JPH09322796A

JPH09322796A - モノクローナル抗体の可変領域をコードするｄｎａ、および組換え抗体

Info

Publication number: JPH09322796A
Application number: JP7689097A
Authority: JP
Inventors: Nobuki Serizawa; 伸記芹澤; Kaori Nakahara; かおり中原; Kimihisa Ichikawa; 公久市川; Shin Yonehara; 伸米原
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1996-04-01
Filing date: 1997-03-28
Publication date: 1997-12-16

Abstract

(57)【要約】【課題】自己免疫疾患および慢性関節リウマチの新し
い治療薬を創製するために有用な、細胞傷害活性を有す
るマウス抗Ｆａｓモノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖
の各可変領域をコードするＤＮＡを提供する。【解決手段】マウス抗Ｆａｓモノクローナル抗体ＣＨ
１１のＨ鎖およびＬ鎖の各可変領域をコードするＤＮＡ
のヌクレオチド配列を決定し、ＣＨ１１の全一次構造を
解明した。さらに、該抗体をヒト化するために必要なＣ
ＤＲ（相補性決定領域）のアミノ酸配列を決定した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は免疫担当細胞のアポ
トーシスに関与する細胞膜分子であるＦａｓ抗原と結合
し、アポトーシスを誘導する組換え抗ヒトＦａｓ抗体及
び該抗体の可変領域をコードするＤＮＡに関する。

【０００２】さらに本発明は、抗Ｆａｓ抗体または、抗
Ｆａｓ抗体及び細胞増殖抑制作用を有する薬物との組み
合わせを有効成分とする自己免疫疾患治療剤、特にリウ
マチ治療剤に関するものである。

【０００３】

【従来の技術】生体内において、正常な細胞交代のため
に生じる生理的な細胞死のことはアポトーシスと呼ば
れ、病理的な細胞死である壊死（ネクローシス）とは区
別されている［Kerr, et al. (1972) Br. J. Cancer 2
6, 239 参照］。いわゆるプログラム細胞死は、生体内
において予め死滅するべくプログラム化されているある
種の細胞にみられる細胞死であるが、アポトーシスもそ
のひとつである。アポトーシスにおいては細胞表面の湾
曲、核クロマチンの凝縮、染色体ＤＮＡの断片化等の現
象が特徴的に観察される。

【０００４】アポトーシスは、リンパ球（Ｔ細胞および
Ｂ細胞）の分化において、自己抗原を認識する細胞を排
除する役割を果たしている。いわゆる自己免疫疾患の発
症は、リンパ球分化におけるアポトーシスの不全によっ
て自己反応性リンパ球が生じることによるものと考えら
れている［中山敬一ら (1995) Mebio 12 (10), 79-86参
照］。

【０００５】最近、免疫担当細胞のアポトーシスに関与
する細胞膜分子であるＦａｓ抗原［Itoh, N., et al.
(1991) Cell 66, 233-243参照］に対する抗ヒトＦａｓ
モノクローナル抗体が作製された［Yonehara, S., et a
l. (1989) J. Exp. Med. 169,1747、Trauth, B. C., et
al. (1989) Science 245, 301 および前出Itoh, N.,et
al. 参照］。これらの抗ヒトＦａｓ抗体は細胞のアポ
トーシスを誘導する細胞障害活性を有することから、自
己免疫疾患、エイズおよび腫瘍の治療剤となり得ると報
告されている［特開平２−２３７９３５および特表平５
−５０３２８１参照］。

【０００６】一方リウマチ、特に慢性関節リウマチは、
内的および外的要因によって引き起こされる種々の免疫
学的異常を伴う滑膜細胞の増殖を基礎病変とする疾患で
あり、炎症性細胞浸潤および骨の侵食を伴う滑膜細胞の
増殖障害と考えられている。慢性関節リウマチにおける
罹患関節を中心とする組織破壊は、炎症性滑膜細胞から
のサイトカインの産生異常がその成因であると考えられ
ている。リウマチ患者の関節の状態を調べると、滑膜細
胞が異常に増殖しており、滑膜絨毛の増生や滑膜細胞の
多層化などが観察される［Daniel J. McCarty (1985) i
n "Arthritis and allied conditions, A textbook of
rheumatology" 10th Edition, Lea & Febiger 参照] 。
現在実施されているリウマチの薬物療法には、専らステ
ロイド等の抗炎症剤または免疫調節剤等が用いられてい
るが、こうした滑膜細胞の異常増殖を薬物で抑制するこ
とができれば、その薬物はリウマチ治療剤として有用で
あると考えられる。

【０００７】ところで、リウマチにおける滑膜細胞の増
殖は無制限に生じるものではなく、自発抑制することが
知られている［Daniel J. McCarty (1985) in "Arthrit
is and allied conditions, A textbook of rheumatolo
gy" 10th Edition, Lea & Febiger 参照］。さらに最
近、リウマチ患者の滑膜細胞にアポトーシスが起こるこ
と、滑膜細胞膜上にＦａｓ抗原が発現していることが明
らかとなった。中島ら［Nakajima, T., et al. (1995)
Arthritis Rheum. 38, 485-491参照］および青野ら［第
３８回日本リウマチ学会抄録集(1994) 487頁および平成
６年日本癌学会総会記事(1994) 338頁参照］は、細胞障
害活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体をリウマチ患者由来の
異常増殖した滑膜細胞に加えることにより、滑膜細胞に
アポトーシスが誘導されるか否かについて検討した結
果、リウマチ患者の異常増殖した滑膜細胞はリウマチ患
者以外の滑膜細胞と比較してアポトーシスが起こる割合
が高いことを見いだしている。従って、抗ヒトＦａｓ抗
体は、リンパ球のみならず、異常増殖している滑膜細胞
も選択的にアポトーシスへと導くことができ、リウマチ
治療剤として有用であると考えられる。

【０００８】しかしながら、マウスモノクローナル抗体
を医薬品としてヒトの生体に投与する場合、その免疫原
性から種々の問題が生じる。すなわち該抗体は、生体の
免疫応答によるアナフィラキシーショックを誘導するお
それがあり、また投与を繰り返す間に効果が減少した
り、血中濃度の低下が早まる等の臨床応用上の欠点を有
している。

【０００９】これらの問題を解決し、より臨床応用に適
した抗体を得るために、マウス抗体の定常領域をヒト抗
体の定常領域と置換したキメラ抗体を組換えＤＮＡ技術
により構築する方法［Morrison, S. L., et al. (1984)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855 参照］、
および組換えＤＮＡ技術によりマウス抗体の可変領域中
に存在する相補性決定領域（complementarity determin
ing region；以下「ＣＤＲ」という）をヒト抗体に移植
する方法［Jones, P. T., et al. (1986) Nature 321,
522-525 参照］が開発されている。このような遺伝子組
換えによる改変抗体を作製するためには、まず標的とす
る抗原を特異的に認識するマウス抗体を構成する重鎖
（以下、「Ｈ鎖」という。）サブユニットおよび軽鎖
（以下、「Ｌ鎖」という。）サブユニットをコードする
遺伝子をクローニングし、その配列を明らかにして、Ｃ
ＤＲを含む可変領域の一次構造を特定することが必要で
ある。

【００１０】しかしながら、細胞障害活性を有するマウ
ス抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＣＨ１１［Yonehar
a, S., et al. (1989) J. Exp. Med. 169, 1747参照］
をコードする遺伝子の配列はこれまで知られておらず、
また該抗体の可変領域の部分アミノ酸配列に関する報告
もない。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、細胞
障害活性を有する抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＣＨ
１１の各サブユニットをコードする遺伝子をクローニン
グして、それらの可変領域の一次構造を解明し、さらに
ＣＤＲを特定することにより、ヒト生体内において異物
と認識され難いキメラ抗体や、ＣＤＲをヒト・イムノグ
ロブリンに移植した人工抗体の作製に有用な、ＤＮＡを
提供することにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、（１）遺伝子
操作によって得られ、サブユニットとして、以下の一般
式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を含むことからなるＨ
鎖タンパク質： −ＦＲＨ₁ −ＣＤＲＨ₁ −ＦＲＨ₂ −ＣＤＲＨ₂ −ＦＲＨ₃ −ＣＤＲＨ₃ −ＦＲＨ₄ − （Ｉ）（式中、ＦＲＨ₁ は１３個ないし３０個からなる任意の
アミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₁ は配列表の配列番号１
で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ₂ は１４個から
なる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₂ は配列表の
配列番号２で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ₃ は
３２個からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₃
は配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列を示し、
ＦＲＨ₄ は１１個からなる任意のアミノ酸配列を示し、
各アミノ酸配列はそれぞれペプチド結合で連結してい
る。）；および、以下の一般式（ＩＩ）で示されるアミ
ノ酸配列を含むことからなるＬ鎖タンパク質： −ＦＲＬ₁ −ＣＤＲＬ₁ −ＦＲＬ₂ −ＣＤＲＬ₂ −ＦＲＬ₃ −ＣＤＲＬ₃ −ＦＲＬ₄ − （ＩＩ）（式中、ＦＲＬ₁ は２３個からなる任意のアミノ酸配列
を示し、ＣＤＲＬ₁ は配列表の配列番号４で示されるア
ミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₂ は１５個からなる任意のア
ミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ₂ は配列表の配列番号５で
示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₃ は３２個からな
る任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ₃は配列表の配
列番号６で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₄ は１
０個からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸配
列はそれぞれペプチド結合で連結している。）；のみか
ら構成され、Ｊ鎖蛋白質を有さず、ヒトＦａｓ抗原分子
と特異的に結合し、アポトーシス誘導活性を有すること
を特徴とするイムノグロブリンタンパク質、（２）Ｈ鎖
サブユニットが配列表の配列番号８のアミノ酸番号１〜
１１６で示されるアミノ酸配列を含むことからなり、Ｌ
鎖サブユニットが配列表の配列番号１０のアミノ酸番号
１〜１１２で示されるアミノ酸配列を含むことからなる
ことを特徴とする、請求項１記載のイムノグロブリンタ
ンパク質、（３）Ｈ鎖サブユニットが配列表の配列番号
８のアミノ酸番号１〜５７１で示されるアミノ酸配列か
らなり、Ｌ鎖サブユニットが配列表の配列番号１０のア
ミノ酸番号１〜２１９で示されるアミノ酸配列からなる
ことを特徴とする、（１）または（２）記載のイムノグ
ロブリンタンパク質、（４）以下の一般式（Ｉ）で示さ
れるアミノ酸配列を含むことからなるＨ鎖タンパク質を
コードするＤＮＡ： −ＦＲＨ₁ −ＣＤＲＨ₁ −ＦＲＨ₂ −ＣＤＲＨ₂ −ＦＲＨ₃ −ＣＤＲＨ₃ −ＦＲＨ₄ − （Ｉ）（式中、ＦＲＨ₁ は１３個ないし３０個からなる任意の
アミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₁ は配列表の配列番号１
で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ₂ は１４個から
なる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₂ は配列表の
配列番号２で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ₃ は
３２個からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₃
は配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列を示し、
ＦＲＨ₄ は１１個からなる任意のアミノ酸配列を示し、
各アミノ酸配列はそれぞれペプチド結合で連結してい
る。）、（５）分子中に配列表の配列番号８のアミノ酸
番号１〜１１６で示されるアミノ酸配列を含むことから
なるＨ鎖タンパク質をコードする（４）記載のＤＮＡ、
（６）分子中に配列表の配列番号７のヌクレオチド番号
５８〜４０５で示されるヌクレオチド配列を含むことか
らなる（４）または（５）記載のＤＮＡ、（７）請求項
６記載のＤＮＡとハイブリダイズし、以下の一般式（Ｉ
Ｉ）で示されるアミノ酸配列を含むことからなるＬ鎖サ
ブユニット： −ＦＲＬ₁ −ＣＤＲＬ₁ −ＦＲＬ₂ −ＣＤＲＬ₂ −ＦＲＬ₃ −ＣＤＲＬ₃ −ＦＲＬ₄ − （ＩＩ）（式中、ＦＲＬ₁ は２３個からなる任意のアミノ酸配列
を示し、ＣＤＲＬ₁ は配列表の配列番号４で示されるア
ミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₂ は１５個からなる任意のア
ミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ₂ は配列表の配列番号５で
示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₃ は３２個からな
る任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ₃は配列表の配
列番号６で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₄ は１
０個からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸配
列はそれぞれペプチド結合で連結している。）；ととも
に、ヒトＦａｓ抗原と特異的に結合し、アポトーシス誘
導活性を有することを特徴とするイムノグロブリンタン
パク質を形成するイムノグロブリンＨ鎖サブユニットを
コードするＤＮＡ、（８）（６）記載のＤＮＡと６０〜
７０℃、６×ＳＳＣの条件でハイブリダイズし、以下の
一般式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含むことから
なるＬ鎖サブユニット： −ＦＲＬ₁ −ＣＤＲＬ₁ −ＦＲＬ₂ −ＣＤＲＬ₂ −ＦＲＬ₃ −ＣＤＲＬ₃ −ＦＲＬ₄ − （ＩＩ）（式中、ＦＲＬ₁ は２３個からなる任意のアミノ酸配列
を示し、ＣＤＲＬ₁ は配列表の配列番号４で示されるア
ミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₂ は１５個からなる任意のア
ミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ₂ は配列表の配列番号５で
示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₃ は３２個からな
る任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ_３は配列表の配
列番号６で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ_４は
１０個からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸
配列はそれぞれペプチド結合で連結している。）；とと
もに、ヒトＦａｓ抗原と特異的に結合し、アポトーシス
誘導活性を有することを特徴とするイムノグロブリンタ
ンパク質を形成するイムノグロブリンＨ鎖サブユニット
をコードするＤＮＡ、（９）（４）乃至（８）のいずれ
かひとつに記載のＤＮＡを含むことからなる組換えＤＮ
Ａベクター、（１０）組換えＤＮＡベクターｐＣＲ３−
Ｈ１２３、（１１）（９）記載の組換えＤＮＡベクター
で形質転換された細胞、（１２）形質転換大腸菌Ｅ．
ｃｏｌｉｐＣＲ３−Ｈ１２３（ＦＥＲＭＢＰ−５２
４７）、（１３）以下の一般式（ＩＩ）で示されるアミ
ノ酸配列を含むことからなるＬ鎖タンパク質をコードす
るＤＮＡ： −ＦＲＬ₁ −ＣＤＲＬ₁ −ＦＲＬ₂ −ＣＤＲＬ₂ −ＦＲＬ₃ −ＣＤＲＬ₃ −ＦＲＬ₄ − （ＩＩ）（式中、ＦＲＬ₁ は２３個からなる任意のアミノ酸配列
を示し、ＣＤＲＬ₁ は配列表の配列番号４で示されるア
ミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₂ は１５個からなる任意のア
ミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ₂ は配列表の配列番号５で
示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₃ は３２個からな
る任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ₃は配列表の配
列番号６で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₄ は１
０個からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸配
列はそれぞれペプチド結合で連結している。）、（１
４）配列表の配列番号１０のアミノ酸番号１〜１１２で
示されるアミノ酸配列を含むことからなるＬ鎖タンパク
質をコードする（１３）記載のＤＮＡ、（１５）配列表
の配列番号９のヌクレオチド番号５８〜３９３で示され
るヌクレオチド配列を含むことからなる（１３）または
（１４）記載のＤＮＡ、（１６）（１５）記載のＤＮＡ
とハイブリダイズし、以下の一般式（Ｉ）で示されるア
ミノ酸配列を含むことからなるＨ鎖サブユニット： −ＦＲＨ₁ −ＣＤＲＨ₁ −ＦＲＨ₂ −ＣＤＲＨ₂ −ＦＲＨ₃ −ＣＤＲＨ₃ −ＦＲＨ₄ − （Ｉ）（式中、ＦＲＨ₁ は１３個ないし３０個からなる任意の
アミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₁ は配列表の配列番号１
で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ₂ は１４個から
なる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₂ は配列表の
配列番号２で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ₃ は
３２個からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₃
は配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列を示し、
ＦＲＨ₄ は１１個からなる任意のアミノ酸配列を示し、
各アミノ酸配列はそれぞれペプチド結合で連結してい
る。）；とともに、ヒトＦａｓ抗原と特異的に結合し、
アポトーシス誘導活性を有することを特徴とするイムノ
グロブリンタンパク質を形成するイムノグロブリンＬ鎖
サブユニットをコードするＤＮＡ、（１７）（１５）記
載のＤＮＡと６０〜７０℃、６×ＳＳＣの条件でハイブ
リダイズし、以下の一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配
列を含むことからなるＨ鎖サブユニット： −ＦＲＨ₁ −ＣＤＲＨ₁ −ＦＲＨ₂ −ＣＤＲＨ₂ −ＦＲＨ₃ −ＣＤＲＨ₃ −ＦＲＨ₄ − （Ｉ）（式中、ＦＲＨ₁ は１３個ないし３０個からなる任意の
アミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₁ は配列表の配列番号１
で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ₂ は１４個から
なる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₂ は配列表の
配列番号２で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ₃ は
３２個からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₃
は配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列を示し、
ＦＲＨ₄ は１１個からなる任意のアミノ酸配列を示し、
各アミノ酸配列はそれぞれペプチド結合で連結してい
る。）；とともに、ヒトＦａｓ抗原と特異的に結合し、
アポトーシス誘導活性を有することを特徴とするイムノ
グロブリンタンパク質を形成するイムノグロブリンＬ鎖
サブユニットをコードするＤＮＡ、（１８）（１３）乃
至（１７）のいずれかひとつに記載のＤＮＡを含むこと
からなる組換えＤＮＡベクター、（１９）組換えＤＮＡ
ベクターｐＣＲ３−Ｌ１０３、（２０）（１８）記載の
組換えＤＮＡベクターで形質転換された細胞、（２１）
形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉｐＣＲ３−Ｌ１０３
（ＦＥＲＭＢＰ−５２４８）、（２２）（９）記載の
ＤＮＡベクターおよび請求項１８記載のＤＮＡベクター
で形質転換された細胞を、該ベクターに含まれるイムノ
グロブリンＨ鎖またはＬ鎖サブユニットをコードするＤ
ＮＡの発現が可能な条件下で培養し、次いで該培養物か
ら、ヒトＦａｓ抗原を特異的に認識しアポトーシス誘導
活性を有するイムノグロブリンタンパク質を回収するこ
とを特徴とする、該タンパク質の製造方法、に関する。

【００１３】本発明者らは、イムノグロブリンＭ型であ
る抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマより作製したｃＤＮＡライブラリーから、該抗体
のＨ鎖、Ｌ鎖およびＪ鎖をコードする遺伝子をそれぞれ
クローン化し、その全ヌクレオチド配列を解明した。次
いで、それらの遺伝子にコードされる該Ｈ鎖およびＬ鎖
のアミノ酸配列におけるＣＤＲのアミノ酸配列を決定し
た。また、該Ｈ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子を含む
ことからなる発現ベクターをそれぞれ作製した。さら
に、これらのベクターで培養動物細胞をコ・トランスフ
ェクションして得られた形質転換体の培養上清中に、抗
ヒトＦａｓ抗体として機能し、細胞障害活性を有するタ
ンパク質が産生されていることを見いだし、本発明を完
成した。

【００１４】本発明において用いられる「ＦＲ」なる語
は、イムノグロブリンＨ鎖またはＬ鎖サブユニットの可
変領域中に存在する、いわゆるフレームワーク領域を指
すものである。フレームワーク領域はＣＤＲを挟むよう
に存在し、イムノグロブリン分子におけるＣＤＲの立体
的な配置を支えることにより、ＣＤＲの抗原との結合に
寄与する領域である。例えば、ＦＲＨ₁ はＨ鎖サブユニ
ット可変領域中の最もＮ末側に存在するフレームワーク
領域を指し、ＦＲＬ₄ はＬ鎖サブユニット可変領域中の
Ｎ末から４番目のフレームワーク領域を指す。同様に、
例えばＣＤＲＨ₁ はＨ鎖サブユニット可変領域中の最も
Ｎ末側に存在するＣＤＲを指し、ＣＤＲＬ₃ はＬ鎖サブ
ユニット可変領域中のＮ末から３番目のＣＤＲを指す。

【００１５】フレームワーク領域自体は抗原に結合しな
いので、本発明においては、ヒトＦａｓ抗原に対する結
合能を損なわない限りにおいて、フレームワーク領域の
アミノ酸配列は任意でよい。

【００１６】また、本発明の抗ヒトＦａｓ抗体の各サブ
ユニットの可変領域のＣ末側には、該抗体の抗原結合能
を損なわない限りにおいて、任意のアミノ酸配列が連結
され得る。そのようなアミノ酸配列としては、天然のイ
ムノグロブリンの各サブユニットに存在する定常領域が
好適であるが、これらに限定されない。

【００１７】また、本発明において「細胞障害活性」な
る語は「アポトーシス誘導活性」と同じ意味を示し、Ｆ
ａｓ抗原を有する細胞にアポトーシスを誘導する活性を
意味する。

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡは、抗ヒトＦａｓ
モノクローナル抗体ＣＨ１１を産生するマウスハイブリ
ドーマ細胞よりポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを調製し、該ポリ
（Ａ）⁺ ＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡに変換してか
ら、該抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単離
することにより得られる。ＣＨ１１産生ハイブリドーマ
は米原ら［Yonehara, S., et al. (1989) J. Exp. Med.
169，1747参照］により、ヒト二倍体繊維芽細胞ＦＳ−
７で免疫して得られたマウスのリンパ球とマウスミエロ
ーマ細胞とを細胞融合して得られたものである。なお、
ＣＨ１１は（株）医学生物学研究所より市販されてい
る。

【００１９】細胞からのポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡの調製は、
まず全ＲＮＡを調製し、該全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）
セルロースやオリゴ（ｄＴ）ラテックスビーズ等のポリ
（Ａ）⁺ ＲＮＡ精製用担体を用いて精製する方法、また
は細胞ライセートから該担体を用いて直接精製する方法
により実施できる。全ＲＮＡの調製方法としては、アル
カリ蔗糖密度勾配遠心分離法［Dougherty, W. G. and H
iebert, E. (1980) Viology 101, 466-474参照］、グア
ニジンチオシアネート・フェノール法、グアニジンチオ
シアネート・トリフルオロセシウム法、フェノール・Ｓ
ＤＳ法等も採用し得るが、グアニジンチオシアネートお
よび塩化セシウムを用いる方法［Chirgwin, J. M., et
al. (1979) Biochemistry 18, 5294-5299 参照］が好適
である。

【００２０】前述の如くして得たポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを
鋳型として、逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成
した後、この一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成
することができる。この方法としてはＳ１ヌクレアーゼ
法［Efstratiadis, A., et al.(1976) Cell 7, 279-288
参照］、グブラー−ホフマン法［Gubler, U. and Hoffm
an, B. J. (1983) Gene 25, 263-269 参照］等を採用し
得るが、本発明においてはオカヤマ−バーグ法［Okayam
a, H. and Berg, P. (1982) Mol. Cell. Biol.2, 161-1
70 参照］が好適である。

【００２１】このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡを
クローニングベクターに組み込み、得られた組換えベク
ターを大腸菌等の微生物に導入して形質転換させ、テト
ラサイクリン耐性或いはアンピシリン耐性を指標として
形質転換体を選択することができる。大腸菌の形質転換
は、ハナハン法［Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol.16
6, 557-580 参照］、すなわち塩化カルシウムや塩化マ
グネシウムまたは塩化ルビジウムを共存させて調製した
コンピテント細胞に、該組換えＤＮＡベクターを加える
方法により実施することができる。なお、ベクターとし
てプラスミドを用いる場合は、上記の薬剤耐性遺伝子を
有することが必要である。また、プラスミド以外のクロ
ーニングベクター、例えばラムダ系のファージ等を用い
ることもできる。

【００２２】上記により得られる形質転換株から、目的
の抗ヒトＦａｓ抗体の各サブユニットをコードするＤＮ
Ａを有する株を選択する方法としては、例えば以下に示
す各種方法を採用できる。

【００２３】（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを
用いるスクリーニング法目的タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部が解明
されている（該配列は、複数個連続した特異的配列であ
れば、目的タンパク質のどの領域のものでもよい）場
合、該アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドを合
成し（この場合、コドン使用頻度を参考に推測されるヌ
クレオチド配列、または考えられるヌクレオチド配列を
組合せた複数個のヌクレオチド配列のいずれも採用で
き、また後者の場合イノシンを含ませてその種類を減ら
すこともできる）、これをプローブ（³²Ｐ、³⁵Ｓあるい
はビオチン等で標識する）として、形質転換株のＤＮＡ
を変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリ
ダイズさせ、得られたポジティブ株を検索して、これを
選択する。

【００２４】（２）ポリメラーゼ連鎖反応を用いる方法目的タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部が解明
されている場合、該アミノ酸配列の一部に対応するセン
スストランドとアンチセンスストランドのオリゴヌクレ
オチドプライマーを合成し、これらを組合せてポリメラ
ーゼ連鎖反応［Saiki, R. K., et al.(1988) Science 2
39, 487-491 参照］を行ない、目的の抗ヒトＦａｓ抗体
サブユニットをコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここ
で用いる鋳型ＤＮＡとしては、抗ヒトＦａｓ抗体ＣＨ１
１を産生するハイブリドーマのｍＲＮＡより逆転写酵素
反応にて合成したｃＤＮＡを用いることができる。この
ようにして調製したＤＮＡ断片は、市販のキット等を利
用して直接プラスミドベクターに組み込むこともできる
し、該断片を³²Ｐ、³⁵Ｓあるいはビオチン等で標識し、
これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼー
ションまたはプラークハイブリダイゼーションを行なう
ことにより目的のクローンを選択することもできる。

【００２５】モノクローナル抗体ＣＨ１１はイムノグロ
ブリンＭ（以下「ＩｇＭ」という）分子であり、Ｈ鎖
（μ鎖）、Ｌ鎖およびＪ鎖の各サブユニットからなる複
合体である。これら各サブユニットの部分アミノ酸配列
を調べる方法としては、電気泳動やカラムクロマトグラ
フィー等、当業者に周知の方法を用いて各サブユニット
を単離してから、自動プロテインシークエンサー（例え
ば、島津製作所（株）社製ＰＰＳＱ−１０）等を利用し
てそれぞれのサブユニットのＮ末端アミノ酸配列を解析
する方法が好適である。

【００２６】上記のごとくして得られた目的の形質転換
株より抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体タンパク質の各
サブユニットをコードするＤＮＡを採取する方法は、公
知の方法［Maniatis, T., et al.(1982) in "Molecular
Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor L
aboratory, NY.参照］に従い実施できる。例えば細胞よ
りベクターＤＮＡに相当する画分を分離し、該プラスミ
ドＤＮＡより目的とするサブユニットをコードするＤＮ
Ａ領域を切り出すことにより行い得る。

【００２７】なお、本発明のＤＮＡを含む組換えＤＮＡ
ベクターで形質転換された大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉｐ
ＣＲ３−Ｈ１２３およびＥ．ｃｏｌｉｐＣＲ３−Ｌ
１０３は平成８年２月２８日付で工業技術院生命工学工
業技術研究所に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ
−５４２７およびＦＥＲＭＢＰ−５４２８が付されて
いる。従って、該寄託菌株からプラスミドを単離する
か、もしくは該寄託菌株の抽出物を鋳型にしてポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うなどの方法により本発明
のＤＮＡを取得することができる。

【００２８】このようにして得られるＤＮＡの配列の決
定は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法［Maxa
m, A. M. and Gilbert, W.(1980) in "Methods in Enzy
mology" 65, 499-276 参照］やＭ１３ファージを用いる
ジデオキシヌクレオチド鎖終結法［Messing, J. and Vi
eira, J.(1982) Gene 19, 269-276 参照］等により行う
ことができる。また近年、ＤＮＡのヌクレオチド配列を
決定するために、従来使用していたラジオアイソトープ
の代わりに蛍光色素を用いて、コンピュータの制御下で
ロボットにジデオキシ法を行わせ、電気泳動後のヌクレ
オチド配列の解読もコンピュータで行うシステムが普及
している（例えばパーキンエルマージャパン社製シーク
エンスロボット“ＣＡＴＡＬＹＳＴ８００”およびモ
デル３７３ＡＤＮＡシークエンサー等）。こうしたシス
テムを利用することで、ＤＮＡヌクレオチド配列決定操
作を能率よく、かつ安全に行うことができる。

【００２９】このようにして決定された本発明のＤＮＡ
のヌクレオチド配列およびＣＨ１１のＨ鎖およびＬ鎖の
各Ｎ末端アミノ酸配列データから、ＣＨ１１のＨ鎖およ
びＬ鎖の全アミノ酸配列を決定することができる。

【００３０】イムノグロブリンのＨ鎖およびＬ鎖は、い
ずれも可変領域および定常領域からなり、可変領域はさ
らに相補性決定領域（以下「ＣＤＲ」という：Ｈ鎖・Ｌ
鎖ともに各３か所）およびそれらに隣接するフレームワ
ーク領域（Ｈ鎖・Ｌ鎖ともに各４か所）からなる。この
うち、定常領域のアミノ酸配列は、抗原の種類に関係な
く、イムノグロブリンサブクラスが同一である抗体間で
は共通である。一方、可変領域、特にＣＤＲのアミノ酸
配列は各抗体に固有のものであるが、数多くの抗体のア
ミノ酸配列データを比較した研究によれば、ＣＤＲの位
置やフレームワーク配列の長さは同じサブグループに属
する抗体サブユニットの間ではほぼ一定していることが
知られている［Kabat, E. A., et al. (1991) in "Sequ
ence ofProteins of Immunological Interest Vol.II":
U.S. Department of Health and Human Services 参
照］。従って、本発明により明らかになったＣＨ１１の
Ｈ鎖およびＬ鎖の各アミノ酸配列とそれら公知のアミノ
酸配列データとを比較することにより、各アミノ酸配列
におけるＣＤＲ、フレームワーク領域および定常領域の
位置を決定することができる。

【００３１】なお、Ｈ鎖の最もＮ末側のフレームワーク
領域の鎖長については、通常（３０アミノ酸）より短い
ことがあり、例えば、マウスＩｇＭとしては該フレーム
ワーク領域が最小１３アミノ酸の例、ＣＨ１１と同じμ
２ａサブタイプとしては最小１９アミノ酸の例などが知
られている［前出 Kabat et al. 参照］。従って、本発
明においては、抗ヒトＦａｓ抗体としての機能を損なわ
ない限りにおいて、Ｈ鎖のＮ末端のフレームワーク領域
の鎖長を１３アミノ酸以上３０アミノ酸以下とする。好
適には１９アミノ酸以上３０アミノ酸以下であり、最も
好適には３０アミノ酸である。アミノ酸配列中の任意の
一つもしくは二つ以上のアミノ酸を欠失させた改変体を
作製するにあたっては、カセット変異法［岸本利光、
“新生化学実験講座２・核酸ＩＩＩ組換えＤＮＡ技
術” 242-251参照］などに従うことができる。

【００３２】この様な本発明の各種のＤＮＡは、例えば
フォスファイト・トリエステル法［Hunkapiller, M., e
t al. (1984) Nature 310, 105-111参照］等の常法に従
い、核酸の化学合成により製造することもできる。［Gr
antham, R., et al.(1981) Nucleic Acids Res. 9, r43
-r74参照］。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、そ
れ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば使用
する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定で
きる。これらヌクレオチド配列コドンの一部改変は、常
法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオ
チドからなるプライマーを利用したサイトスペシフィッ
ク・ミュータジェネシス（site specific mutagenesis
）［Mark, D. F., et al.(1984) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 81, 5662-5666参照］等に従うことができる。

【００３３】あるＤＮＡが（６）または（１５）記載の
ＤＮＡとハイブリダイズするか否かは、例えば、目的と
するＤＮＡをランダムプライマー法［Feinberg, A. P.
andVogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6-13
参照］やニックトランスレーション法［Maniatis, T.,
et al. (1982) in "Molecular Cloning A LaboratoryMa
nual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY. ］等に従
い、［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ等で標識したプローブを用い
てハイブリダイゼーションを行い調べることができる。
ハイブリダイゼーションに用いるＤＮＡは、公知の方
法、例えば、ニトロセルロース膜やナイロン膜等に吸着
させ、加熱あるいは紫外線等により固相化させる。その
後、６×ＳＳＣと５％デンハート溶液、０．１％ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むプレハイブリダイ
ゼーション溶液に浸し、５５℃で４時間以上保温する。
その後先に作成したプローブを同様のプレハイブリダイ
ゼーション溶液に最終比活性１×１０⁶ ｃｐｍ／ｍｌと
なるように加え、６０℃で一晩保温する。その後、室温
下で６×ＳＳＣで５分間の洗浄を５回繰り返し、その後
５７℃で２０分間洗浄し、オートラジオグラフィーを行
うことにより、ハイブリダイズしたか否かを判定するこ
とができる。この方法を利用して、任意のｃＤＮＡライ
ブラリーまたはゲノムライブラリーから、本発明のＤＮ
ＡとハイブリダイズするＤＮＡを単離することができる
［Maniatis, T., et al. (1982) in "Molecular Clonin
g: A laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laborat
ory, NY参照］。

【００３４】このようにして得られた本発明の各ＤＮＡ
をそれぞれ発現ベクターに組み込むことにより、原核生
物または真核生物の宿主細胞を形質転換させることがで
きる。さらに、これらベクターに適当なプロモーターお
よび形質発現に関わる配列を導入することにより、各々
の宿主細胞において各遺伝子を発現させることが可能で
ある。

【００３５】原核細胞の宿主としては、例えば大腸菌
（Esherichia coli ）、や枯草菌（Bacillus subtilis
）等が挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞
内で形質発現させるには、宿主と適合し得る種由来のレ
プリコン、即ち複製起点およびｌａｃＵＶ５等のプロ
モーター配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細
胞を形質転換すれば良い。またベクターは、形質転換細
胞に表現形質（表現型）による選択性を付与することが
できる配列を持つものが望ましい。

【００３６】例えば大腸菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｋ１２株由来のＪＭ１０９株等がよく用いられ、ベクタ
ーとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミ
ドがよく用いられるが、これらに限定されず、公知の各
種の菌株およびベクターがいずれも使用できる。プロモ
ーターとしては、大腸菌に於いてはラクトースプロモー
ター（ｌａｃ）やトリプトファン・ラクトースプロモー
ター（ｔｒｃ）等が挙げられるが、これらに限定されな
い。

【００３７】枯草菌としては、例えば２０７−２５株が
好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８［Ohmura,
K., et al.(1984) J. Biochem. 95, 87-93参照］等が用
いられるが、これに限定されない。プロモーターとして
は、枯草菌α−アミラーゼ遺伝子の調節配列がよく用い
られ、さらに必要に応じてα−アミラーゼのシグナルペ
プチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することによ
り、菌体外への分泌も可能となる。

【００３８】真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母
等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサル
の細胞であるＣＯＳ細胞［Gluzman, Y. (1981) Cell 2
3, 175-182 参照］等が用いられる。酵母としては、パ
ン酵母（Saccharomycse cerevisiae）や分裂酵母（Schi
zosaccharomyces pombe ）等が用いられる。ここに例示
した細胞が一般に宿主細胞としてよく用いられている
が、これらに限定されない。

【００３９】脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通
常は発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモー
ター、ＲＮＡスプライスィング部位、ポリアデニル化部
位および転写終結配列等を有するものを使用でき、これ
にはさらに必要により複製起点を有してもよい。該発現
ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを
有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ［Subramani, S., et al.(198
1) Mol. Cell. Bio. 1,854-864参照］等を例示できる
が、これに限定されない。

【００４０】また真核微生物としては酵母が一般によく
用いられており、パン酵母（S. cerevisiae ）が例示で
きる。酵母の発現ベクターとしては、例えばアルコール
脱水素酵素遺伝子のプロモーター［Bennetzen, J. L. a
nd Hall, B. D.(1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025
参照］や、カルボキシルペプチダーゼ−Ｙ［Ichikawa,
K., et al.(1993) Biosci. Biotech. Biochem. 57, 168
6-1690参照］等を利用できる。さらに、必要によりカル
ボキシルペプチダーゼ−Ｙのシグナルペプチド配列をコ
ードするＤＮＡ配列を連結することにより、細胞外への
分泌も可能となるが、これに限定されない。

【００４１】宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合
を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製
起点を有し、ＣＯＳにおいて自立増殖が可能であり、さ
らに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲ
ＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ
る。該発現ベクターは、ＤＥＡＥ−デキストラン法［Lu
thman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids R
es. 11, 1295-1308 参照］、リン酸カルシウム−ＤＮＡ
共沈法［Graham, F. L. and van der Eb, A. J.(1973)
Virology 52, 456-457 参照］および電気パルス穿孔法
［Neumann, E., et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845 参
照］などによりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、
かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。特
に、本発明のＣＨ１１のＨ鎖をコードするＤＮＡを含む
ことからなる発現ベクターおよび同Ｌ鎖をコードするＤ
ＮＡを含むことからなる発現ベクターでＣＯＳ細胞をコ
・トランスフェクションすることにより、これらのＤＮ
Ａを同時に発現させ、抗ヒトＦａｓ抗体を産生する形質
転換体を得ることができる。

【００４２】上記で得られる所望の形質転換体は、当業
者に周知の方法に従って培養することができ、該培養に
より、形質転換体細胞内または細胞外に抗ヒトＦａｓ抗
体が産生される。該培養に用いられる培地としては、採
用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選
択でき、例えば上記ＣＯＳ細胞の場合、ＲＰＭＩ−１６
４０培地やダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭ
ＥＭ）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清（ＦＢ
Ｓ）などの血清成分を添加したものを使用できる。該形
質転換体の培養の際の培養温度は、細胞内のタンパク質
合成能を著しく低下せしめない温度であればいずれでも
よいが、好適には３２〜４２℃、最も好適には３７℃で
培養することが好ましい。また必要に応じて、１〜１０
％（ｖ／ｖ）の炭酸ガスを含む空気中で培養することが
できる。

【００４３】上記により形質転換体の細胞内または細胞
外に生産される本発明の抗ヒトＦａｓ抗体タンパク質を
含む画分は、該タンパク質の物理的性質や化学的性質等
を利用した各種公知の分離操作法により、分離・精製す
ることができる。かかる方法としては、具体的には例え
ば通常のタンパク質沈澱剤による処理、限外濾過、分子
ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）等の各種クロマトグラフィー、透析法、
およびこれらの組み合わせ等を採用できる。

【００４４】上記方法により、容易に高収率、高純度で
所望の抗ヒトＦａｓ抗体を製造できる。該抗体は、ハイ
ブリドーマにより産生されるＣＨ１１と比較すると、Ｉ
ｇＭ特有の多量体（Ｈ鎖１０個、Ｌ鎖１０個およびＪ鎖
１個からなる）を構成するＪ鎖を欠いていても、ＣＨ１
１と同等の細胞障害活性を有する。

【００４５】このようにして作製される本発明のタンパ
ク質がヒトＦａｓ抗原と特異的に結合することを確認す
る方法としては、例えば、９６穴プレートのウェル底面
に固相化された該抗原に被検検体を接触させ、ウェルを
洗浄後マウスＩｇＭのＨ鎖（μ鎖）を特異的に認識する
酵素標識抗体を接触させ、再び洗浄した後、ウェルに残
った標識物を検出する酵素免疫測定法（以下「ＥＬＩＳ
Ａ法」という）を例示できる。ヒトＦａｓ抗原をコード
するｃＤＮＡは既にクローニングされており、該ｃＤＮ
Ａを動物細胞に導入し発現させる方法も公知となってい
る［Itoh, N.,et al. (1991) Cell 66, 233-243参
照］。また、このＥＬＩＳＡ法の抗原としては、ヒトＦ
ａｓ抗原の細胞外領域とマウスインターロイキン３受容
体の細胞外領域との融合タンパク質をコードする遺伝子
を含む発現ベクターで形質転換された細胞の培養上清を
用いることもできる［上記 Itoh 参照］。

【００４６】また、本発明のタンパク質が細胞障害活性
を有することは、被検検体を添加した培地中で細胞（例
えば、ヒトリンパ球細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ［Morikawa,
S.,et al. (1978) Int. J. Cancer 21, 166-170参照］
またはＪｕｒｋａｔ（American Type Culture No. TIB-
152 ）等）を培養し、その生存率をＭＴＴアッセイ［Gr
een, L. M., et al. (1984) J. Immunological Methods
70, 257-268参照］等の方法で測定することにより確認
することができる。

【００４７】本発明のＣＨ１１の各サブユニットの可変
領域をコードするＤＮＡを利用して、遺伝子工学的手法
により、定常領域をヒト・イムノグロブリンのものに置
換したマウス・ヒトキメラ抗体［Morrison, S. L., et
al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-685
5 参照］を作製することができる。

【００４８】同様に、本発明のＤＮＡを用いて、Ｈ鎖お
よびＬ鎖の可変領域のみから構成されるＦｖ断片や、Ｈ
鎖とＬ鎖を可撓性のあるペプチドで連結させた一本鎖Ｆ
ｖ（ｓｃＦｖ）［Huston, J. S., et al. (1988) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85,5879参照］等を遺伝子工学
的手法により作製することが可能である。

【００４９】さらに、本発明のＣＨ１１のＨ鎖およびＬ
鎖のＣＤＲのアミノ酸配列をヒト・イムノグロブリンに
移植したヒト化抗体を作製する方法［Jones, P. T., et
al.(1986) Nature 321, 522-525 参照］を利用して、
ヒトに対する免疫原性がヒト抗体とほぼ同等の抗Ｆａｓ
抗体を作製することが可能である。

【００５０】かかるヒトに対する免疫原性がヒト抗体と
ほぼ同等の抗Ｆａｓ抗体は、慢性関節リウマチ等のリウ
マチ疾患に対し、このものを有効成分とする抗リウマチ
剤として使用することができる。かかる抗リウマチ剤
は、種々の形態で投与することができる。それらの投与
形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロ
ップ剤等による経口投与、または、注射剤、点滴剤、坐
薬などによる非経口投与を挙げることができる。

【００５１】その投与量は、症状、年齢、体重などによ
って異なるが、通常経口投与では成人に対して、一日約
０．１ｍｇないし１０００ｍｇであり、これらを１回、
または数回に分けて投与することができる。また、非経
口投与では、１回０．１ｍｇないし１０００ｍｇを皮下
注射、筋肉注射、または静脈注射によって投与すること
ができる。

【００５２】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されない。なお、本発
明の実施例で使用した制限酵素は、すべて宝酒造（株）
より購入した。

【００５３】実施例１．ヒトＦａｓに対するマウスモ
ノクローナル抗体（ＣＨ１１）の可変領域をコードする
ＤＮＡのクローニング（１）ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡの調製ＣＨ１１産生ハイブリドーマからの全ＲＮＡの調製は、
公知の方法［Chirgwin, J. M., et al.(1979) Biochemi
stry 18, 5294 参照］に従い実施した。すなわち、まず
ＣＨ１１産生ハイブリドーマ［Yonehara, S., et al.
(1994) International Immunology 6, 1849-1856 参
照］を、１０％のウシ胎児血清（ギブコ社製）を含むＡ
ＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）中で培養し、約
６．７×１０⁸個の細胞を回収し、遠心して上清を除去
した。該細胞に６０ｍｌの４Ｍグアニジンチオシアネー
ト（フルカ社製）溶液を加え、ただちに混合した。２１
ゲージの注射針を付けた注射筒で吸引・排出を３回繰り
返し、細胞を溶解させた。この細胞溶解液を、超遠心用
チューブ（１３ＰＡ；日立工機（株）社製）中に入れた
３ｍｌの５．７Ｍ塩化セシウム／０．１ＭＥＤＴＡ
（ｐＨ７．５）溶液に重層し、超遠心分離（日立製作所
製ＲＰＳ−４０Ｔローター、１３ＰＡチューブ、３００
００ｒｐｍ：１５，０００×ｇ、２０℃、１８時間）す
ることによりＲＮＡを沈澱させた。該沈澱を水に溶解
し、クロロホルム／１−ブタノール（４：１、ｖ／ｖ）
抽出した後、エタノール沈澱を行い、全ＲＮＡを回収し
た。

【００５４】上記のようにして得られた全ＲＮＡからの
ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡの精製は文献［Maniatis, T. et a
l. (1989) in "Molecular Cloning : A Laboratory Man
ual (2nd Edition), Cold Spring Harbor Lab., 7.26-
7.28参照］に掲載されている方法に従い実施した。すな
わち、ディスポーザブルポリスチレンカラム（φ０．７
ｃｍ）にオリゴｄＴセルロース（ファルマシア社製、タ
イプ７）１００ｍｇを充填し、ローディングバッファー
（２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ
塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（以
下「ＥＤＴＡ」という）、０．１％ドデシル硫酸ナト
リウム（以下「ＳＤＳ」という））にて平衡化した。約
１．２ｍｇ／４００μｌのＲＮＡを６５℃で５分間加熱
した後、等量の２倍濃度のローディングバッファーを４
００μｌ加え、室温まで冷却してからカラムに注入し
た。素通り画分を回収し、６５℃、５分間加熱した後、
再度カラムに注入した。１０ｍｌのローディングバッフ
ァーでカラム内を洗浄した後、さらに、塩化ナトリウム
濃度を０．１Ｍに調整したローディングバッファー５ｍ
ｌでカラム内を洗浄することにより、非吸着物および非
特異的吸着物を除去した。次いで５ｍｌの溶出用緩衝液
（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、０．０５％ＳＤＳ）をカラムに注入して特異的吸
着物を溶出させ、溶出液を２００μｌ毎に容器を替えて
回収した。３番目と４番目の溶出画分（計４００μｌ）
に４０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）およ
び１ｍｌのエタノールを加え、−２０℃で一晩保存し
た。翌日、遠心分離（１２０００ｒｐｍ：１０，０００
×ｇ、４℃、１０分間）を行なって沈澱を回収し、ポリ
（Ａ）⁺ ＲＮＡ試料として使用時まで−８０℃で保存し
た。

【００５５】（２）可変領域をコードするＤＮＡのクロ
ーニングマウス抗Ｆａｓ抗体（ＣＨ１１）のＨ鎖およびＬ鎖をコ
ードするｃＤＮＡは、以下に記載する方法、すなわち逆
転写酵素（ＲＴ）反応およびポリメラーゼ連鎖反応（po
lymerase chain reaction ：以下「ＰＣＲ」という）を
組み合わせて、上記（１）で調製したＣＨ１１産生ハイ
ブリドーマ由来のポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡ画分より任意の配
列を特異的に増幅すること（ＲＴ−ＰＣＲ）によりクロ
ーニングした。なお、ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーとし
ては、Ｉｇ−プライムセット（ノバジェン社製）の中か
ら、Ｈ鎖用としてＭｕＩｇＶ_H ５’−ＢおよびＭｕＩｇ
ＭＶ_H ３’−１、またＬ鎖用としてＭｕＩｇκＶ_L ５’
−ＧおよびＭｕＩｇＭＶ_L３’−１の２組のプライマー
セットを用いた。以下、該Ｈ鎖用またはＬ鎖用各プライ
マーセットを使用したＲＴ−ＰＣＲ反応を個別に実施し
た。

【００５６】ａ）逆転写酵素反応１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩
化カリウム、０．１ｍＭｄＡＴＰ、０．１ｍＭｄＧ
ＴＰ、０．１ｍＭｄＣＴＰ、０．１ｍＭｄＴＴＰ、
１．５ｍＭ塩化マグネシウム、２．５ｐｍｏｌのＨ鎖
用またはＬ鎖用３’側プライマー、上記（１）で調製し
たポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡ５０ｎｇおよび２０単位のＭＭ
ＬＶ（Moloney murine leukemia virus ）由来の逆転写
酵素（生化学工業（株）社製）を含有する逆転写酵素反
応溶液４４μｌを４２℃にて１時間保温した。

【００５７】ｂ）ＰＣＲによる増幅上記ａ）の逆転写酵素反応液に２５ｐｍｏｌのＨ鎖用ま
たはＬ鎖用５’側プライマーおよび５単位のＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼ：パーキンエルマー・ジャパン社製）を加え１００μ
ｌとした反応溶液を９４℃で２分間保持した。次に９４
℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で２分間の温度サ
イクルを３０回繰り返した後、さらに７２℃で１０分間
保温した。なお、実施例中のすべてのＰＣＲの反応温度
調節にはジーンアンプＰＣＲシステム９６００（パーキ
ンエルマー・ジャパン社製）を使用した。

【００５８】ｃ）ＰＣＲ産物の検定上記ｂ）のＰＣＲ反応液の一部をとり、１．５％アガロ
ース（ＦＭＣバイオプロダクツ社製）ゲル電気泳動を実
施した。同一ゲルで電気泳動した分子量マーカーのバン
ドと比較することにより、ＰＣＲ産物のバンドの鎖長を
見積もった結果、Ｈ鎖用またはＬ鎖用プライマーセット
のいずれを使用した場合も約４３０ｂｐであった。

【００５９】ｄ）ＰＣＲ産物のクローニングオリジナルＴＡクローニングキット（インビトロジェン
社製）を用いて、上記ｂ）で得られた各ＰＣＲ産物をプ
ラスミドベクターに組み込んだ。すなわち、該ＰＣＲ反
応液（電気泳動検定より目的とするＰＣＲ産物約１０ｎ
ｇ相当量）とｐＣＲＩＩベクター（キットに添付）５０
ｎｇを、リガーゼ反応緩衝液（６ｍＭトリス−塩酸（ｐ
Ｈ７．５）、６ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ塩化
ナトリウム、７ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．
１ｍＭＡＴＰ、２ｍＭジチオスレイトール（以下
「ＤＴＴ」という）、１ｍＭスペルミジン、０．１ｍ
ｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）中で４単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（キットに添付）を加え、１４℃で１５時間
保温した。

【００６０】次いで、０．５Ｍ β−メルカプトエタノ
ール２μｌを加えたコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’
（キットに添付）５０μｌに上記リガーゼ反応液２μｌ
を混ぜ合わせ、氷上で３０分間、次いで４２℃にて３０
秒間、そして再び氷上で２分間静置した。ついでＳＯＣ
培地（２％トリプトン、０．５％イーストエキスト
ラクト、０．０５％塩化ナトリウム、２．５ｍＭ塩
化カリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭグル
コース）５００μｌを加え、１時間往復振とう培養（３
７℃、１１０ｒｐｍ）した。該培養液を１００μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含有するＬ−ブロス寒天培地（１％
トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、
０．５％塩化ナトリウム、０．１％グルコース、
０．６％バクト・アガー（ディフコ社製））プレート上
に塗り広げ、３７℃にて一晩静置培養した。プレート上
に現れた単一のアンピシリン耐性コロニーを選択し、該
コロニーを白金耳で掻き取って、１００μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含有するＬ−ブロス培地５ｍｌ中で３７℃
にて一晩培養した後、該培養物を遠心分離して沈澱した
菌体を回収し、アルカリ法［Maniatis, T., et al. (19
89) in "MolecularCloning: A Laboratory Manual (2nd
Edition), Cold Spring Harbor Laboratory, NY 参
照］によりプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得ら
れたプラスミドを、プラスミドｐＶＨ４（Ｈ鎖用プライ
マーセットを使用して増幅された断片を含むプラスミ
ド）およびｐＶＬ８（Ｌ鎖用プライマーセットを使用し
て増幅された断片を含むプラスミド）と命名した。

【００６１】実施例２．ＣＨ１１可変領域の部分アミ
ノ酸配列およびヌクレオチド配列の決定（１）ＣＨ１１のＨ鎖およびＬ鎖の可変領域のＮ末部分
アミノ酸配列の決定ａ）ＣＨ１１の調製１０％のウシ胎児血清（ギブコ社製）を含むＡＳＦ１０
４培地（味の素（株）社製）中で２×１０⁸ 細胞数まで
増殖させたＣＨ１１産生ハイブリドーマを５００ｍｌの
無血清ＡＳＦ培地で３７℃、５日間培養した。遠心分離
（トミー精工（株）社製Ｎｏ．４ローター、８０００ｒ
ｐｍ：１５，０００×ｇ、４℃、１５分間）により、培
養上清を集めた。培養上清からのＣＨ１１モノクローナ
ル抗体の調製は、イー・ズィー・セップ（Ｅ−Ｚ−Ｓｅ
ｐ）抗体精製キット（ファルマシアバイオテク社製）を
用いた。

【００６２】ｂ）上記ａ）で調製したＣＨ１１（ハイブ
リドーマ培養上清１００μｌ相当分）に、１０％（ｖ／
ｖ）のβ−メルカプトエタノールおよび４％（ｗ／ｖ）
ＳＤＳを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
６．８）１０μｌを加え、９５℃、５分間加熱し変性さ
せた。次にＳＤＳにより変性させた試料を１２％ポリア
クリルアミドゲルで電気泳動した。泳動後のゲルを、転
写緩衝液（２５ｍＭトリス−ホウ酸（ｐＨ９．５）、
１０％メタノール（ｖ／ｖ））中に浸し、室温で１５分
間振とうした後、セミドライブロッティング装置（岩城
硝子（株）社製）を用いてポリビニリデン・ジフルオリ
ド（以下「ＰＶＤＦ」という）膜（日本ミリポア社製）
に転写した（０．２Ａ定電流、４℃、１時間）。転写後
のＰＶＤＦ膜を、０．１％クマシーブリリアントブルー
溶液で染色し、１００％メタノールで脱色した後、Ｈ
鎖、Ｌ鎖に相当する泳動度のタンパク質の染色スポット
を切り出して、室温で乾燥させた。

【００６３】ｃ）上記ｂ）でＰＶＤＦ膜上に転写したタ
ンパク質のアミノ酸配列分析を、気相式プロテインシー
ケンサー（ＰＰＳＱ−１０；島津製作所（株）社製）を
用いて、自動エドマン法［Edman, P., et al. (1967) E
ur. J. Biochem. 1, 80 参照］により行った。

【００６４】このようにして決定されたＣＨ１１のＨ鎖
可変領域のＮ末端部分アミノ酸配列を配列表の配列番号
１３に、同Ｌ鎖可変領域のＮ末端部分アミノ酸配列を配
列番号１４にそれぞれ示す。

【００６５】（２）ＤＮＡのヌクレオチド配列の決定実施例１で作製されたプラスミドｐＶＨ４およびｐＶＬ
８に挿入されている、ＣＨ１１のＨ鎖およびＬ鎖の可変
領域をコードするｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列を、以
下に記載する方法により解析した。ｐＣＲＩＩベクター
はクローニング部位の両側にＳＰ６プロモーター配列お
よびＴ７プロモーター配列を有するので、これらの配列
に対応するオリゴヌクレオチドプライマー（パーキンエ
ルマー・ジャパン社製）を利用することにより、クロー
ニング部位に挿入されたｃＤＮＡ配列を解析することが
できる。これらのプライマーおよびダイプライマーサイ
クルシークエンシングキット（パーキンエルマー・ジャ
パン社製）を用いて、ｐＶＨ４またはｐＶＬ８を鋳型と
した配列解析用サンプルをそれぞれ調製し、ＤＮＡシー
クエンサー（モデル３７３Ａ：パーキンエルマー・ジャ
パン社製）を用いて各ｃＤＮＡの配列を決定した。各ｃ
ＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号１５（Ｈ
鎖可変領域）および１６（Ｌ鎖可変領域）にそれぞれ示
す。

【００６６】配列表の配列番号１３のアミノ酸番号１〜
１５で示されるＣＨ１１のＨ鎖のＮ末端部分アミノ酸配
列は、配列番号１５のヌクレオチド番号３２〜７６で示
されるヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列と完
全に一致しており、プラスミドｐＶＨ４はＣＨ１１のＨ
鎖可変領域をコードする遺伝子を含んでいることが確認
された。

【００６７】配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１〜
２１に示されるＣＨ１１のＬ鎖のＮ末端部分アミノ酸配
列は、配列番号１６のヌクレオチド番号２９〜９１に示
されるヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列と完
全に一致しており、プラスミドｐＶＬ８はＣＨ１１のＬ
鎖可変領域をコードする遺伝子を含んでいることが確認
された。実施例３．ＣＨ１１Ｈ鎖、Ｌ鎖およびＪ鎖の全長をコ
ードするＤＮＡのクローニング（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製ｃＤＮＡライブラリーの作製は、オカヤマ−バーグ法
［Okayama, H., et al.(1987) Methods in Enzymology
154, 3-28参照］に従って実施した。すなわち、まず７
５単位のＡＭＶ（Avian myeloblastosis virus）由来逆
転写酵素（生化学工業（株）社製）を含む３０μｌの反
応液（５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、６ｍＭ
塩化マグネシウム、４０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ
ｄＡＴＰ、２ｍＭｄＧＴＰ、２ｍＭｄＣＴＰ、２
ｍＭｄＴＴＰ、２μｇベクタープライマー（３’−オ
リゴ（ｄＴ）−テイルド・ｐｃＤＶ−１；ファルマシア
社製）中に実施例１（１）で調製したＣＨ１１産生ハイ
ブリドーマ由来のポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡ５μｇを添加し
て、３７℃で３０分間保温した。

【００６８】次いで、該反応液に等量のフェノール−ク
ロロホルム（１：１、ｖ／ｖ）を添加して混合し、遠心
分離（１２０００ｒｐｍ：１０，０００×ｇ、室温、５
分間）した後、水層を回収した（以下、この操作を「フ
ェノール−クロロホルム抽出」という）。この水層に、
３５μｌの４Ｍ酢酸アンモニウムと１４０μｌのエタ
ノールを加え、−７０℃で１５分間冷却した後、遠心分
離（１２０００ｒｐｍ：１０，０００×ｇ、４℃、１５
分間）して上清を除去し、７５％エタノールで沈澱を洗
った後、減圧乾燥した。

【００６９】乾燥した沈澱を１３μｌの蒸留水に溶解
し、５．６μｌのターミナルトランスフェラーゼ反応液
（１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリ
ス−塩酸（ｐＨ６．８）、１ｍＭ塩化コバルト、０．
５ｍＭＤＴＴ、０．３μｇポリアデニル酸（ｐｏｌｙ
（Ａ）；ファルマシア社製）、０．２ｍＭｄＣＴＰ）
を加えた。この反応液を３７℃で５分間保温したのち、
２１単位のターミナルデオキシヌクレオチジルトランス
フェラーゼ（ファルマシア社製）を加え、５分間反応さ
せた。その後、該反応液に対してフェノール−クロロホ
ルム抽出を行い、水層を回収した。次いで、該水層に２
０μｌの４Ｍ酢酸アンモニウム、８０μｌのエタノール
を加え、−７０℃で１５分間冷却した後、遠心分離（１
２０００ｒｐｍ：１０，０００×ｇ、４℃、１５分間）
して上清を除去した。沈澱を７５％エタノールで洗った
後、減圧乾燥した。

【００７０】この沈澱を３０μｌの反応液中（１０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、６０ｍＭ塩化ナトリ
ウム、７ｍＭ塩化マグネシウム）に溶解し、３０単位
の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを添加して、３７℃で一晩消
化した。次に、フェノール−クロロホルム抽出を行って
水層を回収した。ついで、該水層に、３５μｌの４Ｍ酢
酸アンモニウム、１４０μｌのエタノールを加え、−７
０℃で１５分間冷却した。次いで遠心分離（１２０００
ｒｐｍ：１０，０００×ｇ、４℃、１５分間）により沈
澱を回収し、７５％エタノールで沈澱を洗った後、減圧
乾燥したものをｃＤＮＡ試料とした。

【００７１】一方、プラスミドベクターｐｃＤＬ−ＳＲ
α２９６［武部豊ら、(1989) 実験医学７巻、９５
−９９参照］を制限酵素ＰｓｔＩで消化し、さらにその
３’末端にターミナルデオキシヌクレオチジルトランス
フェラーゼ（ファルマシア社製）によりｄＧＴＰを付加
させた。すなわち、５０μｌのＤＮＡ溶液（ＤＮＡ１０
０μｇに相当）に、１０μｌの１０倍濃度ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ緩衝液（１．
４Ｍカコジル酸ナトリウム、０．３Ｍトリス、１０ｍ
Ｍニ塩化コバルト、ｐＨ７．６）、１０μｌの１ｍＭ
ＤＴＴ、２０μｌの０．１ｍＭ ³Ｈ−ｄＧＴＰ（ネン社
製）、１０μｌのターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼ（２１０単位相当：ファルマシア社
製）を加え、３７℃で４０分インキュベートした後、フ
ェノール抽出、フェノール・クロロフォルム抽出、エタ
ノール沈殿を行って、沈殿したＤＮＡを５０μｌのＴＥ
に溶解した。このＤＮＡ全量をＨｉｎｄＩＩＩで消化し
た後、１．８％アガロースデル電気泳動を行って、反応
産物に相当するバンド部分のゲルを切り出した。このも
のからＤＮＡを抽出し、１００μｌのＴＥに溶解し、さ
らに１００μｌのエタノールを加えた。

【００７２】次いで、このものを制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化することにより、ＳＲαプロモーターにオリゴ
（ｄＧ）が付加されたオリゴ（ｄＧ）付きリンカーＤＮ
Ａを作製した。

【００７３】上記ｃＤＮＡ試料を１０μｌのＴＥ緩衝
液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ）に溶解した。この溶液の１μｌを上記オリゴ
（ｄＧ）付きリンカーＤＮＡ０．０８ｐｍｏｌを含む
反応用緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．
５）、１ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭ塩化ナトリウ
ム）に加え、６５℃、５分間加熱し、ついで４２℃、３
０分間保温した。該反応液に、１０μｌの１０倍濃度リ
ガーゼ緩衝液（１０ｍＭＡＴＰ、６６０ｍＭトリス
−塩酸（ｐＨ７．５）、６６ｍＭ塩化マグネシウム、
１００ｍＭＤＴＴ）、７６μｌの蒸留水、１μｌの１
０ｍＭ β−ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチ
ド（以下「ＮＡＤ」という；ベーリンガー・マンハイム
社製）を加え、氷上で１０分間冷却した後、８．４μｇ
相当の大腸菌ＤＮＡリガーゼ（ファルマシア社製）を加
え、１２℃で一晩保温した。

【００７４】次に、２μｌのヌクレオチド溶液（２ｍＭ
ｄＡＴＰ、２ｍＭｄＣＴＰ、２ｍＭｄＧＴＰ、２
ｍＭｄＴＴＰ）、０．５μｌの１０ｍＭＮＡＤ、４
２μｇ相当の大腸菌ＤＮＡリガーゼ（ファルマシア社
製）、４．１単位のＤＮＡポリメラーゼＩ（ファルマシ
ア社製）、５．５単位のリボヌクレアーゼＨ（ファルマ
シア社製）を加え、１２℃で１時間、次いで２２℃で１
時間反応させた。このようにして作製されたｃＤＮＡラ
イブラリーを使用時まで−２０℃で保存した。

【００７５】（２）ＰＣＲによるクローニングａ）プライマーの作製Ｈ鎖：実施例２において決定されたＣＨ１１のＨ鎖の
可変領域のアミノ酸配列について、カバトら［Kabat E.
A. et al., (1991) in "Sequences of Proteins of Im
munological Interest Vol.II", U.S. Department of H
ealth and Human Services参照］により作成された抗体
のアミノ酸配列データベースと比較検討したところ、Ｃ
Ｈ１１のＨ鎖（μ鎖）はサブクラス２ａであることが判
明した。そこで、まず該データベース中のマウスＨ鎖サ
ブクラス２ａ型をコードするＤＮＡの５’側非翻訳領域
の一部とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライ
マー：5'- CTAAGGGAAT TCCGCCTCTC CTCAGACACT GAA -3'
（Ｈ５−１；配列表の配列番号１７）を合成した。ま
た、ゴールドバーグらにより報告されたマウスイムノグ
ロブリンμ鎖定常領域をコードするＤＮＡのヌクレオチ
ド配列［Goldberg, I. G., et al. (1981) Gene 15, 33
-42 参照］を基に、その３’非翻訳領域のヌクレオチド
配列の一部とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプ
ライマー：5'- TTTTACTCTA GAGACCCAAG GCCTGCCTGG TTG
A -3' （Ｈ３−１；配列表の配列番号１８）を合成し
た。

【００７６】Ｌ鎖：実施例２において決定されたＣＨ
１１のＬ鎖の可変領域のアミノ酸配列について、前記カ
バトらにより作成された抗体のアミノ酸配列データベー
スと比較検討したところ、ＣＨ１１のＬ鎖はサブクラス
κ２であることが判明した。そこで、まず該データベー
ス中のマウスＬ鎖サブクラスκ２型をコードするＤＮＡ
の５’側非翻訳領域の一部とハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドプライマー：5'- AAATAGGAAT TCCAGTCTCC
TCAGGCTGTC TCC -3'（Ｌ５−１；配列表の配列番号１
９）を合成した。また、遺伝子配列データベースＧｅｎ
ｂａｎｋに登録名ＭＵＳＩＧＢ１Ｌ１（受入番号Ｄ１４
６３０）として登録されているマウスイムノグロブリン
κ鎖定常領域をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を
基に、その３’非翻訳領域のヌクレオチド配列の一部と
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー：5'
- ATGATCTCTA GAGTGGTGGC ATCTCAGGAC CT -3' （Ｌ３−
１；配列表の配列番号２０）を合成した。

【００７７】Ｊ鎖：マウスＪ鎖は可変領域を有さず、
その全アミノ酸配列および該配列をコードするＤＮＡの
配列は公知である［Cann, G. M., et al. (1982) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 79, 6656-6660 参照］。この知
見に基づき、Ｊ鎖をコードするＤＮＡの５’および３’
側の非翻訳領域の一部とハイブリダイズするオリゴヌク
レオチドプライマー：5'- TTGCGGAATT CCTCACCTGT CCTG
GGGTTA TT -3' （Ｊ５−１；配列表の配列番号２１）お
よび5'- ATTGCCTCTA GAGCCTCTAA GGACAACGAG CT -3'
（Ｊ３−１；配列表の配列番号２２）を合成した。

【００７８】これらのオリゴヌクレオチドプライマーは
すべて自動ＤＮＡ合成機３８０Ｂ（パーキンエルマー・
ジャパン社製）を用いて、ホスホアミダイド法［Mattru
cci,M. D. and Caruthers, M. H. (1981) J. Am. Che
m. Soc. 103, 3185-3191参照］で合成した。各プライマ
ーは合成終了後、支持体から開裂、脱保護したのち凍結
乾燥した。これらを蒸留水に溶解し、使用時まで−２０
℃にて保存した。

【００７９】ｂ）ＰＣＲによる標的遺伝子の増幅１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩
化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、２．５ｍ
ＭｄＡＴＰ、２．５ｍＭｄＧＴＰ、２．５ｍＭｄ
ＣＴＰ、２．５ｍＭｄＴＴＰ、実施例４（１）に記載
のｃＤＮＡライブラリー０．１μｌ、１単位のＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー・ジャパン社
製）および上記ａ）で作製した各１５ｐｍｏｌのオリゴ
ヌクレオチドプライマーを含有するＰＣＲ反応溶液１０
０μｌを、９４℃で２分間加熱した。次いで９４℃で１
分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクル
を３０回繰り返した後、さらに７２℃で１０分間保温し
た。各反応のプライマーの組み合わせは以下の通りであ
った：Ｈ５−１とＨ３−１（Ｈ鎖用）；Ｌ５−１とＬ３−１（Ｌ鎖用）；Ｊ５−１とＪ３−１（Ｊ鎖用）。

【００８０】ｃ）ＰＣＲ産物の検定上記ｂ）のＰＣＲ終了後の反応液の一部をとり、それぞ
れ０．８％（Ｈ鎖）および１．５％（Ｌ鎖およびＪ鎖）
アガロース（ＦＭＣバイオプロダクツ社製）ゲル電気泳
動を実施した。同時に電気泳動した分子量マーカーのバ
ンドの泳動度から見積もった結果、それぞれのプライマ
ーの組み合わせによるＰＣＲ産物の鎖長は、約１９００
ｂｐ（Ｈ鎖）、８００ｂｐ（Ｌ鎖）および６５０ｂｐ
（Ｊ鎖）であった。

【００８１】ｄ）ＰＣＲ産物のクローニング上記ｂ）で得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクターに
組み込むために、真核生物用ＴＡクローニングキット
（インビトロジェン社製）を用いた。すなわち、各ＰＣ
Ｒ反応液（電気泳動検定より目的とするＰＣＲ産物約１
０ｎｇ相当量）とｐＣＲ３ベクター（キットに添付）６
０ｎｇを含むリガーゼ反応緩衝液（６ｍＭトリス−塩酸
（ｐＨ７．５）、６ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ
塩化ナトリウム、７ｍＭ β−メルカプトエタノール、
０．１ｍＭＡＴＰ、２ｍＭＤＴＴ、１ｍＭスペル
ミジン、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）中に
４単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、１４℃で１５時間
保温した。

【００８２】次いで０．５Ｍ β−メルカプトエタノー
ル２μｌを加えたコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’
（キットに添付）５０μｌに上記リガーゼ反応液２μｌ
を混ぜ合わせ、氷上に３０分間静置した後、４２℃で３
０秒間加温してから再び氷上に２分間静置した。このも
のにＳＯＣ培地５００μｌを加え、３７℃で１時間往復
振とう培養（１１０ｒｐｍ）した。この培養液を１００
μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ−ブロス寒天培
地プレート上に塗り広げ、３７℃にて一晩培養した。プ
レート上に現れたアンピシリン耐性の単一コロニーを白
金耳で掻き取り、１００μｌ／ｍｌのアンピシリンを含
有するＬ−ブロス培地５ｍｌ中で３７℃にて一晩培養し
た。該培養液を遠心分離して菌体を回収し、アルカリ法
に従ってプラスミドＤＮＡを調製した。

【００８３】上記のごとくして得られたプラスミドはそ
れぞれｐＣＲ３−Ｈ１２３（Ｈ鎖をコードするｃＤＮＡ
を含む）、ｐＣＲ３−Ｌ１０３（Ｌ鎖をコードするｃＤ
ＮＡを含む）およびｐＣＲ３−Ｊ１１２３（Ｊ鎖をコー
ドするｃＤＮＡを含む）と命名された。また、これらの
プラスミドを保持する形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉｐＣ
Ｒ３−Ｈ１２３、Ｅ．ｃｏｌｉｐＣＲ３−Ｌ１０３お
よびＥ．ｃｏｌｉｐＣＲ３−Ｊ１１２３は、１９９６
（平成８）年２月２８日付で工業技術院生命工学工業技
術研究所に国際寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−５４２７、ＦＥＲＭＢＰ−５４２８およびＦＥ
ＲＭＢＰ−５４２９が付された。従って、ＣＨ１１Ｈ
鎖、Ｌ鎖およびＪ鎖をコードするＤＮＡはそれぞれ該寄
託菌株から当業者に周知の方法を用いて調製することが
できる。

【００８４】実施例４．ＣＨ１１Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｊ鎖を
コードするｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列の決定（１）ＤＮＡのヌクレオチド配列の決定マウスイムノグロブリンμ鎖は、そのＮ末端から約１１
０残基の可変領域およびそれに隣接する約４７０残基の
定常領域からなる。またマウスイムノグロブリンκ鎖
は、そのＮ末端から約１１０残基の可変領域およびそれ
に隣接する１０７残基の定常領域からなる。これらのこ
とから、ＣＨ１１Ｈ鎖およびＬ鎖をコードするｃＤＮＡ
の全ヌクレオチド配列は、実施例２で明らかとなった各
鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列に、それぞ
れ既知の定常領域をコードするヌクレオチド配列［Kaba
t E. A. et al., (1991) in "Sequences of Proteins o
f Immunological Interest Vol.II", U.S. Department
of Health and Human Services参照］が連結しているも
のと推定された。また、Ｊ鎖をコードするヌクレオチド
配列は公知の配列と同一であると推定された。そこで、
これらの推定されるヌクレオチド配列を基に、６０乃至
２００ｂｐの間隔で、２０ヌクレオチドからなる配列に
対応するオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、配列
解析サンプル調製のために使用した。合成されたオリゴ
ヌクレオチドプライマーの配列は以下に記載する通りで
あった：Ｈ鎖用： 5'- TGGGGCCTCA GTGAAGATAT -3' （SHF-2; 配列表の配列番号２３） 5'- CAATGGTGGT ACTGGCTACA -3' （SHF-3; 配列表の配列番号２４） 5'- TGACATCTGA GGACTCTGCA -3' （SHF-4; 配列表の配列番号２５） 5'- TCCTCAGAGA GTCAGTCCTT -3' （SHF-6; 配列表の配列番号２６） 5'- TCCTTCACCT GGAACTACCA -3' （SHF-7; 配列表の配列番号２７） 5'- TCCCAAGAGC ATCCTTGAAG -3' （SHF-8; 配列表の配列番号２８） 5'- AGATCTGCAT GTGCCCATTC -3' （SHF-9; 配列表の配列番号２９） 5'- TCTAAACTCA TCTGCGAGGC -3' （SHF-10; 配列表の配列番号３０） 5'- GGTGACCATC GAGAACAAAG -3' （SHF-11; 配列表の配列番号３１） 5'- AGGGGTCTCA CCTTCTTGAA -3' （SHF-12; 配列表の配列番号３２） 5'- TCCTTTGCCG ACATCTTCCT -3' （SHF-13; 配列表の配列番号３３） 5'- GTGTGTACTG TGACTCACAG -3' （SHF-15; 配列表の配列番号３４） 5'- AACTGAACCT GAGGGAGTCA -3' （SHF-16; 配列表の配列番号３５） 5'- AACTCTTGCC CCAAGAGAAG -3' （SHF-17; 配列表の配列番号３６） 5'- ATCCTGACTG TGACAGAGGA -3' （SHF-18; 配列表の配列番号３７） 5'- ACAAGTCCAC TGGTAAACCC -3' （SHF-19; 配列表の配列番号３８） 5'- AGGATATCTT CACTGAGGCC -3' （SHR-1; 配列表の配列番号３９） 5'- ATCCACTCAA GGCTCTTTCC -3' （SHR-2; 配列表の配列番号４０） 5'- ACTGCAGAGT CCTCAGATGT -3' （SHR-3; 配列表の配列番号４１） 5'- AGACGGTGAC TGAGGTTCTT -3' （SHR-4; 配列表の配列番号４２） 5'- CAGGTGAAGG AAATGGTGCT -3' （SHR-5; 配列表の配列番号４３） 5'- ATGCTCTTGG GAGACAGCAA -3' （SHR-6; 配列表の配列番号４４） 5'- CTCTGTTTTT GCCTCCGTAG -3' （SHR-7; 配列表の配列番号４５） 5'- TGGCCTCGCA GATGAGTTTA -3' （SHR-8; 配列表の配列番号４６） 5'- CCTTTGTTCT CGATGGTCAC -3' （SHR-9; 配列表の配列番号４７） 5'- TGTGGAGGAC ACGTTCTTCA -3' （SHR-10; 配列表の配列番号４８） 5'- ACTTTGAGAA GCCCAGGAGA -3' （SHR-12; 配列表の配列番号４９） 5'- AGATCCCTGT GAGTCACAGT -3' （SHR-13; 配列表の配列番号５０） 5'- AGCAGGTGGA TGTTTGTGCA -3' （SHR-14; 配列表の配列番号５１） 5'- TGAAGCCACT GCACACTGAT -3' （SHR-15; 配列表の配列番号５２） 5'- AGTTCCATTC CTCCTCTGTC -3' （SHR-16; 配列表の配列番号５３） 5'- TGTGTCAGAC ATGATCAGGG -3' （SHR-18; 配列表の配列番号５４）Ｌ鎖用： 5'- TGAAGTTGCC TGTTAGGCTG -3' （SLF-1; 配列表の配列番号５５） 5'- CTTGGAGATC AAGCCTCCAT -3' （SLF-2; 配列表の配列番号５６） 5'- GCTGAGGATC TGGGAGTTTA -3' （SLF-3; 配列表の配列番号５７） 5'- GATGCTGCAC CAACTGTATC -3' （SLF-4; 配列表の配列番号５８） 5'- CGACAAAATG GCGTCCTGAA -3' （SLF-5; 配列表の配列番号５９） 5'- ACGTTGACCA AGGACGAGTA -3' （SLF-6; 配列表の配列番号６０） 5'- ATCTGCAAGA GATGGAGGCT -3' （SLR-2; 配列表の配列番号６１） 5'- ACCCCAGAAA ATCGGTTGGA -3' （SLR-3; 配列表の配列番号６２） 5'- CCGGAGGAAC ATGTGTACTT -3' （SLR-4; 配列表の配列番号６３） 5'- TCGTTCATAC TCGTCCTTGG -3' （SLR-6; 配列表の配列番号６４） 5'- CATCTCAGGA CCTTTGTCTC -3' （SLR-7; 配列表の配列番号６５）Ｊ鎖用： 5'- CACCTGTCCT GGGGTTATTT -3' （SJF-1; 配列表の配列番号６６） 5'- AGACAAGATG AAGACCCACC -3' （SJF-2; 配列表の配列番号６７） 5'- AAGCGACCAT TCTTGCTGAC -3' （SJF-3; 配列表の配列番号６８） 5'- ATATCTCTGA TCCCACCTCC -3' （SJF-8; 配列表の配列番号６９） 5'- GAAATGCGAT CCTGTGGAAG -3' （SJF-5; 配列表の配列番号７０） 5'- CTATACCACT ATGGTCCCAC -3' （SJF-6; 配列表の配列番号７１） 5'- AGAAGCAGGT GGGTCTTCAT -3' （SJR-2; 配列表の配列番号７２） 5'- TAGAGGTAAC TCGGGTACAC -3' （SJR-3; 配列表の配列番号７３） 5'- AAGTTCCTTC TCAGTGGGGA -3' （SJR-8; 配列表の配列番号７４） 5'- GGTGGCAGTA ACAACCTGAT -3' （SJR-5; 配列表の配列番号７５） 5'- CATGATACCT AAGTGGGACC -3' （SJR-6; 配列表の配列番号７６）各オリゴヌクレオチドプライマーは自動ＤＮＡ合成機
（モデル３８０Ｂ：パーキンエルマー・ジャパン社製）
により前出ホスホアミダイト法で合成された。プラスミ
ドｐＣＲ３−Ｈ１２３、プラスミドｐＣＲ３−Ｌ１０
３、またはプラスミドｐＣＲ３−Ｊ１１２３を鋳型と
し、上記プライマーおよびプリズム・レディ・リアクシ
ョン・ターミネーター・サイクル・シークエンシングキ
ット（パーキンエルマー・ジャパン社製）を用いて、以
下に記載する例のようにして配列解析用サンプルを調製
した。

【００８５】例：１．５μｇのｐＣＲ３−Ｈ１２３と
４．８ｐｍｏｌのプライマー（SHF-2 ）を混合し、１６
μｌに調整した。キット添付のプレミックス（ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼを含む）１０．５μｌに、９．５μｌ
のｐＣＲ３−Ｈ１２３／プライマー混合液を加え、自動
反応装置（カタリスト：パーキンエルマー・ジャパン社
製）の所定の位置にセットして反応（９５℃で３０秒、
５０℃で１５秒、６０℃で４分の温度サイクルを２５サ
イクル繰り返す）を行わせた。反応終了後のサンプルに
滅菌水８０μｌを加えてから、フェノール・クロロホル
ム抽出を２回行った後、水層に２Ｍ酢酸ナトリウム１５
μｌおよびエタノール３００μｌを加え、遠心分離を行
って沈澱を回収した。この沈澱を７０％エタノールで洗
浄後、減圧乾燥してから、３μｌの試料溶液（０．２５
ＭＥＤＴＡ４μｌ、ホルムアミド１００μｌ、滅
菌水１６μｌを混合したもの）に溶解した。

【００８６】上記のようにして調製されたＨ鎖用３２サ
ンプル、Ｌ鎖用１１サンプルおよびＪ鎖用１１サンプル
の各配列解析用サンプルについて、ＤＮＡシークエンサ
ー（モデル３７３Ａ：パーキンエルマー・ジャパン社
製）を用いて配列を解析し、各サンプルの解析データを
統合することにより、ＣＨ１１の各サブユニットをコー
ドするＤＮＡのヌクレオチド配列を決定した。各プラス
ミドのｃＤＮＡヌクレオチド配列を配列表の配列番号
７、９および１１にそれぞれ示す。また、これらのヌク
レオチド配列より推定される各アミノ酸配列を配列表の
配列番号８、１０および１２にそれぞれ示す。

【００８７】（２）ＣＨ１１のＨ鎖の一次構造配列表の配列番号１５のヌクレオチド番号３２〜３７９
に示されるＨ鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列番
号７のヌクレオチド番号５８〜４０５に示されるヌクレ
オチド配列と完全に一致していた。カバトら［Kabat E.
A. et al., (1991) in "Sequences of Proteins of Im
munological Interest Vol.II", U.S. Department of H
ealth and Human Services参照］による抗体のアミノ酸
配列のデータベースとの相同性を比較検討した結果、配
列番号８のアミノ酸番号１１７〜５７１に示されるアミ
ノ酸配列は、マウスＩｇＭ由来のＨ鎖定常領域のアミノ
酸配列と完全に一致していた。また、配列番号８のアミ
ノ酸番号−１９〜−１に示されるアミノ酸配列はＣＨ１
１のＨ鎖のシグナル配列と決定された。さらに配列番号
７のヌクレオチド番号４０６〜１７７０に示されるヌク
レオチド配列は、マウスＩｇＭ由来のＨ鎖定常領域のヌ
クレオチド配列と完全に一致していた。以上の結果よ
り、ＣＨ１１をコードするＤＮＡが得られ、ＣＨ１１の
Ｈ鎖の全アミノ酸配列が決定された。

【００８８】（３）ＣＨ１１Ｌ鎖の一次構造配列表の配列番号１６のヌクレオチド番号２９〜３６４
に示されるＬ鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列番
号９のヌクレオチド番号５８〜３９３に示されるヌクレ
オチド配列と完全に一致していた。上記（２）と同様に
抗体のアミノ酸配列のデータベースとの相同性を比較検
討した結果、配列番号１０のアミノ酸番号１１３〜２１
９に示されるアミノ酸配列は、マウスのκＬ鎖定常領域
のアミノ酸配列と完全に一致していた。また、配列番号
１０のアミノ酸番号−１９〜−１に示されるアミノ酸配
列は、Ｌ鎖のシグナル配列と決定された。さらに配列番
号９のヌクレオチド番号３９４〜７１４に示されるヌク
レオチド配列は、マウスのκＬ鎖定常領域のヌクレオチ
ド配列と完全に一致していた。以上の結果より、ＣＨ１
１のＬ鎖の全アミノ酸配列が決定され、該アミノ酸配列
をコードするＤＮＡが提供された。

【００８９】（４）ＣＨ１１のＪ鎖の一次構造配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１〜１３７に示さ
れるアミノ酸配列について、上記（２）および（３）と
同様に抗体のアミノ酸配列のデータベースとの相同性を
比較検討した結果、該アミノ酸配列は公知のマウスのＪ
鎖のアミノ酸配列と完全に一致していた。また同様に、
配列番号１１のヌクレオチド番号６７〜４７７に示され
るヌクレオチド配列は、公知のマウスのＪ鎖のヌクレオ
チド配列と完全に一致していた。さらに配列番号１２の
アミノ酸番号−２２〜−１に示されるアミノ酸配列は、
ＣＨ１１のＪ鎖のシグナル配列と決定された。以上より
ＣＨ１１Ｊ鎖のアミノ酸配列が決定され、該アミノ酸配
列をコードするＤＮＡが提供された。

【００９０】（５）ＣＤＲの決定上記のごとく決定されたＣＨ１１のＨ鎖およびＬ鎖の可
変領域のアミノ酸配列における、それぞれのＣＤＲの位
置および配列は、カバトらの文献［Kabat E. A. et a
l., (1991) in "Sequences of Proteins of Immunologi
cal Interest Vol.II", U.S. Department of Health an
d Human Services参照］による抗体のアミノ酸配列のデ
ータベースとの相同性を比較検討することによって決定
された。該文献によれば、異なる抗体間でもサブタイプ
が同じであれば可変領域中のフレームワーク領域の鎖長
はほぼ一定であり、またそのアミノ酸配列には共通性が
みられる。一方、ＣＤＲはそれらフレームワーク領域に
はさまれて存在する、各抗体に固有の配列である。ＣＨ
１１のＨ鎖の可変領域のアミノ酸配列を、該データベー
ス中のマウスμ２ａサブタイプの配列と比較した結果、
ＣＨ１１のＨ鎖のＣＤＲは配列表の配列番号８のアミノ
酸番号３１〜３５（ＣＤＲＨ₁ ：配列表の配列番号
１）、同アミノ酸番号５０〜６６（ＣＤＲＨ₂ ：配列表
の配列番号２）および同アミノ酸番号９９〜１０５（Ｃ
ＤＲＨ₃ ：配列表の配列番号３）で示されるアミノ酸配
列と決定された。また、ＣＨ１１のＬ鎖の可変領域のア
ミノ酸配列を、該データベース中のマウスκ２サブタイ
プの配列と比較した結果、Ｌ鎖のＣＤＲは配列表の配列
番号１０のアミノ酸番号２４〜３９（ＣＤＲＬ₁ ：配列
表の配列番号４）、同アミノ酸番号５５〜６１（ＣＤＲ
Ｌ₂ ：配列表の配列番号５）および同アミノ酸番号９４
〜１０２（ＣＤＲＬ₃ ：配列表の配列番号６）で示され
るアミノ酸配列と決定された。

【００９１】実施例５．ＣＨ１１の各サブユニットを
コードする遺伝子のＣＯＳ−１細胞での発現（１）発現ベクターの構築高発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ［Hara, T., et al. (199
2) EMBO J. 11, 1875参照］を制限酵素ＥｃｏＲＩおよ
びＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を実施し
た。臭化エチジウムでゲルを染色して約３０００ｂｐに
相当するバンドを切り出し、アガロースゲル電気泳動用
緩衝液とともに透析チューブ（排出限界分子量１２００
０〜１４０００；ギブコ社製）に入れて密閉した。この
ものを同電気泳動用緩衝液の入ったサブマリン型電気泳
動槽中に置いて、電気泳動でゲル内のＤＮＡ断片を溶出
した（１５０Ｖ、１５分間）。透析チューブを取り出
し、該チューブ内の溶出液を回収してフェノール・クロ
ロホルム抽出後、エタノール沈澱処理を行って該ＤＮＡ
断片を単離した。

【００９２】一方、実施例３で調製された、ＣＨ１１の
Ｈ鎖をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＣＲ３−Ｈ
１２３を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化
し、アガロースゲル電気泳動を行って該プラスミドに挿
入されたｃＤＮＡを含む１９００ｂｐの断片を単離・精
製した。このｃＤＮＡ断片およびＥｃｏＲＩ・ＸｂａＩ
消化した発現ベクターｐＭＥ１８ＳをＤＮＡライゲーシ
ョンキット・バージョン１（宝酒造（株）社製）を用い
た反応により連結した。このようにして作製したＣＨ１
１のＨ鎖をコードするＤＮＡを発現させるプラスミドを
ｐＨＥＸ１２６と命名した。

【００９３】また、実施例３で調製された、ＣＨ１１の
Ｌ鎖をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＣＲ３−Ｌ
１０３を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化
し、該プラスミドに挿入されたｃＤＮＡを含む８４０ｂ
ｐの断片を単離・精製した。このｃＤＮＡ断片とＥｃｏ
ＲＩ・ＸｂａＩで消化した発現ベクターｐＭＥ１８Ｓを
ＤＮＡライゲーションキットを用いた反応により連結し
た。このようにして作製したＣＨ１１のＬ鎖をコードす
るＤＮＡを発現させるプラスミドをｐＬＥＸ００４と命
名した。

【００９４】さらに、実施例３で調製されたＣＨ１１の
Ｊ鎖をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＣＲ３−Ｊ
１１２３を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化
し、アガロースゲル電気泳動を行って、該プラスミドに
挿入されたｃＤＮＡを含む６４０ｂｐの断片を単離・精
製した。このｃＤＮＡ断片とＥｃｏＲＩ・ＸｂａＩで消
化した発現ベクターｐＭＥ１８ＳをＤＮＡライゲーショ
ンキットを用いた反応により連結した。このようにして
作製したＣＨ１１のＪ鎖をコードするＤＮＡを発現させ
るプラスミドをｐＪＥＸ００４と命名した。

【００９５】これらのリガーゼによる連結反応終了後、
それぞれの反応液でコンピテント大腸菌を形質転換し、
アンピシリン耐性株を選択した。得られた形質転換株に
ついて、それらが保有するプラスミドＤＮＡをアルカリ
法で調製し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化
してアガロースゲル電気泳動を実施して、それぞれ所望
のＤＮＡが挿入されていることを確認した。

【００９６】（２）ＣＯＳ−１細胞での発現上記（１）で得られたプラスミドｐＨＥＸ１２６、ｐＬ
ＥＸ００４、ｐＪＥＸ００４でのＣＯＳ−１細胞の形質
転換は、遺伝子導入装置ＧＴＥ−１（島津製作所（株）
社製）を用いて、電気穿孔法により行った。すなわち、
ＣＯＳ−１細胞（American Type Culture Collection N
o. CRL-1650 ）を１０％のウシ胎児血清（ＣＳＬ社製）
を含むダルベッコ改変イーグル最小必須培地（以下「Ｄ
ＭＥＭ」という：日水製薬（株）社製）を入れた２２５
ｃｍ² の培養フラスコ（住友ベークライト（株）社製）
中でセミコンフルエントになるまで培養した後、培地を
除去してから、細胞を３ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ溶
液（シグマ社製）で３７℃で３分間処理して回収し、Ｐ
ＢＳ（−）緩衝液（日水製薬（株）社製）で２回洗浄し
た。洗浄したＣＯＳ−１細胞をＰＢＳ（−）緩衝液で６
×１０⁷ 細胞／ｍｌとなるよう調整した。

【００９７】一方、プラスミド大量調製キット（マキシ
プレップ・ＤＮＡピュリフィケーションシステム：プロ
メガ社製）を用いて調製したＣＨ１１の各サブユニット
の発現用プラスミドＤＮＡ２０μｇをエタノール沈殿し
たのち、ＰＢＳ（−）緩衝液２０μｌに溶解した。な
お、２種類以上のプラスミドでコ・トランスフェクショ
ンを行う場合は各プラスミドを２０μｇずつ使用した。

【００９８】上記のように調製した細胞懸濁液２０μｌ
（１．２×１０⁶ 細胞）とプラスミド溶液２０μｌずつ
を混合し、電極間隔２ｍｍのチャンバー（島津製作所
（株）社製）に入れ、遺伝子導入装置にセットしてから
６００Ｖ−３０μｓｅｃのパルスを１秒間隔で２回加え
た。チャンバー内の細胞−ＤＮＡ混合液を１０％のウシ
胎児血清を含むＤＭＥＭ１０ｍｌに加え、細胞培養用
プラスチックシャーレ（９０ｍｍφ；住友ベークライト
（株）社製）に移して、３７℃、７．５％ＣＯ₂下で２
４時間培養した。次いで、培養上清を除去し、無血清Ｄ
ＭＥＭ培地で細胞を洗浄した後、新しい無血清ＤＭＥＭ
培地１０ｍｌを加え、３７℃、７．５％ＣＯ₂ 下でさら
に２４時間培養した後に培養上清を回収した。

【００９９】上記方法により、以下に記載するプラスミ
ド、またはプラスミドの組み合わせでそれぞれＣＯＳ−
１細胞をトランスフェクションし、培養上清を回収し
た：［Ａ］：ｐＭＥ１８Ｓのみ［Ｂ］：ｐＨＥＸ１２６のみ［Ｃ］：ｐＬＥＸ００４のみ［Ｄ］：ｐＪＥＸ００４のみ［Ｅ］：ｐＨＥＸ１２６およびｐＬＥＸ００４［Ｆ］：ｐＨＥＸ１２６、ｐＬＥＸ００４およびｐＪＥ
Ｘ００４。

【０１００】実施例６．抗Ｆａｓ抗体の検出本発明により得られる抗Ｆａｓ抗体の検出は（１）ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下「ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ」という）後のニトロセルロース膜へ転写後の
抗体による発色法（ウエスタンブロッティング法）およ
び（２）Ｆａｓに対する結合活性を検出する（以下「Ｅ
ＬＩＳＡ法」という）にて行った。

【０１０１】（１）ウエスタンブロッティング法１ｍｌの被検検体を５リットルの純水に対して透析した
後、遠心濃縮機（ＣＣ−１０１、トミー精工）を用いて
減圧乾燥させた。このものにサンプル緩衝液（２％（ｗ
／ｖ）ＳＤＳ（電気泳動用グレード：バイオラッド社
製）、５％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール（シグ
マ社製）、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１％
ブロモフェノールブルー）１０μl を加えよく懸濁した
後、１００℃で５分間加熱し、電気泳動用試料とした。
この電気泳動用試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
（４−２０％グラジエントゲル）の１ウェルに全量注入
し、２０ｍＡ定電流で電気泳動した（室温、１時間）。

【０１０２】泳動終了後、ゲル中のタンパク質をセミド
ライブロッティング法［Towbin, H., et al. (1979) Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350 参照］でニトロセ
ルロース膜に転写した。具体的な条件は以下に記載する
通りであった：転写用緩衝液：２０ｍＭトリス、１５０ｍＭグリ
シン、１０％（ｖ／ｖ）メタノールブロッティング装置：岩城硝子（株）社製実施条件：４℃、０．２Ａ（定電流）、１時間以上のようにしてウエスタンブロッティング用のニトロ
セルロース膜を２枚作製した。転写終了後のゲルはシル
ベストステインキット（ナカライテスク（株）社製）を
使用して銀染色した。

【０１０３】上記のようにして作製された２枚のウエス
タンブロッティング用ニトロセルロース膜のうちの１枚
をＨ鎖（μ鎖）検出用、残る１枚をＬ鎖（κ鎖）検出用
として、それぞれ以下の検出操作を行った。

【０１０４】まず、転写終了後のニトロセルロース膜を
３％（ｗ／ｖ）ゼラチン（バイオラッド社製）、２０ｍ
Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ塩化ナ
トリウムを含む溶液に浸し、室温にて１時間穏やかに振
盪した（以下この操作を「ブロッキング」という）。次
いで、μ鎖またはκ鎖をそれぞれ特異的に認識する抗体
を各１０ｍｌの緩衝液（２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
７．５）、５００ｍＭ塩化ナトリウム；以下「ＴＢＳ」
という）で希釈した抗体希釈液中に、ブロッキング終了
後のニトロセルロース膜を浸して、穏やかに振盪した
（室温、２時間）。使用した抗体は、２．５μｌのペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（μ鎖特異
的：ジャクソン・イムノ・リサーチ・ラボラトリーズ社
製）および２５μｌのペルオキシダーゼ標識ラット抗マ
ウスκ軽鎖モノクローナル抗体（ザイメッド・ラボラト
リーズ社製）であった。

【０１０５】次いで、各ニトロセルロース膜を、２％の
Ｔｗｅｅｎ２０（バイオラッド社製）を含むＴＢＳ（以
下「ＴＴＢＳ」という）２０ｍｌ中に浸し、穏やかに振
盪することにより洗浄した（室温、１５分間）。さらに
この膜を２０ｍｌのＴＴＢＳで洗浄してから軽く水分を
切った。このニトロセルロース膜上に残存するペルオキ
シダーゼ活性をＥＣＬウエスタンブロッティング検出シ
ステム（アマシャム社製）を使用して検出した。すなわ
ち、該システム中の基質はペルオキシダーゼの触媒作用
により化学発光するので、この発光をＥＣＬミニカメラ
（アマシャム社製）およびインスタントフィルム（タイ
プ６６７；ポラロイド社製）を用いて撮影した。この写
真と銀染色したゲルとを照合することにより、各抗体と
特異的に結合したバンドを同定した。

【０１０６】その結果、ｐＨＥＸ１２６またはそれを含
む複数のプラスミドで形質転換したＣＯＳ−１細胞の培
養上清由来の試料（実施例５の［Ｂ］、［Ｅ］および
［Ｆ］）のレーンには、マウスμ鎖を特異的に認識する
抗体により、分子量約７８０００のバンドが検出され
た。また、ｐＬＥＸ００４またはそれを含む複数のプラ
スミドで形質転換したＣＯＳ−１細胞の培養上清由来の
試料（実施例５の［Ｃ］、［Ｅ］および［Ｆ］）のレー
ンには、マウスκ鎖を特異的に認識する抗体により、分
子量約２６０００のバンドが検出された。これらの分子
量は、ハイブリドーマが産生するＣＨ１１のＨ鎖および
Ｌ鎖を同様の方法で検出した結果といずれも同じであっ
た。

【０１０７】（２）ＥＬＩＳＡ法によるＦａｓ結合能
の確認（ａ）抗原の調製マウスＦａｓ抗原の細胞外領域とマウスインターロイキ
ン３受容体の細胞外領域との融合タンパク質をコードす
る発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ−ｍＦａｓ−ＡＩＣ［Nish
imura, Y., et al. (1995) J. Immunol. 154, 4395-440
3 参照］の、マウスＦａｓ抗原の細胞外領域をコードす
る部分を、ヒトＦａｓ抗原の細胞外領域をコードするＤ
ＮＡに置き換えることにより、ヒトＦａｓ抗原の細胞外
領域とマウスインターロイキン３受容体の細胞外領域と
の融合タンパク質をコードする発現ベクターｐｈＦａｓ
−ＡＩＣ２を、以下に記載する方法に従って作製した。

【０１０８】まず、ヒトＦａｓ抗原をコードするｃＤＮ
Ａを含むプラスミドベクターｐＣＥＶ４［Itoh, N., et
al. (1991) Cell 66, 233-243参照］の、Ｆａｓ抗原細
胞外領域をコードするＤＮＡをＰＣＲで増幅するため、
以下に記載するヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレ
オチドプライマー：5'- GGGGAATTCC AGTACGGAGT TGGGGA
AGCT CTTT -3' （Ｎ１；配列表の配列番号７７）およ
び5'- GTTTCTTCTG CCTCTGTCAC CAAGTTAGAT CTGGA -3'
（Ｃ３Ｎ；配列表の配列番号７８）を合成した。また、
ｐＭＥ１８Ｓ−ｍＦａｓ−ＡＩＣのマウスインターロイ
キン３受容体の細胞外領域をコードするＤＮＡをＰＣＲ
で増幅するため、以下に記載するヌクレオチド配列を有
するオリゴヌクレオチドプライマー：5'- TCCAGATCTA A
CTTGGTGAC AGAGGCAGAA GAAAC -3' （Ｎ３Ｎ；配列表の
配列番号７９）および5'- CCCTCTAGAC GCGTCACGTG GGCA
TCAC -3' （ＣＴＮ２；配列表の配列番号８０）を合成
した。

【０１０９】これらのプラスミド、オリゴヌクレオチド
プライマーおよびＬＡＰＣＲキット（宝酒造（株）社
製）を用いて、以下の条件で１回目のＰＣＲを実施し
た。

【０１１０】反応液組成：プラスミドＤＮＡ２０μｇオリゴヌクレオチドプライマー各０．５μｇ１０倍濃度ＬＡＰＣＲ緩衝液２５μｌｄＮＴＰｍｉｘ２５μｌＴａｑポリメラーゼ１２．５単位（蒸留水を加えて２５０μｌとする；緩衝液、ｄＮＴＰｍｉｘおよびＴａｑポリメラーゼはキットに添付されている）温度条件：９４℃で２分間加熱した後、９４℃で１分、５５℃で１分、７２ ℃で２分の温度サイクルを３０回繰り返してから、７２℃で１０分間加温する。

【０１１１】ＰＣＲ後の各反応液をそれぞれポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動し、ヒトＦａｓ抗原の細胞外領域
をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（約４６０ｂｐ）
およびマウスインターロイキン３受容体の細胞外領域を
コードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（約１３００ｂｐ）
に相当するバンドを切り出した後、実施例５に記載した
方法でＤＮＡを単離した。

【０１１２】次に、１回目のＰＣＲで得られた２種類の
ＤＮＡ断片と、オリゴヌクレオチドプライマーＣ３Ｎお
よびＮ３Ｎを用いて、２回目のＰＣＲを行った。１回目
のＰＣＲ産物の一方の末端にはこれらのプライマー配列
が組み込まれているが、Ｃ３ＮとＮ３Ｎは互いに相補的
なヌクレオチド配列からなるので、２回目のＰＣＲにお
いては、これらの末端がアニーリングすることにより、
２種類のポリペプチドをコードする遺伝子が同じ読み枠
（リーディングフレーム）で連結されたＤＮＡが増幅さ
れる。２回目のＰＣＲの反応条件は以下の通りであっ
た。

【０１１３】反応液組成：１回目のＰＣＲ産物各全量オリゴヌクレオチドプライマー各０．１μｇ１０倍濃度ＬＡＰＣＲ緩衝液２５μｌｄＮＴＰｍｉｘ２５μｌＴａｑポリメラーゼ１２．５単位（蒸留水を加えて２５０μｌとする）温度条件：１回目と同じ。

【０１１４】ＰＣＲ後の反応液の一部をアガロースゲル
電気泳動して、目的のＰＣＲ産物（約１７００ｂｐ）が
増幅されていることを確認した後、反応液全量をエタノ
ール沈殿処理した。沈殿したＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＸｂａＩで消化してから１％アガロースゲルで
電気泳動し、約１７００ｂｐに相当するバンドを切り出
した後、実施例５に記載した方法でＤＮＡを単離した。

【０１１５】一方、２μｇのｐＭＥ１８Ｓ−ｍＦａｓ−
ＡＩＣを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化して
から０．８％アガロースゲルで電気泳動し、約３０００
ｂｐに相当するバンドを切り出して、ＤＮＡを単離した
後、ＤＮＡライゲーションキット・バージョン２（宝酒
造（株）社製）を用いて、該ＤＮＡと上記ＰＣＲにより
調製した約１７００ｂｐのＤＮＡ断片とを連結した。こ
の連結反応液でコンピテント大腸菌を形質転換し、アン
ピシリン耐性株を選択した。該形質転換体を常法に従っ
て培養後、アルカリ法でプラスミドＤＮＡを調製するこ
とにより、ｐｈＦａｓ−ＡＩＣ２を得た。

【０１１６】ＣＯＳ−１細胞へのｐｈＦａｓ−ＡＩＣ２
の導入は、遺伝子導入装置ＧＴＥ−１を用いて、電気穿
孔法により行った。すなわち、ＣＯＳ−１細胞を１０％
のウシ胎児血清（ＣＳＬ社製）を含むダルベッコ改変イ
ーグル最小必須培地（以下「ＤＭＥＭ」という：日水製
薬（株）社製）を入れた２２５ｃｍ² の培養フラスコ
（住友ベークライト（株）社製）４本でセミコンフルエ
ントになるまで培養した後、培地を除去してから、細胞
をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液を加えて３７℃で３分間処
理して回収し、ＰＢＳ（−）緩衝液（日水製薬（株）社
製）で２回洗浄した。洗浄したＣＯＳ−１細胞をＰＢＳ
（−）緩衝液で６×１０⁷ 細胞／ｍｌとなるよう調整し
た。

【０１１７】一方、プラスミド大量調製キット（マキシ
プレップ・ＤＮＡピュリフィケーションシステム；プロ
メガ社製）を用いて調製したｐｈＦａｓ−ＡＩＣ２２
００μｇをエタノール沈殿した後、ＰＢＳ（−）緩衝液
２００μｌに溶解した。

【０１１８】上記のように調製した細胞懸濁液２０μｌ
（１．２×１０⁶ 細胞）とプラスミド溶液２０μｌを混
合し、電極間隔２ｍｍのチャンバーに入れ、遺伝子導入
装置にセットしてから６００Ｖ−３０μｓｅｃのパルス
を１秒間隔で２回加えた。以上の操作を１０回行った。

【０１１９】１０回分の細胞−ＤＮＡ混合液をまとめ
て、１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ５０ｍｌに
加え、２２５ｃｍ² の細胞培養用フラスコ（住友ベーク
ライト（株）社製）に移し、３７℃、７．５％ＣＯ₂ 下
で２４時間培養した。次いで、培養上清を除去し、無血
清ＤＭＥＭ培地で細胞を洗浄した後、新しい無血清ＤＭ
ＥＭ培地５０ｍｌを加え、３７℃、７．５％ＣＯ₂ 下で
さらに２４時間培養した後に培養上清を回収した。

【０１２０】（ｂ）ＥＬＩＳＡ９６穴イムノプレート（マキシソープ；ヌンク社製）の
各ウエルに、上記（ａ）で調製したＣＯＳ−１培養上清
１００μl を添加し、４℃で一晩保温することにより、
ウエル内面にヒトＦａｓ抗原の細胞外領域を含むタンパ
ク質を固相化した。次いで、各ウエルを０．０５％のＴ
ｗｅｅｎ−２０（ＥＩＡグレード、バイオラッド社製）
を含むＰＢＳで洗浄したのち、０．５％のウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ１００μl を添加し、
室温で１時間放置することによりブロッキングした。各
ウエルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで洗
浄したのち、実施例２で調製したＣＨ１１（標準品）、
および実施例５で調製した被検検体の希釈液１００μl
を各ウエルに添加して、室温で４時間反応させた。その
後０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで洗浄した
後、２０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識ラット抗
マウスＩｇＭモノクローナル抗体（ザイメッド・ラボラ
トリーズ社製）１００μl を各ウエルに分注し、室温で
２時間反応させた。さらに０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２
０含有ＰＢＳで洗浄したのち、１００μｌの基質溶液
（ペルオキシダーゼ基質キット・ＡＢＴＳ；バイオラッ
ド社製）を分注し、発色させた。マイクロプレートリー
ダーを用いて各ウエルの４０５ｎｍの吸光度より４９２
ｎｍの吸光度の差を測定し、ＣＨ１１標準品の測定値と
比較することにより、各被検検体のヒトＦａｓ抗原の細
胞外領域を含むタンパク質に対する結合性を評価した。

【０１２１】その結果を以下の表１に示す。

【０１２２】

【表１】検体ＯＤ₄₀₅ −ＯＤ₄₉₂ ＣＨ１１（標準）０．４４５ＰＢＳ０．１０４ｐＨＥＸ１２６０．１０９ｐＬＥＸ００４０．１３５ｐＪＥＸ００４０．１０７ｐＨＥＸ１２６＋ｐＬＥＸ００４０．３３０ｐＨＥＸ１２６＋ｐＬＥＸ００４＋ｐＪＥＸ００４０．２０２実施例５で調製した培養上清のうち、［Ｅ］（ｐＨＥＸ
１２６およびｐＬＥＸ００４）と［Ｆ］（ｐＨＥＸ１２
６、ｐＬＥＸ００４およびｐＪＥＸ００４）にヒトＦａ
ｓ抗原の細胞外領域を含むタンパク質との結合性が認め
られた。

【０１２３】実施例７．細胞傷害活性の検定上記の実施例５で調製したＣＯＳ−１細胞培養上清の細
胞傷害活性を、以下に記載するＭＴＴ（3-(4,5-dimethy
lthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl 2H-tetrazoliumbromid
e）アッセイ法で測定した。

【０１２４】まず、ヒトリンパ球細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ
［Morikawa, S., et al. (1978) Int. J. Cancer 21, 1
66-170参照］を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０μＭの２
−メルカプトエタノールおよび１０％のウシ胎児血清
（イクイテック・バイオ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０
培地（日水製薬（株）社製）にて、３７℃、５％炭酸ガ
ス存在下で３日間培養した。９６穴培養プレートの各ウ
エルに、実施例５で調製されたＣＯＳ−１細胞培養上清
を７５μｌずつ入れ、次いで２×１０⁵ 個／ｍｌに調整
したＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を２５μｌずつ入れて、３７
℃、５％ＣＯ₂ 存在下で１２時間培養後、５ｍｇ／ｍ
ｌのＭＴＴ溶液（シグマ社製）を１０μｌ／ウエル添加
し、３７℃で４時間保温した。さらに、５０％のＮ，Ｎ
−ジメチルホルムアミドおよび２０％のＳＤＳを含む溶
液を１００μｌ／ウエル添加した後、マイクロプレート
リーダー（日本インターメッド（株）社製）で各ウエル
の５９０ｎｍおよび６２０ｎｍの吸光度を測定し、５９
０ｎｍの吸光度から６２０ｎｍの吸光度を差し引いた値
を求めた。この値は、ウエル中の生細胞が多いほど高値
を示す。

【０１２５】得られた結果を以下の表２に示す。

【０１２６】

【表２】検体ＯＤ₅₉₀ −ＯＤ₆₂₀ ＰＢＳ０．８６４ｐＭＥ１８Ｓ０．８８１ｐＨＥＸ１２６（Ｈ鎖）０．８７６ｐＬＥＸ００４（Ｌ鎖）０．８８７ｐＪＥＸ００４（Ｊ鎖）０．８８３ｐＨＥＸ１２６＋ｐＬＥＸ００４０．１７６ｐＨＥＸ１２６＋ｐＬＥＸ００４＋ｐＪＥＸ００４０．２４２実施例５で調製されたＣＯＳ−１細胞培養上清のうち、
単一のプラスミドでトランスフェクションした細胞の培
養上清（［Ａ］、［Ｂ］、［Ｃ］および［Ｄ］）がいず
れもトランスフェクションしていない細胞の培養上清と
同程度の高値を示したのに対し、ｐＨＥＸ１２６および
ｐＬＥＸ００４をコ・トランスフェクションした細胞の
培養上清（［Ｅ］および［Ｆ］）はＨＰＢ−ＡＬＬ細胞
を入れなかったブランクの値と同程度の低値を示した。
この結果から、本発明のＣＨ１１のＨ鎖をコードするＤ
ＮＡおよび同Ｌ鎖をコードするＤＮＡを同時に発現させ
ることにより、細胞傷害活性を有する物質が生産される
ことが示された。

【０１２７】実施例８．抗体の細胞障害活性の比較（Ｅ
Ｄ₅₀試験）本発明の抗体の細胞障害活性はＥＤ₅₀試験により評価さ
れた。

【０１２８】ここで使用されるＥＤ₅₀は、Ｆａｓ抗原を
発現している細胞標本の５０％が殺される濃度をいう。
ＥＤ₅₀の測定に先立ち、試験に用いられる抗体の濃度を
正確に計算することが必要であった。

【０１２９】（ａ）抗体濃度の決定９６ウエルＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社製）の各ウェ
ルに１００μｌの抗マウスＩｇＭ抗体溶液（５０ｍＭ
Ｎａ₂ ＨＣＯ₃ 、ｐＨ９．６溶液中に０．５μｇ／ｍ
ｌ：バイオシス社より購入）を分注し、プレートは４℃
で終夜保温した。その後抗体溶液を除去し、各ウェルは
０．５％のツィーン２０を含むＰＢＳ（以下「ＰＢＳ−
Ｔ」という。）で４回洗浄した。

【０１３０】スーパー・ブロック（Ｓｕｐｅｒ−Ｂｌｏ
ｃｋ）ブロッキング緩衝液（ピァス社製）を同社の説明
書に従いＰＢＳを用いて調製し、該緩衝液１００μｌを
各ウェルに分注した。プレートはさらに３７℃で４時間
保温された。この後、ブロッキング緩衝液を除去し、各
ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。

【０１３１】濃度を測定すべき各抗体（被検検体）の溶
液をプレートの各ウェルに１００μｌずつ分注した。本
実施例では、抗体ＣＨ１１、及び実施例５の［Ｅ］及び
［Ｆ］の上清中の抗体濃度を測定した。同時に、標準曲
線を求めるため、さまざまな濃度に希釈されたマウスＩ
ｇＭ（ザイムド社）を用いた。被検検体を各ウェルに分
注した後、プレートは３７℃で４時間保温した。この
後、各ウェル中の溶液を除去し、各ウェルをＰＢＳ−Ｔ
で４回洗浄した。

【０１３２】次に、ホースラディッシュ・ペルオキシダ
ーゼ結合抗マウスＩｇＭ溶液（バイオラッド社製：ＰＢ
Ｓ中で１０００倍希釈）１００μｌを各ウェルに分注し
た。室温で４時間保温した後、各ウェルの溶液を除去
し、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。

【０１３３】ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ基
質キット（バイオラッド社製）から調製した基質溶液１
００μｌを各ウェルに加え、プレートは室温で３０分間
保温した。この後、マイクロプレート・リーダーを使用
して４０５ｎｍと４９２ｎｍの吸光度を求め、４０５ｎ
ｍの吸光度から４９２ｎｍの吸光度を引いた値を算定
し、同時に求めたマウスＩｇＭの標準曲線より各被検検
体の抗体濃度を求めた。

【０１３４】（ｂ）ＥＤ₅₀の算定３種の抗体溶液、すなわち、ＣＨ１１溶液、及び実施例
５記載の上清［Ｅ］（Ｈ鎖とＬ鎖を含む）と上清［Ｆ］
（Ｈ鎖、Ｌ鎖及びＪ鎖を含む）を、それぞれ、ＨＢＰ−
ＡＬＬ細胞と保温した。実施例７で記載したＭＴＴアッ
セイを行い、各抗体溶液により殺された細胞数を測定し
た。

【０１３５】ＭＴＴアッセイの結果と、（ａ）で算定し
た抗体濃度の値より、各抗体のＥＤ₅₀値を求めた。この
ときＭＴＴを負の対象、、抗体非存在下で培養したＨＢ
Ｐ−ＡＬＬの値を正の対象とした。結果を以下の表３に
示す。

【０１３６】

【表３】抗体ＥＤ₅₀(ng/ml）ＣＨ１１２１．２上清［Ｅ］（ｐＨＥＸ１２６＋ｐＬＥＸ００４）４．５上清［Ｆ］（ｐＨＥＸ１２６、ｐＬＥＸ００４＋ｐＪＥＸ００４）２２．９以上の結果より、上清［Ｅ］に含まれる生産物は、ＣＨ
１１または上清［Ｆ］に含まれる生産物より約５倍の活
性を有することが示された。

【０１３７】

【発明の効果】以上のごとく、本発明のＤＮＡを利用
することにより、細胞傷害活性を有するタンパク質を製
造することが可能である。また、本発明のＤＮＡを出発
材料として、よりヒトに対する免疫原性が少なく、自己
免疫疾患およびリウマチの治療に有効な抗Ｆａｓ抗体を
作製することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＣＨ１１の各サブユニットの全長をコードす
るＤＮＡのクローニングのためのｃＤＮＡライブラリー
の構築図である。

【図２】ＣＨ１１の各サブユニットの全長をコードす
るＤＮＡのクローニングの工程を示した図である。

【配列表】配列番号：１配列の長さ：５配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質フラグメント型：中間部フラグメント配列番号：２配列の長さ：１７配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質フラグメント型：中間部フラグメント配列 Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser 配列番号：３配列の長さ：７配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質フラグメント型：中間部フラグメント配列番号：４配列の長さ：１６配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質フラグメント型：中間部フラグメント配列 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 配列番号：５配列の長さ：７配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質フラグメント型：中間部フラグメント配列番号：６配列の長さ：９配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質フラグメント型：中間部フラグメント配列番号：７配列の長さ：1773 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル：No アンチセンス：No 起源生物名：マウス（Mus musculus）細胞の種類：ハイブリドーマセルライン：ＣＨ１１配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置:1..1770 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号: mat peptide 存在位置:58..1770 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号: sig peptide 存在位置:1..57 特徴を決定した方法：S 配列 ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGA ACT GCA GGC 48 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly -19 -15 -10 -5 GTC CAC TCT GAG GTC CAG CTT CAG CAG TCA GGA CCT GAG CTG GTG AAA 96 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACA TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT GAC TAC AAC ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGC CAT GGA AAG AGC CTT 192 Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATT GGA TAT ATT TAT CCT TAC AAT GGT GGT ACT GGC TAC AAC 240 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 50 55 60 CAG AAG TTC AAG AGC AAG GCC ACA TTG ACT GTT GAC AAT TCC TCC AGC 288 Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG GAG CTC CGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCA AGA AGT TAC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 95 100 105 ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA GAG AGT CAG TCC TTC CCA AAT GTC TTC 432 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Gln Ser Phe Pro Asn Val Phe 110 115 120 125 CCC CTC GTC TCC TGC GAG AGC CCC CTG TCT GAT AAG AAT CTG GTG GCC 480 Pro Leu Val Ser Cys Glu Ser Pro Leu Ser Asp Lys Asn Leu Val Ala 130 135 140 ATG GGC TGC CTG GCC CGG GAC TTC CTG CCC AGC ACC ATT TCC TTC ACC 528 Met Gly Cys Leu Ala Arg Asp Phe Leu Pro Ser Thr Ile Ser Phe Thr 145 150 155 TGG AAC TAC CAG AAC AAC ACT GAA GTC ATC CAG GGT ATC AGA ACC TTC 576 Trp Asn Tyr Gln Asn Asn Thr Glu Val Ile Gln Gly Ile Arg Thr Phe 160 165 170 CCA ACA CTG AGG ACA GGG GGC AAG TAC CTA GCC ACC TCG CAG GTG TTG 624 Pro Thr Leu Arg Thr Gly Gly Lys Tyr Leu Ala Thr Ser Gln Val Leu 175 180 185 CTG TCT CCC AAG AGC ATC CTT GAA GGT TCA GAT GAA TAC CTG GTA TGC 672 Leu Ser Pro Lys Ser Ile Leu Glu Gly Ser Asp Glu Tyr Leu Val Cys 190 195 200 205 AAA ATC CAC TAC GGA GGC AAA AAC AGA GAT CTG CAT GTG CCC ATT CCA 720 Lys Ile His Tyr Gly Gly Lys Asn Arg Asp Leu His Val Pro Ile Pro 210 215 220 GCT GTC GCA GAG ATG AAC CCC AAT GTA AAT GTG TTC GTC CCA CCA CGG 768 Ala Val Ala Glu Met Asn Pro Asn Val Asn Val Phe Val Pro Pro Arg 225 230 235 GAT GGC TTC TCT GGC CCT GCA CCA CGC AAG TCT AAA CTC ATC TGC GAG 816 Asp Gly Phe Ser Gly Pro Ala Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Glu 240 245 250 GCC ACG AAC TTC ACT CCA AAA CCG ATC ACA GTA TCC TGG CTA AAG GAT 864 Ala Thr Asn Phe Thr Pro Lys Pro Ile Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp 255 260 265 GGG AAG CTC GTG GAA TCT GGC TTC ACC ACA GAT CCG GTG ACC ATC GAG 912 Gly Lys Leu Val Glu Ser Gly Phe Thr Thr Asp Pro Val Thr Ile Glu 270 275 280 285 AAC AAA GGA TCC ACA CCC CAA ACC TAC AAG GTC ATA AGC ACA CTT ACC 960 Asn Lys Gly Ser Thr Pro Gln Thr Tyr Lys Val Ile Ser Thr Leu Thr 290 295 300 ATC TCT GAA ATC GAC TGG CTG AAC CTG AAT GTG TAC ACC TGC CGT GTG 1008 Ile Ser Glu Ile Asp Trp Leu Asn Leu Asn Val Tyr Thr Cys Arg Val 305 310 315 GAT CAC AGG GGT CTC ACC TTC TTG AAG AAC GTG TCC TCC ACA TGT GCT 1056 Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Leu Lys Asn Val Ser Ser Thr Cys Ala 320 325 330 GCC AGT CCC TCC ACA GAC ATC CTA ACC TTC ACC ATC CCC CCC TCC TTT 1104 Ala Ser Pro Ser Thr Asp Ile Leu Thr Phe Thr Ile Pro Pro Ser Phe 335 340 345 GCC GAC ATC TTC CTC AGC AAG TCC GCT AAC CTG ACC TGT CTG GTC TCA 1152 Ala Asp Ile Phe Leu Ser Lys Ser Ala Asn Leu Thr Cys Leu Val Ser 350 355 360 365 AAC CTG GCA ACC TAT GAA ACC CTG AAT ATC TCC TGG GCT TCT CAA AGT 1200 Asn Leu Ala Thr Tyr Glu Thr Leu Asn Ile Ser Trp Ala Ser Gln Ser 370 375 380 GGT GAA CCA CTG GAA ACC AAA ATT AAA ATC ATG GAA AGC CAT CCC AAT 1248 Gly Glu Pro Leu Glu Thr Lys Ile Lys Ile Met Glu Ser His Pro Asn 385 390 395 GGC ACC TTC AGT GCT AAG GGT GTG GCT AGT GTT TGT GTG GAA GAC TGG 1296 Gly Thr Phe Ser Ala Lys Gly Val Ala Ser Val Cys Val Glu Asp Trp 400 405 410 AAT AAC AGG AAG GAA TTT GTG TGT ACT GTG ACT CAC AGG GAT CTG CCT 1344 Asn Asn Arg Lys Glu Phe Val Cys Thr Val Thr His Arg Asp Leu Pro 415 420 425 TCA CCA CAG AAG AAA TTC ATC TCA AAA CCC AAT GAG GTG CAC AAA CAT 1392 Ser Pro Gln Lys Lys Phe Ile Ser Lys Pro Asn Glu Val His Lys His 430 435 440 445 CCA CCT GCT GTG TAC CTG CTG CCA CCA GCT CGT GAG CAA CTG AAC CTG 1440 Pro Pro Ala Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu 450 455 460 AGG GAG TCA GCC ACA GTC ACC TGC CTG GTG AAG GGC TTC TCT CCT GCA 1488 Arg Glu Ser Ala Thr Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Ser Pro Ala 465 470 475 GAC ATC AGT GTG CAG TGG CTT CAG AGA GGG CAA CTC TTG CCC CAA GAG 1536 Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu Gln Arg Gly Gln Leu Leu Pro Gln Glu 480 485 490 AAG TAT GTG ACC AGT GCC CCG ATG CCA GAG CCT GGG GCC CCA GGC TTC 1584 Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gly Ala Pro Gly Phe 495 500 505 TAC TTT ACC CAC AGC ATC CTG ACT GTG ACA GAG GAG GAA TGG AAC TCC 1632 Tyr Phe Thr His Ser Ile Leu Thr Val Thr Glu Glu Glu Trp Asn Ser 510 515 520 525 GGA GAG ACC TAT ACC TGT GTT GTA GGC CAC GAG GCC CTG CCA CAC CTG 1680 Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Gly His Glu Ala Leu Pro His Leu 530 535 540 GTG ACC GAG AGG ACC GTG GAC AAG TCC ACT GGT AAA CCC ACA CTG TAC 1728 Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr 545 550 555 AAT GTC TCC CTG ATC ATG TCT GAC ACA GGC GGC ACC TGC TAT TGA 1773 Asn Val Ser Leu Ile Met Ser Asp Thr Gly Gly Thr Cys Tyr 560 565 570 配列番号：８配列の長さ: 590 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列ＭｅｔＧｌｙＴｒｐＳｅｒＴｒｐＩｌｅＰｈｅＬｅｕＰｈｅ
ＬｅｕＬｅｕＳｅｒＧｌｙＴｈｒＡｌａＧｌｙ −１９ −１５
−１０ −５ＶａｌＨｉｓＳｅｒＧｌｕＶａｌＧｌｎＬｅｕＧｌｎＧｌｎ
ＳｅｒＧｌｙＰｒｏＧｌｕＬｅｕＶａｌＬｙｓ１５
１０ＰｒｏＧｌｙＡｌａＳｅｒＶａｌＬｙｓＩｌｅＳｅｒＣｙｓ
ＬｙｓＡｌａＳｅｒＧｌｙＴｙｒＴｈｒＰｈｅ１５２０
２５ＴｈｒＡｓｐＴｙｒＡｓｎＭｅｔＨｉｓＴｒｐＶａｌＬｙｓ
ＧｌｎＳｅｒＨｉｓＧｌｙＬｙｓＳｅｒＬｅｕ３０３５
４０４５ＧｌｕＴｒｐＩｌｅＧｌｙＴｙｒＩｌｅＴｙｒＰｒｏＴｙｒ
ＡｓｎＧｌｙＧｌｙＴｈｒＧｌｙＴｙｒＡｓｎ５０
５５６０ＧｌｎＬｙｓＰｈｅＬｙｓＳｅｒＬｙｓＡｌａＴｈｒＬｅｕ
ＴｈｒＶａｌＡｓｐＡｓｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒ６５７０
７５ＴｈｒＡｌａＴｙｒＭｅｔＧｌｕＬｅｕＡｒｇＳｅｒＬｅｕ
ＴｈｒＳｅｒＧｌｕＡｓｐＳｅｒＡｌａＶａｌ８０８５
９０ＴｙｒＴｙｒＣｙｓＡｌａＡｒｇＳｅｒＴｙｒＴｙｒＡｌａ
ＭｅｔＡｓｐＴｙｒＴｒｐＧｌｙＧｌｎＧｌｙ９５１００
１０５ＴｈｒＳｅｒＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒＧｌｕＳｅｒ
ＧｌｎＳｅｒＰｈｅＰｒｏＡｓｎＶａｌＰｈｅ１１０１１５
１２０１２５ＰｒｏＬｅｕＶａｌＳｅｒＣｙｓＧｌｕＳｅｒＰｒｏＬｅｕ
ＳｅｒＡｓｐＬｙｓＡｓｎＬｅｕＶａｌＡｌａ１３０
１３５１４０ＭｅｔＧｌｙＣｙｓＬｅｕＡｌａＡｒｇＡｓｐＰｈｅＬｅｕ
ＰｒｏＳｅｒＴｈｒＩｌｅＳｅｒＰｈｅＴｈｒ１４５１５０
１５５ＴｒｐＡｓｎＴｙｒＧｌｎＡｓｎＡｓｎＴｈｒＧｌｕＶａｌ
ＩｌｅＧｌｎＧｌｙＩｌｅＡｒｇＴｈｒＰｈｅ１６０１６５
１７０ＰｒｏＴｈｒＬｅｕＡｒｇＴｈｒＧｌｙＧｌｙＬｙｓＴｙｒ
ＬｅｕＡｌａＴｈｒＳｅｒＧｌｎＶａｌＬｅｕ１７５１８０
１８５ＬｅｕＳｅｒＰｒｏＬｙｓＳｅｒＩｌｅＬｅｕＧｌｕＧｌｙ
ＳｅｒＡｓｐＧｌｕＴｙｒＬｅｕＶａｌＣｙｓ１９０１９５
２００２０５ＬｙｓＩｌｅＨｉｓＴｙｒＧｌｙＧｌｙＬｙｓＡｓｎＡｒｇ
ＡｓｐＬｅｕＨｉｓＶａｌＰｒｏＩｌｅＰｒｏ２１０
２１５２２０ＡｌａＶａｌＡｌａＧｌｕＭｅｔＡｓｎＰｒｏＡｓｎＶａｌ
ＡｓｎＶａｌＰｈｅＶａｌＰｒｏＰｒｏＡｒｇ２２５２３０
２３５ＡｓｐＧｌｙＰｈｅＳｅｒＧｌｙＰｒｏＡｌａＰｒｏＡｒｇ
ＬｙｓＳｅｒＬｙｓＬｅｕＩｌｅＣｙｓＧｌｕ２４０２４５
２５０ＡｌａＴｈｒＡｓｎＰｈｅＴｈｒＰｒｏＬｙｓＰｒｏＩｌｅ
ＴｈｒＶａｌＳｅｒＴｒｐＬｅｕＬｙｓＡｓｐ２５５２６０
２６５ＧｌｙＬｙｓＬｅｕＶａｌＧｌｕＳｅｒＧｌｙＰｈｅＴｈｒ
ＴｈｒＡｓｐＰｒｏＶａｌＴｈｒＩｌｅＧｌｕ２７０２７５
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ＬｙｓＶａｌＩｌｅＳｅｒＴｈｒＬｅｕＴｈｒ２９０
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ＡｓｎＶａｌＴｙｒＴｈｒＣｙｓＡｒｇＶａｌ３０５３１０
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ＡｓｎＶａｌＳｅｒＳｅｒＴｈｒＣｙｓＡｌａ３２０３２５
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ＰｈｅＴｈｒＩｌｅＰｒｏＰｒｏＳｅｒＰｈｅ３３５３４０
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ＡｓｎＬｅｕＴｈｒＣｙｓＬｅｕＶａｌＳｅｒ３５０３５５
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ＡｌａＡｒｇＧｌｕＧｌｎＬｅｕＡｓｎＬｅｕ４５０
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ＴｈｒＧｌｕＧｌｕＧｌｕＴｒｐＡｓｎＳｅｒ５１０５１５
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ＧｌｙＧｌｙＴｈｒＣｙｓＴｙｒ５６０５６５
５７０配列番号：９配列の長さ：７１７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル：No アンチセンス：No 起源生物名：マウス（Mus musculus）細胞の種類：ハイブリドーマセルライン：ＣＨ１１配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..714 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：58..714 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..57 特徴を決定した方法：S 配列 ATG AAG TTG CCT GTT AGG CTG TTG GTG CTG ATG TTC TGG ATT CCT GCT 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala -19 -15 -10 -5 TCC AGC AGT GAT GTT GTG ATG ACC CAA AGT CCA CTC TCC CTG CCT GTC 96 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 1 5 10 AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT AAG AGC CTT 144 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu 15 20 25 GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA 192 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 30 35 40 45 GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 50 55 60 GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA 288 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC 336 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 80 85 90 TCT CAA AGT ACA CAT GTT CCT CCG GCG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG 384 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 95 100 105 GAA ATC AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCC ATC TTC CCA CCA 432 Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro 110 115 120 125 TCC AGT GAG CAG TTA ACA TCT GGA GGT GCC TCA GTC GTG TGC TTC TTG 480 Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu 130 135 140 AAC AAC TTC TAC CCC AAA GAC ATC AAT GTC AAG TGG AAG ATT GAT GGC 528 Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly 145 150 155 AGT GAA CGA CAA AAT GGC GTC CTG AAC AGT TGG ACT GAT CAG GAC AGC 576 Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser 160 165 170 AAA GAC AGC ACC TAC AGC ATG AGC AGC ACC CTC ACG TTG ACC AAG GAC 624 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp 175 180 185 GAG TAT GAA CGA CAT AAC AGC TAT ACC TGT GAG GCC ACT CAC AAG ACA 672 Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr 190 195 200 205 TCA ACT TCA CCC ATT GTC AAG AGC TTC AAC AGG AAT GAG TGT TAG 717 Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 配列番号：１０配列の長さ：238 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala -19 -15 -10 -5 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 1 5 10 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu 15 20 25 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 30 35 40 45 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 80 85 90 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 95 100 105 Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro 110 115 120 125 Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu 130 135 140 Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly 145 150 155 Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser 160 165 170 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp 175 180 185 Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr 190 195 200 205 Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 配列番号：１１配列の長さ：480 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル：No アンチセンス：No 起源生物名：マウス（Mus musculus）細胞の種類：ハイブリドーマセルライン：ＣＨ１１配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..477 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：67..477 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..66 特徴を決定した方法：S 配列 ATG AAG ACC CAC CTG CTT CTC TGG GGA GTC CTC GCC ATT TTT GTT AAG 48 Met Lys Thr His Leu Leu Leu Trp Gly Val Leu Ala Ile Phe Val Lys -22 -20 -15 -10 GCT GTC CTT GTA ACA GGT GAC 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配列 TGGGGCCTCA GTGAAGATAT 20 配列番号：２４配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CAATGGTGGT ACTGGCTACA 20 配列番号：２５配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TGACATCTGA GGACTCTGCA 20 配列番号：２６配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TCCTCAGAGA GTCAGTCCTT 20 配列番号：２７配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TCCTTCACCT GGAACTACCA 20 配列番号：２８配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TCCCAAGAGC ATCCTTGAAG 20 配列番号：２９配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AGATCTGCAT GTGCCCATTC ２０配列番号：３０配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TCTAAACTCA TCTGCGAGGC 20 配列番号：３１配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGTGACCATC GAGAACAAAG 20 配列番号：３２配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AGGGGTCTCA CCTTCTTGAA 20 配列番号：３３配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TCCTTTGCCG ACATCTTCCT 20 配列番号：３４配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GTGTGTACTG TGACTCACAG 20 配列番号：３５配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：Ｎｏ配列ＡＡＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＧＧＡＧＴＣＡ
20 配列番号：３６配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AACTCTTGCC CCAAGAGAAG 20 配列番号：３７配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 ATCCTGACTG TGACAGAGGA 20 配列番号：３８配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：Noアンチセンス :No 配列 ACAAGTCCAC TGGTAAACCC 20 配列番号：３９配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AGGATATCTT CACTGAGGCC 20 配列番号：４０配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 ATCCACTCAA GGCTCTTTCC 20 配列番号：４１配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 ACTGCAGAGT CCTCAGATGT 20 配列番号：４２配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AGACGGTGAC TGAGGTTCTT 20 配列番号：４３配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CAGGTGAAGG AAATGGTGCT 20 配列番号：４４配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 ATGCTCTTGG GAGACAGCAA 20 配列番号：４５配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CTCTGTTTTT GCCTCCGTAG 20 配列番号：４６配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TGGCCTCGCA GATGAGTTTA 20 配列番号：４７配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CCTTTGTTCT CGATGGTCAC 20 配列番号：４８配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TGTGGAGGAC ACGTTCTTCA 20 配列番号：４９配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 ACTTTGAGAA GCCCAGGAGA 20 配列番号：５０配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AGATCCCTGT GAGTCACAGT 20 配列番号：５１配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AGCAGGTGGA TGTTTGTGCA 20 配列番号：５２配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TGAAGCCACT GCACACTGAT 20 配列番号：５３配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AGTTCCATTC CTCCTCTGTC 20 配列番号：５４配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TGTGTCAGAC ATGATCAGGG 20 配列番号：５５配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TGAAGTTGCC TGTTAGGCTG 20 配列番号：５６配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CTTGGAGATC AAGCCTCCAT 20 配列番号：５７配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GCTGAGGATC TGGGAGTTTA 20 配列番号：５８配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GATGCTGCAC CAACTGTATC ２０配列番号：５９配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CGACAAAATG GCGTCCTGAA 20 配列番号：６０配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 ACGTTGACCA AGGACGAGTA 20 配列番号：６１配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 ATCTGCAAGA GATGGAGGCT 20 配列番号：６２配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 ACCCCAGAAA ATCGGTTGGA 20 配列番号：６３配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CCGGAGGAAC ATGTGTACTT 20 配列番号：６４配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：Ｎｏ配列ＴＣＧＴＴＣＡＴＡＣＴＣＧＴＣＣＴＴＧＧ
20 配列番号：６５配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CATCTCAGGA CCTTTGTCTC 20 配列番号：６６配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CACCTGTCCT GGGGTTATTT 20 配列番号：６７配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：Noアンチセンス:No 配列 AGACAAGATG AAGACCCACC 20 配列番号：６８配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AAGCGACCAT TCTTGCTGAC 20 配列番号：６９配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 ATATCTCTGA TCCCACCTCC 20 配列番号：７０配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GAAATGCGAT CCTGTGGAAG 20 配列番号：７１配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CTATACCACT ATGGTCCCAC 20 配列番号：７２配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AGAAGCAGGT GGGTCTTCAT 20 配列番号：７３配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TAGAGGTAAC TCGGGTACAC 20 配列番号：７４配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 AAGTTCCTTC TCAGTGGGGA 20 配列番号：７５配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGTGGCAGTA ACAACCTGAT 20 配列番号：７６配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CATGATACCT AAGTGGGACC 20 配列番号：７７配列の長さ：37 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGGGAATTCC AGTACGGAGT TGGGGAAGCT CTTT 37 配列番号：７８配列の長さ：35 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GTTTCTTCTG CCTCTGTCAC CAAGTTAGAT CTGGA 35 配列番号：７９配列の長さ：35 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 TCCAGATCTA ACTTGGTGAC AGAGGCAGAA GAAAC 35 配列番号：８０配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CCCTCTAGAC GCGTCACGTG GGCATCAC 28

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＢ // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＢＡＢＣＮＡＢＣＧ０１Ｎ 33/531 ＡＧ０１Ｎ 33/531 33/577 Ｂ 33/577 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者米原伸京都府京都市西京区松尾井戸町９−５

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】遺伝子操作によって得られ、サブユニッ
トとして、以下の一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を含むこと
からなるＨ鎖タンパク質： −ＦＲＨ₁ −ＣＤＲＨ₁ −ＦＲＨ₂ −ＣＤＲＨ₂ −ＦＲＨ₃ −ＣＤＲＨ₃ −ＦＲＨ₄ − （Ｉ）（式中、ＦＲＨ₁ は１３個ないし３０個からなる任意の
アミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₁ は配列表の配列番号１
で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ₂ は１４個から
なる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₂ は配列表の
配列番号２で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ₃ は
３２個からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₃
は配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列を示し、
ＦＲＨ₄ は１１個からなる任意のアミノ酸配列を示し、
各アミノ酸配列はそれぞれペプチド結合で連結してい
る。）；および、以下の一般式（ＩＩ）で示されるアミ
ノ酸配列を含むことからなるＬ鎖タンパク質： −ＦＲＬ₁ −ＣＤＲＬ₁ −ＦＲＬ₂ −ＣＤＲＬ₂ −ＦＲＬ₃ −ＣＤＲＬ₃ −ＦＲＬ₄ − （ＩＩ）（式中、ＦＲＬ₁ は２３個からなる任意のアミノ酸配列
を示し、ＣＤＲＬ₁ は配列表の配列番号４で示されるア
ミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₂ は１５個からなる任意のア
ミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ₂ は配列表の配列番号５で
示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₃ は３２個からな
る任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ₃は配列表の配
列番号６で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₄ は１
０個からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸配
列はそれぞれペプチド結合で連結している。）；のみか
ら構成され、Ｊ鎖蛋白質を有さず、ヒトＦａｓ抗原分子
と特異的に結合し、アポトーシス誘導活性を有すること
を特徴とするイムノグロブリンタンパク質。
【請求項２】Ｈ鎖サブユニットが配列表の配列番号８
のアミノ酸番号１〜１１６で示されるアミノ酸配列を含
むことからなり、Ｌ鎖サブユニットが配列表の配列番号
１０のアミノ酸番号１〜１１２で示されるアミノ酸配列
を含むことからなることを特徴とする、請求項１記載の
イムノグロブリンタンパク質。
【請求項３】Ｈ鎖サブユニットが配列表の配列番号８
のアミノ酸番号１〜５７１で示されるアミノ酸配列から
なり、Ｌ鎖サブユニットが配列表の配列番号１０のアミ
ノ酸番号１〜２１９で示されるアミノ酸配列からなるこ
とを特徴とする、請求項１または２記載のイムノグロブ
リンタンパク質。
【請求項４】以下の一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸
配列を含むことからなるＨ鎖タンパク質をコードするＤ
ＮＡ： −ＦＲＨ₁ −ＣＤＲＨ₁ −ＦＲＨ₂ −ＣＤＲＨ₂ −ＦＲＨ₃ −ＣＤＲＨ₃ −ＦＲＨ₄ − （Ｉ）（式中、ＦＲＨ₁ は１３個ないし３０個からなる任意の
アミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₁ は配列表の配列番号１
で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ₂ は１４個から
なる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₂ は配列表の
配列番号２で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ₃ は
３２個からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₃
は配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列を示し、
ＦＲＨ₄ は１１個からなる任意のアミノ酸配列を示し、
各アミノ酸配列はそれぞれペプチド結合で連結してい
る。）。
【請求項５】分子中に配列表の配列番号８のアミノ酸
番号１〜１１６で示されるアミノ酸配列を含むことから
なるＨ鎖タンパク質をコードする請求項４記載のＤＮ
Ａ。
【請求項６】分子中に配列表の配列番号７のヌクレオ
チド番号５８〜４０５で示されるヌクレオチド配列を含
むことからなる請求項４または５記載のＤＮＡ。
【請求項７】請求項６記載のＤＮＡとハイブリダイズ
し、以下の一般式（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含
むことからなるＬ鎖サブユニット： −ＦＲＬ₁ −ＣＤＲＬ₁ −ＦＲＬ₂ −ＣＤＲＬ₂ −ＦＲＬ₃ −ＣＤＲＬ₃ −ＦＲＬ₄ − （ＩＩ）（式中、ＦＲＬ₁ は２３個からなる任意のアミノ酸配列
を示し、ＣＤＲＬ₁ は配列表の配列番号４で示されるア
ミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₂ は１５個からなる任意のア
ミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ₂ は配列表の配列番号５で
示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₃ は３２個からな
る任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ₃は配列表の配
列番号６で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₄ は１
０個からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸配
列はそれぞれペプチド結合で連結している。）；ととも
に、ヒトＦａｓ抗原と特異的に結合し、アポトーシス誘
導活性を有することを特徴とするイムノグロブリンタン
パク質を形成するイムノグロブリンＨ鎖サブユニットを
コードするＤＮＡ。
【請求項８】請求項６記載のＤＮＡと６０〜７０℃、
６×ＳＳＣの条件でハイブリダイズし、以下の一般式
（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含むことからなるＬ
鎖サブユニット： −ＦＲＬ₁ −ＣＤＲＬ₁ −ＦＲＬ₂ −ＣＤＲＬ₂ −ＦＲＬ₃ −ＣＤＲＬ₃ −ＦＲＬ₄ − （ＩＩ）（式中、ＦＲＬ₁ は２３個からなる任意のアミノ酸配列
を示し、ＣＤＲＬ₁ は配列表の配列番号４で示されるア
ミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₂ は１５個からなる任意のア
ミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ₂ は配列表の配列番号５で
示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₃ は３２個からな
る任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ₃は配列表の配
列番号６で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₄ は１
０個からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸配
列はそれぞれペプチド結合で連結している。）；ととも
に、ヒトＦａｓ抗原と特異的に結合し、アポトーシス誘
導活性を有することを特徴とするイムノグロブリンタン
パク質を形成するイムノグロブリンＨ鎖サブユニットを
コードするＤＮＡ。
【請求項９】請求項４乃至８のいずれかひとつに記載
のＤＮＡを含むことからなる組換えＤＮＡベクター。
【請求項１０】組換えＤＮＡベクターｐＣＲ３−Ｈ１
２３。
【請求項１１】請求項９記載の組換えＤＮＡベクター
で形質転換された細胞。
【請求項１２】形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉｐＣ
Ｒ３−Ｈ１２３（ＦＥＲＭＢＰ−５２４７）。
【請求項１３】以下の一般式（ＩＩ）で示されるアミ
ノ酸配列を含むことからなるＬ鎖タンパク質をコードす
るＤＮＡ： −ＦＲＬ₁ −ＣＤＲＬ₁ −ＦＲＬ₂ −ＣＤＲＬ₂ −ＦＲＬ₃ −ＣＤＲＬ₃ −ＦＲＬ₄ − （ＩＩ）（式中、ＦＲＬ₁ は２３個からなる任意のアミノ酸配列
を示し、ＣＤＲＬ₁ は配列表の配列番号４で示されるア
ミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₂ は１５個からなる任意のア
ミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ₂ は配列表の配列番号５で
示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₃ は３２個からな
る任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＬ₃は配列表の配
列番号６で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＬ₄ は１
０個からなる任意のアミノ酸配列を示し、各アミノ酸配
列はそれぞれペプチド結合で連結している。）。
【請求項１４】配列表の配列番号１０のアミノ酸番号
１〜１１２で示されるアミノ酸配列を含むことからなる
Ｌ鎖タンパク質をコードする請求項１３記載のＤＮＡ。
【請求項１５】配列表の配列番号９のヌクレオチド番
号５８〜３９３で示されるヌクレオチド配列を含むこと
からなる請求項１３または１４記載のＤＮＡ。
【請求項１６】請求項１５記載のＤＮＡとハイブリダ
イズし、以下の一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を
含むことからなるＨ鎖サブユニット： −ＦＲＨ₁ −ＣＤＲＨ₁ −ＦＲＨ₂ −ＣＤＲＨ₂ −ＦＲＨ₃ −ＣＤＲＨ₃ −ＦＲＨ₄ − （Ｉ）（式中、ＦＲＨ₁ は１３個ないし３０個からなる任意の
アミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₁ は配列表の配列番号１
で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ₂ は１４個から
なる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₂ は配列表の
配列番号２で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ₃ は
３２個からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₃
は配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列を示し、
ＦＲＨ₄ は１１個からなる任意のアミノ酸配列を示し、
各アミノ酸配列はそれぞれペプチド結合で連結してい
る。）；とともに、ヒトＦａｓ抗原と特異的に結合し、
アポトーシス誘導活性を有することを特徴とするイムノ
グロブリンタンパク質を形成するイムノグロブリンＬ鎖
サブユニットをコードするＤＮＡ。
【請求項１７】請求項１５記載のＤＮＡと６０〜７０
℃、６×ＳＳＣの条件でハイブリダイズし、以下の一般
式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を含むことからなるＨ
鎖サブユニット： −ＦＲＨ₁ −ＣＤＲＨ₁ −ＦＲＨ₂ −ＣＤＲＨ₂ −ＦＲＨ₃ −ＣＤＲＨ₃ −ＦＲＨ₄ − （Ｉ）（式中、ＦＲＨ₁ は１３個ないし３０個からなる任意の
アミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₁ は配列表の配列番号１
で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ₂ は１４個から
なる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₂ は配列表の
配列番号２で示されるアミノ酸配列を示し、ＦＲＨ₃ は
３２個からなる任意のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲＨ₃
は配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列を示し、
ＦＲＨ₄ は１１個からなる任意のアミノ酸配列を示し、
各アミノ酸配列はそれぞれペプチド結合で連結してい
る。）；とともに、ヒトＦａｓ抗原と特異的に結合し、
アポトーシス誘導活性を有することを特徴とするイムノ
グロブリンタンパク質を形成するイムノグロブリンＬ鎖
サブユニットをコードするＤＮＡ。
【請求項１８】請求項１３乃至１７のいずれかひとつ
に記載のＤＮＡを含むことからなる組換えＤＮＡベクタ
ー。
【請求項１９】組換えＤＮＡベクターｐＣＲ３−Ｌ１
０３。
【請求項２０】請求項１８記載の組換えＤＮＡベクタ
ーで形質転換された細胞。
【請求項２１】形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉｐＣ
Ｒ３−Ｌ１０３（ＦＥＲＭＢＰ−５２４８）。
【請求項２２】請求項９記載のＤＮＡベクターおよび
請求項１８記載のＤＮＡベクターで形質転換された細胞
を、該ベクターに含まれるイムノグロブリンＨ鎖または
Ｌ鎖サブユニットをコードするＤＮＡの発現が可能な条
件下で培養し、次いで該培養物から、ヒトＦａｓ抗原を
特異的に認識しアポトーシス誘導活性を有するイムノグ
ロブリンタンパク質を回収することを特徴とする、該タ
ンパク質の製造方法。