JP6774164B2 - マウスＦｃγＲＩＩ特異的Ｆｃ抗体 - Google Patents

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Description

本発明は、マウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドに関する。また、本発明は、該Fc変異体を用いて、ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドのヒトにおける作用を予測する方法に関する。さらに、本発明は、該方法を用いて得られた情報をもとに作製されたポリペプチドおよびそれを有効成分として含むヒト疾患の治療または予防剤に関する。
抗体は血中での安定性が高く、副作用も少ないことから医薬品として注目されている（非特許文献1、非特許文献2）。現在上市されている抗体医薬のほとんどがヒトIgG1サブクラスの抗体である。IgGクラスの抗体の機能の1つとして、抗体依存性細胞障害活性（以下、ADCC活性と表記する）が知られている（非特許文献3）。抗体がADCC活性を発揮するためには、抗体のFc領域とキラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等のエフェクター細胞表面上に存在する抗体結合レセプターであるFcγレセプター（以下、FcγRと表記する）との結合が必要である。
ヒトでは、FcγRのタンパク質ファミリーには、FcγRIa (CD64A)、FcγRIIa (CD32A)、FcγRIIb (CD32B)、FcγRIIIa (CD16A)、FcγRIIIb (CD16B)のアイソフォームが報告されており、それぞれのアロタイプも報告されている（非特許文献7）。FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIaは免疫活性的な機能を有するため活性型FcγRと呼ばれ、FcγRIIbは免疫抑制的な機能を有し、抑制型FcγRと呼ばれる（非特許文献8）。
Fc領域とFcγRとの結合については、抗体のヒンジ領域及びCH2ドメイン内のいくつかのアミノ酸残基およびCH2ドメインに結合しているEUナンバリング297番目のAsnに付加される糖鎖が重要であることが示されている（非特許文献4、非特許文献5、非特許文献6、非特許文献47）。これらの箇所へ変異を導入した抗体を中心に、これまでに様々なFcγR結合特性を持つ変異体が研究され、活性型FcγRに対するより高い結合活性を有するFc変異体が得られている（特許文献1、特許文献2、特許文献３、特許文献４、特許文献6、特許文献7、特許文献8）。
活性型FcγRは免疫複合体で架橋されると、細胞内ドメインもしくは相互作用相手であるFcR common γ-chainに含まれるimmunoreceptor tyrosine-based activating motifs (ITAMs) のリン酸化を引き起こし、シグナル伝達物質であるSYKを活性化し、活性化シグナルカスケードを開始することで炎症性免疫反応を引き起こす（非特許文献9）。
FcγRIIbはB細胞に発現している唯一のFcγRである（非特許文献10）。FcγRIIbに対して抗体のFc領域が相互作用することで、B細胞の初回免疫が抑制されることが報告されている（非特許文献11）。また、B細胞上のFcγRIIbとB細胞受容体（B cell receptor：BCR）とが血中の免疫複合体を介して架橋されると、B細胞の活性化が抑制され、B細胞の抗体産生が抑制されることが報告されている（非特許文献12）。このBCRとFcγRIIbを介した免疫抑制的なシグナルの伝達にはFcγRIIbの細胞内ドメインに含まれるimmunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif（ITIM）が必要である（非特許文献13、非特許文献14）。シグナルが入り、ITIMがリン酸化されると、SH2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase（SHIP）がリクルートされ、他の活性型FcγRのシグナルカスケードの伝達を阻害し、炎症性免疫反応を抑制する（非特許文献15）。また、FcγRIIbのみを会合化することによっても、BCR非依存的にIgM産生B細胞をアポトーシスすることなく、B細胞の増殖とBCRの架橋によるカルシウム流入を一過的に抑制することが報告されている (非特許文献16)。
また、FcγRIIbは樹状細胞、マクロファージ、活性化された好中球、マスト細胞、好塩基球でも発現している。これらの細胞においても、FcγRIIbはphagocytosisや炎症性サイトカインの放出等の活性型FcγRの機能を阻害し、炎症性免疫反応を抑制する（非特許文献8）。
FcγRIIbの免疫抑制的な機能の重要性については、これまでにFcγRIIbノックアウトマウスを用いた研究により明らかにされてきた。FcγRIIbノックアウトマウスでは、液性免疫が適切に制御されず（非特許文献17）、コラーゲン誘導関節炎（CIA）に対する感受性が増加したり（非特許文献18）、ループス（lupus）様の症状を呈したり、グッドパスチャー（Goodpasture）シンドローム様の症状を呈したりする（非特許文献19）ことが報告されている。
また、FcγRIIbの調節不全はヒトの自己免疫疾患との関連も報告されている。例えば、FcγRIIbのプロモーター領域や細胞膜貫通領域における遺伝子多型と、全身性エリテマトーデス（SLE）の発症頻度との関連（非特許文献20、非特許文献21、非特許文献22、非特許文献23、非特許文献24）や、SLE患者のB細胞表面におけるFcγRIIbの発現低下が報告されている（非特許文献25、非特許文献26）。
このようにマウスモデルおよび臨床上の知見から、FcγRIIbはB細胞との関与を中心に、自己免疫疾患、炎症性疾患を制御する役割を果たしていると考えられ、自己免疫疾患、炎症性疾患を制御するための有望な標的分子である。
市販の抗体医薬として主に用いられているIgG1はFcγRIIbだけでなく、活性型FcγRにも強く結合することが知られている（非特許文献27）。FcγRIIbに対する結合を増強した、あるいは活性型FcγRと比較してFcγRIIbへの結合の選択性を向上させたFc変異体を利用することで、IgG1と比べて免疫抑制的な性質を有した抗体医薬の開発可能性が考えられる。例えば、BCRに結合する可変領域と、FcγRIIbに対する結合を増強したFc変異体を有する抗体を利用することで、B細胞の活性化を阻害する可能性が示唆されている（非特許文献28）。B細胞上のFcγRIIbとＢ-cell receptorに結合したIgEとが架橋されることで、B細胞のプラズマ細胞への分化、その結果として起こるIgE産生が抑制され、ヒトPBMCを移植したマウスにおいてヒトIgGやIgM濃度は維持されているが、ヒトIgE濃度は減少することが報告されている（非特許文献29）。IgEだけではなく、B-cell receptor複合体を形成するCD79bとFcγRIIBとを抗体で架橋した場合にはin vitroにおいてB細胞の増殖が抑制され、コラーゲン関節炎モデルにおいて症状を緩和したことが報告されている (非特許文献30)。
B細胞以外にも、IgEの受容体であるFcεRIと結合するIgEのFc部分とFcγRIIbに対する結合を増強したIgGのFc部分とを融合させた分子を使って、マスト細胞上のFcεRIとFcγRIIbとを架橋することで、FcγRIIbのリン酸化を引き起こし、FcεRI依存的なカルシウムの流入を抑制することが報告されており、これはFcγRIIbに対する結合を増強することでFcγRIIbの刺激を介した脱顆粒の阻害が可能であることを示唆している (非特許文献31)。
これらのことから、FcγRIIbに対する結合活性を向上させたFc変異体を持つ抗体が自己免疫疾患等の炎症性疾患の治療薬として有望であることが示唆される。
また、FcγRIIbに対する結合を増強した変異体は、自己免疫疾患等の炎症性疾患の治療薬に加えてがん治療薬としても有望であることが示唆されている。これまでに、FcγRIIbは TNFレセプターファミリーに対するアゴニスト抗体のアゴニスト活性においても重要な役割を果たすことが明らかにされている。具体的にはTNFレセプターファミリーに含まれるCD40、DR4、DR5、CD30、CD137に対する抗体のアゴニスト活性にはFcγRIIbとの相互作用が必要であることが示唆されている（非特許文献32, 33, 34, 35, 36, 37）。非特許文献32においては、FcγRIIbに対する結合を増強した抗体を用いることで、抗CD40抗体の抗腫瘍効果が増強することが示されている。このことから、FcγRIIbに対する結合を増強した抗体はTNFレセプターファミリーに対する抗体を始めとするアゴニスト抗体のアゴニスト作用を増強する効果があると期待される。
これまでにFcγRIIbに対する結合活性を向上させたFc変異体を持つ抗体についての報告はなされている（非特許文献28）。この文献中では、抗体のFc領域にS267E/L328F、G236D/S267E、S239D/S267E等の改変を加えることで、FcγRIIbに対する結合活性を向上させていた。この中で、S267E/L328Fの変異を導入した抗体が最も強くFcγRIIbに対して結合し、FcγRIaおよびFcγRIIaのH型に対する結合は天然型IgG1と同程度に維持していた。しかし、別の報告によると、この改変はFcγRIIaのR型に対する結合がFcγRIIbに対する結合と同程度に数百倍増強しており、FcγRIIa R型と比較した場合、FcγRIIbに対する結合の選択性が向上していない（特許文献5）。さらに、同文献内においてこのS267E/L328Fの変異を導入した抗体のマウスFcγRII（FcγRIIbのマウスホモログ）に対する結合活性が評価されているが、結合活性の増強は見られておらず、FcγRIIb結合増強における種交差性の低さが示唆されている。
いくつかの抗体医薬においてはIgGとFcγRとの相互作用に由来する副作用が報告されている。例えば、VEGFに対する抗体であるbevacizumabが投与された患者群では血栓塞栓症の頻度が上昇することが知られている（非特許文献38）。また、CD40リガンドに対する抗体の臨床開発試験においても同様に血栓塞栓症が観察され、臨床試験が中止された（非特許文献39）。血小板の細胞上には活性型FcγレセプターであるFcγRIIaが発現している（非特許文献40）が、動物モデルなどを使ったその後の研究により、投与されたいずれの抗体も血小板上のFcγRIIaに対する結合を介して血小板が凝集し、その結果血栓を形成することが示唆されている（非特許文献41、 非特許文献42）。自己免疫疾患の一つである全身性エリテマトーデスの患者においてはFcγRIIa依存的な機構によって血小板が活性化し、血小板の活性化が重症度と相関すると報告されている（非特許文献43）。
また、これまでに動物モデルを用いた研究により、抗体と多価抗原の免疫複合体が活性型FcγRを介してアナフィラキシーを誘導することも報告されている（非特許文献44）。
加えて、活性型のFcγRを介して多価抗原と抗体の免疫複合体が取り込まれることにより、その抗原に対する抗体価の産生が高くなることが報告されている（非特許文献45、非特許文献46）。この結果は多価抗原を認識する抗体医薬品の場合、抗体医薬品自身に対する抗体が産生しやすくなる可能性を示唆している。抗体医薬品に対する抗体が産生された場合、その血中動態が悪化する、あるいは中和抗体が医薬品の効果を減弱させることが考えられる。
このように、抗体が多価抗原と結合することで免疫複合体を形成し、その複合体が活性型FcγRと相互作用することで様々な副作用を誘導することが考えられ、抗体の医薬品としての価値を減じてしまう。この問題を回避しながらも、FcγRIIbを介した作用を維持するためには、FcγRIIbに対する結合は維持しつつ、活性型FcγRに対する結合を選択的に減弱することが望ましい。しかし、マウスFcγRに対してこのような特徴を備えたFc変異体の報告はない。
上述のようにヒトFcγRに対してはFcγRIIbに対する結合の選択性を一部向上させたFc変異体の報告はあるが、マウスFcγRに対してその対応するホモログであるFcγRIIに対する結合の選択性を向上させたFc変異体の報告は存在しない。このようなFc変異体が存在しないために、マウスにおいて確立されている様々な病態モデルにおいて、FcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体の効果は十分に検証されていない。従来は、FcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体の効果を評価するために、ヒトFcγRIIbトランスジェニックマウスを利用する (非特許文献30、31、32)、あるいはヒトPBMCを移植したSCIDマウスを利用する（非特許文献29、31）などの方法で検証されてきた。しかし、前者については病態モデルとの交配をしなければ、FcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体の病態モデルにおける効果を検証することはできず、トランスジェニックマウスにおける導入遺伝子の機能が必ずしも本来の機能を発揮するとは限らないという問題点がある。後者については、血球系の細胞についてはヒトFcγRIIbを発現しているが、それ以外の組織においてはマウス由来のFcγRが発現しており、ヒトFcγRIIbを介した効果のみを評価することができない。そのため、マウスにおいて確立されている様々な病態モデルにおいて、FcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体の効果はこれまで十分に評価できていない。しかし、マウスFcγRIIに対して選択的に結合するFc変異体を創出することができれば、上記のような制約はなく、様々な病態モデルマウスにおける効果を検証することが可能となり、FcγRIIb に対して選択的に結合するFc変異体のヒトにおける効果を見極めるのに極めて有用である。このような観点から、マウスFcγRIIに対して選択的に結合するFc変異体の創出が求められていた。
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本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的はマウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドを提供することにある。また、該Fc変異体を用いて、ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドのヒトにおける作用を予測する方法を提供することにある。さらに、本発明は、該方法を用いて得られた情報をもとに作製されたポリペプチドおよびそれを有効成分として含むヒト疾患の治療または予防剤を提供することにある。
本発明者らは、マウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドについて鋭意研究を行った。その結果、本発明者らは、Fc領域にアミノ酸改変を導入することにより、マウスFcγRIIに対する結合活性および／または結合選択性が顕著に増大したFc変異体を多数見出すことに成功した。
本発明は、このような知見に基づくものであり、具体的には以下の発明に関する。
〔１〕 Fc領域を含む親ポリペプチドの変異体で、該Fc領域に少なくとも一つのアミノ酸改変を含み、かつ〔マウスFcγRIIIに対するKD値〕／〔マウスFcγRIIに対するKD値〕の比が6以上であるポリペプチド。
〔２〕 Fc領域を含む親ポリペプチドの変異体で、該Fc領域に少なくとも一つのアミノ酸改変を含み、かつマウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対する結合選択性が親ポリペプチドより5倍以上向上しているポリペプチド。
〔３〕マウスFcγRIIに対するKD値が20nM以下である、〔１〕または〔２〕に記載のポリペプチド。
〔４〕マウスFcγRIIに対する結合活性が親ポリペプチドより10倍以上増強している、〔１〕または〔２〕に記載のポリペプチド。
〔５〕 マウスFcγRIIIに対するKD値が1μM以上である、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔６〕 マウスFcγRIIIに対する結合活性が親ポリペプチドの0.25倍以下に減弱している、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔７〕 アミノ酸改変が、EUナンバリング230番目、231番目、232番目、237番目、238番目、239番目、240番目、241番目、266番目、267番目、268番目、271番目、295番目、296番目、298番目 、324番目、326番目、327番目、330番目、331番目、333番目、334番目、335番目、337番目のアミノ酸のグループから選択される少なくとも一つのアミノ酸の改変である、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔８〕 アミノ酸改変が、EUナンバリング；
230番目のアミノ酸のAsp、Glu、Ile、Pro、GlnまたはValへの置換、
231番目のアミノ酸のAla、Asp、Glu、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、ThrまたはTrpへの置換、
232番目のアミノ酸のAla、Asp、Glu、Phe、Lys、Leu、Asn、Val、TrpまたはTyrへの置換、
237番目のアミノ酸のGluへの置換、
238番目のアミノ酸のAsp 、Glu、ProまたはGlnへの置換、
239番目のアミノ酸のAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、TrpまたはTyrへの置換、
240番目のアミノ酸のGlu、His、GlnまたはTrpへの置換、
241番目のアミノ酸のAsp、Glu、Thr、TrpまたはTyrへの置換、
266番目のアミノ酸のLeuへの置換、
267番目のアミノ酸のAla、GluまたはMetへの置換、
268番目のアミノ酸のAspへの置換、
271番目のアミノ酸のLeuへの置換、
295番目のアミノ酸のLeuへの置換、
296番目のアミノ酸のGlu、Asn、Thr、またはTrpへの置換、
298番目のアミノ酸のHis、Leu、またはMetへの置換、
324番目のアミノ酸のAsp、Leu、またはMetへの置換、
326番目のアミノ酸のAspへの置換、
327番目のアミノ酸のGlyへの置換、
330番目のアミノ酸のGly、Lys、またはGlnへの置換、
331番目のアミノ酸のAsp、Phe、またはTyrへの置換、
333番目のアミノ酸のAsn、Val、またはTyrへの置換、
334番目のアミノ酸のArgへの置換、
335番目のアミノ酸のAsnまたはTyrへの置換、
337番目のアミノ酸のIle、Lys、またはTrpへの置換、
のグループから選択される少なくとも一つの改変である、〔７〕に記載のポリペプチド。
〔９〕 Fc領域がマウスIgG1のFc領域である、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔１０〕 ポリペプチドが抗体である、〔１〕から〔９〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔１１〕 Fc領域を含む親ポリペプチドを改変して、〔マウスFcγRIIIに対するKD値〕／〔マウスFcγRIIに対するKD値〕の比を6以上にする方法であって、該Fc領域のEUナンバリング230番目、231番目、232番目、237番目、238番目、239番目、240番目、241番目、266番目、267番目、268番目、271番目、295番目、296番目、298番目、324番目、326番目、327番目、330番目、331番目、333番目、334番目、335番目、337番目のグループから選択される少なくとも一つのアミノ酸に改変を加えることを含む方法。
〔１２〕 Fc領域を含む親ポリペプチドを改変して、マウスFcγRIIIと比較した場合のマウスFcγRIIに対する結合選択性を親ポリペプチドより5倍以上向上させる方法であって、該Fc領域のEUナンバリング230番目、231番目、232番目、237番目、238番目、239番目、240番目、241番目、266番目、267番目、268番目、271番目、295番目、296番目、298番目、324番目、326番目、327番目、330番目、331番目、333番目、334番目、335番目、337番目のグループから選択される少なくとも一つのアミノ酸に改変を加えることを含む方法。
〔１３〕 アミノ酸改変が、EUナンバリング；
230番目のアミノ酸のAsp、Glu、Ile、Pro、GlnまたはValへの置換、
231番目のアミノ酸のAla、Asp、Glu、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、ThrまたはTrpへの置換、
232番目のアミノ酸のAla、Asp、Glu、Phe、Lys、Leu、Asn、Val、TrpまたはTyrへの置換、
237番目のアミノ酸のGluへの置換、
238番目のアミノ酸のAsp、Glu、ProまたはGlnへの置換、
239番目のアミノ酸のAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、TrpまたはTyrへの置換、
240番目のアミノ酸のGlu、His、GlnまたはTrpへの置換、
241番目のアミノ酸のAsp、Glu、Thr、TrpまたはTyrへの置換、
266番目のアミノ酸のLeuへの置換、
267番目のアミノ酸のAla、GluまたはMetへの置換、
268番目のアミノ酸のAspへの置換、
271番目のアミノ酸のLeuへの置換、
295番目のアミノ酸のLeuへの置換、
296番目のアミノ酸のGlu、Asn、Thr、またはTrpへの置換、
298番目のアミノ酸のHis、Leu、またはMetへの置換、
324番目のアミノ酸のAsp、Leu、またはMetへの置換、
326番目のアミノ酸のAspへの置換、
327番目のアミノ酸のGlyへの置換、
330番目のアミノ酸のGly、Lys、またはGlnへの置換、
331番目のアミノ酸のAsp、Phe、またはTyrへの置換、
333番目のアミノ酸のAsn、Val、またはTyrへの置換、
334番目のアミノ酸のArgへの置換、
335番目のアミノ酸のAsnまたはTyrへの置換、
337番目のアミノ酸のIle、Lys、またはTrpへの置換、
のグループから選択される少なくとも一つの改変である、〔１１〕または〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕 Fc領域がマウスIgG1のFc領域である、〔１１〕から〔１３〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕 ポリペプチドが抗体である、〔１１〕から〔１４〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕 Fc領域を含む親ポリペプチドの変異体で、〔マウスFcγRIIIに対するKD値〕／〔マウスFcγRIIに対するKD値〕の比が6以上のポリペプチドを製造する方法であって、該Fc領域のEUナンバリング230番目、231番目、232番目、237番目、238番目、239番目、240番目、241番目、266番目、267番目、268番目、271番目、295番目、296番目、298番目、324番目、326番目、327番目、330番目、331番目、333番目、334番目、335番目、337番目のグループから選択される少なくとも一つのアミノ酸に改変を加えることを含む方法。
〔１７〕 Fc領域を含む親ポリペプチドの変異体で、マウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対する結合選択性が親ポリペプチドより5倍以上向上したポリペプチドを製造する方法であって、該Fc領域のEUナンバリング230番目、231番目、232番目、237番目、238番目、239番目、240番目、241番目、266番目、267番目、268番目、271番目、295番目、296番目、298番目、324番目、326番目、327番目、330番目、331番目、333番目、334番目、335番目、337番目のグループから選択される少なくとも一つのアミノ酸に改変を加えることを含む方法。
〔１８〕 アミノ酸改変が、EUナンバリング；
230番目のアミノ酸のAsp、Glu、Ile、Pro、GlnまたはValへの置換、
231番目のアミノ酸のAla、Asp、Glu、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、ThrまたはTrpへの置換、
232番目のアミノ酸のAla、Asp、Glu、Phe、Lys、Leu、Asn、Val、TrpまたはTyrへの置換、
237番目のアミノ酸のGluへの置換、
238番目のアミノ酸のAsp 、Glu、ProまたはGlnへの置換、
239番目のアミノ酸のAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、TrpまたはTyrへの置換、
240番目のアミノ酸のGlu、His、GlnまたはTrpへの置換、
241番目のアミノ酸のAsp、Glu、Thr、TrpまたはTyrへの置換、
266番目のアミノ酸のLeuへの置換、
267番目のアミノ酸のAla、GluまたはMetへの置換、
268番目のアミノ酸のAspへの置換、
271番目のアミノ酸のLeuへの置換、
295番目のアミノ酸のLeuへの置換、
296番目のアミノ酸のGlu、Asn、Thr、またはTrpへの置換、
298番目のアミノ酸のHis、Leu、またはMetへの置換、
324番目のアミノ酸のAsp、Leu、またはMetへの置換、
326番目のアミノ酸のAspへの置換、
327番目のアミノ酸のGlyへの置換、
330番目のアミノ酸のGly、Lys、またはGlnへの置換、
331番目のアミノ酸のAsp、Phe、またはTyrへの置換、
333番目のアミノ酸のAsn、Val、またはTyrへの置換、
334番目のアミノ酸のArgへの置換、
335番目のアミノ酸のAsnまたはTyrへの置換、
337番目のアミノ酸のIle、Lys、またはTrpへの置換、
のグループから選択される少なくとも一つの改変である、〔１６〕または〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕 Fc領域がマウスIgG1のFc領域である、〔１６〕から〔１８〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕 ポリペプチドが抗体である、〔１６〕から〔１９〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕 〔１６〕から〔２０〕のいずれかに記載の方法により製造されたポリペプチド。
〔２２〕 マウスFc領域を含む親ポリペプチドの変異体で、該Fc領域にEUナンバリング；
230番目のアミノ酸のAsp、Glu、Ile、Pro、GlnまたはValへの置換、
231番目のアミノ酸のAla、Asp、Glu、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、ThrまたはTrpへの置換、
232番目のアミノ酸のAla、Asp、Glu、Phe、Lys、Leu、Asn、Val、TrpまたはTyrへの置換、
237番目のアミノ酸のGluへの置換、
238番目のアミノ酸のAsp 、Glu、ProまたはGlnへの置換、
239番目のアミノ酸のAla、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、TrpまたはTyrへの置換、
240番目のアミノ酸のGlu、His、GlnまたはTrpへの置換、
241番目のアミノ酸のAsp、Glu、Thr、TrpまたはTyrへの置換、
266番目のアミノ酸のLeuへの置換、
267番目のアミノ酸のGluまたはMetへの置換、
268番目のアミノ酸のAspへの置換、
271番目のアミノ酸のLeuへの置換、
295番目のアミノ酸のLeuへの置換、
296番目のアミノ酸のGlu、Asn、Thr、またはTrpへの置換、
298番目のアミノ酸のHis、Leu、またはMetへの置換、
324番目のアミノ酸のAsp、Leu、またはMetへの置換、
326番目のアミノ酸のAspへの置換、
327番目のアミノ酸のGlyへの置換、
330番目のアミノ酸のGly、Lys、またはGlnへの置換、
331番目のアミノ酸のAsp、Phe、またはTyrへの置換、
333番目のアミノ酸のAsn、Val、またはTyrへの置換、
334番目のアミノ酸のArgへの置換、
335番目のアミノ酸のAsnまたはTyrへの置換、
337番目のアミノ酸のIle、Lys、またはTrpへの置換、
のグループから選択される少なくとも一つのアミノ酸改変を含むポリペプチド。
〔２３〕 さらに、EUナンバリング；
239番目のアミノ酸のAspまたはGluへの置換、
267番目のアミノ酸のAlaへの置換、
のグループから選択されるアミノ酸改変を含む、〔２２〕に記載のポリペプチド。
〔２４〕 Fc領域がマウスIgG1のFc領域である、〔２２〕または〔２３〕に記載のポリペプチド。
〔２５〕 ポリペプチドが抗体である、〔２２〕から〔２４〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔２６〕 ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドをヒトに投与した場合の疾患の治療または予防効果を予測する方法であって、以下の工程を含む方法；
（ａ）マウス抗原に結合する抗原結合領域を含むポリペプチドを取得する工程、
（ｂ）工程（ａ）で取得されたポリペプチドの抗原結合領域、および〔１〕から〔１０〕、〔２１〕から〔２５〕のいずれかに記載のFc変異体を含むポリペプチドを作製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたポリペプチドを、ヒト疾患のモデルマウスに投与する工程、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の結果、当該マウスに疾患の治療または予防効果が見られた場合、前記マウス抗原に対応するヒト抗原に結合する抗原結合領域、およびヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドが前記ヒト疾患の治療または予防に有効であると判断する工程。
〔２７〕 工程（ｂ）（ｃ）に加えて、
（ｂ'）工程（ａ）で取得されたポリペプチドの抗原結合領域、および天然型IgGのFc領域を含むポリペプチドを作製する工程、
（ｃ'）工程（ｂ'）で作製されたポリペプチドを、ヒト疾患のモデルマウスに投与する工程を含み、かつ工程（ｄ）が、
（ｄ）工程（ｃ）（ｃ'）の結果、工程（ｂ'）のポリペプチドを投与されたマウスに比べて、工程（ｂ）のポリペプチドを投与されたマウスでより強い疾患の治療または予防効果が見られた場合、前記マウス抗原に対応するヒト抗原に結合する抗原結合領域、およびヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドが前記ヒト疾患の治療または予防に有効であると判断する工程である、〔２６〕に記載の方法。
〔２８〕 ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドを用いた治療または予防に適した疾患を選択する方法であって、以下の工程を含む方法；
（ａ）マウス抗原に結合する抗原結合領域を含むポリペプチドを取得する工程、
（ｂ）工程（ａ）で取得されたポリペプチドの抗原結合領域、および〔１〕から〔１０〕、〔２１〕から〔２５〕のいずれかに記載のFc変異体を含むポリペプチドを作製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたポリペプチドを、ヒト疾患のモデルマウスに投与する工程、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の結果、当該マウスに疾患の治療または予防効果が見られた場合、前記マウス抗原に対応するヒト抗原に結合する抗原結合領域、およびヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドを用いた治療または予防に適した疾患として前記ヒト疾患を選択する工程。
〔２９〕 工程（ｂ）（ｃ）に加えて、
（ｂ'）工程（ａ）で取得されたポリペプチドの抗原結合領域、および天然型IgGのFc領域を含むポリペプチドを作製する工程、
（ｃ'）工程（ｂ'）で作製されたポリペプチドを、ヒト疾患のモデルマウスに投与する工程を含み、かつ工程（ｄ）が、
（ｄ）工程（ｃ）（ｃ'）の結果、工程（ｂ'）のポリペプチドを投与されたマウスに比べて、工程（ｂ）のポリペプチドを投与されたマウスでより強い疾患の治療または予防効果が見られた場合、前記マウス抗原に対応するヒト抗原に結合する抗原結合領域、およびヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドを用いた治療または予防に適した疾患として前記ヒト疾患を選択する工程である、〔２８〕に記載の方法。
〔３０〕 ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドを用いた治療または予防に適した標的抗原を選択する方法であって、以下の工程を含む方法；
（ａ）マウス抗原に結合する抗原結合領域を含むポリペプチドを取得する工程、
（ｂ）工程（ａ）で取得されたポリペプチドの抗原結合領域、および〔１〕から〔１０〕、〔２１〕から〔２５〕のいずれかに記載のFc変異体を含むポリペプチドを作製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたポリペプチドを、ヒト疾患のモデルマウスに投与する工程、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の結果、当該マウスに疾患の治療または予防効果が見られた場合、ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドを用いた治療または予防に適した標的抗原として前記マウス抗原に対応するヒト抗原を選択する工程。
〔３１〕 工程（ｂ）（ｃ）に加えて、
（ｂ'）工程（ａ）で取得されたポリペプチドの抗原結合領域、および天然型IgGのFc領域を含むポリペプチドを作製する工程、
（ｃ'）工程（ｂ'）で作製されたポリペプチドを、ヒト疾患のモデルマウスに投与する工程を含み、かつ工程（ｄ）が、
（ｄ）工程（ｃ）（ｃ'）の結果、工程（ｂ'）のポリペプチドを投与されたマウスに比べて、工程（ｂ）のポリペプチドを投与されたマウスでより強い疾患の治療または予防効果が見られた場合、ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドを用いた治療または予防に適した標的抗原として前記マウス抗原に対応するヒト抗原を選択する工程である、〔３０〕に記載の方法。
〔３２〕 ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドを用いた治療または予防に適した抗原結合領域を選択する方法であって、以下の工程を含む方法；
（ａ）同一のマウス抗原に結合する抗原結合領域を含むポリペプチドを複数取得する工程、
（ｂ）工程（ａ）で取得されたポリペプチドの抗原結合領域、および〔１〕から〔１０〕、〔２１〕から〔２５〕のいずれかに記載のFc変異体を含むポリペプチドをそれぞれ作製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたポリペプチドを、ヒト疾患のモデルマウスにそれぞれ投与する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）の結果、より強い治療または予防効果を示したポリペプチドの抗原結合領域を、ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドを用いた前記ヒト疾患の治療または予防に適した抗原結合領域として選択する工程。
〔３３〕 ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドをヒトに投与した場合の安全性または毒性を予測する方法であって、以下の工程を含む方法；
（ａ）マウス抗原に結合する抗原結合領域を含むポリペプチドを取得する工程、
（ｂ）工程（ａ）で取得されたポリペプチドの抗原結合領域、および〔１〕から〔１０〕、〔２１〕から〔２５〕のいずれかに記載のFc変異体を含むポリペプチドを作製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたポリペプチドをマウスに投与する工程、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）で得られた、工程（ｂ）のポリペプチドのマウスにおける安全性または毒性の結果を、前記マウス抗原に対応するヒト抗原に結合する抗原結合領域、およびヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドのヒトにおける安全性または毒性として類推する工程。
〔３４〕 ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドをヒトに投与した場合の薬物動態を予測する方法であって、以下の工程を含む方法；
（ａ）マウス抗原に結合する抗原結合領域を含むポリペプチドを取得する工程、
（ｂ）工程（ａ）で取得されたポリペプチドの抗原結合領域、および〔１〕から〔１０〕、〔２１〕から〔２５〕のいずれかに記載のFc変異体を含むポリペプチドを作製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたポリペプチドをマウスに投与する工程、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）で得られた、工程（ｂ）のポリペプチドのマウスにおける薬物動態の結果を、前記マウス抗原に対応するヒト抗原に結合する抗原結合領域、およびヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドのヒトにおける薬物動態として類推する工程。
〔３５〕 疾患が免疫炎症性疾患である、〔２６〕から〔３２〕のいずれかに記載の方法。
〔３６〕 免疫炎症性疾患が自己免疫疾患である、〔３５〕に記載の方法。
〔３７〕 マウスがヒト抗原を発現する遺伝子改変マウスである、〔２６〕から〔３６〕のいずれかに記載の方法。
〔３８〕 Fc領域がIgGのFc領域である、〔２６〕から〔３７〕のいずれかに記載の方法。
〔３９〕 ポリペプチドが抗体である、〔２６〕から〔３８〕のいずれかに記載の方法。
〔４０〕 〔３０〕または〔３１〕に記載の方法により選択された標的抗原に結合する抗原結合領域、およびヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチド。
〔４１〕 〔３２〕に記載の方法により選択された抗原結合領域、およびヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチド。
〔４２〕 Fc領域がIgGのFc領域である、〔４０〕または〔４１〕に記載のポリペプチド。
〔４３〕 ポリペプチドが抗体である、〔４０〕から〔４２〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔４４〕 〔４０〕から〔４３〕のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分として含む、ヒト疾患の治療または予防剤。
マウスFcγRII（本明細書ではmFcγRIIまたはmFcgRIIとも表記される）（配列番号：２１）およびマウスFcγRIII（本明細書ではmFcγRIIIまたはmFcgRIIIとも表記される）（配列番号：２２）の7位から267位までのアミノ酸の配列を比較した結果を示す図である。mFcγRIIおよびmFcγRIIIにおいて、J Mol Biol (2001) 309, 737-749で示されているhuman IgGのFc領域と相互作用するhuman FcγRの部位と対応する部位を太線で囲んだ。また、その部位内における、mFcγRIIとmFcγRIIIとで残基が異なる部分の下に＊を表示した。 mFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合の比較を示す図であり、実施例３で使用した改変を導入した改変体にラベルした。直線は mFcγRIIに対する結合活性の増強度合とmFcγRIIIに対する結合活性の増強度合が一致するところを示す。 mFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合の比較を示す図であり、EUナンバリングで239番目のSerをAspに置換した改変体、および、この改変に加えてさらにもう一つ改変を導入した改変体にラベルした。 mFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合の比較を示す図であり、H237-mIgG1/MRAL-k0と比較した際にmFcγRIIに対する相対的結合活性が200倍以上増強した改変体にラベルした。 EUナンバリング231番目と232番目のアミノ酸置換によるmFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合の変化を示す図である。 mFcγRIIに対する結合およびmFcγRII/III間の選択性の比較を示す図であり、H237-mIgG1/MRAL-k0と比較した際にmFcγRIIに対する相対的結合活性が200倍以上あるいは相対的I/Aが25倍以上の改変体にラベルした。 mFcγRIIに対する結合およびmFcγRII/III間の選択性に対して、EUナンバリングで239番目のアミノ酸の種類が各鋳型に及ぼす効果を比較した図である。 mFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合の比較を示す図であり、H237-MB397/MRAL-k0と比較した際にmFcγRIIに対する相対的結合活性が1.1倍以上の改変体にラベルした。 mFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合の比較を示す図であり、 H237-MB390/MRAL-k0と比較した際にmFcγRIIに対する相対的結合活性が1.1倍以上の改変体にラベルした。 H237-MB367/L104-mk1、H237-mF46/L104-mk1が、ノーマルマウスに投与されたときの当該マウスの血漿中における投与された各抗体の濃度推移を示す図である。 マウスIgGの重鎖定常領域（配列番号:２４〜２７）、Fc領域を構成するアミノ酸残基と、KabatナンバリングおよびEUナンバリング（本明細書においてEU INDEXとも呼ばれる）との関係を表す。その中のCH1ドメインを示す。KabatナンバリングおよびEUナンバリングは非特許文献（SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST VOL.1 ）の記載内容に基づいて番号を付与した。mIgG1については、同文献中において[CELL, 18, 559-568 (1979); NATURE, 277, 627-633 (1979); GENE, 9, 87-97 (1980)]を参照とする配列(81)を参照した。mIgG2aについては、 同文献中において[NUC. ACIDS RES., 8, 3143-3155 (1980); PROC. NAT. ACAD. SCI. USA, 78, 2442-2446 (1981); NUC. ACIDS RES., 9, 1365-1381 (1981); CELL, 32, 515-523 (1983)]を参照とする配列(92)を参照した。mIgG2bについては、同文献中において[SCIENCE, 206, 1303-1306 (1979)]を参照とする配列(86)を参照した。mIgG3については、同文献中において[EMBO J., 3, 2041-2046 (1984)]を参照とする配列(79)を参照した。 図１１−１の続きの図である。その中のヒンジ部を示す。 図１１−２の続きの図である。その中のCH2ドメインを示す。 図１１−３の続きの図である。その中のCH3ドメインを示す。 ヒトIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4の重鎖定常領域（配列番号：２８〜３１）、Fc領域を構成するアミノ酸残基と、EUナンバリング（本明細書においてEU INDEXとも呼ばれる）との関係を表す。 mFcγRIIに対する結合およびmFcγRII/III間の選択性の比較を示す図であり、各templateと比較した際に相対的I/Aが0.75倍以上の改変体にラベルした。 mFcγRIIに対する結合およびmFcγRII/III間の選択性の比較を示す図であり、H237-mIgG1/MRAL-k0と比較した際に相対的I/Aが70倍以上の改変体にラベルした。 mFcγRIIに対する結合およびmFcγRII/III間の選択性に対して、EUナンバリングで239番目のアミノ酸の種類が各鋳型に及ぼす効果を比較した図である。 mFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合の比較を示す図であり、鋳型としたH237-MB630/MRAL-k0にラベルした。直線は mFcγRIIに対する結合活性の増強度合とmFcγRIIIに対する結合活性の増強度合が一致するところを示す。 mFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合の比較を示す図であり、鋳型としたH237-MB716/MRAL-k0にラベルした。直線は mFcγRIIに対する結合活性の増強度合とmFcγRIIIに対する結合活性の増強度合が一致するところを示す。 mFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合の比較を示す図であり、鋳型とした7つの改変体にラベルした。 mFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合の比較を示す図であり、H237-mIgG1/MRAL-k0と比較した際にmFcγRIIに対する相対的結合活性が0.5倍以上2.0倍以下、かつ相対的I/Aが5倍以上の改変体にラベルした。 H237-mIgG1/L104-mk1、H237-MB477/L104-mk1、およびH237-MB492/L104-mk1がノーマルマウスに投与されたときの、当該マウスの血漿中における各抗体と同時に投与された抗原の濃度推移を示す図である。 H237-mIgG1/L104-mk1、H237-MB477/L104-mk1、およびH237-MB492/L104-mk1がノーマルマウスに投与されたときの、当該マウスの血漿中における投与された各抗体の濃度推移を示す図である。
本発明は、マウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対して選択的に結合するFc変異体に関する。
本発明は、Fc領域を含む親ポリペプチドの変異体で、該Fc領域に少なくとも一つのアミノ酸改変を含み、かつ〔マウスFcγRIIIに対するKD値〕／〔マウスFcγRIIに対するKD値〕の比が6以上であるポリペプチドを提供する。また、本発明は、Fc領域を含む親ポリペプチドの変異体で、該Fc領域に少なくとも一つのアミノ酸改変を含み、かつマウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対する結合選択性が親ポリペプチドより5倍以上向上しているポリペプチドを提供する。
本発明のポリペプチドは、Fc領域を含む親ポリペプチドにおいて、該Fc領域に適当なアミノ酸改変を加えることにより作製することができる。アミノ酸改変の位置や個数、改変の種類などは特に限定されておらず、改変されてできたFc変異体を含むポリペプチドが以下のような性質を有していれば、どのような改変であっても構わない。
・〔マウスFcγRIIIに対するKD値〕／〔マウスFcγRIIに対するKD値〕の比が6以上であること、あるいは
・マウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対する結合選択性が親ポリペプチドより5倍以上向上していること。
マウスFcγRIIとマウスFcγRIIIの選択性は、マウスFcγRIIに対する結合活性とマウスFcγRIIIに対する結合活性の比によって表わすことができる。マウスFcγRIIIと比較した場合のマウスFcγRIIに対する結合選択性を、〔マウスFcγRIIIに対するKD値〕を〔マウスFcγRIIに対するKD値〕で割った値（本明細書においてはI/Aとも表記される）として定義する場合、その値が大きければマウスFcγRIIに対する選択性が高いことを意味し、逆にその値が小さければマウスFcγRIIに対する選択性が低いことを意味する。親ポリペプチドのI/Aおよび改変ポリペプチドのI/Aをそれぞれ算出して、親ポリペプチドのI/Aを1としたときの改変ポリペプチドのI/A（本明細書においては相対的I/Aとも表記される）を求めると、相対的I/Aが1を上回れば当該改変によりマウスFcγRIIに対する選択性が向上したことを意味し、相対的I/Aが1を下回れば当該改変によりマウスFcγRIIに対する選択性が低下したことを意味する。
本発明のポリペプチドにおける〔マウスFcγRIIIに対するKD値〕／〔マウスFcγRIIに対するKD値〕の比は、6以上であり、好ましくは10以上、15以上、20以上、25以上、30以上であり、さらに好ましくは35以上、40以上、50以上、60以上、70以上、80以上、90以上である。また、本発明のポリペプチドにおけるマウスFcγRIIIと比較した場合のマウスFcγRIIに対する結合選択性は、親ポリペプチドより5倍以上向上しており、好ましくは10倍以上、15倍以上、20倍以上、25倍以上、30倍以上向上しており、さらに好ましくは35倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上向上している。
本発明のポリペプチドが有する好ましい性質の一つとして、マウスFcγRIIに対して強く結合する性質を挙げることができる。すなわち、以下のような性質を有することが好ましい。
・マウスFcγRIIに対するKD値が20nM以下であること、あるいは
・マウスFcγRIIに対する結合活性が親ポリペプチドより10倍以上増強していること。
本発明のポリペプチドのマウスFcγRIIに対するKD値は、20nM以下であり、好ましくは10nM以下、4nM以下、2nM以下であり、さらに好ましくは1.5nM以下、1nM以下、0.7nM以下、0.5nM以下である。また、本発明のポリペプチドのマウスFcγRIIに対する結合活性は親ポリペプチドより10倍以上増強しており、好ましくは20倍以上、50倍以上、100倍以上増強しており、さらに好ましくは150倍以上、200倍以上、300倍以上、400倍以上増強している。
また、後述のように、KD値の代りに結合量を指標に用いることもできる。すなわち、本明細書においては、マウスFcγRIIに対する結合活性をマウスFcγRIIに対する結合量と読み替えてもよく、マウスFcγRIIIに対する結合活性をマウスFcγRIIIに対する結合量と読み替えてもよい。
上記のような性質を付与することのできるアミノ酸改変として、例えば、EUナンバリング230番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング231番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング232番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング238番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング239番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング240番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング241番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング266番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング267番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング268番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング271番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング295番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング296番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング298番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング324番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング326番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング327番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング330番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング331番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング333番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング334番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング335番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング337番目のアミノ酸の改変などが挙げられる。これらのアミノ酸改変は１箇所であってもよく、また２箇所以上であってもよい。
さらに好ましいアミノ酸改変としては、例えば、EUナンバリング230番目のアミノ酸をAsp、Glu、Ile、Pro、Gln、またはValに置換する改変、EUナンバリング231番目のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、ThrまたはTrpに置換する改変、EUナンバリング232番目のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Phe、Leu、Asn、Val、Trp、またはTyrに置換する改変、EUナンバリング238番目のアミノ酸をGlu、Pro、またはGlnに置換する改変、EUナンバリング239番目のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、またはTyrに置換する改変、EUナンバリング240番目のアミノ酸をGlu、His、Gln、またはTrpに置換する改変、EUナンバリング241番目のアミノ酸をTrpまたはTyrに置換する改変、EUナンバリング266番目のアミノ酸をLeuに置換する改変、EUナンバリング267番目のアミノ酸をAlaまたはGluに置換する改変、EUナンバリング268番目のアミノ酸をAspに置換する改変、EUナンバリング271番目のアミノ酸をLeuに置換する改変、EUナンバリング295番目のアミノ酸をLeuに置換する改変、EUナンバリング296番目のアミノ酸をGlu、Asn、Thr、またはTrpに置換する改変、EUナンバリング298番目のアミノ酸をLeuまたはMetに置換する改変、EUナンバリング324番目のアミノ酸をAsp、Leu、またはMetに置換する改変、EUナンバリング326番目のアミノ酸をAspに置換する改変、EUナンバリング327番目のアミノ酸をGlyに置換する改変、EUナンバリング330番目のアミノ酸をGly、Lys、またはGlnに置換する改変、EUナンバリング331番目のアミノ酸をAsp、Phe、またはTyrに置換する改変、EUナンバリング333番目のアミノ酸をAsn、Val、またはTyrに置換する改変、EUナンバリング334番目のアミノ酸をArgに置換する改変、EUナンバリング335番目のアミノ酸をAsnまたはTyrに置換する改変、EUナンバリング337番目のアミノ酸をIle、Lys、またはTrpに置換する改変などが挙げられる。これらの改変は１箇所であってもよいし、2箇所以上の組み合わせであってもよい。そのような改変の好ましい例として、表２〜１７、表２４、２５に記載の改変などが挙げられる。
本発明には、マウスFc領域を含む親ポリペプチドの変異体で、該Fc領域に特定のアミノ酸改変を含むポリペプチドが含まれる。そのようなアミノ酸改変としては、EUナンバリング230番目のアミノ酸をAsp、Glu、Ile、Pro、GlnまたはValに置換する改変、231番目のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、ThrまたはTrpに置換する改変、232番目のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Phe、Leu、Asn、Val、TrpまたはTyrに置換する改変、238番目のアミノ酸をGlu、ProまたはGlnに置換する改変、239番目のアミノ酸をAla、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、TrpまたはTyrに置換する改変、240番目のアミノ酸をGlu、His、GlnまたはTrpに置換する改変、241番目のアミノ酸をTrpまたはTyrに置換する改変、266番目のアミノ酸をLeuに置換する改変、267番目のアミノ酸をGluに置換する改変、268番目のアミノ酸をAspに置換する改変、271番目のアミノ酸をLeuに置換する改変、295番目のアミノ酸をLeuに置換する改変、296番目のアミノ酸をGlu、Asn、Thr、またはTrpに置換する改変、298番目のアミノ酸をLeuまたはMetに置換する改変、324番目のアミノ酸をAsp、Leu、またはMetに置換する改変、326番目のアミノ酸をAspに置換する改変、327番目のアミノ酸をGlyに置換する改変、330番目のアミノ酸をGly、Lys、またはGlnに置換する改変、331番目のアミノ酸をAsp、Phe、またはTyrに置換する改変、333番目のアミノ酸をAsn、Val、またはTyrに置換する改変、334番目のアミノ酸をArgに置換する改変、335番目のアミノ酸をAsnまたはTyrに置換する改変、337番目のアミノ酸をIle、Lys、またはTrpに置換する改変などが挙げられる。これらの改変は１箇所であってもよいし、2箇所以上の組み合わせであってもよい。
さらに、これらのアミノ酸改変に加えて、別のアミノ酸改変を含んでいてもよい。そのようなアミノ酸改変としては、EUナンバリング239番目のアミノ酸をAspまたはGluに置換する改変、267番目のアミノ酸をAlaに置換する改変などが好ましい。これらの改変は１箇所であってもよいし、2箇所以上の組み合わせであってもよい。これらの改変の好ましい例として、表２〜１７、表２４、２５に記載の改変などが挙げられる。これらのポリペプチドは、マウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対して選択的に結合する特徴を有する点において有用である。
本発明のポリペプチドが有する別の好ましい性質として、マウスFcγRIIIに対して弱く結合する性質を挙げることができる。すなわち、以下のような性質を有することが好ましい。
・マウスFcγRIIIに対するKD値が1μM以上であること、あるいは
・マウスFcγRIIIに対する結合活性が親ポリペプチドの0.25倍以下に減弱していること。
本発明のポリペプチドのマウスFcγRIIIに対するKD値は、1μM以上であり、好ましくは1.2μM以上、1.5μM以上、2μM以上であり、さらに好ましくは2.5μM以上、3μM以上、4μM以上、5μM以上である。また、本発明のポリペプチドのマウスFcγRIIIに対する結合活性は親ポリペプチドの0.25倍以下に減弱しており、好ましくは0.20倍以下、0.18倍以下、0.16倍以下、0.14倍以下に減弱しており、さらに好ましくは0.12倍以下、0.10倍以下、0.08倍以下、0.06倍以下に減弱している。
また、後述のように、KD値の代りに結合量を指標に用いることもできる。すなわち、本明細書においては、マウスFcγRIIに対する結合活性をマウスFcγRIIに対する結合量と読み替えてもよく、マウスFcγRIIIに対する結合活性をマウスFcγRIIIに対する結合量と読み替えてもよい。
上記のような性質を付与することのできるアミノ酸改変として、例えば、EUナンバリング230番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング231番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング232番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング237番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング238番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング239番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング241番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング267番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング298番目のアミノ酸の改変などが挙げられる。これらのアミノ酸改変は１箇所であってもよく、また２箇所以上であってもよい。
さらに好ましいアミノ酸改変としては、例えば、EUナンバリング230番目のアミノ酸をGlu、Ile、またはGlnに置換する改変、EUナンバリング231番目のアミノ酸をAla、Asp、Asn、Pro、またはThrに置換する改変、EUナンバリング232番目のアミノ酸をAla、Lys、Asn、またはTyrに置換する改変、EUナンバリング237番目のアミノ酸をGluに置換する改変、EUナンバリング238番目のアミノ酸をAspまたはGluに置換する改変、EUナンバリング239番目のアミノ酸をAsp、Glu、Phe、Lys、Leu、Asn、Trp、またはTyrに置換する改変、EUナンバリング241番目のアミノ酸をAsp、GluまたはThrに置換する改変、EUナンバリング267番目のアミノ酸をMetに置換する改変、EUナンバリング298番目のアミノ酸をHisに置換する改変などが挙げられる。これらの改変は１箇所であってもよいし、2箇所以上の組み合わせであってもよい。そのような改変の好ましい例として、表１８〜２３、表２６、２７に記載の改変などが挙げられる。
本発明には、マウスFc領域を含む親ポリペプチドの変異体で、該Fc領域に特定のアミノ酸改変を含むポリペプチドが含まれる。そのようなアミノ酸改変としては、EUナンバリング230番目のアミノ酸をGlu、Ile、またはGlnに置換する改変、231番目のアミノ酸をAla、Asp、Asn、Pro、またはThrに置換する改変、232番目のアミノ酸をAla、Lys、Asn、またはTyrに置換する改変、237番目のアミノ酸をGluに置換する改変、238番目のアミノ酸をAspまたはGluに置換する改変、239番目のアミノ酸をPhe、Lys、Leu、Asn、Trp、またはTyrに置換する改変、241番目のアミノ酸をAsp、GluまたはThrに置換する改変、266番目のアミノ酸をLeuに置換する改変、267番目のアミノ酸をMetに置換する改変、298番目のアミノ酸をHisに置換する改変などが挙げられる。これらの改変は１箇所であってもよいし、2箇所以上の組み合わせであってもよい。
さらに、これらのアミノ酸改変に加えて、別のアミノ酸改変を含んでいてもよい。そのようなアミノ酸改変としては、EUナンバリング239番目のアミノ酸をAspまたはGluに置換する改変などが好ましい。これらの改変は１箇所であってもよいし、2箇所以上の組み合わせであってもよい。これらの改変の好ましい例として、表１８〜２３、表２６、２７に記載の改変などが挙げられる。これらのポリペプチドは、マウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対して選択的に結合する特徴を有する点において有用である。
本発明のポリペプチドが有する別の好ましい性質として、マウスFcγRIIに対しては親ポリペプチドと同等かそれ以上の強さで結合し、かつマウスFcγRIIIに対しては親ポリペプチドと比較して弱く結合する性質を挙げることができる。すなわち、以下のような性質を有することが好ましい。
・マウスFcγRIIに対するKD値が400nM以下であり、かつマウスFcγRIIIに対するKD値が1μM以上であること、あるいは
・マウスFcγRIIに対する結合活性が親ポリペプチドの0.5倍以上であり、かつマウスFcγRIIIに対する結合活性が親ポリペプチドの0.25倍以下であること。
本発明のポリペプチドのマウスFcγRIIに対するKD値は、400nM以下であり、好ましくは360nM以下、320nM以下、280nM以下であり、さらに好ましくは250nM以下、200nM以下、150nM以下、100nM以下であり、かつマウスFcγRIIIに対するKD値は、1μM以上であり、好ましくは1.2μM以上、1.5μM以上、2μM以上であり、さらに好ましくは2.5μM以上、3μM以上、4μM以上、5μM以上である。また、本発明のポリペプチドのマウスFcγRIIに対する結合活性は親ポリペプチドの0.5倍以上であり、好ましくは0.6倍以上、0.75倍以上、1.0倍以上であり、さらに好ましくは1.5倍以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上であり、かつマウスFcγRIIIに対する結合活性は親ポリペプチドの0.25倍以下であり、好ましくは0.20倍以下、0.18倍以下、0.16倍以下、0.14倍以下であり、さらに好ましくは0.12倍以下、0.10倍以下、0.08倍以下、0.06倍以下である。
また、後述のように、KD値の代りに結合量を指標に用いることもできる。すなわち、本明細書においては、マウスFcγRIIに対する結合活性をマウスFcγRIIに対する結合量と読み替えてもよく、マウスFcγRIIIに対する結合活性をマウスFcγRIIIに対する結合量と読み替えてもよい。
本発明におけるポリペプチドとは、複数のアミノ酸を有するペプチド、あるいはタンパク質を指す。それらは生物由来の配列からなるポリペプチドであってもよいし、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであってもよい。また、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれであってもよい。
Fcγ受容体（本明細書ではFcγレセプター、FcγR、FcgRと記載することがある）とは、IgGサブクラスのモノクローナル抗体のFc領域に結合し得る受容体をいい、実質的にFcγ受容体遺伝子にコードされるタンパク質のファミリーのいかなるメンバーをも意味する。ヒトでは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4モノクローナル抗体のFc領域に結合し得る受容体をいい、このファミリーには、アイソフォームFcγRIa、FcγRIbおよびFcγRIcを含むFcγRI（CD64）；アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131（H型）およびR131（R型）を含む）、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）およびFcγRIIcを含むFcγRII（CD32）；およびアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγRIII（CD16）、並びにいかなる未発見のヒトFcγR類またはFcγRアイソフォームまたはアロタイプも含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトFcγ受容体の好適な例としてはヒトFcγRI（CD64）、FcγRIIA（CD32）、FcγRIIB（CD32）、FcγRIIIA（CD16）、FcγRIIIB（CD16）が挙げられる。マウスFcγRとは、マウスIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3モノクローナル抗体のFc領域に結合し得る受容体をいい、実質的にFcγ受容体遺伝子にコードされるタンパク質のファミリーのいかなるメンバーをも意味する。マウスFcγR類には、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）およびFcγRIII-2（CD16-2、またはFcγRIV）、並びにいかなる未発見のマウスFcγR類またはFcγRアイソフォームまたはアロタイプも含まれるが、これらに限定されない。マウスFcγ受容体の好適な例としてはマウスFcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）、FcγRIII-2（CD16-2、またはFcγRIV）が挙げられる。FcγRは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサル由来のものが含まれるが、これらに限定されず、いかなる生物由来でもよい。
ヒトFcγRIのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：１０（NM_000566.3）及び１１（NP_000557.1）に、
ヒトFcγRIIAのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：１２（BC020823.1）及び１３（AAH20823.1）に、
ヒトFcγRIIBのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：１４（BC146678.1）及び１５（AAI46679.1）に、
ヒトFcγRIIIAのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：１６（BC033678.1）及び１７（AAH33678.1）に、及び
ヒトFcγRIIIBのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：１８（BC128562.1）及び１９（AAI28563.1）に記載されている（カッコ内はRefSeq登録番号を示す）。
ヒトFcγRIIaには、FcγRIIaの131番目のアミノ酸がヒスチジン（H型）あるいはアルギニン（R型）に置換された2種類の遺伝子多型が存在する（J Exp Med, 172, 19-25, 1990）。
ヒトFcγRIIbにはスプライシングバリアントとしてFcγRIIb１とFcγRIIb２とが報告されている。また、それ以外にもFcγRIIb3というスプライシングバリアントも報告されている（J. Exp. Med, 1989, 170: 1369）。ヒトFcγRIIbにはこれらに加えて、NCBIに登録されているNP_001002273.1、NP_001002274.1、NP_001002275.1、NP_001177757.1、NP_003992.3のスプライシングバリアントを全て含む。また、ヒトFcγRIIbには既存の報告されたあらゆる遺伝子多型を含み、FｃγRIIb（Arthritis Rheum, 2003, 48: 3242-52, Hum Mol Genet, 2005, 14: 2881-92、Arthritis Rheum. 2002 May;46(5):1242-54.）も含まれ、また今後報告されるあらゆる遺伝子多型も含まれる。
マウスFcγRIのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：３３（NM_010186.5）及び２０（NP_034316.1）に、
マウスFcγRIIのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：３４（NM_010187.2）及び２１（NP_034317.1）に、
マウスFcγRIIIのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：３５（NM_010188.5）及び２２（NP_034318.2）に、及び
マウスFcγRIVのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：３６（NM_144559.2）及び２３（NP_653142.2）にそれぞれ記載されている（カッコ内はNCBI Reference Sequence登録番号を示す）。
マウスFcγRIIにはFcγRIIb1とFcγRIIb2のスプライシングバリアントが報告されており、それぞれGenBank accession NoはM16367、X04648である。その他のスプライシングバリアントがJ. Immunol, 1996, 157: 189やJ. Immunol, 1996, 157: 4707に報告されており、これらもマウスFcγRIIに含まれる。マウスFcγRIIには既存の報告されたあらゆる遺伝子多型を含み、また今後報告されるあらゆる遺伝子多型も含まれる。
後述の実施例にも示されている通り、マウスFcγRIIと最も配列同一性の高いマウスFcγRはマウスFcγRIIIであり（細胞外領域の配列同一性93%）、また、マウスIgG1は4種類のマウスFcγRのうち、マウスFcγRI、FcγRIVには結合せず、マウスFcγRII、FcγRIIIにのみ結合を示す（Science, 310, 1510-1512, 2005）ことなどからすると、マウスFcγRIIに対して選択的に結合するFc変異体としては、天然型IgGのFc領域に比べて、FcγRIIに対する結合活性がより高く、FcγRIIIに対する結合活性がより低い性質を有することが望ましい。本明細書において、マウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対して選択的に結合するFc変異体とは、当該Fc領域の〔マウスFcγRIIIに対するKD値〕を〔マウスFcγRIIに対するKD値〕で割った値が、天然型マウスIgGのFc領域の〔マウスFcγRIIIに対するKD値〕を〔マウスFcγRIIに対するKD値〕で割った値より大きいFc領域を意味する。
天然型IgGとは天然に見出されるIgGと同一のアミノ酸配列を包含し、免疫グロブリンガンマ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。例えば天然型マウスIgGとは天然型マウスIgG1、天然型マウスIgG2a、天然型マウスIgG2b、天然型マウスIgG3などを意味する。天然型ヒトIgGとは天然型ヒトIgG1、天然型ヒトIgG2、天然型ヒトIgG3、天然型ヒトIgG4などを意味する。天然型IgGにはそれから自然に生じる変異体等も含まれる。
天然型IgGの重鎖定常領域とは、天然に見出されるIgGを起源とする重鎖定常領域と同一のアミノ酸配列を包含する重鎖定常領域を意味する。例えば天然型マウスIgGを起源とする重鎖定常領域とは、天然型マウスIgG1を起源とする重鎖定常領域、天然型マウスIgG2aを起源とする重鎖定常領域、天然型マウスIgG2bを起源とする重鎖定常領域、天然型マウスIgG3を起源とする重鎖定常領域を意味する。天然型ヒトIgGを起源とする重鎖定常領域とは、天然型ヒトIgG1を起源とする重鎖定常領域、天然型ヒトIgG2を起源とする重鎖定常領域、天然型ヒトIgG3を起源とする重鎖定常領域、天然型ヒトIgG4を起源とする重鎖定常領域を意味する。天然型IgGの重鎖定常領域にはそれから自然に生じる変異体等も含まれる。天然型マウスIgGの重鎖定常領域は図１１−１〜図１１−４（配列番号：２４〜２７）に、天然型ヒトIgGの重鎖定常領域は図１２（配列番号：２８〜３１）に示されている。天然型IgGの重鎖定常領域には既存の報告されたあらゆる遺伝子多型、および今後報告されるあらゆる遺伝子多型も含まれる。例えば、天然型マウスIgG1の重鎖定常領域としては、配列番号：２４に記載のアミノ酸配列からなるものが知られているが、GenBank accession No. J00453やJ35252などの遺伝子多型も全て天然型マウスIgG1に含まれる。本発明において改変が加えられる主要な位置のアミノ酸残基は、これらの遺伝子多型においても全て共通していることから、本発明はこれらの遺伝子多型に対しても有効である。
Fc領域とは、抗体分子中の、ヒンジ部若しくはその一部、CH2、CH3ドメインからなる領域のことをいう。IgGクラスのFc領域は、EU ナンバリング（本明細書ではEU INDEXとも呼ばれる）（図１１−１〜図１１−４、図１２参照）で、例えば226番目のシステインからC末端、あるいは230番目のプロリンからC末端までを意味するが、これに限定されない。
天然型IgGのFc領域とは、天然に見出されるIgGを起源とするFc領域と同一のアミノ酸配列を包含するFc領域を意味する。例えば天然型マウスIgGを起源とするFc領域とは、天然型マウスIgG1を起源とするFc領域、天然型マウスIgG2aを起源とするFc領域、天然型マウスIgG2bを起源とするFc領域、天然型マウスIgG3を起源とするFc領域を意味する。天然型ヒトIgGを起源とするFc領域とは、天然型ヒトIgG1を起源とするFc領域、天然型ヒトIgG2を起源とするFc領域、天然型ヒトIgG3を起源とするFc領域、天然型ヒトIgG4を起源とするFc領域を意味する。天然型IgGのFc領域にはそれから自然に生じる変異体等も含まれる。天然型マウスIgGのFc領域は図１１−１〜図１１−４（配列番号：２４〜２７）中に含まれる一部として、天然型ヒトIgGのFc領域は図１２（配列番号：２８〜３１）中に含まれる一部として示されている。
Fc領域は、IgGモノクローナル抗体等をペプシン等の蛋白質分解酵素にて部分消化した後に、プロテインAあるいはプロテインGカラムに吸着された画分を再溶出することによって好適に取得され得る。かかる蛋白分解酵素としてはpH等の酵素の反応条件を適切に設定することにより制限的にFabやF(ab')2を生じるように全長抗体を消化し得るものであれば特段の限定はされず、例えば、ペプシンやパパイン等が例示できる。
本明細書で「親ポリペプチド」とは、本発明のポリペプチドの作製の基礎となるポリペプチドを意味する。すなわち、Fc領域を含むポリペプチドであって、該Fc領域にアミノ酸改変が加えられる前のポリペプチドを意味する。本発明における好ましい親ポリペプチドの例は、抗体（IgA、IgD、IgE、IgG、IgM）、特にIgGのFc領域を含むポリペプチドであり、さらに好ましくはマウスまたはヒトIgGのFc領域を含むポリペプチドであり、特に好ましくは、マウスIgG1のFc領域を含むポリペプチドである。また、親ポリペプチドは、天然型IgGのFc領域を含むポリペプチドであってもよく、あるいは天然型IgGのFc領域に本発明のアミノ酸改変以外の改変が加えられたFc変異体を含むポリプチドであってもよい。
本発明のFc領域は、抗体（IgA、IgD、IgE、IgG、IgM）、特にIgGのFc領域であれば限定されないが、好ましくはマウスIgG（IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3）またはヒトIgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）のFc領域であり、さらに好ましくはマウスIgG1のFc領域である。マウスおよびヒトIgGのFc領域のアミノ酸配列は図１１−１〜図１１−４（配列番号：２４〜２７）および図１２（配列番号：２８〜３１）に示されているように公知である。
本発明のポリペプチドは、Fc領域を含むものであれば特に限定されないが、好ましくは抗原結合領域（可変領域、Fab、F(ab')2、Fv、CDRなど）およびFc領域を含むものである。特に好ましくは抗体（IgA、IgD、IgE、IgG、IgM）である。抗体の好ましい例としてIgG、特にマウスIgG（IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3）またはヒトIgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）を挙げることができる。さらに好ましくはマウスIgG1である。マウスおよびヒトIgGの重鎖定常領域のアミノ酸配列は図１１−１〜図１１−４（配列番号：２４〜２７）および図１２（配列番号：２８〜３１）に示されているように公知である。
本発明のポリペプチドとして、他に好ましいのはFc融合タンパク質である。融合されるタンパク質としては、生理活性ペプチド、接着分子、リガンド／受容体、酵素等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。具体的には、TNFR、IL1R、VEGFR、CTLA4等の受容体細胞外領域（Nat Med 2003, 9(1), 47-52、BioDrugs 2006, 20(3), 151-60）、scFv（WO2005/037989）、単ドメイン抗体（WO2004/058821, WO2003/002609）、DARPins（WO2002/020565）、Affibody（WO1995/001937）、Avimer（WO2004/044011, WO2005/040229）、Adnectin（WO2002/032925）等の抗体様分子（Current Opinion in Biotechnology 2006, 17, 653-658、Current Opinion in Biotechnology 2007, 18, 1-10、Current Opinion in Structural Biology 1997, 7, 463-469、Protein Science 2006, 15, 14-27）、アセチルコリン受容体、デスモグレイン1、デスモグレイン3、double stranded-DNA、histidine-tRNA ligase、リボヌクレオタンパク質、snRNPコアタンパク質、Ro/SS-A, La/SS-B、centromere、Ri、トポイソメラーゼ-1、ヒストン、ヌクレオポリン62、Sp100核抗原、ヌクレオポリン210kDa、ガングリオシドGQ1B、ガングリオシド GD3、ガングリオシド GM1、アクチン、トロンビン、リン脂質、好中球細胞質抗原、好中球核周囲抗原、細胞内酵素、平滑筋細胞膜抗原、ミトコンドリア、muscle-specific kinase(MUSK)、voltage-gated calcium channel (P/Q-type)、ヨウ化物ペルオキシダーゼ (microsomal)、TSH受容体、Hu、小脳プルキンエ細胞、アミノフィリン、voltage-gated potassium channel (VGKC)、基底核、N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD65)、アンフィフィシン、aquaporin-4等の自己抗体によって認識される自己抗原等が挙げられる。本発明のポリペプチドは、一般的な抗体のように、一種類の標的分子あるいはエピトープに結合するものであってもよいし、多重特異性抗体のように、複数種類の標的分子あるいはエピトープに結合するものであってもよい。
本発明のポリペプチドに、FcRnに対する結合活性を向上させるアミノ酸置換（J Immunol 2006 Jan 1; 176(1), 346-356、J Biol Chem 2006 Aug 18; 281(33), 23514-23524、Int Immunol 2006 Dec; 18(12), 1759-1769、Nat Biotechnol 2010 Feb; 28(2), 157-159、WO2006/019447、WO2006/053301、WO2009/086320）や、抗体のヘテロジェニティーや安定性を向上させるためのアミノ酸置換（WO2009/041613）を加えてもよい。あるいは、本発明のポリペプチドに、抗原の消失を促進させるためのアミノ酸置換（WO2011/122011、PCT/JP2011/072550）や、複数分子の抗原に繰り返し結合させるためのアミノ酸置換（WO2009/125825、PCT/JP2011/077619）を加えてもよい。
本発明におけるアミノ酸改変の種類は、例えばアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入、修飾のいずれか、またはそれらの組み合わせであってもよいが、好ましくはアミノ酸の置換である。
本発明における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、抗体変異体、抗体断片、多特異性抗体（多重特異性抗体）（例えば、二特異性抗体（二重特異性抗体））、キメラ抗体、ヒト化抗体等、如何なる抗体も含まれる。
本発明の抗体は、抗原の種類や由来となる動物などは限定されず、いかなる抗体でもよい。抗体の由来としては、特に限定されないが、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、サル抗体などを挙げることができる。本発明の抗体として、好ましくはマウスまたはヒトの抗体であり、さらに好ましくはマウスの抗体である。
抗体を作製する方法は当業者によく知られているが、例えばモノクローナル抗体の場合ハイブリドーマ法（Kohler and Milstein, Nature 256, 495 (1975)）、組換え方法（米国特許第4,816,567号）により製造してもよい。また、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい（Clackson et al, Nature 352, 624-628 (1991) ; Marks et al, J Mol Biol 222, 581-597 (1991)）。
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばOverlap Extension PCRが公知である。
３つのCDRと４つのFRが連結された抗体可変領域をコードするDNAとヒト抗体定常領域をコードするDNAとをインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト化抗体発現用ベクターが作成できる。該組込みベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、該組換え細胞を培養し、該ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、該ヒト化抗体が該培養細胞の培養物中に産生される（欧州特許公開EP 239400、国際公開WO1996/002576参照）。
必要に応じ、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。
ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物（国際公開WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735参照）を免疫動物とし、DNA免疫により所望のヒト抗体が取得され得る。
さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域が一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現される。抗原に結合するscFvを発現するファージが選択され得る。選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列が決定できる。抗原に結合するscFvのDNA配列を決定した後、当該可変領域配列を所望のヒト抗体定常領域の配列とインフレームで融合させた後に適当な発現ベクターに挿入することによって発現ベクターが作製され得る。当該発現ベクターを上記に挙げたような好適な発現細胞中に導入し、該ヒト抗体をコードする遺伝子を発現させることにより当該ヒト抗体が取得される。これらの方法は既に公知である（国際公開WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388参照）。
本発明の抗体を構成する可変領域は、任意の抗原を認識する可変領域であることが出来る。
本明細書において抗原は特に限定されず、どのような抗原でもよい。抗原の例としては、例えば、リガンド（サイトカイン、ケモカインなど）、受容体、癌抗原、MHC抗原、分化抗原、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンを一部に含む免疫複合体が好適に挙げられる。
サイトカインの例としては、インターロイキン１〜１８、コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ、Ｍ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦなど）、インターフェロン（ＩＦＮ-α、ＩＦＮ-β、ＩＦＮ-γなど）、成長因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、ＨＧＦなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β）、リンホトキシン、エリスロポエチン、レプチン、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＭＣＡＦ、ＢＭＰを挙げることができる。
ケモカインの例としては、ＣＣＬ１〜ＣＣＬ２８などのＣＣケモカイン、ＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１７などのＣＸＣケモカイン、ＸＣＬ１〜ＸＣＬ２などのＣケモカイン、ＣＸ３ＣＬ１などのＣＸ３Ｃケモカインを挙げることができる。
受容体の例としては、例えば、造血因子受容体ファミリー、サイトカイン受容体ファミリー、チロシンキナーゼ型受容体ファミリー、セリン／スレオニンキナーゼ型受容体ファミリー、TNF受容体ファミリー、Gタンパク質共役型受容体ファミリー、GPIアンカー型受容体ファミリー、チロシンホスファターゼ型受容体ファミリー、接着因子ファミリー、ホルモン受容体ファミリー等の受容体ファミリーに属する受容体などを挙げることができる。これら受容体ファミリーに属する受容体、及びその特徴に関しては、多数の文献、例えば、Cooke BA, King RJB, van der Molen HJ ed. New Comprehesive Biochemistry Vol 18B "Hormones and their Actions Part II"pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV、Patthy（Cell (1990) 61(1), 13-14）、Ullrichら（Cell (1990) 61(2), 203-212）、Massague（eにはアキュート・アクセント記号が付く）（Cell (1992) 69(6), 1067-1070）、Miyajimaら（Annu Rev Immunol (1992) 10, 295-331）、Tagaら（FASEB J (1992) 6, 3387-3396）、Fantlら（Annu Rev Biochem (1993), 62, 453-481）、Smithら（Cell (1994) 76(6), 959-962）、Flower DR（Biochim Biophys Acta (1999) 1422(3), 207-234）等に記載されている。
上記受容体ファミリーに属する具体的な受容体としては、例えば、ヒト又はマウスエリスロポエチン（EPO）受容体（Blood (1990) 76(1), 31-35、Cell (1989) 57(2), 277-285）、ヒト又はマウス顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）受容体（Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87(22), 8702-8706、mG-CSFR、Cell (1990) 61(2), 341-350）、ヒト又はマウストロンボポエチン（TPO）受容体（Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89(12), 5640-5644、EMBO J (1993) 12(7), 2645-53）、ヒト又はマウスインスリン受容体（Nature (1985) 313(6005), 756-761）、ヒト又はマウスFlt-3リガンド受容体（Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91(2), 459-463）、ヒト又はマウス血小板由来増殖因子（PDGF）受容体（Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85(10), 3435-3439）、ヒト又はマウスインターフェロン（IFN）-α、β受容体（Cell (1990) 60(2), 225-234及びCell (1994) 77(3), 391-400）、ヒト又はマウスレプチン受容体、ヒト又はマウス成長ホルモン（GH）受容体、ヒト又はマウスインターロイキン（IL）-10受容体、ヒト又はマウスインスリン様増殖因子（IGF）-I受容体、ヒト又はマウス白血病抑制因子（LIF）受容体、ヒト又はマウス毛様体神経栄養因子（CNTF）受容体等が好適に例示される。
癌抗原は細胞の悪性化に伴って発現する抗原であり、腫瘍特異性抗原とも呼ばれる。又、細胞が癌化した際に細胞表面やタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖も癌抗原であり、癌糖鎖抗原とも呼ばれる。癌抗原の例としては、例えば、上記の受容体としてGPIアンカー型受容体ファミリーに属し、肝癌を初めとする幾つかの癌において発現しているGPC3（Int J Cancer (2003) 103(4), 455-65）、肺癌を初めとする複数の癌で発現するEpCAM（Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86(1), 27-31）、CA19-9、CA15-3、シリアルSSEA-1（SLX）等が好適に挙げられる。
MHC抗原は、主にMHC class I抗原とMHC class II抗原に分類され、MHC class I抗原には、HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-Hが含まれ、MHC class II抗原には、HLA-DR、-DQ、-DPが含まれる。
分化抗原には、CD1、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD71、CD73、CD95、CD102、CD106、CD122、CD126、CDw130が含まれ得る。
免疫グロブリンにはIgA、IgM、IgD、IgG、IgEが含まれる。また免疫複合体は少なくとも免疫グロブリンのいずれかの成分を含む。
その他の抗原としては下記のような分子；17-IA、4-1BB、4Dc、6-ケト-PGF1a、8-イソ-PGF2a、8-オキソ-dG、A1 アデノシン受容体、A33、ACE、ACE-2、アクチビン、アクチビンA、アクチビンAB、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンRIA、アクチビンRIA ALK-2、アクチビンRIB ALK-4、アクチビンRIIA、アクチビンRIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、アドレシン、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、アルファ-1-アンチトリプシン、アルファ−V/ベータ-1アンタゴニスト、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、アルテミン、抗Id、ASPARTIC、心房性ナトリウム利尿因子、av/b3インテグリン、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-リンパ球刺激因子（BlyS）、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2 BMP-2a、BMP-3 オステオゲニン（Osteogenin）、BMP-4 BMP-2b、BMP-5、BMP-6 Vgr-1、BMP-7（OP-1）、BMP-8（BMP-8a、OP-2）、BMPR、BMPR-IA（ALK-3）、BMPR-IB（ALK-6）、BRK-2、RPK-1、BMPR-II（BRK-3）、BMP、b-NGF、BOK、ボンベシン、骨由来神経栄養因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補体因子3（C3）、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、カルシトニン、cAMP、癌胎児性抗原（CEA）、癌関連抗原、カテプシンA、カテプシンB、カテプシンC/DPPI、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンH、カテプシンL、カテプシンO、カテプシンS、カテプシンV、カテプシンX/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33（p67タンパク質）、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80（B7-1）、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、ボツリヌス菌毒素、ウェルシュ菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、サイトケラチン腫瘍関連抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補体制御因子（Decay accelerating factor）、des（1-3）-IGF-I（脳IGF-1）、Dhh、ジゴキシン、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR（ErbB-1）、EMA、EMMPRIN、ENA、エンドセリン受容体、エンケファリナーゼ、eNOS、Eot、エオタキシン1、EpCAM、エフリンB2/EphB4、EPO、ERCC、E-セレクチン、ET-1、ファクターIIa、ファクターVII、ファクターVIIIc、ファクターIX、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、Fas、FcR1、FEN-1、フェリチン、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、フィブリン、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵胞刺激ホルモン、フラクタルカイン、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3（Vgr-2）、GDF-5（BMP-14、CDMP-1）、GDF-6（BMP-13、CDMP-2）、GDF-7（BMP-12、CDMP-3）、GDF-8（ミオスタチン）、GDF-9、GDF-15（MIC-1）、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-アルファ1、GFR-アルファ2、GFR-アルファ3、GITR、グルカゴン、Glut4、糖タンパク質IIb/IIIa（GPIIb/IIIa）、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、成長ホルモン放出因子、ハプテン（NP-capまたはNIP-cap）、HB-EGF、HCC、HCMV gBエンベロープ糖タンパク質、HCMV gHエンベロープ糖タンパク質、HCMV UL、造血成長因子（HGF）、Hep B gp120、ヘパラナーゼ、Her2、Her2/neu（ErbB-2）、Her3（ErbB-3）、Her4（ErbB-4）、単純ヘルペスウイルス（HSV） gB糖タンパク質、HSV gD糖タンパク質、HGFA、高分子量黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3ループ、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、ヒト心臓ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）、ヒト成長ホルモン（HGH）、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受容体、IgE、IGF、IGF結合タンパク質、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、インターフェロン（INF）-アルファ、INF-ベータ、INF-ガンマ、インヒビン、iNOS、インスリンA鎖、インスリンB鎖、インスリン様増殖因子1、インテグリンアルファ2、インテグリンアルファ3、インテグリンアルファ4、インテグリンアルファ4/ベータ1、インテグリンアルファ4/ベータ7、インテグリンアルファ5（アルファV）、インテグリンアルファ5/ベータ1、インテグリンアルファ5/ベータ3、インテグリンアルファ6、インテグリンベータ1、インテグリンベータ2、インターフェロンガンマ、IP-10、I-TAC、JE、カリクレイン2、カリクレイン5、カリクレイン6、カリクレイン11、カリクレイン12、カリクレイン14、カリクレイン15、カリクレインL1、カリクレインL2、カリクレインL3、カリクレインL4、KC、KDR、ケラチノサイト増殖因子（KGF）、ラミニン5、LAMP、LAP、LAP（TGF-1）、潜在的TGF-1、潜在的TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、レフティ、ルイス−Y抗原、ルイス−Y関連抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、リポタンパク質、LIX、LKN、Lptn、L-セレクチン、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黄体形成ホルモン、リンホトキシンベータ受容体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、METALLOPROTEASES、MGDF受容体、MGMT、MHC（HLA-DR）、MIF、MIG、MIP、MIP-1-アルファ、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、ムチン（Muc1）、MUC18、ミュラー管抑制物質、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-Cアドヘリン、NCA 90、NCAM、NCAM、ネプリライシン、ニューロトロフィン-3、-4、または-6、ニュールツリン、神経成長因子（NGF）、NGFR、NGF−ベータ、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲状腺ホルモン、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-カドヘリン、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤性アルカリホスファターゼ（PLAP）、PlGF、PLP、PP14、プロインスリン、プロレラキシン、プロテインC、PS、PSA、PSCA、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、レラキシンA鎖、レラキシンB鎖、レニン、呼吸器多核体ウイルス（RSV）F、RSV Fgp、Ret、リウマイド因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清アルブミン、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72（腫瘍関連糖タンパク質−72）、TARC、TCA-3、T細胞受容体（例えば、T細胞受容体アルファ/ベータ）、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP様アルカリホスファターゼ、TfR、TGF、TGF-アルファ、TGF-ベータ、TGF-ベータ Pan Specific、TGF-ベータRI（ALK-5）、TGF-ベータRII、TGF-ベータRIIb、TGF-ベータRIII、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3、TGF-ベータ4、TGF-ベータ5、トロンビン、胸腺Ck-1、甲状腺刺激ホルモン、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-アルファ、TNF-アルファベータ、TNF-ベータ2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A（TRAIL R1 Apo-2、DR4）、TNFRSF10B（TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B）、TNFRSF10C（TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID）、TNFRSF10D（TRAIL R4 DcR2、TRUNDD）、TNFRSF11A（RANK ODF R、TRANCE R）、TNFRSF11B（OPG OCIF、TR1）、TNFRSF12（TWEAK R FN14）、TNFRSF13B（TACI）、TNFRSF13C（BAFF R）、TNFRSF14（HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2）、TNFRSF16（NGFR p75NTR）、TNFRSF17（BCMA）、TNFRSF18（GITR AITR）、TNFRSF19（TROY TAJ、TRADE）、TNFRSF19L（RELT）、TNFRSF1A（TNF RI CD120a、p55-60）、TNFRSF1B（TNF RII CD120b、p75-80）、TNFRSF26（TNFRH3）、TNFRSF3（LTbR TNF RIII、TNFC R）、TNFRSF4（OX40 ACT35、TXGP1 R）、TNFRSF5（CD40 p50）、TNFRSF6（Fas Apo-1、APT1、CD95）、TNFRSF6B（DcR3 M68、TR6）、TNFRSF7（CD27）、TNFRSF8（CD30）、TNFRSF9（4-1BB CD137、ILA）、TNFRSF21（DR6）、TNFRSF22（DcTRAIL R2 TNFRH2）、TNFRST23（DcTRAIL R1 TNFRH1）、TNFRSF25（DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1）、TNFSF10（TRAIL Apo-2リガンド、TL2）、TNFSF11（TRANCE/RANKリガンド ODF、OPGリガンド）、TNFSF12（TWEAK Apo-3リガンド、DR3リガンド）、TNFSF13（APRIL TALL2）、TNFSF13B（BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20）、TNFSF14（LIGHT HVEMリガンド、LTg）、TNFSF15（TL1A/VEGI）、TNFSF18（GITRリガンド AITRリガンド、TL6）、TNFSF1A（TNF-a コネクチン（Conectin）、DIF、TNFSF2）、TNFSF1B（TNF-b LTa、TNFSF1）、TNFSF3（LTb TNFC、p33）、TNFSF4（OX40リガンド gp34、TXGP1）、TNFSF5（CD40リガンド CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP）、TNFSF6（Fasリガンド Apo-1リガンド、APT1リガンド）、TNFSF7（CD27リガンド CD70）、TNFSF8（CD30リガンド CD153）、TNFSF9（4-1BBリガンド CD137リガンド）、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、トランスフェリン受容体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、腫瘍関連抗原CA125、腫瘍関連抗原発現ルイスY関連炭水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、ウロキナーゼ、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-Cadherin、VE-cadherin-2、VEFGR-1（flt-1）、VEGF、VEGFR、VEGFR-3（flt-4）、VEGI、VIM、ウイルス抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNRインテグリン、フォン・ヴィレブランド因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B／13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG、Hsp90, IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、酸化LDL, PCSK9, prekallikrein , RON, TMEM16F、SOD1, Chromogranin A, Chromogranin B、tau, VAP1、高分子キニノーゲン、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, factor B, factor D, factor H, properdin、sclerostin、fibrinogen, fibrin, prothrombin, thrombin, 組織因子, factor V, factor Va, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor IX, factor IXa, factor X, factor Xa, factor XI, factor XIa, factor XII, factor XIIa, factor XIII, factor XIIIa, TFPI, antithrombin III, EPCR, トロンボモデュリン、TAPI, tPA, plasminogen, plasmin, PAI-1, PAI-2、GPC3、Syndecan-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、LPA、S1Pならびにホルモンおよび成長因子のための受容体が例示され得る。
可変領域を構成するアミノ酸配列は、その抗原結合活性が維持される限り、１または複数のアミノ酸残基の改変が許容される。可変領域のアミノ酸配列を改変する場合、改変される部位や改変の種類、改変されるアミノ酸の数は特に限定されない。例えば、CDRおよび／またはFRに存在するアミノ酸を適宜改変することができる。可変領域のアミノ酸を改変する場合、特に限定されないが、結合活性が維持されていることが好ましく、例えば、改変前と比較して50%以上、好ましくは80%以上、さらに好ましくは100%以上の結合活性を有していることが好ましい。又、アミノ酸改変により結合活性が上昇していてもよく、例えば結合活性が改変前と比較して2倍、5倍、10倍等になっていてもよい。本発明の抗体において、アミノ酸配列の改変とは、アミノ酸残基の置換、欠失、付加、挿入、および修飾の少なくとも１つであることができる。
例えば、可変領域のN末端のグルタミンのピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾は当業者によく知られた修飾である。したがって、本発明の抗体は、その重鎖のN末端がグルタミンの場合には、それがピログルタミン酸に修飾された可変領域を含む。
本発明の抗体の可変領域は、任意の配列であってよく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体、および、これらの非ヒト抗体をヒト化したヒト化抗体、および、ヒト抗体など、どのような由来の抗体の可変領域でもよい。「ヒト化抗体」とは、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される、ヒト以外の哺乳動物由来の抗体、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体のCDRへ移植したものである。CDRを同定するための方法は公知である（Kabat et al, Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md; Chothia et al, Nature (1989) 342, 877）。また、その一般的な遺伝子組換え手法も公知である（欧州特許出願公開番号EP125023号公報、WO96/02576 号公報参照）。また、これらの抗体の可変領域に対して、抗原への結合、薬物動態、安定性、免疫原性を改善するために、様々なアミノ酸置換を導入したものであってもよい。本発明の抗体の可変領域は、pH依存的に抗原に結合することで、抗原に対して繰り返し結合することができてもよい（WO2009/125825）。
抗体の軽鎖定常領域にはκ鎖とλ鎖タイプの定常領域が存在しているが、いずれの軽鎖定常領域であってもよい。さらに、本発明において軽鎖定常領域は、アミノ酸の置換、欠失、付加、挿入および／または修飾などの改変が行われた軽鎖定常領域であってもよい。
抗体の重鎖定常領域には、例えばIgA、IgD、IgE、IgG、IgMの定常領域が存在している。本発明においては、例えばIgGの重鎖定常領域、特にマウスまたはヒトIgGの重鎖定常領域を用いることができ、好ましくはマウスIgG1の重鎖定常領域である。
また本発明の抗体には、抗体の修飾物も含まれる。抗体の修飾物の例としては、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）や細胞障害性物質等の各種分子と結合させた抗体を挙げることができる。このような抗体修飾物は、本発明の抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
さらに、本発明の抗体は多重特異性抗体（multispecific antibody）、特に二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。多重特異性抗体とは、複数の異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体をいうが、当該エピトープは異なる抗原分子内に存在していてもよいし、同一の抗原分子内に存在していてもよい。
本発明のポリペプチドは当業者に公知の方法により製造することができる。例えば、抗体は以下の方法で作製することができるが、これに限定されるものではない。
抗体の重鎖をコードするDNAであって、Fc領域中の1又は複数のアミノ酸が他のアミノ酸に改変された重鎖をコードするDNA、および抗体の軽鎖をコードするDNAを発現させる。Fc領域中の1又は複数のアミノ酸が他のアミノ酸に改変された重鎖をコードするDNAは、例えば、天然型の重鎖をコードするDNAのFc領域を取得し、該Fc領域中の特定のアミノ酸をコードするコドンが他のアミノ酸をコードするコドンになるよう適宜改変を行なうことによって得ることが出来る。
また、あらかじめ、天然型重鎖のFc領域中の1又は複数のアミノ酸が他のアミノ酸に改変された重鎖をコードするDNAを設計し、該DNAを化学的に合成することによって、Fc領域中の1又は複数のアミノ酸が他のアミノ酸に改変された重鎖をコードするDNAを得ることも可能である。アミノ酸の改変される部位や改変の種類、改変されるアミノ酸の数は、特に限定されるものではない。改変の種類は、置換、欠失、付加、挿入、修飾のいずれか、又はそれらの組み合わせであってもよい。
また、Fc領域中において1又は複数のアミノ酸が他のアミノ酸に改変された重鎖をコードするDNAは、部分DNAに分けて製造することができる。部分DNAの組み合わせとしては、例えば、可変領域をコードするDNAと定常領域をコードするDNA、あるいはFab領域をコードするDNAとFc領域をコードするDNAなどが挙げられるが、これらの組み合わせに限定されるものではない。軽鎖をコードするDNAもまた、同様に部分DNAに分けて製造することができる。
上記DNAを発現させる方法としては、以下の方法が挙げられる。例えば、重鎖可変領域をコードするDNAを、重鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込み重鎖発現ベクターを構築する。同様に、軽鎖可変領域をコードするDNAを、軽鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込み軽鎖発現ベクターを構築する。これらの重鎖、軽鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込むことも出来る。
抗体重鎖および軽鎖をコードするDNAを発現ベクターへ組み込む際、発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。その際には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などを用いることができる。
本発明のポリペプチドを生産する目的でベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546、FASEB J (1992) 6, 2422-2427、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（Pharmacia社製）、「QIAexpress system」（QIAGEN社製）、pEGFP、またはpET（この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S P et al, J Bacteriol (1987) 169, 4397、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えばリン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（Boehringer Mannheim製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法など当業者に公知の手法を用いて行うことができる。
本発明のポリペプチドを製造するためのベクターとしては、大腸菌由来の発現ベクターの他にも、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3（Invitrogen社製）や、pEGF-BOS (Nucleic Acids Res 1990, 18(17), 5322、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（GIBCO BRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（Invitrogen社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、MMTV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res (1990) 18, 5322、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、CAGプロモーター（Gene (1991) 108, 193、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、形質転換細胞を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。遺伝子コピー数増幅のための発現ベクターは、選択マーカーとして、他にもアミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。また、宿主細胞としては以下の細胞を用いることができる。真核細胞が宿主細胞として使用される場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が適宜使用され得る。具体的には、動物細胞としては、次のような細胞が例示され得る。
（１）哺乳類細胞、：CHO（Chinese hamster ovary cell line）、COS（Monkey kidney cell line）、ミエローマ（Sp2/O、NS0等）、BHK （baby hamster kidney cell line）、Hela、Vero、HEK293（human embryonic kidney cell line with sheared adenovirus (Ad)5 DNA）、Freestyle 293、PER.C6 cell (human embryonic retinal cell line transformed with the Adenovirus Type 5 (Ad5) E1A and E1B genes)など（Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1)）
（２）両生類細胞：アフリカツメガエル卵母細胞など
（３）昆虫細胞：sf9、sf21、Tn5など
あるいは植物細胞としては、ニコティアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）などのニコティアナ（Nicotiana）属由来の細胞による抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細胞の形質転換には、カルス培養した細胞が適宜利用され得る。 更に真菌細胞としては、次のような細胞を利用することができる。
−酵母：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）などのサッカロミセス（Saccharomyces ）属、メタノール資化酵母（Pichia pastoris）などのPichia属
−糸状菌：アスペスギルス・ニガー（Aspergillus niger）などのアスペルギルス（Aspergillus ）属
発現した抗体の回収は、例えば、形質転換した細胞を培養した後、細胞外培養液又は細胞内抽出液を回収し、そこから抗体を分離、精製することによって行うことが出来る。抗体の分離、精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて行うことができる。
アミノ酸の改変は、当分野において公知の種々の方法により行なうことができる。これらの方法には、次のものに限定されるわけではないが、部位特異的変異誘導法（Hashimoto-Gotoh T, Mizuno T, Ogasahara Y and Nakagawa M (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller MJ, and Smith M (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol 100, 468-500、Kramer W, Drutsa V, Jansen HW, Kramer B, Pflugfelder M and Fritz HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA. Methods Enzymol 154, 350-367、Kunkel TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA 82, 488-492）、PCR変異法、カセット変異法等の方法を好適な例として挙げることができる。
アミノ酸残基を置換する場合には、別のアミノ酸残基に置換することで、例えば次の(a)〜(c)のような点について改変する事を目的とする。
(a) シート構造、若しくは、らせん構造の領域におけるポリペプチドの背骨構造；
(b) 標的部位における電荷若しくは疎水性、または
(c)側鎖の大きさ。
アミノ酸残基は一般の側鎖の特性に基づいて以下のグループに分類される：
(1) 疎水性： ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3) 酸性： Asp、Glu；
(4) 塩基性： His、Lys、Arg；
(5) 鎖の配向に影響する残基： Gly、Pro；及び
(6) 芳香族性： Trp、Tyr、Phe。
これらの各グループ内でのアミノ酸残基の置換は保存的置換と呼ばれ、一方、他グループ間同士でのアミノ酸残基の置換は非保存的置換と呼ばれる。本発明における置換は、保存的置換であってもよく、非保存的置換であってもよく、また保存的置換と非保存的置換の組合せであってもよい。
本発明のアミノ酸の修飾には、翻訳後修飾が含まれる。具体的な翻訳後修飾として、糖鎖の付加あるいは欠損を示すことができる。たとえば、IgG1重鎖定常領域において、EUナンバリングの297番目のアミノ酸残基は、糖鎖で修飾されたものであることができる。あるいは、Fc領域の糖鎖にシアル酸を付加したものであってもよい（MAbs 2010 Sep-Oct; 2(5), 519-27）。修飾される糖鎖構造は限定されない。一般的に、真核細胞で発現される抗体は、定常領域に糖鎖修飾を含む。
ここに示した真核細胞には、酵母や動物細胞が含まれる。たとえばCHO細胞やHEK293細胞は、抗体をコードするDNAを含む発現ベクターで形質転換するための代表的な動物細胞である。他方、当該位置に糖鎖修飾が無いものも本発明の定常領域に含まれる。定常領域が糖鎖で修飾されていない抗体は、抗体をコードする遺伝子を大腸菌などの原核細胞で発現させて得ることができる。
本発明において、本発明のポリペプチドの各種FcγRに対する結合活性は、ELISAやFACS（fluorescence activated cell sorting）、ALPHAスクリーン（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay）、表面プラズモン共鳴（SPR）現象を利用したBIACORE法等によって測定することができる。
ALPHAスクリーンは、ドナーとアクセプターの2つのビーズを使用するALPHAテクノロジーによって下記の原理に基づいて実施される。ドナービーズに結合した分子が、アクセプタービーズに結合した分子と生物学的に相互作用し、2つのビーズが近接した状態の時にのみ、発光シグナルが検出される。レーザーによって励起されたドナービーズ内のフォトセンシタイザーは、周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素はドナービーズ周辺に拡散し、近接しているアクセプタービーズに到達するとビーズ内の化学発光反応を引き起こし、最終的に光が放出される。ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子が相互作用しないときは、ドナービーズの産生する一重項酸素がアクセプタービーズに到達しないため、化学発光反応は起きない。
例えば、ドナービーズに天然型IgGのFc領域を含むポリペプチドを結合し、アクセプタービーズにはFcγ受容体を結合する。変異Fc領域を含む本発明のポリペプチドの非存在下では、天然型IgGのFc領域を含むポリペプチドとFcγ受容体は相互作用し、520-620 nmの発光シグナルを生ずるが、変異Fc領域を含む本発明のポリペプチドの存在下では、天然型IgGのFc領域を含むポリペプチドとFcγ受容体の相互作用は競合により阻害される。競合の結果表れる発光シグナルの減少を定量することによって相対的な結合活性が決定され得る。抗体などの本発明のポリペプチドをSulfo-NHS-ビオチン等を用いてビオチン化することは公知である。Fcγ受容体をGSTでタグ化する方法としては、Fcγ受容体をコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドをインフレームで融合した融合遺伝子を発現可能なベクターに保持した細胞等において発現し、グルタチオンカラムを用いて精製する方法等が適宜採用され得る。得られた発光シグナルは、例えばGRAPHPAD PRISM（GraphPad社、San Diego）等のソフトウェアを用いて非線形回帰解析を利用する一部位競合（one-site competition）モデルに適合させることにより好適に解析される。
表面プラズモン共鳴（SPR）現象を利用したBIACORE法は、以下のように説明される。相互作用を観察する物質の一方（リガンド）をセンサーチップの金薄膜上に固定し、センサーチップの裏側から金薄膜とガラスの境界面で全反射するように光を当てると、反射光の一部に反射強度が低下した部分（SPRシグナル）が形成される。相互作用を観察する物質の他方（アナライト）をセンサーチップの表面に流しリガンドとアナライトが結合すると、固定化されているリガンド分子の質量が増加し、センサーチップ表面の溶媒の屈折率が変化する。この屈折率の変化により、SPRシグナルの位置がシフトする（逆に結合が解離するとシグナルの位置は戻る）。Biacoreシステムは、上記のシフトする量、すなわちセンサーチップ表面での質量変化を縦軸にとり、時間を横軸にとることで、質量の時間変化を測定データとして表示する（センサーグラム）。センサーグラムからセンサーチップ表面に捕捉したリガンドに対するアナライトの結合量が求められる。また、センサーグラムのカーブから結合速度定数（ka）と解離速度定数(kd）が、当該定数の比から解離定数（KD）が求められる。BIACORE法では阻害測定法も好適に用いられる（Proc Natl Acad Sci USA, 103(11), 4005-4010, 2006）。
本発明のポリペプチドの各種FcγRに対する結合活性は、例えば後述の実施例に示されるように、表面プラズモン共鳴（SPR）現象を利用したBIACORE法を用いて好適に測定することができる。具体的には、抗体などの本発明のポリペプチドを直接固定化あるいはProteinA、ProteinL、ProteinA/G、ProteinG、抗lamda鎖抗体、抗kappa鎖抗体、抗原ペプチド、抗原タンパク質等を介して固定化したセンサーチップに対して、各種FcγRをアナライトとして相互作用させる。センサーグラムの解析結果から解離定数（KD）を算出し、その値が小さい場合、当該結合活性が高いと判断し、その値が大きい場合、当該結合活性が低いと判断することができる。あるいは、FcγRを直接固定化あるいは抗タグ抗体等を介して固定化したセンサーチップに対して、評価したい抗体などの本発明のポリペプチドをアナライトとして相互作用させる。センサーグラムの解析結果から解離定数（KD）を算出し、その値が小さい場合、当該結合活性が高いと判断し、その値が大きい場合、当該結合活性が低いと判断することができる。
また、KD値の代りに結合量によっても、本発明のポリペプチドの結合活性を測定することができる。ここで結合量とは、ポリペプチドに対してアナライトを相互作用させた前後で変化したセンサーグラムにおけるRU値の差を、センサーチップにポリペプチドを捕捉させた前後で変化したセンサーグラムにおけるRU値の差で割った値など、評価するポリペプチドの量を本質的に同量にしたときのアナライトの結合量を意味する。
具体的には、抗体などの本発明のポリペプチドを直接固定化あるいはProteinA、ProteinL、ProteinA/G、ProteinG、抗lamda鎖抗体、抗kappa鎖抗体、抗原ペプチド、抗原タンパク質等を介して固定化したセンサーチップに対して、各種FcγRをアナライトとして相互作用させる。その際のセンサーグラム上のレゾナンスユニット（RU）値の変化量を、センサーチップに抗体などの本発明のポリペプチドを固定化した際のレゾナンスユニット（RU）の変化量で割った値を算出し、その値が大きい場合、当該結合活性が高いと判断し、その値が小さい場合、当該結合活性が低いと判断することができる。あるいは、FcγRを直接固定化あるいは抗タグ抗体等を介して固定化したセンサーチップに対して、評価したい抗体などの本発明のポリペプチドをアナライトとして相互作用させる。その際のセンサーグラム上のレゾナンスユニット（RU）値の変化量を、センサーチップにFcγRを固定化した際のレゾナンスユニット（RU）の変化量で割った値を算出し、その値が大きい場合、当該結合活性が高いと判断し、その値が小さい場合、当該結合活性が低いと判断することができる。
また、本発明は、マウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対して選択的に結合するようにFc領域を改変する方法に関する。
本発明は、Fc領域を含む親ポリペプチドを改変して、〔マウスFcγRIIIに対するKD値〕／〔マウスFcγRIIに対するKD値〕の比を6以上にする方法であって、該Fc領域における少なくとも一つのアミノ酸に改変を加えることを含む方法を提供する。また、本発明は、Fc領域を含む親ポリペプチドを改変して、マウスFcγRIIIと比較した場合のマウスFcγRIIに対する結合選択性を親ポリペプチドより5倍以上向上させる方法であって、該Fc領域における少なくとも一つのアミノ酸に改変を加えることを含む方法を提供する。
上記の方法の好ましい態様として、例えば以下のような工程を含んでいてもよい；
・Fc領域を含む親ポリペプチドをコードする核酸を取得する工程、
・該Fc領域における少なくとも一つのアミノ酸に改変が加えられるように、前記核酸を改変する工程、
・宿主細胞に前記改変された核酸を導入し、該核酸によってコードされるポリペプチドが発現するように該宿主細胞を培養する工程、
・前記宿主細胞の培養物から前記親ポリペプチドの変異体を回収する工程。
上記の方法において、〔マウスFcγRIIIに対するKD値〕／〔マウスFcγRIIに対するKD値〕の比は、6以上になり、好ましくは10以上、15以上、20以上、25以上、30以上になり、さらに好ましくは35以上、40以上、50以上、60以上、70以上、80以上、90以上になる。また、マウスFcγRIIIと比較した場合のマウスFcγRIIに対する結合選択性は、親ポリペプチドより5倍以上向上し、好ましくは10倍以上、15倍以上、20倍以上、25倍以上、30倍以上向上し、さらに好ましくは35倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上向上する。
上記の方法により付与される好ましい性質の一つとして、マウスFcγRIIに対して強く結合する性質を挙げることができる。すなわち、以下のような性質を付与することが好ましい。
・マウスFcγRIIに対するKD値を20nM以下にする、あるいは
・マウスFcγRIIに対する結合活性を親ポリペプチドより10倍以上増強させる。
上記の方法において、マウスFcγRIIに対するKD値は、20nM以下になり、好ましくは10nM以下、4nM以下、2nM以下になり、さらに好ましくは1.5nM以下、1nM以下、0.7nM以下、0.5nM以下になる。また、マウスFcγRIIに対する結合活性は親ポリペプチドより10倍以上増強し、好ましくは20倍以上、50倍以上、100倍以上増強し、さらに好ましくは150倍以上、200倍以上、300倍以上、400倍以上増強する。
上記のような性質を付与することのできるアミノ酸改変として、例えば、EUナンバリング230番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング231番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング232番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング238番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング239番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング240番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング241番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング266番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング267番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング268番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング271番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング295番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング296番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング298番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング324番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング326番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング327番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング330番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング331番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング333番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング334番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング335番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング337番目のアミノ酸の改変などが挙げられる。これらのアミノ酸改変は１箇所であってもよく、また２箇所以上であってもよい。
さらに好ましいアミノ酸改変としては、例えば、EUナンバリング230番目のアミノ酸をAsp、Glu、Ile、Pro、Gln、またはValに置換する改変、EUナンバリング231番目のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、ThrまたはTrpに置換する改変、EUナンバリング232番目のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Phe、Leu、Asn、Val、Trp、またはTyrに置換する改変、EUナンバリング238番目のアミノ酸をGlu、Pro、またはGlnに置換する改変、EUナンバリング239番目のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、またはTyrに置換する改変、EUナンバリング240番目のアミノ酸をGlu、His、Gln、またはTrpに置換する改変、EUナンバリング241番目のアミノ酸をTrpまたはTyrに置換する改変、EUナンバリング266番目のアミノ酸をLeuに置換する改変、EUナンバリング267番目のアミノ酸をAlaまたはGluに置換する改変、EUナンバリング268番目のアミノ酸をAspに置換する改変、EUナンバリング271番目のアミノ酸をLeuに置換する改変、EUナンバリング295番目のアミノ酸をLeuに置換する改変、EUナンバリング296番目のアミノ酸をGlu、Asn、Thr、またはTrpに置換する改変、EUナンバリング298番目のアミノ酸をLeuまたはMetに置換する改変、EUナンバリング324番目のアミノ酸をAsp、Leu、またはMetに置換する改変、EUナンバリング326番目のアミノ酸をAspに置換する改変、EUナンバリング327番目のアミノ酸をGlyに置換する改変、EUナンバリング330番目のアミノ酸をGly、Lys、またはGlnに置換する改変、EUナンバリング331番目のアミノ酸をAsp、Phe、またはTyrに置換する改変、EUナンバリング333番目のアミノ酸をAsn、Val、またはTyrに置換する改変、EUナンバリング334番目のアミノ酸をArgに置換する改変、EUナンバリング335番目のアミノ酸をAsnまたはTyrに置換する改変、EUナンバリング337番目のアミノ酸をIle、Lys、またはTrpに置換する改変などが挙げられる。これらの改変は１箇所であってもよいし、2箇所以上の組み合わせであってもよい。そのような改変の好ましい例として、表２〜１７、表２４，２５に記載の改変などが挙げられる。
上記の方法により付与される別の好ましい性質として、マウスFcγRIIIに対して弱く結合する性質を挙げることができる。すなわち、以下のような性質を付与することが好ましい。
・マウスFcγRIIIに対するKD値を1μM以上にする、あるいは
・マウスFcγRIIIに対する結合活性を親ポリペプチドの0.25倍以下に減弱させる。
上記の方法において、マウスFcγRIIIに対するKD値は、1μM以上になり、好ましくは1.2μM以上、1.5μM以上、2μM以上になり、さらに好ましくは2.5μM以上、3μM以上、4μM以下、5μM以上になる。また、マウスFcγRIIIに対する結合活性は親ポリペプチドの0.25倍以下に減弱し、好ましくは0.20倍以下、0.18倍以下、0.16倍以下、0.14倍以下に減弱し、さらに好ましくは0.12倍以下、0.10倍以下、0.08倍以下、0.06倍以下に減弱する。
上記のような性質を付与することのできるアミノ酸改変として、例えば、EUナンバリング230番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング231番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング232番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング237番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング238番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング239番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング241番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング267番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング298番目のアミノ酸の改変などが挙げられる。これらのアミノ酸改変は１箇所であってもよく、また２箇所以上であってもよい。
さらに好ましいアミノ酸改変としては、例えば、EUナンバリング230番目のアミノ酸をGlu、Ile、またはGlnに置換する改変、EUナンバリング231番目のアミノ酸をAla、Asp、Asn、Pro、またはThrに置換する改変、EUナンバリング232番目のアミノ酸をAla、Lys、Asn、またはTyrに置換する改変、EUナンバリング237番目のアミノ酸をGluに置換する改変、EUナンバリング238番目のアミノ酸をAspまたはGluに置換する改変、EUナンバリング239番目のアミノ酸をAsp、Glu、Phe、Lys、Leu、Asn、Trp、またはTyrに置換する改変、EUナンバリング241番目のアミノ酸をAsp、GluまたはThrに置換する改変、EUナンバリング267番目のアミノ酸をMetに置換する改変、EUナンバリング298番目のアミノ酸をHisに置換する改変などが挙げられる。これらの改変は１箇所であってもよいし、2箇所以上の組み合わせであってもよい。そのような改変の好ましい例として、表１８〜２３、表２６、２７に記載の改変などが挙げられる。
上記の方法により付与される別の好ましい性質として、マウスFcγRIIに対しては親ポリペプチドと同等かそれ以上の強さで結合し、かつマウスFcγRIIIに対しては親ポリペプチドと比較して弱く結合する性質を挙げることができる。すなわち、以下のような性質を付与することが好ましい。
・マウスFcγRIIに対するKD値を400nM以下にし、かつマウスFcγRIIIに対するKD値を1μM以上にする、あるいは
・マウスFcγRIIに対する結合活性を親ポリペプチドの0.5倍以上にし、かつマウスFcγRIIIに対する結合活性を親ポリペプチドの0.25倍以下にする。
上記の方法において、マウスFcγRIIに対するKD値は、400nM以下になり、好ましくは360nM以下、320nM以下、280nM以下になり、さらに好ましくは250nM以下、200nM以下、150nM以下、100nM以下になり、かつマウスFcγRIIIに対するKD値は、1μM以上になり、好ましくは1.2μM以上、1.5μM以上、2μM以上になり、さらに好ましくは2.5μM以上、3μM以上、4μM以上、5μM以上になる。また、マウスFcγRIIに対する結合活性は親ポリペプチドの0.5倍以上になり、好ましくは0.6倍以上、0.75倍以上、1.0倍以上になり、さらに好ましくは1.5倍以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上になり、かつマウスFcγRIIIに対する結合活性は親ポリペプチドの0.25倍以下になり、好ましくは0.20倍以下、0.18倍以下、0.16倍以下、0.14倍以下になり、さらに好ましくは0.12倍以下、0.10倍以下、0.08倍以下、0.06倍以下になる。
上記の方法によって改変されてできたポリペプチドも本発明に含まれる。
また、本発明は、マウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対して選択的に結合するFc変異体を製造する方法に関する。
本発明は、Fc領域を含む親ポリペプチドの変異体で、〔マウスFcγRIIIに対するKD値〕／〔マウスFcγRIIに対するKD値〕の比が6以上のポリペプチドを製造する方法であって、該Fc領域における少なくとも一つのアミノ酸に改変を加えることを含む方法を提供する。また、本発明は、Fc領域を含む親ポリペプチドの変異体で、マウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対する結合選択性が親ポリペプチドより5倍以上向上したポリペプチドを製造する方法であって、該Fc領域における少なくとも一つのアミノ酸に改変を加えることを含む方法を提供する。
上記の方法の好ましい態様として、例えば以下のような工程を含んでいてもよい；
・Fc領域を含む親ポリペプチドをコードする核酸を取得する工程、
・該Fc領域における少なくとも一つのアミノ酸に改変が加えられるように、前記核酸を改変する工程、
・宿主細胞に前記改変された核酸を導入し、該核酸によってコードされるポリペプチドが発現するように該宿主細胞を培養する工程、
・前記宿主細胞の培養物から前記親ポリペプチドの変異体を回収する工程。
上記の方法において、〔マウスFcγRIIIに対するKD値〕／〔マウスFcγRIIに対するKD値〕の比は、6以上であり、好ましくは10以上、15以上、20以上、25以上、30以上であり、さらに好ましくは35以上、40以上、50以上、60以上、70以上、80以上、90以上である。また、マウスFcγRIIIと比較した場合のマウスFcγRIIに対する結合選択性は、親ポリペプチドより5倍以上向上しており、好ましくは10倍以上、15倍以上、20倍以上、25倍以上、30倍以上向上しており、さらに好ましくは35倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上向上している。
上記の方法により製造されるポリペプチドが有する好ましい性質の一つとして、マウスFcγRIIに対して強く結合する性質を挙げることができる。すなわち、以下のような性質を有することが好ましい。
・マウスFcγRIIに対するKD値が20nM以下である、あるいは
・マウスFcγRIIに対する結合活性が親ポリペプチドより10倍以上増強している。
上記の方法において、マウスFcγRIIに対するKD値は、20nM以下であり、好ましくは10nM以下、4nM以下、2nM以下であり、さらに好ましくは1.5nM以下、1nM以下、0.7nM以下、0.5nM以下である。また、マウスFcγRIIに対する結合活性は親ポリペプチドより10倍以上増強しており、好ましくは20倍以上、50倍以上、100倍以上増強しており、さらに好ましくは150倍以上、200倍以上、300倍以上、400倍以上増強している。
上記のような性質を付与することのできるアミノ酸改変として、例えば、EUナンバリング230番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング231番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング232番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング238番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング239番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング240番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング241番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング266番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング267番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング268番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング271番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング295番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング296番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング298番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング324番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング326番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング327番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング330番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング331番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング333番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング334番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング335番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング337番目のアミノ酸の改変などが挙げられる。これらのアミノ酸改変は１箇所であってもよく、また２箇所以上であってもよい。
さらに好ましいアミノ酸改変としては、例えば、EUナンバリング230番目のアミノ酸をAsp、Glu、Ile、Pro、Gln、またはValに置換する改変、EUナンバリング231番目のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、ThrまたはTrpに置換する改変、EUナンバリング232番目のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Phe、Leu、Asn、Val、Trp、またはTyrに置換する改変、EUナンバリング238番目のアミノ酸をGlu、Pro、またはGlnに置換する改変、EUナンバリング239番目のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、またはTyrに置換する改変、EUナンバリング240番目のアミノ酸をGlu、His、Gln、またはTrpに置換する改変、EUナンバリング241番目のアミノ酸をTrpまたはTyrに置換する改変、EUナンバリング266番目のアミノ酸をLeuに置換する改変、EUナンバリング267番目のアミノ酸をAlaまたはGluに置換する改変、EUナンバリング268番目のアミノ酸をAspに置換する改変、EUナンバリング271番目のアミノ酸をLeuに置換する改変、EUナンバリング295番目のアミノ酸をLeuに置換する改変、EUナンバリング296番目のアミノ酸をGlu、Asn、Thr、またはTrpに置換する改変、EUナンバリング298番目のアミノ酸をLeuまたはMetに置換する改変、EUナンバリング324番目のアミノ酸をAsp、Leu、またはMetに置換する改変、EUナンバリング326番目のアミノ酸をAspに置換する改変、EUナンバリング327番目のアミノ酸をGlyに置換する改変、EUナンバリング330番目のアミノ酸をGly、Lys、またはGlnに置換する改変、EUナンバリング331番目のアミノ酸をAsp、Phe、またはTyrに置換する改変、EUナンバリング333番目のアミノ酸をAsn、Val、またはTyrに置換する改変、EUナンバリング334番目のアミノ酸をArgに置換する改変、EUナンバリング335番目のアミノ酸をAsnまたはTyrに置換する改変、EUナンバリング337番目のアミノ酸をIle、Lys、またはTrpに置換する改変などが挙げられる。これらの改変は１箇所であってもよいし、2箇所以上の組み合わせであってもよい。そのような改変の好ましい例として、表２〜１７、表２４、２５に記載の改変などが挙げられる。
上記の方法により製造されるポリペプチドが有する別の好ましい性質として、マウスFcγRIIIに対して弱く結合する性質を挙げることができる。すなわち、以下のような性質を有することが好ましい。
・マウスFcγRIIIに対するKD値が1μM以上である、あるいは
・マウスFcγRIIIに対する結合活性が親ポリペプチドの0.25倍以下に減弱している。
上記の方法において、マウスFcγRIIIに対するKD値は、1μM以上であり、好ましくは1.2μM以上、1.5μM以上、2μM以上であり、さらに好ましくは2.5μM以上、3μM以上、4μM以上、5μM以上である。また、マウスFcγRIIIに対する結合活性は親ポリペプチドの0.25倍以下に減弱しており、好ましくは0.20倍以下、0.18倍以下、0.16倍以下、0.14倍以下に減弱しており、さらに好ましくは0.12倍以下、0.10倍以下、0.08倍以下、0.06倍以下に減弱している。
上記のような性質を付与することのできるアミノ酸改変として、例えば、EUナンバリング230番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング231番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング232番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング237番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング238番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング239番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング241番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング267番目のアミノ酸の改変、EUナンバリング298番目のアミノ酸の改変などが挙げられる。これらのアミノ酸改変は１箇所であってもよく、また２箇所以上であってもよい。
さらに好ましいアミノ酸改変としては、例えば、EUナンバリング230番目のアミノ酸をGlu、Ile、またはGlnに置換する改変、EUナンバリング231番目のアミノ酸をAla、Asp、Asn、Pro、またはThrに置換する改変、EUナンバリング232番目のアミノ酸をAla、Lys、Asn、またはTyrに置換する改変、EUナンバリング237番目のアミノ酸をGluに置換する改変、EUナンバリング238番目のアミノ酸をAspまたはGluに置換する改変、EUナンバリング239番目のアミノ酸をAsp、Glu、Phe、Lys、Leu、Asn、Trp、またはTyrに置換する改変、EUナンバリング241番目のアミノ酸をAsp、GluまたはThrに置換する改変、EUナンバリング267番目のアミノ酸をMetに置換する改変、EUナンバリング298番目のアミノ酸をHisに置換する改変などが挙げられる。これらの改変は１箇所であってもよいし、2箇所以上の組み合わせであってもよい。そのような改変の好ましい例として、表１８〜２３、表２６、２７に記載の改変などが挙げられる。
上記の方法により製造されるポリペプチドが有する別の好ましい性質として、マウスFcγRIIに対しては親ポリペプチドと同等かそれ以上の強さで結合し、かつマウスFcγRIIIに対しては親ポリペプチドと比較して弱く結合する性質を挙げることができる。すなわち、以下のような性質を有することが好ましい。
・マウスFcγRIIに対するKD値が400nM以下であり、かつマウスFcγRIIIに対するKD値が1μM以上である、あるいは
・マウスFcγRIIに対する結合活性が親ポリペプチドの0.5倍以上であり、かつマウスFcγRIIIに対する結合活性が親ポリペプチドの0.25倍以下である。
上記の方法において、マウスFcγRIIに対するKD値は、400nM以下であり、好ましくは360nM以下、320nM以下、280nM以下であり、さらに好ましくは250nM以下、200nM以下、150nM以下、100nM以下であり、かつマウスFcγRIIIに対するKD値は、1μM以上であり、好ましくは1.2μM以上、1.5μM以上、2μM以上であり、さらに好ましくは2.5μM以上、3μM以上、4μM以上、5μM以上である。また、マウスFcγRIIに対する結合活性は親ポリペプチドの0.5倍以上であり、好ましくは0.6倍以上、0.75倍以上、1倍以上であり、さらに好ましくは1.5倍以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上であり、かつマウスFcγRIIIに対する結合活性は親ポリペプチドの0.25倍以下であり、好ましくは0.20倍以下、0.18倍以下、0.16倍以下、0.14倍以下であり、さらに好ましくは0.12倍以下、0.10倍以下、0.08倍以下、0.06倍以下である。
上記の方法によって製造されたポリペプチドも本発明に含まれる。
また、本発明のポリペプチドをコードする核酸も本発明に含まれる。本発明の該核酸はDNA、RNAなど、如何なる形態でもよい。
さらに、本発明の核酸を含むベクターも本発明に含まれる。ベクターの種類はベクターが導入される宿主細胞に応じて当業者が適宜選択することができ、例えば上述のベクターなどを用いることができる。
さらに、本発明のベクターにより形質転換された宿主細胞も本発明に含まれる。宿主細胞は当業者が適宜選択することができ、例えば上述の宿主細胞などを用いることができる。
本発明は、本発明のポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドに医薬的に許容し得る担体を組み合わせて、それらを公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、本発明のポリペプチドに、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などを適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。担体の例としては、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。これら製剤における有効成分の量は、指示された用量の範囲内で適宜設定することが可能である。
注射用の水溶液としては、例えばブドウ糖やD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム等を含む等張液や生理食塩水が挙げられ、適当な溶解補助剤としてアルコール（エタノールやプロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）や非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80（TM）やHCO-50等）と併用してもよい。
油性液としては、例えばゴマ油や大豆油が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジルやベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤（リン酸塩緩衝液や酢酸ナトリウム緩衝液等）や無痛化剤（塩酸プロカイン等）、安定剤（ベンジルアルコールやフェノール等）、酸化防止剤等と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
また、本発明の医薬組成物の投与量や投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲で、あるいは患者あたり0.001から100000 mg/bodyの範囲で選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与方法としては、経口投与または非経口投与を選択することが可能であるが、好ましくは非経口投与である。非経口投与の例としては、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられ、さらに注射の例としては、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などが挙げられる。これらの投与方法により、医薬組成物を全身または局部に投与することができる。
また、本発明は、マウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドを用いて、ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドのヒトにおける作用を予測する方法に関する。
種交差性の違いから、ヒトFcγRIIbに対して結合選択性を示すFc変異体であっても、マウスFcγRIIに対しては結合選択性を示さない可能性が高い。そのため、当該Fc変異体を用いて、ヒトFcγRIIbに対して選択的に結合する特徴を有する医薬品を開発しようとしても、マウスなどのモデル動物でその効果や安全性などを評価することは困難であった。本発明において見出されたマウスFcγRIIに選択的に結合するFc変異体は、そのような状況を改善して、マウスにおける効果や安全性などの評価を可能にした点において、極めて有用である。後述の実施例に示すように、抗体などのFc領域を含むポリペプチドの血中濃度の推移には、マウスFcγRII（ヒトではFcγRIIb）以外のFcγRファミリーも関与していると考えられることから、ヒトFcγRIIbに対して選択的に結合する特徴を有する医薬品の効果や安全性をマウスで正確に評価するためには、マウスFcγRIIに対して選択的に結合する本発明のポリペプチドが必要不可欠である。
本発明は、ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドをヒトに投与した場合の疾患の治療または予防効果を予測する方法であって、マウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドを当該ヒト疾患のモデルマウスに投与してその治療または予防効果を評価する工程を含む方法を提供する。
すなわち、好ましい態様としては、例えば以下のような工程を含んでいてもよい；
（ａ）マウス抗原に結合する抗原結合領域を含むポリペプチドを取得する工程、
（ｂ）工程（ａ）で取得されたポリペプチドの抗原結合領域、および本発明のFc変異体を含むポリペプチドを作製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたポリペプチドを、ヒト疾患のモデルマウスに投与する工程、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の結果、当該マウスに疾患の治療または予防効果が見られた場合、前記マウス抗原に対応するヒト抗原に結合する抗原結合領域、およびヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドが前記ヒト疾患の治療または予防に有効であると判断する工程。
さらに好ましい態様としては、上記の工程（ｂ）(c) に加えて（ｂ'）（ｃ'）を含み、かつ工程(d)が以下のような工程であってもよい；
（ｂ'）工程（ａ）で取得されたポリペプチドの抗原結合領域、および天然型IgGのFc領域を含むポリペプチドを作製する工程、
（ｃ'）工程（ｂ'）で作製されたポリペプチドを、ヒト疾患のモデルマウスに投与する工程、
（ｄ）工程（ｃ）（ｃ'）の結果、工程（ｂ'）のポリペプチドを投与されたマウスに比べて、工程（ｂ）のポリペプチドを投与されたマウスでより強い疾患の治療または予防効果が見られた場合、前記マウス抗原に対応するヒト抗原に結合する抗原結合領域、およびヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドが前記ヒト疾患の治療または予防に有効であると判断する工程。
本発明は、ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドを用いた治療または予防に適した疾患を選択する方法であって、マウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドをヒト疾患のモデルマウスに投与してその治療または予防効果を評価する工程を含む方法を提供する。
すなわち、好ましい態様としては、例えば以下のような工程を含んでいてもよい；
（ａ）マウス抗原に結合する抗原結合領域を含むポリペプチドを取得する工程、
（ｂ）工程（ａ）で取得されたポリペプチドの抗原結合領域、および本発明のFc変異体を含むポリペプチドを作製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたポリペプチドを、ヒト疾患のモデルマウスに投与する工程、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の結果、当該マウスに疾患の治療または予防効果が見られた場合、前記マウス抗原に対応するヒト抗原に結合する抗原結合領域、およびヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドを用いた治療または予防に適した疾患として前記ヒト疾患を選択する工程。
さらに好ましい態様としては、上記の工程（ｂ）(c) に加えて（ｂ'）（ｃ'）を含み、かつ工程(d)が以下のような工程であってもよい；
（ｂ'）工程（ａ）で取得されたポリペプチドの抗原結合領域、および天然型IgGのFc領域を含むポリペプチドを作製する工程、
（ｃ'）工程（ｂ'）で作製されたポリペプチドを、ヒト疾患のモデルマウスに投与する工程、
（ｄ）工程（ｃ）（ｃ'）の結果、工程（ｂ'）のポリペプチドを投与されたマウスに比べて、工程（ｂ）のポリペプチドを投与されたマウスでより強い疾患の治療または予防効果が見られた場合、前記マウス抗原に対応するヒト抗原に結合する抗原結合領域、およびヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドを用いた治療または予防に適した疾患として前記ヒト疾患を選択する工程。
本発明は、ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドを用いた治療または予防に適した標的抗原を選択する方法であって、マウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドをヒト疾患のモデルマウスに投与してその治療または予防効果を評価する工程を含む方法を提供する。
すなわち、好ましい態様としては、例えば以下のような工程を含んでいてもよい；
（ａ）マウス抗原に結合する抗原結合領域を含むポリペプチドを取得する工程、
（ｂ）工程（ａ）で取得されたポリペプチドの抗原結合領域、および本発明のFc変異体を含むポリペプチドを作製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたポリペプチドを、ヒト疾患のモデルマウスに投与する工程、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の結果、当該マウスに疾患の治療または予防効果が見られた場合、ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドを用いた治療または予防に適した標的抗原として前記マウス抗原に対応するヒト抗原を選択する工程。
さらに好ましい態様としては、上記の工程（ｂ）(c) に加えて（ｂ'）（ｃ'）を含み、かつ工程(d)が以下のような工程であってもよい；
（ｂ'）工程（ａ）で取得されたポリペプチドの抗原結合領域、および天然型IgGのFc領域を含むポリペプチドを作製する工程、
（ｃ'）工程（ｂ'）で作製されたポリペプチドを、ヒト疾患のモデルマウスに投与する工程、
（ｄ）工程（ｃ）（ｃ'）の結果、工程（ｂ'）のポリペプチドを投与されたマウスに比べて、工程（ｂ）のポリペプチドを投与されたマウスでより強い疾患の治療または予防効果が見られた場合、ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドを用いた治療または予防に適した標的抗原として前記マウス抗原に対応するヒト抗原を選択する工程。
本発明は、ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドを用いた治療または予防に適した抗原結合領域を選択する方法であって、マウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドをヒト疾患のモデルマウスに投与してその治療または予防効果を評価する工程を含む方法を提供する。
すなわち、好ましい態様としては、例えば以下のような工程を含んでいてもよい；
（ａ）同一のマウス抗原に結合する抗原結合領域を含むポリペプチドを複数取得する工程、
（ｂ）工程（ａ）で取得されたポリペプチドの抗原結合領域、および本発明のFc変異体を含むポリペプチドをそれぞれ作製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたポリペプチドを、ヒト疾患のモデルマウスにそれぞれ投与する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）の結果、より強い治療または予防効果を示したポリペプチドの抗原結合領域を、ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドを用いた前記ヒト疾患の治療または予防に適した抗原結合領域として選択する工程。
本発明は、ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドをヒトに投与した場合の安全性または毒性を予測する方法であって、マウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドをマウスに投与してその安全性または毒性を評価する工程を含む方法を提供する。
上記の抗原結合領域を選択する方法においては、後述のように、マウス抗原とヒト抗原が同一であることが好ましい。すなわち、ヒトの遺伝子を導入して作製された遺伝子改変マウスをヒト疾患のモデルマウスとして選択し、当該ヒト遺伝子から発現する遺伝子産物をここでのマウス抗原とすることによって、ヒト遺伝子産物に結合する複数の抗原結合領域の中から最適な抗原結合領域を選択することが好ましい。
医薬品の開発において、前臨床段階でサルやマウス等のげっ歯類を使って安全性試験を実施する。しかし、動物種によってはその標的抗原の対応するヒト抗原との相同性が低く、開発候補医薬品がサルやマウスの抗原に対して交差しない場合がある。特にマウスの場合、ヒトの抗原との類似性が低く、十分な交差性を有しないことが多い。そのような場合、開発候補のヒト標的抗原と同様の強さや性質を持ってマウス標的抗原に対して結合するサロゲートを使って安全性評価をすることが可能である（引用文献MAbs, 2009, 1(1), 2-11）。本発明のFc変異体も同様に、ヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体のマウスサロゲートとして使うことができ、本発明のFc変異体を含むポリペプチド（好ましくは抗体など）をマウスに投与することで、ヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドの安全性を評価することが可能である。
すなわち、好ましい態様としては、例えば以下のような工程を含んでいてもよい；
（ａ）マウス抗原に結合する抗原結合領域を含むポリペプチドを取得する工程、
（ｂ）工程（ａ）で取得されたポリペプチドの抗原結合領域、および本発明のFc変異体を含むポリペプチドを作製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたポリペプチドをマウスに投与する工程、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）で得られた、工程（ｂ）のポリペプチドのマウスにおける安全性または毒性の結果を、前記マウス抗原に対応するヒト抗原に結合する抗原結合領域、およびヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドのヒトにおける安全性または毒性として類推する工程。
本発明は、ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドをヒトに投与した場合の薬物動態を予測する方法であって、マウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドをマウスに投与してその薬物動態を測定する工程を含む方法を提供する。
すなわち、好ましい態様としては、例えば以下のような工程を含んでいてもよい；
（ａ）マウス抗原に結合する抗原結合領域を含むポリペプチドを取得する工程、
（ｂ）工程（ａ）で取得されたポリペプチドの抗原結合領域、および本発明のFc変異体を含むポリペプチドを作製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたポリペプチドをマウスに投与する工程、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）で得られた、工程（ｂ）のポリペプチドのマウスにおける薬物動態の結果を、前記マウス抗原に対応するヒト抗原に結合する抗原結合領域、およびヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドのヒトにおける薬物動態として類推する工程。
ヒトFcγRIIbに選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドには、ヒト抗原に結合する抗原結合領域が含まれていることが好ましい。また、当該ヒト抗原は、ヒト疾患の治療または予防の標的となり得る抗原であることが好ましく、当該抗原結合領域は、その抗原に結合することによって、前記ヒト疾患の治療または予防につながる機能を有することが好ましい。その場合、マウスFcγRIIに選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドは、当該ヒト抗原に対応するマウス抗原に結合する抗原結合領域を有しており、また、当該抗原結合領域は、ヒトの抗原結合領域が有するヒト疾患の治療または予防機能に対応する機能をマウスにおいて有することが好ましい。
ヒトFcγRIIbとヒトFcγRIIaの細胞外領域の配列同一性は93%であり、ヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体としては、天然型IgGのFc領域に比べて、FcγRIIbに対する結合活性がより高く、FcγRIIaに対する結合活性がより低い性質を有することが望ましい。本明細書において、ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体とは、当該Fc領域の〔ヒトFcγRIIaに対するKD値〕を〔ヒトFcγRIIbに対するKD値〕で割った値が、天然型ヒトIgGのFc領域の〔ヒトFcγRIIaに対するKD値〕を〔ヒトFcγRIIbに対するKD値〕で割った値より大きいFc領域を意味する。そのようなFc変異体の例はWO2012/115241、WO2008/150494などに記載されているので、それらを用いることができる。
ヒトFcγRIIbに選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドが治療または予防に適した疾患は、特に限定はされないが、好ましい疾患としては、免疫炎症性疾患（特に自己免疫疾患）、腎疾患、肝疾患、肺疾患、糖尿病、骨疾患、血液疾患、がん疾患等が挙げられる。
マウス抗原に結合する抗原結合領域を含むポリペプチドは、例えばハイブリドーマ法（Kohler and Milstein, Nature 256, 495 (1975)）やファージ抗体ライブラリー法（Clackson et al, Nature 352, 624-628 (1991) ; Marks et al, J Mol Biol 222, 581-597 (1991)）などの当業者に公知の方法によって取得することができる。
また、抗原結合領域およびFc領域（天然型IgGのFc領域や本発明のFc変異体など）を含むポリペプチドは、当該抗原結合領域をコードするDNAおよび当該Fc領域をコードするDNAをインフレームで融合させた後に適当な発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを好適な発現細胞中に導入し発現させることで作製することができる。
本明細書において「治療または予防」とは、疾患を有する対象に対して何らかの薬理学的および／または生理学的な効果を得ることを意味する。「治療」とは疾患がすでに診断された対象に対して、病状の進行を抑制し、あるいは軽減することを意味し、「予防」とは疾患がまだ診断されていない対象に対して、発病を抑制することを意味する。そのような効果の強さは、疾患に関連する何らかの所見から定性的に判断してもよいし、何らかの指標から定量的に判断してもよい。指標の例としては、疾患に応じて、ペプチドや代謝産物などの疾患マーカー濃度、症状を数値化した疾患スコア、発病までの期間／発病率、無増悪生存期間／生存率などから選択することができるが、特に限定されない。例えば、疾患が喘息の場合であれば、血漿中IgE濃度の低下、あるいはB細胞、マスト細胞、プラズマ細胞、IgE産生B細胞、IgE産生プラズマ細胞の数の減少で治療効果を評価することができる。
本明細書においてポリペプチドの「安全性」とは、当該ポリペプチドが投与された対象、特にマウスやヒトにおいて、何らかの有害な事象（毒性あるいは副作用）が観察されないことを意味する。対象は健常であってもよいし、何らかの疾患を有していてもよい。
本明細書においてポリペプチドの「毒性」とは、当該ポリペプチドが投与された対象、特にマウスやヒトにおいて、何らかの有害な事象（毒性あるいは副作用）が観察されることを意味する。対象は健常であってもよいし、何らかの疾患を有していてもよい。
本明細書においてポリペプチドの「安全性を評価する」あるいは「安全性を予測する」とは、当該ポリペプチドが投与された対象、特にマウスやヒトにおいて、何らかの有害な事象（毒性あるいは副作用）が観察されるか否かを評価することを意味する。対象は健常であってもよいし、何らかの疾患を有していてもよい。
本明細書において薬物動態とは、薬物が対象に投与された後の薬物の体内的挙動（例えば薬物の血中濃度）を意味し、吸収、分布、代謝、排泄などが挙げられる。薬物動態を示すパラメーターとしては、半減期、分布容積、クリアランス、吸収／消失速度、生物学的利用能（バイオアベイラビリティ）などが挙げられるが、特に限定されない。
マウスFcγRIIに選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドが投与されるマウスは、野生型のマウスであってもよいし、遺伝子が改変されたマウスであってもよい。
本明細書における「マウス抗原」とは、マウスの生体内に存在して抗原となり得る分子であって、なおかつ疾患の治療または予防の標的となり得る分子を意味する。ここでのマウス抗原は、マウスの生体内に存在してさえいれば、マウス由来の分子には限定されず、例えば細菌やウィルスに感染したマウスにおいては、当該細菌やウィルスに由来する分子も含まれるし、あるいはヒトなどのマウス以外の生物の遺伝子を導入して作製された遺伝子改変マウスにおいては、そこから発現するタンパク質などの当該マウス以外の生物に由来する分子も含まれる。
本明細書における「マウス抗原に対応するヒト抗原」とは、マウス抗原がマウスにおいて有する機能と等しい機能をヒトにおいて有する抗原を意味する。マウス抗原がマウス由来の分子である場合は、ヒト抗原はヒトにおけるそのホモログ分子を意味し、マウス抗原が非マウス由来の分子である場合は、その分子がマウスの疾患において示す作用と等しい作用をヒトの疾患において示す分子を意味する。マウスとヒトの両者に感染可能な細菌やウィルスに由来する分子がマウス抗原となる場合、マウス抗原とヒト抗原は同一である。また、ヒトの遺伝子が導入されたマウスにおける当該遺伝子産物がマウス抗原となる場合も、マウス抗原とヒト抗原は同一である。
ヒト疾患のモデルマウスとして、具体的に以下のような例を挙げることができるが、これらには限定されない：ループス腎炎（lupus nephritis）のモデルマウスであるMrl/lprマウス、NZB/W F1マウス、DNA induced SLEモデルマウス、Pristane誘導SLEモデルマウス、BXSBマウス、アトピー性皮膚炎のモデルマウスであるIgE誘導モデルマウス、NC/Ngaマウス、多発性硬化症のモデルマウスであるEAEモデルマウス、敗血症（sepsis）のモデルマウスであるLPS誘導モデルマウス、関節リウマチのモデルマウスであるコラーゲン誘導モデルマウス、アジュバント誘導モデルマウス、細菌由来細胞壁誘導モデルマウス、NZB/KNマウス、Biozziマウス、HTLV-1トランスジェニックマウス、ヒトTNFαトランスジェニックマウス、K/BxNトランスジェニックマウス、1型糖尿病のモデルマウスであるNODマウス、STZマウス、2型糖尿病のモデルマウスであるdb/dbマウス、KKAyマウス、全身性強皮症（systemic scleroderma）のモデルマウスであるBleomycin誘導モデルマウス、慢性腎臓病（CKD）のモデルマウスであるchronic Thy-1モデルマウス、腎繊維症のモデルマウスであるUUOモデルマウス、I/Rモデルマウス、NEP25マウス、IgA腎症のモデルマウスであるβ−1，4−ガラクトース転移酵素欠損マウス、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）のモデルマウスであるCDAHFDマウス、high-carbohydrate, high-fatモデルマウス、肝繊維症のモデルマウスであるTAAマウス、BDLマウス。
また、ヒト疾患のモデルマウスとして天然型マウスを用いることもできる。天然型マウスに対して何らかの疾患を発症させるための外的な処置を施したマウスは、ヒト疾患のモデルマウスになり得る。天然型マウスとしては、BALB/C、C57BL/6などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明に用いられるモデルマウスとしては、上記マウス抗原が治療または予防の標的となり得る疾患と同一の疾患を有するモデルマウスを選択することが好ましい。
上記の方法で選択された標的抗原に結合する抗原結合領域、およびヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドも本発明に含まれる。
また、上記の方法で選択された抗原結合領域、およびヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドも本発明に含まれる。
さらに、このようなポリペプチドを有効成分として含むヒト疾患の治療または予防剤も本発明に含まれる。また、このようなポリペプチドを患者に投与することにより、ヒト疾患を治療または予防する方法も本発明に含まれる。また、ヒト疾患の治療剤または予防剤の製造におけるこのようなポリペプチドの使用も本発明に含まれる。また、ヒト疾患の治療または予防に使用するためのこのようなポリペプチドも本発明に含まれる。ヒト疾患は、上記の方法を用いて、当該ポリペプチドが治療または予防に適していることが評価された疾患であることが好ましい。
また本発明は、このようなポリペプチドを含む、ヒト疾患の治療または予防に用いるためのキットを提供する。ヒト疾患は、上記の方法を用いて、当該ポリペプチドが治療または予防に適していることが評価された疾患であることが好ましい。該キットには、その他、薬学的に許容される担体、媒体、使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
ヒトFcγRIIbに選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドは、B細胞、マスト細胞、樹状細胞および／または好塩基球の活性化を抑制する薬剤の有効成分として有用である。当該ポリペプチドは、活性型FcγRを活性化することなく、FcγRIIbに選択的に作用して、B細胞、マスト細胞、樹状細胞および／または好塩基球の活性化を抑制することが可能である。B細胞の活性化とは、増殖、IgE産生、IgM産生、IgA産生などを含む。当該ポリペプチドの一態様は、FcγRIIbとIgEを架橋することでB細胞のIgE産生を抑制し、IgMと架橋することでB細胞のIgM産生を抑制し、IgAと架橋することでIgA産生を抑制することができる。それ以外にも、BCR、CD19、CD79b、等のB細胞上に発現している分子でITAMドメインを細胞内に含むあるいはITAMドメインと相互作用する分子とFcγRIIbとを直接的又は間接的に架橋することで、上記と同様な抑制作用を発揮することができる。また、マスト細胞の活性化とは、増殖、IgE等による活性化、脱顆粒などを含む。当該ポリペプチドの一態様は、マスト細胞においては、IgE受容体であるFcεRI、DAP12、CD200R3等のマスト細胞上に発現しているITAMドメインを含むあるいはITAMドメインと相互作用する分子とFcγRIIbとを直接的、間接的に架橋することで、増殖、IgE等による活性化、脱顆粒の抑制をすることが可能である。また、好塩基球の活性化とは、増殖、脱顆粒などを含む。当該ポリペプチドの一態様は、好塩基球においても、FcγRIIbと細胞膜上の分子でITAMドメインを細胞内に含むあるいはITAMドメインと相互作用する分子とを直接的又は間接的に架橋することにより活性化、脱顆粒、増殖を抑制することが可能である。また、樹状細胞の活性化とは、増殖、脱顆粒などを含む。当該ポリペプチドは、樹状細胞においても、細胞膜上の分子でITAMドメインを細胞内に含むあるいはITAMドメインと相互作用する分子とFcγRIIbとを直接的又は間接的に架橋することで、活性化、脱顆粒、増殖を抑制することが可能である。
また、ヒトFcγRIIbに選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドは、免疫炎症性疾患の治療剤又は予防剤の有効成分として有用である。上述のように、当該ポリペプチドは、B細胞、マスト細胞、樹状細胞および／または好塩基球の活性化を抑制することができるので、当該ポリペプチドを投与することにより、免疫炎症性疾患を治療又は予防することが可能である。「免疫炎症性疾患」は、次のものを包含するが、それらだけには限定されない：関節リウマチ、自己免疫性肝炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性水疱症、自己免疫性副腎皮質炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、巨赤血球性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性レセプター病、自己免疫不妊、慢性活動型肝炎、糸球体腎炎、間質性肺腺維症、多発性硬化症、パジェット病、オステオポローシス、多発性骨髄腫、ブドウ膜炎、急性及び慢性脊椎炎、痛風性関節炎、炎症性腸疾患、成人呼吸促進症候群（ARDS）、乾癬、クローン病、バセドウ病、若年性糖尿病、アジソン病、重症筋無力症、水晶体性ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、潰瘍性大腸炎、過敏症、筋肉変性、悪液質、全身性強皮症、限局性強皮症、シェーグレン症候群、ベーチェット病、ライター症候群、I型及びII型糖尿病、骨吸収疾患、移植片対宿主反応、虚血性再灌流外傷、アテローム硬化症、脳トラウマ、大脳マラリア、敗血症、敗血性ショック、トキシックショック症候群、発熱、染色によるマルギアス（malgias）、再生不良性貧血、溶血性貧血、突発性血小板減少症、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、橋本病、天疱瘡、IgA腎症、花粉症、抗リン脂質抗体症候群、多発性筋炎、ウェゲナー肉芽腫症、結節性動脈炎、混合性結合組織病、線維筋痛症、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性萎縮性胃炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎、大動脈炎症候群、急速進行性糸球体腎炎、巨赤芽球性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、原発性甲状腺機能低下症、特発性アジソン病、インスリン依存性糖尿病、慢性円板状エリテマトーデス、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状IgA水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、尋常性白斑、サットン後天性遠心性白斑、原田病、自己免疫性視神経症、特発性無精子症、習慣性流産、低血糖症、慢性蕁麻疹、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、腱付着部炎、過敏性腸症候群、慢性疲労症候群、皮膚筋炎、封入体筋炎、シュミット症候群、グレーブス病、悪性貧血、ルポイド肝炎、初老期痴呆、アルツハイマー病、脱髄性疾患、筋萎縮性側索硬化症、副甲状腺機能低下症、ドレスラー症候群、イートン-ランバート症候群、疱疹状皮膚炎、脱毛症、進行性全身性硬化症、CREST症候群（石灰沈着症、レイノー現象、食道運動障害、強指症および毛細血管拡張症）、サルコイドーシス、リウマチ熱、多形性紅斑、クッシング症候群、輸血反応、ハンセン病、高安動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎、巨細胞動脈炎、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、川崎病、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼内炎、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、フェルティ症候群、ヘノッホ-シェーンライン紫斑病、移植拒絶反応、ムンプス、心筋症、化膿性関節炎、家族性地中海熱、マックル-ウェルズ症候群、高IgD症候群。
また、ヒトFcγRIIbに選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドは、自己抗原に対する抗体（自己抗体）の産生が疾患の原因と考えられる自己免疫疾患において、その自己抗体の産生を抑制して、当該自己免疫疾患を治療又は予防する薬剤の有効成分として有用である。重症筋無力症の自己抗原であるAchRと抗体のFc部分とを融合した分子を用いることで、AchRを認識するBCRを発現するB細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを亢進することが報告されている (J Neuroimmunol, 227, 35-43, 2010)。自己抗体が認識する抗原と当該Fc領域との融合タンパク質を使うことで、その自己抗原に対するBCRを発現するB細胞のBCRとFcγRIIbとを架橋し、自己抗原に対するBCRを発現するB細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導することが可能である。このような自己免疫疾患には、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎、大動脈炎症候群、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、バセドウ病、橋本病、原発性甲状腺機能低下症、特発性アジソン病、インスリン依存性糖尿病、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状IgA水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、尋常性白斑、サットン後天性遠心性白斑、原田病、自己免疫性視神経症、特発性無精子症、習慣性流産、二型糖尿病、低血糖症、慢性蕁麻疹が含まれるが、これらだけには限定されない。
また、ヒトFcγRIIbに選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドは、生体に必要なタンパク質を欠損する疾患の治療剤の有効成分として有用である。生体に必要なタンパク質を欠損する疾患に対して、そのタンパク質を薬剤として投与し補充する治療法が用いられるが、患者は元来そのタンパク質を欠損しているため、外部から補充されたそのタンパク質は異物として認識され、そのタンパク質に対する抗体が産生されてしまう。その結果として、そのタンパク質が除去されやすくなってしまい、薬剤としての効果が減弱してしまう。そのようなタンパク質と当該Fc領域との融合タンパク質を使うことで、当該タンパク質を認識するB細胞上においてBCRとFcγRIIbとを架橋し、当該タンパク質に対する抗体産生を抑制することが可能である。補充するタンパク質としてはFactor VIII、Factor IX、TPO、EPO、α-iduronidase、iduronate sulfatase、A型heparan N-sulfatase，B型α-N-acetylglucosaminidase, C型acetyl CoA：α-glucosaminidase acetyltransferase，D型N-acetylglucosamine 6-sulfatase、galactose 6-sulfatase、N-acetylgalactosamine 4-sulfatase、β-glucuronidase、α-galactosidase、acidic α-galactosidase、glucocerebrosidaseが含まれる。また、これらのタンパク質を補充する疾患としては、血友病、特発性血小板減少性紫斑病、腎性貧血、ライソソーム病（ムコ多糖症、ファブリー病、ポンペ病、ゴーシェ病）等が含まれる。ただし、これらに限定されない。
また、ヒトFcγRIIbに選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドは、抗ウィルス剤の有効成分として有用である。ウィルスに対する抗体であって当該Fc領域を含む抗体は、ウィルスに対する抗体に見られる抗体依存性感染増強 (antibody-dependent enhancement) を抑制することが可能である。抗体依存性感染増強とは、ウィルスが、そのウィルスに対する中和抗体を利用して、活性型FcγRを介して貪食されFcγR発現細胞に感染することで、感染を拡大する現象である。デングウィルスに対する中和抗体のFcγRIIbに対する結合が、抗体依存性感染増強を抑制するのに重要な役割を果たしていることが報告されている(Proc Natl Acad Sci USA, 108, 12479-12484, 2011)。デングウィルスに対する中和抗体が形成するデングウィルスとの免疫複合体がFcγRIIbを架橋することで、FcγRを介した貪食を阻害し、その結果として抗体依存性感染増強を抑制する。ウィルスにはデングウィルス（DENV1、DENV2、DENV4）やHIVが含まれる。ただし、これらだけに限定されない。
また、ヒトFcγRIIbに選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドは、動脈硬化予防剤または治療剤の有効成分として有用である。動脈硬化の原因である酸化LDLに対する抗体であって、当該Fc領域を含む抗体はFcγRIIa依存的な炎症性細胞の接着を防ぐことが可能である。抗酸化LDL抗体は酸化LDLとCD36の相互作用を阻害するが、抗酸化LDL抗体が内皮細胞に対して結合し、そのFc部分をモノサイトがFcγRIIaやFcγRI依存的に認識し、接着することが報告されている (Immunol Lett, 108, 52-61, 2007)。このような抗体に、当該Fc領域を含む抗体を利用することで、FcγRIIa依存的な結合は阻害され、かつFcγRIIbを介した抑制シグナルによってモノサイトの接着を抑制することが考えられる。
また、ヒトFcγRIIbに選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドは、癌に対する治療剤又は予防剤の有効成分として有用である。FcγRIIbに対する結合を増強することで、アゴニスト抗体のアゴニスト活性が増強され、そのアゴニスト活性に基づく抗腫瘍効果も増強されることが知られているので、当該Fc領域を用いたアゴニスト抗体は、癌の治療又は予防に有用である。当該Fc領域は、Aliases、CD120a、CD120b、Lymphotoxin β receptor、CD134、CD40、FAS、TNFRSF6B、CD27、CD30、CD137、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10C、TNFRSF10D、RANK、Osteoprotegerin、TNFRSF12A、TNFRSF13B、TNFRSF13C、TNFRSF14、Nerve growth factor receptor、TNFRSF17、TNFRSF18、TNFRSF19、TNFRSF21、TNFRSF25、Ectodysplasin A2 receptor等のTNF受容体ファミリーに対するアゴニスト抗体のアゴニスト活性を増強する。また、上記以外のアゴニスト抗体のアゴニスト活性も増強する。癌は次のものを包含するが、それらだけには限定されない：肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌を含む）、大腸癌、直腸癌、結腸癌、乳癌、肝癌、胃癌、膵癌、腎癌、前立腺癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆管癌、腹膜癌、中皮腫、扁平上皮癌、子宮頸癌、子宮体癌、膀胱癌、食道癌、頭頚部癌、鼻咽頭癌、唾液腺腫瘍、胸腺腫、皮膚癌、基底細胞腫、悪性黒色腫、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、ウィルムス腫瘍、急性骨髄性白血病（急性骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病および急性単球性白血病を含む）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、毛様細胞白血病形質細胞腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫および成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫）、ランゲルハンス細胞組織球症、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、脳腫瘍（神経膠腫、星細胞腫、グリア芽細胞腫、髄膜腫および上衣腫を含む）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、骨肉腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫。
なお、本明細書で用いられるアミノ酸の3文字表記と1文字表記の対応は以下の通りである。
アラニン：Ala：A
アルギニン：Arg：R
アスパラギン：Asn：N
アスパラギン酸：Asp：D
システイン：Cys：C
グルタミン：Gln：Q
グルタミン酸：Glu：E
グリシン：Gly：G
ヒスチジン：His：H
イソロイシン：Ile：I
ロイシン：Leu：L
リジン：Lys：K
メチオニン：Met：M
フェニルアラニン：Phe：F
プロリン：Pro：P
セリン：Ser：S
スレオニン：Thr：T
トリプトファン：Trp：W
チロシン：Tyr：Y
バリン：Val：V
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕現存するマウスFcγR結合増強Fc変異体について（既存技術との比較）
マウスFcγRII（本明細書ではmFcγRIIまたはmFcgRIIとも表記される）に対する結合活性を選択的に増強したFc変異体の報告はこれまでに為されていない。一方、特許文献５（US2009/0136485）において、ヒトFcγRIIb（本明細書ではhFcγRIIbまたはhFcgRIIbとも表記される）に対する結合活性を増強したFc変異体のmFcγRIIに対する結合活性を評価している。これらのFc変異体はヒトIgG1を元にして作製されたものである。この評価結果中において、最も強くmFcγRIIに対する結合活性を増強したFc変異体はEUナンバリングで239番目のSerをAspに置換した改変、EUナンバリングで326番目のLysをAspに置換した改変、およびEUナンバリングで328番目のLeuをTyrに置換した改変を導入したFcであり、ヒトIgG1と比較したmFcγRII結合活性の増強は約130倍であった。しかしながら、マウスFcγRIII（本明細書ではmFcγRIIIまたはmFcgRIIIとも表記される）に対する結合活性のデータの記載がないため、その選択性は不明であった。
そこで、その選択性を評価するために、特許文献５（US2009/0136485）に記載されているヒトIgG1を鋳型としたFc変異体の内、mFcγRIIに対する結合増強が強いものを中心に8つのFc変異体を選抜し、これらのFc変異体を有する改変体を参考例１の方法により発現、精製し、参考例２のBiacore T200を使用した方法によりmFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合を評価した。抗体H鎖の可変領域にはWO2009/125825に記載されている抗IL-6レセプター抗体であるFv4-IgG1のH鎖VH3-IgG1の可変領域であるH237（配列番号：１）を使用した。また、抗体L鎖には抗IL-6レセプター抗体であるtocilizumabのL鎖であるMRAL-k0（配列番号：２）を共通に使用した。抗体H鎖の定常領域には、ヒトIgG1であるhIgG1（配列番号：３）を鋳型にして改変を導入し、上述の8つのFc変異体を作製して用いた。ここで導入した改変には10種類の改変（EUナンバリングで234番目のLeuをTrpに置換した改変；L234W、EUナンバリングで239番目のSerをAspに置換した改変；S239D、EUナンバリングで267番目のSerをAlaに置換した改変；S267A、EUナンバリングで267番目のSerをGluに置換した改変；S267E、EUナンバリングで268番目のHisをAspに置換した改変；H268D、EUナンバリングで326番目のLysをAspに置換した改変；K326D、EUナンバリングで327番目のAlaをAspに置換した改変；A327D、EUナンバリングで328番目のLeuをPheに置換した改変；L328F、EUナンバリングで328番目のLeuをTrpに置換した改変；L328W、EUナンバリングで328番目のLeuをTyrに置換した改変；L328Y）が含まれている。またコントロールとして、H鎖定常領域がマウスIgG1（mIgG1、配列番号：４）であるH237-mIgG1（配列番号：７）とMRAL-k0からなる改変体H237-mIgG1/MRAL-k0を用いた。
H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の、評価した全ての改変体の各mFcγRに対する相対的結合活性および相対的I/A（mFcγRII選択性）を表１に示した。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域（CH）の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表１における改変は、いずれもヒトIgG1（hIgG1）のH鎖定常領域（配列番号：３）に対して導入された改変である。
mFcγRIIに対する選択性を評価する指標として、mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値であるI/Aを用いた。この指標はmFcγRIIに対するKD値が小さくなるほど、あるいはmFcγRIIIに対するKD値が大きくなるほど大きな値を示す。すなわち、より大きなI/A値を示す改変体の方がmFcγRIIIと比較したmFcγRIIに対する選択性が高いことを示す。
Figure 0006774164
 （相対的な結合活性：H237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値）
表１の結果より、特許文献５（US2009/0136485）に記載されているhIgG1を鋳型としたFc変異体の中にはmIgG1と比較した相対的mFcγRII結合活性を約190倍増強させるFc変異体が存在するが、その相対的I/A（mFcγRII選択性）は約4倍程度の弱いものであった。
すなわち、現在までにmFcγRIIIと比較して十分な選択性を持ってmFcγRIIに対する結合を増強したFc変異体の報告はなされておらず、自己免疫疾患をはじめとした様々なマウス病態モデルにおいて、FcγRIIに対して選択的に結合を増強したFc変異体の効果をより正確に検証するためには、より選択性の優れたmFcγRII選択的結合増強Fc変異体が必要であることが明らかとなった。
〔実施例２〕マウスIgG1由来Fc変異体のマウスFcγRに対する結合の網羅的解析
天然型のマウスIgG1(本明細書ではmIgG1とも表記される)は4種類のマウスFcγR（本明細書ではmFcγRまたはmFcgRとも表記される）の内、マウスFcγRI（本明細書ではmFcγRIまたはmFcgRIとも表記される）、マウスFcγRIV（本明細書ではmFcγRIVまたはmFcgRIVとも表記される）には結合せず、mFcγRII、IIIにのみ結合を示す（Science 2005, 310, 1510-1512）。そのため、mIgG1を鋳型とすることで、mFcγRIIIと比較してmFcγRIIに対する選択性を付与することで、mFcγRIIに対して選択的に結合増強したFc変異体が作製可能であると考えた。
mIgG1と比較して、活性型mFcγR、特にmFcγRIIIに比べて、抑制型mFcγR、すなわちmFcγRIIに対する結合活性を選択的に増強させるような改変を見出すために、mIgG1抗体に変異を導入し、各mFcγRに対する結合の網羅的解析を実施した。
以下の評価において、抗体H鎖の可変領域には、WO2009/125825に記載されている抗IL-6レセプター抗体であるFv4-IgG1のH鎖VH3-IgG1の可変領域であるH237（配列番号１）を使用した。また、抗体H鎖の定常領域として、mIgG1（配列番号４）を利用した。このH鎖をH237-mIgG1（配列番号７）と呼ぶ。同様に、抗体L鎖には、抗IL-6レセプター抗体であるtocilizumabのL鎖であるMRAL-k0（配列番号：２）を共通に使用した。
mFcγRII (NCBI Reference Sequence: NP_034317.1)、mFcγRIII (NCBI Reference Sequence: NP_034318.2) の配列を比較した結果を図１に示す。図１からmFcγRIIとmFcγRIIIとではIgGのFcと相互作用すると予想される部位のうち、異なる残基は二つしか存在しないことが明らかとなった。
すなわち、mFcγRIIIに比べてmFcγRIIに対して選択的に結合活性を増強したFc変異体を作製するためには、この二残基の違いを区別する必要がある。加えて、mFcγRIIおよびmFcγRIIIの立体構造情報も得られておらず、目的のFc変異体を合理的に設計することは困難であると考えられた。そこで、H鎖定常領域がmIgG1であるH237-mIgG1/MRAL-k0を鋳型にし、mFcγRの結合に関与すると考えられるアミノ酸とその周辺のアミノ酸（EUナンバリングで230番目から232番目、236番目から241番目、265番目から268番目、296番目、298番目、300番目）を元のアミノ酸とCysを除く18種類のアミノ酸にそれぞれ置換した。これらのFc変異体をmIgG1 variantsと呼ぶ。mIgG1 variantsを参考例１の方法により発現、精製し、参考例２のBiacore 4000を使用した方法によりmFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合を網羅的に評価した。
それぞれのmFcγRとの相互作用解析結果について、以下の方法に従って図を作成した。変異を導入していないH237-mIgG1/MRAL-k0のmFcγRに対するKD値を各mIgG1 variantsのmFcγRに対するKD値で割り、得られた値をmIgG1 variantsの各mFcγRに対する相対的な結合活性の指標とした。横軸に各mIgG1 variantsのmFcγRIIIに対する相対的な結合活性の値、縦軸に各mIgG1 variantsのmFcγRIIに対する相対的な結合活性の値をそれぞれ表示した（図２）。
その結果、図２で示したように、いくつかの改変においてmFcγRIIIに対する相対的な結合活性の増強よりもmFcγRIIに対する相対的な結合活性の増強が上回ること、すなわちmFcγRIIに対する選択性が向上することを見出した。上述のmIgG1 variantsのmFcγRに対する結合の網羅的解析の中で、mFcγRIIに対する相対的な結合活性を1.1倍以上増強し、かつ、相対的I/A (mFcγRII選択性) を1.1倍以上向上した改変の効果をまとめた結果を表２に示した。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域（CH）の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表２における改変は、いずれもマウスIgG1（mIgG1）のH鎖定常領域（配列番号：４）に対して導入された改変である。
全部で288個の改変体を評価した中で基準を満たすものは39個だけであり、また、最も高い相対的I/A（mFcγRII選択性）は4.51倍であった。この中で、より優位であると考えられる、mFcγRIIに対する相対的な結合活性を1.4倍以上増強し、かつ、相対的I/A（mFcγRII選択性）を1.2倍以上向上した改変は 26個のみ（改変可能箇所としては9箇所）であった。このことから、mFcγRII、III間の選択性を付与しながらmFcγRII結合活性を増強することは極めて難易度が高いと考えられた。
Figure 0006774164
 （相対的な結合活性：H237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値）
〔実施例３〕マウスFcγRII選択的に結合活性を増強する改変の組み合わせによる効果の評価
実施例２で見出したmFcγRII選択的結合増強改変の内、EUナンバリングで239番目のSerをAspに置換する改変を導入した改変体H237-MB110/MRAL-k0は、H237-mIgG1/MRAL-k0と比較した際のmFcγRIIに対する相対的結合活性の増強が15.1倍と最も強く、相対的I/A (mFcγRII選択性) も3.4倍を示した。そこで、この改変体を元にして、さらにmFcγRII選択的に結合活性を増強する改変を１つあるいは複数箇所導入し、改変の組合せの効果を評価した。組合せの効果を検討する改変には、表１から8種類の改変（EUナンバリングで230番目のTyrをGluに置換した改変；T230E、EUナンバリングで231番目のValをAlaに置換した改変；V231A、EUナンバリングで231番目のValをAspに置換した改変；V231D、EUナンバリングで232番目のProをGluに置換した改変；P232E、EUナンバリングで238番目のSerをGluに置換した改変；S238E、EUナンバリングで240番目のValをGluに置換した改変；V240E、EUナンバリングで240番目のValをHisに置換した改変；V240H、EUナンバリングで267番目のSerをAlaに置換した改変；S267A）を選び、導入した。
抗体H鎖の可変領域には、WO2009/125825に記載されている抗IL-6レセプター抗体であるFv4-IgG1のH鎖VH3-IgG1の可変領域であるH237（配列番号：１）を使用した。また、抗体L鎖には、抗IL-6レセプター抗体であるtocilizumabのL鎖であるMRAL-k0（配列番号：２）を共通に使用した。H237-mIgG1/MRAL-k0にS239D改変を導入したH237-MB110/MRAL-k0を鋳型にし、上記の改変の組み合わせを導入した改変体群をMB110 variantsと呼ぶ。これらの改変体を参考例１の方法により発現、精製し、参考例２のBiacore T200を使用した方法によりmFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合を評価した。
それぞれのmFcγRとの相互作用解析結果について、以下の方法に従って図を作成した。変異を導入していないH237-mIgG1/MRAL-k0のmFcγRに対するKD値を、H237-MB110/MRAL-k0およびMB110 variantsのmFcγRに対するKD値で割り、得られた値を各mFcγRに対する相対的な結合活性の指標とした。横軸にH237-MB110/MRAL-k0およびMB110 variantsのmFcγRIIIに対する相対的な結合活性の値、縦軸にH237-MB110/MRAL-k0およびMB110 variantsのmFcγRIIに対する相対的な結合活性の値をそれぞれ表示した（図３）。
また、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の、評価した全てのMB110 variantsの各mFcγRに対する相対的結合活性および相対的I/A (mFcγRII選択性) を表３に示した。さらに、追加の改変を導入する前のH237-MB110/MRAL-k0の結合活性およびI/A (mFcγRII選択性) を1とした場合の結果を表４に示した。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域（CH）の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表３および表４における改変は、いずれもマウスIgG1（mIgG1）のH鎖定常領域（配列番号：４）に対して導入された改変である。
Figure 0006774164
 （相対的な結合活性：H237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A (mFcγRII選択性) ：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値）
Figure 0006774164
 （相対的な結合活性：H237-MB110/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各MB110 variantsの各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A (mFcγRII選択性) ：各MB110 variantsのI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-MB110/MRAL-k0のI/Aで割った値）
初めに、H237-MB110/MRAL-k0に上述した8つの改変を1つずつ導入した結果、6つの改変（T230E、V231A、V231D、P232E、S238E、S267A）を導入した場合において、I/A（mFcγRII選択性）を維持または向上させながら、mFcγRIIに対する結合活性を増強させることが見出された（表３、表４）。次に、これら6つの改変の内、H237-MB110/MRAL-k0を1とした場合のmFcγRIIに対する相対的結合活性を2倍以上増強する効果のあった5つの改変（T230E、V231A、V231D、P232E、S238E）を組み合わせて導入した結果、さらなるI/A（mFcγRII選択性）の向上およびmFcγRIIに対する結合活性の増強が観察された。なお、本検討で評価したH237-mIgG1/MRAL-k0に3つ以上の改変を導入した改変体の全てにおいて、実施例１の表１に示した既存Fc変異体を有する抗体の相対的I/A （mFcγRII選択性）を上回る結果が得られた。中でも、H237-mIgG/MRAL-k0にT230E、V231A、S238E、S239Dの4つの改変を導入した改変体（H237-MB337/MRAL-k0）においては、mIgG1と比較した際のmFcγRIIに対する相対的結合活性が73.4倍増強し、相対的I/A (mFcγRII選択性) が16倍向上した（表３、表４）。
一方で、表３と表４の結果から、改変を複数組み合わせていくことで、H237-mIgG1/MRAL-k0を鋳型にした点変異体の網羅的な解析結果から予想できないmFcγRII結合活性およびI/A（mFcγRII選択性）の変化が多く観察された。例えば、H237-MB110/MRAL-k0にP232E改変を導入した場合には、導入前と比較してmFcγRIIに対する結合活性を2.8倍増強させたのに対し、H237-MB110/MRAL-k0にV231A改変を導入し、この改変体H237-MB290/MRAL-k0にさらにP232E改変を導入した改変体H237-MB305/MRAL-k0においては、P232E改変の導入前と比較してmFcγRIIに対する結合活性の増強が見られなかった。同様に、H237-MB110/MRAL-k0にV231D改変を導入した場合には、導入前と比較してmFcγRIIに対する結合活性を3.5倍増強させたのに対し、H237-MB110/MRAL-k0にT230E改変およびS238E改変を導入し、この改変体H237-MB302/MRAL-k0にさらにV231D改変を導入した改変体H237-MB338/MRAL-k0においては、V231D改変の導入前と比較してmFcγRIIに対する結合活性が約0.8倍に減弱することが明らかとなった。
上述したように、改変を組み合わせていくことで期待された効果が得られなくなった要因として、導入している改変の箇所が隣接しているために同じH鎖上において各々の改変が互いに影響を及ぼしあうこと、また導入している改変の箇所が抗体のlower hinge領域に位置し、抗体とmFcγR間の相互作用界面だけでなく、その抗体における各Fc間の相互作用界面に位置するため、異なるH鎖間においても各々の改変が互いに影響を及ぼしあうことが推察される。そのため、H237-mIgG1/MRAL-k0を鋳型にした点変異体の網羅的な解析結果から改変を組み合わせることによる効果を予測することが困難になっていることが考えられた。
〔実施例４〕EUナンバリングで230番目、231番目、232番目におけるマウスFcγRII結合活性増強に最適な改変の組み合わせの探索
実施例３で示した通り、改変を組み合わせていくことでH237-mIgG1/MRAL-k0を鋳型にした点変異体の網羅的な解析結果から期待されるような効果が観察されない例が見られ、実施例２および実施例３で得られた結果からさらなるmFcγRII結合活性増強を目的とした改変の組み合わせを予測することが困難であった。そこで、上述したようにlower hinge領域において改変箇所が隣接しているEUナンバリングで230番目、231番目、および232番目のアミノ酸を、負電荷を有するアミノ酸、正電荷を有するアミノ酸、親水性の高いアミノ酸、特徴的な側鎖長を持つアミノ酸、芳香環を有するアミノ酸など、特徴的な性質を有するアミノ酸に置換し、それらを組み合わせることで、よりmFcγRII結合活性増強およびI/A (mFcγRII選択性) 向上に適した改変の組み合わせを探索することとした。
実施例２、実施例３と同様に、抗体H鎖の可変領域には、WO2009/125825に記載されている抗IL-6レセプター抗体であるFv4-IgG1のH鎖VH3-IgG1の可変領域であるH237（配列番号：１）を使用した。また、抗体L鎖には、抗IL-6レセプター抗体であるtocilizumabのL鎖であるMRAL-k0（配列番号：２）を共通に使用した。H237-mIgG1/MRAL-k0にS238E改変およびS239D改変を導入した上で、EUナンバリングで230番目、231番目、および232番目のアミノ酸の組み合わせを検討した。各改変体は参考例１の方法により発現、精製し、参考例２のBiacore T200を使用した方法によりmFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合を評価した。
それぞれのmFcγRとの相互作用解析結果について、以下の方法に従って図を作成した。変異を導入していないH237-mIgG1/MRAL-k0のmFcγRに対するKD値を、各改変体のmFcγRに対するKD値で割り、得られた値を各mFcγRに対する相対的な結合活性の指標とした。横軸に各改変体のmFcγRIIIに対する相対的な結合活性の値、縦軸に各改変体のmFcγRIIに対する相対的な結合活性の値をそれぞれ表示した（図４）。
また、本検討で評価した改変体の内、EUナンバリングで231番目のアミノ酸およびEUナンバリングで232番目のアミノ酸の置換による効果を評価するにあたり、T230E改変を有する改変体に関してのみ、以下の方法に従って図を作成した。なお、これらの改変体は共通して3つの改変（T230E/S238E/S239D）を有し、アミノ酸の違いはEUナンバリングで231番目および232番目のみである。図において、横軸の下段には各改変体のEUナンバリング232番目のアミノ酸を、上段には各改変体のEUナンバリング231番目のアミノ酸の種類を示した。左縦軸には各改変体のmFcγRII（●）およびmFcγRIII（◆）に対するKD値を示し、右縦軸にはmIgG1と比較した際の相対的I/A（mFcγRII選択性）（○）をそれぞれ表示した（図５）。なお、左縦軸は反転したLogスケール表示となっているため、上に行くほど結合活性が増強していることを示している。
これまでEUナンバリングで232番目のアミノ酸は、実施例２の表２の結果において最も高いmFcγRII結合活性増強およびI/A（mFcγRII選択性）向上を示したP232E改変を使用してきた。しかしながら、図５の結果より、本実施例で新たに検討した5つのアミノ酸（Ala、Asn、Pro、Trp、Tyr）に置換した改変体は、これまで使用してきたP232E改変に比べて、mFcγRII結合活性およびI/A（mFcγRII選択性）において良好な結果を示した。特に、EUナンバリングで232番目のアミノ酸をTrpやTyrなどの芳香族アミノ酸に置換すると、EUナンバリングで231番目のアミノ酸の種類によらず総じて強いmFcγRII結合活性を示した。この時、mFcγRIIIに対する結合の増強も見られるもののその程度は強くなく、結果として、15倍以上の高い相対的I/A(mFcγRII選択性)を示していた。また、EUナンバリングで232番目のアミノ酸がTrpやTyrなどの芳香族アミノ酸でない場合においては、EUナンバリングで231番目のValをProに置換することによりmFcγRIIに対しては顕著に結合を増強させるものの、mFcγRIIIに対する結合増強の程度が弱く、mFcγRII選択性を大きく向上させることが明らかとなった。これらのことから、EUナンバリングで232番目のアミノ酸をTrpやTyrなどの芳香族アミノ酸に置換する改変やEUナンバリングで231番目のValをProに置換する改変が、mFcγRIIに対する結合活性の増強およびI/A（mFcγRII選択性）の向上という観点において好ましい改変であると考えられた。
本検討で評価した全ての改変体について、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的結合活性および相対的I/A（mFcγRII選択性）を表５に示した。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域（CH）の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表５における改変は、いずれもマウスIgG1（mIgG1）のH鎖定常領域（配列番号：４）に対して導入された改変である。
Figure 0006774164
Figure 0006774164
（相対的な結合活性：H237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値）
以上の結果（図４、図５、表５）より、組合せの検討を実施する前の実施例３で見出された最も優れた改変体の一つであるH237-MB337/MRAL-k0と比較して、I/A（mFcγRII選択性）を維持または向上させながら、mFcγRIIに対する結合活性を増強する改変体が数多く見出された。このEUナンバリングで230番目、231番目、および232番目のアミノ酸の改変の組合せの効果は、実施例２で得られていたH237-mIgG1/MRAL-k0を鋳型にした点変異体の網羅的な解析結果からは予測することができない効果であった。すなわち、今回見出した改変の組み合わせは、本検討を行うことで初めて見出すことが可能な改変の組み合わせである。表５の結果より、本検討で評価した全ての改変体が実施例１の表１に示した既存Fc変異体を有する抗体よりも優れた相対的I/A（mFcγRII選択性）を示すと共に、いくつかの改変体においては相対的mFcγRII結合活性においても既存Fc変異体を有する抗体を大きく上回る結果を示した。中でも、H237-mIgG1/MRAL-k0に対して5つの改変（T230E/V231P/P232N/S238E/S239D）を導入したH237-MB390/MRAL-k0、および、H237-mIgG1/MRAL-k0に対して5つの改変（T230E/V231T/P232Y/S238E/S239D）を導入したH237-MB397/MRAL-k0は、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の相対的I/A（mFcγRII選択性）が各々44.0倍および28.9倍と高い値を示しながら、mFcγRIIに対する相対的な結合活性がいずれも500倍を超える強い増強効果を示し、選択性・結合活性の両側面において既存Fc変異体よりも非常に優れたFc変異体であることが示された。これらのmFcγRII選択的な結合増強Fc変異体を用いることで、マウスのin vivoおよびin vitro試験において、より正確に、ヒトにおけるhFcγRIIb選択的結合増強Fc変異体の薬効および安全性を評価することが可能になることが示唆された。
参考のために、H237-mIgG1/MRAL-k0、およびH237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合のmFcγRIIに対する相対的な結合活性が200倍以上を示した改変体について、各mFcγRに対するKD値およびI/A（mFcγRII選択性）を表６に示した。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表６における改変は、いずれもマウスIgG1（mIgG1）のH鎖定常領域（配列番号：４）に対して導入された改変である。
Figure 0006774164
 （I/A（mFcγRII選択性）： mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）
〔実施例５〕EUナンバリングで239番目におけるアミノ酸置換の検討
実施例４ではEUナンバリングで230番目、231番目、232番目のアミノ酸の最適な組み合わせを検討し、mFcγRII結合増強やI/A（mFcγRII選択性）に優れた改変体の作製に成功した。本実施例５においては、さらなるI/A（mFcγRII選択性）の向上およびmFcγRIIIに対する結合増強を抑制することを目的として、EUナンバリングで239番目のアミノ酸の置換を検討した。これまで、EUナンバリングで239番目のアミノ酸はSerをAspに置換していたが、ここでは新たにGlu、Met、Trpへの置換および元のアミノ酸であるSerへの置換を検討した。抗体H鎖の可変領域にはWO2009/125825に記載されている抗IL-6レセプター抗体であるFv4-IgG1のH鎖VH3-IgG1の可変領域であるH237（配列番号：１）を使用した。また、抗体L鎖には抗IL-6レセプター抗体であるtocilizumabのL鎖であるMRAL-k0（配列番号：２）を共通に使用した。検討を行うにあたり、実施例４で得られた改変体の中から表７に示す9つの改変体を選抜し、鋳型名を付与した。なお、EUナンバリングで239番目のアミノ酸以外が同一である改変体は共通の鋳型名を有することとする。これらの9つの改変体を鋳型にしてEUナンバリングで239番目のアミノ酸をGlu、Met、Trp、Serに置換する改変を導入し、参考例１の方法により発現、精製し、参考例２のBiacore T200を使用した方法によりmFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合を評価した。なお、鋳型となった改変体も含めたこれらの改変体群をS239X variantsと呼ぶ。
Figure 0006774164
それぞれのmFcγRとの相互作用解析結果について、以下の方法に従って図を作成した。変異を導入していないH237-mIgG1/MRAL-k0のmFcγRに対するKD値を、各S239X variantsのmFcγRに対するKD値で割り、得られた値を各mFcγRに対する相対的な結合活性の指標とした。横軸に各S239X variantsのmFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値であるI/A （mFcγRII選択性）、縦軸に各S239X variantsのmFcγRIIに対する相対的な結合活性の値をそれぞれ表示した（図６）。この時、EUナンバリングで239番目のアミノ酸がAsp（D）の場合は●、Glu（E）の場合は■、Met（M）の場合は◆、Ser（S）の場合は▲、Trp（W）の場合は▼で表示した。また、EUナンバリングで239番目のアミノ酸の種類が各鋳型に及ぼす効果を比較するために、以下の方法で図７を作成した。横軸の下段にはEUナンバリングで239番目のアミノ酸を、上段には鋳型名を示し、縦軸にはH237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の各S239X variantsの相対的mFcγRII結合活性（■）および相対的I/A（mFcγRII選択性）（□）をそれぞれ表示した。
本検討で評価した全てのS239X variantsについて、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的結合活性および相対的I/A（mFcγRII選択性）を表８に示した。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域（CH）の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表８における改変は、いずれもマウスIgG1（mIgG1）のH鎖定常領域（配列番号：４）に対して導入された改変である。
Figure 0006774164
Figure 0006774164
（相対的な結合活性：H237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値）
図７の結果より、EUナンバリングで239番目のアミノ酸に同じ置換を導入した際のmFcγRII結合活性の順序は各鋳型においてほぼ共通しているが、その変化の程度は鋳型によって大きく異なり、また選択性の変化には共通の挙動は観察されていない。これらのS239X variantsはS238E改変を共通して持ち、これ以外にEUナンバリングで230番目、231番目、232番目、および239番目のいくつかに改変を有している。よって、EUナンバリングで239番目のアミノ酸置換の効果は、EUナンバリングで230番目、231番、および232番目のアミノ酸の種類の影響を受けていることが明らかとなった。
図６、図７、表８の結果から、EUナンバリングで239番目のアミノ酸をGluやMet、Ser、Trpに置換することで、実施例４で得られていたS239D改変を含む改変体と比べてmFcγRIIに対する結合活性は減弱するものの、相対的I/A（mFcγRII選択性）を維持あるいは向上させる改変体が新たにいくつか見出された。これらの改変体の中には、mFcγRIIIに対する結合活性の増強が2倍に満たない改変体も含まれ、これらのFc変異体を用いることでmFcγRIIIに対する結合活性増強の影響をほぼ排除した上で、より正確にmFcγRIIに対する結合活性増強の効果を評価することが可能となることが示唆された。また、H237-MB475/MRAL-k0（H237-mIgG1/MRAL-k0 にT230E、V231P、P232N、S238E、S239E改変を導入）、H237-MB476/MRAL-k0（H237-mIgG1/MRAL-k0にT230Q、V231P、P232N、S238E、S239E改変を導入）、H237-MB513/MRAL-k0（H237-mIgG1/MRAL-k0にT230E、V231P、P232A、S238E、S239M改変を導入）、H237-MB515/MRAL-k0（H237-mIgG1/MRAL-k0にT230E、V231P、P232N、S238E、S239M改変を導入）の4つの改変体は、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の相対的I/A（mFcγRII選択性）が各々62.1倍、73.4倍、83.9倍、100倍を示しており、これまでで最も選択性の高かったH237-MB390/MRAL-k0の44倍を大きく上回った。
参考のために、H237-mIgG1/MRAL-k0、およびH237-mIgG1/MRAL-k0と比較した際のmFcγRIIに対する相対的結合活性が200倍以上、あるいは相対的I/A（mFcγRII選択性）が25倍以上を示した改変体について、各mFcγRに対するKD値およびI/A（mFcγRII選択性）を表９に示した。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表９における改変は、いずれもマウスIgG1（mIgG1）のH鎖定常領域（配列番号：４）に対して導入された改変である。
Figure 0006774164
 （I/A（mFcγRII選択性）： mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）
〔実施例６〕EUナンバリングで230番目、231番目、232番目、238番目、239番目以外におけるアミノ酸置換の検討
これまではEUナンバリングで230番目、231番目、232番目、238番目、239番目のアミノ酸の置換検討を実施してきたが、さらなるmFcγRII結合活性の増強を目的として、上述以外の部位のアミノ酸置換を検討した。
抗体H鎖の可変領域にはWO2009/125825に記載されている抗IL-6レセプター抗体であるFv4-IgG1のH鎖VH3-IgG1の可変領域であるH237（配列番号：１）を使用した。また、抗体L鎖には抗IL-6レセプター抗体であるtocilizumabのL鎖であるMRAL-k0（配列番号：２）を共通に使用した。実施例４においてH237-mIgG1/MRAL-k0 と比較して500倍以上の相対的mFcγRII結合活性増強を示したH237-MB397/MRAL-k0およびH237-MB390/MRAL-k0を鋳型にし、新たに改変を導入した改変体群をそれぞれMB397 variantsおよびMB390 variantsと呼ぶ。これらの改変体を参考例１の方法により発現、精製し、参考例２のBiacore T200を使用した方法によりmFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合を評価した。
それぞれのmFcγRとの相互作用解析結果について、以下の方法に従って図を作成した。鋳型として使用したH237-MB397/MRAL-k0あるいはH237-MB390/MRAL-k0のmFcγRに対するKD値を各々のvariantsのmFcγRに対するKD値で割り、得られた値をH237-MB397/MRAL-k0あるいはH237-MB390/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的な結合活性の指標とした。横軸に各variantsのmFcγRIIIに対する相対的な結合活性の値、縦軸に各 variantsのmFcγRIIに対する相対的な結合活性の値をそれぞれ表示した（図８：MB397 variants、図９：MB390 variants）。
また、H237-mIgG1/MRAL-k0あるいはH237-MB397/MRAL-k0を1とした場合の、評価した全てのMB397 variantsの各mFcγRに対する相対的結合活性および相対的I/A（mFcγRII選択性）を表１０に示した。同様に、H237-mIgG1/MRAL-k0あるいはH237-MB390/MRAL-k0を1とした場合の、評価した全てのMB390 variantsの各mFcγRに対する相対的結合活性および相対的I/A（mFcγRII選択性）を表１１に示した。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域（CH）の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表１０における改変は、いずれもMB397のH鎖定常領域（配列番号：５）に対して導入された改変であり、表１１における改変は、いずれもMB390のH鎖定常領域（配列番号：６）に対して導入された改変である。
Figure 0006774164
 （相対的な結合活性：H237-mIgG1/MRAL-k0あるいはH237-MB397/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0あるいはH237-MB397/MRAL-k0のI/Aで割った値）
Figure 0006774164
 （相対的な結合活性：H237-mIgG1/MRAL-k0あるいはH237-MB390/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0あるいはH237-MB390/MRAL-k0のI/Aで割った値）
これらの結果（図８、図９、表１０、表１１）から、S298L、S298M、N324D、A326D、K334R の内の1つまたは2つ以上の改変を導入することにより、I/A（mFcγRII選択性）を大きく減弱させることなくmFcγRIIに対する結合活性は増強され、これらの改変がmFcγRIIに対する結合活性の増強に有効であることが新たに見出された。実施例５で見出された選択性の高い改変体（H237-MB475/MRAL-k0、H237-MB476/MRAL-k0、H237-MB513/MRAL-k0、H237-MB515/MRAL-k0）にこれらの改変を導入することにより、高い選択性を維持した上で、よりmFcγRIIに対する結合活性が増強されることが期待される。
〔実施例７〕mFcγRIIに対する結合活性を選択的に増強したFc変異体を有する抗体のin vivoにおける血漿中濃度推移の評価
（７−１）mFcγRIIに対する結合活性を選択的に増強したマウス抗体の血漿中濃度推移の評価
これまでの実施例の中で、mFcγRIIに対する結合活性を選択的に増強したFc変異体を有する抗体が取得されてきた。mFcγRIIに対する結合活性を選択的に増強したFc変異体を有する抗体では、mFcγRIIだけでなく、mFcγRIIIに対する結合活性もmFcγRIIと同程度に増強したFc変異体を有する抗体と比較して、in vivo血漿中における抗体の濃度推移がどのように変化するのかを検証するために、ノーマルマウスを使って以下の試験を実施した。
（７−２）FcγRに対する結合活性を増強した抗体の作製
抗体H鎖の可変領域にはWO2009/125825に記載されている抗IL-6レセプター抗体であるFv4-IgG1のH鎖VH3-IgG1の可変領域であるH237（配列番号：１）を使用し、抗体L鎖には抗IL-6レセプター抗体であるtocilizumabのL鎖であるMRAL-k0（配列番号：２）を共通して使用した。H鎖定常領域がmIgG1であるH237-mIgG1（配列番号：７）とMRAL-k0からなる抗ヒトIL-6レセプター抗体H237-mIgG1/MRAL-k0、mFcγRIIに対する結合活性を選択的に増強したFc変異体を有するH237-MB367（配列番号：８）とMRAL-k0からなる抗ヒトIL-6レセプター抗体H237-MB367/MRAL-k0、mFcγRIIおよびmFcγRIIIに対する結合活性を増強する目的で、mIgG1のEUナンバリングで239番目のSerをAspに置換し、327番目のAlaをAspに置換したFc変異体を有するH237-mF46 (配列番号：９)とMRAL-k0からなる抗ヒトIL-6レセプター抗体H237-mF46/MRAL-k0とを参考例１の方法により発現、精製し、参考例２のBiacore T200を使用した方法によりmFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合を評価した。評価した抗体の各mFcγRに対する結合活性およびI/A（mFcγRII選択性）を表１２に示した。更に、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の、評価した抗体の各mFcγRに対する相対的結合活性および相対的I/A (mFcγRII選択性) を表１３に示した。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表１２および表１３における改変は、いずれもH237-mIgG1（配列番号：７）のH鎖定常領域に対して導入された改変である。
Figure 0006774164
 （I/A (mFcγRII選択性) ：各改変体のmFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）
Figure 0006774164
 （相対的な結合活性：H237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A (mFcγRII選択性) ：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値）
この結果から、H237-MB367/MRAL-k0はH237-mF46/MRAL-k0と比べて、mFcγRIIに対する結合活性を同程度に増強しつつも、mFcγRIIIに対する結合増強が抑制された、よりmFcγRIIに対して選択的に結合増強したFc変異体を有することが確認された。
（７−３）ノーマルマウスを用いたin vivo 試験
ノーマルマウス（C57BL/6J mouse、Charles River Japan）に可溶型ヒトIL-6レセプター（参考例３にて作製）を単独投与もしくは可溶型ヒトIL-6レセプターおよび抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体を同時投与した後の抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体の体内動態を評価した。可溶型ヒトIL-6レセプター溶液(5μg/mL)、もしくは、可溶型ヒトIL-6レセプターと抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体の混合溶液を尾静脈に10mL/kgで投与した。抗体は1mg/kgで可溶型ヒトIL-6レセプターは50μg/kgの投与量とした。抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体としては、上述のH237-MB367/MRAL-k0、H237-mF46/MRAL-k0のL鎖をWO2009/125825に記載されている抗IL-6レセプター抗体であるFv4-IgG1のL鎖VL3-CK の可変領域であるL104とマウスκ鎖の定常領域であるmk1からなるL104-mk1（配列番号：３２）に置き換えたH237-MB367/L104-mk1、H237-mF46/L104-mk1を使用した。抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体投与後5分、7時間、1日、2日、3日、7日、14日、21日が経過した後に当該マウスから採血が行なわれた。採取された血液を直ちに4℃、15,000 rpmで15分間遠心分離することによって、血漿が得られた。分離した血漿は、測定を実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫に保存された。
（７−４）ELISA法による血漿中抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体濃度の測定
マウス血漿中の抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体濃度はELISA法にて測定された。まず、可溶型ヒトIL-6レセプター をNunc-Immuno Plate, MaxiSoup（Nalge nunc International）に分注し、4℃で１晩静置することによって可溶型ヒトIL-6レセプター固相化プレートが作成された。血漿中濃度として2.50、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039μg/mLの抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体を含む検量線試料と100倍以上希釈されたマウス血漿測定試料が調製された。これらの検量線試料および血漿測定試料100μLが各ウェルに分注された可溶型ヒトIL-6レセプター固相化プレートを室温で2時間撹拌させた。その後Anti-Mouse IgG-Peroxidase antibody（SIGMA）を室温で2時間反応させた反応液の発色反応が、TMB One Component HRP Microwell Substrate（BioFX Laboratories）を基質として用いて行われた。1N-Sulfuric acid（Showa Chemical）を添加することによって反応が停止された各ウェルの反応液の450 nmの吸光度が、マイクロプレートリーダーにて測定された。マウス血漿中の抗体濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmax PRO（Molecular Devices）を用いて算出された。その結果を図１０に示す。
図１０の結果から、mFcγRIIに対する結合活性が選択的に増強されたH237-MB367/L104-mk1は、mFcγRIIおよびmFcγRIIIの両方に対する結合活性が増強されたH237-mF46/L104-mk1と比較して、血漿中において高い濃度推移を示した。このことからH237-mF46/L104-mk1ではH237-MB367/L104-mk1と比べて、mFcγRIIだけでなく、mFcγRIIIに対しても結合を増強してしまった結果、mFcγRIIIを介した抗体の消失が起きてしまっていると考えられる。すなわち、このように選択性の低い分子を用いることでは、マウスFcγRII（ヒトではFcγRIIb）に対して選択的に結合活性を増強した分子の効果を正しく検証することができないと考えられる。MB367のようなmFcγRIIに対して選択的に結合活性を増強したFc変異体を用いることで、より正確にマウスFcγRII（ヒトではFcγRIIb）に対して選択的に結合活性を増強した効果をin vivoにおいて検証することが可能であることが明らかとなった。
〔実施例８〕mFcγRIIに対する結合活性を選択的に増強した改変体の作製
（８−１）H237-MB476/MRAL-k0およびH237-MB515/MRAL-k0に対する改変追加の検討
高い選択性を有したままmFcγRIIに対する結合活性が増強したFcを得ることを目的として、実施例５で見出された選択性の高い2つの改変体（H237-MB476/MRAL-k0、H237-MB515/MRAL-k0）に対して、実施例６で見出したS298L、N324D、A326D、K334Rの内の1つまたは2つ以上の改変を導入する検討を実施した。
抗体H鎖の可変領域にはWO2009/125825に記載されている抗IL-6レセプター抗体であるFv4-IgG1のH鎖VH3-IgG1の可変領域であるH237（配列番号：１）を使用した。また、抗体L鎖には抗IL-6レセプター抗体であるtocilizumabのL鎖であるMRAL-k0（配列番号：２）を共通に使用した。H237-MB476/MRAL-k0およびH237-MB515/MRAL-k0を鋳型にして新たに改変を導入した。これらの改変体を参考例１の方法により発現、精製し、参考例２のBiacore T200を使用した方法によりこれらの改変体のmFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合を評価した。
それぞれのmFcγRとの相互作用解析結果について、以下の方法に従って図を作成した。鋳型として使用したH237-MB476/MRAL-k0あるいはH237-MB515/MRAL-k0のmFcγRに対するKD値を各改変体のmFcγRに対するKD値で割り、得られた値をH237-MB476/MRAL-k0あるいはH237-MB515/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的な結合活性の指標とした。また、各改変体のmFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値であるI/A （mFcγRII選択性）を、H237-MB476/MRAL-k0あるいはH237-MB515/MRAL-k0のI/A （mFcγRII選択性）で割った値を、H237-MB476/MRAL-k0あるいはH237-MB515/MRAL-k0を1とした場合の相対的なI/A（mFcγRII選択性）の指標とした。横軸に各改変体の相対的なI/A（mFcγRII選択性）の値、縦軸に各改変体のmFcγRIIに対する相対的な結合活性の値をそれぞれ表示した（図１３）。また、同様にして、変異を導入していないH237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合についても、横軸に各改変体の相対的なI/A（mFcγRII選択性）の値、縦軸に各改変体のmFcγRIIに対する相対的な結合活性の値をそれぞれ表示した（図１４）。
また、本検討で評価した全ての改変体について、H237-mIgG1/MRAL-k0あるいは各template（H237-MB476/MRAL-k0あるいはH237-MB515/MRAL-k0）を1とした場合の各mFcγRに対する相対的結合活性および相対的I/A（mFcγRII選択性）を表１４に示した。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域（CH）の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表１４における改変は、各templateであるMB476のH鎖定常領域（配列番号：３７）あるいはMB515のH鎖定常領域（配列番号：３８）に対して導入された改変である。
Figure 0006774164
 （相対的な結合活性：H237-mIgG1/MRAL-k0あるいはH237-MB476/MRAL-k0 、H237-MB515/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0あるいはH237-MB476/MRAL-k0 、H237-MB515/MRAL-k0のI/Aで割った値）
これらの結果（図１３、図１４、表１４）から、S298L、N324D、A326D、K334R の内の1つまたは2つ以上の改変を導入することにより、I/A（mFcγRII選択性）を大きく減弱させることなくmFcγRIIに対する結合活性を増強する改変体がいくつか見出された。この内、H237-MB530/MRAL-k0（H237-MB476/MRAL-k0にN324D/A326D改変を導入）、H237-MB542/MRAL-k0（H237-MB515/MRAL-k0にN324D/A326D改変を導入）、H237-MB548/MRAL-k0（H237-MB515/MRAL-k0にN324D/A326D/K334R改変を導入）、H237-MB544/MRAL-k0（H237-MB515/MRAL-k0にA326D/K334R改変を導入）、H237-MB543/MRAL-k0（H237-MB515/MRAL-k0にN324D/K334R改変を導入）は各templateを1とした場合の 相対的I/A（mFcγRII選択性）を0.75倍以上維持した上で、相対的mFcγRII結合活性を1.4倍以上増強していた。
中でも、H237-MB530/MRAL-k0およびH237-MB542/MRAL-k0、H237-MB548/MRAL-k0は、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の相対的mFcγRII結合活性が350倍以上かつ相対的I/A（mFcγRII選択性）が70倍以上を示しており、これまでに作製された同程度のmFcγRII結合活性を持つ改変体と比較してI/A（mFcγRII選択性）を大きく向上していた。
（８−２）EUナンバリングで239番目のアミノ酸置換の検討
実施例５で示したように、EUナンバリングで239番目のアミノ酸を置換することでI/A（mFcγRII選択性）を維持あるいは向上させる改変体を見出すことができた。そこで、実施例５において検討していない他のアミノ酸置換についても検討した。
抗体H鎖の可変領域にはWO2009/125825に記載されている抗IL-6レセプター抗体であるFv4-IgG1のH鎖VH3-IgG1の可変領域であるH237（配列番号：１）を使用した。また、抗体L鎖には抗IL-6レセプター抗体であるtocilizumabのL鎖であるMRAL-k0（配列番号：２）を共通に使用した。実施例５で使用したものと同一の9つの改変体（全てEUナンバリングで239番目のアミノ酸はAsp）を鋳型にしてEUナンバリングで239番目のアミノ酸をLeu、Asn、Tyr、Pheに置換する改変を導入した。また、9つの鋳型改変体の内、H237-MB389/MRAL-k0およびH237-MB390/MRAL-k0の2つの鋳型改変体に対しては、EUナンバリングで239番目のアミノ酸をAla、Gly、Val、Ile、Pro、Thr、Gln、Arg、Hisに置換する改変も導入した。また、9つの鋳型改変体の内、H237-MB432/MRAL-k0の鋳型改変体に対しては、EUナンバリングで239番目のアミノ酸をVal、Ileに置換する改変も導入した。これらの改変体を参考例１の方法により発現、精製し、参考例２のBiacore T200を使用した方法によりmFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合を評価した。
それぞれのmFcγRとの相互作用解析結果について、以下の方法に従って図を作成した。EUナンバリングで239番目のアミノ酸の種類が各鋳型に及ぼす効果を比較するために、各鋳型改変体のmFcγRに対するKD値を、それらを鋳型にして作製した各改変体のmFcγRに対するKD値で割って得られた値を、各鋳型改変体を1とした場合の各mFcγRに対する相対的な結合活性の指標とした。また、各改変体のmFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値であるI/A （mFcγRII選択性）を、それぞれの鋳型改変体のI/A （mFcγRII選択性）で割った値を、各鋳型改変体を1とした場合の相対的なI/A（mFcγRII選択性）の指標とした。横軸にEUナンバリングで239番目のアミノ酸を、縦軸に相対的mFcγRII結合活性（■）および相対的I/A（mFcγRII選択性）（□）を、各鋳型ごとにそれぞれ図示した（図１５）。
また、本検討で評価した全ての改変体について、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的結合活性および相対的I/A（mFcγRII選択性）を表１５に示した。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域（CH）の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表１５における改変は、いずれもマウスIgG1（mIgG1）のH鎖定常領域（配列番号：４）に対して導入された改変である。
Figure 0006774164
Figure 0006774164
（N.B.：測定は実施したが、結合が弱すぎるために結合が観察できなかった、
相対的な結合活性：H237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値）
図１５、表１５の結果から、全ての改変体においてmFcγRII結合活性は大きく減少しているが、いくつかの改変体においてはI/A（mFcγRII選択性）を維持あるいは向上させていた。なお、各鋳型改変体を1とした場合の相対的I/A（mFcγRII選択性）が0.8倍以上であった改変体は、図１５に矢印でCHの名称を記した。I/A（mFcγRII選択性）を向上させていた改変体の内、H237-MB716/MRAL-k0、H237-MB630/MRAL-k0、H237-MB710/MRAL-k0はH237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の相対的I/A（mFcγRII選択性）が40倍以上であり、高いmFcγRII選択性を有していた。これらの改変体を鋳型として実施例６や実施例８−１に示した改変などを追加することで、高いmFcγRII選択性を維持した上でmFcγRIIに対する結合活性をより増強した改変体が作製できると見込まれる。
（８−３）H237-MB630/MRAL-k0に対する改変追加の検討
実施例８−２の検討から、新たに高いmFcγRII選択性を有する改変体を取得した。その内の1つの改変体（H237-MB630/MRAL-k0）に対して、mFcγRII結合活性増強を目的として、さらなるアミノ酸置換を検討した。
抗体H鎖の可変領域にはWO2009/125825に記載されている抗IL-6レセプター抗体であるFv4-IgG1のH鎖VH3-IgG1の可変領域であるH237（配列番号：１）を使用した。また、抗体L鎖には抗IL-6レセプター抗体であるtocilizumabのL鎖であるMRAL-k0（配列番号：２）を共通に使用した。実施例８−２において見出されたH237-MB630/MRAL-k0を鋳型にし、実施例６で検討した改変などを導入した。これらの改変体を参考例１の方法により発現、精製し、参考例２のBiacore T200を使用した方法によりmFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合を評価した。
それぞれのmFcγRとの相互作用解析結果について、H237-MB630/MRAL-k0あるいはH237-mIgG1/MRAL-k0のmFcγRに対するKD値を各改変体のmFcγRに対するKD値で割り、得られた値をH237-MB630/MRAL-k0あるいはH237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的な結合活性の指標とした。また、各改変体のmFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値であるI/A （mFcγRII選択性）を、H237-MB716/MRAL-k0あるいはH237-mIgG1/MRAL-k0のI/A （mFcγRII選択性）で割った値を、H237-MB716/MRAL-k0あるいはH237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の相対的なI/A（mFcγRII選択性）の指標とした。横軸にH237-MB630/MRAL-k0を1とした場合の各改変体のmFcγRIIIに対する相対的な結合活性の値、縦軸にH237-MB630/MRAL-k0を1とした場合の各改変体のmFcγRIIに対する相対的な結合活性の値をそれぞれ表示した（図１６）。
また、本検討で評価した全ての改変体について、H237-MB630/MRAL-k0あるいはH237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的結合活性および相対的I/A（mFcγRII選択性）を表１６に示した。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域（CH）の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表１６における改変は、いずれもMB630のH鎖定常領域（配列番号：３９）に対して導入された改変である。
Figure 0006774164
Figure 0006774164
Figure 0006774164
（相対的な結合活性：H237-MB630/MRAL-k0あるいはH237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-MB630/MRAL-k0あるいはH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値）
図１６、表１６の結果から、H237-MB630/MRAL-k0に新たにアミノ酸置換を導入することにより、mFcγRII選択性が減弱するもののmFcγRII結合活性が増強した検体が数多く見出された。また、高いmFcγRII選択性を維持したままmFcγRII結合活性が増強あるいは減弱した改変体もいくつか見出された。
（８−４）H237-MB716/MRAL-k0に対する改変追加の検討
実施例８−２の検討においてH237-MB630/MRAL-k0（EUナンバリングで239番目のアミノ酸がLeu）よりも高いmFcγRII選択性を有することが示されていたH237-MB716/MRAL-k0（EUナンバリングで239番目のアミノ酸がIle）に対しても、さらなるアミノ酸置換を検討した。実施例８−３において、H237-MB630/MRAL-k0に対して導入することでmFcγRII結合活性の増強が見られた改変の中から7つの改変（K268D、Q295L、N324D、A326D、A327G、E333Y、K334R）を選び、これらの改変を組み合わせて導入する検討を実施した。
抗体H鎖の可変領域にはWO2009/125825に記載されている抗IL-6レセプター抗体であるFv4-IgG1のH鎖VH3-IgG1の可変領域であるH237（配列番号：１）を使用した。また、抗体L鎖には抗IL-6レセプター抗体であるtocilizumabのL鎖であるMRAL-k0（配列番号：２）を共通に使用した。H237-MB716/MRAL-k0を鋳型にして改変を導入した。これらの改変体を参考例１の方法により発現、精製し、参考例２のBiacore T200を使用した方法によりmFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合を評価した。
それぞれのmFcγRとの相互作用解析結果についてH237-MB716/MRAL-k0あるいはH237-mIgG1/MRAL-k0のmFcγRに対するKD値を各改変体のmFcγRに対するKD値で割り、得られた値をH237-MB716/MRAL-k0あるいはH237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的な結合活性の指標とした。また、各改変体のmFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値であるI/A （mFcγRII選択性）を、H237-MB716/MRAL-k0あるいはH237-mIgG1/MRAL-k0のI/A （mFcγRII選択性）で割った値を、H237-MB716/MRAL-k0あるいはH237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の相対的なI/A（mFcγRII選択性）の指標とした。横軸にH237-MB716/MRAL-k0を1とした場合の各改変体のmFcγRIIIに対する相対的な結合活性の値、縦軸にH237-MB716/MRAL-k0を1とした場合の各改変体のmFcγRIIに対する相対的な結合活性の値をそれぞれ表示した（図１７）。
また、本検討で評価した全ての改変体について、H237-MB716/MRAL-k0あるいはH237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的結合活性および相対的I/A（mFcγRII選択性）を表１７に示した。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域（CH）の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表１７における改変は、いずれもMB716のH鎖定常領域（配列番号：４７）に対して導入された改変である。
Figure 0006774164
 （相対的な結合活性：H237-MB716/MRAL-k0あるいはH237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-MB716/MRAL-k0あるいはH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値）
図１７、表１７の結果から、実施例８−３で見られた場合と同様に、H237-MB716/MRAL-k0に新たにアミノ酸置換を導入することにより、mFcγRII選択性を減弱させるもののmFcγRII結合活性が増強した検体が多く見出された。また、高いmFcγRII選択性を維持したままmFcγRII結合活性が増強した改変体も見出された。
上述のとおり、H237-MB716/MRAL-k0はH237-MB630/MRAL-k0よりも高いmFcγRII選択性を有しており、H237-MB716/MRAL-k0を鋳型とした改変体の方がH237-MB630/MRAL-k0を鋳型とした改変体よりも高いmFcγRII選択性を示していた。よって、H237-MB716/MRAL-k0を鋳型として様々な改変を導入することで、mFcγRII選択性の高い検体を多く得ることができるものと考えられる。
〔実施例９〕mFcγRIIに対する結合活性を天然型と同程度に維持し、mFcγRIIIに対する結合活性を減弱させた改変体の作製
本明細書中に記載のように、抗体が多価抗原と結合することで免疫複合体を形成し、その複合体が活性型FcγRと相互作用することで様々な副作用を誘導することが考えられ、抗体の医薬品としての価値を減じてしまう恐れがある。この問題を回避しながらも、FcγRIIbを介した作用を維持するためには、FcγRIIbに対する結合は維持しつつ、活性型FcγRに対する結合を選択的に減弱することが望ましいが、マウスFcγRに対してこのような特徴を備えたFc変異体の報告はない。そこで、本実施例においては、抑制型のmFcγRIIに対する結合活性は天然型mIgG1と同程度に維持しながら、活性型のmFcγRIIIに対する結合活性を減弱させたFc変異体の作製を目的として検討を行った。
（９−１）mFcγRIIIに対する結合活性を減弱させる改変の組み合わせの検討
実施例２において得られた1アミノ酸変異を有する改変体のmFcγRIIとmFcγRIIIに対する相互作用解析結果から、mFcγRIIIに対する結合活性を選択的に減弱させる改変を探索し、その中から10改変体を選抜した。これらの改変体を参考例１の方法により発現、精製し、参考例２のBiacore T200を使用した方法によりmFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合を評価した。
それぞれのmFcγRとの相互作用解析結果についてH237-mIgG1/MRAL-k0のmFcγRに対するKD値を各改変体のmFcγRに対するKD値で割り、得られた値をH237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的な結合活性の指標とした。また、各改変体のmFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値であるI/A （mFcγRII選択性）を、H237-mIgG1/MRAL-k0のI/A （mFcγRII選択性）で割った値を、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の相対的なI/A（mFcγRII選択性）の指標とした。
評価した全ての改変体の各mFcγRに対する相対的結合活性および相対的I/A（mFcγRII選択性）を表１８に示した。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域（CH）の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表１８における改変は、いずれもマウスIgG1（mIgG1）のH鎖定常領域（配列番号：４）に対して導入された改変である。
Figure 0006774164
 （相対的な結合活性： H237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値。なおH237-mIgG1/MRAL-k0の値は各改変体と同じ測定回の値を使用した）
表１８の結果から、いずれの改変体もmFcγRIIと比較してmFcγRIIIに対してより結合活性を減弱させることで、mFcγRII選択性を向上させていることが確認できた。そこで、これらの改変を組み合わせることで、mFcγRIIIに対する結合活性の減弱効果が強く、mFcγRII選択性が向上している改変体が得られないかを検討した。
抗体H鎖の可変領域にはWO2009/125825に記載されている抗IL-6レセプター抗体であるFv4-IgG1のH鎖VH3-IgG1の可変領域であるH237（配列番号：１）を使用した。また、抗体L鎖には抗IL-6レセプター抗体であるtocilizumabのL鎖であるMRAL-k0（配列番号：２）を共通に使用した。H237-mIgG1/MRAL-k0を鋳型にして改変を導入した。これらの改変体を参考例１の方法により発現、精製し、参考例２のBiacore T200を使用した方法によりmFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合を評価した。
それぞれのmFcγRとの相互作用解析結果についてH237-mIgG1/MRAL-k0のmFcγRに対するKD値を各改変体のmFcγRに対するKD値で割り、得られた値をH237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的な結合活性の指標とした。また、各改変体のmFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値であるI/A （mFcγRII選択性）を、H237-mIgG1/MRAL-k0のI/A （mFcγRII選択性）で割った値を、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の相対的なI/A（mFcγRII選択性）の指標とした。
また、本検討で評価した全ての改変体について、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的結合活性および相対的I/A（mFcγRII選択性）を表１９に示した。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域（CH）の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表１９における改変は、いずれもマウスIgG1（mIgG1）のH鎖定常領域（配列番号：４）に対して導入された改変である。
Figure 0006774164
Figure 0006774164
（N.B.：測定は実施したが、結合が弱すぎるために結合が観察できなかった、
相対的な結合活性： H237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値。なおH237-mIgG1/MRAL-k0の値は各改変体と同じ測定回の値を使用した）
表１９の結果より、改変を組み合わせることでmFcγRIII に対する結合活性をより減弱させ、かつmFcγRII選択性を向上させている改変体が複数見出された。さらに、mFcγRIIに対する結合活性が天然型mIgG1と同程度の改変体もいくつか見出され、H237-mIgG1/MRAL-k0と比較したmFcγRII結合活性の差が2倍以内（H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の相対的なmFcγRII結合活性が0.5倍以上2.0倍以下）であり、相対的I/A（mFcγRII選択性）が5倍以上である6つの改変体（MB594、MB599、MB601、MB611、MB617、MB618）を得ることに成功した。なお、これらの改変体は表１９中において灰色で塗りつぶして表示した。
（９−２）mFcγRII結合活性を選択的に増強した改変体に対するmFcγRへの結合減弱改変導入の検討
mFcγRIIに対する結合を選択的に増強した改変体を鋳型にして、mFcγRIIも含む全てのmFcγRに対する結合活性を減弱させる改変を導入することで、mFcγRIIに対する結合活性はmIgG1と同程度に維持する一方で、mFcγRIIIに対する結合活性がmIgG1よりも減弱した改変体が得られることが期待された。
全てのmFcγRに対する結合活性を減弱させる改変としてP232KやS239Kを用いた。実施例５と同様に、9つの改変体を鋳型として、P232KおよびS239K改変の効果を検討した。
抗体H鎖の可変領域にはWO2009/125825に記載されている抗IL-6レセプター抗体であるFv4-IgG1のH鎖VH3-IgG1の可変領域であるH237（配列番号：１）を使用した。また、抗体L鎖には抗IL-6レセプター抗体であるtocilizumabのL鎖であるMRAL-k0（配列番号：２）を共通に使用した。実施例５で使用したものと同一の9つの改変体（全てEUナンバリングで239番目のアミノ酸はAsp）を鋳型にして改変を導入した。これらの改変体を参考例１の方法により発現、精製し、参考例２のBiacore T200を使用した方法によりmFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合を評価した。
それぞれのmFcγRとの相互作用解析結果についてH237-mIgG1/MRAL-k0のmFcγRに対するKD値を各改変体のmFcγRに対するKD値で割り、得られた値をH237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的な結合活性の指標とした。また、各改変体のmFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値であるI/A （mFcγRII選択性）を、H237-mIgG1/MRAL-k0のI/A （mFcγRII選択性）で割った値を、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の相対的なI/A（mFcγRII選択性）の指標とした。
また、本検討で評価した全ての改変体について、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的結合活性および相対的I/A（mFcγRII選択性）を表２０に示した。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域（CH）の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表２０における改変は、各templateであるMB373のH鎖定常領域（配列番号：４０）、MB382のH鎖定常領域（配列番号：４１）、MB387のH鎖定常領域（配列番号：４２）、MB397のH鎖定常領域（配列番号：５）、MB379のH鎖定常領域（配列番号：４３）、MB389のH鎖定常領域（配列番号：４４）、MB425のH鎖定常領域（配列番号：４５）、MB390のH鎖定常領域（配列番号：６）、あるいはMB432のH鎖定常領域（配列番号：４６）に対して導入された改変である。
Figure 0006774164
 （N.B.：測定は実施したが、結合が弱すぎるために結合が観察できなかった、
相対的な結合活性： H237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値。なおH237-mIgG1/MRAL-k0の値は各改変体と同じ測定回の値を使用した）
表２０の結果から、P232K改変を導入した場合においては、相対的I/A（mFcγRII選択性）が5倍以上を維持している改変体がいくつかあったものの、相対的mFcγRII結合活性が5倍〜15倍程度増強されていた。よって、mFcγRIIに対する結合活性を増強させるための改変を減らす、あるいは実施例９−１で検討したようなmFcγRIIIに対する結合を減弱させる改変をさらに組み合わせることが有効であると考えられた。
一方、S239K改変を導入した場合においては、mFcγRIIに対する結合活性が著しく減弱されていた。鋳型に使用した9つの改変体の相対的mFcγRII結合活性は約200倍〜600倍であったので、実施例６で見出されたH237-MB498/MRAL-k0やH237-MB494/MRAL-k0（相対的mFcγRII結合活性がそれぞれ3300倍程度、2100倍程度）のような、よりmFcγRIIに対する結合活性が増強された改変体を鋳型とすれば、mFcγRIIに対する結合活性をmIgG1程度に維持することができるかもしれない。
また9つの改変体は全てS239D改変を有しており、これがmFcγRII結合活性の増強に大きく寄与しているため、この部位に改変を導入すると、元々有していたmFcγRII結合活性の増強自体を低減させてしまうことになる。そこで、既に改変を導入している部位とは異なる部位でのmFcγR結合活性を減弱させる改変を用いることも有効かもしれない。そのような改変としては、例えばEUナンバリングで297番目のAsnに付加されているN型糖鎖を取り除くためのN297A改変などが考えられる。抗体はFc領域のEUナンバリング297番目のAsnに付加されたN型糖鎖を取り除くことにより、FcγRに対する結合が著しく低減されることが報告されている（The Journal of Biological Chemistry, 2000, 276, 6591-6604）。
（９−３）mFcγRII結合活性を選択的に増強した改変体に対する改変削減の検討
mFcγRIIに対する結合を選択的に増強した改変体から、導入している改変を削減することで、mFcγRIIに対する結合活性はmIgG1と同程度に維持する一方で、mFcγRIIIに対する結合活性がmIgG1よりも減弱した改変体が得られることが期待された。
実施例９−１までに作製した改変体の内、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の相対的mFcγRII結合活性が1倍〜5倍であり、かつ相対的I/A（mFcγRII選択性）が15倍以上であった改変体の中から、7つの改変体（H237-MB594/MRAL-k0、H237-MB628/MRAL-k0、H237-MB632/MRAL-k0、H237-MB636/MRAL-k0、H237-MB642/MRAL-k0、H237-MB646/MRAL-k0、H237-MB657/MRAL-k0）を選び、それらに導入されている改変の削減を検討した。
抗体H鎖の可変領域にはWO2009/125825に記載されている抗IL-6レセプター抗体であるFv4-IgG1のH鎖VH3-IgG1の可変領域であるH237（配列番号：１）を使用した。また、抗体L鎖には抗IL-6レセプター抗体であるtocilizumabのL鎖であるMRAL-k0（配列番号：２）を共通に使用した。上述の7つの改変体を鋳型にして改変箇所のアミノ酸を改変前のアミノ酸に置換した。これらの改変体を参考例１の方法により発現、精製し、参考例２のBiacore T200を使用した方法によりmFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合を評価した。
それぞれのmFcγRとの相互作用解析結果についてH237-mIgG1/MRAL-k0のmFcγRに対するKD値を各改変体のmFcγRに対するKD値で割り、得られた値をH237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的な結合活性の指標とした。また、各改変体のmFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値であるI/A （mFcγRII選択性）を、H237-mIgG1/MRAL-k0のI/A （mFcγRII選択性）で割った値を、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の相対的なI/A（mFcγRII選択性）の指標とした。横軸に各改変体（鋳型の7改変体も含む）のmFcγRIIIに対する相対的な結合活性の値、縦軸に各改変体（鋳型の7改変体も含む）のmFcγRIIに対する相対的な結合活性の値をそれぞれ表示した（図１８）。
また、本検討で評価した全ての改変体（鋳型の7改変体も含む）について、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的結合活性および相対的I/A（mFcγRII選択性）を表２１に示した。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域（CH）の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表２１における改変は、いずれもマウスIgG1（mIgG1）のH鎖定常領域（配列番号：４）に対して導入された改変である。
Figure 0006774164
 （N.B.：測定は実施したが、結合が弱すぎるために結合が観察できなかった、
相対的な結合活性： H237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値。なおH237-mIgG1/MRAL-k0の値は各改変体と同じ測定回の値を使用した）
図１８および表２１の結果より、7つの改変体から改変を削減することによって、mFcγRII およびmFcγRIIIに対する結合活性を共に減弱させることに成功した。その結果、H237-mIgG1/MRAL-k0と比較したmFcγRII結合活性の差が2倍以内（H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の相対的なmFcγRII結合活性が0.5倍以上2.0倍以下）であり、相対的I/A（mFcγRII選択性）が5倍以上である改変体を多数（MB594、MB642、MB657、MB685、MB687、MB688、MB690、MB691、MB692、MB693、MB694、MB700、MB702、MB703）得ることに成功した。なお、これらの改変体は表２１中において灰色で塗りつぶして表示した。
なお、H237-MB697/MRAL-k0やH237-MB701/MRAL-k0などはH237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の相対的なmFcγRII結合活性が0.2倍程度に減弱してしまっているものの、mFcγRIIIに対する結合活性はKD値を算出できないほどに減弱していた。よって、これらの改変体にmFcγRIIに対して結合を増強する改変を加えることでも、目的とする改変体が得られることが期待される。
（９−４）mFcγRII結合活性を選択的に増強した改変体に対するV237E改変導入の検討
実施例９−１の結果から、I/A（mFcγRII選択性）を向上させながらmFcγRIIおよびmFcγRIIIに対する結合を減弱させる改変がいくつか示された。よって、mFcγRIIに対する結合を選択的に増強した改変体を鋳型にして、これらの改変を導入することで、mFcγRIIに対する結合活性はmIgG1と同程度に維持する一方で、mFcγRIIIに対する結合活性がmIgG1よりも減弱した改変体が得られることが期待された。
導入する改変としてV237Eを選抜した。鋳型として用いるmFcγRIIに対する結合を選択的に増強した改変体には、実施例５で鋳型として使用した9つの改変体、および実施例８−２で作製されたH237-MB628/MRAL-k0、H237-MB630/MRAL-k0を用いることとした。これらの11個の改変体を鋳型としてV237E改変導入の効果を検討した。
抗体H鎖の可変領域にはWO2009/125825に記載されている抗IL-6レセプター抗体であるFv4-IgG1のH鎖VH3-IgG1の可変領域であるH237（配列番号：１）を使用した。また、抗体L鎖には抗IL-6レセプター抗体であるtocilizumabのL鎖であるMRAL-k0（配列番号：２）を共通に使用した。上述の11個の改変体を鋳型にして改変を導入した。これらの改変体を参考例１の方法により発現、精製し、参考例２のBiacore T200を使用した方法によりmFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合を評価した。
それぞれのmFcγRとの相互作用解析結果についてH237-mIgG1/MRAL-k0のmFcγRに対するKD値を各改変体のmFcγRに対するKD値で割り、得られた値をH237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的な結合活性の指標とした。また、各改変体のmFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値であるI/A （mFcγRII選択性）を、H237-mIgG1/MRAL-k0のI/A （mFcγRII選択性）で割った値を、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の相対的なI/A（mFcγRII選択性）の指標とした。横軸に各改変体のmFcγRIIIに対する相対的な結合活性の値、縦軸に各改変体のmFcγRIIに対する相対的な結合活性の値をそれぞれ表示した（図１９）。
また、本検討で評価した全ての改変体について、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的結合活性および相対的I/A（mFcγRII選択性）を表２２に示した。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域（CH）の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表２２における改変は、いずれもマウスIgG1（mIgG1）のH鎖定常領域（配列番号：４）に対して導入された改変である。
Figure 0006774164
 （相対的な結合活性： H237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値。なおH237-mIgG1/MRAL-k0の値は各改変体と同じ測定回の値を使用した）
図１９および表２２の結果より、mFcγRIIに対する結合活性を選択的に増強した改変体にV237E改変を導入することによって、高い相対的I/A（mFcγRII選択性）を有したまま、mFcγRII およびmFcγRIIIに対する結合活性を減弱させることに成功した。その結果、H237-mIgG1/MRAL-k0と比較したmFcγRII結合活性の差が2倍以内（H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の相対的なmFcγRII結合活性が0.5倍以上2.0倍以下）であり、相対的I/A（mFcγRII選択性）が5倍以上である改変体が新たに2つ（MB731、MB732）見出された。なお、これらの改変体は表２２中において灰色で塗りつぶして表示した。これらの2つの改変体（H237-MB731/MRAL-k0およびH237-MB732/MRAL-k0）はH237-mIgG1/MRAL-k0と比較したmFcγRII結合活性の差が2割以内であり（H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の相対的なmFcγRII結合活性が0.8倍以上1.2倍以下）、かつ、mFcγRIIIに対する結合活性は0.03倍まで減弱しているという非常に優れた性質を有するものであった。
次に、これらの2つの改変体に対して、導入されている改変の削減を検討した。
抗体H鎖の可変領域にはWO2009/125825に記載されている抗IL-6レセプター抗体であるFv4-IgG1のH鎖VH3-IgG1の可変領域であるH237（配列番号：１）を使用した。また、抗体L鎖には抗IL-6レセプター抗体であるtocilizumabのL鎖であるMRAL-k0（配列番号：２）を共通に使用した。H237-mIgG1/MRAL-k0を鋳型にして、H237-MB731/MRAL-k0およびH237-MB732/MRAL-k0に導入されている改変から1つ除いた改変を導入した。これらの改変体を参考例１の方法により発現、精製し、参考例２のBiacore T200を使用した方法によりmFcγRIIとmFcγRIIIに対する結合を評価した。
それぞれのmFcγRとの相互作用解析結果についてH237-mIgG1/MRAL-k0のmFcγRに対するKD値を各改変体のmFcγRに対するKD値で割り、得られた値をH237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的な結合活性の指標とした。また、各改変体のmFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値であるI/A （mFcγRII選択性）を、H237-mIgG1/MRAL-k0のI/A （mFcγRII選択性）で割った値を、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の相対的なI/A（mFcγRII選択性）の指標とした。
また、本検討で評価した全ての改変体について、H237-mIgG1/MRAL-k0を1とした場合の各mFcγRに対する相対的結合活性および相対的I/A（mFcγRII選択性）を表２３に示した。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域（CH）の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表２３における改変は、いずれもマウスIgG1（mIgG1）のH鎖定常領域（配列番号：４）に対して導入された改変である。
Figure 0006774164
 （N.B.：測定は実施したが、結合が弱すぎるために結合が観察できなかった、
相対的な結合活性： H237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値。なおH237-mIgG1/MRAL-k0の値は各改変体と同じ測定回の値を使用した）
表２３の結果より、H237-MB731/MRAL-k0およびH237-MB732/MRAL-k0から改変を減らすことによりmFcγRII結合活性が増強あるいは減弱し、H237-mIgG1/MRAL-k0と比較した差は拡大する結果であった。しかしながら、高いmFcγRII選択性を維持しているものが多く、これらの改変体にさらにmFcγRIIに対する結合活性を増強あるいは減弱させる改変を組み合わせることでも、H237-mIgG1/MRAL-k0と同程度のmFcγRII結合活性を有し、mFcγRIIIに対する結合活性は減弱した改変体が得られることが期待される。
〔実施例１０〕実施例８および９で作製した改変体の各mFcγRに対するKD値およびI/A（mFcγRII選択性）
参考のために、実施例８および９で作製し評価した改変体の内、いくつかの改変体について、各mFcγRに対するKD値およびI/A（mFcγRII選択性）を表に示す。
H237-mIgG1/MRAL-k0と比較した際のmFcγRIIに対する相対的結合活性が200倍以上の改変体を表２４に示した。これらの改変体はmFcγRIIに対する相対的結合活性が著しく増強しているという点で極めて優れている。H237-mIgG1/MRAL-k0と比較した際のmFcγRIIに対する相対的結合活性が10倍以上、かつ相対的I/A（mFcγRII選択性）が25倍以上の改変体を表２５に示した。これらの改変体はmFcγRに対する相対的結合活性が増強し、かつmFcγRに対する選択性も高いという点で優れている。H237-mIgG1/MRAL-k0と比較した際のmFcγRIIに対する相対的結合活性が0.5倍〜2倍、かつ相対的I/A（mFcγRII選択性）が5倍以上の改変体を表２６に示した。これらの改変体はmFcγRに対する結合活性は維持しつつも、mFcγRIIIに対する結合活性が選択的に低減しているため、mFcγRIIに対する結合のみに由来する効果を評価する際に用いることができる。特にmFcγRIIに対する効果が増強していないため、mIgG1程度にmFcγRIIに結合した場合の効果が評価できるという点で優れている。H237-mIgG1/MRAL-k0と比較した際のmFcγRIIに対する相対的結合活性が0.8倍以上、かつmFcγRIIIに対する相対的結合活性が0.2倍以下、かつ相対的I/A（mFcγRII選択性）が5倍以上の改変体を表２７にそれぞれ示した。これらの改変体も同様に、mFcγRIIに対する結合のみに由来する効果を評価する際に用いることができるという点で優れている。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表２４〜２７における改変は、いずれもマウスIgG1（mIgG1）のH鎖定常領域（配列番号：４）に対して導入された改変である。
Figure 0006774164
 （I/A (mFcγRII選択性) ：各改変体のmFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値、
相対的な結合活性：H237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値）
Figure 0006774164
Figure 0006774164
Figure 0006774164
Figure 0006774164
Figure 0006774164
Figure 0006774164
（I/A (mFcγRII選択性) ：各改変体のmFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値、
相対的な結合活性：H237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値）
Figure 0006774164
Figure 0006774164
（I/A (mFcγRII選択性) ：各改変体のmFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値、
相対的な結合活性： H237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値。なおH237-mIgG1/MRAL-k0の値は各改変体と同じ測定回の値を使用した）
Figure 0006774164
Figure 0006774164
Figure 0006774164
（I/A (mFcγRII選択性) ：各改変体のmFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値、
相対的な結合活性： H237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値。なおH237-mIgG1/MRAL-k0の値は各改変体と同じ測定回の値を使用した）
〔実施例１１〕mFcγRIIに対する結合活性を選択的に増強したFc変異体を有する抗体のin vivo評価
これまでの実施例の中で、mFcγRIIに対する結合活性を選択的に増強したFc変異体を有する抗体が取得されてきた。WO2013/047752において、pH依存的に可溶型抗原に結合し、mFcγRIIに対して選択的に結合活性を増強させたFc変異体を有する抗原結合分子は、生体内に投与された場合に、血漿中の可溶型抗原を効率的に消失させることが可能であることがノーマルマウスにおいて示された。本実施例では、この抗原の消失効果がmFcγRIIに対する結合活性の増強の程度と相関するのかを検証するために、ノーマルマウスを使って以下の試験を実施した。
（１１−１）mFcγRIIに対する結合活性を選択的に増強したFc変異体を有する抗体のmFcγR結合活性
これまでの実施例で作製・評価された改変体の中から、mFcγRIIに対する結合活性を選択的に増強し、かつ増強の程度が異なるものとして、H237-MB477/MRAL-k0およびH237-MB492/MRAL-k0を選抜した。これら2つの改変体およびH237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値およびI/A（mFcγRII選択性）を表２８に示した。なお、表中の名称は評価した改変体のH鎖定常領域の名称を表す。また改変に関しては、EUナンバリング000番目のアミノ酸Xをアミノ酸Zに置換することを「X000Z」と表記した。この際、XおよびZはアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。表２８における改変は、いずれもマウスIgG1（mIgG1）のH鎖定常領域（配列番号：４）に対して導入された改変である。
Figure 0006774164
 （I/A (mFcγRII選択性) ：各改変体のmFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値、
相対的な結合活性：H237-mIgG1/MRAL-k0の各mFcγRに対するKD値を各改変体の各mFcγRに対するKD値で割った値、
相対的I/A（mFcγRII選択性）：各改変体のI/A（mFcγRIIIに対するKD値をmFcγRIIに対するKD値で割った値）をH237-mIgG1/MRAL-k0のI/Aで割った値）
（１１−２）ノーマルマウスを用いたin vivo 試験
ノーマルマウス（C57BL/6J mouse、Charles River Japan）に可溶型ヒトIL-6レセプター（参考例３にて作製）および抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体を同時投与した後の抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体および可溶型ヒトIL-6レセプターの体内動態を評価した。可溶型ヒトIL-6レセプター溶液(5μg/mL)、もしくは、可溶型ヒトIL-6レセプターと抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体の混合溶液を尾静脈に10mL/kgで投与した。抗体は1mg/kgで可溶型ヒトIL-6レセプターは50μg/kgの投与量とした。抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体としては、上述のH237-MB477/MRAL-k0、H237-MB492/MRAL-k0のL鎖をWO2009/125825に記載されている抗ヒトIL-6レセプター抗体であるFv4-IgG1のL鎖VL3-CK の可変領域であるL104とマウスκ鎖の定常領域であるmk1からなるL104-mk1（配列番号：３２）に置き換えたH237-MB477/L104-mk1、H237-MB492/L104-mk1を使用した。抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体投与後5分、2時間、7時間、1日、2日、3日、7日、14日、21日、28日が経過した後に当該マウスから採血が行なわれた。ただし、抗体投与後2時間の採血は実施されていない場合もある。採取された血液を直ちに4℃、15,000 rpmで15分間遠心分離することによって、血漿が得られた。分離した血漿は、測定を実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫に保存された。
（１１−３）電気化学発光法による血漿中可溶型ヒトIL-6レセプター濃度の測定
マウスの血漿中可溶型ヒトIL-6レセプター濃度は電気化学発光法にて測定した。血漿中濃度として12.5、6.25、3.13、1.56、0.781、0.391、0.195 ng/mLに調整した可溶型ヒトIL-6レセプター検量線試料および50倍以上希釈したマウス血漿測定試料を調製し、SULFO-TAG NHS Ester（Meso Scale Discovery）でルテニウム化したMonoclonal Anti-human IL-6R Antibody（R&D）およびBiotinylated Anti-human IL-6 R Antibody （R&D）およびトシリズマブ溶液を混合し37度で1晩反応させた。その後、0.5%BSA(w/v)を含有したPBS-Tween溶液を用いて5度で1晩BlockingしたStreptavidin Gold Multi-ARRAY Plate（Meso Scale Discovery）に分注した。さらに室温で2時間反応させ洗浄後、Read Buffer T(×2）（Meso Scale Discovery）を分注し、ただちにSECTOR Imager 2400 （Meso Scale Discovery）で測定を行った。可溶型ヒトIL-6レセプター濃度は検量線のレスポンスから解析ソフトウェアSOFTmax PRO（Molecular Devices）を用いて算出した。その結果を図２０に示す。
（１１−４）ELISA法による血漿中抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体濃度の測定
マウス血漿中の抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体濃度はELISA法にて測定された。まず、可溶型ヒトIL-6レセプター をNunc-Immuno Plate, MaxiSoup（Nalge nunc International）に分注し、4℃で１晩静置することによって可溶型ヒトIL-6レセプター固相化プレートが作成された。血漿中濃度として2.50、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039μg/mLの抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体を含む検量線試料と100倍以上希釈されたマウス血漿測定試料が調製された。これらの検量線試料および血漿測定試料100μLが各ウェルに分注された可溶型ヒトIL-6レセプター固相化プレートを室温で2時間撹拌させた。その後Anti-Mouse IgG-Peroxidase antibody（SIGMA）を室温で2時間反応させた反応液の発色反応が、TMB One Component HRP Microwell Substrate（BioFX Laboratories）を基質として用いて行われた。1N-Sulfuric acid（Showa Chemical）を添加することによって反応が停止された各ウェルの反応液の450 nmの吸光度が、マイクロプレートリーダーにて測定された。マウス血漿中の抗体濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmax PRO（Molecular Devices）を用いて算出された。その結果を図２１に示した。
図２０の結果から、mFcγRIIに対する結合活性を選択的に増強したFcを有する抗体であるH237-MB477/L104-mk1（H237-mIgG1/L104-mk1を1とした時の相対的mFcγRII結合活性が約200倍）およびH237-MB492/L104-mk1（H237-mIgG1/L104-mk1を1とした時の相対的mFcγRII結合活性が約620倍）をノーマルマウスに投与した際の血漿中からの抗原消失効果は、抗体FcのmFcγRIIに対する結合活性増強の程度に応じて、より高められることが示された。すなわち、相対的mFcγRII結合活性が約620倍であるH237-MB492/L104-mk1が投与されたマウスでは、相対的mFcγRII結合活性が約200倍であるH237-MB477/L104-mk1が投与されたマウスよりも、標的抗原濃度が低減し、相対的mFcγRII結合活性が約200倍であるH237-MB477/L104-mk1を投与されたマウスではH237-mIgG1/L104-mk1を投与されたマウスよりも標的抗原濃度が低減していた。
図２１の結果から、H237-MB477/L104-mk1は相対的mFcγRII結合活性が約200倍であるにも関わらず、H237-mIgG1/L104-mk1とほぼ同等の血漿中抗体濃度推移を示した。相対的mFcγRII結合活性が約620倍であるH237-MB492/L104-mk1は、H237-mIgG1/L104-mk1と比較して血漿中抗体濃度がわずかに低減していた。しかしながら、投与一日後の段階ではH237-MB492/L104-mk1の抗体濃度はH237-mIgG1/L104-mk1の抗体濃度と同程度であるにも関わらず、H237-MB492/L104-mk1を投与したマウスでは可溶型ヒトIL-6レセプター濃度が約10倍低減していた。このことから、H237-MB492/L104-mk1は抗体濃度がわずかにしか低減していないにも関わらず、標的抗原の濃度を著しく減弱することができることが示された。
〔参考例１〕抗体の発現ベクターの作製および抗体の発現と精製
抗体の可変領域のH鎖およびL鎖の塩基配列をコードする全長の遺伝子の合成は、Assemble PCR等を用いて、当業者公知の方法で作製した。アミノ酸置換の導入はPCR等を用いて当業者公知の方法で行った。得られたプラスミド断片を動物細胞発現ベクターに挿入し、H鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。作製したプラスミドをヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株（Invitrogen社）、またはFreeStyle293細胞（Invitrogen社）に、一過性に導入し、抗体の発現を行った。得られた培養上清を回収した後、0.22μmフィルターMILLEX(R)-GV（Millipore）、または0.45μmフィルターMILLEX(R)-GV（Millipore）を通して培養上清を得た。得られた培養上清から、rProtein A Sepharose Fast Flow（GEヘルスケア）またはProtein G Sepharose 4 Fast Flow（GEヘルスケア）を用いて当業者公知の方法で、抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE等の方法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した（Protein Science 1995, 4, 2411-2423）。
〔参考例２〕mFcγRの調製方法および改変抗体とmFcγRとの相互作用解析方法
マウスのFcγRの細胞外ドメインを以下の方法で調製した。まずFcγRの細胞外ドメインの遺伝子の合成を当業者公知の方法で実施した。その際、各FcγRの配列はNCBIに登録されている情報に基づき作製した。具体的には、mFcγRIについてはNCBI Reference Sequence: NP_034316.1、mFcγRIIについてはNCBI Reference Sequence: NP_034317.1、mFcγRIIIについてはNCBI Reference Sequence: NP_034318.2、mFcγRIVについてはNCBI Reference Sequence: NP_653142.2の配列に基づいて作製し、C末端にHisタグを付加した。
得られた遺伝子断片を動物細胞発現ベクターに挿入し、発現ベクターを作製した。作製した発現ベクターをヒト胎児腎癌細胞由来FreeStyle293細胞（Invitrogen社）に、一過性に導入し、目的タンパク質の発現を行った。得られた培養上清を回収した後、0.22μmフィルターを通して培養上清を得た。得られた培養上清は原則として次の4ステップで精製した。第1ステップはイオン交換カラムクロマトグラフィー、第2ステップはHisタグに対するアフィニティカラムクロマトグラフィー（HisTrap HP）、第3ステップはゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Superdex200）、第4ステップは無菌ろ過を実施した。第1ステップのイオン交換カラムクロマトグラフィーについて、mFcγRIはQ Sepharose HP、mFcγRIIおよびmFcγRIVはSP Sepharose FF、mFcγRIIIはSP Sepharose HPを用いた。また第3ステップ以降で用いた溶媒はD-PBS(-)としたが、mFcγRIIIについては0.1M Arginineを含むD-PBS(-)とした。精製したタンパク質については分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE等の方法により算出された吸光係数を用いて精製タンパク質の濃度を算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。
Biacore T100（GEヘルスケア）、Biacore T200（GEヘルスケア）、Biacore A100、Biacore 4000を用いて、各改変抗体と上記で調製したFcγレセプターとの相互作用解析を行った。ランニングバッファーにはHBS-EP+（GEヘルスケア）を用い、測定温度は25℃とした。Series S Sensor Chip CM5（GEヘルスケア）またはSeries S Sensor Chip CM4（GEヘルスケア）に、アミンカップリング法によりProtein L（ACTIGENまたはBioVision）を固定化したチップを用いた。
これらのセンサーチップに目的の抗体をキャプチャーさせ、ランニングバッファーで希釈したmFcγRを相互作用させ、抗体に対する結合量を測定し、抗体間で比較した。ただし、mFcγRの結合量はキャプチャーした抗体の量に依存するため、各抗体のキャプチャー量でmFcγRの結合量を除した補正値で比較した。また、10 mM glycine-HCl、pH1.5を反応させることで、センサーチップにキャプチャーした抗体を洗浄し、センサーチップを再生して繰り返し用いた。
また、各改変抗体のFcγRに対するKD値を算出するため速度論的な解析は以下の方法にしたがって実施した。まず、上記のセンサーチップに目的の抗体をキャプチャーさせ、ランニングバッファーで希釈したmFcγRを相互作用させ、得られたセンサーグラムに対してBiacore Evaluation Softwareにより測定結果を1:1 Langmuir binding modelでglobal fittingさせることで結合速度定数ka (L/mol/s)、解離速度定数kd(1/s)を算出し、その値から解離定数KD (mol/L) を算出した。
〔参考例３〕可溶型ヒトIL-6レセプター（hsIL-6R）の調製
抗原であるヒトIL-6レセプターの組み換えヒトIL-6レセプターは以下のように調製した。J Immunol 152, 4958-4968 (1994)で報告されているN末端側１番目から357番目のアミノ酸配列からなる可溶型ヒトIL-6レセプター（以下、hsIL-6R）のCHO定常発現株を当業者公知の方法で構築し、培養し、hsIL-6Rを発現させた。得られた培養上清から、Blue Sepharose 6 FFカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーの2工程によりhsIL-6Rを精製した。最終工程においてメインピークとして溶出した画分を最終精製品とした。
本発明によって、マウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドが提供された。それらは、ヒトFcγRIIaと比較してヒトFcγRIIbに対して選択的に結合するFc変異体を含むポリペプチドのヒトにおける作用をマウスで予測することを可能にする点において極めて有用である。具体的には、(i) ヒトにおける疾患の治療または予防効果を予測する、(ii) ヒトにおける治療または予防に適した疾患を選択する、(iii) ヒトにおける疾患の治療または予防に適した標的抗原を選択する、(iv) ヒトにおける疾患の治療または予防に適した抗原結合領域を選択する、(v) ヒトにおける安全性または毒性を予測する、(vi) ヒトにおける薬物動態を予測するなどの点において有用である。

Claims (8)

  1. マウスIgG1のFc領域を含む親ポリペプチドの変異体で、該Fc領域に少なくとも２つのアミノ酸改変を含み、かつ〔マウスFcγRIIIに対するKD値〕／〔マウスFcγRIIに対するKD値〕の比が6以上であり、
    前記アミノ酸改変が、EUナンバリング238番目のアミノ酸のGluへの置換であるポリペプチド。
  2. マウスIgG1のFc領域を含む親ポリペプチドの変異体で、該Fc領域に少なくとも２つのアミノ酸改変を含み、かつマウスFcγRIIIと比較してマウスFcγRIIに対する結合選択性が親ポリペプチドより5倍以上向上しており、
    前記アミノ酸改変が、EUナンバリング238番目のアミノ酸のGluへの置換であるポリペプチド。
  3. マウスFcγRIIに対するKD値が20nM以下である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  4. マウスFcγRIIに対する結合活性が親ポリペプチドより10倍以上増強している、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  5. マウスFcγRIIIに対するKD値が1μM以上である、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. マウスFcγRIIIに対する結合活性が親ポリペプチドの0.25倍以下に減弱している、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  7. さらに、EUナンバリング；
    230番目のアミノ酸のAsp、Glu、Ile、またはGlnへの置換、
    231番目のアミノ酸のAla、Asp、Asn、Pro、ThrまたはTrpへの置換、
    232番目のアミノ酸のAla、Asn、TrpまたはTyrへの置換、
    237番目のアミノ酸のGluへの置換、
    239番目のアミノ酸のAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、TrpまたはTyrへの置換、
    240番目のアミノ酸のGlu、His、GlnまたはTrpへの置換、
    241番目のアミノ酸のAsp、Glu、Thr、TrpまたはTyrへの置換、
    266番目のアミノ酸のLeuへの置換、
    267番目のアミノ酸のAla、GluまたはMetへの置換、
    268番目のアミノ酸のAspへの置換、
    271番目のアミノ酸のLeuへの置換、
    295番目のアミノ酸のLeuへの置換、
    296番目のアミノ酸のGlu、Asn、Thr、またはTrpへの置換、
    298番目のアミノ酸のHis、Leu、またはMetへの置換、
    324番目のアミノ酸のAsp、Leu、またはMetへの置換、
    326番目のアミノ酸のAspへの置換、
    327番目のアミノ酸のGlyへの置換、
    330番目のアミノ酸のGly、Lys、またはGlnへの置換、
    331番目のアミノ酸のAsp、Phe、またはTyrへの置換、
    333番目のアミノ酸のAsn、Val、またはTyrへの置換、
    334番目のアミノ酸のArgへの置換、
    335番目のアミノ酸のAsnまたはTyrへの置換、
    337番目のアミノ酸のIle、Lys、またはTrpへの置換、
    のグループから選択される少なくとも一つの改変を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  8. ポリペプチドが抗体である、請求項１から７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
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