ES2278940T3 - Gen implicado en la recombinacion v(d)j y/o la reparacion del adn. - Google Patents
Gen implicado en la recombinacion v(d)j y/o la reparacion del adn. Download PDFInfo
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Abstract
Molécula aislada de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº 1, nucleótidos 39-2114 de SEC ID nº 1, o nucleótidos 60-2114 de SEC ID nº 1.
Description
Gen implicado en la recombinación
V(D)J y/o la reparación del ADN.
La presente invención se refiere a una nueva
secuencia de ADN que está implicada en la recombinación
V(D)J en los linfocitos, y cuya mutación provoca
inmunodeficiencias Combinadas Graves (SCID). La invención se refiere
asimismo a procedimientos de diagnóstico, procedimientos
terapéuticos y procedimientos de rastreo de nuevos compuestos que
utilizan esta secuencia, así como a animales transgénicos no
humanos.
Los linfocitos B y T reconocen antígenos
extraños a través de receptores especializados; las inmunoglobulinas
y el receptor de las células T (TCR), respectivamente. Las regiones
altamente polimórficas de reconocimiento de estos receptores están
compuestas por segmentos génicos variables (V), diversos (D) y de
unión (J) que experimentan una reorganización somática previa a su
expresión mediante un mecanismo conocido como recombinación
V(D)J (Tonegawa, 1983). Cada segmento V, D y J está
franqueado por secuencias señaléticas de recombinación (RSS),
compuestas de heptámeros y nonámeros conservados, separados por
secuencias al azar de 12 ó 23 nucleótidos. Las RSS sirven como
secuencias de reconocimiento para la Recombinasa de
V(D)J.
La recombinación V(D)J puede
dividirse a grandes rasgos en tres etapas. Las proteínas RAG1 y RAG2
inician el proceso de reorganización mediante el reconocimiento de
las RSS y la introducción de una rotura del ADN bicatenario (dsb)
en el borde del heptámero (Schatz et al., 1989; Oettinger,
1990). RAG1 y RAG2 son los únicos dos factores necesarios para
catalizar la fragmentación del ADN en los sistemas libres de células
(McBlane et al., 1995; Van Gent et al., 1995; Eastman
et al., 1996) en una reacción que recuerda la integración
retrovírica y la transposición (Van Gent et al., 1996; Roth
y Craig, 1998). Se mostró que tres residuos ácidos, DDE, componían
el sitio activo transportado por RAG1 (Kim et al., 1999.,
Landree et al., 1999; Fugmann et al., 2000). La
expresión restringida de tanto el gen RAG1 como el RAG2 para los
linfocitos B y T limita la recombinación V(D)J al
linaje linfoide. Al final de esta etapa, que provoca una alteración
del ADN, el ADN cromosómico se deja con dos extremos codificantes
sellados en forma de horquilla codificantes (CE), mientras que las
secuencias RSS y de ADN que intervienen se extirpan del cromosoma
como extremos señaléticos fosforilados y romos (SE) (Roth et
al., 1992; Schlissei et al., 1993; Zhu y Roth,1995). La
etapa siguiente consiste en el reconocimiento y señalización de la
alteración del ADN para la maquinaria de reparación del ADN. A
partir de ahora, están implicadas actividades enzimáticas
omnipresentes.
La descripción de la grave situación murina,
caracterizada por una falta de linfocitos B y T maduros circulantes,
(Bosma et al., 1983), como un defecto general de reparación
del ADN, acompañado por un aumento en la sensibilidad respecto a la
radiación ionizante o a otros agentes que provocan la rotura del ADN
bicatenario (dsb), proporcionó la relación entre la recombinación
V(D)J y la reparación de la rotura del ADN (dsb)
(Fulop, 1990; Biedemann, 1991; Hendrickson, 1991). Esto se confirmó
por el análisis de las progenies celulares ováricas Chinas (CHO),
seleccionadas inicialmente basándose en su defecto en la reparación
del ADN, que puso en marcha una recombinación V(D)J
afectada in vitro. (Taccioli et al., 1993). Esto
condujo a la descripción del complejo
Ku70/Ku80/ADN-PKcs como un sensor de la alteración
del ADN (reseña en (Jackson y Jeggo, 1995)). Brevemente, la
ADN-PKcs es una proteína quinasa que pertenece a la
familia de las Fosfoinositol quinasas (PI), que es reclutada en el
sitio de la lesión del ADN mediante la interacción con el complejo
regulador ku/70/80 que se une a los extremos del ADN (Gottlieb y
Jackson, 1993). La falta de actividad ADN-PK en las
células de los ratones graves es debida a una mutación en el gen
que codifica ADN-PKcs (Blunt et al., 1996,
Danska et al., 1996). Esta gravedad compromete el proceso de
recombinación V(D)J, que conduce finalmente a una
detención en el desarrollo de las células B y T.
Más recientemente, otras dos proteínas, NBS1 y
\gamma-H2AX, se han identificado en el sitio de la
reorganización cromosómica en el locus TCR-\alpha
en los timocitos (Chen et al., 2000). NBS1, que sufre
mutación en el síndrome de rotura de Nijmegen, participa en la
formación del complejo RAD50/MRE11/NBS1 implicado en la reparación
del ADN (Carney et al., 1998; Varon et al., 1998).
\gamma-H2AX representa la forma fosforilada de la
histona H2A en respuesta a la alteración externa, y se considera
como un sensor importante de la alteración del ADN (Rogakou et
al., 1998; Rogakou et al., 1999; Paull et al.,
2000).
La implicación biológica de esta observación no
se entiende todavía completamente, pero indica que el complejo RAD
50/MRE11/NBS1, puede cooperar con el complejo ADN-PK
en la señalización y detección de la rotura del ADN bicatenario
(dsb) mediada por RAG|/2 respecto a la maquinaria de reparación
celular. En la fase final de la reorganización de
V(D)J, la maquinaria de reparación del ADN asegurará
per se otra vez la unión de los dos extremos cromosómicos
rotos. Esta última etapa se parece a la vía bien conocida que une el
extremo no homólogo del ADN (NHEJ) en la levadura Saccharomyces
cerevisiae (revisión en (Haber, 2000)) e implica los factores
XRCC4 (Li et al., 1995) y la ADN-Ligasa IV
(Robins y Lindahl, 1996)). La estructura cristalina obtenida
recientemente para XRCC4 demuestra la conformación de tipo pesa de
esta proteína y proporciona una base estructural para su unión al
ADN, así como su asociación con la ADN-Ligasa IV
(Junop et al., 2000).Todos los modelos animales que
transportan un gen defectuoso de cualquiera de los factores de
recombinación V(D)J conocidos, naturales (murinos y
equinos graves) o tratados mediante ingeniería genética a través de
la recombinación homóloga, tienen un defecto profundo en el
programa de desarrollo linfoide debido a una detención de la
maduración de las células B y T en los estadios tempranos
(Mombaerts et al., 1992; Shinkai et al., 1992;
Nussenzweig et al., 1996; Zhu et al., 1996, Jhappan
et al., 1997; Shin et al., 1997; Barnes et al.,
1998; Frank et al., 1998; Gao et al., 1998; Gao et
al., 1998): Taccioli et al., 1988). En los casos de la
ADN-Ligasa IV y XRCC4 este fenotipo también se
acompaña por una letalidad embrionaria temprana causada por la
muerte apoptósica en masa de las neuronas postmitóticas (Barnes
et al., 1998; Frank et al., 1998; Gao et al.,
1998).
En el hombre, varias situaciones de deficiencia
inmunológica se caracterizan por un programa defectuoso del
desarrollo de las células T y/o B (Fischer et al., 1997). En
cerca del 20% de los casos, el grave fenotipo de inmunodeficiencia
combinada (SCID) es causado por una ausencia completa de los
linfocitos B y T circulantes, asociado con un defecto en el proceso
de recombinación V(D)J, aunque que las células
Naturales Asesinas (NK) se encuentran presentes. Las mutaciones en
cualquiera de los genes RAG1 o RAG2 explican un subconjunto de
pacientes que sufren esta situación (Schwarz et al., 1996;
Corneo et al., 2000; Villa et al., 2001). En algunos
pacientes (RS-SCID), el defecto
T-B-SCID no está causado por las
mutaciones de RAG1 o RAG2 y se acompaña por un aumento en la
sensibilidad a las radiaciones ionizantes de tanto las células de la
médula ósea (CFU-GMs) como de los fibroblastos
primarios de la piel (Cavazzana-Calvo et al.,
1993), así como por un defecto en la recombinación
V(D)J en los fibroblastos (Nicolas et al.,
1998).
Aunque esta situación sugiere que
RS-SCID pudiera tener un defecto general en la
reparación del ADN que recordara a la situación del grave fenotipo
de inmunodeficiencia combinada (scid), la actividad
ADN-PK se encontró normal en estos pacientes y la
implicación del gen ADN-PKcs se ha descartado
inequívocamente mediante medios genéticos en varias familias
consanguíneas (Nicolas et al., 1996). Para todos los otros
genes conocidos que están implicados en la recombinación
V(D)J/reparación del ADN, se excluyó igualmente un
papel en su responsabilidad para la situación
RS-SCID (Nicolas et al., 1996). El gen
defectuoso en RS-SCID codifica por tanto un factor
todavía no descrito. Los inventores asignaron recientemente el
locus relacionado con la enfermedad al brazo corto del cromosoma
humano 10, en una región de 6,5 cM delimitada por dos marcadores
polimórficos D10S1664 y D10S674 (Moshous et al., 2000), una
región que se muestra está relacionada con una situación SCID
similar que se describe en los indios americanos que hablan
atabascano (A-SCID) (Hu et al., 1988; LI
et al., 1998).
La presente invención se refiere a la
identificación y clonación del gen Artemis, localizado en esta
región del cromosoma 10. Artemis codifica un nuevo factor de
recombinación V(D)J y/o de reparación del ADN que
pertenece a la superfamilia de la metalo
\beta-lactamasa y cuyas mutaciones dan lugar a la
situación humana RS-SCID.
En particular, la presente invención se refiere
a una molécula ácido nucleica aislada y purificada seleccionada de
entre el grupo constituido por SEC ID nº 1, nucleótidos
39-2114 de SEC ID nº 1, o nucleótidos
60-2114 de SEC ID
nº 1.
nº 1.
La presente invención se refiere asimismo a los
polipéptidos codificados por el ácido nucleico de la invención y al
empleo diverso que puede dárseles para lograr los objetivos de la
invención.
La Figura 1 representa una vista esquemática de
la organización genómica del gen Artemis, que representa los exones
como rectángulos, e identifica las distintas mutaciones en los
pacientes RS-SCID.
En un primer aspecto, la presente invención se
refiere a una molécula ácido nucleica aislada y purificada
seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº 1,
nucleótidos 39-2114 de SEC ID nº 1, o nucleótidos
60-2114 de SEC ID nº 1.
Asimismo, se prevé que la invención comprenda la
secuencia ácido nucleica genómica que conduce a la SEC ID nº 1
después de la transcripción. La secuencia ácido nucleica genómica
puede obtenerse fácilmente a partir de la SEC ID nº 1 por el experto
en la materia, llevando a cabo el rastreo de una biblioteca del ADN
genómico, utilizando un sonda derivada de la SEC ID nº 1. Asimismo,
puede obtenerse a partir de la secuencia, que tiene el número de
registro AL360083 de GenBank, que puede estar disponible en la
siguiente dirección http://www.ncbi.nim.nih.gov:80/entrez/
query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=12584428&dopt=GenBank.
query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=12584428&dopt=GenBank.
La invención comprende asimismo una molécula
ácido nucleica aislada y purificada que es el complemento de la
molécula ácido nucleica aislada de la invención, tal como se ha
descrito anteriormente.
Por ácido nucleico, secuencia nucleica,
secuencia ácido nucleica, polinucleótido, oligonucleótido, secuencia
polinucleótida, secuencia nucleotídica, todos los términos que se
utilizarán indistintamente en la presente solicitud, se designa una
serie de nucleótidos, modificados o no, que define un fragmento o
región de un ácido nucleico, que comprende nucleótidos naturales o
no. Puede ser un ADN bicatenario, un ADN monocatenario, o sus
productos de transcripción. Las secuencias según la invención
comprenden asimismo Ácidos Nucleicos Peptídicos, o análogos, o
secuencias con nucleótidos modificados (fosforotioatos,
metilfosfonatos...).
Aislado, significa que el ácido nucleico de la
invención no se encuentra en su entorno cromosómico natural. Las
secuencias según la invención se han aislado y/o purificado, lo que
significa que se han obtenido directa o indirectamente (por
ejemplo, mediante copia por amplificación), modificándose
parcialmente por lo menos, su entorno natural. Los ácidos nucleicos
que se han obtenido mediante síntesis química forman parte asimismo
de la presente invención.
Las condiciones rigurosas de hibridización,
pueden definirse tal como se describen en Sambrok et al
((1989): Molecular Cloning: a laboratory manual, 2ª edición, Cold
Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York), con las
condiciones siguientes: 5 x o 6 x SCC, 50-65ºC. Las
condiciones muy rigurosas que pueden utilizarse asimismo para la
hibridización se definen con las siguientes condiciones: 6 X SCC,
60-65ºC.
La hibridización ADN-ADN o
ADN-ARN puede llevarse a cabo en dos etapas: (1)
prehibridización a 42ºC durante 3 horas en tampón fosfato (20 mM,
pH 7,5) que contiene 5 ó 6 x SSC (1 x SSC que corresponde a una
solución 0,15 M NaCl + 0,015 M citrato sódico), formamida al 50%,
sulfato dodecil sódico al 7% (SDS), 10 x solución de Denhardt,
sulfato de dextrano al 5%, y ADN espermático de salmón al 1%; (2)
hibridización durante un tiempo de hasta 20 minutos a una
temperatura de 50-65ºC, más preferentemente a
60-65ºC, seguido por distintos lavados (de
aproximadamente 20 minutos en 2 X SSC+ SDS al 2%, y entonces 0,1 x
SSC + SDS al 0,1%). El último lavado se realiza en 0,2 x SSC + SDS
al 0,1% durante aproximadamente 30 minutos a una temperatura de
aproximadamente 50 a 65ºC y/o en 0,1 x SSC + SDS al 0,1% a la misma
temperatura. Estas condiciones de alta rigurosidad de hibridización
pueden ser adaptadas por un experto en la materia. Verdaderamente,
el experto en la materia puede determinar las mejores condiciones
de rigurosidad, variando las concentraciones en SSC y SDS y la
temperatura de hibridización y los lavados.
El término "condiciones de alta
rigurosidad" se refiere asimismo a la hibridización y a los
lavados bajo condiciones que permiten la unión de una molécula
ácido nucleica utilizada para el rastreo, tal como una sonda
oligonucleótida o una sonda de una molécula de ADNc, a secuencias
altamente homólogas. Una solución de lavado ejemplar de una alta
rigurosidad es 0,2 x SSC y SDS al 0,1% utilizada a una temperatura
de 50-65ºC.
Allí donde las sondas oligonucléotidas se
utilizan para rastrear al ADNc o a las bibliotecas genómicas, se
pueden utilizar una de las dos soluciones siguientes de alta
rigurosidad. La primera es de 6 x SSC con pirofosfato sódico al
0,05% a una temperatura de 35-62ºC, dependiendo de
la longitud de la sonda oligonucleótida. Por ejemplo, sondas de 14
pares de bases se lavan a una temperatura de entre 35 a 40ºC, las
sondas de 17 pares de bases se lavan a una temperatura de entre 45
y 50ºC, las sondas de 20 pares de bases se lavan a una temperatura
de entre 52 y 57ºC y las sondas de 23 pares de bases se lavan a una
temperatura de 57-63ºC. La temperatura puede
aumentarse entre 2 y 3ºC allí donde la unión anterior no específica
es alta. Una segunda solución de alta rigurosidad utiliza cloruro
tetrametilamónico (TMAC) para lavar las sondas oligonucleótidas. Una
solución de lavado rigurosa es 3 M TMAC, 50 mM
Tris-HCl, pH 8,0 y SDS al 0,2%. La temperatura de
lavado que utiliza esta solución está en función de la longitud de
la sonda. Por ejemplo, una sonda de 17 pares de bases es lavada a
una temperatura de aproximadamente
45 a 50ºC.
45 a 50ºC.
Se dice que dos polinucléotidos son
"idénticos" u "homólogos" si la secuencia de nucleótidos o
de residuos aminoácidos, respectivamente, en las dos secuencias, es
la misma cuando se alinean para una correspondencia máxima, tal
como se describe a continuación. El término "complementario" se
utiliza en la presente memoria para significar que la secuencia
complementaria es idéntica a la totalidad o a una parte contigua
especificada de una secuencia polinucleótida de referencia. Las
comparaciones secuenciales entre dos (o más) polinucléotidos o
polipéptidos se llevan a cabo típicamente mediante secuencias
comparativas de dos secuencias alineadas óptimamente a lo largo de
un segmento de "ventana comparativa", para identificar y
comparar regiones locales de similitud secuencial. El alineamiento
óptimo de las secuencias para realizar la comparación, puede
realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith y
Wateman, Ad. App. Math 2: 482 (1981), mediante el algoritmo
de homología del alineamiento de Neddleman y Wunsch, J. Mol.
Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda por el procedimiento
de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 85:2444 (1988), mediante ejecución computarizada de estos
algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST N, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin
Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575
Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección. Para determinar la
ventana óptima de alineación, podría utilizarse el programa BLAST,
utilizando una matriz BLOSUM 62, o las matrices PAM o PAM250, con
los parámetros por defecto, o con los parámetros modificados para
aumentar la especificidad.
El "Porcentaje de identidad u homología
secuencial" se determina comparando dos secuencias óptimamente
alineadas sobre una ventana de comparación, en el que la parte de
la secuencia polinucleótida en la ventana de comparación puede
comprender adiciones o deleciones (por ejemplo, interrupciones)
cuando se compara con la secuencia de referencia (que no incluye
adiciones o deleciones), para la óptima alineación de las dos
secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de
posiciones en las cuales los residuos idénticos de aminoácidos o de
las bases de los ácidos nucleicos se presentan en ambas secuencias
para producir posiciones pareadas, dividiendo el número de
posiciones pareadas por el número total de posiciones en la ventana
de comparación y multiplicando el resultado por 100, para obtener
el porcentaje de identidad secuencial.
Los inventores han demostrado asimismo que es
posible obtener la actividad de recombinación V(D)J,
utilizando sólo un fragmento de la proteína, que es codificado por
los nucleótidos 39-1193 ó 60-1193.
Este fragmento específico también es preferido en la presente
invención.
Es importante apuntar que los fragmentos según
la invención no están comprendidos totalmente, preferentemente,
entre los nucleótidos 158-609,
607-660, o 29-537 de SEC ID nº 1. En
realidad, estos nucleótidos corresponden a EST, habiéndose dado a
conocer en GenBank, con los números de registro AA306797
(nucleótidos 29-537) y AA315885 (nucleótidos
158-609, 607-660). Estas
exposiciones EST son, sin embargo, incompletas, pues AA306797
comprende un "N" en posición 91 que no lo explica
suficientemente, pues representa la totalidad de los 4 nucleótidos
distintos (el nucleótido actual es un "C", tal como se ve en la
posición 119 de SEC ID nº 1). Además, AA306797 empieza antes de la
primera metionina tal como se identifica en la presente invención
(nucleótido 39 de SEC ID nº 1), lo que no sugiere el codón actual
de inicio de la proteína de la invención. EST AA315885 posee un
"C" complementario cuando se compara con la secuencia de la
invención en el nucleótido 453 de AA315885 (que corresponde al
nucleótido 610 de SEC ID nº 1).
Las exposiciones de AA306797 y de AA315885 se
han utilizado por Dronkert et al (2000, Mol. Cell. Biol., 20,
4553-61) para obtener (después de la traducción de
EST) parte de la proteína humana SNM1c que es parcialmente homóloga
al objetivo SNM1 murino de la exposición. Los problemas en los dos
EST que se mencionan anteriormente llevan a una proteína traducida
erróneamente.
Asimismo, hay que apuntar igualmente que Woo
et al (2001, Science, 291, 1284-9) mencionan
el gen EST como correspondiente a SNM1C, como localizado en el
cromosoma 10, pero no precisan la localización (10p), ni
proporcionan ninguna otra información que EST AA315885, que se
mostró errónea.
Los nucleótidos 1 a 35 y 37 a 189 de SEC ID nº
1, se han dado a conocer en EST expuesto en GenBank con el número
de registro AA278590, que es incompleto y erróneo, pues falta el
nucleótido "G" que se encuentra en la posición 36 de SEC ID nº
1.
Los nucleótidos 1848 a 2321 corresponden a
algunos nucleótidos que se encuentran en EST dados a conocer en
GenBank con el número de registro Al859962, que es incompleto. Este
EST da a conocer una parte errónea de la secuencia complementaria
de SEC ID nº 1, no correspondiendo los nucleótidos complementarios a
los nucleótidos presentes en el inicio de EST A1859962 a los
últimos nucleótidos de SEC ID nº 1.
Este EST contiene, en parte, EST AA278850, que
es asimismo incompleto y erróneo (desemparejamiento de un nucleótido
cuando se compara con el complemento de SEC ID nº 1.
Por tanto, estas exposiciones no son sólo
erróneas e incompletas, sino que asimismo no unen el ácido nucleico
de la invención tal como se ha definido anteriormente, a la
recombinación V(D)J y a la deficiencia SCID, como
hacen los inventores en la presente petición. Esto hubiera
confundido al experto en la materia, que no habría podido extraer
mucha información de estas exposiciones.
La presente invención se refiere asimismo a un
vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención,
especialmente la secuencia ácido nucleica que corresponde a los
nucleótidos 39-2114, 60-2114,
39-1193, o 60-1193 de SEC ID nº 1.
Se conocen numerosos vectores en la técnica, y que pueden ser, como
ejemplo, vectores de expresión, o vectores de amplificación.
La invención se refiere asimismo a una célula
huésped que comprende el vector según la invención.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento para producir una proteína implicada en la
recombinación
V(D)J, y/o en la reparación del ADN, que comprende las etapas de:
V(D)J, y/o en la reparación del ADN, que comprende las etapas de:
- a)
- expresar la molécula ácido nucleica según la invención en un huésped apropiado para sintetizar una proteína implicada en la recombinación V(D)J y/o en la reparación del ADN, y
- b)
- aislar la proteína implicada en la recombinación V(D)J y en la reparación del ADN.
La presente invención se refiere asimismo a una
molécula ácidonucleica aislada que es el complemento de la molécula
ácido nucleica aislada de la invención. Tal como se aprecia a
continuación, la proteína o péptido de la invención puede obtenerse
mediante ADN recombinante, técnicas químicas, u otras.
Tiene que entenderse que los términos
polipéptido y proteína significan una fila específica de aminoácidos
que pueden ser naturales o sintéticos. El experto en la materia es
consciente de las maneras existentes para cambiar los aminoácidos.
Las proteínas o polipéptidos preferidos son especialmente SEC ID nº
2, y los aminoácidos 1-385 o 8-385
de SEC ID nº 2.
Los vectores de expresión de la invención
contienen preferentemente un promotor, señales de inicio y
finalización de la traducción, así como regiones apropiadas para la
regulación de la transcripción. Requieren ser mantenidos en la
célula huésped. El experto en la materia es consciente de dichos
vectores y de las maneras para producir y purificar las proteínas,
utilizando especialmente marcadores (como el Marcador Histidina, o
el glutatión). Asimismo, es posible utilizar equipos de traducción
in vitro que están ampliamente disponibles, para producir la
proteína o péptido según la invención.
El ácido nucleico de la invención o su fragmento
puede insertarse en vectores apropiados de expresión o amplificación
utilizando técnicas estándares de unión, o la recombinación
homóloga. El vector se elige para permitir la amplificación del
ácido nucleico de la invención y/o la expresión del gen.
Los vectores pueden seleccionarse para que sean
funcionales en una amplia variedad de huéspedes, tales como
procariotas, levaduras, insectos (sistemas de baculovirus) y/o
células huésped eucariotas. La selección de la célula huésped puede
depender de las propiedades del polipéptido o de su fragmento que
vayan a expresarse, por ejemplo, si son necesarias modificaciones
postraduccionales (tales como glicosilación y/o fosforilación). Si
es así, son preferidas las células eucarióticas, tales como las
levaduras, insectos o células huéspedes de mamíferos.
El experto en la materia es consciente de los
distintos tipos de vectores que pueden utilizarse, y de las
diferentes técnicas utilizadas para hacerlos penetrar en las células
huésped (electroporación, lipofección...).
Revisiones de los distintos huéspedes que pueden
utilizarse, de las células huésped y de las secuencias reguladoras
del ADN en los vectores, dependiendo de las células huéspedes,
pueden encontrarse en la patente US nº 6.165.753, en particular en
las columnas 9, línea 34 en la columna 13, y en la línea 36. Esta
parte técnica del documento, que se refiere al gen de la ciclina E2
y al polipéptido, pero que puede generalizarse a cualquier otro
ADNc, o gen, se incorpora como referencia a la presente
memoria.
Otra revisión de los distintos vectores,
secuencias reguladoras, células huésped, y procedimientos de
expresión de los polipéptidos que pueden utilizarse, pueden
encontrarse en la patente WO 99/55730, página 6, línea 3 en la
página 25, línea 6, que se incorpora a la presente memoria como
referencia.
En resumen, los vectores de la invención
contienen por lo menos un gen marcador seleccionable que codifica
una proteína necesaria para la supervivencia y el desarrollo de la
célula huésped en un medio de cultivo selectivo. Genes marcadores
seleccionables típicos codifican proteínas que confieren resistencia
a antibióticos tales como ampicilina, tetraciclina, o kanamicina
para las células huésped procarióticas, deficiencias auxotróficas
del complemento de la célula (utilización de ura- levaduras, por
ejemplo). Marcadores seleccionables preferidos son el gen de
resistencia a la kanamicina, el gen de resistencia a la ampicilina,
y el gen de resistencia a la tetraciclina. El gen de resistencia a
la kanamicina se prefiere cuando los vectores activos se utilizan
tanto en las células procarióticas como eucarióticas (de mamífero),
pues la proteína da resistencia a la neomicina en las células de
mamíferos.
Los vectores de la invención contienen asimismo
un secuencia de unión ribosómica tal como una secuencia
Shine-Dalgarno, una secuencia Kozak o un sitio
interno de entrada ribosómica (Ires).
Una secuencia señal puede utilizarse asimismo
para dirigir al polipéptido fuera de la célula huésped, donde es
sintetizado. Muchas secuencias de señales son conocidas por los
expertos en la materia, y cualquiera de ellas que sea funcional
(homólogas o heterólogas), en la célula huésped seleccionada, puede
utilizarse conjuntamente con la secuencia nucleica según la
invención.
Los vectores de la invención derivan típicamente
de un vector de iniciación tal como un vector comercialmente
disponible. Dichos vectores pueden o no contener alguno de los
elementos que se incluirán en el vector completo, introduciéndose
dichos elementos mediante técnicas apropiadas de biología molecular.
De este modo, los elementos añadidos pueden introducirse
individualmente con el vector después de digestión enzimática y de
la unión del elemento. El procedimiento es bien conocido en la
técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al.,
supra.
Los vectores preferidos para los cuales es
posible iniciar la obtención de los vectores de la invención son
compatibles con células huésped bacterianas, de insectos y de
mamíferos, e incluyen, sin ser limitantes, pCRII, pCR3, y pcDNA3
(Invitrogen Company, San Diego, Calif), pBSII (Stratagene Company,
LaJolla, Calif), pET15b (Novagen, Madison, Wis), PGEX (Pharmacia
Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (Clontech, Palo
Alto, Calif), PETL (BlueBacII; Invitrogen) y
pFast-BacDual (GibcoBRL, Grand Island, N.Y.).
Después de la construcción del vector y de la
inserción del ácido nucleico de la invención, el vector completo
puede insertarse en una célula huésped apropiada para la
amplificación y/o la expresión polipeptídica.
Dichas células huéspedes pueden ser células
huéspedes procarióticas (tales como E. coli, Bacillus
subtilis) o células huéspedes eucarióticas (tales como una
célula de levadura, una célula de insecto, o una célula de
vertebrado). La célula huésped, cuando se cultiva bajo condiciones
apropiadas, puede sintetizar el polipéptido, que puede recuperarse
a continuación a partir del medio de cultivo (si la célula huésped
los secreta al medio), o directamente, a partir de la célula
huésped que lo produce (si no es secretado). Después de la
recuperación, el polipéptido puede purificarse utilizando
procedimientos tales como cromatografía de tamiz molecular,
cromatografía de afinidad, y similares.
La selección de la célula huésped para la
producción polipeptídica dependerá en parte de si el polipéptido va
a ser glicosilado o fosforilado (en cuyo caso se prefieren las
células huéspedes eucarióticas), y la forma en la que la célula
huésped es capaz de "plegar" la proteína a su estructura
terciaria nativa (por ejemplo, orientación apropiada de los puentes
de hidrógeno, etc.), de forma que la proteína biológicamente activa
sea preparada por la célula. Cuando la célula huésped no sintetiza
el polipéptido que posee la actividad biológica de la recombinación
V(D)J y/o de la reparación del ADN, el polipéptido
puede "plegarse" después de la purificación, después de
diversas diálisis.
Células apropiadas de mamíferos o progenies
celulares son bien conocidas en la técnica e incluyen células
ováricas del hámster chino (CHO), HeLa, HEK293,
Hep-2, células 3T3, progenies celulares
COS-1 y COS-7 de mono, y la
progenie celular CV-1, células N2A del neuroblastoma
del ratón, HeLa, células L-929 del ratón, progenies
3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH,
progenies celulares BHK o HaK del hámster.
Células huéspedes bacterianas útiles, apropiadas
para la presente invención incluyen diversas cepas de E.
coli, tales como HB101, DH5.\alpha.,DH10, o MC1061. Asimismo,
en este procedimiento pueden utilizarse varias cepas de B.
subtilis, Pseudomonas spp., otros Bacillus spp., Streptomyces
spp., y similares.
Muchas cepas de células de levaduras conocidas
para los expertos en la materia, están disponibles asimismo como
células huéspedes para la expresión de los polipéptidos de la
presente invención, y se preferirán cepas de Saccharomyces
cerevisiae, S. pombe, Kluyveromyces...
La penetración (a la que se hace asimismo
alusión como "transformación" o "transfección") del vector
en la célula huésped seleccionada, puede alcanzarse utilizando
procedimientos tales como cloruro cálcico, electroporación,
microinyección, lipofección o el procedimiento
DEAE-dextrano. El procedimiento seleccionado será en
parte función del tipo de célula huésped que vaya a utilizarse.
Estos procedimientos y otros procedimientos apropiados son bien
conocidos por el experto en la materia, y se dan a conocer, por
ejemplo, en Sambrook et al., supra.
El experto en la materia es consciente del medio
que se debe utilizar para el cultivo de las células huésped, que
incluye al agente selectivo (antibiótico) a añadir a dicho medio,
que depende del marcador que se encuentra en el vector que está
insertado en la célula.
La cantidad de polipéptido producida en la
célula huésped puede evaluarse utilizando procedimientos estándar
conocidos en la técnica, tales como, sin limitación, análisis de
transferencia Western, electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida, electroforesis en gel no
desnaturalizante, separación HPLC, inmunoprecipitación, y/o ensayos
de actividad tales como ensayos del cambio de la unión del gel al
ADN.
La purificación del polipéptido producida por
las células de la invención, cuando se encuentra en la solución
(secreción o excreción), puede llevarse acabo utilizando diversas
técnicas. Si contiene un marcador tal como Hexahistidina, puede
esencialmente ser purificado en un procedimiento de una etapa,
haciendo pasar la solución a través de una columna de afinidad en
la que la matriz de la columna posee una alta afinidad por el
marcador o por el polipéptido directamente (columna Nickel para
poly-histidina).
Cuando el polipéptido se prepara sin un marcador
unido, pueden utilizarse para la purificación otro procedimientos
bien conocidos. Dichos procedimientos incluyen, sin limitación,
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de tamiz
molecular, HPLC, electroforesis en gel nativo en combinación con
elución del gel, y enfoque isoeléctrico de preparación
("dispositivo" de espectrometría de gases/técnica, Hoefer
Scientific). En algunos casos, pueden combinarse dos o más de estas
técnicas para alcanzar un aumento en la pureza.
Se prevé que el polipéptido se encontrará
inicialmente en forma intracelular, pudiéndose extraer el material
intracelular (que incluye cuerpos de inclusión para bacterias gram
negativas) a partir de la célula huésped utilizando cualquier
técnica estándar por el experto en la materia. Por ejemplo, las
células huésped pueden lisarse para liberar el contenido del
periplasma/citoplasma mediante la prensa Francesa, homogeneización,
y/o tratamiento con ultrasonidos seguido por centrifugación.
Si el polipéptido ha formado cuerpos de
inclusión en el periplasma, el polipéptido se obtiene utilizando
procedimientos conocidos en la técnica, especialmente con la ayuda
de agentes caotrópicos tales como guanidina o urea para liberar,
fragmentar aparte, y solubilizar los cuerpos de inclusión. Una
diálisis ulterior ayudará a solubilizar el polipéptido.
Se pueden utilizar asimismo otros procedimientos
estándar bien conocidos por los expertos en la materia, tales como
la separación mediante electroforesis, seguida por electroelución,
varios tipos de cromatografía (inmunoafinidad, tamiz molecular, y/o
intercambio iónico) y/o cromatografía líquida de alta resolución. En
algunos casos, puede ser preferible utilizar más de estos
procedimientos para una purificación completa.
Además de preparar y purificar el polipéptido
utilizando técnicas del ADN recombinante, los polipéptidos,
fragmentos y/o sus derivados, pueden prepararse mediante
procedimientos de síntesis química (tales como síntesis de péptidos
en fase sólida), utilizando técnicas conocidas en la técnica tales
como las dadas a conocer por Merrifield et al (J. Am. Chem.
Soc., 85:2149 [1963]), Houghten et al (Proc. Natl Acad. Sci.
USA, 82:5132 [1985]), y Stewart y Young (Solid Phase Peptide
Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, III. [1984]). Dichos
polipéptidos pueden sintetizarse con o sin una metionina en el
extremo amino. Los polipéptidos o sus fragmentos sintetizados
químicamente pueden oxidarse utilizando procedimientos que se
exponen en estas referencias, para formar enlaces disulfuro. Se
espera que estos polipéptidos o fragmentos sintéticos presenten una
actividad biológica comparable con los polipéptidos producidos de
modo recombinante o purificados a partir de fuentes naturales,
principalmente la capacidad para promover la recombinación
V(D)J y/o la reparación del ADN y así, pueden
utilizarse de forma intercambiable con el polipéptido natural o
recombinante.
El polipéptido de la invención puede derivarse
químicamente, o asociarse con un polímero. Los polipéptidos
modificados según la invención, pueden tener propiedades
farmacológicas distintas que las de los polipéptidos que no han
sufrido modificaciones, tales como una semivida biológica aumentada
o disminuida después de administrárselos a un animal o al hombre,
diferentes farmacocinéticas...
Los polipéptidos según la invención, sus
fragmentos, variantes y/o derivados, pueden utilizarse para preparar
anticuerpos utilizando procedimientos estándar, por ejemplo,
después de la administración a un animal tal como un ratón, rata,
conejo o una cabra, utilizando un adyuvante apropiado (en
particular, el adyuvante incompleto o completo de Freund).
De este modo, los anticuerpos pueden reaccionar
con los polipéptidos de la invención, así como los fragmentos
reactivos de dichos anticuerpos, están comprendidos (forman parte)
del alcance de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser
policlonales, monoclonales, recombinantes, quiméricos, de cadena
única y/o biespecífica. En una forma de realización preferida, el
anticuerpo o su fragmento será de origen humano o "estará
humanizado", es decir, preparado de forma tal que prevenga o
minimice una reacción inmune con respecto al anticuerpo, cuando se
administre a un paciente.
El fragmento de anticuerpo puede ser cualquier
fragmento que sea reactivo con los polipéptidos de la presente
invención. La invención comprende asimismo los hibridomas generados
por la presentación del polipéptido según la invención, o un
fragmento suyo como un antígeno a un mamífero seleccionado, seguido
por las células de fusión (por ejemplo, células esplénicas) del
mamífero con ciertas células cancerosas, para crear progenies
celulares inmortales mediante técnicas conocidas, tales como la
técnica de Köhler y Milstein (1975, Nature 256, 495).
Los anticuerpos según la invención son, por
ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fragmentos
Fab o F(ab')_{2}. Pueden ser inmunoconjugados o
anticuerpos marcados.
Los inventores de la presente invención han
demostrado que el gen Artemis (denominado asimismo SNM1C) codifica
una nueva recombinación V(D)J y/o un factor de
reparación del ADN que pertenece a la superfamilia de la metalo
\beta-lactamasa y cuyas mutaciones dan lugar a la
situación humana RS-SCID.
Por tanto, la presente invención se refiere
asimismo a un procedimiento in vitro para la determinación
del tipo de SCID en un paciente, que consiste en analizar el ácido
nucleico y seleccionar el grupo formado por SEC ID nº 1,
nucleótidos 39-2114, 60-2114,
39-1193 y 64-1193 de SEC ID nº 1 en
dicho paciente, permitiendo la clasificación de dicho SCID como
SCID radiosensible, una mutación en dicho ácido nucleico.
Las mutaciones que se investigan comprenden
mutaciones puntuales que conducen a un cambio no conservador en un
aminoácido de la proteína, o a la producción de un codón prematuro
de finalización, deleciones, inserciones o modificaciones debidos a
cambios en el ADN genómico que corresponde a SEC ID nº 1, y a sitios
aceptores y donadores de corte y empalme que franquean los
exones.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento in vitro de diagnóstico en un paciente, que
incluye un diagnóstico prenatal de una situación que se selecciona
de entre el grupo constituido por un SCID, una predisposición al
cáncer, una deficiencia inmunológica, y el transporte de una
mutación que aumenta el riesgo de una progenie que tenga tal
enfermedad, que consiste en analizar el ácido nucleico seleccionado
de entre el grupo constituido por SEC ID nº 1, los nucleótidos
39-2114, 60-2114,
39-1193, y 60-1193 de SEC ID nº 1
y/o la proteína codificada por dicho ácido nucleico en dicho
paciente, una mutación en dicho ácido nucleico y /o una proteína que
indique un aumento en el riesgo de alcanzar dicha situación.
Asimismo, (la invención) comprende que el
procedimiento de diagnóstico según la invención, se lleve a cabo de
forma que se analice uno o los dos alelos del paciente, buscando
cualquier mutación (mutaciones puntuales, deleciones, inserciones,
mutaciones que conduzcan a un corte y empalme incompleto...), que
conduzcan a la producción de una proteína no funcional. Por tanto,
tiene que entenderse que el análisis del ácido nucleico
seleccionado de entre el grupo constituido por SEC ID nº 1, los
nucleótidos 39-2114, 60-2114,
39-1193, y 60-1193 de SEC ID nº 1,
se lleva a cabo directa o indirectamente en el ADN genómico.
Estos procedimientos de diagnóstico se realizan
preferentemente in vitro, sobre ADN o ARN que se han obtenido
a partir de células recogidas en el paciente.
Los procedimientos de diagnóstico según la
invención pueden ser llevados a cabo en el ADN genómico aislado del
paciente, por ejemplo, mediante amplificación de los exones, en
particular con los pares de cebadores SEC ID nº 5 a SEC ID nº 32,
que se localizan en los intrones del gen Artemis, y permiten la
amplificación de los exones y de las uniones
intrón-exón, que los inventores han mostrado que
están mutadas en algunos pacientes RS-SCID. Está
claro que cualquier cebador que amplifique los exones, o permita el
análisis de la unión exón-intrón puede utilizarse
en esta forma de realización de este procedimiento de diagnóstico
según la invención.
Una forma de llevar a cabo un procedimiento de
diagnóstico según la invención sería realizar un
PCR-SSCP, o secuenciar el producto de amplificación
para determinar las mutaciones en el gen Artemis.
La proteína ARTEMIS (o SNM1C) codificada por el
ácido nucleico de la invención está por tanto implicada en la
recombinación V(D)J y/o en la reparación del ADN. Las
mutaciones en el ácido nucleico que conducen a la expresión de una
proteína no funcional, cuando tienen lugar en ambos alelos en un
paciente, conducen a una situación SCID en dicho paciente. Así
mismo se prevé que las propiedades de la proteína ARTEMIS pueden
explotarse en otros campos, tales como en la terapia del cáncer,
como compuestos que interaccionan con la proteína en una célula
cancerosa, pueden ayudar a sensibilizar dicha célula a un agente
antitumoral, cuya acción es destruir el ADN (radiación, agente
químico).
La invención se refiere, por tanto, a un
procedimiento de identificación de un compuesto capaz de unirse al
ácido nucleico o a la proteína de la invención, que comprende las
etapas que consisten en:
- a)
- contactar dicho ácido nucleico o proteína con un compuesto candidato, y
- b)
- determinar la unión entre dicho compuesto candidato y dicho ácido nucleico o proteína.
Los procedimientos para evaluar la unión de un
compuesto a un ácido nucleico o a una proteína, son bien conocidos
en la técnica, y se llevan a cabo preferentemente in vitro.
Un procedimiento para alcanzar tal objetivo puede ser unir el ácido
nucleico o la proteína a un soporte sólido sobre el que el compuesto
que debe ensayarse se hace fluir, controlándose la recuperación del
compuesto después de hacerlo pasar sobre el soporte. Juntando
parámetros, es posible asimismo determinar la afinidad de unión. Los
compuestos pueden asimismo encontrarse mediante otros
procedimientos, que incluyen FRET, SPA... cuando los compuestos y el
ácido nucleico o la proteína son marcados. El ensayo puede
realizarse asimismo sobre células que contienen el ácido nucleico de
la invención, por ejemplo en un vector según la invención, y/o que
exprese la proteína según la invención. Esto da también información
de la capacidad del compuesto para atravesar la membrana y penetrar
en el interior celular. Estas células pueden ser células
bacterianas (investigación de compuestos antibióticos que se unen al
fragmento \beta-lactamasa de la proteína), o
células de mamíferos.
La invención se refiere por tanto, asimismo, a
un compuesto identificado mediante el procedimiento descrito
anteriormente, uniéndose dicho compuesto al ácido nucleico o a la
proteína de la invención.
Compuestos particularmente preferidos son
compuestos que se unen a la región
\beta-lactamasa de la proteína de la invención
(los primeros 180 aminoácidos de SEC ID nº 2) o el dominio
b-CASP asociado (aminoácidos 181-385
de SEC ID nº 2. Dichos compuestos pueden tener una fórmula química
próxima a la fórmula l o IV de WO 00/63213, incorporándose dicha
fórmula y la parte correspondiente de la solicitud a la presente
memoria, como referencia, WO 99/33850, WO 01/02411 o US nº
6.150.350, incorporándose la descripción de los compuestos, como
referencia, a la presente memoria.
Un compuesto identificado mediante un
procedimiento según la invención, puede ser un compuesto con una
estructura química (compuesto químico), un lípido, un hidrato de
carbono (azúcar), una proteína, un péptido, un compuesto híbrido
proteína-lípido, proteína-hidrato de
carbono, péptido-lípido,
péptido-hidrato de carbono, una proteína o un
péptido en el que se ramifican distintos residuos químicos.
Los compuestos químicos previstos (con una
estructura química), pueden contener uno o más (hasta 3 o 4)
anillos, especialmente anillos aromáticos, en particular que tengan
entre 3 y 8 átomo de carbono, y que posean todos los tipos de
grupos ramificados (en particular, alquilos inferiores, es decir,
que tengan entre 1 y 6 átomos de carbono, grupos cetónicos, grupos
alcohólicos, grupos halógenos....). El experto en la materia sabe
cómo preparar distintas variantes de un compuesto, que se inician a
partir de una estructura dada, injertando estos radicales sobre
dicha estructura.
El procedimiento de la invención permite
asimismo el rastreo, detección y/o identificación de compuestos
capaces de inhibir la actividad biológica de la proteína ARTEMIS.
Verdaderamente, es posible ensayar la unión de los compuestos a un
ácido nucleico o a la proteína identificada mediante el
procedimiento según la invención, en un ensayo tal como un ensayo
de complemento, en el que un vector que transporta SEC ID nº 1, o
los nucleótidos 39-2114 de SEC ID nº 1 y que
expresan una proteína funcional, se introduce en una célula que se
ha recuperado de un paciente que padece RS-SCID,
ensayándose el compuesto por su habilidad para inhibir la
restauración de la recombinación V(D)J y/o la
reparación del ADN en dichas células. Los ejemplos ilustran dicho
ensayo, que se lleva a cabo preferentemente in vitro.
La presente invención permite de este modo la
detección, la identificación y/o el rastreo de compuestos que
pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades en las que
están implicados la recombinación V(D)J y/o la
reparación del ADN. Sin embargo, los compuestos que se identifican
mediante es procedimiento según la invención, para utilizarse en un
tratamiento terapéutico, pueden requerir ser optimizados, para tener
una actividad superior y/o una toxicidad menor.
Verdaderamente, el desarrollo de nuevos
medicamentos se lleva a cabo a menudo basándose en lo siguiente:
- -
- rastreo de compuestos con la actividad que se busca, sobre un modelo pertinente, mediante un procedimiento apropiado,
- -
- selección de los compuestos que tienen las propiedades requeridas a partir del primer ensayo de rastreo (aquí, modulación de la recombinación V(D)J y/o de la reparación del ADN),
- -
- determinación de la estructura (en particular de la secuencia, (si es posible de la terciaria) si son péptidos, proteínas o ácidos nucleicos, de la fórmula y esqueleto si son compuestos químicos) de los compuestos seleccionados.
- -
- optimización de los compuestos seleccionados, mediante modificación de la estructura (por ejemplo, cambiando la conformación esteroquímica (por ejemplo, el paso de los aminoácidos en un péptido desde L a D), adición de sustituyentes al péptido o a las estructuras químicas, en particular insertando grupos o radicales en la estructura, modificación de los péptidos (véase en particular Gante, "Peptidomimetics", en Angewandte Chemie-International Edition Engl. 1994, 33.1699-1720),
- -
- paso y rastreo de los compuestos "optimizados" en modelos apropiados que estén próximos a la patología estudiada. En este estadio, se deberían utilizar a menudo modelos animales, en particular roedores (ratas o ratones) o perros o primates no humanos, que son buenos modelos de SCID o cánceres, y buscar los cambios fenotípicos en dichos modelos después de la administración del compuesto.
La presente invención comprende asimismo los
compuestos que se han optimizado después de seguir las etapas o las
etapas equivalentes tal como se ha descrito.
La presente invención se refiere también a un
ácido nucleico, vector, célula huésped, proteína, anticuerpo, y el
compuesto de la invención como un medicamento. Estas sustancias
pueden verdaderamente utilizarse solas para el tratamiento de
distintos tipos de enfermedades, en particular aquéllas en las que
la recombinación V(D)J y/o la reparación del ADN
estén implicadas, las cuales enfermedades incluyen, sin límite,
RS-SCID, deficiencia inmune, cáncer. Estas
sustancias pueden utilizarse asimismo en combinación con otro
tratamiento que sea apropiado para la enfermedad, siendo el uso
simultáneo, separado o secuencial.
En particular, los productos según la invención
pueden utilizarse en combinación con citoquinas, factores de
crecimiento, antibióticos, antiinflamatorios, y/o agentes
quimioterapéuticos, cuando sean apropiados para la indicación que
está siendo tratada.
La invención se refiere asimismo a una
composición farmacológica que comprende un excipiente
farmacéuticamente aceptable, transportador o diluyente con por lo
menos un ácido nucleico, vector, célula huésped, proteína,
anticuerpo, y el compuesto de la invención.
El experto en la materia conoce los excipientes
apropiados y los transportadores que pueden utilizarse, y uno puede
citar, como ejemplos, agua para inyección, complementada
preferentemente con otros materiales habituales en soluciones para
la administración a mamíferos, o soluciones salinas tamponadas
neutras con albúmina sérica. Algunos transportadores pueden
encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, edición 18ª, A.
R. Gennaro, editores, Mack Publishing Company (1990).
La composición farmacéutica de la invención
puede administrarse oral, nasal, mucosalmente, o inyectada, en
particular intravenosamente, intramuscularmente, o subcutáneamente.
El transportador y/o excipiente será seleccionado apropiadamente,
dependiendo de la forma de administración. La patente US nº
6.165.753 ya citada proporciona ejemplos de vías apropiadas de
administración y de excipientes (columna 17, línea 31 a columna 21
línea 55, incorporándose a la presente memoria la información
general como referencia).
La invención se refiere asimismo a la
utilización de por lo menos un ácido nucleico, vector, célula
huésped, proteína, anticuerpo, y el compuesto y la composición
farmacéutica de la invención para la preparación de un medicamento
dirigido al tratamiento de una enfermedad en la que están implicados
la recombinación V(D)J y/o la reparación del ADN,
seleccionándose en particular dicha enfermedad del grupo formado por
cáncer, SCID, especialmente RS-SCID, deficiencia
inmune, por ejemplo debida a problemas en el "encendido" de las
cadenas pesadas de las inmunoglobulinas, o debida a problemas en el
proceso de hipermutación somática de las inmuno-
globulinas.
globulinas.
La patente US nº 6.165.753 describe asimismo
procedimientos de terapia génica, y esta enseñanza se incorpora como
referencia.
En una forma de realización preferida, dicho
ácido nucleico se administra a dicho individuo de forma que se
penetre en las células troncales, que constituyen las células que
son las progenitoras de las células del sistema inmune. Este puede
realizarse in vivo, o ex vivo, después de recoger las
células del paciente, seleccionando las células troncales,
introduciendo el ácido nucleico en el interior de dichas células
seleccionadas, y volviendo a inyectar las células transformadas en
el paciente.
Para la penetración del ácido nucleico en el
interior celular, pueden utilizarse distintos medios por el experto
en la materia, en particular, es posible introducir dicho ácido
nucleico en el interior de las células mediante un vector
vírico.
Dicho virus puede de origen humano o no humano,
siempre que posea la capacidad de infectar las células de los
pacientes, seleccionándose en particular dicho virus del grupo
formado por adenovirus, retrovirus (oncovirus tales como RSV,
espumavirus, lentivirus), poxvirus, herpesvirus (HSV, EBV, CMV...),
iridiovirus, hepadnavirus (virus de la hepatitis B), papovirus
(SV40, papilomavirus), parvovirus (virus
adeno-asociados), reovirus (rotavirus), togavirus
(arbovirus, alfavirus, flavivirus, rubivirus, pestivirus),
coronavirus, paramixovirus, ortomixovirus, rabdovirus (virus de la
rabia), buniavirus, arenavirus, picornavirus (enterovirus, virus de
Coxsackie, ecovirus, rinovirus, aftovirus, cardiovirus, virus de la
hepatitis A), Virus modificado Ankara, y sus virus derivados.
Por "virus derivados", quiere significarse
que el virus posee modificaciones que lo adaptan al hombre (si es
un virus de un origen no humano, que pudiera no infectar las células
humanas sin dichas modificaciones) y/o que reducen su patogenicidad
potencial o actual. En particular, es mejor si el virus que se
utiliza para la transferencia génica es defectuoso respecto a la
replicación dentro del organismo humano. Esto constituye un
importante asunto de seguridad, pues el control de la expresión del
gen funcional puede repercutir en la ejecución del procedimiento de
la invención. No se debe desear una diseminación a otras células o a
otras personas del vector vírico que transporta el gen de interés
terapéutico.
Esta es la razón por la que el vector vírico
utilizado en el procedimiento de la invención es preferentemente
defectuoso para la replicación, y por tanto se deberá preparar con
la ayuda de un virus auxiliar o en una progenie celular
complementaria, que introducirá trans el material genético
necesario para la preparación de un suficiente título viral.
Dichos virus defectuosos y progenies celulares
apropiadas se describen en la técnica, por ejemplo en la patente US
6.133.028, que describe virus adeno-asociados
defectuosos (AAV) y las progenies celulares asociadas de
complemento, el contenido de los cuales se incorpora a la presente
memoria como referencia. Otros virus apropiados se describen por
ejemplo en WO 00/34497. Para los adenovirus o AAV, puede ser
interesante suprimir las regiones E1 y/o E4.
Para el virus MFG que se describe a
continuación, se puede utilizar la progenie celular "1"-CRIP de
complemento que se describió en Hacein-Bey
et al (1996, Blood, 87, 3108-16), que
se incorpora a la presente memoria como referencia. Asimismo, se
podrían utilizar otras progenies celulares apropiadas.
Para mejorar el efecto de larga duración de la
corrección, se preferirá un virus que permita la integración de
dicho gen funcional en un cromosoma de las células infectadas.
En particular, se seleccionarán adenovirus,
alguno de los cuales, defectuosos para la replicación, son bien
conocidos por el experto en la materia, o retrovirus, en particular,
retrovirus murinos derivados. Entre los retrovirus que pueden
utilizarse, se preferirá un vector basado en un virus
mieloproliferativo sarcomatoso (MPSV), tal como se describe en
Bunting et al (1998, Nature Medecine, 4,
58-64, cuyo contenido se incorpora en la presente
memoria como referencia). Otro retrovirus bien adaptado que puede
utilizarse para la implementación del procedimiento de la invención
es el vector MFG, derivado del virus MLV (retrovirus Moloney),
descrito en Hacein-Bey et al
(1996, Blood, 87, 3108-16), o
Cavazzana-Calvo et al (2000, Science, 288,
669-72), incorporándose el contenido de estos dos
documentos a la presente memoria, como referencia.
La selección del virus que va a utilizarse para
llevar a la práctica el procedimiento de la invención, será función
de las características de dicho virus y de la progenie celular de
complemento. Está claro que los distintos virus tienen distintas
propiedades (en particular LTR en los retrovirus), y que los virus y
las progenies celulares mencionadas anteriormente constituyen sólo
ejemplos de los medios que pueden utilizarse para llevar a la
práctica el procedimiento de la invención, y que no se considerarán
limitados. El experto en la materia sabe cómo elegir la mejor
progenie celular-virus-gen y/o virus
auxiliar, para cualquier situación dada.
En otra forma de realización, dicho ácido
nucleico se introduce en el interior de las células mediante un
vector sintético que puede seleccionarse a partir del grupo formado
por un anfifilo catiónico, un lípido catiónico, un polímero
catiónico o neutro, un compuesto prótico polar tal como
propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, etano,
1-metil-L-2-pirrolidona,
o sus derivados y un compuesto aprótico polar tal como
dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilacetamida, tetrametilurea,
acetonitrilo o sus derivados. El experto en la materia es consciente
de los vectores sintéticos que pueden utilizarse y que permitirán
un alto nivel de transfección, tal como los reactivos Lifofectina y
Lipofectamina que están disponibles en Life Technologies (Bethesda,
MD).
Se prevé que la expresión del gen funcional
Artemis en el interior de las células de los pacientes SCID
conseguirá una ventaja selectiva para dichas células o la progenie
de dichas células, cuando se compara con las células no
transformadas o progenie de dichas células no transformadas, y
conduce a una mejora en la situación del paciente.
Como ventaja selectiva, se entiende que la
proporción de células que se han corregido por la introducción del
gen funcional, comparada con las células del mismo tipo en las que
dicho gen no es funcional, aumentará, y que conducirá a un alivio
de la enfermedad, o incluso a la curación.
La posibilidad de obtener dicha ventaja
selectiva se ha demostrado para otro gen por
Cavazzana-Calvo et al (2000, Science, 285,
669-72).
La utilización de la invención se lleva a cabo
mejor cuando las células en las que se introduce el gen funcional
Artemis, son células troncales o células indiferenciadas que son
progenitoras de las células a las que le falta la expresión del gen
funcional Artemis. Esto conducirá al hecho de que un gran número de
células están corregidas en el tiempo, pues la progenie de dichas
células troncales también estará corregida. Además, como las
células troncales se diferenciarán a lo largo del tiempo a un gran
número de células sólo es necesario transfectar un pequeño número
inicial de células.
Es posible identificar algunas de las células
troncales para el sistema hematopoyético, pues albergan el marcador
CD34 en su superficie (células CD34+). El hacer diana en ellas puede
llevarse a cabo in vivo, o ex vivo (clasificación de
estas células, transfección y reinfusión mediante inyección
intravenosa). El experto en la materia sabe que las células
troncales pueden aislarse a partir de la sangre del cordón
umbilical.
Puede ser interesante inducir el ciclo celular
de dichas células troncales, para aumentar la eficiencia de la
transfección. Esto es particularmente cierto cuando el procedimiento
de la invención se lleva a cabo en células ex vivo.
Verdaderamente, alguno de los vectores que
pueden utilizarse para la penetración del gen de interés en las
células son los vectores que pueden incorporarse sólo en células no
quiescentes. Para que las células se repliquen, se pueden utilizar
preferentemente factores de crecimiento y/o citoquinas, tales como
CSF (GM-CSF, M-CSF,
G-CSF), interleuquinas (preferentemente
IL-1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 15), interferones,
(en particular \alpha o \gamma). Asimismo, se podrían utilizar
factores de células troncales, el factor de diferenciación
megacariocítico, acoplado opcionalmente con polietilenglicol, o
Flt-3-L. Estos factores se pueden
utilizar solos o en combinación.
Cuando la utilización de la invención se realiza
ex vivo, las células troncales pueden mantenerse asimismo en
un medio que se complementa con otros nutrientes tales como suero
(suero bovino fetal, habitualmente, o preferentemente suero de
células fetales). Asimismo, puede ser interesante conservar las
células que van a transfectarse en placas que contienen elementos
de adhesión celular tales como proteínas de adhesión celular (en
particular, fibronectina, o vitronectina), o los péptidos que se ha
mostrado que promueven la adhesión celular. Está claro que la
selección del medio de cultivo será influenciada por el tipo de
células y el objetivo después de la búsqueda.
En la utilización según la presente invención
para la terapia del cáncer en un paciente, el ácido nucleico, el
vector, la célula huésped, la proteína, el anticuerpo, el compuesto
y la composición farmacéutica de la invención, son administrados,
preferentemente además con un agente genotóxico, siendo la
utilización simultánea, separada o
secuencial.
secuencial.
La invención se refiere asimismo a un mamífero
transgénico no humano que tiene integrado en su genoma el ácido
nucleico de la invención, especialmente una secuencia ácido nucleica
seleccionada de entre el grupo constituido por los nucleótidos
39-2114, 60-2114,
39-1193, y 60-1193 de SEC ID nº 1,
unidos operativamente a elementos reguladores, en el que la
expresión de dicha secuencia codificante aumente el nivel de la
proteína ARTEMIS y/o el nivel de la recombinación
V(D)J y/o de la reparación del ADN de dicha mamífero,
respecto a un mamífero no transgénico de la misma especie.
Se prefiere cuando la secuencia ácido nucleica
que está integrada en el genoma del animal transgénico no humano,
codifica un polipéptido escogido en el grupo de polipéptidos que
comprenden los aminoácidos 1-692,
1-385 u 8-385 de SEC ID nº 2.
Es asimismo preferido cuando la secuencia ácido
nucleica que está integrada en el genoma del animal no humano
transgénico codifica un polipéptido seleccionado de entre el grupo
de polipéptidos constituido por los aminoácidos
1-692, 1-385 o 8-385
de SEC ID nº 2.
Asimismo, se prevé que los elementos reguladores
(promotores, potenciadores, intrones, similares a los que pueden
utilizarse en la expresión de los vectores de expresión de los
mamíferos), pueden ser específicos de tejidos, lo que permite la
sobre expresión de la proteína ARTEMIS sólo en un tipo específico de
células. En particular, el experto en la materia es consciente de
los distintos promotores que pueden ser utilizados con esta
finalidad.
La inserción del constructo en el genoma del
animal transgénico no humano de la invención, puede llevarse a cabo
mediante procedimientos bien conocidos por el experto en la materia,
puede realizarse al azar o ser dirigida. En pocas palabras, el
experto en la materia construirá un vector que contenga la secuencia
para insertar en el interior del genoma, y un marcador de selección
(por ejemplo, el gen que codifica la proteína que proporciona
resistencia a la neomicina), y que pueda penetrar en las células del
Tronco Embrional (ES). Las células se seleccionan entonces con el
marcador de selección, y se incorporan en un embrión, por ejemplo,
mediante microinyección en un blastocisto, que puede recuperarse
mediante perfusión del útero de las hembras preñadas. La
reimplantación del embrión y la selección de los animales
transformados, seguido por el potencial retrocruzamiento, permite
obtener dicho animal transgénico no humano. Para obtener un animal
"más limpio", el gen marcador de selección puede extraerse
utilizando una recombinasa puntual, si está franqueado por las
secuencias correctas.
La invención se refiere asimismo a un mamífero
no humano transgénico cuyo genoma comprende una interrupción del
gen ARTEMIS endógeno representado por SEC ID nº 1, en el que dicha
interrupción comprende la inserción de una secuencia del marcador
seleccionable, y en el que dicha interrupción da lugar en dicho
mamífero no humano a la exhibición de un defecto en la
recombinación V(D)J y/o en la reparación del ADN,
cuando se compara con un mamífero no humano de tipo salvaje.
En una forma de realización preferida, dicha
interrupción es una interrupción homocigótica.
En una forma de realización preferida, dicha
interrupción homocigótica no da lugar a una mutación del gen
endógeno que codifica ARTEMIS.
En una forma de realización preferida, dicho
mamífero es un roedor, en la forma de realización más preferida,
dicho roedor es un ratón.
La invención comprende asimismo un ácido
nucleico aislado que comprende un constructo con desactivación
génica ARTFMS que comprende una secuencia del marcador
seleccionable franqueada por secuencias del ADN homólogas al gen
ARTEMIS endógeno, cuyo ADNc está representado por SEC ID nº 1, en el
que cuando dicho constructo se introduce en un mamífero no humano o
en un antecesor de dicho mamífero no humano en un estadio embrional,
dicha secuencia del marcador seleccionable interrumpe el gen
endógeno ARTEMIS en el genoma de dicho mamífero no humano, de tal
forma que dicho mamífero no humano exhibe un defecto en la
recombinación V(D)J y/o en la reparación del ADN,
cuando se compara con un mamífero no humano de tipo salvaje.
Dicho constructo se utiliza para obtener los
animales que tienen la copia interrumpida del gen Artemis, y se
llevan generalmente a cabo en un vector que constituye asimismo un
objetivo de la invención.
La invención se refiere asimismo a una célula
huésped de mamífero cuyo genoma comprende una interrupción del gen
Artemis endógeno, en la que dicha interrupción comprende la
inserción de un marcador seleccionable. Preferentemente, dicha
interrupción es homocigótica y conduce a la falta de expresión de
una proteína ARTEMIS funcional (o a la expresión de una proteína
que no es funcional).
Debe hacerse hincapié en que la interrupción
puede conseguirse mediante procedimientos conocidos en la técnica y
puede ser condicional, es decir, que sólo esté presente en tipos
específicos de células, o sea inducida en algunos momentos del
desarrollo. El procedimiento para alcanzar dicho objetivo puede ser
utilizar recombinasas puntuales tales como Cre (que reconocen
sitios lox) o recombinasas FLP (que reconocen sitios FRT), bajo el
control de promotores celulares específicos. Estas recombinasas,
(especialmente Cre) se han mostrado ser apropiadas para
modificaciones y su actividad puede inducirse mediante inyección de
un sustrato (tal como una hormona).Estas modificaciones se conocen
en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Shibata, et
al. (1997, Science 278,
120-3).
120-3).
Por tanto, el animal transgénico no humano o la
célula de la invención puede no mostrar ya más el marcador
seleccionable, que puede haber sido eliminado después de la acción
de las recombinasas, que conducen a la interrupción del gen. Sin
embargo, en el proceso para conseguir dicha interrupción, se ha
insertado un marcador seleccionable en el interior del gen Artemis,
para permitir principalmente la selección de las células
transformadas.
La patente US nº 6.087.555 describe una forma
para obtener un ratón con desactivación génica, y la enseñanza
general de esta patente se incorpora en la presente memoria como
referencia (columna 5, línea 54 a columna 10, línea 13). En esta
patente, se describe un ratón con desactivación génica OPG, pero
idéntico procedimiento se aplica a un ratón con desactivación
génica ARTEMIS. El experto en la materia encontrará asimismo
información en Hogan et al. (Manipulating the Mouse embryo:
a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY; 1986).
En otra forma de realización, la invención se
refiere a un mamífero transgénico no humano cuyo genoma comprende
una primera interrupción que es del gen endógeno ARTEMIS, y una
segunda interrupción que es del gen endógeno p53. En la forma de
realización preferida, por lo menos dicha primera interrupción o
dicha segunda interrupción es una interrupción homocigótica. En la
forma de realización más preferida, dicha primera interrupción y
dicha segunda interrupción son ambas interrupciones homocigóticas,
las cuales dan lugar en particular a una inactivación nula de ambos
genes, ARTEMIS y p53.
En la forma de realización preferida, el
mamífero transgénico es un roedor, preferentemente una rata o un
ratón.
Este mamífero transgénico no humano puede
utilizarse como un modelo para estudiar los linfomas de células
pro-B. Verdaderamente, la invención se refiere a un
procedimiento para proporcionar un modelo para estudiar los
linfomas de células pro-B, que comprende
proporcionar dicho mamífero transgénico a una persona que necesite
dicho modelo par estudiar los linfomas de células
pro-B, y a un procedimiento para estudiar los
linfomas de células pro-B, que comprende estudiar
dicho mamífero transgénico.
Los animales no humanos y las células con
desactivación génica de la invención pueden utilizarse asimismo
para la identificación de compuestos farmacológicamente
interesantes. Por tanto, la invención se refiere asimismo a un
procedimiento para rastrear compuestos que modulan la recombinación
V(D)J y/o la reparación del ADN, que comprende poner
en contacto un compuesto con el mamífero no humano o con la célula
huésped con desactivación génica de la invención, y determinar el
aumento o la disminución de la recombinación V(D)J y/o
de la reparación del ADN en dicho mamífero no humano o en dicha
célula huésped, cuando se compara con la recombinación
V(D)J y/o la reparación del ADN de dicho mamífero no
humano o de dicha célula huésped antes de la administración del
compuesto.
Un procedimiento para ensayar la genotoxicidad
de compuestos, que comprende poner en contacto un compuesto con el
mamífero no humano o con una célula huésped de la invención, y
determinar el aumento o disminución de la recombinación
V(D)J y/o de la reparación del ADN en dicho mamífero
no humano o en dicha célula huésped, cuando se compara con la
recombinación V(D)J y/o la reparación del ADN de dicho
mamífero no humano o de dicha célula huésped antes de la
administración del compuesto, constituye asimismo un objetivo de la
invención.
Aunque puede inferirse del fenotipo de los
pacientes RS-SCID que Artemis constituye parte de la
maquinaria ubicua implicada en la reparación dsb del ADN que es
compartida por el proceso de recombinación V(D)J, la
función exacta para este nuevo factor permanece indefinida.
La investigación repetida para un homólogo
global de Artemis en otras especies en las bases de datos proteicas,
no llegó a proporcionar un candidato decisivo. La única similitud
proviene del péptido 0083, que incluye la fracción completa del
extremo N del Artemis, a los elementos varios de la familia
SNM1.
Sin embargo, Artemis no constituye claramente el
ortólogo humano del SNM1 murino o del PSO2 de la levadura, por, por
lo memos, dos razones:
- -
- En primer lugar, a pesar de sus regiones similares al SNM1,las tres proteínas difieren en sus dominios asociados. En particular, los 331 aminoácidos que comprende la región C-terminal de Artemis, no se encuentran en SNM1/PSO2, y no muestran ninguna similitud obvia con ninguna proteína conocida.
- -
- En segundo lugar, mientras que los mutantes SNM1/PSO2 de la levadura y murino demuestran un defecto importante en la reparación de los daños en el ADN causados por loa agentes de entrecruzamiento entre las cadenas del ADN (Henriques y Moustacchi, 1980; Dronkert et al., 2000), no muestran una sensibilidad elevada a las radiaciones ionizantes, indicando que estas dos proteínas no están probablemente implicadas de modo directo en la reparación de dsb ADN.
Éste constituye un señalado contraste con el
fenotipo de los pacientes RS-SCID, cuyo defecto
molecular primario es verdaderamente la ausencia de la reparación
dsb ADN, ilustrada por la falta de formación de la unión codificante
durante la recombinación V(D)J y el aumento en la
sensibilidad de las células fibroblásticas y de la médula ósea a
los rayos \gamma (Cavazzana-Calvo et al.,
1993; Nicolas et al., 1998).
De forma interesante, Artemis, la SNM1 murina y
la PSO2 de la levadura comparten un dominio adoptando un plegamiento
de la métalo-\beta-lactamasa
(Aravind, 1997) y probablemente su actividad enzimática asociada,
dada la presencia de casi todos los residuos catalíticos críticos
(o residuos conservados que podrían sustituirlos para la función).
Sin embargo, no existe un consenso obvio con respecto a la
naturaleza de los diversos sustratos
métalo-\beta-lactamasa, fuera de
una composición general cargada negativamente. El análisis
secuencial reveló la existencia de una región conservada que
acompaña al dominio de la métalo- \beta-lactamasa
en elementos de la subfamilia Artemis/SNM1/PSO2 (datos que no se
muestran), incluyendo otras diversas secuencias relacionadas con el
metabolismo del ácido nucleico tal como dos subunidades de
fragmentación y del factor de especificidad de la poliadenilación
(CPSF).
Se propone nombrar el dominio, que se describirá
en detallen otro lugar, como \betaCASP, por dominio CPSF
Artemis SNM1/PSO2 asociado a la
métalo-\beta-lactamasa. Este
dominio, aunque altamente divergente y tolerando inserciones
múltiples (por ejemplo, en el interior de la levadura PSO2) alberga
varios residuos conservados, tales como el H319 en Artemis, que
podría jugar un papel en esta reacción catalizada por elementos de
esta subfamilia.
Es tentador especular que este dominio podría
contribuir a la unión del sustrato, de forma similar que el dominio
\alpha-helicoidal de la glioxalasa, otro elemento
de la familia de la \beta-lactamasa (Cameron et
al., 1999).
El ADN dsb puede repararse mediante
recombinación homóloga (HR) o mediante la vía de unión del extremo
no homólogo (NHEJ) (revisión en Haber, 2000). Mientras que HR es la
vía predominante de reparación en las levaduras, NHEJ se utiliza
predominantemente en los eucariotas superiores y representa la vía
de reparación del ADN que se sigue durante la recombinación
V(D)J.
Por lo menos tres complejos proteicos se cree
actúan conjuntamente o secuencialmente en el sitio del dsb derivado
de RAG1/2. El complejo Ku70-80 se recluta
probablemente primero en el sitio de la lesión, seguido por la
adición de la subunidad ADN-PKcs. Este complejo
inicial se considera como el sensor primario de la alteración del
ADN, que activará la maquinaria de reparación del ADN. La
XRCC4/ADN-Ligasa IV representa la mejor candidata
para reparar actualmente el hueco. Más recientemente, el complejo
RAD50/MRE11/NBS1 que se supo participaba en NHEJ (Carney et
al., 1998; Varon et al., 1998), se encontró en el sitio
de los genes TCR de reajuste, arguyendo su posible implicación en
la fase de reparación del ADN de la recombinación
V(D)J (Chen et al, 2000).
Resultaría deseable por supuesto cómo Artemis
juega su papel en esta cascada. En este punto, sólo se pueden
proporcionar respuestas especulativas basadas en la analogía de
fenotipos entre los diversos modelos defectuosos, que incluyen
RS-SCID. Es muy improbable que Artemis esté unido al
complejo RAD50/MREl/NBS1. Verdaderamente, tanto en los pacientes
con trastornos tipo Nijmegen como en los que padecen
ataxia-telangectasia, (ATDL), las mutaciones en los
genes NBS1 y MRE11 conducen a inestabilidad cromosómica acompañada
por un profundo defecto en la detención de la G1 del ciclo celular
inducida por la alteración en el ADN (control GO/G1), mientras que
se repone la recombinación (Carney et al., 1998; Varon et
al., 1998). Este constituye un señalado contraste con la
detención normal de G1 en los fibroblastos de
RS-SCID después de irradiación (resultados no
publicados).
Respecto al complejo
XRCC4/ADN-ligasa IV, existen dos diferencias
importantes entre la situación RS-SCID y los
ratones XRCC4 y ADN-ligasa IV KO:
- -
- En primer lugar, un alelo nulo completo de Artemis (tal como en P6, P15 y P40), no conduce a una letalidad del embrión en el hombre. Esta observación no apoya una implicación de Artemis en esta fase de NHEJ.
- -
- En segundo lugar, la reunión de los constructos linearizados del ADN introducidos en los fibroblastos RS-SCID es normal (resultados no publicados), mientras que este ensayo, cuando es defectuoso, constituye un diagnóstico significativo de NHEJ anormal en las levaduras (Teo y Jackson, 1997; Wilson et al., 1997).
Quizás la relación más evidente entre Artemis y
NHEJ se encuentra con respecto al complejo
Ku/ADN-PK. Verdaderamente, los pacientes
RS-SCID humanos y los ratones scid, que albergan una
mutación en el gen codificante ADN-PKcs, son las
dos únicas situaciones conocidas en las que una recombinación
V(D)J asociada con un defecto en la reparación del
ADN, afecta únicamente a la formación de las uniones
codificantes.
La formación de la señal de unión está asimismo
afectada en el contexto de una recombinación V(D)J
defectuosa en todas las otras posiciones.
Además, las manifestaciones del defecto de
reparación del ADN parecen más o menos restringidas al sistema
inmune, tanto en los pacientes RS-SCID humanos como
en los ratones scid y no parecen conducir a trastornos neurológicos
o al desarrollo, por ejemplo, de cáncer, dos manifestaciones que se
asocian a menudo con defectos en los otros actores de NHEJ (Roth y
Gellert, 2000).
En conclusión, la invención describe la
identificación y la clonación del gen que codifica Artemis, un nuevo
factor de la recombinación V(D)J. Las mutaciones de
Artemis causan defectos T-B-SCID en
el hombre, que se deben a una ausencia de la reparación de la
interrupción del ADN bicatenario mediada por RAG1/2. Artemis
pertenece a una gran familia de moléculas que adoptaron el
plegamiento de la
métalo-\beta-lactamasa como parte
de su sitio catalítico putativo. Una rama de la familia, que
incluye asimismo la SNM1 de las levaduras y la PSO2 murina, tiene
añadido otro dominio que se denomina \betaCASP, que puede dirigir
la actividad del subgrupo de proteínas hacia ácidos nucleicos y, de
este modo, cumple el objetivo de la reparación del ADN.
Finalmente, otros dominios, todavía por definir,
son probablemente responsables de dirigir las distintas proteínas
Artemis/SNM1/PSO2 a sus vías específicas de reparación del ADN; la
reparación dsb para Artemis, o la reparación ADN-ICL
para SNM1/PSO2.
Los ejemplos siguientes se proporcionan
únicamente a título ilustrativo y no limitativo del alcance de la
invención.
13 pacientes RS-SCID de 11
familias se analizaron en este estudio, habiéndose seleccionado por
su fenotipo típico de SCID autosómico recesivo con una ausencia
completa de linfocitos T y B periféricos, pero con la presencia de
células asesinas naturales (Fisher et al., 1997). Todos los
pacientes mostraban un ensayo alterado de la recombinación
V(D)J en los fibroblastos, y para todas las familias
RS-SCID excepto P16, P40 y P47, pudo determinarse
el status de sensibilidad al radio en las células de la médula ósea,
y/o en los fibroblastos (Cavazzana-Calvo et
al., 1993; Nicolas et al., 1998; Moshous et al.,
2000) y nuestros resultados publicados). El genotipado de las
familias consanguíneas utilizando marcadores microsatélites
polimórficos como se informó en otro lugar (Moshous et al,
2000), coincidió en cada caso con nuestra localización anteriormente
descrita de RS-SCID en el cromosoma 10p. El estudió
se basó en 4 pacientes de origen Francés (P1, P3, P6 y P15), uno de
los cuales (P15) nació de padres relacionados, uno era de origen
Italiano (P16), otro griego (P4) y uno africano (P2). Los pacientes
restantes eran originarios de cuatro familias consanguíneas turcas,
dos de ellas estando relacionadas (P38, P5, P11 y P12
respectivamente). Se obtuvo la autorización de las familias antes
de este estudio. Las progenies celulares fibroblásticas primarias se
derivaron de biopsias dérmicas y se pseudoinmortalizaron con SV40
tal como se describe en otro lugar (Nicolas et al., 1988) y
se cultivaron en medio RPMI 1840 (GIBCO BRL) complementado con fetal
de ternera al 15%.
La primera cadena de ADNc se sintetizó a partir
del ARN fibroblástico. La secuencia codificante completa de Artemis
se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
sobre ADNc utilizando el Kit de PCR
"Advantage-GC" de ADNc (Clontech) según las
recomendaciones del fabricante y se diseñaron los cebadores 0083F1
(5'-GATCGGCGGCGCTATGAGTT-3', SEC ID
nº 3), y 169F
(5'-TGTCATCTCTGTGCAGGTTT-3', SEC ID
nº 4), a partir de las secuencias AA278590 y Al859962 EST. Los
productos PCR se secuenciaron directamente en un secuenciador
ABl377 (Perkin-Ehner) utilizando una Reacción
Preparada de Secuenciación de Finalización del Ciclo (Applied
Biosystems) con una serie de oligonucleótidos internos. A causa de
diversos transcritos de corte y empale alternativo, la
secuenciación se puede llevar a cabo también sobre productos PCR
clonados. El ADNc completo del Artemis se subclonó en
plRES-EGFP (Clontech) para utilizarlo ulteriormente
en experimentos de transfección. La estructura genómica del gen
Artemis se dedujo mediante el alineamiento de la secuencia del ADNc
respecto a la secuencia preparada de Bac 2K17 (AL360083). Se
diseñaron series de pares de cebadores oligonucleótidos para la
amplificación específica de cada exón. Los productos PCR del exón 4
y el exón 5 se clonaron en pGemT (Promega) para ulterior
utilización en el análisis de transferencia Southern (véase a
continuación).
Los cebadores que se utilizaron para la
amplificación genómica de los distintos exones 1 a 14, corresponden
a SEC ID nº 5 a SEC ID nº 32. Estos pares de cebadores permiten la
amplificación de cada exón, tal como se indica en el listado de
secuencias, situándose el número del exón después de "Ex",
significando "F" Delante y "R", inverso.
Como parte de su esfuerzo para secuenciar el
cromosoma humano 10, el "Grupo para establecer el mapa del
Cromosoma 10", en el Centro Sanger, construyó varios contenidos
de cromosomas bacterianos artificiales (BAC) que comprendían el
cromosoma 10 completo (http://www.sanger.ac.uk/HGP/Chr10). Dos de
estos contenidos, 10ctg1105 y 10ctg23 (Fig 1A), eran de particular
interés, pues incluían varios BAC que transportaban los marcadores
D10S1664 y D10S674, que franqueaban la región
RS-SCID, así como D10S191 y D10S1653, que mostraron
los máximos resultados LOD en el emparejamiento de bases en
poblaciones A-SCID (Li et al., 1998).
Se inició un seguimiento sistemático de las
secuencias nucleótidas, que comprendían los 24 BAC que se
encontraban en los dos contenidos, llevado a cabo por el "Grupo
para establecer el mapa del Cromosoma 10", en el Centro Sanger,
(http://webace.sanger.ac.uk/egi-bin/ace/simple/IOace).
Los análisis se basaron en anotar la secuencia nucleótida in
silico con los programas GENESCAN (Burge y Karlin, 1997)
(http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/genscan.
html) y FGENESH (Salamov y Solovyev, 2000) (http://genomic.sanger.ac.uk/gf/gfb.html), los cuales estaban dirigidos a buscar genes que codificaran péptidos putativos en voluminosas secuencias genómicas de ADN. Todos los péptidos predichos se procesaron a continuación respecto a las bases de datos redundantes GENBANK/EMBL de nucleótidos, utilizando TBLASTN. En la liberación de la secuencia preparada AL360083, originada a partir de 2K17BAC, FGENESH predijo un péptido con una longitud de 149 aminoácidos (aa) (denominado subsiguientemente péptido "0083" en el interior del cual los 121 aminoácidos produjeron un 35% y un 31% fue idéntico a las proteínas MuSNM1 (AAF64472) y PSO2 (P30620) de las levaduras, respectivamente. La misma predicción péptida se obtuvo utilizando GENESCAN.
html) y FGENESH (Salamov y Solovyev, 2000) (http://genomic.sanger.ac.uk/gf/gfb.html), los cuales estaban dirigidos a buscar genes que codificaran péptidos putativos en voluminosas secuencias genómicas de ADN. Todos los péptidos predichos se procesaron a continuación respecto a las bases de datos redundantes GENBANK/EMBL de nucleótidos, utilizando TBLASTN. En la liberación de la secuencia preparada AL360083, originada a partir de 2K17BAC, FGENESH predijo un péptido con una longitud de 149 aminoácidos (aa) (denominado subsiguientemente péptido "0083" en el interior del cual los 121 aminoácidos produjeron un 35% y un 31% fue idéntico a las proteínas MuSNM1 (AAF64472) y PSO2 (P30620) de las levaduras, respectivamente. La misma predicción péptida se obtuvo utilizando GENESCAN.
SNM1 y PSO2 son dos proteínas implicadas en la
reparación de los daños al ADN causados por los agentes de
entrecruzamiento intercatenario del ADN (ICL) que incluyen el
cisplatino, la mitomicina C, o la ciclofosfamida (Henriques y
Moustacchi, 1980; Dronkert et al., 2000) y las referencias en
los mismos se encuentran). Los mutantes de la levadura y de los
ratones para SNM1/PSO2 son hipersensibles a varios agentes que
causan ICL, pero no a los rayos \gamma, contrariamente a los
pacientes RS-SCID en los que la hipersensibilidad a
los rayos \gammase encontró tanto en las células de la médula
ósea como en los fibroblastos. El gen putativo que codifica el
péptido "0083" representó un buen candidato, debido a la
localización cromosómica y a la similitud del péptido "0083"
con las proteínas de reparación del ADN, a pesar de la importante
discrepancia en el fenotipo de radiosensibilidad. La validez del
péptido putativo "0083" se estableció buscando transcritos del
ARN que codificaran este péptido en la base de datos TIGR de los
Indices Génicos Humanos, utilizando TBLASTN
(http://www.tigr.org/docs/tigrscripts/nhgli_scripts/tgi_blast.
pl?organism=Human).
Esta duda devolvió el índice THC535641 en cuyo
interior AA278590 representaba la máxima secuencia del extremo 5' y
correspondía al clon I.M.A.G.E. 703546. La secuencia nucleótida de
este extremo opuesto del clon (AA278850) se emparejó con el índice
THC483503. La secuencia nucleótida Al859962 en este segundo índice
proporcionó la máxima extensión del extremo 3' del ADNc que
codifica el péptido "0083". Se obtuvo un ADNc completo mediante
amplificación RT-PCR del ARN fibroblástico,
utilizando los cebadores 0083F1 y 169F seleccionados en el interior
de las secuencias nucleótidas AA278590 y Al859962 respectivamente.
Este ADNc se secuenció directamente y se clonó en pGemT. Varios
clones representaron transcritos no productivos generados por
eventos de corte y empalme alternativos. (datos que no se
muestran). Los inventores se concentraron en un conjunto de clones
que albergaban el marco abierto de lectura más largo. La secuencia
completa del ADNc de 2354 pares de bases (SEC ID nº 1) contiene un
marco abierto de lectura (ORF) de 2079 pares de bases. Se asume que
el ATG en posición 39 o el ATG en posición 60 representan el sitio
de iniciación traduccional, basado en el análisis de los nucleótidos
circundantes que casan con (la secuencia de) consenso Kozack, para
el inicio de la traducción. La proteína codificada de 692 o 685
aminoácidos, que se denominó Artemis (y corresponde a SNM1C), posee
un peso molecular predicho de alrededor de 78 kD. El péptido
"0083" (que corresponde al péptido codificado por los
nucleótidos 348 a 800 de SEC ID nº 1), corresponde a
l106-H254 (inicio en el nucleótido 39) y es parte de
una región más voluminosa que muestra similitud con scPSO2 y
muSNM1.
No es posible determinar completamente que este
ADNc representa la secuencia completa, aunque han fallado los
repetidos intentos por ampliar la secuencia 5'. La cola polyA en la
región no traducida del extremo 3' de la secuencia SEC ID nº 1,
está codificada por la secuencia genómica y no es la consecuencia
del procesamiento del ARN, sugiriendo que este ADNc puede ampliarse
posteriormente por debajo. Los estudios de complementación
funcional (véase a continuación) sugieren intensamente, sin embargo,
que el ORF completo de Artemis ha sido verdaderamente clonado. La
estructura del gen Artemis (Tabla 1) se dedujo mediante comparación
de la secuencia del ADNc con respecto a la secuencia genómica
(AL360083). Artemis está compuesto de 14 exones con tamaños
comprendidos entre 52 pares de bases y 1160 pares de bases. En
varios clones ADNc de Artemis se identificaron cuatro exones
alternativos, que dieron lugar a cortes y empalmes no
productivos.
El RS-SCID se había asignado
previamente a una región cromosómica de 6,5 cM franqueada por los
marcadores polimórficos D10S1664 y D10S674, una región demasiado
grande para los clásicos estudios de selección del ADNc (Li et
al., 1998; Moshous et al., 2000). El apunte in
silico de las secuencias genómicas preparadas que comprenden
esta región, condujo a los inventores a la identificación del gen
Artemis.
Diez \mug de ADN de alto peso molecular se
sometieron a digestión con HindIII o Eco881, se procesaron en un
gel de agarosa al 0,7%, se transfirieron sobre una membrana de nylon
(Genescreen) bajo vacío y se hibridizaron con sondas específicas
para los exones 5 y 4 de Artemis, marcadas con P32.
Se obtuvo de Clontech ADNc preparado mediante
PCR procedente de diversos tejidos, y se amplificó con los cebadores
específicos de Artemis 0083F4
(5'-AGCCAAAGTATAAACCACTG-3', SEC ID
nº 33 y 169F (SEC ID nº 4), o con los cebadores GAPDH
proporcionados por los fabricantes, como control, y se procesaron en
geles de agarosa al 1%. Los productos PCR específicos de Artemis se
transfirieron sobre una membrana de nilón y se hibridizaron con un
oligonucleótido interno marcado con P^{32,} mientras el control
GAPDH PCR se reveló mediante tinción con bromuro de etidio.
El aumento de la radiosensibilidad de
RS-SCID a los rayos \gamma no se restringe a las
células del sistema inmune, sino que constituye asimismo una
característica de los fibroblastos, sugiriendo que Artemis se
expresa ubicuamente. Esto fue confirmado por el análisis PCR en un
cuadro de 15 ADNc que representaban un amplio abanico de tejidos
hematopoyéticos y no hematopoyéticos.
El nivel de la expresión de Artemis es ubicuo
pero débil y necesitó 30 ciclos PCR (38 ciclos para el músculo
esquelético), para obtener una señal apropiada con un
oligonucleótido interno marcado con P32, comparado con la tinción
intensa con el bromuro de etidio obtenida para el gen de control
GAPDH.
La expresión de bajo nivel de Artemis podría
reflejar una propiedad general de la familia de la proteína SNM1,
pues la expresión basal de mSNMl en las células ES se encontró
asimismo que era muy baja (Dronkert et al., 2000). Comparada
con otros tejidos, la expresión de Artemis no aumentó en el timo o
en la médula ósea, los sitios de la recombinación
V(D)J.
Tal como se esperaba, dado el aumento
generalizado de la radiosensibilidad en las células de los pacientes
RS-SCID (Cavazzana-Calvo et
al., 1993), Artemis demostró un patrón pleiotrópico de
expresión.
Los análisis de la secuencia de mutación de
Artemis se realizaron bien en ADNc después de la amplificación
RT-PCR o en el ADN genómico después de la
amplificación PCR específica de los exones. Todos los productos PCR
se secuenciaron directamente utilizando la Reacción Preparada de
Secuenciación de Finalización del Ciclo (BigDye).
La estructura y la secuencia del gen Artemis se
analizó en una serie de 11 familias RS-SCID que
incluían 13 pacientes (Tabla 2 y Figura 1). Tres pacientes (P6,
P15, y P40) se caracterizaron por un ausencia completa del
transcrito de Artemis, causada por una deleción genómica que se
extendía desde el exón 1 al 4. Esta mutación puede considerarse
como un alelo nulo completo.
La misma deleción genómica se encontraba en un
alelo en P1, que transportaba un cambio nucleótido C279T en el otro
alelo, que condujo a la formación de un codón sin sentido en R74. La
mutación homocigótica C279T se encontró también en P2 y se encontró
que era heterocigótica en P4.
Otras dos deleciones genómicas fueron
características de esta serie de pacientes RS-SCID.
Una deleción homocigótica que se extendía desde el exón 5 al 8 en
P47 condujo a la formación de un ADNc en el que el exón 4 sufrió un
corte y empalme en el marco de lectura al exón 9, dando lugar a una
proteína putativa a la que le faltaba K96 a Q219. En P3, una
deleción genómica heterocigótica de los exones 5 y 6 dio lugar a la
salida del corte y empalme del marco de lectura del exón 4 al exón
7, conduciendo a un cambio en el marco de lectura en K96. El
segundo alelo en este paciente portaba un cambio heterocigótico del
nucleótido G a C en la secuencia donante canónica del corte y
empalme del exón 11, que provocó la salida del corte y empalme del
marco de lectura del exón 10 al 12, dando lugar a un cambio en el
marco de lectura en T300.
Finalmente, otras tres mutaciones secuenciales
donantes de corte y empalme se identificaron en seis pacientes. Un
cambio nucleótido heterocigótico G a A en el sitio donador del corte
y empalme del exón 10 en P4, produjo un ADNc en el que la fusión
del exón 9 al 12, conservó el marco de lectura abierto y condujo
potencialmente a la producción de una proteína a la que le faltaba
A261 a E317. La mutación homocigótica de G a T en el sitio donador
del exón 5 se encontró en los hermanos P5, P11 y P12, así como en
P38, creando la salida de corte y empalme del marco de lectura del
exón 4 a 6 y la formación de un cambio en el marco de lectura en
K96. Aunque esta forma de ADNc al que le falta el exón 5 como
resultado del evento alternativo de corte y empalme, se detectó
asimismo a un bajo nivel en el ARN de las células normales (datos
que no se muestran), explicó todos los ADNc en P5 y en P38. En el
paciente P16, una deleción homocigótica de G818 en el exón 9, junto
con un cambio homocigótico de C a T nueve nucleótidos por debajo
del intrón, provocó la formación de un cambio en el marco de lectura
en A254.
Siempre que las muestras de los padres de un
paciente estuvieran disponibles, se ensayaron respecto a la
presencia de las mutaciones. Esto podría confirmar la herencia de
las mutaciones en P5, P11, y p12, así como en P38 y P16 mediante
secuenciación directa de la PCR genómica específica del exón
obtenida del ADN parental (datos que se muestran), que coincide con
la herencia autosómica recesiva.
En resumen, todos los 13 pacientes
RS-SCID que se ensayaron en esta serie, portan
mutaciones heterocigóticas u homocigóticas del gen Artemis. Ninguna
de estas mutaciones eran erróneas, y una de ellas (la deleción
genómica del Exón 1 al 4) puede considerarse como un alelo nulo
verdadero, dada da falta completa del transcrito de Artemis en P6,
P15 y P40. Todas las mutaciones se recapitulan en la Figura 1 y en
la Tabla 2.
La primera indicación de que Artemis era
verdaderamente el gen que estaba implicado en
RS-SCID provino de la identificación de mutaciones
en varios pacientes. Generalmente, en 11 familias se encontraron 8
distintas alteraciones del gen. Aunque algunas de las mutaciones se
repetían, no fue posible extraer ninguna correlación clara con
respecto a los orígenes geográficos de los pacientes.
Del análisis de estas mutaciones se desprenden
varias características interesantes:
- -
- En primer lugar, tres de las mutaciones identificadas implican deleciones genómicas que se extienden a través de varios axones, conduciendo a cambios en el marco de lectura y a la aparición de una finalización prematura en dos casos y a una deleción en el marco de lectura de 216 aa en un caso. Esto indica que el gen Artemis puede representar un emplazamiento crítico para la deleción génica.
- -
- En segundo lugar, ninguna de las mutaciones consiste en sustituciones nucleótidas únicas que generen cambios aminoácidos, y sólo una, la transversión C279T, da lugar a una mutación errónea. Los otros cambios nucleótidos afectan a las secuencias donadoras de corte y empalme, que conducen, bien a cambios en el marco de lectura en tres casos, o a una deleción del marco de lectura de parte de la proteína en un caso.
- -
- En tercer lugar, en tres pacientes (P6, P15 y P40), la deleción genómica comprende el exón 1 a 4 y da lugar a una ausencia completa del ADNc codificado por Artemis. Esta deleción, que puede considerarse como productora de un alelo nulo, demuestra por tanto que Artemis no constituye una proteína esencial para la viabilidad, contrariamente a, por ejemplo, XRCC4 y la ADN-Ligasa-IV (Barnes et al., 1998; Frank et al., 1998; Gao et al., 1998), o que es parcialmente redundante.
Esta información es de interés particular para
el establecimiento de un homólogo con desactivación génica murino
respecto a la situación RS-SCID humana. La
implicación de Artemis en la situación RS-SCID se
estableció inequívocamente mediante complementación del defecto en
la recombinación V(D)J en los fibroblastos del
paciente después de la transfección de un ADNc de Artemis wt (véase
el ejemplo siguiente).
El ensayo de recombinación V(D)J
se llevó a cabo tal como se ha descrito previamente (Nicolas et
al., 1998). Brevemente, 5 x 10^{6} fibroblastos dérmicos
transformados con SV40 que crecían exponencialmente, se sometieron
a electroporación en 400 \mul de medio de cultivo (RPMI1640, FCS
al 10%), con 6 \mug y 4,8 \mug de los plásmidos codificantes de
expresión RAG-1 y RAG-2,
respectivamente, juntamente con 2,5 \mug de los sustratos
extracromosómicos de V(D)J, pHRecCJ (unión de
codificación) o pHRecSJ (señal de unión). Estos plásmidos portan un
gen LacZ interrumpido por un ADN de relleno franqueado por
secuencias recombinatorias V(D)J de señalización.
Después de la recombinación, el ADN de relleno se extirpó,
reorganizándose el gen LacZ, dando lugar a colonias bacterianas
azules cuando se sembraron en el medio Xgal/lf TG. Se añadió
pARTE-ires-EGFP (2,5 \mug) para
el análisis de complementación. Los constructos transfectados se
recuperaron a las 48 horas, se volvieron a introducir en las
bacterias DH10B y se sembraron en placas que contenían Xgal/IPTG. El
porcentaje de recombinación se determinó haciendo recuento de las
colonias azules y blancas y calculando su proporción. Las colonias
azules se seleccionaron al azar y el ADN plasmídico se secuenció
para analizar la calidad de las uniones V(D)J.
Los inventores demostraron previamente la
ausencia de codificación de la formación de la unión derivada de la
recombinación V(D)J en los fibroblastos de los
pacientes RS-SCID después de la transfección de los
constructos RAG1 y RAG2 de expresión, junto con sustratos
extracromosómicos de recombinación V(D)J, específicos
para el análisis de la unión de codificación (pHRec CJ) (Nicolas
et al., 1998). Al contrario, la formación de la señal de
unión se encontró siempre normal en los fibroblastos
RS-SCID ((Nicolas et al., 1998) y Tabla
3).
El gen Artemis se clonó en el vector de
expresión en mamíferos pires-EGFP, evaluándose su
actividad de complementación funcional en el ensayo de
recombinación V(D)J en los fibroblastos de 7 pacientes
RS-SCID, utilizando el sustrato pHRecCJ (Tabla 3).
En todos los casos, las colonias bacterianas azules se recuperaron
después de transfecciones en presencia de Artemis wt, atestiguando
la recombinación del sustrato gobernada por RAG1/2, mientras que
virtualmente no se obtuvieron dichas colonias en ausencia del
Artemis wt exógeno.
Las frecuencias de los eventos recombinatorios
oscilaron entre 1,5x10^{-3} y 2,9x10^{-3,} que concordó con la
frecuencia de 3,2x10^{-3} obtenida cuando se utilizó una progenie
celular fibroblástica de control. El análisis secuencial de los
plásmidos pHRecCJ recuperados que formaban colonias azules, en este
ensayo en las progenies fibroblásticas de P1 y de P40, demostró que
las uniones eran bona fide, uniones que codifican
V(D)J con ribetes limitados de los extremos
codificantes similares a los obtenidos en los fibroblastos de
control (que no se muestran).
En general, estos resultados indican que el
defecto de recombinación V(D)J en
RS-SCID está relacionado directamente con las
mutaciones descritas en el gen Artemis y puede complementarse
introduciendo un ADNc de Artemis wt en los fibroblastos de los
pacientes. Aunque la expresión de alto nivel, transitoria, de
Artemis no parece ser tóxica, los transfectantes estables no
pudieron derivarse para analizar la complementación de la
hipersensibilidad a las radiaciones ionizantes. Esto podría deberse
a una toxicidad de la expresión de alto nivel a largo plazo de
Artemis wt en los fibroblastos transfectados. Una toxicidad celular
análoga se describió previamente después de la sobreexpresión de
otros homólogos murinos o humanos de SNM1 in vitro y puede
ser una característica de esta familia de proteínas (Dronkert et
al., 2000). Esto concuerda asimismo con la expresión fisiológica
de bajo nivel del ARN de estos genes (véase anteriormente).
Es interesante hacer hincapié en que la proteína
que está compuesta por los primeros 385 aminoácidos de SEC ID nº 2
fue también capaz de complementar el defecto de recombinación
V(D)J en este ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3
(continuación)
Las búsquedas de las bases de datos utilizando
el programa BLAST2 con el Artemis como secuencia "dudosa"
reveló similitudes significativas con varias proteínas, que
incluyen las proteínas PSO2 de las levaduras y la murina SNM1,
sobre los primeros 360 aminoácidos de Artemis. Repeticiones
posteriores con el programa PSI-BLAST dio luz sobre
similitudes significativas de los primeros 150 aminoácidos con
elementos bien establecidos de la superfamilia de la
metalo-\beta-lactamasa.
El pliegue de la
metalo-\beta-lactamasa, descrito
primero para la \beta-lactamasa de Bacillus
cereus (Carfi et al, 1995) es adoptado por varios
metalo-enzimas con una amplia distribución y
especificidad de sustrato (Aravind,1997). Está formado por un
\beta-sándwich de cuatro capas con dos
\beta-láminas mezcladas, franqueadas por
\alpha-hélices, con los sitios de unión al metal
localizados en un borde del \beta-sándwich. El
análisis secuencial, así como la predicción de la estructura
secundaria para Artemis, indicó claramente la conservación de
motivos típicos del pliegue de la
metalo-\beta-lactamasa. Esto es
cierto en particular para los aminoácidos D17, [HXHKDH]
33-38, H115, y D136 que participan en la estructura
de unión al metal y que representan el sitio catalítico de las
métalo-\beta-lactamasas. El último
residuo de unión al metal de las
metalo-\beta-lactamasas, H225 en
la metalo-\beta-lactama sa de
Tenotrophomonas maltophilia (1SML), que está localizado al
final de una cadena \beta (cadena \beta12), está ausente en
Artemis/SNM1/PSO2, pero podría ser sustituida funcionalmente por el
ácido aspártico D165 de Artemis, conservado asimismo en SNM1/PSO2.
El residuo situado más al final se localiza en el extremo de una
cadena \beta predicha, separada por una
\alpha-helix de la cadena que porta el residuo
precedente de unión al metal.
Generalmente, este análisis no sólo indica que
Artemis adoptó probablemente el pliegue de la
\beta-lactamasa, sino que puede haber conservado
asimismo una actividad catalítica asociada, al contrario que en
otras varias proteínas que han perdido muchos de los residuos
catalíticos (Aravind, 1997).
El análisis de la secuencia proteica de Artemis
reveló la existencia de un dominio putativo de la
métalo-\beta-lactamasa (M1 a
R179) que sugiere que Artemis podría tener alguna función catalítica
tal como la de hidrolasa. Este dominio está seguido por otro
dominio (E180 a S385) que se denominó \beta-CASP
por el dominio asociado \beta-lactamasa
CPSF-Artemis-SNM1-PSO2.
El dominio \beta-CASP está siempre asociado al
dominio \beta-lact en una serie de proteínas con
función sobre el metabolismo de los ácidos nucleicos (reparación del
ADN, procesamiento del ARN...). Finalmente, el último dominio
(C-ter) comprende E386 a T692. El papel y la
interdependencia de estos dos dominios se analizó in vitro
generando mutantes y ensayando su actividad tanto en la
recombinación V(D)J como en la reparación del
ADN.
Este ensayo se basa en la transfección de un
fibroblasto con los constructos de expresión Rag1 y Rag2 para
analizar la recombinación V(D)J de un sustrato
extracromosómico (pHRec-CJ o
pHRec-CS, véase el Ejemplo 4). La región
\betaLact+\betaCASP (M1 a S385) es suficiente para complementar
el defecto de recombinación V(D)J en los fibroblastos
de los pacientes (RS-SCID) deficientes en
Artemis.
Sin embargo, el dominio \betaLact (M1 a R179)
solo, no complementa este defecto. No existe actividad cuando se
utilizan las configuraciones de Artemis
\betaCASP-Cter (E180 a T692) o
C-ter (E386 a T692).
El sitio catalítico de las
metalo-\beta-lactamasas en las
bacterias está caracterizado por la reorganización de diversos
residuos His y Asp conservados que unen átomos de Zn y confieren la
actividad hidrolasa. Muchos de estos residuos están conservados
asimismo en Artemis, lo que sugiere además la posible actividad
hidrolasa de Artemis.
Varios de estos residuos His y Asp mutaron a Val
y la función residual de la proteína se analizó en el ensayo
V(D)J.
V(D)J.
D17A, H35A, D37A, y D136A abolieron casi
completamente la función de Artemis, mientras que H165A y H319A
redujeron su actividad. H38A y H151A parece que no tuvieron
efecto.
Este ensayo se basa en el análisis de la
sensibilidad a los rayos x de los fibroblastos
RS-SCID transducidos con un vector retrovírico que
expresa varias formas de Artemis. Mientras
\betaLact-\betaCASP/C-ter
complementa la hiperradiosensibilidad de las células
RS-SCID, \betaLact-\betaCASP, no
tiene efecto.
Estos experimentos de mutagénesis sugieren que
Artemis tiene probablemente alguna actividad catalítica,
considerando esta hipótesis por su homología con las
metalo-\beta-lactamasas
bacterianas.
El dominio \betaLact + \betaCASP de Artemis
porta esta actividad catalítica, ya que 1) puede asegurar una
recombinación V(D)J sobre sustratos extracromosómicos,
y 2) la mutación de varios residuos catalíticos putativos (His y
Asp) y abole la función.
Sin embargo, es interesante hacer hincapié en
que el dominio \betaLact + \betaCASP no parece ser suficiente
para permitir por sí mismo la actividad de Artemis en el contexto de
la totalidad del cromosoma, como la longitud total de la proteína
de Artemis, o por lo menos, parte del dominio
C-term, parece necesario para complementar el
fenotipo de radiosensibilidad.
Esto sugiere que Artemis interacciona
probablemente con otras proteínas en el contexto de su sustrato en
el interior de la cromatina.
Basándose en este resultado, es posible que la
actividad de recombinación V(D)J sobre la Ig endógena
(en la cromatina respecto a la extracromosómica) y los genes TCR,
pueda necesitar asimismo la proteína completa de Artemis.
Esta situación es algo similar a la de la
proteína Rag2. En Rag2, es necesaria y suficiente una región nuclear
para gobernar la recombinación de los sustratos extracromosómicos,
mientras que no es efectiva en la reorganización de los loci
endógenos.
En un seguimiento de pacientes SCID, Los
inventores se encontraron con 4 casos (en 2 familias) que
presentaban un fenotipo complejo que se parecía a la Ataxia
telangectasia, aunque sin una ataxia clara. Estos pacientes
padecían una grave linfopenia e hipogammaglobulinemia.
En algunos de estos pacientes el hallazgo de
aberraciones cromosómicas en los linfocitos, sugirió que podrían
presentar un defecto de reparación del ADN, que se confirmó
posteriormente mostrado la hipersensibilidad de la médula ósea a
los rayos \gamma.
La recombinación V(D)J en los
fibroblastos de dos de estos pacientes (que representaban a las dos
familias) estaba ausente o gravemente disminuida y se restableció
al nivel normal añadiendo Artemis, como en el Ejemplo 4.
Finalmente, fue posible demostrar que el gen
Artemis había mutado en los dos casos, dando lugar a codones de
finalización prematuros en T432 y D451 respectivamente (al comienzo
del dominio C-Ter).
Esta observación confirma en cierto modo los
resultados de la mutagénesis in vitro (véase Ejemplo 6),
mostrando que la proteína Artemis desprovista del dominio
C-Ter completo puede tener todavía actividad de
recombinación en el contexto de la cromatina in vivo (estos
pacientes tienen algunos linfocitos), pero la eficiencia sobre los
loci endógenos es muy débil (estos pacientes son intensamente
linfopénicos).
En dos pacientes de la primera familia, la
deficiencia inmune se acompañó por el desarrollo del síndrome
linfoproliferativo (SLP) agresivo y diseminado, con presencia de
EBV.
Estos SLP pueden asimilarse probablemente los
verdaderos linfomas de células B, basados en su clonalidad y en su
agresividad.
La conclusión principal de esta observación es
que Artemis puede probablemente considerarse como un
"cuidador", ya que su defecto está asociado aparentemente con
el desarrollo de linfomas de células B.
Esta idea está apoyada por la literatura que
muestra (en varios informes) que los defectos en otros factores de
recombinación V(D)J/reparación del ADN (tales como
Ku80, ADN-PK, XRCC4, ADN-LigasaIV)
en los modelos animales, conduce siempre al desarrollo de células
pro-B cuando se introducen en un P53-/-antecedente,
estableciéndose como verdaderos "cuidadores".
Esta hipótesis puede experimentarse en un modelo
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LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM)
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<120> Gen implicado en la recombinación
V(D)J y/o la reparación del ADN
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<130> D19427
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<140>
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<141>
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<150> PCT/IB01/00546
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<151>
2001-03-22
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<160> 33
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2354
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de codificación:
nucleótidos 36 a 2114 ó 60 a 2114.
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 692
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio alternativo de inicio de
proteína: Met 8
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador 0083F1
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<400> 3
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador 169F
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex1F1.
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<212> ADN
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex1R1
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex2F1
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex2R1
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<212> ADN
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artificial: Cebador Ex3F1
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex3R1
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex4F1’
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex4R1
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex5F1
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex5R1
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex6F1
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex6R1
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex7F1
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex7R2
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<400> 18
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<210> 19
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex8F2
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<400> 19
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\hfill21
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<210> 20
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<211> 18
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex8R1
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<400> 20
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\hskip-.1em\dddseqskipggccaacatg gtgaaatg
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<210> 21
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<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex9F1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcactgaata gccaaaaact
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex9R1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcctagatcg caccact
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex10F1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgagactct gcctacaaca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex10R1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagcatcccc tccattta
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex11F1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacacgcggt ctacaa
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex11R1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggactacc tgtcaactac
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex12F1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagatcttt gggagtgag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex12R1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipacctctcaat tctgccacac
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex13F1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipatttgccact ttattacatc
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
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<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex13R1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipgcaaagtact tcctgagac
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex 14F1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagattggcct ccctattct
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador Ex14R1
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 32
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\hskip-.1em\dddseqskipccaaccaggt tatttgaaca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador 0083F4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccaaagta taaaccactg
\hfill20
Claims (30)
1. Molécula aislada de ácido nucleico
seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº 1,
nucleótidos 39-2114 de SEC ID nº 1, o nucleótidos
60-2114 de SEC ID nº 1.
2. Molécula aislada de ácido nucleico
seleccionada de entre el grupo constituido por nucleótidos
39-1193, o los nucleótidos 60-1193
de SEC ID nº 1.
3. Molécula aislada de ácido nucleico que es
el complemento de la molécula aislada de ácido nucleico según la
reivindicación 1.
4. Vector que comprende la molécula de ácido
nucleico según la reivindicación 1.
5. Célula huésped que comprende el vector
según la reivindicación 4.
6. Procedimiento para producir una proteína
implicada en la recombinación V(D)J y/o en la
reparación del ADN, que comprende las etapas siguientes:
- a)
- expresar la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 en un huésped apropiado, para sintetizar una proteína implicada en la recombinación V(D)J y/o en la reparación del ADN, y
- b)
- aislar la proteína implicada en la recombinación V(D)J y/o en la reparación del ADN.
7. Proteína o péptido aislados, codificados
por el ácido nucleico según la reivindicación 1.
8. Anticuerpo policlonal o monoclonal que
reconoce específicamente la proteína o el péptido según la
reivindicación 7.
9. Procedimiento in vitro para la
determinación del tipo de inmunodeficiencia grave combinada (SCID)
en un paciente, que consiste en analizar el ácido nucleico
seleccionado de entre el grupo constituido por SEC ID nº 1,
nucleótidos 39-2114, 60-2114,
39-1193 y 60-1193, y
60-1193 de SEC ID nº 1, de dicho paciente,
permitiendo una mutación en dicho ácido nucleico la clasificación
de dicha SCID como SCID radiosensible.
10. Procedimiento in vitro de
diagnóstico, que comprende un diagnóstico prenatal, de una situación
en un paciente seleccionado de entre el grupo constituido por una
SCID, una predisposición al cáncer, una inmunodeficiencia, y el
transporte de una mutación que aumente el riesgo de la progenie de
tener dicha enfermedad, que consiste en analizar el ácido nucleico
seleccionado de entre el grupo constituido por SEC ID nº 1,
nucleótidos 39-2114, 60-2114,
39-1193 y 60-1193 de SEC ID nº 1,
y/o la proteína codificada por dicho ácido nucleico de dicho
paciente, indicando una mutación en dicho ácido nucleico y/o
proteína un aumento en el riesgo de tener una SCID.
11. Procedimiento para la identificación de un
compuesto capaz de unirse al ácido nucleico según la reivindicación
1 ó 3, o a la proteína según la reivindicación 7, que comprende las
etapas siguientes
- a)
- poner en contacto dicho ácido nucleico o proteína con un compuesto candidato, y
- b)
- determinar la unión entre dicho compuesto candidato y dicho ácido nucleico o proteína.
12. Uno de los ácidos nucleicos según la
reivindicación 1 ó 7, el vector según la reivindicación 4, la célula
huésped según la reivindicación 5, la proteína según la
reivindicación 7, y el anticuerpo según la reivindicación 8, como
un medicamento.
13. Composición farmacéutica que comprende un
excipiente farmacéuticamente aceptable con por lo menos uno de los
ácidos nucleicos según la reivindicación 1 ó 3, el vector según la
reivindicación 4, la célula huésped según la reivindicación 5, la
proteína según la reivindicación 7, y el anticuerpo según la
reivindicación 8.
14. Utilización de por lo menos uno de los
ácidos nucleicos según la reivindicación 1 ó 3, el vector según la
reivindicación 4, la célula huésped según la reivindicación 5, la
proteína según la reivindicación 7, el anticuerpo según la
reivindicación 8, y la composición farmacéutica según la
reivindicación 13, para la preparación de un fármaco destinado a la
terapia de una inmunodeficiencia grave combinada (SCID).
15. Utilización de por lo menos uno de los
ácidos nucleicos según la reivindicación 1 ó 3, el vector según la
reivindicación 4, la célula huésped según la reivindicación 5, la
proteína según la reivindicación 7, el anticuerpo según la
reivindicación 8, y la composición farmacéutica según la
reivindicación 13, para la preparación de un fármaco destinado a la
terapia cancerosa, preferentemente además con un agente genotóxico,
siendo su uso simultáneo, separado o secuencial.
\newpage
16. Mamífero transgénico no humano que presenta
integrado en su genoma la secuencia ácido nucleica según la
reivindicación 1, unida funcionalmente a unos elementos reguladores,
en el que la expresión de dicha secuencia codificante aumenta el
nivel de la proteína ARTEMIS representada por SEC ID nº 2, y/o el
nivel de recombinación V(D)J, y/o de reparación del
ADN de dicho mamífero, respecto al mamífero no transgénico de la
misma especie.
17. Mamífero transgénico no humano cuyo genoma
comprende una interrupción del gen endógeno ARTEMIS representado
por SEC ID nº 1, en el que dicha interrupción comprende la inserción
de una secuencia marcadora seleccionable, y en el que dicha
interrupción da como resultado dicho mamífero no humano que presenta
un defecto en la recombinación V(D)J y/o en la
reparación del ADN, cuando se compara con un mamífero no humano de
tipo salvaje.
18. Mamífero transgénico según la
reivindicación 17, en el que dicha interrupción es una interrupción
homocigótica.
19. Mamífero transgénico según la
reivindicación 18, en el que dicha interrupción homocigótica da como
resultado una mutación nula del gen endógeno que codifica ARTEMIS,
representado por SEC ID nº 2.
20. Mamífero según la reivindicación 16 ó 17,
que es un ratón.
21. Ácido nucleico aislado que comprende un
constructo con desactivación génica ARTEMIS que comprende una
secuencia marcadora seleccionable franqueada por secuencias de ADN
homólogas al gen endógeno ARTEMIS, cuyo ADNc está representado por
SEC ID nº 1, en el que cuando dicho constructo se introduce en un
mamífero no humano o en un antepasado de dicho mamífero no humano
en un estadio embrional, dicha secuencia marcadora seleccionable
interrumpe el gen endógeno ARTEMIS en el genoma de dicho mamífero no
humano, de manera que dicho mamífero no humano presenta un defecto
en la recombinación V(D)J y/o en la reparación del
ADN, cuando se compara con un mamífero no humano de tipo
salvaje.
22. Vector que comprende el ácido nucleico
según la reivindicación 21.
23. Célula huésped de mamífero cuyo genoma
comprende una interrupción del gen endógeno ARTEMIS, cuyo ADNc está
representado por SEC ID nº 1, en la que dicha interrupción comprende
la inserción de una secuencia marcadora seleccionable.
24. Procedimiento para rastrear compuestos que
modulan la recombinación V(D)J y/o la reparación del
ADN, que comprende poner en contacto un compuesto con el mamífero
no humano según la reivindicación 17, o con la célula huésped según
la reivindicación 23, y determinar el aumento o la disminución de la
recombinación V(D)J y/o de la reparación del ADN en
dicho mamífero no humano o en dicha célula huésped, cuando se
compara con la recombinación V(D)J y/o la reparación
del ADN de dicho mamífero no humano o de dicha célula huésped, antes
de la administración del compuesto.
25. Procedimiento para ensayar la genotoxicidad
de compuestos, que comprende poner en contacto un compuesto con el
mamífero no humano según la reivindicación 17 o con la célula
huésped según la reivindicación 23, y determinar el aumento o la
disminución de la recombinación V(D)J y/o de la
reparación del ADN en dicho mamífero no humano o en dicha célula
huésped, cuando se compara con la recombinación V(D)J
y/o la reparación del ADN de dicho mamífero no humano o de dicha
célula huésped antes de la administración del compuesto.
26. Utilización de por lo menos un compuesto
seleccionado de entre el grupo constituido por el ácido nucleico
según la reivindicación 1 o 3, el vector según la reivindicación 4,
la célula huésped según la reivindicación 5, la proteína según la
reivindicación 7, el anticuerpo según la reivindicación 8, y la
composición farmacéutica según la reivindicación 13, para la
preparación de un medicamento para la modulación de la expresión y/o
de la actividad de la proteína ARTEMIS representada por SEC ID nº 2
en una célula.
27. Mamífero transgénico no humano cuyo genoma
comprende una primera interrupción que es del gen endógeno ARTEMIS,
cuyo ADNc está representado por SEC ID nº 1, y una segunda
interrupción que es del gen endógeno p53.
28. Mamífero transgénico según la
reivindicación 27, en el que por lo menos dicha primera interrupción
o dicha segunda interrupción es una interrupción homocigótica.
29. Mamífero transgénico según la
reivindicación 27, en el que dicha primera interrupción y dicha
segunda interrupción son interrupciones homocigóticas.
30. Mamífero transgénico según la
reivindicación 27, que es un ratón.
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