ES2299205T3

ES2299205T3 - Factor de transcripcion islet-brain 1 (ib1).

Info

Publication number: ES2299205T3
Application number: ES98913958T
Authority: ES
Inventors: Gerard Waeber; Christophe Bonny
Original assignee: Xigen SA
Current assignee: Xigen SA
Priority date: 1997-04-03
Filing date: 1998-04-02
Publication date: 2008-05-16
Anticipated expiration: 2018-04-02
Also published as: DE69838905T2; EP1889913B1; DK0973895T3; DE69838905D1; ATE382087T1; EP1889913A1; EP1889912A1; WO1998044106A1; US5880261A; EP0973895A1; ATE517993T1; PT973895E; AU6847298A; EP0973895B1; US6620914B1

Abstract

Polipéptido aislado (i) que tiene más del 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en la Fig. 1A, (ii) que es un fragmento de la secuencia de aminoácidos tal como se expone en la Fig. 1A, incluido el dominio desde los aminoácidos 566 a 612 de la secuencia mostrada en la Fig. 1A o una parte activa de aquel dominio o (iii) que es un fragmento de una secuencia de aminoácidos tal como se expone en la Fig. 1A con al menos 20 aminoácidos de longitud, caracterizado porque el polipéptido tiene la propiedad de inhibir o promover la apoptosis.

Description

Factor de transcripción Islet-Brain 1 (IB1).

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la identificación y caracterización del Islet-Brain 1 (Islote-Cerebro 1) (IB1), un activador transcripcional que está involucrado en el control del GLUT2 y los genes de insulina mediante su interacción con los elementos cis-reguladores homólogos de GLUT2 y promotores de la insulina, así como a los materiales y métodos que derivan de este trabajo. En particular, la presente invención se refiere al ácido nucleico IB1 y a los polipéptidos IB1, así como a su utilización en el diagnóstico y en el tratamiento profiláctico y terapéutico de condiciones tales como la diabetes, enfermedades neurológicas como la demencia y/o la enfermedad de Parkinson, el cáncer y en la promoción o la inhibición de la apoptosis.

Antecedentes de la invención

La isoforma de transporte de la glucosa facilitado por GLUT2 es una proteína de membrana presente en las células pancreáticas secretoras de \beta-insulina, en la membrana basolateral de las células de absorción intestinales y renales, en los hepatocitos y en un subconjunto de neuronas (21, 31, 44). En estas células, el GLUT2 cataliza el transporte transepitelial de la glucosa. En los islotes pancreáticos, el GLUT2 permite un equilibrio rápido de la glucosa entre el espacio extracelular y el interior de las células y puede desempeñar un papel crucial en el mecanismo de señalización de la glucosa que conduce a la secreción de insulina (43). Sin embargo, la importancia relativa del GLUT2 en la detección de las células \beta-pancreáticas con respecto a la glucosa sigue debatiéndose. En las células \beta humanas, el nivel de expresión de GLUT2 es bajo y la actividad intracelular de la glucoquinasa parece ser la etapa limitante de crecimiento de la ruta glucolítica (5, 11). Por otra parte, las células del insulinoma que habían perdido su capacidad de respuesta normal a la glucosa tienen un bajo contenido en GLUT2, pero se puede recuperar cierta sensibilidad a la glucosa después de la reintroducción de la expresión de GLUT2 mediante la transfección estable de estas células (10, 16). Además, en ratones transgénicos que expresan los ARNs antisentido de GLUT2, conducidos por el promotor de insulina, llevan a una reducción del 80% en el GLUT2, lo cual ocurría en paralelo a una menor respuesta secretora de insulina inducida por glucosa y al inicio de la diabetes (48). Estas observaciones son críticas, ya que varios modelos experimentales de diabetes han mostrado que la expresión de GLUT2 se reduce drásticamente, en particular en las células \beta pancreáticas, y que este mecanismo podría participar en el inicio de la enfermedad (18, 29, 30, 32, 45-47). Por tanto, aunque los niveles de GLUT2 permanezcan sin cambios o incluso estén sobrerregulados en diversos tejidos tales como el hígado y el intestino durante los estados hiperglucémicos observados en la diabetes, el mismo gen experimenta una desregulación drástica solamente en los islotes pancreáticos.

Se clonó un fragmento del promotor de GLUT2 murino, demostrando ser sensible a la glucosa cuando se transfectaba en células diferenciadas productoras de insulina o en hepatocitos (35, 36, 52). Dentro de esta región del promotor se identificaron importantes secuencias cis-reguladoras, incluido un elemento PDX-1 funcionalmente sensible, un elemento que responde al AMP cíclico y tres elementos cis denominados GTI, GTII y GTIII (3, 36, 53). La presencia de GTI, II y III es tanto suficiente como necesaria para conferir la expresión pancreática-específica a un gen reporter in vitro o in vivo, utilizando un estudio en ratones transgénicos (3, 51). Se había mostrado anteriormente que GTI y GTIII unían factores trans-actuantes distintos pero expresados de forma omnipresente.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en la expresión con éxito de clonar un factor de transcripción que se une al elemento GTII del GLUT2 y a los genes de insulina a partir de una librería de cADN diferenciada secretora de insulina. En parte, el éxito de este ejercicio se basa en que los inventores se percataron de la importancia del GTII y de la librería que construyeron para encontrar el gen IB1. Los polipéptidos de IB1 descritos aquí son relativamente grandes y su clonación se realizó mediante la construcción por los inventores de una librería de cADN de gran calidad para clonar la expresión.

Este factor se expresa ampliamente en los islotes pancreáticos y en el cerebro y se ha denominado IB1 para el Islet-Brain 1. Se obtuvieron genes y polipéptidos IB1 tanto humanos como de rata. El cADN de IB1 de la rata codifica una proteína de 714 amoniácidos y el cADN de IB1 humano una proteína de 711 aminoácidos. Los cADNs que codifican los polipéptidos IB1 humanos y de rata tienen una identidad de secuencia del 94% y los polipéptidos tienen una identidad de secuencia de aminoácidos del 97% (véase la alineación de las secuencias en la figura 1D), y tienen una región rica en prolina y un dominio putativo básico hélice-bucle-hélice (bHLH). El gen IB1 se expresa ampliamente en los islotes pancreáticos y en el cerebro y en menor medida en el corazón y en los riñones. En los islotes de Langerhans y en las líneas celulares \beta, estas transcripciones se traducen en una proteína citoplásmica y nuclear inmunodetectable. Cuando se ensaya in vitro, el IB1 se une específicamente al elemento cis de GTII del gen GLUT2 y a una secuencia reguladora homóloga del promotor de insulina denominada RIPE3. Este elemento promotor de insulina de la rata 3 (RIPE3) es una importante secuencia amplificadora suficiente para conferir la expresión específica de células \beta al gen de insulina. Funcionalmente, el IB1 transactivó la región proximal del promotor de GLUT2 unido a un gen reporter luciferasa y era también un potente activador del gen de insulina. Este efecto es mediado por la secuencia RIPE3, tal como lo demuestra la observación de que múltiples copias de esta secuencia amplificadora clonada 5' de un promotor heterólogo fue transactivada por un vector de expresión que codificaba IB1 en estudios de transfección temporal. Parece que el IB1 funciona solamente en las células secretoras de insulina, ya que no se observó ninguna transactivación en las líneas celulares no pancreáticas o en las productoras de glucagón. Estos datos demuestran la presencia de un nuevo activador transcripcional ampliamente expresado en el páncreas endocrino y que participa en el adecuado control específico de las células \beta del GLUT2 y de los genes de insulina a través de las secuencias homólogas presentes en ambos promotores.

El ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos de IB1 de rata se muestran en la Figura 1A. En la Figura 1E se muestra el cADN de IB1 humano, con la secuencia de amoniácidos traducida mostrada en la Figura 1F. El gen IB1 humano está localizado en el cromosoma 11 en 11p11.12 del mapa citogénico de LDB. El gen IB1 es adyacente a los marcadores D11S134 y D11S3979.

Se construyó el cADN humano como un ARN utilizando tejido obtenido de un insulinoma humano eliminado quirúrgicamente. Se extrajo el ARN poli A^{+} y se construyó una librería de cADN, que fue examinada posteriormente con una sonda de cADN radiomarcado de IB1 de rata. Esto permitió que los inventores aislaran el cADN humano que codifica IB1. Luego se utilizó este cADN como sonda para clonar el gen IB1 humano a partir de un cromosoma artificial bacteriano (BAC). Se obtuvieron varios clones y se secuenció parte de los mismos. Luego se utilizó el protocolo anterior para completar la secuenciación del ácido nucleico de IB1 humano que se muestra en la Figura 1E.

El gen IB1 humano es multiexónico y está localizado en el cromosoma 11p11.12. Se obtuvo un mapa cromosómico mediante los experimentos de FISH y por PCR de células híbridas (hámster-humanas) utilizando como sonda el gen IB1 multiexónico. El IB1 se expresa en el cerebro de la rata, del ratón y del ser humano y en los tejidos con un alto grado de similitud, tales como el páncreas endocrino (numerosas características neuronales están presentes en células-\beta de insulina).

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido aislado (i) que tiene más de un 80% de identidad en su secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 1A, (ii) que es un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la Figura 1A, incluyendo el dominio desde los aminoácidos 566-612 de la secuencia mostrada en la Figura 1A, o una parte activa de ese dominio, o (iii) que es un fragmento de una secuencia de aminoácidos tal como se expone en la Figura 1A de al menos 20 aminoácidos de longitud, caracterizada porque el polipéptido tiene la propiedad de inhibir o promover la apoptosis. Como se piensa que este dominio (ii) es responsable de algunas de las interacciones entre IB1 y otros polipéptidos, se puede utilizar en los métodos de screening para compañeros de unión, por ejemplo para los péptidos que podrían actuar como inhibidores de IB1.

En otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican cualquiera de los polipéptidos anteriores. Ejemplos de tales secuencias de ácido nucleico son las secuencias de ácido nucleico expuestas en la Figura 1A. La presente invención incluye también las moléculas de ácido nucleico que tienen más de un 90% de homología de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de la Figura 1A.

En otros aspectos, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de IB1 anterior operativamente unido a las secuencias control, para dirigir su expresión, y las células huésped que contienen el vector. La presente invención incluye también un método para producir los polipéptidos de IB1 que comprende el cultivo de las células huésped y el aislamiento del polipéptido de IB1 así producido.

El vector de expresión que comprende el ácido nucleico IB1 podría emplearse en métodos de terapia genética, por ejemplo en el tratamiento de pacientes que no pueden producir suficiente IB1, o para fabricar líneas celulares capaces de producir IB1.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una línea celular para su trasplante en un paciente, conteniendo la línea celular un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido IB1 tal como se ha definido anteriormente, y que es capaz de producir el polipéptido IB1.

La expresión de IB1 en una línea celular transformada puede afectar a genes endógenos, tales como los genes de insulina o de GLUT2. En una realización, las líneas celulares pueden estar encapsuladas, por ejemplo en un polímero biocompatible, de forma que el IB1 producido por la línea celular pueda secretarse dentro del paciente, al mismo tiempo que impide el rechazo por el sistema inmune del huésped. En WO 93/16687 y WO 96/31199 se describen métodos para la encapsulación de células en polímeros biocompatibles.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más polipéptidos de IB1, tal como se ha definido anteriormente.

En otros aspectos, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que corresponden a los polipéptidos descritos anteriormente, para su utilización en métodos de tratamiento médico. La presente invención proporciona además la utilización de los polipéptidos de IB1 en la preparación de un medicamento para activar los promotores de insulina o de GLUT2 que conducen a la producción de insulina o de GLUT2. Preferentemente, la activación tiene lugar de una manera específica de la célula, por ejemplo en células-\beta. Esto podría utilizarse en el tratamiento de estados tratables con insulina o GLUT2, por ejemplo en la diabetes. Debido a que IB1 también está presente en tejidos musculares, por ejemplo en el corazón, puede funcionar modulando la sensibilidad a la insulina y mejorando la anormal eliminación de glucosa en los pacientes diabéticos.

En otro aspecto de la presente invención, también se podría utilizar IB1 como agente que mantiene un estado de diferenciación dentro de una célula, es decir que actúa como agente anti-apoptótico. Por tanto, se puede utilizar IB1 como agente anti-neoplástico, por ejemplo como medicamento para controlar o tratar ciertos cánceres. Como ejemplo, los insulinomas son tumores humanos que experimentan una desdiferenciación y se dividen. Así, se podría utilizar IB1 para proteger el tejido sano circundante de los efectos del tratamiento de las células tumorales, utilizando diversos métodos tales como la radioterapia o la quimioterapia. Así, IB1 podría actuar como un agente de diferenciación para tratar estas células.

IB1 es similar a JIP-1, una proteína citoplásmica identificada por Dickens y col., Science, 277:693-696, 1997. Sin embargo, IB1 difiere de JIP-1 en la inserción de 47 aminoácidos en la parte carboxi terminal de la proteína y tiene una homología de aminoácidos del 97% con respecto a la secuencia remanente del IB1 de rata mostrada en la Figura 1A (es decir, excluyendo la inserción no presente en JIP-1). Como la sobreexpresión de JIP-1 en las células neuronales inhibe la apoptosis celular, se podría utilizar IB1 para suprimir la apoptosis en las células, por ejemplo, la apoptosis inducida por estrés inducido en neuronas. Esta activación del estrés puede provocarse con radiación ultravioleta (UV), por anoxia, hipoglucemia, citoquinas como IL-6, o por traumas. Esto a la vez apoya la sugerencia anterior de los presentes inventores del uso de IB1 para impedir la muerte celular que tiene lugar en enfermedades tales como la demencia, enfermedades neurodegenerativas, isquemia del corazón, infarto de miocardio (IB1 está presente en el corazón) y en enfermedades post-traumáticas, por ejemplo en secciones de la columna vertebral parapléjica y en el trauma neuronal.

L. Hillier y col. revelaron un EST humano que tenía un cierto porcentaje de homología con la secuencia de IB1 de la presente solicitud (EMBL Sequence Database, AN=R85141).

Además, la EP-A-0679716 revela un método de identificación de cADN procedente de diversos tejidos humanos. En consecuencia, esta solicitud describe una secuencia de ácido nucleico identificada por dicho método que muestra cierta similitud de secuencia con la secuencia de IB1 humano tal como se revela aquí.

En otro aspecto, la presente invención proporciona la utilización de un polipéptido de IB1 para preparar un medicamento que inhibe la apoptosis celular, así como para el tratamiento de la diabetes o de trastornos neurodegenerativos o del cáncer.

Además, en otro aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un polipéptido de IB1 en un método de screeining de sustancias de ensayo como compañeros específicos de unión del polipéptido de IB1. Además, la presente invención también proporciona un método para el screening de sustancias que afectan o modulan una actividad biológica de un polipéptido de IB1.

Estos y otros aspectos de la presente invención se describen de forma más detallada a continuación. Mediante los ejemplos, las realizaciones de la presente invención se describirán ahora más detalladamente con referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripción de las figuras

Figura 1

cADN de IB1 y secuencia de proteínas prevista

A.: Secuencia de nucleótidos de cADN de IB1 de rata y su secuencia de aminoácidos prevista. Los residuos de ácido nucleico están numerados a partir del nucleótido del cADN y los residuos de aminoácido están numerados desde el principio del marco de lectura abierto largo. El análisis asistido por ordenador de la secuencia de proteínas indica la presencia de una estructura altamente helicoidal (residuos 31-61 y 114-125) y una región rica en prolina (residuos 292-366) en la parte terminal amino de la proteína, una señal putativa de localización nuclear (subrayada dos veces), así como un dominio putativo de unión al ADN y un dominio de dimerización de bHLH (subrayado una vez).

B.: Comparación de la secuencia de aminoácidos de IB1 con otras proteínas de bHLH. Se alineó la secuencia de aminoácidos para maximizar la homología dentro de la región de bHLH. Los aminoácidos sombreados se conservan entre las proteínas de bHLH.

C.: Diagrama esquemático de la proteína IB1 con los dominios putativos indicados. Obsérvese la inserción del aminoácido 47 (recuadro negro) que diferencia IB1 de JIP-1.

D.: Comparación de las secuencias de aminoácidos traducidos de IB1 humano y de rata. || = identidad, negrita = inserción del aminoácido 47 en IB1, \bullet = ningún aminoácido presente.

E.: Secuencia de nucleótidos completa del cADN de IB1 humano, \bullet = unión exón-intrón.

F.: Secuencia de aminoácidos completa del polipéptido de IB1 humano.

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Figura 2

Expresión específica del tejido del gen IB1

A.: Se determinó la distribución de la transcripción de IB1 en los tejidos y líneas celulares por análisis Northern Blot utilizando 10 \mug de ARN total preparado a partir de INS-1 y RIN5F (dos líneas de células-\beta que producen insulina), a partir de InR1-G9 (una línea de células-\alpha que producen glucagón) y diversos tejidos de rata. Las transcripciones de IB1 de 3,0 y 3,2 kb se detectan solamente en las líneas celulares que secretan insulina y en el cerebro, así como, en menor grado, en el corazón y el riñón. Se desprendió y rehibridizó la mancha con una sonda de actina-\beta (fondo).

B.: Se analizaron del mismo modo cinco microgramos de ARN poli(A+) preparado a partir de 2 líneas celulares secretoras de insulina distintas, procedentes de hígado, riñón y páncreas de rata, en busca de la expresión del gen IB1. Se detectaron las transcripciones de IB1 de una manera específica en la célula y el tejido.

C.: Se analizaron un total de 5 \mug de ARN obtenido a partir de islotes pancréaticos aislados de rata incubados en 2,8 mM o 30 mM de glucosa durante 14 horas mediante Northern Blotting junto junto con ARNs de tejido adiposo y de hígado de rata. El IB1 se expresa abundantemente en los islotes aislados y su expresión no está regulada por la glucosa.

D.: Expresión del gen IB1 en el cerebro de la rata. Se separó un total de 10 \mug de ARN extraído del córtex (banda 1), de la glándula pituitaria (banda 2), del hipotálamo (banda 3), del cerebelo (banda 4) y de la médula (banda 5) en un gel de formaldehído y se analizaron mediante Northern Blot en busca de la presencia de IB1. Las dos transcripciones de IB1 se detectaron ampliamente en el córtex y en las regiones del hipotálamo. Posteriormente se rehibridizó la misma mancha con actina-\beta (fondo).

Figura 3

La proteína de IB1 se detecta en tejidos de rata adulta

A.: Análisis inmunoblot de IB1. Se dirigió un anticuerpo policlonal de conejo (\alpha-IB1) hacia la parte N-terminal de la proteína recombinante (aa 1-280) y se purificó por afinidad. El análisis Western Blot de los extractos celulares totales de \betaTC3 con el anticuerpo \alpha-IB1 demostró la presencia de un producto de 120 kDa que no se había detectado con el suero preinmune (CTRL).

B.: Determinación del peso molecular aparente de IB1. Se separó mediante electroforesis SDS-PAGE cADN de IB1 traducido in vitro en orientación sentido (S, ARN-polimerasa T3) o antisentido (AS, ARN-polimerasa T7) en presencia de metionina marcada ^{35}S. Se detecta un producto de 120 kDa solamente en el cADN traducido en la orientación sentido.

C.: Se transfectó transitoriamente en células COS-7 un plásmido que contenía cADN de IB1 conducido por un promotor CMV o su vector parental y los extractos celulares brutos (20 \mug) de estas células transfectadas se analizaron por Western Blotting. Utilizando los anticuerpos \alpha-IB1, se detectó una proteína de aproximadamente 120 kDa solamente en las células transfectadas que sobreexpresaban IB1.

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D.: Se llevaron a cabo experimentos similares en células COS-7 transfectadas transitoriamente con el vector pCMV-IB1 y se prepararon extractos citoplásmicos (CE) o nucleares (NE) 48 horas después de la transfección. Mediante análisis Western Blot, se detecta IB1 en el citoplasma y en el núcleo de las células transfectadas.

E.: 20 \mug de extractos celulares brutos procedentes de varios tejidos de rata y de la línea de células-\beta secretoras de insulina \betaTC3 se analizaron mediante Western Blotting utilizando anticuerpos \alpha-IB1. Se detectó la proteína IB1 en el cerebro y en la línea celular secretora de insulina.

Figura 4

Actividad similar de unión de ADN entre el elemento cis de GTII del promotor de GLUT2 y la secuencia amplificadora de insulina RIPE3

A.: Comparación de las secuencias de ácido nucleico entre el elemento regulador cis de GTII murino y el elemento promotor 3 de insulina de rata (RIPE3). Se describe alguna identidad de secuencias y corresponden, en parte, al elemento RIPE3b.

B.: Se realizaron experimentos SouthWestern utilizando extractos nucleares INS-1 separados por electroforesis en gel SDS-PAGE y transferidos una membrana de nitrocelulosa, posteriormente incubada con los oligonucleótidos marcados GTII, GTIII y RIPE3 concatenados. No se detectó ninguna unión específica con la sonda GTIII, mientras que las sondas GTII y RIPE3 se unen a una proteína de aproximadamente 120 kDa y con menos especificidad a un factor presente en 40 kDa, también detectable con la sonda GTIII.

C.: Se tranfectaron transitoriamente plásmidos que contenían cADN de IB1 conducido por un promotor de CMV (pCMV-IB1) o su vector parental (pCMV) en células COS-7 y se analizaron los extractos celulares brutos (20 \mug) de estas células transfectadas por SouthWestern con la sonda marcada GTII. Se detectó la proteína expresada de 120 kDa solamente en las células transfectadas con el vector de expresión eucariota que contenía el cADN de IB1.

D.: Análisis de retardo en gel realizado con las sondas GTII y RIPE3 utilizando extractos nucleares de \betaTC3. La actividad de unión a RIPE3 compite con un exceso 100 veces más importante de oligonucleótidos de RIPE3 o GTII no marcados, pero no con una secuencia no asociada (GTI). A la inversa, la actividad de unión a GTII compite con un exceso 1.000 veces más importante de oligonucleótidos de RIPE3 no marcados, pero no con una secuencia no asociada (GTI).

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Figura 5

Activación de los constructos amplificadoras de insulina y del promotor de GLUT2 por IB1

A.: Se transfectaron transitoriamente en células \betaTC3 dos \mug del vector de expresión eucariota que contenía el cADN de IB1 (PBKS/IB1) o su vector parental (PBKS) junto con 1 \mug del vector no promotor que codifica el gen de luciferasa (pGL3) o -338 pb del promotor GLUT2 murino clonado en el vector pGL3 (-338LUC) o -410 pb del promotor I de insulina de rata similarmente clonado en pGL3 (-410LUC). IB1 transactiva el promotor GLUT2 (1,6\pm0,1 (SEM) sobre el basal), pero es un potente transactivador del promotor de insulina (aumento repetido de 3,8\pm0,8 (SEM) sobre el basal). Este efecto es específico de las células-\beta, ya que no se observó en una línea celular productora de glucagón (InR1-G9, datos no mostrados) o en células no asociadas (COS-3).

B.: Se transfectaron transitoriamente varios constructos de deleción de exonucleasa III del promotor de insulina de rata unido a un gen reporter CAT en células de \betaTC3 en presencia de PBKS o PBKS/IB1. El IB1 transactivó el promotor de insulina y este efecto fue máximo dentro de los -316 a -159 pb del gen. Estudio representativo realizado por duplicado en tres experimentos independientes normalizado mediante el contenido en proteínas.

C.: Cinco copias del motivo RIPE3 fueron multimerizadas 5' de un promotor SV40 unido a un gen reporter de luciferasa. Este constructo fue transfectado en células \betaTC3 en presencia de PBKS o del constructo PBKS/IB1. El IB1 transactivó el constructo RIPE3-luc en estas células (aumento repetido de 2,9\pm0,3 (SEM) sobre el basal). Experimento representativo realizado 12 veces, por duplicado, y normalizado según el contenido en proteínas y/o la cotransfección de un constructo de HSK/TK-Renilla luciferasa como control interno.

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Figura 6

Estructura y organización del gen humano IB1, del cADN humano de IB1 y del seudogén humano de IB1

Se obtuvo una secuencia terminal 3' de cADN humano de IB1 examinando una librería de cADN de insulinoma humano, mientras que el extremo 5' se obtuvo por aproximación RACE (banda superior) o por comparación de la secuencia genómica (obtenida por subclonación de un clon BAC) con la secuencia del cADN de IB1 de rata, tal como se describe en los Métodos. El gen IB1 humano contiene 12 exones (rectángulos negros) separados por 11 intrones. Los dominios funcionales de IB1, tal como se deduce del análisis por ordenador, se dan dentro del rectángulo de cADN; \alpha indica la estructura alfa-helicoidal; NTS: señal de translocalización nuclear; P-rica: región rica en prolina; HLH: estructura hélice-bucle-hélice; PID: dominio de interacción de la fosfotirosina. Se obtuvo la secuencia del seudogen de IB1 mediante el análisis de la secuencia de parte de un fragmento de 4,8 kb aislado por subclonación de un clon de BAC.

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Figura 7 Análisis Southern Blot

Esta figura muestra el análisis Southern Blot del gen humano IB1.

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Descripción detallada Ácido nucleico de IB1

El "ácido nucleico de IB1" incluye una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A.

La secuencia que codifica IB1 puede ser aquella que se muestra en la Figura 1A, una secuencia de ácido nucleico complementaria o puede ser un mutante, una variante, un derivado o alelo de estas secuencias. La secuencia puede ser distinta de la que se muestra debido a un cambio que es uno o más de entre adición, inserción, deleción y sustitución de uno o más nucleótidos de la secuencia mostrada. Los cambios en una secuencia de nucleótidos pueden o no resultar en un cambio de aminoácidos al nivel de la proteína, tal como lo determina el código genético.

Por tanto, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede incluir una secuencia distinta de la secuencia mostrada en la Figura 1A que incluso codifica un polipéptido con la misma secuencia de aminoácidos. La secuencia completa de aminoácidos del polipéptido de IB1 de rata mostrada en la Figura 1A se compone de 714 aminoácidos. La secuencia completa de cADN humano de IB1 se muestra en la Figura 1E, componiéndose la secuencia de aminoácidos traducida de los 711 aminoácidos expuestos en la Figura 1F. El IB1 humano y de rata comparten un 94% de identidad con la secuencia del ácido nucleico y un 97% de identidad con la secuencia de aminoácidos.

Por otra parte, el polipéptido codificado puede comprender una secuencia de aminoácidos que difiere en uno o más residuos de aminoácido de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A. La presente invención proporciona además el ácido nucleico que codifica un polipéptido que es una secuencia de aminoácidos mutante, variante, derivada o alela de la secuencia mostrada en la Figura 1A. Se habla a continuación de estos polipéptidos. El ácido nucleico que codifica este polipéptido puede mostrar más de aproximadamente un 90% de homología de secuencia con la secuencia codificadora mostrada en la Figura 1A.

En general, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se proporciona como un aislado, en forma aislada y/o purificada, o exento o sustancialmente exento de material con el que está naturalmente asociado, por ejemplo exento o sustancialmente exento de ácido nucleico flanqueante de gen en el genoma humano, excepto posiblemente una o más secuencia(s) reguladora(s) para la expresión. El ácido nucleico puede ser total o parcialmente sintético y puede incluir ADN, cADN o ARN genómico. Cuando el ácido nucleico de acuerdo con la invención incluye ARN, la referencia a la secuencia mostrada debe interpretarse como referencia al equivalente de ARN, con T sustituyendo a U.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican la totalidad o parte del gen IB1 y/o sus elementos reguladores pueden ser preparadas fácilmente por el especialista que utilice la información y referencias contenidas aquí, así como mediante las técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, véase Sambrook, Fritsch y Maniatis, ``Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, y Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992). Estas técnicas incluyen (i) el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las muestras de este ácido nucleico, por ejemplo procedente de fuentes genómicas, (ii) la síntesis química, o (iii) la amplificación en E. coli. Se pueden realizar modificaciones en las secuencias de IB1, por ejemplo utilizando la mutagénesis sitio dirigida, para proporcionar la expresión del polipéptido IB1 modificado o tener en cuenta la preferencia del codón en las células huésped utilizadas para expresar el ácido nucleico.

Con el fin de obtener la expresión de las secuencias de ácido nucleico de IB1, las secuencias se pueden incorporar en un vector que tenga secuencias control operativamente unidas al ácido nucleico de IB1 para controlar su expresión. Los vectores pueden incluir otras secuencias, tales como promotores o amplificadores, para conducir la expresión del ácido nucleico insertado, secuencias de ácido nucleico para que el polipéptido de IB1 se produzca como una fusión y/o como ácido nucleico que codifica señales secretoras para que el polipéptido producido en la célula huésped sea secretado desde la célula. Entonces, el polipéptido de IB1 se puede obtener mediante la transformación de los vectores en células huésped en las que el vector es funcional, cultivo de las células huésped para que se produzca el polipéptido de IB1 y recuperación del polipéptido de IB1 de las células huésped o del medio circundante. Para ello, en la técnica se utilizan células procariotas y eucariotas, incluyendo cepas de E. coli, levaduras y células eucariotas tales como las células COS o CHO. Se puede utilizar la selección de la célula huésped para controlar las propiedades del polipéptido de IB1 expresadas en estas células, por ejemplo controlando dónde se deposita el polipéptido en las células huésped o influyendo en propiedades tales como su glucosilación y fosforilación.

En la patente de Estados Unidos Nº 4.683.195 se describen técnicas PCR para la amplificación de ácidos nucleicos. En general, estas técnicas requieren que la información de la secuencia procedente de los extremos de la secuencia diana sea conocida para que puedan diseñarse los cebadores de oligonucleótidos directos e inversos adecuados con el fin de que sean idénticos o similares a la secuencia de polinucleótidos diana para la amplificación. La PCR comprende las etapas de desnaturalización del ácido nucleico patrón (si es de doble cadena), alineación del cebado a la diana y polimerización. El ácido nucleico sondado o utilizado como patrón en la reacción de amplificación puede ser ADN, cADN o ARN genómico. La PCR puede utilizarse para amplificar secuencias específicas procedentes de ADN genómico, secuencias específicas de ARN y cADN transcrito a partir de mARN, bacteriófagos o secuencias de plásmidos. Las secuencias de ácido nucleico de IB1 proporcionadas aquí permiten fácilmente que el especialista diseñe los cebadores para la PCR. Como referencias para el uso general de las técnicas de PCR se incluyen Mullis y col., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, (1987), Ehrlich (ed), PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989, Ehrlich y col., Science, 252:1643-1650, (1991), "PCR protocols; A Guide to Methods and Applications", Eds. Innis y col. Academic Press, New York, (1990).

La hibridación generalmente viene seguida de la identificación de una hibridación exitosa y del aislamiento del ácido nucleico que se ha hibridizado con la sonda, lo que puede implicar una o más etapas de PCR.

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El ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se puede obtener mediante uno o más cebadores o sondas de oligonucleótidos diseñados para hibridizarse con uno o más fragmentos de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 1A, en particular fragmentos de secuencia relativamente rara, basados en el uso del codón o el análisis estadístico. Se puede emplear un cebador diseñado para hibridizarse con un fragmento de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la figura anterior conjuntamente con uno o más oligonucleótidos diseñados para hibridizarse en una secuencia en un vector de clonación, dentro del cual ha sido clonado el ácido nucleico diana, o en la denominada "RACE" (amplificación rápida de extremos de cADN), donde los cADNs de una librería se ligan a un enlazador de oligonucleótidos y se realiza la PCR utilizando un cebador que se hibridiza con la secuencia mostrada en la Figura 1A y un iniciador que se hibridiza al enlazador de oligonucleótidos.

Estas sondas o cebadores de oligonucleótidos, así como la secuencia de longitud completa (y los mutantes, alelos, variantes y derivados) son también útiles para el screening de una muestra de prueba que contenga ácido nucleico en busca de la presencia de alelos, mutantes y variantes, especialmente aquellos que conduzcan a la producción de formas inactivas de proteína de IB1, hibridizándose las sondas con la secuencia diana a patir de una muestra obtenida del individuo que se esté sometiendo a prueba. Pueden controlarse las condiciones de hibridación para que se minimice la unión no específica, y son preferentes las condiciones de hibridación preferentemente estringentes a moderadamente estringentes. Un especialista puede fácilmente diseñar estas sondas, marcarlas e idear las condiciones adecuadas para las reacciones de hibridación, ayudado por libros de texto tal como Sambrook y col. (1989) y Ausubel y col. (1992).

Así como determinan la presencia de polimorfismos o mutaciones en la secuencia de IB1, las sondas pueden emplearse también para determinar si en una célula o tejido está presente el IB1 que codifica mARN.

El ácido nucleico aislado y/o purificado a partir de una o más células (por ejemplo humanas) o a partir de una librería de ácidos nucleicos derivada de un ácido nucleico aislado y/o purificado procedente de células (por ejemplo una librería de cADN derivada de mARN aislado de células), puede ser sondado en condiciones de hibridación selectiva y/o puede ser sometido a una reacción de amplificación específica del ácido nucleico, tal como una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El gen humano de IB1 se localiza en el cromosoma 11 (11p11.12) y contiene múltiples exones. Puede utilizarse los polimorfismos dentro de este gen como marcadores para enfermedades genéticas humanas tales como la diabetes y trastornos neurológicos, incluyendo enfermedades neurodegenerativas tales como la demencia, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer; la epilepsia refractaria (formas de la familia); incapacidades neuronales tales como trastornos del habla y alteración de la memoria; tumores neuronales o gliales tales como neuroblastomas o glioblastomas; enfermedades autoinmunes que afectan al SNC como el lupus eritematoso sistémico; diabetes; enfermedades del corazón como infarto de miocardio e isquemia, ya que la apoptosis está implicada en las zonas
que rodean el infarto; y ataque cerebral; en particular en la prevención de la apoptosis en la isquemia o el infarto.

En el contexto de la clonación, puede resultar necesario que uno o más fragmentos del gen estén ligados para generar una secuencia codificadora de longitud completa. Asimismo, cuando no se ha obtenido una molécula de ácido nucleico codificador de longitud completa, puede emplearse una molécula más pequeña que representa parte de la molécula completa para obtener clones de longitud completa. Se pueden preparar inserciones procedentes de clones de cADN parciales y utilizarse para examinar las librerías de cADN. Los clones de longitud completa aislados pueden ser subclonados en vectores de expresión y se puede ensayar la actividad mediante transfección en células huésped adecuadas, por ejemplo con un plásmido reporter.

Un método puede incluir la hibridación de una o más (por ejemplo, dos) sondas o cebadores para dirigirse al ácido nucleico. Cuando el ácido nucleico es un ADN de doble hebra, generalmente la hibridación será precedida de la desnaturalización, para producir un ADN de hebra única. La hibridación puede ser parte de un procedimiento PCR o parte de un procedimiento de sondas que no implique la PCR. Un ejemplo de procedimiento sería una combinación de PCR e hibridación de baja estringencia. Un procedimiento de screening, elegido de entre los muchos de los que disponen los especialistas, se utiliza para identificar los eventos exitosos de hibridación y el ácido nucleido aislado hibridizado.

Puede medirse la unión de una sonda al ácido nucleico diana (por ejemplo, ADN) mediante cualquiera de las diversas técnicas de las que disponen los especialistas. Por ejemplo, las sondas pueden marcarse de forma radioactiva, fluorescente o enzimáticamente. Otros métodos que no emplean el marcado de sonda incluyen el examen de los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción, la amplificación mediante PCR, segmentación de los ARNs y sondeo de oligonucleótidos específicos de alelos.

Los sondeos pueden emplear la técnica estándar de Southern Blotting. Por ejemplo, se puede extraer el ADN de las células y digerirse con distintas enzimas de restricción. Los fragmentos de restricción pueden separarse entonces por electroforesis sobre un gel de agarosa, antes de la desnaturalización y ser transferidos a un filtro de nitrocelulosa. La sonda marcada puede ser hibridizada a los fragmentos de ADN sobre el filtro y determinarse la unión. Se puede preparar el ADN para los sondeos a partir de preparaciones de ARN procedentes de células.

Pueden llevarse a cabo experimentos preliminares por hibridación en condiciones de baja estringencia de varias sondas a las manchas Southern de ADN digerido con enzimas de restricción. Se pueden lograr condiciones adecuadas cuando se obtiene un gran número de fragmentos de hibridación, mientras la hibridación de fondo es baja. Al utilizar estas condiciones, se pueden buscar librerías de ácidos nucleicos, por ejemplo librerías de cADN, representativas de las secuencias expresadas.

Los especialistas en la materia pueden determinar las condiciones adecuadas de estringencia deseada para la hibridación selectiva teniendo en cuenta factores tales como la longitud del oligonucleótido y la composición de base, temperatura, etc.

En base a la información de la secuencia de aminoácidos, se pueden diseñar sondas o cebadores de oligonucleótidos teniendo en cuenta la degeneración del código genético y, cuando sea apropiado, el uso del codón del organismo del que deriva el ácido nucleico del candidato. Un oligonucleótido a utilizar en la amplificación del ácido nucleico puede tener aproximadamente 10 o menos codones (por ejemplo, 6, 7 u 8), es decir, tener una longitud de aproximadamente 30 o menos nucleótidos (por ejemplo, 18, 21 ó 24). Generalmente, los cebadores específicos tienen más de 14 nucleótidos de longitud, pero no más de 18-20. Los especialistas en la técnica conocen en profundidad el diseño de cebadores para los procedimientos a utilizar, por ejemplo PCR.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un fragmento de oligonucleótido o polinucleótido de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1A, caracterizado porque el fragmento de oligonucleótido o polinucleótido codifica para un polipéptido que tiene más del 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A, siendo un fragmento de la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la Fig. 1A, incluyendo el dominio desde los aminoácidos 566 a 612 de la secuencia mostrada en la Fig. 1A o una parte activa de aquel dominio o siendo un fragmento de una secuencia de aminoácidos tal como se expone en la Fig. 1A con al menos 20 aminoácidos en su longitud. El fragmento puede encontrarse por un método de obtención y/o de screening de ácidos nucleicos. Las secuencias mencionadas anteriormente pueden ser modificadas mediante la adición, sustitución, inserción o deleción de uno o más nucleótidos, pero preferentemente sin la abolición de la capacidad de hibridizarse selectivamente con el ácido nucleico de la secuencia mostrada en la Figura 1A, es decir cuando el grado de homología del oligonucleótido o del polinucleótido con una de las secuencias dadas es lo suficientemente alto.

Los fragmentos y demás oligonucleótidos pueden utilizarse como cebadores o sondas, tal como se ha dicho, pero se pueden generar también (por ejemplo, por PCR) en métodos relacionados con la determinación de la presencia, en una muestra de ensayo, de una secuencia indicativa de la susceptibilidad a una de las condiciones mencionadas anteriormente, por ejemplo a la diabetes, a la enfermedad de Parkinson y/o a la demencia.

El ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede utilizarse en métodos de terapia genética, por ejemplo en el tratamiento de individuos con el fin de prevenir o curar (total o parcialmente) las enfermedades anteriormente mencionadas. Esto también se expone a continuación.

Una forma adecuada para producir un polipéptido de acuerdo con la presente invención consiste en expresar el ácido nucleico que lo codifica, utilizando el ácido nucleico en un sistema de expresión. La utilización de los sistemas de expresión ha alcanzado un avanzado grado de sofisticación.

El polipéptido (tal como se revela) puede obtenerse según un método que incluye la expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido (generalmente el ácido nucleico de acuerdo con la invención). Esto se puede lograr de forma adecuada cultivando una célula huésped en un cultivo que contenga tal vector, en condiciones apropiadas que provoquen o permitan la expresión del polipéptido. Los polipéptidos se pueden expresar también en sistemas in vitro, por ejemplo en un lisato de reticulocitos.

Los sistemas para clonar y expresar un polipéptido en una variedad de distintas células huésped son bien conocidos. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células eucariotas, tales como aquellas de mamífero, y levaduras, y sistemas de baculovirus. Las líneas celulares mamíferas disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino, células HeLa, células renales de cría de hámster, células COS y muchas otras. Un huésped bacteriano común preferente es la E. coli.

Se pueden elegir o construir vectores adecuados que contengan las secuencias reguladoras apropiadas, incluidas las secuencias promotoras, fragmentos terminadores, secuencias de poliadenilación, secuencias amplificadoras, genes marcadores y demás secuencias, según convenga. Los vectores pueden ser plásmidos, virales por ejemplo fagos, o fagemidos, según convenga. Para más detalles, véase por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. En Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., eds., John Wiley & Sons, 1992, se describen detalladamente numerosas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo en la preparación de constructos de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión de genes, así como el análisis de las proteínas.

Así, otro aspecto de la presente invención proporciona una célula huésped que contiene el ácido nucleico tal como se revela aquí. El ácido nucleico de la invención puede estar integrado en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula huésped. La integración puede ser favorecida por la inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, según técnicas estándar. El ácido nucleico puede estar en un vector extracromosómico dentro de la célula.

El ácido nucleico se puede introducir en una célula huésped. La introducción, que generalmente se puede denominar sin limitación (particularmente para la introducción in vitro) "transformación", puede basarse en cualquier técnica disponible. Para las células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir la transfección con fosfato de calcio, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción utilizando retrovirus u otros virus, por ejemplo vaccinia o, para células de insectos, baculovirus. En cuanto a las células bacterianas, las técnicas apropiadas pueden incluir la transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección mediante el bacteriófago. Como alternativa, se puede emplear la inyección directa del ácido nucleico.

Pueden emplearse genes marcadores, tal como genes de sensibilidad o resistencia a los antibióticos, en la identificación de clones que contengan el ácido nucleico de interés, tal como es sabido en la técnica.

La introducción puede estar seguida de la provocación o permisividad de la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, cultivando células huésped (lo que puede incluir células realmente transformadas, aunque es probable que las células sean descendientes de las células transformadas) en condiciones que permitan la expresión del gen, para que se produzca el polipéptido codificado. Si el polipéptido se expresa acoplado a un péptido señal líder apropiado, se puede secretar desde la célula en el medio de cultivo. Después de la producción por expresión, un polipéptido puede aislarse y/o purificarse de la célula huésped y/o del medio de cultivo, según el caso, y posteriormente utilizarse como se desee, por ejemplo en la formulación de una composición, la cual puede incluir uno o más componentes adicionales, tal como una composición farmacéutica que incluya uno o más excipientes, vehículos o soportes farmacéuticamente aceptables (véase por ejemplo lo siguiente).

La introducción del ácido nucleico puede tener lugar in vivo por medio de terapias genéticas, tal como se expone a continuación.

Una célula huésped que contiene un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, por ejemplo como consecuencia de introducir el ácido nucleico en la célula o en un ascendiente de la célula y/o de la alteración genética de la secuencia endógena de la célula o ascendiente (introducción o alteración que puede tener lugar in vivo o ex vivo), puede estar incluida (por ejemplo en el soma) dentro de un organismo animal, en particular en un mamífero, humano o no humano, tal como un conejo, conejillo de Indias, una rata, un ratón u otro roedor, perros, gatos, cerdos, ovejas, cabras, ganado o caballos, o un ave, tal como un pollo. Se proporcionan también animales o aves genéticamente modificadas o transgénicas que comprenden esta célula como otros aspectos de la presente invención.

Esto puede tener un objetivo terapéutico. (Se expone a continuación la terapia genética.) La presencia de una secuencia mutante, de alelos o de variantes dentro de las células de un organismo, particularmente en lugar de una secuencia endógena homóloga, puede permitir utilizar el organismo como modelo en ensayos y/o estudios del papel del gen IB1 o de las sustancias que modulan la actividad del polipéptido codificado in vitro.

En el lugar en que se utilice, o lo mismo que se utiliza, para la producción de un polipéptido codificado por un transgen, las células huésped pueden utilizarse como fábricas de ácidos nucleicos para replicar el ácido nucleico de interés, con el fin de generar grandes cantidades del mismo. Se pueden realizar múltiples copias del ácido nucleico de interés dentro de una célula cuando se acopla a un gen amplificable tal como un DHFR. Las células huésped transformadas con el ácido nucleico de interés, o que descienden de células huésped en las que se ha introducido el ácido nucleico, pueden cultivarse bajo condiciones adecuadas, por ejemplo en un fermentador, pueden ser tomadas del cultivo y sometidas a un procesamiento para purificar el ácido nucleico. Después de la purificación, el ácido nucleico o uno o más fragmentos del mismo se pueden utilizar según se desee, por ejemplo en un ensayo de diagnóstico o pronóstico, tal como se expondrá aquí posteriormente.

Proteínas IB1

El término "actividad biológica de IB1" se define aquí como la unión al ácido nucleico que define los elementos promotores GTII o RIPE3 que provocan la activación transcripcional de un gen bajo el control de un promotor que incluye estos elementos. Los experimentos para determinar esta y otras actividades de IB1 se describen en detalle a continuación.

El especialista puede utilizar las técnicas descritas aquí y otras bien conocidas en la técnica para producir grandes cantidades del polipéptido de IB1, o fragmentos o partes activas del mismo, para su uso como producto farmacéutico, en el desarrollo de medicamentos, y para el estudio posterior de sus propiedades y papel in vivo.

Así, en otro aspecto de la presente invención se proporciona un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la Figura 1A, el cual puede encontrarse en forma aislada y/o purificada, exento o sustancialmente exento del material al que estaría asociado naturalmente, tal como otros polipéptidos o como otros polipéptidos humanos distintos del polipéptido de IB1 o (por ejemplo si se produce mediante la expresión en una célula procariota) que carezca de glucosilación nativa, por ejemplo no glucosilado.

La presente invención proporciona también polipéptidos que son variantes, alelos, derivados o mutantes de la secuencia de aminoácidos. Un polipéptido que es una variante, alelo, derivado o mutante puede tener una secuencia de aminoácidos diferente de la que se muestra en la Figura 1A en referencia uno o más de entre adiciones, sustituciones, deleciones e inserciones de uno o más aminoácidos. Los polipéptidos preferentes tienen la función de IB1, es decir activan los promotores de GLUT2 o de insulina, lo que conduce a la producción de proteína GLUT2 o insulina. Preferentemente, esta activación es específica de las células secretoras de insulina y no tiene lugar en células no pancreáticas o productoras de glucagón.

Un polipéptido que es una variante, alelo, derivado o mutante de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A puede comprender una secuencia de aminoácidos que comparte más del 80%, más del 90%, más del 95%, más del 98% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A. Se realizó la comparación de secuencias utilizando el programa de GCG, disponible de Genetics Computer Group, Oxford Molecular Group, Madison, Wisconsin, USA, Versión 9.1. Las variantes particulares de la secuencia de aminoácidos pueden ser diferentes de las que se muestran en la Figura 1A debido a la inserción, adición, sustitución o deleción de 1 aminoácido, 2, 3, 4, 5-10, 10-20, 20-30, 30-50, 50-100, 100-150, o más de 150 aminoácidos. A este respecto, "identidad de secuencia" significa la estricta identidad de aminoácidos entre las secuencias que se están comparando. Sin embargo, la "similitud de secuencias" incluye los cambios conservados en la secuencia de aminoácidos en base a que estos cambios conservados no afectarán sustancialmente a la estructura y/o a la función de la proteína. A modo de ejemplo, existe identidad de secuencias cuando dos polipéptidos tienen un residuo Met en las posiciones correspondientes. Si los dos polipéptidos tuvieran Val e Ile en las posiciones correspondientes, existe un alto grado de similitud, ya que ambos aminoácidos tienen cadenas laterales hidrofóbicas. Existe un grado más bajo de similitud entre Ser y Ala, mientras que no existe similitud alguna entre Gln y Glu. Los métodos de comparación de similitud son bien conocidos en la técnica.

La presente invención también incluye partes activas, fragmentos, derivados y miméticos funcionales de los polipéptidos de IB1 de la invención.

Una "parte activa" del polipéptido de IB1 alude a un péptido que es inferior a dicho polipéptido de IB1 de longitud completa, pero que conserva al menos algo de su actividad biológica esencial. Por ejemplo, fragmentos más pequeños de IB1 pueden actuar como secuestradores o antagonistas competidores mediante su interacción con otras
proteínas.

Un "fragmento" del polipéptido de IB1 alude a un trozo de los residuos de aminoácidos de al menos 20 a 30 o más aminoácidos contiguos. Los fragmentos de los determinantes antigénicos de la secuencia de polipéptidos de IB1 o epítopos son útiles para elevar los anticuerpos hasta una parte de la secuencia de aminoácido de IB1.

Un "derivado" del polipéptido de IB1 o un fragmento del mismo alude a un polipéptido modificado mediante la variación de la secuencia de aminoácidos de la proteína, por ejemplo por manipulación del ácido nucleico que codifica la proteína o alteración de la proteína misma. Estos derivados de la secuencia natural de aminoácidos pueden implicar la inserción, adición, deleción o sustitución de uno, dos, tres, cinco o más aminoácidos, sin alterar fundamentalmente la actividad esencial del polipéptido de IB1 de tipo salvaje.

"Mimético funcional" alude a una sustancia que puede no contener una parte activa de la secuencia de aminoácidos de IB1, y que probablemente no es un péptido en absoluto, pero que conserva la actividad biológica esencial del polipéptido natural de IB1. Se describe en detalle a continuación el diseño y el examen de los candidatos miméticos.

En algunas realizaciones, los fragmentos o derivados incluyen el dominio desde los aminoácidos 566 a 612 de la secuencia mostrada en la Figura 1A.

Tal como se muestra en la Figura 1C, IB1 comprende varios dominios distintos. La inserción del aminoácido 47 contiene un dominio putativo hélice-bucle-hélice, así como un PID. Los dominios PID tienen una longitud media de 100-160 aminoácidos y se componen de cuatro bloques conservados. El primer bloque del dominio de PID de IB1 está incluido dentro de la inserción del aminoácido 47. Este y el dominio HLH vecino pueden tener en cuenta las interacciones proteína-proteína, posiblemente con otros miembros de la vía de señalización de la tirosina-quinasa o con los factores de transcripción. El análisis por ordenador mostró también dos estructuras acídicas helicoidales (aa 31-61 y 114-125 en la secuencia de IB1 de rata) y una región rica en prolina (aa 292-366). Se encontraron señales putativas de localización nuclear en aa 163-190 y 242-270.

Un polipéptido de acuerdo con la presente invención puede ser aislado y/o purificado (por ejemplo mediante un anticuerpo), por ejemplo después de la producción, mediante la expresión del ácido nucleico codificador (para el cual véase a continuación). Los polipéptidos de acuerdo con la presente invención pueden generarse también total o parcialmente por síntesis química. El polipéptido aislado y/o purificado puede utilizarse en la formulación de una composición, que puede incluir al menos un componente adicional, por ejemplo una composición farmacéutica que incluye un excipiente, vehículo o soporte farmacéuticamente aceptable. Una composición que incluye un polipéptido de acuerdo con la invención puede utilizarse en un tratamiento profiláctico y/o terapéutico, tal como se expone a continuación.

Un polipéptido, fragmento de péptido, alelo, mutante o variante de acuerdo con la presente invención puede utilizarse como inmunogen o, de otro modo, en la obtención de anticuerpos específicos. Los anticuerpos son útiles en la purificación y demás manipulaciones de los polipéptidos y péptidos, examen de diagnóstico y contextos terapéuticos. Esto se expone más abajo.

Un polipéptido de acuerdo con la presente invención puede utilizarse en un screening en busca de moléculas que afecten o modulen su actividad o función. Estas moléculas pueden ser útiles en un contexto terapéutico (incluyendo posiblemente el profiláctico).

Los polipéptidos de IB1 pueden estar unidos también a un compañero de acoplamiento, por ejemplo a una molécula efectora, una marca, un medicamento, una toxina y/o una molécula de soporte o transporte. Las técnicas para acoplar los péptidos de la invención a los compañersos de acoplamiento, tanto peptidilo como no peptidilo, son bien conocidos en la técnica. En una realización, la molécula de soporte es una secuencia de péptidos de 16 aa derivada del homeodominio de Antennapedia (por ejemplo, la vendida bajo el nombre de "Penetratin"), que se puede acoplar a un péptido a través de un residuo terminal Cys. La molécula "Penetratin" y sus propiedades se describen en la WO 91/18981.

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Antagonistas de IB1

Los antagonistas de IB1 incluyen sustancias que tienen una o más de las siguientes propiedades:

(a): son sustancias capaces de inhibir la expresión de IB1;

(b): son sustancias capaces de reducir los niveles del IB1 presente en un tipo de tejido o célula diana uniéndose a y neutralizando el IB1; y/o

(c): son sustancias capaces de contrarrestar una propiedad biológica de la proteína IB1.

Un ejemplo de antagonista de IB1 es un anticuerpo capaz de unirse específicamente a la proteína de IB1.

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Métodos de Diagnóstico

Se conocen en la técnica diversos métodos para analizar muestras biológicas procedentes de individuos para determinar si el individuo porta un alelo de IB1 que le predisponga. Se pueden utilizar como marcadores para enfermedades genéticas humanas tales como la diabetes; trastornos neurológicos, incluyendo enfermedades neurodegenerativas como la demencia, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer; la epilepsia refractaria (formas de familia); incapacidad neuronal tal como trastornos del habla y alteración de la memoria; tumores neuronales o gliales como neuroblastomas o glioblastomas; enfermedades autoinmunes que afectan al SNC como el lupus eritematoso sistémico (SLE); diabetes; enfermedades del corazón como infarto de miocardio e isquemia, ya que la apoptosis está implicada en las zonas que rodean el infarto; y ataque cerebral; en particular en la prevención de la apoptosis en la isquemia o infarto. El propósito de estos análisis puede ser utilizado para el diagnóstico o pronóstico, para ayudar a un médico a determinar la gravedad o el curso probable del estado y/o para optimizar el tratamiento del mismo. Alternativamente, se pueden utilizar los métodos para detectar alelos de IB1 que estadísticamente se asociarían a una posibilidad de estos estados en el futuro, por ejemplo, identificando aquellos individuos, que se beneficiarían de un examen regular o de un tratamiento profiláctico.

En términos generales, los métodos se dividen en aquellos que buscan la presencia de secuencias de ácido nucleico de IB1 y aquellos que dependen de la detección de la presencia o ausencia del polipéptido de IB1. Los métodos hacen uso de muestras biológicas procedentes de individuos de las que se sospecha contienen secuencias de ácido nucleico o polipéptido. Ejemplos de muestras biológicas incluyen sangre, plasma, suero, muestras de tejidos, muestras de tumores, saliva y orina.

Los estudios típicos para detectar el ácido nucleico o polipéptidos de IB1 incluyen:

(a): la comparación de la secuencia de ácido nucleico en la muestra con la secuencia de ácido nucleico de IB1 para determinar si la muestra procedente del paciente contiene mutaciones; o,

(b): la determinación de la presencia en una muestra procedente de un paciente del polipéptido codificado por el gen de IB1 y, si está presente, la determinación de si el polipéptido es de longitud completa y/o está mutado y/o está expresado en el nivel normal; o,

(c): la utilización de la impresión digital de ADN para comparar el modelo de restricción producido cuando una enzima de restricción corta una muestra de ácido nucleico procedente del paciente con el modelo de restricción obtenido del gen normal de IB1 o de las mutaciones conocidas del mismo; o,

(d): la utilización de un miembro de unión específico capaz de unirse a una secuencia de ácido nucleico de IB1 (una secuencia normal o una secuencia mutada conocida), comprendiendo el miembro de unión específico un ácido nucleico hibridizable con la secuencia de IB1, o sustancias que comprendan un dominio de anticuerpos con especificidad para una secuencia nativa o mutada de ácido nucleico de IB1 o el polipéptido codificado por la misma, estando marcado el miembro de unión específico para que la unión del miembro de unión específico a su asociado de unión sea detectable; o,

(e): la utilización de una PCR que implica uno o más cebadores basados en la secuencia normal o mutada de genes de IB1 en busca del gen normal o mutante de IB1 en una muestra procedente de un paciente.

Un "par de unión específico" comprende un miembro de unión específico (sbm) y un compañero de unión (bp) que tienen mutuamente una especificidad particular y que, en condiciones normales, se unen uno a otro preferentemente a otras moléculas. Ejemplos de pares específicos de unión son los antígenos y anticuerpos, las moléculas y receptores y las secuencias complementarias de nucleótidos. El especialista podrá pensar en muchos otros ejemplos y no hace falta relacionarlos aquí. Además, el término "par de unión específico" es aplicable también cuando ambos o uno de entre el miembro de unión específico y el asociado de unión comprende parte de una molécula más grande. En los ejemplos en los cuales el par de unión específico es una secuencia de ácido nucleico, tendrán una longitud que les permita hibridizarse mutuamente en las condiciones de ensayo, preferentemente superior a 10 nucleótidos de longitud, en especial superior a 15 ó 20 nucleótidos de longitud.

En la mayoría de los ejemplos de screening de alelos con susceptibilidad a IB1, el ácido nucleico de IB1 en la muestra será amplificado inicialmente, por ejemplo mediante PCR, para aumentar la cantidad de analito en comparación con otras secuencias presentes en la muestra. Esto permite detectar las secuencias diana con un algo grado de sensibilidad, cuando están presentes en la muestra. Este paso inicial se puede evitar utilizando técnicas de análisis en micromatriz muy sensibles, que son cada vez más importantes en la técnica.

Una forma de variante del gen de IB1 puede contener una o más inserciones, deleciones, sustituciones y/o adiciones de uno o más nucleótidos en comparación con la secuencia de tipo salvaje, lo cual puede o no alterar la función del gen. Las diferencias en el nivel de ácido nucleico no se reflejan forzosamente en una diferencia en la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado, sino que pueden estar vinculadas a una disfunción conocida. Sin embargo, una mutación u otra diferencia en un gen puede resultar en un cambio de marco o codón stop, que podría afectar seriamente a la naturaleza del polipéptido producido (si lo hubiera), o resultar en una mutación puntual o cambio mutacional bruto del polipéptido codificado, incluidas la inserción, deleción, sustitución y/o adición de uno o más aminoácidos o regiones en el polipéptido. Una mutación en una secuencia promotora u otra región reguladora puede impedir o reducir la expresión del gen o afectar al procesamiento o a la estabilidad de la transcripción del mARN.

Existen diversos métodos para determinar la presencia o ausencia, en una muestra de ensayo, de una secuencia particular de aminoácidos, tal como la secuencia mostrada en la Figura 1A o 1E o de un mutante, variante o alelo de la misma. Ensayos típicos son la secuenciación del nucleótido, la hibridación mediante ácido nucleico inmovilizado en chips, pruebas de fenotipo molecular, pruebas de truncación de proteínas (PTT), pruebas de polimorfismo de conformación de hebra única (SSCP), detección de desajustes en la segmentación y electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE). Estas técnicas y sus ventajas e inconvenientes se revisan en Nature Biotechnology, 15:422-426, 1997.

Los ensayos se pueden llevar a cabo en preparaciones que contienen ADN, cADN y/o mARN genómico. Los ensayos de cADN o mARN presentan la ventaja de la complejidad del ácido nucleico, la cual se reduce debido a la ausencia de secuencias intrón, pero los posibles inconvenientes del mucho tiempo y esfuerzo necesario para elaborar las preparaciones. El ARN es más difícil de manipular que el ADN debido a la amplia aparición de ARNasas.

El ácido nucleico de una muestra a ensayar puede ser secuenciado y la secuencia ser comparada con la secuencia mostrada en la Figura 1A, para determinar si existen o no diferencias. Si existe, la diferencia se puede comparar con los alelos de susceptibilidad para determinar si el ácido nucleico de ensayo contiene una o más de las variaciones indicadas.

Ya que, en general, no resulta eficaz en tiempo o trabajo secuenciar todo el ácido nucleico en una muestra a ensayar o incluso todo el gen de IB1, se puede emplear una reacción de amplificación específica tal como una PCR utilizando uno o más pares de cebadores para amplificar la región de interés del ácido nucleico, por ejemplo el gen de IB1 o una región particular en la cual las mutaciones están asociadas a una susceptibilidad a una de las condiciones mencionadas anteriormente. El ácido nucleico amplificado se puede secuenciar entonces tal como se menciona anteriormente y/o se puede someter a ensayo de otra forma, para determinar la presencia o ausencia de una característica particular. El ácido nucleico para el ensayo se puede preparar a partir del ácido nucleico obtenido de células o de una librería, utilizando variedad de otras técnicas tales como la digestión y la electroforesis con enzimas de restricción.

Se puede examinar el ácido nucleico con una sonda específica de alelos o de variantes. En la secuencia, esta sonda corresponde a una región del gen de IB1, o a su complementaio, y contiene una alteración de secuencia conocida por estar asociada a una susceptibilidad a las condiciones mencionadas anteriormente. En condiciones estringentes adecuadas, la hibridación específica de una sonda como ésta para someter a ensayo el ácido nucleico es indicativa de la presencia de una alteración de secuencia en el ácido nucleico de prueba. En base a la eficacia, se puede utilizar más de una sonda en la misma muestra a ensayar.

De forma similar, se pueden utilizar oligonucleótidos específicos de variantes o alelos en la PCR para amplificar específicamente las secuencias particulares, cuando están presentes, en una muestra de prueba. La valoración de si una banda de PCR contiene una variante génica puede llevarse a cabo de diversas maneras conocidas por los especialistas en la materia. El producto de la PCR se puede tratar, por ejemplo de manera tal que se permita visualizar la mutación o el polimorfismo sobre un gel de secuenciación de ADN de poliacrilamida desnaturalizante, con bandas específicas que están unidas a las variantes del gen que se está seleccionando.

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Una alternativa o un suplemento para buscar la presencia de secuencias de variantes en una muestra de ensayo es buscar la presencia de la secuencia normal, por ejemplo utilizando una sonda o un cebador de oligonucleótido específico adecuado.

La utilización de sondas y cebadores de oligonucleótidos ha sido expuesta detalladamente anteriormente.

Se pueden emplear pruebas que dependen de la hibridación entre una sonda y el ácido nucleico de prueba y detección posterior de desajustes. En condiciones apropiadas (temperatura, pH, etc.), una sonda de oligonucleótido se hibridizará con una secuencia que no es totalmente complementaria. El grado de apareamiento de bases entre las dos moléculas será suficiente para que se alineen, a pesar del desajuste. En la técnica son bien conocidas diversas maneras de detectar la presencia de un desajuste entre dos moléculas de ácido nucleico de alineación.

Por ejemplo, la ARNasa A se segmenta en el sitio de un desajuste. La segmentación puede detectarse por electroforesis del ácido nucleico de ensayo, al que la sonda relevante o sonda se ha alineado, y buscando moléculas más pequeñas (es decir moléculas con movilidad electroforética más alta) que el híbrido sonda/prueba de longitud total. Otros estudios se basan en el uso de enzimas, tales como resolvasas o endonucleasas.

Así, una sonda de oligonucleótido que tiene la secuencia de una región del gen normal de IB1 (hebra sentido o antisentido) en el que se sabe que tienen lugar mutaciones puede alinearse al ácido nucleico de ensayo, determinándose la presencia o ausencia de un desajuste. La detección de la presencia de un desajuste puede indicar la presencia en el ácido nucleico de ensayo de una mutación. Por otra parte, una sonda de oligonucleótido que tiene la secuencia de una región del gen de IB1 que incluye una mutación puede alinearse al ácido nucleico de ensayo, determinándose la presencia o ausencia de un desajuste. La ausencia de un desajuste puede indicar que el ácido nucleico en la muestra de prueba tiene la secuencia normal. En cualquiera de los dos casos, se puede emplear una batería de sondas en distintas regiones del gen.

La presencia de diferencias en la secuencia de las moléculas de ácido nucleico puede detectarse mediante digestión con enzimas de restricción, tal como en un método de impresión digital de ADN donde el modelo de restricción producido cuando se utiliza una o más enzimas de restricción para cortar una muestra de ácido nucleico se compara con el modelo obtenido cuando una muestra que contiene el gen normal, o una variante o un alelo, es digerida con tal enzima o enzimas.

La presencia o ausencia de un elemento regulador importante en un promotor o en otra secuencia reguladora localizada en los intrones se puede evaluar también determinando el nivel de producción de mARN mediante transcripción o determinando el nivel de producción de polipéptidos mediante traducción a partir del mARN.

Por ejemplo, se puede proporcionar una muestra de ensayo de ácido nucleico mediante la extracción del ácido nucleico de las células, por ejemplo en la saliva o preferentemente sangre, o, para ensayos prenatales, del amnión, de la placenta o del feto mismo.

Existen varios métodos para determinar la presencia o ausencia, en una muestra de ensayo, de un polipéptido particular, tal como el polipéptido con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A o un mutante, variante o alelo de la secuencia de aminoácidos.

Se puede ensayar una muestra en busca de la presencia de un asociado de unión para un miembro de unión específico tal como un anticuerpo (o mezcla de anticuerpos) específico de una o más variantes particulares del polipéptido mostrado en la Figura 1A.

Se puede ensayar una muestra en busca de la presencia de un asociado de unión para un miembro de unión específico tal como un anticuerpo (o mezcla de anticuerpos) específico del polipéptido mostrado en la Figura 1A.

En estos casos, se puede ensayar la muestra poniéndola en contacto con un miembro de unión específico, tal como un anticuerpo, bajo condiciones apropiadas para la unión específica, antes de que se determine la unión, por ejemplo mediante un sistema reporter tal como se ha expuesto. Cuando se utiliza un panel de anticuerpos, se pueden emplear distintas etiquetas reporteras para cada anticuerpo, con el fin de poder determinar la unión de cada uno.

Se puede utilizar un miembro de unión específico, tal como un anticuerpo, para aislar y/o purificar su polipéptido asociado de unión de una muestra de ensayo, con el fin de determinar, en la secuencia y/o en el análisis bioquímico del polipéptido, si tiene la secuencia y/o las propiedades del polipéptido cuya secuencia se muestra en la Figura 1A, o si es una forma mutante o una variante. La secuenciación de aminoácidos es una rutina en la técnica y utiliza máquinas automatizadas de secuenciación.

Terapéutica Terapias con Productos Farmacéuticos y Péptidos

Los polipéptidos de IB1 pueden ser útiles en el tratamiento de un amplio espectro de trastornos debidos a la actividad biológica de IB1. En general, los estados que se pueden tratar caen dentro de cuatro áreas principales, diabetes, trastornos neurológicos, cáncer y en la inhibición o promoción de la apoptosis.

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Para el tratamiento de la diabetes, se puede utilizar IB1 para elevar el contenido y la secreción de insulina en un paciente y/o para elevar la expresión de GLUT2 y, con ello, la sensibilidad de un paciente a la glucosa. Además, los efectos antiapoptóticos de IB1 se pueden utilizar para inhibir la apoptosis de las células-\beta que aparece cuando se produce el agotamiento de las células-\beta en la diabetes de tipo II. También se podría utilizar el IB1 para inhibir la apoptosis observada durante la destrucción autoinmune en la diabetes de tipo I. El IB1 puede ayudar también a mejorar la supervivencia celular cuando se manipulan las células-\beta para su xenotransplante o encapsulación, por ejemplo en un polímero biocompatible.

Por otra parte, se puede utilizar el IB1 para promover la supervivencia celular de las neuronas y, como consecuencia, ser útil en la terapia de trastornos neurodegenerativos, enfermedades isquémicas, enfermedades autoinmunes del SNC, infarto cerebral, para promover la supervivencia celular en las células que rodean el infarto, enfermedad de Parkinson y para promover la supervivencia celular en secciones de la columna vertebral.

Teniendo en cuenta las aplicaciones anteriores, el IB1 desempeña un papel general en la protección de las células cuando existe apoptosis.

Los polipéptidos, péptidos y los ácidos nucleicos de IB1 de la invención pueden formularse en composiciones farmacéuticas. Estas composiciones pueden comprender, además de una de las sustancias anteriores, un excipiente, soporte, tampón, estabilizante u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los especialistas en la materia. Estos materiales no deben ser tóxicos y no deben dificultar la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza exacta del soporte o de otro material puede depender de la vía de administración, por ejemplo, oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular, intraperitoneal.

Las composiciones farmacéuticas para la administración oral pueden encontrarse en forma de pastillas, cápsulas, polvos o líquidos. Una pastilla puede incluir un soporte sólido, tal como gelatina, o un adyuvante. En general, las composiciones farmacéuticas líquidas incluyen un vehículo líquido tal como agua, productos petroquímicos, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Se puede incluir una solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles tales como etlenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

Para la inyección intravenosa, cutánea o subcutánea o para la inyección en el sitio enfermo, el ingrediente activo se encontrará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógenos y con un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Las personas muy especializadas la técnica son perfectamente capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando vehículos isotónicos tales como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección Lactada de Ringer, por ejemplo. Se pueden incluir, según se necesiten, conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos.

Cuando se trate de administrar un polipéptido, péptido, molécula de ácido nucleico, pequeña molécula u otro compuesto farmacéuticamente útil de acuerdo con la presente invención a un individuo, la administración se realiza preferentemente en una "cantidad profilácticamente eficaz" o en una "cantidad terapéuticamente eficaz" (según el caso, aunque se pueda considerar la profilaxis como terapia), siendo esto suficiente para ser de provecho para el individuo. La cantidad real administrada, así como la velocidad y la duración de administración, dependerán de la naturaleza y de la gravedad de lo que se esté tratando. La prescripción de tratamiento, por ejemplo la decisión de dosificación, etc., se encuentra bajo la responsabilidad de los internistas y demás médicos, y normalmente se basa en el trastorno a tratar, el estado del paciente individual, el sitio de suministro, el método de administración y demás factores conocidos por los médicos. Los ejemplos de técnicas y protocolos mencionados anteriormente se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980.

Alternativamente, se pueden utilizar terapias diana para suministrar el agente activo de forma más específica a ciertos tipos de células, utilizando sistemas diana tales como ligandos específicos de anticuerpos o células. El objetivo puede resultar deseable por diversas razones; por ejemplo cuando el agente es inaceptablemente tóxico, o cuando se requiera una dosificación demasiado alta, o si no se pudiera penetrar en las células diana de otro modo.

En lugar de administrar estos agentes directamente, podrían ser producidos en las células diana mediante la expresión desde un gen codificador introducido en las células, por ejemplo en un vector viral (una variante de la técnica VDEPT - véase a continuación). El vector podría dirigirse a las células específicas a tratar o podría contener elementos reguladores que fueran orientados de forma más o menos selectiva por las células diana.

Alternativamente, el agente podría ser administrado de forma precursora, para su conversión en la forma activa mediante un agente activador producido en o dirigido hacia las células a tratar. Este tipo de ensayo es conocido a veces como ADEPT o VDEPT; implicando el primero la orientación del agente activador hacia las células mediante la conjugación con un anticuerpo específico de las células, mientras que el último implica la producción del agente activador, por ejemplo, una enzima, en un vector, mediante la expresión desde el ADN codificador en un vector viral (véanse, por ejemplo, la EP-A-415731 y la WO 90/07936).

Una composición puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, simultánea o secuencialmente, dependiendo del estado a tratar.

Métodos de Terapia Genética

Como otra alternativa, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de IB1 auténtico biológicamente activo podría utilizarse en un método de terapia genética para tratar a un paciente incapaz de sintetizar el polipéptido activo o incapaz de sintetizarlo al nivel normal, produciendo así el efecto proporcionado por el IB1 de tipo salvaje y suprimiendo la aparición de diabetes en las células diana.

Para introducir genes en una gran variedad de distintas células diana, en la técnica anterior se han utilizado vectores tales como vectores virales. Típicamente, los vectores se exponen a las células diana para que pueda tener lugar la transfección en una proporción suficiente de células como para producir un efecto terapéutico o profiláctico útil a partir de la expresión del polipéptido deseado. El ácido nucleico transfectado se puede incorporar de forma permanente en el genoma de cada una de las células tumorales diana, produciendo un efecto de larga duración, o alternativamente puede que el tratamiento tenga que ser repetido periódicamente.

En el estado de la técnica se conocen diversos vectores, tanto vectores virales como vectores plásmidos, véase la patente de Estados Unidos Nº 5.252.479 y la WO 93/07282. En particular, se han utilizado diversos virus como vectores de transferencia de genes, incluidos papovavirus, por ejemplo SV40, virus Vaccinia, virus del herpes, incluidos el HSV y EBV, así como retrovirus. Numerosos protocolos de terapia genética han utilizado en la técnica anterior retrovirus murinos incapacitados.

Como alternativa al uso de vectores virales, otros método conocidos para introducir ácidos nucleicos en células incluyen la electroporación, coprecipitación de fosfato de calcio, técnicas mecánicas como la microinyección, transferencia mediada por liposomas y captación directa de ADN y transferencia de ADN mediada por receptor.

Tal como se ha mencionado anteriormente, el objetivo de la terapia genética utilizando un ácido nucleico que codifica el polipéptido de IB1, o una parte activa del mismo, consiste en incrementar la cantidad del producto de expresión del ácido nucleico en las células en las cuales el nivel de polipéptido de IB1 de tipo salvaje está ausente o está presente sólo a niveles reducidos. Las células diana para la terapia genética incluyen las células-\beta secretoras de insulina o las neuronas derivadas de células. Se puede utilizar la ingeniería celular para proporcionar una sobreexpresión de IB1 en las líneas celulares transfectadas, que entonces se pueden transplantar posteriormente a los humanos. La terapia genética se puede emplear utilizando un promotor para conducir la expresión de IB1 en un tejido de forma específica (es decir, un promotor de insulina unido al cADN de IB1 sobreexpresará IB1 en las células-\beta y temporalmente en el cerebro). Si una función defectuosa de IB1 estuviera implicada en la enfermedad neurológica, IB1 se puede sobreexpresar en las líneas celulares transformadas para el transplante.

Son preferentes las técnicas de transferencia de genes que se orientan selectivamente hacia el ácido nucleico de IB1 a tejidos diana. Ejemplos de ello incluyen la transferencia de genes mediada por el receptor, en la que el ácido nucleico está unido a un ligando-proteína vía polilisina, siendo el ligando específico de un receptor presente en la superficie de las células diana.

Podrían emplearse los vectores que expresan IB1 (utilizados en varios vectores como el adenovirus o retrovirus) si están integrados establemente como producto genético antiapoptótico. Esto permite que las células sobrevivan a un suceso de encapsulación altamente estresante para el xenotransplante, y/o sobrevivan a la hipoxia si están transplantadas en un entorno pobre en oxígeno, tal como el peritoneo. Las células entonces pueden sobrevivir y, si es necesario, secretar IB1. El IB1 puede ser útil en el tratamiento o la prevención de los estados descritos anteriormente, por ejemplo para promover la supervivencia celular si se secreta dentro del sistema nervioso central en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa.

Se ha expuesto anteriormente la tecnología antisentido basada en las secuencias del ácido nucleico de IB1.

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Métodos de Screening para Medicamentos

Un polipéptido de acuerdo con la presente invención puede utilizarse para detectar las moléculas que afectan o modulan su actividad o función. Estas moléculas pueden ser útiles en un contexto terapéutico (incluido posiblemente el terapéutico).

Es bien conocido que la investigación farmacéutica que conduce a la identificación de un nuevo medicamento puede implicar el screening de muchísimas sustancias candidatas, tanto antes o incluso después de haber encontrado un compuesto líder. Este es un factor que hace que la investigación farmacéutica sea muy cara y larga. Los medios para ayudar en el proceso de screening pueden tener una importancia y utilidad comercial considerable.

Un método para el screening de una sustancia que module la actividad de un polipéptido puede incluir poner en contacto una o más sustancias de ensayo con el polipéptido en un medio de reacción adecuado, probar la actividad del polipéptido tratado y comparar aquella actividad con la del polipéptido en un medio de reacción comparable no tratado con la sustancia o sustancias de ensayo. Una diferencia en la actividad entre los polipéptidos tratados y no tratados es indicativa de un efecto modulador de la o las sustancias relevante(s) de prueba.

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La tecnología de librerías combinatorias proporciona una manera eficaz de ensayar un número potencialmente considerable de distintas sustancias en cuanto a su capacidad para modular la actividad de un polipéptido. Estas librerías y su utilización son conocidas en la técnica. Es preferente el uso de librerías de péptidos.

Antes o al mismo tiempo que se examina la modulación de su actividad, se puede examinar la capacidad de las sustancias de ensayo para interactuar con el polipéptido, por ejemplo en un sistema de dos híbridos de levadura (que requiere que tanto el polipéptido como la sustancia de prueba puedan expresarse en la levadura a partir del ácido nucleico codificante). Esto se puede utilizar como un tamiz grueso antes de ensayar una sustancia en busca de su capacidad real para modular la actividad del polipéptido. Alternativamente, el tamiz se podría utilizar para cribar las sustancias de prueba en su unión a un asociado de unión específico de IB1, para encontrar miméticos del polipéptido de IB1, por ejemplo para someterlo a prueba en terapéutica.

En un ejemplo, las sustancias de prueba se pueden detectar en cuanto a la actividad biológica de un polipéptido de IB1, empleando el método una línea celular que no expresa el polipéptido de IB1, transformándose la línea celular con un vector de expresión que comprende un gen reporter bajo el control específico del promotor de GTII, comprendiendo el método la exposición de la línea celular a una sustancia de prueba y determinando si tiene lugar la expresión del gen reporter. Así, la unión de una sustancia de prueba al elemento promotor de GTII produce una señal desde el reporter (por ejemplo un cambio de color o la expresión de un producto detectable).

Después de la identificación de una sustancia que modula o afecta a la actividad del polipéptido, más tarde se puede investigar la sustancia. Además, se puede fabricar y/o utilizar en la preparación, es decir fabricación o formulación, de una composición, tal como un medicamento, composición farmacéutica o medicina. Se puede administrar a los individuos.

La sustancia identificada mediante la utilización de una molécula de ácido nucleico tal como un modulador de la actividad del polipéptido se puede utilizar en una composición farmacéutica, medicamento, medicina u otra composición que incluya esta sustancia, un método que comprende la administración de esta composición a un paciente, por ejemplo para el tratamiento (que puede incluir un tratamiento preventivo) de la diabetes, la utilización de esta sustancia en la fabricación de una composición para su administración, y un método para fabricar una composición farmacéutica que comprende la mezcla de esta sustancia con un excipiente, vehículo o soporte farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente otros ingredientes.

Una sustancia identificada utilizándola como modulador de la función del polipéptido puede ser peptídica o no peptídica por naturaleza. A menudo "pequeñas moléculas" no peptídicas son preferentes para numerosos usos farmacéuticos in vivo. En consecuencia, puede diseñarse un mimético o mímico de la sustancia (en particular si se trata de un péptido) para uso farmacéutico.

El diseño de un mimético de un compuesto farmacéuticamente activo conocido es un paso conocido hacia el desarrollo de productos farmacéuticos basados en un compuesto "líder". Esto puede resultar deseable cuando el compuesto activo es difícil o caro de sintetizar o cuando es inadecuado para una método particular de administración, por ejemplo los péptidos son agentes activos inapropiados para las composiciones orales ya que tienden a ser degradados rápidamente por las proteasas del tubo digestivo. Generalmente, se utilizan generalmente diseños miméticos, síntesis y pruebas para evitar el screening aleatorio de un gran número de moléculas en cuanto a su propiedad objetivo.

Normalmente se llevan a cabo varios pasos en el diseño de un mimético a partir de un compuesto que tiene una propiedad objetivo determinada. En primer lugar, se determinan las partes particulares del compuesto que son críticas y/o importantes en la determinación de la propiedad buscada. En el caso de un péptido, esto se puede realizar variando sistemáticamente los residuos de aminoácidos del péptido, por ejemplo por sustitución de cada residuo sucesivamente. Para refinar estos motivos peptídicos habitualmente en emplean exploraciones de alanina del péptido. Estas partes o residuos que constituyen la región activa del compuesto son conocidos como "farmacóforos".

Una vez encontrado el farmacóforo, se modela su estructura de acuerdo con sus propiedades físicas, por ejemplo la estereoquímica, unión, tamaño y/o carga, utilizando datos procedentes de múltiples fuentes, por ejemplo de técnicas espectroscópicas, datos de difracción de rayos X y NMR. En este proceso de modelación pueden emplearse análisis computacionales, mapas de similitud (que modelan la carga y/o el volumen de un farmacóforo, más que la unión entre los átomos) y demás técnicas.

En una variante de esta aproximación, se modela la estructura tridimensional del ligando y su compañero de unión. Esto puede ser especialmente útil cuando el ligando y/o el compañero de unión cambia la conformación en la unión, permitiendo que el modelo lo tenga en cuenta en el diseño del mimético.

Se selecciona entonces una molécula plantilla sobre la que se pueden injertar los grupos químicos que imitan el farmacóforo. La molécula plantilla y los grupos químicos injertados en el mismo pueden seleccionarse convenientemente para que el mimético sea fácil de sintetizar, sea probablemente aceptable desde el punto de vista farmacológico y no se degrade in vivo, mientras conserva la actividad biológica del compuesto "líder". Como alternativa, cuando el mimético se basa en un péptido, se puede lograr más estabilidad ciclando el péptido, aumentando su rigidez. El o los miméticos descubiertos mediante esta aproximación se pueden examinar entonces para ver si tienen la propiedad objetivo, o hasta qué punto la muestran. Luego se puede llevar a cabo otra optimización o modificación para obtener uno o más miméticos finales para un ensayo in vivo o clínico.

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Materiales y Métodos Construcción de una librería de expresión de cADN de INS-1 y clonación del cADN de IB1

Se generó un cADN cebado con oligo(dT) a partir de 10 \mug de ARN poli(A)^{+} obtenido de la línea celular diferenciada secretora de insulina INS-1 mediante un kit de síntesis de cADN (Stratagene, La Jolla, CA) según las instrucciones del fabricante. Se clonaron los cADN en los sitios EcoRI y XhoI del vector de expresión Lambda Zap Express (Stratagene, La Jolla, CA). Un total de 2 x 10^{6} colonias fueron cribadas por el procedimiento descrito por Singh y col. (38), utilizando como sonda los oligonucleótidos concatenados GTII. Se registraron 5 \mug de oligonucleótidos GTII de doble hebra (5'-GTAAAGGGTGTATTGATTGGATTACCATCAATACTCAGCTTCT-3') por el fragmento Klenow de ADN polimerasa I en presencia de (\alpha^{32}P)-desoxicitosina-trifosfato y los nucleótidos libres se separaron mediante una columna de centrifugación G-50. Estos oligonucleótidos marcados se ligaron posteriormente para generar la sonda concatenada. La clonación y expresión se realizaron exactamente como se ha descrito anteriormente para los experimentos SouthWestern, excepto que usamos 10 \mug/ml de ADN monohebra en lugar de poli dI/dC en un volumen total de reacción de 250 ml (3). Se obtuvo un clon positivo de IB1 a partir del cribado y del cADN secuenciado en ambas orientaciones 5' y 3'.

Líneas celulares

La línea celular INS-1 de insulinoma transplantable de rata inducido por rayos X fue proporcionada por Asfari y col., y se cultivó tal como se ha descrito (1). La línea celular \betaTC3 productora de insulina en el ratón, las células InR1-G9 productoras de glucagón en el hámster y la línea celular COS-7 derivada del riñón fueron cultivadas en un medio RPMI 1640 que contenía un 10% de suero de ternera fetal, 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina (9, 40).

Construcciones de plásmidos, transfecciones temporales, ensayos con CAT y luciferasa

Se construyó el vector de expresión eucariota que codifica IB1 mediante la inserción del cADN de IB1 en los sitios NhI/XhoI del plásmido PBKS conducido por CMV (Stratagene, La Jolla, CA) para generar el vector PBKS-IB1. Se empleó la mutagénesis por PCR para añadir un epítope FLAG (Kodak, New Haeven, CT) justo en el C-terminal de la metionina iniciadora del cADN de IB1 en el constructo PBKS-IB1. Se utilizó la secuenciación con didesoxi de los plásmidos resultantes para confirmar la secuencia correcta de los clones así obtenidos. El -410 pb del promotor de insulina II en rata y el -338 pb del promotor de GLUT2 murino fueron clonados 5' del gen de la luciferasa del vector pGL3Basic (Promega, Madison, WI). Se multimerizaron los oligonucleótidos de doble hebra de RIPE3 (5-GATCTGGAAACTGCAGCTTCAGCCCCTCTGGCCATCTGCTGATCCG-3'), se registraron por Klenow y se ligaron con los extremos redondeados en el sitio SmaI del promotor temprano mínimo SV40 unido a un gen de luciferasa (promotor pGL3, Promega). Las cinco copias del elemento RIPE3 clonado en el promotor pGL3 fueron secuenciadas. Los -316, -289, -254, -188, -159 y -66 pb del promotor de insulina I de rata unidos al gen reporter de CAT fueron proporcionados amablemente por Jacques Philippe de la University Medical School de Ginebra.

Todas los constructos fueron transfectados temporalmente utilizando el reactivo catiónico DOTAP en solución, tal como lo recomienda el suministrador (Boehringer Mannheim). Dos \mug de los ADNs reporter (constructos de luciferasa o CAT) con 1 \mug del transactivador (PBKS o PBK/IB1) se utilizaron para 1-2 x 10^{6} células y se incubaron durante 48-56 horas. En algunos experimentos de transfección, se incluyó la cotransfección con 500 ng del promotor de la timidina-quinasa del virus de herpes simplex (HSV-TK) que conduce el gen de la luciferasa Renilla (Promega, Madison, WI) para controlar la eficacia de la transfección. Las células transfectadas se cosecharon con tampón de lisis Promega, se eliminaron los restos celulares y se recogió el sobrenadante. Se determinaron las concentraciones de proteínas mediante el ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Se midieron dos veces las actividades de la luciferasa con 50 a 100 \mug de extractos proteicos procedentes de cada placa transfectada de acuerdo con el protocolo de Brasier y col. (4).

Ensayos de cambio de gel y experimentos SouthWestern

Se prepararon extractos nucleares y citoplásmicos de acuerdo con el método de Dent y Latchmann (7). Se describen más arriba las secuencias de los oligonucleótidos GTII y RIPE3. Los oligonucleótidos sentido y antisentido complementarios fueron hibridizados y luego registrados por el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I en presencia de trifosfato de desoxicitosina (\alpha32P). La sonda marcada en sus extremos fue incubada con 2 \mug de extractos nucleares exactamente tal como se ha descrito anteriormente para los ensayos de cambio de banda (3). Se realizaron los experimentos SouthWestern tal como se ha descrito con las modificaciones detalladas más arriba (3). Los experimentos de traducción in vitro se realizaron utilizando el kit de translación-traducción acoplado (TNT) de Promega (Madison, MI) y de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en presencia de metionina (^{35}S). La proteína marcada se resolvió mediante PAGE sobre un gel que contenía un 10% de SDS.

ARN y Análisis Northern Blot

El aislamiento del ARN y el análisis Northern Blot procedente de tejidos o líneas celulares de rata se realizaron exactamente como se ha descrito anteriormente (3). Los islotes pancreáticos de rata fueron aislados por medio del método de Gotoh y col. (15).

Preparación de Antisueros

Se preparó el antisuero anti-IB1 utilizando un fragmento de cADN que codifica los primeros 280 aminoácidos de la proteína. Se insertó este fragmento en el vector de expresión pQE-9 marcado con His (Quiagen, Basilea, Suiza), expresado y posteriormente purificado a través de una columna que contenía Ni^{2+} siguiendo las instrucciones del fabricante (Quiagen, Basilea, Suiza) y utilizado para obtener anticuerpos policlonales en los conejos. Para purificar por afinidad los anticuerpos, los 1-280 aa purificados por columna de Ni^{2+} de la proteína recombinante fueron inmovilizados sobre una membrana de nitrocelulosa y el suero de conejo fue purificado mediante varios pasos de incubación con esta membrana en PBS (solución salina tamponada con fosfato) y elución en 0,2M de Tris-glicina a un pH 2,8, seguido de neutralización a un pH de \sim7,5.

Inmunohistoquímica

Se realizó una perfusión con PBS en ratones adultos bajo anestesia profunda y se quitaron rápidamente los páncreas, se incubaron durante 6 horas en paraformaldehído al 4% y se procesaron para inmersión en parafina. Se utilizaron para la inmunocitoquímica secciones de 8 \mum. En resumen, se incubaron las secciones en presencia de un 5% de H_{2}O_{2} durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron en PBS y se incubaron durante toda la noche en presencia de un 5% de seroalbúmina bovina disuelta en el tampón PBS que contenía un 0,5% de Triton X-100 y un 2% de suero de cabra. Luego, se incubaron las secciones durante 14 horas a 4ºC con el suero anti-IB1 preinmune o inmune purificado por afinidad (dilución 1/200) y luego durante 2 horas a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario (IgG cabra anti-conejo biotinilado del Vector/Reactolab S.A.) y 2 horas a temperatura ambiente con un complejo de avidina-peroxidasa biotinilada (ABC, Vector Reactolab S.A.). La reacción de peroxidasa se visualizó finalmente con 3,3'-diaminobencidina tetrahidrocloruro dihidrato (Fluka, Buchs, Suiza) en PBS que contenía un 0,2% de H_{2}O_{2}. Se tomaron fotografías con un microscopio Leica utilizando la óptica de luz transmitida y películas Kodak Ektachrome EPJ 320. Para la inmunocoloración, células \betaTC3 o células COS-7 transfectadas, se colocaron estas células sobre placas de portaobjetos de vidrio 48 horas antes del experimento.. Se fijaron las células con metanol/acetona (50:50) enfriados con hielo y se procesaron tal como se ha descrito anteriormente con el kit de detección ABC. En las células COS-7, se consiguió la detección del epítope FLAG utilizando como anticuerpo secundario un anticuerpo monoclonal de ratón comercialmente disponible (Kodak, New Haeven, CT) dirigido contra el FLAG, posteriormente visualizado con los anticuerpos cabra anti-ratón marcados con isotiocianato de fluoroesceína (FITC). Los anticuerpos anti-IB1 de conejo se detectaron utilizando un anticuerpo cabra anti-conejo marcado con rojo Texas. Se obtuvieron las imágenes de fluorescencia con películas Kodak 1600 ASA.

Secuencia del cADN de IB1 humano

Se utilizó inicialmente un cADN de IB1 de rata radiomarcado para cribar a baja estringencia una librería de cADN de insulinoma humano. Brevemente, se aisló el ARN poli(A)+ utilizando el kit de purificación de ARN Poli A+ de Promega (Promega, Madison, WI) y se construyó una librería de cADN utilizando el vector de expresión \lambda Zapp II Express (Stratagene, La Jolla, CA) según las instrucciones del fabricante. Se sometió un clon positivo al análisis secuencial, lo que reveló que la inserción de 1,8-kb era homóloga a los nucleótidos 1.440 a 2.252 del cADN de IB1 de rata. Se utilizaron dos reacciones RACE en 5' (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Alemania) para obtener parte de la secuencia 5' del cADN de IB1 humano. El primer paso en estas dos reacciones fue una amplificación por RT-PCR en ARN total aislado de un glucagonoma humano. Las amplificaciones por RT-PCR se realizaron utilizando un iniciador de anclaje oligo-dT (proporcionado en el kit) y como iniciadores antisentido los oligonucleótidos RACE-1 ó -2, respectivamente (Tabla 1). Dos pasos consecutivos de amplificación por PCR se realizaron entonces sobre el producto de RT-PCR utilizando el iniciador de anclaje por PCR (proporcionado en el kit) y como iniciadores antisentido los oligonucleótidos anidados RACE-3 y -4 (para la primera reacción) o RACE-5 y -6 (para la segunda reacción). La primera reacción de RACE produjo la secuencia correspondiente a los nucleótidos 70 a 290, mientras que la segunda reacción de RACE dio las secuencias 480 a 711 del cADN de IB1 humano. Las secuencias restantes del cADN de IB1 humano (nucleótidos 1 a 69, 291 a 479 y 712 a 1.439) se dedujeron comparando la secuencia del cADN de IB1 de rata con las secuencias genómicas obtenidas de una librería de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) de ADN genómico humano (véase a continuación).

Screening de una librería de BAC de ADN genómico humano y análisis de secuencias de los clones de BAC

Se cribó una librería de BAC del ADN genómico humano (Research Genetics, Rockville, MD) utilizando como sonda el fragmento de 1,8-kb correspondiente al extremo 3' del cADN de IB1 humano, tal como se ha descrito anteriormente. Se seleccionaron los clones positivos a BAC, se purificaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se digirieron con BamH1/BglII para su análisis Southern Blotting según los protocolos estándar. Para la comparación, se utilizó ADN genómico extraído de leucocitos circulantes de un individuo aparentemente sano.

Los fragmentos generados por digestión con BamH1/BglII de dos clones positivos de BAC fueron subclonados dentro de un vector KS=/-Bluescript. Estos subclones fueron cribados utilizando dos sondas de no-solapamiento, el fragmento de 1,8 kb correspondiente al extremo 3' del cADN de IB1 humano, tal como se ha descrito anteriormente, o un fragmento de 955 pb correspondiente al extremo 5' del cADN de IB1 de rata. Los clones positivos se identificaron y se sometieron al análisis de secuencia utilizando los oligonucleótidos T3 y T7. Se utilizó una aproximación de trabajo para obtener las secuencias intervinientes. Finalmente, dos pares de oligonucleótidos (IB1-787F e IB1-1326R; IB1-1346F e IB1-1602R) diseñados en base a la secuencia del cADN de IB1 humano se utilizaron para la amplificación por PCR, empleando el clon de BAC o los subclones de Bluescript como plantillas. Los fragmentos amplificados por PCR fueron clonados dentro del factor del plásmido pGEM-T Easy (Promega) o se secuenciaron directamente.

Hibridación fluorescente in situ (FISH)

Se realizó un análisis FISH utilizando como sondas los productos de los clones BAC-A o BAC-B digeridos con BamH1/BglII, respectivamente. Una parte alícuota de células de sangre periférica fresca se lavó dos veces en PBS y se cultivó durante 2-3 días en RPMI 1640 que contenía un 20% de suero de ternera fetal. Se incubaron las células con colcemid, se trataron con una solución hipotónica de KCl y se fijaron con una solución de ácido acético:metanol (1:3). Los portaobjetos de los cromosomas fueron desnaturalizados en una solución que contenía un 70% de formamida en 2 x SSC a 75ºC durante 2 minutos. Un total de -250 ng deADN fueron marcados por translación de nick incorporando biotina-dUTP (Boehringer-Mannheim) y tratados luego con ADNasa I (Pharmacia, Uppsala, Suecia) a una concentración de 50 pg/\mul durante 20 minutos a temperatura ambiente. La ADNasa I fue inactivada a 70ºC durante 10 minutos. La sonda marcada fue desnaturilazada a 37ºC durante 10 minutos en 25 \mul de Hybridsol VII (Oncor), se dejó que se realineara al ADN humano Cot1 (3 \mug) a 37ºC durante 15 a 30 minutos y se hibridizó durante toda la noche. Las señales de hibridación se detectaron utilizando anticuerpos monoclonales anti-digoxigenina conjugados con rhodamina o FITC-avidina (Boehringer-Mannheim).

Mapas de híbridos de radiación

Se utilizaron mapas de híbridos de radiación para realizar con precisión el mapa del gen de IB1. En la primera serie de experimentos, la amplificación por PCR se llevó a cabo utilizando un par de oligonucleótidos (IB1-1346F y IB1-1602R) diseñados al principio de acuerdo con la secuencia del cADN de IB1 humano (nucleótidos 1.346 a 1.602). Posteriormente, se diseño un segundo conjunto de oligonucleótidos (IB1-f e IB1-r). La amplificación se realizó en placas de 96 pozos (Polyfiltronics, Rockland, MA). Cada reacción contenía 25 ng de ADN, 0,3 mM de cada cebador, 0,2 mM de dNTP's, 0,2 unidades de polimerasa AmpliTaq y 1x tampón de PCR (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) (se añadió también un 5% de DMSO cuando se estaba utilizando el segundo conjunto de cebadores) en un volumen total de 20 \mul. El programa de PCR consistió en una desnaturalización inicial de 2 minutos (4 minutos para el segundo conjunto de cebadores) a 94ºC, seguida de 35 ciclos de 94ºC durante 30 segundos (1 minuto), 58ºC (62ºC) durante 1 minuto, 72ºC durante 1 minuto y una extensión final de 3 minutos (4 minutos) a 72ºC. Se registraron los amplicones después de la electroforesis en 3:1 gel NuSieve-Agarosa al 3% (peso/volumen) (FMC BioProducts, Rockland ME). Se evaluaron los STS de IB1 por célula somática y el híbrido de radiación tanto en Panel # 2 de Mapas de híbridos de células somáticas Humanas/Roedores de NIGMS (Cornell Institute for Medical Research, Camden NJ) como en Panel de Híbridos de Células Somáticas Monocromosómicas de ADN capaces de PCR (BIOS, New Haven CT). Se utilizaron los paneles de híbridos de radiación Stanford 3 (G3) y Genebridge 4 (GB4) (Research Genetics) para localizar con más precisión los genes. Los vectores procedentes de los paneles G3 y BG4 fueron analizados utilizando la Versión 3.0 RHMAP RH2PT (57) y la Versión 1.1 RHMAPPER (58) respectivamente.

Análisis Northern Blot de la expresión de IB1 en tejidos humanos

Se hibridizaron un total de 2 \mug de ARN poli(A)+ aislado de varios tejidos humanos (Clontech) a 42ºC con la sonda de 1,8 kb marcada ^{32}P correspondiente al extremo 3' del cADN de IB1 humano (tal como se ha descrito anteriormente) en un tampón 5 x SSC que contenía 0,1 M de NaPO_{4}, 10 mmol/l de EDTA, un 50% (v/v) de formamida, un 1% (peso/volumen) de SDS, 5 x Denhardt's y 0,1 mg/ml de tARN. Después de su lavado, se expuso el filtro.

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Resultados Ejemplo 1 Aislamiento y análisis de secuencias de cADN de IB1

La identificación de un elemento cis denominado GTII localizado en la región proximal del promotor GLUT2 que es funcionalmente importante para conferir la expresión pancreática del gen fue el paso inicial hacia la identificación de los factores putativos de transacción específicos del islote (3). Por tanto, los inventores construyeron un librería utilizando células INS-1 ya que la actividad de unión de GTII se reduce a las células secretoras de insulina y su abundancia era la más alta en una línea celular que expresa grandes cantidades de GLUT2 endógeno. Por tanto, se construyó e investigó una librería de expresión de cADN de INS-1 iniciado por poli-dT mediante el procedimiento descrito por Singh y col., (38), utilizando como sonda los oligonucleótidos GTII concatenados. Se aisló un clon positivo de un primer screening de aproximadamente 2 x 10^{6} placas de fagos. La inserción larga de 2.990 pb codifica un marco de lectura muy abierto de 714 aminoácidos. El producto genético contenido en este clon fue denominado posteriormente IB1 para el Islet-Brain 1, ya que su expresión se limita principalmente a estos dos tejidos, tal como se expone más abajo. La secuencia de aminoácidos deducida reveló la presencia de un dominio putativo de dimerización HLH conservado con otros miembros de la familia de bHLH (Figura 1). Con la utilización del algoritmo SOPMA (método de predicción auto-optimizado a partir de alineaciones, CNRS, Lyon, Francia), el análisis por ordenador predice dos estructuras helicoidales ácidas (aa 31-61 y 114-125) y una región rica en prolina (aa 292-366) en la parte amino terminal de la proteína, que podrían actuar como dominios de transactivación (25). También se reconocieron las señales putativas de localización nuclear (aa 163-190 y 242-270) (8).

Ejemplo 2 Distribución del tejido de la expresión de IB1

El análisis Northern Blot de ARN total y de ARN poliA+ procedentes de varios tejidos de rata adulta, así como las líneas celulares, indicaban que el IB1 se expresa ampliamente como una transcripción de 3 y 3,2 kb en varias líneas celulares secretoras de insulina (INS-1 y RIN5F), en los islotes pancreáticos aislados y en el cerebro (Figura 2). Se detectaron también las transcripciones de IB1, aunque en menor grado, en el riñón y el corazón. En este último, se detectó una única transcripción de 3,2 kb. En el cerebro, la expresión de IB1 es más alta en el córtex y en la glándula pituitaria, aunque también se detectaron transcripciones de IB1 en el hipotálamo, el cerebelo y la médula (Figura 2D). En los islotes pancreáticos aislados, la expresión de IB1 no se reguló mediante el incremento de la concentración de glucosa en el medio de incubación de 2,8 mM a 30 mM, lo que sugiere que el gen no es regulado transcripcionalmente por la glucosa como es el caso para GLUT2 (52). Por tanto, la expresión de IB1 se limita a unos pocos tejidos y, es importante, el mARN de IB1 no se detecta en el hígado en el que GLUT2 se expresa ampliamente.

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Ejemplo 3 El IB1 se inmunodetecta en tejidos de rata y en líneas celulares secretoras de insulina

Los anticuerpos se elevaron contra la parte N-terminal de IB1 producida de forma bacteriana (aa 1-280). Estos anticuerpos policlonales fueron purificados por afinidad, tal como se describe en Materials and Methods y se utilizaron en el Western Blotting. Como se muestra en la Figura 3A, estos anticuerpos detectan una proteína de 120 kDa en los extractos nucleares de \betaTC3, que comigran con el producto obtenido por la traducción in vitro del cADN de IB1 en presencia de ^{35}S metionina (Figura 3B). De forma similar, se ha podido detectar la proteína de IB1 en los extractos tanto nucleares como citoplásmicos obtenidos de células COS-7 temporalmente transfectadas con el cADN de IB1 conducido por CMV, lo que sugiere que IB1 está translocalizado activamente en el núcleo (Figura 3C y D). Un estudio de diversos tejidos de rata confirmó que las transcripciones de IB1 expresadas en el cerebro se traducen en proteína inmunodetectable una vez analizadas por Western Blotting (Figura 3E).

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Ejemplo 4 Análisis de inmunotinción de la expresión de IB1

Para obtener más información con respecto al tejido y a la localización celular de IB1 dentro del páncreas, se realizaron estudios inmunohistoquímicos sobre islotes de ratón y células \betaTC3. Utilizando anticuerpos purificados por afinidad dirigidos contra IB1, se detectó este factor en el islote pancreático, con una coloración que es diferente de la que se obtuvo con los anticuerpos anti-GLUT2 o anti-insulina. La reacción de inmunotinción es negativa en células \betaTC3 incubadas con suero preinmune, mientras que la señal es positiva en los núcleos y el citoplasma de las mismas células expuestas al suero anti-IB1. Para confirmar la especificidad de los anticuerpos anti-IB1 en la inmunocitoquímica, se generó un constructo que incluía un epítope FLAG N-terminal de la proteína de IB1 expresada bajo el control de un promotor de CMV. Este constructo fue transfectado temporalmente en células COS-7, se inmunodetectó con un anticuerpo anti-FLAG, visualizado posteriormente mediante coloración con FITC, o con el anticuerpo anti-IB1, visualizado posteriormente con un anticuerpo anti-conejo marcado con rojo Texas. La proteína de IB1 se detectó en las células COS-7 transfectadas con los anticuerpos tanto anti-FLAG como anti-IB1, lo que confirma que la proteína está translocalizada correctamente, al menos en parte, en los núcleos de las células COS-7 y que el anticuerpo anti-IB1 es específico de IB1.

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Ejemplo 5 La proteína de IB1 se une específicamente a GTII y a la secuencia del amplificador de insulina RIPE3

Por analogía con PDX-1, que demostró ser un factor de transcripción de tipo homeodominio y que se expresa específicamente en los islotes pancreáticos y es capaz de controlar varios genes expresados solamente en estas células a través de las secuencias de ADN homólogas (22, 24, 28, 53, 54), supusimos que IB1 podría controlar de forma similar varios genes dentro de las células-\beta. La cis-secuencia de GTII utilizada para la clonación y expresión de IB1 comparte identidad con algunas secuencias de ácido nucleico, con una importante secuencia del amplificador del promotor de insulina denominado RIPE3 para el elemento 3 del promotor de insulina de rata. Se demostró anteriormente que este elemento RIPE3 participaba en el control específico de la célula-\beta del gen de insulina (17, 20). Tal como se describe en la Figura 4A, algunas secuencias conservadas de ácido nucleico están presentes entre GTII y RIPE3.

Mediante análisis SouthWestern de los extractos nucleares de INS-1, las sondas tanto de GTII como de RIPE3 detectaron una proteína de 120 kDa que era similar en tamaño al producto obtenido por la traducción in vitro del cADN de IB1 en presencia de ^{35}S metionina y a la proteína detectada por la utilización de los anticuerpos anti-IB1 (Figura 4B). Además, el cADN de IB1 fue clonado en 3' a un promotor de CMV y transfectado temporalmente en COS-7, una línea celular que carece de IB1 endógeno. Los extractos celulares brutos fueron analizados posteriormente por la técnica SouthWestern, utilizando una sonda de GTII. Sólo las células COS-7 transfectadas con IB1 expresan la proteína de unión a GTII de 120 kDa esperada (Figura 4C). Por tanto, el cADN de IB1 se traduce en un producto de 120 kDa que es capaz de unirse a la sonda de GTII de una forma similar a la actividad de unión endógena observada en los extractos nucleares de INS-1 y \betaTC3.

También se realizaron análisis de retardo en gel utilizando los elementos de GTII o de RIPE3 como sonda con los extractos nucleares de \betaTC3. Tal como se muestra en la Figura 4D, la actividad de unión a GTII compite con un exceso de RIPE3 frío y a la inversa, la actividad de unión a RIPE3 compite con un exceso de nucleótidos de GTII frío. Por tanto, las actividades similares de unión al ADN presentes en las células secretoras de insulina interactúan con las secuencias reguladoras tanto de GTII como de RIPE3. Esto sugiere que IB1, que se une a GTII y RIPE3, puede regular la expresión de los genes de insulina y GLUT2. Entonces se generaron constructos que incluían solamente la parte amino (aminoácidos 1-280) o la COOH-terminal (280-714) de la proteína, y se obtuvieron a partir de estos plásmidos proteínas de IB1 recombinantes producidas de forma bacteriana. La proteína 280-714 aa, pero no la proteína 1-280 aa, fue capaz de unirse a la cis-secuencia de GTII cuando fue sometida a prueba por análisis SouthWestern, lo que implica que el extremo carboxilo de la proteína contiene el dominio de unión al ADN de IB1.

Ejemplo 6 Activación transcripcional por IB1

Se ensayó la activación transcripcional por IB1 mediante experimentos de cotransfección en una línea celular secretora de insulina \betaTC3 y en una línea celular productora de glucagón (InR1-G9), así como en células COS-7 de la línea celular derivada no pancreática con un vector de expresión de IB1 (PBK/IB1) y en varios constructos reporter (Figura 5A). La región del promotor de insulina I de tipo salvaje (-410 pb) y la región proximal del promotor de GLUT2 (-338 pb) fueron ligadas a un gen reporter de luciferasa y transfectadas temporalmente en estas líneas celulares. La sobreexpresión de IB1 transactivó el promotor de GLUT2 1,7 veces, mientras que el gen de insulina se inducía 3,8 veces en comparación con una cotransfección con el vector de expresión que carece de cADN de IB1 (PBKS). Este efecto se limitaba a las células secretoras de insulina y estaba claramente ausente en el constructo reporter sin promotor (pGL3). La acción limitada de IB1 en las células-\beta sugiere que IB1 funciona solamente en presencia de otros reguladores presentes en las células-\beta, posiblemente otros factores de transcripción específicos de las células-\beta por ser identificados todavía. Se transfectaron de forma similar diversos constructos de deleción en 5' del promotor de insulina I de rata en las células \betaTC3 en presencia o ausencia del vector de expresión que codifica IB1. Este último transactivó varias regiones eliminadas por exonucleasa III del promotor de insulina. Aunque este efecto era más pequeño una vez utilizadas los constructos 3' al -159 pb (Figura 5B). Esto indica que la secuencia de RIPE3 localizada en 5' al -159 pb del promotor podría ser un importante elemento regulador por el que IB1 transactiva el gen de insulina (13). Para la siguiente serie de experimentos, nos preguntamos si IB1 podría mediar su efecto estimulador a través de la secuencia del amplificador de RIPE3 del gen de insulina II en rata. Esta secuencia de amplificador ha sido ampliamente estudiada por varios investigadores. Dos subelementos separados de RIPE3, RIPE3a y RIPE3b, funcionan cooperativamente para generar la actividad máxima de este amplificador específico de los tejidos (17). Cada subelemento se une a los factores de transacción específica de las células-\beta o se expresan en todas partes tales como BETA1, BETA2 y E47 (26, 27, 34, 37). De forma más interesante, se ha demostrado que el heterodímero BETA2/E47 era un transactivador potente de los elementos de RIPE3, efecto mediado a través de la caja E localizada dentro del subelemento RIPE3a (27). Sin embargo, este efecto estimulador necesita el subelemento adyacente RIPE3b, donde el(los) factor(es) de transacción específica de las células-\beta putativas pueden unirse para optimizar el efecto estimulador de los factores HLH. Para investigar si IB1 es uno de los posibles asociados de los factores de unión a RIPE3, 5 copias del elemento RIPE3 fueron clonadas en 5' a un promotor heterólogo mínimo (SV40) ligado a un gen de luciferasa. Este constructo o su vector parental (luciferasa SV40) fueron transfectados en las células \betaTC3 con o sin el vector de expresión que codifica IB1. Tal como se muestra en la Figura 5C, el IB1 transactivó el constructo de RIPE3 5 veces y este efecto no estaba presente en la línea celular que produce glucagón InR1-G9 (datos no mostrados). Tomados en su conjunto, estos resultados confirman que IB1 es un componente de los factores de unión de RIPE3, tal como lo evalúan los análisis SouthWestern y los ensayos de competición cruzada con los elementos RIPE3 y GTII (Figura 5) y tal como lo evalúan los datos funcionales obtenidos con el constructo RIPE3 (Figura 5).

Ejemplo 7 Secuencia de cADN de IB1 humano y comparación con cADN de IB1 de rata

El screening de una librería de cADN de insulinoma humano utilizando como sonda cADN de IB1 de rata produjo el extremo 3' de la secuencia de cADN de IB1 humano. Esta secuencia empezó en la posición correspondiente al nucleótido 1.324 del cADN de IB1 de rata. Parte del extremo 5' del cADN de IB1 humano fue obtenido por RACE y RT-PCR, realizados con ARN total aislado de un glucagonoma humano, tal como se describe en Methods, mientras que el extremo 5' restante de la secuencia fue deducido por comparación de las secuencias genómicas con el cADN de IB1 de rata. El cADN de IB1 humano comprende un total de 2.136 nucleótidos (Figura 1). Una secuencia de 141 pb correspondiente a un motivo de 47 aminoácidos que distingue IB1 de JIP-1 estaba presente en el clon de cADN, indicado en negrita. La comparación en el nivel de aminoácidos de las secuencias deducidas de IB1 humano (banda superior) y de rata (banda inferior) se muestra en la Tabla 2. En general, existe una similitud del 95% y una identidad del 94% entre el IB1 humano y el de rata. El cADN de IB1 de rata comprendía dos codones ATG separados por una secuencia de 18 pb, de modo que la metionina iniciadora era ambigua. El cADN de IB1 humano contenía solamente un codón ATG no ambiguo que estaba flanqueado en 3' por un gran marco de lectura abierto (ORF) homólogo a los nucleótidos 21 a 122 del cADN de IB1 de rata. En comparacoón con el IB1 de rata, el IB1 humano contiene cinco residuos insertados (en las posiciones 7, 115, 142 y 267), mientras que falta un aminoácido entre los residuos 79 y 80, de modo que, en su conjunto, el IB1 humano contiene cuatro residuos más que el IB1 de rata. Merece la pena observar el hecho de que las secuencias aparentemente importantes funcionalmente, tal como se deduce del análisis por ordenador, de las secuencias de IB1 de rata, se conservan muy bien entre el IB1 humano y el de rata. Finalmente, los 46 aminoácidos de los 47 fragmentos de residuos de aminoácidos que distinguen el IB1 de JIP-1 eran idénticos entre el IB1 humano y el de rata. Tomados en su conjunto, estos datos muestran que el gen de IB1 se expresa en el insulinoma humano. Además, el alto grado de identidad al nivel de aminoácidos entre el IB1 humano y el de rata sugiere que IB1 puede desempeñar un papel biológico importante.

Ejemplo 8 Análisis Southern Blot del gen de IB1 humano

Se examinó una librería BAC de ADN genómico humano utilizando como sonda un fragmento de 1,8 kb correspondiente al extremo 3' del cADN de IB1 humano. Se seleccionaron seis clones fuertemente positivos. Se realizó el análisis Southern Blot sobre clones BAC digeridos por BamH1/BgIII con esta misma sonda. Se observaron dos patrones distintos. Un clon, BAC-A, mostró cuatro bandas de tamaño aparente \sim2,0; \sim1,6; \sim1,3 y \sim0,8 kb (Figura 7, banda 2), respectivamente. Por contraste, BAC-B (banda 3) mostró la presencia de una fuerte banda de 4,8 kb y dos bandas débiles más anchas adicionales. La banda destacada de 4,8 kb visible en BAC-B estaba presente también en los cuatro clones de BAC restantes seleccionados (datos no mostrados). Los modelos en forma de bandas obtenidos con los clones de BAC-A y BAC-B fueron comparados con el modelo observado al analizar ADN genómico humano digerido por BamH1/BgIII (banda 1). Un total de siete bandas era visible en el ADN genómico humano. Todas las bandas identificadas en el ADN genómico humano fueron justificadas por las bandas visibles cuando se analizó BAC-A y BAC-B. En particular, la banda destacada de 4,8 kb y las dos bandas débiles más anchas era similares en tamaño a las bandas detectadas en BAC-B (banda 3), mientras que las cuatro bandas débiles más pequeñas visibles en el ADN genómico humano eran comparables en tamaño con las cuatro bandas visibles en BAC-A (banda 2). Se desmontó el filtro y se utilizó como sonda el fragmento de 955 pb correspondiente al extremo 5' del cADN de IB1 de rata. Un total de tres bandas de tamaños aparentes 6,0; 1,5 y 1,4 kb, respectivamente, eran visibles para BAC-A, mientras que la banda fuerte de 4,8 kb previamente identificada cuando se estaba utilizando la sonda en 3' fue la única banda visible para BAC-B (datos no mostrados). Tomados en su conjunto, estos datos indican que: 1) BAC-A incluye probablemente el gen de IB1 multiexónico; 2) el tamaño del gen de IB1 se aproxima a 14 kb; 3) BAC-B contiene un homólogo del gen de IB1 o un seudogen de IB1; 4) la presencia de homólogos o seudogenes adicionales de IB1 en el genoma humano es improbable; en particular, nuestros datos no proporcionan evidencia alguna de la presencia en el genoma humano de un gen distinto del gen de IB1 que codificaría JIP-1.

Ejemplo 9 Estructura del gen de IB1 humano

Los fragmentos generados por la digestión de BAC-A con BamH1/BgIII fueron clonados en un vector fagémido de Bluescript y estos clones fueron cribados utilizando dos sondas que no se solapaban, un fragmento de 955 pb correspondiente al extremo 5' del cADN de IB1 de rata o el fragmento de 1,8 kb correspondiente al extremo 3' del cADN de IB1 humano. Los clones positivos se sometieron a análisis de secuencias. Este análisis, completado por una aproximación basada en PCR para las regiones del gen que no estaban presentes en los subclones de Bluescript, revelaron la secuencia de la región de codificación del gen de IB1 y su organización estructural (Figura 6). El gen de IB1 contiene 12 exones y 11 intrones. El tamaño de los exones oscila entre los nucleótidos 71 (exón 10) y los 813 nucleótidos (exón 5). Se observó una identidad completa entre la secuencia del ácido nucleico disponible del cADN de IB1 humano (obtenida como se ha descrito anteriormente) y las secuencias de las regiones de codificación del gen de IB1. La posición de las uniones intrón-exón viene indicada en la Figura 6 con un punto negro. Merece la pena observar que la secuencia que codifica el motivo del aminoácido 47 que distingue el IB1 de JIP-1 (que se indica con una barra en la Figura 6) se extiende sobre dos exones adyacentes (exones 8 y 9). El análisis de secuencias de las uniones intrón-exón (Tabla 3) reveló que todos los sitios de empalme obedecen al paradigma GT-AG. Estos datos indican que: 1) IB1 es codificado por un gen multiexónico contenido en el clon BAC-A y 2) la isoforma JIP-1 puede ser una variante de empalme alternativa del gen de IB1; sin embargo, la estructura del intrón-exón del gen de IB1 hace que esta posibilidad sea improbable.

Ejemplo 10 Secuencia del fragmento de 4,8 kb del clon BAC-B

Este análisis reveló un alto grado de homología entre este fragmento genómico y el cADN del IB1 humano. En particular, se identificó un ORF de 737-pb que era en un 97% homólogo a los nucleótidos 1.297 a 2.133 del cADN de IB1 humano. Se identificó un ORF adicional de 657 pb que incluía una secuencia de 488 pb homóloga a los nucleótidos 228 a 716 del cADN de IB1 humano. Sin embargo, se identificaron numerosos codones de parada entre los ORF. Como primer paso para determinar si estos ORF se expresaban en las células eucariotas, el vector de Bluescript que contenía el fragmento de 4,8 kb fue transfectado en células COS-1. No se identificó ningún material inmunorreactivo en las células COS-1 transfectadas (datos no mostrados), descubrimiento que estaba de acuerdo con el ORF que no se expresaba en las células COS-1. Se obtuvo el mismo resultado cuando el fragmento de 4,8 kb se suprimió y se insertó dentro de un plásmido conducido por CMV transfectado de la misma forma (datos no mostrados). Tomados en su conjunto, estos datos sugieren en gran parte que esta secuencia genómica asociada al cADN de IB1 corresponde a un seudogen deIB1. No se determinó la naturaleza de las dos bandas más anchas identificadas en el análisis Southern Blot del ADN genómico humano y BAC-B. El hecho de que estas dos bandas se detectaran solamente cuando se utilizaba la sonda de 1,8 kb desde el extremo 3' del cADN de IB1 sugiere que corresponden a las secuencias que comparten alguna homología con el extremo 3' del cADN de IB1 humano.

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Ejemplo 11 Localización cromosómica del gen de IB1 y del seudogen de IB1

Se llevó a cabo una hibridación fluorescente in situ (FISH) para elaborar el mapa del gen de IB1 y del seudogen de IB1. Los fragmentos generados por la digestión con BamH1/BgIII de BAC-A y BAC-B fueron marcados y utilizados como sondas de BAC-A (correspondientes al gen de IB1) y sondas de BAC-B (correspondientes al seudogen de IB1). El gen de IB1 y el seudogen de IB1 se localizan en cromosomas separados. El gen de IB1 está posicionado cerca del centrómero en el brazo corto del cromosoma 11, mientras que los mapas del seudogen de IB1 en el brazo largo del cromosoma 17. Las localizaciones cromosómicas se confirmaron cuando se utilizaron marcadores específicos del centrómero para el cromosoma 11 y el cromosoma 17.

A continuación, se realizó un mapa fino del gen de IB1 y del seudogen de IB1 utilizando los mapas de híbridos de radiación. Este análisis se llevó a cabo inicialmente utilizando un par de oligonucleótidos diseñados mediante la utilización de la secuencia de cADN de IB1 humano. Estos cebadores amplificaron un fragmento de \sim260 pb en el sistema de mapas de híbridos de radiación correspondiente a las secuencias 1.346 a 1.602 del cADN humano. Este fragmento corresponde a las secuencias del seudogen de IB1, ya que la amplificación de las secuencias desde el gen IB1 hubiera resultado en un producto más grande extendiéndose sobre tres exones (exones 5 a 7) y dos intrones. El análisis de los paneles de híbridos de radiación Stanford G3 y Genebridge G4 confirmaron la observación realizada por FISH de que el seudogen de IB1 está localizado en el brazo largo del cromosoma 17, lo que corresponde a 17q21.32-33 en el mapa citogénico de LDB (59). No se conoce la razón por la que la localización del gen de IB1 no fue detectada mediante este par de oligonucleótidos. Para localizar la posición del gen de IB1, se utilizó un par adicional de cebadores. Se diseño un cebador en base a la secuencia del cADN de IB1 y el otro en base a las secuencias intrónicas dentro del gen de IB1. Los resultados procedentes de los dos paneles de híbridos de radiación colocaron el gen de IB1 en el brazo corto del cromosoma 11, confirmando así la observación anterior realizada por FISH, que corresponde a 11p11.12 en el mapa citogénico de LDB (59). El gen de IB1 se localizó adyacente a los marcadores D11S1344 y D11S3979.

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Ejemplo 12 Expresión de IB1 en tejidos humanos

Se estudió la expresión de IB1 en tejidos humanos mediante análisis Northern Blot de ARN poli(A)+ aislado de un panel de distintos tejidos humanos y con el fragmento de 1,8 kb correspondiente al extremo 3' del cADN de IB1 humano como sonda. El IB1 se expresó como transcripción única en el páncreas, corazón, cerebro y testículo. La distribución de los tejidos del IB1 en los tejidos humanos se parece mucho a la distribución anteriormente indicada en los tejidos de rata.

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Discusión

Estos resultados muestran el aislamiento y la caracterización de un nuevo transactivador del GLUT2 y de los genes de insulina. Este factor, denominado IB1, es altamente expresado en las células-\beta pancreáticas y fue aislado por su capacidad de unión a un elemento regulador cis del promotor de GLUT2. Demostramos también que IB1 es capaz de unirse a un elemento regulador homólogo del gen de insulina, RIPE3. Esta secuencia amplificadora contiene dos subelementos separados, RIPE3a y RIPE3b, que funcionan cooperativamente para generar la actividad máxima de este amplificador específico de los tejidos (Hwung y col., 1990). RIPE3 se une a los factores de transacción específica de las células-\beta y se expresan en todas partes, tales como BETA1, BETA2 y E47 (Shieh y Tsai, 1991; Murre y col., 1989; Peyton y col.,1994; Naya y col., 1995). Se ha demostrado que el heterodímero BETA2/E47 era un transactivador potente del elemento de RIPE3, efecto mediado a través de la caja E localizada dentro del subelemento RIPE3a (Naya y col., 1995). Este efecto estimulador necesita el subelemento adyacente RIPE3b donde se une(n) el(los) factor(es) de transacción específica de las células-\beta, todavía por identificar. Debido a que IB1 es capaz de unirse a RIPE3 in vitro y a que este factor es capaz de transactivar la expresión del gen reporter mediada por RIPE3 en células-\beta, proponemos que IB1 sea uno de los importantes asociados de las proteínas de unión a RIPE3. Los ensayos de competición utilizando como sonda GTII o RIPE3 demostraron que las proteínas de unión a GTII tienen una gran afinidad por el elemento cis de GTII, sin embargo compiten con un exceso de oligonucleótidos de RIPE3 frío. A la inversa, las proteínas de unión a RIPE3 detectadas por el ensayo de cambio de movilidad (EMSA) con la sonda de RIPE3 compiten con un exceso de GTII frío. Sin embargo, no podemos "supershift", mediante la utilización de anticuerpos anti-IB1, las actividades de unión a GTII o RIPE3 detectadas por EMSA. Esta observación sugiere que los anticuerpos elevados contra IB1 son incapaces de detectar IB1 en condiciones de no desnaturalización, donde los epítopes pueden ser enmascarados por otras proteínas de unión. Además, la actividad de unión de IB1 necesita modificaciones post-traduccionales. La desfosforilación de los extractos nucleares de \betaTC3 anula la unión de IB1 a GTII o RIPE3 cuando se valora mediante análisis SouthWestern.

Funcionalmente, IB1 es un transactivador del promotor de GLUT2 (un 170% de incremento sobre el basal), pero un inductor potente de la transcripción del gen de insulina (un 380% de incremento sobre el basal). Este efecto puede reflejar una mayor afinidad de unión de IB1 a GTII más que a RIPE3 (véase la Figura 5). Como IB1 funciona solamente en las líneas celulares \beta donde está presente IB1 endógeno, se puede especular sobre el hecho de que el constructo reporter de GLUT2 no puede estimularse con el vector de expresión que codifica IB1, ya que los elementos cis de GTII de alta afinidad están ya ocupados por el IB1 endógeno. Más recientemente, Stellrecht y coautores han demostrado que múltiples copias de la secuencia de RIPE3 pueden conducir la expresión del gen reporter de forma limitada en células-\beta pancreáticas y en el cerebro de ratones transgénicos (Stellrecht y col., 1997). Como la expresión de IB1 es más alta en el cerebro y en las células-\beta y como este factor transactiva el gen de insulina a través de RIPE3, estas observaciones muestran que IB1 participa en el control específico de los tejidos del gen de insulina.

Tal como se observa con BETA2, IB1 se expresa de una forma muy limitada (Naya y col., 1995). Se encuentra BETA2 en las células-\alpha y -\beta y en el cerebro, mientras que la expresión de IB1 está presente solamente en las células-\beta, en el cerebro y en menor grado en el corazón y el riñón. Es interesante observar que GLUT2 se expresa en células-\beta, en el intestino, el riñón, el hígado y en un subconjunto de neuronas (Thorens y col., 1988; Leloup y col., 1994; Orci y col., 1989) y el gen que codifica GLUT2 es anormalmente regulado solamente en el páncreas endocrino cuando existe diabetes (Johnson y col., 1990; Ohneda y col., 1993; Orci y col., 1990b; Orci y col., 1990a; Thorens y col., 1992; Thorens y col., 1990; Unger, 1991). Como IB1 es un transactivador de la insulina y los genes de GLUT2 y como la expresión de IB1 se limita principalmente a las células-\beta y no se expresa en el hígado, la expresión o función anormal de IB1 podría ser responsable de la desregulación específica de las células diabéticas y \beta de GLUT2. La fosforilación es necesaria, como modificación post-traducción de IB1, para permitir la unión de IB1 a su sitio de reconocimiento. Algunas funciones de las células-\beta, incluidas las actividades de fosforilación, se ven alteradas durante la diabetes y, por tanto, podrían inducir a una pérdida de actividad de la unión de IB1.

La reciente identificación de mutaciones presentes en los factores de transcripción HNF-1\alpha y HNF-4\alpha, factores que son transactivadores débiles del gen de insulina y que se expresan también en las células-\beta, es interesante, ya que son responsables del inicio de dos formas de diabetes, MODY3 y MODY1, respectivamente (Yamagata y col., 1996b; Yamagata y col., 1996a).

Una observación intrigante en cuanto a IB1 es su localización subcelular, ya que está localizado en los compartimentos tanto citoplásmicos como nucleares. IB1 contiene una señal putativa de translocalización nuclear (Dingwall y Laskey, 1991) y varias líneas de evidencia sugieren que realmente IB1 es una proteína nuclear. En primer lugar, IB1 es una proteína de unión al ADN, ya que este factor ha sido clonado en base a su capacidad de unión al elemento cis de GTII. En segundo lugar, los experimentos SouthWestern han podido detectar IB1 en los extractos nucleares de las células COS transfectadas con el vector de expresión que codifica IB1. En tercer lugar, una coloración nuclear inmunodetectable está presente mediante la histoquímica en los islotes pancreáticos, así como en las células \betaTC3, y el análisis Western Blot de estas células ha podido detectar también IB1 en el citoplasma y el núcleo. Finalmente, IB1 es claramente un transactivador del GLUT2 y el promotor de insulina ligado a un gen reporter, lo que implica que este factor funciona como factor de transcripción. Los mecanismos responsables de la translocalización activa de IB1 en el núcleo no se entienden todavía, pero podrían ser importantes, ya que las funciones de transacción de IB1 pueden depender simplemente del control de la translocalización. Se describen varias otras observaciones similares en las que una proteína de unión a ADN está secuestrada en el citoplasma y está translocalizada en el núcleo cuando aparece un estímulo adecuado. NF\kappaB está secuestrado en el citoplasma por medio de una interacción con I\alpha-B (Beg y col., 1992). Una vez fosforilado, el complejo se disasocia y NF\kappaB es translocalizado en el núcleo y actúa como transactivador (Ghosh y Baltimore, 1990). La BZP ha sido descrito recientemente también como una proteína de unión a ADN en dedo de zinc expresado en las células-\beta (Franklin y col., 1994). La privación de suero provocó que BZP permaneciera citoplásmica, mientras que la adición de suero induce la translocalización de BZP, dejando que funcione como inhibidor de la transcripción genética. También se ha descrito el mecanismo de secuestro de la proteína de unión del elemento sensible de cAMP (CREB) en el citoplasma de las células germinales, e implica la formación de una proteína truncada de CREB que carece de la señal de translocalización nuclear, mediante la utilización de un exón de empalme alternativamente (Waeber y Habener, 1991; Waeber y col., 1991). Los mecanismos que accionan la translocalización de IB1 en el núcleo pueden implicar la glucosa, el suero o cualquier componente celular como cAMP o ATP. Es importante resolver este asunto, ya que la función de transactivación de IB1 puede depender de la translocalización adecuadamente regulada de la proteína en el núcleo.

Los resultados anteriores demuestran que IB1 es una nueva proteína de unión a ADN que se expresa de una forma muy limitada en las células-\beta y en el cerebro, que funciona junto con otros factores específicos de las células-\beta no identificados, como transactivador de GLUT2 y del gen de insulina, a través de secuencias homólogas de ADN. Debido a la expresión limitada de IB1, proponemos que IB1 es un importante factor que confiere la especificidad de las células-\beta a los genes de insulina y GLUT2.

IB1/JIP-1 es un regulador clave de la secreción de insulina en la rata y un inhibidor de la vía de activación de JNK en el ratón. Demostramos en este estudio que IB1/JIP-1 también está presente en los seres humanos. Realmente, el IB1 humano es muy similar al IB1 del ratón y de la rata. Además, IB1 se expresa en los humanos en los mismos tejidos que se indicaron anteriormente para los roedores. El gen de IB1 se encuentra en el mapa en el brazo largo del cromosoma 11, en la posición 11p11.12, y es multiexónico. Existe también un seudogen que comparte un alto grado de homología con el cADN de IB1 y que está localizado en el cromosoma 17. Los resultados anteriores muestran también que no está presente ningún otro homólogo asociado a IB1 en el genoma humano, lo que sugiere que, si JIP-1 está presente en los humanos, representa una isoforma de IB1 codificada por el gen de IB1.

Aparte de su inserción en el residuo 47, se mostró anteriormente que el IB1 de rata era idéntico en un 97% al JIP-1 de ratón. Esta sorprendente identidad entre especies se refuerza además por las presentes observaciones, que muestran una identidad del 94% entre el IB1 humano y de rata o ratón. La estructura muy conservada del IB1 en los mamíferos es la evidencia de la importancia biológica de IB1.

Se identificó una secuencia altamente homóloga al cADN de IB1 humano en el genoma humano y se representó en el mapa como cromosoma 17q21-22. Dos observaciones apoyan la conclusión de que esta secuencia representa un seudogen de IB1. En primer lugar, a pesar de la presencia de dos ORF potenciales de 737 y 657 nucleótidos respectivamente, esta secuencia contenía numerosos codones de parada. En segundo lugar, los datos muestran que estos ORF potenciales no se traducen en proteínas una vez transfectados en las células COS-1, aun cuando están colocados enfrente de un promotor fuerte de CMV, lo que sugiere la falta de sitios iniciadores correctos. Además, es interesante que esta secuencia contenga la secuencia de 141 pb que falta en JIP-1. Por tanto, es muy improbable que JIP-1 sea codificado por esta secuencia.

Nuestros datos muestran que, aparte del seudogen de IB1, la presencia del gen adicional asociado a IB1 en el genoma humano es improbable. Además, mostramos que la inserción de 141 pb que distingue JIP-1 de IB1 se extiende sobre dos exones. Tomadas en su conjunto, estas observaciones plantean la cuestión de si JIP-1 se expresa en los tejidos humanos, y si así es, cuál es el mecanismo responsable de la generación de la transcripción. El clon que contiene el extremo 3' del cADN de IB1 humano se obtuvo a partir de una librería de cADN de insulinoma humano y contenía la inserción. Las amplificaciones por RT-PCR de esta librería se realizaron utilizando oligonucleótidos que flanqueaban la inserción y sólo se obtuvo un amplicón que contenía la inserción. Aunque puede ser que el JIP-1 se exprese en otros tejidos o durante el desarrollo embriónico, JIP-1 no parece ser una "simple" variante de empalme del gen de IB1. En los exones 8 y 9 existen sitios potenciales de donadores/aceptores de empalme. Sin embargo, el empalme en estos sitios resultaría en un cambio de marco y en una proteína truncada.

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TABLA 1 Secuencia de oligonucleótidos utilizados para caracterizar el gen de IB1 humano

1

2

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Referencias

1. Asfari et al, Endocrinology 130:167-178, 1992.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: WAEBER Gérard

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(B): CALLE: Chemin de la Rueyre 59

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(C): CIUDAD: Jouxtens

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(E): PAÍS: Suiza

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 1008

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(A): NOMBRE: NICOD Pascal

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(B): CALLE: Avenue Général Guisan 55

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(C): CIUDAD: Pully

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(E): PAÍS: Suiza

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 1009

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(A): NOMBRE: BONNY Christophe

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(B): CALLE: Rue du Lyon 7

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(C): CIUDAD: Ginebra

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(E): PAÍS: Suiza

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 1202

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(A): NOMBRE: KIDDLE Simon John

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(B): CALLE: Mewburn Ellis, York House, 23 Kingsway

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(C): CIUDAD: Londres

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(E): PAÍS: Reino Unido

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): MC2B 6HP

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Factor de Transcripción Islet Brain 1 (IB1)

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 56

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(iv): FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO MEDIO: Disquete

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)

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(v): DATOS ACTUALES DE SOLICITUD:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/GB98/00972

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(vi): DATOS SOBRE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: GB 9706731.8

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 3 de abril de 1997

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(vi): DATOS SOBRE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: GB 9709920.4

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 15 de mayo de 1997

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 2953 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 108..2252

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

3

4

5

6

7

8

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 714 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

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9

10

11

12

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 2136 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 711 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

200

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

201

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

202

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

203

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

204

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

205

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 711 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 714 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

30

31

32

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACCACGCGT ATCGATGTCG ACTTTTTTTT TTTTTTTTV

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACCACGCGT ATCGATGTCG AC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCAGGTCCA TCTGCAGCAT CTC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAAGGGCTG TCGGTGGAGG TGCCTCGA

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCATCTGCA TCTCGGCCT

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACAGGGTG TCTTTGC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGCAGCTCA TCGCTCAGGC A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTCATGCGG TGGTGTCTGC T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCGAGACC GAATCCAC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTCAGGAAT TTCTTGGAGA AATG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGATGAACCC GACGTCCAT

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCAGTGCGC ATGTTGTAGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGCCTTCA TGACCTGCCT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATTCGGTC TCGATGCGAG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAATTTCAGG TGAGAGTCCC CGGCCGCCGC G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGCTTCC TGTCCCCACC AGGCTCACCC A

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCTTACGGG TAAGGGCAAG CTCCCAGGAG C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCCCCTCCG TGCGCTGTGC AGCCCCCGCG C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGTCTCAGG TGAGGCGCCA ACGTGGGGGG C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGCCTTTTG TTCCCTGCAC AGGACACACT G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAAGACAGG TAAGTCAGGG CCCTCTTCCT T

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCATGACCTG CCTGCTCTCC AGGGGAGCAG A

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:41:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCCTCCAG TGAGTCAGCA ACCCCAAGCA G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:42:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCCACACCA CCTCACCTGC AGGTGCTGAG T

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATATTCAGG TGAGAGCCAT GGGCTGGCTG G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:44:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACCTGTCCT TGCTGGGGAC AGGTTTGTGC C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:45:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACATGGCAGG TAGTGTTCCC TCCCTGGCCT G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:46:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAATTCACG CTTGCTTTCC AGCCCTGGCC A

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:47:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGCAAAAGG TACCTGAGCC CTCTCCCTTC T

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:48:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGCTCCATT TGTCACCTGT AGATTGCCAC C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGGCCAAGG TGACTTCTTC CAACCCAGCC C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:50:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTTCTTTTC TCCCTCCTGT AGGGGAATAA A

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:51:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAACAACAAG TAAGTGGGGG TGGGATGGCA G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:52:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACAGACAGAC CTGTCCCTGC AGGTACTTTG G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:53:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCCGTGGGG TACGTGTACA CCCTGCTGAG C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:54:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGTGTGTCC CCTGGCTTCT AGGAGAGCAT T

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:55:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAAGGGTG TATTGATTGG ATTACCATCA ATACTCAGCT TCT

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:56:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATCTGGAAA CTGCAGCTTC AGCCCCTCTG GCCATCTGCT GATCCG

\hfill

46

Claims

1. Polipéptido aislado (i) que tiene más del 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en la Fig. 1A, (ii) que es un fragmento de la secuencia de aminoácidos tal como se expone en la Fig. 1A, incluido el dominio desde los aminoácidos 566 a 612 de la secuencia mostrada en la Fig. 1A o una parte activa de aquel dominio o (iii) que es un fragmento de una secuencia de aminoácidos tal como se expone en la Fig. 1A con al menos 20 aminoácidos de longitud, caracterizado porque el polipéptido tiene la propiedad de inhibir o promover la apoptosis.

2. Polipéptido según la reivindicación 1 que tiene más del 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en la Fig. 1A.

3. Polipéptido según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que tiene más del 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en la Fig. 1A.

4. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 que tiene más del 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en la Fig. 1A.

5. Polipéptido según la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la Fig. 1A.

6. Polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido está ligado a un compañero de acoplamiento.

7. Molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 7 que tiene la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la Fig. 1A.

9. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 7 que tiene más del 90% de homología de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos de la Fig. 1A.

10. Vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, ligado de forma operativa a las secuencias control para dirigir su expresión.

11. Células huésped que contienen un vector de expresión según la reivindicación 10.

12. Método para producir un polipéptido IB1 que comprende el cultivo de las células huésped según la reivindicación 11 y el aislamiento del polipéptido así producido.

13. Línea celular para el transplante a un paciente, conteniendo la línea celular un ácido nucleico que codifica un polipéptido IB1 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, teniendo la línea celular la propiedad de producir dicho polipéptido IB1.

14. Línea celular según la reivindicación 13 que está encapsulada por un recubrimiento polimérico biocompatible para que el polipéptido IB1 producido por la línea celular pueda ser liberado a través del recubrimiento polimérico.

15. Composición farmacéutica que comprende uno o más polipéptidos IB1 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

16. Molécula de ácido nucleico de IB1 según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 para su uso en un tratamiento médico.

17. Utilización de un polipéptido IB1 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la preparación de un medicamento para inhibir que las células experimenten una apoptosis.

18. Utilización de un polipéptido IB1 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes o de trastornos neurodegenerativos o del cáncer, caracterizada porque el medicamento ayuda a proteger las células sanas que rodean las células cancerosas.

19. Utilización de un polipéptido IB1 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un método de screening de sustancias de prueba que son compameros de unión específicos del polipéptido IB1.

20. Método de screening para sustancias que afecta o modula una actividad biológica de un polipéptido IB1 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo el método la puesta en contacto de una o más sustancias de prueba con un polipéptido IB1 en un medio de reacción, la comprobación de la actividad del polipéptido IB1 tratado y la comparación de esta actividad con la actividad del polipéptido IB1 en un medio de reacción comparable sin la sustancia o sustancias de prueba, caracterizado porque la actividad biológica es la modulación de la apoptosis.