JP3865418B2 - ヒトインターロイキン−８に対する再構成ヒト抗体 - Google Patents
ヒトインターロイキン−８に対する再構成ヒト抗体 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトインターロイキン−８（ＩＬ−８）に対するマウスモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び可変領域（Ｖ領域）、並びにヒトＩＬ−８に対するヒト／マウスキメラ抗体、ヒト軽鎖（Ｌ鎖）可変領域及びヒト重鎖（Ｈ鎖）可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＣＤＲにより置き換えられている再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体に関する。本発明はさらに、上記の抗体又はその部分をコードするＤＮＡを提供する。本発明はさらに、前記ＤＮＡを含んで成るベクター、特に発現ベクター、並びに該ベクターにより形質転換された宿主に関する。本発明はさらに、ヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体の製造方法、及びヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体の製造方法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
インターロイキン−８（ＩＬ−８）は、リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激した単球の培養上清より見いだされ、ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ（ＭＤＮＣＦ）あるいはｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＮＡＰ−１）等と称されていた遊走性サイトカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）である。ＩＬ−８は様々な細胞により産生され、多形核白血球およびリンパ球に作用して、その濃度勾配に沿って遊走（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ）させる活性を有している。また、好中球に対してはその遊走を誘導するばかりでなく、脱顆粒、活性酸素の放出、内皮細胞への接着亢進などの好中球の機能をも活性化させる作用を有している。
【０００３】
炎症性疾患、より詳しくは、嚢胞性肺線維症、特発性肺線維症、成人呼吸促迫症候群、サルコイドーシス、化膿性胸膜炎などの呼吸器疾患、並びに乾癬などの皮膚疾患、並びに慢性リウマチ関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎などの疾患においては、それらの病巣部位に白血球浸潤が病理学的に認められている。また、これら疾患の患者由来の被検物質に、ＩＬ−８が検出されており、炎症において中心的役割を果たしていると考えられている。
【０００４】
（ＭｃＥｌｖａｎｅｙ，Ｎ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９０，１２９６−１３０１，１９９２、Ｌｙｎｃｈ III，Ｊ．Ｐ．ら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．，１４５，１４３３−１４３９，１９９２、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｌａｎｃｅｔ，３４１，６４３−６４７，１９９３、Ｃａｒ，Ｂ．Ｄ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，１４９，６５５−６５９，１９９４、Ａｎｔｏｎｙ，Ｖ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１，７２１６−７２２３，１９９３、Ｔａｋｅｍａｔｓｕ，Ｈ．ら、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１２９，７４−８０，１９９３、Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２１４１−２１４４，１９９０、Ｉｚｚｏ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，２８，２９６−３００，１９９３、Ｉｚｚｏ，Ｒ．Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，８７，１４４７−１４５２，１９９２）。
【０００５】
Ｋｏ，Ｙ−Ｃ．らは、ヒトＩＬ−８を抗原としてマウスに免疫することにより、ヒトＩＬ−８に結合し、かつ、その結合によってヒトＩＬ−８が好中球に結合することを阻害する、すなわちヒトＩＬ−８が有する生物学的活性を中和するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４を調製した。マウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のアイソタイプは、κ型Ｌ鎖及びＣγ１型Ｈ鎖であることが明らかになっている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４９，２２７−２３５，１９９２）。
【０００６】
ＷＳ−４以外の抗ヒトＩＬ−８抗体としては、Ａ．５．１２．１４（Ｂｏｙｌａｎ，Ａ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８９，１２５７−１２６７，１９９２）、国際特許出願ＷＯ９２−０４３７２に開示されている抗Ｐｅｐ−１抗体または抗Ｐｅｐ−３抗体あるいはＤＭ／Ｃ７（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５０，５５８５−５５９５，１９９３）等が知られている。
【０００７】
家兎を用いた実験系に於て、マウスモノクローナル抗体ＷＳ−４を投与することによって、肺虚血・再灌流障害（Ｓｅｋｉｄｏ，Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３６５，６５４−６５７，１９９３）、ＬＰＳ誘導の皮膚炎（Ｈａｒａｄａ，Ａ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，６８１−６９０，１９９３）、ＬＰＳあるいはインターロイキン−１（ＩＬ−１）誘導の関節炎（Ａｋａｈｏｓｈｉ，Ｔ．ら、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．，１３，１１３−１１６，１９９４）における好中球浸潤が抑制されたことが見いだされた。
【０００８】
家兎にもヒトＩＬ−８の相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）が存在し、ウサギＩＬ−８と称されている。マウスモノクローナル抗体ＷＳ−４はウサギＩＬ−８に対して交差反応し、ウサギＩＬ−８がウサギ好中球に結合するのを阻害することが明らかになっている（Ｈａｒａｄａ，Ａ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，６８１−６９０，１９９３）ので、これらのことは、ヒトにおける炎症性疾患の治療のための療法剤として抗ヒトＩＬ−８抗体が有用であることを示唆している。
【０００９】
ヒト以外の哺乳類由来のモノクローナル抗体はヒトにおいて高度に免疫原性（「抗原性」という場合もある）があり、そしてこの理由のため、ヒトにおけるそれらの医学療法的価値は制限される。例えば、マウス抗体をヒトに投与しても異物として代謝されうるので、ヒトにおけるマウス抗体の半減期は比較的短く、期待された効果を充分に発揮できない。さらに、投与したマウス抗体に対して発生するヒト抗マウス抗体は、血清病あるいは他のアレルギー反応など、患者にとって不都合で危険な免疫応答を惹起する。そしてこの理由のため、ヒトにマウス抗体を頻回投与することはできない。
【００１０】
これらの問題を解決するため、ヒト型化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体の製造方法が開発された。マウス抗体は２つの方法でヒト型化することができる。より簡単な方法としては、可変領域（Ｖ領域）はもとのマウスモノクローナル抗体に由来し、定常領域（Ｃ領域）は適当なヒト抗体に由来するキメラ抗体を作製する方法がある。得られるキメラ抗体はもとのマウス抗体の可変領域を完全なかたちで含有するので、もとのマウス抗体と同一の特異性をもって抗原に結合することが期待できる。
【００１１】
さらに、キメラ抗体ではもとのマウス抗体に比べヒト以外の動物に由来する蛋白質配列の比率が実質的に滅少しているためもとのマウス抗体に比べて免疫原性が低いと予想される。キメラ抗体は抗原によく結合しそして免疫原性が低いが、それでもなおマウス可変領域に対する免疫応答が生ずる可能性がある（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ａ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，４２２０−４２２４，ｌ９８９）。
【００１２】
マウス抗体をヒト型化するための第二の方法は一層複雑であるが、しかしマウス抗体が有する潜在的な免疫原性を大幅に低下させるものである。この方法においては、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）のみをヒト可変領域に移植して「再構成」（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト可変領域を作製する．ただし必要によっては、再構成ヒト可変領域のＣＤＲの構造をより一層もとのマウス抗体の構造に近づけるために、ＣＤＲを支持しているフレームワーク領域（ＦＲ）の一部の蛋白質配列をマウス抗体の可変領域からヒト可変領域に移植する場合がある。
【００１３】
次に、これらの再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。最終的に再構成されたヒト抗体のヒト以外の蛋自質配列に由来する部分はＣＤＲ、および、極く一部のＦＲのみである。ＣＤＲは超可変蛋自質配列により構成されており、これらは種特異的配列を示さない。この理由のため、マウスＣＤＲを担持する再構成ヒト抗体はもはやヒトＣＤＲを含有する天然ヒト抗体より強い免疫原性を有しないはずである。
【００１４】
再構成ヒト抗体についてはさらに、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２７，ｌ９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，ｌ５３４−ｌ５３６，ｌ９８８；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，４，７７３−７８３，ｌ９９ｌ；Ｍａｅｄａ，Ｈ．ら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，２，ｌ２４−ｌ３４，ｌ９９ｌ；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４ｌ８ｌ−４ｌ８５，ｌ９９ｌ；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，２６６−２７ｌ，ｌ９９ｌ；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，２８６９−２８７３，ｌ９９ｌ；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，ｌ９９２；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｌ４８，ｌｌ４９−ｌｌ５４，ｌ９９２；およびＳａｔｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３，８５ｌ−８５６，ｌ９９３を参照のこと。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
前記のごとく、再構成ヒト抗体は療法目的のために有用であると予想されるが、ヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体は知られていない。さらに、再構成ヒト抗体の製造方法において任意の抗体に普遍的に適用し得る画一的な方法は存在しない。従って、特定の抗原に対して十分な結合活性あるいは／ならびに中和活性を示す再構成ヒト抗体を作製するためには種々の工夫が必要である（例えば、Ｓａｔｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３，８５ｌ−８５６，ｌ９９３）。従って、本発明はヒトＩＬ−８に対する、免疫原性の低い抗体を提供するものである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明はヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体を提供する。本発明はまた、該再構成ヒト抗体の作製の過程で有用であるヒト／マウスキメラ抗体を提供する。本発明はさらに、再構成ヒト抗体の断片を提供する。並びに本発明はキメラ抗体、再構成ヒト抗体およびそれらの断片の製造のための発現系を提供する。本発明はさらにまた、ヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体およびそれらの断片の製造方法、及びヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体およびそれらの断片の製造方法を提供する。
【００１７】
さらに具体的には、本発明は、
（１）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域；並びに
（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域；
を提供する。
本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに
（２）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖；
を提供する。
【００１８】
本発明はさらにまた、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに
（２）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖；
を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体を提供する。
本発明はさらに、
（１）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖Ｖ領域；並びに
（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖Ｖ領域；を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに
（２）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖；
を提供する。
本発明はさらにまた、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに
（２）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖；
を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、
（１）ヒトＩＬ−８に対するモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；並びに
（２）ヒトＩＬ−８に対するモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；を提供する。
本発明はさらに、
（１）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；並びに
（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）；並びに
（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域；並びに
（１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のＦＲ；並びに
（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域；並びに
（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ領域；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＬ鎖；並びに
（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域；並びに
（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＨ鎖を提供する。
【００２３】
本発明はさらにまた、
（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、並びに
（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖；並びに
（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、並びに
（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖；
を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体を提供する。
【００２４】
本発明はさらに詳しくは
（１）以下のアミノ酸配列に示す又はその一部を有する、ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、
並びに
（２）以下のアミノ酸配列に示す又はその一部を有する、ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、
を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）；並びに
（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域；並びに
（１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のＦＲ；並びに
（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域
を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域；並びに
（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ領域；
を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＬ鎖；並びに
（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域；並びに
（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域；
を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＨ鎖を提供する。
【００２７】
本発明はさらにまた、
（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、並びに
（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖；並びに
（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、並びに
（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖；
を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体を提供する。
【００２８】
前記ヒトＬ鎖ＦＲは以下のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
【００２９】
または、
【００３０】
前記ヒトＨ鎖ＦＲは以下のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
【００３１】
【００３２】
【００３３】
【００３４】
【００３５】
【００３６】
【００３７】
または、
【００３８】
本発明はまた、前記種々の抗体を構成するポリペプチド、又はその断片をコードするＤＮＡに関する。本発明はまた、上記ＤＮＡを含んで成るベクター、例えば発現ベクターに関する。本発明はさらに、上記ベクターにより形質転換された宿主を提供する。
本発明はさらにまた、ヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体およびその断片の製造方法、及びヒトｌＬ−８に対する再構成ヒト抗体およびその断片の製造方法を提供する。
【００３９】
【具体的な説明】
マウスＶ領域をコードするＤＮＡのクローニング
ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードする遺伝子をクローニングするためには、該遺伝子の取得源として、ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製することが必要である。ハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出した後、既知の方法により一本鎖ｃＤＮＡに変換し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて目的とするＤＮＡを増幅することで得られる。この遺伝子の取得源として、Ｋｏ，Ｙ−Ｃ．らが作製した、ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＷＳ−４があげられる。このハイブリドーマの作製方法はＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４９，２２７−２３５，１９９２に記載されており、これを参考例１に後記する。
【００４０】
（１）全ＲＮＡの採取
マウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードする目的のＤＮＡをクローン化するため、グアニジンチオシアネート処理によりハイブリドーマ細胞を破壊し、塩化セシウム密度勾配遠心（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８、５２９４−５２９９，１９７９）をおこなって全ＲＮＡを得ることができる。なお、他の蛋白質の遺伝子をクローニングする際に用いられたすでに報告されている方法、例えばバナジウム複合体などのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）インヒビター存在下で、界面活性剤処理、フェノール処理をおこなう方法（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８，５１４３−５１４９，１９７９）を用いることもできる。
【００４１】
（２）ｃＤＮＡの合成
次に、ｍＲＮＡの３′末端に局在するｐｏｌｙＡ鎖に相補的なオリゴヌクレオチドであるオリゴ（ｄＴ）をプライマーとして、上記のごとくして得た全ＲＮＡに含まれているｍＲＮＡを鋳型に、逆転写酵素で処理してｍＲＮＡに相補的な一本鎖ｃＤＮＡを合成することができる（Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７、９３４−９３８，１９８９）。また、その時にランダムプライマーを用いても良い。なお、ｍＲＮＡだけを取得する場合は、全ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースカラムにかけｐｏｌｙＡ鎖を有するｍＲＮＡだけを分離することができる。
【００４２】
（３）ポリメラーゼ連鎖反応によるＶ領域をコードするＤＮＡの増幅
次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて前記Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを特異的に増幅する。マウスモノクローナル抗体のカッパ（κ）型Ｌ鎖Ｖ領域の増幅のため、配列番号；１〜１１に示す１１種のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ Ｋａｐｐａ Ｖａｒｉａｂｌｅ；ＭＫＶ）及び配列番号：１２に示すオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ Ｋａｐｐａ Ｃｏｎｓｔａｎｔ；ＭＫＣ）をそれぞれ５′末端プライマー及び３′末端プライマーとして使用する．前記ＭＫＶプライマーはマウスカッパ型Ｌ鎖リーダー配列をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズし、そして前記ＭＫＣプライマーはマウスカッパ型Ｌ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズする。
【００４３】
マウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域の増幅のため、配列番号：１３〜２４に示す１２種のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ Ｈｅａｖｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ；ＭＨＶ）及び配列番号：２５に示すオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ Ｈｅａｖｙ Ｃｏｎｓｔａｎｔ；ＭＨＣ）をそれぞれ５′未端プライマー及び３′末端プライマーとして使用する。前記ＭＨＶプライマーはマウスＨ鎖リーダー配列をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズし、そして前記ＭＨＣプライマーはマウスＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズする。
【００４４】
なお、全ての５′末端プライマー（ＭＫＶ及びＭＨＶ）はその５′末端近傍に制限酵素ＳａｌＩ切断部位を提供する配列ＧＴＣＧＡＣを含有し、そして、全ての３′末端プライマー（ＭＫＣ及びＭＨＣ）はその５′末端近傍に制限酵素ＸｍａＩ切断部位を提供するヌクレオチド配列ＣＣＣＧＧＧを含有する。これらの制限酵素切断部位は両Ｖ領域をコードする目的のＤＮＡ断片をそれぞれのクローニングベクターにサブクローニングするために用いられる。これらの制限酵素切断部位が、両Ｖ領域をコードする目的のＤＮＡ配列中にも存在する場合、それぞれのクローニングベクターにサブクローニングするために用いられる限り、他の制限酵素切断部位でも良い。
【００４５】
（４）Ｖ領域をコードするＤＮＡの単離
次に、目的とするマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ断片を得るために、ＰＣＲ増幅生成物を低融点アガロースゲルあるいはカラム〔ＰＣＲ産物精製用キット（ＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ：ＱＩＡＧＥＮ社製）、ＤＮＡ精製用キット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ II ：ＢＩＯ １０１社製）〕等により、分離、精製をおこなう。その精製物を制限酵素Ｓａｌ I及びＸｍａ Iで酵素処理して、マウスモノクローナル抗体の目的とするＶ領域をコードするＤＮＡ断片を得る。
【００４６】
他方、プラスミドｐＵＣ１９のごとき適当なクローニングベクターを同じ制限酵素Ｓａｌ I及びＸｍａ Iにより切断させ、このｐＵＣ１９に前記ＤＮＡ断片を酵素的に連結することにより、マウスモノクローナル抗体の目的とするＶ領域をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドを得る。クローニングされたＤＮＡの配列決定は任意の常法に従って行うことができ、例えば、自動ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．製）が挙げられる。目的とするＤＮＡのクローニング及びその配列決定を実施例ｌ及び実施例２に具体的に記載する。
【００４７】
相補性決定領域（ＣＤＲ）
本発明はさらに、ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域の超Ｖ領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を提供する。抗体のＬ鎖及びＨ鎖の両Ｖ領域は抗原結合部位を形成する。Ｌ鎖及びＨ鎖上のこの領域は類似する基本的構造を有する。両鎖のＶ領域は配列が比較的保存された４個のフレームワーク領域を含み、それらは３個の超Ｖ領域又はＣＤＲにより連結されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ １９９１）。
【００４８】
前記４個のフレームワーク領域（ＦＲ）の多くの部分はβ−シート構造をとり、３個のＣＤＲはループを形成する。ＣＤＲはある場合にはβ−シート構造の一部分を形成することもある。ＦＲによって３個のＣＤＲは相互に立体的に非常に近い位置に保持され、そして、対をなす３個のＣＤＲと共に抗原結合部位の形成に寄与する。本発明は、ヒト型化抗体の素材として有用なこれらのＣＤＲ、及びそれをコードするＤＮＡをも提供する。これらのＣＤＲ領域は、Ｖ領域の既知アミノ酸配列と照合することによって、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」の経験則から決定することができ、実施例３において具体的に説明する。
【００４９】
キメラ抗体の作製
ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＶ領域を設計するに先立って、使用するＣＤＲが実際に抗原結合領域を形成することを確かめる必要がある。この目的のため、キメラ抗体を作製した。キメラ抗体を作製するためにキメラ抗体のＬ鎖並びにＨ鎖をコードするＤＮＡを構築する必要がある。両ＤＮＡを構築する基本的な方法は、ＰＣＲ−クローン化ｃＤＮＡに見られるマウスリーダー配列及びマウスＶ領域配列のそれぞれのＤＮＡ配列を、哺乳類細胞発現ベクター中にすでに存在するヒトＣ領域をコードするＤＮＡ配列に連結することである。
【００５０】
前記ヒト抗体Ｃ領域は、任意のヒトＬ鎖Ｃ領域および任意のヒトＨ鎖Ｃ領域であることができ、例えば、Ｌ鎖についてはヒトＬ鎖ＣκあるいはＣλ、Ｈ鎖についてはＩｇＧであればＣγ１，Ｃγ２，Ｃγ３あるいはＣγ４（Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．ら、ＤＮＡ，１，１１−１８（１９８１），Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎ．ら、Ｃｅｌｌ，２９，６７１−６７９（１９８２），Ｋｒａｗｉｎｋｅｌ，Ｕ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１，４０３−４０７（１９８２））あるいは他のアイソタイプをそれぞれ挙げることができる。
【００５１】
キメラ抗体の製造のためには２種類の発現ベクターを作製する。即ち、エンハンサー／プロモーター系のような発現制御領域による制御のもとで、マウスＬ鎖Ｖ領域ならびにヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクター、およびエンハンサー／プロモーター系のような発現制御領域による制御のもとで、マウスＨ鎖Ｖ領域ならびにヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターを作製する。次に、これらの両発現ベクターにより哺乳類細胞などの宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞をイン−ビトロまたはイン−ビボで培養してキメラ抗体を製造する（例えば、ＷＯ９１−１６９２８）。
【００５２】
あるいは、マウスＬ鎖Ｖ領域ならびにヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡおよびマウスＨ鎖Ｖ領域ならびにヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに導入し、そして、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、そして形質転換された細胞をイン−ビトロまたはイン−ビボで培養してキメラ抗体を製造することもできる。
【００５３】
モノクローナル抗体ＷＳ一４からのキメラ抗体の作製を実施例４に記載する。マウスＷＳ−４κ型Ｌ鎖リーダー領域及びＶ領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いてクローニングし、ヒトＬ鎖Ｃκ領域をコードするヒトゲノムＤＮＡを含有する発現ベクターに連結する。同様にマウスＷＳ−４抗体のＨ鎖リーダー領域及びＶ領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いてクローニングし、ヒトＣγ１領域をコードするゲノムＤＮＡを含有する発現ベクターに連結する。
【００５４】
より詳しくは、特に設計されたＰＣＲプライマーを用いて、マウスＷＳ−４抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡをそれらの５′及び３′末端において適当な塩基配列を導入して（１）それらが発現ベクターに容易に挿人されるように、且つ（２）それらが該発現ベクター中で適切に機能するようにした（例えば、本発明ではＫｏｚａｋ配列を導入することにより転写効率を上げるよう工夫してある）。
【００５５】
次に、これらのプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して得たマウスＷＳ−４抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、所望のヒトＣ領域をすでに含有するＨＥＦ発現ベクター（図１参照）に挿人した。これらのベクターは、種々の哺乳類細胞系における遺伝子操作された抗体の一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現又は安定な発現のために適当である。
このように作製したキメラＷＳ−４抗体の結合活性を試験したところ、キメラＷＳ−４抗体はヒトＩＬ−８に結合する活性を示した（図２参照）。従って、正しいマウスＶ領域がクローニングされ、そして正しく配列が決定されていたことが示された。
【００５６】
再構成ヒトＷＳ−４抗体の設計
マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト抗体に移植されている再構成ヒト抗体を作製するためには、移植するＣＤＲを有するマウスモノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列と、ＣＤＲが移植されるヒトモノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列との間に高い同一性が存在することが望ましい。
【００５７】
この目的のためには、マウスモノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列とヒトモノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列とを比較することにより、再構成ヒトＷＳ−４抗体のＶ領域の設計の基礎となるヒトＶ領域を選択することが可能になる。具体的には遺伝子解析ソフトＧＥＮＥＴＸ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いてマウスＷＳ−４抗体のＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＮＢＲＦ）のデータベースに見出されるすべての既知のヒトのＶ領域と比較した。
【００５８】
マウスＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域は、既知のヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域との比較においてヒト抗体ＨＡＵ（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓ．ら、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３５１，１２９１−１２９５，１９７０）のＬ鎖Ｖ領域に最も類似しており、６９．２％の同一性が存在する。一方、ＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域は、既知のヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域との比較においてヒト抗体ＶＤＨ２６（Ｂｕｌｕｗｅｌａ．，Ｌ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．，７，２００３−２０１０，１９８８）に最も類似しており、７１．４％の同一性が存在する。
【００５９】
一般的に、マウスＶ領域のアミノ酸配列のヒトＶ領域のアミノ酸配列に対する同一性は、マウスＶ領域のアミノ酸配列に対する同一性よりも低い。これはマウスＷＳ−４抗体のＶ領域がヒトＶ領域に完全には類似していないこと示し、そして同時に、ヒト患者における免疫原性の問題を解決するためにマウスＷＳ−４のＶ領域をヒト型化する（ｈｕｍａｎｉｚｅ）ことが最善であることを示している。
【００６０】
マウスＷＳ−４抗体のＶ領域をさらに、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ ０ｆｆｉｃｅにより定義されるヒトＶ領域サブグループのコンセンサス配列と比較し、Ｖ領域のＦＲ間で対比された。その結果を表１に示す。
【００６１】
【表１】
【００６２】
マウスＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域のＦＲはヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループ I（ＨＳＧ I）のＦＲのコンセンサス配列に最も類似しており、６４．４％の同一性が存在する。一方、マウスＷＳ−４のＨ鎖Ｖ領域のＦＲはヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループ III（ＨＳＧ III）のＦＲのコンセンサス配列に最も類似しており、６２．３％の同一性が存在する。
【００６３】
これらの結果は、既知のヒト抗体との比較から得られた結果を支持しており、ヒト抗体ＨＡＵ中のＬ鎖Ｖ領域はヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループ Iに属し、そしてヒト抗体ＶＤＨ２６中のＨ鎖Ｖ領域はヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループ IIIに属する。再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の設計のためにはサブグループＩ（ＨＳＧ I）に属するヒトＬ鎖Ｖ領域を使用し、そして再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の設計のためにはサブグループ III（ＨＳＧ III）に属するヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域を用いるのが最善であろう。
【００６４】
既知ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域との比較において、マウスＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域はヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループ Iの１構成員であるヒト抗体ＲＥＩのＬ鎖Ｖ領域にも類似していた。従って、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の設計においてＲＥＩのＦＲを使用した。ＲＥＩに基くこれらのヒトＦＲ中には、原著のヒトＲＥＩ（Ｐａｌｍ，Ｗら、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３５６，１６７−１９１，１９７５；Ｅｐｐ，Ｏ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４，４９４３−４９５２，１９７５）に比較して５個のアミノ酸（位置３９，７１，１０４，１０５及び１０７；表２を参照）の相違が存在する。
【００６５】
なお、表におけるアミノ酸番号はＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）の経験に基づいている。位置３９及び７１における２個のアミノ酸の変化はラットＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体のＬ鎖Ｖ領域のＦＲ中に存在するアミノ酸にもどる変化であった（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）。Ｋａｂａｔら、（１９９１）によれば、ＦＲ４中の３個のアミノ酸の変化（位置１０４，１０５及び１０７）は他のヒトκＬ鎖からのＪ領域に基いており、ヒトから逸脱するものではない。
【００６６】
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の２つのバージョンを設計した。第一のバージョンＲＶＬａにおいては、ＦＲは再構成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体中に存在するＲＥＩに基くＦＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）と同一であり、そしてＣＤＲはマウスＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域中のＣＤＲと同一にした。第二のバージョンＲＶＬｂはＲＶＬａに基き、ヒトＦＲ３中の位置７１におけるアミノ酸１個のみを異にする。Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７により定義されるごとく、残基７１はＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１の標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）構造の部分である。
【００６７】
この位置のアミノ酸はＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１ループの構造に直接影響すると予想され、それ故に抗体結合に大きく影響すると考えられている。再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域のＲＶＬｂにおいては、位置７１のフェニルアラニンがチロシンに変えられている。表２は、マウスＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域、再構成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体中での使用のために修飾されたＲＥＩのＦＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）及び再構成ヒトＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域の２種類のバージョンの、それぞれのアミノ酸配列を示す。
【００６８】
【表２】
【００６９】
注：ＲＥＩのＦＲは再構成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体中に見出されるものである（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）。ＲＥＩのＦＲ中の５個の下線を付したアミノ酸はヒトＲＥＩのアミノ酸配列と異なるアミノ酸である。なお、アミノ酸は一文字表記による。アミノ酸番号はＫａｂａｔらの定義によるものである。
マウスＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域中のＦＲはサブグループIII に属するヒトＨ鎖Ｖ領域に最も類似している（表１）。
【００７０】
マウスＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域は、既知のヒトＨ鎖Ｖ領域との比較において、ＦＲ１からＦＲ３までは、ヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループIII の１構成員であるヒト抗体ＶＤＨ２６のＨ鎖Ｖ領域（Ｂｕｌｕｗｅｌａ，Ｌ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．，７，２００３−２０１０，１９８８）に最も類似していた。ＦＲ４については、ＶＤＨ２６のＦＲ４の配列が明らかになっていなかったため、サブグループIII に属するヒト抗体４Ｂ４（Ｓａｎｚ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２，８８３−８８７，１９８９）のＦＲ４のアミノ酸配列を用いることとした。これらのヒトＨ鎖Ｖ領域を、再構成ヒトＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域の設計のための基礎として用いた。
【００７１】
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の８種類のバージョンを設計した。８種類のバージョンのすべてにおいて、ヒトＦＲ１，２及び３はヒト抗体ＶＤＨ２６のＦＲ１，２及び３に、ＦＲ４はヒト抗体４Ｂ４のＦＲ４に基いており、そして、マウスＣＤＲはマウスＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲと同一である。
表３および４に、マウスＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域、鋳型のヒト抗体ＶＤＨ２６のＦＲ１〜３、ヒト抗体４Ｂ４のＦＲ４および再構成ヒトＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域の８種類のバージョンの、それぞれのアミノ酸配列を示す。
【００７２】
【表３】
【００７３】
【表４】
【００７４】
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡの作製
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ領域の作製を実施例５に具体的に記載する。
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のそれぞれの第一バージョンをコードするＤＮＡを合成した。そして配列決定して、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」の全体ＤＮＡ配列が正しいアミノ酸配列をコードしていることを確認した。再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」の配列を配列番号：６２に、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」の配列を配列番号：３８に示す。
【００７５】
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ領域の他のバージョンをコードするＤＮＡは、第一バージョン「ａ」を鋳型に、公表されているＰＣＲ−変異誘発法（Ｋａｍｍａｎｎ，Ｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７，５４０４，１９８９）にわずかな変更を加えた方法を用いて作製した。再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ領域の設計に関して記載したように、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の１つの追加のバージョン（バージョン「ｂ」）をコードするＤＮＡを作製し、そして再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の７種類の追加のバージョン（バージョン「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」，「ｆ」，「ｇ」及び「ｈ」）をコードするＤＮＡを作製した。
【００７６】
これらの追加のバージョンは、第一バージョンからのアミノ酸配列の一連の微細な変化を含み、アミノ酸配列のこれらの微細な変化はＰＣＲ変異誘発を用いてＤＮＡ配列の微細な変更を行うことにより達成された。ＤＮＡ配列に必要な変化を導入するＰＣＲプライマーが設計された。一連のＰＣＲ反応に続き、ＰＣＲ生成物をクローン化し、そして配列決定してＤＮＡ配列中の変化が計画通りに起っていることを確認した。再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ｂ」の配列を配列番号：６５に、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョン「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」，「ｆ」，「ｇ」，「ｈ」のそれぞれの配列を配列番号４１，４４，４５，４８，５１，５４，５５に示す。
【００７７】
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ領域の種々のバージョンのＤＮＡ配列を配列決定により確認した後、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡを、ヒトＣ領域をコードするＤＮＡをすでに含有する哺乳類細胞発現ベクターにサブクローニングした。即ち、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ鎖Ｌ領域をコードするＤＮＡをヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列に、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒトＣγ１領域をコードするＤＮＡ配列にそれぞれ連結した。
【００７８】
次に再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」あるいは「ｂ」と、Ｈ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」〜「ｈ」のすべての組合せをヒトＩＬ−８への結合について試験し、そしてその結果、図７に記載するように、Ｌ鎖バージョン「ａ」または「ｂ」とＨ鎖バージョン「ｇ」とを含んで成る両再構成ヒト抗体（ＲＶＬａ／ＲＶＨｇ及びＲＶＬｂ／ＲＶＨｇ）がキメラＷＳ−４抗体と同じレベルでＩＬ−８に結合する能力を示した。
【００７９】
ヒトＩＬ−８に対する本発明のキメラ抗体又は再構成ヒト抗体の製造のために任意の発現系、例えば真核細胞、例えば動物細胞、例えば樹立された哺乳類細胞系、真糸状菌細胞、及び酵母細胞、並びに原核細胞、例えば細菌細胞、例えば大腸菌細胞等を使用することができる。好ましくは、本発明のキメラ抗体又は再構成抗体は哺乳類細胞、例えばＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞中で発現される。
【００８０】
これらの場合、哺乳類細胞での発現のために有用な常用のプロモーターを用いることができる。例えば、ヒト・サイトメガロウィルス前期（ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ；ＨＣＭＶ）プロモーターを使用するのが好ましい。ＨＣＭＶプロモーターを含有する発現ベクターの例には、ＨＣＭＶ−ＶＨ−ＨＣγ1 、ＨＣＭＶ−ＶＬ−ＨＣκ等があり、ｐＳＶ２ｎｅｏに由来するもの（国際公開出願ＷＯ９２−１９７５９を参照）が含まれる。
【００８１】
また、その他に本発明に用いることのできる哺乳動物細胞に於ける遺伝子発現のプロモーターとしては、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーター、あるいは、ヒト・ポリペプチド・チェーン・エロンゲーション・ファクター−１α（ＨＥＦ−１α）等の哺乳動物細胞由来のプロモーターを用いればよい。例えば、ＳＶ４０のプロモーターを使用する場合は、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．らの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２７７，１０８−１１４，１９７９）、また、ＨＥＦ−１αプロモーターを使用する場合は、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．らの方法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）に従えば実施することができる。
【００８２】
本発明のために有用なプロモーターの他の具体例はＨＥＦ−１αプロモーターである。このプロモーターを含有する発現ベクターにはＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１及びＨＥＦ−ＶＬ−ｇκ（図１）が含まれる。複製起点としては、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ＳＶ４０、牛パピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のＤＮＡ配列を用いることができ、さらに、宿主細胞系中での遺伝子コピー数増幅のため、選択マーカーとして、アミノグルコシド３′−ホスホトランスフェラーゼあるいはｎｅｏ耐性遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を用いることができる。
【００８３】
要約すれば、本発明はまず、ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｖ領域、並びに該Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及び該Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを提供する。これらは、ヒトＩＬ−８に対するヒト／マウスキメラ抗体及び再構成ヒト抗体の作製のために有用である。モノクローナル抗体としては、例えばＷＳ−４があげられる。Ｌ鎖Ｖ領域は例えば配列番号：２６に示すアミノ酸配列を有し、そしてＨ鎖Ｖ領域は例えば配列番号：２７に示すアミノ酸配列を有する。これらのアミノ酸配列は例えばそれぞれ配列番号：２６，２７に示すヌクレオチド配列によりコードされている。
【００８４】
本発明のヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体は、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域及びマウスＬ鎖Ｖ領域；並びに
（２）ヒトＨ鎖Ｃ領域及びマウスＨ鎖Ｖ領域；
から構成される。
マウスＬ鎖Ｖ領域及びマウスＨ鎖Ｖ領域並びにこれらをコードするＤＮＡは前記の通りである。前記ヒトＬ鎖Ｃ領域は任意のヒトＬ鎖Ｃ領域であることができ、そして例えばヒトＣκあるいはＣλ領域である。前記ヒトＨ鎖Ｃ領域は任意のヒトＨ鎖Ｃ領域であることができ、そして例えばヒトＣγ１，Ｃγ２，Ｃγ３あるいはＣγ４領域（Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．ら、ＤＮＡ，１，１１−１８（１９８１），Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎ．ら、Ｃｅｌｌ，２９，６７１−６７９（１９８２），Ｋｒａｗｉｎｋｅｌ，Ｕら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１，４０３−４０７（１９８２））である。
【００８５】
キメラ抗体の製造のためには２種類の発現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとでマウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターを作製する。次に、これらの発現ベクターにより哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞をイン−ビトロ又はイン−ビボで培養してキメラ抗体を製造する。
【００８６】
あるいは、マウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ並びにマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに導入し、そして該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、次にこの形質転換された宿主をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して目的とするキメラ抗体を生産させる。
【００８７】
本発明の再構成ヒトＷＳ−４抗体は、
（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び
（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ領域、を含んで成るＬ鎖；並びに
（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び
（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域、を含んで成るＨ鎖；
から構成される。
【００８８】
好ましい態様においては、前記Ｌ鎖ＣＤＲは配列番号：２６に示されるアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列の範囲が表５において定義されるアミノ酸配列を有し、前記Ｈ鎖ＣＤＲは配列番号：２７に示されるアミノ酸配列であって該アミノ酸配列の範囲が表５において定義されるアミノ酸配列を有し；前記ヒトＬ鎖ＦＲがＲＥＩに由来するものであり；前記ヒトＨ鎖ＦＲ１，２および３はＶＤＨ２６に、ＦＲ４は４Ｂ４に由来するものであり；前記ヒトＬ鎖Ｃ領域はヒトＣκ領域であり；そして前記ヒトＨ鎖Ｃ領域はヒトＣγ１領域である。また、前記ヒトＨ鎖Ｃ領域はヒトＣγ４領域であってもよく、あるいは前記ヒトＬ鎖Ｃ領域および／またはヒトＨ鎖Ｃ領域のかわりにラジオアイソトープを結合させてもよい。
特定の抗原に対して十分に活性がある再構成ヒト抗体を作製するために、前記ヒトＦＲのアミノ酸配列の一部を置換することが望ましい。
【００８９】
好ましい態様においては、Ｌ鎖Ｖ領域は表２においてＲＶＬａあるいはＲＶＬｂとして示されるアミノ酸配列を有し、Ｈ鎖Ｖ領域は表３および表４にＲＶＨａ、ＲＶＨｂ、ＲＶＨｃ、ＲＶＨｄ、ＲＶＨｅ、ＲＶＨｆ、ＲＶＨｇ又はＲＶＨｈとして示されるアミノ酸配列を有する。さらに、Ｈ鎖Ｖ領域ＦＲ２中の４１位のアミノ酸がプロリンであること、同４７位のアミノ酸がトリプトファンであること、および／または同ＦＲ３中の６７位のアミノ酸がフェニルアラニンであることがよく、ＲＶＨｂ，ＲＶＨｄ，ＲＶＨｅ，ＲＶＨｆ，ＲＶＨｇ又はＲＶＨｈとして示されるアミノ酸配列を有するものがより好ましい。このうち、ＲＶＨｇがＨ鎖Ｖ領域として最も好ましい。
【００９０】
再構成抗体の製造のためには、２種類の発現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとに前に定義した再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクター、及びエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとに前に定義した再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡを含んで成るもう一つの発現ベクターを作製する。次に、これらの発現ベクターを用いて哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そしてこの形質転換された細胞をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して再構成ヒト抗体を生産せしめる。
【００９１】
あるいは、再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡ及び再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに導入し、そしてこのベクターを用いて宿主を形質転換し、次にこの形質転換された宿主細胞をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して目的とする再構成ヒト抗体を生産せしめる。
こうして生産されたキメラ抗体又は再構成ヒト抗体は、常法に従って、例えばプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等により単離、精製することができる。
【００９２】
本発明のキメラＬ鎖又は再構成ヒトＬ鎖はＨ鎖と組合わせることにより完全な抗体を作製するために使用することができる。同様に本発明のキメラＨ鎖又は再構成ヒトＨ鎖はＬ鎖と組合わせることにより完全な抗体を作製するために用いることができる。
本発明のマウスＬ鎖Ｖ領域、再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域、マウスＨ鎖Ｖ領域、及び再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域は、本来、抗原であるヒトＩＬ−８と結合する領域であり、それ自体として、又は他の蛋白質との融合蛋白質として医薬、診断薬等として有用であると考えられる。
また、本発明のＬ鎖Ｖ領域ＣＤＲ及びＨ鎖Ｖ領域ＣＤＲも、本来、抗原であるヒトＩＬ−８と結合する部分であり、それ自体として又は他の蛋白質との融合蛋白質として医薬、診断薬等として有用であると考えられる。
【００９３】
本発明のマウスＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡはキメラＬ鎖をコードするＤＮＡ又は再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡの作製のために有用である。同様にマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡはキメラＨ鎖をコードするＤＮＡ又は再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡの作製のために有用である。また、本発明のＬ鎖Ｖ領域ＣＤＲをコードするＤＮＡは再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及び再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡの作製のために有用である。
【００９４】
同様に本発明のＨ鎖Ｖ領域ＣＤＲをコードするＤＮＡは再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及び再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡ作製のために有用である。さらには、再構成ヒト抗体のＦ（ａｂ′）2 ，ＦａｂあるいはＦｖを、又は、Ｈ鎖及びＬ鎖の両Ｆｖを連結させたシングルチェーンＦｖを適当な宿主で産生させ、前述の目的に使用することができる（例えば、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、ＴＩＢＴＥＣＨ，９，１３２−１３７，１９９１を参照）。
【００９５】
シングルチェインＦｖは、ヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を連結してなる。このシングルチェインＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域はリンカー、好ましくは、ペプチドリンカーを介して連結されている（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，５８７９−５８８３，１９８８）。
【００９６】
シングルチェインＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、再構成ヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域として前記記載されたもののいずれであってもよい。具体例として、配列番号３８，４１，４４，４５，４８，５１，５４，５５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるＨ鎖Ｖ領域と、配列番号６２，６５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるＬ鎖Ｖ領域を含んでなるシングルチェインＦｖが挙げられる（ＷＯ８８−０１６４９を参照）。
これらのＶ領域は、好ましくは、ペプチドリンカーによって連結されている。ペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる（ＷＯ８８−０９３４４を参照）。
【００９７】
シングルチェインＦｖをコードするＤＮＡは、前記記載の再構成ヒト抗体のＨ鎖または、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖または、Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを鋳型とし、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を、その両端を規定するプライマー対を用いて、ＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡおよびその両端を各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
【００９８】
また、一旦シングルチェインＦｖをコードするＤＮＡが作成されれば、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に従って、シングルチェインＦｖを得ることができる。
シングルチェインＦｖは、抗体分子に比べ、組織への移行性が優れており、ラジオアイソトープ標識によるイメージングへの利用、および再構成ヒト抗体と同様の機能を有する治療剤としての利用が期待される。
【００９９】
本発明のヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体、再構成ヒト抗体およびそのＦ（ａｂ′）2 ，Ｆａｂ，ＦｖあるいはシングルチェーンＦｖの結合活性を確認する方法として、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法），ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、キメラ抗体、再構成ヒト抗体について、酵素免疫測定法を用いる場合、抗ヒトＩＬ−８ポリクローナル抗体をコートしたプレートにヒトＩＬ−８を添加し、ここにヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体、再構成ヒト抗体を産生する細胞の培養上清あるいは精製サンプルを加え、アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した適切な二次抗体を添加する。プレートのインキュベーションおよび洗浄の後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
【０１００】
本発明のヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体、再構成ヒト抗体およびそのＦ（ａｂ′）2 ，Ｆａｂ，ＦｖあるいはシングルチェインＦｖのＩＬ−８レセプターに対するＩＬ−８結合阻害活性は、通常のリガンドレセプター結合阻害アッセイにより評価される。例えば、好中球上のＩＬ−８レセプターに対するＩＬ−８の結合阻害アッセイには、ヘパリン採血などにより得られる好中球を遠心分離等の手段で分離した後、上記アッセイに好適な数の細胞懸濁液となるよう調製して用いることができる。
【０１０１】
125Ｉなどで適当に標識したＩＬ−８と非標識のＩＬ−８を含む溶液と適当な濃度に調製した本発明の抗体またはその断片を含む溶液を混合し、次いでこれを上記好中球懸濁液に添加する。一定時間の後、好中球を分離し、好中球上の標識された活性を測定すればよい。
本発明の抗体またはその断片による好中球遊走作用（ケモタキシス；ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ）の阻害能を評価するには通常知られた方法、例えばＧｒｏｂ，Ｐ．Ｍ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，８３１１−８３１６，１９９０に記載された方法を用いることができる。
【０１０２】
市販のケモタキシスチャンバーを用いる場合、本発明の抗体またはその断片を適当な培養液で希釈した後、ＩＬ−８を加え、これをチャンバーに分注する。ついで、調製した好中球懸濁液をチャンバーに添加し、一定時間放置する。遊走する好中球は、チャンバーに装着されたフィルターに付着するので、その好中球の数を染色液あるいは蛍光抗体等の通常の方法で測定すればよい。また、顕微鏡下での肉眼による判定や機械を用いる自動測定も可能である。
【０１０３】
本発明のヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体、再構成ヒト抗体およびそのＦ（ａｂ′）2 ，Ｆａｂ，ＦｖあるいはシングルチェーンＦｖは、メンブレンフィルターによる濾過滅菌の後、好ましくは非経口的に、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等によりあるいは経気道的に、例えばネブライザー（ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）により医薬療法剤として投与することができる。ヒトに対する投与量は、患者の状態、年齢等により異なるがおよそ１〜１０００mg／bodyであり、１−１０mg／kg／週の分割用量を選択することができる。
【０１０４】
本発明のヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体、再構成ヒト抗体およびそのＦ（ａｂ′）2 ，Ｆａｂ，ＦｖあるいはシングルチェーンＦｖは、精製され結合活性を評価された後に、生理活性タンパク質の製剤化に通常用いられる方法により、医薬療法剤として製剤化される。たとえば、注射用製剤は精製されたヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体、再構成ヒト抗体およびそのＦ（ａｂ′）2 ，Ｆａｂ，ＦｖあるいはシングルチェーンＦｖを、溶剤、例えば、生理食塩水、緩衝液などに溶解し、それに吸着防止剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などを加えたものであり、または使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては、糖アルコール又は糖、例えばマンニトール、ブドウ糖などをもちいることができる。
【０１０５】
【実施例】
次に、本発明を下記の実施例により具体的に説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
実施例１． ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡのクローニング
ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体の可変領域をコードするＤＮＡを次の様にしてクローニングした。
【０１０６】
１．全ＲＮＡの調製
ハイブリドーマＷＳ−４からの全ＲＮＡを、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４−５２９９，１９７９により記載されている塩化セシウム密度勾配遠心法を修飾して調製した。
すなわち、１×１０7 個のハイブリドーマＷＳ−４の細胞を２５mlの４Ｍグアニジンチオシアネート（Ｆｕｌｋａ社製）中で完全にホモジナイズさせた。ホモジネートを遠心管中の５．７Ｍ塩化セシウム溶液層上に重層し、次にこれをＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ４０ローター中で３１，０００rpm にて２０℃で１４時間遠心分離することによりＲＮＡを沈澱させた。
【０１０７】
ＲＮＡ沈澱物を８０％エタノールにより洗浄し、そして１０mM ＥＤＴＡ及び０．５％ Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウムを含有する２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）２００μｌ中に溶解し、そしてそれにＰｒｏｔｅｎａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社製）を０．５mg／mlとなるように添加した後、３７℃にて３０分間温浴中でインキュベートした。混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、そしてＲＮＡをエタノールで沈澱させた。次に、ＲＮＡ沈澱物を１mM ＥＤＴＡを含有する１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）２００μｌに溶解した。
【０１０８】
２．メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の抽出
マウスモノクローナル抗体ＷＳ−４Ｈ鎖をコードするｍＲＮＡを抽出するため、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、その指示書に記載の方法に従い、上記１．で得られた全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）ポジティブなｍＲＮＡを抽出した。
【０１０９】
３．一本鎖ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡ Ｃｙｃｌｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、その指示書に記載の方法に従い、上記２．で得られた約４０ｎｇのｍＲＮＡより一本鎖ｃＤＮＡを合成し、マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの増幅に用いた。尚、マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを増幅するために、約１０μｇの上記全ＲＮＡより一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０１１０】
４．抗体可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲ法による増幅
（１）マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの増幅
ＰＣＲのためのプライマーは、配列番号：１３〜２４に示すＭＨＶ（ＭｏｕｓｅＨｅａｖｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ）プライマー１〜１２、及び配列番号：２５に示すＭＨＣ（Ｍｏｕｓｅ Ｈｅａｖｙ Ｃｏｎｓｔａｎｔ）プライマー（Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｔ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，１９９１を使用した。
【０１１１】
ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３），５０mM ＫＣｌ，０．１mM ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１．５mM ＭｇＣｌ2 ，０．００１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン，５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社）、０．２５μＭの配列番号：１３〜２４に示すＭＨＶプライマーのうち一つと１．７５μＭの配列番号：２５に示すＭＨＣプライマー及び上記３．で得られた一本鎖ｃＤＮＡ溶液１．５μｌを含有し、ＭＨＶ１〜１２プライマーの各々について別々に用意した。これを５０μｌの鉱油で覆った後、９４℃の初期温度にて３分間そして次に９４℃にて１分間、５５℃にて１分間及び７２℃にて１分間、この順序で加熱した。この温度サイクルを３０回反復した後、反応混合物をさらに７２℃にて１０分間インキュベートした。
【０１１２】
（２）マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの増幅
ＰＣＲのためのプライマーとして配列番号：１〜１１に示すＭＫＶ（Ｍｏｕｓｅ Ｋａｐｐａ Ｖａｒｉａｂｌｅ）プライマー１〜１１、及び配列番号：１２に示すＭＫＣ（Ｍｏｕｓｅ Ｋａｐｐａ Ｃｏｎｓｔａｎｔ）プライマー（Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｔ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，１９９１）を使用した。
【０１１３】
ｃＤＮＡの増幅は、それぞれ０．２５μＭのＭＫＶプライマー混合物と３．０μＭのＭＫＣプライマーを用いて増幅した点を除いて、前記４．（１）においてＨ鎖Ｖ領域遺伝子の増幅について記載したのと同じ方法により上記３．で得られた一本鎖ｃＤＮＡ溶液２．０μｌから増幅を行なった。
【０１１４】
５．ＰＣＲ生成物の精製および断片化
前記のようにしてＰＣＲ法により増幅したＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域それぞれのＤＮＡ断片を１．５％低融点アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）を用いるアガロースゲル電気泳動により分離した。約４５０bp長のＨ鎖ＤＮＡ断片と約４００bp長のＬ鎖ＤＮＡ断片を含有するアガロース片をそれぞれ切り取り、そして６５℃にて５分間溶融せしめ、そしてこれと同容積の２mM ＥＤＴＡ及び３００mM ＮａＣｌを含有する２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）を加えた。
【０１１５】
この混合物をフェノール及びクロロホルムにより抽出し、そしてＤＮＡ断片をエタノール沈澱により回収し、そして１mM ＥＤＴＡを含有する１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）に溶解した。次に、１０mM ＭｇＣｌ2 及び１mMジチオスレイトールを含有する１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．９）中で５ユニットの制限酵素Ｘｍａ I（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製）を用いて３７℃にて３時間消化した。次に、４０ユニットの制限酵素Ｓａｌ I（宝酒造社製）により３７℃にて２時間消化し、そして生ずるＤＮＡ断片を、１．５％低融点アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）を用いるアガロースゲル電気泳動により分離した。
【０１１６】
ＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り取りそして６５℃にて５分間溶融せしめ、そしてこれと同容積の２mM ＥＤＴＡ及び３００mM ＮａＣｌを含有する２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）を加えた。この混合物をフェノール及びクロロホルムにより抽出し、そしてＤＮＡ断片をエタノール沈澱により回収し、そして１mM ＥＤＴＡを含有する１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）に溶解した。
こうして、マウスκ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断片、及びマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断片を各々得た。上記ＤＮＡ断片はいずれもその５′末端にＳａｌＩ接着末端を有し、そしてその３′末端にＸｍａＩ接着末端を有する。
【０１１７】
６．連結及び形質転換
上記のようにして調製したマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含んで成るＳａｌＩ−ＸｍａＩ ＤＮＡ断片約０．３μｇを、ＳａｌＩ、ＸｍａＩ及び大腸菌由来のアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ；宝酒造社製）で消化することにより調製したｐＵＣ１９ベクター（宝酒造社製）約０．１μｇと、１ユニットＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）及び添付のバッファーを含有する反応混液中で、１６℃にて４時間反応させ連結した。
【０１１８】
次に、５μｌの上記連結混合物を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）５０μｌに加え、そしてこの細胞を氷上で３０分間、４２℃にて１分間そして再び氷上で１分間静置した。次いで４００μｌの２×ＹＴ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））を加え、３７℃にて１時間インキュベートした後、５０μｇ／mlのアンピシリン（明治製菓社製）を含有する２×ＹＴ寒天培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
【０１１９】
尚、この際選択マーカーとしてＸ−Ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ，宝酒造社製）５０μｇを塗布した。
この形質転換体を、５０μｇ／mlのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地１０ml中で３７℃にて一夜培養し、そしてこの培養物から、ＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、その指示書に記載の方法に従ってプラスミドＤＮＡを調製した。
【０１２０】
こうして得られた、ハイブリドーマＷＳ−４に由来するマウスκ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをｐＵＣ−ＷＳ４−ＶＬと命名した。大腸菌コンピテント細胞をＪＭ１０９を用いた点を除いて、上記の同じ方法に従って、ハイブリドーマＷＳー４に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをＳａｌ I−Ｘｍａ I ＤＮＡ断片から作成し、そしてｐＵＣ−ＷＳ４−ＶＨと命名した。
【０１２１】
実施例２． ＤＮＡの塩基配列の決定
前記のプラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列を、シークエンスプライマーとしてＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶおよびＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（両者とも宝酒造社製）、自動ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ製）およびＴａｑ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ製）を用いて、メーカー指定のプロトコールに従って塩基配列を決定した。プラスミドｐＵＣ−ＷＳ４−ＶＬに含まれるマウスＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：２６に示す。また、プラスミドｐＵＣ−ＷＳ４−ＶＨに含まれるマウスＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：２７に示す。
【０１２２】
実施例３． ＣＤＲの決定
Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域の基本的構造は、互いに類似性を有しており、それぞれ４つのフレームワーク領域が３つの超可変領域、即ち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較的良く保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）。
【０１２３】
この様な事実に基づき、ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベースにあてはめて、相同性を調べることによりＣＤＲ領域を表５に示す如く決定した。
【０１２４】
【表５】
【０１２５】
実施例４． クローン化ｃＤＮＡの発現の確認（キメラＷＳ−４抗体の作製）
発現ベクターの作製
キメラＷＳ−４抗体を発現するベクターを作製するため、それぞれマウスＷＳ−４Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡクローンｐＵＣ−ＷＳ４−ＶＬ及びｐＵＣ−ＷＳ４−ＶＨをＰＣＲ法により修飾した。そしてＨＥＦ発現ベクター（前記、ＷＯ９２−１９７５９及び図１を参照のこと）に導入した。
【０１２６】
Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマー（配列番号：２８）及びＨ鎖Ｖ領域のための後方プライマー（配列番号：２９）は、各々のＶ領域のリーダー配列の最初をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７−９５０，１９８７）及びＨｉｎｄIII 制限部位を有するように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマー（配列番号：３０）及びＨ鎖Ｖ領域のための前方プライマー（配列番号：３１）は、Ｊ領域の末端をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズし、且つ、スプライスドナー配列及びＢａｍＨＩ制限部位を付加するように設計した。
【０１２７】
２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．２）、１０mM ＫＣｌ、６mM（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ １００μＭ ｄＮＴＰｓ、１．５mM ＭｇＣｌ2 、１００pmole ずつの各プライマー、１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ（ｐＵＣ−ＶＬ又はｐＵＣ−ＶＨ）、及び２．５ＵのＡｍｐｌｉ Ｔａｑ酵素を含有する１００μｌのＰＣＲ反応混合物を５０μｌの鉱油で覆い、９４℃にて３分間最初の変性の後、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間のサイクルを３０回行い、最後に７２℃にて１０分間インキュベートした。
【０１２８】
ＰＣＲ生成物を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで消化し、そしてＬ鎖Ｖ領域については、ＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶＬ−ｇκに、Ｈ鎖Ｖ領域についてはＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１にそれぞれクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをそれぞれＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｌ−ｇκ，ＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｈ−ｇγ１と命名した。
【０１２９】
ＣＯＳ細胞へのトランスフェクション
キメラＷＳ−４抗体の一過性発現を観察するため、前記発現ベクターをＣＯＳ細胞において試験した。ＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｌ−ｇκならびにＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｈ−ｇγ１をＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ細胞に同時形質転換した。各ＤＮＡ（１０μｇ）を、ＰＢＳ中１×１０7 細胞／mlの０．８mlのアリコートに加え、１．５ｋＶ、２５μＦの容量にてパルスを与えた。
【０１３０】
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、５％のγ−グロブリンフリーウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培養液（ＧＩＢＣＯ社製）１５ｍｌに懸濁し、組織培養シャーレに添加した。９６時間のインキュベーションの後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、直径０．４５μｍのディスクフィルター（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて濾過した。
【０１３１】
ＥＬＩＳＡ
抗原結合測定および抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調整した。抗原結合活性測定のためのＥＬＩＳＡプレートは次の様にして調製した。９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルを、濃度２μｇ／ｍｌで固層化バッファー（０．１Ｍ 炭酸水素ナトリウム、０．０２％ アジ化ナトリウム）に溶解したヤギ抗ヒトＩＬ−８ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）１００μｌで固層化し、希釈バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２，１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），１ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０，０．０２％ アジ化ナトリウム）２００μｌでブロッキングの後、濃度５ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−８（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）１００μｌを添加した。
【０１３２】
キメラ抗体の精製サンプル、あるいはこれらを発現させたＣＯＳ細胞の培養上清を順次希釈して、各ウェルに加え、次に濃度１μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社製）１００μｌを加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質溶液（１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニル燐酸）を加え、次に４０５nmでの吸光度を測定した。
【０１３３】
抗体濃度測定には、９６穴プレートを濃度１μｇ／ｍｌヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社製）１００μｌで固層化し、ブロッキングの後、キメラ抗体の精製サンプル、あるいはこれらを発現させたＣＯＳ細胞の培養上清を順次希釈して、各ウェルに加え、次に濃度１μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社製）１００μｌを加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質溶液（１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニル燐酸、Ｓｉｇｍａ社製）を加え、次に４０５nmでの吸光度を測定した。
その結果、キメラ抗体ＷＳ−４がＩＬ−８に特異的に結合したことにより、このキメラ抗体がマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＶ領域の正しい構造を有することが示唆された（図２を参照のこと）。
【０１３４】
なお、前記プラスミドＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｌ−ｇκを有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｌ−ｇκ）、および前記プラスミドＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｈ−ｇγ1 を有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｈ−ｇγ1 ）として工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成６年７月１２日に各々ＦＥＲＭ ＢＰ−４７３９、およびＦＥＲＭ ＢＰ−４７４０としてブタペスト条約に基づき国際寄託された。
【０１３５】
実施例５． 再構成ヒトＷＳ−４抗体の作製
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の作製
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを次の様にして設計した。ヒト抗体ＶＤＨ２６のＦＲ１〜３およびヒト抗体４Ｂ４のＦＲ４をコードするそれぞれ既知のＤＮＡ配列をマウスＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲをコードするＤＮＡ配列が連結されるように再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードする全長ＤＮＡを設計した。
【０１３６】
次に、このＤＮＡ配列のそれぞれ５′側及び３′側にＨｉｎｄIII 認識部位／ＫＯＺＡＫコンセンサス配列及びＢａｍＨＩ認識部位／スプライスドナー配列をそれぞれ付加して、ＨＥＦ発現ベクターに挿入できるようにした。こうして設計したＤＮＡ配列をほぼ均等な４本のオリゴヌクレオチドに分け、そして次に、これらのオリゴヌクレオチドのアセンブリーを妨害する可能性のあるオリゴヌクレオチド中の二次構造についてコンピューター解析した。
【０１３７】
４本のオリゴヌクレオチド配列を配列番号：３２〜３５に示す。これらのオリゴヌクレオチドは１１３〜１４３塩基の長さを有し、隣接する２本のオリゴヌクレオチドは互いに２０塩基のオーバラップ領域を有する。４本のオリゴヌクレオチドの内ＨＦ１（配列番号：３２）、ＨＦ３（配列番号：３４）はセンスＤＮＡ配列を有し、そして他のＨＦ２（配列番号：３３）、ＨＦ４（配列番号：３５）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。これらのオリゴヌクレオチドを自動ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によって合成した。
【０１３８】
また、これら４本のオリゴヌクレオチドのＰＣＲ法によるアッセンブリーの方法を図３に記す。約１００ngずつのＨＦ１とＨＦ２、ＨＦ３とＨＦ４を組み合わせて、２．５ｕのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを含有する最終容量９８μｌのＰＣＲ反応液に添加した。９４℃にて３分間の最初の変性の後、９４℃にて２分間、５５℃にて２分間及び７２℃にて２分間を１サイクルとし、これを２サイクル行った。
【０１３９】
ＰＣＲ反応液の半量を相互に交換したのち、さらに２サイクルのインキュベーションを行った。１００ｐmoleずつのＲＶＨ５′プライマー（配列番号：３６）及びＲＶＨ３′プライマー（配列番号：３７）を外部プライマーとして添加した後、ＰＣＲ反応液を５０μｌの鉱油で覆い、そして９４℃にて３分間の最初の変性の後、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間及び７２℃にて１分間の４５サイクルを行い、そして次に７２℃にて１０分間インキュベートした。
【０１４０】
約４５０塩基対のＤＮＡ断片を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨ Iにより消化し、そして次にＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１にクローニングした。ＥＦ−１プライマー（配列番号：６６）およびＨＩＰプライマー（配列番号：６７）を用いてＤＮＡ配列決定の後、正しいＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＨａ−ｇγ１と命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：３８に示す。
【０１４１】
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の各バージョン「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」，「ｆ」，「ｇ」，「ｈ」を以下のようにして作製した。
バージョン「ｂ」（ＲＶＨｂ）は、４７位のロイシンがトリプトファンに変異するように設計した変異原プライマーＬＴＷ１（配列番号：３９）およびＬＴＷ−２（配列番号：４０）を用い、両端を規定するプライマーとしてはＲＶＨ５′（配列番号：３６）およびＲＶＨ３′（配列番号：３７）を用いて、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｂ−ｇγ１を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｂ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：４１に示す。
【０１４２】
バージョン「ｃ」は、４１位のグルタミンがプロリンに変異するように設計した変異原プライマーＱＴＰ１（配列番号：４２）およびＱＴＰ２（配列番号：４３）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｃ−ｇγ１を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｃ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：４４に示す。
【０１４３】
バージョン「ｄ」は、変異原プライマーとしてＱＴＰ１およびＱＴＰ２を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｂ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとしてプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｄ−ｇγ１を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｄ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：４５に示す。
バージョン「ｅ」は、４０位のアラニンがプロリンに変異するように設計した変異原プライマーＡＴＰ１（配列番号：４６）およびＡＴＰ２（配列番号：４７）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｄ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｅ−ｇγ１を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｅ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域に含まれるアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：４８に示す。
【０１４４】
バージョン「ｆ」は、４４位のグリシンがアラニンに変異するように設計した変異原プライマーＧＴＡ１（配列番号：４９）およびＧＴＡ２（配列番号：５０）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｄ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｆ−ｇγ１を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｆ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：５１に示す。
【０１４５】
バージョン「ｇ」は、６７位のロイシンがフェニルアラニンに変異するように設計した変異原プライマーＬＴＦ１（配列番号：５２）およびＬＴＦ２（配列番号：５３）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｄ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｇ−ｇγ１を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｇ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：５４に示す。
【０１４６】
バージョン「ｈ」は、変異原プライマーとしてＬＴＦ１およびＬＴＦ２を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｂ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ｇγ１を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：５５に示す。
【０１４７】
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを次の様にして設計した。ヒト抗体ＲＥＩのＦＲをコードするＤＮＡ配列とマウスＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域のＣＤＲをコードするＤＮＡ配列が連結されるように再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする全長ＤＮＡを設計した。
【０１４８】
次に、このＤＮＡ配列のそれぞれ５′側及び３′側にＨｉｎｄIII 認識部位／ＫＯＺＡＫコンセンサス配列及びＢａｍＨＩ認識部位／スプライスドナー配列をそれぞれ付加して、ＨＥＦ発現ベクターに挿入できるようにした。こうして設計したＤＮＡ配列をほぼ均等な長さの４本のオリゴヌクレオチドに分け、そして次に、これらのオリゴヌクレオチドのアセンブリーを妨害する可能性のあるオリゴヌクレオチド中の二次構造についてコンピューター解析した。
【０１４９】
４本のオリゴヌクレオチド配列を配列番号：５６〜５９に示す。これらのオリゴヌクレオチドは１０６〜１２４塩基の長さを有し、隣接する２本のオリゴヌクレオチドは互いに１９〜２３塩基のオーバラップ領域を有する。４本のオリゴヌクレオチドの内ＬＦ１（配列番号：５６）、ＬＦ３（配列番号：５８）はセンスＤＮＡ配列を有し、そして他のＬＦ２（配列番号：５７）、ＬＦ４（配列番号：５９）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。これらオリゴヌクレオチドを前記のＨＦ１〜４と同様の方法で合成した。
【０１５０】
アッセンブリーは、１００ngずつの４種のオリゴヌクレオチド及び５ｕのＡｍｐｌｉ Ｔａｑを含有する９８μｌのＰＣＲ混合物を、９４℃にて３分間の最初の変性の後、９４℃にて２分間、５５℃にて２分間及び７２℃にて３分間を１サイクルとし、これを２サイクル行った。１００ｐmoleずつのＲＶＬ５′プライマー（配列番号：６０）及びＲＶＬ３′プライマー（配列番号：６１）を外部プライマーとして添加した後、ＰＣＲ反応液を５０μｌの鉱油で覆い、そして９４℃にて３分間の最初の変性の後、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間及び７２℃にて１分間を１サイクルとしてこれを３０サイクルを行い、そして次に７２℃にて１０分間インキュベートした（図３参照）。
【０１５１】
約４００塩基対のＤＮＡ断片を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより消化し、そして次にＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶＬ−ｇκにクローニングした。ＥＦ−１プライマー（配列番号：６６）およびＫＩＰプライマー（配列番号：６８）を用いてＤＮＡ配列決定の後、正しいＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＬａ−ｇκと命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬａ−ｇκに含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：６２に示す。
【０１５２】
バージョン「ｂ」（ＲＶＬｂ）は、７１位のフェニルアラニンがチロシンに変異するように設計した変異原プライマーＦＴＹ１（配列番号：６３）およびＦＴＹ２（配列番号：６４）を用い、両端を規定するプライマーとしてはＲＶＬ５′（配列番号：６０）およびＲＶＬ３′（配列番号：６１）を用いて、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬａ−ｇκを鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬｂ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬｂ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：６５に示す。
【０１５３】
再構成ヒトＷＳ−４抗体の各鎖の抗原結合活性を評価するため、まず、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖の「ａ」バージョンための発現ベクターＨＥＦ−ＲＶＬａ−ｇκとキメラＷＳ−４抗体Ｈ鎖のための発現ベクターＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｈ−ｇγ１とによりＣＯＳ細胞を前記のようにして同時トランスフェクションし、前記のようにして培養上清を回収した後、前記実施例４ＥＬＩＳＡに記載のとおりの方法を用いて、産生された抗体について産生抗体量および抗原結合活性を測定した。この結果を図４に示す。図４に示すように陽性対照としてのキメラ抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）および再構成Ｌ鎖とキメラＨ鎖とからなる抗体（ＲＶＬａ／ｃｈＨ）との間には抗原結合性に差がないことが確認された。
【０１５４】
同時に、キメラＷＳ−４抗体Ｌ鎖のための発現ベクターＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｌ−ｇκと再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖の「ａ」バージョンとの組み合せを評価するため、両者をＣＯＳ細胞に同時トランスフェクションし、前記実施例４ＥＬＩＳＡに記載のとおりの方法を用いて、得られた抗体について産生抗体量および抗原結合活性を測定した。その結果、この抗体（ｃｈＬ／ＲＶＨａ）には抗原結合活性が見られなかった（図４を参照のこと）。
【０１５５】
前記のごとく、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖の「ａ」バージョン（ＲＶＬａ）はキメラＷＳ−４抗体Ｌ鎖と同等の結合活性を示したので、これ以後の再構成Ｈ鎖各バージョンの評価には、再構成Ｈ鎖各バージョンと再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖の「ａ」バージョン（ＲＶＬａ）をＣＯＳ細胞に同時トランスフェクションすることにより行なった。
【０１５６】
その結果、「ｂ」，「ｄ」，「ｅ」，「ｆ」，「ｇ」，「ｈ」の各再構成Ｈ鎖バージョンを有する抗体は、陽性対照であるキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）に匹敵する程度の抗原結合性を示し、この組み合せがヒト抗体における機能的抗原結合部位を形成することが示唆された。しかし、産生量については、「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）以外はいずれもキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）より低かった。なお、Ｈ鎖バージョン「ｃ」を有する抗体には抗原結合活性が見られなかった（図５を参照のこと）。
【０１５７】
このことから、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖の「ａ」バージョン（ＲＶＬａ）ならびに再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖の「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）を有する抗体は、良好な抗原結合性を示す機能的抗原結合部位を再形成し、ＣＯＳ細胞に同時トランスフェクションすることによりキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）に匹敵する程度の産生量を示すことが示唆された。
【０１５８】
次に、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖の「ｂ」バージョン（ＲＶＬｂ）を用いて、Ｈ鎖各バージョンとＣＯＳ細胞に同時トランスフェクションし、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖の「ｂ」バージョン（ＲＶＬｂ）の評価をおこなった。その結果、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖「ｇ」バージョンを有する抗体（ＲＶＬｂ／ＲＶＨｇ）だけが、陽性対照であるキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）に匹敵する程度の抗原結合性を示し、この組み合せがヒト抗体における機能的抗原結合部位を形成することが示唆された。また、産生量についても、「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）以外はいずれもキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）より低かった（図６を参照のこと）。
【０１５９】
前記の評価において、キメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）に匹敵する産生量とＩＬ−８に対する結合活性を示した２種の再構成ヒト抗体（ＲＶＬａ／ＲＶＨｇとＲＶＬｂ／ＲＶＨｇ）をそれぞれプロティンＡカラムで精製して、実施例４ＥＬＩＳＡに記載の方法で結合活性をより正確に評価した。その結果、キメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）、ＲＶＬａ／ＲＶＨｇ抗体並びにＲＶＬｂ／ＲＶＨｇ抗体のいずれも同程度の結合活性を示した（図７参照のこと）。
【０１６０】
このことから、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖の「ａ」バージョン（ＲＶＬａ）あるいは「ｂ」バージョン（ＲＶＬｂ）と、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖の「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）を有する抗体は、良好な抗原結合性を示す機能的抗原結合部位を再形成し、ＣＯＳ細胞に同時トランスフェクションすることによりキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）に匹敵する程度の産生量を示すことが示唆された。
【０１６１】
再構成ヒトＷＳ−４抗体のＬ鎖「ａ」バージョン（ＲＶＬａ）と同Ｈ鎖「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）、または同Ｌ鎖「ｂ」バージョン（ＲＶＬｂ）と同Ｈ鎖「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）からなる再構成ヒト抗体のＩＬ−８レセプターに対するＩＬ−８結合阻害活性を、リガンドレセプター結合阻害アッセイにより評価した。
【０１６２】
健常人よりヘパリン採血した約１００mlの血液を、１５mlのＭｏｎｏ−Ｐｏｌｙ分離溶液（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）に３５mlずつ重層し、添付の指示書に従い遠心分離をおこなってヒト好中球層を単離した。この細胞を１％ＢＳＡ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地にて洗浄した後、混入した赤血球を１５０mMの塩化アンモニウム溶液にて除去した。これを遠心分離した後、細胞を１％ＢＳＡ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地にて洗浄し、２ｘ１０7 Cells／mlの細胞濃度になるように再懸濁した。この細胞懸濁液の好中球の含有率は、サイトスピン（Ｓｈａｎｄｏｎ社）による塗抹標本をＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（ミドリ十字社製）染色して測定した結果９５％以上であった。
【０１６３】
上記好中球懸濁液を遠心分離し、結合バッファー（１％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むＤ−ＰＢＳ）にて細胞濃度２ｘ１０7 Cells／mlになるように再懸濁した。この時、好中球上のＦｃレセプターをあらかじめ飽和する目的で、本発明のヒト抗体と同一のＦｃ部分を有するＳＫ２キメラ抗体（国際特許出願出願番号ＰＣＴ／ＪＰ９４／００８５９参照）とその抗原であるヒトＩＬ−６をそれぞれ濃度約５０μｇ／mlおよび約４０ng／mlになるように添加し、氷温中で３０分間インキュベートした。
【０１６４】
125Ｉで放射標識したＩＬ−８（７４ＴＢｑ／ｍｍｏｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）と未標識ＩＬ−８（Ａｍｅｒｓｂａｍ社製）を各濃度が４ng／mlになるように結合バッファーにて混合し調製した。キメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）、再構成ヒト抗体（ＲＶＬａ／ＲＶＨｇおよびＲＶＬｂ／ＲＶＨｇ）、陰性対照のヒト抗体（ＰＡＥＳＥＬ＋ＬＯＲＥＩ社製）あるいは陽性対照のマウスＷＳ−４抗体のそれぞれを結合バッファーにて濃度２０００ng／mlから約８ng／mlまで２倍段階希釈した。ＩＬ−８溶液ならびに各抗体溶液をそれぞれ５０μｌずつ混合し氷温中で３０分間インキュベートした。その後、上記好中球懸濁液１００μｌを添加し、更に１５分毎に撹拌しながら氷温中で１時間インキュベートした。インキュベート後、この細胞懸濁液を２００μｌの２０％サッカロース溶液に重層し、遠心、凍結させた。細胞に結合したＩＬ−８を測定するため、細胞沈渣を切断し、γ−カウンター（アロカ社製）で放射活性を測定した。その結果を図８に示す。
【０１６５】
再構成ヒトＷＳ−４抗体のＬ鎖「ａ」バージョン（ＲＶＬａ）と同Ｈ鎖「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）、または同Ｌ鎖「ｂ」バージョン（ＲＶＬｂ）と同Ｈ鎖「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）を有する抗体は、ＩＬ−８レセプターに対するＩＬ−８の結合に対して、キメラ抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）と同程度の結合阻害活性を有することが明らかになった。
【０１６６】
なお、前記プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬａ−ｇκを有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ＨＥＦ−ＲＶＬａ−ｇκ）、およびプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｇ−ｇγ１を含有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ＨＥＦ−ＲＶＨｇ−ｇγ１）として工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成６年７月１２日に、各々ＦＥＲＭ ＢＰ−４７３８および、ＦＥＲＭ ＢＰ−４７４１としてブタペスト条約に基づき国際寄託された。
【０１６７】
参考例１． ハイブリドーマＷＳ−４の作製
抗ヒトＩＬ−８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ヒトＩＬ−８で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３をポリエチレングリコールを用いた常法により融合して作製した。ヒトＩＬ−８と結合する活性を指標としたスクリーニングを行い、ハイブリドーマＷＳ−４を樹立した（Ｋｏ，Ｙ−Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４９，２２７−２３５，１９９２）。
【０１６８】
【発明の効果】
本発明はヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体を提供し、この抗体においてはヒト抗体のＶ領域のＣＤＲがヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＣＤＲにより置き換えられている。この再構成ヒト抗体の大部分がヒト抗体に由来し、そしてＣＤＲは元来、抗原性が低いことから、本発明の再構成ヒト抗体はヒトに対する抗原性が低く、そしてそれ故に医学療法用として期待される。
【０１６９】
【配列表】
【０１７０】
【０１７１】
【０１７２】
【０１７３】
【０１７４】
【０１７５】
【０１７６】
【０１７７】
【０１７８】
【０１７９】
【０１８０】
【０１８１】
【０１８２】
【０１８３】
【０１８４】
【０１８５】
【０１８６】
【０１８７】
【０１８８】
【０１８９】
【０１９０】
【０１９１】
【０１９２】
【０１９３】
【０１９４】
【０１９５】
【０１９６】
【０１９７】
【０１９８】
【０１９９】
【０２００】
【０２０１】
【０２０２】
【０２０３】
【０２０４】
【０２０５】
【０２０６】
【０２０７】
【０２０８】
【０２０９】
【０２１０】
【０２１１】
【０２１２】
【０２１３】
【０２１４】
【０２１５】
【０２１６】
【０２１７】
【０２１８】
【０２１９】
【０２２０】
【０２２１】
【０２２２】
【０２２３】
【０２２４】
【０２２５】
【０２２６】
【０２２７】
【０２２８】
【０２２９】
【０２３０】
【０２３１】
【０２３２】
【０２３３】
【０２３４】
【０２３５】
【０２３６】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、それぞれ本発明の抗体のＬ鎖およびＨ鎖の発現のために有用な、ヒト・エロンゲーション・ファクター−１α（ＨＥＦ−１α）プロモーター／エンハンサー系を含んで成る発現ベクターＨＥＦ−ＶＬ−ｇκおよびＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１を示す。
【図２】図２は、ＣＯＳ細胞の培養上清中に産生された本発明のキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）のヒトＩＬ−８に対する結合能の確認のためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の再構成ヒトＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域の第一バージョン「ａ」（ＲＶＨａ）、および再構成ヒトＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域の第一バージョン「ａ」（ＲＶＬａ）の各アミノ酸配列をコードするＤＮＡを構築するためのダイヤグラムである。
【図４】図４は、本発明の再構成ヒトＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域（ＲＶＬａ）ならびにＨ鎖Ｖ領域（ＲＶＨａ）を、それぞれキメラＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域（ｃｈＨ）ならびにキメラＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域（ｃｈＬ）とＣＯＳ細胞に発現させ、ヒトＩＬ−８に対する結合能と産生量を、ＣＯＳ細胞の培養上清中に産生された本発明のキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）と比較するためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図５】図５は、ＣＯＳ細胞の培養上清中に産生された本発明のＲＶＬａを含んでなる８種の再構成ヒトＷＳ−４抗体（ＲＶＬａ／ＲＶＨａ，ＲＶＬａ／ＲＶＨｂ，ＲＶＬａ／ＲＶＨｃ，ＲＶＬａ／ＲＶＨｄ，ＲＶＬａ／ＲＶＨｅ，ＲＶＬａ／ＲＶＨｆ，ＲＶＬａ／ＲＶＨｇ，ＲＶＬａ／ＲＶＨｈ）のヒトＩＬ−８に対する結合能と産生量を、ＣＯＳ細胞の培養上清中に産生された本発明のキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）と比較するためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図６】図６は、ＣＯＳ細胞の培養上清中に産生された本発明のＲＶＬｂを含んでなる８種の再構成ヒトＷＳ−４抗体（ＲＶＬｂ／ＲＶＨａ，ＲＶＬｂ／ＲＶＨｂ，ＲＶＬｂ／ＲＶＨｃ，ＲＶＬｂ／ＲＶＨｄ，ＲＶＬｂ／ＲＶＨｅ，ＲＶＬｂ／ＲＶＨｆ，ＲＶＬｂ／ＲＶＨｇ，ＲＶＬｂ／ＲＶＨｈ）のヒトＩＬ−８に対する結合能と産生量を、ＣＯＳ細胞の培養上清中に産生された本発明のキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）と比較するためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図７】図７は、精製した本発明の再構成ヒトＷＳ−４抗体ＲＶＬａ／ＲＶＨｇ並びにＲＶＬｂ／ＲＶＨｇのヒトＩＬ−８に対する結合能を、精製した本発明のキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）と比較するためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図８】図８は、精製した本発明の再構成ヒト型化抗体ＲＶＬａ／ＲＶＨｇならびにＲＶＬｂ／ＲＶＨｇのＩＬ−８レセプターに対するＩＬ−８の結合阻害活性をマウスＷＳ−４抗体ならびに本発明のキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）と比較するための、リガンドレセプター結合阻害アッセイの結果を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトインターロイキン−８（ＩＬ−８）に対するマウスモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び可変領域（Ｖ領域）、並びにヒトＩＬ−８に対するヒト／マウスキメラ抗体、ヒト軽鎖（Ｌ鎖）可変領域及びヒト重鎖（Ｈ鎖）可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＣＤＲにより置き換えられている再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体に関する。本発明はさらに、上記の抗体又はその部分をコードするＤＮＡを提供する。本発明はさらに、前記ＤＮＡを含んで成るベクター、特に発現ベクター、並びに該ベクターにより形質転換された宿主に関する。本発明はさらに、ヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体の製造方法、及びヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体の製造方法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
インターロイキン−８（ＩＬ−８）は、リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激した単球の培養上清より見いだされ、ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ（ＭＤＮＣＦ）あるいはｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＮＡＰ−１）等と称されていた遊走性サイトカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）である。ＩＬ−８は様々な細胞により産生され、多形核白血球およびリンパ球に作用して、その濃度勾配に沿って遊走（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ）させる活性を有している。また、好中球に対してはその遊走を誘導するばかりでなく、脱顆粒、活性酸素の放出、内皮細胞への接着亢進などの好中球の機能をも活性化させる作用を有している。
【０００３】
炎症性疾患、より詳しくは、嚢胞性肺線維症、特発性肺線維症、成人呼吸促迫症候群、サルコイドーシス、化膿性胸膜炎などの呼吸器疾患、並びに乾癬などの皮膚疾患、並びに慢性リウマチ関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎などの疾患においては、それらの病巣部位に白血球浸潤が病理学的に認められている。また、これら疾患の患者由来の被検物質に、ＩＬ−８が検出されており、炎症において中心的役割を果たしていると考えられている。
【０００４】
（ＭｃＥｌｖａｎｅｙ，Ｎ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９０，１２９６−１３０１，１９９２、Ｌｙｎｃｈ III，Ｊ．Ｐ．ら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．，１４５，１４３３−１４３９，１９９２、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｌａｎｃｅｔ，３４１，６４３−６４７，１９９３、Ｃａｒ，Ｂ．Ｄ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，１４９，６５５−６５９，１９９４、Ａｎｔｏｎｙ，Ｖ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１，７２１６−７２２３，１９９３、Ｔａｋｅｍａｔｓｕ，Ｈ．ら、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１２９，７４−８０，１９９３、Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２１４１−２１４４，１９９０、Ｉｚｚｏ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，２８，２９６−３００，１９９３、Ｉｚｚｏ，Ｒ．Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，８７，１４４７−１４５２，１９９２）。
【０００５】
Ｋｏ，Ｙ−Ｃ．らは、ヒトＩＬ−８を抗原としてマウスに免疫することにより、ヒトＩＬ−８に結合し、かつ、その結合によってヒトＩＬ−８が好中球に結合することを阻害する、すなわちヒトＩＬ−８が有する生物学的活性を中和するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４を調製した。マウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のアイソタイプは、κ型Ｌ鎖及びＣγ１型Ｈ鎖であることが明らかになっている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４９，２２７−２３５，１９９２）。
【０００６】
ＷＳ−４以外の抗ヒトＩＬ−８抗体としては、Ａ．５．１２．１４（Ｂｏｙｌａｎ，Ａ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８９，１２５７−１２６７，１９９２）、国際特許出願ＷＯ９２−０４３７２に開示されている抗Ｐｅｐ−１抗体または抗Ｐｅｐ−３抗体あるいはＤＭ／Ｃ７（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５０，５５８５−５５９５，１９９３）等が知られている。
【０００７】
家兎を用いた実験系に於て、マウスモノクローナル抗体ＷＳ−４を投与することによって、肺虚血・再灌流障害（Ｓｅｋｉｄｏ，Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３６５，６５４−６５７，１９９３）、ＬＰＳ誘導の皮膚炎（Ｈａｒａｄａ，Ａ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，６８１−６９０，１９９３）、ＬＰＳあるいはインターロイキン−１（ＩＬ−１）誘導の関節炎（Ａｋａｈｏｓｈｉ，Ｔ．ら、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．，１３，１１３−１１６，１９９４）における好中球浸潤が抑制されたことが見いだされた。
【０００８】
家兎にもヒトＩＬ−８の相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）が存在し、ウサギＩＬ−８と称されている。マウスモノクローナル抗体ＷＳ−４はウサギＩＬ−８に対して交差反応し、ウサギＩＬ−８がウサギ好中球に結合するのを阻害することが明らかになっている（Ｈａｒａｄａ，Ａ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，６８１−６９０，１９９３）ので、これらのことは、ヒトにおける炎症性疾患の治療のための療法剤として抗ヒトＩＬ−８抗体が有用であることを示唆している。
【０００９】
ヒト以外の哺乳類由来のモノクローナル抗体はヒトにおいて高度に免疫原性（「抗原性」という場合もある）があり、そしてこの理由のため、ヒトにおけるそれらの医学療法的価値は制限される。例えば、マウス抗体をヒトに投与しても異物として代謝されうるので、ヒトにおけるマウス抗体の半減期は比較的短く、期待された効果を充分に発揮できない。さらに、投与したマウス抗体に対して発生するヒト抗マウス抗体は、血清病あるいは他のアレルギー反応など、患者にとって不都合で危険な免疫応答を惹起する。そしてこの理由のため、ヒトにマウス抗体を頻回投与することはできない。
【００１０】
これらの問題を解決するため、ヒト型化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体の製造方法が開発された。マウス抗体は２つの方法でヒト型化することができる。より簡単な方法としては、可変領域（Ｖ領域）はもとのマウスモノクローナル抗体に由来し、定常領域（Ｃ領域）は適当なヒト抗体に由来するキメラ抗体を作製する方法がある。得られるキメラ抗体はもとのマウス抗体の可変領域を完全なかたちで含有するので、もとのマウス抗体と同一の特異性をもって抗原に結合することが期待できる。
【００１１】
さらに、キメラ抗体ではもとのマウス抗体に比べヒト以外の動物に由来する蛋白質配列の比率が実質的に滅少しているためもとのマウス抗体に比べて免疫原性が低いと予想される。キメラ抗体は抗原によく結合しそして免疫原性が低いが、それでもなおマウス可変領域に対する免疫応答が生ずる可能性がある（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ａ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，４２２０−４２２４，ｌ９８９）。
【００１２】
マウス抗体をヒト型化するための第二の方法は一層複雑であるが、しかしマウス抗体が有する潜在的な免疫原性を大幅に低下させるものである。この方法においては、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）のみをヒト可変領域に移植して「再構成」（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト可変領域を作製する．ただし必要によっては、再構成ヒト可変領域のＣＤＲの構造をより一層もとのマウス抗体の構造に近づけるために、ＣＤＲを支持しているフレームワーク領域（ＦＲ）の一部の蛋白質配列をマウス抗体の可変領域からヒト可変領域に移植する場合がある。
【００１３】
次に、これらの再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。最終的に再構成されたヒト抗体のヒト以外の蛋自質配列に由来する部分はＣＤＲ、および、極く一部のＦＲのみである。ＣＤＲは超可変蛋自質配列により構成されており、これらは種特異的配列を示さない。この理由のため、マウスＣＤＲを担持する再構成ヒト抗体はもはやヒトＣＤＲを含有する天然ヒト抗体より強い免疫原性を有しないはずである。
【００１４】
再構成ヒト抗体についてはさらに、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２７，ｌ９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，ｌ５３４−ｌ５３６，ｌ９８８；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，４，７７３−７８３，ｌ９９ｌ；Ｍａｅｄａ，Ｈ．ら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，２，ｌ２４−ｌ３４，ｌ９９ｌ；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４ｌ８ｌ−４ｌ８５，ｌ９９ｌ；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，２６６−２７ｌ，ｌ９９ｌ；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，２８６９−２８７３，ｌ９９ｌ；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，ｌ９９２；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｌ４８，ｌｌ４９−ｌｌ５４，ｌ９９２；およびＳａｔｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３，８５ｌ−８５６，ｌ９９３を参照のこと。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
前記のごとく、再構成ヒト抗体は療法目的のために有用であると予想されるが、ヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体は知られていない。さらに、再構成ヒト抗体の製造方法において任意の抗体に普遍的に適用し得る画一的な方法は存在しない。従って、特定の抗原に対して十分な結合活性あるいは／ならびに中和活性を示す再構成ヒト抗体を作製するためには種々の工夫が必要である（例えば、Ｓａｔｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３，８５ｌ−８５６，ｌ９９３）。従って、本発明はヒトＩＬ−８に対する、免疫原性の低い抗体を提供するものである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明はヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体を提供する。本発明はまた、該再構成ヒト抗体の作製の過程で有用であるヒト／マウスキメラ抗体を提供する。本発明はさらに、再構成ヒト抗体の断片を提供する。並びに本発明はキメラ抗体、再構成ヒト抗体およびそれらの断片の製造のための発現系を提供する。本発明はさらにまた、ヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体およびそれらの断片の製造方法、及びヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体およびそれらの断片の製造方法を提供する。
【００１７】
さらに具体的には、本発明は、
（１）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域；並びに
（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域；
を提供する。
本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに
（２）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖；
を提供する。
【００１８】
本発明はさらにまた、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに
（２）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖；
を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体を提供する。
本発明はさらに、
（１）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖Ｖ領域；並びに
（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖Ｖ領域；を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに
（２）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖；
を提供する。
本発明はさらにまた、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに
（２）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖；
を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、
（１）ヒトＩＬ−８に対するモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；並びに
（２）ヒトＩＬ−８に対するモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；を提供する。
本発明はさらに、
（１）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；並びに
（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）；並びに
（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域；並びに
（１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のＦＲ；並びに
（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域；並びに
（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ領域；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＬ鎖；並びに
（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域；並びに
（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＨ鎖を提供する。
【００２３】
本発明はさらにまた、
（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、並びに
（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖；並びに
（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、並びに
（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖；
を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体を提供する。
【００２４】
本発明はさらに詳しくは
（１）以下のアミノ酸配列に示す又はその一部を有する、ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、
（２）以下のアミノ酸配列に示す又はその一部を有する、ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、
【００２５】
本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）；並びに
（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域；並びに
（１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のＦＲ；並びに
（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域
を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域；並びに
（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ領域；
を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＬ鎖；並びに
（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域；並びに
（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域；
を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＨ鎖を提供する。
【００２７】
本発明はさらにまた、
（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、並びに
（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖；並びに
（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、並びに
（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖；
を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体を提供する。
【００２８】
前記ヒトＬ鎖ＦＲは以下のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
または、
前記ヒトＨ鎖ＦＲは以下のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
または、
本発明はまた、前記種々の抗体を構成するポリペプチド、又はその断片をコードするＤＮＡに関する。本発明はまた、上記ＤＮＡを含んで成るベクター、例えば発現ベクターに関する。本発明はさらに、上記ベクターにより形質転換された宿主を提供する。
本発明はさらにまた、ヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体およびその断片の製造方法、及びヒトｌＬ−８に対する再構成ヒト抗体およびその断片の製造方法を提供する。
【００３９】
【具体的な説明】
マウスＶ領域をコードするＤＮＡのクローニング
ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードする遺伝子をクローニングするためには、該遺伝子の取得源として、ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製することが必要である。ハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出した後、既知の方法により一本鎖ｃＤＮＡに変換し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて目的とするＤＮＡを増幅することで得られる。この遺伝子の取得源として、Ｋｏ，Ｙ−Ｃ．らが作製した、ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＷＳ−４があげられる。このハイブリドーマの作製方法はＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４９，２２７−２３５，１９９２に記載されており、これを参考例１に後記する。
【００４０】
（１）全ＲＮＡの採取
マウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードする目的のＤＮＡをクローン化するため、グアニジンチオシアネート処理によりハイブリドーマ細胞を破壊し、塩化セシウム密度勾配遠心（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８、５２９４−５２９９，１９７９）をおこなって全ＲＮＡを得ることができる。なお、他の蛋白質の遺伝子をクローニングする際に用いられたすでに報告されている方法、例えばバナジウム複合体などのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）インヒビター存在下で、界面活性剤処理、フェノール処理をおこなう方法（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８，５１４３−５１４９，１９７９）を用いることもできる。
【００４１】
（２）ｃＤＮＡの合成
次に、ｍＲＮＡの３′末端に局在するｐｏｌｙＡ鎖に相補的なオリゴヌクレオチドであるオリゴ（ｄＴ）をプライマーとして、上記のごとくして得た全ＲＮＡに含まれているｍＲＮＡを鋳型に、逆転写酵素で処理してｍＲＮＡに相補的な一本鎖ｃＤＮＡを合成することができる（Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７、９３４−９３８，１９８９）。また、その時にランダムプライマーを用いても良い。なお、ｍＲＮＡだけを取得する場合は、全ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースカラムにかけｐｏｌｙＡ鎖を有するｍＲＮＡだけを分離することができる。
【００４２】
（３）ポリメラーゼ連鎖反応によるＶ領域をコードするＤＮＡの増幅
次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて前記Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを特異的に増幅する。マウスモノクローナル抗体のカッパ（κ）型Ｌ鎖Ｖ領域の増幅のため、配列番号；１〜１１に示す１１種のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ Ｋａｐｐａ Ｖａｒｉａｂｌｅ；ＭＫＶ）及び配列番号：１２に示すオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ Ｋａｐｐａ Ｃｏｎｓｔａｎｔ；ＭＫＣ）をそれぞれ５′末端プライマー及び３′末端プライマーとして使用する．前記ＭＫＶプライマーはマウスカッパ型Ｌ鎖リーダー配列をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズし、そして前記ＭＫＣプライマーはマウスカッパ型Ｌ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズする。
【００４３】
マウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域の増幅のため、配列番号：１３〜２４に示す１２種のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ Ｈｅａｖｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ；ＭＨＶ）及び配列番号：２５に示すオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ Ｈｅａｖｙ Ｃｏｎｓｔａｎｔ；ＭＨＣ）をそれぞれ５′未端プライマー及び３′末端プライマーとして使用する。前記ＭＨＶプライマーはマウスＨ鎖リーダー配列をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズし、そして前記ＭＨＣプライマーはマウスＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズする。
【００４４】
なお、全ての５′末端プライマー（ＭＫＶ及びＭＨＶ）はその５′末端近傍に制限酵素ＳａｌＩ切断部位を提供する配列ＧＴＣＧＡＣを含有し、そして、全ての３′末端プライマー（ＭＫＣ及びＭＨＣ）はその５′末端近傍に制限酵素ＸｍａＩ切断部位を提供するヌクレオチド配列ＣＣＣＧＧＧを含有する。これらの制限酵素切断部位は両Ｖ領域をコードする目的のＤＮＡ断片をそれぞれのクローニングベクターにサブクローニングするために用いられる。これらの制限酵素切断部位が、両Ｖ領域をコードする目的のＤＮＡ配列中にも存在する場合、それぞれのクローニングベクターにサブクローニングするために用いられる限り、他の制限酵素切断部位でも良い。
【００４５】
（４）Ｖ領域をコードするＤＮＡの単離
次に、目的とするマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ断片を得るために、ＰＣＲ増幅生成物を低融点アガロースゲルあるいはカラム〔ＰＣＲ産物精製用キット（ＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ：ＱＩＡＧＥＮ社製）、ＤＮＡ精製用キット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ II ：ＢＩＯ １０１社製）〕等により、分離、精製をおこなう。その精製物を制限酵素Ｓａｌ I及びＸｍａ Iで酵素処理して、マウスモノクローナル抗体の目的とするＶ領域をコードするＤＮＡ断片を得る。
【００４６】
他方、プラスミドｐＵＣ１９のごとき適当なクローニングベクターを同じ制限酵素Ｓａｌ I及びＸｍａ Iにより切断させ、このｐＵＣ１９に前記ＤＮＡ断片を酵素的に連結することにより、マウスモノクローナル抗体の目的とするＶ領域をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドを得る。クローニングされたＤＮＡの配列決定は任意の常法に従って行うことができ、例えば、自動ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．製）が挙げられる。目的とするＤＮＡのクローニング及びその配列決定を実施例ｌ及び実施例２に具体的に記載する。
【００４７】
相補性決定領域（ＣＤＲ）
本発明はさらに、ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域の超Ｖ領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を提供する。抗体のＬ鎖及びＨ鎖の両Ｖ領域は抗原結合部位を形成する。Ｌ鎖及びＨ鎖上のこの領域は類似する基本的構造を有する。両鎖のＶ領域は配列が比較的保存された４個のフレームワーク領域を含み、それらは３個の超Ｖ領域又はＣＤＲにより連結されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ １９９１）。
【００４８】
前記４個のフレームワーク領域（ＦＲ）の多くの部分はβ−シート構造をとり、３個のＣＤＲはループを形成する。ＣＤＲはある場合にはβ−シート構造の一部分を形成することもある。ＦＲによって３個のＣＤＲは相互に立体的に非常に近い位置に保持され、そして、対をなす３個のＣＤＲと共に抗原結合部位の形成に寄与する。本発明は、ヒト型化抗体の素材として有用なこれらのＣＤＲ、及びそれをコードするＤＮＡをも提供する。これらのＣＤＲ領域は、Ｖ領域の既知アミノ酸配列と照合することによって、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」の経験則から決定することができ、実施例３において具体的に説明する。
【００４９】
キメラ抗体の作製
ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＶ領域を設計するに先立って、使用するＣＤＲが実際に抗原結合領域を形成することを確かめる必要がある。この目的のため、キメラ抗体を作製した。キメラ抗体を作製するためにキメラ抗体のＬ鎖並びにＨ鎖をコードするＤＮＡを構築する必要がある。両ＤＮＡを構築する基本的な方法は、ＰＣＲ−クローン化ｃＤＮＡに見られるマウスリーダー配列及びマウスＶ領域配列のそれぞれのＤＮＡ配列を、哺乳類細胞発現ベクター中にすでに存在するヒトＣ領域をコードするＤＮＡ配列に連結することである。
【００５０】
前記ヒト抗体Ｃ領域は、任意のヒトＬ鎖Ｃ領域および任意のヒトＨ鎖Ｃ領域であることができ、例えば、Ｌ鎖についてはヒトＬ鎖ＣκあるいはＣλ、Ｈ鎖についてはＩｇＧであればＣγ１，Ｃγ２，Ｃγ３あるいはＣγ４（Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．ら、ＤＮＡ，１，１１−１８（１９８１），Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎ．ら、Ｃｅｌｌ，２９，６７１−６７９（１９８２），Ｋｒａｗｉｎｋｅｌ，Ｕ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１，４０３−４０７（１９８２））あるいは他のアイソタイプをそれぞれ挙げることができる。
【００５１】
キメラ抗体の製造のためには２種類の発現ベクターを作製する。即ち、エンハンサー／プロモーター系のような発現制御領域による制御のもとで、マウスＬ鎖Ｖ領域ならびにヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクター、およびエンハンサー／プロモーター系のような発現制御領域による制御のもとで、マウスＨ鎖Ｖ領域ならびにヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターを作製する。次に、これらの両発現ベクターにより哺乳類細胞などの宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞をイン−ビトロまたはイン−ビボで培養してキメラ抗体を製造する（例えば、ＷＯ９１−１６９２８）。
【００５２】
あるいは、マウスＬ鎖Ｖ領域ならびにヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡおよびマウスＨ鎖Ｖ領域ならびにヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに導入し、そして、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、そして形質転換された細胞をイン−ビトロまたはイン−ビボで培養してキメラ抗体を製造することもできる。
【００５３】
モノクローナル抗体ＷＳ一４からのキメラ抗体の作製を実施例４に記載する。マウスＷＳ−４κ型Ｌ鎖リーダー領域及びＶ領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いてクローニングし、ヒトＬ鎖Ｃκ領域をコードするヒトゲノムＤＮＡを含有する発現ベクターに連結する。同様にマウスＷＳ−４抗体のＨ鎖リーダー領域及びＶ領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いてクローニングし、ヒトＣγ１領域をコードするゲノムＤＮＡを含有する発現ベクターに連結する。
【００５４】
より詳しくは、特に設計されたＰＣＲプライマーを用いて、マウスＷＳ−４抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡをそれらの５′及び３′末端において適当な塩基配列を導入して（１）それらが発現ベクターに容易に挿人されるように、且つ（２）それらが該発現ベクター中で適切に機能するようにした（例えば、本発明ではＫｏｚａｋ配列を導入することにより転写効率を上げるよう工夫してある）。
【００５５】
次に、これらのプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して得たマウスＷＳ−４抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、所望のヒトＣ領域をすでに含有するＨＥＦ発現ベクター（図１参照）に挿人した。これらのベクターは、種々の哺乳類細胞系における遺伝子操作された抗体の一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現又は安定な発現のために適当である。
このように作製したキメラＷＳ−４抗体の結合活性を試験したところ、キメラＷＳ−４抗体はヒトＩＬ−８に結合する活性を示した（図２参照）。従って、正しいマウスＶ領域がクローニングされ、そして正しく配列が決定されていたことが示された。
【００５６】
再構成ヒトＷＳ−４抗体の設計
マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト抗体に移植されている再構成ヒト抗体を作製するためには、移植するＣＤＲを有するマウスモノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列と、ＣＤＲが移植されるヒトモノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列との間に高い同一性が存在することが望ましい。
【００５７】
この目的のためには、マウスモノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列とヒトモノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列とを比較することにより、再構成ヒトＷＳ−４抗体のＶ領域の設計の基礎となるヒトＶ領域を選択することが可能になる。具体的には遺伝子解析ソフトＧＥＮＥＴＸ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いてマウスＷＳ−４抗体のＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＮＢＲＦ）のデータベースに見出されるすべての既知のヒトのＶ領域と比較した。
【００５８】
マウスＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域は、既知のヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域との比較においてヒト抗体ＨＡＵ（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓ．ら、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３５１，１２９１−１２９５，１９７０）のＬ鎖Ｖ領域に最も類似しており、６９．２％の同一性が存在する。一方、ＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域は、既知のヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域との比較においてヒト抗体ＶＤＨ２６（Ｂｕｌｕｗｅｌａ．，Ｌ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．，７，２００３−２０１０，１９８８）に最も類似しており、７１．４％の同一性が存在する。
【００５９】
一般的に、マウスＶ領域のアミノ酸配列のヒトＶ領域のアミノ酸配列に対する同一性は、マウスＶ領域のアミノ酸配列に対する同一性よりも低い。これはマウスＷＳ−４抗体のＶ領域がヒトＶ領域に完全には類似していないこと示し、そして同時に、ヒト患者における免疫原性の問題を解決するためにマウスＷＳ−４のＶ領域をヒト型化する（ｈｕｍａｎｉｚｅ）ことが最善であることを示している。
【００６０】
マウスＷＳ−４抗体のＶ領域をさらに、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ ０ｆｆｉｃｅにより定義されるヒトＶ領域サブグループのコンセンサス配列と比較し、Ｖ領域のＦＲ間で対比された。その結果を表１に示す。
【００６１】
【表１】
マウスＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域のＦＲはヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループ I（ＨＳＧ I）のＦＲのコンセンサス配列に最も類似しており、６４．４％の同一性が存在する。一方、マウスＷＳ−４のＨ鎖Ｖ領域のＦＲはヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループ III（ＨＳＧ III）のＦＲのコンセンサス配列に最も類似しており、６２．３％の同一性が存在する。
【００６３】
これらの結果は、既知のヒト抗体との比較から得られた結果を支持しており、ヒト抗体ＨＡＵ中のＬ鎖Ｖ領域はヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループ Iに属し、そしてヒト抗体ＶＤＨ２６中のＨ鎖Ｖ領域はヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループ IIIに属する。再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の設計のためにはサブグループＩ（ＨＳＧ I）に属するヒトＬ鎖Ｖ領域を使用し、そして再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の設計のためにはサブグループ III（ＨＳＧ III）に属するヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域を用いるのが最善であろう。
【００６４】
既知ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域との比較において、マウスＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域はヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループ Iの１構成員であるヒト抗体ＲＥＩのＬ鎖Ｖ領域にも類似していた。従って、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の設計においてＲＥＩのＦＲを使用した。ＲＥＩに基くこれらのヒトＦＲ中には、原著のヒトＲＥＩ（Ｐａｌｍ，Ｗら、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３５６，１６７−１９１，１９７５；Ｅｐｐ，Ｏ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４，４９４３−４９５２，１９７５）に比較して５個のアミノ酸（位置３９，７１，１０４，１０５及び１０７；表２を参照）の相違が存在する。
【００６５】
なお、表におけるアミノ酸番号はＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）の経験に基づいている。位置３９及び７１における２個のアミノ酸の変化はラットＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体のＬ鎖Ｖ領域のＦＲ中に存在するアミノ酸にもどる変化であった（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）。Ｋａｂａｔら、（１９９１）によれば、ＦＲ４中の３個のアミノ酸の変化（位置１０４，１０５及び１０７）は他のヒトκＬ鎖からのＪ領域に基いており、ヒトから逸脱するものではない。
【００６６】
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の２つのバージョンを設計した。第一のバージョンＲＶＬａにおいては、ＦＲは再構成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体中に存在するＲＥＩに基くＦＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）と同一であり、そしてＣＤＲはマウスＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域中のＣＤＲと同一にした。第二のバージョンＲＶＬｂはＲＶＬａに基き、ヒトＦＲ３中の位置７１におけるアミノ酸１個のみを異にする。Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７により定義されるごとく、残基７１はＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１の標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）構造の部分である。
【００６７】
この位置のアミノ酸はＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１ループの構造に直接影響すると予想され、それ故に抗体結合に大きく影響すると考えられている。再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域のＲＶＬｂにおいては、位置７１のフェニルアラニンがチロシンに変えられている。表２は、マウスＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域、再構成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体中での使用のために修飾されたＲＥＩのＦＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）及び再構成ヒトＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域の２種類のバージョンの、それぞれのアミノ酸配列を示す。
【００６８】
【表２】
注：ＲＥＩのＦＲは再構成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体中に見出されるものである（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）。ＲＥＩのＦＲ中の５個の下線を付したアミノ酸はヒトＲＥＩのアミノ酸配列と異なるアミノ酸である。なお、アミノ酸は一文字表記による。アミノ酸番号はＫａｂａｔらの定義によるものである。
マウスＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域中のＦＲはサブグループIII に属するヒトＨ鎖Ｖ領域に最も類似している（表１）。
【００７０】
マウスＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域は、既知のヒトＨ鎖Ｖ領域との比較において、ＦＲ１からＦＲ３までは、ヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループIII の１構成員であるヒト抗体ＶＤＨ２６のＨ鎖Ｖ領域（Ｂｕｌｕｗｅｌａ，Ｌ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．，７，２００３−２０１０，１９８８）に最も類似していた。ＦＲ４については、ＶＤＨ２６のＦＲ４の配列が明らかになっていなかったため、サブグループIII に属するヒト抗体４Ｂ４（Ｓａｎｚ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２，８８３−８８７，１９８９）のＦＲ４のアミノ酸配列を用いることとした。これらのヒトＨ鎖Ｖ領域を、再構成ヒトＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域の設計のための基礎として用いた。
【００７１】
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の８種類のバージョンを設計した。８種類のバージョンのすべてにおいて、ヒトＦＲ１，２及び３はヒト抗体ＶＤＨ２６のＦＲ１，２及び３に、ＦＲ４はヒト抗体４Ｂ４のＦＲ４に基いており、そして、マウスＣＤＲはマウスＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲと同一である。
表３および４に、マウスＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域、鋳型のヒト抗体ＶＤＨ２６のＦＲ１〜３、ヒト抗体４Ｂ４のＦＲ４および再構成ヒトＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域の８種類のバージョンの、それぞれのアミノ酸配列を示す。
【００７２】
【表３】
【表４】
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡの作製
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ領域の作製を実施例５に具体的に記載する。
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のそれぞれの第一バージョンをコードするＤＮＡを合成した。そして配列決定して、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」の全体ＤＮＡ配列が正しいアミノ酸配列をコードしていることを確認した。再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」の配列を配列番号：６２に、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」の配列を配列番号：３８に示す。
【００７５】
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ領域の他のバージョンをコードするＤＮＡは、第一バージョン「ａ」を鋳型に、公表されているＰＣＲ−変異誘発法（Ｋａｍｍａｎｎ，Ｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７，５４０４，１９８９）にわずかな変更を加えた方法を用いて作製した。再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ領域の設計に関して記載したように、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の１つの追加のバージョン（バージョン「ｂ」）をコードするＤＮＡを作製し、そして再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の７種類の追加のバージョン（バージョン「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」，「ｆ」，「ｇ」及び「ｈ」）をコードするＤＮＡを作製した。
【００７６】
これらの追加のバージョンは、第一バージョンからのアミノ酸配列の一連の微細な変化を含み、アミノ酸配列のこれらの微細な変化はＰＣＲ変異誘発を用いてＤＮＡ配列の微細な変更を行うことにより達成された。ＤＮＡ配列に必要な変化を導入するＰＣＲプライマーが設計された。一連のＰＣＲ反応に続き、ＰＣＲ生成物をクローン化し、そして配列決定してＤＮＡ配列中の変化が計画通りに起っていることを確認した。再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ｂ」の配列を配列番号：６５に、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョン「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」，「ｆ」，「ｇ」，「ｈ」のそれぞれの配列を配列番号４１，４４，４５，４８，５１，５４，５５に示す。
【００７７】
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ領域の種々のバージョンのＤＮＡ配列を配列決定により確認した後、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡを、ヒトＣ領域をコードするＤＮＡをすでに含有する哺乳類細胞発現ベクターにサブクローニングした。即ち、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ鎖Ｌ領域をコードするＤＮＡをヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列に、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒトＣγ１領域をコードするＤＮＡ配列にそれぞれ連結した。
【００７８】
次に再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」あるいは「ｂ」と、Ｈ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」〜「ｈ」のすべての組合せをヒトＩＬ−８への結合について試験し、そしてその結果、図７に記載するように、Ｌ鎖バージョン「ａ」または「ｂ」とＨ鎖バージョン「ｇ」とを含んで成る両再構成ヒト抗体（ＲＶＬａ／ＲＶＨｇ及びＲＶＬｂ／ＲＶＨｇ）がキメラＷＳ−４抗体と同じレベルでＩＬ−８に結合する能力を示した。
【００７９】
ヒトＩＬ−８に対する本発明のキメラ抗体又は再構成ヒト抗体の製造のために任意の発現系、例えば真核細胞、例えば動物細胞、例えば樹立された哺乳類細胞系、真糸状菌細胞、及び酵母細胞、並びに原核細胞、例えば細菌細胞、例えば大腸菌細胞等を使用することができる。好ましくは、本発明のキメラ抗体又は再構成抗体は哺乳類細胞、例えばＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞中で発現される。
【００８０】
これらの場合、哺乳類細胞での発現のために有用な常用のプロモーターを用いることができる。例えば、ヒト・サイトメガロウィルス前期（ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ；ＨＣＭＶ）プロモーターを使用するのが好ましい。ＨＣＭＶプロモーターを含有する発現ベクターの例には、ＨＣＭＶ−ＶＨ−ＨＣγ1 、ＨＣＭＶ−ＶＬ−ＨＣκ等があり、ｐＳＶ２ｎｅｏに由来するもの（国際公開出願ＷＯ９２−１９７５９を参照）が含まれる。
【００８１】
また、その他に本発明に用いることのできる哺乳動物細胞に於ける遺伝子発現のプロモーターとしては、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーター、あるいは、ヒト・ポリペプチド・チェーン・エロンゲーション・ファクター−１α（ＨＥＦ−１α）等の哺乳動物細胞由来のプロモーターを用いればよい。例えば、ＳＶ４０のプロモーターを使用する場合は、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．らの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２７７，１０８−１１４，１９７９）、また、ＨＥＦ−１αプロモーターを使用する場合は、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．らの方法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）に従えば実施することができる。
【００８２】
本発明のために有用なプロモーターの他の具体例はＨＥＦ−１αプロモーターである。このプロモーターを含有する発現ベクターにはＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１及びＨＥＦ−ＶＬ−ｇκ（図１）が含まれる。複製起点としては、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ＳＶ４０、牛パピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のＤＮＡ配列を用いることができ、さらに、宿主細胞系中での遺伝子コピー数増幅のため、選択マーカーとして、アミノグルコシド３′−ホスホトランスフェラーゼあるいはｎｅｏ耐性遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を用いることができる。
【００８３】
要約すれば、本発明はまず、ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｖ領域、並びに該Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及び該Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを提供する。これらは、ヒトＩＬ−８に対するヒト／マウスキメラ抗体及び再構成ヒト抗体の作製のために有用である。モノクローナル抗体としては、例えばＷＳ−４があげられる。Ｌ鎖Ｖ領域は例えば配列番号：２６に示すアミノ酸配列を有し、そしてＨ鎖Ｖ領域は例えば配列番号：２７に示すアミノ酸配列を有する。これらのアミノ酸配列は例えばそれぞれ配列番号：２６，２７に示すヌクレオチド配列によりコードされている。
【００８４】
本発明のヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体は、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域及びマウスＬ鎖Ｖ領域；並びに
（２）ヒトＨ鎖Ｃ領域及びマウスＨ鎖Ｖ領域；
から構成される。
マウスＬ鎖Ｖ領域及びマウスＨ鎖Ｖ領域並びにこれらをコードするＤＮＡは前記の通りである。前記ヒトＬ鎖Ｃ領域は任意のヒトＬ鎖Ｃ領域であることができ、そして例えばヒトＣκあるいはＣλ領域である。前記ヒトＨ鎖Ｃ領域は任意のヒトＨ鎖Ｃ領域であることができ、そして例えばヒトＣγ１，Ｃγ２，Ｃγ３あるいはＣγ４領域（Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．ら、ＤＮＡ，１，１１−１８（１９８１），Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎ．ら、Ｃｅｌｌ，２９，６７１−６７９（１９８２），Ｋｒａｗｉｎｋｅｌ，Ｕら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１，４０３−４０７（１９８２））である。
【００８５】
キメラ抗体の製造のためには２種類の発現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとでマウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターを作製する。次に、これらの発現ベクターにより哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞をイン−ビトロ又はイン−ビボで培養してキメラ抗体を製造する。
【００８６】
あるいは、マウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ並びにマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに導入し、そして該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、次にこの形質転換された宿主をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して目的とするキメラ抗体を生産させる。
【００８７】
本発明の再構成ヒトＷＳ−４抗体は、
（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び
（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ領域、を含んで成るＬ鎖；並びに
（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び
（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域、を含んで成るＨ鎖；
から構成される。
【００８８】
好ましい態様においては、前記Ｌ鎖ＣＤＲは配列番号：２６に示されるアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列の範囲が表５において定義されるアミノ酸配列を有し、前記Ｈ鎖ＣＤＲは配列番号：２７に示されるアミノ酸配列であって該アミノ酸配列の範囲が表５において定義されるアミノ酸配列を有し；前記ヒトＬ鎖ＦＲがＲＥＩに由来するものであり；前記ヒトＨ鎖ＦＲ１，２および３はＶＤＨ２６に、ＦＲ４は４Ｂ４に由来するものであり；前記ヒトＬ鎖Ｃ領域はヒトＣκ領域であり；そして前記ヒトＨ鎖Ｃ領域はヒトＣγ１領域である。また、前記ヒトＨ鎖Ｃ領域はヒトＣγ４領域であってもよく、あるいは前記ヒトＬ鎖Ｃ領域および／またはヒトＨ鎖Ｃ領域のかわりにラジオアイソトープを結合させてもよい。
特定の抗原に対して十分に活性がある再構成ヒト抗体を作製するために、前記ヒトＦＲのアミノ酸配列の一部を置換することが望ましい。
【００８９】
好ましい態様においては、Ｌ鎖Ｖ領域は表２においてＲＶＬａあるいはＲＶＬｂとして示されるアミノ酸配列を有し、Ｈ鎖Ｖ領域は表３および表４にＲＶＨａ、ＲＶＨｂ、ＲＶＨｃ、ＲＶＨｄ、ＲＶＨｅ、ＲＶＨｆ、ＲＶＨｇ又はＲＶＨｈとして示されるアミノ酸配列を有する。さらに、Ｈ鎖Ｖ領域ＦＲ２中の４１位のアミノ酸がプロリンであること、同４７位のアミノ酸がトリプトファンであること、および／または同ＦＲ３中の６７位のアミノ酸がフェニルアラニンであることがよく、ＲＶＨｂ，ＲＶＨｄ，ＲＶＨｅ，ＲＶＨｆ，ＲＶＨｇ又はＲＶＨｈとして示されるアミノ酸配列を有するものがより好ましい。このうち、ＲＶＨｇがＨ鎖Ｖ領域として最も好ましい。
【００９０】
再構成抗体の製造のためには、２種類の発現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとに前に定義した再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクター、及びエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとに前に定義した再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡを含んで成るもう一つの発現ベクターを作製する。次に、これらの発現ベクターを用いて哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そしてこの形質転換された細胞をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して再構成ヒト抗体を生産せしめる。
【００９１】
あるいは、再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡ及び再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに導入し、そしてこのベクターを用いて宿主を形質転換し、次にこの形質転換された宿主細胞をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して目的とする再構成ヒト抗体を生産せしめる。
こうして生産されたキメラ抗体又は再構成ヒト抗体は、常法に従って、例えばプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等により単離、精製することができる。
【００９２】
本発明のキメラＬ鎖又は再構成ヒトＬ鎖はＨ鎖と組合わせることにより完全な抗体を作製するために使用することができる。同様に本発明のキメラＨ鎖又は再構成ヒトＨ鎖はＬ鎖と組合わせることにより完全な抗体を作製するために用いることができる。
本発明のマウスＬ鎖Ｖ領域、再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域、マウスＨ鎖Ｖ領域、及び再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域は、本来、抗原であるヒトＩＬ−８と結合する領域であり、それ自体として、又は他の蛋白質との融合蛋白質として医薬、診断薬等として有用であると考えられる。
また、本発明のＬ鎖Ｖ領域ＣＤＲ及びＨ鎖Ｖ領域ＣＤＲも、本来、抗原であるヒトＩＬ−８と結合する部分であり、それ自体として又は他の蛋白質との融合蛋白質として医薬、診断薬等として有用であると考えられる。
【００９３】
本発明のマウスＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡはキメラＬ鎖をコードするＤＮＡ又は再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡの作製のために有用である。同様にマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡはキメラＨ鎖をコードするＤＮＡ又は再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡの作製のために有用である。また、本発明のＬ鎖Ｖ領域ＣＤＲをコードするＤＮＡは再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及び再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡの作製のために有用である。
【００９４】
同様に本発明のＨ鎖Ｖ領域ＣＤＲをコードするＤＮＡは再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及び再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡ作製のために有用である。さらには、再構成ヒト抗体のＦ（ａｂ′）2 ，ＦａｂあるいはＦｖを、又は、Ｈ鎖及びＬ鎖の両Ｆｖを連結させたシングルチェーンＦｖを適当な宿主で産生させ、前述の目的に使用することができる（例えば、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、ＴＩＢＴＥＣＨ，９，１３２−１３７，１９９１を参照）。
【００９５】
シングルチェインＦｖは、ヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を連結してなる。このシングルチェインＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域はリンカー、好ましくは、ペプチドリンカーを介して連結されている（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，５８７９−５８８３，１９８８）。
【００９６】
シングルチェインＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、再構成ヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖Ｖ領域として前記記載されたもののいずれであってもよい。具体例として、配列番号３８，４１，４４，４５，４８，５１，５４，５５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるＨ鎖Ｖ領域と、配列番号６２，６５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるＬ鎖Ｖ領域を含んでなるシングルチェインＦｖが挙げられる（ＷＯ８８−０１６４９を参照）。
これらのＶ領域は、好ましくは、ペプチドリンカーによって連結されている。ペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる（ＷＯ８８−０９３４４を参照）。
【００９７】
シングルチェインＦｖをコードするＤＮＡは、前記記載の再構成ヒト抗体のＨ鎖または、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖または、Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを鋳型とし、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を、その両端を規定するプライマー対を用いて、ＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡおよびその両端を各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
【００９８】
また、一旦シングルチェインＦｖをコードするＤＮＡが作成されれば、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に従って、シングルチェインＦｖを得ることができる。
シングルチェインＦｖは、抗体分子に比べ、組織への移行性が優れており、ラジオアイソトープ標識によるイメージングへの利用、および再構成ヒト抗体と同様の機能を有する治療剤としての利用が期待される。
【００９９】
本発明のヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体、再構成ヒト抗体およびそのＦ（ａｂ′）2 ，Ｆａｂ，ＦｖあるいはシングルチェーンＦｖの結合活性を確認する方法として、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法），ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、キメラ抗体、再構成ヒト抗体について、酵素免疫測定法を用いる場合、抗ヒトＩＬ−８ポリクローナル抗体をコートしたプレートにヒトＩＬ−８を添加し、ここにヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体、再構成ヒト抗体を産生する細胞の培養上清あるいは精製サンプルを加え、アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した適切な二次抗体を添加する。プレートのインキュベーションおよび洗浄の後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
【０１００】
本発明のヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体、再構成ヒト抗体およびそのＦ（ａｂ′）2 ，Ｆａｂ，ＦｖあるいはシングルチェインＦｖのＩＬ−８レセプターに対するＩＬ−８結合阻害活性は、通常のリガンドレセプター結合阻害アッセイにより評価される。例えば、好中球上のＩＬ−８レセプターに対するＩＬ−８の結合阻害アッセイには、ヘパリン採血などにより得られる好中球を遠心分離等の手段で分離した後、上記アッセイに好適な数の細胞懸濁液となるよう調製して用いることができる。
【０１０１】
125Ｉなどで適当に標識したＩＬ−８と非標識のＩＬ−８を含む溶液と適当な濃度に調製した本発明の抗体またはその断片を含む溶液を混合し、次いでこれを上記好中球懸濁液に添加する。一定時間の後、好中球を分離し、好中球上の標識された活性を測定すればよい。
本発明の抗体またはその断片による好中球遊走作用（ケモタキシス；ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ）の阻害能を評価するには通常知られた方法、例えばＧｒｏｂ，Ｐ．Ｍ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，８３１１−８３１６，１９９０に記載された方法を用いることができる。
【０１０２】
市販のケモタキシスチャンバーを用いる場合、本発明の抗体またはその断片を適当な培養液で希釈した後、ＩＬ−８を加え、これをチャンバーに分注する。ついで、調製した好中球懸濁液をチャンバーに添加し、一定時間放置する。遊走する好中球は、チャンバーに装着されたフィルターに付着するので、その好中球の数を染色液あるいは蛍光抗体等の通常の方法で測定すればよい。また、顕微鏡下での肉眼による判定や機械を用いる自動測定も可能である。
【０１０３】
本発明のヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体、再構成ヒト抗体およびそのＦ（ａｂ′）2 ，Ｆａｂ，ＦｖあるいはシングルチェーンＦｖは、メンブレンフィルターによる濾過滅菌の後、好ましくは非経口的に、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等によりあるいは経気道的に、例えばネブライザー（ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）により医薬療法剤として投与することができる。ヒトに対する投与量は、患者の状態、年齢等により異なるがおよそ１〜１０００mg／bodyであり、１−１０mg／kg／週の分割用量を選択することができる。
【０１０４】
本発明のヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体、再構成ヒト抗体およびそのＦ（ａｂ′）2 ，Ｆａｂ，ＦｖあるいはシングルチェーンＦｖは、精製され結合活性を評価された後に、生理活性タンパク質の製剤化に通常用いられる方法により、医薬療法剤として製剤化される。たとえば、注射用製剤は精製されたヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体、再構成ヒト抗体およびそのＦ（ａｂ′）2 ，Ｆａｂ，ＦｖあるいはシングルチェーンＦｖを、溶剤、例えば、生理食塩水、緩衝液などに溶解し、それに吸着防止剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などを加えたものであり、または使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては、糖アルコール又は糖、例えばマンニトール、ブドウ糖などをもちいることができる。
【０１０５】
【実施例】
次に、本発明を下記の実施例により具体的に説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
実施例１． ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡのクローニング
ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体の可変領域をコードするＤＮＡを次の様にしてクローニングした。
【０１０６】
１．全ＲＮＡの調製
ハイブリドーマＷＳ−４からの全ＲＮＡを、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４−５２９９，１９７９により記載されている塩化セシウム密度勾配遠心法を修飾して調製した。
すなわち、１×１０7 個のハイブリドーマＷＳ−４の細胞を２５mlの４Ｍグアニジンチオシアネート（Ｆｕｌｋａ社製）中で完全にホモジナイズさせた。ホモジネートを遠心管中の５．７Ｍ塩化セシウム溶液層上に重層し、次にこれをＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ４０ローター中で３１，０００rpm にて２０℃で１４時間遠心分離することによりＲＮＡを沈澱させた。
【０１０７】
ＲＮＡ沈澱物を８０％エタノールにより洗浄し、そして１０mM ＥＤＴＡ及び０．５％ Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウムを含有する２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）２００μｌ中に溶解し、そしてそれにＰｒｏｔｅｎａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社製）を０．５mg／mlとなるように添加した後、３７℃にて３０分間温浴中でインキュベートした。混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、そしてＲＮＡをエタノールで沈澱させた。次に、ＲＮＡ沈澱物を１mM ＥＤＴＡを含有する１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）２００μｌに溶解した。
【０１０８】
２．メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の抽出
マウスモノクローナル抗体ＷＳ−４Ｈ鎖をコードするｍＲＮＡを抽出するため、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、その指示書に記載の方法に従い、上記１．で得られた全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）ポジティブなｍＲＮＡを抽出した。
【０１０９】
３．一本鎖ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡ Ｃｙｃｌｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、その指示書に記載の方法に従い、上記２．で得られた約４０ｎｇのｍＲＮＡより一本鎖ｃＤＮＡを合成し、マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの増幅に用いた。尚、マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを増幅するために、約１０μｇの上記全ＲＮＡより一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０１１０】
４．抗体可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲ法による増幅
（１）マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの増幅
ＰＣＲのためのプライマーは、配列番号：１３〜２４に示すＭＨＶ（ＭｏｕｓｅＨｅａｖｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ）プライマー１〜１２、及び配列番号：２５に示すＭＨＣ（Ｍｏｕｓｅ Ｈｅａｖｙ Ｃｏｎｓｔａｎｔ）プライマー（Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｔ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，１９９１を使用した。
【０１１１】
ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３），５０mM ＫＣｌ，０．１mM ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１．５mM ＭｇＣｌ2 ，０．００１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン，５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社）、０．２５μＭの配列番号：１３〜２４に示すＭＨＶプライマーのうち一つと１．７５μＭの配列番号：２５に示すＭＨＣプライマー及び上記３．で得られた一本鎖ｃＤＮＡ溶液１．５μｌを含有し、ＭＨＶ１〜１２プライマーの各々について別々に用意した。これを５０μｌの鉱油で覆った後、９４℃の初期温度にて３分間そして次に９４℃にて１分間、５５℃にて１分間及び７２℃にて１分間、この順序で加熱した。この温度サイクルを３０回反復した後、反応混合物をさらに７２℃にて１０分間インキュベートした。
【０１１２】
（２）マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの増幅
ＰＣＲのためのプライマーとして配列番号：１〜１１に示すＭＫＶ（Ｍｏｕｓｅ Ｋａｐｐａ Ｖａｒｉａｂｌｅ）プライマー１〜１１、及び配列番号：１２に示すＭＫＣ（Ｍｏｕｓｅ Ｋａｐｐａ Ｃｏｎｓｔａｎｔ）プライマー（Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｔ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，１９９１）を使用した。
【０１１３】
ｃＤＮＡの増幅は、それぞれ０．２５μＭのＭＫＶプライマー混合物と３．０μＭのＭＫＣプライマーを用いて増幅した点を除いて、前記４．（１）においてＨ鎖Ｖ領域遺伝子の増幅について記載したのと同じ方法により上記３．で得られた一本鎖ｃＤＮＡ溶液２．０μｌから増幅を行なった。
【０１１４】
５．ＰＣＲ生成物の精製および断片化
前記のようにしてＰＣＲ法により増幅したＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域それぞれのＤＮＡ断片を１．５％低融点アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）を用いるアガロースゲル電気泳動により分離した。約４５０bp長のＨ鎖ＤＮＡ断片と約４００bp長のＬ鎖ＤＮＡ断片を含有するアガロース片をそれぞれ切り取り、そして６５℃にて５分間溶融せしめ、そしてこれと同容積の２mM ＥＤＴＡ及び３００mM ＮａＣｌを含有する２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）を加えた。
【０１１５】
この混合物をフェノール及びクロロホルムにより抽出し、そしてＤＮＡ断片をエタノール沈澱により回収し、そして１mM ＥＤＴＡを含有する１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）に溶解した。次に、１０mM ＭｇＣｌ2 及び１mMジチオスレイトールを含有する１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．９）中で５ユニットの制限酵素Ｘｍａ I（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製）を用いて３７℃にて３時間消化した。次に、４０ユニットの制限酵素Ｓａｌ I（宝酒造社製）により３７℃にて２時間消化し、そして生ずるＤＮＡ断片を、１．５％低融点アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）を用いるアガロースゲル電気泳動により分離した。
【０１１６】
ＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り取りそして６５℃にて５分間溶融せしめ、そしてこれと同容積の２mM ＥＤＴＡ及び３００mM ＮａＣｌを含有する２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）を加えた。この混合物をフェノール及びクロロホルムにより抽出し、そしてＤＮＡ断片をエタノール沈澱により回収し、そして１mM ＥＤＴＡを含有する１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）に溶解した。
こうして、マウスκ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断片、及びマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断片を各々得た。上記ＤＮＡ断片はいずれもその５′末端にＳａｌＩ接着末端を有し、そしてその３′末端にＸｍａＩ接着末端を有する。
【０１１７】
６．連結及び形質転換
上記のようにして調製したマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含んで成るＳａｌＩ−ＸｍａＩ ＤＮＡ断片約０．３μｇを、ＳａｌＩ、ＸｍａＩ及び大腸菌由来のアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ；宝酒造社製）で消化することにより調製したｐＵＣ１９ベクター（宝酒造社製）約０．１μｇと、１ユニットＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）及び添付のバッファーを含有する反応混液中で、１６℃にて４時間反応させ連結した。
【０１１８】
次に、５μｌの上記連結混合物を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）５０μｌに加え、そしてこの細胞を氷上で３０分間、４２℃にて１分間そして再び氷上で１分間静置した。次いで４００μｌの２×ＹＴ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））を加え、３７℃にて１時間インキュベートした後、５０μｇ／mlのアンピシリン（明治製菓社製）を含有する２×ＹＴ寒天培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
【０１１９】
尚、この際選択マーカーとしてＸ−Ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ，宝酒造社製）５０μｇを塗布した。
この形質転換体を、５０μｇ／mlのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地１０ml中で３７℃にて一夜培養し、そしてこの培養物から、ＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、その指示書に記載の方法に従ってプラスミドＤＮＡを調製した。
【０１２０】
こうして得られた、ハイブリドーマＷＳ−４に由来するマウスκ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをｐＵＣ−ＷＳ４−ＶＬと命名した。大腸菌コンピテント細胞をＪＭ１０９を用いた点を除いて、上記の同じ方法に従って、ハイブリドーマＷＳー４に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをＳａｌ I−Ｘｍａ I ＤＮＡ断片から作成し、そしてｐＵＣ−ＷＳ４−ＶＨと命名した。
【０１２１】
実施例２． ＤＮＡの塩基配列の決定
前記のプラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列を、シークエンスプライマーとしてＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶおよびＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（両者とも宝酒造社製）、自動ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ製）およびＴａｑ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ製）を用いて、メーカー指定のプロトコールに従って塩基配列を決定した。プラスミドｐＵＣ−ＷＳ４−ＶＬに含まれるマウスＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：２６に示す。また、プラスミドｐＵＣ−ＷＳ４−ＶＨに含まれるマウスＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号：２７に示す。
【０１２２】
実施例３． ＣＤＲの決定
Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域の基本的構造は、互いに類似性を有しており、それぞれ４つのフレームワーク領域が３つの超可変領域、即ち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較的良く保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）。
【０１２３】
この様な事実に基づき、ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベースにあてはめて、相同性を調べることによりＣＤＲ領域を表５に示す如く決定した。
【０１２４】
【表５】
実施例４． クローン化ｃＤＮＡの発現の確認（キメラＷＳ−４抗体の作製）
発現ベクターの作製
キメラＷＳ−４抗体を発現するベクターを作製するため、それぞれマウスＷＳ−４Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡクローンｐＵＣ−ＷＳ４−ＶＬ及びｐＵＣ−ＷＳ４−ＶＨをＰＣＲ法により修飾した。そしてＨＥＦ発現ベクター（前記、ＷＯ９２−１９７５９及び図１を参照のこと）に導入した。
【０１２６】
Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマー（配列番号：２８）及びＨ鎖Ｖ領域のための後方プライマー（配列番号：２９）は、各々のＶ領域のリーダー配列の最初をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７−９５０，１９８７）及びＨｉｎｄIII 制限部位を有するように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマー（配列番号：３０）及びＨ鎖Ｖ領域のための前方プライマー（配列番号：３１）は、Ｊ領域の末端をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズし、且つ、スプライスドナー配列及びＢａｍＨＩ制限部位を付加するように設計した。
【０１２７】
２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．２）、１０mM ＫＣｌ、６mM（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ １００μＭ ｄＮＴＰｓ、１．５mM ＭｇＣｌ2 、１００pmole ずつの各プライマー、１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ（ｐＵＣ−ＶＬ又はｐＵＣ−ＶＨ）、及び２．５ＵのＡｍｐｌｉ Ｔａｑ酵素を含有する１００μｌのＰＣＲ反応混合物を５０μｌの鉱油で覆い、９４℃にて３分間最初の変性の後、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間のサイクルを３０回行い、最後に７２℃にて１０分間インキュベートした。
【０１２８】
ＰＣＲ生成物を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで消化し、そしてＬ鎖Ｖ領域については、ＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶＬ−ｇκに、Ｈ鎖Ｖ領域についてはＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１にそれぞれクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドをそれぞれＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｌ−ｇκ，ＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｈ−ｇγ１と命名した。
【０１２９】
ＣＯＳ細胞へのトランスフェクション
キメラＷＳ−４抗体の一過性発現を観察するため、前記発現ベクターをＣＯＳ細胞において試験した。ＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｌ−ｇκならびにＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｈ−ｇγ１をＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ細胞に同時形質転換した。各ＤＮＡ（１０μｇ）を、ＰＢＳ中１×１０7 細胞／mlの０．８mlのアリコートに加え、１．５ｋＶ、２５μＦの容量にてパルスを与えた。
【０１３０】
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、５％のγ−グロブリンフリーウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培養液（ＧＩＢＣＯ社製）１５ｍｌに懸濁し、組織培養シャーレに添加した。９６時間のインキュベーションの後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、直径０．４５μｍのディスクフィルター（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて濾過した。
【０１３１】
ＥＬＩＳＡ
抗原結合測定および抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調整した。抗原結合活性測定のためのＥＬＩＳＡプレートは次の様にして調製した。９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルを、濃度２μｇ／ｍｌで固層化バッファー（０．１Ｍ 炭酸水素ナトリウム、０．０２％ アジ化ナトリウム）に溶解したヤギ抗ヒトＩＬ−８ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）１００μｌで固層化し、希釈バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２，１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），１ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０，０．０２％ アジ化ナトリウム）２００μｌでブロッキングの後、濃度５ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−８（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）１００μｌを添加した。
【０１３２】
キメラ抗体の精製サンプル、あるいはこれらを発現させたＣＯＳ細胞の培養上清を順次希釈して、各ウェルに加え、次に濃度１μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社製）１００μｌを加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質溶液（１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニル燐酸）を加え、次に４０５nmでの吸光度を測定した。
【０１３３】
抗体濃度測定には、９６穴プレートを濃度１μｇ／ｍｌヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社製）１００μｌで固層化し、ブロッキングの後、キメラ抗体の精製サンプル、あるいはこれらを発現させたＣＯＳ細胞の培養上清を順次希釈して、各ウェルに加え、次に濃度１μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社製）１００μｌを加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質溶液（１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニル燐酸、Ｓｉｇｍａ社製）を加え、次に４０５nmでの吸光度を測定した。
その結果、キメラ抗体ＷＳ−４がＩＬ−８に特異的に結合したことにより、このキメラ抗体がマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＶ領域の正しい構造を有することが示唆された（図２を参照のこと）。
【０１３４】
なお、前記プラスミドＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｌ−ｇκを有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｌ−ｇκ）、および前記プラスミドＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｈ−ｇγ1 を有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｈ−ｇγ1 ）として工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成６年７月１２日に各々ＦＥＲＭ ＢＰ−４７３９、およびＦＥＲＭ ＢＰ−４７４０としてブタペスト条約に基づき国際寄託された。
【０１３５】
実施例５． 再構成ヒトＷＳ−４抗体の作製
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の作製
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを次の様にして設計した。ヒト抗体ＶＤＨ２６のＦＲ１〜３およびヒト抗体４Ｂ４のＦＲ４をコードするそれぞれ既知のＤＮＡ配列をマウスＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲをコードするＤＮＡ配列が連結されるように再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードする全長ＤＮＡを設計した。
【０１３６】
次に、このＤＮＡ配列のそれぞれ５′側及び３′側にＨｉｎｄIII 認識部位／ＫＯＺＡＫコンセンサス配列及びＢａｍＨＩ認識部位／スプライスドナー配列をそれぞれ付加して、ＨＥＦ発現ベクターに挿入できるようにした。こうして設計したＤＮＡ配列をほぼ均等な４本のオリゴヌクレオチドに分け、そして次に、これらのオリゴヌクレオチドのアセンブリーを妨害する可能性のあるオリゴヌクレオチド中の二次構造についてコンピューター解析した。
【０１３７】
４本のオリゴヌクレオチド配列を配列番号：３２〜３５に示す。これらのオリゴヌクレオチドは１１３〜１４３塩基の長さを有し、隣接する２本のオリゴヌクレオチドは互いに２０塩基のオーバラップ領域を有する。４本のオリゴヌクレオチドの内ＨＦ１（配列番号：３２）、ＨＦ３（配列番号：３４）はセンスＤＮＡ配列を有し、そして他のＨＦ２（配列番号：３３）、ＨＦ４（配列番号：３５）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。これらのオリゴヌクレオチドを自動ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によって合成した。
【０１３８】
また、これら４本のオリゴヌクレオチドのＰＣＲ法によるアッセンブリーの方法を図３に記す。約１００ngずつのＨＦ１とＨＦ２、ＨＦ３とＨＦ４を組み合わせて、２．５ｕのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを含有する最終容量９８μｌのＰＣＲ反応液に添加した。９４℃にて３分間の最初の変性の後、９４℃にて２分間、５５℃にて２分間及び７２℃にて２分間を１サイクルとし、これを２サイクル行った。
【０１３９】
ＰＣＲ反応液の半量を相互に交換したのち、さらに２サイクルのインキュベーションを行った。１００ｐmoleずつのＲＶＨ５′プライマー（配列番号：３６）及びＲＶＨ３′プライマー（配列番号：３７）を外部プライマーとして添加した後、ＰＣＲ反応液を５０μｌの鉱油で覆い、そして９４℃にて３分間の最初の変性の後、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間及び７２℃にて１分間の４５サイクルを行い、そして次に７２℃にて１０分間インキュベートした。
【０１４０】
約４５０塩基対のＤＮＡ断片を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨ Iにより消化し、そして次にＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１にクローニングした。ＥＦ−１プライマー（配列番号：６６）およびＨＩＰプライマー（配列番号：６７）を用いてＤＮＡ配列決定の後、正しいＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＨａ−ｇγ１と命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：３８に示す。
【０１４１】
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の各バージョン「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」，「ｆ」，「ｇ」，「ｈ」を以下のようにして作製した。
バージョン「ｂ」（ＲＶＨｂ）は、４７位のロイシンがトリプトファンに変異するように設計した変異原プライマーＬＴＷ１（配列番号：３９）およびＬＴＷ−２（配列番号：４０）を用い、両端を規定するプライマーとしてはＲＶＨ５′（配列番号：３６）およびＲＶＨ３′（配列番号：３７）を用いて、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｂ−ｇγ１を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｂ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：４１に示す。
【０１４２】
バージョン「ｃ」は、４１位のグルタミンがプロリンに変異するように設計した変異原プライマーＱＴＰ１（配列番号：４２）およびＱＴＰ２（配列番号：４３）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｃ−ｇγ１を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｃ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：４４に示す。
【０１４３】
バージョン「ｄ」は、変異原プライマーとしてＱＴＰ１およびＱＴＰ２を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｂ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとしてプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｄ−ｇγ１を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｄ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：４５に示す。
バージョン「ｅ」は、４０位のアラニンがプロリンに変異するように設計した変異原プライマーＡＴＰ１（配列番号：４６）およびＡＴＰ２（配列番号：４７）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｄ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｅ−ｇγ１を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｅ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域に含まれるアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：４８に示す。
【０１４４】
バージョン「ｆ」は、４４位のグリシンがアラニンに変異するように設計した変異原プライマーＧＴＡ１（配列番号：４９）およびＧＴＡ２（配列番号：５０）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｄ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｆ−ｇγ１を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｆ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：５１に示す。
【０１４５】
バージョン「ｇ」は、６７位のロイシンがフェニルアラニンに変異するように設計した変異原プライマーＬＴＦ１（配列番号：５２）およびＬＴＦ２（配列番号：５３）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｄ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｇ−ｇγ１を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｇ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：５４に示す。
【０１４６】
バージョン「ｈ」は、変異原プライマーとしてＬＴＦ１およびＬＴＦ２を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｂ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ｇγ１を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：５５に示す。
【０１４７】
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製
再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを次の様にして設計した。ヒト抗体ＲＥＩのＦＲをコードするＤＮＡ配列とマウスＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域のＣＤＲをコードするＤＮＡ配列が連結されるように再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする全長ＤＮＡを設計した。
【０１４８】
次に、このＤＮＡ配列のそれぞれ５′側及び３′側にＨｉｎｄIII 認識部位／ＫＯＺＡＫコンセンサス配列及びＢａｍＨＩ認識部位／スプライスドナー配列をそれぞれ付加して、ＨＥＦ発現ベクターに挿入できるようにした。こうして設計したＤＮＡ配列をほぼ均等な長さの４本のオリゴヌクレオチドに分け、そして次に、これらのオリゴヌクレオチドのアセンブリーを妨害する可能性のあるオリゴヌクレオチド中の二次構造についてコンピューター解析した。
【０１４９】
４本のオリゴヌクレオチド配列を配列番号：５６〜５９に示す。これらのオリゴヌクレオチドは１０６〜１２４塩基の長さを有し、隣接する２本のオリゴヌクレオチドは互いに１９〜２３塩基のオーバラップ領域を有する。４本のオリゴヌクレオチドの内ＬＦ１（配列番号：５６）、ＬＦ３（配列番号：５８）はセンスＤＮＡ配列を有し、そして他のＬＦ２（配列番号：５７）、ＬＦ４（配列番号：５９）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。これらオリゴヌクレオチドを前記のＨＦ１〜４と同様の方法で合成した。
【０１５０】
アッセンブリーは、１００ngずつの４種のオリゴヌクレオチド及び５ｕのＡｍｐｌｉ Ｔａｑを含有する９８μｌのＰＣＲ混合物を、９４℃にて３分間の最初の変性の後、９４℃にて２分間、５５℃にて２分間及び７２℃にて３分間を１サイクルとし、これを２サイクル行った。１００ｐmoleずつのＲＶＬ５′プライマー（配列番号：６０）及びＲＶＬ３′プライマー（配列番号：６１）を外部プライマーとして添加した後、ＰＣＲ反応液を５０μｌの鉱油で覆い、そして９４℃にて３分間の最初の変性の後、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間及び７２℃にて１分間を１サイクルとしてこれを３０サイクルを行い、そして次に７２℃にて１０分間インキュベートした（図３参照）。
【０１５１】
約４００塩基対のＤＮＡ断片を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより消化し、そして次にＨＥＦ発現ベクターＨＥＦ−ＶＬ−ｇκにクローニングした。ＥＦ−１プライマー（配列番号：６６）およびＫＩＰプライマー（配列番号：６８）を用いてＤＮＡ配列決定の後、正しいＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＬａ−ｇκと命名した。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬａ−ｇκに含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：６２に示す。
【０１５２】
バージョン「ｂ」（ＲＶＬｂ）は、７１位のフェニルアラニンがチロシンに変異するように設計した変異原プライマーＦＴＹ１（配列番号：６３）およびＦＴＹ２（配列番号：６４）を用い、両端を規定するプライマーとしてはＲＶＬ５′（配列番号：６０）およびＲＶＬ３′（配列番号：６１）を用いて、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬａ−ｇκを鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬｂ−ｇκを得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬｂ−ｇκに含まれるＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：６５に示す。
【０１５３】
再構成ヒトＷＳ−４抗体の各鎖の抗原結合活性を評価するため、まず、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖の「ａ」バージョンための発現ベクターＨＥＦ−ＲＶＬａ−ｇκとキメラＷＳ−４抗体Ｈ鎖のための発現ベクターＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｈ−ｇγ１とによりＣＯＳ細胞を前記のようにして同時トランスフェクションし、前記のようにして培養上清を回収した後、前記実施例４ＥＬＩＳＡに記載のとおりの方法を用いて、産生された抗体について産生抗体量および抗原結合活性を測定した。この結果を図４に示す。図４に示すように陽性対照としてのキメラ抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）および再構成Ｌ鎖とキメラＨ鎖とからなる抗体（ＲＶＬａ／ｃｈＨ）との間には抗原結合性に差がないことが確認された。
【０１５４】
同時に、キメラＷＳ−４抗体Ｌ鎖のための発現ベクターＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｌ−ｇκと再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖の「ａ」バージョンとの組み合せを評価するため、両者をＣＯＳ細胞に同時トランスフェクションし、前記実施例４ＥＬＩＳＡに記載のとおりの方法を用いて、得られた抗体について産生抗体量および抗原結合活性を測定した。その結果、この抗体（ｃｈＬ／ＲＶＨａ）には抗原結合活性が見られなかった（図４を参照のこと）。
【０１５５】
前記のごとく、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖の「ａ」バージョン（ＲＶＬａ）はキメラＷＳ−４抗体Ｌ鎖と同等の結合活性を示したので、これ以後の再構成Ｈ鎖各バージョンの評価には、再構成Ｈ鎖各バージョンと再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖の「ａ」バージョン（ＲＶＬａ）をＣＯＳ細胞に同時トランスフェクションすることにより行なった。
【０１５６】
その結果、「ｂ」，「ｄ」，「ｅ」，「ｆ」，「ｇ」，「ｈ」の各再構成Ｈ鎖バージョンを有する抗体は、陽性対照であるキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）に匹敵する程度の抗原結合性を示し、この組み合せがヒト抗体における機能的抗原結合部位を形成することが示唆された。しかし、産生量については、「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）以外はいずれもキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）より低かった。なお、Ｈ鎖バージョン「ｃ」を有する抗体には抗原結合活性が見られなかった（図５を参照のこと）。
【０１５７】
このことから、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖の「ａ」バージョン（ＲＶＬａ）ならびに再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖の「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）を有する抗体は、良好な抗原結合性を示す機能的抗原結合部位を再形成し、ＣＯＳ細胞に同時トランスフェクションすることによりキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）に匹敵する程度の産生量を示すことが示唆された。
【０１５８】
次に、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖の「ｂ」バージョン（ＲＶＬｂ）を用いて、Ｈ鎖各バージョンとＣＯＳ細胞に同時トランスフェクションし、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖の「ｂ」バージョン（ＲＶＬｂ）の評価をおこなった。その結果、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖「ｇ」バージョンを有する抗体（ＲＶＬｂ／ＲＶＨｇ）だけが、陽性対照であるキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）に匹敵する程度の抗原結合性を示し、この組み合せがヒト抗体における機能的抗原結合部位を形成することが示唆された。また、産生量についても、「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）以外はいずれもキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）より低かった（図６を参照のこと）。
【０１５９】
前記の評価において、キメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）に匹敵する産生量とＩＬ−８に対する結合活性を示した２種の再構成ヒト抗体（ＲＶＬａ／ＲＶＨｇとＲＶＬｂ／ＲＶＨｇ）をそれぞれプロティンＡカラムで精製して、実施例４ＥＬＩＳＡに記載の方法で結合活性をより正確に評価した。その結果、キメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）、ＲＶＬａ／ＲＶＨｇ抗体並びにＲＶＬｂ／ＲＶＨｇ抗体のいずれも同程度の結合活性を示した（図７参照のこと）。
【０１６０】
このことから、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖の「ａ」バージョン（ＲＶＬａ）あるいは「ｂ」バージョン（ＲＶＬｂ）と、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖の「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）を有する抗体は、良好な抗原結合性を示す機能的抗原結合部位を再形成し、ＣＯＳ細胞に同時トランスフェクションすることによりキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）に匹敵する程度の産生量を示すことが示唆された。
【０１６１】
再構成ヒトＷＳ−４抗体のＬ鎖「ａ」バージョン（ＲＶＬａ）と同Ｈ鎖「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）、または同Ｌ鎖「ｂ」バージョン（ＲＶＬｂ）と同Ｈ鎖「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）からなる再構成ヒト抗体のＩＬ−８レセプターに対するＩＬ−８結合阻害活性を、リガンドレセプター結合阻害アッセイにより評価した。
【０１６２】
健常人よりヘパリン採血した約１００mlの血液を、１５mlのＭｏｎｏ−Ｐｏｌｙ分離溶液（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）に３５mlずつ重層し、添付の指示書に従い遠心分離をおこなってヒト好中球層を単離した。この細胞を１％ＢＳＡ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地にて洗浄した後、混入した赤血球を１５０mMの塩化アンモニウム溶液にて除去した。これを遠心分離した後、細胞を１％ＢＳＡ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地にて洗浄し、２ｘ１０7 Cells／mlの細胞濃度になるように再懸濁した。この細胞懸濁液の好中球の含有率は、サイトスピン（Ｓｈａｎｄｏｎ社）による塗抹標本をＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（ミドリ十字社製）染色して測定した結果９５％以上であった。
【０１６３】
上記好中球懸濁液を遠心分離し、結合バッファー（１％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むＤ−ＰＢＳ）にて細胞濃度２ｘ１０7 Cells／mlになるように再懸濁した。この時、好中球上のＦｃレセプターをあらかじめ飽和する目的で、本発明のヒト抗体と同一のＦｃ部分を有するＳＫ２キメラ抗体（国際特許出願出願番号ＰＣＴ／ＪＰ９４／００８５９参照）とその抗原であるヒトＩＬ−６をそれぞれ濃度約５０μｇ／mlおよび約４０ng／mlになるように添加し、氷温中で３０分間インキュベートした。
【０１６４】
125Ｉで放射標識したＩＬ−８（７４ＴＢｑ／ｍｍｏｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）と未標識ＩＬ−８（Ａｍｅｒｓｂａｍ社製）を各濃度が４ng／mlになるように結合バッファーにて混合し調製した。キメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）、再構成ヒト抗体（ＲＶＬａ／ＲＶＨｇおよびＲＶＬｂ／ＲＶＨｇ）、陰性対照のヒト抗体（ＰＡＥＳＥＬ＋ＬＯＲＥＩ社製）あるいは陽性対照のマウスＷＳ−４抗体のそれぞれを結合バッファーにて濃度２０００ng／mlから約８ng／mlまで２倍段階希釈した。ＩＬ−８溶液ならびに各抗体溶液をそれぞれ５０μｌずつ混合し氷温中で３０分間インキュベートした。その後、上記好中球懸濁液１００μｌを添加し、更に１５分毎に撹拌しながら氷温中で１時間インキュベートした。インキュベート後、この細胞懸濁液を２００μｌの２０％サッカロース溶液に重層し、遠心、凍結させた。細胞に結合したＩＬ−８を測定するため、細胞沈渣を切断し、γ−カウンター（アロカ社製）で放射活性を測定した。その結果を図８に示す。
【０１６５】
再構成ヒトＷＳ−４抗体のＬ鎖「ａ」バージョン（ＲＶＬａ）と同Ｈ鎖「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）、または同Ｌ鎖「ｂ」バージョン（ＲＶＬｂ）と同Ｈ鎖「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）を有する抗体は、ＩＬ−８レセプターに対するＩＬ−８の結合に対して、キメラ抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）と同程度の結合阻害活性を有することが明らかになった。
【０１６６】
なお、前記プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬａ−ｇκを有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ＨＥＦ−ＲＶＬａ−ｇκ）、およびプラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｇ−ｇγ１を含有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ＨＥＦ−ＲＶＨｇ−ｇγ１）として工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成６年７月１２日に、各々ＦＥＲＭ ＢＰ−４７３８および、ＦＥＲＭ ＢＰ−４７４１としてブタペスト条約に基づき国際寄託された。
【０１６７】
参考例１． ハイブリドーマＷＳ−４の作製
抗ヒトＩＬ−８モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ヒトＩＬ−８で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３をポリエチレングリコールを用いた常法により融合して作製した。ヒトＩＬ−８と結合する活性を指標としたスクリーニングを行い、ハイブリドーマＷＳ−４を樹立した（Ｋｏ，Ｙ−Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４９，２２７−２３５，１９９２）。
【０１６８】
【発明の効果】
本発明はヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体を提供し、この抗体においてはヒト抗体のＶ領域のＣＤＲがヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＣＤＲにより置き換えられている。この再構成ヒト抗体の大部分がヒト抗体に由来し、そしてＣＤＲは元来、抗原性が低いことから、本発明の再構成ヒト抗体はヒトに対する抗原性が低く、そしてそれ故に医学療法用として期待される。
【０１６９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、それぞれ本発明の抗体のＬ鎖およびＨ鎖の発現のために有用な、ヒト・エロンゲーション・ファクター−１α（ＨＥＦ−１α）プロモーター／エンハンサー系を含んで成る発現ベクターＨＥＦ−ＶＬ−ｇκおよびＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１を示す。
【図２】図２は、ＣＯＳ細胞の培養上清中に産生された本発明のキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）のヒトＩＬ−８に対する結合能の確認のためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の再構成ヒトＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域の第一バージョン「ａ」（ＲＶＨａ）、および再構成ヒトＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域の第一バージョン「ａ」（ＲＶＬａ）の各アミノ酸配列をコードするＤＮＡを構築するためのダイヤグラムである。
【図４】図４は、本発明の再構成ヒトＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域（ＲＶＬａ）ならびにＨ鎖Ｖ領域（ＲＶＨａ）を、それぞれキメラＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域（ｃｈＨ）ならびにキメラＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域（ｃｈＬ）とＣＯＳ細胞に発現させ、ヒトＩＬ−８に対する結合能と産生量を、ＣＯＳ細胞の培養上清中に産生された本発明のキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）と比較するためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図５】図５は、ＣＯＳ細胞の培養上清中に産生された本発明のＲＶＬａを含んでなる８種の再構成ヒトＷＳ−４抗体（ＲＶＬａ／ＲＶＨａ，ＲＶＬａ／ＲＶＨｂ，ＲＶＬａ／ＲＶＨｃ，ＲＶＬａ／ＲＶＨｄ，ＲＶＬａ／ＲＶＨｅ，ＲＶＬａ／ＲＶＨｆ，ＲＶＬａ／ＲＶＨｇ，ＲＶＬａ／ＲＶＨｈ）のヒトＩＬ−８に対する結合能と産生量を、ＣＯＳ細胞の培養上清中に産生された本発明のキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）と比較するためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図６】図６は、ＣＯＳ細胞の培養上清中に産生された本発明のＲＶＬｂを含んでなる８種の再構成ヒトＷＳ−４抗体（ＲＶＬｂ／ＲＶＨａ，ＲＶＬｂ／ＲＶＨｂ，ＲＶＬｂ／ＲＶＨｃ，ＲＶＬｂ／ＲＶＨｄ，ＲＶＬｂ／ＲＶＨｅ，ＲＶＬｂ／ＲＶＨｆ，ＲＶＬｂ／ＲＶＨｇ，ＲＶＬｂ／ＲＶＨｈ）のヒトＩＬ−８に対する結合能と産生量を、ＣＯＳ細胞の培養上清中に産生された本発明のキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）と比較するためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図７】図７は、精製した本発明の再構成ヒトＷＳ−４抗体ＲＶＬａ／ＲＶＨｇ並びにＲＶＬｂ／ＲＶＨｇのヒトＩＬ−８に対する結合能を、精製した本発明のキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）と比較するためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図８】図８は、精製した本発明の再構成ヒト型化抗体ＲＶＬａ／ＲＶＨｇならびにＲＶＬｂ／ＲＶＨｇのＩＬ−８レセプターに対するＩＬ−８の結合阻害活性をマウスＷＳ−４抗体ならびに本発明のキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）と比較するための、リガンドレセプター結合阻害アッセイの結果を示すグラフである。
Claims (22)
- L鎖V領域ペプチドが配列番号：62のアミノ酸番号１〜107のアミノ酸配列の又は配列番号：65のアミノ酸番号１〜107のアミノ酸配列で示され、そしてH鎖V領域ペプチドが配列番号：54のアミノ酸番号１〜122のアミノ酸配列で示される抗IL-8再構成ヒト抗体。
- ヒトL鎖C領域がヒトCκ領域であり、そしてヒトH鎖C領域がヒトCγ1領域である、請求項１に記載の抗IL-8再構成ヒト抗体。
- ヒトL鎖C領域がヒトCκ領域であり、そしてヒトH鎖C領域がヒトCγ4領域である、請求項１に記載の抗IL-8再構成ヒト抗体。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載のL鎖V領域ペプチドとH鎖V領域ペプチドとを12〜19個のアミノ酸からなるリンカーを介して接続したシングルチェインFv。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の再構成ヒト抗体から作製されるF(ab')2フラグメント又はFabフラグメント。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載のIL-8再構成ヒト抗体のL鎖ペプチドをコードするDNA。
- L鎖V領域ペプチドが配列番号：62のアミノ酸番号１〜 107 で示されるアミノ酸配列又は配列番号：65のアミノ酸番号１〜 107 で示されるアミノ酸配列からなる、請求項６に記載のDNA。
- ヒトL鎖C領域がヒトL鎖Cκ領域である請求項６又は７に記載のDNA。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載のIL-8再構成ヒト抗体のH鎖ペプチドをコードするDNA。
- H鎖V領域ペプチドが配列番号：54のアミノ酸番号１〜 122で示されるアミノ酸配列からなる、請求項９に記載のDNA。
- ヒトH鎖C領域がヒトH鎖Cγ1領域である、請求項９又は10に記載のDNA。
- ヒトH鎖C領域がヒトH鎖Cγ4領域である、請求項９又は10に記載のDNA。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載のL鎖V領域ペプチドをコードするDNAとH鎖V領域ペプチドをコードするDNAとを任意の12〜19個のアミノ酸のペプチドリンカーをコードするDNAリンカーで接続した、シングルチェインFvをコードするDNA。
- 請求項６〜８のいずれか１項に記載のDNAを含む発現ベクター。
- 請求項９〜12のいずれか１項に記載のDNAを含む発現ベクター。
- 請求項６〜８のいずれか１項に記載のDNA、及び請求項９〜12のいずれか１項に記載のDNAを含む発現ベクター。
- 請求項13に記載のDNAを含む発現ベクター。
- 請求項14に記載の発現ベクター及び請求項15に記載の発現ベクターにより同時に形質転換された宿主細胞。
- 請求項16に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 請求項17に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 請求項18又は19に記載の宿主細胞を培養し、そして目的とする抗体を回収する段階を含んでなる再構成ヒト抗体の製造方法。
- 請求項20に記載の宿主細胞を培養し、そして目的とする抗体を回収する段階を含んでなるシングルチェインFvの生産方法。
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