前記Fcドメインが、DHS(配列番号7;L309D;Q311H;N434S)またはDHY(配列番号8;L309D;Q311H;N434Y)を含む、またはそれからなる、項目17に記載のポリペプチド。
(項目19)
前記Fcドメインが、FcRnに約550nM未満のK D 値で結合する、項目1~18のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目20)
前記Fcドメインが、FcRnに約250nM未満のK D 値で結合する、項目19に記載のポリペプチド。
(項目21)
前記Fcドメインが、FcRnに約125nM未満のK D 値で結合する、項目19に記載のポリペプチド。
(項目22)
非Fc受容体(非FcR)結合ドメインをさらに含む、項目1~21のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目23)
前記非FcR結合ドメインが、Ig可変ドメインである、項目22に記載のポリペプチド。
(項目24)
全長抗体である、項目23に記載のポリペプチド。
(項目25)
前記抗体が、アゴニスト抗体である、項目24に記載のポリペプチド。
(項目26)
前記抗体が、アンタゴニスト抗体である、項目24に記載のポリペプチド。
(項目27)
前記抗体が、Her2/neu、CD20、CD40、IL-10、4-1BB、PD-1、PD-L1、CTLA-4OX40、IL-1、IL-6、IL6R、TNFα、RANKL、EGFR、c-Met、CD11a、VEGF-A、VEGFR1、VEGFR2、C5、またはインテグリン-α4に選択的に結合する、項目24に記載のポリペプチド。
(項目28)
前記抗体が、毒素に化学的にコンジュゲートしているまたは共有結合している、項目1~27のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目29)
前記非FcR結合領域が、抗体の抗原結合部位ではない、項目22に記載のポリペプチド。
(項目30)
前記非FcR結合領域が、細胞表面タンパク質に結合する、項目22に記載のポリペプチド。
(項目31)
前記非FcR結合領域が、可溶性タンパク質に結合する、項目22に記載のポリペプチド。
(項目32)
項目1~31に記載のポリペプチドのいずれかをコードする核酸。
(項目33)
DNAセグメントである、項目32に記載の核酸。
(項目34)
発現ベクターである、項目32に記載の核酸。
(項目35)
項目32~34のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞。
(項目36)
前記核酸を発現する、項目35に記載の宿主細胞。
(項目37)
ポリペプチドを調製するための方法であって、
a)項目36に記載の宿主細胞を得るステップと、
b)非グリコシル化ポリペプチドの発現を促進するための条件下で、培養において前記宿主細胞をインキュベートするステップと、
c)前記宿主細胞から、発現された前記ポリペプチドを精製するステップと
を含む、方法。
(項目38)
前記宿主細胞が原核細胞または哺乳動物細胞である、項目37に記載の方法。
(項目39)
薬学的に許容される担体中に、項目1~31のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは項目32~34のいずれか一項に記載の核酸を含む医薬品製剤。
(項目40)
対象に抗体を与えるステップを含む、対象においてタンパク質を結合させる方法であって、前記抗体が、前記タンパク質に結合し、かつ項目1~31のいずれか一項に記載のFcドメインを含む、方法。
(項目41)
前記抗体が、ヒトFcRnに約500nM未満のK D で特異的に結合することができる、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記抗体が、ヒトFcRnに約250nM未満のK D で特異的に結合することができる、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記抗体が、ヒトFcRnに約125nM未満のK D で特異的に結合することができる、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記抗体が、グリコシル化されており、かつ前記Fcドメインが、野生型と比較してほぼ同等または同等のFcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIへの結合を有する、項目40~43のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
前記抗体が、グリコシル化治療抗体である、項目40~44のいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
前記抗体が、非グリコシル化バージョンの治療抗体である、項目40~44のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
疾患を有する対象を処置する方法であって、有効量の項目39に記載の製剤を前記対象に投与するステップを含む、方法。
(項目48)
抗体依存性細胞傷害を誘導する、項目47に記載の方法。
(項目49)
前記疾患が、がん、感染、または自己免疫疾患である、項目47に記載の方法。
(項目50)
前記対象が、ヒト患者である、項目47に記載の方法。
(項目51)
前記製剤が、腫瘍内に、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、眼内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、結膜下、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、経口によって、吸入によって、注射によって、注入によって、持続注入によって、標的細胞を直接浸す局在化灌流によって、カテーテルにより、または洗浄により投与される、項目47に記載の方法。
(項目52)
前記疾患ががんであり、少なくとも第2の抗がん療法を前記対象に投与するステップをさらに含む、項目47~51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記第2の抗がん療法が、外科療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、免疫療法またはサイトカイン療法である、項目52に記載の方法。
(項目54)
疾患の処置における使用のための、項目1~31のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目55)
前記疾患が、がん、感染、または自己免疫疾患である、項目54に記載のポリペプチド。
(項目56)
前記疾患が、細菌感染またはウイルス感染である、項目54に記載のポリペプチド。
(項目57)
がん、感染、細菌感染、ウイルス感染、または自己免疫疾患等の疾患の処置のための医薬の調製における、項目1~31のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
(項目58)
項目1~31のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的に許容される組成物。
(項目59)
疾患の処置を必要とする対象において疾患を処置する方法における使用のための組成物であって、項目1~31のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物。
(項目60)
前記疾患が、がん、感染、細菌感染、ウイルス感染、または自己免疫疾患である、項目59に記載の組成物。
新生児Fc受容体(FcRn)は、哺乳動物における血清IgGレベルの調節において中心的な役割を果たすことが周知である(Ghetie, V., and Ward, E. S. 2000)。Fc結合FcRnは、β2-ミクログロブリン(β2m)および主要組織適合性遺伝子複合体クラスI(MHCクラスI)分子の鎖に関連する膜繋留鎖を含むヘテロ二量体である。IgG-FcRn相互作用は、わずかに酸性pHにおける強力なものから中性および塩基性pHにおける弱いものまで変動する顕著なpH依存性を示す(Rodewald,R. 1976 and Raghavan, M. et al., 1995)。一般に認められているFcRn媒介性IgGリサイクリング機構は、以下の手順である1)ピノサイトーシスによるIgGの内部移行、2)エンドソームの酸性化(初期エンドソーム:約pH6.0、後期エンドソーム:約pH4.5)およびIgGとFcRnの相互作用、3)IgGのエキソサイトーシスおよびFcRnからの解離、4)エンドサイトーシスによって放出されなかったIgGの再内部移行、5)リソソーム融合およびIgGの分解。結果として、リサイクリングされるIgGは、他の血清タンパク質と比較して有意に延長された血清中半減期を示す(Ghetie,V. et al., 1996 and Borvak, J. et al., 1998)。中性pHにおいてFcRnへの有意な結合を維持するIgGは、血清持続が有意に低下している(Dall'Acqua,W. F. et al., 2003)。
表1:単離されたIgGバリアント(配列ナンバリングは、Kabatに基づき、変異は以下に指定されている)
EDHS(V264E、L309D、Q311H、N434S;配列番号5)、
EDHY(V264E、L309D、Q311H、N434Y;配列番号6)、
DHS(L309D、Q311H、N434S;配列番号7)、
DHY(L309D、Q311H、N434Y;配列番号8)、
IgG2-DHS(V309D、Q311H、N434S;配列番号9)、
IgG3-DHS(L309D、Q311H、N434S;配列番号10)、
IgG4-DHS(L309D、Q311H、N434S;配列番号11)
一部の実施形態は、改変されたタンパク質およびポリペプチド、特に、無改変バージョンに匹敵する少なくとも1種の機能活性を示す改変されたタンパク質またはポリペプチドに関係し、さらに、改変されたタンパク質またはポリペプチドは、B細胞活性化を抑制すること、産生がより容易もしくはより安価であること、より少ない副作用を誘発すること、および/またはより優れたまたはより長い有効性もしくは生物学的利用能を有すること等、無改変バージョンを上回る追加的な利点を保有する。したがって、本願が、「改変されたタンパク質」または「改変されたポリペプチド」の機能または活性について言う場合、当業者であれば、これが、例えば、1)無改変タンパク質またはポリペプチドと同じ活性のうち少なくとも1種を実行する、または同じ特異性のうち少なくとも1種を有するが、別の活性または特異性の異なるレベルを有し得;2)無改変タンパク質またはポリペプチドを上回る追加的な利点を保有するタンパク質またはポリペプチドを含むことを理解するであろう。活性の決定は、特に、タンパク質の活性に関する、当業者によく知られたアッセイを使用して達成することができ、比較目的で、例えば、改変または無改変タンパク質またはポリペプチドのいずれかのネイティブおよび/または組換えバージョンの使用を含めることができる。具体的には、「改変されたタンパク質」に関係する実施形態を、「改変されたポリペプチド」に関して実行することができ、逆もまた同じであることが企図される。本明細書に記す改変されたタンパク質およびポリペプチドに加えて、実施形態には、特に参照により本明細書に組み込むPCT公開WO2008/137475に記載されているドメイン、ポリペプチド、およびタンパク質が関与し得る。
Fcドメインが単離されると、分子を少なくとも1種の作用物質に連結して、この分子の有用性を増強するためのコンジュゲートを形成することが望ましいことがある。例えば、診断または治療用作用物質としてのFcドメインまたは抗体分子の有効性を増加させるために、従来、少なくとも1種の所望の分子または部分を連結または共有結合または複合体形成させる。かかる分子または部分は、少なくとも1種のエフェクターまたはレポーター分子であってよいがこれらに限定されない。エフェクター分子は、所望の活性、例えば、細胞傷害活性を有する分子を含む。抗体に取り付けられたエフェクター分子の非限定例として、毒素、抗腫瘍剤、治療用酵素、放射標識ヌクレオチド、抗ウイルス剤、キレート剤、サイトカイン、増殖因子およびオリゴまたはポリヌクレオチドが挙げられる。対照的に、レポーター分子は、アッセイを使用して検出され得るいずれかの部分として規定される。抗体にコンジュゲートされたレポーター分子の非限定例として、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色粒子またはビオチン等のリガンドが挙げられる。別のかかる例は、細胞傷害性または抗細胞剤に連結された抗体を含むコンジュゲートの形成であり、「免疫毒素」と命名することができる。かかる分子を標識するための技法は、当業者に公知であり、本明細書に上述されている。
、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2リガンド、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANKリガンド ODF、OPGリガンド)、TNFSF12(TWEAK Apo-3リガンド、DR3リガンド)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEMリガンド、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITRリガンドAITRリガンド、TL6)、TNFSF1A(TNF-aコネクチン、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40リガンドgp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40リガンドCD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(FasリガンドApo-1リガンド、APT1リガンド)、TNFSF7(CD27リガンドCD70)、TNFSF8(CD30リガンドCD153)、TNFSF9(4-1BBリガンド CD137リガンド)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、トランスフェリン受容体(transferring receptor)、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、腫瘍関連抗原CA125、ルイスY関連炭水化物を発現する腫瘍関連抗原、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、ウロキナーゼ、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-カドヘリン、VE-カドヘリン-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(fit-4)、VEGI、VIM、ウイルス抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNRインテグリン、フォン・ヴィルブランド因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、ならびにホルモンおよび増殖因子の受容体。一部の実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質は、1種または複数の細胞表面腫瘍抗原またはB細胞抗原に特異的な抗原結合ドメインを有する。方法および組成物は、腫瘍細胞またはB細胞を標的にするために用いることができる。
多様な抗体Fcドメインおよび/またはかかるドメインを含む抗体の作製のための実施形態と併せて用いることができる技法の例は、米国特許第5,824,520号に記載されている免疫グロブリン重鎖ライブラリーの発現のための技法と同様の技法を用いることができる。以前に用いられたFcライブラリーは、特に参照により本明細書に組み込むPCT公開WO2008/137475に記されている。
種々の抗体結合ドメイン(例えば、FcRポリペプチド)は、本技術分野で公知であり、本発明の方法および組成物において使用することができる。例えば、一部の態様では、FcRは、IgA、IgM、IgEまたはIgG(例えば、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3またはIgG4)等、Igの特定の型または亜型に特異性を有することができる。よって、一部の実施形態では、抗体結合ドメインは、IgG結合ドメインとして規定することができる。FcRポリペプチドは、真核生物、原核生物または合成FcRドメインを含むことができる。例えば、抗体Fc結合ドメインは、哺乳動物、細菌または合成結合ドメインとして規定することができる。本発明における使用のための一部のFc結合ドメインとして、表3のポリペプチドのうち1種由来の結合ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Fc結合ポリペプチドは、FCGR2A、FCGR2B、FCGR2C、FCGR3A、FCGR3B、FCGR1A、Fcgr1、FCGR2、FCGR2、Fcgr2、Fcgr2、FCGR3、FCGR3、Fcgr3、FCGR3、Fcgr3、FCGRT、mrp4、spaまたはspg遺伝子によってコードされ得る。好ましくは、本発明に係る使用のためのFcRポリペプチドは、ヒトFcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcαRIまたはC1q由来のFc結合領域であり得る。Fcドメインが結合する種々のFc受容体は、本技術分野で周知であり、受容体の一部の例を下表3に収載する。
ある特定の態様では、標的リガンド(例えば、Fc受容体等の抗体結合ポリペプチド)に特異的な親和性を有する抗体Fcドメインを同定するための方法が存在する。かかる方法は、本明細書、ならびにその全体を特に参照により本明細書に組み込むPCT公開WO2008/137475に記載されている。例えば、当該方法を使用して、本明細書に開示されているFcドメイン置換変異に加えて(例えば、ヒトIgG FcドメインにおけるL309D、Q311H、およびN434S/Yに加えて)変異体またはバリアントFcドメインまたは抗体にさらに含めることができる追加的な変異を識別することができる。追加的な変異を同定するための種々の方法が本技術分野で公知であり、本発明において使用することができる(例えば、米国特許第7094571号、同第7419783号、同第7611866号および米国特許公開第2003/0219870号;Harvey et al., 2004; Harvey et al., 2006)。
核酸に基づく発現系は、本発明のある特定の実施形態では、組換えタンパク質の発現に使用を見出すことができる。例えば、本発明の一実施形態は、抗体Fcドメインまたは好ましくは、複数の別個のFcドメインのコード配列によるグラム陰性細菌の形質転換が関与する。
本発明のある特定の態様は、標的細胞(例えば、グラム陰性細菌)への核酸の送達を含むことができる。例えば、細菌宿主細胞は、FcRに結合する可能性がある候補Fcドメインをコードする核酸により形質転換することができる。本発明の特定の実施形態では、細菌のペリプラズムへの発現を標的化することが望まれ得る。真核生物宿主細胞の形質転換は、同様に、標的リガンドに結合することができると識別される様々な候補分子の発現における使用を見出すことができる。
異種核酸配列の発現の文脈において、「宿主細胞」は、原核細胞を指し、ベクターを複製することができるおよび/またはベクターによってコードされた異種遺伝子を発現することができるいずれかの形質転換可能な生物を含む。宿主細胞は、ベクターのレシピエントとして使用することができ、そのように使用されてきた。宿主細胞は、「トランスフェクト」または「形質転換」することができ、これは、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。形質転換された細胞は、初代対象細胞およびその後代を含む。
上に記す組成物の少なくとも部分または全部を含む、多数の発現系が存在する。かかる系は、例えば、特定のリガンドに結合することができると本発明に従って識別されたポリペプチド産物の産生に使用することができる。原核生物に基づく系は、本発明による使用に用いて、核酸配列またはその同族ポリペプチド、タンパク質およびペプチドを産生することができる。多くのかかる系は、市販されており、広く入手できる。発現系の他の例は、T7、Tac、Trc、BAD、ラムダpL、テトラサイクリンまたはLacプロモーター等、強い原核生物プロモーターを含有するベクター、pET発現系およびE.coli発現系を含む。
タンパク質精製技法は、当業者に周知である。これらの技法には、あるレベルにおいて、細胞、組織、または器官のポリペプチドおよび非ポリペプチド画分へのホモジナイゼーションおよび粗分画が関与する。他に指定がなければ、目的のタンパク質またはポリペプチドは、クロマトグラフィーおよび電気泳動技法を使用してさらに精製して、部分的または完全な精製(または均一になるまで精製)を達成することができる。純粋なペプチドの調製に特に適する分析方法としては、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、および等電点電気泳動が挙げられる。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速性能液体クロマトグラフィー(FPLC)またはさらには高速液体クロマトグラフィー(高圧液体クロマトグラフィーまたはHPLCとも称される)である。本技術分野で一般に知られている通り、種々の精製ステップの実施順序を変化させても、またはある特定のステップを省略しても、依然として、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製に適した方法をもたらすことができることが考えられる。
ポリペプチドまたは抗体を含有する医薬組成物の臨床適用が行われる場合、意図される適用に適切な医薬または治療組成物を調製することが一般に有益であり得る。一般に、医薬組成物は、薬学的に許容される担体に溶解または分散された、有効量の1種または複数のポリペプチドまたは追加的な作用物質を含むことができる。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、少なくとも約0.1%のポリペプチドまたは抗体を含むことができる。他の実施形態では、ポリペプチドまたは抗体は、例えば約2%~約75%の間の重量の単位または約25%~約60%の間、およびそこから導くことができるいずれかの範囲を含むことができる。各治療的に有用な組成物における活性化合物(単数または複数)の量は、いずれかの所定の単位用量の化合物の適した投与量が得られるような仕方で調製することができる。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品有効期間、ならびに他の薬理学的考察等の因子は、かかる医薬品製剤を調製する分野の当業者によって企図され、したがって、種々の投与量および処置レジメンが所望され得る。
本発明のある特定の態様は、例えば、本明細書に記載されている変異体またはバリアントFcドメインを含む治療タンパク質または抗体を用いて腫瘍等の疾患を処置するためのポリペプチドを提供する。特に、ポリペプチドは、ヒトポリペプチド配列を有してよく、したがって、ヒト患者におけるアレルギー反応を防止し、反復投与を可能にし、治療有効性を増大させることができる。
ある特定の実施形態では、本実施形態の組成物および方法は、第2のまたは追加的な治療法と組み合わせたポリペプチドまたは抗体の投与が関与する。かかる治療法は、CDCに応答性のいずれかの疾患の処置において適用することができる。例えば、疾患は、がんであり得る。
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
多種多様な化学療法剤を、本実施形態に従って使用することができる。用語「化学療法」は、がんを処置するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの処置において投与される化合物または組成物を暗示するように使用される。これらの作用物質または薬物は、細胞内におけるその活性機序によって、例えば、これが細胞周期に影響を与えるか否かおよびいずれのステージでそれが為されるかによってカテゴリー化される。あるいは、作用物質は、DNAを直接架橋する、DNA内にインターカレートする、または核酸合成に影響を与えることにより染色体および有糸分裂異常を誘導するその能力に基づき特徴付けることができる。
DNA損傷を生じる、広範に使用されてきた他の因子は、γ線、X線および/または腫瘍細胞への放射性同位元素の定方向送達として一般的に公知のものを含む。マイクロ波、陽子線照射(米国特許第5,760,395号および同第4,870,287号)およびUV照射等、他の形態のDNA損傷因子も企図される。これらの因子の全てが、DNA、DNAの前駆体、DNAの複製および修復、ならびに染色体のアセンブリおよび維持における広範囲の損傷に影響を与える可能性が最も高い。X線の線量範囲は、延長された期間にわたる(3~4週間)50~200レントゲンの一日線量から、2000~6000レントゲンの単一線量に及ぶ。放射性同位元素の線量範囲は、広く変動し、同位元素の半減期、放射する放射線の強度および種類、ならびに新生物細胞による取込みに依存する。
当業者であれば、本実施形態の方法と組み合わせてまたは併せて、免疫療法を使用することができることを理解されよう。がん処置の文脈において、免疫療法は、一般に、免疫細胞を標的にし、抑制する免疫エフェクター細胞および分子の使用に頼る。ブリナツモマブ(Blincyto(登録商標))は、かかる一例である。例えば、イピリムマブ等のチェックポイント阻害剤は、別のかかる例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面におけるあるマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は、単独で治療法のエフェクターとして機能させることもでき、細胞死滅に実際に影響を及ぼすように他の細胞を動員させることができる。抗体を薬物または毒素(化学療法薬、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等)とコンジュゲートし、単に標的化作用物質として作用させることもできる。あるいは、エフェクターは、直接的または間接的のいずれかで、腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を有するリンパ球であり得る。種々のエフェクター細胞として、細胞傷害性T細胞およびNK細胞が挙げられる。
がんを有する人のおよそ60%は、予防的、診断的または進行度診断的、根治的および姑息的外科手術を含むある種の外科手術を受ける。根治的外科手術は、がん性組織の全体または部分が物理的に除去される、切り取られるおよび/または破壊される切除を含み、本実施形態の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法および/または代替的治療法等、他の治療法と併せて使用することができる。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも部分の物理的除去を指す。腫瘍切除に加えて、外科手術による処置は、レーザー外科手術、凍結外科手術、電気外科手術および顕微鏡により制御された外科手術(モース外科手術)を含む。
本実施形態のある特定の態様と組み合わせて他の作用物質を使用して、処置の治療有効性を改善することができることが企図される。これらの追加的な作用物質としては、細胞表面受容体およびGAP結合の上方調節に影響を与える作用物質、細胞増殖抑制および分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖細胞の感受性を増大させる作用物質、または他の生物学的作用物質が挙げられる。GAP結合の数が増加することによる細胞間のシグナル伝達の増大により、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果が増大し得る。他の実施形態では、細胞増殖抑制または分化剤を本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用して、処置の抗過剰増殖有効性を改善することができる。細胞接着の阻害剤により、本実施形態の有効性が改善されることが企図される。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ(FAK)阻害剤およびロバスタチンである。さらに、抗体c225等の、アポトーシスに対する過剰増殖細胞の感度を増大させる他の作用物質を本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用して処置有効性を改善することができることが企図される。
本発明のある特定の態様は、治療用キット等、キットを提供することができる。例えば、キットは、本明細書に記載されている1種または複数の医薬組成物と、任意選択で、その使用のための説明書とを含むことができる。キットは、かかる組成物の投与を達成するための1種または複数のデバイスを含むこともできる。例えば、対象キットは、医薬組成物と、がん性腫瘍への組成物の直接静脈内注射を達成するためのカテーテルとを含むことができる。他の実施形態では、対象キットは、送達装置による使用のための、任意選択で医薬品として製剤化されたまたは凍結乾燥されたポリペプチドの予め充填されたアンプルを含むことができる。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示されている技法は、本発明者により、本発明の実施においてよく機能することが発見された技法であり、したがって、それを実施するための好ましいモードを構成するとみなすことができることが当業者には理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するべきである。
IgG1 Fcドメインを単離するためのライブラリー構築戦略
E.coliは、タンパク質グリコシル化機構をコードせず、したがって、E.coliのペリプラズムにおいて発現されるIgGのFcドメインはグリコシル化されておらず、通常はFcドメインのN297に付加されているグリカンを欠く。非グリコシル化Fcドメインは、コンフォメーション上の柔軟性の程度が高く、その結果、エフェクターFcγR(FcγRIA、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIc、FcγRIIIA、FcγRIIIB)およびC1qへの結合が大きく減弱するか、または検出可能な結合が存在しないが(Jefferis et al., 2005; Borrok et al., 2012)、グリカンの喪失はIgGのpH依存性FcRn結合特性に影響を及ぼさない。FcRnへの野生型IgGよりも増強された結合を可能にする変異を含有するFcドメインバリアントを単離するために、FcドメインのFcRnへの結合部位をランダム化した。Asp249、Thr250、Leu251、Met252、Ile253、Ser254、Arg255、Val308、Leu309、Gln311、Asp312、Leu314、Glu430、Leu432、Tyr436、およびGln438にランダムなアミノ酸置換を導入した。8種のプライマー(配列番号12~19)を設計し、以下の実施例2に記載の変異誘発のために使用した(表4)。
Fcドメインを操作するためのライブラリーの構築
全てのプラスミドおよびプライマーを表4、10および11に記載する。プライマーは全て、Integrated DNA Technologiesにより合成されたものである。IgGポリペプチドを、ベクター:pBAD30-PelB-VL-Ck-NlpA-VL-Ck-His-cMycおよびpMopac12-pelB-IgG-VH-CH1-CH2-CH3-FLAGを使用してE.coliの内膜上に発現させ、ディスプレイさせた(Jung et al., 2012 and Lee et al., 2017)(図1~2)。FcドメインのFcRn結合部位をランダム化するために、8種のプライマー(配列番号12~19)を設計した(表4および図2)。8種のプライマーを用いてIgG1の重鎖遺伝子の4つの断片を増幅し、PCHT01(配列番号12)およびPCHT08(配列番号19)との重複伸長によってひとまとめにした。Fcライブラリー遺伝子を以下のサーモサイクリングプログラムを用いて増幅した:94℃で5分を1サイクル;94℃で1分、55℃で1分、および72℃で1.5分を30サイクル;72℃で5分を1サイクル。増幅された重鎖ライブラリー遺伝子を、SfiI消化したpMopac12-pelB-IgG-VH-CH1-CH2-CH3-FLAGベクターにインフレームでライゲーションした。得られたプラスミドを、プラスミドpBAD30-PelB-VL-Ck-NlpA-VL-Ck-His-cMycを含有するE.coli JUDE-1細胞中に形質転換した(Junget al., 2010; Jung et al., 2012; Lee et al., 2017)。ライブラリーのサイズは1×108であった。
ヒトFcRn-β2m-GSTの調製
FcRnの哺乳動物での発現のためのプラスミドを以前に記載されている通り構築した(Leeet al., 2017)。FcRn-β2m-GSTを、pcDNA3.4(Thermofisher)を使用したHEK293F細胞(Invitrogen)の一過性トランスフェクションによって作製した。トランスフェクトされたHEK293F細胞を、5%CO2インキュベーター中、37℃で5日間培養した。4,000×gで10分間遠心分離することによって上清を採取し、0.22μmのポリエーテルスルホン(PES)メンブランフィルター(PALL)を使用して濾過した。FcRn-β2m-GSTを、グルタチオンセファロース(GE Healthcare)アフィニティーカラムを用い、製造者の指示に従って精製した。リポ多糖(LPS)および非特異的に結合したタンパク質を除去するために、FcRn-β2m-GST結合樹脂を、0.1%Triton(登録商標)X-114(Sigma-Aldrich)を含有するPBS、50mL、およびPBS、50mLを用いて洗浄した。FcRn-β2m-GSTを、10mMの還元型L-グルタチオンを含有するPBSを用いて溶出した。溶出したFcRn-β2m-GSTの緩衝液を、Amicon Ultra-4(Millipore)ユニットを使用してPBSと交換した。また、単鎖FcRn-β2m-his(scFcRn)をAcro Biosystemsから購入した(Cat番号FCM-H5286)。ヒトscFcRnをFITC Fast Conjugation Kit(Abcam、Cat番号ab188285)を製造者の指示に従って使用して、FITCで標識した。さらに、ヒトFcRn-β2m-GSTをEasyLink R-PE Conjugation Kit(Abcam)を製造者の指示に従って使用してR-フィコエリトリン(R-PE)で標識した。
FcRnに対するFcライブラリーのスクリーニング
E.coli JUDE-1細胞を、クロラムフェニコール(40μg/mL)およびカナマイシン(50μg/mL)を伴うTerrific Broth(TB)中、37℃、250rpmで一晩培養した。一晩育成させた後、細胞を、2種の抗生物質を伴う新鮮なTB培地100mL中、1:50に希釈した。E.coli JUDE-1細胞を37℃、250rpmでOD600がおよそ0.4の値に達するまで培養した。次いで、タンパク質の発現を容易にするために、1mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG、Sigma Aldrich)および2%L-アラビノース(Sigma-Aldrich)をE.coli JUDE-1細胞に添加し、次いで、細胞を25℃で20時間さらにインキュベートした。培養物(培養体積8mL)を遠心分離によって収集し、氷で冷却した10mMのトリス-HCl(pH8.0)、1mLで2回洗浄した。洗浄した細胞を氷で冷却したSTE溶液(0.5Mのスクロース、10mMのトリス-HCl、10mMのEDTA、pH8.0)、1mLに再懸濁させ、37℃で30分インキュベートした。細胞を13,000rpmで1分遠心分離し、溶液A(0.5Mのスクロース、20mMのMgCl2、10mMのMOPS、pH6.8)、1mLで洗浄した。洗浄した細胞を、溶液A、1mL中、1mg/mLのニワトリ卵リゾチーム(Sigma-Aldrich)と一緒に37℃で15分間インキュベートした。13,000rpmで1分間遠心分離した後、ペレット化したスフェロプラストを冷たいPBS1mLに再懸濁させた(Jung et al., 2010; Jung et al., 2012; Lee et al., 2017)。
IgGバリアントのFACS解析
4種のIgGバリアント、EDH(V264E、L309D、およびQ311H)、EDHS(配列番号5;V264E、L309D、Q311H、およびN434S)、EDHY(配列番号6;V264E、L309D、Q311H、およびN434Y)、およびTEDHY(A231T、V264E、L309D、Q311H、およびN434Y)を同定した。それぞれの遺伝子をE.coli JUDE-1中に形質転換し、その細胞をスフェロプラスト化し、pH5.8のPBS中10nMのFcRn-β2m-FITCまたはpH7.4のPBS中50nMのFcRn-β2m-GST-APCを用いてFACSによって解析した。図4に示されている通り、4種のIgGバリアントでFcRn-β2m-FITCに関して野生型非グリコシル化IgGと比べて2.6~5.1倍の平均蛍光強度(MFI)値が示された。pH7.4のPBS中FcRn-β2m-GST-APCについては、EDHYおよびTEDHYが野生型IgG1よりも有意に高い結合活性を示したが、EDHおよびEDHSは野生型IgG1と比較して同様またはわずかに増大した結合活性を示した。
選択された変異体IgGバリアントの発現および精製
全てのプラスミドおよびプライマーを表4、10および11に記載する。4種の変異体Fc遺伝子をpMopac12-pelB-IgG-VH-CH1-CH2-CH3-FLAGから2種の特異的なプライマー(TH083(配列番号20)およびTH084(配列番号21))を使用して増幅した。pcDNA3.4-IgHプラスミドを、2種の特異的なプライマー(TH081(配列番号22)およびTH082(配列番号23))を使用して増幅した。4種のFc遺伝子をpcDNA3.4にGibson Assembly(登録商標)クローニングキット(NEB)を製造者の指示に従って使用してクローニングした(Lee et al., 2017)。Gibsonによりアセンブルされた混合物をE.coli JUDE-1細胞中に形質転換し、それらの配列を確認した。また、トラスツズマブのFabを使用した。4種のトラスツズマブ-Fcバリアントの重鎖遺伝子を、等質量の軽鎖プラスミドを用いてHEK293F細胞(Invitrogen)に一過性にトランスフェクトした。5%CO2インキュベーター中、37℃で6日間インキュベートした後、4,000×gで10分間遠心分離することによって上清を採取し、0.22μmのPESメンブランフィルター(PALL)を使用して濾過した。濾過した上清を、プロテインA大容量アガロース樹脂(Thermo Scientific)を3回通過させた。LPSおよび非特異的に結合したタンパク質を除去するために、IgG結合樹脂を0.1%Triton(登録商標)X-114(Sigma-Aldrich)を含有するPBS、50mLおよびPBS、50mLで洗浄した。全てのIgGバリアントを、100mMのグリシン緩衝液(pH3.0)を用いて溶出し、1Mのトリス-HCl緩衝液(pH8.0)を用いてすぐに中和した。溶出したトラスツズマブ-Fc抗体バリアントの全ての緩衝液をAmicon(登録商標)Ultra-4(Millipore)によってPBSと交換した。上記の通りHEK293細胞において発現させたトラスツズマブ-Fc抗体バリアントおよび真正(w.t.)トラスツズマブについての還元タンパク質または非還元タンパク質の純度を、還元条件下および非還元条件下で4%~20%勾配SDS-PAGEゲル(NuSep)によって評価した。
選択されたIgGバリアントのヒトFcRnおよびFcγRに対する結合特性
3種のIgGバリアント、EDH、EDHSおよびEDHYのヒトFcRnに対する結合親和性を、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)および表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて評価した。
DHS-Fcバリアントの構築および特徴付け
FcγRによるエフェクター機能は、病原体を除去するために必須である、抗体に媒介される免疫応答である。ハーセプチン-EDHSは、エフェクターFcγRに結合することができなかった。ハーセプチン-EDHSは、4つのアミノ酸置換、V264E、L309D、Q311H、およびN434Sを含有する。V264Eにより、エフェクターFcRへの結合のために重大であるIgGのグリコシル化が損なわれる(Xiaojie Yu et al., 2013)。したがって、V264E変異を有さないハーセプチン-DHS(配列番号7;L309D;Q311H;N434S)を構築した。DHSのヒトFcRnおよびFcγRへの結合親和性を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)および表面プラズモン共鳴(SPR)で評価した。
ハーセプチン-DHSのエフェクター機能
ADCCアッセイ:ADCCアッセイの前日に、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を健康なドナー由来のヒト血液から単離した。ヒト血液50mLをヘパリン添加バイアル(BD biosciences)中に採取し、チューブを数回穏やかに反転させることによって十分に混合した。血液25mLを50mLコニカルチューブ中の室温のフィコールHistopaque(Invitrogen)25mL上に層状に重ねた。チューブを、スイングバケットローター中、ブレーキなしで、2,500rpmで30分間遠心分離した。ヒトPBMCをhistopaqueと培地との相間において吸引した。ヒトPBMCを赤血球(RBC)溶解緩衝液(155mMのNH4Cl、12mMのNaHCO3、および0.1mMのEDTA)に再懸濁させ、PBSで2回洗浄した。単離されたヒトPBMCを、96ウェルプレート中、カルセインAM標識したSK-BR3 Her2陽性がん細胞および種々の濃度のIgGバリアントと混合した。腫瘍対エフェクター細胞の比を1:10とし、プレートを37℃、5%CO2で4時間インキュベートした。腫瘍細胞溶解のパーセントを次式に従って計算した:100×(E-S)/(M-S)(式中、Eは実験ウェルの蛍光であり、Sは抗体の非存在下での蛍光であり(腫瘍細胞を培地およびエフェクター細胞と一緒にインキュベートした)、Mは溶解緩衝液を用いた腫瘍細胞の蛍光である)。実施例8に記載の通り、ハーセプチン-DHSは、PBMCでハーセプチンと比較して同等のADCC活性を示した。なぜなら、ハーセプチン-DHSがFcγRに対してハーセプチンと比較して同じ親和性を有するからである(図10A~Fおよび11A)。
ハーセプチン-DHSのFcRnに対する結合特性
ハーセプチン-DHSの詳細なpH依存性結合活性を調査するために、抗体を3つの異なる密度のscFcRnを用いてまたは異なるpH条件でSPRによって評価した。
ヒトFcRnトランスジェニックマウスにおけるハーセプチン-DHSの薬物動態
改変されたIgGの薬物動態を、マウスFcRn欠損B6.129X1-Fcgrttm1Dcr/DcrJとhFcRn cDNAトランスジェニック系統B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Tg(CAG-FCGRT)276 Dcr/DcrJのF1交配によって作製されたヘミ接合性hFcRnトランスジェニックマウス(276系統)において実施した(Roopenian et al., 2003 and Chaudhury et al., 2003)。0日目に、hFcRnマウスに2mg/kgの抗体のボーラス静脈内(IV)用量を与えた。抗体当たり11匹のマウスを使用した。2~3週間の研究全体を通して異なる時点において血液試料を尾静脈からキャピラリーピペットを使用して得た。定量的ELISAを使用して、試験した抗体の血清中濃度をモニタリングした。簡単に述べると、96ウェルプレートを2μg/mlのヤギ抗ヒトF(ab’)2断片特異的F(ab’)2(Jackson Immunoresearch)でコーティングした。プレートを、PBS中1%フィッシュゼラチン(AMRESCO-inc)を用いて1時間にわたってブロッキングし、次いで、適切に希釈した血清試料(前の時点では1:200、および後の時点では1:50または1:100)と一緒にインキュベートした。抗カッパ軽鎖抗体-HRP(Abcam)を使用してヒト抗体を検出した(希釈1:5,000)。TMB基質(Pierce Biotechnology、Rockford、IL)を製造者の指示に従って発色させた後、450nmにおける吸光度を測定した。1:100の予め採血したマウス血清に希釈した各抗体バリアントについて標準曲線を作成した。次いで、Prism(GraphPad Software)で作成された標準曲線の直線部分を使用して血清試料中のヒトIgGを定量化した。AUCinf(無限大までの曲線下面積)を、対数線形台形法を使用して計算した。消失半減期(T1/2)を、測定可能な濃度を伴う少なくとも最後の3回の試料採取時点を含む濃度データの対数線形回帰を使用して計算した。血清クリアランスをCL=用量/AUCinfとして推定した。次いで、主要なPKパラメータについての記述統計を計算した。結果として、ハーセプチン-DHSは野生型ハーセプチンと比して6.8倍のベータ相血清中半減期の増大(β相T1/2=336±24.8時間)を示した(図14および表7)。ハーセプチン-DHSはまた、野生型ハーセプチンと比して9.5分の1のクリアランス速度(0.061±0.003ml/日/kg)、7.9倍に増強されたAUCinf(326.6±17.9μg*日/ml)、および3.96分の1の組織分布(0.28±0.01ml/kg)も示した。
IgGサブクラスにおけるDHS変異
IgGには4種のサブクラスメンバー、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4が存在する。IgGサブクラスにおけるFcRn結合部位は高度に保存されており、したがって、IgG2およびIgG4はIgG1の血清中半減期に匹敵する血清中半減期を呈する。IgGの435番目の残基に2つの一塩基多型が存在する:IgG3-R435は血清中半減期(約8日)が短いが、IgG3-H435の半減期は他のIgGサブクラスと比較して同様である(約21日)。DHS変異(L309D、Q311H、およびN434S変異)により他のIgGサブクラスのFcRn結合活性を増強することができるかどうかを調査するために、IgG2、IgG3-H435、およびIgG4の重鎖遺伝子にDHS変異を導入した。IgG2-DHS、IgG3-DHS、およびIgG4-DHSのFc遺伝子をIDTによって合成し、Fc遺伝子をpcDNA3.4にGibson Assembly(登録商標)クローニングキット(NEB)を製造者の指示に従って使用してクローニングした(Lee et al., 2017)。Gibsonによりアセンブルされた混合物をE.coli JUDE-1細胞中に形質転換し、それらの配列を確認した。また、トラスツズマブのFabを使用した。4種のトラスツズマブ-Fcバリアントの重鎖遺伝子を、等質量の軽鎖プラスミドを用いてHEK293F細胞(Invitrogen)に一過性にトランスフェクトした。5%CO2インキュベーター中、37℃で6日間インキュベートした後、4,000×gで10分間遠心分離することによって上清を採取し、0.22μmのPESメンブランフィルター(PALL)を用いて濾過した。濾過した上清を、プロテインA大容量アガロース樹脂(Thermo Scientific)を3回通過させた。LPSおよび非特異的に結合したタンパク質を除去するために、IgG結合樹脂を0.1%Triton(登録商標)X-114(Sigma-Aldrich)を含有するPBS、50mLおよびPBS、50mLで洗浄した。全てのIgGバリアントを、100mMのグリシン緩衝液(pH3.0)を用いて溶出し、1Mのトリス-HCl緩衝液(pH8.0)を用いてすぐに中和した。溶出したトラスツズマブ-Fc抗体バリアントの全ての緩衝液をAmicon(登録商標)Ultra-4(Millipore)によってPBSと交換した。上記の通りHEK293細胞において発現させたトラスツズマブ-Fc抗体バリアントおよび真正(w.t.)トラスツズマブについての還元タンパク質または非還元タンパク質の純度を、還元条件下および非還元条件下で4%~20%勾配SDS-PAGEゲル(NuSep)によって評価した。
リウマチ因子結合特性
関節リウマチ(RA)を含めた自己免疫疾患を有する患者では、リウマチ因子(RF)が観察されることが多く、血清抗体が血液から除去されることによって治療抗体の治療有効性が弱まる恐れがある(Newkirk 2002, Ingegnoli et al., 2013、Maeda et al., 2017)。したがって、抗体バリアントのRF結合能をELISAによって試験した。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載のものを補足する例示的な手続き上のまたは他の詳細をもたらすものである限りでは、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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Claims (39)
- 酸性pHにおいてヒトFcRnに結合するIgG Fcドメインを含むポリペプチドであって、前記Fcドメインが、以下:
(i)309位におけるアスパラギン酸(L/V309D);
(ii)311位におけるヒスチジン(Q311H);および
(iii)434位におけるセリンまたはチロシンのいずれかの置換(N434YまたはN434S)
(アミノ酸位置ナンバリングは、Kabatシステムにしたがう)の置換を有し、
前記Fcドメインは、酸性pHでは増強された親和性でFcRnに結合するが、生理学的pHまたは中性pHでは結合の低減を示すまたは検出可能な結合を示さず、
前記ポリペプチドは、野生型と比較して増大した血清半減期を有する、ポリペプチド。 - 前記434位における置換が、セリン(N434S)である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記434位における置換が、チロシン(N434Y)である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインが、グリコシル化されている、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインが、野生型と比較してほぼ同じ、または同じであるFcγRへの結合を有する、請求項4に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインが、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIのうちの1つ、2つ、または全てに対して野生型Fcドメインと比較してほぼ同じである、同じである、または等しい結合能を有する、請求項4に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインが、FcRnに酸性pHにおいて野生型Fcドメインよりも高い親和性で結合する、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインが、中性pHではFcRnに検出可能もしくは選択的には結合しない、またはFcRnへの結合を示さない、請求項7に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインが、FcRnに対して、野生型Fcドメインと比較して、(i)pH5.8では結合の増強を示し、かつ(ii)pH7.4では結合の低減を示すまたは検出可能な結合を示さない、請求項8に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインが、非グリコシル化されている、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインが、264位におけるグルタミン酸の置換(V264E)をさらに含む、請求項10に記載のポリペプチド。
- 前記IgGが、IgG1である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記IgGが、IgG2である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記IgGが、IgG3である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記IgGが、IgG4である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインが、以下:
V264E、L309D、Q311H、およびN434S;
V264E、L309D、Q311H、およびN434Y;
V264E、V309D、Q311H、およびN434S;
V264E、V309D、Q311H、およびN434Y;
L309D、Q311H、およびN434S;
V309D、Q311H、およびN434S;
V309D、Q311H、およびN434Y;ならびに
L309D、Q311H、およびN434Y
からなる群から選択される置換を含む、またはそれからなる、請求項1に記載のポリペプチド。 - 前記Fcドメインが、L309D、Q311H、およびN434S;またはL309D、Q311H、およびN434Yを含む、またはそれからなる、請求項16に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインが、FcRnに550nM未満のKD値で結合する、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインが、FcRnに250nM未満のKD値で結合する、請求項18に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインが、FcRnに125nM未満のKD値で結合する、請求項18に記載のポリペプチド。
- 非Fc受容体(非FcR)結合ドメインをさらに含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記非FcR結合ドメインが、Ig可変ドメインである、請求項21に記載のポリペプチド。
- 全長抗体である、請求項22に記載のポリペプチド。
- 前記抗体が、アゴニスト抗体である、請求項23に記載のポリペプチド。
- 前記抗体が、アンタゴニスト抗体である、請求項23に記載のポリペプチド。
- 前記抗体が、Her2/neu、CD20、CD40、IL-10、4-1BB、PD-1、PD-L1、CTLA-4OX40、IL-1、IL-6、IL6R、TNFα、RANKL、EGFR、c-Met、CD11a、VEGF-A、VEGFR1、VEGFR2、C5、またはインテグリン-α4に選択的に結合する、請求項23に記載のポリペプチド。
- 前記抗体が、毒素に化学的にコンジュゲートしているまたは共有結合している、請求項23に記載のポリペプチド。
- 前記非FcR結合領域が、抗体の抗原結合部位ではない、請求項21に記載のポリペプチド。
- 前記非FcR結合領域が、細胞表面タンパク質に結合する、請求項21に記載のポリペプチド。
- 前記非FcR結合領域が、可溶性タンパク質に結合する、請求項21に記載のポリペプチド。
- 薬学的に許容される担体中に、請求項1に記載のポリペプチドを含む医薬品製剤。
- 前記Fcドメインが、配列番号5を含む、請求項16に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインが、V264E、L309D、Q311H、およびN434Sを含む、請求項16に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインが、V264E、L309D、Q311H、およびN434Yを含む、請求項16に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインが、L309D、Q311H、およびN434Sを含む、請求項16に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインが、L309D、Q311H、およびN434Yを含む、請求項16に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインが、V309D、Q311H、およびN434Sを含む、請求項16に記載のポリペプチド。
- 前記Fcドメインが、V309D、Q311H、およびN434Yを含む、請求項16に記載のポリペプチド。
- 前記IgG Fcドメインが、ヒトIgG Fcドメインである、請求項1~30および32~38のいずれか一項に記載のポリペプチド。
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