JP2005520569A - バクテリア内で複数のジスルフィド結合を有する蛋白質の分泌とその利用 - Google Patents
バクテリア内で複数のジスルフィド結合を有する蛋白質の分泌とその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005520569A JP2005520569A JP2003580492A JP2003580492A JP2005520569A JP 2005520569 A JP2005520569 A JP 2005520569A JP 2003580492 A JP2003580492 A JP 2003580492A JP 2003580492 A JP2003580492 A JP 2003580492A JP 2005520569 A JP2005520569 A JP 2005520569A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- bacterium
- protein
- heterologous polypeptide
- fdng
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/034—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a motif for targeting to the periplasmic space of Gram negative bacteria as a soluble protein, i.e. signal sequence should be cleaved
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
本発明は、2002年3月23日に出願された米国仮特許出願第60/367,130の優先権を主張するものであり、その開示全体が引用によって具体的に本明細書に組み込まれる。
1つの態様で、本発明は、異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流でツイン・アルギニン転座経路を通じた蛋白質排出を指示するリーダー・ペプチドを包含する発現カセットで遺伝子的に形質転換されるバクテリアを提供し、上記異種ポリペプチドはバクテリア細胞によって産生され、少なくとも1つのジスルフィド結合を包含する。上記バクテリアは酸化性細胞質を有してもよい。本発明による特定の実施の形態で、上記異種ポリペプチドは約1から約17のジスルフィド結合を含むことができ、及び/又は生物学的に活性な形で産生されることができる。本発明による別の特定の実施の形態で、上記リーダー・ペプチドは、大腸菌TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD及びYaeIで構成される群から選択される蛋白質をコードする遺伝子からのものでもよい。上記リーダー・ペプチドは、これら配列のいずれかの相同物をコードする遺伝子に由来してもよい。
細胞質を有し、周辺質ジスルフィド結合形成経路が損なわれているバクテリア内で発現する。蛋白質の酸化を再構成することができる変異したポリペプチドは、周辺質ジスルフィド結合形成から生じた活性を発現させるバクテリアから単離される。1つの実施の形態で、酸化性細胞質を有し、周辺質ジスルフィド結合形成経路が損なわれている代表的なバクテリアは、大腸菌DR473-Aまたは大腸菌DR473-Bであり、上記変異したポリペプチドは、変異したチオレドキシン1(TrxA)をコードする。
大腸菌チオレドキシン(TrxA)発現プラスミドを以下のように作製した。野生型チオレドキシン1及びdsbA活性部位を有するチオレドキシン1(trx-AdsbA -CPHC-)を、PCRによってそれぞれプラスミドpFA3及びpFA6から(Mossner et al., 1999)プライマーSalI-TrxA-F(5'-ctctcgtcgacatgagcgataaaattattcac-3')(配列識別番号NO:1)及びR-TrxA-Hind3(5'-ctctcaagcttacgccaggttagcgtcgag-3')(配列識別番号NO:2)と共に増幅した。これらのプライマーは、SalI及びHindIII制限酵素認識部位をTrxA遺伝子のそれぞれ5'及び3'末端で導入する。PCR増幅断片を、SalI及びHindIII部位でpBAD33(Guzman et al., 1995)へクローニングされたトリメチルアミンN酸化物レダクターゼ(TorA)のpBAD33-TorAプラスミド(シグナル配列(初めの150塩基対))へクローニングし、pBAD33-TorA::TrxA及びpBAD33-TorA::Trx-AdsbAを得た。これら2つのプラスミドをテンプレートとして用いて、TorA::TrxA及びTorA::Trx-AdsbA挿入物を、BspHI(NcoI適合)及びHindIII制限酵素認識部位をTrxA遺伝子のそれぞれ5'及び3'末端で導入するプライマーと共にPCRによって増幅した。これらPCR増幅断片を、pTrc99a(Amersham Pharmacia)へNcoI/HindIII部位でクローニングし、pTrc99a-TorA::TrxA及びpTrc99a-TorA::Trx-AdsbAを得た。
初めに単一のコロニーを、M9カゼイン培地(1X M9最小塩類(Sigma, M6030)、0.4%(w/v)グリセロール、0.1%(w/v)カゼイン酵素水解物(Sigma, C0626)、2mM MgSO4、0.05 mg/mlチアミン)で対応する抗生物質と共に37℃で振動しながら1晩培養した。1晩経過した培養物をOD600に基づいて希釈し、約100個の細胞をM9CASEIN運動性プレート(0.3%(w/v)寒天及び適切な抗生物質を添加したM9CASEIN培地)上にプロットした。その後、細胞を37℃で40時間培養した。
大腸菌アルカリ・ホスファターゼ(PhoA)遺伝子を、発現ベクターpBAD33-TorAを用いてTorAリーダー・ペプチドに融合した。その結果生じたTorA-PhoA融合蛋白質を、酸化性細胞質(株DR473-A、図1A、レーン2)と共に株内に産生された場合に周辺質へ排出した。対照的に、還元性細胞質(図1A、レーン1)を有する同質遺伝子親株(株DHB4-A)の周辺質コンパートメント内に測定可能なPhoA蛋白質はなかった。重要なことは、大量のPhoA蛋白質が合成され、DHB4-A及びDR473-A細胞の両方の細胞質に集積されたことである。しかし、細胞質及び周辺質コンパートメントの両方での活性の完全な欠如によって明らかなように、DHB4-Aの還元性細胞質は、PhoAの適切な折り畳みを抑制する(図1B)。DHB4-Aの細胞質でのPhoAの不完全な折り畳みによって、2つの明確な結果が得られたと考えられる:i)ウェスタン・ブロット上の数多くのより低分子のバンドによって明示されるように、DHB4-A細胞の細胞質において誤って折り畳まれたPhoA蛋白質の著しい分解はなかった(図1A、レーン3);ii)細胞質内の酸化的折り畳みの欠如によって、PhoAはTAT依存分泌と両立しなくなり、測定可能なPhoA蛋白質(図1A)またはアルカリ・ホスファターゼ活性(図1B)は、DHB4周辺質画分で観察されなかった。
PhoAに関して上に概要が説明されたような同様の実験を、TorAリーダー・ペプチドとの融合物として発現するヒト組織プラスミノゲン・アクチベータ(vtPA)の切断型について行なった。tpAの切断型をコードする遺伝子(Bessette et al. 2001)を、pBAD33-TorAでTorAリーダーをコードする配列と融合した。図2に示されるように、TorA-vtPA融合蛋白質が細胞内で還元性細胞質と共に発現する場合(DHBA-4)、非常に低レベルのプラスミノゲン活性がすべての細胞溶解物で観察された。この活性の大部分は周辺質コンパートメントに分画され(図2B)、DHB4-Aの還元性細胞質内であっても、少量のvtPAが適切に折り畳まれ、従って、TAT経路によって排出可能であることを示唆する。驚くべきことに、同じTorA- vtPAコンストラクトがDR473-A細胞の酸化性細胞質で産生された場合、非常に高レベルのtPA活性が、細胞溶解物全体で観察された(図2A)。細胞成分の分画の際、大部分のtPA酵素活性は周辺質に局在した。注目すべきことに、DR473-A細胞の周辺質画分でのtPA活性は、DHB4-A細胞で観察された活性と比較して極めて高かった(図2B)。
ジゴキシンに特異的な抗体の重鎖(Levis et al. 2001)は、アラビノース誘導プロモータを含んでいるpBAD33-TorA発現ベクターのTorAリーダー・ペプチドにイン・フレームで融合した。その融合の概略図を図3Aに示す。注目すべきことに、上記抗体の抗原結合断片(Fab)は、合計5つのジスルフィド結合、すなわち、重鎖の可変及び定常領域をFabの軽鎖の可変及び定常領域に共有結合させる4つの分子内橋上結合及び1つの分子間橋上結合を含んでいる。このコンストラクトの1つのユニークな特徴は、TAT排出シグナルが、重鎖の可変領域にのみ付加されたことである。従って、活性なFabの周辺質集積は、排出の前にTorA重鎖融合物による軽鎖の補充を必要とした。この方法で、TorA重鎖は、鎖間ジスルフィド橋上結合が初めに細胞質内に形成される場合に限って、周辺質へ軽鎖を『肩車』して運搬する。
以下の実施例は、TAT分泌経路の利用がいかにして酸化性細胞質から周辺質蛋白質への酸化性等価物の運搬(ジスルフィド結合)運搬を可能にするかを示すものである。バクテリアの鞭毛の集合は、周辺質内のジスルフィド結合を形成する能力が損なわれた突然変異細胞内で(すなわち、dsbAまたはdsbB突然変異体で)バラバラにされる。これは、鞭毛構造に組み立てられて適切に機能するためには、鞭毛Pリング蛋白質(FIgI)がジスルフィド結合を必要とするからである(Dailey and Berg, 1993)。この表現型は、細胞が運動性プレート上で培養される場合に容易に理解できる。図4Bに示されるように、DR473細胞は運動性プレート上で大きな運動性『ハロー』を示すのに対して、dsbBを欠失したDR473-B細胞は非運動性である(図4A)。
組み合わせライブラリ・スクリーニングでTAT分泌経路を活用するため、突然変異させた1群の遺伝子を、Tat特異的リーダー・ペプチドで発現することができる。特に、scFv抗体は、免疫化動物から作製されたものか、または未変性免疫レパートリーの代表的なもののいずれかである抗体の組み合わせライブラリから単離することができる。PCRを用いて、IgG重鎖及び軽鎖をscFvsへ構築し(Hoogenboom et al. 1998)、周辺質発現及び細胞質スクリーニング(PECS)またはファージ・ディスプレイに好適な、または微生物での発現を必要とするその他の組み合わせライブラリ・スクリーニング形式に好適なベクターへ挿入した。スクリーニング完了後、2つの抗体のそれぞれと結合して、Tatで発現するスクリーニング・ライブラリに誘導されるクローンの配列を決定し、リガンド結合クローンのアミノ酸配列を特定する。
用いたバクテリアの株及びプラスミドを表1に記載する。APの排出をモニターするために、LB培地で1晩培養した細胞を、0.2%グルコース、1μg/mlビタミンB1、1mM MgSO4、50μg/ml 18アミノ酸(メチオニン及びシステインを除く)を添加したM9塩類で100倍の希釈度で継代し、その後30℃で培養した。scFv及びFab抗体断片の発現のために、1晩経過した培養液から新鮮なLB培地(5% v/v)へ細胞を継代し、その後30℃で培養した。蛋白質合成は、細胞がOD600−0.5に達した時にIPTGを最終濃度0.1 mMまで加えることによって誘導した。適切な場合には、pBAD-ΔssDsbCからのDsbCの共発現を0.2%アラビノースを用いて誘導した。抗生物質の選択は、プラスミドのすべてのマーカーに対して以下の濃度を維持した:アンピシリン、100μg/ml;クロラムフェニコール、25μg/ml;カナマイシン、50μg/ml;及びスペクチノマイシン、100μg/ml。
APを発現させる細胞を誘導から3時間後に回収し、上記のような100 mMヨードアセトアミドで処理し、遠心分離によってペレット化し、そして、冷却浸透圧衝撃法によって分画した(Sargent et al., 1998)。可溶性蛋白質を、標準としてのBSAを使って、Bio-Rad活性アッセイによって定量化した。AP活性及びβガラクトシダーゼ活性のアッセイを先に述べたように行なった(Derman et al., 1993)。≧95%のβガラクトシダーゼ活性が細胞質画分に見られた分画実験からのデータのみを報告する。試料を初めにヨードアセトアミドで処理したことを除き、APのトリプシン抵抗性を先に述べたように評価した(Sone et al., 1997)。
バクテリア内で、チオレドキシン及びグルタレドキシン経路は、蛋白質チオールの酸化を強力に忌避する、高度に還元性な状態に細胞質を維持する(Ritz and Beckwith, 2001)。この理由のために、ジスルフィド結合を必要とする蛋白質は、より酸化性な環境へ排出されなければならない。アルカリ・ホスファターゼ(AP)は、通常Sec特異的リーダー・ペプチドを介して細胞周辺腔へ分泌され、そこでアルカリ・ホスファターゼは、DsbAによって急速に酸化され、蛋白質の安定性と触媒作用に不可欠である、その2個のジスルフィド結合を形成する(Sone et al., 1997)。これまでの研究により、APのTat特異的リーダー・ペプチドとの融合物は、Tat経路を介して排出されるのではないことが示された(Berks, 1996: Kebir and Kendall, 2002; Reinartz et al., 1998; Sambasivarao et al., 1990; Stanley et al., 2002)。本発明者等は、AP融合物がTat経路を介して排出されないのは、そうした蛋白質は、ジスルフィド結合の形成を妨げる強力な還元性状態に維持されている細胞質内で通常折り畳まれていないという事実によるものではないかと推論した。これを詳しく調べて、折り畳みとTat排出能の関係を検討するために、本発明者等は、細胞質内でのジスルフィド結合の形成が可能である大腸菌突然変異体、または逆に周辺質内で蛋白質の酸化を無効にする大腸菌突然変異体の有用性を利用した。
APに加えて、クラスIリーダー・ペプチドは、C:ox株の細胞質からの細胞内及び細胞間ジスルフィド結合を有するその他の蛋白質排出を媒介することができるであろう。単鎖抗体(scFv)は、2つの細胞間ジスルフィド結合を含んでおり、1つはVH、もう1つはVl鎖にある。26-10抗ジゴキシンscFc(Levy et al., 2001)をクラスITatリーダー・ペプチドであるssTorAと融合し、C:ox/P:ox細胞の細胞周辺腔内での抗原結合蛋白質の集積をELISAによってモニターした(図7)。ほぼ45%のジゴキシン結合活性が細胞周辺腔に局在した。周辺質内の活性な抗ジゴキシンscFv抗体の集積はDR473 dsbA (C:ox/P:red)では影響を及ぼさなかったが、tatC突然変異体でのバックグラウンド・レベルを減少させた。
Tat経路を、脂質二重層膜を通り抜ける蛋白質転座のその他すべての形態から傑出したものにしているその顕著な特徴は、二次、または恐らくは三次構造で安定度が既に想定されているポリペプチドを排出する能力である。細胞質または細胞周辺腔で酸化的蛋白質折り畳み選択性を遺伝子的に促進するその能力によって、本発明者等は:(i)共同因子を含んでいない、そして、(ii)十分に特徴づけされた折り畳み動力学を示す、蛋白質の排出能のための必要条件を調べることができた。
*細胞を回収直後に100 mMヨードアセトアミドで処理し、次のサンプリング・プロセス中のジスルフィド結合形成を防止した。AP活性は、25℃でpH8.0で加水分解されたp-ニトロフェニル・フォスフェイト(μmol)の1分あたりの量として計算した。AP活性の報告された数値は、2つの独立した研究(n=6)からの3つの個別の測定の平均値である。標準誤差は、報告されたすべてのデータの10%未満である。括弧内の値は、周辺質画分内の酵素活性全体のパーセンテージを示す。
a:未変性リーダー・ペプチド内でΔ2-20を有するAP、b:リーダー・ペプチドはC領域正電荷を運ぶ、nd:検出不能。
下に挙げる参考文献は、それらが、背景を補足、説明、提供し、あるいは、本明細書で用いられる方法、技術及び/又は組成物を教示する程度に、引用によって本明細書に組み込まれる。
Angelini et al., FEBS Lett., 506:8159-8164,2001.
Belin and Boquet, C. R. Acad. Sci, III. 316:469-473, 1993.
Berks, Mol. Microbiol., 22:393-404, 1996,
Bessette et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 96:13703:13708, 1999.
Bogsch et al., EMBO J., 16:3851-3859, 1997.
Chen et al., Nat. Biotechnol., 19:537-542, 2001.
Clark and Theg, Mol. Biol. Cell, 8:923-934, 1997.
Cristobal et al., EMBO J., 18:2982-2990, 1999.
Dalbey and Robinson, Trends Biochem. Sci., 24:17-22, 1999.
DeLisa et al., J. Biol. Chem., 277:29825-29831, 2002.
Derman et al., Science, 262:1744-1747, 1993.
Guzman et al., J. Bacteriol., 177:4121-4130(1995).
Halbig et al., Eur. J. Biochem., 263:543-551, 1999.
Halbig et al., FEBS Lett., 447:95-98, 1999.
Hynds et al., Biol. Chem., 273:34868-34874, 1998.
Ize et al., J. Mol. Bio., 317:327-335, 2002.
Kebir and Kendall, Biochemistry, 41:5573-5580, 2002.
Keegstra and Cline, Plant Cell, 11(4):557-570, 1999.
Levy et al., Protein Expr. Purif., 23:338-347, 2001.
Mori and Cline, J. Biol. Chem., 273:11405-11408, 1998.
Mossner et al., J. Biol. Chem., 274:25254-25259 (1999).
Pugsley, Microbiol. Rev., 57:50-108, 1993.
Reinartz et al., Arch. Microbiol., 170:59-68, 1998.
Ritz and Beckwith, Annu. Rev. Microbiol., 55:21-48 (2001).
Ritz and Beckwith, Annu. Rev. Microbiol., 55:5573-5580, 2002.
Robinson and Bolhuis, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2:350-356, 2001.
Rodrigue et al., J. Biol. Chem., 274:13223-13228, 1999.
Roy and Barkan, J. Cell Biol., 141:385-395, 1998.
Sambasivarao et al., J. Bateriol., 172:5938-5948, 1990.
Sanders et al., Mol. Microbiol., 41:241-246, 2001.
Santini et al., J. Biol. Chem., 276:8159-8164, 2001.
Sargent et al., EMBO J., 17:3640-3650, 1998.
Schatz and Dobberstein, Science, 271:1519-26 (1996).
Schnell and Blobel, J. Cell Biol., 120:103-115, 1993.
Settles and Martienssen, Trends Cell Biol., 8:494-501, 1998.
Settles et al., Sience, 278:1467-70(1997)
Sone et al., J. Biol. Chem., 272:6174-6178, 1997.
Stanley et al., Mol, Microbiol., 43:1005-1021, 2002.
Stuart and Neupert, Nature, 406:575-577, 2000.
Thomas et al., Mol, Microbiol., 39:47-53, 2001.
Walker and Gilbert, J. Biol. Chem., 269:28487-28493, 1994.
Weiner et al., Cell, 93:93-101, 1998.
Wexler et al., FEBS Lett., 431:339-342, 1998.
Yahr and Wickner, EMBO J., 20:2472-2479, 2001.
Claims (41)
- 異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流でツイン・アルギニン転座経路を通じた蛋白質排出を指示するリーダー・ペプチドを包含する発現カセットで遺伝子的に形質転換されるバクテリアであって、前記異種ポリペプチドがバクテリア細胞によって産生され、少なくとも1つのジスルフィド結合を包含することを特徴とするバクテリア。
- 酸化性細胞質を有するとしてさらに定義される請求項1記載のバクテリア。
- 前記異種ポリペプチドが、約2から約17のジスルフィド結合を含んでいることを特徴とする請求項1記載のバクテリア。
- 前記異種ポリペプチドが生物学的に活性な形で産生されることを特徴とする請求項1記載のバクテリア。
- 前記リーダー・ペプチドが、大腸菌TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD及びYaeIで構成される群から選択される蛋白質をコードする遺伝子からのものであることを特徴とする請求項1記載のバクテリア。
- 前記リーダー・ペプチドが、大腸菌TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD及びYaeIの相同物で構成される群から選択される蛋白質をコードする遺伝子に由来することを特徴とする請求項1記載のバクテリア。
- 前記バクテリアが、trxB遺伝子機能を減少または排除する突然変異体を包含することを特徴とする請求項1記載のバクテリア。
- グラム陽性菌としてさらに定義される請求項1記載のバクテリア。
- グラム陰性菌としてさらに定義される請求項1記載のバクテリア。
- 前記バクテリアが大腸菌であることを特徴とする請求項1記載のバクテリア。
- 前記異種ポリペプチドが、バクテリアから分泌され、そしてバクテリアの周辺質から単離されるか、または内在性膜蛋白質であることを特徴とする請求項1記載のバクテリア。
- 前記異種ポリペプチドが、前記バクテリアの培養上清から単離可能であることを特徴とする請求項1記載のバクテリア。
- 前記異種ポリペプチドが、哺乳動物ポリペプチドであることを特徴とする請求項1記載のバクテリア。
- 前記異種ポリペプチドが、抗体またはその断片であることを特徴とする請求項1記載のバクテリア。
- 前記異種ポリペプチドが、未変性コンフォメーションのポリペプチド、突然変異したポリペプチド及び切断されたポリペプチドで構成される群から選択されることを特徴とする請求項1記載のバクテリア。
- 前記異種ポリペプチドが、前記バクテリアの細胞質細胞膜の表面上に発現することを特徴とする請求項1記載のバクテリア。
- 前記異種ポリペプチドが、前記バクテリアの周辺質細胞膜の表面上に発現することを特徴とする請求項1記載のバクテリア。
- 前記異種ポリペプチドが、前記バクテリアの周辺質内で発現することを特徴とする請求項1記載のバクテリア。
- 前記異種ポリペプチドが、抗体またはその断片であることを特徴とする請求項1記載のバクテリア。
- バクテリア細胞内で少なくとも1つのジスルフィド結合を包含する少なくとも1つの異種ポリペプチドを産生する方法であって、前記方法が:
a)異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流でツイン・アルギニン転座経路を通じて蛋白質排出を指示するリーダー・ペプチドを包含する発現カセットを作製するステップと;そして、
b)酸化性細胞質を包含するバクテリア細胞内で発現カセットを発現させるステップであって、前記異種ポリペプチドが産生され、少なくとも1つのジスルフィド結合を包含することを特徴とするステップ
で構成される方法。 - 前記異種ポリペプチドが、約1から約17のジスルフィド結合を含んでいることを特徴とする請求項20記載の方法。
- 前記異種ポリペプチドのうち2つが、少なくとも1つのジスルフィド結合によって結合されることを特徴とする請求項20記載の方法。
- 前記異種ポリペプチドが、生物学的に活性な形で産生されることを特徴とする請求項20記載の方法。
- 前記リーダー・ペプチドが、大腸菌TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD及びYaeIで構成される群から選択される蛋白質をコードする遺伝子からのものであることを特徴とする請求項20記載の方法。
- 前記リーダー・ペプチドが、大腸菌TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD及びYaeIの相同物で構成される群から選択される蛋白質をコードする遺伝子に由来することを特徴とする請求項20記載の方法。
- 前記異種ポリペプチドが、バクテリア細胞から分泌されることを特徴とする請求項20記載の方法。
- 前記異種ポリペプチドが、バクテリアの周辺質から単離可能であることを特徴とする請求項20記載の方法。
- 前記異種ポリペプチドが、内在性膜蛋白質であることを特徴とする請求項20記載の方法。
- 前記異種ポリペプチドが、前記バクテリア細胞の培養上清から単離可能であることを特徴とする請求項20記載の方法。
- 前記異種ポリペプチドが、哺乳動物ポリペプチドであることを特徴とする請求項20記載の方法。
- 前記異種ポリペプチドが、未変性コンフォメーションのポリペプチド、突然変異したポリペプチド及び切断されたポリペプチドで構成される群から選択されることを特徴とする請求項20記載の方法。
- 前記異種ポリペプチドが、前記バクテリアの細胞質細胞膜の表面上に発現することを特徴とする請求項20記載の方法。
- 前記異種ポリペプチドが、前記バクテリアの周辺質細胞膜の表面上に発現することを特徴とする請求項20記載の方法。
- 前記異種ポリペプチドが、抗体またはその断片であることを特徴とする請求項20記載の方法。
- 分泌コンパートメント内の蛋白質酸化を再構成することができる突然変異ポリペプチドをコードする核酸を識別する方法であって、前記方法が:
a)酸化性活性を有する蛋白質の突然変異ポリペプチドをコードする核酸配列の上流でツイン・アルギニン転座経路に特異的なリーダー・ペプチドを包含する発現カセットを取得するステップと;
b)酸化性細胞質を有し、周辺質ジスルフィド結合形成が損なわれているバクテリア内で前記発現カセットを発現させるステップと;そして
c)前記損なわれた周辺質ジスルフィド結合形成活性が、発現カセットの発現によって補完されて、分泌コンパートメント内の蛋白質酸化を再構成することができる突然変異ポリペプチドをコードする核酸配列を識別するステップ
で構成される方法。 - 組み合わせライブラリをスクリーニングする方法であって、上記方法が:
a)当該ポリペプチドのライブラリを生成するステップと;
b)前記ポリペプチドをコードする遺伝子の上流でツイン・アルギニン転座経路に特異的なリーダー・ペプチドを配置する発現カセットを作製するステップと;
c)酸化性細胞質を包含するバクテリア内で前記発現カセットを発現させるステップと;そして
d)発現した分泌ポリペプチドをスクリーニングするステップ
で構成される方法。 - 前記発現に対するスクリーニングが、周辺質発現法及び細胞数測定スクリーニングまたはファージ・ディスプレイによるものであることを特徴とする請求項36記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、哺乳動物ポリペプチドであることを特徴とする請求項36記載の方法。
- 前記哺乳動物ポリペプチドが、抗体またはその断片であることを特徴とする請求項38記載の方法。
- 前記リーダー・ペプチドが、大腸菌TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD及びYaeIで構成される群から選択される蛋白質をコードする遺伝子に由来することを特徴とする請求項36記載の方法。
- 前記リーダー・ペプチドが、大腸菌TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD及びYaeIの相同物で構成される群から選択される蛋白質をコードする遺伝子に由来することを特徴とする請求項36記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US36713002P | 2002-03-23 | 2002-03-23 | |
PCT/US2003/008969 WO2003083056A2 (en) | 2002-03-23 | 2003-03-24 | Secretion of proteins with multiple disulfide bonds in bacteria and uses thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005520569A true JP2005520569A (ja) | 2005-07-14 |
JP2005520569A5 JP2005520569A5 (ja) | 2006-05-11 |
Family
ID=28675326
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003580492A Pending JP2005520569A (ja) | 2002-03-23 | 2003-03-24 | バクテリア内で複数のジスルフィド結合を有する蛋白質の分泌とその利用 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20030219870A1 (ja) |
EP (1) | EP1487966B1 (ja) |
JP (1) | JP2005520569A (ja) |
CN (1) | CN100516194C (ja) |
AT (1) | ATE348146T1 (ja) |
AU (1) | AU2003220493B2 (ja) |
CA (1) | CA2480159A1 (ja) |
DE (1) | DE60310385T2 (ja) |
WO (1) | WO2003083056A2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011105344A1 (ja) * | 2010-02-23 | 2011-09-01 | 東レ株式会社 | カダベリンの製造方法 |
JP2014129358A (ja) * | 2007-07-09 | 2014-07-10 | Genentech Inc | ポリペプチドの組換え生産中におけるジスルフィド結合還元の防止 |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10256669B4 (de) * | 2002-12-04 | 2006-03-09 | Universitätsklinikum Charité an der Humboldt-Universität zu Berlin Technologietransferstelle | Gemisch mindestens zweier Fusionsproteine sowie ihre Herstellung und Verwendung |
US7842289B2 (en) | 2003-12-24 | 2010-11-30 | Aduro Biotech | Recombinant nucleic acid molecules, expression cassettes, and bacteria, and methods of use thereof |
MXPA06007144A (es) * | 2003-12-24 | 2007-01-31 | Cerus Corp | Moleculas de acido nucleico recombinante que codifican proteinas de fusion que comprenden polipeptidos de senal secretoria bacterial y de antigenos, casetes de expresion y bacterias, y metodos para usar las mismas. |
DK1748077T3 (da) * | 2004-04-20 | 2013-04-08 | Ajinomoto Kk | Fremgangsmåde til fremstilling af protein |
MX2007011801A (es) * | 2005-03-24 | 2008-02-19 | Neose Technologies Inc | Expresion de glicosiltransferasas eucarioticas activas, solubles en organismos procarioticos. |
US20070026012A1 (en) * | 2005-08-01 | 2007-02-01 | Cornell Research Foundation, Inc. | Compositions and methods for monitoring and altering protein folding and solubility |
US9150850B2 (en) | 2005-08-22 | 2015-10-06 | Cornell Research Foundation, Inc. | Compositions and methods for analyzing protein interactions |
KR100742218B1 (ko) | 2005-10-21 | 2007-07-24 | 학교법인 포항공과대학교 | 트윈 아르기닌 트랜스로케이션 분비경로를 가지는오가노포스포러스 하이드롤라제 분비서열을 이용한대장균에서의 목적 외래 단백질 분비 |
US7935804B2 (en) | 2006-03-01 | 2011-05-03 | Aduro Biotech | Engineered Listeria and methods of use thereof |
WO2008067547A2 (en) | 2006-11-30 | 2008-06-05 | Research Development Foundation | Improved immunoglobulin libraries |
US8722584B2 (en) | 2007-01-12 | 2014-05-13 | Cornell University | Genetic selection for protein folding and solubility in the bacterial periplasm |
AU2008247819B2 (en) | 2007-05-01 | 2013-02-14 | Research Development Foundation | Immunoglobulin Fc libraries |
CA2766065C (en) * | 2009-06-30 | 2020-07-21 | Research Development Foundation | Immunoglobulin fc polypeptides |
WO2011116276A2 (en) * | 2010-03-18 | 2011-09-22 | Matthew Delisa | Engineering correctly folded antibodies using inner membrane display of twin-arginine translocation intermediates |
AU2012214643B2 (en) | 2011-02-07 | 2016-12-15 | Research Development Foundation | Engineered immunoglobulin Fc polypeptides |
GB201419899D0 (en) | 2014-11-07 | 2014-12-24 | Univ Kent Canterbury | Biopharmaceutical production method |
WO2016130516A1 (en) | 2015-02-09 | 2016-08-18 | Research Development Foundation | Engineered immunoglobulin fc polypeptides displaying improved complement activation |
WO2017040380A2 (en) | 2015-08-28 | 2017-03-09 | Research Development Foundation | Engineered antibody fc variants |
WO2019033087A1 (en) | 2017-08-11 | 2019-02-14 | Research Development Foundation | MODIFIED FC ANTIBODY VARIANTS FOR ENHANCED SERIAL HALF LIFE |
JP7426389B2 (ja) * | 2018-11-08 | 2024-02-01 | ストロ バイオファーマ, インコーポレイテッド | 酸化的細胞質を有する大腸菌株 |
CN110616227A (zh) * | 2019-09-30 | 2019-12-27 | 天津科技大学 | 一种来源于黄粉虫的抗冻蛋白的基因、重组表达载体、工程菌株和应用 |
US20240010742A1 (en) | 2022-06-10 | 2024-01-11 | Research Development Foundation | Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08289794A (ja) * | 1995-04-11 | 1996-11-05 | Behringwerke Ag | 大腸菌における抗体、抗体フラグメントおよび抗体フラグメント融合分子の細胞質発現 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6277375B1 (en) * | 1997-03-03 | 2001-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobulin-like domains with increased half-lives |
US6022952A (en) * | 1998-04-01 | 2000-02-08 | University Of Alberta | Compositions and methods for protein secretion |
WO2002022667A2 (en) * | 2000-09-18 | 2002-03-21 | Genencor International, Inc. | Twin-arginine translocation in bacillus |
EP1354056B1 (en) * | 2000-10-10 | 2014-11-26 | Danisco US Inc. | Enhanced secretion of a polypeptide by a microorganism |
US7419783B2 (en) * | 2001-11-05 | 2008-09-02 | Research Development Foundation | Engineering of leader peptides for the secretion of recombinant proteins in bacteria |
-
2003
- 2003-03-24 AT AT03716803T patent/ATE348146T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-03-24 CN CNB038116480A patent/CN100516194C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-03-24 CA CA002480159A patent/CA2480159A1/en not_active Abandoned
- 2003-03-24 WO PCT/US2003/008969 patent/WO2003083056A2/en active IP Right Grant
- 2003-03-24 US US10/395,897 patent/US20030219870A1/en not_active Abandoned
- 2003-03-24 EP EP03716803A patent/EP1487966B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-24 JP JP2003580492A patent/JP2005520569A/ja active Pending
- 2003-03-24 DE DE60310385T patent/DE60310385T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-24 AU AU2003220493A patent/AU2003220493B2/en not_active Ceased
-
2010
- 2010-08-30 US US12/871,618 patent/US20110046011A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08289794A (ja) * | 1995-04-11 | 1996-11-05 | Behringwerke Ag | 大腸菌における抗体、抗体フラグメントおよび抗体フラグメント融合分子の細胞質発現 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
J BACTERIOL. 2001 DEC;183(23):6727-32., JPN6009030997, ISSN: 0001353767 * |
MOL MICROBIOL. 2002;43(4):1005-1021, JPN6009030995, ISSN: 0001353766 * |
PROC NATL ACAD SCI U S A. 1999 NOV 23;96(24):13703-8., JPN6009031003, ISSN: 0001353769 * |
PROTEIN EXPR PURIF. 2001 NOV;23(2):338-47., JPN6009031001, ISSN: 0001353768 * |
Cited By (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11976127B1 (en) | 2007-07-09 | 2024-05-07 | Genentech, Inc. | Prevention of disulfide bond reduction during recombinant production of polypeptides |
JP2014129358A (ja) * | 2007-07-09 | 2014-07-10 | Genentech Inc | ポリペプチドの組換え生産中におけるジスルフィド結合還元の防止 |
US10759866B2 (en) | 2007-07-09 | 2020-09-01 | Genentech, Inc. | Prevention of disulfide bond reduction during recombinant production of polypeptides |
US10808037B1 (en) | 2007-07-09 | 2020-10-20 | Genentech, Inc. | Prevention of disulfide bond reduction during recombinant production of polypeptides |
US10906986B2 (en) | 2007-07-09 | 2021-02-02 | Genentech, Inc. | Prevention of disulfide bond reduction during recombinant production of polypeptides |
US11078294B2 (en) | 2007-07-09 | 2021-08-03 | Genentech, Inc. | Prevention of disulfide bond reduction during recombinant production of polypeptides |
US11639395B2 (en) | 2007-07-09 | 2023-05-02 | Genentech, Inc. | Prevention of disulfide bond reduction during recombinant production of polypeptides |
US11987638B1 (en) | 2007-07-09 | 2024-05-21 | Genentech, Inc. | Prevention of disulfide bond reduction during recombinant production of polypeptides |
US11987637B1 (en) | 2007-07-09 | 2024-05-21 | Genentech, Inc. | Prevention of disulfide bond reduction during recombinant production of polypeptides |
US11999791B2 (en) | 2007-07-09 | 2024-06-04 | Genentech, Inc. | Prevention of disulfide bond reduction during recombinant production of polypeptides |
US8871477B2 (en) | 2010-02-23 | 2014-10-28 | Toray Industries, Inc. | Process for production of cadaverine |
JP5853695B2 (ja) * | 2010-02-23 | 2016-02-09 | 東レ株式会社 | カダベリンの製造方法 |
WO2011105344A1 (ja) * | 2010-02-23 | 2011-09-01 | 東レ株式会社 | カダベリンの製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1656213A (zh) | 2005-08-17 |
WO2003083056A2 (en) | 2003-10-09 |
ATE348146T1 (de) | 2007-01-15 |
CA2480159A1 (en) | 2003-10-09 |
AU2003220493A1 (en) | 2003-10-13 |
EP1487966B1 (en) | 2006-12-13 |
US20030219870A1 (en) | 2003-11-27 |
EP1487966A2 (en) | 2004-12-22 |
AU2003220493B2 (en) | 2008-06-05 |
WO2003083056A3 (en) | 2004-07-15 |
CN100516194C (zh) | 2009-07-22 |
DE60310385D1 (de) | 2007-01-25 |
DE60310385T2 (de) | 2007-09-20 |
EP1487966A4 (en) | 2005-11-23 |
US20110046011A1 (en) | 2011-02-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20110046011A1 (en) | Secretion of proteins with multiple disulfide bonds in bacteria and uses thereof | |
Georgiou et al. | Preparative expression of secreted proteins in bacteria: status report and future prospects | |
US7419783B2 (en) | Engineering of leader peptides for the secretion of recombinant proteins in bacteria | |
US20080254511A1 (en) | Process for the fermentative production of proteins | |
US20080076157A1 (en) | Signal peptide for the production of recombinant proteins | |
JP2002504826A (ja) | 細菌細胞における異種ジスルフィド結合含有ポリペプチドを生成する方法 | |
US20090148894A1 (en) | Methods for optimizing the secretion of protein in prokaryotes | |
JP5591445B2 (ja) | 異種タンパク質の製造方法、タンパク質の分泌方法並びに前記方法の実施のためのe.コリ菌株 | |
US20050147962A1 (en) | Display of dimeric proteins on phage | |
JP2014512814A (ja) | 大腸菌での異種タンパク質生成のための新規発現および分泌ベクター系 | |
AU777246B2 (en) | Microbial protein expression system | |
US20140154742A1 (en) | Novel expression and secretion vector systems for heterologous protein production in escherichia coli | |
JP7242829B2 (ja) | 新規細菌lpp突然変異体及び組換えタンパク質の分泌産生のためのその使用 | |
DK175020B1 (da) | Fremgangsåde til udtrykkelse og ekstracellulær udskillelse af proteiner i G(-)bakterie, rekombinant DNA-konstruktion og plasmidvektor kodende herfor, samt G(-)bakterie indeholdende disse | |
EP1451367A2 (en) | Engineering of leader peptides for the secretion of recombinant proteins in bacteria | |
AU2002360348B2 (en) | Engineering of leader peptides for the secretion of recombinant proteins in bacteria | |
US7829687B2 (en) | Artificial disulfide isomerases and uses thereof | |
WO2008025744A1 (en) | Extra-cellular production of recombinant proteins | |
AU2002360348A1 (en) | Engineering of leader peptides for the secretion of recombinant proteins in bacteria | |
AU779150B2 (en) | Production of heterologous proteins | |
CN114829578A (zh) | 用于在发酵方法中释放重组蛋白的细菌菌株 | |
Swartz et al. | Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060316 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060316 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090623 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090918 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20091027 |