KR100277769B1 - 항-파스 재조합 항체 및 이에 대한 디엔에이 - Google Patents

Abstract

재조합 단백질은 인간 Fas 에 대해 특이적인 면역글로불린 가변 부위에 대응하는 하나이상의 부위를 갖고, 실질적으로 인간 항체뿐만아니라 인간에서의 면역원성을 갖지않으며, 특히 류마티즘과 같은 자가면역 질환의 치료에 유용하다.

Description

항-파스 재조합 항체 및 이에 대한 디엔아이

본 발명은 Fas, 특히 인간 Fas 에 대한 재조합 항체 및 이런 항체를 코딩하는 DNA 에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이러한 항체를 함유하며 류마티스성 관절염을 포함한 자가면역 질환을 치료하는 약제, 임의로 세포 성장 억제제를 추가 함유하는 제제에 관한 것이다. 또한 본 발명은 항-Fas 상보성 결정 부위(CDR's) 및 이러한 항체의 생성에서의 이들의 용도, 및 이러한 CDR's 을 코딩하는 DNA 에 관한 것이다.

생물체내의 세포의 자연적인 과정에 따른 생리학적 사멸은 세포소멸(apoptosis)로 공지되어 있고, 세포의 병리학적 사멸, 즉, 괴사와는 구별된다 [참조, Kerr et al., (1972), Br. J. Cancer, 26, 239 이하 참조]. 세포소멸은 예정된 세포 사멸의 한 예이며, 이는 해당 세포가 소정의 기능을 행한 경우와 같이, 특정 세포가 생물체내에서 자연적인 과정에 따라 죽도록 미리 예정되어진 경우이다. 세포소멸은 기타의 것들중, 굴곡진 세포표면, 응축된 핵 크로마틴 및 단편화된 크로모좀 DNA 와 같은 형태학적 변화를 특징으로한다.

세포소멸은 T 및 B 림프구 분화의 과정중에 자가항원을 인식하는 세포의 처분에 중요한 역활을 한다. 소위 자가면역 질환의 발증은 통상 림프구 분화동안 세포소멸의 실패로부터 발생하는 자가-반응성 림프구의 출현으로 발병한다 [참조, Keiichi Nakayama et al,, (1995), Mebio 12(10),79-86].

Fas 는 면역적격 세포의 세포소멸에 관여되는 세포막 분자이다 [참조, Yonehara, S., et al. (1989), J.Exp.Med. 169, 1747 이하 참조; Trauth, B.C., et al. (1989), Science 24, 301 이하 참조; 및 Itoh, N., et a1., 이하]. 쥐 모노클론성 항체를 인간 Fas 항원에 대하여 발생시켰다 [참조, Itoh, N., et al. (1991), Ce11 66, 233-243 및 상기 Yonehara (인간 Fas 에 특이적인, CH11 로 나타낸 모노클론성 항체를 개시하였다)]. 상기 항-인간 Fas 항체는 세포소멸-유도 세포독성 활성을 갖으며, 종양, 및 AIDS 와 같은 자가면역 질환에 대한 잠재적 치료제로 제안되어 있다 [참조, 일본 비심사 특허 공보 제 헤이 2-237935 및 일본 비심사 PCT 공보 제 헤이 5-503281]. 오가사와라 등 [Nature (1993), 364, 806-809]에 의해 쥐 항-Fas 항체는 분명히 간에서 대량의 세포소멸로, 빠르게 야생형 마우스를 죽임이 보고되었다.

또한 인간 Fas 에 대한 모노클론성 항체가 하기의 간행물에 공지되어 있다 : J.Exp.Med. (1989), 169, 1747-1756; WO 91/10448; Science (1989), 245, 301-305; Cel1 (1991), 66, 233-243; J.Imm (1992), 149, 3166-3173; 및 Internat. Immun.(1994), 6, (12) 1849-1856.

류마티즘, 특히 류마티스성 관절염은 다양한 면역학적 비정상을 수반하는 활막세포의 증식으로부터 발생하는 것으로 여겨진다. 활막세포의 증식에는 전형적으로 뼈의 염증 세포성 침윤 및 미란 (erosion) 을 수반한다. 만성 류마티스성 관절염에서의 감염된 관절 주위의 조직 미란은 분명히 염증성 활막세포로부터의 세포질의 비정상적 생성으로 야기된다. 류마티즘 환자에서의 관절의 검사로 활막세포의 비정상 증식, 활액 융모의 과형성, 다층 활막세포등이 밝혀졌다[참조, Daniel J. McCarty (1985), in "Arthritis and allied conditions, A textbook of rheumatology" 10th Edition, Lea & Febiger]. 현재 류마티즘에 대한 약제에는 우세하게 스테로이드 및 면역조절물질과 같은 항염증약을 함유한다. 활막세포의 비정상적 증식을 억제할 수 있다면, 임의의 이런 제제는 류마티즘의 치료에 유용할 것이다.

류마티즘에서의 활막세포는 무제한적 방식으로 증식하지 않으며 [참조, Daniel J. McCarty (1985), in "Arthritis and allied conditions, A textbook of rheumato1ogy" 10th Edition, Lea & Febiger], 류마티즘 환자의 활막 세포에서 세포소멸이 발생함이 실증되었다. Fas 항원은 활막세포의 막상에서 발현하고, 나까지마등 [Nakajima,T., et al.(1995), Arthritis Rheum. 38, 485-491] 및 아오노등 [Abstracts of the 38th Meeting of Japan Rheumatism Society (1994), p.487, 및 articles of 1994 Meeting of Japan Cancer Society, (1994), p.388]은 세포독성 항-인간 Fas 항체는 류마티즘 환자로부터 비정상적으로 증식된 활막세포에서 세포소멸을 유도할 수 있는지를 조사하였다. 이들은 류마티즘외의 질환을 앓는 환자로부터의 활막세포를 특징으로하는 대조군과 비교하여, 류마티즘 환자로부터 비정상적으로 증식된 활막세포에서 높은 수준의 세포소멸을 유도할 수 있었다.

따라서, 항-인간 Fas 항체는 림프구 및 비정상적으로 증식된 활막세포에서 세포소멸을 선택적으로 유도할 수 있어, 항-인간 Fas 항체는 항류마티즘제로서 유용하다.

그러나, 장기투여용 약제로 인간에게 쥐 모노클론성 항체의 투여는 쥐 기원으로부터 생기는 항원성 때문에, 다양한 문제점을 유발하기 매우 쉽다. 아나필락시스성 쇼크가 발생하기 쉬우며, 반복적인 투여는 효능을 감소시키거나 혈액수준등에서의 감소를 촉진시킬 수 있어, 만일 항체가 임상실습에서 사용된다면 효과는 바람직하지 않을 수 있다.

쥐 모노클론성 항체와 관련된 문제점을 해소하고자, 마우스 항체의 불변 부위가 대응하는 인간 항체의 불변 부위로 대치된 키메릭 항체을 수득하기 위하여 재조합 DNA 기술을 이용하였다. [참조, Morrison, S.L., et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 6851-6855]. 쥐 항체의 인간화의 대안적 공정에 있어서, 마우스 항체의 가변 부위에 존재하는 쥐 CDR [참조, Jones, P.T., et al. (1986), Nature, 321, 522-5251 는 본질적으로 동등한 공정으로 인간 항체에 삽입된다. 이러한 유전적으로 조작된 항체를 제조하기 위해서는, 처음에 마우스 항체를 구성하는 H 및 L 사슬 소단위 양쪽을 코딩하는 DNA 를 클론할 필요가 있다. 이러한 사슬들은 특이적으로 표적 항원을 인식하여, 이들의 서열의 규명으로 CDR 을 포함하는 가변 부위의 일차 구조가 밝혀졌으며, 이것은 인간화(humanized) 항체의 제조에 사용할 수 있다.

현재까지, 세포독성 마우스 항-인간 Fas 모노클론성 항체의 CDR 의 임의의 부분, 또는 이에 대한 DNA 서열은 개시되어 있지 않다.

본 발명의 목적은 항체 가변 부위를 코딩하고 인간 Fas 에 특이적인 인간화 항체의 구축을 가능케하는 하나이상의 뉴클레오티드 서열을 제공하는 것이다.

따라서, 첫번째 양상으로, 본 발명은 재조합 단백질을 제공하고, 단백질은 면역글로불린 가변 부위에 대응하는 하나이상의 부위를 포함하고, 하나이상의 부위는 상기 단백질이 항원을 인식하고 특이적으로 결합하도록 하며, 항원은 인간 Fas 이고, 상기 단백질은 실질적으로 인간 항체와 마찬가지로 인간환자에서 면역원성을 갖지 않는다.

본 발명의 기타 목적, 목표, 양상 및 양태은 이후에 명백해질 것이다.

제 1도는 CH11의 총길이의 각각의 소단위를 코딩하는 DNA의 클로링을 가능케 하는 cDNA 라이브러리의 구축의 개략도이다.

제 2도는 CH11의 총길이의 각각의 소단위를 코딩하는 DNA의 클로링 및 증폭공정을 보여주는 도이다.

여기에서 사용하는, 용어 "재조합체" 는 유전공학으로 수득되는 임의의 물질에 관한것이며, 이는 해당 물질이 원래의 물질로부터 개질되거나, 원래와 다른 방식으로 또는 다른 시스템으로 발현되는 한에 한한다.

용어 "단백질" 은 통상 펩티드 다리로 연결된 아미노산 잔기의 임의의 서열에 관한것이고, 폴리펩티드뿐만아니라 올리고펩티드 및 다합성 펩티드 또는 폴리 펩티드 조합체를 포함할 수 있다.

면역글로불린 가변 부위에 대응하는 부위는 면역글로불린 가변 부위의 특징적 구조를 갖으며, 면역글로불린의 H 사슬 또는 L 사슬의 가변 부위에 대응할 수 있다. 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 단백질은, 하나는 H 사슬 가변 부위에 대응하고, 또 하나는 L 사슬 가변 부위에 대응하며, 이 둘다 인간 Fas 에 특이적인 상기와 같은 2 개의 부위를 갖는다.

본 발명의 단백질은 이질적 불변 부위에 대응하는 항체의 부분이 존재하지 않기 때문에, 인간 항체와 마찬가지로 인간환자에서 면역원성을 실질적으로 갖지 않는다. 따라서, 본 발명의 단백질은 쥐 모노클론성 항체로부터 발생하는 가변 부위 또는 부위들을 갖을 수 있으나, 쥐의 불면 부위는 제거되었다. 그 결과, 본 발명의 단백질은, 쥐 가변 부위는 충분히 인간의 것과 동일하고, 임의의 상승된 수준의 면역원성은 단지 가변 부위(들)이 일부인 임의의 기타 아미노산 서열로부터만 생길 수 있기 때문에, 환자에 대해 예컨대, 대안적 원(源) 으로 부터의 인간 항체와 동일한 수준의 면역원성만을 갖는다.

본 발명의 가변 부위는 인간 Fas 에 대한 항체를 발생시킬 수 있는 임의의 원으로부터 유래할 수 있다. 비록 이것으로 가장 편리한 것은 마우스이나, 쥐 및 토끼와 같은 기타의 원도 가능하다. 그러나, 이것들 및 기타의 고등 동물은 불편한 경향이 있다.

본 발명의 가변 부위는 단백질내에 임의의 적당한 구조로 존재할 수 있다. 이의 가장 단순하게는, 단백질은 본질적으로 단지 하나의 가변 부위로만 구성될 수있으나, 이러한 단백질의 효능은 상당히 감소되는 경향이 있다. 부분적으로, 이는 삼차구조의 안정화의 부족에 기인하지만, 결합은 여전히 관찰될 수 있다.

높은 수준으로, 단백질은 본질적으로 하나의 H 사슬 가변 부위 -및 하나의 L 사슬 가변영역으로 함께 연결되어 구성될 수 있다. 이러한 연결은 직적 결합될 수 있거나, 하나이상의 여분 아미노산 잔기를 수반하는 신축성 펩티드 결합의 형태일 수 있다. 이러한 구조체는 잠재적 면역원성을 발생시키기는 임의의 여분 펩티드 서열을 갖지 않는 장점을 갖는다.

비록 본 발명의 단백질은 단지 하나의 가변 부위를 갖을 수 있으나, 두개를 갖는 것이 바람직하다. 추가로, 이 두개는 CH11 와 같은 하나의 특정항체 (각각의 하나는 H 및 L 사슬로부터 유래) 로부터 유래하여, 좀더 가깝게 자연 항체와 경쟁하는 것이 바람직하다. 이 점에 있어서, 가변 서열은 인간 불변 부위, 특히 H 및 L 사슬로부터의 적당한 불변 부위와 통합되는 것이 바람직하다.

상기의 양태에 있어서, 두개의 가변 부위는 각각 더 큰 폴리펩티드의 일부이고, 두개의 폴리펩티드는 결합하여 항체 헤테로이합체를 형성하는 것이 바람직하다.

항체의 성질은 본 발명에서는 중요하지 않고, 임의의 적당한 형태일 수 있으며, 본 발명의 단백질은 실제적으로 항체형에 상응한다. 예컨대, 형태는 IgG, IgM 또는 IgE 일 수 있고, 예컨대, 형태는 전적으로 투여경로에 좌우될 수 있다. 비록 CH11 은 IgM 분자이나, 가변부위는 IgG 구조에 포함될 수 있다. 사실, 만일 5 개의 중사슬 및 경사슬 쌍과 5 합체 항체 구조를 형성하는 J 사슬 없이, IgM 형 구조를 사용하면, 세포소멸 활성이 5 배 또는 그이상 증가되는 것을 발견하였다.

본 발명은 추가로 임의의 상기 확인된 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA, 특히 DNA 을 제공하는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이 DNA 는 단순히 단백질을 코딩하거나, 예컨대, 단백질이 헤테로이합체이면, 특정의 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.

또한 DNA 는 임의의 적합한 형태일 수 있어서, 벡터, 적합하게는 발현 벡터에 통합될 수 있음을 이해하게 될 것이다. 또한 이는 임의의 기타 적합한 서열, 예컨대 판독 서열 또는 융합 단백질 형태로 코팅된 단백질의 발현을 위한 서열과 조합될 수 있다.

추가로 본 발명은 전술한 바와 같은 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 상기 DNA 를 함유하는 하나이상의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 포함하는 본 발명의 단백질의 발현을 위한 계에 관한 것이다. 본 발명의 단백질은 표준기술로, 이러한 계, 계의 배양후 수득할 수 있다.

본 발명의 특정의 바람직한 양상 및 양태는 하기와 같다 :

하기 일반식 1 로 나타낸 아미노산 서열를 포함하는 H 사슬 소단위체 :

[일반식 1]

-FRH₁-CDRH₁-FRH₂-CDRH₂-FRH₃-CDRH₃-FRH₄-

(식중, FRH₁은 13 내지 30 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, CDRH1₁은 SEQ ID NO.1 의 아미노산 서열을 나타내며, FRH₂은 14 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산서열을 나타내고, CDRH₂는 SEQ ID NO.2 의 아미노산 서열을 나타내며, FRH₃는 32 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, CDRH₃은 SEQ ID NO.3 의 아미노산 서열을 나타내며, FRH₄은 11 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, 각각의 아미노산 서열은 펩티드 결합을 통해 다음의 아미노산 서열에 결합된다);

하기 일반식 2 로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 소단위체 :

[일반식 2]

-FRL₁-CDRL₁-FRL₂-CDRL₂-FRL₃-CDRL₃-FRL₄-

(식중, FRL₁은 23 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, CDRL₁은 SEQ ID NO.4 의 아미노산 서열을 나타내며, FRL₂는 15 아미노산 잔기를 포함한 아미노산 서열을 나타내고, CDRL₂는 SEQ ID NO.5 의 아미노산 서열을 나타내며, FRL₃는 32 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, CDRL₃은 SEQ ID NO.6 의 아미노산 서열을 나타내며, FRL4 는 10 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, 각각의 아미노산 서열은 펩티드 결합을 통해 다음의 아미노산 서열에 결합된다) 로 본질적으로 구성된 인간 Fas 에 특이적으로 결합하는 유전적으로 조작된 면역글로불린 단백질.

상기의 단백질은, H 사슬 소단위체가 SEQ ID NO.8 의 아미노산 번호 1 내지 116 으로 나타낸 아미노산 서열을 포함, 및/또는 L 사슬 소단위체가 SEQ ID NO.10 의 아미노산 번호 1 내지 112 으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경우, 바람직하다.

상기의 단백질은, H 사슬 소단위체가 SEQ ID NO.8 의 아미노산 번호 1 내지 571 로 나타낸 아미노산 서열을 포함, 및/또는 L 사슬 소단위체가 SEQ ID NO. 10 의 아미노산 번호 1 내지 219 로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경우, 좀더 바람직하다.

추가로 본 발명은 전술한 바와 같은 일반식 1 의 펩티드를 포함하는 H 사슬 소단위체를 코딩하는 DNA 를 제공한다. DNA 가 SEQ ID NO.7 의 뉴클레오티드 번호 58 내지 405 로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우의 DNA 가 바람직하다.

또한 일반식 2 의 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 소단위체와 함께 인간 Fas 에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 H 사슬 소단위체를 코딩하는 센스가닥인, 상기와 같은 DNA 와 혼성화하는 DNA 가 바람직하다. 이러한 DNA 는 60 내지 70T 및 6 x SSC 에서 혼성화할 수 있는 것이 바람직하다.

또한 일반식 2 로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 소단위체를 코딩하는 DNA 는, 특히 SEQ ID NO.9 의 뉴클레오티드 번호 58 내지 393 로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우 바람직하다. 이러한 DNA 와 혼성화하고 이의 대응하는 센스 가닥은 일반식 1 의 아미노산 서열을 포함하는 전술한 바와 같은 H 사슬 소단위체와 함께 인간 Fas 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 L 사슬 소단위체를 코딩하는 DNA 가 또한 바람직하고, 특히 혼성화는 60 내지 70℃ 및 6 x SSC 에서 행하는 것이 바람직하다.

추가로 전술한 임의의 DNA 를 포함하는 재조합 DNA 벡터, 특히 재조합 DNA 벡터 pCR3-H123 및 pCR3-L103, 이러한 벡터로 형질전환된 세포 및 특히 대장균 pCR3-H123 (FERM BP-5247) 및 대장균 pCR3-L103 (FERM BP-5248) 이 바람직하다.

인간 Fas 항원을 특이적으로 인식하는 면역글로불린 단백질을 제조하는 바람직한 방법을 하기와 같다 :

전술한 DNA 벡터로 형질전환된 세포를, 벡터내에 포함되어 있는 면역글로불린 H 사슬 또는 L 사슬 소단위체을 코딩하는 DNA 의 발현을 가능케하는 조건하 배양하고,

배양물로부터 면역글로불린 단백질을 회수한다.

추가로 본 발명은 상기에서 확인된 바와 같은 FR's 로 결합되었던지 그렇지 않던지, CDR's 의 용도, 및 통상 인간 Fas 에 선택적으로 결합하는 인간화 항체 및 단백질의 구축에서, 이러한것을 코딩하는 DNA 에 관한 것이다.

본질적으로, 현재 IgM 모노클론성 항체인, 항-인간 Fas 의 H, L 및 J 사슬 각각을 코딩하는 유전자를 클로닝하는데 성공하였다. 항체를 생성하는 하이브리도마로부터 제조된 cDNA 라이브러리를 사용하여, 각각의 유전자의 전 뉴클레오티드 서열 및 이의 대응하는 아미노산 서열을 규명할 수 있다. 이로부터, H 및 L 사슬의 CDR 서열을 얻는 것이 가능하다. H,L 및 J 사슬을 포함하는 발현 벡터의 구축으로, 항-인간 Fas 항체에 대해 동일한 활성을 갖는 세포독성 단백질은 상기 벡터로 배양 동물 세포를 형질감염시켜 수득한 배양물의 상층액으로부터 수득가능하다는 것을 발견하였다.

본 발명의 DNA는 처음에 CH11 와 같은, 항-인간 Fas 모노클론성 항체를 생성하는 마우스 하이브리도마 세포로부터 폴리(A)⁺RNA 를 제조하여 수득할 수 있다. 이어서 폴리(A)⁺RNA 는 역전사효소를 이용하여 cDNA 로 전환시키고, 항체의 H, L 및 임의적으로 J 사슬을 코딩하는 cDNA 를 정제할 수 있다. 요네하라 등 [(1989), J.Exp.Med. 169, 1747 이하참조] 는 마우스를 Fas-발힌 인간 이배체 섬유아세포-주 FS-7 로 면역시킨후 마우스 골수종 세포와 마우스 림프구를 융합하여, CH11 로 명명한 항-인간 Fas 모노클론성 항체을 수득하였다. CH11 항체는 일본 의약 생물 연구소사제에서 시판한다.

폴리(A)⁺RNA 는 처음에 총 RNA 을 제조한후, 예컨대 올리고(dT)셀룰로오스, 올리고(dT)라멕스 구슬등으로 충진된 친화성 컬럼을 이용하여 총 RNA 로부터 폴리(A)⁺RNA 를 정제하거나, 전술한 바와 같은 친화성 물질을 이용하여 세포 용해물로부터 폴리(A)⁺RNA 를 직접 정제하여 수득할 수 있다. 총 RNA 는 예컨대, 하기와 같은 방법으로 제조가능하다 : 알칼리 수크로오스 밀도 구배 초윈심분리[참조, Dougherty, W. G. & Heiebert, E., (1980), Virology, 101, 466-474]; 구아니딘 티오시아네이트-페놀 방법; 구아니딘 티오시아네이트-트리플루오로세슘 방법 및 페놀-SDS 방법. 그러나, 바람직한 방법은 구아니딘 티오시아네이트 및 염화세슘을 사용한다 [참조, Chirgwin, J.M., et al (1979), Biochemistry, 18, 5294-5299] .

이어서, 전술한 바와 같은 역전사효소를 사용하여 수득한 단일 가닥(ss)cDNA는 이중가닥 (ds)cDNA 로 전환시킬 수 있다. ds cDNA 를 수득하기에 적합한 방법에는 S1 뉴클레아제 방법 [참조, Efstratiadis, A., et al.(1976), Cell, 7, 279-288] 및 구블러-호프만 방법 [참조, Gubler, U. Hoffman, B. J.(1983), Gene, 25, 263-269] 을 들 수 있다. 그러나, 바람직하게는 오까야마-베르그 방법 [참조, Okayama, H, & Berg, P. (1982), Mol. Cell. Biol. 2, 161-170] 을 사용한다.

이어서 상기에서 수득한 ds cDNA는 클로닝 벡터에 통합시킬 수 있고, 생성된 재조합 벡터는 대장균과 같은 적합한 미생물을 형질전환시키는데 사용할 수 있다. 형질전환체는 표준 방법, 예컨대 재조합 벡터로 코딩되는 내테트라사이클린 및 내암피실린성에 대해서 선택함으로서 선택할 수 있다. 만일 대장균를 사용하면, 형질전환은 한나한 방법 [참조, Hanahan, D. (1983), J. Mo1. Bio1., 166, 557-580] 으로 실행할 수 있다. 이와는 달리, 재조합 벡터는 염화 칼슘 및 염화마그네슘 또는 염화루비듐에 공노출시켜 제조한 감응세포에 도입할 수 있다. 만일 플라스미드를 벡터로 사용하면, 플라스미드는 전술한 바와 같은 내약품성 유전자를 함유케하여 선택을 용이하게 하는 것이 매우 바람직하다. 부르트 퍼스(Brute fore) 선택이 가능하나, 바람직하지는 않다. 비록 플라스미드에 대해서 거론되었으나, lambda 파아지와 같은 기타 클로닝 비클 (vehicles)을 사용할 수 있음이 이해될 것이다.

목적하는 DNA 를 갖는 형질전환체를 선택하는 방법을 하기와 같다 :

(1) 합성 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 스크리닝

만일 목적 단백질의 아미노산 서열의 전부 또는 일부가 규명되면, 또한 목적 단백질을 대표하는, 짧은 연속 서열을 이용하여 올리고뉴클레오티드 프로브를 구축할 수 있다. 프로브는 아미노산 서열을 코딩하나, 유전 코드의 동의성 때문에, 제조될 수 있는 다수의 프로브가 존재할 수 있다. 따라서, 제한된 수의 올리고뉴클레오티드에의해 코딩될 수 있는 아미노산 서열이 통상 선택될 것이다. 제조하는데 필요한 올리고뉴클레오티드의 수는 추가로 임의의 4 개의 정상 염기가 사용될 수 있는 이노신의 치환으로 감소될 수 있다. 이어서 프로브는 예컨대,³²p,³⁵S 또는 바이오틴으로 적절히 표식한후, 니트로셀룰로오스 필터상에서 고정된 형질전환체로부터의 변성, 형질전환된 DNA 와 혼성화시킨다. 양성 균주는 프로브에 대한 표식의 검출로 나타난다.

(2) 폴리머라아제 사슬 반응

만일 목적 단백질의 아미노산 서열의 전부 또는 일부가 규명되면, 이어서 아미노산 서열의 개별적 비연속부분에 대응하는 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를, 예컨대 상기 (1) 에 기재된 방법으로 합성할 수 있다. 이어서 이러한 프라이머는 주형 DNA 를 이용한 폴리머라아제 사슬 반응 기술 [참조, Saki, R.K., et a1.(1988), Science, 239, 487-491] 에서 사용할 수 있다· 여기에서 사용하는 주형 DNA 는 CH11 를 발현시키는 것과 같은, 항-인간 Fas 항체를 생성시키는 하이브리드마로부터 수득한 mRNA 를 이용하여 역전사효소 반응으로 합성된 cDNA 일 수 있다. 이렇게 합성된 DNA 단편은 예컨대, 시판 키트를 이용하여 플라스미드 벡터로 직접 통합시키거나, 예컨대,³²p,³⁵S 또는 바이오틴으로 표식한후, 콜로니 혼성화 또는 플라크 혼성화용 프로브로 사용하여 목적 클론을 수득할 수 있다.

모노클론성 항체 CH11 은 각각의 H (μ) 사슬 및 L 사슬, 및 하나의 J 사슬의 5 개의 소단위체로 구정된 복합체인, 면역글로불린 M("IgM") 분자이다. 따라서, 소단위체에 대한 부분적 아미노산 서열을 규명하기 위해서는, 소단위체는 분리되어야하고, 이는 예컨대, 전기영동, 컬럼크로마토그래피등 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 일단 소단위체 분리되면, 이것은 예컨대, 적어도 각각의 소단위체의 N-말단의 아미노산 서열을 결정하기 위하여, 자동단백질서열기 (예, PPsQ-10 시마드즈사제) 를 이용하여 서열화시킬 수 있다. 이어서 올리고뉴클레오티드/프라이머를 상기 정보를 이용하여 제조할수 있다.

상기에서 수득한 적당한 형질전환체로부터의 항-인간 Fas 모노클론성 항체의 각각의 소단위체를 코딩하는 DNA 의 수확은 공지된 기술, 예컨대 마니아티스, 티., 등 ["Molecular C1oning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY, (1982)] 에 의해 기재된 기술로 실행할 수 있다. 예컨대, 목적 소단위체를 코딩하는 DNA 의 영역은 필요한 플라스미드를 갖는 것으로 결정된 형질전환체로부터 벡터 DNA 에 대응하는 분획을 분리후 플라스미드 DNA 로부터 절달할 수 있다.

전술한 바와 같이 제조된, CH11 의 중사슬, 경사슬 및 J 사슬을 코딩하는 DNA 를 포함하는 플라스미드로 대장균 DH5α 를 형질전환시켜, 생성된 3 개의 형질전환체 (대장균 pCR3-H123, 대장균 pCR3-L103, 대장균 pCR3-J1123 으로 각각 명명) 을 미생물 기탁에 대한 부다페스트 조약에 따라 1996 년 2 월 28 일자로 산업과학기술청의 생명과학기술 연구소에 기탁하였고, 각각 기탁 번호 FERM BP-5427, FERM BP-5428 및 FERM BP-5429 를 부여받았다. 이러한 플라스미드를 포함하는 대장균 DH5α 는 상기 플라스미드를 포함하지 않는 대장균 DH5α와 직적 비교할 수 있는 방법으로 배양할 수 있다. 기탁된 균주 모두는 이들의 내암피실린성으로 선택할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 DNA 는 상기 기탁물을 이용하여 수득할 수 있다. 예컨대, 이것은 기탁물을 배양하고 플라스미드를 단리하거나, 또는 주형으로 플라스미드를 이용하는 폴리머라아제 사슬 반응(PCR) 를 이용하여 실시할 수 있다. J 사슬은 당해기술분야에서 공지된 서열을 갖고, 가변부위를 갖지않는다.

적당하다면, DNA 서열은 예컨대, 맥섬-길버트 화학 변경 기술 [참조, Maxam, A.M. & Gilbert, W.(1980) in "Methods in Enzymo1ogy" 65, 499-276] 및 M13 파아지를 이용한 디데옥시 사슬 말단 방법 [참조, Messing, J. & Vieira, J. (9182), Gene, 19, 269-276] 을 포함한, 당해 기술분야에서 공지된 다양한 방법에 따라 서열화할 수 있다. 최근에, DNA 를 서열화하는 추가의 방법이 호평받았으며, 디데옥시 방법에서의 통상의 방사선동위원소 대신에 플루오로원성 염료를 사용한다. 전기영동후 뉴클레오티드 서열의 판독을 포함한, 전공정이 컴퓨터화 되었다. 공정을 위한 적합한 기계는 예컨대, 퍼킨-엘머 시퀀스 로봇 "CATALYST 800" 및 퍼킨-엘머 모델 373A DNA 서열기이다. 상기 기술의 이용으로 DNA 뉴클레오티드 서열의 결정이 효율적이고 안정적이 된다.

따라서, 이렇게 결정된 CH11 의 H 및 L 사슬을 코딩하는 DNA 의 뉴클레오티드 서열과 함께, H 및 L 사슬의 N-말단에 대한 서열 데이타로부터, CH11 의 H 및 L 사슬의 전 아미노산 서열을 결정하는 것이 가능하다.

골격 부위 (FR's) 는 면역글로불린의 H 및 L 사슬의 가변 부위에 존재하고, 가변 부위를 포함하고 CDR's 를 분리시키는 역활을 한다. 따라서, 각각의 가변 부위에서 CDR's 의 수와 비교하여 하나이상의 FR 이 존재한다. 또한 골격부위는 가변 부위의 3 차원 구조에 기여하여, 부위의 3 차구조를 안정화시켜 항원 결합을 도와준다. 가변 부위에서의 각각의 FR 및 CDR 에 적용되는 전문용어의 설명으로, FRH₁은 H 사슬의 가변 부위의 N-말단에서의 골결 부위이다. C 말단쪽으로 각각, CDRH₁, FRH2, CDRH2, FRH3, CDRH3 및 최종적으로 FRH4 가 존재한다. 동일한 명명이 L 사슬에도 적용되어, 첫번째 골격 부위는 FRL1 등으로 명명된다.

면역글로불린 H 및 L 사슬 양쪽은 가변 부위 및 불변 부위를 포함한다. 가변 부위는 CDR's 로 구성되고, 전술한 바와 같이, H 사슬 및 L 사슬은 4 개의 골격 부위로 상호연결 및 포함되어진 3 개의 CDR's 을 갖는다. 불변 부위의 아미노산 서열은 인식되는 항원에 무관하게 일정하며, 이는 각각 H 및 L 사슬에도 해당되며, 단 면역글로불린 종류는 동일하다. 대조적으로, 가변 부위의 아미노산 서열, 특히 CDR's 은 각각의 항체에 특이적이다. 그러나, 많은 항체의 아미노산 서열에 대한 비교 연구에 따라, CDR's 의 위치 및 이들을 연결하는 골격서열의 길이 모두는 동일한 서브그룹의 항체 소단위체중에서 실제적으로 일정하다[Kabat, E. A., et al. (1991), in "Sequence of Proteins of Immunologica1 Interest Vo1. Ⅱ" U.S.Department of Health and Human Services]. 그러므로, 상기 정보로, 공지된 아미노산 서열로 결정된 아미노산 서열과 비교하여 CH11 의 각각의 H 및 L 사슬 의 CDR's 의 위치, 골격 부위 및 불변부위를 결정하는 것이 가능하다.

골격부위는 CDR's 를 분리하는데 중요하고, 가변 부위의 구조의 입체 결정에 도움이되나, 단 이 요건이 충족되면, 각각의 골격 부위의 실제적 크기 및 서열을 본 발명에서 중요하지 않다 (단, FR's 가 항원에 결합하는데 관여하지 않는다면) 는 것을 이해하게 될 것이다. 따라서, 임의의 적합한 아미노산 서열은 각각의 FR 을 위해 사용될 수 있다. 그러나, 골격 부위는 통상 자연적으로 보존되는 것이 관찰되기 때문에, CH11 에서 발견되는 것과 동일하거나 근사하게 상응하는 부위를 보유하는 것이 바람직하다 (Yonehara et al., 상기 참조).

비록 골격 부위의 사슬 길이는 통상 실질적으로, 특히 면역글로불린 서브타입내에서 보존되지만, H 사슬의 N-말단에 위치하는 FRH₁은 종종 기대했던 것보다 짧을 수 있다는 것이 확인되었다. 따라서, 30 아미노산 대신, FRH₁은 마우스 IgM 에서 13 아미노산만큼 짧을 수 있으며, CH11 에 대한 μ2a 서브타입에 대한 19 아미노산의 최소 길이가 확인되었다 [참조, Kabat et al. 같은책에]. 따라서, H 사슬의 N-말단에서의 골격 부위의 사슬 길이는 어디든 13 내지 30 아미노산사이일 수 있다. 이 범위는 바람직하게는 19 내지 30, 가장 바람직하게는 30 아미노산이다.

통상, 가변 부위의 양 말단 (H 사슬의 FRH₁및 FRH₄) 에서의 골격부위는 실제적으로 CDR's (H 사슬의 FRH₂및 FRH₃) 을 연결하는 간극 골격부위보다 덜 중요함이 이해될 것이다. 따라서, 플랭킹 (flanking) 골격 부위는 임의의 주어진 항체형에 대한 유리정수로부터 길이 약 60% 이하까지 변할 수 있는 반면, 간극 골격부위는 단지 제한된 정도까지만 길이에서 변할 수 있으며, 이는 전형적으로 단지 약 하나의 아미노산이다. 몇몇의 경우에서, 임의의 길이에서의 변화는 실질적으로 감소된 효율을 갖어올 수 있어, 당업자는 용이하게 임의의 주어진 가변부위 구조에 대한 필요한 변수를 확립할 수 있을 것이다.

만일 임의의 하나이상의 아미노산이 아미노산 서열에서 결실된 개조 서열을 구축하고자 한다면, 예컨대, 카세트 돌연변이 방법을 사용할 수 있다 [참조, Toshimitsu Kishimoto, "Shin-Seikagaku Jikken Kouza (New Biochemistry Experiment Series) Ⅱ : Nucleic Acid Ⅲ, Recombinant DNA Technology", pp. 242-251].

임의의 적당한 아미노산 서열은 양 가변 부위의 C-말단에 결합될 수 있으나, (단, 이것이 항체의 항원-결합력에 역효과를 주지 않는다면) 이는 예컨대 판독서열의 형태로 전구체 분자를 형성시키는 것과 같은 이유가 아닌한에 한한다. 통상, C-말단 서열이 존재하는 경우, 이는 적당한 H 또는 L 사슬로부터의 인간불변 부위에 대응하는 것이 바람직하다.

본 발명의 DNA 는 포스페이트-트리에스테르 방법과 같은, 통상의 방법을 이용한 화학 합성과 같은 임의의 적합한 방법으로 제조할 수 있다 [참조, Hunkapiller, M, et al. (1984), Nature, 310, 105-111 ; & Grantham, R, et al. (1981), Nucleic Acids Res.9, r43-r74]. 아미노산에 대한 다양한 코돈이 공지되어 있고, 이것들의 선택은 전적으로 임의적일 수 있으나, 이는 선택된 숙주에 대한 코돈의 사용의 빈도에 근거하여 선택하는 것이 바람직하다. 만일 직접적 화학 합성이외의 기술을 사용하면, 이는 수득된 서열의 코돈을 일부 변화시키는 것이 바람직할 것이며, 이는 예컨대, 프라이머로, 목적하는 변환이 포함된 합성 올리고뉴클레오티드를 이용한 위치 특이 돌연변이로 실행할 수 있다 [참조, Mark, D.F., et al.(1984). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666].

본 발명에 있어서, DNA 가 기타의 DNA와 혼성화할 수 있는 것이 상술되어 있고, 이는 당해 기술에서 공지된 기술로 확인될 수 있다. 예컨대, 어떤 특정서열이 임의의 기타 주어진 서열과 혼성화 하는지 확인하기 위해서는, 하나이상의 서열을 예컨대, 랜덤 프라이머 방법 [참조, Feinberg. A.P. & Vogelstein, B.(1983), Anal. Biochem., 132, 6-13] 또는 닉(nick) 번역 방법 [Maniatis, T., et al.(1982), in "Molecular C1oning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY] 을 이용하여, [α-³²]dCTP 로 표식시킬 수 있다. 혼성화 시험에서 사용하는 하나의 DNA 가닥을 예컨대, 니트로셀룰로오스 또는 나일론막에 적절히 흡착시켜, 여기에 통상의 방법으로 가열 또는 UV 조사로 고정시킨다. 하나의 바람직한 양태로, 이어서 막을 6 x SSC, 5%(v/v) 덴하르츠 용액 및 0.1%⒱/v) 황산도데실나트륨 (SDS) 를 함유하는 예비혼성화 용액에 침지시키고, 55℃ 에서 4 시간동안 배양한다. 이어서 기타 표식된 가닥을 예비혼성화 용액에 최종 특이 활성 1 x 10⁶cpm/m1 로 가하고, 60℃ 에서 밤새워 배양한다. 이후, 막을 실온에서 6 x SSC 로 각각 5 분동안 5 회 세정한다. 추가로 57℃ 에서 20분간 세정한후, 막을 방사선사진을 찍어 혼성화가 일어났는지를 결정한다. 이어서, 본 발명의 DNA 와 혼성화한 DNA 를 제조 및 단리시킬 수 있다 [Maniatis, T., et al.(1982), in "Molecular C1oning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY].

이렇게 수득한 본 발명의 DNA 의 발현 벡터로의 통합은 원핵 또는 진핵 숙주 세포의 형질전환을 가능케한다. 이러한 발현 벡터는 전형적으로 숙주세포에서 DNA 가 발현되도록하는, 유전자 발현에서 수반되는 적합한 프로모터, 복제 위치 및 서열을 포함할 것이다.

적합한 원핵 숙주 세포의 예로는 대장균 (Escherichia coli) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 를 들 수 있다. 이러한 숙주 세포에서 목적하는 유전자를 발현시키기 위해서, 이러한 숙주 세포는 1ac UV5 와 같은, 복제의 오리진 및 프로모터 서열을 전형적으로 갖는, 숙주와 병립할 수 있는 종으로부터 유래한 리플리콘을 포함하는 플라스미드 벡터로 형질 전환시킬 수 있다. 이러한 벡터는 바람직하게는 형질전환된 세포에 대한 선별 표현형을 부여할 수 있는 서열을 갖는다.

대장균의 적합한 균주는 대장균 K12 로부터 유래한 균주 JM109 이다. 적합한 벡터에는 pBR322 및 pUC 시리즈 플라스미드가 포함된다. 적합한 프로모터에는 락토오스 프로모터(lac) 및 트립트판 락토오스 프로모터 (trc) 가 포함된다. 통상, 본 발명은 여기에서 예시된 바와 같은, 이러한 숙주, 벡터, 프로모터등의 사용에만 한정되는 것은 아니며, 필요에 따라, 임의의 적합한 계를 사용할 수 있음이 이해될 것이다.

바실러스 서브틸리스의 적합한 바람직한 균주는 균주 207-25 이고, 바람직한 벡터는 pTUB228 [참조, Ohmura, K., et al.(1984), J. Biochem., 95, 87-93] 이다. 적합한 프로모터는 바실러스 서브틸리스 α-아밀라아제 유전자의 조절 서열이다. 만일 원한다면, α-아밀라아제의 시그널 펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열을 세포외분비를 가능케하는 본 발명의 DNA 에 결합시킬 수 있다.

적합한 진핵 세포 숙주에는 척추동물, 이스트등으로부터 유래한 것이 포함된다. 적합한 척추동물 세포의 예로는 원숭이 세포주 COS 이다 [참조, Gluzman, Y. (1981), Cel1, 23, 175-182]. 적합한 이스트에는 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae) 및 쉬조사카로마이세스 프롬브(Schizosaccharomyces pombe) 가 포함된다.

통상, 척추동물용의 적합한 발현 벡터의 요건은 하기와 같다 : 발현될 유전자의 통상 업스트림인 프로모터; RNA 스플라이싱 위치; 폴리아데닐화 위치; 및 전사 말단 서열등. 필요하다면, 이것들은 복제의 오리진을 필요에 따라 포함할 수 있다. 적합한 플라스미든 SV40 초기 프로모터를 포함하는 pSV2dhfr 이다[참조, Subramani, S., et a1.(1981), Mo1. Cel1. Bio1., 1. 854-884]

적합한 진핵생물은 사카로마이세스 세레비시아와 같은 이스트이고, 이스테에 대한 적합한 발현 벡터에는 pAH301, pAH82 및 YEp51 이 포함된다. 적합한 벡터의 예로는, 알코올 데히드로진아제 유전자의 프로모터 [참조, Bennetzen, J.L. & Hal1, B.D. (1982), J. Bio1. Chem., 257, 3018-3025] 또는 카르복시펩티다아제 YGAL 10 프로모터 [참조, Ichikawa, K., et al.(1993), Biosci. Biotech. Biochem., 57, 1686-1690] 을 들 수 있다. 필요하다면, 카르복시펩티다아제 Y 의 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 세포외 분비를 위하여 발현될 DNA 에 결합시킬 수 있다.

COS 세포가 숙주세포로 사용되는 경우, 적합한 벡터로는 자율증식을 가능케하는 SV40 복제 오리진, 전사프로모터, 전사 말단 시그널 및 RNA 스플라이싱 위치가 포함된다. 발현 벡터는 DEAE-덱스트린 방법 [참조, Luthman, H,& Magnusson, G.(1983), Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308], 포스페이트 칼슘-DNA 공침전 방법 [참조, Graham, F.L. & van der Eb, A.J. (1973), Virology, 52, 456-457] 및 전기 펄스 전기천공방법 [참조, Neumann, E., et al.(1982), EMBO J., 1, 841-845] 과 같은 임의의 적합한 방법으로 세포를 형질전환시키는데 사용할 수 있다. 바람직한 양태에 있어서 COS 세포는 2 개의 개별적 발현 벡터-CH11 의 H 사슬의 가변부위를 포함하는 단백질을 코딩하는 DNA 를 포함하는 벡터 및 CH11 의 L 사슬의 가변부위를 포함하는 단백질을 코딩하는 DNA 를 포함하는 벡터로 공형질감염시키며, 상기 벡터는 동시에 발현되어 재조합 항-인간 Fas 항체를 발생시킨다.

본 발명의 형질전환체는 통상의 방법을 사용하여 배양할 수 있고, 목적 단백질은 세포내 또는 세포외 발현된다. 적합한 배양 배지에는 통상 사용되는 각종 배지가 포함되고, 통상 선택된 숙주에 따라 선택될 것이다. 예컨대, COS 세포에 대한 적합한 배지에는 RPMI-1640 및 필요에 따라, 소형 태아 혈청(FBS) 로 보충할 수 있는 둘베코 개질 최소 필수 배지가 포함된다. 배양온도는 세포의 단백질 합성 능력을 현격히 억제하는 임의의 적합한 온도일 수 있고, 바람직하게는 32 내지 42℃, 특히 포유류 세포를 위해서는 가장 바람직하게는 37℃ 이다. 필요하다면, 배양은 1 내지 10%(v/v) 이산화탄소를 포함하는 분위기에서 실행할 수 있다.

본 발명의 형질전환체로 발현된 단백질은 단백질이 세포내 또는 세포외로 발현되는지, 단백질의 물리적 및 화학적 특성과 같은 고려에 따라 공지된 각종 분리방법으로 단리 및 정제할 수 있다. 분리의 적합한 특이 방법으로는 하기의 것이 포함된다 : 통상 사용되는 단백질용 침전제에 의한 처리; 초원심분리, 분자체 크로마토그래피 (겔여과), 흡착 크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 와 같은 크로마트그래피의 각종 방법; 및 이의 조합.

전술한 바와 같은 방법들을 이용하여, 목적 단백질은 용이하게 고수율 및 고순도로 수득할 수 있다. 바람직한 양태에서 생성되는 항체는 만일 J 사슬을 코딩하는 여분의 플라스미드가 없다면 J 사슬이 부족할 것이다. 이러한 경우에서, 생성된 H 및 L 사슬 헤테로이합체는 CH11 보다 약 5 배의 세포독성을 갖는 것을 확립하였다.

Fas 항원에 대한 본 발명의 단백질의 특이 결합 활성은 예컨대, 효소-결합 면역흡수 분석 (ELlSA) 로 측정할 수 있다. ELISA 의 하나의 특이적 양태에 있어서, Fas 항원을 96-웰 플레이트의 웰의 바닥에 고정시키고, 시험 단백질을 웰에 도입한후, 세포를 세척하여 비결합 단백질을 제거한다. 세척후, 웰을 단백질, 예컨대 이의 불변부위에 특이적인 효소-표식 항체에 노출시킨다. 이어서 다시 세포를 세척하고, 웰에 남아있는 임의의 표식을 검출한다. 인간 Fas 항원을 코딩하는 cDNA 는 이미 개시되어 있고, cDNA 를 이의 발현을 위한 동물세포에 도입하는 방법이 또한 공지되어 있다 [참조, Itoh, N., et aI (1991), Ce11, 66, 233-243]. 상기 ELISA 방법에 사용하는 항원은 이또우 (상기) 가 개시한 바와 같이, 인간 Fas 항원의 세포외 부위 및 마우스 인터루킨 3 수용체의 세포의 부위를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 세포의 배양 상층액으로부터 수득할 수 있다.

본 발명의 단백질의 세포독성은 예컨대, 시험 시료가 첨가된 또는 첨가될 배지에서 Fas 발힌 세포 {예, 인간 럼프구 세포주 HPB-ALL [참조, Morikawa, S., et al.(1978), Int. J. Cancer, 21, 166-170] 및 Jurkat (American Type Culture No. TIB-152)} 를 배양하고, MTT 분석 [참조 Green, L.M., et al (1984), J. Immunological Methods,70, 257-268] 으로 생존률을 측정하여 확립시킬 수 있다.

본 발명의 DNA 를 이용하면, 불변부위가 인간 면역글로불린으로 대치된 키메릭 마우스 항체 [참조, Morrison, S, L., et al.(1984), Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855] 을 구축할 수 있다.

마찬가지로, 본질적으로 단지 H 및 L 사슬의 가변 부위로 구성된 Fv 분획을 구축하는 것이 가능하고, 이는 H 및 L 사슬이 신축성 펩티드로 연결된 단일사슬 Fv(scFv) [참조, Huston, J.S., et al.(1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879 이하 참조] 이다.

따라서, 본 발명에 따라, 인간에서의 감소된 면역원성을 갖는 항- Fas 항체는 쥐 인간 항-Fas 항체의 CDR's 로 인간항체의 불변 부위를 포함하는 인간화 항체를 구축함으로서 생성시킬 수 있다 [참조, Jones, P.T., et al.(1986), Nature, 321, 522-525] .

또한 본 발명은 앞서 언급된 증세를 치료하기위한 방법 및 치료조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 전형적으로 본 발명의 치료적으로 유효한 양의 단백질과 혼합된 이에 대한 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유한다. 조성물은 비경구, 정맥내, 피하 또는 국부투여와 같은 임의의 적합한 방법으로 투여할 수 있다. 특히, 처리할 증세가 국부적인 경우, 단백질은 치료한 위치에 가능한한 가깝게 투여하는 것이 바람직하다. 예컨대, 심각한 류마티스 통증은 주로 관절에서 경험할 수 있으며, 단백질은 이러한 곳에 투여할 수 있다. 본 발명의 전신 투여 단백질은 특히 바람직하게는 피로겐이 없는, 치료학적으로, 특히 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태이다. pH, 등장성, 안정성등과 같은 면과 관련한 상기와 같은 약제학적으로 허용가능한 단백질 용액의 제조는 당해 기술의 당업자의 기술범위내이다. 또한, 본 발명의 조성물은 세포성장지연제 및 기타 약제와 같은, 적당하리라 생각될수 있는 추가의 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 단백질로 처리가능한 각종 증세에 대한 투여량 요법은, 증세, 체중, 성별 및 환자의 식이요법, 임의의 기타 적당한 임상 요소를 고려하면, 당업자에게는 쉽게 명백해 질 것이다. 통상적 가이드로서, 일일 투여량은 전형적으로 체중 1 kg 당 1-1000μg 단백질 범위이어야 한다.

본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 좀더 상세히 설명할 것이며, 실시예는 본 발명을 설명하나 이에만 한정되는 것은 아니다. 구체적으로 한정되지않은 임의의 방법, 제제용액 등은 'Molecular cloning-A Laboratory Handbook' (상기)에 찾을 수 있다. 모든 용액은 기타 특별한 언급이 없으면, 수성이고 살균, 탈이온수로 구성되어 있다.

[실시예 1]

인간 Fas 항원에 대한 마우스 모노클론성 항체CH11의 가변 부위를 코딩하는 DNA의 클로닝

(1-1) 폴리(A)⁺-RNA의 제조

총 RNA 를 처그인 및 공역자에 의해 기재된 방법 [참조, Chirgwin, J.M., et al., (1979) Biochemistry 18 : 5294] 에 따라 CH11-생성 하이브리도마 (요네하라로부터 수득되는, 상기) 으로부터 제조한다. 특히, CH11-생성 하이브리도마 [참조, Yonehara, S., et al.,(1994) 'International Immuno1ogy 6, 1849-1856]을 10% (v/v) 소형 태아 헐청 (지브코사제) 을 함유하는 ASFl04 배지 (아지노모또사제) 에서 배양한다· 약 6.7 x 10⁸세포를 원심분리하여 수확하고 상층액은 버린다. 이어서 세포의 생성된 펠릿을 4 M 구아니딘 티오시안에이트 용액 (플루카사제) 60 m1 과 즉시 혼합한다. 생성된 현탁액중의 세포를 이어서 21-게이지니들이 장착된 시린지를 통해 3 회 세포 현탁액을 통기화하여 용해시킨다. 이렇게 수득한 세포 용해질을 초원심분리관 (13PA : 히다찌 고끼) 중의 5.7M 염화세슘/0.l M EDTA 용액 (pH 7.5) 3 m1 상에 깔고 관을 히다찌 RPS-40T 로우터 (13 PA 관, 150,000 x g 20℃, 18 시간) 로 회전시켜 RNA 를 침전시킨다. 침전된 RNA 를 물에 용해시키고, 클로로포름/1-부탄올 (4 : 1, v/v) 로 추출하고, 이어서 100% 에탄올로 재침전시킨다.

폴리(A)⁺RNA 를 바로뒤에 통상의 방법으로 상기에서 제조된 생성된 총 RNA로부터 정제한다 [참조, Maniatis, T. et al., (1988), "Molecular C1oning : A Laboratory Manua1′′ (2nd Edition), Cold Spring Harbor Lab.,7.26-7.28]. 좀더 구체적으로는, 일회용 폴리스티렌 컬럼(직경 0.7 cm)에 올리고 dT 셀룰로오스(파르마시아사제, 타입 7) 100mg을 충진한다. 컬럼을 20 mM 트리스-염산(pH 7.6), 0.5M 염화나트륨, 1 mM 에틸렌디아민 테트라아세테이트(EDTA) 및 0.1% (x/v) 도데실황산나트륨(SDS)를 함유하는 부하(loading) 버퍼로 평형시킨다. 이어서 총 RNA (약 1.2 mg)을 65℃에서 5분간 가열하여 총부피 400㎕의 물에 용해시킨 후 부하 버퍼(상기 농도의 2배로 구성된) 400㎕를 용액에 가한다. 생성된 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 이어서 컬럼에 붓는다. 컬럼을 즉시 통과한 분획을 재회수하고, 추가로 5분간 65℃에서 가열하여, 컬럼에 다시 붓는다.

이어서 컬럼을 부하 버퍼 10 m1 로 세정한후, 추가로 0.1 M 염화나트륨을

함유하는 부하버퍼 5 m1 로 세정하여 비흡착물 및 비특이적 흡착물 모두를 제거한다. 이어서, 용리버퍼 5 ml [10 mM 트리스염산 (pH 7.5), 1 mM EDTA 및 0.05%(w/v)SDS] 를 컬럼상에 부어 특이적 흡착물을 용출시킨다. 생성된 용출물을 200㎕ 의 분획으로 회수한다. 세 번째 및 네번째 200㎕ 용리 분획 (총 400㎕)을 합하고, 3 M 아세트산나트륨 (pH 4.0) 40 ㎕ 및 에탄올 1 ml 과 혼합한다. 생성된 혼합물을 -20℃ 에서 밤새워 저장한다. 다음날 혼합물을 원심분리기로 회전시켜 (10,000 x g, 4℃ 에서 10 분) 펠릿을 회수한다. 이 펠릿을 폴리(A)⁺RNA 시료로 사용하고, 사용할때까지 -80℃ 로 저장한다.

[(1-2) 가변 부위를 코딩하는 DNA 의 클로닝]

마우스 항-Fas 항원 (Cm11) 의 H 사슬 및 L 사슬의 가변 부위를 코딩하는 cDNA 단편을 역전사(역전사효소-RT 이용)와 폴리머라아제 사슬 반응 (PCR) 가 결합된, 'RT-PCR' 로 클로닝시킨다. 상기 기술의 조합으로 (1-1) 에서 제조된 CH11-생성 하이브리도마로부터 유래한 폴리(A)⁺RNA 시료로부터 목적하는 서열의 특이적 증폭이 가능하다.

RT-PCR 반응을 위한 두 세트의 프라이머를 Ig-Prime 세트 (노바겐사제) 로부터 선택한다. MuIgV_H5'-B 및 MuIgMV_H3'-1 을 사용하여 H 사슬의 부위를 증폭시키는 반면, MuIgkV_L5' 및 MuIgMV_L3'-1 을 사용하여 L 사슬의 부위를 증폭시킨다. RT-PCR 반응을 H 사슬 프라이머 세트 및 L 사슬 프라이머 세트 양쪽을 각각 사용하여 실시한다.

a) 역전사효소 반응

역전사효소반응 용액 (44 ㎕) 를 하기와 같이 제조한다 :

10 mM 트리스-염산 (pH 8.3),50 mM 염화칼륨, 0.l mM dATP, 0.l mM dGTP, 0.1 mM dCTP, 0.l mM dTTP, 1.5 mM 염화마그네슘, 2.5 pmo1 의 H 사슬 및 L 사슬 3'-측 프라이머, (1.1) 에서 제조한 50 ng 의 폴리(A)⁺RNA 및 몰로니 쥐 백혈구 바이러스 (MMLV) 로부터 유래한 20 단위의 역전사효소 (바이오케미칼 고오교사제)를 합치고 생성된 혼합물을 42℃ 에서 1 시간동안 인큐베이션시킨다.

[b) PCR에 의한 증폭]

a) 에서 제조한 역전사효소 반응용액을 H 사슬 및 L 사슬 5' 프라이머 25 pmol 과, 적합하면, Taq DNA 폴리머라아제 5 단위 (일본, 퍼긴 엘머사제, ampliTaq DNA 폴리머라아제) 와 혼합하여 키트로 공급되는 반응 버퍼의 100 ㎕ 의 초종부피로 만든다 (특별한 언급이 없는 한, 효소에 대한 버퍼 및 용액은 공급자의 키트로 공급되는 것으로 한다). 생성된 총 반응 혼합물을 94℃ 에서 2 분간 가열하고, 이어서 94℃ 에서 1 분, 50℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분간의 열주기로 가열한다. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서 용액을 추가로 10 분간 72℃ 로 유지시킨다. 유전자 증폭기 PCR 시스템 (퍼킨 엘머사제, 일본) 을 사용하여 모든 PCR 반응에서 반응 온도를 조절한다.

[c) PCR 생성물의 분석]

b) 에서 제조된 PCR 반응 혼합물의 일부를 1.5% (w/v) 아가로오스 젤 (FMC 바이오프러덕츠사제) 상에서 젤 전기영동시켜 분석한다. H 및 L 사슬 PCR 반응의 각각의 생성물을 약 430 bp 밴드로 수득한다. 밴드 크기는 또한 동일한 겔에서 조작한 분자량 마커와 비교하여 측정한다.

[d) PCR 생성물의 클로닝]

b) 에서 수득한 PCR 생성물의 각각을 원래의 TA 클로닝 키트 (인비트로겐사제) 를 이용하여 별개의 플라스미드 벡터로 접합시킨다. 좀더 구체적으로는, 50 ng 의 pCRII 벡터 및 4 단위의 T4 DNA 리가아제 (모두 키트내에 포함된) 을 리가아제 반응 버퍼 [6mM 트리스-염산 (pH 7.5), 6mM 염화마그네슘, 5mM 염화나트륨, 7mM β-메르캅토에탄올, 0.1 mM ATP, 2 mM 디티오트레이톨 (DTT), 1 mM 스퍼미딘 및 0.1 mg/m1 소형 태아 혈청] 에 가한다. 또한 리가아제 반응버퍼에는 상기 c) 의 겔 전기영동으로 측정시, 약 10 ng 의 목적 PCR 생성물을 함유하는 정도로 선택된 PCR 반응 혼합물의 일부를 포함한다. 생성된 혼합물을 14℃ 에서 15 시간동안 인큐베이tus 시킨다.

이어서, 리가아제 반응 혼합물 2 ㎕ 을 미리 0.5 M β-메르캅토에탄올 2 ㎕를 가하여 감응세포화시킨, 대장균 균주 TOP1OF' 50 ㎕ (키트내 포함) 과 혼합한다. 생성된 형질전환 혼합물을 30 분간 빙상에 위치시키고, 42℃ 에서 30 분간 가열하고, 이어서 다시 빙상에 추가로 2 분간 위치시킨다. 이후, 이어서 혼합물을 SOC 배지 500㎕ [2%(w/v) 트립톤, 0.5%(w/v) 이스트 추출물, 0.05%(w/v) 염화나트륨, 2.5 mM 염화나트륨, 1mM 염화마그네슘, 20 mM 글루코오스] 에 가하고, 생성된 혼합물을 1 시간동안 회전 진탕하면서 배양한다 (37℃, 110rpm). 생성된 혼합물을 이어서 암피실린 100 ㎍/ml 를 함유하는 L-육즙 아가 배지 플레이트[1%(w/v) 트립톤, 0.5%(w/v) 이스트 추출물, 0.5%(w/v) 염화나트륨, 0.1% (w/v) 글루코오스, 0.6% (w/v) 박트 아가 (디프코사제)] 에 깔고 플레이트를 교반없이 37℃ 에서 밤새워 배양한다.

이 절차로 발생된 내암피실린성 콜로니를 선택하고 백금 피크로 긁어낸다. 선택된 콜로니로부터의 세포를 개별적으로 암피실린 100㎍/ml 을 함유하는 L-육즙 배지 5m1 중에서, 37℃로 밤새워 배양한다. 이어서 배양물을 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 플라스미드 DNA 를 알칼리 용해 방법 (참조, Maniatis, T., et al., 상기) 를 이용하여 세포로부터 제조한다. 각각의 H 및 L 프라이머 세트에 대한 플라스미드를 수득하고, 이를 pVH4 (H 사슬 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 단편을 포함하는 플라스미드) 및 pVL8 (L 사슬 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 단편을 포함하는 플라스미드) 로 명명하였다.

[실시예 2]

CH11의 가변 부위의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열의 결정

(2-1) CH11의 H 사슬 및 L 사슬의 가변 부위의 N-말단 아미노산 서열의 결정

[a) CH11의 제조]

CH11-생성 하이브리도마 (참조 실시예 1) 을 10% (v/v) 소형 혈철 (지브코사제) 를 함유하는 ASF 104 배지 (아지노모또사제) 에서 2 x 10⁸의 세포수로 육성하고, 이어서 이 시료를 혈청이 없는 ASF 104 배지 50 m1 에서 37℃ 로 5 일간 배양한다. 이후, 배양물을 원심분리하고 (토미세이코사제, 번호 4 회전기, 15,000 x g, 4℃, 15 분), 상층액을 수집한다. CH11 를 E-Z-Sep 항체 정제 키트(파르마시아 바이오테크사제) 를 이용하여 배양 상층액으로부터 수득한다.

b) a) 에서 제조한 상층액 100㎕ 에 해당하는, 정제된 CH11 의 일부를 10%(v/v) 의 p-메르캅토에탄올 및 4% (w/v) SDS 를 함유하는 100 mM 트리스-염산 버퍼 (pH 6.8) 10㎕ 에 가한다. 생성된 혼합물을 95℃ 에서 5 분간 가열하여 변성시킨다. 이어서 변성된 시료를 12% (w/v) 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 전기영동후 겔을 전달 버퍼 [25 mM 트리스-붕산 (pH9.5), 10% 메탄올(v/v)] 에 침지시키고 실온에서 15 분간 진탕한다. 이어서 겔상의 단백질 밴드를 세미드라이브 블롯팅 장치 (이와끼 글래스사제) 를 이용하여, 0.2 A 의 정류, 4℃ 에서 1 시간동안 폴리비닐리덴 디플로라이드(PVDF) 막 (닛뽕 밀리포어사제)으로 옮긴다. 이후, PVDF 막을 0.1% (w/v) 코마시에 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 용액으로 염색하고, 100% 메탄올로 탈염시킨다. 단지 2개의 주요한 단백질 반점만이 보이며, 이는 H 사슬 및 L 사슬에 해당한다. 이 단백질 반점을 절단하고, 이를 포함하는 겔을 실온에서 건조시킨다.

c) b) 의 PVDF 막으로 옮겨진 단백질의 아미노산 서열을 자동 에드만 방법에 따라 [참조, Edman, P., et al., (1967), Eur.J. Biochem, 1, 80 이하 참조] 기상 단백질 서열기 (PPSQ-10; 시마드즈사제) 를 이용하여 분석한다. 이에 따라 CHl1 의 H 사슬의 가변부위의 N-말단 아미노산 서열, 및 L 사슬의 N-말단 아미노산 서열을 결정되었고, 이를 각각 서열 목록의 SEQ ID NO.13 및 14 로 나타내었다.

[(2-2) DNA 뉴클레오티드 서열의 결정]

CHl1 의 H 및 L 사슬의 가변 부위를 코딩하는 cDNA 의 총 뉴클레오티드 서열을, 각각의 플라스미드 pVH 4 및 pVL 8 (실시예 1 에서 제조) 내의 삽입체를 서열화하여 결정하였다.

pCRII 벡터는 SP6 프로모터 서열 및 T7 프로모터 서열을 갖고, 이는 임의의 삽입된 cDNA 를 포함하여, 서열에 대응하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 (퍼킨 엘머사제, 일본) 을 이용하여 pVH 4 및 pVL 8 의 삽입체의 서열을 결정하는 것을 가능케한다. 서열 분석에 대한 시료는 상기 플라이머 및 염료 프라이머 주기-서열화 키트 (퍼킨 엘머사제, 일본) 을 이용하여 제조한다. 플라스미드 pVH 4 및 pVL 8 로부터의 플라스미드 DNA 를 주형으로 사용한다. 각각의 cDNA 삽입체의 서열을 DNA 서열기 (모델 373, 퍼킨 엘머사제, 일본) 를 이용하여 결정한다. H 사슬 가변 부위의 cDNA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.15 로 나타내었고, L 사슬 가변 부위의 cDNA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID N0.16 으로 나타내었다.

서열 목록의 SEQ ID NO.13 의 아미노산 번호 1 내지 15 로 나타낸, CH11 의 H 사슬의 N-말단 아미노산 서열은 완전히 SEQ ID NO.15 의 뉴클레오티드 번호 32 내지 76 으로 코딩된 아미노산 서열과 일치한다. 그러므로, 플라스미드 pVH 4는 CH11 의 H 사슬의 가변 부위를 코딩하는 DNA 를 포함함이 추론된다.

서열 목록의 SEQ ID NO.14 의 아미노산 번호 1 내지 21 로 나타낸, CH11 의 L 사슬의 N-말단 아미노산 서열은 완전히 SEQ ID NO.16 의 뉴클레오티드 번호 29 내지 91 로 코딩된 아미노산 서열과 일치한다. 그러므로, 플라스미드 pVL 8은 CH11 의 L 사슬의 가변 부위를 코딩하는 DNA 를 포함함이 추론된다.

[실시예 3]

CH11의 완전한 H 사슬, L 사슬 및 J 사슬을 코딩하는 DNA의 클로닝

(3-1) cDNA 라이브러리의 제조

cDNA 라이브러리를 오까야마-베르그 방법 [Okayann, H. et al., (1987), Methods in Enzymology 154, 3-28] 로 제조한다. 좀더 구체적으로는, CH11-생성 하이브리도마로부터 실시예 1-1(a)로부터 제조한 바와 같은, 폴리(A)⁺RNA 5㎍을 아비안 마이엘로블라스토시스 (Avian myeloblastosis) 바이러스 (AMV) 로부터 유래한 75 단위의 역전사효소 (세이까가꾸 고오교사제) 를 함유하는 반응혼합물 30㎕ {50mM 트리스-염산 [pH 8.3], 6 mM 염화마그네슘, 40 mM 염화칼륨, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mM dCTP, 2 mM dTTP, 2㎍ 벡터 프라이머 [3'-올리고(dT)-꼬리 pcDV-1] : 파르마시아사제}에 가한다. 생성된 혼합물을 37℃에서 30분간 배양한다.

이후, 동일한 부피의 페놀-클로로포름(1 : 1, v/v)를 반응 혼합물에 가하고 완전히 혼합한다. 생성된 혼합물을 원심분리하고 (10,000 x g, 실온, 5분), 수성층을 회수한다(페놀 : 클로로포름으로 추출하고 수성 상층액을 회수하는 이 절차를 이후 "페놀-클로로포름 추출"로 칭한다). 생성된 수성층에 4 M 아세트산 암모늄 35㎕ 및 에탄올 140㎕을 가하고, 생성된 혼합물을 -70℃에서 15분간 냉각시킨후, 원심분리(10,000 x g, 4℃, 15분)한다. 펠릿을 에탄올의 75% (v/v) 용액으로 세정하고 이어서 감압하 건조시킨다.

이어서 건조된 침전물을 증류수 13 ㎕ 에 용해시킨후, 말단 전사효소 반응 혼합물 [140 mM 소듐 카코딜레이트, 30 mM 트리스-염산 (pH 6.8), 1 mM 염화코발트, 0.5 mM DTT, 0.3 ㎍ 폴리아데닐산 (폴리 A, 파르마시아사제), 0.2 mM dCTP]을 가하고 생성된 반응 혼합물을 37℃ 에서 5 분간 인큐베이션 시킨다. 이어서 공급자의 지시에 따라, 말단 데옥시뉴클레오티딜 전사효소 (21 단위, 파르마시아사제) 를 가하고, 반응을 5 분간 진행시킨다. 이어서 반응 혼합물을 페놀-클로로포름 추출시킨다. 이어서, 4 M 아세트산암모늄 20 ㎕ 및 에탄올 80 ㎕ 을 회수한 수정층에 가하고, 혼합물을 -70℃ 에서 15 분간 냉각시킨후, 원심분리(10,000 x g, 4℃, 15 분) 시킨다. 펠릿을 에탄올의 75% (v/v) 용액으로 세정하고 감압하 건조시킨다.

상기 방법으로 수득한 DNA 침전물을 반응 혼합물 [10 mM 트리스-염산 (pH 7.5),60 mM 염화나트륨, 7 mM 염화마그네슘] 30 ㎕ 에 용해시키고, 30 단위의 제한효소 HindIII 를 생성된 용액에 가한다. 통상, 제한 효소를 사용하나, 버퍼는 상술되지 않는 경우, 사용하는 버퍼는 효소가 공급된 버퍼이다. DNA 를 2개의 효소로 분해하는 경우, 분해는 2 개의 효소로 연속적으로 실행한다. 첫번째 분해후, DNA 는 침전되며, 이를 재현탁시킨후 두번째 효소로 분해시킨다. 침전 및 재현탁 기술은 당해 분야에 공지되어 있다 (참조, Maniatis et al., 상기). 본 실시예에서 사용하는 모든 제한효소 및 버퍼는 다까라 슈조사제로 공급한다.

DNA 를 제한 용액에서 37℃ 밤새워 분해시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 페놀-클로로포름 추출한다. 이어서, 4 M 아세트산암모늄 35 ㎕ 및 에탄올 140 ㎕ 을 회수한 수성층에 가하고, 혼합물을 -70℃ 에서 15 분간 냉각시킨다. 혼합물을 원심분리시켜 (10,000 x g, 4℃, 15 분) DNA 를 침전시키고, 생성된 펠릿을 에탄올의 75%(v/v) 용액으로 세정하고 감압하 건조시킨다. 이렇게 제조된 침전물 DNA 를 후속 절차에서 cDNA 주형으로 사용한다.

병행하여, 벡터 pcDL-SRα296 로부터의 플라스미드 DNA [참조, Takebe, Y et al.,(1989), "JIKKEN IGAKU (실험 약제)", 7, pp 95-99] 를 제한효소 PstI 로 분해시킨다· 분해 생성물을 dGTP 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 전사효소 (파르마시아사제) 로 처리하여, 올리고 dG 를 하기와 같이 3' 말단에 부가한다 :

pcDL-SRα296 DNA (50㎕ 중의, 100㎍) 를 10 x 말단 데옥시뉴클레오티딜 전사효소 버퍼 10 ㎕ [1 x 버퍼 : 1.4 M 소듐 카코딜레이트, 0.3 M Tris-HC1, (pH 7.6), DTT 10 ㎕ [1mM), 0.1 mM³H-dGTP 20㎕ (듀퐁사제) 및 말단 전사효소(210IU, 파르마시아사제) 10 ㎕] 에 가한다. 혼합물을 37℃ 에서 40 분간 인큐베이션하고, 이어서 동부피의 TE 버퍼-포화 페놀과 혼합한다. 정치후, 수성층을 제거하고 페놀-클로로포름으로 추출한다. 페놀 및 페놀-클로로포름 양쪽으로추출한후, DNA 를 에탄올을 이용하여 침전시키고 TE 버퍼 50㎕ 에 재현탁시킨다.

침전된 모든 DNA 를 제한효소 HindIII 로 분해시키고, 분해 생성물을 18%(w/v) 아가로오스 겔 상에서 겔 전기영동으로 분리시킨다. 800 bp 의 밴드를 겔로부터 절단하고, 제조자의 지시에 따라 GENECLEAN 키트(후나꼬시사제) 를 이용하여 젤로부터 추출한다. 생성된 DNA 를 TE 버퍼 100 ㎕ 에 용해시키고, 에탄올 100㎕을 가한다. DNA의 최종 농도는 0.09 ㎍/㎕ 이다.

생성된 생성물은 올리고(dG)가 SRα 프로모터에 부착된 링커-DNA를 생성시킨다(도 1).

상기에서 제조된, 침전 건조된 cDNA 시료를 TE 버퍼 10㎕ [10mM 트리스-염산 (pH 7.5), 1 mM EDTA]에 용해시킨다. 생성된 용액(1㎕)의 일부를 상기에서 제조된 링커-DNA 0.08 pmol을 함유하는 반응 버퍼 [10mM 트리스-염산 (pH 7.5), 1mM EDTA, 100 mM 염화나트륨]에 가한다. 생성된 혼합물을 65℃에서 5분간 가열한후, 42℃에서 30분간 배양한다. 이후, 10x 리가아제 버퍼 [10mM ATP, 660mM 트리스-염산 (pH 7.5), 66 mM 염화마그네슘, 100 mM DTT], 76㎕ 증류수 및 1㎕의 10 mM β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD, 베링거 만하임)을 반응 혼합물에 가하고, 생성된 혼합물을 빙상에서 10분간 냉각시킨다. 대장균 DNA 리가아제 (8.4 ㎍ 당량, 파르마시아사제)를 이어서 냉각된 반응 혼합물에 가하고 전체를 밤새워 12℃에서 배양한다.

이 인큐베이션후, 뉴클레오티드 용액 2㎕(2mM, dATP, 2mM dGTP, 2mM dCTP, 2mM dTTP), 0.5㎕의 10mM NAD, 42㎍ 당량의 대장균 DNA 리가아제 (파르마시아제), 4.1 단위의 DNA 폴리머라아제 I(파르마시아사제), 및 5.5 단위의 리보뉴클레오티드 H (파르마시아사제)를 반응 혼합물에 가한다. 이어서 반응 혼합물을 12℃에서 1시간동안 인큐베이션하고 이어서 추가로 22℃에서 1시간동안 인큐베이션한다. 이 방법으로 제조된 cDNA 라이브러리를 필요할 때까지 -20℃에서 저장한다.

[(3-2) PCR에 의한 클로닝]

[a) 프라이머의 제조]

H 사슬의 경우, 실시예 2 에서 결정한 바와 같은, CH11 의 H 사슬의 가변부위의 아미노산 서열을 카바트 등이 제조한 항체 아미노산 서열 데이터베이스와 비교한다 [참조, kabat E.A. et al., (1991), in "Sequences of Proteins of Immunological Interest Vo1. II", U.S. Department of Health and Human Services]. CH11 의 H 사슬 (μ 사슬) 은 서브클래스 2A 임이 결정되었다. 그러므로, 올리고뉴큘레오티드 프라이머는 서브클래스 2a 인 마우스 H 사슬을 코딩하는 DNA 의 5'-비번역 부위의 일부와 혼성되도록 합성한다. 선택된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 이후의 서열을 갖는다 : 5'-CTAAGGGAAT TCCGCCTCTCCTCAGACACT GAA-3' (H5-1; 서열목록의 SEQ ID NO.17).

또한 CH11 H-사슬의 3' 비번역 부위의 일부와 혼성될 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계한다. 올리고뉴클레오티드의 설계는 골드베르그 등 [참조, Goldberg, I.G., et a1., (1981) Gene 15, 33-42] 에 의해 보고된 마우스 면역글로불린 M 사슬 불변부위를 코딩하는 DNA 의 뉴클레오티드 서열에 기초하며, 선택된 서열은 이후와 같다 : 5'-TTTTACTCTA GAGACCCAAG GCCTGCCTGGTTGA-3' (H3-1; 서열목록의 SEQ ID NO.18).

L 사슬에 대해서는, 실시예 2 에서 결정된 바와 같은, CH11 의 L 사슬의 가변 부위의 아미노산 서열을 카바트 와 공역자 (상기) 에 의해 제조된 항체 아미노산데이타베이스와 비교한다. CH11 의 L 사슬은 서브클래스 k2 임이 밝혀졌다.

그러므로, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서브클래스 k2인 마우스 L 사슬을 코딩하는 DNA의 5'-말단 비번역 부위의 일부와 혼성하도록 설계한다. 선택되는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 이후의 서열을 갖는다 : 5'-AAATAGGAATTCCAGTCTCC TCAGGCTGTC TCC-3' (L5-1; 서열목록의 SEQ ID NO. 19).

또한 3' 비번역 부위와 혼성할 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계한다. 올리고뉴클레오티드의 설계는 등록이름 MUSIGB1L1(수납 번호 D14630) 하 등록된 마우스 면역글로불린 k 사슬 불변 부위를 코딩하는 DNA 의 뉴클레오티드 서열에 기초한다. 사용하는 서열은 이후와 같다 : 5'-ATGATCTCTA GAGTGGTGGC ATCTCAGGACCT-3' (L3-1; 서열목록 SEQ ID NO. 20).

J 사슬의 경우에서는, 가변 부위가 존재하지 않으며, J 사슬을 코딩하는 DNA 의 서열 및 J 사슬의 아미노산 서열 양쪽이 공지되어 있다 [참조, Cann, G. M., et al., (1982), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 79, 6656-6660]. 이 발견에 근거하여, J 사슬을 코딩하는 DNA 의 5' 및 3' 비번역 부위의 일부와 혼성될 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성한다. 이 올리고뉴클레오티드는 이후의 서열을 갖는다 : 5'-TTGCGGATT CCTCACCTGT CCTGGGGTTA TT-3' (J5-1; 서열목록의 SEQ ID NO. 21) 및 5'-ATTGCCTCTA GAGCCTCTAA GGACAACGAC CT-3' (J3-1; 서열목록의 SEQ ID NO. 22).

상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 모두 포스포아미다이트 방법 [참조, Mattrucci, M.D. & Caruthers, M.H. (1981), J.Am.Chem.Soc., 103, 3185-3191]에 따라 자동 DNA 합성기 380 B (퍼킨 엘머사제, 일본)을 이용하여 합성한다. 합성 완료후, 각각의 프라이머를 지지체로부터 절단하여 탈보호시킨후 냉동 건조시킨다.

생성된 생성물을 증류수에 용해시키고, 필요할 때까지 -20℃ 에서 저장한다.

b) PCR 로 목표 유전자의 증폭

PCR 반응 용액 [10 mM 트리스-염산 (pH 8.3),50 mM 염화칼륨, 1.5 mM 염화마그네슘, 2.5 mM dATP, 2.5 mM dGTP, 2.5 mM dCTP, 2.5 mM dTTP] 을 제조하고, 실시예 4-1 에 기재된 cDNA 0.1 ㎕, Taq DNA 폴리머라아제 1 단위 (퍼킨 ,엘머사제, 일본) 및 올리고뉴클레오티드 프라이머 15 pmo1 (3-2a 에서 제조) 를 PCR 반응용액 100 ㎕에 가하고 94℃ 에서 2 분간가열한다. 이어서 생성된 혼합물을 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분의 열주기로 가열한다. 이 주기를 30 회 반복한다. 마지막 주기후, 용액을 추가로 10 분간 72℃ 에서 유지시킨다.

각각의 반응에서 사용하는 프라이머의 조합은 하기와 같다 :

H5-1 및 H3-1 (H 사슬);

L5-1 및 L3-1 (L 사슬);

J5-1 및 J3-1 (J 사슬).

c) PCR 생성물의 분석

b) 의 PCR 반응을 실행한후, 반응 혼합물의 일부를 H 사슬의 경우 0.8% (w/v) 아가로오스 겔상에서 젤 전기영동으로 분석한다. L 및 J 사슬에 대해서는 5% (w/v) 아가로오스 겔 (아가로오스는 FMC 바이오프러덕츠로부터 얻는다)을 사용한다. PCR 반응의 생성물은 H 사슬에 대해서는 약 1900bp, L 사슬에 대해서는 800bp, J 사슬에 대해서는 650bp 의 밴드이다. 밴드 크기는 동일한 겔상에서 실행된 분자량 마커와 비교하여 측정한다.

[d) PCR 생성물의 클로닝]

b) 에서 수득한 각각의 PCR 생성물을 진핵생물 TA 클로닝 키트 (인비트로겐사제)를 이용하여, 플라스미드 벡터에 접합시킨다. 좀더 구체적으로는, 60 ng의 pCR3 벡터 (키트내 포함) 및 4 단위의 T4 DNA 리가아제를 PCR 반응 혼합물의 일부를 함유하는 리가아제 반응 버퍼 [6mM 트리스-염산 (pH 7.5), 6mM 염화마그네슘, 5mM 염화나트륨, 7mM β-메르캅토에탄올, 0.1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM 스퍼미딘 및 0.1 mg/m1 소형 태아 혈청] 에 가한다. PCR 반응 혼합물의 부피는 겔전기영동으로 측정시, 약 10 ng 의 목적 PCR 생성물을 함유하는 정도로 선택한다. 생성된 혼합물을 14℃ 에서 15 시간동안 배양한다.

리가아제 반응 혼합물 (2㎕) 의 일부를 0.5 M p-메르캅토에탄올 2㎕ 을 첨가하여 감응세포화된, 대장균 세포, 균주 TOP1OF' (키트내 포함) 50㎕ 와 혼합한다. 생성된 혼합물을 빙상에 30 분간 위치시키고, 42℃ 에서 30 초간 덥힌후, 다시 빙상에서 2 분간 위치시킨다. 이어서 SOC 배지 (500㎕, 전술한 바와같이)를 상기 혼합물에 가하고, 생성된 혼합물을 37℃ 에서 1 시간동안 회전진탕(110rpm) 하여 배양한다. 이어서 배양액을 100 μg/m1 의 암피실린을 함유하는 L-육즙 아가 배지 플레이트상에 도포하고 37℃ 에서 밤새워 배양한다. 이어서 나타난 내암피실린성 클로니를 백금 피크로 긁어내어 100 μg/m1 의 암피실린을 함유하는 L-육즙 배지 5ml 에서 37℃ 로 밤새워 배양한다. 상기 배양물을 원심분리하여 알칼리 용해 방법 (Maniatis et a1., 상기) 으로 플라스미드 DNA 을 제조하는데 사용되는 세포를 침전시킨다.

3 개의 생성된 플라스미드를 pCR3-H123 (H 사슬-코딩 cDNA 를 포함하는 플라스미드), pCR3-L103 (L 사슬-코딩 cDNA 를 포함하는 플라스미드) 및 pCR3-J1123 (J 사슬-코딩 cDNA 를 포함하는 플라스미드) 로 나타낸다. 대장균 균주 DH5α (지브코사제) 의 감응세포를 pCR3-H123, pCR3-L103 및 pCR3-J1123 중의 하나로 형질전환시키고, 생성된 형질전환체를 각각 기탁번호 FERM BP-5427, FERM BP-5428 및 FERM BP-5429 로 1996 년 2 월 28 일자로 산업과학기술청의 생명과학기술연구소에 기탁하였다. CH11 의 H, L 및 J 사슬을 코딩하는 DNA 를 용이하게 공지된 방법으로 상기 균주로부터 제조한다.

[실시예 4]

CH11 의 H 사슬, L 사슬 및 J 사슬을 코딩하는 cDNA의 총 뉴클레오티드 서열의 결정

(4-1) DNA의 뉴클레오티드 서열의 결정

마우스 면역글로불린 M 사슬은 약 110 잔기를 포함하는 N-말단 가변 부위 및 가변 부위에 인접한 약 470 잔기를 포함하는 불변 부위로 구성된다. 마우스 면역글로불린 k 사슬은 약 110 잔기를 포함하는 N-말단 가변 부위 및 가변 부위에 인접한 약 107 잔기를 포함하는 불변 부위로 구성된다. CH11 의 H 사슬 및 L 사슬을 코딩하는 cDNA 의 완전한 뉴클레오티드 서열은 실시예 2 에서 확인된 바와 같이, [참조, Kabat E.A. et al., (1991), in "Sequences of Proteins of Immunological Interest Vo1. II", U. S. Department of Health and Human Services] 공지된 불변 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 이에 접합된 사슬의 가변 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성됨이 예상된다.

CH11 의 J 사슬을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 공지된 J 사슬 서열과 동일하리라 추정된다.

상기 추정된 뉴클레오티드 서열에 근거하여, 길이 20 bp 의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하며, 이는 60 내지 200 bp 의 코딩 간격으로 분리되는, H, L 및 J 사슬의 서열에 상응한다. 상기 프라이머를 서열 분석을 위해 사용한다.

합성된 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기와 같다 :

H 사슬 :

L 사슬 :

J 사슬 :

각각의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 자동 DNA 합성기 (모델 380B : 퍼킨엘머사제, 일본) 를 이용하여 포스포아미다이트 방법으로 합성한다. H 사슬의 서열분석을 위한 시료를 플라스미드 pCR3-H123 으로부터의 DNA 를 이용하여 제조한다. L 사슬의 서열분석을 위한 시료를 플라스미드 pCR3-L103 으로부터의 DNA를 이용하여 제조한다. J 사슬의 서열분석을 위한 시료를 플라스미드 pCR3-J1123 으로부터의 DNA 를 이용하여 제조한다. PCR 반응을 하기와 같이, Prism Ready Reaction Terminator Cycle Sequencing Kit (퍼킨 엘머사제, 일본)을 이용하여 실행한다. pCR3-H123 (1.5 μg) 및 4.8pmo1 의 프라이머 (SHF-2)를 혼합하여 증류수중에서 최종 부피 16㎕ 로 만든다. 상기 pCR3-H123/프라이머 혼합물 (9.5㎕) 의 일부를 Taq DNA 폴리머라아제를 함유하는 프리믹스 10.5 ㎕ 와 혼합한다. 이 모든 절차는 키트내의 지시에 따른다. 생성된 혼합물을 자동 반응기 (Catalyst : 퍼킨 엘머사제, 일본) 에 위치시킨다. 사용하는 반응 주기는 하기와 같다 : 95℃ 에서 30 초, 50℃ 에서 15 초 및 60℃ 에서 4 분간 25 회 반복한다.

반응주기의 완료후, 증류수 80㎕ 를 생성된 용액에 가하고, 생성된 혼합물내의 DNA 를 페놀/클로로포름 방법으로 2 회 추출한다. 회수된 수성층을 2 M 아세트산나트륨 15 ㎕ 및 에탄올 300 ㎕ 와 혼합한후, 원심분리하여 침전물을 회수한다. 침전물을 에탄올 70% (v/v) 용액으로 세정하고 감압하 건조시킨후, 시료 용액 3 ㎕ (4㎕ 0.25M EDTA 100㎕ 포름아미드 및 15㎕ 증류수) 에 용해시킨다.

서열 반응을 실행하고, 32 H사슬 프라이머, 11 L사슬 프라이머 및 11 J사슬 프라이머에 대하여, DNA 서열기 (모델 373 A : 퍼킨 엘머사제, 일본) 로 분석한다.

각각의 프라이머에 대해서 얻은 서열 데이타를 통합하여 CH11 의 H, L 및 J 사슬의 완전한 뉴클레오티드 서열을 결정한다. 각각의 플라스미드 삽입체의 cDNA 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 목록의 SEQ ID NO.7,9 및 11 로 나타내었다.

상기 뉴클레오티드 서열에 대응하는 아미노산 서열을 각각 서열 목록의 SEQ ID NO.8,10 및 12 로 나타내었다.

[(4-2) CH11의 H 사슬의 일차 구조]

서열 목록의 SEQ ID NO.15 의 뉴클레오티드 번호 32 내지 379 로 나타낸 바와 같이, H 사슬 가변부위의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.7 의 뉴클레오티드 번호 58 내지 405 와 일치하는 것으로 밝혀졌다.

SEQ ID NO.8 의 아미노산 번호 117내지 571 로 나타낸 아미노산 서열은 항체 아미노산 서열의 데이타베이스와 비교할때 [kabat E.A. et al., 상기, 마우스 IgM 으로부터 유래한 H 사슬 불변 부위내의 아미노산 서열과 일치하는 것으로 밝혀졌다.

SEQ ID NO.8 의 아미노산 번호 -19 내지 1-로 나타낸 아미노산 서열은 CH11의 H 사슬의 시그널 서열임으로 밝혀졌다.

SEQ ID NO.7 의 뉴클레오티드 번호 406 내지 1770 으로 나타낸 뉴클레오티드 서열은 마우스 IgM 의 H 사슬 불변 부위와 일치하는 것으로 밝혀졌다.

이러한 결과에 근거하여, 총 뉴클레오티드 서열은 총 아미노산 서열과 함께 확립될 수 있었다.

(4-3) CH11 의 L 사슬의 일차 구조

서열 목록의 SEQ ID NO.16 의 뉴클레오티드 번호 29 내지 364 로 나타낸 바와 같이, L 사슬 가변부위의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.9 의 뉴클레오티드 번호 58 내지 393 와 일치하는 것으로 밝혀졌다.

SEQ ID NO.10 의 아미노산 번호 113 내지 219 로 나타낸 아미노산 서열은 항체 아미노산 서열의 카바트의 데이타베이스와 비교할때, 마우스 kL 사슬 불변 부위내의 아미노산 서열과 일치하는 것으로 밝혀졌다.

SEQ ID NO.10 의 아미노산 번호 -19 내지 -1 로 나타낸 아미노산 서열은 CHl1 의 L 사슬의 시그널 서열임으로 밝혀졌다.

SEQ ID NO.9 의 뉴클레오티드 번호 394 내지 714 로 나타낸 뉴클레오티드 서열은 마우스 kL사슬 불변 부위와 완전히 일치하는 것으로 밝혀졌다.

이러한 결과에 근거하여, 총 뉴클레오티드 서열은 총 아미노산 서열과 함께 확립될 수 있었다.

(4-4) CH11의 J 사슬의 일차구조

SEQ ID NO.12 의 아미노산 번호 1 내지 137 로 나타낸 아미노산 서열을 항체 아미노산 서열의 데이타베이스와 비교한 결과 공지된 마우스 J 사슬과 일치하는 것으로 밝혀졌다.

SEQ ID NO.11 의 아미노산 번흐 67 내지 477 로 나타낸 뉴클레오티드 서열은 공지된 마우스 J 사슬과 동일함이 밝혀졌다.

SEQ ID NO.12 의 아미노산 번호 -22 내지 -1 로 나타낸 아미노산 서열은 CH11 의 J 사슬에 대한 시그널 서열임이 밝혀졌다.

이러한 결과에 근거하여, 총 뉴클레오티드 서열은 총 아미노산 서열과 함께 확립될 수 있었다.

(4-5) 상보성 결정 부위 (CDR) 의 결정

전술된 바와 같이 결정된, CH11 의 H 사슬 및 L 사슬의 가변부위내의 각각의 CDR 의 위치 및 아미노산 서열 모두를 카바트의 항체 아미노산 서열 데이타베이스(상기) 와 비교하여 확인하였다. 이 데이타베이스는 가변 부위내의 골격영역의 아미노산 사슬 길이는 상이한 항체 (단, 서브타입은 동일하다) 전반에 걸쳐 실질적으로 일정하며, 단 서브타입은 동일하고, 아미노산 서열은 동일한 공통 특성을 갖는다. 그러나, 이러한 골격 부위사이에 존재하는 CDR's 는 각각의 항체에 특이적인 서열이다.

CH1l H 사슬의 가변 부위의 아미노산 서열과 마우스 μ2a 서브 타입의 서열과 비교하여, CH11 H 사슬내의 CDR 를 SEQ ID NO.8 의 아미노산 번호 31 내지 35 (CDRH₁, 서열목록의 SEQ ID NO.1 에 대응), SEQ ID NO.8 의 아미노산 번호 50 내지 66 (CDRH₂, 서열목록의 SEQ ID NO.2 에 대응) 및 SEQ ID NO.8의 아미노산 번호 99 내지 99 내지 105 (CDRH₃, 서열목록의 SEQID NO.3에 대응)로 나타내었고, 이 모든 것은 서열목록의 SEQ ID NO.8에 존재한다.

CH11 L 사슬의 가변 부위의 아미노산 서열과 마우스 k2 서브 타입의 서열과 비교하여, CH11 L 사슬의 CDR 는 SEQ ID NO.10의 아미노산 번호 24 내지 39 CDVRL₁, 서열목록의 SEQ ID NO.4에 대응), SEQ ID NO.10의 아미노산 번호 55 내지 61 (CDRL₂, 서열목록의 SEQ ID NO.5에 대응) 및 SEQ ID NO.10의 아미노산 번호 94 내지 102(CDRL₃, 서열목록의 SEQ ID NO.6에 대응)로 나타내었고, 이 모든 것은 서열목록의 SEQ ID NO.10에 존재한다.

[실시예 5]

COS-1 세포내 CH11 의 각각의 소단위체를 코딩하는 유전자의 발현

(5-1) 발현 벡터의 구축

고발현 벡터 pME18S 로부터의 DNA [참조, Hara, T., et al., (1992), EMBO J., 11, 1875 이하 참조]를 제한효소 EcoRI 및 Xbal 로 분해한다. 생성된 분해 생성물을 0.8% 아가로오스 겔상에서 겔 전기영동으로 분리시킨다. 전기 영동후, 겔을 에티듐 브로마이드 (0.25 ㎍/ml) 로 염색하여 DNA를 염색한다. 대략 3000 bp의 밴드를 겔로부터 절단하여 TBE 아가로오스 겔 전기영동 버퍼(TBE 버퍼 : Tris 0.089M, EDTA(pH 8.0) 0.002M) 250㎕와 함께 투석관(투과한계 : 12000 내지 14000 Da, 기브코사제)로 옮긴후 관을 밀봉한다. 밀봉한 관을 좀더 아가로오스 겔 전기영동 버퍼를 함유하는 잠수함형 전기영동 탱크에 위치시키고 DNA를 겔로부터 전기영동적으로 용출시킨다 (150V, 15 분). 투석관을 꺼내고, 관내의 DNA 용출물을 회수하여 페놀/클로로포름 추출한다.

병행하여, 실시예 3 d) 에 기재된 바와 같이 제조된, CH1l H 사슬을 코딩하는 DNA 를 포함하는 플라스미드 pCR3-H123 를 제한효소 EcoRI 및 Xba1 로 분해시킨다. 1900 bp EcoRI-Xba1 단편을 상기 5-1 에 기재된 바와 같이, 0.8% 겔상에서 아가로오스 겔 전기영동으로 단리 및 정제한다. 이 cDNA 단편을 DNA 접합 키트버전 1 (다까라슈조사제, 일본) 을 이용하여, 상기에서 단리된, pME18S 의 3 kb EcoRI-Xba1 에 접합시킨다.

실시예 3 에서 제조된, CH11 L 사슬을 코딩하는 DNA 를 포함하는 플라스미드 pCR3-L103 을 제한효소 EcoRI 및 Xba1 로 분해시킨다. cDNA 플라스미드 삽입체를 포함하는 840 bp EcoRI-Xba1 단편을 상기 5-1 에 기재된 바와 같이, 0.8% 겔상에서 아가로오스 겔 전기영동으로 단리 및 정제한다. 이 cDNA 단편을 DNA 접합 키트 버전 1 (다까라슈조사제, 일본) 을 이용하여, 상기에서 수득된 pME18S 의 3 kb EcoRI-XbaI 에 접합시킨다.

실시예 3 에서 제조된, CH11 J사슬을 코딩하는 DNA 를 포함하는 플라스미드 pCR3-J1123 을 제한효소 EcoRI 및 Xba1 로 분해시킨다. cDNA 플라스미드 삽입체를 포함하는 640 bp EcoRI-Xba1 단편을 상기 5-1 에 기재된 바와 같이, 0.8% 겔상에서 아가로오스 젤 전기영동으로 단리 및 정제한다. 이 cDNA 단편을 DNA 접합 키트 버전 1 (다까라슈조사제, 일본) 을 이용하여, 상기에서 수득된 pME18S 의 3 kb EcoRI-Xba1 에 접합시킨다.

접합 반응 종료후, JM109 대장균 감응세포 (다까라슈조사제) 를 각각의 반응 혼합물을 이용하여 형질전환시키고 내암피실린성 균주에 대한 콜로니를 선택한다.

플라스미드 DNA 를 알칼리 용해 (마니아티스, 상기) 로 형질전환된 균주로부터 제조한다. 생성된 플라스미드 DNA 를 EcoRI 및 Xba1 로 분해시키고, 이어서 이를 0.8% 겔상에서 아가로오스 겔 전기영동시켜 원하는 크기의 DNA 가 클로닝되었는지 확인한다.

CHl1 H 사슬을 코딩하는 DNA 를 포함하는 발현 벡터는 pHEX126 으로 나타내었다. CH11 L 사슬을 코딩하는 DNA 를 포함하는 발현 벡터는 pLEX004로 나타내었다. CH11 J 사슬을 코딩하는 DNA 를 포함하는 발현 벡터는 pJEX004 로 나타내었다.

5-2 COS-1 세포에서의 발현

COS-1 세포를 GTE-1 장치 (시마드즈사제) 를 이용하여 전기천공으로 pHEX126, pLEX004 및 pJEX004 로 형질전환시킨다. 좀더 구체적으로는, COS-1 세포 (미국 모식균 배양수집 번호 CRL-1650) 을 225㎠ 배양 플라스크 (스미또모 베이크라이트사제) 에서 배양한다. 세포를 10% (v/v) 소형 태아 혈청 (CSL)을 포함하는 둘베코 개질 이글스 최소 필수배지 (DMEM, 니수이제약사제) 에서 세미컨플루언트(semiconfluent) 상태로 육성한다. 배지를 제거하고 세포를 37℃ 에서 3 분간 트립신-EDTA 용액 (시그마사제) 3m1 로 2 회 처리한다. 세포를 회수한후, 포스페이트 완충 식염수(PBS, pH8.0)버퍼 (니수이제약사제) 로 2 회 세정한다. 세정된 COS-1 세포를 PBS(-) 버퍼 (1 1 당 8 g NaC1,0.2 g KC1, 1.15g Na₂HPO₄, 0.2g KH₂PO₄, 니수이 제약사제)로 6 x 10⁷세포/ml의 밀도로 조정한다.

DNA를 플라스미드 맥시프레프 키트(맥시프레프 DNA 정제 시스템; 프로마게사제)를 이용하여, CH11 의 3 가지의 모든 소단위체를 코딩하는 pHEX126, pLEX004 및 pJEX004 의 각각으로부터 제조한다. 각각의 플라스미드 맥스프레프의 일부 (20㎍)을 에탄올을 이용하여 침전시키고, 침전물을 PBS(-)버퍼 20㎕ 에 용해시킨다. 이 방법으로 제조된 DNA를 COS-1 세포의 형질감염을 위해 사용한다. 임의의 형질감염을 각각의 플라스미드의 20㎍이 사용된 하나이상의 플라스미드를 이용하여 실행한다.

이 방법으로 제조된 COS-1 세포(20㎕; 1.2 x 10⁶세포)의 현탁액을 각각의 시료 20㎕와 혼합하고, 생성된 혼합물을 전극 간격 2mm의 전기천공 큐베트(시마드즈사제)에 위치시킨다. 큐베트를 전기천공 장치에 위치시키고, 펄스사이에 1초 간격으로, 두 번의 600V-30μsec을 적용한다. 세포와 DNA의 혼합물을 10% (v/v)소형 태아 혈청을 포함하는 DMEM 10ml에 가하고, 이어서 세포배양 플라스틱 접시(직경 : 90mM; 스미또모 베이라이크사제)에 옮겨 37℃, 7.5% CO₂하 24 시간동안 배양한다. 이후 배양 상층액을 제거하고 세포를 혈청이 없는 DMEM 배지로 세정한다. 신선한 혈청이 없는 DMEM 배지를 가하고 (10ml), 37℃, 7.5% CO₂하 24 시간동안 배양한다. 이어서 배양 상층액을 회수한다.

COS-1 세포를하나의 플라스미드, 또는 플라스미드의 조합을 이용하여 하기와 같이, 형질감염시킨다. 배양 상층액을 각각의 경우에서 회수한다.

[A] : pME18S

[B] : pHEX126

[C] : pLEX004

[D] : pJEX004

[E] : pHEX126 및 pLEX004

[F] : pHEX126, pLEX004 및 pJEX004

[실시예 6]

항-Fas 항체의 검출

본 발명에 따라 제조된 항-Fas 항체를 개별적으로 두개의 방법으로 검출한다.

(1) 첫번째 방법은 웨스턴 블롯팅이다. 단백질 시료를 하기에 나타낸 조건하 SDS-폴리아크릴아미드 겔상에 걸고, 전기영동으로 시료 단백질을 분리시킨다(이 모든 방법은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 'SDS-PAGE' 로 공지되어 있다). 단백질을 니트로셀룰로오스막으로 옮기고, 항-Fas 항체에 특이적인 항체와 반응시킨다. 목표 항-Fas 단백질과 항체의 교차반응을 적당한 지지체의 존재하, 사진필름상에서 약한 발광으로 검출할수 있다.

(2) 두번째 방법은 Fas 항원에 대한 결합 친화성을 측정하는 것이다.

(6-1) 웨스턴 블롯팅

배양 상층액 (1ml) 의 시험 시료를 순수 5 1 로 투석시키고, 이어서 원심농축기 (CC-101; 토미세이코사제) 를 이용하여 감압하 건조시킨다. 생성된 생성물을 시료 버퍼 [2%(w/v)SDS (전기영동등급 ; 바이오래드사제), 5%(v/v) β-메르캅토에단올(시그마사제), 10%(v/v)글리세롤, 0.1%(w/v)브로모페놀 블루] 10㎕ 에 넣고 완전히 혼합한다. 생성된 현탁액을 100℃ 에서 5 분간 가열하여 전기영동에 적합한 시료를 수득한다. 모든 전기영동시료를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 (4 내지 20% 구배 겔, ℓ 당 버퍼 조성; Tris 3.0g, 글리신 14.4 g, SDS 10g, pH 8.3)의 하나의 웰에 적하하고, 겔을 20 mA 의 정류에서 조작한다 (실온, 1 시간).

일단 전기영동이 실시되면, 단백질을 세미-건조 블롯팅 방법 [참조, Towbin, H, et al.,(1979), Proc. Natl.Acad. Sci.USA 76, 4350 이하참조] 을 이용하여 젤로부터 니트로셀룰로오스막으로 옮긴다. 사용하는 특정 장치 및 조건은 하기와 같다 :

전달 버퍼 : 20mM tris, 150 mM 글리신, 10%(v/v) 메탄올

블롯팅 장치 : 이와끼 글래스사제

작업조건 : 4℃, 0.2 A(정류), 1 시간

웨스턴 블롯팅을 위한 2 개의 니트로셀룰로오스막을 상기와 같이 제조한다. 웨스턴 전달이후, 겔을 'Sil Best Kit' (나까라이 데스꾸 가부시끼가이샤제)를 이용하여 은으로 염색한다.

상기와 같이 제조된 두 개의 웨스턴 블롯팅 니트로셀룰로오스 막중의 하나를 H 사슬 (μ사슬) 검출에 사용하고 나머지를 L 사슬 (k사슬) 검출에 사용한다. 하기의 절차를 이용한다.

웨스턴 전달이후, 니트로셀룰로오스막을 3%(w/v) 젤라틴 (바이오래드사제), 20 mM 트리스-염산 (pH 7.5) 및 500 mM 염화나트륨을 함유하는 수용액에 침지시킨다. 막을 실온에서 1 시간동안 부드럽게 진탕한다 ("웨스턴 전달이후" 이후 기재된 절차는 여기에서는 "찬단화(blocking)" 라 칭한다). 이렇게 차단된 니트로셀룰로오스막을 희석된 항체 용액에 침지시키고 실온에서 2 시간동안 부드럽게 진탕한다. 생성된 항체 용액을 2.5㎕ 의 퍼옥시다아제-표식 염소 항-마우스 IgM 항체 (μ 사슬-특이 : 잭슨 면역 연구 실험소) 또는 25㎕ 의 퍼옥시다아제-표식 토끼 항-마우스 k 사슬 모노클론성 항체 (지메드 실험소) 을 이후 "TBS" 로 언급될 10 ml 의 버퍼 [20 mM 트리스-염산 (pH 7.5) 및 500 mM 염화나트륨] 으로 희석하여 제조한다.

이어서 각각의 니트로셀룰로오스 막을 2% (v/v) Tween 20(바이오래드사제)를 함유하는 TBS 인 TTBS 20ml 에 침지시키고, 실온에서 15 분간 부드럽게 진탕하여 세정한다. 처리된 막을 TTBS 20 m1 로 세정하고, 이어서 이를 배수하여 버린다. 상기 니트로셀룰로오스막에 대한 잔류 퍼옥시다아제 활성을 ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시스템 (아메르샴사제) 을 이용하여 검출한다. 좀더 구체적으로는, 이 시스템에서의 기질은 퍼옥시다아제의 촉매작용하 화학반응동안 빛을 방출한다. 빛 방출은 ECL 미니 카메라 (아메르샴사제) 및 즉석 필름 (Type 667; 폴라로이드사제) 를 이용하여 사진필름으로 검출할 수 있다. 찍은 필름을 은-염색 겔과 비교하여 항체에 특이적으로 결합하는 단백질 밴드를 확인한다.

마우스 M-사슬에 대한 항체는 약 78,000 Da 의 단백질 밴드와 교차결합하였다. 이 크기의 밴드는 단독으로 또는 다른 플라스미드와, pHEX126 으로 형질감염된 COS-1 의 상층액에 존재한다. 이 시료는 실시예 5 의 [B],[E] 및 [F] 에 상응한다.

마우스 k 사슬에 대한 항체는 약 26,000 Da 의 단백질 밴드와 교차결합하였다. 이 크기의 밴드는 단독으로 또는 다른 플라스미드와, pLEX004 로 형질감염된 COS-1 의 상층액에 존재한다. 이 시료는 실시예 5 의 [C], [E] 및 [F] 에 상응한다.

하이브리도마로 생성된 항체를 동일한 방법론을 이용하여 웨스턴 블롯팅으로 분석한다. 하이브리도마로부터의 CH11 의 H 및 L 사슬에 대응하는 밴드는 형질감염된 COS-1 세포로부터 수득된 것과 동일한 크기로 보인다.

(6-2) ELISA에 의한 FAS 결합력의 확인

(a) 항원의 제조

발현 벡터 pME18S-mFas-AIC [참조, Nishimura, Y., et al., (1995), Mo1. Immuno1., 154, 4395-4403] 은 마우스 Fas 항원의 세포외 부위 및 마우스 인터루킨 3 수용체의 세포외 부위로 구성된 융합 단백질을 코딩한다. 마우스 Fas 항원의 세포외 부위를 코딩하는 벡터의 단백질을 인간 Fas 항윈의 세포외 부위를 코딩하는 DNA 단편으로 대치한다. 인간 Fas 항원의 세포외 부위 및 마우스 인터루킨 3 수용체의 세포외 부위로 구성된 융합 단백질을 코딩하는, 이 새로운 발현 벡터, phFas-AIC2 을 하기와 같이 제조한다.

올리고뉴클레오티드 플라이머를 설계 및 합성하여 Fas 항원 세포외 부위를 코딩하는 DNA 을 PCR 증폭시킨다. 사용하는 DNA 주형은 인간 Fas 항원을 코딩하는 cDNA 를 포함하는 플라스미드 벡터 pCEV4 [Itoh, N., et al.,(1991), Cel1, 66, 233-243] 이다. 선택된 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기와 같다 :

5'-GGGGAATTCC AGTACGGAGT TGGGGAAGAA GCTCTTT-3' (N1; 서열목록의 SEQ ID NO.77); 및

5'-GTTTCTTCTG CCTCTGTCAC CAAGTTAGAT CTGGA-3' (C3N; 서열목록의 SEQ ID NO. 78).

또한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계 및 합성하여 마우스 인터루킨 3 수용체의 세포외 부위를 코딩하는 DNA 을 PCR 증폭시킨다. 사용하는 DNA 주형은 플라스미드 벡터 pME18S-mFas-AIC (Nishinnra, Y. et al., 1995, Mo1. Immunology, 154, 4395-4403] 이다. 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기와 같다

5'-TCCAGATCTA ACTTGGTGAC AGAGGCAGAA GAAAC-3' (N3N; 서열목록의 SEQ ID NO.79); 및

5'-CCCTCTAGAC GCGTCACGTG GGCATCAC-3' (CTN2; 서열목록의 SEQ ID NO.80).

PCR 반응을 하기의 조건하 상기 플라스미드, 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 LA PCR 키트 (다까라슈조사제) 를 이용하여 실시한다.

반응 혼합물의 조성

증류수를 가하여 최종부피 250㎕ 로 만들고; 버퍼, dNTP 믹스 및 Taq 폴리머라아제를 키트에 포함시킨다.

온도 조건 :

시료를 처음에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 반응 혼합물을 94℃ 에서 1 분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분의 열주기로 가열하고, 이 주기를 30 회 반복한후, 추가로 72℃ 에서 10 분간 가열한다.

각각의 PCR 반응의 생성물을 8% 폴리아크릴아미드 겔 (TBE 버퍼, 100V, 2 시간 조작) 상에서 전기영동으로 분리시킨다. 인간 Fas 항윈의 세포외 부위를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편에 해당하는, 약 460bp 의 밴드를 겔로부터 절단한다. 또한 마우스 인터루킨 3 수용체의 세포외 부위를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편에 해당하는, 약 1300 bp 의 밴드를 겔로부터 절단한다. DNA 단편을 실시예 5 에 기재된 바와 같이 겔로부터 용출시킨다.

처음의 PCR 반응이후 수득한 두개의 DNA 단편을 올리고뉴클레오티드 프라이머 C3N 및 N3N 과 더불어, 두번째의 PCR 반응에서 함꼐 사용한다. 각각의 프라이머를 원래의 단편의 하나에 혼성시킨다. PCR 반응에서 사용하는 경우, 프라이머는 두개의 폴리펩티드-코딩 유전자가 동일한 판독 플레임에 접합된 DNA의 단편을 증폭시킨다. 두번째 PCR 반응은 하기의 조건하 실시한다 :

반응 혼합물의 조성

증류수를 가하여 최종부피 250㎕ 로 만든다.

가열주기조건은 바로 앞서의 PCR 반응에서 사용한 것과 동일하다 :

두번째 PCR 의 반응 혼합물의 일부를 적하하고 아가로오스 겔상에서 조작한 결과, 약 1700 bp 의 윈하는 PCR 생성물이 증폭되었음이 확인되었다. 이어서 반응 혼합물의 잔류물을 에탄올을 이용하여 침전시킨다. 침전된 DNA 를 제한 효소 EcoRI 및 Xba1 로 분해시키고 분해 생성물을 1% (w/v) 아가로오스 겔상에서 아가로오스 겔 전기영동으로 분리시킨다. 약 1700 bp 의 밴드를 겔로부터 절단하고, DNA 를 실시예 5 에 기재된 것과 동일한 방법으로 겔로부터 정제한다.

병행하여, 2 ㎍ pME18S-mFas-AIC DNA 를 제한 효소 EcoRI 및 Xba1 로 분해시킨다. 분해 생정물을 0.8%(w/v) 아가로오스겔 상에서 전기영동시켜 분리하고, 약 3000 bp 의 밴드를 겔로부터 절단한다. DNA 를 단리하여 DNA 접착 키트버전 2 (다까라슈조사제) 를 이용하여 1700 bp PCR 생성물에 접합시킨다. 총 반응 혼합물 (10㎕) 을 사용하여 JM109 대장균 감응 세포(다까라슈조사제) 를 형질전환시키고 내암피실린성 콜로니를 선별한다. 이러한 내암피실린성 형질전환체 하나를 통상의 절차에 따라 배양하고, 플라스미드 DNA 를 알칼리 용해 (마니아티스, 상기) 로 세포로부터 제조한다. 생성된 플라스미드를 phFas-AIC2 로 나타내었다.

phFas-AIC2 DNA 를 GTE-1 장치를 이용하여, 전기천공으로 COS-1 세포에 형질 감염시킨다. 좀더 구체적으로는, COS-1 세포를 4 개의 225㎠ 배양 플라스크(스미또모 베이크라이트사제) 에서 배양한다. 세포를 10% (v/v) 소형 태아 혈청 (CSL) 을 포함하는 DMEM 에서 세미컨플루언트상태로 육성한다. 배지를 제거하고 세포를 37℃ 에서 3 분간 트립신-EDTA 용액 (시그마사제) 3m1 로 2 회 처리한다. 세포를 회수한후, PBS(-)버퍼 (니수이제약사제) 로 2 회 세정한다. 세정된 COS-1 세포를 PBS(-) 버퍼로 6 x 10⁷세포/m1 의 밀도로 조정한다.

phFas-AIC2 플라스미드 DNA 를 플라스미드 매스 제조 키트 (맥시프레프 DNA 정제 시스템; 프로마게사제) 를 이용하여 제조하고, 이 플라스미드 DNA 200㎍을 에탄올로 침전시킨후, PBS(-)버퍼 200㎕ 에 용해시킨다.

세포현탁액 (20㎕ ; 1.2 x 10⁶세포) 일부와 플라스미드 용액 20㎕ 를 혼합하고, 생성된 혼합물을 전극간격 2 mm 의 전기천공 큐베트에 도입한다. 큐베트를 전기천공 장치에 위치시키고, 두번의 600V-30μsec 펄스를 펄스사이를 1 초간격으로 시료에 적용한다. 이 절차를 10개의 시료에 대하여 실시한다.

10개 시료의 세포-DNA 혼합물을 합하여 10% (v/v)소형 태아 혈청를 포함하는 DMEM 50 m1 에 가하고, 생성된 혼합물을 225㎠ 세포배양 플라스크 (스미또모베이크라이트사제) 로 옮긴다. 세포를 37℃, 7.5% CO₂하 24 시간동안 배양한다. 이후 배양 상층액을 제거하고 세포를 혈청이 없는 DMEM 배지로 세정한다. 신선한 혈청이 없는 DMEM 배지(50ml) 를 배양액에 가하고, 세포를 37℃, 7.5% CO₂하 24 시간동안 배양한다. 이어서 배양 상층액을 회수한다.

(b) ELISA

COS-1 배양 상층액 (100㎕) 의 일정량들을 피펫으로 96-웰 면역플레이트(Maxisorb; 넝크사제) 의 웰에 옮겨 4℃ 에서 밤새워 저장한다. 이로해서 인간 Fas 항원의 세포외 부위를 포함하는, 웰의 내부표면상에 고형상의 단백질이 형성된다. 각각의 웰을 0.05%(v/v) Tween-20(EIA 등급, 바이오래드사제) 를 함유하는 PBS 로 세정하고, 이어서 0.5%(w/v) 의 소형 혈청 알부민 (BSA) 를 함유하는 PBS 100㎕ 를 가한다. 플레이트를 실온에서 1 시간동안 방치하여 차단시킨다.

각각의 웰을 0.05%(v/v) Tween-20 을 함유하는 PBS 로 세정하고, 이어서 실시예 5 에서 제조한 100㎕ 의 희석된 시험 시료 용액과 더불어, 실시예 2 에서 제조한 CH11 (표준) 을 피펫으로 웰에 옮긴다. 반응을 실온에서 4 시간동안 지속한다.

이어서 웰을 0.05%(v/v) Tween-20 을 함유하는 PBS 로 세정한다. 퍼옥시다아제-표식 쥐 항-마우스 IgM 모노클론정 항체 (1/2000 희석, 지메드 실험소) 의 일부 (100㎕) 를 각각의 웰로 피펫으로 옮기고, 반응을 실온에서 2 시간동안 행한다.

이어서 추가로 웰을 0.05%(v/v) Tween-20 을 함유하는 PBS 로 세정한다.기질 용액 (퍼옥시다아제 기질 키트 ABTS ; 바이오래드사제) 의 일부 (100㎕) 을 각각의 웰에 피펫으로 옮겨 색반응을 개시시킨다. 405 nm 및 492nm 에서의 각각의 웰의 흡수치를 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정하고 492nm 에서의 흡수치를 405nm 흡수치로부터 감한다. 이렇게 얻은 값을 CH11 표준의 값과 비교하여 인간 Fas 항원의 세포외부위를 포함하는 단백질에 결합하는 시험 시료의 능력을 평가한다.

결과를 하기의 표 1 에 나타내었다. 보는 바와 같이, 결합은 실시예 5에서 제조한 상층액 [E](pHEX126 및 pLEX004) 및 [F](pHEX126, pLEXO04 및 pJEX004) 을 이용하여 관찰한다.

[표 1]

[실시예 7]

세포독성 분석

실시예 5 에서 제조한 각각의 COS-1 세포 배양 상층액의 세포독성을 후술된 MTT[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 2H-테트라졸리움 브로마이드] 분석 방법으로 측정한다.

인간 림프구 세포 균주 HPB-ALL [참조 Morikawa, S., et a1., (1978), Int.J.Cancer, 21, 166-170] 을 20 mM HEPES (HEPES : N-2-히드록시에틸피페라진-N-2-에탄 술폰산), 50μM 2-메르캅토에탄올 및 10%(v/v) 소형 태아 혈청 (이퀴텍 바이오사제) 를 함유하는 RPMI1640 배지 (니수이제약사제) 상에서 5% CO₂, 37℃, 3 일간배양한다. 실시예 5 에서 제조한 COS-1 세포 배양 상층액의 일부 (75㎕)를 96-웰 배양 플레이트의 웰에 피펫으로 넣고, 이어서 HPB-ALL 세포 25㎕ (2 x 10⁵세포/m1 로 조정) 을 가한다. 세포를 5% CO₂의 존재하 12 시간동안 37℃ 에서 배양한다. 접시의 각각의 웰에 MTT(시그마사제) 의 5mg/m1 수용액 10㎕ 를 가하여 플레이트를 37℃ 에서 4 시간동안 배양한다. 인큐베이션후 50% (v/v) N,N-디메틸포름아미드 및 20% (w/v) SDS 를 함유하는 용액 100㎕ 를 각각의 웰에 가한다. 각각의 웰에 대한 흡수치를 마이크로플레이트 리더(닛뽕 인터메드사제)을 이용하여 590nm 및 620nm 에서 읽는다. 620nm 에서의 흡수치를 590nm 에서의 흡수치에서 감한다. 값이 높을 수록, 웰에 남아있는 살아있는 세포의 수가 많아진다. 결과치를 하기 표 2 에 나타내었다.

[표 2]

실시예 5 ([A], [B], [C] 및 [D]) 에서 단일 플라스미드로 형질감염된 상기COS-1 세포 배양약은 모두, 비형질감염된 세포와 비교하여, 높은 수치를 보인다. pHEX126 및 pLEX004 ([E] 및 [F]) 로 형질감염된 상기 세포는 세포가 존재하지 않는 블랭크와 비교하여 낮은 수치를 보인다. 이 결과로부터, 세포독성물질이 CH11 H사슬 및 CHl1 L사슬을 코딩하는 DNA 의 공발현으로 생성됨을 발견하였다.

[실시예 8]

비교 항체 세포독성(ED₅₀시험)

본 발명의 항체의 세포독성은 ED₅₀시험으로 평가한다. 여기에서 사용한 바와 같이, ED₅₀은 Fas 항원을 발현시키는 세포 시료의 50% 가 죽은 항체의 농도이다. ED₅₀을 측정하기에 앞서, 정확하게 시험하 항체의 농도를 계산할 필요가 있다.

8-1 항체 농도의 결정

96 웰 ELISA (넌크사제) 의 각각의 웰에 항-마우스 IgM 항체 용액 (50 mM Na₂HCO₃중의 0.5㎍/ml, pH 9.6, 바이오시스사제) 100㎕ 을 피펫으로 넣고 플레이트를 4℃ 에서 밤새워 인큐베이션시킨다. 이어서 항체 용액을 버리고 각각의 웰을 0.5% Tween-20 을 함유하는 PBS (이후 'PBS-T' 로 칭함) 로 4 회 세정한다.

'Super-Block' 차단 버퍼(피어스사제) 를 제조사의 지시에 따라 PBS 중에 만들고, 상기 버퍼 100㎕ 를 각각의 웰에 피펫으로 넣는다. 이어서 추가로 플레이트를 37℃ 에서 4 시간동안 인큐베이션한다. 이후, 차단 용액을 버리고, 각각의 웰을 PBS-T 로 4 회 세정한다.

시험할 각각의 항체 제제의 100㎕ 시료를 플레이트의 각각의 웰에 가한다. 시험시료에는 CHl1, 및 실시예 5의 상층액 [E] 및 [F] 가 포함된다. 상이한 농도로 희석된 마우스 IgM(지메드사제) 를 포함하는 각종 표준 제제를 사용한다. 시료를 웰에 가한후, 플레이트를 37℃ 에서 4 시간동안 배양한다. 이후, 시험 및 표준 용액을 버리고, 각각의 웰을 PBS-T 로 4 회 세정한다.

양고추냉이 퍼옥시다아제-복합 항 마우스 IgM (PBS 중에 1/1000 희석의 100㎕) 의 시료를 각각의 웰에 가한다. 이어서 이 용액을 버리고 각각의 웰을 PBS-T 로 4 회 세정한다.

양고추냉이 퍼옥시다아제 기질 키트 (바이오래드사제) 로부터 제조한 100㎕ 시료를 각각의 웰에 가하고 플레이트를 실온에서 30 분간 배양한다. 이후, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 405nm 및 492nm 에서 흡수치를 읽는다. 이어서 492nm 에서의 흡수치를 405nm 에서의 흡수치로부터 감한다.

표준 시료에대한 흡수치를 이용하여, 각각의 시험 항체의 농도를 결정할 수 있는 표준 곡선을 작성하는 것이 가능하다.

따라서 ED₅₀을 평가하는 것이 가능하다.

(8-2) ED₅₀계산

CH11, 실시예 5 의 상층액 [E] (H 및 L 사슬 포함) 및 상층액 [F] (H, L 및 J 사슬 포함) 의 3 개의 항체 용액을 각각 HBP-ALL 세포와 함께 배양한다. 실시예 7 에 기술된 MTT 분석을 이용하여 각각의 항체 용액으로 얼마만큼의 세포가 죽었는가를 평가한다.

각각의 항체에 대한 MTT 결과를 상기 (8-1) 에서 얻은 단백질 농도의 함수로 계산하여 ED₅₀을 측정하고, MTT 를 음성 대조군으로 취하고 항체의 부재하에서 배양된 HBP-ALL 에 대한 결과를 양성 대조군으로 취한다. 결과를 표 3 에 나타내었다.

[표 3]

상기의 결과는 명백히 상층액 [E] 에 함유된 생성물은 놀랍게도 CH11 또는 상층액 [F] 에 함유된 생성물보다 5 배이상의 활성을 갗는다는 것을 보여준다. IgM 구조는 상층액 [F] 에 함유된 생성물로 형성되는 반면, 상층액 [E] 에 함유된 생성물은 단순히 항체 접합을 형성하고, 이런한 환경하, ED₅₀은 현격히 증가하는것 같다.

서열 목록

(1) 일반 정보 :

(i) 출원인 :

(A) 성명 : 상꾜 가부시끼가이샤

(B) 거리 : 쥬오꾸 니혼바시 혼쵸 3 쵸메 5 방 1 고

(C) 도시 : 도오꼬

(E) 국가 : 일본

(F) 우편번호 : 103

(G) 전화번호 : 81-3-5255-7111

(ii) 발명의 명칭 : 재조합 항 인간 Fas 항체

(iii) 서열수 : 80

(iv) 컴퓨터 판독형 :

(A) 매체형 : 플로피 디스크

(B) 컴퓨터 : 호환성 IBM PC

(C) 운용시스템 : PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 : 페이튼트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.30 (EPO)

(vi) 종래 출원 데이터 :

(A) 출원번호 : JP 헤이 8-78570

(B) 출원일 : 1996년 4월 1일

(2) SEQ ID NO.1 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 5 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 단백질

(V) 단편유형 : 중간부

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.1 :

(2) SEQ ID NO.2 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 17 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 단백질

(V) 단편유형 : 중간부

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.2 :

(2) SEQ ID NO.3 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 7 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 단백질

(V) 단편유형 : 중간부

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.3 :

(2) SEQ ID NO.4 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 16 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 단백질

(V) 단편유형 : 중간부

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.4 :

(2) SEQ ID NO.5 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 7 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 단백질

(V) 단편유형 : 중간부

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.5 :

(2) SEQ ID NO.6 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 9 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 단백질

(V) 단편유형 : 중간부

(xi) 서열 설명 : SEQ ID N0.6 :

(2) SEQ ID NO.7 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 1773 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 이중

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : cDNA 내지 mDNA

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초의 원천 :

(A) 생물 : 무스 무수쿨루스 (Mus musculus)

(G) 세포유형 : 하이브리도마

(H) 세포주 : CH11

(ix) 특징 :

(A) 이름/키 : CDS

(B) 위치 : 1..1770

(ix) 특징 :

(A) 이름/키 : mat_펩티드

(B) 위치 : 58..1770

(ix) 특징 :

(A) 이름/키 : sig-펩티드

(B) 위치 : 1..57

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.7 :

(2) SEQ ID NO.8 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 590 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 단백질

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.8 :

(2) SEQ ID NO.9 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 717 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 이중

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : cDNA 내지 mDNA

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초의 원천 :

(A) 생물 : 무스 무수쿨루스

(G) 세포유형 : 하이브리도마

(H) 세포주 : CHl1

(ix) 특징 :

(A) 이름/키 : CDS

(B) 위치 : 1..714

(ix) 특징 :

(A) 이름/키 : mat-펩티드

(B) 위치 : 58..714

(ix) 특징 :

(A) 이름/키 : sig-펩티드

(B) 위치 : 1..57

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.9 :

(2) SEQ ID NO.10 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 238 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 단백질

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.10 :

(2) SEQ ID NO.11 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 480 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 이중

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : cDNA 내지 mDNA

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초의 윈천 :

(A) 생물 : 무스 무수쿨루스 (Mus musculus)

(G) 세포유형 : 하이브리도마

(H) 세포주 : CHl1

(ix) 특징 :

(A) 이름/키 : CDS

(B) 위치 : 1..477

(ix) 특징 :

(A) 이름/키 : mat-펩티드

(B) 위치 : 67..477

(ix) 특징 :

(A) 이름/키 : sig-펩티드

(B) 위치 : 1..66

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.11 :

(2) SEQ ID NO.12 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 159 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 단백질

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.12 :

(2) SEQ ID NO.13 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 15 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥형태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 단백질

(v) 단편유형 : N-말단

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.13 :

(2) SEQ ID NO.14 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 21 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 가닥형태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 단백질

(v) 단편유형 : 중간부

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.14 :

(2) SEQ ID NO.15 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 391 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 이중

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : cDNA 내지 mDNA

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초의 원천 :

(A) 생물 : 무스 무수쿨루스

(G) 세포유형 : 하이브리도마

(H) 세포주 : CH11

(ix) 특징 :

(A) 이름/키 : CDS

(B) 위치 : 2..391

(ix) 특징 :

(A) 이름/키 : mat-펩티드

(B) 위치 : 32..391

(ix) 특징 :

(A) 이름/키 : sig-펩티드

(B) 위치 : 2..31

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.15 :

(2) SEQ ID NO. 16에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 388 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 이중

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : cDNA 내지 mDNA

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(vi) 최초의 원천 :

(A) 생물 : 무스 무수쿨루스

(G) 세포유형 : 하이브리도마

(H) 세포주 : CH11

(ix) 특징 :

(A) 이름/키 : CDS

(B) 위치 : 2..388

(ix) 특징 :

(A) 이름/키 : mat_펩티드

(B) 위치 : 29..388

(ix) 특징 :

(A) 이름/키 : sig_펩티드

(B) 위치 : 2..28

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.16 :

(2) SEQ ID NO.17 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 33 염기씽·

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec="합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.17 :

(2) SEQ ID NO.18 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 34 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.18 :

(2) SEQ ID NO.19 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 33 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.19 :

(2) SEQ ID NO.20 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 32 염기쌍·

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.20 :

(2) SEQ ID NO.21 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 32 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.21 :

(2) SEQ ID NO.22 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 32 염기쌍·

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

⒧) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.22 :

(2) SEQ ID NO.23 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.23 :

(2) SEQ ID NO.24 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.24 :

(2) SEQ ID NO.25 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.25 :

(2) SEQ ID NO.26 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.26 :

(2) SEQ lD NO.27 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.27 :

(2) SEQ ID NO.28 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.28 :

(2) SEQ ID NO.29 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.29 :

(2) SEQ ID NO.30 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.30 :

(2) SEQ ID NO.31 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.31 :

(2) SEQ ID NO.32 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.32 :

(2) SEQ ID NO.33 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.33 :

(2) SEQ ID NO.34 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.34 :

(2) SEQ ID NO.35 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.35 :

(2) SEQ ID NO.36 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.36 :

(2) SEQ ID NO.37 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.37 :

(2) SEQ ID NO.38 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.38 :

(2) SEQ ID NO.39 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.39 :

(2) SEQ ID NO.40 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.40 :

(2) SEQ ID NO.41 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.41 :

(2) SEQ ID NO.42 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.42 :

(2) SEQ ID NO.43 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.43 :

(2) SEQ ID NO.44 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.44 :

(2) SEQ ID NO.45 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.45 :

(2) SEQ ID NO.46 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.46 :

(2) SEQ ID NO.47 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.47 :

(2) SEQ ID NO.48 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.48 :

(2) SEQ ID NO.49 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.49 :

(2) SEQ ID NO.50 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.50 :

(2) SEQ ID NO.51 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.51 :

(2) SEQ ID NO.52 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.52 :

(2) SEQ ID NO.53 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

⒧) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.53 :

(2) SEQ ID NO.54 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.54 :

(2) SEQ ID NO.55 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.55 :

(2) SEQ ID NO.56 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.56 :

(2) SEQ ID NO.57 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.57 :

(2) SEQ ID NO.58 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.58 :

(2) SEQ ID NO.59 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

⒧) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.59 :

(2) SEQ ID NO.60 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.60 :

(2) SEQ ID NO.61 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.61 :

(2) SEQ ID NO.62 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.62 :

(2) SEQ ID NO.63 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍·

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.63 :

(2) SEQ ID NO.64 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.64 :

(2) SEQ ID NO.65 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기씽·

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.65 :

(2) SEQ ID NO.66 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.66 :

(2) SEQ ID NO.67 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.67 :

(2) SEQ ID NO.68 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.68 :

(2) SEQ ID NO.69 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.69 :

(2) SEQ ID NO.70 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.70 :

(2) SEQ ID NO.71 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.71 :

(2) SEQ ID NO.72 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.72 :

(2) SEQ ID NO.73 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

⒧) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.73 :

(2) SEQ ID NO.74 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍·

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.74 :

(2) SEQ ID NO.75 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.75 :

(2) SEQ ID NO.76 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.76 :

(2) SEQ ID NO.77 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 37 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.77 :

(2) SEQ ID NO.78 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 35 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.78 :

(2) SEQ ID NO.79 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 35 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.79 :

(2) SEQ ID NO.80 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 28 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥상태 : 단일

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자유형 : 기타 핵산

(A) 설명 : /dec= "합성 DNA"

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센스 : 없음

(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO.80 :

본 발명의 재조합 단백질은 인간 Fas 에 대해 특이적인 면역글로불린 가변부위에 대응하는 하나이상의 부위를 갖고, 실질적으로 인간 항체뿐만아니라 인간에서의 면역원성을 갖지않으며, 특히 류마티즘과 같은 자가면역 질환의 치료에 유용하다.

Claims (24)

1. 인간 Fas 에 특이적으로 결합하는 유전적으로 조작된 면역글로불린 단백질에 있어서, 면역글로불린 단백질은 H 사슬 소단위체 및 L 사슬 소단위체로 주요구성되고, H 사슬 소단위체는 하기의 일반식 1 로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고

   [일반식 1]

   -FRH₁-CDRH₁-FRH₂-CDRH₂-FRH₃-CDRH₃-FRH₄-

   (식중, FRH₁은 13 내지 30 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, CDRH1₁은 SEQ ID NO.1 의 아미노산 서열을 나타내며, FRH₂은 14 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산서열을 나타내고, CDRH₂는 SEQ ID NO.2 의 아미노산 서열을 나타내며, FRH₃는 32 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, CDRH₃은 SEQ ID NO.3 의 아미노산 서열을 나타내며, FRH₄은 11 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, 각각의 아미노산 서열은 펩티드 결합을 통해 다음의 아미노산 서열에 결합된다);

   L 사슬 소단위체는 하기의 일반식 2 로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 :

   [일반식 2]

   -FRL₁-CDRL₁-FRL₂-CDRL₂-FRL₃-CDRL₃-FRL₄-

   (식중, FRL₁은 23 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, CDRL₁은 SEQ ID NO.4 의 아미노산 서열을 나타내며, FRL₂는 15 아미노산 잔기를 포함한 아미노산 서열을 나타내고, CDRL₂는 SEQ ID NO.5 의 아미노산 서열을 나타내며, FRL₃는 32 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, CDRL₃은 SEQ ID NO.6 의 아미노산 서열을 나타내며, FRL₄는 10 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, 각각의 아미노산 서열은 펩티드 결합을 통해 다음의 아미노산 서열에 결합된다) 유전적으로 조작된 면역글로불린 단백질.
2. 제 1항에 있어서, H 사슬 소단위체는 SEQ ID NO.8 의 아미노산 번호 1 내지 116 으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경우의 단백질.
3. 제 1항에 있어서, L 사슬 소단위체가 SEQ ID NO.10 의 아미노산 번호 1 내지 1l2 로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경우의 단백질.
4. 제 1항에 있어서, H 사슬 소단위체가 SEQ ID NO.8 의 아미노산 번호 1 내지 571 로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
5. 제 1항에 있어서, L 사슬 소단위체가 SEQ ID NO.10 의 아미노산 번호 1내지 219 로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
6. 하기 일반식 1 의 팹티드를 코딩하는 DNA :

   [일반식 1]

   -FRH₁-CDRH₁-FRH₂-CDRH₂-FRH₃-CDRH₃-FRH₄-

   (식중, FRH₁은 13 내지 30 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, CDRH₁은 SEQ ID NO.1 의 아미노산 서열을 나타내며, FRH₂은 14 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산서열을 나타내고, CDRH₂는 SEQ ID NO.2 의 아미노산 서열을 나타내며, FRH₃는 32 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, CDRH₃은 SEQ ID NO.3 의 아미노산 서열을 나타내며, FRH₄은 11 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, 각각의 아미노산 서열은 펩티드 결합을 통해 다음의 아미노산 서열에 결합된다).
7. 제 6항에 있어서, SEQ ID NO.7 의 뉴클레오티드 번호 58 내지 405 로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
8. 제 7항의 DNA 와 혼성화하는 DNA 에 있어서, 제 1항에 정의된 일반식 2 의 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 소단위체와 함께 인간 Fas 에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 H 사슬 소단위체를 코딩하는 혼성화 DNA 에 대응하는 센스 가닥인, 제 7항의 DNA 와 혼성화하는 DNA.
9. 60 내지 70℃ 및 6 x SSC 에서 혼성화하는 제 8 항의 혼성화 DNA.
10. 일반식 2 로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 소단위체를 코딩하는 DNA :

    [일반식 2]

    -FRL₁-CDRL₁-FRL₂-CDRL₂-FRL₃-CDRL₃-FRL₄-

    (식중, FRL₁은 23 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, CDRL₁은 SEQ ID NO.4 의 아미노산 서열을 나타내며, FRL₂는 15 아미노산 잔기를 포함한 아미노산 서열을 나타내고, CDRL₂는 SEQ ID NO.5 의 아미노산 서열을 나타내며, FRL₃는 32 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, CDRL₃은 SEQ ID NO.6 의 아미노산 서열을 나타내며, FRL₄는 10 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, 각각의 아미노산 서열은 펩티드 결합을 통해 다음의 아미노산 서열에 결합된다)
11. 제 10항에 있어서, SEQ ID NO.9 의 뉴클레오티드 번호 58 내지 393 으로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
12. 제 11항의 DAN 와 혼성화하는 DNA 에 있어서, 제 1항에 정의된 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 소단위체와 함께 인간 Fas 에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 L 사슬 소단위체를 코딩하는 혼성화 DNA 에 대응하는 센스 가닥인, 제 11항의 DNA 와 혼성화하는 DNA.
13. 60 내지 70℃ 및 6 x SSC 에서 혼성화하는 제 12항의 혼성화 DNA.
14. 제 6항의 DNA 를 포함하는 재조합 DNA 벡터.
15. 제 10항의 DNA 를 포함하는 재조합 DNA 벡터.
16. pCR3-H123 및 pCR3-L103 으로 구성된 군으로부터 선택된 재조합 DNA 벡터.
17. 제 14항의 벡터로 형질전환된 세포,
18. 제 15항의 벡터로 형질전환된 세포.
19. 제 16항의 벡터로 형질전환된 세포.
20. 대장균 pCR3-H123 (FERM BP-5247).
21. 대장균 pCR3-L103 (FERM BP-5248).
22. 제 14항, 제 15항 및 제 16항의 DNA 로 구성된 군으로부터 선택한 DNA 를 포함하는 DNA 벡터로 형질전환된 세포를, 벡터내에 포함된 면역글로불린 H 사슬 또는 L 사슬 소단위체를 코딩하는 DNA 의 발현을 가능케하는 조건하, 배양하고, 배양물로부터 면역글로불린 단백질을 회수하는 것을 특징으로하는, 인간 Fas 항원을 특이적으로 인식하는 면역글로불린 단백질을 생산하는 방법.
23. 인간화 항체의 구축에 사용되는 제 1항에 정의된 바와 같은 CDRH₁, CDRH₂, CDRH₃, CDRL₁, CDRL₂및 CDRL₃, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 CDR's.
24. 항체를 코딩하는 DNA 의 구축에 사용되는 제 1항에 정의된 바와 같은 CDRH₁, CDRH₂, CDRH₃, CDRL₁, CDRL₂및 CDRL₃, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 CDR's 을 코딩하는 DNA.

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