JPH10114795A - Ｔｎｆ結合タンパク質 - Google Patents

Ｔｎｆ結合タンパク質

Info

Publication number
JPH10114795A
JPH10114795A JP9257432A JP25743297A JPH10114795A JP H10114795 A JPH10114795 A JP H10114795A JP 9257432 A JP9257432 A JP 9257432A JP 25743297 A JP25743297 A JP 25743297A JP H10114795 A JPH10114795 A JP H10114795A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
pro
seq
glu
thr
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP9257432A
Other languages
English (en)
Inventor
Manfred Brockhaus
ブロックハウス マンフレッド
Zlatko Dembic
デンビック ズラトコ
Reiner Gentz
ゲンツ ライナー
Werner Lesslauer
レスラウアー ヴェルナー
Hansruediger Loetscher
レッチャー ハンスリューディ
Ernst-Juergen Schlaeger
シュレーガー エルンスト−ユルゲン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27172382&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JPH10114795(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of JPH10114795A publication Critical patent/JPH10114795A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/026—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a baculovirus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/144—Tumor necrosis factor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＴＮＦが関与する疾病の治療およびＴＮＦの
検出に使用される、ＴＮＦに結合する均質な形態の不溶
性タンパク質を提供する。 【解決手段】 本発明のタンパク質は、免疫アフィニテ
ィークロマトグラフィー、リガンドアフィニティークロ
マトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等により
精製して得られ、非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
約５５ｋＤまたは７５ｋＤの分子量および特定の部分ア
ミノ酸配列を含有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はＴＮＦに結合する均
質な形態の不溶性タンパク質、その単離方法、それを含
有するＴＮＦが関与する疾病の治療用医薬製剤およびＴ
ＮＦを検出するための検査薬に関する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】ある種の
腫瘍に及ぼす出血−壊死活性の結果として発見された腫
瘍壊死因子α（ＴＮＦα、カシェクチンとも称する）お
よびリンフォトキシン（ＴＮＦβ）はリンフォカイン／
サイトカインのクラスに属する２つの緊密に関連したペ
プチド因子［Ｌ．Ｊ．Ｏｌｄ：Ｓｃｌｅｎｃｅ ２３
０，６３０，１９８５］であり、双方とも以下 ＴＮＦ
と称する［Ｂ．Ｂｅｕｔｌｅｒ およびＡ．Ｃｅｒａｍ
ｉ：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３１６，３
７９，１９８７，Ｌ．Ｊ．Ｏｌｄ：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
３０，６３０，１９８５］。ＴＮＦは広範囲な細胞活性
スペクトルを有する。例えば、ＴＮＦは一連の腫瘍細胞
系に対して阻害または細胞障害活性を有し［Ｂ．Ｂｅｕ
ｔｌｅｒ およびＡ．Ｃｅｒａｍｉ：ＮｅｗＥｎｇｌａ
ｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３１６，３７９，１９８７，Ｌ．
Ｊ．Ｏｌｄ：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，６３０，１９８
５］、繊維芽細胞の増殖および骨髄細胞の食作用／細胞
障害活性を刺激し［Ｇ．Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，Ｍ．Ｋ
ｏｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．Ｒｏｓｅｎ，Ｒ．Ｌｏｕｄｏ
ｎ，Ｍ．ＭｕｒｐｈｙおよびＢ．Ｐｅｒｕｓｓｉａ：
Ｊ．ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４，１２０６，１９８６，
Ｊ．Ｖｉｌｃｅｋ，Ｖ．Ｊ．Ｐａｌｏｍｂｅｌｌａ，
Ｄ．Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ−ｄｅＳｔｅｆａｎｏ，Ｃ．Ｓ
ｗｅｎｓｏｎ，Ｒ．Ｆｅｉｎｍａｎ，Ｍ．Ｈｉｒａｉお
よびＭ．Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ：Ｊ．ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１
６３，６３２，１９８６，Ｂ．Ｊ．Ｓｕｇａｒｍａｎ，
Ｂ．Ｂ．Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｐ．Ｅ．Ｈａｓｓ，Ｉ．
Ｓ．Ｆｉｇａｒｉ，Ｍ．Ａ．Ｐａｌｌａｄｉｎｏ およ
び Ｈ．Ｍ．Ｓｈｅｐａｒｄ：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３
０，９４３，１９８５］、内皮細胞における付着分子を
誘導するか、または内皮に対して抑制作用を示し［Ｊ．
Ｒ．Ｇａｍｂｌｅ，Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｌａｎ，Ｓ．Ｊ．Ｋ
ｌｅｂａｎｏｆｆおよびＭ．Ａ．Ｖａｄａｓ：Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，８６
６７，１９８５，Ｎ．Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｇｏｔｏ，Ｋ．Ｈ
ａｒａｎａｋａ，Ｎ．Ｓａｔｏｍｉ，Ｈ．Ｎａｒｉｕｃ
ｈｉ，Ｙ．Ｍａｎｏ よびＹ．Ｓａｗａｓａｋｉ：Ｊ．
Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．７６，１１１３，
１９８６，Ａ．Ｈ．Ｓｔｏｌｐｅｎ，Ｅ．Ｃ．Ｇｕｌｎ
ａｎ，Ｗ．ＦｉｅｒｓおよびＪ．Ｓ．Ｐｏｂｅｒ：Ａ
ｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１２３，１６，１９８６］、脂
肪細胞において特定の酵素の合成を阻害し［Ｍ．Ｋａｗ
ａｋａｍｉ，Ｐ．Ｐｅｋａｌａ，Ｍ．Ｌａｎｅおよび
Ａ．Ｃｅｒａｍｉ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ７９，９１２，１９８２］そして組織適
合性抗原の発現を誘導する［Ｔ．Ｃｏｌｌｅｎｓ，Ｌ．
Ａ．Ｌａｐｉｅｒｒｅ，Ｗ．Ｆｉｅｒｓ，Ｊ．Ｌ．Ｓｔ
ｒｏｍｉｎｇｅｒおよびＪ．Ｓ．Ｐｏｂｅｒ：Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，４４
６，１９８６］。これらのＴＮＦ活性の多くは、他の因
子の誘導を介するかまたは例えばインターフェロンまた
はインターロイキンのような他の因子との相乗作用によ
りもたらされる［Ｇ．Ｈ．Ｗ．ＷｏｎｇおよびＤ．Ｖ．
Ｇｏｅｄｄｅｌ：Ｎａｔｕｒｅ ３２３，８１９，１９
８６，Ｊ．Ｗ．Ｌｏｗｅｎｔｈａｌ，Ｄ．Ｗ．Ｂａｌｌ
ａｒｄ，Ｂ．ＢｏｈｎｌｅｉｎおよびＷ．Ｃ．Ｇｒｅｅ
ｎｅ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６，２３３１，１９８９，Ｍ．Ｊ．Ｌｅｎａｒｄ
ｏ，Ｃ．Ｍ．Ｆａｎ，Ｔ．ＭａｎｉａｔｉｓおよびＤ．
Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｃｅｌｌ ５７，２８７，１９８
９，Ａ．Ｅ．ＧｏｌｄｆｅｌｄおよびＴ．Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６，１４９０，１９８９］。
【０００３】ＴＮＦは一連の病的状態、例えば髄膜炎菌
敗血症［Ａ．Ｗａａｇｅ，Ａ．Ｈａｌｓｔｅｕｒｅｎお
よびＴ．Ｅｓｐｅｖｉｋ：Ｌａｎｃｅｔ，Ｆｅｂｒ．１
４，３５５，１９８７］、マウス自己免疫糸球体腎炎の
発生［Ｃ．Ｏ．ＪａｃｏｂおよびＨ．Ｏ．ＭｃＤｅｖｉ
ｔｔ：Ｎａｔｕｒｅ３３１，３５６，１９８８］または
マウス［Ｇ．Ｅ．Ｇｒａｕ，Ｌ．Ｆ．Ｆａｊａｒｄｏ，
Ｐ．Ｐｉｇｕｅｔ，Ｂ．Ａｌｌｅｔ，Ｐ．Ｌａｍｂｅｒ
ｔ［およびＰ．Ｖａｓｓａｌｌｉ：Ｓｃｉｅｎｃｅ２３
７，１２１０，１９８７］およびヒト［Ｇ．Ｅ．Ｇｒａ
ｕ，Ｔ．Ｅ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．Ｂ．Ｍｏｌｙｎｅｕ
ｘ，Ｊ．Ｊ．Ｗｉｒｉｍａ，Ｐ．Ｖａｓｓａｌｌｉ，
Ｍ．ＨｏｍｍｅｌおよびＰ．Ｌａｍｂｅｒｔ：Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２０，１５８６，１９８９］
の脳マラリアにおけるショック状態に関与している。最
も一般的には、内毒素の毒性作用はＴＮＦにより媒介さ
れていると考えられる［Ｂ．Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｉ．Ｗ．
ＭｉｌｓａｒｋおよびＡ．Ｃ．Ｃｅｒａｍｉ：Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２２９，８６９，１９８５］。更にＴＮＦはイ
ンターロイキン−１発熱を誘発しうる［Ｄｉｎａｒｅｌ
ｌｏ，Ｃｈ．Ａ．，ｉｎＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ，Ｖｏ
ｌ．１４，Ｅ．Ｐｉｃｋ，ｅｄ．，ｐ．１，Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７］。ＴＮ
Ｆの多面発現性の機能特性に基づけば、ＴＮＦは他のサ
イトカインとの相互作用において、免疫応答、炎症また
は他の過程のメジエーターとして、付加的な病理学的状
態のすべての系列に関わっているといえる。
【０００４】これらの生物学的作用は特異的なレセプタ
ーを介してＴＮＦによりは媒介されており、このため、
現在の知識によれば、ＴＮＦαのみならずＴＮＦβも同
じレセプターに結合する［Ｂ．Ｂ．Ａｇｇａｒｗａｌ，
Ｔ．Ｅ．ＥｅｓｓａｌｕおよびＰ．Ｅ．Ｈａｓｓ：Ｎａ
ｔｕｒｅ ３１８，６６５，１９８５］。異なる種類の
細胞は、ＴＮＦレセプターの数が異なる［Ｍ．Ｔｓｕｊ
ｉｍｏｔｏ，Ｙ．Ｋ．ＹｉｐおよびＪ．Ｖｉｌｃｅｋ：
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
２，７６２６，１９８５，Ｃ．Ｂａｇｌｉｏｎｉ，Ｓ．
ＭｃＣａｎｄｌｅｓｓ，Ｊ．Ｔａｖｅｒｎｉｅｒ およ
びＷ．Ｆｉｅｒｓ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，
１３３９５，１９８５，Ｐ．Ｈｏｈｍａｎｎ，Ｒ．Ｒｅ
ｍｙ，Ｍ．ＢｒｏｃｋｈａｕｓおよびＡ．Ｐ．Ｇ．Ｍ．
Ｖａｎ Ｌｏｏｎ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｉｎ
ｐｒｅｓｓ］。このような極めて一般的に語られるＴＮ
Ｆ結合タンパク質（ＴＮＦ−ＢＰ）は放射性標識ＴＮＦ
への供有結合により検出され［Ｐ．ｌｌｏｈｍａｎｎ，
Ｒ．Ｒｅｍｙ，Ｍ．ＢｒｏｃｋｈａｕｓおよびＡ．Ｐ．
Ｇ．Ｍ．Ｖａｎ Ｌｏｏｎ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，ｉｎ ｐｒｅｓｓ，Ｆ．Ｃ．Ｋｕｌｌ，Ｓ．Ｊａ
ｃｏｂｓおよびＰ．Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ：Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，５７
５６，１９８５，Ａ．Ａ．Ｃｒｅａｓｙ，Ｒ．Ｙａｍａ
ｍｏｔｏおよびＣｈ．Ｒ．Ｖｉｔｔ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，３２９３，１９
８７，Ｇ．Ｂ．Ｓｔａｕｂｅｒ，Ｒ．Ａ．Ａｉｙｅｒ
およびＢ．Ｂ．Ａｇｇａｒｗａｌ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６３，１９０９８，１９８８，Ｋ．Ｈｉｒａｎ
ｏ，Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉお
よびＴ．Ｏｓａｗａ：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５，１
２０，１９８９，Ｙ．Ｎｉｉｔｓｕ，Ｎ．Ｗａｔａｎａ
ｂｅ，Ｈ．Ｓｏｎｅ，Ｈ．Ｎｅｄａ，Ｎ．Ｙａｍａｕｃ
ｈｉ，Ｍ．ＭａｅｄａおよびＩ．Ｕｒｕｓｈｉｚａｋ
ｉ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐ．Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ７，
２７６，１９８８］、それにより、得られたＴＮＦ／Ｔ
ＮＦ−ＢＰ複合体の見かけの分子量が以下のとおり測定
されている。即ち９５／１００ｋＤおよび７５ｋＤ
［Ｐ．Ｈｏｈｍａｎｎ，Ｒ．Ｒｅｍｙ，Ｍ．Ｂｒｏｃｋ
ｈａｕｓおよびＡ．Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｖａｎ Ｌｏｏｎ：
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｉｎ ｐｒｅｓｓ］，９５
ｋＤおよび７５ｋＤ［Ｆ．Ｃ．Ｋｕｌｌ，Ｓ．Ｊａｃｏ
ｂｓおよびＰ．Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ：Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，５７５６，
１９８５］，１３８ｋＤ，９０ｋＤ，７５ｋＤおよび５
４ｋＤ［Ａ．Ａ．Ｃｒｅａｓｙ，Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ
およびＣｈ．Ｒ．Ｖｉｔｔ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，３２９３，１９８７］，
１００±５ｋＤ［Ｇ．Ｂ．Ｓｔａｕｂｅｒ，Ｒ．Ａ．Ａ
ｉｙｅｒ およびＢ．Ｂ．Ａｇｇａｒｗａｌ：Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１９０９８，１９８８］，９
７ｋＤおよび７０ｋＤ［Ｋ．Ｈｉｒａｎｏ，Ｋ．Ｙａｍ
ａｍｏｔｏ，Ｙ．ＫｏｂａｙａｓｈｉおよびＴ．Ｏｓａ
ｗａ：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５，１２０，１９８
９］および１４５ｋＤ［Ｙ．Ｎｉｉｔｓｕ，Ｎ．Ｗａｔ
ａｎａｂｅ，Ｈ．Ｓｏｎｅ，Ｈ．Ｎｅｄａ，Ｎ．Ｙａｍ
ａｕｃｈｉ，Ｍ．Ｍａｅｄａ およびＩ．Ｕｒｕｓｈｉ
ｚａｋｉ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐ．Ｍｏｄｉｆｉｅｒ
ｓ７，２７６，１９８８］。かかるＴＮＦ／ＴＮＦ−Ｂ
Ｐ複合体の１つは抗−ＴＮＦ抗体免疫アフィニティクロ
マトグラフィーおよび調製用ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により単離できた
［Ｇ．Ｂ．Ｓｔａｕｂｅｒ，Ｒ．Ａ．Ａｉｙｅｒおよび
Ｂ．Ｂ．Ａｇｇａｒｗａｌ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６３，１９０９８，１９８８］。この複合体の還元的
分解および続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ＴＮＦ結
合活性に関して試験対象とならなかった幾つかのバンド
が得られた。複合体の分解に用いなければならなかった
特定の条件が結合タンパク質を不活性化させるため
［Ｈ．Ｒ．Ｌｏｔｓｃｈｅｒおよび Ｍ．Ｂｒｏｃｋｈ
ａｕｓ：Ａｂｓｔｒａｃｔ，２ｎｄ Ｉｎｔｅｒｎ．Ｃ
ｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓ
ｉｓ ＦａｃｔｏｒおよびＲｅｌａｔｅｄ Ｃｙｔｏｋ
ｉｎｅｓ，Ｎａｐａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，１５．−
２０．Ｊａｎｕａｒ１９８９］、後者方法もまた不可能
であった。ヒトの血清または尿からのイオン交換クロマ
トグラフィーおよびゲル濾過（分子量範囲５０ｋＤ）に
よる可溶性ＴＮＦ−ＢＰの分離はＯｌｓｓｏｎ等［Ｉ．
Ｏｌｓｓｏｎ，Ａ．Ｇｒｕｂｂ，Ｕ．Ｇｕｌｌｂｅｒ
ｇ，Ｍ．Ｌａｎｔｚ，Ｅ．Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｃ．Ｐｅｅ
ｔｒｅおよびＨ．Ｔｈｙｓｅｌｌ：Ａｂｓｔｒａｃｔ，
２ｎｄ Ｉｎｔｅｒｎ．Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ
Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ ＦａｃｔｏｒおよびＲ
ｅｌａｔｅｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｎａｐａ，Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ，１５．−２０．Ｊａｎｕａｒ１９８
９］により報告されている。
【０００５】Ｂｒｏｃｋｈａｕｓ等［Ｍ．Ｂｒｏｃｋｈ
ａｕｓ，Ｈ．Ｌｏｔｓｃｈｅｒ，Ｈ．−Ｐ．Ｈｏｈｍａ
ｎｎおよびＷ．Ｈｕｎｚｉｋｅｒ：Ａｂｓｔｒａｃｔ，
２ｎｄ Ｉｎｔｅｒｎ．Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ
Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ ＦａｃｔｏｒおよびＲ
ｅｌａｔｅｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｎａｐａ，Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ，１５．−２０．Ｊａｎｕａｒ１９８
９］は、ＴＮＦα−リガンドアフィニティクロマトグラ
フィーおよびＨＰＬＣにより、ＨＬ６０細胞の膜抽出物
から、ＴＮＦ−ＢＰ富化調製物を得ており、これをＴＮ
Ｆ−ＢＰに対するモノクローナル抗体の生産のための抗
原調製物として使用した。かかる固定化された抗体（免
疫アフィニティクロマトグラフィー）を用いることによ
り、ＬｏｅｔｓｃｈｅｒとＢｒｏｃｋｈａｕｓ［Ｈ．
Ｒ．ＬｏｔｓｃｈｅｒおよびＭ．Ｂｒｏｃｋｈａｕｓ：
Ａｂｓｔｒａｃｔ，２ｎｄ Ｉｎｔｅｒｎ．Ｃｏｎｆｅ
ｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆ
ａｃｔｏｒおよびＲｅｌａｔｅｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ
ｓ，Ｎａｐａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，１５．−２０．
Ｊａｎｕａｒ１９８９］は、ＴＮＦα−リガンドアフィ
ニティクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣを用いてヒト
胎盤の抽出物からＴＮＦ−ＢＰに富む調製物を得てお
り、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、３５ｋＤに
強く広いバンド、約４０ｋＤに弱いバンド、そして５５
ｋＤ〜６０ｋＤの領域に非常に弱いバンドを示した。さ
らに、このゲルは３３ｋＤ〜４０ｋＤの範囲にタンパク
質バックグラウンドしみを示した。しかしながら、この
ようにして得られたタンパク質バンドの意義は、使用さ
れた出発物質（胎盤組織：幾つかの胎盤から得られた混
合材料）の非均質性を考慮すると、はっきりしなかっ
た。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の目的はＴＮＦに
結合する均質な形態の不溶性タンパク質（ＴＮＦ−Ｂ
Ｐ）、即ち例えばタンパク質またはいわゆるレセプタ
ー、およびその可溶性または不溶性断片、並びに生理学
的に適合性のあるその塩である。好ましいタンパク質
は、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば、見かけ
の分子量約５５ｋＤ，５１ｋＤ，３８ｋＤ，３６ｋＤお
よび３４ｋＤまたは７５ｋＤおよび６５ｋＤ、特に５５
ｋＤおよび７５ｋＤを特徴とするタンパク質である。さ
らに、下記に示すアミノ酸部分配列（ただしＸａａは明
確に判定できなかったアミノ酸残基を示す）の少なくと
も１つにより特徴付けられるタンパク質が好ましい。
【０００７】（ＩＡ）Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−
Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ（配列番
号１） （ＩＢ）Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈ
ｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（配列番号２） （ＩＩＡ）Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓ
ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅ
ｕ（配列番号５） （ＩＩＢ）Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ（配列番号
６） （ＩＩＣ）Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ（配列番号７） （ＩＩＤ）Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−
Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙ
ｓ（配列番号３） （ＩＩＥ）Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｕ（配列番号４） （ＩＩＦ）Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号
８） （ＩＩＧ）Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−
Ａｌａ−Ａｓｐ （配列番号９）（ＩＩＨ）Ｇｌｙ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｎ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ａｌａ
−Ｐｒｏ（配列番号１０）
【０００８】現在の技術水準では、ＴＮＦ−ＢＰは既に
Ｎ−末端部分配列により特性決定されており［欧州特許
出願公開３０８ ３７８号］、それによれば、この配列
は本発明の式（ＩＡ）のＮ末端部分配列とは異なる。さ
らに、現在の技術水準において記載されているＴＮＦ結
合タンパク質は、可溶性、即ち膜以外に結合したＴＮＦ
−ＢＰでありそして尿から単離された膜結合即ち不溶性
ＴＮＦ−ＢＰではない。
【０００９】本発明によるＴＮＦ−ＢＰの単離方法もま
た本発明の目的の一つである。この方法は、本質的に以
下の精製工程、即ち、細胞または組織抽出物の調製、免
疫アフィニティクロマトグラフィーおよび／または単一
または複数リガンドアフィニティクロマトグラフィー、
高分解液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および調製
用ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）を順次行なうことを包含する。現在の技術水
準で知られている個々の精製工程の組合せが本発明の方
法を成功させるための必須要件であり、このため解決す
べき問題点に関して個々の工程は変更および改良されて
いる。即ち、例えば、ヒト胎盤からＴＮＦ−ＢＰを富化
させるために本来用いられた免疫アフィニティクロマト
グラフィー／ＴＮＦαリガンドアフィニティクロマトグ
ラフィー工程の組合せ［Ｌ．Ｊ．Ｏｌｄ：Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ２３０，６３０，１９８５］を、ＢＳＡ−セファロー
ス４Ｂプレカラムを用いることにより変更を加えてあ
る。細胞または膜の抽出物を適用するために、このプレ
カラムを順次、免疫アフィニティカラム、次にリガンド
アフィニティカラムに連結した。抽出物の適用の後、２
つの上記したカラムを結合させ、それぞれ溶離しそして
ＴＮＦ−ＢＰ活性フラクションをリガンドアフィニティ
カラムで再度精製した。逆相ＨＰＬＣ工程を実施するた
めに界面活性剤含有溶媒混合物を使用することが本発明
にとって必須要件である。
【００１０】更に、ＴＮＦ−ＢＰを単離できる哺乳類細
胞を高い細胞密度で調製するための工業的方法もまた本
発明の目的である。かかる方法は、使用される細胞系に
特異的な増殖要件に合せて開発された培地を例えば実施
例２に詳細に記載する灌流装置と組わ合せて用いること
を包含する。かかる方法により、例えばＨＬ−６０細胞
の場合通常より２０倍以上までの高い細胞密度を生成で
きる。
【００１１】これらに加え本発明はまた、ＴＮＦに結合
するタンパク質およびその可溶性または不溶性断片をコ
ードするＤＮＡ配列にも関する。ここで、例えば、ＴＮ
Ｆに結合する不溶性タンパク質またはその可溶性および
不溶性断片をコードするＤＮＡ配列とは、下記より選択
されるＤＮＡ配列であると理解されたい。 （ａ）図１および２または図５および６に示されるＤＮ
Ａ配列、およびその相補鎖、またはこれらの配列を含有
する配列； （ｂ）（ａ）項で定義された配列とハイブリダイズする
ＤＮＡ配列またはその断片； （ｃ）遺伝暗号の縮重ゆえに上記（ａ）項および（ｂ）
項で定義した配列とハイブリダイズしないが、厳密に同
じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列。
【００１２】即ち、本発明は対立変種のみならず、図１
および２または図５および６に示す配列の１つまたはそ
れ以上のヌクレオチドから欠失、置換および付加により
生ずるＤＮＡ配列をも包含し、従って、これらによりコ
ードされるタンパク質の場合、前記と正に同様にＴＮＦ
−ＢＰも意図される。かかる欠失により生じる配列の１
つは、例えばＳｃｉｅｎｃｅ２４８，１０１９−１０２
３（１９９０）に記載されている。見かけの分子量約５
５ｋＤを有するかかるタンパク質をコードするＤＮＡ配
列が第１番目に好ましいものであり、従って図１および
２に示す配列が特に好ましく、かかるタンパク質の不溶
性および可溶性断片をコードする配列も好ましい。例え
ば、かかる不溶性タンパク質断片をコードするＤＮＡ配
列は、図１および２に示す配列のヌクレオチド−１８５
から１１２２に及んでいる。可溶性タンパク質断片をコ
ードするＤＮＡ配列は、例えば、図１および２に示す配
列のヌクレオチドの−１８５から６３３までまたは−１
４から６３３に及ぶ配列である。約７５／６５ｋＤのタ
ンパタ質をコードするＤＮＡ配列も好ましく、従って図
５および６に示す
【００１３】ｃＤＮＡ部分配列を含有するものも好まし
い。この場合特に好ましいＤＮＡ配列はヌクレオチド２
〜１，１７７の読み枠の配列である。ペプチドＩＩＡ，
ＩＩＣ，ＩＩＥ，ＩＩＦ，ＩＩＧおよびＩＩＨは、図５
および６のｃＤＮＡ部分配列によりコードされており、
実験的に決定されたアミノ酸配列における有意でない偏
りは気相配列決定の限られた分解能から生ずるｃＤＮＡ
由来配列に基づく可能性が最も高い。見かけの分子量６
５／７５ｋＤを有するＴＮＦ結合タンパク質の不溶性お
よび可溶性フラクションをコードするＤＮＡ配列も好ま
しい。 かかる可溶性断片のＤＮＡ配列は、このような
不溶性ＴＮＦ−ＢＰをコードする核酸配列に由来するア
ミノ酸配列に基づいて決定できる。
【００１４】本発明はまた、一方の部分配列がＴＮＦに
結合する不溶性タンパク質の可溶性断片をコードしてお
り（前記参照）、そして他方の部分配列がＩｇＧ，Ｉｇ
Ａ，ＩｇＭまたはＩｇＥのようなヒト免疫グロブリンの
重鎖の不変領域の第１のドメイン以外の全ドメインをコ
ードしているものである２つのＤＮＡ部分配列の組合せ
を含有するＤＮＡ配列にも関する。
【００１５】本発明はまた、かかるＤＮＡ配列によりコ
ードされる組み換えタンパク質にも関する。従って当然
ながら、アミノ酸配列中においてアミノ酸が、例えば計
画的突然変異誘発により交換されてそれによりＴＮＦ−
ＢＰまたはその断片の活性、即ちＴＮＦの結合またはシ
グナル転移に関与しているその他の膜部分との相互作用
が所望の様式で変化または維持されているようなタンパ
ク質も包含される。かかる分子の活性を一般的に変化さ
せないタンパク質およびペプチドにおけるアミノ酸交換
は従来知られており、そして例えばＨ．Ｎｅｕｒａｔｈ
およびＲ．Ｌ．Ｈｉｌｌの「Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，１９７９、特に第６図、第１４図参照）に記載され
ている。最も普通に起こる交換は、以下のとおりであ
る。Ａｌａ／Ｓｅｒ，Ｖａｌ／Ｉｌｅ，Ａｓｐ／Ｇｌ
ｕ，Ｔｈｒ／Ｓｅｒ，Ａｌａ／Ｇｌｙ，Ａｌａ／Ｔｈ
ｒ，Ｓｅｒ／Ａｓｎ，Ａｌａ／Ｖａｌ，Ｓｅｒ／Ｇｌ
ｙ，Ｔｙｒ／Ｐｈｅ，Ａｌａ／Ｐｒｏ，Ｌｙｓ／Ａｒ
ｇ，Ａｓｐ／Ａｓｎ，Ｌｅｕ／Ｉｌｅ，Ｌｅｕ／Ｖａ
ｌ，Ａｌａ／Ｇｌｕ，Ａｓｐ／Ｇｌｙおよびこれらの
逆。
【００１６】本発明はまた、本発明によるＤＮＡ配列を
含有しており、そして好適な原核生物および真核生物宿
主系の形質転換に適するベクターにも関し、その場合そ
の使用により本発明のＤＮＡ配列によりコードされるタ
ンパク質の発現をもたらすベクターが好ましい。最後
に、本発明はかかるベクターで形質転換された原核生物
および真核生物宿主系、ならびに、かかる宿主系を培養
し次いで宿主系それ自体またはその培養上清からこれら
化合物を単離することによる本発明の組み換え化合物の
製法にも関する。
【００１７】本発明はまた、所望の場合は他の医薬上活
性な物質および／または無毒性、不活性で治療上適合す
る担体物質と組合せた、ＴＮＦ−ＢＰまたはその断片の
少なくとも１種を含有する医薬製剤にも関する。 最後
に、本発明は一方では医薬製剤の製造のため、そして他
方では好ましくはＴＮＦがその経過に関与する疾病の治
療の為のかかるＴＮＦ−ＢＰの使用に関する。
【００１８】
【発明の実施の形態】本発明のＴＮＦ−ＢＰを得るため
の出発物質は、膜結合形態でかかるＴＮＦ−ＢＰを含有
しそして一般的に当業者が制限なく入手できるきわめて
一般的な細胞、例えばＨＬ６０［ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣ
Ｌ２４０］，Ｕ ９３７［ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ １５
９３］，ＳＷ４８０［ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ２２８］
およびＨＢｐ２細胞［ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ２３］で
ある。これらの細胞は従来知られた方法［Ｄ．Ｊ．Ｍｅ
ｒｃｈａｎｔ，Ｒ．Ｈ．ＫａｈｎおよびＷ．Ｈ．Ｍｕｒ
ｐｈｙ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＣｅｌｌおよびＯｒ
ｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｂｕｒｇｅｓｓ Ｐｕｂｌ．
Ｃｏ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，１９６９］で培養す
るか、またはより高密度の細胞を得るためには、既に一
般的に記載されておりそしてＨＬ６０細胞に関して実施
例２で詳細に記載される方法により培養できる。次に、
培地から遠心分離により採取しそして例えばトリトンＸ
−１１４，１−Ｏ−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラ
ノシド（オクチルグルコシド）または３−［（３−コリ
ルアミドプロピル）−ジメチルアンモニウム］−１−プ
ロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、特に好ましくはト
リトンＸ−１００のような適当な界面活性剤を用いて、
従来知られた方法で洗浄された細胞からＴＮＦ−ＢＰを
抽出できる。かかるＴＮＦ−ＢＰを検出するには、ＴＮ
Ｆ−ＢＰに通常用いられる検出方法、例えば１２５Ｉ−
ＴＮＦ／ＴＮＦ−ＢＰ複合体のポリエチレングリコール
により誘導される沈澱［Ｇ．Ｂ．Ｓｔａｕｂｅｒ，Ｒ．
Ａ．Ａｉｙｅｒ およびＢ．Ｂ．Ａｇｇａｒｗａｌ：
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１９０９８，１９８
８］、特に実施例１記載の放射性標識ＴＮＦを用いるフ
ィルター結合試験を使用できる。本発明によりＴＮＦ−
ＢＰを調製するためには、タンパク質、特に膜タンパク
質の精製に従来用いられる一般的方法、例えば、イオン
交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティクロ
マトグラフィー、ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを用
いることができる。本発明によるＴＮＦ−ＢＰの調製に
特に好ましい方法は、特に固相に結合されたリガンドと
してＴＮＦ−αを用いるアフィニティクロマトグラフィ
ー、および免疫アフィニティクロマトグラフィー、ＨＰ
ＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
を用いて分離されたＴＮＦ−ＢＰバンドの溶離は、タン
パク質化学で知られた方法、例えばＨｕｎｋａｐｉｌｌ
ｅｒ等［Ｍ．Ｗ．Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｅ．Ｌｕｊ
ａｎ，Ｆ．Ｏｓｔｒａｎｄｅｒ，Ｌ．Ｅ．Ｈｏｏｄ：Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１，２２７，１９８
３］による電気溶離方法で行なうことができるが、その
際、現在の知識によれば、そこに記載されている電気透
析時間を一般的に２倍する必要がある。その後、なお残
存している痕跡のＳＤＳはＢｏｓｓｅｒｈｏｆｆ等［Ｂ
ｏｓｓｅｒｈｏｆｆ，Ｊ．ＷａｌｌａｃｈおよびＲ．
Ｗ．Ｆｒａｎｋ：Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．４７３，
７１，１９８９］の方法に従って除去できる。
【００１９】このようにして精製されたＴＮＦ−ＢＰは
現在知られているペプチド化学の方法、例えばＮ末端ア
ミノ酸配列決定または酵素的および化学的ペプチド分解
により特性決定できる。酵素的または化学的分解により
得られる断片は、通常の方法、例えばＨＰＬＣで分離で
き、そしてそのものを更にＮ末端配列決定に付すことが
できる。それ自体ＴＮＦに結合するかかる断片は、上記
したＴＮＦ−ＢＰの検出方法を用いて同定でき、これら
も同様に本発明の目的である。
【００２０】このようにして得られたアミノ酸配列の情
報、または図１および２並びに図５および６に示すＤＮ
Ａおよびアミノ酸配列から、遺伝暗号の縮重を考慮し
て、現在知られている方法に従って、適当なオリゴヌク
レオチドを調製できる［Ｒ．Ｌａｔｈｅ：Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．１８３，１，１９８５］。これら分子生物学
でも知られている方法により［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ：
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ，１９８９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂ
ｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏ
ｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎお
よびＫ．Ｓｔｒｕｈｌ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
１９８７−１９８８，Ｓ．ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７］、ｃＤＮＡまたはゲノム
ＤＮＡバンクを検索して、ＴＮＦ−ＢＰをコードする核
酸配列を含有するクローンを探索することができる。さ
らに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［Ｄ．Ｈ．Ｅｒ
ｌｉｃｈ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋ
ｉ： Ｎａｔｕｒｅ３３１，６１，１９８８］を用い
て、遺伝暗号を考慮しながら２つの離れた比較的短いセ
グメントのアミノ酸配列を完全に縮重させ、そしてそれ
らの相補的に適するオリゴヌクレオチドに「プライマ
ー」として導入することによりｃＤＮＡ断片をクローニ
ングすることができ、これによりこれら２つの配列の間
に存在する断片を増幅し、同定できる。かかる断片のヌ
クレオチド配列の決定により、それがコードするタンパ
ク質断片のアミノ酸配列を独立して決定できる。
【００２１】ＰＣＲにより取得できるｃＤＮＡ断片はま
た、オリゴヌクレオチドそのものについて既に記載され
ているように、知られた方法により、ｃＤＮＡまたはゲ
ノムＤＮＡのバンクから、ＴＮＦ−ＢＰをコードする核
酸配列を含有するクローンを探索するのに使用できる。
次にかかる核酸配列を知られた方法で配列決定できる
［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈおよ
びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９］。この
ようにして決定された配列および特定のレセプターに関
して既に知られた配列に基づいて、可溶性ＴＮＦ−ＢＰ
断片をコードする部分配列を決定して既に知られた配列
に基づいて、可溶性ＴＮＦ−ＢＰ断片をコードする部分
配列を決定して知られた方法で完全な配列から切り出す
ことができる［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉ
ｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８
９］。
【００２２】次にこの完全な配列またはかかる部分配列
を知られた方法で、原核生物における増殖および発現に
関する当該分野で記載されているベクターに組み込むこ
とができる［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔ
ｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９
８９］。好適な原核生物体宿主体は例えば、グラム陰性
およびグラム陽性の細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１
０１［ＡＴＣＣ Ｎｏ．３３ ６９４］またはＥ．ｃｏ
ｌｉ Ｗ３１１０［ＡＴＣＣ Ｎｏ．２７ ３２５］の
ようなＥ．ｃｏｌｉ株またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株で
ある。
【００２３】更に、ＴＮＦ−ＢＰおよびＴＮＦ−ＢＰ断
片をコードする本発明の核酸配列を、知られた方法を用
いて、真核生物宿主細胞例えば酵母、昆虫細胞および哺
乳類細胞における増殖および発現に適するベクターに組
み込むことができる。かかる配列の発現は、好ましくは
哺乳類および昆虫の細胞で行われる。
【００２４】哺乳類細胞にとって代表的な発現ベクター
は、良好な転写速度を得るための効率の良いプロモータ
ーエレメント、発現すべきＤＮＡ配列、および効率の良
い転写の終止およびポリアデニル化のためのシグナルを
含有する。使用できる付加的なエレメントは、「エンハ
ンサー」であり、これは転写増強、および例えばｍＲＮ
Ａのより長い半減期をもたらしうる配列である。シグナ
ルペプチドをコードする内生配列断面が欠落している核
酸配列を発現させるには、他の知られたタンパク質のシ
グナルペプチドをコードしている適当な配列を含有する
ベクターを使用できる。例えばＣｕｌｌｅｎ，Ｂ．Ｒ．
によりＣｅｌｌ ４６：９７３−９８２（１９８６）
に、およびＳｈａｒｍａ．Ｓ．らにより“Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｇｅｔｈｉｎｇ，Ｍ．
Ｊ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂ．（１９８５），ｐ７３−７８に記載されているベク
ターｐＬＪ２６８が使用できる。
【００２５】哺乳類細胞における特定のＤＮＡ配列の一
時的発現に用いられるこれらベクターの大部分は、ＳＶ
４０ウイルスの複製源を含有している。ウイルスのＴ抗
原を発見する細胞（例えばＣＯＳ細胞）においてこれら
のベクターは豊富に再製される。しかしながら一時的発
現はＣＯＳ細胞に限らない。原則的にすべてのトランス
フェクション可能な哺乳類細胞系をこの目的に使用でき
る。強力な転写をもたらすシグナルは、例えばＳＶ４０
の初期および後期のプロモーター、ＨＣＭＶ（ヒトサイ
トメガロウイルス）の「主要極初期」遺伝子プロモータ
ーおよびエンハンサー、レトロウイルス、例えばＲＳ
Ｖ，ＨＩＶおよびＭＭＴＶのＬＴＲ（「長い末端反
復」）である。しかしながら、例えばアクチンおよびコ
ラゲナーゼ遺伝子のプロモーターのような細胞遺伝子の
シグナルも使用できる。
【００２６】しかしながら、別法として、ゲノム（染色
体）に組み込まれた特定のＤＮＡ配列を有する安定な細
胞系も得ることができる。このためには、ＤＮＡ配列を
選択可能なマーカー、例えばネオマイシン、ハイグロマ
イシン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）または
ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ（ｈｇｐｔ）と共に同時トランスフェクションす
る。染色体に安定に導入されたＤＮＡ配列もまた豊富に
再製されうる。このための適当な選択マーカーは、例え
ばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）である。トラ
ンス感染実施後に無傷のｄｈｆｒ遺伝子を全く含まない
哺乳類細胞（例えばＣＨＯ細胞）を、漸増量のメトトレ
キセートとインキュベートする。この方法により、所望
のＤＮＡ配列１０００コピー以上を含有する細胞系を得
ることができる。
【００２７】発現に用いることのできる哺乳類細胞は、
例えばヒト細胞系の細胞ＨｅＬａ［ＡＴＣＣＣＣＬ
２］、および２９３［ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３］、
ならびに３Ｔ３［ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３］およびＬ
細胞、例えば［ＡＴＣＣ ＣＣＬ１４９］，（ＣＨＯ）
細胞［ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１］，ＢＨＫ［ＡＴＣＣＣ
ＣＬ １０］細胞およびＣＶ １［ＡＴＣＣ ＣＣＬ
７０］、およびＣＯＳ細胞系［ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６
５０，ＣＲＬ １６５１］である。
【００２８】適当な発現ベクターには、例えばｐＢＣ１
２ＭＩ［ＡＴＣＣ６７ １０９］，ｐＳＶ２ｄｈｆｒ
［ＡＴＣＣ ３７ １４６］，ｐＳＶＬ［Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ］，ｐＲＳＶｃ
ａｔ［ＡＴＣＣ ３７ １５２］およびｐＭＳＧ［Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ］が包
含される。実施例９で用いられるベクターｐＫ１９およ
びｐＮ１２３が特に好ましいベクターである。これら
は、これらで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１
（ｐＫ１９）およびＨＢ１０１（ｐＮ１２３）から知ら
れた方法で単離できる［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．
Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ：Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ，１９８９］。これらのＥ．ｃｏｌｉ株は、ＨＢ１
０１（ｐＫ１９）についてはＤＳＭ５７６１、そしてＨ
Ｂ１０１（ｐＨ１２３）についてはＤＭＳ５７６４の下
に西独ＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇのＤｅｕｔｓｃｈｅｎ
Ｓａｍｍｌｕｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ
（ＤＳＭ）に１９９０年１月２６日に寄託されている。
不溶性ＴＮＦ−ＢＰの可溶性断片および免疫グロブリン
断片、即ち重鎖の最初の不変領域を除く全ドメインより
なるタンパク質の発現には、例えばＧｅｒｍａｎ，Ｃ．
が“ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，ｖｏｌ．ＩＩ、Ｇｌｏ
ｖｅｒＤ．Ｍ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒ
ｄ，１９８５、に記載の特に適するｐＳＶ２−由来ベク
ターがある。西独Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇの Ｄｅｕ
ｔｓｃｈｅｎ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒ
ｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）に寄託されており欧州特許出
願９０１０７３９３．２号に詳細に記載されているベク
ターｐＣＤ４−Ｈμ（ＤＳＭ５３１５），ｐＤＣ４−Ｈ
γＩ（ＤＳＭ ５３１４）およびｐＣＤ４−Ｈγ３（Ｄ
ＳＭ５５２３）が特に好ましいベクターである。この欧
州特許明細書および同等の出願は実施例１１で参照され
ており、これらもまた、このようなｃｈｉｍａｒｙタン
パク質の発現（実施例１１参照）および他の免疫グロブ
リン断片を有するかかるｃｈｉｍａｒｙタンパク質を発
現させる為のベクターの構築の為にこれらのベクターを
更に使用することに関するデータを含んでいる。
【００２９】細胞をトランスフェクションする方法は、
選択された発現系およびベクター系の如何による。これ
らの方法の概略は、例えばＰｏｌｌａｒｄ等の“Ｍｅｔ
ｈｅｄｓｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”
中の”ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ”［ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓＶｏｌ．２，１９８４，Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．
Ｍ．，Ｈｕｍａｎａ編，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅ
ｒｓｅｙ］に記載されている。さらに別の方法は、Ｃｈ
ｅｎおよびＯｋａｙａｍａの“Ｈｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉ
ｅｎｃｙ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ Ｍａｍ
ｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｄ
ＮＡ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ７，２７４５−２７５２，１９８７、および
Ｆｅｌｇｎｅｒ らの“Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ：Ａ ｈ
ｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｌｉｐｉｄ−ｍｅｄ
ｉａｔｅｄＤＮＡ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏ
ｃｅｄｕｒｅ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ．８４，７４１３−７４１７，１９８７、に
記載されている。
【００３０】バキュロウイルス発現系は、すでに一連の
タンパク質の発現にうまく用いられているが（概説はＬ
ｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓのＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ６：４７−５５，１９８８参照）、これら
は昆虫細胞における発現に使用できる。組み換えタンパ
ク質は真正形態または融合タンパクとして生産できる。
このようにして産生されたタンパク質はまた、例えばグ
リコシル化のような修飾を行うことができる（Ｓｍｉｔ
ｈ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ．８２：８４０４−８４０８，１９８７）。所望のタ
ンパク質を発現する組み換えバキュロウイルスを生成さ
せるには、いわゆる「転移ベクター」が使用される。こ
の用語は強力なプロモーター、例えば多面体遣伝子のプ
ロモーターの制御下にあり、それによりウイルス配列に
よって両側が囲まれている異種ＤＮＡ配列を有するプラ
スミドが理解されるべきである。実施例１０で用いられ
るベクターｐＮ１１３、ｐＮ１１９およびｐＮ１２４が
特に好ましいベクターである。これらベクターは、これ
らで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１（ｐＮ１
１３）、ＨＢ１０１（ｐＮ１１９）およびＨＢ１０１
（ｐＮ１２４）から知られた方法で単離できる。これら
のＥ．ｃｏｌｉ株はＨＢ１０１（ｐＮ１１３）について
はＤＳＭ５７６２，ＨＢ１０１（ｐＮ１１９）について
はＤＳＭ５７６３そしてＨＢ１０１（ｐＮ１２４）につ
いてはＤＳＭ５７６５の番号のもとに、西独Ｂｒａｕｎ
ｓｃｈｗｅｉｇのＤｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｓａｍｍｌｕｎ
ｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚ
ｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）に１９９
０年１月２６日に寄託されている。次に転移ベクターを
野生型バキュロウイルスのＤＮＡ とともに昆虫細胞に
トランスフェクションする。次に相同組み換えにより細
胞中に生ずる組み換えウイルスを知られた方法に従って
同定および単離することができる。バキュロウイルス発
現系およびそこで用いられる方法の概略は、Ｌｕｃｋｏ
ｗおよびＳｕｍｍｅｒｓの文献に記載されている［Ｌｕ
ｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，”Ａ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕ
ｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ”，Ｔｅｘａ
ｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ，Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５，２
ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８８］。
【００３１】次に、発現されたＴＮＦ−ＢＰおよびその
不溶性または可溶性フラクションを、タンパク質化学に
おいて従来知られた方法、例えば前述した方法で、細胞
塊または培養上清から精製できる。
【００３２】本発明により得られるＴＮＦ−ＢＰは、知
られた方法［Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ：Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ，１９８８，Ｓ．Ｆａｚｅｋａｓ ｄｅＳ
ｔ．Ｇｒｏｔｈおよび Ｄ．Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ：
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ３５，１，１９８
０］または実施例３に記載される操作に従ってポリクロ
ーナルおよびモノクローナル抗体を生成させるための抗
原としても使用できる。かかる抗体、特に７５ｋＤ Ｔ
ＮＦ−ＢＰ種に対するモノクローナル抗体もまた、本発
明の目的である。７５ｋＤ ＴＮＦ−ＢＰに対する抗体
は当業者によく知られた実施例４〜６に詳述する精製操
作の変法によりＴＮＦ−ＢＰの単離に使用できる。
【００３３】ＴＮＦに対する本発明のＴＮＦ−ＢＰの高
い結合アフィニティ（Ｋｄ値１０−９〜１０−１０Ｍ）
に基づき、これらまたはその断片は、当該分野で知られ
た方法により、例えば固相結合試験において、または、
いわゆる「サンドイッチ」試験において抗−ＴＮＦ−Ｂ
Ｐ抗体と組合せて血清または他の体液中におけるＴＮＦ
検出のための診断剤として使用できる。
【００３４】更に本発明のＴＮＦ−ＢＰは当該分野で知
られた操作に従って、一方ではＴＮＦの精製に、そして
他方ではＴＮＦアゴニストおよびＴＮＦアンタゴニスト
の検出に使用できる。
【００３５】本発明のＴＮＦ−ＢＰおよび、当該技術分
野で知られた方法により製造できる生理学的に適合する
その塩は、医薬製剤、主に、その経過にＴＮＦが関与し
ている疾病の治療の為の医薬製剤の製造にも使用でき
る。この目的には、これらの化合物の１種またはそれ以
上を所望によるかまたは必要な場合は他の医薬上活性な
物質と組合せて、通常用いられる固形または液体の担体
物質とともに、知られた方法で製剤化できる。かかる製
剤の用量は、同様の活性および構造を有する製剤で既に
用いられているものと同様の通常の基準を考慮して決定
できる。
【００３６】
【実施例】以上のように本発明を一般的に説明したが、
以下の実施例により本発明をより詳細に説明する。これ
により本発明が制限されるわけではない。
【００３７】〔実施例１〕 ＴＮＦ結合タンパク質の検出 ヒト放射性ヨウ素標識１２５Ｉ−ＴＮＦを用いるフィル
ター試験でＴＮＦ−ＢＰを検出した。ＴＮＦ（４６，４
７）はＮａ１２５Ｉ（ＩＭＳ４０，Ａｍｅｒｓｈａｍ，
Ａｍｅｒｓｈａｍ，英国）およびヨード遺伝子（＃２８
６００，Ｐｉｅｒｃｅ Ｅｕｒｏｃｈｅｍｉｅ，Ｏｕｄ
−Ｂｅｉｊｅｒｌａｎｄ，オランダ）を用い、Ｆｒａｋ
ｅｒおよびＳｐｅｃｋの方法［Ｐ．Ｊ．Ｆｒａｋｅｒお
よびＪ．Ｃ．Ｓｐｅｃｋ：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０，８４９，１９８
７］に従い放射性標識した。ＴＮＦ−ＢＰを検出するに
は、細胞から単離した膜、またはそれを可溶化、濃縮お
よび精製したフラクションを湿潤ニトロセルロースフィ
ルター（０．４５μ，ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎ
ｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）に適用した。次に、
１％スキムミルク末含有緩衝液中でフィルターをブロッ
クし、続いて未標識ＴＮＦα５μｇ／ｍＬを添加したバ
ッチおよび未添加バッチの２種のバッチ中で、５×１０
５ｃｐｍ／ｍＬの１２５Ｉ−ＴＮＦα（０．３〜１．０
×１０８ｃｐｍ／μｇ）とインキュベートし、洗浄しそ
して風乾した。結合した放射能をオートラジオグラフィ
ーで半定量的に検出するか、またはガンマカウンターで
計数した。特異的１２５Ｉ−ＴＮＦα結合は、過剰量の
未標識ＴＮＦ−αの存在下における非特異的結合につい
て補正した後に測定した。フィルター試験における特異
的ＴＮＦ−結合を種々のＴＮＦ濃度で測定しそしてスキ
ャッチャード分析したところ、ｋｄ値は〜１０−９ない
しは１０−１０Ｍであった。
【００３８】〔実施例２〕 ＨＬ−６０細胞の細胞抽出物 ２ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３および５％ウシ胎児血清を含有
するＰＲＭＩ１６４０培地［ＧＩＢＣＯ，カタログ番号
０７４−０１８００］中、実験室規模でＨＬ６０細胞
［ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ ２４０］を５％ＣＯ２雰囲
気下培養し続いて遠心分離した。
【００３９】工業的規模で高密度の細胞を得るために以
下の操作を用いた。処理容量５８Ｌの７５Ｌ Ａｉｒｌ
ｉｆｔ醗酵器（Ｆａ．Ｃｈｅｍａｐ，スイス）中で培養
を行なった。 これには、外部循環回路に組み込まれ
た、膜表面積０．３２ｍ２（１カセット当たり）を有す
るカセット膜システム「ＰＲＯＳＴＡＫ」（Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ，スイス）を用いた。５Ｌ／分の流量で、Ｗａ
ｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗポンプ６０３型を用いて培養基
（表１）を送り込んだ。「ＰＲＯＳＴＡＫ」を個々にオ
ートクレーブ滅菌して装置を蒸気滅菌後、２０Ｌ Ａｉ
ｒｌｉｆｔ醗酵器（Ｃｈｅｍａｐ）から出発してＨＬ−
６０細胞の増殖を開始した。接種醗酵器中における細胞
培養は、慣用のバッチ工程で、表１記載の培地中初期細
胞濃度２×１０５個／ｍＬで行なった。４日後、ＨＬ６
０バッチを４．９×１０６個／ｍＬの細胞濃度で７５Ｌ
容の醗酵器に移した。ｐＨは７．１に、ｐＯ２値は２５
％飽和に維持し、ミクロ細孔フリットを通して酸素を導
入した。初期バッチ醗酵の後、２日目に細胞濃度４×１
０６個／ｍＬで灌流を培地交換３０Ｌ／日で開始した。
培地の濾液側で馴化培地を除き、新しい培地を加えるこ
とにより交換した。添加した培地には、プリマトン（Ｐ
ｒｉｍａｔｏｎ）０．２５〜０．３５％、グルタミン５
ｍＭ〜６ｍＭおよびグルコース４ｇ／Ｌ〜６ｇ／Ｌを添
加してあった。次に灌流量を３日目および４日目には培
地７２Ｌ／日に、そして５日目には培地１００Ｌ／日に
増大させた。連続培養１２０時間後に醗酵が終了した。
所定の醗酵条件下で４０×１０６個／ｍＬまでの指数増
殖が起こった。細胞数倍増時間は１０×１０６個／ｍＬ
までは２０〜２２時間であり、その後細胞密度の増加と
ともに３０〜３６時間に増大した。全醗酵期間を通じ、
生存細胞の割合は９０〜９５％であった。次にＨＬ−６
０バッチを醗酵器中、約１２℃まで冷却し、そして細胞
を遠心分離により回収した（Ｂｅｃｋｍａｎ遠沈器Ｊ−
６Ｂ型、ＲｏｔｏｒＪＳ ３０００ｒｐｍ，１０分，４
℃）。
【００４０】
【表１】
【００４１】５％ジメチルホルムアミド、１０ｍＭベン
ズアミジン、１００Ｕ／ｍＬアプロチニン、１０μＭロ
イペプチン、１μＭペプスタチン、１ｍＭｏ−フェナン
トロリ３、５ｍＭヨードアセトアミド、１ｍＭフェニル
メチルスルホニルフルオライドで処理しておいた等張リ
ン酸塩緩衝液（ＰＢＳ；０．２ｇ／ＬＫＣｌ，０．２ｇ
／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４，８．０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ，２．１
６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ）（以下ＰＢＳ−
Ｍと称する）で、遠沈物を洗浄した。洗浄した細胞を、
トリトンＸ−１００添加（最終濃度１．０％）ＰＢＳ−
Ｍ中、細胞密度２．５×１０８個／ｍＬで抽出した。細
胞抽出液は遠心分離（１５，０００×ｇ，１時間；１０
０，０００×ｇ，１時間）により清澄化した。
【００４２】〔実施例３〕 モノクローナル（ＴＮＦ−ＢＰ）抗体の生産 実施例２により得られた実験室規模のＨＬ６０細胞培養
物の遠沈上清を１：１０にＰＢＳで希釈した。希釈した
上清を製造者の推奨に従って組み換えヒトＴＮＦ−α
［Ｐｅｎｎｉｃａ，Ｄ．等，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ
３１２，７２４；Ｓｈｉｒａｉ Ｔ．等，（１９８５）
Ｎａｔｕｒｅ３１３，８０３；Ｗａｎｇ， Ａ．Ｍ．
等、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８，１４９］２０
ｍｇを結合させたＡｆｆｉｇｅｌ １０（ＢｉｏＲａ
３，カタログＮｏ．１５３ ６０９９）２ｍＬを含有す
るカラムに４℃で加えた（流量：０．２ｍＬ／分）。４
℃で、まず０．１％トリトンＸ１１４含有３３ＢＳ ２
０ｍＬを用い、次にＰＢＳ ２０ｍＬを用いて、流量１
ｍＬ／分でカラムを洗浄した。このようにして富化され
たＴＮＦ−ＢＰを２２℃、流量２ｍＬ／分で、１００ｍ
Ｍグリシン、ｐＨ２．８、０．１％デシルマルトシド４
ｍＬを用いて溶離した。溶出液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ３
０ユニット［Ａｍｉｃｏｎ］中１０μＬまで濃縮した。
【００４３】この溶出液１０μＬをフロイント完全アジ
ュバント２０μＬと混合して乳濁液とした。この乳濁液
１０μＬを、Ｈｏｌｍｄａｈｌ，Ｒ．等の方法［（１９
８５），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８３，
３７９］に記載される操作に従い、第０日、７日および
１２日目に、麻酔下のＢａｌｂ／ｃマウスの後足に注射
した。
【００４４】免疫化されたマウスを１４日に屠殺し、膝
窩リンパ節を摘出し、２ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３を含有す
るＩｓｃｏｖｅ培地（ＩＭＥＭ，ＧＩＢＣＯカタログＮ
ｏ．０７４−２２００）中で反復ピペッティングするこ
とにより、粉砕懸濁した。Ｄｅ Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈおよ
びＳｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒの変法［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０），３５：１］に従い、
リンパ節細胞５×１０７個を対数増殖期にあるＰＡＩマ
ウスミエローマ細胞（Ｊ．Ｗ．Ｓｔｏｃｋｅｒ等，Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ，２１７，１９８
２年５月，１５５−１５７）５×１０７個と融合させ
た。細胞を混合し、遠心分離により回収しそしてわずか
に振とうしながら室温でＩＭＢＭ中の５０％（ｖ／ｖ）
ポリエチレングリコール２ｍＬ中に再懸濁しそして１０
分間慎重に振とうしながらＩＭＥＭ１０ｍＬをゆっくり
添加して希釈した。遠心分離により細胞を回収し、そし
て完全培地［ＩＭＢＭ＋２０％ウシ胎児血清、グルタミ
ン（２．０ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（１００
μＭ）、１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノ
プテリンおよび１６μＭチミジン（ＨＡＴ）］２００ｍ
Ｌ中に再懸濁した。再懸濁液を９６ウェル組織培養皿１
０枚に分注し、５％ＣＯ２雰囲気下、相対湿度９８％で
培地交換することなく、１１日間３７℃でインキュベー
トした。
【００４５】ＨＬ６０細胞へのＴＮＦの結合に及ぼす阻
害作用または実施例１のフィルター試験における抗原へ
の結合に基づいて抗体を識別した。抗（ＴＮＦ−ＢＰ）
抗体の生物活性を検出する為に以下の方法を用いた。即
ち、５×１０５個のＨＬ６０またはＵ９３７細胞を、濃
度範囲１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬのアフィニティ精
製モノクローナル抗−（ＴＮＦ−ＢＰ）抗体または対照
抗体（すなわちＴＮＦ−ＢＰに対しない抗体）とともに
完全ＲＰＭＩ１６４０培地中でインキュベートした。１
時間３７℃でインキュベートした後、細胞を遠心分離に
より回収し、０℃でＰＨＳ４．５ｍＬを用いて洗浄し
た。これらを、未標識のＴＮＦα（前述）を添加するか
またはしないで、０．１％アジ化ナトリウムおよび
１２５Ｉ−ＴＮＦα（１０６ｃｐｍ／ｍＬ）をさらに含
有する完全ＲＰＭＩ１６４０培地（実施例２）１ｍＬ中
に再懸濁した。１２５Ｉ−ＴＮＦαの比放射能は７００
Ｃｉ／ミリモルであった。細胞を４℃で２時間インキュ
ベートし、回収して、１％ＢＳＡおよび０．００１％ト
リトンＸ１００（Ｆｌｕｋａ）を含有するＰＢＳ４．５
ｍＬを用い０℃で４回洗浄した。細胞に結合した放射能
をγ−シンチレーションカウンターで測定した。抗（Ｔ
ＮＦ−ＢＰ）抗体で処理しなかった細胞の細胞結合放射
能を比較実験で測定した（約１０，０００ｃｐｍ／５×
１０６細胞）。
【００４６】〔実施例４〕 アフィニティクロマトグラフィー さらに精製するには、実施例３で得られたモノクローナ
ル抗（５５ｋＤ ＴＮＦ−ＢＰ）抗体（２．８ｍｇ／ｍ
Ｌゲル）、ＴＮＦα（３．０ｍｇ／ｍＬゲル）およびウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ，８．５ｍｇ／ｍＬゲル）を
各々、製造者の指示書に従ってＣＮＢｒ−活性化セファ
ロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，ス
ウェーデン）に共有結合させた。このようにして調製し
たカラムに実施例２に従って得られた細胞抽出液を通し
た。このカラムは以下の順序、即ちＢＳＡ−セファロー
スプレカラム、免疫アフィニティカラム［抗−（５５ｋ
Ｄ−ＴＮＦ−ＢＰ）抗体］、ＴＮＦα−リガンドアフィ
ニティカラムの順で連結して用いた。適用終了後最後の
２つのカラムを分け、それぞれ以下の緩衝溶液：（１）
ＰＢＳ，１．０％トリトンＸ−１００，１０ｍＭベンズ
アミジン，１００Ｕ／ｍｌアプロチニン；（２）ＰＢ
Ｓ，０．１％トリトンＸ−１００，０．５ＭＮａＣｌ，
１０ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭベンズアミジン，１００Ｕ
／ｍｌアプロチニン；および（３）ＰＢＳ，０．１％ト
リトンＸ−１００，１０ｍＭベンズアミジン，１００Ｕ
／ｍｌアプロチニン１００ｍＬずつを用いて洗浄した。
次に免疫アフィニティカラムおよびＴＮＦα−リガンド
アフィニティカラムを各々、１００ｍＭグリシンｐＨ
２．５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．２％デシルマルト
シド、１０ｍＭベンズアミジン、１００Ｕ／ｍｌアプロ
チニンで溶離した。実施例１のフィルター試験で活性を
示した各カラムのフラクションを合わせ、１Ｍトリスｐ
Ｈ８．０を用いて中和した。
【００４７】一方は免疫アフィニティクロマトグラフィ
ーそして他方はＴＮＦα−リガンドアフィニティクロマ
トグラフィーのこのように合一したＴＮＦ−ＢＰ活性フ
ラクションをさらに精製するために、再度各々小型のＴ
ＮＦα−リガンドアフィニティカラムに適用した。次
に、これら２本のカラムを、（１）ＰＢＳ，１．０％ト
リトンＸ−１００，１０ｍＭベンズアミジン，１００Ｕ
／ｍｌアプロチニン，（２）ＰＢＳ，０．１％トリトン
Ｘ−１００，０．５Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＡＴＰ，
１０ｍＭベンズアミジン，１００Ｕ／ｍｌアプロチニ
ン，（３）ＰＢＳ，０．１％トリトンＸ−１００，
（４）５０ｍＭトリスｐＨ７．５，１５０ｍＭＮａＣ
ｌ，１．０％ＮＰ−４０，１．０％デスオキシコレー
ト，０．１％ＳＤＳ（５）ＰＢＳ，０．２％デシルマル
トシドの各々４０ｍＬで洗浄した。次にカラムを１００
ｍＭグリシンｐＨ２．５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．
２％デシルマルトシドで溶離した。各カラムから０．５
ｍＬずつのフラクションを回収し、フィルター試験（実
施例１）で活性を示した各カラムのフラクションを合わ
せＣｅｎｔｒｉｃｏｎユニット（Ａｍｉｃｏｎ，分子量
排除１０，０００）で濃縮した。
【００４８】〔実施例５〕 ＨＰＬＣによる分離 実施例４で得られた活性フラクションを、０．１％トリ
フルオロ酢酸、０．１％オクチルグルコシドで平衡化さ
せておいたＣ１／Ｃ８逆相ＨＰＬＣカラム（ＰｒｏＲＰ
Ｃ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，５×２０ｍｍ）に、それらの
異なる調製元（免疫またはリガンドアフィニティクロマ
トグラフィー）に従って適用した。次にカラムを、０．
５ｍＬ／分の流量で、同一緩衝液中アセトニトリルの直
線状グラジエント（０〜８０％）で溶離した。各カラム
から１．０ｍＬずつのフラクションを回収し、各カラム
から得られた活性フラクションを合わせた（検出は実施
例１のとおり）。
【００４９】〔実施例６〕 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離 実施例５により得られ、フィルター試験（実施例１）で
活性を示したフラクションを更に文献［Ｍ．Ｗ．Ｈｕｎ
ｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｅ．Ｌｕｊａｎ，Ｆ．Ｏｓｔｒａｎ
ｄｅｒ，Ｌ．Ｅ．Ｈｏｏｄ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．９１，２２７，１９８３］に従ってＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより分離した。この目的には、試料をＳＤＳ試
料緩衝液中３分間９５℃に加熱し、次に５％回収ゲルを
有する１２％アクリルアミド分離ゲル上での電気泳動に
より分離した。以下の標準タンパク質即ち、ホスホリラ
ーゼＢ（９７．４ｋＤ），ＢＳＡ（６６．２ｋＤ），卵
アルブミン（４２．７ｋＤ），カルボアンヒドラーゼ
（３１．０ｋＤ），大豆トリプシン阻害剤（２１．５ｋ
Ｄ）およびリゾチーム（１４．４ｋＤ）を、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲル上の見かけの分子量の測定の為の標準物質と
して用いた。
【００５０】上記した条件下では、免疫アフィニティク
ロマトグラフィー溶出液のＴＮＦαリガンドアフィニテ
ィクロマトグラフィーにより実施例４で得られ、そして
更に実施例５のＨＰＬＣで分離された試料については、
５５ｋＤおよび５１ｋＤの２つのバンド、および３８ｋ
Ｄ，３６ｋＤおよび３４ｋＤの３つの弱いバンドが得ら
れた。Ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓ Ｂｌｏｔ Ｓｙｓｔｅｍ
（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉａ，米国）を用いて、２５ｍＭ トリス、１９２ｍＭ
グリシン、２０％メタノール中、１００Ｖで１時間電気
泳動することによりこれらのバンドをＰＶＤＦ膜（Ｉｍ
ｍｏｂｉｌｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒ
ｄ，Ｍａｓｓ，米国）に移した。次にＰＶＤＦ膜をメタ
ノール／水／氷酢酸（５０／４０／１０容量部）中の
０．１５％ Ｓｅｒｖａ−Ｂｌｕｅ（Ｓｅｒｖａ，Ｈｅ
ｉｄｅｌｂｅｒｇ，西独）でタンパク染色するか、また
は、スキムミルク末でブロックし、続いて実施例１に記
載されたフィルター試験の条件に従って１２５Ｉ−ＴＮ
Ｆαとインキュベートし、ＴＮＦ−ＢＰ活性を有するバ
ンドを検出した。これにより、タンパク質染色で生成し
た全てのバンドが特異的にＴＮＦαに結合したことが示
された。Ｔｏｗｂｉｎ等［Ｈ．Ｔｏｗｂｉｎ，Ｔ．Ｓｔ
ａｅｈｅｌｉｎおよびＪ．Ｇｏｒｄｏｎ：Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６，４３５０，
１９７９］によるウェスタンブロットにおいては、これ
らのバンドの全てがまた、実施例３で調製したモノクロ
ーナル抗−５５ｋＤ ＴＮＦ−ＢＰ抗体に結合してい
た。この場合、Ｎａ１２５Ｉ放射性標識、アフィニティ
精製（マウス免疫グロブリン−セファロース４Ｂアフィ
ニティカラム）ウサギ抗−マウス免疫グロブリン抗体を
用いた実施例１に記載の方法を用いてこの抗体のオート
ラジオグラフィー検出を行なった。
【００５１】免疫アフィニティクロマトグラフィー回収
物の２回ＴＮＦαリガンドアフィニティクロマトグラフ
ィーにより実施例４で得られ、そして、実施例５のＨＰ
ＬＣで更に分離された試料は、上記に詳細に記載したＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥおよびブロット転移条件下では、２個の
付加的なバンド７５ｋＤおよび６５ｋＤを示し、これら
は共に、フィルター試験（実施例１）でＴＮＦに特異的
に結合した。Ｔｏｗｂｉｎ等によるウェスタンブロット
（前述）では、これらの２つのバンドのタンパク質は実
施例３で生産された抗−（５５ｋＤ ＴＮＦ−ＢＰ）抗
体とは反応しなかった。しかしながらこれらは実施例３
に従って７５ｋＤバンドから出発して生産されたモノク
ローナル抗体（抗−７５ｋＤ ＴＮＦ−ＢＰ抗体）とは
反応した。
【００５２】〔実施例７〕 アミノ酸配列分析 アミノ酸配列分析には、実施例５により得られ、そして
フィルター試験（実施例１）で活性を示したフラクショ
ンを、実施例６記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件を用いるが
ただし今回は還元条件下（ＳＤＳ試料緩衝液に１２５ｍ
Ｍ ジチオトレイトールを添加）で分離した。実施例６
と同じバンドが見られたが、実施例６に比較してＳＤＳ
−ＰＡＧＥが還元条件下であったため、全てが約１〜２
ｋＤ高い分子量を示した。次にこれらのバンドを実施例
６に従ってＰＶＤＦ膜に移し、そしてメタノール／水／
氷酢酸（５０／４０／１０容量部）中の０．１５％Ｓｅ
ｒｖａ−Ｂｌｕｅを用いて１分間染色し、メタノール／
水／氷酢酸（４５／４８／７容量部）で脱色し、水です
すぎ、風乾して切り出した。Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ
［Ｍ．Ｗ．Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｅ．Ｌｕｊａｎ，
Ｆ．Ｏｓｔｒａｎｄｅｒ，Ｌ．Ｅ．Ｈｏｏｄ：Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ１．９１，２２７，１９８３］の
条件を全段階に適用することにより、Ｎ末端ブロッキン
グを回避した。先ず、精製されたＴＮＦ−ＢＰを未変化
のまま用いてアミノ酸配列決定を行なった。更に配列情
報を得るために、還元およびＳ−カルボキシメチル化
［Ｊｏｎｅｓ，Ｂ．Ｎ．（１９８６），“Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔ
ｅｒｉｚａｔｉｏｎ”Ｊ．Ｅ．Ｓｈｉｖｅｌｙ編，Ｈｕ
ｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ，１２４
−１２５］後のＴＮＦ−ＢＰを臭化シアン（Ｔａｒｒ，
Ｇ．Ｅ．前記“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ”，１
６５−１６６）、トリプシンおよび／またはプロティナ
ーゼＫで分解し、そしてペプチドをタンパク質化学上知
られた方法に従ってＨＰＬＣにより分離した。このよう
にして調製された試料を次に、出口に連結されたオンラ
イン自動ＨＰＬＣ ＰＴＨアミノ酸分析基（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ １２０，Ａ
ＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ，米国）を
備えた自動気相ミクロ配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ４７０Ａ，ＡＢＩ
前記）で配列決定して、以下のアミノ酸配列が決定され
た。
【００５３】１．５５ｋＤバンド（非還元ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）に関し： Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｓｅ
ｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−
Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ，（配列番号１） および Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈ
ｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ （配列番号２） （式中Ｘａａは決定できなかったアミノ酸残基を示す） ２．５１ｋＤおよび３８ｋＤバンド（非還元ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）に関し： Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ（配列番号３４） ３．６５ｋＤバンド（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に関
し：６５ｋＤバンドのＮ末端配列決定では、２つの平衡
配列が中断なく１５番目の残基まで決定された。２つの
配列の１方がユビキチン［Ｔ．Ｓｔ．Ｊｏｈｎ，Ｗ．
Ｍ．Ｇａｌｌａｔｉｎ，Ｍ．Ｓｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｈ．
Ｔ．Ｓｍｉｔｈ，Ｖ．Ａ．ＦｒｉｅｄおよびＩ．Ｌ．Ｗ
ｅｉｓｓｍａｎ：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１，８４５，１
９８６，Ｍ．Ｓｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｍ．Ｗ．Ｂｏｎｄ，
Ｗ．Ｍ．Ｇａｌｌａｔｉｎ，Ｔ．Ｓｔ．Ｊｏｈｎ，Ｈ．
Ｔ．Ｓｍｉｔｈ，Ｖ．Ａ．ＦｒｉｅｄおよびＩ．Ｌ．Ｗ
ｅｉｓｓｍａｎ：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１，８２３，１
９８６］の部分配列であったため、以下の配列を６５ｋ
Ｄバンドのものとした。 Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐ
ｈｅ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（配列番
号３） （式中Ｘａａは決定できなかったアミノ酸残基を示す） ７５（６５）ｋＤａ−ＴＮＦ−ＢＰについて更にペプチ
ド配列を決定した。 Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖ
ａｌ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｕ （配列番号４） および Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番
号５） および Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ （配列番号６） および Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ （配列番号７） および Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ （配列番号８） および Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａ
ｓｐ （配列番号９） および Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｎ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘａ
ａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ （配列番号１０） （式中Ｘａａは決定できなかったアミノ酸残基を示
す）。
【００５４】〔実施例８〕 相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の塩基配列決定 式ＩＡのアミノ酸配列から出発し、アミノ酸残基２〜７
および１７〜２３の遺伝暗号を考慮しながら、適当な相
補性の相当する完全縮重オリゴヌクレオチド（「セン
ス」および「アンチセンス」オリゴヌクレオチド）を合
成した。全細胞ＲＮＡをＨＬ６０から単離し［Ｊ．Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅ
ｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓ
ｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏ
ｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．
Ｇ．ＳｅｉｄｍａｎおよびＫ．Ｓｔｒｕｈｌ：Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９８７−１９８８，Ｓ．Ｗｉｌ
ｅｙおよびＳｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７］そ
して最初のｃＤＮＡ鎖をオリゴ−ｄＴプライミングまた
は「アンチセンス」オリゴヌクレオチドによるプライミ
ングによりｃＤＮＡ合成キット（ＲＰＮ １２５６，Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，英国）を用いて、
製造元の指示書に従って合成した。このｃＤＮＡ鎖およ
び２つの合成縮重「センス」および「アンチセンス」オ
リゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応に用いて（Ｐ
ＣＲ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒ
ｗａｌｋ，ＣＴ，米国，製造元の指示書による）アミノ
酸残基８〜１６（式ＩＡ）をコードする塩基配列をｃＤ
ＮＡ断片として合成した。このｃＤＮＡ断片の塩基配列
は５’−ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＡＧＴＧＴＧ
ＴＧＴＣＣＣ−３’であった。このｃＤＮＡ断片を、ヒ
ト胎盤からのλｇｔｌｌ−ｃＤＮＡ遺伝子バンクにおけ
る５５ｋＤ ＴＮＦ−ＢＰをコードするｃＤＮＡクロー
ンを、知られた方法により同定するためのプローブとし
て用いた［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓ
ｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８
９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．
Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．
Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．ＳｅｉｄｍａｎおよびＫ．Ｓｔｒ
ｕｈｌ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９８７−１９
８８，Ｓ．ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，１９８７］。次にこのクローンをλ−ベクターから
常法により切り出しそしてプラスミドｐＵＣ１８（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）およ
びｐＵＣ１９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，
スウェーデン）およびＭ１３ｍｐ１８／Ｍ１３ｍｐ１９
バクテリオファージ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａ
ｌａ，スウェーデン）にクローニングした［Ｊ．Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅ
ｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓ
ｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏ
ｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．
Ｇ．ＳｅｉｄｍａｎおよびＫ．Ｓｔｒｕｈｌ：Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＢｉｏｌｏｇｙ １９８７−１９８８，Ｓ．Ｗｉｌｅ
ｙおよびＳｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７］。こ
のｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列は製造元の指示
に従いＳｅｑｕｅｎａｓｅキット（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ，米国）
を用いて決定した。５５ｋＤ ＴＮＦ−ＢＰに対するヌ
クレオチド配列およびそれに由来するアミノ酸配列およ
びそのシグナルペプチド（アミノ酸−２８〜アミノ酸
０）を当該分野で通常のアミノ酸のような塩基に関する
略号を使用して図１および２に示す。その他の既に知ら
れたレセプタータンパク質配列と比較することにより、
約１８０アミノ酸を含有するＮ末端ドメインおよび２２
０アミノ酸を含有するＣ末端ドメインを決定でき、これ
らはお互いに１９アミノ酸（図１および２下線部）のト
ランスメンブレン領域により隔てられており、これは配
列比較より明らかである仮説上のグリコシル化部位は、
図１および２中、相当するアミノ酸の上に星印を付して
示した。
【００５５】本質的に同様の方法を用いて、７５／６５
ｋＤ ＴＮＦ−ＢＰ−コードｃＤＮＡ部分配列を同定し
たが、ここではゲノムヒトＤＮＡおよびペプチドＩＩＡ
由来完全縮重１４量体および１５量体「センス」および
「アンチセンス」オリゴヌクレオチドを用いて、ポリメ
ラーゼ連鎖反応において一次２６ｂｐ ｃＤＮＡ プロ
ーブを生成させた。次にこのｃＤＮＡプローブをＨＬ−
６０ ｃＤＮＡライブラリーに対して使用し、種々の長
さのｃＤＮＡクローンを同定した。このｃＤＮＡライブ
ラリーは、製造元の指示に従い、単離したＨＬ６０ＲＮ
ＡおよびｃＤＮＡクローニングキット（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）を用いて調整した。かかるｃＤＮＡクローンの配列
を図５および６に示し、ここでは、反復した配列決定に
より以下の補正がなされる。即ち、「ＴＣＣ」ではなく
「ＡＣＣ」でコードされるトレオニンがセリンの代わり
に３−位に位置しなければならない。
【００５６】〔実施例９〕 ＣＯＳ１細胞における発現 プラスミドｐＮ１１から出発するベクターをＣＯＳ細胞
での発現用に作製した。プラスミドｐＮ１１はヒトサイ
トメガロウイルスの「主要極初期」遺伝子の効率良いプ
ロモーターおよびエンハンサーを含有している（「ＨＣ
ＭＶ」；Ｂｏｓｈａｒｔ等，Ｃｅｌｌ，４１；５２１−
５３０，１９８５）。プロモーターの後に位置する短い
ＤＮＡ配列はそのプラスミド中に１か所しか存在しない
（「ポリリンカー」）いくつかの制限酵素切断部位、特
にＨｉｎｄＩＩＩ，ＢａｌＩ，ＢａｍＨＩおよびＰｖｕ
ＩＩの切断部位を含有する（配列参照）。
【００５７】 これらの切断部位の後に、全ての３つの読み枠内に３つ
の翻訳終止コドンが位置する。ポリリンカー配列の後に
ラットプレプロインシュリン遺伝子の２番目のイントロ
ンおよびポリアデニル化シグナルが位置する（Ｌｏｍｅ
ｄｉｃｏ等，Ｃｅｌｌ １８：５４５−５５８，１９７
９）。このプラスミドはまたＳＶ４０ウイルスの複製起
点およびｐＢＲ３２２由来断片を有しており、これが
Ｅ．ｃｏｌｉ細菌にアンピシリン耐性を付与しそして
Ｅ．ｃｏｌｉ内でのプラスミドの複製を可能にする
【００５８】発現ベクターｐＮ１２３を作製するには、
このプラスミドｐＮ１１を制限エンドヌクレアーゼＰｖ
ｕＩＩで切断し、次にアルカリホスファターゼで処理し
た。次に脱ホスホリル化されたベクターをアガロースゲ
ルから単離した（ＶＩ）。５５ｋＤ ＴＮＦ−ＢＰ−ｃ
ＤＮＡのＥｃｏＲＩ切断１．３ｋｂ断片の５’突出ヌク
レオチド（実施例８参照）をクレノウ酵素を用いてフィ
ルインした。次にこの断片をアガロースゲルから単離し
た（Ｆ１）。然るのち Ｔ４−リガーゼを用いてＶ１と
Ｆ１を連結した。次に知られた方法［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｉｎｇ，Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，１９８９］に従ってこの連結バッチでＥ．
ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換した。制限分析お
よび知られた方法によるＤＮＡ配列決定［Ｊ．Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅ
ｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９］により、プラス
ミドで形質転換されそしてＨＣＭＶ−プロモーターによ
る発現にとって正しい方向に５５ｋＤ ＴＮＦ−ＢＰ−
ｃＤＮＡの１．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を含有する形質
転換体を同定した。このベクターには「ｐＮ１２３」の
名称を付した。
【００５９】以下の方法を用いてベクターｐＫ１９を作
製した。５５ｋＤ ＴＮＦ−ＢＰの細胞外部分（アミノ
酸−２８〜１８２，図１および２中）をコードするｃＤ
ＮＡのみを含有するＤＮＡ断片をＰＣＲ法により得た
（Ｓａｉｋｉ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０−
１３５４，１９８５，実施例８も参照）。下記のオリゴ
ヌクレオチドを用いて５５ｋＤ ＴＮＦ−ＢＰの細胞外
部分をコードするｐＮ１２３からのｃＤＮＡを増殖させ
た。
【００６０】
【００６１】これらのオリゴヌクレオチドを用いて、ア
ミノ酸１８２の後の翻訳終止コドン２つも導入した。こ
のようにして増幅されたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよび
Ａｓｐ ７１８で切断し、それにより生成する突き出た
末端をクレノウ酵素でフィルインしそしてこの断片をア
ガロースゲルから単離した（Ｆ２）。次にＦ２をＶ１と
連結しそして全バッチを用いて前記したようにＥ．ｃｏ
ｌｉＨＢ１０１の形質転換を行なった。ＨＣＭＶ−プロ
モータによる発現にとって正しい方向にＤＮＡ断片を含
有するプラスミドで形質転換された形質転換体をＤＮＡ
配列決定（前述）により同定した。これから単離したプ
ラスミドには名称「ｐＫ１９」を付した。
【００６２】プラスミドｐＮ１２３またはｐＫ１９によ
るＣＯＳ細胞のトランスフェクションはＦｅｌｇｎｅｒ
等によるリポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：７４１３−７４１７，
１９８７）に従って行なった。トランスフェクション７
２時間後、ｐＮ１２３でトランスフェクションされた細
胞を１２５Ｉ−ＴＮＦαとの結合に関し、知られた方法
で分析した。かくして得られた結合データ（図３Ａ）の
スキャッチャード分析［Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ｇ．，Ａ
ｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０，１９
４９］の結果を図３Ｂに示す。ｐＫ１９でトランスフェ
クションされた細胞の培養上清を「サンドイッチ」試験
で調べた。この目的には、ＰＣＶマイクロタイタープレ
ート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＡ，
米国）をウサギ抗−マウス免疫グロブリン（１０μｇ／
ｍＬ ＰＢＳ）１００μＬ／ウェルで感作した。次に、
プレートを洗浄し、そして実施例３で抗原結合性により
検出され単離されたが細胞へのＴＮＦの結合は阻害しな
い抗−５５ｋＤ ＴＮＦ−ＢＰ抗体とインキュベート
（３時間，２０℃）した。次にプレートを再度洗浄しそ
して培養上清（１％スキムミルク末，５０ｍＭトリス／
塩酸ｐＨ７．４，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ，０．０２％アジ化ナトリウムを含有する緩衝液Ａ
で１：４に希釈）１００μＬ／ウェルと４℃で一夜イン
キュベートした。プレートを空にし、未標識ＴＮＦ ２
μｇ／ｍＬを添加するかまたはしないで１２５Ｉ−ＴＮ
Ｆα含有緩衝液Ａ（１０６ｃｐｍ／ｍＬ，１００μＬ／
ウェル）と２時間４℃でインキュベートした。次にプレ
ートをＰＢＳで４回洗浄し、各ウェルを切り離し、γ−
カウンターで測定した。５つの平行トランスフェクショ
ン（カラム＃２，３，４，６および７）、ｐＮ１１ベク
ターによる２つの対照トランスフェクション（カラム＃
１，５）およびＨＬ６０細胞溶解物を用いた対照（カラ
ム＃８）の結果を図４に示す。
【００６３】〔実施例１０〕 昆虫細胞での発現 プラスミドｐＶＬ９４１（ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍ
ｅｒｓ，１９８９，「Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓ
ｉｓウイルス発現ベクターによる非融合外来遺伝子の高
レベル発現」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７０：３１−３９）に
以下のとおり改変を加えてバキュロウイルス発現系にお
ける発現を行なった。ｐＶＬ９４１中の１個のＥｃｏＲ
Ｉ切断部位を、ＥｃｏＲＩでプラスミドを切断すること
により除去し、５’突出末端をクレノウ酵素でフィルイ
ンした。これより得られたプラスミドｐＶＬ９４１／Ｅ
をＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、そしてベク
ター本体をアガロースゲルから単離した。この断片を以
下に示す配列の合成オリゴヌクレオチドと連結した。
【００６４】
【００６５】連結バッチでＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を
形質転換し、オリゴヌクレオチドが正しく導入されたプ
ラスミドを含有する形質転換体を既知方法（前出）に従
い制限分析およびＤＮＡ配列決定により同定した。この
プラスミドをｐＮＲ７０４と命名した。転移ベクターｐ
Ｎ１１３を作製するには、このプラスミドｐＮＲ７０４
をＥｃｏＲＩで切断し、アルカリホスファターゼで処理
し、そしてこのようにして得られたベクター本体（Ｖ
２）を次にアガロースゲルから単離した。前記したよう
にＥｃｏＲＩで切断した５５ｋＤ ＴＮＦ−ＢＰ−ｃＤ
ＮＡの１．３ｋｂ断片を断片Ｖ２と連結した。この連結
バッチを用いて得られた形質転換体で、多面体プロモー
ターによる発現にとって正しい方向のｃＤＮＡ挿入物を
有するプラスミドを含有するものを同定した（前記）。
これより単離されたベクターをｐＮ１１３と命名した。
【００６６】以下の操作を用いて転移ベクターｐＮ１１
９を作製した。ｐＵＣ１９プラスミド中の５５ｋＤ Ｔ
ＮＦ−ＢＰ ｃＤＮＡの１．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ／Ｅｃ
ｏＲＩ断片（実施例８参照）をＢａｎＩで消化しそして
以下に示す合成オリゴヌクレオチドと連結した。
【００６７】
【００６８】アミノ酸１８２の後の２つの翻訳終止コド
ンおよび制限エンドヌクレアーゼＡｓｐ７１８の切断部
位を上記アダプターを用いて導入した。連結した後、バ
ッチをＥｃｏＲＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、部分的
５５ｋＤＴＮＦ−ＢＰ断片（Ｆ３）を単離した。さら
に、同様にしてＡｓｐ７１８およびＥｃｏＲＩで切断さ
れたプラスミドｐＮＲ７０４をＦ３と連結し、そして連
結バッチをＥ．ｃｏｌｉＨＢ １０１に形質転換させ
た。部分的５５ｋＤ ＴＮＦ−ＢＰ ｃＤＮＡが正しく
発現されるように組み込まれたプラスミドを含有する形
質転換体の同定はすでに記載したようにして行なった。
これらの形質転換体から単離されたプラスミドをｐＮ１
１９と命名した。
【００６９】以下の操作を用いて、転移ベクターｐＮ１
２４の作製を行なった。実施例９記載の５５ｋＤ ＴＮ
Ｆ−ＢＰの細胞外部分をコードするｃＤＮＡ断片を、実
施例９記載のＰＣＲ技術により、特定のオリゴヌクレオ
チドで増幅させた。この断片をＢａｍＨＩおよびＡｓｐ
７１８で切断し、そしてアガロースゲルから単離した
（Ｆ４）。プラスミドｐＮＲ７０４もまたＢａｍＨＩお
よびＡｓｐ７１８で切断し、そしてベクター本体（Ｖ
４）を単離した（前記）。断片Ｖ４およびＦ４を連結
し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１をこれで形質転換し、そ
して組換え転移ベクターｐＮ１２４を前述のようにして
同定および単離した。
【００７０】以下の操作を用いて昆虫細胞をトランスフ
ェクションした。転移ベタターｐＮ１１３の３μｇをＳ
ｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）中 Ａｕｔｏ
ｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａｎｕｃｌｅａｒ
ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）
（ＥＰ１２７８３９）のＤＮＡ１μｇでトランスフェク
ションした。多面体陰性ウイルスを同定しそして「プラ
ーク」から精製した［Ｌｕｃｋｏｗ およびＳｕｍｍｅ
ｒｓ，”Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆ
ｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎ
ｄ ＩｎｓｅｃｔＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃ
ｅｄｕｒｅｓ”，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ
ｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅ
ｘａｓＡ ＆ Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｕｌｌｅ
ｔｉｎ Ｎｏ．１５５５，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１
９８８］。Ｓｆ９細胞を文献［Ｌｕｃｋｏｗ およびＳ
ｕｍｍｅｒｓ，”Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ
ｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ”，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉ
ｏｎ，Ｔｅｘａｓ Ａ ＆ Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ，Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５，２ｎｄ ｅｄ
ｉｔｉｏｎ，１９８８］記載のようにしてこれら組換え
ウイルスに再度感染させた。培養３日後、感染した細胞
を、１２５Ｉ−ＴＮＦαを用いてＴＮＦ−結合に関して
調べた。この目的には、トランスフェクションされた細
胞をパスツールピペットを用いて細胞培養皿から洗い取
り、そして未標識ＴＮＦα５μｇ／ｍＬの存在下、また
は非存在下で、１２５Ｉ−ＴＮＦα １０ｎｇ／ｍＬを
含有する培養基［ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒ
ｓ，”Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏ
ｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ
Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃ
ｅｄｕｒｅｓ”，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ
ｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅ
ｘａｓ Ａ ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｕｌｌｅ
ｔｉｎ Ｎｏ．１５５５，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１
９８８］中に細胞密度５×１０６個／ｍＬで再懸濁し、
氷上２時間インキュベートした。その後、純粋な培養基
で細胞を洗浄しそして細胞に結合した放射能をγ−カウ
ンターで計数した（第２表参照）。
【００７１】
【表２】
【００７２】〔実施例１１〕実施例９記載の方法と同様
にして、５５ｋＤ ＴＮＦ−ＢＰの細胞外領域をコード
するＣＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応で増幅させた
が、今回はプライマーとして以下のオリゴヌクレオチド
を用いた。
【００７３】
【００７４】このｃＤＮＡ断片を、ＳｓｔＩ制限切断部
位であらかじめＣＤ４−ｃＤＮＡを除いておいたｐＣＤ
４−Ｈ γ３ ベクター［ＤＳＭ５５２３：欧州特許出
願９０１０７３９３．２；日本国特許出願１０８９６７
／９０：米国特許出願５１０７７３／９０］中に連結し
た。ＳｓｔＩ切断部位はベクターｐＣＤ４−Ｈγ３中で
は、ＣＤ４−部分配列断片の前のみならず中および後に
位置している。この構造物を、Ｏｉ等のプロトプラスト
融合法（Ｐｒｏｃｄ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ．８０：８２５−８２９，１９８３）を用いてＪ５
５８ミエローマ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ６）にト
ランスフィックスした。トランスフェクタントは、基礎
培地（ダルベッコ改変イーグル培地、１０％ウシ胎児血
清、５×１０−５Ｍ ２−メルカプトエタノール）中ミ
コフェノール酸５μｇ／ｍＬおよびキサンチン２５０μ
ｇ／ｍＬを添加することにより、選択した［Ｔｒａｕｎ
ｅｃｋｅｒ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：８
５１−８５４（１９８６）］。トランスフィックスされ
た細胞から分泌された発現産物は、タンパク質化学の常
法、例えばＴＮＦ−ＢＰ抗体アフィニティクロマトグラ
フィーにより精製できた。特段の記載が無い限り、例え
ば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．の「Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ」，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉ
ｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）記載の
標準操作を用いて、使用細胞系の培養、クローニング、
クローン化細胞の選択または増殖を行なった。
【００７５】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：２８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 他の情報：Ｘａａは未決定アミノ酸を示す。 配列 配列番号：２ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：３ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 他の情報：Ｘａａは未決定アミノ酸を示す。 配列 配列番号：４ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 他の情報：Ｘａａは未決定アミノ酸を示す。 配列 配列番号：５ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：６ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：７ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：８ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：９ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：１０ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 他の情報：Ｘａａは未決定アミノ酸を示す。 配列 配列番号：１１ 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 他の情報：Ｘａａは未決定アミノ酸を示す。 配列 配列番号：１２ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 配列番号：１３ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 配列番号：１４ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 配列番号：１５ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 配列番号：１６ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 配列番号：１７ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 他の情報：Ｘａａは未決定アミノ酸を示す。 配列 配列番号：１８ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 配列番号：１９ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 配列番号：２０ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 配列番号：２１ 配列の長さ：８３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 他の情報：Ｘａａは未決定アミノ酸を示す。 配列 配列番号：２２ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 配列番号：２３ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 他の情報：Ｘａａは未決定アミノ酸を示す。 配列 配列番号：２４ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 配列番号：２５ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 配列番号：２６ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 配列番号：２７ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 配列番号：２８ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 配列番号：２９ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 配列番号：３０ 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 配列番号：３１ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 配列番号：３２ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 配列番号：３３ 配列の長さ：２２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 配列番号：３４ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：３５ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 アンチセンス：Ｎｏ 配列 配列番号：３６ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 配列番号：３７ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド アンチセンス：Ｎｏ 配列 配列番号：３８ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 配列番号：３９ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド アンチセンス：Ｎｏ 配列 配列番号：４０ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド ァンチセンス：Ｙｅｓ 配列 配列番号：４１ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド アンチセンス：Ｎｏ 配列 配列番号：４２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 配列番号：４３ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 配列番号：４４ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列
【００７６】
【図面の簡単な説明】
【図１】見かけの分子量約５５ｋＤを有し、ＴＮＦに結
合するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を示す。
【図２】見かけの分子量約５５ｋＤを有し、ＴＮＦに結
合するタンパク質をコードするＤＮΛ配列を示す。
【図３】Ａは５５ｋＤ ＴＮＦ−ＢＰ−ｃＤＮＡを含有
するベクターでトランスフェクションされたＣＯＳ細胞
の１２５Ｉ−ＴＮＦαとの結合データを示し、Ｂはスキ
ャッチャード分析の結果を示す。
【図４】トランスフェクションされたＣＯＳ細胞の培養
上清の１２５Ｉ−ＴＮＦαとの結合能を示す。
【図５】見かけの分子量約７５／６５ｋＤを有し、ＴＮ
Ｆに結合するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を示
す。
【図６】見かけの分子量約７５／６５ｋＤを有し、ＴＮ
Ｆに結合するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 5/10 Ｃ０７Ｋ 7/08 7/06 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 7/08 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＤＺ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ライナー ゲンツ ドイツ連邦共和国 7888 ラインフェルデ ン， フィンケンヴェーク 13 (72)発明者 ヴェルナー レスラウアー スイス国 4059 バーゼル， マリグナー ノシュトラーセ 16 (72)発明者 ハンスリューディ レッチャー スイス国 4313 メーリン， フランケン シュトラーセ 18 (72)発明者 エルンスト−ユルゲン シュレーガー ドイツ連邦共和国 7859 エフリンゲン− キルヒェン，ノイエ シュトラーセ 63

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
    約５５ｋＤまたは７５ｋＤの分子量を有し、下記アミノ
    酸配列： Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａ
    ｓｐ−Ａｒｇ−ＧｌｕＬｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ
    −Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−
    Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ａ
    ｓｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ （配列番号１）； Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇ
    ｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈ
    ｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ （配列番号２）； Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐ
    ｈｅ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
    ｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（配列番
    号３）； Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖ
    ａｌ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
    ｕ （配列番号４）； Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇ
    ｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈ
    ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番
    号５）； Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ （配列番号６）； Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇ
    ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌ
    ａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ （配列番号７）； Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ （配列番号８）； Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａ
    ｓｐ （配列番号９）； Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇ
    ｌｎ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘａ
    ａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ （配列番号１０） ［上記配列中Ｘａａは未決定アミノ酸残基を示す］の少
    なくとも１つを含有する、ＴＮＦに結合する均質な形態
    の不溶性タンパク質またはその可溶性若しくは不溶性の
    断片、あるいは生理学的に適合性のあるそれらの塩であ
    って、但しヒト尿から単離された、ＴＮＦに結合する均
    質な形態の可溶性タンパク質は除く。そのような除かれ
    るタンパク質は、下記アミノ酸配列 あるいは非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる約３０
    ｋＤの分子量、下記のＮ末端アミノ酸配列 Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｘａａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇ
    ｌｙ Ｌｙｓ ＴｙｒＩｌｅ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ
    Ｖａｌ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｘａａ ＬｙｓＴｈｒ
    （配列番号１１） ［上記配列中Ｘａａは未決定アミノ酸残基を示す］、 Ｃ末端アミノ酸配列：Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ、および
    下記部分アミノ酸配列Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ
    Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ （配列番 号１２）；Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
    （配列番号１３）； Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａ
    ｒｇ（配列番号１４）； Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｃ
    ｙｓ Ｓｅｒ ＡｓｎＣｙｓ Ｌｙｓ （配列番号１
    ５）； Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｃ
    ｙｓ Ｓｅｒ ＡｓｎＣｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ （配列
    番号１６）； Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｘａａ Ａ
    ｓｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ（配列番号１７）； Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐ
    ｈｅ Ｔｈｒ ＡｌａＳｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｓｎ
    Ｌｙｓ （配列番号１８）； Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａ
    ｓｐ Ａｒｇ （配列番号１９）； Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇ
    ｌｕ Ｉｌｅ ＳｅｒＳｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ
    Ａｓｐ Ａｒｇ （配列番号２０）； Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａ
    ｓｐ Ｃｙｓ ＰｒｏＧｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｎ
    Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｇｌｎ ＶａｌＧｌｕ Ｉ
    ｌｅ Ｓｅｒ Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ Ｖａｌ Ａｓ
    ｐ ＬｙｓＧｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ
    Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ ＳｅｒＣｙｓ Ｔｈｒ Ｖａ
    ｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ
    Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｘ
    ａａ Ａｓｎ ＳｅｒＩｌｅ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｔｈｒ
    Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｙｓ ＧｌｙＸａａ Ｔ
    ｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｓ
    ｎ ＡｓｐＣｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
    Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｔｈｒ ＸａａＸａａ Ａｒｇ （配
    列番号２１）； Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇ
    ｌｕ Ａｓｎ （配列番号２２）； Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｘ
    ａａ Ｈｉｓ ＡｌａＧｌｙ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
    Ａｒｇ （配列番号２３）； Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌ
    ｅｕ Ｃｙｓ ＬｅｕＰｒｏ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ
    Ａｓｎ （配列番号２４） ［上記配列中Ｘａａは未決定アミノ酸残基を示す］、あ
    るいは非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる約３３ｋ
    Ｄの分子量および下記のＮ末端アミノ酸配列 Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇ
    ｌｙ Ｌｙｓ ＴｙｒＩｌｅ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ
    Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ （配列番号２５） あるいは下記アミノ酸配列 あるいは非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる約４２
    ｋＤの分子量および下記のＮ末端アミノ酸配列 Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐ
    ｒｏ Ｇｌｙ ＳｅｒＴｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ
    Ａｒｇ Ｇｌｕ （配列番号２６）； Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇ
    ｌｕ Ｐｒｏ ＧｌｙＳｅｒ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ
    Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ （配列番号２７）； Ａｌａ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐ
    ｒｏ Ｇｌｕ ＰｒｏＧｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｃｙｓ
    Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ （配列番号２
    ８）； Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａ
    ｌａ Ｐｒｏ ＧｌｕＰｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ
    Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ（配列番号
    ２９）； Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔ
    ｙｒ Ａｌａ ＰｒｏＧｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
    Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ ＡｒｇＧｌｕ
    （配列番号３０）； Ａｌａ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐ
    ｒｏ Ｔｙｒ ＡｌａＰｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
    Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ ＬｅｕＡｒｇ Ｇ
    ｌｕ （配列番号３１）； Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｔ
    ｈｒ Ｐｒｏ ＴｙｒＡｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
    Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｃｙｓ ＡｒｇＬｅｕ Ａ
    ｒｇ Ｇｌｕ （配列番号３２）；または Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐ
    ｈｅ Ｔｈｒ ＰｒｏＴｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ
    Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ＣｙｓＡｒｇ Ｌ
    ｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ （配列番号３３） により特徴付けられる。
  2. 【請求項２】 本質的に以下の精製工程、即ち：細胞抽
    出物の調製、免疫アフィニティクロマトグラフィーおよ
    び／または単一または複数リガンドアフィニティクロマ
    トグラフィー、ＨＰＬＣおよび調製用ＳＤＳ−ＰＡＧ
    Ｅ、そして所望の場合はこのようにして単離された化合
    物の化学的または酵素的な分解および／またはこれを好
    適な塩に変換する工程を順次実施することを包含する、
    請求項１記載の不溶性化合物の単離方法。
  3. 【請求項３】 所望の場合は付加的な医薬上活性な物質
    および／または無毒性、不活性で治療上適合する担体物
    質と組合せた、請求項１記載の化合物の１種またはそれ
    以上を含有する、ＴＮＦが関与する疾病の治療用の医薬
    製剤。
  4. 【請求項４】 請求項１記載の化合物を含有する敗血症
    ショックの治療のための医薬製剤。
  5. 【請求項５】 請求項１記載の化合物を含有するＴＮＦ
    が免疫反応のメディエーターとして関与する炎症性疾患
    あるいは病理学的症状の治療のための医薬製剤。
  6. 【請求項６】 請求項２記載の方法に従って製造され
    た、請求項１記載の化合物。
  7. 【請求項７】 請求項１記載の化合物を含有するＴＮＦ
    を検出するための検査薬。
JP9257432A 1989-09-12 1997-08-18 Ｔｎｆ結合タンパク質 Pending JPH10114795A (ja)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH03319/89-6 1989-09-12
CH331989 1989-09-12
CH74690 1990-03-08
CH00746/90-4 1990-03-08
CH134790 1990-04-20
CH01347/90-6 1990-04-20

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2240176A Division JP2728968B2 (ja) 1989-09-12 1990-09-12 Ｔｎｆ結合タンパク質

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH10114795A true JPH10114795A (ja) 1998-05-06

Family

ID=27172382

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2240176A Expired - Lifetime JP2728968B2 (ja) 1989-09-12 1990-09-12 Ｔｎｆ結合タンパク質
JP9257432A Pending JPH10114795A (ja) 1989-09-12 1997-08-18 Ｔｎｆ結合タンパク質
JP9257433A Pending JPH1095800A (ja) 1989-09-12 1997-08-18 Ｔｎｆ結合タンパク質

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2240176A Expired - Lifetime JP2728968B2 (ja) 1989-09-12 1990-09-12 Ｔｎｆ結合タンパク質

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP9257433A Pending JPH1095800A (ja) 1989-09-12 1997-08-18 Ｔｎｆ結合タンパク質

Country Status (8)

Country Link
US (4) US5610279A (ja)
EP (3) EP1132471A3 (ja)
JP (3) JP2728968B2 (ja)
AT (2) ATE236249T1 (ja)
BG (2) BG63284B2 (ja)
DE (3) DE59010933D1 (ja)
DK (2) DK0417563T3 (ja)
NL (1) NL300129I2 (ja)

Families Citing this family (233)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL83878A (en) * 1987-09-13 1995-07-31 Yeda Res & Dev Soluble protein corresponding to tnf inhibitory protein its preparation and pharmaceutical compositions containing it
US6479632B1 (en) 1988-09-12 2002-11-12 Yeda Research And Development Co. Ltd. Tumor necrosis factor inhibitory protein and its purification
US6018026A (en) 1988-01-22 2000-01-25 Zymogenetics, Inc. Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions
US5811261A (en) * 1988-09-12 1998-09-22 Yeda Research And Development Co. Ltd. Expression of the recombinant tumor necrosis factor binding protein I (TBP-I)
US6406697B1 (en) 1989-02-23 2002-06-18 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US7264944B1 (en) 1989-04-21 2007-09-04 Amgen Inc. TNF receptors, TNF binding proteins and DNAs coding for them
US6221675B1 (en) 1989-04-21 2001-04-24 Amgen, Inc. TNF receptors, TNF binding proteins and DNAs coding for them
DE59010941D1 (de) * 1989-04-21 2005-03-24 Amgen Inc TNF-Rezeptor, TNF bindende Proteine und dafür kodierende DNAs
DE69017753T3 (de) * 1989-05-18 2013-06-20 Yeda Research And Development Co., Ltd. Tumor-Nekrosefaktor-Bindungsprotein II, seine Reinigung und spezifische Antikörper
US6232446B1 (en) * 1989-05-18 2001-05-15 Yeda Research And Development Co. Ltd. TNF ligands
US6143866A (en) * 1989-07-18 2000-11-07 Amgen, Inc. Tumor necrosis factor (TNF) inhibitor and method for obtaining the same
IL95031A (en) * 1989-07-18 2007-03-08 Amgen Inc A method of producing a recombinant human necrotic factor absorber
US20030225254A1 (en) * 1989-08-07 2003-12-04 Rathjen Deborah Ann Tumour necrosis factor binding ligands
US5959087A (en) * 1989-08-07 1999-09-28 Peptide Technology, Ltd. Tumour necrosis factor binding ligands
EP0486526B2 (en) * 1989-08-07 2001-03-07 Peptech Limited Tumour necrosis factor binding ligands
NZ235148A (en) 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
US5395760A (en) * 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
US5945397A (en) * 1989-09-05 1999-08-31 Immunex Corporation Purified p75 (type II) tumor necrosis factor receptor polypeptides
US6541610B1 (en) * 1989-09-05 2003-04-01 Immunex Corporation Fusion proteins comprising tumor necrosis factor receptor
EP1132471A3 (de) 1989-09-12 2001-11-28 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
US6552170B1 (en) * 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US7253264B1 (en) 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
ES2120949T4 (es) * 1990-06-28 2011-12-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh 50% Proteinas de fusión con porciones de inmunoglobulinas, su preparación y empleo.
US20030064480A1 (en) * 1990-06-28 2003-04-03 Leander Lauffer Fusion proteins with immunoglobulin portions, the preparation and use thereof
EP0533006A1 (en) * 1991-09-18 1993-03-24 F.Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft Chimaeric interleukin 5-receptor/immunoglobulin polypeptides
NZ251820A (en) * 1992-03-30 1996-07-26 Immunex Corp Fusion proteins with tnf-r (tumour necrosis factor-receptor) peptide linked to another tnf-r or an il-1r (interleukin-1-receptor) peptide
US5795975A (en) * 1993-01-10 1998-08-18 Yeda Research And Development Co. Ltd. TNF receptor promoter
IL104355A (en) 1993-01-10 2006-08-20 Yeda Res & Dev Tnf receptor promoter
ES2153384T3 (es) * 1993-07-30 2001-03-01 Kennedy Inst Of Rheumatology Metodo para tratar la esclerosis multiple.
CA2139385C (en) * 1994-02-04 2001-12-25 Gottfried Alber Products containing g-csf and tnf binding protein
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
AU747029B2 (en) * 1994-05-11 2002-05-09 Yeda Research And Development Co. Ltd. Modulator of TNF/NGF superfamily receptors and soluble oligomeric TNF/NGF superfamily receptors
US6579697B1 (en) * 1995-05-11 2003-06-17 Yeda Research And Development Co. Ltd. Modulator of TNF/NGF superfamily receptors and soluble oligomeric TNF/NGF superfamily receptors
IL111125A0 (en) * 1994-05-11 1994-12-29 Yeda Res & Dev Soluble oligomeric tnf/ngf super family ligand receptors and their use
US5741667A (en) * 1994-05-27 1998-04-21 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor receptor-associated factors
US5708142A (en) * 1994-05-27 1998-01-13 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor receptor-associated factors
JPH09508140A (ja) * 1994-07-22 1997-08-19 エフ・ホフマン−ラ ロシュ アーゲー キメラｔｎｆ結合タンパク質を含有する医薬組成物
US7070783B1 (en) * 1995-05-09 2006-07-04 The Mathilda And Terence Kennedy Institute Of Rheumatology Small molecular weight TNF receptor multimeric molecule
US5705364A (en) 1995-06-06 1998-01-06 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process
ZA966663B (en) * 1995-08-17 1998-02-06 Genentech Inc Traf Inhibitors.
US6936439B2 (en) 1995-11-22 2005-08-30 Amgen Inc. OB fusion protein compositions and methods
US20030040467A1 (en) 1998-06-15 2003-02-27 Mary Ann Pelleymounter Ig/ob fusions and uses thereof.
US6998116B1 (en) 1996-01-09 2006-02-14 Genentech, Inc. Apo-2 ligand
US6030945A (en) 1996-01-09 2000-02-29 Genentech, Inc. Apo-2 ligand
EP1500702A1 (en) 1996-04-01 2005-01-26 Genentech, Inc. APO-2LI and APO-3 apoptosis polypeptides from the TNFR1 familiy
JP2000510113A (ja) * 1996-05-08 2000-08-08 エフ・ホフマン―ラ ロシュ アーゲー ＴＮＦＲ―Ｉｇによる喘息の治療
TW555765B (en) 1996-07-09 2003-10-01 Amgen Inc Low molecular weight soluble tumor necrosis factor type-I and type-II proteins
US6462176B1 (en) 1996-09-23 2002-10-08 Genentech, Inc. Apo-3 polypeptide
JP2001513754A (ja) 1996-12-06 2001-09-04 アムジェン インコーポレイテッド Ｔｎｆ媒介疾患を処置するためのｔｎｆ結合タンパク質を使用する組み合わせ治療
CA2273852C (en) 1996-12-06 2009-09-29 Amgen Inc. Combination therapy using an il-1 inhibitor for treating il-1 mediated diseases
US6342369B1 (en) 1997-05-15 2002-01-29 Genentech, Inc. Apo-2-receptor
EP1032661A1 (en) 1997-06-18 2000-09-06 Genentech, Inc. Apo-2DcR
DK1015587T3 (da) 1997-09-18 2008-08-25 Genentech Inc DcR3 polypeptid, en TNFR-homolog
CA2305713A1 (en) 1997-10-10 1999-04-22 Genentech, Inc. Apo-3 ligand
DE69939732D1 (de) 1998-01-15 2008-11-27 Genentech Inc Apo-2 ligand
EP2050762A3 (en) 1998-03-10 2009-07-08 Genentech, Inc. Human cornichon-like protein and nucleic acids encoding it
US6620382B1 (en) 1998-05-22 2003-09-16 Biopheresis Technologies, Llc. Method and compositions for treatment of cancers
US8197430B1 (en) * 1998-05-22 2012-06-12 Biopheresis Technologies, Inc. Method and system to remove cytokine inhibitor in patients
WO2000021981A2 (de) * 1998-10-09 2000-04-20 Bioserv Ag TNFα BINDENDE PEPTIDE UND IHRE ANWENDUNG FÜR DIE DETEKTION, INAKTIVIERUNG UND/ODER ENTFERNUNG VON TNFα AUS BIOLOGISCHEN FLÜSSIGKEITEN
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
HU228582B1 (en) * 1998-10-23 2013-04-29 Kirin Amgen Inc Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to mp1 receptor and having thrombopoietic activity
AU2587500A (en) * 1998-11-30 2000-06-19 Drexel University Methods and kits for identifying individuals at risk of developing osteoporosis
IL145676A0 (en) 1999-04-12 2002-06-30 Genentech Inc Tumor necrosis factor homologs and nucleic acids encoding the same
US20040220103A1 (en) * 1999-04-19 2004-11-04 Immunex Corporation Soluble tumor necrosis factor receptor treatment of medical disorders
EP1956030B1 (en) 1999-06-15 2009-11-11 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids endoding the same
EP2339003A3 (en) 1999-06-28 2011-10-19 Genentech, Inc. Apo-2 ligand substitutional variants
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US6808902B1 (en) * 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
MXPA02007683A (es) * 2000-02-10 2002-12-13 American Home Prod Metodo para tratar o inhibir la lesion celular o muerte celular.
DE60028830T2 (de) 2000-02-16 2007-01-18 Genentech, Inc., South San Francisco Anti-april antikörper und hybridomazellen
CA2401683A1 (en) 2000-03-02 2001-09-07 Xencor Design and discovery of protein based tnf-.alpha. variants for the treatment of tnf-.alpha. related disorders
BR0001078A (pt) * 2000-04-06 2003-05-13 Maria Amalia Rotolo De Moraes Método e aparelho de estìmulo positivo mental
EP1272647B1 (en) 2000-04-11 2014-11-12 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
IL153948A0 (en) 2000-07-27 2003-07-31 Genentech Inc Apo-2l receptor agonist and cpt-11 synergism
JP2004536786A (ja) * 2001-03-02 2004-12-09 メディミューン，インコーポレイテッド インテグリンαｖβ３拮抗薬を他の予防薬もしくは治療薬と組み合わせて投与することによる炎症性疾患または自己免疫疾患の予防または治療方法
EP1414517A4 (en) * 2001-06-26 2008-02-06 Photomed Technologies Inc MULTIPLE WAVELENGTH ILLUMINATOR
YU103003A (sh) 2001-06-26 2006-05-25 Abgenix Inc. Antitela za opgl
US20060073141A1 (en) * 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
US20050271663A1 (en) * 2001-06-28 2005-12-08 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
CA2451680C (en) 2001-07-03 2011-04-19 Genentech, Inc. Human dr4 antibodies and uses thereof
HUP0500992A3 (en) * 2001-08-03 2007-11-28 Genentech Inc Tacis and br3 polypeptides and uses thereof
EP2348043A1 (en) 2001-10-02 2011-07-27 Genentech, Inc. APO-2 ligand variants and uses thereof
US7205275B2 (en) 2001-10-11 2007-04-17 Amgen Inc. Methods of treatment using specific binding agents of human angiopoietin-2
US7521053B2 (en) 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
US7741285B2 (en) * 2001-11-13 2010-06-22 Genentech, Inc. APO-2 ligand/trail formulations
US7842668B1 (en) 2001-11-13 2010-11-30 Genentech, Inc. Apo-2 ligand/trail formulations
WO2003042344A2 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Genentech, Inc. Apo2 ligand/trail formulations
EP1463942B2 (en) * 2001-12-21 2012-06-20 Immunex Corporation Methods for purifying protein
ES2311094T3 (es) 2002-02-27 2009-02-01 Immunex Corporation Composicion estabilizada de tnfr-fc que comprende arginina.
AU2003220529B2 (en) 2002-03-27 2006-09-07 Immunex Corporation Methods for increasing polypeptide production
JP2005535572A (ja) * 2002-04-12 2005-11-24 メディミューン，インコーポレーテッド 組換え抗インターロイキン−９抗体
EP2500032A1 (en) 2002-06-24 2012-09-19 Genentech, Inc. APO-2 ligand/trail variants and uses thereof
US20080008713A1 (en) * 2002-06-28 2008-01-10 Domantis Limited Single domain antibodies against tnfr1 and methods of use therefor
US9028822B2 (en) 2002-06-28 2015-05-12 Domantis Limited Antagonists against TNFR1 and methods of use therefor
US20060002935A1 (en) * 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
US20050043516A1 (en) * 2002-07-25 2005-02-24 Genentech, Inc. TACI antibodies and uses thereof
JP2006517191A (ja) 2002-12-30 2006-07-20 アムジエン・インコーポレーテツド 共刺激因子を用いた併用療法
US7101978B2 (en) * 2003-01-08 2006-09-05 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
EP2316487B1 (en) 2003-04-11 2014-06-11 MedImmune, LLC Recombinant IL-9 antibodies & uses thereof
ES2333598T5 (es) * 2003-05-06 2013-09-04 Biogen Idec Hemophilia Inc Proteinas quimericas del factor de coagulacion fc para tratar la hemofilia.
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
AU2004238263A1 (en) * 2003-05-06 2004-11-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of drug binding to serum albumin
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ES2537738T3 (es) * 2003-06-05 2015-06-11 Genentech, Inc. Terapia de combinación para trastornos de células B
US20050163775A1 (en) * 2003-06-05 2005-07-28 Genentech, Inc. Combination therapy for B cell disorders
US20070027075A1 (en) * 2003-06-09 2007-02-01 Smithrud David B Compositions and methods for targeted drug delivery
CA2545603A1 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. Neonatal fc receptor (fcrn)-binding polypeptide variants, dimeric fc binding proteins and methods related thereto
US7435799B2 (en) * 2004-01-08 2008-10-14 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
BRPI0507174A (pt) * 2004-01-28 2008-04-01 Syntonix Pharmaceuticals Inc proteìnas de fusão hormÈnio-fc (fsh-fc) heterodiméricas estimuladoras de folìculo para o tratamento da infertilidade
US7351739B2 (en) * 2004-04-30 2008-04-01 Wellgen, Inc. Bioactive compounds and methods of uses thereof
PL1949915T3 (pl) * 2004-04-30 2013-04-30 Biopheresis Tech Inc Sposób i układ do usuwania rozpuszczalnych TNFR1, TNFR2 i IL2R u pacjentów
US8143380B2 (en) * 2004-07-08 2012-03-27 Amgen Inc. Therapeutic peptides
RU2431676C2 (ru) 2004-08-06 2011-10-20 Дженентек, Инк. Анализы и способы с применением биомаркеров
EP2292794A3 (en) 2004-08-06 2011-07-06 Genentech, Inc. Death receptor (DR) antibody for pharmaceutical use and assays employing biomarkers for predicting sensitivity of cells to said antibody
US7294484B2 (en) 2004-08-27 2007-11-13 Wyeth Research Ireland Limited Production of polypeptides
TWI374935B (en) 2004-08-27 2012-10-21 Pfizer Ireland Pharmaceuticals Production of α-abeta
TWI364458B (en) 2004-08-27 2012-05-21 Wyeth Res Ireland Ltd Production of tnfr-lg
JP5017116B2 (ja) * 2004-09-24 2012-09-05 アムジエン・インコーポレーテツド 修飾Ｆｃ分子
US20060121042A1 (en) 2004-10-27 2006-06-08 Medimmune, Inc. Modulation of antibody specificity by tailoring the affinity to cognate antigens
CA2593212A1 (en) 2005-01-05 2006-07-13 Biogen Idec Ma Inc. Cripto binding molecules
US8029783B2 (en) 2005-02-02 2011-10-04 Genentech, Inc. DR5 antibodies and articles of manufacture containing same
EP1909831A4 (en) 2005-06-14 2013-02-20 Amgen Inc PREPARATIONS OF SPONTANEOUS TAMPING PROTEINS
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
EP1915626B1 (en) 2005-08-16 2011-11-09 Genentech, Inc. Apoptosis sensitivity to apo2l/trail by testing for galnac-t14 expression in cells/tissues
US8741260B2 (en) * 2005-10-07 2014-06-03 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of GDNF to the CNS
AR058140A1 (es) * 2005-10-24 2008-01-23 Wyeth Corp Metodo de produccion proteica utilizando compuestos anti-senescencia
CA2629323A1 (en) * 2005-11-10 2007-05-24 The University Of North Carolina At Chapel Hill Splice switching oligomers for tnf superfamily receptors and their use in treatment of disease
US7785834B2 (en) * 2005-11-10 2010-08-31 Ercole Biotech, Inc. Soluble TNF receptors and their use in treatment of disease
WO2007062037A2 (en) 2005-11-21 2007-05-31 Laboratoires Serono Sa Compositions and methods of producing hybrid antigen binding molecules and uses thereof
CA2629306A1 (en) 2005-11-23 2007-05-31 Genentech, Inc. Methods and compositions related to b cell assays
US9283260B2 (en) 2006-04-21 2016-03-15 Amgen Inc. Lyophilized therapeutic peptibody formulations
WO2008008373A2 (en) 2006-07-11 2008-01-17 Arubor Corp Rhinosinusitis prevention and therapy with proinflammatory cytokine inhibitors
PT2495307T (pt) 2006-07-13 2018-05-10 Wyeth Llc Produção do fator ix de coagulação com padrão melhorado de glicosilação
DK2068889T3 (da) 2006-08-10 2020-02-03 Roy C Levitt Anakinra til anvendelse i behandling af bronchiolitis obliterans syndrom
US8759297B2 (en) * 2006-08-18 2014-06-24 Armagen Technologies, Inc. Genetically encoded multifunctional compositions bidirectionally transported between peripheral blood and the cns
US7833527B2 (en) 2006-10-02 2010-11-16 Amgen Inc. Methods of treating psoriasis using IL-17 Receptor A antibodies
BRPI0719250A2 (pt) 2006-10-12 2015-06-16 Wyeth Corp Métodos e composições com opalescência reduzida.
US20090264353A1 (en) * 2007-10-19 2009-10-22 Santaris Pharma A/S Splice Switching Oligomers for TNF Superfamily Receptors and their Use in Treatment of Disease
EP2395077A1 (en) 2006-11-03 2011-12-14 Wyeth LLC Glycolysis-inhibiting substances in cell culture
RU2009128039A (ru) * 2006-12-22 2011-01-27 Дженентек, Инк. (Us) Антагонисты dr6 и способы их применения в лечении неврологических нарушений
AU2008223133A1 (en) 2007-03-02 2008-09-12 Wyeth Use of copper and glutamate in cell culture for production of polypeptides
TW200902708A (en) * 2007-04-23 2009-01-16 Wyeth Corp Methods of protein production using anti-senescence compounds
CN101861168B (zh) 2007-05-07 2014-07-02 米迪缪尼有限公司 抗-icos抗体及其在治疗肿瘤、移植和自身免疫病中的应用
CA2683801A1 (en) * 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Polypeptides, antibody variable domains and antagonists
CA2694762A1 (en) 2007-07-27 2009-02-05 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing alpha-l-iduronidase activity in the cns
WO2009126564A1 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Bayer Healthcare Llc Methods of recombinant production of glycoproteins
EP2294413A4 (en) * 2008-06-12 2012-04-25 Genentech Inc SCREENING METHOD FOR IDENTIFYING COMPOUNDS THAT INHIBIT NEURODEGENERESCENCE
CA2743469C (en) 2008-11-12 2019-01-15 Medimmune, Llc Antibody formulation
EP2376120A2 (en) 2008-11-25 2011-10-19 Biogen Idec MA Inc. Use of dr6 and p75 antagonists to promote survival of cells of the nervous system
CA2748889A1 (en) * 2009-03-18 2010-09-23 Armagen Technologies, Inc. Compositions and methods for blood-brain barrier delivery of igg-decoy receptor fusion proteins
EP2421892A1 (en) 2009-04-20 2012-02-29 Pfizer Inc. Control of protein glycosylation and compositions and methods relating thereto
EP2464377B1 (en) 2009-08-14 2016-07-27 The Government of the United States of America as represented by The Secretary of the Department of Health and Human Services Use of il-15 to increase thymic output and to treat lymphopenia
ES2725200T3 (es) 2009-10-09 2019-09-20 Armagen Inc Métodos y composiciones para aumentar la actividad de iduronato 2-sulfatasa en el SNC
CA2777162A1 (en) * 2009-10-09 2011-04-14 Anaphore, Inc. Polypeptides that bind il-23r
TW201117824A (en) 2009-10-12 2011-06-01 Amgen Inc Use of IL-17 receptor a antigen binding proteins
BR112012009997A2 (pt) * 2009-11-12 2019-09-24 Genentech Inc ''método para aumentar a densidade de espinhas dentriticas nos neurônios de um paciente com um distúrbios cognitivo ou psiquiatrico,método de manutenção da cognição em um sujeito durante o processo de envelhecimento,uso de um antagonista de dr6 na preparação de um medicamento para uso em um paciente com um disturbio cognitivo uo psiquíatrico e uso de um antagonista de p75 na preparação de um medicamento para uso em um paciente com um distúrbio cognitivo ou psiquiátrico''
JP2013512674A (ja) * 2009-12-02 2013-04-18 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期を増加させるための組成物および方法
HUE046670T2 (hu) 2010-01-15 2020-03-30 Kirin Amgen Inc Anti IL-17RA ellenanyag kiszerelés és terápiás rendek pikkelysömör kezelésére
WO2012006635A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Biogen Idec Hemophilia Inc. Processable single chain molecules and polypeptides made using same
WO2012006623A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Biogen Idec Hemophilia Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
EA037095B1 (ru) 2010-07-09 2021-02-05 Биовератив Терапьютикс Инк. Способ лечения гемофилии в и эпизодов кровотечения
WO2012019160A1 (en) 2010-08-05 2012-02-09 Amgen Inc. Dipeptides to enhance yield and viability from cell cultures
WO2012023085A1 (en) 2010-08-20 2012-02-23 Wyeth Llc Cell culture of growth factor-free adapted cells
DK2632446T3 (en) 2010-10-30 2019-04-01 Univ Oxford Innovation Ltd TREATMENT OF DUPUYTRY CONTRACT
WO2012145682A1 (en) 2011-04-21 2012-10-26 Amgen Inc. A method for culturing mammalian cells to improve recombinant protein production
EP2718328A4 (en) 2011-06-08 2014-12-24 Acceleron Pharma Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING THE HALF TIME OF SERUM
KR102558247B1 (ko) 2011-07-01 2023-07-24 암젠 인크 포유동물 세포 배양
US9738707B2 (en) 2011-07-15 2017-08-22 Biogen Ma Inc. Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
WO2013010840A2 (en) 2011-07-18 2013-01-24 Arts Biologics A/S Long acting biologically active luteinizing hormone (lh) compound
US20140234330A1 (en) 2011-07-22 2014-08-21 Amgen Inc. Il-17 receptor a is required for il-17c biology
JP2014529473A (ja) 2011-09-02 2014-11-13 アムジエン・インコーポレーテツド 医薬製品および医薬製品の露光を分析する方法
US9812699B2 (en) 2011-10-05 2017-11-07 Oned Material Llc Silicon nanostructure active materials for lithium ion batteries and processes, compositions, components and devices related thereto
US20140322758A1 (en) 2011-10-21 2014-10-30 Pfizer Inc. Addition of iron to improve cell culture
RU2768492C2 (ru) 2011-11-18 2022-03-24 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Полимерные белковые микрочастицы
CN104093414A (zh) 2011-11-29 2014-10-08 神经噬菌体制药股份有限公司 噬菌体的p3作为淀粉样蛋白结合剂的用途
EP4338797A3 (en) 2011-12-02 2024-06-12 Armagen, Inc. Methods and compositions for increasing arylsulfatase a activity in the cns
AR089231A1 (es) 2011-12-15 2014-08-06 Amgen Inc Metodo de floculacion
WO2013106577A2 (en) 2012-01-10 2013-07-18 Biogen Idec Ma Inc. Enhancement of transport of therapeutic molecules across the blood brain barrier
EP2846822A2 (en) 2012-05-11 2015-03-18 Prorec Bio AB Method for diagnosis and treatment of prolactin associated disorders
ES2657377T3 (es) 2012-09-11 2018-03-05 Coherus Biosciences, Inc. Etanercept plegado correctamente con alta pureza y excelente rendimiento
LT2906235T (lt) 2012-10-02 2017-10-25 Proclara Biosciences, Inc. Bakteriofago sulietų baltymų p3, kaip amiloido rišamųjų agentų, naudojimas
CN103509121B (zh) 2012-11-22 2015-01-28 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 一种fsh融合蛋白及其制备方法和用途
US20150353542A1 (en) 2013-01-14 2015-12-10 Amgen Inc. Methods of using cell-cycle inhibitors to modulate one or more properties of a cell culture
CA2898354C (en) 2013-01-25 2017-11-21 Thymon, Llc Compositions for selective reduction of circulating bioactive soluble tnf and methods for treating tnf-mediated disease
TWI625390B (zh) 2013-03-14 2018-06-01 安美基公司 用於增加重組蛋白質之甘露糖含量之方法
LT3395423T (lt) 2013-03-14 2023-12-11 Amgen Inc. Pratekančių giminingumo gryninimo ligandų pašalinimas
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
TWI683666B (zh) 2013-03-15 2020-02-01 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ｉｘ多肽調配物
CN105473153A (zh) 2013-05-28 2016-04-06 神经噬菌体制药股份有限公司 包含具有减小的免疫原性的经修饰的噬菌体g3p氨基酸序列的多肽
US9481901B2 (en) 2013-05-30 2016-11-01 Amgen Inc. Methods for increasing mannose content of recombinant proteins
MX2016005572A (es) 2013-10-31 2016-12-09 Amgen Inc Uso de monensina para regular la glicosilacion de proteinas recombinantes.
US10513723B2 (en) 2014-01-13 2019-12-24 Amgen Inc. Decreasing ornithine production to decrease high mannose glycoform content of recombinant proteins
KR102519540B1 (ko) 2014-01-29 2023-04-10 암젠 인크 재조합 단백질의 글리코실화를 조절하기 위한 n-글리코실화 경로 조절자의 과발현
US10106829B2 (en) 2014-01-29 2018-10-23 Amgen Inc. Overexpression of N-glycosylation pathway regulators to modulate glycosylation of recombinant proteins
EP3696193A1 (en) 2014-02-02 2020-08-19 MedImmune Limited Chimeric protein composed of ngf antagonist domain and a tnfa antagonist domain
AU2015241373B2 (en) 2014-03-31 2020-11-05 Amgen K-A, Inc. Methods of treating nail and scalp psoriasis
ES2909630T3 (es) 2014-06-04 2022-05-09 Amgen Inc Métodos de recolección en cultivos de células de mamífero
WO2016081770A1 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Amgen Inc. Quantitation of glycan moiety in recombinant glycoproteins
ES2784503T3 (es) 2014-12-01 2020-09-28 Amgen Inc Procedimiento para manipular el nivel de contenido de glicano de una glicoproteína
ES2910017T3 (es) 2014-12-03 2022-05-11 Proclara Biosciences Inc Polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos modificada de g3p de bacteriófago que carece de una señal de glicosilación
WO2016100232A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 The Regents Of The University Of California Bispecific or-gate chimeric antigen receptor responsive to cd19 and cd20
CA2971186A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 The Regents Of The University Of California Cytotoxic molecules responsive to intracellular ligands for selective t cell mediated killing
AU2015364396B2 (en) 2014-12-19 2018-08-09 Alkermes, Inc. Single chain Fc fusion proteins
US10538589B2 (en) 2015-01-14 2020-01-21 Armagen Inc. Methods and compositions for increasing N-acetylglucosaminidase (NAGLU) activity in the CNS using a fusion antibody comprising an anti-human insulin receptor antibody and NAGLU
CN107636159B (zh) 2015-02-04 2022-06-14 百时美施贵宝公司 选择治疗性分子的方法
KR20170138426A (ko) 2015-03-13 2017-12-15 삼성바이오에피스 주식회사 항-tnf-알파 폴리펩티드 조성물 및 그 용도
TW202340452A (zh) 2015-08-04 2023-10-16 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
CN108366968B (zh) 2015-12-16 2022-02-18 瑞泽恩制药公司 制造蛋白质微粒的组合物和方法
AU2017291321B2 (en) 2016-06-22 2020-06-18 Alkermes, Inc. Compositions and methods for modulating IL-10 immunostimulatory and anti-inflammatory properties
HUP1600456A2 (en) 2016-07-19 2018-01-29 Richter Gedeon Nyrt Novel cell-based tnf-alpha binding assay
CN109963590B (zh) 2016-09-02 2024-03-15 加利福尼亚大学董事会 涉及白介素-6受体α结合单链可变片段的方法和组合物
JP6884858B2 (ja) 2016-10-21 2021-06-09 アムジエン・インコーポレーテツド 医薬製剤及びその製造方法
HUE055417T2 (hu) 2016-12-09 2021-11-29 Akston Biosciences Corp Inzulin-Fc fúziók és alkalmazási eljárások
SG11201912548XA (en) 2017-07-06 2020-01-30 Regeneron Pharma Cell culture process for making a glycoprotein
US20210031012A1 (en) 2018-01-26 2021-02-04 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a pde4 inhibitor
KR20210005689A (ko) 2018-05-01 2021-01-14 암젠 인크 조절된 글리칸 프로파일을 갖는 항체
US20230033021A1 (en) 2018-06-20 2023-02-02 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an integrin inhibitor
WO2019246313A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a tnf inhibitor
US20230009902A1 (en) 2018-06-20 2023-01-12 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue orginating from the endoderm
WO2019246271A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-12/il-23 inhibitor
US20230041197A1 (en) 2018-06-20 2023-02-09 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
US20220257600A1 (en) 2018-06-20 2022-08-18 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a jak or other kinase inhibitor
US11952399B2 (en) 2018-12-18 2024-04-09 Amgen Inc. Methods for purifying proteins
CN114761412B (zh) 2019-11-25 2024-10-11 阿尔克姆斯有限公司 取代的大环化合物和相关治疗方法
CA3165060C (en) 2020-01-21 2023-06-20 Yiming Zhao Deglycosylation methods for electrophoresis of glycosylated proteins
JP2024503239A (ja) 2020-12-22 2024-01-25 アムジェン インコーポレイテッド 細胞培養法
AU2022317215A1 (en) 2021-07-27 2024-02-29 Astrazeneca Ab Treatment of lupus
EP4413359A1 (en) 2021-10-07 2024-08-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ph meter calibration and correction
CN118076894A (zh) 2021-10-07 2024-05-24 里珍纳龙药品有限公司 pH建模和控制的系统及方法
WO2023129974A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Generation of landing pad cell lines
WO2023154799A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Combination immunotherapy for treating cancer
US20240245779A1 (en) 2023-01-25 2024-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modeling liquid protein composition stability

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4769326A (en) 1980-02-29 1988-09-06 The Regents Of The University Of California Expression linkers
US4593002A (en) 1982-01-11 1986-06-03 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Viruses with recombinant surface proteins
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
ATE37060T1 (de) 1984-07-27 1988-09-15 Abs Brandschutz Begehbares schutzhaus.
US4675285A (en) 1984-09-19 1987-06-23 Genetics Institute, Inc. Method for identification and isolation of DNA encoding a desired protein
JPS61293924A (ja) 1985-06-23 1986-12-24 Asahi Chem Ind Co Ltd 生理活性物質の受容タンパク
US4770995A (en) * 1985-08-29 1988-09-13 New York Blood Center, Inc Detection of the sensitivity of cells to the effects of tumor necrosis factor and lymphotoxin
DE3535987A1 (de) 1985-10-09 1987-04-23 Basf Ag Verfahren zur herstellung von meophilen mikroorganismen, die eine bei hoeherer temperatur aktive d-hydantoinase enthalten
US4894439A (en) 1986-05-22 1990-01-16 Cetus Corporation N-terminal derivatives of tumor necrosis factor purified by microporous PTFE membranes
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
JPS62153300A (ja) 1985-12-26 1987-07-08 Teijin Ltd ヒト免疫グロブリンＧＦｃ領域蛋白質およびその製造方法
EP0230574A3 (en) * 1986-01-31 1989-03-22 Yale University Pharmaceutical compositions against infections caused by lav/htlv iii virus and the use thereof
US5098702A (en) 1986-04-09 1992-03-24 Cetus Corporation Combination therapy using interleukin-2 and tumor necrosis factor
IL80005A (en) 1986-09-10 1992-11-15 Yeda Res & Dev Compositions for modulating the effect of tnf and il-1
EP0269455A3 (en) 1986-11-28 1989-09-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. Highly purified fused protein comprising human ige fc fragment and production thereof
JPH07106158B2 (ja) * 1986-12-04 1995-11-15 サントリー株式会社 抗腫瘍活性を有する新規ポリペプチドおよびその製造法
US4965271A (en) 1986-12-31 1990-10-23 Hoechst Roussel Pharmaceuticals, Inc. Method of inhibiting the activity of leukocyte derived cytokines
US4963354A (en) 1987-01-21 1990-10-16 Genentech, Inc. Use of tumor necrosis factor (TNF) as an adjuvant
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5359032A (en) 1987-08-26 1994-10-25 Biogen Inc. Interkeukin-1 inhibitor
IL83878A (en) 1987-09-13 1995-07-31 Yeda Res & Dev Soluble protein corresponding to tnf inhibitory protein its preparation and pharmaceutical compositions containing it
US5512544A (en) 1987-09-13 1996-04-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Pharmaceutical compositions comprising an anticytokine
PT88641B (pt) * 1987-10-02 1993-04-30 Genentech Inc Metodo para a preparacao de uma variante de adesao
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
EP0325224B1 (en) * 1988-01-22 1996-07-31 ZymoGenetics, Inc. Methods of producing secreted receptor analogs
ZA89430B (en) 1988-01-22 1989-10-25 Gen Hospital Corp Cloned genes encoding ig-cd4 fusion proteins and the use thereof
WO1989008114A1 (en) * 1988-02-25 1989-09-08 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
GB8806339D0 (en) * 1988-03-17 1988-04-13 Hoffmann La Roche Monoclonal antibodies
GB8807803D0 (en) * 1988-03-31 1988-05-05 Glaxo Group Ltd Biochemical product
AU631545B2 (en) 1988-04-15 1992-12-03 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
US6858409B1 (en) 1988-05-27 2005-02-22 Amgen Inc. Nucleic acids encoding interleukin-1 inhibitors and processes for preparing interleukin-1 inhibitors
DE3817955A1 (de) 1988-05-27 1989-11-30 Hoechst Ag Tnf-inhibitor enthaltendes arzneimittel
US5075222A (en) 1988-05-27 1991-12-24 Synergen, Inc. Interleukin-1 inhibitors
US5055447A (en) 1988-07-28 1991-10-08 Genentech, Inc. Method and compositions for the treatment and prevention of septic shock
US5359037A (en) 1988-09-12 1994-10-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to TNF binding protein I
US5811261A (en) 1988-09-12 1998-09-22 Yeda Research And Development Co. Ltd. Expression of the recombinant tumor necrosis factor binding protein I (TBP-I)
IL94039A (en) * 1989-08-06 2006-09-05 Yeda Res & Dev Antibodies to tbp - 1 and their use
AU643427B2 (en) 1988-10-31 1993-11-18 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
US5223395A (en) 1988-12-01 1993-06-29 Centocor, Inc. Immunometric assays for tumor necrosis factor-alpha and methods for preventing the loss of biological activity of tumor necrosis factor-alpha in biological samples
US5098833A (en) 1989-02-23 1992-03-24 Genentech, Inc. DNA sequence encoding a functional domain of a lymphocyte homing receptor
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US6221675B1 (en) 1989-04-21 2001-04-24 Amgen, Inc. TNF receptors, TNF binding proteins and DNAs coding for them
DE59010941D1 (de) 1989-04-21 2005-03-24 Amgen Inc TNF-Rezeptor, TNF bindende Proteine und dafür kodierende DNAs
JPH03164179A (ja) * 1989-04-21 1991-07-16 Boehringer Ingelheim Internatl Gmbh Ｔｎｆレセプター、ｔｎｆ結合たん白質およびこれらをコードするｄｎａ
EP0394827A1 (en) 1989-04-26 1990-10-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Chimaeric CD4-immunoglobulin polypeptides
DE3922089A1 (de) 1989-05-09 1990-12-13 Basf Ag Neue proteine und ihre herstellung
DE69017753T3 (de) * 1989-05-18 2013-06-20 Yeda Research And Development Co., Ltd. Tumor-Nekrosefaktor-Bindungsprotein II, seine Reinigung und spezifische Antikörper
CA2033082A1 (en) 1989-06-15 1990-12-16 Linda S. Park Interleukin-7 receptors
US6143866A (en) 1989-07-18 2000-11-07 Amgen, Inc. Tumor necrosis factor (TNF) inhibitor and method for obtaining the same
IL95031A (en) * 1989-07-18 2007-03-08 Amgen Inc A method of producing a recombinant human necrotic factor absorber
EP0486526B2 (en) 1989-08-07 2001-03-07 Peptech Limited Tumour necrosis factor binding ligands
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
WO1991002743A1 (en) 1989-08-23 1991-03-07 The General Hospital Corporation Non-human primate cd4 polypeptides, fusions thereof, dna encoding, and uses thereof
US5395760A (en) * 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
US5605690A (en) 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
US5945397A (en) 1989-09-05 1999-08-31 Immunex Corporation Purified p75 (type II) tumor necrosis factor receptor polypeptides
NZ235148A (en) 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
US6541610B1 (en) 1989-09-05 2003-04-01 Immunex Corporation Fusion proteins comprising tumor necrosis factor receptor
AU630497B2 (en) * 1989-09-05 1992-10-29 Immunex Corporation Tumor necrosis factor-alpha and -beta receptors
EP1132471A3 (de) 1989-09-12 2001-11-28 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
JPH0578396A (ja) * 1989-12-13 1993-03-30 Yeda Res & Dev Co Ltd ヒト腫瘍壊死因子結合蛋白
US5136021A (en) 1990-02-27 1992-08-04 Health Research, Inc. TNF-inhibitory protein and a method of production
WO1991017184A1 (en) 1990-04-27 1991-11-14 The Upjohn Company Modified interleukin-1 inhibitors
US5350683A (en) 1990-06-05 1994-09-27 Immunex Corporation DNA encoding type II interleukin-1 receptors
WO1991018982A1 (en) 1990-06-05 1991-12-12 Immunex Corporation Type ii interleukin-1 receptors
GB2246569A (en) 1990-06-15 1992-02-05 Charing Cross Sunley Research Tumour necrosis factor - alpha binding protein
US7253264B1 (en) 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
US20030064480A1 (en) 1990-06-28 2003-04-03 Leander Lauffer Fusion proteins with immunoglobulin portions, the preparation and use thereof
ES2120949T4 (es) * 1990-06-28 2011-12-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh 50% Proteinas de fusión con porciones de inmunoglobulinas, su preparación y empleo.
GB9022648D0 (en) 1990-10-18 1990-11-28 Charing Cross Sunley Research Polypeptide and its use
EP1149913A1 (en) 1990-11-09 2001-10-31 GILLIES, Stephen D. Cytokine immunoconjugates
DE4037837A1 (de) 1990-11-28 1992-06-04 Behringwerke Ag Zellfreie rezeptorbindungsteste, ihre herstellung und verwendung
JP2864434B2 (ja) 1991-01-18 1999-03-03 サイナーゲン，インコーポレーテッド 腫瘍壊死因子媒介疾患の治療方法
IL99120A0 (en) 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
DE69230862T2 (de) 1991-10-15 2000-12-14 Michael F. Mullarkey Rezeptoren zur Behandlung von Entzündungen vom verzögerten Typ
US5270038A (en) 1992-01-23 1993-12-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Tumor necrosis factor receptors on microorganisms
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
IL101769A (en) 1992-05-03 2007-02-11 Yeda Res & Dev Modulation of TNF receptor action
IL104355A (en) 1993-01-10 2006-08-20 Yeda Res & Dev Tnf receptor promoter
US5721121A (en) 1995-06-06 1998-02-24 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing a tumor necrosis factor receptor immunoglobulin chimeric protein
US5705364A (en) 1995-06-06 1998-01-06 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process
US6165476A (en) 1997-07-10 2000-12-26 Beth Israel Deaconess Medical Center Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker

Also Published As

Publication number Publication date
BG64881B2 (en) 2006-07-31
EP0939121B1 (de) 2003-04-02
US8063182B1 (en) 2011-11-22
JP2728968B2 (ja) 1998-03-18
EP0939121B2 (de) 2007-12-26
NL300129I2 (nl) 2010-02-01
US8163522B1 (en) 2012-04-24
DK0939121T4 (da) 2008-02-04
DK0939121T3 (da) 2003-06-30
JPH1095800A (ja) 1998-04-14
NL300129I1 (nl) 2003-09-01
EP0417563A3 (en) 1992-04-29
US5808029A (en) 1998-09-15
BG63284B2 (bg) 2001-08-31
EP1132471A2 (de) 2001-09-12
DE10399023I1 (de) 2003-10-23
DE10399023I2 (de) 2006-11-23
JPH04164099A (ja) 1992-06-09
EP1132471A3 (de) 2001-11-28
DK0417563T3 (da) 2000-11-06
EP0417563A2 (de) 1991-03-20
EP0417563B1 (de) 2000-07-05
EP0939121A3 (de) 1999-11-24
US5610279A (en) 1997-03-11
DE59010933D1 (de) 2003-05-08
EP0939121A2 (de) 1999-09-01
ATE194384T1 (de) 2000-07-15
ATE236249T1 (de) 2003-04-15
DE59010908D1 (de) 2000-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH10114795A (ja) Ｔｎｆ結合タンパク質
KR100687388B1 (ko) 인터루킨-18 결합 단백질, 이들의 제조방법 및 용도
EP1644415B1 (en) Antibodies against interleukin-22 and uses therefor
JP2866706B2 (ja) 腫瘍壊死因子結合蛋白
EP0475746B1 (en) Human and murine interleukin-5 receptor
JP4741139B2 (ja) 可溶性インターロイキン−２０レセプター
JP2898064B2 (ja) ヒトｇｐ１３０蛋白質
EP0491878B1 (en) Compositions for the inhibition of protein hormone formation and uses thereof
JP4156034B2 (ja) 単離された哺乳動物単球細胞遺伝子；関連する試薬
KR100277769B1 (ko) 항-파스 재조합 항체 및 이에 대한 디엔에이
JP3104187B2 (ja) インターフエロン―ガンマ結合蛋白
KR100382628B1 (ko) 인터페론α/β결합단백질과이의제조및용도
JPH10324699A (ja) 抗ヒトＦａｓヒト化抗体
JP2000154149A (ja) 抗ヒトＦａｓヒト化抗体含有抗リウマチ剤
Schlaeger Brockhaus et al.
JPH08173172A (ja) インヒビンα鎖及び／又はβ鎖の合成方法