JP2000154149A - 抗ヒトFasヒト化抗体含有抗リウマチ剤 - Google Patents
抗ヒトFasヒト化抗体含有抗リウマチ剤Info
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Abstract
い治療薬として有用なアポトーシス誘導活性を有する抗
ヒトFasヒト化抗体を有効成分とする抗リウマチ剤を
提供する。 【解決手段】 抗ヒトFasヒト化抗体を遺伝子操作の
手法を用いて発現させ、該抗体がアポトーシス誘導活性
を有することを見いだし、該抗体を有効成分とする抗リ
ウマチ剤を調製した。
Description
する細胞膜分子であるFas抗原を認識する抗ヒトFa
sヒト化抗体を有効成分とする医薬、特に自己免疫疾患
治療剤、さらにはリウマチ治療剤に関するものである。
」という。)は、分子量約23000の軽ポリペプチ
ド鎖(以下「L鎖」という。)、分子量約50000の
重ポリペプチド鎖(以下「H鎖」という。)各2本づつ
から構成される。H鎖、L鎖とも約110残基から成
る、アミノ酸配列が保存されている領域のくり返し構造
を持ち、これらは Ig G の3次元構造の基本単位(以
下、「ドメイン」という。)を構成する。H鎖及びL鎖
は、それぞれ連続した4個、及び2個のドメインから構
成されている。H鎖、L鎖いずれにおいても、アミノ末
端のドメインは他のドメインに比べ各抗体分子間でのア
ミノ酸配列の変異が大きく、このドメインは可変ドメイ
ン(variable domain : 以下、「Vドメイン」とい
う。)と呼ばれる。 Ig G のアミノ末端においては、H
鎖、L鎖のVドメインが相補的に会合し可変領域を形成
している。これに対し、残余のドメインは、全体として
定常領域を形成する。定常領域は、各動物種に特徴的な
配列を有し、例えば、マウス Ig G の定常領域はヒト I
g G の定常領域とは異なっているので、マウス Ig G は
ヒトの免疫系によって異物として認識され、その結果、
ヒト抗マウス抗体( Human AntiMouse Antibody:以下
「HAMA」という。)応答が起こる(シュロッフら、Canc
erRes., 45, 879-85 (1985)参照)。従って、マウス抗
体はヒトに繰返し投与することはできない。このような
抗体をヒトに投与するためには、抗体の特異性を保持し
たまま HAMA 応答を起こさないように抗体分子を修飾す
る必要がある。
に、このようなドメインは3本から4本のβ鎖からなる
逆平行βシートが2層重なり合った長円筒状の構造をと
る。可変領域では、H鎖、L鎖のVドメインそれぞれに
つき各3個のループが集合し、抗原結合部位を形成す
る。この各ループは相補性決定領域(complementarity
determining region : 以下、「CDR」という。)と
呼ばれ、アミノ酸配列の変異が最も著しい。可変領域の
CDR以外の部分は、一般に、CDRの構造を保持する
役割を有し、「フレームワーク」と呼ばれる。
配列を多数収集し、配列の保存性に基づき、それぞれの
一次配列をCDR及びフレームワークに分類した表を作
成した(カバトら、SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTER
EST, 5th edition, NIH publication, No.91-3242, E.
A. Kabatt et al. 参照)。また、各フレームワーク
は、アミノ酸配列が共通の特徴を有する複数のサブグル
ープに分類された。さらに、ヒトとマウスの間で対応す
るフレームワークが存在することも見いだされた。
から以下のヒト化抗体の作製法が考案された。
変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体が提
案された(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6
855,(1984) 参照)。しかし、そのようなキメラ抗体
は、依然として、多くの非ヒトアミノ酸残基を含むの
で、特に長期間投与した場合にはHAMA応答を誘導しうる
(Begentら Br. J. Cancer, 62, 487, (1990) 参照)。
ある、非ヒトほ乳動物由来のアミノ酸残基を更に少なく
する方法として、CDR部分のみをヒト由来の抗体に組
み込む方法が提案された( Nature, 321, 522-525, (19
86) 参照)が、一般に、抗原に対する免疫グロブリン活
性を保持するにはCDRのみの移植では不十分であっ
た。
構造解析データを用い、(i) CDRのアミノ酸配列中に
は、抗原に直接結合する部位とCDR自体の構造を維持
する部位とが存在し、CDRの取り得る三次元構造は、
複数の典型的なパターン(カノニカル構造)に分類され
ること、(ii)カノニカル構造のクラスは、CDRのみな
らずフレームワーク部分の特定の位置のアミノ酸の種類
によって決定されること、を見いだした( J. Mol. Bio
l., 196, 901-917, (1987)参照)。
場合、CDRの配列に加え一部のフレームワークのアミ
ノ酸残基もヒト抗体に移植する必要性が示唆された(特
表平4-502408号参照)。
哺乳動物由来の抗体は「ドナー」、CDRが移植される
側のヒト抗体は「アクセプター」と定義されるが、本発
明もこの定義に従うことにする。
は、可能な限りCDRの構造を保存し、免疫グロブリン
分子の活性を保持することにある。この目的を達成する
ため、(i) アクセプターは、いずれのサブグループに属
するものを選択すべきか。(ii)ドナーのフレームワーク
からいずれのアミノ酸残基を選択すべきか。の2点に留
意する必要がある。
アミノ酸残基が、以下の基準の少なくともひとつに該当
する場合、CDR配列とともにアクセプターに移植する
デザインの方法を提唱した(特表平4-502408号参照): (a)アクセプターのフレームワーク領域中のアミノ酸が
その位置において稀であり、ドナーの対応するアミノ酸
がアクセプターの前記位置において普通である。 (b)該アミノ酸がCDRのひとつのすぐ近くである。 (c)該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいて
CDRの約3Å以内に側鎖原子を有し、そして抗原とま
たはヒト化抗体のCDRと相互作用することができると
予想される。
」という。)は、通常H鎖及びL鎖各10ずつに加え
て、分子の中心に位置するジョイニング鎖(以下、「J
鎖」という。)から構成される。マウス Ig M も定常領
域を有するので、マウス Ig Gと同様にヒトに繰り返し
投与することはできない。したがって、このものをヒト
に対する医薬として使用する場合は、上記で述べたCD
R移植法により分子をデザインする必要がある。
として存在するが、J鎖を欠失した6量体として存在し
得ることが報告されており( J. Biol. Chem,, 267, (2
5),18002-18007, (1992) )、また、このようなJ鎖欠
失型 Ig M の補体結合活性が増強することも報告されて
いる( Eur. J. Immunol., 18, :1001-1008, (198
8))。しかし、従来 Ig M の分子構造を維持しその免疫
グロブリン活性を保持するためにはJ鎖の存在が必須と
考えられており、J鎖を保有しない Ig M が依然として
元の免疫グロブリン活性を保持し得るかについては、現
在まで知られていない。
ために生じる生理的な細胞死はアポトーシスと呼ばれ、
病理的な細胞死である壊死(ネクローシス)とは区別さ
れている(Kerr, et al. (1972) Br. J. Cancer 26, 23
9 参照)。いわゆるプログラム細胞死は、生体内におい
て予め死滅するべくプログラム化されている、ある種の
細胞にみられる細胞死であるが、アポトーシスもそのひ
とつである。アポトーシスにおいては細胞表面の湾曲、
核クロマチンの凝縮、染色体DNAの断片化等の現象が
特徴的に観察される。
B細胞)の分化において、自己抗原を認識する細胞を排
除する役割を果たしている。いわゆる自己免疫疾患の発
症は、リンパ球分化におけるアポトーシスの不全によっ
て自己反応性リンパ球が生じることによるものと考えら
れている(中山敬一ら (1995) Mebio 12 (10), 79-86参
照)。
たモノクローナル抗体(Yonehara,S., et al. (1989)
J. Exp. Med. 169, 1747)が免疫担当細胞のアポトーシ
スに関与することが見出され、それに対応する抗原とし
てFasが同定された(前出Itoh, N., et al. 参
照)。これらの抗ヒトFas抗体はヒト由来の細胞のア
ポトーシスを誘導する細胞障害活性を有することから、
自己免疫疾患、エイズおよび腫瘍の治療剤となり得ると
報告されている(特開平2−237935号および特表
平5−503281号参照)。
内的および外的要因によって引き起こされる種々の免疫
学的異常を伴う、滑膜細胞の増殖を基礎病変とする疾患
であり、炎症性細胞浸潤および骨の侵食を伴う滑膜細胞
の増殖障害と考えられている。慢性関節リウマチにおけ
る罹患関節を中心とする組織破壊は、炎症性滑膜細胞か
らのサイトカインの産生異常がその成因であると考えら
れている。リウマチ患者の関節の状態を調べると、滑膜
細胞が異常に増殖しており、滑膜絨毛の増生や滑膜細胞
の多層化などが観察される(Daniel J. McCarty (1985)
in "Arthritisand allied conditions, A textbook of
rheumatology" 10th Edition, Lea &Febiger 参照)。
現在実施されているリウマチの薬物療法には、専らステ
ロイド等の抗炎症剤または免疫調節剤等が用いられてい
るが、こうした滑膜細胞の異常増殖を薬物で抑制するこ
とができれば、その薬物はリウマチ治療剤として有用で
あると考えられる。
殖は無制限に生じるものではなく、自発抑制することが
知られている(Daniel J. McCarty (1985) in "Arthrit
is and allied conditions, A textbook of rheumatolo
gy" 10th Edition, Lea & Febiger 参照)。さらに最
近、リウマチ患者の滑膜細胞にアポトーシスが起こるこ
と、滑膜細胞膜上にFas抗原が発現していることが明
らかとなった。中島ら(Nakajima, T., et al. (1995)
Arthritis Rheum. 38, 485-491参照)および青野ら(第
38回日本リウマチ学会抄録集(1994) 487頁および平成
6年日本癌学会総会記事(1994) 338頁参照)は、細胞障
害活性を有する抗ヒトFas抗体をリウマチ患者由来の
異常増殖した滑膜細胞に加えることにより、滑膜細胞に
アポトーシスが誘導されるか否かについて検討した結
果、リウマチ患者の異常増殖した滑膜細胞はリウマチ患
者以外の滑膜細胞と比較してアポトーシスが起こる割合
が高いことを見いだしている。従って、抗ヒトFas抗
体は、リンパ球のみならず、異常増殖している滑膜細胞
も選択的にアポトーシスへと導くことができ、リウマチ
治療剤として有用であると考えられる。
既に数種得られており(Yonehara,S., et al. (1989)
J. Exp. Med. 169, 1747-1756, (1989) ;SCIENCE, 24
5, 301-305, (1989) などを参照)、また、前記のよう
に、該抗体がリウマチ患者の滑膜細胞にイン・ビトロで
アポトーシスを誘導することも報告されている(第38
回日本リウマチ学会抄録集(1994) 487頁および平成6年
日本癌学会総会記事(1994) 338頁参照)。しかし、Ig G
型と Ig M 型の如何を問わず、抗ヒトFasヒト化抗
体を製造した例はない。さらに、J鎖を有せず、アポト
ーシス誘導活性を有する Ig M 型抗ヒトFasヒト化抗
体の取得に成功した例はない。
は、ヒト抗体アクセプターに移植されるべき可変領域中
アミノ酸配列を選択する必要がある。かかるアミノ酸配
列は想定されるCDR配列と、さらに、FR配列中の選
択されるアミノ酸配列を含まなければならない。
クセプターのサブグループは以下の二つのうちのひとつ
の方法で選択されていた。 (i) 公知の天然ヒト抗体の同一分子に由来する重鎖及び
軽鎖を使用する。 (ii)ドナー鎖に高度の配列相同性を有するかコンセンサ
ス配列を共有する、天然ヒト抗体の異なった分子に由来
する重鎖及び軽鎖を使用する。ただし、アクセプター鎖
のサブグループのコンビネーションとしては天然に存在
するものを維持する。
り、天然に生じるコンビネーションを維持することは免
疫グロブリン活性の維持のために重要と考えられてい
た。
然に存在するサブグループのコンビネーションを維持す
ることも、または、同一の抗体よりのH鎖及びL鎖を使
用することも必須でないこと、すなわち、アクセプター
のH鎖及びL鎖は、サブグループの天然のコンビネーシ
ョンを無視して、ドナー及びアクセプターのフレームワ
ーク領域の相同性のみに基づき、ヒト抗体の一次配列の
ライブラリーから選択し得ること、かかる選択手段を用
いても、抗体の免疫グロブリン活性を維持できることを
見いだした。また、本発明者らは、Ig M 型である抗ヒ
トFasマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマより作製したcDNAライブラリーから、該抗体
のH鎖、L鎖をコードする遺伝子をそれぞれクローン化
し、その全ヌクレオチド配列を解明した。次いで、それ
らの遺伝子にコードされる該H鎖およびL鎖のアミノ酸
配列におけるCDRのアミノ酸配列を決定した。次に、
既知のIg M 型ヒト免疫グロブリンのH鎖及びL鎖のア
ミノ酸配列へ該CDRのアミノ酸配列及びフレームワー
ク中の数種のアミノ酸残基を組み込むようにアミノ酸配
列のデザインを行い、抗ヒトFasヒト化抗体のH鎖及
びL鎖のアミノ酸全配列を予め特定した。さらに、該H
鎖及びL鎖のアミノ酸全配列をコードするDNAを製造
し、該DNAをそれぞれ含むことから成る複数の発現ベ
クターを作製した。さらに、これらのベクターで培養動
物細胞をコ・トランスフェクションして得られた形質転
換体の培養上清中に、抗ヒトFas抗体として機能しア
ポトーシス誘導活性を有するタンパク質が産生されてい
ることを見いだし、かかる蛋白質を有効成分とする抗リ
ウマチ剤を調製し、本発明を完成した。
る「配列相同性」なる語は、DNA配列相同性及びアミ
ノ酸配列相同性のいずれにも関する。「相同性」なる語
は、二つの配列間の類似性を意味し、本技術分野で標準
的な語である。アミノ酸配列相同性は、配列のデータ・
ベースのコンピューター検索を含む、一連の方法のいず
れによっても評価することができる。これらの方法は本
技術分野の当業者に周知である。
は、イムノグロブリンH鎖またはL鎖サブユニットの可
変領域中に存在する、いわゆるフレームワーク領域を指
す。例えば、FRH1 はH鎖サブユニット可変領域中の
最もN末側に存在するフレームワーク領域を指し、FR
L4 はL鎖サブユニット可変領域中のN末端から4番目
のフレームワーク領域を指す。同様に、例えばCDRH
1 はH鎖サブユニット可変領域中の最もN末端側に存在
するCDRを指し、CDRL3 はL鎖サブユニット可変
領域中のN末端から3番目のCDRを指す。
れ、配列表の配列番号78で示されるアミノ酸配列を含
むことから成る軽ポリペプチド鎖蛋白質、配列表の配列
番号80で示されるアミノ酸配列を含むことから成る軽
ポリペプチド鎖蛋白質、配列表の配列番号82で示され
るアミノ酸配列を含むことから成る軽ポリペプチド鎖蛋
白質又は配列表の配列番号84で示されるアミノ酸配列
を含むことから成る軽ポリペプチド鎖蛋白質、及び、配
列表の配列番号86で示されるアミノ酸配列を含むこと
から成る重ポリペプチド鎖蛋白質又は配列表の配列番号
88で示されるアミノ酸配列を含むことから成る重ポリ
ペプチド鎖蛋白質のみから構成され、J鎖蛋白質を有さ
ず、アポトーシス誘導活性を有することを特徴とする免
疫グロブリンM蛋白質を有効成分とする抗リウマチ剤、
(2)遺伝子操作によって得られ、配列表の配列番号7
8で示されるアミノ酸配列を含むことから成る軽ポリペ
プチド鎖蛋白質、及び、配列表の配列番号86で示され
るアミノ酸配列を含むことから成る重ポリペプチド鎖蛋
白質のみから構成され、J鎖蛋白質を有さず、アポトー
シス誘導活性を有することを特徴とする免疫グロブリン
M蛋白質を有効成分とする(1)記載の抗リウマチ剤、
(3)遺伝子操作によって得られ、配列表の配列番号7
8で示されるアミノ酸配列を含むことから成る軽ポリペ
プチド鎖蛋白質、及び、配列表の配列番号88で示され
るアミノ酸配列を含むことから成る重ポリペプチド鎖蛋
白質のみから構成され、J鎖蛋白質を有さず、アポトー
シス誘導活性を有することを特徴とする免疫グロブリン
M蛋白質を有効成分とする(1)記載の抗リウマチ剤、
(4)遺伝子操作によって得られ、配列表の配列番号8
0で示されるアミノ酸配列を含むことから成る軽ポリペ
プチド鎖蛋白質、及び、配列表の配列番号86で示され
るアミノ酸配列を含むことから成る重ポリペプチド鎖蛋
白質のみから構成され、J鎖蛋白質を有さず、アポトー
シス誘導活性を有することを特徴とする免疫グロブリン
M蛋白質を有効成分とする(1)記載の抗リウマチ剤、
(5)遺伝子操作によって得られ、配列表の配列番号8
0で示されるアミノ酸配列を含むことから成る軽ポリペ
プチド鎖蛋白質、及び、配列表の配列番号88で示され
るアミノ酸配列を含むことから成る重ポリペプチド鎖蛋
白質のみから構成され、J鎖蛋白質を有さず、アポトー
シス誘導活性を有することを特徴とする免疫グロブリン
M蛋白質を有効成分とする(1)記載の抗リウマチ剤、
(6)遺伝子操作によって得られ、配列表の配列番号8
2で示されるアミノ酸配列を含むことから成る軽ポリペ
プチド鎖蛋白質、及び、配列表の配列番号86で示され
るアミノ酸配列を含むことから成る重ポリペプチド鎖蛋
白質のみから構成され、J鎖蛋白質を有さず、アポトー
シス誘導活性を有することを特徴とする免疫グロブリン
M蛋白質を有効成分とする(1)記載の抗リウマチ剤、
(7)遺伝子操作によって得られ、配列表の配列番号8
2で示されるアミノ酸配列を含むことから成る軽ポリペ
プチド鎖蛋白質、及び、配列表の配列番号88で示され
るアミノ酸配列を含むことから成る重ポリペプチド鎖蛋
白質のみから構成され、J鎖蛋白質を有さず、アポトー
シス誘導活性を有することを特徴とする免疫グロブリン
M蛋白質を有効成分とする(1)記載の抗リウマチ剤、
(8)遺伝子操作によって得られ、配列表の配列番号8
4で示されるアミノ酸配列を含むことから成る軽ポリペ
プチド鎖蛋白質、及び、配列表の配列番号86で示され
るアミノ酸配列を含むことから成る重ポリペプチド鎖蛋
白質のみから構成され、J鎖蛋白質を有さず、アポトー
シス誘導活性を有することを特徴とする免疫グロブリン
M蛋白質を有効成分とする(1)記載の抗リウマチ剤、
(9)遺伝子操作によって得られ、配列表の配列番号8
4で示されるアミノ酸配列を含むことから成る軽ポリペ
プチド鎖蛋白質、及び、配列表の配列番号88で示され
るアミノ酸配列を含むことから成る重ポリペプチド鎖蛋
白質のみから構成され、J鎖蛋白質を有さず、アポトー
シス誘導活性を有することを特徴とする免疫グロブリン
M蛋白質を有効成分とする(1)記載の抗リウマチ剤、
に関する。
ル抗体CH11をコードするDNAは、該抗体を産生す
るマウスハイブリドーマ細胞よりポリ(A)+ RNAを
調製し、該ポリ(A)+RNAを逆転写酵素でcDNA
に変換してから、該抗体のH鎖およびL鎖をコードする
DNAを単離することにより得られる。CH11産生ハ
イブリドーマは米原ら(Yonehara, S., et al. (1989)
J. Exp. Med. 169,1747参照)により、ヒト二倍体繊維
芽細胞FS−7で免疫して得られたマウスのリンパ球と
マウスミエローマ細胞とを細胞融合して得られたもので
ある。なお、ハイブリドーマ由来のCH11自体は
(株)医学生物学研究所より市販されている。
まず全RNAを調製し、該全RNAからオリゴ(dT)
セルロースやオリゴ(dT)ラテックスビーズ等のポリ
(A)+RNA精製用担体を用いて精製する方法、また
は細胞ライセートから該担体を用いて直接精製する方法
により実施できる。全RNAの調製方法としては、アル
カリ蔗糖密度勾配遠心分離法(Dougherty, W. G. and H
iebert, E. (1980) Viology 101, 466-474参照)、グア
ニジンチオシアネート・フェノール法、グアニジンチオ
シアネート・トリフルオロセシウム法、フェノール・S
DS法等も採用し得るが、グアニジンチオシアネートお
よび塩化セシウムを用いる方法(Chirgwin, J. M., et
al. (1979) Biochemistry 18, 5294-5299 参照)が好適
である。
鋳型として、逆転写酵素を用いて一本鎖cDNAを合成
した後、この一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを合成
することができる。この方法としてはS1ヌクレアーゼ
法(Efstratiadis, A., et al.(1976) Cell 7, 279-288
参照)、グブラー−ホフマン法(Gubler, U. and Hoffm
an, B. J. (1983) Gene 25, 263-269 参照)等を採用し
得るが、本発明においてはオカヤマ−バーグ法(Okayam
a, H. and Berg, P. (1982) Mol. Cell. Biol.2, 161-1
70 参照)が好適である。
クローニングベクターに組み込み、得られた組換えベク
ターを大腸菌等の微生物に導入して形質転換させ、テト
ラサイクリン耐性或いはアンピシリン耐性を指標として
形質転換体を選択することができる。大腸菌の形質転換
は、ハナハン法(Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol.16
6, 557-580 参照)、すなわち塩化カルシウムや塩化マ
グネシウムまたは塩化ルビジウムを共存させて調製した
コンピテント細胞に、該組換えDNAベクターを加える
方法により実施することができる。なお、ベクターとし
てプラスミドを用いる場合は、上記の薬剤耐性遺伝子を
有することが必要である。また、プラスミド以外のクロ
ーニングベクター、例えばラムダ系のファージ等を用い
ることもできる。
トFasマウスモノクローナル抗体の各サブユニットを
コードするDNAを有する株を選択する方法としては、
例えば以下に示す各種方法を採用できる。
用いるスクリーニング法 目的タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部が解明
されている(該配列は、複数個連続した特異的配列であ
れば、目的タンパク質のどの領域のものでもよい)場
合、該アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドを合
成し(この場合、コドン使用頻度を参考に推測されるヌ
クレオチド配列、または考えられるヌクレオチド配列を
組合せた複数個のヌクレオチド配列のいずれも採用で
き、また後者の場合イノシンを含ませてその種類を減ら
すこともできる)、これをプローブ( 32P、35Sあるい
はビオチン等で標識する)として、形質転換株のDNA
を変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリ
ダイズさせ、得られたポジティブ株を検索して、これを
選択する。
されている場合、該アミノ酸配列の一部に対応するセン
スストランドとアンチセンスストランドのオリゴヌクレ
オチドプライマーを合成し、これらを組合せてポリメラ
ーゼ連鎖反応(Saiki, R. K., et al.(1988) Science 2
39, 487-491 参照)を行ない、目的の抗ヒトFasマウ
スモノクローナル抗体サブユニットをコードするDNA
断片を増幅する。ここで用いる鋳型DNAとしては、抗
ヒトFas抗体CH11を産生するハイブリドーマのm
RNAより逆転写酵素反応にて合成したcDNAを用い
ることができる。このようにして調製したDNA断片
は、市販のキット等を利用して直接プラスミドベクター
に組み込むこともできるし、該断片を32P、35Sあるい
はビオチン等で標識し、これをプローブとして用いてコ
ロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリ
ダイゼーションを行なうことにより目的のクローンを選
択することもできる。
M 分子であり、H鎖、L鎖およびJ鎖の各サブユニット
からなる複合体である。これら各サブユニットの部分ア
ミノ酸配列を調べる方法としては、電気泳動やカラムク
ロマトグラフィー等、当業者に周知の分離方法を用いて
各サブユニットを単離してから、自動プロテインシーク
エンサー(例えば、島津製作所(株)社製PPSQ−1
0)等を利用してそれぞれのサブユニットのN末端アミ
ノ酸配列を解析する方法が好適である。
株より抗ヒトFasマウスモノクローナル抗体タンパク
質の各サブユニットをコードするDNAを採取する方法
は、公知の方法(Maniatis, T., et al.(1982) in "Mol
ecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Ha
rbor Laboratory, NY.参照)に従い実施できる。例えば
細胞よりベクターDNAに相当する画分を分離し、該プ
ラスミドDNAより該サブユニットをコードするDNA
領域を切り出すことにより行い得る。
された大腸菌株E. coli pCR3−H123お
よびE. coli pCR3−L103は平成8年
(1996年)2月28日付で工業技術院生命工学工業
技術研究所に国際寄託され、受託番号FERM BP−
5427およびFERM BP−5428が付されてい
る。従って、該寄託菌株からプラスミドを単離するか、
もしくは該寄託菌株の抽出物を鋳型にしてポリメラーゼ
連鎖反応( Polymerase Chain Reaction :以下、「PC
R」という。)を行うなどの方法により抗ヒトFasマ
ウスモノクローナル抗体タンパク質の各サブユニットを
コードするDNAを取得することができる。
定は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法(Maxa
m, A. M. and Gilbert, W.(1980) in "Methods in Enzy
mology" 65, 499-276 参照)やM13ファージを用いる
ジデオキシヌクレオチド鎖終結法(Messing, J. and Vi
eira, J.(1982) Gene 19, 269-276 参照)等により行う
ことができる。また近年、DNAのヌクレオチド配列を
決定するために、従来使用していたラジオアイソトープ
の代わりに蛍光色素を用いて、コンピュータの制御下で
ロボットにジデオキシ法を行わせ、電気泳動後のヌクレ
オチド配列の解読もコンピュータで行うシステムが普及
している(例えばパーキンエルマージャパン社製シーク
エンスロボット“CATALYST 800”およびモ
デル373ADNAシークエンサー等)。こうしたシス
テムを利用することで、DNAヌクレオチド配列決定操
作を能率よく、かつ安全に行うことができる。
列およびCH11のH鎖およびL鎖の各N末端アミノ酸
配列データから、CH11のH鎖およびL鎖の全アミノ
酸配列を決定することができる。
鎖およびL鎖の各アミノ酸配列と,カバトらにより決定
された、免疫グロブリンの公知のアミノ酸配列データと
を比較することにより、各アミノ酸配列におけるCD
R、FR領域および定常領域の位置を決定することがで
きる。
ヒト化するためには、決定されたCDR配列全体及びF
R配列の一部のアミノ酸残基をヒト抗体へ移植するよう
に、可変領域のアミノ酸配列を設計する必要がある。こ
の設計は、以下の方法に従う。
めに、あるひとつのドナー抗体からすべてのCDRがひ
とつのアクセプター抗体に移植されることが好ましいと
されているが、本発明では、ヒト化抗体の免疫グロブリ
ン活性が保持されるならば、全CDRでなくそれ未満の
個数のCDRを移植することが好ましい場合もあり得
る。また、ヒト化抗体の免疫グロブリン活性が保持され
るならば、CDRの一部のみを移植する場合も考えられ
る。
セプターのサブグループとしては、ドナーのサブグルー
プに対応するものが選択されていた。本発明において
は、ドナーのサブグループを考慮することなく、ヒト抗
体の一次配列のライブラリーの中からドナーのFRと最
も相同性の高いH鎖、L鎖のFRを選択する。この選択
法により、ドナー及びアクセプター間での、FR部分の
アミノ酸の同一性が少なくとも70%以上とすることが
可能となる。この方法を採用することによりドナーより
移植するアミノ酸残基の数をより少なくすることが可能
となり、HAMA 応答誘導を減少させることができる。ま
た、抗体分子の一次配列より三次構造を予測する操作
(以下、この操作を「分子モデリング」という。)はそ
の予測精度に限界があり、そのドナーが属するサブグル
ープにおいて稀にしか出現しないアミノ酸残基の役割を
十分に特定することができない。クィーンらの方法に従
い、かかる位置においてドナー、アクセプターのいずれ
のアミノ酸残基を選択すべきかを判断することは一般に
困難である。本発明の選択法によれば、このような判断
をする機会を著しく減少することができる。
同定法は、以下に従う。
べ、両者のFRの対応する位置でアミノ酸残基が異なっ
ていた場合、どちらの残基を選択するべきかを決定する
必要があるが、この選択においては、ドナー由来のCD
Rの三次元構造を損なわないよう選択を行う必要があ
る。
いて、FR上のアミノ酸残基が、以下の基準の少なくと
もひとつに該当する場合、CDR配列とともにアクセプ
ターに移植する方法を提唱した。 1)アクセプターのFR領域中のアミノ酸がその位置に
おいて稀であり、ドナーの対応するアミノ酸がアクセプ
ターの前記位置において普通である。 2)該アミノ酸がCDRのひとつのすぐ近くである。 3)該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいて
CDRの約3Å以内に側鎖原子を有し、そして抗原とま
たはヒト化抗体のCDRと相互作用することができると
予想される。
の性質を示すことより、本発明ではこの2)の規範を削
除し、別に新たに3種の規範を設ける。すなわち、本発
明では、CDRと共に移植すべきドナーのFR上のアミ
ノ酸残基については、 a)アクセプターのFR中のアミノ酸がその位置におい
て稀でありドナーの対応するアミノ酸が当該位置におい
て普通であるか、 b)該アミノ酸が三次元構造モデルにおいて、CDRの
構成アミノ酸原子と抗原又は移植すべきCDRループと
の相互作用が予想されるか、 c)当該位置がカノニカルクラス決定残基であるか、 d)当該位置がH鎖とL鎖の接触面を構成するか、また
は、 e)当該位置がドナー分子内部に存在する場合に、ドナ
ーのFRから当該アミノ酸残基を移植することにする。
い、同一サブクラスの抗体について当該位置で90%以
上の頻度で見いだされるアミノ酸を「普通」、10%未
満の頻度で見いだされるアミノ酸を「稀」と定義する。
クラス決定残基であるか」否かについては、前述したチ
ョッチアの表に従い、一義的に決定することができる。
めの抗体可変領域の分子モデリングが必要となる。分子
モデリング用ソフトウェアとしては、市販のものならい
ずれのものも採用し得るが、好適には、AbM(オック
スフォード・モレキュラー・リミティッド社製)を使用
することができる。
があるので、本発明においては、種々の抗体の可変領域
のX線結晶解析の実験結果を参照することにより、分子
モデリングから得られる構造予測の確からしさを2段階
に区別する。
ング用ソフトウェアによって構築されたところの可変領
域の3次元構造において、2原子間の距離が、各々のフ
ァンデルワールス力半径の和に0.5Åを加えた値より
短いとき、当該2原子間はファンデルワールス接触して
いると推定した。主鎖及び側鎖のアミド窒素、カルボニ
ル酸素など極性の原子間距離が平均の水素結合距離であ
る2.9Åに0.5Å加えた距離より短い場合は、その
間に水素結合が存在すると推定した。さらに、相反する
電価を持つ原子間が、2.85Åに0.5Å加えた距離
より短い場合は、その間にイオン対が形成されているも
のと推定した。
造解析の実験結果から、サブグループと無関係に、高頻
度にCDRとの接触が見いだされるFR上の位置とし
て、カバトの表に従い、L鎖では、1、2、3、4、
5、23、35、36、46、48、49、58、6
9、71、88番の位置、H鎖では、2、4、27、2
8、29、30、36、38、46、47、48、4
9、66、67、69、71、73、78、92、9
3、94、103番の位置が特定される。分子モデリン
グと同じ基準を適用した場合、これらの位置のアミノ酸
残基は、公知の抗体可変領域の3分の2においてCDR
のアミノ酸残基との接触が認められる。これらの知見に
基づき、b)の「該アミノ酸が三次元構造モデルにおい
て、CDRの構成アミノ酸原子が抗原又は移植すべきC
DRループとの相互作用が予想される」とは、以下の規
範を意味する。
の接触の可能性が予見されたFRの位置が、X線結晶解
析により実験的にFRとCDRとの接触が高頻度に検出
される位置のいずれかに一致する場合は、ドナーのアミ
ノ酸残基の移植を優先する。それ以外の場合は、この規
範b)は考慮しない。
構成する」とは、以下の規範を意味する。種々の抗体の
可変領域のX線結晶解析の実験結果から、カバトの表に
従い、L鎖においては、36、38、43、44、4
6、49、87、98番目のアミノ酸残基、H鎖におい
ては、37、39、45、47、91、103、104
番目のアミノ酸残基が、高頻度にH鎖−L鎖間接触をす
ることが認められている。分子モデリングにおいて、H
鎖−L鎖間接触の可能性が予見され、その位置が上述の
位置のいずれかに一致する場合は、ドナーのアミノ酸残
基の移植を優先する。それ以外の場合は、この規範d)
は考慮しない。
在する」とは、ペーダーソンらの報告(J. Mol. Biol.
235, 959-973, (1994)参照)を参考にして、当該アミノ
酸残基の表面露出度が50%以下であり、ドナー由来の
アミノ酸残基を使用しても当該アミノ酸残基が抗原性を
示さない場合をいう。すなわち、各位置の表面露出度を
( J. Mol. Biol., 55, 379-400 (1971) )記載の方法
により計算した場合、表面露出度が50%以下となる共
通位置は、カバトの表に従い、L鎖では、2、4、6、
11、13、19、21、23、35、37、47、4
8、58、61、62、71、73、75、78、8
2、83、84、86、88、102、104、106
番のアミノ酸残基であり、H鎖では、2、4、6、1
2、18、20、22、24、27、29、36、3
8、40、46、48、49、66、67、69、7
1、73、76、78、80、82、82c、86、8
8、90、92、94、107、109、111番のア
ミノ酸残基である。これらの位置で、疎水性、極性、側
鎖の大きさ等のアミノ酸の性質が大幅に変化しない場合
は、ドナーのアミノ酸残基の移植を優先する。それ以外
の場合は、この規範e)は考慮しない。
びL鎖の可変領域をコードするDNAは、以下の方法で
製造することができる。
DNAの部分ヌクレオチド配列から成る複数のポリヌク
レオチド断片を、センス側及びアンチセンス側において
互い違いになるように化学合成し、その後各ポリヌクレ
オチド断片をアニーリングし、DNAリガーゼにより結
合し、所望の抗ヒトFasヒト化抗体のH鎖及びL鎖の
可変領域をコードするDNAを有するDNAを得ること
ができる。
の全アミノ酸配列をコードするDNAをヒトリンパ球よ
り分離し、CDRをコードする領域に当業者に周知の方
法でヌクレオチド置換を行うことにより、制限酵素切断
配列を導入する。対応する制限酵素で該領域を切断した
後、ドナーのCDRを領域をコードするヌクレオチド配
列を合成し、DNAリガーゼにより結合して、所望の抗
ヒトFasヒト化抗体のH鎖及びL鎖の可変領域をコー
ドするDNAを得ることができる。
るオーバーラップ・エクステンション・PCR法(ホル
トンら、Gene, 77, 61-68, (1989) 参照)に従い、所望
の抗ヒトFasヒト化抗体のH鎖及びL鎖の可変領域を
コードするDNAを得ることができる。
配列をそれぞれコードする2種のDNAを、便宜的に
(A)及び(B)とする。(A)の5’側にアニールす
る20乃至40ヌクレオチドのセンスプライマ−(以
下、このプライマーを(C)とする。)及び(B)の
3’側にアニールする20乃至40ヌクレオチドのアン
チセンスプライマー(以下、このプライマーを(D)と
する。)を化学合成する。さらに、(A)の3’側の2
0乃至30ヌクレオチドと(B)の5’側20乃至30
ヌクレオチドを連結した、キメラ型のセンスプライマー
(以下、このプライマーを(E)とする。)及びこれに
相補的なアンチセンスプライマー(以下、このプライマ
ーを(F)とする。)を合成する。(A)を含む適当な
ベクターDNAを基質にして、センスプライマ−(C)
及びキメラ型アンチセンスプライマー(F)を用いたP
CRを行うことにより、(A)の3’末端に(B)の
5’末端側20乃至30ヌクレオチドが付加したDNA
を得ることができる(この新たに得られたDNAを
(G)とする。)。同様に、(B)を含む適当なベクタ
ーDNAを基質にして、アンチセンスプライマー(D)
及びキメラ型センスプライマー(E)を用いたPCRを
行うことにより、(B)の5’末端に(A)の3’末端
側20乃至30ヌクレオチドが付加したDNAを得るこ
とができる(この新たに得られたDNAを(H)とす
る。)。このようにして得られた(G)と(H)は、
(G)の3’側40乃至60ヌクレオチドと(H)の
5’側40乃至60ヌクレオチドにおいて相補的なヌク
レオチド配列を保持している。増幅された(G)及び
(H)を混合してPCRを行った場合、1回目の変性反
応で(G)と(H)は1本鎖になり、その後のアニーリ
ング反応で殆どのDNAは元に戻るが、一部のDNAに
ついては相補的ヌクレオチド配列領域でアニーリングす
るヘテロDNA2本鎖を形成する。その後の伸長反応
で、突出した1本鎖部分が修復され、(A)と(B)が
連結したキメラ型のDNA(以下、このDNAを(I)
とする。)を得ることができる。さらにこの(I)を基
質として、センスプライマー(C)とアンチセンスプラ
イマー(D)を用いPCRを行うことにより、(I)を
増幅することができる。本発明では、抗ヒトFasマウ
スモノクローナル抗体のH鎖及びL鎖のCDR領域をコ
ードするDNA及びヒト免疫グロブリン Ig M のFR領
域をコードするDNA、さらには、ヒト免疫グロブリン
Ig M の分泌シグナルをコードするDNAを、それぞれ
ケース・バイ・ケースにより(A)及び(B)として上
記の連結反応を行うことができる。
れ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば使用
する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定で
きる。これらヌクレオチド配列コドンの一部改変は、常
法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオ
チドからなるプライマーを利用したサイトスペシフィッ
ク・ミュータジェネシス(site specific mutagenesis
)(Mark, D. F., etal.(1984) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 81, 5662-5666参照)等に従うことができる。し
たがって、各プライマーを化学合成する際に、予め点突
然変異を導入するように各プライマーを設計することに
より、所望の抗ヒトFasヒト化抗体のH鎖及びL鎖の
可変領域をコードするDNAを得ることができる。
をそれぞれ発現ベクターに組み込むことにより、原核生
物または真核生物の宿主細胞を形質転換させることがで
きる。さらに、これらベクターに適当なプロモーターお
よび形質発現に関わる配列を導入することにより、各々
の宿主細胞において各遺伝子を発現させることが可能で
ある。
L鎖の可変領域をコードするDNAを組み込んだ、4種
の形質転換体、E.coli pHκKY2−58株、
E.coli pHκKF2−19株、E.coli
pHκRY2−10株及びE.coli pHκRF2
−52株、並びに、本発明の抗ヒトFasヒト化抗体の
H鎖の可変領域をコードするDNAを組み込んだ、2種
の形質転換体、E.coli pHμH5−1株及び
E.coli pHμM1−1株は、平成9年(199
7年)3月11日に工業技術院生命工学工業技術研究所
に国際寄託され、それぞれ受託番号FERM BP−5
861、BP−5860、BP−5859及びBP−5
862、並びに、BP−5863およびFERM BP
−5864が付されている。従って、該寄託菌株からプ
ラスミドを単離するか、もしくは該寄託菌株の抽出物を
鋳型にしてポリメラーゼ連鎖反応( Polymerase Chain
Reaction :以下、「PCR」という。)を行うなどの方
法により抗ヒトFasヒト化抗体タンパク質の各サブユ
ニットをコードするDNAを取得することができる。
(Esherichia coli )、や枯草菌(Bacillus subtilis
)等が挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞
内で形質発現させるには、宿主と適合し得る種由来のレ
プリコン、即ち複製起点およびlac UV5等のプロ
モーター配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細
胞を形質転換すれば良い。またベクターは、形質転換細
胞に表現形質(表現型)による選択性を付与することが
できる配列を持つものが望ましい。
K12株由来のJM109株等がよく用いられ、ベクタ
ーとしては、一般にpBR322やpUC系のプラスミ
ドがよく用いられるが、これらに限定されず、公知の各
種の菌株およびベクターがいずれも使用できる。プロモ
ーターとしては、大腸菌に於いてはラクトースプロモー
ター(lac)やトリプトファン・ラクトースプロモー
ター(trc)等が挙げられるが、これらに限定されな
い。
好ましく、ベクターとしてはpTUB228(Ohmura,
K., et al.(1984) J. Biochem. 95, 87-93参照)等が用
いられるが、これに限定されない。プロモーターとして
は、枯草菌α−アミラーゼ遺伝子の調節配列がよく用い
られ、さらに必要に応じてα−アミラーゼのシグナルペ
プチド配列をコードするDNA配列を連結することによ
り、菌体外への分泌も可能となる。
等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサル
の細胞であるCOS細胞(Gluzman, Y. (1981) Cell 2
3, 175-182 参照)等が用いられる。酵母としては、パ
ン酵母(Saccharomyces cerevisiae)や分裂酵母(Schi
zosaccharomyces pombe )等が用いられる。ここに例示
した細胞が一般に宿主細胞としてよく用いられている
が、これらに限定されない。
常は発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモー
ター、RNAスプライスィング部位、該遺伝子の下流に
位置するポリアデニル化部位および転写終結配列等を有
するものを使用でき、これにはさらに必要により複製起
点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、SV
40の初期プロモーターを有するpSV2dhfr(Su
bramani, S., et al.(1981) Mol. Cell. Bio. 1, 854-8
64参照)等を例示できるが、これに限定されない。
用いられており、パン酵母(S. cerevisiae )が例示で
きる。酵母の発現ベクターとしては、例えばアルコール
脱水素酵素遺伝子のプロモーター(Bennetzen, J. L. a
nd Hall, B. D.(1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025
参照)や、カルボキシルペプチダーゼ−Y(Ichikawa,
K., et al.(1993) Biosci. Biotech. Biochem. 57, 168
6-1690参照)等を利用できる。さらに、必要によりカル
ボキシルペプチダーゼ−Yのシグナルペプチド配列をコ
ードするDNA配列を連結することにより、細胞外への
分泌も可能となるが、これに限定されない。
を例に挙げると、発現ベクターとしては、SV40複製
起点を有し、COSにおいて自立増殖が可能であり、さ
らに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびR
NAスプライス部位を備えたものを用いることができ
る。該発現ベクターは、DEAE−デキストラン法(Lu
thman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids R
es. 11, 1295-1308 参照)、リン酸カルシウム−DNA
共沈法(Graham, F. L. and van der Eb, A. J.(1973)
Virology 52, 456-457 参照)および電気パルス穿孔法
(Neumann, E., et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845 参
照)などによりCOS細胞に取り込ませることができ、
かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。特
に、本発明の抗ヒトFasヒト化抗体のH鎖をコードす
るDNAを含むことからなる発現ベクターおよび抗ヒト
Fasヒト化抗体のL鎖をコードするDNAを含むこと
からなる発現ベクターでCOS細胞をコ・トランスフェ
クションすることにより、抗ヒトFasヒト化抗体を産
生する形質転換体を得て、これらのDNAを同時に発現
させることができる。
者に周知の方法に従って培養することができ、該培養に
より、形質転換体細胞内または細胞外に抗ヒトFasヒ
ト化抗体が産生される。該培養に用いられる培地として
は、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを
適宜選択でき、例えば上記COS細胞の場合、RPMI
−1640培地やダルベッコ修正イーグル最小必須培地
(DMEM)などの培地に、必要に応じウシ胎児血清
(FBS)などの血清成分を添加したものを使用でき
る。該形質転換体の培養の際の培養温度は、細胞内のタ
ンパク質合成能を著しく低下せしめない温度であればい
ずれでもよいが、好適には32〜42℃、最も好適には
37℃で培養することが好ましい。また必要に応じて、
1〜10%(v/v)の炭酸ガスを含む空気中で培養す
ることができる。
外に生産される本発明の抗ヒトFasヒト化抗体タンパ
ク質を含む画分は、該タンパク質の物理的性質や化学的
性質等を利用した各種公知の分離操作法により、分離・
精製することができる。かかる方法としては、具体的に
は例えば通常のタンパク質沈澱剤による処理、限外濾
過、分子ふるいクロマトグラフィー(ゲル濾過)、吸着
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマト
グラフィー(HPLC)等の各種クロマトグラフィー、
透析法、およびこれらの組み合わせ等を採用できる。
所望の抗ヒトFasヒト化抗体を製造できる。該抗体
は、ハイブリドーマにより産生されるCH11と比較す
ると、IgMを構成するJ鎖を欠いていても、CH11
と同等の細胞傷害活性を有する。
ク質がヒトFas抗原と特異的に結合することを確認す
る方法としては、例えば、96穴プレートのウェル底面
に固相化された該抗原に被検検体を接触させ、ウェルを
洗浄後ヒトIgMのH鎖(μ鎖)を特異的に認識する酵
素標識抗体を接触させ、再び洗浄した後、ウェルに残っ
た標識物を検出する酵素免疫測定法(以下「ELISA
法」という)を例示できる。ヒトFas抗原をコードす
るcDNAは既にクローニングされており、該cDNA
を動物細胞に導入し発現させる方法も公知となっている
(Itoh, N., etal. (1991) Cell 66, 233-243参照)。
また、このELISA法の抗原としては、ヒトFas抗
原の細胞外領域とマウスインターロイキン3受容体の細
胞外領域との融合タンパク質をコードする遺伝子を含む
発現ベクターで形質転換された細胞の培養上清を用いる
こともできる。
誘導活性を有することは、被検検体を添加した培地中で
細胞(例えば、ヒトリンパ球細胞株HPB−ALL(Mo
rikawa, S., et al. (1978) Int. J. Cancer 21, 166-1
70参照)またはJurkat(American Type Culture
No. TIB-152 )等)を培養し、その生存率をMTTアッ
セイ(Green, L. M., et al. (1984) J. Immunological
Methods 70, 257-268参照)等の方法で測定することに
より確認することができる。
の可変領域のみから構成されるFv断片や、H鎖とL鎖
を可撓性のあるペプチドで連結させた一本鎖Fv(sc
Fv)(Huston, J. S., et al. (1988) Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 85, 5879参照)等を遺伝子工学的手法に
より作製することが可能である。
ものを有効成分とする抗リウマチ剤として使用すること
ができる。かかる抗リウマチ剤は、種々の形態で投与す
ることができる。それらの投与形態としては、錠剤、カ
プセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投
与、または、注射剤、点滴剤、坐薬などによる非経口投
与をあげることができる。
って異なるが、通常、経口投与では、成人に対して、1
日約0.1mg ないし1000mgであり、これらを1 回、または
数回に分けて投与することができる。また、非経口投与
では、1 回0.1mg ないし1000mgを皮下注射、筋肉注射、
または静脈注射によって投与することができる。
れも遺伝子操作によりヒト化した免疫グロブリンを使用
するものであり、それらの免疫原性に伴う毒性は低い。
マウスモノクローナル抗体(CH11)をコードするD
NAのクローニングについて説明する。 参考例1. ヒトFasに対するマウスモノクローナル
抗体(CH11)の可変領域をコードするDNAのクロ
ーニング (1)ポリ(A)+ RNAの調製 CH11産生ハイブリドーマからの全RNAの調製は、
公知の方法(Chirgwin, J. M., et al.(1979) Biochemi
stry 18, 5294 参照)に従い実施した。すなわち、まず
CH11産生ハイブリドーマ(Yonehara, S., et al.
(1994) International Immunology 6, 1849-1856 参
照)を、10%のウシ胎児血清(ギブコ社製)を含むA
SF104培地(味の素(株)社製)中で培養し、約
6.7×108個の細胞を回収し、遠心して上清を除去
した。該細胞に60mlの4Mグアニジンチオシアネー
ト(フルカ社製)溶液を加え、ただちに混合した。21
ゲージの注射針を付けた注射筒で吸引・排出を3回繰り
返し、細胞を溶解させた。この細胞溶解液を、超遠心用
チューブ(13PA;日立工機(株)社製)中に入れた
3mlの5.7M 塩化セシウム/0.1M EDTA
(pH7.5)溶液に重層し、超遠心分離(日立製作所
製RPS−40Tローター、13PAチューブ、300
00rpm、20℃、18時間)することによりRNA
を沈澱させた。該沈澱を水に溶解し、クロロホルム/1
−ブタノール(4:1、v/v)抽出した後、エタノー
ル沈澱を行い、全RNAを回収した。
ポリ(A)+ RNAの精製は文献(Maniatis, T. et a
l. (1989) in "Molecular Cloning : A Laboratory Man
ual (2nd Edition), Cold Spring Harbor Lab., 7.26-
7.28参照)に掲載されている方法に従い実施した。すな
わち、ディスポーザブルポリスチレンカラム(φ0.7
cm)にオリゴdTセルロース(ファルマシア社製、タ
イプ7)100mgを充填し、ローディングバッファー
(20mM トリス−塩酸(pH7.6)、0.5M
塩化ナトリウム、1mM エチレンジアミン四酢酸(以
下「EDTA」という)、0.1% ドデシル硫酸ナト
リウム(以下「SDS」という))にて平衡化した。約
1.2mg/400μlのRNAを65℃で5分間加熱
した後、400μlの2倍濃度のローディングバッファ
ーを加え、室温まで冷却してからカラムに注入した。素
通り画分を回収し、65℃、5分間加熱した後、再度カ
ラムに注入した。10mlのローディングバッファーで
カラム内を洗浄した後、さらに、塩化ナトリウム濃度を
0.1Mに調整したローディングバッファー5mlでカ
ラム内を洗浄することにより、非吸着物および非特異的
吸着物を除去した。次いで5mlの溶出用緩衝液(10
mMトリス−塩酸(pH7.5)、1mM EDTA、
0.05% SDS)をカラムに注入して特異的吸着物
を溶出させ、溶出液を200μl毎に容器を替えて回収
した。3番目と4番目の溶出画分(計400μl)に4
0μlの3M 酢酸ナトリウム(pH4.0)および1
mlのエタノールを加え、−20℃で一晩保存した。翌
日、遠心分離(12000rpm、4℃、10分間)を
行なって沈澱を回収し、ポリ(A)+ RNA試料として
使用時まで−80℃で保存した。
ーニング マウス抗Fas抗体(CH11)のH鎖およびL鎖をコ
ードするcDNAは、以下に記載する方法、すなわち逆
転写酵素(RT)反応およびPCRを組み合わせて、上
記(1)で調製したCH11産生ハイブリドーマ由来の
ポリ(A)+ RNA画分より任意の配列を特異的に増幅
すること(以下、この操作を「RT−PCR」とい
う。)によりクローニングした。なお、RT−PCR用
のプライマーとしては、Ig−プライムセット(ノバジ
ェン社製)の中から、H鎖用としてMuIgVH5’−
BおよびMuIgMVH 3’−1、またL鎖用としてM
uIgκVL 5’−GおよびMuIgMVL 3’−1の
2組のプライマーセットを用いた。以下、該H鎖用また
はL鎖用各プライマーセットを使用したRT−PCR反
応を個別に実施した。
化カリウム、0.1mM dATP、0.1mM dG
TP、0.1mM dCTP、0.1mM dTTP、
1.5mM 塩化マグネシウム、2.5pmolのH鎖
用またはL鎖用3’側プライマー、上記(1)で調製し
たポリ(A)+RNA 50ngおよび20単位のMM
LV(Moloney murine leukemia virus )由来の逆転写
酵素(生化学工業(株)社製)を含有する逆転写酵素反
応溶液44μlを42℃にて1時間保温した。
たはL鎖用5’側プライマーおよび5単位のTaqDN
Aポリメラーゼ(AmpliTaqDNAポリメラー
ゼ:パーキンエルマー・ジャパン社製)を加えた反応溶
液100μlを、94℃で2分間保持した。次に94℃
で1分間、50℃で1分間、72℃で2分間の温度サイ
クルを30回繰り返した後、さらに72℃で10分間保
温した。なお、参考例及び実施例中のすべてのPCRの
反応温度調節にはジーンアンプPCRシステム9600
(パーキンエルマー・ジャパン社製)を使用した。
ース(FMCバイオプロダクツ社製)ゲル電気泳動を実
施した。同一ゲルで電気泳動した分子量マーカーのバン
ドと比較することにより、PCR産物のバンドの鎖長を
見積もった結果、H鎖用またはL鎖用プライマーセット
のいずれを使用した場合も約430bpであった。
社製)を用いて、上記b)で得られた各PCR産物をプ
ラスミドベクターに組み込んだ。すなわち、該PCR反
応液(電気泳動検定より目的とするPCR産物約10n
g相当量)とpCRIIベクター(キットに添付)50
ngを、リガーゼ反応緩衝液(6mMトリス−塩酸(p
H7.5)、6mM 塩化マグネシウム、5mM 塩化
ナトリウム、7mM β−メルカプトエタノール、0.
1mM ATP、2mM ジチオスレイトール(以下
「DTT」という)、1mM スペルミジン、0.1m
g/ml ウシ血清アルブミン)中で4単位のT4DN
Aリガーゼ(キットに添付)を加え、14℃で15時間
保温した。
ール2μlを加えたコンピテント大腸菌TOP10F’
株(キットに添付)50μlに上記リガーゼ反応液2μ
lを混ぜ合わせ、氷上で30分間、次いで42℃にて3
0秒間、そして再び氷上で2分間静置した。ついでSO
C培地(2% トリプトン、0.5% イーストエキス
トラクト、0.05% 塩化ナトリウム、2.5mM
塩化カリウム、1mM塩化マグネシウム、20mM グ
ルコース)500μlを加え、1時間往復振とう培養
(37℃、110rpm)した。該培養液を100μg
/mlのアンピシリンを含有するL−ブロス寒天培地
(1% トリプトン、0.5% イーストエキストラク
ト、0.5% 塩化ナトリウム、0.1% グルコー
ス、0.6%バクト・アガー(ディフコ社製))プレー
ト上に塗り広げ、37℃にて一晩静置培養した。プレー
ト上に現れた単一のアンピシリン耐性コロニーを選択
し、該コロニーを白金耳で掻き取って、100μg/m
lのアンピシリンを含有するL−ブロス培地5ml中で
37℃にて一晩培養した後、該培養物を遠心分離して沈
澱した菌体を回収し、アルカリ法(Maniatis, T., et a
l. (1989) in "Molecular Cloning: A Laboratory Manu
al (2nd Edition), Cold Spring Harbor Laboratory, N
Y 参照)によりプラスミドDNAを調製した。こうして
得られたプラスミドを、プラスミドpVH4(H鎖用プ
ライマーセットを使用して増幅された断片を含むプラス
ミド)およびpVL8(L鎖用プライマーセットを使用
して増幅された断片を含むプラスミド)と命名した。
ノ酸配列およびヌクレオチド配列の決定 (1)CH11のH鎖およびL鎖の可変領域のN末部分
アミノ酸配列の決定a)CH11の調製 10%のウシ胎児血清(ギブコ社製)を含むASF10
4培地(味の素(株)社製)中で2×108細胞数まで
増殖させたCH11産生ハイブリドーマを500mlの
無血清ASF培地で37℃、5日間培養した。遠心分離
(トミー精工(株)社製No.4ローター、8000r
pm、4℃、15分間)により、培養上清を集めた。培
養上清からのCH11モノクローナル抗体の調製は、イ
ー・ズィー・セップ(E−Z−Sep)抗体精製キット
(ファルマシアバイオテク社製)を用いた。
リドーマ培養上清100μl相当分)に、10%(v/
v)のβ−メルカプトエタノールおよび4%(w/v)
SDSを含む100mM トリス−塩酸緩衝液(pH
6.8)10μlを加え、95℃、5分間加熱し変性さ
せた。次にSDSにより変性させた試料を12%ポリア
クリルアミドゲルで電気泳動した。泳動後のゲルを、転
写緩衝液(25mM トリス−ホウ酸(pH9.5)、
10%メタノール(v/v))中に浸し、室温で15分
間振とうした後、セミドライブロッティング装置(岩城
硝子(株)社製)を用いてポリビニリデン・ジフルオリ
ド(以下「PVDF」という)膜(日本ミリポア社製)
に転写した(0.2A定電流、4℃、1時間)。転写後
のPVDF膜を、0.1%クマシーブリリアントブルー
溶液で染色し、100%メタノールで脱色した後、H
鎖、L鎖に相当する泳動度のタンパク質の染色スポット
を切り出して、室温で乾燥させた。
ンパク質のアミノ酸配列分析を、気相式プロテインシー
ケンサー(PPSQ−10;島津製作所(株)社製)を
用いて、自動エドマン法(Edman, P., et al. (1967) E
ur. J. Biochem. 1, 80 参照)により行った。
可変領域のN末端部分アミノ酸配列を配列表の配列番号
13に、同L鎖可変領域のN末端部分アミノ酸配列を配
列番号14にそれぞれ示す。
8に挿入されている、CH11のH鎖およびL鎖の可変
領域をコードするcDNAの全ヌクレオチド配列を、以
下に記載する方法により解析した。pCRIIベクター
はクローニング部位の両側にSP6プロモーター配列お
よびT7プロモーター配列を有するので、これらの配列
に対応するオリゴヌクレオチドプライマー(パーキンエ
ルマー・ジャパン社製)を利用することにより、クロー
ニング部位に挿入されたcDNA配列を解析することが
できる。これらのプライマーおよびダイプライマーサイ
クルシークエンシングキット(パーキンエルマー・ジャ
パン社製)を用いて、pVH4またはpVL8を鋳型と
した配列解析用サンプルをそれぞれ調製し、DNAシー
クエンサー(モデル373A:パーキンエルマー・ジャ
パン社製)を用いて各cDNAの配列を決定した。各c
DNAのヌクレオチド配列を配列表の配列番号15(H
鎖可変領域)および16(L鎖可変領域)にそれぞれ示
す。
15で示されるCH11のH鎖のN末端部分アミノ酸配
列は、配列番号15のヌクレオチド番号32〜76で示
されるヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列と完
全に一致しており、プラスミドpVH4はCH11のH
鎖可変領域をコードする遺伝子を含んでいることが確認
された。
21に示されるCH11のL鎖のN末端部分アミノ酸配
列は、配列番号16のヌクレオチド番号29〜91に示
されるヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列と完
全に一致しており、プラスミドpVL8はCH11のL
鎖可変領域をコードする遺伝子を含んでいることが確認
された。
鎖の全長をコードするDNAのクローニング (1)cDNAライブラリーの作製 cDNAライブラリーの作製は、オカヤマ−バーグ法
(Okayama, H., et al.(1987) Methods in Enzymology
154, 3-28参照)に従って実施した。すなわち、まず7
5単位のAMV(Avian myeloblastosis virus)由来逆
転写酵素(生化学工業(株)社製)を含む30μlの反
応液(50mM トリス−塩酸(pH8.3)、6mM
塩化マグネシウム、40mM 塩化カリウム、2mM
dATP、2mM dGTP、2mM dCTP、2
mM dTTP、2μgベクタープライマー(3’−オ
リゴ(dT)−テイルド・pcDV−1;ファルマシア
社製)中に参考例1(1)で調製したCH11産生ハイ
ブリドーマ由来のポリ(A) +RNA 5μgを添加し
て、37℃で30分間保温した。
ロロホルム(1:1、v/v)を添加して混合し、遠心
分離(12000rpm、室温、5分間)した後、水層
を回収した(以下、この操作を「フェノール−クロロホ
ルム抽出」という)。この水層に、35μlの4M 酢
酸アンモニウムと140μlのエタノールを加え、−7
0℃で15分間冷却した後、遠心分離(12000rp
m、4℃、15分間)して上清を除去し、75%エタノ
ールで沈澱を洗った後、減圧乾燥した。
し、5.6μlのターミナルトランスフェラーゼ反応液
(140mM カコジル酸ナトリウム、30mM トリ
ス−塩酸(pH6.8)、1mM 塩化コバルト、0.
5mM DTT、0.3μgポリアデニル酸(poly
(A);ファルマシア社製)、0.2mM dCTP)
を加えた。この反応液を37℃で5分間保温したのち、
21単位のターミナルデオキシヌクレオチジルトランス
フェラーゼ(ファルマシア社製)を加え、5分間反応さ
せた。その後、該反応液に対してフェノール−クロロホ
ルム抽出を行い、水層を回収した。次いで、該水層に2
0μlの4M酢酸アンモニウム、80μlのエタノール
を加え、−70℃で15分間冷却した後、遠心分離(1
2000rpm、4℃、15分間)して上清を除去し
た。沈澱を75%エタノールで洗った後、減圧乾燥し
た。
トリス−塩酸(pH7.5)、60mM 塩化ナトリ
ウム、7mM 塩化マグネシウム)に溶解し、30単位
の制限酵素HindIIIを添加して、37℃で一晩消
化した。次に、フェノール−クロロホルム抽出を行って
水層を回収した。ついで、該水層に、35μlの4M酢
酸アンモニウム、140μlのエタノールを加え、−7
0℃で15分間冷却した。次いで遠心分離(12000
rpm、4℃、15分間)により沈澱を回収し、75%
エタノールで沈澱を洗った後、減圧乾燥したものをcD
NA試料とした。
α296(武部 豊ら、(1989) 実験医学 7巻、95
−99参照)を制限酵素PstIで消化し、さらにその
3’末端にターミナルデオキシヌクレオチジルトランス
フェラーゼ(ファルマシア社製)によりdGTPを付加
させた。次いで、このものを制限酵素HindIIIで
消化することにより、SRαプロモーターにオリゴ(d
G)が付加されたオリゴ(dG)付きリンカーDNAを
作製した。
液(10mM トリス−塩酸(pH7.5)、1mM
EDTA)に溶解した。この溶液の1μlを上記オリゴ
(dG)付きリンカーDNA 0.08pmolを含む
反応用緩衝液(10mM トリス−塩酸(pH7.
5)、1mM EDTA、100mM 塩化ナトリウ
ム)に加え、65℃、5分間加熱し、ついで42℃、3
0分間保温した。該反応液に、10μlの10倍濃度リ
ガーゼ緩衝液(10mM ATP、660mM トリス
−塩酸(pH7.5)、66mM 塩化マグネシウム、
100mM DTT)、76μlの蒸留水、1μlの1
0mM β−ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチ
ド(以下「NAD」という;ベーリンガー・マンハイム
社製)を加え、氷上で10分間冷却した後、8.4μg
相当の大腸菌DNAリガーゼ(ファルマシア社製)を加
え、12℃で一晩保温した。
dATP、2mM dCTP、2mM dGTP、2
mM dTTP)、0.5μlの10mM NAD、4
2μg相当の大腸菌DNAリガーゼ(ファルマシア社
製)、4.1単位のDNAポリメラーゼI(ファルマシ
ア社製)、5.5単位のリボヌクレアーゼH(ファルマ
シア社製)を加え、12℃で1時間、次いで22℃で1
時間反応させた。このようにして作製されたcDNAラ
イブラリーを使用時まで−20℃で保存した。
可変領域のアミノ酸配列について、カバトら(Kabat E.
A. et al., (1991) in "Sequences of Proteins of Im
munological Interest Vol.II", U.S. Department of H
ealth and Human Services参照)により作成された抗体
のアミノ酸配列データベースと比較検討したところ、C
H11のH鎖(μ鎖)はサブクラス2aであることが判
明した。そこで、まず該データベース中のマウスH鎖サ
ブクラス2a型をコードするDNAの5’側非翻訳領域
の一部とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライ
マー:5'- ctaagggaat tccgcctctc ctcagacact gaa -3'
(H5−1;配列表の配列番号17)を合成した。ま
た、ゴールドバーグらにより報告されたマウスイムノグ
ロブリンμ鎖定常領域をコードするDNAのヌクレオチ
ド配列(Goldberg, I. G., et al. (1981) Gene 15, 33
-42 参照)を基に、その3’非翻訳領域のヌクレオチド
配列の一部とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプ
ライマー:5'- ttttactcta gagacccaag gcctgcctgg ttg
a -3' (H3−1;配列表の配列番号18)を合成し
た。
11のL鎖の可変領域のアミノ酸配列について、前記カ
バトらにより作成された抗体のアミノ酸配列データベー
スと比較検討したところ、CH11のL鎖はサブクラス
κ2であることが判明した。そこで、まず該データベー
ス中のマウスL鎖サブクラスκ2型をコードするDNA
の5’側非翻訳領域の一部とハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドプライマー:5'- aaataggaat tccagtctcc
tcaggctgtc tcc -3'(L5−1;配列表の配列番号1
9)を合成した。また、遺伝子配列データベースGen
bankに登録名MUSIGB1L1(受入番号D14
630)として登録されているマウスイムノグロブリン
κ鎖定常領域をコードするDNAのヌクレオチド配列を
基に、その3’非翻訳領域のヌクレオチド配列の一部と
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー:5'
- atgatctcta gagtggtggc atctcaggac ct -3' (L3−
1;配列表の配列番号20)を合成した。
その全アミノ酸配列および該配列をコードするDNAの
配列は公知である(Cann, G. M., et al. (1982) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 79, 6656-6660 参照)。この知
見に基づき、J鎖をコードするDNAの5’および3’
側の非翻訳領域の一部とハイブリダイズするオリゴヌク
レオチドプライマー:5'- ttgcggaatt cctcacctgt cctg
gggtta tt -3' (J5−1;配列表の配列番号21)お
よび5'- attgcctcta gagcctctaa ggacaacgag ct -3'
(J3−1;配列表の配列番号22)を合成した。
すべて自動DNA合成機380B(パーキンエルマー・
ジャパン社製)を用いて、ホスホアミダイド法(Mattru
cci,M. D. and Caruthers, M. H. (1981) J. Am. Che
m. Soc. 103, 3185-3191参照)で合成した。各プライマ
ーは合成終了後、支持体から開裂、脱保護したのち凍結
乾燥した。これらを蒸留水に溶解し、使用時まで−20
℃にて保存した。
化カリウム、1.5mM 塩化マグネシウム、2.5m
M dATP、2.5mM dGTP、2.5mM d
CTP、2.5mM dTTP、参考例4(1)に記載
のcDNAライブラリー0.1μl、1単位のTaq
DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー・ジャパン社
製)および上記a)で作製した各15pmolのオリゴ
ヌクレオチドプライマーを含有するPCR反応溶液10
0μlを、94℃で2分間加熱した。次いで94℃で1
分間、55℃で1分間、72℃で2分間の温度サイクル
を30回繰り返した後、さらに72℃で10分間保温し
た。各反応のプライマーの組み合わせは以下の通りであ
った: H5−1とH3−1(H鎖用); L5−1とL3−1(L鎖用); J5−1とJ3−1(J鎖用)。
れ0.8%(H鎖)および1.5%(L鎖およびJ鎖)
アガロース(FMCバイオプロダクツ社製)ゲル電気泳
動を実施した。同時に電気泳動した分子量マーカーのバ
ンドの泳動度から見積もった結果、それぞれのプライマ
ーの組み合わせによるPCR産物の鎖長は、約1900
bp(H鎖)、800bp(L鎖)および650bp
(J鎖)であった。
組み込むために、真核生物用TAクローニングキット
(インビトロジェン社製)を用いた。すなわち、各PC
R反応液(電気泳動検定より目的とするPCR産物約1
0ng相当量)とpCR3ベクター(キットに添付)6
0ngを含むリガーゼ反応緩衝液(6mMトリス−塩酸
(pH7.5)、6mM 塩化マグネシウム、5mM
塩化ナトリウム、7mM β−メルカプトエタノール、
0.1mM ATP、2mM DTT、1mM スペル
ミジン、0.1mg/ml ウシ血清アルブミン)中に
4単位のT4DNAリガーゼを加え、14℃で15時間
保温した。
ル 2μlを加えたコンピテント大腸菌TOP10F’
株(キットに添付)50μlに上記リガーゼ反応液2μ
lを混ぜ合わせ、氷上に30分間静置した後、42℃で
30秒間加温してから再び氷上に2分間静置した。この
ものにSOC培地500μlを加え、37℃で1時間往
復振とう培養(110rpm)した。この培養液を10
0μg/mlのアンピシリンを含有するL−ブロス寒天
培地プレート上に塗り広げ、37℃にて一晩培養した。
プレート上に現れたアンピシリン耐性の単一コロニーを
白金耳で掻き取り、100μg/mlのアンピシリンを
含有するL−ブロス培地5ml中で37℃にて一晩培養
した。該培養液を遠心分離して菌体を回収し、アルカリ
法に従ってプラスミドDNAを調製した。
れぞれpCR3−H123(H鎖をコードするcDNA
を含む)、pCR3−L103(L鎖をコードするcD
NAを含む)およびpCR3−J1123(J鎖をコー
ドするcDNAを含む)と命名された。また、これらの
プラスミドを保持する形質転換大腸菌E.colipC
R3−H123、E.coli pCR3−L103お
よびE.colipCR3−J1123は、1996
(平成8)年2月28日付で工業技術院生命工学工業技
術研究所に国際寄託され、それぞれ受託番号FERM
BP−5427、FERM BP−5428およびFE
RM BP−5429が付された。従って、CH11H
鎖、L鎖およびJ鎖をコードするDNAはそれぞれ該寄
託菌株から当業者に周知の方法を用いて調製することが
できる。
コードするcDNAの全ヌクレオチド配列の決定 (1)DNAのヌクレオチド配列の決定 マウスイムノグロブリンμ鎖は、そのN末端から約11
0残基の可変領域およびそれに隣接する約470残基の
定常領域からなる。またマウスイムノグロブリンκ鎖
は、そのN末端から約110残基の可変領域およびそれ
に隣接する107残基の定常領域からなる。これらのこ
とから、CH11H鎖およびL鎖をコードするcDNA
の全ヌクレオチド配列は、参考例2で明らかとなった各
鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列に、それぞ
れ既知の定常領域をコードするヌクレオチド配列(Kaba
t E. A. et al., (1991) in "Sequences of Proteins o
f Immunological Interest Vol.II", U.S. Department
of Health and Human Services参照)が連結しているも
のと推定された。また、J鎖をコードするヌクレオチド
配列は公知の配列と同一であると推定された。そこで、
これらの推定されるヌクレオチド配列を基に、60乃至
200bpの間隔で、20ヌクレオチドからなる配列に
対応するオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、配列
解析サンプル調製のために使用した。以下に記載する各
ヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマ
ーを合成した。: H鎖用: 5'- tggggcctca gtgaagatat -3'(SHF-2; 配列表の配列番号23) 5'- caatggtggt actggctaca -3'(SHF-3; 配列表の配列番号24) 5'- tgacatctga ggactctgca -3'(SHF-4; 配列表の配列番号25) 5'- tcctcagaga gtcagtcctt -3'(SHF-6; 配列表の配列番号26) 5'- tccttcacct ggaactacca -3'(SHF-7; 配列表の配列番号27) 5'- tcccaagagc atccttgaag -3'(SHF-8; 配列表の配列番号28) 5'- agatctgcat gtgcccattc -3'(SHF-9; 配列表の配列番号29) 5'- tctaaactca tctgcgaggc -3'(SHF-10; 配列表の配列番号30) 5'- ggtgaccatc gagaacaaag -3'(SHF-11; 配列表の配列番号31) 5'- aggggtctca ccttcttgaa -3'(SHF-12; 配列表の配列番号32) 5'- tcctttgccg acatcttcct -3'(SHF-13; 配列表の配列番号33) 5'- gtgtgtactg tgactcacag -3'(SHF-15; 配列表の配列番号34) 5'- aactgaacct gagggagtca -3'(SHF-16; 配列表の配列番号35) 5'- aactcttgcc ccaagagaag -3'(SHF-17; 配列表の配列番号36) 5'- atcctgactg tgacagagga -3'(SHF-18; 配列表の配列番号37) 5'- acaagtccac tggtaaaccc -3'(SHF-19; 配列表の配列番号38) 5'- aggatatctt cactgaggcc -3'(SHR-1; 配列表の配列番号39) 5'- atccactcaa ggctctttcc -3'(SHR-2; 配列表の配列番号40) 5'- actgcagagt cctcagatgt -3'(SHR-3; 配列表の配列番号41) 5'- agacggtgac tgaggttctt -3'(SHR-4; 配列表の配列番号42) 5'- caggtgaagg aaatggtgct -3'(SHR-5; 配列表の配列番号43) 5'- atgctcttgg gagacagcaa -3'(SHR-6; 配列表の配列番号44) 5'- ctctgttttt gcctccgtag -3'(SHR-7; 配列表の配列番号45) 5'- tggcctcgca gatgagttta -3'(SHR-8; 配列表の配列番号46) 5'- cctttgttct cgatggtcac -3'(SHR-9; 配列表の配列番号47) 5'- tgtggaggac acgttcttca -3'(SHR-10; 配列表の配列番号48) 5'- actttgagaa gcccaggaga -3'(SHR-12; 配列表の配列番号49) 5'- agatccctgt gagtcacagt -3'(SHR-13; 配列表の配列番号50) 5'- agcaggtgga tgtttgtgca -3'(SHR-14; 配列表の配列番号51) 5'- tgaagccact gcacactgat -3'(SHR-15; 配列表の配列番号52) 5'- agttccattc ctcctctgtc -3'(SHR-16; 配列表の配列番号53) 5'- tgtgtcagac atgatcaggg -3'(SHR-18; 配列表の配列番号54) L鎖用: 5'- tgaagttgcc tgttaggctg -3'(SLF-1; 配列表の配列番号55) 5'- cttggagatc aagcctccat -3'(SLF-2; 配列表の配列番号56) 5'- gctgaggatc tgggagttta -3'(SLF-3; 配列表の配列番号57) 5'- gatgctgcac caactgtatc -3'(SLF-4; 配列表の配列番号58) 5'- cgacaaaatg gcgtcctgaa -3'(SLF-5; 配列表の配列番号59) 5'- acgttgacca aggacgagta -3'(SLF-6; 配列表の配列番号60) 5'- atctgcaaga gatggaggct -3'(SLR-2; 配列表の配列番号61) 5'- accccagaaa atcggttgga -3'(SLR-3; 配列表の配列番号62) 5'- ccggaggaac atgtgtactt -3'(SLR-4; 配列表の配列番号63) 5'- tcgttcatac tcgtccttgg -3'(SLR-6; 配列表の配列番号64) 5'- catctcagga cctttgtctc -3'(SLR-7; 配列表の配列番号65) J鎖用: 5'- cacctgtcct ggggttattt -3'(SJF-1; 配列表の配列番号66) 5'- agacaagatg aagacccacc -3'(SJF-2; 配列表の配列番号67) 5'- aagcgaccat tcttgctgac -3'(SJF-3; 配列表の配列番号68) 5'- atatctctga tcccacctcc -3'(SJF-8; 配列表の配列番号69) 5'- gaaatgcgat cctgtggaag -3'(SJF-5; 配列表の配列番号70) 5'- ctataccact atggtcccac -3'(SJF-6; 配列表の配列番号71) 5'- agaagcaggt gggtcttcat -3'(SJR-2; 配列表の配列番号72) 5'- tagaggtaac tcgggtacac -3'(SJR-3; 配列表の配列番号73) 5'- aagttccttc tcagtgggga -3'(SJR-8; 配列表の配列番号74) 5'- ggtggcagta acaacctgat -3'(SJR-5; 配列表の配列番号75) 5'- catgatacct aagtgggacc -3'(SJR-6; 配列表の配列番号76) 各オリゴヌクレオチドプライマーは自動DNA合成機
(モデル380B:パーキンエルマー・ジャパン社製)
により前出ホスホアミダイト法で合成された。プラスミ
ドpCR3−H123、プラスミドpCR3−L10
3、またはプラスミドpCR3−J1123を鋳型と
し、上記プライマーおよびプリズム・レディ・リアクシ
ョン・ターミネーター・サイクル・シークエンシングキ
ット(パーキンエルマー・ジャパン社製)を用いて、配
列解析用サンプルを調製した。以下にその調製の一例を
記載する。
4.8pmolのプライマー(SHF-2 )を混合し、16
μlに調整した。キット添付のプレミックス(TaqD
NAポリメラーゼを含む)10.5μlに、9.5μl
のpCR3−H123/プライマー混合液を加え、自動
反応装置(カタリスト:パーキンエルマー・ジャパン社
製)の所定の位置にセットして反応(95℃で30秒、
50℃で15秒、60℃で4分の温度サイクルを25サ
イクル繰り返す)を行わせた。反応終了後のサンプルに
滅菌水80μlを加えてから、フェノール・クロロホル
ム抽出を2回行った後、水層に2M酢酸ナトリウム15
μlおよびエタノール300μlを加え、遠心分離を行
って沈澱を回収した。この沈澱を70%エタノールで洗
浄後、減圧乾燥してから、3μlの試料溶液(0.25
M EDTA 4μl、ホルムアミド 100μl、滅
菌水 16μlを混合したもの)に溶解した。
ンプル、L鎖用11サンプルおよびJ鎖用11サンプル
の各配列解析用サンプルについて、DNAシークエンサ
ー(モデル373A:パーキンエルマー・ジャパン社
製)を用いて配列を解析し、各サンプルの解析データを
統合することにより、CH11の各サブユニットをコー
ドするDNAのヌクレオチド配列を決定した。各プラス
ミドのcDNAヌクレオチド配列を配列表の配列番号
7、9および11にそれぞれ示す。また、これらのヌク
レオチド配列より推定される各アミノ酸配列を配列表の
配列番号8、10および12にそれぞれ示す。
示されるヌクレオチド配列は、配列番号15のヌクレオ
チド番号32〜379に示されるH鎖可変領域のヌクレ
オチド配列と完全に一致していた。カバトら(Kabat E.
A. et al., (1991) in "Sequences of Proteins of Im
munological Interest Vol.II", U.S. Department of H
ealth and Human Services参照)による抗体のアミノ酸
配列のデータベースとの相同性を比較検討した結果、配
列番号8のアミノ酸番号117〜571に示されるアミ
ノ酸配列は、マウスIgM由来のH鎖定常領域のアミノ
酸配列と完全に一致していた。また、配列番号8のアミ
ノ酸番号−19〜−1に示されるアミノ酸配列はCH1
1のH鎖のシグナル配列と決定された。さらに配列番号
7のヌクレオチド番号406〜1770に示されるヌク
レオチド配列は、マウスIgM由来のH鎖定常領域のヌ
クレオチド配列と完全に一致していた。以上の結果よ
り、CH11のH鎖の全アミノ酸配列が決定され、該ア
ミノ酸配列をコードするDNAが提供された。
に示されるL鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列番
号9のヌクレオチド番号58〜393に示されるヌクレ
オチド配列と完全に一致していた。上記(2)と同様に
抗体のアミノ酸配列のデータベースとの相同性を比較検
討した結果、配列番号10のアミノ酸番号113〜21
9に示されるアミノ酸配列は、マウスのκL鎖定常領域
のアミノ酸配列と完全に一致していた。また、配列番号
10のアミノ酸番号−19〜−1に示されるアミノ酸配
列は、L鎖のシグナル配列と決定された。さらに配列番
号9のヌクレオチド番号394〜714に示されるヌク
レオチド配列は、マウスのκL鎖定常領域のヌクレオチ
ド配列と完全に一致していた。以上の結果より、CH1
1のL鎖の全アミノ酸配列が決定され、該アミノ酸配列
をコードするDNAが提供された。
れるアミノ酸配列について、上記(2)および(3)と
同様に抗体のアミノ酸配列のデータベースとの相同性を
比較検討した結果、該アミノ酸配列は公知のマウスのJ
鎖のアミノ酸配列と完全に一致していた。また同様に、
配列番号11のヌクレオチド番号67〜477に示され
るヌクレオチド配列は、公知のマウスのJ鎖のヌクレオ
チド配列と完全に一致していた。さらに配列番号12の
アミノ酸番号−22〜−1に示されるアミノ酸配列は、
CH11のJ鎖のシグナル配列と決定された。以上より
CH11J鎖のアミノ酸配列が決定され、該アミノ酸配
列をコードするDNAが提供された。
変領域のアミノ酸配列における、それぞれのCDRの位
置および配列は、カバトらの文献(Kabat E. A. et a
l., (1991) in "Sequences of Proteins of Immunologi
cal Interest Vol.II", U.S. Department of Health an
d Human Services参照)による抗体のアミノ酸配列のデ
ータベースとの相同性を比較検討することによって決定
された。該文献によれば、異なる抗体間でもサブタイプ
が同じであれば可変領域中のフレームワーク領域の鎖長
はほぼ一定であり、またそのアミノ酸配列には共通性が
みられる。一方、CDRはそれらフレームワーク領域に
はさまれて存在する、各抗体に固有の配列である。CH
11のH鎖の可変領域のアミノ酸配列を、該データベー
ス中のマウスμ2aサブタイプの配列と比較した結果、
CH11のH鎖のCDRは配列表の配列番号8のアミノ
酸番号31〜35(CDRH1 :配列表の配列番号
1)、同アミノ酸番号50〜66(CDRH2 :配列表
の配列番号2)および同アミノ酸番号99〜105(C
DRH3 :配列表の配列番号3)で示されるアミノ酸配
列と決定された。また、CH11のL鎖の可変領域のア
ミノ酸配列を、該データベース中のマウスκ2サブタイ
プの配列と比較した結果、L鎖のCDRは配列表の配列
番号10のアミノ酸番号24〜39(CDRL1 :配列
表の配列番号4)、同アミノ酸番号55〜61(CDR
L2 :配列表の配列番号5)および同アミノ酸番号94
〜102(CDRL3 :配列表の配列番号6)で示され
るアミノ酸配列と決定された。
するが、本発明はこれらに限定されない。 実施例1.CH11の可変領域の分子モデリング CH11の可変領域の分子モデリングは、一般にホモロ
ジーモデリングとして知られる手法( Methods in Enzy
mology, 203, p121-153, (1991) 参照)を用いて行っ
た。すなわち、プロテイン・データ・バンク( Protein
Data Bank : Chemistry Department, Building 555, B
rookheaven National Laboratory, P.O. BOX 5000, Upt
on, NY 11973-5000, U.S.A. 参照:以下、「PDB」と
いう。)に登録されている、X線結晶構造解析が行われ
たヒト免疫グロブリンの可変領域の一次配列を、CH1
1のフレームワーク部分と比較し、相同性の最も高いフ
レームワークの3次元構造として、L鎖については1N
BV、H鎖として1IGIを選択した。両者を組み合わ
せて、フレームワーク部分の3次元構造(以下、「フレ
ームワークモデル」という。)を構築した。チョッチア
らの分類に従うと、CH11のCDRのうち、CDRL
1 はカノニカルクラス4、以下、CDRL2 はカノニカ
ルクラス1、CDRL3 はカノニカルクラス1、CDR
H1 はカノニカルクラス1に分類された。CDRH2 、
CDRH3 は、特定のカノニカルクラスに対応しなかっ
た。CDRL1 乃至CDRL3 及びCDRH1 のCDR
ループは、各カノニカルクラス固有のコンホメーション
に固定し、フレームワークモデルに組み込んだ。CDR
H2 、CDRH3 については、相同性の高い配列のコン
ホメーションをPDBより検索し、エネルギー計算を併
用する事によって、もっとも確からしいCDRループの
コンホメーションを構築し、フレームワークモデルに組
み込んだ。最終的には、エネルギー的に不利な原子間の
接触をなくすようにエネルギー計算を行い、CH11の
分子モデルを得た。上述の操作は市販の一般的な分子モ
デリングシステムを用いて行い得るが、本発明では、A
bM(オックスフォード・モレキュラー・リミティッド
社製)を用いた。
エアのプロチェック( PROCHECK :J. Appl. Cryst. (1
993) 26, 283-291)を用いて、構造の精度を評価した
後、各残基の表面露出度を計算し、原子間接触の有無を
検索した。 実施例2.アクセプターの選択 CH11のL鎖、H鎖の配列は、ヒト抗体の個々のサブ
グループのコンセンサス配列と比較された。CH11L
鎖はヒト・サブグループ・kappa IIと83%、CH11
H鎖はヒト・サブグループIと74%の同一性を示した
ので、配列相同性に基づき、アクセプターとして、それ
ぞれのサブグループに属するヒト抗体の中からL鎖とし
てはRPMI6410'CL 、H鎖としては21・28'CLを選択した。 実施例3.アクセプターに移植するドナー残基の選択 ソフトウェアのカメレオン(オックスフォード・モレキ
ュラー・リミティッド社製)を用いて、CH11のL
鎖、H鎖それぞれとアクセプターのアクセプターのアミ
ノ酸配列を整列し、先に述べたa)からe)の規範に従
いヒト化配列をデザインした。抗ヒトFas ヒト化抗体及
びそれをコードするDNAのヌクレオチド配列として、
以下の候補を選択した: L 鎖(κ鎖)としては、VL-KY鎖と命名されるポリペプ
チド鎖(配列番号78)及びそれをコードするDNAヌ
クレオチド配列(配列番号77)。
列番号80)及びそれをコードするDNAヌクレオチド
配列(配列番号79)。
列番号82)及びそれをコードするDNAヌクレオチド
配列(配列番号81)。
列番号84)及びそれをコードするDNAヌクレオチド
配列(配列番号83)。
れるポリペプチド鎖(配列番号86)及びそれをコード
するDNAヌクレオチド配列(配列番号85)。
列番号88)及びそれをコードするDNAヌクレオチド
配列(配列番号87)。実施例4.可変領域にサブグル
ープ I型をもつヒトH 鎖、及びサブグループ II型をも
つヒトL 鎖の全長をコードするDNA のクローニング、及
びその全ヌクレオチド配列の決定 (1)プライマーの作製 a )H 鎖 配列番号89に示すマウスモノクローナル抗体CH11 H鎖
の可変領域のアミノ酸配列についてカバトらにより作製
された抗体のアミノ酸配列データベース(Kabat E. A.
et al., (1991). in “Sequence of Proteins
of Immunological Interest Vol. II”U. S. Depart
ment of Health and Human Services. 参照)を検
索したところ、CH11のH 鎖(μ鎖)可変領域のフレーム
ワーク部分のアミノ酸配列と相同性のあるヒト型抗体H
鎖は、サブグループI型であることが判明した。そこ
で、まず該データベース中のヒト免疫グロブリンH 鎖サ
ブグループI型をコードするDNA の5'非翻訳領域の一部
とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー:
5-gggaattcatggactggacctggagg(a/t)tcct(c/t)tt-3'(
HVHI5-1とする:配列番号90)を合成した。また、ド
ライらにより報告されたヒト免疫グロブリンH鎖定常領
域をコードするDNA のヌクレオチド配列( Dorai,H. an
d Gillies,S.D.(1989). Nucleic Acids Res. 17:641
2 参照)を基に、その3'非翻訳領域のヌクレオチド配列
の一部とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライ
マー:5'-cctctagaggttagtttgcatgcacacacaga-3 ’(HC
μ3 -1とする:配列番号91)を合成した。 b )L 鎖 配列番号92に示したマウスモノクローナル抗体CH11 L
鎖の可変領域のアミノ酸配列について、前記カバトらに
より作製された抗体のアミノ酸配列データベースを検索
したところ、CH11のL 鎖(κ鎖)可変領域のフレームワ
ーク部分のアミノ酸配列と相同性のあるヒト型抗体κ鎖
は、サブグループII型であることが判明した。そこで、
まず該データベース中のヒト免疫グロブリンL 鎖サブグ
ループII型をコードするDNA の5'非翻訳領域の一部とハ
イブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー:5'-g
cgaattctgccttgactgatcagagtttcctca-3'(HVK II5-4 と
する:配列番号93)を合成した。またヒーターらによ
り報告されたヒト免疫グロブリンL 鎖定常領域をコード
するDNA のヌクレオチド配列(Hieter,P.A., et.al.
(1980). Cell 22:197 参照)を基に、その3'非翻訳領
域のヌクレオチド配列の一部とハイブリダイズするオリ
ゴヌクレオチドプライマー:5'-gctctagatgaggtgaaagat
gagctggagga-3'(HKCL3-3 とする:配列番号94)を合
成した。
すべて自動DNA 合成機380B(パーキンエルマー社製)を
用いて、ホスホアミダイド法(Mattrucci, M.D. and C
aruthers, M.H.(1981). J. Am.Chem.Soc. 103:3185
参照)で合成した。各プライマーは合成終了後、支持体
から開裂、脱保護したのち凍結乾燥した。これらを100
μl 蒸留水に溶解し、使用時まで -20℃にて保存した。 (2)PCR による標的遺伝子の増幅 CH11のH 鎖をコードするDNA 断片は、ヒトリンパ球cD
NAライブラリーを出発材料として、PCR法を用い
て、以下のように増幅・単離した。すなわち、94℃で下
記の反応液を2分間加熱した後、94℃で1 分間、55℃で
1 分間、72℃で2分間の温度サイクルを30回繰り返して
から、72℃で10分間加温した。 反応液組成: ヒトリンパ球cDNAライブラリー(ライフテクノロジー社製) 25 ng オリゴヌクレオチドプライマー HVHI5-1 50 pmol オリゴヌクレオチドプライマー HCμ3 -1 50 pmol 25 mM dNTPs 混合液 10 μl 100 mM トリス- 塩酸緩衝液(pH8.5 ) 10 μl 1 M 塩化カリウム 5 μl 25 mM 塩化マグネシウム 10 μl Taq DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社製) 1 単位 (再蒸留水を加えて100 μl とした。なお、 dNTPs:デオキシヌクレオチド三リ ン酸は、 dATP :デオキシアデノシン三リン酸、 dCTP :デオキシシトシン三リ ン酸 、 dGTP :デオキシグアノシン三リン酸、 dTTP :デオキシチミジン三リ ン酸の混合液をいい、以下同様とする。) CH11のL 鎖をコードするDNA 断片は、ヒトリンパ球cD
NAライブラリーを出発材料として、PCR法を用い
て、以下のように増幅・単離した。すなわち、94℃で下
記の反応液を2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55℃で
1 分間、72℃で2分間の温度サイクルを30回繰り返して
から、72℃で10分間加温した。 反応液組成: ヒトリンパ球cDNAライブラリー(ライフテクノロジー社製) 25 ng オリゴヌクレオチドプライマー HVKII5-4 50 pmol オリゴヌクレオチドプライマー HKCL3-3 50 pmol 25 mM dNTPs 混合液 10 μl 100 mM トリス- 塩酸緩衝液( pH 8.5 ) 10 μl 1 M 塩化カリウム 5 μl 25 mM 塩化マグネシウム 10 μl Taq DNA ポリメラーゼ(パーキンエルマー社製) 1 単位 (再蒸留水を加えて100 μl とした。) (3)PCR 産物の検定 上記(2)のPCR 後の反応液の一部(100 μl )をと
り、それぞれ 0.8% アガロースゲル電気泳動を実施し
た。同時に電気泳動した分子量マーカーのバンドの泳動
度から判定した結果、それぞれのPCR 産物の鎖長は、ヒ
ト免疫グロブリンH鎖では約2000塩基対(以下「bp」と
いう。)、ヒト免疫グロブリンL 鎖では約800bp であっ
た。 (4)PCR 産物のクローニング 上記(3)で合成が確認されたPCR 産物のプラスミドベ
クターへの組み込みは、真核生物用TAクローニングキッ
ト(登録商標:インビトロジェン社製)を用いて行なっ
た。すなわち、目的とするPCR 産物約10ng相当量を含む
各PCR 反応液とpCR3ベクターDNA (インビトロジェン社
TAクローニングキットに添付)60ngを含むリガーゼ反応
緩衝液[6mM トリス- 塩酸(pH7.5 )、6mM 塩化マグネ
シウム、5mM 塩化ナトリウム、7mM β- メルカプトエタ
ノール、0.1mM ATP 、2mM DTT 、1mM スペルミジン、0.
1mg/mlウシ血清アルブミン]中に4単位の T4 DNA リガ
ーゼを加え、14℃で15時間保温した。
を加えたコンピテント大腸菌 TOP10F ’株(インビトロ
ジェン社TAクローニングキットに予め添付) 50 μl
に、上記リガーゼ反応液2 μl を添加し、氷上に30分間
静置した。その後、SOC 培地(キットに予め添付)500
μl を加え、37℃で1時間振盪培養した。この培養液を
100μg/mlのアンピシリンを含むL-ブロス寒天培地プレ
ート[1%バクトトリプトン(ディフコ社製)、0.5%バク
トイーストエキストラクト(ディフコ社製)、0.1%グル
コース、0.5%塩化ナトリウム、1.2%バクトアガー(ディ
フコ社製)]上に塗布し、37℃にて一晩培養した。プレ
ート上に出現したアンピシリン耐性の単一コロニーを白
金耳で掻きとり、100 μg/mlのアンピシリンを含有する
L- ブロス液体培地[1%バクトトリプトン(ディフコ社
製)、0.5%バクトイーストエキストラクト(ディフコ社
製)、0.5%塩化ナトリウム]5ml に接種し、37℃下、一
晩、振盪培養した。得られた培養液より菌体を遠心分離
により回収し、アルカリ法(Sambrook,J. et. al.,(19
89). "Molecular Cloning. A Laboratory manual.Sec
ond edition." Cold Spring Harbor Laboratory Press.
参照)に従ってプラスミドDNA を調製した。
で消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動に供与した。同
時に電気泳動した分子量マーカーのバンドから判定し
て、ヒト免疫グロブリンH 鎖の場合約2000bp、ヒト免疫
グロブリンL 鎖の場合約800bpのDNA 断片を保持するク
ローンを選択した。
ードするDNA 断片を保持した、可変領域にサブグループ
I型をもつヒト免疫グロブリンH 鎖をコードする cDNA
を含むプラスミドpHH1-5、及び、ヒト免疫グロブリンL
鎖をコードするDNA 断片を保持したプラスミドpHL15-27
(可変領域にサブグループII型をもつヒト免疫グロブリ
ンL 鎖をコードする cDNA を含む)を得た。 (5)クローニングしたヒト免疫グロブリンH 鎖、ヒト
免疫グロブリンL 鎖をコードする cDNA の全ヌクレオチ
ド配列の確認 ヒト免疫グロブリンH 鎖は、そのN 末端から約 110アミ
ノ酸残基の可変領域、及びそれに隣接する約510 残基の
定常領域からなる。またヒト免疫グロブリンL鎖は、そ
のN 末端から約 110残基の可変領域、及びそれに隣接す
る 107残基の定常領域からなる。これらのことから、上
記(4)でクローニングしたヒト免疫グロブリンH 鎖を
コードする cDNA のヌクレオチド配列は、既知のサブグ
ループI型ヒト免疫グロブリンH 鎖(たとえばクローン
21/28’CL;Kabat E. A. et al.(1991). “Sequenc
e of Proteins of Immunological Interest Vol.
II”, U.S. Department of Health and Human Ser
vices.参照)可変領域をコードするヌクレオチド配列に
相同性の高いヌクレオチド配列に、既知のヒト免疫グロ
ブリンH 鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列(Ka
bat E. A. et al.(1991). “Sequence of Proteins
of Immunological Interest Vol. II”, U.S. Dep
artment of Health and Human Services.参照)が
連結しているものと考えられた。また同様に上記(4)
でクローニングしたヒト免疫グロブリンL 鎖をコードす
る cDNA の全ヌクレオチド配列は、既知のサブグループ
II型ヒト免疫グロブリンL 鎖(たとえばクローン RPMI6
410'CL;前出 Kabat E.A. et.al.(1991). 参照)可変
領域をコードするヌクレオチド配列に相同性の高いヌク
レオチド配列に、既知のヒト免疫グロブリンL 鎖定常領
域をコードするヌクレオチド配列(前出;Kabat E.A. e
t.al. (1991). 参照)が連結しているものと考えられ
た。そこで可変領域中の、配列がよく保存されているフ
レームワーク部分の公知のヌクレオチド配列、及び定常
領域内の公知のヌクレオチド配列を基に、100 乃至200b
p の間隔で、20ヌクレオチドからなる複数のオリゴヌク
レオチドプライマーを合成し、(2)のPCR で用いたプ
ライマー HVHI5-1、 HC μ3 -1、HVKII5-4 、及びHKCL3
-3 と共にヌクレオチド配列解析用に使用した。合成し
たH鎖用のオリゴヌクレオチドプライマーの各配列を以
下に示す。:5'-cctcgtctcctgtgagaatt-3'(SHHF-1とす
る:配列番号95)、5'-actctgacatcagcagtacc-3'(SH
HF-2とする:配列番号96)、5'-acgaacacgtggtgtgcaa
a-3'(SHHF-3とする:配列番号97)、5'-aagtccaagct
catctgcca-3'(SHHF-4とする:配列番号98)、5'-tac
aaggtgaccagcacact-3'(SHHF-5とする:配列番号9
9)、5'-aatgcgtcctccatgtgtgt-3'(SHHF-6とする:配
列番号100)、5'-agacctgaccacctatgaca-3'(SHHF-7
とする:配列番号101)、5'-tctgcgaggatgactggaat-
3'(SHHF-8とする:配列番号102)、5'-atgtctacttg
ctgccacca-3'(SHHF-9とする:配列番号103)、5'-t
tgtccccggagaagtatgt-3'(SHHF-10 とする:配列番号1
04)、5'-gtgtccgaagaggaatggaa-3'(SHHF-11 とす
る:配列番号105)、5'-ctcagtgaaggtttcctgca-3'
(SHHF-13 とする:配列番号106)、5'-aaaggcttgag
tggatggga-3'(SHHF-14 とする:配列番号107)、5'
-tgagcagcctgagatctgaa-3'(SHHF-15 とする:配列番号
108)、5'-ggtactgctgatgtcagagt-3'(SHHR-1とす
る:配列番号109)、5'-aatcactggaagaggcacgt-3'
(SHHR-2とする:配列番号110)、5'-tggcagatgagct
tggactt-3'(SHHR-3とする:配列番号111)、5'-agc
cagtcgctctctttgat-3'(SHHR-4とする:配列番号11
2)、5'-aggaagatgctggcaaagga-3'(SHHR-5とする:配
列番号113)、5'-tggtgtgggttttcacagct-3'(SHHR-6
とする:配列番号114)、5'-ttccagtcatcctcgcagat-
3'(SHHR-7とする:配列番号115)、5'-tggtggcagca
agtagacat-3'(SHHR-8とする:配列番号116)、5'-a
catacttctccggggacaa-3'(SHHR-9とする:配列番号11
7)、5'-gtgttccattcctcttcgga-3'(SHHR-10 とする:
配列番号118)、5'-tttaccggtggacttgtcca-3'(SHHR
-11 とする:配列番号119)、5'-tatccagaagccttgca
gga-3'(SHHR-12 とする:配列番号120)、5'-tgtgt
ccctggtaatggtga-3'(SHHR-13 とする:配列番号12
1)、5'-ctcgcacagtaataccacgc-3'(SHHR-14 とする:
配列番号122)、5'-tatccgacggggaattctca-3'(SHHR
-15 とする:配列番号123)。各プライマーが結合す
る位置を図3に示した。
イマーの各配列を以下に示す。:5'-tgtcttcatcttcccgc
cat-3'(SHKF-1とする:配列番号124)、5'-acgctga
gcaaagcagacta-3'(SHKF-2とする:配列番号125)、
5'-tccagtggggatgttgtgat-3'(SHKF-4とする:配列番号
126)、5'-agtgggtcaggcactgattt-3'(SHKF-5とす
る:配列番号127)、5'-tctcctgcaggtctagtcaa-3'
(SHKF-6とする:配列番号128)、5'-gggtaactcccag
gagagtg-3'(SHKF-11 とする:配列番号129)、5'-a
gggaccaaggtggaaatc-3' (SHKF-12 とする:配列番号1
30)、5'-tactttggcctctctgtgat-3'(SHKR-1とする:
配列番号131)、5'-acttcgcaggcgtagacttt-3'(SHKR
-2とする:配列番号132)、5'-tctcccctgttgaagctct
t-3'(SHKR-3とする:配列番号133)、5'-ttaaagcca
aggaggaggag-3'(SHKR-4とする:配列番号134)、5'
-ctccaccctgctgattttca-3'(SHKR-6とする:配列番号1
35)、5'-tgcagccacagtacgtttga-3'(SHKR-13 とす
る:配列番号136)。各プライマーが結合する位置を
図4に示した。 (4)記載のプラスミドpHH1-5 DNA、プラスミドpHL15-
27DNA を鋳型として、上記プライマー、及びプリズムレ
ディ・リアクション・ターミネーター・サイクルシーク
エンシング・キット(パーキンエルマー社製)を用い
て、配列解析用サンプルを調製した。即ち、精製した各
プラスミドDNA 1.5 μg と、予め合成した4.8pmol のプ
ライマーのひとつを混合し、16μl に調製した(以下、
この溶液を、「プラスミドDNA ・プライマー混合液」と
する。)。キットに添付されている、Taq DNA ポリメラ
ーゼを含むプレミックス溶液 10.5μl に、それぞれの
プライマーに対応するプラスミドDNA ・プライマー混合
液9.5 μl を加え、自動反応装置(カタリスト:パーキ
ンエルマー社製)にセットし、反応(反応条件:95℃で
30秒間、50℃で15秒間、60℃で4 分間の温度サイクルを
25サイクル繰り返す)を行なった。反応終了後のサンプ
ルに蒸留水80μl を加えてから、フェノール・クロロホ
ルム抽出を2 回行い、水層を回収した。得られた水層に
2M酢酸ナトリウム15μl 、及びエタノール300 μl を加
え、遠心分離を行って沈殿を回収した。この沈殿を70%
エタノールで洗浄後、真空乾燥し、3 μl の試料溶液
(0.25M EDTA 4μl 、ホルムアミド 100μl 、蒸留水16
μl を混合したもの)に溶解した。
ンプル(ヒト免疫グロブリンH 鎖用:30サンプル、ヒト
免疫グロブリンL 鎖用:17サンプル)を、DNA シークエ
ンサー(モデル 373A :パーキンエルマー社製)に供与
し、ヌクレオチド配列を解析した。各サンプルより得ら
れた解析データにより、プラスミドpHH1-5は、可変領域
がサブグループ I型のヒト免疫グロブリンH 鎖をコード
するDNA を保持していることが確認された。一方、プラ
スミドpHL15-27は、可変領域がサブグループII型のヒト
免疫グロブリンL 鎖をコードするDNA を保持しているこ
とが確認された。プラスミドpHH1-5が保持するDNA のヌ
クレオチド配列を配列番号137に、プラスミドpHL15-
27が保持するDNA のヌクレオチド配列を配列番号138
に示した。 実施例5.CH11 L鎖をヒト化した発現ベクターの構築 (1)プライマーの作製 選択したVL-KY 鎖のポリペプチド鎖(配列番号78)を
コードするDNA (配列番号77)、 VL-KF鎖のポリペプ
チド鎖(配列番号80)をコードするDNA (配列番号7
9)、 VL-RY鎖のポリペプチド鎖(配列番号82)をコ
ードするDNA (配列番号81)、またはVL-RF 鎖のポリ
ペプチド鎖(配列番号84)をコードするDNA (配列番
号83)の合成は、PCR 法を組み合わせて行なった。
イマーを作製した。作製した配列を以下に示す。:5'-a
gccggcctccatctcctgcagatctagtaagagccttgt-3'(VL1Pと
する:配列番号139)、5'-acaaggctcttactagatctgca
ggagatggaggccggct-3'(VL1Nとする:配列番号14
0)、5'-aagtttccaaccgattttctggggtcccagacagattcag-
3'(VL2Pとする:配列番号141)、5'-ctgaatctgtctg
ggaccccagaaaatcggttggaaactt-3'(VL2Nとする:配列番
号142)、5'-ggctgaggatgttggggtttattactgctctcaaa
gtacacatgttcctc-3'(VL3TYRP とする:配列番号14
3)、5'-gaggaacatgtgtactttgagagcagtaataaaccccaaca
tcctcagcc-3'(VL3TYRN とする:配列番号144)、5'
-ggctgaggatgttggggtttatttctgctctcaaagtacacatgttcct
c-3'(VL3PHEP とする:配列番号145)、5'-gaggaac
atgtgtactttgagagcagaaataaaccccaacatcctcagcc-3'(VL
3PHEN とする:配列番号146)、5'-ctcaaagtacacatg
ttcctccggcgttcggccaagggaccaaggtggaaat-3'(VL4Pとす
る:配列番号147)、5'-atttccaccttggtcccttggccga
acgccggaggaacatgtgtactttgag-3'(VL4Nとする:配列番
号148)、5'-gggctcgagtgccttgactgatcaggactcctcag
ttcac-3'(VL5Pとする:配列番号149)、5'-ggccagt
ctccaaggctcctgatctacaaag-3'(VL50RPとする:配列番
号150)、5'-ctttgtagatcaggagccttggagactggcc-3'
(VL50RNとする:配列番号151)、5'-ccctctagactaa
cactctcccctgttgaag-3'(VLTERMとする:配列番号15
2)。 (2)プラスミドpHκKY2-58、及びプラスミドpHκKF2-
19の作製 a )第一段階PCR 第一段階PCR の概要は図5に示した。
DRL1 領域のアミノ末端(以下、「N 末端」とする)
側をコードするDNA 断片(以下、「VL1 DNA 断片」とい
う。)は、PCR法により、以下の条件で作製された。 反応液組成:プラスミドpHL15-27 DNA 1 μg オリゴヌクレオチドプライマーVL5P 80 pmol オリゴヌクレオチドプライマーVL1N 80 pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10 x Pfu 緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製)10 単位 (再蒸留水を加えて200 μl とする。10xPfu緩衝液はPfu DNA ポリメラーゼに予 め添付された緩衝液を用いた) 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
末端」とする)側、CDRL1 領域、及びFRL2 領域
のN 末端側をコードするDNA 断片(以下、「VL2 DNA 断
片」という。)は、以下の条件で作製された。 反応液組成:プラスミドpCR3-L103 DNA 1 μg オリゴヌクレオチドプライマー VL1P 80 pmol オリゴヌクレオチドプライマー VL2N 80 pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10xPfu 緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製)10 単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
バトの番号による)をチロシン残基に変えたFRL3 領
域、及びCDRL3 領域をコードする DNA断片(以下、
「VL3Y DNA断片」という。)は、以下の条件で作製され
た。 反応液組成:プラスミドpHL15-27 DNA 1 μg オリゴヌクレオチドプライマー VL2P 80 pmol オリゴヌクレオチドプライマー VL3TYRN 80 pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10xPfu緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製) 10 単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
バトの番号による)をフェニルアラニン残基に変えたF
RL3 領域、及びCDRL3 領域をコードする DNA断片
(以下、「VL3F DNA断片」という。)は、以下の条件で
作製された。 反応液組成:プラスミドpHL15-27 DNA 1 μg オリゴヌクレオチドプライマー VL2P 80 pmol オリゴヌクレオチドプライマー VL3PHEN 80 pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10xPfu 緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製)10 単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
常領域の一部であるCk領域をコードするDNA 断片(以
下、「VL4 DNA 断片」という。)は、以下の条件で作製
された。 反応液組成:プラスミドpHL15-27 DNA 1 μg オリゴヌクレオチドプライマー VL4P 80 pmol オリゴヌクレオチドプライマー VLTERM 80 pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10xPfu 緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製)10 単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
F、及びVL4 DNA 断片は、フェノール抽出とエタノール
沈殿の後、5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動され、1
μg/mlの濃度のエチジウムブロミドにより染色した後、
紫外線照射下で検出された。検出されたそれぞれのDNA
バンドを、剃刀により切り取り、セントリコン10(アミ
コン社製)を装着したセントリリューター(アミコン社
製)を用いて、電気的にDNA をアクリルアミドゲルより
溶出した。溶出したDNA を7,500xg 、約1時間の遠心分
離により濃縮し、エタノール沈殿の後、50μl の蒸留水
に溶解した。 b )第二段階PCR 第二段階PCR の概要は図6に示した。
たDNA 断片(以下、「VL1-2 DNA 断片」という。)は、
以下の条件で作製された。 反応液組成:第一段階PCR で作製したVL1 DNA 溶液 10 μl 第一段階PCR で作製したVL2 DNA 溶液 10 μl オリゴヌクレオチドプライマー VL5P 80 pmol オリゴヌクレオチドプライマー VL2N 80 pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10xPfu緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製) 10 単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
たDNA 断片(以下、「VL3Y-4 DNA断片」という。)
は、以下の条件で作製された。 反応液組成:第一段階PCR で作製したVL3Y DNA溶液 10 μl 第一段階PCR で作製したVL4 DNA 溶液 10 μl オリゴヌクレオチドプライマー VL2P 80 pmol オリゴヌクレオチドプライマー VLTERM 80 pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10xPfu緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製) 10 単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
したDNA 断片(以下、「VL3F-4 DNA 断片」という。)
は、以下の条件で作製された。 反応液組成:第一段階PCR で作製したVL3F DNA溶液 10 μl 第一段階PCR で作製したVL4 DNA 溶液 10 μl オリゴヌクレオチドプライマー VL2P 80 pmol オリゴヌクレオチドプライマー VLTERM 80 pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10xPfu緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製)10 単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
VL3F-4 DNA断片は、フェノール抽出とエタノール沈殿の
後、5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動され、1 μg/ml
の濃度のエチジウムブロミドにより染色した後、紫外線
照射下で検出された。検出したVL1-2 、VL3Y-4、及びVL
3F-4に相当する融合DNA 断片を、剃刀で切り出し、セン
トリコン、及びセントリリューターを用いてアクリルア
ミドゲルより溶出した。溶出したDNA を7,500xg 、約1
時間の遠心分離により濃縮し、エタノール沈殿の後、50
μl の蒸留水に溶解した。 c )第三段階PCR 第三段階PCR の概要は図7に示した。
合したDNA 断片(以下、「VL-KY DNA 断片」という。)
は、以下の条件で作製された。 反応液組成:第二段階PCR で作製したVL1-2 DNA 溶液 10 μl 第二段階PCR で作製したVL3Y-4 DNA溶液 10 μl オリゴヌクレオチドプライマー VL5P 80 pmol オリゴヌクレオチドプライマー VLTERM 80 pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10xPfu緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製)10 単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
融合したDNA 断片(以下、「VL-KFDNA 断片」とい
う。)は、以下の条件で作製された。 反応液組成:第二段階PCR で作製したVL1-2 DNA 溶液 10 μl 第二段階PCR で作製したVL3F-4 DNA溶液 10 μl オリゴヌクレオチドプライマー VL5P 80 pmol オリゴヌクレオチドプライマー VLTERM 80 pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10xPfu緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製) 10 単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
A 断片は、フェノール抽出とエタノール沈殿の後、5%ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動され、1 μg/mlの濃度の
エチジウムブロミドにより染色した後、紫外線照射下で
検出された。検出したVL-KY、及びVL-KF に相当する融
合DNA 断片を、剃刀で切り出し、セントリコン、及びセ
ントリリューターを用いてアクリルアミドゲルより溶出
し回収した。
ラスミドの作成方法の概要は図8 に示した。
ノール抽出とエタノール沈殿により、さらに精製した
後、制限酵素XhoIと制限酵素XbaIにより消化した。
iyajima,A.(1992). EMBO J. 11:1875 参照)1 μg
を、予め制限酵素XhoIとXbaIで消化し、アルカリンフォ
スファターゼ・カウフ・インテスティン(Alkaline Pho
sphatase Calf Intestine :以下「CIP 」とする:宝酒
造社製)で脱リン酸化した。このようにして得られた脱
リン酸化プラスミドpME18S DNAと、予め制限酵素で消化
したVL-KY DNA 断片、またはVL-KF DNA 断片それぞれ
を、ライゲーションキット(宝酒造社製)を用いて連結
した後、大腸菌DH5 α株でクローニングした。これによ
りpME18SのSRαプロモーター下流に順方向にVL-KY DNA
断片、またはVL-KF DNA 断片が挿入されたプラスミドpH
κKY2-58(VL-KY DNA を保持する)とプラスミドpHκKF
2-19(VL-KFDNA を保持する)を得た。 (3)プラスミドpHκRY2-10、及びプラスミドpHκRF2-
52の作製 得られたプラスミドpHκKY2-58 DNA、及びプラスミドpH
κKF2-19 DNAを鋳型として、更に2 種類の発現ベクター
を作製した。 a )第一段階PCR 第一段階PCR の概要は図9に示した。
L1 領域、及び45位のアミノ酸残基(カバトの番号によ
る)をリジン残基からアルギニン残基に変えたFRL2
領域をコードする DNA断片(以下、「VLR5'- DNA断片」
という。)は、以下の条件で作製された。 反応液組成:プラスミドpHκKY2-58 DNA 1 μg オリゴヌクレオチドプライマー VL5P 80 pmol オリゴヌクレオチドプライマー VLRN 80 pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10xPfu緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製)10 単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
る)をリジン残基からアルギニン残基に変えたFRL2
領域、CDRL2 領域、87位がチロシン残基であるFR
L3領域、CDRL3 領域、FRL4 領域、及びCk領域
をコードする DNA断片(以下、「VLR3'Y DNA断片」とい
う。)は、以下の条件で作製された。 反応液組成:プラスミドpHκKY2-58 DNA 1 μg オリゴヌクレオチドプライマー VLRP 80 pmol オリゴヌクレオチドプライマー VLTERM 80 pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10xPfu緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製) 10 単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
る)をリジン残基からアルギニン残基に変えたFRL2
領域、CDRL2 領域、87位がフェニルアラニン残基で
あるFRL3 領域、CDRL3 領域、FRL4 領域、及
びCk領域をコードする DNA断片(以下、「VLR3'F DNA断
片」という。)は、以下の条件で作製された。 反応液組成:プラスミドpHκKF2-19 DNA 1 μg オリゴヌクレオチドプライマー VLRP 80 pmol オリゴヌクレオチドプライマー VLTERM 80 pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10xPfu緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製) 10 単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
VLR3'F DNA断片は、フェノール抽出とエタノール沈殿の
後、5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、1 μg/
mlの濃度のエチジウムブロミドにより染色した後、紫外
線照射下で検出された。検出したVLR5' 、VLR3'Y、及び
VLR3'Fに相当する融合DNA 断片を、剃刀で切り出し、セ
ントリコン、及びセントリリューターを用いてアクリル
アミドゲルより溶出した。溶出したDNA を7,500xg 、約
1時間の遠心分離により濃縮し、エタノール沈殿の後、
50μl の蒸留水に溶解した。 b )第二段階PCR 第二段階PCR の概要は図10に示した。
を融合したDNA 断片(以下、「VL-RY DNA 断片」とい
う。)は、以下の条件で作製された。 反応液組成:第一段階PCR で作製したVLR5' DNA 溶液 10 μl 第一段階PCR で作製したVLR3'Y DNA溶液 10 μl オリゴヌクレオチドプライマー VL5P 80 pmol オリゴヌクレオチドプライマー VLTERM 80 pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10xPfu緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製) 10 単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
を融合した DNA断片(以下、「VL-RF DNA 断片」とい
う。)は、以下の条件で作製された。 反応液組成:第一段階PCR で作製したVLR5' DNA 溶液 10 μl 第一段階PCR で作製したVLR3'F DNA溶液 10 μl オリゴヌクレオチドプライマー VL5P 80 pmol オリゴヌクレオチドプライマー VLTERM 80 pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10xPfu緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製) 10 単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
A 断片は、フェノール抽出とエタノール沈殿の後、5%ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行い、1 μg/mlの濃度
のエチジウムブロミドにより染色した後、紫外線照射下
で検出された。検出したVL-RY 、及びVL-RF に相当する
融合DNA 断片を、剃刀で切り出し、セントリコン、及び
セントリリューターを用いてアクリルアミドゲルより溶
出した。溶出したDNAを7,500xg 、約1時間の遠心分離
により濃縮し、エタノール沈殿の後、50μl の蒸留水に
溶解した。
ラスミドの作製方法の概要は図11に示した。
ノール抽出とエタノール沈殿により、さらに精製した
後、制限酵素XhoIと制限酵素XbaIにより消化した。
限酵素XhoIとXbaIで消化し、CIP で脱リン酸化した。こ
のようにして得られた脱リン酸化プラスミドpME18SDNA
と予め制限酵素で消化したVL-RY またはVL-RF DNA をそ
れぞれライゲーションキットを用いて連結した後、大腸
菌DH5 α株でクローニングした。これによりプラスミド
pME18SのSRαプロモーター下流に順方向でVL-RY DNA が
挿入されたプラスミドpHκRY2-10、またはプラスミドpM
E18SのSRαプロモーター下流にVL-RF DNA が挿入された
プラスミドpHκRF2-52を得た。 (4)ヌクレオチド配列の確認 作製したプラスミドpHκKY2-58、プラスミドpHκKF2-1
9、プラスミドpHκRY2-10、及びプラスミドpHκRF2-52
の挿入DNA が、目的とするヌクレオチドの配列を保持し
ているかどうかを確認するため、挿入DNA のヌクレオチ
ド配列の決定を行なった。ヌクレオチドの配列を決定す
るにあたり、用いたプライマーは前出のSHKF-4、 SHKF-
5 、 SHKR-6 、 SHKF-12、 SHKR-13、 SHKF-11、 SHKF-
2 、及び SHKR-3 、の他に新たに3 種類を合成した。合
成したプライマーは5'-ctgctctaaaagctgcggaa-3'( PME
F2とする:配列番号153)、5'-tagatctgcaggagargga
g-3'( SHKF-14とする:配列番号154)、及び5'-tat
gtttcaggttcaggggg-3'( PMER2とする:配列番号15
5)である。ヌクレオチド配列の決定は、アルカリSDS
法(Sambrook,J. et. al.,(1989). in "Molecular Cl
oning. A Laboratory manual. Second edition." Cold
Spring Harbor Laboratory Press. 参照)と塩化セシウ
ム法(Sambrook,J. et. al.,(1989). in "Molecular
Cloning. A Laboratory manual. Second edition." Col
d Spring Harbor Laboratory Press. 参照)により精製
した各プラスミドDNA を鋳型とし、ジデオキシヌクレオ
チド鎖終結法(Sanger,F.S. et. al.,(1977). Pro. N
atl. Acad. Sci. USA. 74:5463参照)で行なった。即
ち、1 μg の精製したプラスミドDNA を16μl の再蒸留
水に溶解し、2 μl の2mM EDTAと2 μl の2N水酸化ナト
リウムを加え、室温で5 分間静置した。その後、4 μl
の10M 酢酸アンモニウム溶液と100 μl のエタノールを
加え、攪拌の後ドライアイス上で10分間静置した。15,0
00rpm 、5分間の遠心分離の後、得られた沈殿を80% エ
タノールで洗浄後、真空乾燥した。真空乾燥したDNA を
7 μl の再蒸留水に溶解し、ヌクレオチド配列決定に用
いた。ヌクレオチド配列決定の反応は7-デアザ- シーク
エナーゼ・バージョン2.0 ・キットフォアdCTP(アマシ
ャム社製)を用いた。前出プラスミド溶液7 μl に、予
め合成したプライマー1pmol と、1 μl の反応緩衝液
(キットに予め添付されている緩衝液)を加え、65℃で
2 分間保温した。その後、室温まで徐冷しプライマーと
アニーリングさせ、[α-32P]dCTP(アマシャム社製)
で標識した。反応産物は、TBE緩衝液(100mM トリス、1
00mM ホウ酸、1mM EDTA、pH8.3 )中、8M尿素を含む5%
ポリアクリルアミドを用いてゲル電気泳動された。ゲル
を乾燥した後、オートラジオグラフィーを行いヌクレオ
チド配列を解読した。
A 断片は、配列番号77番に記載したヌクレオチド配列
を保持していた。得られた配列番号77番のヌクレオチ
ド配列よりポリペプチド鎖の読み枠を探索したところ、
配列番号78番に記載したポリペプチド鎖配列をコード
することを確認した。
配列番号79番に記載したヌクレオチド配列を保持して
いた。得られた配列番号79番のヌクレオチド配列より
ポリペプチド鎖の読み枠を探索したところ、配列番号8
0番に記載したポリペプチド鎖配列をコードすることを
確認した。プラスミドpHκRY2-10の挿入DNA 断片は、配
列番号81番に記載したヌクレオチド配列を保持してい
た。得られた配列番号81番のヌクレオチド配列よりポ
リペプチド鎖の読み枠を探索したところ、配列番号82
番に記載したポリペプチド鎖配列をコードすることを確
認した。プラスミドpHκRF2-52の挿入DNA 断片は、配列
番号83番に記載したヌクレオチド配列を保持してい
た。得られた配列番号83番のヌクレオチド配列よりポ
リペプチド鎖の読み枠を探索したところ、配列番号84
番に記載したポリペプチド鎖配列をコードすることを確
認した。 実施例6.CH11 H鎖のヒト化発現ベクターの構築 (1)プライマーの作製 選択したH μH 鎖(ヒト化抗Fas 抗体CH11 H鎖)のポリ
ペプチド鎖(配列番号86)をコードするDNA (配列番
号85)、またはH μM 鎖(ヒト化抗Fas 抗体CH11 H
鎖)のポリペプチド鎖(配列番号88)をコードするDN
A (配列番号87)の合成は、PCR 法を組み合わせて行
なった。
を作製した。作製した各配列を以下に示す。:5'-gggct
cgagctaagggaattccgcctctcctcagacactg-3'(VH1Pとす
る:配列番号156)、5'-gaactgcaggcgtccactctgaggt
gcagcttgtgcagtc-3'(VHSPとする:配列番号157)、
5'-gactgcacaagctgcacctcagagtggacgcctgcagttc-3'(VH
SNとする:配列番号158)、5'-aatatgcataaattcgaat
ggatgggatatatttatccttacaatggtgg-3'(VH2Pとする:配
列番号159)、5'-catccattcgaatttatgcatattatagtca
gtgaaggtgtatccagaag-3'(VH2Nとする:配列番号16
0)、5'-ccacattgactgttgacaattccgcgagcacagcctacat-
3'(VH3Pとする:配列番号161)、5'-atgtaggctgtgc
tcgcggaattgtcaacagtcaatgtgg-3'(VH3Nとする:配列番
号162)、5'-aagttactatggctatggactactggggccaggga
accct-3'(VH4Pとする:配列番号163)、5'-tagtcca
tagcatagtaacttctcgcacagtaatacacag-3'(VH4Nとする:
配列番号164)、5'-gggctcgaggccaaagagtctgggcccac
gacctacaag-3'(VHAPAPX とする:配列番号165)、
5'-cttgtaggtcgtgggcccagactctttggc-3'(VHAPANとす
る:配列番号166)、5'-gggtctagatcagtagcaggtgcca
gctgtg-3'(VHTERMとする:配列番号167)、5'-tatg
cattgggtgcgccaggcccccggacaaggactcgaatggatgggatatat
ttatcc-3'(HUMFR2P とする:配列番号168)、5'-cg
agtccttgtccgggggcctggcgcacccaatgcatattatagtcagtgaa
ggtgtatc-3'(HUMFR2N とする:配列番号169)、5'-
tatgcattgggtgaagcaggcccatggaaagagcctcgaatggatgggat
atatttatcc-3'( MOUFR2Pとする:配列番号170)、
5'-cgaggctctttccatgggcctgcttcacccaatgcatattatagtca
gtgaaggtgtatc-3'( MOUFR2 とする:配列番号17
1)、5'-gagcgactggctcagccagagcatgttcac-3'(GTOSP
とする:配列番号172)、5'-gtgaacatgctctggctgagc
cagtcgctc-3'(GTOSN とする:配列番号173)、5'-a
cctacatctgcgtggtggcccatgaggccctgccc-3'(TCVVAPとす
る:配列番号174)、5'-ggcctcatgggccaccacgcagatg
taggtctcccccgtgttccattcct-3'(TCVVN1とする:配列番
号175)、5'- gctttatttgtaaccattataagctg-3'(ME1
8P とする:配列番号176)、5'-catagtaacttctcgcac
agtaat-3'(VH06とする:配列番号178)。 (2)プラスミドpMEC22の構築 CH11ヒト化H 鎖発現ベクターを構築するために、まず、
ヒトIgM のH 鎖定常領域のカルボキシル末端(以下「C
末端」とする)側を保持するベクターを作製した。ヒト
IgM のH 鎖のC 末端側のアミノ酸配列をコードするDNA
断片(以下、「MEC DNA 断片」という。)はPCR により
作製した。作製法の概略を図12に示す。
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
ノール抽出とエタノール沈殿の後、5%ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行い、1 μg/mlの濃度のエチジウムブ
ロミドにより染色した後、紫外線照射下で検出された。
検出したMEC DNA 断片を、剃刀で切り出し、セントリコ
ン、及びセントリリューターを用いてアクリルアミドゲ
ルより溶出した。溶出したDNA を7,500xg 、約1時間の
遠心分離により濃縮し、エタノール沈殿の後、50μl の
蒸留水に溶解した。
方法の概略を図13に示した。得られたMEC DNA は、フ
ェノール抽出とエタノール沈殿によりさらに精製された
後、制限酵素XhoIと制限酵素XbaIにより消化された。
5, (1992) 参照) 1μg を、予め制限酵素XhoIとXbaIで
消化し、CIP で脱リン酸化した。このようにして得られ
た脱リン酸化プラスミドpME18S DNAと予め制限酵素で消
化されたMEC DNA 断片を、ライゲーションキットを用い
て連結した後、大腸菌JM109 株でクローニングした。こ
れによりpME18SのSRαプロモーター下流に順方向にMEC
DNA が挿入されたベクターpMEC22を得た。 (3)プラスミドpMEHC20 の作製 a )第一段階PCR 第一段階PCR の概略を図14に示した。
末端側をコードする DNA断片(以下、「HSEC DNA断片」
という。)は、以下の条件で作製された。 反応液組成:プラスミドpCR3-H123 DNA 1 μg オリゴヌクレオチドプライマー VHSN 80 pmol オリゴヌクレオチドプライマー VH1P 80 pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10倍Pfu緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製)10 単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
端側をコードするDNA 断片(以下、「VH1 DNA 断片」と
いう。)は、以下の条件で作製された。 反応液組成:プラスミドpHH1-5 DNA 1 μg オリゴヌクレオチドプライマー VHSP 80 pmol オリゴヌクレオチドプライマー VH2N 80 pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10倍Pfu緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製)10 単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
側、及びCDRH2 領域のN 末端側をコードするDNA 断
片(以下、「VH2 DNA 断片」という。)は、以下の条件
で作製された。 反応液組成:プラスミドpCR3-H123 DNA 1 μg オリゴヌクレオチドプライマー VH2P 80 pmol オリゴヌクレオチドプライマー VH3N 80 pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10倍Pfu緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製)10 単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
域、及びCDRH3 領域をコードするDNA 断片(以下、
「VH3 DNA 断片」という。)は、以下の条件で作製され
た。 反応液組成:プラスミドpHH1-5 DNA 1 μg オリゴヌクレオチドプライマー VH3P 80 pmol オリゴヌクレオチドプライマー VH4N 80 pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10倍Pfu緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製)10 単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
のN 末端側をコードするDNA 断片(以下、「VH4 DNA 断
片」という。)は、以下の条件で作製された。 反応液組成:プラスミドpHH1-5 DNA 1μg オリゴヌクレオチドプライマー VH4P 80pmol オリゴヌクレオチドプライマー VHAPAN 80pmol 25 mM dNTPs 混合液 20 μl 10倍Pfu緩衝液 20 μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製)10 単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
3 、及びVH4 DNA 断片は、フェノール抽出とエタノール
沈殿の後、5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、
1 μg/mlの濃度のエチジウムブロミドにより染色した
後、紫外線照射下で検出された。検出した各 DNA断片
を、剃刀で切り出し、セントリコン、及びセントリリュ
ーターを用いてアクリルアミドゲルより溶出した。溶出
したDNA を7,500xg 、約1時間の遠心分離により濃縮
し、エタノール沈殿の後、50μl の蒸留水に溶解した。 b )第二段階PCR 第二段階PCR の概要は図15に示した。
2 DNA 断片を融合したDNA 断片(以下、「VHS12 DNA 断
片」という。)は、以下の条件で作製された。 反応液組成:第一段階PCR で作製したHSEC DNA溶液 10μl 第一段階PCR で作製したVH1 DNA 溶液 10μl 第一段階PCR で作製したVH2 DNA 溶液 10μl オリゴヌクレオチドプライマー VH1P 80pmol オリゴヌクレオチドプライマー VH3N 80pmol 25 mM dNTPs 混合液 20μl 10倍Pfu緩衝液 20μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製) 10単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
した DNA断片(以下、「VH34 DNA断片」という。)は、
以下の条件で作製された。 反応液組成:第一段階PCR で作製したVH3 DNA 溶液 10μl 第一段階PCR で作製したVH4 DNA 溶液 10μl オリゴヌクレオチドプライマー VH3P 80pmol オリゴヌクレオチドプライマー VHAPAN 80pmol 25 mM dNTPs 混合液 20μl 10倍Pfu緩衝液 20μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製)10単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
断片は、フェノール抽出とエタノール沈殿の後、5%ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行い、1 μg/mlの濃度の
エチジウムブロミドにより染色した後、紫外線照射下で
検出された。検出した各 DNA断片を、剃刀で切り出し、
セントリコン、及びセントリリューターを用いてアクリ
ルアミドゲルより溶出した。溶出したDNA を7,500xg 、
約1時間の遠心分離により濃縮し、エタノール沈殿の
後、50μl の蒸留水に溶解した。 c )第三段階PCR 第三段階PCR の概要は図16に示した。
合したDNA 断片(以下、「VHS1234DNA 断片」とい
う。)は、以下の条件で作製された。 反応液組成:第二段階PCR で作製したVHS12 DNA 溶液 10μl 第二段階PCR で作製したVH34 DNA溶液 10μl オリゴヌクレオチドプライマー VH1P 80pmol オリゴヌクレオチドプライマー VHAPAN 80pmol 25 mM dNTPs 混合液 20μl 10倍Pfu緩衝液 20μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製) 10単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
フェノール抽出とエタノール沈殿の後、5%ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行い、1 μg/mlの濃度のエチジウ
ムブロミドにより染色した後、紫外線照射下で検出され
た。検出した各 DNA断片を、剃刀で切り出し、セントリ
コン、及びセントリリューターを用いてアクリルアミド
ゲルより溶出した。溶出したDNA を7,500xg 、約1時間
の遠心分離により濃縮し、エタノール沈殿の後、50μl
の蒸留水に溶解した。
製方法の概要は図17に示した。
とエタノール沈殿によりさらに精製した後、制限酵素Xh
oIと制限酵素ApaIにより消化した。
酵素XhoIとApaIで消化し、CIP で脱リン酸化した。この
ようにして得られた脱リン酸化プラスミドpMEC22 DNA
と、予め制限酵素で消化したVHS1234 DNA をライゲーシ
ョンキットを用いて連結した後、大腸菌JM109 株でクロ
ーニングした。これによりpMHC22のSRαプロモーター下
流に順方向にVHS1234 DNA 断片が挿入されたプラスミド
pMEHC20 を得た。 (4)プラスミドpHFR3 、及びプラスミドpHFR4 の作製 a )第一段階PCR 第一段階PCR の概要は図18に示した。
H1 領域、及び38位から44位までをアルギニン、グルタ
ミン、アラニン、プロリン、グリシン、グルタミン、グ
リシン残基に変えたFRH2 領域をコードするHUMFR5'
DNA 断片は、以下の条件で作製された。 反応液組成:プラスミドpMEHC20 DNA 1 μg オリゴヌクレオチドプライマー VH1P 80pmol オリゴヌクレオチドプライマー HUMFR2N 80pmol 25 mM dNTPs 混合液 20μl 10倍Pfu緩衝液 20μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製)10単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
ン、グルタミン、アラニン、プロリン、グリシン、グル
タミン、グリシン残基に変えたFRH2 領域、CDRH
2 領域、FRH3 領域、CDRH3 領域、FRH4 領
域、及びH 鎖定常領域のN 末端側をコードするDNA 断片
(以下、「HUMFR3' DNA 断片」という。)は、以下の条
件で作製された。 反応液組成:プラスミドpMEHC20 DNA 1 μg オリゴヌクレオチドプライマー VH06 80pmol オリゴヌクレオチドプライマー HUMFR2P 80pmol 25 mM dNTPs 混合液 20μl 10倍Pfu緩衝液 20μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製)10単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
H1 領域、及び38位から44位までをそれぞれリジン、グ
ルタミン、アラニン、ヒスチジン、グリシン、リジン、
セリン残基に変えたFRH2 領域をコードするDNA 断片
(以下、「MOUFR5' DNA 断片」という。)は、以下の条
件で作製された。 反応液組成:プラスミドpMEHC20 DNA 1 μg オリゴヌクレオチドプライマー VH1P 80pmol オリゴヌクレオチドプライマー MOUFR2N 80pmol 25 mM dNTPs 混合液 20μl 10倍Pfu緩衝液 20μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製) 10単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
ルタミン、アラニン、ヒスチジン、グリシン、リジン、
セリン残基に変えたFRH2 領域、CDRH2 領域、F
RH 3 領域、CDRH3 領域、FRH4 領域、及びH 鎖
定常領域のN 末端側をコードするDNA 断片(以下、「MO
UFR3' DNA 断片」という。)は、以下の条件で作製され
た。 反応液組成:プラスミドpMEHC20 DNA 1 μg オリゴヌクレオチドプライマー VH06 80pmol オリゴヌクレオチドプライマー MOUFR2P 80pmol 25 mM dNTPs 混合液 20μl 10倍Pfu緩衝液 20μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製) 10単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
MOUFR5' 、及びMOUFR3'DNA断片は、フェノール抽出とエ
タノール沈殿の後、5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行い、1 μg/mlの濃度のエチジウムブロミドにより染
色した後、紫外線照射下で検出された。検出した各 DNA
断片を、剃刀で切り出し、セントリコン、及びセントリ
リューターを用いてアクリルアミドゲルより溶出した。
溶出したDNA を7,500xg 、約1時間の遠心分離により濃
縮し、エタノール沈殿の後、50μl の蒸留水に溶解し
た。 b )第二段階PCR 第二段階PCR の概要は図19に示した。
NA断片を融合したDNA 断片(以下、「 HUMFR2 DNA 断
片」という。)は、以下の条件で作製された。 反応液組成:第一段階PCR で作製したHUMFR5' DNA 溶液 10μl 第一段階PCR で作製したHUMFR3' DNA 溶液 10μl オリゴヌクレオチドプライマー VH1P 80pmol オリゴヌクレオチドプライマー VH06 80pmol 25 mM dNTPs 混合液 20μl 10倍Pfu緩衝液 20μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製) 10単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
NA断片を融合した DNA断片(以下、「MOUFR2 DNA断片」
という。)は、以下の条件で作製された。 反応液組成:第一段階PCR で作製したMOUFR5' DNA 溶液 10μl 第一段階PCR で作製したMOUFR3' DNA 溶液 10μl オリゴヌクレオチドプライマー VH1P 80pmol オリゴヌクレオチドプライマー VH06 80pmol 25 mM dNTPs 混合液 20μl 10倍Pfu緩衝液 20μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製) 10単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
NA断片は、フェノール抽出とエタノール沈殿の後、5%ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行い、1 μg/mlの濃度
のエチジウムブロミドにより染色した後、紫外線照射下
で検出された。検出した各 DNA断片を、剃刀で切り出
し、セントリコン、及びセントリリューターを用いてア
クリルアミドゲルより溶出した。溶出したDNA を7,500x
g 、約1時間の遠心分離により濃縮し、エタノール沈殿
の後、50μl の蒸留水に溶解した。
るプラスミドの作成方法の概要は図20に示した。
ノール抽出とエタノール沈殿によりさらに精製した後、
制限酵素XhoIと制限酵素BglII により消化した。
限酵素XhoIとBglII で消化し、CIPで脱リン酸化した。
このようにして得られた脱リン酸化プラスミドpMEHC20
DNAと、予め制限酵素で消化したHUMFR2、またはMOUFR2
DNA断片を、ライゲーションキットを用いて連結した
後、大腸菌JM109 株でクローニングした。これによりHU
MFR2 DNA断片を保持するプラスミドpHFR3 とMOUFR2 DNA
断片を保持するプラスミドpHFR4 を得た。 (5)プラスミドpMECW5の作製 プラスミドpMECW5は、プラスミドpMEC22を鋳型として、
PCR により作製された。
HHC1 DNA断片は、以下の条件で作製された。 反応液組成:プラスミドpMEC22 DNA 1μg オリゴヌクレオチドプライマー ME18P 80pmol オリゴヌクレオチドプライマー GTOSN 80pmol 25 mM dNTPs 混合液 20μl 10倍Pfu緩衝液 20μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製) 10単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
域である DNA断片(以下、「HHC2 DNA断片」という。)
は、以下の条件で作製された。 反応液組成:プラスミドpMEC22 DNA 1μg オリゴヌクレオチドプライマー GTOSP 80pmol オリゴヌクレオチドプライマー TCVVN1 80pmol 25 mM dNTPs 混合液 20μl 10倍Pfu緩衝液 20μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製) 10単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
側領域である DNA断片(以下、「HHC3 DNA断片」とい
う。)は、以下の条件で作製された。 反応液組成:プラスミドpMEC22 DNA 1 μg オリゴヌクレオチドプライマー TCVVAP 80pmol オリゴヌクレオチドプライマー VHTERM 80pmol 25 mM dNTPs 混合液 20μl 10倍Pfu緩衝液 20μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製)10単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
DNA断片は、フェノール抽出とエタノール沈殿の後、5%
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、1 μg/mlの濃
度のエチジウムブロミドにより染色した後、紫外線照射
下で検出された。検出した各DNA断片を、剃刀で切り出
し、セントリコン、及びセントリリューターを用いてア
クリルアミドゲルより溶出した。溶出したDNA を7,500x
g 、約1時間の遠心分離により濃縮し、エタノール沈殿
の後、50μl の蒸留水に溶解した。 b )第二段階PCR 第二段階PCR の概要は図22に示した。
融合した DNA断片(以下、「HHC1-2DNA断片」とい
う。)は、以下の条件で作製された。 反応液組成:第一段階PCR で作製したHHC1 DNA溶液 10μl 第一段階PCR で作製したHHC2 DNA溶液 10μl オリゴヌクレオチドプライマー ME18P 80pmol オリゴヌクレオチドプライマー TCVVN 80pmol 25 mM dNTPs 混合液 20μl 10倍Pfu緩衝液 20μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製) 10単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
ェノール抽出とエタノール沈殿の後、5%ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行い、1 μg/mlの濃度のエチジウム
ブロミドにより染色した後、紫外線照射下で検出され
た。検出したDNA 断片を、剃刀で切り出し、セントリコ
ン、及びセントリリューターを用いてアクリルアミドゲ
ルより溶出した。溶出したDNA を7,500xg 、約1時間の
遠心分離により濃縮し、エタノール沈殿の後、50μl の
蒸留水に溶解した。 c )第三段階PCR 第三段階PCR の概要は図23に示した。
を融合した DNA断片(以下、「HHC123 DNA断片」とい
う。)は、以下の条件で作製された。 反応液組成:第一段階PCR で作製したHHC3 DNA溶液 10μl 第二段階PCR で作製したHHC1-2 DNA溶液 10μl オリゴヌクレオチドプライマー ME18P 80pmol オリゴヌクレオチドプライマー VHTERM 80pmol 25 mM dNTPs 混合液 20μl 10倍Pfu緩衝液 20μl Pfu DNA ポリメラーゼ(ストラタジーン社製)10単位 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
ェノール抽出とエタノール沈殿の後、5%ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行い、1 μg/mlの濃度のエチジウム
ブロミドにより染色した後、紫外線照射下で検出され
た。検出したDNA 断片を、剃刀で切り出し、セントリコ
ン、及びセントリリューターを用いてアクリルアミドゲ
ルより溶出した。溶出したDNA を7,500xg 、約1時間の
遠心分離により濃縮し、エタノール沈殿の後、50μl の
蒸留水に溶解した。
成方法の概要は図24に示した。
エタノール沈殿によりさらに精製した後、制限酵素XhoI
と制限酵素XbaIにより消化した。
酵素XhoIとXbaIで消化し、CIP で脱リン酸化した。この
ようにして得られた脱リン酸化pME18S DNAと予め制限酵
素で消化したHHC123 DNAを、ライゲーションキットを用
いて連結した後、大腸菌JM109 株でクローニングした。
これによりHHC123 DNAを保持するpMECW5を得た。 (6)CH11 H鎖のヒト化発現プラスミドpHμH5-1、及び
プラスミドpHμM1-1の作製 最終的に目的とする発現プラスミドpHμH5-1、及び発現
プラスミドpHμM1-1は、前作のプラスミドpHFR3 DNA 、
プラスミドpHFR4 DNA 、及びpMECW5 DNAを用いて行なっ
た。作製法の概要は図25に示した。
μg を、制限酵素ApaI、及びXhoIにより二重消化し、5%
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。泳動後の
ゲルを1 μg/mlの濃度のエチジウムブロミドにより染色
した後、紫外線照射下で検出された。分子量約950bp の
目的DNA 断片を含むバンドを剃刀にて切り出し、セント
リコン、及びセントリリューターを用いてアクリルアミ
ドゲルより溶出し回収した。
0μg を、制限酵素ApaI、及びXhoIにより二重消化し、5
%ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。泳動後
のゲルを1 μg/mlの濃度のエチジウムブロミドにより染
色した後、紫外線照射下で検出された。分子量約950bp
の目的DNA 断片を含むバンドを剃刀にて切り出し、セン
トリコン、及びセントリリューターを用いてアクリルア
ミドゲルより溶出し回収した。
oIとApaIで消化し、CIP で脱リン酸化した。このように
して得られた脱リン酸化プラスミドpMECW5 DNAと回収し
たHFR3 DNA、またはHFR4 DNAを、ライゲーションキット
を用いて連結した後、大腸菌DH5 α株でクローニングし
た。これによりHFR3 DNA断片を保持するプラスミドpHμ
H5-1と、HFR4 DNA断片を保持するプラスミドpHμM1-1を
得た。 (7)ヌクレオチド配列の確認 作製したプラスミドpHμH5-1、及びプラスミドpHμM1-1
それぞれの挿入DNA が、目的とするヌクレオチドの配列
を保持しているかどうかを確認するため、ヌクレオチド
配列の決定を行なった。ヌクレオチドの配列を決定する
にあたり、先に作製したプライマーME18P (配列番号1
76)、及びプライマーVH06(配列番号178)に加
え、更に8 種類のプライマーを作製した。作製したプラ
イマーは、5'-ctagatcagtagcaggtgccagctgtgtcg-3'(ME
18RVとする:配列番号177)、5'-gatacaccttcactgac
tataat-3' ( VH05 とする:配列番号179)、5'-cgt
cggatacgagcagcgtg-3'( VH07 とする:配列番号18
0)、5'-caccccgcgacggcttctt-3' ( VH08 とする:配
列番号181)、5'-ggatcacaggggcctgacct-3'( VH01
とする:配列番号182)、5'-ctgtgaaaacccacaccaac-
3'( VH02 とする:配列番号183)、5'-gctgaacctgc
gggagtcgg-3'( VH03 とする:配列番号184)、5'-g
tggcccatgaggccctgcc-3'( VH04 とする:配列番号18
5)である。
法(Sambrook,J. et. al.,(1989). in "Molecular Cl
oning. A Laboratory manual. Second edition." Cold
Spring Harbor Laboratory Press. 参照)と塩化セシウ
ム法(Sambrook,J. et. al.,(1989). in "Molecular
Cloning. A Laboratory manual. Second edition." Col
d Spring Harbor Laboratory Press. 参照)により精製
した各プラスミドDNAを鋳型とし、ジデオキシヌクレオ
チド鎖終結法(Sanger,F.S. et. al.,(1977). Pro. N
atl. Acad. Sci. USA. 74:5463参照)で行なった。
H5-1は配列番号86に示したポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列を、pHμM1-1は配列番号88に示した
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を保持して
いることを確認した。 実施例7.ヒト化 CH11 の各サブユニットをコードする
遺伝子のCOS-7 細胞での発現 作製したヒト化H 鎖DNA 、及びヒト化L 鎖DNA の発現
は、サル腎臓由来細胞株(以下、「COS-7 」とする)を
用いて行なった。上記で得られたヒト化H 鎖発現プラス
ミド、及びヒト化L 鎖発現プラスミドのCOS-7 細胞への
形質導入は、遺伝子導入装置 ECM600 M(BTX 社製)を
用いて、電気穿孔法により行った。即ち、COS-7 細胞
(American Type Culture Collection No. CRL-1651 )
を、10% のウシ胎児血清(CSL 社製)を含むダルベッコ
改変イーグル最小必須培地(以下、「DMEM」とする:日
水製薬社製)を入れた細胞培養用フラスコ(大角、培養
面積 225cm2:住友ベークライト製)中でセミコンフル
エントになるまで培養した。その後、培地を除去し、3m
l のトリプシン-EDTA 溶液(シグマ社製)中、 37 ℃、
3分間処理することによりCOS-7 細胞をフラスコから遊
離させた。遊離した細胞は、800rpm、2 分間の遠心分離
により回収し、リン酸緩衝液[0.02% 塩化カリウム、0.
02% リン酸2水素カリウム、0.8%塩化ナトリウム、1.15
% リン酸水素2ナトリウム、以下、「PBS (- )緩衝
液」とする;日水製薬社製]で2回洗浄した。洗浄した
COS-7細胞を PBS(- )緩衝液で 4x106細胞数/mlと
なるよう調製し、COS-7 細胞懸濁液とした。
プレップDNA ピュリフィケーションキット:プロメガ社
製)を用いて調製したH 鎖発現プラスミド DNA 40 μg
、及びL 鎖発現プラスミド DNA 40 μg を混合した
後、同一チューブ内でエタノール沈殿し、 PBS(- )緩
衝液 40 μl に懸濁した。得られたプラスミド懸濁液40
μl を、先に調製したCOS-7 細胞懸濁液500 μl (2x10
6 細胞数)と混合し、電極間隔 4mmのチャンバー(バイ
オラッド社製)に移し、遺伝子導入装置に装着した。そ
の後、150V-900μF の減衰波型パルスを与えることによ
り、目的とするプラスミドDNA をCOS-7 細胞内に導入し
た。パルスを与えた後のチャンバー内の細胞-DNA 混合
液を、10% ウシ胎児血清を含むDMEM 20ml に懸濁し、細
胞培養用フラスコ(中角、培養面積 75cm2:住友ベーク
ライト社製)に移した。7.5% CO2下、37℃、 24 時間培
養した後、培養上清を除き、無血清DMEM培地で細胞を洗
浄した。新しい無血清DMEM培地20mlを加え、7.5% CO
2下、37℃、24時間培養した後に培養上清を回収した。
から[I]のプラスミドの組み合わせでそれぞれCOS-7
細胞を形質転換し、培養上清を回収した。 [A]:pME18S [B]:pHμM1-1、及び pH κKY2-58 [C]:pHμM1-1、及び pH κKF2-19 [D]:pHμM1-1、及び pH κRY2-10 [E]:pHμM1-1、及び pH κRF2-52 [F]:pHμH5-1、及び pH κKY2-58 [G]:pHμH5-1、及び pH κKF2-19 [H]:pHμH5-1、及び pH κRY2-10 [I]:pHμH5-1、及び pH κRF2-52 実施例8.抗ヒト Fasヒト化抗体の検出 本発明により得られる抗ヒト Fasヒト化抗体の検出は、
SDS- ポリアクリルアミドゲル電気泳動(以下「SDS-PA
GE」とする)後、分離した蛋白質をニトロセルロース膜
へ電気的に転写・固定し、抗体により検出する方法(ウ
エスタンブロッティング法)により行なった。 (1)SDS-PAGEによる分離 実施例7で得られた培養上清を1ml を、5Lの純水に対し
て、排除限界12,000〜14,000の透析チュ−ブを用いて4
℃で15時間透析した後、遠心濃縮機(CC-101:トミー
精工社製)を用いて減圧乾燥させた。これにサンプル緩
衝液[2%(w/v) SDS(電気泳動用グレード:バイオラ
ッド社製)、5%(v/v )β- メルカプトエタノール(シ
グマ社製)、10% (v/v )グリセロール、0.1%ブロモフ
ェノール・ブルー]10μl を加えよく懸濁した後、100
℃で5分間加熱し、電気泳動用試料とした。得られた電
気泳動用試料全量を、SDS-PAGE(4 〜20% グラジエント
ゲル:岩城硝子社製)に重層し、20mA定電流下で電気泳
動した(室温下、1時間)。 (2)蛋白質の転写・固定 電気泳動終了後、ゲル内で分離した蛋白質をセミドライ
ブロッティング法(Towbin, H., et.al.(1979). Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350参照)によりニトロ
セルロース膜(トランスブロットトランスファーメンブ
レン:バイオラット社製)に電気的に転写した。転写
は、以下の条件で実施した。 転写用緩衝液: 20mMトリス、150mM グリシン、10%
(v/v )メタノール ブロッティング装置:ブロッティング装置(TF03-050:
岩城硝子社製) 実施条件: 4 ℃下、0.2A(定電流)、1 時間 H 鎖、及びL 鎖を個別に検出するため、SDS-PAGE、及び
ウェスタンブロッティングは、同時に二回行なった。こ
れにより、同一条件下で転写されたニトロセルロース膜
を二枚得た。得られたセルロース膜のうち、一方はH 鎖
検出用、残る一方をL 鎖検出用として用いた。 (3)抗体による検出 転写終了後のニトロセルロース膜を 3% (w/v )ゼラチ
ン(日本バイオラッド社製)を含む20mMトリス−塩酸緩
衝液(pH7.5 )、500mM 塩化ナトリウム(以下、「TBS
」とする)溶液に浸し、室温下、1時間、穏やかに振
盪した(以下、この操作を「ブロッキング」とする)。
ペルオキシダーゼ標識抗体(ペルオキシダーゼ−コンジ
ュゲーティド アフィニピュア ヤギ抗ヒトIgM 、Fc5
μフラグメント(Peroxidase-conjugated AffiniPure G
oatAnti-Human IgM, Fc5μ Fragment Specific):ジャ
クソンイムノリサーチラボラトリー社製)を用いて行な
った。抗ヒトIgM H 鎖標識抗体5 μl を含む10mlの緩衝
液(1%(w/v )ゼラチンを含むTBS 溶液)中で、ブロッ
キングを終えたニトロセルロース膜を、室温下、4 時間
振盪した。反応後、取り出したニトロセルロース膜を、
2%の Tween20(バイオラッド社製)を含むTBS 溶液20ml
中に浸し、室温下、20分間、穏やかに振盪し洗浄した。
同様の洗浄操作を再び繰り返した後、洗浄されたニトロ
セルロース膜の水分をペーパータオルで吸い取った。抗
体と反応した蛋白質は、抗体に予め結合させているペル
オキシダーゼの活性として検出することができる。そこ
で、ペルオキシダーゼ活性は化学発光基質を用いたECL
ウエスタンブロッティングシステム(アマシャム社製)
を用いて検出した。即ち、洗浄を終えたニトロセルロー
ス膜を、本システムに添付されている発光基質に浸し、
抗体の反応した蛋白質バンドを発光させた。発光は、イ
ンスタントフィルム(タイプ667 :ポラロイド社製)を
装着したECL ミニカメラ(アマシャム社製)により検出
した。ゲルに残存した蛋白質については、銀染色法にて
染色した。得られた写真と銀染色したゲルを照合するこ
とにより、各抗体と特異的に結合したバンドを同定し
た。
は、上述方法により行った。すなわち、ウェスタンブロ
ッティング法により特異的に検出された各培養上清中に
含まれるバンドと、各濃度に調整したヒトIgM (ピアス
社製)のバンドを、デンシトメーター(アトー社製)で
比較することにより行った。
ペルオキシダーゼ標識抗体(ペルオキシダーゼ標識抗ヒ
トκL 鎖モノクローナル抗体HP6156(Peroxidase-Label
ledMonoclonal Antibody to Human Kappa Light Chain
HP6156 ):キルケガードアンド ペリー ラボラトリ
ー社製)を用いて行なった。抗ヒトIgM L 鎖標識抗体10
μl を含む10mlの緩衝液(1%(w/v )ゼラチンを含むTB
S 溶液)中で、ブロッキングを終えたニトロセルロース
膜を、室温下、4 時間振盪した。反応後、取り出したニ
トロセルロース膜を、0.05% の Tween20を含むTBS 溶液
20ml中に浸し、室温下、20分間、穏やかに振盪し洗浄し
た。同様の洗浄操作を再び繰り返した後、洗浄されたニ
トロセルロース膜の水分をペーパータオルで吸い取っ
た。抗体が反応した蛋白質バンドは、ヒト化H 鎖同様、
ECL ウエスタンブロッティング検出システム(アマシャ
ム社製)を用い発光させ、インスタントフィルムを装着
したECL カメラにて検出した。得られた写真と銀染色し
たゲルを照合することにより、各抗体と特異的に結合し
たバンドを同定した。
スミドpHμH5-1を含む複数のプラスミドで形質転換した
COS-7細胞の培養上清由来の試料(実施例7記載の
[B]、[C]、[D]、[E]、[F]、[G]、
[H]、及び[I])のレーンには、ヒトH 鎖を特異的
に認識する抗体により、分子量約 78,000 のシグナルバ
ンドが検出された。またプラスミドpHκKY2-58、プラス
ミドpHκKF2-19、プラスミドpHκRY2-10、またはプラス
ミド pH κRF2-52を含む複数のプラスミドで形質転換し
た COS-7細胞の培養上清由来の試料(実施例7の
[B]、[C]、[D]、[E]、[F]、[G]、
[H]、及び[I])のレーンには、ヒトL 鎖を特異的
に認識する抗体により、分子量約25,000のシグナルバン
ドが検出された。 実施例9.抗Fas 抗体のFas 抗原に対する結合活性の測
定 本発明で得られる抗Fas 抗体のFas 抗原に対する結合能
の検定は、可溶性のヒトFas 抗原融合蛋白質を作製し、
これに対する結合能を検出する方法(以下「ELISA 法」
とする)により行なった。 (1)可溶性ヒトFas 抗原融合蛋白質の発現 可溶性ヒトFas 抗原を得るため、ヒトFas 抗原の細胞外
領域とマウス・インターロイキン3 受容体の細胞外領域
とを融合した融合蛋白質(以下、「ヒトFas 融合蛋白
質」とする)発現プラスミドベクターを作製した。ヒト
Fas 融合蛋白質をコードするDNA は、PCR 法により作製
した。 a )鋳型プラスミドDNA PCR を行なうにあたり、鋳型として用いたプラスミドDN
A は、マウス Fas抗原の細胞外領域(Watanabe-Fukunag
a,R., et.al.(1992). J.Immunol. 148:1274参照)と
マウスインターロイキン3 受容体の細胞外領域(Gorma
n,D., et.al. (1990). Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 87:
5459, Hara,T. and Miyajima,A.(1992). EMBO J. 11:
1875 参照)との融合蛋白質をコードするDNA の発現プ
ラスミドベクター pME18S-mFas-AIC(Nishimura, Y., e
t.al. (1995) J. Immunol. 154:4395 参照)、ヒト
Fas抗原をコードするcDNAを保持するプラスミドベクタ
ーpCEV4 (Itoh, N., et.al.(1991). Cell 66:233 )
である。 b )プライマーの作製 PCR を行なうにあたり、4 種のヌクレオチドプライマー
を作製した。作製した配列は、5'- ggggaattccagtacgga
gttggggaagctcttt-3' (N1とする:配列番号186)、
5'-gtttcttctgcctctgtcaccaagttagatctgga-3' (C3N と
する:配列番号187)、5'-tccagatctaacttggtgacaga
ggcagaagaaac-3' (N3N とする:配列番号188)、及
び5'- ccctctagacgcgtcacgtgggcatcac-3' (CTN2とす
る:配列番号189)である。 c )第一段階PCR 第一段階PCR の概略を図26に示した。
AS DNA断片は、LA PCRキット(宝酒造社製)を用いて、
以下の条件で作製された。 反応液組成:プラスミドpCEV4 DNA 20 ng オリゴヌクレオチドプライマーN1 0.5 μg オリゴヌクレオチドプライマーC3N 0.5 μg dNTPmix 25 μl 10xLA PCR 緩衝液 25 μl LA Taqポリメラーゼ(宝酒造社製) 12.5 単位 (再蒸留水を加えて250 μl とする。dNTPmix 、10x LA PCR緩衝液、及びLA Taq ポリメラーゼは、キットに添付されている物を用いた。) 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
領域をコードするMAIC DNA断片は、LA PCRキット(宝酒
造社製)を用いて、以下の条件で作製された。 反応液組成:プラスミドpME18S-mFas-AIC DNA 20 ng オリゴヌクレオチドプライマーN3N 0.5 μg オリゴヌクレオチドプライマーCTN2 0.5 μg dNTPmix 25 μl 10xLA PCR 緩衝液 25 μl LA Taqポリメラーゼ(宝酒造社製) 12.5 単位 (再蒸留水を加えて250 μl とする。dNTPmix 、10x LA PCR緩衝液、及びLA Taq ポリメラーゼは、キットに添付されている物を用いた。) 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
NA断片は、フェノール抽出とエタノール沈殿の後、5%ポ
リアクリルアミドケル電気泳動を行い、1 μg/mlの濃度
のエチジウムブロミドにより染色した後、紫外線照射下
で検出された。検出した各 DNA断片を、剃刀で切り出
し、セントリコン、及びセントリリューターを用いてア
クリルアミドゲルより溶出した。溶出したDNA を7,500x
g の遠心分離により濃縮し、エタノール沈殿の後、20μ
l の蒸留水に溶解した。 d )第二段階PCR 第二段階PCR の概要は図27に示した。
NA断片は、 LA PCR キット(宝酒造社製)を用いて、以
下の条件で作製された。 反応液組成:第一段階PCR で作製したHFAS DNA溶液 20 μl 第一段階PCR で作製したMAIC DNA溶液 20 μl オリゴヌクレオチドプライマー N1 0.5 μg オリゴヌクレオチドプライマー CTN2 0.5 μg dNTPmix 25 μl 10xLA PCR 緩衝液 25 μl LA Taqポリメラーゼ(宝酒造社製) 12.5 単位 (再蒸留水を加えて250 μl とする。dNTPmix 、10x LA PCR緩衝液、及びLA Taq ポリメラーゼは、キットに添付されている物を用いた。) 温度条件:94℃で2 分間加熱した後、94℃で1 分間、55
℃で1 分間、72℃で2 分間の温度サイクルを30回繰り返
してから、72℃で10分間加温した。
ノール抽出とエタノール沈殿の後、1%アガロースゲル電
気泳動を行い、1 μg/mlの濃度のエチジウムブロミドに
より染色した後、紫外線照射下で検出された。検出した
各 DNA断片を、剃刀で切り出し、セントリコン、及びセ
ントリリューターを用いてアガロースゲルより溶出し
た。溶出したDNA を7,500xg の遠心分離により濃縮し、
エタノール沈殿の後、50μl の蒸留水に溶解した。
作製方法の概略を図28に示した。得られたFASAIC DNA
は、フェノール抽出とエタノール沈殿によりさらに精製
した後、制限酵素EcoRI と制限酵素XbaIにより消化し
た。
を、予め制限酵素EcoRI とXbaIで消化し、0.8%アガロー
スゲル電気泳動を行なった。エチジウムブロミド1 μg/
mlにより染色した後、紫外線照射下で検出された約3000
bpのDNA バンドを剃刀で切り出し、DNA を回収した。こ
のようにして得られた制限酵素消化プラスミドpME18S-m
Fas-AIC DNA と、予め制限酵素で消化したFASAIC DNA断
片をライゲーションキットを用いて連結した後、大腸菌
DH5 α株でクローニングした。これによりSRαプロモー
ター下流に順方向にヒトFas 融合蛋白質をコードするFA
SAIC DNA断片が挿入されたプラスミドphFas-AIC2を得
た。 e )COS-7 細胞での発現 上記で得られたヒトFas 融合蛋白質発現プラスミドphFa
s-AIC2のCOS-7 細胞への形質導入は、遺伝子導入装置EC
M600M (BTX 社製)を用いて、電気穿孔法により行っ
た。即ち、COS-7 細胞を、10% のウシ胎児血清(CSL 社
製)を含むDMEM(日水製薬社製)を入れた細胞培養用フ
ラスコ(大角、培養面積 225cm2 :住友ベークライト
製)中でセミコンフルエントになるまで培養した。その
後、培地を除去し、3ml のトリプシン-EDTA 溶液(シグ
マ社製)中、 37 ℃、3分間処理することによりCOS-7
細胞をフラスコから遊離させた。遊離した細胞は、800r
pm、2分間の遠心分離により回収し、PBS (- )緩衝液
(日水製薬社製)で2回洗浄した。洗浄した COS-7細胞
を PBS(- )緩衝液で 4x106細胞数/mlとなるよう調製
し、COS-7 細胞懸濁液とした。
プレップ・DNA ピューリフィケーションシステム;プロ
メガ社製)を用いて調製したプラスミドphFas-AIC2 DNA
100μg をエタノール沈殿した後、PBS (- )緩衝液 1
00μl に懸濁した。得られたプラスミド懸濁液100 μl
を、先に調製したCOS-7 細胞懸濁液500 μl (2x106細
胞数)と混合し、電極間隔 4mmのチャンバー(バイオラ
ッド社製)に移し、遺伝子導入装置にセットした。その
後、150V-900μF の減衰波型パルスを与えることによ
り、目的とするプラスミドDNA は、COS-7 細胞内に導入
した。パルスを与えた後のチャンバー内の細胞-DNA混合
液を、10% ウシ胎児血清を含むDMEM 20mlに懸濁し、細
胞培養用フラスコ(中角、培養面積 75cm2:住友ベーク
ライト社製)に移した。7.5% CO2 下、37℃、 24 時間
培養した後、培養上清を除き、無血清DMEM培地で細胞を
洗浄した。新しい無血清DMEM培地20mlを加え、7.5% CO2
下、37℃、24時間培養した後に培養上清を回収した。 (2)ELISA 法による Fas抗原への結合能の検定 ELISA 法によるFas 抗原への結合能の検定は、以下の方
法によった。即ち、96ウエル E.I.A. プレート(コース
ター社製:3690 底面積 0.16cm2)の各ウエルに、上記
(1)で調製した COS-7培養上清と 50mM 炭酸-重炭酸
緩衝液(pH9.5)を 1:5で混合した溶液を50μl ずつ入
れ、4℃で一晩保温することにより、ウエル表面にヒト
Fas抗原融合蛋白質を吸着させた。吸着の後、各ウエル
を 0.05%の Tween-20 (EIA グレード:バイオラッド社
製)を含む PBS(- )緩衝液(以下、「PBS-T 」とす
る)で洗浄した。洗浄後、スーパーブロックブロッキン
グバッファー イン PBS (SuperBlock Blocking Buff
er in PBS :ピアス社製)を各ウエル当たり50μl ずつ
添加し、室温で2時間静置することによりブロッキング
した。再び、各ウエルをPBS-T で洗浄したのち、実施例
7で調製した培養上清希釈液 50 μl を各ウエルに添加
し、37℃下、2 時間保温した。その後、PBS-Tで洗浄し
たのち、10000 倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
ヒト IgMモノクローナル抗体(ジャクソンイムノリサー
チラボラトリー社製)50μl を各ウエルに分注し、37℃
下、2 時間保温した。PBS-T で洗浄したのち、50μl の
基質溶液(ペルオキシダーゼ基質セット・ABTS:バイオ
ラッド社製)を各ウエルに分注し、発色反応を行った。
各培養上清中に含まれる発現産物のヒト Fas抗原融合蛋
白質に対する結合活性は、マイクロプレートリーダー
(モデル 3550UV :バイオラッド社製)を用いて各ウエ
ルの 405nm、及び 492nmにおける吸光度を測定し、評価
した。
[D]、[E]、[F]、[G]、[H]及び[I]で
調製したヒト化発現産物に、ヒトFas 抗原融合蛋白質と
の結合性が認められた(図29及び30)。 実施例10.アポトーシス誘導活性の検定 上記の実施例7で調製した COS-7細胞培養上清の細胞障
害活性は、「Cell counting kit 」(和光純薬(株)
製)を使用し、該培養上清存在下で培養したヒトリンパ
球細胞株HPB−ALL細胞(以下、「HPB-ALL 細胞」
とする)の生存率を計測することにより算定した( Mor
ikawa, S., et al. (1978). Int. J. Cancer 21:166 参
照)。
ルカプトエタノール、0.33% 重炭酸ナトリウム(シグマ
社製)、及び10% ウシ胎児血清(CSL 社製)を含むRPMI
1640培地(日水製薬社製)(以下、「RPMI培地」とす
る)にて、5 % CO2下、37℃で培養した。対数増殖期に
あるHPB−ALL細胞を回収し、5×106 細胞/m
lになるようにRPMI培地にて懸濁し、HPB−ALL細
胞懸濁液とした。
社製)の各ウエルに、実施例7で調製された COS-7細胞
培養上清又はマウス抗ヒトFas抗体CH11(MBL
社)を50μl と、先に作製した HPB-ALL細胞懸濁液
(2.5×105 細胞/50μl )を50μl を分注し、5
% CO2下、37℃、20時間培養した。培養後、各ウエル
に、キットに含まれているWST−1溶液を10μl 添加
し、5% CO2下、37℃で2時間加温した。次に、マイク
ロプレートリーダーModel3550−UV(Bio
Rad社製)で各ウェルの450nm及び750nm
の2波長の吸光度を測定した。各 COS-7細胞培養上清及
びCH11溶液の IgM の濃度は、実施例8記載のウェ
スタン・ブロッティング試験におけるデンシトメーター
を用いた解析により算定された。HPB−ALL細胞の
%生存率は、下記式を用いて算定された。 生存率(%)=(A−C)/(B−C)×100 [ここで、A=HPB−ALL細胞をCH11または C
OS-7細胞培養上清存在下で培養した場合の残存細胞数、
B=(CH11または COS-7細胞培養上清非存在下で)
HPB−ALL細胞のみを培養した場合の残存細胞数、
C=(上記A又はBと同様に20時間インキュベートし
た場合の)HPB−ALL細胞が存在しない場合のRPMI
培地単独の数値を表す。] この結果は、図31に図示されている。細胞障害活性の
指標であるED50値は各実験において算定された。ED
50は細胞生存率が50%になるIgMの濃度を表す。以
下にその結果を示す。 検体 ED50(ng/ml) [B] 1.1 [C] 1.0 [D] 1.7 [E] 1.5 [G] 2.4 [I] 3.4 CH11 10.7 この結果より、J鎖を欠損する組換えIgM分子は、C
H11分子に比較して3ないし10倍高い細胞障害活性
を有することが明らかである。 製剤例1.本発明の抗ヒトFasヒト化モノクローナル
抗体は、水またはそれ以外の薬理学的に許容し得る溶液
に溶解した無菌性溶液または懸濁液のアンプルとして使
用に供され、また無菌粉末製剤(抗ヒトFasヒト化モ
ノクローナル抗体溶液を凍結乾燥するのが好ましい。)
をアンプルに充填しておき、同時に薬理学的に許容し得
る溶液で希釈してもよい。
Fas抗原に対し結合能を有し、優れたアポトーシス誘
導活性を有する。したがって、本抗体は、優れた抗リウ
マチ剤として有用である。
DNAのクローニングのためのcDNAライブラリーの
構築図。
DNAのクローニングの工程を示した図。
階PCR作成図
階PCR作成図
階PCR作成図
2−19の構築図
階PCR作成図
段階PCR作成図
F2−52の構築図
成図
成図
成図
断片の第一段階PCR作成図
断片の第二段階PCR作成図
図
成図
成図
成図
図
成図
成図
定図
るcDNAにハイブリダイズするプライマー 配列番号:18 マウスイムノグロブリンμ鎖定常領域をコードするcD
NAにハイブリダイズするプライマー 配列番号:19 マウスイムノグロブリンκ鎖定常領域をコードするcD
NAにハイブリダイズするプライマー 配列番号:20 マウスイムノグロブリンκ鎖定常領域をコードするcD
NAにハイブリダイズするプライマー 配列番号:21 マウスイムノグロブリンJ鎖をコードするcDNAにハ
イブリダイズするプライマー 配列番号:22 マウスイムノグロブリンJ鎖をコードするcDNAにハ
イブリダイズするプライマー 配列番号:23 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:24 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:25 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:26 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:27 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:28 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:29 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:30 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:31 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:32 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:33 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:34 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:35 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:36 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:37 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:38 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:39 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:40 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:41 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:42 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:43 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:44 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:45 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:46 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:47 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:48 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:49 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:50 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:51 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:52 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:53 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:54 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のH鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:55 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のL鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:56 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のL鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:57 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のL鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:58 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のL鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:59 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のL鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:60 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のL鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:61 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のL鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:62 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のL鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:63 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のL鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:64 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のL鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:65 マウス抗ヒトFasモノクローナル抗体CH11のL鎖
をコードするcDNAのシークエンシング用プライマー 配列番号:66 マウスイムノグロブリンJ鎖をコードするcDNAのシ
ークエンシング用プライマー 配列番号:67 マウスイムノグロブリンJ鎖をコードするcDNAのシ
ークエンシング用プライマー 配列番号:68 マウスイムノグロブリンJ鎖をコードするcDNAのシ
ークエンシング用プライマー 配列番号:69 マウスイムノグロブリンJ鎖をコードするcDNAのシ
ークエンシング用プライマー 配列番号:70 マウスイムノグロブリンJ鎖をコードするcDNAのシ
ークエンシング用プライマー 配列番号:71 マウスイムノグロブリンJ鎖をコードするcDNAのシ
ークエンシング用プライマー 配列番号:72 マウスイムノグロブリンJ鎖をコードするcDNAのシ
ークエンシング用プライマー 配列番号:73 マウスイムノグロブリンJ鎖をコードするcDNAのシ
ークエンシング用プライマー 配列番号:74 マウスイムノグロブリンJ鎖をコードするcDNAのシ
ークエンシング用プライマー 配列番号:75 マウスイムノグロブリンJ鎖をコードするcDNAのシ
ークエンシング用プライマー 配列番号:76 マウスイムノグロブリンJ鎖をコードするcDNAのシ
ークエンシング用プライマー 配列番号:77 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNA 配列番号:78 ヒト化抗Fas抗体のL鎖 配列番号:79 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNA 配列番号:80 ヒト化抗Fas抗体のL鎖 配列番号:81 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNA 配列番号:82 ヒト化抗Fas抗体のL鎖 配列番号:83 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNA 配列番号:84 ヒト化抗Fas抗体のL鎖 配列番号:85 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNA 配列番号:86 ヒト化抗Fas抗体のH鎖 配列番号:87 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNA 配列番号:88 ヒト化抗Fas抗体のH鎖 配列番号:90 ヒトイムノグロブリンH鎖サブグループI型をコードす
るDNAにハイブリダイズするプライマー 配列番号:91 ヒトイムノグロブリンH鎖サブグループI型をコードす
るDNAにハイブリダイズするプライマー 配列番号:93 ヒトイムノグロブリンL鎖サブグループII型をコード
するDNAにハイブリダイズするプライマー 配列番号:94 ヒトイムノグロブリンL鎖サブグループII型をコード
するDNAにハイブリダイズするプライマー 配列番号:95 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:96 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:97 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:98 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:99 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:100 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:101 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:102 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:103 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:104 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:105 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:106 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:107 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:108 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:109 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:110 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:111 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:112 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:113 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:114 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:115 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:116 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:117 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:118 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:119 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:120 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:121 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:122 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:123 ヒトイムノグロブリンのH鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:124 ヒトイムノグロブリンのL鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:125 ヒトイムノグロブリンのL鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:126 ヒトイムノグロブリンのL鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:127 ヒトイムノグロブリンのL鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:128 ヒトイムノグロブリンのL鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:129 ヒトイムノグロブリンのL鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:130 ヒトイムノグロブリンのL鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:131 ヒトイムノグロブリンのL鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:132 ヒトイムノグロブリンのL鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:133 ヒトイムノグロブリンのL鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:134 ヒトイムノグロブリンのL鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:135 ヒトイムノグロブリンのL鎖をコードするDNAのシー
クエンシング用プライマー 配列番号:136 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNAのシーク
エンシング用プライマー 配列番号:139 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:140 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:141 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:142 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:143 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:144 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:145 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:146 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:147 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:148 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:149 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:150 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:151 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:152 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:153 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNAのシーク
エンシング用プライマー 配列番号:154 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNAのシーク
エンシング用プライマー 配列番号:155 ヒト化抗Fas抗体のL鎖をコードするDNAのシーク
エンシング用プライマー 配列番号:156 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:157 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:158 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:159 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:160 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:161 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:162 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:163 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:164 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:165 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:166 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:167 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:168 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:169 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:170 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:171 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:172 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:173 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:174 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:175 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:176 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:177 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:178 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:179 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAのシーク
エンシング用プライマー 配列番号:180 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAのシーク
エンシング用プライマー 配列番号:181 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAのシーク
エンシング用プライマー 配列番号:182 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAのシーク
エンシング用プライマー 配列番号:183 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAのシーク
エンシング用プライマー 配列番号:184 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAのシーク
エンシング用プライマー 配列番号:185 ヒト化抗Fas抗体のH鎖をコードするDNAのシーク
エンシング用プライマー 配列番号:186 Fas抗原の細胞外領域ををコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:187 Fas抗原の細胞外領域ををコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:188 Fas抗原の細胞外領域ををコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー 配列番号:189 Fas抗原の細胞外領域ををコードするDNAの断片を
増幅するためのPCR用プライマー
Claims (9)
- 【請求項1】遺伝子操作によって得られ、配列表の配列
番号78で示されるアミノ酸配列を含むことから成る軽
ポリペプチド鎖蛋白質、配列表の配列番号80で示され
るアミノ酸配列を含むことから成る軽ポリペプチド鎖蛋
白質、配列表の配列番号82で示されるアミノ酸配列を
含むことから成る軽ポリペプチド鎖蛋白質又は配列表の
配列番号84で示されるアミノ酸配列を含むことから成
る軽ポリペプチド鎖蛋白質、及び、配列表の配列番号8
6で示されるアミノ酸配列を含むことから成る重ポリペ
プチド鎖蛋白質又は配列表の配列番号88で示されるア
ミノ酸配列を含むことから成る重ポリペプチド鎖蛋白質
のみから構成され、J鎖蛋白質を有さず、アポトーシス
誘導活性を有することを特徴とする免疫グロブリンM蛋
白質を有効成分とする抗リウマチ剤。 - 【請求項2】遺伝子操作によって得られ、配列表の配列
番号78で示されるアミノ酸配列を含むことから成る軽
ポリペプチド鎖蛋白質、及び、配列表の配列番号86で
示されるアミノ酸配列を含むことから成る重ポリペプチ
ド鎖蛋白質のみから構成され、J鎖蛋白質を有さず、ア
ポトーシス誘導活性を有することを特徴とする免疫グロ
ブリンM蛋白質を有効成分とする請求項1記載の抗リウ
マチ剤。 - 【請求項3】遺伝子操作によって得られ、配列表の配列
番号78で示されるアミノ酸配列を含むことから成る軽
ポリペプチド鎖蛋白質、及び、配列表の配列番号88で
示されるアミノ酸配列を含むことから成る重ポリペプチ
ド鎖蛋白質のみから構成され、J鎖蛋白質を有さず、ア
ポトーシス誘導活性を有することを特徴とする免疫グロ
ブリンM蛋白質を有効成分とする請求項1記載の抗リウ
マチ剤。 - 【請求項4】遺伝子操作によって得られ、配列表の配列
番号80で示されるアミノ酸配列を含むことから成る軽
ポリペプチド鎖蛋白質、及び、配列表の配列番号86で
示されるアミノ酸配列を含むことから成る重ポリペプチ
ド鎖蛋白質のみから構成され、J鎖蛋白質を有さず、ア
ポトーシス誘導活性を有することを特徴とする免疫グロ
ブリンM蛋白質を有効成分とする請求項1記載の抗リウ
マチ剤。 - 【請求項5】遺伝子操作によって得られ、配列表の配列
番号80で示されるアミノ酸配列を含むことから成る軽
ポリペプチド鎖蛋白質、及び、配列表の配列番号88で
示されるアミノ酸配列を含むことから成る重ポリペプチ
ド鎖蛋白質のみから構成され、J鎖蛋白質を有さず、ア
ポトーシス誘導活性を有することを特徴とする免疫グロ
ブリンM蛋白質を有効成分とする請求項1記載の抗リウ
マチ剤。 - 【請求項6】遺伝子操作によって得られ、配列表の配列
番号82で示されるアミノ酸配列を含むことから成る軽
ポリペプチド鎖蛋白質、及び、配列表の配列番号86で
示されるアミノ酸配列を含むことから成る重ポリペプチ
ド鎖蛋白質のみから構成され、J鎖蛋白質を有さず、ア
ポトーシス誘導活性を有することを特徴とする免疫グロ
ブリンM蛋白質を有効成分とする請求項1記載の抗リウ
マチ剤。 - 【請求項7】遺伝子操作によって得られ、配列表の配列
番号82で示されるアミノ酸配列を含むことから成る軽
ポリペプチド鎖蛋白質、及び、配列表の配列番号88で
示されるアミノ酸配列を含むことから成る重ポリペプチ
ド鎖蛋白質のみから構成され、J鎖蛋白質を有さず、ア
ポトーシス誘導活性を有することを特徴とする免疫グロ
ブリンM蛋白質を有効成分とする請求項1記載の抗リウ
マチ剤。 - 【請求項8】遺伝子操作によって得られ、配列表の配列
番号84で示されるアミノ酸配列を含むことから成る軽
ポリペプチド鎖蛋白質、及び、配列表の配列番号86で
示されるアミノ酸配列を含むことから成る重ポリペプチ
ド鎖蛋白質のみから構成され、J鎖蛋白質を有さず、ア
ポトーシス誘導活性を有することを特徴とする免疫グロ
ブリンM蛋白質を有効成分とする請求項1記載の抗リウ
マチ剤。 - 【請求項9】遺伝子操作によって得られ、配列表の配列
番号84で示されるアミノ酸配列を含むことから成る軽
ポリペプチド鎖蛋白質、及び、配列表の配列番号88で
示されるアミノ酸配列を含むことから成る重ポリペプチ
ド鎖蛋白質のみから構成され、J鎖蛋白質を有さず、ア
ポトーシス誘導活性を有することを特徴とする免疫グロ
ブリンM蛋白質を有効成分とする請求項1記載の抗リウ
マチ剤。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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JP10-264598 | 1998-09-18 | ||
JP11263984A JP2000154149A (ja) | 1998-09-18 | 1999-09-17 | 抗ヒトFasヒト化抗体含有抗リウマチ剤 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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JP2000154149A true JP2000154149A (ja) | 2000-06-06 |
Family
ID=26546295
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2000154149A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2005005636A1 (ja) * | 2003-07-15 | 2006-08-24 | 中外製薬株式会社 | 形質転換細胞によるIgMの産生とその定量方法 |
US8920797B2 (en) | 2003-10-09 | 2014-12-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Highly concentrated stabilized IgM solution |
-
1999
- 1999-09-17 JP JP11263984A patent/JP2000154149A/ja not_active Withdrawn
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2005005636A1 (ja) * | 2003-07-15 | 2006-08-24 | 中外製薬株式会社 | 形質転換細胞によるIgMの産生とその定量方法 |
US8257703B2 (en) | 2003-07-15 | 2012-09-04 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-ganglioside antibodies and compositions |
US8920797B2 (en) | 2003-10-09 | 2014-12-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Highly concentrated stabilized IgM solution |
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