RU2647769C2

RU2647769C2 - Химерный улучшенный рекомбинантный фактор VIII

Info

Publication number: RU2647769C2
Application number: RU2015144150A
Authority: RU
Inventors: Дмитрий Валентинович Морозов; Александр Владимирович Карабельский; Кирилл Владимирович Соловьев; Анастасия Юрьевна Физикова; Ольга Владимировна Гончарова; Татьяна Вениаминовна Черновская; Елена Леонидовна Морозова; Роман Алексеевич Иванов
Original assignee: Закрытое Акционерное Общество "Биокад"
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2018-03-19
Also published as: RU2015144150A

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению нового рекомбинантного фактора свертывания крови, представляющего собой химерный белок с увеличенным временем полужизни в плазме, состоящий из фактора III человека и мутантного Fc-фрагмента IgG человека, что может быть использовано в медицине. Полученные химерные белки используют в составе фармацевтической композиции для терапии гемостатических нарушений, в том числе для лечения гемофилии А. Изобретение позволяет осуществлять эффективную терапию гемофилии А за счет повышенного времени полужизни полученного фактора свертывания в плазме. 6 н. и 9 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 табл., 8 пр.

Description

Область применения

Настоящее изобретение относится в основном к области терапии гемостатических нарушений, а именно к новым рекомбинантным факторам свертывания крови, использующимся для лечения гемофилии А.

Уровень техники

Свертывание является сложным процессом образования кровью тромбов. Важной частью гемостаза является прекращение тока крови из поврежденного сосуда, при котором стенка поврежденного сосуда покрывается бляшками и содержащими фибрин тромбами для того, чтобы остановить кровотечение и начать восстановление поврежденного сосуда. Нарушения свертываемости крови могут привести к повышенному риску возникновения кровотечений (геморрагии) или образованию закупоривающих тромбов (тромбозу).

Свертывание начинается практически сразу после того, как при повреждении кровеносного сосуда была повреждена эндотелиальная выстилка сосуда. Воздействие на кровь таких белков, как тканевой фактор, инициирует изменения в тромбоцитах и плазменном белке фибриногене - факторе свертывания крови. Тромбоциты мгновенно образуют пробку в месте повреждения; это называется первичным гемостазом. Одновременно происходит вторичный гемостаз: белки, находящиеся в плазме крови, которые называются факторами коагуляции или факторами свертывания крови, откликаются сложным каскадом реакций, образуя фибриновые нити, которые укрепляют тромбоцитарную пробку. Неограничивающие факторы коагуляции включают, но не ограничиваются этим, фактор I (фибриноген), фактор II (протромбин), тканевый фактор, фактор V (проакцелерин, лабильный фактор), фактор VII (стабильный фактор, проконвертин), фактор VIII (антигемофильный глобулин А), фактор IX (антигемофильный глобулин В или кристмас-фактор), фактор X (фактор Стюарта-Прауэра), фактор XI (плазменный предшественник тромбопластина), фактор XII (фактор Хагемана), фактор XIII (фибринстабилизирующий фактор), ФВ, прекалликреин (фактор Флетчера), высокомолекулярный кининоген (ВМК) (фактор Фитцджеральда), фибронектин, антитромбин III, кофактор гепарина II, протеин С, протеин S, протеин Z, плазминоген, альфа 2-антиплазмин, тканевой активатор плазминогена (ТАЛ), урокиназа, ингибитор активатора плазминогена-1 (ИАП-1) ингибитор активатора плазминогена-2 (ИАП-2).

Гемофилия А является нарушением свертываемости крови, возникающим из-за дефектов в гене, кодирующем фактор коагуляции VIII(FVIII), и проявляющимся у 1-2 из 10,000 младенцев мужского пола. Grawetal., Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005). Данное заболевание характеризуется спонтанным кровоизлиянием и избыточным кровотечением после травмы. С течением времени повторяющееся кровоизлияние в мышцы и суставы, которое часто начинается в раннем детстве, приводит к гемофилической артропатии и необратимому повреждению суставов. Это повреждение прогрессирует и может привести к существенному ограничению подвижности суставов, мышечной атрофии и хронической боли (Rodriguez-Merchan, Е.С., Semin. Thromb. Hemost. 29:87-96 (2003), содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки).

По некоторым оценкам, сегодня количество больных гемофилией А в мире составляет 400 тыс. человек (один из 10 тысяч мужчин). По данным Всемирной организации здравоохранения, на территории России проживает около 15 тысяч больных гемофилией, из них дети составляют около 6 тысяч человек. При этом каждый год еще у 50 тыс. людей выявляют нарушения, связанные с дефицитом и выработкой фактора свертывания VIII в организме. Таким образом, в мире и в России в частности существует значимая потребность в доступном и эффективном лечении гемофилии А.

Пациентов, страдающих гемофилией А можно лечить путем вливаний очищенного или полученного с помощью рекомбинантных технологий FVIII. При этом все коммерчески доступные продукты, содержащие FVIII, как известно, имеют время полужизни, составляющее 8-12 часов, и требуют частых внутривенных введений пациентам, практически каждый день, что создает ощутимые неудобства, как для пациента, так и для клинических врачей. При этом нередко возникновение дозозависимых побочных эффектов и аллергических реакций. В связи с чем, разработка фактора свертывания VIII нового поколения, лишенного этих недостатков, позволит сделать лечение гемофилических заболеваний доступнее и эффективнее. Смотрите Weiner М.А. and Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T., 12. Disorders of Coagulation, Elsevier Health Sciences, 2001; Lillicrap, D. Thromb. Res. 122 Suppl 4:S2-8 (2008). Ввиду чего было предпринято большое количество попыток с целью продлить время полужизни FVIII.

В настоящее время известные формы рекомбинантного фактора свертывания VIII, сшитого с константным доменом иммуноглобулина G, содержат нативную форму Fc-фрагмента (Powell et al., 2012), что позволяет продлить время циркуляции в крови по сравнению с немодицифированными формами фактора свертывания крови VIII в 1,7 раз.

Из уровня техники известен физиологически активный полипептид (RU 2352583), находящийся в конъюгации с Fc-фрагментом посредством полиэтиленгликоля. Данный полипептид может являться фактором свертывания крови, в частности фактором VIII. В результате такой конъюгации достигается увеличение продолжительности действия физиологически активного пептида in vivo, а также увеличение относительной активности конъюгатов с белками в сравнении с нативными белками. Константный домен может быть агликолизированным, иметь шарнирную область и может происходить от различных видов иммуноглобулина (IgG, IgA, IgD, IgE, IgM).

Известен конъюгат физиологически активного полипептида (RU 2356909), связанного с Fc-фрагментом посредством полиэтиленгликолевого линкера, при этом Fc-фрагмент может быть от иммуноглобулинов IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, быть негликолизированным и содержать шарнирную область. Кроме того, раскрыт способ получения данного конъюгата. При этом биологические исследования показали, что конъюгаты согласно изобретению обладают более высокой внутриклеточной активностью (более чем на 28%) и более длительным временем полужизни в сыворотке (примерно в 2 раза) по сравнению с нативными белкам.

В патенте ЕА 12566 описаны химерные белки, содержащие биологически активную молекулу, которой может быть фактор свертывания крови, связанный через линкер с Fc-фрагментом иммунноглобулина в месте связывания с FcRn - рецептором. При этом описанные белки представляют собой гибриды ''мономер-димером''. Данная модификация фактора свертывания крови имеет активность примерно в 3 раза более высокую по сравнению с только димерными формами фактора свертывания, что, в свою очередь, позволяет снизить дозу вводимого препарата или частоту введения.

В заявке на патент ЕА 201290443 описываются химерные полипептиды, содержащие фактор VIII и Fc-фрагмент, при этом Fc-фрагмент содержит делецию В-домена. Заявленные полипептиды обладают улучшенной эффективностью: более продолжительным временем полужизни и активностью примерно в 2 раза по сравнению с немодифицированными рекомбинатными факторами свертывания VIII. Описанные полипептиды позволяют снизить частоту введения препарата фактора VIII до 1 раза в неделю, что представляет удобство для пациентов.

Техническим результатом данного изобретение является получение рекомбинантного фактора свертывания крови, обладающего повышенным временем полужизни и улучшенным сродством к FcRn.

Описание чертежей

Фиг 1. Анализ HPLC рекомбинантного мономерно-димерного FVIII-Fc по сравнению с препаратом Xyntha.

Фиг 2. SDS-PAGE рекомбинантного мономерно-димерного FVIII-Fc.

Фиг 3. Усредненные кривые изменения концентрации FVIII во времени после однократного внутривенного введения мышам препаратов FVIII-Fc и FVIII (XYNTHA®) в дозе 0,00494 мг/кг.

Фиг. 4 - Активность фактора FVIII в сыворотке мышей после однократного внутривенного введения фактора FVIII-Fc (Биокад) в дозе 23 МЕ/мышь (черная кривая-животное №1; Красная кривая - животное №2; - Зеленая кривая - животное №3).

Определения

Термин ''полинуклеотид'' или ''нуклеотид'' включает в себя как одиночную нуклеиновую кислоту, так и множественные нуклеиновые кислоты, и относится к выделенной молекуле или конструкции нуклеиновой кислоты, например, информационной РНК (иРНК) или плазмидной ДНК (пДНК). В определенных вариантах реализации изобретения полинуклеотид содержит обычную фосфодиэфирную связь или альтернативную связь (например, амидную связь, которую можно обнаружить в пептидных нуклеиновых кислотах (ПНК)). Термин ''нуклеиновая кислота'' к какому-либо одному или более сегментам нуклеиновой кислоты, например, фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде. Под ''выделенными'' нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом подразумевается молекула нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, которая была удалена из своей естественной среды. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора VIII, содержащийся в векторе, считается выделенным в контексте настоящего изобретения. Дополнительные примеры выделенного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, содержащиеся в гетерологичной клетке-хозяине или очищенные (частично или в значительной степени) от других полинуклеотидов в растворе. Выделенные молекулы РНК включают in vivo или in vitro РНК транскрипты полинуклеотидов, являющихся объектами настоящего изобретения. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению дополнительно включают такие молекулы, полученные синтетическим способом. Вдобавок полинуклеотид или нуклеиновая кислота может содержать регуляторные элементы, такие как промоторы, энхансеры, участки связывания рибосом или сигналы терминации транскрипции.

При употреблении в данном тексте ''кодирующая область'' или ''кодирующая последовательность'' представляют собой фрагмент полинуклеотида, который состоит из кодонов, которые могут транслироваться в аминокислоты. Хотя ''стоп-кодон'' (TAG, TGA или ТАЛ) обычно не транслируется в аминокислоту, он может считаться частью кодирующей области, но любые фланкирующие последовательности, например, промоторы, участки связывания рибосом, терминаторы транскрипции, нитроны и тому подобные элементы не являются частью кодирующей области. Границы кодирующей области обычно определяются стартовым кодоном на 5'-конце, кодирующем амино конец результирующего полипептида, и трансляционным стоп-кодоном на 3'-конце, кодирующем карбоксильный конец результирующего полипептида. Две или более кодирующих областей согласно настоящему изобретению могут присутствовать в одиночной полинуклеотидной конструкции, например, в одиночном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, например, в отдельных (различных) векторах. Следовательно, отсюда вытекает, что одиночный вектор может содержать только одиночную кодирующую область или содержать две или более кодирующих областей, например, одиночный вектор может отдельно кодировать связывающий домен-А и связывающий домен-В. Вдобавок вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота, являющиеся объектами данного изобретения, могут кодировать гетерологичные кодирующие области, как сшитые, так и несшитые с нуклеиновой кислотой, кодирующей связывающий домен согласно изобретению. Гетерологичные кодирующие области без ограничений включают специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен.

Определенные белки, секретируемые клетками млекопитающих, связаны с секреторным сигнальным пептидом, который отщепляется от зрелого белка, как только инициируется экспорт растущей белковой цепи через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Специалистам в данной области техники известно, что сигнальные пептиды в общем случае сшиты с N-концом полипептида для того, чтобы вырабатывать секретируемую или ''зрелую'' форму полипептида. В определенных вариантах реализации изобретения применяется нативный сигнальный пептид, например, сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, либо функциональное производное такой последовательности, которое сохраняет способность управлять секрецией функционально связанного с ней полипептида. В альтернативном варианте может применяться гетерологичный сигнальный пептид млекопитающего, например, человеческий тканевой активатор плазминогена (ТАП) или мышиный сигнальный пептид Р-глюкуронидазы, либо его функциональное производное.

Термин ''нижележащая'' относится к нуклеотидной последовательности, которая расположена в направлении 3' от основной нуклеотидной последовательности. В определенных вариантах реализации изобретения нижележащие нуклеотидные последовательности относятся к последовательностям, которые следуют за точкой старта транскрипции. Например, ко дон инициации трансляции гена расположен ниже сайта старта транскрипции.

Термин ''вышележащая'' относится к нуклеотидной последовательности, которая расположена в направлении 5' от основной нуклеотидной последовательности. В определенных вариантах реализации изобретения Вышележащие нуклеотидные последовательности относятся к последовательностям, которые расположены на 5' стороне кодирующей области или точки старта транскрипции. Например, большинство промоторов располагаются выше сайта старта транскрипции.

При употреблении в данном тексте ''регуляторная область'' относится к нуклеотидным последовательностям, расположенным выше (в направлении 5' некодирующих последовательностей), в рамках или ниже (в направлении 3' некодирующих последовательностей) кодирующей области, и которые оказывают влияние на транскрипцию, процессинг РНК, стабильность или трансляцию связанной с ней кодирующей области. Регуляторные области могут включать промоторы, трансляционные лидерные последовательности, нитроны, последовательности распознавания полиаденилирования, участки процессинга РНК, участки связывания эффекторов и структуры типа ''стебель - петля''. Если кодирующая область предназначена для экспрессии в эукариотической клетке, сигнальная последовательность полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции обычно расположены в направлении 3' относительно кодирующей последовательности.

Полинуклеотид, который кодирует генный продукт, например, полипептид, может включать промотор и/или другие транскрипционные или трансляционные контрольные элементы, функционально связанные с одной или более кодирующими областями. Находящаяся в функциональной связи кодирующая область для генного продукта, например, полипептида, связана с одной или более регуляторными областями таким образом, чтобы экспрессия генного продукта оказалась под влиянием или контролем регуляторной области (областей). Например, кодирующая область и промотор являются функционально связанными, если индукция действия промотора приводит к транскрипции иРНК, кодирующей генный продукт, кодируемый кодирующей областью, и если природа связи между промотором и кодирующей областью не препятствует возможности промотора управлять экспрессией генного продукта или не препятствует возможности транскрибирования ДНК-матрицы. Другие транскрипционные контрольные элементы, кроме промотора, например, энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, также могут быть функционально связанными с кодирующей областью для того, чтобы управлять экспрессией генного продукта.

Специалистам в данной области техники известно множество транскрипционных контрольных областей. Они включают без ограничения транскрипционные контрольные области, которые функционируют в клетках позвоночных, такие как промоторные и энхансерные сегменты цитомегаловирусов (предранний промотор в сочетании с интроном-А), вирус обезьян 40 (ранний промотор) и ретровирусы (такие как вирус саркомы Рауса). Другие транскрипционные контрольные области включают те, которые получены из генов позвоночных, такие как актин, белок теплового шока, бычий гормон роста и кроличий Р-глобин, а также другие последовательности, способные контролировать генную экспрессию в эукариотических клетках. Дополнительные подходящие транскрипционные контрольные области включают тканеспецифические промоторы и энхансеры, а также лимфокин-индуцибельные промоторы (например, индуцибельные интерферонами или интерлейкинами промоторы).

Аналогично, специалистам в данной области техники известно множество трансляционных контрольных элементов. Они включают без ограничения участки связывания рибосом, кодоны инициации и терминации трансляции и элементы, полученные из пикорнавирусов (в частности, участок внутренней посадки рибосомы или УВПР, также называемый CITE-последовательностью).

Употребляемый в данном тексте термин ''экспрессия'' относится к процессу, посредством которого полинуклеотид продуцирует генный продукт, например, РНК или полипептид. Он включает без ограничения транскрипцию полинуклеотида в информационную РНК (иРНК), транспортную РНК (тРНК), малую шпилечную РНК (мшРНК), малую интерферирующую РНК (миРНК) или любой другой РНК-продукт, и трансляцию иРНК в полипептид. При помощи экспрессии получают ''генный продукт''. При употреблении в данном тексте генный продукт может представлять нуклеиновую кислоту, например, информационную РНК, полученную посредством транскрипции гена, или полипептид, который был транслирован с транскрипта. Описанные в данном тексте генные продукты дополнительно включают нуклеиновые кислоты, прошедшие посттранскрипционные модификации, например, полиаденилирование или сплайсинг, или полипептиды, прошедшие пост-транскрипционные модификации, например, метилирование, гликозилирование, добавление липидов, объединение с другими белковыми субъединицами или протеолитическое расщепление.

''Вектор'' относится к любому средству для клонирования и/или переноса нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Вектор может являться репликоном, к которому может быть присоединен сегмент другой нуклеиновой кислоты таким образом, чтобы привести к репликации присоединенного сегмента. ''Репликон'' относится к любому генетическому элементу (например, плазмиде, фагу, космиде, хромосоме, вирусу), который функционирует как автономная единица репликации in vivo, т.е., способен к самостоятельно управляемой репликации. Термин ''вектор'' включает как вирусной, так и невирусной природы средства для внесения нуклеиновой кислоты в клетку in vitro, ex vivo или in vivo. В данной области техники известно и применяется большое количество векторов, включая, например, плазмиды, модифицированные эукариотические вирусы или модифицированные бактериальные вирусы. Вставку полинуклеотида в подходящий вектор можно осуществить путем лигирования соответствующих фрагментов полинуклеотида в выбранный вектор, который имеет комплементарные липкие концы.

Векторы могут быть сконструированы таким образом, чтобы кодировать селектируемые маркеры или репортеры, которые обеспечивают отбор или идентификацию клеток, в которые был инкорпорирован вектор. Экспрессия селектируемых маркеров или репортеров позволяет осуществлять идентификацию и/или отбор клеток-хозяев, которые инкорпорируют и экспрессируют другие кодирующие области, содержащиеся в векторе. Примеры известных и применяемых в данной области техники генов селектируемых маркеров включают: гены, обеспечивающие устойчивость к ампициллину, стрептомицину, гентамицину, канамицину, гигромицину, гербициду биалафос, сульфонамиду и тому подобным веществам; и гены, которые применяются в качестве фенотипических маркеров, т.е., регуляторные гены антоцианов, ген изопентенил трансферазы и тому подобные. Примеры известных и применяемых в данной области техники репортеров включают: люциферазу, зеленый флуоресцентный белок, хлорамфеникол-ацетилтрансферазу и тому подобные вещества. Селектируемые маркеры также могут считаться репортерами.

Термин ''плазмида'' относится к внехромосомному элементу, часто несущему ген, который не является частью центрального метаболизма клетки, и обычно находящемуся в форме кольцевых двухцепочечных молекул ДНК. Такие элементы могут являться автономно реплицирующимися последовательностями, интергирующимися в геном последовательностями, фагом или нуклеотидными последовательностями, линейными, кольцевыми или сверхспиральными одно- или двухцепочечных ДНК или РНК, полученными из произвольного источника, в которых определенное число нуклеотидных последовательностей было соединено или рекомбинировано в уникальную конструкцию, которая способна внести в клетку фрагмент промотора и последовательность ДНК для выбранного генного продукта вместе с соответствующей 3' нетранслируемой последовательностью.

Эукариотические вирусные векторы, которые могут применяться, включают, но не ограничиваются этим, аденовирусные векторы, ретровирусные векторы, адено-ассоциированные вирусные векторы, поксвирус, например, векторы на основе вируса осповакцины, векторы на основе бакуловирусов или векторы на основе вируса герпеса. Невирусные векторы включают плазмиды, липосомы, электрически заряженные липиды (цитофектины), ДНК-белковый комплексы и биополимеры.

''Клонирующий вектор'' относится к ''репликону'', который является единицей длины нуклеиновой кислоты, которая последовательно реплицируется и которая содержит точку начала репликации, такую как плазмида, фаг или космида, к которой может быть присоединен сегмент другой нуклеиновой кислоты таким образом, чтобы привести к репликации присоединенного сегмента. Определенные клонирующие векторы способны к репликации в одном типе клеток, например, в бактериальных клетках, и экспрессии в другом, например, в эукариотических клетках. Клонирующие векторы обычно содержат одну или более последовательностей, которые могут применяться для отбора клеток, содержащих вектор, и/или один или более множественных клонирующих участков для вставки представляющих интерес нуклеотидных последовательностей.

Термин ''экспрессионный вектор'' относится к элементу, сконструированному для того, чтобы сделать возможной экспрессию вставленной нуклеотидной последовательности после внесение в клетку-хозяина. Вставленная нуклеотидная последовательность размещается в функциональной связи с регуляторными областями, как описано выше.

Векторы вносят в клетки-хозяев способами, хорошо известными в данной области техники, например, путем трансфекции, электропорации, микроинъекции, трансдукции, клеточного слияния, при помощи диэтиламиноэтилдекстрана, осаждения фосфата кальция, липофекции (слияния лизосом), применения генной пушки или транспортера ДНК-вектора.

При употреблении в данном тексте ''культивировать'', ''культивирование'' и ''культивация'' обозначают инкубацию клеток в таких in vitro условиях, которые способствуют росту клеток или делению, или поддержанию клеток в живом состоянии. При употреблении в данном тексте ''культивированные клетки'' обозначают клетки, которые были размножены in vitro.

При употреблении в данном тексте термин ''полипептид'' включает в себя как одиночный ''полипептид'', так и множественные ''полипептиды'', и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин ''полипептид'' относится к любой цепи или цепям двух или более аминокислот и не относится к специфичной длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, ''белок'', ''аминокислотная цепь'' либо любой другой термин, применяемый для обозначения цепи или цепей двух или более аминокислот, включены в определение ''полипептида'', а термин ''полипептид'' может применяться вместо либо взаимозаменяемо с любым из этих терминов. Термин ''полипептид'' также относится к продуктам пост-экспрессионной модификации полипептида, включая без ограничений гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию известными защитными/блокирующими группами, протеолитическое расщепление или модификацию аминокислотами неприродного происхождения. Полипептид может быть получен из природного биологического ресурса или при помощи рекомбинатной технологии, но не обязательно являться транслированным из определенной нуклеотидной последовательности. Он может быть получен любым способом, включая химический синтез.

''Выделенный'' полипептид или его фрагмент, вариант или производное обозначает полипептид, который не находится в своем естественном окружении. Никакой конкретный уровень очистки не требуется. Например, выделенный полипептид может быть просто удален из своего природного или естественного окружения. Полученные при помощи рекомбинантных технологий полипептиды и белки, экспрессируемые в клетках-хозяевах, считаются выделенными в контексте данного изобретения, как и нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были отделены, фракционированы либо частично или в значительной степени очищены любым подходящим способом.

Также в настоящее изобретение включены фрагменты или варианты полипептидов и любые их комбинации. Термин ''фрагмент'' или ''вариант'' в отношении связывающих доменов полипептидов или связывающих молекул, являющихся объектами настоящего изобретения, включают любые полипептиды, которые сохраняют по меньшей мере некоторые свойства (например, аффинность связывания с FcRn в случае FcRn-связывающего домена или Fc-варианта, активность коагуляции в случае ФУШ-варианта) основного полипептида. Фрагменты полипептидов включают протеолитические фрагменты, а также делеционные фрагменты дополнительно к специфическим фрагментам антител, обсуждаемым в другом месте данного текста, но не включают полноразмерный полипептид природного происхождения (или зрелый полипептид). Варианты связывающих доменов полипептидов или связывающих молекул, являющихся объектами настоящего изобретения, включают фрагменты, как описано выше, а также полипептиды с аминокислотными последовательностями, измененными вследствие аминокислотных замен, делеций или инсерций. Варианты могут быть природного и неприродного происхождения. Варианты неприродного происхождения могут быть получены путем известных в данной области техники методов мутагенеза. Вариантные полипептиды могут содержать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, делеций или добавки.

Употребляемый в данном тексте термин ''фактор, ограничивающий время полужизни'' или ''фактор, ограничивающий время полужизни FVIII'' определяет фактор, который предупреждает продление времени полужизни белка FVIII более чем в 1,5 раз или 2 раза по сравнению с FVIII дикого типа (например, ADVATE® или REFACTO®).

Как известно в данной области техники ''идентичность последовательностей'' между двумя полипептидами определяется путем сравнения аминокислотной последовательности одного полипептида с последовательностью второго полипептида. При обсуждении в данном тексте определение того, является ли любой конкретный полипептид идентичным по меньшей мере на около 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% другому полипептиду, осуществляется при помощи известных в данной области техники методов и компьютерных программ/программного обеспечения, включающих, но не ограничивающихся этим, программу BESTFIT (WisconsinSequenceAnalysisPackage, Версия 8 для Unix, GeneticsComputerGroup, UniversityResearchPark, 575 ScienceDrive, Madison, WI 53711). BESTFIT использует алгоритм локальной гомологии Смита и Уотермана, AdvancesinAppliedMathematics 2: 482-489 (1981), для того, чтобы найти сегмент наибольшей гомологии между двумя последовательностями. При применении BESTFIT или любой другой программы для выравнивания последовательностей для определения того, является ли конкретная последовательность, например, на 95% идентичной основной последовательности согласно настоящему изобретению, параметры устанавливают, конечно, таким образом, что процент идентичности рассчитывается относительно полной длины основной полипептидной последовательности и допускаются расхождения в гомологии до 5% относительно общего числа аминокислот в основной последовательности.

Употребляемый в данном тексте термин ''время полужизни'' относится к биологическому времени полужизни конкретного полипептида in vivo. Время полужизни может обозначать время, необходимое для того, чтобы половина количества введенного испытуемому объекту препарата была выведена из кровообращения и/или других тканей животного. При построении кривой выведения данного полипептида как функции времени кривая обычно является двухфазной с быстрой а-фазой и более длинной Р-фазой. а-фаза обычно отображает равновесное распределение введенного Fc полипептида между внутрисосудистым и внесосудистым пространством и частично определяется размером полипептида. Р-фаза обычно отображает катаболизм полипептида во внутрисосудистом пространстве. В некоторых вариантах реализации изобретения ФУШ и содержащие ФУШхимерные белки являются монофазными и, таким образом, не имеют альфа-фазы, а только бета-фазу. Следовательно, в определенных вариантах реализации изобретения употребляемый в данном тексте термин время полужизни относится ко времени полужизни полипептида в Р-фазе. Обычное время полужизни Р-фазы человеческого антитела у человека составляет 21 день.

Употребляемый в данном тексте термин ''связанный'' относится к первой аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, ковалентно или нековалентно соединенной со второй аминокислотной последовательностью или нуклеотидной последовательностью соответственно. Термин ''ковалентно связанный'' или ''ковалентная связь'' относится к ковалентной связи, например, дисульфидной связи, пептидной связи или одной или более аминокислотам, например, линкеру, между двумя связанными между собой компонентами. Первая аминокислотная или нуклеотидная последовательность может быть прямым образом связана или соединена со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью, или в другом варианте промежуточная последовательность может ковалентно связывать первую последовательность со второй последовательностью. Термин ''связанный'' обозначает не только сшивание первой аминокислотной последовательности со второй аминокислотной последовательностью в области С-конца или N-конца, но также включает вставку полной первой аминокислотной последовательности (или второй аминокислотной последовательности) между любыми двумя аминокислотами второй аминокислотной последовательности (или первой аминокислотной последовательности соответственно). В одном варианте реализации изобретения первая аминокислотная последовательность может быть соединена со второй аминокислотной последовательностью посредством пептидной связи или линкера. Первая аминокислотная последовательность может быть соединена со второй аминокислотной последовательностью посредством фосфодиэфирной связи или линкера. Линкер может представлять собой пептид или полипептид (для полипептидных цепей) или нуклеотид или нуклеотидную цепь (для нуклеотидных цепей) либо любое химическое соединение (как для полипептидных, так и для полинуклеотидных цепей). Ковалентную связь иногда обозначают как (-) или дефис.

Употребляемый в данном тексте термин ''связанный с'' относится к ковалентной или нековалентной связи, образованной между первой аминокислотной цепью и второй аминокислотной цепью. В одном варианте реализации изобретения термин ''связанный с'' обозначает ковалентную, непептидную связь или нековалентную связь. В некоторых вариантах реализации изобретения такую связь обозначают двоеточием, т.е., (:). В другом варианте реализации изобретения он обозначает ковалентную связь за исключением пептидной связи. В других вариантах реализации изобретения употребляемый в данном тексте термин ''ковалентно связанный'' обозначает связь между двумя компонентами посредством ковалентной связи, например, дисульфидной связи, пептидной связи или одной или более аминокислот (например, линкера). Например, аминокислота цистеин содержит тиольную группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик с тиольной группой второго остатка цистеина. В большинстве молекул IgG природного происхождения области СН1 и CL связаны дисульфидной связью, а две тяжелые цепи связаны двумя дисульфидными связями в позициях, соответствующих 239 и 242 согласно системе нумерации Кабата (позиции 226 и 229 в Европейской системе нумерации). Примеры ковалентных связей включают, но не ограничиваются этим, пептидную связь, металлическую связь, водородную связь, дисульфидную связь, сигма-связь, пи-связь, дельта-связь, гликозидную связь, агностическую связь, изогнутую связь, диполярную связь, пи-обратную связь, двойную связь, тройную связь, четвертную связь, пятерную связь, шестерную связь, конъюгацию, гиперконъюгацию, ароматичность, гаптичность или антисвязывание. Неограничивающие примеры нековалентной связи включают ионную связь (например, катионную пи-связь или соляную связь), металлическую связь, водородную связь (например, диводородную связь, диводородный комплекс, низкобарьерную водородную связь или симметричную водородную связь), Ван-дер-Ваальсовы силы, лондоновские дисперсионные силы, механическую связь, галогенную связь, аурофильность, интеркаляцию, стэкинг, энтропийные силы или химическую полярность.

Употребляемый в данном тексте термин ''мономерно-димерный гибрид'' относится к химерному белку, содержащему первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, которые связаны друг с другом дисульфидной связью, при этом первая цепь содержит фактор свертывания крови, например, фактор VIII, и Fc-область, а вторая цепь содержит, состоит преимущественно из или состоит из Fc-области без фактора свертывания крови. Мономерно-димерная гибридная конструкция, таким образом, является гибридом, содержащим мономерную часть, содержащую только один фактор свертывания крови, и димерную часть, содержащую две Fc-области.

При употреблении в данном тексте гемостатическое нарушение означает генетически унаследованное или приобретенное заболевание, которое характеризуется склонностью к кровоизлияниям, как к спонтанным, так и в результате травмы, из-за нарушения способности или неспособности образовывать фибриновые сгустки. Примеры таких нарушений включают разные виды гемофилии. Тремя основными формами являются гемофилия А (дефицит фактора VIII), гемофилия В (дефицит фактора IX или ''болезнь Кристмаса'') и гемофилия С (дефицит фактора XI, склонность к умеренным кровотечениям). Другие гемостатические нарушения включают, например, болезнь Виллебранда, дефицит фактора XI (дефицит ПТП), дефицит фактора XII, дефицит или структурные аномалии фибриногена, протромбина, фактора V, фактора VII, фактора X или фактора XIII, синдром Бернара-Сулье, который является дефектом или дефицитом GPIb. GPIb - рецептор для ФВ - может быть дефективным и приводить к недостатку первичного тромбообразования (первичного гемостаза) и повышенной склонности к кровотечениям, и тромбастении Гланцманна и Негели (тромбастении Гланцманна). При печеночной недостаточности (острой и хронической формах) наблюдается недостаточная выработка факторов свертывания крови печенью, что может привести к повышенному риску кровотечений.

Химерные молекулы, являющиеся объектом данного изобретения, можно применять в профилактических целях. Употребляемый в данном тексте термин ''профилактическое лечение'' относится к применению данной молекулы до случая кровотечения. В одном варианте реализации изобретения пациенту, нуждающемуся в общем гемостатическом средстве, проводят или собираются проводить хирургическую операцию. Химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, можно применять до или после хирургической операции в качестве профилактики. Химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, можно применять во время или после хирургической операции для контролирования острых случаев кровотечения. Хирургическая операция может включать, но не ограничивается этим, трансплантацию печение, резекцию печени, стоматологические процедуры или трансплантацию стволовых клеток.

Химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, также применяется для лечения по требованию (также называемому ''эпизодическим''). Термин ''лечение по требованию'' или ''эпизодическое лечение'' относится к применению химерной молекулы в ответ на проявление симптомов случая кровотечения или перед действием, которое может вызвать кровотечение. В одном аспекте реализации лечение пациента по требованию (эпизодическое лечение) может проводиться тогда, когда кровотечение началось, например, после травмы, или тогда, когда кровотечение ожидается, например, перед хирургической операцией. В другом аспекте реализации лечение пациента по требованию может проводиться до действий, которые повышают риск кровотечения, например, в случае контактного спорта.

Употребляемый в данном тексте термин ''острое кровотечение'' относится к случаю кровотечения вне зависимости от его причин. Например, пациент может получить травму, страдать уремией, наследственным нарушением, связанным с кровотечением (например, дефицитом фактора VII), нарушением тромбоцитарного звена гемостаза или обладать сопротивлением благодаря выработке антител к факторам свертывания крови.

При употреблении в данном тексте лечение, проведение лечения, осуществление лечения относится к, например, снижению степени тяжести заболевания или болезненного состояния; снижению продолжительности заболевания; уменьшению интенсивности одного или более симптомов, связанных с заболеванием или болезненным состоянием, без обязательного излечения заболевания или болезненного состояния или предупреждения одного или более симптомов, связанных с заболеванием или болезненным состоянием.

''В-домен'' фактора VIII при использовании в этом документе соответствует В-домену, известному специалистам в данной области, который определяют по присущей ему идентичности аминокислотной последовательности и сайтам протеолитического расщепления тромбином, например, по остаткам Ser741-Arg1648 в составе полноразмерного фактора VIII человека. Другие домены фактора VIII человека определяют по следующим аминокислотным остаткам: А1, остатки Ala1-Arg372; А2, остатки Ser373-Arg740; A3, остатки Ser1690-Ile2032; С1, остатки Arg2033-Asn2172; С2, остатки Ser2173-Tyr2332. Последовательность А3-С1-С2 включает остатки Ser1690-Tyr2332. Остальная часть последовательности, остатки Glu1649-Arg1689, обычно обозначают как активационный пептид легкой цепи фактора VIII. Расположение и границы всех доменов, включая В-домен, в факторе VIII свиньи, мыши и собаки также известны специалистам в данной области. Предпочтительно, В-домен фактора VIII делетирован (''фактор VIII с делетированным В-доменом'' или ''BDD FVIII'').

''Фактор VIII с делетированным В-доменом'' может содержать полные или частичные делеций, раскрытые в патентах США №№6316226, 6346513, 7041635, 5789203, 6060447, 5595886, 6228620, 5972885, 6048720, 5543502, 5610278, 5171844, 5112950, 4868112 и 6458563, содержание каждого из которых специально целиком включено сюда в качестве ссылки. В некоторых вариантах воплощения последовательность фактора VIII с делетированным В-доменом по настоящему изобретению включает любую одну делецию из раскрытых, начиная со столбца 4, строки 4 по столбец 5, строку 28 и в примерах 1-5 в патенте США №6316226 (также в патенте США №6346513). В некоторых вариантах воплощения фактор VIII с делетированным В-доменом по настоящему изобретению содержит делецию, раскрытую в столбце 2, строках 26-51 и примерах 5-8 в патенте США №5789203 (также в патентах США №№6060447, 5595886 и 6228620). В некоторых вариантах воплощения фактор VIII с делетированным В-доменом содержит делецию, описанную начиная со столбца 1, строка 25 по столбец 2, строка 40 в патенте США №5972885; в столбце 6, строках 1-22 и примере 1 в патенте США №6048720; в столбце 2, строки 17-46 в патенте США №5543502; начиная со столбца 4, строка 22 по столбец 5, строка 36 в патенте США №5171844; в столбце 2, строки 55-68, на фигуре 2 и в примере 1 в патенте США №5112950; начиная со столбца 2, строка 2 по столбец 19, строка 21 и в таблице 2 в патенте США №4868112; начиная со столбца 2, строка 1 по столбец 3, строка 19, начиная со столбца 3, строка 40 по столбец 4, строка 67, начиная со столбца 7, строка 43 по столбец 8, строка 26 и начиная со столбца 11, строка 5 по столбец 13, строка 39 в патенте США №7041635; или в столбце 4, строки 25-53 в патенте США №6458563. В некоторых вариантах воплощения фактор VIII с делетированным В-доменом имеет делецию большей части В-домена, но все-таки содержит аминоконцевые последовательности В-домена, которые существенны для протеолитического процессинга in vivo первичного продукта трансляции с образованием двух полипептидных цепей, как описано в WO 91/09122, содержание которой целиком включено сюда в качестве ссылки. В некоторых вариантах воплощения фактор VIII с делетированным В-доменом сконструирован с делецией аминокислот 747-1638, т.е., с фактически полной делецией В-домена. Hoeben R.C., et al, J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990), содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки. Фактор VIII с делетированным В-доменом также может содержать делецию аминокислот 771-1666 или аминокислот 868-1562 факторов VIII. Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988), содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки. Дополнительные делеций В-домена, которые являются частью изобретения, включают, например: делецию аминокислот с 982 по 1562 или с 760 по 1639 (Toole et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), с 797 no 1562 (Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25: 8343-8347)), с 741 no 1646 (Kaufman (опубликованная заявка PCT № WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver, et al., DNA (1987) 6: 553-564)), с 741 no 1648 (Pasek (заявка PCT №88/00831)), с 816 no 1598 или с 741 по 1689 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) № 82: 16-25, EP 295597)), содержание каждой из которых специально целиком включено сюда в качестве ссылки. Каждая из вышеупомянутых делеций может быть внесена в любую последовательность фактора VIII.

''Химерный полипептид'' при использовании в этом документе означает полипептид, который содержит в своем составе, по меньшей мере, два полипептида (или подпоследовательности, или пептида) из разных источников. Химерные полипептиды могут включать, например, два, три, четыре, пять, шесть, семь или более полипептидов из разных источников, таких как разные гены, разные кДНК или разные животные или другие биологические виды. Химерные полипептиды могут включать, например, один или несколько линкеров, соединяющих различные подпоследовательности. Таким образом, подпоследовательности могут быть соединены непосредственно, или они могут соединяться опосредованно, через линкеры, или обоими способами в пределах единого химерного полипептида. Химерные полипептиды могут включать, например, дополнительные пептиды, такие как сигнальные последовательности и такие последовательности, как 6His и FLAG, которые помогают осуществлять очистку и детекцию белка. Кроме того, химерные полипептиды могут иметь дополнительные аминокислоту или пептид на N- и/или С-концах.

В некоторых вариантах воплощения химерный полипептид включает соответствующую фактору VIII часть и отличную от фактора VIII часть. Примеры отличных от фактора VIII частей включают, например, Fc, XTEN и альбумин. Примеры химерных полипептидов по изобретению включают, например, химерные полипептиды фактора VIII-Fc, химерные полипептиды фактора VIII-XTEN и химерные полипептиды фактора VIII-альбумин.

Как обсуждалось выше, примеры химерных полипептидов включают фактор VIII, сшитый с одним или несколькими полипептидами XTEN. Schellenburger et al., Nat. Biotech. 27: 1186-90 (2009), содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки. Фактор VIII может быть сшит либо с N-концом полипептида XTEN, либо с С-концом полипептида XTEN, при условии, что соответствующий фактору VIII компонент химерного белка фактора VIII-XTEN может подвергаться процессингу протеазой с образованием полипептида, содержащего процессированный фактор VIII. Для того чтобы такой процессинг был возможен, сайт для расщепления протеазой может располагаться между соответствующей XTEN частью и соответствующей фактору VIII частью. Полипептиды XTEN включают, например, полипептиды, описанные в WO 2009/023270, WO 2010/091122, WO 2007/103515, US 2010/0189682 и US 2009/0092582, содержание каждой из которых специально целиком включено сюда в качестве ссылки.

Как обсуждалось выше, примеры химерных полипептидов также включают фактор VIII, сшитый с одним или несколькими полипептидами альбумина. Предпочтительно, альбумин является альбумином человека. Фактор VIII может быть сшит либо с N-концом альбумина, либо с С-концом альбумина, при условии, что соответствующий фактору VIII компонент химерного белка фактор VIII-альбумин может подвергаться процессингу с участием ферментативно активной конвертазы пробелка с образованием полипептида, содержащего процессированный фактор VIII. Примеры альбумина, например, его фрагменты, которые могут применяться в настоящем изобретении, известны специалистам, см., например, патент США №7592010; патент США №6686179; и Schulte, Thrombosis Res. 124 Suppl. 2: S6-S8 (2009), содержание каждого из которых специально целиком включено сюда в качестве ссылки.

В некоторых вариантах воплощения химерный полипептид, включающий соответствующую фактору VIII часть, имеет увеличенный период полувыведения (t1/2), по сравнению с полипептидом, состоящим из той же соответствующей фактору VIII части без отличной от фактора VIII части. Химерный полипептид фактора VIII с увеличенным t1/2 может называться в этом документе фактором VIII длительного действия. Химерные полипептиды фактора VIII длительного действия включают, например, фактор VIII, сшитый с Fc (в том числе, например, химерные полипептиды фактора VIII в форме гибрида, такого как димерный гибрид из мономеров FVIIIFc; см. патенты США №№7404956 и 7348004), фактор VIII, сшитый с XTEN, и фактор VIII, сшитый с альбумином.

''Культура'', ''культивировать'' и ''культивирование'' при использовании в этом документе означает, что клетки инкубируют в условиях in vitro, которые позволяют клеткам расти и делиться, или клетки поддерживают в живом состоянии. ''Культивируемые клетки'' при использовании в этом документе означает клетки, которые пролиферируют in vitro.

''Фактор VIII'' при использовании в этом документе означает полипептид функционального фактора VIII в его нормальной роли при свертывании крови, если не указано иначе. Таким образом, термин фактор VIII включает вариантные полипептиды, которые являются функционально активными. Предпочтительными белками фактора VIII являются белки фактора VIII человека, свиньи, собаки и мыши. Как описано в разделе ''Предпосылки создания изобретения'', известны последовательности полноразмерных полипептидов и полинуклеотидов, а также множество функциональных фрагментов, мутантных и модифицированных вариантов. Полипептиды фактора VIII включают, например, полноразмерный фактор VIII, полноразмерный фактор VIII без Met на N-конце, зрелый фактор VIII (без сигнальной последовательности), зрелый фактор VIII с дополнительным Met на N-конце и/или фактор VIII с полной или частичной делецией В-домена. Предпочтительные варианты фактора VIII содержат делеций В-домена, либо частичные, либо полные делеций.

Известно большое количество функциональных вариантов фактора VIII, как обсуждается выше и далее. Кроме того, сотни нефункциональных мутаций в факторе VIII идентифицированы у пациентов с гемофилией, и было установлено, что воздействие этих мутаций на функционирование фактора VIII в большей степени зависит от их местоположения в пространственной структуре фактора VIII, чем от природы замены (Cutler et al., Hum. Mutat. 19: 274-8 (2002)), содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки. Кроме того, сравнение фактора VIII человека и других видов выявило консервативные остатки, которые, по-видимому, необходимы для функционирования (Cameron et al., Thromb. Haemost. 79: 317-22 (1998); патент США 6251632), содержание которых целиком включено сюда в качестве ссылки.

Ген фактора VIII человека был изолирован и экспрессирован в клетках млекопитающих (Toole, J.J., et al, Nature 312: 342-347 (1984); Gitschier, J., et al., Nature 312: 326-330 (1984); Wood, W.I., et al, Nature 312: 330-337 (1984); Vehar, G.A., et al, Nature 312: 337-342 (1984); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; патент США №4757006), содержание каждого из которых специально целиком включено сюда в качестве ссылки, и аминокислотная последовательность была выведена из последовательности кДНК. Capon et al. в патенте США №4965199, содержание которого целиком включено сюда в качестве ссылки, раскрывают способ получения с применением рекомбинантных ДНК фактора VIII в клетках-хозяевах, полученных от млекопитающих, и очистки фактора VIII человека. Сообщалось об экспрессии фактора VIII человека в клетках СНО (яичника китайского хомячка) и ВНКС (клетках почки новорожденного хомяка). Были проведены модификации фактора VIII человека с делецией части или всего В-домена (патенты США №№4994371 и 4868112, содержание каждого из которых специально целиком включено сюда в качестве ссылки), и осуществлена замена В-домена фактора VIII человека на В-домен фактора V человека (патент США № 5 004 803, содержание которого целиком включено сюда в качестве ссылки). Последовательность кДНК, кодирующая фактор VIII человека, и предсказанная аминокислотная последовательность представлены в SEQ ID Nos: 1 и 2, соответственно, в публикации заявки на патент США. № 2005/0100990, содержание которой целиком включено сюда в качестве ссылки.

В патенте США №5859204, принадлежащем Lollar, J.S., содержание которого целиком включено сюда в качестве ссылки, сообщается о функциональных мутантных формах фактора VIII, обладающих сниженной антигенностью и уменьшенной иммунореактивностью. В патенте США №6376463, принадлежащем Lollar, J.S., содержание которого целиком включено сюда в качестве ссылки, также сообщается о мутантных формах фактора VIII, обладающих уменьшенной иммунореактивностью. В публикации заявки на патент США №2005/0100990, принадлежащей Saenko et al., содержание которой целиком включено сюда в качестве ссылки, сообщается о функциональных мутациях в А2-домене фактора VIII.

Ряд функциональных молекул фактора VIII, в том числе с делециями В-домена, раскрыт в следующих патентах США: 6316226 и 6346513, оба переданы компании Baxter; 7041635, переданном компании In2Gen; 5789203, 6060447, 5595886 и 6228620, переданных компании Chiron; 5972885 и 6048720, переданных компании Biovitrum, 5543502 и 5610278, переданных компании Novo Nordisk; 5171844, переданном компании Tmmuno Ag; 5112950, переданном компании Transgene S.A.; 4868112, переданном компании Genetics Institute, содержание каждого из которых специально целиком включено сюда в качестве ссылки.

Опубликована последовательность фактора VIII свиньи (Toole, J. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5939-5942 (1986), содержание которой целиком включено сюда в качестве ссылки), и сообщалось о полноразмерной последовательности кДНК свиньи, полученной в результате ПЦР-амплификации последовательностей фактора VIII из библиотеки кДНК селезенки свиньи (Healey, J.F., et al., Blood 88: 4209-4214 (1996), содержание которой целиком включено сюда в качестве ссылки). Гибридные факторы VIII человека/свиньи, содержащие замены всех доменов, всех субъединиц и специфичных аминокислотных последовательностей, были описаны в патенте США №5364771, принадлежащем Lollar и Runge, и в заявке WO 93/20093, содержание которых целиком включено сюда в качестве ссылки. Позже сообщалось о нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностях доменов А1 и А2 фактора VIII свиньи и о химерном факторе VIII, в котором соответствующие домены молекулы человека были заменены на домены А1 и/или А2 свиньи (заявка WO 94/11503, содержание которой целиком включено сюда в качестве ссылки). В патенте США №5859204, принадлежащем Lollar, J. S., также раскрываются последовательности кДНК и выведенные из них аминокислотные последовательности молекулы свиньи. Патент № 6 458 563, содержание которого целиком включено сюда в качестве ссылки, переданный компании Emory, раскрывает фактор VIII свиньи с делетированным В-доменом.

''Эквивалентное количество'' при использовании в этом документе означает такое же количество активности фактора VIII, выраженной в международных единицах, которое не зависит от молекулярной массы рассматриваемого полипептида. Одна международная единица (ME) активности фактора VIII примерно соответствует количеству фактора VIII в одном миллилитре нормальной плазмы человека. Имеется несколько способов анализа для измерения активности фактора VIII, в том числе описанный в Европейской Фармакопее анализ с хромогенным субстратом и одноэтапный анализ свертывания.

''Fc'' при использовании в этом документе означает функциональных неонатальных партнеров связывания с рецептором для Fc (FcRn), если не указано иначе. Партнер связывания с FcRn - это любая молекула, которая способна специфично связываться с рецептором FcRn с последующим активным транспортом при помощи рецептора FcRn партнера связывания с FcRn. Таким образом, термин Fc включает любые варианты Fc из состава IgG, если они являются функциональными. Область Fc-части молекулы IgG, которая связывается с рецептором FcRn, была описана на основании данных рентгеноструктурной кристаллографии (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379, содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки). Основная область контакта Fc с FcRn расположена рядом с областью соединения доменов СН2 и СН3. Все контакты Fc-FcRn происходят в пределах единичной тяжелой цепи иммуноглобулина. Партнеры связывания с FcRn включают, например, полноразмерный IgG, фрагмент Fc из молекулы IgG и другие фрагменты молекулы IgG, которые содержат полноразмерную область связывания с FcRn. Основные сайты контактов включают аминокислотные остатки 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 домена СН2 и аминокислотные остатки 385-387, 428 и 433-436 домена СН3. Все ссылки на нумерацию аминокислот в составе иммуноглобулинов или фрагментов иммуноглобулинов, или областей, основаны на публикации Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda; MD, содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки. (Рецептор FcRn был выделен из клеток нескольких видов млекопитающих, включая человека. Известны последовательности FcRn человека, FcRn крысы и FcRn мыши (Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180: 2377), содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки). Fc может включать домены СН2 и СН3 иммуноглобулина с шарнирной областью иммуноглобулина или без нее. Примеры вариантов Fc представлены в WO 2004/101740 и WO 2006/074199, содержание которых специально целиком включено сюда в качестве ссылки.

Fc (или соответствующая Fc часть химерного полипептида) может содержать одну или несколько мутаций и комбинации мутаций.

Fc (или соответствующая Fc часть химерного полипептида) может содержать мутации, придающие свойство удлинения периода полувыведения, такие как M252Y, S254T, Т256Е и их комбинации, как описано в работе Oganesyan et al., Mol. Immunol. 46: 1750 (2009), содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки; H433K, N434F и их комбинации, как описано в работе Vaccaro et al., Nat. Biotechnol. 23: 1283 (2005), содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки; мутации, описанные на стр. 1-2, в параграфе [0012] и в примерах 9 и 10 заявки US 2009/0264627 A1, содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки; и мутации, описанные на стр. 2, в параграфах с [0014] по [0021] заявки US 20090163699 A1, содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки.

Fc (или соответствующая Fc часть химерного полипептида) может также содержать, например, следующие мутации: Область Fc из молекулы IgG может быть модифицирована с применением хорошо известных методик, таких как сайт-направленный мутагенез и т.п., с получением модифицированных IgG, или фрагментов Fc, или их частей, которые будут связываться с FcRn. Такие модификации включают, например, модификации, отдаленные от сайтов контакта с FcRn, а также модификации в пределах сайтов контакта, которые предотвращают или даже усиливают связывание с FcRn. Например, следующие одиночные аминокислотные остатки в составе Fc из IgG1 человека (Fcy1) могут быть заменены без существенной потери аффинности связывания Fc с FcRn: Р238А, S239A, K246A, K248A, D249A, М252А, Т256А, Е258А, Т260А, D265A, S267A, Н268А, Е269А, D270A, Е272А, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, Е283А, Н285А, N286A, Т289А, K290A, R292A, Е293А, Е294А, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, Т307А, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, Е318А, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, Р329А, A330Q, A330S, Р331А, P331S, Е333А, K334A, Т335А, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, Е345А, Q347A, R355A, Е356А, М358А, Т359А, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A D376A, A378Q, Е380А, Е382А, S383A, N384A, Q386A, Е388А, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, Е430А, N434A, Т437А, Q438A, K439A, S440A, S444A и K447A, где пример Р238А представляет собой замену характерного для дикого типа пролина на аланин в положении 238. В дополнение к аланину, другие аминокислоты могут служить заменой аминокислотам дикого типа в указанных выше положениях. Мутации в Fc могут быть внесены по одной, с образованием более чем сотни партнеров связывания с FcRn, отличных от нативного Fc. Дополнительно, комбинации двух, трех или более из этих индивидуальных мутаций могут вноситься одновременно, с образованием еще сотен партнеров связывания с FcRn. Некоторые из этих мутаций могут придавать партнеру связывания с FcRn новые функциональные свойства. Например, в одном варианте воплощения внесена мутация N297A, в результате которой удаляется высококонсервативный сайт N-гликозилирования. В результате этой мутации снижается иммуногенность, и тем самым увеличивается период полувыведения из циркуляции партнера связывания с FcRn, и партнеру связывания с FcRn придается неспособность связываться с FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB и FcyRIIIA, не изменяя при этом аффинность к FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60: 847, содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки; Friend et al. 1999, Transplantation 68: 1632, содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276: 6591, содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки). Дополнительно, по меньшей мере, три гамма-рецептора Fc человека, по-видимому, узнают сайт связывания на IgG в пределах нижней шарнирной области, обычно аминокислоты 234-237. Следовательно, еще один пример новых функциональных свойств и, потенциально, сниженной иммуногенности может быть получен при мутациях в этой области, например, при замене аминокислот 233-236 молекулы IgG1 человека ''ELLG'' на соответствующую последовательность из молекулы IgG2 ''РУА'' (с делецией одной аминокислоты).

Показано, что FcyRI, FcyRII и FcyRIII, которые опосредуют различные эффекторные функции, не будут связываться с IgG1 при внесении таких мутаций (Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77, содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки; и Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613, содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки). В качестве дополнительного примера новых функциональных свойств, появляющихся в результате мутаций, описанных выше, служит то, что в некоторых случаях аффинность к FcRn может быть повышена относительно аффинности молекулы дикого типа. Эта повышенная аффинность может отражать повышенную скорость ассоциации, пониженную скорость диссоциации или одновременно повышенную скорость ассоциации и пониженную скорость диссоциации. Мутации, которые, как полагают, влияют на увеличение аффинности к FcRn, включают, например Т256А, Т307А, Е380А и N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591, содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки).

''Гибридные'' полипептиды и белки при использовании в этом документе означают комбинацию химерного полипептида со вторым полипептидом. Химерный полипептид и второй полипептид в гибриде могут быть связаны друг с другом посредством белок-белковых взаимодействий, таких как электростатические или гидрофобные взаимодействия. Химерный полипептид и второй полипептид в гибриде могут быть связаны друг с другом посредством дисульфидной или другой ковалентной связи (или связей). Гибриды описаны в WO 2004/101740 и WO 2006/074199, содержание каждой из которых целиком включено сюда в качестве ссылок. См. также патенты США №№7404956 и 7348004, содержание каждого из которых специально целиком включено сюда в качестве ссылки. Этот второй полипептид может являться второй копией того же самого химерного полипептида или может представлять собой неидентичный химерный полипептид. В предпочтительных вариантах воплощения второй полипептид является полипептидом, включающим Fc. В предпочтительных вариантах воплощения химерный полипептид является химерным полипептидом фактора FVIII-Fc и второй полипептид в существенной степени состоит из Fc, например, гибридный полипептид из Примера 1, который является рекомбинантным химерным белком rFVIIIFc, состоящим из единичной молекулы рекомбинантного FVIII человека с делетированным В-доменом (BDD-rFVIII), сшитой с димерным Fc-доменом из молекулы IgG1 человека, без вставочной линкерной последовательности. Этот гибридный полипептид называется в этом документе химерным белком FVIIIFc и мономерного Fc, мономерным гибридом FVIIIFc, гибридом мономерного FVIIIFc и FVIIIFc-мономер-димером. В примерах приведены результаты доклинических и клинических испытаний этого гибридного полипептида.

''Полипептид'', ''пептид'' и ''белок'' используются как взаимозаменяемые и означают полимерное соединение, состоящее из ковалентно связанных аминокислотных остатков.

Описание изобретения

Согласно настоящему изобретению, предложен химерный белок, состоящий из модифицированного рекомбинантного фактора VIII человека, тяжелая цепь которого лишена В-домена, первого модифицированного Fc-фрагмента IgG человека, связанного с рекомбинантным фактором VIII через легкую цепь, и второго модифицированного Fc-фрагмента IgG человека, который образует димер с первым IgG посредством электростатических или стерических взаимодействий.

В предпочтительном варианте реализации изобретения рекомбинантный фактор VIII, входящий в химерный белок, содержит одну или более мутаций, приводящих к увеличению стабильности секретируемого фактора VIII. Одна или более мутация выбраны из группы, состоящей из F309S, C1899G, C1903G.

В еще одном предпочтительном варианте реализации изобретения первый модифицированный Fc-фрагмент IgG человека, входящий в химерный белок, содержит одну или более из следующих мутаций: T250Q, M428L, T366S, L368A, Y407V, E356K, D399K.

В еще одном предпочтительном варианте реализации изобретения второй модифицированный Fc-фрагмент IgG человека, входящий в химерный белок, содержит одну или более мутацию выбранную из группы: T250Q, M428L, T366W, K392D, K409D.

Также согласно настоящему изобретению, предложен химерный белок, состоящий из модифицированного рекомбинантного фактора VIII человека, тяжелая цепь которого лишена В-домена, первого модифицированного Fc-фрагментом IgG человека, связанного с тяжелой цепью посредством Gly-Ser линкера, и второго модифицированного Fc-фрагмента IgG человека сшитого с легкой цепью рекомбинантного фактора VIII человека. Согласно настоящему изобретению, Gly-Ser линкер может содержать два и более повтора GGGGS.

В предпочтительном варианте реализации изобретения рекомбинантный фактор VIII, содержит одну или более мутаций, приводящих к увеличению стабильности секретируемого фактора VIII. Одна или более мутации выбраны из группы, состоящей из F309S, C1899G, C1903G.

В еще одном предпочтительном варианте реализации изобретения первый модифицированный Fc-фрагмент IgG человека содержит одну или более мутацию выбранную из группы T250Q, M428L, E356K, D399K.

В еще одном предпочтительном варианте реализации изобретения второй модифицированный Fc-фрагмент IgG человека сдержит одну или более мутацию выбранную из группы T250Q, M428L, K392D, K409D.

Согласно изобретению предложен полинуклеотид, кодирующих химерные белки, описанные выше, а также предложен вектор, который содержит данный нуклеотид.

Согласно изобретению предложена клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид или вектор, описанные выше.

Согласно изобретению предложена фармацевтическая композиция для терапии гемофилии А, содержащая эффективное количество химерного белка, описанного выше, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, разбавителями или носителями. Данная композиция может представлять собой лиофилизированный порошок.

Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции, содержащие химерный белок, являющийся объектом настоящего изобретения, могут содержать подходящий фармацевтически приемлемый носитель. Например, они могут содержать наполнители и/или вспомогательные вещества, которые способствуют превращению активных компонентов в препараты, предназначенные для доставки в место действия.

Фармацевтический состав может быть приготовленным для парентерального введения (т.е., внутривенного, подкожного или внутримышечного) при помощи болюсной инъекции. Лекарственная форма для инъекции может быть представлена в виде единичной дозировки, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах с добавление консерванта. Фармацевтические композиции могут иметь вид суспензий, растворов или эмульсий на основе масляных или водных растворителей, и содержать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие вещества. В альтернативном варианте активный ингредиент может находиться в виде порошка для соединения с подходящим растворителем, например, апирогенной водой.

Подходящие лекарственные формы для парентерального введения также включают водные растворы активных компонентов в водорастворимой форме, например, водорастворимые соли. Вдобавок, могут применяться суспензии активных компонентов в виде подходящих масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или среды включают жирные масла, например, кунжутное масло, или эфиры синтетических жирных кислот, например, этилолеат или триглицериды. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, включая, например, натриевую карбоксиметилцеллюлозу, сорбитол и декстран. В некоторых случаях суспензия также может содержать стабилизаторы. Также могут использоваться липосомы для инкапсуляции молекул, являющихся объектами данного изобретения, для доставки их в клетки или интерстициальное пространство. Примерами фармацевтически приемлемых носителей являются физиологически совместимые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые вещества, изотонические и замедляющие всасывание вещества, вода, солевой раствор, фосфатно-солевой буферный раствор, декстроза, глицерол, этанол и тому подобное. В некоторых вариантах реализации изобретения состав содержит изотонические вещества, например, сахара, полиспирты, такие какманнитол, сорбитол, или хлорид натрия. В других вариантах реализации изобретения составы содержат фармацевтически приемлемые вещества, такие как смачивающие вещества, или небольшие количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие вещества, консерванты или буферы, которые повышают срок годности или эффективность активных ингредиентов.

Фармацевтические композиции, являющиеся объектами данного изобретения, могут находиться в различных формах, включая, например, жидкость (например, растворы для инъекций и инфузий), дисперсии, суспензии, полутвердые и твердые дозировочные формы. Предпочтительная форма зависит от способа введения и терапевтического применения.

Фармацевтическая композиция может быть изготовлена в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомной или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного препарата. Стерильные растворы для инъекций можно изготовить путем внесения необходимого количества активного ингредиента в подходящий растворитель, в случае необходимости - с одним или комбинацией вышеперечисленных ингредиентов, с последующей фильтрующей стерилизацией. В общем случае дисперсии изготавливают путем внесения активного ингредиента в стерильный растворитель, который содержит базовую дисперсную среду и другие необходимые ингредиенты из вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для изготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами изготовления являются вакуумная сушка и лиофильная сушка, которая на выходе дает порошок из активного ингредиента плюс любой дополнительный необходимый ингредиент из исходного стерильно- отфильтрованного раствора. Необходимую текучесть раствора можно сохранить, например, путем применения покрытия, такого как лецитин, путем сохранения необходимого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Пролонгированное всасывание составов для инъекций может быть достигнуто путем включения в состав вещества, которое замедляет всасывание, например, солей моностеарата или желатина.

Примеры

1. Получение векторов, экспрессирующих рекомбинантные FVIII-Fc

Для получения векторов, стабильно экспрессирующих мономерно-димерный гибрид фактора VIII человека, лишенного В-домена, связанного с Fc-фрагментом IgG человека через легкую цепь FVIII, и второго Fc-фрагмента IgG человека, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор VIII человека, лишенного В-домена, связанного с Fc-фрагментом IgG человека через легкую цепь FVIII, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей второй Fc-фрагмент IgG человека, соответственно, вставляли с помощью стандартных методов клонирования в два одинаковых вектора. Указанные вектора содержали следующие структурные элементы: ранний промотор p-CMVe/EF1alpha, сигнал полиаденилирования, энхансер SV-40, ори джин репликации 1 (Rep origin 1), ген устойчивости к ампициллину, ори джин репликации 2 (F1 origin), промотор SV40, ген устойчивости к пуромицину или гигромицину (для отбора клонов-продуцентов), сигнал полиаденилирования 2, последовательность Козака перед ATG - кодоном вставки ''GCCACCATG'', последовательность сигнального пептида для секреции белка. Последовательности полученных векторов, кодирующих гибрид фактора VIII человека, лишенного В-домена, связанного с Fc-фрагментом IgG человека через легкую цепь FVIII, содержащие ген устойчивости к пуромицину или гигромицину, отражены в SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2, соответственно. Последовательности полученных векторов, кодирующих второй Fc-фрагмент IgG человека, содержащие ген устойчивости к пуромицину или гигромицину, отражены в SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 4, соответственно.

Для получения векторов, транзиентно экспрессирующих двуцепочечный гетеродимер тяжелой цепи фактора VIII человека, лишенной В-домена, связанной с Fc-фрагментом IgG человека посредством Gly-Ser линкера, и легкой цепи фактора VIII человека, сшитой с Fc-фрагментом IgG человека, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь фактора FVIII человека, лишенную В-домена, сшитую с Fc фрагментом IgG человека посредством Gly-Ser линкера (вариант 2GS и 4GS), и последовательность легкой цепи фактора VIII человека, сшитой с Fc-фрагментом IgG человека, соответственно, вставляли с помощью стандартных методов клонирования в два одинаковых вектора. Указанные вектора содержали следующие структурные элементы: ранний промотор CMV, лидерный сигнальный пептид IgK для секреции, ориджин репликации Р, ген устойчивости к ампициллину. Последовательности полученных векторов, кодирующих тяжелую цепь фактора FVIII человека, лишенную В-домена, сшитую с Fc фрагментом IgG человека посредством Gly-Ser линкера, отражены в SEQ ID NO 5 и SEQ ID NO 6. Последовательность полученного вектора, кодирующего легкую цепь фактора VIII человека, сшитую с Fc-фрагментом IgG человека, отражена в SEQ ID NO 7.

2. Получение стабильной клеточной линии-продуцента рекомбинантного мономерно-димерного FVIII-Fc

За день до трансфекции клетки CHO-K1-S пересеивали в концентрации 3×10⁵ кл./мл на свежую среду PowerCHO 2 CD с содержанием 4 мМ глутамина. Использовали клетки, прошедшие не более 6-8 пассажей. Далее отбирали необходимое для трансфекции количество клеток, отмывали от среды с помощью буфера PBS и трансфицировали с помощью двух раундов трансфекции, используя электропоратор Neon, смесью из вектора SEQ ID NO 1 (содержит FVIII-Fc, ген устойчивости к пуромицину) и вектора SEQ ID NO 3 (содержит Fc, ген устойчивости к пуромицину) и смесью из вектора SEQ ID NO 2 (содержит FVIII-Fc, ген устойчивости к гигромицину) и вектора SEQ ID NO 4 (содержит Fc, ген устойчивости к гигромицину), соответственно, в соотношении 1:1. Также проводили трансфекцию плазмидами, содержащими RFP (Tomato) для контроля эффективности трансфекции. На следующие сутки измерили эффективность трансфекции на проточном цитофлуориметре Guava PSA-96, позволяющем анализировать популяцию клеток, экспрессирующих специфический белок, в данном случае белок Tomato. Предварительно отобрали клетки-контроль, трансфецированные Red-белком (Tomato), а также не трансфецированные клетки родительской линии CHO-K1-S. 500 мкл клеточной суспензии центрифугировали в эппендорфе в центрифуге 5 мин при 1300 об/мин, осадок отмывали в эквивалентном количестве PBS. Помещали 100 мкл суспензии в V-образный планшет и измеряли эффективность. Эффективность трансфекции составила 96% светящихся клеток.

С периодичностью 3-5 дней наблюдали за конфлюентностью в рассеянных лунках до достижения средней конфлюэтности 70-90%, производили измерение продуктивности.

Условия культивирования: 275 rpm, температура - 37°С, влажность - 70%, СО₂ - 5%. Длительность культивирования составила 5 дней. Определение концентрации белка и его активности в культуральной жидкости проводили с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), используя методику определения специфической активности человеческого фактора VIII с помощью коммерческого набора ''Human Factor VIII Activity Kit'' и коммерческого набора ''AssayMax Human Factor VIII (FVIII) ELISA Kit'' (AssayPro) согласно инструкциям производителей. Далее 37 лучших по продуктивности минипулов (0,15-0,19 мг/л) переносили в 24-луночный формат. Для этого готовили среду Lonza Power СНО-2, с добавлением 4 мМоль глутамина, содержащую гигромицин и пуромицин из расчета 0,5 мл на каждую лунку. Затем из 24-луночного формата провели перенос в 6-луночный формат всех клонов с продуктивностью от 0,2 до 0,65 мг/л. В ходе отбора минипулов для получения моноклональных линий (рассев на среду CloneMedia) и закладки на хранение было отобрано 6 минипулов. На этапе получения клонов с помощью прибора автоматического отбора клеточных колоний ClonePix переносили 316 колоний. Последующий отбор клонов осуществлялся на основании лучшего титра, анализ проводился с использованием метода ИФА по методике, описанной выше. Был проанализирован 61 клон, отобранный на ClonePix. В результате всех этапов отбора лучших клонов включая 24-, 6- луночный форматы, а также формат минибиореактора объемом 5 мл рабочего объема среды, при культивировании на среде PowerCHO-2CD содержащей 4 мМоль глутамина, были отобраны 5 лучших клонов продуцента с продуктивностью от 1,0 до 3,7 мг/л. Для этапа минибиореакторвов готовили свежую среду и разливали ее по 3 мл в каждый минибиореактор. Аккуратно пипетировали лунки, переносили клоны из 6-луночных планшетов в формат минибиореакторов. Условия культивирования: 180 rpm, орбита шейкера - 25 мм, температура - 37°С, влажность - 70%, СО₂ - 5%. Пять лучших клонов были промасштабированы. Масштабирование проводили в 125 мл колбах с рабочим объемом в 25 мл. Условия культивирования: 150 rpm, 5.0% CO₂, 70% влажности, 37С. Посевная концентрация клеток 3*10⁵ кл./мл. В результате был отобран лучший по продуктивности и активности клон, который использовался для дальнейшей работы.

3. Получение рекомбинантного мономерно-димерного FVIII-Fc методом перфузии

Все этапы культивирования проводили в бессывороточной среде Lonza Power СНО-2, содержащей дополнительно 4 мМоль глутамина. Ампулу клеток-продуцентов CHO-K1-S/F8Fc размораживали на водяной бане, засевали колбы 125 мл, которые культивировали в шейкере-инкубаторе. Параметры процесса культивирования в колбах были следующие: температура культивирования 37°С, влажность 5%, перемешивание 100 rpm. Когда значение плотности жизнеспособных клеток находилось между 10×10⁵ и 30×10⁵ кл./мл, и жизнеспособность клеток составляла >90%, проводили пересев культуры в колбу объемом 250 мл. Далее клетки из этой колбы переносили в мешок объемом 2 литра для культивирования в реакторе Wave с конечной плотностью клеток (3-5)×10⁵ кл./мл. Параметры проведения процесса составляли: температура 37°С, скорость качания платформы 24-25 об/мин, угол наклона 10-11, скорость подачи воздушной смеси 0,15-0,2 л/мин, содержание CO₂ 5%. Полученный посевной материал в мешке объемом 2 литра передавали на следующую стадию получения посевного материала в мешке объемом 25 литров, когда значение плотности жизнеспособных клеток составляла от 30×10⁵ до 50×10⁵ кл./мл и жизнеспособность >90%. Стартовая концентрация клеток в 25 л мешке составляла (3-5)×10⁵ кл./мл. Полученный посевной материал передавали на стадию культивирования в биореакторе HyClone с системой ATF4 с перфузией объемом 250 литров, когда общая плотность клеток составляла от 30×10⁵ до 50×10⁵ кл./мл, а жизнеспособность >90%. Клетки переносили в биореактор до достижения плотности посева 0.3-0.4*10⁶ кл./мл. Процесс культивирования проводили при следующих параметрах: температура 37°С, рН (7,0±0,1), скорость перемешивания 80 об/мин, растворенный кислород 40%. Перфузию начинали при плотности клеток 2-2.5*10⁶ кл./мл со скоростью перфузии 0,8 рабочий объем/сутки. Поддерживали оптимальную плотность клеток на уровне 20-25*10⁶ кл./мл. Процесс заканчивали и культуральную жидкость передали на стадию фильтрации и выделения, когда жизнеспособность культуры в биореакторе составляла 70(±5). Культуральную жидкость собирали в специальный контейнер и хранили при +4°С до стадии очистки белка методом аффинной хроматографии в несколько этапов.

4. Выделение и очистка рекомбинантного мономерно-димерного FVIII-Fc

Осветленную культуральную жидкость (КЖосв) - сырье для процесса выделения и очистки целевого белка - получали в процессе культивирования в режиме Perfusion на полых волокнах с пределом отсечения 30000 кДа. Выделение и очистку FVIIIFc проводили посредством пяти стадий хроматографической очистки. На первом этапе FVIIIFc специфически выделяли из КЖосв на аффинном сорбенте VIIISelect (GE HealthCare). Затем, для удаления основной части примесей: белков клеток хозяина (НСР), ДНК, лиганда VIIISelect, эндотоксинов, а также низкомолекулярных фрагментов целой молекулы (отдельные тяжелые и легкие цепи) и агрегатов; элюат с аффинного сорбента VIIISelect чистили на двух ионообменных сорбентах. Сначала элюат с аффинной колонки чистили на анионообменном сорбенте Q Sepharose FF (GE HealthCare) для отделения от легкой цепи, затем на катионообменном сорбенте SP Sepharose FF для отделения от тяжелой цепи. Дополнительная стадия доочистки от перечисленных выше примесей проводилась на гидрофобном сорбенте Butyl Sepharose FF (GE HealthCare). После очистки на гидрофобном сорбенте белок концентрировали на мембранах с пределом отсечения 30 kDa и переводили в буфер субстанции на эксклюзионном сорбенте Superdex 200 (GE HealthCare). Раствор субстанции FVIII-Fc фильтровали через стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и хранили при -70°С в виде аликвот по 0.5 мл.

Все хроматографические процессы осуществляли на градиентной системе ''Amersham akta basic'' под контролем УФ детектора на длине волны 280 нм. Нанесение КЖ на сорбент FVIIISelect осуществляли с помощью перистальтического насоса в холодной комнате при температуре +(2-8)°С. Геометрию колонки выбирали исходя из рабочей скорости 100-150 см/час и времени контакта не менее 4 мин. Элюцию проводили на скорости 40-50 см/час в обратном потоке. Перед началом процесса очистки на Q SepharoseFF белок доводили до кондуктивности 9-10 мСм/см буфером разбавления для SP Sepharose, проверяли рН (рН=7,1±0,1) и при необходимости дотитровывали. Для очистки на сорбенте SP SepharoseFF перед нанесением проверяли кондуктивность и рН белка (Ω≤9,5 мСм/см, рН=7,1±0,1), при необходимости доводили кондуктивность с помощью буфера разбавления VIIISelect. При очистке на Butyl SepharoseFF перед началом процесса в белок добавляли буфер разбавления до концентрации 1,5М ацетата аммония. Нанесение и элюцию белка в случае SP SepharoseFF и Q SepharoseFF осуществляли при рабочей скорости 150 см/час, в случае Butyl SepharoseFF 75 см/час, для Superdex 200 - 30 см/ч. Подробно хроматографические процессы описаны в Таблице 1.

5. Характеристика полученного очищенного рекомбинантного мономерно-димерного FVIII-Fc

Анализ HPLC проводили с помощью системы Waters Alliance с использованием колонки TSKgel Super SW3000 (4,6×300 мм) со скоростью потока 0,3 мл/мин (Фиг. 1). SDS-PAGE проводили в 8% геле, детекцию проводили с помощью окрашивания серебром. В качестве стандартного белка использовали коммерческий белок FVIII без Fc-фрагмента (Фиг. 2).

Определение специфической активности рекомбинантного мономерно-димерного FVIII-Fc проводили методом хромогенного анализа с помощью набора Coatest SPFVIII (Chromogenix). В качестве стандарта использовали плазму контрольную нормальную (НПО ''РЕНАМ''). Для определения использовали 96-луночные плашки для ИФА с низкой сорбцией, в которые вносили по 25 мкл калибровочных растворов разных концентраций и исследуемых образцов в 25 мкл буфера для разведения. Далее в лунки планшета вносили смесь фосфолипидов с фактором IXa-Х (по 50 мкл), инкубировали его при 37°С 5 мин. После этого в лунки вносили раствор хлорида кальция (по 25 мкл) и инкубировали планшет при 37°С 10 мин. Для детекции в лунки вносили по 50 мкл раствора хромогенного субстрата, инкубировали планшет при 37°С 10 мин, после чего останавливали реакцию добавлением 25 мкл 2% раствора лимонной кислоты. Оптическую плотность раствора в лунках измеряли на микропланшетном спектрофотометре Tecan (Австрия) при длине волны 405 нм. На основании полученных данных строили калибровочную кривую, отражающую зависимость оптической плотности от специфической активности калибровочных растворов. Для построения кривой использовали среднее арифметическое значение оптической плотности, полученное в трех определениях. На основании калибровочной кривой находили значение специфической активности испытуемого раствора, соответствующее полученным в эксперименте значениям оптической плотности. Оно составляло в среднем 3250 МЕ/мг.

6. Исследование фармакокинетики рекомбинантного мономерно-димерного FVIII-Fc при внутривенном введении белым беспородным мышам.

Беспородным белым мышам (вес 20.0 гр) вводили однократно внутривенно препарат рекомбинантного мономерно-димерного FVIII-Fc (ЗАО ''Биокад'') или FVIII (коммерческий препарат XYNTHA®, Wyeth BioPharma Division of Wyeth Pharmaceuticals Inc) в дозе 0,00494 мг/кг. Через 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 24, 36, 48, 72, 96 и 192 часа после ведения препаратов отбирали пробы крови. Сыворотки отделяли центрифугированием и хранили при температуре минус 20°С. Уровень факторов FVIII-Fc и FVIII в сыворотке крови оценивался с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Лунки 96-луночного микропланшета для микротитрования сенсибилизировали аффинно очищенными поликлональными антителами кролика против фактора VIII производства ЗАО ''Биокад'' (без кросс-реактивности с суммарными IgG человека) из расчета 250 нг/100 мкл/лунку в 20 мМ карбонатном буфере, рН 9.0 и инкубировали 16-18 часов при 4°С. Не связавшиеся иммуноглобулины удаляли из лунок. Для блокирования неспецифических участков связывания, в лунки вносили по 200 мкл 20 мМ Трис-HCl буфера, рН 7.2-7.4 (ТБ), содержащего 0.14 М NaCl и 0,5% NFDM (блокирующий буфер - ББ) и инкубировали 30 минут при 37°С. Раствор ББ удаляли, в лунки вносили по 100 мкл исследуемой сыворотки, разведенной в 2-4 раза ББ. Параллельно в лунки вносили 100 мкл стандартных образцов, содержащих известные концентрации факторов FVIII-Fc (ЗАО ''Биокад'') или FVIII (препарат XYNTHA®) в диапазоне 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, и 0 нг/мл в ББ. Планшеты инкубировали 30 минут при 37°С. Содержимое лунок удаляли, лунки промывали 3 раза по 200 мкл ТБ, содержащим 0.05 Твина-20, в лунки вносили по 100 мкл ББ, содержащего аффинно очищенные антитела кролика против фактора VIII, меченые биотином в рабочем разведении и инкубировали 30 минут при 37°С. После инкубации содержимое лунок отсасывали и в лунки вносили авидин, коньюгированный с пероксидазой по 100 мкл/лунку, в рабочем разведении и инкубировали 30 минут при 37°С. Содержимое лунок отсасывали, лунки промывали 4 раза по 200 мкл ТБ, содержащим 0.05 Твина-20, и в лунки вносили по 100 мкл 0.1 М Na-ацетатного буфера, рН 5.0, содержащего 0.1 мг/мл тетраметилбензидина и 0.003% Н₂О₂. Для остановки реакции в лунки вносили по 50 мкл 2М H₂SO₄ и измеряли оптическую плотность в лунках с использованием планшетного спектрофотометра Tecan при 450 нм.

Для определения концентрации факторов FVIII-Fc и FVIII в исследуемых образцах, строили калибровочную кривую зависимости оптической плотности раствора от концентрации факторов FVIII-Fc или FVIII в стандартных образцах. По оптической плотности тестируемого образца находили концентрацию соответствующего фактора с учетом фактора разведения исследуемой сыворотки. Нижний предел достоверного обнаружения факторов FVIII-Fc и FVIII составлял примерно 0,5 и 3 нг/мл, соответственно.

Полученные результаты использовали для построения кривой изменения концентрации факторов FVIII-Fc и FVIII во времени в полулогарифмических координатах. Значения фармакокинетических параметров были получены по экспериментальным данным в автоматическом режиме с использованием программы ''Kinetica 5.1''. В таблице 2 представлены основные фармакокинетические параметры препаратов FVIII и XYNTHA®_при однократном внутривенном введении мышам в дозе 0,00494 мг/кг. На рис. 3 представлены усредненные кривые изменения концентрации FVIII во времени при однократном внутривенном введении мышам препарата FVIII-Fc и препарата XYNTHA®.

7. Исследование фармакодинамики рекомбинантного мономерно-димерного FVIII-Fc при внутривенном введении мышам линии 129S- F8 tm1Kaz / J.

Исследуемый препарат рекомбинантного мономерно-димерного FVIII-Fc (ЗАО ''Биокад'') в дозе 1150 МЕ/кг вводили в латеральную хвостовую вену гемофильных мышей линии 129S- F8 tm1Kaz / J с помощью одноразового инсулинового шприца объемом 1 мл однократно в нулевой день исследования. Для определения параметров фармакодинамики использовали следующие тесты: определение активности FVIII в сыворотке животных (через 0,5, 4, 10, 24, 48 ч после введения) методом ИФА (согласно описанию в Примере 6 выше) и определение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ). Пробы крови отбирали через 0, 0,5, 4, 10, 24, 48 часа после ведения препарата у трех животных. Сыворотки отделяли центрифугированием и хранили при температуре минус 70°С до проведения анализа. Для проведения клоттинговой коагулометрии проводился забор 200 микролитров цельной крови в пробирки с цитратом натрия. Коагулометрические исследования проводили на приборе Amelung KC 4 Delta с применением набора реактивов для определения АЧТВ (аРРТ) ''TriniCLOT аРТТ HS'' REF# Т1204, LOT#F094012. Исследование проводилось не позднее часа после забора крови. Для проведения иммуноферментного анализа использовали сыворотку лабораторных животных. Определение активности препарата проводилось с использованием коммерческих тест систем COATEST SP FVIII 82 4086 63 lot N1137694 (2015-10), контрольной плазмы KM-2 (РЕНАМ) сер. 0414 (согласно описанию в Примере 6 выше). Результаты представлены в Таблицах 3, 4 и 5 и на Фиг. 4.

8. Продукция рекомбинантного двуцепочечного FVIII-Fc в транзиентной системе экспрессии

Проводили трансфекцию клеток линии СНО с помощью PEI векторами SEQI ID NO5 и SEQ ID NO7 и SEQI ID NO6 и SEQ ID NO7 для транзиентной экспрессии двуцепочечного FVIII-Fc в формате 2GS или 4GS, соответственно. Через 3 и 8 суток после трансфекции оценивали активность двуцепочечного FVIII-Fc в культуральной среде методом хромогенного теста с помощью набора Coatest SPFVIII (Chromogenix) (согласно описанию в Примере 4). Через 3 суток после трансфекции активность белка FVIII-Fc в формате 2GS и 42GS составила 0,3 МЕ/мл среды и 0,4 МЕ/мл среды, соответственно. Через 8 суток после трансфекции активность белка FVIII-Fc в формате 2GS и 42GS составила 0,1 МЕ/мл среды и 0,2 МЕ/мл среды, соответственно.

Для определения концентрации FVIII-Fc в культуральной жидкости методом ИФА использовали набор Matched-Pair Antibody Set for ELISA of human FactorVIII antigen'' Affinity Biologicals inc. В качестве стандарта для обоих методов использовали плазму контрольную нормальную (НПО ''РЕНАМ''). В лунки 96-луночные планшета для ИФА с высокой сорбцией вносили по 100 мкл разведенного в 100 раз в ''забивочном'' буфере Capture Antibody и инкубировали 2 часа при 22°С. Референсный образец плазмы разводили ¼ (100%), затем последовательно в 2 раза до 1/256 (1,56%). Исследуемые образцы разводили последовательно в 2 раза от 1/2 до 1/32. В лунки планшета помещали по 100 мкл разведенных растворов плазм и исследуемых образцов. Инкубировали 2 часа при 22°С затем промывали промывочным буфером по 3 раза. Далее во все заполненные лунки вносили по 100 мкл предварительно разведенных Detecting Antibody. Планшет инкубировали при 22°С в течение 60 минут. Далее промывали 3 раза промывочным буфером. Добавляли по 100 мкл свежеприготовленного OPD-раствора в каждую лунку. Инкубировали 5-10 минут в темноте при комнатной температуре и добавляли по 50 мкл останавливающего раствора. Оптическую плотность раствора в лунках измеряли на микропланшетном спектрофотометре при длине волны 490 нм. На основании полученных данных строили калибровочную кривую, отражающую зависимость оптической плотности от концентрации FVIII в калибровочных растворах. Для построения кривой использовали среднее арифметическое значение оптической плотности, полученное в трех определениях. На основании калибровочной кривой находили значение концентрации FVIII в испытуемом растворе, соответствующее полученным в эксперименте значениям оптической плотности. Учитывая, что концентрация FVIII в контрольной плазме крови составляет примерно 200 нг/мл, то 100% на калибровочной кривой соответствует разведению ¼ (50 нг/мл).

Через 3 суток после трансфекции концентрация белка FVIII-Fc в формате 2GS и 42GS составила 61,5 нг/мл и 81 нг/мл соответственно. Через 8 суток после трансфекции концентрация белка FVIII-Fc в формате 2GS и 42GS составила 62,5 нг/мл и 108 нг/мл, соответственно. При этом удельные активности белков в формате 2 GC и 4GS составили на 3 и 8 сутки 4878 МЕ/мг и 4938 МЕ/мг, и 1600 МЕ/мг и 1851 МЕ/мг, соответственно. Из литературных данных известно, что специфическая активность препарата

Как описано выше, химерный белок по настоящему изобретению обеспечивает значительное увеличение времени полужизни лекарственных средств в плазме. С другой стороны, использование химерного белка позволяет устранить большинство значительных недостатков, присущих стандартным композициям пролонгированного действия, путем снижения титров лекарственных средств, и, тем самым, увеличения их времени пребывания в кровотоке и увеличения in vivo активности этих белковых конъюгатов. Благодаря этим преимуществам, указанные химерные белки могут быть использованы для изготовления белковых лекарственных препаратов пролонгированного действия.

Claims

1. Химерный белок с увеличенным временем полужизни в плазме, состоящий из:

1) легкой цепи рекомбинантного фактора VIII человека, связанной с первой цепью Fc-фрагмента IgG человека, которая может содержать одну или более из следующих мутаций: T250Q, M428L, T366S, L368A, Y407V, K392D, K409D и

2) модифицированной тяжелой цепи рекомбинантного фактора VIII человека, лишенной В-домена, связанной со второй цепью Fc-фрагмента IgG человека, которая может содержать одну или более из следующих мутаций: T250Q, M428L, T366S, L368A, Y407V, K392D, K409D,

при этом вторая цепь Fc-фрагмента IgG человека образует димер с первой цепью Fc-фрагмента IgG посредством электростатических или стерических взаимодействий.

2. Химерный белок по п. 1, отличающийся тем, что рекомбинантный фактор VIII содержит одну или более мутаций, приводящих к увеличению стабильности секретируемого фактора VIII.

3. Химерный белок по п. 2, отличающийся тем, что одна или более мутации выбраны из группы, состоящей из F309S, C1899G, C1903G.

4. Химерный белок по п. 1, отличающийся тем, что первая цепь Fc-фрагмента IgG человека содержит одну или более из следующих мутаций: T250Q, M428L, T366S, L368A, Y407V, K392D, K409D.

5. Химерный белок по п. 1, отличающийся тем, что вторая цепь Fc-фрагмента IgG человека содержит одну или более из следующих мутаций: T250Q, M428L, T366S, L368A, Y407V, K392D, K409D.

6. Химерный белок с увеличенным временем полужизни в плазме, состоящий из:

2) модифицированной тяжелой цепи рекомбинантного фактора VIII человека, где тяжелая цепь лишена В-домена, связанной посредством Gly-Ser линкера со второй цепью Fc-фрагмента IgG человека, которая может содержать одну или более из следующих мутаций: T250Q, M428L, T366S, L368A, Y407V, K392D, K409D,

7. Химерный белок по п. 6, отличающийся тем, что Gly-Ser линкер может содержать два и более повтора GGGGS.

8. Химерный белок по п. 6, отличающийся тем, что рекомбинантный фактор VIII содержит одну или более мутаций, приводящих к увеличению стабильности секретируемого фактора VIII.

9. Химерный белок по п. 8, отличающийся тем, что одна или более мутации выбраны из группы, состоящей из F309S, C1899G, C1903G.

10. Химерный белок по п. 6, отличающийся тем, что первая цепь Fc-фрагмента IgG человека содержит одну или более из следующих мутаций: T250Q, M428L, T366S, L368A, Y407V, K392D, K409D.

11. Химерный белок по п. 6, отличающийся тем, что вторая цепь Fc-фрагмента IgG человека содержит одну или более из следующих мутаций: T250Q, M428L, T366S, L368A, Y407V, K392D, K409D.

12. Полинуклеотид, кодирующий химерный белок по любому из пп. 1 или 6.

13. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п. 12.

14. Клетка-хозяин для продукции химерного белка по любому из пп. 1-11, содержащая полинуклеотид по п. 12 или вектор по п. 13.

14. Фармацевтическая композиция для терапии гемофилии А, содержащая эффективное количество химерного белка по п. 1 или 6, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, разбавителями или носителями.

15. Композиция по п. 14, характеризующаяся тем, что представляет собой лиофилизированный порошок.