ES2278940T3 - Gen implicado en la recombinacion v(d)j y/o la reparacion del adn. - Google Patents

Abstract

Molécula aislada de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº 1, nucleótidos 39-2114 de SEC ID nº 1, o nucleótidos 60-2114 de SEC ID nº 1.

Description

Gen implicado en la recombinación V(D)J y/o la reparación del ADN.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una nueva secuencia de ADN que está implicada en la recombinación V(D)J en los linfocitos, y cuya mutación provoca inmunodeficiencias Combinadas Graves (SCID). La invención se refiere asimismo a procedimientos de diagnóstico, procedimientos terapéuticos y procedimientos de rastreo de nuevos compuestos que utilizan esta secuencia, así como a animales transgénicos no humanos.

Antecedentes de la invención

Los linfocitos B y T reconocen antígenos extraños a través de receptores especializados; las inmunoglobulinas y el receptor de las células T (TCR), respectivamente. Las regiones altamente polimórficas de reconocimiento de estos receptores están compuestas por segmentos génicos variables (V), diversos (D) y de unión (J) que experimentan una reorganización somática previa a su expresión mediante un mecanismo conocido como recombinación V(D)J (Tonegawa, 1983). Cada segmento V, D y J está franqueado por secuencias señaléticas de recombinación (RSS), compuestas de heptámeros y nonámeros conservados, separados por secuencias al azar de 12 ó 23 nucleótidos. Las RSS sirven como secuencias de reconocimiento para la Recombinasa de V(D)J.

La recombinación V(D)J puede dividirse a grandes rasgos en tres etapas. Las proteínas RAG1 y RAG2 inician el proceso de reorganización mediante el reconocimiento de las RSS y la introducción de una rotura del ADN bicatenario (dsb) en el borde del heptámero (Schatz et al., 1989; Oettinger, 1990). RAG1 y RAG2 son los únicos dos factores necesarios para catalizar la fragmentación del ADN en los sistemas libres de células (McBlane et al., 1995; Van Gent et al., 1995; Eastman et al., 1996) en una reacción que recuerda la integración retrovírica y la transposición (Van Gent et al., 1996; Roth y Craig, 1998). Se mostró que tres residuos ácidos, DDE, componían el sitio activo transportado por RAG1 (Kim et al., 1999., Landree et al., 1999; Fugmann et al., 2000). La expresión restringida de tanto el gen RAG1 como el RAG2 para los linfocitos B y T limita la recombinación V(D)J al linaje linfoide. Al final de esta etapa, que provoca una alteración del ADN, el ADN cromosómico se deja con dos extremos codificantes sellados en forma de horquilla codificantes (CE), mientras que las secuencias RSS y de ADN que intervienen se extirpan del cromosoma como extremos señaléticos fosforilados y romos (SE) (Roth et al., 1992; Schlissei et al., 1993; Zhu y Roth,1995). La etapa siguiente consiste en el reconocimiento y señalización de la alteración del ADN para la maquinaria de reparación del ADN. A partir de ahora, están implicadas actividades enzimáticas omnipresentes.

La descripción de la grave situación murina, caracterizada por una falta de linfocitos B y T maduros circulantes, (Bosma et al., 1983), como un defecto general de reparación del ADN, acompañado por un aumento en la sensibilidad respecto a la radiación ionizante o a otros agentes que provocan la rotura del ADN bicatenario (dsb), proporcionó la relación entre la recombinación V(D)J y la reparación de la rotura del ADN (dsb) (Fulop, 1990; Biedemann, 1991; Hendrickson, 1991). Esto se confirmó por el análisis de las progenies celulares ováricas Chinas (CHO), seleccionadas inicialmente basándose en su defecto en la reparación del ADN, que puso en marcha una recombinación V(D)J afectada in vitro. (Taccioli et al., 1993). Esto condujo a la descripción del complejo Ku70/Ku80/ADN-PKcs como un sensor de la alteración del ADN (reseña en (Jackson y Jeggo, 1995)). Brevemente, la ADN-PKcs es una proteína quinasa que pertenece a la familia de las Fosfoinositol quinasas (PI), que es reclutada en el sitio de la lesión del ADN mediante la interacción con el complejo regulador ku/70/80 que se une a los extremos del ADN (Gottlieb y Jackson, 1993). La falta de actividad ADN-PK en las células de los ratones graves es debida a una mutación en el gen que codifica ADN-PKcs (Blunt et al., 1996, Danska et al., 1996). Esta gravedad compromete el proceso de recombinación V(D)J, que conduce finalmente a una detención en el desarrollo de las células B y T.

Más recientemente, otras dos proteínas, NBS1 y \gamma-H2AX, se han identificado en el sitio de la reorganización cromosómica en el locus TCR-\alpha en los timocitos (Chen et al., 2000). NBS1, que sufre mutación en el síndrome de rotura de Nijmegen, participa en la formación del complejo RAD50/MRE11/NBS1 implicado en la reparación del ADN (Carney et al., 1998; Varon et al., 1998). \gamma-H2AX representa la forma fosforilada de la histona H2A en respuesta a la alteración externa, y se considera como un sensor importante de la alteración del ADN (Rogakou et al., 1998; Rogakou et al., 1999; Paull et al., 2000).

La implicación biológica de esta observación no se entiende todavía completamente, pero indica que el complejo RAD 50/MRE11/NBS1, puede cooperar con el complejo ADN-PK en la señalización y detección de la rotura del ADN bicatenario (dsb) mediada por RAG|/2 respecto a la maquinaria de reparación celular. En la fase final de la reorganización de V(D)J, la maquinaria de reparación del ADN asegurará per se otra vez la unión de los dos extremos cromosómicos rotos. Esta última etapa se parece a la vía bien conocida que une el extremo no homólogo del ADN (NHEJ) en la levadura Saccharomyces cerevisiae (revisión en (Haber, 2000)) e implica los factores XRCC4 (Li et al., 1995) y la ADN-Ligasa IV (Robins y Lindahl, 1996)). La estructura cristalina obtenida recientemente para XRCC4 demuestra la conformación de tipo pesa de esta proteína y proporciona una base estructural para su unión al ADN, así como su asociación con la ADN-Ligasa IV (Junop et al., 2000).Todos los modelos animales que transportan un gen defectuoso de cualquiera de los factores de recombinación V(D)J conocidos, naturales (murinos y equinos graves) o tratados mediante ingeniería genética a través de la recombinación homóloga, tienen un defecto profundo en el programa de desarrollo linfoide debido a una detención de la maduración de las células B y T en los estadios tempranos (Mombaerts et al., 1992; Shinkai et al., 1992; Nussenzweig et al., 1996; Zhu et al., 1996, Jhappan et al., 1997; Shin et al., 1997; Barnes et al., 1998; Frank et al., 1998; Gao et al., 1998; Gao et al., 1998): Taccioli et al., 1988). En los casos de la ADN-Ligasa IV y XRCC4 este fenotipo también se acompaña por una letalidad embrionaria temprana causada por la muerte apoptósica en masa de las neuronas postmitóticas (Barnes et al., 1998; Frank et al., 1998; Gao et al., 1998).

En el hombre, varias situaciones de deficiencia inmunológica se caracterizan por un programa defectuoso del desarrollo de las células T y/o B (Fischer et al., 1997). En cerca del 20% de los casos, el grave fenotipo de inmunodeficiencia combinada (SCID) es causado por una ausencia completa de los linfocitos B y T circulantes, asociado con un defecto en el proceso de recombinación V(D)J, aunque que las células Naturales Asesinas (NK) se encuentran presentes. Las mutaciones en cualquiera de los genes RAG1 o RAG2 explican un subconjunto de pacientes que sufren esta situación (Schwarz et al., 1996; Corneo et al., 2000; Villa et al., 2001). En algunos pacientes (RS-SCID), el defecto T-B-SCID no está causado por las mutaciones de RAG1 o RAG2 y se acompaña por un aumento en la sensibilidad a las radiaciones ionizantes de tanto las células de la médula ósea (CFU-GMs) como de los fibroblastos primarios de la piel (Cavazzana-Calvo et al., 1993), así como por un defecto en la recombinación V(D)J en los fibroblastos (Nicolas et al., 1998).

Aunque esta situación sugiere que RS-SCID pudiera tener un defecto general en la reparación del ADN que recordara a la situación del grave fenotipo de inmunodeficiencia combinada (scid), la actividad ADN-PK se encontró normal en estos pacientes y la implicación del gen ADN-PKcs se ha descartado inequívocamente mediante medios genéticos en varias familias consanguíneas (Nicolas et al., 1996). Para todos los otros genes conocidos que están implicados en la recombinación V(D)J/reparación del ADN, se excluyó igualmente un papel en su responsabilidad para la situación RS-SCID (Nicolas et al., 1996). El gen defectuoso en RS-SCID codifica por tanto un factor todavía no descrito. Los inventores asignaron recientemente el locus relacionado con la enfermedad al brazo corto del cromosoma humano 10, en una región de 6,5 cM delimitada por dos marcadores polimórficos D10S1664 y D10S674 (Moshous et al., 2000), una región que se muestra está relacionada con una situación SCID similar que se describe en los indios americanos que hablan atabascano (A-SCID) (Hu et al., 1988; LI et al., 1998).

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a la identificación y clonación del gen Artemis, localizado en esta región del cromosoma 10. Artemis codifica un nuevo factor de recombinación V(D)J y/o de reparación del ADN que pertenece a la superfamilia de la metalo \beta-lactamasa y cuyas mutaciones dan lugar a la situación humana RS-SCID.

En particular, la presente invención se refiere a una molécula ácido nucleica aislada y purificada seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº 1, nucleótidos 39-2114 de SEC ID nº 1, o nucleótidos 60-2114 de SEC ID
nº 1.

La presente invención se refiere asimismo a los polipéptidos codificados por el ácido nucleico de la invención y al empleo diverso que puede dárseles para lograr los objetivos de la invención.

Descripción de las figuras

La Figura 1 representa una vista esquemática de la organización genómica del gen Artemis, que representa los exones como rectángulos, e identifica las distintas mutaciones en los pacientes RS-SCID.

Descripción de las formas de realización preferidas

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una molécula ácido nucleica aislada y purificada seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº 1, nucleótidos 39-2114 de SEC ID nº 1, o nucleótidos 60-2114 de SEC ID nº 1.

Asimismo, se prevé que la invención comprenda la secuencia ácido nucleica genómica que conduce a la SEC ID nº 1 después de la transcripción. La secuencia ácido nucleica genómica puede obtenerse fácilmente a partir de la SEC ID nº 1 por el experto en la materia, llevando a cabo el rastreo de una biblioteca del ADN genómico, utilizando un sonda derivada de la SEC ID nº 1. Asimismo, puede obtenerse a partir de la secuencia, que tiene el número de registro AL360083 de GenBank, que puede estar disponible en la siguiente dirección http://www.ncbi.nim.nih.gov:80/entrez/
query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=12584428&dopt=GenBank.

La invención comprende asimismo una molécula ácido nucleica aislada y purificada que es el complemento de la molécula ácido nucleica aislada de la invención, tal como se ha descrito anteriormente.

Por ácido nucleico, secuencia nucleica, secuencia ácido nucleica, polinucleótido, oligonucleótido, secuencia polinucleótida, secuencia nucleotídica, todos los términos que se utilizarán indistintamente en la presente solicitud, se designa una serie de nucleótidos, modificados o no, que define un fragmento o región de un ácido nucleico, que comprende nucleótidos naturales o no. Puede ser un ADN bicatenario, un ADN monocatenario, o sus productos de transcripción. Las secuencias según la invención comprenden asimismo Ácidos Nucleicos Peptídicos, o análogos, o secuencias con nucleótidos modificados (fosforotioatos, metilfosfonatos...).

Aislado, significa que el ácido nucleico de la invención no se encuentra en su entorno cromosómico natural. Las secuencias según la invención se han aislado y/o purificado, lo que significa que se han obtenido directa o indirectamente (por ejemplo, mediante copia por amplificación), modificándose parcialmente por lo menos, su entorno natural. Los ácidos nucleicos que se han obtenido mediante síntesis química forman parte asimismo de la presente invención.

Las condiciones rigurosas de hibridización, pueden definirse tal como se describen en Sambrok et al ((1989): Molecular Cloning: a laboratory manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York), con las condiciones siguientes: 5 x o 6 x SCC, 50-65ºC. Las condiciones muy rigurosas que pueden utilizarse asimismo para la hibridización se definen con las siguientes condiciones: 6 X SCC, 60-65ºC.

La hibridización ADN-ADN o ADN-ARN puede llevarse a cabo en dos etapas: (1) prehibridización a 42ºC durante 3 horas en tampón fosfato (20 mM, pH 7,5) que contiene 5 ó 6 x SSC (1 x SSC que corresponde a una solución 0,15 M NaCl + 0,015 M citrato sódico), formamida al 50%, sulfato dodecil sódico al 7% (SDS), 10 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 5%, y ADN espermático de salmón al 1%; (2) hibridización durante un tiempo de hasta 20 minutos a una temperatura de 50-65ºC, más preferentemente a 60-65ºC, seguido por distintos lavados (de aproximadamente 20 minutos en 2 X SSC+ SDS al 2%, y entonces 0,1 x SSC + SDS al 0,1%). El último lavado se realiza en 0,2 x SSC + SDS al 0,1% durante aproximadamente 30 minutos a una temperatura de aproximadamente 50 a 65ºC y/o en 0,1 x SSC + SDS al 0,1% a la misma temperatura. Estas condiciones de alta rigurosidad de hibridización pueden ser adaptadas por un experto en la materia. Verdaderamente, el experto en la materia puede determinar las mejores condiciones de rigurosidad, variando las concentraciones en SSC y SDS y la temperatura de hibridización y los lavados.

El término "condiciones de alta rigurosidad" se refiere asimismo a la hibridización y a los lavados bajo condiciones que permiten la unión de una molécula ácido nucleica utilizada para el rastreo, tal como una sonda oligonucleótida o una sonda de una molécula de ADNc, a secuencias altamente homólogas. Una solución de lavado ejemplar de una alta rigurosidad es 0,2 x SSC y SDS al 0,1% utilizada a una temperatura de 50-65ºC.

Allí donde las sondas oligonucléotidas se utilizan para rastrear al ADNc o a las bibliotecas genómicas, se pueden utilizar una de las dos soluciones siguientes de alta rigurosidad. La primera es de 6 x SSC con pirofosfato sódico al 0,05% a una temperatura de 35-62ºC, dependiendo de la longitud de la sonda oligonucleótida. Por ejemplo, sondas de 14 pares de bases se lavan a una temperatura de entre 35 a 40ºC, las sondas de 17 pares de bases se lavan a una temperatura de entre 45 y 50ºC, las sondas de 20 pares de bases se lavan a una temperatura de entre 52 y 57ºC y las sondas de 23 pares de bases se lavan a una temperatura de 57-63ºC. La temperatura puede aumentarse entre 2 y 3ºC allí donde la unión anterior no específica es alta. Una segunda solución de alta rigurosidad utiliza cloruro tetrametilamónico (TMAC) para lavar las sondas oligonucleótidas. Una solución de lavado rigurosa es 3 M TMAC, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 y SDS al 0,2%. La temperatura de lavado que utiliza esta solución está en función de la longitud de la sonda. Por ejemplo, una sonda de 17 pares de bases es lavada a una temperatura de aproximadamente
45 a 50ºC.

Se dice que dos polinucléotidos son "idénticos" u "homólogos" si la secuencia de nucleótidos o de residuos aminoácidos, respectivamente, en las dos secuencias, es la misma cuando se alinean para una correspondencia máxima, tal como se describe a continuación. El término "complementario" se utiliza en la presente memoria para significar que la secuencia complementaria es idéntica a la totalidad o a una parte contigua especificada de una secuencia polinucleótida de referencia. Las comparaciones secuenciales entre dos (o más) polinucléotidos o polipéptidos se llevan a cabo típicamente mediante secuencias comparativas de dos secuencias alineadas óptimamente a lo largo de un segmento de "ventana comparativa", para identificar y comparar regiones locales de similitud secuencial. El alineamiento óptimo de las secuencias para realizar la comparación, puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith y Wateman, Ad. App. Math 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de homología del alineamiento de Neddleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda por el procedimiento de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444 (1988), mediante ejecución computarizada de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST N, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección. Para determinar la ventana óptima de alineación, podría utilizarse el programa BLAST, utilizando una matriz BLOSUM 62, o las matrices PAM o PAM250, con los parámetros por defecto, o con los parámetros modificados para aumentar la especificidad.

El "Porcentaje de identidad u homología secuencial" se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en el que la parte de la secuencia polinucleótida en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (por ejemplo, interrupciones) cuando se compara con la secuencia de referencia (que no incluye adiciones o deleciones), para la óptima alineación de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las cuales los residuos idénticos de aminoácidos o de las bases de los ácidos nucleicos se presentan en ambas secuencias para producir posiciones pareadas, dividiendo el número de posiciones pareadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100, para obtener el porcentaje de identidad secuencial.

Los inventores han demostrado asimismo que es posible obtener la actividad de recombinación V(D)J, utilizando sólo un fragmento de la proteína, que es codificado por los nucleótidos 39-1193 ó 60-1193. Este fragmento específico también es preferido en la presente invención.

Es importante apuntar que los fragmentos según la invención no están comprendidos totalmente, preferentemente, entre los nucleótidos 158-609, 607-660, o 29-537 de SEC ID nº 1. En realidad, estos nucleótidos corresponden a EST, habiéndose dado a conocer en GenBank, con los números de registro AA306797 (nucleótidos 29-537) y AA315885 (nucleótidos 158-609, 607-660). Estas exposiciones EST son, sin embargo, incompletas, pues AA306797 comprende un "N" en posición 91 que no lo explica suficientemente, pues representa la totalidad de los 4 nucleótidos distintos (el nucleótido actual es un "C", tal como se ve en la posición 119 de SEC ID nº 1). Además, AA306797 empieza antes de la primera metionina tal como se identifica en la presente invención (nucleótido 39 de SEC ID nº 1), lo que no sugiere el codón actual de inicio de la proteína de la invención. EST AA315885 posee un "C" complementario cuando se compara con la secuencia de la invención en el nucleótido 453 de AA315885 (que corresponde al nucleótido 610 de SEC ID nº 1).

Las exposiciones de AA306797 y de AA315885 se han utilizado por Dronkert et al (2000, Mol. Cell. Biol., 20, 4553-61) para obtener (después de la traducción de EST) parte de la proteína humana SNM1c que es parcialmente homóloga al objetivo SNM1 murino de la exposición. Los problemas en los dos EST que se mencionan anteriormente llevan a una proteína traducida erróneamente.

Asimismo, hay que apuntar igualmente que Woo et al (2001, Science, 291, 1284-9) mencionan el gen EST como correspondiente a SNM1C, como localizado en el cromosoma 10, pero no precisan la localización (10p), ni proporcionan ninguna otra información que EST AA315885, que se mostró errónea.

Los nucleótidos 1 a 35 y 37 a 189 de SEC ID nº 1, se han dado a conocer en EST expuesto en GenBank con el número de registro AA278590, que es incompleto y erróneo, pues falta el nucleótido "G" que se encuentra en la posición 36 de SEC ID nº 1.

Los nucleótidos 1848 a 2321 corresponden a algunos nucleótidos que se encuentran en EST dados a conocer en GenBank con el número de registro Al859962, que es incompleto. Este EST da a conocer una parte errónea de la secuencia complementaria de SEC ID nº 1, no correspondiendo los nucleótidos complementarios a los nucleótidos presentes en el inicio de EST A1859962 a los últimos nucleótidos de SEC ID nº 1.

Este EST contiene, en parte, EST AA278850, que es asimismo incompleto y erróneo (desemparejamiento de un nucleótido cuando se compara con el complemento de SEC ID nº 1.

Por tanto, estas exposiciones no son sólo erróneas e incompletas, sino que asimismo no unen el ácido nucleico de la invención tal como se ha definido anteriormente, a la recombinación V(D)J y a la deficiencia SCID, como hacen los inventores en la presente petición. Esto hubiera confundido al experto en la materia, que no habría podido extraer mucha información de estas exposiciones.

La presente invención se refiere asimismo a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención, especialmente la secuencia ácido nucleica que corresponde a los nucleótidos 39-2114, 60-2114, 39-1193, o 60-1193 de SEC ID nº 1. Se conocen numerosos vectores en la técnica, y que pueden ser, como ejemplo, vectores de expresión, o vectores de amplificación.

La invención se refiere asimismo a una célula huésped que comprende el vector según la invención.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento para producir una proteína implicada en la recombinación
V(D)J, y/o en la reparación del ADN, que comprende las etapas de:

a)

expresar la molécula ácido nucleica según la invención en un huésped apropiado para sintetizar una proteína implicada en la recombinación V(D)J y/o en la reparación del ADN, y

b)

aislar la proteína implicada en la recombinación V(D)J y en la reparación del ADN.

La presente invención se refiere asimismo a una molécula ácidonucleica aislada que es el complemento de la molécula ácido nucleica aislada de la invención. Tal como se aprecia a continuación, la proteína o péptido de la invención puede obtenerse mediante ADN recombinante, técnicas químicas, u otras.

Tiene que entenderse que los términos polipéptido y proteína significan una fila específica de aminoácidos que pueden ser naturales o sintéticos. El experto en la materia es consciente de las maneras existentes para cambiar los aminoácidos. Las proteínas o polipéptidos preferidos son especialmente SEC ID nº 2, y los aminoácidos 1-385 o 8-385 de SEC ID nº 2.

Los vectores de expresión de la invención contienen preferentemente un promotor, señales de inicio y finalización de la traducción, así como regiones apropiadas para la regulación de la transcripción. Requieren ser mantenidos en la célula huésped. El experto en la materia es consciente de dichos vectores y de las maneras para producir y purificar las proteínas, utilizando especialmente marcadores (como el Marcador Histidina, o el glutatión). Asimismo, es posible utilizar equipos de traducción in vitro que están ampliamente disponibles, para producir la proteína o péptido según la invención.

El ácido nucleico de la invención o su fragmento puede insertarse en vectores apropiados de expresión o amplificación utilizando técnicas estándares de unión, o la recombinación homóloga. El vector se elige para permitir la amplificación del ácido nucleico de la invención y/o la expresión del gen.

Los vectores pueden seleccionarse para que sean funcionales en una amplia variedad de huéspedes, tales como procariotas, levaduras, insectos (sistemas de baculovirus) y/o células huésped eucariotas. La selección de la célula huésped puede depender de las propiedades del polipéptido o de su fragmento que vayan a expresarse, por ejemplo, si son necesarias modificaciones postraduccionales (tales como glicosilación y/o fosforilación). Si es así, son preferidas las células eucarióticas, tales como las levaduras, insectos o células huéspedes de mamíferos.

El experto en la materia es consciente de los distintos tipos de vectores que pueden utilizarse, y de las diferentes técnicas utilizadas para hacerlos penetrar en las células huésped (electroporación, lipofección...).

Revisiones de los distintos huéspedes que pueden utilizarse, de las células huésped y de las secuencias reguladoras del ADN en los vectores, dependiendo de las células huéspedes, pueden encontrarse en la patente US nº 6.165.753, en particular en las columnas 9, línea 34 en la columna 13, y en la línea 36. Esta parte técnica del documento, que se refiere al gen de la ciclina E2 y al polipéptido, pero que puede generalizarse a cualquier otro ADNc, o gen, se incorpora como referencia a la presente memoria.

Otra revisión de los distintos vectores, secuencias reguladoras, células huésped, y procedimientos de expresión de los polipéptidos que pueden utilizarse, pueden encontrarse en la patente WO 99/55730, página 6, línea 3 en la página 25, línea 6, que se incorpora a la presente memoria como referencia.

En resumen, los vectores de la invención contienen por lo menos un gen marcador seleccionable que codifica una proteína necesaria para la supervivencia y el desarrollo de la célula huésped en un medio de cultivo selectivo. Genes marcadores seleccionables típicos codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos tales como ampicilina, tetraciclina, o kanamicina para las células huésped procarióticas, deficiencias auxotróficas del complemento de la célula (utilización de ura- levaduras, por ejemplo). Marcadores seleccionables preferidos son el gen de resistencia a la kanamicina, el gen de resistencia a la ampicilina, y el gen de resistencia a la tetraciclina. El gen de resistencia a la kanamicina se prefiere cuando los vectores activos se utilizan tanto en las células procarióticas como eucarióticas (de mamífero), pues la proteína da resistencia a la neomicina en las células de mamíferos.

Los vectores de la invención contienen asimismo un secuencia de unión ribosómica tal como una secuencia Shine-Dalgarno, una secuencia Kozak o un sitio interno de entrada ribosómica (Ires).

Una secuencia señal puede utilizarse asimismo para dirigir al polipéptido fuera de la célula huésped, donde es sintetizado. Muchas secuencias de señales son conocidas por los expertos en la materia, y cualquiera de ellas que sea funcional (homólogas o heterólogas), en la célula huésped seleccionada, puede utilizarse conjuntamente con la secuencia nucleica según la invención.

Los vectores de la invención derivan típicamente de un vector de iniciación tal como un vector comercialmente disponible. Dichos vectores pueden o no contener alguno de los elementos que se incluirán en el vector completo, introduciéndose dichos elementos mediante técnicas apropiadas de biología molecular. De este modo, los elementos añadidos pueden introducirse individualmente con el vector después de digestión enzimática y de la unión del elemento. El procedimiento es bien conocido en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., supra.

Los vectores preferidos para los cuales es posible iniciar la obtención de los vectores de la invención son compatibles con células huésped bacterianas, de insectos y de mamíferos, e incluyen, sin ser limitantes, pCRII, pCR3, y pcDNA3 (Invitrogen Company, San Diego, Calif), pBSII (Stratagene Company, LaJolla, Calif), pET15b (Novagen, Madison, Wis), PGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Calif), PETL (BlueBacII; Invitrogen) y pFast-BacDual (GibcoBRL, Grand Island, N.Y.).

Después de la construcción del vector y de la inserción del ácido nucleico de la invención, el vector completo puede insertarse en una célula huésped apropiada para la amplificación y/o la expresión polipeptídica.

Dichas células huéspedes pueden ser células huéspedes procarióticas (tales como E. coli, Bacillus subtilis) o células huéspedes eucarióticas (tales como una célula de levadura, una célula de insecto, o una célula de vertebrado). La célula huésped, cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas, puede sintetizar el polipéptido, que puede recuperarse a continuación a partir del medio de cultivo (si la célula huésped los secreta al medio), o directamente, a partir de la célula huésped que lo produce (si no es secretado). Después de la recuperación, el polipéptido puede purificarse utilizando procedimientos tales como cromatografía de tamiz molecular, cromatografía de afinidad, y similares.

La selección de la célula huésped para la producción polipeptídica dependerá en parte de si el polipéptido va a ser glicosilado o fosforilado (en cuyo caso se prefieren las células huéspedes eucarióticas), y la forma en la que la célula huésped es capaz de "plegar" la proteína a su estructura terciaria nativa (por ejemplo, orientación apropiada de los puentes de hidrógeno, etc.), de forma que la proteína biológicamente activa sea preparada por la célula. Cuando la célula huésped no sintetiza el polipéptido que posee la actividad biológica de la recombinación V(D)J y/o de la reparación del ADN, el polipéptido puede "plegarse" después de la purificación, después de diversas diálisis.

Células apropiadas de mamíferos o progenies celulares son bien conocidas en la técnica e incluyen células ováricas del hámster chino (CHO), HeLa, HEK293, Hep-2, células 3T3, progenies celulares COS-1 y COS-7 de mono, y la progenie celular CV-1, células N2A del neuroblastoma del ratón, HeLa, células L-929 del ratón, progenies 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH, progenies celulares BHK o HaK del hámster.

Células huéspedes bacterianas útiles, apropiadas para la presente invención incluyen diversas cepas de E. coli, tales como HB101, DH5.\alpha.,DH10, o MC1061. Asimismo, en este procedimiento pueden utilizarse varias cepas de B. subtilis, Pseudomonas spp., otros Bacillus spp., Streptomyces spp., y similares.

Muchas cepas de células de levaduras conocidas para los expertos en la materia, están disponibles asimismo como células huéspedes para la expresión de los polipéptidos de la presente invención, y se preferirán cepas de Saccharomyces cerevisiae, S. pombe, Kluyveromyces...

La penetración (a la que se hace asimismo alusión como "transformación" o "transfección") del vector en la célula huésped seleccionada, puede alcanzarse utilizando procedimientos tales como cloruro cálcico, electroporación, microinyección, lipofección o el procedimiento DEAE-dextrano. El procedimiento seleccionado será en parte función del tipo de célula huésped que vaya a utilizarse. Estos procedimientos y otros procedimientos apropiados son bien conocidos por el experto en la materia, y se dan a conocer, por ejemplo, en Sambrook et al., supra.

El experto en la materia es consciente del medio que se debe utilizar para el cultivo de las células huésped, que incluye al agente selectivo (antibiótico) a añadir a dicho medio, que depende del marcador que se encuentra en el vector que está insertado en la célula.

La cantidad de polipéptido producida en la célula huésped puede evaluarse utilizando procedimientos estándar conocidos en la técnica, tales como, sin limitación, análisis de transferencia Western, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, electroforesis en gel no desnaturalizante, separación HPLC, inmunoprecipitación, y/o ensayos de actividad tales como ensayos del cambio de la unión del gel al ADN.

La purificación del polipéptido producida por las células de la invención, cuando se encuentra en la solución (secreción o excreción), puede llevarse acabo utilizando diversas técnicas. Si contiene un marcador tal como Hexahistidina, puede esencialmente ser purificado en un procedimiento de una etapa, haciendo pasar la solución a través de una columna de afinidad en la que la matriz de la columna posee una alta afinidad por el marcador o por el polipéptido directamente (columna Nickel para poly-histidina).

Cuando el polipéptido se prepara sin un marcador unido, pueden utilizarse para la purificación otro procedimientos bien conocidos. Dichos procedimientos incluyen, sin limitación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de tamiz molecular, HPLC, electroforesis en gel nativo en combinación con elución del gel, y enfoque isoeléctrico de preparación ("dispositivo" de espectrometría de gases/técnica, Hoefer Scientific). En algunos casos, pueden combinarse dos o más de estas técnicas para alcanzar un aumento en la pureza.

Se prevé que el polipéptido se encontrará inicialmente en forma intracelular, pudiéndose extraer el material intracelular (que incluye cuerpos de inclusión para bacterias gram negativas) a partir de la célula huésped utilizando cualquier técnica estándar por el experto en la materia. Por ejemplo, las células huésped pueden lisarse para liberar el contenido del periplasma/citoplasma mediante la prensa Francesa, homogeneización, y/o tratamiento con ultrasonidos seguido por centrifugación.

Si el polipéptido ha formado cuerpos de inclusión en el periplasma, el polipéptido se obtiene utilizando procedimientos conocidos en la técnica, especialmente con la ayuda de agentes caotrópicos tales como guanidina o urea para liberar, fragmentar aparte, y solubilizar los cuerpos de inclusión. Una diálisis ulterior ayudará a solubilizar el polipéptido.

Se pueden utilizar asimismo otros procedimientos estándar bien conocidos por los expertos en la materia, tales como la separación mediante electroforesis, seguida por electroelución, varios tipos de cromatografía (inmunoafinidad, tamiz molecular, y/o intercambio iónico) y/o cromatografía líquida de alta resolución. En algunos casos, puede ser preferible utilizar más de estos procedimientos para una purificación completa.

Además de preparar y purificar el polipéptido utilizando técnicas del ADN recombinante, los polipéptidos, fragmentos y/o sus derivados, pueden prepararse mediante procedimientos de síntesis química (tales como síntesis de péptidos en fase sólida), utilizando técnicas conocidas en la técnica tales como las dadas a conocer por Merrifield et al (J. Am. Chem. Soc., 85:2149 [1963]), Houghten et al (Proc. Natl Acad. Sci. USA, 82:5132 [1985]), y Stewart y Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, III. [1984]). Dichos polipéptidos pueden sintetizarse con o sin una metionina en el extremo amino. Los polipéptidos o sus fragmentos sintetizados químicamente pueden oxidarse utilizando procedimientos que se exponen en estas referencias, para formar enlaces disulfuro. Se espera que estos polipéptidos o fragmentos sintéticos presenten una actividad biológica comparable con los polipéptidos producidos de modo recombinante o purificados a partir de fuentes naturales, principalmente la capacidad para promover la recombinación V(D)J y/o la reparación del ADN y así, pueden utilizarse de forma intercambiable con el polipéptido natural o recombinante.

El polipéptido de la invención puede derivarse químicamente, o asociarse con un polímero. Los polipéptidos modificados según la invención, pueden tener propiedades farmacológicas distintas que las de los polipéptidos que no han sufrido modificaciones, tales como una semivida biológica aumentada o disminuida después de administrárselos a un animal o al hombre, diferentes farmacocinéticas...

Los polipéptidos según la invención, sus fragmentos, variantes y/o derivados, pueden utilizarse para preparar anticuerpos utilizando procedimientos estándar, por ejemplo, después de la administración a un animal tal como un ratón, rata, conejo o una cabra, utilizando un adyuvante apropiado (en particular, el adyuvante incompleto o completo de Freund).

De este modo, los anticuerpos pueden reaccionar con los polipéptidos de la invención, así como los fragmentos reactivos de dichos anticuerpos, están comprendidos (forman parte) del alcance de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales, recombinantes, quiméricos, de cadena única y/o biespecífica. En una forma de realización preferida, el anticuerpo o su fragmento será de origen humano o "estará humanizado", es decir, preparado de forma tal que prevenga o minimice una reacción inmune con respecto al anticuerpo, cuando se administre a un paciente.

El fragmento de anticuerpo puede ser cualquier fragmento que sea reactivo con los polipéptidos de la presente invención. La invención comprende asimismo los hibridomas generados por la presentación del polipéptido según la invención, o un fragmento suyo como un antígeno a un mamífero seleccionado, seguido por las células de fusión (por ejemplo, células esplénicas) del mamífero con ciertas células cancerosas, para crear progenies celulares inmortales mediante técnicas conocidas, tales como la técnica de Köhler y Milstein (1975, Nature 256, 495).

Los anticuerpos según la invención son, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fragmentos Fab o F(ab')_{2}. Pueden ser inmunoconjugados o anticuerpos marcados.

Los inventores de la presente invención han demostrado que el gen Artemis (denominado asimismo SNM1C) codifica una nueva recombinación V(D)J y/o un factor de reparación del ADN que pertenece a la superfamilia de la metalo \beta-lactamasa y cuyas mutaciones dan lugar a la situación humana RS-SCID.

Por tanto, la presente invención se refiere asimismo a un procedimiento in vitro para la determinación del tipo de SCID en un paciente, que consiste en analizar el ácido nucleico y seleccionar el grupo formado por SEC ID nº 1, nucleótidos 39-2114, 60-2114, 39-1193 y 64-1193 de SEC ID nº 1 en dicho paciente, permitiendo la clasificación de dicho SCID como SCID radiosensible, una mutación en dicho ácido nucleico.

Las mutaciones que se investigan comprenden mutaciones puntuales que conducen a un cambio no conservador en un aminoácido de la proteína, o a la producción de un codón prematuro de finalización, deleciones, inserciones o modificaciones debidos a cambios en el ADN genómico que corresponde a SEC ID nº 1, y a sitios aceptores y donadores de corte y empalme que franquean los exones.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento in vitro de diagnóstico en un paciente, que incluye un diagnóstico prenatal de una situación que se selecciona de entre el grupo constituido por un SCID, una predisposición al cáncer, una deficiencia inmunológica, y el transporte de una mutación que aumenta el riesgo de una progenie que tenga tal enfermedad, que consiste en analizar el ácido nucleico seleccionado de entre el grupo constituido por SEC ID nº 1, los nucleótidos 39-2114, 60-2114, 39-1193, y 60-1193 de SEC ID nº 1 y/o la proteína codificada por dicho ácido nucleico en dicho paciente, una mutación en dicho ácido nucleico y /o una proteína que indique un aumento en el riesgo de alcanzar dicha situación.

Asimismo, (la invención) comprende que el procedimiento de diagnóstico según la invención, se lleve a cabo de forma que se analice uno o los dos alelos del paciente, buscando cualquier mutación (mutaciones puntuales, deleciones, inserciones, mutaciones que conduzcan a un corte y empalme incompleto...), que conduzcan a la producción de una proteína no funcional. Por tanto, tiene que entenderse que el análisis del ácido nucleico seleccionado de entre el grupo constituido por SEC ID nº 1, los nucleótidos 39-2114, 60-2114, 39-1193, y 60-1193 de SEC ID nº 1, se lleva a cabo directa o indirectamente en el ADN genómico.

Estos procedimientos de diagnóstico se realizan preferentemente in vitro, sobre ADN o ARN que se han obtenido a partir de células recogidas en el paciente.

Los procedimientos de diagnóstico según la invención pueden ser llevados a cabo en el ADN genómico aislado del paciente, por ejemplo, mediante amplificación de los exones, en particular con los pares de cebadores SEC ID nº 5 a SEC ID nº 32, que se localizan en los intrones del gen Artemis, y permiten la amplificación de los exones y de las uniones intrón-exón, que los inventores han mostrado que están mutadas en algunos pacientes RS-SCID. Está claro que cualquier cebador que amplifique los exones, o permita el análisis de la unión exón-intrón puede utilizarse en esta forma de realización de este procedimiento de diagnóstico según la invención.

Una forma de llevar a cabo un procedimiento de diagnóstico según la invención sería realizar un PCR-SSCP, o secuenciar el producto de amplificación para determinar las mutaciones en el gen Artemis.

La proteína ARTEMIS (o SNM1C) codificada por el ácido nucleico de la invención está por tanto implicada en la recombinación V(D)J y/o en la reparación del ADN. Las mutaciones en el ácido nucleico que conducen a la expresión de una proteína no funcional, cuando tienen lugar en ambos alelos en un paciente, conducen a una situación SCID en dicho paciente. Así mismo se prevé que las propiedades de la proteína ARTEMIS pueden explotarse en otros campos, tales como en la terapia del cáncer, como compuestos que interaccionan con la proteína en una célula cancerosa, pueden ayudar a sensibilizar dicha célula a un agente antitumoral, cuya acción es destruir el ADN (radiación, agente químico).

La invención se refiere, por tanto, a un procedimiento de identificación de un compuesto capaz de unirse al ácido nucleico o a la proteína de la invención, que comprende las etapas que consisten en:

a)

contactar dicho ácido nucleico o proteína con un compuesto candidato, y

b)

determinar la unión entre dicho compuesto candidato y dicho ácido nucleico o proteína.

Los procedimientos para evaluar la unión de un compuesto a un ácido nucleico o a una proteína, son bien conocidos en la técnica, y se llevan a cabo preferentemente in vitro. Un procedimiento para alcanzar tal objetivo puede ser unir el ácido nucleico o la proteína a un soporte sólido sobre el que el compuesto que debe ensayarse se hace fluir, controlándose la recuperación del compuesto después de hacerlo pasar sobre el soporte. Juntando parámetros, es posible asimismo determinar la afinidad de unión. Los compuestos pueden asimismo encontrarse mediante otros procedimientos, que incluyen FRET, SPA... cuando los compuestos y el ácido nucleico o la proteína son marcados. El ensayo puede realizarse asimismo sobre células que contienen el ácido nucleico de la invención, por ejemplo en un vector según la invención, y/o que exprese la proteína según la invención. Esto da también información de la capacidad del compuesto para atravesar la membrana y penetrar en el interior celular. Estas células pueden ser células bacterianas (investigación de compuestos antibióticos que se unen al fragmento \beta-lactamasa de la proteína), o células de mamíferos.

La invención se refiere por tanto, asimismo, a un compuesto identificado mediante el procedimiento descrito anteriormente, uniéndose dicho compuesto al ácido nucleico o a la proteína de la invención.

Compuestos particularmente preferidos son compuestos que se unen a la región \beta-lactamasa de la proteína de la invención (los primeros 180 aminoácidos de SEC ID nº 2) o el dominio b-CASP asociado (aminoácidos 181-385 de SEC ID nº 2. Dichos compuestos pueden tener una fórmula química próxima a la fórmula l o IV de WO 00/63213, incorporándose dicha fórmula y la parte correspondiente de la solicitud a la presente memoria, como referencia, WO 99/33850, WO 01/02411 o US nº 6.150.350, incorporándose la descripción de los compuestos, como referencia, a la presente memoria.

Un compuesto identificado mediante un procedimiento según la invención, puede ser un compuesto con una estructura química (compuesto químico), un lípido, un hidrato de carbono (azúcar), una proteína, un péptido, un compuesto híbrido proteína-lípido, proteína-hidrato de carbono, péptido-lípido, péptido-hidrato de carbono, una proteína o un péptido en el que se ramifican distintos residuos químicos.

Los compuestos químicos previstos (con una estructura química), pueden contener uno o más (hasta 3 o 4) anillos, especialmente anillos aromáticos, en particular que tengan entre 3 y 8 átomo de carbono, y que posean todos los tipos de grupos ramificados (en particular, alquilos inferiores, es decir, que tengan entre 1 y 6 átomos de carbono, grupos cetónicos, grupos alcohólicos, grupos halógenos....). El experto en la materia sabe cómo preparar distintas variantes de un compuesto, que se inician a partir de una estructura dada, injertando estos radicales sobre dicha estructura.

El procedimiento de la invención permite asimismo el rastreo, detección y/o identificación de compuestos capaces de inhibir la actividad biológica de la proteína ARTEMIS. Verdaderamente, es posible ensayar la unión de los compuestos a un ácido nucleico o a la proteína identificada mediante el procedimiento según la invención, en un ensayo tal como un ensayo de complemento, en el que un vector que transporta SEC ID nº 1, o los nucleótidos 39-2114 de SEC ID nº 1 y que expresan una proteína funcional, se introduce en una célula que se ha recuperado de un paciente que padece RS-SCID, ensayándose el compuesto por su habilidad para inhibir la restauración de la recombinación V(D)J y/o la reparación del ADN en dichas células. Los ejemplos ilustran dicho ensayo, que se lleva a cabo preferentemente in vitro.

La presente invención permite de este modo la detección, la identificación y/o el rastreo de compuestos que pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades en las que están implicados la recombinación V(D)J y/o la reparación del ADN. Sin embargo, los compuestos que se identifican mediante es procedimiento según la invención, para utilizarse en un tratamiento terapéutico, pueden requerir ser optimizados, para tener una actividad superior y/o una toxicidad menor.

Verdaderamente, el desarrollo de nuevos medicamentos se lleva a cabo a menudo basándose en lo siguiente:

-

rastreo de compuestos con la actividad que se busca, sobre un modelo pertinente, mediante un procedimiento apropiado,

-

selección de los compuestos que tienen las propiedades requeridas a partir del primer ensayo de rastreo (aquí, modulación de la recombinación V(D)J y/o de la reparación del ADN),

-

determinación de la estructura (en particular de la secuencia, (si es posible de la terciaria) si son péptidos, proteínas o ácidos nucleicos, de la fórmula y esqueleto si son compuestos químicos) de los compuestos seleccionados.

-

optimización de los compuestos seleccionados, mediante modificación de la estructura (por ejemplo, cambiando la conformación esteroquímica (por ejemplo, el paso de los aminoácidos en un péptido desde L a D), adición de sustituyentes al péptido o a las estructuras químicas, en particular insertando grupos o radicales en la estructura, modificación de los péptidos (véase en particular Gante, "Peptidomimetics", en Angewandte Chemie-International Edition Engl. 1994, 33.1699-1720),

-

paso y rastreo de los compuestos "optimizados" en modelos apropiados que estén próximos a la patología estudiada. En este estadio, se deberían utilizar a menudo modelos animales, en particular roedores (ratas o ratones) o perros o primates no humanos, que son buenos modelos de SCID o cánceres, y buscar los cambios fenotípicos en dichos modelos después de la administración del compuesto.

La presente invención comprende asimismo los compuestos que se han optimizado después de seguir las etapas o las etapas equivalentes tal como se ha descrito.

La presente invención se refiere también a un ácido nucleico, vector, célula huésped, proteína, anticuerpo, y el compuesto de la invención como un medicamento. Estas sustancias pueden verdaderamente utilizarse solas para el tratamiento de distintos tipos de enfermedades, en particular aquéllas en las que la recombinación V(D)J y/o la reparación del ADN estén implicadas, las cuales enfermedades incluyen, sin límite, RS-SCID, deficiencia inmune, cáncer. Estas sustancias pueden utilizarse asimismo en combinación con otro tratamiento que sea apropiado para la enfermedad, siendo el uso simultáneo, separado o secuencial.

En particular, los productos según la invención pueden utilizarse en combinación con citoquinas, factores de crecimiento, antibióticos, antiinflamatorios, y/o agentes quimioterapéuticos, cuando sean apropiados para la indicación que está siendo tratada.

La invención se refiere asimismo a una composición farmacológica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable, transportador o diluyente con por lo menos un ácido nucleico, vector, célula huésped, proteína, anticuerpo, y el compuesto de la invención.

El experto en la materia conoce los excipientes apropiados y los transportadores que pueden utilizarse, y uno puede citar, como ejemplos, agua para inyección, complementada preferentemente con otros materiales habituales en soluciones para la administración a mamíferos, o soluciones salinas tamponadas neutras con albúmina sérica. Algunos transportadores pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, edición 18ª, A. R. Gennaro, editores, Mack Publishing Company (1990).

La composición farmacéutica de la invención puede administrarse oral, nasal, mucosalmente, o inyectada, en particular intravenosamente, intramuscularmente, o subcutáneamente. El transportador y/o excipiente será seleccionado apropiadamente, dependiendo de la forma de administración. La patente US nº 6.165.753 ya citada proporciona ejemplos de vías apropiadas de administración y de excipientes (columna 17, línea 31 a columna 21 línea 55, incorporándose a la presente memoria la información general como referencia).

La invención se refiere asimismo a la utilización de por lo menos un ácido nucleico, vector, célula huésped, proteína, anticuerpo, y el compuesto y la composición farmacéutica de la invención para la preparación de un medicamento dirigido al tratamiento de una enfermedad en la que están implicados la recombinación V(D)J y/o la reparación del ADN, seleccionándose en particular dicha enfermedad del grupo formado por cáncer, SCID, especialmente RS-SCID, deficiencia inmune, por ejemplo debida a problemas en el "encendido" de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas, o debida a problemas en el proceso de hipermutación somática de las inmuno-
globulinas.

La patente US nº 6.165.753 describe asimismo procedimientos de terapia génica, y esta enseñanza se incorpora como referencia.

En una forma de realización preferida, dicho ácido nucleico se administra a dicho individuo de forma que se penetre en las células troncales, que constituyen las células que son las progenitoras de las células del sistema inmune. Este puede realizarse in vivo, o ex vivo, después de recoger las células del paciente, seleccionando las células troncales, introduciendo el ácido nucleico en el interior de dichas células seleccionadas, y volviendo a inyectar las células transformadas en el paciente.

Para la penetración del ácido nucleico en el interior celular, pueden utilizarse distintos medios por el experto en la materia, en particular, es posible introducir dicho ácido nucleico en el interior de las células mediante un vector vírico.

Dicho virus puede de origen humano o no humano, siempre que posea la capacidad de infectar las células de los pacientes, seleccionándose en particular dicho virus del grupo formado por adenovirus, retrovirus (oncovirus tales como RSV, espumavirus, lentivirus), poxvirus, herpesvirus (HSV, EBV, CMV...), iridiovirus, hepadnavirus (virus de la hepatitis B), papovirus (SV40, papilomavirus), parvovirus (virus adeno-asociados), reovirus (rotavirus), togavirus (arbovirus, alfavirus, flavivirus, rubivirus, pestivirus), coronavirus, paramixovirus, ortomixovirus, rabdovirus (virus de la rabia), buniavirus, arenavirus, picornavirus (enterovirus, virus de Coxsackie, ecovirus, rinovirus, aftovirus, cardiovirus, virus de la hepatitis A), Virus modificado Ankara, y sus virus derivados.

Por "virus derivados", quiere significarse que el virus posee modificaciones que lo adaptan al hombre (si es un virus de un origen no humano, que pudiera no infectar las células humanas sin dichas modificaciones) y/o que reducen su patogenicidad potencial o actual. En particular, es mejor si el virus que se utiliza para la transferencia génica es defectuoso respecto a la replicación dentro del organismo humano. Esto constituye un importante asunto de seguridad, pues el control de la expresión del gen funcional puede repercutir en la ejecución del procedimiento de la invención. No se debe desear una diseminación a otras células o a otras personas del vector vírico que transporta el gen de interés terapéutico.

Esta es la razón por la que el vector vírico utilizado en el procedimiento de la invención es preferentemente defectuoso para la replicación, y por tanto se deberá preparar con la ayuda de un virus auxiliar o en una progenie celular complementaria, que introducirá trans el material genético necesario para la preparación de un suficiente título viral.

Dichos virus defectuosos y progenies celulares apropiadas se describen en la técnica, por ejemplo en la patente US 6.133.028, que describe virus adeno-asociados defectuosos (AAV) y las progenies celulares asociadas de complemento, el contenido de los cuales se incorpora a la presente memoria como referencia. Otros virus apropiados se describen por ejemplo en WO 00/34497. Para los adenovirus o AAV, puede ser interesante suprimir las regiones E1 y/o E4.

Para el virus MFG que se describe a continuación, se puede utilizar la progenie celular "1"-CRIP de complemento que se describió en Hacein-Bey et al (1996, Blood, 87, 3108-16), que se incorpora a la presente memoria como referencia. Asimismo, se podrían utilizar otras progenies celulares apropiadas.

Para mejorar el efecto de larga duración de la corrección, se preferirá un virus que permita la integración de dicho gen funcional en un cromosoma de las células infectadas.

En particular, se seleccionarán adenovirus, alguno de los cuales, defectuosos para la replicación, son bien conocidos por el experto en la materia, o retrovirus, en particular, retrovirus murinos derivados. Entre los retrovirus que pueden utilizarse, se preferirá un vector basado en un virus mieloproliferativo sarcomatoso (MPSV), tal como se describe en Bunting et al (1998, Nature Medecine, 4, 58-64, cuyo contenido se incorpora en la presente memoria como referencia). Otro retrovirus bien adaptado que puede utilizarse para la implementación del procedimiento de la invención es el vector MFG, derivado del virus MLV (retrovirus Moloney), descrito en Hacein-Bey et al (1996, Blood, 87, 3108-16), o Cavazzana-Calvo et al (2000, Science, 288, 669-72), incorporándose el contenido de estos dos documentos a la presente memoria, como referencia.

La selección del virus que va a utilizarse para llevar a la práctica el procedimiento de la invención, será función de las características de dicho virus y de la progenie celular de complemento. Está claro que los distintos virus tienen distintas propiedades (en particular LTR en los retrovirus), y que los virus y las progenies celulares mencionadas anteriormente constituyen sólo ejemplos de los medios que pueden utilizarse para llevar a la práctica el procedimiento de la invención, y que no se considerarán limitados. El experto en la materia sabe cómo elegir la mejor progenie celular-virus-gen y/o virus auxiliar, para cualquier situación dada.

En otra forma de realización, dicho ácido nucleico se introduce en el interior de las células mediante un vector sintético que puede seleccionarse a partir del grupo formado por un anfifilo catiónico, un lípido catiónico, un polímero catiónico o neutro, un compuesto prótico polar tal como propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, etano, 1-metil-L-2-pirrolidona, o sus derivados y un compuesto aprótico polar tal como dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilacetamida, tetrametilurea, acetonitrilo o sus derivados. El experto en la materia es consciente de los vectores sintéticos que pueden utilizarse y que permitirán un alto nivel de transfección, tal como los reactivos Lifofectina y Lipofectamina que están disponibles en Life Technologies (Bethesda, MD).

Se prevé que la expresión del gen funcional Artemis en el interior de las células de los pacientes SCID conseguirá una ventaja selectiva para dichas células o la progenie de dichas células, cuando se compara con las células no transformadas o progenie de dichas células no transformadas, y conduce a una mejora en la situación del paciente.

Como ventaja selectiva, se entiende que la proporción de células que se han corregido por la introducción del gen funcional, comparada con las células del mismo tipo en las que dicho gen no es funcional, aumentará, y que conducirá a un alivio de la enfermedad, o incluso a la curación.

La posibilidad de obtener dicha ventaja selectiva se ha demostrado para otro gen por Cavazzana-Calvo et al (2000, Science, 285, 669-72).

La utilización de la invención se lleva a cabo mejor cuando las células en las que se introduce el gen funcional Artemis, son células troncales o células indiferenciadas que son progenitoras de las células a las que le falta la expresión del gen funcional Artemis. Esto conducirá al hecho de que un gran número de células están corregidas en el tiempo, pues la progenie de dichas células troncales también estará corregida. Además, como las células troncales se diferenciarán a lo largo del tiempo a un gran número de células sólo es necesario transfectar un pequeño número inicial de células.

Es posible identificar algunas de las células troncales para el sistema hematopoyético, pues albergan el marcador CD34 en su superficie (células CD34+). El hacer diana en ellas puede llevarse a cabo in vivo, o ex vivo (clasificación de estas células, transfección y reinfusión mediante inyección intravenosa). El experto en la materia sabe que las células troncales pueden aislarse a partir de la sangre del cordón umbilical.

Puede ser interesante inducir el ciclo celular de dichas células troncales, para aumentar la eficiencia de la transfección. Esto es particularmente cierto cuando el procedimiento de la invención se lleva a cabo en células ex vivo.

Verdaderamente, alguno de los vectores que pueden utilizarse para la penetración del gen de interés en las células son los vectores que pueden incorporarse sólo en células no quiescentes. Para que las células se repliquen, se pueden utilizar preferentemente factores de crecimiento y/o citoquinas, tales como CSF (GM-CSF, M-CSF, G-CSF), interleuquinas (preferentemente IL-1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 15), interferones, (en particular \alpha o \gamma). Asimismo, se podrían utilizar factores de células troncales, el factor de diferenciación megacariocítico, acoplado opcionalmente con polietilenglicol, o Flt-3-L. Estos factores se pueden utilizar solos o en combinación.

Cuando la utilización de la invención se realiza ex vivo, las células troncales pueden mantenerse asimismo en un medio que se complementa con otros nutrientes tales como suero (suero bovino fetal, habitualmente, o preferentemente suero de células fetales). Asimismo, puede ser interesante conservar las células que van a transfectarse en placas que contienen elementos de adhesión celular tales como proteínas de adhesión celular (en particular, fibronectina, o vitronectina), o los péptidos que se ha mostrado que promueven la adhesión celular. Está claro que la selección del medio de cultivo será influenciada por el tipo de células y el objetivo después de la búsqueda.

En la utilización según la presente invención para la terapia del cáncer en un paciente, el ácido nucleico, el vector, la célula huésped, la proteína, el anticuerpo, el compuesto y la composición farmacéutica de la invención, son administrados, preferentemente además con un agente genotóxico, siendo la utilización simultánea, separada o
secuencial.

La invención se refiere asimismo a un mamífero transgénico no humano que tiene integrado en su genoma el ácido nucleico de la invención, especialmente una secuencia ácido nucleica seleccionada de entre el grupo constituido por los nucleótidos 39-2114, 60-2114, 39-1193, y 60-1193 de SEC ID nº 1, unidos operativamente a elementos reguladores, en el que la expresión de dicha secuencia codificante aumente el nivel de la proteína ARTEMIS y/o el nivel de la recombinación V(D)J y/o de la reparación del ADN de dicha mamífero, respecto a un mamífero no transgénico de la misma especie.

Se prefiere cuando la secuencia ácido nucleica que está integrada en el genoma del animal transgénico no humano, codifica un polipéptido escogido en el grupo de polipéptidos que comprenden los aminoácidos 1-692, 1-385 u 8-385 de SEC ID nº 2.

Es asimismo preferido cuando la secuencia ácido nucleica que está integrada en el genoma del animal no humano transgénico codifica un polipéptido seleccionado de entre el grupo de polipéptidos constituido por los aminoácidos 1-692, 1-385 o 8-385 de SEC ID nº 2.

Asimismo, se prevé que los elementos reguladores (promotores, potenciadores, intrones, similares a los que pueden utilizarse en la expresión de los vectores de expresión de los mamíferos), pueden ser específicos de tejidos, lo que permite la sobre expresión de la proteína ARTEMIS sólo en un tipo específico de células. En particular, el experto en la materia es consciente de los distintos promotores que pueden ser utilizados con esta finalidad.

La inserción del constructo en el genoma del animal transgénico no humano de la invención, puede llevarse a cabo mediante procedimientos bien conocidos por el experto en la materia, puede realizarse al azar o ser dirigida. En pocas palabras, el experto en la materia construirá un vector que contenga la secuencia para insertar en el interior del genoma, y un marcador de selección (por ejemplo, el gen que codifica la proteína que proporciona resistencia a la neomicina), y que pueda penetrar en las células del Tronco Embrional (ES). Las células se seleccionan entonces con el marcador de selección, y se incorporan en un embrión, por ejemplo, mediante microinyección en un blastocisto, que puede recuperarse mediante perfusión del útero de las hembras preñadas. La reimplantación del embrión y la selección de los animales transformados, seguido por el potencial retrocruzamiento, permite obtener dicho animal transgénico no humano. Para obtener un animal "más limpio", el gen marcador de selección puede extraerse utilizando una recombinasa puntual, si está franqueado por las secuencias correctas.

La invención se refiere asimismo a un mamífero no humano transgénico cuyo genoma comprende una interrupción del gen ARTEMIS endógeno representado por SEC ID nº 1, en el que dicha interrupción comprende la inserción de una secuencia del marcador seleccionable, y en el que dicha interrupción da lugar en dicho mamífero no humano a la exhibición de un defecto en la recombinación V(D)J y/o en la reparación del ADN, cuando se compara con un mamífero no humano de tipo salvaje.

En una forma de realización preferida, dicha interrupción es una interrupción homocigótica.

En una forma de realización preferida, dicha interrupción homocigótica no da lugar a una mutación del gen endógeno que codifica ARTEMIS.

En una forma de realización preferida, dicho mamífero es un roedor, en la forma de realización más preferida, dicho roedor es un ratón.

La invención comprende asimismo un ácido nucleico aislado que comprende un constructo con desactivación génica ARTFMS que comprende una secuencia del marcador seleccionable franqueada por secuencias del ADN homólogas al gen ARTEMIS endógeno, cuyo ADNc está representado por SEC ID nº 1, en el que cuando dicho constructo se introduce en un mamífero no humano o en un antecesor de dicho mamífero no humano en un estadio embrional, dicha secuencia del marcador seleccionable interrumpe el gen endógeno ARTEMIS en el genoma de dicho mamífero no humano, de tal forma que dicho mamífero no humano exhibe un defecto en la recombinación V(D)J y/o en la reparación del ADN, cuando se compara con un mamífero no humano de tipo salvaje.

Dicho constructo se utiliza para obtener los animales que tienen la copia interrumpida del gen Artemis, y se llevan generalmente a cabo en un vector que constituye asimismo un objetivo de la invención.

La invención se refiere asimismo a una célula huésped de mamífero cuyo genoma comprende una interrupción del gen Artemis endógeno, en la que dicha interrupción comprende la inserción de un marcador seleccionable. Preferentemente, dicha interrupción es homocigótica y conduce a la falta de expresión de una proteína ARTEMIS funcional (o a la expresión de una proteína que no es funcional).

Debe hacerse hincapié en que la interrupción puede conseguirse mediante procedimientos conocidos en la técnica y puede ser condicional, es decir, que sólo esté presente en tipos específicos de células, o sea inducida en algunos momentos del desarrollo. El procedimiento para alcanzar dicho objetivo puede ser utilizar recombinasas puntuales tales como Cre (que reconocen sitios lox) o recombinasas FLP (que reconocen sitios FRT), bajo el control de promotores celulares específicos. Estas recombinasas, (especialmente Cre) se han mostrado ser apropiadas para modificaciones y su actividad puede inducirse mediante inyección de un sustrato (tal como una hormona).Estas modificaciones se conocen en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Shibata, et al. (1997, Science 278,
120-3).

Por tanto, el animal transgénico no humano o la célula de la invención puede no mostrar ya más el marcador seleccionable, que puede haber sido eliminado después de la acción de las recombinasas, que conducen a la interrupción del gen. Sin embargo, en el proceso para conseguir dicha interrupción, se ha insertado un marcador seleccionable en el interior del gen Artemis, para permitir principalmente la selección de las células transformadas.

La patente US nº 6.087.555 describe una forma para obtener un ratón con desactivación génica, y la enseñanza general de esta patente se incorpora en la presente memoria como referencia (columna 5, línea 54 a columna 10, línea 13). En esta patente, se describe un ratón con desactivación génica OPG, pero idéntico procedimiento se aplica a un ratón con desactivación génica ARTEMIS. El experto en la materia encontrará asimismo información en Hogan et al. (Manipulating the Mouse embryo: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; 1986).

En otra forma de realización, la invención se refiere a un mamífero transgénico no humano cuyo genoma comprende una primera interrupción que es del gen endógeno ARTEMIS, y una segunda interrupción que es del gen endógeno p53. En la forma de realización preferida, por lo menos dicha primera interrupción o dicha segunda interrupción es una interrupción homocigótica. En la forma de realización más preferida, dicha primera interrupción y dicha segunda interrupción son ambas interrupciones homocigóticas, las cuales dan lugar en particular a una inactivación nula de ambos genes, ARTEMIS y p53.

En la forma de realización preferida, el mamífero transgénico es un roedor, preferentemente una rata o un ratón.

Este mamífero transgénico no humano puede utilizarse como un modelo para estudiar los linfomas de células pro-B. Verdaderamente, la invención se refiere a un procedimiento para proporcionar un modelo para estudiar los linfomas de células pro-B, que comprende proporcionar dicho mamífero transgénico a una persona que necesite dicho modelo par estudiar los linfomas de células pro-B, y a un procedimiento para estudiar los linfomas de células pro-B, que comprende estudiar dicho mamífero transgénico.

Los animales no humanos y las células con desactivación génica de la invención pueden utilizarse asimismo para la identificación de compuestos farmacológicamente interesantes. Por tanto, la invención se refiere asimismo a un procedimiento para rastrear compuestos que modulan la recombinación V(D)J y/o la reparación del ADN, que comprende poner en contacto un compuesto con el mamífero no humano o con la célula huésped con desactivación génica de la invención, y determinar el aumento o la disminución de la recombinación V(D)J y/o de la reparación del ADN en dicho mamífero no humano o en dicha célula huésped, cuando se compara con la recombinación V(D)J y/o la reparación del ADN de dicho mamífero no humano o de dicha célula huésped antes de la administración del compuesto.

Un procedimiento para ensayar la genotoxicidad de compuestos, que comprende poner en contacto un compuesto con el mamífero no humano o con una célula huésped de la invención, y determinar el aumento o disminución de la recombinación V(D)J y/o de la reparación del ADN en dicho mamífero no humano o en dicha célula huésped, cuando se compara con la recombinación V(D)J y/o la reparación del ADN de dicho mamífero no humano o de dicha célula huésped antes de la administración del compuesto, constituye asimismo un objetivo de la invención.

Función de Artemis

Aunque puede inferirse del fenotipo de los pacientes RS-SCID que Artemis constituye parte de la maquinaria ubicua implicada en la reparación dsb del ADN que es compartida por el proceso de recombinación V(D)J, la función exacta para este nuevo factor permanece indefinida.

La investigación repetida para un homólogo global de Artemis en otras especies en las bases de datos proteicas, no llegó a proporcionar un candidato decisivo. La única similitud proviene del péptido 0083, que incluye la fracción completa del extremo N del Artemis, a los elementos varios de la familia SNM1.

Sin embargo, Artemis no constituye claramente el ortólogo humano del SNM1 murino o del PSO2 de la levadura, por, por lo memos, dos razones:

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En primer lugar, a pesar de sus regiones similares al SNM1,las tres proteínas difieren en sus dominios asociados. En particular, los 331 aminoácidos que comprende la región C-terminal de Artemis, no se encuentran en SNM1/PSO2, y no muestran ninguna similitud obvia con ninguna proteína conocida.

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En segundo lugar, mientras que los mutantes SNM1/PSO2 de la levadura y murino demuestran un defecto importante en la reparación de los daños en el ADN causados por loa agentes de entrecruzamiento entre las cadenas del ADN (Henriques y Moustacchi, 1980; Dronkert et al., 2000), no muestran una sensibilidad elevada a las radiaciones ionizantes, indicando que estas dos proteínas no están probablemente implicadas de modo directo en la reparación de dsb ADN.

Éste constituye un señalado contraste con el fenotipo de los pacientes RS-SCID, cuyo defecto molecular primario es verdaderamente la ausencia de la reparación dsb ADN, ilustrada por la falta de formación de la unión codificante durante la recombinación V(D)J y el aumento en la sensibilidad de las células fibroblásticas y de la médula ósea a los rayos \gamma (Cavazzana-Calvo et al., 1993; Nicolas et al., 1998).

De forma interesante, Artemis, la SNM1 murina y la PSO2 de la levadura comparten un dominio adoptando un plegamiento de la métalo-\beta-lactamasa (Aravind, 1997) y probablemente su actividad enzimática asociada, dada la presencia de casi todos los residuos catalíticos críticos (o residuos conservados que podrían sustituirlos para la función). Sin embargo, no existe un consenso obvio con respecto a la naturaleza de los diversos sustratos métalo-\beta-lactamasa, fuera de una composición general cargada negativamente. El análisis secuencial reveló la existencia de una región conservada que acompaña al dominio de la métalo- \beta-lactamasa en elementos de la subfamilia Artemis/SNM1/PSO2 (datos que no se muestran), incluyendo otras diversas secuencias relacionadas con el metabolismo del ácido nucleico tal como dos subunidades de fragmentación y del factor de especificidad de la poliadenilación (CPSF).

Se propone nombrar el dominio, que se describirá en detallen otro lugar, como \betaCASP, por dominio CPSF Artemis SNM1/PSO2 asociado a la métalo-\beta-lactamasa. Este dominio, aunque altamente divergente y tolerando inserciones múltiples (por ejemplo, en el interior de la levadura PSO2) alberga varios residuos conservados, tales como el H319 en Artemis, que podría jugar un papel en esta reacción catalizada por elementos de esta subfamilia.

Es tentador especular que este dominio podría contribuir a la unión del sustrato, de forma similar que el dominio \alpha-helicoidal de la glioxalasa, otro elemento de la familia de la \beta-lactamasa (Cameron et al., 1999).

Artemis en la vía NHEJ de la reparación del ADN

El ADN dsb puede repararse mediante recombinación homóloga (HR) o mediante la vía de unión del extremo no homólogo (NHEJ) (revisión en Haber, 2000). Mientras que HR es la vía predominante de reparación en las levaduras, NHEJ se utiliza predominantemente en los eucariotas superiores y representa la vía de reparación del ADN que se sigue durante la recombinación V(D)J.

Por lo menos tres complejos proteicos se cree actúan conjuntamente o secuencialmente en el sitio del dsb derivado de RAG1/2. El complejo Ku70-80 se recluta probablemente primero en el sitio de la lesión, seguido por la adición de la subunidad ADN-PKcs. Este complejo inicial se considera como el sensor primario de la alteración del ADN, que activará la maquinaria de reparación del ADN. La XRCC4/ADN-Ligasa IV representa la mejor candidata para reparar actualmente el hueco. Más recientemente, el complejo RAD50/MRE11/NBS1 que se supo participaba en NHEJ (Carney et al., 1998; Varon et al., 1998), se encontró en el sitio de los genes TCR de reajuste, arguyendo su posible implicación en la fase de reparación del ADN de la recombinación V(D)J (Chen et al, 2000).

Resultaría deseable por supuesto cómo Artemis juega su papel en esta cascada. En este punto, sólo se pueden proporcionar respuestas especulativas basadas en la analogía de fenotipos entre los diversos modelos defectuosos, que incluyen RS-SCID. Es muy improbable que Artemis esté unido al complejo RAD50/MREl/NBS1. Verdaderamente, tanto en los pacientes con trastornos tipo Nijmegen como en los que padecen ataxia-telangectasia, (ATDL), las mutaciones en los genes NBS1 y MRE11 conducen a inestabilidad cromosómica acompañada por un profundo defecto en la detención de la G1 del ciclo celular inducida por la alteración en el ADN (control GO/G1), mientras que se repone la recombinación (Carney et al., 1998; Varon et al., 1998). Este constituye un señalado contraste con la detención normal de G1 en los fibroblastos de RS-SCID después de irradiación (resultados no publicados).

Respecto al complejo XRCC4/ADN-ligasa IV, existen dos diferencias importantes entre la situación RS-SCID y los ratones XRCC4 y ADN-ligasa IV KO:

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En primer lugar, un alelo nulo completo de Artemis (tal como en P6, P15 y P40), no conduce a una letalidad del embrión en el hombre. Esta observación no apoya una implicación de Artemis en esta fase de NHEJ.

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En segundo lugar, la reunión de los constructos linearizados del ADN introducidos en los fibroblastos RS-SCID es normal (resultados no publicados), mientras que este ensayo, cuando es defectuoso, constituye un diagnóstico significativo de NHEJ anormal en las levaduras (Teo y Jackson, 1997; Wilson et al., 1997).

Quizás la relación más evidente entre Artemis y NHEJ se encuentra con respecto al complejo Ku/ADN-PK. Verdaderamente, los pacientes RS-SCID humanos y los ratones scid, que albergan una mutación en el gen codificante ADN-PKcs, son las dos únicas situaciones conocidas en las que una recombinación V(D)J asociada con un defecto en la reparación del ADN, afecta únicamente a la formación de las uniones codificantes.

La formación de la señal de unión está asimismo afectada en el contexto de una recombinación V(D)J defectuosa en todas las otras posiciones.

Además, las manifestaciones del defecto de reparación del ADN parecen más o menos restringidas al sistema inmune, tanto en los pacientes RS-SCID humanos como en los ratones scid y no parecen conducir a trastornos neurológicos o al desarrollo, por ejemplo, de cáncer, dos manifestaciones que se asocian a menudo con defectos en los otros actores de NHEJ (Roth y Gellert, 2000).

En conclusión, la invención describe la identificación y la clonación del gen que codifica Artemis, un nuevo factor de la recombinación V(D)J. Las mutaciones de Artemis causan defectos T-B-SCID en el hombre, que se deben a una ausencia de la reparación de la interrupción del ADN bicatenario mediada por RAG1/2. Artemis pertenece a una gran familia de moléculas que adoptaron el plegamiento de la métalo-\beta-lactamasa como parte de su sitio catalítico putativo. Una rama de la familia, que incluye asimismo la SNM1 de las levaduras y la PSO2 murina, tiene añadido otro dominio que se denomina \betaCASP, que puede dirigir la actividad del subgrupo de proteínas hacia ácidos nucleicos y, de este modo, cumple el objetivo de la reparación del ADN.

Finalmente, otros dominios, todavía por definir, son probablemente responsables de dirigir las distintas proteínas Artemis/SNM1/PSO2 a sus vías específicas de reparación del ADN; la reparación dsb para Artemis, o la reparación ADN-ICL para SNM1/PSO2.

Los ejemplos siguientes se proporcionan únicamente a título ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Clonación del ADNc de Artemis Pacientes y células

13 pacientes RS-SCID de 11 familias se analizaron en este estudio, habiéndose seleccionado por su fenotipo típico de SCID autosómico recesivo con una ausencia completa de linfocitos T y B periféricos, pero con la presencia de células asesinas naturales (Fisher et al., 1997). Todos los pacientes mostraban un ensayo alterado de la recombinación V(D)J en los fibroblastos, y para todas las familias RS-SCID excepto P16, P40 y P47, pudo determinarse el status de sensibilidad al radio en las células de la médula ósea, y/o en los fibroblastos (Cavazzana-Calvo et al., 1993; Nicolas et al., 1998; Moshous et al., 2000) y nuestros resultados publicados). El genotipado de las familias consanguíneas utilizando marcadores microsatélites polimórficos como se informó en otro lugar (Moshous et al, 2000), coincidió en cada caso con nuestra localización anteriormente descrita de RS-SCID en el cromosoma 10p. El estudió se basó en 4 pacientes de origen Francés (P1, P3, P6 y P15), uno de los cuales (P15) nació de padres relacionados, uno era de origen Italiano (P16), otro griego (P4) y uno africano (P2). Los pacientes restantes eran originarios de cuatro familias consanguíneas turcas, dos de ellas estando relacionadas (P38, P5, P11 y P12 respectivamente). Se obtuvo la autorización de las familias antes de este estudio. Las progenies celulares fibroblásticas primarias se derivaron de biopsias dérmicas y se pseudoinmortalizaron con SV40 tal como se describe en otro lugar (Nicolas et al., 1988) y se cultivaron en medio RPMI 1840 (GIBCO BRL) complementado con fetal de ternera al 15%.

Clonación del ADNc de Artemis y amplificación genómica

La primera cadena de ADNc se sintetizó a partir del ARN fibroblástico. La secuencia codificante completa de Artemis se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) sobre ADNc utilizando el Kit de PCR "Advantage-GC" de ADNc (Clontech) según las recomendaciones del fabricante y se diseñaron los cebadores 0083F1 (5'-GATCGGCGGCGCTATGAGTT-3', SEC ID nº 3), y 169F (5'-TGTCATCTCTGTGCAGGTTT-3', SEC ID nº 4), a partir de las secuencias AA278590 y Al859962 EST. Los productos PCR se secuenciaron directamente en un secuenciador ABl377 (Perkin-Ehner) utilizando una Reacción Preparada de Secuenciación de Finalización del Ciclo (Applied Biosystems) con una serie de oligonucleótidos internos. A causa de diversos transcritos de corte y empale alternativo, la secuenciación se puede llevar a cabo también sobre productos PCR clonados. El ADNc completo del Artemis se subclonó en plRES-EGFP (Clontech) para utilizarlo ulteriormente en experimentos de transfección. La estructura genómica del gen Artemis se dedujo mediante el alineamiento de la secuencia del ADNc respecto a la secuencia preparada de Bac 2K17 (AL360083). Se diseñaron series de pares de cebadores oligonucleótidos para la amplificación específica de cada exón. Los productos PCR del exón 4 y el exón 5 se clonaron en pGemT (Promega) para ulterior utilización en el análisis de transferencia Southern (véase a continuación).

Los cebadores que se utilizaron para la amplificación genómica de los distintos exones 1 a 14, corresponden a SEC ID nº 5 a SEC ID nº 32. Estos pares de cebadores permiten la amplificación de cada exón, tal como se indica en el listado de secuencias, situándose el número del exón después de "Ex", significando "F" Delante y "R", inverso.

Resultados

Como parte de su esfuerzo para secuenciar el cromosoma humano 10, el "Grupo para establecer el mapa del Cromosoma 10", en el Centro Sanger, construyó varios contenidos de cromosomas bacterianos artificiales (BAC) que comprendían el cromosoma 10 completo (http://www.sanger.ac.uk/HGP/Chr10). Dos de estos contenidos, 10ctg1105 y 10ctg23 (Fig 1A), eran de particular interés, pues incluían varios BAC que transportaban los marcadores D10S1664 y D10S674, que franqueaban la región RS-SCID, así como D10S191 y D10S1653, que mostraron los máximos resultados LOD en el emparejamiento de bases en poblaciones A-SCID (Li et al., 1998).

Se inició un seguimiento sistemático de las secuencias nucleótidas, que comprendían los 24 BAC que se encontraban en los dos contenidos, llevado a cabo por el "Grupo para establecer el mapa del Cromosoma 10", en el Centro Sanger, (http://webace.sanger.ac.uk/egi-bin/ace/simple/IOace). Los análisis se basaron en anotar la secuencia nucleótida in silico con los programas GENESCAN (Burge y Karlin, 1997) (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/genscan.
html) y FGENESH (Salamov y Solovyev, 2000) (http://genomic.sanger.ac.uk/gf/gfb.html), los cuales estaban dirigidos a buscar genes que codificaran péptidos putativos en voluminosas secuencias genómicas de ADN. Todos los péptidos predichos se procesaron a continuación respecto a las bases de datos redundantes GENBANK/EMBL de nucleótidos, utilizando TBLASTN. En la liberación de la secuencia preparada AL360083, originada a partir de 2K17BAC, FGENESH predijo un péptido con una longitud de 149 aminoácidos (aa) (denominado subsiguientemente péptido "0083" en el interior del cual los 121 aminoácidos produjeron un 35% y un 31% fue idéntico a las proteínas MuSNM1 (AAF64472) y PSO2 (P30620) de las levaduras, respectivamente. La misma predicción péptida se obtuvo utilizando GENESCAN.

SNM1 y PSO2 son dos proteínas implicadas en la reparación de los daños al ADN causados por los agentes de entrecruzamiento intercatenario del ADN (ICL) que incluyen el cisplatino, la mitomicina C, o la ciclofosfamida (Henriques y Moustacchi, 1980; Dronkert et al., 2000) y las referencias en los mismos se encuentran). Los mutantes de la levadura y de los ratones para SNM1/PSO2 son hipersensibles a varios agentes que causan ICL, pero no a los rayos \gamma, contrariamente a los pacientes RS-SCID en los que la hipersensibilidad a los rayos \gammase encontró tanto en las células de la médula ósea como en los fibroblastos. El gen putativo que codifica el péptido "0083" representó un buen candidato, debido a la localización cromosómica y a la similitud del péptido "0083" con las proteínas de reparación del ADN, a pesar de la importante discrepancia en el fenotipo de radiosensibilidad. La validez del péptido putativo "0083" se estableció buscando transcritos del ARN que codificaran este péptido en la base de datos TIGR de los Indices Génicos Humanos, utilizando TBLASTN (http://www.tigr.org/docs/tigrscripts/nhgli_scripts/tgi_blast. pl?organism=Human).

Esta duda devolvió el índice THC535641 en cuyo interior AA278590 representaba la máxima secuencia del extremo 5' y correspondía al clon I.M.A.G.E. 703546. La secuencia nucleótida de este extremo opuesto del clon (AA278850) se emparejó con el índice THC483503. La secuencia nucleótida Al859962 en este segundo índice proporcionó la máxima extensión del extremo 3' del ADNc que codifica el péptido "0083". Se obtuvo un ADNc completo mediante amplificación RT-PCR del ARN fibroblástico, utilizando los cebadores 0083F1 y 169F seleccionados en el interior de las secuencias nucleótidas AA278590 y Al859962 respectivamente. Este ADNc se secuenció directamente y se clonó en pGemT. Varios clones representaron transcritos no productivos generados por eventos de corte y empalme alternativos. (datos que no se muestran). Los inventores se concentraron en un conjunto de clones que albergaban el marco abierto de lectura más largo. La secuencia completa del ADNc de 2354 pares de bases (SEC ID nº 1) contiene un marco abierto de lectura (ORF) de 2079 pares de bases. Se asume que el ATG en posición 39 o el ATG en posición 60 representan el sitio de iniciación traduccional, basado en el análisis de los nucleótidos circundantes que casan con (la secuencia de) consenso Kozack, para el inicio de la traducción. La proteína codificada de 692 o 685 aminoácidos, que se denominó Artemis (y corresponde a SNM1C), posee un peso molecular predicho de alrededor de 78 kD. El péptido "0083" (que corresponde al péptido codificado por los nucleótidos 348 a 800 de SEC ID nº 1), corresponde a l106-H254 (inicio en el nucleótido 39) y es parte de una región más voluminosa que muestra similitud con scPSO2 y muSNM1.

No es posible determinar completamente que este ADNc representa la secuencia completa, aunque han fallado los repetidos intentos por ampliar la secuencia 5'. La cola polyA en la región no traducida del extremo 3' de la secuencia SEC ID nº 1, está codificada por la secuencia genómica y no es la consecuencia del procesamiento del ARN, sugiriendo que este ADNc puede ampliarse posteriormente por debajo. Los estudios de complementación funcional (véase a continuación) sugieren intensamente, sin embargo, que el ORF completo de Artemis ha sido verdaderamente clonado. La estructura del gen Artemis (Tabla 1) se dedujo mediante comparación de la secuencia del ADNc con respecto a la secuencia genómica (AL360083). Artemis está compuesto de 14 exones con tamaños comprendidos entre 52 pares de bases y 1160 pares de bases. En varios clones ADNc de Artemis se identificaron cuatro exones alternativos, que dieron lugar a cortes y empalmes no productivos.

TABLA 1 Límites exónicos del gen ARTEMIS

1

El RS-SCID se había asignado previamente a una región cromosómica de 6,5 cM franqueada por los marcadores polimórficos D10S1664 y D10S674, una región demasiado grande para los clásicos estudios de selección del ADNc (Li et al., 1998; Moshous et al., 2000). El apunte in silico de las secuencias genómicas preparadas que comprenden esta región, condujo a los inventores a la identificación del gen Artemis.

Ejemplo 2 Expresión de Artemis Análisis de transferencia Southern

Diez \mug de ADN de alto peso molecular se sometieron a digestión con HindIII o Eco881, se procesaron en un gel de agarosa al 0,7%, se transfirieron sobre una membrana de nylon (Genescreen) bajo vacío y se hibridizaron con sondas específicas para los exones 5 y 4 de Artemis, marcadas con P32.

Análisis de expresión del ARN

Se obtuvo de Clontech ADNc preparado mediante PCR procedente de diversos tejidos, y se amplificó con los cebadores específicos de Artemis 0083F4 (5'-AGCCAAAGTATAAACCACTG-3', SEC ID nº 33 y 169F (SEC ID nº 4), o con los cebadores GAPDH proporcionados por los fabricantes, como control, y se procesaron en geles de agarosa al 1%. Los productos PCR específicos de Artemis se transfirieron sobre una membrana de nilón y se hibridizaron con un oligonucleótido interno marcado con P^{32,} mientras el control GAPDH PCR se reveló mediante tinción con bromuro de etidio.

Resultados

El aumento de la radiosensibilidad de RS-SCID a los rayos \gamma no se restringe a las células del sistema inmune, sino que constituye asimismo una característica de los fibroblastos, sugiriendo que Artemis se expresa ubicuamente. Esto fue confirmado por el análisis PCR en un cuadro de 15 ADNc que representaban un amplio abanico de tejidos hematopoyéticos y no hematopoyéticos.

El nivel de la expresión de Artemis es ubicuo pero débil y necesitó 30 ciclos PCR (38 ciclos para el músculo esquelético), para obtener una señal apropiada con un oligonucleótido interno marcado con P32, comparado con la tinción intensa con el bromuro de etidio obtenida para el gen de control GAPDH.

La expresión de bajo nivel de Artemis podría reflejar una propiedad general de la familia de la proteína SNM1, pues la expresión basal de mSNMl en las células ES se encontró asimismo que era muy baja (Dronkert et al., 2000). Comparada con otros tejidos, la expresión de Artemis no aumentó en el timo o en la médula ósea, los sitios de la recombinación V(D)J.

Tal como se esperaba, dado el aumento generalizado de la radiosensibilidad en las células de los pacientes RS-SCID (Cavazzana-Calvo et al., 1993), Artemis demostró un patrón pleiotrópico de expresión.

Ejemplo 3 El gen Artemis muta en los RS-SCID humanos Análisis de la mutación

Los análisis de la secuencia de mutación de Artemis se realizaron bien en ADNc después de la amplificación RT-PCR o en el ADN genómico después de la amplificación PCR específica de los exones. Todos los productos PCR se secuenciaron directamente utilizando la Reacción Preparada de Secuenciación de Finalización del Ciclo (BigDye).

Resultados

La estructura y la secuencia del gen Artemis se analizó en una serie de 11 familias RS-SCID que incluían 13 pacientes (Tabla 2 y Figura 1). Tres pacientes (P6, P15, y P40) se caracterizaron por un ausencia completa del transcrito de Artemis, causada por una deleción genómica que se extendía desde el exón 1 al 4. Esta mutación puede considerarse como un alelo nulo completo.

La misma deleción genómica se encontraba en un alelo en P1, que transportaba un cambio nucleótido C279T en el otro alelo, que condujo a la formación de un codón sin sentido en R74. La mutación homocigótica C279T se encontró también en P2 y se encontró que era heterocigótica en P4.

Otras dos deleciones genómicas fueron características de esta serie de pacientes RS-SCID. Una deleción homocigótica que se extendía desde el exón 5 al 8 en P47 condujo a la formación de un ADNc en el que el exón 4 sufrió un corte y empalme en el marco de lectura al exón 9, dando lugar a una proteína putativa a la que le faltaba K96 a Q219. En P3, una deleción genómica heterocigótica de los exones 5 y 6 dio lugar a la salida del corte y empalme del marco de lectura del exón 4 al exón 7, conduciendo a un cambio en el marco de lectura en K96. El segundo alelo en este paciente portaba un cambio heterocigótico del nucleótido G a C en la secuencia donante canónica del corte y empalme del exón 11, que provocó la salida del corte y empalme del marco de lectura del exón 10 al 12, dando lugar a un cambio en el marco de lectura en T300.

Finalmente, otras tres mutaciones secuenciales donantes de corte y empalme se identificaron en seis pacientes. Un cambio nucleótido heterocigótico G a A en el sitio donador del corte y empalme del exón 10 en P4, produjo un ADNc en el que la fusión del exón 9 al 12, conservó el marco de lectura abierto y condujo potencialmente a la producción de una proteína a la que le faltaba A261 a E317. La mutación homocigótica de G a T en el sitio donador del exón 5 se encontró en los hermanos P5, P11 y P12, así como en P38, creando la salida de corte y empalme del marco de lectura del exón 4 a 6 y la formación de un cambio en el marco de lectura en K96. Aunque esta forma de ADNc al que le falta el exón 5 como resultado del evento alternativo de corte y empalme, se detectó asimismo a un bajo nivel en el ARN de las células normales (datos que no se muestran), explicó todos los ADNc en P5 y en P38. En el paciente P16, una deleción homocigótica de G818 en el exón 9, junto con un cambio homocigótico de C a T nueve nucleótidos por debajo del intrón, provocó la formación de un cambio en el marco de lectura en A254.

Siempre que las muestras de los padres de un paciente estuvieran disponibles, se ensayaron respecto a la presencia de las mutaciones. Esto podría confirmar la herencia de las mutaciones en P5, P11, y p12, así como en P38 y P16 mediante secuenciación directa de la PCR genómica específica del exón obtenida del ADN parental (datos que se muestran), que coincide con la herencia autosómica recesiva.

En resumen, todos los 13 pacientes RS-SCID que se ensayaron en esta serie, portan mutaciones heterocigóticas u homocigóticas del gen Artemis. Ninguna de estas mutaciones eran erróneas, y una de ellas (la deleción genómica del Exón 1 al 4) puede considerarse como un alelo nulo verdadero, dada da falta completa del transcrito de Artemis en P6, P15 y P40. Todas las mutaciones se recapitulan en la Figura 1 y en la Tabla 2.

TABLA 2 Mutaciones del gen Artemis en pacientes RS-SCID

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La primera indicación de que Artemis era verdaderamente el gen que estaba implicado en RS-SCID provino de la identificación de mutaciones en varios pacientes. Generalmente, en 11 familias se encontraron 8 distintas alteraciones del gen. Aunque algunas de las mutaciones se repetían, no fue posible extraer ninguna correlación clara con respecto a los orígenes geográficos de los pacientes.

Del análisis de estas mutaciones se desprenden varias características interesantes:

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En primer lugar, tres de las mutaciones identificadas implican deleciones genómicas que se extienden a través de varios axones, conduciendo a cambios en el marco de lectura y a la aparición de una finalización prematura en dos casos y a una deleción en el marco de lectura de 216 aa en un caso. Esto indica que el gen Artemis puede representar un emplazamiento crítico para la deleción génica.

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En segundo lugar, ninguna de las mutaciones consiste en sustituciones nucleótidas únicas que generen cambios aminoácidos, y sólo una, la transversión C279T, da lugar a una mutación errónea. Los otros cambios nucleótidos afectan a las secuencias donadoras de corte y empalme, que conducen, bien a cambios en el marco de lectura en tres casos, o a una deleción del marco de lectura de parte de la proteína en un caso.

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En tercer lugar, en tres pacientes (P6, P15 y P40), la deleción genómica comprende el exón 1 a 4 y da lugar a una ausencia completa del ADNc codificado por Artemis. Esta deleción, que puede considerarse como productora de un alelo nulo, demuestra por tanto que Artemis no constituye una proteína esencial para la viabilidad, contrariamente a, por ejemplo, XRCC4 y la ADN-Ligasa-IV (Barnes et al., 1998; Frank et al., 1998; Gao et al., 1998), o que es parcialmente redundante.

Esta información es de interés particular para el establecimiento de un homólogo con desactivación génica murino respecto a la situación RS-SCID humana. La implicación de Artemis en la situación RS-SCID se estableció inequívocamente mediante complementación del defecto en la recombinación V(D)J en los fibroblastos del paciente después de la transfección de un ADNc de Artemis wt (véase el ejemplo siguiente).

Ejemplo 4 Artemis complementa el defecto de recombinación V(D)J de RS-SCID Ensayo de recombinación V(D)J

El ensayo de recombinación V(D)J se llevó a cabo tal como se ha descrito previamente (Nicolas et al., 1998). Brevemente, 5 x 10^{6} fibroblastos dérmicos transformados con SV40 que crecían exponencialmente, se sometieron a electroporación en 400 \mul de medio de cultivo (RPMI1640, FCS al 10%), con 6 \mug y 4,8 \mug de los plásmidos codificantes de expresión RAG-1 y RAG-2, respectivamente, juntamente con 2,5 \mug de los sustratos extracromosómicos de V(D)J, pHRecCJ (unión de codificación) o pHRecSJ (señal de unión). Estos plásmidos portan un gen LacZ interrumpido por un ADN de relleno franqueado por secuencias recombinatorias V(D)J de señalización. Después de la recombinación, el ADN de relleno se extirpó, reorganizándose el gen LacZ, dando lugar a colonias bacterianas azules cuando se sembraron en el medio Xgal/lf TG. Se añadió pARTE-ires-EGFP (2,5 \mug) para el análisis de complementación. Los constructos transfectados se recuperaron a las 48 horas, se volvieron a introducir en las bacterias DH10B y se sembraron en placas que contenían Xgal/IPTG. El porcentaje de recombinación se determinó haciendo recuento de las colonias azules y blancas y calculando su proporción. Las colonias azules se seleccionaron al azar y el ADN plasmídico se secuenció para analizar la calidad de las uniones V(D)J.

Resultados

Los inventores demostraron previamente la ausencia de codificación de la formación de la unión derivada de la recombinación V(D)J en los fibroblastos de los pacientes RS-SCID después de la transfección de los constructos RAG1 y RAG2 de expresión, junto con sustratos extracromosómicos de recombinación V(D)J, específicos para el análisis de la unión de codificación (pHRec CJ) (Nicolas et al., 1998). Al contrario, la formación de la señal de unión se encontró siempre normal en los fibroblastos RS-SCID ((Nicolas et al., 1998) y Tabla 3).

El gen Artemis se clonó en el vector de expresión en mamíferos pires-EGFP, evaluándose su actividad de complementación funcional en el ensayo de recombinación V(D)J en los fibroblastos de 7 pacientes RS-SCID, utilizando el sustrato pHRecCJ (Tabla 3). En todos los casos, las colonias bacterianas azules se recuperaron después de transfecciones en presencia de Artemis wt, atestiguando la recombinación del sustrato gobernada por RAG1/2, mientras que virtualmente no se obtuvieron dichas colonias en ausencia del Artemis wt exógeno.

Las frecuencias de los eventos recombinatorios oscilaron entre 1,5x10^{-3} y 2,9x10^{-3,} que concordó con la frecuencia de 3,2x10^{-3} obtenida cuando se utilizó una progenie celular fibroblástica de control. El análisis secuencial de los plásmidos pHRecCJ recuperados que formaban colonias azules, en este ensayo en las progenies fibroblásticas de P1 y de P40, demostró que las uniones eran bona fide, uniones que codifican V(D)J con ribetes limitados de los extremos codificantes similares a los obtenidos en los fibroblastos de control (que no se muestran).

En general, estos resultados indican que el defecto de recombinación V(D)J en RS-SCID está relacionado directamente con las mutaciones descritas en el gen Artemis y puede complementarse introduciendo un ADNc de Artemis wt en los fibroblastos de los pacientes. Aunque la expresión de alto nivel, transitoria, de Artemis no parece ser tóxica, los transfectantes estables no pudieron derivarse para analizar la complementación de la hipersensibilidad a las radiaciones ionizantes. Esto podría deberse a una toxicidad de la expresión de alto nivel a largo plazo de Artemis wt en los fibroblastos transfectados. Una toxicidad celular análoga se describió previamente después de la sobreexpresión de otros homólogos murinos o humanos de SNM1 in vitro y puede ser una característica de esta familia de proteínas (Dronkert et al., 2000). Esto concuerda asimismo con la expresión fisiológica de bajo nivel del ARN de estos genes (véase anteriormente).

Es interesante hacer hincapié en que la proteína que está compuesta por los primeros 385 aminoácidos de SEC ID nº 2 fue también capaz de complementar el defecto de recombinación V(D)J en este ensayo.

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TABLA 3 Complementación de la codificación de la formación de la unión derivada de la recombinación V(D)J en los fibroblastos RS-SCD transfectados con Artemis wt

3

TABLA 3 (continuación)

4

Ejemplo 5 Artemis pertenece a la superfamilia de la metalo-\beta-lactamasa

Las búsquedas de las bases de datos utilizando el programa BLAST2 con el Artemis como secuencia "dudosa" reveló similitudes significativas con varias proteínas, que incluyen las proteínas PSO2 de las levaduras y la murina SNM1, sobre los primeros 360 aminoácidos de Artemis. Repeticiones posteriores con el programa PSI-BLAST dio luz sobre similitudes significativas de los primeros 150 aminoácidos con elementos bien establecidos de la superfamilia de la metalo-\beta-lactamasa.

El pliegue de la metalo-\beta-lactamasa, descrito primero para la \beta-lactamasa de Bacillus cereus (Carfi et al, 1995) es adoptado por varios metalo-enzimas con una amplia distribución y especificidad de sustrato (Aravind,1997). Está formado por un \beta-sándwich de cuatro capas con dos \beta-láminas mezcladas, franqueadas por \alpha-hélices, con los sitios de unión al metal localizados en un borde del \beta-sándwich. El análisis secuencial, así como la predicción de la estructura secundaria para Artemis, indicó claramente la conservación de motivos típicos del pliegue de la metalo-\beta-lactamasa. Esto es cierto en particular para los aminoácidos D17, [HXHKDH] 33-38, H115, y D136 que participan en la estructura de unión al metal y que representan el sitio catalítico de las métalo-\beta-lactamasas. El último residuo de unión al metal de las metalo-\beta-lactamasas, H225 en la metalo-\beta-lactama sa de Tenotrophomonas maltophilia (1SML), que está localizado al final de una cadena \beta (cadena \beta12), está ausente en Artemis/SNM1/PSO2, pero podría ser sustituida funcionalmente por el ácido aspártico D165 de Artemis, conservado asimismo en SNM1/PSO2. El residuo situado más al final se localiza en el extremo de una cadena \beta predicha, separada por una \alpha-helix de la cadena que porta el residuo precedente de unión al metal.

Generalmente, este análisis no sólo indica que Artemis adoptó probablemente el pliegue de la \beta-lactamasa, sino que puede haber conservado asimismo una actividad catalítica asociada, al contrario que en otras varias proteínas que han perdido muchos de los residuos catalíticos (Aravind, 1997).

Ejemplo 6 Mutagénesis in vitro del gen de Artemis

El análisis de la secuencia proteica de Artemis reveló la existencia de un dominio putativo de la métalo-\beta-lactamasa (M1 a R179) que sugiere que Artemis podría tener alguna función catalítica tal como la de hidrolasa. Este dominio está seguido por otro dominio (E180 a S385) que se denominó \beta-CASP por el dominio asociado \beta-lactamasa CPSF-Artemis-SNM1-PSO2. El dominio \beta-CASP está siempre asociado al dominio \beta-lact en una serie de proteínas con función sobre el metabolismo de los ácidos nucleicos (reparación del ADN, procesamiento del ARN...). Finalmente, el último dominio (C-ter) comprende E386 a T692. El papel y la interdependencia de estos dos dominios se analizó in vitro generando mutantes y ensayando su actividad tanto en la recombinación V(D)J como en la reparación del ADN.

Resultados Recombinación V(D)J

Este ensayo se basa en la transfección de un fibroblasto con los constructos de expresión Rag1 y Rag2 para analizar la recombinación V(D)J de un sustrato extracromosómico (pHRec-CJ o pHRec-CS, véase el Ejemplo 4). La región \betaLact+\betaCASP (M1 a S385) es suficiente para complementar el defecto de recombinación V(D)J en los fibroblastos de los pacientes (RS-SCID) deficientes en Artemis.

Sin embargo, el dominio \betaLact (M1 a R179) solo, no complementa este defecto. No existe actividad cuando se utilizan las configuraciones de Artemis \betaCASP-Cter (E180 a T692) o C-ter (E386 a T692).

El sitio catalítico de las metalo-\beta-lactamasas en las bacterias está caracterizado por la reorganización de diversos residuos His y Asp conservados que unen átomos de Zn y confieren la actividad hidrolasa. Muchos de estos residuos están conservados asimismo en Artemis, lo que sugiere además la posible actividad hidrolasa de Artemis.

Varios de estos residuos His y Asp mutaron a Val y la función residual de la proteína se analizó en el ensayo
V(D)J.

D17A, H35A, D37A, y D136A abolieron casi completamente la función de Artemis, mientras que H165A y H319A redujeron su actividad. H38A y H151A parece que no tuvieron efecto.

Reparación del ADN

Este ensayo se basa en el análisis de la sensibilidad a los rayos x de los fibroblastos RS-SCID transducidos con un vector retrovírico que expresa varias formas de Artemis. Mientras \betaLact-\betaCASP/C-ter complementa la hiperradiosensibilidad de las células RS-SCID, \betaLact-\betaCASP, no tiene efecto.

Conclusiones

Estos experimentos de mutagénesis sugieren que Artemis tiene probablemente alguna actividad catalítica, considerando esta hipótesis por su homología con las metalo-\beta-lactamasas bacterianas.

El dominio \betaLact + \betaCASP de Artemis porta esta actividad catalítica, ya que 1) puede asegurar una recombinación V(D)J sobre sustratos extracromosómicos, y 2) la mutación de varios residuos catalíticos putativos (His y Asp) y abole la función.

Sin embargo, es interesante hacer hincapié en que el dominio \betaLact + \betaCASP no parece ser suficiente para permitir por sí mismo la actividad de Artemis en el contexto de la totalidad del cromosoma, como la longitud total de la proteína de Artemis, o por lo menos, parte del dominio C-term, parece necesario para complementar el fenotipo de radiosensibilidad.

Esto sugiere que Artemis interacciona probablemente con otras proteínas en el contexto de su sustrato en el interior de la cromatina.

Basándose en este resultado, es posible que la actividad de recombinación V(D)J sobre la Ig endógena (en la cromatina respecto a la extracromosómica) y los genes TCR, pueda necesitar asimismo la proteína completa de Artemis.

Esta situación es algo similar a la de la proteína Rag2. En Rag2, es necesaria y suficiente una región nuclear para gobernar la recombinación de los sustratos extracromosómicos, mientras que no es efectiva en la reorganización de los loci endógenos.

Ejemplo 7 Análisis de pacientes con una deficiencia parcial de Artemis Observación

En un seguimiento de pacientes SCID, Los inventores se encontraron con 4 casos (en 2 familias) que presentaban un fenotipo complejo que se parecía a la Ataxia telangectasia, aunque sin una ataxia clara. Estos pacientes padecían una grave linfopenia e hipogammaglobulinemia.

En algunos de estos pacientes el hallazgo de aberraciones cromosómicas en los linfocitos, sugirió que podrían presentar un defecto de reparación del ADN, que se confirmó posteriormente mostrado la hipersensibilidad de la médula ósea a los rayos \gamma.

La recombinación V(D)J en los fibroblastos de dos de estos pacientes (que representaban a las dos familias) estaba ausente o gravemente disminuida y se restableció al nivel normal añadiendo Artemis, como en el Ejemplo 4.

Finalmente, fue posible demostrar que el gen Artemis había mutado en los dos casos, dando lugar a codones de finalización prematuros en T432 y D451 respectivamente (al comienzo del dominio C-Ter).

Esta observación confirma en cierto modo los resultados de la mutagénesis in vitro (véase Ejemplo 6), mostrando que la proteína Artemis desprovista del dominio C-Ter completo puede tener todavía actividad de recombinación en el contexto de la cromatina in vivo (estos pacientes tienen algunos linfocitos), pero la eficiencia sobre los loci endógenos es muy débil (estos pacientes son intensamente linfopénicos).

En dos pacientes de la primera familia, la deficiencia inmune se acompañó por el desarrollo del síndrome linfoproliferativo (SLP) agresivo y diseminado, con presencia de EBV.

Estos SLP pueden asimilarse probablemente los verdaderos linfomas de células B, basados en su clonalidad y en su agresividad.

Conclusión

La conclusión principal de esta observación es que Artemis puede probablemente considerarse como un "cuidador", ya que su defecto está asociado aparentemente con el desarrollo de linfomas de células B.

Esta idea está apoyada por la literatura que muestra (en varios informes) que los defectos en otros factores de recombinación V(D)J/reparación del ADN (tales como Ku80, ADN-PK, XRCC4, ADN-LigasaIV) en los modelos animales, conduce siempre al desarrollo de células pro-B cuando se introducen en un P53-/-antecedente, estableciéndose como verdaderos "cuidadores".

Esta hipótesis puede experimentarse en un modelo animal.

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<110> INSTITUT NATIONAL DE LA SANTÉ ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM)

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<120> Gen implicado en la recombinación V(D)J y/o la reparación del ADN

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<130> D19427

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<140>

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<141>

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<150> PCT/IB01/00546

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<151> 2001-03-22

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<160> 33

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 2354

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<223> Secuencia de codificación: nucleótidos 36 a 2114 ó 60 a 2114.

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<400> 1

5

6

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<210> 2

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<211> 692

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<223> Sitio alternativo de inicio de proteína: Met 8

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<400> 2

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7

8

9

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<210> 3

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador 0083F1

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<400> 3

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gatcggcggc gctatgagtt

\hfill

20

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<210> 4

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador 169F

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<400> 4

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tgtcatctct gtgcaggttt

\hfill

20

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<210> 5

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex1F1.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctccggactc ctctgattgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex1R1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggacaaggc gtgtgct

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex2F1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acttgcagaa gaaagag

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex2R1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtgtatttg gtaggattat

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex3F1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attttgtgcc agcgtaa

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex3R1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgaactcct gacctcaagt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex4F1’

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actttacaat tctttctgtt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex4R1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgagcattca aaatca

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex5F1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggattcca cttgtttcta

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex5R1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcagcctcc aactc

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex6F1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgagggaaga ggtgacag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex6R1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaccccatc tccactaaaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex7F1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atagttggga ggctgaggta

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex7R2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacctacggg gacagtt

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex8F2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatcctaac tgtccccgta g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex8R1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccaacatg gtgaaatg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex9F1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcactgaata gccaaaaact

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex9R1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcctagatcg caccact

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex10F1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgagactct gcctacaaca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex10R1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tagcatcccc tccattta

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex11F1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacacgcggt ctacaa

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex11R1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggactacc tgtcaactac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex12F1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggagatcttt gggagtgag

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex12R1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acctctcaat tctgccacac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex13F1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atttgccact ttattacatc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex13R1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaaagtact tcctgagac

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex 14F1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agattggcct ccctattct

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador Ex14R1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaaccaggt tatttgaaca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador 0083F4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

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\hskip-.1em\dddseqskip

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Claims (30)

1. Molécula aislada de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº 1, nucleótidos 39-2114 de SEC ID nº 1, o nucleótidos 60-2114 de SEC ID nº 1.

2. Molécula aislada de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo constituido por nucleótidos 39-1193, o los nucleótidos 60-1193 de SEC ID nº 1.

3. Molécula aislada de ácido nucleico que es el complemento de la molécula aislada de ácido nucleico según la reivindicación 1.

4. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1.

5. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 4.

6. Procedimiento para producir una proteína implicada en la recombinación V(D)J y/o en la reparación del ADN, que comprende las etapas siguientes:

a)

expresar la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 en un huésped apropiado, para sintetizar una proteína implicada en la recombinación V(D)J y/o en la reparación del ADN, y

b)

aislar la proteína implicada en la recombinación V(D)J y/o en la reparación del ADN.

7. Proteína o péptido aislados, codificados por el ácido nucleico según la reivindicación 1.

8. Anticuerpo policlonal o monoclonal que reconoce específicamente la proteína o el péptido según la reivindicación 7.

9. Procedimiento in vitro para la determinación del tipo de inmunodeficiencia grave combinada (SCID) en un paciente, que consiste en analizar el ácido nucleico seleccionado de entre el grupo constituido por SEC ID nº 1, nucleótidos 39-2114, 60-2114, 39-1193 y 60-1193, y 60-1193 de SEC ID nº 1, de dicho paciente, permitiendo una mutación en dicho ácido nucleico la clasificación de dicha SCID como SCID radiosensible.

10. Procedimiento in vitro de diagnóstico, que comprende un diagnóstico prenatal, de una situación en un paciente seleccionado de entre el grupo constituido por una SCID, una predisposición al cáncer, una inmunodeficiencia, y el transporte de una mutación que aumente el riesgo de la progenie de tener dicha enfermedad, que consiste en analizar el ácido nucleico seleccionado de entre el grupo constituido por SEC ID nº 1, nucleótidos 39-2114, 60-2114, 39-1193 y 60-1193 de SEC ID nº 1, y/o la proteína codificada por dicho ácido nucleico de dicho paciente, indicando una mutación en dicho ácido nucleico y/o proteína un aumento en el riesgo de tener una SCID.

11. Procedimiento para la identificación de un compuesto capaz de unirse al ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 3, o a la proteína según la reivindicación 7, que comprende las etapas siguientes

a)

poner en contacto dicho ácido nucleico o proteína con un compuesto candidato, y

b)

determinar la unión entre dicho compuesto candidato y dicho ácido nucleico o proteína.

12. Uno de los ácidos nucleicos según la reivindicación 1 ó 7, el vector según la reivindicación 4, la célula huésped según la reivindicación 5, la proteína según la reivindicación 7, y el anticuerpo según la reivindicación 8, como un medicamento.

13. Composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable con por lo menos uno de los ácidos nucleicos según la reivindicación 1 ó 3, el vector según la reivindicación 4, la célula huésped según la reivindicación 5, la proteína según la reivindicación 7, y el anticuerpo según la reivindicación 8.

14. Utilización de por lo menos uno de los ácidos nucleicos según la reivindicación 1 ó 3, el vector según la reivindicación 4, la célula huésped según la reivindicación 5, la proteína según la reivindicación 7, el anticuerpo según la reivindicación 8, y la composición farmacéutica según la reivindicación 13, para la preparación de un fármaco destinado a la terapia de una inmunodeficiencia grave combinada (SCID).

15. Utilización de por lo menos uno de los ácidos nucleicos según la reivindicación 1 ó 3, el vector según la reivindicación 4, la célula huésped según la reivindicación 5, la proteína según la reivindicación 7, el anticuerpo según la reivindicación 8, y la composición farmacéutica según la reivindicación 13, para la preparación de un fármaco destinado a la terapia cancerosa, preferentemente además con un agente genotóxico, siendo su uso simultáneo, separado o secuencial.

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16. Mamífero transgénico no humano que presenta integrado en su genoma la secuencia ácido nucleica según la reivindicación 1, unida funcionalmente a unos elementos reguladores, en el que la expresión de dicha secuencia codificante aumenta el nivel de la proteína ARTEMIS representada por SEC ID nº 2, y/o el nivel de recombinación V(D)J, y/o de reparación del ADN de dicho mamífero, respecto al mamífero no transgénico de la misma especie.

17. Mamífero transgénico no humano cuyo genoma comprende una interrupción del gen endógeno ARTEMIS representado por SEC ID nº 1, en el que dicha interrupción comprende la inserción de una secuencia marcadora seleccionable, y en el que dicha interrupción da como resultado dicho mamífero no humano que presenta un defecto en la recombinación V(D)J y/o en la reparación del ADN, cuando se compara con un mamífero no humano de tipo salvaje.

18. Mamífero transgénico según la reivindicación 17, en el que dicha interrupción es una interrupción homocigótica.

19. Mamífero transgénico según la reivindicación 18, en el que dicha interrupción homocigótica da como resultado una mutación nula del gen endógeno que codifica ARTEMIS, representado por SEC ID nº 2.

20. Mamífero según la reivindicación 16 ó 17, que es un ratón.

21. Ácido nucleico aislado que comprende un constructo con desactivación génica ARTEMIS que comprende una secuencia marcadora seleccionable franqueada por secuencias de ADN homólogas al gen endógeno ARTEMIS, cuyo ADNc está representado por SEC ID nº 1, en el que cuando dicho constructo se introduce en un mamífero no humano o en un antepasado de dicho mamífero no humano en un estadio embrional, dicha secuencia marcadora seleccionable interrumpe el gen endógeno ARTEMIS en el genoma de dicho mamífero no humano, de manera que dicho mamífero no humano presenta un defecto en la recombinación V(D)J y/o en la reparación del ADN, cuando se compara con un mamífero no humano de tipo salvaje.

22. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 21.

23. Célula huésped de mamífero cuyo genoma comprende una interrupción del gen endógeno ARTEMIS, cuyo ADNc está representado por SEC ID nº 1, en la que dicha interrupción comprende la inserción de una secuencia marcadora seleccionable.

24. Procedimiento para rastrear compuestos que modulan la recombinación V(D)J y/o la reparación del ADN, que comprende poner en contacto un compuesto con el mamífero no humano según la reivindicación 17, o con la célula huésped según la reivindicación 23, y determinar el aumento o la disminución de la recombinación V(D)J y/o de la reparación del ADN en dicho mamífero no humano o en dicha célula huésped, cuando se compara con la recombinación V(D)J y/o la reparación del ADN de dicho mamífero no humano o de dicha célula huésped, antes de la administración del compuesto.

25. Procedimiento para ensayar la genotoxicidad de compuestos, que comprende poner en contacto un compuesto con el mamífero no humano según la reivindicación 17 o con la célula huésped según la reivindicación 23, y determinar el aumento o la disminución de la recombinación V(D)J y/o de la reparación del ADN en dicho mamífero no humano o en dicha célula huésped, cuando se compara con la recombinación V(D)J y/o la reparación del ADN de dicho mamífero no humano o de dicha célula huésped antes de la administración del compuesto.

26. Utilización de por lo menos un compuesto seleccionado de entre el grupo constituido por el ácido nucleico según la reivindicación 1 o 3, el vector según la reivindicación 4, la célula huésped según la reivindicación 5, la proteína según la reivindicación 7, el anticuerpo según la reivindicación 8, y la composición farmacéutica según la reivindicación 13, para la preparación de un medicamento para la modulación de la expresión y/o de la actividad de la proteína ARTEMIS representada por SEC ID nº 2 en una célula.

27. Mamífero transgénico no humano cuyo genoma comprende una primera interrupción que es del gen endógeno ARTEMIS, cuyo ADNc está representado por SEC ID nº 1, y una segunda interrupción que es del gen endógeno p53.

28. Mamífero transgénico según la reivindicación 27, en el que por lo menos dicha primera interrupción o dicha segunda interrupción es una interrupción homocigótica.

29. Mamífero transgénico según la reivindicación 27, en el que dicha primera interrupción y dicha segunda interrupción son interrupciones homocigóticas.

30. Mamífero transgénico según la reivindicación 27, que es un ratón.