EA037095B1 - Способ лечения гемофилии в и эпизодов кровотечения - Google Patents

Способ лечения гемофилии в и эпизодов кровотечения Download PDF

Info

Publication number
EA037095B1
EA037095B1 EA201790876A EA201790876A EA037095B1 EA 037095 B1 EA037095 B1 EA 037095B1 EA 201790876 A EA201790876 A EA 201790876A EA 201790876 A EA201790876 A EA 201790876A EA 037095 B1 EA037095 B1 EA 037095B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
fix
dose
activity
human
rfixfc
Prior art date
Application number
EA201790876A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201790876A1 (ru
Inventor
Гленн Пирс
Саманта Трюкс
Роберт Т. Питерс
Хайянь Цзян
Original Assignee
Биовератив Терапьютикс Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=45441870&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA037095(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Биовератив Терапьютикс Инк. filed Critical Биовератив Терапьютикс Инк.
Publication of EA201790876A1 publication Critical patent/EA201790876A1/ru
Publication of EA037095B1 publication Critical patent/EA037095B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/38—Albumins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение предоставляет способы введения фактора IX; способы введения химерных и гибридных полипептидов, содержащих фактор IX; химерные и гибридные полипептиды, содержащие фактор IX; полинуклеотиды, кодирующие такие химерные и гибридные полипептиды; клетки, содержащие такие полинуклеотиды; и способы производства таких химерных и гибридных полипептидов с использованием таких клеток.

Description

(54) СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ГЕМОФИЛИИ В И ЭПИЗОДОВ КРОВОТЕЧЕНИЯ (31) 61/363,064; 61/424,555; 61/430,819;
61/438,572; 61/442,079; 61/470,951 (32) 2010.07.09; 2010.12.17; 2011.01.07;
2011.02.01; 2011.02.11; 2011.04.01 (33) US (43) 2017.12.29 (62) 201291480; 2011.07.11 (71)(73) Заявитель и патентовладелец:
БИОВЕРАТИВ ТЕРАПЬЮТИКС
ИНК. (US) (72) Изобретатель:
Пирс Гленн, Трюке Саманта, Питерс
Роберт Т., Цзян Хайянь (US) (74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (56) PETERS Robert Т. et al. Prolonged activity of factor IX as a monomeric Fc fusion protein. Blood, 11 March 2010, Volume 115, Number 10, реферат, c. 2057-2063
WO-A2-2009130602
HUANG Chichi. Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and MIMETIBODY™ technology. Current Opinion in Biotechnology 2009, 20:692-699, реферат, c. 692-697
REAGAN-SHAW Shannon et al. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB Journal Vol. 22, No. 3, 17 October 2007, pp:659-661, реферат, c.659-661
SCHELLENBERGER Volker et al. A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptid and proteins in a tunable manner. Nature Biotechnology, Volume 27, Number 12, 15 November 2009, реферат, c. 1186-1189
EA-B1-12566
037095 В1 (57) Изобретение предоставляет способы введения фактора IX; способы введения химерных и гибридных полипептидов, содержащих фактор IX; химерные и гибридные полипептиды, содержащие фактор IX; полинуклеотиды, кодирующие такие химерные и гибридные полипептиды; клетки, содержащие такие полинуклеотиды; и способы производства таких химерных и гибридных полипептидов с использованием таких клеток.
037095 Bl
Область изобретения
Настоящее изобретение относится в целом к области терапии гемостатических болезней.
Уровень техники
Гемофилия В (также известная как болезнь Кристмаса) одна из наиболее распространенных наследуемых болезней крови в мире. Она приводит к уменьшению in vivo и in vitro свертываемости крови и требует постоянного медицинского наблюдения в течение жизни больного. Если отсутствуют внешние повреждения, больные подвержены спонтанному кровотечению в суставах, которое приводит к сильной боли и вредному для здоровья отсутствию подвижности; кровотечению в мышцах, приводящему к аккумуляции крови в этих тканях; спонтанному кровотечению в горле и шее, которое может стать причиной асфиксии при отсутствии немедленного лечения; почечному кровотечению; распространены также тяжелые кровотечения после хирургического вмешательства, незначительных случайных повреждений или удаления зубов. Нормальная коагуляция крови in vivo требует как минимум сериновых протеаз факторов П (протромбин), VII, IX, X и М (растворимых белков плазмы); кофакторов, включающих трансмембранный белковый тканевой фактор и плазматические белковые факторы V и VIII; фибриноген, трансглотаминазу фактор МП, фосфолипид (включая активированные тромбоциты) и кальций. Дополнительные белки, включающие калликреин, кининоген высокого молекулярного веса и фактор XII требуются в некоторых из тестов свертываемости in vitro, и могут играть роль in vivo при патологических нарушениях.
При гемофилии свертывание крови нарушается из-за отсутствия определенных плазматических факторов свертывания крови. Причиной гемофилии В является дефицит фактора IX, что может быть результатом как уменьшения синтеза белка фактора Ж, так и дефективной молекулой со сниженной активностью. Лечение гемофилии производится путем замещения отсутствующего фактора свертывания экзогенными концентратами фактора, высоко обогащенными фактором Ж. Однако производство такого концентрата из крови связано с множеством технических трудностей, как описано ниже.
При очистке фактора IX из плазмы (полученный из плазмы фактор IX; pdFIX) почти исключительно получается активный фактор IX. Однако такая очистка фактора IX из плазмы очень трудна, поскольку фактор IX представлен в плазме только в низкой концентрации (5 мкг/мл. Andersson, Thrombosis Research 7: 451 459 (1975). Кроме того, очистка из крови требует удаления или инактивации инфекционных агентов, таких как ВИЧ и вирус гепатита С. Более того, pdFIX имеет короткий период полувыведения и, следовательно, требует частого дозирования. Рекомбинантный фактор IX (rFIX) также доступен, но имеет такой же короткий период полувыведения и требует такого же частого дозирования (например, 2-3 раза в неделю для профилактики), как и pdFIX. rFIX также обладает более низким увеличением концентрации (К значением) по сравнению с pdFIX, что делает необходимым использование более высоких доз rFIX, чем в случае pdFIX. Снижение смертности, предотвращение повреждения суставов и улучшенное качество жизни стали важным достижением вследствие разработки полученного из плазмы и рекомбинантного фактора IX. Пролонгированная защита от кровотечения станет другим значительным прогрессом в лечении пациентов с гемофилией В. Однако на настоящее время не разработано продуктов, которые давали бы пролонгированную защиту. Следовательно, остается потребность в усовершенствованных способах лечения гемофилии, возникшей вследствие недостатка фактора IX, которые были бы более переносимы и более эффективны, чем существующие терапевтические способы.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение предоставляет способы введения фактора IX с использованием химерных полипептидов, содержащих Фактор IX, и гибридов таких химерных полипептидов; полинуклеотидов. кодирующих такие химерные и гибридные полипептиды; клеток, содержащих такие полинуклеотиды; и способы производства таких химерных и гибридных полипептидов с использованием таких клеток. В некоторых вариантах воплощения фактор IX химерный полипептид представляет собой фактор IX FcRn связывающий партнер (ВР) химерный полипептид, такой как фактор IX Fc химерный полипептид. В других вариантах воплощения фактор IX химерный полипептид представляет собой фактор IX-XTEN полипептид.
Настоящее изобретение предоставляет способ введения фактора IX нуждающемуся в этом пациенту, включая введение пациенту дозы не менее, чем около 10, не менее, чем около 20, или не менее, чем около 25 МЕ/кг Фактора IX FcRn BP химерного полипептида, например, фактора IX-Fc химерного полипептида или фактора IX-XTEN химерного полипептида, с интервалом дозирования примерно один раз в неделю или реже.
В некоторых вариантах воплощения концентрация в плазме крови химерного полипептида достигает среднего минимального значения не менее, чем около 1 МЕ/дл после не менее, чем около 6 дней у не менее, чем около 70%, не менее, чем около 80%, не менее, чем около 90%, или около 100% популяции пациентов, или достигает у пациента минимального значения не менее, чем около 1, 2, 3, 4 или 5 МЕ/дл после не менее, чем около 6 дней. В некоторых вариантах воплощения уровень в плазме вышеупомянутого химерного полипептида достигает среднего минимального значения около 1-5 или 1-3 МЕ/дл. Такое минимальное или среднее минимальное значение может быть достигнуто после около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17, около 18, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29,
- 1 037095 около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39 или около 40 дней. В некоторых вариантах воплощения химерный полипептид имеет сильно редуцированную фосфорилизацию и сульфатацию по сравнению с полученным из плазмы фактором IX. В некоторых вариантах воплощения химерный полипептид менее, чем на 25% фосфорилирован и менее, чем на 25% сульфатирован, например, менее чем на 25% полностью полностью фосфорилирован и сульфатирован. В некоторых вариантах воплощения химерный полипептид менее чем на около 10% фосфорилирован и менее, чем на около 9% сульфатирован. В некоторых вариантах воплощения химерный полипептид имеет паттерн/распределение гамма карбоксилирования, содержание гамма карбоксилирования, паттерн/ распределение сиалирования, и/или содержание сиалирования, сходное (то есть в пределах 10%) или равное тому же у Фактора IX Fc химерного полипептида в примерах 5-6.
В некоторых вариантах воплощения химерный полипептид имеет увеличение концентрации более чем 0,7 или более чем 0,75 мкг/мл (антиген). В некоторых вариантах воплощения химерный полипептид имеет среднее увеличение концентрации (K-значение) (активность; наблюдаемое) не менее чем около 0,8, не менее чем около 0,9 или не менее чем около 1 МЕ/дл на МЕ/кг.
В некоторых вариантах воплощения химерный полипептид демонстрирует один или более фармакокинетических параметров, у указанной популяции пациентов или у указанного пациента, выбранного из группы, состоящей из:
(a) средний клиренс (CL) (активность) у указанной популяции пациентов около 3,36 ± 0,93 мл/ч/кг; средний клиренс (CL) (активность) у указанной популяции пациентов около 3,0-3,72, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7 или 3,72 мл/ч/кг; средний клиренс (CL) (активность) у указанной популяции пациентов который в около 2,5 раза ниже, чем клиренс полипептида, содержащего указанный фактор IX без указанного FcRn BP; клиренс (CL) (активность) у указанного пациента около 1,84-4,58 мл/ч/кг.
(b) среднее среднее время удержания (MRT) (активность) у указанной популяции пациентов не менее, чем около 68,05±11,16 ч; среднее MRT (активность) у указанной популяции пациентов около 60-78, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 или 78 ч; среднее MRT (активность) у указанной популяции пациентов, которое в около 3 раз длиннее, чем среднее MRT полипептида, содержащего указанный фактор IX без указанного FcRn BP; среднее время удержания (MRT) (активность) у указанного пациента около 53,185,8 ч; среднее время удержания (MRT) (активность) у указанного пациента не менее, чем около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85 или около 90 ч;
(c) среднее t1/2бетa (активность) у указанной популяции пациентов около 52,5±9,2 ч; среднее t1/2бетa (активность) у указанной популяции пациентов, которое составляет около 47-60 ч, около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59, около 60 ч; среднее t1/2бетa (активность) у указанной популяции пациентов, которое около 3 раз длиннее, чем среднее Ц2бета полипептида, содержащего указанный фактор IX без указанного FcRn BP; t1/2бетa (активность) у указанного пациента около 40-67,4, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70 или около 75 ч;
(d) среднее увеличение концентрации (К значение) (активность; наблюдаемое) у указанной популяции пациентов около 0,93 ± 0,18 МЕ/дл на МЕ/кг; среднее увеличение концентрации (К значение) (активность; наблюдаемое) у указанной популяции пациентов около 0,85 - 1,0, около 0,85, около 0,86, около 0,87, около 0,88, около 0,89, около 0,90, около 0,91, около 0,92, около 0,93, около 0,94, около 0,95, около 0,96, около 0,97, около 0,98, около 0,99, около 1,0, около 1,05, около 1,10 или около 1,15 МЕ/дл на МЕ/кг; среднее увеличение концентрации (К значение) (активность; наблюдаемое) у указанной популяции пациентов, которое на около 24% лучше, чем среднее увеличение концентрации полипептида, содержащего указанный фактор IX без указанного FcRn BP; увеличение концентрации (К значение) (активность; наблюдаемое) у указанного пациента около 0,62-1,17 МЕ/дл на МЕ/кг;
(e) средняя VSS (активность) у указанной популяции пациентов около 226 ± 67,76 (скорректированное до 69,8) мл/кг; средняя VSS (активность) у указанной популяции пациентов около 200 - 300, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290 или около 300 мл/кг; VSS (активность) у указанного пациента около 145-365 мл/кг;
(f) средняя AUC/доза (активность) у указанной популяции пациентов около 32,44±10,75 МЕ-ч/дл на МЕ/кг; средняя AUC/доза (активность) у указанной популяции пациентов около 26-40, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39 или около 40 МЕ-ч/дл на МЕ/кг; AUC/доза у указанного пациента около 21,80-54,30 МЕ-ч/дл на МЕ/кг.
В некоторых вариантах воплощения доза химерного полипептида содержит значительно более низкую (в 10-100 раз) концентрацию (0,01-0,001%) активированного FIX (FIXa), чем в производимых в настоящее время продуктах Фактора IX, таких как MONONINE™ (pdFIX; CSL Behring)) или BENEFIX™ (Wyeth; rFIX) (0,1%). Такая концентрация может быть в 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 раз ниже, чем производимых в настоящее время продуктов, или 0,01, 0,05, 0,0033, 0,0025, 0,002, 0,00167, 0,00142, 0,00125, 0,00111 или 0,001%.
В некоторых вариантах воплощения интервал дозирования составляет 6-18, 6-10, 9-18, не менее чем
- 2 037095
6, не менее чем 7, не менее чем 8, не менее чем 9, не менее чем 10, не менее чем 11, не менее чем 12, не менее чем 13, не менее чем 14, не менее чем 15, не менее чем 16, не менее чем 17 или не менее чем 18 дней, еженедельно два раза в месяц или один раз в месяц. Интервал дозирования может быть профилактическим интервалом дозирования, фиксированным профилактическим интервалом дозирования или индивидуализированным профилактическим интервалом дозирования.
Способы изобретения применяются к пациенту, нуждающемуся в контроле или предотвращении кровотечения или эпизодов кровотечения, нуждающемуся в интермиттирующей терапии, нуждающемуся в профилактическом лечении или нуждающемуся в лечении при необходимости.
Терапевтические дозы, которые могут быть использованы в способах изобретения, составляют около 25-180, около 20-180, около 20-50, около 20-100, около 10-180, около 10-50, около 10-30 или около 50100 МЕ/кг. Доза может быть фиксированной дозой или индивидуализированной дозой.
В некоторых вариантах воплощения химерный полипептид вводится внутривенно или подкожно.
Пациентом в способах изобретения может быть человек или не являющееся человеком млекопитающее. Не являющиеся людьми млекопитающие включают мышей, собак, приматов, обезьян, кошек, лошадей, коров, свиней и других домашних животных и маленьких животных.
Химерный полипептид может быть в форме гибрида, содержащего второй полипептид в соединении с указанным химерным полипептидом, при этом указанный второй полипептид содержит или состоит преимущественно из FcRn BP, например, Fc. Химерный полипептид может быть не менее, чем на 90%, не менее чем на 95% или 100% идентичен последовательности фактора IX, последовательности Fc или как последовательности фактора IX, так и последовательности Fc в табл. 2А (SEQ ID NO: 2) и/или 2В (SEQ ID NO: 4), с или без сигнальной последовательностью (ями) и полипептидом.
Химерный полипептид или гибрид может вводиться как часть фармацевтического состава, содержащего не менее чем одно вспомогательное вещество.
Изобретение также предоставляет сами вышеописанные химерные и гибридные полипептиды, полинуклеотиды, их кодирующие, культивируемые человеческие эмбриональные клетки, содержащие полинуклеотиды, и способы производства таких химерных и гибридных полипептидов, и полипептиды, производимые такими способами.
Краткое описание рисунков/фигур
Фиг. 1 - схема одного типа фактора IX химерного полипептида, фактора IX-Fc гибрида.
Фиг. 2 - групповая средняя концентрация FIXFc по сравнению с временными профилями; сравнение номинальной дозы.
Фиг. 3 - групповая средняя активность FIXFc по сравнению с временными профилями; сравнение номинальной дозы.
Фиг. 4 - дерево решений вычитания базового уровня.
Фиг. 5 - дозопропорциональное возрастание Cmax и AUC для FIX активности.
Фиг. 6 - оцененная терапевтическая продолжительность rFIXFc при 50 (А) и 100 (В) МЕ/кг.
Фиг. 7 - дозопропорциональное возрастание Cmax и AUC для FIX антигена.
Фиг. 8 - фармакокинетические оценки для rFIXFc антигена при 50 (А) и 100 (В) МЕ/кг номинальных дозах.
Фиг. 9 - точная корреляция между rFIXFc активностью и уровнями антигена. Следует заметить, что вследствие перерасчета PK активности, как обсуждается в примере 11, R2 = 0,946.
Фиг. 10 - rFIX-Fc доменная структура и пострансляционные модификации. PRO: пропептид, расщепленный процессирующим ферментом. GLA: содержит 12 γ-карбоксилированных остатков глутаминовой кислоты (Gla). ACT PEP: активационный пептид расщепляется для получения активной протеазы. Другие модификации: N- и О- гликозилирование, Asp(64) β-гидроксилирование, Tyr сульфатация, Ser фосфорилирование.
Фиг. 11 - SDS-PAGE гель очистки промежуточных продуктов и очищенного FIXFc мономера. Пробы с различных этапов очистки FIXFc анализировалась с помощью невосстановительного SDS-PAGE. Дорожка 1: Маркеры SeeBlue плюс молекулярного веса (Invitrogen). Дорожка 2: пустая дорожка. Дорожка 3: белок А загружен. Дорожка 4: белок А элюат. Дорожка 5: фрактогель DEAE элюат. Дорожка 6: Q Seph FF элюат. Дорожка 7: конечный объем FIXFc. Дорожка 8: пустая дорожка. Дорожка 9: конечный объем редуцированного FIXFc.
Фиг. 12 - функциональная активность FIXFc у дефицитных по FIX мышей. Дефицитным по FIX мышам была введена внутривенно доза 219 МЕ/кг FIXFc (3 или 4 на группу, 6 групп, n = 23) или 200 МЕ/кг rFIX (3 или 4 на группу, 5 групп, n = 23) на времени = 0. Пробы крови были собраны в различное время после дозировки (от 0,25 ч до 96 ч) и проанализированы на активность свертывания с использованием анализа FIX активности. * rFIX активность не определялась у всех мышей на временных точках после 48 ч после дозирования.
Фиг. 13 - время свертывания цельной крови FIXFc по сравнению с рекомбинантным FIX у дефицитных по FIX мышей. Дефицитные по FIX мыши (6 на группу) получили внутривенно дозу 50 МЕ/кг FIXFc или 50 МЕ/кг rFIX. Пробы крови были собраны перед дозированием и на различных временах по- 3 037095 сле дозирования. Пробы крови инкубировались при 37°С и визуально проверялись на присутствие сгустков крови один раз в минуту. Время, необходимое для формирования сгустков крови, отмечалось, и когда активность свертывания возвращалась к базовому уровню (то есть сгустки не формировались), дополнительные пробы не получали (пробы собирались от 15 мин до 144 ч для FIXFc или от 15 мин до 72 ч для rFIX).
Фиг. 14 - фармакодинамика FIXFc у дефицитных по FIX мышей. Дефицитным по FIX мышам была введена доза 219 МЕ/кг FIXFc (5 на группу, 6 групп, n = 30) или 200 МЕ/кг rFIX (4 или 5 на группу, 6 групп, n = 28) на день 0, 4 и 8. Пробы плазмы крови были собраны путем пункции сердца на 15 мин и 96 ч после каждой дозы и активность свертывания измерялась с использованием анализа FIX активности. Плазма была также собрана из крови хвоста на 8, 24, 48 и 72 ч после каждой дозы. Уровни FIXFc были подсчитаны во всех пробах с использованием ELISA, специфичного на FIXFc. (А) Измеренная v. Рассчитанная активность. Активность свертывания для FIXFc рассчитывалась с использованием анализа FIX активности на 15 мин и 96 ч после трех доз. Было определено, что активность свертывания in vitro для FIXFc составляла 43,8±5,4 МЕ/мг. Основываясь на этой активности (МЕ/мг) и измеренных уровнях белка, рассчитанный уровень активности свертывания был определен на временных точках 15 мин, 8, 24, 48, 72 и 96 ч после каждой дозы. (В) У дефицитных по FIX мышей, обработанных тремя дозами 200 МЕ/кг rFIX, уровни FIX были рассчитаны с использованием FIX-специфичного ELISA. С использованием измеренных специфичных активностей FIXFc и rFIX, стало возможно сравнить рассчитанную активность свертывания для всех проб, анализированных с помощью ELISA.
Фиг. 15 - фармакокинетика и фармакодинамика FIXFc у дефицитных по FIX собаках. Двум собакам с гемофилией В внутривенно влили 140 МЕ/кг FIXFc. Пробы крови были собраны на 5, 15 и 30 мин и на 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 27, 30, 48, 51, 54, 72, 80, 96, 126, 144 и 168 ч. (А) Метод сэндвича ELISA с использованием FIX иммобилизированного антитела и Fc-HRP идентифицирующего антитела был использован для измерения концентрации интактного FIXFc в пробах крови собак с гемофилией В. (В) FIX активность свертывания измерялась на всех временных точках по отношению к стандартной кривой, сделанной с FIXFc. (С) Кровь, собранная у животных, немедленно анализировалась на время свертывания цельной крови. Пробы крови инкубировались при 28°С и визуально проверялись на присутствие сгустков крови один раз в минуту, и отмечалось время, за которое формировался сгусток.
Фиг. 16 - фармакокинетика FIXFc у яванских макак. Макакам была введена однократная доза (0,5, 2 и 10 мг/кг, соответствующая приблизительно 25, 100 или 500 МЕ/кг) FIXFc (n = 2, 3 и 3, соответственно). Пробы крови были собраны на 0,25, 0,5, 1, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144 и 168 ч после дозы и плазма была подготовлена для анализа концентрации белка с помощью FIXFc-специфичного ELISA.
Фиг. 17 - rFIXFc и BENEFIX™ показывают сравнимую активность и дозозависимую реакцию в цельной крови из HemB мышей. (A) ROTEM® Параметры. rFIX или BENEFIX™ были впрыснуты в кровь HemB мышей и параметры свертывания измерялись по ROTEM®. (B)-(D) Дозозависимый ответ, измерение (В) СТ, (С) CfT и (D) Альфа-угол.
Фиг. 18 - определение эффективности в неотложных случаях в модели отсечения хвоста у мышей с гемофилией.
Фиг. 19 - (А) Потеря крови после отрезания хвоста у отдельных HemB мышей, обработанных rFIXFc или BENEFIX™. (В) Дозозависимая реакция на rFIXFc и BENEFIX™ по медианной потере крови после отрезания хвоста у HemB мышей.
Фиг. 20 - модель кровотечения при рассечении хвостовой вены (TVT) у HemB мышей: модель для характеристики венозного кровотечения у пациентов с тяжелой гемофилией.
Фиг. 21 - пролонгированная активность rFIXFc по сравнению с BENEFIX™ в опытных HemB мышах по цельной крови ROTEM®. (А) СТ, (В) CFT, (С) Альфа-угол, и (D) частичная корреляция между активностью свертывания цельной крови (СТ) по ROTEM® по сравнению с плазматической активность по аРТТ.
Фиг. 22 - пролонгированная эффективность FIXFc по сравнению с BENEFIX™ в модели кровотечения при рассечении хвостовой вены (TVT) у HemB мышей. (А) Выживаемость: Степени выживаемости сравнивались у мышей, получавших BENEFIX™ за 24 ч перед TVT, и у мышей, получавших rFIXFc за 72 ч перед TVT, и (В) Остановка кровотечения: степени кровотечения сравнивались у мышей, получавших BENEFIX™ за 24 ч перед TVT, и у мышей, получавших rFIXFc за 72 ч перед TVT.
Фиг. 23 - корреляция между повышением концентрации активного rFIXFc по отношению к весу тела у 12 пациентов, которые получали однократную дозу 12,5 - 100 МЕ/кг rFIXFc.
Фиг. 24 - моделирование по методу Монте-Карло с использованием структурной PK модели rFIXFc активности для создания профилей активность-время для достижения минимального уровня 1 МЕ/дл выше базового уровня после еженедельного (А), каждые 10 дней (В) или каждые две недели режима дозирования (С). Медианные PK параметры популяции и релевантные вариации между пациентами и у одного пациента были взяты из фазы 1/2а клинического исследования. 1000 пациентов вошли в моделирование на дозовый режим с 14-16 точками взятия проб для каждого пациента, и среднее ± SD профилей активность-время 1000 пациентов было сконструировано графически для различных дозовых режимов.
- 4 037095
Фиг. 25 - моделирование по методу Монте-Карло для rFIXFc доз для достижения минимального уровня 1 МЕ/дл (1%), основанное на пересчитанных фармакокинетических данных. (А) один раз в неделю, (В) каждые 10 дней, и (С) каждые две недели.
Детальное описание изобретения
Настоящее изобретение предоставляет способ лечения недостатка фактора IX, например, гемофилии В, фактором IX, с использованием более длинного интервала дозирования и/или улучшенных фармакокинетических параметров, чем это возможно с известными в настоящее время продуктами с Фактором IX. Настоящее изобретение также предоставляет улучшенные фактор IX химерные полипептиды, фактор IX химерные полинуклеотиды и способы производства. Введение при использовании здесь, означает дать фармацевтически приемлемый фактор IX полипептид изобретения пациенту фармацевтически приемлемым способом. Предпочитаемые способы введения являются внутривенными, например, внутривенная инъекция и внутривенное вливание, например, посредством центрального венозного доступа. Дополнительные способы введения включают подкожное, внутримышечное, пероральное, назальное и пульмонарное введение, предпочтительно подкожное. Фактор IX химерные полипептиды и гибридные белки могут быть введены как часть фармацевтического состава, содержащего не менее, чем одно вспомогательное вещество. Преимущества настоящего изобретения включают: улучшенное соблюдение режима; снижение повреждений из-за кровотечения; повышенную защиту суставов от кровотечений; профилактику повреждения суставов; сниженную болезненность; сниженную смертность; пролонгированную защиту от кровотечения; снижение тромботических случаев; и улучшенное качество жизни.
Химерный полипептид при использовании здесь, означает полипептид, который включает в себя не менее чем два полипептида (или их части, такие как субпоследовательности или пептиды) из различных источников. Химерные полипептиды могут включать два, три, четыре, пять, шесть, семь или более полипептидов или их частей из различных источников, таких как различные гены, различные кДНК или различные животные или другие виды. Химерные полипептиды могут включать один или более линкеров, связывающих различные полипептиды или их части. Таким образом, полипептиды или их части могут быть соединены прямо или они могут быть соединены непрямо, посредством линкеров, или обоими способами, с одним химерным полипептидом. Химерные полипептиды могут включать дополнительные пептиды, такие как сигнальные последовательности и такие последовательности как 6His и FLAG, что способствует очистке или детекции белка. Кроме того, химерные полипептиды могут иметь аминокислотные или пептидные добавки на N- и/или С-конце. Примерами химерных полипептидов изобретения являются фактор IX-FcRn BP химерные полипептиды, например, фактор IX-Fc химерные полипептиды, такие как FIXFc на фиг. 1, SEQ ID NO: 2 (табл. 2) и примеров 1-4, с или без своей сигнальной последовательности и пропептида. Другие примеры химерных полипептидов изобретения включают, не ограничиваясь тем самым, фактор IX-XTEN химерные полипептиды. Фактор IX может быть гибридизирован или с N-концом, или с С-концом XTEN.
Химерный полипептид может содержать последовательность, не менее чем на 90% или не менее чем на 95% или 100% идентичную фактору IX и FcRn BP, например, Fc аминокислотную последовательность, показанную в табл. 2А без сигнальной последовательности и пропептидной последовательности (аминокислоты с 1 по 642 из SEQ ID NO: 2), или альтернативно, с пропептидной последовательностью, или альтернативно с сигнальной последовательностью и пропептидной последовательностью.
Культура, культивировать и культивирование при использовании здесь, означает инкубировать клетки в условиях in vitro, которые дают клеткам возможность расти или делиться или поддерживают клетки в живом состоянии. Культивируемые клетки при использовании здесь означает клетки, которые размножаются in vitro.
Фактор IX и FIX при использовании здесь означает функциональный фактор IX полипептид в своей нормальной роли в коагуляции, если не указано иное. Таким образом, термин фактор IX включает различные полипептиды, которые являются функциональными, и полинуклеотиды, которые кодируют такие функциональные варианты полипептидов. Предпочитаемые фактор IX полипептиды представляют собой человеческие, бычьи, свиные, собачьи, кошачьи и мышиные фактор IX полипептиды. Известны полной длины полипептид и полинуклеотидные последовательности фактора IX, а также многие функциональные варианты, например, фрагменты, мутанты и модифицированные версии. Фактор IX полипептиды включают полной длины фактор IX, полной длины фактор IX без Met на N-конце, полной длины фактор IX без сигнальной последовательности, зрелый фактор IX (без сигнальной последовательности и пропептида), и зрелый фактор IX с добавочным Met на N-конце. Фактор IX предпочтительно производится рекомбинантными методами (рекомбинантный фактор IX или rFIX), то есть он не является природным или полученным из плазмы крови. Известно очень много функциональных вариантов фактора IX. Международная публикация номер WO 02/040544 A3, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки, раскрывает мутанты, которые демонстрируют повышенную устойчивость к ингибированию гепарином, на странице 4, строчки 9-30, и на странице 15, строчки 6-31. Международная публикация номер WO 03/020764 А2, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки, раскрывает мутанты фактора IX с редуцированной иммуногенностью Т-клеток в табл. 2 и 3 (на страницах 14-24), и на странице 12, строчки 1-27. Международная публикация номер WO
- 5 037095
2007/149406 А2, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки, раскрывает функциональный мутант фактора IX молекул, который демонстрирует повышенную белковую стабильность, повышенный период полувыведения in vivo и in vitro и повышенную устойчивость к протеазам от страницы 4, строчка 1 до страницы 19, строчка 11. WO 2007/149406 А2 также раскрывает химерный и другой вариант фактора IX молекул от страницы 19, строчка 12 до страницы 20, строчка 9. Международная публикация номер WO 08/118507 А2, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки, раскрывает мутанты фактора IX, которые демонстрируют повышенную активность свертывания крови, от страницы 5, строчка 14 до страницы 6, строчка 5. Международная публикация номер WO 09/051717 А2, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки, раскрывает мутанты фактора IX, имеющие повышенное число N-связанных и/или О-связанных сайтов гликозилирования, которое приводит к возросшему периоду полувыведения и/или удержания от страницы 9, строчка 11 до страницы 20, строчка 2. Международная публикация номер WO 09/137254 А2, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки, также раскрывает мутанты фактора IX с повышенным числом сайтов гликозилирования от страницы 2, параграф [006] до страницы 5, параграф [011] и от страницы 16, параграф [044] до страницы 24, параграф [057]. Международная публикация номер WO 09/130198 А2, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки, раскрывает функциональный мутант фактора IX молекул, который имеет повышенное число сайтов гликозилирования, что приводит к возрастанию периода полувыведения, от страницы 4, строчка 26, до страницы 12, строчка 6. Международная публикация номер WO 09/140015 А2, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки, раскрывает функциональные фактор IX мутанты, которые имеют повышенное количество Cys остатков, что может быть использовано для полимерной (например, PEG) конъюгации, от страницы 11, параграф [0043] до страницы 13, параграф [0053]. Кроме того, сотни нефункциональных мутаций по фактору IX идентифицированы у пациентов с гемофилией, многие из которых раскрыты в табл. 1, на страницах 11-14 Международной публикации номер WO 09/137254 А2, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Такие нефункциональные мутации не включены в изобретение, но предоставляют дополнительное руководством к тому, какие мутации с большей или меньшей вероятностью приведут к получению функционального фактор IX полипептида. Фактор IX (или фактор IX часть химерного полипептида) может быть не менее, чем на 90% или не менее, чем на 95% или не менее, чем на 100% идентичен фактора IX аминокислотной последовательности, показанной в табл. 2А без сигнальной последовательности и пропептидной последовательности (аминокислоты с 1 по 415 из SEQ ID NO: 2), или альтернативно, с пропептидной последовательностью, или с пропептидной и сигнальной последовательностью (полной длины фактор IX).
Фактора IX коагуляционная активностью выражается в Международных Единицах (ME). Одна ME активности фактора IX соответствует приблизительно количеству фактора IX в одном миллилитре нормальной плазмы крови человека. Несколько исследований подходят для измерения активности фактора IX, включая одностадийное исследование свертываемости крови (активированное частичное тромбопластиновое время; аРТТ), время образования тромбина (TGA) и ротационная тромбоэластография (ROTEM®). См., например, пример 3. FcRn связывающий партнер или FcRn BP при использовании здесь, означает связывающие партнеры функционального неонатального Fc рецептора (FcRn), если не указано другое. FcRn связывающий партнер является любой молекулой, которая может специфично связываться с FcRn рецептором с последующим активным транспортом FcRn рецептором FcRn связывающего партнера. Таким образом, термин FcRn BP включает любые варианты IgG Fc, которые являются функциональными. Например, область Fc части IgG, которая связывается с FcRn рецептором, описана на основе рентгеноструктурной кристаллографии (Burmeister et al., 1994, Nature 372:379, включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки). Главный контактный участок Fc с FcRn находится рядом с соединением CH2 и CH3 доменов. Fc-FcRn контакты все находятся внутри одной Ig тяжелой цепи. FcRn BPs включает целый IgG, Fc фрагмент IgG, и другие фрагменты IgG, которые включают полный связывающий регион FcRn. Главные контактные сайты включают аминокислотные остатки 248, 250257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 CH2 домена и аминокислотные остатки 385-387, 428 и 433-436 CH3 домена. Все упоминания аминокислотной нумерации иммуноглобулинов или фрагментов иммуноглобулинов, или участков, основаны на Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Public Health, Bethesda; MD, включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. (FcRn рецептор выделен из нескольких видов млекопитающих, включая человека. Известны последовательности человеческих FcRn, крысиных FcRn и мышиных FcRn (Story et al., 1994, J. Exp. Med. 180: 2377), включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.) FcRn BP может содержать CH2 и CH3 домены иммуноглобулинов, имеющие или не имеющие петлевые участки иммуноглобулина. Приведенные в качестве примера FcRn BP варианты предоставлены в WO 2004/101740 и WO 2006/074199, которые включены в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.
FcRn BP также включает альбумин и его фрагменты, которые связываются с FcRn. Предпочтительно альбумин представляет собой альбумин человека. Фактор IX может быть соединен или с N-концом альбумина или с С-концом альбумина, при условии, что фактора IX компонент фактор IX-альбумин гибридного белка может процессироваться ферментативно активной пропротеинконвертазой для получения
- 6 037095 процессированного фактор IX-содержащего полипептида. Примеры альбумина, например, его фрагменты, которые можно использовать в настоящем изобретении, известны, например, Патент США No.
7,592,010; Патент США No. 6,686,179; и Schulte, Thrombosis Res. 124 Suppl. 2:S6-S8 (2009), каждый из которых включен в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.
FcRn BP (или участок FcRn BP в химерном полипептиде) может содержать одну или более мутаций, и комбинаций мутаций.
FcRn BP ((или участок FcRn BP в химерном полипептиде) может содержать мутации, дающие увеличенный период полураспада, такие как M252Y, S254T, Т256Е и их комбинации, как раскрыто у Oganesyan et al., Mol. Immunol. 46:1750 (2009), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки; H433K, N434F и их комбинации, как раскрыто у Vaccaro et al., Nat. Biotechnol. 23:1283 (2005), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки; мутанты раскрыты на стр. 1-2, параграф [0012], и в примерах 9 и 10 США 2009/0264627 А1, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки; и мутанты раскрыты на стр. 2, параграфы с [0014] по [0021] из США 20090163699 А1, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.
FcRn BP (или участок FcRn BP в химерном полипептиде) также может включать следующие мутации: Fc регион IgG может быть модифицирован в соответствии с хорошо известными процедурами, такими как сайт-направленный мутагенез и тому подобными для получения модифицированных IgG или Fc фрагментов или их частей, которые будут связываться с FcRn. Такие модификации включают модификации, далекие от контактирующих с FcRn сайтов, а также модификации внутри контактирующих сайтов, которые сохраняют или даже усиливают связывание с FcRn. Например, следующие одиночные аминокислотные остатки в человеческом IgG1 Fc (Fcy1) могут быть замещены без значительной потери Fc связывающей аффинности к FcRn:
Р238А, S239A, К246А, К248А, D249A, М252А,
Т256А, Е258А, Т260А, D265A, S267A, Н268А, Е269А, D270A, Е272А, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, Е283А, Н285А, N286A, Т289А, К290А, R292A, Е293А, Е294А, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, Т307А, L309A, Q311A, D312A, N315A, К317А, Е318А, К320А, К322А, S324A, К326А, A327Q, Р329А, A330Q, A330S, Р331А, P331S, ЕЗЗЗА, К334А, Т335А, S337A, К338А, К340А, Q342A, R344A, Е345А, Q347A, R355A, Е356А, М358А, Т359А, К360А, N361A, Q362A, Y373A, S375A D376A, A378Q, Е380А, Е382А, S383A, N384A, Q386A, Е388А, N389A, N390A, Y391F, К392А, L398A, S400A, D401A, D413A, К414А, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, Е430А, N434A, Т437А, Q438A, К439А, S440A, S444A и К447А, где например Р238А представляет дикий тип пролина, замещенный аланином в позиции номер 238. В добавление к аланину, другие аминокислоты могут быть замещены диким типом аминокислот в позициях, обозначенных выше. Мутации могут быть внедрены однократно в Fc, давая начало более, чем одной сотне FcRn связывающих партнеров, отличающихся от нативного Fc. Кроме того, комбинации двух, трех или более из этих индивидуальных мутаций могут быть введены вместе, давая начало еще сотням FcRn связывающих партнеров. Некоторые из этих мутаций могут давать новую функциональность относительно FcRn связывающего партнера. Например, один вариант воплощения включает N297A, удаляя высококонсервативный сайт N-гликозилирования. Действие этой мутации уменьшает иммуногенность, тем самым усиливая циркулирующий полупериод FcRn связывающего партнера, и возмещая неспособность FcRn связывающего партнера связываться с FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB и FcyRIIIA, без мешающей аффинности к FcRn (Routledge et al., 1995, Transplantation 60:847, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки; Friend et al., 1999, Transplantation 68:1632, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки; Shields et al., 1995, J. Biol. Chem. 276:6591, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки). Кроме того, не менее, чем три человеческих Fc гамма рецептора, по-видимому, распознают сайт связывания IgG внутри нижнего петлевого участка, обычно аминокислоты 234-237. Следовательно, другой пример новой функциональности и потенциально сниженной иммуногенности может стать результатом мутаций в этом участке, как, например, путем замещения аминокислот 233-236 человеческого IgG1 ELLG на соответствующую последовательность из IgG2 PVA (с одной аминокислотной делецией). Показано, что FcyRI, FcyRII и FcyRIII, которые опосредуют различные эффекторные функции, не будут связываться с IgG1, если интродуцированы такие мутации. (Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки; и Armour et al., 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки). Как дальнейший пример новой функциональности, возникающей вследствие мутаций, описанных выше, аффинность к FcRn может быть повышена более, чем у дикого типа в некоторых случаях. Эта повышенная аффинность может отражать
- 7 037095 повышенную степень включения, сниженную степень выключения или как повышенную степень включения, так и пониженную степень выключения. Считается, что мутации придают повышенную аффинность FcRn, включая Т256А, Т307А, Е380А и N434A (Shields et al., 6 2001, J. Biol. Chem. 276:6591, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки).
The FcRn BP (или участок FcRn BP в химерном полипептиде) может быть не менее, чем на 90% или не менее, чем на 95% или на 100% идентичен Fc аминокислотной последовательности, показанной в табл. 2А или В без сигнальной последовательности (аминокислоты от 1 до 227 из SEQ ID NO: 2), или альтернативно, с сигнальной последовательностью.
Гибридные полипептиды и белки, при использовании здесь, означает комбинацию химерного полипептида со вторым полипептидом. Химерный полипептид и второй полипептид в гибриде могут быть связаны друг с другом посредством нековалентных взаимодействий белок-белок, таких как цепь-цепь или гидрофобные взаимодействия. Химерный полипептид и второй полипептид в гибриде могут быть связаны друг с другом через ковалентную связь(и), такие как дисульфидные связи. Химерный полипептид и второй полипептид в гибриде могут быть связаны друг с другом посредством более, чем одного типа связи, таких как нековалентные и дисульфидные связи. Гибриды описаны в WO 2004/101740, WO2005/001025, US Pat. No. 7,404,956, US Pat. No. 7,348,004 и WO 2006/074199, каждая из которых включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Второй полипептид может быть второй копией того же химерного полипептида или может быть неидентичным химерным полипептидом. В предпочитаемых вариантах воплощения второй полипептид представляет собой полипептид, содержащий FcRn BP, например, Fc. В предпочитаемых вариантах воплощения химерный полипептид представляет собой фактор IX-FcRn BP, например, фактор IX-Fc химерный полипептид, а второй полипептид состоит полностью из Fc. См., например, фиг. 1, примеры 1-3 и табл. 2 (SEQ ID NOs: 2 и 4). См., например, US 7404956, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.
Второй полипептид в гибриде содержит или полностью состоит из последовательности, не менее, чем на 90% или не менее, чем на 95% или 100% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в табл. 2В без сигнальной последовательности (аминокислоты с 1 по 227 из SEQ ID NO: 4), или альтернативно, с сигнальной последовательностью.
Полипептид настоящего изобретения также включает фактор IX, гибридизированный с одним или более XTEN полипептидами. Schellenburger et al., Nat. Biotech. 27:1186-90 (2009), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Фактор IX может быть гибридизирован или с Nконцом XTEN полипептида, или с С-концом XTEN полипептида. XTEN полипептиды включают, но не ограничиваясь тем самым, полипептиды, раскрытые в WO 2009/023270, WO 2010/091122, WO 2007/103515, US 2010/0189682, и US 2009/0092582, каждая из которых включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.
Интервал дозирования при использовании здесь означает количество времени, которое проходит между повторными дозами, вводимыми пациенту. Интервал дозирования в способах изобретения, использующих химерный FIX-FcRn BP, например, химерный FIX-Fc, может быть не менее, чем от полутора до восьми раз длиннее, чем интервал дозирования, требуемый для эквивалентного количества (в МЕ/кг) указанного фактора IX без FcRn BP, например, Fc части (то есть полипептида, состоящего из указанного FIX). Интервал дозирования при введении, например, фактора IX-Fc химерного полипептида (или гибрида) изобретения может быть не менее, чем в полтора раза длиннее, чем интервал дозирования, требуемый для эквивалентного количества указанного фактора IX без FcRn BP, например, Fc, portion (то есть полипептида, состоящего из указанного фактора IX). Интервал дозирования может быть не менее чем от полутора до восьми раз длиннее, чем интервал дозирования, требуемый для эквивалентного количества указанного фактора IX без, например, Fc части (или полипептида, состоящего из указанного фактора IX).
В некоторых вариантах воплощения интервал дозирования составляет 6-18, 6-10, 9-18, не менее чем 6, не менее чем 7, не менее чем 8, не менее чем 9, не менее чем 10, не менее чем 11, не менее чем 12, не менее чем 13, не менее чем 14, не менее чем 15, не менее чем 16, не менее чем 17 или не менее чем 18 дней. Интервал дозирования может быть не менее, чем около одного раза в неделю, и может составлять 6-10 дней, например около 7-10, около 7-9, около 7-8, около 8-10, около 9-10, около 6-7, около 8-9, около 6, около 7, около 8, около 9, или около 10 дней. Интервал дозирования может составлять 9-18 дней, например около 9-17, около 9-16, около 9-15, около 9-14, около 9-13, около 9-12, около 9-11, около 9-10 дней, около 10-18, около 11-18, около 12-18, около 13-18, около 14-18, около 15-18, около 16-18, около 17-18 дней, около 10-11, около 11-12, около 12-13, около 13-14, около 14-15, около 15-16, и около 16-17 дней, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17 или около 18 дней. Интервал дозирования может составлять около 10-14 дней. Интервал дозирования может составлять примерно каждые две недели или два раза в месяц. Интервал дозирования может составлять более, чем 18 дней, например, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39 или около 40 дней. Интервал дозирования может быть фиксированным интервалом, например, 7 дней для 25-50 МЕ/кг, 10-13 дней для 50-100 МЕ/кг или 14 дней для 100-150
- 8 037095
МЕ/кг. Фиксированный интервал и доза определяются так, что комбинация интервала и дозы будут приводить к минимальному уровню не менее, чем около 1-5 или не менее, чем около 1-3, или не менее, чем около 1, не менее, чем около 2, или не менее, чем около 3 МЕ/дл FIX активности в популяции пациентов или у отдельного пациента. Фиксированный интервал дозирования может также составлять 7 дней для 20-50 МЕ/кг, 10-14 дней для 50-100 МЕ/кг, 14-16 дней для 100-150 МЕ/кг, 7 дней для 10-50 МЕ/кг, 10-13 дней для 15-100 МЕ/кг, или 14-15 дней для 50-150 МЕ/кг. Фиксированный интервал дозирования может также составлять 7 дней для 10-30 МЕ/кг, 10 дней для 15-50 МЕ/кг, 11 дней для 20-70 МЕ/кг, 12 дней для 25-85 МЕ/кг, 13 дней для от 30 до 100 МЕ/кг, 14 дней для от 40 до 125 МЕ/кг и 15 дней для 50-150 МЕ/кг. В предпочитаемых вариантах воплощения интервал дозирования составляет 20 МЕ/кг один раз в неделю, 40 МЕ/кг каждые 10 дней или 100 МЕ/кг каждые две недели (два раза в месяц).
Интервал дозирования может, альтернативно, быть индивидуализированным интервалом, который определен для каждого пациента на основании фармакокинетических данных или другой информации об этом пациенте. Комбинация индивидуализированной дозы/интервала дозирования может быть такой же, как для заданных интервальных режимов в предшествующих параграфах, или может отличаться, как проиллюстрировано в примерах. Режим может первоначально быть с фиксированным интервалом дозирования, и потом может измениться на индивидуализированный интервал дозирования.
Лечение по необходимости при использовании здесь означает лечение, которое предназначено для применения в течение короткого времени и соответствует существующему состоянию, такому как эпизод кровотечения, или выявленная кратковременная необходимость, такая как планируемое хирургическое вмешательство. Состояния, которые могут требовать лечения по необходимости, включают эпизод кровотечения, гемартроз, мышечное кровотечение, ротовое кровотечение, геморрагию, кровоизлияние в мышцу, ротовое кровоизлияние, травму, травму головы, желудочно-кишечное кровотечение, внутричерепное кровоизлияние, внутрибрюшинное кровоизлияние, внутригрудное кровоизлияние, перелом кости, кровотечение центральной нервной системы, кровотечение в заглоточном пространстве, кровотечение в забрюшинном пространстве или кровотечение во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. Прочие эпизоды кровотечения также включены. Пациент может нуждаться в оперативной профилактике, периоперативном уходе или подготовке к операции. Такие операции включают малое хирургическое вмешательство, большое хирургическое вмешательство, удаление зуба, тонзиллэктомию, другие стоматологические/грудные и лицевые операции, сечение паховой грыжи, синовэктомию, полную замену коленного сустава, замену других суставов, краниотомию, остеосинтез, травматическую хирургию, внутричерепные операции, внутрибрюшные операции, внутригрудные операции. Прочие операции также включены. Дополнительные состояния, которые могут требовать лечения по необходимости, включают перечисленные в табл. 26.
Дополнительные состояния, которые могут требовать лечения по необходимости, включают малое кровоизлияние, гемартроз, поверхностное мышечное кровоизлияние, кровоизлияние в мягкие ткани, среднее кровоизлияние, внутримышечное кровоизлияние или кровоизлияние в мягкие ткани с расслоением, кровоизлияние в слизистые, гематурию, сильное кровоизлияние, глоточное кровоизлияние, заглоточное кровоизлияние, забрюшинное кровоизлияние, кровоизлияние центральной нервной системы, ушибы, порезы, царапины, суставное кровоизлияние, носовое кровотечение, ротовое кровотечение, кровотечение из десен, внутричерепное кровотечение, внутрибрюшинное кровотечение, малое спонтанное кровоизлияние, кровотечение после серьезной травмы, средний кожный кровоподтек или спонтанное кровоизлияние в суставы, мышцы, внутренние органы либо в мозг. Дополнительные причины для лечения по необходимости включают необходимость в периоперативном уходе при хирургическом вмешательстве или удалении зуба, большое хирургическое вмешательство, обширные операции в полости рта, урологические операции, операции на грыже, ортопедические операции, такие как замена коленного, тазобедренного или любого другого основного сустава.
- 9 037095
Аббревиатуры:
AUCinf Площадь под кривой концентрация-время от нуля до бесконечности
AUCa Площадь под кривой концентрация-время над фазой распределения
AUCP Площадь под кривой концентрация-время над фазой выведения
Альфа HL Полупериод фазы распределения
Бета HL Полупериод фазы выведения; также обозначается как ti/2
С168 Оцененная FIXFc активность выше базовой через примерно 168 ч после дозы
Стах Максимальная концентрация, присутствующая на Ттах
CV% Процент коэффициента вариации
С1 Клиренс
IVR in vivo увеличение концентрации (%)
К-значение Увеличение концентрации
MRT Среднее время удержания
N Номер
NC Не рассчитывалось
NR Не сообщалось
SD Стандартное отклонение
SE Стандартная ошибка
TBLP1 Модель-прогнозированное время после дозы, когда FIXFc активность уменьшается до примерно 1 МЕ/дл выше базового уровня
TBLP3 Модель-прогнозированное время после дозы, когда FIXFc активность уменьшается до примерно 3 МЕ/дл выше базового уровня
TBLP5 Модель-прогнозированное время после дозы, когда FIXFc активность уменьшается до примерно 5 МЕ/дл выше базового уровня
Vss Объем распределения на стационарной фазе
Vi Объем распределения в центральном компартменте
Фармакокинетические (РК) параметры включают вышеуказанные термины и следующие термины, которые имеют свое обычное значение в данной области техники, если не указано иное. Некоторые из терминов более детально объясняются в примерах. PK параметры могут основываться на уровне FIX антигена (часто обозначенном в настоящей заявке в скобках как антиген) или уровень FIX активности (часто обозначенном в настоящей заявке в скобках как активность). В литературе PK параметры часто основываются на уровне FIX активности из-за присутствия в плазме некоторых пациентов эндогенных неактивных FIX, которые служат помехой возможности оценить введенный (т.е. экзогенный) FIX, используя антитело к FIX. Однако когда FIX вводится как часть гибридного белка, содержащего гетерологичный пептид, такой как FcRn BP, вводимый (то есть экзогенный) FIX антиген может быть точно измерен с использованием антитела к гетерологичному полипептиду. Кроме того, определенные PK параметры могут быть основаны на прогнозируемых данных (часто обозначамых в настоящей заявке в скобках как модель-прогнозируемые) или на наблюдаемых данных (часто обозначаемых в настоящей заявке в скобках как наблюдаемое), и предпочтительно основанные на наблюдаемых данных. Базовый при использовании здесь означает самый низкий подсчитанный уровень фактора IX в плазме крови у пациента перед введением дозы. В впервые проведенном на человеке исследовании, описанном в примере 1, уровни фактора IX в плазме были подсчитаны на двух временных точках перед дозированием: на скрининговом визите и непосредственно перед дозированием. Предозовые времена рассматривались как ноль (базовый уровень) для целей вычислений, то есть для получения данных с вычетом базового уровня. См., например, фиг. 4. Альтернативно, (а) базовый уровень у пациентов, чья FIX активность <1%, которые не имеют детектируемый FIX антиген и имеют нонсенс генотипы, определяется как 0%, (b) базовый уровень у пациентов с FIX активностью перед лечением <1%, которые имеют детектируемый FIX антиген, установлен на 0,5%, (с) базовый уровень у пациентов, чья FIX активность перед лечением между 12% - Cmin (самая низая активность в ходе PK исследования), и (d) базовый уровень у пациентов, чья FIX активность перед лечением >2%-2%. Активность выше базового уровня перед дозированием рассматри- 10 037095 вается как остаточное лекарство от предыдущего лечения и сводится к базовому уровню и вычитается из
PK данных после rFIXFc дозирования. См. пример 11.
Площадь под кривой плазматическая концентрация по отношению к времени (AUC), которая, при использовании здесь, основывается на скорости и протяженности элиминации фактора IX после введения. AUC определяется на определенном временном периоде, таком как 12, 18, 24, 36, 48 или 72 ч, или для бесконечности с использованием экстраполяции, основанной на угле наклона кривой. Если здесь не указано иное, AUC определяется для бесконечности (AUCINF). AUC также может быть подсчитано на основании дозы. Как со многими другими PK параметрами, определение AUC может быть проведено на одном пациенте или на популяции пациентов, по которой подсчитано среднее. В примере 1 среднее AUC/доза в популяции пациентов было 32,44 МЕ-ч/дл на МЕ/кг и диапазон для отдельных пациентов составлял 21,80-54,30 МЕ-ч/дл на МЕ/кг. (см. табл. 13 для средней AUC/доза, основанной на активности.) Следовательно, среднее AUC/доза в популяции пациентов может быть около 26-40, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39 или около 40 МЕ-ч/для МЕ/кг. См. табл. 14 для AUC/дозы и других AUC параметров, основанных на антигене. In vivo увеличение концентрации (IVR) представлено нарастающим увеличением концентрации (K-значение), которое означает наблюдаемый пик активности минус предозовый уровень, разделенные на дозу. IVR также может быть рассчитано на основе процентов, как описано в примерах. Для ясности, в настоящей заявке используются единицы (K-значение или МЕ/дл на МЕ/кг по отношению к %). Среднее IVR можно определить в популяции пациентов, или индивидуальное IVR можно определить у отдельного пациента. FIXFc, использованное в впервые проведенном на человеке исследовании, описанном в примере 1, выражало среднее IVR около 0,93 МЕ/дл на МЕ/кг в популяции пациентов; и IVR у каждого пациента, которое варьировало от 0,62 до 1,17 МЕ/дл на МЕ/кг (табл. 13). Следовательно, химерный полипептид изобретения выражает среднее IVR в популяции пациентов 0,85-1,15 (например, около 0,85, около 0,86, около 0,87, около 0,88, около 0,89, около 0,90, около 0,91, около 0,92, около 0,93, около 0,94, около 0,95, около 0,96, около 0,97, около 0,98, около 0,99, около 1,0, около 1,05, около 1,10, около 1,15) и IVR у пациента не менее чем около 0,6, около 0,7, 0,8, около 0,9, около 1,0, около 1,1 или около 1,2 МЕ/дл на МЕ/кг. Скорость клиренса (CL) при использовании здесь означает оценку способности организма элиминировать лекарство, и выражается как объем плазмы, свободной от лекарства, по прошествии времени. FIXFc, использованный в исследовании, описанном в примере 1, демонстрировал средний CL около 3,36 мл/ч/кг (см. табл. 13), который в около 2,5 раза ниже, чем CL (8,2 мл/ч/кг) полипептида, состоящего из фактора IX (BENEFIX™); диапазон CL значений у отдельных пациентов составлял 1,84-4,58 мл/ч/кг. Следовательно, химерный полипептид изобретения демонстрирует средний CL в популяции 3,0-3,72, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7 или 3,72 мл/ч/кг. Для CL, основанного на антигене, см. табл. 14. Среднее время выведения (MRT) при использовании здесь означает измерение среднего времени существования лекарственных молекул в организме. FIXFc, использованный в исследовании, описанном в примере 1, демонстрировал средний MRT около 68,05 ч (см. табл. 13); диапазон MRT значений составлял 53,1-85,8 ч у отдельных пациентов. Следовательно, химерный полипептид изобретения демонстрирует среднее MRT в популяции 60-78, около 60, около 62, около 64, около 66, около 68, около 70, около 72, около 74, около 76 или около 78 ч и MRT у пациента не менее чем около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85 или около 90 ч. Для MRT, основанной на антигене, см. табл. 14.
t1/2e или t1/2 beta или Beta HL, при использовании здесь, означает полупериод, связанный с фазой элиминации, t1/2β=(ln2)/константа скорости элиминации, связанная с терминальной фазой. В исследовании, описанном в примере 1, использованный FIXFc показывал среднее t1/2Z в популяции пациентов, которое составляло около 52,5 ч (см. табл. 13) и диапазон t1/2p значений у отдельных пациентов составлял 47-60 ч. Следовательно, химерный полипептид изобретения выражает среднее t1/2p более чем около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59 или около 60 ч. Для t1/2p основанного на антигене, см. табл. 14.
Минимальный уровень при использовании здесь означает самый низкий уровень активности фактора IX в плазме, достигнутый после введения дозы химерного полипептида изобретения или другой молекулы фактора IX и до введения следующей дозы, если оно будет. Минимальный уровень в настоящей заявке используется взаимозаменяемо с пороговой величиной. Базовые уровни фактора IX вычитаются из измеренных уровней фактора IX для расчета минимального уровня. В некоторых вариантах воплощения минимальный уровень составляет 1-5 или 1-3 МЕ/дл после около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13 или около 14 дней. В некоторых вариантах воплощения уровень химерного полипептида в плазме достигает среднего минимального уровня не менее, чем около 1 МЕ/дл после не менее чем около 6 дней у не менее чем около 70%, не менее чем около 80%, не менее чем около 90% или около 100% популяции пациентов или достигает минимального уровня не менее чем около 1, 2, 3, 4 или 5 МЕ/дл после не менее чем около 6 дней у пациента. В некоторых вариантах воплощения уровень вышеупомянутого химерного полипептида в плазме достигает среднего минимального уровня около 1-5 или 1-3 МЕ/дл. Такой минимальный уровень или средний минимальный уровень может быть дос- 11 037095 тигнут после около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около
15, около 16, около 17, около 18, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около
36, около 37, около 38, около 39 или около 40 дней.
Объем распределения на стационарной фазе (VSS) при использовании здесь обозначает видимое пространство (объем), в котором распределяется лекарство. VSS = количество лекарства в теле разделенное на концентрацию в плазме на стационарной фазе. В примере 1 средний VSS, обнаруженный в популяции, составлял около 226 мл/кг, и диапазон у пациентов составлял около 145-365 мл/кг. (см. табл. 13.) Таким образом, средний VSS у популяци пациентов может составлять 200-300, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290 или около 300 мл/кг. VSS у отдельных пациентов может составлять около 145, около 150, около 160, около 170, около 180, около 190, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290, около 300, около 310, около 320, около 330, около 340, около 350, около 360 или около 370 мл/кг. VSS, основанный на антигене, см. в табл. 14.
Полипептид, пептид и белок используются взаимозаменяемо и относятся к полимерному соединению, содержащему ковалентно связанные аминокислотные остатки.
Полинуклеотид и нуклеиновая кислота используются взаимозаменяемо и относятся к полимерному соединению, содержащему ковалентно связанные нуклеотидные остатки. Полинуклеотиды могут быть ДНК, кДНК, РНК, однонитевыми или двунитевыми. векторами, плазмидами, фагами или вирусами. Полинуклеотиды включают указанные в табл. 1, которые кодируют полипептиды табл. 2 (см. табл. 1). Полинуклеотиды также включают фрагменты полинуклеотидов табл. 1, например, те, которые кодируют фрагменты полипептидов из табл. 2, такие как фактор IX, Fc, сигнальную последовательность, пропептид, 6His и другие фрагменты полипептидов табл. 2.
Профилактическое лечение при использовании здесь означает введение фактора IX полипептида в многократных дозах пациенту временными курсами для повышения уровня активности фактора IX в плазме крови пациента. Предпочтительно, возросший уровень достаточен для снижения частоты случаев спонтанного кровотечения или предотвращения кровотечения в случае неожиданного повреждения. Профилактическое лечение уменьшает или предотвращает эпизоды кровотечения, например, те, которые описаны ниже при лечении по необходимости. Профилактическое лечение может быть заданным или может быть индивидуализированным, как обсуждается ниже при интервале дозирования, например, для компенсации вариабельности между пациентами. Пациент при использовании здесь означает человека или не являющееся человеком млекопитающее. Не являющиеся человеком млекопитающие включают мышей, собак, приматов, обезьян, кошек, лошадей, коров, свиней и других домашних животных и мелких животных. Пациенты также включают педиатрических пациентов, являющихся людьми. Педиатрические пациенты, являющиеся людьми, имеют возраст до 20 лет, предпочтительно до 18 лет, до 16 лет, до 15 лет, до 12 лет, до 11 лет, до 6 лет, до 5 лет, до 2 лет и от 2 до 11 лет. Способы изобретения могут практиковаться на пациенте, нуждающемся в контроле или предотвращении кровотечения или эпизодов кровотечения. Такие пациенты включают тех, которые нуждаются в контроле или предотвращении кровотечения при малом кровоизлиянии, гемартрозе, поверхностном мышечном кровоизлиянии, среднем кровоизлиянии, внутримышечном кровоизлиянии или кровоизлиянии в мягкие ткани с расслоением, кровоизлиянии в слизистые, гематурии, сильном кровоизлиянии, глоточном кровоизлиянии, заглоточном кровоизлиянии, забрюшинном кровоизлиянии, кровоизлиянии центральной нервной системы, ушибах, порезах, царапинах, суставном кровоизлиянии, носовом кровотечении, ротовом кровотечении, кровотечении из десен, внутричерепном кровотечении, внутрибрюшинном кровотечении, малом спонтанном кровоизлиянии, кровотечении после серьезной травмы, среднем кожном кровоподтеке или спонтанном кровоизлиянии в суставы, мышцы, внутренние органы либо в мозг. Такие пациенты также включают тех, которые нуждаются в периоперативном уходе, таком как уход при кровотечении, связанном с хирургической операцией или удалением зуба.
Терапевтическая доза при использовании здесь означает дозу, посредством которой достигается терапевтическая цель, как описано здесь. Расчет требуемой дозировки полученного из плазмы крови фактора IX (pdFIX) основывается на эмпирических наблюдениях, что, в среднем, 1 ME pdFIX на кг веса тела повышает активность плазматического фактора IX приблизительно на 1 МЕ/дл (1%). На этой основе требуемая дозировка определяется с использованием следующей формулы:
Требуемые единицы = вес тела (кг)хжелаемое повышение фактора IX (МЕ/дл или % от нормы)х 1 (МЕ/кг на МЕ/дл).
Поскольку FIXFc, например, как описано в примерах и на фиг. 1, имеет повышение концентрации такое же, как у pdFIX (отличающееся от такового у BENEFIX™), требуемая доза определяется по формуле выше, или слегка подгоняется. См. также в табл. 26 особые рекомендованные дозы для различных вариантов лечения по требованию. Для педиатрических пациентов, использующих pdFIX, руководство по дозировке такое же, как для взрослых. Однако педиатрические пациенты могут иметь более долгое повышение концентрации, и следовательно дозировку может быть необходимо в соответствии с этим
- 12 037095 изменять.
Терапевтические дозы, которые могут быть использованы в способах изобретения, составляют 10180, 20-180 или 25-180 МЕ/кг, более определенно, предпочитаемые дозы для 6-10 дневного интервала дозирования являются следующими: около 25-110, около 30-110, около 40-110, около 50-110, около 60110, около 70-110, около 80-110, около 90-110 и около 100-110; около 30-100, около 30-90, около 30-80, около 30-70, около 30-60, около 30-50, около 30-40 МЕ/кг; около 40-110, около 50-100, около 60-90 и около 70-80 МЕ/кг; около 40-50, около 50-60, около 60-70, около 70-80, около 80-90, около 90-100 и около 100-110 МЕ/кг; около 25, около 30, около 35, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90, около 95, около 100, около 105 и около 110 МЕ/кг. 6-10 дневный интервал дозирования включает недельный интервал дозирования. Дополнительные терапевтические дозы для 6-10 дневного, например, недельного интервала дозирования, включают 20-50, 20100 и 20-180 МЕ/кг, более определенно, предпочитаемые дозы для 6-10 дневного, например, недельного интервала дозирования являются следующими: около 20-110, около 20-100, около 20-90, около 20-80, около 20-70, около 20-60, около 20-50, около 20-40, около 20-30, около 20-40 и около 20 МЕ/кг. См. также примеры 10 и 11. Дозы могут быть ниже, чем 20 МЕ/кг, если это эффективно для данного пациента, например, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17, около 18 или около 19 МЕ/кг.
Предпочитаемые терапевтические дозы для 9-18 дневного, например, два раза в месяц, интервала дозирования являются следующими: около 50-180, около 60-180, около 70-180, около 80-180, около 90180, около 100-180, около 110-180, около 120-180, около 130-180, около 140-180, около 150-180, около 160-180 и около 170-180 МЕ/кг; около 90-170, около 90-160, около 90-150, около 90-140, около 90-130, около 90-120, около 90-110 и около 90-100 МЕ/кг; около 100-170, около 110-160, около 120-150, и около 130-140 МЕ/кг; около 90-100, около 100-110, около 110-120, около 120-130, около 130-140, около 140150, около 150-160 и около 160-170 МЕ/кг; около 60, около 70, около 80, около 90, около 95, около 100, около 105, около 110, около 115, около 120, около 125, около 130, около 135, около 140, около 145, около 150, около 155, около 160, около 165, около 170, около 175 и около 180 МЕ/кг. См. также примеры 10 и 11.
Предпочитаемые терапевтические дозы составляют 10-50, 15-100, 20-100, 20-50, 50-100, 10, 20, 40, 50 и 100 МЕ/кг.
Терапевтическая доза может составлять около 20-50, около 20-100, около 20-180, 25-110, около 30110, около 40-110, около 50-110, около 60-110, около 70-110, около 80-110, около 90-110, около 100-110, около 30-100, около 30-90, около 30-80, около 30-70, около 30-60, около 30-50, около 30-40 МЕ/кг, около 40-110, около 50-100, около 60-90, около 70-80 МЕ/кг, около 40-50, около 50-60, около 60-70, около 7080, около 80-90, около 90-100, около 100-110 МЕ/кг, около 20, около 25, около 30, около 35, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90, около 95, около 100, около 105 и около 110 МЕ/кг. Такие дозы предпочтительны для интервалов дозирования около 6-10, около 7-10, около 7-9, около 7-8, около 8-10, около 9-10, около 6-7, около 8-9, около 6, около 7, около 8, около 9 и около 10 дней,и один раз в неделю. Терапевтическая доза может составлять около 90-180, около 100-180, около 110-180, около 120-180, около 130-180, около 140-180, около 150-180, около 160-180 и около 170-180 МЕ/кг. Доза может составлять около 90-170, около 90-160, около 90-150, около 90-140, около 90-130, около 90-120, около 90-110 и около 90-100 МЕ/кг. Доза может составлять около 100-170, около 110-160, около 120-150 и около 130-140 МЕ/кг. Доза может составлять около 90-100, около 100-110, около 110-120, около 120-130, около 130-140, около 140-150, около 150-160 и около 160-170 МЕ/кг. Доза может составлять около 90, около 95, около 100, около 105, около 110, около 115, около 120, около 125, около 130, около 135, около 140, около 145, около 150, около 155, около 160, около 165, около 170, около 175 и около 180 МЕ/кг. Такие дозы предпочтительны для интервала дозирования около 9-18, около 9-17, около 9-16, около 9-15, около 9-14, около 9-13, около 9-12, около 9-11, около 9-10, около 1018, около 11-18, около 12-18, около 13-18, около 14-18, около 15-18, около 16-18, около 17-18, около 1011, около 11-12, около 12-13, около 13-14, около 14-15, около 15-16 и около 16-17 дней, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17 и около 18 дней один раз в месяц и два раза в месяц (каждые две недели).
Предпочитаемая терапевтическая доза и интервалы дозирования являются следующими: 20 МЕ/кг один раз в неделю, 40 МЕ/кг каждые 10 дней, и 100 МЕ/кг каждые две недели (дважды в месяц). Дополнительные комбинации дозы и дозового интервала включают: дозу не менее, чем около 50 МЕ/кг и интервал дозирования не менее, чем около 7 дней, дозу не менее, чем около 100 МЕ/кг и интервал дозирования не менее, чем около 9 дней, дозу не менее, чем около 100 МЕ/кг и интервал дозирования не менее, чем около 12 дней, дозу не менее, чем около 150 МЕ/кг и интервал дозирования не менее, чем около 14 дней, 20-50 или 20-100 МЕ/кг и указанный интервал дозирования представляет собой один раз в неделю, доза 20-50 МЕ/кг и интервал дозирования 7 дней, доза 50-100 МЕ/кг и интервал дозирования 10-14 дней, или доза 100-150 МЕ/кг и интервал дозирования 14-16 дней. Предпочитаемые комбинации интервала дозирования и дозы также включают 10-50 МЕ/кг для 7 дней, 15-100 МЕ/кг для 10-13 дней, 50-150 МЕ/кг для 14-15 дней, 10-30 МЕ/кг для 7 дней, 15-50 МЕ/кг для 10 дней, 20-70 МЕ/кг для 11 дней, 25-85 МЕ/кг
- 13 037095 для 12 дней, от 30 до 100 МЕ/кг для 13 дней, от 40 до 125 МЕ/кг для 14 дней и 50-150 МЕ/кг для 15 дней.
Вариант при использовании здесь означает полинуклеотид или полипептид, отличный от исходного полинуклеотида или полипептида, но сохраняющий его основные свойства, например, коагулирующую активность фактора IX или Fc (FcRn-связывающую) активность. Обычно варианты в целом сходны и на многих участках идентичны исходным полинуклеотидам или полипептидам. Варианты включают фрагменты полинуклеотидов и полипептидов, делеции, вставки и модифицированные версии исходных полипептидов.
Вариантные полинуклеотиды могут содержать или же, альтернативно, состоять из последовательности нуклеотидов, не менее, чем на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной, например, кодирующей последовательности нуклеотидов в SEQ ID NO: 1 или 3 (участок фактора IX, участок Fc, по отдельности или вместе) или соответствующей ей комплементарной нити, последовательности нуклеотидов, кодирующей известные мутантные и рекомбинантные фактор IX или Fc, как то раскрытые в процитированных здесь публикациях и патентах, или соответствующей ей комплементарной нити, последовательности нуклеотидов, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 2 или 4 (участок фактора IX, участок Fc, по отдельности или вместе), и/или полинуклеотидным фрагментам любой из этих нуклеиновых кислот (например, их фрагментам, описанным здесь). Полинуклеотиды, которые гибридизируются с этими молекулами нуклеиновых кислот при строгих условиях гибридизации или в менее строгих условиях, также включаются как варианты, равно как и полипептиды, кодируемые этими полинуклеотидами в случае их функциональности.
Вариантные полипептиды могут содержать, или, альтернативно, состоять из последовательности аминокислот, не менее чем на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной, например, последовательности полипептидов, показанной в SEQ ID NO: 2 или 4 (участок фактора IX, участок Fc, по отдельности или вместе), и/или полипептидным фрагментам любого из этих полипептидов (например, описанным здесь фрагментам).
Под нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность нуклеотидов, идентичную эталонной последовательности нуклеотидов не менее чем, например, на 95%, подразумевается, что последовательность нуклеотидов в нуклеиновой кислоте идентична эталонной последовательности, за тем исключением, что эта последовательность нуклеотидов может включать до пяти точковых мутаций на каждые 100 нуклеотидов эталонной последовательности нуклеотидов. Другими словами, чтобы получить нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность нуклеотидов, не менее, чем на 95% идентичную эталонной последовательности нуклеотидов, до 5% нуклеотидов в эталонной последовательности могут быть удалены или заменены другими нуклеотидами, либо нуклеотиды в количестве до 5% от общего числа нуклеотидов в эталонной последовательности могут быть вставлены в эталонную последовательность. Запрашиваемой последовательностью может быть, например, целая последовательность, показанная в SEQ ID NO: 1 или 3, ORF (открытая рамка считывания) или любой фрагмент, определенный как описанный здесь.
На практике, является ли любая конкретная молекула нуклеиновой кислоты или полипептида не менее чем на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности нуклеотидов или полипептиду настоящего изобретения, можно установить конвенциональным путем с использованием известных компьютерных программ. Предпочтительный способ установления лучшего общего совпадения между запрашиваемой последовательностью (эталонной или исходной последовательностью) и исследуемой последовательностью, также известный как глобальное выравнивание последовательностей, может быть выбран при помощи компьютерной программы FASTDB, основанной на алгоритме Brutlag et al. (Comp. Арр. Biosci. (1990) 6:237-245), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. В выравнивании последовательностей как запрашиваемая, так и исследуемая последовательности являются последовательностями ДНК. Последовательность РНК может быть сравнена путем конвертации U в Т. Результат вышеозначенного глобального выравнивания последовательностей дается в процентном соотношении. Предпочтительные параметры, применяемые в выравнивании последовательностей ДНК при помощи FASTDB для вычисления процентного соотношения: Матрица=Единичная, k-кратный=4, Поправочный коэффициент за несогласованием, Поправочный коэффициент за сшивание = 30, Длина группы рандомизации=0, Порог=1, Поправочный коэффициент за гэп = 5, Поправочный коэффициент размера гэпа 0,05, Размер окна = 500 либо длине исследуемой последовательности нуклеотидов, если она короче.
Если исследуемая последовательность короче запрашиваемой последовательности вследствие делеций 5' или 3', но не вследствие внутренних делеций, результаты должны быть откорректированы вручную. Это потому, что программа FASTDB не учитывает усечения 5' и 3' исследуемой последовательности при вычислении процентного соотношения. Для исследуемых последовательностей, усеченных на окончаниях 5' или 3' относительно запрашиваемой последовательности, процентное соотношение корректируется путем вычисления количества оснований в запрашиваемой последовательности, которые являются 5' и 3' в исследуемой последовательности, и которые не совпадают/выровнены, в процентах от общего числа оснований в запрашиваемой последовательности. Совпадает/выровнен ли нуклеотид, определяется по результатам выравнивания последовательностей FASTDB. Этот процент затем вычитается
- 14 037095 из процентного соотношения, вычисленного вышеупомянутой программой FASTDB с использованием установленных параметров, для получения итогового значения процентного соотношения. Это откорректированное значение и используется для целей настоящего изобретения. Только основания, расположенные вне оснований 5' и 3' исследуемой последовательности, согласно показаниям выравнивания FASTD, которые не совпадают/выровнены с запрашиваемой последовательностью, учитываются в целях ручной правки значения процентного соотношения.
Например, исследуемая последовательность из 90 оснований выровнена с запрашиваемой последовательностью из 100 оснований для определения процентного соотношения. Делеции присутствуют на окончании 5' исследуемой последовательности, и следовательно, выравнивание FASTDB не показывает совпадения/выравнивания первых 10 оснований на окончании 5'. Эти 10 непарных оснований представляют собой 10% последовательности (число несовпавших оснований на окончаниях 5' и 3'/общее число оснований в запрашиваемой последовательности), следовательно, 10% вычитаются из значения процентного соотношения, вычисленного программой FASTDB. Если остальные 90 оснований совпадают идеально, итоговое процентное соотношение будет 90%. В другом примере исследуемая последовательность из 90 оснований сравнивается с запрашиваемой последовательностью из 100 оснований. На этот раз делеции являются внутренними делециями, так что отсутствуют основания на 5' или 3' исследуемой последовательности, которые не совпадают/выровнены с запрашиваемой. В таком случае, процентное соотношение, вычисленное FASTDB, вручную не корректируется. Только для оснований 5' и 3' исследуемой последовательности, которые не совпадают/выровнены с запрашиваемой последовательностью, выполняется ручная коррекция. Никакие другие ручные коррекции не требуются для целей настоящего изобретения.
Под полипептидом, содержащим последовательность аминокислот, идентичную запрашиваемой последовательности аминокислот настоящего изобретения не менее чем, например, на 95%, подразумевается, что последовательность аминокислот исследуемого полипептида идентична запрашиваемой последовательности, за тем исключением, что исследуемая последовательность полипептидов может включать до пяти изменений аминокислот на каждые 100 аминокислот запрашиваемой последовательности аминокислот. Другими словами, чтобы получить полипептид, содержащий последовательность аминокислот, не менее чем на 95% идентичную запрашиваемой последовательности аминокислот, до 5% аминокислотных остатков в исследуемой последовательности могут быть вставлены, удалены или заменены другими аминокислотами. Такие изменения в эталонной последовательности могут присутствовать на амино- или карбокси-терминальных позициях эталонной последовательности аминокислот либо где угодно между этими терминальными позициями, поодиночке среди остатков в эталонной последовательности или в виде одной или более слитных групп в пределах эталонной последовательности.
На практике, является ли любой конкретный полипептид не менее чем на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным, например, последовательности аминокислот в SEQ ID NO: 2 (участок фактора IX, участок Fc, по отдельности или вместе) или 4, либо известной полипептидной последовательности фактора IX или Fc, можно установить конвенциональным путем с использованием известных компьютерных программ. Предпочтительный способ установления лучшего общего совпадения между запрашиваемой последовательностью (эталонной или исходной последовательностью) и исследуемой последовательностью, также известный как глобальное выравнивание последовательностей, может быть выбран при помощи компьютерной программы FASTDB, основанной на алгоритме Brutlag et al. (Comp. Арр. Biosci. (1990) 6:237-245), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. В выравнивании последовательностей как запрашиваемая, так и исследуемая последовательности являются последовательностями нуклеотидов, либо как запрашиваемая, так и исследуемая последовательности являются последовательностями аминокислот. Результат вышеозначенного глобального выравнивания последовательностей дается в процентном соотношении. Предпочтительные параметры, применяемые в выравнивании аминокислот при помощи FASTDB для вычисления процентного соотношения: Матрица=РАМ 0, k-кратный=2, Поправочный коэффициент за несогласованием, Поправочный коэффициент за сшивание = 20, Длина группы рандомизации=0, Порог=1, Размер окна=длина последовательности, Поправочный коэффициент за гэп = 5, Поправочный коэффициент размера гэпа 0,05, Размер окна = 500 либо длине исследуемой последовательности нуклеотидов, если она короче. Если исследуемая последовательность короче запрашиваемой последовательности вследствие N- или С-концевых делеций, но не вследствие внутренних делеций, результаты должны быть откорректированы вручную. Это потому, что программа FASTDB не учитывает N- и С-концевые усечения исследуемой последовательности при вычислении итогового процентного соотношения. Для исследуемых последовательностей, усеченных на N- и С-концах относительно запрашиваемой последовательности, процентное соотношение корректируется путем вычисления количества остатков в запрашиваемой последовательности, которые являются N- и С-концевыми в исследуемой последовательности, и которые не совпадают/выровнены с соответствующими исследуемыми остатками, в процентах от общего числа оснований в запрашиваемой последовательности. Совпадает/выровнен ли остаток, определяется по результатам выравнивания последовательностей FASTDB. Этот процент затем вычитается из процентного соотношения, вычисленного вышеупомянутой программой FASTDB с использованием установленных параметров, для получения
- 15 037095 итогового значения процентного соотношения. Это откорректированное значение и используется для целей настоящего изобретения. Только остатки на N- и С-концах исследуемой последовательности, которые не совпадают/выровнены с запрашиваемой последовательностью, учитываются в целях ручной правки значения процентного соотношения. Иными словами, только позиции остатков в запрашиваемой последовательности, расположенные за пределами наиболее удаленных N- и С-терминальных остатков исследуемой последовательности.
Например, исследуемая последовательность из 90 аминокислотных остатков выровнена с запрашиваемой последовательностью из 100 аминокислотных остатков для определения процентного соотношения. Делеции присутствуют на N-конце исследуемой последовательности, и следовательно, выравнивание FASTDB не показывает совпадения/выравнивания первых 10 остатков на N-конце. Эти 10 непарных остатков представляют собой 10% последовательности (число не совпавших остатков на N- и Сконцах/общее число остатков в запрашиваемой последовательности), следовательно, 10% вычитаются из значения процентного соотношения, вычисленного программой FASTDB. Если остальные 90 остатков совпадают идеально, итоговое процентное соотношение будет 90%. В другом примере, исследуемая последовательность из 90 остатков сравнивается с запрашиваемой последовательностью из 100 остатков. На этот раз делеции являются внутренними делециями, так что отсутствуют основания на N- и C-концах исследуемой последовательности, которые не совпадают/выровнены с запрашиваемой. В таком случае, процентное соотношение, вычисленное FASTDB, вручную не корректируется. Только для позиций остатков, расположенных за пределами N- и С-концов исследуемой последовательности, согласно показаниям выравнивания FASTDB, которые не совпадают/выровнены с запрашиваемой последовательностью, выполняется ручная коррекция. Никакие другие ручные коррекции не требуются для целей настоящего изобретения.
Варианты полинуклеотида могут содержать изменения в кодирующих участках, некодирующих участках, или и там, и там. Наиболее предпочтительны варианты полинуклеотида, содержащие изменения, которые производят молчащие замены, вставки или делеции, но не изменяют свойства и активность кодируемого полипептида. Предпочтительны варианты нуклеотида, произведенные посредством молчащей замены вследствие дегенерации генетического кода. Помимо того, предпочтительны варианты, в которых 5-10, 1-5, или 1-2 аминокислоты заменены, удалены или вставлены в любом сочетании. Варианты полинуклеотида могут быть произведены с различными целями, например, для оптимизации экспрессии кодонов в конкретном носителе (заменить кодоны в человеческой иРНК на предпочтительные для бактериального носителя, такого как Е. coli). Природные варианты называются аллельные варианты и относятся к одной из нескольких различных форм гена, занимающих данный локус на хромосоме организма (Genes II, Lewin, В., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). Эти аллельные варианты могут различаться на уровне полинуклеотидов и/или на уровне полипептидов и включаются в настоящее изобретение. Альтернативно, неприродные варианты могут быть произведены при помощи техник мутагенеза или прямым синтезом.
Используя известные способы белковой инженерии и рекомбинантной ДНК-технологии, можно производить варианты с целью улучшить или изменить характеристики полипептидов. Например, одна или более аминокислот могут быть удалены с N-конца или С-конца выделенного белка без значительных потерь в биологической функции. Авторы Ron et al., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки, отмечали, что варианты белка KGF сохраняли гепарин-связывающую активность даже после удаления 3, 8, или 27 аминотерминальных аминокислотных остатков. Подобным же образом, гамма интерферон демонстрировал повышенную до 10 раз активность после удаления 8-10 аминокислотных остатков с карбокси-конца этого белка. (Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.)
Более того, существует достаточное количество данных, которые демонстрируют, что варианты нередко сохраняют биологическую активность, подобную активности природного белка. Например, Gayle и сотрудники (J. Biol. Chem. 268:22105-22111 (1993), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки) провели расширенный мутационный анализ человеческого цитокина IL-1n. Они использовали неспецифический мутагенез для генерации более 3,500 независимых мутантов IL-1a, которые в среднем содержали по 2,5 изменения аминокислот на вариант по всей длине молекулы. Множественные мутации были рассмотрены на каждой из возможных аминокислотных позиций. Исследователи обнаружили, что большая часть молекулы может быть изменена без особого влияния на связывающую или биологическую активность) (См. Abstract.) В действительности, только 23 уникальные последовательности аминокислот из более 3,500 исследованных последовательностей нуклеотидов производили белок, значительно отличавшийся по своей активности от дикого типа. Как указано выше, варианты полипептидов включают модифицированные полипептиды. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гемовой группы, ковалентное присоединение нуклеотида или производной нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производной липида, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, перекрёстное сшивание, циклизацию, формирование дисульфидных связей, демети
- 16 037095 лирование, формирование ковалентных сшивок, формирование цистеина, формирование пироглютамата, формилирование, гамма- карбоксилирование, гликозилирование, формирование гликозилфосфатидилинозитола, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристиолирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование, тРНК-опосредованная вставка аминокислот в белки, как то аргинилирование, и убиквитинирование.
Термин около применяется здесь в значении приблизительно, округленно, примерно или в районе. Когда термин около используется в сочетании с областью числовых значений, он модифицирует эту область путем расширения ее пределов выше и ниже указанных числовых значений. В целом, термин около используется здесь для модификации числового значения на величину в 10%, как вверх, так и вниз (больше или меньше).
Теперь, когда мы описали настоящее изобретение детально, все то же можно полнее уяснить посредством отсылки к нижеследующим примерам, которые включены сюда только в целях иллюстрации и не ограничивают это изобретение. Все приведенные здесь патенты и публикации включены полностью посредством ссылки.
Пример 1.
Исследование, впервые поставленное на человеке, было открытым, с эскалацией дозы, фаза 1/2 исследованием для определения безопасности, переносимости и фармакокинетических (ФК) параметров FIXFc (рекомбинантный гибридный белок человеческого коагуляции фактора IX). FIXFc представляет собой рекомбинантный гибридный белок, содержащий человеческий свертывания фактор IX, соединенный с Fc доменом из человеческого IgG1. Гибридный белок экспрессируется в человеческих эмбриональных почечных клетках (HEK 293). См. пример 3.
FIXFc разработан для контроля и предотвращения геморрагических случаев у пациентов с гемофилией В (врожденный дефицит фактора IX или болезнь Кристмаса), включая контроль и предотвращение кровотечения при хирургических вмешательствах.
FIXFc представляет собой рекомбинантный гибридный белок, содержащий коагуляции фактора IX (FIX) и Fc домена человеческого антитела (IgG1 изотип). Молекула FIXFc представляет собой гетеродимер с одной цепью FIXFc (FIXFc-sc) и одной цепью Fc (Fc-sc), связанными вместе посредством двух дисульфидных связей в петлевом участке Fc. См. фиг. 1 и табл. 2.
rFIXFc лекарственный продукт представляет собой прозрачный бесцветный раствор, предназначенный для внутривенного (ВВ) введения. rFIXFc поставляется как 1000 ME на объем 5 мл в 10 мл ампуле одноразового использования. Лекарственный продукт упаковывается в USP тип I стеклянные ампулы с бромбутиловыми пробками и отрывными простыми алюминиевыми дополнительными укупорочными средствами. rFIXFc лекарственный продукт содержит 200 МЕ/мл в 10 мМ натрий-фосфатном буфере pH 7,0 с добавлением 145 мМ NaCl и 0.1% полисорбата 20. Раствор rFIXFc не следует растворять.
Дизайн исследования. Пациенты общим числом 14, ранее подвергавшиеся лечению, с тяжелой гемофилией В, были включены в исследование и обработаны FIXFc путем внутривенного (ВВ) вливания в течение приблизительно 10 мин. В исследовании оценивалось шесть дозовых уровней, 1; 5; 12,5; 25; 50 и 100 МЕ/кг. Один пациент на дозовый уровень был включен в исследование дозовых уровней 1; 5; 12,5 и 25 МЕ/кг, и по меньшей мере три подлежащих оценке пациента на дозовый уровень были включены в исследование 50 и 100 МЕ/кг. После скрининга (назначенного в течение 14 дней FIXFc дозы) начался период лечения пациентов. Период лечения для каждого дозового уровня включал одну дозу FIXFc (день 1) до завершения 72-часового периода наблюдения безопасности (3 дня) для дозовых уровней 1 и 5 МЕ/кг или до момента взятия последней пробы PK для пациентов в случае дозовых уровней от 12,5 до 100 МЕ/кг (приблизительно 10 дней). Пациенты, обработанные 1; 5; 12,5 или 25 МЕ/кг были включены в исследование и обработаны последовательным образом начиная с 1 МЕ/кг. Пациенты, получившие 50 МЕ/кг, не получали больше лечения в тот же день, и по меньшей мере один день разделял дозирование. После лечения пациентов 50 МЕ/кг, начиналось лечение пациентов 100 МЕ/кг.
Период после лечения был 30-дневным периодом наблюдения за безопасностью, начинавшимся со дня, когда пациент получал дозу FIXFc, и частично совпадавшим с периодом лечения с того момента, когда пациенты подвергались требуемым оценочным исследованиям, таким как взятие проб РК, в течение этого времени. У пациентов, которым были назначены дозовые уровни от 12,5 до 100 МЕ/кг, брались образцы крови для оценки FIX активности и FIXFc концентрации. Образцы крови брались непосредственно перед введением FIXFc; через 15 мин после конца вливания; и на 1, 3, 6, 9, 24, 48, 72, 96, 120, 168 и 240 ч после конца вливания или до того как были достигнуты базовые уровни FIX. Если у пациента продолжали наблюдаться уровни FIX выше базового на 240-часовой временной точке (день 11 исследования), образцы брались на 288 ч (день 13 исследования) и снова на 336 ч (день 15 исследования), если уровень FIX был выше базового на день 13 исследования.
Пациент 10 получил BENEFIX™ лечение кровотечения перед назначенным взятием FIXFc образца на 216 ч после дозирования. Следовательно, FIXFc активность и данные по антигену на 216 ч и на последующих временных точках были исключены из анализа. Не произошло дополнительных отклонений, которые, как считается, повлияли бы на предварительные результаты анализа в этом исследовании.
- 17 037095
Для фактора IX антигена фармакокинетические анализы были проведены на отдельном пациенте, наблюдалась концентрация FIXFc в соответствии с временными данными после ВВ вливания FIXFc. Первичный анализ был проведен с использованием модельзависимой методологии. Данные по концентрации FIXFc были компьютерным образом обработаны для двухкомпартментной открытой модели с элиминацией из центрального компартмента с использованием определенных пользователем оценок первичного параметра для расчета значений исходного параметра. WinNonlin оцененные константы микроскопической степени были выработаны и данные по FIXFc концентрации были оценены по функции 1/(Y-hatxY-hat). Наблюдаемые данные для двух пациентов (например, пациенты 5 и 6) были недостаточно описаны двухкомпартментой моделью. Поэтому для этих двух пациентов был проведен модельнезависимый анализ с использованием WinNonlin некомпарментного анализа BB-вливания модели входа (линейное правило трапеций для AUC расчета). Для некомпарментного анализа полупериод был рассчитан по бета фазе с использованием точек данных, которые описывают терминальное логарифмическилинейное снижение регрессии. Минимум три точки использовались для описания фазы элиминации. Это произошло приблизительно между 4 и 14 днями. Для PK анализа антигена были использованы мг/кг дозовые эквиваленты. Эти значения были определены на основе специфической активности FIXFc 60,2 МЕ/мг. Фактические временные точки взятия проб, дозы и продолжительности вливания были использованы для расчетов. Номинальные временные точки взятия проб и дозы были использованы для создания таблиц и фигур концентрация-время. Представлены индивидуальные и средние PK параметры и описательная статистика. Формальный статистический анализ не был проведен, поскольку дозовый диапазон и число пациентов в каждой когорте были слишком маленькими для предметного анализа.
Для активности фактора IX способ вычитания базового уровня был примерен к активности по сравнению с временным профилем в соответствии с деревом решений вычитания базового уровня (фиг. 4). Значения активности <1% были определены при 1 МЕ/дл для затухания к базовому уровню. Предозовые временные точки считались нулем для целей расчетов. Кроме того, скорректированные по базовому уровню данные активности были округлены по временным точкам, что представляло возвращение к базовым уровням. Фармакокинетический анализ был проведен на FIX-активности с вычетом базового уровня по сравнению с временными точками, полученными после введения FIXFc путем BB вливания. Модель-зависимая оценка была использована для анализа BB-вливания дозовых групп. Данные с вычетом базового уровня были компьютерным образом обработаны для двухкомпартментной открытой модели с элиминацией из центрального компартмента с использованием WinNonlin-определенных границ параметров для расчета значений исходного параметра. WinNonlin оцененные константы микроскопической степени были выработаны, и данные по FIXFc концентрации были оценены по функции 1/ (Y-hatxY-hat). Фактические временные точки взятия проб, дозы и продолжительности вливания были использованы для расчетов. Номинальные временные точки взятия проб и дозы были использованы для создания таблиц и фигур концентрация-время.
Если не имелось фактических данных по ним, активность на 168 ч после дозирования (С168) и время при 1 МЕ/дл выше базового уровня (TBLP1) rFIXFc были получены с использованием WinNonlin произведенных констант микроскопической степени для моделирования уровня активности FIXFc по сравнению с временными данными. Индивидуальные и средние PK параметры и описательная статистика представлены в этом примере. Формальный статистический анализ не был проведен, поскольку дозовый диапазон и число пациентов в каждой когорте были слишком маленькими для предметного анализа. Результаты фармакокинетики FIXFc антигена показали, что концентрации FIXFc в плазме крови резко возрастали после быстрого BB вливания FIXFc, со средними (±SD) Cmax значениями 1670 (n=1), 2730 (n=1), 7510±2480 и 15400±3960 нг/мл для 12,5; 25; 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней, соответственно, и были достигнуты в течение первого получаса для всех пациентов. Все FIXFc-обработанные пациенты имели дозозависимое возрастание системного FIXFc экспонирования в плазме (как оценивалось по Cmax и AUCINF). Хотя и ограниченное одним оцененным пациентом при 12,5 и 25 МЕ/кг номинальной дозе, наблюдаемое увеличение как Cmax, так и AUCINF было достаточно пропорционально дозе в оцененном дозовом диапазоне. (табл. 3 показывает среднюю FIXFc антигена концентрацию для отдельных пациентов и групп в сопоставлении с временными данными; рассортировано по номинальной дозе, фактической дозе, длительности вливания и номеру пациента. Табл. 4 показывает средние FIXFc антигена PK суммарные данные, отдельных пациентов и групповые, рассортированные по номинальной дозе, фактической дозе, мг/кг эквивалентной дозе и номеру пациента, показывает средние FIXFc антигена PK суммарные данные, отдельных пациентов и групповые, рассортированные по номинальной дозе, фактической дозе, мг/кг эквивалентной дозе и номеру пациента, и см. табл. 11.) Концентрации FIXFc в плазме крови снижались по биэкспоненте после короткого BB вливания. Периоды полувыведения как значений распределения (альфа), так и элиминации (бета), по видимости, являлись дозонезависимыми в интервале доз, оцененных по периодам полувыведения альфа и бета у отдельного пациента в интервале от 9,79 до 21,2 ч и от 71,0 до 140 ч, соответственно. Средние периоды полувыведения альфа (±SD) для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней составляли 13,1±4,77 и 12,1±2,33 ч, соответственно. Средние периоды полувыведения бета (±SD) для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней составляли
- 18 037095
110±26,5 и 95,8±11,1 ч, соответственно. Кроме того, были определены первичные значения параметра PK для Cl, VSS, и MRT и, в целом, все, по видимости, являлись дозонезависимыми в интервале получивших оценку доз. Как показано, эта оценка ограничена данными по одному пациенту на 12,5 и 25 МЕ/кг номинальных дозовых уровней (табл. 12 и фиг. 2, 7 и 8.) Кроме того, средние Cl значения составляли 2,28±0,374 и 2,11±0,464 мл/ч/кг для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней, соответственно. Средние VSS значения составляли 259±78,5 и 238±52,2 мл/кг для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней, соответственно. Кроме того, средние MRT значения составляли 112±21,5 и 114±17,1 ч для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней. Результаты для скорректированной по базовому уровню фармакокинетической активности FIXFc показали, что FIXFc активность резко возросла после короткого BB вливания FIXFc, со средними (±SD) модель-прогнозируемыми Cmax значениями 11,9 (n=1), 19,9 (n=1), 41,6±8,97 и 98,2±8,21 МЕ/дл для 12,5, 25, 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней, соответственно, и была достигнута в течение первого получаса для всех пациентов. (В табл. 5 показана средняя скорректированная по базовому уровню FIXFc активность в сопоставлении с временными данными; распределены по номинальной дозе, фактической дозе, продолжительности вливания и номеру пациента. В табл. 6 показаны PK суммарные данные средней FIXFc активности отдельных пациентов и группы; распределены по номинальной дозе, фактической дозе, мг/кг эквивалентной дозе и номеру пациента.)
Все FIXFc-обработанные пациенты имели дозозависимое возрастание FIX активности (по сравнению с базовым ответом перед дозой). Хотя ограниченное тем, что оценивался только один пациент на номинальных дозовых уровнях 12,5 и 25 МЕ/кг, наблюдаемое возрастание как Cmax, так и AUCINF было достаточно пропорционально дозе внутри оцениваемого дозового диапазона. (табл. 6, 9 и 13 и фиг. 3 и 5.)
После окончания вливания снижение скорректированной по базовому уровню FIX активности демонстрировало биэкспоненциальный спад; характеризовалось быстрой фазой распределения (альфа), за которой следовала линейная логарифмическая фаза элиминации (бета). Во время альфа-фазы степень уменьшения FIXFc активности варьировала со значениями полупериода альфа у отдельных пациентов от 0,140 до 16,6 ч. Видимое дозозависимое возрастание средних значений полупериода альфа было сбито у одного пациента при 12,5 и 25 МЕ/кг номинальных дозовых уровнях. Напротив, значения полупериода элиминации (бета), по-видимому, являются дозонезависимыми при дозовом диапазоне со значениями бета полупериода у отдельных пациентов в диапазоне от 42,1 до 67,4 ч при дозовом диапазоне от 25 до 100 МЕ/кг. Хотя получивший оценку и описанный, полупериод элиминации у пациента 1, получившего лечение 12,5 МЕ/кг rFIXFc, не вошел в суммарную оценку из-за того, что уровни FIX у этого пациента детектировались только в течение периода до 96 ч из-за укороченной терминальной фазы и способствовали недооценке терминального полупериода элиминации. Средние периоды полувыведения бета (±SD) для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней составляли 52,1±10,4 и 52,5±10,1 ч, соответственно, и 52,5±9,2 (диапазон 40-67,4) ч для комбинированных 25, 50 и 100 МЕ/кг номинальных доз. (табл. 6, 8 и 13).
Кроме того, были определены первичные значения параметра PK для Cl, V1, VSS и MRT и, в целом, все, по-видимому, были дозонезависимыми в оцененном диапазоне доз.
Кроме того, средние значения Cl составляли 3,77±1,12 и 2,89±0,615 мл/ч/кг для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней, соответственно, и 3,36±0,928 мл/ч/кг для комбинированных 25, 50 и 100 МЕ/кг номинальных доз. (табл. 6, 8 и 13.)
Средние значения VSS составляли 264±77,6 и 179±31,1 мл/кг для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней, соответственно, и 226±69,8 мл/кг для комбинированных 25, 50, и 100 МЕ/кг номинальных доз. (табл. 6, 8 и 13). Кроме того, средние значения MRT составляли 71,7±13,0 и 62,8±8,82 ч для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней, соответственно, и 68,05 ± 11,16 ч для комбинированных 25, 50 и 100 МЕ/кг номинальных доз. (табл. 6, 8 и 13.) В дополнение к первичным PK параметрам, вторичные PK параметры (например, С168, K-значения, IVR и т.д.) были определены для оценки FIXFc продолжительности эффекта. Как ожидалось, наблюдалось дозозависимое возрастание С168, TBLP1, TBLP3 и TBLP5 значений. Напротив, K-значения и IVR значения, по видимости, были дозонезависимыми в оцененном диапазоне доз. В полном дозовом диапазоне модель-прогнозируемые и наблюдаемые K-значения отдельных пациентов находились в диапазоне от 0,61 до 1,02 и от 0,62 до 1,17 МЕ/дл на МЕ/кг, соответственно. Средние модель-прогнозируемые K-значения для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней составляли 0,76 и 0,90 МЕ/дл на МЕ/кг, соответственно, и 0,821±0,1387 (диапазон 0,61-1,02) МЕ/дл на 1 МЕ/кг для комбинированных 25, 50 и 100 МЕ/кг номинальных доз. Средние модель-прогнозируемые IVR значения для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней составляли 34,5 и 35,1%, соответственно. Средние наблюдаемые K-значения для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней составляли 0,86 и 1,02 МЕ/дл на МЕ/кг, соответственно, и 0,926±0,1787 (диапазон 0,97-1,17) МЕ/дл на 1 МЕ/кг для комбинированных 25, 50 и 100 МЕ/кг номинальных доз. Средние наблюдаемые IVR значения для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней составляли 39,2 и 39,8%, соответственно. (табл. 6, 7, 8 и 13.) Табл. 7А-7В шоу7 показывает вторичные PK суммарные данные активности FIXFc у отдельных пациентов и групповое среднее; сортировано по номинальной дозе, фактической дозе и номеру пациента.
- 19 037095
Каждый 1 МЕ/кг влитого rFIXFc повышал активность FIX в плазме крови на 0,93±0,18 МЕ/дл в среднем, и это увеличение концентрации (K значение) показывало слабую положительную корреляцию с весом тела (R2=0,336, p=0,048) (фиг. 23). Фармакокинетические оценки FIXFc активности согласовывались с оценками rFIXFc антигена (например, сравните табл. 13 и 14). Кроме того, наблюдалась превосходная корреляция между активностью rFIXFc и уровнями антигена, показывающая сохранение активности rFIXFc in vivo. (фиг. 9.) Кроме того, по сравнению с накопленными данными по BENEFIX™ (Wyeth), rFIXFc демонстрировал (табл. 8) следующее:
дозовая линейность от 25-100 МЕ/кг;
3-кратное возрастание t1/2beta;
3-кратное возрастание среднего времени удержания;
24% повышенное увеличение концентрации;
в 2,5 раза пониженный клиренс.
FIXFc представляет собой рекомбинантный гибридный белок, состоящий из FIX, прикрепленного к Fc домену человеческого IgG1. FIXFc разработан как версия FIX с продленным действием. Доклинические исследования с FIXFc показали удлинение периода полувыведения активности FIX по сравнению с BENEFIX™, имеющимся в продаже рекомбинантным FIX продуктом. Обоснованием для этого исследования была оценка безопасности и PK FIXFc у пациентов с тяжелой гемофилией В. Для этого исследования 12 подлежащих оценке пациентов в возрасте от 18 до 76 лет подходили для оценки РК. Каждый пациент получил одно введение FIXFc в номинальной дозе 12,5, 25, 50 или 100 МЕ/кг веса тела путем внутривенного вливания в течение примерно 10 мин. Образцы плазмы крови для оценки PK как на активность FIXFc, так и на концентрации антигена, наблюдались перед вливанием, а также на протяжении периода времени до 14 дней после дозировки. PK как FIXFc антигена, так и активности были независимо охарактеризованы в этом исследовании с использованием модельзависимых и модельнезависимых способов.
FIXFc хорошо переносился после введения единичных BB доз 12,5; 25; 50 и 100 МЕ/кг веса тела. В этом исследовании не было доказательств серьезных лекарственно зависимых побочных эффектов. Ни у одного пациента не определялись нейтрализующие или связывающие антитела к rFIXFc. Аппроксимированное дозопропорциональное возрастание Cmax и AUCINF наблюдалось как для FIXFc антигена, так и для активности после введения доз от 12,5 до 100 МЕ/кг, но V и Cl были одинаковыми при всех дозах. Эти результаты показывают, что FIXFc антиген и активность демонстрировали линейный PK на протяжении оцененного дозового диапазона. Сравнительно маленькие значения V параметра могут показывать, что FIXFc входит во внутритканевую жидкость, но не проникает через клеточную мембрану во внутриклеточные жидкости. Пиковые концентрации в плазме крови FIXFc антигена и активности наблюдались в течение 0,5 ч после окончания вливания и оставались детектируемыми в течение нескольких дней после дозирования. Свидетельства сниженного клиренса и пролонгированного периода полувыведения наблюдались как для FIXFc антигена, так и для активности.
Средний клиренс и конечные значения полупериода элиминации, связанные с концентрациями FIXFc антигена в дозовых уровнях 50 и 100 МЕ/кг, составляли 2,28 и 2,11 мл/ч/кг и 110 и 95,8 ч, соответственно. Подобным образом, средний клиренс и конечные значения полупериода элиминации, связанные с уровнями активности FIXFc в том же дозовом диапазоне, составляли 3,77 и 2,89 мл/ч/кг и 52,1 и 52,5 ч, соответственно. Сравнение PK результатов FIXFc активности, наблюдаемых в настоящем исследовании, с сообщенными PK для BENEFIX™ активности (Summary of Product Characteristics of BENEFIX™; 18 ноября, 2009) показало приблизительно 3-кратное уменьшение FIXFc клиренса и приблизительно 3кратное увеличение как FIXFc полупериода конечной элиминации, так и среднего времени нахождения в организме по сравнению с BENEFIX™. С наблюдаемыми улучшениями PK, FIXFc предоставит пролонгированную защиту от кровотечений, позволяя снизить частоту инъекций индивидуумам с Гемофилией В. Основываясь на результатах этого иследования, rFIXFc может дозироваться каждые две недели или дважды в месяц с использованием доз 100 МЕ/кг и по меньшей мере раз в неделю с использованием более низких доз. Такой режим требует более редких инъекций. Кроме того, использование rFIXFc будет иметь другие потенциальные клинические влияния, такие как: доступ к центральным венам; улучшенную схему приема лекарства; снижение повреждений из-за кровотечений; и повышенную защиту суставов от кровотечений.
Пример 2. B-протяженная фаза 1/2/3 исследования.
Это будет открытое, мультицентровое исследование безопасности, фармакокинетики и эффективности рекомбинантного, долгодействующего коагулянта фактора IX Fc гибрида (rFIXFc) в профилактике и лечении кровотечения у ранее подвергавшихся лечению пациентов с тяжелой гемофилией В. Лечение FIX продуктами, имеющимися в настоящее время в продаже, требует дозировки 2-3 раза в неделю. Продукт с продотированным периодом полувыведения, у которого требуемый интервал дозирования продлен до одного раза в неделю или более, медицинское сообщество сочло бы значимым улучшением в лечении пациентов с тяжелой гемофилией.
Дозовые уровни широко варьируют в клинических профилактических исследованиях rFIX продук
- 20 037095 тов: сообщаемые дозы варьируют от 10 до 171 МЕ/кг (Roth et al., Blood 98:3600 (2001)) или от 40 до 100 МЕ/кг (MASAC Recommendation 177, National Hemophilia Foundation (Oct. 2006)). Кроме того, минимальные уровни FIX активности во время профилактического лечения у пациентов без клиничеких признаков кровотечения прогнозируются в диапазоне между 0,2 и 3,8 МЕ/дл (Carlsson et al., Hemophilia 4:83 (1998)). Принимая во внимание индивидуальную вариабельность у пациента, индивидуализированные дозовые режимы на основании клинического статуса пациента являются общепринятой практикой. Результаты фазы 1/2а исследования (пример 1), оценивающей безопасность и фармакокинетику однократной дозы замороженной липидной лекарственной формы rFIXFc продемонстрировали, что лекарство хорошо переносимо в дозах в диапазоне от 1 до 100 МЕ/кг и характеризация PK подверждает несколько преимуществ по сравнению с доступными в настоящее время способами лечения, а именно период полувыведения и MRT в 3 раза длиннее, чем те, о которых ранее сообщалось для BENEFIX™ (61 ч по сравнению с 19 часами). Целью этого исследования было определить параметр PK дальнейшей оценки лиофилизированного rFIXFc у людей, сравнить его с BENEFIX™ PK параметром оценок у людей, и продемонстрировать эффективность лиофилизированного rFIXFc для предотвращения и лечения кровотечения и безопасности его повторяющегося дозирования у предварительно подвергавшихся лечению пациентов с тяжелой гемофилией В.
В исследование вошло четыре группы: низкодозовый профилактический режим лечения (n=25), высокодозовый профилактический режим лечения (n=25), режим лечения по необходимости (n=20) и режим лечения при серьезных хирургических вмешательствах (n=5). Группа низкодозового режима включила PK подгруппу (n=16), получившую дозу BENEFIX™, после чего последовало лечение rFIXFc. Первостепенные цели исследования следующие: оценить безопасность и переносимость rFIXFc во всех лечебных группах; оценить эффективность rFIXFc во всех лечебных группах; и оценить эффективность профилактики при терапии по необходимости (сравнение годового числа эпизодов кровотечения между группами 1 и 2 по отношению к режиму по требованию группы 3).
Второстепенные цели исследования следующие: сравнить оценки параметра PK у rFIXFc и BENEFIX™; оценить эффективность rFIXFc в группе лечения по необходимости и хирургической группе; оценить и сравнить оценки параметра PK у rFIXFc базовые и на Неделе 26 (± 1 неделя) в подгруппе PK; оценить реакцию пациентов на лечение во всех группах; и оценить потребление rFIXFc во всех группах.
Основные критерии включения:
Мужской пол, 12 лет и старше, вес по меньшей мере 40 кг.
Диагностирована гемофилия В (базовый уровень фактора IX менее чем или эквивалентен 2%).
В анамнезе по меньшей мере 100 дней воздействия любым продуктом с фактором IX.
Число тромбоцитов >100000 клеток/мкл.
INR (международное нормализованное соотношение) <1,40 как определено по тестируемому лабораторному нормальному диапазону.
CD4 число >200 клеток/мкл.
Основные критерии исключения:
Ингибиторы фактора IX в анамнезе.
Дисфункция почек или печени.
Диагностирован другой дефект коагуляции, отличный от гемофилии В.
В анамнезе были случаи анафилаксии, связанной с каким-либо BB ведением FIX или иммуноглобулина.
Прием системных иммуносупрессорных лекарств (например, системные кортикостероиды; однако, HAART (высокоактивная антиретровирусная терапия) разрешена).
Пример 3. FIXFc производство в HEK293 клетках.
FIXFc был произведен в стабильно трансфицированных HEK293 клетках, содержащих экспрессионную кассету для FIXFc (нативный FIX, соединенный прямо с Fc участком) и экспрессионную кассету для одного Fc. В клетки также была трансфицирована экспрессионная кассета PC5, которая представляет собой процессирующийся энзим, который дает возможность полному процессингу FIX пропептида. Трансфицированные клетки росли в бессывороточной суспензионной среде, содержащей витамин K, и они секретировали три белка: FIXFc димер, FIXFc мономер (одна цепь FIXFc и одна цепь Fc), и Fc димер. FIXFc мономер (FIXFc) был очищен путем колоночной хроматографии (Белок А, Фрактогель DEAE, и Q Сефароза псевдоаффинное элюирование с низкой ионной силой CaCl2), и вирус был инактивирован и профильтрован для введения пациентам, являющимся людьми. Также см. Peters et al., Blood. 2010 Mar 11;115(10):2057-64 (Epub 2010 Jan 7); и Патент США No. 7566565; каждый из которых включен в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.
Коагулирующая активность FIXFc была оценена путем подсчета его способности восстанавливать активность свертывания дефицитной по FIX плазмы крови с использованием MLA Electra 1600C (Medical Laboratory Automation/Instrument Labs, Pleasantville, NY). Результаты сравнивались с калибровочной кривой, сгенерированной с использованием серийных разведений FIX стандарта Всемирной Организации Здравоохранения.
- 21 037095
Предполагают, что фосфорилирование серина и сульфатация тирозина фактора IX важны для возрастания концентрации in vivo. Сообщалось, что MONONINE™ (очищенный из плазмы фактор IX (pdFIX), продающийся CSL Berhing) обладает лучшим возрастанием концентрации in vivo, чем BENEFIX™ (рекомбинантный FIX (rFIX), продающийся Wyeth) из-за более высокого уровня фосфорилирования/сульфатации MONONINE™ (>90%/>90% в сравнении с <10%/5%). Однако FIXFc, вырабатываемый в HEK293 клетках, почти не имеет фосфорилирования/сульфатации (<10%/4%, что очень сходно с BENEFIX™), и показывает лучший IVR (1.0 МЕ/дл на МЕ/кг), чем BENEFIX™ (0,7). Кроме того, FIXFc, произведенный, как описано выше, имел значительно более низкий (в 10-100 раз) уровень (0,01-0,001%) активированного FIX (FIXa), связанной с продуктом примеси, чем MONONINE™ (pdFIX) или BENEFIX™ (rFIX) (0,1%). Получившийся в результате FIXFc будет реже давать нежелательные случаи тромбообразования после введения, чем MONONINE™ или BENEFIX™.
Пример 4. Педиатрические исследования: экстраполяция и взаимосвязь между разработкой у взрослой и педиатрической выборок.
Характеристики пациентов, которые показывают взаимосвязь с FIX фармакокинетикой, включают возраст-зависимые физиологические изменения (Bjorkman and Berntorp, Clin. Pharmacokinetics 40:815-32 (2001); and Bjorkman, Hemophilia 9(suppl 1): 101-10 (2003)) и размер и сложение тела (Shapiro, Hemophilia 11:571-82 (2005)). Таким образом, обычно обнаруживалось, что приведенный в соответствие с весом клиренс (CL) FIX уменьшается с возрастом и и/или весом тела во время роста от младенческого периода к взрослому состоянию, с соответствующим повышением терминального полупериода (t1/2). Для rFIX продукта (BENEFIX™) CL и объем распределения в стационарной фазе (VSS) возрастают у детей и затем остаются постоянными во взрослом состоянии; таким образом, эти параметры будут тщательно мониториться в педиатрических исследованиях.
Пиковые уровни FIX прокоагулянтной активности (FIX:C) зависят от первичного объема распределения FIX:C после однократных и/или повторных доз FIX. Первоначальное распределение FIX быстрое. Однако показано, что in vivo возрастание концентрации (среднее нарастающее возрастание концентрации) для BENEFIX™ было обычно на 30% ниже, чем у фактора коагуляции, полученного из плазмы и очищенного моноклональным антителом (pdFIX) (Roth et al., Blood 98:3600-3606 (2001)). Кроме того, исследования с pdFIX показали, что пациенты в возрасте 15 лет и моложе имеют значительно более низкое возрастание концентрации, чем пациенты более старшего возраста (White et al., Thromb. Haemost. 73:779-84 (1995)). Поэтому в педиатрических исследованиях будет также проводиться мониторинг минимальных и пиковых уровней.
Поскольку исследования показали, что дети могут реагировать по-другому по сравнению со взрослыми, фармакокинетические оценки при базовом уровне 50 МЕ/кг rFIXFc будут проведены на детях с сокращенным фармакокинетическим взятием проб.
Фаза 1/2а исследования (SYN-FIXFc-07-001), оценивающая безопасность и фармакокинетический профиль однократного внутривенного введения rFIXFc в PTPs в возрасте 18 лет и старше с серьезной гемофилией В, была завершена недавно. Предварительные результаты этого первичного исследования на людях демонстрируют приблизительно 3-кратное повышение фармакокинетических параметров (средний терминальный полупериод, MRT и AUC) rFIXFc в сравнении с тем, что сообщалось в литературе для BENEFIX™ (см. выше). Кроме того, rFIXFc хорошо переносился и не было признаков реакций в месте инъекции, а также не вырабатывались ингибиторы. Взятые вместе, эти результаты по безопасности и фармакокинетике говорят в пользу начала фазы 1/2/3 регистрационного исследования (998НВ102 Исследование (B-LONG), см. выше), оценивающего безопасность, фармакокинетику и эффективность rFIXFc в предотвращении и лечении кровотечения у 104 PTPs (с по меньшей мере 100 лечебных EDs предыдущих продуктов) 12 лет и старше с тяжелой гемофилией В (<2%). Когда достаточное количество данных по безопасности будет доступно после регистрационного исследования, будет начата педиатрическая программа для дальнейшего исследования безопасности и эффективности rFIXFc у детей. Демонстрация прологнированного полупериода rFIX у взрослых будет означать, что для профилактики и лечения кровотечений у индивидуумов с гемофилией В будут требоваться более редкие инъекции.
Фаза 2/3. Педиатрическое PTPs исследование ранее подвергавшихся лечению детей (возраст < 12 лет).
Когда будут доступны даныне по 10 PTPs (>12 лет) для 26 EDs из регистрационного исследования (Исследование 998НВ 102), будет начато Педиатрическое Исследование, фаза 3. Эта фаза 2/3 педиатрического исследования, относительно PTPs, которые имели по меньшей мере 50 EDs к FIX продуктам до включения в исследование, будет проведена глобально примерно по 25 клиническим сайтам. Приблизительно 25 PTPs (для того чтобы гарантировать 20 подходящих для оценки пациентов), в возрасте 2-11 лет с тяжелой гемофилией В (<2 МЕ/дл [<2%] эндогенный FIX), будут скринированы и отобраны в соответствии с определенными заранее критериями. Все получившие оценку пациенты войдут в фармакокинетическую часть исследования (РК с предисследуемым FIX продуктом и затем PK с rFIXFc) и будут получать еженедельно дозу rFIXFc на протяжении 52 недель. В этом исследовании будет фиксироваться постепенное повышение концентрации, период полувыведения in vivo, AUC, и клиренс rFIXFc. Все паци- 22 037095 енты подвергнутся фармакокинетической оценке базового уровня с FIX и rFIXFc перед исследованием, и продолжительность исследования для каждого пациента будет приблизительно составлять 69 недель, включая скрининг и последующее наблюдение.
Каждый пациент получит 50 МЕ/кг rFIXFc при первом визите для фармакокинетической оценки, после чего последуют повторяющиеся еженедельные дозы 50-60 МЕ/кг rFIXFc. С учетом соблюдения режима пациентом, фармакокинетические пробы для пред-исследования продукта и для rFIXFc будут браться по сокращенной программе, а именно: перед дозой, конец инъекции, 30+10 мин, 3±1 ч, 24±3 (день 1), 72±3 (день 3), 120±3 (день 5) и 168±3 ч (день 7) после окончания инъекции. Для того чтобы исследовать иммуногенность, все пациенты получат rFIXFc еженедельно минимум 50 EDs. Параметры безопасности будут включены для немедленной оценки безопасности и переносимости, такие как: (а) основные показатели состояния организма (пульс, давление крови, частота дыхания, температура) перед инъекцией rFIXFc и через 30 мин после инъекции; (b) параметры гематологии и коагуляции; (с) клиническая химия; (d) частые определения FIX ингибитора с использованием модифицированного по Неймегену Бетезда-анализа (непосредственно перед первым воздействием, ED4 [Неделя 4], ED12, ED24, ED36 и ED50); и (е) нежелательные явления.
Эффективность будет оцениваться по оценке числа эпизодов кровотечения, интервалов между кровотечениями и числу лечений и потребления FIX в оцениваемый год и на случай, требующий лечения.
Фаза 2/3 Педиатрическое PUPs исследование ранее не получавших лечение детей (возраст 0-11 лет)
Когда данные по 10 ранее получившим лечение детям (2-11 лет) с полной фармакокинетикой и 50 EDs будут доступны в предшествующем исследовании, будет начата фаза 2/3 педиатрического PUPs исследования. Это исследование будет проведено глобально примерно на 60 клинических сайтах. До 30 PUPs (для обеспечения 20 пригодных для оценки пациентов) в возрасте 0 лет и старше с серьезной гемофилией В (<2 МЕ/дл [<2%] эндогенный FIX) будут скринированы и отобраны в соответствии с предварительно определенными критериями. Участие в исследовании будет варьировать, поскольку при начале лечения может использоваться rFIXFc как модифицированный профилактический режим. Ожидается, что участие пациента в исследовании будет продолжаться примерно четыре года, включая скрининг и наблюдение за отдаленными результатами. Ожидается, что в течение этого времени большинство пациентов достигнут 50 EDs до rFIXFc. Для того чтобы исследовать иммуногенность, все пациенты будут подвергнуты лечению приблизительно 50 EDs rFIXFc или в течение периода времени до 4 лет. Параметры безопасности будут включены для немедленной оценки безопасности и переносимости: (a) частые определения FIX ингибитора с использованием модифицированного по Неймегену Бетезда-анализа; и (b) нежелательные явления.
Эффективность будет оцениваться по оценке числа эпизодов кровотечения, интервалов между кровотечениями и числа лечений и потребления FIX на анализируемый год и на случай, требующий лечения.
Пример 5. Биохимическая характеристика, активность и анализ PK у животных, не являющихся человеком rFIXFc, произведенный в примере 3, был охарактеризован по своей посттрансляционной модификации, и были получены следующие результаты (см. табл. 15 и фиг. 11). Пропептид rFIXFc был должным образом процессирован во время производства. Паттерн rFIXFc's гамма-карбоксилирования был подобен паттерну rFIX. Кроме того, общее Gla/молекула (11,2±0,7) rFIXFc было сравнимо с rFIX. Поскольку гамма-карбоксилирование определенных остатков необходимо для активности FIX, эти результаты являются важными. Кроме того, Ser 158 фосфорилирование и Tyr 155 сульфатирование rFIXFc были сравнимы с rFIX. N-связанные гликаны в FIX не полностью сиалированны, так же как у rFIX. rFIXFc О-связанное гликозилирование первого EGF домена было таким же, как у FIX, хотя и в различных сравнительных соотношениях. Asp 64 из rFIXFc имел более высокую степень бета-гидроксилирования, чем rFIX или полученный из плазмы FIX (pdFIX). Активированный FIX присутствовал в намного более низкой концентрации в препарате rFIXFc, чем в rFIX или pdFIX препаратах, как описано детально в примере 3.
Кроме того, rFIXFc был введен различным видам животных для определения его активности и параметров РК. Результаты показаны в табл. 16 и на фиг. 12-16.
Пример 6. Гамма-карбоксилирование.
Целями этого исследования было проанализировать и охарактеризовать γ-карбоксилирование глутаминовых кислот (Gla) в доклинической партии FIXFc материала и имеющихся в продаже FIX продуктах, охарактеризовать содержание Gla в обогащенной пиковой фракции и высокосолевого элюирования стрип фракции, первоначально полученной на этапе псевдоаффинной ион-обменной хроматографии, и в дальнейшем разделить на обогащенную пиковую и на высокосолевого элюирования стрип фракцию путем анион-обменной ВЭЖХ, а затем охарактеризовать различные образцы.
Для достижения этих целей, было разработано множество дополнительных аналитических способов. Они включают аминокислотный анализ (ААА) с использованием щелочного гидролиза для определения (общего) содержания Gla, пептидную карту (LC/MS) с использованием Lys-C пептидов для определения распределения Gla, аналитическую анионобменную ВЭЖХ интактных молекул для разделения
- 23 037095 изоформ, и активированное частичное тромбопластиновое время (аРТТ) для определения биологической активности. Два Gla (E) содержащих пептида представляют собой:
-KI К2: YNSGKL7E8EFVQGNL15ER17ECM20E21EK • [М+Н]+6 Gla = 2953,9 • [М+Н]+5 Gla = 2909,9
-КЗ: CSF26E27EAR30EVF33ENT36ERTT40EFWK • [М+Н]+6 Gla = 2959,9 • [М+Н]+5 Gla = 2915,9 • [М+Н]+4 Gla = 2871,9
Тридцать микрограмм образца (полученного из обогащенной пиковой фракции, высокосолевой стрип-фракции, и каждый образец из аналитической анионобменной ВЭЖХ) был денатурирован, восстановлен, алкилирован и обработан Lys-C (1:20, E:S). Реакция была остановлена 2% TFA, и обработанный продукт был введен в Jupiter C18 (2,0x250 мм) Phenomenex колонку. Разделение было осуществлено Agilent 1100 системой. Колонка была установлена на 25°С и пептиды были элюированы по многоступенчатому ацетоннитриловому градиенту. Масс-спектрометрия (Thermo-Fisher LCQ) была проведена по Triple Play способу. Для анализа и характеристики содержания Gla и распределения доклинического rFIXFc материала были разработаны дополнительные способы. γ-карбоксилирование доли глутаминовых кислот (Gla) и распределение доклинической партии rFIXFc (обогащенная пиковая фракция) было проведено и сравнено с имеющимися в продаже продуктами. Анализ продемонстрировал такое же содержание и распределение Gla, как и у имеющихся в продаже продуктов. Высокосолевого элюирования стрип фракция была проанализирована и сравнена с обогащенной пиковой фракцией. Анализ показал пониженный уровень γ-карбоксилирования.
FIXFc (Обогащенная Пиковая Фракция) была выделена на ион-обменном этапе псевдоаффинной хроматографии и затем разделена на 3 изоформы путем аналитической анионобменной ВЭЖХ. Загруженные в АЕХ колонку и разделенные образцы были высоко у-карбоксилированы. (Загрузка АЕХ колонки представляет собой стрип фракцию, собранную во время этапа высокосолевого элюирования из этапа псевдоаффинной ион-обменной хроматографии.) Загруженные в АЕХ колонку и разделенные образцы были биологически активными. Содержание и распределение Gla было подобно rFIX. Пептидная карта показала распределение 4/5/6 Gla's у K3 пептида. Пептидная карта показывает высокое количество 6 Gla's в K1K2 пептиде и следовые количества 5 Gla's.
FIXFc (Стрип Пиковая Фракция) была выделена на ионобменном этапе псевдоаффинной хроматографии и затем разделена на 2 изоформы путем аналитической анионобменной ВЭЖХ. Загруженные в АЕХ колонку и разделенные образцы имели сниженный уровень у-карбоксилирования. Наблюдалось уменьшенное содержание Gla по сравнению с обогащенной FIXFc пиковой фракцией. Наблюдался пониженный уровень биологической активности. Пептидная карта показывает повышенное количество 5 Gla's в K1K2 по сравнению с обогащенной пиковой фракцией, что может подтверждать влияние биологической активности.
Ссылки (каждая из которых включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки): Dumont JA, et al., Monomeric Fc Fusion Molecules in Therapeutic Abs-From Bench to Clinic, Ch. 33 p779795; Gillis S, et al., Protein Science (1997) 6:185; White GC, et al., J. Thrombosis and Haemostasis (1997) 78:261; Hansson K, and Stenflo J, Journal Thrombosis and Haemostasis (2005) 3:2633; and Peters RT, et al., Blood (2010) 115:2057.
Пример 7. Оценка rFIXFc про-коагулянтной активности в моделях кровотечений у HemB мышей.
Сравнительный потенциал rFIXFc и BENEFIX™ был продемонстрирован у HemB мышей по анализу цельной крови ROTEM in vitro и у HemB мышей модели кровотечения при отсечении хвоста in vivo.
Способность rFIXFc формировать прочные и стабильные сгустки была оценена по Ротационной Тромбоэластометрии (ROTEM®, Pentapharm GmbH, Munich, Germany) с хлоридом кальция как активатором (NATEM). Совокупная цельная кровь, собранная из полой вены HemB мышей, была разделена на семь аликвот, в которые был впрыснут rFIXFc до конечной концентрации 7,4%, 0,74% и 0,074% нормальной плазматической FIX активности, или BENEFIX™ до 10%, 1%, 0,1% от нормы. В качестве негативного контроля, в пробу крови был впрыснут буфер FIX состава. Пулы общим числом 10 от 5 HemB мышей были созданы для завершения исследования. Реакция NATEM была инициирована добавлением CaCl2. Исследовались параметры коагуляции, включая Время Свертывания (СТ), Время Формирования Сгустков (CFT) и Альфа Угол. Среднее и SD от СТ, CFT и альфа угол суммированы в табл. 17. Дозовые ответы для трех параметров нанесены на график на фиг. 17. Все три параметра сравнивались между rFIXFc и BENEFIX™ в тестируемом дозовом диапазоне (р>0,05 по однофакторному ANOVA (КрускалУоллис) анализу).
Эффективность в неотложном случае rFIXFc была также оценена в модели кровотечения при отсе- 24 037095 чении хвоста у HemB мышей. (фиг. 18.) Самцы HemB мышей были стратифицированы для эквивалентной презентации веса тела и возраста в различных экспериментальных группах. Перед отсечением хвоста мыши были анестезированы смесью 50 мг/кг Кетамина и 0,5 мг/кг Дексмедетомидина и помещены на подогреваемую подушку для подержания температуры тела. Хвосты мышей были затем погружены в 37°С воду на 10 мин для расширения латеральной вены. После расширения латеральной вены rFIXFc, BENEFIX™ или раствор-наполнитель были введены путем инъекции в хвостовую вену и через 5 мин дистальные 4 мм хвоста были отсечены с использованием #11 скальпеля с прямым лезвием. Изливавшаяся кровь собиралась в 13 мл теплого солевого раствора в течение 30 мин и потеря крови была подсчитана гравиметрически. Тестировались шесть rFIXFc экспериментальных групп (720, 360, 240, 120, 80, 40 МЕ/кг, n=15) и три BENEFIX™ экспериментальные группы (360, 120, 40 МЕ/кг, n=15). Объем потери крови отдельного животного и кривая дозового ответа медианной потери крови показаны на фиг. 19(А), и медианный объем потери крови каждой экспериментальной группы суммирован в табл. 18. Дозовые ответы по медианному объему потери крови для rFIXFc и BENEFIX™ сравнимы (p = 0,9315 по непарному t критерию с коррекцией Уэлча).
Для определения того, является ли трехкратное увеличение продолжительности периода полувыведения rFIXFc по сравнению с BENEFIX™ результатом пролонгированной эффективности rFIXFc, изобретатели настоящего изобретения оценили эффективность rFIXFc и BENEFIX™ как в ex-vivo ROTEM® анализе, так и в модели кровотечения при рассечении хвостовой вены (TVT) у HemB мышей. фиг. 20.
Для ex vivo ROTEM®, самцы HemB мышей получили 50 МЕ/кг rFIXFc или 100 МЕ/кг BENEFIX™ путем внутривенной инъекции. Цельная кровь была собрана из полой вены обработанных животных на 5 мин, 24, 72, 96, 120, 168 и 216 ч после rFIXFc дозирования (n=8 мышей на каждую временную точку) или на 5 мин, 24, 48, 72 и 96 ч после BENEFIX™ дозирования (n=4 мыши/временная точка). Пробы крови анализировались с помощью NATEM. Среднее и SD для СТ, CFT и альфа угол показаны в табл. 19, и СТ, CFT и альфа угол по сравнению с временными кривыми показаны на фиг. 21. В сравнении с BENEFIX™, rFIXFc показал сравнимый СТ, CFT и альфа угол на 5 мин, но достоверно повышенный СТ, CFT и альфа угол после 72 ч несмотря на дозу в 2 раза ниже по сравнению с BENEFIX™.
Для оценки профилактической эффективности rFIXFc и BENEFIX™, самцы HemB мышей были стратифицированы для эквивалентной репрезентации веса тела и возраста в 9 различных опытных группах. rFIXFc был введен путем вв инъекции в дозе 4 МЕ/кг, 13 МЕ/кг, 40 МЕ/кг и 120 МЕ/кг на 72 ч перед рассечением хвостовой вены, тогда как те же дозы BENEFIX™ были введены на 24 ч перед травмой. Перед рассечением хвостовой вены мыши были анестезированы смесью 50 мг/кг Кетамин/0,125 мг/кг Дексмедетомидин/ 0,1 мг/кг Бупренекс. Для того чтобы дать возможность мышам поддерживать нормальную активность после рассечения хвостовой вены, 1 мг/кг раствора Атипамезола было дано для того чтобы обратить действие Дексмедетомидина, за чем немедленно последовало рассечение латеральной хвостовой вены хирургическим скальпелем номер 11 с плоским лезвием в области, где диаметр хвоста приблизительно равняется 3 мм. Льющаяся кровь смывалась теплым солевым раствором для обеспечения четкой видимости раны, и мышь была затем помещена отдельно в чистую клетку с белой бумажной подкладкой на следующие 24 ч. Остановка кровотечения и физическая активность наблюдались и фиксировались ежечасно в течении периода времени до 12 ч после травмы. Умирающие мыши были немедленно подвергнуты эфтаназии после идентификации, и полный осмотр для завершения исследования был проведен через 24 ч после травмы. Кривая Каплана-Мейера для времени эвтаназии и карта степеней выживаемости через 24 ч после TVT показаны на фиг. 22. Логарифмический ранговый критерий определил, что все экспериментальные группы с дозой выше чем 4 МЕ/кг достоверно лучше, чем группа, обработанная раствором-наполнителем (р<0,001). Кроме того, выживаемость сравнивалась между мышами, которые получили одинаковую дозу rFIXFc на 72 ч перед травмой и BENEFIX™ на 24 ч перед травмой (р=0,4886; 0,9268; 0,7279 и 0,5209 для 4, 13, 40 и 120 МЕ/кг дозовых групп соответственно). Степени выживаемости на 24 ч после TVT были нанесены на график и ED50 значение для каждой молекулы было экстраполировано из кривой, ED50 для двух обработок одинаковы при 17,8 МЕ/кг для rFIXFc и 15,4 МЕ/кг для rFIX. Следовательно, rFIXFc предоставлял в 3 раза большую продолжительность защиты у HemB мышей по сравнению со сравнимой дозой BENEFIX™, как оценивалось по выживаемости и повторному кровотечению после травмы рассечения хвостовой вены. Следовательно, rFIXFc предоставлял в 3 раза большую продолжительность защиты у HemB мышей по сравнению со сравнимой дозой BENEFIX™, как оценивалось по выживаемости и повторному кровотечению после травмы рассечения хвостовой вены.
В заключение, как показывают данные, несмотря на то, что 15,4 МЕ/кг BENEFIX™ приводило к 50% выживаемости HemB мышей при рассечении хвостовой вены на 24 ч после дозирования, 50% выживаемости у животных, получивших 17,8 МЕ/кг rFIXFc было достигнуто при травме на 72 ч после дозирования. Следовательно, rFIXFc демонстрирует в 3 раза более длительную профилактическую эффективность в корреляции с продлением его периода полувыведения в сравнении с BENEFIX™. Результаты мо моделям кровотечения в дальнейшем были подтверждены ex vivo ROTEM® анализом цельной крови
- 25 037095 из HemB мышей, обработанных или 100 МЕ/кг BENEFIX™, или 50 МЕ/кг rFIXFc. На 5 мин после дозирования, сравнимые улучшения в образовании сгустка наблюдались в обеих экспериментальных группах. Однако большинство ROTEM® параметров, таких как время свертывания, время образования сгустка и альфа-угол были достоверно лучше у rFIXFc-обработанных мышей от 72 до 216 ч после дозирования, несмотря на в 2 раза более низкую дозу rFIXFc по сравнению с BENEFIX™. Подводя итог, потенциал rFIXFc в неотложном случае сравним с таковым у BENEFIX™, как показано и на ROTEM® цельной крови in vitro, и на модели кровотечения при отсечении хвоста у HemB мышей. Пролонгированная профилактическая эффективность rFIXFc была показана на ex vivo ROTEM® цельной крови у обработанных HemB мышей и была определена как приблизительно в 3 раза более длинная в сравнении с BENEFIX™ в модели кровотечения при рассечении хвостовой вены у HemB мышей. Пролонгированная эффективность rFIXFc хорошо коррелирует с в 3 раза более длинным T1/2 rFIXFc по сравнению с BENEFIX™, ранее демонстрировавшимся в фармакокинетическом исследовании у HemB мышей. Следовательно, rFIXFc полностью активен для лечения по требованию, поскольку достигается достоверно пролонгированная профилактическая защита с потенциалом уменьшения частоты дозирования, что является объектом изучения в фазе 3 исследования.
Пример 8. Анализ фармакокинетики и фаркакодинамики rFIXFc и BENEFIX™ после однократной подкожной дозы дефицитным по FIX мышам.
Фармакокинетические (PK) и фармакодинамические (PD) профили рекомбинантного фактора IX-Fc (rFIXFc) и BENEFIX™ (rFIX) были определены после однократной внутривенной или подкожной инъекции 200 или 400 МЕ/кг у дефицитных по FIX мышей. Цельная кровь была собрана из полой вены (n=4 мыши/временная точка/обработка). Концентрации rFIXFc и BENEFIX™ в плазме крови были определены с использованием специфичного на человеческий FIX анализа ИФА. Активность rFIXFc и BENEFIX™ определялась с использованием анализа активированого частичного времени тромбопластина. PK анализы были проведены с использованием модель-зависимой методологии, использующей WinNonLin. Результаты показаны в табл. 22 и 23.
Для FIXFc, биодоступность у дефицитных по FIX мышей составляла 38% для дозы 200 МЕ/кг и 3846% для комбинированной дозы (антиген ИФА) и 29% для дозы 200 МЕ/кг и 29-39% для комбинированной дозы (исследование аРТТ активности) по сравнению с rFIX, 23% и 19%, соответственно. rFIXFc имел в 1,5-1,7 раза (доза 200 МЕ/кг) и в 1,5-2,5 раза (комбинированные дозы) повышенную биодоступность по сравнению с BENEFIX™.
Для rFIXFc терминальный полупериод (антиген ИФА) составлял 62 ч для дозы 200 МЕ/кг и 51-62 ч для комбинированных доз и терминальный полупериод (исследование аРТТ активности) составлял 42 ч для дозы 200 МЕ/кг и 40-42 ч для комбинированных доз, тогда как для BENEFIX™ терминальный полупериод составлял 24 ч (антиген ИФА) для дозы 200 МЕ/кг и 17 ч (исследование аРТТ активности) для дозы 200 МЕ/кг. Это указывает на 2,5-2,6 кратное (доза 200 МЕ/кг и комбинированная доза) повышение полупериодас rFIXFc.
Кроме того, как показано в табл. 22 и 23, rFIXFc имел 4,5-5,6 кратное возрастание AUC/доза и 1,93,7 кратное возрастание Cmax/доза по сравнению с BENEFIX™.
Рекомбинантный фактор IX Fc гибридный (rFIXFc) белок является долгодействующей формой рекомбинантного FIX (rFIX), что даст возможность менее частого дозирования rFIX при лечении гемофилии В. У мышей и нечеловекообразных приматов и пациентов с гемофилией В rFIXFc имеет приблизительно в 3 раза более длинный период полувыведения по сравнению с rFIX (BENEFIX™). Для профилактического лечения внутривенное введение rFIX остается сложным способом доставки, особенно у детей и пациентов с трудно доступными венами. Подкожное введение rFIX представляется более привлекательным путем доставки, менее травматичным и с менее частым дозированием. Таким образом, подкожное введение rFIXFc причинит меньше боли и дискомфорта чем внутривенное введение, и приведет к улучшенному соблюдению режима лечения, поскольку введение более легкое и занимает меньше времени, чем в случае внутривенного введения. Профилактический режим также улучшит качество жизни, и клинические последствия будут включать сниженные случаи кровотечения.
Концентрация rFIXFc в плазме мышей была подсчитана с использованием FIX-специфичного человеческого ИФА, по которому оценивалась FIX часть молекулы и мг/кг номинальная доза использовалась в анализе. Суммарные PK параметры для rFIXFc и BENEFIX™ показаны в табл. 20 (антиген ИФА) и табл. 21 (исследование активности аРТТ) для n=4/группа. Оба анализа антигена и активности показали, что Cmax и AUC в случае rFIXFc были достоверно улучшены по сравнению с BENEFIX™. При использовании антигена ИФА, биодоступность (F %) составляла 38% для rFIXFc по сравнению с 23% для BENEFIX™. Подобным образом, при использовании исследования активности аРТТ биодоступность составляла 29% для rFIXFc по сравнению с 19% для BENEFIX™. Таким образом, rFIXFc по сравнению с BENEFIX™ демонстрировал повышение биодоступности в 1,5-1,6 раза. Оценки полупериода элиминации показали, что rFIXFc заметно повышал полупериод, как было подсчитано по анализам антигена (rFIXFc 62 ч по сравнению с BENEFIX™ 24 ч) или активности (rFIXFc 42 ч по сравнению с BENEFIX™ 17 ч). Эти
- 26 037095 данные показывают, что rFIXFc имел полупериод, удлиненный по сравнению с BENEFIX™ в 2,6-2,5 раза.
rFIXFc, даваемый подкожно дефицитным по FIX мышам, демонстрировал PK и PD профиль с возрастаниями в Cmax и AUC для rFIXFc по сравнению с BENEFIX™. В целом, биодоступность для rFIXFc находилась в диапазоне от 29% (активность) до 38% (антиген) с полупериодом от 42 ч (активность) до 62 ч (антиген) по сравнению с BENEFIX™, который имел биодоступность от 19-23% и полупериод от 1724%, соответственно. Таким образом, полупериод для rFIXFc, введенного подкожно дефицитным по FIX мышам, продемонстрировал возрастание в от около 2,2 (антиген) раза до 3,3 (активность) раза по сравнению с имеющимися в продаже rFIX продуктами, даваемыми внутривенно. В целом, эти данные подтверждают, что замечание, что rFIXFc, доставляемый подкожно, будет иметь клиническое преимущство для профилактического лечения пациентов с гемофилией В.
Пример 9. Фармакокинетический анализ rFIXFc после однократной подкожной дозы яванским макакам.
Фармакокинетический профиль (РК) рекомбинантного фактора IX-Fc (rFIXFc) был исследован после однократной подкожной дозы 50 МЕ/кг, 100 МЕ/кг или 200 МЕ/кг яванским макакам. Концентрация rFIXFc в плазме крови была подсчитана с использованием FIX-специфичного ИФА. Первичный анализ был проведен с использованием модель-зависимой методологии с использованием WinNonLin. См. табл. 22-25.
Фармакокинетический анализ концентрации в плазме по сравнению с временными данными (подсчитан по FIX-специфичной ИФА) продемонстрировал, что биодоступность и терминальный полупериод были одинаковыми при различных дозах. Биодоступность rFIXFc составляла 40% (50 МЕ/кг), 34% (100 МЕ/кг), 36% (200 МЕ/кг) и 36-45% (комбинированные дозы). Терминальные полупериоды для rFIXFc составляли 61 ч (50 МЕ/кг), 45 ч (100 МЕ/кг), 49 ч (200 МЕ/кг) и 44-58 ч (комбинированные дозы).
Концентрация rFIXFc в плазме крови обезьян была подсчитана с использованием FIXспецифичного ИФА, который измерял FIX часть молекулы, и мг/кг номинальная доза была использована в анализе. Анализы выброса и повышения концентрации продемонстрировали точность этого FIXспецифичного ИФА анализа для детекции rFIXFc в диапазоне оцениваемых плазматических концентраций. Сводки PK параметров для rFIXFc показаны в табл. 22 (50 МЕ/кг), табл. 23 (100 МЕ/кг) и табл. 24 (200 МЕ/кг) для и=3/группа. Для rFIXFc SC геометрические средние и CV% геометрического среднего для Cmax составляли 860 + 22 (50 МЕ/кг), 1630 + 97 (100 МЕ/кг) и 3,750 + 26 (200 МЕ/кг), соответственно указывая на дозозависимое возрастание. Подобные возрастания наблюдались для AUC. Геометрические средние для биодоступности (F %) составляли 40 + 16 (50 МЕ/кг), 30 + 75 (100 МЕ/кг) и 36 + 27 (200 МЕ/кг), демонстрируя, что биодоступность была одинакова при разных дозах. Измерения терминального полупериода показали, что полупериод был одинаков в диапазоне доз 58 + 39 ч (50 МЕ/кг), 45 + 13 ч (100 МЕ/кг) и 46 + 44 ч (200 МЕ/кг). rFIXFc, даваемый подкожно яванским макакам, демонстрировал PK профиль с дозозависимым возрастанием Cmax и AUC. В целом, биоактивность находилась в диапазоне 3040% с полупериодом 45-58 ч. Таким образом, полупериод для rFIXFc, введенного подкожно макакам, демонстрировал примерно 2,8-кратное возрастание по сравнению с имеющимися в продаже rFIX продуктами, даваемыми внутривенно. В целом, эти данные поддерживают представление, что rFIXFc, вводимый подкожно, будет имет клиническое преимущество для профилактического лечения пациентов с гемофилией В.
Пример 10. Рекомендуемые профилактические дозовые режимы.
По сравнению со стандартными рекомендованными дозовыми режимами от 25 до 40 МЕ/кг FIX дважды или три раза в неделю, медианная rFIXFc активность РК, полученная в ходе фазы 1/2а исследования, описанного выше, подтверждает, что дозирование rFIXFc около одного раза в неделю около 22,5 МЕ/кг, или примерно каждые 10 дней около 45 МЕ/кг, или примерно каждые 2 недели около 120 МЕ/кг достаточно для поддержания минимального уровня 1% выше базового уровня (фиг. 24). Эти модельсимулированные оценки валидированы по доступным данным из фазы 1/2а исследования, которое полностью попадает в 95% доверительный интервал моделированной кривой активность по отношению ко времени. Эти режимы часто будут служить для начала терапии. Принимая во внимание гетерогенность сообщаемых клинических случаев прорывного кровотечения по отношению к минимальному уровню плазматической FIX активности, поддерживающие дозы необходимо будет рассчитывать индивидуально.
После перерасчета PK результатов фазы 1/2 исследования (см. пример 11), новый расчетный дозовый режим, например, для профилактики, составляет 20 МЕ/кг один раз в неделю, 40 МЕ/кг каждые 10 дней или 100 МЕ/кг каждые две недели (два раза в месяц). См. также табл. 27 и фиг. 25.
Пример 11. Перерасчет фармакокинетических данных впервые проведенного на человеке (FiH) исследования (пример 1).
Пациенты с различными генотипами гемофилии В, такими как стоп кодон/нонсенс и мисенсмутациями, были включены в FiH исследование, обсуждаемое в примере 1. Несколько пациентов имели заметно сниженные эндогенные уровни FIX антигена, что коррелировало с заметно сниженной FIX ак- 27 037095 тивностью, тогда как у нескольких пациентов с миссенс-генотипами было больше антигена, чем подсчитанной активности, что указывает на дисфункциональный циркулирующий белок. FIX активность до лечения у 2 пациентов превышала 2 МЕ/дл, вероятно, вследствие неполного вымывания после последнего вливания FIX концентрата на основе тестирования в анамнезе и фенотипа болезни. Основываясь на этой информации, PK данные из примера 1 были перерасчитаны без вычитания базового уровня, как детально описано ниже. См. табл. 27.
В отличие от PK расчетов (на основании активности) в примере 1, если rFIXFc активность PK моделировалась без вычитания базового уровня, как недавно сообщалось для PK анализа гликопегилированного rFIX (Negrier et al., Blood DOI 10.1182/blood 2011 02 335596 (2011), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки), получившиеся в результате оценки полупериода элиминации и MRT намного длиннее, чем оценки в примере 1, на 82,2 ± 21,6 и 96,8±22,0 ч (среднее ±SD), соответственно. Однако, зная, что не все пациенты с тяжелой гемофилией В имеют 0% эндогенной FIX активности, и принимая во внимание генотип пациента и эндогенный уровень FIX антигена, изобретатели настоящего изобретения адаптировали способ анализа с вычитанием базового уровня в своем PK моделировании. Более точно, (а) базовый уровень у двух пациентов был определен как 0%, поскольку их FIX активность перед лечением составляла <1%, они не имели определяемого FIX антигена и имели нонсенс-генотипы, (b) базовый уровень у трех пациентов был установлен как 0,5%, поскольку их FIX активность перед лечением была <1% и они имели детектируемый FIX антиген, (с) для пациентов, чья FIX активность перед лечением была между 1-2%, Cmin (самая низкая активность в ходе PK исследования) определялась как базовый уровень, и (d) для пациентов, чья FIX активность перед лечением была >2%, 2% (что было выше пограничного значения для вхождения в исследование) было базовым уровнем. Активность выше базового уровня перед дозой рассматривалась как остаточное действие лекарства от предыдущего лечения, и была сведена к базовому уровню и вычтена из PK данных после rFIXFc дозирования.
Получившийся в результате средний терминальный полупериод (56,7±10,9 ч, диапазон 42,4-74,5 ч) и MRT (71,8±10 ч, диапазон 53,2-85,9 ч) rFIXFc приблизительно в 3 раза длиннее, чем сообщаемые для rFIX. Сообщаемый терминальный полупериод rFIX составляет 19,3±4,97 ч (диапазон 11,1-36,4 ч) и MRT 26,0±6,07 ч (диапазон 15,8-46,1 ч). Roth et al., Blood 98:3600-3606 (2001); и Summary of Product Characteristics for BENEFIX™, Electronic Medicines Compendium (2010) (http://www.medicines.org.uk/ emc/medicine/20376/SPC/BENEFIX™/#PHARMACOD YNAMIC_PROPS), каждая из которых включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Таким образом, диапазоны для rFIXFc не перекрывают диапазоны для rFIX. Подобным образом, среднее CL rFIXFc активности (3,18±0,78 мл/ч/кг, диапазон 2,05-4,18 мл/ч/кг) приблизительно в 2,6 раза меньше, чем сообщаемое для rFIX (8,40±2,01 мл/ч/кг, диапазон 4,66-13,64 мл/ч/кг), тогда как VSS обоих белков сравнимы при 4-5 кратном объеме плазмы.
Хотя та же тенденция улучшения показателей наблюдалась при rFIXFc антигене PK, и T1/2a, и T1/2e rFIXFc антигена были достоверно длиннее, чем исходит из подсчетов FIX активности. T1/2a оцененный для rFIXFc антигена, определенно отклоняется от того, который в норме связан с FIX (2-3 ч). Кроме того, возможное недостаточное вымывание от заместительной терапии до исследования перед вливанием rFIXFc иногда приводило к более высокому базовому значению, которое в свою очередь могло приводить к недооценке rFIXFc T1/2e, как подсчитано по FIX активности. Многие пациенты имели аРТТ активность до 3 МЕ/дл, что значительно превышает предельное количество (1 МЕ/дл) для аРТТ анализа, на последних временных точках 336 ч (14 дней) после дозы. Однако эти временные точки были исключены из оценки терминального полупериода, поскольку эти значения или находились на базовых уровнях, или были лишь слегка выше их, что рассматривалось как возвращение к базовому уровню. Напротив, низкие но детектируемые терминальные уровни rFIXFc могут быть обнаружены путем специфичного и высокочувствительного rFIXFc антиген ИФА, который детектирует 0,1 МЕ/дл, в сравнении с самым нижним лимитом для аРТТ в 1,0 МЕ/дл.
Оставшиеся PK параметры (активность) изменялись незначительно в соответствии с полупериодом элиминации и MRT. См. табл. 27(В). Дозопропорциональное линейное повышение FIX активности наблюдалось на основе Cmax, возникающего сразу же после вливания и AUCINF (табл. 4). FIX активность демонстрировала биэкспоненциальное затухание после вливания rFIXFc и характеризовалась быстрой фазой распределения (альфа), за которой следовала линейно-логарифмическая фаза элиминации (бета). Средний полупериод распределения (T1/2a) был высоко вариабелен у отдельных пациентов (среднее 3,4 и 10,3 ч для двух групп с более высокими дозами) (табл. 27(В)). Средний полупериод элиминации (T1/2P) был дозонезависимым в тестируемом терапевтическом дозовом диапазоне, то есть, 53,5 ч, 57,5±8,2 ч и 56,5±14,1 ч при 25 МЕ/кг, 50 МЕ/кг и 100 МЕ/кг, соответственно. Время 1% (1 МЕ/дл) выше базовой линии, при оценке rFIXFc активности, показало дозопропорциональное возрастание. Это составляло 7,3; 10,1±1,5 и 12,3±2,5 дней для доз 25, 50 и 100 МЕ/кг, соответственно. На 168 ч (1 неделя) после дозы плазматическая FIX активность установилась как 1,1 МЕ/дл, 2,5±0,9 МЕ/дл и 4,6±1,7 МЕ/дл выше базо- 28 037095 вого уровня для 25, 50 и 100 МЕ/кг дозовых групп, соответственно. Также дозонезависимыми были
MRT, CL и VSS в пределах дозового диапазона от 25 до 100 МЕ/кг. Кроме того, каждый 1 МЕ/кг влитого rFIXFc поднимал плазматическую FIX активность в среднем на 0,93±0,18 МЕ/дл (табл. 27(В)), и это увеличение концентрации (K) показало слабую позитивную корреляцию с весом тела (R2=0,336, p=0,048).
Долговременный эмпирический клинический опыт подтверждает, что постоянной активности фактора в плазме на уровне 1-2 МЕ/дл будет достаточно для предотвращения спонтанных случаев кровотечения у пациентов с тяжелой гемофилией А и В, (Nilsson et al., J. Intern. Med. 232:25-32 (1992), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки), и учащенные случаи кровотечения связаны с количеством времени ниже 1% от нормальной FVIII активности. Collins et al., Thromb Haemost 7:413-420 (2009), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Таким образом, PK анализы предоставляют средства для оптимизации профилактического лечения с индивидуализированным моделированием дозы для достижения постоянных минимальных уровней выше 1% (1 МЕ/дл) от базового уровня, уменьшения вариабельности пик/минимум и улучшения соотношения стоимость/эффективность лечения. Carlsson et al., Haemophilia 4:83-88 (1998); Kisker et al., Haemophilia 9:279284 (2003), каждая из которых включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.
Для создания профилей концентрация-время, соответствующих различным режимам дозирования, был проведено моделирование по способу Монте-Карло с использованием популяционной PK модели rFIXFc. Средние оценки параметров модели (CL, объем распределения, внутри-компартментый клиренс и объем второго компартмента) в тестируемой популяции, вариабельность между отдельными индивидуумами, и остаточная вариабельность были адаптированы для этой фазы 1/2а исследования. Wang et al., J. Clin. Pharmacol. 49:1012-1024 (2009), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Одна тысяча пациентов была смоделирована на дозовый режим с 14-16 точками взятия проб для каждого пациента. Было 14 точек взятия проб для еженедельного дозирования, 15 для дозирования каждые 10 дней, и 16 для дозирования раз в 2 недели. Вес тела (BW) был смоделирован в соответствии с опубликованным способом, Wang et al. (2009), то есть на основе степенного уравнения Z=BW-0,5. Медианный BW у 1000 пациентов был предположен как 75 кг. На основе моделированных профилей концентрация-время, среднее ± стандартное отклонение (SD) лекарственных профилей концентрация-время у 1000 пациентов было сконструировано графически для различных режимов дозирования. Фиг. 25.
В сравнении со стандартным рекомендованным дозовым режимом от 25 до 40 МЕ/кг FIX дважды в неделю, моделирующие результаты медианной rFIXFc активности PK из этого исследования показывают, что дозирование один раз в неделю rFIXFc при 20 МЕ/кг, или каждые 10 дней при 40 МЕ/кг, или каждые 2 недели при 100 МЕ/кг достаточно для поддержания минимального уровня 1% выше базового уровня. Фиг. 25. Эти модель-прогнозируемые оценки подтверждены доступными данными этой фазы 1/2а исследования, которые полностью попадают в 95% доверительный интервал моделированной кривой активность по отношению ко времени. Однако, принимая во внимание гетерогенность сообщаемых клинических случаев прорывного кровотечения по отношению к минимальному уровню плазматической FIX активности (Bjorkman, Haemophilia, 9:101-110 (2003); Ahnstrom et al., Haemophilia, 10:689-697 (2004), каждая из которых включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки), поддерживающая доза скорее всего будет требовать индивидуального подбора.
- 29 037095
Таблицы
Таблица 1. Полинуклеотидные последовательности: FIX-Fc
A. FIX-Fc цепи ДНК последовательность (SEQ ID NO: 1, которая кодирует SEQ ID NO: 2) pSYN-FIX-030 Нуклеотидная последовательность (nt 1 до 7583):
FIX экзон 1 (сигнальный пептид, 1-я аминокислота пропептида): nt 690-777
FIX мини интрон: nt 778-1076
FIX пропептидная последовательность : nt 1077-1126
Зрелая FIX последовательность : nt 1127-2371
Fc : nt 2372-3052 gcgcgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatg gagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaat aatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactg cccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcc tggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattac catggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccacc ccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgcccca ttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccac tgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagcttcgcgacgtacggccgccaccatgc agcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagtgctgaa tgtacaggtttgtttccttttttaaaatacattgagtatgcttgccttttagatatagaaatatctgatgctgtctt cttcactaaattttgattacatgatttgacagcaatattgaagagtctaacagccagcacgcaggttggtaagtact gtgggaacatcacagattttggctccatgccctaaagagaaattggctttcagattatttggattaaaaacaaagac tttcttaagagatgtaaaattttcatgatgttttcttttttgctaaaactaaagaattattcttttacatttcagtt tttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgt tcaagggaatctagagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactg aaagaacaactgaattttggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagt tgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaac atgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactg agggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttca caaacttctaagctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccat tttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgggttgttggtggagaagatgccaaaccag gtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatgg attgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgaggagac agaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagtaca accatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgac aaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggag atcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcacca tctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccat gttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaata tggaatatataccaaggtgtcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactgacaaaactcacacat gcccaccgtgcccagctccggaactcctgggcggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctc atgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactg gtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtgg tcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctc ccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatc ccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtgg agtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgttggactccgacggctccttcttc ctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggc tctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagaattcagacatgataagatacatt gatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgcttt atttgtaaccattataagctgcaataaacaagttggggtgggcgaagaactccagcatgagatccccgcgctggagg atcatccagccggcgtcccggaaaacgattccgaagcccaacctttcatagaaggcggcggtggaatcgaaatctcg tagcacgtgtcagtcctgctcctcggccacgaagtgcacgcagttgccggccgggtcgcgcagggcgaactcccgcc
- 30 037095 cccacggctgctcgccgatctcggtcatggccggcccggaggcgtcccggaagttcgtggacacgacctccgaccac tcggcgtacagctcgtccaggccgcgcacccacacccaggccagggtgttgtccggcaccacctggtcctggaccgc gctgatgaacagggtcacgtcgtcccggaccacaccggcgaagtcgtcctccacgaagtcccgggagaacccgagcc ggtcggtccagaactcgaccgctccggcgacgtcgcgcgcggtgagcaccggaacggcactggtcaacttggccatg gtttagttcctcaccttgtcgtattatactatgccgatatactatgccgatgattaattgtcaacacgtgctgatca gatccgaaaatggatatacaagctcccgggagctttttgcaaaagcctaggcctccaaaaaagcctcctcactactt ctggaatagctcagaggcagaggcggcctcggcctctgcataaataaaaaaaattagtcagecatggggcggagaat gggcggaactgggcggagttaggggcgggatgggcggagttaggggcgggactatggttgctgactaattgagatgc atgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgct ttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacaccctcgtcgagctagettegtgaggetccggtgcc cgtcagtgggcagagcgcacategeecacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgceta gagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaac cgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtg tgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctccagta cgtgattcttgatcccgagctggagccaggggcgggccttgcgctttaggagccccttcgcctcgtgcttgagttga ggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctegetgetttegataagt ctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccag gatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggc gaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctg gcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaaga tggccgcttcccggccctgctccagggggctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacc cacacaaaggaaaggggcctttccgtcctcagccgtegetteatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggc acctcgattagttctggagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccc cacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttga gtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaacac gtggtcgcggccgcgccgccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttcc actggtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctgggaggaccgtcagtcttcctcttccc cccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaag accctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcag tacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtg caaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccac aggtgtacaccctgcccccatcccgcgatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttc tatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgtt ggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttct catgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgactc gagagatctggccggctgggcccgtttcgaaggtaagcctatccctaaccctctcctcggtctcgattctacgcgta ccggtcatcatcaccatcaccattgagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagecatct gttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgagga aattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggatt gggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagtggcggtaat acggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgta aaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcag aggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctagaagctccctcgtgcgctctcctgttcc gaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgta ggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgc geettatccggtaactategtettgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcageeactggtaa caggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaa gaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaa caaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaaga tcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgacattaa cctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatg cagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcggg tgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtg tgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttggg aagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgcca
B. Fc ДНК последовательность (мышиный IgK сигнальный пептид подчеркнут) (SEQ ID NO: 3, которая кодирует SEQ ID NO: 4) Это Fc кассета из pSYN-FIX-030. Кроме того, существует раздельная Fc экспрессионная кассета, которая трансфипируется в клеточную линию в плазмидную pSYN-Fc-015, которая кодирует ту же самую аминокислотную последовательность, но содержит несколько некодирующих цепей. Вторая копия Fc кодирующей последовательности запускает в работу больший мономер: димер соотношение.
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacaaaactcacacatgcc caccgtgcccagcacctgaactcctgggaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatga tctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtac gtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtc agcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctccc agcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcc cgcgatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtgga gtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgttggactccgacggctccttcttcc tctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggct ctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
- 31 037095
Таблица 2. Полипептидные последовательности
FIX-Fc Мономер гибрид: создан коэкспрессией FIX-Fc и Fc цепей.
A. FIX-Fc цепь (SEQ ID NO: 2): (28-аминокислотная сигнальная последовательность подчеркнута, 18-аминокислотный пропептид подчеркнут двойной линией, Fc участок выделен курсивом.) Стерминальный лизин не представлен ни в одной субъединице; этот процессинг часто наблюдается в рекомбинантных белках, вырабатываемых в культуре клеток млекопитающих, а также в белках, полученных из плазмы крови.
FIXFC-SC Субъединица:
FIX Сигнальный пептид: -46 MQRVNMIMAE SPGLITICLL GYLLSAEC.
FIX Пропептид: -18 TVFLDHENAN KILNRPKR.
YNSGKLEEFV QGNLERECME EKCSFEEARE VFENTERTTE FWKQYVDGDQ
CESNPCLNGG SCKDDINSYE CWCPFGFEGK NCELDVTCNI KNGRCEQFCK
101 NSADNKWCS CTEGYRLAEN QKSCEPAVPF PCGRVSVSQT SKLTRAETVF
151 PDVDYVNSTE AETILDNITQ STQSFNDFTR WGGEDAKPG QFPWQWLNG
201 KVDAFCGGSI VNEKWIVTAA HCVETGVKIT WAGEHNIEE TEHTEQKRNV
251 IRIIPHHNYN AAINKYNHDI ALLELDEPLV LNSYVTPICI ADKEYTNIFL
301 KFGSGYVSGW GRVFHKGRSA LVLQYLRVPL VDRATCLRST KFTIYNNMFC
351 AGFHEGGRDS CQGDSGGPHV TEVEGTSFLT GIISWGEECA MKGKYGIYTK
401 VSRYVNWIKE KTKLTDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR
451 TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV
501 LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR
551 DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF
601 LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
В. Fc цепь (SEQ ID NO: 4).
20-аминокислотный сигнальный пептид легкой цепи гетерологичного мышиного IgK (подчеркнуто):
-20 METDTLLLWV LLLWVPGSTG.
Зрелая Fc последовательность (в соответствии с нумерацией человеческого IgG1 аминокислот с 221 по 447, нумерация EU)
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK
101 CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK
151 GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG
201 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
- 32 037095
Таблица 3. Концентрация антигена FIXFc у отдельного пациента в соответствии с временными данными;
рассортировано по номинальной дозе, фактической дозе, продолжительности вливания и
номеру пациента
Фактическ Концентраци Фактическ Концентраци Фактическ Концентраци Фактическ Концентраци
ое время я (нг/мл) ое время я (нг/мл) ое время я (нг/мл) ое время я (нг/мл)
(ч) (ч) (ч) (ч)
Пациент 1 Пациент 2 Пациент 3 Пациент 4
-0,50 0,0 -1,23 0,0 -0,18 0,0 -0,18 0,0
0,17 2325,3 0,17 3352,1 0,28 5915,3 0,17 8166,5
0,42 1632,4 0,40 3017,3 0,42 6574,3 0,42 7362,3
1,17 1497,7 1,15 2280,7 1,17 5764,7 1,17 6723,4
3,18 1466,4 3,15 2077,5 3,17 4204,8 3,17 5291,4
6,13 1268,2 6,15 2054,7 6,17 3956,2 6,18 4673,1
9,12 1100,7 9,15 1700,4 9,17 3567,7 9,17 3954,6
24,12 805,0 24,23 1417,3 24,17 2805,6 24,17 3327,6
48,03 544,5 48,40 766,0 48,98 1727,7 48,20 2148,7
72,23 377,7 70,73 719,0 72,40 1165,8 72,17 1632,2
96,75 215,3 92,57 480,2 96,98 917,1 96,17 1234,4
120,13 192,6 119,98 326,3 121,23 673,9 120,13 894,0
141,95 128,6 141,10 241,1 168,65 568,2 144,18 645,2
169,45 112,4 167,98 194,6 240,15 265,4 168,22 564,1
192,37 93,6 192,85 160,1 290,97 286,4 192,20 509,2
216,28 76,1 216,98 149,0 337,98 238,5 216,23 474,5
237,30 76,4 238,65 125,7 240,23 446,1
Пациент 5 Пациент 6 Пациент 7 Пациент 8
-0,18 0,0 -0,07 0,0 -1,27 0,0 -1,37 0,0
0,17 7520,2 0,17 11671,7 0,22 7055,9 0,25 27413,4
0,43 7233,9 0,42 8654,5 0,42 6215,7 0,47 23640,8
1,20 6752,1 1,17 8880,4 1,17 5498,6 1,35 18505,6
3,15 5873,1 3,17 8509,3 3,17 4477,7 3,22 15708,1
6,23 5919,2 6,17 7618,7 6,17 4084,8 6,17 14915,6
9,20 5332,9 9,17 6584,2 9,17 3888,9 9,17 16486,4
24,17 4215,9 48,17 3217,7 24,17 2849,4 24,72 9937,8
48,15 2986,6 72,17 1651,6 48,82 1630,6 48,90 6383,5
72,15 1933,3 96,17 1580,1 72,57 1295,7 72,38 4190,6
96,03 1249,0 120,17 722,7 96,57 1150,7 96,40 3774,7
120,13 401,4 240,17 329,5 121,15 954,9 120,30 2514,9
144,03 482,3 288,17 292,7 144,10 780,6 168,77 1626,0
168,17 478,0 336,17 252,7 168,82 447,6 240,27 924,7
192,12 433,7 192,77 446,5 288,83 682,4
216,15 368,9 240,57 427,8 337,03 586,4
240,07 264,0
Пациент 9 Пациент 10 Пациент 11 Пациент 12
-0,82 0,0 -0,48 0,0 -0,15 0,0 -1,12 0,0
0,28 15027,1 0,25 16760,0 0,23 19641,7 0,17 15194,5
0,63 13374,1 0,50 11529,0 0,47 17267,2 0,42 12255,7
1,17 12395,6 1,22 10566,3 1,22 15902,2 1,17 11171,3
3,20 10808,4 3,22 9889,0 3,22 13708,9 3,17 9835,4
6,22 9640,2 6,22 8290,2 6,25 12469,4 6,17 8513,2
9,15 10505,5 9,22 7114,7 9,22 12029,8 9,17 8413,0
23,15 6487,3 24,22 5877,0 24,22 8083,3 24,17 5538,2
46,62 5324,8 48,22 3980,4 47,72 4431,0 48,20 3885,5
70,10 2895,5 72,22 2455,6 71,88 2162,6 72,13 2959,9
94,15 3208,3 96,12 2052,6 191,72 1468,7 95,17 2215,4
118,13 2610,6 120,22 1302,5 263,72 428,6 119,17 1799,7
166,10 2007,2 144,22 1349,3 167,38 1339,7
238,15 1086,2 168,22 1221,0 239,50 892,4
286,15 942,8 192,18 910,2 287,25 646,9
335,57 621,3 216,22 136,2
- 33 037095
Таблица 4. Суммарные данные по фармакокинетике FIXFc антигена - отдельные пациенты и среднее групповое значение
Номина льная доза (МЕ/кг) Фактиче ская доза (МЕ/кг) Эквивален т дозы (мг/кг) Пацие нт Стах (НГ/МЛ) AUCinf (ч*нг/мл) CI* (мл/ч/кг) VSs* (мл/кг) MRT* (ч) Альф a HL* (ч) Бета HL* (ч)
12,5 13,714 0,228 1 1670 91300 2,50 245 98,2 21,2 107
N 1 1 1 1 1 1 1
25 27,250 0,453 2 2730 144000 3,14 273 87,1 11,3 71,0
N 1 1 1 1 1 1 1
50 54,5 0,905 3 5470 356000 2,54 366 144 18,6 138
54,5 0,905 4 6910 389000 2,32 244 105 10,6 85,3
54,5 0,905 5 7520 416000 2,77 184 84,5 NC 94,3
54,513 0,906 6 11700 531000 1,71 190 112 NC 140
55,878 0,928 7 5950 348000 2,67 310 116 10,1 93,9
N 5 5 5 5 5 3 5
Среднее 7510 408000 2,28 259 112 13,1 110
SD 2480 73900 0,374 78,5 21,5 4,77 26,5
SE 1110 33100 0,167 35,1 9,60 2,75 11,8
Среднее геометрическое 7230 403000 2,26 250 111 12,6 108
CV% среднее геометрическое 30,3 17,1 17,6 30,8 19,4 34,9 23,8
100 109 1,81 10 12500 667000 2,72 263 96,8 9,79 78,0
109 1,81 8 21600 1200000 1,51 156 103 15,7 94,3
109 1,81 9 13400 998000 1,81 248 137 11,5 107
109,176 1,81 11 17200 844000 2,15 226 105 13,0 97,1
109,441 1,82 12 12500 778000 2,34 295 126 10,6 102
N 5 5 5 5 5 5 5
Среднее 15400 897000 2,11 238 114 12,1 95,8
SD 3960 206000а 0,464ь 52,2е 17,1 2,33 11,1
SE 1770 92000 0,208 23,3 7,64 1,04 4,96
Среднее геометрическое 15100 878000 2,06 232 113 11,9 95,2
CV% среднее геометрическое 24,5 22,9 22,9 24,7 14,8 118,7 12,2
* CL, VSS, MRT, T1/2a и Т1/2в для комбинированных 12,5-100 МЕ/кг доз составляют 2,30±0,46 (1,512,72); 250±58,2 (156-366); 110±18,5 (84,5-144); 12,0±4,0 (10,1-18,6, не включая двух пациентов, чьи PK параметры были определены по некомпартментному анализу); и 101±20,9 (78-140), соответственно. Вследствие коррекции округления или других ошибок, (а) должно быть 207000, и (b) должно быть 0,468, (с) должно быть 52,1.
Таблица 5. Средняя активность FIXFc у отдельных пациентов и групповая и скорректированная по базовому уровню FIXFc активность по сравнению с временными данными.
Распределено по номинальной дозе, фактической дозе, продолжительности введения и номеру пациента
Фактичес кое время (ч) Результа т (МЕ/дл) Скорректирован ный по базовому уровню результат (МЕ/дл) Фактичес кое время (ч) Результа т (МЕ/дл) Скорректирован ный по базовому уровню результат (МЕ/дл) Фактиче с кое время (ч) Результат (МЕ/дл) Скорректирован ный по базовому уровню результат (МЕ/дл)
Пациент 1 Пациент 2 Пациент 3
-309,80 2 NC -310,60 3 NC -524,08 < 1,0 NC
-0,50 3 0,0 -1,23 2 0,0 -0,18 2 0,0
0,17 16 13,0 0,17 23 21,0 0,28 44 42,0
0,42 11 8,1 0,40 19 17,0 0,42 31 29,0
1Д7 10 7,1 1,15 15 13,0 1,17 27 25,1
3,18 12 9,4 3,15 13 11,0 3,17 22 20,2
6,13 9 6,6 6,15 11 9,0 6,17 18 16,4
9,12 10 7,9 9,15 13 11,0 9,17 17 15,6
24,12 7 5,0 24,23 8 6,0 24,17 12 11,0
48,03 6 4,0 48,40 6 4,0 48,98 7 6,0
72,23 4 2,0 70,73 6 4,0 72,40 6 5,0
96,75 3 1,0 92,57 4 2,0 96,98 6 5,0
120,13 3 1,0 119,98 4 2,0 121,23 5 4,0
141,95 3 1,0 141,10 4 2,0 168,65 3 2,0
169,45 2 0,0 167,98 3 1,0 240,15 1 0,0
192,37 3 1,0 192,85 2 0,0 290,97 1 0,0
216,28 3 1,0 216,98 3 1,0 337,98 1 0,0
237,30 3 1,0 238,65 3 1,0 675,22 2 1,0
746,22 3 1,0 891,90 2 0,0
- 34 037095
Пациент 4 Пациент 5 Пациент 6
-285,52 1 NC -104,18 < 1,0 NC -503,20 3 NC
-0,18 <1,0 0,0 -0,18 < 1,0 0,0 -0,07 3 0,0
0,17 59 58,0 0,17 35 34,0 0,17 3 0,0
0,42 45 44,0 0,43 30 29,0 0,42 64 61,0
1,17 40 39,0 1,20 25 24,0 1,17 57 54,1
3,17 30 29,0 3,15 21 20,0 3,17 54 51,3
6,18 26 25,0 6,23 19 18,0 6,17 42 39,6
9,17 22 21,0 9,20 NR NR 9,17 43 40,9
24,17 14 13,0 24,17 13 12,0 24,17 26 24,0
48,20 9 8,0 48,15 9 8,0 48,17 17 15,0
72,17 8 7,0 72,15 7 6,0 72,17 13 11,0
96,17 5 4,0 96,03 5 4,0 96,17 10 8,0
120,13 4 3,0 120,13 4 3,0 120,17 9 7,0
144,18 4 3,0 144,03 3 2,0 168,17 6 4,0
168,22 3 2,0 168,17 2 1,0 240,17 4 2,0
192,20 3 2,0 192,12 2 1,0 288,17 3 1,0
216,23 2 1,0 216,15 2 1,0 336,17 4 2,0
240,23 2 1,0 240,07 2 1,0 504,17 3 1,0
720,73 <1,0 0,0 547,07 <1,0 0,0
Пациент 7 Пациент 8 Пациент 9
-438,43 < 1,0 NC -120,42 < 1,0 NC -193,05 8 NC
-1,27 4 0,0 -1,37 < 1,0 0,0 -0,82 3 0,0
0,22 46 42,0 0,25 129 128,0 0,28 100 97,0
0,42 38 34,1 0,47 117 116,0 0,63 93 90,1
1,17 30 26,2 1,35 102 101,0 1,17 94 91,1
3,17 28 24,5 3,22 98 97,0 3,20 80 77,3
6,17 24 20,8 6,17 80 79,0 6,22 69 66,6
9,17 22 19,2 9,17 72 71,0 9,15 64 61,9
24,17 14 12,4 24,72 53 52,0 23,15 47 45,0
48,82 10 9,0 48,90 30 29,0 46,62 25 23,0
72,57 6 5,0 72,38 19 18,0 70,10 17 15,0
96,57 5 4,0 96,40 14 13,0 94,15 13 11,0
121,15 4 3,0 120,30 9 8,0 118,13 9 7,0
144,10 3 2,0 168,77 6 5,0 166,10 5 3,0
168,82 2 1,0 240,27 3 2,0 238,15 3 1,0
192,77 2 1,0 288,83 2 1,0 286,15 2 0,0
240,57 2 1,0 337,03 2 1,0 335,57 2 0,0
744,57 3 2,0 840,28 <1,0 0,0 741,77 3 1,0
Пациент 10 Пациент 11 Пациент 12
-334,63 1 NC -912,28 2 NC -342,58 2 NC
-0,48 2 0,0 -0,15 2 0,0 -1,12 2 0,0
0,25 120 118,0 0,23 ПО 108,0 0,17 108 106,0
0,50 104 102,0 0,47 106 104,0 0,42 90 88,0
1,22 84 82,1 1,22 96 94,0 1,17 70 68,0
3,22 75 73,2 3,22 92 90,0 3,17 69 67,0
6,22 60 58,4 6,25 81 79,0 6,17 55 53,0
9,22 56 54,6 9,22 70 68,0 9,17 55 53,0
24,22 36 35,0 24,22 53 51,0 24,17 37 35,0
48,22 21 20,0 47,72 33 31,0 48,20 25 23,0
72,22 14 13,0 71,88 25 23,0 72,13 14 12,0
96,12 И 10,0 167,72 8 6,0 95,17 10 8,0
120,22 7 6,0 191,72 8 6,0 119,17 7 5,0
144,22 6 5,0 263,72 4 2,0 167,38 6 4,0
168,22 6 5,0 359,72 3 1,0 239,50 3 1,0
192,18 4 3,0 383,97 3 1,0 287,25 2 0,0
216,22 85 84,0 890,97 14 12,0 526,42 4 2,0
744,95 2 1,0
Примечание: данные, выделенные полужирным шрифтом, представляют возврат к базовому уровню и были исключены из анализа.
- 35 037095
Таблица 6. Фармакокинетические суммарные данные по средней активности FIXFc у отдельных пациентов и групповой.
Распределено по номинальной дозе, фактической дозе и номеру пациента
Номинал ьная доза (МЕ/кг) 12,5 Фактическая Пациен доза (МЕ/кг) т Стах (МЕ/д л) 11,9 1 AUCinf (ч*МЕ/дл ) 418 1 AUCa (%) 0,231 1 AUCP (%) 99,8 1 AUC/Доза (МЕ*ч/дл на МЕ/кг) 30,5 1 CI (мл/ч/кг) 3,28 1 V! (мл/кг) 102 1 VSs (мл/кг) 157 1 MRT (ч) 48,0 1 Альф a HL (ч) 0,140 1 Бета HL (ч) 33,3 1
13,714 N 1
25 27,25 | 2 19,9 753 2,50 97,8 27,6 3,62 134 275 76,0 1,20 54,0
N 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
54,5 3 34,5 1280 5,7 94,5 23,5 4,26 155 365 85,8 2,32 62,9
54,5 4 48,5 1450 12,4 87,7 26,6 3,76 111 282 75,1 3,64 58,9
54,5 5 33,0 1190 1,5 98,3 21,8 4,58 160 274 59,9 0,840 42,1
54,513 6 53,5 2960 1,0 99,1 54,3 1,84 100 149 81,1 1,07 56,7
55,878 7 38,6 1270 2,2 97,9 22,7 4,41 141 248 56,4 1,07 40,0
N 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
50 Среднее 41,6 1630 4,56 95,5 29,8 3,77 133 264 71,7 1,79 52,1
SD 8,97а 750 4,75 4,70 13,8 1,12 26,7 77,6 13,0 1,19 10,4
SE 4,01 335 2,13 2,10 6,18 0,501 11,9 34,7 5,79 0,531 4,65
Среднее 40,9 1530 2,98 95,4 27,9 3,59 131 254 70,7 1,52 51,3
геометрическое
CV% среднее геометрическое 21,4 39,1 136,5 5,0 39,4 39,4 21,1 33,8 18,8 68,6 21,0
109 10 98,9 3330 18,5 81,3 30,6 3,28 109 216 65,9 6,53 54,6
109 8 111 4580 28,9 71,1 42,0 2,38 98,0 145 61,1 13,2 54,2
109 9 92,1 3540 17,0 82,9 32,5 3,08 118 163 53,1 9,43 42,4е
109,176 11 99,1 5150 28,6 71,3 47,2 2,12 110 162 76,2 16,6 67,4
100 109,441 12 89,9 3060 9,2 90,8 28,0 3,58 121 207 57,9 4,19 43,8
N 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
Среднее 98,2 3930 20,4 79,5 36,1 2,89 111 179 62,8 9,99 52,5
SD 8,2Г 893е 8,37 8,37 8,17 0,615 8,98 31,1 8,82 4,99 10,1
SE 3,67 399 3,74 3,74 3,65 0,275 4,02 13,9 3,95 2,23 4,51
Среднее 97,9 3860 18,9 79,1 35,4 2,83 111 177 62,4 8,92 51,7
геометрическое
CV% Среднее геометрическое 8,2 22,4 49,7 10,5 22,4 22,5 8,2 17,4 13,8 59,4 19,0
Вследствие коррекции округления и других ошибок, (а) должно быть 8,98, (b) должно быть 8,23, (с) должно быть 892, и (d) должно быть 42,2.
Таблица 7А-7В. Вторичные фармакокинетические суммарные данные по средней активности FIXFc у отдельных пациентов и групповой.
Распределено по номинальной дозе, фактической дозе и номеру пациента
Номинал ьная доза (МЕ/кг) Факти ческая доза (МЕ/кг ) Пацие нт С168а (МЕ/дл) TBLPlb (День) TBLP3 С (День) TBLP5d (День) К значение® (МЕ/дл на МЕ/кг) К значениег (МЕ/дл на МЕ/кг) In Vivo повышени е концентра ции8 (%) In Vivo Повышен ие концентр ацииь (%)
12,5 13,714 1 0,264 4,34 2,13 1,11 0,87 0,95 30,8 33,6
N 1 1 1 1 1 1 1 1
25 27Ц5 |2 1,09 7,28 3,72 2,06 0,73 0,77 31,8 33,5
N 1 1 1 1 1 1 1 1
50 54,5 3 2,09 9,79 5,64 3,70 0,63 0,77 33,0 40,2
54,5 4 2,08 9,58 5,69 3,89 0,89 1,06 37,8 45,2
54,5 5 1,22 7,50 4,72 3,42 0,61 0,62 33,6 34,6
54,513 6 4,61 12,2 8,47 6,72 0,98 1,12 38,2 43,6
55,878 7 1,17 7,37 4,74 3,51 0,69 0,75 29,9 32,6
N 5 5 5 5 5 5 5 5
Среднее 2,23 9,29 5,85 4,25 0,76 0,86 34,5 39,2
SD 1,40 1,98 1,54 1,39 0,17 0,22 3,5 5,5
SE 0,627 0,886 0,687 0,623 0,074 0,0963 1,6 2,5
Среднее геометр ическо е 1,96 9,12 5,71 4,10 0,75 0,84 34,4 38,9
CV % среднее геометрическо е 60,0 21,2 24,1 28,6 21,5 25,4 10,2 14,4
- 36 037095 аС168 = Оцененная FIX активность выше базового уровня приблизительно 168 ч после дозы. Значение, выделенное курсивом, было оценено по стимуляции, осуществленной с использованием однокомпартментной модели и констант микроскопической степени пациента.
bTBLP1 = Модель-прогнозируемое время после дозы, когда FIX активность уменьшается до приблизительно 1 МЕ/дл выше базового уровня. Значения, выделенные курсивом, были оценены по стимуляции, проведенной с использованием однокомпартментной модели и констант микроскопической степени пациента.
cTBLP3 = Модель-прогнозируемое время после дозы, когда FIX активность уменьшается до приблизительно 3 МЕ/дл выше базового уровня.
dTBLP5 = Модель-прогнозируемое время после дозы, когда FIX активность уменьшается до приблизительно 5 МЕ/дл выше базового уровня.
eK-значение было рассчитано с использованием модель-прогнозируемого Cmax значения, сгенерированного по результатом с вычетом исходных вычтенных результатов, разделенных на дозу.
fK-значение было рассчитано с использованием наблюдаемого максимального после дозы результата пробы; K-значение = (с вычетом базового уровня Cmax наблюдаемый)/Доза).
gIn-vivo повышение концентрации = 100х(модель-прогнозируемое Cmax из данных с вычетом базового уровня/Доза)хобъем плазмы (дл)/Доза в ME; где объем плазмы в мл = (23,7xHt в см)+(9,0хWt в кг) 1709.
hIn-vivo Recovery = 100х(с вычетом базового уровня наблюдаемый Cmax)xобъем плазмы (дл)/Доза в ME; где объем плазмы в мл = (23,7xHt in cm)+(9,0xWt в кг) - 1709.
_____________________________________________________________________Таблица 7В
Номинал ьная доза (МЕ/кг) Фактиче ская доза (МЕ/кг) Пациен т С168а (МЕ/дл) TBLPlb (День) TBLP3C (День) TBLP5d (День) К значение6 (МЕ/дл на МЕ/кг) К значение] f (МЕ/дл на МЕ/кг) In Vivo повышен не концентр ацииё (%) In Vivo повышени е концентра ции11 (%)
100 10 4,08 11,6 8,01 6,34 0,91 1,08 43,4 51,8
109 8 4,88 12,1 8,57 6,92 1,02 1,17 28,7 33,1
109 9 3,09 9,87 7,07 5,78 0,84 0,89 39,7 41,8
109,176 11 6,77 14,7 10,3 8,21 0,91 0,99 27,8 30,3
109,441 12 3,09 9,96 7,07 5,72 0,82 0,97 35,8 42,2
N | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5
Среднее 4,38 11,6 8,20 6,59 0,90 1,02 35,1 39,8
SD 1,53 1,97 1,34 1,03 0,0784 0,11 6,8 8,5
SE 0,685 0,881 0,597 0,459 0,0351 0,0482 3,0 3,8
Среднее геометрическое 4,19 11,5 8,12 6,53 0,90 1,02 34,5 39,1
CV% среднее геометрическое 34,1 16,5 15,7 15,0 8,6 10,5 19,8 21,6
Таблица 8. Исследование фазы 1/2а: сравнение PK параметров для rFIXFc и BENEFIX™
Параметры *rFIXFc [Среднее+SD (min max)] |N=111 TBENEFIX™ [Среднее±8О (min - max)] 1 N= 11 ]
ti/2 (часы) 52,5 ±9,2 (40 - 67,4) 19,3 ±4,97(11,1 -36,4)
MRT (часы) 68,05 ±11,16 (53,1 - 85,8) 26,0 ±6,07(15,81 -46,09)
CL (мл/час/кг) 3,36 ±0,93 (1,84 - 4,58) 8,4 ±2,01 (4,66-13,64)
Постепенное повышение концентрации (МЕ/дл на МЕ/кг) 0,93 ±0,18 (0,62 - 1,17)a 0,75 ±0,23 (0,34- 1,38)
Стах (МЕ/дл на МЕ/кг) 24 ч после инъекции
AUC 48 ч после инъекции
*Оценки по 2-компартментному анализу FIX активности при номинальных дозах 25, 50 и 100МЕ/кг(п=11) t Суммарные характеристики продукта BENEFIX™ (18 ноября, 2009); Медиана и вариационный размах (n=56)
а. Диапазон, скорректированный из-за округления или других ошибок как 0,63 - 1,18.
По сравнению с данными в анамнезе по BENEFIX™, rFIX-Fc демонстрировал:
- 37 037095
3-х разовое возрастание периода полувыведения и среднего времени удержания;
24% улучшенное сравнительное постепенное повышение концентрации;
2,5- х уменьшенный клиренс.
Таблица 9. Фаза 1/2а исследования: дозопропорциональное возрастание Cmax и AUC rFIXFc (активность) I I
Доза # пациентов Стах (МЕ/дл) AUC (ч*МЕ/дл)
(МЕ/кг) [Среднее+SD (min max)] [Среднее±8О (min max)]
25 1 19,9 753
50 5 41,6 ±8,97 (33,0- 53,5) 1630 ±750(1190-2960)
100 5 98,2 ±8,21 (89,9- 111,0) 3930 ±893 (3060-5150)
Также см. фиг. 5.
Таблица 10А-10В. Оцененная терапевтическая продолжительность rFIXFc в дозах 50 и 100 МЕ/кг
Параметр Г еометрическая медиана
FIX:С на День 7 2,0 МЕ/дл (выше базового уровня)
Время при 1 МЕ/дл выше базового уровня 9,1 дней
Время при 3 МЕ/дл выше базового уровня 5,7 дней
FIX:С на День 7 4,2 МЕ/дл (выше базового уровня)
Время при 1 МЕ/дл выше базового уровня 11,5 дней
Время при 3 МЕ/дл выше базового уровня 8,1 дней
См. также фиг. 6А-6В.
ТаС 5лица 11. Дозо Доза (МЕ/кг) 25 •пропорционал # пациентов 1 ьное возрастание Cm Стах (нг/мл) [Среднее ±SD] 2730 ax и AUC для rFIXFc антиг AUC (ч*нг/мл) [Среднее ±SD] 144000 ена
50 5 7510 ±2480 408000 ±73900
100 5 15400 ±3960 897000 ± 206000
См. также фиг. 7.
- 38 037095
Таблица 12. Фармакокинетические оценки для rFIXFc антигена
Параметры 50 МЕ/кг [Среднее +SD] (N=5) 100 МЕ/кг [Среднее +SD] (N=5)
CL (мл/час/кг) 2,28 ± 0,37 2,11 ± 0,46
Vss (мл/кг) 259 + 78,5 238 + 52,2
MRT (часы) 112 + 21,5 114 ± 17,1
ti/2 (часы) ПО ±26,5 95,8 ± 11,1
См. также фиг. 8А-8В.
Таблица 13. Средние значения PK на основании активности
Стах (МЕ/дл) AUCINF (ч*МЕ/дл ) AUCa (%) AUCb (%) AUC/Доза (МЕ*ч/дл на МЕ/кг) С1 (мл/кг) VI (мл/ч/кг) VSS (мл/кг) MRT (ч) tl/2a (ч) tl/2₽ (ч)
η И 11 И И И 11 И И И И И
Средне е 65,364 2596,636 11,591 88,427 32,436 3,555 123,364 226,000 68,045 5,463 52,455
Ст, откл 32,9708 1497,1234 10,4490 10,5210 10,7506 0,9257 21,2804 69,7582 11,1637 9,1674
5,4197
%cv 50,4420 57,6563 90,1479 11,8980 33,1435 27,5890 17,2501 30,8664 16,4063 17,4768
99,2128
Медиа на 53,500 2960,000 9,200 90,800 28,000 3,580 118,000 216,000 65,900 3,640 54,200
Миним ум 19,90 753,00 1,00 71,10 21,80 1,84 98,00 145,00 53,10 0,84 40,00
Макси мум 111,00 5150,00 28,90 99,10 54,30 4,58 160,00 365,00 85,80 16,60 67,40
Геом. средне е 56,951 2181,294 6,781 87,826 31,020 3,226 121,767 216,533 67,218 3,326 51,715
η Среднее Ст, откл %CV Медиана Минимум С168 [1] (МЕ/дл) И 3,106 1,8231 58,6897 3,090 1,09 TBLP1 [2] (День) И 10,177 2,3315 22,9088 9,870 7,28 TBLP3 [3] (День) 11 6,727 2,0089 29,8623 7,070 3,72 TBLP5 [4] (День) И 5,115 1,8975 37,0944 5,720 2,06 Постепенное повышение концентраци И [5] (МЕ/дл на МЕ/кг) И 0,821 0,1387 16,8921 0,840 0,61 Постепенное повышение концентрац ИИ [6] (МЕ/дл на МЕ/кг) И 0,926 0,1787 19,2940 0,970 0,62 In Vivo повышение концентрац ии [7] (%) И 34,518 4,9250 14,2678 33,600 27,80 In Vivo повышение концентрац ии [8] (%) И 38,991 6,6636 17,0900 40,200 30,30
Максиму м 6,77 14,70 10,30 8,21 1,02 1,17 43,40 51,80
Геом, среднее 2,621 9,938 6,447 4,761 0,810 0,910 34,202 38,486
Сноски:
Примечание: значения PK параметра были определены по 2-компартментному способу.
Г еом. Среднее = Г еометрическое Среднее
[1] С168 = FIX активность выше базового уровня на 168 ч после дозы.
[2] TBLP1 = Оцененное время после дозы, когда FIX активность уменьшилась до 1 МЕ/дл выше базового уровня.
[3] TBLP3 = Оцененное время после дозы, когда FIX активность уменьшилась до 3 МЕ/дл выше базового уровня.
[4] TBLP5 = Оцененное время после дозы, когда FIX активность уменьшилась до 5 МЕ/дл выше ба-
- 39 037095 зового уровня.
[5] Нарастающее повышение концентрации было рассчитано с использованием модельпрогнозируемого Cmax значения, сгенерированного из исходноых вычтенных результатов, разделенных на дозу.
[6] Нарастающее повышение концентрации было рассчитано с использованием наблюдаемого максимального результата последозовой пробы; Повышение концентрации = (с вычетом базового уровня наблюдаемое Cmax )/Доза.
[7] In-vivo повышение концентрации = 100х(Модель-прогнозируемое Cmax из с вычетом базового уровня данных/Доза)хОбъем плазмы (дл)/Доза в ME; где объем плазмы в мл = (23,7xHt в cm)+(9,0xWt в кг) - 1709.
[8] In-vivo повышение концентрации = 100х(С вычетом базового уровня наблюдаемое Cmax)xОбъем плазмы (дл)/Доза в ME; где объем плазмы в мл = (23,7xHt в см)+(9,0xWt в кг) - 1709.
Таблица 14. Средние значения PK на основе уровня антигена
Номинальная доза (МЕ/кг) Фактическая доза (МЕ/кг) Эквивалентная доза (мг/кг) Пациент Стах (нг/мл) aucinf (ч*нг/мл) С1 (мл/ч/кг) Vss (мл/кг) MRT (ч) Альфа HL Бетаа HL
(ч) (ч)
12,5 13,714 0,228 1 1670 91300 2,5 245 98,2 21,2 107
25 27,25 0,453 2 2730 144000 3,14 273 87,1 11,3 71
50 54,5 0,905 3 5470 356000 2,54 366 144 18,6 138
54,5 0,905 4 6910 389000 2,32 244 105 10,6 85,3
54,5 0,905 5 7520 416000 2,17 184 84,5 NC 94,3
54,513 0,906 6 II700 531000 1,71 190 112 NC 140
55,878 0,928 7 5950 348000 2,67 310 116 10,1 93,9
100 109 1,81 10 12500 667000 2,72 263 96,8 9,79 78
109 1,81 8 21600 1200000 1,51 156 103 15,7 94,3
109 1,81 9 13400 998000 1,81 248 137 11,5 107
109,176 1,81 11 17200 844000 2,15 226 105 13 97,1
109,441 1,82 12 12500 778000 2,34 295 126 10,6 102
N 12 12 12 12 12 12 12
Среднее 9929,0 563525,0 2,3 250,0 109,6Ь 13,2е 100,7е
SD 5940,0 339925,0 0,5а 58,2 18,5 4,0е1 20,9
SE 1715,0 98128,0 0,1 16,8 5,3 1,3 6,0
Геометрическое Среднее 8014,0 452356,0 2,3 243,7 108,2 12,8 98,8
Вследствие коррекции округления или других ошибок, (а) должно быть 0,46, (b) должно быть 110, (с) должно быть 12,0, (d) должно быть 3,95 и (е) должно быть 101
Таблица 15. Биохимическая характеристика фактора IX
FIXFc rFIX pdFIX
Гамма-карбоксилирование
аа 1-23 % 6 Gia 97,8 96,9 99,6
(К1К2 пептид) % 5 Gia 2,2 3,1 0,4
% 4 Gia 0 0 0
аа 24-43 % 6 Gia 61,3 63,7 98,9
(КЗ пептид) % 5 Gla 26,3 30,9 1,1
% 4 Gla 12,5 5,4 0
Общее Gla/mol, пептидная карта 11,5 11,6 12,0
Общее Gla/mol, AAA 11,3 + 0,3 11,5 + 0,3 (12)
Содержание пропептидов не обнаружено не обнаружено не обнаружено
^-гидроксилирование Asp 64 70% 49% 37%
Сульфатация Туг 155 4% 5% (>90%)
Фосфорилирование Ser 158 <10% <10% (>90%)
Ala 148/Thr 148 0/100% 100/0% 30/70%
Активированный FIX <0,0125% 0,109 +/0,00185% 0,21 +/- 0,010%
FXIa активация 94,8 +/- 2,4% 96,6+/- 1,8% Не сделано
- 40 037095
Таблица 16. Сводка терминальных полупериодов FIXFc и BENEFIX™ после однократной внутривенной ________________________дозы________________________
Виды BENEFIX™ FIXFc
Нормальные мыши 12,3 ч 47,2 ± 4,8 ч
Дефицитные по FIX мыши 13,2 ч 46,2 ± 10,1ч
FcRN КО мыши 16,5 ± 3,0 ч 16,9 ±2,1 ч
FcRN Tg32b мыши 14,2 ± 2,9 ч 53,0 ± 6,6 ч
Крысы 5,8 ч 34,8 ± 5,3 ч
Дефицитные по FIX собаки 14-18ч* 47,5 ч
Обезьяна 12,7 ч f 47,3±9,1 ч
*Brinkhous et al., Blood, 1996; 88: 2603-2610.
fMcCarthy et al., 2002, Thromb Haemost, 2002; 87: 824-830.
Таблица 17. Сводка in vitro ROTEM® параметров для rFIXFc и BENEFIX™ впрыснутых в пулы цельной крови HemB мышей
% нормальной активности СТ (сек) (Среднее ± SD) CFT (сек) (Среднее + SD) Альфа Угол (°) (Среднее ± SD)
rFIXFc (п-10 пулов) 0,074 2263 ± 209 1152 ±170 24 ±5
0,74 1371 ± 82 459 ± 45 34 ±5
7,4 790,8 + 30 226 + 20 52 + 2
BENEFIX™ (п=10 пулов) ОД 2019 +178 732 +123 30 + 3
1 1090+38 324+33 43+3
10 551,1 + 38 127 +10 67 + 2
Таблица 18. Медианная потеря крови после отрезания хвоста у HemB мышей, обработанных rFIXFc или BENEFIX™
Доза (МЕ/кг) Мединная потеря крови (мл)
rFIXFc (п=15/доза) BENEFIX™ (п=15/доза) Наполнитель (п=18)
720 0,101
360 0,651 0,218
240 0,298
120 0,4567 0,564
80 0,8474
40 1,0097 0,918
0 1,1586
Таблица 19. Ex vivo ROTEM® параметр у HemB мышей, обработанных rFIXFc и BENEFIX™
Время (час) СТ (sec) (Среднее + SD) CFT (sec) (Среднее + SD) Альфа угол (степень) (Среднее + SD)
100 МЕ/кг BENEFIX™ (п=4 мыши/време иную точку) 0,083 599+23 174 +16 58 + 2
24 682 + 49 184 + 34 57 + 5
48 897 +114 310 + 89 45+7
72 1141 ± 155 508 ±123 32 ±7
96 1613 +181 605 + 92 27 + 3
50 МЕ/кг rFIXFc (п=8 мышей/време иную точку) 0,083 700 +18 213 + 9 53 + 1
24 836+31 261 +15 47 + 2
72 845 + 38 285 +17 45 + 2
96 957 + 30 296 + 26 43 + 2
120 1014 + 83 342 + 50 42 + 4
168 1139 ± 65 408 ± 41 36 ±3
216 1366 + 96 453 + 48 34 + 3
- 41 037095
Таблица 20А. PK параметры rFIXFc и BENEFIX™ (200 МЕ/кг) после подкожной инъекции однократной дозы дефицитным по FIX мышам (антиген ИФА)
Соединен не Доза нг/кг V/F мл/кг Hag ч AUCrw Ч*нг/ мл Абсорбция HL Ч Элими нация HL4 CL/F мл/Ч/кг Ттах Чг Стах нг/мл AUC/Д оза Ч.кг/м л: Стах/Д оза г/мл Е%
BENEFI 727273 3920 2,86 6397 1,96 23,9 114 10,6 148 0,00880 0,204 23,3
rFIXFc 327868 9 2071 0,896 14137 0 7,67 61,9 23,2 27,3 1178 0,0431 0,359 38,1
Таблица 20В. PK параметры rFIXFc и BENEFIX™ (200 МЕ/кг) после подкожной инъекции однократной ________дозы дефицитным по FIX мышам (антиген ИФА) (анализ аРТТ активности)________
Соединен ие Доза нг/кг V/F мл/кг Tlag ч AUCinf Ч*нг/ мл Абсорбция HL Ч Элими нация HL4 CL/F мл/Ч/кг Ттах Чг Стах нг/мл AUC/Д оза Ч.кг/мл: Стах/Д оза г/мл F%
BENEFIX 207 54,8 0,631 93,9 7,01 17,2 2,20 16,0 2,04 0,454 9,86 18,9
rFIXFc 172 25,1 2,32 418 6,84 42,4 0,411 23,8 4,82 2,43 28,0 29,1
Таблица 21. PK и PD анализы rFIXFc и BENEFIX™ после однократной подкожной дозы дефицитным по FIX мышам
Анализ AUC/Д оза (Ч*кг/мл) ЭЛИМ, полуперио Д(Ч) CL/F (мл/Ч/кг)/% Ттах (Ч) Стах/Доза (кг/мл) F (%)
rFIXFc 200 МЕ/кг Антиген 0,041 61,9 23,2 27,3 0,00035 38,1
BENEFIX™ 200 МЕ/кг Антиген 0,0073 23,9 114 10,6 0,00017 23,3
Соотношение (rFIXFc/BENEFIX™) Антиге н 5,62 2,59 0,20 2,58 2,05 1,63
rFIXFc 400 МЕ/кг Антиген 0,042 50,9 23,7 18,3 0,00045 45,6
BENEFIX™ 400 МЕ/кг Антиген 0,0089 20,2 113 8,13 0,00024 20,2
Соотношение (rFIXFc/BENEFIX™) Антиге н 4,72 2,52 0,21 2,25 1,91 2,26
AUC/Д оза (Ч*кг/мл) ЭЛИМ, полуперио Д (Нг) CL/F (мл/Ч/кг)/% Ттах (ч) Стах/Доза (кг/мл) F (%)
rFIXFc 200 МЕ/кг Активно сть 0,021 42,4 41,1 23,8 0,00024 29,1
BENEFIX™ 200 МЕ/кг Активно сть 0,0047 17,2 220 16,0 0,00010 18,9
Соотношение (rFIXFc/BENEFIX™) Активн ость 4,47 2,46 0,19 1,49 2,40 1,54
rFIXFc 400 МЕ/кг Активно сть 0,028 40,3 35,6 15,9 0,00037 39,2
BENEFIX™ 400 МЕ/кг Активно сть 0,0052 15,6 193 18,1 0,00010 15,5
Соотношение (rFIXFc/BENEFIX™) Активн ость 5,38 2,58 0,18 0,88 3,70 2,53
- 42 037095
Таблица 22. PK параметры rFIXFc (50 МЕ/кг) после подкожной инъекции однократной дозы яванским макакам
Групп а Животное_Ш v/F (мл/кг) AUC (Ч'нг/мл) Абсорбц ня EIL (Ч) Конечн ый HL (Ч) CL/F (мл/Ч/кг) Тшах (Ч) Стах (нг/мл) AUC/D ^Ч*кг/мл F(%)
50 МЕ/кг rFIXF С 5С4 545 109000 8,42 50,2 7,53 26,1 1050 0,133 43,7
С37716 975 108000 6,4 89 7,6 26,2 685 0,132 43,3
С41440 622 82500 8,54 43,4 9,93 24,9 885 0,101 33,1
N 3 3 3 3 3 3 3 3 3
Среднее 714 99800 7,79 60,9 8,35 25,7 873 0,122 40,1
SD 229 14900 1,2 24,6 1,37 0,685 182 0,0183 6,03
SE 132 8630 0,695 14,2 0,79 0,396 105 0,0106 3,48
Г еометрическое среднее 691 99000 7,72 57,9 8,28 25,7 860 0,121 39,7
CV% Геометриче ское среднее 31,2 15,8 16,4 39,4 15,8 2,68 21,7 15,9 15,9
Таблица 23. PK параметры rFIXFc (100 МЕ/кг) после подкожной инъекции однократной дозы яванским макакам.
Групп а Животное_Ш V/F (мл/кг) AUC (Ч'нг/мл) Абсорбц ня HL (Ч) Конечн ый HL (Ч) CL/F (мл/Ч/кг) Тшах (Ч) Стах (нг/мл) AUC/D ^Ч*кг/мл F(%)
100 МЕ/кг rFIXF С 29109 1630 69800 11,4 48,1 23,5 31 644 0,0426 14,0
605097 561 207000 5,12 49,2 7,9 18,6 2250 0,126 41,5
С35785 387 238000 6,37 39 6,89 19,9 2970 0,145 47,8
N 3 3 3 3 3 3 3 3 3
Среднее 858 172000 7,62 45,4 12,8 23,2 1950 0,105 34,4
SD 671 89600 3,31 5,58 9,3 6,79 1190 0,0546 18,0
SE 388 51700 1,91 3,22 5,37 3,92 687 0,0315 10,4
Г еометрическое среднее 707 151000 7,18 45,2 10,9 22,6 1630 0,0921 30,3
CV% Геометриче ское среднее 86.2 75.5 43,1 12,8 75,5 28,2 96,9 75,5 75,5
Таблица 24. PK параметры rFIXFc (200 МЕ/кг) после подкожной инъекции однократной дозы яванским макакам.
Групп а Животное_Ш V/F (мл/кг) AUC (Ч'нг/мл) Абсорбц ня HL (Ч) Конечн ый HL (Ч) CL/F (мл/Ч/кг) Тшах (Ч) Стах (нг/мл) AUC/D ^Ч*кг/мл F(%)
100 МЕ/кг rFIXF С 50883 855 408000 3,36 73,7 8,03 15,7 3310 0,124 40,9
С31129 461 415000 6,42 40,4 7,91 20,2 5030 0,127 41,6
С41410 147 262000 11,5 32,6 3,12 26,7 3160 0,0799 26,3
N 3 3 3 3 3 3 3 3 3
Среднее 487 362000 7,08 48,9 6,36 20,9 3830 0,110 36,3
SD 354 86100 4,08 21,8 2,8 5,51 1040 0,0263 8,67
SE 205 49700 2,36 12,6 1,62 3,18 598 0,0152 5,00
Г еометрическое среднее 387 354000 6,27 46 5,83 20,4 3750 0,108 35,5
CV% Геометриче ское среднее ПО 26,4 67,6 44,2 58,3 27 25,9 26,5 26,5
- 43 037095
Таблица 25. PK анализ rFIXFc после однократной подкожной дозы яванским макакам
rFIXFc (МЕ/кг ) AUC (Ч*нг/мл ) Абе. полупер иод (Ч) Элим. полупер иод (Нг) CL/F (мл/Ч/кг )/% Ттах (Ч) Стах (нг/мл) F(%)
50 Геом. средн ее 99000 7,72 57,9 8,28 25,7 860 39,7
CV% Geo. Μη 15,8 16,4 39,4 15,8 2,68 21,7 15,9
100 Геом. средн ее 221959 5,71 43,8 7,38 19,2 2585 44,5
CV% Geo. Μη 9,89 15,5 16,5 9,70 4,78 19,8 10,0
200 Геом. средн ее 354000 6,27 46 5,83 20,4 3750 35,5
CV% Геом. Ср. 26,4 67,6 44,2 58,3 27 25,9 26,5
Биодоступность в диапазоне от 35,5 до 44,5% для rFIXFc.
Полупериод элиминации в диапазоне от 43,8 до 57,9 ч для rFIXFc.
Таблица 26. Рекомендации по дозировке для rFIXFc терапии гемофилии В
Требуемая концентрация Частота фактора IX дозировки
Тип кровотечения (%) (часы)
Слабое
Носовое кровотечение
Гемартрозы, неосложненные 20-30 48
Поверхностное мышечное 20-30 48
Поверхностное мягкой ткани 20-30 48
Среднее Носовое кровотечение Внутримышечное с рассечением 25-50 48
Мягкая ткань с рассечением 25-50 48
Слизистые мембраны 25-50 48
Удаление зуба 25-50 48
Г ематурия 25-50 48
Гемартрозы, с ограниченной подвижностью 40-80 48
Сильное Носовое кровотечение 50-100 24-48
Глоточное 50-100 24-48
Заглоточное 50-100 24-48
Забрюшинное 50-100 24-48
Хирургия 50-100 24-48
CNS 50-100 24-48
Пациент должен консультироваться со своим лечащим врачом, но должен принимать только 1 следующую дозу по меньшей мере через 24-48 ч после первой дозы.
- 44 037095
Таблицы 27 А и 27В. Сравнение данных с использованиеа расчетов в (А) примере 1 и (В) примере
11.
Доза (МЕ/к г) Параметр (среднее±8П)
η Сгаах (МЕ/дл) AUCIM (ч· МЕ/дл) CL (мл/ч/кг) Vss (мл/кг) MRT (ч) Т1/2а(ч) Τ1/2β (ч) Постепенное увеличение концентрации (МЕ/дл на МЕ/кг)* C168h (МЕ/дл)1 Время при 1% выше базового уровня (День)*
25 1 19,9 753 3,62 275 76,0 1,20 54,0 0,77 1,09 7,28
50 5 41,6+8,97 /8,98 1630+750 3,77+1,12 264+77,6 71,7+13,0 1,79+1,19 52,1+10,4 0,86+0,22 2,23+1,40 9,29+1,98
100 5 98,2+8,21 /8,23 3930+893 2,89+0,615 179+31,1 62,8+8,82 9,99+4,99 52,5+10,1 1,02+0,11 4,38+1,53 11,6+1,97
25-100 11 ΝΑ* NA* ND ND ND ND ND ND ΝΑ* NA*
Доза (МЕ/к г) Параметр (среднее+SD) (Диапазон)
η Сгаах (МЕ/дл) АиСЮР (ч· МЕ/дл) CL (мл/ч/кг) Vss (мл/кг) MRT (ч) Τ1/2α (ч) Τ1/2β (ч) Постепенно е увеличение концентрац ии (МЕ/дл per МЕ/кг) C]68h (МЕ/дл)* Время при 1% выше базового уровня (День)*
25 1 20,4 766 3,56 271 76,2 0,61 53,5 0,77 1,11 7,3
50 5 47,5+12,8 (33,0- 61,1) 1700+550 (1300- 2660) 3,44+0,84 (2,05-4,18) 262+55,4 (163-296) 76,8+6,7 (67,9-85,9) 3,4+3,4 (0,138,72) 57,5+8,2 (47,9-67,2) 0,87+0,21 (0,63-1,12) 2,46 + 0,89 (1,63-3,92) 10,1 + 1,5 (8,4-12,3)
100 5 98,5+7,9 (90,8110) 4020+986 (30905130) 2,84+0,66 (2,13-3,55) 183+27,9 (162-221) 65,9+10,3 (53,2-76,5) 10,3+5,6 (3,97- 16,6) 56,5+14,1 (42,4-74,5) 1,02+0,11 (0,89-1,18) 4,65 + 1,73 (3,08-6,85) 12,3 +2,5 (9,9-15,0)
25-100 11 ΝΑ* NA* 3,18 + 0,78 (2,05-4,18) 227 + 58,6 (162-296) 71,8 + 10,0 (53,2-85,9) ΝΑ* 56,7 + 10,9 (42,4-74,5) 0,93 + 0,18 (0,63-1,18) NA* NA*
Представленные результаты являются средним ±SD с диапазоном, указанным в скобках Cmax показывает максимальную концентрацию; AUCINF, область под кривой (нулевое время, экстраполированное к времени на бесконечности); CL, клиренс; VSS, объем распределения в стабильном состоянии; MRT, среднее время удержания; Т1/2а, полупериод распределения; Т12β, полупериод элиминации; NA, не применимо. Повышение концентрации было рассчитано с использованием наблюдаемого Cmax с вычетом значения базового уровня перед лечением и разделенного на дозу.
t Плазматическая FIX активность выше базового уровня при 168 ч (7 дней) после дозы.
*Модель-прогнозируемое время после дозы, когда FIX активность уменьшается до 1 МЕ/дл выше базового уровня пациента.
§Данные не применимы, поскольку параметры не являются дозонезависимыми, таким образом среднее и SD значения не были рассчитаны по различным дозовым группам.
- 45 037095
Перечень последовательностей <110> БИОВЕРАТИВ ТЕРАПЬЮТИКС ИНК.
<120> Способ лечения гемофилии В и эпизодов кровотечения <130> 2159.273РС06 <140> PCT/US2011/043569 <141> 2011-07-11 <150> 61/470,951 <151> 2011-04-01 <150> 61/442,079 <151> 2011-02-11 <150> 61/438,572 <151> 2011-02-01 <150> 61/430,819 <151> 2011-01-07 <150> 61/424,555 <151> 2010-12-17 <150> 61/363,064 <151> 2010-07-09 <160> 4 < 170> Patentin version 3.5 < 210> 1 < 211> 7583 < 212> ДНК < 213> Искусственная < 220>
< 223> FIX-Fc цепь ДНК (pSYN-FIX-030) <400> 1
gcgcgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 60
ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 120
gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 180
caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 240
cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 300
ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 360
- 46 037095
tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 420
gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 480
gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 540
tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctctctggc 600
taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga 660
cccaagcttc gcgacgtacg gccgccacca tgcagcgcgt gaacatgatc atggcagaat 720
caccaggcct catcaccatc tgccttttag gatatctact cagtgctgaa tgtacaggtt 780
tgtttccttt tttaaaatac attgagtatg cttgcctttt agatatagaa atatctgatg 840
ctgtcttctt cactaaattt tgattacatg atttgacagc aatattgaag agtctaacag 900
ccagcacgca ggttggtaag tactgtggga acatcacaga ttttggctcc atgccctaaa 960
gagaaattgg ctttcagatt atttggatta aaaacaaaga ctttcttaag agatgtaaaa 1020
ttttcatgat gttttctttt ttgctaaaac taaagaatta ttcttttaca tttcagtttt 1080
tcttgatcat gaaaacgcca acaaaattct gaatcggcca aagaggtata attcaggtaa 1140
attggaagag tttgttcaag ggaatctaga gagagaatgt atggaagaaa agtgtagttt 1200
tgaagaagca cgagaagttt ttgaaaacac tgaaagaaca actgaatttt ggaagcagta 1260
tgttgatgga gatcagtgtg agtccaatcc atgtttaaat ggcggcagtt gcaaggatga 1320
cattaattcc tatgaatgtt ggtgtccctt tggatttgaa ggaaagaact gtgaattaga 1380
tgtaacatgt aacattaaga atggcagatg cgagcagttt tgtaaaaata gtgctgataa 1440
caaggtggtt tgctcctgta ctgagggata tcgacttgca gaaaaccaga agtcctgtga 1500
accagcagtg ccatttccat gtggaagagt ttctgtttca caaacttcta agctcacccg 1560
tgctgagact gtttttcctg atgtggacta tgtaaattct actgaagctg aaaccatttt 1620
ggataacatc actcaaagca cccaatcatt taatgacttc actcgggttg ttggtggaga 1680
agatgccaaa ccaggtcaat tcccttggca ggttgttttg aatggtaaag ttgatgcatt 1740
ctgtggaggc tctatcgtta atgaaaaatg gattgtaact gctgcccact gtgttgaaac 1800
tggtgttaaa attacagttg tcgcaggtga acataatatt gaggagacag aacatacaga 1860
gcaaaagcga aatgtgattc gaattattcc tcaccacaac tacaatgcag ctattaataa 1920
gtacaaccat gacattgccc ttctggaact ggacgaaccc ttagtgctaa acagctacgt 1980
- 47 037095
tacacctatt tgcattgctg acaaggaata cacgaacatc ttcctcaaat ttggatctgg 2040
ctatgtaagt ggctggggaa gagtcttcca caaagggaga tcagctttag ttcttcagta 2100
ccttagagtt ccacttgttg accgagccac atgtcttcga tctacaaagt tcaccatcta 2160
taacaacatg ttctgtgctg gcttccatga aggaggtaga gattcatgtc aaggagatag 2220
tgggggaccc catgttactg aagtggaagg gaccagtttc ttaactggaa ttattagctg 2280
gggtgaagag tgtgcaatga aaggcaaata tggaatatat accaaggtgt cccggtatgt 2340
caactggatt aaggaaaaaa caaagctcac tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc 2400
agctccggaa ctcctgggcg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac 2460
cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga 2520
ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa 2580
gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca 2640
ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc 2700
ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac 2760
cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa 2820
aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa 2880
ctacaagacc acgcctcccg tgttggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct 2940
caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga 3000
ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatgagaatt 3060
cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 3120
aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 3180
ataaacaagt tggggtgggc gaagaactcc agcatgagat ccccgcgctg gaggatcatc 3240
cagccggcgt cccggaaaac gattccgaag cccaaccttt catagaaggc ggcggtggaa 3300
tcgaaatctc gtagcacgtg tcagtcctgc tcctcggcca cgaagtgcac gcagttgccg 3360
gccgggtcgc gcagggcgaa ctcccgcccc cacggctgct cgccgatctc ggtcatggcc 3420
ggcccggagg cgtcccggaa gttcgtggac acgacctccg accactcggc gtacagctcg 3480
tccaggccgc gcacccacac ccaggccagg gtgttgtccg gcaccacctg gtcctggacc 3540
gcgctgatga acagggtcac gtcgtcccgg accacaccgg cgaagtcgtc ctccacgaag 3600
- 48 037095
tcccgggaga acccgagccg gtcggtccag aactcgaccg ctccggcgac gtcgcgcgcg 3660
gtgagcaccg gaacggcact ggtcaacttg gccatggttt agttcctcac cttgtcgtat 3720
tatactatgc cgatatacta tgccgatgat taattgtcaa cacgtgctga tcagatccga 3780
aaatggatat acaagctccc gggagctttt tgcaaaagcc taggcctcca aaaaagcctc 3840
ctcactactt ctggaatagc tcagaggcag aggcggcctc ggcctctgca taaataaaaa 3900
aaattagtca gccatggggc ggagaatggg cggaactggg cggagttagg ggcgggatgg 3960
gcggagttag gggcgggact atggttgctg actaattgag atgcatgctt tgcatacttc 4020
tgcctgctgg ggagcctggg gactttccac acctggttgc tgactaattg agatgcatgc 4080
tttgcatact tctgcctgct ggggagcctg gggactttcc acaccctcgt cgagctagct 4140
tcgtgaggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag 4200
ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg 4260
gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata 4320
agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggta 4380
agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc ttgcgtgcct 4440
tgaattactt ccacctggct ccagtacgtg attcttgatc ccgagctgga gccaggggcg 4500
ggccttgcgc tttaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg cctgggcgct 4560
ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct ttcgataagt 4620
ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg caagatagtc 4680
ttgtaaatgc gggccaggat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc gcgggcggcg 4740
acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga gcgcggccac 4800
cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct ggcctcgcgc 4860
cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca gttgcgtgag 4920
cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctc cagggggctc aaaatggagg acgcggcgct 4980
cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaagg ggcctttccg tcctcagccg 5040
tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat tagttctgga 5100
gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg gagtttcccc 5160
acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa ttctccttgg 5220
- 49 037095
aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca gtggttcaaa 5280
gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgaa cacgtggtcg cggccgcgcc gccaccatgg 5340
agacagacac actcctgcta tgggtactgc tgctctgggt tccaggttcc actggtgaca 5400
aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct gggaggaccg tcagtcttcc 5460
tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg 5520
tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg 5580
tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg 5640
tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca 5700
aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc 5760
agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg cgatgagctg accaagaacc 5820
aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg 5880
agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgttg gactccgacg 5940
gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg 6000
tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct 6060
ccctgtctcc gggtaaatga ctcgagagat ctggccggct gggcccgttt cgaaggtaag 6120
cctatcccta accctctcct cggtctcgat tctacgcgta ccggtcatca tcaccatcac 6180
cattgagttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 6240
gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 6300
taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 6360
ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat 6420
gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagtg gcggtaatac ggttatccac 6480
agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 6540
ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 6600
caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 6660
gtttccccct agaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 6720
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 6780
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 6840
- 50 037095
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 6900
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 6960
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 7020
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 7080
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 7140
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 7200
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac 7260
gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct 7320
cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg 7380
cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat 7440
tgtactgaga gtgcaccata tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 7500
taccgcatca ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg 7560
cgggcctctt cgctattacg cca 7583
<210> 2
<211> 688
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> FIX-Fc цепь
<220> <221> Сигнальная последовательность
<222> (1)--(28)
<220> <221> Пропептид
<222> (29)..(46)
<220> <221> зрелый пептид
<222> (47)..(688)
<220> <221> прочий признак
<222> (1)--(415)
<223> FIX часть
<220>
- 51 037095 <221> прочий признак <222> (416)..(688) <223> Fc часть <400> 2
Met Gin Arg Vai Asn Met lie Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu lie Thr
-45 -40-35 lie Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Vai Phe Leu
-30 -25 -20-15
Asp His Glu Asn Ala Asn Lys lie Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn -10 -5-1 1
Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Vai Gin Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys 5 1015
Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Vai Phe Glu Asn 20 2530
Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gin Tyr Vai Asp Gly Asp Gin 35 40 4550
Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp lie 55 6065
Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys 70 7580
Glu Leu Asp Vai Thr Cys Asn lie Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gin Phe 85 9095
Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Vai Vai Cys Ser Cys Thr Glu Gly
100 105110
Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gin Lys Ser Cys Glu Pro Ala Vai Pro Phe 115 120 125130
Pro Cys Gly Arg Vai Ser Vai Ser Gin Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala 135 140145
- 52 037095
Glu Thr Vai Phe Pro Asp Vai Asp Tyr Vai Asn Ser Thr Glu Ala Glu
150 155160
Thr lie Leu Asp Asn lie Thr Gin Ser Thr Gin Ser Phe Asn Asp Phe 165 170175
Thr Arg Vai Vai Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gin Phe Pro Trp
180 185190
Gin Vai Vai Leu Asn Gly Lys Vai Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser lie
195 200 205210
Vai Asn Glu Lys Trp lie Vai Thr Ala Ala His Cys Vai Glu Thr Gly 215 220225
Vai Lys lie Thr Vai Vai Ala Gly Glu His Asn lie Glu Glu Thr Glu
230 235240
His Thr Glu Gin Lys Arg Asn Vai lie Arg lie lie Pro His His Asn 245 250255
Tyr Asn Ala Ala lie Asn Lys Tyr Asn His Asp lie Ala Leu Leu Glu
260 265270
Leu Asp Glu Pro Leu Vai Leu Asn Ser Tyr Vai Thr Pro lie Cys lie 275 280 285290
Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn lie Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr 295 300305
Vai Ser Gly Trp Gly Arg Vai Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Vai 310 315320
Leu Gin Tyr Leu Arg Vai Pro Leu Vai Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg 325 330335
Ser Thr Lys Phe Thr lie Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His
340 345350
Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Vai 355 360 365370
- 53 037095
Thr Glu Vai Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly lie lie Ser Trp Gly 375 380385
Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly lie Tyr Thr Lys Vai Ser
390 395400
Arg Tyr Vai Asn Trp lie Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr Asp Lys Thr 405 410415
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
420 425430
Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg
435 440 445450
Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro 455 460465
Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala 470 475480
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai 485 490495
Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
500 505510
Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr
515 520 525530 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu 535 540545
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys
550 555560
Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser 565 570575
- 54 037095
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
600
610
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
620
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
630
640 <210> 3 <211> 741 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Fc ДНК последовательность <400> 3 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt60 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggagg accgtcagtc120 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca180 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac240 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac300 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag360 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa420 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgcgatga gctgaccaag480 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag540 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc600 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg660 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc720 ctctccctgt ctccgggtaa a741 <210> 4 <211> 247
- 55 037095 <212> Белок <213> Искусственная <220>
<223> Fc цепь <220>
<221> SIGNAL <222> (1)..(20) < 223> Гетерологичный сигнальный пептид легкой цепи Igk мыши < 220>
< 221> зрелый пептид < 222> (21)..(247) < 223> Зрелая последовательность Fc < 400> 4
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro -20 -15 -10-5
Gly Ser Thr Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro -11 510
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 15 2025
Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 30 3540
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 45 50 5560
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 65 7075
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 80 8590
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 95 100105
Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg
110 115120
- 56 037095
Glu
125
Pro
Gin
Vai
Tyr
Thr
130
Leu
Pro
Pro
Ser
Arg 135
Asp
Glu
Leu
Thr
Lys 140
Asn
Gin
Vai
Ser
Leu 145
Thr
Cys
Leu
Vai
Lys 150
Gly
Phe
Tyr
Pro
Ser 155
Asp
He
Ala
Vai
Glu
160
Trp
Glu
Ser
Asn
Gly 165
Gin
Pro
Glu
Asn
Asn 170
Tyr
Lys
Thr
Thr
Pro 175
Pro
Vai
Leu
Asp
Ser 180
Asp
Gly
Ser
Phe
Phe 185
Leu
Tyr
Ser
Lys
Leu 190
Thr
Vai
Asp
Lys
Ser 195
Arg
Trp
Gin
Gin
Gly 200
Asn
Vai
Phe
Ser
Cys 205
Ser
Vai
Met
His
Glu
210
Ala
Leu
His
Asn
His
215
Tyr
Thr
Gin
Lys
Ser
220
Leu
Ser
Leu
Ser
Pro 225
Gly
Lys

Claims (19)

1. Способ лечения гемофилии В, включающий внутривенное введение больному человеку множественных доз от приблизительно 50 МЕ/кг до приблизительно 100 МЕ/кг химерного полипептида фактора (FIX), содержащего FIX человека с аминокислотой последовательностью, идентичной аминокислотам 1-415 последовательности SEQ ID NO: 2, и FcRn связывающий партнер (FcRn ВР), с интервалом дозирования, составляющим от приблизительно 10 до приблизительно 14 дней между дозами, где FcRn BP представляет собой Fc человека или альбумин человека, и где введение обеспечивает лечение человека, которое заключается в снижении частоты спонтанного кровотечения.
2. Способ лечения эпизода кровотечения по необходимости, включающий внутривенное введение больному человеку многократных доз от приблизительно 50 МЕ/кг до приблизительно 100 МЕ/кг полипептида химерного фактора IX (FIX), содержащего FIX человека с аминокислотной последовательностью, идентичной аминокислотам 1-415 последовательности SEQ ID NO: 2, и FcRn связывающий партнер (FcRn BP), с интервалом дозирования, составляющим от приблизительно 10 до приблизительно 14 дней между дозами, где FcRn ВР представляет собой Fc человека или альбумин человека, где больной страдает гемофилией В.
3. Способ по п.2, где эпизод кровотечения вызван хирургическим вмешательством.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где интервал дозирования составляет 10 дней.
5. Способ по любому из пп. 1-3, где интервал дозирования составляет 11 дней.
6. Способ по любому из пп. 1-3, где интервал дозирования составляет 12 дней.
7. Способ по любому из пп. 1-3, где интервал дозирования составляет 13 дней.
8. Способ по любому из пп. 1-3, где интервал дозирования составляет 14 дней.
9. Способ по любому из пп.1-8, где каждая из множественных доз составляет приблизительно 50 МЕ/кг, приблизительно 60 МЕ/кг, приблизительно 70 МЕ/кг, приблизительно 80 МЕ/кг, приблизительно 90 МЕ/кг или приблизительно 100 МЕ/кг.
10. Способ по любому из пп.1-9, где больной человека демонстрирует активность FIX в плазме выше 1 МЕ/дл во время интервала дозирования.
11. Способ по любому из пп.1-9, где больной человек демонстрирует активность FIX в плазме выше 2 МЕ/дл во время интервала дозирования.
12. Способ по любому из пп.1-9, где больной человека демонстрирует активность FIX в плазме выше 3 МЕ/дл во время интервала дозирования.
13. Способ по любому из пп.1-9, где больной человека демонстрирует активность FIX в плазме выше 4 МЕ/дл во время интервала дозирования.
14. Способ по любому из пп.1-9, где больной человека демонстрирует активность FIX в плазме выше 5 МЕ/дл во время интервала дозирования.
- 57 037095
15. Способ по любому из пп.1-14, где химерный полипептид FIX содержит FIX человека с аминокислотной последовательностью, идентичной аминокислотам 1-415 последовательности SEQ ID NO: 2, и
Fc человека.
16. Способ по п.15, где Fc человек содержит аминокислоты 1-227 последовательности SEQ ID NO:
4.
17. Способ по любому из пп.1-14, где химерный полипептид FIX содержит FIX человека с аминокислотной последовательностью, идентичной аминокислотам 1-415 последовательности SEQ ID NO: 2, и альбумин человека.
18. Способ по любому из пп.1-17, где химерный полипептид дополнительно содержит линкер, соединяющий FIX человека и Fc человека или альбумин человека.
19. Способ по любому из пп.10-18, где активность FIX в плазме измеряют с помощью одностадийного анализа свертывания крови, определяющего частичное тромбопластиновое время.
EA201790876A 2010-07-09 2011-07-11 Способ лечения гемофилии в и эпизодов кровотечения EA037095B1 (ru)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36306410P 2010-07-09 2010-07-09
US201061424555P 2010-12-17 2010-12-17
US201161430819P 2011-01-07 2011-01-07
US201161438572P 2011-02-01 2011-02-01
US201161442079P 2011-02-11 2011-02-11
US201161470951P 2011-04-01 2011-04-01

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201790876A1 EA201790876A1 (ru) 2017-12-29
EA037095B1 true EA037095B1 (ru) 2021-02-05

Family

ID=45441870

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201790876A EA037095B1 (ru) 2010-07-09 2011-07-11 Способ лечения гемофилии в и эпизодов кровотечения
EA201291480A EA028067B1 (ru) 2010-07-09 2011-07-11 Способы контроля или предотвращения кровотечения или эпизодов кровотечения

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201291480A EA028067B1 (ru) 2010-07-09 2011-07-11 Способы контроля или предотвращения кровотечения или эпизодов кровотечения

Country Status (17)

Country Link
US (13) US9670475B2 (ru)
EP (2) EP3552619A1 (ru)
JP (5) JP2013534426A (ru)
KR (5) KR20190104442A (ru)
CN (1) CN103140237A (ru)
AU (5) AU2011274414B2 (ru)
BR (1) BR112013000650A8 (ru)
CA (1) CA2804274A1 (ru)
CL (1) CL2013000058A1 (ru)
EA (2) EA037095B1 (ru)
IL (3) IL223990B (ru)
MX (2) MX356527B (ru)
MY (2) MY192639A (ru)
NZ (1) NZ605348A (ru)
SG (3) SG10201505218YA (ru)
UA (2) UA115120C2 (ru)
WO (1) WO2012006624A2 (ru)

Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
WO2010091122A1 (en) 2009-02-03 2010-08-12 Amunix, Inc. Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
US20120263701A1 (en) 2009-08-24 2012-10-18 Volker Schellenberger Coagulation factor vii compositions and methods of making and using same
UA115120C2 (uk) 2010-07-09 2017-09-25 Байоджен Хемофіліа Інк. Спосіб застосування химерного поліпептиду фактора ix
KR20140002601A (ko) 2010-07-09 2014-01-08 바이오겐 이데크 헤모필리아 인코포레이티드 키메라 응고 인자
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CA2821992A1 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US10656167B2 (en) 2011-07-25 2020-05-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Assays to monitor bleeding disorders
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
ES2911677T3 (es) 2011-10-03 2022-05-20 Modernatx Inc Nucleósidos, nucleótidos y ácidos nucleicos modificados, y sus usos
DE12858350T1 (de) 2011-12-16 2021-10-07 Modernatx, Inc. Modifizierte mrna zusammensetzungen
EA029560B1 (ru) * 2012-01-12 2018-04-30 Байоджен Эмэй Инк. Применение химерного фактора свертывания крови для уменьшения ингибирующего иммунного ответа у субъекта
LT2814840T (lt) 2012-02-15 2020-02-25 Bioverativ Therapeutics Inc. Faktoriaus viii kompozicijos ir jų gavimo ir naudojimo būdai
EP2822577B1 (en) 2012-02-15 2019-02-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
EP3501550A1 (en) 2012-04-02 2019-06-26 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US10317376B2 (en) 2012-04-11 2019-06-11 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of detecting glycosaminoglycans
EP4079316A1 (en) 2012-06-08 2022-10-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Procoagulant compounds
WO2013185114A2 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Biogen Idec Ma Inc. Chimeric clotting factors
US10001495B2 (en) 2012-07-25 2018-06-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Blood factor monitoring assay and uses thereof
WO2014052490A1 (en) * 2012-09-25 2014-04-03 Biogen Idec Ma Inc. Methods of using fix polypeptides
EP2908847B1 (en) * 2012-10-18 2022-03-30 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using a fixed dose of a clotting factor
EP2922871B1 (en) * 2012-11-20 2019-06-19 The University of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for modified factor ix proteins
US9597380B2 (en) 2012-11-26 2017-03-21 Modernatx, Inc. Terminally modified RNA
US10717965B2 (en) 2013-01-10 2020-07-21 Gloriana Therapeutics, Inc. Mammalian cell culture-produced neublastin antibodies
DK3889173T3 (da) 2013-02-15 2023-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc Optimeret faktor viii-gen
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
UY35463A (es) * 2013-03-15 2014-10-31 Biogen Idec Inc Formulaciones de polipéptido fc-factor ix.
EP3033097B1 (en) 2013-08-14 2021-03-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii-xten fusions and uses thereof
HUE057005T2 (hu) 2013-09-25 2022-04-28 Bioverativ Therapeutics Inc Oszlopon történõ vírusinaktiváló eljárások
EP3052521A1 (en) 2013-10-03 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
US10325687B2 (en) 2013-12-06 2019-06-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Population pharmacokinetics tools and uses thereof
JP2017500017A (ja) 2013-12-20 2017-01-05 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 生物薬剤フェドバッチ生産能力及び生産物品質を改善するための灌流シード培養の使用
EP3086804A4 (en) * 2013-12-23 2017-07-19 CSL Limited Fusion proteins comprising factor ix for prophylactic treatment of hemophilia and methods thereof
KR20230136616A (ko) 2014-02-04 2023-09-26 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 번역 후 변형을 강화시키기 위한 통류 방식 양이온교환 크로마토그래피의 용도
KR102385372B1 (ko) * 2014-03-24 2022-04-11 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 동결건조된 ix 인자 제형
WO2016004113A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Biogen Ma Inc. Optimized factor ix gene
MA40864A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Hypotaurine, gaba, bêta-alanine et choline pour la régulation de l'accumulation de sous-produits résiduaires dans des procédés de culture de cellules mammifères
AU2016301303B2 (en) 2015-08-03 2021-10-07 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor IX fusion proteins and methods of making and using same
PT3411478T (pt) 2016-02-01 2022-09-13 Bioverativ Therapeutics Inc Genes do fator viii otimizados
EA201892347A1 (ru) 2016-04-15 2019-04-30 Баксалта Инкорпорейтед Способ и устройство для предоставления фармакокинетической схемы дозирования лекарственных препаратов
TW201739448A (zh) * 2016-05-06 2017-11-16 安成生物科技股份有限公司 用於治療及/或預防血液相關疾病之方法及配方
AU2017294555B2 (en) 2016-07-08 2022-04-28 CSL Behring Lengnau AG Subcutaneous administration of long-acting factor IX in humans
EP3502143A4 (en) 2016-08-19 2020-07-15 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. BINDING PEPTIDE FOR THE CONSTRUCTION OF A FUSION PROTEIN
CN106279437B (zh) 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
CN106317226B (zh) 2016-08-19 2017-09-05 安源医药科技（上海）有限公司 用于构建融合蛋白的连接肽
EP3548066A1 (en) 2016-12-02 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilic arthropathy using chimeric clotting factors
US10896749B2 (en) 2017-01-27 2021-01-19 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Drug monitoring tool
TW201831521A (zh) 2017-01-31 2018-09-01 美商生物化學醫療公司 因子ｉｘ融合蛋白以及其製備方法及使用方法
US11045128B2 (en) 2017-06-03 2021-06-29 Sentinel Medical Technologies, LLC Catheter for monitoring intra-abdominal pressure
US10813589B2 (en) 2017-06-03 2020-10-27 Sentinel Medical Technologies, LLC Catheter for monitoring uterine contraction pressure
US11185245B2 (en) 2017-06-03 2021-11-30 Sentinel Medical Technologies, Llc. Catheter for monitoring pressure for muscle compartment syndrome
US10799131B2 (en) 2017-06-03 2020-10-13 Sentinel Medical Technologies, LLC Catheter for monitoring intrauterine pressure to protect the fallopian tubes
US11045143B2 (en) 2017-06-03 2021-06-29 Sentinel Medical Technologies, LLC Catheter with connectable hub for monitoring pressure
MX2019014651A (es) 2017-06-29 2020-02-07 CSL Behring Lengnau AG Regimen de dosificacion de 21 dias para proteinas de fusion que comprenden el factor ix y albumina humana para el tratamiento profilactico de hemofilia y metodos del mismo.
SG11202000764RA (en) 2017-08-09 2020-02-27 Bioverativ Therapeutics Inc Nucleic acid molecules and uses thereof
MX2020003351A (es) 2017-09-27 2020-10-12 Sigilon Therapeutics Inc Metodos, composiciones y elementos implantables que comprenden celulas activas.
US20210145889A1 (en) 2018-04-04 2021-05-20 Sigilon Therapeutics, Inc. Methods, compositions, and implantable elements comprising stem cells
TW202014181A (zh) 2018-04-04 2020-04-16 美商希吉隆醫療公司 可植入顆粒及相關方法
AU2019270184A1 (en) 2018-05-18 2020-11-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilia A
MX2021001599A (es) 2018-08-09 2021-07-02 Bioverativ Therapeutics Inc Moleculas de acido nucleico y sus usos para la terapia genica no viral.
UY38389A (es) 2018-09-27 2020-04-30 Sigilon Therapeutics Inc Dispositivos implantables para terapia celular y métodos relacionados
US11672457B2 (en) 2018-11-24 2023-06-13 Sentinel Medical Technologies, Llc. Catheter for monitoring pressure
US11779263B2 (en) 2019-02-08 2023-10-10 Sentinel Medical Technologies, Llc. Catheter for monitoring intra-abdominal pressure for assessing preeclampsia
KR20210141608A (ko) 2019-03-19 2021-11-23 체에스엘 베링 렝나우 아게 치료요법에서 인자 ix 변이체 및 이의 용도
KR20220009389A (ko) 2019-04-17 2022-01-24 코디악 바이오사이언시즈, 인크. 엑소좀 및 aav 의 조성물
CN112175088B (zh) * 2019-07-02 2023-03-28 江苏晟斯生物制药有限公司 改进的fix融合蛋白、缀合物及其应用
WO2021026020A1 (en) 2019-08-08 2021-02-11 Sentinel Medical Technologies, LLC Cable for use with pressure monitoring catheters
US11617543B2 (en) 2019-12-30 2023-04-04 Sentinel Medical Technologies, Llc. Catheter for monitoring pressure
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation
EP4362971A1 (en) * 2021-07-01 2024-05-08 CSL Behring Lengnau AG Factor ix subcutaneous administration with enhanced safety
WO2024081309A1 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Sigilon Therapeutics, Inc. Engineered cells and implantable elements for treatment of disease
WO2024081310A1 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Sigilon Therapeutics, Inc. Engineered cells and implantable elements for treatment of disease

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009130602A2 (en) * 2008-04-24 2009-10-29 Celtic Pharma Peg Ltd. Factor ix conjugates with extended half-lives
EA012566B1 (ru) * 2003-05-06 2009-10-30 Синтоникс Фармасьютикалз, Инк. Химерный белок, способ его получения и способ лечения заболеваний с применением химерного белка

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4786726A (en) * 1986-01-06 1988-11-22 Blood Systems, Inc. Factor IX therapeutic blood product, means and methods of preparing same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
US4994371A (en) 1987-08-28 1991-02-19 Davie Earl W DNA preparation of Christmas factor and use of DNA sequences
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
US6406697B1 (en) 1989-02-23 2002-06-18 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
EP0394827A1 (en) 1989-04-26 1990-10-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Chimaeric CD4-immunoglobulin polypeptides
US5766883A (en) 1989-04-29 1998-06-16 Delta Biotechnology Limited Polypeptides
ATE92107T1 (de) 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
EP1132471A3 (de) 1989-09-12 2001-11-28 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
EP0517895B1 (en) 1990-12-14 1996-11-20 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
US6037452A (en) 1992-04-10 2000-03-14 Alpha Therapeutic Corporation Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate
ES2252732T3 (es) 1992-05-26 2006-05-16 Immunex Corporation Nueva citoquina que une cd30.
US6277975B1 (en) 1992-10-23 2001-08-21 Genetics Institute, Inc. Fusions of P-selectin ligand protein and polynucleotides encoding same
US5621039A (en) 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
EP0742830B1 (en) 1994-02-01 2001-07-18 THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Fusion proteins that include antibody and nonantibody portions
GB9415379D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
NZ292124A (en) 1994-07-29 1998-10-28 Smithkline Beecham Plc Il-4 antagonist comprising a fusion of a mutant il-4-antibody fragment
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
ATE331438T1 (de) 1995-01-17 2006-07-15 Brigham & Womens Hospital Rezeptorspezifischer transepithelealer transport von immunogenen
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
CA2249195A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
ES2340008T3 (es) 1997-02-14 2010-05-27 American Red Cross Expresion de factor ix humano activo en tejido mamario de animales transgenicos.
BR9815975A (pt) 1998-07-31 2001-12-04 Wallace E Carroll Método e aparelho para a determinação defatores de terapia anticoagulante
US20010031721A1 (en) 1999-05-05 2001-10-18 Chandra Webb Highly concentrated, lyophilized, and liquid factor IX formulations
US20030096355A1 (en) * 1999-07-09 2003-05-22 Ke Zhang Isolation, identification and characterization of ymkz5, a novel member of the TNF-receptor supergene family
CA2399832C (en) 2000-02-11 2011-09-20 Stephen D. Gillies Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
EP1276756A4 (en) 2000-04-12 2004-06-09 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
AU2001252084B2 (en) 2000-04-28 2006-07-06 Inflazyme Pharmaceuticals Limited 3-nitrogen-6,7-dioxygen steroids and uses related thereto
WO2002040544A2 (en) 2000-11-14 2002-05-23 Board Of Regents, University Of Texas Systems Mutant human factor ix with an increased resistance to inhibition by heparin
US20030203845A1 (en) 2001-02-05 2003-10-30 Knudsen Jens Bjerre Combined use of factor VII polypeptides and factor IX polypeptides
WO2003020764A2 (en) 2001-09-04 2003-03-13 Merck Patent Gmbh Modified factor ix
SG159381A1 (en) 2001-10-10 2010-03-30 Novo Nordisk As Remodeling and glycoconjugation of peptides
WO2003059934A2 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
ES2545090T3 (es) 2001-12-21 2015-09-08 Human Genome Sciences, Inc. Proteínas de fusión de albúmina y GCSF
KR101204712B1 (ko) * 2003-03-18 2012-11-27 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 Ｇｌａ-잔기 함유 세린 프로테아제의 제조 방법
WO2006127896A2 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor ix
MXPA05010846A (es) 2003-04-09 2006-03-30 Nektar Therapeutics Tratamiento de hemofilia mediante inhalacion de factores de coagulacion.
EP1624891B2 (en) 2003-05-06 2013-04-10 Biogen Idec Hemophilia Inc. Clotting factor-fc chimeric proteins to treat hemophilia
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7212798B1 (en) * 2003-07-17 2007-05-01 Cisco Technology, Inc. Adaptive AGC in a wireless network receiver
EP1653996A2 (en) 2003-08-08 2006-05-10 Novo Nordisk Health Care AG Use of galactose oxidase for selective chemical conjugation of protractor molecules to proteins of therapeutic interest
JP2007531707A (ja) * 2003-10-15 2007-11-08 ピーディーエル バイオファーマ， インコーポレイテッド ＩＧの重鎖定常領域の位置２５０、３１４および／または４２８の変異誘発によるＦｃ融合タンパク質血清半減期の改変
AU2004296860B2 (en) 2003-12-03 2010-04-22 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
BRPI0514396A2 (pt) 2004-08-17 2009-05-12 Csl Behring Gmbh polipeptìdeos dependentes de vitamina k modificada
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
EP1831363A1 (en) 2004-12-21 2007-09-12 Novo Nordisk Health Care AG Expression of gamma-carboxylated polypeptides in gamma-carboxylation deficient host systems
US20060162552A1 (en) 2005-01-26 2006-07-27 Mohawk Valley Energy Solutions, Inc. Systems and methods for controlling room air quality
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
WO2007053533A2 (en) 2005-11-01 2007-05-10 Wyeth Sodium chloride solution for drug reconstitution or dilution
US8759292B2 (en) 2006-02-03 2014-06-24 Prolor Biotech, Llc Long-acting coagulation factors and methods of producing same
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
EP1996937A4 (en) 2006-03-06 2009-04-08 Amunix Inc GENETIC PACKS AND USES THEREOF
LT2004683T (lt) 2006-03-24 2016-10-10 Biogen Hemophilia Inc. Pc5, kaip faktoriaus ix pro-peptidą apdorojantis fermentas
PL2007885T3 (pl) * 2006-04-11 2010-12-31 Csl Behring Gmbh Sposób zwiększania odzysku peptydów terapeutycznych in vivo
BRPI0712008A2 (pt) 2006-05-24 2012-01-10 Novo Nordisk Healthcare Ag derivados e análogos de fix prolongados
US7939632B2 (en) 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
KR101641899B1 (ko) 2006-06-14 2016-08-01 체에스엘 베링 게엠베하 혈액 응고 인자를 포함하는 단백질분해적으로 절단가능한 융합 단백질
EP2084274A2 (en) 2006-06-19 2009-08-05 Nautilus Technology LLC Modified coagulation factor ix polypeptides and use thereof for treatment
JP2009543841A (ja) 2006-07-17 2009-12-10 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー 増加した活性を有する第ｖｉｉａ因子アナログの新規用途
WO2008022151A1 (en) 2006-08-15 2008-02-21 Inspiration Biopharmaceuticals, Inc. Prophylactic treatment of hemophilia
US20100113339A1 (en) * 2006-09-08 2010-05-06 Ablynx N. V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
US7700734B2 (en) 2007-01-09 2010-04-20 Shu-Wha Lin Recombinant human factor IX and use thereof
WO2008119815A1 (en) 2007-04-02 2008-10-09 Novo Nordisk A/S Subcutaneous administration of coagulation factor ix
US8933197B2 (en) 2007-08-15 2015-01-13 Amunix Operating Inc. Compositions comprising modified biologically active polypeptides
JP5613876B2 (ja) 2007-10-15 2014-10-29 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル 延長された半減期を備えるヒト第ｉｘ因子変異体
CN102065887A (zh) 2008-04-16 2011-05-18 拜耳医药保健有限公司 因子ix的定点修饰
CN102083856A (zh) 2008-04-16 2011-06-01 拜耳医药保健有限公司 经修饰的因子ix多肽及其用途
EP2268807A2 (en) 2008-04-21 2011-01-05 Novo Nordisk A/S Hyperglycosylated human coagulation factor ix
US20090282865A1 (en) 2008-05-16 2009-11-19 Ortloff Engineers, Ltd. Liquefied Natural Gas and Hydrocarbon Gas Processing
AU2009284113B2 (en) 2008-08-21 2015-05-14 Octapharma Ag Recombinantly produced human factor VIII and IX
CN102164943A (zh) 2008-09-24 2011-08-24 稳定技术有限公司 使用糖和聚乙烯亚胺保存多肽的方法
WO2010091122A1 (en) 2009-02-03 2010-08-12 Amunix, Inc. Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
JP5936112B2 (ja) 2009-02-11 2016-06-15 アルブミディクス アクティーゼルスカブ アルブミン変異体及び複合体
WO2011030641A1 (ja) 2009-09-08 2011-03-17 コニカミノルタホールディングス株式会社 身体用装具
CA2776241A1 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
EP2353588B1 (en) 2010-01-21 2015-04-15 Agricultural Technology Research Institute A sustained release preparation of factor IX
WO2011124718A1 (en) 2010-04-09 2011-10-13 Novozymes A/S Albumin derivatives and variants
UA115120C2 (uk) 2010-07-09 2017-09-25 Байоджен Хемофіліа Інк. Спосіб застосування химерного поліпептиду фактора ix
CA2830660A1 (en) 2011-05-05 2012-11-08 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
EP2780364A2 (en) 2011-11-18 2014-09-24 Eleven Biotherapeutics, Inc. Proteins with improved half-life and other properties
WO2014052490A1 (en) 2012-09-25 2014-04-03 Biogen Idec Ma Inc. Methods of using fix polypeptides
WO2014125082A1 (en) 2013-02-16 2014-08-21 Novozymes Biopharma Dk A/S Pharmacokinetic animal model
UY35463A (es) 2013-03-15 2014-10-31 Biogen Idec Inc Formulaciones de polipéptido fc-factor ix.
EP3086804A4 (en) 2013-12-23 2017-07-19 CSL Limited Fusion proteins comprising factor ix for prophylactic treatment of hemophilia and methods thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA012566B1 (ru) * 2003-05-06 2009-10-30 Синтоникс Фармасьютикалз, Инк. Химерный белок, способ его получения и способ лечения заболеваний с применением химерного белка
WO2009130602A2 (en) * 2008-04-24 2009-10-29 Celtic Pharma Peg Ltd. Factor ix conjugates with extended half-lives

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUANG Chichi. Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and MIMETIBODY technology. Current Opinion in Biotechnology 2009, 20:692-699, реферат, с. 692-697 *
PETERS Robert T. et al. Prolonged activity of factor IX as a monomeric Fc fusion protein. Blood, 11 March 2010, Volume 115, Number 10, реферат, с. 2057-2063 *
REAGAN-SHAW Shannon et al. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB Journal Vol. 22, No. 3, 17 October 2007, pp:659-661, реферат, с.659-661 *
SCHELLENBERGER Volker et al. A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptid and proteins in a tunable manner. Nature Biotechnology, Volume 27, Number 12, 15 November 2009, реферат, с. 1186-1189 *

Also Published As

Publication number Publication date
US9675676B2 (en) 2017-06-13
US9867873B2 (en) 2018-01-16
EA028067B1 (ru) 2017-10-31
EP3552619A1 (en) 2019-10-16
AU2011274414B2 (en) 2016-10-06
MY192639A (en) 2022-08-29
CN103140237A (zh) 2013-06-05
KR20230156435A (ko) 2023-11-14
US20210023185A1 (en) 2021-01-28
US10561714B2 (en) 2020-02-18
UA126265C2 (uk) 2022-09-14
IL284368A (en) 2021-07-29
JP2019023242A (ja) 2019-02-14
AU2020200118B2 (en) 2022-04-07
US20160346365A1 (en) 2016-12-01
US20130202595A1 (en) 2013-08-08
JP2022044828A (ja) 2022-03-17
US10568943B2 (en) 2020-02-25
AU2017268650B2 (en) 2019-10-10
NZ605348A (en) 2015-01-30
SG10201913700SA (en) 2020-03-30
EA201291480A1 (ru) 2013-09-30
US20190192640A1 (en) 2019-06-27
JP2017036328A (ja) 2017-02-16
KR20220097518A (ko) 2022-07-07
KR20190104442A (ko) 2019-09-09
WO2012006624A2 (en) 2012-01-12
UA115120C2 (uk) 2017-09-25
AU2022204643A1 (en) 2022-07-21
US20160166657A1 (en) 2016-06-16
EP2590668A4 (en) 2014-04-02
US10548954B2 (en) 2020-02-04
KR20140017480A (ko) 2014-02-11
US9629903B2 (en) 2017-04-25
AU2016228243A1 (en) 2016-10-06
SG10201505218YA (en) 2015-08-28
BR112013000650A2 (pt) 2016-05-31
AU2011274414A1 (en) 2013-01-24
US20180228878A1 (en) 2018-08-16
AU2020200118A1 (en) 2020-01-30
WO2012006624A3 (en) 2012-08-02
EP2590668A2 (en) 2013-05-15
AU2017268650A1 (en) 2017-12-21
US20130171175A1 (en) 2013-07-04
KR20180118808A (ko) 2018-10-31
US20180228879A1 (en) 2018-08-16
IL277432A (en) 2020-11-30
US10898554B1 (en) 2021-01-26
US20180207244A1 (en) 2018-07-26
US9670475B2 (en) 2017-06-06
US9623091B2 (en) 2017-04-18
MX2013000281A (es) 2013-03-22
BR112013000650A8 (pt) 2017-10-17
CL2013000058A1 (es) 2014-03-28
MY166954A (en) 2018-07-25
US20160257943A1 (en) 2016-09-08
US20190192641A1 (en) 2019-06-27
MX2020009702A (es) 2020-10-07
US20210008178A1 (en) 2021-01-14
IL223990B (en) 2020-10-29
US9233145B2 (en) 2016-01-12
US20160243206A1 (en) 2016-08-25
IL277432B (en) 2021-07-29
JP2013534426A (ja) 2013-09-05
EA201790876A1 (ru) 2017-12-29
JP2016034973A (ja) 2016-03-17
SG186856A1 (en) 2013-02-28
MX356527B (es) 2018-06-01
CA2804274A1 (en) 2012-01-12
AU2016228243B2 (en) 2017-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2022204643A1 (en) Factor IX polypeptides and methods of use thereof
AU2020202863B2 (en) Lyophilized factor IX formulations
US10927362B2 (en) Processable single chain molecules and polypeptides made using same
AU2019208273B2 (en) Factor IX polypeptide formulations
TW202003554A (zh) 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途
AU2018206758A1 (en) Methods of Using a Fixed Dose of a Clotting Factor
EA045351B1 (ru) Лиофилизированный состав фактора ix для предупреждения или уменьшения приступов кровотечения при гемофилии b
NZ724351B2 (en) Lyophilized factor ix formulations