JPH08217799A

JPH08217799A - ヒトインターロイキン−８に対する再構成ヒト抗体

Info

Publication number: JPH08217799A
Application number: JP7177572A
Authority: JP
Inventors: Tsunaharu Matsushima; 綱治松島; Yoshihiro Matsumoto; 義弘松本; Yoshiki Yamada; 良樹山田; Isao Sato; 功佐藤; Masayuki Tsuchiya; 政幸土屋; Tatsumi Yamazaki; 達美山崎
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-07-13
Filing date: 1995-07-13
Publication date: 1996-08-27
Anticipated expiration: 2015-07-13
Also published as: JP3865418B2

Abstract

(57)【要約】【構成】（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒ
トＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクロ
ーナル抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んでなるＬ鎖Ｖ領域、を含
んで成るＬ鎖；並びに（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒトＨ鎖Ｆ
Ｒ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗
体のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ
鎖；を含んで成るヒトＩＬ−８に対する再構成された抗
体。【効果】この再構成ヒト抗体の大部分がヒト抗体に由
来し、そしてＣＤＲは抗原性が低いことから、本発明の
再構成ヒト抗体はヒトに対する抗原性が低く、そしてそ
れ故に医学療法用として期待される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトインターロイ
キン−８（ＩＬ−８）に対するマウスモノクローナル抗
体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び可変領域（Ｖ領
域）、並びにヒトＩＬ−８に対するヒト／マウスキメラ
抗体、ヒト軽鎖（Ｌ鎖）可変領域及びヒト重鎖（Ｈ鎖）
可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒトＩＬ−８に
対するマウスモノクローナル抗体のＣＤＲにより置き換
えられている再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体に関
する。本発明はさらに、上記の抗体又はその部分をコー
ドするＤＮＡを提供する。本発明はさらに、前記ＤＮＡ
を含んで成るベクター、特に発現ベクター、並びに該ベ
クターにより形質転換された宿主に関する。本発明はさ
らに、ヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体の製造方法、及
びヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体の製造方法を提
供する。

【０００２】

【従来の技術】インターロイキン−８（ＩＬ−８）は、
リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激した単球の培養上清より見い
だされ、ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｔ
ｒｏｐｈｉｌｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃｆａｃｔｏｒ
（ＭＤＮＣＦ）あるいはｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌａｃｔ
ｉｖａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＮＡＰ−１）等
と称されていた遊走性サイトカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎ
ｅ）である。ＩＬ−８は様々な細胞により産生され、多
形核白血球およびリンパ球に作用して、その濃度勾配に
沿って遊走（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ）させる活性を有し
ている。また、好中球に対してはその遊走を誘導するば
かりでなく、脱顆粒、活性酸素の放出、内皮細胞への接
着亢進などの好中球の機能をも活性化させる作用を有し
ている。

【０００３】炎症性疾患、より詳しくは、嚢胞性肺線維
症、特発性肺線維症、成人呼吸促迫症候群、サルコイド
ーシス、化膿性胸膜炎などの呼吸器疾患、並びに乾癬な
どの皮膚疾患、並びに慢性リウマチ関節炎、クローン
病、潰瘍性大腸炎などの疾患においては、それらの病巣
部位に白血球浸潤が病理学的に認められている。また、
これら疾患の患者由来の被検物質に、ＩＬ−８が検出さ
れており、炎症において中心的役割を果たしていると考
えられている。

【０００４】（ＭｃＥｌｖａｎｅｙ，Ｎ．Ｇ．ら、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９０，１２９６−１３０
１，１９９２、Ｌｙｎｃｈ III，Ｊ．Ｐ．ら、Ａｍ．Ｒ
ｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．，１４５，１４３３−１
４３９，１９９２、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｌ
ａｎｃｅｔ，３４１，６４３−６４７，１９９３、Ｃａ
ｒ，Ｂ．Ｄ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．
ＣａｒｅＭｅｄ．，１４９，６５５−６５９，１９９
４、Ａｎｔｏｎｙ，Ｖ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，１５１，７２１６−７２２３，１９９３、Ｔａｋ
ｅｍａｔｓｕ，Ｈ．ら、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏ
ｌ．，１２９，７４−８０，１９９３、Ｂｒｅｎｎａ
ｎ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２
０，２１４１−２１４４，１９９０、Ｉｚｚｏ，Ｒ．
Ｓ．ら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏ
ｌ．，２８，２９６−３００，１９９３、Ｉｚｚｏ，
Ｒ．Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏ
ｌ．，８７，１４４７−１４５２，１９９２）。

【０００５】Ｋｏ，Ｙ−Ｃ．らは、ヒトＩＬ−８を抗原
としてマウスに免疫することにより、ヒトＩＬ−８に結
合し、かつ、その結合によってヒトＩＬ−８が好中球に
結合することを阻害する、すなわちヒトＩＬ−８が有す
る生物学的活性を中和するマウスモノクローナル抗体Ｗ
Ｓ−４を調製した。マウスモノクローナル抗体ＷＳ−４
のアイソタイプは、κ型Ｌ鎖及びＣγ１型Ｈ鎖であるこ
とが明らかになっている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ，１４９，２２７−２３５，１９９２）。

【０００６】ＷＳ−４以外の抗ヒトＩＬ−８抗体として
は、Ａ．５．１２．１４（Ｂｏｙｌａｎ，Ａ．Ｍ．ら、
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８９，１２５７−１２
６７，１９９２）、国際特許出願ＷＯ９２−０４３７２
に開示されている抗Ｐｅｐ−１抗体または抗Ｐｅｐ−３
抗体あるいはＤＭ／Ｃ７（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｍ．Ｓ．
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５０，５５８５−５５９
５，１９９３）等が知られている。

【０００７】家兎を用いた実験系に於て、マウスモノク
ローナル抗体ＷＳ−４を投与することによって、肺虚血
・再灌流障害（Ｓｅｋｉｄｏ，Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，
３６５，６５４−６５７，１９９３）、ＬＰＳ誘導の皮
膚炎（Ｈａｒａｄａ，Ａ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，５，６８１−６９０，１９９３）、Ｌ
ＰＳあるいはインターロイキン−１（ＩＬ−１）誘導の
関節炎（Ａｋａｈｏｓｈｉ，Ｔ．ら、Ｌｙｍｐｈｏｋｉ
ｎｅａｎｄＣｙｔｏｋｉｎｅＲｅｓ．，１３，１
１３−１１６，１９９４）における好中球浸潤が抑制さ
れたことが見いだされた。

【０００８】家兎にもヒトＩＬ−８の相同体（ｈｏｍｏ
ｌｏｇｕｅ）が存在し、ウサギＩＬ−８と称されてい
る。マウスモノクローナル抗体ＷＳ−４はウサギＩＬ−
８に対して交差反応し、ウサギＩＬ−８がウサギ好中球
に結合するのを阻害することが明らかになっている（Ｈ
ａｒａｄａ，Ａ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．，５，６８１−６９０，１９９３）ので、これら
のことは、ヒトにおける炎症性疾患の治療のための療法
剤として抗ヒトＩＬ−８抗体が有用であることを示唆し
ている。

【０００９】ヒト以外の哺乳類由来のモノクローナル抗
体はヒトにおいて高度に免疫原性（「抗原性」という場
合もある）があり、そしてこの理由のため、ヒトにおけ
るそれらの医学療法的価値は制限される。例えば、マウ
ス抗体をヒトに投与しても異物として代謝されうるの
で、ヒトにおけるマウス抗体の半減期は比較的短く、期
待された効果を充分に発揮できない。さらに、投与した
マウス抗体に対して発生するヒト抗マウス抗体は、血清
病あるいは他のアレルギー反応など、患者にとって不都
合で危険な免疫応答を惹起する。そしてこの理由のた
め、ヒトにマウス抗体を頻回投与することはできない。

【００１０】これらの問題を解決するため、ヒト型化
（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体の製造方法が開発された。
マウス抗体は２つの方法でヒト型化することができる。
より簡単な方法としては、可変領域（Ｖ領域）はもとの
マウスモノクローナル抗体に由来し、定常領域（Ｃ領
域）は適当なヒト抗体に由来するキメラ抗体を作製する
方法がある。得られるキメラ抗体はもとのマウス抗体の
可変領域を完全なかたちで含有するので、もとのマウス
抗体と同一の特異性をもって抗原に結合することが期待
できる。

【００１１】さらに、キメラ抗体ではもとのマウス抗体
に比べヒト以外の動物に由来する蛋白質配列の比率が実
質的に滅少しているためもとのマウス抗体に比べて免疫
原性が低いと予想される。キメラ抗体は抗原によく結合
しそして免疫原性が低いが、それでもなおマウス可変領
域に対する免疫応答が生ずる可能性がある（ＬｏＢｕｇ
ｌｉｏ，Ａ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，４２２０−４２２４，ｌ９８
９）。

【００１２】マウス抗体をヒト型化するための第二の方
法は一層複雑であるが、しかしマウス抗体が有する潜在
的な免疫原性を大幅に低下させるものである。この方法
においては、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域
（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎ
ｉｎｇｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）のみをヒト可変領域に
移植して「再構成」（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト可変領域
を作製する．ただし必要によっては、再構成ヒト可変領
域のＣＤＲの構造をより一層もとのマウス抗体の構造に
近づけるために、ＣＤＲを支持しているフレームワーク
領域（ＦＲ）の一部の蛋白質配列をマウス抗体の可変領
域からヒト可変領域に移植する場合がある。

【００１３】次に、これらの再構成ヒト可変領域をヒト
定常領域に連結する。最終的に再構成されたヒト抗体の
ヒト以外の蛋自質配列に由来する部分はＣＤＲ、およ
び、極く一部のＦＲのみである。ＣＤＲは超可変蛋自質
配列により構成されており、これらは種特異的配列を示
さない。この理由のため、マウスＣＤＲを担持する再構
成ヒト抗体はもはやヒトＣＤＲを含有する天然ヒト抗体
より強い免疫原性を有しないはずである。

【００１４】再構成ヒト抗体についてはさらに、Ｒｉｅ
ｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３
−３２７，ｌ９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．ら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２３９，ｌ５３４−ｌ５３６，ｌ９８
８；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏ
ｔｅｉｎＥｎｇ．，４，７７３−７８３，ｌ９９ｌ；
Ｍａｅｄａ，Ｈ．ら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，２，ｌ２４−ｌ３４，ｌ９９
ｌ；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４ｌ８ｌ−４ｌ８
５，ｌ９９ｌ；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．ら、Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，２６６−２７ｌ，ｌ９９
ｌ；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，２８６９−２８７３，ｌ９
９ｌ；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５−４２８９，
ｌ９９２；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
ｌ４８，ｌｌ４９−ｌｌ５４，ｌ９９２；およびＳａｔ
ｏ，Ｋ．ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５３，８５ｌ−
８５６，ｌ９９３を参照のこと。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】前記のごとく、再構成
ヒト抗体は療法目的のために有用であると予想される
が、ヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体は知られてい
ない。さらに、再構成ヒト抗体の製造方法において任意
の抗体に普遍的に適用し得る画一的な方法は存在しな
い。従って、特定の抗原に対して十分な結合活性あるい
は／ならびに中和活性を示す再構成ヒト抗体を作製する
ためには種々の工夫が必要である（例えば、Ｓａｔｏ，
Ｋ．ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５３，８５ｌ−８５
６，ｌ９９３）。従って、本発明はヒトＩＬ−８に対す
る、免疫原性の低い抗体を提供するものである。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明はヒトＩＬ−８に
対する再構成ヒト抗体を提供する。本発明はまた、該再
構成ヒト抗体の作製の過程で有用であるヒト／マウスキ
メラ抗体を提供する。本発明はさらに、再構成ヒト抗体
の断片を提供する。並びに本発明はキメラ抗体、再構成
ヒト抗体およびそれらの断片の製造のための発現系を提
供する。本発明はさらにまた、ヒトＩＬ−８に対するキ
メラ抗体およびそれらの断片の製造方法、及びヒトＩＬ
−８に対する再構成ヒト抗体およびそれらの断片の製造
方法を提供する。

【００１７】さらに具体的には、本発明は、（１）ヒト
ＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領
域；並びに（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクロ
ーナル抗体のＨ鎖Ｖ領域；を提供する。本発明はさら
に、（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対する
マウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ
鎖；並びに（２）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に
対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んで
成るＨ鎖；を提供する。

【００１８】本発明はさらにまた、（１）ヒトＬ鎖Ｃ領
域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗
体のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに（２）ヒトＨ
鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクロー
ナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖；を含んで成
る、ヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体を提供する。本発
明はさらに、（１）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノク
ローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖Ｖ領域；並びに（２）ヒト
ＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４の
Ｈ鎖Ｖ領域；を提供する。

【００１９】本発明はさらに、（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、
及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体Ｗ
Ｓ−４のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに（２）ヒ
トＨ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノク
ローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖；
を提供する。本発明はさらにまた、（１）ヒトＬ鎖Ｃ領
域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗
体ＷＳ−４のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに
（２）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対するマウ
スモノクローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖Ｖ領域を含んで成
るＨ鎖；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対するキメラ抗
体を提供する。

【００２０】本発明はさらに、（１）ヒトＩＬ−８に対
するモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；並びに
（２）ヒトＩＬ−８に対するモノクローナル抗体のＨ鎖
Ｖ領域のＣＤＲ；を提供する。本発明はさらに、（１）
ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖
Ｖ領域のＣＤＲ；並びに（２）ヒトＩＬ−８に対するマ
ウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；を提供
する。

【００２１】本発明はさらに、（１）ヒトＬ鎖Ｖ領域の
フレームワーク領域（ＦＲ）；並びに（２）ヒトＩＬ−
８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣ
ＤＲ；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構
成ヒトＬ鎖Ｖ領域；並びに（１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のＦ
Ｒ；並びに（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクロ
ーナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；を含んで成る、ヒト
ＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域を提供す
る。

【００２２】本発明はさらに、（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域；
並びに（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対する
マウスモノクローナル抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ
鎖Ｖ領域；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の
再構成ヒトＬ鎖；並びに（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域；並びに
（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウス
モノクローナル抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領
域；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成
ヒトＨ鎖を提供する。

【００２３】本発明はさらにまた、（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、並びに（２）ヒトＬ鎖Ｆ
Ｒ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗
体のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖；並びに（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、並びに（２）ヒトＨ鎖Ｆ
Ｒ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗
体のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖；を含んで成る、ヒト
ＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体を提供する。

【００２４】本発明はさらに詳しくは（１）以下のアミ
ノ酸配列に示す又はその一部を有する、ヒトＩＬ−８に
対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖Ｖ領域
のＣＤＲ、ＣＤＲ１；Arg Ala Ser Glu Ile Ile Tyr Ser Tyr Leu
Ala ＣＤＲ２；Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp ＣＤＲ３；Gln His His Phe Gly Phe Pro Arg Thr 並びに（２）以下のアミノ酸配列に示す又はその一部を
有する、ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗
体ＷＳ−４のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、ＣＤＲ１；Asp Tyr Tyr Leu Ser ＣＤＲ２；Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr
Arg Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly ＣＤＲ３；Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu Ala
Tyr を提供する。

【００２５】本発明はさらに、（１）ヒトＬ鎖Ｖ領域の
フレームワーク領域（ＦＲ）；並びに（２）ヒトＩＬ−
８に対するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖Ｖ
領域のＣＤＲ；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗
体の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域；並びに（１）ヒトＨ鎖Ｖ領
域のＦＲ；並びに（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモ
ノクローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；を含
んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＨ鎖
Ｖ領域を提供する。

【００２６】本発明はさらに、（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域；
並びに（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対する
マウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＬ鎖ＣＤＲを含ん
で成るＬ鎖Ｖ領域；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対す
る抗体の再構成ヒトＬ鎖；並びに（１）ヒトＨ鎖Ｃ領
域；並びに（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対
するマウスモノクローナル抗体ＷＳ−４のＨ鎖ＣＤＲを
含んで成るＨ鎖Ｖ領域；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に
対する抗体の再構成ヒトＨ鎖を提供する。

【００２７】本発明はさらにまた、（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、並びに（２）ヒトＬ鎖Ｆ
Ｒ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗
体ＷＳ−４のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖；並びに（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、並びに（２）ヒトＨ鎖Ｆ
Ｒ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗
体ＷＳ−４のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖；を含んで成
る、ヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体を提供する。

【００２８】前記ヒトＬ鎖ＦＲは以下のアミノ酸配列を
有するものが挙げられる。ＦＲ１：Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys ＦＲ２：Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr ＦＲ３：Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys ＦＲ４：Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

【００２９】または、ＦＲ１：Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys ＦＲ２：Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr ＦＲ３：Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys ＦＲ４：Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

【００３０】前記ヒトＨ鎖ＦＲは以下のアミノ酸配列を
有するものが挙げられる。ＦＲ１：Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser ＦＲ２：Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val Gly ＦＲ３：Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg ＦＲ４：Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser ；

【００３１】ＦＲ１：Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser ＦＲ２：Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly ＦＲ３：Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg ＦＲ４：Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser ；

【００３２】ＦＲ１：Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser ＦＲ２：Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val Gly ＦＲ３：Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg ＦＲ４：Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser ；

【００３３】ＦＲ１：Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser ＦＲ２：Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly ＦＲ３：Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg ＦＲ４：Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser ；

【００３４】ＦＲ１：Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser ＦＲ２：Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly ＦＲ３：Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg ＦＲ４：Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser ；

【００３５】ＦＲ１：Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser ＦＲ２：Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val Gly ＦＲ３：Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg ＦＲ４：Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser ；

【００３６】ＦＲ１：Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser ＦＲ２：Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly ＦＲ３：Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg ＦＲ４：Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

【００３７】または、ＦＲ１：Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser ＦＲ２：Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly ＦＲ３：Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg ＦＲ４：Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

【００３８】本発明はまた、前記種々の抗体を構成する
ポリペプチド、又はその断片をコードするＤＮＡに関す
る。本発明はまた、上記ＤＮＡを含んで成るベクター、
例えば発現ベクターに関する。本発明はさらに、上記ベ
クターにより形質転換された宿主を提供する。本発明は
さらにまた、ヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体およびそ
の断片の製造方法、及びヒトｌＬ−８に対する再構成ヒ
ト抗体およびその断片の製造方法を提供する。

【００３９】

【具体的な説明】マウスＶ領域をコードするＤＮＡのクローニングヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領
域をコードする遺伝子をクローニングするためには、該
遺伝子の取得源として、ヒトＩＬ−８に対するマウスモ
ノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製する
ことが必要である。ハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出
した後、既知の方法により一本鎖ｃＤＮＡに変換し、ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて目的とするＤ
ＮＡを増幅することで得られる。この遺伝子の取得源と
して、Ｋｏ，Ｙ−Ｃ．らが作製した、ヒトＩＬ−８に対
するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マＷＳ−４があげられる。このハイブリドーマの作製方
法はＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４９，２
２７−２３５，１９９２に記載されており、これを参考
例１に後記する。

【００４０】（１）全ＲＮＡの採取マウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードする目的の
ＤＮＡをクローン化するため、グアニジンチオシアネー
ト処理によりハイブリドーマ細胞を破壊し、塩化セシウ
ム密度勾配遠心（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８、５２９４−５２９９，１
９７９）をおこなって全ＲＮＡを得ることができる。な
お、他の蛋白質の遺伝子をクローニングする際に用いら
れたすでに報告されている方法、例えばバナジウム複合
体などのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）インヒビター
存在下で、界面活性剤処理、フェノール処理をおこなう
方法（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、１８，５１４３−５１４９，１９７９）を用い
ることもできる。

【００４１】（２）ｃＤＮＡの合成次に、ｍＲＮＡの３′末端に局在するｐｏｌｙＡ鎖に相
補的なオリゴヌクレオチドであるオリゴ（ｄＴ）をプラ
イマーとして、上記のごとくして得た全ＲＮＡに含まれ
ているｍＲＮＡを鋳型に、逆転写酵素で処理してｍＲＮ
Ａに相補的な一本鎖ｃＤＮＡを合成することができる
（Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ、７、９３４−９３８，１９８９）。また、そ
の時にランダムプライマーを用いても良い。なお、ｍＲ
ＮＡだけを取得する場合は、全ＲＮＡをオリゴｄＴセル
ロースカラムにかけｐｏｌｙＡ鎖を有するｍＲＮＡだけ
を分離することができる。

【００４２】（３）ポリメラーゼ連鎖反応によるＶ領域
をコードするＤＮＡの増幅次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて前記
Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを特異的に増幅する。マウ
スモノクローナル抗体のカッパ（κ）型Ｌ鎖Ｖ領域の増
幅のため、配列番号；１〜１１に示す１１種のオリゴヌ
クレオチドプライマー（ＭｏｕｓｅＫａｐｐａＶａ
ｒｉａｂｌｅ；ＭＫＶ）及び配列番号：１２に示すオリ
ゴヌクレオチドプライマー（ＭｏｕｓｅＫａｐｐａ
Ｃｏｎｓｔａｎｔ；ＭＫＣ）をそれぞれ５′末端プライ
マー及び３′末端プライマーとして使用する．前記ＭＫ
Ｖプライマーはマウスカッパ型Ｌ鎖リーダー配列をコー
ドするＤＮＡ配列とハイブリダイズし、そして前記ＭＫ
Ｃプライマーはマウスカッパ型Ｌ鎖Ｃ領域をコードする
ＤＮＡ配列とハイブリダイズする。

【００４３】マウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域の
増幅のため、配列番号：１３〜２４に示す１２種のオリ
ゴヌクレオチドプライマー（ＭｏｕｓｅＨｅａｖｙ
Ｖａｒｉａｂｌｅ；ＭＨＶ）及び配列番号：２５に示す
オリゴヌクレオチドプライマー（ＭｏｕｓｅＨｅａｖ
ｙＣｏｎｓｔａｎｔ；ＭＨＣ）をそれぞれ５′未端プ
ライマー及び３′末端プライマーとして使用する。前記
ＭＨＶプライマーはマウスＨ鎖リーダー配列をコードす
るＤＮＡ配列とハイブリダイズし、そして前記ＭＨＣプ
ライマーはマウスＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列と
ハイブリダイズする。

【００４４】なお、全ての５′末端プライマー（ＭＫＶ
及びＭＨＶ）はその５′末端近傍に制限酵素ＳａｌＩ切
断部位を提供する配列ＧＴＣＧＡＣを含有し、そして、
全ての３′末端プライマー（ＭＫＣ及びＭＨＣ）はその
５′末端近傍に制限酵素ＸｍａＩ切断部位を提供するヌ
クレオチド配列ＣＣＣＧＧＧを含有する。これらの制限
酵素切断部位は両Ｖ領域をコードする目的のＤＮＡ断片
をそれぞれのクローニングベクターにサブクローニング
するために用いられる。これらの制限酵素切断部位が、
両Ｖ領域をコードする目的のＤＮＡ配列中にも存在する
場合、それぞれのクローニングベクターにサブクローニ
ングするために用いられる限り、他の制限酵素切断部位
でも良い。

【００４５】（４）Ｖ領域をコードするＤＮＡの単離次に、目的とするマウスモノクローナル抗体のＶ領域を
コードするＤＮＡ断片を得るために、ＰＣＲ増幅生成物
を低融点アガロースゲルあるいはカラム〔ＰＣＲ産物精
製用キット（ＱＩＡＧＥＮＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎＳｐｉｎＫｉｔ：ＱＩＡＧＥＮ社製）、Ｄ
ＮＡ精製用キット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮII ：ＢＩＯ
１０１社製）〕等により、分離、精製をおこなう。その
精製物を制限酵素Ｓａｌ I及びＸｍａ Iで酵素処理し
て、マウスモノクローナル抗体の目的とするＶ領域をコ
ードするＤＮＡ断片を得る。

【００４６】他方、プラスミドｐＵＣ１９のごとき適当
なクローニングベクターを同じ制限酵素Ｓａｌ I及びＸ
ｍａ Iにより切断させ、このｐＵＣ１９に前記ＤＮＡ断
片を酵素的に連結することにより、マウスモノクローナ
ル抗体の目的とするＶ領域をコードするＤＮＡ断片を含
むプラスミドを得る。クローニングされたＤＮＡの配列
決定は任意の常法に従って行うことができ、例えば、自
動ＤＮＡシークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓＩｎｃ．製）が挙げられる。目的とするＤ
ＮＡのクローニング及びその配列決定を実施例ｌ及び実
施例２に具体的に記載する。

【００４７】相補性決定領域（ＣＤＲ）本発明はさらに、ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクロ
ーナル抗体のＶ領域の超Ｖ領域又は相補性決定領域（Ｃ
ＤＲ）を提供する。抗体のＬ鎖及びＨ鎖の両Ｖ領域は抗
原結合部位を形成する。Ｌ鎖及びＨ鎖上のこの領域は類
似する基本的構造を有する。両鎖のＶ領域は配列が比較
的保存された４個のフレームワーク領域を含み、それら
は３個の超Ｖ領域又はＣＤＲにより連結されている（Ｋ
ａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ
ＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，ＵＳＤｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ
ａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ１９９１）。

【００４８】前記４個のフレームワーク領域（ＦＲ）の
多くの部分はβ−シート構造をとり、３個のＣＤＲはル
ープを形成する。ＣＤＲはある場合にはβ−シート構造
の一部分を形成することもある。ＦＲによって３個のＣ
ＤＲは相互に立体的に非常に近い位置に保持され、そし
て、対をなす３個のＣＤＲと共に抗原結合部位の形成に
寄与する。本発明は、ヒト型化抗体の素材として有用な
これらのＣＤＲ、及びそれをコードするＤＮＡをも提供
する。これらのＣＤＲ領域は、Ｖ領域の既知アミノ酸配
列と照合することによって、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、
「ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆ
ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ」の
経験則から決定することができ、実施例３において具体
的に説明する。

【００４９】キメラ抗体の作製ヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＶ領域を設計す
るに先立って、使用するＣＤＲが実際に抗原結合領域を
形成することを確かめる必要がある。この目的のため、
キメラ抗体を作製した。キメラ抗体を作製するためにキ
メラ抗体のＬ鎖並びにＨ鎖をコードするＤＮＡを構築す
る必要がある。両ＤＮＡを構築する基本的な方法は、Ｐ
ＣＲ−クローン化ｃＤＮＡに見られるマウスリーダー配
列及びマウスＶ領域配列のそれぞれのＤＮＡ配列を、哺
乳類細胞発現ベクター中にすでに存在するヒトＣ領域を
コードするＤＮＡ配列に連結することである。

【００５０】前記ヒト抗体Ｃ領域は、任意のヒトＬ鎖Ｃ
領域および任意のヒトＨ鎖Ｃ領域であることができ、例
えば、Ｌ鎖についてはヒトＬ鎖ＣκあるいはＣλ、Ｈ鎖
についてはＩｇＧであればＣγ１，Ｃγ２，Ｃγ３ある
いはＣγ４（Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．ら、ＤＮＡ，１，１
１−１８（１９８１），Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎ．ら、
Ｃｅｌｌ，２９，６７１−６７９（１９８２），Ｋｒａ
ｗｉｎｋｅｌ，Ｕ．ら、ＥＭＢＯＪ．１，４０３−４
０７（１９８２））あるいは他のアイソタイプをそれぞ
れ挙げることができる。

【００５１】キメラ抗体の製造のためには２種類の発現
ベクターを作製する。即ち、エンハンサー／プロモータ
ー系のような発現制御領域による制御のもとで、マウス
Ｌ鎖Ｖ領域ならびにヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ
を含んでなる発現ベクター、およびエンハンサー／プロ
モーター系のような発現制御領域による制御のもとで、
マウスＨ鎖Ｖ領域ならびにヒトＨ鎖Ｃ領域をコードする
ＤＮＡを含んでなる発現ベクターを作製する。次に、こ
れらの両発現ベクターにより哺乳類細胞などの宿主細胞
を同時形質転換し、そして形質転換された細胞をイン−
ビトロまたはイン−ビボで培養してキメラ抗体を製造す
る（例えば、ＷＯ９１−１６９２８）。

【００５２】あるいは、マウスＬ鎖Ｖ領域ならびにヒト
Ｌ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡおよびマウスＨ鎖Ｖ領域
ならびにヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを単一の発
現ベクターに導入し、そして、該ベクターを用いて宿主
細胞を形質転換し、そして形質転換された細胞をイン−
ビトロまたはイン−ビボで培養してキメラ抗体を製造す
ることもできる。

【００５３】モノクローナル抗体ＷＳ一４からのキメラ
抗体の作製を実施例４に記載する。マウスＷＳ−４κ型
Ｌ鎖リーダー領域及びＶ領域をコードするｃＤＮＡをＰ
ＣＲ法を用いてクローニングし、ヒトＬ鎖Ｃκ領域をコ
ードするヒトゲノムＤＮＡを含有する発現ベクターに連
結する。同様にマウスＷＳ−４抗体のＨ鎖リーダー領域
及びＶ領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いてク
ローニングし、ヒトＣγ１領域をコードするゲノムＤＮ
Ａを含有する発現ベクターに連結する。

【００５４】より詳しくは、特に設計されたＰＣＲプラ
イマーを用いて、マウスＷＳ−４抗体のＶ領域をコード
するｃＤＮＡをそれらの５′及び３′末端において適当
な塩基配列を導入して（１）それらが発現ベクターに容
易に挿人されるように、且つ（２）それらが該発現ベク
ター中で適切に機能するようにした（例えば、本発明で
はＫｏｚａｋ配列を導入することにより転写効率を上げ
るよう工夫してある）。

【００５５】次に、これらのプライマーを用いてＰＣＲ
により増幅して得たマウスＷＳ−４抗体のＶ領域をコー
ドするＤＮＡを、所望のヒトＣ領域をすでに含有するＨ
ＥＦ発現ベクター（図１参照）に挿人した。これらのベ
クターは、種々の哺乳類細胞系における遺伝子操作され
た抗体の一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現又は安定な
発現のために適当である。このように作製したキメラＷ
Ｓ−４抗体の結合活性を試験したところ、キメラＷＳ−
４抗体はヒトＩＬ−８に結合する活性を示した（図２参
照）。従って、正しいマウスＶ領域がクローニングさ
れ、そして正しく配列が決定されていたことが示され
た。

【００５６】再構成ヒトＷＳ−４抗体の設計マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト抗体に移植さ
れている再構成ヒト抗体を作製するためには、移植する
ＣＤＲを有するマウスモノクローナル抗体のＦＲのアミ
ノ酸配列と、ＣＤＲが移植されるヒトモノクローナル抗
体のＦＲのアミノ酸配列との間に高い同一性が存在する
ことが望ましい。

【００５７】この目的のためには、マウスモノクローナ
ル抗体のＦＲのアミノ酸配列とヒトモノクローナル抗体
のＦＲのアミノ酸配列とを比較することにより、再構成
ヒトＷＳ−４抗体のＶ領域の設計の基礎となるヒトＶ領
域を選択することが可能になる。具体的には遺伝子解析
ソフトＧＥＮＥＴＸ（ＳｏｆｔｗａｒｅＤｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔＣｏ．，Ｌｔｄ．）を用いてマウスＷＳ−
４抗体のＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域を、Ｎａｔｉｏｎａｌ
ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄ
ａｔｉｏｎ（ＮＢＲＦ）のデータベースに見出されるす
べての既知のヒトのＶ領域と比較した。

【００５８】マウスＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域は、既知
のヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域との比較においてヒト抗体ＨＡＵ
（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓ．ら、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅ
ｒ’ｓＺ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３５１，１２
９１−１２９５，１９７０）のＬ鎖Ｖ領域に最も類似し
ており、６９．２％の同一性が存在する。一方、ＷＳ−
４抗体のＨ鎖Ｖ領域は、既知のヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域との
比較においてヒト抗体ＶＤＨ２６（Ｂｕｌｕｗｅｌ
ａ．，Ｌ．ら、ＥＭＢＯＪ．，７，２００３−２０１
０，１９８８）に最も類似しており、７１．４％の同一
性が存在する。

【００５９】一般的に、マウスＶ領域のアミノ酸配列の
ヒトＶ領域のアミノ酸配列に対する同一性は、マウスＶ
領域のアミノ酸配列に対する同一性よりも低い。これは
マウスＷＳ−４抗体のＶ領域がヒトＶ領域に完全には類
似していないこと示し、そして同時に、ヒト患者におけ
る免疫原性の問題を解決するためにマウスＷＳ−４のＶ
領域をヒト型化する（ｈｕｍａｎｉｚｅ）ことが最善で
あることを示している。

【００６０】マウスＷＳ−４抗体のＶ領域をさらに、Ｋ
ａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ．ＦｉｆｔｈＥｄｉｔ
ｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａ
ｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．
Ｓ．ＧｏｖｅｒｎｍｅｎｔＰｒｉｎｔｉｎｇ０ｆｆ
ｉｃｅにより定義されるヒトＶ領域サブグループのコン
センサス配列と比較し、Ｖ領域のＦＲ間で対比された。
その結果を表１に示す。

【００６１】

【表１】

【００６２】マウスＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域のＦＲは
ヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループ I（ＨＳＧ I）のＦＲの
コンセンサス配列に最も類似しており、６４．４％の同
一性が存在する。一方、マウスＷＳ−４のＨ鎖Ｖ領域の
ＦＲはヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループ III（ＨＳＧ II
I）のＦＲのコンセンサス配列に最も類似しており、６
２．３％の同一性が存在する。

【００６３】これらの結果は、既知のヒト抗体との比較
から得られた結果を支持しており、ヒト抗体ＨＡＵ中の
Ｌ鎖Ｖ領域はヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループ Iに属し、
そしてヒト抗体ＶＤＨ２６中のＨ鎖Ｖ領域はヒトＨ鎖Ｖ
領域のサブグループ IIIに属する。再構成ヒトＷＳ−４
抗体Ｌ鎖Ｖ領域の設計のためにはサブグループＩ（ＨＳ
Ｇ I）に属するヒトＬ鎖Ｖ領域を使用し、そして再構成
ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の設計のためにはサブグル
ープ III（ＨＳＧ III）に属するヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域を
用いるのが最善であろう。

【００６４】既知ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域との比較におい
て、マウスＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域はヒトＬ鎖Ｖ領域
のサブグループ Iの１構成員であるヒト抗体ＲＥＩのＬ
鎖Ｖ領域にも類似していた。従って、再構成ヒトＷＳ−
４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の設計においてＲＥＩのＦＲを使用し
た。ＲＥＩに基くこれらのヒトＦＲ中には、原著のヒト
ＲＥＩ（Ｐａｌｍ，Ｗら、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’
ｓＺ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３５６，１６７
−１９１，１９７５；Ｅｐｐ，Ｏ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，１４，４９４３−４９５２，１９７５）に
比較して５個のアミノ酸（位置３９，７１，１０４，１
０５及び１０７；表２を参照）の相違が存在する。

【００６５】なお、表におけるアミノ酸番号はＫａｂａ
ｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）の経験に基づいている。位
置３９及び７１における２個のアミノ酸の変化はラット
ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体のＬ鎖Ｖ領域のＦＲ中に存在
するアミノ酸にもどる変化であった（Ｒｉｅｃｈｍａｎ
ｎら、１９８８）。Ｋａｂａｔら、（１９９１）によれ
ば、ＦＲ４中の３個のアミノ酸の変化（位置１０４，１
０５及び１０７）は他のヒトκＬ鎖からのＪ領域に基い
ており、ヒトから逸脱するものではない。

【００６６】再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の２つ
のバージョンを設計した。第一のバージョンＲＶＬａに
おいては、ＦＲは再構成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体
中に存在するＲＥＩに基くＦＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ
ら、１９８８）と同一であり、そしてＣＤＲはマウスＷ
Ｓ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域中のＣＤＲと同一にした。第二
のバージョンＲＶＬｂはＲＶＬａに基き、ヒトＦＲ３中
の位置７１におけるアミノ酸１個のみを異にする。Ｃｈ
ｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：
９０１−９１７，１９８７により定義されるごとく、残
基７１はＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１の標準的（ｃａｎｏｎｉ
ｃａｌ）構造の部分である。

【００６７】この位置のアミノ酸はＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ
１ループの構造に直接影響すると予想され、それ故に抗
体結合に大きく影響すると考えられている。再構成ヒト
ＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域のＲＶＬｂにおいては、位置７
１のフェニルアラニンがチロシンに変えられている。表
２は、マウスＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域、再構成ヒトＣ
ＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体中での使用のために修飾された
ＲＥＩのＦＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）及び
再構成ヒトＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域の２種類のバージ
ョンの、それぞれのアミノ酸配列を示す。

【００６８】

【表２】

【００６９】注：ＲＥＩのＦＲは再構成ヒトＣＡＭＰＡ
ＴＨ−１Ｈ抗体中に見出されるものである（Ｒｉｅｃｈ
ｍａｎｎら、１９８８）。ＲＥＩのＦＲ中の５個の下線
を付したアミノ酸はヒトＲＥＩのアミノ酸配列と異なる
アミノ酸である。なお、アミノ酸は一文字表記による。
アミノ酸番号はＫａｂａｔらの定義によるものである。
マウスＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域中のＦＲはサブグルー
プIII に属するヒトＨ鎖Ｖ領域に最も類似している（表
１）。

【００７０】マウスＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域は、既知
のヒトＨ鎖Ｖ領域との比較において、ＦＲ１からＦＲ３
までは、ヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループIII の１構成員
であるヒト抗体ＶＤＨ２６のＨ鎖Ｖ領域（Ｂｕｌｕｗｅ
ｌａ，Ｌ．ら、ＥＭＢＯＪ．，７，２００３−２０１
０，１９８８）に最も類似していた。ＦＲ４について
は、ＶＤＨ２６のＦＲ４の配列が明らかになっていなか
ったため、サブグループIII に属するヒト抗体４Ｂ４
（Ｓａｎｚ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２，
８８３−８８７，１９８９）のＦＲ４のアミノ酸配列を
用いることとした。これらのヒトＨ鎖Ｖ領域を、再構成
ヒトＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域の設計のための基礎とし
て用いた。

【００７１】再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の８種
類のバージョンを設計した。８種類のバージョンのすべ
てにおいて、ヒトＦＲ１，２及び３はヒト抗体ＶＤＨ２
６のＦＲ１，２及び３に、ＦＲ４はヒト抗体４Ｂ４のＦ
Ｒ４に基いており、そして、マウスＣＤＲはマウスＷＳ
−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲと同一である。表３および
４に、マウスＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域、鋳型のヒト抗
体ＶＤＨ２６のＦＲ１〜３、ヒト抗体４Ｂ４のＦＲ４お
よび再構成ヒトＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域の８種類のバ
ージョンの、それぞれのアミノ酸配列を示す。

【００７２】

【表３】

【００７３】

【表４】

【００７４】再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ領域をコードす
るＤＮＡの作製再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ領域の作製を実施例５に具体
的に記載する。再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ
領域のそれぞれの第一バージョンをコードするＤＮＡを
合成した。そして配列決定して、再構成ヒトＷＳ−４抗
体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」の全体ＤＮＡ
配列が正しいアミノ酸配列をコードしていることを確認
した。再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン
「ａ」の配列を配列番号：６２に、再構成ヒトＷＳ−４
抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」の配列を配列番号：３
８に示す。

【００７５】再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ領域の他のバー
ジョンをコードするＤＮＡは、第一バージョン「ａ」を
鋳型に、公表されているＰＣＲ−変異誘発法（Ｋａｍｍ
ａｎｎ，Ｍら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．，１７，５４０４，１９８９）にわずかな変更を加
えた方法を用いて作製した。再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ
領域の設計に関して記載したように、再構成ヒトＷＳ−
４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の１つの追加のバージョン（バージョ
ン「ｂ」）をコードするＤＮＡを作製し、そして再構成
ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の７種類の追加のバージョ
ン（バージョン「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」，
「ｆ」，「ｇ」及び「ｈ」）をコードするＤＮＡを作製
した。

【００７６】これらの追加のバージョンは、第一バージ
ョンからのアミノ酸配列の一連の微細な変化を含み、ア
ミノ酸配列のこれらの微細な変化はＰＣＲ変異誘発を用
いてＤＮＡ配列の微細な変更を行うことにより達成され
た。ＤＮＡ配列に必要な変化を導入するＰＣＲプライマ
ーが設計された。一連のＰＣＲ反応に続き、ＰＣＲ生成
物をクローン化し、そして配列決定してＤＮＡ配列中の
変化が計画通りに起っていることを確認した。再構成ヒ
トＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ｂ」の配列を配
列番号：６５に、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域バ
ージョン「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」，「ｆ」，
「ｇ」，「ｈ」のそれぞれの配列を配列番号４１，４
４，４５，４８，５１，５４，５５に示す。

【００７７】再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ領域の種々のバ
ージョンのＤＮＡ配列を配列決定により確認した後、再
構成ヒトＷＳ−４抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡを、ヒ
トＣ領域をコードするＤＮＡをすでに含有する哺乳類細
胞発現ベクターにサブクローニングした。即ち、再構成
ヒトＷＳ−４抗体Ｖ鎖Ｌ領域をコードするＤＮＡをヒト
Ｌ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列に、再構成ヒトＷＳ
−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒトＣγ１領
域をコードするＤＮＡ配列にそれぞれ連結した。

【００７８】次に再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域バージョン
「ａ」あるいは「ｂ」と、Ｈ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」
〜「ｈ」のすべての組合せをヒトＩＬ−８への結合につ
いて試験し、そしてその結果、図７に記載するように、
Ｌ鎖バージョン「ａ」または「ｂ」とＨ鎖バージョン
「ｇ」とを含んで成る両再構成ヒト抗体（ＲＶＬａ／Ｒ
ＶＨｇ及びＲＶＬｂ／ＲＶＨｇ）がキメラＷＳ−４抗体
と同じレベルでＩＬ−８に結合する能力を示した。

【００７９】ヒトＩＬ−８に対する本発明のキメラ抗体
又は再構成ヒト抗体の製造のために任意の発現系、例え
ば真核細胞、例えば動物細胞、例えば樹立された哺乳類
細胞系、真糸状菌細胞、及び酵母細胞、並びに原核細
胞、例えば細菌細胞、例えば大腸菌細胞等を使用するこ
とができる。好ましくは、本発明のキメラ抗体又は再構
成抗体は哺乳類細胞、例えばＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞
中で発現される。

【００８０】これらの場合、哺乳類細胞での発現のため
に有用な常用のプロモーターを用いることができる。例
えば、ヒト・サイトメガロウィルス前期（ｈｕｍａｎ
ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｉｍｍｅｄｉａｔｅ
ｅａｒｌｙ；ＨＣＭＶ）プロモーターを使用するのが
好ましい。ＨＣＭＶプロモーターを含有する発現ベクタ
ーの例には、ＨＣＭＶ−ＶＨ−ＨＣγ1 、ＨＣＭＶ−Ｖ
Ｌ−ＨＣκ等があり、ｐＳＶ２ｎｅｏに由来するもの
（国際公開出願ＷＯ９２−１９７５９を参照）が含まれ
る。

【００８１】また、その他に本発明に用いることのでき
る哺乳動物細胞に於ける遺伝子発現のプロモーターとし
ては、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウ
ィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィル
スプロモーター、あるいは、ヒト・ポリペプチド・チェ
ーン・エロンゲーション・ファクター−１α（ＨＥＦ−
１α）等の哺乳動物細胞由来のプロモーターを用いれば
よい。例えば、ＳＶ４０のプロモーターを使用する場合
は、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．らの方法（Ｎａｔｕｒ
ｅ，２７７，１０８−１１４，１９７９）、また、ＨＥ
Ｆ−１αプロモーターを使用する場合は、Ｍｉｚｕｓｈ
ｉｍａ，Ｓ．らの方法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲ
ｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）に従えば実施する
ことができる。

【００８２】本発明のために有用なプロモーターの他の
具体例はＨＥＦ−１αプロモーターである。このプロモ
ーターを含有する発現ベクターにはＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ
１及びＨＥＦ−ＶＬ−ｇκ（図１）が含まれる。複製起
点としては、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、Ｓ
Ｖ４０、牛パピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のＤ
ＮＡ配列を用いることができ、さらに、宿主細胞系中で
の遺伝子コピー数増幅のため、選択マーカーとして、ア
ミノグルコシド３′−ホスホトランスフェラーゼあるい
はｎｅｏ耐性遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝
子、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元
酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を用いることができる。

【００８３】要約すれば、本発明はまず、ヒトＩＬ−８
に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域及びＨ
鎖Ｖ領域、並びに該Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及び
該Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを提供する。これら
は、ヒトＩＬ−８に対するヒト／マウスキメラ抗体及び
再構成ヒト抗体の作製のために有用である。モノクロー
ナル抗体としては、例えばＷＳ−４があげられる。Ｌ鎖
Ｖ領域は例えば配列番号：２６に示すアミノ酸配列を有
し、そしてＨ鎖Ｖ領域は例えば配列番号：２７に示すア
ミノ酸配列を有する。これらのアミノ酸配列は例えばそ
れぞれ配列番号：２６，２７に示すヌクレオチド配列に
よりコードされている。

【００８４】本発明のヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体
は、（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域及びマウスＬ鎖Ｖ領域；並び
に（２）ヒトＨ鎖Ｃ領域及びマウスＨ鎖Ｖ領域；から構
成される。マウスＬ鎖Ｖ領域及びマウスＨ鎖Ｖ領域並び
にこれらをコードするＤＮＡは前記の通りである。前記
ヒトＬ鎖Ｃ領域は任意のヒトＬ鎖Ｃ領域であることがで
き、そして例えばヒトＣκあるいはＣλ領域である。前
記ヒトＨ鎖Ｃ領域は任意のヒトＨ鎖Ｃ領域であることが
でき、そして例えばヒトＣγ１，Ｃγ２，Ｃγ３あるい
はＣγ４領域（Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．ら、ＤＮＡ，１，
１１−１８（１９８１），Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎ．
ら、Ｃｅｌｌ，２９，６７１−６７９（１９８２），Ｋ
ｒａｗｉｎｋｅｌ，Ｕら、ＥＭＢＯＪ．，１，４０３
−４０７（１９８２））である。

【００８５】キメラ抗体の製造のためには２種類の発現
ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系のご
とき発現制御領域による制御のもとでマウスＬ鎖Ｖ領域
及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発
現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のご
とき発現制御領域のもとでマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ
鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクター
を作製する。次に、これらの発現ベクターにより哺乳類
細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転
換された細胞をイン−ビトロ又はイン−ビボで培養して
キメラ抗体を製造する。

【００８６】あるいは、マウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖
Ｃ領域をコードするＤＮＡ並びにマウスＨ鎖Ｖ領域及び
ヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを単一の発現ベクタ
ーに導入し、そして該ベクターを用いて宿主細胞を形質
転換し、次にこの形質転換された宿主をイン−ビボ又は
イン−ビトロで培養して目的とするキメラ抗体を生産さ
せる。

【００８７】本発明の再構成ヒトＷＳ−４抗体は、（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒトＬ鎖Ｆ
Ｒ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗
体ＷＳ−４のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ領域、を含
んで成るＬ鎖；並びに（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び（２）ヒトＨ鎖Ｆ
Ｒ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗
体ＷＳ−４のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域、を含
んで成るＨ鎖；から構成される。

【００８８】好ましい態様においては、前記Ｌ鎖ＣＤＲ
は配列番号：２６に示されるアミノ酸配列であって、該
アミノ酸配列の範囲が表５において定義されるアミノ酸
配列を有し、前記Ｈ鎖ＣＤＲは配列番号：２７に示され
るアミノ酸配列であって該アミノ酸配列の範囲が表５に
おいて定義されるアミノ酸配列を有し；前記ヒトＬ鎖Ｆ
ＲがＲＥＩに由来するものであり；前記ヒトＨ鎖ＦＲ
１，２および３はＶＤＨ２６に、ＦＲ４は４Ｂ４に由来
するものであり；前記ヒトＬ鎖Ｃ領域はヒトＣκ領域で
あり；そして前記ヒトＨ鎖Ｃ領域はヒトＣγ１領域であ
る。また、前記ヒトＨ鎖Ｃ領域はヒトＣγ４領域であっ
てもよく、あるいは前記ヒトＬ鎖Ｃ領域および／または
ヒトＨ鎖Ｃ領域のかわりにラジオアイソトープを結合さ
せてもよい。特定の抗原に対して十分に活性がある再構
成ヒト抗体を作製するために、前記ヒトＦＲのアミノ酸
配列の一部を置換することが望ましい。

【００８９】好ましい態様においては、Ｌ鎖Ｖ領域は表
２においてＲＶＬａあるいはＲＶＬｂとして示されるア
ミノ酸配列を有し、Ｈ鎖Ｖ領域は表３および表４にＲＶ
Ｈａ、ＲＶＨｂ、ＲＶＨｃ、ＲＶＨｄ、ＲＶＨｅ、ＲＶ
Ｈｆ、ＲＶＨｇ又はＲＶＨｈとして示されるアミノ酸配
列を有する。さらに、Ｈ鎖Ｖ領域ＦＲ２中の４１位のア
ミノ酸がプロリンであること、同４７位のアミノ酸がト
リプトファンであること、および／または同ＦＲ３中の
６７位のアミノ酸がフェニルアラニンであることがよ
く、ＲＶＨｂ，ＲＶＨｄ，ＲＶＨｅ，ＲＶＨｆ，ＲＶＨ
ｇ又はＲＶＨｈとして示されるアミノ酸配列を有するも
のがより好ましい。このうち、ＲＶＨｇがＨ鎖Ｖ領域と
して最も好ましい。

【００９０】再構成抗体の製造のためには、２種類の発
現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系の
ごとき発現制御領域による制御のもとに前に定義した再
構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベク
ター、及びエンハンサー／プロモーター系のごとき発現
制御領域のもとに前に定義した再構成ヒトＨ鎖をコード
するＤＮＡを含んで成るもう一つの発現ベクターを作製
する。次に、これらの発現ベクターを用いて哺乳類細胞
のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そしてこの形質転
換された細胞をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して
再構成ヒト抗体を生産せしめる。

【００９１】あるいは、再構成ヒトＬ鎖をコードするＤ
ＮＡ及び再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡを単一の発
現ベクターに導入し、そしてこのベクターを用いて宿主
を形質転換し、次にこの形質転換された宿主細胞をイン
−ビボ又はイン−ビトロで培養して目的とする再構成ヒ
ト抗体を生産せしめる。こうして生産されたキメラ抗体
又は再構成ヒト抗体は、常法に従って、例えばプロテイ
ンＡアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、ゲル濾過等により単離、精製するこ
とができる。

【００９２】本発明のキメラＬ鎖又は再構成ヒトＬ鎖は
Ｈ鎖と組合わせることにより完全な抗体を作製するため
に使用することができる。同様に本発明のキメラＨ鎖又
は再構成ヒトＨ鎖はＬ鎖と組合わせることにより完全な
抗体を作製するために用いることができる。本発明のマ
ウスＬ鎖Ｖ領域、再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域、マウスＨ鎖Ｖ
領域、及び再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域は、本来、抗原である
ヒトＩＬ−８と結合する領域であり、それ自体として、
又は他の蛋白質との融合蛋白質として医薬、診断薬等と
して有用であると考えられる。また、本発明のＬ鎖Ｖ領
域ＣＤＲ及びＨ鎖Ｖ領域ＣＤＲも、本来、抗原であるヒ
トＩＬ−８と結合する部分であり、それ自体として又は
他の蛋白質との融合蛋白質として医薬、診断薬等として
有用であると考えられる。

【００９３】本発明のマウスＬ鎖Ｖ領域をコードするＤ
ＮＡはキメラＬ鎖をコードするＤＮＡ又は再構成ヒトＬ
鎖をコードするＤＮＡの作製のために有用である。同様
にマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡはキメラＨ鎖を
コードするＤＮＡ又は再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮ
Ａの作製のために有用である。また、本発明のＬ鎖Ｖ領
域ＣＤＲをコードするＤＮＡは再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域を
コードするＤＮＡ及び再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮ
Ａの作製のために有用である。

【００９４】同様に本発明のＨ鎖Ｖ領域ＣＤＲをコード
するＤＮＡは再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ
及び再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡ作製のために有
用である。さらには、再構成ヒト抗体のＦ（ａｂ′）
₂ ，ＦａｂあるいはＦｖを、又は、Ｈ鎖及びＬ鎖の両Ｆ
ｖを連結させたシングルチェーンＦｖを適当な宿主で産
生させ、前述の目的に使用することができる（例えば、
Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、ＴＩＢＴＥＣＨ，９，１３２−
１３７，１９９１を参照）。

【００９５】シングルチェインＦｖは、ヒトＩＬ−８に
対する再構成ヒト抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を連結
してなる。このシングルチェインＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ
領域とＬ鎖Ｖ領域はリンカー、好ましくは、ペプチドリ
ンカーを介して連結されている（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．
Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．，８５，５８７９−５８８３，１９８８）。

【００９６】シングルチェインＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域
およびＬ鎖Ｖ領域は、再構成ヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖
Ｖ領域として前記記載されたもののいずれであってもよ
い。具体例として、配列番号３８，４１，４４，４５，
４８，５１，５４，５５のいずれかに記載のアミノ酸配
列からなるＨ鎖Ｖ領域と、配列番号６２，６５のいずれ
かに記載のアミノ酸配列からなるＬ鎖Ｖ領域を含んでな
るシングルチェインＦｖが挙げられる（ＷＯ８８−０１
６４９を参照）。これらのＶ領域は、好ましくは、ペプ
チドリンカーによって連結されている。ペプチドリンカ
ーとしては、例えばアミノ酸１２〜１９残基からなる任
意の一本鎖ペプチドが用いられる（ＷＯ８８−０９３４
４を参照）。

【００９７】シングルチェインＦｖをコードするＤＮＡ
は、前記記載の再構成ヒト抗体のＨ鎖または、Ｈ鎖Ｖ領
域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖または、Ｌ鎖Ｖ領域
をコードするＤＮＡを鋳型とし、それらの配列のうちの
所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を、その両
端を規定するプライマー対を用いて、ＰＣＲ法により増
幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードす
るＤＮＡおよびその両端を各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結される
ように規定するプライマー対を組み合せて増幅すること
により得られる。

【００９８】また、一旦シングルチェインＦｖをコード
するＤＮＡが作成されれば、それらを含有する発現ベク
ター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主
を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用い
て常法に従って、シングルチェインＦｖを得ることがで
きる。シングルチェインＦｖは、抗体分子に比べ、組織
への移行性が優れており、ラジオアイソトープ標識によ
るイメージングへの利用、および再構成ヒト抗体と同様
の機能を有する治療剤としての利用が期待される。

【００９９】本発明のヒトＩＬ−８に対するキメラ抗
体、再構成ヒト抗体およびそのＦ（ａｂ′）₂ ，Ｆａ
ｂ，ＦｖあるいはシングルチェーンＦｖの結合活性を確
認する方法として、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定
法），ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測
定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例え
ば、キメラ抗体、再構成ヒト抗体について、酵素免疫測
定法を用いる場合、抗ヒトＩＬ−８ポリクローナル抗体
をコートしたプレートにヒトＩＬ−８を添加し、ここに
ヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体、再構成ヒト抗体を産
生する細胞の培養上清あるいは精製サンプルを加え、ア
ルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した適切な二次
抗体を添加する。プレートのインキュベーションおよび
洗浄の後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加
えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価するこ
とができる。

【０１００】本発明のヒトＩＬ−８に対するキメラ抗
体、再構成ヒト抗体およびそのＦ（ａｂ′）₂ ，Ｆａ
ｂ，ＦｖあるいはシングルチェインＦｖのＩＬ−８レセ
プターに対するＩＬ−８結合阻害活性は、通常のリガン
ドレセプター結合阻害アッセイにより評価される。例え
ば、好中球上のＩＬ−８レセプターに対するＩＬ−８の
結合阻害アッセイには、ヘパリン採血などにより得られ
る好中球を遠心分離等の手段で分離した後、上記アッセ
イに好適な数の細胞懸濁液となるよう調製して用いるこ
とができる。

【０１０１】¹²⁵Ｉなどで適当に標識したＩＬ−８と非
標識のＩＬ−８を含む溶液と適当な濃度に調製した本発
明の抗体またはその断片を含む溶液を混合し、次いでこ
れを上記好中球懸濁液に添加する。一定時間の後、好中
球を分離し、好中球上の標識された活性を測定すればよ
い。本発明の抗体またはその断片による好中球遊走作用
（ケモタキシス；ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ）の阻害能を評
価するには通常知られた方法、例えばＧｒｏｂ，Ｐ．
Ｍ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，８３１１−
８３１６，１９９０に記載された方法を用いることがで
きる。

【０１０２】市販のケモタキシスチャンバーを用いる場
合、本発明の抗体またはその断片を適当な培養液で希釈
した後、ＩＬ−８を加え、これをチャンバーに分注す
る。ついで、調製した好中球懸濁液をチャンバーに添加
し、一定時間放置する。遊走する好中球は、チャンバー
に装着されたフィルターに付着するので、その好中球の
数を染色液あるいは蛍光抗体等の通常の方法で測定すれ
ばよい。また、顕微鏡下での肉眼による判定や機械を用
いる自動測定も可能である。

【０１０３】本発明のヒトＩＬ−８に対するキメラ抗
体、再構成ヒト抗体およびそのＦ（ａｂ′）₂ ，Ｆａ
ｂ，ＦｖあるいはシングルチェーンＦｖは、メンブレン
フィルターによる濾過滅菌の後、好ましくは非経口的
に、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮
下注射等によりあるいは経気道的に、例えばネブライザ
ー（ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）により医薬療法剤として投与
することができる。ヒトに対する投与量は、患者の状
態、年齢等により異なるがおよそ１〜１０００mg／body
であり、１−１０mg／kg／週の分割用量を選択すること
ができる。

【０１０４】本発明のヒトＩＬ−８に対するキメラ抗
体、再構成ヒト抗体およびそのＦ（ａｂ′）₂ ，Ｆａ
ｂ，ＦｖあるいはシングルチェーンＦｖは、精製され結
合活性を評価された後に、生理活性タンパク質の製剤化
に通常用いられる方法により、医薬療法剤として製剤化
される。たとえば、注射用製剤は精製されたヒトＩＬ−
８に対するキメラ抗体、再構成ヒト抗体およびそのＦ
（ａｂ′）₂ ，Ｆａｂ，Ｆｖあるいはシングルチェーン
Ｆｖを、溶剤、例えば、生理食塩水、緩衝液などに溶解
し、それに吸着防止剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ゼラ
チン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などを加えたもの
であり、または使用前に溶解再構成するために凍結乾燥
したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤とし
ては、糖アルコール又は糖、例えばマンニトール、ブド
ウ糖などをもちいることができる。

【０１０５】

【実施例】次に、本発明を下記の実施例により具体的に
説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるもの
ではない。実施例１．ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナ
ル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡのクローニングヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体の可変
領域をコードするＤＮＡを次の様にしてクローニングし
た。

【０１０６】１．全ＲＮＡの調製ハイブリドーマＷＳ−４からの全ＲＮＡを、Ｃｈｉｒｇ
ｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
８，５２９４−５２９９，１９７９により記載されてい
る塩化セシウム密度勾配遠心法を修飾して調製した。す
なわち、１×１０⁷個のハイブリドーマＷＳ−４の細胞
を２５mlの４Ｍグアニジンチオシアネート（Ｆｕｌｋａ
社製）中で完全にホモジナイズさせた。ホモジネートを
遠心管中の５．７Ｍ塩化セシウム溶液層上に重層し、次
にこれをＢｅｃｋｍａｎＳＷ４０ローター中で３１，
０００rpm にて２０℃で１４時間遠心分離することによ
りＲＮＡを沈澱させた。

【０１０７】ＲＮＡ沈澱物を８０％エタノールにより洗
浄し、そして１０mM ＥＤＴＡ及び０．５％Ｎ−ラウ
ロイルサルコシン酸ナトリウムを含有する２０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）２００μｌ中に溶解し、そし
てそれにＰｒｏｔｅｎａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社
製）を０．５mg／mlとなるように添加した後、３７℃に
て３０分間温浴中でインキュベートした。混合物をフェ
ノール及びクロロホルムで抽出し、そしてＲＮＡをエタ
ノールで沈澱させた。次に、ＲＮＡ沈澱物を１mM ＥＤ
ＴＡを含有する１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）
２００μｌに溶解した。

【０１０８】２．メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の
抽出マウスモノクローナル抗体ＷＳ−４Ｈ鎖をコードするｍ
ＲＮＡを抽出するため、ＦａｓｔＴｒａｃｋｍＲＮ
ＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒｓｉｏｎ
３．２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、その指
示書に記載の方法に従い、上記１．で得られた全ＲＮＡ
からｐｏｌｙ（Ａ）ポジティブなｍＲＮＡを抽出した。

【０１０９】３．一本鎖ｃＤＮＡの合成ｃＤＮＡＣｙｃｌｅＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
社製）を用いて、その指示書に記載の方法に従い、上記
２．で得られた約４０ｎｇのｍＲＮＡより一本鎖ｃＤＮ
Ａを合成し、マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの
増幅に用いた。尚、マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤ
ＮＡを増幅するために、約１０μｇの上記全ＲＮＡより
一本鎖ｃＤＮＡを合成した。

【０１１０】４．抗体可変領域をコードする遺伝子のＰ
ＣＲ法による増幅（１）マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの増幅ＰＣＲのためのプライマーは、配列番号：１３〜２４に
示すＭＨＶ（ＭｏｕｓｅＨｅａｖｙＶａｒｉａｂｌ
ｅ）プライマー１〜１２、及び配列番号：２５に示すＭ
ＨＣ（ＭｏｕｓｅＨｅａｖｙＣｏｎｓｔａｎｔ）プ
ライマー（Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｔ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，１９９１を使用した。

【０１１１】ＰＣＲ溶液１００μｌは、１０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH８．３），５０mMＫＣｌ，０．１mM ｄ
ＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ）、１．５mM ＭｇＣｌ₂ ，０．００１％（Ｗ／Ｖ）
ゼラチン，５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉ
Ｔａｑ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ社）、
０．２５μＭの配列番号：１３〜２４に示すＭＨＶプラ
イマーのうち一つと１．７５μＭの配列番号：２５に示
すＭＨＣプライマー及び上記３．で得られた一本鎖ｃＤ
ＮＡ溶液１．５μｌを含有し、ＭＨＶ１〜１２プライマ
ーの各々について別々に用意した。これを５０μｌの鉱
油で覆った後、９４℃の初期温度にて３分間そして次に
９４℃にて１分間、５５℃にて１分間及び７２℃にて１
分間、この順序で加熱した。この温度サイクルを３０回
反復した後、反応混合物をさらに７２℃にて１０分間イ
ンキュベートした。

【０１１２】（２）マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤ
ＮＡの増幅ＰＣＲのためのプライマーとして配列番号：１〜１１に
示すＭＫＶ（ＭｏｕｓｅＫａｐｐａＶａｒｉａｂｌ
ｅ）プライマー１〜１１、及び配列番号：１２に示すＭ
ＫＣ（ＭｏｕｓｅＫａｐｐａＣｏｎｓｔａｎｔ）プ
ライマー（Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｔ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，１９９１）を使用し
た。

【０１１３】ｃＤＮＡの増幅は、それぞれ０．２５μＭ
のＭＫＶプライマー混合物と３．０μＭのＭＫＣプライ
マーを用いて増幅した点を除いて、前記４．（１）にお
いてＨ鎖Ｖ領域遺伝子の増幅について記載したのと同じ
方法により上記３．で得られた一本鎖ｃＤＮＡ溶液２．
０μｌから増幅を行なった。

【０１１４】５．ＰＣＲ生成物の精製および断片化前記のようにしてＰＣＲ法により増幅したＨ鎖Ｖ領域お
よびＬ鎖Ｖ領域それぞれのＤＮＡ断片を１．５％低融点
アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）を用いるアガロースゲル
電気泳動により分離した。約４５０bp長のＨ鎖ＤＮＡ断
片と約４００bp長のＬ鎖ＤＮＡ断片を含有するアガロー
ス片をそれぞれ切り取り、そして６５℃にて５分間溶融
せしめ、そしてこれと同容積の２mM ＥＤＴＡ及び３０
０mM ＮａＣｌを含有する２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH７．５）を加えた。

【０１１５】この混合物をフェノール及びクロロホルム
により抽出し、そしてＤＮＡ断片をエタノール沈澱によ
り回収し、そして１mM ＥＤＴＡを含有する１０mM Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）に溶解した。次に、１０mM
ＭｇＣｌ₂ 及び１mMジチオスレイトールを含有する１
０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．９）中で５ユニットの
制限酵素Ｘｍａ I（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬ
ａｂｓ社製）を用いて３７℃にて３時間消化した。次
に、４０ユニットの制限酵素Ｓａｌ I（宝酒造社製）に
より３７℃にて２時間消化し、そして生ずるＤＮＡ断片
を、１．５％低融点アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）を用
いるアガロースゲル電気泳動により分離した。

【０１１６】ＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り
取りそして６５℃にて５分間溶融せしめ、そしてこれと
同容積の２mM ＥＤＴＡ及び３００mM ＮａＣｌを含有
する２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）を加えた。
この混合物をフェノール及びクロロホルムにより抽出
し、そしてＤＮＡ断片をエタノール沈澱により回収し、
そして１mM ＥＤＴＡを含有する１０mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（pH７．５）に溶解した。こうして、マウスκ型Ｌ
鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断片、
及びマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含んで成る
ＤＮＡ断片を各々得た。上記ＤＮＡ断片はいずれもその
５′末端にＳａｌＩ接着末端を有し、そしてその３′末
端にＸｍａＩ接着末端を有する。

【０１１７】６．連結及び形質転換上記のようにして調製したマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域を
コードする遺伝子を含んで成るＳａｌＩ−ＸｍａＩＤ
ＮＡ断片約０．３μｇを、ＳａｌＩ、ＸｍａＩ及び大腸
菌由来のアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ；宝酒造社
製）で消化することにより調製したｐＵＣ１９ベクター
（宝酒造社製）約０．１μｇと、１ユニットＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）及び添付のバッ
ファーを含有する反応混液中で、１６℃にて４時間反応
させ連結した。

【０１１８】次に、５μｌの上記連結混合物を大腸菌Ｄ
Ｈ５αのコンピテント細胞（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）
５０μｌに加え、そしてこの細胞を氷上で３０分間、４
２℃にて１分間そして再び氷上で１分間静置した。次い
で４００μｌの２×ＹＴ培地（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１
９８９））を加え、３７℃にて１時間インキュベートし
た後、５０μｇ／mlのアンピシリン（明治製菓社製）を
含有する２×ＹＴ寒天培地（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８
９））上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュ
ベートして大腸菌形質転換体を得た。

【０１１９】尚、この際選択マーカーとしてＸ−Ｇａｌ
（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌ
ｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ，宝酒造社製）
５０μｇを塗布した。この形質転換体を、５０μｇ／ml
のアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地１０ml中で３７
℃にて一夜培養し、そしてこの培養物から、ＱＩＡＧＥ
Ｎｐｌａｓｍｉｄｍｉｎｉｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ
社製）を用いて、その指示書に記載の方法に従ってプラ
スミドＤＮＡを調製した。

【０１２０】こうして得られた、ハイブリドーマＷＳ−
４に由来するマウスκ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子
を含有するプラスミドをｐＵＣ−ＷＳ４−ＶＬと命名し
た。大腸菌コンピテント細胞をＪＭ１０９を用いた点を
除いて、上記の同じ方法に従って、ハイブリドーマＷＳ
ー４に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を
含有するプラスミドをＳａｌ I−Ｘｍａ I ＤＮＡ断片
から作成し、そしてｐＵＣ−ＷＳ４−ＶＨと命名した。

【０１２１】実施例２．ＤＮＡの塩基配列の決定前記のプラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列
を、シークエンスプライマーとしてＭ１３Ｐｒｉｍｅ
ｒＲＶおよびＭ１３ＰｒｉｍｅｒＭ４（両者とも
宝酒造社製）、自動ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉ
ｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍＩｎｃ製）およびＴａｑ
ＤｙｅＤｅｏｘｙＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌ
ｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ
ＢｉｏｓｙｓｔｅｍＩｎｃ製）を用いて、メーカー指
定のプロトコールに従って塩基配列を決定した。プラス
ミドｐＵＣ−ＷＳ４−ＶＬに含まれるマウスＷＳ−４抗
体のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列を配列番
号：２６に示す。また、プラスミドｐＵＣ−ＷＳ４−Ｖ
Ｈに含まれるマウスＷＳ−４抗体のＨ鎖Ｖ領域をコード
する遺伝子の塩基配列を配列番号：２７に示す。

【０１２２】実施例３．ＣＤＲの決定Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域の基本的構造は、互いに類似性を
有しており、それぞれ４つのフレームワーク領域が３つ
の超可変領域、即ち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連
結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較
的良く保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸
配列の変異性は極めて高い（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、
「ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆ
ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ」Ｕ
ＳＤｅｐｔ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳ
ｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）。

【０１２３】この様な事実に基づき、ヒトＩＬ−８に対
するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配
列をＫａｂａｔらにより作成された抗体のアミノ酸配列
のデータベースにあてはめて、相同性を調べることによ
りＣＤＲ領域を表５に示す如く決定した。

【０１２４】

【表５】

【０１２５】実施例４．クローン化ｃＤＮＡの発現の
確認（キメラＷＳ−４抗体の作製）発現ベクターの作製キメラＷＳ−４抗体を発現するベクターを作製するた
め、それぞれマウスＷＳ−４Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域をコー
ドするｃＤＮＡクローンｐＵＣ−ＷＳ４−ＶＬ及びｐＵ
Ｃ−ＷＳ４−ＶＨをＰＣＲ法により修飾した。そしてＨ
ＥＦ発現ベクター（前記、ＷＯ９２−１９７５９及び図
１を参照のこと）に導入した。

【０１２６】Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマー（配列
番号：２８）及びＨ鎖Ｖ領域のための後方プライマー
（配列番号：２９）は、各々のＶ領域のリーダー配列の
最初をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＫｏｚ
ａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７−９５０，１９８７）及
びＨｉｎｄIII 制限部位を有するように設計した。Ｌ鎖
Ｖ領域のための前方プライマー（配列番号：３０）及び
Ｈ鎖Ｖ領域のための前方プライマー（配列番号：３１）
は、Ｊ領域の末端をコードするＤＮＡ配列にハイブリダ
イズし、且つ、スプライスドナー配列及びＢａｍＨＩ制
限部位を付加するように設計した。

【０１２７】２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．２）、
１０mM ＫＣｌ、６mM（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄，１％Ｔｒｉ
ｔｏｎＸ−１００１００μＭｄＮＴＰｓ、１．５mM
ＭｇＣｌ₂ 、１００pmole ずつの各プライマー、１０
０ｎｇの鋳型ＤＮＡ（ｐＵＣ−ＶＬ又はｐＵＣ−Ｖ
Ｈ）、及び２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ酵素を含有す
る１００μｌのＰＣＲ反応混合物を５０μｌの鉱油で覆
い、９４℃にて３分間最初の変性の後、９４℃にて１分
間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間のサイクルを
３０回行い、最後に７２℃にて１０分間インキュベート
した。

【０１２８】ＰＣＲ生成物を１．５％低融点アガロース
ゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩで消
化し、そしてＬ鎖Ｖ領域については、ＨＥＦ発現ベクタ
ーＨＥＦ−ＶＬ−ｇκに、Ｈ鎖Ｖ領域についてはＨＥＦ
発現ベクターＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１にそれぞれクローニ
ングした。ＤＮＡ配列決定の後、正しいＤＮＡ配列を有
するＤＮＡ断片を含むプラスミドをそれぞれＨＥＦ−ｃ
ｈＷＳ４Ｌ−ｇκ，ＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｈ−ｇγ１と命
名した。

【０１２９】ＣＯＳ細胞へのトランスフェクションキメラＷＳ−４抗体の一過性発現を観察するため、前記
発現ベクターをＣＯＳ細胞において試験した。ＨＥＦ−
ｃｈＷＳ４Ｌ−ｇκならびにＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｈ−ｇ
γ１をＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ社
製）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ細胞
に同時形質転換した。各ＤＮＡ（１０μｇ）を、ＰＢＳ
中１×１０⁷ 細胞／mlの０．８mlのアリコートに加え、
１．５ｋＶ、２５μＦの容量にてパルスを与えた。

【０１３０】室温にて１０分間の回復期間の後、エレク
トロポレーション処理された細胞を、５％のγ−グロブ
リンフリーウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培養液（Ｇ
ＩＢＣＯ社製）１５ｍｌに懸濁し、組織培養シャーレに
添加した。９６時間のインキュベーションの後、培養上
清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、直径０．
４５μｍのディスクフィルター（ＧｅｌｍａｎＳｃｉ
ｅｎｃｅ社製）にて濾過した。

【０１３１】ＥＬＩＳＡ抗原結合測定および抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプ
レートを次のようにして調整した。抗原結合活性測定の
ためのＥＬＩＳＡプレートは次の様にして調製した。９
６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルを、濃度２μ
ｇ／ｍｌで固層化バッファー（０．１Ｍ炭酸水素ナト
リウム、０．０２％アジ化ナトリウム）に溶解したヤ
ギ抗ヒトＩＬ−８ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓ
ｔｅｍｓ社製）１００μｌで固層化し、希釈バッファー
（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２，１％ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ），１ｍＭＭｇＣｌ₂ ，０．
１５ＭＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，０．
０２％アジ化ナトリウム）２００μｌでブロッキング
の後、濃度５ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−８（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ社製）１００μｌを添加した。

【０１３２】キメラ抗体の精製サンプル、あるいはこれ
らを発現させたＣＯＳ細胞の培養上清を順次希釈して、
各ウェルに加え、次に濃度１μｇ／ｍｌのアルカリホス
ファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社製）
１００μｌを加えた。インキュベーション及び洗浄の
後、基質溶液（１ｍｇ／ｍｌｐ−ニトロフェニル燐
酸）を加え、次に４０５nmでの吸光度を測定した。

【０１３３】抗体濃度測定には、９６穴プレートを濃度
１μｇ／ｍｌヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社製）
１００μｌで固層化し、ブロッキングの後、キメラ抗体
の精製サンプル、あるいはこれらを発現させたＣＯＳ細
胞の培養上清を順次希釈して、各ウェルに加え、次に濃
度１μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−
ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社製）１００μｌを加えた。
インキュベーション及び洗浄の後、基質溶液（１ｍｇ／
ｍｌｐ−ニトロフェニル燐酸、Ｓｉｇｍａ社製）を加
え、次に４０５nmでの吸光度を測定した。その結果、キ
メラ抗体ＷＳ−４がＩＬ−８に特異的に結合したことに
より、このキメラ抗体がマウスモノクローナル抗体ＷＳ
−４のＶ領域の正しい構造を有することが示唆された
（図２を参照のこと）。

【０１３４】なお、前記プラスミドＨＥＦ−ｃｈＷＳ４
Ｌ−ｇκを有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
ｏｌｉＤＨ５α（ＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｌ−ｇκ）、お
よび前記プラスミドＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｈ−ｇγ₁を有
する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ
１０９（ＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｈ−ｇγ₁）として工業技
術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目
１番３号）に、平成６年７月１２日に各々ＦＥＲＭＢ
Ｐ−４７３９、およびＦＥＲＭＢＰ−４７４０として
ブタペスト条約に基づき国際寄託された。

【０１３５】実施例５．再構成ヒトＷＳ−４抗体の作
製再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の作製再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ
を次の様にして設計した。ヒト抗体ＶＤＨ２６のＦＲ１
〜３およびヒト抗体４Ｂ４のＦＲ４をコードするそれぞ
れ既知のＤＮＡ配列をマウスＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の
ＣＤＲをコードするＤＮＡ配列が連結されるように再構
成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードする全長ＤＮＡ
を設計した。

【０１３６】次に、このＤＮＡ配列のそれぞれ５′側及
び３′側にＨｉｎｄIII 認識部位／ＫＯＺＡＫコンセン
サス配列及びＢａｍＨＩ認識部位／スプライスドナー配
列をそれぞれ付加して、ＨＥＦ発現ベクターに挿入でき
るようにした。こうして設計したＤＮＡ配列をほぼ均等
な４本のオリゴヌクレオチドに分け、そして次に、これ
らのオリゴヌクレオチドのアセンブリーを妨害する可能
性のあるオリゴヌクレオチド中の二次構造についてコン
ピューター解析した。

【０１３７】４本のオリゴヌクレオチド配列を配列番
号：３２〜３５に示す。これらのオリゴヌクレオチドは
１１３〜１４３塩基の長さを有し、隣接する２本のオリ
ゴヌクレオチドは互いに２０塩基のオーバラップ領域を
有する。４本のオリゴヌクレオチドの内ＨＦ１（配列番
号：３２）、ＨＦ３（配列番号：３４）はセンスＤＮＡ
配列を有し、そして他のＨＦ２（配列番号：３３）、Ｈ
Ｆ４（配列番号：３５）はアンチセンスＤＮＡ配列を有
する。これらのオリゴヌクレオチドを自動ＤＮＡ合成装
置（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によっ
て合成した。

【０１３８】また、これら４本のオリゴヌクレオチドの
ＰＣＲ法によるアッセンブリーの方法を図３に記す。約
１００ngずつのＨＦ１とＨＦ２、ＨＦ３とＨＦ４を組み
合わせて、２．５ｕのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを含
有する最終容量９８μｌのＰＣＲ反応液に添加した。９
４℃にて３分間の最初の変性の後、９４℃にて２分間、
５５℃にて２分間及び７２℃にて２分間を１サイクルと
し、これを２サイクル行った。

【０１３９】ＰＣＲ反応液の半量を相互に交換したの
ち、さらに２サイクルのインキュベーションを行った。
１００ｐmoleずつのＲＶＨ５′プライマー（配列番号：
３６）及びＲＶＨ３′プライマー（配列番号：３７）を
外部プライマーとして添加した後、ＰＣＲ反応液を５０
μｌの鉱油で覆い、そして９４℃にて３分間の最初の変
性の後、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間及び７２
℃にて１分間の４５サイクルを行い、そして次に７２℃
にて１０分間インキュベートした。

【０１４０】約４５０塩基対のＤＮＡ断片を１．５％低
融点アガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII 及び
ＢａｍＨ Iにより消化し、そして次にＨＥＦ発現ベクタ
ーＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１にクローニングした。ＥＦ−１
プライマー（配列番号：６６）およびＨＩＰプライマー
（配列番号：６７）を用いてＤＮＡ配列決定の後、正し
いＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を
含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＨａ−ｇγ１と命名し
た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ｇγ１に含まれる
Ｈ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：
３８に示す。

【０１４１】再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域の各バ
ージョン「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」，「ｆ」，
「ｇ」，「ｈ」を以下のようにして作製した。バージョ
ン「ｂ」（ＲＶＨｂ）は、４７位のロイシンがトリプト
ファンに変異するように設計した変異原プライマーＬＴ
Ｗ１（配列番号：３９）およびＬＴＷ−２（配列番号：
４０）を用い、両端を規定するプライマーとしてはＲＶ
Ｈ５′（配列番号：３６）およびＲＶＨ３′（配列番
号：３７）を用いて、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ｇ
γ１を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅し、プラ
スミドＨＥＦ−ＲＶＨｂ−ｇγ１を得た。本プラスミド
ＨＥＦ−ＲＶＨｂ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミ
ノ酸配列および塩基配列を配列番号：４１に示す。

【０１４２】バージョン「ｃ」は、４１位のグルタミン
がプロリンに変異するように設計した変異原プライマー
ＱＴＰ１（配列番号：４２）およびＱＴＰ２（配列番
号：４３）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨａ−ｇγ
１を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法により増幅し、プラス
ミドＨＥＦ−ＲＶＨｃ−ｇγ１を得た。本プラスミドＨ
ＥＦ−ＲＶＨｃ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ
酸配列および塩基配列を配列番号：４４に示す。

【０１４３】バージョン「ｄ」は、変異原プライマーと
してＱＴＰ１およびＱＴＰ２を用い、プラスミドＨＥＦ
−ＲＶＨｂ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとしてプラスミドＨＥ
Ｆ−ＲＶＨｄ−ｇγ１を得た。本プラスミドＨＥＦ−Ｒ
ＶＨｄ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列お
よび塩基配列を配列番号：４５に示す。バージョン
「ｅ」は、４０位のアラニンがプロリンに変異するよう
に設計した変異原プライマーＡＴＰ１（配列番号：４
６）およびＡＴＰ２（配列番号：４７）を用い、プラス
ミドＨＥＦ−ＲＶＨｄ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅
し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｅ−ｇγ１を得た。本プ
ラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｅ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領
域に含まれるアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：
４８に示す。

【０１４４】バージョン「ｆ」は、４４位のグリシンが
アラニンに変異するように設計した変異原プライマーＧ
ＴＡ１（配列番号：４９）およびＧＴＡ２（配列番号：
５０）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｄ−ｇγ１を
鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｆ
−ｇγ１を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｆ−ｇγ
１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列
を配列番号：５１に示す。

【０１４５】バージョン「ｇ」は、６７位のロイシンが
フェニルアラニンに変異するように設計した変異原プラ
イマーＬＴＦ１（配列番号：５２）およびＬＴＦ２（配
列番号：５３）を用い、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨｄ−
ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラスミドＨＥＦ−
ＲＶＨｇ−ｇγ１を得た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＨ
ｇ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および
塩基配列を配列番号：５４に示す。

【０１４６】バージョン「ｈ」は、変異原プライマーと
してＬＴＦ１およびＬＴＦ２を用い、プラスミドＨＥＦ
−ＲＶＨｂ−ｇγ１を鋳型ＤＮＡとして増幅し、プラス
ミドＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ｇγ１を得た。本プラスミドＨ
ＥＦ−ＲＶＨｈ−ｇγ１に含まれるＨ鎖Ｖ領域のアミノ
酸配列および塩基配列を配列番号：５５に示す。

【０１４７】再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ
を次の様にして設計した。ヒト抗体ＲＥＩのＦＲをコー
ドするＤＮＡ配列とマウスＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域のＣ
ＤＲをコードするＤＮＡ配列が連結されるように再構成
ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする全長ＤＮＡを
設計した。

【０１４８】次に、このＤＮＡ配列のそれぞれ５′側及
び３′側にＨｉｎｄIII 認識部位／ＫＯＺＡＫコンセン
サス配列及びＢａｍＨＩ認識部位／スプライスドナー配
列をそれぞれ付加して、ＨＥＦ発現ベクターに挿入でき
るようにした。こうして設計したＤＮＡ配列をほぼ均等
な長さの４本のオリゴヌクレオチドに分け、そして次
に、これらのオリゴヌクレオチドのアセンブリーを妨害
する可能性のあるオリゴヌクレオチド中の二次構造につ
いてコンピューター解析した。

【０１４９】４本のオリゴヌクレオチド配列を配列番
号：５６〜５９に示す。これらのオリゴヌクレオチドは
１０６〜１２４塩基の長さを有し、隣接する２本のオリ
ゴヌクレオチドは互いに１９〜２３塩基のオーバラップ
領域を有する。４本のオリゴヌクレオチドの内ＬＦ１
（配列番号：５６）、ＬＦ３（配列番号：５８）はセン
スＤＮＡ配列を有し、そして他のＬＦ２（配列番号：５
７）、ＬＦ４（配列番号：５９）はアンチセンスＤＮＡ
配列を有する。これらオリゴヌクレオチドを前記のＨＦ
１〜４と同様の方法で合成した。

【０１５０】アッセンブリーは、１００ngずつの４種の
オリゴヌクレオチド及び５ｕのＡｍｐｌｉＴａｑを含
有する９８μｌのＰＣＲ混合物を、９４℃にて３分間の
最初の変性の後、９４℃にて２分間、５５℃にて２分間
及び７２℃にて３分間を１サイクルとし、これを２サイ
クル行った。１００ｐmoleずつのＲＶＬ５′プライマー
（配列番号：６０）及びＲＶＬ３′プライマー（配列番
号：６１）を外部プライマーとして添加した後、ＰＣＲ
反応液を５０μｌの鉱油で覆い、そして９４℃にて３分
間の最初の変性の後、９４℃にて１分間、５５℃にて１
分間及び７２℃にて１分間を１サイクルとしてこれを３
０サイクルを行い、そして次に７２℃にて１０分間イン
キュベートした（図３参照）。

【０１５１】約４００塩基対のＤＮＡ断片を１．５％低
融点アガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII 及び
ＢａｍＨＩにより消化し、そして次にＨＥＦ発現ベクタ
ーＨＥＦ−ＶＬ−ｇκにクローニングした。ＥＦ−１プ
ライマー（配列番号：６６）およびＫＩＰプライマー
（配列番号：６８）を用いてＤＮＡ配列決定の後、正し
いＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を
含むプラスミドをＨＥＦ−ＲＶＬａ−ｇκと命名した。
本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬａ−ｇκに含まれるＨ鎖Ｖ
領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：６２に
示す。

【０１５２】バージョン「ｂ」（ＲＶＬｂ）は、７１位
のフェニルアラニンがチロシンに変異するように設計し
た変異原プライマーＦＴＹ１（配列番号：６３）および
ＦＴＹ２（配列番号：６４）を用い、両端を規定するプ
ライマーとしてはＲＶＬ５′（配列番号：６０）および
ＲＶＬ３′（配列番号：６１）を用いて、プラスミドＨ
ＥＦ−ＲＶＬａ−ｇκを鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ法に
より増幅し、プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬｂ−ｇκを得
た。本プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬｂ−ｇκに含まれるＬ
鎖Ｖ領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号：６
５に示す。

【０１５３】再構成ヒトＷＳ−４抗体の各鎖の抗原結合
活性を評価するため、まず、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ
鎖の「ａ」バージョンための発現ベクターＨＥＦ−ＲＶ
Ｌａ−ｇκとキメラＷＳ−４抗体Ｈ鎖のための発現ベク
ターＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｈ−ｇγ１とによりＣＯＳ細胞
を前記のようにして同時トランスフェクションし、前記
のようにして培養上清を回収した後、前記実施例４ＥＬ
ＩＳＡに記載のとおりの方法を用いて、産生された抗体
について産生抗体量および抗原結合活性を測定した。こ
の結果を図４に示す。図４に示すように陽性対照として
のキメラ抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）および再構成Ｌ鎖とキ
メラＨ鎖とからなる抗体（ＲＶＬａ／ｃｈＨ）との間に
は抗原結合性に差がないことが確認された。

【０１５４】同時に、キメラＷＳ−４抗体Ｌ鎖のための
発現ベクターＨＥＦ−ｃｈＷＳ４Ｌ−ｇκと再構成ヒト
ＷＳ−４抗体Ｈ鎖の「ａ」バージョンとの組み合せを評
価するため、両者をＣＯＳ細胞に同時トランスフェクシ
ョンし、前記実施例４ＥＬＩＳＡに記載のとおりの方法
を用いて、得られた抗体について産生抗体量および抗原
結合活性を測定した。その結果、この抗体（ｃｈＬ／Ｒ
ＶＨａ）には抗原結合活性が見られなかった（図４を参
照のこと）。

【０１５５】前記のごとく、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ
鎖の「ａ」バージョン（ＲＶＬａ）はキメラＷＳ−４抗
体Ｌ鎖と同等の結合活性を示したので、これ以後の再構
成Ｈ鎖各バージョンの評価には、再構成Ｈ鎖各バージョ
ンと再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖の「ａ」バージョン
（ＲＶＬａ）をＣＯＳ細胞に同時トランスフェクション
することにより行なった。

【０１５６】その結果、「ｂ」，「ｄ」，「ｅ」，
「ｆ」，「ｇ」，「ｈ」の各再構成Ｈ鎖バージョンを有
する抗体は、陽性対照であるキメラＷＳ−４抗体（ｃｈ
Ｌ／ｃｈＨ）に匹敵する程度の抗原結合性を示し、この
組み合せがヒト抗体における機能的抗原結合部位を形成
することが示唆された。しかし、産生量については、
「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）以外はいずれもキメラＷ
Ｓ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）より低かった。なお、Ｈ
鎖バージョン「ｃ」を有する抗体には抗原結合活性が見
られなかった（図５を参照のこと）。

【０１５７】このことから、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ
鎖の「ａ」バージョン（ＲＶＬａ）ならびに再構成ヒト
ＷＳ−４抗体Ｈ鎖の「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）を有
する抗体は、良好な抗原結合性を示す機能的抗原結合部
位を再形成し、ＣＯＳ細胞に同時トランスフェクション
することによりキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）
に匹敵する程度の産生量を示すことが示唆された。

【０１５８】次に、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖の
「ｂ」バージョン（ＲＶＬｂ）を用いて、Ｈ鎖各バージ
ョンとＣＯＳ細胞に同時トランスフェクションし、再構
成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ鎖の「ｂ」バージョン（ＲＶＬ
ｂ）の評価をおこなった。その結果、再構成ヒトＷＳ−
４抗体Ｈ鎖「ｇ」バージョンを有する抗体（ＲＶＬｂ／
ＲＶＨｇ）だけが、陽性対照であるキメラＷＳ−４抗体
（ｃｈＬ／ｃｈＨ）に匹敵する程度の抗原結合性を示
し、この組み合せがヒト抗体における機能的抗原結合部
位を形成することが示唆された。また、産生量について
も、「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）以外はいずれもキメ
ラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）より低かった（図６
を参照のこと）。

【０１５９】前記の評価において、キメラＷＳ−４抗体
（ｃｈＬ／ｃｈＨ）に匹敵する産生量とＩＬ−８に対す
る結合活性を示した２種の再構成ヒト抗体（ＲＶＬａ／
ＲＶＨｇとＲＶＬｂ／ＲＶＨｇ）をそれぞれプロティン
Ａカラムで精製して、実施例４ＥＬＩＳＡに記載の方法
で結合活性をより正確に評価した。その結果、キメラＷ
Ｓ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）、ＲＶＬａ／ＲＶＨｇ抗
体並びにＲＶＬｂ／ＲＶＨｇ抗体のいずれも同程度の結
合活性を示した（図７参照のこと）。

【０１６０】このことから、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｌ
鎖の「ａ」バージョン（ＲＶＬａ）あるいは「ｂ」バー
ジョン（ＲＶＬｂ）と、再構成ヒトＷＳ−４抗体Ｈ鎖の
「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）を有する抗体は、良好な
抗原結合性を示す機能的抗原結合部位を再形成し、ＣＯ
Ｓ細胞に同時トランスフェクションすることによりキメ
ラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）に匹敵する程度の産
生量を示すことが示唆された。

【０１６１】再構成ヒトＷＳ−４抗体のＬ鎖「ａ」バー
ジョン（ＲＶＬａ）と同Ｈ鎖「ｇ」バージョン（ＲＶＨ
ｇ）、または同Ｌ鎖「ｂ」バージョン（ＲＶＬｂ）と同
Ｈ鎖「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）からなる再構成ヒト
抗体のＩＬ−８レセプターに対するＩＬ−８結合阻害活
性を、リガンドレセプター結合阻害アッセイにより評価
した。

【０１６２】健常人よりヘパリン採血した約１００mlの
血液を、１５mlのＭｏｎｏ−Ｐｏｌｙ分離溶液（ＩＣＮ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）に３５mlずつ重層し、
添付の指示書に従い遠心分離をおこなってヒト好中球層
を単離した。この細胞を１％ＢＳＡ添加ＲＰＭＩ−１６
４０培地にて洗浄した後、混入した赤血球を１５０mMの
塩化アンモニウム溶液にて除去した。これを遠心分離し
た後、細胞を１％ＢＳＡ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地に
て洗浄し、２ｘ１０⁷ Cells／mlの細胞濃度になるよう
に再懸濁した。この細胞懸濁液の好中球の含有率は、サ
イトスピン（Ｓｈａｎｄｏｎ社）による塗抹標本をＤｉ
ｆｆ−Ｑｕｉｋ（ミドリ十字社製）染色して測定した結
果９５％以上であった。

【０１６３】上記好中球懸濁液を遠心分離し、結合バッ
ファー（１％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウムを含
むＤ−ＰＢＳ）にて細胞濃度２ｘ１０⁷ Cells／mlにな
るように再懸濁した。この時、好中球上のＦｃレセプタ
ーをあらかじめ飽和する目的で、本発明のヒト抗体と同
一のＦｃ部分を有するＳＫ２キメラ抗体（国際特許出願
出願番号ＰＣＴ／ＪＰ９４／００８５９参照）とその抗
原であるヒトＩＬ−６をそれぞれ濃度約５０μｇ／mlお
よび約４０ng／mlになるように添加し、氷温中で３０分
間インキュベートした。

【０１６４】¹²⁵Ｉで放射標識したＩＬ−８（７４ＴＢ
ｑ／ｍｍｏｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）と未標識ＩＬ−
８（Ａｍｅｒｓｂａｍ社製）を各濃度が４ng／mlになる
ように結合バッファーにて混合し調製した。キメラＷＳ
−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）、再構成ヒト抗体（ＲＶＬ
ａ／ＲＶＨｇおよびＲＶＬｂ／ＲＶＨｇ）、陰性対照の
ヒト抗体（ＰＡＥＳＥＬ＋ＬＯＲＥＩ社製）あるいは陽
性対照のマウスＷＳ−４抗体のそれぞれを結合バッファ
ーにて濃度２０００ng／mlから約８ng／mlまで２倍段階
希釈した。ＩＬ−８溶液ならびに各抗体溶液をそれぞれ
５０μｌずつ混合し氷温中で３０分間インキュベートし
た。その後、上記好中球懸濁液１００μｌを添加し、更
に１５分毎に撹拌しながら氷温中で１時間インキュベー
トした。インキュベート後、この細胞懸濁液を２００μ
ｌの２０％サッカロース溶液に重層し、遠心、凍結させ
た。細胞に結合したＩＬ−８を測定するため、細胞沈渣
を切断し、γ−カウンター（アロカ社製）で放射活性を
測定した。その結果を図８に示す。

【０１６５】再構成ヒトＷＳ−４抗体のＬ鎖「ａ」バー
ジョン（ＲＶＬａ）と同Ｈ鎖「ｇ」バージョン（ＲＶＨ
ｇ）、または同Ｌ鎖「ｂ」バージョン（ＲＶＬｂ）と同
Ｈ鎖「ｇ」バージョン（ＲＶＨｇ）を有する抗体は、Ｉ
Ｌ−８レセプターに対するＩＬ−８の結合に対して、キ
メラ抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）と同程度の結合阻害活性を
有することが明らかになった。

【０１６６】なお、前記プラスミドＨＥＦ−ＲＶＬａ−
ｇκを有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉＤＨ５α（ＨＥＦ−ＲＶＬａ−ｇκ）、およびプラ
スミドＨＥＦ−ＲＶＨｇ−ｇγ１を含有する大腸菌はＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０９（ＨＥＦ
−ＲＶＨｇ−ｇγ１）として工業技術院生命工学工業技
術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成
６年７月１２日に、各々ＦＥＲＭＢＰ−４７３８およ
び、ＦＥＲＭＢＰ−４７４１としてブタペスト条約に
基づき国際寄託された。

【０１６７】参考例１．ハイブリドーマＷＳ−４の作
製抗ヒトＩＬ−８モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマは、ヒトＩＬ−８で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス
の脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６
５３をポリエチレングリコールを用いた常法により融合
して作製した。ヒトＩＬ−８と結合する活性を指標とし
たスクリーニングを行い、ハイブリドーマＷＳ−４を樹
立した（Ｋｏ，Ｙ−Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ，１４９，２２７−２３５，１９９２）。

【０１６８】

【発明の効果】本発明はヒトＩＬ−８に対する再構成ヒ
ト抗体を提供し、この抗体においてはヒト抗体のＶ領域
のＣＤＲがヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル
抗体のＣＤＲにより置き換えられている。この再構成ヒ
ト抗体の大部分がヒト抗体に由来し、そしてＣＤＲは元
来、抗原性が低いことから、本発明の再構成ヒト抗体は
ヒトに対する抗原性が低く、そしてそれ故に医学療法用
として期待される。

【０１６９】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＫＶ１配列 ACTAGTCGAC ATGAAGTTGC CTGTTAGGCT GTTGGTGCTG 40

【０１７０】配列番号：２配列の長さ：３９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＫＶ２配列 ACTAGTCGAC ATGGAGWCAG ACACACTCCT GYTATGGGT 39

【０１７１】配列番号：３配列の長さ：４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＫＶ３配列 ACTAGTCGAC ATGAGTGTGC TCACTCAGGT CCTGGSGTTG 40

【０１７２】配列番号：４配列の長さ：４３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＫＶ４配列 ACTAGTCGAC ATGAGGRCCC CTGCTCAGWT TYTTGGMWTC TTG 43

【０１７３】配列番号：５配列の長さ：４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＫＶ５配列 ACTAGTCGAC ATGGATTTWC AGGTGCAGAT TWTCAGCTTC 40

【０１７４】配列番号：６配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＫＶ６配列 ACTAGTCGAC ATGAGGTKCY YTGYTSAGYT YCTGRGG 37

【０１７５】配列番号：７配列の長さ：４１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＫＶ７配列 ACTAGTCGAC ATGGGCWTCA AGATGGAGTC ACAKWYYCWG G 41

【０１７６】配列番号：８配列の長さ：４１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＫＶ８配列 ACTAGTCGAC ATGTGGGGAY CTKTTTYCMM TTTTTCAATT G 41

【０１７７】配列番号：９配列の長さ：３５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＫＶ９配列 ACTAGTCGAC ATGGTRTCCW CASCTCAGTT CCTTG 35

【０１７８】配列番号：１０配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＫＶ１０配列 ACTAGTCGAC ATGTATATAT GTTTGTTGTC TATTTCT 37

【０１７９】配列番号：１１配列の長さ：３８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＫＶ１１配列 ACTAGTCGAC ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCC 38

【０１８０】配列番号：１２配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＫＣ配列 GGATCCCGGG TGGATGGTGG GAAGATG 27

【０１８１】配列番号：１３配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＨＶ１配列 ACTAGTCGAC ATGAAATGCA GCTGGGTCAT STTCTTC 37

【０１８２】配列番号：１４配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＨＶ２配列 ACTAGTCGAC ATGGGATGGA GCTRTATCAT SYTCTT 36

【０１８３】配列番号：１５配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＨＶ３配列 ACTAGTCGAC ATGAAGWTGT GGTTAAACTG GGTTTTT 37

【０１８４】配列番号：１６配列の長さ：３５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＨＶ４配列 ACTAGTCGAC ATGRACTTTG GGYTCAGCTT GRTTT 35

【０１８５】配列番号：１７配列の長さ：４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＨＶ５配列 ACTAGTCGAC ATGGACTCCA GGCTCAATTT AGTTTTCCTT 40

【０１８６】配列番号：１８配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＨＶ６配列 ACTAGTCGAC ATGGCTGTCY TRGSGCTRCT CTTCTGC 37

【０１８７】配列番号：１９配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＨＶ７配列 ACTAGTCGAC ATGGRATGGA GCKGGRTCTT TMTCTT 36

【０１８８】配列番号：２０配列の長さ：３３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＨＶ８配列 ACTAGTCGAC ATGAGAGTGC TGATTCTTTT GTG 33

【０１８９】配列番号：２１配列の長さ：４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＨＶ９配列 ACTAGTCGAC ATGGMTTGGG TGTGGAMCTT GCTATTCCTG 40

【０１９０】配列番号：２２配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＨＶ１０配列 ACTAGTCGAC ATGGGCAGAC TTACATTCTC ATTCCTG 37

【０１９１】配列番号：２３配列の長さ：３８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＨＶ１１配列 ACTAGTCGAC ATGGATTTTG GGCTGATTTT TTTTATTG 38

【０１９２】配列番号：２４配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＨＶ１２配列 ACTAGTCGAC ATGATGGTGT TAAGTCTTCT GTACCTG 37

【０１９３】配列番号：２５配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＭＨＣ配列 GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG 28

【０１９４】配列番号：２６配列の長さ：３８２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列の名称：ＷＳ４ＶＬ起源生物名：マウス直接の起源クローン：ｐＵＣ−ＷＳ４−ＶＬ特徴：１．．６０ｓｉｇｐｅｐｔｉｄｅ６１．．３８２ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ配列 ATG AGT GTG CTC ACT CAG GTC CTG GGG TTG CTG CTG CTG TGG CTT ACA 48 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr -20 -15 -10 -5 GGT GCC AGA TGT GAC ATC CAG ATG ACT CAG TCT CCA GCC TCC CTA TCT 96 Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser -1 1 5 10 GCA TCT GTG GGA GAA ACT GTC ACC ATC ACA TGT CGA GCA AGT GAG ATT 144 Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ile 15 20 25 ATT TAC AGT TAT TTA GCA TGG TAT CAG CAG AAA CAG GGA AAA TCT CCT 192 Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 30 35 40 CAG CTC CTG GTC TAT AAT GCA AAA ACC TTA GCA GAT GGT GTG TCA TCA 240 Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Ser Ser 45 50 55 60 AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGC ACA CAG TTT TCT CTG CGG ATC AGC 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Arg Ile Ser 65 70 75 AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GGG AGT TAT TAC TGT CAA CAT CAT TTT 336 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Phe 80 85 90 GGT TTT CCT CGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA CTC AAA C 382 Gly Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 95 100 105

【０１９５】配列番号：２７配列の長さ：４２４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列の名称：ＷＳ４ＶＨ起源生物名：マウス直接の起源クローン：ｐＵＣ−ＷＳ４−ＶＨ特徴：１．．５７ｓｉｇｐｅｐｔｉｄｅ５８．．４２４ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ配列 ATG AAG TTG TGG TTA AAC TGG GTT TTT CTT GTG ACA CTT TTA AAT GGT 48 Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly -19 -15 -10 -5 ATC CAG TGT GAG GTG AAA CTG GTG GAG TCT GGA GGA GGC TTG ATA CAG 96 Ile Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln -1 1 5 10 CCT GGG GAT TCT CTG AGA CTC TCC TGT GTA ACC TCT GGG TTC ACC TTC 144 Pro Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe 15 20 25 AGT GAT TAC TAC CTG AGC TGG GTC CGC CAG CCT CCA GGA AAG GCA CTT 192 Ser Asp Tyr Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu 30 35 40 45 GAG TGG GTG GGT CTC ATT AGA AAC AAA GCC AAT GGT TAC ACA AGA GAG 240 Glu Trp Val Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu 50 55 60 TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGT CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAT GAT TCC 288 Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 65 70 75 CAA AGC ATC CTC TAT CTT CAA ATG AAC ACC CTG AGA GGT GAG GAC AGT 336 Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Gly Glu Asp Ser 80 85 90 GCC ACT TAT TAC TGT GCA CGA GAG AAC TAT AGG TAC GAC GTA GAG CTT 384 Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu 95 100 105 GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA G 424 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 110 115 120

【０１９６】配列番号：２８配列の長さ：３４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ｃｈＶＬ後方プライマー配列 ACAAAGCTTC CACCATGAGT GTGCTCACTC AGGT 34

【０１９７】配列番号：２９配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ｃｈＶＨ後方プライマー配列 GATAAGCTTC CACCATGAAG TTGTGGTTAA ACTGGGT 37

【０１９８】配列番号：３０配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ｃｈＶＬ前方プライマー配列 CTTGGATCCA CTCACGTTTG AGTTCCAGCT TGGTGCC 37

【０１９９】配列番号：３１配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ｃｈＶＨ前方プライマー配列 GTCGGATCCA CTCACCTGCA GAGACAGTGA CCAGAGT 37

【０２００】配列番号：３２配列の長さ：１３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＨＦ１配列 TAAGCTTCCA CCATGGAGTT TGGGCTGAGC TGGGTTTTCC TTGTTGCTAT 50 TTTAAAGGGT GTCCAGTGTG AAGTGCAGCT GTTGGAGTCT GGGGGAGGCT 100 TGGTCCAGCC TGGGGGTTCT CTGAGACTCT CATGTGC 137

【０２０１】配列番号：３３配列の長さ：１４３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＨＦ２配列 GCACTGTACT CTCTTGTGTA ACCATTGGCT TTGTTTCTAA TGAGACCCAC 50 CAACTCTAGC CCTTTCCCTT GAGCTTGGCG GACCCAGCTC AGGTAGTAAT 100 CACTGAAGGT GAATCCAGAG GCAGCACATG AGAGTCTCAG AGA 143

【０２０２】配列番号：３４配列の長さ：１１３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＨＦ３配列 TACACAAGAG AGTACAGTGC ATCTGTGAAG GGCAGACTTA CCATCTCAAG 50 AGAAGATTCA AAGAACACGC TGTATCTGCA AATGAGCAGC CTGAAAACCG 100 AAGACTTGGC CGT 113

【０２０３】配列番号：３５配列の長さ：１１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＨＦ４配列 TCGGATCCAC TCACCTGAGG AGACGGTGAC CAGGGTTCCC TGGCCCCAGT 50 AAGCAAGCTC TACGTCGTAG CGATAGTTCT CTCTAGCACA GTAATACACG 100 GCCAAGTCTT CGGTTTT 117

【０２０４】配列番号：３６配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＲＶＨ５’プライマー配列 GATAAGCTTC CACCATGGAG TTTGGGCTGA GCTGGGT 37

【０２０５】配列番号：３７配列の長さ：３１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＲＶＨ３’プライマー配列 GTCGGATCCA CTCACCTGAG GAGACGGTGA C 31

【０２０６】配列番号：３８配列の長さ：４２４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＲＶＨａ起源生物名：マウス及びヒト直接の起源クローン：ＨＥＦ−ＲＶＨａ−ｇγ１アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒアミノ酸１−３０：ＦＲ１アミノ酸３１−３５：ＣＤＲ１アミノ酸３６−４９：ＦＲ２アミノ酸５０−６８：ＣＤＲ２アミノ酸６９−１００：ＦＲ３アミノ酸１０１−１１１：ＣＤＲ３アミノ酸１１２−１２２：ＦＲ４配列 ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT GCT ATT TTA AAG GGT 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly -19 -15 -10 -5 GTC CAG TGT GAA GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln -1 1 5 10 CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCA TGT GCT GCC TCT GGA TTC ACC TTC 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 15 20 25 AGT GAT TAC TAC CTG AGC TGG GTC CGC CAA GCT CAA GGG AAA GGG CTA 192 Ser Asp Tyr Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45 GAG TTG GTG GGT CTC ATT AGA AAC AAA GCC AAT GGT TAC ACA AGA GAG 240 Glu Leu Val Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu 50 55 60 TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGC AGA CTT ACC ATC TCA AGA GAA GAT TCA 288 Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser 65 70 75 AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AGC AGC CTG AAA ACC GAA GAC TTG 336 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu 80 85 90 GCC GTG TAT TAC TGT GCT AGA GAG AAC TAT CGC TAC GAC GTA GAG CTT 384 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu 95 100 105 GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA G 424 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２０７】配列番号：３９配列の長さ：３４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＬＴＷ１配列 GGCTAGAGTG GGTGGGTCTC ATTAGAAACA AAGC 34

【０２０８】配列番号：４０配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＬＴＷ２配列 GAGACCCACC CACTCTAGCC CTTTCCCTTG AGCTTG 36

【０２０９】配列番号：４１配列の長さ：４２４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＲＶＨｂ起源生物名：マウス及びヒト直接の起源クローン：ＨＥＦ−ＲＶＨｂ−ｇγ１アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒアミノ酸１−３０：ＦＲ１アミノ酸３１−３５：ＣＤＲ１アミノ酸３６−４９：ＦＲ２アミノ酸５０−６８：ＣＤＲ２アミノ酸６９−１００：ＦＲ３アミノ酸１０１−１１１：ＣＤＲ３アミノ酸１１２−１２２：ＦＲ４配列 ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT GCT ATT TTA AAG GGT 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly -19 -15 -10 -5 GTC CAG TGT GAA GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln -1 1 5 10 CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCA TGT GCT GCC TCT GGA TTC ACC TTC 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 15 20 25 AGT GAT TAC TAC CTG AGC TGG GTC CGC CAA GCT CAA GGG AAA GGG CTA 192 Ser Asp Tyr Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG GTG GGT CTC ATT AGA AAC AAA GCC AAT GGT TAC ACA AGA GAG 240 Glu Trp Val Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu 50 55 60 TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGC AGA CTT ACC ATC TCA AGA GAA GAT TCA 288 Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser 65 70 75 AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AGC AGC CTG AAA ACC GAA GAC TTG 336 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu 80 85 90 GCC GTG TAT TAC TGT GCT AGA GAG AAC TAT CGC TAC GAC GTA GAG CTT 384 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu 95 100 105 GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA G 424 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２１０】配列番号：４２配列の長さ：３２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＱＴＰ１配列 TGGGTCCGCC AAGCTCCAGG GAAAGGGCTA GA 32

【０２１１】配列番号：４３配列の長さ：３２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＱＴＰ２配列 TCTAGCCCTT TCCCTGGAGC TTGGCGGACC CA 32

【０２１２】配列番号：４４配列の長さ：４２４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＲＶＨｃ起源生物名：マウス及びヒト直接の起源クローン：ＨＥＦ−ＲＶＨｃ−ｇγ１アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒアミノ酸１−３０：ＦＲ１アミノ酸３１−３５：ＣＤＲ１アミノ酸３６−４９：ＦＲ２アミノ酸５０−６８：ＣＤＲ２アミノ酸６９−１００：ＦＲ３アミノ酸１０１−１１１：ＣＤＲ３アミノ酸１１２−１２２：ＦＲ４配列 ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT GCT ATT TTA AAG GGT 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly -19 -15 -10 -5 GTC CAG TGT GAA GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln -1 1 5 10 CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCA TGT GCT GCC TCT GGA TTC ACC TTC 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 15 20 25 AGT GAT TAC TAC CTG AGC TGG GTC CGC CAA GCT CCA GGG AAA GGG CTA 192 Ser Asp Tyr Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45 GAG TTG GTG GGT CTC ATT AGA AAC AAA GCC AAT GGT TAC ACA AGA GAG 240 Glu Leu Val Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu 50 55 60 TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGC AGA CTT ACC ATC TCA AGA GAA GAT TCA 288 Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser 65 70 75 AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AGC AGC CTG AAA ACC GAA GAC TTG 336 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu 80 85 90 GCC GTG TAT TAC TGT GCT AGA GAG AAC TAT CGC TAC GAC GTA GAG CTT 384 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu 95 100 105 GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA G 424 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２１３】配列番号：４５配列の長さ：４２４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＲＶＨｄ起源生物名：マウス及びヒト直接の起源クローン：ＨＥＦ−ＲＶＨｄ−ｇγ１アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒアミノ酸１−３０：ＦＲ１アミノ酸３１−３５：ＣＤＲ１アミノ酸３６−４９：ＦＲ２アミノ酸５０−６８：ＣＤＲ２アミノ酸６９−１００：ＦＲ３アミノ酸１０１−１１１：ＣＤＲ３アミノ酸１１２−１２２：ＦＲ４配列 ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT GCT ATT TTA AAG GGT 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly -19 -15 -10 -5 GTC CAG TGT GAA GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln -1 1 5 10 CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCA TGT GCT GCC TCT GGA TTC ACC TTC 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 15 20 25 AGT GAT TAC TAC CTG AGC TGG GTC CGC CAA GCT CCA GGG AAA GGG CTA 192 Ser Asp Tyr Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG GTG GGT CTC ATT AGA AAC AAA GCC AAT GGT TAC ACA AGA GAG 240 Glu Trp Val Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu 50 55 60 TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGC AGA CTT ACC ATC TCA AGA GAA GAT TCA 288 Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser 65 70 75 AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AGC AGC CTG AAA ACC GAA GAC TTG 336 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu 80 85 90 GCC GTG TAT TAC TGT GCT AGA GAG AAC TAT CGC TAC GAC GTA GAG CTT 384 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu 95 100 105 GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA G 424 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２１４】配列番号：４６配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＡＴＰ１配列 TGGGTCCGCC AACCTCCAGG GAAAGG 26

【０２１５】配列番号：４７配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＡＴＰ２配列 CCTTTCCCTG GAGGTTGGCG GACCCA 26

【０２１６】配列番号：４８配列の長さ：４２４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＲＶＨｅ起源生物名：マウス及びヒト直接の起源クローン：ＨＥＦ−ＲＶＨｅ−ｇγ１アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒアミノ酸１−３０：ＦＲ１アミノ酸３１−３５：ＣＤＲ１アミノ酸３６−４９：ＦＲ２アミノ酸５０−６８：ＣＤＲ２アミノ酸６９−１００：ＦＲ３アミノ酸１０１−１１１：ＣＤＲ３アミノ酸１１２−１２２：ＦＲ４配列 ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT GCT ATT TTA AAG GGT 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly -19 -15 -10 -5 GTC CAG TGT GAA GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln -1 1 5 10 CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCA TGT GCT GCC TCT GGA TTC ACC TTC 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 15 20 25 AGT GAT TAC TAC CTG AGC TGG GTC CGC CAA CCT CCA GGG AAA GGG CTA 192 Ser Asp Tyr Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG GTG GGT CTC ATT AGA AAC AAA GCC AAT GGT TAC ACA AGA GAG 240 Glu Trp Val Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu 50 55 60 TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGC AGA CTT ACC ATC TCA AGA GAA GAT TCA 288 Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser 65 70 75 AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AGC AGC CTG AAA ACC GAA GAC TTG 336 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu 80 85 90 GCC GTG TAT TAC TGT GCT AGA GAG AAC TAT CGC TAC GAC GTA GAG CTT 384 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu 95 100 105 GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA G 424 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２１７】配列番号：４９配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＧＴＡ１配列 CAAGCTCCAG GGAAAGCGCT AGAGTGGGT 29

【０２１８】配列番号：５０配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＧＴＡ２配列 ACCCACTCTA GCGCTTTCCC TGGAGCTTG 29

【０２１９】配列番号：５１配列の長さ：４２４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＲＶＨｆ起源生物名：マウス及びヒト直接の起源クローン：ＨＥＦ−ＲＶＨｆ−ｇγ１アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒアミノ酸１−３０：ＦＲ１アミノ酸３１−３５：ＣＤＲ１アミノ酸３６−４９：ＦＲ２アミノ酸５０−６８：ＣＤＲ２アミノ酸６９−１００：ＦＲ３アミノ酸１０１−１１１：ＣＤＲ３アミノ酸１１２−１２２：ＦＲ４配列 ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT GCT ATT TTA AAG GGT 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly -19 -15 -10 -5 GTC CAG TGT GAA GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln -1 1 5 10 CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCA TGT GCT GCC TCT GGA TTC ACC TTC 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 15 20 25 AGT GAT TAC TAC CTG AGC TGG GTC CGC CAA GCT CCA GGG AAA GCG CTA 192 Ser Asp Tyr Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu 30 35 40 45 GAG TGG GTG GGT CTC ATT AGA AAC AAA GCC AAT GGT TAC ACA AGA GAG 240 Glu Trp Val Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu 50 55 60 TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGC AGA CTT ACC ATC TCA AGA GAA GAT TCA 288 Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser 65 70 75 AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AGC AGC CTG AAA ACC GAA GAC TTG 336 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu 80 85 90 GCC GTG TAT TAC TGT GCT AGA GAG AAC TAT CGC TAC GAC GTA GAG CTT 384 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu 95 100 105 GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA G 424 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２２０】配列番号：５２配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＬＴＦ１配列 GTGAAGGGCA GATTTACCAT CTC 23

【０２２１】配列番号：５３配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＬＴＦ２配列 GAGATGGTAA ATCTGCCCTT CAC 23

【０２２２】配列番号：５４配列の長さ：４２４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＲＶＨｇ起源生物名：マウス及びヒト直接の起源クローン：ＨＥＦ−ＲＶＨｇ−ｇγ１アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒアミノ酸１−３０：ＦＲ１アミノ酸３１−３５：ＣＤＲ１アミノ酸３６−４９：ＦＲ２アミノ酸５０−６８：ＣＤＲ２アミノ酸６９−１００：ＦＲ３アミノ酸１０１−１１１：ＣＤＲ３アミノ酸１１２−１２２：ＦＲ４配列 ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT GCT ATT TTA AAG GGT 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly -19 -15 -10 -5 GTC CAG TGT GAA GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln -1 1 5 10 CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCA TGT GCT GCC TCT GGA TTC ACC TTC 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 15 20 25 AGT GAT TAC TAC CTG AGC TGG GTC CGC CAA GCT CCA GGG AAA GGG CTA 192 Ser Asp Tyr Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG GTG GGT CTC ATT AGA AAC AAA GCC AAT GGT TAC ACA AGA GAG 240 Glu Trp Val Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu 50 55 60 TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGC AGA TTT ACC ATC TCA AGA GAA GAT TCA 288 Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser 65 70 75 AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AGC AGC CTG AAA ACC GAA GAC TTG 336 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu 80 85 90 GCC GTG TAT TAC TGT GCT AGA GAG AAC TAT CGC TAC GAC GTA GAG CTT 384 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu 95 100 105 GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA G 424 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２２３】配列番号：５５配列の長さ：４２４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＲＶＨｈ起源生物名：マウス及びヒト直接の起源クローン：ＨＥＦ−ＲＶＨｈ−ｇγ１アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒアミノ酸１−３０：ＦＲ１アミノ酸３１−３５：ＣＤＲ１アミノ酸３６−４９：ＦＲ２アミノ酸５０−６８：ＣＤＲ２アミノ酸６９−１００：ＦＲ３アミノ酸１０１−１１１：ＣＤＲ３アミノ酸１１２−１２２：ＦＲ４配列 ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT GCT ATT TTA AAG GGT 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly -19 -15 -10 -5 GTC CAG TGT GAA GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln -1 1 5 10 CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCA TGT GCT GCC TCT GGA TTC ACC TTC 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 15 20 25 AGT GAT TAC TAC CTG AGC TGG GTC CGC CAA GCT CAA GGG AAA GGG CTA 192 Ser Asp Tyr Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG GTG GGT CTC ATT AGA AAC AAA GCC AAT GGT TAC ACA AGA GAG 240 Glu Trp Val Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu 50 55 60 TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGC AGA TTT ACC ATC TCA AGA GAA GAT TCA 288 Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser 65 70 75 AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AGC AGC CTG AAA ACC GAA GAC TTG 336 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Leu 80 85 90 GCC GTG TAT TAC TGT GCT AGA GAG AAC TAT CGC TAC GAC GTA GAG CTT 384 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu 95 100 105 GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA G 424 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【０２２４】配列番号：５６配列の長さ：１２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＬＦ１配列 TTGAAGCTTC CACCATGGGA TGGAGCTGTA TCATCCTCTT CTTGGTAGCA 50 ACAGCTACAG GTGTCCACTC CGACATCCAG ATGACCCAGA GCCCAAGCAG 100 CCTGAGCGCC AGCGTAGGTG ACAG 124

【０２２５】配列番号：５７配列の長さ：１２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＬＦ２配列 GCATTGTAGA TCAGCAGCTT TGGAGCCTTT CCTGGCTTCT GCTGGTACCA 50 TGCTAAATAA CTGTAAATAA TCTCGCTTGC TCGACAGGTG ATGGTCACTC 100 TGTCACCTAC GCTGGCGCTC AG 122

【０２２６】配列番号：５８配列の長さ：１２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＬＦ３配列 AGCTGCTGAT CTACAATGCA AAAACCTTAG CAGATGGAGT GCCAAGCAGA 50 TTCAGCGGTA GCGGTAGCGG TACCGACTTC ACCTTCACCA TCAGCAGCCT 100 CCAGCCAGAG GACATCGCTA C 121

【０２２７】配列番号：５９配列の長さ：１０６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＬＦ４配列 GTAGGATCCA CTCACGTTTG ATTTCGACCT TGGTCCCTTG GCCGAACGTC 50 CGAGGAAAAC CAAAATGATG TTGGCAGTAG TAGGTAGCGA TGTCCTCTGG 100 CTGGAG 106

【０２２８】配列番号：６０配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＲＶＬ５’ 配列 TTGAAGCTTC CACCATGGGA 20

【０２２９】配列番号：６１配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＲＶＬ３’ 配列 GTAGGATCCA CTCACGTTTG 20

【０２３０】配列番号：６２配列の長さ：３７９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＲＶＬａ起源生物名：マウス及びヒト直接の起源クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬａ−ｇκ アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒアミノ酸１−２３：ＦＲ１アミノ酸２４−３４：ＣＤＲ１アミノ酸３５−４９：ＦＲ２アミノ酸５０−５６：ＣＤＲ２アミノ酸５７−８８：ＦＲ３アミノ酸８９−９７：ＣＤＲ３アミノ酸９８−１０７：ＦＲ４配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -19 -15 -10 -5 GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC 96 Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala -1 1 5 10 AGC GTA GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT CGA GCA AGC GAG ATT ATT 144 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ile Ile 15 20 25 TAC AGT TAT TTA GCA TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA AAG GCT CCA AAG 192 Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 30 35 40 45 CTG CTG ATC TAC AAT GCA AAA ACC TTA GCA GAT GGA GTG CCA AGC AGA 240 Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC ACC TTC ACC ATC AGC AGC 288 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser 65 70 75 CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC TAC TGC CAA CAT CAT TTT GGT 336 Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Phe Gly 80 85 90 TTT CCT CGG ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTC GAA ATC AAA C 379 Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 95 100 105

【０２３１】配列番号：６３配列の長さ：３８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＦＴＹ１配列 AGCGGTAGCG GTACCGACTA CACCTTCACC ATCAGCAG 38

【０２３２】配列番号：６４配列の長さ：３８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＦＴＹ２配列 CTGCTGATGG TGAAGGTGTA GTCGGTACCG CTACCGCT 38

【０２３３】配列番号：６５配列の長さ：３７９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＲＶＬｂ起源生物名：マウス及びヒト直接の起源クローン：ＨＥＦ−ＲＶＬｂ−ｇκ アミノ酸 −１９−−１：ｌｅａｄｅｒアミノ酸１−２３：ＦＲ１アミノ酸２４−３４：ＣＤＲ１アミノ酸３５−４９：ＦＲ２アミノ酸５０−５６：ＣＤＲ２アミノ酸５７−８８：ＦＲ３アミノ酸８９−９７：ＣＤＲ３アミノ酸９８−１０７：ＦＲ４配列 ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -19 -15 -10 -5 GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC 96 Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala -1 1 5 10 AGC GTA GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT CGA GCA AGC GAG ATT ATT 144 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ile Ile 15 20 25 TAC AGT TAT TTA GCA TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA AAG GCT CCA AAG 192 Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 30 35 40 45 CTG CTG ATC TAC AAT GCA AAA ACC TTA GCA GAT GGA GTG CCA AGC AGA 240 Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TAC ACC TTC ACC ATC AGC AGC 288 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser 65 70 75 CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC TAC TGC CAA CAT CAT TTT GGT 336 Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Phe Gly 80 85 90 TTT CCT CGG ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTC GAA ATC AAA C 379 Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 95 100 105

【０２３４】配列番号：６６配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＥＦ１配列 CAGACAGTGG TTCAAAGT 18

【０２３５】配列番号：６７配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＨＩＰ配列 GCCCCAAAGC CAAGGTC 17

【０２３６】配列番号：６８配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列の名称：ＫＩＰ配列 AACTCAATGC TTTAGGCAAA 20

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、それぞれ本発明の抗体のＬ鎖およびＨ
鎖の発現のために有用な、ヒト・エロンゲーション・フ
ァクター−１α（ＨＥＦ−１α）プロモーター／エンハ
ンサー系を含んで成る発現ベクターＨＥＦ−ＶＬ−ｇκ
およびＨＥＦ−ＶＨ−ｇγ１を示す。

【図２】図２は、ＣＯＳ細胞の培養上清中に産生された
本発明のキメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）のヒト
ＩＬ−８に対する結合能の確認のためのＥＬＩＳＡの結
果を示すグラフである。

【図３】図３は、本発明の再構成ヒトＷＳ−４抗体のＨ
鎖Ｖ領域の第一バージョン「ａ」（ＲＶＨａ）、および
再構成ヒトＷＳ−４抗体のＬ鎖Ｖ領域の第一バージョン
「ａ」（ＲＶＬａ）の各アミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａを構築するためのダイヤグラムである。

【図４】図４は、本発明の再構成ヒトＷＳ−４抗体のＬ
鎖Ｖ領域（ＲＶＬａ）ならびにＨ鎖Ｖ領域（ＲＶＨａ）
を、それぞれキメラＷＳ−４抗体Ｈ鎖Ｖ領域（ｃｈＨ）
ならびにキメラＷＳ−４抗体Ｌ鎖Ｖ領域（ｃｈＬ）とＣ
ＯＳ細胞に発現させ、ヒトＩＬ−８に対する結合能と産
生量を、ＣＯＳ細胞の培養上清中に産生された本発明の
キメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）と比較するため
のＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図５】図５は、ＣＯＳ細胞の培養上清中に産生された
本発明のＲＶＬａを含んでなる８種の再構成ヒトＷＳ−
４抗体（ＲＶＬａ／ＲＶＨａ，ＲＶＬａ／ＲＶＨｂ，Ｒ
ＶＬａ／ＲＶＨｃ，ＲＶＬａ／ＲＶＨｄ，ＲＶＬａ／Ｒ
ＶＨｅ，ＲＶＬａ／ＲＶＨｆ，ＲＶＬａ／ＲＶＨｇ，Ｒ
ＶＬａ／ＲＶＨｈ）のヒトＩＬ−８に対する結合能と産
生量を、ＣＯＳ細胞の培養上清中に産生された本発明の
キメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）と比較するため
のＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図６】図６は、ＣＯＳ細胞の培養上清中に産生された
本発明のＲＶＬｂを含んでなる８種の再構成ヒトＷＳ−
４抗体（ＲＶＬｂ／ＲＶＨａ，ＲＶＬｂ／ＲＶＨｂ，Ｒ
ＶＬｂ／ＲＶＨｃ，ＲＶＬｂ／ＲＶＨｄ，ＲＶＬｂ／Ｒ
ＶＨｅ，ＲＶＬｂ／ＲＶＨｆ，ＲＶＬｂ／ＲＶＨｇ，Ｒ
ＶＬｂ／ＲＶＨｈ）のヒトＩＬ−８に対する結合能と産
生量を、ＣＯＳ細胞の培養上清中に産生された本発明の
キメラＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）と比較するため
のＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図７】図７は、精製した本発明の再構成ヒトＷＳ−４
抗体ＲＶＬａ／ＲＶＨｇ並びにＲＶＬｂ／ＲＶＨｇのヒ
トＩＬ−８に対する結合能を、精製した本発明のキメラ
ＷＳ−４抗体（ｃｈＬ／ｃｈＨ）と比較するためのＥＬ
ＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図８】図８は、精製した本発明の再構成ヒト型化抗体
ＲＶＬａ／ＲＶＨｇならびにＲＶＬｂ／ＲＶＨｇのＩＬ
−８レセプターに対するＩＬ−８の結合阻害活性をマウ
スＷＳ−４抗体ならびに本発明のキメラＷＳ−４抗体
（ｃｈＬ／ｃｈＨ）と比較するための、リガンドレセプ
ター結合阻害アッセイの結果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＡ６１Ｋ 39/395 ＡＢＮＣ１２Ｐ 21/08 ＡＢＳＵ // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＥ 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＡＢＮ 9162−4Ｂ 15/00 ＣＡＢＳ 9162−4ＢＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者佐藤功静岡県御殿場市駒門１丁目135番地中外製薬株式会社内 (72)発明者土屋政幸静岡県御殿場市駒門１丁目135番地中外製薬株式会社内 (72)発明者山崎達美静岡県御殿場市駒門１丁目135番地中外製薬株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトインターロイキン−８（ＩＬ−８）
に対するマウスモノクローナル抗体の軽鎖（Ｌ鎖）可変
領域（Ｖ領域）。
【請求項２】配列番号：２６に示されるアミノ酸配列
またはその一部を有する請求項１に記載のＬ鎖Ｖ領域。
【請求項３】ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクロー
ナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）Ｖ領域。
【請求項４】配列番号：２７に示されるアミノ酸配列
またはその一部を有する請求項３に記載のＨ鎖Ｖ領域。
【請求項５】ヒトＬ鎖定常領域（Ｃ領域）、及びヒト
ＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領
域を含んで成るキメラＬ鎖。
【請求項６】前記マウスＬ鎖Ｖ領域が配列番号：２６
に示されるアミノ酸配列またはその一部を有する請求項
５に記載のキメラＬ鎖。
【請求項７】ヒトＨ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−８に対
するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んで成
るキメラＨ鎖。
【請求項８】前記マウスＨ鎖Ｖ領域が配列番号：２７
に示されるアミノ酸配列またはその一部を有する請求項
７に記載のキメラＨ鎖。
【請求項９】（１）ヒトＬ鎖定常領域（Ｃ領域）、及
びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ
鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに（２）ヒトＨ鎖Ｃ領
域、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗
体のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖；を含んで成るキメラ
抗体。
【請求項１０】前記マウスＬ鎖Ｖ領域が配列番号：２
６に示されるアミノ酸配列またはその一部を有し、そし
て前記マウスＨ鎖Ｖ領域が配列番号：２７に示されるア
ミノ酸配列またはその一部を有する、請求項９に記載の
キメラ抗体。
【請求項１１】ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクロ
ーナル抗体のＬ鎖Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）。
【請求項１２】下記並びに配列番号：２６に示される
アミノ酸配列またはその一部を有する、請求項１１に記
載のＣＤＲ。ＣＤＲ１；Arg Ala Ser Glu Ile Ile Tyr Ser Tyr Leu
Ala ＣＤＲ２；Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp ＣＤＲ３；Gln His His Phe Gly Phe Pro Arg Thr
【請求項１３】ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクロ
ーナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ。
【請求項１４】下記並びに配列番号：２７に示される
アミノ酸配列またはその一部を有する、請求項１３に記
載のＣＤＲ。ＣＤＲ１；Asp Tyr Tyr Leu Ser ＣＤＲ２；Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr
Arg Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly ＣＤＲ３；Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu Ala
Tyr
【請求項１５】（１）ヒトＬ鎖Ｖ領域のフレームワー
ク領域（ＦＲ）、及び（２）ヒトＩＬ−８に対するマウ
スモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含んで
成るヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成（ｒｅｓｈａｐ
ｅｄ）ヒトＬ鎖Ｖ領域。
【請求項１６】前記ＣＤＲが請求項１２に示されるア
ミノ酸配列またはその一部を有する、請求項１５に記載
の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域。
【請求項１７】前記ＦＲがヒト抗体ＲＥＩに由来す
る、請求項１５又は１６に記載の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領
域。
【請求項１８】前記Ｌ鎖Ｖ領域が、表２においてＲＶ
Ｌａ又はＲＶＬｂとして示されるアミノ酸配列またはそ
の一部を有する請求項１５に記載の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領
域。
【請求項１９】（１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び
（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体
のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含んで成る、ヒトＩＬ−８に
対する抗体の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域。
【請求項２０】前記ＣＤＲが請求項１４に示されるア
ミノ酸配列またはその一部を有する、請求項１９に記載
の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域。
【請求項２１】前記ＦＲ１，２及び３がヒト抗体ＶＤ
Ｈ２６に由来し、およびＦＲ４がヒト抗体４Ｂ４に由来
する、請求項１９又は２０に記載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領
域。
【請求項２２】前記Ｈ鎖Ｖ領域が、表３および表４に
おけるＲＶＨａ，ＲＶＨｂ，ＲＶＨｃ，ＲＶＨｄ，ＲＶ
Ｈｅ，ＲＶＨｆ，ＲＶＨｇ、又はＲＶＨｈとして示され
るアミノ酸配列またはその一部を有する、請求項１９に
記載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域。
【請求項２３】（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、並びに（２）
ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノク
ローナル抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ領域、を
含んで成るヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体のＬ
鎖。
【請求項２４】前記ヒトＬ鎖Ｃ領域がヒトＣκ領域で
あり、ヒトＬ鎖ＦＲがＲＥＩに由来し、前記Ｌ鎖ＣＤＲ
が請求項１２に示されるアミノ酸配列またはその一部を
有する、請求項２３に記載の再構成ヒト抗体Ｌ鎖。
【請求項２５】前記Ｌ鎖Ｖ領域が表２においてＲＶＬ
ａ又はＲＶＬｂとして示されるアミノ酸配列またはその
一部を有する、請求項２３に記載の再構成ヒト抗体Ｌ
鎖。
【請求項２６】（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、並びに（２）
ヒトＨ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノク
ローナル抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域、を
含んで成るヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体のＨ
鎖。
【請求項２７】前記ヒトＨ鎖Ｃ領域がヒトＣγ１領域
であり、前記ヒトＨ鎖ＦＲ１，２及び３がヒト抗体ＶＤ
Ｈ２６に由来し；ＦＲ４がヒト抗体４Ｂ４に由来し、前
記Ｈ鎖ＣＤＲが請求項１４に示されるアミノ酸配列また
はその一部を有する、請求項２６に記載の再構成ヒト抗
体Ｈ鎖。
【請求項２８】前記Ｈ鎖Ｖ領域が表３および表４にお
けるＲＶＨａ，ＲＶＨｂ，ＲＶＨｃ，ＲＶＨｄ，ＲＶＨ
ｅ，ＲＶＨｆ，ＲＶＨｇ、又はＲＶＨｈとして示される
アミノ酸配列またはその一部を有する、請求項２６に記
載の再構成ヒト抗体Ｈ鎖。
【請求項２９】（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、並びに
（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウス
モノクローナル抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ領
域、を含んで成るＬ鎖；並びに（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、並びに（２）ヒトＨ鎖Ｆ
Ｒ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗
体のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域、を含んで成る
Ｈ鎖；を含んで成るヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗
体。
【請求項３０】前記Ｌ鎖ＣＤＲが請求項１２に示され
るアミノ酸配列またはその一部を有し、前記Ｈ鎖ＣＤＲ
が請求項１４に示されるアミノ酸配列またはその一部を
有する、請求項２９に記載の再構成ヒト抗体。
【請求項３１】前記Ｌ鎖ＣＤＲが請求項１２に示され
るアミノ酸配列またはその一部を有し、前記Ｈ鎖ＣＤＲ
が請求項１４に示されるアミノ酸配列またはその一部を
有し；前記ヒトＬ鎖ＦＲがヒト抗体ＲＥＩに由来し；前
記ヒトＨ鎖ＦＲ１，２及び３がヒト抗体ＶＤＨ２６に由
来し、ＦＲ４がヒト抗体４Ｂ４に由来し、前記ヒトＬ鎖
Ｃ領域はヒトＣκ領域であり；そして前記ヒトＨ鎖Ｃ領
域はヒトＣγ１領域である、請求項２９に記載の再構成
ヒト抗体。
【請求項３２】前記Ｌ鎖ＣＤＲが請求項１２に示され
るアミノ酸配列またはその一部を有し、前記Ｈ鎖ＣＤＲ
が請求項１４に示されるアミノ酸配列またはその一部を
有し；前記ヒトＬ鎖ＦＲがヒト抗体ＲＥＩに由来し；前
記ヒトＨ鎖ＦＲ１，２及び３がヒト抗体ＶＤＨ２６に由
来し、ＦＲ４がヒト抗体４Ｂ４に由来し、前記ヒトＬ鎖
Ｃ領域はＣκ領域であり；そして前記ヒトＨ鎖Ｃ領域は
Ｃγ４である、請求項２９に記載の再構成ヒト抗体。
【請求項３３】前記Ｌ鎖Ｖ領域が表２においてＲＶＬ
ａ又はＲＶＬｂとして示されるアミノ酸配列またはその
一部を有する、請求項２９に記載の再構成ヒト抗体。
【請求項３４】前記Ｈ鎖Ｖ領域が表３および表４にお
けるＲＶＨａ，ＲＶＨｂ，ＲＶＨｃ，ＲＶＨｄ，ＲＶＨ
ｅ，ＲＶＨｆ，ＲＶＨｇ、又はＲＶＨｈとして示される
アミノ酸配列またはその一部を有する、請求項２９に記
載の再構成ヒト抗体。
【請求項３５】（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域；及び（２）ヒ
トＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ
領域；を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体のキメ
ラＬ鎖をコードするＤＮＡ。
【請求項３６】前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：２６に示
されるアミノ酸配列またはその一部をコードする、請求
項３５に記載のＤＮＡ。
【請求項３７】前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：２６に示
されるヌクレオチド配列またはその一部を有する請求項
３５に記載のＤＮＡ。
【請求項３８】（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域；及び（２）ヒ
トＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ
領域を含んで成る、ヒトＩＬ−８に対する抗体のキメラ
Ｈ鎖をコードするＤＮＡ。
【請求項３９】前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：２７に示
されるアミノ酸配列またはその一部をコードする、請求
項３８に記載のＤＮＡ。
【請求項４０】前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：２７に示
されるヌクレオチド配列またはその一部を有する請求項
３８に記載のＤＮＡ。
【請求項４１】ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクロ
ーナル抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ。
【請求項４２】前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：２６に示
されるアミノ酸配列またはその一部をコードする、請求
項４１に記載のＤＮＡ。
【請求項４３】前記Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡが
配列番号：２６に示されるヌクレオチド配列またはその
一部を有する、請求項４１に記載のＤＮＡ。
【請求項４４】ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクロ
ーナル抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ。
【請求項４５】前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：２７に示
されるアミノ酸配列またはその一部をコードする、請求
項４４に記載のＤＮＡ。
【請求項４６】前記Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡが
配列番号：２７に示されるヌクレオチド配列またはその
一部を有する、請求項４４に記載のＤＮＡ。
【請求項４７】ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクロ
ーナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲをコードするＤＮＡ。
【請求項４８】前記ＣＤＲが請求項１２に示されるア
ミノ酸配列またはその一部をコードする、請求項４７に
記載のＣＤＲをコードするＤＮＡ。
【請求項４９】前記ＣＤＲが配列番号：２６に示され
るヌクレオチド配列またはその一部を有する、請求項４
７に記載のＣＤＲをコードするＤＮＡ。
【請求項５０】ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクロ
ーナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲをコードするＤＮＡ。
【請求項５１】前記ＣＤＲが請求項１４に示されるア
ミノ酸配列またはその一部を有する、請求項５０に記載
のＣＤＲをコードするＤＮＡ。
【請求項５２】前記ＣＤＲが配列番号：２７に示され
るヌクレオチド配列またはその一部を有する、請求項５
０に記載のＣＤＲをコードするＤＮＡ。
【請求項５３】（１）ヒトＬ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び
（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体
のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲを含んで成る、ヒトＩＬ−８に対
する抗体の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ。
【請求項５４】前記ＣＤＲが請求項１２に示されるア
ミノ酸配列またはその一部を有する、請求項５３に記載
の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ。
【請求項５５】前記ＦＲがヒト抗体ＲＥＩに由来す
る、請求項５３又は５４に記載の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域
をコードするＤＮＡ。
【請求項５６】前記Ｌ鎖Ｖ領域が表２におけるＲＶＬ
ａ又はＲＶＬｂとして示されるアミノ酸配列またはその
一部をコードする、請求項５３に記載のＤＮＡ。
【請求項５７】配列番号：６２又は配列番号：６５に
示されるヌクレオチド配列またはその一部を有する請求
項５３に記載のＤＮＡ。
【請求項５８】（１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び
（２）ヒトＩＬ−８に対するマウスモノクローナル抗体
のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、を含んで成る、ヒトＩＬ−８に
対する抗体の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮ
Ａ。
【請求項５９】前記ＣＤＲが請求項１４に示されるア
ミノ酸配列またはその一部を有する、請求項５８に記載
の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ。
【請求項６０】前記ＦＲ１，２及び３がヒト抗体ＶＤ
Ｈ２６に由来し、並びにＦＲ４がヒト抗体４Ｂ４に由来
する、請求項５８又は５９に記載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領
域をコードするＤＮＡ。
【請求項６１】Ｈ鎖Ｖ領域が表３および表４における
ＲＶＨａ，ＲＶＨｂ，ＲＶＨｃ，ＲＶＨｄ，ＲＶＨｅ，
ＲＶＨｆ，ＲＶＨｇ、又はＲＶＨｈとして示されるアミ
ノ酸配列またはその一部をコードする、請求項５８に記
載の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ。
【請求項６２】配列番号：３８，４１，４４，４５，
４８，５１，５４又は５５に示されるヌクレオチド配列
またはその一部を有する、請求項５８に記載のＤＮＡ。
【請求項６３】（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域；並びに（２）
ヒトＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクロー
ナル抗体のＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ領域；を含んで成
るヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＬ鎖をコード
するＤＮＡ。
【請求項６４】前記Ｌ鎖Ｖ領域が表２におけるＲＶＬ
ａ又はＲＶＬｂとして示されるアミノ酸配列またはその
一部をコードする、請求項６３に記載のＤＮＡ。
【請求項６５】前記Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：６２又は
配列番号：６５に示されるヌクレオチド配列またはその
一部を有する請求項６３に記載のＤＮＡ。
【請求項６６】前記ヒトＬ鎖Ｃ領域がヒトＬ鎖Ｃκ領
域である請求項６３，６４及び６５のいずれか１項に記
載のＤＮＡ。
【請求項６７】（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域；並びに（２）
ヒトＦＲ、及びヒトＩＬ−８に対するマウスモノクロー
ナル抗体のＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域；を含んで成
るヒトＩＬ−８に対する抗体の再構成ヒトＨ鎖をコード
するＤＮＡ。
【請求項６８】Ｈ鎖Ｖ領域が表３および表４における
ＲＶＨａ，ＲＶＨｂ，ＲＶＨｃ，ＲＶＨｄ，ＲＶＨｅ，
ＲＶＨｆ，ＲＶＨｇ、又はＲＶＨｈとして示されるアミ
ノ酸配列またはその一部をコードする、請求項６７に記
載の再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡ。
【請求項６９】前記Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：３８，４
１，４４，４５，４８，５１，５４又は５５に示される
ヌクレオチド配列またはその一部を有する請求項６７に
記載のＤＮＡ。
【請求項７０】前記ヒトＨ鎖Ｃ領域がヒトＨ鎖Ｃγ１
領域である請求項６７，６８及び６９のいずれか１項に
記載のＤＮＡ。
【請求項７１】前記ヒトＨ鎖Ｃ領域がヒトＨ鎖Ｃγ４
領域である請求項６７，６８及び６９のいずれか１項に
記載のＤＮＡ。
【請求項７２】請求項３５，３６，３７，３８，３
９，４０，６３，６４，６５，６６，６７，６８，６
９，７０及び７１のいずれか１項に記載のＤＮＡを含ん
で成るベクター。
【請求項７３】請求項７２に記載のベクターにより形
質転換された宿主細胞。
【請求項７４】ヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体の製
造方法であって、請求項３５，３６及び３７のいずれか
１項に記載のＤＮＡを含んで成る発現ベクター及び請求
項３８，３９及び４０のいずれか１項に記載のＤＮＡを
含んで成る発現ベクターにより同時形質転換された宿主
細胞を培養し、そして目的とする抗体を回収する、段階
を含んで成る方法。
【請求項７５】ヒトＩＬ−８に対するキメラ抗体の製
造方法であって、請求項３５，３６及び３７のいずれか
１項に記載のＤＮＡ及び請求項３８，３９及び４０のい
ずれか１項に記載のＤＮＡを含んでなる発現ベクターに
より形質転換された宿主細胞を培養し、そして目的とす
る抗体を回収する、段階を含んで成る方法。
【請求項７６】ヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体
の製造方法であって、請求項６３，６４，６５及び６６
のいずれか１項に記載のＤＮＡを含んで成る発現ベクタ
ー及び請求項６７，６８，６９、７０及び７１のいずれ
か１項に記載のＤＮＡを含んで成る発現ベクターにより
同時形質転換された宿主細胞を培養し、そして目的とす
る抗体を回収する、段階を含んで成る方法。
【請求項７７】ヒトＩＬ−８に対する再構成ヒト抗体
の製造方法であって、請求項６３，６４，６５及び６６
のいずれか１項に記載のＤＮＡ及び請求項６７，６８，
６９，７０及び７１のいずれか１項に記載のＤＮＡを含
んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を
培養し、そして目的とする抗体を回収する、段階を含ん
で成る方法。