EA029560B1 - Применение химерного фактора свертывания крови для уменьшения ингибирующего иммунного ответа у субъекта - Google Patents
Применение химерного фактора свертывания крови для уменьшения ингибирующего иммунного ответа у субъекта Download PDFInfo
- Publication number
- EA029560B1 EA029560B1 EA201491211A EA201491211A EA029560B1 EA 029560 B1 EA029560 B1 EA 029560B1 EA 201491211 A EA201491211 A EA 201491211A EA 201491211 A EA201491211 A EA 201491211A EA 029560 B1 EA029560 B1 EA 029560B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- rush
- subject
- coagulation factor
- factor
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 title claims abstract description 164
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 title claims abstract description 154
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 title claims abstract description 153
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title claims abstract description 113
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 104
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 title claims abstract description 53
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 410
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 401
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 399
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 211
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 44
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 43
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 15
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 220
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 210
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 165
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 124
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 117
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 claims description 75
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 72
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 69
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 69
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 55
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 49
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 49
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 45
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 43
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 37
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 33
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 28
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 claims description 24
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 21
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 18
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 16
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 16
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 claims description 16
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 15
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 claims description 13
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 claims description 12
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 claims description 12
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 claims description 12
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 11
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 11
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 11
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 claims description 10
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 claims description 8
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 8
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 7
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims description 7
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims description 7
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 claims 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 claims 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 abstract description 42
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 abstract description 9
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 abstract description 9
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 abstract 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 249
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 203
- 238000000034 method Methods 0.000 description 188
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 173
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 160
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 94
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 90
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 79
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 78
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 77
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 76
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 72
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 62
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 59
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 59
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 54
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 51
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 51
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 49
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 48
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 48
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 46
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 46
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 45
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 40
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 39
- 241001181114 Neta Species 0.000 description 36
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 36
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 34
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 32
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 31
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 30
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 29
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 29
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 28
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 28
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 28
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 27
- 238000011161 development Methods 0.000 description 26
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 26
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 26
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 25
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 23
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 23
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 22
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 22
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 21
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 20
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 19
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 19
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 19
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 18
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 18
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 18
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 18
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 16
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 16
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 16
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 16
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 15
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 14
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 14
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 14
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 13
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 13
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 13
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 13
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 12
- 230000001667 episodic effect Effects 0.000 description 12
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 12
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 12
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 12
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 12
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 12
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 11
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 11
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 11
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 11
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 10
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 10
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 10
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 10
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 10
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 9
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 9
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 8
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 8
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 8
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 8
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 7
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 7
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 7
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 7
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 7
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 7
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100027192 Scavenger receptor class A member 3 Human genes 0.000 description 6
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 description 6
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 6
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 6
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 5
- 241000731961 Juncaceae Species 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 208000026552 Severe hemophilia A Diseases 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 5
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 5
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 5
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 5
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 5
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 4
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 4
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 4
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- 102100038823 RNA-binding protein 45 Human genes 0.000 description 4
- 101710202912 RNA-binding protein 45 Proteins 0.000 description 4
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 108091006116 chimeric peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 4
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 4
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 4
- 238000007428 craniotomy Methods 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 4
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 4
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 4
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 4
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 4
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 4
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 4
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 description 3
- 102000002110 C2 domains Human genes 0.000 description 3
- 108050009459 C2 domains Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010018985 Haemorrhage intracranial Diseases 0.000 description 3
- 206010019196 Head injury Diseases 0.000 description 3
- 101001081105 Homo sapiens Helicase-like transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 208000029836 Inguinal Hernia Diseases 0.000 description 3
- 206010061249 Intra-abdominal haemorrhage Diseases 0.000 description 3
- 208000008574 Intracranial Hemorrhages Diseases 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 101150010944 P10 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 3
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 3
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- -1 for example Proteins 0.000 description 3
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 208000002085 hemarthrosis Diseases 0.000 description 3
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 3
- 102000046226 human HLTF Human genes 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000629 knee joint Anatomy 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 3
- 235000021017 pears Nutrition 0.000 description 3
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 3
- 101150074365 rush gene Proteins 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000013169 thromboelastometry Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 244000166652 Cymbopogon martinii Species 0.000 description 2
- 235000018793 Cymbopogon martinii Nutrition 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 2
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 208000012671 Gastrointestinal haemorrhages Diseases 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 238000000342 Monte Carlo simulation Methods 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 2
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 2
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 2
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000011225 antiretroviral therapy Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- ACSIXWWBWUQEHA-UHFFFAOYSA-N clodronic acid Chemical compound OP(O)(=O)C(Cl)(Cl)P(O)(O)=O ACSIXWWBWUQEHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002286 clodronic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- ZXUMUPVQYAFTLF-UHFFFAOYSA-N etryptamine Chemical compound C1=CC=C2C(CC(N)CC)=CNC2=C1 ZXUMUPVQYAFTLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 208000030304 gastrointestinal bleeding Diseases 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003673 groundwater Substances 0.000 description 2
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 2
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000006674 lysosomal degradation Effects 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008884 pinocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 2
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000001296 transplacental effect Effects 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- 239000004808 2-ethylhexylester Substances 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n-diethylpyrimidine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(N)=CC(Cl)=N1 XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 102100034540 Adenomatous polyposis coli protein Human genes 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 235000005749 Anthriscus sylvestris Nutrition 0.000 description 1
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 206010060964 Arterial haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000722731 Carex Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100316028 Drosophila melanogaster Uggt gene Proteins 0.000 description 1
- 206010052804 Drug tolerance Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 101710121810 Galectin-9 Proteins 0.000 description 1
- 102100031351 Galectin-9 Human genes 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288105 Grus Species 0.000 description 1
- 206010062713 Haemorrhagic diathesis Diseases 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 230000010556 Heparin Binding Activity Effects 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 101000924577 Homo sapiens Adenomatous polyposis coli protein Proteins 0.000 description 1
- 101100459282 Homo sapiens MB gene Proteins 0.000 description 1
- 101001008816 Homo sapiens N-lysine methyltransferase KMT5A Proteins 0.000 description 1
- 101001072081 Homo sapiens Proprotein convertase subtilisin/kexin type 5 Proteins 0.000 description 1
- 101001035676 Homo sapiens Pseudouridine-5'-phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010088212 Indole 2,3-dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000004137 Lysophosphatidic Acid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000642 Lysophosphatidic Acid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000050019 Membrane Cofactor Human genes 0.000 description 1
- 108700031312 Membrane Cofactor Proteins 0.000 description 1
- 101100098938 Methanosarcina acetivorans (strain ATCC 35395 / DSM 2834 / JCM 12185 / C2A) tbp3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028024 Mouth haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100354849 Mus musculus Pc gene Proteins 0.000 description 1
- 102100027771 N-lysine methyltransferase KMT5A Human genes 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 208000009613 Oral Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101710178747 Phosphatidate cytidylyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010034960 Photophobia Diseases 0.000 description 1
- 244000089486 Phragmites australis subsp australis Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008866 Prostaglandin E receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010088540 Prostaglandin E receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 102100030800 Ras suppressor protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710102668 Ras suppressor protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 206010038980 Retroperitoneal haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031075 Serine/threonine-protein kinase Chk2 Human genes 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 208000025371 Taste disease Diseases 0.000 description 1
- IOYNQIMAUDJVEI-BMVIKAAMSA-N Tepraloxydim Chemical group C1C(=O)C(C(=N/OC\C=C\Cl)/CC)=C(O)CC1C1CCOCC1 IOYNQIMAUDJVEI-BMVIKAAMSA-N 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- KRADHMIOFJQKEZ-UHFFFAOYSA-N Tri-2-ethylhexyl trimellitate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)C1=CC=C(C(=O)OCC(CC)CCCC)C(C(=O)OCC(CC)CCCC)=C1 KRADHMIOFJQKEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 206010046306 Upper respiratory tract infection Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 1
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- IHHXIUAEPKVVII-ZSCHJXSPSA-N [(1s)-5-amino-1-carboxypentyl]azanium;2-[4-(2-methylpropyl)phenyl]propanoate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCC[NH3+].CC(C)CC1=CC=C(C(C)C([O-])=O)C=C1 IHHXIUAEPKVVII-ZSCHJXSPSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000009056 active transport Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007675 cardiac surgery Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000009535 clinical urine test Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- HRLIOXLXPOHXTA-NSHDSACASA-N dexmedetomidine Chemical compound C1([C@@H](C)C=2C(=C(C)C=CC=2)C)=CN=C[N]1 HRLIOXLXPOHXTA-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- 229960004253 dexmedetomidine Drugs 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 229930004094 glycosylphosphatidylinositol Natural products 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000011540 hip replacement Methods 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 102000046152 human PUDP Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000000147 hypnotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006057 immunotolerant effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 108091008042 inhibitory receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000008316 intracellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011542 limb amputation Methods 0.000 description 1
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000006655 lysosomal degradation pathway Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 239000012907 medicinal substance Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 1
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 230000037125 natural defense Effects 0.000 description 1
- 230000012177 negative regulation of immune response Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 101710135378 pH 6 antigen Proteins 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 210000001986 peyer's patch Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 125000001095 phosphatidyl group Chemical group 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003863 physical function Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000013823 prenylation Effects 0.000 description 1
- 230000007112 pro inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 108010014806 prothrombinase complex Proteins 0.000 description 1
- 238000013138 pruning Methods 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043131 pyroglutamate Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000020029 respiratory tract infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 102200015255 rs121912297 Human genes 0.000 description 1
- 210000005212 secondary lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000019669 taste disorders Nutrition 0.000 description 1
- 101150020633 tbp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical group CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000020192 tolerance induction in gut-associated lymphoid tissue Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 1
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 1
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 1
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- A61K38/37—Factors VIII
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
- A61K47/6815—Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6056—Antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
Abstract
В настоящем изобретении предложено применение полипептидов химерного фактора свёртывания крови, в частности фактора VIII (FVIII), содержащих часть фактора свертывания крови и Fc-часть, для производства лекарственного средства для уменьшения ингибирующего иммунного ответа у субъекта с риском развития ингибирующих иммунных реакций, включающих появление антител к фактору свертывания крови и/или клеточно-опосредованный иммунитет. Введение таких полипептидов является достаточным для активации коагуляции и индуцирования иммунной толерантности к указанному фактору свертывания крови. Такой химерный полипептид может содержать полноразмерный FVIII или FVIII-полипептид, включающий делецию, например полную или частичную делецию В-домена. Также предложен набор, содержащий фармацевтическую композицию, содержащую указанный химерный фактор свертывания крови.
Description
Данное изобретение также предлагает улучшенные химерные пептиды РУШ и способы их получения. Способы индуцирования иммунной толерантности к фактору РУШ и получение улучшенных химерных пептидов РУШ также в основном применимы к одному или многим факторам свёртывания крови, например, РУН и Р1Х. Согласно настоящему изобретению, относящемуся к химерным пептидам РУШ (например, РУШРс) и их применению, в равной степени применимы к химерные пептидам, содержащим часть фактора свёртывания крови или Рс-часть. В некоторых отдельных примерах фрагмент факторов свёртывания крови химерного полипептида является фактором РУ11 или Р1Х. Настоящее изобретение в целом предлагает способ индуцирования иммунной толерантности к фактору свёртывания крови у пациента, нуждающегося в этом факторе, включающий введение пациенту химерного полипептида, содержащего часть фактора свёртывания крови и часть Рс. Настоящее изобретение также предлагает способ предотвращения или ингибирования развития выработки ингибитора фактора свёртывания, включающий введение пациенту, нуждающемуся в иммунной толерантности к химерному полипептиду фактора свёртывания, при котором этот химерный полипептид состоит из части фактора свёртывания и Рс-части. Лечение гемофилии А для предотвращения спонтанных случаев крово- 10 029560
течений достигается путем заместительной терапии целевым восстановлением активности РУШ от 1% до 5% его нормального уровня активности (статья Мапписсц Р.М., и др., N. Еи§1. 1. Мей. 344:1773-9 (2001), содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки). Существуют препараты РУШ, получаемые из плазмы, и рекомбинантные препараты РУШ доступные для лечения случаев кровотечений по требованию или для предотвращения появления случаев кровотечений профилактическим лечением. На основании величин периода полувыведения таких препаратов (8-12 ч) (\У1Ше С.С., и др., ТЬготЬ. НаетокТ 77:660-7 (1997); Могйш, М., НаеторЬШа 9 (кирр1 1):94-99; Шксиккюи 100 (2003)), схемы лечения требуют частого внутривенного введения препаратов обычно два-три раза в неделю для профилактики и один-три раза в сутки для лечения по требованию (МаисоНойикои, М.Р. и др., N. Еи§1. 1. Мей. 357:535-544 (2007)), содержание каждой из статей полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки). Такое частое применение препаратов является болезненным и неудобным. Другой основной проблемой, связанной с доступными в настоящее время препаратами РУШ, является появление нейтрализующих антител к РУШ у получающих лечение препаратами РУШ пациентов. Ингибирующие РУШ иммунные реакции могут включать антитела к фактору РУШ и/или клеточноопосредованные иммунные реакции. В настоящем изобретение предлагается способ введения РУШ для нуждающихся в нём людей (например, пациентов), у которых существует риск развития ингибирующего иммунного ответа к РУШ. Указанный способ включает введение химерного полипептида, содержащего РУШ-часть и часть Рс.
В некоторых вариантах осуществления изобретения такое введение химерного полипептида снижает у пациента количество антител к РУШ по сравнению с этим количеством до введения. В некоторых вариантах осуществления изобретения химерный полипептид вводится пациенту с ингибирующим иммунным ответом к РУШ и такое введение способно снизить ингибирующий иммунный ответ. Ингибирующий активность РУШ иммунный ответ может быть иммунным ответом с ингибирующими антителами и/или клеточно-опосредованным иммунным ответом. Введение химерного полипептида согласно способу, представленному в этой заявке, может снизить или нейтрализовать ингибирующий иммунный ответ. Поэтому, в некоторых вариантах, количество антител к РУШ у субъекта исследования снижается или предотвращается после введения химерного полипептида, содержащего РУШ-часть и часть Рс. Это снижение может составлять, например, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% снижение. В некоторых вариантах осуществления изобретения такое введение данного химерного полипептида снижает у пациента титры антител к РУШ по сравнению с этим титром до введения. В некоторых вариантах титр антител к РУШ у субъекта исследования снижается после введения химерного полипептида, содержащего РУШчасть и часть Рс. Соответственно введение химерного полипептида, содержащего РУШ-часть и Рс-часть, может снизить количество ингибиторов до менее чем 20, менее чем 10, менее чем 5, менее чем 4, менее чем 3, менее чем 2, менее чем 1 или менее чем 0,6 единиц Бетесды (БЕ).
В некоторых вариантах осуществления изобретения такое введение данного химерного полипептида снижает у субъекта исследования уровень цитокинов по сравнению с этим уровнем до введения. В некоторых вариантах, уровни цитокинов у субъекта исследования снижается после введения химерного полипептида, содержащего РУШ-часть и часть Рс. Цитокинами могут быть, например, Ш-12, Ш-4 и/или ΤΝΓ-α. Это снижение может составлять, например, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% снижение.
В некоторых вариантах осуществления изобретения химерный полипептид вводится пациенту, у которого ранее развился ингибирующий РУШ иммунный ответ. Введение химерного полипептида для таких пациентов согласно способам, представленным в этой заявке, может снизить иммунный ответ по сравнению с предыдущим ответом. Поэтому, в некоторых вариантах, меньшее количество антител к РУШ вырабатывается у субъекта исследования после введения химерного полипептида, согласно данным способам, чем вырабатывается после введения полипептида, состоящего из полипептида РУШ. В некоторых вариантах осуществления изобретения такое введение химерного полипептида снижает у пациента количество антител к РУШ по сравнению с этим количеством у пациента после предыдущего лечения полипептидом, состоящим из полипептида РУШ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения такое введение химерного полипептида снижает у пациента титр антител к РУШ по сравнению с таким титром у пациента после предыдущего лечения полипептидом, состоящим из полипептида РУШ. В некоторых вариантах, титр антител к РУШ у субъекта исследования ниже после введения химерного полипептида, содержащего РУШ-часть и часть Рс, чем вырабатываемый титр после введения полипептида, состоящего из полипептида РУШ. В некоторых вариантах, такое введение химерного полипептида снижает у пациента уровень цитокина по сравнению с таким уровнем у пациента после предыдущего лечения полипептидом, состоящим из полипептида РУШ. В некоторых вариантах, уровни цитокинов (например, Ш-12, Ш-4, и/или ΤΝΕ-α) у субъекта является ниже после введения химерного полипептида, содержащего части РУШ и часть Рс, чем эти уровни после введения полипептида, состоящего из полипептида РУШ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения такое введение химерного полипептида снижает у пациента количество антител к фактору свёртывания крови по сравнению с этим количеством, которое могло вырабатываться у пациента в результате введения полипептида, состоящего из части фактора
- 11 029560
свёртывания крови или полипептида, состоящего из части фактора свёртывания, но не содержащего Рсчасть. В некоторых вариантах, химерный полипептид вводится пациенту, у которого ранее развился ингибирующий РУШ иммунный ответ. Введение химерного полипептида для таких пациентов согласно способам, представленным в этой заявке, может в результате снизить иммунный ответ, который мог бы появиться при введении полипептида, состоящего из полипептида РУШ. Поэтому, в некоторых вариантах, меньшее количество антител к РУШ вырабатывается у субъекта исследования после введения химерного полипептида, согласно данным способам, чем могло бы вырабатываться при введении полипептида, состоящего из полипептида РУШ.
В некоторых вариантах, такое введение данного химерного полипептида снижает у пациента титр антител к фактору свёртывания крови по сравнению с этим титром, который мог бы вырабатываться у пациента в результате введения полипептида, состоящего из части фактора свёртывания или полипептида, состоящего из части фактора свёртывания, но не содержащего Рс-часть. В некоторых вариантах, этот титр антител к РУШ у субъекта исследования является ниже после введения химерного полипептида, содержащего РУШ-часть и часть Рс, чем мог бы вырабатываться после введения полипептида, состоящего из полипептида РУШ. В некоторых вариантах, такое введение данного химерного полипептида снижает у пациента уровень цитокина (например, Ш-12, Ш-4, и/или ΤΝΤ-α) по сравнению с этим уровнем, который мог бы вырабатываться у пациента в результате введения полипептида, состоящего из части фактора свёртывания или полипептида, состоящего из части фактора свёртывания, но не содержащего Рс-часть. В некоторых вариантах, уровни цитокинов (например, Ш-12, Ш-4, и/или ΤΝΤ-α) у субъекта исследования является ниже после введения химерного полипептида, содержащего РУШ-часть и часть Рс, чем эти уровни, которые могли бы образовываться после введения полипептида, состоящего из полипептида РУШ.
Варианты данного изобретения могут дополнительно включать перед введением химерного полипептида, идентификацию у пациента одного или нескольких параметров, выбранных из группы, состоящей из: (а) обладание мутацией или делецией гена, кодирующего фактор свёртывания крови; (Ь) обладание перестройкой гена, кодирующего фактор свёртывания крови; (с) наличие родственника, у которого ранее развился ингибирующий иммунный ответ к фактору свёртывания крови; (6) получение терапии препаратами интерферонов; (е) получение терапии противовирусными препаратами; (ί) обладание генетической мутацией гена, отличного от гена, кодирующего фактор свёртывания крови, которая связана с повышенным риском развития ингибирующего иммунного ответа; и (д) наличие комбинации двух или большим количеством этих факторов. В некоторых вариантах, пациент, несущий генетическую мутацию гена, отличного от гена, кодирующего фактор свёртывания крови, включает одну или более мутаций, выбранных из множества: (ί) генетический полиморфизм, связанный с повышением уровня ΤΝΤ-α; (ίί) генетический полиморфизм, связанный с повышением уровня Ш10; (ίίί) генетический полиморфизм, связанный с понижением уровня СТЬА-4; (ίν) мутация молекул ΌΚ15 или ΌΟΒ0602 молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) II класса; и (ν) включает комбинацию двух или больше этих вариантов. В некоторых вариантах полиморфизм, связанный с повышением уровня ΤΝΤ-α является заменой 308С>А. В некоторых вариантах полиморфизм, связанный с повышением уровня Ш10 обусловленного микросателлитным локусом Ш10О в аллели 134.
В настоящем изобретении также предлагается способ введения препарата РУШ нуждающимся в нём лицам (например, пациентам), включающий введение такому лицу терапевтической дозы химерного полипептида РУШ, например, химерного полипептида РУШ-Рс, или гибрида такого полипептида в интервале дозирования по меньшей мере примерно в полтора раза большем, чем интервал дозирования, требуемый для эквивалентной дозы упомянутого препарата РУШ без Не-РУШ-части (полипептид, состоящий из упомянутой РУШ-части), например, без Рс-части. Настоящее изобретение также направлено на способ увеличения временного интервала дозирования при введении препаратов РУШ для нуждающихся в них людей, включая введение химерного полипептида РУШ.
Этот временной интервал дозирования может быть по меньшей мере примерно от полутора до шести раз дольше, от полутора до пяти раз дольше, от полутора до четырёх раз дольше, от полутора до трёх раз дольше или полутора до двух раз дольше, чем интервал дозирования, требуемый для эквивалентной дозы упомянутого препарата РУШ без Не-РУШ-части (полипептид, состоящий из упомянутой РУШчасти), например, без Рс-части. Этот временной интервал дозирования может быть по меньшей мере примерно в полтора, два, два с половиной, три, три с половиной, четыре, четыре с половиной, пять, пять с половиной или шесть раз дольше, чем интервал дозирования, требуемый для эквивалентной дозы упомянутого белка РУШ без Не-РУШ-фрагмента (полипептид, состоящий из упомянутого РУШ), например, без Рс-части. Этот интервал дозирования может составить примерно каждые три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать или четырнадцать дней или дольше. Этот интервал дозирования может составить по меньшей мере примерно от полутора до 5 дней; полтора, 2, 3, 4 или 5 дней или дольше.
В настоящем изобретении также предлагается способ введения препарата РУШ нуждающимся в нём лицам, включающий введение такому лицу терапевтической дозы химерного полипептида РУШ,
- 12 029560
например, химерного полипептида РУШ-Рс, или гибрид такого полипептида для получения площади под кривой зависимости концентрации препарата в плазме от времени (ЛИС) по меньшей мере в один с четвертью раза больше, чем ЛИС, полученный для эквивалентной дозы упомянутого препарата РУШ без неРУШ-части (полипептид, состоящий из упомянутой РУШ-части), например, без Рс-части. Таким образом, настоящее изобретение включает способ увеличения или продления ЛИС для активности препаратов РУШ для нуждающихся в них пациентов, включая введение химерного полипептида РУШ.
В настоящем изобретении также предлагается способ введения препарата РУШ нуждающимся в нём лицам, включающий введение такому лицу терапевтической дозы полипептида РУШ, содержащего последовательности РУШ или Рс, или гибрид такого полипептида во временном интервале дозирования около каждые три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать или четырнадцать дней или дольше.
Этот представленный в данной заявке способ может применяться для субъекта с необходимостью в профилактическом лечении или лечении по требованию. Термин "введение" используется в этой заявке в значении "давать" фармацевтически приемлемый полипептид РУШ, предлагаемый в этой заявке, пациенту посредством фармацевтически приемлемого способа введения. Способами введения может быть внутривенный, например, внутривенная инъекция или инфузия. Дополнительные способы введения включают, например подкожное, внутримышечное, оральное, назальное и лёгочное введение. Химерные полипептиды и гибридные белки могут быть введены в виде составляющего фармацевтической композиции, включающей по меньшей мере одно вспомогательное вещество.
"Площадь под кривой зависимости концентрации препарата в плазме от времени (ЛИС)", как используется в этой заявке, обозначает то же, что и термин из сферы фармакологии, и выводится из скорости и степени абсорбции препарата РУШ после его введения. ЛИС измеряют через определённый период времени, такой как 12, 18, 24, 36, 48 или 72 ч, или для бесконечного периода времени путём экстраполяции на основе коэффициента наклона кривой. Если в данном описании не указано иное, ЛИС определяется для бесконечного периода времени. Определение ЛИС может выполняться на единственном пациенте или на популяции пациентов, для которых рассчитывают среднее значение.
"В-домен" фактора РУШ, используется в этой заявке, в том же значении, что и В-домен, известный в этой сфере знания, что определяет идентичность внутренней последовательности аминокислот и сайтов протеолитического расщепления тромбином, например, остатки Сер741-Арг1648 полноразмерного фактора РУШ человека. Другие домены фактора РУШ человека определяют по следующим остаткам аминокислот: А1 -остатки Ала1-Арг372; А2 - остатки Сер373-Арг740; А3 - остатки Сер1690-Иле2032; С1 остатки Арг2033-Асн2172; С2 - остатки Сер2173-Тир2332. Последовательности А3-С1-С2 включают остатки Сер1690-Тир2332. Оставшаяся последовательность, остатки Глю1649-Арг1689, обычно относятся к пептиду активации лёгкой цепи РУШ. Размещение границ для каждого из этих доменов, включая Вдомены, для фактора РУШ свиньи, мыши и лошади также известны в этой сфере знаний. В одном варианте осуществления изобретения В-домен фактора РУШ удалён (препарат "РУШ с удалённым Вдоменом" или "УВД РУШ").
Примером препарата УВД РУШ является КЕРАСТО® (рекомбинантный УВД РУШ), который обладает такой же последовательностью, как и часть последовательности РУШ в табл. 2А (1)(аминокислоты 1-1457 или 20-1457 8ЕО ГО № 2). В другом варианте осуществления изобретения В-домен фактора РУШ содержит интактный сайт внутриклеточного процессинга, который соответствует аргинину в остатке 754 удалённого В-домена РУШ, который соответствует аргинину в остатке 773 последовательности 8ЕО ГО № 2 или остатку 1648 полноразмерного РУШ, который соответствует остатку аргинину 1667 8ЕО ГО № 6. Использованные в этой заявке номера остатков этой последовательности без ссылки на какие-либо идентифицирующие номера 8ЕО ГО соответствуют последовательности РУШ без сигнальной пептидной последовательности (19 аминокислот) если не указано иное. Например, полноразмерный фактор РУШ8743/О1638 отвечает последовательности 8762/01657 8Е0 ГО № 6, благодаря сигнальной пептидной последовательности из 19 аминокислот.
Конструкция "РУШ с удалённым В-доменом" может обладать полными или частичными делециями, раскрытыми в патентах США №№ 6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502, 5,610,278, 5,171,844, 5,112,950, 4,868,112 и 6,458,563, каждый из которых включён в данную заявку посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность РУШ с удалённым В-доменом содержит какую-либо одну из делеций, приведённых в колонке 4, строке 4 колонки 5, строке 28 и примерах 1-5 патента США № 6,316,226 (а также 6,346,513). В некоторых вариантах, последовательность РУШ с удалённым В-доменом содержит делецию, приведённую в колонке 2, строках 26-51 и примерах 5-8 патента США № 5,789,203 (а также 6,060,447, 5,595,886 и 6,228,620). В некоторых вариантах, последовательность РУШ с удалённым Вдоменом содержит делецию, описанную в колонке 1, строке 25 колонки 2, строке 40 патента США № 5,972,885; колонке 6, строках 1-22 и примере 1 патента США № 6,048,720; колонке 2, строках 17-46 патента США № 5,543,502; колонки 4, строке 22 колонки 5, строке 36 патента США № 5,171,844; колонке 2, строках 55-68, фигуре 2 и примере 1 патента США № 5,112,950; колонке 2, строке 2 колонки 19, строке 21 и табл. 2 патента США № 4,868,112; колонке 2, строке 1 колонки 3, строке 19, колонке 3, строке 40
- 13 029560
колонки 4, строке 67, колонке 7, строке 43 колонки 8, строке 26 и колонке 11, строке 5 колонки 13, строке 39 патента США № 7,041,635; или колонке 4, строках 25-53, патента США № 6,458,563. В некоторых вариантах осуществления изобретения РУШ с удалённым В-доменом содержит делецию большей части В-домена, но всё ещё содержащую аминотерминальные последовательности В-домена, который является необходимым для протеолитического процессинга ίη νίνο в продукте первичной трансляции на две полипептидные цепи (например, сайт внутриклеточного процессинга), как описано в публикации 91/09122, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
В некоторых вариантах, РУШ с удалённым В-доменом сконструирован с удалением аминокислот 747-1638, например, практически с полным удалением В-домена. Статья НоеЬеп К.С., и др. 1. ΒίοΙ. СЬет. 265 (13): 7318-7323 (1990), содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. РУШ с удалённым В-доменом также может содержать делецию аминокислот 771-1666 или аминокислот 868-1562 фактора РУШ. Статья МеиЬеп Р., и др. Рго1еш Епд. 2(4): 301-6 (1988), содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. Дополнительные делеции Вдомена, которые являются частью данного раскрытия сущности изобретения включают, например: делецию аминокислот 982-1562 или 760-1639 (Тоо1е и др., Ргос. Ыа11. Асаб. δει. υ.δ.Ά. 53:5939-5942 (1986)), 797-1562 (Еа1оп и др., ВюсЬетШгу 25:8343-8347 (1986)), 741-1646 (КаиРтап (опубликованная заявка согласно РСТ № АО 87/04187)), 747-1560 Миле г и др., ΌΝΆ 6:553-564 (1987)), 741-1648 (Ракек (заявка согласно РСТ № 88/00831)), 816-1598 или 741-1689 (Ьадпег (ВеЬппд 1п§1. МШ. (1988) № 82:16-25, ЕР 295597)), содержание каждого из этих документов полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. Каждая из вышеупомянутых делеций может быть выполнена в любой последовательности РУШ.
В одном варианте РУШ-часть с удалённым В-доменом в химерном полипептиде процессируется в две цепи связанные (или соединённые) металл-ионной связью, первая цепь, состоит из тяжёлой цепи (А1-А2-частично В) и вторая цепь, состоит из лёгкой цепи (А3-С1-С2). В другом варианте осуществления изобретения РУШ-часть с удалённым В-доменом является одноцепочечной молекулой фактора РУШ. Одноцепочечный фактор РУШ может содержать сайт внутриклеточного процессинга, который соответствует аргинину в остатке 754 удалённого В-домена РУШ (остаток 773 последовательности 8Еф ГО № 2) или в остатке 1648 полноразмерного РУШ (остаток 1657 последовательности 8Еф ГО № 6).
Металл-ионная связь между тяжёлой и лёгкой цепями может обеспечиваться любым металлом, известным в этой сфере техники. Например, металл может быть бивалентным ионом металла. Эти металлы, которые могут быть использованы для связывания тяжёлой и лёгкой цепи включают, не ограничиваясь, Са2'. Мп2' или Си2'. Ра1оиго8 и др., 1п1егп. 1. РЬагт. 155(1): 121-131 (1997); АакаЬауакЫ и др., ГОС. 279(13): 12677-12684 (2004).
В некоторых вариантах осуществления изобретения РУШ-часть в химерном полипептиде, содержит А1-домен фактора РУШ. В некоторых вариантах, РУШ-часть в химерном полипептиде, содержит А2домен фактора РУШ. В некоторых вариантах, РУШ-часть в химерном полипептиде, содержит А3-домен фактора РУШ. В некоторых вариантах, РУШ-часть в химерном полипептиде, содержит С1-домен фактора РУШ. В некоторых вариантах, РУШ-часть в химерном полипептиде, содержит С2-домен фактора РУШ.
"Химерный полипептид", используется в этой заявке для обозначения полипептида, который содержит в себе один по меньшей мере два полипептида (в виде последовательностей или пептидов) из разных источников. Химерные полипептиды могут содержать, например, два, три, четыре, пять, шесть, семь и более полипептидов из разных источников, таких как разные гены, разные кДНК или разных животных или других видов. Химерные полипептиды могут содержать, например, один и более линкеров, соединяющие разные последовательности. Таким образом, эти последовательности могут быть прямо связаны или могут быть связаны опосредованно через линкеры, обе или в рамках единственного химерного полипептида. Химерные полипептиды могут содержать, например, дополнительные пептиды, такие как сигнальные последовательности и последовательности, такие как 6Гис и РЬАС, которые облегчают очистку белков или их детектирование. Кроме того, химерные полипептиды могут нести аминокислотные или пептидные дополнения к Ν- и/или С-терминальным сайтам транскрипции. В некоторых вариантах осуществления изобретения, химерные полипептиды включают части фактора свёртывания крови (например, фрагмент РУШ) и часть, не относящуюся к фактору свёртывания (например, не-РУШ часть). Иллюстративные части, не относящиеся к фактору свёртывания (например, не-РУШ части), включают, например, Рс. Иллюстративные химерные РУШ-Рс полипептиды включают, например, последовательность 8Еф ГО № 2 или № 6 (табл. 2), с или без их сигнальной последовательности и химерный Рсполипептид 8Еф ГО № 4 (табл. 2). Как используется в этом документе термин "часть", когда он применяется к химерному полипептиду, относится к одному из компонентов или составляющих такого химерного полипептида (например., "химерный полипептид, содержащий РУШ-часть и Рс-часть" или "РУШчасть химерного полипептида"). Другими словами, термин "часть" используется для указания источника различных компонентов в химерном полипептиде, но не используется для указания фрагмента белка РУШ или фрагмента участка Рс. Химерный полипептид может содержать последовательность по меньшей мере на 90% или 95% идентичную аминокислотной последовательности РУШ и Рс, показанную в
- 14 029560
табл. 2(ί) без сигнальной последовательности (аминокислоты 20-1684 БЕЦ ГО № 2) или по меньшей мере на 90% или 95% идентичную аминокислотной последовательности РУШ и Ре, показанной в табл. 2Α(ί) с сигнальной последовательностью (аминокислоты 1-1684 §ЕЦ ГО № 2), с которой эта последовательность обладает активностью фактора РУШ. Активность фактора РУШ может быть измерена анализом времени частичной активации тромбопластина (аРРТ), хромогенным анализом или другими известными методами. Химерные полипептид может содержать последовательность идентичную аминокислотной последовательности РУШ и Рс, показанной в табл. 2Α(ί) без сигнальной последовательности (аминокислоты 201684 §ЕЦ ГО № 2) или идентичной аминокислотной последовательности РУШ и Рс, показанной в табл. 2Α(ί) с сигнальной последовательностью (аминокислоты 1-1684 §ЕЦ ГО № 2).
В некоторых вариантах осуществления изобретения РУШ-часть включает А3-домен РУШ. В некоторых вариантах часть РУШ содержит РУШ человека. В некоторых вариантах, часть РУШ несёт полную или частичную делецию В-домена. В некоторых вариантах РУШ-часть является по меньшей мере на 90% или 95% идентичной аминокислотной последовательности РУШ, показанной в табл. 2, без сигнальной последовательности (аминокислоты 20-1457 §ЕЦ ГО № 2; аминокислоты 20-2351 §ЕЦ ГО № 6). В некоторых вариантах РУШ-часть является идентичной аминокислотной последовательности РУШ, показанной в табл. 2, без сигнальной последовательности (аминокислоты 20-1457 §ЕЦ ГО № 2; аминокислоты 202351 §ЕЦ ГО № 6). РУШ-часть является по меньшей мере на 90% или 95% идентичной аминокислотной последовательности РУШ, показанной в табл. 2, с сигнальной последовательностью (аминокислоты 11457 §ЕЦ ГО № 2; аминокислоты 1-2351 §ЕЦ ГО № 6). В некоторых вариантах, РУШ-часть является идентичной аминокислотной последовательности РУШ, показанной в табл. 2, с сигнальной последовательностью (аминокислоты 1-1457 §ЕЦ ГО № 2; аминокислоты 1-2351 §ЕЦ ГО № 6). В некоторых вариантах осуществления изобретения РУШ-часть обладает коагулирующей кровь активностью.
В некоторых вариантах часть молекулы Рс является идентичной аминокислотной последовательности Рс, показанной в табл. 2 (аминокислоты 1458-1684 §ЕЦ ГО № 2 или аминокислоты 2352-2578 §ЕЦ ГО № 6). В некоторых вариантах химерный полипептид представляет собой форму гибридной молекулы, включающей второй полипептид в сочетании с химерным полипептидом, тогда как второй полипептид состоит в основном из молекулы Рс или состоит из Рс-части или участника связывания молекулы РсКи.
В некоторых вариантах часть фактора свёртывания химерного полипептида содержит фактор IX. В некоторых вариантах часть фактора IX (Р1Х) химерного полипептида является по меньшей мере на 90, 95 или 100% идентична аминокислотной последовательности Р1Х, показанной в табл. 2, без сигнальной последовательности (аминокислоты 20-1457 §ЕЦ ГО № 2; аминокислоты 20-2351 §ЕЦ ГО № 6). В некоторых вариантах химерный полипептид представляет собой мономер димера гибридной молекулы, включающей первую цепь, содержащую Р1Х-часть и Рс-часть, и вторую цепь, в основном состоящую из Рсчасти или состоящую из Рс-части.
В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный химерный полипептид включает часть фактора У11 (РУ11). В некоторых вариантах химерный полипептид представляет собой мономер димера гибридной молекулы, включающей первую цепь, содержащую РУ11-часть и Рс-часть, и вторую цепь, в основном состоящую из Рс-части или состоящую из Рс-части. В некоторых вариантах осуществления изобретения РУ11-часть является неактивным РУ11, активированным РУ11 или активирующимся РУ11.
В некоторых вариантах химерный полипептид, как раскрывается в данной заявке, содержит фактор свёртывания крови, отличающийся от РУШ, например, РУ11, РУ11а или Р1Х. В одном примере РУ11 представляет собой профермент фактора У11 (неактивная форма РУ11), активированным РУ11 или активирующимся РУ11. В другом примере Р1Х является проферментом Р1Х или активированным Р1Х. В этой сфере знаний известно множество частей молекул, не относящихся к факторам свёртывания, способных увеличивать период полувыведения полипептидов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения химерный полипептид, содержащий РУШчасть, обладает увеличенным периодом полувыведения (ί1/2) превышающий такой для полипептида, содержащего такую же РУШ-часть без не-РУШ части. Под химерным полипептидом с увеличенным ί1/2 в этой заявке может подразумеваться как РУШ длительного действия. Химерные полипептиды РУШ длительного действия включают, например, РУШ соединённый с Рс (включая, например, химерные полипептиды РУШ в форме гибридной молекулы, такой как мономер димера гибридной молекулы РУШРс: см. пример 1, фиг. 1, табл. 2А и патенты США №№ 7,404,956 и 7,348,004), и РУШ соединённый с альбумином.
"Культура", "культивировать" и "культивирование", используются в этой заявке в значении инкубировать клетки в условиях ίη νίίτο, которые позволяют клетке расти или делиться или поддерживать клетки в жизнеспособном состоянии. "Культивируемые клетки", как используется в этой заявке, обозначают клетки, которые размножают ίη νίίτο.
"Фактор УШ" в пределах данной заявки обозначен аббревиатурой "РУШ" и обозначает функциональный полипептид в его обычной роли коагуляции крови, если не указывается иное. Следовательно, термин РУШ охватывает варианты полипептидов, обладающих одной функциональностью. Белки РУШ могут быть белками РУШ человека, свиньи, лошади или мыши. Как описано в разделе "Уровень техни- 15 029560
ки", известными являются полноразмерный полипептид и полинуклеотидные последовательности, а также много функциональных фрагментов, мутантных и модифицированных вариантов этого белка. Примеры последовательностей РУШ человека показаны как подпоследовательности 8ЕО ГО № 2 или 6 (табл. 2). Полипептиды РУШ включают, например, полноразмерный РУШ, полноразмерный РУШ без остатка Мет в Ν-терминальном сайте, зрелый РУШ (без сигнальной последовательности), зрелый РУШ с дополнительным Мет в Ν-терминальном сайте и/или РУШ с полной или частичной делецией В-домена. Варианты РУШ включают делеции В-домена, частичные или полные делеции.
Известно очень много функциональных вариантов, которые обсуждаются в тексте выше и ниже. Кроме того, у пациентов с гемофилией было идентифицировано сотни нефункциональных мутаций фактора РУШ. И было определено, что влияние этих мутаций на функционирование РУШ больше зависит от того, где они находятся в 3-мерной структуре РУШ, чем от природы заместителя (статья СиЙег и др., Нит. Ми1а1. 79:274-8 (2002)), содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. К тому же при сравнении между РУШ людей и других видов были обнаружены консервативные остатки, которые вероятно необходимы для функционирования фактора (статья Сатегои и др., ТЬготЬ. Наеток1. 79:317-22 (1998); патент США 6,251,632), содержание которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылок.
Ген РУШ человека был выделен и экспрессирован в клетках млекопитающих (Тоо1е, 1. 1, и др., Να1иге 312:342-347 (1984); СЬксЫег, 1., и др., №1иге 312:326-330 (1984); \\оос1. \. I, и др., №1иге 312:330337 (1984); УеЬаг, С. А, и др., №1иге 312:337-342 (1984); \О 87/04187; \О 88/08035; \О 88/03558; пат. США № 4,757,006), содержание которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылок, и последовательности аминокислот были определены посредством кДНК. Авторы Сароп и др., пат. США № 4,965,199, содержание которого полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки, раскрывает способ использования рекомбинантной ДНК для получения РУШ в клетках-хозяинах млекопитающих и очистку РУШ человека. Сообщалось об экспрессии РУШ человека в клетках СНО (яичника китайского хомяка) и ВНКС (клетках почки новорождённого хомяка). РУШ человека модифицировали для удаления части или всего В-домена (пат. США №№ 4,994,371 и 4,868,112, содержание каждого из которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылок), выполняли замену В-домена РУШ человека В-доменом фактора У (пат. США № 5,004,803, содержание которого полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки). Последовательность кДНК, кодирующая РУШ человека и расчётная аминокислотная последовательность показаны в 8ЕО ГО № 1 и 2, соответственно, взяты из опубл. заявки США № 2005/0100990, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
В пат. США № 5,859,204, содержание которого полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки, автором Ьо11аг 1. 8. сообщается, что функциональные мутантные варианты РУШ обладают пониженной антигенностью и иммунореактивностью. В пат. США № 6,376,463, содержание которого полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки, автором Ьо11аг 1. 8. сообщается также, что мутантные варианты РУШ обладают пониженной иммунореактивностью. В опубл. заявке США № 2005/0100990, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки, автор 8аепко и др. сообщает о функциональных мутациях А2-домена РУШ.
Некоторое количество функциональных молекул РУШ, включающих делеции В-домена, представлены в следующих патентах США: 6,316,226 и 6,346,513, оба закреплён за компанией Вах1ег; 7,041,635 закреплён за 1п2Сеп; 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886 и 6,228,620 закреплены за СЫгоп; 5,972,885 и 6,048,720 закреплены за Вюуйгит; 5,543,502 и 5,610,278 закреплены за Ν\ό ШгФкк; 5,171,844 закреплён за 1ттипо Ад; 5,112,950 закреплён за Тгапкдепе 8.А.; 4,868,112 закреплён за Сепейск 1п8Й1и1е, содержание которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. Опубликована последовательность РУШ свиньи (статья Тоо1е, 1. 1., и др., Ргос. N11. Асаб. 8с1. И8А 83:5939-5942 (1986)), содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки, и сообщалось о полной последовательности кДНК свиньи, полученной ПЦР амплификацией последовательностей РУШ из библиотеки кДНК селезёнки свиньи (статья Неа1еу, 1. Р. и др., В1ооб 88:4209-4214 (1996), содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки). Гибридные РУШ человека/свиньи несущие замены всех доменов, всех субединиц и специфических аминокислотных последовательностей были предложены в пат. США № 5,364,771 авторами Ьо11аг и Кипде и в заявке \О 93/20093, содержание которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылок. Совсем недавно нуклеотид и соответствующая аминокислотная последовательность А1- и А2-доменов РУШ свиньи и химерного РУШ с доменами А1 и А2 свиньи, замещающие соответствующие человеческие домены, представлены в заявке \О 94/11503, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. В пат. США 5,859,204 автор Ьо11аг 1. 8. также раскрывает к ДНА свиньи и производные от неё аминокислотные последовательности. В пат. США № 6,458,563, содержание которого полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки, закреплённый за автором Етогу, предлагает РУШ свиньи с удалённым В-доменом.
Фактор РУШ (или РУШ-часть химерного полипептида) может быть по меньшей мере на 90% или 95% идентичным аминокислотной последовательности РУШ, показанной в табл. 2, без сигнальной по- 16 029560
следовательности (аминокислоты 20-1457 последовательности δΕΟ ΙΌ № 2; и аминокислоты 20-2351 последовательности δΕΟ ΙΌ № 6), в котором упомянутая РУШ-часть обладает активностью РУШ. Фактор РУШ (или РУШ-часть химерного полипептида) может быть идентичным аминокислотной последовательности РУШ, показанной в табл. 2, без сигнальной последовательности (аминокислоты 20-1457 δΕΟ ΙΌ № 2; и аминокислоты 20-2351 δΕΟ ΙΌ № 6). Фактор РУШ (или РУШ-часть химерного полипептида) может быть по меньшей мере на 90% или 95% идентичным аминокислотной последовательности РУШ, показанной в табл. 2, с сигнальной последовательностью (аминокислоты 1-1457 δΕΟ ΙΌ № 2; и аминокислоты 1-2351 последовательности δΕΟ ΙΌ № 6), в котором упомянутая РУШ-часть обладает активностью РУШ. Фактор РУШ (или РУШ-часть химерного полипептида) может быть идентичным аминокислотной последовательности РУШ, показанной в табл. 2, с сигнальной последовательностью (аминокислоты 1-1457 δΕΟ ΙΌ № 2; и аминокислоты 1-2351 δΕΟ ΙΌ № 6).
В некоторых вариантах осуществления изобретения фактор свёртывания крови является зрелой формой профермента фактора УП, активированным РУН (РУЛа), способным к активации РУН (РУНа) или их вариантами. Фактор УН (РУН, Р7, также именуемый как фактор 7, фактор коагуляции УН, фактор сыворотки УН, сывороточный ускоритель конверсии протромбина, проконвертин и эптаког-альфа) представляет собой сериновую протеазу, которая является частью каскада коагуляции крови. РУН включает С1а-домен, два домена ΕСР (БОР-1 и ΕΟР-2) и домен сериновой протеазы (или пептидазный δ1-домен), который является высококонсервативным среди членов семейства пептидаз δ1-сериновых протеаз, например, таких как химотрипсин. РУН встречается как одноцепочный профермент, активированный профермент-подобный двухцепочечный полипептид и полностью активированная двухцепочечная форма. Как используется в этой заявке, термин "профермент-подобный" белок или полипептид относится к белку, который активирован путём протеолитичесого расщепления, но по-прежнему проявляющий свойства, связанные с проферментом такими как, например, низкая или отсутствие активности или конформация, напоминающая конформацию формы белка зимогена. Например, двухцепочечная активированная форма РУН является профермент-подобным белком, когда она не связана с тканевым фактором, она сохраняет конформацию сходную с нерасщеплённым проферментом, и поэтому проявляющая очень низкую активность. После связывания с тканевым фактором двухцепочечная активированная форма РУН претерпевает конформационное изменение и проявляет свою полную активность как фактор коагуляции. Иллюстративные варианты РУН включают варианты с повышенной удельной активностью, например, мутации, повышающие активность РУН путём повышения его ферментной активности (Кса! или Кт). Такие варианты были описаны в этой сфере знаний и включают, например, мутантные формы этой молекулы как описано, например, в статьях Регион и др. 2001. ΡΝΑδ 98:13583; РеНоуаи апб КиЕ. 2001. 1. ΒίοΙ. СЬет. 276:6616; Рег88оп и др. 2001 I. ΒίοΙ. СЬет. 276:29195; δοςριηπ и др. 2001. I. ΒίοΙ. СЬет. 276:17229; δοςριηπ и др. 2002. 1. ΒίοΙ. СЬет. 247:49027. В одном варианте осуществления изобретения форма вариантов включает мутации РУН. Иллюстративные мутации включают замены аминокислот Υ158Ό-Ε296ΥМ298О. В другом варианте осуществления изобретения форма варианта РУН включает замещение аминокислот 608-619 (ΡΟΟδΚΚΥΟΌδΡΝ, соответствующих 170-й петле) зрелой последовательности РУН аминокислотами ΕΑδΥΡΟΚ из 170-й петли трипсина. Варианты с высокой удельной активностью также известны в этой сфере знаний и для РРХ. Например, авторы δίιηίοηί и др. (2009 Ν.Ε. ΙοιίΓηηΙ οί Мебюше 361:1671) описывают мутацию К338Б. Авторы СЬапд и др. (1988 ШС 273:12089) и Р1ет и др. (2009 Нитап Оепе ТЬегару 20:479) описывают мутацию К338А. Известны в этой сфере и другие мутации, включающие описанные, например, в статьях Ζ裏 апб Егапбвюиег. 2009 δΙπκΙιιΐΌ 17:1669; δίΟιΡΓ е! а1., 2003. 1. ΒίοΙ. СЬет. 278:4121 и δΐи^ζеЬесЬе^ и др. 1997. РΕΒδ Бей 412:295. Содержание этих статей полностью включено в эту заявку посредством ссылок. Полная активизация, которая происходит при конформационном изменении профермент-подобной формы, происходит после связывания с ней кофакторного тканевого фактора. Мутации могут вводиться также для получения конформационного изменения в отсутствии тканевого фактора. Таким образом, упоминание РУНа включает профермент-подобную форму, полностью активированную двухцепочечную форму или активируемую форму фактора. "Активируемый фактор УН" является фактором УН в неактивной форме (например, в форме его профермента), которая способна к превращению в активную форму.
В некоторых вариантах осуществления изобретения фактор свёртывания крови является зрелой формой фактора ΙΧ или его вариантом. Фактор ΙΧ распространён как одноцепочечный профермент плазмы из 415 аминокислот (А. УуюЮЬт и др., 1. ΒίοΙ. СЬет. 268, 8436 (1993)). Профермент РК активируется фактором ΕΧΕι или комплексом тканевый фактор/РУНа. Специфическое расщепление связи аминокислот аргинин-аланин 145-146 и аргинин-валин 180-181 приводит к сохранению соединения лёгкой и тяжёлой цепей единственной дисульфидной связью между цистеином 132 и цистеином 289 (δ. Еа^а) и др., Β^οсЬет^8ΐ^у 22, 4047 (1983)).
Структура РК подобна структуре белков свёртывания крови, зависимых от витамина К, РУН, РХ и белка С (В. Рште и В. Рипе, см. выше). Приблизительно 45 аминокислот аминотерминального сайта содержат гамма-карбоксиглютаминовую кислоту или О1а-домен. За которым следуют два гомологичных эпидермальному фактору роста (ΕΟΕ) домена, пептид активации и каталитическая "тяжёлая цепь", которая входит в семейство сериновых протеаз (Α. ΥλΧΟίΟιπι и др., 1. ΒίοΙ. СЬет. 268, 8436 (1993); δ. δρίΐ/ег и
- 17 029560
др., Вюсйетюа1 1оита1 265, 219 (1990); Н. ВгапбЧеИег и др., Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб δα. υδΑ 92, 9796 (1995)).
"Эквивалентная доза" используется в этой заявке в значении такой дозы активности РУШ, выраженной в международных единицах, которая не зависит от молекулярной массы взятого полипептида. Одна международная единица (МЕ) активности РУШ соответствует приблизительно количеству РУШ в одном миллилитре плазмы крови человека в норме. Существует несколько видов анализов для количественного измерения активности РУШ, включая количественное определение с хромогенным субстратом Европейской Фармакопеи и одностадийный анализ коагулирующей активности.
"Рс" в этой заявке обозначает молекулы - участники связывания с функциональным неонатальным Рс-рецептором (РсКп), если не указано иное. Участник связывания РсКп представляет собой какую-либо молекулу, которая может специфически связываться с рецептором РсКп с последующим активным транспортом участника связывания с помощью РсКп-рецептора. Таким образом, обозначение Рс включает какие-либо варианты 1дС к Рс обладающие функциональностью. Участок Рс-части 1дС, связывающий РсКп-рецептор описан методом рентгеновской кристаллографии (статья ВигтеШег и др., №Циге 372:379 (1994), содержание которой полностью включено в эту заявку посредством ссылки). Основная область контакта молекулы Рс с РсКп находится возле соединения СН2 и СН3 доменов. Все контакты Рс-РсКп находятся в пределах одной тяжёлой цепи 1д. Участники связывания РсКп включают, например, целый 1дС, Рс фрагмент 1дС и другие фрагменты 1дС, которые включают полный участок связывания РсКп. Основные сайты контакта содержат аминокислотные остатки 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308311 и 314 СН2-домена и аминокислотные остатки 385-387, 428 и 433-436 СН3-домена.
Информация, представленная относительно нумерации иммуноглобулинов и фрагментов иммуноглобулинов или их участков, основана на публикации КаЬа! и др. 1991, δе^иеηсе5 о! Рто1еш5 о! 1ттипо1одюа1 IШегеь1. υ. δ. Иерайтеп! о! РиЬйс НеаИЪ, ВеШевба, МИ; содержание которой полностью включено в эту заявку посредством ссылки. Рецептор РсКп был изолирован у нескольких видов млекопитающих, включая человека. Известны последовательности РсКп человека, РсКп крысы и РсКп мыши (статья δΦ^ и др., 1. Ехр. Меб. 180: 2377 (1994), содержание которой полностью включено в эту заявку посредством ссылки). Рецептор РсКп может содержать домены СН2 и СН3 иммуноглобулина с или без шарнирной области иммуноглобулина. Иллюстративные варианты Рс представлены в заявках ΥΘ 2004/101740 и ΥΘ 2006/074199, содержание которых полностью включено в эту заявку посредством ссылки.
Пептид Рс (Рс-часть химерного полипептида) может нести одну и более мутаций и комбинации мутаций. Например, пептид Рс (Рс-часть химерного полипептида) может содержать мутации увеличивающие период полувыведения, такие как Μ252Υ, δ254Τ, Т256Е и их сочетания, как описано в статье Одапевуаи и др., Мо1. 1ттипо1. 46:1750 (2009), содержание которой полностью включено в эту заявку посредством ссылки; Н433К, Ν434Ε и их сочетания как описано в статье Уассаго и др., Ν;·ιΙ. ВюФсЬпоР 23:1283 (2005), содержание которой полностью включено в эту заявку посредством ссылки; мутантные последовательности, раскрытые на страницах 1-2, в параграфе [0012] и в примере 9 и 10 опубл. заявки США № 2009/0264627 А1, содержание которой полностью включено в эту заявку посредством ссылки; и мутантные последовательности, раскрытые на странице 2, в параграфах [0014]-[0021] опубл. заявки США № 20090163699 А1, содержание которой полностью включено в эту заявку посредством ссылки.
Пептид Рс (Рс-часть химерного полипептида) может также включать следующие мутации: Участок Рс 1дС может быть модифицирован согласно широко распространённым методикам, таким как сайториентированный мутагенез, и подобным им для того, чтобы обеспечить модификацию 1дС или Рсфрагментов или их частей, которые будут связываться с РсКп. Такие модификации включают, например, модификации удалённые от сайтов, контактирующих с РсКп, а также модификации в пределах контактирующих сайтов, сохраняющих или даже усиливающих связывание с РсКп. Например, следующие отдельные аминокислотные остатки Рс-части 1дС1 (Рсу1) человека могут быть заменены без значительной потери аффинности связывания с РсКп: Р238А, δ239Α, К246А, К248А, Ό249Α, М252А, Т256А, Е258А, Т260А, Ό265Α, δ267Α, Н268А, Е269А, Ό270Α, Е272А, Ь274А, Ν276Α, Υ278Α, Ό280Α, У282А, Е283А, Н285А, Ν286Α, Т289А, К290А, К292А, Е293А, Е294А, Ц295А, Υ296Р, Ν297Α, δ298Α, Υ300Р, К301А, У303А, У305А, Т307А, Ь309А, Ц311А, Ό312Α, Ν315Α, К317А, Е318А, К320А, К322А, δ324Α, К326А, А327ф, Р329А, А330ф, Α330δ, Р331А, Ρ331δ, Е333А, К334А, Т335А, δ337Α, К338А, К340А, Ц342А, К344А, Е345А, Ц347А, К355А, Е356А, М358А, Т359А, К360А, Ν361Α, Ц362А, Υ373Α, δ375Α Ό376Α, Α378φ, Е380А, Е382А, δ383Α, Ν384Α, Ц386А, Е388А, Ν389Α, Ν390Α, Υ391Ε, К392А, Ь398А, δ400Α, Ό401Α, Ό413Α, К414А, К416А, Ц418А, Ц419А, Ν421Α, У422А, δ424Α, Е430А, Ν434Α, Т437А, Ц438А, К439А, δ440Α, δ444Α и К447А, где, например, Р238А представляет замену пролина дикого типа аланином в номере положения 238. В дополнении к аланину аминокислоты дикого типа могут замещаться другими аминокислотами в положениях, описанных выше. Мутации в единственном количестве могут вводиться в более чем одну сотню участников связывания РсКп, отличающихся от нативного Рс. Кроме того, могут вместе вводиться комбинации из двух, трёх или более отдельных мутаций, давая увеличение участников связывания РсКп до более нескольких сотен вариантов. Отдельные из этих мутаций могут обладать новыми видами функциональности кроме участника связывания РсКп. Например, один вариант, включающий Ν297Α, удаляет высококонсервативный сайт Ν-гликозилирования. Влияние этой му- 18 029560
тации заключается в снижении иммуногенности, таким образом, увеличивается полупериод циркуляции этого участника связывания РсКи и создаётся участник связывания РсКи неспособный связываться с рецепторами РсуЫ, РсуКПА, РсуКПВ и РсуКША без нарушения аффиности к РсКп (статьи Коибебде и др. 1995, Тгап8р1айабоп 60:847; Рпепб и др. 1999, Тгап8р1айабоп 68:1632; §Ые1б8 и др. 1995, 1. ΒίοΙ. СНет. 276:6591, содержание которых полностью включено в эту заявку посредством ссылок).
Кроме того по меньшей мере три Рс-гамма-рецептора человека оказались способными распознавать сайт связывания на ГС с более низкой шарнирной областью, главным образом аминокислоты 234-237. Поэтому другой пример новой функциональности и потенциального снижения иммуногенности может выявиться при мутации в этом участке, например заменой аминокислот 233-236 ГС 1 человека "ЕЬЬС" на соответствующую последовательность ГС2 "РУА" (с одной делецией аминокислоты). Показано, что рецепторы РсуЫ, РсуКП, апб РсуКШ, которые выступают медиаторами различных эффекторных функций не могут связываться с ГС1, когда в них введены такие мутации (статьи Шагб апб Сбебе, Тбегареибс Iттипο1οду 2:11 (1995) содержание которых полностью включено в эту заявку посредством ссылок; и Агтоиг и др., Еиг. ί. Iттиηο1. 29:2613 (1999), содержание которых полностью включено в эту заявку посредством ссылок). В качестве дополнительного примера новой функциональной способности, полученной в результате описанных выше мутаций, аффинность к РсКп в некоторых случаях может быть увеличена выше аффинности молекулы дикого типа. Это увеличенная аффинность может отражать повышение скорости ассоциации, снижение скорости диссоциации или оба варианта повышения скорости ассоциации и снижения скорости диссоциации. Предполагается, что мутации, которые обеспечивают повышенную аффинность к РсКп, включают, к примеру, мутации Т256А, Т307А, Е380А и Ж34А (статья §Ые1б§ и др., ί. Вю1. СНет. 276:6591 (2001), содержание которой полностью включено в эту заявку посредством ссылки).
Пептид Рс (или Рс-часть химерного полипептида) может быть по меньшей мере на 90 или 95% идентичный аминокислотной последовательности Рс, показанной в табл. 2 (аминокислоты 1458-1684 последовательности 8ЕО ГО № 2 или аминокислоты 2352-2578 последовательности 8ЕО ГО № 6). Пептид Рс (или Рс-часть химерного полипептида) может быть идентичный аминокислотной последовательности Рс, показанной в табл. 2 (аминокислоты 1458-1684 8ЕО ГО № 2 или аминокислоты 2352-2578 8ЕО ГО № 6). "Гибридные" полипептиды или белки, как используется в этой заявке, обозначают комбинирование химерного полипептида с другим полипептидом. Химерный полипептид и второй полипептид в гибридной молекуле могут быть связаны друг с другом белок-белковыми взаимодействиями, такими как взаимодействия электростатических зарядов или гидрофобными взаимодействиями. Химерный полипептид и второй полипептид в гибридной молекуле могут быть связаны друг с другом дисульфидной или другой ковалентной связью (ями). Гибридные белки описаны в заявках ШО 2004/101740 и ШО 2006/074199, содержание каждой из которых полностью включено в эту заявку посредством ссылки. См. также патенты США №№ 7,404,956 и 7,348,004, содержание каждого из которых полностью включено в эту заявку посредством ссылки. Второй полипептид может быть второй копией такого же химерного полипептида или может быть неидентичным химерным полипептидом. См. например фиг. 1, пример 1 и табл. 2.
В одном варианте осуществления изобретения второй полипептид является полипептидом, содержащим Рс. В другом варианте химерный полипептид является химерным полипептидом РУШ-Рс, и второй полипептид содержит главным образом Рс, например, гибридный полипептид примера 1, который представляет собой рекомбинантный белок слияния гРУШРс, состоящий из единой молекулы рекомбинантного РУШ человека с удалённым В-доменом (гРУШ-УВД), соединённой с димерным Рс-доменом ГС1 человека без промежуточной линкерной последовательности. Этот гибридный полипептид, именуемый в этой заявке как РУШРс - белок слияния с мономерным Рс, гибрид мономерного белка РУШРс, мономерный гибридный белок РУППРс и мономер-димер РУШРс. См. пример 1, фиг. 1 и табл. 2А. Доклинические и клинические данные исследования этого гибридного полипептида представлены в примерах.
Второй полипептид в этом гибриде может включать или содержать главным образом последовательность по меньшей мере на 90 или 95% идентичную аминокислотной последовательности, показанной в табл. 2А(б) без сигнальной последовательности (аминокислоты 21-247 8ЕО ГО № 4) или по меньшей мере на 90 или 95% идентичную аминокислотной последовательности, показанной в табл. 2А(б) с сигнальной последовательностью (аминокислоты 1-247 8ЕО ГО № 4). Второй полипептид может включать или содержать главным образом последовательность идентичную аминокислотной последовательности, показанной в табл. 2А(и) без сигнальной последовательности (аминокислоты 21-247 8ЕО ГО № 4) или идентичную аминокислотной последовательности, показанной в табл. 2А(и) с сигнальной последовательностью (аминокислоты 1-247 8ЕО ГО № 4).
Фиг. 1 - это схематическое изображение, показывающее структуру В-домена, удалённого у химерного полипептида РУШ-Рс и его соединение со вторым полипептидом, таким как Рс-полипептид. Для того, чтобы получить этот гибрид с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ), используя РУШ-специфические праймеры, из поли-А-РНК печени человека (С1оп1есН) синтезировали кодирующую последовательность рекомбинантного РУШ человека с удалённым В-доменом. Последовательность РУШ включает нативную сигнальную последовательность фактора РУШ. Делеция
- 19 029560
В-домена расположена от остатка серина 743 (§743; 2287 пар оснований) до глютамина 1638 (01638; 4969 пар оснований) с общим размером делеции в 2682 пар оснований. Потом кодирующую последовательность человеческого рекомбинантного полипептида Рс получили из кДНК библиотеки лейкоцитов человека (С1опГесЬ) с помощью ПЦР-ОТ, используя специфические Рс-праймеры. Праймеры были сконструированы таким образом, чтобы РУШ последовательность с удалённым В-доменом была соединена напрямую с Ν-терминальным сайтом последовательности Рс без промежуточного линкера. ДНК последовательность РУШРс была клонирована в векторе с двойной экспрессией млекопитающих рВИИСЕ4.1 (1пуйгодеп) под контролем промотора СМУ. Вторая идентичная последовательность включает сигнальную последовательность 1дк мыши, полученной с помощью ПЦР-ОТ и клонированной в обратном направлении от второго промотора - ЕР1а в векторе экспрессии рВИИСЕ4.1.
Вектор экспрессии гРУШРс перенесли в клетки почки эмбриона человека 293 (НЕК293Н; 1пуйтодеп), используя в качестве агента транфекции ЫроГесГатше 2000 (1пуйгодеп). Отбором с применением реагента 2еосш (1пуйгодеп) были получены стабильные линии клонированных клеток. Одна линия клонированных клеток - 3С4-22 была использована для синтеза молекул РУШРс для получения их характеристик ш У1уо. В компании Вюдеп Иес (СатЪгИде, МА) был получен и очищен рекомбинантный белок РУШРс (МсСие и др. 2009). Описанная выше методика трансфекции, как ожидалось, привела бы к получению трёх продуктов, например, мономерных гибридных белков гРУШРс, димерных гибридных белков гРУШРс и димерных полипептидов Рс. Однако в кондиционированной для таких клеток среде практически не было обнаружено димерных молекул гРУШРс. В значительной степени эта кондиционированная среда содержала Рс и мономерные гРУШРс. Возможно, что размер димерного белка гРУШРс был слишком большой и препятствовал эффективной его секреции из этих клеток. Этот результат был успешным, поскольку при нём обеспечивалась менее сложная очистка мономера, чем, если были бы в получены все три белка. Полученный продукт, использованный в таких исследованиях, имел удельную активность примерно 9000 МЕ/мг.
"Интервал дозирования" используется в этой заявке для обозначения времени дозирования, которое проходит между многократным приёмом препарата, введенного субъекту. Сравнение интервала дозирования может выполняться на единственном пациенте или на популяции пациентов, после чего рассчитывают среднее значение, полученное в этой популяции.
Интервал дозирования при введении химерного полипептида РУШ, например, химерного полипептида РУШ-Рс (полипептида, содержащего РУШ или гибридный белок) в настоящем изобретении может длиться по меньшей мере примерно в полтора раза дольше, чем интервал дозирования, требуемый для эквивалентной дозы упомянутого белка РУШ без Не-РУШ-части, например, без Рс-части (полипептид, содержащий упомянутый РУШ). Этот временной интервал дозирования может быть по меньшей мере примерно от полутора до шести раз дольше, от полутора до пяти раз дольше, от полутора до четырёх раз дольше, от полутора до трёх раз дольше или полутора до двух раз дольше, чем интервал дозирования, требуемый для эквивалентной дозы упомянутого белка РУШ без Не-РУШ-части, например без Рс-части (полипептид, состоящий из упомянутого РУШ). Этот временной интервал дозирования может быть по меньшей мере примерно в полтора, два, два с половиной, три, три с половиной, четыре, четыре с половиной, пять, пять с половиной или шесть раз дольше, чем интервал дозирования, требуемый для эквивалентной дозы упомянутого белка РУШ без Не-РУШ-фрагмента, например, без Рс-части (полипептид, состоящий из упомянутого РУШ). Этот интервал дозирования может составить примерно каждые три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать или четырнадцать дней или дольше. Этот интервал дозирования может составить по меньшей мере примерно от полутора до 5 дней, полтора, 2, 3, 4 или 5 дней или дольше. Для лечения по требованию интервал дозирования указанного химерного полипептида или гибридного белка составляет примерно каждые 24-36, 2448, 24-72, 24-96, 24-120, 24-144, 24-168, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 или 72 ч или дольше.
В одном варианте осуществления изобретения эффективная доза составляет 25-65 МЕ/кг (25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 62, 64 или 65 МЕ/кг) и интервал дозирования составляет каждые 3-5, 3-6, 3-7, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или более дней или три раза в неделю или не более чем три раза в неделю. В другом варианте эффективная доза составляет 65 МЕ/кг и интервал дозирования составляет раз в неделю или раз в каждые 6-7 дней. Эти дозы могут быть введены повторно так долго, сколько необходимо (например, по меньшей мере 10, 20, 28, 30, 40, 50, 52 или 57 недель, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 лет).
В некоторых вариантах эффективная доза для лечения по требованию составляет 20-50 МЕ/кг (20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 МЕ/кг). Лечение по требованию может проводиться в виде одноразового введения дозы или в виде повторных введений. Для повторных дозировок интервал дозирования может составлять каждые 12-24 ч, каждые 24-36 ч, каждые 24-48 ч, каждые 36-48 ч или каждые 48-72 ч.
Соответственно, термин "повторное дозирование" относится к введению более чем одной дозы в
- 20 029560
течение периода времени. Дозы, вводимые в режиме "повторное дозирование" относятся к "повторным дозам". В некоторых вариантах осуществления изобретения каждая из повторных доз отделяется от другой по меньшей мере 12 чми, по меньшей мере 24 чми, по меньшей мере двумя днями, по меньшей мере тремя днями, по меньшей мере четырьмя днями, по меньшей мере пятью днями, по меньшей мере шестью днями, по меньшей мере семью днями, по меньшей мере восемью днями, по меньшей мере девятью днями, по меньшей мере десятью днями, по меньшей мере 11 днями, по меньшей мере 12 днями, по меньшей мере 13 днями, по меньшей мере 14 днями или по меньшей мере 15 днями. В некоторых вариантах повторные дозы составляют по меньшей мере две дозы, по меньшей мере пять доз, по меньшей мере 10 доз, по меньшей мере 20 доз, по меньшей мере 25 доз, по меньшей мере 30 доз, по меньшей мере 35 доз, по меньшей мере 40 доз, по меньшей мере 45 доз, по меньшей мере 50 доз, по меньшей мере 55 доз, по меньшей мере 60 доз, по меньшей мере 65 доз или по меньшей мере 70 доз. Повторные дозы составляют от около двух доз до около 100 доз, от около пяти доз до около 80 доз, от около 10 доз до около 70 доз, от около 10 доз до около 60 доз, от около 10 доз до около 50 доз, от около 15 доз до около 40 доз, от около 15 доз до около 30 доз, от около 20 доз до около 30 доз, от около 20 доз до около 40 доз. Повторные дозы составляют около двух доз, около пяти доз, около 10 доз, около 15 доз, около 20 доз, около 25 доз, около 30 доз, около 35 доз, около 40 доз, около 45 доз, около 50 доз, около 55 доз, около 60 доз, около 65 доз, около 70 доз, около 75 доз, около 80 доз, около 90 доз или около 100 доз.
В некоторых вариантах осуществления изобретения пациенту после повторных доз дополнительно вводится фармацевтическая композиция, содержащая белок фактора свёртывания, которая включает фактор свёртывания, но не содержит Ре-часть. Этот фактор свёртывания может быть полноразмерным или зрелым фактором свёртывания. В некоторых вариантах осуществления изобретения таким фактором могли быть препараты: ΑΌνΑΤΕ®, ΚΕΟΟΜΒΙΝΑΤΕ®, ΚΟΟΕΝΑΤΕ Ρ8®, НЕЫХАТЕ Ρ8®, ΧΥΝΤΗΑ®/ΚΕΡΑΟΤΟ АВ®, IΙΕΜΟΙΊΙ.-Μ®. ΜΟΝΑΚΟ-Μ®, ΜΟΝΟΕΕΑΤΕ-Ρ®. ΗυΜΑΤΕ-Ρ®, ΑΣΡΗΑΝΑΤΕ®, ΚΟΑΤΕ-Όνΐ® и ΗΥΑΤΕ:Ο®.
В этой заявке термины "длительно действующий" и "стойкий" являются взаимозаменяемыми. "Стойкие факторы свёртывания" или "длительно действующие факторы свёртывания" (например, длительно действующий ΡνΐΙ, ΡνΐΙΙ и Р1Х) являются факторы свёртывания, например, ΡνΐΙ, ΡνΐΙΙ или Р1Х, обладающие увеличенным периодом полувыведения (также упоминаемым в этой заявке как 11/2, бета 11/2, полупериод элиминации и 1111) референтного фактора свёртывания, например, РУЛ, ΡνΐΙΙ или ΡΙΧ. "Более длительная" активность ΡνΐΙΙ может измеряться любым из известных в этой сфере методов, например, анализом аРТТ, хромогенным анализом, методами ΚΟΤΕΜ, ΤΟΑ и т.д. В одном варианте осуществления изобретения "более длительная" активность ΡνΐΙΙ может быть показана определением бета Τ1/2 (активность). В другом варианте "более длительная" активность ΡνΐΙΙ может быть по уровню антигена ΡνΐΙΙ в плазме, например, бета Τ1/2 (антиген). В других вариантах длительно действующий или стойкий ΡνΐΙΙ-полипептид дольше участвует в каскаде коагуляции, например, остаётся активным в течение более долгого периода времени по сравнению с ΡνΐΙΙ-полипептидом дикого типа, препаратов ΚΕΡΑΟΤΟ® или ΑΌνΑΤΕ®.
Увеличенный период полувыведения длительно действующего фактора свёртывания, например, длительно действующий ΡνΐΙΙ, может быть достигнут, благодаря слиянию с одним или большим количеством полипептидов, не связанных с факторами свёртывания, такими как, например, Рс. Увеличенный период полувыведения может быть достигнут, благодаря одной или более модификаций, таких как, пэгилирование. Иллюстрационные длительно действующие факторы свёртывания (например, длительно действующие полипептиды ΡνΐΙΙ) включают, к примеру, химерные факторы свёртывания (например, химерные полипептиды ΡνΐΙΙ, содержащие Рс) и химерные факторы свёртывания, содержащие альбумин (например, химерные полипептиды ΡνΐΙΙ, содержащие альбумин). Дополнительные иллюстрационные длительно действующие факторы свёртывания (например, длительно действующие полипептиды ΡνΐΙΙ) включают, к примеру, пэгилированные факторы свёртывания (например, пэгилированный ΡνΐΙΙ). "Референтный" полипептид, например, в отношении длительно действующего химерного фактора свёртывания (к примеру, длительно действующий химерный ΡνΐΙΙ-полипептид), представляет собой полипептид состоящий, главным образом, из части фактора свёртывания химерного полипептида. Например, в отношении длительно действующего ΡνΐΙΙ, референтный полипептид является частью ΡνΐΙΙ химерного полипептида, к примеру, такой же частью ΡνΐΙΙ без Ρс-части или без альбуминовой части. Аналогичным образом, референтный полипептид в отношении модифицированного ΡνΐΙΙ представляет собой такой же ΡνΐΙΙ без модификации, например, ΡνΐΙΙ без пэгилирования. В некоторых вариантах осуществления изобретения длительно действующий ΡνΐΙΙ при введении субъекту имеет одно или больше следующих характеристик:
среднее время удержания (ΜΚΤ) (активность) у упомянутого субъекта составляет около 14-41,3 ч; клиренс (СЬ) (активность) у упомянутого субъекта составляет около 1,22-5,19 мл/ч/кг или меньше; ί1/2 бета у упомянутого субъекта составляет около 11-26,4 ч;
восстановление показателей (значение Κ) (наблюдаемая активность) у упомянутого субъекта составляет около 1,38-2,88 МЕ/дл на МЕ/кг;
- 21 029560
Ух, (активность) у упомянутого субъекта составляет около 37,7-79,4 мл/кг; и соотношение ЛИС/доза у упомянутого субъекта составляет 19,2-81,7 МЕ-ч/дл на МЕ/кг.
В некоторых вариантах осуществления изобретения длительно действующий РУШ при введении
популяции пациентов имеет одну или больше следующих характеристик:
среднее восстановление показателей (значение К) (наблюдаемая активность) больше 1,38 МЕ/дл на
МЕ/кг;
среднее восстановление показателей (значение К) (наблюдаемая активность) по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,85, по меньшей мере 2,46 МЕ/дл на МЕ/кг;
средний клиренс (СЬ) (активность) у упомянутой популяции пациентов составляет около 2,33±1,08 мл/ч/кг или меньше;
средний клиренс (СЬ) (активность) у упомянутой популяции пациентов составляет около 1,8-2,69 мл/ч/кг;
средний клиренс (СЬ) (активность) у упомянутой популяции пациентов, который составляет около 65% клиренса полипептида, содержащего указанный РУШ без модификации;
среднее время удержания препарата (МКТ) (активность) у упомянутой популяции пациентов составляет по меньшей мере 26,3±8,33 ч;
среднее МКТ (активность) у упомянутой популяции пациентов составляет примерно 25,9-26,5 ч; среднее МКТ (активность) у упомянутой популяции пациентов, который составляет примерно в 1,5
большее время, чем среднее МКТ полипептида, содержащего указанный РУШ без модификации;
средний ΐ1/2 бета (активность) у упомянутой популяции пациентов составляет примерно 18,3-5,79 ч; средний γ бета (активность) у упомянутой популяции пациентов, который равен примерно 18-18,4
ч;
средний γ бета (активность) у упомянутой популяции пациентов, который составляет примерно в
1,5 больший период, чем средний ί1/2 бета полипептида, содержащего указанный РУШ без модификации; среднее восстановление показателей (значение К) (наблюдаемая активность) у упомянутой популяции пациентов составляет около 2,01±0,44 МЕ/дл на МЕ/кг;
среднее восстановление показателей (значение К) (наблюдаемая активность) у упомянутой популяции пациентов составляет около 1,85-2,46 МЕ/дл на МЕ/кг;
среднее восстановление показателей (значение К) (наблюдаемая активность) у упомянутой популяции пациентов, которое составляет около 90% значения клиренса среднего восстановления показателей полипептида, содержащего указанный РУШ без модификации;
среднее значение У88 (активность) у упомянутой популяции пациентов составляет примерно
55,1±12,3 мл/кг;
среднее значение Ух, (активность) у упомянутой популяции пациентов составляет примерно 45,356,1 мл/кг;
среднее значение ЛИС/доза (активность) у упомянутой популяции пациентов составляет примерно
49,9±18,2 МЕ-ч/дл на МЕ/кг;
среднее значение ЛИС/доза (активность) у упомянутой популяции пациентов составляет примерно
44,8-57,6 МЕ-ч/дл на МЕ/кг;
В других вариантах осуществления изобретения длительно действующий РУШ при введении популяции пациентов имеет одно или больше следующих свойств.
Максимальная наблюдаемая концентрация (Стах_ОВ8) у упомянутого субъекта исследования, принявшего химерный полипептид, сравнима с Стах_ОВ8 у пациента, принявшего такое же количество полипептида, состоящего из полноразмерного, зрелого РУШ, в условиях измерения концентраций одностадийным (аРТТ) анализом или двустадийным (хромогенным) анализом.
Стах_ОВ8 у упомянутого пациента составляет примерно 60,5 МЕ/дл, 60,5±1 МЕ/дл, примерно 60,5±2 МЕ/дл, примерно 60,5±3 МЕ/дл, примерно 60,5±4 МЕ/дл, примерно 60,5±5 МЕ/дл, примерно 60,5±6 МЕ/дл, примерно 60,5±7 МЕ/дл, примерно 60,5±8 МЕ/дл, примерно 60,5±9 МЕ/дл или примерно 60,5±10 МЕ/дл после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Стах_ОВ8 у упомянутого пациента составляет примерно 53,1-69 МЕ/дл после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Стах_ОВ8 у упомянутого пациента составляет примерно 119 МЕ/дл, 119±1 МЕ/дл, примерно 119±2 МЕ/дл, примерно 119±3 МЕ/дл, примерно 119±4 МЕ/дл, примерно 119±5 МЕ/дл, примерно 119±6 МЕ/дл, примерно 119±7 МЕ/дл, примерно 119±8 МЕ/дл, примерно 119±9 МЕ/дл, примерно 119±10 МЕ/дл, примерно 119±11 МЕ/дл, примерно 119±12 МЕ/дл, примерно 119±13 МЕ/дл, примерно 119±14 МЕ/дл, примерно 119±15 МЕ/дл, примерно 119±16 МЕ/дл, примерно 119±17 МЕ/дл или примерно 119±18 МЕ/дл после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Стах_ОВ8 у упомянутого пациента составляет примерно 103-136 МЕ/дл после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Стах_ОВ8 у упомянутого пациента составляет примерно76,5 МЕ/дл, 76,5±1 МЕ/дл, примерно 76,5±2
- 22 029560
МЕ/дл, примерно 76,5±3 МЕ/дл, примерно 76,5±4 МЕ/дл, примерно 76,5±5 МЕ/дл, примерно 76,5±6 МЕ/дл, примерно 76,5±7 МЕ/дл, примерно 76,5±8 МЕ/дл, примерно 76,5±9 МЕ/дл, примерно 76,5±10 МЕ/дл, примерно 76,5±11 МЕ/дл, примерно 76,5±12 МЕ/дл, примерно 76,5±13 МЕ/дл, примерно 76,5±14 МЕ/дл или примерно 76,5±15 МЕ/дл после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при определении двустадийным (хромогенным) анализом.
Стах_ОВ8 у упомянутого пациента составляет примерно 64,9-90.1 МЕ/дл после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при определении двустадийным (хромогенным) анализом.
Стах_ОВ8 у упомянутого пациента составляет примерно 182 МЕ/дл, 182±2 МЕ/дл, примерно 182±4 МЕ/дл, примерно 182±6 МЕ/дл, примерно 182±8 МЕ/дл, примерно 182±10 МЕ/дл, примерно 182±12 МЕ/дл, примерно 182±14 МЕ/дл, примерно 182±16 МЕ/дл, примерно 182±18 МЕ/дл или примерно 182±20 МЕ/дл после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при определении двустадийным (хромогенным) анализом.
Стах_ОВ8 у упомянутого пациента составляет примерно 146-227 МЕ/дл, примерно 146±5 МЕ/дл, примерно 146±10 МЕ/дл, примерно 227±5 МЕ/дл или примерно 146±10 МЕ/дл после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при определении двустадийным (хромогенным) анализом.
В других вариантах осуществления изобретения длительно действующий РУШ при введении популяции пациентов имеет одно или больше следующих характеристик:
Уз-бета (активность) у упомянутого субъекта исследования, составляет по меньшей мере в 1,48; 1,49; 1,50; 1,51; 1,52; 1,53; 1,54; 1,55; 1,56; 1,57; 1,58; 1,59; 1,60; 1,61; 1,62; 1,63; 1,64; 1,65; 1,66; 1,67; 1,68; 1,69; 1,70; 1,71; 1,72; 1,73; 1,74; 1,75; 1,76; 1,77; 1,78; 1,79; 1,80; 1,81; 1,82; 1,83; 1,84; 1,85; 1,86; 1,87; 1,88; 1,89 или 1,90 раза больший период времени, чем у2-бета (активность) у пациента; принявшего такое же количество полипептида, состоящего из полноразмерного, зрелого РУШ, в условиях измерения концентраций одностадийным (аРТТ) анализом или двустадийным (хромогенным) анализом.
й/2-бета (активность) у упомянутого пациента составляет примерно 18,8 ч, 18,8±1 ч, 18,8± 1 ч, 18,8±2 ч, 18,8±3 ч, 18,8±4 ч, 18,8±5 ч, 18,8±6 ч, 18,8±7 ч, 18,8±8 ч, 18,8±9 ч, 18,8±10 ч или 18,8±11 ч при определении полипептида одностадийным (аРТТ) анализом.
й/2-бета (активность) у упомянутого пациента составляет примерно 14,3-24.5 МЕ/дл при определении полипептида одностадийным (аРТТ) анализом.
й/2-бета (активность) у упомянутого пациента составляет примерно 16,7 ч, 16,7± 1 ч, 16,7±2 ч, 16,7±3 ч, 16,7±4 ч, 16,7±5 ч, 16,7±6 ч, 16,7±7 ч, 16,7±8 ч, 16,7±9 ч, 16,7±10 ч или 16,7±11 ч при определении полипептида двустадийным (хромогенным) анализом.
й/2-бета (активность) у упомянутого пациента составляет примерно 13,8 - 20,1 часов при определении полипептида двустадийным (хромогенным) анализом.
й/2-бета (активность) у упомянутого пациента составляет примерно 19,8 ч, 19,8± 1 ч, 19,8±2 ч, 19,8±3 ч, 19,8±4 ч, 19,8±5 ч, 19,8±6 ч, 19,8±7 ч, 19,8±8 ч, 19,8±9 ч, 19,8±10 ч или 19,8±11 ч при определении полипептида двустадийным (хромогенным) анализом.
Или к/2-бета (активность) у упомянутого пациента составляет примерно 14,3-27,5 ч при определении полипептида двустадийным (хромогенным) анализом. В других вариантах осуществления изобретения длительно действующий РУШ при введении популяции пациентов имеет одно или больше следующих характеристик:
Клиренс (СЬ) (активность) у упомянутого субъекта исследования составляет в 0,51; 0,52; 0,53; 0,54; 0,55; 0,56; 0,57; 0,58; 0,59; 0,60; 0,61; 0,62; 0,63; 0,64; 0,65; 0,66; 0,67; 0,68; 0,69 или 0,70 раза больший период времени, чем ί1/2 -бета (активность) у пациента; принявшего такое же количество полипептида, состоящего из полноразмерного, зрелого РУШ, в условиях измерения концентраций одностадийным (аРТТ) анализом или двустадийным (хромогенным) анализом.
Клиренс (СЬ) (активность) у упомянутого пациента составляет примерно 1,68 мл/ч/кг, 1,68±0,1 мл/ч/кг, 1,68±0,2 мл/ч/кг, 1,68±0,3 мл/ч/кг, 1,68±0,4 мл/ч/кг, 1,68±0,5 мл/ч/кг, 1,68±0,6 мл/ч/кг или 1,68±0,7 мл/ч/кг, после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Клиренс (СЬ) (активность) у упомянутого пациента составляет примерно 1,31-2,15 мл/ч/кг после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Клиренс (СЬ) (активность) у упомянутого пациента составляет около 2,32 мл/ч/кг, 2,32±0,1 мл/ч/кг, 2,32±0,2 мл/ч/кг, 2,32±0,3 мл/ч/кг, 2,32±0,4 мл/ч/кг, 2,32±0,5 мл/ч/кг, 2,32±0,6 мл/ч/кг или 2,32±0,7 мл/ч/кг, после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Клиренс (СЬ) (активность) у упомянутого пациента составляет около 1,64-3,29 мл/ч/кг после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Клиренс (СЬ) (активность) у упомянутого пациента составляет около 1,49 мл/ч/кг, 1,49±0,1 мл/ч/кг, 1,49±0,2 мл/ч/кг, 1,49±0,3 мл/ч/кг, 1,49±0,4 мл/ч/кг, 1,49±0,5 мл/ч/кг, 1,49±0,6 мл/ч/кг или 1,49±0,7 мл/ч/кг, после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при определении двустадийным (хромоген- 23 029560
ным) анализом.
Клиренс (СЬ) (активность) у упомянутого пациента составляет около 1,16-1,92 мл/ч/кг после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при определении двустадийным (хромогенным) анализом.
Клиренс (СЬ) (активность) у упомянутого пациента составляет около 1,52 мл/ч/кг, 1,52±0,1 мл/ч/кг, 1,52±0,2 мл/ч/кг, 1,52±0,3 мл/ч/кг, 1,52±0,4 мл/ч/кг, 1,52±0,5 мл/ч/кг, 1,52±0,6 мл/ч/кг или 1,52±0,7 мл/ч/кг, после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при определении двустадийным (хромогенным) анализом.
Или клиренс (СЬ) (активность) у упомянутого пациента составляет около 1,05-2,20 мл/ч/кг после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при определении двустадийным (хромогенным) анализом.
В некоторых вариантах осуществления изобретения длительно действующий РУШ при введении популяции пациентов имеет одно или больше следующих характеристик:
МКТ у упомянутого субъекта исследования, составляет по меньшей мере в 1,46; 1,47; 1,48; 1,49; 1,50; 1,51; 1,52; 1,53; 1,54; 1,55; 1,56; 1,57; 1,58; 1,59; 1,60; 1,61; 1,62; 1,63; 1,64; 1,65; 1,66; 1,67; 1,68; 1,69; 1,70; 1,71; 1,72; 1,73; 1,74; 1,75; 1,76; 1,77; 1,78; 1,79; 1,80; 1,81; 1,82; 1,83; 1,84; 1,85; 1,86; 1,87; 1,88; 1,89; 1,90; 1,91; 1,92 или 1,93 раза больший период времени, чем МКТ у пациента; принявшего такое же количество полипептида, состоящего из полноразмерного зрелого РУШ, в условиях измерения одностадийным (аРТТ) анализом или двустадийным (хромогенным) анализом.
МКТ (активность) у упомянутого пациента составляет примерно 27 ч, 27±1 ч, 27±2 ч, 27±3 ч, 27±4 ч, 27±5 ч, 27±6 ч, 27±7 ч, 27±8 ч, 27±9 ч или 27±10 ч при определении активности полипептида одностадийным (аРТТ) анализом.
МКТ (активность) у упомянутого пациента составляет примерно 20,6-35.3 ч при определении активности полипептида одностадийным (аРТТ) анализом.
МКТ (активность) у упомянутого пациента составляет примерно 23,9-28,5 ч при определении активности полипептида двустадийным (хромогенным) анализом.
МКТ (активность) у упомянутого пациента составляет примерно 19,8-28,9 ч при определении активности полипептида двустадийным (хромогенным) анализом.
МКТ (активность) у упомянутого пациента составляет примерно 20,5-39,6 ч при определении активности полипептида двустадийным (хромогенным) анализом. В других вариантах осуществления изобретения длительно действующий РУШ при введении популяции пациентов имеет одно или больше следующих свойств:
Восстановление показателей у упомянутого субъекта исследования сравнимо с восстановлением показателей у пациента, принявшего такое же количество полипептида, состоящего из полноразмерного зрелого РУШ, в условиях измерения одностадийным (аРТТ) анализом или двустадийным (хромогенным) анализом.
Восстановление показателей у упомянутого пациента составляет около 2,44 МЕ/дл на МЕ/кг, 2,44±0,1 МЕ/дл на МЕ/кг, 2,44±0,2 МЕ/дл на МЕ/кг, 2,44±0,3 МЕ/дл на МЕ/кг, 2,44±0,4 МЕ/дл на МЕ/кг,
2,44±0,5 МЕ/дл на МЕ/кг, 2,44±0,6 МЕ/дл на МЕ/кг, 2,44±0,7 МЕ/дл на МЕ/кг, 2,44±0,8 МЕ/дл на МЕ/кг,
2,44±0,9 МЕ/дл на МЕ/кг, 2,44±1,0 МЕ/дл на МЕ/кг, 2,44±1,1 МЕ/дл на МЕ/кг или 2,44±1,2 МЕ/дл на МЕ/кг, после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Восстановление показателей у упомянутого пациента составляет около 2,12-2,81 МЕ/дл на МЕ/кг после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Восстановление показателей у упомянутого пациента составляет около 1,83 МЕ/дл на МЕ/кг, 1,83±0,1 МЕ/дл на МЕ/кг, 1,83±0,2 МЕ/дл на МЕ/кг, 1,83±0,3 МЕ/дл на МЕ/кг, 1,83±0,4 МЕ/дл на МЕ/кг,
1,83±0,5 МЕ/дл на МЕ/кг, 1,83±0,6 МЕ/дл на МЕ/кг, 1,83±0,7 МЕ/дл на МЕ/кг, 1,83±0,8 МЕ/дл на МЕ/кг,
1,83±0,9 МЕ/дл на МЕ/кг, 1,83±1,0 МЕ/дл на МЕ/кг или 1,83±1,1 МЕ/дл на МЕ/кг, после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Восстановление показателей у упомянутого пациента составляет около 1,59-2,10 МЕ/дл на МЕ/кг после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Восстановление показателей у упомянутого пациента составляет около 3,09 МЕ/дл на МЕ/кг, 3,09±0,1 МЕ/дл на МЕ/кг, 3,09±0,2 МЕ/дл на МЕ/кг, 3,09±0,3 МЕ/дл на МЕ/кг, 3,09±0,4 МЕ/дл на МЕ/кг, 3,09±0,5 МЕ/дл на МЕ/кг, 3,09±0,6 МЕ/дл на МЕ/кг, 3,09±0,7 МЕ/дл на МЕ/кг, 3,09±0,8 МЕ/дл на МЕ/кг, 3,09±0,9 МЕ/дл на МЕ/кг, 3,09±1,0 МЕ/дл на МЕ/кг, 3,09±1,1 МЕ/дл на МЕ/кг, 3,09±1,2 МЕ/дл на МЕ/кг или 3,09±1,3 МЕ/дл на МЕ/кг, после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при определении двустадийным (хромогенным) анализом.
Восстановление показателей у упомянутого пациента составляет около 2,80 МЕ/дл на МЕ/кг, 2,80±0,1 МЕ/дл на МЕ/кг, 2,80±0,2 МЕ/дл на МЕ/кг, 2,80±0,3 МЕ/дл на МЕ/кг, 2,80±0,4 МЕ/дл на МЕ/кг,
2,80±0,5 МЕ/дл на МЕ/кг, 2,80±0,6 МЕ/дл на МЕ/кг, 2,80±0,7 МЕ/дл на МЕ/кг, 2,80±0,8 МЕ/дл на МЕ/кг,
2,80±0,9 МЕ/дл на МЕ/кг, 2,80±1,0 МЕ/дл на МЕ/кг, 2,80±1,1 МЕ/дл на МЕ/кг или 2,80±1,2 МЕ/дл на МЕ/кг, после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при определении двустадийным (хромогенным) анализом.
- 24 029560
Восстановление показателей у упомянутого пациента составляет около 2,61-3,66 МЕ/дл на МЕ/кг после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при определении двустадийным (хромогенным) анализом.
Или восстановление показателей у упомянутого пациента составляет около 2,24-3,50 МЕ/дл на МЕ/кг после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при определении двустадийным (хромогенным) анализом.
В остальных других вариантах осуществления изобретения длительно действующий РУГГГ при введении популяции пациентов имеет одно или больше следующих свойств:
Значение У88 (активность) у упомянутого субъекта исследования сравнимо со значением У88 (активность) у пациента, принявшего такое же количество полипептида, состоящего из полноразмерного зрелого РУГГГ, в условиях измерения одностадийным (аРТТ) анализом или двустадийным (хромогенным) анализом.
Значение У88 (активность) у упомянутого пациента составляет примерно 45,5 мл/кг, 45,5±1 мл/кг, 45,5±2 мл/кг, 45,5±3 мл/кг, 45,5±4 мл/кг, 45,5±5 мл/кг, 45,5±6 мл/кг, 45,5±7 мл/кг, 45,5±8 мл/кг, 45,5±9 мл/кг, 45,5±10 мл/кг или примерно 45,5±11 мл/кг после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при его определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Значение У88 (активность) у упомянутого пациента составляет около 39,3 - 52,5 мл/ч/кг после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при его определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Значение У88 (активность) у упомянутого пациента составляет примерно 62,8 мл/кг, 62,8±1 мл/кг, 62,8±2 мл/кг, 62,8±3 мл/кг, 62,8±4 мл/кг, 62,8±5 мл/кг, 62,8±6 мл/кг, 62.8 ± 7 мл/кг, 62,8±8 мл/кг, 62,8±9 мл/кг, 62,8±10 мл/кг, 62,8±11 мл/кг, 62,8±12 мл/кг, 62,8±13 мл/кг, 62,8±14 мл/кг, 62,8±15 мл/кг или примерно 62,8±16 мл/кг после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при его определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Значение У88 (активность) у упомянутого пациента составляет около 55,2 - 71,5 мл/ч/кг после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при его определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Значение У88 (активность) у упомянутого пациента составляет примерно 35,9 мл/кг, 35.9 ± 1 мл/кг, 35,9±2 мл/кг, 35,9±3 мл/кг, 35,9±4 мл/кг, 35,9±5 мл/кг, 35,9±6 мл/кг, 35,9±7 мл/кг, 35,9±8 мл/кг, 35,9±9 мл/кг, 35,9±10 мл/кг, 35,9±11 мл/кг, 35,9±12 мл/кг или примерно 35,9±13 мл/кг после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при его определении двустадийным (хромогенным) анализом.
Значение У88 (активность) у упомянутого пациента составляет около 30,4-42,3 мл/кг после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при определении двустадийным (хромогенным) анализом.
Значение У88 (активность) у упомянутого пациента составляет примерно 43,4 мл/кг, 43,4±1 мл/кг, 43,4±2 мл/кг, 43,4±3 мл/кг, 43,4±4 мл/кг, 43,4±5 мл/кг, 43,4±6 мл/кг, 43,4±7 мл/кг, 43,4±8 мл/кг, 43,4±9 мл/кг, 43,4±10 мл/кг, 43,4±11 мл/кг, 43,4±12 мл/кг, 43,4±13 мл/кг, 43,4±14 мл/кг, 43,4±15 мл/кг или 43,4±16 мл/кг после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при его определении двустадийным (хромогенным) анализом.
Или значение У88 (активность) у упомянутого пациента составляет около 38,2-49,2 мл/кг после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при определении двустадийным (хромогенным) анализом.
В дополняющих других вариантах осуществления изобретения длительно действующий РУГГГ при введении популяции пациентов имеет одно или больше следующих свойств:
Значение АИСГХР (АИС при инфузионном введении) у упомянутого субъекта исследования, составляет по меньшей мере в 1,45; 1,46; 1,47; 1,48; 1,49; 1,50; 1,51; 1,52; 1,53; 1,54; 1,55; 1,56; 1,57; 1,58; 1,59; 1,60; 1,61; 1,62; 1,63; 1,64; 1,65; 1,66; 1,67; 1,68; 1,69; 1,70; 1,71; 1,72; 1,73; 1,74; 1,75; 1,76; 1,77; 1,78; 1,79; 1,80; 1,81; 1,82; 1,83; 1,84; 1,85; 1,86; 1,87; 1,88; 1,89; 1,90 раз больший период времени, чем значение АИСГХР у пациента; принявшего такое же количество полипептида, состоящего из полноразмерного зрелого РУГГГ, в условиях измерения одностадийным (аРТТ) анализом или двустадийным (хромогенным) анализом.
Значение АИС^р у упомянутого пациента составляет около 1440±316 ч-МЕ/дл на МЕ/кг после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Значение АИС^р у упомянутого пациента составляет около 1160-1880 ч-МЕ/дл на МЕ/кг после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Значение АиСГМР у упомянутого пациента составляет примерно 1480 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 1480±100 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 1480±200 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 1480±300 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 1480±400 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 1480±500 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 1480±600 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 1480±700 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 1480±800 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 1480±900 ч-МЕ/дл на МЕ/кг или 1480±1000 ч-МЕ/дл на МЕ/кг после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Значение АИСГХР у упомянутого пациента составляет около 2910±1320 ч-МЕ/дл на МЕ/кг после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Значение АиСГХР- у упомянутого пациента составляет примерно 1980±3970 ч-МЕ/дл на МЕ/кг после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при определении одностадийным (аРТТ) анализом.
- 25 029560
Значение АиСЮР у упомянутого пациента составляет примерно 2800 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 2800±100 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 2800±200 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 2800±300 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 2800±400 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 2800±500 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 2800±600 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 2800±700 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 2800±800 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 2800±900 ч-МЕ/дл на МЕ/кг или 2800±1000 ч-МЕ/дл на МЕ/кг после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при определении одностадийным (аРТТ) анализом.
Значение АИСтР у упомянутого пациента составляет примерно 1660 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 1660± 100 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 1660±200 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 1660±300 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 1660±400 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 1660±500 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 1660±600 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 1660±700 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 1660±800 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 1660±900 ч-МЕ/дл на МЕ/кг или 1660±1000 ч-МЕ/дл на МЕ/кг после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при определении двустадийным (хромогенным) анализом.
Значение АИС^ у упомянутого пациента составляет около 1300-2120 ч-МЕ/дл на МЕ/кг после введения 25 МЕ/кг химерного полипептида при определении одвустадийным (хромогенным) анализом.
Значение АИС^ у упомянутого пациента составляет примерно 4280 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 4280±100 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 4280±200 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 4280±300 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 4280±400 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 4280±500 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 4280±600 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 4280±700 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 4280±800 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 4280±900 ч-МЕ/дл на МЕ/кг, 4280±1000 ч-МЕ/дл, 4280±1100 ч-МЕ/дл, 4280±1200 ч-МЕ/дл, 4280±1300 ч-МЕ/дл, 4280±1400 ч-МЕ/дл, 4280±1500 ч-МЕ/дл или 4280±1600 ч-МЕ/дл на МЕ/кг после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при определении двустадийным (хромогенным) анализом.
Или значение АИС^ у упомянутого пациента составляет около 2960 - 6190 ч-МЕ/дл на МЕ/кг после введения 65 МЕ/кг химерного полипептида при определении одвустадийным (хромогенным) анализом.
"Лечение по требованию" используется в этой заявке в значении лечения, которое, как предполагается, осуществляют в течение короткого периода времени и в ответ на существующее состояние, такое как эпизод кровотечения или при возникшей необходимости, такой как запланированное хирургическое вмешательство. Термины "лечение по требованию" и "эпизодическое лечение" используются взаимозаменяемо. Состояния, при которых может потребоваться лечение по требованию (эпизодическое лечение), к примеру, такие: крототечение вследствие нарушения коагуляции, гемартроз, кровотечение в мышечной ткани, кровотечение в ротовой полости, кровоизлияние, кровоизлияние в мышечной ткани, кровоизлияние в ротовой полости, последствие травмы, травма головы, гастроинтеральное кровотечение, внутричерепное кровоизлияние, внутрибрюшное кровоизлияние, внутригрудное кровоизлияние, переломы костей, кровотечение в пределах центральной нервной системы, кровотечение в заглоточной области, кровотечение в забрюшинной области или кровотечение в области окружения мышц иллиопсоас. Пациент может нуждаться в хирургическом профилактическом вмешательстве, периоперативном управлении или лечении перед хирургической операцией. Такие оперативные вмешательства включают, к примеру: малое хирургическое вмешательство, обширное оперативное вмешательство, удаление зубов, удаление миндалин, удаление паховых грыж, синовэктомию, полную замену коленного соединения, трепанацию черепа, остеосинтез, хирургичесокое лечение травм, внутричерепное хирургическое вмешательство, внутрибрюшинное хирургическое вмешательство, внутригрудное хирургическое вмешательство или операции по замене суставов.
В одном варианте осуществления изобретения лечение по требованию (эпизодическое) при однократном введении дозы препарата предотвращается более чем 80% (более чем 80%, более чем 81%, более чем 82%, более чем 83%, более чем 84%, более чем 85%, более чем 86%, более чем 87%, более чем 88%, более чем 89%, более чем 90%, более чем 91%, более чем 92%, более чем 93%, более чем 94%, более чем 95%, более чем 96%, более чем 97%, более чем 98%, более чем 99% или 100%) или 80-100%, 80-90%, 8590%, 90-100%, 90-95% или 95-100% случаев кровотечений. В другом варианте осуществления изобретения более чем 80% (более чем 81%, более чем 82%, более чем 83%, более чем 84%, более чем 85%, более чем 86%, более чем 87%, более чем 88%, более чем 89%, более чем 90%, более чем 91%, более чем 92%, более чем 93%, более чем 94%, более чем 95%, более чем 96%, более чем 97%, более чем 98%, более чем 99% или 100%) или 80-100%, 80-90%, 85-90%, 90-100%, 90-95% или 95-100% эпизодов кровотечений после получения лечения по требованию (эпизодического лечения) оцениваются докторами в отношении результатов лечения как отличные или хорошие. В остальных вариантах более чем 5% (более чем 6%, более чем 7%, более чем 8%, более чем 9%, более чем 10%, более чем 11%, более чем 12%, более чем 13%, более чем 14%, более чем 15%, более чем 16%, более чем 17%, более чем 18%, более чем 19%, более чем 20) или 5-20%, 5-15%, 5-10%, 10-20% или 10-15% эпизодов кровотечений после получения лечения по требованию (эпизодического лечения) оцениваются докторами в отношении результатов лечения как удовлетворительные.
"Полипептид", "пептид" и "белок" используются как взаимозаменяемые в отношении полимерного вещества, состоящего из ковалентно-связанных аминокислотных остатков.
"Полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота" используются как взаимозаменяемые термины в отношении полимерного вещества, состоящего из ковалентно-связанных нуклеотидных остатков. Полинук- 26 029560
леотидами могут быть ДНК, кДНК, РНК, одноцепочечные или двухцепочечные молекулы, векторы, плазмиды, фаги или вирусы. Полинуклеотиды включают, например, описанные в табл. 1, которые кодируют полипептиды из табл. 2 (см. табл. 1). Полинуклеотиды включают также, например, фрагменты полинуклеотидов табл. 1, которые, например, кодируют фрагменты полипептидов из табл. 2, такие как РУШ, Рс, сигнальную последовательность, 6Гис- и другие фрагменты полипептидов табл. 2.
"Профилактическое лечение" используется в этой заявке для обозначения введения полипептида РУШ для субъекта в многократных дозах в течение периода времени для того, чтобы увеличить уровень активности РУШ в плазме крови субъекта.
Увеличение уровня может быть достаточным для снижения случаев спонтанного возникновения кровотечения или предотвращения кровотечения, например, в случае непредвиденного повреждения. Во время профилактического лечения уровень белка в плазме пациента может снизиться ниже исходного значения уровня для этого пациента или быть ниже уровня РУШ, который характерен для тяжёлого заболевания гемофилией (<1 МЕ/дл - наблюдается у 1% больных).
В одном варианте осуществления изобретения схема профилактики "подбирается" для каждого пациента, например, путём определения для каждого пациента данных фармакокинентики (ΡΚ) и введения РУШ данного изобретения в таком интервале дозирования, который обеспечит минимальный уровень 13% активности РУШ. Могут проводиться корректировки, когда с пациентом происходят неприемлемые случаи возникновения кровотечения, определяемые как >2 спонтанных эпизодов кровотечения в течение непрерывного двухмесячного периода. В этом случае корректировка дозы будет направлена на изменение минимальных уровней активности до 3-5%. В другом варианте профилактическое лечение направлено на предотвращение и контроль возникновения кровотечений, долговременный контроль кровотечений, долговременную защиту против появления кровотечений и/или на долговременную пользу. Профилактика, например, долговременная защита может быть продемонстрирована путём увеличения АИС до последней измеряемой временной точки (АиС-ЬА8Т) и пониженного клиренса, что приводит к увеличению ΐι/2 по сравнению с РУШ с коротким периодом действия. Профилактика может быть продемонстрирована путём улучшения значений Стах, и Ттах и/или большим средним временем удержания препарата по сравнению с РУШ быстрого действия. В некоторых вариантах в результате профилактики не было отмечено спонтанных эпизодов кровотечений в пределах примерно 24, 36, 48, 72 или 96 ч (например, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55,
56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,
96, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 или 96 ч) после введения препарата (например, последней инъекции).
В некоторых вариантах профилактика приводит к повышению более чем на 30% (например, более чем на 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,
61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 96, 87, 88, 89 или
90%, например, более чем на 50%) среднего снижения среднегодичных эпизодов кровотечения при введении доз препарата раз в неделю (например, при дозе 65 МЕ/кг).
"Субъект" используется в этой заявке в значении человеческого индивидуума. Субъект может быть пациентом, который в данный момент страдает нарушением свёртываемости крови или ожидаемо нуждается в таком лечении. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект ранее никогда не подвергался лечению с помощью фактора свёртывания крови (например, субъект являлся ранее не лечившимся субъектом или ранее не лечившимся пациентом). В некоторых вариантах субъект представлял собой плод, и способы лечения включали введение химерного полипептида матери этого плода, и введение субъекту происходило через плаценту от матери. В некоторых вариантах субъектом является ребёнок или взрослый. В некоторых вариантах пациентом является ребёнок возрастом младше одного года, младше двух лет, младше двух лет, младше трёх лет, младше четырёх лет, младше пяти лет, младше шести лет, младше семи лет, младше восьми лет, младше девяти лет, младше десяти лет, младше одинадцати лет или младше двенадцати лет. В некоторых вариантах возраст ребёнка был меньше одного года. В некоторых вариантах осуществления изобретения у ребёнка и взрослого развивалось нарушение свёртывания крови, тогда как проявление симптомов нарушения свёртывания крови появилось в возрасте более одного года. В некоторых вариантах химерный полипептид вводится субъекту в количестве, достаточном для предотвращения, ингибирования или снижения развития иммунного ответа, выявляющемся в виде гуморального иммунного ответа, клеточно-опосредованного иммунного ответа или обоих гуморального и клеточно-опосредованного иммунных ответах к фактору свёртывания крови.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в этой заявке, у пациента существует риск развития ингибирующего иммунного ответа к РУШ. У субъекта может существовать риск развития ингибирующего иммунного ответа к РУШ, например, из-за того, что у субъекта раннее развился ингибирующий иммунный ответ к РУШ или в данное время существует ингибирующий иммунный ответ к РУШ. В некоторых вариантах у субъекта развился ингибирующий иммунный ответ к РУШ после лечения с помощью препаратов РУШ, полученных из плазмы крови. В некоторых вариантах у субъекта развился ингибирующий иммунный ответ к РУШ после лечения с помощью рекомбинантных препаратов РУШ. В некоторых вариантах у субъекта развился ингибирующий иммунный ответ к РУШ после лечения с помощью полноразмерных белков РУШ. В некоторых вариантах у субъекта развился ингибирую- 27 029560
щий иммунный ответ к ΡνΙΙΙ после лечения с помощью белков ΡνΙΙΙ, содержащих делеции последовательности, например, полное или частичное удаление В-домена.
В некоторых вариантах осуществления изобретения у пациента развился ингибирующий иммунный ответ к ΡνΙΙΙ после лечения с помощью препаратов ΡνΙΙΙ, выбранных из группы: А^VАТЕ®, КЕСОМВШАТЕ®. КООЕ^ТЕ Ρ3®, НЕЫХАТЕ Ρ3®, XΥNТНА®/КЕΡАСТО АВ®, НЕМОΡI^-М®, МОтКСМ®, МОХОС1.АТН-Р®. НИМАТЕ-Р®, А1.Р11АХАТН®. КОАТЕ-ΌνΙ® или НУАТЕ:С®.
В некоторых вариантах иммунный ответ после лечение с помощью фактора свёртывания крови, например, ΡνΙΙΙ, включает выработку ингибирующих антител к этому фактору свёртывания. В некоторых вариантах концентрация ингибирующих антител составляет по меньшей мере 0,6 единицам Бетесды (БЕ). В некоторых вариантах концентрация ингибирующих антител составляет по меньшей мере 5 БЕ. В некоторых вариантах осуществления изобретения концентрация ингибирующих антител составляет, по меньшей мере 0,5, по меньшей мере 0,6, по меньшей мере 0,7, по меньшей мере 0,8, по меньшей мере 0,9, по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 2,0, по меньшей мере 3,0, по меньшей мере 4,0, по меньшей мере 5,0, по меньшей мере 6,0, по меньшей мере 7,0, по меньшей мере 8,0, по меньшей мере 9,0 или по меньшей мере 10,0 БЕ.
В некоторых вариантах иммунный ответ после лечение с помощью фактора свёртывания крови, например, ΡνΙΙΙ, включает клеточно-опосредованный иммунный ответ. В некоторых вариантах иммунный ответ включает клеточно-опосредованный иммунный ответ. Клеточно-опосредованный иммунный ответ может включать высвобождение цитокинов, выбранных из группы, состоящей из ГЬ-12, ΙΕ-4 и ТОТ1-». В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунный ответ после лечения с помощью фактора свёртывания крови, например, ΡνΙΙΙ, включает клинический симптом, выбранный из группы, состоящей из: увеличения тенденции кровотечений, высокой степени использования фактора свёртывания, недостаточного ответа на терапию с помощью фактора свёртывания, снижения эффективности терапии с помощью фактора свёртывания и/или сокращения периода полувыведения фактора свёртывания. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект несёт мутацию или делецию гена фактора свёртывания крови. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект несёт перестройку гена фактора свёртывания крови. В некоторых вариантах осуществления изобретения пациенты страдают серьёзной формой гемофилии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у субъектов есть родственники, у которых ранее развился ингибирующий иммунный ответ к фактору свёртывания крови. В некоторых вариантах пациент получает терапию препаратами интерферонов. В некоторых вариантах пациент получает терапию противовирусными препаратами.
В некоторых вариантах у пациента с риском кровотечений ранее развился ингибирующий иммунный ответ к терапевтическому протеину, отличному от ΡνΙΙΙ. В дополнение к этому, у субъекта может также существовать риск развития ингибирующего иммунного ответа к ΡνΙΙΙ как результат влияния нескольких факторов внешней среды или генетических факторов, которые увеличивают вероятность развития ингибирующего иммунного ответа. Известны факторы, увеличивающие вероятность того, что у пациента возникнет ингибирующий иммунный ответ. См. к примеру статью Какрег С. "Б1адпок1к апй Мападетеп! оГ [пЫЬЬогк !о ЕасЮгк νΙΙΙ апй ΙΧ - Ап ЕНгойисЮгу БЕсикбоп Гог РЬуыиапк," Тгеа!теп! оГ НеторЫШа 34 (2004), содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. Например, ингибиторы чаще образуются в случае серьёзного заболевания гемофилией (например, исходный уровень ΡνΙΙΙ менее 1%), чем в случае лёгкого или среднего заболевания. См. отчёт Керог! оГ Ехрег! Меейпд оп ΡνΙΙΙ Ргойис!к апй ййиЬПог Беуе1ортеп!, Еигореап Мейютек Адепсу (ЕеЬшагу 28, 2006-МагсЬ 2, 2006), содержание которого полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Результатом наличия генетических факторов может быть увеличение вероятности того, что у субъекта возникнет ингибирующий иммунный ответ, для пациента с, по крайней мере, одним членом семьи (например, брат или сестра, родитель, ребёнок, прародитель, тётя, дядя или двоюродный родственник), у которого развился ингибирующий иммунный ответ к ΡνΙΙΙ или другому терапевтическому протеину, может существовать риск развития ингибирующего иммунного ответа к ΡνΙΙΙ. Ингибиторы обычно встречаются у пациентов с генетическими мутациями, которые предотвращают экспрессию ΡνΙΙΙ, такие как большие генетические делеции, нонсенс-мутации, вызывающие образование стоп-кодонов и большие инверсии гена ΡνΙΙΙ. Поэтому, в некоторых вариантах субъект с риском развития ингибирующего иммунного ответа к ΡνΙΙΙ несёт мутацию, делецию или перестройку гена ΡνΙΙΙ. В некоторых вариантах субъект с риском развития ингибирующего иммунного ответа к ΡνΙΙΙ несёт мутацию в последовательности ΡνΙΙΙ, которая предотвращает связывание ΡνΙΙΙ с Т-клетками. Наблюдалось существование связи появления ингибиторов с большими перестройками генов ΡνΙΙΙ. См. статью Ак!егтагк и др., В1оой 707:3167-3172 (2006), содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. Таким образом, в некоторых вариантах белок слияния ΡνΠΙ-Ρο вводится субъекту с большими перестройками гена ΡνΙΙΙ, например, инверсия интрона 22 или инверсия интрона 1. В некоторых вариантах ΡνΠΙ-Ρο вводится субъекту с двумя большими перестройками гена ΡνΙΙΙ. Наблюдалось также существование связи появления ингибиторов с нуль-мутациями. Ак!егтагк и др., В1оой 108:3739-3745 (2006). Таким образом, в некоторых вариантах белок слияния ΡνΠΙ-Ρο вводится субъекту с нуль-мутацией.
- 28 029560
Ингибиторы также чаще встречаются после лечения экзогенными факторами свёртывания крови всего лишь после нескольких случаев введения. Поэтому, в некоторых вариантах субъекты с риском развития ингибирующего иммунного ответа получали лечение менее чем 200, 175, 150, 125, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10 или 5 дней. В некоторых вариантах субъекты с риском развития ингибирующего иммунного ответа ранее не получали РУШ.
В некоторых вариантах субъектом является внутриутробный плод. Иммунная толерантность может индуцироваться у плода путем введения матери плода химерного полипептида, содержащего РУШ-часть и часть Рс.
Ингибиторы также чаще появляются у потомков чёрных африканцев. См. к примеру статью Какрег С. ’таадиоык аий Маиадетеи! о£ 1иШЬЬогк Ю РасЮгк УШ аий IX -Аи 1и1гойис!огу ПЦсиккюи £ог ΡΗνκίиаик," Тгеа1теШ о£ НеторЫНа 34 (2004), содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. Поэтому, в некоторых вариантах осуществления изобретения субъект с риском развития ингибирующего иммунного ответа является чёрным африканцев.
Генетические мутации в генах, отличных от РУШ также были связаны с повышением риска развития ингибирующего иммунного ответа. Например, полиморфизм ΤΝΓ-α-308Ο>Α на участке Нар2, который связан с повышением уровня конституитивной и индуцибельной транскрипции фактора ΤΝΓ и связан с возрастанием риска развития ингибирующего иммунного ответа. См. статью Ак!егтагк и др., Ак(егтагк и др., В1оой 108: 3739-3745 (2006), содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. Поэтому, в некоторых вариантах осуществления изобретения субъект с риском развития ингибирующего иммунного ответа обладает генетическим полиморфизмом с повышенным синтезом ΤΝΓ-α. В некоторых вариантах полиморфизм является фактором ΤΝΓ-α-308Ο>Α. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект с риском развития ингибирующего иммунного ответа обладает генетическим полиморфизмом гена Ш10, например, полиморфизм, связанный с повышенной секрецией Ш10. В некоторых вариантах РУШ-Рс вводится для лечения субъекта с микросателлитом Ш10О на участке промотора аллели 134 гена Ш10. См. статью Айегтагк и др. Неток1ак1к, Τ^отЬок^к, аий Уакси1аг Вю1оду 108: 3739-3745 (2006), содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Поэтому, в некоторых вариантах осуществления изобретения субъект с риском развития ингибирующего иммунного ответа обладает генетическим полиморфизмом связанным со снижением экспрессии СТЬА-4 (цитотоксичным антигеном-4 Т-лимфоцитов). В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект с риском развития ингибирующего иммунного ответа несёт мутацию ΌΚ15 (НЬАΌΚ15) или ЭОВ0602 молекул МНС (главного компекса гистосовместимости) II класса. Другие варианты молекул МНС II класса, связанные с развитием ингибирующего иммунного ответа у пациентов с гемофилией: А3, В7, С7, ПЦА0102, С2, ПЦА0103, 0ЦВ0603 и ΌΚ13 (см. ШЫЬЬогк ш РайеЫк \νί11ι НеторЫНа, Е.С. Коййдие7-МегсНаи & С.А. Ьее, Ейк., В1аск\уе11 §аеисе, Ый, 2002).
В некоторых вариантах осуществления изобретения пациент с риском развития ингибирующего иммунного ответа ранее не получал факторов свёртывания, к примеру РУШ. В некоторых вариантах пациент с риском развития ингибирующего иммунного ответа к факторам, например РУШ, получал препараты РУШ. В некоторых вариантах пациенты с риском развития ингибирующего иммунного ответа к фактору свёртывания, к примеру РУШ, принимали препараты РУШ менее 150, менее 50 или менее 20 дней лечения. В некоторых вариантах субъект принимал лечение с помощью фактора свёртывания по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах субъект принимал лечение с помощью фактора свёртывания по меньшей мере 25, 30, 35, 40, 45 или 50 дней. В некоторых вариантах субъект принимал лечение с помощью фактора свёртывания по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 или 150 дней.
В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибирующий иммунный ответ представлял собой ингибирующий иммунный ответ к РУШ. В некоторых вариантах осуществления изобретения развился ингибирующий иммунный ответ к препарату РУШ, выбранному из группы, состоящей из препаратов: КЕСОМВША'ГЕ®, КОСЕ^’ГЕ Р8®, ННМХАРН Р8®, ХУЭТНА®/КЕРАСТО АВ®,
НЕМОШЬ-М®, МОNΑΚС-М®, МОNОС^ΑΤЕ-Р®, НυМΑΤЕ-Р®, АЬРНАт'ГЕ®, КОΑΤЕ-^УI® или НУА'ГЕ:С®. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибирующий иммунный ответ представлял собой ингибирующий иммунный ответ к РУШ, возникший в ответ на введение рекомбинантного препарата РУШ.
В некоторых вариантах субъект с риском развития ингибирующего иммунного ответа получает или недавно получал иммуностимулирующую терапию. Например, сообщали о наличии ингибиторов у ВИЧпозитивных пациентов с гемофилией А, подвергавшихся лечению препаратами интерферонов, а также у ВИЧ-позитивных пациентов с гемофилией А с воспалительным синдромом восстановления иммунитета, связанного с антиретровирусной терапией. См. отчёт Верой о£ Ехрей Меейид ои РУШ РгойисЫ аий ЫЫЬИог Пеуе1ортеи1, Еигореаи Мейютек Адеису (РеЬгиагу 28, 2006-МагсН 2, 2006), содержание которого полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. Поэтому, в некоторых вариантах осуществления изобретения субъект с риском развития ингибирующего иммунного ответа принимал терапию с
- 29 029560
помощью препаратов интерферонов. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект с риском развития ингибирующего иммунного ответа стадал от воспалительного синдрома восстановления иммунитета и принимал антиретровирусную терапию. Ингибирующий иммунный ответ к РУШ определялся по клиническим реакциям при лечении препаратами РУШ. Известны и описаны клинические проявления ингибиторов РУШ, например, см. статью Какрег С. "Όίαβποδίδ апб Мападетеп! о£ 1пЫЬДог8 !о Рас!ог8 УШ апб IX - Αп 1п1гобис!огу П18си881оп £ог РЬукюгапк," ТгеаИпеШ о£ ИеторЫПа 34 (2004), содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. Например, присутствие в крови ингибиторов делает сложным контролирование кровотечений, так как иммунные реакции к РУШ отмечаются по увеличению тенденции кровотечений, высокому уровню использования РУШ, недостаточному ответу на терапию с помощью РУШ, снижению эффективности терапии с помощью РУШ и/или сокращению периода полувыведения РУШ.
Ингибирующие иммунные реакции к РУШ могут также быть определены лабораторными анализами, такими как Бетесда-тест или модификацией Неймеген Бетесда-теста. Величина уровня ингибиторов по крайней мере 0,6 единиц Бетесды (БЕ) может указывать на наличие ингибирующего иммунного ответа. Величина уровня по крайней мере 5 БЕ может указывать на наличие высокого титра ингибитора. Могут также использоваться измерения в условиях ш У1уо восстановления показателей и периода полувыведения при болюсном инфузионном введении препарата РУШ. В некоторых вариантах осуществления изобретения у субъекта с риском развития ингибирующего иммунного ответа ранее был обнаружен ингибирующий иммунный ответ с пиковым титром, по меньшей мере 0,5, по меньшей мере 0,6, по меньшей мере 0,7, по меньшей мере 0,8, по меньшей мере 0,9, по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 2,0, по меньшей мере 3,0, по меньшей мере 4,0, по меньшей мере 5,0, по меньшей мере 6,0, по меньшей мере 7,0, по меньшей мере 8.0, по меньшей мере 9,0 или по меньшей мере 10,0 БЕ.
В некоторых предлагаемых в этой заявке вариантах способы лечения включают определение ингибирующего РУШ иммунного ответа и введение субъекту химерного полипептида, содержащего РУШчасть и часть Рс, если у субъекта имеется риск развития ингибирующего иммунного ответа. Поэтому, в некоторых вариантах способы лечения включают определение того, есть ли у субъекта мутация, делеция или перестройка генов РУШ, и введение химерного полипептида, если такие изменения есть. В некоторых вариантах способы лечения включают определение того, образуются ли у субъекта белки РУШ, и введение химерного полипептида, если в организме субъекта не синтезируются такие белки. В некоторых вариантах способы лечения включают определение того, поражён ли субъект лёгкой, умеренной или серьёзной формой гемофилии, и введении химерного полипептида, если субъект болен серьёзной формой. В некоторых вариантах способы лечения включают определение того, проявляется ли у субъекта ингибирующий РУШ иммунный ответ, например, путём оценки клинических проявлений иммунного ответа измерением титров, уровней или активности антител к РУШ или измерением клеточноопосредованного иммунного ответа (к примеру, измерением уровней цитокинов), и введение химерного полипептида, если у субъекта есть по крайней мере одно из этих показаний.
"Терапевтическия доза" используется в этой заявке для обозначения дозы, введение которой достигает терапевтического эффекта, описанного в этой заявке. Расчёт требуемой дозировки РУШ базируется на эмпирическом результате того, что в среднем 1 МЕ РУШ на кг массы тела повышает активность РУШ в плазме крови приблизительно на 2 МЕ/дл. Требуемая дозировка определяется с использованием следующей формулы: Требуемые единицы = масса тела (кг) х желаемое повышение РУШ (МЕ/дл или % от нормальной активности)х0,5 (МЕ/кг на МЕ/дл).
Терапевтические дозы, которые могут использоваться в способах лечения настоящего изобретения, составляют примерно 10-100 МЕ/кг, более определённо 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 8090 или 90-100 МЕ/кг, и более определённою, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 МЕ/кг. Дополнительные терапевтические дозы, которые могут использоваться в способах лечения настоящего изобретения составляют от около 10 до около 150 МЕ/кг, более определённо около 100110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150 МЕ/кг, и более определённо 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 или 150 МЕ/кг.
"Вариант" используется в этой заявке относительно обозначения полинуклеотида или полипептида, отличающихся от исходных полинуклеотида или полипептида, но сохраняющих их значимые свойства, например, коагулирующую активность РУШ или активность Рс (связывание с рецептором РсКи). Как правило, варианты в основном обладают полным подобием и, по многим участкам, идентичны исходному полинуклеотиду или полипептиду. Варианты, к примеру, включают полинуклеотидные фрагменты, делеции, инсерции и модифицированные версии исходных полипептидов.
Полинуклеотидные варианты могут содержать или, в другом случае, состоять из нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична, например, нуклеотидным кодирующим последовательностям §Еф ГО № 1, 3 или 5 (РУШ-часть, Рс-часть, по отдельности или вместе) или комплементарным им цепям; нуклеотидным кодирующим последовательностям известных мутантных и рекомбинантных РУШ и Рс, таким как разглашённые в публикациях и патентах, цитируемые в этой заявке, или их комплементарным цепям, нуклеотидным последовательностям, кодирующим полипептиды §Еф ГО № 2, 4 или 6 (РУШ-часть, Рс-часть, по отдельности или вместе) и/или по- 30 029560
линуклеотидным фрагментам каким-либо из этих молекул нуклеиновых кислот (например, тех фрагментов, которые описаны в этой заявке). Полинуклеотиды, которые гибридизируются с такими молекулами нуклеиновых кислот в строгих условиях гибридизации или менее строгих условиях также включают как варианты, так и полипептиды, кодируемыми такими полинуклеотидами, поскольку они являются функциональными.
Полинуклеотидные варианты могут содержать или, в другом случае, состоять из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична, например, полипептидным кодирующим последовательностям 8ЕО ГО № 2, 4 или 6 (РУШ-часть, Рс-часть, по отдельности или вместе) и/или полинуклеотидным фрагментам каким-либо из этих полипептидов (например, тех фрагментов, которые описаны в этой заявке).
В отношении нуклеиновой кислоты, обладающей нуклеотидной последовательностью по меньшей мере, например, на 95% "идентичной" референтной нуклеотидной последовательности, подразумевается, что эта нуклеотидная последовательность нуклеиновой кислоты является идентичной референтной последовательности за исключением тех случаев, что нуклеотидная последовательность может включать до пяти точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов референтной нуклеотидной последовательности. Другими словами, для получения нуклеиновой кислоты, обладающей нуклеотидной последовательностью, по крайней мере, на 95% идентичной референтной нуклеотидной последовательности до 5% нуклеотидов этой референтной последовательности может быть заменено или удалено другими нуклеотидами или количество нуклеотидов до 5% от общего количества нуклеотидов референтной последовательности должно быть введено в эту референтную последовательность. Запрашиваемая последовательность может быть, к примеру, полной последовательностью, показанной как 8ЕО ГО № 1 или 3, открытой рамкой считывания (ОКР) или каким-либо определённым фрагментом, описанным в этой заявке. С практической точки зрения то, что какая-то определённая молекула нуклеиновой кислоты или полипептид по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичена нуклеотидной последовательности или полипептиду настоящего изобретения может быть определено обычным способом с использованием известных компьютерных программ. В одном варианте изобретения способ определения наилучшего полного соответствия между запрашиваемой последовательностью (референтной или исходной последовательностью) и исследуемой последовательностью, также известное как полное выравнивание последовательностей, может быть определено с использованием компьютерной программы РΑ§Τ^В, основанной на работе алгоритма авторов статьи ВгиИад и др., Сотр. Арр. Вюкск 6:237-245 (1990), содержание которой полностью включено в эту заявку посредством ссылки. При выравнивании последовательностей обе последовательности запрашиваемая и исследуемая являются ДНК-последовательностями. РНКпоследовательность можно сравнивать, заменяя нуклеотиды У на Т. Результат полного выравнивания последовательностей представляют в процентах идентичности. В другом варианте изобретения параметры, используемые при ДНК-выравнивании последовательностей в программе РΑ§Τ^В для расчёта процента идентичности такие: Матрица=Унитарная, к-мерность=4, Ошибка несовпадениям, Ошибка связывания=30, Длина группы рандомизации=0, Счёт отсекания=1, Ошибка промежутка=5, Ошибка размера промежутка 0,05, Размер окна=500 или длина исследуемой нуклеотидной последовательности, которая может быть короче.
Если исследуемая последовательность короче, чем запрашиваемая последовательность из-за 5'- или 3'-делеций, но не из-за внутренних делеций, то для получения результатов необходимо провести коррекцию в ручном режиме. Это необходимо потому, что программа РΑ§Τ^В не учитывает 5'- и 3'-усечения исследуемой последовательности при расчёте процента идентичности. Для исследуемой последовательности, усечённой с 5'- и 3'-концов, подобной запрашиваемой последовательности, процент идентичности корректируется путём расчёта количества оснований запрашиваемой последовательности, что находятся в пределах 5'- и 3'-концов исследуемой последовательности, которые не совпадают/ не выравниваются, как процент общего количества оснований запрашиваемой последовательности. Если же нуклеотидная последовательность совпадает/выравнивается, то это определяется по результатам выравнивания последовательности в программе РΑ§Τ^В. Это процентное значение потом отнимается от процента идентичности, рассчитанного выше программой РΑ§Τ^В, используя специальные параметры для получения финального значения процента идентичности. Это скорректированное значение является тем, что используется в целях настоящего изобретения. В целях корректировки значения процента идентичности в ручном режиме рассчитываются только основания за пределами 5'- и 3'-концов исследуемой последовательности, что отображаются при выравнивании в программе РΑ§Τ^В, которые не совпадают/не выравниваются с запрашиваемой последовательностью.
Например, исследуемая последовательность длиной 90 оснований для определения процента идентичности выравнивается с запрашиваемой последовательностью длиной 100 оснований. Делеции встречаются на 5'-конце исследуемой последовательности и поэтому при выравнивании программой РΑ§Τ^В не будет отмечаться совпадение/выравнивание первых 10 оснований 5'-конца. 10 неспаренных оснований представляют 10% последовательности (количество оснований на 5'- и 3'-концах не совпадают/не равны общему числу оснований запрашиваемой последовательности), таким образом, 10% отнимается от значения процента идентичности, рассчитанного программой РΑ§Τ^В. Если оставшиеся 90 оснований со- 31 029560
вершенно совпали, то финального значение процента идентичности было бы 90%. В другом примере, исследуемая последовательность длиной 90 оснований сравнивается с запрашиваемой последовательностью длиной 100 оснований. В этот раз делеции являются внутренними так, что нет оснований на 5'- или 3'-концах исследуемой последовательности, которые не совпадают/не выравниваются с запрашиваемой последовательностью. В этом случае процент идентичности, рассчитанный программой РА§ТОВ не корректируется вручную. И ещё раз, только основания 5'- и 3'-концов исследуемой последовательности, которые не совпадают/не выравниваются с запрашиваемой последовательностью, учитываются для ручной корректировки. В целях настоящего изобретения никакие другие корректировки в ручном режиме не производятся.
В полипептиде, обладающем аминокислотной последовательностью по меньшей мере, например, на 95% "идентичной" запрашиваемой аминокислотной последовательности настоящего изобретения, подразумевается, что аминокислотная последовательность рассматриваемого полипетида является идентичной запрашиваемой последовательности за исключением того, что рассматриваемая последовательность может включать до пяти аминокислотных изменений на каждые 100 аминокислот запрашиваемой аминокислотной последовательности. Другими словами, для получения полипептида, обладающего аминокислотной последовательностью, по крайней мере на 95% идентичной запрашиваемой аминокислотной последовательности до 5% аминокислотных остатков этой запрашиваемой последовательности, можеть быть изменено (вставками), удалено или замещено другими аминокислотами. Эти изменения референтной последовательности могут происходить в амино- или карбокситерминальных положениях референтной аминокислотной последовательности или где-либо между этими терминальными последовательностями, рассеяно или размещено по-отдельности среди остатков референтной последовательности или в одной или более непрерывных групп референтной последовательности.
С практической точки зрения, какой-либо определённый полипептид по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичный, например, аминокислотным последовательностям §Еф ГО № 2 (РУШчасти, Рс-части, по отдельности и вместе) или № 4 или известные полипептидные последовательности РУШ или Рс, может быть определён обычным способом с использованием известных компьютерных программ. В одном варианте изобретения способ определения наилучшего полного соответствия между запрашиваемой последовательностью (референтной или исходной последовательностью) и исследуемой последовательностью, также известное как полное выравнивание последовательностей, может быть определено с использованием компьютерной программы РА§ТОВ, основанной на работе алгоритма авторов статью ВгиИад и др., Сотр. Арр. Вю8С1. 6:237-245 (1990), содержание которой полностью включено в эту заявку посредством ссылки. При выравнивании последовательностей обе запрашиваемая и исследуемая последовательности обе являются ДНК-последовательностями или обе - аминокислотными последовательностями. Результат указанного полного выравнивания последовательностей представляют в процентах идентичности. В другом варианте изобретения параметры, используемые при выравнивании аминокислотных последовательностей в программе РА8ТОВ такие: Матрица=Унитарная 0, к-мерность=2, Ошибка несовпадениям, Ошибка связывания=20, Длина группы рандомизации=0, Счёт отсекания=1, Размер окна=длине последовательности, Ошибка промежутка=5, Ошибка размера промежутка=0,05, Размер окна=500 или длине исследуемой аминокислотной последовательности, которая может быть короче.
Если исследуемая последовательность короче, чем запрашиваемая последовательность из-за Ν- или С-терминальных делеций, но не из-за внутренних делеций, то для получения результатов необходимо провести коррекцию в ручном режиме. Это необходимо потому, что программа РА8ТОВ не учитывает Ν- или С-терминальные усечения исследуемой последовательности при расчёте общего процента идентичности. Для исследуемых последовательностей, усечённых с Ν- и С-терминальных концов, подобных запрашиваемой последовательности, процент идентичности корректируется путём расчёта количества оснований запрашиваемой последовательности, что находятся в пределах Ν- и С-терминальных концов исследуемой последовательности, которые не совпадают/не выравниваются с соответствующей исследуемой последовательностью, как процент общего количества остатков запрашиваемой последовательности. Если же остатки не совпадают/не выравниваются, то это определяется по результатам выравнивания последовательности в программе РА§ТОВ. Это процентное значение потом отнимается от процента идентичности, рассчитанного выше программой РА8ТОВ. используя специальные параметры для получения финального значения процента идентичности. Это значение финального процента идентичности является тем, что используется в целях настоящего изобретения. В целях корректировки значения процента идентичности в ручном режиме учитываются только остатки около Ν- и С-терминальных концов исследуемой последовательности, которые не совпадают/не выравниваются с запрашиваемой последовательностью. Это только те запрашиваемые положения остатков, которые находятся за пределами самих удалённых Ν- и С-терминальных остатков исследуемой посследовательности.
Например, исследуемая последовательность длиной 90 остатков для определения процента идентичности выравнивается с запрашиваемой последовательностью длиной 100 остатков. Делеции встречаются на Ν-терминальном конце исследуемой последовательности и поэтому при выравнивании программой РА§ТОВ не будет отмечаться совпадение/выравнивание первых 10 остатков Ν-терминальном конца.
- 32 029560
10 несоответствующих остатков представляют 10% последовательности (количество остатков на Ν- и Стерминальных концах не совпадают /не равны общему числу остатков запрашиваемой последовательности), таким образом, 10% отнимается от значения процента идентичности, рассчитанного программой РА8ТЭВ. Если оставшиеся 90 остатков совершенно совпали, то финальное значение процента идентичности было бы 90%. В другом примере, исследуемая последовательность длиной 90 остатков сравнивается с запрашиваемой последовательностью длиной 100 остатков. В этот раз делеции являются внутренними так, что нет остатков на Ν- и С-терминальных концах исследуемой последовательности, которые не совпадают/не выравниваются с запрашиваемой последовательностью. В этом случае процент идентичности, рассчитанный программой РА8ТЭВ не корректируется вручную. И ещё раз, только положения остатков Ν- и С-терминальных концов исследуемой последовательности, как отмечается при выравнивании программой РА8ТЭВ, которые не совпадают/не выравниваются с запрашиваемой последовательностью, корректируются вручную. В целях настоящего изобретения никакие другие корректировки в ручном режиме не производятся.
Полинуклеотидные варианты могут содержать изменения в кодирующих участках, некодирующих участках или в них обоих. В одном варианте осуществления изобретения полинуклеотидные варианты содержат изменения, которые приводят к "молчащим" заменам, добавлениям или удалениям, но не изменяют свойств или активности кодируемых полипептидов. В другом варианте изобретения нуклеотидные варианты приводят к "молчащим" заменам из-за вырождения генетического кода. В других вариантах изобретения предложены варианты последовательностей, у которых 5-10, 1-5 или 1-2 аминокислоты замещены, удалены или добавлены в любых комбинациях. Полинуклеотидные варианты могут быть созданы по разнообразным причинам, например, для оптимизации экспрессии кодонов особого хозяина (изменение кодонов мРНК человека на другие, к примеру, хозяина-бактерии, такого как Е. сой).
Естественно встречающиеся варианты называются "аллельными вариантами" и относятся к одной из нескольких альтернативных форм гена, несущего данный локус на хромосоме организма (Сепек II, Бе\уш. В., еб., 1оЬп Абеу & 8опк, Νον Уогк (1985)). Эти аллельные варианты могут изменяться на уровне полинуклеотида и/или полипептида и включены в настоящее изобретение. В другом случае не встречающиеся естественно варианты могут создаваться методами мутагенеза или прямым синтезом. Используя известные методы белковой инженерии и технологии рекомбинантных ДНК, варианты могут быть созданы для улучшения и изменения характеристик полипептидов. К примеру, одна или более аминокислот могут быть удалены из Ν-терминального или С-терминального конца секретируемого белка без значительной потери его биологической функции. В статье Коп и др., I. Вю1. СЬет. 268: 2984-2988 (1993), содержание которой полностью включено в эту заявку посредством ссылки, сообщается о вариантах белков-факторов роста кератиноцитов (КСР), обладающих гепарин-связывающей активностью после удаления 3, 8 или 27 амино-терминальных аминокислотных остатков. Сходным образом, для интерферона-гамма показано до десяти раз большая активность после удаления 8-10 аминокислотных остатков от карбокси-терминального конца этого белка. (Статья ЭоЬеП и др., I. Вю!есЬпо1оду 7:199-216 (1988), содержание которой полностью включено в эту заявку посредством ссылки).
Более того, достаточно доказательств иллюстрирует, что варианты часто сохраняют биологическую активность подобную той, которая отмечается для естественно встречающегося белка. Например, в работе Сау1е с соавторами (I. Вю1. СЬет 268:22105-22111 (1993), содержание которой полностью включено в эту заявку посредством ссылки) проведён расширенный анализ мутаций цитокина 1Ь-1а человека. Авторы применили случайный мутагенез для получения более 3500 отдельных 1Ь-1а мутаций, составляющих в среднем 2,5 изменения аминокислот на вариант по всей длине молекулы. Наличие множественных мутаций проверялось в каждом возможном положении аминокислот. Исследователи обнаружили, что: "в большинстве случаев эта молекула может быть изменена с небольшим влиянием на (её связывающую или биологическую активность)". Фактически только 23 уникальные аминокислотные последовательности из более чем 3500 проверенных нуклеотидных последовательностей приводили к получению белка со значительными отличиями активности от дикого типа.
Как указано выше, варианты полипептидов включают, например, модифицированные полипептиды. Модификации включают, к примеру, ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение функциональной группы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, перекрёстное сшивание, циклизацию, образование дисульфидных связей, деметилирование, образование ковалентных сшивок, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, прикрепление гликозилфосфатидилинозитола (СР1), гидроксилирование, йодирование, метилирование, присоединение остатка миристиловой кислоты, окисление, пэгилирование (статья Ме1 и др., В1ооб 116:210-19 (2010), содержание которой полностью включено в эту заявку посредством ссылки), протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, присоединение остатка селеновой кислоты, сульфатация, РНК-опосредованный перенос аминокислот на белки, такой как аргинилирование и убихитинация. В некоторых вариантах осуществления изобретения фактор РУШ модифицирован, например, путём пэгилирования в любом подходящем положении. В некоторых
- 33 029560
вариантах РУШ пэгилирован по обращенным к поверхности аминокислотам РУШ, например, на расположенном на поверхности цистеине, который может быть технически присоединённым цистеином. Там же. В некоторых вариантах модифицированый РУШ, например, пегилированый РУШ является длительно действующим фактором РУШ.
"Объем распределения в равновесном состоянии (У88)", как используется в этой заявке, имеет то же значение, что и термин, используемый в фармакологии, который обозначает кажущееся пространство (объём), в котором распределяется лекарственное вещество. У88 равен количеству лекарственного вещества в организме, делённому на его концентрацию в плазме в равновесном состоянии.
"Около", "примерно" используется в этой заявке для обозначения диапазона и изменяет обе границы диапазона. Таким образом, фраза "около 10-20" значит "около 10 -около 20".
"Химерный полипептид", как используется в этой заявке, может включать процессированный РУШ, одноцепочечный РУШ или их комбинацию. "Процессированный РУШ" используется в этой заявке для обозначения РУШ, который расщеплён по остатку аргинина 1648 (полноразмерного РУШ) или аргинина 754 (РУШ с удалённым В-доменом), например, в сайте внутриклеточного процессинга. Благодаря расщеплению в сайте внутриклеточного процессинга, процессированный РУШ образует две полипептидные цепи: первая цепь является тяжёлой цепью, а вторая - лёгкой. Например, процессированный белок слияния РУШ-Рс (например, тяжёлая и лёгкая цепи соединены с частью Рс) соответствует белкам 90 и 130 кДа при электрофорезе в ПААГ с ДДС в невостанавливающих условиях (δΌδ-РАОЕ), соответственно, и 90 и 105 кДа при электрофорезе в ПААГ с ДДС в восстанавливающих условиях, соответственно. Поэтому в одном варианте изобретения по меньшей мере примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или примерно 100% РУШ-части химерного полипептида является процессированным РУШ.
В другом варианте изобретения около 50%, около 60%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% РУШ-части химерного полипептида является процессированным РУШ. В отдельном варианте изобретения химерный полипептид, содержащий процессированный РУШ очищается (или изолируется) от химерного полипептида, содержащего одноцепочечный РУШ, и по крайней мере примерно 90%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или примерно 100% РУШ-части химерного полипептида является процессированным РУШ.
Термин "одноцепочечный РУШ" используется в этой заявке для обозначения РУШ, который не был расщеплён по сайту аргинина - остатку 1648 полноразмерного РУШ (например, остаток 1667 §ЕЦ ГО № 6) или остатку 774 РУШ с удалённым В-доменом (например, остаток 773 §ЕЦ ГО № 2). Поэтому, одноцепочечный РУШ в химерном полипептиде, используемый в этой заявке, состоит из одной цепи. В одном варианте осуществления изобретения одноцепочечный РУШ содержит интактный сайт внутриклеточного процессинга. Одноцепочечный белок слияния РУШ-Рс соответствует белку приблизительно 220 кДа при электрофорезе в ПААГ с ДДС в невостанавливающих условиях и приблизительно 195 кДа при электрофорезе в ПААГ с ДДС в восстанавливающих условиях.
В одном варианте изобретения химерный полипептид, содержащий одноцепочечный РУШ, очищен (или отделён) от химерного полипептида, содержащего процессированный РУШ, и по крайней мере около 30%, около 40%, около 50%, около 60%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 99% или около 100% РУШ-части химерного полипептида, использованого в этой заявке, является одноцепочечным РУШ. В другом варианте изобретения по крайней мере около 1%, около 5%, около 10%, около 15%, около 20% или около 25% РУШ-части химерного полипептида являются одноцепочечным РУШ. В остальных вариантах около 1% - около 10%, около 5% - около 15%, около 10% около 20%, около 15% - около 25%, около 20% -около 30%, около 25% - около 35%, около 30% - около 40% РУШ-части химерного полипептида, использованого в этой заявке, является одноцепочечным РУШ. В отдельном варианте около 1%, около 5%, около 10%, около 15%, около 20% или около 25% РУШчасти химерного полипептида является одноцепочечным РУШ. В других вариантах около 30%, около 40%, около 50%, около 60%, около 70%, около 80%,около 90%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% РУШ-части химерного полипептида, использованого в этой заявке, является одноцепочечным РУШ. В некоторых вариантах соотношение одноцепочечного РУШ к процессированному РУШ химерного полипептида составляет: (а) около 25% одноцепочечного РУШ и около 75% процессированного РУШ; (Ь) около 20% одноцепочечного РУШ и около 80% процессированного РУШ; (с) около 15% одноцепочечного РУШ и около 85% процессированного РУШ; (ά) около 10% одноцепочечного РУШ и около 90% процессированного РУШ; (е) около 5% одноцепочечного РУШ и около 95% процессированного РУШ; (£) около 1% одноцепочечного РУШ и около 99% процессированного РУШ; или (д) около 100% процессированного РУШ.
В других вариантах соотношение одноцепочечного РУШ к процессированному РУШ химерного полипептида составляет: (а) около 30% одноцепочечного РУШ и около 70% процессированного РУШ; (Ь) около 40% одноцепочечного РУШ и около 60% процессированного РУШ; (с) около 50% одноцепочечного РУШ и около 50% процессированного РУШ; (ά) около 60% одноцепочечного РУШ и около 40%
- 34 029560
процессированного РУШ; (е) около 70% одноцепочечного РУШ и около 30% процессированного РУШ; (ί) около 80% одноцепочечного РУШ и около 20% процессированного РУШ; (д) около 90% одноцепочечного РУШ и около 10% процессированного РУШ; (Ь) около 95% одноцепочечного РУШ и около 5% процессированного РУШ; (ί) около 99% одноцепочечного РУШ и около 1% процессированного РУШ; или (]) около 100% одноцепочечного РУШ. РУШ-часть в химерном полипептиде, используемом в этой заявке, обладает активностью фактора РУШ. Активность РУШ измеряется любым из известных методов в этой сфере знаний. Например, одним из таких методов может быть хромогенный количественный анализ. Механизм хромогенного анализа основан на закономерностях каскада коагуляции крови, при котором активированный РУШ ускоряет конверсию фактора X в фактор Ха в присутствии активированного фактора IX, фосфолипидов и ионов кальция. Активность фактора Ха оценивают по степени гидролиза пнитроанилидного (рNА) субстрата, специфичного для фактора Ха. Начальная скорость освобождения пнитроанилина, измеряемая при 405 нм, прямопропорциональная активности фактора Ха и, таким образом, активности РУШ.
Хромогенный анализ рекомендован Подкомитетом по РУШ и фактору IX Комитета по научным исследованиям и стандартизации (88С) Международного сообщества по вопросам тромбоза и гемостаза (18ТН). С 1994 года хромогенного анализ также является стандартным методом Европейской Фармакопеи для установления активности концентратов РУШ. Поэтому, в одном варианте химерный полипептид, содержащий одноцепочечный РУШ, обладал активностью РУШ сравнимой с активностью химерного полипептида, содержащего процессированный РУ111 (например, химерный полипептид, состоящий в основном, или состоящий из двух частей Рс и процессированного РУШ, тогда как упомянутый процессированный РУШ присоединён к одной из двух частей Рс), когда активность РУШ измеряется в условиях ш уйго хромогенным анализом.
В другом варианте химерный полипептид, содержащий одноцепочечный РУШ настоящего изобретения, обладает скоростью образования фактора Ха, сравнимой с активностью химерного полипептида, содержащего процессированный РУШ (например, химерный полипептид, состоящий в основном, или состоящий из двух частей Рс и процессированного РУШ, тогда как упомянутый процессированный РУШ присоединён к одной из двух частей Рс).
Для того, чтобы превратить фактор X в фактор Ха, активированный фактор IX (фактор 1Ха) в присутствии Са2+, мембранных фосфолипидов и кофактора РУШ гидролизует одну аргинин-изолейциновую связь фактора X для образования фактора Ха. Поэтому, взаимодействие РУШ с фактором IX является критичным для механизма коагуляции. В определённых вариантах химерный полипептид, содержащий одноцепочечный РУШ настоящего изобретения, может взаимодействовать с фактором Ка со скоростью, сравнимой с такой для химерного полипептида, содержащего процессированный РУШ (например, химерный полипептид, состоящий в основном, или состоящий из двух частей Рс и процессированного РУШ, тогда как упомянутый процессированный РУШ присоединён к одной из двух частей Рс).
Кроме того, РУШ при циркуляции в неактивном состоянии связывается с фактором фон Виллебранда (у\Р). Когда РУШ не связан с у\Р, он быстро деградирует и освобождается от у\Р под действием тромбина. В некоторых вариантах химерный полипептид, содержащий одноцепочечный РУШ, связывает фактор фон Виллебранда на уровне, сравнимом с таким для химерного полипептида, содержащего процессированный РУШ (например, химерный полипептид, состоящий в основном, или состоящий из двух частей Рс и процессированного РУШ, тогда как упомянутый процессированный РУШ присоединён к одной из двух частей Рс).
РУШ может быть инактивирован в присутствии кальция и фосфолипидов активированным протеином С. Активированный протеин С расщепляет тяжёлую цепь после аргинина 336 А1-домена, что разрушает сайт взаимодействия с субстратом фактора X, и расщепляет связь после аргинина 562 А2-домена, что усиливает диссоциацию А2-домена, а также разрушает сайт взаимодействия с фактором Ка. Это расщепление также разрезает А2-домен (43 кДа) и образует домены АЗ-Ν (18 кДа) и А2-С (25 кДа). Таким образом, активированных протеин С может катализировать множественные расщепления сайтов тяжёлой цепи. В одном варианте изобретения химерный полипептид, содержащий одноцепочечный РУШ, инактивируется активированным протеином С на уровне, сравнимом с таким для химерного полипептида, содержащего процессированный РУШ (например, химерный полипептид, состоящий в основном, или состоящий из двух частей Рс и процессированного РУШ, тогда как упомянутый процессированный РУШ присоединён к одной из двух частей Рс).
В других вариантах химерный полипептид, содержащий одноцепочечный РУШ настоящего изобретения, обладает активностью РУШ ш У1уо, сравнимой с активностью химерного полипептида, содержащего процессированный РУШ (например, химерный полипептид, состоящий в основном, или состоящий из двух частей Рс и процессированного РУШ, тогда как упомянутый процессированный РУШ присоединён к одной из двух частей Рс). В отдельном варианте химерный полипептид, содержащий одноцепочечный РУШ, способен защищать мышей с гемофилией А (НетА) в степени, сравнимой с такой для химерного полипептида, содержащего процессированный РУШ (например, химерный полипептид, состоящий в основном, или состоящий из двух частей Рс и процессированного РУШ, тогда как упомянутый процессированный РУШ присоединён к одной из двух частей Рс) в модели рассечения хвостовой вены мышей с
- 35 029560
НетА.
Термин "сравнимый" используется в этой заявке в значении сравнимой степени или уровня, получаемых при использовании химерного полипептида, являющихся равными или практически равными или сходными с референтной степенью или уровнем. Термин "сходный", "подобный" используется в этой заявке в значении сравнимой степени или уровня, обладающими разницей не более 10% или не более 15% от референтной степени или уровня (например, скорость образования РХа химерным полипептидом, состоящим в основном, или состоящим из двух частей Рс и процессированного РУШ, тогда как упомянутый процессированный РУШ присоединён к одной из двух частей Рс). Термин "практически равный" обозначает сранимую степень или уровень, обладающие отличием от референтной степени или уровня не более чем 0,01%, 0,5% или 1%.
Настоящее изобретения далее включает композицию, содержащую химерный полипептид, обладающий активностью РУШ, по меньшей мере примерно 30%, примерно 40%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, или примерно 99% активности химерного полипептида, включающего РУШ-часть, которая является одноцепочечным РУШ, и вторую часть. В другом варианте изобретения около 30%, около 40%, около 50%, около 60%, около 70%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98% или около 99% химерного полипептида в композиции являются одноцепочечным РУШ. В остальных вариантах вторую часть представляет фрагмент Рс. В дополнительных других вариантах химерный полипептид включает другой функциональный фрагмент, обеспечивающий продолжительный период полувыведения, например, альбумин. В оставшихся других вариантах композиция настоящего изобретения включает комбинацию химерного полипептида, содержащий процессированный РУШ, и химерного полипептида, содержащего одноцепочечный РУШ: (а) в которой около 30% части химерного полипептида является одноцепочечным РУШ и около 70% РУШ-части химерного полипептида является процессированным РУШ; (Ь) в которой около 40% части химерного полипептида является одноцепочечным РУШ и около 60% РУШчасти химерного полипептида является процессированным РУШ; (с) в которой около 50% части химерного полипептида является одноцепочечным РУШ и около 50% РУШ-части химерного полипептида является процессированным РУШ; (ά) в которой около 60% части химерного полипептида является одноцепочечным РУШ и около 40% РУШ-части химерного полипептида является процессированным РУШ; (е) в которой около 70% части химерного полипептида является одноцепочечным РУШ и около 30% РУШ-части химерного полипептида является процессированным РУШ; (£) в которой около 80% части химерного полипептида является одноцепочечным РУШ и около 20% РУШ-части химерного полипептида является процессированным РУШ; (д) в которой около 90% части химерного полипептида является одноцепочечным РУШ и около 10% РУШ-части химерного полипептида является процессированным РУШ; (Ь) в которой около 95% части химерного полипептида является одноцепочечным РУШ и около 5% РУШ-части химерного полипептида является процессированным РУШ; (ί) в которой около 99% части химерного полипептида является одноцепочечным РУШ и около 1% РУШ-части химерного полипептида является процессированным РУШ; или (]) в которой около 100% части химерного полипептида является одноцепочечным РУШ.
В определённых вариантах композиция настоящего изобретения обладает активностью РУШ сравнимой с композицией, содержащей процессированный РУШ (например, композиция, содержащая химерный полипептид, состоящий в основном, или состоящий из двух частей Рс и процессированного РУШ, тогда как процессированный РУШ соединён с одной из двух частей Рс), когда активность РУШ измеряется в условиях ш νίΙΐΌ хромогенным анализом.
В других вариантах композиция настоящего изобретения обладает скоростью образования фактора Ха, сравнимой с композицией, содержащей процессированный РУШ (например, композиция, содержащая химерный полипептид, состоящий в основном, или состоящий из двух частей Рс и процессированного РУШ, тогда как упомянутый процессированный РУШ соединён с одной Рс из двух частей Рс). В оставшихся других вариантах композиция, содержащая одноцепочечный РУШ может взаимодействовать с фактором 1Ха со скоростью, сравнимой с композицией, содержащей процессированный РУШ (например, композиция, содержащая химерный полипептид, состоящий в основном, или состоящий из двух частей Рс и процессированного РУШ, тогда как процессированный РУШ соединён с одной частью Рс).
В дополнительных вариантах изобретения одноцепочечный РУШ в химерном полипептиде настоящей композиции инактивируется активированным протеином С на уровне, сравнимом с процессированным РУШ в химерном полипептиде композиции (например, композиция, содержащая химерный полипептид, состоящий в основном, или состоящий из двух частей Рс и процессированного РУШ, тогда как процессированный РУШ соединён с одной Рс из двух частей Рс). В особом варианте композиция, содержащая одноцепочечный РУШ обладает активностью РУШ ш У1уо, сравнимой с активностью композиции, содержащей процессированный РУШ (например, композиция, содержащая химерный полипептид, состоящий в основном, или состоящий из двух частей Рс и процессированного РУШ, тогда как процессированный РУШ соединён с одной Рс из двух частей Рс). В некоторых вариантах композиция, содержащая одноцепочечный РУШ настоящего изобретения, способен защищать мышей с гемофилией А (НетА) в степени, сравнимой с такой для композиции, содержащей процессированный РУШ (например,
- 36 029560
композиция, содержащая химерный полипептид, состоящий в основном, или состоящий из двух частей Рс и процессированного РУШ, тогда как упомянутый процессированный РУШ присоединён к одной Рс из двух частей Рс) в модели рассечения хвостовой вены мышей с ΗетΑ.
Настоящее изобретение далее представляет способ лечения, используя предлагаемые в этой заявке композиции состояния кровотечений у людей. Иллюстративный способ включает введение пациенту, необходимого для терапевтического эффекта количества фармацевтической композиции/состава, содержащего химерный полипептид, обладающий активностью РУШ, по меньшей мере примерно 30%, примерно 40%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, или примерно 99% активности химерного полипептида, включающего РУШ-часть, которая является одноцепочечным РУШ, и вторую часть.
Состояние кровотечения может быть обусловлено нарушением коагуляции крови. Нарушением коагуляции крови может также рассматриваться как коагулопатия. В одном варианте нарушением коагуляции крови, которое может лечиться фармацевтической композицией настоящего изобретения, является гемофилия или заболевание фон Виллебранда (νΑΌ). В другом варианте нарушением коагуляции крови, которое может лечиться фармацевтической композицией настоящего изобретения, является гемофилия А.
В некоторых вариантах тип кровотечения, связанный с состоянием кровотечения, выбирается из гемартроза, кровотечения в мышечной ткани, кровотечения в ротовой полости, кровоизлияния, кровоизлияния в мышечной ткани, кровоизлияния в ротовой полости, последствия травмы, травмы головы, гастроинтерального кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, внутрибрюшного кровоизлияния, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в пределах центральной нервной системы, кровотечения в заглоточной области, кровотечения в забрюшинной области или кровотечения в области окружения мышц иллиопсоас.
В других вариантах изобретения пациент, страдающий от состояний кровотечения, нуждается в лечении для осуществления хирургического вмешательства, например, профилактического хирургического лечения или периоперационного управления. В одном примере хирургическое вмешательство выбирается из малой или обширной операции. Иллюстративные оперативные вмешательства включают: удаление зубов, удаление миндалин, удаление паховых грыж, синовэктомию, трепанацию черепа, остеосинтез, хирургическое лечение травм, внутричерепное хирургическое вмешательство, внутрибрюшинное хирургическое вмешательство, внутригрудное хирургическое вмешательство, операции по замене суставов (например, полная замена коленного соединения, замещение тазобедренного сустава и подобные операции), хирургию сердца и кесарево сечение.
В другом примере субъект в сопутствующем режиме лечится с помощью Р1Х. Из-за того, что вещества настоящего изобретения способны активировать Р1Ха, то перед введением Р1Ха пациенту они могут использоваться для предварительной активации полипептида Р1Ха.
Этот представленный в данной заявке способ может применяться для пациента с необходимостью в профилактическом лечении или лечении по требованию. Фармацевтические композиции, содержащие по крайней мере 30% одноцепочечного РУШ можут быть составлены для любого приемлемого способа введения, включающего, например, местное (например, трансдермальное или глазное), оральное, буккальное, назальное, вагинальное, ректальное или парентеральное введение. Термин "парентеральное", как используется в этой заявке, включает подкожное, внутрикожное, внутрисосудистое (например, интравенозное), внутримышечное, спинальное, внутричерепное, интратекальное, периокулярное, интраорбитальное, внутрисуставное и интраперитонеальное инъецирование, а также любую методику подобной инъекции или инфузии. Эта композиция может также может быть к примеру суспензией, эмульсией, составом с замедленным высвобождением, кремом, гелем или порошком. Эта композиция может быть составлена как суппозиторий с традиционными связующими и носителями, такими как триглицериды. В одном примере фармацевтический состав является жидкой лекарственной формой, к примеру, забуференным изотоническим водным раствором. В одном примере фармацевтический состав имеет значение рН, которое является физиологическим или близким к физиологическому. В других примерах водный состав имеет физиологические или близкие к физиологическим осмолярность и солёность. Он может содержать хлорид натрия и/или ацетат натрия. В некоторых примерах композиция настоящего изобретения является лиофилизованной. В некоторых вариантах осуществления изобретения эта фармацевтическая композиция не содержит иммунных клеток. В некоторых вариантах эта фармацевтическая композиция не содержит клеток.
Настоящее изобретение также предлагает набор, включающий: (а) фармацевтическую композицию, состоящую из химерного полипептида, содержащего часть фактора свёртывания крови, Рс-часть и фармацевтически приемлемый носитель, и (Ь) инструкцию по введению этой композиции пациенту, нуждающемуся в иммунной толерантности к фактору свёртывания крови. В некоторых вариантах осуществления изобретения этот химерный полипептид набора включает РУШ-часть, РУ11-часть или Р1Х-часть. В других вариантах этот химерный полипептид набора является мономер-димерным гибридным фактором РУШ, мономер-димерным гибридным фактором РУ11 или мономер-димерным гибридным фактором Р1Х. В некоторых вариантах эти инструкции дополнительно включают по меньшей мере одну стадию опреде- 37 029560
ления того, что пациент нуждается в приобретении иммунной толерантности к фактору свёртывания крови. В некоторых вариантах эта стадия определения того, что пациент нуждается в приобретении иммунной толерантности, включает один или больше этапов из группы, состоящей из:
(ί) идентификации субъекта, несущего мутацию или делецию гена фактора свёртывания крови;
(ίί) идентификации субъекта, обладающего перестройкой гена фактора свёртывания крови;
(ίίί) идентификации субъекта, у которого есть родственник, с ранее возникшим ингибирующим иммунным ответов к фактору свёртывания крови;
(ίν) идентификации субъекта, получающего лечение интерферонами;
(ν) идентификации субъекта, получающего противовирусное лечение;
(νί) идентификации субъекта, несущего генетическую мутацию в генах, отличных от гена, кодирующего фактор свёртывания, связанных с повышением риска развития ингибирующего иммунного ответа; и
(νίί) комбинации двух или больше этих этапов.
В некоторых вариантах указанная генетическая мутация гена, отличного от гена, кодирующего фактор свёртывания крови, включает одну или более мутаций, выбранных из множества:
(ί) генетический полиморфизм, связанный с повышением уровня ΤΝΕ-α;
(ίί) генетический полиморфизм, связанный с повышением уровня 1Ь10;
(ίίί) генетический полиморфизм, связанный с понижением уровня ί'ΤΕ·Λ-4;
(ίν) мутация молекул ΌΚ15 или Ό0Β0602 главного комплекса гистосовместимости (МНС) II класса; и
(ν) комбинации двух или больше этих мутаций.
Дополнительно на конейтенере(ах) может быть уведомление в форме предписания государственного органа, регулирующего производство, применение или продажу фармацевтических или биологических препаратов, уведомление которого отражает разрешение этого органа на производство, применение и продажу данного набора для введения людям.
Осуществление изобретения
Е1. Способ индуцирования иммунной толерантности к фактору свёртывания крови у субъекта, нуждающегося в этом факторе, включающий введение пациенту химерного полипептида, отличающийся тем, что химерный полипептид содержит часть фактора свёртывания крови и часть молекулы Рс.
Е2. Способ предотвращения или ингибирования ингибитора фактора свёртывания, включающего введение пациенту, нуждающемуся в иммуной толерантности к химерному полипептиду фактора свёртывания, отличающийся тем, что этот химерный полипептид содержит часть фактора свёртывания и Рсчасть.
Е3. Способ осуществления изобретения Е1 или Е2, отличающийся тем, что у субъекта может развиваться ингибирующий иммунный ответ к фактору свёртывания, если вводится эквивалентная доза полипептида, содержащего фактор свёртывания.
Е4. Способ осуществления изобретения Е1 или Е3, отличающийся тем, что у субъекта возник ингибирующий иммунный ответ к фактору свёртывания.
Е5. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1 - Е4, отличающийся тем, что субъект никогда ранее не подвергался лечению фактором свёртывания.
Е6. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1 - Е5, отличающийся тем, что часть фактора свёртывания крови включает фактор УШ, фактор IX, фактор УП, фактор фон Виллебранда или их фрагменты.
Е7. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1 - Е5, отличающийся тем, что субъект представляет собой плод, и этот способ лечения дополнительно включает введение химерного полипептида для матери этого плода, и указанное введение субъекту происходит через плаценту матери.
Е8. Способ осуществления изобретения Е7, отличающийся тем, что функциональная группа фактора свёртывания включает фактор УШ, фактор IX, фактор УП, фактор фон Виллебранда или их фрагменты.
Е9. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1 - Е6, отличающийся тем, что субъект является ребёнком или взрослым.
Е10. Способ осуществления изобретения Е9, отличающийся тем, что субъектом является ребёнок возрастом младше одного года, младше двух лет, младше двух лет, младше трёх лет, младше четырёх лет, младше пяти лет, младше шести лет, младше семи лет, младше восьми лет, младше девяти лет, младше десяти лет, младше одинадцати лет или младше двенадцати лет.
Е11. Способ осуществления изобретения Е10, отличающийся тем, что возраст ребёнка меньше одного года.
Е12. Способ осуществления изобретения Е11, отличающийся тем, что у ребёнка и взрослого развивается нарушение свёртывания крови, при этом проявление симптомов нарушения свёртывания крови появилось в возрасте более одного года.
Е13. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е12, отличающийся тем, что введение композиции происходит в количестве, достаточном для предотвращения, ингибирования или снижения
- 38 029560
развития иммунного ответа, выявляющемся в гуморальном иммунном ответе, клеточно-опосредованном иммунном ответе или в обоих гуморальном и клеточно-опосредованном иммунных ответах к фактору свёртывания крови.
Е14. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е13, отличающийся тем, что композиция вводится в повторных дозах.
Е15. Способ осуществления изобретения Е14, отличающийся тем, что каждая из повторных доз разделяется от другой по меньшей мере 12 ч, по меньшей мере 24 ч, по меньшей мере двумя днями, по меньшей мере тремя днями, по меньшей мере четырьмя днями, по меньшей мере пятью днями, по меньшей мере шестью днями, по меньшей мере семью днями, по меньшей мере восемью днями, по меньшей мере девятью днями, по меньшей мере десятью днями, по меньшей мере 11 днями, по меньшей мере 12 днями, по меньшей мере 13 днями, по меньшей мере 14 днями или по меньшей мере 15 днями.
Е16. Способ осуществления изобретения Е14 или Е15, отличающийся тем, что повторные дозы составляют по меньшей мере две дозы, по меньшей мере пять доз, по меньшей мере 10 доз, по меньшей мере 25 доз, по меньшей мере 30 доз, по меньшей мере 35 доз, по меньшей мере 40 доз, по меньшей мере 45 доз, по меньшей мере 50 доз, по меньшей мере 55 доз, по меньшей мере 60 доз, по меньшей мере 65 доз или по меньшей мере 70 доз.
Е17. Способ осуществления изобретения Е16, отличающийся тем, что повторные дозы составляют от около двух доз до около 100 доз, от около пяти доз до около 80 доз, от около 10 доз до около 70 доз, от около 10 доз до около 60 доз, от около 10 доз до около 50 доз, от около 15 доз до около 40 доз, от около 15 доз до около 30 доз, от около 20 доз до около 30 доз или от около 20 доз до около 40 доз.
Е18. Способ осуществления изобретения Е16 или Е17, отличающийся тем, что повторные дозы составляют около двух доз, около пяти доз, около 10 доз, около 15 доз, около 20 доз, около 25 доз, около 30 доз, около 35 доз, около 40 доз, около 45 доз, около 50 доз, около 55 доз, около 60 доз, около 65 доз, около 70 доз, около 75 доз, около 80 доз, около 90 доз или около 100 доз.
Е19. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е14-Е18, отличающийся тем, что пациенту после повторных доз дополнительно вводится фармацевтическая композиция, содержащая белок фактора свёртывания, которая включает фактор свёртывания, но не содержит Рс-часть.
Е20. Способ осуществления изобретения Е19, отличающийся тем, что белок фактора свёртывания может быть полноразмерным или зрелым фактором свёртывания.
Е21. Способ осуществления изобретения Е19, отличающийся тем, что белок фактора свёртывания содержит одну или более функциональных групп, обеспечивающих продление периода полувыведения препарата, отличающихся от Рс-части.
Е22. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е21, отличающийся тем, что указанное введение обеспечивает лечение одного или более эпизодов кровотечения.
Е23. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е22, отличающийся тем, что указанное введение обеспечивает предотвращение одного или более эпизодов кровотечения.
Е24. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е23, отличающийся тем, что указанное введение является эпизодическим лечением одного или более эпизодов кровотечения.
Е25. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е23, отличающийся тем, что субъект нуждается в профилактическом хирургическом вмешательстве, периоперационном управлении или оперативном лечении.
Е26. Способ осуществления изобретения Е25, отличающийся тем, что оперативные вмешательства представляют собой: малое хирургическое вмешательство, обширное оперативное вмешательство, удаление зубов, удаление миндалин, удаление паховых грыж, синовэктомию, полную замену коленного соединения, трепанацию черепа, остеосинтез, хирургичесокое лечение травм, внутричерепное хирургическое вмешательство, внутрибрюшинное хирургическое вмешательство, внутригрудное хирургическое вмешательство, или операции по замене суставов.
Е27. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е13-Е26, отличающийся тем, что ингибирующий иммунный ответ включает синтез ингибирующих антител к фактору свёртывания крови.
Е28. Способ осуществления изобретения Е27, отличающийся тем, что концентрация таких антител составляет по меньшей мере 0,6 единицам Бетесды (БЕ).
Е29. Способ осуществления изобретения Е28, отличающийся тем, что концентрация таких антител составляет по меньшей мере 5 БЕ.
Е30. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е13-Е26, отличающийся тем, что такой иммунный ответ включает клеточно-опосредованный иммунный ответ.
Е31. Способ осуществления изобретения Е30, отличающийся тем, что клеточно-опосредованный иммунный ответ может включать высвобождение цитокинов, выбранных из группы, состоящей из 1Б-12. 1Ь-4 и ΊΝΈ-α.
Е32. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е13-Е31, отличающийся тем, что этот иммунный ответ включает клинический симптом, выбранный из группы, состоящей из увеличения тенденции кровотечений, высокого уровня использования фактора свёртывания, недостаточного ответа на терапию с помощью фактора свёртывания, снижения эффективности терапии с помощью фактора свёрты- 39 029560
вания и/или сокращения периода полувыведения фактора свёртывания.
Е33. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е32, отличающийся тем, что субъект несёт мутацию или делецию гена фактора свёртывания крови.
Е34. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е32, отличающийся тем, что субъект несёт перестройку гена фактора свёртывания крови.
Е35. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е34, отличающийся тем, что субъект страдает серьёзной гемофилией.
Е36. Способ осуществления изобретения Е1-Е34, отличающийся тем, что у субъекта есть родственник, у которого ранее возник ингибирующий иммунный ответ к фактору свёртывания.
Е37. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е36, отличающийся тем, что субъект получает лечение препаратми интерферонов.
Е38. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е37, отличающийся тем, что субъект получает противовирусное лечение.
Е39. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е38, отличающийся тем, что субъект обладает генетическим полиморфизмом, связанным с повышенным уровнем ΤΝΤ-α.
Е40. Способ осуществления изобретения Е39, отличающийся тем, что полиморфизм является полиморфизмом ΤΝΤ-α 308С>А.
Е41. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е40, отличающийся тем, что субъект обладает генетическим полиморфизмом, связанным с повышенным уровнем Ш0.
Е42. Способ осуществления изобретения Е41, отличающийся тем, что полиморфизм находится в виде микросателлита ГЬ10С в аллели 134.
Е43. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е42, отличающийся тем, что субъект обладает генетическим полиморфизмом, связанным с пониженной экспрессией СТЬА-4.
Е44. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е43, отличающийся тем, что субъект несёт мутацию в молекулах ΌΚ15 или ΩΟΒ0602 главноко комплекса гистосовместимости (МНС) II класса.
Е45. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е44, отличающийся тем, что субъект получает фактор свёртывания крови менее чем 150 дней лечения (ДЛ).
Е46. Способ осуществления изобретения Е45, отличающийся тем, что субъект получает лечения менее чем 50 ДЛ.
Е47. Способ осуществления изобретения Е46, отличающийся тем, что субъект получает лечения менее чем 20 ДЛ.
Е48. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е3-Е47, отличающийся тем, что ингибирующий иммунный ответ к РУШ развился в ответ на введение полноразмерного или зрелого фактора свёртывания РУШ.
Е49. Способ осуществления изобретения Е3-Е48, отличающийся тем, что ингибирующий иммунный ответ представлял собой ингибирующий иммунный ответ к РУШ, возникший в ответ на введение рекомбинантного препарата РУШ.
Е50. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е49, отличающийся тем, что указанное введение снижает у пациента количество антител к РУШ по сравнению с таким количеством до введения.
Е51. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е50, отличающийся тем, что указанное введение снижает у пациента титр антител к РУШ по сравнению с таким титром до введения.
Е52. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е51, отличающийся тем, что указанное введение снижает у пациента уровень цитокина по сравнению с таким уровнем до введения.
Е53. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е52, отличающийся тем, что указанное введение снижает у субъекта количество антител к РУШ по сравнению с таким количеством у субъекта после предыдущего лечения полипептидом, содержащим полипептид РУШ.
Е54. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е53, отличающийся тем, что указанное введение снижает у субъекта титр антител к РУШ по сравнению с таким титром у субъекта после предыдущего лечения полипептидом, содержащим полипептид РУШ.
Е55. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е54, отличающийся тем, что указанное введение снижает у субъекта уровень цитокина по сравнению с таким уровнем у субъекта после предыдущего лечения полипептидом, содержащим полипептид РУШ.
Е56. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е55, отличающийся тем, что указанное введение снижает у пациента количество антител к фактору свёртывания по сравнению с таким количеством, которое могло бы образоваться у пациента при введении полипептида, состоящего из части фактора свёртывания.
Е57. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е56, отличающийся тем, что указанное введение снижает у пациента титр антител к фактору свёртывания по сравнению с таким титром, который мог бы образоваться у пациента при введении полипептида, состоящего из части фактора свёртыва- 40 029560
ния.
Е58. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е57, отличающийся тем, что указанное введение снижает у пациента уровень цитокина по сравнению с таким уровнем, который мог бы образоваться у пациента при введении полипептида, состоящего из части фактора свёртывания.
Е59. Способ осуществления изобретения Е52, Е55 или Е58, отличающийся тем, что цитокин является выбранным из группы, состоящей из: 1Ь-12, 1Ь-4 и ΤNР-α.
Е60. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е59, который перед введением химерного полипептида дополнительно включает определение того, что субъект обладает одной или более особенностями, выбранными из множеста:
(a) несёт мутацию или делецию гена, кодирующего фактор свёртывания крови;
(b) несёт перестройку гена, кодирующего фактор свёртывания крови;
(c) имеет родственника, у которого ранее развился ингибирующий иммунный ответ к фактору свёртывания крови;
(б) получает терапию препаратами интерферонов; (б) получает противовирусную терапию;
(Г) несёт генетическую мутацию в гене, отличном от гена, кодирующего фактор свёртывания, связанную с повышением риска развития ингибирующего иммунного ответа; и
(д) комбинация двух или больше этих особенностей.
Е61. Способ осуществления изобретения Е60, отличающийся тем, что генетическая мутация гена, отличного от гена, кодирующего фактор свёртывания крови, включает одну или более мутаций, выбранных из множества:
(ί) генетический полиморфизм, связанный с повышением уровня ΊΝΈ-σ;
(ίί) генетический полиморфизм, связанный с повышением уровня 1Ь10;
(ίίί) генетический полиморфизм, связанный с понижением уровня СТЬЛ-4;
(ΐν) мутация молекул ΌΚ15 или ЭОВ0602 главного комплекса гистосовместимости (МНС) II класса; и
(ν) комбинация двух или больше этих мутаций.
Е62. Способ осуществления изобретения Е61, отличающийся тем, что такой полиморфизм, связанный с повышенным уровнем ΤNР-α, является полиморфизмом 308С>Л.
Е63. Способ осуществления изобретения Е61, отличающийся тем, что полиморфизм, связанный с повышенным уровнем 1Ь10, присутствует в виде микросателлита 1Ь10С в аллели 134.
Е64. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е6 и Е8-Е62, отличающийся тем, что РУШ-часть включает А3-домен РУШ.
Е65. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е6 и Е8-Е63, отличающийся тем, что РУШ-часть включает РУШ человека.
Е66. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е6 и Е8-Е64, отличающийся тем, что РУШ-часть несёт полную или частичную делецию В-домена.
Е67. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е6 и Е8-Е66, отличающийся тем, что РУШ-часть является по меньшей мере на 90% или 95% идентичной аминокислотной последовательности РУШ, показанной в табл. 2, без сигнальной последовательности (аминокислоты 20-1457 8ЕО ГО № 2; аминокислоты 20-2351 8ЕО ГО № 6).
Е68. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е6 и Е8-Е66, отличающийся тем, что РУШ-часть является идентичной аминокислотной последовательности РУШ, показанной в табл. 2, без сигнальной последовательности (аминокислоты 20-1457 8ЕО ГО № 2; аминокислоты 20-2351 8ЕО ГО № 6).
Е69. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е6 и Е8-Е66, отличающийся тем, что РУШ-часть является по меньшей мере на 90% или 95% идентичной аминокислотной последовательности РУШ, показанной в табл. 2, с сигнальной последовательностью (аминокислоты 1-1457 8ЕО ГО № 2; аминокислоты 1-2351 8ЕО ГО № 6).
Е70. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е6 и Е8-Е66, отличающийся тем, что РУШ-часть является идентичной аминокислотной последовательности РУШ, показанной в табл. 2, с сигнальной последовательностью (аминокислоты 1-1457 8ЕО ГО № 2; аминокислоты 1-2351 8ЕО ГО № 6).
Е71. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е6 и Е8-Е70, отличающийся тем, что РУШ-часть обладает коагулируюшщей активностью.
Е72. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е71, отличающийся тем, что Рс-часть является идентичной аминокислотной последовательности Рс, показанной в табл. 2 (аминокислоты 14581684 8ЕО ГО № 2 или аминокислоты 2352-2578 8ЕО ГО № 6).
Е73. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е72, отличающийся тем, что химерный полипептид представляет собой форму гибридной молекулы, включающую второй полипептид в сочетании с химерным полипептидом, отличающимся тем, что второй полипептид состоит в основном из Рс или содержит Рс-часть или молекулы связывающейся с РсКп.
Е74. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е73, отличающийся тем, что химерный
- 41 029560
полипептид вводится в любой дозе из диапазона 10-100 МЕ/кг.
Е75. Способ осуществления изобретения Е74, отличающийся тем, что эта доза составляет 10-20, 2030, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90 или 90-100 МЕ/кг.
Е76. Способ осуществления изобретения Е75, отличающийся тем, что эта доза составляет 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 МЕ/кг.
Е77. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е76, отличающийся тем, что субъект находится в состоянии появления кровотечения, выбраном из множества: крототечение вследствие нарушения коагуляции, гемартроз, кровотечение в мышечной ткани, кровотечение в ротовой полости, кровоизлияние, кровоизлияние в мышечной ткани, кровоизлияние в ротовой полости, последствие травмы, травма головы, гастроинтеральное кровотечение, внутричерепное кровоизлияние, внутрибрюшное кровоизлияние, внутригрудное кровоизлияние, перелом костей, кровотечение в пределах центральной нервной системы, кровотечение в заглоточной области, кровотечение в забрюшинной области или кровотечение в области окружения мышц иллиопсоас.
Е78. Способ осуществления изобретения Е77, отличающийся тем, что нарушением коагуляции является гемофилия А.
Е79. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е6 и Е8-Е63, отличающийся тем, что часть фактора свёртывания включает фактор ΙΧ.
Е80. Способ осуществления изобретения Е79, отличающийся тем, что часть фактора ΙΧ является по меньшей мере на 90%, 95% или 100% идентичной аминокислотной последовательности РУШ, показанной в табл. 2, без сигнальной последовательности (аминокислоты 20-1457 δΕΟ ΙΌ № 2; аминокислоты 20-2351 δΕΟ ΙΌ № 6).
Е81. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е6 и Е8-Е63, отличающийся тем, что химерный полипептид представляет собой мономер димера гибридной молекулы, включающей первую цепь, содержащую РРХ-часть и Рс-часть или связывающую РсКп молекулу, и вторую цепь, состоящую в основном из Рс или содержащую Рс-часть.
Е82. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е6 и Е8-Е63, отличающийся тем, что химерный полипептид содержит часть фактора РУН.
Е83. Способ осуществления изобретения Е62, отличающийся тем, что химерный полипептид представляет собой мономер димера гибридной молекулы, включающей первую цепь, содержащую РУПчасть и Рс-часть, и вторую цепь, в основном состоящую из Рс или состоящую из Рс-части.
Е84. Способ осуществления изобретения Е82 или Е83, отличающийся тем, что РУП-часть является неактивным РУН, активированным РУЛ или активирующимся РУН.
Е85. Набор, включающий: (а) фармацевтическую композицию, состоящую из химерного полипептида, состоящего из части фактора свёртывания крови и Рс-части или части молекулы связывания с РсКп и фармацевтически приемлемого носителя, и (Ь) инструкцию по введению этой композиции пациенту, нуждающемуся в иммунной толерантности к фактору свёртывания крови.
Е86. Набор осуществления изобретения Е85, отличающийся тем, что этот химерный полипептид включает РУШ-часть, РУП-часть или РРХ-часть.
Е87. Набор осуществления изобретения Е86, отличающийся тем, что этот химерный полипептид является мономер-димерным гибридным фактором РУШ, мономер-димерным гибридным фактором РУН или мономер-димерным гибридным фактором ИХ.
Е88. Набор какого-либо из осуществлений изобретения Е85-Е87, отличающийся тем, что такие инструкции дополнительно включают по меньшей мере одну стадию определения того, что пациент нуждается в создании иммунной толерантности к фактору свёртывания крови.
Е89. Набор осуществления изобретения Е88, отличающийся тем, что эта стадия определения того, что пациент нуждается в создании иммунной толерантности, включает один или больше вариантов из группы, состоящей из:
(a) идентификации субъекта, несущего мутацию или делецию гена фактора свёртывания крови;
(b) идентификации субъекта, обладающего перестройкой гена фактора свёртывания крови;
(c) идентификации субъекта, у которого есть родственник, с ранее возникшим ингибирующим иммунным ответов к фактору свёртывания крови;
(б) идентификации субъекта, получающего лечение интерферонами;
(е) идентификации субъекта, получающего противовирусное лечение;
(£) идентификации субъекта, несущего генетическую мутацию в генах, отличных от гена, кодирующего фактор свёртывания, связанных с повышением риска развития ингибирующего иммунного ответа; и
(д) комбинации двух или больше этих вариантов.
Е90. Способ осуществления изобретения Е89, отличающийся тем, что указанная генетическая мутация гена, отличного от гена, кодирующего фактор свёртывания крови, включает одну или более мутаций, выбранных из множества:
(ί) генетический полиморфизм, связанный с повышением уровня ΤΝΕ-α;
(ίί) генетический полиморфизм, связанный с повышением уровня Ш10;
- 42 029560
(ίίί) генетический полиморфизм, связанный с понижением уровня СТЬА-4;
(ΐν) мутация молекул ΌΚ15 или ЭОВ0602 главного комплекса гистосовместимости (МНС) II класса; и
(ν) комбинация двух или больше этих мутаций.
Е91. Способ какого-либо из осуществлений изобретения Е1-Е84, отличающийся тем, что дополнительно включены измерения уровня ингибирующего иммунного ответа после указанного введения.
Е92. Способ осуществления изобретения Е91, отличающийся тем, что дополнительно включено сравнение уровня ингибирующего иммунного ответа после указанного введения с уровнем ингибирующего иммунного ответа перед указанным введением.
Е93. Способ осуществления изобретения Е91 или Е92, отличающийся тем, что ингибирующий иммунный ответ проявляется в синтезе антител к РУШ.
Е94. Способ осуществления изобретения Е91 или Е92, отличающийся тем, что ингибирующий иммунный ответ проявляется в секреции цитокинов.
Теперь, с получением детально описанного настоящего изобретения, то же содержание будет более понятным при рассмотрении следующих примеров, которые при этом включены только с целью иллюстрации и не предвведены для ограничения этого изобретения. Все патенты и публикации, указанные в этой заявке, намерено включены посредством ссылки.
Примеры
Пример 1. Клонирование, экспрессия и очистка белка гРУШРс.
Все методики молекулярной биологии выполняли соответственно следующим стандартным методам. Кодирующая последовательность РУШ человека (номер доступа ОеиЬаик ΝΜ_000132), включает свою нативную сигнальную последовательность, полученную с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ) из поли-А-РНК печени чаловека. Из-за большого размера РУШ, кодирующая последовательность была получена в виде нескольких фрагментов с помощью отдельных реакций ПЦР-ОТ и собранных при участии серии ПЦР-реакций, заданных расщеплений и реакций лигирования с получением промежуточного вектора для клонирования, содержащий кодирующий участок РУШ с удалённым В-доменом (УВД) с соединением от серина 743 (§743) до глютамина 1638 (01638), с удалением 2682 оснований из В-домена полноразмерного РУШ. Последовательность участка Рс 1дО1 человека (например, номер доступа ОеиЬаик Υ14735) был получен методом ПЦР из библиотеки кДНК лейкоцитов, и конечная кассета экспрессии была создана таким образом, чтобы последовательность УВД РУШ была непосредственно соединена с Ν-терминальным концом последовательности Рс (шарнирная область, СН2- и СН3-домены, начало с Ό221 последовательности 1дО1, нумерация ЕЙ) без промежуточного линкера. Для экспрессии только одной Рс-цепи, из синтетических олигонуклеотидов создали сигнальную последовательность 1дк (каппа) мыши и добавили её, используя ПЦР, к кодирующей последовательности Рс для обеспечения секреции этого белковог препарата. Кодирующие последовательности РУШРс и цепи Рс были клонированы в векторе двойной экспрессии рВи4СЕ4.1 (ΙηνίΐΓο^η, СаШЬай, СА). Клеткам НЕК293Н (Ιηνίίτο^η, СагкЬай, СА) с помощью агента для трансфекции Ыро£ес1атте (ΙηνίΐΓο^η, СаШЬай, СА) трансфекцией была введена плазмида р8ΥN-РУШ-013. И стабильная клеточная линия была отобрана с помощью зеоцина. Клетки выращивали в бессывороточной суспензионной культуре и белок гРУШРс очистили от осветлённой среды накопления при использовании процесса очистки на четырёх колонках, включающем стадию аффинной очистки, специфической для РУШ (МсСие ί. и др., ί. СЬгота1одг. А., 1216(45): 7824-30 (2009)), с последующей комбинацией анион-обменных колонок и колонки для разделения при помощи гидрофобных взаимодействий.
Пример 2. Определение параметров белка гРУШРс.
(а) Биохимические параметры.
Процессированный рекомбинантный белок РУШ-Рс (гРУШРс) был синтезиован в виде двух полипептидных цепей, одна цепь состоит из УВД РУШ (соединение 8743-01638, 1438 аминокислоты), соединённым с Рс-доменом (шарнирная область, домены СН2 и СН3) 1дО1 (226 аминокислоты, простирающаяся от остатка Ό221 до остатка О456, нумерация ЕЙ) общей длиной 1664 аминокислоты, вторая цепь состоит из того же единственного Рс-участка (226 аминокислот). Хотя клетки, изменённые трансфекцией с помощью плазмиды двойной экспресии РУШРс/Рс, ожидаемо могли секретировать три продукта (димер РУШРс, мономер РУШРс и димер Рс), в кондиционированной среде были обнаружены только мономер РУШРс и димер Рс. Очищенный белок РУШРс был проанализирован в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях с помощью электрофореза в ПААГ с ДДС (8Э8-РАОЕ) (фиг. 2А и 2В). При электрофорезе в ПААГ с ДДС в невосстанавливающих условиях было обнаружено полосы, мигрирующие с массами приблизительно 90 и 130 кДа, состоявшие из белков прогнозированных молекулярных масс: тяжёлой цепи (НС) РУШРс и лёгкой цепи - димерного соединения Рс (ЬСРс2) (фиг. 2А, дорожка 3). Третья полоса также была обнаружена с массой приблизительно 220 кДа, состоявшая из прогнозированной молекулярной массы одноцепочечного РУШРс (8С РУШРс; НС+ЬСРс2), в котором остаток аргинина в положении 754 (1648 в соответствии с полной длиной последовательности) не был расщеплён во время секреции. При электрофорезе в ПААГ с ДДС в восстанавливающих условиях было видны основные полосы, мигрирующие с массами приблизительно 25, 90, 105 и 195 кДа, состоявшие из
- 43 029560
белков прогнозированных молекулярных масс: одноцепочечного Рс, тяжёлой цепи НС, лёгкой цепи ЬСРс и 8С РУШРс (фиг. 2В, дорожка 3). Котрансфекция с РС5 человека, представителя типа протеаз пропротеинконвертазы субтлизин/кексина (РС8К), привела к полному процессингу препарата гРУШРс (фиг. 2А, 2В, дорожка 2).
Денсиметрический анализ нескольких серий гРУШРс при анализе в ПААГ с ДДС показал более чем 98 % чистоты ожидаемых полос белков. Эксклюзионная хроматография (8ЕС) также использовалась для оценки степени имеющейся агрегации, и было обнаружено, что все серии имеют степени агрегации на уровне 0,5% или менее. Структура молекулы гРУШРс была дополнительно проанализирована расщеплением тромбином, восстановлением и анализом методами ЖХ/УФ и ЖХ/МС. Четыре фрагмента РУШ образовались после обработки тромбином (расщеплением трёх аргининовых остатков в положениях 372, 740 и 795; остаток 795 отвечает остатку 1689 соответствующей полноразмерной последовательности РУШ), которые обнаруживались по УФ-поглощению (фиг. 2С), соответствовали следующим сегментам белка: Рс (пик 1), одноцепочечный Рс (пик 2), А1-домен тяжёлой цепи (пик 3) и А2-домен тяжёлой цепи (пик 4). Линкер В-домена из 14 аминокислот и аЗ-связанные пептиды массой ~ 6 кДа не обнаруживались по УФ-поглощению из-за их малых размеров.
Полипептид гРУШРс, полученный без котрансфектированных ферментов процессинга, оказался содержащим 15-25% одноцепочечного РУШРс (8С РУШРс), который отличался от процессированного белка гРУШРс единственной пептидной связью между остатками К754 и Е755 (К1648/Е1649 в соответствии с полноразмерной молекулой РУШ). Эта изоформа была очищена и охарактеризована всеми описанными выше биохимическими методами исследования, и было обнаружено, что она сравнима с белком гРУШРс, как показано ниже. Найдено, что активность очищенного одноцепочечного белка РУШРс сходна с активностью гРУШРс в хромогенном анализе, а также при проведении различных функциональных анализов, описанных ниже.
(Ь) Измерение активности РУШ хромогенным и одностадийным аРТТ анализами.
Активность РУШ измерялась хромогенным анализом. Средняя удельная активность четырёх различных серий гРУШРс найдена равной 9762±449 МЕ/мг при определении хромогенным анализом, что соответствует концентрации 2148±99 МЕ/нмоль. Активность РУШ одноцепочечного белка РУ111:Рс также измерялась хромогенным анализом и сравнивалась с активностью полностью процессированных молекул гРУШРс или гРУШРс Ό8 (двухцепочечный белок, содержащий около 25% одноцепочечного гРУП1Рс). Как показано в табл. 3А, одноцепочечный гРУШРс не выявил значительного отличия активности РУШ по сравнению с активностью РУШ полностью процессированного РУШРс или гРУШРс Ό8 при определении хромогенным анализом в присутствии и в отсутствии фактора фон Виллебранда (УТОР). В табл. 3В показано, что полная активность 8С гРУШРс наблюдалась в отсутствии УТОР при измерении одностадийным анализом времени частичной активации тромбопластина (аРТТ).
Таблица 3А. Активность РУШ хромогенным анализом
| Среда | Образец | Удельная активность хромогенным анализом (МЕ/мг) | КВ*, % |
| Плазма с удалённым РУШ | гРУШРсО8 (25% чистого белка) (КЕСО-19189-09-013) | 9066 | 2,49 |
| Одноцепочечный гРУШРс (очищенный от КЕСО 19189-09-013) | 8194 | 2,72 | |
| Полностью процессированный гРУШРс (очищенный, генноинженерная клеточная линия) | 9577 | 8,34 | |
| Плазма с удалёнными РУШ и У\УР | гРУШРсОЗ (25% чистого белка) (КЕСО-19189-09-013) | 10801 | 8,92 |
| Одноцепочечный гРУШРс (очищенный от КЕСО 19189-09-013) | 9498 | 4,70 | |
| Полностью процессированный гРУШРс (очищенный, генноинженерная клеточная линия) | 9569 | 4,54 |
*КВ - коэффициент вариации
- 44 029560
Таблица 3В. Активность РУШ аРТТ анализом
| Среда | Образец | Коагуляционная (аРТТ) удельная активность (МР/мг) | КВ, % |
| Плазма е удалённым РУШ | гРУШРсПЗ (25% чистого белка) (КЕСО-19189-09-013) | 8210 | 5,88 |
| Одноцепочечный гРУШРс (очищенный от ΚΡΟϋ 19189-09-013) | 3108 | 6,57 | |
| Полностью процессированный гРУШРс (очищенный, генноинженерная клеточная линия) | 8683 | 3,57 | |
| Плазма с удалёнными РУШ и У\УР | гРУШРсПЗ (25% чистого белка) (КРСО-19189-09-013) | 15621 | 6,47 |
| Одноцепочечный гРУШРс (очищенный от ΚΕΟϋ 19189-09-013) | 13572 | 2,41 | |
| Полностью процессированный гРУШРс (очищенный, генноинженерная клеточная линия) | 15170 | 10,42 |
(с) Активность в комплексе Х-азы.
Активность РУШ была также измерена в окружении комплекса Х-азы путём инкубации активированного ΠΧ и тромбин-активированного препарата КЕРΑСΤО® или белка гРУШРс на фосфолипидной поверхности в присутствии кальция и наблюдении за конверсией факторов ΗΧ в ΡΧη с измерением расщепления хромогенным или флуорогенным субстратом, при этом определялись скорости образования Ι;Χα. Потом этот анализ был модифицирован варьированием одного компонента анализа, с сохранением всех остальных на постоянном уровне для того, чтобы проверить взаимодействия с каждым отдельным компонентом.
Скорость образования Ι;.Χα была определена в виде функции разных концентраций фосфолипидов для белков гРУШРс Όδ, γΒΌΌ РУШ и одноцепочечного гРУШРс (табл. 3А), используя синтетические фософлипидные везикулы (25% фосфатидилсерина/75% фосфатидилхолина). Было обнаружено, что оба белка обладали схожим профилем активности с пиком активности при примерной концентрации фосфолипидов 156 мкМ.
Скорость образования ΡΧη далее была определена в виде функций разных концентраций ΡΧ и расчитаны значения Кт и Утах (табл. 3В). Было найдено, что профили активности гРУШРс Όδ, гУВД РУШ и одноцепочечного гРУШРс сходны, с подобными значениями Кт и Утах (табл. 4). Наконец, скорость образования ΗΧη была определена в виде функций разных концентраций ΓΙΧ (табл. 3С). Их профили активности выявились сходными с подобными значениями Кт и Ута\ (табл. 5). Сходные результаты были получены с использованием тромбоцитов как источника фосфолипидов (неопубликованные данные, июнь 2009).
Таблица 4. Параметры образования ΓΧα для белков РУ111 в зависимости от содержания фосфолипидов
| Источник липидов | Молекула | Кт (нМ) | Утах (нМУмин) |
| 25% Ρδ-75% РС | гРУШРс ϋδ | 55,0 ± 5,9 | 65,6 ±8,6 |
| гУВД РУШ | 51,0 ± 8,7 | 73,5 ± 10,1 | |
| ΝΡ гРУШРс | 53,2 ± 7,5 | 56,0 ± 13,8 |
Таблица 5. Взаимодействие РКа с белками РУ111
| Источник липидов | Молекула | Кт (нМ) | Утах (нМ/мин) |
| 25% Ρδ-75% РС | гРУШРс Ώδ | 2,8 ± 0,4 | 4,5 ± 0,3 |
| гУВД РУШ | 2,5 ± 0,3 | 4,0 ± 1,0 | |
| ΝΡ гРУШРс | 2,3 ± 0,2 | 3,8 ±0,4 |
(ά) Инактивация АРС.
После активации РУ111 инактивируется при расщеплении активированным белком С (АРС), а также при диссоциации домена А2. Препараты гРУШРс и гУВД РУ111 были активированы тромбином после чего их инкубировали с АРС разное время и определяли активность анализом образования РΧа (фиг. 4). Без активации тромбином было обнаружено небольшое образование РΧа и его образование значительно возрастало после расщепления тромбином. Обработка АРС в течение 90 мин вела к значительному уменьшению скоростей образования РΧа, сходному с неактивированными образцами, и эти результаты были подобны для белков гРУШРс Όδ, гУВД РУ111 и одноцепочечного гРУШРс.
(е) Аффинность к ν\\Ρ.
Взаимодействия РУ111 с фактором фон Виллебранда (У^Р) измеряли анализом биомолекулярных
- 45 029560
взаимодействий в масштабе реального времени (В1Асоге), основанного на технологии поверхностного плазмонного резонанса (8РК), для определения кинетики связывания гРУШРс и гУВД РУ111 к ν\\Τ (табл. 6). Кинетические параметры Ка (ассоциации), Ка (диссоциации) и аффинности Ко (Ка/Ка) были определены для каждого взаимодействия РУ111 в идентичных условиях. Найдено, что белки гРУШРс и гУВД РУ111 обладают аффинностью связывания (Ко) к ν\\Τ при низкой концентрации в нМ, соответственно, 1,64±0,37 и 0,846+0,181 нМ. Эти белки обладают схожими скоростями диссоциации с двухкратным отличием в скорости ассоциации, приводящим к двухкратному отличию в аффинности.
Таблица 6. Анализ связывания белков РУ111 с ν\\Τ методом Вюсоге
| Кинетические параметры | Диссоциация/ассоциация | ||||
| Аналит | Лиганд | Ν | Ассоциация (М-13-1) | Диссоциация (5-1) | КО(М) |
| гРУШРс ϋ 8 | ΗνλΥΡ | 5 | 7,92 ± 1,51х105 | 1,25 ± 1,12х10'3 | 1,64 ± 0.37х10'9 |
| ΝΡ гРУШРс | ΗνλΥΡ | 5 | 8,66 ± Ι.ΙΟχΙΟ5 | 1,09 ± 0.09х10'3 | 1,28 ± 0.22х10’9 |
| гУВД РУШ | ΗνλΥΡ | 5 | 13,7 ± 1.50х105 | 1,14 ± 0.12х10'3 | 0,846 ± 0.181х10'9 |
Как показано в табл. 6, была обнаружена аффинность гРУШРс 1)8 или одноцепочечного гРУШРс к ν\ΥΙ' в диапазоне низких значений концентраций нМ, приблизительно в два раза больше чем самого белка УВД РУШ. В физиологических концентрациях это явление может привести к небольшому увеличению процентного количества гРУШРс (процессированный или одноцепочечный), образующего комплекс с ν\\Τ, по сравнению со свободным РУШ. Однако исследования ΐη νίνο показали, что период полувыведения гРУШРс значительно пролонгирован по сравнению с полноразмерным или УВД РУ111, несмотря на его немного меньшую аффинность. Поэтому этот показатель не повлияет на период полувыведения данной молекулы. Свободный белок гРУШРс может более эффективно рециркулировать посредством механизма с участием рецепторов РсКи и, следовательно, это приведёт к большему пролонгированию периода полувыведения.
Пример 3. Клинические испытания белка гРУШРс, фазы 1/11а.
Открытое, многоцентровое, перекрёстное исследование фаз 1/11а с повышением дозы, впервые проводимое на человеке было разработано для оценки безопасности, переносимости и фармакинетики разовой дозы белка гРУШРс у пациентов с серьёзной (определена как <1 МЕ/дл [1%] эндогенного РУ111 [РУ111]) гемофилией А. Приблизительно 12 ранее лечившихся пациентов было вовлечено в исследование, они получали дозы гРУШРс по 25 или 65 МЕ/кг. После проведения скрининга (проводился в течение 28 суток перед получение первой дозы препарата АЭУАТЕ® [гРУШ], референтный препарат сравнения) и при минимум 4-суточном (96 ч) прошествии времени без лечения РУ111 перед первой инъекцией, приблизительно 6 пациентов получили однократную дозу в 25 МЕ/кг препарата АЭУАТЕ® с последующим получением профиля фармакинетики (РК) с последующей заменой препарата и введением разовой дозы гРУШРс без использования плацебо для получения РК-профиля в течении 7 суток (168 ч). Первые три пациента получали дозы последовательно. Первым трём (3) пациентам вводили гРУШРс в дозах 25 МЕ/кг, каждый пациент проходил проверку на наличие ингибиторов в течение 14 суток (336 ч) после инъекции препарата гРУШРс. Введение дозы следующему пациенту (только касательно первых трёх пациентов) проводилось сразу, как только завершалось исследование на наличие ингибиторов. После того, как третий пациент прошёл 14-суточную оценку на наличие ингибиторов, оставшиеся три пациента принимали 25 МЕ/кг препарата, а другие 6 пациентов - 65 МЕ/кг препарата, начиналось последовательное вовлечение каждой группы дозирования, по крайней мере, с 1-суточной отсрочкой.
Через одну неделю после того как последний пациент получил дозу гРУШРс 25 МЕ/кг, приблизительно 6 отдельных пациентов были вовлечены в группу, принимавшую дозу 65 МЕ/кг. Каждый субъект в группе, получавшей 65 МЕ/кг препарата, получил разовую дозу 65 МЕ/кг препарата Абуа!:е® с последующей оценкой РК-профиля в течение 4 суток (96 ч) потом проведена замена препарата и введение однократной дозы 65 МЕ/кг гРУШРс без использования плацебо для оценки профиля в течение 10 суток (240 ч). Если случай кровотечения происходил перед первой инъекцией гРУШРс в какой-либо группе, то для лечения использовали препарат РУ111, применявшийся для пациента перед исследованием, и перед получением первой инъекции белка гРУШРс для оценки РК-профиля должен был пройти период времени, составляющий по крайней мере 4 суток. Все пациенты проходили последующий 14-суточный период (336 ч) и 28-суточный период оценки безопасности препарата после введения доз гРУШРс 25 и 65 МЕ/кг для оценки безопасности. У всех субъектов исследования в введенные временные точки отбирали образцы крови для оценки фармакокинетики препарата перед и после получения ними доз препаратов вместе с анализами проб крови на активность РУШ. Для белка РУШРс были продемонстрированы следующие результаты оценки фармакокинетических данных фазы 1/11а клинического испытания. Препарат РУШРс показал около 50% увеличение системного воздействия (ЛРС1ХР), ОКОЛО 50% снижение клиренса (С1) и около 50-70% повышение периода полувыведения и среднего времени удержания (МКТ) препарата по сравнению с препаратом АЭУАТЕ® (полноразмерным белком гРУШ). Кроме того, белок РУШРс повысил уровни покзателей С168, ТВЬР1, ТВЬР3 и ТВЬР5 по сравнению с препаратом АЭУАТЕ®. Измеренные параметры РК были такие:
- 46 029560
АиСЮР - площадь под кривой концентрация-время в интервале времени от нуля до бесконечности;
Бета-НЬ - фаза периода полувыведения, также обозначаемая как ΐ1/2;
С168 - оценочная активность РУШРс выше базового уровня приблизительно через 168 ч после дозировки;
С1 - клиренс;
МКТ - среднее время удержания;
ТВЬР1 - прогнозированное моделированное время после получения дозы препарата, когда активность РУШРс снизилась до приблизительно значения на 1 МЕ/дл больше исходного значения;
ТВЬР3 - прогнозированное моделированное время после получения дозы препарата, когда активность РУШРс снизилась до приблизительно значения на 3 МЕ/дл больше исходного значения;
ТВЬР5 - прогнозированное моделированное время после получения дозы препарата, когда активность РУШРс снизилась до приблизительно значения на 5 МЕ/дл больше исходного значения;
Пример 4. Фармакокинетические (РК) испытания белка гРУШРс.
Рекомбинантный белок слияния с удалённым В-доменом (гРУШРс) был создан как реализация способа продления периода полувыведения фактора РУШ. Параметры фармакокинетики гРУШРс сравнили с препаратом гРУШ у мышей с гемофилией А. Конечный период полувыведения для белка гРУШРс был в два раза большим по сравнению с периодом для гРУШ. С целью подтверждения того, что лежащий в основе механизм продолжения периода полувыведения был связан с защитой гРУШРс рецепторами РсКп, РК-исследование было проведено при нокауте генов РсКп и на трансгенных мышах с РсКп человека (ЬРсКп).
Вводили однократную внутривенную дозу (125 МЕ/кг) и измеряли концентрации в плазме с использованием хромогенного анализа. Для препаратов гРУШРс и гРУШ (ХУХГНА®) Стах были сходными для обеих линий мышей. Однако если период полувыведения для гРУШРс был сравнимым с таким для гРУШ у мышей с нокаутом генов РсКп, то период полувыведения для гРУШРс был определён приблизительно в два раза большим, чем такой период для гРУШ у трансгенных мышей с генами ЬРсКп. Эти результаты подтвердили, что рецепторы РсКп выступают посредниками или отвечают за пролонгированный период полувыведения гРУШРс по сравнению с препаратом гРУШ.
Поскольку гемостаз цельной крови измерялся с помощью ротационной тромбоэластометрии (КОТЕМ®), то было показано корреляцию с эффективностью факторов коагуляции на моделях кровотечений мышей с гемофилией, а также клинические применения, которые мы искали для оценки эффективности ех νί\Ό гРУШРс у мышей с гемофилией А, используя метод КОТЕМ®.
Мышам с с гемофилией А вводили однократные внутривенные дозы по 50 МЕ/кг препаратов гРУ111Рс, Х^^ТНА® (РУШ) или АЭУАТЕ® (РУШ). Через 5 мин после получения дозы образование сгустка было подобным в отношении времени свёртывания крови (СТ), времени образования сгустка (СРТ) и аугла. Тем не менее, препарат гРУШРс показал значительное улучшение СТ через 72 и 96 ч после получения дозы. Показатели СРТ и а-угола были также улучшены по сравнению с обоими препаратами ΧΥΝТНА® (РУШ) и АЭУАТЕ® (РУШ), что согласуется с пролонгированной РК препарата гРУШРс. Эти результаты указывают на то, что гРУШРС обладает определённым механизмом действия, который приводит к повышению периода полувыведения и обеспечивает пролонгированную защиту от кровотечений.
Пример 5. Результаты клинических испытаний фаз 1/11а белка гРУШРс.
В этом примере представлены финальные результаты анализа активности РУШ, опеределённой у 16 пациентов, получавших лечение препаратами РУШ в дозах 25 и 65 МЕ/кг. См. пример 3. гРУШРс представляет собой рекомбинантный белок слияния, состоящий из единой молекулы рекомбинантного РУШ человека с удалённым В-доменом (гРУШ-УВД), соединённой с димерным Рс-доменом 1дС1 человека без промежуточной линкерной последовательности. Этот гибридный полипептид, также именуемый в этой заявке как гетеродимерный гибридный белок РУШРс, белок слияния РУШРс с мономерным Рс, гибрид мономерного белка РУШРс, мономерный гибридный белок РУ1111Рс и мономер-димер РУШРс. См. пример 1, фиг. 1 и табл. 2А.
Доклинические исследования белка гРУШРс показали примерно 2-х кратное пролонгирование периода полувыведения активности гРУШ по сравнению с коммерчески доступными препаратами гРУШ. Рациональным объяснением этого исследования была оценка безопасности и переносимости одноразовой дозы гРУШРс в виде замороженного жидкого препарата и получение данных РК у пациентов, страдающих серьёзной гемофилией. В этом исследовании 16 пригодных для оценивания пациентов были привлечены для определения РК. Однократное введение двух доз обоих препаратов гРУШРс и АЭУАТЕ® в номинальных дозах 25 (п=6) и 65 МЕ/кг массы тела (п=10) проводилось внутривенной инфузией в течение приблизительно 10 мин. Образцы крови для оценок РК препаратов в плазме отбирали перед инфузией, а также после 10 дней после введения доз. Показатели РК активности РУШ для обоих препаратов АЭУАТЕ® и гРУШРс были охарактеризованы в этом исследовании с использованием зависимого модельного исследования.
Цели исследования
- 47 029560
Первоначальной целью этого исследования была оценка безопасности и переносимости одноразового введения обеих доз препарата гРУГГГРс (25 и 65 МЕ/кг) у предварительно лечившихся пациентов (ПЛП) в возрасте 12 лет и выше с серьёзной гемофилией А. Второстепенной целью исследования было определение параметров фармакокинетики (РК), измеряемых по фармакодинамической (РО) активности РУГГГ в течение периода времени после однократного введения 25-65 МЕ/кг гРУГГГРс по сравнению с препаратом АОУАТЕ® при одностадийном анализе образования сгустка и хромогенном анализе.
План исследования (см. пример 3)
Образцы крови отбирали для оценки РК параметров активности РУГГГ при посещении пациента в ходе проведения скринига (в интервале 28 дней перед введением дозы АОУАТЕ®); на 0 день (введение АОУАТЕ®) перед инъекцией и через 10 и 30 мин и 1, 3, 6 и 9 ч после инъекции; на 1 день через 24 ч после инъекции АОУАТЕ®; на 2 день через 48 ч после инъекции АОУАТЕ®; на 3 день через 72 ч после инъекции АОУАТЕ®; и на 4 день через 96 ч после инъекции высокой дозы АОУАТЕ® (только группа В).
Образцы крови отбирали для оценки РК параметров активности РУГГГ в день введения гРУГГГРс перед введением преарата гРУГГГРс через 10 и 30 мин и 1, 3, 6 и 9 ч после инъекции гРУГГГРс; на 1 день через 24 ч после инъекции гРУГГГРс; с 2 по 5 дни через 48, 72, 96 и 120 ч после инъекции АОУАТЕ®; на 7 день через 168 ч после инъекции гРУГГГРс; и на 8,9 и 10 дни через 192, 216 и 240 ч после инъекции высокой дозы гРУГГГРс (только группа В). Активность РУГГГ была также измерена при последнем посещении в ходе исследования (28 дней после инъекции гРУГГГРс) через 672 ч после введения гРУГГГРс.
Фармакокинентическое моделирование
Аббревиатуры:
ТВЬР1 - прогнозированное моделированное время после получения дозы препарата, когда активность РУГГГ снизилась до приблизительно значения на 1 МЕ/дл больше исходного значения;
ТВЬР3 - прогнозированное моделированное время после получения дозы препарата, когда активность РУГГГ снизилась до приблизительно значения на 3 МЕ/дл больше исходного значения.
Расчёты
КУ_М = Стах_М/Действительная доза (МЕ/кг).
КУ_ОВ = Стах_ОВ/Действительная доза (МЕ/кг).
ГУК_М = 100хСтах_МхОбъём плазмы (дл)/Общая доза в МЕ; где объём плазмы в мл = (23,7хРост в см) + (9,0хВес в кг) - 1709.
ГУК_ОВ = 100хСтах_ОВхОбъём плазмы (дл)/Общая доза в МЕ; где объём плазмы в мл = (23,7хРост в см) + (9,0хВес в кг) - 1709.
Результаты
(а) Фармакокинетика однодозового введения (одностадийный анализ) Наблюдаемая активность РУГГГ резко возрасла вскоре после в/в инфузии препаратов АОУАТЕ® или гРУГГГРс со средними значениями Стах предсказанными в модели (±СО) равными 56,6±4,74 и 121±28,2 МЕ/дл для препарата АОУАТЕ®Н 55,6±8,18 и 108±16,9 МЕ/дл для гРУГГГРс для групп, соответственно, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг. У всех пациентов, лечившихся препаратами АОУАТЕ® и гРУГГГРс, были дозозависимые увеличения активности РУГГГ. Наблюдаемое увеличение значений Стах и АиСГХР было немного меньше чем пропорциональные дозе значения в пределах оцененного диапазона доз.
После завершения инфузии снижение наблюдаемой активности выявило моноэкспоненциальные характеристики снижения активности до достижения исходного уровня. Скорость снижения активности РУГГГ была меньше для гРУГГГРс, чем для препарата АОУАТЕ® со средними прогнозируемыми модельными значениями периода полувыведения (±СО) равными 11,9±2,98 и 10,4±3,03 ч для препарата АОУАТЕ® и 18,0±3,88 и 18,4±6,99 ч для гРУГГГРс для групп, соответственно, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг. Значения периодов полувыведения оказались дозонезависимыми в диапазоне доз, оценённом для обоих препаратов РУГГГ.
Общее системное воздействие (оценивалось по АиСГХР) было на ~48 и 61% больше после введения препарата гРУГГГРс, чем АОУАТЕ®, соответственно для уровней доз 25 и 65 МЕ/кг. Средние прогнозируемые модельные значения АиСГХР (±СО) составили 974±259 и 1810±606 ч-МЕ/дл для препарата АОУАТЕ®Н 1440±316 и 2910± 1320 ч-МЕ/дл для гРУГГГРс, соответственно, для групп, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг. Подобно значениям периода полувыведения значения МКТ для гРУГГГРс также были пролонгированы по сравнению с препаратом АОУАТЕ®. Средние прогнозируемые модельные значения МКТ (±СО) были равны 17,1±4,29 и 14,9±4,38 ч для препарата АОУАТЕ® и 25,9±5,60 и 26,5±10,1 ч для гРУГГГРс для групп, соответственно, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг. Значения МКТ оказались дозонезависимыми в диапазоне доз, оценённом для обоих препаратов РУГГГ.
Дополнительно были определены первичные параметры РК значений СЬ и У. Значения СЬ для белка гРУГГГРс составили только ~66% от таких значений, наблюдаемых для эквивалентных доз АОУАТЕ®. Средние прогнозируемые модельные значения СЬ (±СО) были равны 2,70±0,729 и 4,08±1,69 мл/ч/кг для препарата АОУАТЕ® и 1,80±0,409 и 2,69±1,25 мл/ч/кг для гРУГГГРс для групп, соответствен- 48 029560
но, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг. Значения У сравнивали для препаратов Α^УΑΤЕ® и гРУШРс со средними прогнозируемыми модельными значениями У (±СО) равными 43,9±4,27 и 56,1± 13,4 мл/кг для препарата Α^УΑΤЕ® и 45,3±7,23 и 61,6± 10,6 мл/кг для гРУШРс для групп, соответственно, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг. С возрастанием дозы Α^УΑΤЕ® и гРУШРс были отмечены небольшие увеличения значений СЬ и У. Однако, возрастание стандартных отклонений (СО) для дозы 65 МЕ/кг сочеталось с ограниченными уровнями доз, помешавшими оценить дозозависимый характер этих параметров. Например, КВ в % среднего геометрического значения СЬ для группы, лечившейся препаратом гРУШРс, возрос с 23,0% (25 МЕ/кг) до 48,6% (65 МЕ/кг).
Кроме первичных параметров РК для оценки продолжительности действия РУШ были определены вторичные параметры РК (например, К-значения, снижение объёма инфузии (1УК) и т.д.). Наблюдали также доказательство отличия РК для гРУШРс, продемонстрированное увеличенными значениями ТВЬР1 и ТВЬР3 по сравнению с препаратом Α^УΑΤЕ®, введённом в эквивалентных дозах. 1УК и Кзначения для препаратов Α^УΑΤЕ® и гРУШРс оказались сравнимыми. Небольшое увеличение значений ТВЬР1 и ТВЬР3 наблюдалось с увеличением доз препаратов Α^УΑΤЕ® и гРУШРс. Напротив, с увеличением доз препаратов Α^УΑΤЕ® и гРУШРс было отмечено небольшое увеличение средних значений 1УК и К-значений. Как указано ранее, оценивание дозозависимости этих параметров осложнено ограниченными уровнями доз.
Средние наблюдаемые значения ТВЬР1 (±СО) были равны 2,88±0,733 и 2,93±0,848 МЕ/дл на МЕ/кг для препарата Α^УΑΤЕ® и 4,28±0,873 и 5,16±2,02 МЕ/дл на МЕ/кг для гРУШРс для групп, соответственно, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг. Средние наблюдаемые значения ТВЬР3 (±СО) были равны 2,06±0,527 и 2,26±0,666 МЕ/дл на МЕ/кг для препарата Α^УΑΤЕ® и 3,09±0,623 и 3,93± 1,59 МЕ/дл на МЕ/кг для гРУШРс для групп, соответственно, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг.
Средние значения 1УК и К-значений рассчитаны с помощью значений Стах (с вычитанием значений исходного уровня и остаточной активности лекарств в рамках модели) в основном были больше значений, определённых с помощью прогнозированных модельных значений Стах; что согласуется с небольшой недооценкой наблюдаемой пиковой активности, определяемой с помощью однокамерной модели. Средние наблюдаемые К-значения (±СО) были равны 2,57±0,198 и 2,13±0,598 МЕ/дл на МЕ/кг для препарата Α^УΑΤЕ® и 2,46±0,330 и 1,85±0,332 МЕ/дл на МЕ/кг для гРУШРс для групп, соответственно, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг. Средние наблюдаемые значения 1УК (±СО) были равны 94,1±15,6 и 85,8±16,5 % для препарата Α^УΑΤЕ® и 89,5± 11,9 и 74,8±6,72 % для гРУШРс для групп, соответственно, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг.
(Ь) Фармакокинетика однократного введения (хромогенный анализ) Наблюдаемая активность РУШ резко возрасла вскоре после в/в инфузии препаратов Α^УΑΤЕ® или гРУШРс со средними значениями 0^ предсказанными в модели (±СО) равными 70,2±9,60 и 157±38,6 МЕ/дл для препарата Α^УΑΤЕ® и 70,3±10,0 и 158±34,7 МЕ/дл для гРУШРс для групп, соответственно, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг.
У всех пациентов, лечившихся препаратами Α^УΑΤЕ® и гРУШРс, были дозозависимые увеличения активности РУШ. Наблюдаемое увеличение значений Стах и Αυ^^ были немного меньше чем пропорциональные дозе значения в пределах оцененного диапазона доз.
После завершения инфузии снижение наблюдаемой активности выявило моноэкспоненциальные характеристики снижения до достижения исходного уровня. Скорость снижения активности РУШ была меньше для гРУШРс, чем для препарата Α^УΑΤЕ® со средними прогнозируемыми модельными значениями периода полувыведения (±СО) равными 10,7±1,98 и 10,3±3,27 ч для препарата Α^УΑΤЕ® и 16,2±2,92 и 19,0±7,94 ч для гРУШРс для групп, соответственно, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг. Значения периодов полувыведения оказались дозонезависимыми в диапазоне доз, оценённом для обоих препаратов РУШ.
Общее системное воздействие (оценивалось по Αυ^^) было на ~53 и 84% больше после введения препарата гРУШРс, чем Α^УΑΤЕ®, соответственно, для уровней доз 25 и 65 МЕ/кг. Средние прогнозируемые модельные значения ΑυСINР (±СО) составили 1080±236 и 2320±784 ч-МЕ/дл для препарата Α^УΑΤЕ® и 1650±408 и 4280±1860 ч-МЕ/дл для гРУШРс, соответственно, для групп, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг. Подобно значениям периода полувыведения, значения МКТ для гРУШРс также были пролонгированы по сравнению с препаратом Α^УΑΤЕ®. Средние прогнозируемые модельные значения МКТ (±СО) были равны 15,3±2,86 и 14,8±4,72 ч для препарата Α^УΑΤЕ® и 23,4±4,22 и 27,3±11,4 часов для гРУШРс для групп, соответственно, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг. Значения МКТ оказались дозонезависимыми в диапазоне доз, оценённом для обоих препаратов РУШ.
Дополнительно были определены первичные параметры РК значений СЬ и У. Значения СЬ для белка гРУШРс составили только ~58-66% от таких значений, наблюдаемых для эквивалентных доз ΑΌУΑΤЕ®. Средние прогнозируемые модельные значения СЬ (±СО) были равны 2,39±0,527 и 3,21±1,40 мл/ч/кг для препарата Α^УΑΤЕ® и 1,57±0,349 и 1,86±0,970 мл/ч/кг для гРУШРс для групп, соответственно, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг. Значения У сравнивали для препаратов Α^УΑΤЕ® и гРУШРс со средними прогнозируемыми модельными значениями У (±СО) равными 35,8±5,52 и 43,6±11,2 мл/кг для
- 49 029560
препарата ΑΌνΑΤΕ® и 35,9±6,65 и 42,7±8,91 мл/кг для гЕУШЕс для групп, соответственно, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг. С возрастанием дозы для препаратов ΑΌνΑΤΕ® и гЕУШЕс были отмечены увеличения значений СЬ и ν. Однако возрастание стандартных отклонений (СО) для дозы 65 МЕ/кг сочеталось с ограниченными уровнями доз, помешавшими оценить дозозависимый характер этих параметров.
Кроме первичных параметров ΡΚ для оценки продолжительности действия ΡνΐΙΙ были определены вторичные параметры ΡΚ (например, Κ-значения, снижение объёма инфузии (ΐνΚ) и т.д.). Наблюдали также свидетельство отличия ΡΚ для ΓΡνΐΙΙΡο, продемонстрированное увеличенными значениями ΤΒΌΡ1 и ΤΒΌΡ3, от препарата ΑΌνΑΤΕ®, введённого в эквивалентных дозах. ΐνΚ и Κ-значения для препаратов ΑΌνΑΤΕ® и ШУПИс оказались сравнимыми.
Небольшое увеличение значений ΤΒΌΡ1 и ΤΒΌΡ3 наблюдалось с увеличением доз препаратов ΑΌνΑΤΕ® и гЕУШЕс. Напротив, с увеличением доз препаратов ΑΌνΑΤΕ® и гЕУШЕс было отмечено небольшое увеличение средних значений ΐνΚ и Κ-значений. Как указывалось ранее, оценивание дозозависимости этих параметров осложнено ограниченным уровнем доз.
Средние наблюдаемые значения ΤΒΌΡ1 (±СО) были равны 2,70±0,511 и 3,09±0,978 МЕ/дл на МЕ/кг для препарата ΑΌνΑΤΕ® и 4,06±0,798 и 5,66±2,38 МЕ/дл на МЕ/кг для гЕУШЕс для групп, соответственно, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг. Средние наблюдаемые значения ΤΒΌΡ3 (±СО) были равны 1,98±0,377 и 2,39±0,718 МЕ/дл на МЕ/кг для препарата ΑΌνΑΤΕ® и 3,04±0,598 и 4,44±1,84 МЕ/дл на МЕ/кг для гЕУШЕс для групп, соответственно, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг.
Средние значения ΐνΚ и Κ-значений рассчитаны с помощью значений Стах (с вычитанием значений исходного уровня и остаточной активности лекарств в рамках модели) в основном были больше значений, определённых с помощью прогнозированных модельных значений Стах; что согласуется с небольшой недооценкой наблюдаемой пиковой активности, определяемой с помощью однокамерной модели. Средние наблюдаемые Κ-значения (±СО) были равны 3,08±0,429 и 2,85±0,721 МЕ/дл на МЕ/кг для препарата ΑΌνΑΤΕ® и 3,12±0,451 и 2,92±0,985 МЕ/дл на МЕ/кг для гЕУШЕс для групп, соответственно, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг. Средние наблюдаемые значения ΐνΚ (±СО) были равны 112±14,5 и 116±26,9 % для препарата ΑΌνΑΤΕ® и 113±16,3 и 117±33,6 % для гЕУШЕс для групп, соответственно, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг.
Выводы
У всех пациентов, лечившихся препаратами ΑΌνΑΤΕ® и ίΡνΐΠΡο, были дозозависимые увеличения значений Стах и Αυ^^· В диапазоне оценённых доз. Пиковые уровни в плазме препаратов ΑΌνΑΤΕ® и ίΡνΐΠΡο обычно наблюдались в пределах первого часа после завершения инфузии и оставались обнаруживаемые в течение нескольких дней после введения дозы. После завершения инфузии снижение активности ΡνΙΙΙ скорректированной к исходному уровню выявило моноэкспоненциальное снижение до достижения исходного уровня активности для обоих препаратов. Значения параметров периодов полувыведения и ΜΚΤ оказались дозонезависимые в диапазоне доз, оценённом для обоих препаратов ΡνΐΙΙ. С возрастанием дозы ΑΌνΑΤΕ® и ίΡνΐΠΡο были отмечены небольшие увеличения значений СЬ и ν. Однако возрастание вариабельности среди пациентов для дозы 65 МЕ/кг сочеталось с ограниченными уровнями дозами, помешавшими оценить дозозависимый характер этих параметров.
Сравнение активности параметров ΡΚ препаратов ίΡνΐΠΡο и ΑΌνΑΤΕ® выявило приблизительно 48-61% (одностадийный анализ) или 53-84% (хромогенный анализ) возрастание системного воздействия, примерно 30-40% снижение клиренса и приблизительно 50-80% возрастание обоих значений периода полувыведения и ΜΚΤ для препарата гЕУШЕс по сравнению с ΑΌνΑΤΕ® в сравнимых дозах. Наблюдали также свидетельство отличия ΡΚ для ιΈνΐΙΙΡ^ продемонстрированное увеличенными значениями ΤΒΌΡ1 и ΤΒΌΡ3 по сравнению с препаратом ΑΌνΑΤΕ®, введённом в эквивалентных дозах. ΐνΚ и Κзначения для препаратов ΑΌνΑΤΕ® и ίΡνΐΠΡο оказались сравнимыми.
Параметры ΡΚ полученные в результате хромогенного анализа обычно согласовывались с такими результатами для одностадийного анализа, за исключением того, что при хромогенном анализе получали более высокие значения параметров экспозиции (например, Стах, Αυ^^·, и т.д.).
Наблюдавшиеся улучшенные параметры ΡΚ указывают на то, что препарат ίΡνΐΠΡο способен обеспечить продолжительную защиту от кровотечений, допуская менее частые инъекции пациентам с гемофилией А.
Пример 6. Клиническое испытание белка ίΡνΐΠΡο Α-ΌΟΝΟ фазы 3.
На основе предварительного анализа данных РК, полученных при первом исследовании белка ίΡνΐΠΡο на людях (см. пример 3) было разработано испытание А-ΌΟΝΟ. Испытание Α-ΌΟΝΟ представляет собой открытое, масштабное, многоцентровое испытание фазы 3 оценивания безопасности, фармакокинетики и эффективности рекомбинантного белка слияния ΡνΐΙΙ Ρс (ΡνΐΙΙ:Ρο) для предотвращения и лечения кровотечений у ранее лечившихся пациентов с серьёзной гемофилией А (определяемой как <1 МЕ/дл [<1%] эндогенного ΡνΐΙΙ).
Первоначальными целями исследования Α-ΌΟΝΟ были: (ί) оценка безопасности и переносимости препарата ίΡνΐΠΡο, вводимого для профилактики, еженедельного введения, лечения по требованию и в
- 50 029560
режимах хирургического лечения, и (ίί) оценка безопасности и переносимости препарата гРУШРс, вводимого для подбираемого режима профилактики, режимах лечения по требованию и в режимах хирургического лечения. Второстепенной целью исследования А-ЬОЫО были: (ί) определение параметров РКпрофиля препарата гРУШРс и сравнение РК гРУШРс с присутствующими в данный момент на рынке препаратами АЭУАТЕ®, (ίί) оценка индивидуальных откликов на приём гРУШРс, (ίίί) определение диапазона доз и графиков, необходимых для удовлетворительного предотвращения кроветечений, для режима профилактики, поддержания гомеостаза при хирургическом вмешательстве или лечении эпизодов кровотечения при лечении по требованию, еженедельном лечении или профилактическом лечении и (ίν) оценки расходования гРУШРс (например, общее ежегодное использование гРУШРс на пациента).
165 пациентов были вовлечены в один из трёх режимов: подбираемый режим профилактики (группа 1), режим еженедельного дозирования (группа 2) и режим лечения по требованию (группа 3). Дополнительно препарат гРУШРс оценивали в подгруппе периоперационного управления.
Ключевые критерии приёма в группы: (ί) мужчины, (ίί) >12 лет и по меньшей мере 40 кг, (ίίί) диагноз - серьёзное заболевание гемофилией А, определённое как <1% (<1 МЕ/мл) эндогенной активности РУШ, и (ίν) история болезни >150 задокументированных дней предварительного воздействия каких-либо коммерческих препаратов РУШ, распространяемых в настоящее время.
Группа 1. Подбираемый режим профилактики.
Группа 1 включала всю группу и подгруппу изучения РК. В начальном режиме дважды в неделю вводили дозу 25 МЕ/кг в первый день с последующим введением 50 МЕ/кг на четвёртый день недели (день 4). Субъектам исследования вводили препарат гРУШРс в этом режиме еженедельной профилактики до получения результатов РК для белка гРУШРс. На основании этих результатов для каждого человека назначали подбираемый режим профилактики, при котором доза и интервал введения были определены для поддержания минимальных уровней 1-3% активности РУШ. Потом каждому пациенту производили введение согласно его индивидуально подобранному режиму профилактики в течение всего периода исследования.
За пациентами наблюдали в течение всего лечения и проводили текущие коррекции дозы и интервалов введения препаратов. Могут проводиться корректировки, только когда с пациентом происходят неприемлемые случаи возникновения кровотечения, определяемые как >2 спонтанных эпизодов кровотечения в течение непрерывного двухмесячного периода. В этом случае корректировка дозы была направлена на изменение минимальных уровней активности до 3-5%.
Группа 2. Режим еженедельного дозирования.
Субъекты исследования проходили сокращённые исследования профилей РК препарата гРУШРс согласно следующим параметрам: период вымывания препарата по меньшей мере 96 ч; одноразовая доза гРУШРс 65 МЕ/кг; сокращённый отбор проб, начинавшийся с 0-го дня введения гРУШРс, включая момент перед инъекцией и через 10 (±2) мин, 3 ч (±15 мин), 72 (± 2) ч [3 день] и 96 (± 2) ч [4 день] с начала введения препарата. После сокращённого исследования РК профиля пациентам далее вводили фиксированную дозу гРУШРс 65 МЕ/кг каждые 7 дней по меньшей мере 28 недель вплоть до 52 недель.
Группа 3. Эпизодическое лечение (по требованию).
Субъекты исследования получали эпизодическое лечение препаратом гРУШРс по мере необходимости при возникновении кровотечений. Пациенты вовлекались в исследование, рандомизированно распределялись и проходили сокращённые исследования профилей РК препарата гРУШРс согласно следующим параметрам:
(ί) Период вымывания: По меньшей мере 96 ч.
(ίί) Дозирование гРУШРс на 0-й день: одноразовая доза гРУШРс 50 МЕ/кг, вводимая под медицинским наблюдением.
(ш) Сокращённый отбор проб, начинавшийся с 0-го дня введения гРУШРс: Перед инъекцией и через 30 (±3) мин, 3 ч (±15 мин), 72 (±2) ч [3 день] и 96 (±2) ч [4 день] после начала инъекции.
В выбранных местах проводился отбор образцов одновременно для ТОА во всех временных точках определения профиля РЬ. Выборка пациентов, сдававших пробы для исследования методами КОТЕМ/ТЕО, отбор образцов происходил в следующие временные точки: Перед инъекцией и через 3 ч (±15 мин), 72 (±2) ч [3 день] и 96 (±2) ч [4 день] после начала инъекции.
В промежутке между запланированными визитами пациенты получали лечение при эпизодах кровотечений дозами препарата гРУШРс в пределах 10-50 МЕ/кг в зависимости от тяжести кровотечения.
Подгруппа периоперационного управления
В этом исследовании препарат гРУШРс вводили перед последующей хирургической операцией в выборке пациентов, требующих обширное хирургическое вмешательство. Обширное хирургическое вмешательство определяется как хирургическая операция (рекомендованная или неотложная), в которой используется общая анастезия и/или искусственное дыхание, при которой происходит проникновение или воздействие на основные полости организма или в ходе которой возникает значительное ухудшение физических или физиологических функций (например, лапаротомия, торакотомия, краниотомия, замена сустава и ампутация конечностей).
- 51 029560
Для получения профилактики во время хирургической операции субъекты исследования получали лечение дозами ιΡνΙΠΡο 20-50 МЕ/кг каждые 12-24 ч. Перед операцией доктор персматривал РКпрофиль пациента в отношении ιΡ"νΠΙΡο и оценивал режим дозирования замещения активности ΡνΙΙΙ, обычно требуемого для этого типа запланированной хирургической операции и клинического статуса данного пациента. Рекомендации по выбору необходимой дозы ιΡ"νΠΙΡο на период хирургического лечения, включая какой-либо период реабилитации, принимали во внимание эти факторы. Оценка фармакокинетики (РК): Все пациенты во всех группах проходили начальное оценивание после получения первой дозы препарата ιΈνΙΙΙΡο Выборке пациентов из группы 1 была определена в подгруппу протоколопределённого последовательного изучения РК для сравнения РК ιΡνΙΠΡο с РК рекомбинантного фактора νΙΙΙ (τΡνΙΙΙ, А^VАТЕ® [метод определения антигемофильного фактора (рекомбинантный), способ получения без плазмы и альбумина]) согласно следующих условий:
(ί) Перед проведением лечения в группе 1 РК оценивалась после введения однократной дозы 50 МЕ/кг препарата А^VАТЕ®. Потом среди тех же пациентов оценивалась РК после введения однократной дозы 50 МЕ/кг ιΈνΙΙΙΡο
(ίί) Оценка РК повторялась через 12-24 ч.
Ключевые результаты определения эффективности (включая начальные данные): (ί) Ежегодный показатель возникновения кровотечений (АВК) в группе 1 против группы 3 (группа с индивидуальной профилактикой по сравнению с группой эпизодического лечения), (ίί) число инъекций, требуемых для прекращения эпизода кровотечения, (ίίί) оценивание лечащими врачами отклика пациентов на хирургическое вмешательство при применении ιΈνΙΙΙΡο используя 4-бальную шкалу. Результирующие измерения РК: РК препаратов ΓΗνΙ ИГс и А^VАТЕ®. Ключевые результаты определения эффективности: (ί) Частота развития ингибирующего эффекта; и (ίί) частота возникновения неблагоприятных явлений (НЯ), происходящих за пределами периода периоперационного управления.
Результаты
Субъекты исследования: всего в этом исследовании было задействовано 165 пациентов.
Группа 1 (индивидуальная профилактика), п = 118; группа 2 (еженедельная профилактика), п = 24; группа 3 (эпизодическое лечение), п = 23; подгруппа периоперационного управления, п = 9, 9 операций (8 пациентов из группы 1, и 1 - из группы 2). Это исследование прошли 92,7% пациентов.
Эффективность препарата: медианное значение АВК (группа индивидуальной профилактики: 1,6; группа еженедельной профилактики: 3,6; группа эпизодического лечения: 33,6). В группе индивидуальной профилактики медиана для интервала дозирования составила 3,5 суток во время последних 3 месяцев исследования. 30% пациентов в группе индивидуальной профилактики достигли среднего значения интервала дозирования по меньшей мере 5 дней. 98% эпизодов кровотечений контролировались одной или двуми инъекциями ιΈνΙΙΙΡο При периоперационном управлении лечащие врачи оценили гемостатическую эффективность препарата ιΡ"νΠΙΡο как отличную или хорошую в 100% случаев хирургических операций. РК: Среднее геометрическое значение конечного периода полувыведения белка ΓΡνΠΙΡο составил приблизительно 19,0 ч, что оказалось в 1,53 раза дольше, чем у препарата А^VАТЕ® (приблизительно 12,4 ч).
Безопасность: не сообщалось об обнаружении ингибиторов к ΓΡνΠΙΡο и о случаях анафилактических реакций. Обычно препарат ιΡ"νΠΙΡο переносился хорошо. Наиболее частые НЯ, вне зависимости от причин (частота возникновения >5%), случались за пределами периода периоперационного управления и включали назофарингит, боль в суставах и инфекции верхних дыхательных путей. У 12 пациентов (7.3%) за пределами периода периоперационного управления возникли серьёзные НЯ (СНЯ). Исследователем не было определено СНЯ, связанных с приёмом препарата.
Резюме
Исследование режимов индивидуальной и еженедельной профилактики в результате привели к однозначному медианному значению ежегодной частоты возникновения кровотечений. В группе индивидуальной профилактики медиана для интервала дозирования составила 3,5 суток. В течение последних 3 месяцев исследования 30% пациентов в группе индивидуальной профилактики достигли среднего значения интервала дозирования по меньшей мере 5 дней. 98% эпизодов кровотечений контролировались одной или двуми инъекциями ΓΡνΙΙΙΡο. Гемостатическая эффективность препарата ιΈνΙΙ^ была оценена лечащими врачами как отличная или хорошая в 100% случаев хирургических операций. Период полувыведения ιΈνΙΙ^ составил приблизительно 19,0 ч по сравнению с 12,4 ч для препарата А^VАТЕ®. Ни у одного пациента не появился ингибитор или не возникло анафилактической реакции на препарат ιΈνΙΙΙΡο Рекомбинантный препарат ΡνΠΙΡο обычно хорошо переносился.
Пример 7. Клиническая оценка с помощью метода КОТЕМ.
В дополнение к измерению активности ΡνΙΙΙ в плазме методом измерения времени одностадийной частичной активации тромбопластина (аРТТ), также был использован метод ротационной тромбоэластометрии крови (КОТЕМ®) для оценки улучшения общего гемостаза при применении препаратов ιΈνΙΙ^ и А^VАТЕ® у 2 пациентов, в частности у 1 пациента из группы, получавшей низкую дозу, и 1 - из группы, получавшей высокую дозу.
- 52 029560
Оказалось, что препараты гРУШРс и АЭУАТЕ® активны в сравнимой степени относительно формирования сгустка, при добавлении препаратов к образцам крови пациентов до лечения препаратом гРУШРс. Время образования сгустка (СТ) было линейным в отношении дозы препаратов гРУШРс и АЭУАТЕ® в диапазоне приблизительно 1-100% от нормы. И у одного и того же пациента этот эффект дозы был сравним у обоих препаратов гРУШРс и АЭУАТЕ®.
После введения дозы АЭУАТЕ® с последующим введением гРУШРс были отобраны образцы цельной цитратной крови в разные временные точки и методом КОТЕМ® оценивали образование сгустка после рекальцификации крови. Несмотря на варьирование исходных значений СТ из-за остаточных уровней активности РУ111 перед введением доз АЭУАТЕ® или гРУШРс, оба препарата эффективно корректировали СТ до получения сравнимых значений в 30 мин после инъекций. Кроме того, улучшение показателей СТ дольше сохранялось и после 3 ч после инъекции 25 МЕ/кг гРУШРс по сравнению с введением этому пациенту АЭУАТЕ® в низкой дозе. Однако отличие в улучшении показателей под действием гРУШРс против АЭУАТЕ® было намного менее ощутимым при дозировке 65 МЕ/кг.
Пример 8. Определение эффективности препарата гРУШРс и одноцепочечного (8С) гРУШ ш νίνο на мышах с гемофилией (НетА) А.
Рекомбинантный фактор У111Рс (гРУШРс) содержит белок гРУШ с удалённым В-доменом (УВД ΒΌΌ) генетически гибридизированный с Рс-доменом иммуноглобулина человека (1дО1). Перед секрецией клетками НЕК 293 основное количество белка гРУШРс процессируется в виде тяжёлой цепи (НС) РУ111 и лёгкой цепи (ЬС+Рс). В процессе циркуляции молекула гРУШРс образует комплекс с фактором фон Виллебранда (У^Р) и высвобождается при активации способом, неотличимым от природного РУШ. Предполагется, что спонтанная диссоциация НС и ЬС вносит свой вклад в потерю активности РУ111 в плазме и во время хранения лекарственных препаратов РУШ. В этом примере изобретателями описывается одноцепочечная непроцессированнная изоформа гРУШРс (8С гРУШРс), котороая может обеспечить лучшую технологичность и повышенную стабильность по сравнению с препаратом природного РУШ. Белок 8С гРУШРс был отделён от гРУШРс, который содержал фракцию непроцессированной изоформы. По сравнению с гРУШРс, белок 8С гРУШРс показал эквивалентную хромогенную активность, но приблизительно на 60% меньшую активность при определении одностадийным (аРТТ) анализом (табл. 3А и 3В). Анализ определения образования тромбина (ТОА) выполнялся с использованием калиброванного автоматизированного устройства получения тромбограм (ТЬготЪтозсоре®). При проведении анализа ТОА белок 8С гРУШРс также показал пониженный потенциал образования тромбина (фиг. 13А) и пиковой концентрации тромбина (фиг. 13В) по сравнению с гРУШРс. Однако, как показано в табл. 3В, вся активность 8С гРУШРс при определении методом аРТТ наблюдалась в отсутствии ν\\Τ', что предполагает возможное замедленное высвобождение ν\\Τ' из-за ковалентной связи а3-кислотного участка с НС после расщепления связи Агр 1680 в молекуле 8С гРУШРс, в противоположность высвобождению и диссоциации участка а3 от полностью процессированного белка РУШ. Замедление диссоциации от ν\\Τ' может объяснять снижение активности, наблюдаемой в анализах аРТТ и ТОА, тогда как в двухстадийном хромогенном анализе наблюдалась полная активность. Пониженная скорость активации в присутствии ν\\Τ' подтверждена при хромогенном анализе с модифицированным хромогенным субстратом с лимитированным содержанием тромбина, как активатора РУШ.
Функционирование 8С гРУШРс в условиях т νίνο оценивалось на модели рассечения хвостовой вены (РХВ) мышей с НетА. Сначала мышей подвергали анестезии, потом им вводили 4,6 мкг/кг, 1,38 мкг/кг или 0,46 мкг/кг или процессированного гРУШРс (лекарственная субстанция, содержащая около 75-85% процессированного гРУШРс) и очищенного одноцепочечного белка (8С) гРУШРс за 48 ч до РХВ. Конец хвоста отрезался и немедленно помещался в пробирку для сбора крови. Процентное значение защиты для выживания измерено для процессированного белка гРУШРс (лекарственная субстанция) и одноцепочечного белка (8С) гРУШРс как показано в табл. 7 и фиг. 7А, 7В и 7С.
Таблица 7. Определение эффективности препарата гРУШРс и одноцепочечного (8С) гРУШ т νίνο
| Доза (мкг/кг) | 4,6 | 1,38 | 0,46 | |
| % защиты для выживания | гРУШРс Ό8 | 93 | 52 | 19 |
| Одноцепочечный гРУШРс | 93 | 64 | 14 |
Показатели исследования т νίνο повторное хвостовое кровотечение и выживание подвергали ежечасному мониторингу вплоть до 12 ч после РХВ с последним наблюдением через 24 ч после РХВ. Белки 8С гРУШРс и гРУШРс продемонстрировали эквивалентную эффективность на этой модели в условиях т νίνο, со значениями ЭД50 (эффективная доза в 50% случаев) равными, соответственно, 1,17 мкг/кг и 1,23 мкг/кг, когда РХВ проводили через 48 ч после инфузионного введения препаратов (фиг. 7А). Для каждого уровня протестированной дозы препаратов 8С гРУШРс и гРУШРс наблюдали сравнимые кривые выживания в течение 24 ч после РХВ (р>0,65) (фиг. 7В) и частоты возникновения повторных кровотечений (фиг. 7С), что указывает на эффективность 8С гРУШРс эквивалентную гРУШРс, несмотря на его более низкую кажущуюся активность при анализе методом аРТТ. Поэтому замедленная активация 8С гРУШРс в условиях т νίΐτο в присутствии ν\\Τ', как оказалось, не обладает значительным влиянием на эффектив- 53 029560
ность этого белка ίη νίνο. Эти наблюдения указывают на то, что белок 8С гРУШРс представляет собой новую и эффективную изоформу гРУШРс с потенциалом клинического применения.
Пример 9. Фазы 1/2а клинического исследования.
гРУШРс - это рекомбинантный белок слияния, состоящий из единой молекулы РУШ, ковалентно связанной с Рс-доменом 1дО1 человека для продления полупериода циркуляции белка гРУШ. В этом исследовании, впервые проводимом на людях, на ранее лечившихся пациентах-мужчинах с серьёзной формой гемофилии А определяли безопасность и фармакокинетику препарата гРУШРс. Шестнадцать пациентов получали единственную дозу препарата Α^VΑΤΕ® 25 или 65 МЕ/кг с последующим введением равной дозы гРУШРс. Большинство нежелательных явлений не были связаны с исследуемым препаратом. Ни у одного пациента в исследовании не появились антитела или ингибитры к гРУШРс. Среди применённых уровней доз, в сравнении с препаратом Α^VΑΤΕ®, гРУШРс показал 1,54 и 1,71-кратное продление ί1/2 элиминирования и значений среднего времени удержания, 1,49- и 1,56-кратное снижение клиренса и 1,49- и 1,56-кратное повышение общего системного воздействия. Α^VΑΤΕ® и гРУШРс обладали сравнимыми дозозависимыми пиковыми концентрациями в плазме и показателями восстановления. Время достижения уровня 1% активности РУШ, превышающего исходный уровень среди применённых уровней доз, было примерно в 1,53 и 1,68 раз дольше, чем для препарата Α^VΑΤΕ®. Таким образом, с препаратом гРУШРс может быть предложен приемлемый терапевтический подход для достижения пролонгированной гемостатической защиты и меньшая частота введения доз для пациентов с гемофилией А. гРУШРс является рекомбинантным белком слияния, состоящим из одиночной молекулы гРУШ с удалённым В-доменом, ковалентно связанным с Рс-доменом 1дО1 человека. Потенциальные выгоды Рс-белков слияния включают лучшую переносимость и пролонгированную гемостатическую защиту, а Рс-домен представляет собой природную молекулу, которой не свойственна известная токсичность. Оитой ί.Α. и др., ВюОгидк 20(3).151-60 (2006), Оитой ΙΑ. и др., "Мопотепс Рс Гикюп 1есЬпо1оду: ап арргоаск ίο сгеа1е 1опд-1акйпд с1оШпд Гайот," в книге: Койегтапп К., ей., Ткегареийс Рго1еЙ8 - 8ййед1е8 ίο Мойи1а1е На1ГЫГе, глава 11, Айеу УСН риЬШЬег; предварительная публикация онлайн, ОО1: 10.1002/ 9783527644827.ск10. Присоединение Рс-домена к молекуле 1дО1 позволяет сязываться с неонатальным Рс-рецептором (РсКп), который экспрессируется во многих типах клеток, включая эндотелиальные клетки. Экспрессия РсКп сохраняется на стабильном уровне в продолжение жизни и отвечает за защиту 1дО1 и Рс-белков слияния от лизосомальной деградации, таким образом пролонгируя ί1/2 данного белка. Оитой ί.Α. и др., ВюОгидк 20(3): 151-60 (2006), Коорейап О.С. и др., Ν;·ιΙ Кет 1ттипо1. 7(9):715-25 (БрнЬ 2007 Αιι§ 17). Многочисленные белки при циркуляции крови захватываются клетками, выстилающими сосудистое русло, посредством неспецифического пиноцитоза и перемещаются по путям эндосомальной и лизосомальной деградации.
Рс-белки взаимодействуют с рецепторами РсКп, расположенными в эндосомах. Эндосомы, содержащие РсКп, направляют Рс-белки слияния обратно к плазматической мембране, высвобождая в русло циркуляции крови рН-зависимым механизмом, Ьепсег Α.Ι. апй В1итЬегд К.8., Тгепйк Се11 Βίο1. 15(1):5-9 (2005), таким образом, белки избегают лизосомальной деградации. Это подход с использование рециркуляции был успешно использован для продления ί1/2 терапевтических биологических белков. Несколько лекарственных препаратов на основе Рс-белков слияния были одобрены для клинического использования (например, этанерцепт, ромиплостин), а другие находятся на этапе разработки. Ниапд С, Сигг Орт Βίο1ескпо1. 20(6):692-9. (БриЬ 2009 Νον 4), 8с1ийй1 8.К., Сигг Орт Огид ОЬсоу Эеге1. 720:284-295 (2009).
Доклинические данные исследования гРУШРс указывают, что РУШ может избежать деградации, таким образом, продлевая ΐ1/2 природным защитным механизмом, опосредованным РсКп. У мышей и собак с гемофилией А, значение конечного ί1/2 в плазме для гРУШРс было приблизительно в 2 раза больше, чем для гРУШ. Оитой ί. и др., В1оой. 116(21) Α^ϋηΛ 545 (2009), Ши Т. и йр., ί ТЬготЬ НаетокЕ 9(82):561 (2011). На основании этих данных можно утверждать, что изобретателями впервые на людях проведено клиническое исследование для изучения безопасности и РК белка слияния гРУШРс продолжительного действия у пациентов с гемофилией А.
План исследования
В этом открытом многоцентровом исследовании фаз 1/2а с повышением дозы на ранее лечившихся пациентах с серьёзной гемофилией А изучали безопасность препарата гРУШРс и его фармакокинетику (РК) по сравнению с препаратом Α^VΑΤΕ® (антигемофильный фактор [рекомбинантный], способ получения без плазмы и альбумина, октоког альфа, производитель Вах1ег НеаЪЬсаге). Это исследование выполнено в соответствии с требованиями Свода Федеральных законов США (И8 СРК) и руководств 1СН по надлежащей клинической практике. Перед проведением какого-либо испытания, были получены одобрения от принимающих участие экспертных советов организаций и письменные информированные согласия от всех субъекктов исследований. План исследования был последовательным. Введяли единственную дозу препарата Α^VΑΤΕ® в дозе 25 или 65 МЕ/кг с последующим введением равной дозы гРУШРс (фиг. 8). Оба лекарственных препарата вводили внутривенно в течение примерно 10 мин. Как ожидалось, два выбранных уровня доз охватывали охватывали обычный терапевтический диапазон доз. Субъекты исследования в течение 28 дней после получения гРУШРс проходили анализы на безопас- 54 029560
ность, включая тестирование на наличие антител и ингибиторов к РУШ на 14-й и 28-й дни после инъекции этого препарата. У пациентов измеряли активность РУШ плазмы перед инъекцией, 10 и 30 мин, 1, 3, 6, 9, 24, 48, 72, 96, 120 и 168 ч (7 дней) после инъекции гРУШРс с дополнительным отбором образцов через 192, 216 и 240 ч (10 дней) для пациентов, получивших дозу гРУШРс 65 МЕ/кг. Активность РУШ в плазме крови измерялась в те же временные точки после лечения Λ^УАΤΕ®, в течение 72 ч для группы, получившей дозу 25 МЕ/кг, и 96 ч для группы, получившей дозу 65 МЕ/кг.
(a) Субъекты исследования.
Пациенты-мужчины возрастом по меньшей мере 12 лет с серьёзной гемофилией А (определённой как уровень активности РУШ <1%) и имеющие документированное подтверждение по меньшей мере 100 дней предварительного воздействия препаратами РУШ (из плазмы - рбРУШ или рекомбинантного гРУШ). Были исключены пациенты, у которых известны проявления гиперчувствительности к белкам мыши или хомяка, в истории болезни были ингибиторы или определялись титры ингибиторов при отборе пациентов или, которые принимали лекарственные препараты, способные повлиять на гемостаз или системные иммуносупрессорные препараты или, которые переживают острую фазу бактериальной или вирусной инфекции (отличной от гепатита или ВИЧ) в течение 30 дней отбора. Генотип пациента, если был известен, записывали при приёме в исследование.
(b) Лекарственный препарат.
Трангсгенны, содержащие последовательности гРУШРс и Рс человека, были надёжно перенесены трансфекцией в клетки НЕК293 и полученная клеточная линия для обеспечения безопасности продукта интенсивно изучалась на стабильность, стерильность и вирусную контаминацию. Очищенный фармацевтический продукт состоит из мономерного белка РУШ с удалённым В-доменом, ковалентны связанный своим карбоксильным терминальным концом с Ν-терминальным концом Рс-мономера, который образует дисульфидную связь со вторым Рс-мономером во время синтеза и секреции белка из клетки. Белок гРУПГРс был очищен с помощью хроматографии и нанофильтрации и проявил полную активность в одностадийном и хромогенном анализах в отношении коммерчески доступных препаратов гРУШ. Препарат поставлялся в виде замороженной жидкости, содержащей 1000 МЕ в 2 мл раствора в составе с Ьгистидином (рН 7), хлоридом натрия, хлоридом кальция, сахарозой, манитом и полисорбатом 20. Перед введением препарат разбавлялся солевым раствором (0,9% №С1).
(c) Результирующие измерения.
Первоочерёдной целью этого исследования была безопасность, оцениваемая посредством медицинского осмотра, сообщения появившихся при лечении нежелательных явлений (НЯ), появления антител и мониторинга лабораторных показателей в течение определённого периода. Вторичные цели включали параметры, получаемые при анализах показателей фармакокинетики (РК). Лабораторные анализы оценивания включали определение времени конверсии протромбина, времени частичной активации тромбопластина (аРТТ), международного приведённого значения, уровней Ό-димера, антигена фактора фон Виллебранда (ννΤ), стандартные гематологические анализы и испытания химии крови, а также анализы мочи.
Активность РУШ была измерена одностадийным анализом образования сгустка (аРТТ) на анализаторе §1етеи8 ВС8-ХР с использованием коммерческих реактивов (Иа6е АсБп Р8Ь) с проведением калибровки по отношению к референтной плазме здорового человека (Ргейзюп Вю1од1е8 СКУОсЬеск™), сравниваемой с 5-м международным стандартным образцом 08) плазмы человека Всемирной организации здравохранения (ВОЗ). В дополнение анализу аРТТ, активность РУШ измеряли анализом с хромогенным субстратом Ко8еп 8., 8сап6 ί Наета1о1 8ирр1. 33(8ирр1 40): 139-45 (1984), используя коммерчески доступный набор (Атага ΒIОРНЕN РУШ:С), который соответствует рекомендациям Европейской Фармакопеи. Проведение хромогенного анализа калибровалось по сравнению с референтной плазмой здорового человека 0п81гитеп1аПоп ЬаЬога1опе8 ОККЕ45), для которой также была определена активность в отношении 5-го стандартного образца (Σ8) плазмы человека ВОЗ.
Нижний предел количественного определения (ЬЬОО) для одностадийного и хромогенного анализов составил, соответственно, 0,5 и 0,4 МЕ/дл. Ингибиторы РУШ определяли при Бетесда-тесте в модификации Неймегена и его результаты с содержанием менее 0,6 БЕ/мл считались негативными. Содержание антител к гРУШРс оценивали используя электрохемилюминисцентный иммунохимический анализ со специфическим связыванием, в котором использовали биотин и меченный сульфогруппами гРУШРс. Чувствительность анализа была определена равной 89 нг/мл с использованием в качестве заменителя контроля моноклональные антитела к РУШ человека. Диагностический анализ методом ротационной тромбоэластометрии цельной крови (ΚΟΤΕΜ®) был выполнен для двух пациентов, по одному на каждый уровень дозы, в разные временные точки для оценки улучшения общего гемостаза после введения препаратов А^УАΤΕ® и гРУШРс.
(6) Фармакокинентический анализ.
Выбираемая произвольно однокамерная модель распределения, которая автоматически оценивала уровень эндогенного РУШ и последующий остаточной кровень после выведения, была реализована программой νΕΝΝΟΝΌΓΝ® для анализа данных активности РУШ плазмы отдельного субъекта относитель- 55 029560
но времени, прошедшего после однократного введения препаратов АИУАТЕ® или гРУШРс. Для рачёта параметров, включающих максимальную активность (Стах), ί1/2, клиренс (СЬ), объём распределения в равновесном состоянии (УД, площадь под кривой (время нулевого значения экстраполированого до бесконечности [АиСЮТ]), среднее время удержания (МКТ) и восстановления показателей.
Моделирование методом Монте-Карло профиля активности гРУШРс во времени: Для построения профилей активность РУШ - время после применения режимов дозирования 25 и 65 МЕ/кг было проведено моделирование Монте-Карло с использованием РК модели этой популяции для препаратов АЭУАТЕ® и гРУШРс. На основе данных определения активности одностадийным анализом образования сгустка (аРТТ) при применении препаратов АИУАТЕ® и гРУШРс у 16 пациентов в этом исследовании фаз 1/2а были оценены средние показатели модельных параметров (СЬ, объём распределения) в изучаемой популяции, межиндивидуальная вариабельность и остаточная вариабельность. В моделировании были использовано пять сотен субъектов с 15 точками отбора образцов для каждого пациента и каждого режима дозирования. Был оценён процент популяции с активностью выше или равной 1 и 3% в разные моменты времени после разных режимов дозирования препаратов АИУАТЕ® и гРУШРс. Статистический анализ: Отдельные фармакокинетические (РК) параметры для препаратов гРУШРс и АИУАТЕ® сравнили с использованием модели дисперсионного анализа. Параметры РК были трансформированы в логарифмические значения для проведения этого анализа и оценивались средние значения, средние различия и доверительные интервалы в 1од-масштабе, которые были трансформированы для получения оценки средних геометрических значений, среднегеометрического соотношения (СМК) и доверительных интервалов, соответственно, в исходном масштабе. СМК является среднегеометрическим значением межиндивидуального соотношения значения РК параметра гРУШРс к значению РК параметра препарата АИУАТЕ®.
Результаты
Распределение субъектов исследования: В этом исследовании были привлечены девятнадцать пациентов. 16 пациентов прошли РК оценку для обоих препаратов АИУАТЕ® и гРУШРс. Один пациент самостоятельно ввёл себе ранее принимавшийся препарат перед завершением периода вымывания после получения дозы АИУАТЕ® и, поэтому, был исключён из РК анализа, но учитывался при анализе безопасности. Три пациента выбыли из этого исследования перед получением какого-либо исследуемого препарата: один доброволец выбыл; второй был удалён исследователем из-за несоответствия и один был удалён по просьбе спонсора из-за завершения регистрации в исследовании. Из всех получавших дозирование пациентов шесть пациентов получили 25 МЕ/кг и 10 пациентов получили 65 МЕ/кг обоих препаратов АИУАТЕ® и гРУШРс. Средний возраст пациентов был 40,3 года (23-61 лет). Данные генотипической идентификации были собраны для семи пациентов. Инверсия интрона 22 отмечена у шести пациентов, и дефект рамки считывания отмечен у одного пациента. Генотип был неизвестен у девяти пациентов. У тринадцати пациентов были антитела к гепатиту С, четверо из них также были ВИЧ-позитивными.
Безопасность
Подтверждено сорок четыре появившихся при лечении НЯ у 11 (69%) пациентов во время лечения и последующих периодов. Этот период включает день введения доз АИУАТЕ® или гРУШРс до 28 дня периода наблюдений после дозирования. Большинство событий были расценены как лёгкие, и ни один из них не привёл к отмене лечения. Один случай расстройства вкуса произошел, как транзиторный у одного пациента после получения дозы гРУШРс 65 МЕ/кг и был расценен связанным с препаратом гРУШРс. Один пациент пережил состояния беспокойства после получения 65 МЕ/кг гРУШРс, в результате у него было 21 НЯ, 19 из которых были определены как лёгкие и два из которых (головная боль и светобоязнь) как умеренные. Ни одно из них не было признано исследователем как относящееся к применению гРУПГРс. Не было сообщений о серьёзных эпизодах кровотечений. Не было обнаружено доказательств возникновения аллергических реакций в ответ на инъекцию препарата. Все протестированные образцы плазмы были негативными относительно содержания ингибиторов и антител к РУШ. Не наблюдалось местных реакций в месте инъекции. Не сообщалось о клинически значимых изменениях аномальных лабораторных значений.
Фармакокинетика
Корреляция между результатами определения активности гРУШРс в плазме аРТТ и хромогенным методами: Активность препаратов АИУАТЕ® и гРУШРс определяли такими же анализами с использованием коммерчески доступных реактивов и калибровки по отношению к стандартам плазмы здорового человека. Существовала сильная корреляция между результатами, полученными одностадийным анализом определения образования сгустка и хромогенным анализом в образцах, которые обладали активностью выше нижнего предела количественного определения (ЕЕОО). Коэффициенты корреляции (К2 Пирсона) 0,94 и 0,95 наблюдали между результатами обоих анализов, соответственно, для 151 образца после получения доз АИУАТЕ® и 185 образцов после получения доз гРУШРс. По сравнению с результатами анализа аРТТ результаты определения активности РУШ хромогенным анализом в среднем были на 21% больше для препарата АИУАТЕ® и на 32% больше для гРУШРс, но не были статистически значимыми (фиг. 9). Это наблюдение привело к слегка повышенной оценке параметров воздействия при оценке обо- 56 029560
их препаратов хромогенным анализом. Кажущиеся более высокие показатели восстановления активности РУШ, определённые хромогенным анализом являются обычными для рекомбинантных препаратов РУШ, испытываемых в клинических анализах и этот факт согласовывается с большинством других выпущенных на рынок препаратов. Ьее С.А. и др., ТЬготЬ Наето§1. 82(6):1644-7 (Бес. 1999), М1кае1§§оп М. апб О8\уакР§оп и., Зетт ТЬготЬ Нето§1. 28(3) :257-64 (1ипе 2002), 31гооЬап1§ А.К. и др., I ТЬготЬ Наето§1. 9 (Зирр1 2) (2011).
Улучшенная фармакокинетика препарата РУШРс: Результаты первичной оценки РК были получены из данных определения активности одностадийным (аРТТ) анализом образования сгустка. У пациентов, которые получали 25 или 65 МЕ/кг препарата АБУАТЕ® с последующим введением равных доз гРУШРс, происходил резкий рост активности РУШ в плазме и Стах достигалось в течение первого часа после дозирования. Последующее снижение наблюдаемой активности РУШ выявилось как моноэкспоненциальные характеристики снижения до достижения исходного уровня активности РУШ (фиг. 10А и 10В). Значение Стах возрастало пропорционально дозе, но было сравнимо между равными дозами препаратов АБУАТЕ® и гРУШРс (табл. 8). Показатель общего воздействия (АИСют) также возрос пропорционально дозе. Однако, АБСют для гРУШРс было в 1,48 и 1,56 раз больше, чем для препарата АБУАТЕ® при дозе 25 МЕ/кг (р=0,002) и 65 МЕ/кг (р<0,001), соответственно (табл. 8).
Таблица 8. РК параметры при одностадийном (аРТТ) анализе для гРУШРс и АБУАТЕ по группам дозирования
| Параметр | Доза: 25 МЕ/кг (N=6) | Доза: 65 МЕ/кг (N=9) | ||||
| АИУАТЕ1' Среднее геом. [95% ДИ] | гГУШГс Среднее геом. [95% ДИ] | Среднее геом. соотношение [95%ДИ](рзначение) | АИУАТЕ® Среднее геом. [95% ДИ] | гГУШГс Среднее геом. [95% ДИ] | Среднее геом. соотношение [95% ДИ] (рзначение) | |
| Стах_ОВЗ (МЕ/дл) | 63,6 [59,1; 68,3] | 60,5 [53,1; 69,0] | 0,952 [0,819; 1,11] 0,440 | 133 [105; 168] | 119 [ЮЗ; 136] | 0,895 [0,795; 1,01] (р = 0,061) |
| АиСпчг (час*МЕ/дл) | 994 [723; 1370] | 1480 [1160; 1880] | 1,48 [1,26; 1,76] (р = 0,002) | 1800 [1350; 2400] | 2800 [1980; 3970] | 1,56 [1,33; 1,83] (р < 0,001) |
| ΐι/2 (часов) | 12,2 [9,14; 16.31 | 18,8 [14,8; 23,8] | 1,54 [1,40; 1,69] (р< 0,001) | п,о [8,76; 13,9] | 18,8 [14,3; 24,5] | 1,70 [1,54; 1,89] (р< 0,001) |
| МКТ (часов) | 17,5 [13,1; 23,4] | 27,0 [21,3; 34,2] | 1,54 [1,40; 1,69] (р < 0,001) | 15,8 [12,6; 19,9] | 27,θ’ [20,6; 35,3] | 1,71 [1,54; 1,89] (р < 0,001) |
| СЬ (мл/час/кг) | 2,49 [1,80; 3,45] | 1,68 [1,31; 2,15] | 0,673 [0,569; 0,796] (р = 0,002) | 3,61 [2,71; 4,83] | 2,32 [1,64; 3,29] | 0,642 [0,547; 0,753] (р < 0,001) |
| У55 (мл/кг) | 43,9 [39,3; 49,0] | 45,4 [39,3; 52,5] | 1,04 [0,947; 1,13] (Р = 0,357) | 57,4 [48,3; 68,3] | 62,8 [55,2; 71,5] | 1,09 [0,976; 1,22] (р = 0,107) |
| Постепенное восстановление (МЕ/дл на МЕ/кг) | 2,56 [2,36; 2,78] | 2,44 [2,12; 2,81] | 0,952 [0,819; 1,11] (р = 0,444) | 2,04 [1,61; 2,59] | 1,83 [1,59; 2,Ю] | 0,894 [0,795; 1,01] (р = 0,060) |
ДИ - доверительный интервал; Среднее геом. - Среднее геометрическое; ОВЗ -наблюдаемое. Оценённые средние значения, 95% ДИ для средних значений и средние отличия были трансформировании для получения оценённых средних геометрических значений, 95% ДИ средних геометрических значений и среднегеометрических соотношений, соответственно.
Значения 11/2, МКТ, СЬ и У88 оказались независимыми от дозы (табл. 8). Среднее геометрическое 11/2 препарате гРУШРс составило 18,8 ч в обеих группах, получавших дозы 25 и 65 МЕ/кг. Это значение выявляет 1,54 и 1,70-кратное улучшение показателя, чем для препарата АБУАТЕ® (12,2 и 11,0 ч), соответственно, в эквивалентных дозах (р<0,001) (табл. 8). Такое же внутрисубъектное улучшение наблюдали для значений МКТ для гРУШРс (27,0 ч для обеих групп дозирования) по сравнению с АБУАТЕ® (17,5 ч для дозы 25 МЕ/кг и 15,8 ч для дозы 65 МЕ/кг) (р<0,001). Сопоставимым с улучшением показателей ΐ1/2 и МКТ было соответствующее 1,49 и 1,56-кратное уменьшение внутрисубъектного значения СЕ, соответственно, при дозах 25 МЕ/кг (р=0,002) и 65 МЕ/кг (р<0,001). Не было обнаружено статистически значимых отличий показателей У88 и постепенного восстановления параметров между препаратами АБУАТЕ® и гРУШРс. Поэтому у каждого пациента для препарата гРУШРс был продемонстрирован улучшенный РК-профиль по сравнению с АБУАТЕ®. Улучшенный РК-профиль гРУШРс привёл к возрастанию времени после получения дозы до снижения активности РУШ до 1%, которое было в 1,53 и 1,68 раз дольше, чем у препарата АБУАТЕ®, соответственно, при дозе 25 МЕ/кг (р<0,001) и 65 МЕ/кг (р<0,001)
- 57 029560
(данные не показаны), что предполагает потенциально большую терапевтическую длительность действия препарата гРУШРс. Благоприятный РК-профиль гРУШРс в отношении Α^УΑΤЕ® также был продемонстрирован по активности РУШ, измеренной хромогенным анализом (табл. 9), который был сравним с данными, полученными аРТТ анализом. Оценка воздействия, т.е. Стах аий АИС^, тем не менее была слегка выше для хромогенного анализа, чем для одностадийного анализа (аРТТ) образования сгустка для обоих препаратов Α^УΑΤЕ® и гРУШРс.
Таблица 9. РК параметры при двустадийном (хромогенном) анализе для гРУШРс и Α^УΑΤЕ® по группам дозирования
| Параметр | Доза: 25 МЕ/кг (N=6) | Доза: 65 МЕ/кг (N=9) | ||||
| АИУАТЕ® Среднее геом. [95% ДИ] | гРУШРс Среднее геом. [95% ДИ] | Среднее геом. соотношение [95% ДИ] (рзначение) | АИУАТЕ® Среднее геом. [95% ДИ] | гРУШРс Среднее геом. [95% ДИ] | Среднее геом. соотношение [95% ДИ] (рзначение) | |
| Сщах_ОВ 8 (МЕ/дл) | 75,5 [65,5; 87,1] | 76,5 [64,9; 90,1] | 1,01 [0,940; 1,09] (р = 0,686) | 175 [143; 215] | 182 [146; 227] | 1,04 [0,900; 1,20] (Р = 0,571) |
| АиСичр (час*МЕ/дл) | 1060 [822; 1360] | 1660 [1300; 2120] | 1,57 [1,38; 1,80] (р < 0,001) | 2270 [1670; 3070] | 4280 [2960; 6190] | 1,89 [1,61; 2,21] (р < 0,001) |
| ΐΐ/г (час) | 10,5 [8,49; 12,9] | 16,7 [13,8; 20,1] | 1,59 [1,35; 1,87] (р< 0,001) | 10,8 [8,16; 14,2] | 19,8 [14,3; 27,5] | 1,84 [1,60; 2,12] (р< 0,001) |
| МКТ (часов) | 15,0 [12,2; 18,6] | 23,9 [19,8; 28,9] | 1,59 [1,35; 1,87] (р < 0,001) | 15,4 [П,7; 20,4] | 28,5 [20,5; 39,6] | 1,85 [1,61; 2,12] (р < 0,001) |
| СЬ (мл/час/кг) | 2,35 [1,80; 3,06] | 1,49 [1,16; 1,92] | 0,636 [0,557; 0,727] (р < 0,001) | 2,87 [2,12; 3,89] | 1,52 [1,05; 2,20] | 0,530 [0,453; 0,620] (р < 0,001) |
| У85 (мл/кг) | 35,5 [30,5; 41,3] | 35,9 [30,4; 42,3] | 1,01 [0,898; 1,14] (р = 0,822) | 44,5 [36,7; 54,1] | 43,4 [38,2; 49,4] | 0,975 [0,863; 1,Ю] (р = 0,653) |
| Постепенное восстановление (МЕ/дл на МЕ/кг) | 3,05 [2,62; 3,54] | 3,09 [2,61; 3,66] | 1,01 [0,940; 1,09] (р = 0,679) | 2,70 [2,20; 3,31] | 2,80 [2,24; 3,50] | 1,04 [0,900; 1,20] (Р = 0,571) |
ДИ - доверительный интервал; Среднее геом. - Среднее геометрическое; ОВЗ -наблюдаемое. Оценённые средние значения, 95% ДИ для средних значений и средние отличия были трансформированы для получения оценённых средних геометрических значений, 95% ДИ средних геометрических значений и среднегеометрических соотношений, соответственно.
Корреляция между фактором фон Виллебранда и распределением гРУШРс: В связи с тем, что большинство молекул РУШ находятся циркуляции в комплексе с У^Р, ЬеиНид Р.1. и др.,1 'ГйготЬ НаетокЕ 5: 1353-60 (2007) и из-за того, что в ходе связанного с определением полного генома исследовании определены генетические детерминанты уровней РУШ, которые изначально независимы от уровней У^Р, Втйй Ν.Κ и др., СксиЫюи 121:1382-1392 (2010), изобретателями обнаружена связь между концентрациями У^Р и гРУШРс. Сильная корреляция наблюдалась между концентрацией У^Р и значениями СЬ и 11/2 для обоих препаратов гРУШРс и Α^УΑΤЕ®. Как показано на фиг. 11А аий 11В, как только увеличивалось содержание У^Р, так сразу происходило снижение значения СЬ гРУШРс (р=0,0016) и Α^УΑΤЕ® (р=0,0012). Противоположное взаимодействие наблюдали между концентрацией У^Р и 11/2. Как только увеличивалось содержание У^Р, так сразу происходило возрастание значения ίι/2. гРУШРс (р=0,0003) и Α^УΑΤЕ® (р<0,0001). Эта корреляция указывает, что функциональная группа гРУШРс не изменяет роли У^Р в защите РУШ от клиренса. Влияние пролонгированной РК препарата гРУШРс на цельную кровь при определении методом ΚОΤЕМ®: Перед введением исследуемого препарата к пробе крови пациента из каждой группы дозирования добавили равные дозы гРУШРс или Α^УΑΤЕ® и эти пробы проанализировали методом ΚОΤЕМ® для цельной крови. Время образования сгустка (СТ) было линейным в отношении дозы препаратов гРУШРс и Α^УΑΤЕ® в диапазоне приблизительно 1-100% от нормы. И у одного и того же пациента этот эффект дозы был сравним у обоих препаратов гРУШРс и Α^УΑΤЕ® (данные не показаны), что указывает на сравнимую активность гРУШРс и Α^УΑΤЕ® для формирования сгустка.
Несмотря на варьирование исходных значений СТ из-за остаточных уровней активности РУШ перед введением доз Α^УΑΤЕ® или гРУШРс, оба препарата эффективно корректировали СТ до получения сравнимых значений через 30 мин после инъекций (см. фиг. 12А и 12В). Лучшие значения СТ через 3 ч
- 58 029560
после получения дозы 25 МЕ/кг (фиг. 12А) и после 24 ч получения дозы 65 МЕ/кг (фиг. 12В) дольше сохранялись для препарата гРУШРс, чем АОУАТЕ®.
Препарат гРУШРс хорошо переносился пациентами в обеих дозах. Не наблюдалось клинически значимых изменений показателей анализов гематологии, химии крови и мочи. Большинство НЯ были лёгкими, не связанными с гРУШРс, и проходили без последствий. Во время этого исследования не произошло серьёзных НЯ или гибели пациентов. И ни у одного пациента не появилось нейтрализующих или связывающих антител к белку гРУШРс.
Препарат гРУШРс продемонстрировал значительно улучшенный РК-профиль активности РУШ в отношении АОУАТЕ®, со значениями 11/2 и МКТ среди уровней доз в 1,54 и 1,71 раза дольше при измерении одностадийным анализом образования сгустка (аРТТ) и в 1,59 и 1,84 раза дольше при измерении двустадийным хромогенным анализом. Пролонгированная активность гРУШРс предполагает возможное продолжение эффективности, позволяя использовать менее частый режим дозирования в профилактическом лечении пациентов с гамофилией А.
Применение РК параметров, полученных в этом исследовании для моделирования Монте-Карло, показало, что у большего процента пациентов, принимавших гРУШРс, будут сохраняться уровни активности РУШ выше 1 и 3%, по сравнению с пациентами, принимавшими равные дозы препарата АОУАТЕ® (табл. 10). Например, было предсказано, что при введении дозы 25 МЕ/кг у 12,2% пациентов, лечившихся АОУАТЕ®, по сравнению с 71,2% пациентов, лечившихся гРУШРс, были минимальные концентрации РУШ более 1% на 4 день. А при введении дозы 65 МЕ/кг у 11,0% пациентов, лечившихся АОУАТЕ®, по сравнению с 66,4% пациентов, лечившихся гРУШРс, были найдены минимальные концентрации РУШ более 3% на 4 день. Планируется проведение клинических испытаний на большем количестве пациентов для подтверждения результатов исследования фаз 1/2а и расчётов моделирования Монте-Карло.
Таблица 10. Предсказанный процент пациентов, достигающих минимальных уровней более 1 и 3% от нормальной активности в определённом режиме дозироавния прапаратов АОУАТЕ® или гРУШРс
| Временные точки после дозирования (Суток) | АОУАТЕ® | гРУШРс | ||
| 25 МЕ/кг | 65 МЕ/кг | 25 МЕ/кг | 65 МЕ/кг | |
| Процент пациентов с минимальными уровнями РУШ более 1% | ||||
| 3 | 40,0 | 67,8 | 92,6 | 99,0 |
| 4 | 12,2 | 31,0 | 71,2 | 90,0 |
| 5 | 4,20 | 13,6 | 39,4 | 71,6 |
| 7 | 0,200 | 1,40 | 7,80 | 26,4 |
| Процент пациентов с минимальными уровнями РУШ более 3% | ||||
| 3 | 10,6 | 34,6 | 62,2 | 91,0 |
| 4 | 1,60 | п,о | 25,4 | 66,4 |
| 5 | 0,200 | 3,20 | 7,00 | 36,2 |
| 7 | 0 | 0,200 | 0,400 | 6,60 |
При определении коагуляции т уДго не продемонстрировано потери удельной активности гРУШРс, по сравнению с РУШ с удалённым В-доменом или природным РУШ, и анализом образования сгустка и хромогенным анализом с использованием коммерчески доступных реактивов и обычно используемых референтных стандартов РУШ (Оитоп1 и др., В1ооб (2012), предварительная публикация онлайн ПОР 10.1182/Ь1ооб-2011-08-367813). Кроме того, эти результаты указывают на то, что препарат гРУШРс может быть надёжно количественно определяем в клинической лаборатории одностадийным анализом или хромогенным анализом.
В заключение следует отметить, что в этом клиническом исследовании фаз 1/2а продемонстрирована безопасность и пролонгированный период 11/2 препарата гРУШРс у пациентов с серьёзной формой гемофилии А. Продолжается основное исследование препарата гРУШРс фазы 3 для определения эффективных профилактических режимов дозирования для больных гемофилией А.
Пример 10. Фармакокинетика и эффективность препарата гРУШРс на моделях мышей и собак с гемофилией А.
Была проведена оценка фармакокинетики и эффективности препарата гРУШРс по сравнению с гРУШ на моделях мышей и собак с гемофилией А, в целях подтверждения исследований на человеке. гРУШРс представляет собой гетеродимерный белок с единственным РУШ с удалённым В-доменом (УВД), рекомбинантно связанный с Рс-доменом человеческого иммуноглобулина С1 ЩдС1). Обычные димерные Рс-слияния, создаваемые путём соединения мономерного эффекторного белка с мономером Рс и дальнейшим соединением через дисульфидную связь с образованием димера, были неэффективны для больших белков коагуляции, таких как РУШ. Поэтому мы разработали методы создания новых конст- 59 029560
рукций Рс-белков слияния, в которых одна (мономерная) эффекторная молекула присоединяется к Рс (Эитоп) !А., и др., ВюОгидк 20(3):151-60 (2006)), (Όитоги !А., и др., 1оигпа1 оГ аегоко1 тебюте. 18(3):294-303 (2005)), (Вйопй, и др., Ргос Νίθ1 Асаб δοΐ И.8.А. 101(26):9763-9768 (2004)). Этот подход применён изобретателями для ряда белков, включая гР1Х человека (Ре1ег8, К.Т., и др., В1ооб. 115(10):2057-2064 (2010)), гРУ11а (8а1ак, ί, и др., ί ТйготЬ НаетокЕ 9(52):О-ТИ-026. бог 10.1111/).15387836.2011.04380 2.x (2011)), и белка гРУШ с УВД (ΈΌΌ гРУШ). Материалы и методы
Рекомбинантный белок слияния РУШ-Рс (гРУШРс): Плазмида экспрессии рВЬОСЕ4.1 (1пу11годеп) белка гРУШРс, содержала две кассеты экспрессии. Одна кассета экспрессии находилась под контролем промотора СМУ, за сигнальной последовательностью природного РУШ человека следовал фрагмент РУШ УВД (слияние положений 8743-ф1638) непосредственно связанный с Рс-участком 1дС1 человека (аминокислоты от Ό221 до К457, нумерация ЕЙ) без промежуточной последовательности. В другой кассете использован промотор ЕР1а для экспрессии только одного Рс-участка с гетерологичной сигнальной последовательностью 1дКВ мыши. Эмбриональные клетки почки человека линии 293 (НЕК293Н, ΙηνίΙΐΌдеп) были трансфецированы этой плазмидой и была получена стабильно клонирующаяся суспензионнная клеточная линия, которая экспрессировала белок гРУШРс. Белок гРУШРс очистили от разработанной среды накопления для культуры клеток с использованием процесса очистки на трёх колонках, включающем стадию аффинной очистки, специфической для РУШ (МсСие ί. и др., ί. СйготаФдг. А., 1216(45): 7824-30 (2009)), с последующей комбинацией хроматографической очистки на анионобменных колонках и колонках гидрофобного взаимодействия.
Рекомбинантный белок РУШ (гРУШ): Рекомбинантные препараты РУШ УВД (КЕРАСТО® апб ХУХТНА®) и полноразмерным РУШ (АЭУАТЕ®) были приобретены в компании №у® Рйагтасеийсай (М1ат1, РЬ) и приготовлены в соответствии с инструкциями производителей.
Животные: мыши с гемофилией А (НетА), несущие нокаут экзона 16 гена РУШ на фоне 129хВ6 были получены у д-ра X. Казазияна в Университете штата Пеньсильвания (В1, Ь., и др., ΝηΙ Сепе). 10(1):119-121 (1995)) и выращены в лаборатории Вюдеп 1бес изучения гемофилии. Трансгенные мыши с нокаутом мышинного гена РсКп (РсКп КО) и геном РсКп человека были получены из мышей линии С57ВЙ/61 у д-ра Дэрри Рупениана в лаборатории йюАоп в г. Бар Харбор, штат Мэн, США. Генотипы мышей РсКп КО являются такими тРсКп (-/-) и т$2т (-/-), а мышей Тд32В - тРсКп (-/-), т$2т (-/-), йРсКп (+/+) и й$2т (+/+). Мыши С57ВЬ приобретены в лаборатории 1асккоп (г. Бар Харбор, штат Мэн). Все виды деятельности, связанные с животными, одобрены требованиям Институциональными Комитетами по уходу за животными и их использованию и выполнялись согласно "Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных".
Собаки с гемофилией А были получены из инбредной колонии, поддерживаемой в лаборатории исследования крови Фрэнсиса Авена (Ргапак О\уеп В1ооб Кекеагсй йаЬогаЮгу) в Университете штата Северная Каролина, г. Чапел Хил. Эти собаки были поражены серьёзной формой гемофилии с фенотипом, сравнимым с серьёзной формой человеческого заболевания (Сгайат, ЕВ. апб Виск^аЙег, РА., и др., Тйе .Гоита1 оГ Ехр. Меб. 90(2):97-111 (1949)), (Ео/аег ΙΝ., и др., Ргос Асаб 8с И.8.А. 99(20): 12991-12996
(2002)).
Фармакокинентические (РК) исследования на мышах: РК показатели препаратов гРУШРс и гРУШ (ХУЭТНА®) оценивали на мышах с НетА С57ВЙ/6, РсКп КО и Тд32В после внутривенного введения доз 125 МЕ/кг. Кровь собирали из полой вены в одну десятую объёма 4% цитрата натрия через 5 мин и 4, 8, 16, 24, 32, 48, 54 и 72 ч после дозирования препарата гРУШРс и через 5 мин и 1, 4, 8, 16, 20, 24, 32 и 48 ч после дозирования препарата гРУШ (4 мыши/временная точка/лечение). Плазма быстро замораживалась в бане из этанола/сухого льда и хранилась при -80°С до выполнения анализа активности РУШ с использованием специфического для РУШ человека хромогенного анализа (набор РУШ С'оаЮЧ 8Р от компании О1аРйагта |Ае5) Сйе81ег, ОН]). Фармакокинетические параметры оценивали некомпартментным моделированием с применением программы АШХОЖШ® версия 5.2 (РйагчдйЕ МоиШат У1е№, СА).
Исследования эффективности на мышах с НетА: Все исследования эффективности выполнялись вслепую. Эффективность препарата для острого случая кровотечения изучалась на модели кровотечения надрезания хвоста. Самцы мышей с НетА (8-12 недельного возраста) анестезировали смесью препаратов 50 мг/кг кетамина и 0,5 мг/кг дексмедетомидина. Потом хвосты погружали в солевой раствор при 37°С в течение 10 мин для расслабления боковой вены с последующим введением в вену препаратов гРУШРс, гРУШ (АЭУАТЕ®) или плацебо. Через пять минут отрезался 1 см от края хвоста, и вытекающая кровь собиралась в 13 мл тёплого солевого раствора в течение 30 мин. Кровопотеря количественно измерялась гравиметрически.
Профилактическую эффективность изучали в модели кровотечения методом рассечения хвостовой вены (РХВ), как описано ранее (Рап, ί. апб Шт, ΕΥ., В1ооб. 114(13):2802-2811 (2009)), за исключением того, что мыши с НетА получали однократное введение 12 МЕ/кг гРУШРс, гРУШ (АЭУАТЕ®) или плацебо за 24 или 48 ч до рассечения боковой хвостовой вены. Доза в 12 МЕ/кг была определена в предыдущем эксперименте измерения эффективности дозы гРУШ, в котором при 12 МЕ/кг достигалось 50% защита мышей с НетА при повреждении РХВ, причинённом через 24 ч после дозирования (данные не
- 60 029560
показаны).
Исследования на собаках с НетА: При РК/РЭ исследовании однократного дозирования гРУШРс две собаки с врождённой гемофилией А (М10 и М11) получали внутривенные дозы препарата 125 МЕ/кг. Образцы крови собирали до дозирования и после дозирования препарата через 5 и 30 мин и 1, 2, 4, 8, 24, 32, 48, 72, 96, 144 и 168 ч для определения времени сворачивания цельной крови (ХУБСТ). Отборы крови для определения активности РУШ (аРТТ и хромогенный анализы), наличия антигенов к гРУШРсЩЬКА), гематологические испытаний и показателей химии крови, включали временные точки, указанные выше для анализа УЕСТ, а также через 15 мин и 3, 6 и 12 ч после введения дозы.
В следующем исследовании последовательного применения препарат гРУШ (КВРАСТО®) вводили внутривенно в дозе 114 МЕ/кг собаке М12 и 120 МЕ/кг собаке М38. Показатель ХУбСТ измеряли до тех пор, пока время свёртывания не стало >20 мин (это время соответствовало содержанию РУШ:С <1%), и также отбирали образцы в указаных временных точках для определения активности РУШ (аРТТ и хромогенный анализы), наличия антигенов к гРУШРсЩЬКА) и гематологических испытаний. Потом этим же собакам внутривенно вводили 125 МЕ/кг гРУШРс и образцы крови отбирали для проведения анализов УбСТ, аРТТ, ΕυδΆ, определения показателей гематологии и химии сыворотки крови. Временные точки для анализа УЕСТ включали момент до дозирования и через 5 и 30 мин и 1, 2, 4, 8, 24, 32, 48 и 72 ч после дозирования препаратов гРУШ и гРУШРс. Кровь также отбирали через 96, 120, 144 и 168 ч после дозирования гРУШРс. Отборы крови для определения активности РУШ и наличия антигенов, включали временные точки, указанные выше для анализа XУЕСΤ. а также через 15 мин и 3, 6 и 12 ч после введения дозы. Анализы XУЕСΤ и аРТТ выполнялись как указано выше (Не^д, и др., Νΐ Меб. 5(1):56-63 (1999)).
Определение активности РУШ хромогенным анализом: Активность РУШ в плазме собак с гемофилией А анализировали автоматизированным хромогенным анализом на приборе δу8теx СА1500 ^уятех, ΙΚ) с реактивами компании δ^етеη8 НеаЬЬсаге □(адгюяЕся (Па11а8, ТХ). Стандартная кривая строилась с помощью концентрата 7-го международного стандарта РУШ (NIΒδС тобе 99/678), добавленного в плазму человека с удалённым РУШ (δΙί·ΐ£Ο„ ИЬА) в концентрациях в пределах 1,5-0,016 МЕ/мл. Активность РУШ в плазме мышей измеряли с помощью набора для количественного определения РУШ Сοаΐе8ΐ δΡ компании СЬ^οтοдеη^x (ЭхаРЬагта, ЕехтдЮгг МА), согласно инструкций изготовителя. Стандартную кривую строили с использованием серийных разведений гРУШРс или гРУШ с концентрацией от 100 мЕ/мл до 0,78 мЕ/мл в буферном растворе, содержащем необработанную плазму мышей с гемофилией А. Для измерения активности РУШ человека в плазме мышей С57Β^/6, РсКп КО и Τд32Β введённые в плазму мышей препараты гРУШРс или гРУШ сначала связывали моноклональными антителами специфическими к РУШ человека тАЬ ОМА8016 (Огееп Мοиηίа^η Αηΐ^Ьοб^е8, УТ) с последующим проведением стандартного анализа с набором Сοаΐе8ΐ.
Определение методом Ε^IδΑ антигенов, специфичных к белкам гРУШ и гРУШР: Уровни содержания антигенов к гРУШ и гРУШРс в плазме собак с геиофилией А измеряли методом иммуноферментного анализа (ЕЕКА) согласно стандартного протокола методики. Как антитела связывания использовали моноклональные антитела, специфичные к А1-домену РУШ, тАЬ ОМА-8002 (Огееп Мοиηίа^η Αηΐ^Ьοб^е8, Βи^1^ηдΐοη, УТ). Для обнаружения гРУШ были использованы поликлональные антитела Р8С-ΕIΑ-^ против РУШ, коньюгированные с пероксидазой хрена (НКР) (АГПпНу Β^ο1οд^са18). Для обнаружения гРУПГРс были использованы коньюгированные с НКР антитела осла против фрагмента (Р(аЬ)'2) человека 709036-098 (ΕκΕδΟπ Iттиηο1οд^са18).
δΡК анализ взаимодействия молекул гРУШРс-РсКп: Эксперименты по поверхностному плазмонному резонансу были выполнены на приборе Βί;κοΐΌ Т100. Сенсорные чипы СМ5 исследовательского уровня, буфферные растворыи реактивы для иммобилизаии были приобретены в компании Βί;κοΐΌ (ΟΕ НеаШсаге, Р18са1а№ау, Νί). Препараты одноцепочечных рецепторов РсКп мыши, собаки и человека были иммобилизированы стандартным аминным связыванием с соседними проточными ячейками одного чипа с плотностью приблизительно 370 резонансных единиц (РЕ) с последующим блокированием этаноламином. Ассоциацию в равновесном состоянии Рс-содержащих аналитов (РУШРс и ЩО) с иммобилизованными молекулами РсКп разных видов оценивали последовательным введением аналитов в 16 концентрациях (0,0625-2000 нМ) при рН 6,0 в проточном буфере (50 мМ МΕδ [4-морфолинэтансульфоновой кислоты], 250 мМ хлорида натрия, 2 мМ хлорида кальция, 0,01% Твин 20 [монолаурат полиэтиленгликольсорбитана]). Каждый цикл измерений выполнялся дважды и включал 45 мин фазы ассоциации и 15 мин фазы диссоциации, обе при скорости потока 5 мкл/мин, с последующей регенерацией двумя инъекциями 1М раствора Трис-НС1 при 25 мкл/мин. После двойного вычитания исходных уровней (пустая проточная ячейка и чистый проточный буфер) отклики связывания записывали вблизи завершения фазы ассоциации и откладывали на графике как функцию концентрации аналита от значений эффективной концентрации 50% (ЭК50) (50% Ктах), сопоставляемые путём анализа данных построением нелинейной регрессии.
Статистический анализ: в программе ОгарЬРаб Рп8т 5 (ОгарЬ-Раб δοΓΐγ-аге Шс., Ьа .011¾ СА) были выполнены: !-тест для одной выборки, тест Манна-Уитни, тест Краскела-Уоллиса с преобразованием Данна, построение кривых выживаемости и логрангового теста. Двустороннее Р-значение было менее 0,05, что считается статистически значимым.
- 61 029560
Результаты
Рекомбинантный белок связывания РУШ Рс (гРУШРс): гРУШРс является рекомбинантным белком связывания РУШ человека с удалённым В-доменом с Рс-частью 1дО1 человека без промежуточной линкерной последовательности (фиг. 14), который получен в хорошо охарактеризованной линии клеток НЕК293Н. Белок гРУШРс протеолитически расщепляется внутри клетки с образованием тяжёлой цепи размером ~90 кДа и лёгкой цепи-Рс ~130 кДа, которые нековалентно связаны между собой посредством металл-ионных взаимодействий, опосредованных доменами А1 и А3 молекулы РУШ. Средняя удельная активность гРУШРс четырнадцати отдельных серий составила 8460±699 МЕ/мг при определении одностадийным анализом образования сгустка (аРТТ) и 9348±1353 МЕ/кг при определении хромогенным анализом, что соответствует значениям 1861+154 и 2057±298 МЕ/нмоль. Удельная активность гРУШРс является сравнимой с такой дикого типа РУШ плазмы человека (1429 МЕ/нмоль) (ВШепаз, 8. апб Мапп, К.О., ВюсРеш1з1гу (Мозс). 67(1)3-12 (2002)). Таким образом, РУШ-активность белка гРУШРс не изменилось при слиянии С-терминального конца молекулы РУШ человека с Ν-терминальным концом Рс человека и результаты, полученные аРТТ и хромогенным анализом, находились в пределах один от другого примерно 10%.
Связывание гРУШРс с РсКп. Методом поверхностного плазмонного резонанса оценивали аффинность белка гРУШРс с одноцепочечными рецепторами РсКп мыши, собаки и человека. Скорости ассоциации и диссоциации комплекса гРУШРс и РсКп мыши были намного меньше, чем такие скорости для РсКп собаки и человека. Степень полумаксимального связывания (ЭК50) гРУШРс и РсКп человека была приблизительно в 4 раза слабее, чем для РсКп собаки и более чем в 20 раз меньше чем с РсКп мыши (табл. 11). Сходным образом, 1дО1 человека также выявил наибольшую аффинность с РсКп мыши, тогда как аффинность связывания с РсКп собаки была меньше по сравнению с РсКп мыши, но больше по сравнению с РсКп человека (табл. 11).
Таблица 11. Результаты поверхностного плазмонного резонанса связывания РсКп мыши, собаки и человека с гРУШРс и 1дО1 человека
| Образец Рс* | РсКп | Плотность РсКп (РЕ) | ЭК50 (нМ)т | Ктах (РЕ) |
| гРУШРс | мыши | 370 | < 1,5 : | 581,4 |
| гРУШРс | собаки | 367 | 8,6 | 499,3 |
| гРУШРс | человека | 369 | 33,4 | 365,4 |
| 1дО1 человека | мыши | 378 | < 22,4 : | 320,0 |
| 1дСг1 человека | собаки | 367 | 196,3 | 282,2 |
| 1дСг1 человека | человека | 378 | 558,4 | 211,0 |
гРУШРс или 1дО1 вводили в проточную ячейку, в которой различные молекулы РсКп были химически коньюгированы в приблизительно равных плотностях (~370 РЕ).
|ЭК50 значения (50% Ктах) являлись средними значениями, полученными при регресионном анализе кривых отклика связывания подобранных для 16 концентраций аналитов (0,0625-2000 нМ) двух повторностей.
Шз-за высокой аффиности кривые связывания при низких концентрациях не достигли равновесия при нормальных условиях эксплуатации прибора.
РсКп зависимое улучшение фармакокинетики гРУШРс у мышей.
Взаимодействие Рс с РсКп рассматривается как основной механизм продления периода полувыведения 1дО и Рс-белков слияния. Для подтверждения того, что этот механизм действия также отвечает за продления периода полувыведения гРУШРс, мы сравнили фармакокинетические (РК) профили гРУШРс с профилями тРУШ у мышей с дефицитом РУШ (НетА) (фиг. 15А), здоровых мышей (С57ВЬ/6) (фиг. 15В), мышей с дефицитом РсКп (РсКп КО) (фиг. 15С) и трансгенных мышей с РсКп человека (фиг. 15Ώ) после однократного внутривенного введения дозы препарата 125 МЕ/кг.
РК параметры (табл. 12) определены хромогенным измерением активности РУШ человека в плазме мышей. Период ί1/2 для гРУШРс был в 1,8-2,2 раза больше, чем для тРУШ у мышей с НетА (13,7 против 7,6 ч) и здоровых мышей (9,6 против 4,3 ч). Увеличение р/2 для гРУШРс по отношению к тРУШ отсутствовало у мышей РсКп КО (6,4 против 6,9 ч) и наблюдалось у трансгенных мышей Тд32В с РсКп человека (9,6 против 4,1 ч). Таким образом, эти результаты подтверждают, что взаимодействие гРУШРс с рецептором РсКп, обуславливает продление ί1/2 препарата. Более того, согласованность с улучшением значения Ϊ1/2 гРУШРс также отмечена в 1,6-2,4-кратном увеличении МКТ и 1,2-1,8-кратном увеличении системного воздействия (АиС) по сравнению с препаратом тРУШ у мышей экспрессирующих РсКп (НетА, С57В1/6 и Тд32В), но не у мышей РсКп КО.
Таблица 12. Сводка РК параметров для препаратов гРУШРс и тРУШ для разных линий мышей
- 62 029560
| Линия мышей | НетА1 | С57ВЬ/б1 | РсКп КО1 | Трансгенная линия ЬРсКп (Т§32В)1 | ||||
| гРУШРс * | гРУШ* | гРУШРс* | гРУШ* | гРУШРс* | гРУШ* | гРУШРс* | гРУШ* | |
| Стах (мМЕ/мл) | 2613,6 | 2710,4 | 2356,2 | 2000,1 | 2734,9 | 2458,4 | 3135,3 | 3137,0 |
| Период полувыведения (часов) | 13,7 | 7,6 | 9,6 | 4,3 | 6,4 | 6,9 | 9,6 | 4,1 |
| МКТ (часов) | 17,6 | п,о | 9,8 | 5,4 | 6,3 | 8,5 | 12,8 | 5,4 |
| У88 (мл/кг) | 68,2 | 49,2 | 67,5 | 50,8 | 49,3 | 51,6 | 64,1 | 49,6 |
| СЬ (мл/час/кг) | 3,9 | 4,5 | 6,9 | 9,3 | 7,8 | 6,1 | 4,1 | 7,3 |
| лис (час*мМЕ/м л) | 32332,4 | 28026,8 | 18089,1 | 13404,0 | 16087,2 | 20609,3 | 30534,5 | 17165,7 |
Стах: максимальная активность РУШ в плазме после инфузии; МКТ: среднее время удержания; Узз: объём распределения в равновесном состоянии; СР: клиренс; АиС: площадь под кривой.
фРК параметры препаратов гРУШ и гРУШРс сравнивались только среди той же линии мышей, но не между линиями, так как одна и та же молекула может показать различные значения ΐ1/2 в разных линиях мышей.
* Оценка РК каждой молекулы использовалась в группе из 36 мышей, образцы отбирали путём создания кровотечения хвостовой полой вены для 4 мышей каждой из 9 временных точек. Средние значения группы в каждой временной точке использовали в некомпартментном моделировании в программе ΑΙΝΝΟΝΡΙΝ Α для получения оценочных параметров.
гРУШРс является полностью активным препаратом для лечения острых случаев кровотечений у мышей с НетА: Для оценки эффективности препарата гРУШРс для острого случая кровотечения в сравнении с гРУШ мыши с НетА (16-20 мышей/группа) были обработаны повышающими дозами препаратов (24, 72 и 216 МЕ/кг) гРУШРс или гРУШ и им нанесли повреждения надрезанием хвоста через 5 мин после введения доз. По сравнению с мышами, получившими плацебо (п=18), у которых медиана кровопотери составила 1 мл, получение обоих препаратов гРУШРс и гРУШ привело к статистически значимому повышению защиты (Р<0,05, тест Краскал-Уоллиса в обработке Данна) (фиг. 16). Медиана кровопотери с возрастанием доз постепенно снижалась, достигая максимального снижения в 0,23 мл при дозе 72 МЕ/кг гРУШРс и 0,20 мл при при дозе 216 МЕ/кг гРУШ. В общем, кровопотери были сравнимы у животных принявших равные дозы гРУШРс или гРУШ, что указывает на то, что оба препарата обладают сравнимой активностью для предотвращения острого артериального кровотечения. Пролонгированная профилактическая эффективность препарата гРУШРс для мышей с НетА: Для определения того, может ли пролонгирование РК параметров привести к пролонгации защиты от повреждений, мы сравнили профилактическую эффективность препаратов гРУШРс и гРУШ на мышах с НетА. Через двадцать четыре часа после внутривенного введения дозы 12 МЕ/кг прводилось рассечение одной боковой вены хвоста мышей с НетА. После нанесения повреждения выжило 49% (п=39) мышей, получивших препарат гРУШ, по сравнению с 100% (п=19) выживших мышей, получивших препарат гРУШРс, логранговый тест) (фиг. 17А). Для дальнейшей демонстрации того, что гРУШРс дольше сохраняет длительную эффективности, мышам с НетА нанесли повреждения через 48 ч после введения дозы 12 МЕ/кг гРУШРс. Тем не менее, 58% (п=40) мышей, получивших препарат гРУШРс выжили, что сходно с результатом для мышей, получивших препарат гРУШ (49%) после 24 ч введения дозы (фиг. 17А). Результаты лечения как препаратом гРУШРс, так и препаратом гРУШ было значительно лучше, чем для контрольной группы, получившей плацебо (п=30), в которой только 3% мышей выжили после повреждения (Р<0,0001) (фиг. 17А). Улучшение и пролонгирование профилактичесокй эффективности гРУШРс также очевидно при измерении случаев повторных кровотечений посте нанесения повреждения (фиг. 17В). В то время как 100% мышей, получивших плацебо, пережили повторные кровотечения в течение 10 ч после рассечения хвостовой вены, 87% мышей, получивших гРУШ, и 47% мышей, получивших гРУШРс, пережили повторные кровотечения после повреждения, причинённого через 24 ч после дозирования препаратов, соответственно (Р=0,002, гРУШРс в сравнении с гРУШ) (фиг. 17В). Профиль повторного кровотечения для мышей, получивших гРУШРс и травмированных через 48 ч, в значительной степени сравнимый с профилем мышей, получивших гРУШ и травмированных через 24 ч после получения препарата. В противоположность этому, оба профиля выживания и повторных кровотечений для мышей, получивших гРУШ и травмированных через 48 ч, являются неразличимыми от профиля для группы, получившей плацебо (данные не показаны). Поэтому эти результаты показывают, что гРУШРс защищает мышей с НетА от повреждения хвостовой вены в два раза дольше, чем такая защита от такой же дозы препарата гРУШ.
Улучшенные показатели РК/РЭ у собак с гемофилией А: Показатели РК и фармакодинамики (РЭ) для препарата гРУШРс также изучались на собаках с гемофилией А. После внутривенного введения дозы
- 63 029560
125 МЕ/кг гРУШРс показатель АВСТ немедленно возвращался к норме, которая у здоровых собак находится в пределах 8-12 мин (фиг. 18А и В). Значение АВСТ сохранялось на уровне менее 20 мин, что указывает на активность РУШ >1%, в течение примерно 4 суток у 3 из 4 собак, получивших препарат гРУП1Рс, и 3 дня у оставшейся собаки (фиг. 18А). У собаки М12, получившей 114 МЕ/кг гРУШ, и собаки М38, получившей 120 МЕ/кг гРУШ, АВСТ было также скорректировано до нормального значения незамедлительно после дозирования. Однако значение АВСТ сохранялось на уровне менее 20 мин в течение 2 суток у М12 и 3 суток у М38, что приблизительно в 1,5-2 раза меньше, чем период, достигнутый при применении препарата гРУШРс (фиг. 18В). Более того, лечение как препаратом гРУШРс, так и препаратом гРУШ также сходным образом улучшило время свёртывания в анализе аРТТ через 5 мин после дозирования.
РК появления антигена гРУШРс (фмг. 19 А) определялась измерением концентрации гРУШРс в плазме методом ЕШЗА, специфичным к гРУШРс, который позволял обнаружить и РУШ-часть, и Рсчасть молекулы препарата. Значение 11/2 для антигена гРУШРс составляет 15,7±1,7 ч (фиг. 19А), что сходно с 11/2 активности гРУШРс (фиг. 19В), при измерении хромогенным анализом: 15,4±0,3 ч (табл. 13). Существует хорошая корреляция между активностью РУШ и данными по антигену гРУШРс, тем самым демонстрируя то, что белок гРУШРс обладает полной активностью в условиях ш хзео.
Таблица 13. Сводка РК параметров для препаратов гРУШРс и гРУШ для собак с гемофилией А
РК по данным измерения активности РУШ
Лечение
АИС Τι/2 СР УЗЗ
(МЕ/мл) (час-МЕ/мл) (часов) (мл/час/кг) (мл/кг)
гРУШРс* 2,0 ± 0,54 25,9 ± 6,47 15,4 ±0,3 5,1 ± 1,4 86,4 ± 14,0
гРУШт 2,0 18,2 7,4 6,5 64,0
РК по данным измерения гРУШ и антигена гРУШРс
| Лечение | Стах (нг/мл) | лис (час-нг/мл) | Τι/2 (часов) | СР (мл/час/кг) | Узз (мл/кг) |
| гРУШРс* | 210 ± 33 | 2481 ±970 | 15,7 ± 1,7 | 6,2 ± 3,0 | 86,1 ± 19,2 |
| гРУШТ | 211 | 1545 | 6,9 | 8,7 | 80,7 |
* Результаты представлены в виде среднего значения±стандартное отклонение (СО), полученные на 4 собаках.
/Результаты представлены в виде среднего значения. Значения СО не сообщаются, так как две собаки выбыли.
У двух собак (М12 и М38), которые также получали однократную дозу гРУШ за 72 ч перед введением дозы гРУШРс, значение 11/2 антигена гРУШ было определено равное 6,9 часам и для активности гРУШ - 7,4 часам. Поэтому период полувыведения гРУШРс был приблизительно в два раза большим по сравнению с периодом для препарата гРУШ по данным измерений антигена и активности.
Дополнительно были оценены число тромбоцитов и концентрация фибриногена для использования их как предварительных испытаний тромбогенности. После введения доз препарата гРУШРс или гРУШ число тромбоцитов и концентрация фибриногена в плазме не отличались от этих показателей до получения доз препаратов (данные не показаны).
Обсуждение
Эти исследования показали, что гРУШРс является полностью активным препаратом для лечения острых случаев кровотечений у мышей с НетА, в дополнение к сохранению нормальной специфической активности. Другие исследования, не показанные в этой заявке, показали, что белок гРУШРс также является полностью функциональным во взаимодействиях с Р1Ха, РХ и фосфолипидами при формировании Х-азного комплекса (Ре1егз и др., Р ТЬготЬ НаетозЬ ΌΟΙ: 10.1111/цЬ. 12076 (2012)). Более того, аффинность связывания с фактором фон Виллебранда (УАР) была сравнимой между препаратами гРУШРс и гРУШ, со значением Кб приблизительно 1,4 и 0,8 для белков гРУШРс и гРУШ, соответственно (Ре1егз и др., I. ТЬготЬ НаетозЬ ΌΟΙ: 10.1111/цЬ. 12076 (2012)).
Активность гРУШРс не изменялась при слиянии С-терминального конца молекулы РУШ с Νтерминальным концом Рс-части, поскольку С1 и С2 домены молекулы РУШ участвовали в связывании с фосфолипидами, которое было необходимым для образования комплека протромбиназы на поверхности активированных тромбоцитов (Роз1ег, Р.А., и др., В1ооб. 75(10): 1999-2004 (1990)). Однако эти данные согласовывались с наблюдением того, что остатки аминокислот предположительно связывались с фосфолипидами, например, К2092/Р2093 домена С1, М2199/Р2200 и Ь2251/Ь2252 домена С2, эти явления, как оказалось, формируют поверхность, которая удаляет С-терминальные остатки РУШ (ЗЬеп, В.А., и др., В1ооб. (2007); Ν^, РС, и др., 81гис1иге. 16(4):597-606 (2008)).
Период полувыведения гРУШРс удвоился только у мышей, экспрессирующих эндогенный рецептор РсКп мыши или трансгенный РсКп человека, но не изменился у мышей РсКп КО (см. фиг. 15 и табл. 12), этот результат демонстрирует, что механизм пролонгации периода полувыведения гРУШРс опосредован рецепторами РсКп. В то же время известно, что эндотелиальные и гемапоэтические клетки вносят одинаковый вклад в рециклинг интернализованного 1дС к клеточной поверхности, что способствует продолжительности существования и защите белка от деградации (Вогуак, Р, и др., 1п1 1ттипо1. 10(9): 1289- 64 029560
1298 (1998)), (АкПекк, 8., и др., ί Iттиηο1. 179(7):4580-4588 (2007)). Определённо не известно, какой тип(ы) клеток, экспрессирующих рецепторы РсКп отвечает за абсорбцию и рециклинг белка гРУШРс. Рецепторы РсКп заметно экспрессируются в сосудистом эндотелии, эпителии почек, печени, селезёнке, а также в антиген-представляющих клетках (АРС) костного мозга, включая макрофаги (Вогуак, ί., и др., Ιηΐ 1ттипо1. 10(9): 1289-1298 (1998)), (Аккекк, §., и др., ί 1ттипо1. 179(7):4580-4588 (2007)), (ГозЫка, Μ., и др., 1ттипку. 20(6) :769-783 (2004)). Поскольку РУШ циркулирует в основном (~98 %) в виде комплекса с У\УР (Ьепкпд, Р.Ь, и др., ί ТкготЬ Наетокк 50:1353-1360 (2007)), и оба белка совместно локализованы с макрофагами в печени и селезёнке, когда рекомбинантные белки РУШ и У\УР вводятся вместе мышам с дефицитом У\УР (уап 8скоо1еп, С.1, и др., В1оок. 112(5):1704-1712 (2008)), то макрофаги могут играть роль в спасении гРУШРс от деградации и пролонгировании его периода полувыведения. Однако эти результаты могут также свидетельствовать о ранее неизвестном механизме, обусловленном Рс-слиянием, катаболизмом РУШ и защитой этого белка.
Подходы для разработки методов продления периода полувыведения факторов свёртывания крови включают пэгилирование (Коккп, ί., и др., Вюсоищд Скет. 11(3):387-396 (2000)), (Ме1, В., и др., В1оок. 116(2):270-279 (2010)), гликопэгилирование (Мокк, ί., и др., ί ТкготЬ Наетокк 9(7):1368-1374 (2011)), (№дпег, С, и др., В1оок. (2011)), и конъюгацию с альбумином (МеПпег, Н.к, и др., ТкготЬ Наетокк 102(4):634-644 (2009)), (ХУеипег Т., и др., ТкготЬ Наетокк 99(4):659-667 (2008)). Несмотря на использование методов белковой инженерии, периоды полувыведения модифицированных вариантов гРУШ оказываются максимум в два раза больше чем у дикого типа РУШ в разнообразных моделях доклинических исследований на животных (Ыи, Т., и др., В1оок. 112:511 (2008)), (Кагрк, Ό.Μ., и др., 16(8ирр1. 84):40 (2010)). Непротиворечивые результаты были продемонстрированы на людях, например, сообщалось об улучшении периода полувыведения гРУШРс приблизительно в 1,7 раз по сравнению с препаратом АЭУАТЕ® у пациентов с гемофилией А (Ро^е11, ί.8., и др., В1оок. (2012), предварительная публикация онлайн ΌΟΙ:10.1182/Ь1оок-2011-09-382846). Это ограничение продолжительности периода полувыведения РУШ кажется связанным с У\УР. У мышей с нокаутом экспресии белков РУШ и У\УР в предварительных экспериментех наблюдали 5-кратное увеличение периода полувыведения гРУШРс по сравнению с гРУШ (Ши, Т и др., неопубликованные результаты). О подобных наблюдениях ранее сообщалось в эксперименте на мышах с нокаутом экспресии У\УР при применениии пэгилированного РУШ (Мер В., и др., В1оок. 116(2):270-279 (2010)). Рассматриваемые вместе эти результаты указывают, что У\УР может быть лимитирующим фактором для дальнейшего продления периода полувыведения РУШ.
Кроме продления периода полувыведения, препарат гРУШРс обеспечивает дополнительные преимущества. Основной сложностью РУШ-заместительной терапии является возникновение нейтрализующих антител к РУШ (ингибиторов). Это явление встречается у 15-30% ранее не лечившихся пациентов. Белок гРУШРс обладает потенциалом индуцировать иммунную толерантность и, таким образом, предотвращать развитие нейтрализующих антител. Сообщалось, что В-клетки, трансдуцированные ретровирусным вектором, презентирующие домены РУШ как белки 1д, специфически предотвращают или снижают циркуляцию антител у мышей с НетА (Ье1, Т.С. апк 8сок, Ό.Α., В1оок. 105(12) 4865-4870 (2005)). Было также обнаружено, что Рс-содержащие регуляторное эпитопы Т-клеток способны индуцировать у регуляторных Т-клеток усиление или подавление антиген-специфических иммунных ответов в условиях ίη укго (Ое Огоо1, и др., В1оок. 112(8):3303-3311 (2008)). В дополнение к этому РсКпопосредованный перенос материнских 1дО и Рс-белков слияния через плаценту в русло циркуляции крови плода (81т1к1ег, Ν/Е., Уассше. 21(24):3365-3369 (2003)), ОгиЬЬ, 1Н., и др., Ргос №И1 Асак 8с1 и.8.А. 105(24):8375-8380 (2008)) может индуцировать неонатальную толерантность к белку гРУШРс, в то же время, обеспечивая необходимую защиту новорожденного от кровотечения при родах.
В заключение, изобретателями продемонстрировано, что препарат гРУШРс обеспечивает приблизительно в 2 раза большую эффективную длительность действия в отношении гРУШ по защите мышей с НетА от повреждения рассечением хвостовой вены и улучшает показатель \УВСТ у собак с НетА. Пролонгирование эффективности хорошо коррелирует с 2-кратным увеличением Ц/2 препарата гРУШРс в результате рециклинга Рс-белка слияния посредством специфических и хорошо охарактеризованных внутриклеточных механизмов.
Пример 11. Иммуногенность белка гРУШРс у мышей.
130 самцов мышей с гемофилией А, возрастом на начало исследования 7-9 недель, были случайным образом, учитывая возраст и вес, разделены на 13 групп лечения (п=10/группа). Мыши получали лечение повторяющимися внутривенными дозами препаратов гРУШРс , гРУШ-тРс, ΧΥΝ^Ά® или АЭУАТЕ® по 50, 100 и 250 МЕ/кг, в качестве плацебо для контрольной группы использовали три состава буферных раствора препаратов РУШРс, Х^^ТНА® и АЭУАТЕ®. Время в/в введения препаратов было 0, 7, 14, 21, 35-й день после первой в/в инъекции, а образцы крови отбирали с помощью ретро-орбитального устройства отбора крови в дни (-1), 14, 21, 28 и 42 после получения первой дозы лечения (фиг. 20).
Немедленно после отбора крови образцы плазмы отделяли центрифугированием и инактивировали в течение 30 мин обработкой нагреванием при 56°С для обеспечения точного измерения антител к РУШ. Появление суммарных антител к РУШ (фиг. 21А, 21В и 21С), нейтрализирующих РУШ антител (фиг. 23)
- 65 029560
и суммарных антител к Рс (фиг. 24) было изучено с использованием образцов плазмы.
После введения доз РУГГГ 50 МЕ/кг на 28 день после первой инъекции, только у 1 из 10 мышей в группе, получавшей препарат гРУГГГРс, у 2 из 10 мышей в группе, получавшей гРУГГГ-тРс, появились определяемые антитела к РУГГГ по сравнению с 5 из 10 мышей и 7 из 10 мышей, получавших препараты XΥNΤΗΑ® и АОУАТЕ® (фиг. 22С). При дозе 100 МЕ/кг количество мышей, у которых появились определяемые антитела РУГГГ на 28 день составило 2, 5, 8 и 9 в группах, принимавших, соответственно, гРУГГГРс, гРУШ-тРс, Х^^ТНА® и АОУАТЕ® (фиг. 22С). При дозе 250 МЕ/кг количество мышей, у которых появились определяемые антитела РУГГГ на 28 день составило 10, 10, 7 и 7 в группах, принимавших, соответственно, гРУГГГРс, гРУШ-тРс, ΧΥNΤΗΑ® и АОУАТЕ® (фиг. 22С). Данные, соответствующие 14, 21 и 42 дням показаны, соответственно, на фиг. 22А, 22В и 220.
В общем, изобретателями наблюдалась хорошая корреляция между суммарным количеством тел и нейтрализующих антител к РУГГГ (К2=0,7452) и титры обоих типов антител возрастали с течением времени (фиг. 23). В пределах диапазона терапевтических доз (50 и 100 МЕ/кг), количество мышей, у которых появились специфические к РУГГГ антитела, как и титры антител в группах, принимавших гРУГГГРс, были значительно ниже по сравнению с препаратом АОУАТЕ® (р<0,05) и немного меньше по сравнению с препаратом Х^^ТНА® (р=0,05). Этот результат указывает на потенциальную низкую иммуногенность препарата гРУГГГРс.
Пример 12. Ответ лимфоцитов селезёнки к гРУГГГРс по сравнению с коммерчески доступными препаратами гРУШ.
Определяли ответ лимфоцитов селезёнки к рекомбинантному фактору УГГГ (гРУШ) при его соединении с фрагментом Рс человека (НРс, Г§С1) или Рс мыши (тРс, Г§С2а) и сравнивали с откликом лимфоцитов селезёнки к коммерчески доступным препаратам гРУШ [полноразмерный РУГГГ (АОУАТЕ®) и РУГГГ с удалённым В-доменом (Х^^ТНА®/КЕРАСТО АР®)].
Мышам с гемофилией А (НетА) каждую неделю на протяжении 6 недель вводили 50 или 250 МЕ/кг испытуемых препаратов. На 56 день 4 мыши из каждой группы подвергли эвтаназии и отобрали спленоциты (фиг. 25). Одну половину спленоцитов использовали для определения профиля иммуногенности спленоцитов с помощью окрашивания внутриклеточных цитокинов, маркеров регуляторных Тклеток и дендритных клеток, используя проточную цитометрию (РАСЗ) (фиг. 26). Другую половину клеток использовали для выделения РНК и проведения определения профиля механизмов отклика, используя метод ПЦР в режиме реального времени на основе микрочипов. На фиг. 27А показан точечный график профиля результатов РАСЗ анализа изотипного контроля. На фиг. 27В показан точечный график профиля результатов РАСЗ анализа образцов, содержащих спленоциты позитивные по молекулам СО4 и ТЫР-а. Процентное содержание дважды положительных клеток было определено из точечных графиков во всех случаях лечения с применением препаратов и плацебо. Процентное содержание дважды положительных клеток у мышей, которым вводили РУГГГ, получено сравнением с группой, которой вводили плацебо.
Внутриклеточное окрашивание цитокинов выполнялось совместно с окрашиванием СО4-маркера Тхелперных клеток и таких цитокинов, как ГЬ-2 (фиг. 28), ГЬ-4 (фиг. 30) и ТЫР-а (фиг. 29). ГЬ-2 представляет собой митоген Т-клеток, участвующий в пролиферации Т-клеток, который секретируется активированными Т-клетки у мышей с НетА в ответ на присутствие РУГГГ. ГЬ-4 идентифицирован как цитокин, секретируемый активированными Т-клетками у мышей с НетА в ответ на присутствие РУГГГ. ТЫР-а является провоспалительным цитокином, отвечающим за повышенную продукцию антител у пациентов, больных гемофилией. С использованием метода проточной цитометрии измеряли усиление флуоресценции каждого типа окрашенных молекул. Аналогичным образом определяли соотношение толерогенных и иммуногенных дендритных клеток путём окрашивания поверхности и проточным цитометрическим анализом маркеров, таких как РО-Ь1 (СО274) (фиг. 32) и СО80 (фиг. 33). РО-Ь1 представляет собой ингибиторный лиганд, который участвует во взаимодействии с рецептором РО-1 на активированных Т-клетках, таким образом, блокируя синтез ГЬ-2, опосредованный Т-клеточным рецептором (ТСК) и пролиферацию клеток. Повышенная экспрессия в дендритных клетках (ОС) лигандов РО-Ь1 является критическим фактором, которым может ингибировать иммуногенность и повышать толерантность организма. СО80 является поверхностным маркером, обычно обнаруживаемым на дендритных клетках после фагоцитоза антигена и во время его созревания до презентирующего антигена для Т-клеток. Маркер СО80 принадлежит набору корецепторов пролиферации в активирующихся Т-клетках. Возрастание окрашивания поверхностных молекул СО80 косвенно указывает на лучшее созревание и презентацию антигенов дендритными клетками.
Дополнительно процент регуляторных Т-клеток (Тгед) в селезёнке оценивали совместным окрашиванием молекул СО4 и Гохр3 (фиг. 34) - маркера этих клеток. Рохр3 представляет собой внутриклеточный маркер регуляторных Т-клеток. Рохр3+ Т-клетки участвуют в установлении, поддержании и адаптивном переносе периферийной толерантности, опосредованной Т-клетками.
Оценивали также наличие клеток, экспрессирующих оба маркера СО4 и Т1т3 (фиг. 35) или СО279 (РО-1) (фиг. 36). Тип3 (Т-клеточный иммуноглобулиновый домен и муциновый домен 3) выступает как
- 66 029560
отрицательный регулятор ответов Т-хелперных клеток 1 (ТН1-клеток). Молекула Тип3 экспрессируется также нативными иммунными клетками и может повышать уровень провоспалительных ответов. Молекула Тип3 ингибирует ТН1-опосредованные ауто- и аллоиммунные реакции и действует через свой лиганд, галектин-9, для индукции клеточной гибели ТН1, но не ТН2 клеток. СИ279 (РИ-1) является представителем большого семейства СИ28/СТЬА-4 Т-клеточных регуляторов. Молекула РИ-1 экспрессируется на поверхности активированных Т-клеток, В-клеток и макрофагов, что наталкивает на предположение, что по сравнению с СТЬА-4, молекула РИ-1 обеспечивает более широкую отрицательную регуляцию иммунных реакций. Среди изучаемых цитокинов есть такие, которые отвечают за иммуногенность и образование ингибиторов. У мышей, которым вводили 50 МЕ/кг гРУШ-НРс или гРУШ-тРс отмечено существенное ингибирование уровней синтеза ГЬ-4 и ТОТА, а уровень синтеза ГЬ-2 не изменился по сравнению с группой животных, которым вводили плацебо. Напротив, уровни синтеза этих цитокинов были выше в группах животных, получавших 250 МЕ/кг этих препаратов. У мышей, которым вводили 50 МЕ/кг Х^^ТНА® и АИУАТЕ® не выявлено какого-либо ингибирования, тогда как в группе, получавшей 250 МЕ/кг, выявлено возрастание внутренней концентрации ГЬ-2, ГЬ-4 и ΊΝΕ-α. В дополнение к этому, высокий процент £охр3-положительных Т-клеток отмечен у мышей, которым вводили 50 МЕ/кг гРУШ-тРс по сравнению с другими препаратами. У мышей, получавших 50 МЕ/кг гРУШ-НРс и гРУШтРс наблюдался больший процент дендритных клеток селезёнки, положительных по молекуле РИ-Ь1 (СИ274), несущих ингибирующий сигнал для активации и пролиферации Т-клеток. Эти группы обладали также большим процентом незрелых дендритных клеток, как показано снижением окрашивания СИ80маркеров.
Эти результаты показали, что препарат гРУШРс в дозе 50 МЕ/кг у мышей с НетА выявил меньшую иммуногенность, чем коммерчески доступные препараты гРУШ [полноразмерный РУШ (АИУАТЕ®) и РУШ с удалённым В-доменом (Х^^ТНА®/КЕРАСТО АР®)]. Следовательно, препарат гРУШРс может обеспечивать снижение синтеза антител и индуцировать иммунную толерантность.
Пример 13. Биораспределение и клиренс гРУШРс у мышей.
Показано, что рекомбинантный белок слияния одной молекулы РУШ с константным участком ГС1 Рс (гРУШРс) снижает клиренс по сравнению с препаратами гРУШ РсКп-зависимым механизмом (Ро^е11 и др., 2012 В1ооб), используя природный способ, который обеспечивает рециркуляцию антител в кровяном русле. Кроме того, как указано выше, клиническое испытание фаз 1/2а на пациентах с гемофилией показало, что белок гРУШРс обладает в 1,5-1,7 раз большим периодом полувыведения, чем полноразмерный фактор РУШ (АИУАТЕ®). Следовательно, исследование проводилось для: (ί) идентификации типов клеток и органов, которые вносят вклад в защиту белка гРУШРс и (ΐΐ) оценки относительного вклада РУШ- и Рс-доменов в биораспределение и клиренс гРУШРс у мышей.
Клиренс гРУШРс и гРУШ сравнивали на моделях генноинженерных мышей с дефицитом или РУШ (НетА) или фактора фон Виллебранда (УШР). Для удаления клеток Купфера и моноцитов/макрофагов у этих мышиных моделей было использовано внутривенное введение клодронат-содержащих липидных везикул. Эффективность удаления количественно учитывалась иммуногистохимичесикми анализами и РАС8. Фармакокинетический анализ выполняли после внутривенной инъекции гРУШРс или гРУШ с помощью РУШ-специфического набора для анализа СоШеН.
Удаление клеток Купфера у мышей с НетА приводило к возрастанию клиренса гРУШРс. Более того, в отсутствии УШР (мыши с двойным нокаутом НетА/УШР) удаление клеток Купфера и макрофагов привело к возрастанию клиренса гРУШРс до значений подобных с гРУШ, что указывает на то, что эти клетки отвечают за большинство отличий в клиренсе в этой модели между препаратами гРУШ и гРУШРс. Эти исследования выдвигают предположение, что клетки Купфера могут вносить свой вклад в осуществлении РсКп-опосредованого рециклинга молекул гРУШРс. Для проверки наличия этого механизма продолжаются исследования с использованием трансплантантов костного мозга мышам РсКп КО. Эти исследования в сочетании с экспериментами по клеточному поглощению ш ν 11го будут попыткой распознавания участия клеток Купфера и нахождения отличия от других РсКп-экспрессирующих типов клеток, включая эндотелиальные клетки.
Пример 14. Клеточно-опосредованный иммунный ответ на препарат гРУШРс у мышей с гемофилией А.
Целью настоящего исследования была идентификация клеточно-опосредованных иммунных реакций на рекомбинантный РУШ, который является интересным для разработки лучшего терапевтического управления гемофилией А. Поэтому мы изучали ответ лифоцитов селезёнки на рекомбинантный белок РУШ (гРУШ), связанный с участком Рс человека (гРУШРс; ^С1) в сравнении с коммерчески доступными препаратами: полноразмерным гРУШ (АИУАТЕ®) и гРУШ с удалённым В-доменом (ΧΥΝТНА®/КЕРАСТО АР®). Мышам с НетА вводили 4 раза в неделю с последующим введением 2 раза каждую неделю препараты в дозах 50, 100 или 200 МЕ/кг. По завершению 8 недель мышей из каждой группы подвергали эвтаназии и определяли профиль иммуногенности их лейкоцитов селезёнки испытаниями на содержание внутриклеточных цитокинов, маркеров регуляторных Т-клеток и дендритных клеток используя проточную цитометрию и профили РНК. У мышей, которым вводили 50 МЕ/кг гРУШРс
- 67 029560
отмечено существенное ингибирование уровней синтеза 1Ь-2, 1Ь-4 и ТМР-а (цитокинов, которые способствуют проявлению иммуногенности). Уровни синтеза этих цитокинов были выше у мышей, получавших 250 МЕ/кг этого препарата. У мышей, которым вводили 50 МЕ/кг ΧΥΝ^Α® и Α^VΑΤЕ® не выявлено какого-либо ингибирования, тогда как в группе, получавшей 250 МЕ/кг, выявлено возрастание внутриклеточной концентрации 1Ь-2, 1Ь-4 и ТМР-а. В дополнение к этому, высокий процент Го\р3положительных Т-клеток отмечен у мышей, которым вводили 50 и 100 МЕ/кг гРУШРс по сравнению с другими препаратами. У мышей, получавших 50 и 100 МЕ/кг гРУШРс, наблюдался больший процент дендритных клеток селезёнки, положительных по молекуле ΡΌ-Ы (СЭ279). несущих ингибирующий сигнал для активации и пролиферации Т-клеток. Эти группы обладали также большим процентом незрелых дендритных клеток, как показано снижением окрашивания СО80-маркеров. Таким образом, обе дозы 50 и 100 МЕ/кг препарата гРУШРс показали пониженную иммуногенность и синтез антител в этой модели.
Введение
Образование ингибиторов к РУШ признано серьёзным осложнением для управления проявлениями гемофилии А. Вероятность образования ингибиторов оценивается в диапазоне от 20 до 30% для всех случаев гемофилии А и 30-40% в случае тяжёлых заболеваний (Огееп, НаеторЬШа 17:831-838 (2011); ЕскЬагй! и др. ί. ТЬготЬ. Наеток!. 9:1948-58 (2011)). Заболевания, обусловленные синтезом ингибиторов, в настоящее время лечатся индукцией иммуной толерантности, включающей частое введенение высоких доз препаратов РУШ. Механизмы образования у пациентов ингибиторов в большинстве случаев остаются неизвестными и зависят от множества факторов риска, а также клеток и молекул иммунной системы.
Образование ингибиторов при гемофилии вовлекает комплексное взаимодействие множества типов клеток, поверхностных молекул и секретируемых белков иммунной системы, включая Т-лимфоциты, Влимфоциты, антиген-презентирующие клетки (АРС; дендритные клетки и макрофаги), цитокины и регуляторные компоненты этих типов клеток. Синтез антител В-клетками зависят от оптимальной помощи Тклеток, которые активированы представлением антигена на АРС. Толерантность к терапевтическим пептидами белкам, вводимым инъекционно, включая рекомбинантный РУШ, опосредовано классом Тклеток, называемыми регуляторными Т-клетками (Тгед) (Сао и др., ί. ТЬготЬ. Наеток!. 7(δ1):88-91 (2009)).
Несколько ключевых молекул были идентифицированы как такие, что коррелируют с образованием ингибитором у пациентов с гемофилией. Такие молекулы, среди прочих, включают провоспалительный цитокин ТОТМ, противовоспалительный цитокин интерлейкин (Ш)-10 и маркер Тгед клеток €±^4 (Αδ!егтагк и др., I. ТЬготЬ. Наеток!. 5:263-5 (2007); Ρаν1оνа и др. I. ТЬготЬ. Наеток!. 7:2006-15 (2009)).
В этом исследовании изобретателями изучен ответ лимфоцитов селезёнки на белок слияния рекомбинантного фактора УШ и Рс (гРУШРс) по сравнению с коммерчески доступными препаратами полноразмерного гРУШ (пр-гРУШ; Α^VΑΤЕ®) и гРУШ с удалённым В-доменом (УВД-гРУШ; ΧΥΝΤΗΑ®/КЕРΑСΤО ΑΕ®).
Материалы и методы
Материалы: мыши с дефицитом фактора РУШ (Βί и др. №·ιΙ Оепе!. 10:119-21 (1995)) были первоначально получены от д-ра Казазияна (Университет штата Пенсильвания, г. Филадельфия, штат Пенсильвания, США) и поддерживались в виде воспроизводимой колонии в лаборатории изучения гемофилии Вшдеп Мес или в лаборатории СЬаг1ек Ккег.
Антитела, используемые для окрашивания и анализа РΑСδ были получены в компании ΒΌ Вшксь епсек (РгапкЬп Ьакек, Ш, υδΑ) или еВшкаепсе (±ап Э1едо, СΑ, υδΑ).
Использованные антитела были направлены против поверхностных маркеров мыши, таких как ΕΌ4 (Т-хелперные клетки), СЭ11с и СЭ80 (дендритные клетки), ΡΌ-1, ΡΌ-Ы, СЭ25 (клетки Тгед), внутриклеточные цитокины (Ш-2, Ш-4, ТМР-а) и факторы транскрипции (Ро\р3).
План исследования иммуногенности: Три группы лечения получали внутривенные инъекции в дозах 50, 100 или 250 МЕ/кг, которые вводили по определённым дням (фиг. 37). Проводили каждое лечение 10 мышам, и им производили введение при каждом уровне дозы. Животных подвергали эвтаназии на 56 сутки путём ингаляции СО2 и вырезанные селезёнки помещали в стерильный фосфатно-солевой буфер (ΡΒδ).
Спленоциты разделяли с использованием набора для разрушения селезёнки и устройства для мягкого разрушения биологических тканей ΜΑСδ (МШепуа Вю!ес, Со1одпе, Оегтапу). Одноклеточные суспензии фиксировали 3% раствором формалина для окрашивания в анализе РΑСδ или хранили в буфере для разрушения для выделения РНК (КосЬе).
Оценка результатов: Антитела к РУШ определяли с использованием собственного разработанного в компании метода ЕЕ-ΙδΑ. Схематичное описание: белком РУШ покрывали поверхность 96-луночных планшетов, которые использовали для захватывания антител плазмы мышей, собранной в определённые временные точки. Антитела, специфичные к РУШ, обнаруживали с использованием антител к 1§О мыши. Определение профиля ответа Т-клеток проводили на выделенных спленоцитах мыши (фиг. 38). Лимфоциты и дендритные клетки селезёнки окрашивали по поверхностным и внутриклеточным мишеням.
- 68 029560
Для поверхностного окрашивания общее количество 1х106 спленоцитов инкубировали с антителами подходящих концентраций. Для внутриклеточного окрашивания клетки делали проницаемыми с помощью раствора ВБ Ρίχ-Регт (ВБ Вюкаепсек) с их последующей инкубацией с антителами к цитокинам в этом же буфере. Окрашивание молекул Ροxр3 выполнялось с использованием антител в буферном растворе для окрашивания Ροxр3 (ВБ Вюкаепсек). Интенсивность флуоресценции записывали с использованием прибора ВБ ΡАС3 Сап!о ΙΙ, анализ данных выполнен, используя программное обеспечение 1;1.О\\'.Ю®.
Лимфоциты совместно окрашивали с рецепторами СБ4 и внутриклеточными маркерами ΙΕ-2, ТОТ1а и ГЬ-4. В клетках Тгед окрашивали поверхностные маркеры СБ4 и СБ25 с последующим окрашиванием внутриклеточных маркеров Ροxр3. Спленоциты окрашивали на присутствие маркеров СБ11с и РБ-Ь1 (дендритные клетки) или СБ4 и РБ-1 (СБ4+ Т-клетки) для идентификации клеток, вовлечённых в механизм взаимодействия РБ-Ы-РБ-1. Всё количество РНК выделяли (КосЬе) и на ней синтезировали кДНК с помощью обратной транскрипции (О1адеп. НПйеп, Оегтапу). Праймеры для молекул ТОΡ-$, Ш-10, Ш12а и ЕВЕ3 приобретали в компании ЮТ !есЬпо1од1ек. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени с использованием красителя ЗУВК дгееп выполнялась на системе ОиапШес! (О1адеп) с применением оборудования для ПЦР в режиме реального времени АΒI 7900 Ρак! В1оск. Данные анализировали на программном обеспечении 7500 версии 2.0.5.
Результаты
Общие уровни содержания антител к ΡνΙΙΙ на 42 сутки: Общие уровни содержания антител к ΡνΙΙΙ на 42 сутки определяли в плазме мышей, которым инъекционно ввели 50, 100 или 250 МЕ/кг препаратов ΓΡνΙΙΙΡο УВД-ΡνΙΙΙ (ХУЭТНА®) или полноразмерного ΡνΙΙΙ (пр-ΓΡνΙΠ) (А^VАТЕ®) с использованием метода ЕЫЗА. В обеих группах, получавших 50 и 100 МЕ/кг ΓΡνΙΙΙΡο были значительно ниже уровней антител по сравнению с УВД-ΓΡνΊΙΙ или полноразмерным пр-ΡνΙΙΙ препаратами, что указывает на более низкую антигенность ΡνΙΙΙ в сравнении с инъекциями τΡνΙΙΙΡα В группах, получавших 250 МЕ/кг τΡνΙΙШс, не было статистической разницы между разными препаратами, и отмечались высокие уровни содержания антител (фиг. 39). Внутриклеточные цитокины (Ш-2 и ΊΝΕ-α) в СБ4+ клетках: Мыши, получавшие по 50 МЕ/кг препаратов в каждой группе лечения, не отвечали по этому показателю в отношении данных уровня антител к ΡνΙΙΙ, тогда как мыши, получавшие по 250 МЕ/кг препаратов в каждой группе лечения, отвечали в виде наибольших уровней антител (данные не показаны). Дозы ΓΡνΠΙΡο в 50 и 100 МЕ/кг (фиг. 40А и 40В) обеспечивали пониженный процент содержания ΙΕ-2- и "Т^-а-положительных СБ4+ клеток, что указывает на пониженную иммуногенность этого препарата, тогда как препараты УВДτΡνΙΙΙ или пр-ΡνΙΙΙ показали более высокие количества цитокин-положительных клеток. Все три схемы лечения в дозах 250 МЕ/кг (фиг. 40С) обеспечили повышенный процент цитокин-положительных клеток, что иллюстрирует на более высокую иммуногенность этой дозы. Сходные результаты были получены и для Ш-4. СБ4/СБ25/Еохр3 трижды положительные клетки (маркеры Тгед клеток): При дозе 100 МЕ/кг процент превышения Тгед клеток в отношении плацебо был статистически значимо выше в группе τΡνΙΙШс (Р<0,05) по сравнению с группами, получавшими УВД-τΡνΙΙΙ или пр-ΡνΙΙΙ (фиг. 41). Подобные результаты были получены для дозы 50 МЕ/кг ΓΡνΙΙΙΡο что иллюстрирует на то, что обе дозы лечения 50 и 100 МЕ/кг могут способствовать доминированию Тгед клеток и подавлять иммунные реакции на ΡνΙΙΙ.
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени для цитокинов, связанных с развитием толерантности: Анализ ПЦР в режиме рального времени для цитокинов, связанных с развитием иммунной толерантности, а именно: ТОΡ-β (фиг. 42А), Ш-10 (фиг. 42В) и Ш-35 (субъединицы Ш-12а и ЕВЕ3, показаны соответственно, на фиг. 42С и 42Б), выполняли с использованием РНК, изолированной у мышей, относящихся к получавшей лечение дозой 100 МЕ/кг группе. Для определяемых цитокинов в группе, получавшей ΓΡνΙΙΙΡο уровни мРНК были повышены (Р<0,05) по сравнению с другими типами лечения в дозе 100 МЕ/кг, что указывает на наличие спленоцитов, эспрессирующих толерогенные цитокины, таким образом усиливая иммуносупрессивное микроокружение. Во всех спленоцитах группы, получавшей дозу 100 МЕ/кг, содержание мРНК, отвечавшей за экспрессию маркеров иммунотолерантности Ροxр3 (фиг. 42Е), СБ25 (фиг. 42Ρ), СТЬА-4 (фиг. 42О) и индоламин-2,3-диоксигеназы (ЮО-1) (фиг. 42Н) было повышенным.
Данные анализа ΡАС3 в установлении механизма РБ-Ы-РБ-1: Молекула РБ-Ы (СБ274) на дендритных клетках соединяется с РБ-1 (СБ279) на Т-клетках для иницирования механизмов, которые подавляют активацию и пролиферацию Т-клеток, таким образом, приводя к подавлению иммунных реакций. У спленоцитов группы, принимавшей дозы 100 МЕ/кг, окрашивались поверхностные рецепторы СБ11с и РБ-Ы (фиг. 43 А) или СБ4 и РБ-1 (фиг. 43В). При дозе 100 МЕ/кг процент положительных по маркеру РБ-Ы дендритных клеток и процент положительных по маркеру РБ-1 Т-клеток были выше у животных, получавших препарат ΓΡνΠΙΡο (Р<0,05) по сравнению с животными, получавшими УВД-ΡνΙΙΙ и пр-ΡνΙΙΙ. Это указывает на положительную регуляцию иммуносупрессорных механизмов в дендритных и в Т-клетках молекулами ΓΡνΊΙΙΡα
Обсуждение
Экспериментальные результаты, показанные выше, показали, что препарат γΡνΙΙΙЕс в дозах 50 и
- 69 029560
100 МЕ/кг обладает меньшей иммуногенностью и повышает толерантность к РУШ, что продемонстрировано следующими данными:
(a) Пониженный уровень содержания проиммуногенных цитокинов (Ш-2 и ΊΝΈ-σ) в СЭ4+ Тклетках по сравнению с другими молекулами РУШ.
(b) Стимуляция регуляторных Т-клеток и синтеза маркеров (Рохр3, СЭ25, РЭ-1, СΤ^Α4), которые отвечают за иммунную толерантность в мышей, котрым вводили гРУШРс. Значение Рохр3+ Тгед клеток и роль молекул СΤ^Α4 в повышении толерантности к РУШ при гемофилии было описано ранее (Сао и др., 1. ТЬготЬ. Ηаетο8ΐ. 7(81):88-91 (2009); Αδ^πηηΦ и др. 1. ТЬготЬ. Ηаетο8ΐ. 5:263-5 (2007)).
(c) Более высокий уровень содержание толерогенных цитокинов (Ш-10, ТОР-5, Ш-35) в спленоцитах мышей, которым вводили гРУШ. Эти маркеры были обнаружены в нескольких исследованиях как ключевые иммунорегуляторные цитокины и главные детерминанты иммунотолерантности (В1 и др., Νΐ. Оепе!. 10:119-21 (1995)).
(б) Возрастание популяции толерогенных дендритных клеток (РО-Ы, ГОО-1 и снижение СЭ80) у мышей, проходящих лечение введением препарата гРУШРс.
Одновремнно с этим, у мышей, лечившиеся препаратом гРУШРс, выявили понижение или отсутствие антител к РУШ в дозах 50 и 100 МЕ/кг (Ши и др., ΑΕΗ ΑόδΙπκΙ #РВ-АЕ-04.2-5 (2012)) и устойчивость при стимулировании дозой 250 МЕ/кг после развития толерантности от доз 50 МЕ/кг гРУШРс.
Выводы: У мышей, лечившихся препаратом гРУШРс, выявили понижение или отсутствие антител к РУШ в дозах 50 и 100 МЕ/кг по сравнению с обычными видами лечений с помощью РУШ. На основании изучения Т-клеток и дендритных клеток мышей, препарат гРУШРс определён как менее иммуногенный, чем традиционные лекарственные средства РУШ и обеспечивает развитие толерогенных механизмов. Препарат гРУШРс вызывает повышение уровней ключевых иммунорегуляторных цитокинов у спленоцитов мышей с гемофилией А, что является индикаторов развития иммунотолерантности. Собранные вместе эти результаты указывают на существование толерогенного микроокружения в селезёнке мышей, которым в малых дозах инъекционно вводили гРУШРс (50 и 100 МЕ/кг).
Эти исследования впервые продемонстрировали, что гРУШРс активирует передачу сигналов дендритными клетками, которая является ключевым фактором иммунотелерантности. Эти данные указывают, что существующая функциональная иммунная толерантность к РУШ у мышей с гемофилией А обеспечивается препаратом гРУШРс.
Пример 15. Оценка синтеза антител к препарату гРУШРс по сравнению с ΧΥΝ^Α® и Α^УΑΤЕ® у мышей с гемофилией А.
Развитие ингибирующих антител к заместительным белкам РУШ случается у 20-30% ранее нелечившихся пациентов, что является наиболее серьёзным осложнением при лечении гемофилии. Индукция иммунной толерантности (ИИТ), которая сопровождает частое введение препаратов, в настоящее время используется для лечения пациентов, у которых появились ингибиторы. Однако субпопуляция таких пациентов не отвечает на ИИТ. См., например, публикации Огееп, ИаеторЬШа 17:831-838 (2011); ЕскЬагб! и др. 1. ТЬготЬ. ИаетокГ 9:1948-58 (2011); Сао и др., 1. ТЬготЬ. ИаетокГ 7(81):88-91 (2009). Рекомбинантный белок РУШРс обладает периодом полувыведения приблизительно в 1,6 раз большим, чем период полувыведения гРУШ, и этот препарат в данный момент находится на клиническом изучении фаз 2/3. Эксперименты, представленные в этой заявке, определяют иммуногенные и иммунотолерантные свойства гРУШРс по сравнению с другими гРУШ заместительными гРУШ белками при лечении гемофилии А (ΗетΑ) у мышей.
(a) Сравнение иммуногенности препаратов гРУШРс, ΧΥΝ^Α® и Α^УΑΤЕ® у мышей с ΗетΑ: Образование антител: Четыре группы мышей с ΗетΑ, с 9-12 мышами с ΗетΑ в группе, получали дозы по 50, 100 и 250 МЕ/кг препаратов гРУШРс, ΧΥΝΈΑ®, Α^УΑΤЕ® и контроль плацебо. Дозы вводили мышам на 0, 7, 14, 21 и 35-й день. Кровь отбирали на 0, 14, 21, 28 и 42-й день (фиг. 44).
Препарат гРУШРс индуцировал значительно более низкий уровень образования антител в дозе 50 МЕ/кг (фиг. 45) и 100 МЕ/кг (фиг. 46) по сравнению с препаратами ΧΥΝ^Α® и Α^УΑΤЕ®. Однако все белки РУШ показали схожее образование антител в дозе 250 МЕ/кг (фиг. 47). Титры нейтрализующих антител коррелировали с общим уровнем содержания связывающих антител (фиг. 48).
(b) Сравнение иммуногенности препаратов гРУШРс, ΧΥΝ^Α® и Α^УΑΤЕ® у мышей с ΗетΑ: Профили ответа Т-клеток: Для определения профилей Т-клеток спленоцитов на 53 день вводили дополнительные дозы препаратов гРУШРс, ΧΥΝ^Α®, Α^УΑΤЕ® и контроль плацебо. Селезёнку мышей извлекали на 56-й день (фиг. 49). Полученные результаты показывают, что препарат гРУШРс способствует доминированию СО4/СЭ25/Рохр3-положительных Тгед клеток (фиг. 50, правая сторона). Резюме: Введение препарата гРУШРс привело к значительному снижению образования антител по сравнению с препаратами ΧΥΝ^Α® и Α^УΑΤЕ® в дозах 50 и 100 МЕ/кг. Профиль толерогенности после получения доз 50 и 100 МЕ/кг гРУШРс показал, что гРУШРс может способствовать доминированию Тгед клеток и подавлять иммунные реакции на РУШ.
(c) Исследование приобретения иммуной толерантности: Для проверки того, могут ли повторные введения гРУШРс индуцировать функциональную толерантность в условиях ш угуо, были приняты сле- 70 029560
дующие режимы дозирования. Мышам с ΗетΑ (возрастом 8-10 недель) вводили 50 МЕ/кг гЕУШЕс или плацебо еженедельно в течение 4 недель (на 0, 7, 14, 21-й день) с последующей одной инъекцией на 35-й день. На 49-й день от начала исследования этим мышам ввели недельную дозу γΡΥΠΙΡο 250 МЕ/кг для определения того, что эти животные могут переносить высокие дозы ιΈνΐΙΙΡο. Эти разрешающие дозы вводили на 0, 7, 14 и 21-й дни с 49 дня от начала исследования (см. фиг. 51). Образцы крови отбирали в определённые временные точки для проверки на наличие антител к ΡνΐΙΙ методом ΕΟ8Α. Как показано на фиг. 52 повторные дозы привели к статистически значимому снижению содержания антител к ιΈνΐΙΙΡο при его введении в высоких дозах 250 МЕ/кг, тогда как у животных, получавших плацебо, были высокие уровни антител после введения. Эти данные ясно показывают, что повторное введение γΡΎΙΙΙΡο в дозе 50 МЕ/кг на основе этой использованной схемы дозирования способно индуцировать толерантность к высоким дозам препарата γΡΎΠΙΡο (250 МЕ/кг). Выводы: Было найдено, что в терапевтических дозах ιΡνΐΙΙΡο был: (1) менее иммуногенным в сравнении с ΧΥΝΤΗΑ® и ΑΌνΑΤΕ®, и (2) способен к индуцированию иммунной толерантности к ΡνΐΙΙ у мышей с ΗетΑ.
В настоящее время устанавливается, могут ли даже низкие дозы γΡΎΠΙΡο привести к приобретению иммунной толерантности к высоким дозам γΡΎΠΙΡο. В таком исследование низкие дозы ΓΡνΐΙΙΡο, а именно 25 и 10 МЕ/кг, будут использованы во время фазы индукции толерантности. После чего будут введены дозы 250 МЕ/кг γΡΎΙΙΙΡο и измерены уровни содержания антител к ΡΎΙΙΙ, как было проведено в предыдущем исследовании.
Пример 16. Метаболические пути клиренса препарата γΡΎΙΙΙΡο у мышей с гемофилией А.
Длительно действующий рекомбинантный белок слияния фактора коагуляции ΡΎΙΙΙ и Ес (гЕУШЕс) в настоящее время находится в фазе 3 клинического исследования эпизодического и профилактического лечения пациентов с гемофилией А. По сравнению с рекомбинантным препаратом полноразмерного белка ΡΎΙΙΙ (ΑΌΎΑΤΕ®, Бах1ег НеаНЬсаге Согрогайои), γΡΎΙΙΙΡο обладает в 1,7 раз более продолжительным периодом выведения и значительно большим клиренсом у пациентов с гемофилией А. См. статью Ρο\\ΎΙ и др., Βίοοά 119:3031-7(2012). Этот улучшенный фармакокинетический (ΡΚ) профиль опосредован взаимодействием Ρο с неонатальным Ρο-рецептором (ΡοΚη). См. ΌιιιηοηΙ и др., Βίοοά 119:3024-30 (2012). γΡΎΙΙΙΡο состоит из одной молекулы фактора коагуляции человека ΡΎΙΙΙ с удалённым В-доменом непосредственно соединённым с Ρο-доменом иммуноглобулина человека Ο1, который посредством взаимодействия с рецепторами ΡοΚη рециркулирует природным путём после поглощения клетками (эндоцитоз или пиноцитоз) (фиг. 53). Моноцитные клетки (макрофаги и дендритные клетки), включая находящиеся в печени макрофаги (клетки Купфера) принимают участие в обеспечении клиренса фактора фон Виллебранда (ΎΑΡ) и ΡΎΙΙΙ (фиг. 54). См. статью ап δοΙιοοΕη и др., Βίοοά 112(5): 1704-12 (2008).
Для того, чтобы выяснить, какие типы клеток вовлечены в поглощение молекул γΡΎΙΙΙΡο, их выведение и ΡοΚη-опосредованный рециклинг, изобретателями изучено влияние удаления макрофагов и клеток Купфера на клиренс γΡΎΙΙΙΡο на моделях генноинженерных мышей.
Материалы и методы
Клиренс препаратов γΡΎΙΙΙΡο и γΡΎΪΙΙ (УВД - с удалённым В-доменом) сравнивали в 3 моделях мышей с нокаутом (ΚΟ) генов: (1) с гемофилией Α (ΡνΙΙΙ ΚΟ), дефицитных по ΡνΙΙΙ; (2) с двойным нокаутом (ΌΚΟ) по ΡΎΙΙΙ и ΎΑΡ, с недостатком экспресии ΡνΐΙΙ и ΎΑΡ; и (3) ΡοΚη-ΚΟ, с недостатком экспрессии ΡοΚη. Во всех трёх моделях макрофаги и клетки Купфера удаляли препаратом ΡΈΟΌΡΟ8ΟΜΕ® (Εηсар8и1а ΝιπιοδΥι^δ, Ιηο), который является токсичным аналогом АТФ (клодронат) инкапсулированный в липосомах, который специфически захватывается макрофагами путём фагоцитоза и запускает их апоптоз. См. статью νаη Κοο^η & Не^йкх, ΜеίЬοά8 Μοί. ΒίοΙ. 605:189-203 (2010).
Контрольные мыши в каждой группе получали нетоксичные липосомы ΕNСΑΡΟδΟΜΕ® (фиг. 55). Единственную дозу ΡΎΙΙΙ или γΡΎΙΙΙΡο (125 или 250 МЕ/кг) вводили за 24 ч до получения липосом. Образцы крови отбирали ретроорбитальным способом или из полой вены, кровь отбиралась в определённые промежутки времени (4 образца в одну временную точку).
Потом измерялась активность ΡνΙΙΙ человека в образцах плазмы хромогенным анализом ΡνΙΙΙ, а ΡΚ параметры оценивались с помощью программного обеспечения ΑΙΝΝΟΝΌΙΝ® (Ρ1ι;πδί§1ιΙ Согр.), включая анализ некомпартментальной модели. Удаление клеток Купфера и макрофагов определяли иммунохимическим окрашиванием и количественно измеряли программным обеспечением νίδίορίκιπη (Ηοе^δΙιοΙιη, ^еηта^к) или с помощью полимеразной цепной реакции обратной транскрипции (ПЦР-ОР). Результаты
(а) Удаление макрофагов и клеток.
Купфера: Фиг. 56 иллюстрирует репрезентативное окрашивание срезов печени антителами к !Ьа-1, специфичного маркера макрофагов, через 24 ч после контрольной обработки мышей с гемофилией А препаратом ΕNСΑΡδΟΜΕ® (А, А') или получения препарата ΡΈΟΌΡΟδΟΜΕ® (В, В'). Снимки А и А' показывают шаблоны количественного учёта, отмечающие окрашенные клетки Купфера (голубой цвет), общую область ткани (тёмно-синий цвет) и пустые области (серый цвет). Подобные профили удаления были получены и для других линий мышей. Количественный анализ положительно окрашенных областей показал, что >90% клеток Купфера печени были удалены и остались на низком уровне в течение 3
- 71 029560
дней после обработки препаратом СЬООКО8ОМЕ® (п=4) по сравнению с животными, обработанными контрольным препаратом ΕNСΛРδΟΜΕ® (фиг. 57). Циркуляция моноцитных клеток также была снижена на >50% в течение 24 ч после обработки препаратом СЬООКО8ОМЕ®, как определено цитометрическим анализом клеток крови, окрашенных меченными антителами к маркерам Р4/80+ (п=4). В течение 48 ч количество удалённых клеток восстанавливалось (фиг. 57). В соответствии с наблюдаемым удалением макрофагов в печени анализ ПЦР в режиме реального времени (ΚΤ-РСК) экспрессии маркера макрофагов - фрагмента эпидермального ростового фактора, содержащего муцин-подобный рецептор 1 (Етг1) (Р4/80), показал, что обработка препаратом СЬООКО8ОМЕ® снижала экспрессию Етг1 мРНК на >95% в печени и лёгких мышей с гемофилией А (фиг. 58). Етг1 - это обозначение, используемое для белка человека. Гомологичный белок мыши известен как Р4/80. Етг1 является трансмембранным белком, представленным на клеточной поверхности зрелых макрофагов.
(Ь) Клиренс препаратов РУШ на моделях мышей.
В противоположность ранее представленным результатам, которые полагали, что клетки Купфера играют роль в выведении белков РУШ и У\УР (уап 8с1юо1еп С1, и др. В1оо6. 112(5): 1704-12 (2008)), удаление клеток Купфера не привело к ожидавшемуся снижению клиренса РУШ у мышей с гемофилией А (фиг. 59). Наоборот, удаление клеток Купфера у мышей с гемофилией А значительно увеличили клиренс гРУШРс (фиг. 59). Аналогичным образом, у мышей ОКО удаление клеток Купфера не снизило клиренс РУШ, а значительно повысило клиренс гРУШРс (фиг. 60). У мышей РсКп-КО удаление клеток Купфера не повлияло на клиренс РУШ или гРУШРс (фиг. 61).
Выводы
Удаление макрофагов и клеток Купфера у мышей с гемофилией А и мышей ОКО (дефицитных по РУШ и У^Р) повысило клиренс гРУШРс, но не снизило клиренс РУШ, что указывает на то, что макрофаги и клетки Купфера могут отвечать за основное отличие клиренсов препаратов РУШ и гРУШРс в этих мышах. В отсутствие У\УР и РУШ (мыши ЭКО), удаление макрофагов и клеток Купфера повысило клиренс гРУШРс до уровней, достигнутых для РУШ.
Недостаточное влияние удаления клеток Купфера на клиренс РУШ у мышей с гемофилией А и мышей ОКО отличалось от данных ранее опубликованных исследований. См. статью νаη Кооуеп & Неп6пкх, Ме11юб8 Мо1. Вю1. 605:189-203 (2010). Удаление макрофагов и клеток Купфера у мышей РсКп-КО не привело к значительным отличиям клиренса между РУШ и гРУШРс, указывающим на потенциальную роль РсКп в макрофаг-опосредованном рециклинге молекул гРУШРс.
Вместе эти исследования показывают, что гРУШРс защищал организм независимым от макрофагов и/или клеток Купфера путём, и что естественный механизм регуляции этих клеток может влиять на опосредованный рециклинг препарата гРУШРс.
Пример 17. Приобретение иммунной толерантности к уже существующим антителам к фактору
УШ.
Очень вероятно, что пациенты, которые получают препарат гРУШРс предварительно лечились разными методами терапии препаратами гРУШ. У около 30% пациентов с гемофилией А образовывались антитела к РУШ, что является главной проблемой в действующей заместительной терапии с помощью РУШ. В настоящее время единственным утверждённым подходом достижения толерантности у пациентов, имеющих ингибиторы к РУШ, является введение им высоких доз РУШ в течение неопределённого периода времени, т.е. пока пациент не выработает устойчивость. Поэтому существует интерес определения того, могут ли низкие дозы гРУШРс направить в обратную сторону развитие иммуногенности РУШ путём ингибирования сигнальных механизмов Т- и В-клеток и сместить его в сторону развития толерантности. В этом исследовании мышам с 1 етА (возрастом 8-10 недель) будут инъекционно вводиться еженедельно в течение 5 недель препараты УВД-РУШ (XΥNΤНА®) или пр-РУШ (Λ^УАΤΕ®) в дозе 50 МЕ/кг. В образцах крови, отобранных у этих животных в определённые дни, как указано на схеме, будут определяться уровни содержания антител к РУШ. После индукции ингибирующих антител, животные будут инициироваться введениями 50 МЕ/кг препарата гРУШРс еженедельно в течение 5 недель. Это будет фазой развития толерантности. Снова будут определяться уровни содержания антител к РУШ в образцах крови, отобранных как указано. После прохождения фазы развития толерантности животным снова введут препараты XΥNΤНА® или Λ^УАΤΕ® в дозе 50 МЕ/кг, ещё четыре инъекции, и отобранные образцы крови будут проанализированы на наличие антител к РУШ. В случае успешного приобретения толерантности, второе применение препаратов ХУХША® или А^УАΤΕ® не приведёт к синтезу каких-либо антител к РУШ, что может указать на способность гРУШРс индуцировать иммунотолерантность к РУШ.
Пример 18. Адаптивная иммунотерапия Т-клеток и перенос иммунной толерантности.
Регуляторные Т-клетки Цгед) являются главными игроками в индукции и поддержании периферийной толерантности к РУШ и другим пептидным лекарственным средствам. Одним из ключевых исследований, использованных для определения наличия функциональной иммунной толерантности, является перенос ГОед клеток, изолированных у животных с приобретённой толерантностью реципиентам, которыем потом вводят высокие дозы препаратов РУШ. Наличием функционального переноса толерант- 72 029560
ности является свидетельство недостаточности или меньшей продукции антител у мышей, получивших дозу препарата.
В этом исследовании мышам с НетА (возрастом 8-10 недель) будут индуцировать толерантность введением 50 МЕ/кг гРУШРс или плацебо еженедельно в течение 4 недель (на 0, 7, 14, 21-й день) с последующими двумя инъекциями препарата на 35 и 53-й день. Образцы плазмы будут отбираться для определения уровней антител к РУШ с использованием метода ЕЫ8А. На 56-й день мыши без антител пройдут эвтаназию и их селезёнки будут изолированы. Спленоциты этих мышей будут собираться и переводиться в одноклеточные суспензии с использованием набора для изоляции спленоцитов (МШепу1 Вю1ес). Тгед клетки из общей массы спленоцитов будут отделяться с использованием набора для изоляции на основе магнитных гранул, меченных маркерами СЭ4 и СЭ25 мыши (МН1епуί Вю1ес). Изолированные Тгед клетки будут подсчитаны с применением счётчика клеток. Аликвота клеточной суспензии будет фиксироваться с помощью 3% раствора формалина для фенотипического анализа методом РАС8 при определения чистоты изолята. Тгед клетки потом будут в/в вводиться в мышам-реципиентам на 0-й день в количестве 1x10 клеток/мышь в 200 цЬ раствора. В 1-й день начала исследования животным будут вводиться дозы по 250 МЕ/кг гРУШРс с последующими повторными инъекциями еженедельно на 8, 15, 22 и 29-й день. Образцы крови будут отбираться на 15, 22, 29 и 36-й день для анализа плазмы на содержание антител к РУШ с использованием метода ЕЫ8А. В случае успешного переноса толерантности у мышей, получивших Тгед клетки от животных с приобретённой толерантностью, не будут образовываться антитела РУШ, тогда как у мышей, которым введут Тгедк клетки от доноров, получивших плацебо, обнаружатся антитела к РУШ.
Пример 19. Идентификация механизмов в индукции иммунной толераннтности к гРУШРс.
Исследования с дендритными клетками и макрофагами.
Одной из ключевых особенностей, отличающих гРУШРс от других лекарственных препаратов РУШ, является присутствие активной последовательности Рс, которая представляет собой естественно встречающийся компонент. Он может быть тем обуславливающим фактором, который подавляет иммунный ответ и вызывает реакцию развития иммунной толерантности. Молекулы Рс, присутствующие в 1§О и белке гРУШРс, способствуют взаимодействию с классическими рецепторами Рс 1дО и РсКп. Среди Рсрецепторов подтип РсуКПЪ (РсуК2Ъ) представляет собой ингибирующий рецептор и передачей супрессирующих сигналов, которые сдерживают активацию типов клеток, несущих этот рецептор. Рс-рецепторы, включая РсКп, главным образом локализованы в антиген-репрезентирующих клетках (АРС - дендритные клетки, макрофаги и В-клетки), но не Т-клетках. Поэтому, вероятно, что молекулы гРУШРс могут задействовать рецепторы РсК2Ъ и/или РсКп в этих клетках для активации развития у них толерогенного фенотипа.
Для установления того, вовлекаются ли рецепторы РсК2Ъ и/или РсКп в дендритных клетках и макрофагах в развитие толерогенного фенотипа, будут проводиться следующие эксперименты.
1. Идентификация маркеров по мРНК и уровню содержания клеточных поверхностных (белков) в клеточных линиях макрофагов мышей, макрофагов и дендритных клеток селезёнки, которые регулируются гРУШРс, в сравнении с только одним РУШ или мутантной формой гРУШРс, которые не взаимодействуют с Рс-рецепторами.
2. Сверхэкспрессия и нокдаун белков РсдК2Ъ или РсКп в клеточной линии макрофагов мышей КАУ 264.7 и изучение влияния гРУШРс на эти рецепторы исследованием последующих мишеней каскада.
3. Идентификация возможного вовлечения других важных механизмов, таких как опосредованная рецепторами ТЬК передача сигналов в клетках АРС в ответ на молекулы гРУШРс.
Пример 20. Альтернативные пути для индукции толерантности.
Иммунная толерантность к гРУШРс может также быть достигаться через мукозальный путь введения препаратов (через слизистые оболочки). Двумя возможными местами индуцирования толерантности является гастроэнтеральная и респираторная слизистые оболочки. Можно индуцировать оральную толерантность к гРУШРс или путём скармливания животным кормов или использованием искусственного вскармливания через зонд, для доставки молекул к желудочно-кишечной слизистой оболочке. Слизистая кишечника обладает специализированными вторичными лимфоидными органами, называемыми Пейеровыми бляшками, которые содержат антиген-репрезентирующие клетки (АРС), что представляет возможность для участия в регуляторных иммунных реакциях. Эти АРС могут синтезировать антигены и активировать специфические субпопуляции дендритных клеток и Тгедк клеток, которые могут перемещаться в другие области организма и программировать другие клетки иммунной системы для подавления иммунного ответа на присутствии антигена, в нашем случае экзогенно вводимого РУШ. Этот феномен может быть опосредован взаимодействиями Рс с рецепторами РсКп и/или РсдК2Ъ, представленными на клетках АРС иммунной системы слизистой кишечника. Для слизистой оболочки дыхательных путей может быть сообщена толерантность путём ингаляции аерозолей гРУШРс, которая может обеспечиваться теми же механизмами, что и в кишечнике.
Определение того, может ли иммунная толерантность быть достигнута через мукозальный путь,
- 73 029560
препараты ХУЯТНА® или АОУАТЕ® будут вводиться пероральным путём или через аерозоль мышам с кетА. После индукции ингибирующих антител, животные будут инициироваться введениями препарата гРУШРс. Это будет фазой развития толерантности. Уровни содержания антител к РУШ будут определяться в образцах крови, отобранных согласно указаниям. После прохождения фазы развития толерантности животным снова введут препараты ХУЯТНА® или АОУАТЕ® и отобранные образцы крови будут проанализированы на наличие антител к РУШ. В случае успешного приобретения толерантности, второе применение препаратов ХУЯТНА® или АОУАТЕ® не приведёт к синтезу каких-либо антител к РУШ, что может указать на способность гРУШРс индуцировать иммунотолерантность к РУШ после мукозального введения препаратов.
Пример 21. Иммунотолерантность к другим факторам свёртывания.
Для установления того, может ли иммунотолерантность обеспечиваться добавлением Рс-части к активным фрагментам факторов свёртывания отличным от РУШ, созданы химерные полипептиды, содержащие фактор свёртывания РУ11а связанный с Рс (гРУПаРс) или фактор свёртывания Р1Х связанный с Рс (гР1ХРс). Выполнены клонирование, экспрессия и очистка белков гРУПаРс и гР1ХРс согласно способов, известных в этой сфере знаний. Определены биохимические, биофизические и фармакокинентические свойства белков гРУПаРс и гР1ХРс как описано в примерах выше и/или с использованием способов, известных в этой сфере знаний. Проведены исследования по иммунотолерантности и оцениванию образования антител к белкам гРУПаРс и гР1ХРс по сравнению с коммерческими препаратами факторов свёртывания, как представлено в вышеприведённых примерах. Химерные полипептиды, содержащие активные фрагменты факторов свёртывания и действующую Рс-часть, такие как гРУПаРс и гРРХРс, способны эффективно индуцировать иммунотолерантность к немодифицированным факторам свёртывания (т.е. Р1Х или РУ11 без Рс-части).
Пример 22. Трансплацентарный перенос иммунной толерантности к РУШ с использованием гРУП1Рс.
Целью этого изучения было определение того, может ли введение гРУШРс беременным мышам обеспечить перенос этих молекул через плаценту плоду (благодаря взаимодействию Рс-части с РсКп рецептором на плацентарных клетках), и может ли воздействие гРУШРс на иммунную систему плода на ранней стадии развития привести к получению толерантности программированием тимуса на распознавание РУШ, как собственного антигена, и не приводить к развитию на него иммунной реакции. Беременным мышам внутривенно инфузионно вводили с помощью ретроорбитальной инъекции на 16-й день вынашивания одну дозу (6 Ед) препарата гРУШРс или ХУЯТНА® или две дозы (по 6 Ед каждая) инъекцией в хвостовую вену на 15 и 17-й дни вынашивания. Иммуногенность препарата ХУЯТНА® оценивалась на новоожденных мышатах, родившихся у иммунизированных мышей, до достижения ими зрелости (в возрасте 6-9 недель). 16-й день беременности был выбран потому, что он совпал с временем развития аутоиммунной регуляторной молекулы, А1КЕ, которая играет ключевую роль в удалении аутореактивных Т-клеток из тимуса. Результаты показали, что первый эксперимент, в котором тестировалось дозирование беременным мышам однократной инфузией препаратов гРУШРс или ХУЯТНА® на 16-й день вынашивания, родившиеся у беременный мышей, получавших препарат гРУШРс, мышата статистически значимо имели более низкие титры Бетесда к препарату ХУЯТНА® по сравнению с мышатами, родившимися у беременный мышей, получавших ХУЯТНА® (фиг. 62). Во втором эксперименте, в котором тестировалось дозирование беременным мышам препаратов на 15 и на 17-й день вынашивания, родившиеся у беременный мышей, получавших препарат гРУШРс, мышата статистически значимо имели более низкие титры Бетесда к препарату ХУЯТНА® по сравнению с мышатами, родившимися у котрольных самок, и отмечена тенденция к меньшим титрам антител по сравнению с мышатами, родившимися у самок, получавших ХУЯТНА® (фиг. 63).
Путём обнаружения активности РУШ у мышат, рождённых у иммунизированных самок, будет определён трансплацентарный перенос белка (гРУШРс) от материнского контура кровообращения к контуру плода. Функционирование на уровне Т-клеток будет оцениваться определением профилей Т-клеток и исследованиями переноса от мышат с приобретённой толерантностью к гРУШРс.
Пример 23. Препарат гРУШРс регулирует появление толерогенных маркеров к антигенрепрезентирующим клеткам.
Материалы и методы
Мыши: мыши (С57ВБ/6) с гемофилией А (НетА), несущие нокаут экзона 16 гена РУШ на фоне 129хВ6 (В1, Ь., ЬаМег, А.М., Аηΐοηа^ак^8, 8.Е., Шдк, К.А., Оеагкай, Ю., и Ка/а/хащ Н.Н., 1г. 1995. Тагде!ек άίδΐυρΠοη οί !ке тоизе Рас!ог УШ дене ргокисез а токе1 οί каеторЫка А. Яа! Оене1 10:119-121) были получены у д-ра Х. Казазияна (Университет штата Пенсильвания, г. Филадельфия, штат Пенсильвания, США) и поддерживались в виде воспроизводимой колонии в лаборатории изучения гемофилии Вюдеη Мес или в лаборатории Скаг1е§ КЫег. Все процедуры, связанные с животными, одобрены требованиям Институциональным Комитетом по уходу за животными и их использованию (1АСИС) и выполнялись на основании "Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных".
Антитела и реактивы: антитела, используемые для окрашивания и проточной цитометрии были по- 74 029560
лучены в компании ВО Вюкаепсек (РгапкЬп Ьакек, Νί, υδΑ) или еВюкаепсе (8ап О1едо, СΑ, υδΑ). Использованные антитела были направлены против поверхностных маркеров мыши, таких как СО4 и Ρϋ-1 (Т-хелперные клетки), СО11с, СО80 и РО-Ь1 (дендритные клетки) и СО25 (клетки Тгед), внутриклеточных цитокинов (1Ь-2, 1Ь-4, ТИР-а) и факторов транскрипции (Рохр3). Реактивы для внутриклеточного окрашивания цитокинов и факторов транскрипции были приобретены в компании ВО Вюкйепсек. Рекомбинантный белок РУШРс с удалённым В-доменом (гРУШРс) и рекомбинантный белок РУШ с удалённым В-доменом (гРУШ) были синтезированы как описано авторами Ре1егк и др. (Ре1егк, К.Т., ТоЬу, О., Ьи, р., Ши, Т., Ки1тап, Ю., Ьоте, 8.С., ВЬопЬ, Α.Ρ, апй Р1егсе, О.Р. 2012. ВюсЬетюа1 апй ГипсЬопа1 сЬагайеп/айоп оГ а гесотЬшай топотепс Райог УШ-Рс Гикюп рго1еш. ί. ТЬготЬ НаетокЕ ОО1: 10.1111/]1к. 12076).
Другие лекарственные субстанции фактора УШ, а именно гУВД РУШ XΥNΤΗΑ® (Ауей РЬагтасейюа1к, РЫ1айе1рЫа, ΡΑ, υδΑ), и полноразмерный РУШ Α^VΑΤΕ® (Вах1ег НеаЬЬсаге СогрогаЬоп, АекЙаке УШаде, СΑ, υδΑ) приобрели и приготовили согласно руководств производителей.
Индукция иммунизации/толерантности у мышей: Три группы лечения, состоящие из самцов мышей возрастом 8-10 дней с ΗетΑ получали внутривенные инъекции в дозах 50, 100 или 250 МЕ/кг, которые вводили на 0, 7, 14, 21, 35 и 53-й дни. Проводили каждое лечение 10 мышам, и им производили введение при каждом уровне дозы. Образцы крови собирали методом ретроорбитального кровоотбора на 0 (предварительный кровоотбор), 14, 21, 28 и 42-й дни и использовали их для отделения плазмы и определения уровней содержания антител к РУШ методом ΕΕΙδΑ. Животным ещё раз вводили препараты на 53-й день, животных подвергали эвтаназии на 56-день путём ингаляции СО2 и вырезанные селезёнки помещали в стерильный фосфатно-солевой буфер (РВ8). Спленоциты разделяли с использованием набора для разрушения селезёнки и устройства для мягкого разрушения биологических тканей МΑСδ (Мйепу1 Вю1ес, Со1одпе, Оегтапу). Одноклеточные суспензии фиксировали 3% раствором формалина (Войоп ВюРгойийк) для окрашивания при анализе ΡΑСδ или хранили в буфере для разрушения для выделения РНК (КосЬе Αрр1^ей δс^еηсе, 1пй1апароЬк, ΙΝ). Для определения иммунной толерантности мышам первоначально вводили по 50 МЕ/кг препарата на 0, 7, 14, 21 и 35-й день. После подтверждения отсутствия антител к РУШ на 42-й день этим мышам вводили 250 МЕ/кг гРУШРс раз в неделю, т.е. на 49, 56, 63 и 70-й день (0, 7, 14 и 21-й день после повторного введения). Животных подвергшихся разовому введению исследовали на уровни содержания антител к РУШ в пробах крови на 14, 21 и 28-й день. Антитела к РУШ, определяемые методом ΕΕΙδΑ. Следующий протокол исследования был разработан в лаборатории Вюдеп 1йес по изучению гемофилии. Перед анализом все образцы плазмы прогревали на водяной бане до 56°С для инактивации остаточных факторов коагуляции, введённых при лечении, и антикоагуляционных ферментов, способных разрушить нанесённые на планшеты стандарты. На 1-й день 96-луночный планшет для микротитрования с высокой способностью связывания (ТЬегто 1тти1оп 2НВ) покрывался 1 мкг/мл (100 мкл/лунка) РУШ с удалённым В-доменом в 0,05 М растворе карбоната натрия, рН 9,6 и инкубировался в течение ночи (12-18 ч) при температуре 4°С. На следующий день супернатант удаляли, и планшет промывали 4 раза с помощью РВ8Т (забуференного фосфатно-солевого раствора, содержащего 0,05% Твин 20). Поверхность планшета потом блокировали с помощью 200 мкл РВ8Т, содержащего инактивированный нагреванием 10% раствор сыворотки лошади, рН 7,4, в течение 60 мин при комнатной температуре. Стандартным образцом, использованным для определения 1дО мыши, был поликлональный пул моноклональных антител к РУШ, приготовленный смешиванием равного количества антител ОМΑ8002 (Α1), ОМΑ8008 (С2), ОМΑ8011(С1), ОМΑ8015(Α2), ОМΑ8016 (А2), ОМΑ8005 (А1/А3). Все моноклональные антитела были получены в компании Огееп Моийаш Αй^Ьοй^ек, 1пс, ВигЬпдйп, УТ с эпитопами РУШ-доменов, показанных в скобках. Испытуемые образцы плазмы мышей разбавляли блокирующим буфером и содержали такие же концентрации прогретой плазмы, как и стандартные образцы. Блокирующий буфер потом удаляли и разбавленные стандарты добавляли по 100 мкл/лунка в двух повторениях. Планшет инкубирвали в течение 2 ч при 37°С встряхиванием на орбитальной мешалке. После промывания 4 раза РВ8Т по 100 мкл/лунка добавляли коньюгат 1дО козла-НКР против 1дО мышей, разбавленный блокирующим буфером 1:20000 и инкубировали планшет в течение 60 мин при 37°С, встряхивая на орбитальной мешалке. Планшет снова промывали 4 раза РВ8Т и потом добавляли по 100 мкл/лунка ТМВ и инкубировали при комнатной температуре 5-10 мин. Результаты определения считывали на ОП при длине волны 650 нм с помощью устройства считывания планшетов.
Анализ активности Бетесда для определения титров нейтрализующих антител: Этим анализом определяли титр антител нейтрализующих РУШ в полученных образцах плазмы. Схематично анализ выполнялся смешиванием образцов плазмы с известными концентрациями рекомбинантного препарата РУШ и инкубированием в течение 2 ч при 37°С. Остаточная активность этой смеси определялась с использованием набора Соа1ей РУШ 8Р в присутствии фактора 1Ха, фактора Х, фосфолипидов и СаС12. Активность РУШ рассчитывали с применением стандартной кривой для активности РУШ, построенной с использованием гРУШ в отсутствии каких-либо ингибиторов.
Окрашивание для анализа ΡΑСδ: Определение профиля ответа Т-клеток и дендритных клеток проводили на выделенных спленоцитах мыши. Лимфоциты и дендритные клетки селезёнки окрашивали по
- 75 029560
поверхностным и внутриклеточным мишеням. Для поверхностного окрашивания общее количество 1х106 спленоцитов инкубировали с антителами подходящих концентраций. Для внутриклеточного окрашивания, клетки делали проницаемыми с помощью раствора ВО Р1х-Регт (ВО Вюкшепсек) с их последующей инкубацией с антителами к цитокинам в этом же буфере. Окрашивание молекул Рохр3 выполнялось с использованием антител в буферном растворе для окрашивания Рохр3 (ВО Вюкаепсек). Интенсивность флуоресценции записывали с использованием прибора ВО РАС8 Сап1о II, анализ данных выполнялся, используя программное обеспечение РЬО\ГО. Лимфоциты совместно окрашивали с СЭ4рецепторами и внутриклеточными маркерами ГО-2, ТОТ1-» и ГЕ-4. У регуляторных Т-клеток (Тгед) окрашивали поверхностные маркеры СГО4 и СЭ25 с последующим окрашиванием внутриклеточных маркеров Рохр3. Спленоциты окрашивали на присутствие маркеров СГО11с и РЭ-П (дендритные клетки) или СЭ4 и РЭ-1 (СЭ4+ Т-клетки) для идентификации клеток, вовлечённых в механизм взаимодействия РЭ-П-РЭ1.
Анализ ПЦР в режиме реального времени и ПЦР в режиме реального времени на основе микрочипов: всё количество РНК выделяли с использованием набора для выделения РНК (КосЬе АррНеб 8с1епсе, ЫЛапароНк, ΕΝ) и на ней синтезировали кДНК с помощью обратной транскрипции ^адеп, Нббеп, Сегтапу). Праймеры изучаемых генов для ПЦР в режиме реального времени были разработаны с использованием доступных онлайн алгоритмов на веб-сайте компании ГОТ 1есЬио1од1ек (\у\у\улб1бпа.сот) и были приобретены в компании ГОТ 1есЬио1од1ек (СогаГОШе, ^). ПЦР в режиме реального времени с использованием красителя 8УВК дгееп выполнялась на системе ОиапШес! ^адеп, Нббеп, Сегтапу) с применением оборудования для ПЦР в режиме реального времени АШ 7900 Рак1 В1оск (АррНеб Вюкук1етк, Рок1ег Сбу, СА). Для ПЦР в режиме реального времени на основе микрочипов 500 нг кДНК смешивали с мастер-микс-раствором для количественной ПЦР на основе красителя 8УВК дгееп и аликвоты распределяли в 96-луночном планшете с набором микрочипов (РАММ0472, Т-се11 Апегду апб Iттипе То1егапсе РСК Аггау; 8А Вюкаепсек, Ргебепск, МО, И8А). Реакции выполнялись с применением оборудования для ПЦР в режиме реального времени АВI 7900 Рак1 В1оск (АррНеб Вюкукйтк, Рок1ег Сбу, СА). Результаты анализировали с использованием программного обеспечения 7500 версии 2.0.5 и соответствующие уровни генных транскриптов были измерены эндогенными конститутивными генами в качестве контроля, используя относительный метод количественного определения 2-ААС1 (Ыуак, Кб., апб 8сЬт111деп, ТГО. 2001. Апа1ук1к оЕ ге1абуе депе ехргеккюп ба1а икшд геа1-бте сщапШаНуе РСК апб 1Ье 2(ГОе11а ЭеНа С(Т)) Ме1Ьоб. Ме1Ьобк 25:402-408.). Конститутивные гены, которые использовались для нормализации были такие: САРЭН, НРКТ, Нкр90аЬ, Ье1а-асбп и СикВ. Для каждого образца средние значения пороговых циклов (С1) для конституитивных генов были взяты вместе и использованы для расчёта АС1. мРНК, для которых получены С1 >35 исключали из анализа данных.
Пролиферация Т-клеток и определение уровней содержания интерферона-γ (ΣΕΝ-γ): мышам с НетА (возрастом 8-10 недель) инъекционно вводили лекарственные субстанции РУШ раз в неделю в течение 2 недель. Через семдесят два часа после второй инъекции мышей эвтанизировали и собирали перитонеальные макрофаги промыванием стерильным раствором РВ8. Т-клетки селезёнки выделяли, используя магнитные гранулы набора для выделения СГО4+ Т-клеток мышей (Мб1епу1 Вю1ес, Сегтапу). Т-клетки метили 10 мкМ раствором карбоксифлуоресцеин-сукцинимидилового эфира (СР8Е) Дпубгодеп, Саг1кЬаб, СА) в тёплом растворе РВ8 в течение 15 мин и помещали на 96-луночные планшеты с поверхностью с ультранизкой адгезией (Согшпд) вместе с перитонеальными макрофагами с плотностью 1х10 клеток в мл в каждую лунку. Клетки инкубировали с 0,1; 1 и 10 нМ раствором гРУШ, плацебо или микрогранулами СН3/СН28 (положительный контроль, Мб1епу1 Вю1ес) в питательной среде Х-У!УО 15 (Еоп/а), содержащей костимулирующие антитела, а именно антитела к СГО28 и СГО49б (ВО Вюкаепсек), в течение 96 ч при 37°С. В конце инкубации в супернатанте культуры проводили измерения набором для ЕЫ8А компании Меко 8са1е Эеуюек (М8Э). Пролиферация Т-клеток определялась измерением интенсивности флуоресценции СР8Е (средней интенсивности флуоресценции - МРЦ проходящих Т-клеток, используя метод РАС8 (ВО РАС8 САЭТО II) при прямом и боковом рассеянии излучения.
Статистический анализ: статистический анализ результатов выполнен с использованием одностороннего критерия Стьюдента (Т-тест) и критерия Манн-Уитни (Т-тест). Статистически значимыми считали Р-значения <0,05.
Результаты: дендритные клетки являются специализироанными антиген-репрезентирующими клетками и несут ключевые молекулы и ферменты, которые являются главными в направлении иммунного ответа в сторону развития толерантности. Спленоциты, полученные у мышей с ЬетА, которым вводили лекарственные субстанции РУШ или плацебо, окрашивались по маркерам СГО11с и молекулам главного комплекса гистосовместимости (МНС) II класса для учёта дендритных клеток. Совместным окрашиванием со специфическими антителами к этим молекулам был идентифицирован набор дендритных клеток селезёнки, экспрессировавших такие маркеры как СЭ80, поверхностный маркер, активизирующийся у зрелых дендритных клеток, что указывает на более выраженную презентацию антигена, и СГО274 (РЭЬ1), лиганд РЭ-1 рецептора. Как показано на фиг. 63А спленоциты, отобранные у мышей с НетА, получавших по 100 МЕ/кг препаратов гРУШРс или УВД-РУШ, показали значительное снижение процентного
- 76 029560
содержания дендритных клеток, экпрессирующих маркеры СЭ80. что предположительно вызвано избытком незрелых дендритных клеток.
Хотя мыши, получавшие препарат пр-РУШ показали снижение процентного содержания СЭ80+ дендритных клеток по сравнению с плацебо, этот факт не был статистически значимым (фиг. 64А). Эта тенденция была схожей для мышей, получавших дозу гРУШРс 50 МЕ/кг. При дозах 250 МЕ/кг все три типа лечения не выявили отличий в процентном содержании ί'.Ό80+ дендритных клеток среди спленоцитов. Результаты анализов методом РАС8 дендритных клеток селезёнки, экспрессирующих маркеры ί'.Ό274 (РО-Ы), выявил, что препарат гРУШРс в дозе 100 МЕ/кг, повышал процент таких клеток по сравнению с плацебо и другими типами лечения препаратами РУШ (фиг. 64В). Как показано анализом ПЦР в режиме реального времени эта молекула также регулировалась на уровне мРНК с помощью препарата гРУШРс (фиг. 64С). Этот факт вызывает предположение, что молекулы гРУШРс регулируют механизм Р0-Ь1:Р0-1 - один из ключевых иммуносупрессорных механизмов, таким образом снижая иммуногенность к белкам РУШ. Кроме маркеров СЭ274, гРУШРс также повышает уровни мРНК индоламин-2,3диоксигеназы (ГОО) - ключевого фермента, который регулирует пролиферацию и активацию Т-клеток, влияя на метаболизм триптофана (фиг. 64Ό).
Пример 24. Препарат гРУШРс в низких дозировках усиливает экспрессию маркеров иммунной толерантности и анэргию спленоцитов.
Экспериментальные методики проводились согласно материалам и методам, описанным в примере 23.
Для идентификации маркеров иммунной толерантности, индуцированной гРУШРс, был применён метод ПЦР в режиме реального времени на основе микрочипов, направленный на выявление специфических для иммунной толерантности и анэргии клеток генов (8А Вюзаепсез). Для идентификации новых элементов отклика, активированных лекарственной субстанцией, использовали мРНК, выделенную у спленоцитов, полученных у мышей, которым вводили препарат гРУШРс по 50 и 250 МЕ/кг и плацебо.
Кандидатов идентифицировали на основе их уровня экспрессии (2-х кратное превышение или понижение по сравнению с плацебо) и расчёте р-значений на основе критерия Стьюдента (<0,05). Относительную экспрессию каждого гена измеряли, используя метод расчёта 2-ДС| (Шак, К.Р, апб 8с1ип111деп„ Т.Э. 2001. Апа1уз1з о£ ге1абуе депе ехргеззюп ба1а изшд геа1-бте сщапШабуе РСК апб 1Не 2(-Эе11а ШеНа С(Т)) Мебюб. Мебюбз 25:402-408) после нормализации средних значений С1 набора из 5 конститутивных генов (см. пример 23, Материалы и методы).
На основании этих критериев выполненный анализ на микрочипах выявил кандидатов, которые преимущественно регулировались на уровне спленоцитов белком гРУШРс в дозе 50 МЕ/кг, по сравнению с введением мышам плацебо и дозы препарата 250 МЕ/кг (фиг. 65 и 66). Эти результаты включали статистически значимые повышения активности генов, специфических для развития толерантности, таких как Рохр3, СТЬА-4 и СЭ25; генов, связанных с развитием анэргии, таких как Едг2, Эдка и СВЬ-В; генов, принадлежащих к суперсемейству фактора некроза опухолей (Т№К8Р); простагландин-синтазе-2 (РТО82) и рецептору простагландина Е2 (РТОЕК2) (см. фиг. 66). И наоборот, с использованием микрочипов идентифицированы некоторые гены, понижающие активность, известные как относящиеся к провоспалительным молекулам, таким как ССЬ3 и 8ТАТ3 (фиг. 66).
Эти результаты указывали на наличие толерогенных механизмов и толерогенного микроокружения у спленоцитов и животных, получавших дозы 50 МЕ/кг препарата гРУШРс. Эти профили экспрессии генов, определённых с использованием микрочипов, были валидированы используя ПЦР в режиме реального времени с парами индивидуальных праймеров для идентифицированных кандидатов.
Пример 25. Пролиферирующие и синтезирующие высокие уровни ΙΕΝ-γ СЭ4+ спленоциты, выделенные у группы мышей, получавших 250 МЕ/кг препарата.
Экспериментальные методики проводились согласно материалам и методам, описанным в примере 23.
Исследования пролиферации Т-клеток проведено для изучения специфических реакций Т-клеток на фактор УШ ех νίνο. СЭ4+ Т-клетки, изолированные у мышей, получавших две еженедельные инъекции по 50 или 250 МЕ/кг гРУШРс, метили красителем СР8Е, разбавляли перитонеальными макрофагами (антиген-репрезентирующие клетки, АРС) и инкубировали в присутствии препарата гРУШ с удалённым Вдоменом в трёх концентрациях 0,1; 1 и 10 нМ.
Анализ пролиферации методом РАС8 на основе сигналов разбавления СР8Е выявил, что Т-клетки из групп животных, получавших препарат гРУШРс в дозе 250 МЕ/кг, показали дозозависимое увеличение пролиферации, которое было статистически значимым при концентрации 10 нМ (фиг. 67). Помимо этого, Т-клетки мышей, получавших 50 МЕ/кг препарата гРУШРс не показали статистически значимого повышения пролиферации при возрастании концентраций гРУШ ех νίνο по сравнению с плацебо (фиг. 67).
Уровни содержания интерферона (ΙΕΝ) измеренные в супернатантах культур таких инкубирований выявили подобный профиль схемы пролиферации Т-клеток, т.е. дозозависимое увеличение секреции Тклеток, полученных у мышей, получавших 250 МЕ/кг препарата гРУШРс (фиг. 68А), тогда как измене- 77 029560
ний уровней содержания Т-клеток у мышей, получавших 50 МЕ/кг препарата гРУГГГРс, не было (фиг. 68В). Для того, чтобы вскрыть механизм(ы) действия препарата гРУГГГРс в подавлении иммунного ответа к РУГГГ, мы применили две мутантные конструкции: одна -не связывающая рецептор Рсу (названная гРУШРс-Ы297А) и другая - с недостатком связывания рецептора РсКп (названная гРУГГГРс-ГНН). Эти конструкции использовались для идентификации взаимодействий гРУГГГРс одного из этих рецепторов связывания в обеспечении иммуносупрессорного действия. С этой целью изобретателями изучался профиль секреции ГРЫу Т-клетками, выделенными у мышей, получавших две еженедельные инъекции препарата гРУШРс-Ы297А в дозе 250 МЕ/кг (фиг. 68С) и 50 МЕ/кг (фиг. 68Ό).
Непосредственное сравнение секреции ГРЫу Т-клетками, выделенными у мышей, получавших дозы 250 МЕ/кг препаратов гРУГГГРс и гРУШРс-Ы297А, выявило, что уровни содержания цитокинов были сильно снижены у Т-клеток животных, получавших мутантную молекулу, хоть и были значительно выше уровней в сравнении с плацебо. Тем не менее, уровни содержания ГРЫу в группе, получавшей 50 МЕ/кг мутантного белка, не показали статистически значимого отличия от дозы 50 МЕ/кг препарата гРУГГГРс. Этот факт наталкивает на предположение, что высокий уровень образования антител и пролиферация Тклеток, наблюдаемая при высоких дозах гРУГГГРс, может быть результатом взаимодействий доменов Рс с рецепторами Рсу, которые блокируются Рсу несвязывающимся с мутантным белком.
Вышеизложенное описание специальных осуществлений изобретения должно столь полно раскрыть общую природу этого изобретения, что другие исследователи, применив знания в пределах компетентности в этой области техники, могут легко модифицировать и/или внедрить различные применения таких специальных осуществлений, без излишних экспериментов, не отходя от общего принципа данного изобретения. Поэтому, подразумевается, что такие адаптации и модификации, находятся в пределах значения и диапазоне эквивалентов раскрытых осуществлений изобретения, на основе знаний и руководств, представленных в этой заявке. Следует понимать, что фразеология или терминология, представленная в этой заявке, приводится с целью описания, но не является ограничивающей, так что эту терминологию и фразеологию данных параметров следует интерпретировать компетентным изобретателем в свете наставлений и руководств.
- 78 029560
Таблица 1. Полинуклеотидные последовательности
А. гРУШРс с удалённым В-доменом.
(ΐ) Цепь ДНК последовательности белка РУШРс с удалённым В-доменом (подчёркнут сигнальный пептид РУШ, Рс-участок выделен жирным шрифтом) (последовательность 8ЕЩ ГО №1, кодирующая последовательность 8НС) ГО №2).
661_а тесАААТАел естстсслсс тесттстттс
721 тетесстттт есеАттстес тттлетессА сса6аа6ата стлсстееет еслетееААС 781 Т6ТСАТ666А СТАТАТеСАА А6Т6АТСТС6 6Т6А6СТ6СС Т6Т66АС6СА А6АТТТССТС 841 СТА6А6Т6СС ААААТСТТТТ ССАТТСААСА ССТСА6ТС6Т 6ТАСААААА6 АСТСТ6ТТТ6 901 ТА6ААТТСАС 66АТСАССТТ ТТСААСАТС6 СТАА6ССАА6 6ССАСССТ66 АТ666ТСТ6С 961 ТА66ТССТАС САТССА66СТ 6А66ТТТАТ6 АТАСА6Т66Т САТТАСАСТТ АА6ААСАТ66
1021 СТТСССАТСС Т6ТСА6ТСТТ САТ6СТ6ТТ6 6Т6ТАТССТА СТ66ААА6СТ ТСТ6А666А6 1081 СТ6ААТАТ6А Т6АТСА6АСС А6ТСААА666 АбАААбААбА ТбАТАААбТС ТТСССТ66Т6 1141 еААессАТАС Атлтетстее слеетсстел ААелеААтее тссААтеесс тстелсссАС 1201 тетессттлс стастсатат стттстслте теелсстеет ААААелстте ААТтслеесс 1261 ТСАТТ66А6С ССТАСТА6ТА Т6ТА6А6АА6 66А6ТСТ66С СААССААААС АСАСАСАССТ 1321 ТССА.САААТТ ТАТАСТАСТТ ТТТССТСТАТ ТТСАТСААСС СААЛЛСТТСе САСТСАСААА 1381 САААСААСТС СТТ6АТ6СА6 6АТА666АТ6 СТ6САТСТ6С ТС666ССТ66 ССТААААТСС 1441 АСАСАСТСАА Т66ТТАТ6ТА ААСА66ТСТС Т6ССА66ТСТ 6АТТ66АТ6С САСАССАААТ 1501 СА6ТСТАТТ6 6САТ6Т6АТТ 66ААТ666СА ССАСТССТСА А6Т6САСТСА АТАТТССТСС 1561 АА66ТСАСАС АТТТСТТ6Т6 АССААССАТС 6ССА66С6ТС СТТ66АААТС ТССССААТАА 1621 СТТТССТТАС ТССТСАААСА СТСТТ6АТ66 АССТТ66АСА 6ТТТСТАСТ6 ТТТТСТСАТА 1681 ТСТСТТСССА ССААСАТСАТ 66САТ66АА6 СТТАТСТСАА АСТАСАСАСС Т6ТССА6А66 1741 ААССССААСТ АССААТСААА ААТААТСААС ААССССААСА СТАТ6АТ6АТ 6АТСТТАСТ6 1801 АТТСТСАААТ 66АТ6Т66ТС А66ТТТ6АТ6 АТСАСААСТС ТССТТССТТТ АТССАААТТС 1861 6СТСА6ТТ6С СААСААССАТ ССТААААСТТ 666ТАСАТТА САТТ6СТ6СТ 6АА6А66А66 1921 АСТ666АСТА ТССТСССТТА 6ТССТС6ССС СС6АТ6АСА6 ААСТТАТААА АСТСААТАТТ 1981 Т6ААСААТ66 СССТСА6С66 АТТ66ТА66А АСТАСААААА А6ТСС6АТТТ АТСССАТАСА 2041 САСАТСАААС СТТТААСАСТ С6Т6АА6СТА ТТСА6САТ6А АТСАССААТС ТТ666АССТТ 2101 тлстттАтее ссаасттсса елсАСАСтет тсаттататт таасаатсаа 6САА6СА6АС 2161 САТАТААСАТ СТАСССТСАС 66ААТСАСТ6 АТ6ТСС6ТСС ТТТСТАТТСА АССАСАТТАС 2221 САААА66Т6Т ААААСАТТТС АА66АТТТТС СААТТСТССС АССАСАААТА ТТСАААТАТА 2281 ААТ66АСА6Т САСТСТАСАА 6АТ666ССАА СТАААТСАСА ТССТС66Т6С СТ6АССС6СТ 2341 АТТАСТСТАС ТТТССТТААТ АТ66А6А6А6 АТСТАССТТС А66АСТСАТТ 66СССТСТСС 2401 ТСАТСТеСТА САААСААТСТ СТАСАТСААА САССАААССА САТААТСТСА САСААСАССА 2461 АТеТСАТССТ 6ТТТТСТ6ТА ТТТ6АТ6А6А АСС6АА6СТ6 СТАССТСАСА САСААТАТАС 2521 ААСеСТТТСТ ССССААТССА 6СТ66А6Т6С А6СТТ6А66А ТССА6А6ТТС СААСССТССА 2581 АСАТСАТеСА САССАТСААТ 66СТАТ6ТТТ ТТ6АТА6ТТТ 6СА6ТТ6ТСА 6ТТТ6ТТТ6С 2641 АТ6А66Т66С АТАСТееТАС АТТСТААССА ТТ66А6САСА 6АСТ6АСТТС СТТТСТСТСТ 2701 ТСТТСТСТее АТАТАССТТС АААСАСАААА Т66ТСТАТ6А АСАСАСАСТС АСССТАТТСС 2761 САТТСТСА66 АСАААСТСТС ТТСАТ6ТС6А ТССААААССС А66ТСТАТ66 АТТСТ6666Т 2821 еССАСААСТС А6АСТТТС66 ААСАСАСССА Т6АСС6ССТТ АСТ6АА66ТТ ТСТА6ТТ6Т6 2881 АСААСААСАС Т66Т6АТТАТ ТАССАССАСА СТТАТСААСА ТАТТТСАССА ТАСТТ6СТ6А 2941 еТАААААСАА Т6ССАТТ6АА ССААСААССТ ТСТСТСАААА СССАССАСТС ТТ6АААС6СС 3001 АТСААС666А ААТААСТССТ АСТАСТСТТС АСТСАСАТСА А6А66АААТТ 6АСТАТ6АТ6 3061 АТАССАТАТС А6ТТ6АААТ6 ААСААССААС АТТТТСАСАТ ТТАТ6АТ6А6 САТСААААТС 3121 А6А6ССССС6 САССТТТСАА ААСААААСАС 6АСАСТАТТТ ТАТТ6СТ6СА 6Т66А6А66С 3181 ТСТ666АТТА Т666АТ6А6Т АССТССССАС АТ6ТТСТАА6 АААСАССССТ СА6А6Т66СА 3241 етеТСССТСА 6ТТСАА6ААА еттеттттсс АббААТТТАС Т6АТ66СТСС ТТТАСТСА6С 3301 ССТТАТАССе Т66А6ААСТА ААТСААСАТТ Т666АСТССТ 6666ССАТАТ АТААСАССАС 3361 АА6ТТ6АА6А ТААТАТСАТС СТААСТТТСА САААТСАССС СТСТССТССС ТАТТССТТСТ 3421 АТТСТАСССТ ТАТТТСТТАТ 6А66АА6АТС АСАСССААСС А6СА6ААССТ АСААААААСТ 3481 ТТ6ТСАА6СС ТААТСАААСС ААААСТТАСТ ТТТ66ААА6Т ССААСАТСАТ АТ66САСССА 3541 СТАААСАТСА 6ТТТ6АСТ6С ААА6ССТ666 СТТАТТТСТС Т6АТ6ТТ6АС СТССАААААС 3601 Атетеслстс Аеесстелтт еелссссттс теетстессл састаасаса стсаассстс 3661 СТСАТ666А6 АСААСТСАСА СТАСАССААТ ТТ6СТСТ6ТТ ТТТСАССАТС ТТТ6АТ6А6А 3721 ССАААА6СТ6 СТАСТТСАСТ СААААТАТСС АААСАААСТС СА666СТССС ТССААТАТСС 3781 А6АТ66АА6А ТСССАСТТТТ АААСАСААТТ АТСССТТССА ТССААТСААТ СССТАСАТАА 3841 Т66АТАСАСТ АССТ66СТТА 6ТААТ66СТС АССАТСАААС 6АТТС6АТ66 ТАТСТССТСА 3901 6САТ666СА6 СААТСААААС АТССАТТСТА ТТСАТТТСАС Т66АСАТ6Т6 ТТСАСТСТАС 3961 САААААААСА 66А6ТАТААА АТ66САСТ6Т АСААТСТСТА ТССА66Т6ТТ ТТТ6А6АСА6 4021 Т66АААТ6ТТ АССАТССААА 6СТ66ААТТТ 66С666Т66А АТСССТТАТТ 66С6А6САТС 4081 тлсАтестее елтелесАСА стттттстее тетлслесАА таастстсас лстсссстее 4141 6ААТ66СТТС Т66АСАСАТТ А6А6АТТТТС АСАТТАСАСС ТТСАССАСАА ТАТ66АСА6Т 4201 ееессссААА естеесслел сттсаттатт ссеелтсААТ СААтесстее ассассаасс
- 79 029560
4261 А6СССТТТТС ТТЕЕАТСААЕ ЕТЕЕАТСТЕТ Т66САССААТ ЕАТТАТТСАС ЕЕСАТСААЕА 4321 СССА666Т6С СС6ТСА6АА6 ТТСТССАЕСС ТСТАСАТСТС ТСАЕТТТАТС АТСАТЕТАТА 4381 6ТСТТ6АТ66 6АА6АА6Т66 САЕАСТТАТС 6А66АААТТС САСТ66ААСС ТТААТ66ТСТ 4441 ТСТТТееСАА Т6Т66АТТСА ТСТ666АТАА ААСАСААТАТ ТТТТААСССТ ССААТТАТТЕ 4501 СТСЕАТАСАТ СС6ТТТ6САС ССААСТСАТТ АТА6САТТС6 САЕСАСТСТТ С6САТ66А6Т 4561 Т6АТ666СТ6 ТЕАТТТАААТ А6ТТ6СА6СА Т6ССАТТ666 ААТ66А6А6Т АААЕСААТАТ 4621 СА6АТ6САСА 6АТТАСТ6СТ ТСАТССТАСТ ТТАССААТАТ 6ТТТ6ССАСС Т66ТСТССТТ 4681 САААА6СТС6 АСТТСАССТС СААСССАССА 6ТААТ6ССТ6 6А6АССТСА6 ЕТЕААТААТС 4741 САААА6А6Т6 6СТ6САА6Т6 ЕАСТТССАЕА АЕАСААТЕАА АЕТСАСАЕЕА ЕТААСТАСТС 4801 А666А6ТААА АТСТСТЕСТТ АССА6САТ6Т АТ6Т6АА66А ЕТТССТСАТС ТССА6СА6ТС 4861 ААЕАТЕЕССА ТСАЕТЕЕАСТ СТСТТТТТТС АЕААТЕЕСАА АЕТАААЕЕТТ ТТТСАЕЕЕАА 4921 АТСААЕАСТС СТТСАСАССТ 6Т66Т6ААСТ СТСТАЕАССС АСС6ТТАСТ6 АСТСЕСТАСС 4981 ТТС6ААТТСА СССССА6А6Т Т666Т6САСС АСАТТбСССТ САССАТССАС 6ТТСТ666СТ 5041 6С6А66САСА 66АССТСТАС ЗАСААААСТС АСАСАТЗССС АССЗТЗСССА ЗСТССАЗААС 5101 тсстееесее ассзтсазтс ттсстсттсс ссссаааасс сааззасасс стсатзатст 5161 СССЗЗАСССС ТЗАЗЗТСАСА ТЗСЗТвЗТвЗ ТввАСвТЗАЗ ССАСЗААЗАС ССТЗАЗЗТСА 5221 АЗТТСААСТЗ ЗТАСвТвЗАС ЗвСвТвЗАвв ТЗСАТААТЗС СААЗАСАААв ССЗСввЗАвв 5281 АЗСАЗТАСАА САЗСАСЗТАС СвТЗТввТСА ЗСЗТССТСАС СЗТССТЗСАС САЗЗАСТввС 5341 ТЗААТЗЗСАА вЗАЗТАСААЗ ТвСААЗЗТСТ ССААСАААЗС ССТСССАЗСС СССАТСЗАЗА 5401 АААССАТСТС САААЗССААА ЗввСАЗСССС ЗАЗААССАСА ЗЗТвТАСАСС СТЗСССССАТ 5461 СССЗЗЗАТЗА ЗСТЗАССААЗ ААССАЗЗТСА ЗССТЗАССТЗ ССТЗЗТСААА ЗЗСТТСТАТС 5521 ССАЗСЗАСАТ СвССЗТвЗАЗ ТввЗАЗАЗСА АТвввСАЗСС ЗЗАЗААСААС ТАСААЗАССА 5581 СЗССТСССЗТ ЗТТЗЗАСТСС ЗАСввСТССТ ТСТТССТСТА САЗСААЗСТС АССвТввАСА 5641 АЗАЗСАЗЗТЗ вСАЗСАвввв ААСЗТСТТСТ САТЗСТССЗТ ЗАТЗСАТЗАЗ ЗСТСТЗСАСА 5701 АССАСТАСАС ЗСАЗААЗАЗС СТСТСССТЗТ СТССвввТАА А
(ίί) Последовательность ДНК Рс (подчёркнут сигнальный пептид мыши) (последовательность 8Е() ГО № 3, кодирующая последовательность 8Е() ГО №4)
7981_АТЕЕА ЕАСАЕАЕАСА
8 041 стсстеетат ееетастест еетстееетт сеаееттеса стеетеаеаа аастсасаса 8101 ТЕССЕАЕСЕТ СЕССАСЕАСЕ ТСААЕТЕЕТС ЕЕАЕЕАЕЕСТ САЕТЕТТЕСТ СТТССССССА 8161 АААЕЕСААЕС АСАСССТСАТ ЕАТЕТСЕЕСЕ АЕЕЕЕТСАСЕ ТЕАСАТЕЕСТ СЕТЕЕТЕЕАЕ 8221 СТСАЕСЕАСЕ ААСАЕСЕТЕА ЕЕТЕААСТТЕ ААЕТЕСТАСЕ ТЕЕАЕЕЕЕСТ СЕАЕЕТЕЕАТ 8281 ААТЕЕСААЕА ЕАААЕСЕЕСЕ ЕЕАЕЕАЕЕАЕ ТАЕААСАЕСА СЕТАЕЕЕТСТ ЕЕТСАЕСЕТЕ 8341 ЕТСАЕСЕТСЕ ТЕСАЕСАЕЕА СТЕЕСТЕААТ ЕЕЕААССАСТ АСААЕТЕСАА СЕТСТССААС 8401 АААЕСССТСС ЕАСЕЕСЕЕАТ СЕАЕААААСС АТЕТЕСАААЕ ССАААЕЕЕСА ЕССССЕАЕАА 8461 ЕЕАЕАСЕТЕТ АСАСССТЕСС СССАТСССЕС ЕАТЕАССТСА ССААЕААССА СЕТСАЕСЕТЕ 8521 АССТЕССТЕЕ ТСАААЕЕСТТ СТАТСССАЕС ЕАСАТСЕССЕ ТЕЕАЕТЕЕЕА ЕАЕСААТЕЕЕ 8581 САЕССЕЕАЕА АСААСТАСАА ЕАССАСЕССТ СССЕТЕТТЕЕ АСТССЕАСЕЕ СТССТТСТТС 8641 СТСТАСАЕСА АЕСТСАССЕТ ЕЕАСААЕАЕС АЕЕТЕЕСАЕС АЕЕЕЕААСЕТ СТТСТСАТЕС 8701 ТССЕТЕАТЕС АТЕАЕЕСТСТ ЕСАСААССАС ТАСАСЕСАЕА АЕАЕССТСТС ССТЕТСТССЕ 8761 ЕЕТААА
В. Полноразмерный белок РУШРс.
(ί) Полноразмерная последовательность ДНК белка РУШРс (подчёркнут сигнальный пептид РУШ, Рс-участок выделен жирным шрифтом) (последовательность 8ЕЭ ГО №5, кодирующая последовательность 8Е() ГО №6)
661 АТЕ САААТАЕАЕС ТСТССАССТЕ
721 СТТСТТТСТЕ ТЕССТТТТЕС САТТСТЕСТТ ТАЕТЕССАСС АЕААЕАТАСТ АССТЕЕЕТОС 781 АЕТ6ЕААСТЕ ТСАТЕЕЕАСТ АТАТ6САААЕ ТЕАТСТС6ЕТ 6АЕСТЕССТ6 ТЕЕАС6СААЕ 841 АТТТССТССТ АЕАЕТЕССАА ААТСТТТТСС АТТСААСАСС ТСАЕТСЕТЕТ АСАААААЕАС 901 ТСТЕТТТЕТА ЕААТТСАСЕЕ АТСАССТТТТ СААСАТСЕСТ ААЕССААЕЕС САСССТЕЕАТ 9 61 ЕЕЕТСТЕСТА ЕЕТССТАССА ТССАЕЕСТЕА ЕЕТТТАТЕАТ АСАЕТЕЕТСА ТТАСАСТТАА
1021 ЕААСАТЕЕСТ ТСССАТССТЕ ТСАЕТСТТСА ТЕСТЕТТЕЕТ ЕТАТССТАСТ ЕЕАААЕСТТС 10 81 ТЕА6ЕЕАЕСТ ЕААТАТЕАТЕ АТСА6АССАЕ ТСАААЕЕ6А6 ΑΑΑΘΑΑΕΑΤ6 АТААА6ТСТТ 1141 СССТЕЕТЕЕА АЕССАТАСАТ АТЕТСТЕЕСА ЕЕТССТЕААА ЕАЕААТЕЕТС СААТЕЕССТС 1201 ТЕАСССАСТЕ ТЕССТТАССТ АСТСАТАТСТ ТТСТСАТЕТЕ ЕАССТЕЕТАА ААЕАСТТЕАА 1261 ТТСАЕЕССТС АТТЕЕАЕССС ТАСТАЕТАТЕ ТАЕАЕААЕЕЕ АЕТСТЕЕССА АЕЕААААЕАС 1321 АСАЕАССТТЕ САСАААТТТА ТАСТАСТТТТ ТЕСТЕТАТТТ ΕΑΤΘΑΑΕΕΕΑ АААЕТТЕЕСА 1381 СТСАЕАААСА ААОААСТССТ ТЕАТ6СА0ЕА ТА60ЕАТ6СТ 6САТСТЕСТС ЕЕЕССТОЕСС 1441 ТААААТЕСАС АСАЕТСААТЕ СТТАТСТААА САЕЕТСТСТЕ ССАЕЕТСТЕА ТТЕЕАТЕССА 1501 САЕЕАААТСА ЕТСТАТТЕЕС АТЕТЕАТТЕЕ ААТЕЕЕСАСС АСТССТЕААЕ ТЕСАСТСААТ 1561 АТТССТСЕАА ЕЕТСАСАСАТ ТТСТТЕТЕАЕ ЕААССАТСЕС САЕЕСЕТССТ ТССАААТСТС1621 ЕССААТААСТ ТТССТТАСТЕ СТСАААСАСТ СТТЕАТЕЕАС СТТОЕАСАЕТ ТТСТАСТЕТТ
- 80 029560
1681 ТТеТСАТАТС ТСТТСССАСС ААСАТ6АТ66 САТ66АА6СТ ТАТ6ТСААА6 ТА6АСА6СТ6 1741 ТССАСА66АА ССССААСТАС бААТбААААА ТААТ6АА6АА 6С66АА6АСТ АТ6АТ6АТ6А 1801 ТСТТАСТ6АТ ТСТ6АААТ66 АТ6Т66ТСА6 6ТТТ6АТ6АТ 6АСААСТСТС СТТССТТТАТ 1861 ССАААТТСеС ТСА6ТТ6ССА А6АА6САТСС ТААААСТТбе СТАСАТТАСА ТТ6СТ6СТ6А 1921 АСАССАССАС Т666АСТАТ6 СТСССТТАСТ ССТС6ССССС САТСАСАСАА СТТАТААААС 1981 ТСААТАТТТе ААСААТСССС СТСА6С66АТ Т66ТА66АА6 ТАСААААААС ТСССАТТТАТ 2041 ееСАТАСАСА 6АТ6АААССТ ТТАА6АСТС6 Т6АА6СТАТТ САССАТСААТ СА66ААТСТТ 2101 666АССТТТА СТТТАТ6666 АА6ТТ66А6А САСАСТ6ТТ6 АТТАТАТТТА АСААТСААСС 2161 ААССАСАССА ТАТААСАТСТ АСССТСАС66 ААТСАСТСАТ 6ТСС6ТССТТ Т6ТАТТСАА6 2221 6А6АТТАССА АААССТСТАА ААСАТТТСАА 66АТТТТССА АТТСТ6ССА6 6А6АААТАТТ 2281 САААТАТААА Т66АСА6Т6А СТСТАСААСА Т666ССААСТ АААТСАСАТС СТС66Т6ССТ 2341 6АССС6СТАТ ТАСТСТАСТТ ТССТТААТАТ 66А6А6А6АТ СТА6СТТСА6 6АСТСАТТ66 2401 СССТСТССТС АТСТССТАСА ААСААТСТСТ АСАТСАААСА ССАААССАСА ТААТСТСАСА 2461 САА6А66ААТ 6ТСАТССТ6Т ТТТСТСТАТТ ТСАТСАСААС С6АА6СТ66Т АССТСАСАСА 2521 СААТАТАСАА СССТТТСТСС ССААТССАСС Т66А6Т6СА6 СТТ6А66АТС СА6А6ТТССА 2581 А6ССТССААС АТСАТССАСА 6САТСААТ66 СТАТСТТТТТ 6АТА6ТТТ6С А6ТТ6ТСА6Т 2641 ттетттеслт елеетееслт АстеетАслт тстаассатт еелесАслел стелсттсст 2701 ТТСТСТСТТС ТТСТСТ66АТ АТАССТТСАА АСАСААААТС 6ТСТАТ6АА6 АСАСАСТСАС 2761 ССТАТТСССА ТТСТСА66А6 АААСТСТСТТ САТ6ТС6АТ6 СААААСССАС 6ТСТАТ66АТ 2821 тстсссстсс сасаастсас астттсссаа слелеесАте Ассессттлс тсаасстттс 2881 ТА6ТТ6Т6АС ААСААСАСТС 6Т6АТТАТТА С6А66АСА6Т ТАТСААСАТА ТТТСАССАТА 2941 СТТ6СТ6А6Т АААААСААТС ССАТТСААСС ААСААССТТС ТСССАСААТТ СААСАСАССС 30 01 ТА6САСТА66 СААААССААТ ТТААТСССАС САСААТТССА СААААТСАСА ТАСАСААСАС 3061 Т6АСССТТ66 ТТТеСАСАСА СААСАССТАТ СССТААААТА СААААТСТСТ ССТСТА6Т6А 3121 ТТТ6ТТ6АТ6 СТСТТ6С6АС А6А6ТССТАС ТССАСАТ666 СТАТССТТАТ СТСАТСТССА 3181 АСААСССААА ТАТ6А6АСТТ ТТТСТ6АТ6А ТССАТСАССТ 66А6СААТА6 АСАСТААТАА 3241 СА6ССТ6ТСТ САААТСАСАС АСТТСА66СС АСАССТССАТ САСА6Т6666 АСАТ66ТАТТ 3301 ТАССССТ6А6 ТСА66ССТСС ААТТААСАТТ АААТСАСААА СТ6666АСАА СТ6СА6СААС 3361 А6А6ТТ6АА6 АААСТТСАТТ ТСАААСТТТС ТАСТАСАТСА ААТААТСТСА ТТТСААСААТ 3421 ТССАТСАСАС ААТТТ66СА6 СА66ТАСТ6А ТААТАСААСТ ТССТТА66АС ССССААСТАТ 3481 СССАСТТСАТ ТАТ6АТА6ТС ААТТАСАТАС САСТСТАТТТ СССАААААСТ САТСТССССТ 3541 ТАСТСАСТСТ 66Т66АССТС Т6А6СТТ6А6 ТСААСААААТ ААТСАТТСАА АСТТСТТАСА 3601 АТСАССТТТА АТСААТАССС ААСАААСТТС АТ6666АААА ААТ6ТАТС6Т СААСАСАСАС 3661 Т66ТА66ТТА ТТТААА666А АААСАССТСА Т66АССТ6СТ ТТ6ТТ6АСТА ААСАТААТСС 3721 СТТАТТСААА 6ТТА6САТСТ СТТТСТТААА САСАААСААА АСТТССААТА АТТСАССААС 3781 ТААТАСАААС АСТСАСАТТС АТ66СССАТС АТТАТТААТТ САСААТАСТС САТСА6ТСТ6 3841 еСААААТАТА ТТАСАААСТС АСАСТ6А6ТТ ТААААААСТС АСАССТТТСА ТТСАТ6АСА6 3901 ААТеСТТАТе 6АСАААААТ6 СТАСАССТТТ САСССТАААТ САТАТСТСАА АТААААСТАС 3961 ТТСАТСАААА ААСАТССААА Т66ТССААСА СААААААСАС 66ССССАТТС САССА6АТ6С 4021 АСААААТССА 6АТАТ6ТС6Т ТСТТТААСАТ 6СТАТТСТТ6 ССАСААТСАС САА66Т66АТ 4081 АСАААССАСТ САТССАААСА АСТСТСТСАА СТСТ666САА 66ССССА6ТС САААССААТТ 4141 А6ТАТССТТА ССАССАСААА ААТСТСТССА АССТСАСААТ ТТСТТ6ТСТ6 АСАААААСАА 4201 АСТССТАСТА 66ААА666Т6 ААТТТАСААА 66АС6ТА66А СТСАААСАСА Т66ТТТТТСС 4261 АА6СА6СА6А ААССТАТТТС ТТАСТААСТТ ССАТААТТТА САТСААААТА АТАСАСАСАА 4321 ТСААСААААА ААААТТСАСС ААСАААТАСА АААСААССАА АСАТТААТСС ААСАСААТСТ 4381 А6ТТТТ6ССТ САСАТАСАТА СА6Т6АСТ66 САСТААСААТ ТТСАТСААСА АССТТТТСТТ 4441 АСТ6А6САСТ АСССААААТС ТАСААССТТС АТАТ6АС666 6САТАТ6СТС САСТАСТТСА 4501 А6АТТТТА66 ТСАТТАААТС АТТСААСААА ТАСААСАААС АААСАСАСАС СТСАТТТСТС 4561 АААААААССС 6А66АА6ААА АСТТ66АА66 СТТ666АААТ САААССААСС АААТТСТАСА 4621 6АААТАТ6СА ТССАССАСАА 66АТАТСТСС ТААТАСААСС САССАСААТТ ТТ6ТСАС6СА 4681 АС6ТА6ТАА6 А6А6СТТТ6А ААСААТТСАС АСТСССАСТА СААСАААСАС ААСТТСАААА 4741 ААССАТААТТ СТССАТСАСА ССТСААСССА 6Т66ТССААА ААСАТСАААС АТТТСАСССС 4801 6А6САСССТС АСАСАСАТАС АСТАСААТСА СААССАСААА 6666ССАТТА СТСАСТСТСС 4861 СТТАТСАСАТ Т6ССТТАС6А 66А6ТСАТА6 САТСССТСАА ССАААТАСАТ СТССАТТАСС 4921 САТТССАААС СТАТСАТСАТ ТТССАТСТАТ ТАСАССТАТА ТАТСТСАССА 666ТССТАТТ 4981 ССААСАСААС ТСТТСТСАТС ТТССА6СА6С АТСТТАТАСА ААСАААСАТТ СТ6666ТССА 5041 А6ААА6СА6Т САТТТСТТАС ААССАСССАА ААААААТААС СТТТСТТТАС ССАТТСТААС 5101 СТТССАСАТС АСТ66Т6АТС ААА6А6А66Т Т66СТСССТ6 666АСАА6Т6 ССАСАААТТС 5161 АСТСАСАТАС АА6ААА6ТТ6 АСААСАСТСТ ТСТССССААА ССА6АСТТ6С ССААААСАТС 5221 Т66СААА6ТТ 6ААТТ6СТТС СААААСТТСА САТТТАТСАС ААССАССТАТ ТСССТАС66А 5281 ААСТАССААТ 666ТСТССТ6 6ССАТСТ66А ТСТС6Т66АА 666А6ССТТС ТТСА666ААС 5341 АСАСССАССС АТТААСТССА АТСААССААА СА6АССТ66А АААСТТСССТ ТТСТ6А6А6Т 5401 АССААСАСАА А6СТСТ6САА АСАСТСССТС САА6СТАТТ6 6АТССТСТТ6 СТТ666АТАА 5461 ССАСТАТееТ АСТСАСАТАС СААААСААСА 6Т66АААТСС СААСАСААСТ САССАСАААА 5521 ААСАССТТТТ ААСАААААСС АТАССАТТТТ 6ТСССТ6ААС 6СТТ6Т6ААА 6СААТСАТ6С 5581 ААТАССАССА АТАААТСАСС САСААААТАА СССССАААТА 6АА6ТСАССТ 666СААА6СА 5641 А66ТА66АСТ 6ААА66СТ6Т ССТСТСАААА СССАССАСТС ТТ6АААС6СС АТСААССССА 5701 ААТААСТСеТ АСТАСТСТТС АСТСАСАТСА А6А66АААТТ 6АСТАТ6АТ6 АТАССАТАТС 5761 АСТТСАААТС ААСААССААС АТТТТСАСАТ ТТАТ6АТ6А6 САТСААААТС А6А6ССССС6 5821 САССТТТСАА ААСААААСАС САСАСТАТТТ ТАТТ6СТ6СА 6Т66А6А66С ТСТ666АТТА 5881 Т666АТ6А6Т АССТССССАС АТ6ТТСТАА6 АААСАССССТ СА6А6Т66СА 6Т6ТСССТСА
- 81 029560
5941 еттсааеааа еттеттттсс аееаатттас театеестсс тттастсаес ссттатассс
6001 ТЕЕАЕААСТА ААТСААСАТТ ТЕССАСТССТ ЕЕЕЕССАТАТ АТААЕАЕСАЕ ААЕТТЕААЕА
6061 ТААТАТСАТС СТААСТТТСА ЕАААТСАЕЕС СТСТССТССС ТАТТССТТСТ АТТСТАСССТ
6121 ТАТТТСТТАТ ЕАЕЕААЕАТС АЕАСЕСААСЕ АССАСААССТ АСААААААСТ ТТЕТСААЕСС
6181 ТААТСАААСС ААААСТТАСТ ТТТЕЕАААЕТ ССААСАТСАТ АТЕССАСССА СТАААСАТСА
6241 етттеастес аааесстеее сттатттстс театеттеас стееааааае атетесастс
6301 аеесстеатт есассссттс теетстесса састаасаса стсаассстс стсатеееае
6361 АСААЕТЕАСА ЕТАСАЕЕААТ ТТЕСТСТЕТТ ТТТСАССАТС ТТТЕАТЕАЕА ССААААЕСТЕ
6421 ЕТАСТТСАСТ ЕААААТАТЕЕ АААЕАААСТЕ САЕЕЕСТССС ТССААТАТСС АЕАТЕЕААЕА
6481 ТСССАСТТТТ АААЕАЕААТТ АТСЕСТТССА ТЕСААТСААТ ЕЕСТАСАТАА ТСЕАТАСАСТ
6541 АССТЕЕСТТА ЕТААТЕЕСТС АЕЕАТСАААЕ ЕАТТСЕАТЕЕ ТАТСТЕСТСА ЕСАТЕЕЕСАЕ
6601 СААТЕААААС АТССАТТСТА ТТСАТТТСАЕ ТЕЕАСАТЕТЕ ТТСАСТЕТАС ЕАААААААЕА
6661 ЕЕАЕТАТААА АТЕЕСАСТЕТ АСААТСТСТА ТССАЕЕТЕТТ ТТТЕАЕАСАЕ ТЕЕАААТЕТТ
6721 АССАТССААА ЕСТЕЕААТТТ ЕЕСЕЕЕТЕЕА АТЕССТТАТТ ЕЕСЕАЕСАТС ТАСАТЕСТЕЕ
6781 ЕАТЕАССАСА СТТТТТСТСЕ ТЕТАСАССАА ТААЕТСТСАС АСТССССТСЕ СААТЕССТТС
6841 ТЕОАСАСАТТ АЕАЕАТТТТС АЕАТТАСАОС ТТСАЕЕАСАА ТАТЕОАСАЕТ ЕЕЕССССААА
6901 ЕСТЕЕССАЕА СТТСАТТАТТ ССЕЕАТСААТ СААТЕССТЕЕ АЕСАССААЕЕ АЕСССТТТТС
6961 ТТОЕАТСААЕ ЕТЕЕАТСТЕТ ТЕЕСАССААТ ЕАТТАТТСАС ЕЕСАТСААЕА СССАЕЕЕТЕС
7021 ССЕТСАЕААЕ ТТСТССАЕСС ТСТАСАТСТС ТСАЕТТТАТС АТСАТЕТАТА ЕТСТТЕАТЕЕ
7081 ЕААЕААЕТЕЕ САЕАСТТАТС ЕАЕЕАААТТС САСТЕЕААСС ТТААТЕЕТСТ ТСТТТЕЕСАА
7141 ТСТЕСАТТСА ТСТСЕСАТАА ААСАСААТАТ ТТТТААСССТ ССААТТАТТЕ СТСЕАТАСАТ
7201 ССЕТТТЕСАС ССААСТСАТТ АТАЕСАТТСЕ САЕСАСТСТТ СЕСАТЕЕАЕТ ТЕАТЕЕЕСТЕ
7261 ТЕАТТТАААТ АЕТТЕСАЕСА ТЕССАТТЕЕЕ ААТЕЕАЕАЕТ АААЕСААТАТ ЕАЕАТЕСАСА
7321 ЕАТТАСТЕСТ ТСАТЕЕТАЕТ ТТАСЕААТАТ ЕТТТЕЕЕАЕЕ ТЕЕТСТЕЕТТ СААААЕСТСЕ
7381 АЕТТЕАЕСТЕ СААЕЕЕАЕЕА СТААТСЕЕТЕ ЕАЕАССТСАЕ ЕТЕААТААТС ЕААААЕАЕТС
7441 ЕСТЕСААЕТЕ ЕАЕТТЕСАЕА АЕАСААТЕАА АЕТСАСАЕЕА СТААСТАЕТС АЕЕЕАЕТААА
7501 АТСТСТЕСТТ АСЕАЕЕАТЕТ АТЕТЕААЕЕА ЕТТЕЕТЕАТЕ ТСЕАЕЕАЕТС ААЕАТЕЕЕСА
7561 ТСАЕТЕЕАСТ ЕТЕТТТТТТС АЕААТЕЕСАА АЕТАААЕЕТТ ТТТСАЕЕЕАА АТСААЕАСТС
7621 ЕТТЕАЕАСЕТ ЕТЕЕТЕААСТ СТСТАЕАССС АЕССТТАСТЕ АСТЕЕЕТАЕС ТТЕСААТТСА
7681 СССССАЕАЕТ ТЕЕЕТЕСАСС АЕАТТСЕЕСТ ЕАЕЕАТЕЕАЕ ЕТТСТЕЕЕСТ ЕСЕАЕЕСАСА
7741 ЕЕАССТСТАС ЕАСААААСТС АСАСАТЕССС АССЕТЕСССА ЕСТССАЕААС ТССТЕЕЕСЕЕ
7801 АССеТСАСТС ТТССТСТТСС ССССААААСС СААЕ6АСАСС СТСАТЕАТСТ СССЕЕАСССС
7861 теаеетсаса тбсбтббтбе тееасетеае ссасеааеас сстеаеетса аеттсаасте
7921 ЕТАССТЕЕАС 6ЕС6Т6ЕА6Е ТеСАТААТСС СААОАСАААС СССССССАОС АОСАЕТАСАА
7981 САОСАСОТАС ССТОТОСТСА ОСОТССТСАС С6ТССТ6САС САСОАСТСОС ТСААТОССАА
8041 ООАОТАСААЕ Т6САА66ТСТ ССААСАААСС ССТСССАССС СССАТСЕАОА АААССАТСТС
8101 САААЕССААА ОЕЕСАОСССС ЕАЕААССАСА ООТЕТАСАСС СТЕСССССАТ СССЕЕОАТЕА
8161 ОСТЕАССААЕ ААССАООТСА ЕССТЕАССТЕ ССТОЕТСААА ООСТТСТАТС ССАОСОАСАТ
8221 СОССОТООАО ТЕЕЕАЕАЕСА АТОЕОСАОСС ООАОААСААС ТАСААСАССА СОССТСССЕТ
8281 ОТТООАСТСС ОАСООСТССТ ТСТТССТСТА САЕСААЕСТС АССОТООАСА аоаесаеете
8341 ЕСАЕСАЕЕЕЕ ААСЕТСТТСТ САТОСТССОТ ОАТОСАТОАО ОСТСТЕСАСА АССАСТАСАС
8401 ЕСАБААЕАЕС СТСТСССТЕТ СТССЕЕОТАА А
(ΐΐ) Рс (такая же последовательность как А (ΐΐ) (8ЕЦ ΙΌ №3))].
Таблица 2. Полипептидные последовательности
А. мономерный гибридный белок с удалённым В-доменом РУШ-Рс (УВД РУШРс мономер димер): создан коэкспрессией цепей УВД РУШРс и Рс.
Конструкция = белок слияния НС-РС-Рс. Для синтеза мономерного белка РУШРс УВД совместно с последовательностью УВД РУШ-Рс трансфекцией введена кассета экспрессии Рс. В пептидной цепи УВД РУШРс последовательность Рс показана жирным шрифтом, последовательность тяжёлой цепи (НС) показана двойным подчёркиванием, оставшаяся последовательность В-домена показана курсивом. Сигнальные пептиды подчёркнуты.
ΐ) Цепь с удалённым В-доменом РУШ-Рс (сигнальная последовательность из 19 аминокислот подчёркнута) (8ЕЦ ГО №2)
МСТЕЬЗТСЕЕЬСЬЬЕЕСЕЗ
АТЕЕУУЬЕАУЕЬЗИРУМОЗРЬЕЕЬРУРАЕЕРРЕУРКЗЕРЕЫТЗУУУККТЬЕУЕЕТРНЬЕЫ1АКРЕРРИМЕЬЬЕРТ1ОАЕУУРТУУ1
ТЬКЫМАЗНРУЗЬНАУЕУЗУИКАЗЕЕАЕУРРОТЗОЕЕКЕРРКУЕРЕЕЗНТУУИОУЬКЕЫЕРМАЗРРЬСЬТУЗУЬЗНУРЬУКРЬЫЗЕЬ
1ЕАЬЬУСЕЕЕЗЬАКЕКТОТЬНКЕ1ЬЬЕАУЕРЕЕКЗИНЗЕТКЫЗЬМОРЕРААЗАКАИРКМНТУМЕУУМЕЗЬРЕЫЕСНЕКЗУУИНУ1
ЕМЕТТРЕУНЗIЕЬЕЕНТЕЬУЕЛНЕОАЗЬЕ!ЗР1ТЕЬТАОТЬЬМРЬЕОЕЬЬЕСН13ЗНОНРЕМЕАУУКУРЗСРЕЕРОЬКМКЫЫЕЕАЕ
РУРРРЬТРЗЕМРУУЕЕРРРЫЗРЗЕ1О1ЕЗУАККНРКТИУНУ1ААЕЕЕРИРУАРЬУЬАРРРЕЗУКЗОУЬЫЫЕРОЕ1ЕЕКУККУЕЕМА
ΥΤΡΕΤΕΚΤΡΕΑΙΟΗΕ3ΕΙЬЕРЬЬУЕЕУЕРТЬЫIΕΚΝΟΑ3ΡΡΥΝΙУРНЕ1ТРУРРЬУЗРРЬРКЕУКНЬКРЕР1ЬРЕЕ!ЕКУКИТУТ
УЕРЕРТК5РРРСЬТРУУ5 5ЕУММЕРРЬА5ЕЫЕРЬЫСУКЕ5УРС>РЕЫО1М5РКРЫУ1ЬЕ5УЕРЕЫР5№УЬТЕ111ОРЕЬРЫРАЕУО
ЬЕРРЕЕОА5111МН51ЫЕУУЕР5ЬОЬ5УСЬНЕУАУ№У1Ь51ЕАОТРЕЬ5УЕЕ5ЕУТЕКНКМУУЕРТЬТЬЕРЕ5ЕЕТУЕМ5МЕЫРЕЬ№
IЬЕСНЫЗРЕРЫРЕМТАЬЬКУЗЗСРКЫТЕРУУЕРЗΥΕΡΙЗАУЬЬЗКЫЫА!ЕРР5Е50/УРРУ1ККН0ДЕ1ТРТТЬ03Р0ЕЕ1РУРРТ1 ЗУЕМККЕОЕ01УОЕОЕМОЗРРЗЕОККТРНУЕ1ААУЕРЬТОУЕМЗЗЗРНУЬРЫРАОЗЕЗУРОЕККУУЕОЕЕТОЕЗЕТОРЬУРЕЕЬЫЕ НЬЕЬЬЕРУ1РАЕУЕОЫ1МУТЕРЫСАЗРРУЗЕУЗЗЫЗУЕЕОСРСЕАЕРРКЫЕУКРЫЕТКТУЕИКУЭННМАРТКОЕЕОСКАВДАУЕЗО УОЬЕКОУНЗЕЫЕРЬЬУСНТЫТЬЫРАНЕРСУТУСЕЕАЬЕЕТ1ЕОЕТКЗИУЕТЕЫМЕРЫСРАРСЫ1СМЕОРТЕКЕЫУРЕНА1ЫЕУ1М ОТЬРЕЬУМАСОСР1РИУЬЬЗМЕЗЫЕЫ1Н31НЕЗЕНУЕТУРККЕЕУКМАЬУЫЬУРЕУЕЕТУЕМЬРЗКАЕ1ИРУЕСЫЕЕНЬНАЕМЗТ ЬЕЬУУ5ЖССТРЬЕМАЗЕН1РОЕС1ТА5ЕСУЕСВДАРКЬАРЬНУ5Е51ЫАВД5ТКЕРЕ5ВД1КУОЫАРМ11НЕ1КТСЕАРСКЕ55ЬУ1 ЗСЕ11МУ5ЬОЕКК№2ТУРЕЫ5ТЕТЬМУЕЕЕЫУО53ΕΙΚΗΝΙΕΝΡΡΙΙΑΡΥΙРЬНРТНУЗ1РЗТЬРМЕЬМЕСОЬЫЗСЗМРЬЕМЕЗКА 15ОАС1ТА55УЕТЫМЕА™5Р5КАРЬНЬСЕР5ЫАВДРРСУЖРКЕВДЬСУОЕСКТМКУТЕУТТСЕУК5ЬЬТ5МУУКЕЕЬ15 55СОЕНС ВДТЬЕЕСЫЕКУКУЕСЕЫ2О5ЕТРУУЛ5ЬОРРЬЬТРУЬР1НРС5ВДУНС1АЬРМЕУЬЕСЕАСОЬУПКТНТСРРСРАРЕЫ,ЕЕР5УГЬГР РКРКЦТЬМ13КТРЕУТСУУУЦУЗНЕЦРЕУКПгаУУЦЕУЕУНЫАКТКРКЕЕ0У№ТУКУУЗУЬТУЬН0ЦИШЕКЕУКСКУЗЦКАЬРА Р1ЕКТ13КАКЕСРЕЕР2УУТЬРРЗКОЕЬТК№УЗЬТСЬУКЕЕУРЗШАУЕИЕЗЫЕСРЕ11ЫУКТТРРУЬПЗПЕЗЕЕЬУЗКЬТУОКЗК ИССЕЫУЕЗ СЗУМНЕАЬНЫНУТСКЗЬЗ ЬЗ РЕК
- 82 029560
ίί) Цепь Рс (гетерологический сигнальный пептид из 20 аминокислот цепи Г к мыши подчёркнут) (8Е0 ГО №4)
МЕТРТьььиуььшурезте
РКТНТСРРСРАРЕЬЬееРЗУЕЬЕРРКРКРТЬМ13ЕТРЕУТСУУУРУЗНЕРРЕУКЕЯИУУРеУЕУНЯАКТКРЕЕЕСУЯЗТУЕУУЗУЬ
ТУЬНСРИЬЯеКЕУКСКУЗЯКАЬРАР1ЕКТ13КАКеСРЕЕРСУУТЬРРЗЕРЕЬТКНСУЗЬТСЬУКеЕУРЗР1АУЕИЕЗЯеСРЕЯМУК
ТТРРУЬРЗРеЗЕЕЬУЗКЬТУРКЗЕИ20еЯУЕЗСЗУМНЕАЬНЯНУТ0КЗЬЗЬЗРеК
В. Полноразмерный мономерный гибридный белок РУШ-Рс (полноразмерный РУШРс мономер димер): создан коэкспрессией цепей УВД РУШРс и Рс.
Конструкция = белок слияния НС-В-РС-Рс. Для синтеза полноразмерного мономерного белка РУПГРс совместно с полноразмерной последовательностью РУШ-Рс трансфекцией введена кассета экспресии Рс. В пептидной цепи РУШРс последовательность Рс показана жирным шрифтом, последовательность тяжёлой цепи (НС) показана двойным подчёркиванием, оставшаяся последовательность В-домена показана курсивом. Сигнальные пептиды подчёркнуты.
(ί) Полноразмерная цепь белка РУШРс (подчёркнут сигнальный пептид РУШ (последовательность
8Е0 ГО №6)
МС1ЕЬ5ТСЕЕЬСЬЬКЕСЕ5
АТЕЕУУЬеАУЕЬЗИРУМОЗРЬеЕЬРУРАЕЕРРЕУРКЗЕРЕЯТЗУУУККТЬЕУЕЕТРНЬЕЯ1АКРЕРРИМеЬЬеРТ1ОАЕУУРТУУ1
ТЬКЫМАЗНРУЗЬНАУеУЗУИКАЗЕеАЕУРРОТЗОЕЕКЕРРКУЕРееЗНТУУИОУЬКЕЫеРМАЗРРЬСЬТУЗУЬЗНУРЬУКРЬЫЗеЬ
1еАЬЬУСЕЕеЗЬАКЕКТОТЬНКЕ1ЬЬЕАУЕРЕеКЗИНЗЕТКЫЗЬМОРЕРААЗАЕАИРКМНТУМеУУМЕЗЬРеыеСНЕКЗУУИНУ1
емеТТРЕУН31ЕЬЕеНТЕЬУЕМНЕОАЗЬЕ13Р1ТЕЬТАОТЬЬМРЬеОЕЬЬЕСН133НОНРеМЕАУУКУРЗСРЕЕРОЬЕМКЫЫЕЕАЕ
РУРРРЬТРЗЕМРУУЕЕРРРЫЗРЗЕ1О1ЕЗУАККНРКТИ\/НУ1ААЕЕЕРИРУАРЬУЬАРРРЕЗУКЗОУЬЫЫеРОЕ1еЕКУККУЕЕМА
УТРЕТЕКТЕЕА10НЕЗе1ЬеРЬЬУеЕУеРТЬЫ1ЕКЫ0АЗЕРУН1УРН61ТРУЕРЬУЗЕЕЬРКеУКНЬКРЕР1ЬРеЕ1ЕКУКИТУТ
УЕР6РТК5РРЕСЬТЕУУ5 5ЕУММЕЕРЬА56Ы6РЬЫСУКЕ5УР0Е6ЫС>1М5РКЕЫУ1ЬЕ5УЕРЕЫЕ5№УЬТЕ1410ЕЕЬРЫРА6У0
ЬЕРРЕЕ0АЗЫ1МН31ЫеУУЕРЗЬ0ЬЗУСЬНЕУАУИУ1Ь31еА0ТРЕЬЗУЕЕЗеУТЕКНКМУУЕРТЬТЬЕРЕ36ЕТУЕМЗМЕЫРеЬИ
1ЬеСНЫЗРЕЕЫЕеМТАЬЬКУЗЗСРКЫТеРУУЕРЗУЕР13АУЬЬЗКЫЫА1ЕРЕ5Е50ЖДЯЕ5ГД0Х0ЕЛАтЕ£ЛРТ£ХГРЕ№ЕА ΗΚΤΡΜΡΚΙΰΝν555ΟΣΣΜΣΣΚΰ5ΡΤΡΗΰί5Σ5ΰίΰΕΑΚΥΕΤΡ5ΌΰΡ5ΡβΑΙΰ5ΝΝ5Σ5ΕΜΤΗΡΚΡΰΣΗΗ5ΰΰΜνΡΤΡΕ5ΰΣΰίΚΣΝ ΕΚΡ3ΤΤΑΑΤΕΡΚΚΡΏΡΚν33Τ3ΝΝΡΙ3ΤΙΡ3ΡΝΕΑΑ3ΤΠΝΤ33ί3ΡΡ3ΜΡνΗΥΏ3ΰΡΠΤΤΡΡ(3ΚΚ33ΡΡΤΕ3(33ΡΡ3Ρ3ΕΕΝΝΡ3Κ ΕΕΕ5αΕΜΝ5ΰΕ55ίίΰΚΝν55ΤΕ5αΡΕΡΚαΚΡΑΗαΡΑΕΕΤΚΡΝΑίΡΚν5Ι3ΕΕΚΤΝΚΤ3ΝΝ3ΑΤΝΡΚΤΗΙΰΰΡ3ΕΕΙΕΝ3Ρ3νΝΰΝΙ ΕΕ5ΕΤΕΕΚΚνΤΡΕΙΗΕΡΜΕΜΡΚΝΑΤΑΕΡΕΝΗΜ5ΝΚΤΤ53ΚΝΜΕΜνΰΰΚΚΕ(ΥΡΙΡΡΕΑΰΝΡΕΜ5ΕΕΚΜΕΕΕΡΕ3ΑΡΜΙΰΡΤΗ(ΥΚΝ5Ε Ν33ΰαΡ3ΡΚΰΕν3Ε3ΡΕΚ3νΕ3ΰΝΡΕ3ΕΚΝΚννν3Κ3ΕΡΤΚ0ναΕΚΕΜνΡΡ33ΡΝΕΡΕΤΝΕ0ΝΕΗΕΝΝΤΗΝΰΕΚΚΙΰΕΕΙΕΚΚΕΤΕ ΙΰΕΝννΕΡΰΙΗΤνΤ3ΤΚΝΡΜΚΝΕΕΕΕ3ΤΡΰΝνΕ33ΥΕ3ΑΥΑΡνίΰΕΕΡ3ΕΝΕ3ΤΝΡΤΚΚΗΤΑΗΕ3ΚΚ3ΕΕΕΝΕΕ3Ε3ΝΰΤΚΰΐνΕΚ ΥΑ3ΤΤΡΙ3ΡΝΤ3ΰΰΝΡνΤ0Ρ3ΚΡΑΕΚΰΡΡΕΡΕΕΕΤΕΕΕΚΡΙΐνΌΟΤ3Τΰ№5ΚΝΜΚΗΕΤΡ3ΤΕΤΰΙΟΥΝΕΚΕΚ(3ΑΙΤΰ3ΡΕ3θαΕΤΡ 3Η3ΙΡΰΑΝΡ3ΡΕΡΙΑΚν33ΕΡ3ΙΡΡΙΥΕΤΡνΕΕΰΕΝ33ΗΕΡΑΑ3ΥΡΚΚΌ33νΰΕ33ΗΕΕΰ3ΑΚΚΝΝΕ3ΕΑΙΕΤΕΕΜΤ3ΡΰΡΕν33Ε αΤ3ΑΤΝ3νΤΥΚΚνΕΝΤνΕΡΚΡΰΕΡΚΤ3ακνΕΕΕΡΚνΗΙΥΰΚΕΕΡΡΤΕΤ3Να3ΡαΗΕΰΕνΕα3ΕΕΰαΤΕαΑΙΚΜΝΕΑΝΡΡακνΡΡΕΡ νΑΤΕ33ΑΚΤΡ3ΚΕΕΕΡΕΑίίΰΝΗΥ(3ΤΰΙΡΚΕΕΜΚ3ΰΕΚ3ΡΕΚΤΑΡΚΚΚΕΤΙΕ3ΕΝΑαΕ3ΝΗΑΙΑΑΙΝΕαΰΝΚΡΕΙΕντηΑΚΰΰΡΤΕΡ РСЗе№РРУРХДЯеДЕ1ТЕТТЬОЗРОЕЕЮУРРТ13УЕМККЕРЕР1УРЕРЕЫОЗРЕЗЕОККТЕНУЕ1;\АУЕЕШРУеМЗЗЗРНУЬЕЫ ЕАСЗеЗУРСЕККУУЕСЕЕТРеЗЕТСРЬУЕеЕЬЯЕНЬеЬРеРУ1ЕУкЕУЕРЯ1МУТЕЕЯСАЗЕРУЗЕУЗЗЫЗУЕЕРСЕСеАЕРЕКЯЕ УКРЫЕТКТУЕЖУ0ННМАРТКРЕЕРСКАИАУЕЗРУРЬЕКРУНЗСЫСРЬЬУСНТЫТЬЫРАНСЕ0УТУеЕЕАЬЕЕТ1ЕРЕТКЗИУЕТ ЕЯМЕЕЯСЕАРСЯ1СМЕРРТЕКЕЯУЕЕНА1ЯеУ1МРТЬРСЬУМАСРСЕ1ЕИУЬЬЗМеЗЯЕЯ1Н31НЕЗеНУЕТУЕККЕЕУКМАЬУЯЬ УРеУЕЕТУЕМЬРЗКАе1ИЕУЕСЫеЕНЬНАеМЗТЬЕЬУУЗЯКССТРЬеМАЗеН1ЕРЕС1ТАЗеСУеСИАРКЬАЕЬНУЗе31ЯАИЗТ КЕРЕЗИ1КУРЬЬАРМ11Не1КТСеАЕСКЕЗЗЬУ13СЕ11МУЗЬЕеККИ2ТУЕеЯЗТеТЬМУЕЕеЯУРЗЗе1КНЯ1ЕЯРР11АЕУ1Е ЬНРТНУ31ЕЗТЬЕМЕЬМеСРЬЯЗСЗМРЬеМЕЗКА13РАС1ТАЗЗУЕТЯМЕА™ЗРЗКАЕЬНЬдеЕЗЯАИЕРСУЯЯРКЕИЬСУЕЕСК ТМКУТеУТТ2еУКЗЬЬТЗМУУКЕЕЫЗЗЗОРеНСИТЬЕГОЫеКУКУЕОСЫОРЗЕТРУУЯЗЬРРРЬЬТЕУЬЕ1НРОЗИ\/НО1АЬЕМЕ УЬ6СКАуРЬУРКТНТСРРСРАРЕЬЬееРЗУГЬГРРКРКРТЬМ13ЕТРЕУТСУУУРУЗНЕРРЕУКПтУУРеУЕУНЫАКТКРКЕЕ2У НЗТУРУУЗУЪТУЬН0РНЬ№КЕУКСКУЗЫКАЬРАР1ЕКТ13КАКе2РЕЕР2УУТЬРРЗЕРЕЬТК№УЗЬТСЬУКеГУРЗР1АУЕНЕ ЗЫОСРЕНЫУКТТРРУЫЭЗПеЗЕЕЬУЗКЬТУПКЗЮТССе11УЕЗСЗУМНЕАЫтНУТСКЗЬЗЬЗРеК
11) Цепь Рс (гетерологический сигнальный пептид из 20 аминокислот цепи Г к мыши подчёркнут) (ЗЕО ГО №4)
МЕТРТьььиуььриурезте
РКТНТСРРСРАРЕЬЬееРЗУЕЬЕРРКРКРТЬМ13ЕТРЕУТСУУУРУЗНЕРРЕУКЕЯИУУРеУЕУНЯАКТКРЕЕЕСУЯЗТУЕУУЗУЬ
ТУЬНСРИЬЯеКЕУКСКУЗЯКАЬРАР1ЕКТ13КАКеСРЕЕР2УУТЬРРЗЕРЕЬТКЯСУЗРТСРУКеЕУРЗР1АУЕИЕЗЯеСРЕЯЯУК
ТТРРУЬРЗРеЗГГЬУЗКЬТУРКЗЕИСОСЯУГЗСЗУМНЕАЬНЯНУТОКЗЬЗЬЗРеК
- 83 029560
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> БАЙОДЖЕН АЙДЕК МА ИНК.
Цзян, Хайянь Лю, Туняо
Кришнамурти, Шрирам Джозефсон, Нейл
<120> СПОСОБЫ СНИЖЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ ФАКТОРА СВЁРТЫВАНИЯ КРОВИ VIII У ПАЦИЕНТОВ, ПОЛУЧАЮЩИХ ЛЕЧЕНИЕ ФАКТОРОМ VIII
<130> 2159.371РС02/ЕКЗ/С-К/ДСА
<140> Присвоен
<141> 2013-01-11
<150> ИЗ 61/668,961
<151> 2012-07-06
<150> ИЗ 61/586,103
<151> 2012-01-12
<160> 6
<170> Версия патента 3.5
<210> 1
<211> 5052
<212> ДНК
<213> Ното зарФепз
| <400> 1 аСдсаааСад 60 | адсСсСссас | сСдсССсССС | сСдСдссССС | СдсдаССсСд | сСССадСдсс |
| ассадаадаС 120 | асСассСддд | СдсадСддаа | сСдСсаСддд | асСаСаСдса | аадСдаСсСс |
| ддСдадсСдс 180 | сСдСддасдс | аадаСССссС | ссСададСдс | сааааСсССС | СссаССсаас |
| ассСсадСсд 240 | СдСасааааа | дасСсСдССС | дСадааССса | сддаСсассС | СССсаасаСс |
| дсСаадссаа 300 | ддссасссСд | даСдддСсСд | сСаддСссСа | ссаСссаддс | СдаддСССаС |
| даСасадСдд 360 | СсаССасасС | СаадаасаСд | дсССсссаСс | сСдСсадСсС | СсаСдсСдСС |
| ддСдСаСссС 420 | асСддааадс | ССсСдаддда | дсСдааСаСд | аСдаСсадас | садСсааадд |
| дадааадаад 480 | аСдаСааадС | сССсссСддС | ддаадссаСа | саСаСдСсСд | дсаддСссСд |
| ааададааСд | дСссааСддс | сСсСдассса | сСдСдссССа | ссСасСсаСа | СсСССсСсаС |
540
- 84 029560
| дЕддассЕдд 600 | ЕаааадасЕЕ | дааЕЕсаддс | сЕсаЕЕддад | сссЕасЕадЕ | аЕдЕададаа |
| дддадЕсЕдд 660 | ссааддаааа | дасасадасс | ЕЕдсасаааЕ | ЕЕаЕасЕасЕ | ЕЕЕЕдсЕдЕа |
| ЕЕЕдаЕдаад 720 | ддаааадЕЕд | дсасЕсадаа | асааадаасЕ | ссЕЕдаЕдса | ддаЕадддаЕ |
| дсЕдсаЕсЕд 780 | сЕсдддссЕд | дссЕааааЕд | сасасадЕса | аЕддЕЕаЕдЕ | ааасаддЕсЕ |
| сЕдссаддЕс 840 | ЕдаЕЕддаЕд | ссасаддааа | ЕсадЕсЕаЕЕ | ддсаЕдЕдаЕ | ЕддааЕдддс |
| ассасЕссЕд 900 | аадЕдсасЕс | ааЕаЕЕссЕс | дааддЕсаса | саЕЕЕсЕЕдЕ | даддаассаЕ |
| сдссаддсдЕ 960 | ссЕЕддаааЕ | сЕсдссааЕа | асЕЕЕссЕЕа | сЕдсЕсааас | асЕсЕЕдаЕд |
| дассЕЕддас 1020 | адЕЕЕсЕасЕ | дЕЕЕЕдЕсаЕ | аЕсЕсЕЕссс | ассаасаЕда | ЕддсаЕддаа |
| дсЕЕаЕдЕса 1080 | аадЕадасад | сЕдЕссадад | даассссаас | ЕасдааЕдаа | аааЕааЕдаа |
| даадсддаад 1140 | асЕаЕдаЕда | ЕдаЕсЕЕасЕ | даЕЕсЕдааа | ЕддаЕдЕддЕ | саддЕЕЕдаЕ |
| даЕдасаасЕ 1200 | сЕссЕЕссЕЕ | ЕаЕссаааЕЕ | сдсЕсадЕЕд | ссаадаадса | ЕссЕаааасЕ |
| ЕдддЕасаЕЕ 1260 | асаЕЕдсЕдс | Едаададдад | дасЕдддасЕ | аЕдсЕсссЕЕ | адЕссЕсдсс |
| сссдаЕдаса 1320 | даадЕЕаЕаа | аадЕсааЕаЕ | ЕЕдаасааЕд | дсссЕсадсд | даЕЕддЕадд |
| аадЕасаааа 1380 | аадЕссдаЕЕ | ЕаЕддсаЕас | асадаЕдааа | ссЕЕЕаадас | ЕсдЕдаадсЕ |
| аЕЕсадсаЕд 1440 | ааЕсаддааЕ | сЕЕдддассЕ | ЕЕасЕЕЕаЕд | дддаадЕЕдд | адасасасЕд |
| ЕЕдаЕЕаЕаЕ 1500 | ЕЕаадааЕса | адсаадсада | ссаЕаЕааса | ЕсЕасссЕса | сддааЕсасЕ |
| даЕдЕссдЕс 1560 | сЕЕЕдЕаЕЕс | ааддадаЕЕа | ссааааддЕд | ЕаааасаЕЕЕ | дааддаЕЕЕЕ |
| ссааЕЕсЕдс 1620 | саддадаааЕ | аЕЕсаааЕаЕ | аааЕддасад | ЕдасЕдЕада | адаЕдддсса |
| асЕаааЕсад 1680 | аЕссЕсддЕд | ссЕдасссдс | ЕаЕЕасЕсЕа | дЕЕЕсдЕЕаа | ЕаЕддадада |
| даЕсЕадсЕЕ | саддасЕсаЕ | ЕддсссЕсЕс | сЕсаЕсЕдсЕ | асааадааЕс | ЕдЕадаЕсаа |
1740
- 85 029560
| ададдааасс 1800 | адаОааОдОс | адасаададд | ааОдОсаОсс | ОдООООсОдО | аОООдаОдад |
| аассдаадсО 1860 | ддОассОсас | ададааОаОа | саасдсОООс | ОссссааОсс | адсОддадОд |
| садсООдадд 1920 | аОссададОО | ссаадссОсс | аасаОсаОдс | асадсаОсаа | ОддсОаОдОО |
| ОООдаОадОО 1980 | ОдсадООдОс | адОООдОООд | саОдаддОдд | саОасОддОа | саООсОаадс |
| аООддадсас 2040 | адасОдасОО | ссОООсОдОс | ООсООсОсОд | даОаОассОО | сааасасааа |
| аОддОсОаОд 2100 | аадасасасО | сасссОаООс | ссаООсОсад | дадааасОдО | сООсаОдОсд |
| аОддаааасс 2160 | саддОсОаОд | даООсОдддд | ОдссасаасО | садасОООсд | даасададдс |
| аОдассдссО 2220 | ОасОдааддО | ООсОадООдО | дасаадааса | сОддОдаООа | ООасдаддас |
| адООаОдаад 2280 | аОаОООсадс | аОасООдсОд | адОаааааса | аОдссаООда | ассаадаадс |
| ООсОсОсааа 2340 | асссассадО | сООдааасдс | саОсаасддд | аааОаасОсд | ОасОасОсОО |
| садОсадаОс 2400 | аададдаааО | ОдасОаОдаО | даОассаОаО | садООдаааО | даадааддаа |
| даООООдаса 2460 | ОООаОдаОда | ддаОдааааО | сададссссс | дсадсОООса | ааадааааса |
| сдасасОаОО 2520 | ООаООдсОдс | адОддададд | сОсОдддаОО | аОдддаОдад | ОадсОсссса |
| саОдООсОаа 2580 | дааасадддс | ОсададОддс | адОдОсссОс | адООсаадаа | адООдООООс |
| саддааОООа 2640 | сОдаОддсОс | сОООасОсад | сссООаОасс | дОддадаасО | аааОдаасаО |
| ООдддасОсс 2700 | ОддддссаОа | ОаОаададса | даадООдаад | аОааОаОсаО | ддОаасОООс |
| адаааОсадд 2760 | ссОсОсдОсс | сОаООссООс | ОаООсОадсс | ООаОООсООа | ОдаддаадаО |
| сададдсаад 2820 | дадсадаасс | Оадаааааас | ОООдОсаадс | сОааОдааас | саааасООас |
| ООООддааад 2880 | ОдсаасаОса | ОаОддсассс | асОааадаОд | адОООдасОд | сааадссОдд |
| дсООаОООсО | сОдаОдООда | ссОддааааа | даОдОдсасО | саддссОдаО | ОддассссОО |
2940
- 86 029560
| сЕддЕсЕдсс 3000 | асасЕаасас | асЕдаасссЕ | дсЕсаЕддда | дасаадЕдас | адЕасаддаа |
| ЕЕЕдсЕсЕдЕ 3060 | ЕЕЕЕсассаЕ | сЕЕЕдаЕдад | ассаааадсЕ | ддЕасЕЕсас | ЕдааааЕаЕд |
| дааадааасЕ 3120 | дсадддсЕсс | сЕдсааЕаЕс | садаЕддаад | аЕсссасЕЕЕ | ЕааададааЕ |
| ЕаЕсдсЕЕсс 3180 | аЕдсааЕсаа | ЕддсЕасаЕа | аЕддаЕасас | ЕассЕддсЕЕ | адЕааЕддсЕ |
| саддаЕсааа 3240 | ддаЕЕсдаЕд | дЕаЕсЕдсЕс | адсаЕдддса | дсааЕдаааа | саЕссаЕЕсЕ |
| аЕЕсаЕЕЕса 3300 | дЕддасаЕдЕ | дЕЕсасЕдЕа | сдааааааад | аддадЕаЕаа | ааЕддсасЕд |
| ЕасааЕсЕсЕ 3360 | аЕссаддЕдЕ | ЕЕЕЕдадаса | дЕддаааЕдЕ | ЕассаЕссаа | адсЕддааЕЕ |
| ЕддсдддЕдд 3420 | ааЕдссЕЕаЕ | ЕддсдадсаЕ | сЕасаЕдсЕд | ддаЕдадсас | асЕЕЕЕЕсЕд |
| дЕдЕасадса 3480 | аЕаадЕдЕса | дасЕссссЕд | ддааЕддсЕЕ | сЕддасасаЕ | ЕададаЕЕЕЕ |
| садаЕЕасад 3540 | сЕЕсаддаса | аЕаЕддасад | Едддссссаа | адсЕддссад | асЕЕсаЕЕаЕ |
| ЕссддаЕсаа 3600 | ЕсааЕдссЕд | дадсассаад | дадсссЕЕЕЕ | сЕЕддаЕсаа | ддЕддаЕсЕд |
| ЕЕддсассаа 3660 | ЕдаЕЕаЕЕса | сддсаЕсаад | асссадддЕд | сссдЕсадаа | дЕЕсЕссадс |
| сЕсЕасаЕсЕ 3720 | сЕсадЕЕЕаЕ | саЕсаЕдЕаЕ | адЕсЕЕдаЕд | ддаадаадЕд | дсадасЕЕаЕ |
| сдаддаааЕЕ 3780 | ссасЕддаас | сЕЕааЕддЕс | ЕЕсЕЕЕддса | аЕдЕддаЕЕс | аЕсЕдддаЕа |
| ааасасааЕа 3840 | ЕЕЕЕЕаассс | ЕссааЕЕаЕЕ | дсЕсдаЕаса | ЕссдЕЕЕдса | сссаасЕсаЕ |
| ЕаЕадсаЕЕс 3900 | дсадсасЕсЕ | ЕсдсаЕддад | ЕЕдаЕдддсЕ | дЕдаЕЕЕааа | ЕадЕЕдсадс |
| аЕдссаЕЕдд 3960 | дааЕддадад | ЕааадсааЕа | ЕсадаЕдсас | адаЕЕасЕдс | ЕЕсаЕссЕас |
| ЕЕЕассааЕа 4020 | ЕдЕЕЕдссас | сЕддЕсЕссЕ | ЕсаааадсЕс | дасЕЕсассЕ | ссаадддадд |
| адЕааЕдссЕ 4080 | ддадассЕса | ддЕдааЕааЕ | ссаааададЕ | ддсЕдсаадЕ | ддасЕЕссад |
| аадасааЕда | аадЕсасадд | адЕаасЕасЕ | садддадЕаа | ааЕсЕсЕдсЕ | ЕассадсаЕд |
4140
- 87 029560
какдкдаадд адккссксак 4200
садаакддса аадкаааддк 4260
кскскадасс сассдккаск 4320
садаккдссс кдаддакдда 4380
сасасакдсс сассдкдссс 4440
сссссаааас ссааддасас 4500
дкддасдкда дссасдаада 4560
дкдсакаакд ссаадасааа 4620
адсдксскса ссдксскдса 4680
кссаасааад сссксссадс 4740
сдадаассас аддкдкасас 4800
адсскдасск дсскддксаа 4860
аакдддсадс сддадаасаа 4920
ккскксскск асадсаадск 4980
ксакдскссд кдакдсакда 5040
кскссдддка аа 5052
скссадсадк
кккксаддда
дасксдскас
ддккскдддс
адскссадаа
ссксакдакс
ссскдаддкс
дссдсдддад
ссаддаскдд
ссссаксдад
сскдссссса
аддсккскак
скасаадасс
сассдкддас
ддскскдсас
саадакддсс
ааксаадаск
скксдааккс
кдсдаддсас
сксскдддсд
ксссддассс
аадкксааск
дадсадкаса
скдаакддса
аааассакск
ксссдддакд
сссадсдаса
асдссксссд
аададсаддк
аассаскаса
<210> 2
<211> 1684
<212> БЕЛОК
<213> Ното зартепз
<400> 2
Мек С1п 11е С1и Беи Бег ТЬг Суз РЬе РЬе Беи 1 5 10
аксадкддас кскскккккк
сскксасасс кдкддкдаас
асссссадад ккдддкдсас
аддасскска сдасааааск
дассдксадк сккссксккс
скдаддксас акдсдкддкд
ддкасдкдда сддсдкддад
асадсасдка ссдкдкддкс
аддадкасаа дкдсааддкс
ссааадссаа адддсадссс
адскдассаа даассаддкс
ксдссдкдда дкдддададс
кдккддаскс сдасддсксс
ддсадсаддд даасдксккс
сдсадаадад сскскссскд
Суз Беи Беи Агд РЬе 15
- 88 029560
| Суз | РЬе | Зег А1а ТЬг 20 | Агд | Агд Туг | Туг 25 | Ьеи С1у А1а Уа1 | С1и 30 | Ьеи | Зег | ||||||
| Тгр | Азр | Туг | МеЬ | С1п | Зег | Азр | Ьеи | С1у | С1и | Ьеи | Рго | Уа1 | Азр | А1а | Агд |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| РЬе | Рго | Рго | Агд | Уа1 | Рго | Ьуз | Зег | РЬе | Рго | РЬе | Азп | ТЬг | Зег | Уа1 | Уа1 |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Туг | Ьуз | Ьуз | ТЬг | Ьеи | РЬе | Уа1 | С1и | РЬе | ТЬг | Азр | Нтз | Ьеи | РЬе | Азп | 11е |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| А1а | Ьуз | Рго | Агд | Рго | Рго | Тгр | МеЬ | С1у | Ьеи | Ьеи | С1у | Рго | ТЬг | 11е | С1п |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| А1а | С1и | Уа1 | Туг | Азр | ТЬг | Уа1 | Уа1 | 11е | ТЬг | Ьеи | Ьуз | Азп | МеЬ | А1а | Зег |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| ΗΪ3 | Рго | Уа1 | Зег | Ьеи | Нтз | А1а | Уа1 | С1у | Уа1 | Зег | Туг | Тгр | Ьуз | А1а | Зег |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| С1и | С1у | А1а | С1и | Туг | Азр | Азр | С1п | ТЬг | Зег | С1п | Агд | С1и | Ьуз | С1и | Азр |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Азр | Ьуз | Уа1 | РЬе | Рго | С1у | С1у | Зег | Нтз | ТЬг | Туг | Уа1 | Тгр | С1п | Уа1 | Ьеи |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Ьуз | С1и | Азп | С1у | Рго | МеЬ | А1а | Зег | Азр | Рго | Ьеи | Суз | Ьеи | ТЬг | Туг | Зег |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Туг | Ьеи | Зег | Нтз | Уа1 | Азр | Ьеи | Уа1 | Ьуз | Азр | Ьеи | Азп | Зег | С1у | Ьеи | 11е |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| С1у | А1а | Ьеи | Ьеи | Уа1 | Суз | Агд | С1и | С1у | Зег | Ьеи | А1а | Ьуз | С1и | Ьуз | ТЬг |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| С1п | ТЬг | Ьеи | Нтз | Ьуз | РЬе | 11е | Ьеи | Ьеи | РЬе | А1а | Уа1 | РЬе | Азр | С1и | С1у |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Ьуз | Зег | Тгр | Нтз | Зег | С1и | ТЬг | Ьуз | Азп | Зег | Ьеи | МеЬ | С1п | Азр | Агд | Азр |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| А1а | А1а | Зег | А1а | Агд | А1а | Тгр | Рго | Ьуз | МеЬ | Нтз | ТЬг | Уа1 | Азп | С1у | Туг |
| 245 | 250 | 255 |
- 89 029560
| Уа1 | Азп | Агд | Зег 260 | Ьеи | Рго С1у | Ьеи | 11е 265 | С1у | Суз | Нтз | Агд | Ьуз 270 | Зег | Уа1 | |
| Туг | Тгр | ΗΪ3 | Уа1 | 11е | С1у | МеО | С1у | ТЬг | ТЬг | Рго | С1и | Уа1 | Нтз | Зег | 11е |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| РЬе | Ьеи | С1и | С1у | Нтз | ТЬг | РЬе | Ьеи | Уа1 | Агд | Азп | Нтз | Агд | С1п | А1а | Зег |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Ьеи | С1и | 11е | Зег | Рго | 11е | ТЬг | РЬе | Ьеи | ТЬг | А1а | С1п | ТЬг | Ьеи | Ьеи | МеО |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Азр | Ьеи | С1у | С1п | РЬе | Ьеи | Ьеи | РЬе | Суз | Нтз | 11е | Зег | Зег | Нтз | С1п | Нтз |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Азр | С1у | МеО | С1и | А1а | Туг | Уа1 | Ьуз | Уа1 | Азр | Зег | Суз | Рго | С1и | С1и | Рго |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| С1п | Ьеи | Агд | МеО | Ьуз | Азп | Азп | С1и | С1и | А1а | С1и | Азр | Туг | Азр | Азр | Азр |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Ьеи | ТЬг | Азр | Зег | С1и | МеО | Азр | Уа1 | Уа1 | Агд | РЬе | Азр | Азр | Азр | Азп | Зег |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Рго | Зег | РЬе | 11е | С1п | 11е | Агд | Зег | Уа1 | А1а | Ьуз | Ьуз | Нтз | Рго | Ьуз | ТЬг |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Тгр | Уа1 | Нтз | Туг | 11е | А1а | А1а | С1и | С1и | С1и | Азр | Тгр | Азр | Туг | А1а | Рго |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Ьеи | Уа1 | Ьеи | А1а | Рго | Азр | Азр | Агд | Зег | Туг | Ьуз | Зег | С1п | Туг | Ьеи | Азп |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Азп | С1у | Рго | С1п | Агд | 11е | С1у | Агд | Ьуз | Туг | Ьуз | Ьуз | Уа1 | Агд | РЬе | МеО |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| А1а | Туг | ТЬг | Азр | С1и | ТЬг | РЬе | Ьуз | ТЬг | Агд | С1и | А1а | 11е | С1п | Нтз | С1и |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Зег | С1у | 11е | Ьеи | С1у | Рго | Ьеи | Ьеи | Туг | С1у | С1и | Уа1 | С1у | Азр | ТЬг | Ьеи |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Ьеи | 11е | 11е | РЬе | Ьуз | Азп | С1п | А1а | Зег | Агд | Рго | Туг | Азп | 11е | Туг | Рго |
| 485 | 490 | 495 |
- 90 029560
| ΗΪΞ | С1у | 11е | ТЬг Αξρ 500 | Уа1 | Α^ | Рго | Ьеи 505 | Туг | Зег | Α^ | Α^ | Ьеи 510 | Рго | ^уΞ | |
| С1у | Уа1 | ^уΞ | Ηϊξ | Ьеи | ^уΞ | Αξρ | РЬе | Рго | 11е | Ьеи | Рго | 31у | 31и | 11е | РЬе |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| ΣιΥΞ | Туг | ^уΞ | Тгр | ТЬг | Уа1 | ТЬг | Уа1 | 31и | Αξρ | 31у | Рго | ТЬг | ^уΞ | Зег | Αξρ |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| Рго | Агд | Ο^Ξ | Ьеи | ТЬг | Α^ | Туг | Туг | Зег | Зег | РЬе | Уа1 | ΑΞη | МеЬ | 31и | Α^ |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| Αξρ | Ьеи | А1а | Зег | 31у | Ьеи | 11е | 31у | Рго | Ьеи | Ьеи | 11е | Ο^Ξ | Туг | ^уΞ | 31и |
| 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
| Зег | Уа1 | Αξρ | 31η | Α^ | 31у | ΑΞη | 31η | 11е | МеЬ | Зег | Αξρ | ^УΞ | Α^ | ΑΞη | Уа1 |
| 580 | 585 | 590 | |||||||||||||
| 11е | Ьеи | РЬе | Зег | Уа1 | РЬе | Αξρ | 31и | ΑΞη | Α^ | Зег | Тгр | Туг | Ьеи | ТЬг | 31и |
| 595 | 600 | 605 | |||||||||||||
| ΑΞη | 11е | 31η | Α^ | РЬе | Ьеи | Рго | ΑΞη | Рго | Α1β | 31у | Уа1 | 31η | Ьеи | 31и | Αξρ |
| 610 | 615 | 620 | |||||||||||||
| Рго | С1и | РЬе | Ο1η | Α1β | Зег | ΑΞη | 11е | МеЬ | Ηϊξ | Зег | 11е | ΑΞη | 31у | Туг | Уа1 |
| 625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
| РЬе | Αξρ | Зег | Ьеи | Ο1η | Ьеи | Зег | Уа1 | Ο^Ξ | Ьеи | Ηϊξ | 31и | Уа1 | Α1β | Туг | Тгр |
| 645 | 650 | 655 | |||||||||||||
| Туг | 11е | Ьеи | Зег | 11е | 31у | Α1β | 31η | ТЬг | Αξρ | РЬе | Ьеи | Зег | Уа1 | РЬе | РЬе |
| 660 | 665 | 670 | |||||||||||||
| Зег | С1у | Туг | ТЬг | РЬе | ^уΞ | Ηϊξ | ^уΞ | МеЬ | Уа1 | Туг | 31и | Αξρ | ТЬг | Ьеи | ТЬг |
| 675 | 680 | 685 | |||||||||||||
| Ьеи | РЬе | Рго | РЬе | Зег | 31у | 31и | ТЬг | Уа1 | РЬе | МеЬ | Зег | МеЬ | 31и | ΑΞη | Рго |
| 690 | 695 | 700 | |||||||||||||
| С1у | Ьеи | Тгр | 11е | Ьеи | 31у | Ο^Ξ | Ηϊξ | ΑΞη | Зег | Αξρ | РЬе | Α^ | ΑΞη | Α^ | 31у |
| 705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
| МеЬ | ТЬг | А1а | Ьеи | Ьеи | ^уΞ | Уа1 | Зег | Зег | Ο^Ξ | Αξρ | ^уΞ | ΑΞη | ТЬг | 31у | Αξρ |
| 725 | 730 | 735 |
- 91 029560
| Туг Туг С1и Азр 740 | Зег | Туг | С1и | Азр | 11е 745 | Зег | А1а | Туг | Ьеи | Ьеи 750 | Зег | Ьуз | |||
| Азп | Азп | А1а | 11е | С1и | Рго | Агд | Зег | РЬе | Зег | С1п | Азп | Рго | Рго | Уа1 | Ьеи |
| 755 | 760 | 765 | |||||||||||||
| Ьуз | Агд | Нтз | С1п | Агд | С1и | 11е | ТЬг | Агд | ТЬг | ТЬг | Ьеи | С1п | Зег | Азр | С1п |
| 770 | 775 | 780 | |||||||||||||
| С1и | С1и | 11е | Азр | Туг | Азр | Азр | ТЬг | 11е | Зег | Уа1 | С1и | МеЬ | Ьуз | Ьуз | С1и |
| 785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
| Азр | РЬе | Азр | 11е | Туг | Азр | С1и | Азр | С1и | Азп | С1п | Зег | Рго | Агд | Зег | РЬе |
| 805 | 810 | 815 | |||||||||||||
| С1п | Ьуз | Ьуз | ТЬг | Агд | Нтз | Туг | РЬе | 11е | А1а | А1а | Уа1 | С1и | Агд | Ьеи | Тгр |
| 820 | 825 | 830 | |||||||||||||
| Азр | Туг | С1у | МеЬ | Зег | Зег | Зег | Рго | Нтз | Уа1 | Ьеи | Агд | Азп | Агд | А1а | С1п |
| 835 | 840 | 845 | |||||||||||||
| Зег | С1у | Зег | Уа1 | Рго | С1п | РЬе | Ьуз | Ьуз | Уа1 | Уа1 | РЬе | С1п | С1и | РЬе | ТЬг |
| 850 | 855 | 860 | |||||||||||||
| Азр | С1у | Зег | РЬе | ТЬг | С1п | Рго | Ьеи | Туг | Агд | С1у | С1и | Ьеи | Азп | С1и | Нтз |
| 865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
| Ьеи | С1у | Ьеи | Ьеи | С1у | Рго | Туг | 11е | Агд | А1а | С1и | Уа1 | С1и | Азр | Азп | 11е |
| 885 | 890 | 895 | |||||||||||||
| МеЬ | Уа1 | ТЬг | РЬе | Агд | Азп | С1п | А1а | Зег | Агд | Рго | Туг | Зег | РЬе | Туг | Зег |
| 900 | 905 | 910 | |||||||||||||
| Зег | Ьеи | 11е | Зег | Туг | С1и | С1и | Азр | С1п | Агд | С1п | С1у | А1а | С1и | Рго | Агд |
| 915 | 920 | 925 | |||||||||||||
| Ьуз | Азп | РЬе | Уа1 | Ьуз | Рго | Азп | С1и | ТЬг | Ьуз | ТЬг | Туг | РЬе | Тгр | Ьуз | Уа1 |
| 930 | 935 | 940 | |||||||||||||
| С1п | Нтз | Нтз | МеЬ | А1а | Рго | ТЬг | Ьуз | Азр | С1и | РЬе | Азр | Суз | Ьуз | А1а | Тгр |
| 945 | 950 | 955 | 960 | ||||||||||||
| А1а | Туг | РЬе | Зег | Азр | Уа1 | Азр | Ьеи | С1и | Ьуз | Азр | Уа1 | Нтз | Зег | С1у | Ьеи |
| 965 | 970 | 975 |
- 92 029560
11е С1у Рго Ьеи Ьеи Уа1 Суе Ηϊξ ТЬг Азп ТЬг Ьеи Азп Рго А1а Нгз 980 985 990
С1у Агд С1п Уа1 ТЬг Уа1 С1п С1и РЬе А1а Ьеи РЬе РЬе ТЬг 11е РЬе
| 995 | 1000 | 1005 | ||||||||||||
| Азр | С1и | ТЬг | Ьуз | Зег | Тгр | Туг | РЬе | ТЬг | С1и | Азп | МеЬ | С1и | Агд | Азп |
| 1010 | 1015 | 1020 | ||||||||||||
| Суз | Агд | А1а | Рго | Суз | Азп | 11е | С1п | МеЬ | С1и | Азр | Рго | ТЬг | РЬе | Ьуз |
| 1025 | 1030 | 1035 | ||||||||||||
| С1и | Азп | Туг | Агд | РЬе | Нгз | А1а | 11е | Азп | С1у | Туг | 11е | МеЬ | Азр | ТЬг |
| 1040 | 1045 | 1050 | ||||||||||||
| Ьеи | Рго | С1у | Ьеи | Уа1 | МеЬ | А1а | С1п | Азр | С1п | Агд | 11е | Агд | Тгр | Туг |
| 1055 | 1060 | 1065 | ||||||||||||
| Ьеи | Ьеи | Зег | МеЬ | С1у | Зег | Азп | С1и | Азп | 11е | Нгз | Зег | 11е | Нгз | РЬе |
| 1070 | 1075 | 1080 | ||||||||||||
| Зег | С1у | Нгз | Уа1 | РЬе | ТЬг | Уа1 | Агд | Ьуз | Ьуз | С1и | С1и | Туг | Ьуз | МеЬ |
| 1085 | 1090 | 1095 | ||||||||||||
| А1а | Ьеи | Туг | Азп | Ьеи | Туг | Рго | С1у | Уа1 | РЬе | С1и | ТЬг | Уа1 | С1и | МеЬ |
| 1100 | 1105 | 1110 | ||||||||||||
| Ьеи | Рго | Зег | Ьуз | А1а | С1у | 11е | Тгр | Агд | Уа1 | С1и | Суз | Ьеи | 11е | С1у |
| 1115 | 1120 | 1125 | ||||||||||||
| С1и | Нгз | Ьеи | Нгз | А1а | С1у | МеЬ | Зег | ТЬг | Ьеи | РЬе | Ьеи | Уа1 | Туг | Зег |
| 1130 | 1135 | 1140 | ||||||||||||
| Азп | Ьуз | Суз | С1п | ТЬг | Рго | Ьеи | С1у | МеЬ | А1а | Зег | С1у | Нгз | 11е | Агд |
| 1145 | 1150 | 1155 | ||||||||||||
| Азр | РЬе | С1п | 11е | ТЬг | А1а | Зег | С1у | С1п | Туг | С1у | С1п | Тгр | А1а | Рго |
| 1160 | 1165 | 1170 | ||||||||||||
| Ьуз | Ьеи | А1а | Агд | Ьеи | Нгз | Туг | Зег | С1у | Зег | 11е | Азп | А1а | Тгр | Зег |
| 1175 | 1180 | 1185 | ||||||||||||
| ТЬг | Ьуз | С1и | Рго | РЬе | Зег | Тгр | 11е | Ьуз | Уа1 | Азр | Ьеи | Ьеи | А1а | Рго |
| 1190 | 1195 | 1200 |
- 93 029560
| МеЬ 1205 | 11е 1 | 11е | Нгз | С1у | 11е 1210 | Ьуз | ТЬг | С1п | С1у А1а Агд 1215 | С1п | Ьуз | РЬе |
| Зег | Зег | Ьеи | Туг | 11е | Зег | С1п | РЬе | 11е | 11е МеЬ Туг | Зег | Ьеи | Азр |
| 1220 | 1225 | 1230 | ||||||||||
| С1у | Ьуз | Ьуз | Тгр | С1п | ТЬг | Туг | Агд | С1у | Азп Зег ТЬг | С1у | ТЬг | Ьеи |
| 1235 | 1240 | 1245 | ||||||||||
| МеЬ | Уа1 | РЬе | РЬе | С1у | Азп | Уа1 | Азр | Зег | Зег С1у 11е | Ьуз | Нгз | Азп |
| 1250 | 1255 | 1260 | ||||||||||
| 11е | РЬе | Азп | Рго | Рго | 11е | 11е | А1а | Агд | Туг 11е Агд | Ьеи | Нгз | Рго |
| 1265 | 1270 | 1275 | ||||||||||
| ТЬг | Н13 | Туг | Зег | 11е | Агд | Зег | ТЬг | Ьеи | Агд МеЬ С1и | Ьеи | МеЬ | С1у |
| 1280 | 1285 | 1290 | ||||||||||
| Суз | Азр | Ьеи | Азп | Зег | Суз | Зег | МеЬ | Рго | Ьеи С1у МеЬ | С1и | Зег | Ьуз |
| 1295 | 1300 | 1305 | ||||||||||
| А1а | 11е | Зег | Азр | А1а | С1п | 11е | ТЬг | А1а | Зег Зег Туг | РЬе | ТЬг | Азп |
| 1310 | 1315 | 1320 | ||||||||||
| МеЬ | РЬе | А1а | ТЬг | Тгр | Зег | Рго | Зег | Ьуз | А1а Агд Ьеи | Нгз | Ьеи | С1п |
| 1325 | 1330 | 1335 | ||||||||||
| С1у | Агд | Зег | Азп | А1а | Тгр | Агд | Рго | С1п | Уа1 Азп Азп | Рго | Ьуз | С1и |
| 1340 | 1345 | 1350 | ||||||||||
| Тгр | Ьеи | С1п | Уа1 | Азр | РЬе | С1п | Ьуз | ТЬг | МеЬ Ьуз Уа1 | ТЬг | С1у | Уа1 |
| 1355 | 1360 | 1365 | ||||||||||
| ТЬг | ТЬг | С1п | С1у | Уа1 | Ьуз | Зег | Ьеи | Ьеи | ТЬг Зег МеЬ | Туг | Уа1 | Ьуз |
| 1370 | 1375 | 1380 | ||||||||||
| С1и | РЬе | Ьеи | 11е | Зег | Зег | Зег | С1п | Азр | С1у Нгз С1п | Тгр | ТЬг | Ьеи |
| 1385 | 1390 | 1395 | ||||||||||
| РЬе | РЬе | С1п | Азп | С1у | Ьуз | Уа1 | Ьуз | Уа1 | РЬе С1п С1у | Азп | С1п | Азр |
| 1400 | 1405 | 1410 | ||||||||||
| Зег | РЬе | ТЬг | Рго | Уа1 | Уа1 | Азп | Зег | Ьеи | Азр Рго Рго | Ьеи | Ьеи | ТЬг |
| 1415 | 1420 | 1425 |
- 94 029560
| Агд Туг 1430 | Ьеи | Агд | 11е | Нтз 1435 | Рго | С1п | Зег | Тгр | Уа1 1440 | Нтз 1 | С1п | 11е | А1а |
| Ьеи Агд | МеЕ | С1и | Уа1 | Ьеи | С1у | Суз | С1и | А1а | С1п | Азр | Ьеи | Туг | Азр |
| 1445 | 1450 | 1455 | |||||||||||
| Ьуз ТЬг | ΗΪ3 | ТЬг | Суз | Рго | Рго | Суз | Рго | А1а | Рго | С1и | Ьеи | Ьеи | С1у |
| 1460 | 1465 | 1470 | |||||||||||
| С1у Рго | Зег | Уа1 | РЬе | Ьеи | РЬе | Рго | Рго | Ьуз | Рго | Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи |
| 1475 | 1480 | 1485 | |||||||||||
| МеЕ 11е | Зег | Агд | ТЬг | Рго | С1и | Уа1 | ТЬг | Суз | Уа1 | Уа1 | Уа1 | Азр | Уа1 |
| 1490 | 1495 | 1500 | |||||||||||
| Зег Нтз | С1и | Азр | Рго | С1и | Уа1 | Ьуз | РЬе | Азп | Тгр | Туг | Уа1 | Азр | С1у |
| 1505 | 1510 | 1515 | |||||||||||
| Уа1 С1и | Уа1 | ΗΪ3 | Азп | А1а | Ьуз | ТЬг | Ьуз | Рго | Агд | С1и | С1и | С1п | Туг |
| 1520 | 1525 | 1530 | |||||||||||
| Азп Зег | ТЬг | Туг | Агд | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Уа1 | Ьеи | Нтз | С1п |
| 1535 | 1540 | 1545 | |||||||||||
| Азр Тгр | Ьеи | Азп | С1у | Ьуз | С1и | Туг | Ьуз | Суз | Ьуз | Уа1 | Зег | Азп | Ьуз |
| 1550 | 1555 | 1560 | |||||||||||
| А1а Ьеи | Рго | А1а | Рго | 11е | С1и | Ьуз | ТЬг | 11е | Зег | Ьуз | А1а | Ьуз | С1у |
| 1565 | 1570 | 1575 | |||||||||||
| С1п Рго | Агд | С1и | Рго | С1п | Уа1 | Туг | ТЬг | Ьеи | Рго | Рго | Зег | Агд | Азр |
| 1580 | 1585 | 1590 | |||||||||||
| С1и Ьеи | ТЬг | Ьуз | Азп | С1п | Уа1 | Зег | Ьеи | ТЬг | Суз | Ьеи | Уа1 | Ьуз | С1у |
| 1595 | 1600 | 1605 | |||||||||||
| РЬе Туг | Рго | Зег | Азр | 11е | А1а | Уа1 | С1и | Тгр | С1и | Зег | Азп | С1у | С1п |
| 1610 | 1615 | 1620 | |||||||||||
| Рго С1и | Азп | Азп | Туг | Ьуз | ТЬг | ТЬг | Рго | Рго | Уа1 | Ьеи | Азр | Зег | Азр |
| 1625 | 1630 | 1635 | |||||||||||
| С1у Зег | РЬе | РЬе | Ьеи | Туг | Зег | Ьуз | Ьеи | ТЬг | Уа1 | Азр | Ьуз | Зег | Агд |
| 1640 | 1645 | 1650 |
- 95 029560
| Тгр 1655 | С1п | С1п С1у Азп | Уа1 1660 | РНе | Зег | Суз | Зег | Уа1 1665 | МеЬ | Нтз | С1и | А1а | ||
| Ьеи | Нтз | Азп | Нтз | Туг | ТНг | С1п | Ьуз | Зег | Ьеи | Зег | Ьеи | Зег | Рго | С1у |
| 1670 | 1675 | 1680 |
Ьуз
<210> 3
<211> 741
<212>ДНК
<213> Ното зартепз
<400> 3
аЬддадасад асасасЬссЬ дсЬаЬдддЬа сЬдсЬдсЬсЬ дддЬЬссадд ЬЬссасЬддЬ 60
дасаааасЬс асасаЬдссс ассдЬдссса дсассЬдаас ЬссЬдддадд ассдЬсадЬс 120
ЬЬссЬсЬЬсс ссссаааасс сааддасасс сЬсаЬдаЬсЬ сссддасссс ЬдаддЬсаса 180
ЬдсдЬддЬдд ЬддасдЬдад ссасдаадас ссЬдаддЬса адЬЬсаасЬд дЬасдЬддас 240
ддсдЬддадд ЬдсаЬааЬдс саадасааад ссдсдддадд адсадЬасаа садсасдЬас 300
сдЬдЬддЬса дсдЬссЬсас сдЬссЬдсас саддасЬддс ЬдааЬддсаа ддадЬасаад 360
ЬдсааддЬсЬ ссаасааадс ссЬсссадсс сссаЬсдада ааассаЬсЬс сааадссааа 420
дддсадсссс дадаассаса ддЬдЬасасс сЬдсссссаЬ сссдсдаЬда дсЬдассаад 480
аассаддЬса дссЬдассЬд ссЬддЬсааа ддсЬЬсЬаЬс ссадсдасаЬ сдссдЬддад 540
Ьдддададса аЬдддсадсс ддадаасаас Ьасаадасса сдссЬсссдЬ дЬЬддасЬсс 600
дасддсЬссЬ ЬсЬЬссЬсЬа садсаадсЬс ассдЬддаса ададсаддЬд дсадсадддд 660
аасдЬсЬЬсЬ саЬдсЬссдЬ даЬдсаЬдад дсЬсЬдсаса ассасЬасас дсадаададс 720
сЬсЬсссЬдЬ сЬссдддЬаа а
741
<210> 4
<211> 247
- 96 029560
<212>ДНК
<213> Ното заргепз
<400> 4
| МеО 1 | С1и | ТЬг Азр | ТЬг 5 | Ьеи | Ьеи | Ьеи Тгр | Уа1 10 | Ьеи | Ьеи | Ьеи | Тгр | Уа1 15 | Рго | ||
| С1у | Зег | ТЬг | С1у | Азр | Ьуз | ТЬг | Нгз | ТЬг | Суз | Рго | Рго | Суз | Рго | А1а | Рго |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| С1и | Ьеи | Ьеи | С1у | С1у | Рго | Зег | Уа1 | РЬе | Ьеи | РЬе | Рго | Рго | Ьуз | Рго | Ьуз |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Азр | ТЬг | Ьеи | МеО | 11е | Зег | Агд | ТЬг | Рго | С1и | Уа1 | ТЬг | Суз | Уа1 | Уа1 | Уа1 |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Азр | Уа1 | Зег | Нгз | С1и | Азр | Рго | С1и | Уа1 | Ьуз | РЬе | Азп | Тгр | Туг | Уа1 | Азр |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| С1у | Уа1 | С1и | Уа1 | Нгз | Азп | А1а | Ьуз | ТЬг | Ьуз | Рго | Агд | С1и | С1и | С1п | Туг |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Азп | Зег | ТЬг | Туг | Агд | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Уа1 | Ьеи | Нгз | С1п | Азр |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Тгр | Ьеи | Азп | С1у | Ьуз | С1и | Туг | Ьуз | Суз | Ьуз | Уа1 | Зег | Азп | Ьуз | А1а | Ьеи |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Рго | А1а | Рго | 11е | С1и | Ьуз | ТЬг | 11е | Зег | Ьуз | А1а | Ьуз | С1у | С1п | Рго | Агд |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| С1и | Рго | С1п | Уа1 | Туг | ТЬг | Ьеи | Рго | Рго | Зег | Агд | Азр | С1и | Ьеи | ТЬг | Ьуз |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Азп | С1п | Уа1 | Зег | Ьеи | ТЬг | Суз | Ьеи | Уа1 | Ьуз | С1у | РЬе | Туг | Рго | Зег | Азр |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| 11е | А1а | Уа1 | С1и | Тгр | С1и | Зег | Азп | С1у | С1п | Рго | С1и | Азп | Азп | Туг | Ьуз |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| ТНг | ТЬг | Рго | Рго | Уа1 | Ьеи | Азр | Зег | Азр | С1у | Зег | РЬе | РЬе | Ьеи | Туг | Зег |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Ьуз | Ьеи | ТЬг | Уа1 | Азр | Ьуз | Зег | Агд | Тгр | С1п | С1п | С1у | Азп | Уа1 | РЬе | Зег |
| 210 | 215 | 220 |
- 97 029560
| Суз Зег Уа1 МеЕ Нтз С1и А1а Ьеи Нтз Азп Нтз Туг ТЬг С1п Ьуз Зег | |||||
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||
| Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз 245 | |||||
| <210> 5 <211> 7734 <212>ДНК <213> Ното зартепз | |||||
| <400> 5 аЕдсаааЕад 60 | адсЕсЕссас | сЕдсЕЕсЕЕЕ | сЕдЕдссЕЕЕ | ЕдсдаЕЕсЕд | сЕЕЕадЕдсс |
| ассадаадаЕ 120 | асЕассЕддд | ЕдсадЕддаа | сЕдЕсаЕддд | асЕаЕаЕдса | аадЕдаЕсЕс |
| ддЕдадсЕдс 180 | сЕдЕддасдс | аадаЕЕЕссЕ | ссЕададЕдс | сааааЕсЕЕЕ | ЕссаЕЕсаас |
| ассЕсадЕсд 240 | ЕдЕасааааа | дасЕсЕдЕЕЕ | дЕадааЕЕса | сддаЕсассЕ | ЕЕЕсаасаЕс |
| дсЕаадссаа 300 | ддссасссЕд | даЕдддЕсЕд | сЕаддЕссЕа | ссаЕссаддс | ЕдаддЕЕЕаЕ |
| даЕасадЕдд 360 | ЕсаЕЕасасЕ | ЕаадаасаЕд | дсЕЕсссаЕс | сЕдЕсадЕсЕ | ЕсаЕдсЕдЕЕ |
| ддЕдЕаЕссЕ 420 | асЕддааадс | ЕЕсЕдаддда | дсЕдааЕаЕд | аЕдаЕсадас | садЕсааадд |
| дадааадаад 480 | аЕдаЕааадЕ | сЕЕсссЕддЕ | ддаадссаЕа | саЕаЕдЕсЕд | дсаддЕссЕд |
| ааададааЕд 540 | дЕссааЕддс | сЕсЕдассса | сЕдЕдссЕЕа | ссЕасЕсаЕа | ЕсЕЕЕсЕсаЕ |
| дЕддассЕдд 600 | ЕаааадасЕЕ | дааЕЕсаддс | сЕсаЕЕддад | сссЕасЕадЕ | аЕдЕададаа |
| дддадЕсЕдд 660 | ссааддаааа | дасасадасс | ЕЕдсасаааЕ | ЕЕаЕасЕасЕ | ЕЕЕЕдсЕдЕа |
| ЕЕЕдаЕдаад 720 | ддаааадЕЕд | дсасЕсадаа | асааадаасЕ | ссЕЕдаЕдса | ддаЕадддаЕ |
| дсЕдсаЕсЕд 780 | сЕсдддссЕд | дссЕааааЕд | сасасадЕса | аЕддЕЕаЕдЕ | ааасаддЕсЕ |
| сЕдссаддЕс 840 | ЕдаЕЕддаЕд | ссасаддааа | ЕсадЕсЕаЕЕ | ддсаЕдЕдаЕ | ЕддааЕдддс |
| ассасЕссЕд | аадЕдсасЕс | ааЕаЕЕссЕс | дааддЕсаса | саЕЕЕсЕЕдЕ | даддаассаЕ |
900
- 98 029560
| сдссаддсдС 960 | ссССддаааС | сСсдссааСа | асСССссССа | сСдсСсааас | асСсССдаСд |
| дассССддас 1020 | адСССсСасС | дССССдСсаС | аСсСсССссс | ассаасаСда | СддсаСддаа |
| дсССаСдСса 1080 | аадСадасад | сСдСссадад | даассссаас | СасдааСдаа | аааСааСдаа |
| даадсддаад 1140 | асСаСдаСда | СдаСсССасС | даССсСдааа | СддаСдСддС | саддСССдаС |
| даСдасаасС 1200 | сСссССссСС | СаСссаааСС | сдсСсадССд | ссаадаадса | СссСаааасС |
| СдддСасаСС 1260 | асаССдсСдс | Сдаададдад | дасСдддасС | аСдсСсссСС | адСссСсдсс |
| сссдаСдаса 1320 | даадССаСаа | аадСсааСаС | ССдаасааСд | дсссСсадсд | даССддСадд |
| аадСасаааа 1380 | аадСссдаСС | СаСддсаСас | асадаСдааа | ссСССаадас | СсдСдаадсС |
| аССсадсаСд 1440 | ааСсаддааС | сССдддассС | ССасСССаСд | дддаадССдд | адасасасСд |
| ССдаССаСаС 1500 | ССаадааСса | адсаадсада | ссаСаСааса | СсСасссСса | сддааСсасС |
| даСдСссдСс 1560 | сСССдСаССс | ааддадаССа | ссааааддСд | СаааасаССС | дааддаСССС |
| ссааССсСдс 1620 | саддадаааС | аССсаааСаС | аааСддасад | СдасСдСада | адаСдддсса |
| асСаааСсад 1680 | аСссСсддСд | ссСдасссдс | СаССасСсСа | дСССсдССаа | СаСддадада |
| даСсСадсСС 1740 | саддасСсаС | СддсссСсСс | сСсаСсСдсС | асааадааСс | СдСадаСсаа |
| ададдааасс 1800 | адаСааСдСс | адасаададд | ааСдСсаСсс | СдССССсСдС | аСССдаСдад |
| аассдаадсС 1860 | ддСассСсас | ададааСаСа | саасдсСССс | СссссааСсс | адсСддадСд |
| садсССдадд 1920 | аСссададСС | ссаадссСсс | аасаСсаСдс | асадсаСсаа | СддсСаСдСС |
| СССдаСадСС 1980 | СдсадССдСс | адСССдСССд | саСдаддСдд | саСасСддСа | саССсСаадс |
| аССддадсас 2040 | адасСдасСС | ссСССсСдСс | ССсССсСсСд | даСаСассСС | сааасасааа |
| аСддСсСаСд | аадасасасС | сасссСаССс | ссаССсСсад | дадааасСдС | сССсаСдСсд |
2100
- 99 029560
| акддаааасс 2160 | саддкскакд | даккскдддд | кдссасааск | садасккксд | даасададдс |
| акдассдсск 2220 | каскдааддк | ккскадккдк | дасаадааса | скддкдакка | ккасдаддас |
| адккакдаад 2280 | акаккксадс | акасккдскд | адкаааааса | акдссаккда | ассаадаадс |
| кксксссада 2340 | акксаадаса | ссскадсаск | аддсаааадс | аакккаакдс | сассасаакк |
| ссадаааакд 2400 | асакададаа | даскдассск | кддкккдсас | асадаасасс | какдсскааа |
| акасаааакд 2460 | ксксскскад | кдакккдккд | акдсксккдс | дасададксс | каскссасак |
| дддскаксск 2520 | какскдакск | ссаадаадсс | ааакакдада | скккккскда | кдакссакса |
| сскддадсаа 2580 | кадасадкаа | каасадсскд | кскдааакда | сасаскксад | дссасадскс |
| саксасадкд 2640 | дддасакддк | акккасссск | дадксаддсс | кссааккаад | аккааакдад |
| аааскдддда 2700 | сааскдсадс | аасададккд | аадааасккд | аккксааадк | ккскадкаса |
| ксааакаакс 2760 | кдаккксаас | ааккссакса | дасаакккдд | садсаддкас | кдакаакаса |
| адккссккад 2820 | дасссссаад | какдссадкк | саккакдака | дксааккада | кассаскска |
| кккддсаааа 2880 | адксаксксс | ссккаскдад | кскддкддас | скскдадскк | дадкдаадаа |
| аакаакдакк 2940 | сааадккдкк | адааксаддк | ккаакдаака | дссаадааад | кксакдддда |
| ааааакдкак 3000 | сдксаасада | дадкддкадд | ккакккааад | ддаааададс | ксакддасск |
| дскккдккда 3060 | скааадакаа | кдссккаккс | ааадккадса | кскскккдкк | ааадасааас |
| ааааскксса 3120 | акаакксадс | ааскаакада | аадасксаса | ккдакддссс | аксаккакка |
| аккдадаака 3180 | дкссаксадк | скддсаааак | акаккадааа | дкдасаскда | дкккаааааа |
| дкдасасскк 3240 | кдакксакда | садаакдскк | акддасаааа | акдскасадс | кккдаддска |
| ааксакакдк | сааакаааас | каскксакса | ааааасакдд | ааакддксса | асадаааааа |
3300
- 100 029560
| дадддсссса 3360 | ЕЕссассада | ЕдсасааааЕ | ссадаЕаЕдЕ | сдЕЕсЕЕЕаа | даЕдсЕаЕЕс |
| ЕЕдссадааЕ 3420 | садсааддЕд | даЕасааадд | асЕсаЕддаа | адаасЕсЕсЕ | даасЕсЕддд |
| сааддсссса 3480 | дЕссааадса | аЕЕадЕаЕсс | ЕЕаддассад | аааааЕсЕдЕ | ддааддЕсад |
| ааЕЕЕсЕЕдЕ 3540 | сЕдадааааа | сааадЕддЕа | дЕаддааадд | дЕдааЕЕЕас | аааддасдЕа |
| ддасЕсааад 3600 | адаЕддЕЕЕЕ | Ессаадсадс | адааассЕаЕ | ЕЕсЕЕасЕаа | сЕЕддаЕааЕ |
| ЕЕасаЕдааа 3660 | аЕааЕасаса | сааЕсаадаа | аааааааЕЕс | аддаадаааЕ | адаааадаад |
| дааасаЕЕаа 3720 | Ессаададаа | ЕдЕадЕЕЕЕд | ссЕсадаЕас | аЕасадЕдас | ЕддсасЕаад |
| ааЕЕЕсаЕда 3780 | адаассЕЕЕЕ | сЕЕасЕдадс | асЕаддсааа | аЕдЕадаадд | ЕЕсаЕаЕдас |
| ддддсаЕаЕд 3840 | сЕссадЕасЕ | ЕсаадаЕЕЕЕ | аддЕсаЕЕаа | аЕдаЕЕсаас | аааЕадааса |
| аадааасаса 3900 | садсЕсаЕЕЕ | сЕсааааааа | ддддаддаад | аааасЕЕдда | аддсЕЕддда |
| ааЕсааасса 3960 | адсаааЕЕдЕ | ададаааЕаЕ | дсаЕдсасса | сааддаЕаЕс | ЕссЕааЕаса |
| адссадсада 4020 | аЕЕЕЕдЕсас | дсаасдЕадЕ | аадададсЕЕ | ЕдааасааЕЕ | садасЕссса |
| сЕадаадааа 4080 | садаасЕЕда | аааааддаЕа | аЕЕдЕддаЕд | асассЕсаас | ссадЕддЕсс |
| ааааасаЕда 4140 | аасаЕЕЕдас | сссдадсасс | сЕсасасада | ЕадасЕасаа | Едадааддад |
| аааддддсса 4200 | ЕЕасЕсадЕс | ЕсссЕЕаЕса | даЕЕдссЕЕа | сдаддадЕса | ЕадсаЕсссЕ |
| саадсаааЕа 4260 | даЕсЕссаЕЕ | асссаЕЕдса | ааддЕаЕсаЕ | саЕЕЕссаЕс | ЕаЕЕадассЕ |
| аЕаЕаЕсЕда 4320 | ссадддЕссЕ | аЕЕссаадас | аасЕсЕЕсЕс | аЕсЕЕссадс | адсаЕсЕЕаЕ |
| адааадааад 4380 | аЕЕсЕддддЕ | ссаадааадс | адЕсаЕЕЕсЕ | Еасааддадс | сааааааааЕ |
| аассЕЕЕсЕЁ 4440 | ЕадссаЕЕсЕ | аассЕЕддад | аЕдасЕддЕд | аЕсааадада | ддЕЕддсЕсс |
| сЕддддасаа | дЕдссасааа | ЕЕсадЕсаса | Еасаадааад | ЕЕдадаасас | ЕдЕЕсЕсссд |
4500
- 101 029560
| ааассадаск 4560 | кдсссаааас | акскддсааа | дккдааккдс | ккссаааадк | ксасакккак |
| садааддасс 4620 | каккссскас | ддаааскадс | аакдддкскс | скддссакск | ддаксксдкд |
| даадддадсс 4680 | ккскксаддд | аасададдда | дсдаккаадк | ддаакдаадс | ааасадасск |
| ддаааадккс 4740 | сскккскдад | адкадсааса | дааадскскд | сааадасксс | скссаадска |
| ккддаксскс 4800 | ккдсккддда | каассаскак | ддкасксада | кассаааада | ададкддааа |
| ксссаадада 4860 | адксассада | ааааасадск | кккаадаааа | аддакассак | кккдкссскд |
| аасдсккдкд 4920 | ааадсаакса | кдсаакадса | дсаакааакд | адддасаааа | каадсссдаа |
| акадаадкса 4980 | сскдддсааа | дсааддкадд | аскдаааддс | кдкдскскса | ааасссасса |
| дксккдааас 5040 | дссаксаасд | ддааакааск | сдкаскаскс | кксадксада | ксаададдаа |
| аккдаскакд 5100 | акдакассак | аксадккдаа | акдаадаадд | аадаккккда | сакккакдак |
| даддакдааа 5160 | аксададссс | ссдсадсккк | саааадаааа | сасдасаска | ккккаккдск |
| дсадкддада 5220 | ддскскддда | ккакдддакд | адкадскссс | сасакдккск | аадааасадд |
| дсксададкд 5280 | дсадкдкссс | ксадкксаад | ааадккдккк | кссаддаакк | каскдакддс |
| ксскккаскс 5340 | адсссккака | ссдкддадаа | скааакдаас | акккдддаск | сскддддсса |
| какакаадад 5400 | садаадккда | адакаакакс | акддкааскк | ксадааакса | ддссксксдк |
| ссскакксск 5460 | кскаккскад | ссккакккск | какдаддаад | аксададдса | аддадсадаа |
| сскадааааа 5520 | аскккдксаа | дсскаакдаа | ассааааскк | асккккддаа | адкдсаасак |
| сакакддсас 5580 | ссаскааада | кдадкккдас | кдсааадсск | дддсккаккк | скскдакдкк |
| дасскддааа 5640 | аадакдкдса | сксаддсскд | аккддасссс | ккскддкскд | ссасаскаас |
| асаскдаасс | скдсксакдд | дадасаадкд | асадкасадд | аакккдскск | дккккксасс |
5700
- 102 029560
| аСсСССдаСд 5760 | адассаааад | сСддСасССс | асСдааааСа | Сддааадааа | сСдсадддсС |
| сссСдсааСа 5820 | СссадаСдда | адаСсссасС | СССааадада | аССаСсдсСС | ссаСдсааСс |
| ааСддсСаса 5880 | СааСддаСас | асСассСддс | ССадСааСдд | сСсаддаСса | ааддаССсда |
| СддСаСсСдс 5940 | СсадсаСддд | садсааСдаа | аасаСссаСС | сСаССсаССС | садСддасаС |
| дСдССсасСд 6000 | Сасдаааааа | ададдадСаС | ааааСддсас | СдСасааСсС | сСаСссаддС |
| дСССССдада 6060 | садСддаааС | дССассаСсс | ааадсСддаа | СССддсдддС | ддааСдссСС |
| аССддсдадс 6120 | аСсСасаСдс | СдддаСдадс | асасСССССс | СддСдСасад | сааСаадСдС |
| садасСсссс 6180 | СдддааСддс | ССсСддасас | аССададаСС | ССсадаССас | адсССсадда |
| сааСаСддас 6240 | адСдддсссс | ааадсСддсс | адасССсаСС | аССссддаСс | ааСсааСдсс |
| Сддадсасса 6300 | аддадсссСС | ССсССддаСс | ааддСддаСс | СдССддсасс | ааСдаССаСС |
| сасддсаСса 6360 | адасссаддд | СдсссдСсад | аадССсСсса | дссСсСасаС | сСсСсадССС |
| аСсаСсаСдС 6420 | аСадСсССда | Сдддаадаад | СддсадасСС | аСсдаддааа | ССссасСдда |
| ассССааСдд 6480 | СсССсСССдд | сааСдСддаС | СсаСсСддда | Саааасасаа | СаСССССаас |
| ссСссааССа 6540 | ССдсСсдаСа | саСссдСССд | сасссаасСс | аССаСадсаС | СсдсадсасС |
| сССсдсаСдд 6600 | адССдаСддд | сСдСдаСССа | ааСадССдса | дсаСдссаСС | дддааСддад |
| адСааадсаа 6660 | СаСсадаСдс | асадаССасС | дсССсаСссС | асСССассаа | СаСдСССдсс |
| ассСддСсСс 6720 | сССсаааадс | СсдасССсас | сСссааддда | ддадСааСдс | сСддадассС |
| саддСдааСа 6780 | аСссаааада | дСддсСдсаа | дСддасССсс | адаадасааС | дааадСсаса |
| ддадСаасСа 6840 | сСсадддадС | ааааСсСсСд | сССассадса | СдСаСдСдаа | ддадССссСс |
| аСсСссадса | дСсаадаСдд | ссаСсадСдд | асСсСсСССС | ССсадааСдд | сааадСааад |
6900
- 103 029560
| дЕЕЕЕЕсадд 6960 | даааЕсаада | сЕссЕЕсаса | ссЕдЕддЕда | асЕсЕсЕада | сссассдЕЕа |
| сЕдасЕсдсЕ 7020 | ассЕЕсдааЕ | Есасссссад | адЕЕдддЕдс | ассадаЕЕдс | ссЕдаддаЕд |
| даддЕЕсЕдд 7080 | дсЕдсдаддс | асаддассЕс | Еасдасаааа | сЕсасасаЕд | сссассдЕдс |
| ссадсЕссад 7140 | аасЕссЕддд | сддассдЕса | дЕсЕЕссЕсЕ | Ессссссааа | асссааддас |
| асссЕсаЕда 7200 | ЕсЕсссддас | сссЕдаддЕс | асаЕдсдЕдд | ЕддЕддасдЕ | дадссасдаа |
| дасссЕдадд 7260 | ЕсаадЕЕсаа | сЕддЕасдЕд | дасддсдЕдд | аддЕдсаЕаа | Едссаадаса |
| аадссдсддд 7320 | аддадсадЕа | саасадсасд | ЕассдЕдЕдд | ЕсадсдЕссЕ | сассдЕссЕд |
| сассаддасЕ 7380 | ддсЕдааЕдд | сааддадЕас | аадЕдсаадд | ЕсЕссаасаа | адсссЕссса |
| дсссссаЕсд 7440 | адаааассаЕ | сЕссааадсс | ааадддсадс | сссдадаасс | асаддЕдЕас |
| асссЕдсссс 7500 | саЕсссддда | ЕдадсЕдасс | аадаассадд | ЕсадссЕдас | сЕдссЕддЕс |
| аааддсЕЕсЕ 7560 | аЕсссадсда | саЕсдссдЕд | дадЕдддада | дсааЕдддса | дссддадаас |
| аасЕасаада 7620 | ссасдссЕсс | сдЕдЕЕддас | ЕссдасддсЕ | ссЕЕсЕЕссЕ | сЕасадсаад |
| сЕсассдЕдд 7680 | асаададсад | дЕддсадсад | дддаасдЕсЕ | ЕсЕсаЕдсЕс | сдЕдаЕдсаЕ |
| даддсЕсЕдс | асаассасЕа | сасдсадаад | адссЕсЕссс | ЕдЕсЕссддд | Еааа |
7734
<210> 6
<211> 2578
<212>БЕЛОК
<213> Ното зартепз
<400> 6
| МеЕ 1 | С1п | 11е | С1и | Ьеи 5 | Зег | ТЬг | Суз | РЬе | РЬе 10 | Ьеи | Суз | Ьеи | Ьеи | Агд 15 | РЬе |
| Суз | РЬе | Зег | А1а | ТЬг | Агд | Агд | Туг | Туг | Ьеи | С1у | А1а | Уа1 | С1и | Ьеи | Зег |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Тгр | Азр | Туг | МеЕ | С1п | Зег | Азр | Ьеи | С1у | С1и | Ьеи | Рго | Уа1 | Азр | А1а | Агд |
35 40 45
- 104 029560
| РЬе | Рго 50 | Рго | Агд νβ1 | Рго | Ьуз 55 | Зег | РЬе | Рго | РЬе | Азп 60 | ТЬг | Зег | νβ1 | νβ1 | |
| Туг | Ьуз | Ьуз | ТЬг | Ьеи | РЬе | νβ1 | С1и | РЬе | ТЬг | Азр | Нтз | Ьеи | РЬе | Азп | Не |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| А1а | Ьуз | Рго | Агд | Рго | Рго | Тгр | МеС | С1у | Ьеи | Ьеи | С1у | Рго | ТЬг | Не | С1п |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| А1а | С1и | νβ1 | Туг | Азр | ТЬг | νβ1 | νβ1 | Не | ТЬг | Ьеи | Ьуз | Азп | МеС | А1а | Зег |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| ΗΪΞ | Рго | νβ1 | Зег | Ьеи | Нтз | А1а | νβ1 | С1у | νβ1 | Зег | Туг | Тгр | Ьуз | А1а | Зег |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| С1и | С1у | А1а | С1и | Туг | Азр | Азр | С1п | ТЬг | Зег | С1п | Агд | С1и | Ьуз | С1и | Азр |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Азр | Ьуз | νβ1 | РЬе | Рго | С1у | С1у | Зег | Нтз | ТЬг | Туг | νβ1 | Тгр | С1п | νβ1 | Ьеи |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Ьуз | С1и | Азп | С1у | Рго | МеС | А1а | Зег | Азр | Рго | Ьеи | Суз | Ьеи | ТЬг | Туг | Зег |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Туг | Ьеи | Зег | Нтз | νβ1 | Азр | Ьеи | νβ1 | Ьуз | Азр | Ьеи | Азп | Зег | С1у | Ьеи | Не |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| С1у | А1а | Ьеи | Ьеи | νβ1 | Суз | Агд | С1и | С1у | Зег | Ьеи | А1а | Ьуз | С1и | Ьуз | ТЬг |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| С1п | ТЬг | Ьеи | Нтз | Ьуз | РЬе | Не | Ьеи | Ьеи | РЬе | А1а | νβ1 | РЬе | Азр | С1и | С1у |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Ьуз | Зег | Тгр | Нтз | Зег | С1и | ТЬг | Ьуз | Азп | Зег | Ьеи | МеС | С1п | Азр | Агд | Азр |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| А1а | А1а | Зег | А1а | Агд | А1а | Тгр | Рго | Ьуз | МеС | Нтз | ТЬг | νβ1 | Азп | С1у | Туг |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| νβ1 | Азп | Агд | Зег | Ьеи | Рго | С1у | Ьеи | Не | С1у | Суз | НФз | Агд | Ьуз | Зег | νβ1 |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Туг | Тгр | Нтз | νβ1 | Не | С1у | МеС | С1у | ТЬг | ТЬг | Рго | С1и | νβ1 | Нтз | Зег | Не |
| 275 | 280 | 285 |
- 105 029560
| РЬе 290 | Ьеи | С1и | С1у | Нтз | ТЬг 295 | РЬе | Ьеи Уа1 | Агд | Азп 300 | Нтз | Агд | С1п | А1а | Бег | |
| Ьеи | С1и | 11е | Бег | Рго | 11е | ТЬг | РЬе | Ьеи | ТЬг | А1а | С1п | ТЬг | Ьеи | Ьеи | Мек |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Азр | Ьеи | С1у | С1п | РЬе | Ьеи | Ьеи | РЬе | Суз | Нтз | 11е | Бег | Бег | Нтз | С1п | Нтз |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Азр | С1у | Мек | С1и | А1а | Туг | Уа1 | Ьуз | Уа1 | Азр | Бег | Суз | Рго | С1и | С1и | Рго |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| С1п | Ьеи | Агд | Мек | Ьуз | Азп | Азп | С1и | С1и | А1а | С1и | Азр | Туг | Азр | Азр | Азр |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Ьеи | ТЬг | Азр | Бег | С1и | Мек | Азр | Уа1 | Уа1 | Агд | РЬе | Азр | Азр | Азр | Азп | Бег |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Рго | Бег | РЬе | 11е | С1п | 11е | Агд | Бег | Уа1 | А1а | Ьуз | Ьуз | Нтз | Рго | Ьуз | ТЬг |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Тгр | Уа1 | Нтз | Туг | 11е | А1а | А1а | С1и | С1и | С1и | Азр | Тгр | Азр | Туг | А1а | Рго |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Ьеи | Уа1 | Ьеи | А1а | Рго | Азр | Азр | Агд | Бег | Туг | Ьуз | Бег | С1п | Туг | Ьеи | Азп |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Азп | С1у | Рго | С1п | Агд | 11е | С1у | Агд | Ьуз | Туг | Ьуз | Ьуз | Уа1 | Агд | РЬе | Мек |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| А1а | Туг | ТЬг | Азр | С1и | ТЬг | РЬе | Ьуз | ТЬг | Агд | С1и | А1а | 11е | С1п | Нтз | С1и |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Бег | С1у | 11е | Ьеи | С1у | Рго | Ьеи | Ьеи | Туг | С1у | С1и | Уа1 | С1у | Азр | ТЬг | Ьеи |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Ьеи | 11е | 11е | РЬе | Ьуз | Азп | С1п | А1а | Бег | Агд | Рго | Туг | Азп | 11е | Туг | Рго |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| Нтз | С1у | 11е | ТЬг | Азр | Уа1 | Агд | Рго | Ьеи | Туг | Бег | Агд | Агд | Ьеи | Рго | Ьуз |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| С1у | Уа1 | Ьуз | Нтз | Ьеи | Ьуз | Азр | РЬе | Рго | 11е | Ьеи | Рго | С1у | С1и | 11е | РЬе |
| 515 | 520 | 525 |
- 106 029560
| Ьуз | Туг 530 | Ьуз | Тгр | ТЬг | Уа1 | ТЬг 535 | Уа1 | С1и Азр С1у Рго 540 | ТЬг | Ьуз | Зег | Азр | |||
| Рго | Агд | Суз | Ьеи | ТЬг | Агд | Туг | Туг | Зег | Зег | РЬе | Уа1 | Азп | МеЕ | С1и | Агд |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| Азр | Ьеи | А1а | Зег | С1у | Ьеи | 11е | С1у | Рго | Ьеи | Ьеи | 11е | Суз | Туг | Ьуз | С1и |
| 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
| Зег | Уа1 | Азр | С1п | Агд | С1у | Азп | С1п | 11е | МеЕ | Зег | Азр | Ьуз | Агд | Азп | Уа1 |
| 580 | 585 | 590 | |||||||||||||
| 11е | Ьеи | РЬе | Зег | Уа1 | РЬе | Азр | С1и | Азп | Агд | Зег | Тгр | Туг | Ьеи | ТЬг | С1и |
| 595 | 600 | 605 | |||||||||||||
| Азп | 11е | С1п | Агд | РЬе | Ьеи | Рго | Азп | Рго | А1а | С1у | Уа1 | С1п | Ьеи | С1и | Азр |
| 610 | 615 | 620 | |||||||||||||
| Рго | С1и | РЬе | С1п | А1а | Зег | Азп | 11е | МеЕ | Нтз | Зег | 11е | Азп | С1у | Туг | Уа1 |
| 625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
| РЬе | Азр | Зег | Ьеи | С1п | Ьеи | Зег | Уа1 | Суз | Ьеи | Нтз | С1и | Уа1 | А1а | Туг | Тгр |
| 645 | 650 | 655 | |||||||||||||
| Туг | 11е | Ьеи | Зег | 11е | С1у | А1а | С1п | ТЬг | Азр | РЬе | Ьеи | Зег | Уа1 | РЬе | РЬе |
| 660 | 665 | 670 | |||||||||||||
| Зег | С1у | Туг | ТЬг | РЬе | Ьуз | Нтз | Ьуз | МеЕ | Уа1 | Туг | С1и | Азр | ТЬг | Ьеи | ТЬг |
| 675 | 680 | 685 | |||||||||||||
| Ьеи | РЬе | Рго | РЬе | Зег | С1у | С1и | ТЬг | Уа1 | РЬе | МеЕ | Зег | МеЕ | С1и | Азп | Рго |
| 690 | 695 | 700 | |||||||||||||
| С1у | Ьеи | Тгр | 11е | Ьеи | С1у | Суз | Нтз | Азп | Зег | Азр | РЬе | Агд | Азп | Агд | С1у |
| 705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
| МеЕ | ТЬг | А1а | Ьеи | Ьеи | Ьуз | Уа1 | Зег | Зег | Суз | Азр | Ьуз | Азп | ТЬг | С1у | Азр |
| 725 | 730 | 735 | |||||||||||||
| Туг | Туг | С1и | Азр | Зег | Туг | С1и | Азр | 11е | Зег | А1а | Туг | Ьеи | Ьеи | Зег | Ьуз |
| 740 | 745 | 750 | |||||||||||||
| Азп | Азп | А1а | 11е | С1и | Рго | Агд | Зег | РЬе | Зег | С1п | Азп | Зег | Агд | Нтз | Рго |
| 755 | 760 | 765 |
- 107 029560
| Зег ТЬг | Агд С1п | Ьуз | С1п | РЬе Азп А1а ТЬг 775 | ТЬг | 11е 780 | Рго | С1и | Азп | Азр | |||||
| 770 | |||||||||||||||
| 11е | С1и | Ьуз | ТЬг | Азр | Рго | Тгр | РЬе | А1а | Нтз | Агд | ТЬг | Рго | Мек | Рго | Ьуз |
| 785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
| 11е | С1п | Азп | Уа1 | Зег | Зег | Зег | Азр | Ьеи | Ьеи | Мек | Ьеи | Ьеи | Агд | С1п | Зег |
| 805 | 810 | 815 | |||||||||||||
| Рго | ТЬг | Рго | Нтз | С1у | Ьеи | Зег | Ьеи | Зег | Азр | Ьеи | С1п | С1и | А1а | Ьуз | Туг |
| 820 | 825 | 830 | |||||||||||||
| С1и | ТЬг | РЬе | Зег | Азр | Азр | Рго | Зег | Рго | С1у | А1а | 11е | Азр | Зег | Азп | Азп |
| 835 | 840 | 845 | |||||||||||||
| Зег | Ьеи | Зег | С1и | Мек | ТЬг | Нтз | РЬе | Агд | Рго | С1п | Ьеи | Нтз | Нтз | Зег | С1у |
| 850 | 855 | 860 | |||||||||||||
| Азр | Мек | Уа1 | РЬе | ТЬг | Рго | С1и | Зег | С1у | Ьеи | С1п | Ьеи | Агд | Ьеи | Азп | С1и |
| 865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
| Ьуз | Ьеи | С1у | ТЬг | ТЬг | А1а | А1а | ТЬг | С1и | Ьеи | Ьуз | Ьуз | Ьеи | Азр | РЬе | Ьуз |
| 885 | 890 | 895 | |||||||||||||
| Уа1 | Зег | Зег | ТЬг | Зег | Азп | Азп | Ьеи | 11е | Зег | ТЬг | 11е | Рго | Зег | Азр | Азп |
| 900 | 905 | 910 | |||||||||||||
| Ьеи | А1а | А1а | С1у | ТЬг | Азр | Азп | ТЬг | Зег | Зег | Ьеи | С1у | Рго | Рго | Зег | Мек |
| 915 | 920 | 925 | |||||||||||||
| Рго | Уа1 | Нтз | Туг | Азр | Зег | С1п | Ьеи | Азр | ТЬг | ТЬг | Ьеи | РЬе | С1у | Ьуз | Ьуз |
| 930 | 935 | 940 | |||||||||||||
| Зег | Зег | Рго | Ьеи | ТЬг | С1и | Зег | С1у | С1у | Рго | Ьеи | Зег | Ьеи | Зег | С1и | С1и |
| 945 | 950 | 955 | 960 | ||||||||||||
| Азп | Азп | Азр | Зег | Ьуз | Ьеи | Ьеи | С1и | Зег | С1у | Ьеи | Мек | Азп | Зег | С1п | С1и |
| 965 | 970 | 975 | |||||||||||||
| Зег | Зег | Тгр | С1у | Ьуз | Азп | Уа1 | Зег | Зег | ТЬг | С1и | Зег | С1у | Агд | Ьеи | РЬе |
| 980 | 985 | 990 |
Ьуз С1у Ьуз Агд А1а ΗΪ5 995
С1у Рго А1а Ьеи Ьеи ТЬг Ьуз Азр Азп А1а 1000 1005
- 108 029560
| Ьеи | РНе 1010 | Ьуз | Уа1 | Зег | 11е | Зег 1015 | Ьеи | Ьеи | Ьуз | ТНг | Азп 1020 | Ьуз | ТНг | Зег |
| Азп | Азп | Зег | А1а | ТНг | Азп | Агд | Ьуз | ТНг | Нтз | 11е | Азр | С1у | Рго | Зег |
| 1025 | 1030 | 1035 | ||||||||||||
| Ьеи | Ьеи | 11е | С1и | Азп | Зег | Рго | Зег | Уа1 | Тгр | С1п | Азп | 11е | Ьеи | С1и |
| 1040 | 1045 | 1050 | ||||||||||||
| Зег | Азр | ТНг | С1и | РНе | Ьуз | Ьуз | Уа1 | ТНг | Рго | Ьеи | 11е | Нтз | Азр | Агд |
| 1055 | 1060 | 1065 | ||||||||||||
| МеЬ | Ьеи | МеЬ | Азр | Ьуз | Азп | А1а | ТНг | А1а | Ьеи | Агд | Ьеи | Азп | Нтз | МеЬ |
| 1070 | 1075 | 1080 | ||||||||||||
| Зег | Азп | Ьуз | ТНг | ТНг | Зег | Зег | Ьуз | Азп | МеЬ | С1и | МеЬ | Уа1 | С1п | С1п |
| 1085 | 1090 | 1095 | ||||||||||||
| Ьуз | Ьуз | С1и | С1у | Рго | 11е | Рго | Рго | Азр | А1а | С1п | Азп | Рго | Азр | МеЬ |
| 1100 | 1105 | 1110 | ||||||||||||
| Зег | РНе | РНе | Ьуз | МеЬ | Ьеи | РНе | Ьеи | Рго | С1и | Зег | А1а | Агд | Тгр | 11е |
| 1115 | 1120 | 1125 | ||||||||||||
| С1п | Агд | ТНг | Нтз | С1у | Ьуз | Азп | Зег | Ьеи | Азп | Зег | С1у | С1п | С1у | Рго |
| 1130 | 1135 | 1140 | ||||||||||||
| Зег | Рго | Ьуз | С1п | Ьеи | Уа1 | Зег | Ьеи | С1у | Рго | С1и | Ьуз | Зег | Уа1 | С1и |
| 1145 | 1150 | 1155 | ||||||||||||
| С1у | С1п | Азп | РНе | Ьеи | Зег | С1и | Ьуз | Азп | Ьуз | Уа1 | Уа1 | Уа1 | С1у | Ьуз |
| 1160 | 1165 | 1170 | ||||||||||||
| С1у | С1и | РНе | ТНг | Ьуз | Азр | Уа1 | С1у | Ьеи | Ьуз | С1и | МеЬ | Уа1 | РНе | Рго |
| 1175 | 1180 | 1185 | ||||||||||||
| Зег | Зег | Агд | Азп | Ьеи | РНе | Ьеи | ТНг | Азп | Ьеи | Азр | Азп | Ьеи | Нтз | С1и |
| 1190 | 1195 | 1200 | ||||||||||||
| Азп | Азп | ТНг | Нтз | Азп | С1п | С1и | Ьуз | Ьуз | 11е | С1п | С1и | С1и | 11е | С1и |
| 1205 | 1210 | 1215 | ||||||||||||
| Ьуз | Ьуз | С1и | ТНг | Ьеи | 11е | С1п | С1и | Азп | Уа1 | Уа1 | Ьеи | Рго | С1п | 11е |
| 1220 | 1225 | 1230 |
- 109
029560
| Нтз | ТЬг 1235 | Уа1 | ТЬг | С1у | ТЬг | Ьуз 1240 | Азп | РЬе | МеЕ | Ьуз | Азп 1245 | Ьеи | РЬе | Ьеи |
| Ьеи | Зег | ТЬг | Агд | С1п | Азп | Уа1 | С1и | С1у | Зег | Туг | Азр | С1у | А1а | Туг |
| 1250 | 1255 | 1260 | ||||||||||||
| А1а | Рго | Уа1 | Ьеи | С1п | Азр | РЬе | Агд | Зег | Ьеи | Азп | Азр | Зег | ТЬг | Азп |
| 1265 | 1270 | 1275 | ||||||||||||
| Агд | ТЬг | Ьуз | Ьуз | Нтз | ТЬг | А1а | Нтз | РЬе | Зег | Ьуз | Ьуз | С1у | С1и | С1и |
| 1280 | 1285 | 1290 | ||||||||||||
| С1и | Азп | Ьеи | С1и | С1у | Ьеи | С1у | Азп | С1п | ТЬг | Ьуз | С1п | 11е | Уа1 | С1и |
| 1295 | 1300 | 1305 | ||||||||||||
| Ьуз | Туг | А1а | Суз | ТЬг | ТЬг | Агд | 11е | Зег | Рго | Азп | ТЬг | Зег | С1п | С1п |
| 1310 | 1315 | 1320 | ||||||||||||
| Азп | РЬе | Уа1 | ТЬг | С1п | Агд | Зег | Ьуз | Агд | А1а | Ьеи | Ьуз | С1п | РЬе | Агд |
| 1325 | 1330 | 1335 | ||||||||||||
| Ьеи | Рго | Ьеи | С1и | С1и | ТЬг | С1и | Ьеи | С1и | Ьуз | Агд | 11е | 11е | Уа1 | Азр |
| 1340 | 1345 | 1350 | ||||||||||||
| Азр | ТЬг | Зег | ТЬг | С1п | Тгр | Зег | Ьуз | Азп | МеЕ | Ьуз | Нтз | Ьеи | ТЬг | Рго |
| 1355 | 1360 | 1365 | ||||||||||||
| Зег | ТЬг | Ьеи | ТЬг | С1п | 11е | Азр | Туг | Азп | С1и | Ьуз | С1и | Ьуз | С1у | А1а |
| 1370 | 1375 | 1380 | ||||||||||||
| 11е | ТЬг | С1п | Зег | Рго | Ьеи | Зег | Азр | Суз | Ьеи | ТЬг | Агд | Зег | Нтз | Зег |
| 1385 | 1390 | 1395 | ||||||||||||
| 11е | Рго | С1п | А1а | Азп | Агд | Зег | Рго | Ьеи | Рго | 11е | А1а | Ьуз | Уа1 | Зег |
| 1400 | 1405 | 1410 | ||||||||||||
| Зег | РЬе | Рго | Зег | 11е | Агд | Рго | 11е | Туг | Ьеи | ТЬг | Агд | Уа1 | Ьеи | РЬе |
| 1415 | 1420 | 1425 | ||||||||||||
| С1п | Азр | Азп | Зег | Зег | Нтз | Ьеи | Рго | А1а | А1а | Зег | Туг | Агд | Ьуз | Ьуз |
| 1430 | 1435 | 1440 | ||||||||||||
| Азр | Зег | С1у | Уа1 | С1п | С1и | Зег | Зег | Нтз | РЬе | Ьеи | С1п | С1у | А1а | Ьуз |
| 1445 | 1450 | 1455 |
- 110
029560
| Ьуз | Азп 1460 | Азп | Ьеи | Зег | Ьеи | А1а 1465 | 11е | Ьеи | ТЬг | Ьеи | С1и 1470 | МеЬ | ТЬг | С1у |
| Азр | С1п | Агд | С1и | Уа1 | С1у | Зег | Ьеи | С1у | ТЬг | Зег | А1а | ТЬг | Азп | Зег |
| 1475 | 1480 | 1485 | ||||||||||||
| Уа1 | ТЬг | Туг | Ьуз | Ьуз | Уа1 | С1и | Азп | ТЬг | Уа1 | Ьеи | Рго | Ьуз | Рго | Азр |
| 1490 | 1495 | 1500 | ||||||||||||
| Ьеи | Рго | Ьуз | ТЬг | Зег | С1у | Ьуз | Уа1 | С1и | Ьеи | Ьеи | Рго | Ьуз | Уа1 | Нгз |
| 1505 | 1510 | 1515 | ||||||||||||
| 11е | Туг | С1п | Ьуз | Азр | Ьеи | РЬе | Рго | ТЬг | С1и | ТЬг | Зег | Азп | С1у | Зег |
| 1520 | 1525 | 1530 | ||||||||||||
| Рго | С1у | Нгз | Ьеи | Азр | Ьеи | Уа1 | С1и | С1у | Зег | Ьеи | Ьеи | С1п | С1у | ТЬг |
| 1535 | 1540 | 1545 | ||||||||||||
| С1и | С1у | А1а | 11е | Ьуз | Тгр | Азп | С1и | А1а | Азп | Агд | Рго | С1у | Ьуз | Уа1 |
| 1550 | 1555 | 1560 | ||||||||||||
| Рго | РЬе | Ьеи | Агд | Уа1 | А1а | ТЬг | С1и | Зег | Зег | А1а | Ьуз | ТЬг | Рго | Зег |
| 1565 | 1570 | 1575 | ||||||||||||
| Ьуз | Ьеи | Ьеи | Азр | Рго | Ьеи | А1а | Тгр | Азр | Азп | Нгз | Туг | С1у | ТЬг | С1п |
| 1580 | 1585 | 1590 | ||||||||||||
| 11е | Рго | Ьуз | С1и | С1и | Тгр | Ьуз | Зег | С1п | С1и | Ьуз | Зег | Рго | С1и | Ьуз |
| 1595 | 1600 | 1605 | ||||||||||||
| ТЬг | А1а | РЬе | Ьуз | Ьуз | Ьуз | Азр | ТЬг | 11е | Ьеи | Зег | Ьеи | Азп | А1а | Суз |
| 1610 | 1615 | 1620 | ||||||||||||
| С1и | Зег | Азп | Нгз | А1а | 11е | А1а | А1а | 11е | Азп | С1и | С1у | С1п | Азп | Ьуз |
| 1625 | 1630 | 1635 | ||||||||||||
| Рго | С1и | 11е | С1и | Уа1 | ТЬг | Тгр | А1а | Ьуз | С1п | С1у | Агд | ТЬг | С1и | Агд |
| 1640 | 1645 | 1650 | ||||||||||||
| Ьеи | Суз | Зег | С1п | Азп | Рго | Рго | Уа1 | Ьеи | Ьуз | Агд | Нгз | С1п | Агд | С1и |
| 1655 | 1660 | 1665 | ||||||||||||
| 11е | ТЬг | Агд | ТЬг | ТЬг | Ьеи | С1п | Зег | Азр | С1п | С1и | С1и | 11е | Азр | Туг |
| 1670 | 1675 | 1680 |
- 111
029560
| Азр | Азр 1685 | ТЬг | 11е | Зег | Уа1 | С1и 1690 | МеЬ | Ьуз | Ьуз | С1и | Азр 1695 | РЬе | Азр | 11е |
| Туг | Азр | С1и | Азр | С1и | Азп | С1п | Зег | Рго | Агд | Зег | РЬе | С1п | Ьуз | Ьуз |
| 1700 | 1705 | 1710 | ||||||||||||
| ТЬг | Агд | Нгз | Туг | РЬе | 11е | А1а | А1а | Уа1 | С1и | Агд | Ьеи | Тгр | Азр | Туг |
| 1715 | 1720 | 1725 | ||||||||||||
| С1у | МеЬ | Зег | Зег | Зег | Рго | Нгз | Уа1 | Ьеи | Агд | Азп | Агд | А1а | С1п | Зег |
| 1730 | 1735 | 1740 | ||||||||||||
| С1у | Зег | Уа1 | Рго | С1п | РЬе | Ьуз | Ьуз | Уа1 | Уа1 | РЬе | С1п | С1и | РЬе | ТЬг |
| 1745 | 1750 | 1755 | ||||||||||||
| Азр | С1у | Зег | РЬе | ТЬг | С1п | Рго | Ьеи | Туг | Агд | С1у | С1и | Ьеи | Азп | С1и |
| 1760 | 1765 | 1770 | ||||||||||||
| Нгз | Ьеи | С1у | Ьеи | Ьеи | С1у | Рго | Туг | 11е | Агд | А1а | С1и | Уа1 | С1и | Азр |
| 1775 | 1780 | 1785 | ||||||||||||
| Азп | 11е | МеЬ | Уа1 | ТЬг | РЬе | Агд | Азп | С1п | А1а | Зег | Агд | Рго | Туг | Зег |
| 1790 | 1795 | 1800 | ||||||||||||
| РЬе | Туг | Зег | Зег | Ьеи | 11е | Зег | Туг | С1и | С1и | Азр | С1п | Агд | С1п | С1у |
| 1805 | 1810 | 1815 | ||||||||||||
| А1а | С1и | Рго | Агд | Ьуз | Азп | РЬе | Уа1 | Ьуз | Рго | Азп | С1и | ТЬг | Ьуз | ТЬг |
| 1820 | 1825 | 1830 | ||||||||||||
| Туг | РЬе | Тгр | Ьуз | Уа1 | С1п | Нгз | Нгз | МеЬ | А1а | Рго | ТЬг | Ьуз | Азр | С1и |
| 1835 | 1840 | 1845 | ||||||||||||
| РЬе | Азр | Суз | Ьуз | А1а | Тгр | А1а | Туг | РЬе | Зег | Азр | Уа1 | Азр | Ьеи | С1и |
| 1850 | 1855 | 1860 | ||||||||||||
| Ьуз | Азр | Уа1 | Нгз | Зег | С1у | Ьеи | 11е | С1у | Рго | Ьеи | Ьеи | Уа1 | Суз | Нгз |
| 1865 | 1870 | 1875 | ||||||||||||
| ТЬг | Азп | ТЬг | Ьеи | Азп | Рго | А1а | Нгз | С1у | Агд | С1п | Уа1 | ТЬг | Уа1 | С1п |
| 1880 | 1885 | 1890 | ||||||||||||
| С1и | РЬе | А1а | Ьеи | РЬе | РЬе | ТЬг | 11е | РЬе | Азр | С1и | ТЬг | Ьуз | Зег | Тгр |
| 1895 | 1900 | 1905 |
- 112
029560
| Туг | РЬе 1910 | ТЬг | 31и | ΑΞη | МеЬ | 31и 1915 | Α^ ΑΞη | СуΞ | Α^ | Α1β 1920 | Рго | СуΞ | ΑΞη | |
| 11е | 31η | МеЬ | 31и | Αξρ | Рго | ТЬг | РЬе | ^уΞ | 31и | ΑΞη | Туг | Α^ | РЬе | ΗΪΞ |
| 1925 | 1930 | 1935 | ||||||||||||
| Α1β | 11е | ΑΞη | 31у | Туг | 11е | МеЬ | Αξρ | ТЬг | Ьеи | Рго | 31у | Ьеи | Уа1 | МеЬ |
| 1940 | 1945 | 1950 | ||||||||||||
| Α1β | 31η | Αξρ | 31η | Α^ | 11е | Α^ | Тгр | Туг | Ьеи | Ьеи | Зег | МеЬ | 31у | Зег |
| 1955 | 1960 | 1965 | ||||||||||||
| ΑΞη | 31и | ΑΞη | 11е | ΗΪΞ | Зег | 11е | ΗΪΞ | РЬе | Зег | 31у | ΗΪΞ | Уа1 | РЬе | ТЬг |
| 1970 | 1975 | 1980 | ||||||||||||
| Уа1 | Α^ | ^уΞ | ^уΞ | 31и | 31и | Туг | ^уΞ | МеЬ | Α1β | Ьеи | Туг | ΑΞη | Ьеи | Туг |
| 1985 | 1990 | 1995 | ||||||||||||
| Рго | 31у | Уа1 | РЬе | 31и | ТЬг | Уа1 | 31и | МеЬ | Ьеи | Рго | Зег | ^уΞ | Α1β | 31у |
| 2000 | 2005 | 2010 | ||||||||||||
| 11е | Тгр | Α^ | Уа1 | 31и | СуΞ | Ьеи | 11е | 31у | 31и | ΗΪΞ | Ьеи | ΗΪΞ | Α1β | 31у |
| 2015 | 2020 | 2025 | ||||||||||||
| МеЬ | Зег | ТЬг | Ьеи | РЬе | Ьеи | Уа1 | Туг | Зег | ΑΞη | ^уΞ | СуΞ | 31η | ТЬг | Рго |
| 2030 | 2035 | 2040 | ||||||||||||
| Ьеи | 31у | МеЬ | Α1β | Зег | 31у | ΗΪΞ | 11е | Α^ | Αξρ | РЬе | 31η | 11е | ТЬг | Α1β |
| 2045 | 2050 | 2055 | ||||||||||||
| Зег | 31у | 31η | Туг | 31у | 31η | Тгр | Α1β | Рго | ^уΞ | Ьеи | Α1β | Α^ | Ьеи | ΗΪΞ |
| 2060 | 2065 | 2070 | ||||||||||||
| Туг | Зег | 31у | Зег | 11е | ΑΞη | Α1β | Тгр | Зег | ТЬг | ^уΞ | 31и | Рго | РЬе | Зег |
| 2075 | 2080 | 2085 | ||||||||||||
| Тгр | 11е | ^уΞ | Уа1 | Αξρ | Ьеи | Ьеи | Α1β | Рго | МеЬ | 11е | 11е | ΗΪΞ | 31у | 11е |
| 2090 | 2095 | 2100 | ||||||||||||
| ^уΞ | ТЬг | 31η | 31у | Α1β | Α^ | 31η | ^уΞ | РЬе | Зег | Зег | Ьеи | Туг | 11е | Зег |
| 2105 | 2110 | 2115 | ||||||||||||
| 31η | РЬе | 11е | 11е | МеЬ | Туг | Зег | Ьеи | Αξρ | 31у | ^уΞ | ^уΞ | Тгр | 31η | ТЬг |
| 2120 | 2125 | 2130 |
- 113
029560
| Туг Агд | С1у | Азп | Зег | ТЬг | С1у 2140 | ТЬг | Ьеи | МеЬ | Уа1 | РЬе 2145 | РЬе | С1у | Азп | |
| 2135 | ||||||||||||||
| Уа1 | Азр | Зег | Зег | С1у | 11е | Ьуз | Нтз | Азп | 11е | РЬе | Азп | Рго | Рго | 11е |
| 2150 | 2155 | 2160 | ||||||||||||
| 11е | А1а | Агд | Туг | 11е | Агд | Ьеи | Нтз | Рго | ТЬг | Нтз | Туг | Зег | 11е | Агд |
| 2165 | 2170 | 2175 | ||||||||||||
| Зег | ТЬг | Ьеи | Агд | МеЬ | С1и | Ьеи | МеЬ | С1у | Суз | Азр | Ьеи | Азп | Зег | Суз |
| 2180 | 2185 | 2190 | ||||||||||||
| Зег | МеЬ | Рго | Ьеи | С1у | МеЬ | С1и | Зег | Ьуз | А1а | 11е | Зег | Азр | А1а | С1п |
| 2195 | 2200 | 2205 | ||||||||||||
| 11е | ТЬг | А1а | Зег | Зег | Туг | РЬе | ТЬг | Азп | МеЬ | РЬе | А1а | ТЬг | Тгр | Зег |
| 2210 | 2215 | 2220 | ||||||||||||
| Рго | Зег | Ьуз | А1а | Агд | Ьеи | Нтз | Ьеи | С1п | С1у | Агд | Зег | Азп | А1а | Тгр |
| 2225 | 2230 | 2235 | ||||||||||||
| Агд | Рго | С1п | Уа1 | Азп | Азп | Рго | Ьуз | С1и | Тгр | Ьеи | С1п | Уа1 | Азр | РЬе |
| 2240 | 2245 | 2250 | ||||||||||||
| С1п | Ьуз | ТЬг | МеЬ | Ьуз | Уа1 | ТЬг | С1у | Уа1 | ТЬг | ТЬг | С1п | С1у | Уа1 | Ьуз |
| 2255 | 2260 | 2265 | ||||||||||||
| Зег | Ьеи | Ьеи | ТЬг | Зег | МеЬ | Туг | Уа1 | Ьуз | С1и | РЬе | Ьеи | 11е | Зег | Зег |
| 2270 | 2275 | 2280 | ||||||||||||
| Зег | С1п | Азр | С1у | Нтз | С1п | Тгр | ТЬг | Ьеи | РЬе | РЬе | С1п | Азп | С1у | Ьуз |
| 2285 | 2290 | 2295 | ||||||||||||
| Уа1 | Ьуз | Уа1 | РЬе | С1п | С1у | Азп | С1п | Азр | Зег | РЬе | ТЬг | Рго | Уа1 | Уа1 |
| 2300 | 2305 | 2310 | ||||||||||||
| Азп | Зег | Ьеи | Азр | Рго | Рго | Ьеи | Ьеи | ТЬг | Агд | Туг | Ьеи | Агд | 11е | Нтз |
| 2315 | 2320 | 2325 | ||||||||||||
| Рго | С1п | Зег | Тгр | Уа1 | Нтз | С1п | 11е | А1а | Ьеи | Агд | МеЬ | С1и | Уа1 | Ьеи |
| 2330 | 2335 | 2340 | ||||||||||||
| С1у | Суз | С1и | А1а | С1п | Азр | Ьеи | Туг | Азр | Ьуз | ТЬг | Нтз | ТЬг | Суз | Рго |
| 2345 | 2350 | 2355 |
- 114
029560
| Рго | Суз 2360 | Рго | А1а | Рго | С1и | Ьеи 2365 | Ьеи | С1у | С1у | Рго | Зег 2370 | Уа1 | РЬе | Ьеи |
| РЬе | Рго | Рго | Ьуз | Рго | Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | МеО | 11е | Зег | Агд | ТЬг | Рго |
| 2375 | 2380 | 2385 | ||||||||||||
| С1и | Уа1 | ТЬг | Суз | Уа1 | Уа1 | Уа1 | Азр | Уа1 | Зег | Нгз | С1и | Азр | Рго | С1и |
| 2390 | 2395 | 2400 | ||||||||||||
| Уа1 | Ьуз | РЬе | Азп | Тгр | Туг | Уа1 | Азр | С1у | Уа1 | С1и | Уа1 | Нгз | Азп | А1а |
| 2405 | 2410 | 2415 | ||||||||||||
| Ьуз | ТЬг | Ьуз | Рго | Агд | С1и | С1и | С1п | Туг | Азп | Зег | ТЬг | Туг | Агд | Уа1 |
| 2420 | 2425 | 2430 | ||||||||||||
| Уа1 | Зег | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Уа1 | Ьеи | Нгз | С1п | Азр | Тгр | Ьеи | Азп | С1у | Ьуз |
| 2435 | 2440 | 2445 | ||||||||||||
| С1и | Туг | Ьуз | Суз | Ьуз | Уа1 | Зег | Азп | Ьуз | А1а | Ьеи | Рго | А1а | Рго | 11е |
| 2450 | 2455 | 2460 | ||||||||||||
| С1и | Ьуз | ТЬг | 11е | Зег | Ьуз | А1а | Ьуз | С1у | С1п | Рго | Агд | С1и | Рго | С1п |
| 2465 | 2470 | 2475 | ||||||||||||
| Уа1 | Туг | ТЬг | Ьеи | Рго | Рго | Зег | Агд | Азр | С1и | Ьеи | ТЬг | Ьуз | Азп | С1п |
| 2480 | 2485 | 2490 | ||||||||||||
| Уа1 | Зег | Ьеи | ТЬг | Суз | Ьеи | Уа1 | Ьуз | С1у | РЬе | Туг | Рго | Зег | Азр | 11е |
| 2495 | 2500 | 2505 | ||||||||||||
| А1а | Уа1 | С1и | Тгр | С1и | Зег | Азп | С1у | С1п | Рго | С1и | Азп | Азп | Туг | Ьуз |
| 2510 | 2515 | 2520 | ||||||||||||
| ТЬг | ТЬг | Рго | Рго | Уа1 | Ьеи | Азр | Зег | Азр | С1у | Зег | РЬе | РЬе | Ьеи | Туг |
| 2525 | 2530 | 2535 | ||||||||||||
| Зег | Ьуз | Ьеи | ТЬг | Уа1 | Азр | Ьуз | Зег | Агд | Тгр | С1п | С1п | С1у | Азп | Уа1 |
| 2540 | 2545 | 2550 | ||||||||||||
| РЬе | Зег | Суз | Зег | Уа1 | МеО | Нгз | С1и | А1а | Ьеи | Нгз | Азп | Нгз | Туг | ТЬг |
| 2555 | 2560 | 2565 | ||||||||||||
| С1п | Ьуз | Зег | Ьеи | Зег | Ьеи | Зег | Рго | С1у | Ьуз |
2570 2575
- 115
029560
Claims (25)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Применение химерного полипептида, содержащего часть фактора свёртывания крови и Рс-часть, для производства лекарственного средства для уменьшения ингибирующего иммунного ответа у субъекта, причём у указанного субъекта присутствует ингибирующий иммунный ответ на фактор свёртывания крови.
- 2. Применение по п.1, которое отличается тем, что указанная часть фактора свёртывания крови включает фактор УШ, фактор IX, фактор У11, фактор фон Виллебранда или их фрагменты.
- 3. Применение по п.1 или 2, которое отличается тем, что субъектом является плод, ребёнок или взрослый.
- 4. Применение по п.3, которое отличается тем, что ребёнок имеет возраст меньше 1 года или взрослый является беременной женщиной.
- 5. Применение по любому из пп.1-4, которое отличается тем, что часть фактора свёртывания крови является полноразмерным или зрелым фактором свёртывания крови.
- 6. Применение по любому из пп.1-5, которое отличается тем, что часть фактора свёртывания крови включает один или больше отличающихся от Рс-части фрагментов, которые увеличивают период полувыведения.
- 7. Применение по любому из пп.2-6, которое отличается тем, что иммунный ответ включает образование ингибирующих антител к фактору свёртывания крови.
- 8. Применение по п.7, которое отличается тем, что концентрация антител составляет по меньшей мере 0,6 единиц Бетесда (БЕ) или по меньшей мере 5 БЕ.
- 9. Применение по любому из пп.1-8, которое отличается тем, что иммунный ответ включает клеточно-опосредованный иммунный ответ.
- 10. Применение по п.9, которое отличается тем, что клеточно-опосредованный иммунный ответ включает высвобождение цитокинов, выбранных из ГЬ-12, 1Ь-4 и ТХР-а.
- 11. Применение по любому из пп.1-10, которое отличается тем, что иммунный ответ включает клинический симптом, выбранный из группы, состоящей из увеличения тенденции возникновения кровотечений, высокого уровня использования фактора свёртывания крови, недостаточного ответа на терапию с помощью фактора свёртывания крови, снижения эффективности терапии с помощью фактора свёртывания крови и сокращения периода полувыведения фактора свёртывания крови.
- 12. Применение по любому из пп.1-11, которое отличается тем, что химерный полипептид понижает у субъекта количество антител к фактору РУШ или титр антител к РУШ, понижает у субъекта уровень цитокина, понижает у субъекта количество антител к РУШ в сравнении с таким количеством после предварительного лечения субъекта полипептидом, состоящим из полипептида РУШ, понижает у субъекта титр антител к РУШ в сравнении с таким титром после предварительного лечения субъекта полипептидом, состоящим из полипептида РУШ, понижает у субъекта уровень цитокина в сравнении с таким уровнем после предварительного лечения субъекта полипептидом, состоящим из полипептида РУШ, понижает у субъекта количество антител к фактору свёртывания крови в сравнении с таким количеством, которое могло бы возникнуть в результате введения субъекту полипептида, состоящего из части фактора свёртывания крови, понижает у субъекта титр антител к фактору свёртывания крови в сравнении с таким титром, который мог бы возникнуть в результате введения субъекту полипептида, состоящего из части фактора свёртывания крови, или понижает у субъекта уровень цитокина в сравнении с таким уровнем, который мог бы возникнуть в результате введения субъекту полипептида, состоящего из части фактора свёртывания крови.
- 13. Применение по любому из пп.1-12, которое отличается тем, что у субъекта идентифицирована одна или больше особенностей, выбранных из группы, состоящей из:(a) наличие мутации или делеции гена, кодирующего фактор свёртывания крови;(b) наличие перестройки гена, кодирующего фактор свёртывания крови;(c) наличие родственника, у которого ранее развился ингибирующий иммунный ответ к фактору свёртывания крови;(б) получение лечения препаратами интерферонов;(е) получение лечения противовирусными препаратами;(Г) наличие генетической мутации в гене, отличном от гена, кодирующего фактор свёртывания крови, который связан с повышенным риском развития ингибирующего иммунного ответа; и(д) комбинации двух или большего количества таких особенностей.
- 14. Применение по п.13, которое отличается тем, что генетическая мутация в гене, отличном от гена, кодирующего фактор свёртывания крови, включает одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из:(ί) генетического полиморфизма, связанного с повышением уровня ТХР-а;- 116 029560(ίί) генетического полиморфизма, связанного с повышением уровня Ш10;(ίίί) генетического полиморфизма, связанного с понижением уровня ΟΈΑ(ίν) мутации молекул ΌΚ15 или ЭОВ0602 главного комплекса гистосовместимости (МНС) II класса;(ν) комбинации двух или большего количества таких мутаций.
- 15. Применение по любому из пп.1-14, которое отличается тем, что часть фактора свёртывания крови включает РУШ человека.
- 16. Применение по п.15, которое отличается тем, что РУШ человека несёт полную или частичную делецию В-домена.
- 17. Применение по любому из пп.1-14, которое отличается тем, что часть фактора свёртывания крови включает фактор ΙΧ человека.
- 18. Применение по любому из пп.1-14, которое отличается тем, что часть фактора свёртывания крови включает фактор У11 человека.
- 19. Применение по любому из пп.1-18, которое отличается тем, что химерный полипептид является мономер-димерным гибридным белком, содержащим первую цепь, содержащую часть фактора свёртывания крови и Рс-часть, и вторую цепь, в основном состоящую из Рс-части или состоящую из Рс-части.
- 20. Набор, содержащий:(a) фармацевтическую композицию, содержащую химерный полипептид, содержащий часть фактора свёртывания крови и Рс-часть или часть молекулы связывания с РсКп, и фармацевтически приемлемый носитель, и(b) инструкции по введению указанной композиции субъекту, нуждающемуся в уменьшении ингибирующего иммунного ответа к фактору свёртывания крови.
- 21. Набор по п.20, который отличается тем, что химерный полипептид содержит РУШ-часть, РУ11часть или ΠΧ-часть.
- 22. Набор по п.20, который отличается тем, что химерный полипептид является мономер-димерным гибридным белком РУШ, мономер-димерным гибридным белком РУ11 или мономер-димерным гибридным белком ΠΧ.
- 23. Набор по любому из пп.20-22, который отличается тем, что инструкции дополнительно включают по меньшей мере одну стадию определения того, что субъект нуждается в уменьшении ингибирующего иммунного ответа к фактору свёртывания крови.
- 24. Набор по п.23, который отличается тем, что стадия определения того, что субъект нуждается в уменьшении ингибирующего иммунного ответа включает один или более вариантов из группы, состоящей из:(a) идентификации субъекта, несущего мутацию или делецию гена фактора свёртывания крови;(b) идентификации субъекта, обладающего перестройкой гена фактора свёртывания крови;(c) идентификации субъекта, у которого есть родственник с ранее развившимся ингибирующим иммунным ответом к фактору свёртывания крови;(ά) идентификации субъекта, который получает лечение интерферонами;(е) идентификации субъекта, который получает противовирусное лечение;(£) идентификации субъекта, несущего генетическую мутацию в генах, отличных от гена, кодирующего фактор свёртывания крови, связанных с повышенным риском развития ингибирующего иммунного ответа; и(д) комбинации двух или большего количества таких вариантов.
- 25. Набор по п.24, который отличается тем, что генетическая мутация гена, отличающегося от гена, кодирующего фактор свёртывания крови, содержит одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из:(ί) генетического полиморфизма, связанного с повышением уровня 'ТИР-а;(ίί) генетического полиморфизма, связанного с повышением уровня Ш10;(ίίί) генетического полиморфизма, связанного с понижением уровня ΟΈΑ(ίν) мутации молекул ΌΚ15 или ЭОВ0602 главного комплекса гистосовместимости (МНС) II класса и(ν) комбинации двух или большего количества таких мутаций.- 117 029560ρνιιιΑ1 .3 1 Α2 !а2| .1V3 ,,,°163 Г У 8~АЗ~ ГС1 ~РУШ-УЗД __А_1 . А2-.. <»2 ДаЗ _ А3_.. С1..... С2I [ I - V -.411.1 ;Т> 1Нг..:, Г, *':!!(-! .·Ίημκ . υ-, 9С кДи - .„ятя иеп·. 8С -:Д .:____________к и !__________ί ..к.I Ме’· .ϋ' ΑΪ "а1\ А2 агГПаЗ АЗ’ С1 | С2 ММономерРУШРс-УЗДРсТ я,.; елся испь 90 кДаΙ'ΊВнутриклеточный процессии!Г<л.номе|. >е. сои ие.ти I-'.: - ;30 ..Цг>^ΓΣΣΣΊΣΣΣΓΣΣΒ^^Β
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201261586103P | 2012-01-12 | 2012-01-12 | |
| US201261668961P | 2012-07-06 | 2012-07-06 | |
| PCT/US2013/021332 WO2013106789A1 (en) | 2012-01-12 | 2013-01-12 | Methods of reducing immunogenicity against factor viii in individuals undergoing factor viii therapy |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201491211A1 EA201491211A1 (ru) | 2015-05-29 |
| EA029560B1 true EA029560B1 (ru) | 2018-04-30 |
Family
ID=48781969
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201790221A EA038705B1 (ru) | 2012-01-12 | 2013-01-12 | Способы снижения иммуногенности фактора свёртывания крови viii у пациентов, получающих лечение фактором viii |
| EA201491211A EA029560B1 (ru) | 2012-01-12 | 2013-01-12 | Применение химерного фактора свертывания крови для уменьшения ингибирующего иммунного ответа у субъекта |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201790221A EA038705B1 (ru) | 2012-01-12 | 2013-01-12 | Способы снижения иммуногенности фактора свёртывания крови viii у пациентов, получающих лечение фактором viii |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10221455B2 (ru) |
| EP (3) | EP3970737A1 (ru) |
| JP (4) | JP6234378B2 (ru) |
| CN (2) | CN108465106B (ru) |
| AU (2) | AU2016210768B2 (ru) |
| BR (1) | BR112014017111A8 (ru) |
| CA (1) | CA2863329C (ru) |
| CY (1) | CY1121157T1 (ru) |
| DK (1) | DK2802668T3 (ru) |
| EA (2) | EA038705B1 (ru) |
| ES (2) | ES2700583T3 (ru) |
| HR (1) | HRP20181714T1 (ru) |
| HU (1) | HUE041595T2 (ru) |
| IL (1) | IL233565B (ru) |
| LT (1) | LT2802668T (ru) |
| NZ (1) | NZ627078A (ru) |
| PL (2) | PL3453402T3 (ru) |
| PT (2) | PT3453402T (ru) |
| RS (1) | RS57936B1 (ru) |
| SI (1) | SI2802668T1 (ru) |
| TR (1) | TR201816253T4 (ru) |
| WO (1) | WO2013106789A1 (ru) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SI2802668T1 (sl) * | 2012-01-12 | 2019-01-31 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Zmanjšanje imunogeničnosti proti faktorju VIII pri posameznikih, ki se zdravijo zaradi faktorja VIII |
| WO2014070953A1 (en) * | 2012-10-30 | 2014-05-08 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods of Using FVIII Polypeptide |
| SG11201505926VA (en) | 2013-03-15 | 2015-09-29 | Biogen Ma Inc | Factor ix polypeptide formulations |
| HUE050869T2 (hu) * | 2013-11-15 | 2021-01-28 | Univ Pennsylvania | Készítmények VIII-as faktorral szembeni inhibitorképzõdés szuppresszálására A-típusú hemofíliás betegekben |
| US20170128544A1 (en) * | 2014-06-12 | 2017-05-11 | University Of Hawaii | Uses of Humanized Cobra Venom Factor for Reducing or Preventing Immunogenicity |
| JP6695426B2 (ja) * | 2015-11-13 | 2020-05-20 | バクスアルタ インコーポレイテッド | 組換えｆｖｉｉｉ変異型をコードする血友病ａ遺伝子治療用高発現ウイルスベクター |
| KR20230008256A (ko) * | 2015-11-13 | 2023-01-13 | 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 | A형 혈우병의 유전자 요법을 위한 증가된 발현을 갖는 재조합 fviii 변이체를 인코딩하는 바이러스 벡터 |
| RU2647769C2 (ru) * | 2015-12-30 | 2018-03-19 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Химерный улучшенный рекомбинантный фактор VIII |
| US20190046620A1 (en) * | 2016-02-12 | 2019-02-14 | Bloodworks | Therapeutic induction of tolerance using recombinant cell surface antigens |
| WO2017155981A1 (en) * | 2016-03-07 | 2017-09-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Protein-chaperoned t-cell vaccines |
| CN107759696A (zh) | 2016-08-19 | 2018-03-06 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 人白介素7融合蛋白及其制备方法 |
| CN106279437B (zh) * | 2016-08-19 | 2017-10-31 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 |
| CN110520149A (zh) * | 2016-12-02 | 2019-11-29 | 比奥维拉迪维治疗股份有限公司 | 诱导对凝血因子的免疫耐受性的方法 |
| EP3548066A1 (en) | 2016-12-02 | 2019-10-09 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Methods of treating hemophilic arthropathy using chimeric clotting factors |
| US20210163986A1 (en) | 2017-08-09 | 2021-06-03 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Nucleic acid molecules and uses thereof |
| JP2021523878A (ja) | 2018-05-18 | 2021-09-09 | バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド | 血友病ａを処置する方法 |
| CA3106590A1 (en) | 2018-07-16 | 2020-01-23 | Baxalta Incorporated | Gene therapy of hemophilia a using viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression |
| US20200069817A1 (en) | 2018-08-09 | 2020-03-05 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy |
| CN113105562B (zh) | 2018-09-26 | 2023-12-01 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 突变型单链人凝血因子viii在制备融合蛋白中的应用 |
| CA3127065A1 (en) | 2019-01-16 | 2020-07-23 | Baxalta Incorporated | Viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression for gene therapy of hemophilia a |
| JP2022531095A (ja) | 2019-04-17 | 2022-07-06 | コディアック バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド | エキソソーム及びａａｖの組成物 |
| CA3144630A1 (en) | 2019-06-19 | 2020-12-24 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Methods and compositions for treating hemophilia and low bone mineral density with factor viiifc protein |
| EP4016078A1 (en) * | 2020-12-18 | 2022-06-22 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Method useful in tolerance induction therapy and kits therefore |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009149303A1 (en) * | 2008-06-04 | 2009-12-10 | Bayer Healthcare Llc | Fviii muteins for treatment of von willebrand disease |
| WO2011069164A2 (en) * | 2009-12-06 | 2011-06-09 | Biogen Idec Ma Inc. | Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof |
| US20110182896A1 (en) * | 2003-05-06 | 2011-07-28 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | CLOTTING FACTOR-Fc CHIMERIC PROTEINS TO TREAT HEMOPHILIA |
Family Cites Families (54)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4757006A (en) | 1983-10-28 | 1988-07-12 | Genetics Institute, Inc. | Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production |
| US4965199A (en) | 1984-04-20 | 1990-10-23 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection |
| CA1341174C (en) | 1985-04-12 | 2001-01-30 | John J. Toole Jr. | Procoagulant proteins derived from factor viii: c |
| KR910006424B1 (ko) | 1985-08-21 | 1991-08-24 | 인코텍스 비.브이 | 편성브리프(brief) 제조방법 |
| DE3785102T2 (de) | 1986-01-03 | 1993-07-22 | Genetics Inst | Verfahren zur herstellung von faktor-viii:c-typ-proteinen. |
| US5595886A (en) | 1986-01-27 | 1997-01-21 | Chiron Corporation | Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof |
| US4695199A (en) | 1986-06-02 | 1987-09-22 | Chevron Research Company | Elastomeric bearing pad and seal for a removable bottom founded structure |
| US5543502A (en) | 1986-06-24 | 1996-08-06 | Novo Nordisk A/S | Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments |
| US4912040A (en) | 1986-11-14 | 1990-03-27 | Genetics Institute, Inc. | Eucaryotic expression system |
| CA1331157C (en) | 1987-04-06 | 1994-08-02 | Randal J. Kaufman | Method for producing factor viii:c-type proteins |
| US6060447A (en) | 1987-05-19 | 2000-05-09 | Chiron Corporation | Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof |
| US6346513B1 (en) | 1987-06-12 | 2002-02-12 | Baxter Trading Gmbh | Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
| IE69026B1 (en) | 1987-06-12 | 1996-08-07 | Immuno Ag | Novel proteins with factor VIII activity process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
| DE3720246A1 (de) | 1987-06-19 | 1988-12-29 | Behringwerke Ag | Faktor viii:c-aehnliches molekuel mit koagulationsaktivitaet |
| FR2619314B1 (fr) | 1987-08-11 | 1990-06-15 | Transgene Sa | Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant |
| US4994371A (en) | 1987-08-28 | 1991-02-19 | Davie Earl W | DNA preparation of Christmas factor and use of DNA sequences |
| US5004803A (en) | 1988-11-14 | 1991-04-02 | Genetics Institute, Inc. | Production of procoagulant proteins |
| SE465222C5 (sv) | 1989-12-15 | 1998-02-10 | Pharmacia & Upjohn Ab | Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning |
| US5859204A (en) | 1992-04-07 | 1999-01-12 | Emory University | Modified factor VIII |
| US6376463B1 (en) | 1992-04-07 | 2002-04-23 | Emory University | Modified factor VIII |
| US5364771A (en) | 1992-04-07 | 1994-11-15 | Emory University | Hybrid human/porcine factor VIII |
| US5563045A (en) | 1992-11-13 | 1996-10-08 | Genetics Institute, Inc. | Chimeric procoagulant proteins |
| SE504074C2 (sv) | 1993-07-05 | 1996-11-04 | Pharmacia Ab | Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering |
| SE9503380D0 (sv) | 1995-09-29 | 1995-09-29 | Pharmacia Ab | Protein derivatives |
| US6458563B1 (en) | 1996-06-26 | 2002-10-01 | Emory University | Modified factor VIII |
| CA2225189C (en) | 1997-03-06 | 2010-05-25 | Queen's University At Kingston | Canine factor viii gene, protein and methods of use |
| WO2001058957A2 (en) | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
| DE60123238T2 (de) * | 2000-06-05 | 2007-05-03 | University of Tennessee Corp., Knoxville | Zusammensetzungen zur behandlung von autoimmunkrankheiten |
| US20040096456A1 (en) * | 2000-12-01 | 2004-05-20 | Conti-Fine Bianca M | Method to treat hemophilia |
| US7485314B2 (en) | 2002-05-06 | 2009-02-03 | Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center | Induction of antigen specific immunologic tolerance |
| US20040110929A1 (en) * | 2002-07-12 | 2004-06-10 | Bjorn Soren E. | TF binding compound |
| US7041635B2 (en) | 2003-01-28 | 2006-05-09 | In2Gen Co., Ltd. | Factor VIII polypeptide |
| TWI353991B (en) | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
| US7348004B2 (en) | 2003-05-06 | 2008-03-25 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
| US7211559B2 (en) | 2003-10-31 | 2007-05-01 | University Of Maryland, Baltimore | Factor VIII compositions and methods |
| US8367805B2 (en) | 2004-11-12 | 2013-02-05 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
| US7871624B2 (en) * | 2006-06-27 | 2011-01-18 | Saint Louis University | Chimeral polypeptide composition for cross-placenta delivery |
| GB0714361D0 (en) * | 2007-07-24 | 2007-09-05 | 3M Innovative Properties Co | Cation conductive membranes comprising polysulfonic acid polymers and metal salts having an F-containing anion |
| GB0723712D0 (en) | 2007-12-04 | 2008-01-16 | Apitope Technology Bristol Ltd | Peptides |
| DE202008009492U1 (de) * | 2008-07-15 | 2009-11-26 | Tallinn University Of Technology | Halbleitermaterial und dessen Verwendung als Absorptionsmaterial für Solarzellen |
| WO2010006635A1 (en) * | 2008-07-16 | 2010-01-21 | Paion Deutschland Gmbh | Treatment of inflammatory bowel disease |
| EP2184070A1 (en) | 2008-11-07 | 2010-05-12 | Hla-G Technologies | HLA-G proteins and pharmaceutical uses thereof |
| US20120142593A1 (en) | 2009-03-24 | 2012-06-07 | Bayer Healthcare Llc | Factor VIII Variants and Methods of Use |
| US9221075B2 (en) * | 2009-11-09 | 2015-12-29 | Ethicon, Inc. | Surgical needle coatings and methods |
| PL2499165T3 (pl) | 2009-11-13 | 2017-04-28 | Grifols Therapeutics Inc. | Preparaty zawierające czynnik von willenbranda (vwf) oraz sposoby, zestawy i zastosowania z nim powiązane |
| EP3508573A1 (en) | 2010-07-09 | 2019-07-10 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Systems for factor viii processing and methods thereof |
| NZ605348A (en) * | 2010-07-09 | 2015-01-30 | Biogen Idec Hemophilia Inc | Factor ix polypeptides and methods of use thereof |
| EP3513804B1 (en) * | 2011-07-08 | 2022-03-23 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof |
| SI2802668T1 (sl) | 2012-01-12 | 2019-01-31 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Zmanjšanje imunogeničnosti proti faktorju VIII pri posameznikih, ki se zdravijo zaradi faktorja VIII |
| US20150252345A1 (en) | 2012-09-25 | 2015-09-10 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods of Using FIX Polypeptides |
| AU2013331000B2 (en) * | 2012-10-18 | 2018-04-19 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Methods of using a fixed dose of a clotting factor |
| WO2014070953A1 (en) | 2012-10-30 | 2014-05-08 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods of Using FVIII Polypeptide |
| SG11201505926VA (en) * | 2013-03-15 | 2015-09-29 | Biogen Ma Inc | Factor ix polypeptide formulations |
| TWI741992B (zh) * | 2015-08-03 | 2021-10-11 | 美商百歐維拉提夫治療公司 | 因子ｉｘ融合蛋白以及其製備及使用方法 |
-
2013
- 2013-01-12 SI SI201331223T patent/SI2802668T1/sl unknown
- 2013-01-12 JP JP2014552355A patent/JP6234378B2/ja active Active
- 2013-01-12 CN CN201711393005.5A patent/CN108465106B/zh active Active
- 2013-01-12 CN CN201380013831.6A patent/CN104254614A/zh active Pending
- 2013-01-12 ES ES13735995T patent/ES2700583T3/es active Active
- 2013-01-12 EA EA201790221A patent/EA038705B1/ru unknown
- 2013-01-12 ES ES18183272T patent/ES2899848T3/es active Active
- 2013-01-12 PL PL18183272T patent/PL3453402T3/pl unknown
- 2013-01-12 CA CA2863329A patent/CA2863329C/en active Active
- 2013-01-12 US US14/371,931 patent/US10221455B2/en active Active
- 2013-01-12 RS RS20181307A patent/RS57936B1/sr unknown
- 2013-01-12 LT LTEP13735995.6T patent/LT2802668T/lt unknown
- 2013-01-12 DK DK13735995.6T patent/DK2802668T3/en active
- 2013-01-12 PT PT18183272T patent/PT3453402T/pt unknown
- 2013-01-12 WO PCT/US2013/021332 patent/WO2013106789A1/en active Application Filing
- 2013-01-12 HU HUE13735995A patent/HUE041595T2/hu unknown
- 2013-01-12 EP EP21184612.6A patent/EP3970737A1/en active Pending
- 2013-01-12 EA EA201491211A patent/EA029560B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2013-01-12 BR BR112014017111A patent/BR112014017111A8/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-01-12 TR TR2018/16253T patent/TR201816253T4/tr unknown
- 2013-01-12 EP EP18183272.6A patent/EP3453402B1/en active Active
- 2013-01-12 EP EP13735995.6A patent/EP2802668B1/en active Active
- 2013-01-12 PT PT13735995T patent/PT2802668T/pt unknown
- 2013-01-12 PL PL13735995T patent/PL2802668T3/pl unknown
- 2013-01-12 NZ NZ627078A patent/NZ627078A/en unknown
-
2014
- 2014-07-09 IL IL233565A patent/IL233565B/en active IP Right Grant
-
2016
- 2016-08-05 AU AU2016210768A patent/AU2016210768B2/en active Active
-
2017
- 2017-06-09 JP JP2017114122A patent/JP6462044B2/ja active Active
-
2018
- 2018-10-19 HR HRP20181714TT patent/HRP20181714T1/hr unknown
- 2018-11-01 CY CY20181101133T patent/CY1121157T1/el unknown
- 2018-11-22 AU AU2018267631A patent/AU2018267631B2/en active Active
- 2018-12-26 JP JP2018242151A patent/JP6868605B2/ja active Active
-
2019
- 2019-01-11 US US16/246,225 patent/US11286528B2/en active Active
-
2020
- 2020-10-27 JP JP2020179560A patent/JP2021020950A/ja active Pending
-
2022
- 2022-02-25 US US17/681,435 patent/US20230002828A1/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110182896A1 (en) * | 2003-05-06 | 2011-07-28 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | CLOTTING FACTOR-Fc CHIMERIC PROTEINS TO TREAT HEMOPHILIA |
| WO2009149303A1 (en) * | 2008-06-04 | 2009-12-10 | Bayer Healthcare Llc | Fviii muteins for treatment of von willebrand disease |
| WO2011069164A2 (en) * | 2009-12-06 | 2011-06-09 | Biogen Idec Ma Inc. | Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HAY et al., "The diagnosis and management of factor VIII and IX inhibitors: a guideline from the United Kingdom Haemophilia Centre Doctors Organisation". British J. Haematology 133(6): Pgs. 591-605. June 2006, entire document * |
| KEMPTON et al., "How we treat a hemophilia A patient with a factor VIII inhibitor". Blood 113: Pgs. 11-17. September 2008, entire document * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA029560B1 (ru) | Применение химерного фактора свертывания крови для уменьшения ингибирующего иммунного ответа у субъекта | |
| AU2008310263B2 (en) | Modulation of SIRPALPHA - CD47 interaction for increasing human hematopoietic stem cell engraftment and compounds therefor | |
| EA029045B1 (ru) | Химерные и гибридные полипептиды фактора viii и способы их применения | |
| Graubert et al. | The role of granzyme B in murine models of acute graft-versus-host disease and graft rejection | |
| Sabatino et al. | Animal models of hemophilia | |
| ES2296829T3 (es) | Imaginologia, diagnostico y tratamiento de la enfermedad. | |
| TW201335371A (zh) | Ａｆｏｄ及ａｆｃｃ之方法以及蛋白質之製備及純化方法 | |
| Porada et al. | Clinical and molecular characterization of a re‐established line of sheep exhibiting hemophilia A | |
| CA2275141A1 (en) | Cell stress regulated human mhc class i gene | |
| KR20160002681A (ko) | 골격 성장 지연 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 용해성 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(fgr3) 폴리펩티드 | |
| KR20160141718A (ko) | Uti 융합 단백질 | |
| ES2966835T3 (es) | Modulación de la inmunogenicidad del FVIII por VWF truncado | |
| KR20210102331A (ko) | 암 및 기타 질환의 진단 및 치료를 위한 종양 촉진 암종 관련 섬유아세포의 식별 및 표적화 | |
| Lewis et al. | Replication of hemorrhagic fever viruses in monocytic cells | |
| US20070179095A1 (en) | Oral treatment of hemophilia | |
| ES2278940T3 (es) | Gen implicado en la recombinacion v(d)j y/o la reparacion del adn. | |
| Byrne | The Generation and Characterisation of Novel Mouse Models of Haemophilia A | |
| Gomez | The molecular basis of hemophilia | |
| Prasant | Recent trends and advances in hemophilia-its management and new therapeutic outcomes | |
| Mannucci et al. | BIC International Conference: Abstract Book | |
| Waters | Tolerance Induction and The Immunobiology of Factor VIII in Hemophilia A | |
| Nepomuceno | cDNA cloning and expression analysis of C1qR (P), a human C1q/MBL/SPA receptor involved in the enhancement of phagocytosis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): TJ TM |