ES2284502T3 - 22025, una nueva nucleotido ciclico fosfodiesterasa humana. - Google Patents
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Abstract
2025, UNA NUEVA NUCLEÓTIDO CÍCLICO FOSFODIESTERASA HUMANA Una mol¿cula de cido nucleico aislada seleccionada del grupo constituido por: a) una mol¿cula de cido nucleico que comprende la secuencia de nucle¢tidos mostrada en la SEC. ID n§: 2 o 4; b) una mol¿cula de cido nucleico que comprende el inserto de ADNc del pl smido depositado con ATCC como n£mero de dep¢sito de patente PTA-1644, o complementos de la misma, c) una mol¿cula de cido nucleico que codifica un polip¿ptido que comprende la secuencia de amino cidos de SEC. ID n§: 1 o 3, o una secuencia de amino cidos codificada por el inserto de ADNc del pl smido depositado con ATCC como n£mero de dep¢sito de patente PTA-1644.
Description
22025, una nueva nucleótido cíclico
fosfodiesterasa humana.
La presente invención se refiere a una
nucleótido cíclico fosfodiesterasa humana recientemente identificada
que pertenece a la superfamilia de fosfodiesterasas de mamífero. La
invención también se refiere a polinucleótidos que codifican la
fosfodiesterasa. La invención se refiere adicionalmente a
procedimientos que usan los polipéptidos y polinucleótidos de
fosfodiesterasa como una diana para el diagnóstico y tratamiento en
trastornos mediados o relacionados con las fosfodiesterasas. La
invención se refiere adicionalmente a procedimientos de cribado de
fármacos que usan los polipéptidos y polinucleótidos de
fosfodiesterasa para identificar agonistas y antagonistas para el
diagnóstico y tratamiento. La invención abarca adicionalmente a
agonistas y antagonistas basados en los polipéptidos y
polinucleótidos de fosfodiesterasa. La invención se refiere
adicionalmente a procedimientos para la producción de los
polipéptidos y polinucleótidos de fosfodiesterasa.
Las nucleótido cíclico fosfodiesterasas muestran
especificidad por sustratos de nucleótido cíclico de purina y
catalizan la hidrólisis de AMP cíclico (AMPc) y de GMP cíclico
(GMPc) (Thompson W.J. (1991) Pharma. Ther.
51:13-33). Las nucleótido cíclico
fosfodiesterasas regulan los niveles en el estado estacionario de
AMPc y de GMPc y modulan tanto la amplitud como la duración de la
señal de nucleótido cíclico. Actualmente se sabe que existen al
menos ocho familias de genes diferentes pero homólogas en los
tejidos de los mamíferos. La mayoría de las familias contienen
genes distintos, muchos de los cuales se expresan en diferentes
tejidos como variantes de corte y empalme alternativas exclusivas
funcionalmente. (Beavo (1995) Physiological Reviews
75:725-748, Dousa (1999) Kidney int.
55:29-62 y el documento U.S. 5.798.246).
Todas las nucleótido cíclico fosfodiesterasas
contienen un núcleo de aproximadamente 270 aminoácidos conservados
en la mitad COOH terminal de la proteína que se piensa que es el
dominio catalítico de la enzima. Un motivo conservado de la
secuencia HDXXHXX se ha identificado en el dominio catalítico de
todas las nucleótido cíclico fosfodiesterasas aisladas hasta la
fecha. Las nucleótido cíclico fosfodiesterasas dentro de cada
familia muestran aproximadamente un 65% de homología de aminoácidos
y la similitud cae hasta menos de un 40% cuando se compara entre
familias diferentes teniendo lugar la mayor parte de la similitud en
los dominios catalíticos.
La mayor parte de los genes de nucleótido
cíclico fosfodiesterasa presentan más de un ARNm alternativamente
cortado y empalmado transcrito para ellos y en muchos casos el corte
y empalme alternativo parece ser altamente específico de tejido,
proporcionando un mecanismo para la expresión selectiva de
diferentes nucleótido cíclico fosfodiesterasas (Beavo, referencia
citada anteriormente). La expresión específica del tipo de célula
sugiere que las diferentes isoenzimas probablemente presentan
diferentes propiedades específicas del tipo de célula.
Las nucleótido cíclico fosfodiesterasas de tipo
1 son dependientes de Ca^{2+}/calmodulina, y se reseña que
contienen tres genes diferentes, cada uno de los cuales parece
presentar al menos dos variantes diferentes de corte y empalme, y
se han encontrado en el pulmón, corazón y cerebro. Algunas de las
fosfodiesterasas dependientes de calmodulina se regulan in
vitro mediante acontecimientos de
fosforilación/desfosforilación. El efecto de la fosforilación es la
reducción de la afinidad de la enzima por calmodulina, que disminuye
la actividad de la fosfodiesterasa, aumentando de esta forma el
nivel en el estado estacionario de AMPc. Las nucleótido cíclico
fosfodiesterasas de tipo 2 están estimuladas por GMPc, están
localizadas en el cerebro y se piensa que median los efectos de
AMPc sobre la secreción de catecolamina. Las nucleótido cíclico
fosfodiesterasas de tipo 3 están inhibidas por GMPc, presentan una
alta especificidad por AMPc como sustrato, y son una de las
principales isoenzimas de fosfodiesterasa presentes en el músculo
liso vascular y desempeñan un papel en la función cardiaca. Una
isoenzima de tipo 3 está regulada por una o más quinasas
dependientes de insulina. Las nucleótido cíclico fosfodiesterasas
de tipo 4 son las isoenzimas predominantes en la mayoría de las
células inflamatorias, activándose algunos de los miembros mediante
la fosforilación dependiente de AMPc. Las nucleótido cíclico
fosfodiesterasas de tipo 5 ha sido consideradas tradicionalmente
como reguladoras de la función de GMPc pero pueden también afectar
a la función de AMPc. Se encuentran altos niveles de nucleótido
cíclico fosfodiesterasas de tipo 5 en la mayor parte de las
preparaciones de músculo liso, plaquetas y riñón. Los miembros de la
familia de las nucleótido cíclico fosfodiesterasas de tipo 6
desempeñan un papel en la visión y están regulados por la luz y
GMPc. Un miembro de la familia de las nucleótido cíclico
fosfodiesterasas de tipo 7 se encuentra en altas concentraciones en
el músculo esquelético. En Beavo, referencia citada anteriormente,
se proporciona un listado de las familias 1-7 de
nucleótido cíclico fosfodiesterasas, de su localización y de su
papel fisiológico. En el documento US 5.798.246 se reseña una
familia de tipo 8.
Muchas funciones de las respuestas inmunes e
inflamatorias están inhibidas por agentes que aumentan los niveles
intracelulares de AMPc (Verghese (1995) Mol. Pharmacol.
47:1164-1171) mientras que el metabolismo de GMPc
está implicado en la función de las células del músculo liso, pulmón
y cerebro (Thompson W. (1991) Pharma. Ther.
51:13-33). Se han atribuido una variedad de
enfermedades a una actividad de nucleótido cíclico fosfodiesterasa
aumentada que da como resultado niveles reducidos de nucleótidos
cíclicos. Por ejemplo, una forma de diabetes insípida en el ratón
se ha asociado con una actividad aumentada de la familia 4 de
fosfodiesterasas y se ha reseñado un aumento en la actividad de
fosfodiesterasa de AMPc de baja K_{m} en leucocitos de pacientes
atópicos. Los defectos en nucleótido cíclico fosfodiesterasas se han
asociado también con la enfermedad retinal. La degeneración retinal
en el ratón rd, retinitis pigmentosa autosómica recesiva humana, y
displasia 1 de bastones/conos en perros setter irlandés se han
atribuido a mutaciones en el gen B de la familia 6 de
fosfodiesterasas. Se ha asociado la familia 3 de fosfodiesterasas
con la enfermedad cardiaca.
Se han identificado muchos inhibidores de
diferentes nucleótido cíclico fosfodiesterasas y algunos han
experimentado evaluación clínica. Por ejemplo, se están
desarrollando inhibidores de la familia 3 de fosfodiesterasas como
agentes antitrombóticos, como agentes antihipertensivos, y como
agentes cardiotónicos útiles en el tratamiento de insuficiencia
cardiaca congestiva. El Rolipram, un inhibidor de la familia 4 de
fosfodiesterasas, se ha usado en el tratamiento de la depresión y
otros inhibidores de la familia 4 de fosfodiesterasas están
experimentando evaluación como agentes antiinflamatorios. Se ha
demostrado también que el rolipram inhibe la producción de
TNF-alfa inducida por lipopolisacárido (LPS) que ha
demostrado que potencia la replicación de VIH-1
in vitro. Por lo tanto, el rolipram puede inhibir la
replicación del VIH-1 (Angel y col. (1995) AIDS
9:1137-44). De manera adicional, en base a su
capacidad para suprimir la producción de TNF alfa y beta y del
interferón gamma, el rolipram ha demostrado ser eficaz en el
tratamiento de encefalomielitis, el modelo animal experimental para
la esclerosis múltiple (Sommer y col. (1995) Nat. Med.
1:244-248) y puede ser eficaz en el tratamiento
de disquinesia tardía (Sasaki y col. (1995) Eur. J.
Pharmacol. 282:72-76).
Existen también inhibidores de fosfodiesterasa
no específicos tales como teofilina, usada en el tratamiento de
asma bronquial y otras enfermedades respiratorias, y pentoxifilina,
usada en el tratamiento de claudicación intermitente y enfermedad
vascular periférica inducida por diabetes. La teofilina se piensa
que actúa sobre la función del músculo liso de las vías
respiratorias así como en una capacidad inmunomoduladora o
antiinflamatoria en el tratamiento de enfermedades respiratorias
(Banner y col. (1995) Eur. Respir. J
8:996-1000) donde se piensa que actúa
inhibiendo la hidrólisis de las AMPc y GMPc nucleótido cíclico
fosfodiesterasas (Banner y col. (1995) Monaldi Arch. Chest Dis.
50:286-292). La pentoxifilina, conocida también
por bloquear la producción de TNF-alfa, puede
inhibir la replicación de VIH-1 (Angel y col.,
referencia citada anteriormente). En Beavo (referencia
citada anteriormente) se proporciona un listado de inhibidores de
nucleótido cíclico fosfodiesterasas.
Se ha reseñado también que las nucleótido
cíclico fosfodiesterasas afectan a la proliferación celular de una
diversidad de tipos de células y han estado implicadas en el
tratamiento de diversos cánceres. (Bang y col. (1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91:5330-5334)
reseñaron que en las líneas celulares de carcinoma de próstata DU
145 y LNCaP se inhibió el crecimiento mediante el suministro de
derivados de AMPc y de inhibidores de fosfodiesterasa y se observó
una conversión permanente en el fenotipo desde una morfología
epitelial a otra neuronal; Matousovic y col. ((1995) J. Clin.
Invest. 96:401-410) sugieren que los inhibidores
de la isoenzima nucleótido cíclico fosfodiesterasa tienen el
potencial de regular la proliferación celular mesangial; Joulain y
col. ((1995) J. Mediat. Cell Signal 11:63-79)
reseñan que la nucleótido cíclico fosfodiesterasa ha demostrado ser
una diana importante implicada en el control de la proliferación de
linfocitos; y Deonarain y col. ((1994) Brit. J. Cancer
70:786-94) sugieren un enfoque de
direccionamiento tumoral para el tratamiento del cáncer que implica
el suministro intracelular de fosfodiesterasas a compartimientos
celulares particulares, dando como resultado la muerte celular.
Por consiguiente, las nucleótido cíclico
fosfodiesterasas son una diana principal para la acción y desarrollo
de fármacos. En consecuencia, es de gran valor para el campo del
desarrollo de fármacos identificar y caracterizar fosfodiesterasas
previamente desconocidas. La presente invención hace progresar al
estado de la técnica proporcionando una nucleótido cíclico
fosfodiesterasa humana previamente no identificada.
Un objeto de la invención es identificar
nucleótido cíclico fosfodiesterasas novedosas.
Otro objeto de la invención es proporcionar
nuevos polipéptidos de nucleótido cíclico fosfodiesterasas que sean
útiles como reactivos o dianas en ensayos de fosfodiesterasas
aplicables al tratamiento y al diagnóstico de trastornos mediados
por o relacionados con nucleótido cíclico fosfodiesterasas.
Otro objeto de la invención es proporcionar
polinucleótidos que correspondan a los polipéptidos de
fosfodiesterasa novedosos que sean útiles como dianas y reactivos
en ensayos de fosfodiesterasa aplicables al tratamiento y
diagnóstico de trastornos mediados por o relacionados con
fosfodiesterasas y útiles para la producción de nuevos polipéptidos
de fosfodiesterasa mediante procedimientos recombinantes.
Un objeto específico de la invención es
identificar compuestos que actúen como agonistas y antagonistas y
modulen la expresión de la nueva fosfodiesterasa.
Un objeto específico adicional de la invención
es proporcionar compuestos que modulen la expresión de la
fosfodiesterasa para el tratamiento y el diagnóstico de trastornos
relacionados con la fosfodiesterasa.
La invención se basa, por consiguiente, en la
identificación de una nueva nucleótido cíclico fosfodiesterasa
humana. La invención abarca una forma larga y corta de la
fosfodiesterasa. La secuencia de aminoácidos de la forma más larga
se muestra en la SEC. ID Nº: 1 y la secuencia de aminoácidos de la
forma más corta se muestra como SEC. ID Nº: 3. La secuencia de
nucleótidos de la forma más larga se muestra como SEC. ID Nº: 2 o la
secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc depositado como
ATCC Nº PTA-1644 el 5 de Abril de 2000 en la
American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas,
VA 20110-2209 US ("el ADNc depositado") y la
secuencia de nucleótidos de la forma más corta se muestra como SEC.
ID Nº: 4.
La invención proporciona polipéptidos de
fosfodiesterasa aislados, incluyendo un polipéptido que presenta la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID Nº: 1 o la SEC. ID
Nº: 3.
La invención también proporciona moléculas de
ácido nucleico de fosfodiesterasa aisladas que presentan la
secuencia mostrada en la SEC. ID Nº: 2 o la SEC. ID Nº: 4 o en el
ADNc depositado.
La invención describe también variantes de
polipéptidos que presentan una secuencia de aminoácidos que es
sustancialmente homóloga a la secuencia de aminoácidos mostrada en
la SEC. ID Nº: 1 o en la SEC. ID Nº: 3 o codificada por el ADNc
depositado.
La invención describe también variantes de
secuencias de ácido nucleico que son sustancialmente homólogas a la
secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID Nº: 2 o en la SEC.
ID Nº: 4 o en el ADNc depositado.
La invención describe también fragmentos del
polipéptido mostrado en la SEC. ID Nº: 1 o en la SEC. ID Nº: 3 y la
secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID Nº: 2 o en la SEC.
ID Nº: 4, así como fragmentos sustancialmente homólogos del
polipéptido o del ácido nucleico.
La invención proporciona adicionalmente
construcciones de ácido nucleico que comprenden las moléculas de
ácido nucleico descritas en la presente memoria. En una realización
preferida, las moléculas de ácido nucleico de la invención están
unidas de forma funcional a una secuencia reguladora.
La invención proporciona también vectores y
células huésped para expresar las moléculas de ácido nucleico y los
polipéptidos de fosfodiesterasa, y particularmente vectores
recombinantes y células huésped.
La invención proporciona también procedimientos
de preparación de los vectores y células huésped y procedimientos
para usarlos para producir las moléculas de ácido nucleico y
polipéptidos de fosfodiesterasa.
La invención proporciona también anticuerpos o
fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen de forma
selectiva a los polipéptidos y fragmentos de fosfodiesterasa.
La invención proporciona también procedimientos
de cribado de compuestos que modulan la expresión o actividad del
ácido nucleico (ARN o ADN) o polipéptidos de fosfodiesterasa.
La invención contempla también un procedimiento
para modular la expresión o actividad del ácido nucleico o
polipéptido de fosfodiesterasa, especialmente usando los compuestos
cribados. La modulación se puede usar para tratar afecciones
relacionadas con una actividad o expresión aberrante de los ácidos
nucleicos o polipéptidos de fosfodiesterasa.
La invención proporciona también ensayos para
determinar la actividad de o la presencia o ausencia de las
moléculas de ácido nucleico o polipéptidos de fosfodiesterasa en una
muestra biológica, incluyendo para el diagnóstico de una
enfermedad.
La invención proporciona también ensayos para
determinar la presencia de una mutación en los polipéptidos o
moléculas de ácido nucleico, incluyendo para el diagnóstico de
enfermedades.
Todavía en una realización adicional, la
invención describe un medio legible por ordenador que contiene las
secuencias de nucleótidos y/o de aminoácidos de los ácidos nucleicos
y polipéptidos de la invención, respectivamente.
La Figura 1 muestra la secuencia larga de
nucleótidos de fosfodiesterasa (SEC. ID Nº: 2) y la secuencia de
aminoácidos deducida (SEC. ID Nº: 1). Se predice que los aminoácidos
1-223 constituyen el dominio regulador amino
terminal, los aminoácidos 224-462 constituyen el
dominio catalítico, y los aminoácidos 463-502
constituyen el dominio carboxi terminal.
La Figura 2 muestra una comparación de la
fosfodiesterasa larga frente a la base de datos Prosite de patrones
de proteína, que muestra específicamente una alta puntuación frente
a la familia 7 de 3',5'-nucleótido cíclico
fosfodiesterasas. El área subrayada muestra un distintivo de
fosfodiesterasa.
La Figura 3 muestra un análisis de la secuencia
larga de aminoácidos de fosfodiesterasa: regiones de giro
\alpha\beta y de enrollamiento; hidrofilia; regiones
anfipáticas; regiones flexibles; índice antigénico; y
representación gráfica de la probabilidad superficial.
La Figura 4 muestra una representación gráfica
de la hidrofobia de la fosfodiesterasa larga.
La Figura 5 muestra un análisis del marco
abierto de lectura de la fosfodiesterasa larga para los aminoácidos
que corresponden a sitios funcionales específicos. Los sitios de
glicosilación se encuentran desde aproximadamente el aminoácido 107
hasta aproximadamente el aminoácido 110, desde aproximadamente el
aminoácido 290 hasta aproximadamente el aminoácido 293, y desde
aproximadamente el aminoácido 447 hasta aproximadamente el
aminoácido 450. Un sitio de unión de glicosaminoglicano se
encuentra entre aproximadamente el aminoácido 479 y aproximadamente
el aminoácido 482. Los sitios de fosforilación por proteína quinasa
dependiente de AMP cíclico y de GMP cíclico se encuentran desde
aproximadamente el aminoácido 15 hasta aproximadamente el aminoácido
18 y desde aproximadamente el aminoácido 94 hasta aproximadamente
el aminoácido 97. Los sitios de fosforilación de la proteína quinasa
C se encuentran desde aproximadamente el aminoácido 117 hasta
aproximadamente el aminoácido 119 y desde aproximadamente el
aminoácido 390 hasta aproximadamente el aminoácido 392. Los sitios
de fosforilación de la caseína quinasa II se encuentran desde
aproximadamente el aminoácido 18 hasta aproximadamente el aminoácido
21, desde aproximadamente el aminoácido 56 hasta aproximadamente el
aminoácido 59, desde aproximadamente el aminoácido 251 hasta
aproximadamente el aminoácido 254, desde aproximadamente el
aminoácido 292 hasta aproximadamente el aminoácido 295, desde
aproximadamente el aminoácido 449 hasta aproximadamente el
aminoácido 452, desde aproximadamente el aminoácido 481 hasta
aproximadamente el aminoácido 484, y desde aproximadamente el
aminoácido 492 hasta aproximadamente el aminoácido 495. Un sitio de
fosforilación de la tirosina quinasa se encuentra desde
aproximadamente el aminoácido 392 hasta aproximadamente el
aminoácido 398. Los sitios de N-miristoilación se
encuentran desde aproximadamente el aminoácido 22 hasta
aproximadamente el aminoácido 27, desde aproximadamente el
aminoácido 29 hasta aproximadamente el aminoácido 34, desde
aproximadamente el aminoácido 67 hasta aproximadamente el
aminoácido 72, desde aproximadamente el aminoácido 258 hasta
aproximadamente el aminoácido 263, y desde aproximadamente el
aminoácido 477 hasta aproximadamente el aminoácido 482. Un sitio de
amidación se encuentra desde aproximadamente el aminoácido 13 hasta
aproximadamente el aminoácido 16. Además, los aminoácidos que
corresponden al distintivo de las fosfodiesterasas, HDXXHXX, se
encuentran en la secuencia HDVDHPG en los aminoácidos
265-271.
La Figura 6 muestra la secuencia corta de
nucleótidos de fosfodiesterasa (SEC. ID Nº: 4) y la secuencia de
aminoácidos deducida (SEC. ID Nº: 3). Se predice que los aminoácidos
1-223 constituyen el dominio regulador amino
terminal, y los aminoácidos 224-320 constituyen el
dominio catalítico.
La Figura 7 muestra una comparación de la
fosfodiesterasa corta frente a la base de datos Prosite de patrones
de proteína, mostrando específicamente una alta puntuación frente a
la familia 7 de 3',5'-nucleótido cíclico
fosfodiesterasas. El área subrayada muestra un distintivo de
fosfodiesterasa.
La Figura 8 muestra una representación gráfica
de la hidrofobia de la fosfodiesterasa corta.
La Figura 9 muestra un análisis del marco
abierto de lectura de la fosfodiesterasa corta para los aminoácidos
que corresponden a sitios funcionales específicos. Los sitios de
glicosilación se encuentran desde aproximadamente el aminoácido 107
hasta aproximadamente el aminoácido 110, y desde aproximadamente el
aminoácido 290 hasta aproximadamente el aminoácido 293. Los sitios
de fosforilación por proteína quinasa dependiente de AMP cíclico y
de GMP cíclico se encuentran desde aproximadamente el aminoácido 15
hasta aproximadamente el aminoácido 18 y desde aproximadamente el
aminoácido 94 hasta aproximadamente el aminoácido 97. Los sitios de
fosforilación de la proteína quinasa C se encuentran desde
aproximadamente el aminoácido 117 hasta aproximadamente el
aminoácido 119. Los sitios de fosforilación de la caseína quinasa
II se encuentran desde aproximadamente el aminoácido 18 hasta
aproximadamente el aminoácido 21, desde aproximadamente el
aminoácido 56 hasta aproximadamente el aminoácido 59, desde
aproximadamente el aminoácido 251 hasta aproximadamente el
aminoácido 254, y desde aproximadamente el aminoácido 292 hasta
aproximadamente el aminoácido 295. Los sitios de
N-miristoilación se encuentran desde
aproximadamente el aminoácido 22 hasta aproximadamente el aminoácido
27, desde aproximadamente el aminoácido 29 hasta aproximadamente el
aminoácido 34, desde aproximadamente el aminoácido 67 hasta
aproximadamente el aminoácido 72, desde aproximadamente el
aminoácido 258 hasta aproximadamente el aminoácido 263, y un sitio
de amidación se encuentra desde aproximadamente el aminoácido 13
hasta aproximadamente el aminoácido 16. Además, los aminoácidos que
corresponden al distintivo de las fosfodiesterasas, HDXXHXX, se
encuentran en la secuencia HDVDHPG en los aminoácidos
265-271.
Tal y como se usa en el presente documento, una
"ruta de señalización" se refiere a la modulación (por ejemplo,
estimulación o inhibición) de una función/actividad celular tras la
unión de un ligando a un receptor. Entre los ejemplos de dichas
funciones se incluyen la movilización de moléculas intracelulares
que participan en una ruta de transducción de señal, por ejemplo,
fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP_{2}),
inositol 1,4,5-trifosfato (IP_{3}) y adenilato
ciclasa; polarización de la membrana plasmática; producción o
secreción de moléculas; alteración en la estructura de un
componente celular; proliferación celular, por ejemplo, síntesis de
ADN; migración celular; diferenciación celular; y supervivencia
celular.
La respuesta depende del tipo de célula. En
algunas células, la unión de un ligando al receptor puede estimular
una actividad tal como la liberación de compuestos, control de
apertura de un canal, adhesión, migración, diferenciación
celulares, etc., a través del metabolismo y recambio de AMP cíclico
o de fosfatidilinositol mientras que en otras células, la unión
producirá un resultado diferente.
Una ruta de señalización es la ruta de recambio
de AMPc. Tal y como se usa en el presente documento, "recambio y
metabolismo de AMP cíclico" se refiere a las moléculas implicadas
en el recambio y metabolismo de AMPc así como a las actividades de
estas moléculas. El AMP cíclico es un segundo mensajero producido
como respuesta a la estimulación inducida por el ligando de ciertos
receptores. En la ruta de señalización de AMPc, la unión de un
ligando puede conducir a la activación de la enzima adenil ciclasa,
que cataliza la síntesis de AMPc. El AMPc recién sintetizado puede
activar, a su vez, a una proteína quinasa dependiente de AMPc. Esta
quinasa activada puede fosforilar a una proteína del canal de
potasio cuya apertura está controlada por voltaje, o una proteína
asociada, y conducir a la incapacidad del canal de potasio a abrirse
durante un potencial de acción. La incapacidad del canal de potasio
a abrirse da como resultado una reducción en el flujo de salida de
potasio, que normalmente repolariza la membrana de una neurona,
conduciendo a una despolarización prolongada de la membrana.
La invención se basa en el descubrimiento de una
nueva nucleótido cíclico fosfodiesterasa humana. Específicamente,
se seleccionó una etiqueta de secuencia expresada (EST) en base a la
homología con las secuencias de fosfodiesterasa. Esta EST se usó
para diseñar cebadores basados en secuencias que contiene y se usó
para identificar un ADNc de una biblioteca de ADNc de glándula
suprarrenal y de riñón. Los clones positivos se secuenciaron y se
ensamblaron los fragmentos que se solapaban. El análisis de la
secuencia ensamblada reveló que la molécula de ADNc clonada
codifica una nucleótido cíclico fosfodiesterasa. Se aisló también a
partir de una biblioteca de ADNc de osteoblasto el ácido nucleico
que codifica una forma truncada de la enzima.
La invención se refiere así a una nueva
fosfodiesterasa que presenta la secuencia de aminoácidos deducida
mostrada en la Figura 1 o la Figura 6 (SEC. ID Nº: 1 o SEC. ID Nº:
3).
El depósito se mantendrá bajo los términos del
Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del
Depósito de Microorganismos (Internacional Recognition of the
Deposit of Microorganisms). La secuencia depositada, así como los
polipéptidos codificados por las secuencias, se incorporan en el
presente documento por referencia y controla en caso de cualquier
conflicto, tal como un error en la secuenciación, con descripción en
esta solicitud.
"Polipéptido de fosfodiesterasa" o
"proteína de fosfodiesterasa" se refiere a los polipéptidos en
la SEC. ID Nº: 1 o SEC. ID Nº: 3. El término "proteína de
fosfodiesterasa" o "polipéptido de fosfodiesterasa", sin
embargo, incluye adicionalmente las numerosas variantes descritas en
el presente documento, así como fragmentos derivados de las
fosfodiesterasas de longitud completa y variantes.
Los tejidos y/o células en los cuales se
encuentran las fosfodiesterasas incluyen, pero sin limitación,
corazón (incluyendo fetal), ovario, cerebro, páncreas, riñones,
mama, hígado, testículos, próstata, músculo esquelético, y
osteoblastos. Además, las fosfodiesterasas se expresan en tejidos
enfermos, incluyendo pero sin limitación, aquellos implicados en la
insuficiencia cardiaca congestiva y el cáncer de mama. La expresión
se ha confirmado mediante el análisis de transferencia Northern y
adición, en osteoblastos, mediante hibridación in situ.
La presente invención proporciona de esta forma
un polipéptido de fosfodiesterasa aislado o purificado y variantes
y fragmentos del mismo.
Las fosfodiesterasas incluyen un distintivo
catalítico, HDVDHPG, en los restos 265-271. La
secuencia incluye HXXDHXX, una secuencia de aminoácidos de consenso
en nucleótido cíclico fosfodiesterasas.
En base a una búsqueda BLAST, se mostró la mayor
homología a la familia 7. La forma larga se designa como B2 y la
forma corta como B1.
Tal y como se usa en el presente documento, se
dice que un polipéptido está "aislado" o "purificado"
cuando está sustancialmente libre de material celular cuando se
aísla a partir de células recombinantes y no recombinantes, o libre
de precursores químicos o de otros agentes químicos cuando se
sintetiza químicamente. Un polipéptido, sin embargo, se puede unir
a otro polipéptido con el que normalmente no está asociado en una
célula y todavía se considera "aislado" o
"purificado".
Los polipéptidos de fosfodiesterasa se pueden
purificar hasta homogeneidad. Se entiende, sin embargo, que las
preparaciones en las cuales el polipéptido no está purificado hasta
homogeneidad son útiles y se considera que contienen una forma
aislada del polipéptido. La característica crítica es que la
preparación permite la función deseada del polipéptido, incluso en
la presencia de cantidades considerables de otros componentes. De
esta forma, la invención abarca diversos grados de pureza.
En una realización, el lenguaje
"sustancialmente libre de material celular" incluye
preparaciones de la fosfodiesterasa que presentan menos de
aproximadamente un 30% (en peso en seco) de otras proteínas (es
decir, proteína contaminante), menos de aproximadamente un 20% de
otras proteínas, menos de aproximadamente un 10% de otras proteínas,
o menos de aproximadamente un 5% de otras proteínas. Cuando el
polipéptido se produce de forma recombinante, también puede estar
sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de
cultivo representa menos de aproximadamente un 20%, menos de
aproximadamente un 10%, o menos de aproximadamente un 5% del volumen
de la preparación de proteína.
Un polipéptido de fosfodiesterasa también se
considera aislado cuando forma parte de una preparación de membrana
o está purificado y después reconstituido con vesículas o liposomas
de membrana.
La expresión "sustancialmente libre de
precursores químicos o de otros agentes químicos" incluye
preparaciones del polipéptido de fosfodiesterasa en las cuales está
separado de los precursores químicos o de otros agentes químicos
que están implicados en su síntesis. En una realización, la
expresión "sustancialmente libre de precursores químicos o de
otros agentes químicos" incluye preparaciones del polipéptido que
presentan menos de aproximadamente un 30% (en peso en seco) de
precursores químicos o de otros agentes químicos, menos de
aproximadamente un 20% de precursores químicos o de otros agentes
químicos, menos de aproximadamente un 10% de precursores químicos o
de otros agentes químicos, o menos de aproximadamente un 5% de
precursores químicos o de otros agentes químicos.
En una realización, el polipéptido de
fosfodiesterasa comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEC. ID Nº: 1 o la SEC. ID Nº: 3. Sin embargo, la invención también
describe variantes de secuencia. Las variantes incluyen una
proteína sustancialmente homóloga codificada por el mismo locus
genético en un organismo, es decir, una variante alélica. La
fosfodiesterasa ha sido mapeada en el cromosoma 6 humano
(6q21-q23.2), con marcadores flanqueantes
AFMA074ZG9 (2.6cR) y AFM214ZF6 (7.9cR). Entre las mutaciones cerca
de este locus se incluyen, pero sin limitación, las siguientes:
PPAC, artropatía pseudorreumatoide progresiva de la infancia; ODDD,
displasia oculodentodigital; persistencia hereditaria heterocelular
de hemoglobina fetal; DFNA 10, sordera neurosensorial no sindrómica
autosómica dominante 10; CMD1F, cardiomiopatía dilatada, 1F; y
diabetes mellitus neonatal transitoria. En el ratón este locus está
asociado con lo siguiente: mutación gl, gris-letal;
dl, downless; Cat5, catarata dominante 5; Lwq3, lugares de
cuantificación de rasgos en cromosoma 3 (QTL 3) asociados al peso
de hígado; mshi, esterilidad masculina e histoincompatilibidad;
Mop2, preferencia por morfina 2; H60, histocompatibilidad 60; Daq4,
lugares de cuantificación de rasgos en cromosoma 4 (QTL 4) asociados
a asimetría direccional; Daq5, lugares de cuantificación de rasgos
en cromosoma 5 (QTL 5) asociados a asimetría direccional; y
Kd/enfermedad renal. Entre los genes cerca de este locus se incluyen
PDNP1 (fosfodiesterasa 1/nucleótido pirofosfatasa 1 (homólogo al
antígeno Ly-41 de ratón)), MACS, PTPRK, ARG1, PCMT1,
DFNA10, MEKK5, CTGF, SGK, HIVEP2, CMD1F, EPB41L2, HPFH, UTRN,
IFNGR1, y ESR1.
Las variantes descritas en el presente documento
abarcan también proteínas derivadas de otros loci genéticos en un
organismo, pero que presentan homología sustancial con la
fosfodiesterasa de la SEC. ID Nº: 1 o la SEC. ID Nº: 3. Las
variantes también incluyen proteínas sustancialmente homólogas a la
fosfodiesterasa pero derivadas de otro organismo, en concreto, un
ortólogo. Las variantes también incluyen proteínas que son
sustancialmente homólogas a la fosfodiesterasa que se producen
mediante síntesis química. Las variantes también incluyen proteínas
que son sustancialmente homólogas a la fosfodiesterasa que se
producen mediante procedimientos recombinantes.
Tal y como se usa en el presente documento, dos
proteínas (o una región de las proteínas) son sustancialmente
homólogas cuando las secuencias de aminoácidos son homólogas al
menos en aproximadamente un 70-75%, típicamente en
al menos aproximadamente un 80-85%, y lo más
típicamente en al menos aproximadamente un 90-95% o
más. Una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga, de
acuerdo con la presente invención, estará codificada por una
secuencia de ácido nucleico que se hibrida a la secuencia de ácido
nucleico, o a una porción de la misma, de la secuencia mostrada en
la SEC. ID Nº: 2 o la SEC. ID Nº: 4 bajo condiciones estrictas tal y
como se describirá de forma más completa más adelante.
Para determinar la identidad porcentual de dos
secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico,
las secuencias se alinean con el propósito de una comparación óptima
(por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas de una
primera y una segunda secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos
para un alineamiento óptimo y las secuencias no homólogas pueden
ignorarse para los propósitos de comparación). En una realización
preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada con
propósitos de comparación es al menos un 30%, preferiblemente al
menos un 40%, más preferiblemente al menos un 50%, incluso más
preferiblemente al menos un 60%, e incluso más preferiblemente al
menos un 70%, 80%, o 90% de la longitud de la secuencia de
referencia (por ejemplo, cuando se alinea una segunda secuencia a
las secuencias de aminoácidos en el presente documento que
presentan 502 restos de aminoácidos, se alinean al menos 165,
preferiblemente al menos 200, más preferiblemente al menos 250,
incluso más preferiblemente al menos 300, e incluso más
preferiblemente al menos 350, 400, 450, y 500 restos de
aminoácidos). Posteriormente se comparan los restos de aminoácidos
o nucleótidos en las correspondientes posiciones de los aminoácidos
o posiciones de los nucleótidos. Cuando una posición en la primera
secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido
que la correspondiente posición en la segunda secuencia, entonces
las moléculas son idénticas en esa posición (tal y como se usa en
el presente documento "identidad" de aminoácidos o de ácidos
nucleicos es equivalente a "homología" de aminoácidos o de
ácidos nucleicos). La identidad porcentual entre las dos secuencias
es una función del número de posiciones idénticas compartidas por
las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la
longitud de cada hueco, que necesitan introducirse para un
alineamiento óptimo de las dos secuencias.
La invención también describe polipéptidos que
presentan un menor grado de identidad pero que presentan suficiente
similitud como para llevar a cabo una o más de las mismas funciones
realizadas por la fosfodiesterasa. La similitud se determina
mediante sustitución de aminoácidos conservada. Dichas sustituciones
son aquellas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido
por otro aminoácido de características similares. Las sustituciones
conservativas es probable que sean fenotípicamente silenciosas.
Típicamente contemplados como sustituciones conservativas están los
reemplazos, uno por el otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala,
Val, Leu, e Ile; intercambio de los restos hidroxilo Ser y Thr,
intercambio de los restos ácidos Asp y Glu, sustitución entre los
restos amida Asn y Gln, intercambio de los restos básicos Lys y Arg
y reemplazos entre los restos aromáticos Phe, Tyr. Una guía
respecto a qué cambios de aminoácidos es probable que sean
fenotípicamente silenciosos se encuentran en Bowie y col.,
Science 247:1306-1310 (1990).
La comparación de secuencias y la determinación
de la identidad porcentual y de la similitud entre dos secuencias
se puede llevar a cabo usando un algoritmo matemático.
(Computacional Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford
University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and
Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York,
1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1,
Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey,
1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje,
G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer,
Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York,
1991).
Un ejemplo no limitante preferido de dicho
algoritmo matemático se describe en Karlin y col. (1993) Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:5873-5877.
Dicho algoritmo se incorpora en los programas NBLAST Y XBLAST
(versión 2.0) tal y como se describe en Altschul y col. (1997)
Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Cuando se
utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los
parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo,
NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. En una
realización, los parámetros para la comparación de secuencias
pueden fijarse a una puntuación = 100, longitud de palabra = 12, o
pueden variarse (por ejemplo, W = 5 o W = 20).
En una realización preferida, la identidad
porcentual entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando
el algoritmo de Needleman y col. (1970) (J. Mol. Biol.
48:444-453) que se ha incorporado en el programa
GAP en el paquete de software GCG (disponible en
http://www.gcg.com), usando una matriz BLOSUM 62 o una matriz
PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso
de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. En aún otra realización
preferida, la identidad porcentual entre dos secuencias de
nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de
software GCG (Devereux y col. (1984) Nucleic Acids Res.
12(1):387) (disponible en http://www.gcg.com), usando
una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70, u 80
y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6.
Otro ejemplo no limitante preferido de un
algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es
el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Dicho algoritmo se
incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del
paquete de software de alineamiento de secuencias CGC. Cuando se
utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos,
se pueden usar una tabla de restos de peso PAM120, una penalización
por la longitud del hueco de 12, y una penalización de hueco de 4.
En la técnica se conocen algoritmos adicionales para el análisis de
secuencias e incluyen ADVANCE y ADAM tal y como se describe en
Torellis y col. (1994) Comput. Appl. Biosci.
10:3-5; y FASTA descrito en Pearson y col.
(1988) PNAS 85:2444-8.
Una variante de polipéptido puede diferir en la
secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, eliminaciones,
inserciones, inversiones, fusiones, y truncamientos o una
combinación de cualquiera de éstas.
Las variantes de polipéptidos pueden ser
totalmente funcionales o pueden carecer de función en una o más
actividades. De esta forma, en el caso presente, las variaciones
pueden afectar a la función, por ejemplo, de una o más de las
regiones que corresponden a la región catalítica conservada,
regiones reguladoras carboxi terminales, regiones reguladoras amino
terminales, regiones de direccionamiento amino terminales, regiones
implicadas en la asociación de membrana, regiones implicadas en la
activación de enzimas, por ejemplo, mediante la fosforilación, y
regiones implicadas en la interacción con componentes de otras rutas
de transducción de señal dependientes de nucleótido cíclico (por
ejemplo, AMP, GMP).
Las variantes totalmente funcionales típicamente
contienen sólo variación conservativa o variación en restos no
críticos o en regiones no críticas. Las variantes funcionales pueden
contener también sustitución de aminoácidos similares, que da como
resultado una ausencia de cambio o un cambio insignificante en la
función. De forma alternativa, dichas sustituciones pueden afectar
positiva o negativamente a la función en algún grado.
Las variantes no funcionales típicamente
contienen una o más sustituciones, eliminaciones, inserciones,
inversiones, o truncamientos no conservativas de aminoácidos o una
sustitución, inserción, inversión, o eliminación en un resto
crítico o en una región crítica.
Tal y como se ha indicado, las variantes pueden
ser de origen natural o se pueden preparar mediante medios
recombinantes o síntesis química para proporcionar características
útiles y novedosas para el polipéptido de fosfodiesterasa. Esto
incluye la prevención de la inmunogenicidad de formulaciones
farmacéuticas evitando la agregación de proteínas.
Entre las variaciones útiles se incluye
adicionalmente la alteración de la actividad catalítica. Por
ejemplo, una realización implica una variación en el sitio de unión
que da como resultado la unión pero no la hidrólisis, o una
hidrólisis más lenta, de AMPc. Una variación útil adicional en el
mismo sitio puede dar como resultado una afinidad alterada para el
AMPc. Entre las variaciones útiles también se incluyen cambios que
proporcionan afinidad por otro nucleótido cíclico. Otra variación
útil incluye aquella que evita la activación por la proteína
quinasa A. Otra variación útil proporciona una proteína de fusión en
la cual uno o más dominios o subregiones están fusionados
funcionalmente a uno o más dominios o subregiones de otra isoforma o
familia de fosfodiesterasa.
Los aminoácidos que son esenciales para la
función pueden identificarse mediante procedimientos conocidos en
la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis
de exploración con alanina (Cunningham y col. (1985) Science
244:1081-1085). El último procedimiento
introduce mutaciones individuales con alanina en cada resto en la
molécula. En las moléculas mutantes resultantes se ensaya
posteriormente la actividad biológica, tal como hidrólisis de AMPc
in vitro o actividad in vitro dependiente de AMPc, tal
como la actividad proliferativa. Los sitios que son críticos para
la unión a AMPc o a proteína quinasa A también se pueden determinar
mediante análisis estructural tal como mediante cristalización,
resonancia magnética nuclear o marcado por fotoafinidad (Smith y
col. (1992) J. Mol. Biol. 224:899-904; de Vos
y col. (1992) Science 255:306-312).
La homología sustancial puede ser respecto a la
secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico entera o respecto a
fragmentos de estas secuencias.
La invención por tanto también describe
fragmentos polipeptídicos de la fosfodiesterasa. Los fragmentos
pueden derivarse de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC.
ID Nº: 1 o en la SEC. ID Nº: 3. Sin embargo, la invención también
abarca fragmentos de las variantes de las fosfodiesterasas tal y
como se describe en el presente documento.
Sin embargo, los fragmentos a los cuales se
refiere la invención, no deben interpretarse como que abarcan
fragmentos que puedan estar descritos anteriormente a la presente
invención.
En consecuencia, un fragmento puede comprender
al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más
aminoácidos contiguos. Los fragmentos pueden conservar una o más de
las actividades biológicas de la proteína, por ejemplo la capacidad
de unirse a o de hidrolizar al AMPc, así como fragmentos que se
puedan usar como un inmunógeno para generar anticuerpos de
fosfodiesterasa.
Los fragmentos biológicamente activos (péptidos
que tienen una longitud de, por ejemplo, 5, 7, 10, 12, 15, 20, 30,
35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 o más aminoácidos) pueden comprender
un dominio o motivo, por ejemplo, sitio catalítico, distintivo de
fosfodiesterasa, y sitios de glicosilación, sitios de fosforilación
de proteína quinasa dependiente de AMPc y de GMPc, sitios de
fosforilación de proteína quinasa C, sitios de fosforilación de
caseína quinasa II, sitios de fosforilación de tirosina quinasa,
sitios de N-miristoilación, sitios de amidación, y
sitios de unión de glicosaminoglicano. Entre los fragmentos posibles
adicionales se incluyen el dominio o sitio catalítico que incluye
HDXXHXX, un sitio de unión alostérico, sitios importantes para el
direccionamiento celular y subcelular, sitios funcionales para la
interacción con componentes de otras rutas de transducción de señal
dependientes de AMPc, y sitios reguladores amino terminales y
carboxi terminales.
Dichos dominios o motivos pueden identificarse
por medio de procedimientos de búsqueda de homología computarizada
de rutina.
Los fragmentos, por ejemplo, pueden extenderse
en una o ambas direcciones desde el sitio funcional para abarcar 5,
10, 15, 20, 30, 40, 50, o hasta 100 aminoácidos. Además, los
fragmentos pueden incluir subfragmentos de los dominios específicos
mencionados anteriormente, dichos subfragmentos conservan la función
del dominio del cual derivan.
Estas regiones pueden identificarse mediante
procedimientos bien conocidos que implican análisis de homología
computarizado.
La invención proporciona también fragmentos con
propiedades inmunogénicas. Éstos contienen una parte de la
fosfodiesterasa y variantes que porta un epítope. Estos péptidos que
portan un epítope son útiles para generar anticuerpos que se unen
específicamente a un polipéptido o región o fragmento de
fosfodiesterasa. Estos péptidos pueden contener al menos 10, 12, al
menos 14, o entre al menos aproximadamente 15 y aproximadamente 30
aminoácidos.
Entre los ejemplos no limitantes de polipéptidos
antigénicos que se pueden usar para generar anticuerpos se
incluyen, pero sin limitación, péptidos derivados de un sitio
extracelular. En las Figuras 3 y 8 se muestran regiones que
presentan un alto índice de antigenicidad. Sin embargo, también
están abarcados anticuerpos preparados intracelularmente
("intracuerpos"), que reconocerían regiones peptídicas
intracelulares.
Los polipéptidos de fosfodiesterasa que portan
un epítope pueden producirse mediante cualquier medio convencional
(Houghten, R.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
82:5131-5135). En la patente de EE.UU. nº
4.631.211 se describe una síntesis múltiple simultánea de
péptidos.
Los fragmentos pueden ser discretos (no
fusionados a otros aminoácidos o polipéptidos) o pueden estar dentro
de un polipéptido mayor. Además, varios fragmentos pueden estar
comprendidos dentro de un único polipéptido mayor. En una
realización un fragmentos diseñado para la expresión en un huésped
puede tener regiones pre- y pro-polipeptídicas
heterólogas fusionadas al extremo amino terminal del fragmento de
fosfodiesterasa y una región adicional fusionada al extremo carboxi
terminal del fragmento.
La invención proporciona de esta manera
proteínas quiméricas o de fusión. Éstas comprenden una secuencia
peptídica de fosfodiesterasa unida de forma funcional a un péptido
heterólogo que presenta una secuencia de aminoácidos que no es
sustancialmente homóloga a la fosfodiesterasa. "Unido de forma
funcional" indica que el péptido de la fosfodiesterasa y el
péptido heterólogo están fusionados en fase. El péptido heterólogo
puede estar fusionado al extremo N terminal o al extremo C terminal
de la fosfodiesterasa o puede estar localizado internamente.
En una realización la proteína de fusión no
afecta a la función de la fosfodiesterasa como tal. Por ejemplo, la
proteína de fusión puede ser una proteína de fusión GST (glutatión S
transferasa) en la cual las secuencias de fosfodiesterasa están
fusionadas al extremo C terminal de las secuencias de GST. Otros
tipos de proteínas de fusión incluyen, pero sin limitación,
proteínas de fusión enzimáticas, por ejemplo fusiones con
beta-galactosidasa, fusiones de
GAL-4 de dos híbridos en levadura, fusiones
poli-His y fusiones Ig. Dichas proteínas de fusión,
particularmente las fusiones poli-His, pueden
facilitar la purificación de fosfodiesterasa recombinante. En
ciertas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero),
la expresión y/o secreción de una proteína puede aumentarse usando
una secuencia señal heteróloga. Por lo tanto, en otra realización,
la proteína de fusión contiene una secuencia señal heteróloga en su
extremo N terminal.
El documento
EP-A-O 464 533 describe proteínas de
fusión que comprenden diversas porciones de regiones constantes de
inmunoglobulina. La porción Fc es útil en terapia y en el
diagnóstico y de esta manera da como resultado, por ejemplo,
propiedades farmacocinéticas mejoradas (documento
EP-A-0232 262). En el descubrimiento
de fármacos, por ejemplo, se han fusionado proteínas humanas con
porciones Fc con el propósito de que los ensayos de cribado de alto
rendimiento identificaran antagonistas (Bennett y col. (1995) J.
Mol. Recog. 8:52-58 (1995) y Johanson y col.
J. Biol. Chem. 270:9459-9471). De esta forma,
esta invención abarca también proteínas de fusión solubles que
contienen un polipéptido de fosfodiesterasa y diversas porciones de
las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de
inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se
prefiere como inmunoglobulina la parte constante de la cadena
pesada de la IgG humana, particularmente IgG1, donde la fusión
tiene lugar en la región bisagra. Para algunos usos es deseable
retirar la porción Fc después de que la proteína de fusión se haya
usado para su propósito pretendido, por ejemplo cuando la proteína
de fusión se ha de usar como antígeno para inmunizaciones. En una
realización particular, la parte Fc se puede retirar de una forma
sencilla mediante una secuencia de escisión, que también se
incorpora y se puede escindir con el factor Xa.
Se puede producir una proteína de fusión o
quimérica mediante técnicas de ADN recombinante estándar. Por
ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes
secuencias de proteínas se ligan conjuntamente en fase de acuerdo
con técnicas convencionales. En otra realización, el gen de fusión
se puede sintetizar mediante técnicas convencionales que incluyen
sintetizadores automáticos de ADN. De forma alternativa, la
amplificación por PCR de fragmentos génicos se puede llevar a cabo
usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes
complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que
posteriormente pueden hibridarse y reamplificarse para generar una
secuencia génica quimérica (véase Ausubel y col. (1992) Current
Protocols in Molecular Biology). Además, muchos vectores de
expresión disponibles en el mercado ya codifican un resto de fusión
(por ejemplo, una proteína GST). Un ácido nucleico que codifica una
fosfodiesterasa puede clonarse en dicho vector de expresión de tal
forma que el resto de fusión esté unido en fase a la
fosfodiesterasa.
Otra forma de proteína de fusión es una que
afecta directamente a las funciones de la fosfodiesterasa. Por
consiguiente, la presente invención abarca un polipéptido de
fosfodiesterasa en el cual uno o más de los dominios de
fosfodiesterasa (o partes de la misma) han sido reemplazados por
dominios homólogos (o partes de los mismos) de otra fosfodiesterasa
de la familia 7 o de otra familia de fosfodiesterasa. Por
consiguiente, son posibles diversas permutaciones. Por ejemplo, el
dominio regulador amino terminal, o una subregión del mismo, puede
ser reemplazado con el dominio o subregión de otra isoforma de la
familia 7 o de otra familia de fosfodiesterasas. Como ejemplo
adicional, puede ser reemplazado el dominio catalítico o partes del
mismo; puede ser reemplazado el dominio o subregión carboxi
terminal. De esta forma, se pueden formar fosfodiesterasas
quiméricas en las cuales uno o más de los dominios o subregiones
nativos ha sido reemplazado por otro.
De forma adicional, se pueden producir proteínas
de fosfodiesterasa quiméricas en las cuales uno o más sitios
funcionales derivan de una isoforma de la familia 7 diferente, o de
otra familia de fosfodiesterasas, tal como 1-6 y 8.
Sin embargo se entiende que los sitios podrían derivarse de familias
de fosfodiesterasa que se dan en el genoma de mamíferos pero que
todavía no se han descubierto o caracterizado. Dichos sitios
incluyen, pero sin limitación, el sitio catalítico, el sitio
regulador amino terminal, el sitio regulador carboxi terminal,
sitios importantes para el direccionamiento a localizaciones
subcelulares y celulares, sitios funcionales para la interacción
con componentes de otras rutas de transducción de señal dependientes
de AMP cíclico, sitios de fosforilación de proteína quinasa A,
sitios de glicosilación, y otros sitios funcionales descritos en el
presente documento.
Las fosfodiesterasas aisladas pueden purificarse
a partir de células que las expresan de forma natural, tal como a
partir del corazón (incluyendo fetal), ovario, cerebro, páncreas,
riñones, mama, hígado, testículos, próstata, músculo esquelético, y
osteoblastos, entre otros, especialmente pueden purificarse a partir
de células que han sido alteradas para expresarlas (recombinante),
o sintetizarse usando procedimientos de síntesis de proteínas
conocidos.
En una realización, la proteína se produce
mediante técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, una molécula de
ácido nucleico que codifica el polipéptido de fosfodiesterasa se
clona en un vector de expresión, el vector de expresión se
introduce en una célula huésped y la proteína se expresa en la
célula huésped. La proteína puede aislarse después de las células
mediante un esquema de purificación apropiado usando técnicas de
purificación de proteínas estándar.
Los polipéptidos a menudo contienen aminoácidos
distintos a los 20 aminoácidos comúnmente denominados como los 20
aminoácidos de origen natural. Además, muchos aminoácidos,
incluyendo los aminoácidos terminales, pueden modificarse mediante
procesos naturales, tales como procesamiento y otras modificaciones
post-traduccionales, o mediante técnicas de
modificación química bien conocidas en la técnica. Las
modificaciones habituales que se dan de forma natural en los
polipéptidos se describen en los textos básicos, monografías
detalladas, y en la bibliografía de investigación, y son bien
conocidas para los expertos en la técnica.
Por consiguiente, la patente describe
polipéptidos derivados o análogos en los cuales un resto de
aminoácido sustituido no es uno codificado por el código genético,
en los cuales está incluido un grupo sustituyente, en los cuales el
polipéptido maduro está fusionado con otro compuesto, tal como un
compuesto para aumentar la semivida del polipéptido (por ejemplo,
polietilenglicol), o en los cuales los aminoácidos adicionales están
fusionados al polipéptido maduro, tal como una secuencia líder o
secretora o una secuencia para la purificación del polipéptido
maduro o una secuencia de pro-proteína.
Entre las modificaciones conocidas se incluyen,
pero sin limitación, acetilación, acilación,
ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de
flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un
nucleótido o de un derivado de nucleótido, unión covalente de un
lípido o de un derivado de lípido, unión covalente de
fosfatidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de
enlaces disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos
covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato,
formilación, gamma carboxilación, glicosilación, formación de
anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación,
oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación,
racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN
de transferencia de aminoácidos a proteínas tal como arginilación, y
ubiquitinación.
Dichas modificaciones son bien conocidas para
aquellos expertos en la técnica y han sido descritas en gran
detalle en la bibliografía científica. Varias modificaciones
particularmente habituales, glicosilación, unión de lípidos,
sulfatación, gamma carboxilación de restos ácido glutámico,
hidroxilación y ADP-ribosilación, por ejemplo, se
describen en la mayoría de los textos básicos, tales como
Proteins - Structure and Molecular Properties, segunda
edición, T.E. Creighton, W.H. Freeman y Compañía, Nueva York (1993).
Muchas revisiones detalladas están disponibles acerca de este tema,
tales como la revisión de Wold, F., Posttranslational Covalent
Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press,
Nueva York 1-12 (1983); Seifter y col. (1990)
Meth. Enzymol. 182:626-646) y Rattan y col.
(1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62).
Como es bien sabido también, los polipéptidos no
son siempre enteramente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos
pueden ser ramificados como resultado de la ubiquitinación, y pueden
ser circulares, con o sin ramificación, generalmente como resultado
de acontecimientos post-traduccionales, incluyendo
acontecimientos de procesamiento natural y acontecimientos
ocasionados por manipulación humana que no se producen de forma
natural. Pueden sintetizarse polipéptidos circulares, ramificados y
circulares ramificados mediante procesos naturales no
traduccionales y mediante procedimientos sintéticos.
Las modificaciones pueden producirse en
cualquier lugar en un polipéptido, incluyendo la cadena principal
del péptido, las cadenas laterales aminoacídicas y el extremo amino
o carboxi terminal. El bloqueo del grupo amino o carboxilo en un
polipéptido, o de ambos, mediante una modificación covalente, es
habitual en polipéptidos de origen natural y en polipéptidos
sintéticos. Por ejemplo, el resto amino terminal de polipéptidos
preparados en E. coli, antes del procesamiento proteolítico,
casi de forma invariable será N-formilmetionina.
Las modificaciones pueden ser una función de
cómo se prepara la proteína. Para polipéptidos recombinantes, por
ejemplo, las modificaciones estarán determinadas por la capacidad de
modificación post-traduccional de la célula huésped
y por las señales de modificación en la secuencia de aminoácidos del
polipéptido. Por consiguiente, cuando se desea glicosilación, un
polipéptido debe expresarse en un huésped glicosilante, generalmente
una célula eucariota. Las células de insecto a menudo llevan a cabo
las mismas glicosilaciones post-traduccionales que
las células de mamífero y, por esta razón, se han desarrollado
sistemas de expresión de células de insecto para expresar de manera
eficaz proteínas de mamífero que presentan patrones nativos de
glicosilación. Se aplican consideraciones similares a otras
modificaciones.
El mismo tipo de modificación puede estar
presente en un mismo grado o en grados variables en varios sitios
en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener
más de un tipo de modificación.
Las secuencias de proteínas de la presente
invención pueden usarse como una "secuencia de búsqueda" para
llevar a cabo una búsqueda frente a bases de datos públicas para,
por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias
relacionadas. Dichas búsquedas pueden llevarse a cabo usando los
programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul y col. (1990)
J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de
nucleótidos BLAST pueden llevarse a cabo con el programa NBLAST,
puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias
de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico de la
invención. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden llevar a cabo
con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3
para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las proteínas de
la invención. Para obtener alineamientos con huecos con propósitos
de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST tal y como se
describe en Altschul y col., (1997) Nucleic Acids Res.
25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los
programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por
defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y
NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Los polipéptidos de fosfodiesterasa son útiles
para producir anticuerpos específicos para la fosfodiesterasa,
regiones, o fragmentos. En las Figuras 3 y 8 se muestran las
regiones que presentan una alta puntuación en el índice de
antigenicidad.
Los polipéptidos de fosfodiesterasa son útiles
para ensayos biológicos relacionados con fosfodiesterasas,
especialmente de la familia 7. Dichos ensayos implican cualquiera de
las funciones o actividades o propiedades conocidas de las
fosfodiesterasas útiles para el diagnóstico y el tratamiento de
afecciones relacionadas con fosfodiestera-
sas.
sas.
Los polipéptidos de fosfodiesterasa son también
útiles en ensayos de cribado de fármacos, en sistemas basados en
células o libres de células. Los sistemas basados en células pueden
ser nativos, es decir, células que normalmente expresan la
fosfodiesterasa, como una biopsia o expandidos en cultivo celular.
Sin embargo, en una realización, los ensayos basados en células
implican células huésped recombinantes que expresan la
fosfodiesterasa.
La determinación de la capacidad del compuesto
de ensayo de interactuar con la fosfodiesterasa puede comprender
también la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo de
unirse con preferencia al polipéptido en comparación con la
capacidad de una molécula de unión conocida (por ejemplo, AMPc) de
unirse al polipéptido.
Los polipéptidos pueden usarse para identificar
compuestos que modulan la actividad fosfodiesterasa. Dichos
compuestos, por ejemplo, pueden aumentar o disminuir la afinidad o
velocidad de unión a AMPc, competir con AMPc por la unión a la
fosfodiesterasa, o desplazar el AMPc unido a la fosfodiesterasa.
Tanto la fosfodiesterasa como las variantes y fragmentos apropiados
pueden usarse en cribas de alto rendimiento para ensayar compuestos
candidatos respecto a su capacidad de unión a la fosfodiesterasa.
Estos compuestos pueden cribarse adicionalmente contra una
fosfodiesterasa funcional para determinar el efecto del compuesto
sobre la actividad de la fosfodiesterasa. Pueden identificarse
compuestos que activen (agonistas) o inactiven (antagonistas) a la
fosfodiesterasa hasta el grado deseado. Pueden llevarse a cabo
procedimientos moduladores in vitro (por ejemplo, mediante el
cultivo de la célula con el agente) o, alternativamente, in
vivo (por ejemplo, mediante la administración del agente a un
sujeto).
Los polipéptidos de fosfodiesterasa pueden
usarse para cribar un compuesto respecto a su capacidad para
estimular o inhibir la interacción entre la proteína de
fosfodiesterasa y una molécula diana que normalmente interactúa con
la proteína de fosfodiesterasa. La diana puede ser un nucleótido
cíclico u otro componente de la ruta de señal con la que
normalmente interactúa la proteína de fosfodiesterasa (por ejemplo,
proteína quinasa A u otro interactuador implicado en el recambio
del AMPc). El ensayo incluye las etapas de combinación de la
proteína de fosfodiesterasa con un compuesto candidato bajo
condiciones que permiten que la proteína o fragmento de
fosfodiesterasa interactúe con la molécula diana, y detecte la
formación de un complejo entre la proteína de fosfodiesterasa y la
diana o detecte la consecuencia bioquímica de la interacción con la
fosfodiesterasa y la diana, tal como cualquiera de los efectos
asociados de transducción de señal tal como fosforilación de
proteína quinasa A, recambio de AMPc, y criterios de valoración
biológicos de la ruta.
La determinación de la capacidad de la
fosfodiesterasa para unirse a una molécula diana puede llevarse a
cabo también usando una tecnología tal como Análisis de Interacción
Bimolecular (BIA) a tiempo real. Sjolander y col. (1991) Anal.
Chem. 63:2338-2345 y Szabo y col. (1995)
Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705. Tal y
como se usa en el presente documento, "BIA" es una tecnología
para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin
etiquetar ninguno de los interactuadores (por ejemplo
BIAcore^{TM}). Pueden usarse cambios en el fenómeno óptico de
resonancia de Plasmón de Superficie (SPR) como una indicación de
reacciones a tiempo real entre moléculas biológicas.
Los compuestos de ensayo de la presente
invención pueden obtenerse usando cualquiera de los numerosos
enfoques en procedimientos de bibliotecas combinatorias conocidos
en la técnica, incluyendo: bibliotecas biológicas; bibliotecas en
fase en solución o en fase sólida obtenidas por síntesis paralela
localizables espacialmente; procedimientos de bibliotecas
sintéticas que requieren desconvolución; el procedimiento de
biblioteca
"una-perla-un-compuesto";
y procedimientos de bibliotecas sintéticas que usan selección por
cromatografía de afinidad. El enfoque de las bibliotecas biológicas
está limitado a las bibliotecas polipeptídicas, mientras que los
otros cuatro enfoques son aplicables a bibliotecas de compuestos de
molécula pequeña, oligómero no peptídico, o de polipéptido (Lam,
K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).
En la técnica se pueden encontrar ejemplos de
procedimientos para la síntesis de bibliotecas moleculares, por
ejemplo en De Witt y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 90:6909; Erb y col. (1994) Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU. 91:11422; Zuckermann y col. (1994). J.
Med. Chem. 37:2678; Cho y col. (1993) Science 261:1303;
Carell y col. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059;
Carell y col. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; y
en Gallop y col. (1994) J. Med. Chem. 37:1233. Las
bibliotecas de compuestos pueden presentarse en solución (por
ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques
13:412-421), o sobre perlas (Lam (1991)
Nature 354:82-84), chips (Fodor (1993)
Nature 364:555-556), bacterias (Ladner USP
5.223.409), esporas (Ladner USP `409), plásmidos (Cull y col. (1992)
Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
89:1865-1869) o sobre fago (Scott y Smith
(1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990)
Science 249:404-406); (Cwirla y col. (1990)
Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6378-6382); (Felici
(1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner
(referencia citada anteriormente)).
Los compuestos candidatos incluyen, por ejemplo,
1) péptidos tales como péptidos solubles, incluyendo péptidos de
fusión con cola de Ig y miembros de bibliotecas de péptidos
aleatorias (véase, por ejemplo, Lam y col. (1991) Nature
354:82-84; Houghten y col. (1991) Nature
354:84-86) y bibliotecas moleculares derivadas
de química combinatoria compuestas de aminoácidos de configuración D
y/o L; 2) fosfopéptidos (por ejemplo, miembros de bibliotecas de
fosfopéptidos dirigidas, aleatorias y parcialmente degeneradas,
véase, por ejemplo, Songyang y col. (1993)
Cell 72:767-778); 3) anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, anti-idiotípicos, quiméricos, y de cadena única así como fragmentos Fab, F(ab')_{2}, fragmentos de la biblioteca de expresión de Fab, y fragmentos de anticuerpos que se unen a epítope); y 4) moléculas inorgánicas y orgánicas pequeñas (por ejemplo, moléculas obtenidas a partir de bibliotecas de productos naturales y combinatorias).
Cell 72:767-778); 3) anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, anti-idiotípicos, quiméricos, y de cadena única así como fragmentos Fab, F(ab')_{2}, fragmentos de la biblioteca de expresión de Fab, y fragmentos de anticuerpos que se unen a epítope); y 4) moléculas inorgánicas y orgánicas pequeñas (por ejemplo, moléculas obtenidas a partir de bibliotecas de productos naturales y combinatorias).
Un compuesto candidato es una fosfodiesterasa
soluble de longitud completa o un fragmento que compite por la
unión a AMPc. Otros compuestos candidatos incluyen fosfodiesterasas
mutantes o fragmentos apropiados que contienen mutaciones que
afectan a la función de la fosfodiesterasa y de esta forma compiten
por el AMPc. Por consiguiente, la invención abarca un fragmento que
compite por AMPc, por ejemplo con una mayor afinidad, o un
fragmento que se une a AMPc pero no lo degrada.
La invención proporciona otros criterios de
valoración para identificar compuestos que modulen (estimulen o
inhiban) la actividad de la fosfodiesterasa. Los ensayos implican
típicamente un ensayo de acontecimientos en la ruta de transducción
de señal que indican la actividad de la fosfodiesterasa. De esta
forma, se puede ensayar la expresión de genes que están regulados
al alza o a la baja en respuesta a la cascada de señal dependiente
de la fosfodiesterasa. En una realización, la región reguladora de
dichos genes puede estar unida funcionalmente a un marcador que sea
fácilmente detectable, tal como luciferasa. Como alternativa,
también se podría medir la fosforilación de la fosfodiesterasa, o
de una diana de fosfodiesterasa.
Cualquiera de las funciones biológicas o
bioquímicas mediadas por la fosfodiesterasa puede usarse como un
ensayo de criterio de valoración. Éstas incluyen todos los
acontecimientos bioquímicos o bioquímicos/biológicos descritos en
el presente documento, en las referencias citadas en el presente
documento, incorporadas por referencia para estas dianas de ensayo
de criterio de valoración, y otras funciones conocidas por los
expertos habituales en la técnica.
En el caso de la fosfodiesterasa, criterios de
valoración específicos pueden incluir la hidrólisis de AMPc y una
reducción en la activación de proteína quinasa A.
Los compuestos de unión y/o activación también
se pueden cribar usando proteínas de fosfodiesterasa quiméricas en
las cuales uno o más dominios, sitios, y similares, tal y como se ha
descrito en el presente documento, o partes de los mismos, pueden
reemplazarse por sus homólogos heterólogos derivados de otras
fosfodiesterasas de la familia 7 o de isoformas de fosfodiesterasa
de cualquier otra familia de fosfodiesterasa. Por ejemplo, se puede
usar una región catalítica que interactúa con una diferente
especificidad y/o afinidad por el nucleótido cíclico que la
fosfodiesterasa nativa. Por consiguiente, un conjunto diferente de
componentes de transducción de señal está disponible como un ensayo
de criterio de valoración para la activación. Como alternativa, una
secuencia de direccionamiento heteróloga puede reemplazar a la
secuencia de direccionamiento nativa. Esto dará como resultado una
localización subcelular o celular diferente y en consecuencia puede
dar como resultado el tener un efecto sobre una ruta de
transducción de señal diferente. En consecuencia, está disponible un
conjunto diferente de componentes de transducción de señal como un
ensayo de criterios de valoración para la activación. Como
alternativa adicional, el sitio de modificación por una proteína
efectora, por ejemplo fosforilación por la proteína quinasa A,
puede reemplazarse con el sitio de una proteína efectora diferente.
Esto podría proporcionar también el uso de una ruta de transducción
de señal diferente para la determinación del criterio de
valoración. La activación puede detectarse también mediante un gen
reportero que contiene una región codificante fácilmente detectable
unida de manera funcional a una secuencia reguladora transcripcional
que es parte de la ruta de transducción de señal nativa.
Los polipéptidos de fosfodiesterasa son también
útiles en ensayos de unión por competición en procedimientos
diseñados para descubrir compuestos que interactúen con la
fosfodiesterasa. De esta forma, un compuesto se expone a un
polipéptido de fosfodiesterasa en condiciones que permitan al
compuesto unirse o interactuar de otra forma con el polipéptido.
También se añade a la mezcla polipéptido de fosfodiesterasa soluble.
Si el compuesto de ensayo interactúa con el polipéptido de
fosfodiesterasa soluble, éste disminuye la cantidad de complejo
formado o la actividad desde la diana de fosfodiesterasa. Este tipo
de ensayo es particularmente útil en casos en los cuales se buscan
compuestos que interactúen con regiones específicas de la
fosfodiesterasa. De esta forma, el polipéptido soluble que compite
con la región de fosfodiesterasa diana está diseñado para que
contenga secuencias de péptidos que correspondan a la región de
interés.
Otro tipo de ensayo de unión por competición se
puede usar para descubrir compuestos que interactúen con sitios
funcionales específicos. Como un ejemplo, se pueden añadir proteína
quinasa A y un compuesto candidato a una muestra de la
fosfodiesterasa. Los compuestos que interactúan con la
fosfodiesterasa en el mismo sitio que la proteína quinasa A
reducirán la cantidad de complejo formado entre la fosfodiesterasa y
la proteína quinasa A. Por consiguiente, es posible descubrir un
compuesto que evite de forma específica la interacción entre la
fosfodiesterasa y la proteína quinasa A. Otro ejemplo implica la
adición de un compuesto candidato a una muestra de fosfodiesterasa
y AMPc. Un compuesto que compita con AMPc reducirá la cantidad de
hidrólisis o de unión del AMPc a la fosfodiesterasa. En
consecuencia, se pueden descubrir compuestos que interactúen
directamente con la fosfodiesterasa y compitan con AMPc. Dichos
ensayos pueden implicar cualquier otro componente que interactúe
con la fosfodiesterasa.
Para llevar a cabo ensayos de cribado de
fármacos libres de células, es deseable inmovilizar o bien la
fosfodiesterasa, o un fragmento, o su molécula diana para facilitar
la separación de complejos de las formas no complejadas de una o
ambas de las proteínas, así como ajustar la automatización del
ensayo.
Se pueden usar técnicas para la inmovilización
de proteínas sobre matrices en los ensayos de cribado de fármacos.
En una realización, se puede proporcionar una proteína de fusión que
añada un dominio que permita a la proteína estar unida a una
matriz. Por ejemplo, las proteínas de fusión
glutatión-S-transferasa/fosfodiesterasa
puede ser adsorbidas sobre perlas de glutatión sefarosa (Sigma
Chemical, St. Louis, MO) o placas de microensayo derivatizadas con
glutatión, que posteriormente se combinan con los lisados celulares
(por ejemplo, marcados con ^{35}S) y el compuesto candidato, y la
mezcla se incuba en condiciones que contribuyen a la formación de
complejo (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para sal y pH).
Después de la incubación, las perlas se lavan para retirar
cualquier etiqueta no unida, y la etiqueta radiactiva inmovilizada
por la matriz se determina directamente, o en el sobrenadante
después de la disociación de los complejos. Como alternativa, los
complejos pueden disociarse de la matriz, separarse por
SDS-PAGE, y el nivel de proteína de unión a
fosfodiesterasa encontrado en la fracción de perlas se cuantifica a
partir del gel usando técnicas electroforéticas estándar. Por
ejemplo, el polipéptido o su molécula diana pueden inmovilizarse
utilizando conjugación de biotina y estreptavidina usando técnicas
bien conocidas en la técnica. Como alternativa, pueden derivatizarse
en los pocillos de la placa anticuerpos que son reactivos con la
proteína pero que no interfieren con la unión de la proteína a su
molécula diana, y la proteína puede quedar atrapada en los pocillos
mediante conjugación con el anticuerpo. Las preparaciones de un
componente diana de unión a fosfodiesterasa, tal como AMPc o
proteína quinasa A, y un compuesto candidato se incuban en los
pocillos que presentan fosfodiesterasa y puede cuantificarse la
cantidad de complejo atrapada en el pocillo. Entre los
procedimientos para detectar dichos complejos, además de aquellos
descritos anteriormente para los complejos inmovilizados por GST, se
incluyen la inmunodetección de complejos usando anticuerpos que son
reactivos con la molécula diana de fosfodiesterasa, o que son
reactivos con fosfodiesterasa y compiten con la molécula diana; así
como ensayos ligados a enzimas que se basan en la detección de una
actividad enzimática asociada con la molécula diana.
Se pueden usar moduladores de la actividad de
fosfodiesterasa identificados de acuerdo con estos ensayos de
cribado de fármacos para tratar un sujeto con un trastorno mediado
por la ruta de fosfodiesterasa, tratando células que expresan la
fosfodiesterasa, tal como corazón, ovario, cerebro, páncreas,
riñones, mama, hígado, testículos, próstata, músculo esquelético, y
tejido que contiene osteoblastos, tal como el hueso. Estos
procedimientos de tratamiento incluyen las etapas de administrar
los moduladores de la actividad de fosfodiesterasa en una
composición farmacéutica tal y como se ha descrito en el presente
documento, a un sujeto que necesite dicho tratamiento.
La fosfodiesterasa se expresa en osteoblastos y
está implicada en la diferenciación de osteoblastos. En
consecuencia, está implicada en la deposición de matriz ósea y de
esta forma, en la formación de hueso. Como tal, el gen es
particularmente relevante para el tratamiento de trastornos que
implican al tejido óseo y particularmente en la osteoporosis.
Entre los trastornos en los cuales es relevante
la expresión de fosfodiesterasa se incluyen, pero sin limitación,
demencia, pérdida de memoria, insuficiencia cardiaca congestiva,
trombosis, hipertensión pulmonar, glomerulonefritis, depresión
bipolar, asma bronquial, enfermedades atópicas, encefalomielitis
autoinmune, transplante de órganos, retención de sal en el síndrome
nefrótico, y disfunción eréctil.
Las fosfodiesterasas están también
específicamente implicadas en enfermedad cardiaca, tal como en
insuficiencia cardiaca congestiva y cáncer de mama.
Los polipéptidos de fosfodiesterasa son, de esta
forma, útiles para el tratamiento de un trastorno asociado con
fosfodiesterasa caracterizado por expresión o actividad aberrante de
una fosfodiesterasa. En una realización, el procedimiento implica
la administración de un agente (por ejemplo, un agente identificado
mediante un ensayo de cribado descrito en el presente documento), o
combinación de agentes que modula (por ejemplo, regula al alza o
regula a la baja) la expresión o actividad de la proteína. En otra
realización, el procedimiento implica la administración de la
fosfodiesterasa como terapia para compensar la expresión o actividad
reducida o aberrante de la proteína.
Entre los procedimientos para el tratamiento se
incluyen, pero sin limitación, el uso de fosfodiesterasa soluble o
fragmentos de la proteína fosfodiesterasa que compiten por AMPc o
por proteína quinasa A. Estas fosfodiesterasas o fragmentos pueden
tener una mayor afinidad por la diana de tal forma que proporcionen
una competición eficaz.
La estimulación de la actividad es deseable en
situaciones en las que la proteína está anormalmente regulada a la
baja y/o en las cuales una actividad aumentada es probable que tenga
un efecto beneficioso. Igualmente, la inhibición de la actividad es
deseable en situaciones en las cuales la proteína está anormalmente
regulada al alza y/o en las cuales una reducción de la actividad es
probable que tenga un efecto beneficioso. En un ejemplo de una
situación tal, un sujeto tiene un trastorno caracterizado por una
diferenciación celular o desarrollo aberrantes. En otro ejemplo, el
sujeto tiene una enfermedad proliferativa (por ejemplo, cáncer) o
un trastorno caracterizado por una respuesta hematopoyética
aberrante. En otro ejemplo, es deseable conseguir regeneración de
tejido en un sujeto (por ejemplo, cuando un sujeto ha sufrido una
lesión cerebral o de la médula espinal y es deseable regenerar el
tejido neuronal de una manera regulada).
En aún otro aspecto de la invención, las
proteínas de la invención pueden usarse como "proteínas cebo"
en un ensayo de dos híbridos o en un ensayo de tres híbridos
(véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.283.317; Zervos y
col. (1993) Cell 72:223-232; Madura y col.
(1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel
y col. (1993) Biotechniques 14:920-924;
Iwabuchi y col. (1993) Oncogene 8:1693-1696;
y Brent documento WO 94/10300), para identificar otras proteínas
(proteínas capturadas) que se unen a o interactúan con las
proteínas de la invención y modulan su actividad.
Los polipéptidos de fosfodiesterasa son útiles
también para proporcionar una diana para el diagnóstico de una
enfermedad o de la predisposición a una enfermedad mediada por la
fosfodiesterasa, incluyendo, pero sin limitación, enfermedades que
implican tejidos en los cuales las fosfodiesterasas se expresan tal
y como se describe en el presente documento, y particularmente en
la osteoporosis, cáncer de mama, e insuficiencia cardiaca
congestiva. En consecuencia, se proporcionan procedimientos para la
detección de la presencia, o de los niveles de, la fosfodiesterasa
en una célula, un tejido, o en un organismo. El procedimiento
implica poner en contacto una muestra biológica con un compuesto
capaz de interactuar con la fosfodiesterasa de tal forma que la
interacción se pueda detectar.
Un agente para la detección de la
fosfodiesterasa es un anticuerpo capaz de unirse selectivamente a la
fosfodiesterasa. Una muestra biológica incluye tejidos, células, y
fluidos biológicos aislados a partir de un sujeto, así como
tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto.
La fosfodiesterasa proporciona también una diana
para el diagnóstico de una enfermedad activa, o de la predisposición
a una enfermedad, en un paciente que presenta una variante de
fosfodiesterasa. De esta forma, se puede aislar la fosfodiesterasa
a partir de una muestra biológica y se puede someter a ensayo para
detectar la presencia de una mutación genética que dé como
resultado una proteína aberrante. Ésta incluye una sustitución,
eliminación, inserción, transposición de aminoácidos, (como
resultado de acontecimientos de corte y empalme aberrantes), y una
modificación post-traduccional inapropiada. Entre
los procedimientos analíticos se incluyen movilidad electroforética
alterada, digestión alterada de péptidos por tripsina, actividad
alterada de fosfodiesterasa en un ensayo basado en células o exento
de células, alteración en la unión o degradación de AMPc,
fosforilación por o unión a proteína quinasa A, o patrón de unión
de anticuerpos, punto isoeléctrico alterado, secuenciación directa
de aminoácidos, y cualquier otra de la técnicas de ensayo conocidas
útiles para detectar mutaciones en una proteína en general o en una
fosfodiesterasa específicamente.
Entre las técnicas in vitro para la
detección de fosfodiesterasa se incluyen ensayos de inmunoabsorción
ligados a enzimas (ELISA), transferencias Western,
inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. De forma alternativa,
la proteína puede detectarse in vivo en un sujeto
introduciendo en el sujeto un anticuerpo
anti-fosfodiesterasa etiquetado. Por ejemplo, el
anticuerpo puede etiquetarse con un marcador radiactivo cuya
presencia y localización en un sujeto pueden detectarse mediante
técnicas de formación de imágenes convencionales. En particular son
útiles los procedimientos, que detectan la variante alélica de la
fosfodiesterasa expresada en un sujeto, y los procedimientos, que
detectan fragmentos de la fosfodiesterasa en una muestra.
Los polipéptidos de fosfodiesterasa son también
útiles en análisis farmacogenómico. La farmacogenómica aborda las
variaciones hereditarias clínicamente significativas en la respuesta
a fármacos debido a una disposición alterada de los fármacos y una
acción anormal en personas afectadas. Véase, por ejemplo,
Eichelbaum, M. (1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23
(10-11):983-985, y Linder, M.W.
(1997) Clin. Chem. 43 (2):254-266. Las
consecuencias clínicas de estas variaciones dan como resultado una
toxicidad grave de los fármacos terapéuticos en ciertos individuos
o un fallo terapéutico de los fármacos en ciertos individuos como
resultado de la variación individual en el metabolismo. De esta
forma, el genotipo del individuo puede determinar la manera en la
que un compuesto terapéutico actúa sobre el cuerpo o la manera en
la que el cuerpo metaboliza el compuesto. Además, la actividad de
las enzimas que metabolizan los fármacos afecta tanto a la
intensidad como a la duración de la acción del fármaco. De esta
forma, la farmacogenómica del individuo permite la selección de los
compuestos eficaces y de las dosificaciones eficaces de dichos
compuestos para el tratamiento profiláctico o terapéutico en base
al genotipo del individuo. El descubrimiento de polimorfismos
genéticos en algunas enzimas que metabolizan fármacos ha explicado
por qué algunos pacientes no obtienen los efectos farmacológicos
esperados, muestran un efecto farmacológico exagerado, o
experimentan una grave toxicidad a partir de dosificaciones
farmacológicas convencionales. Los polimorfismos pueden expresarse
en el fenotipo del metabolizador de gran alcance y en el fenotipo
del metabolizador pobre. En consecuencia, el polimorfismo genético
puede conducir a variantes proteicas alélicas de la fosfodiesterasa
en las cuales una o más de las funciones de la fosfodiesterasa en
una población es diferente de aquellas en otra población. Los
polipéptidos permiten de esta manera que una diana verifique una
predisposición genética que pueda afectar a la modalidad del
tratamiento. De esta manera, en un tratamiento basado en AMPc, el
polimorfismo puede dar lugar a regiones catalíticas que son más o
menos activas. En consecuencia, la dosificación sería modificada
necesariamente para maximizar el efecto terapéutico dentro de una
población dada que contiene el polimorfismo. Como alternativa al
genotipado, se podrían identificar polipéptidos polimórficos
específicos.
Los polipéptidos de fosfodiesterasa son también
útiles para controlar los efectos terapéuticos durante ensayos
clínicos y otros tratamientos. De esta forma, la eficacia
terapéutica de un agente que está diseñado para aumentar o
disminuir la expresión génica, los niveles de proteínas o la
actividad de fosfodiesterasa puede controlarse a lo largo del
transcurso del tratamiento usando los polipéptidos de
fosfodiesterasa como un criterio de valoración diana. El control
puede ser, por ejemplo, tal y como se muestra a continuación: (i)
obtención de una muestra previa a la administración de un sujeto
antes de la administración del agente; (ii) detección del nivel de
expresión o actividad de la proteína en la muestra previa a la
administración; (iii) obtención de una o más muestras del sujeto
después de la administración; (iv) detección del nivel de expresión
o actividad de la proteína en las muestras posteriores a la
administración; (v) comparación del nivel de expresión o actividad
de la proteína en la muestra previa a la administración con la
proteína en la muestra o muestras posteriores a la administración;
y (vi) aumento o reducción de la administración del agente al sujeto
en consecuencia con lo anterior.
La invención proporciona también anticuerpos que
se unen de forma selectiva a la fosfodiesterasa y a sus variantes y
fragmentos. Se considera que un anticuerpo se une de forma
selectiva, incluso si se une también a otras proteínas que no son
sustancialmente homólogas con la fosfodiesterasa. Estas otras
proteínas comparten homología con un fragmento o dominio de la
fosfodiesterasa. Esta conservación en regiones específicas da lugar
a anticuerpos que se unen a ambas proteínas en virtud de la
secuencia homóloga. En este caso, se entendería que la unión del
anticuerpo con la fosfodiesterasa es aún selectiva.
Para generar anticuerpos, se usa un polipéptido
de fosfodiesterasa aislado como un inmunógeno para generar
anticuerpos usando técnicas convencionales para la preparación de
anticuerpos policlonales y monoclonales. Se puede usar o bien la
proteína de longitud completa o un fragmento de péptido antigénico.
En las Figuras 3 o 8 se muestran regiones que presentan una alto
índice de antigenicidad.
Los anticuerpos se preparan de forma preferible
a partir de estas regiones o a partir de fragmentos discretos en
estas regiones. Sin embargo, se pueden preparar anticuerpos a partir
de cualquier región del péptido tal y como se describe en el
presente documento. Un fragmento preferido produce un anticuerpo que
disminuye o evita completamente la unión o hidrólisis de AMPc. Se
pueden desarrollar anticuerpos frente a la fosfodiesterasa completa
o frente a dominios de la fosfodiesterasa tal y como se describe en
el presente documento. Se pueden desarrollar también anticuerpos
frente a sitios funcionales específicos tal y como se describe en el
presente documento.
El péptido antigénico puede comprender una
secuencia contigua de al menos 12, 14, 15, o 30 restos de
aminoácidos. En una realización, los fragmentos corresponden a
regiones que están localizadas en la superficie de la proteína, por
ejemplo, regiones hidrófilas. No debe interpretarse, sin embargo,
que estos fragmentos abarcan cualquier fragmento, que pueda estar
descrito con anterioridad a esta invención.
Los anticuerpos pueden ser policlonales o
monoclonales. Se puede usar un anticuerpo intacto, o un fragmento
del mismo (por ejemplo Fab o F(ab')_{2}).
La detección puede facilitarse mediante el
acoplamiento (es decir, uniendo físicamente) el anticuerpo a una
sustancia detectable. Entre los ejemplos de sustancias detectables
se incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales
fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales
bioluminiscentes, y materiales radiactivos. Entre los ejemplos de
enzimas adecuadas se incluyen peroxidasa de rábano picante,
fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa, o
acetilcolinesterasa; entre los ejemplos de complejos de grupos
prostéticos adecuados se incluyen estreptavidina/biotina y
avidina/biotina; entre los ejemplos de materiales fluorescentes
adecuados se incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de
fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro
de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente
incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen
luciferasa, luciferina, y ecuorina, y ejemplos de material
radiactivo adecuado incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S o
^{3}H.
Una preparación inmunogénica apropiada puede
derivar de péptidos nativos, expresados de manera recombinante, o
sintetizados químicamente.
Los anticuerpos se pueden usar para aislar una
fosfodiesterasa mediante técnicas convencionales, tales como
cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Los anticuerpos
pueden facilitar la purificación de la fosfodiesterasa natural a
partir de células y de fosfodiesterasa producida de manera
recombinante expresada en células huésped.
Los anticuerpos son útiles para detectar la
presencia de fosfodiesterasa en células o tejidos para determinar
el patrón de expresión de la fosfodiesterasa entre diversos tejidos
en un organismo y a lo largo del curso del desarrollo normal.
Los anticuerpos pueden usarse para detectar
fosfodiesterasa in situ, in vitro, o en un
sobrenadante o lisado celular con el fin de evaluar la abundancia y
el patrón de expresión.
Los anticuerpos pueden usarse para evaluar la
distribución tisular anormal o la expresión anormal durante el
de-
sarrollo.
sarrollo.
La detección por medio de anticuerpos de
fragmentos en circulación de la fosfodiesterasa de longitud completa
puede usarse para identificar el recambio de fosfodiesterasa.
Además, los anticuerpos se pueden usar para
evaluar la expresión de fosfodiesterasa en estados de enfermedad
tales como en etapas activas de la enfermedad o en un individuo con
una predisposición a una enfermedad relacionada con la función de
la fosfodiesterasa. Cuando un trastorno está provocado por una
distribución tisular, expresión durante el desarrollo, o nivel de
expresión de la proteína de fosfodiesterasa inapropiados, el
anticuerpo puede prepararse frente a la proteína de fosfodiesterasa
normal. Si un trastorno está caracterizado por una mutación
específica en la fosfodiesterasa, pueden usarse anticuerpos
específicos para esta proteína mutante con el fin de someter a
ensayo la presencia de la fosfodiesterasa mutante específica. Sin
embargo, también están abarcados los anticuerpos preparados
intracelularmente ("intracuerpos"), que reconocerían regiones
de péptidos de fosfodiesterasa
intracelulares.
intracelulares.
Los anticuerpos también pueden usarse para
evaluar la localización subcelular normal y aberrante de células en
los diversos tejidos en un organismo. Los anticuerpos pueden
desarrollarse frente a la fosfodiesterasa entera o frente a
porciones de la fosfodiesterasa.
Los usos diagnósticos pueden aplicarse, no sólo
en ensayos genéticos, sino también en el control de una modalidad
de tratamiento. En consecuencia, cuando el tratamiento está
destinado esencialmente a la corrección del nivel de expresión de
la fosfodiesterasa o a la corrección de la presencia de
fosfodiesterasas aberrantes y de una distribución tisular o
expresión durante el desarrollo aberrantes, se pueden usar
anticuerpos dirigidos contra la fosfodiesterasa o fragmentos
relevantes de la misma para controlar la eficacia terapéutica.
En consecuencia, los anticuerpos se pueden usar
diagnósticamente para controlar los niveles proteicos en el tejido
como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para
determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado.
De forma adicional, los anticuerpos son útiles
en análisis farmacogenómico. De esta forma, se pueden usar
anticuerpos preparados contra fosfodiesterasa polimórfica para
identificar individuos que requieran modalidades de tratamiento
modificadas.
Los anticuerpos son útiles también como
herramientas de diagnóstico como un marcador inmunológico para
fosfodiesterasa aberrante analizada mediante movilidad
electroforética, punto isoeléctrico, digestión de péptidos con
tripsina, y otros ensayos físicos conocidos por los expertos en la
técnica.
Los anticuerpos son útiles también para el
tipificado de tejidos. De esta forma, cuando una fosfodiesterasa
específica se ha correlacionado con la expresión en un tejido
específico, se pueden usar anticuerpos que sean específicos para
esta fosfodiesterasa con el fin de identificar un tipo de
tejido.
Los anticuerpos son útiles también en
identificación forense. En consecuencia, cuando un individuo se ha
correlacionado con un polimorfismo genético específico que da como
resultado una proteína polimórfica específica, se puede usar un
anticuerpo específico para la proteína polimórfica como un
coadyuvante para la identificación.
Los anticuerpos son útiles también para la
inhibición de la función de la fosfodiesterasa, por ejemplo,
bloqueando el AMPc, la proteína quinasa A, o el sitio
catalítico.
Estos usos pueden aplicarse también en un
contexto terapéutico en el cual el tratamiento implica la inhibición
de la función fosfodiesterasa. Se puede usar un anticuerpo, por
ejemplo, para bloquear la unión de AMPc. Se pueden preparar
anticuerpos contra fragmentos específicos que contienen sitios
requeridos para la función o contra fosfodiesterasa intacta
asociada con una célula.
Se desean de manera particular los anticuerpos
completamente humanos para el tratamiento terapéutico de pacientes
humanos. Para una visión general de esta tecnología para producir
anticuerpos humanos, véase Lonberg y col. (1995) Int. Rev.
Immunol. 13:65-93. Para una discusión detallada
de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos
monoclonales humanos y protocolos para producir dichos anticuerpos,
por ejemplo, véanse la patente de EE.UU. 5.625.126; patente de
EE.UU. 5.633.425; patente de EE.UU. 5.569.825; patente de EE.UU.
5.661.016; y patente de EE.UU. 5.545.806.
La invención también abarca kits para usar
anticuerpos para detectar la presencia de una proteína de
fosfodiesterasa en una muestra biológica. El kit puede comprender
anticuerpos tales como un anticuerpo etiquetado o etiquetable y un
compuesto o agente para detectar fosfodiesterasa en una muestra
biológica; medios para determinar la cantidad de fosfodiesterasa en
la muestra; y medios para comparar la cantidad de fosfodiesterasa en
la muestra con un patrón. El compuesto o agente puede estar
empaquetado en un recipiente adecuado. El kit puede comprender
adicionalmente instrucciones para usar el kit para la detección de
la fosfodiesterasa.
Las secuencias de nucleótidos en la SEC. ID nº:
2 o en la SEC. ID nº: 4 se obtuvieron mediante la secuenciación del
ADNc humano. En consecuencia, para la SEC. ID nº: 2 la secuencia del
clon depositado está controlando en lo que se refiere a cualquier
discrepancia entre las dos y cualquier referencia a la secuencia de
la SEC. ID nº: 2 incluye la referencia a las secuencias del ADNc
depositado.
Los ADNc descritos específicamente comprenden la
región codificante y las secuencias 5' y 3' no traducidas en la
SEC. ID nº: 2 o la SEC. ID nº: 4.
La invención proporciona polinucleótidos
aislados que codifican las nuevas fosfodiesterasas. El término
"polinucleótido de fosfodiesterasa" o "ácido nucleico de
fosfodiesterasa" se refiere a las secuencias mostradas en la SEC.
ID nº: 2 o la SEC. ID nº: 4 o en los ADNc depositados. El término
"polinucleótido de fosfodiesterasa" o "ácido nucleico de
fosfodiesterasa" incluye adicionalmente variantes y fragmentos de
los polinucleótidos de fosfodiesterasa.
Un ácido nucleico de fosfodiesterasa
"aislado" es aquel que está separado de otro ácido nucleico
presente en la fuente natural del ácido nucleico de
fosfodiesterasa. De forma preferible, un ácido nucleico
"aislado" está libre de secuencias que flanquean de forma
natural el ácido nucleico de fosfodiesterasa (es decir, secuencias
localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN
genómico del organismo a partir del cual deriva el ácido nucleico.
Sin embargo, pueden haber algunas secuencias de nucleótidos
flanqueantes, por ejemplo hasta aproximadamente 5 KB. El punto
importante es que el ácido nucleico de fosfodiesterasa está aislado
de las secuencias flanqueantes de forma que éste se puede someter a
las manipulaciones específicas descritas en el presente documento,
tales como expresión recombinante, preparación de sondas y
cebadores, y otros usos específicos de las secuencias de ácido
nucleico de fosfodiesterasa.
Además, una molécula de ácido nucleico
"aislada", tal como una molécula de ADNc o de ARN, puede estar
sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo
cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente
libre de precursores químicos o de otros agentes químicos cuando se
sintetiza químicamente. Sin embargo, la molécula de ácido nucleico
puede fusionarse con otras secuencias codificantes o secuencias
reguladoras y aún considerarse aislada.
En algunos casos, el material aislado formará
parte de una composición (por ejemplo, un extracto en bruto que
contiene otras sustancias), sistema tampón o mezcla de reactivos. En
otras circunstancias, el material puede ser purificado hasta
homogeneidad esencial, por ejemplo tal y como se determina mediante
PAGE (electroforesis en geles de poliacrilamida) o cromatografía en
columna tal como HPLC. De forma preferible, un ácido nucleico
aislado comprende al menos aproximadamente 50, 80, o 90% (sobre una
base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.
Por ejemplo, las moléculas de ADN recombinantes
contenidas en un vector se consideran aisladas. Entre los ejemplos
adicionales de moléculas de ADN aisladas se incluyen moléculas de
ADN recombinantes mantenidas en células huésped heterólogas o
moléculas de ADN purificadas (parcialmente o sustancialmente) en
solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN
in vivo o in vitro de las moléculas de ADN aisladas
de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico aisladas
de acuerdo con la presente invención incluyen adicionalmente dichas
moléculas producidas sintéticamente.
En algunos casos, el material aislado formará
parte de una composición (por ejemplo, un extracto en bruto que
contiene otras sustancias), sistema tampón o mezcla de reactivos. En
otras circunstancias, el material puede ser purificado hasta
homogeneidad esencial, por ejemplo tal y como se determina mediante
PAGE (electroforesis en geles de poliacrilamida) o cromatografía en
columna tal como HPLC. De forma preferible, un ácido nucleico
aislado comprende al menos aproximadamente 50, 80, o 90% (sobre una
base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa pueden
codificar la proteína madura más aminoácidos amino o carboxi
terminales adicionales, o aminoácidos interiores al polipéptido
maduro (cuando la forma madura presenta más de una cadena
polipeptídica, por ejemplo). Dichas secuencias pueden desempeñar un
papel en el procesamiento de una proteína desde un precursor hasta
una forma madura, pueden facilitar el tráfico de proteína, prolongar
o acortar la semivida de la proteína o facilitar la manipulación de
una proteína para un ensayo o producción, entre otras cosas. Como
generalmente es el caso in situ, los aminoácidos adicionales
pueden ser procesados lejos de la proteína madura mediante enzimas
celulares.
Entre los polinucleótidos de fosfodiesterasa se
incluyen, pero sin limitación, la secuencia que codifica el
polipéptido maduro en solitario, la secuencia que codifica el
polipéptido maduro y secuencias codificantes adicionales, tales
como una secuencia líder o secuencia secretora (por ejemplo, una
secuencia pre-pro o pro-proteína),
la secuencia que codifica el polipéptido maduro, con o sin las
secuencias codificantes adicionales, más secuencias no codificantes
adicionales, por ejemplo intrones y secuencias 5' y 3' no
codificantes tales como secuencias transcritas pero no traducidas
que desempeñan un papel en la transcripción, procesamiento de ARNm
(incluyendo señales de corte y empalme y de poliadenilación), unión
al ribosoma y estabilidad del ARNm. Además, el polinucleótido puede
fusionarse a una secuencia marcadora que codifica, por ejemplo, un
péptido que facilita la purificación.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa pueden
estar en la forma de ARN, tal como ARNm, o en la forma de ADN,
incluyendo ADNc y ADN genómico obtenidos mediante clonación o
producidos mediante técnicas de síntesis química o mediante una
combinación de las mismas. El ácido nucleico, especialmente ADN,
puede ser de doble cadena o de una sola cadena. El ácido nucleico
de una sola cadena puede ser la cadena codificante (cadena de
polaridad positiva) o la cadena no codificante (cadena de sentido
opuesto).
El ácido nucleico de fosfodiesterasa puede
comprender las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEC. ID
nº: 2 o la SEC. ID nº: 4, que corresponden al ADNc de osteoblasto
humano (forma corta) y de riñón y glándula suprarrenal humanos
(forma larga).
En una realización, el ácido nucleico de
fosfodiesterasa comprende solamente la región codificante.
La invención proporciona adicionalmente
variantes de polinucleótidos de fosfodiesterasa, y fragmentos de los
mismos, que difieren de las secuencias de nucleótidos mostradas en
la SEC. ID nº: 2 o en la SEC. ID nº: 4 debido a la degeneración del
código genético y de esta forma codifican la misma proteína que
aquella codificada por las secuencias de nucleótidos mostradas en
la SEC. ID nº: 2 o la SEC. ID nº: 4.
La invención describe también moléculas de ácido
nucleico de fosfodiesterasa que codifican las variantes de
polipéptidos descritas en el presente documento. Dichos
polinucleótidos pueden ser de origen natural, tales como variantes
alélicas (mismo locus), homólogos (diferente locus), y ortólogos
(diferente organismo), o pueden construirse mediante procedimientos
de ADN recombinante o mediante síntesis química. Dichas variantes de
origen no natural pueden prepararse mediante técnicas de
mutagénesis, incluyendo aquellas aplicadas a polinucleótidos,
células, u organismos. En consecuencia, tal y como se ha discutido
anteriormente, las variantes pueden contener sustituciones,
eliminaciones, inversiones e inserciones de nucleótidos.
De forma típica, las variantes presentan una
identidad sustancial con las moléculas de ácido nucleico de la SEC.
ID nº: 2 o la SEC. ID nº: 4 y los complementos de las mismas. La
variación puede tener lugar o bien en la región codificante o bien
en la región no codificante o en ambas. Las variaciones pueden
producir sustituciones de aminoácidos tanto conservativas como no
conservativas.
Se pueden identificar ortólogos, homólogos y
variantes alélicas usando procedimientos bien conocidos en la
técnica. Estas variantes comprenden una secuencia de nucleótidos que
codifica una fosfodiesterasa que es homóloga en al menos
aproximadamente un 60-65%, 65-70%,
típicamente en al menos aproximadamente un 70-75%,
más típicamente en al menos aproximadamente un
80-85%, y lo más típicamente en al menos
aproximadamente un 90-95% o más a la secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEC ID nº: 2 o la SEC. ID nº: 4 o a un
fragmento de esta secuencia. Dichas moléculas de ácido nucleico
pueden identificarse fácilmente por ser capaces de hibridarse en
condiciones estrictas, a la secuencia de nucleótidos mostrada en la
SEC. ID nº: 2 o SEC. ID nº: 4 o a un fragmento de la secuencia. Se
entiende que hibridación estricta no indica homología sustancial
cuando se debe a homología general, tal como secuencias poli A, o
secuencias comunes a todas o a la mayoría de las proteínas, todas
las nucleótido cíclico fosfodiesterasas, o todas las
fosfodiesterasas de la familia 7. Además, se entiende que las
variantes no incluyen ninguna de las secuencias de ácido nucleico
que puedan haber sido descritas con anterioridad a la
invención.
Tal y como se usa en el presente documento, el
término "se hibrida en condiciones estrictas" pretende
describir condiciones para la hibridación y lavado bajo las cuales
las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido con al
menos aproximadamente un 60-65% de homología entre
sí permanecen típicamente hibridadas entre sí. Las condiciones
pueden ser tales que secuencias idénticas en al menos
aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos
aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos
aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95% o más entre
sí permanecen hibridadas entre sí. Los expertos en la técnica
conocen dichas condiciones estrictas y pueden encontrarse en
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &
Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, incorporado mediante
referencia. Un ejemplo de condiciones de hibridación estrictas es
hibridación en 6X cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a
aproximadamente 45ºC, seguido de uno o más lavados en 0,2 X SSC,
SDS al 0,1% a 50-65ºC. En otro ejemplo no limitante,
se permite la hibridación de moléculas de ácido nucleico en 6X
cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido
de uno o más lavados de rigurosidad baja en 0,2 X SSC/SDS al 0,1% a
temperatura ambiente, o por uno o más lavados de rigurosidad
moderada en 0,2 X SSC/SDS al 0,1% a 42ºC, o lavado en 0,2 X SSC/SDS
al 0,1% a 65ºC para una alta rigurosidad. En una realización, una
molécula de ácido nucleico aislada que se hibrida en condiciones
estrictas a la secuencia de SEC. ID nº: 1 o a la SEC. ID nº: 3
corresponde a una molécula de ácido nucleico de origen natural. Tal
y como se usa en el presente documento, una molécula de ácido
nucleico de "origen natural" se refiere a una molécula de ARN
o de ADN que presenta una secuencia de nucleótidos que se da en la
naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína natural).
Tal y como entienden los expertos habituales en
la técnica, las condiciones exactas pueden determinarse
empíricamente y dependen de la fortaleza iónica, de la temperatura
y de la concentración de agentes desestabilizantes tales como
formamida o agentes desnaturalizantes tales como SDS. Otros factores
considerados en la determinación de las condiciones de hibridación
deseadas incluyen la longitud de las secuencias de ácidos nucleicos,
la composición de bases, el porcentaje de apareamiento erróneo
entre las secuencias que se hibridan y la frecuencia de aparición
de subconjuntos de las secuencias dentro de otras secuencias no
idénticas. De esta forma, se pueden determinar condiciones
equivalentes variando uno o más de estos parámetros manteniendo al
mismo tiempo un grado similar de similitud o identidad entre las
dos moléculas de ácido nucleico.
La presente invención también describe ácidos
nucleicos aislados que contienen un fragmento o porción de una sola
cadena o de doble cadena que se hibrida en condiciones estrictas a
la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID nº: 2 o a la SEC. ID nº:
4 o al complemento de la SEC. ID nº: 2 o SEC. ID nº: 4. En una
realización, el ácido nucleico está constituido de una porción de
la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID nº: 2 o la SEC. ID nº: 4
y el complemento de la SEC. ID nº: 2 o la SEC. ID nº: 4. Los
fragmentos del ácido nucleico de la invención tienen una longitud
de al menos aproximadamente 15, preferiblemente al menos
aproximadamente 18, 20, 23 o 25 nucleótidos, y pueden tener una
longitud de 30, 40, 50, 100, 200, 500 o más nucleótidos. Son útiles
fragmentos más largos, por ejemplo, con una longitud de 30 o más
nucleótidos, que codifican polipéptidos o proteínas antigénicos
descritos en el presente documento.
Además, la invención describe polinucleótidos
que comprenden un fragmento de los polinucleótidos de
fosfodiesterasa de longitud completa. El fragmento puede ser de
cadena única o de doble cadena y puede comprender ADN o ARN. El
fragmento puede derivarse de la secuencia codificante o de la
secuencia no codificante.
En otra realización un ácido nucleico de
fosfodiesterasa aislado codifica la región codificante entera. En
otra realización el ácido nucleico de fosfodiesterasa aislado
codifica una secuencia que corresponde a la proteína madura que
puede ser desde aproximadamente el aminoácido 6 hasta el último
aminoácido. Otros fragmentos incluyen secuencias de nucleótidos que
codifican los fragmentos de aminoácidos descritos en el presente
documento.
De esta forma, los fragmentos de ácido nucleico
de fosfodiesterasa incluyen además secuencias que corresponden a
los dominios descritos en el presente documento, subregiones también
descritas y sitios funcionales específicos. Los fragmentos de ácido
nucleico de fosfodiesterasa incluyen también combinaciones de los
dominios, segmentos, y otros sitios funcionales descritos
anteriormente. Una persona experta habitual en la técnica sería
consciente de las muchas permutaciones que son posibles.
Cuando la localización de los dominios o sitios
ha sido predicha por análisis informático, un experto habitual en
la técnica apreciaría que los restos de aminoácidos que constituyen
estos dominios pueden variar dependiendo del criterio usado para
definir los dominios.
Sin embargo, se entiende que un fragmento de
fosfodiesterasa incluye cualquier secuencia de ácido nucleico que
no incluye el gen entero.
La invención describe también fragmentos de
ácido nucleico de fosfodiesterasa que codifican regiones de las
proteínas de fosfodiesterasa que portan epítope descritas en el
presente documento.
Las secuencias de nucleótidos de la presente
invención se pueden usar como una "secuencia de búsqueda" para
llevar a cabo una búsqueda frente a bases de datos públicas, por
ejemplo, para identificar otros miembros de la familia o secuencias
relacionadas. Dichas búsquedas pueden llevarse a cabo usando los
programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul y col. (1990)
J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de
proteínas BLAST pueden llevarse a cabo con el programa XBLAST,
puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de
aminoácidos homólogas a las proteínas de la invención. Para obtener
alineamientos con huecos con propósitos de comparación, se puede
utilizar Gapped BLAST tal y como se describe en Altschul y col.
(1997) Nucleic Acids Res.
25(17):3389-3402. Cuando se utilizan
los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros
por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y
NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Los fragmentos de ácido nucleico de la invención
proporcionan sondas o cebadores en ensayos tales como los descritos
a continuación. "Sondas" son oligonucleótidos que se hibridan
de una manera específica de base a una cadena complementaria del
ácido nucleico. Dichas sondas incluyen ácidos nucleicos de
polipéptido, tal y como se describe en Nielsen y col. (1991)
Science 254:1497-1500. De forma típica, una
sonda comprende una región de secuencia de nucleótidos que se
hibrida bajo condiciones altamente rigurosas con al menos
aproximadamente 15, típicamente aproximadamente
20-25, y de forma más típica aproximadamente 40, 50
o 75 nucleótidos consecutivos de la secuencia de ácido nucleico
mostrada en la SEC. ID nº: 2 o en la SEC. ID nº: 4 y los
complementos de las mismas. De forma más típica, la sonda comprende
además una etiqueta, por ejemplo, un isótopo radiactivo, compuesto
fluorescente, enzima, o co-factor de la enzima.
Tal y como se usa en el presente documento, el
término "cebador" se refiere a un oligonucleótido de una única
cadena que actúa como un punto de iniciación de la síntesis de ADN
dirigida por plantilla usando procedimientos bien conocidos (por
ejemplo, PCR, LCR) incluyendo, pero sin limitación, aquellos
descritos en el presente documento. La longitud apropiada del
cebador depende del uso particular, pero varía de forma típica entre
aproximadamente 15 a 30 nucleótidos. El término "sitio del
cebador" se refiere al área del ADN diana al cual se hibrida un
cebador. El término "par cebador" se refiere a un conjunto de
cebadores que incluye un cebador 5' (cadena arriba) que se hibrida
con el extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico a amplificar y
un cebador 3' (cadena abajo) que se hibrida con el complemento de
la secuencia a amplificar.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa son por
tanto útiles para sondas, cebadores, y en ensayos biológicos.
Cuando se usan los polinucleótidos para evaluar
las propiedades o funciones de la fosfodiesterasa, tales como en
los ensayos descritos en el presente documento, puede ser útil todo
el ADNc entero o menos de todo el ADNc entero. Los ensayos
dirigidos específicamente a las funciones de la fosfodiesterasa,
tales como evaluar la actividad agonista o antagonista, abarcan el
uso de fragmentos conocidos. Además, también se pueden poner en
práctica procedimientos de diagnóstico, para evaluar la función de
la fosfodiesterasa, con cualquier fragmento, incluyendo aquellos
fragmentos que pueden haberse dado a conocer con anterioridad a esta
invención. De forma similar, en procedimientos que implican el
tratamiento de la disfunción de fosfodiesterasa, están abarcados
todos los fragmentos incluyendo aquellos, que pueden haberse dado a
conocer con anterioridad en la técnica.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa son
útiles como una sonda de hibridación para el ADNc y el ADN genómico
para aislar un ADNc de longitud completa y clones genómicos que
codifican los polipéptidos descritos en la SEC. ID nº: 1 o en la
SEC. ID nº: 3 y para aislar el ADNc y clones genómicos que
correspondan a variantes que producen los mismos polipéptidos
mostrados en la SEC. ID nº:1 o SEC ID nº: 3 o las otras variantes
descritas en el presente documento. Se pueden aislar variantes a
partir del mismo tejido y organismo a partir de los cuales se
aislaron los polipéptidos mostrados en la SEC ID nº: 1 o SEC. ID
nº:3, tejidos diferentes del mismo organismo, o a partir de
organismos diferentes. Este procedimiento es útil para aislar genes
y ADNc que están controlados en su desarrollo y por lo tanto pueden
expresarse en el mismo tejido o en diferentes tejidos en diferentes
puntos del desarrollo de un organismo.
La sonda puede corresponder a cualquier
secuencia a lo largo de la longitud entera del gen que codifica a
la fosfodiesterasa. En consecuencia, podría derivarse de regiones 5'
no codificantes, la región codificante, y regiones 3' no
codificantes.
La sonda de ácido nucleico puede ser, por
ejemplo, ADNc de longitud completa de la SEC. ID nº: 2 o de la SEC.
ID nº: 4, o un fragmento de las mismas, tales como un
oligonucleótido con una longitud de al menos 12, 15, 30, 50, 100,
250, o 500 nucleótidos y suficiente para hibridarse específicamente
bajo condiciones rigurosas al ARNm o al ADN.
Los fragmentos de los polinucleótidos descritos
en el presente documento son útiles también para sintetizar
fragmentos más grandes o polinucleótidos de longitud completa
descritos en el presente documento. Por ejemplo, un fragmento puede
hibridarse a cualquier porción de un ARNm y se puede producir un
ADNc de mayor longitud o de longitud completa.
Los fragmentos son también útiles para
sintetizar moléculas de sentido contrario de la longitud y secuencia
deseadas.
Los ácidos nucleicos de sentido contrario de la
invención pueden diseñarse usando las secuencias de nucleótidos de
la SEC. ID nº: 2 o SEC. ID nº: 4, y construirse usando reacciones de
síntesis química y de unión enzimática usado procedimientos
conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico de sentido
contrario (por ejemplo, un oligonucleótido de sentido contrario)
puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos de origen natural
o nucleótidos modificados de diversas maneras diseñados para
aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar
la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos
de sentido contrario y de polaridad positiva, por ejemplo, se
pueden usar derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos con
acridina. Entre los ejemplos de nucleótidos modificados que se
pueden usar para generar el ácido nucleico de sentido contrario se
incluyen 5-fluorouracilo,
5-bromouracilo, 5-clorouracilo,
5-yodouracilo, hipoxantina, xantina,
4-acetilcitosina,
5-(carboxihidroxilmetil)uracilo,
5-carboximetilaminometil-2-tiouridina,
5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,
beta-D-galactosilqueosina, inosina,
N6-isopenteniladenina,
1-metilguanina, 1-metilinosina,
2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina,
2-metilguanina, 3-metilcitosina,
5-metilcitosina, N6-adenina,
7-metilguanina,
5-metilaminometiluracilo,
5-metoxiaminometil-2-tiouracilo,
beta-D-manosilqueosina,
5'-metoxicarboximetiluracilo,
5-metoxiuracilo,
2-metiltio-N6-isopenteniladenina,
ácido uracil-5-oxiacético (v),
wibutoxosina, pseudouracilo, queosina,
2-tiocitosina,
5-metil-2-tiouracilo,
2-tiouracilo, 4-tiouracilo,
5-metiluracilo, éster metílico del ácido
uracil-5-oxiacético, ácido
uracil-5-oxiacético (v),
5-metil-2-tiouracilo,
3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo,
(acp3)w, y 2,6-diaminopurina. De forma
alternativa, el ácido nucleico de sentido contrario se puede
producir biológicamente usando un vector de expresión en el cual se
ha subclonado un ácido nucleico en una orientación de sentido
contrario (es decir, ARN transcrito a partir del ácido nucleico
insertado será de una orientación de sentido contrario a un ácido
nucleico diana de
interés).
interés).
De forma adicional, las moléculas de ácido
nucleico de la invención pueden modificarse en el resto de la base,
resto del azúcar o cadena principal de fosfato para mejorar, por
ejemplo, la estabilidad, hibridación, o solubilidad de la molécula.
Por ejemplo, la cadena principal desoxirribosa fosfato de los ácidos
nucleicos se puede modificar para generar ácidos nucleicos
peptídicos (véase Hyrup y col. (1996) Bioorganic & Medicinal
Chemistry 4:5). Tal y como se usa en el presente documento, los
términos "ácidos nucleicos peptídicos" o "PNA" se refieren
a imitadores de ácido nucleico, por ejemplo, imitadores de ADN, en
los cuales la cadena principal desoxirribosa fosfato se reemplaza
por una cadena principal pseudopeptídica y solamente se mantienen
las cuatro nucleobases naturales. Se ha demostrado que la cadena
principal neutra de los PNA permite la hibridación específica a ADN
y ARN en condiciones de baja fortaleza iónica. La síntesis de
oligómeros de PNA puede llevarse a cabo usando protocolos de
síntesis de péptidos en fase sólida convencionales tal y como se
describe en Hyrup y col. (1996), referencia mencionada
anteriormente; Perry-O'Keefe y col. (1996) Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93:14670. Los PNA pueden modificarse
adicionalmente, por ejemplo, para potenciar su estabilidad,
especificidad o captación celular, uniendo grupos auxiliares
lipófilos u otros grupos auxiliares al PNA, mediante la formación
de quimeras PNA-ADN, o mediante el uso de liposomas
o de otras técnicas de administración de fármacos conocidas en la
técnica. La síntesis de quimeras PNA-ADN puede
llevarse a cabo tal y como se describe en Hyrup (1996), referencia
mencionada anteriormente, Finn y col. (1996) Nucleic Acids Res.
24(17):3357-63, Mag y col. (1989) Nucleic
Acids Res. 17:5973, y Peterser y col. (1975) Bioorganic Med.
Chem. Lett. 5:1119.
Las moléculas y fragmentos de ácido nucleico de
la invención pueden incluir también otros grupos anexados tales
como péptidos (por ejemplo, para el direccionamiento de
fosfodiesterasas célula huésped in vivo), o agentes que
faciliten el transporte a través de la membrana celular (véase, por
ejemplo, Letsinger y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
86:6553-6556; Lemaitre y col. (1987) Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84:648-652; Publicación
PCT nº WO 88/0918) o a través de la barrera hematoencefálica (véase,
por ejemplo, la publicación PCT nº WO 89/10134). Además, se pueden
modificar oligonucleótidos con agentes de escisión desencadenados
por la hibridación (véase, por ejemplo, Krol y col. (1988)
BioTechniques 6:958-976) o agentes
intercalantes (véase, por ejemplo, Zon (1988) Pharm. Res.
5:539-549).
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa son
también útiles como cebadores para PCR para amplificar cualquier
región dada de un polinucleótido de fosfodiesterasa.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa son
también útiles para construir vectores recombinantes. Dichos
vectores incluyen vectores de expresión que expresan una parte de,
o la totalidad de los polipéptidos de fosfodiesterasa. Los vectores
también incluyen vectores de inserción, usados para integrarlos en
otra secuencia de polinucleótidos, tal como en el genoma celular,
para alterar la expresión in situ de genes y productos
génicos de fosfodiesterasa. Por ejemplo, una secuencia codificante
de fosfodiesterasa endógena puede reemplazarse mediante
recombinación homóloga con toda o con una parte de la región
codificante que contiene una o más mutaciones introducidas de
manera específica.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa son
útiles también para expresar partes antigénicas de las proteínas de
fosfodiesterasa.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa son
también útiles como sondas para determinar las posiciones
cromosómicas de los polinucleótidos de fosfodiesterasa por medio de
procedimientos de hibridación in situ, tales como FISH (Para
una revisión de esta técnica, véase Verma y col. (1988) Human
Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press,
Nueva York) y mapeado por PCR de híbridos de la célula somática. El
mapeado de las secuencias a cromosomas es una primera etapa
importante en la correlación de estas secuencias con genes
asociados con la enfermedad.
Los reactivos para el mapeado en el cromosoma
pueden usarse de manera individual para marcar un único cromosoma o
un único sitio de ese cromosoma, o se pueden usar grupos de
reactivos para marcar múltiples sitios y/o múltiples cromosomas.
Para los fines del mapeado realmente se prefieren los reactivos
correspondientes a regiones no codificantes de los genes. Las
secuencias codificantes es más probable que se conserven dentro de
las familias de genes, aumentando de esta manera la posibilidad de
hibridaciones cruzadas durante el mapeado cromosómico.
Una vez que una secuencia ha sido mapeada a una
localización cromosómica precisa, la posición física de la
secuencia en el cromosoma puede correlacionarse con los datos del
mapa genético. (Dichos datos se encuentran, por ejemplo, en V.
McKusick, Mendelian Inheritance in Man, disponible en línea a
través de Johns Hopkins University Welch Medical Library). La
relación entre un gen y una enfermedad mapeada a la misma región del
cromosoma, puede identificarse posteriormente a través del análisis
de ligamiento (herencia común de genes físicamente adyacentes),
descrito en, por ejemplo, Egeland y col. ((1987) Nature
325:783-787).
Además, se pueden determinar diferencias en las
secuencias de ADN entre individuos aquejados y no aquejados con una
enfermedad asociada con un gen específico. Si se observa una
mutación en alguno o en todos los individuos aquejados pero no se
observa en ninguno de los individuos no aquejados, entonces la
mutación es probable que sea el agente causante de la enfermedad
particular. La comparación de los individuos aquejados y no
aquejados implica generalmente la búsqueda en primer lugar de
alteraciones estructurales en los cromosomas, tales como
eliminaciones o translocaciones, que sean visibles a partir de
dispersiones cromosómicas, o detectables usando PCR en base a esa
secuencia de ADN. Por último, se puede llevar a cabo una
secuenciación completa de genes de varios individuos para confirmar
la presencia de una mutación y para distinguir entre mutaciones y
polimorfismos.
Las sondas de polinucleótidos de fosfodiesterasa
son útiles también para determinar patrones de la presencia del gen
que codifica las fosfodiesterasas y sus variantes con respecto a la
distribución tisular, por ejemplo, si la duplicación génica ha
tenido lugar y si la duplicación tiene lugar en todos o solamente en
un subconjunto de los tejidos. Los genes pueden ser de origen
natural o pueden haber sido introducidos en una célula, tejido u
organismo de manera exógena.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa son
útiles también para diseñar ribozimas correspondientes a todo, o a
parte, del ARNm producido a partir de genes que codifican los
polinucleótidos descritos en el presente documento.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa son
también útiles para construir células huésped que expresan una
parte, o todos, los polipéptidos y polinucleótidos de
fosfodiesterasa.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa son
también útiles para construir animales transgénicos que expresan
todos, o una parte, de los polipéptidos y polinucleótidos de
fosfodiesterasa.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa son
también útiles para preparar vectores que expresen parte, o todos,
los polipéptidos de fosfodiesterasa.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa son
también útiles como sondas de hibridación para determinar el nivel
de expresión del ácido nucleico de fosfodiesterasa. En consecuencia,
las sondas se pueden usar para detectar la presencia de, o para
determinar niveles de, ácido nucleico de fosfodiesterasa en células,
tejidos, y en organismos. El ácido nucleico cuyo nivel se determina
puede ser ADN o ARN. En consecuencia, se pueden usar sondas que
correspondan a los polipéptidos descritos en el presente documento
para evaluar el número de copias del gen en una célula, tejido u
organismo dado. Esto es particularmente importante en los casos en
los cuales ha habido una amplificación de los genes de
fosfodiesterasa.
De manera alternativa, la sonda se puede usar en
un contexto de hibridación in situ para evaluar la posición
de copias extra de los genes de fosfodiesterasa, sobre elementos
extracromosómicos o integradas en cromosomas en los cuales el gen
de fosfodiesterasa no se encuentra normalmente, por ejemplo en forma
de una región de tinción homogénea.
Estos usos son relevantes para el diagnóstico de
trastornos que implican un aumento o disminución de la expresión de
la fosfodiesterasa con respecto a la expresión normal, tal como un
trastorno proliferativo, un trastorno diferenciador o del
desarrollo, o un trastorno hematopoyético.
Las fosfodiesterasas se expresan en osteoblastos
y están implicadas en la diferenciación de los osteoblastos. En
consecuencia, están implicadas en la deposición de matriz ósea y por
tanto, en la formación del hueso. Como tal, el gen es
particularmente relevante para el tratamiento de trastornos que
implican al tejido óseo y particularmente en la osteoporosis.
Las fosfodiesterasas están también implicadas de
manera específica en la enfermedad cardiaca, tal como insuficiencia
cardiaca congestiva, y en el cáncer de mama.
Entre los trastornos en los cuales es relevante
la expresión de la fosfodiesterasa también se incluyen, pero sin
limitación, la demencia, la pérdida de memoria, la insuficiencia
cardiaca congestiva, la trombosis, la hipertensión pulmonar, la
glomerulonefritis, la depresión bipolar, el asma bronquial, las
enfermedades atópicas, la encefalomielitis autoinmune, el
transplante de órganos, la retención de sal en el síndrome
nefrótico, y la disfunción eréctil.
De esta forma, la presente invención proporciona
un procedimiento para la identificación de una enfermedad o
trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante del ácido
nucleico de fosfodiesterasa, en el cual se obtiene una muestra de
ensayo a partir de un sujeto y se detecta el ácido nucleico (por
ejemplo, ARNm, ADN genómico), donde la presencia del ácido nucleico
se diagnostica para un sujeto que tiene o está en riesgo de
desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con una expresión o
actividad aberrante del ácido nucleico.
Un aspecto de la invención se refiere a ensayos
de diagnóstico para determinar la expresión del ácido nucleico así
como la actividad en el contexto de una muestra biológica (por
ejemplo, sangre, suero, células, tejido) para determinar si un
individuo tiene una enfermedad o trastorno, o está en riesgo de
desarrollar una enfermedad o trastorno, asociado con una expresión
o actividad aberrante del ácido nucleico. Dichos ensayos se pueden
usar con fines de pronóstico o predictivos para de esta manera
tratar profilácticamente a un individuo antes del comienzo de un
trastorno caracterizado por o asociado a una expresión o actividad
de las moléculas de ácido nucleico.
Entre las técnicas in vitro para la
detección de ARNm se incluyen hibridaciones de tipo Northern e
hibridaciones in situ. Entre las técnicas in vitro
para detectar ADN se incluyen hibridaciones Southern e hibridación
in situ.
Se pueden usar sondas como una parte de un kit
de ensayo de diagnóstico para identificar células o tejidos que
expresen la fosfodiesterasa, tal como midiendo el nivel de un ácido
nucleico que codifica a fosfodiesterasa en una muestra de células
de un sujeto por ejemplo, ARNm o ADN genómico, o determinando si el
gen de fosfodiesterasa ha sido mutado.
Los ensayos de expresión del ácido nucleico son
útiles en el cribado de fármacos para identificar compuestos que
modulen la expresión del ácido nucleico de fosfodiesterasa (por
ejemplo, moléculas de sentido contrario, polipéptidos, miméticos de
péptido, moléculas pequeñas u otros fármacos). Una célula se pone en
contacto con un compuesto candidato y se determina la expresión del
ARNm. El nivel de expresión del ARNm en presencia del compuesto
candidato se compara con el nivel de expresión del ARNm en ausencia
del compuesto candidato. El compuesto candidato puede identificarse
posteriormente como un modulador de la expresión del ácido nucleico
en base a esta comparación y se puede usar, por ejemplo para tratar
un trastorno caracterizado por la expresión aberrante del ácido
nucleico. El modulador se puede unir al ácido nucleico o modular la
expresión de forma indirecta, tal como mediante la interacción con
otros componentes celulares que afectan a la expresión del ácido
nucleico.
Los procedimientos moduladores se pueden llevar
a cabo in vitro (por ejemplo, mediante el cultivo de la
célula con el agente) o, alternativamente, in vivo (por
ejemplo, mediante la administración del agente a un sujeto) en
pacientes o en animales transgénicos.
La invención proporciona de esta manera un
procedimiento para identificar un compuesto que se pueda usar para
tratar un trastorno asociado con la expresión por ácido nucleico del
gen de fosfodiesterasa. El procedimiento incluye típicamente
someter a ensayo la capacidad del compuesto para modular la
expresión del ácido nucleico de fosfodiesterasa y de esta manera
identificar un compuesto que se pueda usar para tratar un trastorno
caracterizado por una expresión no deseada del ácido nucleico de
fosfodiesterasa.
Los ensayos se pueden llevar a cabo en sistemas
basados en células o en sistemas libres de células. Los ensayos
basados en células incluyen células que expresan de forma natural el
ácido nucleico de fosfodiesterasa o células recombinantes
modificadas mediante ingeniería genética para expresar secuencias de
ácido nucleico específicas.
De forma alternativa, se pueden ensayar los
compuestos candidatos in vivo en pacientes o en animales
transgénicos.
El ensayo para la expresión del ácido nucleico
de fosfodiesterasa puede implicar el ensayo directo de los niveles
de ácido nucleico, tales como los niveles del ARNm, o en compuestos
colaterales implicados en la ruta de señal (tal como recambio del
AMP cíclico). Además, se puede también ensayar la expresión de genes
que están regulados al alza o a la baja en respuesta a la ruta de
señal de fosfodiesterasa. En esta realización, las regiones
reguladoras de estos genes pueden estar ligadas de forma funcional a
un gen reportero tal como la luciferasa.
De esta forma, se pueden identificar moduladores
de la expresión del gen de fosfodiesterasa en un procedimiento en
el cual una célula se pone en contacto con un compuesto candidato y
se determina la expresión del ARNm. Se compara el nivel de
expresión del ARNm de fosfodiesterasa en presencia del compuesto
candidato con el nivel de expresión del ARNm de fosfodiesterasa en
ausencia del compuesto candidato. Posteriormente se puede
identificar el compuesto candidato como un modulador de la
expresión del ácido nucleico en base a esta comparación y se puede
usar, por ejemplo para tratar un trastorno caracterizado por una
expresión aberrante del ácido nucleico. Cuando la expresión del
ARNm sea estadísticamente y significativamente mayor en presencia
del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato
se identifica como un estimulador de la expresión del ácido
nucleico. Cuando la expresión del ácido nucleico sea
estadísticamente y significativamente menor en presencia del
compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se
identifica como un inhibidor de la expresión del ácido
nucleico.
En consecuencia, la invención proporciona
procedimientos de tratamiento, con el ácido nucleico como una diana,
usando un compuesto identificado a través del cribado de fármacos
como un modulador del gen para modular la expresión del ácido
nucleico de fosfodiesterasa. La modulación incluye tanto la
regulación al alza (es decir, la activación o agonización) como la
regulación a la baja (supresión o antagonización) o efectos sobre la
actividad del ácido nucleico (por ejemplo cuando el ácido nucleico
está mutado o está modificado inapropiadamente). El tratamiento es
para los trastornos caracterizados por la expresión o actividad
aberrante del ácido nucleico.
El gen es particularmente relevante para el
tratamiento de trastornos que implican al tejido óseo y en
particular es relevante en la osteoporosis. El gen está también
implicado en la enfermedad cardiaca, tal como insuficiencia
cardiaca congestiva, y en el cáncer de mama. Otros trastornos en los
cuales es relevante la expresión incluyen, pero sin limitación,
demencia, pérdida de memoria, insuficiencia cardiaca congestiva,
trombosis, hipertensión pulmonar, glomerulonefritis, depresión
bipolar, asma bronquial, enfermedades atópicas, encefalomielitis
autoinmune, transplante de órganos, retención de sal en el síndrome
nefrótico, y disfunción eréctil.
De forma alternativa, un modulador de la
expresión del ácido nucleico de fosfodiesterasa puede ser una
molécula pequeña o fármaco identificado usando los ensayos de
cribado descritos en el presente documento siempre que el fármaco o
la molécula pequeña inhiban la expresión del ácido nucleico de
fosfodiesterasa.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa son
útiles también para controlar la eficacia de los compuestos
moduladores sobre la expresión o actividad del gen de
fosfodiesterasa en ensayos clínicos o en un régimen de tratamiento.
De esta forma, el patrón de expresión del gen puede servir como un
barómetro para la eficacia permanente del tratamiento con el
compuesto, en particular con compuestos frente a los cuales el
paciente puede desarrollar resistencia. El patrón de expresión del
gen puede servir también como un marcador indicativo de una
respuesta fisiológica de las células afectadas frente al compuesto.
En consecuencia, dicho control permitiría la administración
aumentada del compuesto o la administración de compuestos
alternativos frente a los cuales el paciente no ha llegado a ser
resistente. De manera similar, si el nivel de la expresión del ácido
nucleico cae por debajo de un nivel deseable, la administración del
compuesto podría reducirse de manera proporcional.
El control puede ser, por ejemplo, de la forma
siguiente: (i) obtención de una muestra previa a la administración
a partir de un sujeto antes de la administración del agente; (ii)
detección del nivel de expresión de un ARNm especificado o del ADN
genómico de la invención en la muestra previa a la administración;
(iii) obtención de una o más muestras posteriores a la
administración a partir del sujeto; (iv) detección del nivel de
expresión o actividad del ARNm o del ADN genómico en las muestras
posteriores a la administración; (v) comparación del nivel de
expresión o actividad del ARNm o del ADN genómico en la muestra
anterior a la administración con el ARNm o el ADN genómico en la
muestra o muestras posteriores a la administración; (vi) aumento o
reducción de la administración del agente al sujeto en consecuencia
con lo anterior.
Los polinucléotidos de fosfodiesterasa son
útiles también en ensayos de diagnóstico para los cambios
cualitativos en el ácido nucleico de fosfodiesterasa, y de manera
particular en los cambios cualitativos que dan lugar a una
patología. Los polinucleótidos se pueden usar para detectar
mutaciones en genes de fosfodiesterasa y productos de expresión de
genes de fosfodiesterasa tales como ARNm. Los polinucleótidos se
pueden usar como sondas de hibridación para detectar mutaciones
genéticas de origen natural en el gen de la fosfodiesterasa y para
determinar así si un sujeto que presenta la mutación están en riesgo
de padecer un trastorno causado por la mutación. Las mutaciones
incluyen eliminación, adición, o sustitución de uno o más
nucleótidos en el gen, redisposición de cromosomas, tal como
inversión o transposición, modificación del ADN genómico, tal como
patrones de metilación aberrante o cambios en el número de copias
del gen, tal como amplificación. La detección de una forma mutada
del gen de la fosfodiesterasa asociado con una disfunción
proporciona una herramienta de diagnóstico de una enfermedad activa
o de la susceptibilidad a una enfermedad cuando la enfermedad
resulta de la expresión por encima de los niveles normales,
expresión por debajo de los límites normales, o de la expresión
alterada de una fosfodiesterasa.
Se pueden detectar mutaciones en el gen de la
fosfodiesterasa a nivel de ácido nucleico mediante una diversidad
de técnicas. El ADN genómico puede analizarse directamente o puede
amplificarse usando PCR antes del análisis. Se pueden usar ARN o
ADNc de la misma manera.
En ciertas realizaciones, la detección de la
mutación implica el uso de una sonda/cebador en una reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) (véanse, por ejemplo, las patentes de
EE.UU. n^{os} 4.683.195 y 4.683.202), tal como PCR de anclaje o
RACE PCR (PCR de extremos de ADNc de amplificación rápida), o,
alternativamente, en una reacción en cadena de ligamiento (LCR)
(véase, por ejemplo, Landegran y col. (1988) Science
241:1077-1080; y Nakazawa y col. (1994) PNAS
91:360-364), pudiendo ser la última de ellas
particularmente útil para detectar mutaciones puntuales en el gen
(véase Abravaya y col. (1995) Nucleic Acids Res.
23:675-682). Este procedimiento puede incluir
las etapas de recolección de una muestra de células a partir de un
paciente, aislar el ácido nucleico (por ejemplo, genómico, ARNm o
ambos) a partir de las células de la muestra, puesta en contacto de
la muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores que se hibridan
de manera específica con un gen en condiciones tales para que tenga
lugar la hibridación y amplificación del gen (si está presente), y
la detección de la presencia o ausencia de un producto de
amplificación, o la detección del tamaño del producto de
amplificación y la comparación de la longitud con respecto a una
muestra de control. Se pueden detectar eliminaciones e inserciones
mediante un cambio en el tamaño del producto amplificado en
comparación con el genotipo normal. Se pueden identificar
mutaciones puntuales mediante la hibridación del ADN amplificado con
secuencias de ADN de sentido contrario o de ARN normal.
Se prevé que PCR y/o LCR pueden ser deseables
para su uso como una etapa de amplificación preliminar junto con
cualquiera de las técnicas usadas para detectar mutaciones descritas
en el presente documento.
Los procedimientos de amplificación alternativos
incluyen: replicación de secuencia autosostenida (Guatelli y col.
(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
87:1874-1878), sistema de amplificación
transcripcional (Kwoh y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 86:1173-1177), Q-Beta
Replicasa (Lizardi y col. (1988) Bio/Technology 6:1197), o
cualquier otro procedimiento de amplificación de ácido nucleico,
seguido de la detección de las moléculas amplificadas usando
técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica. Estos
esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de
moléculas de ácido nucleico si dichas moléculas están presentes un
números muy bajos.
De forma alternativa, se pueden identificar
directamente mutaciones en un gen de fosfodiesterasa, por ejemplo,
mediante alteraciones en patrones de digestión con enzimas de
restricción determinadas mediante electroforesis en gel.
Además, se pueden usar ribozimas específicas de
secuencia (patente de EE.UU. nº 5.498.531) para puntuar la
presencia de mutaciones específicas mediante el desarrollo o pérdida
de un sitio de escisión por ribozima.
Las secuencias perfectamente apareadas pueden
distinguirse de las secuencias apareadas de manera errónea mediante
ensayos de digestión por escisión con nucleasa o mediante
diferencias en la temperatura de fusión.
Se pueden evaluar también los cambios en las
secuencias en localizaciones específicas mediante ensayos de
protección de nucleasa tales como la protección de RNasa y S1 o el
procedimiento de escisión química.
Además, las diferencias en las secuencias entre
un gen de fosfodiesterasa mutante y un gen de tipo salvaje pueden
determinarse mediante secuenciación directa de ADN. Se puede
utilizar una variedad de procedimientos de secuenciación
automatizados cuando se llevan a cabo los ensayos de diagnóstico
((1995) Biotechniques 19:448), incluyendo la
secuenciación mediante espectrometría de masas (véase, por ejemplo,
Publicación Internacional PCT nº WO 94/16101; Cohen y col. (1996)
Adv. Chromatogr. 36:127-162; y Griffin y col.
(1993) Appl. Biochem. Biotechnol.
38:147-159).
Otros procedimientos para la detección de
mutaciones en el gen incluyen procedimientos en los cuales se usa
la protección contra agentes de escisión para detectar bases
apareadas de forma errónea en los dúplex ARN/ARN o ARN/ADN (Myers y
col. (1985) Science 230:1242); Cotton y col. (1988) PNAS
85:4397; Saleeba y col. (1992) Meth. Enzymol.
217:286-295), se compara la movilidad
electroforética del ácido nucleico mutante y de tipo salvaje (Orita
y col. (1989) PNAS 86:2766; Cotton y col. (1993) Mutat.
Res. 285:125-144; y Hayashi y col. (1992)
Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79), y se
ensaya el movimiento de fragmentos mutantes o de tipo salvaje en
geles de poliacrilamida que contienen un gradiente de
desnaturalizante usando electroforesis en geles de gradiente
desnaturalizante (Myers y col. (1985) Nature 313:495). La
sensibilidad del ensayo puede potenciarse mediante el uso de ARN
(más que el uso de ADN), en el cual la estructura secundaria es más
sensible a un cambio en la secuencia. En una realización, el
procedimiento objeto utiliza análisis de heterodúplex para separar
moléculas heterodúplex de doble cadena en base a los cambios en la
movilidad electroforética (Keen y col. (1991) Trends Genet.
7:5). Ejemplos de otras técnicas para detectar mutaciones
puntuales incluyen, hibridación selectiva de oligonucléotidos,
amplificación selectiva, y extensión selectiva del cebador.
En otras realizaciones, se pueden identificar
mutaciones genéticas mediante la hibridación de una muestra y
ácidos nucleicos de control, por ejemplo, ADN o ARN, con matrices de
alta densidad que contienen cientos o miles de sondas de
oligonucleótidos (Cronin y col. (1996) Human Mutation
7:244-255; Kozal y col. (1996) Nature
Medicine 2:753-759). Por ejemplo, se pueden
identificar mutaciones genéticas en matrices de dos dimensiones que
contienen sondas de ADN generadas por luz tal y como se describe en
Cronin y col, referencia mencionada anteriormente. Brevemente, se
puede usar una primera matriz de sondas de hibridación para explorar
a través de largos tramos de ADN en una muestra y para identificar
cambios de bases entre las secuencias haciendo matrices lineales de
sondas solapantes secuenciales. Esta etapa permite la identificación
de mutaciones puntuales. A esta etapa le sigue una segunda matriz
de hibridación que permite la caracterización de mutaciones
específicas usando matrices de sondas más pequeñas y especializadas
complementarias a todas las variantes o mutaciones detectadas. Cada
matriz de mutación está compuesta de grupos de sondas en paralelo,
una complementaria al gen de tipo salvaje y la otra complementaria
al gen mutante.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa son
útiles también para ensayar en un individuo un genotipo que aunque
no necesariamente provoca la enfermedad, sin embargo afecta a la
modalidad del tratamiento. De esta forma, los polinucleótidos se
pueden usar para estudiar la relación entre un genotipo del
individuo y la respuesta del individuo a un compuesto usado para el
tratamiento (relación farmacogenómica). En el presente caso, por
ejemplo, una mutación en el gen de la fosfodiesterasa que da como
resultado una afinidad alterada por el AMPc podría dar como
resultado un efecto del fármaco excesivo o reducido con
concentraciones convencionales de AMPc que activa la
fosfodiesterasa. En consecuencia, los polinucleótidos de
fosfodiesterasa descritos en el presente documento se pueden usar
para evaluar el contenido de mutación del gen en un individuo con el
fin de seleccionar un compuesto o un régimen de dosificación
apropiados para el tratamiento.
De esta forma, los polinucleótidos que muestran
variaciones genéticas que afectan al tratamiento proporcionan una
diana de diagnóstico que se puede usar para confeccionar el
tratamiento en un individuo. En consecuencia, la producción de
animales y células recombinantes que contienen estos polimorfismos
permite el diseño clínico eficaz de compuestos y de regímenes de
dosificación para el tratamiento.
Los procedimientos pueden implicar la obtención
de una muestra biológica de control a partir de un sujeto de
control, la puesta en contacto de la muestra de control con un
compuesto o agente capaz de detectar el ARNm, o el ADN genómico, de
forma que se detecte la presencia del ARNm o del ADN genómico en la
muestra biológica, y la comparación de la presencia del ARNm o del
ADN genómico en la muestra de control con la presencia del ARNm o
del ADN genómico en la muestra de ensayo.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa son
útiles también para la identificación de cromosomas cuando la
secuencia se identifica con un cromosoma individual y en una
localización particular del cromosoma. En primer lugar, la
secuencia de ADN se aparea con el cromosoma mediante hibridación
in situ o mediante otra hibridación específica de cromosoma.
Las secuencias se pueden correlacionar también con cromosomas
específicos mediante la preparación de cebadores de PCR que se
pueden usar para el cribado mediante PCR de híbridos de célula
somática que contienen cromosomas individuales de las especies
deseadas. Solamente los híbridos que contienen el cromosoma que
contiene el gen homólogo al cebador darán lugar a un fragmento
amplificado. La sublocalización se puede lograr usando fragmentos
de cromosomas. Entre otras estrategias se incluyen un cribado previo
con cromosomas aislados por citometría de flujo y marcados y una
selección previa mediante hibridación con genotecas específicas de
cromosomas. Otras estrategias de mapeado incluyen hibridación in
situ acoplada a un sistema de fluorescencia, que permite la
hibridación con sondas más cortas que aquellas usadas
tradicionalmente. Los reactivos para el mapeado en cromosomas se
pueden usar de manera individual para marcar un único cromosoma o un
único sitio del cromosoma, o se pueden usar grupos de reactivos
para marcar múltiples sitios y/o múltiples cromosomas. Para fines
de mapeado se prefieren en realidad los reactivos que corresponden a
regiones no codificantes de los genes. Las secuencias codificantes
es más probable que se conserven dentro de las familias de genes,
aumentando de esta forma la posibilidad de hibridaciones cruzadas
durante el mapeado cromosómico.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa se pueden
usar también para identificar individuos a partir de pequeñas
muestras biológicas. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo,
usando polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción
(RFLP) para identificar a un individuo. De esta forma, los
polinucleótidos descritos en el presente documento son útiles como
marcadores de ADN para RFLP (véase la patente de EE.UU. nº
5.272.057).
Además, la secuencia de fosfodiesterasa se puede
usar para proporcionar una técnica alternativa, que determina la
secuencia de ADN real de fragmentos seleccionados en el genoma de un
individuo. De esta manera, las secuencias de fosfodiesterasa
descritas en el presente documento se pueden usar para preparar dos
cebadores para la PCR desde los extremos 5' y 3' de las secuencias.
Estos cebadores se pueden usar posteriormente para amplificar el
ADN de un individuo para una posterior secuenciación.
Los grupos de secuencias de ADN correspondientes
de individuos preparadas de esta manera pueden proporcionar
identificaciones de individuos exclusivas, ya que cada individuo
tendrá un grupo exclusivo de dichas secuencias de ADN. Se estima
que la variación alélica en seres humanos tiene lugar con una
frecuencia de aproximadamente una vez por cada 500 bases. La
variación alélica tiene lugar en un cierto grado en las regiones
codificantes de estas secuencias, y en un grado mayor en las
regiones no codificantes. Las secuencias de fosfodiesterasa se
pueden usar para obtener dichas secuencias de identificación a
partir de individuos y a partir de tejidos. Las secuencias
representan fragmentos exclusivos del genoma humano. Cada una de las
secuencias descritas en el presente documento pueden usarse, en un
cierto grado, como un patrón frente al que puede compararse el ADN
de un individuo con fines de IDENTIFICACIÓN.
Si un grupo de reactivos de las secuencias se
usa para generar una base de datos de identificación exclusiva para
un individuo, esos mismos reactivos se pueden usar posteriormente
para identificar tejido de ese individuo. Usando la base de datos
de identificación exclusiva, se puede hacer una identificación
positiva del individuo, vivo o muerto, a partir de muestras de
tejido extremadamente pequeñas.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa se pueden
usar también en procedimientos de identificación forense. Se puede
usar tecnología PCR para amplificar secuencias de ADN tomadas de
muestras biológicas muy pequeñas, tales como un único folículo
capilar, fluidos corporales (por ejemplo, sangre, saliva, o semen).
La secuencia amplificada se puede comparar posteriormente con un
patrón permitiendo la identificación del origen de la muestra.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa, por
consiguiente, se pueden usar para proporcionar reactivos de
polinucleótido, por ejemplo, cebadores para la PCR, dirigidos a
loci específicos en el genoma humano, que pueden potenciar la
fiabilidad de las identificaciones forenses basadas en ADN
proporcionando, por ejemplo, otro "marcador de identificación"
(es decir, otra secuencia de ADN que es exclusiva para un individuo
particular). Tal y como se describe anteriormente, se puede usar
información de secuencias de bases reales para la identificación
como una alternativa precisa a los patrones formados mediante
fragmentos generados por enzimas de restricción. Las secuencias
dirigidas a la región no codificante son particularmente útiles
puesto que en las regiones no codificantes se da un mayor
polimorfismo, haciendo más fácil diferenciar individuos usado esta
técnica.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa pueden
usarse de manera adicional para proporcionar reactivos de
polinucleótido, por ejemplo, sondas marcadas o marcables que se
pueden usar, por ejemplo, en una técnica de hibridación in
situ, para identificar un tejido específico. Esto es útil en los
casos en los que a un patólogo forense se le presenta un tejido de
origen desconocido. Se pueden usar grupos de sondas de
fosfodiesterasa para identificar tejidos por especies y/o por tipo
de órgano.
De manera similar, estos cebadores y sondas se
pueden usar para detectar la contaminación en cultivos titulares
(es decir, detectar la presencia de una mezcla de diferentes tipos
de células en un cultivo).
De manera alternativa, los polinucleótidos de
fosfodiesterasa se pueden usar directamente para bloquear la
transcripción o traducción de secuencias de genes de fosfodiesterasa
por medio de construcciones de sentido contrario o de ribozima. De
esta manera, en un trastorno caracterizado por una expresión del gen
de la fosfodiesterasa anormalmente alta o indeseable, se pueden
usar ácidos nucleicos directamente para el tratamiento.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa son por
tanto útiles como construcciones de sentido contrario para
controlar la expresión del gen de fosfodiesterasa en células,
tejidos, y organismos. Se diseña un polinucleótido ADN de sentido
contrario para que sea complementario a una región del gen implicada
en la transcripción, evitando la transcripción y por tanto la
producción de la proteína de fosfodiesterasa. Un polinucleótido ARN
o ADN de sentido contrario se hibridaría con el ARNm y así
bloquearía la traducción del ARNm en la proteína de
fosfodiesterasa.
Entre los ejemplos de moléculas de sentido
contrario útiles para inhibir la expresión del ácido nucleico se
incluyen moléculas de sentido contrario complementarias a un
fragmento de la región 5' no traducida de la SEC. ID nº: 2 o de la
SEC. ID nº: 4 que también incluye el codón de inicio y moléculas de
sentido contrario que son complementarias a un fragmento de la
región 3' no traducida de la SEC. ID nº: 2 o de la SEC. ID nº:
4.
De manera alternativa, una clase de moléculas de
sentido contrario se puede usar para inactivar el ARNm con el fin
de reducir la expresión del ácido nucleico de fosfodiesterasa. En
consecuencia, estas moléculas pueden tratar un trastorno
caracterizado por una expresión anormal o no deseada del ácido
nucleico de fosfodiesterasa. Esta técnica implica la escisión por
medio de ribozimas que contienen secuencias de nucleótidos
complementarias a una o más regiones en el ARNm que atenúan la
capacidad del ARNm de ser traducido. La regiones posibles incluyen
regiones codificantes y en particular regiones codificantes que
corresponden a la actividad catalítica y otras actividades
funcionales de la proteína de fosfodiesterasa.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa
proporcionan también vectores para la terapia génica en pacientes
que contienen células que son aberrantes en la expresión del gen de
fosfodiesterasa. De esta manera, células recombinantes, que
incluyen las células del paciente que han sido modificadas por
ingeniería genética ex vivo y han sido devueltas al
paciente, se introducen en un individuo donde las células producen
la proteína de fosfodiesterasa deseada para tratar al
individuo.
La invención también abarca kits para la
detección de la presencia de un ácido nucleico de fosfodiesterasa
en una muestra biológica. Por ejemplo, el kit puede comprender
reactivos tales como un ácido nucleico marcado o marcable o agente
capaz de detectar ácido nucleico de fosfodiesterasa en una muestra
biológica; medios para determinar la cantidad de ácido nucleico de
fosfodiesterasa en la muestra; y medios para comparar la cantidad
de ácido nucleico de fosfodiesterasa en la muestra con un patrón. El
compuesto o agente puede estar empaquetado en un recipiente
adecuado. El kit puede comprender adicionalmente instrucciones para
el uso del kit para detectar ADN o ARNm de fosfodiesterasa.
Las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos
de la invención están descritas también en una diversidad de medios
para facilitar el uso de las mismas. Esto se refiere a una
fabricación, distinta de una molécula de ácido nucleico o de
aminoácido aislada, que contiene una secuencia de nucleótidos o de
aminoácidos de la presente invención. Dicha fabricación proporciona
las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos, o un subconjunto de
las mismas (por ejemplo, un subconjunto de los marcos abiertos de
lectura (ORF)) en una forma que permite al experto en la técnica
examinar la fabricación usando medios no directamente aplicables al
examen de las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos, o un
subconjunto de las mismas, tal y como existen en la naturaleza o en
forma purificada.
En una aplicación, una secuencia de nucleótidos
o de aminoácidos de la presente invención se puede grabar en medios
legibles por ordenador. Tal y como se usa en el presente documento,
"medios legibles por ordenador" se refiere a cualquier medio
que se pueda leer y al que se pueda acceder directamente mediante un
ordenador. Dichos medios incluyen, pero sin limitación: medios de
almacenamiento magnético, tal como disquetes, medios de
almacenamiento de disco duro, y cinta magnética; medios de
almacenamiento óptico tal como CD-ROM; medios de
almacenamiento eléctrico tal como RAM y ROM; e híbridos de estas
categorías tales como medios de almacenamiento magnético/óptico. El
experto en la técnica apreciará fácilmente cómo se pueden usar
cualquiera de los medios legibles por ordenador conocidos en la
actualidad para crear una fabricación que comprenda un medio legible
por ordenador sobre el que se ha grabado una secuencia de
nucleótidos o de aminoácidos de la presente invención.
Tal y como se usa en el presente documento,
"grabado" se refiere a un procedimiento para almacenar
información sobre un medio legible por ordenador. El experto en la
técnica puede adoptar fácilmente cualquiera de los procedimientos
conocidos en la actualidad para grabar información en un medio
legible por ordenador para generar fabricaciones que comprendan la
información de la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de la
presente invención.
Un experto en la técnica dispone de una
diversidad de estructuras de almacenamiento de datos para crear un
medio legible por ordenador sobre el que se haya grabado una
secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de la presente invención.
La elección de la estructura de almacenamiento de datos estará
basada generalmente en los medios elegidos para acceder a la
información almacenada. Además, se puede usar una diversidad de
formatos y programas procesadores de datos para almacenar la
información de la secuencia de nucleótidos de la presente invención
en un medio legible por ordenador. La información de la secuencia
puede presentarse en un archivo de texto de procesamiento de
palabras, formateado en software disponible en el mercado tal como
WordPerfect y Microsoft Word, o presentarse en la forma de un
archivo ASCII, almacenado en un aplicación de base de datos, tal
como DB2, Sybase, Oracle, o similar. El experto en la técnica puede
adaptar fácilmente cualquier número de formatos estructurantes de
procesador de datos (por ejemplo, archivo de texto o base de datos)
con el fin de obtener un medio legible por ordenador sobre el que
se haya grabado la información de la secuencia de nucleótidos de la
presente invención.
Proporcionando las secuencias de nucleótidos o
de aminoácidos de la invención en formato legible por ordenador, el
experto en la técnica puede acceder de manera rutinaria a la
información de la secuencia para una diversidad de fines. Por
ejemplo, un experto en la técnica puede usar las secuencias de
nucleótidos o de aminoácidos de la invención en formato legible por
ordenador para comparar una secuencia diana o un motivo estructural
diana con la información de la secuencia almacenada en el medio de
almacenamiento de los datos. Se usan medios de búsqueda para
identificar fragmentos o regiones de las secuencias de la invención
que coincidan con una secuencia diana o con un motivo diana en
particular.
Tal y como se usa en el presente documento, una
"secuencia diana" puede ser cualquier secuencia de ADN o de
aminoácidos de seis o más nucleótidos o de dos o más aminoácidos. Un
experto en la técnica puede reconocer fácilmente que cuanto más
larga sea una secuencia diana, menos probable es que una secuencia
diana se presente como una aparición aleatoria en la base de datos.
La longitud más preferida de una secuencia diana está entre
aproximadamente 10 y 100 aminoácidos o entre aproximadamente 30 y
300 restos de nucleótido. Sin embargo, está bien reconocido que los
fragmentos importantes en el mercado, tales como fragmentos de
secuencia implicados en la expresión del gen y en el procesamiento
de la proteína, pueden ser de menor longitud.
Tal y como se usa en el presente documento, un
"motivo estructural diana", o "motivo diana", se refiere a
cualquier secuencia o combinación de secuencias seleccionadas de
manera racional en las que la (s) secuencia (s) se elige (n) en
base a una configuración tridimensional que se forma tras el
plegamiento del motivo diana. Existe una diversidad de motivos
diana conocidos en la técnica. Los motivos diana proteicos incluyen,
pero sin limitación, sitios activos de enzima y secuencias señal.
Los motivos diana de ácido nucleico incluyen, pero sin limitación,
secuencias de promotor, estructuras en forma de horquilla y
elementos de expresión inducible (secuencias de unión de
proteína).
Existe software informático disponible al
público que permite al experto en la técnica acceder a la
información de secuencia proporcionada en un medio legible por
ordenador para su análisis y comparación con otras secuencias.
Están descritos al público una diversidad de algoritmos conocidos y
existe una diversidad de software disponible en el mercado para
llevar a cabo los medios de búsqueda y se puede usar en los sistemas
basados en ordenador de la presente invención. Entre los ejemplos
de dicho software se incluyen, pero sin limitación, MacPattern
(EMBL), BLASTN y BLASTX (NCBIA).
Por ejemplo, se puede usar software que
implementa los algoritmos de búsqueda BLAST (Altschul y col. (1990)
J. Mol. Biol. 215:403-410) y BLAZE (Brutlag y
col. (1993) Comp. Chem. 17:203-207) sobre un
sistema Sybase para identificar marcos abiertos de lectura (ORF) de
las secuencias de la invención que contienen homología con los ORF
o proteínas de otras genotecas. Dichos ORF son fragmentos que
codifican proteínas y son útiles a la hora de producir proteínas
importantes en el mercado tales como enzimas usadas en diversas
reacciones y en la producción de metabolitos útiles en el
mercado.
La invención proporciona también vectores que
contienen los polinucleótidos de fosfodiesterasa. El término
"vector" se refiere a un vehículo, preferiblemente una molécula
de ácido nucleico que puede transportar los polinucleótidos de
fosfodiesterasa. Cuando el vector es una molécula de ácido nucleico,
los polinucleótidos de fosfodiesterasa están covalentemente unidos
al ácido nucleico vector. Con este aspecto de la invención, el
vector incluye un plásmido, un fago de una única cadena o de cadena
doble, un vector viral ADN o ARN de una única cadena o de cadena
doble, o cromosoma artificial, tal como BAC, PAC, YAC, o MAC.
Un vector se puede mantener en la célula huésped
como un elemento extracromosómico donde se replica y produce copias
adicionales de los polinucleótidos de fosfodiesterasa. De manera
alternativa, el vector se puede integrar en el genoma de la célula
huésped y producir copias adicionales de los polinucléotidos de
fosfodiesterasa cuando la célula huésped se replica.
La invención proporciona vectores para el
mantenimiento (vectores de clonación) o vectores para la expresión
(vectores de expresión) de los polinucleótidos de fosfodiesterasa.
Los vectores pueden funcionar en células procariotas o eucariotas o
en ambas (vectores lanzadera).
Los vectores de expresión contienen regiones
reguladoras que actúan en cis que están unidas de forma funcional
en el vector a los polinucleótidos de fosfodiesterasa de forma tal
que la transcripción de los polinucleótidos está permitida en una
célula huésped. Los polinucléotidos se pueden introducir en la
célula huésped con un polinucleótido separado capaz de afectar a la
transcripción. De esta forma, el segundo polinucleótido puede
proporcionar un factor de actuación en trans que interactúa con la
región de control reguladora en cis para permitir la transcripción
de los polinucleótidos de fosfodiesterasa a partir del vector. De
forma alternativa, la célula huésped puede suministrar un factor
que actúa en trans. Finalmente, se puede producir un factor que
actúa en trans a partir del propio vector.
Se entiende, sin embargo, que en algunas
realizaciones, la transcripción y/o traducción de los
polinucléotidos de fosfodiesterasa puede tener lugar en un sistema
libre de células.
La secuencia reguladora a la que pueden estar
unidos de forma funcional los polinucleótidos descritos en el
presente documento incluye promotores para dirigir la transcripción
del ARNm. Éstos incluyen, pero sin limitación, el promotor
izquierdo del bacteriófago \lambda, los promotores lac, TRP, y TAC
de E. coli, los promotores temprano y tardío de SV40, el
promotor inmediato temprano de CMV, los promotores temprano y tardío
de adenovirus, y repeticiones terminales largas de retrovirus.
Además de las regiones de control que promueven
la transcripción, los vectores de expresión también pueden incluir
regiones que modulan la transcripción, tales como potenciadores y
sitios de unión del represor. Entre los ejemplos se incluyen el
potenciador de SV40, el potenciador inmediato temprano de
citomegalovirus, el potenciador de polioma, potenciadores de
adenovirus, y potenciadores de repeticiones terminales largas (LTR)
de retrovirus.
Además de contener sitios para el inicio y
control de la transcripción, los vectores de expresión pueden
contener también secuencias necesarias para la terminación de la
transcripción, y en la región transcrita un sitio de unión a
ribosoma para la traducción. Otros elementos de control reguladores
para la expresión incluyen codones de inicio y terminación así como
señales de poliadenilación. El experto habitual en la técnica sería
consciente de las numerosas secuencias reguladoras que son útiles en
vectores de expresión. Dichas secuencias reguladoras se describen,
por ejemplo, en Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual segunda edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Se puede usar una diversidad de vectores de
expresión para expresar un polinucleótido de fosfodiesterasa.
Dichos vectores incluyen vectores cromosómicos, episomales, y
derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos
bacterianos, derivados de bacteriófagos, derivados de episomas de
levadura, derivados de elementos cromosómicos de levadura,
incluyendo, cromosomas artificiales de levadura, derivados de virus
tales como baculovirus, papovavirus tales como SV40, virus
Vaccinia, adenovirus, poxvirus, virus de la pseudorabia, y
retrovirus. Los vectores pueden derivar también de combinaciones de
estas fuentes tales como aquellos derivados de elementos genéticos
de bacteriófago y plásmido, por ejemplo fagémidos y cósmidos. En
Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY se describen vectores de clonación y
expresión apropiados para huéspedes procariotas y eucariotas.
La secuencia reguladora puede proporcionar
expresión constitutiva en una o más células huésped (es decir,
específica de tejido) o puede proporcionar la expresión inducible en
uno o más tipos celulares tales como mediante temperatura, aditivo
nutriente, o factor exógeno tal como una hormona u otro ligando. Los
expertos habituales en la técnica conocen bien una diversidad de
vectores que proporcionan una expresión constitutiva e inducible en
huéspedes procariotas y eucariotas.
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa se pueden
insertar en el vector ácido nucleico mediante metodología bien
conocida. En general, la secuencia de ADN que finalmente será
expresada se une a un vector de expresión escindiendo la secuencia
de ADN y el vector de expresión con una o más enzimas de restricción
y después ligando los fragmentos entre sí. Los expertos habituales
en la técnica conocen bien los procedimientos para la digestión
mediante enzimas de restricción y el ligamiento.
El vector que contiene el polinucleótido
apropiado puede ser introducido en una célula huésped apropiada para
la propagación o expresión usando técnicas bien conocidas. Las
células bacterianas incluyen, pero sin limitación, E. coli,
Streptomyces, y Salmonella typhimurium. Las células
eucariotas incluyen, pero sin limitación, levadura, células de
insecto tales como Drosophila, células animales tales como
células COS y CHO, y células vegetales.
Tal y como se describe en el presente documento,
puede ser deseable expresar el polipéptido como una proteína de
fusión. En consecuencia, la invención proporciona vectores de fusión
que permiten la producción de los polipéptidos de fosfodiesterasa.
Los vectores de fusión pueden aumentar la expresión de una proteína
recombinante, aumentar la solubilidad de la proteína recombinante,
y ayudar en la purificación de la proteína actuando por ejemplo
como un ligando para la purificación por afinidad. Se puede
introducir un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto
de fusión de forma que el polipéptido deseado pueda separarse al
final del resto de fusión. Entre las enzimas proteolíticas se
incluyen, pero sin limitación, el factor Xa, trombina, y
enteroquinasa. Entre los vectores de expresión de fusión típicos se
incluyen pGEX (Smith y col. (1988) Gene
67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly,
MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutatión
S-transferasa (GST), proteína de unión de maltosa
E, o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana.
Entre los ejemplos de vectores de expresión de E. coli
inducibles que no son de fusión adecuados se incluyen pTrc (Amann y
col. (1988) Gene 69:301-315) y pET 11d
(Studier y col. (1990) Gene Expression Technology: Methods in
Enzymology 185:60-89).
La expresión de la proteína recombinante puede
maximizarse en una bacteria huésped proporcionando un fondo
genético en el que la célula huésped tenga una capacidad alterada
para escindir proteolíticamente la proteína recombinante
(Gottesman, S. (1990) Gene Expression Technology: Methods in
Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California
119-128). De manera alternativa, la secuencia del
polinucleótido de interés se puede alterar para proporcionar un uso
de codón preferencial para una célula huésped específica, por
ejemplo E. coli (Wada y col. (1992) Nucleic Acids Res.
20:2111-2118).
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa se pueden
expresar también mediante vectores de expresión que son funcionales
en levaduras. Entre los ejemplos de vectores para la expresión en
levaduras por ejemplo, S. cerevisiae se incluyen pYepSec1
(Baldari y col. (1987) EMBO J. 6:229-234),
pMFa (Kurjan y col. (1982) Cell 30:933-943),
pJRY88 (Schultz y col. (1987) Gene
54:113-123), y pYES2 (Invitrogen Corporation,
San Diego, CA).
Los polinucleótidos de fosfodiesterasa se pueden
expresar también en células de insecto usando, por ejemplo,
vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus
disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto
cultivadas (por ejemplo, células Sf9) incluyen las series pAc (Smith
y col. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y
las series pVL (Lucklow y col. (1989) Virology
170:31-39).
En ciertas realizaciones de la invención, los
polinucleótidos descritos en el presente documento se expresan en
células de mamífero usando vectores de expresión de mamífero. Entre
los ejemplos de vectores de expresión de mamífero se incluyen pCDM8
(Seed, B. (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman y col.
(1987) EMBO J. 6:187-195).
Los vectores de expresión enumerados en el
presente documento se proporcionan solamente a modo de ejemplo de
los vectores bien conocidos disponibles para los expertos habituales
en la técnica que serían útiles para expresar los polinucleótidos
de fosfodiesterasa. El experto habitual en la técnica estaría al
tanto de otros vectores adecuados para el mantenimiento de la
propagación o expresión de los polinucleótidos descritos en el
presente documento. Éstos se encuentran por ejemplo en Sambrook y
col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual segunda
edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
La invención también abarca vectores en los
cuales las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente
documento están clonadas en el vector en orientación inversa, pero
unidas de forma funcional a una secuencia reguladora que permite la
transcripción del ARN de sentido contrario. De esta forma, se puede
producir un tránscrito de sentido contrario a todas, o a una parte,
de las secuencias de polinucleótidos descritas en el presente
documento, incluyendo tanto a las regiones codificantes como a las
regiones no codificantes. La expresión de este ARN de sentido
contrario está sujeta a cada uno de los parámetros descritos
anteriormente en relación a la expresión del ARN de polaridad
positiva (secuencias reguladoras, expresión constitutiva o
inducible, expresión específica de tejido).
La invención también se refiere a células
huésped recombinantes que contienen los vectores descritos en el
presente documento. Las células huésped incluyen por lo tanto
células procariotas, células eucariotas inferiores tales como
levadura, otras células eucariotas tales como células de insecto, y
células eucariotas superiores tales como células de mamífero.
Las células huésped recombinantes se preparan
mediante la introducción de las construcciones de vectores descritas
en el presente documento en las células mediante técnicas
fácilmente disponibles para el experto habitual en la técnica.
Éstas incluyen, pero sin limitación, transfección por fosfato de
calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano,
transfección mediada por lípido catiónico, electroporación,
transducción, infección, lipofección, y otras técnicas tales como
aquellas encontradas en Sambrook y col. (Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY).
Las células huésped pueden contener más de un
vector. De esta manera, se pueden introducir diferentes secuencias
de nucleótidos en diferentes vectores de la misma célula. De manera
similar, los polinucleótidos de fosfodiesterasa se pueden
introducir o bien en solitario o con otros polinucleótidos que no
están relacionados con los polinucleótidos de fosfodiesterasa tales
como aquellos que proporcionan factores de actuación en trans para
vectores de expresión. Cuando se introduce más de un vector en una
célula, los vectores se pueden introducir de manera independiente,
se pueden introducir conjuntamente o se pueden unir al vector
polinucleótido de fosfodiesterasa.
En el caso de vectores virales y de
bacteriófago, éstos se pueden introducir en células en forma de
virus envasado o encapsulado mediante procedimientos convencionales
para infección y transducción. Los vectores virales pueden ser
competentes respecto a la replicación o defectuosos respecto a la
replicación. En el caso en el que la replicación viral sea
defectuosa, la replicación tendrá lugar en células huésped que
proporcionen funciones que complementen los defectos.
Los vectores incluyen generalmente marcadores de
selección que permiten la selección de la subpoblación de células
que contienen las construcciones de vectores recombinantes. El
marcador puede estar contenido en el mismo vector que contiene los
polinucleótidos descritos en el presente documento o puede estar en
un vector distinto. Los marcadores incluyen genes de resistencia a
ampicilina o tetraciclina para células huésped procariotas y de
resistencia a neomicina o dihidrofolato reductasa para células
huésped eucariotas. Sin embargo, será eficaz cualquier marcador que
proporcione selección para un rasgo fenotípico.
Aunque las proteínas maduras se pueden producir
en bacterias, levaduras, células de mamífero, y otras células bajo
el control de las secuencias reguladoras apropiadas, se pueden usar
también sistemas de transcripción y traducción libres de células
para producir estas proteínas usando ARN derivado de las
construcciones de ADN descritas en el presente documento.
Cuando se desea la secreción del polipéptido, se
incorporan señales de secreción apropiadas en el vector. La
secuencia señal puede ser endógena a los polipéptidos de
fosfodiesterasa o heteróloga a estos polipéptidos.
Cuando el polipéptido no se secreta en el medio,
la proteína puede aislarse de la célula huésped mediante
procedimientos de alteración convencionales, incluyendo congelación
descongelación, sonicación, alteración mecánica, uso de agente de
lisis y similares. El polipéptido puede posteriormente recuperarse y
purificarse mediante procedimientos de purificación bien conocidos
incluyendo precipitación por sulfato amónico, extracción ácida,
cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en
fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba,
cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxilapatita,
cromatografía en lectina, o cromatografía líquida de alta
resolución.
Se entiende también que dependiendo de la célula
huésped en la producción recombinante de los polipéptidos descritos
en el presente documento, los polipéptidos pueden tener diversos
patrones de glicosilación, dependiendo de la célula, o pueden estar
no glicosilados como se da cuando se producen en bacterias. Además,
los polipéptidos pueden incluir una metionina modificada inicial en
algunos casos como resultado de un proceso mediado por el
huésped.
Se entiende que "células huésped" y
"células huésped recombinantes" se refieren no sólo a la célula
objeto en particular sino también a la progenie o a la progenie
potencial de dicha célula. Como pueden tener lugar ciertas
modificaciones en las generaciones posteriores debido a o bien la
mutación o a influencias del entorno, dicha progenie, de hecho,
puede no ser idéntica a la célula precursora, pero aún así está
incluida dentro del alcance del término tal y como se usa en el
presente documento.
Las células huésped que expresan los
polipéptidos descritos en el presente documento, y en particular las
células huésped recombinantes, presentan una variedad de usos. En
primer lugar, las células son útiles para la producción de
proteínas o polipéptidos de fosfodiesterasa que se pueden purificar
adicionalmente para producir cantidades deseadas de proteína o
fragmentos de fosfodiesterasa. De esta forma, las células huésped
que contienen vectores de expresión son útiles para la producción
de polipéptidos.
Las células huésped son también útiles para
llevar a cabo ensayos basados en células que implican a la
fosfodiesterasa o a fragmentos de la fosfodiesterasa. De esta
forma, una célula huésped recombinante que expresa una
fosfodiesterasa nativa es útil para ensayar compuestos que
estimulan o inhiben la función de la fosfodiesterasa. Esto incluye
la unión a AMPc, la expresión del gen a nivel de transcripción o
traducción, la interacción con la proteína quinasa A, y componentes
de la ruta de transducción de señal.
Las células huésped son útiles también para
identificar mutantes de fosfodiesterasa en los cuales estas
funciones están afectadas. Si los mutantes se dan de forma natural
y dan lugar a una patología, las células huésped que contienen las
mutaciones son útiles para ensayar compuestos que tengan un efecto
deseado sobre la fosfodiesterasa mutante (por ejemplo, estimulando
o inhibiendo la función) que pueden no estar indicados por su efecto
sobre la fosfodiesterasa nativa.
Las células huésped recombinantes son también
útiles para expresar los polipéptidos quiméricos descritos en el
presente documento para evaluar compuestos que activan o suprimen la
activación por medio de un dominio heterólogo, segmento, sitio, y
similar, tal y como se describe en el presente documento.
Además, se pueden diseñar fosfodiesterasas
mutantes en las cuales una o más de las diversas funciones se
modifica por medio de ingeniería genética para ser aumentada o
disminuida (por ejemplo, unión a AMPc o unión a quinasa A) y se
usan para aumentar o reemplazar las proteínas de fosfodiesterasa en
un individuo. De esta manera, las células huésped pueden
proporcionar un beneficio terapéutico reemplazando una
fosfodiesterasa aberrante o proporcionando una fosfodiesterasa
aberrante que proporcione un resultado terapéutico. En una
realización, las células proporcionan fosfodiesterasas que son
anormalmente activas.
En otra realización, las células proporcionan
fosfodiesterasas que son anormalmente inactivas. Estas
fosfodiesterasas pueden competir con fosfodiesterasas endógenas en
el individuo.
En otra realización, las células que expresan
fosfodiesterasas que no pueden ser activadas, se introducen en un
individuo con el fin de competir con fosfodiesterasas endógenas por
el AMPc. Por ejemplo, en el caso en el cual AMPc excesivo es parte
de una modalidad de tratamiento, puede ser necesario inactivar esta
molécula en un punto específico del tratamiento. Podría ser
beneficioso proporcionar células que compitan por la molécula pero
que no puedan verse afectadas por la activación de la
fosfodiesterasa.
Se pueden producir también células huésped
recombinantes de manera homóloga que permitan la alteración in
situ de secuencias de polinucleótidos de fosfodiesterasa
endógenas en un genoma de célula huésped. Esta tecnología se
describe con mayor detenimiento en los documentos WO 93/09222, WO
91/12650 y U.S. 5.641.670, En resumen, se permite que secuencias de
polinucleótidos específicas que corresponden a los polinucleótidos
de fosfodiesterasa o a secuencias proximales o distales a un gen de
fosfodiesterasa se integren en un genoma de célula huésped mediante
recombinación homóloga donde la expresión del gen puede verse
afectada. En una realización, se introducen secuencias reguladoras
que o bien aumentan o bien disminuyen la expresión de una secuencia
endógena. En consecuencia, una proteína de fosfodiesterasa puede
producirse en una célula que normalmente no la produce, o la
expresión aumentada de la proteína de fosfodiesterasa puede dar como
resultado una célula que normalmente produce la proteína a un nivel
específico. Como alternativa, se puede eliminar el gen entero.
Además, se pueden introducir mutaciones específicas en cualquier
región deseada del gen para producir proteínas de fosfodiesterasa
mutantes. Dichas mutaciones podrían introducirse, por ejemplo, en
las regiones específicas descritas en el presente documento.
En una realización, la célula huésped puede ser
un oocito fertilizado o célula madre embriónica que se puede usar
para producir un animal transgénico que contiene el gen de la
fosfodiesterasa alterado. Como alternativa, la célula huésped puede
ser una célula madre u otro precursor tisular temprano que dé lugar
a un subconjunto específico de células y se pueda usar para
producir tejidos transgénicos en un animal. Véase también Thomas y
col., Cell 51:503 (1987) para una descripción de vectores de
recombinación homóloga. El vector se introduce en una línea de
célula madre embriónica (por ejemplo, mediante electroporación) y se
seleccionan las células en las que el gen introducido se ha
recombinado de manera homóloga con el gen de la fosfodiesterasa
endógeno (véase por ejemplo, Li, E. y col. (1992) Cell
69:915). Las células seleccionadas se inyectan posteriormente
en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón) para formar
quimeras de agregación (véase por ejemplo, Bradley, A. en
Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical
Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) pags.
113-152). Un embrión quimérico puede implantarse
posteriormente en un animal adoptivo hembra pseudopreñado adecuado
y llevar a término el embrión. La progenie que alberga el ADN
recombinado de manera homóloga en sus células madre se puede usar
para criar animales en los cuales todas las células del animal
contengan el ADN recombinado de manera homóloga mediante transmisión
de la línea germinal del transgen. Los procedimientos para
construir vectores de recombinación homóloga y animales
recombinantes homólogos se describen de manera adicional en
Bradley, A. (1991) Current Opinion in Biotechnology
2:823-829 y en las Publicaciones
Internacionales PCT n^{os} WO 90/11354; WO 91/01140; y WO
93/04169.
Las células huésped modificadas por ingeniería
genética se pueden usar para producir animales transgénicos no
humanos. Un animal transgénico es de forma preferible un mamífero,
por ejemplo un roedor, tal como una rata o un ratón, en el cual una
o más de las células del animal incluyen un transgen. Un transgen es
ADN exógeno que está integrado en el genoma de una célula a partir
del cual se desarrolla un animal transgénico y que permanece en el
genoma del animal maduro en uno o más tipos celulares o tejidos del
animal transgénico. Estos animales son útiles para estudiar la
función de una proteína de fosfodiesterasa y para identificar y
evaluar moduladores de la actividad de la proteína de
fosfodiesterasa.
Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen
primates no humanos, ovejas, perros, vacas, gatos, pollos, y
anfibios.
En una realización, una célula huésped es un
oocito fertilizado o una célula madre embriónica en los cuales se
han introducido secuencias de polinucleótidos de
fosfodiesterasa.
Un animal transgénico se puede producir
introduciendo ácido nucleico en el pronúcleo macho de un oocito
fertilizado, por ejemplo, mediante microinyección, infección
retroviral, y permitiendo que el oocito se desarrolle en un animal
adoptivo hembra pseudopreñado. Cualquiera de las secuencias de
nucleótidos de fosfodiesterasa se puede introducir como un transgen
en el genoma de un animal no humano, tal como un ratón.
Cualquiera de las secuencias reguladoras u otras
secuencias útiles en vectores de expresión pueden formar parte de
la secuencia transgénica. Esto incluye secuencias intrónicas y
señales de poliadenilación, si no están ya incluidas. Una (s)
secuencia (s) reguladora (s) específica (s) de tejido puede (n)
estar ligada (s) de forma funcional al transgen para dirigir la
expresión de la proteína de fosfodiesterasa a células
particulares.
Los procedimientos para generar animales
transgénicos mediante manipulación y microinyección de embriones,
en particular animales tales como ratones, han llegado a ser
convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las
patentes de EE.UU. n^{os} 4.736.866 y 4.870.009, ambas de Leder y
col., patente de EE.UU. nº 4.873.191 de Wagner y col. y en Hogan,
B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Se usan
procedimientos similares para la producción de otros animales
transgénicos. Un animal fundador transgénico se puede identificar en
base a la presencia del transgen en su genoma y/o a la expresión
del ARNm transgénico en tejidos o células de animales. Un animal
fundador transgénico puede usarse posteriormente para engendrar
animales adicionales que porten el transgen. Además, los animales
transgénicos que portan un transgen pueden además cruzarse con otros
animales transgénicos que portan otros transgenes. Un animal
transgénico también incluye animales en los cuales el animal entero
o tejidos en el animal han sido producidos usando las células
huésped recombinantes de manera homóloga descritas en el presente
documento.
En otra realización, se pueden producir animales
no humanos transgénicos que contienen sistemas seleccionados, que
permiten la expresión regulada del transgen. Un ejemplo de dicho
sistema es el sistema cre/loxP recombinasa del bacteriófago P1.
Para una descripción del sistema cre/loxP recombinasa, véase, por
ejemplo, Lakso y col. (1992) PNAS
89:6232-6236. Otro ejemplo de un sistema
recombinasa es el sistema de FLP recombinasa de S.
cerevisiae (O'Gorman y col. (1991) Science
251:1351-1355). Si un sistema cre/loxP
recombinasa se usa para regular la expresión del transgen, se
requieren animales que contengan transgenes que codifiquen tanto la
recombinasa Cre como una proteína seleccionada. Dichos animales
pueden proporcionarse a través de la construcción de animales
transgénicos "dobles", por ejemplo, apareando dos animales
transgénicos, uno conteniendo un transgen que codifica una proteína
seleccionada y el otro conteniendo un transgen que codifica una
recombinasa.
Se pueden producir también clones de los
animales transgénicos no humanos descritos en la presente memoria
de acuerdo con los procedimientos descritos en Wilmut y col. (1997)
Nature 385:810-813 y en las Publicaciones
Internacionales PCT n^{os} WO 97/07668 y WO 97/07669. En resumen,
una célula, por ejemplo, una célula somática, de un animal
transgénico se puede aislar e inducir su salida del ciclo de
crecimiento y su entrada en la fase G_{o}. La célula quiescente
puede posteriormente fusionarse, por ejemplo, a través del uso de
pulsos eléctricos, a un oocito enucleado de un animal de la misma
especie a partir del cual se aísla la célula quiescente. El oocito
reconstruido se cultiva después de forma que se desarrolle hasta la
mórula o blastocito y después se transfiera a un animal adoptivo
hembra pseudopreñado. La descendencia nacida de este animal adoptivo
hembra será un clon del animal a partir del cual se aísla la
célula, por ejemplo, la célula somática.
Los animales transgénicos que contienen células
recombinantes que expresan los polipéptidos descritos en el
presente documento son útiles para llevar a cabo los ensayos
descritos en el presente documento en un contexto in vivo.
En consecuencia, los diversos factores fisiológicos que están
presentes in vivo y que podrían afectar a la unión al AMPc,
la activación de la fosfodiesterasa, y la transducción de señal,
pueden no ser evidentes a partir de ensayos in vitro libres
de células o basados en células.
En consecuencia, resulta útil proporcionar
animales transgénicos no humanos para ensayar la función de la
fosfodiesterasa in vivo, incluyendo la interacción con el
AMPc, el efecto de fosfodiesterasas mutantes específicas sobre la
función de la fosfodiesterasa y sobre la interacción con el AMPc, y
el efecto de fosfodiesterasas quiméricas. También es posible
evaluar el efecto de mutaciones nulas, es decir mutaciones que
eliminan sustancialmente o completamente una o más funciones de la
fosfodiesterasa.
Pueden incorporarse las moléculas de ácido
nucleico de fosfodiesterasa, proteína (tal como un bucle
extracelular), moduladores de la proteína, y anticuerpos (también
denominados en el presente documento "compuestos activos") en
composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un
sujeto, por ejemplo, un ser humano. Dichas composiciones
típicamente comprenden la molécula de ácido nucleico, la proteína,
el modulador, o el anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
El término "administrar" se usa en su
sentido más amplio e incluye cualquier procedimiento de introducción
de las composiciones de la presente invención en un sujeto. Esto
incluye la producción de polipéptidos o polinucléotidos in
vivo como mediante la transcripción o traducción, in
vivo, de polinucleótidos que han sido introducidos de forma
exógena en un sujeto. De esta forma, dentro del término
"administrar" quedan abarcados polipéptidos o ácidos nucleicos
producidos en el sujeto a partir de las composiciones exógenas.
Tal y como se usa en el presente documento la
expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende
incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión,
revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes
isotónicos y agentes que retardan la absorción, y similares,
compatibles con la administración farmacéutica. En la técnica se
conoce bien el uso de dichos medios y agentes para sustancias
farmacéuticamente activas. Excepto en el caso en que cualquier
medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto
activo, dichos medios se pueden usar en las composiciones de la
invención. Se pueden incorporar también compuestos activos
suplementarios en las composiciones.
Una composición farmacéutica de la invención se
formula para que sea compatible con su vía de administración
pretendida. Entre los ejemplos de vías de administración se incluyen
administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica,
subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica),
transmucosal, y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para
aplicación parenteral, intradérmica, o subcutánea pueden incluir
los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para
inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles,
glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes
antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos;
antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico;
agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético;
tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el
ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH
puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o
hidróxido sódico. La preparación parenteral puede estar incluida en
ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiple hechos de
vidrio o de plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
el uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando
sean solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la
preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables
estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos
adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua
bacteriostática, Cremophor EL^{TM} (BASF, Parsippany, NJ) o
solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la
composición debe ser estéril y debe ser fluida de forma que sea
fácil la administración mediante jeringa. Deber ser estable en las
condiciones de preparación y almacenamiento y debe conservarse
frente a la acción contaminante de microorganismos tales como
bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de
dispersión conteniendo, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por
ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y
similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada
se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento
tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de
partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de
tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se
puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y
antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido
ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible
incluir agentes isotónicos en la composición, por ejemplo, azúcares,
polialcoholes tales como manitol y sorbitol, y cloruro sódico. La
absorción prolongada de las composiciones inyectables puede
llevarse a cabo incluyendo en la composición un agente que retarda
la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y
gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se pueden
preparar incorporando el compuesto activo (por ejemplo, una
proteína de fosfodiesterasa o un anticuerpo
anti-fosfodiesterasa) en la cantidad requerida en un
disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes
enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de la
esterilización por filtración. En general, las dispersiones se
preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril
que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes
requeridos a partir de aquellos enumerados anteriormente. En el
caso de polvos estériles para la preparación de soluciones
inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación
son secado al vacío y liofilización que proporciona un polvo del
ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a
partir de una solución previamente esterilizada por filtración de
los mismos.
Las composiciones orales incluyen generalmente
un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden estar
incluidas en cápsulas de gelatina o prensadas en forma de
comprimidos. Para la administración oral, el agente puede estar
contenido en formas entéricas para sobrevivir en el estómago o
revestido o mezclado adicionalmente para ser liberado en una región
particular del tracto gastrointestinal mediante procedimientos
conocidos. Para los fines de administración terapéutica oral, el
compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en la
forma de comprimidos, trociscos, o cápsulas. Las composiciones
orales pueden también prepararse usando un vehículo fluido para su
uso como un colutorio bucal, en el que el compuesto en el vehículo
fluido se aplica oralmente y se enjuaga y se escupe o se traga. Los
agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles, y/o materiales
adyuvantes pueden incluirse como parte de la composición. Los
comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos, y similares pueden
contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de
una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa
microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como
almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico,
Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de
magnesio o Sterotes; un agente deslizante tal como dióxido de
silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o
sacarina; o un agente aromatizante tal como pipermin, salicilato de
metilo, o aromatizante de naranja.
Para la administración por inhalación, los
compuestos se suministran en la forma de una pulverización de
aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado, que contiene
un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de
carbono, o un nebulizador.
La administración sistémica puede también ser
por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración
transmucosal o transdérmica, se usan en la formulación agentes de
penetración apropiados para la barrera a penetrar. Dichos
penetrantes se conocen generalmente en la técnica, e incluyen, por
ejemplo, para la administración transmucosal, detergentes, sales
biliares, y derivados del ácido fusídico. La administración
transmucosal se puede llevar a cabo mediante el uso de
pulverizadores nasales o supositorios. Para la administración
transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos,
pomadas, geles, o cremas tal y como se conoce generalmente en la
técnica.
Los compuestos se pueden preparar también en la
forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio
convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o
enemas de retención para la administración rectal.
En una realización, los compuestos activos se
preparan con vehículos que protegerán al compuesto frente a la
eliminación rápida desde el cuerpo, tal como una formulación de
liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de
administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros
biodegradables y biocompatibles, tales como etilen vinil acetato,
polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y
ácido poliláctico. Los procedimientos para la preparación de dichas
formulaciones serán evidentes para aquellos expertos en la técnica.
Los materiales se pueden obtener también en el mercado en Alza
Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También se pueden usar
suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos hacia
células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos
virales) como vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstas se
pueden preparar de acuerdo con procedimientos conocidos para los
expertos en la técnica, por ejemplo, tal y como se describe en la
patente de EE.UU. nº 4.522.811.
Es especialmente ventajoso formular
composiciones orales o parenterales en forma de dosificación
unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la
dosificación. "Forma de dosificación unitaria" tal y como se
usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente
discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a
tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de
compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico
deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Las
especificaciones para las formas de dosificación unitarias de la
invención están dictadas por y dependen directamente de las
características exclusivas del compuesto activo y del efecto
terapéutico particular a conseguir, y las limitaciones inherentes
en la técnica de formar compuestos tal como un compuesto activo para
el tratamiento de individuos.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención
se pueden insertar en vectores y se pueden usar como vectores para
terapia génica. Los vectores para la terapia génica pueden
suministrarse a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección
intravenosa, administración local (U.S. 5.328.470) o mediante
inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Chen y col. (1994)
PNAS 91:3054-3057). La preparación
farmacéutica del vector para terapia génica puede incluir el vector
para terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender
una matriz de liberación lenta en la cual está embebido el vehículo
de administración génica. De forma alternativa, cuando el vector de
administración génica completo se puede producir intacto a partir de
células recombinantes, por ejemplo vectores retrovirales, la
preparación farmacéutica puede incluir una o más células que
producen el sistema de administración de genes.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar
incluidas en un recipiente, paquete, o dispensador junto con
instrucciones para la administración.
<110> Robison, Keith E.
\hskip1cmKapeller-Libermann, Rosana
\hskip1cmWhite, David
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Una nueva nucleótido cíclico
fosfodiesterasa humana
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<130>
5800-28-1
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<160> 40
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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
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<210> 1
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<211> 502
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2201
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS (secuencia codificante)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (224)...(1729)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3336
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature (característica
miscelánea)
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(3336)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 279
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia consenso para la Familia 7
de 3',5'-nucleótido cíclico fosfodiesterasa a
partir de la base de datos Prosite
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia consenso para la Familia 7
de 3',5'-nucleótido cíclico fosfodiesterasa a partir
de la base de datos Prosite
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr Ser Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Met Ser Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Ser Thr Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gly Ser Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Trp Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Gly Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Gly Pro Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Lys Ser Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Pro Leu Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Val Leu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Leu Ser Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gly Pro Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Glu Ser Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Val Cys Glu Glu Phe Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Val Leu Pro Ser Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Arg Pro Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ile Leu Asp Asn Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Leu Ala Ala Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Ser Gly Ser Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Gly Arg Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Ser Thr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Met Ser val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Trp Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Gly Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Gly Pro Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Lys Ser Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Pro Leu Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Val Leu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Val Leu Pro Ser Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Arg Pro Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ile Leu Asp Asn Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Leu Ala Ala Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Gly Arg Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Asp Xaa Xaa His Xaa Xaa}
Claims (17)
1. Una molécula de ácido nucleico aislada
seleccionada del grupo constituido por:
a) una molécula de ácido nucleico que comprende
la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID nº: 2 o 4;
b) una molécula de ácido nucleico que comprende
el inserto de ADNc del plásmido depositado con ATCC como número de
depósito de patente PTA-1644, o complementos de la
misma,
c) una molécula de ácido nucleico que codifica
un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC. ID
nº: 1 o 3, o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto
de ADNc del plásmido depositado con ATCC como número de depósito de
patente PTA-1644.
2. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1 que comprende además secuencias de ácido nucleico
vector.
3. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1 que comprende además secuencias de ácido nucleico
que codifican un polipéptido heterólogo.
4. Una célula huésped que contiene la molécula
de ácido nucleico de la reivindicación 1, excepto células madre
embriónicas humanas y células germinales humanas.
5. La célula huésped de la reivindicación 4 que
es una célula huésped de mamífero.
6. Una célula huésped de mamífero no humano que
contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.
7. Un polipéptido aislado seleccionado entre el
grupo constituido por:
a) un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos de la SEC. ID nº: 1 o 3, o una secuencia de aminoácidos
codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado con ATCC
como número de depósito de patente PTA-1644;
b) un polipéptido que está codificado por una
molécula de ácido nucleico tal y como se define por la SEC. ID nº:
2 o 4.
8. El polipéptido de la reivindicación 7 que
comprende además secuencias de aminoácidos heterólogas.
9. Un procedimiento para producir un polipéptido
tal y como se define por la reivindicación 7 u 8.
10. Un procedimiento para detectar la presencia
de un polipéptido de la reivindicación 7 en una muestra, que
comprende:
a) poner en contacto la muestra con un
anticuerpo que se une de manera selectiva a un polipéptido de la
reivindicación 7; y
b) determinar si el compuesto se une al
polipéptido en la muestra.
11. Un procedimiento para detectar la presencia
de una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 en una
muestra, que comprende las etapas de:
a) poner en contacto la muestra con un cebador o
una sonda de ácido nucleico que se hibrida de manera selectiva a la
molécula de ácido nucleico; y
b) determinar si el cebador o sonda de ácido
nucleico se une a una molécula de ácido nucleico en la muestra.
12. El procedimiento de la reivindicación 11 en
el que la muestra comprende moléculas de ARNm y se pone en contacto
con una sonda de ácido nucleico.
13. Un procedimiento para identificar un
compuesto que se une a un polipéptido de la reivindicación 7 que
comprende las etapas de:
a) poner en contacto un polipéptido, o una
célula que expresa un polipéptido de la reivindicación 7 con un
compuesto de ensayo; y
b) determinar si el polipéptido se une al
compuesto de ensayo.
\newpage
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que la unión del compuesto de ensayo con el polipéptido se
detecta mediante un procedimiento seleccionado entre el grupo
constituido por:
a) detección de la unión mediante la detección
directa de la unión del compuesto de ensayo/polipéptido;
b) detección de la unión usando un ensayo de
unión por competición.
15. Un procedimiento para identificar un
compuesto que modula la actividad de un polipéptido de la
reivindicación 7, que comprende:
a) poner en contacto un polipéptido de la
reivindicación 7 con un compuesto de ensayo; y
b) determinar el efecto del compuesto de ensayo
sobre la actividad del polipéptido para identificar de este modo un
compuesto que modula la actividad del polipéptido.
16. Un procedimiento para identificar un agente
que modula el nivel de expresión de una molécula de ácido nucleico
de la reivindicación 1 en una célula, comprendiendo dicho
procedimiento poner en contacto dicho agente con la célula que
expresa dicha molécula de ácido nucleico de forma que dicho nivel de
expresión de dicha molécula de ácido nucleico pueda estar modulado
en dicha célula mediante dicho agente y medir dicho nivel de
expresión de dicha molécula de ácido nucleico.
17. Una composición farmacéutica que contiene
cualquiera de los polipéptidos de la reivindicación 7 en un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
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