JP2003502046A - 新規ヒト環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、哺乳類ホスホジエステラーゼスーパーファミリーに属する新たに同定されたヒト環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼに関する。本発明はまた、ホスホジエステラーゼをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、ホスホジエステラーゼ媒介性疾患またはホスホジエステラーゼ関連疾患の診断および治療の標的としてホスホジエステラーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用する方法に関する。本発明はさらに、診断および治療のためのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためにホスホジエステラーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用する薬物スクリーニング方法に関する。本発明はさらに、ホスホジエステラーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドに基づいたアゴニストおよびアンタゴニストを含む。本発明はさらに、ホスホジエステラーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドを作製するための手法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 技術分野 本発明は、哺乳類ホスホジエステラーゼのスーパーファミリーに属する新たに
同定された環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼに関する。本発明はまた、ホ
スホジエステラーゼをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、
ホスホジエステラーゼ媒介性疾患またはホスホジエステラーゼ関連疾患の診断お
よび治療の標的としてホスホジエステラーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドを使用する方法に関する。本発明はさらに、診断および治療のためのアゴニス
トおよびアンタゴニストを同定するためにホスホジエステラーゼポリペプチドお
よびポリヌクレオチドを使用する薬物スクリーニング方法に関する。本発明はさ
らに、ホスホジエステラーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドに基づいたア
ゴニストおよびアンタゴニストを含む。本発明はさらに、ホスホジエステラーゼ
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを作製するための方法に関する。

【０００２】 背景技術 環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼは、プリン環状ヌクレオチド基質に対
する特異性を示し、環状AMP(cAMP)および環状GMP(cGMP) 加水分解を触媒する(Th
ompson W. J. (1991) Pharma. Ther. 51:13-33)。環状ヌクレオチドホスホジエ
ステラーゼは、cAMPおよびcGMPの定常状態レベルを調節し、環状ヌクレオチドシ
グナルの大きさおよび長さを調節する。少なくとも8種の異なるが、相同の遺伝
子ファミリーが哺乳類の組織に存在することが現在知られている。ほとんどのフ
ァミリーは別個の遺伝子を含有し、その多くは、機能的に独自の別のスプライシ
ング種として異なる組織において発現される。(Beavo(1995) Physiolosical Rev
iews 75: 725-748および米国特許第5,798,246号）。

【０００３】 全ての環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼは、酵素の触媒部位であると考
えられるタンパク質のCOOH末端側の半分に約270の保存されたアミノ酸のコアを
含有する。配列HDXXHXXの保存されたモチーフは、これまでに単離されている全
ての環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの触媒部位において同定されている
。各ファミリーの環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼは、約65％のアミノ酸
相同性を示し、異なるファミリー間で比較すると、類似性は40％未満に低下し、
類似性のほとんどが触媒部位に生じている。

【０００４】 ほとんどの環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ遺伝子は、その遺伝子から
転写され選択的スプライシングを受ける2つ以上のmRNAを有し、多くの場合、選
択的スプライシングは、組織特異性が高いと思われ、異なる環状ヌクレオチドホ
スホジエステラーゼの選択的発現の機構となる（Beavo上記）。細胞種特異的発
現は、アイソザイムが異なると細胞種特異的特性も異なる可能性があることを示
唆している。

【０００５】 1型環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼは、Ca²⁺/カルモジュリン依存性で
あり、3種の異なる遺伝子を含有し、その各々は少なくとも2つの異なるスプライ
シング種を有すると考えられ、肺、心臓および脳において見出されている。カル
モジュリン依存的ホスホジエステラーゼにはインビトロにおいてリン酸化/脱リ
ン酸化事象によって調節されるものもある。リン酸化の影響はカルモジュリンに
対する酵素の親和性を低下することであり、これによりホスホジエステラーゼ活
性が低下し、それによってcAMPの定常状態レベルを増加する。2型環状ヌクレオ
チドホスホジエステラーゼはcGMP刺激性で、脳に局在化しており、カテコールア
ミン分泌に対するcAMPの影響を仲介すると考えられている。3型環状ヌクレオチ
ドホスホジエステラーゼは、cGMP阻害性であり、基質としてのcAMPに対する高い
特異性を有し、血管平滑筋に存在する主要なホスホジエステラーゼアイソザイム
の1つであり、心機能に対する役割を有する。3型のアイソザイムは1種以上のイ
ンスリン依存性キナーゼによって調節される。4型環状ヌクレオチドホスホジエ
ステラーゼは、ほとんどの炎症細胞における主要なイソ酵素であり、このメンバ
ーの中にはcAMP依存性リン酸化によって活性化されるものもある。5型環状ヌク
レオチドホスホジエステラーゼは、従来、cGMP機能の調節因子と考えられていた
が、cAMP機能にも影響を与えることがある。高レベルの5型環状ヌクレオチドホ
スホジエステラーゼはほとんどの平滑筋調製物、血小板および腎臓において見出
される。6型環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼファミリーメンバーは、視
覚に対して何らかの役割を果たし、光線およびcGMPによって調節される。7型環
状ヌクレオチドホスホジエステラーゼファミリーのメンバーは、骨格筋において
高濃度に見出される。環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼファミリー1〜7、
それらの局在化および生理学的役割は、Beavo、上記に掲載されている。8型ファ
ミリーは、米国特許第5,798,246号に報告されている。

【０００６】 免疫および炎症応答の多数の機能は、cAMPの細胞内レベルを増加する薬剤によ
って阻害される(Verghese(1995)Mol. Pharmacol. 47: 1164-1171)が、cGMPの代
謝は平滑筋、肺および脳細胞機能に関与する（Thompson W. (1991)Pharma. Ther
. 51: 13-33)。種々の疾患が環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の増加
に起因しており、環状ヌクレオチドレベルが低下する。例えば、マウスにおける
尿崩病(diabetes insipidus)はホスホジエステラーゼファミリー4活性の増加に
関連があり、低K_mcAMPホスホジエステラーゼ活性の増加がアトピー患者の白血球
内で報告されている。環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの欠損も網膜疾患
に関連している。rdマウスにおける網膜変性、ヒト常染色体劣性色素性網膜炎お
よびアイリッシュセッター犬の円柱体/錐状体異形成は、ファミリー6ホスホジエ
ステラーゼ、遺伝子Bの突然変異に起因するとされている。ファミリー3ホスホジ
エステラーゼは心疾患に関連するとされている。

【０００７】 異なる環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの多数の阻害剤が同定されてお
り、いくつかは臨床評価を受けている。例えば、ファミリー3ホスホジエステラ
ーゼ阻害剤は、抗血栓薬として、抗高血圧薬としておよびうっ血性心不全の治療
に有用な強心薬として開発されている。ファミリー4ホスホジエステラーゼ阻害
剤であるロリプラム(Rolipram)は、抑うつの治療に有用であるとされており、フ
ァミリー4ホスホジエステラーゼの他の阻害剤は抗炎症剤として評価を受けてい
る。ロリプラム(Rolipram)は、インビトロにおいてHIV-1複製を増強することが
知られているリポ多糖(LPS)誘導性TNF-αを阻害することも示されている。従っ
て、ロリプラム(Rolipram)はHIV-1複製を阻害する可能性がある(Angel et al.(1
995)AIDS 9: 1137-44)。また、TNF-αおよびβ並びにインターフェロンγの産生
を抑制する能力に基づいて、ロリプラム(Rolipram)は、脳脊髄炎、多発性硬化症
の実験動物モデルの治療有効であることが示されており(Sommer et al.(1995)Na
t. Med. 1: 244-248)、遅発性運動障害の治療に有効である可能性がある(Sasaki
et al.(1995) Eur. J. Pharmacol. 282:72-76)。

【０００８】 気管支喘息および他の呼吸器疾患の治療に使用されるテオフィリン並びに間欠
跛行および糖尿病性抹消血管疾患の治療に使用されるペントキシフィリンなどの
非特異的ホスホジエステラーゼ阻害剤もある。テオフィリンは、呼吸器疾患を治
療する際に、気道平滑筋機能並びに抗炎症または免疫調節能力に対して作用する
と考えられており(Banner et al(1995)Eur. Respir. J 8: 996-1000)、その場合
には、テオフィリンは、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼcAMPおよびcGMP
加水分解を阻害することによって作用すると考えられている(Banner et al.(199
5)Monaldi Arch. Chest Dis. 50: 286-292)。TNF-α産生を阻害することも知ら
れているペントキシフィリンは、HIV-1複製を阻害する可能性がある(Angel et a
l.上記）。環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤の一覧は、Beavo上記
に掲載されている。

【０００９】 環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼはまた、種々の細胞種の細胞増殖に影
響を与えることが報告されており、種々の癌の治療に適応されている。Bang et
al.(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA91: 5330-5334)は、前立腺癌細胞系統DU1
45およびLNCaPが、cAMP誘導体およびホスホジエステラーゼ阻害剤の送達によっ
て増殖阻害されることを報告しており、表現型の上皮からニューロン形態への永
久的な転換を観察し、Matousovic et al.((1995) J. Clin. Invest. 96: 401-41
0)は、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼアイソザイム阻害剤が糸球体間質
細胞の増殖を調節する可能性を有することを示唆しており、Joulain et al((199
5) J. Medat. Cell Signal 11: 63-79)は、環状ヌクレオチドホスホジエステラ
ーゼがリンパ球増殖のコントロールに関与する重要な標的であると示されたこと
を報告しており、Deonarain et al.((1994) Brit. J. Cancer 70 786-94)は、ホ
スホジエステラーゼを特定の細胞コンパートメントに細胞内送達して細胞死を生
ずることに関与する癌治療の主要標的方法を示唆している。

【００１０】 従って、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼは、薬物の作用および開発の
主要な標的である。従って、これまで未知であったホスホジエステラーゼを同定
し、特徴づけることは薬剤開発分野にとって有用である。本発明は、これまで同
定されていなかったヒト環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼを提供すること
によって当分野の状況を進歩させる。

【００１１】 発明の開示 本発明の目的は、新規環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼを同定すること
である。

【００１２】 本発明のさらに別の目的は、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ媒介性疾
患または関連疾患の治療および診断に適用可能なホスホジエステラーゼアッセイ
の試薬または標的として有用である新規環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ
ポリペプチドを提供することである。

【００１３】 本発明のさらに別の目的は、ホスホジエステラーゼ媒介性疾患または関連疾患
の治療および診断に適用可能なホスホジエステラーゼアッセイの標的および試薬
として有用であり、組換え方法によって新規ホスホジエステラーゼポリペプチド
を作製するのに有用である新規ホスホジエステラーゼポリペプチドに対応するポ
リヌクレオチドを提供することである。

【００１４】 本発明の具体的な目的は、アゴニストおよびアンタゴニストとして作用し、新
規ホスホジエステラーゼの発現を調節する化合物を同定することである。

【００１５】 本発明のさらに別の具体的な目的は、ホスホジエステラーゼ関連疾患を治療お
よび診断するためにホスホジエステラーゼの発現を調節する化合物を提供するこ
とである。

【００１６】 従って、本発明は、新規ヒト環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの同定に
基づいている。本発明は、長鎖型および短鎖型ホスホジエステラーゼを含む。長
鎖型のアミノ酸配列は配列番号1に示し、短鎖型のアミノ酸配列は配列番号3に示
す。長鎖型のヌクレオチド配列は配列番号2またはAmerican Type Culture Colle
ction, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USに2000年4月5日
にATCC番号PTA-1644として寄託されたcDNA（「寄託cDNA」)によってコードされ
るアミノ酸配列として示し短鎖型のヌクレオチド配列は配列番号4として示す。

【００１７】 本発明は、配列番号1または配列番号3に示すアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドを含む、単離ホスホジエステラーゼポリペプチドを提供する。

【００１８】 本発明はまた、配列番号2または配列番号4、または寄託cDNAに示す配列を有す
る単離ホスホジエステラーゼ核酸分子を提供する。

【００１９】 本発明はまた、配列番号1または配列番号3、または寄託cDNAによってコードさ
れるアミノ酸配列と実質的に相同なアミノ酸配列を有する変異ポリペプチドを提
供する。

【００２０】 本発明はまた、配列番号2または配列番号4または寄託cDNAに示すヌクレオチド
配列に実質的に相同である変異核酸配列を提供する。

【００２１】 本発明はまた、配列番号1または配列番号3に示すポリペプチドの断片および配
列番号2または配列番号4に示すヌクレオチド配列、並びにポリペプチドまたは核
酸の実質的に相同な断片を提供する。

【００２２】 本発明はさらに、本明細書に記載する核酸を含む核酸構築物をさらに提供する
。好ましい実施態様において、本発明の核酸は調節配列に作動可能に結合する。

【００２３】 本発明は、ホスホジエステラーゼ核酸分子およびポリペプチドを発現するため
のベクターおよび宿主細胞を提供し、特には組換えベクターおよび宿主細胞を提
供する。

【００２４】 本発明はまた、ベクターおよび宿主細胞を作製する方法と、それらを使用して
ホスホジエステラーゼ核酸分子およびポリペプチドを作製する方法とを提供する
。

【００２５】 本発明はまた、ホスホジエステラーゼポリペプチドおよび断片に選択的に結合
する抗体または抗原結合断片を提供する。

【００２６】 本発明はまた、ホスホジエステラーゼポリペプチドまたは核酸（RNAまたはDNA
）の発現または活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。

【００２７】 本発明はまた、ホスホジエステラーゼポリペプチドまたは核酸発現または活性
を調節する、特にはスクリーニングした化合物を使用する方法を提供する。ホス
ホジエステラーゼポリペプチドまたは核酸の異常な活性または発現を治療するた
めに調節を使用することができる。

【００２８】 本発明はまた、生物試料中のホスホジエステラーゼポリペプチドまたは核酸分
子の活性または有無を測定する、疾患の診断のためを含むアッセイを提供する。

【００２９】 本発明はまた、ポリペプチドまたは核酸分子の突然変異の存在を測定する、疾
患の診断を含む、アッセイを提供する。

【００３０】 よりさらに別の実施態様において、本発明は、本発明の核酸およびポリペプチ
ドのヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列をそれぞれ含有するコンピュ
ータ読み取り可能な手段を提供する。

【００３１】 発明の詳細な説明 本明細書中で使用される「シグナリング経路」は、受容体にリガンドが結合す
る結果の細胞機能/活性の調節（例えば、刺激または阻害）をいう。このような
機能の例には、例えば、ホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート(PIP ₂ )、イノシトール1,4,5-トリホスフェート(IP₃)およびアデニル酸シクラーゼの
ような信号伝達経路に関与する細胞内分子の移動、血漿膜の分極、分子の産生ま
たは分泌、細胞成分の構造の変化、例えば、DNAの合成のような細胞増殖、細胞
遊走、細胞分化および細胞生存が含まれる。

【００３２】 応答は細胞の種類によって左右される。ある細胞では、受容体に対するリガン
ドの結合は、ホスファチジルイノシトールまたは環状AMPの代謝およびターンオ
ーバーにより、化合物の放出、チャネルの通門(gating)、細胞接着、遊走、分化
等などの作用を刺激する場合があるが、他の細胞では、結合は異なる結果を生ず
る。

【００３３】 シグナリング経路はcDNAターンオーバー経路である。本明細書中で使用される
「環状AMPのターンオーバーおよび代謝」は、cAMPのターンオーバーおよび代謝
に関与する分子並びにこれらの分子の活動をいう。環状AMPは、ある種の受容体
のリガンド誘導性刺激に応答して生ずる二次メッセンジャーである。cAMPシグナ
リング経路では、リガンドの結合により、cAMPの合成を触媒する酵素アデニルシ
クラーゼを活性化することができる。新たに合成されたcAMPは次いでcAMP依存性
プロテインキナーゼを活性化することができる。この活性化されたキナーゼは、
電圧ゲート型カリウムチャネルタンパク質または関連タンパク質をリン酸化し、
活動電位が作用している間にカリウムチャネルを開かせない。カリウムチャネル
が開かないことにより、通常ニューロン膜を再分極するカリウムの細胞外への流
出が減少し、膜の脱分極が長期化する。

【００３４】ポリペプチド 本発明は、新規環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの発見に基づいている
。具体的には、発現配列タグ(expressed sequence tag; EST)は、ホスホジエス
テラーゼ配列との相同性に基づいて選択される。このESTを使用して、それが含
有する配列に基づいてプライマーを設計し、またESTを使用して腎臓および副腎c
DNAライブラリーからcDNAを同定した。陽性クローンを配列決定し、重複する断
片を集成した。集成した配列の分析により、クローニングしたcDNA分子が環状ヌ
クレオチドホスホジエステラーゼをコードすることが明らかになった。先端が切
断された形態(trancated form)の酵素をコードする核酸はまた造骨細胞cDNAライ
ブラリーからも単離された。

【００３５】 従って、本発明は、図1または図6に示す推定アミノ酸配列（配列番号1または
配列番号3）を有する新規ホスホジエステラーゼに関する。

【００３６】 寄託は、微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約(the Budapest Tr
eaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms)
に準拠して管理される。寄託は当業者にとって便利なものとして提供され、寄託
は35U.S.C.§112に基づいて必要とされる許可ではない。寄託された配列並びに
その配列によってコードされるポリペプチドは、参照することにより本明細書に
組み入れられており、配列決定エラーなどのどのような矛盾の場合にも本願の説
明を用いて調整する。

【００３７】 「ホスホジエステラーゼポリペプチド」または「ホスホジエステラーゼタンパ
ク質」は、配列番号1または配列番号3のポリペプチドをいう。しかし、「ホスホ
ジエステラーゼタンパク質」または「ホスホジエステラーゼポリペプチド」とい
う用語は、さらに本明細書に記載する数多くの変異体並びに全長のホスホジエス
テラーゼおよび変異体から誘導される断片を含む。

【００３８】 ホスホジエステラーゼが見出される組織および/または細胞には、心臓（胎児
を含む）、卵巣、脳、膵臓、腎臓、乳房、肝臓、精巣、前立腺、骨格筋および造
骨細胞が含まれるが、それらに限定されない。また、ホスホジエステラーゼは、
うっ血性心不全および乳癌に関与する組織を含むが、それらに限定されない疾患
組織において発現される。発現はノーザンブロット分析によって確認され、また
、造骨細胞では、インサイチューハイブリダイゼーションによって確認されてい
る。

【００３９】 従って、本発明は単離または精製されたホスホジエステラーゼポリペプチド並
びにそれらの変異体および断片を提供する。

【００４０】 ホスホジエステラーゼは、残基265〜271に触媒識別特性(catalytic signature
)、すなわち、HDVDHPGを含む。配列は、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ
内にHXXDHXX、すなわちコンセンサスアミノ酸配列を含む。

【００４１】 BLAST検索に基づいて、ファミリー7との最も高い相同性が示された。長鎖型を
B2と命名し、短鎖型はB1と命名した。

【００４２】 本明細書中で使用される、ポリペプチドは、それが組換えおよび非組換え細胞
から単離されるとき、細胞材料を実質的に含有しない場合、または化学的に合成
されるとき、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含有しない場合に「
単離」または「精製」されているといわれる。しかし、ポリペプチドは通常では
細胞内で結合しない別のポリペプチドと結合させられることがああり、この場合
でも、「単離」または「精製」されていると考えられる。

【００４３】 ホスホジエステラーゼポリペプチドは均一になるまで精製することができる。
しかし、ポリペプチドが均一まで精製されていない調製物も有用であり、単離さ
れた形態のポリペプチドを含有すると考えられる。重要な特徴は、大量の他の成
分の存在下でも調製物がポリペプチドの望ましい機能を発揮することができると
いうことである。従って、本発明は種々の程度の純度を含む。

【００４４】 一実施態様において、「実質的に細胞物質を含有しない」という用語は、約30
％（乾燥重量％)未満の他のタンパク質（すなわち、混入タンパク質）、約20％
未満の他のタンパク質、約10％未満の他のタンパク質または約5％未満の他のタ
ンパク質を有するホスホジエステラーゼの調製物を含む。ポリペプチドが組換え
技法により作製される場合には、ポリペプチドは実質的に培養培地も含有しない
ことが可能であり、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の約20％未満、約
10％未満または約5％未満である。

【００４５】 ホスホジエステラーゼポリペプチドはまた、膜調製物の一部である場合、また
は精製され、次いで膜小胞もしくはリポソームと共に再構成される場合にも単離
されていると考えられる。

【００４６】 「実質的に化学的前駆体または他の化学物質を含有しない」という用語は、そ
の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されているホスホジ
エステラーゼポリペプチドの調製物を含む。一実施態様において、「実質的に化
学的前駆体または他の化学物質を含有しない」という用語は、約30％（乾燥重量
％)未満の化学的前駆体もしくは他の化学物質、約20％未満の化学的前駆体もし
くは他の化学物質、約10％未満の化学的前駆体もしくは他の化学物質、または約
5％未満の化学的前駆体もしくは他の化学物質を有するポリペプチドの調製物を
含む。

【００４７】 一実施態様において、ホスホジエステラーゼポリペプチドは配列番号1または
配列番号3に示すアミノ酸を含む。しかし、本発明はまた配列変異体を含む。変
異体は、生物の同じ遺伝子座によってコードされる実質的に相同なタンパク質、
すなわち、対立遺伝子変異体を含む。ホスホジエステラーゼは、隣接マーカーAF
MA074ZG9(2.6cR)およびAFM214ZF6(7.9cR)を用いてヒト第6染色体（6q21〜q23.2
）にマッピングされている。この遺伝子座に近接した突然変異には、以下が含ま
れるが、それらに限定されない。PPAC、関節障害、小児の進行性偽リウマチ様疾
患、ODDD、眼歯指異形成、異種細胞性遺伝子性高胎児性ヘモクロビン血症、DFNA
10、聴覚消失症、常染色体優性非症候性（nonsyndromic)難聴10、CMD1F、心筋症
、拡張型、1Fおよび真性糖尿病、一過性新生児性。マウスでは、この遺伝子座は
以下と関連している：gl、グレイ(grey)-致死的、dl、ダウンレス（downless）
、Cat5、優性白内障5、Lwq3、肝臓重量QTL 3、mshi、雄性不妊症および組織不適
合性、Mop2、モルヒネ嗜好性2、H60、組織適合性60、Daq4、方向性非対称(direc
tional asymmetry) QTL 4、Daq5、方向性非対称(directional asymmetry) QTL 5
およびkd/腎臓疾患。この遺伝子座に近接する遺伝子には、PDNP1(ホスホジエス
テラーゼ1/ヌクレオチドピロホスファターゼ1(マウスLy-41抗原と相同））、MAC
S、PTPRK、ARG1、PCMT1、DFNA10、MEKK5、CTGF、SGK、HIVEP2、CMD1F、EPB41L2
、HPFH、UTRN、IFNGR1およびESR1が含まれる。

【００４８】 変異体はまた、生物の他の遺伝子座から誘導されるが、配列番号1または配列
番号3と実質的な相同性を有するタンパク質、すなわち、オーソロガス(ortholog
)を含む。変異体はまた、化学合成によって作製されるホスホジエステラーゼと
実質的に相同なタンパク質を含む。変異体はまた、組換え方法によって作製され
るホスホジエステラーゼと実質的に相同なタンパク質を含む。しかし、変異体は
本発明の以前に開示されているいかなるアミノ酸配列も含まないことが理解され
る。

【００４９】 本明細書中で使用される、2つのタンパク質（またはタンパク質の領域）は、
アミノ酸配列が少なくとも約70〜75％、典型的には、少なくとも約80〜85％、最
も典型的には、約90〜95％以上相同である場合には実質的に相同である。本発明
による実質的に相同なアミノ酸配列は、以下にさらに詳細に記載されているスト
リンジェントな条件下において、配列番号2または配列番号4に示す配列の核酸配
列またはその一部とハイブリダイゼーションする核酸配列によってコードされる
。

【００５０】 2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の同一率を求めるために、最適な比較
を実施できるように配列を並べる（例えば、最適に並べるために1番目および2番
目のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを組み入れることがあ
り、比較のために非相同配列を無視することができる）。好ましい実施態様にお
いて、比較のために配列する基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも30
％、好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくとも50％、よりさらに
好ましくは少なくとも60％、よりさらに好ましくは少なくとも70％、80％または
90％である（例えば、502アミノ酸残基を有する本明細書のアミノ酸配列に対し
て第2の配列を並べる場合には、少なくとも165、好ましくは少なくとも200、さ
らに好ましくは少なくとも250、よりさらに好ましくは少なくとも300、よりさら
に好ましくは少なくとも350、400、450および500アミノ酸残基を並べる）。次い
で、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレ
オチドを比較する。第1の配列の位置が第2の配列の対応する位置と同じアミノ酸
残基またはヌクレオチドによって占められている場合には、分子はその位置が同
一である（本明細書中で使用されるアミノ酸または核酸「同一性」はアミノ酸ま
たは核酸「相同性」と等価である）。

【００５１】 本発明はまた、低い程度の同一性を有するが、ホスホジエステラーゼによって
実施されるものと同じ機能の1つ以上を実施するのに十分な類似性を有するポリ
ペプチドを含む。類似性は保存されたアミノ酸置換によって決定される。このよ
うな置換は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を同様の特徴の別のアミノ酸によ
って置換されたものである。保存的置換は表現型的にサイレントであると思われ
る。脂肪族アミノ酸Ala、Val、LeuおよびIle間の1対1置換、ヒドロキシル残基Se
rおよびThrの交換、酸性残基AspおよびGluの交換、アミド残基AsnおよびGlnの置
換、塩基性残基LysおよびArgの交換並びに芳香族残基Phe、Tyrの置換は典型的に
は、保存的置換と考えられる。どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントであ
るかに関するガイダンスはBowie et al., Science 247: 1306-1310(1990)に見ら
れる。

【００５２】

【表１】

【００５３】 配列の比較および2つの配列間の同一性および類似性の割合の測定は、数学的
アルゴリズムを使用して実施することができる(Computational Molecular Biolo
gy, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomput
ing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press,
New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.
M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence
Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and
Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockt
on Press, New York, 1991)。

【００５４】 このような数学的アルゴリズムの好ましいが、限定的でない例はKarlin et al
.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877に記載されている。Altsch
ul et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されているように、
このようなアルゴリズムをNBLASTおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0)に組
み入れる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを使用するとき、それぞれのプ
ログラム（例えば、NBLAST）のデフォルトパラメーターを使用することができる
。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照。一実施態様において、配列比較のパラ
メーターはスコアー=100、ワード長=12に設定してもよく、または変更してもよ
い（例えば、W=5またはW=20）。

【００５５】 好ましい実施態様において、2つのアミノ酸配列間の同一性の割合は、Needlem
an et al. (1970)(J. Mol. Biol. 48: 444-453)アルゴリズムをGCGソフトウェア
ーパッケージのGAPプログラム（http://www.gcg.comで入手可能）に組み入れて
使用し、BLOSUM 62マトリックスまたはPAM250マトリックスおよびギャップ重み1
6、14、12、10、8、6または4および長さ重み1、2、3、4、5または6を使用して求
められる。さらに別の好ましい実施態様において、2つのヌクレオチド配列間の
同一性の割合は、GCGソフトウェアーパッケージのGAPプログラム(Devereux et a
l.(1984) Nucleic Acids Res. 12(1): 387)(http://www.gcg.comで入手可能）を
使用し、NWSgapdna.CMPマトリックスおよびギャップ重み40、50、60、70または8
0および長さ重み1、2、3、4、5または6を使用して求められる。

【００５６】 配列の比較に使用される別の好ましい限定的でない数学的アルゴリズムはMyer
s and Millerのアルゴリズム、CABIOS(1989)である。このようなアルゴリズムを
、CGC配列整列ソフトウェアーパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージ
ョン2.0)に組み入れる。アミノ酸配列を比較するためのALIGNプログラムを使用
する場合には、PAM120重みづけ残基表（weight residue table)、ギャップ長さ
ペナルティ12およびギャップペナルティ4を使用することができる。配列分析の
別のアルゴリズムは当技術上周知であり、Torellis et al.(1994)Comput. Appl.
Biosci. 10:3-5に記載されているADVANCEおよびADAM並びにPerson et al.(1988
) PNA 85: 2444-8に記載されているFASTAを含む。

【００５７】 変異体ポリペプチドはアミノ酸配列が1つ以上の置換、欠損、挿入、転移（inv
ersions)、融合および切断またはこれらのいずれかの組合せによって異なること
がある。

【００５８】 変異体ポリペプチドは機能が完全であっても、1つ以上の活性の機能を欠損し
ていてもよい。従って、本発明の場合には、変異が、例えば、保存された触媒領
域に対応する領域、カルボキシ末端調節領域、アミノ末端調節領域、アミノ末端
標的領域、膜結合に関与する領域、酵素活性化に関与する領域、例えば、リン酸
化および他の環状ヌクレオチド（例えば、AMP、GMP)依存的信号伝達経路の成分
との相互作用に関与する領域の1つ以上の機能に影響を与えることがある。

【００５９】 機能が完全な変異体は、典型的には、保存的変異のみまたは重要でない残基も
しくは重要でない領域の変異を含有する。機能を有する変異体も、機能が変化し
ないまたは大きな変化を生じない保存的アミノ酸の置換を含有する。または、こ
のような置換は機能に正または負にある程度影響を与えることがある。

【００６０】 機能のない変異体は、典型的には、非保存的アミノ酸置換、欠失、挿入、転移
(inversions)もしくは切断または重要な残基もしくは重量な領域の置換、挿入、
転移(inversions)もしくは欠損の1つ以上を含有する。

【００６１】 示すように、変異体は、天然型であってもまたはホスホジエステラーゼポリペ
プチドの有用で新規な特徴を提供するための組換え手段もしくは化学的合成によ
って作製されてもよい。これは、タンパク質の凝集を防止することによって、製
剤が免疫原性を持たないようにすることを含む。

【００６２】 有用な変異体はさらに触媒活性の変更を含む。例えば、一実施態様は、cAMPに
結合するが、加水分解しないかまたは緩徐に加水分解する結合部位の変更に関係
する。同じ部位のさらに別の有用な変更によりcAMPに対する親和性が変更される
。有用な変更はまた、別の環状ヌクレオチドに対する親和性を提供する変化を含
む。別の有用な変更は、プロテインキナーゼによる活性化を防ぐものを含む。別
の有用な変更は、1つ以上の領域またはサブ領域が、別のホスホジエステラーゼ
イソフォームまたはファミリーの1つ以上の領域またはサブ領域に機能的に融合
する融合タンパク質を提供する。

【００６３】 機能に必須のアミノ酸は、部位特異的突然変異またはアラニンスキャニング突
然変異などの、当技術上周知の方法によって同定することができる(Cunningham
et al.(1985)Science 244: 1081-1085)。後者の手法は、分子の全ての残基に1つ
のアラニン突然変異を導入する。次いで、得られた突然変異分子を、インビトロ
におけるcAMP加水分解または増殖活性などのcAMP依存性インビトロ活性などの生
物活性について試験する。cAMPまたはプロテインキナーゼA結合に重要な部位も
、結晶化、核磁気共鳴または光学的親和性標識などの構造分析によって求めるこ
とができる(Smith et al. (1992) J. Mol. Biol. 224: 899-904; de Vos et al.
(1992) Science 225: 306-312）。

【００６４】 実質的な相同性は核酸もしくはアミノ酸配列全体またはこれらの配列の断片で
あってもよい。

【００６５】 従って、本発明はホスホジエステラーゼのポリペプチド断片も含む。断片は、
配列番号1または配列番号3に示すアミノ酸配列から誘導することができる。しか
し、本発明はまた、本明細書に記載するホスホジエステラーゼの変異体の断片も
含む。

【００６６】 しかし、本発明が関係する断片は、本発明の以前に開示されている可能性のあ
る断片を含むものとして構成されるべきではない。

【００６７】 従って、断片は少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50以上連続す
るアミノ酸を含んでもよい。断片は、cAMPに結合するもしくはcAMPを加水分解す
る能力のようなタンパク質の生物活性の1つ以上を保持してもよく、同様に断片
はホスホジエステラーゼ抗体を形成するための免疫原として使用することができ
る。

【００６８】 生物学的に活性な断片（例えば、鎖長が5、7、10、12、15、20、30、35、36、
37、38、39、40、50、100以上のアミノ酸であるペプチド）は、例えば、触媒部
位、ホスホジエステラーゼ識別特性(signature)およびグリコシル化部位、cAMP
およびcGMP依存的プロテインキナーゼリン酸化、プロテインキナーゼCリン酸化
、カゼインキナーゼIIリン酸化、チロシンキナーゼリン酸化、N-ミリストイル化
、アミド化並びにグリコサミノグリカン結合のような領域またはモチーフを含ん
でもよい。さらに考えられる断片は、HDXXHXXを含む触媒部位または領域、アロ
ステリック結合部位、細胞および細胞下標的に重要な部位、他のcAMP依存的信号
伝達経路の成分と相互作用するのに機能的な部位並びにアミノ末端およびカルボ
キシ末端調節部位を含む。

【００６９】 このような領域またはモチーフは、通常のコンピュータ化相同性検索手法によ
って同定することができる。

【００７０】 断片は、例えば、5、10、15、20、30、40、50または100までのアミノ酸を含む
ように、機能的部位から一方向または両方向に延在することができる。さらに、
断片は上記の特定の領域のサブ断片を含むことがあり、サブ断片は、それらが誘
導される領域の機能を保持している。

【００７１】 これらの領域は、コンピュータ化相同性分析に関与する周知の方法によって同
定することができる。

【００７２】 本発明はまた免疫原性特性を有する断片を提供する。これらは、ホスホジエス
テラーゼおよび変異体のエピトープ形成部分を含有する。これらのエピトープ形
成ペプチドは、ホスホジエステラーゼポリペプチドまたは領域または断片に特異
的に結合する抗体を生ずるのに有用である。これらのペプチドは、少なくとも10
、12、少なくとも14または少なくとも約15〜約30アミノ酸を含有することができ
る。

【００７３】 抗体を形成するのに使用することができる抗原性ポリペプチドの限定的でない
例には、細胞外部位から誘導されるペプチドが含まれるが、それらに限定されな
い。高い抗原性指数を有する領域を図3および8に示す。しかし、細胞内ペプチド
領域を認識すると思われる細胞内形成される抗体（「intrabodies」）も含まれ
る。

【００７４】 エピトープ担持ホスホジエステラーゼポリペプチドは、任意の従来の手段によ
って作製することができる(Houghten, R. A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 82: 5131-5135)。同時多ペプチド合成は米国特許第4,631,211号に記載されて
いる。

【００７５】 断片は別個であっても（他のアミノ酸またはポリペプチドに融合していない）
またはより大きいポリペプチド内にあってもよい。さらに、いくつかの断片が1
つのより大きいポリペプチド内に含まれてもよい。一実施態様において、宿主内
で発現するように設計された断片は、ホスホジエステラーゼ断片のアミノ末端に
融合した異種プレポリペプチドおよびプロポリペプチド領域並びに断片のカルボ
キシル末端に融合した別の領域を含むことができる。

【００７６】 従って、本発明はキメラまたは融合タンパク質を提供する。これらは、ホスホ
ジエステラーゼと実質的に相同でないアミノ酸配列を有する異種ペプチドに機能
的に結合するホスホジエステラーゼペプチド配列を含む。「作動可能に結合する
」は、ホスホジエステラーゼペプチドと異種ペプチドがフレームを合わせて(in-
frame)融合していることを示す。異種ペプチドはホスホジエステラーゼのN末端
またはC末端に融合されても、または内部に配置されてもよい。

【００７７】 一実施態様において、融合タンパク質はホスホジエステラーゼ機能自体に影響
しない。例えば、融合タンパク質は、ホスホジエステラーゼ配列がGST配列のC末
端に融合しているGST融合タンパク質であってもよい。融合タンパク質の他の種
類には、酵素融合タンパク質、例えば、β-ガラクトシダーゼ融合物、酵母2-ハ
イブリッドGAL-4融合物、ポリHis融合物およびIg融合物が含まれるが、それらに
限定されない。このような融合タンパク質、特にポリHis融合物は組換えホスホ
ジエステラーゼの精製を容易にすることができる。ある種の宿主細胞（例えば、
哺乳類宿主細胞）では、タンパク質の発現および/または分泌は異種シグナル配
列を使用することによって増加することができる。従って、別の実施態様におい
て、融合タンパク質はN末端に異種シグナル配列を含有する。

【００７８】 欧州特許出願番号第EP-A-O-464 533号は、免疫グロブリン定常部の種々の部分
を含む融合タンパク質を開示している。Fcは治療および診断に有用であり、従っ
て薬物動力学的特性が改善される（欧州特許出願番号第EP-A-0232 262号）。薬
物の発見において、例えば、ヒトタンパク質が、アンタゴニストを同定するため
の高スループットスクリーニングアッセイのために、Fc部分と融合されている(B
ennett et al. (1995) J. Mol. Recog. 8: 52-58(1995) and Johanson et al. J
. Biol. Chem. 270:9459-9471)。従って、本発明はまた、ホスホジエステラーゼ
ポリペプチドおよび種々のサブクラス(IgG、IgM、IgA、IgE)の免疫グロブリンの
重鎖または軽鎖の定常部の種々の部分を含有する可溶性融合タンパク質も含む。
融合がヒンジ領域で生じているヒトIgG、特にIgG1の重鎖の不変部は免疫グロブ
リンとして好ましい。いくつかの用途のために、例えば、融合タンパク質を免疫
化のための抗原として使用する予定の場合には、融合タンパク質が意図された目
的に使用されてからFcを除去することが望ましい。特定の実施態様において、Fc
部は、組み込まれ、ファクターXaで切断することができる切断配列によって簡単
に除去することができる。

【００７９】 キメラまたは融合タンパク質は標準的な組換えDNA技法によって作製すること
ができる。例えば、異なるタンパク質配列をコードするDNA断片は従来の技法に
よりフレームを合わせて(in-frame)結合される。別の実施態様において、融合遺
伝子は、自動化DNA合成装置を含む従来の技法によって合成することができる。
または、遺伝子断片のPCR増幅は、2つの連続する遺伝子断片間に相補的なオーバ
ーハングを生じ、その後アニーリングされ、再度増幅されてキメラ遺伝子配列を
作製するアンカープライマーを使用して実施することができる(Ausbel et al.(1
992) Current Protocols in Molecular Biology)。さらに融合部分をすでにコー
ドしている多数の発現ベクターを購入することができる（例えば、GSTタンパク
質）。ホスホジエステラーゼをコードする核酸を、融合部分がホスホジエステラ
ーゼにフレームを合わせて(in-frame)結合するように、このような発現ベクター
にクローニングすることができる。

【００８０】 別の形態の融合タンパク質は、ホスホジエステラーゼ機能に直接影響するもの
である。従って、ホスホジエステラーゼ領域（またはその一部）の1つ以上が別
のファミリー7ホスホジエステラーゼまたは他のホスホジエステラーゼファミリ
ーの相同領域（またはその一部）によって置換されているホスホジエステラーゼ
ポリペプチドは本発明に含まれる。従って、種々の置換が可能である。例えば、
アミノ末端調節領域またはそのサブ領域を別のファミリー7イソフォームまたは
ホスホジエステラーゼファミリーの領域またはサブ領域で置換することができる
。さらに別の例として、触媒領域またはその一部を置換することができ、カルボ
キシ末端領域またはサブ領域を置換することができる。従って、天然の領域また
はサブ領域の1つ以上を別のもので置換したキメラホスホジエステラーゼを形成
することができる。

【００８１】 また、1つ以上の機能部位が、異なるファミリー7イソフォームまたは1〜6およ
び8などの別のホスホジエステラーゼファミリーから誘導されるキメラホスホジ
エステラーゼタンパク質を作製することができる。しかし、部位は、哺乳類ゲノ
ムに生じるが、まだ発見も特徴づけもされていないホスホジエステラーゼファミ
リーから誘導されることが理解される。このような部位には、触媒部位、アミノ
末端調節部位、カルボキシ末端調節部位、細胞下および細胞位置を標的化するの
に重要な部位、他の環状AMP依存的信号伝達経路の成分と相互作用するのに機能
的な部位、プロテインキナーゼAリン酸化部位、グリコシル化部位および本明細
書に開示されている他の機能的部位が含まれるが、それらに限定されない。

【００８２】 単離ホスホジエステラーゼは、中でも心臓（胎児を含む）、卵巣、脳、膵臓、
腎臓、乳房、肝臓、精巣、前立腺、骨格筋および造骨細胞などの天然にそれを発
現する細胞から精製され、特にそれを発現するように改変されている（組換え）
細胞から精製することができ、または既知のタンパク質合成方法を使用して合成
することができる。

【００８３】 一実施態様において、タンパク質は組換えDNA技法によって作製される。例え
ば、ホスホジエステラーゼポリペプチドをコードする核酸分子を発現ベクターに
クローニングし、この発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞内でタンパク
質が発現される。次いで、標準的な精製技法を使用した適当な精製スキームによ
ってタンパク質を細胞から単離することができる。

【００８４】 ペプチドは、20種類の天然型アミノ酸と通常呼ばれる20のアミノ酸以外のアミ
ノ酸を含有することがしばしばある。さらに、末端アミノ酸を含む多数のアミノ
酸はプロセシングおよび他の翻訳後修飾などの天然の過程によってまたは当技術
上周知の化学的修飾技法によって修飾することができる。ポリペプチドに天然に
生じる通常の修飾は基本的な教科書、詳細な研究論文および研究文献に記載され
ており、それらは当技術上周知である。

【００８５】 従って、ポリペプチドはまた、置換されたアミノ酸残基が遺伝子コードによっ
てコードされるものではない誘導体または類似物、置換基が含まれる誘導体また
は類似物、成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加する化合物（例え
ば、ポリエチレングリコール）などの別の化合物で融合される誘導体または類似
物、または別のアミノ酸が、リーダーもしくは分泌配列または成熟ポリペプチド
を精製するための配列またはプロタンパク質配列などの成熟ポリペプチドに融合
している誘導体または類似物も含む。

【００８６】 既知の修飾には、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビ
ンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の
共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共
有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、
シスチン形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グ
リコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化
、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化
、アルギニル化などのトランスファーRNA媒介性のタンパク質へのアミノ酸の付
加およびユビキチン化が含まれるが、それらに限定されない。

【００８７】 このような修飾は当業者に周知であり、科学文献にかなり詳細に記載されてい
る。いくつかの特に普通の修飾、例えば、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グ
ルタミン酸残基のγ-カルボキシル化、水酸化およびADP-リボシル化は、Protein
s-Structure and Molecular Properties, 2nd ed., T. E. Creighton, W. H. Fr
eeman and Company, New York(1993)などの最も基本的な教科書に記載されてい
る。Wold, F., Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C.
Johnson, Ed., Academic Press, New York 1-12(1983); Seifter et al. (1990
) Meth. Enzymol. 182: 626-646)およびRattan et al. (1992) Ann. N. Y. Acad
. Sci. 663: 48-62)などの、この主題に関する多数の詳細な総説が入手可能であ
る。

【００８８】 周知であるように、ポリペプチドは必ず全体が鎖状でなくてもよい。例えば、
ポリペプチドはユビキチン化の結果として分岐してもよく、一般に天然の処理事
象および天然には生じない人為的によって生じる事象を含む翻訳後事象の結果と
して分岐を含むまたは含まない環状であってもよい。環状、分岐および分岐環状
ポリペプチドは非翻訳天然過程および合成方法によって合成することができる。

【００８９】 修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端を含
む、ポリペプチドのいかなる箇所に生じてもよい。ポリペプチドのアミノ基もし
くはカルボキシル基またはその両方の共有結合的修飾によるブロックは天然型お
よび合成ポリペプチドにおいて普通である。大腸菌(E.coli)によって作製される
ポリペプチドのアミノ末端残基は、タンパク質分解過程を受ける前はほぼ常にN-
ホルミルメチオニンである。

【００９０】 修飾は、タンパク質がどのように作製されるかの関数である。組換えポリペプ
チドでは、例えば、修飾は宿主細胞翻訳後修飾能力およびポリペプチドアミノ酸
配列の修飾シグナルによって決定される。従って、グリコシル化が望ましい場合
には、ポリペプチドはグリコシル化宿主、一般に真核細胞において発現されるべ
きである。昆虫細胞は、しばしば哺乳類細胞と同じ翻訳後グリコシル化を実施し
、このため、昆虫細胞発現系は天然パターンのグリコシル化を有する哺乳類タン
パク質を効率的に発現するように開発されている。同様の考えを他の修飾に適用
する。

【００９１】 同じ型の修飾が、所定のポリペプチドのいくつかの部位において同じ程度また
は種々の程度で存在してもよい。また、所定のポリペプチドが2種以上の型の修
飾を含有してもよい。

【００９２】ポリペプチドの使用 本発明のタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連する
配列を同定するために、公共のデータベースに対して検索を実施するための「照
会配列(query sequence)」として使用することができる。このような検索は、Al
tschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10のNBLASTおよびXBLASTプログ
ラム（バージョン2.0)を使用して実施することができる。本発明の核酸分子と相
同なヌクレオチド配列を入手するために、NBLASTプログラム、スコアー=100、ワ
ード長さ=12を用いてBLASTヌクレオチド検索を実施することができる。BLASTタ
ンパク質検索は、本発明のタンパク質と相同なアミノ酸配列を得るためにXBLAST
プログラム、スコアー=50、ワード長さ=3を用いて実施することができる。比較
のためにギャップを入れた整列を得るために、Altschul et al. (1997) Nucleic
Acids Res. 25(17): 3389-3402に記載されているようにGapped BLASTを使用す
ることができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを使用する場合には、そ
れぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメーター
を使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.参照。

【００９３】 ホスホジエステラーゼポリペプチドは、ホスホジエステラーゼ、領域または断
片に特異的な抗体を作製するのに有用である。高い抗原性指数を有する領域を図
3および8に示す。

【００９４】 ホスホジエステラーゼポリペプチドは、特にファミリー7のホスホジエステラ
ーゼに関連する生物アッセイに有用である。このようなアッセイは、ホスホジエ
ステラーゼ関連状態の診断および治療に有用な既知のホスホジエステラーゼ機能
または活性または特性いずれかに関係する。

【００９５】 ホスホジエステラーゼポリペプチドは、細胞系システムまたは細胞不含システ
ムにおける薬物スクリーニングアッセイにも有用である。細胞系システムは天然
、すなわち、通常ホスホジエステラーゼを発現する生検試料としての細胞または
細胞培養において増殖される細胞であってもよい。しかし、一実施態様において
、細胞系アッセイはホスホジエステラーゼを発現する組換え宿主細胞に関係する
。

【００９６】 試験化合物がホスホジエステラーゼと相互作用する能力を判定することは、機
知の結合分子（例えば、cAMP）がポリペプチドに結合する能力と比較して、試験
化合物がポリペプチドに主に結合する能力を判定することも含んでもよい。

【００９７】 ポリペプチドは、ホスホジエステラーゼ活性を調節する化合物を同定するため
に使用することができる。このような化合物は、例えば、cAMPとの結合親和性ま
たは速度を増加または低下してもよく、ホスホジエステラーゼに対する結合に関
してcAMPと競合してもよく、またはホスホジエステラーゼに結合したcAMPと置換
してもよい。ホスホジエステラーゼと適当な変異体および断片を共に、ホスホジ
エステラーゼと結合する能力について候補化合物をアッセイする高スループット
スクリーニングに使用することができる。これらの化合物は、ホスホジエステラ
ーゼ活性に対する化合物の影響を判定するために、機能的ホスホジエステラーゼ
に対してさらにスクリーニングすることができる。ホスホジエステラーゼを望ま
しい程度活性化する（アゴニスト）または不活性化する（アンタゴニスト）化合
物を同定することができる。調節方法は、インビトロ（例えば、細胞を薬剤と共
に培養することによる）またはインビボ（例えば、薬剤を被検者に投与すること
による）において実施することができる。

【００９８】 ホスホジエステラーゼポリペプチドは、ホスホジエステラーゼタンパク質と、
通常ホスホジエステラーゼタンパク質と相互作用する標的分子との相互作用を刺
激するまたは阻害する能力について化合物をスクリーニングするために使用する
ことができる。標的は、ホスホジエステラーゼタンパク質が通常相互作用するシ
グナル経路の環状ヌクレオチドまたは別の成分（例えば、プロテインキナーゼA
またはcAMPターンオーバーに関与する他の相互作用因子）であってもよい。アッ
セイは、ホスホジエステラーゼタンパク質または断片に標的分子と相互作用させ
、ホスホジエステラーゼタンパク質と標的との複合体の形成を検出するまたはプ
ロテインキナーゼAリン酸化、cAMPターンオーバーおよび経路の生物学的エンド
ポイントなどの信号伝達の関連する影響のいずれかなどの、ホスホジエステラー
ゼと標的との相互作用の生化学的な結果を検出する条件下において、ホスホジエ
ステラーゼタンパク質と候補化合物を合わせるステップを含む。

【００９９】 ホスホジエステラーゼが標的分子と結合する能力を判定することはまた、実時
間2分子相互作用分析（Bimolecular Interaction Analysis(BIA)などの技術を使
用して実施することができる。Sjolander et al. (1991) Anal. Chem. 63: 2338
-2345およびSzabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705。本
明細書中で使用される「BIA」は、相互作用物質のどれも標識することなく実時
間で生物特異的な相互作用を検討するための技術である（例えば、登録商標BISc
ore）。光学的な現象の変化表面プラズモン共鳴(surface plasmon rezonance(SP
R))を、生物分子間の実時間反応の指標として使用することができる。

【０１００】 本発明の試験化合物は、生物的ライブラリー、空間処理式パラレル(spatially
addressable parallel)固相または液相ライブラリー、逆応答を必要とする合成
ライブラリー方法、「1-ビーズ1-化合物」ライブラリー方法および親和性クロマ
トグラフィー選択を使用した合成ライブラリー方法を含む当技術上周知のコンビ
ナトリアルライブラリー方法において数多く方法のいずれかを使用して得ること
ができる。生物的ライブラリー方法はポリペプチドライブラリーに限定されるが
、他の4種の方法はポリペプチド、非ポリペプチドオリゴマーまたは化合物の小
分子ライブラリーに適用可能である(Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des.
12: 145）。

【０１０１】 分子ライブラリーを合成するための方法の例は、例えば、De Witt et al. (19
93) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al.(1994) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37: 2678;
Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carell et al. (1994) Angew. Chem.
Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl
. 33: 2061;およびGallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233のように、
当技術上見出すことができる。化合物のライブラリーは溶液の形態（例えば、Ho
ughten(1992) Biotechniques 13: 412-421)、またはビーズ上(Lam (1991) Natur
e 354: 82-84)、チップ上(Fodor(1993) Nature 364: 555-556)、細菌(Ladner US
P 5,223,409)、胞子(Ladner USP '409)、プラスミド(Cull et al. (1992)Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869)またはファージ(Scott and Smith (1990)
Science249: 386-390);(Devlin (1990)Science 249: 404-406); (Cwirla et al.
(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6378-6382); (Felici (1991)J. Mol.
Biol. 222: 301-310); (Ladner上記）で存在してもよい。

【０１０２】 候補化合物には、例えば、1)Ig末端融合ペプチドおよびランダムペプチドライ
ブラリーのメンバー(例えば、Lam et al. (1991)Nature 354: 82-84; Houghten
et al. (1991)Nature 354: 84-86)並びにD-および/またはL-配置アミノ酸から作
製されるコンビナトリアル化学誘導性分子ライブラリーを含む、可溶性ペプチド
などのペプチド、2)ホスホペプチド（例えば、ランダムおよび部分的変性指向性
ホスホペプチドライブラリーのメンバー、例えば、Songyang et al. (1993)Cell
72: 767-778参照）、3)抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト
化、抗-イディオタイプ、キメラおよび1本鎖抗体並びに抗体のFab、F(ab')₂、Fa
b発現ライブラリー断片およびエピトープ結合断片）および4)小型の有機および
無機分子（例えば、コンビナトリアルおよび天然産物ライブラリーから入手され
る分子）が含まれる。

【０１０３】 1つの候補化合物は、cAMP結合に競合する可溶性の全長のホスホジエステラー
ゼまたは断片である。他の候補化合物には、突然変異ホスホジエステラーゼまた
はホスホジエステラーゼ機能に影響を与え、cAMPと競合する突然変異を含有する
適当な断片が含まれる。従って、例えば、より高い親和性でcAMPと競合する断片
またはcAMPに結合するがcAMPを分解しない断片は本発明に含まれる。

【０１０４】 本発明は、ホスホジエステラーゼ活性を調節（刺激または阻害）する化合物を
同定するための他のエンドポイントを提供する。アッセイは、典型的には、ホス
ホジエステラーゼ活性を示す信号伝達経路の事象のアッセイに関係する。従って
、ホスホジエステラーゼ依存的シグナルカスケードに応答してアップレギュレー
ションまたはダウンレギュレーションされる遺伝子の発現をアッセイすることが
できる。一実施態様において、このような遺伝子の調節領域は、ルシフェラーゼ
などの容易に検出可能なマーカーに機能的に結合することができる。または、ホ
スホジエステラーゼのリン酸化またはホスホジエステラーゼ標的が測定されても
よい。

【０１０５】 ホスホジエステラーゼによって媒介される生物学的または生化学的機能のいず
れかをエンドポイントアッセイとして使用することができる。これらには、これ
らのエンドポイントアッセイについて参照として組み入れられ、本明細書に引用
されている文献に記載されている生化学的または生化学的/生物学的事象の全て
および当業者に周知の他の機能が含まれる。

【０１０６】 ホスホジエステラーゼの場合には、特異的なエンドポイントにはcAMP加水分解
およびプロテインキナーゼA活性化の低下が含まれうる。

【０１０７】 結合および/または活性化化合物はまた、本明細書に開示されている1つ以上の
ドメイン、部位等またはそれらの一部が、他のファミリー7ホスホジエステラー
ゼまたは任意の他のホスホジエステラーゼファミリーのホスホジエステラーゼイ
ソフォームから誘導される異種相対物によって置換されてもよい。例えば、天然
のホスホジエステラーゼとは異なる環状ヌクレオチド特異性および/または親和
性で相互作用する触媒領域を使用することができる。従って、異なるセットの信
号伝達成分が活性化のエンドポイントアッセイとして利用可能である。または、
異種標的配列が天然の標的配列と交換することがある。これにより、細胞下また
は細胞内局在化が異なり、従って異なる信号伝達経路に対して影響を与えること
ができる。従って、異なるセットの信号伝達成分が活性化のエンドポイントアッ
セイとして利用可能である。さらに別の例として、エフェクタータンパク質によ
る修飾部位、例えば、プロテインキナーゼAによるリン酸化は、異なるエフェク
タータンパク質の部位で置換することができる。これはまた、エンドポイント決
定のための異なる信号伝達経路の用途を提供することになると思われる。活性化
はまた、天然の信号伝達経路の一部である転写調節配列に機能的に結合する容易
に検出可能なコード領域を含有するレポーター遺伝子によって検出することもで
きる。

【０１０８】 ホスホジエステラーゼポリペプチドはまた、ホスホジエステラーゼと相互作用
する化合物を発見するように設計された方法の競合結合アッセイにおいて有用で
ある。従って、化合物をポリペプチドに結合させるまたは結合以外の相互作用さ
せる条件下において、化合物をホスホジエステラーゼポリペプチドに暴露する。
可溶性ホスホジエステラーゼポリペプチドも混合物に添加される。試験化合物が
可溶性ホスホジエステラーゼポリペプチドと相互作用する場合には、試験化合物
は、ホスホジエステラーゼ標的から形成される複合体の量またはホスホジエステ
ラーゼ標的の活性を低下する。この種類のアッセイは、ホスホジエステラーゼの
特異的領域と相互作用する化合物を検索する場合に特に有用である。従って、標
的ホスホジエステラーゼ領域と競合する可溶性ポリペプチドは、関心のある領域
に対応するペプチド配列を含有するように設計される。

【０１０９】 別の種類の競合結合アッセイは、特異的な機能部位と相互作用する化合物を発
見するために使用することができる。一例として、プロテインキナーゼAおよび
候補化合物をホスホジエステラーゼの試料に添加することができる。プロテイン
キナーゼAと同じ部位でホスホジエステラーゼと相互作用する化合物は、ホスホ
ジエステラーゼとプロテインキナーゼAとで形成される複合体の量を低下する。
従って、ホスホジエステラーゼとプロテインキナーゼAとの相互作用を特異的に
妨害する化合物を発見することが可能になる。別の例は、候補化合物をホスホジ
エステラーゼおよびcAMPの試料に添加することに関係する。cAMPと競合する化合
物は加水分解の量またはcAMPのホスホジエステラーゼとの結合を低下する。従っ
て、ホスホジエステラーゼと直接相互作用し、cAMPと競合する化合物を発見する
ことができる。このようなアッセイは、ホスホジエステラーゼと相互作用する任
意の他の成分に関係してもよい。

【０１１０】 細胞不含薬物スクリーニングアッセイを実施するためには、タンパク質の一方
または両方の複合体でない形態からの複合体の分離を容易にするため、並びにア
ッセイの自動化に対応するために、ホスホジエステラーゼもしくは断片またはそ
の標的分子を固定することが望ましい。

【０１１１】 タンパク質を基質に固定する技法を薬物スクリーニングアッセイに使用するこ
とができる。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ/ホスホジエステラー
ゼ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, St. Lou
is, MO)またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレートに吸着させ、次い
で細胞溶解物（例えば、³⁵S-標識化）および候補化合物と合わせ、複合体形成に
いたる条件下（例えば、塩およびpHの生理的条件）で混合物をインキュベーショ
ンすることができる。インキュベーション後、ビーズを洗浄して、全ての未結合
標識を除去し、基質を固定し、放射能を直接または複合体を解離後の上清中で測
定する。または、複合体を基質から解離し、SDS-PAGEによって分離し、標準的な
電気泳動技法を使用して、ビーズ分画中に見出されるホスホジエステラーゼ結合
タンパク質のレベルをゲルから定量する。例えば、当技術上周知の技法を使用し
てビオチンおよびストレプトアビジンの結合を使用してポリペプチドまたはその
標的分子を固定することができる。または、タンパク質と反応性であるが、タン
パク質の標的分子への結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導化し、抗
体結合によってタンパク質をウェルに捕獲することができる。cAMPおよびプロテ
インキナーゼAなどのホスホジエステラーゼ結合標的成分と候補化合物の調製物
をホスホジエステラーゼが存在するウェル内でインキュベーションし、ウェルに
捕獲される複合体の量を定量することができる。GST固定化複合体について上記
したもの以外にこのような複合体を検出するための方法には、ホスホジエステラ
ーゼ標的分子と反応性である、またはホスホジエステラーゼに反応性で、標的分
子と競合する抗体を使用した複合体の免疫検出並びに標的分子と関連する酵素活
性を検出することを使用する酵素結合アッセイが含まれる。

【０１１２】 これらの薬物スクリーニングアッセイにより同定されるホスホジエステラーゼ
活性の調節物質を使用して、心臓、卵巣、脳、膵臓、腎臓、乳房、肝臓、精巣、
前立腺、骨格筋および骨などの造骨細胞含有組織などの、ホスホジエステラーゼ
を発現する細胞を治療することによって、ホスホジエステラーゼ経路が媒介する
疾患を有する被検者を治療することができる。これらの治療方法は、製薬学的組
成物中のホスホジエステラーゼ活性の調節物質を、このような治療を必要として
いる被検者に投与するステップを含む。

【０１１３】 ホスホジエステラーゼは造骨細胞において発現され、造骨細胞の分化に関与す
る。従って、ホスホジエステラーゼは骨基質沈着、従って骨形成に関与する。同
様に、遺伝子は、骨組織に関与する疾患、特に骨粗鬆症の治療に特に関連がある
。

【０１１４】 ホスホジエステラーゼの発現が関連する疾患には、痴呆、記憶喪失、うっ血性
心不全、血栓、肺性抗血圧、糸球体腎炎、双極性抑うつ、気管支喘息、アトピー
性疾患、自己免疫性脳脊髄炎、臓器移植、ネフローゼ症候群における塩類貯留お
よび勃起障害が含まれるが、それらに限定されない。

【０１１５】 ホスホジエステラーゼはまた、うっ血性心不全などの心疾患および乳癌に特異
的に関与する。

【０１１６】 従って、ホスホジエステラーゼポリペプチドは、ホスホジエステラーゼの異常
な発現または活性に特徴付けられるホスホジエステラーゼ関連疾患を治療するの
に有用である。一実施態様において、本発明の方法は、タンパク質の発現または
活性を調節（例えば、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）
する薬剤（例えば、本明細書において記載されているスクリーニングアッセイに
よって同定された薬剤）または薬剤の組合せを投与することに関係する。別の実
施態様において、本発明の方法は、タンパク質の低いまたは異常な発現または活
性を代償するための治療としてホスホジエステラーゼを投与することに関係する
。

【０１１７】 治療の方法には、cAMPまたはプロテインキナーゼAと競合する可溶性ホスホジ
エステラーゼまたはホスホジエステラーゼタンパク質の断片の使用が含まれるが
、それらに限定されない。これらのホスホジエステラーゼまたは断片は、効果的
に競合するように標的に対するより高い親和性を持たせることができる。

【０１１８】 活性の刺激は、タンパク質が異常にダウンレギュレーションされている状況お
よび/または高い活性が有用な影響を有すると思われる状況において望ましい。
同様に、活性の阻害は、タンパク質が異常にアップレギュレーションされている
状況および/または低い活性が有用な影響を有すると思われる状況において望ま
しい。このような状況の一例では、被検者は異常な発育または細胞分化によって
特徴付けられる疾患を有する。別の例では、被検者は、増殖性疾患（例えば、癌
）または異常な造血応答によって特徴付けられる疾患を有する。別の例では、被
検者において組織再生することが望ましい（例えば、被検者が脳または脊髄傷害
を受けており、神経組織を調節的に再生することが望ましい場合）。

【０１１９】 本発明のよりさらに別の態様において、本発明のタンパク質は、本発明のタン
パク質と結合または相互作用してそれらの活性を調節する他のタンパク質（捕獲
タンパク質）を同定するため、2-ハイブリッドアッセイまたは3-ハイブリッドア
ッセイにおける「ベイトタンパク質」として使用することができる（例えば、米
国特許第5,283,317号;Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al.
(1993) J. Biol. Chem. 268: 12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniq
ues 14: 920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693-1696; およびBre
nt 国際公開公報第9410300を参照）。

【０１２０】 ホスホジエステラーゼポリペプチドはまた、本明細書に開示されているように
、ホスホジエステラーゼが発現される組織に関係する疾患、特に骨粗鬆症、乳癌
およびうっ血性心不全を含むが、それらに限定されないホスホジエステラーゼが
媒介する疾患または疾患の素因を診断するための標的を提供するのに有用である
。従って、細胞、組織または器官におけるホスホジエステラーゼの存在またはレ
ベルを検出する方法が提供される。本発明の方法は、相互作用を検出することが
できるように、生物試料に、ホスホジエステラーゼと相互作用することができる
化合物を接触させることに関係する。

【０１２１】 ホスホジエステラーゼを検出するための薬剤は、ホスホジエステラーゼに選択
的に結合することができる抗体である。生物試料には、被検者から単離された組
織、細胞および体液並びに被検者内に存在する組織、細胞および体液が含まれる
。

【０１２２】 ホスホジエステラーゼはまた、変異体ホスホジエステラーゼを有する患者の活
動性疾患または疾患の素因を診断するための標的を提供する。従って、ホスホジ
エステラーゼは生物試料から単離され、異常なタンパク質を生ずる遺伝的突然変
異の存在をアッセイすることができる。これには、アミノ酸置換、欠失、挿入、
転移（異常なスプライシング事象の結果として）および不適当な翻訳後修飾が含
まれる。分析方法には、電気泳動の移動度の変化、トリプシンペプチド消化の変
化、細胞系または細胞不含アッセイにおけるホスホジエステラーゼ活性の変化、
cAMP結合もしくは変性、プロテインキナーゼA結合もしくはリン酸化または抗体
結合パターンの変化、等電点の変化、直接アミノ酸配列決定および一般にタンパ
ク質、具体的にはホスホジエステラーゼの突然変異を検出するのに有用な既知の
アッセイ技法の任意のその他が含まれる。

【０１２３】 ホスホジエステラーゼを検出するためのインビトロ技法には、酵素結合免疫吸
着アッセイ(ELISA)、ウェスタンブロット、免疫沈降法および免疫蛍光が含まれ
る。または、タンパク質は、被検者に標識した抗ホスホジエステラーゼ抗体を導
入することによって被検者においてインビボで検出することができる。例えば、
被検者内での存在および位置を標準的な画像形成技法によって検出することがで
きる放射性マーカーで抗体を標識することができる。被検者内で発現されるホス
ホジエステラーゼの対立遺伝子変種を検出する方法および試料中のホスホジエス
テラーゼ断片を検出する方法が特に有用である。

【０１２４】 ホスホジエステラーゼポリペプチドはまた薬理ゲノミクス分析に有用である。
薬理ゲノミクスは、罹患者における薬物の性質の変化および異常な作用による薬
物に対する応答の臨床的に重要な遺伝的変化を取り扱う。例えば、Eichelbaum,
M.(1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10-11): 983-985およびLinder,
M. W. (1997) Clin. Chem. 43(2): 254-266参照。これらの変化の臨床的な結果
により、ある患者では治療薬が重症の毒性を生じたり、ある患者では代謝の個体
差の結果として薬物治療が失敗したりする。従って、個人の遺伝子型は、治療化
合物が生体に作用する仕方または生体が化合物を代謝する仕方を判定することが
できる。さらに、薬物代謝酵素の活性は薬物作用の強度および持続時間に影響を
与える。従って、個人の薬理ゲノミクスにより、個人の遺伝子型に基づいて、効
果的な化合物およびこのような化合物の用量を選択することができる。いくつか
の薬物代謝酵素における遺伝的多型が発見されたことにより、ある患者は予期さ
れた薬物効果を得られず、ある患者は薬物効果の増大を示し、またはある患者は
標準的な薬物用量により重篤な毒性を経験する理由が説明されるようになった。
多型は、広範な代謝因子(metabolizer)の表現型および限局的な代謝因子(poor m
etabolizer)の表現型において発現されうる。従って、遺伝的多型により、1つ集
団のホスホジエステラーゼの機能の1つ以上が別の集団のものと異なるホスホジ
エステラーゼの対立遺伝子タンパク質変異体が生ずることがある。従って、ポリ
ペプチドによって、標的は治療法に影響を与えることがある遺伝的素因を確認す
ることができる。従って、cAMPに基づいた治療では、多型が、より強い活性また
は弱い活性を示す触媒領域を生ずることがある。従って、用量は多型を含有する
所定の集団内で治療効果を最大にするように必然的に調節される。遺伝子型分け
の別法として、特定の多型ポリペプチドが同定される。

【０１２５】 ホスホジエステラーゼポリペプチドはまた、臨床試験および他の治療中に治療
効果をモニターするのに有用である。従って、遺伝子発現、タンパク質レベルま
たはホスホジエステラーゼ活性を増加または低下するように設計されている薬剤
の治療的有効性は、ホスホジエステラーゼポリペプチドをエンドポイント標的と
して使用して治療コースに渡ってモニターすることができる。モニタリングは、
例えば、以下のようにすることができる。(i)薬剤を投与する前に被検者から投
与前試料を入手する、(ii)投与前試料中のタンパク質の存在または活性レベルを
検出する、(iii)被検者から1つ以上の投与後試料を入手する、(iv)投与後試料中
のタンパク質の発現または活性レベルを検出する、(v)投与前試料中のタンパク
質の発現または活性レベルと投与後試料中のタンパク質の発現または活性レベル
を比較する、および(vi)被検者への薬剤の投与をそれなりに増減する。

【０１２６】抗体 本発明はまた、ホスホジエステラーゼ並びにその変異体および断片に選択的に
結合する抗体を提供する。抗体は、ホスホジエステラーゼと実質的に相同でない
他のタンパク質にも結合したとしても、選択的に結合すると考えられている。こ
れらの他のタンパク質は、ホスホジエステラーゼの断片またはドメインと相同性
を有する。特定の領域のこのような保存が、相同配列に関して両方のタンパク質
に結合する抗体を生ずる。この場合には、ホスホジエステラーゼに結合する抗体
は依然として選択性であることが理解されるだろう。

【０１２７】 抗体を形成するためには、単離されたホスホジエステラーゼポリペプチドを、
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体作製のための標準的な技法を使用
して抗体を形成するための免疫原として使用する。全長のタンパク質または抗原
性ペプチド断片を使用することができる。高い抗原性指数を有する領域を図3ま
たは8に示す。

【０１２８】 抗体は、好ましくは、これらの領域またはこれらの領域の別個の断片から作製
される。しかし、抗体は、本明細書に記載するペプチドの任意の領域から作製す
ることもできる。好ましい断片は、cAMP加水分解または結合を低下または完全に
妨害する抗体を作製する。抗体は、ホスホジエステラーゼ全体または本明細書に
記載されているホスホジエステラーゼの領域に対して形成することができる。抗
体はまた、本明細書に開示されている特異的な機能部位に対して形成することも
できる。

【０１２９】 抗原ペプチドは、少なくとも12、14、15または30のアミノ酸残基の連続する配
列を含むことができる。一実施態様において、断片は、タンパク質の表面に位置
する領域、例えば、親水性領域に相当する。しかし、これらの断片は本発明の以
前に開示されている可能性のあるいかなる断片も含むと考えるべきではない。

【０１３０】 抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。無傷の(int
act)抗体またはその断片（例えば、FabまたはF(ab')₂）を使用することができる
。

【０１３１】 検出は、抗体を検出可能な物質と結合（すなわち、物理的に結合）することに
よって容易にすることができる。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分
子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が含まれる。好適な
酵素の例には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカル性ホスファターゼ、
β-ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが含まれ、好適な補欠
分子族複合体の例にはストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが
含まれ、好適な蛍光物質の例にはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレ
セインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレ
セイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが含まれ、発光物質の例にはルミ
ノールが含まれ、生物発光物質の例にはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエ
クオリンが含まれ、好適な放射性物質の例には¹²⁵I、¹³¹I、³⁵Sまたは³Hが含ま
れる。

【０１３２】 適当な免疫原性調製物は天然、組換え発現または化学合成ペプチドから誘導す
ることができる。

【０１３３】抗体の使用 抗体は、アフィニティクロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的な技法
によってホスホジエステラーゼを単離するために使用することができる。抗体は
細胞からの天然のホスホジエステラーゼの精製および宿主細胞において発現され
る組換え作製ホスホジエステラーゼの精製を容易にすることができる。

【０１３４】 抗体は、生物の種々の組織間のホスホジエステラーゼの発現パターンを正常な
発育経過にわたって測定するために、細胞または組織におけるホスホジエステラ
ーゼの存在を検出するのに有用である。

【０１３５】 抗体は、発現の量およびパターンを評価するために、インサイチュー、インビ
トロまたは細胞溶解物中のホスホジエステラーゼを検出するために使用すること
ができる。

【０１３６】 抗体は、発育中の異常な組織分布または異常な発現を評価するために使用する
ことができる。

【０１３７】 全長のホスホジエステラーゼの循環断片の抗体検出は、ホスホジエステラーゼ
ターンオーバーを同定するために使用することができる。

【０１３８】 さらに、抗体は、疾患の活動期またはホスホジエステラーゼ機能に関連する疾
患の素因を有する個人などの疾患状態におけるホスホジエステラーゼ発現を評価
するために使用することができる。疾患がホスホジエステラーゼタンパク質の不
適当な組織分布、不適当な発育上の発現または不適当な発現レベルによって生じ
る場合には、抗体は正常なホスホジエステラーゼタンパク質に対して作製するこ
とができる。障害がホスホジエステラーゼの特異的な突然変異によって特徴づけ
られる場合には、この突然変異タンパク質に特異的な抗体は特異的な突然変異ホ
スホジエステラーゼの存在をアッセイするために使用することができる。しかし
、細胞内ホスホジエステラーゼペプチド領域を認識すると思われる細胞内で作製
される抗体（「intrabodies」）も含まれる。

【０１３９】 抗体はまた、生物の種々の組織の細胞の正常および異常な細胞下局在化を評価
するために使用することができる。抗体は、ホスホジエステラーゼ全体またはホ
スホジエステラーゼの一部に対して作製することができる。

【０１４０】 診断的用途は遺伝子試験においてだけでなく治療法をモニタリングする際にも
適用することができる。従って、ホスホジエステラーゼの発現レベルまたは異常
なホスホジエステラーゼの存在および異常な組織分布または異常な発育上の発現
を矯正することを最終的に治療が目的とする場合には、ホスホジエステラーゼま
たは関連する断片に対する抗体は治療効果をモニターするために使用することが
できる。

【０１４１】 従って、抗体は、例えば、所定の治療法の効果を判定するための臨床試験手法
の一部として組織中のタンパク質レベルをモニターするために診断的に使用する
ことができる。

【０１４２】 また、抗体は薬理ゲノミクス分析に有用である。従って、多型ホスホジエステ
ラーゼに対して作製される抗体は、治療法の修正を必要とする個人を同定するた
めに使用することができる。

【０１４３】 抗体はまた、電気泳動の移動度、等電点、トリプシンペプチド消化および当業
者に周知の他の物理的アッセイによって分析される異常なホスホジエステラーゼ
の免疫学的マーカーとしての診断ツールとしても有用である。

【０１４４】 抗体はまた組織型分けにも有用である。従って、特定のホスホジエステラーゼ
が特定の組織における発現に相関している場合には、このホスホジエステラーゼ
に特異的な抗体は組織型を同定するために使用することができる。

【０１４５】 抗体はまた法医学的同定に有用である。従って、個人が、特定の多型タンパク
質を生ずる特定の遺伝子多型に関連している場合には、多型タンパク質に特異的
な抗体が同定の助力として使用することができる。

【０１４６】 抗体はまた、ホスホジエステラーゼ機能を阻害するのに、例えば、cAMP、プロ
テインキナーゼAまたは触媒部位を遮断するのに有用である。

【０１４７】 これらの用途は、治療がホスホジエステラーゼ機能を阻害することに関係する
治療内容に適用することができる。抗体はまた、cAMP結合を遮断するのに有用と
なりうる。抗体は機能に必要な部位を含有する特定の断片に対してまたは細胞に
関連する無傷のホスホジエステラーゼに対して作製することができる。

【０１４８】 完全にヒトの抗体が、ヒト患者の治療に特に望ましい。ヒト抗体を作製するこ
の技術に関する総説は、Lonberg et al. (1995) Int. Rev. Immunol. 13: 65-93
を参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの技術並び
にこのような抗体を作製するためのプロトコールの詳細な考察は、例えば、米国
特許第5,625,126号、米国特許第5,633,425号、米国特許第5,569,825号、米国特
許第5,661,016号および米国特許第5,545,806号を参照。

【０１４９】 本発明はまた、生物試料中のホスホジエステラーゼタンパク質の存在を検出す
るために抗体を使用するキットも含む。キットは、標識済みまたは標識可能な抗
体などの抗体と、生物試料中のホスホジエステラーゼを検出するための化合物ま
たは薬剤と、試料中のホスホジエステラーゼの量を測定するための手段と、試料
中のホスホジエステラーゼの量と標準とを比較する手段とを含む。化合物または
薬剤は好適な容器内に包装されてもよい。キットはホスホジエステラーゼを検出
するためのキットを使用する使用説明書もさらに含んでもよい。

【０１５０】ポリヌクレオチド 配列番号2または配列番号4のヌクレオチド配列はヒトcDNAを配列決定すること
によって得た。従って、配列番号2については、寄託されているクローンのの配
列が両者のいかなる矛盾に関してもコントロールしており、配列番号2の配列へ
のいかなる言及も寄託されているcDNAへの配列の言及を含む。

【０１５１】 具体的に開示されているcDNAは、コード領域、配列番号2または配列番号4の5'
および3'を含む。

【０１５２】 本発明は、新規ホスホジエステラーゼをコードする単離ポリヌクレオチドを提
供する。「ホスホジエステラーゼポリヌクレオチド」または「ホスホジエステラ
ーゼ核酸」という用語は、配列番号2もしくは配列番号4または寄託されているcD
NAに示す配列をいう。「ホスホジエステラーゼポリヌクレオチド」または「ホス
ホジエステラーゼ核酸」という用語はさらに、ホスホジエステラーゼポリヌクレ
オチドの変異体および断片を含む。

【０１５３】 「単離ホスホジエステラーゼ核酸」は、天然起源のホスホジエステラーゼ核酸
に存在する他の核酸から分離されたものをいう。好ましくは、「単離核酸」は、
核酸を誘導した生物のゲノムDNAにおいてホスホジエステラーゼ核酸と天然に隣
接する配列（すなわち、核酸の5'および3'末端に位置する配列）を含まない。し
かし、例えば、約5KBまでのいくつかの隣接ヌクレオチド配列が存在してもよい
。重要な点は、ホスホジエステラーゼ核酸は、組換え発現、プローブおよびプラ
イマーの作製並びにホスホジエステラーゼ核酸配列に特有の他の用途などの、本
明細書に記載されている特定の操作を実施することができるように、隣接配列か
ら単離されているということである。

【０１５４】 さらに、cDNAまたはRNA分子などの「単離された」核酸分子は、組換え技法に
よって作製されるとき他の細胞物質または培養培地を実質的に含有しないことが
でき、または化学的に合成されたとき化学的前駆体または他の化学物質を含有し
ないことができる。しかし、核酸分子は他のコード配列または調節配列と融合し
てもよく、好ましくは、場合も単離されていると考えることができる。

【０１５５】 単離された物質が組成物（例えば、他の物質を含有する粗抽出物）、緩衝系ま
たは試薬混合物の一部を形成する場合もある。他の場合には、物質は、例えば、
PAGEまたはHPLCなどのカラムクロマトグラフィーによって測定されるとき、必須
な均一さまで精製することができる。好ましくは、単離核酸は、存在する全ての
高分子種の少なくとも約50、80または90％（分子に基づいて）を含む。

【０１５６】 例えば、ベクターに含有される組換えDNA分子は単離されていると考える。単
離DNA分子のさらに別の例には、異種宿主細胞中に維持される組換えDNA分子また
は溶液状態の精製された（部分的または実質的に）DNA分子が含まれる。単離RNA
分子には、本発明の単離DNA分子のインビボまたはインビトロにおける転写物が
含まれる。本発明による単離核酸分子にはさらに合成によって作製されるこのよ
うな分子が含まれる。

【０１５７】 単離された物質が組成物（例えば、他の物質を含有する粗抽出物）、緩衝系ま
たは試薬混合物の一部を形成する場合もある。他の場合には、物質は、例えば、
PAGEまたはHPLCなどのカラムクロマトグラフィーによって測定されるとき、必須
な均一さまで精製することができる。好ましくは、単離核酸は、存在する全ての
高分子種の少なくとも約50、80または90％（分子に基づいて）を含む。

【０１５８】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドは成熟タンパク質プラス追加のアミノ
またはカルボキシ末端アミノ酸、または（例えば、成熟形態が1つ以上のポリペ
プチド鎖を有する場合には）成熟ポリペプチドの内部のアミノ酸をコードするこ
とができる。このような配列は、中でも、前駆体から成熟型へのタンパク質のプ
ロセッシングに何らかの役割を果たし、タンパク質の交通(trafficking)を容易
にし、タンパク質の半減期を延長もしくは短縮し、またはアッセイもしくは産生
のためのタンパク質の操作を容易にすることがある。一般にその場合はインサイ
チューであるので、追加のアミノ酸は細胞酵素によって成熟タンパク質からプロ
セッシングされることがある。

【０１５９】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドには、成熟型ポリペプチド単独をコー
ドする配列、成熟型ポリペプチドおよびリーダーまたは分泌配列（例えば、プレ
プロタンパク質またはプロタンパク質配列）などの追加のコード配列をコードす
る配列、追加のコード配列を含むまたは含まない成熟型ポリペプチドプラス追加
の非コード配列、例えば、転写、mRNAプロセッシング（スプライシングおよびポ
リアデニル化シグナルを含む）、リボソーム結合およびmRNAの安定性になんらか
の役割を果たす転写されるが翻訳されない配列などのイントロンおよび非コード
5'および3'配列をコードする配列が含まれるが、それらに限定されない。また、
ポリヌクレオチドは、例えば、精製を促進するペプチドをコードするマーカー配
列に融合してもよい。

【０１６０】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドは、mRNAなどのRNAの形態またはクロ
ーニングまたは化学合成技法またはそれらの組合せによって作製されるcDNAおよ
びゲノムDNAを含むDNAの形態であってもよい。核酸、特にDNAは2本鎖であっても
、1本鎖であってもよい。1本鎖核酸はコード鎖（センス鎖）または非コード鎖（
アンチ-センス鎖）であってもよい。

【０１６１】 ホスホジエステラーゼ核酸はヒト造骨（短鎖型）並びに腎臓および副腎（長鎖
型）cDNAに相当する、配列番号2または配列番号4に示すヌクレオチド配列を含ん
でもよい。

【０１６２】 一実施態様において、ホスホジエステラーゼ核酸はコード領域だけを含む。

【０１６３】 本発明はさらに、遺伝子コードの縮重により配列番号2または配列番号4に示す
ヌクレオチド配列と異なって、配列番号2または配列番号4に示すヌクレオチド配
列によってコードされるものと同じタンパク質をコードする変異体ホスホジエス
テラーゼポリヌクレオチドおよびそれらの断片を提供する。

【０１６４】 本発明はまた、本明細書に記載する変異体ポリペプチドをコードするホスホジ
エステラーゼ核酸分子を提供する。このようなポリヌクレオチドは、対立遺伝子
変異体（同じ遺伝子座）、相同物（異なる遺伝子座）およびオーソロガス(ortho
logs)（異なる生物）などの天然型であっても、または組換えDNA方法もしくは化
学合成によって構築されてもよい。このような非天然型変異体は、ポリヌクレオ
チド、細胞または生物に適用されるものを含む突然変異技法によって作製するこ
とができる。従って、上記に考察するように、変異体はヌクレオチド置換、欠損
、転移(inversions)および挿入を含有することがある。

【０１６５】 典型的には、変異体は配列番号2または配列番号4の核酸分子およびそれらの相
補鎖と実質的な同一性を有する。変異は、コード領域および非コード領域のどち
らかまたは両方に生じることがある。変異は、保存的および非保存的アミノ酸置
換を生じることがある。

【０１６６】 オーソロガス、相同物および対立遺伝子変異体は、当技術上周知の方法を使用
して同定することができる。これらの変異体は、配列番号2もしくは配列番号4に
示すヌクレオチド配列またはこの配列の断片と少なくとも約60〜65％、65〜70％
、典型的には、少なくとも約70〜75％、さらに典型的には、少なくとも約80〜85
％および最も典型的には、少なくとも約90〜95％以上相同であるホスホジエステ
ラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。このような核酸分子は、配列番号
2もしくは配列番号4に示すヌクレオチド配列またはこの配列の断片とストリンジ
ェントな条件下においてハイブリダイゼーションすることができると容易に同定
することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、ポリA配列
、または全てのもしくはほとんどのタンパク質、全ての環状ヌクレオチドホスホ
ジエステラーゼ、もしくは全てのファミリー7ホスホジエステラーゼに共通な配
列などの、一般的な相同性による場合には実質的な相同性を示さないことが理解
される。さらに、変異体は、本発明より以前に開示されている可能性のある核酸
配列のいずれをも含まないことが理解される。

【０１６７】 本明細書中で使用される、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーシ
ョンする」という用語は、典型的に互いに少なくとも約60〜65％相同なポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列が互いにハイブリダイゼーションできるハイ
ブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載することが意図されている。条件は
、互いに少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも
約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％以上同一である配列が互いにハイ
ブリダイゼーションすることができるようであってもよい。このようなストリン
ジェントな条件は当業者に周知であり、参照として組み入れられている、Curren
t Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1
-6.3.6に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
の一例は、約45℃における6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中での
ハイブリダイゼーション、次に50〜65℃における0.2×SSC、0.1％SDSにおける1
回以上の洗浄である。別の限定的でない例には、核酸分子を約45℃において6×
塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)においてハイブリダイゼーションし、
次に室温における0.2×SSC/0.1％SDS中での1回以上のストリンジェンシー（厳密
性）が低い洗浄、または42℃における0.2×SSC/0.1％SDSでの1回以上のストリン
ジェンシーが中程度な洗浄、またはストリンジェンシーの高い65℃における0.2
×SSC/0.1％SDSにおける洗浄を実施する。一実施態様において、配列番号1また
は配列番号3の配列とストリンジェントな条件下においてハイブリダイゼーショ
ンする単離核酸分子は天然型核酸分子に相当する。本明細書中で使用される「天
然型」核酸分子は天然に生ずる（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌク
レオチド配列を有するRNAまたはDNAをいう。

【０１６８】 当業者に理解されるように、正確な条件は実験的に決定することができ、ホル
ムアミドなどの不安定剤(destabilizing agents)またはSDSなどの変性剤のイオ
ン強度、温度および濃度に依存する。望ましいハイブリダイゼーション条件を決
定する際に考慮される他の要因には、核酸配列の鎖長、塩基の組成、ハイブリダ
イゼーションする配列間のミスマッチの割合および他の同一でない配列内の配列
サブセットの出現頻度が含まれる。従って、等価な条件はこれらのパラメーター
の1つ以上を変更するが、2つの核酸分子間のほぼ同じ程度の同一性または類似性
を維持することによって決定することができる。

【０１６９】 本発明はまた、配列番号2もしくは配列番号4のヌクレオチド配列または配列番
号2もしくは配列番号4の相補鎖にストリンジェントな条件下においてハイブリダ
イゼーションする1本鎖または2本鎖断片または一部を含有する単離核酸を提供す
る。一実施態様において、核酸は配列番号2または配列番号4のヌクレオチド配列
および配列番号2または配列番号4の相補鎖の一部からなる。本発明の核酸断片は
、鎖長が少なくとも約15、好ましくは少なくとも約18、20、23または25ヌクレオ
チドであり、鎖長が30、40、50、100、200、500以上のヌクレオチドであっても
よい。本明細書において記載する抗原性タンパク質またはポリペプチドをコード
するより長い断片、例えば、鎖長が30以上のヌクレオチドが有用である。

【０１７０】 さらに、本発明は、全長のホスホジエステラーゼポリヌクレオチドの断片を含
むポリヌクレオチドを提供する。断片は1本鎖または2本鎖であってもよく、DNA
またはRNAを含んでもよい。断片はコード配列または非コード配列から誘導され
てもよい。

【０１７１】 別の実施態様において、単離されたホスホジエステラーゼ核酸はコード領域全
体をコードする。別の実施態様において、単離されたホスホジエステラーゼ核酸
は、約アミノ酸6から最後のアミノ酸であってもよい成熟タンパク質に相当する
配列をコードする。他の断片は、本明細書に記載するアミノ酸断片をコードする
ヌクレオチド配列を含む。

【０１７２】 従って、ホスホジエステラーゼ核酸断片は、本明細書に記載するドメイン、本
明細書に記載するサブ領域および特定の機能部位に相当する配列をさらに含む。
ホスホジエステラーゼ核酸断片はまた、上記に記載するドメイン、セグメントお
よび他の機能的部位の組合せを含む。当業者は、考えられる多数の置き換えに気
づくだろう。

【０１７３】 ドメインまたは部位の位置がコンピュータ分析によって予測されている限り、
当業者は、これらのドメインを構成するアミノ酸残基がドメインを規定するため
に使用される基準に応じて変わりうることを理解しているだろう。

【０１７４】 しかし、ホスホジエステラーゼ断片は、遺伝子全体を含まないいずれの核酸配
列も含むことが理解される。

【０１７５】 本発明はまた、本明細書に記載されるホスホジエステラーゼタンパク質の領域
を保有するエピトープをコードするホスホジエステラーゼ核酸断片を提供する。

【０１７６】 本発明による核酸断片は、本発明の以前に開示されている可能性があるような
断片を含むと解釈されるべきではない。

【０１７７】ポリヌクレオチドの使用 本発明のヌクレオチド配列は、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配
列を同定するために、公共のデータベースに検索を実施するための「照会配列(q
uery sequence)」として使用することができる。このような検索は、Altshul et
al. (1990)J. Mol. Biol. 215: 403-10のNBLASTおよびXBLASTプログラム（バー
ジョン2.0）を使用して実施することができる。BLASTタンパク質検索は、本発明
のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラム、スコアー
=50、ワード長さ=3を用いて実施することができる。Altshul et al. (1997) Nuc
leic Acids Res. 25(17): 3389-3402に記載されているように、比較目的のため
に、ギャップを挿入して整列させるために、Gapped BLASTを使用することがで
きる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを使用する場合には、それぞれのプ
ログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメーターを使用する
ことができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照。

【０１７８】 本発明の核酸断片は、以下に記載するものなどのアッセイのプローブまたはプ
ライマーを提供する。「プローブ」は、核酸の相補鎖に塩基特異的にハイブリダ
イゼーションするオリゴヌクレオチドである。このようなプローブは、Nielsen
et al. (1991) Science 254:1497-1500に記載されているポリペプチド核酸を含
む。典型的には、配列番号2または配列番号4に示す核酸配列およびその相補鎖の
少なくとも約15、典型的には約20〜25、さらに典型的には約40、50または75連続
するヌクレオチドに高度にストリンジェントな条件下においてハイブリダイゼー
ションするヌクレオチド配列の領域を含む。さらに典型的には、プローブは、例
えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素コファクターのような標識を
さらに含む。

【０１７９】 本明細書中で使用される「プライマー」という用語は、本明細書において記載
されるものを含むが、それらに限定されない周知の方法（例えば、PCR、LCR）を
使用した鋳型志向型DNA合成の開始点として作用する1本鎖オリゴヌクレオチドを
いう。適当な鎖長のプライマーは特定の用途に依存するが、典型的には、約15〜
30ヌクレオチドの範囲である。「プライマー部位」という用語は、プライマーが
ハイブリダイゼーションする標的DNAの領域をいう。「プライマー対」という用
語は、増幅対象の核酸配列の5'側末端にハイブリダイゼーションする5'側（上流
）プライマーおよび増幅対象の配列の相補鎖にハイブリダイゼーションする3'側
（下流）プライマーを含むプライマーセットをいう。

【０１８０】 従って、ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはプローブ、プライマーのた
めにおよび生物アッセイにおいて有用である。

【０１８１】 ポリヌクレオチドが、本明細書において記載するアッセイなどのホスホジエス
テラーゼ特性または機能を評価するのに使用される場合には、cDNA全長の全てま
たはcDNA全長の全てではない部分が有用となりうる。アゴニストまたはアンタゴ
ニスト活性を評価するなどの、ホスホジエステラーゼ機能に特異的に向けられる
アッセイは既知の断片の使用を含む。さらに、ホスホジエステラーゼ機能を評価
するための診断方法は、本発明より以前に知られている可能性のあるような断片
を含むいかなる断片を用いても実施することができる。同様に、ホスホジエステ
ラーゼの機能不全の治療に関係する方法では、当技術上周知である可能性のある
全ての断片が含まれる。

【０１８２】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドは、配列番号1または配列番号3に記載
するポリペプチドをコードする全長のcDNAおよびゲノムクローンを単離するため
の、および配列番号1もしくは配列番号3に示す同じポリペプチドまたは本明細書
に記載する他の変異体に対応するcDNAおよびゲノムクローンを単離するためのcD
NAおよびゲノムDNAのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。変異
体は、配列番号1もしくは配列番号3に示すポリペプチドが単離された同じ組織お
よび生物から単離されてもよく、同じ生物の異なる組織から単離されてもよく、
異なる生物から単離されてもよい。この方法は、発育上コントロールされること
により、生物の発生の異なる経過時点において同じ組織または異なる組織におい
て発現されてもよい遺伝子およびcDNAを単離するのに有用である。

【０１８３】 プローブは、ホスホジエステラーゼをコードする遺伝子の全体の鎖長の任意の
配列に対応することができる。従って、プローブは5'側非コード領域、コード領
域および3'側非コード領域から誘導されてもよい。

【０１８４】 核酸プローブは、例えば、鎖長が少なくとも12、15、30、50、100、250または
500ヌクレオチドで、ストリンジェントな条件下においてmRNAまたはDNAと特異的
にハイブリダイゼーションするのに十分なオリゴヌクレオチドなどの配列番号2
もしくは配列番号4の全長のcDNAまたはそれらの断片であってもよい。

【０１８５】 本明細書に記載するポリヌクレオチドの断片はまた、本明細書に記載するより
大きい断片または全長のポリヌクレオチドを合成するのに有用である。例えば、
断片はmRNAの任意の一部にハイブリダイゼーションし、より大きいcDNAまたは全
長のcDNAを作製することができる。

【０１８６】 断片はまた、望ましい鎖長および配列のアンチセンス分子を合成するのに有用
である。

【０１８７】 本発明のアンチセンス核酸は配列番号2または配列番号4のヌクレオチド配列を
使用して設計され、当技術上周知の手法を使用して化学合成および酵素的なライ
ゲーション反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（
例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は天然型ヌクレオチドまたは分子の
生物的安定性を増加するようにまたはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形
成される2量体の物理的安定性を増加するように設計された種々の修飾型ヌクレ
オチドを使用して化学的に合成することができる。例えば、チオリン酸エステル
誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセン
ス核酸を作製するために使用することができる修飾型ヌクレオチドの例には、5-
フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、
ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシ
ルメチル）ウラシル、5-カルボキシメチルアミノエチル-2-チオウリジン、5-カ
ルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシル
ケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチ
ルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-
メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチ
ルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マン
ノシルケオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル
、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイ
ブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チ
オウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5
-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラ
シル、3-(3-アミノ3-N-2-カルボキシプロピル）ウラシル、(acp3)wおよび2,6-ジ
アミノプリンが含まれる。または、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方
向にサブクローニングされている発現ベクターを使用して生物学的に作製するこ
とができる（すなわち、挿入された核酸から転写されるRNAは関心のある標的核
酸のアンチセンス方向のものである）。

【０１８８】 また、本発明の核酸分子は、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション
または溶解性を改善するために塩基部分、糖部分またはリン酸骨格が修飾されて
もよい。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格は、ペプチド核酸を作製す
るように修飾することができる(Hyrup et al. (1996) Bioorganic & Medicinal
Chemistry 4:5)。本明細書中で使用される「ペプチド核酸」または「PNA」とい
う用語は、核酸模倣物、例えば、デオキシリボースリン酸骨格がシュードペプチ
ド骨格で置換され、4つの天然の核酸塩基だけが保持されているDNA模倣物をいう
。PNAの中性の骨格は、低いイオン強度の条件下においてDNAおよびRNAとの特異
的なハイブリダイゼーションが可能であることが示されている。PNAオリゴマー
の合成は、Hyrup et al. (1996),上記; Perry-O'Keefe et al. (1996)Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 93: 14670に記載されている標準的な固相ペプチド合成プロ
トコールを使用して実施することができる。PNAは、例えば、PNAに親油性基また
は他のヘルパー基を結合することによって、PNA-DNAキメラを形成することによ
って、または当技術上周知のリポソームもしくは他の薬物送達技法を使用するこ
とによって、安定性、特異性または細胞取り込みを増大するためにさらに修飾す
ることができる。PNA-DNAキメラの合成はHyrup(1996)上記、Finn et al.(1996)N
ucleic Acids Res. 24(17): 3357-63、Mag et al. (1989)Nucleic Acids Res. 1
7: 5973およびPeterser et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5: 1119
に記載されているように実施することができる。

【０１８９】 本発明の核酸分子および断片はまた、ペプチド（例えば、インビボにおいて宿
主細胞ホスホジエステラーゼを標的とするため）または細胞膜を貫通した輸送を
促進する薬剤(例えば、Letsinger et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA86
: 6553-6556; Lemaitre et al. (1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648-65
2; PCT Publication国際公開公報第88/0918号を参照）もしくは血液脳関門を通
過した輸送を促進する薬剤（例えば、PCT Publication国際公開公報第89/10134
号を参照）などの他の付加基を含んでもよい。また、オリゴヌクレオチドは、ハ
イブリダイゼーション誘発性切断剤（例えば、Krol et al. (1988) Bio-Techniq
ues 6: 958-976)または挿入剤（例えば、Zon (1988) Pharm Res. 5:539-549参照
）で修飾してもよい。

【０１９０】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはまた、ホスホジエステラーゼポリヌ
クレオチドの任意の所定の領域を増幅するためのPCRのプライマーとしても有用
である。

【０１９１】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはまた、組換えベクターを構築するの
に有用である。このようなベクターには、ホスホジエステラーゼポリペプチドの
一部または全てを発現する発現ベクターが含まれる。ベクターはまた、ホスホジ
エステラーゼ遺伝子および遺伝子産物のインサイチュー発現を変更するために、
細胞ゲノムなどの別のポリヌクレオチド配列に組み込むために使用される挿入ベ
クターを含む。例えば、内因性ホスホジエステラーゼコード配列は、相同組換え
によって、1つ以上の特異的に導入された突然変異を含有するコード領域の全て
または一部と交換してもよい。

【０１９２】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはまた、ホスホジエステラーゼタンパ
ク質の抗原性部分を発現するのに有用である。

【０１９３】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはまた、FISH(この技法の総説は、Ver
ma et al.(1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques(Pergamon
Press, New York)を参照）および体細胞ハイブリッドのPCRマッピングなどの、
インサイチューハイブリダイゼーション方法によってホスホジエステラーゼポリ
ヌクレオチドの染色体位置を決定するためのプローブとして有用である。配列の
染色体へのマッピングは、これらの配列と、疾患に関連のある遺伝子とを関連さ
せる際の重要な最初の段階である。

【０１９４】 染色体マッピングの試薬は、1つの染色体またはその染色体の1つの部位をマー
キングするために個別に使用することができ、また試薬団は多数の部位および/
または多数の染色体をマーキングするために使用することができる。遺伝子の非
コード領域に対応する試薬が実際にはマッピング目的のためには好ましい。コー
ティング配列は遺伝子ファミリー内で保存されている可能性が高い、従って染色
体マッピング中の交差ハイブリダイゼーションの確率が増加する。

【０１９５】 配列が正確な染色体位置にマッピングされたら、染色体上の配列の物理的な位
置を遺伝子マッピングデータに相関させることができる。（このようなデータは
、例えば、Johns Hopkins University Welch Medical Libraryからオンラインで
利用可能なV. McKusick, Mendelian Inhetitance in Manにおいて見出される）
。次いで、例えば、Egeland et al.((1987) Nature 325: 783-787)に記載されて
いるように、連係分析（linkage analysis)により遺伝子と同じ染色体領域にマ
ッピングされた疾患との関係を同定することができる（物理的に隣接する遺伝子
の同時遺伝）。

【０１９６】 さらに、特定の遺伝子に関連する疾患に罹患している個人と罹患していない個
人との間のDNA配列の差を求めることができる。突然変異が罹患患者の一部また
は全員に観察されるが、罹患していない個人には観察されない場合には、その突
然変異が特定の疾患の原因因子である可能性がある。罹患患者と罹患していない
個人との比較は、一般に、染色体の広がり(chromosome spreads)から見ることが
でき、そのDNA配列に基づいたPCRを使用して検出可能である欠損または転移など
の染色体の構造変化をまず見ることに関係する。最終的には、突然変異の存在を
確認し、突然変異を多型と識別するために、数人の個人の遺伝子の完全な配列決
定を実施することができる。

【０１９７】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドプローブはまた、例えば、遺伝子の複
製が生じているかどうかおよび複製が組織の全てまたはサブセットだけにおいて
生じているかどうかのような、組織分布に関してホスホジエステラーゼおよびそ
れらの変異体をコードする遺伝子の存在パターンを決定するのに有用である。遺
伝子は天然型であってもよいし、細胞、組織または生物に外因的に導入されてい
てもよい。

【０１９８】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはまた、本明細書において記載するポ
リヌクレオチドをコードする遺伝子から作製されるmRNAの全てまたは一部に対応
するリボザイムを設計するのに有用である。

【０１９９】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはまた、ホスホジエステラーゼポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの一部または全てを発現する宿主細胞を構築する
ために有用である。

【０２００】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはまた、ホスホジエステラーゼポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの全てまたは一部を発現するトランスジェニック
動物を構築するのに有用である。

【０２０１】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはまた、ホスホジエステラーゼポリペ
プチドの一部または全てを発現するベクターを作製するのに有用である。

【０２０２】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはまた、ホスホジエステラーゼ核酸発
現のレベルを求めるためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。
従って、プローブは、細胞、組織および生物中のホスホジエステラーゼ核酸の存
在を検出するため、またはそのレベルを求めるために使用することができる。レ
ベルが求められる核酸はDNAまたはRNAであってもよい。従って、本明細書におい
て記載するポリペプチドに対応するプローブを、所定の細胞、組織または生物に
おける遺伝子コピー数を評価するために使用することができる。これは、ホスホ
ジエステラーゼ遺伝子の増幅が存在している症例では特に関連がある。

【０２０３】 または、プローブは、ホスホジエステラーゼ遺伝子の余剰のコピーの位置を染
色体外因子上または例えば、均質に染色する領域のように、ホスホジエステラー
ゼ遺伝子が通常では見いだされない染色体内に組み込まれているとして評価する
ためにインサイチューハイブリダイゼーションに関して使用することができる。

【０２０４】 これらの用途は、増殖性疾患、分化もしくは発生上の疾患または造血疾患など
の、正常と比較したホスホジエステラーゼ発現の増加または減少に関係する疾患
の診断に関連する。

【０２０５】 ホスホジエステラーゼは造骨細胞中で発現され、造骨細胞の分化に関与する。
従って、それらは骨基質沈着、従って骨形成に関与する。このように、遺伝子は
骨組織、特に造骨細胞に関与する疾患の治療に特に関連がある。

【０２０６】 ホスホジエステラーゼはまた、うっ血性心不全などの心疾患および乳癌に特に
関与する。

【０２０７】 ホスホジエステラーゼ発現が関連する疾患には、痴呆、記憶喪失、うっ血性心
不全、血栓、肺性抗血圧、糸球体腎炎、双極性抑うつ、気管支喘息、アトピー性
疾患、自己免疫性脳脊髄炎、臓器移植、ネフローゼ症候群における塩類貯留およ
び勃起障害が含まれるが、それらに限定されない。

【０２０８】 従って、本発明は、ホスホジエステラーゼ核酸の異常な発現または活性に関連
する疾患または障害を同定するための方法であって、試験試料が被検者から入手
されて、核酸（例えば、mRNA、ゲノムDNA）が検出され、核酸の存在が、核酸の
異常な発現または活性に関連する疾患または障害を有する被検者または疾患また
は障害を発症するリスクを有する被検者の診断となる方法を提供する。

【０２０９】 本発明の一態様は、個人が、異常な核酸発現または活性に関連する疾患または
障害を有するかどうか、または異常な核酸の発現または活性に関連する疾患また
は障害を発症するリスクを有するかどうかを判定するために、生物試料（例えば
、血液、血清、細胞、組織）に関して核酸の発現および活性を求めるための診断
的アッセイに関する。このようなアッセイは、核酸分子の発現または活性によっ
て特徴付けられるまたは関連する障害の発症前に個人を予防的に治療する予後ま
たは予測的な目的に使用することができる。

【０２１０】 mRNAを検出するためのインビトロにおける技法にはノーザンハイブリダイゼー
ションおよびインサイチューハイブリダイゼーションが挙げられる。DNAを検出
するためのインビトロにおける技法にはサザンハイブリダイゼーションおよびイ
ンサイチューハイブリダイゼーションが挙げられる。

【０２１１】 プローブは、被検者の細胞試料中のホスホジエステラーゼをコードする核酸、
例えば、mRNAまたはゲノムDNAのレベルを測定する、またはホスホジエステラー
ゼ遺伝子が突然変異されているかどうかを判定することによるなどの、ホスホジ
エステラーゼを発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部
として使用することができる。

【０２１２】 核酸発現アッセイは、ホスホジエステラーゼ核酸発現を調節する化合物を同定
する薬物スクリーニングに有用である（例えば、アンチセンス、ポリペプチド、
ペプチド様物質、小型分子または他の薬剤）。細胞を候補化合物に接触させ、mR
NAの発現を測定する。候補化合物の存在下におけるmRNAの発現レベルを候補化合
物が存在しない場合のmRNAの発現レベルと比較する。次いで、この比較に基づい
て、候補化合物を核酸発現の調節物質として同定することができ、例えば、異常
な核酸発現によって特徴付けられる障害を治療するために使用することができる
。調節物質は核酸に結合してもよく、または核酸の発現に影響を与える他の細胞
成分と相互作用することなどによって間接的に発現を調節してもよい。

【０２１３】 調節方法はインビトロにおいて（例えば、細胞を薬剤と共に培養することによ
って）または患者もしくはトランスジェニック動物中でインビボにおいて（例え
ば、被検者に薬剤(gent)を投与することによって）実施することができる。

【０２１４】 従って、本発明は、ホスホジエステラーゼ遺伝子の核酸発現に関連する障害を
治療するために使用することができる化合物を同定するための方法を提供する。
本発明の方法は、典型的には、化合物がホスホジエステラーゼ核酸の発現を調節
する能力をアッセイし、それによって望ましくないホスホジエステラーゼ核酸発
現によって特徴付けられる障害を治療するために使用することができる化合物を
同定することを含む。

【０２１５】 アッセイは細胞系システムおよび細胞不含システムにおいて実施することがで
きる。細胞系アッセイは、ホスホジエステラーゼ核酸を天然に発現する細胞およ
び特定の核酸配列を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞を含む。

【０２１６】 または、候補化合物を患者またはトランスジェニック動物においてインビボに
おいてアッセイすることができる。

【０２１７】 ホスホジエステラーゼ核酸発現のアッセイはmRNAレベルなどの核酸レベルの直
接アッセイに関係しても、またはシグナル経路（環状AMPターンオーバーなどの
）に関与する二次的な化合物に関係してもよい。さらに、ホスホジエステラーゼ
シグナル経路に応答してアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション
される遺伝子の発現もアッセイすることができる。この実施態様では、これらの
遺伝子の調節領域をルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子に機能的に結合する
ことができる。

【０２１８】 従って、細胞を候補化合物と接触させ、mRNAの発現を測定する方法において、
ホスホジエステラーゼ遺伝子発現の調節物質を同定することができる。候補化合
物の存在下におけるホスホジエステラーゼmRNAの発現レベルを、候補化合物が存
在しない場合のホスホジエステラーゼmRNAの発現レベルと比較する。次いで、こ
の比較に基づいて、候補化合物を核酸発現の調節物質と同定することができ、例
えば、異常な核酸発現によって特徴付けられる障害を治療するために使用するこ
とができる。mRNAの発現が候補化合物の存在下の方が存在しない場合より統計的
に有意に大きい場合には、候補化合物は核酸発現の刺激物質と同定される。核酸
発現が候補化合物の存在下の方が存在しない場合より統計的に有意に小さい場合
には、候補化合物は核酸発現の阻害剤と同定される。

【０２１９】 従って、本発明は、ホスホジエステラーゼ核酸発現を調節するための遺伝子調
節物質として薬物スクリーニングにより同定される化合物を使用し、標的として
核酸を用いる治療方法を提供する。調節はアップレギュレーション（すなわち、
活性化もしくは作用性）またはダウンレギュレーション（例えば、抑制もしくは
拮抗性）または核酸の活動に対する影響（例えば、核酸が突然変異されるもしく
は不適切に修飾される場合）を含む。治療は、核酸の異常な発現または活性によ
って特徴付けられる障害のである。

【０２２０】 遺伝子は、骨組織、特に造骨細胞に関係する障害の治療に特に関連する。遺伝
子はまた、うっ血性心不全などの心疾患および乳癌に関係する。さらに、発現が
関連する障害には、痴呆、記憶喪失、うっ血性心不全、血栓、肺性抗血圧、糸球
体腎炎、双極性抑うつ、気管支喘息、アトピー性疾患、自己免疫性脳脊髄炎、臓
器移植、ネフローゼ症候群における塩類貯留および勃起障害が含まれるが、それ
らに限定されない。

【０２２１】 または、ホスホジエステラーゼ核酸発現の調節物質は、薬剤または小型分子が
ホスホジエステラーゼ核酸発現を阻害する限り、本明細書において記載するスク
リーニングを使用して同定された小型分子または薬剤であってもよい。

【０２２２】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはまた、臨床試験または治療方法にお
いて、ホスホジエステラーゼ遺伝子の発現または活性に対する調節化合物の有効
性をモニタリングするのに有用である。従って、遺伝子の発現パターンは、化合
物、特に患者が耐性を形成する可能性のある化合物を用いた治療の持続的な有効
性のバロメーターとして働くことができる。遺伝子の発現パターンはまた、化合
物に対する罹患細胞の生理学的応答を示すマーカーとしても働くことができる。
従って、このようなモニタリングにより化合物の投与の増加または患者が耐性を
形成していない別の化合物の投与が可能になる。同様に、核酸の発現レベルが望
ましいレベルより低下した場合には、化合物の投与を対応して減量してもよい。

【０２２３】 モニタリングは例えば、以下のようにすることができる：(i)薬剤を投与する
前に被検者から投与前試料を入手する、(ii)投与前試料中の本発明の特定のmRNA
またはゲノムDNAの発現レベルを検出する、(iii)被検者から1つ以上の投与後試
料を入手する、(iv)投与後試料中のmRNAまたはゲノムDNAの発現または活性レベ
ルを検出する、(v)投与前試料中のmRNAまたはゲノムDNAの発現または活性レベル
と投与後試料中のmRNAまたはゲノムDNAの発現または活性レベルを比較する、お
よび(vi)被検者への薬剤の投与をそれなりに増減する。

【０２２４】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはまた、ホスホジエステラーゼ核酸の
定量的な変化、特に異常にいたる定量的な変化についての診断アッセイに有用で
ある。ポリヌクレオチドは、mRNAなどのホスホジエステラーゼ遺伝子および遺伝
子発現産物の突然変異を検出するのに使用することができる。ポリペプチドはホ
スホジエステラーゼ遺伝子の天然に生ずる遺伝子突然変異を検出し、それによっ
て突然変異を有する被検者が突然変異によって生ずる障害のリスクを有するかど
うかを判定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用することがで
きる。突然変異には、遺伝子の1つ以上のヌクレオチドの欠損、付加もしくは置
換、反転もしくは転位などの染色体改変、異常なメチル化パターンなどのゲノム
DNAの修飾もしくは増幅などの遺伝子コピー数の変化が含まれる。機能不全に関
連するホスホジエステラーゼ遺伝子の突然変異形態の検出は、その疾患がホスホ
ジエステラーゼの発現過剰、発現低下または発現の変更によって生ずる場合には
活動性疾患または疾患の感受性の診断ツールとなる。

【０２２５】 ホスホジエステラーゼ遺伝子の突然変異は、種々の技法によって核酸レベルで
検出することができる。ゲノムDNAは直接分析されても、分析の前にPCRを使用し
て増幅されてもよい。RNAまたはcDNAは同じように使用することができる。

【０２２６】 ある種の実施態様において、突然変異の検出は、アンカーPCRもしくはRACE PC
Rポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば、米国特許第4,683,195号および同第4,6
83,202号を参照）またはライゲーション連鎖反応(LCR)(例えば、Landegran et a
l. (1988)Science 241:1077-1080およびNakazawa et al. (1994)PNA 91: 360-36
4を参照）においてプローブ/プライマーを使用することに関係し、後者は遺伝子
の点変異を検出するのに特に有用である（Abravaya et al.(1995).Nucleic Acid
s Res. 23: 675-682)。この方法は、患者から細胞試料を回収するステップと、
試料の細胞から核酸（例えば、ゲノム、mRNAまたは両方）を単離するステップと
、核酸試料に、（存在する場合には）遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増
幅が生ずる条件下において特異的に遺伝子にハイブリダイゼーションする1つ以
上のプライマーを接触させるステップと、増幅産物の有無を検出するステップま
たは増幅産物のサイズを検出するステップと、鎖長を対照試料と比較するステッ
プとを含むことができる。欠損および挿入は、正常な遺伝子型と比較したときの
増幅産物のサイズの変化によって検出することができる。点変異は、正常なRNA
またはアンチセンスDNA配列に増幅したDNAをハイブリダイゼーションすることに
よって同定することができる。

【０２２７】 PCRおよび/またはLCRは、本明細書において記載する突然変異を検出するため
に使用される技法のいずれかと併用した予備的な増幅ステップとして使用するた
めに望ましい場合があることが考えられる。

【０２２８】 別の増幅方法には、自己持続配列複製(self sustained sequence replication
)(Guatelli et al. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA87: 1874-1878)、転写増
幅システム(Kwoh et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA86: 1173-1177)、Q
-Beta Replicase(Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6: 1197)または任意
の他の核酸増幅方法、次に当業者に周知の技法を使用した増幅した分子の検出が
含まれる。これらの検出スキームは、このような分子が非常に少数で存在する場
合に核酸分子を検出するのに特に有用である。

【０２２９】 または、ホスホジエステラーゼ遺伝子の突然変異は、例えば、ゲル電気泳動に
よって測定される制限酵素消化パターンの変化によって直接同定することができ
る。

【０２３０】 さらに、配列特異的リボザイム（米国特許第5,498,531号）は、リボザイム切
断部位の形成または損失によって特異的な突然変異の存在のスコアリングに使用
することができる。

【０２３１】 完全にマッチした配列は、ヌクレアーゼ切断消化アッセイまたは融点の差によ
ってミスマッチ配列から識別することができる。

【０２３２】 特定の位置の配列の変化も、RNaseおよびS1保護などのヌクレアーゼ保護アッ
セイまたは化学的切断方法によって評価することができる。

【０２３３】 さらに、突然変異体のホスホジエステラーゼ遺伝子と野生型遺伝子との配列の
差は直接的なDNA配列決定によって求めることができる。質量分析法（例えば、
国際公開公報第94/16101号; Cohen et al.(1996) Adv. Chromatogr. 36: 127-16
2;およびGriffin et al. (1993)Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159)によ
る配列決定を含む診断アッセイ（（1995)Biotechniques 19: 448)を実施する場
合に、種々の自動化配列決定手法を使用することができる。

【０２３４】 遺伝子の突然変異を検出する他の方法には、切断剤からの保護をRNA/RNAまた
はRNA/DNA2本鎖のミスマッチ塩基を検出するために使用する方法(Myers et al.(
1985)Science230:1242); Cotton et al. (1988)PNA 85:4397; Saleeba et al.(1
992) Meth. Enzymol. 217: 286-295)、突然変異体と野生型の核酸の電気泳動移
動度を比較する方法(Orita et al. (1989)PNA 86: 2766; Cotton et al.(1993)
Mutat. Res. 285: 125-144;およびHayashi et al. (1992)Genet. Anal. Tech. A
ppl. 9: 73-79)および濃度を勾配させた変性剤を含有するポリアクリルアミドゲ
ルにおける突然変異体または野生型断片の移動を変性性濃度勾配ゲル電気泳動を
使用してアッセイする方法(Myers et al. (1985)Nature 313: 495)が挙げられる
。アッセイの感度は、二次構造が配列の変化により敏感であるRNA（DNAではなく
）を使用して増強することができる。一実施態様において、本発明の方法は、電
気泳動の移動度の変化に基づいて、2本鎖のヘテロ二本鎖分子を分離するヘテロ
二本鎖分析を利用する(Keen et al. (1991) Trends Genet. 7:5)。点突然変異を
検出するための他の技法の例には選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーシ
ョン、選択的増幅および選択的プライマー伸長が含まれる。

【０２３５】 他の実施態様において、遺伝子の突然変異は、数百または数千のオリゴヌクレ
オチドプローブを含有する高密度アレイに例えば、DNAまたはRNAのような試料お
よび対照の核酸をハイブリダイゼーションすることによって同定することができ
る(Cronin et al. (1996) Human Mutation 7: 244-255; Kozal et al. (1996) N
ature Medicine 2: 753-759)。例えば、遺伝子の突然変異は、Cronin et al.上
記に記載されているように光形成型(light-generated)DNAプローブを含有する2
方向アレイにおいて同定することができる。簡単に説明すると、第1のハイブリ
ダイゼーションプローブアレイは、試料および対照中の長鎖DNAを走査し、配列
が重なったプローブの鎖状アレイを作製することによって配列間の塩基の変化を
同定するために使用することができる。このステップは点変異の同定を可能にす
る。このステップの次には、検出される全ての変異体または突然変異に相補的な
より小型で、特殊化されたプローブアレイを使用することによって、特異的な突
然変異を特徴づけることができる第2のハイブリダイゼーションアレイを使用す
る。各突然変異アレイは、野生型遺伝子に相補的なものと突然変異遺伝子に相補
的なものとのパラレルプローブセットを含む。

【０２３６】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはまた、必ずしも疾患を生じるわけで
はないが、治療法に影響を与える遺伝子型について個人を試験するのに有用であ
る。従って、ポリヌクレオチドは、個人の遺伝子型と治療に使用する化合物に対
する個人の応答との関係を検討するために使用することができる（薬理ゲノミク
ス的関係）。本発明の場合には、例えば、cAMPに対する親和性を変更するホスホ
ジエステラーゼ遺伝子の突然変異により、ホスホジエステラーゼを活性化する標
準的な濃度のcAMPにより薬物の影響が過剰になるまたは低下すると思われる。従
って、本明細書において記載するホスホジエステラーゼポリヌクレオチドは、治
療に適当な化合物または用法を選択するために、個人の遺伝子の突然変異含量を
評価するために使用することができる。

【０２３７】 従って、治療に影響を与える遺伝的変化を示すポリヌクレオチドは、個人に対
する治療を形成するために使用することができる診断標的となる。従って、これ
らの多型を含有する組換え細胞および動物を作製することにより、治療化合物お
よび用法を有効的に臨床設計することができる。

【０２３８】 本発明の方法は、対照被検者から対照生物試料を入手し、mRNAまたはゲノムDN
Aの存在が生物試料中で検出されるように、対照試料にmRNAまたはゲノムDNAを検
出することができる化合物または薬剤を接触させ、対照試料中のmRNAまたはゲノ
ムDNAの存在を試験試料中のmRNAまたはゲノムDNAの存在と比較することに関係し
てもよい。

【０２３９】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはまた、配列が個々の染色体を用いて
、染色体の特定の位置に同定される場合には、染色体同定に有用である。まず、
DNA配列をインサイチューまたは染色体特異的ハイブリダイゼーションによって
染色体にマッチさせる。望ましい種由来の個々の染色体を含有する体細胞ハイブ
リッドのPCRスクリーニングに使用することができるPCRプライマーを作製するこ
とによって特定の染色体に配列を相関させることもできる。プライマーに相同な
遺伝子を含有する染色体を含有するハイブリッドだけが増幅された断片を産生す
る。サブ局在化(sublocalization)は、染色体断片を使用して実施することがで
きる。他の方法は、標識したフロー-ソート型（flow-sorted）染色体を用いた事
前スクリーニングおよび染色体特異的ライブラリーとのハイブリダイゼーション
による事前選択を含む。さらに別のマッピング方法は、従来使用されるものより
短いプローブを用いたハイブリダイゼーションを可能にする蛍光インサイチュー
ハイブリダイゼーションを含む。染色体マッピングの試薬は、1つの染色体また
は染色体の1箇所の部位をマーキングするために個別に使用することができ、ま
た試薬団は多数の部位および/または多数の染色体をマーキングするために使用
することができる。遺伝子の非コード領域に対応する試薬は実際にマッピング目
的に好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内に保されている可能性が高い
ので、染色体マッピング中の交差ハイブリダイゼーションの確率が増加する。

【０２４０】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはまた、少量の生物試料から個人を同
定するために使用することができる。これは、例えば、個人を同定するための、
制限断片長多型(RFLP)を使用して実施することができる。従って、本明細書にお
いて記載するポリヌクレオチドはRFLPのDNAマーカーとして使用される（米国特
許第5,272,057号を参照）。

【０２４１】 さらに、ホスホジエステラーゼ配列は、個人のゲノムの選択された断片の実際
のDNA配列を決定する、別の技法を提供するために使用することができる。従っ
て、本明細書において記載するホスホジエステラーゼ配列は、配列5'側および3'
側末端から2つのPCRプライマーを作製するために使用することができる。次いで
、その後の配列決定のために、これらのプライマーを個人由来のDNAを増幅する
ために使用することができる。

【０２４２】 各個人はこのようなDNA配列の独自のセットを有しているので、このように作
製した個人由来の対応するDNA配列団は独自の個人の識別を提供することができ
る。ヒトの対立遺伝子変異体は各々500塩基ごとに約1回の頻度で生じることが推
定される。対立遺伝子変異体はこれらの配列のコード領域ではある程度生じ、非
コード領域ではかなりの程度生じる。ホスホジエステラーゼ配列は、個人および
組織からこのような識別配列を入手するために使用することができる。配列はヒ
トゲノムの独自の断片である。本明細書において記載する配列の各々は、ある程
度、個人由来のDNAをIDENTIFICATION目的のために比較することができる標準と
して使用することができる。

【０２４３】 配列由来の試薬団が個人の独自の識別データベースを作製するために使用され
る場合には、そのような同じ試薬は後にその個人由来の組織を同定するために使
用することができる。独自の識別データベースを使用して、生存しているまたは
死亡している個人の陽性の識別をきわめて少量の組織試料から実施することがで
きる。

【０２４４】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはまた、法医学的識別手法に使用する
ことができる。PCR技術は、1本の毛嚢、体液（例えば、血液、唾液または精液）
などの非常に少量の生物試料から採取されるDNA配列を増幅するために使用する
ことができる。次いで、増幅した配列を標準と比較し、試料の起源を識別するこ
とができる。

【０２４５】 従って、ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドは、例えば、別の「識別マー
カー」（すなわち、特定の個人に独自の別のDNA配列）を提供することによって
、DNAに基づいた法医学的識別の信頼性を増大することができるヒトゲノムの特
定の遺伝子座を標的とするPCRプライマーのようなポリヌクレオチド試薬を提供
するために使用することができる。上記のように、実際の塩基配列情報は、制限
酵素によって作製される断片によって形成されるパターンの正確な代替物として
識別に使用することができる。非コード領域に標的化する配列は、より大きい多
型が非コード領域内に生じて、この技法を使用して個人を識別することをより容
易にするので、特に有用である。

【０２４６】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドは、特定の組織を同定するために、例
えば、インサイチューハイブリダイゼーション技法に使用することができる標識
化または標識可能なプローブのようなポリヌクレオチド試薬を提供するために使
用することができる。法医学病理学者に未知の起源の組織が提供される場合にも
これは有用である。ホスホジエステラーゼプローブ団は、種および/または器官
の種類によって組織を同定するために使用することができる。

【０２４７】 同様に、これらのプライマーおよびプローブは、汚染について組織培養物をス
クリーニングするために使用することができる（すなわち、培養中の異なる種類
の細胞の混合物の存在についてスクリーニングする）。

【０２４８】 または、ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドは、アンチセンスまたはリボ
ザイム構築物によってホスホジエステラーゼ遺伝子配列の転写または翻訳を直接
遮断するために使用することができる。従って、異常に高いまたは望ましくない
ホスホジエステラーゼ遺伝子の発現によって特徴付けられる障害では、核酸を治
療に直接使用することができる。

【０２４９】 従って、ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドは、細胞、組織および生物に
おけるホスホジエステラーゼ遺伝子の発現をコントロールするためのアンチセン
ス構築物として有用である。DNAアンチセンスポリヌクレオチドは、転写に「関
与する遺伝子領域に相補的であるように設計され、転写、従ってホスホジエステ
ラーゼタンパク質の産生を防止する。アンチセンスRNAまたはDNAポリヌクレオチ
ドはmRNAにハイブリダイゼーションし、従ってmRNAのホスホジエステラーゼタン
パク質への翻訳を遮断する。

【０２５０】 核酸の発現を阻害するのに有用なアンチセンス分子の例には、開始コドンも含
む、配列番号2または配列番号4の5'側非翻訳領域の断片に相補的なアンチセンス
分子および配列番号2または配列番号4の3'側非翻訳領域の断片に相補的なアンチ
センス分子が含まれる。

【０２５１】 または、アンチセンス分子のクラスは、ホスホジエステラーゼ核酸の発現を低
下するために、mRNAを不活性化するために使用することができる。従って、これ
らの分子は、異常または望ましくないホスホジエステラーゼ核酸の発現によって
特徴付けられる障害を治療することができる。この技法は、mRNAを翻訳されにく
くする、mRNAの1箇所以上の領域に相補的なヌクレオチド配列を含有するリボザ
イムによる切断に関係する。可能な領域はコード領域、特にホスホジエステラー
ゼタンパク質の触媒活性および他の機能的活性に対応するコード領域を含む。

【０２５２】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはまた、ホスホジエステラーゼ遺伝子
の発現が異常である細胞を含有する患者に対する遺伝子治療のベクターを提供す
る。従って、半ビボにおいて操作され、患者に戻された患者の細胞を含む組換え
細胞を個人に導入し、そこで細胞は、個人を治療する望ましいホスホジエステラ
ーゼタンパク質を産生する。

【０２５３】 本発明はまた、生物試料中のホスホジエステラーゼ核酸の存在を検出するため
のキットを含む。例えば、キットは、生物試料中のホスホジエステラーゼ核酸を
検出することができる標識化または標識可能な核酸または薬剤などの試薬と、試
料中のホスホジエステラーゼ核酸の量を測定するための手段と、試料中のホスホ
ジエステラーゼ核酸の量を標準と比較するための手段とを含む。化合物または薬
剤は好適な容器内に包装されてもよい。キットはさらにホスホジエステラーゼmR
NAまたはDNAを検出するキットを使用するための使用説明書をさらに含んでもよ
い。

【０２５４】コンピュータ読み込み可能な手段 本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列はまた、それらの使用を容易にする
種々の媒体で提供される。本明細書中で使用される「提供される」は、本発明の
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を含有する、単離された核酸またはアミノ酸分
子以外の製品をいう。このような製品は、それらが天然に存在するまたは精製さ
れた形態で存在するとき、ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列またはそのサブセ
ットを調査するのに直接適用可能でない手段を使用して、当業者が製品を調査す
ることができる形態のヌクレオチドもしくはアミノ酸配列またはそのサブセット
（例えば、オープンリーディングフレーム(ORFs)のサブセット）を提供する。

【０２５５】 この実施態様の一適用において、本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列は
コンピュータ読み取り可能な媒体に記録することができる。本明細書中で使用さ
れる「コンピュータ読み取り可能な媒体」は、コンピュータによって直接読み、
評価することができる任意の媒体をいう。このような媒体には、フロッピーディ
スク、ハードディスク記憶媒体および磁気テープなどの磁気記憶媒体、CD-ROMな
どの光学的記憶媒体、RAMおよびROMなどの電気的記憶媒体並びに磁気的/工学的
記憶媒体などのこのようなカテゴリーのハイブリッドが含まれるが、それらに限
定されない。当業者は、現在既知のコンピュータ読み込み可能な媒体のいずれが
、本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を記録したコンピュータ読み込み可
能な媒体を含む製品を作製するために使用することができるかを容易に評価する
ことができる。

【０２５６】 本明細書中で使用される「記録された」は、コンピュータ読み込み可能な媒体
に情報を保存するための過程をいう。当業者は、本発明のヌクレオチドまたはア
ミノ酸配列情報を含む製品を作製するためにコンピュータ読み込み可能な媒体に
情報を記録するための現在既知の方法のいずれかを容易に採用することができる
。

【０２５７】 本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列が記録されたコンピュータ読み込み
可能な媒体を作製するために、種々のデータ記憶構造物が当業者に利用可能であ
る。データ記憶構造物の選択は、一般に、記憶される情報を利用するために選択
される手段に基づく。また、種々のデータプロセッサプログラムおよびフォーマ
ットを、コンピュータ読み込み可能な媒体に本発明のヌクレオチド配列情報を記
憶するために使用することができる。配列の情報はWordPerfectおよびMicrosoft
Wordなどの市販のソフトウェアーでフォーマットされたワードプロセシングテ
キストファイルで提供されても、またはASCIIファイルの形態で提供されてもよ
く、DB2、Sybase、Oracle等などのデータベースアプリケーションに記憶するこ
とができる。当業者は、本発明のヌクレオチド配列情報が記録されたコンピュー
タ読み込み可能な媒体を入手するために、任意の数のデータプロセッサ構造形式
（例えば、テキストファイルまたはデータベース）に容易に順応することができ
る。

【０２５８】 コンピュータ読み込み可能な形態の本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列
を提供することによって、当業者は、種々の目的のために配列情報を通常利用す
ることができる。例えば、当業者は、標的配列または標的構造モチーフをデータ
記憶手段内に記憶した配列情報と比較するために、コンピュータ読み込み可能な
形態の本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を使用することができる。検索
手段は、特定の標的配列または標的モチーフにマッチする本発明の配列の断片ま
たは領域を同定するために使用することができる。

【０２５９】 本明細書中で使用される「標的配列」は、6以上のヌクレオチドまたは2つ以上
のアミノ酸の任意のDNAまたはアミノ酸配列であってもよい。標的配列が長いほ
ど、データベース中にランダム出現(random occurrence)として存在する可能性
が低いことを当業者は容易に認識することができる。標的配列の最も好ましい配
列の鎖長は約10〜100アミノ酸または約30〜300ヌクレオチド残基である。しかし
、遺伝子発現およびタンパク質プロセッシングに関与する配列断片などの市販的
に重要な断片はより短い鎖長であってもよいことが十分に認識される。

【０２６０】 本明細書中で使用される「標的構造モチーフ」または「標的モチーフ」は、タ
ンパク質モチーフの折りたたみの結果形成される三次元的配置に基づいて配列が
選択される合理的に選択される任意の配列または配列の組合せをいう。当技術上
周知の種々の標的モチーフが存在する。タンパク質標的モチーフには、酵素活性
部位およびシグナル配列が含まれるが、それらに限定されない。核酸標的モチー
フには、プロモーター配列、ヘアピン構造および誘導性発現要素（タンパク質結
合配列）が含まれるが、それらに限定されない。

【０２６１】 分析および他の配列と比較するために、コンピュータ読み込み可能な媒体の形
態で提供される配列情報を当業者が利用することができるコンピュータソフトウ
ェアーが公的に利用可能である。種々の既知のアルゴリズムが公的に開示されて
おり、検索手段を実施するための市販の種々のソフトウェアーが本発明のコンピ
ュータに基づいたシステムに使用されており、また使用することができる。この
ようなソフトウェアーの例には、MacPattern(EMBL)、BLASTNおよびBLASTX(NCBIA
)が含まれるが、それらに限定されない。

【０２６２】 例えば、BLAST(Altshul et al. (1990)J. Mol. Biol. 215: 403-410)およびBL
AZE(Brutlag et al.(1993) Comp. Chem. 17: 203-207)検索アルゴリズムをSybas
eシステムで実施するソフトウェアーは、他のライブラリーのORFsまたはタンパ
ク質との相同性を有する本発明の配列のオープンリーディングフレーム(ORFs)を
同定するために使用することができる。このようなORFsはタンパク質をコードす
る断片であり、種々の反応に使用される酵素などの市販的に重要なタンパク質を
産生する際および市販的に有用な代謝物を産生する際に有用である。

【０２６３】 ベクター/宿主細胞 本発明はまた、ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドを含有するベクターを
提供する。「ベクター」という用語は、担体、好ましくは、ホスホジエステラー
ゼポリヌクレオチドを輸送することができる核酸分子をいう。ベクターが核酸分
子である場合には、ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはベクター核酸に共
有結合する。本発明のこの態様では、ベクターはプラスミド、1本鎖もしくは2本
鎖ファージ、1本鎖もしくは2本鎖RNAまたはDNAウィルスベクター、またはBAC、P
AC、YAC OR MACなどの人工的な染色体を含む。

【０２６４】 ベクターは、ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドの追加のコピーを複製し
、作製する場合には、染色体外要素として宿主細胞内に維持されうる。または、
ベクターは宿主細胞ゲノムに組み込まれて、宿主細胞が複製するとき、ホスホジ
エステラーゼポリヌクレオチドの追加のコピーを作製することができる。

【０２６５】 本発明は、ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドの維持のベクター（クロー
ニングベクター）または発現のベクター（発現ベクター）を提供する。ベクター
は、原核細胞もしくは真核細胞または両者において作用することができる（シャ
トルベクター）。

【０２６６】 発現ベクターは、ポリヌクレオチドの転写が宿主細胞内で可能であるように、
ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドのベクターに機能的に結合するシス作用
型調節領域を含有する。ポリヌクレオチドは、転写に影響を与えることができる
別個のポリヌクレオチドと共に宿主細胞に導入されてもよい。従って、第2のポ
リヌクレオチドは、ベクターからのホスホジエステラーゼポリヌクレオチドの転
写を可能にするために、シス-調節コントロール領域と相互作用するトランス-作
用型因子を提供することができる。または、トランス-作用型因子は宿主細胞に
よって供給されてもよい。最後にトランス-作用型因子は、ベクター自体から作
製されてもよい。

【０２６７】 しかし、ある実施態様では、ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドの転写お
よび/または翻訳が細胞不含系で生じうることが理解される。

【０２６８】 本明細書において記載するポリヌクレオチドが機能的に結合する調節配列には
、mRNAの転写を指示するプロモーターが含まれる。これらには、バクテリオファ
ージλの左側プロモーター、大腸菌(E.coli)のlac、TRPおよびTACプロモーター
、SV40の早期および後期プロテインキナーゼ、CMV即時型プロモーター、アデノ
ウィルス早期および後期プロモーター並びにレトロウィルス末端反復配列が含ま
れるが、それらに限定されない。

【０２６９】 転写を促進するコントロール領域以外に、発現ベクターは、リプレッサー結合
部位およびエンハンサーなどの転写を調節する領域を含んでもよい。例には、SV
40エンハンサー、サイトメガロウィルス即時型エンハンサー、ポリオーマエンハ
ンサー、アデノウィルスエンハンサーおよびレトロウィルスLTRエンハンサーが
含まれる。

【０２７０】 転写開始およびコントロールのための部位を含有する以外に、発現ベクターは
また、転写停止に必要な配列および転写領域に翻訳のためのリボザイム結合部位
を含有する。発現のための他の調節コントロール要素には開始および停止コドン
並びにポリアデニル化シグナルを含む。当業者は、発現ベクターに有用な数多く
の調節配列に気づいているだろう。このような調節配列は、例えば、Sambrook e
t al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. ed., Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)に記載されている。

【０２７１】 種々の発現ベクターがホスホジエステラーゼポリヌクレオチドを発現するため
に使用することができる。このようなベクターには染色体、エピソームおよびウ
ィルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピ
ソーム、酵母人工染色体を含む酵母染色体要素、バキュロウィルス、SV40などの
パポバウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、ポックスウィルス、仮
性狂犬病ウィルスおよびレトロウィルスなどのウィルスから誘導されるベクター
が含まれる。ベクターは、プラスミドとバクテリオファージ遺伝子要素から誘導
されるものなどのこれらの起源の組合せ、例えば、コスミドおよびファージミド
から誘導されてもよい。原核宿主および真核宿主のための適当なクローニングお
よび発現ベクターはSambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual 2nd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbo
r, NYに記載されている。

【０２７２】 調節配列は、1つ以上の宿主細胞（例えば、組織特異的）において構成的発現
を提供しても、温度、栄養素添加またはホルモンもしくは他のリガンドなどの外
因的な因子などの1つ以上の細胞種において誘導性発現を提供してもよい。原核
および真核宿主において構成的および誘導性発現を提供する種々のベクターは当
業者に周知である。

【０２７３】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドは、周知の方法によってベクター核酸
に挿入することができる。一般に、最終的に発現されるDNA配列は、DNA配列およ
び発現ベクターを1つ以上の制限酵素切断し、次いで断片を一体としてライゲー
ションすることによって、発現ベクターに結合される。制限酵素消化およびライ
ゲーションの手法は当業者に周知である。

【０２７４】 適当なポリヌクレオチドを含有するベクターは、周知の技法を使用して、増殖
または発現のために適当な宿主細胞に導入することができる。細菌細胞には、大
腸菌(E.coli)、放線菌(Streptpmyces)およびネズミチフス菌（Salmonella typhi
murium)が含まれるが、それらに限定されない。真核細胞には、酵母、ショウジ
ョウバエ(Drosophila)などの昆虫細胞、COSおよびCHO細胞などの動物細胞並びに
植物細胞が含まれるが、それらに限定されない。

【０２７５】 本明細書において記載するように、ポリペプチドを融合タンパク質として発現
することが望ましい場合がある。従って、本発明は、ホスホジエステラーゼポリ
ヌクレオチドの作製を可能にする融合ベクターを提供する。融合ベクターは組換
えタンパク質の発現を増加し、組換えタンパク質の溶解度を増加し、例えば、親
和性精製のためのリガンドとして作用することによってタンパク質の精製の助力
となることができる。望ましいタンパク質が最終的に融合部分から分離されうる
ように、タンパク質分解切断部位を融合部分の接続部に導入することができる。
タンパク質分解酵素には、第Xa因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含ま
れるが、それらに限定されない。典型的な融合発現ベクターには、グルタチオン
S-トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合タンパク質またはプロテインAを
それぞれ標的組換えタンパク質に融合するpGEX(Smith et al. (1988)Gene 67: 3
1-40)、pMAL(New England Biolabs, Beverly, MA)およびpRIT5(Pharmacia, Pisc
ataway, NJ)が含まれる。好適な誘導性非融合大腸菌(E.coli)発現ベクターの例
にはpTrc(Amann et al.(1988)Gene 69: 301-315)およびpET 11d(Studier et al.
(1990)Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185:60-89)が含ま
れる。

【０２７６】 組換えタンパク質発現は、宿主細胞は組換えタンパク質をタンパク質分解的に
切断する能力が損傷している遺伝的バックグラウンドを提供することによって、
宿主細菌ないで最大にすることができる。(Gottesman, S.(1990)Gene Expressio
n Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diedo, Cali
fornia 119-128)。または、特定の宿主細胞、例えば、大腸菌(E.coli)に優先的
なコドン利用性を提供するように、関心のあるポリヌクレオチドの配列を改変す
ることができる(wada et al.(1992)Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118)。

【０２７７】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはまた、酵母において機能的である発
現ベクターによって発現されうる。酵母、例えば、S. セレビシエ(S. cerevisia
e) における発現のためのベクターの例にはpYepSec1(Baldari et al. (1987) EM
BO J. 6: 229-234)、pMFa(Kurjan et al.(1982)Cell 30: 933-943)、pJRY88(Sch
ultz et al. (1987) Gene 54: 113-123)およびpYES2(Invitorogen Corporation,
San Diego, CA) が挙げられる。

【０２７８】 ホスホジエステラーゼポリヌクレオチドはまた、例えば、バキュロウィルス発
現ベクターを使用して昆虫細胞中で発現されうる。培養中の昆虫細胞（例えば、
Sf9細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウィルスベクターに
はpAcシリーズ(Smith et al.(1983)Mol. Cell Biol. 3:2156-2165)およびpVLシ
リーズ(Lucklow et al. (1989)Virology 170: 31-39)が挙げられる。

【０２７９】 本発明のある種の実施態様において、本明細書において記載するポリヌクレオ
チドは、哺乳類発現ベクターを使用して哺乳類細胞中で発現される。哺乳類発現
ベクターの例にはpCDM8(Seed, B. (1987)Nature 329:840)およびpMT2PC(Kaufman
et al.(1987)EMBO J. 6: 187-195)が挙げられる。

【０２８０】 本明細書に掲載する発現ベクターは、ホスホジエステラーゼポリヌクレオチド
を発現するために有用であると思われる、当業者に利用可能な周知のベクターを
例示するためだけに提供されている。当業者は、本明細書において記載するポリ
ヌクレオチドの維持増殖または発現に好適な他のベクターに気づくだろう。これ
らは、例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Man
ual 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, Cold Spring Harbor, NYに見出される。

【０２８１】 本発明はまた、本明細書において記載する核酸配列が逆方向でベクターにクロ
ーニングされるが、アンチセンスRNAの転写を可能にする調節配列に機能的に結
合するベクターを含む。従って、アンチセンス転写物は、コード領域および非コ
ード領域を含む、本明細書において記載するポリヌクレオチド配列の全てまたは
一部に対して作製することができる。このアンチセンスRNAの発現をセンスRNAの
発現に関連して上記したパラメーターの各々に供する（調節配列、構成または誘
導性発現、組織特異的発現）。

【０２８２】 本発明はまた、本明細書において記載するベクターを含有する組換え宿主細胞
に関する。従って、宿主細胞には原核細胞、酵母などの下等真核細胞、昆虫細胞
などの他の真核細胞、および哺乳類細胞などの高等真核細胞が含まれる。

【０２８３】 組換え宿主細胞は、当業者に容易に利用可能な技法によって、細胞内に本明細
書において記載するベクター構築物を導入することによって作製される。これら
には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介型トラ
ンスフェクション、陽イオン性脂質媒介型トランスフェクション、エレクトロポ
レーション、トランスダクション、感染、リポフェクションおよびSambrook et
al. ( Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbo
r Laboratory , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY)に見出されるものなどの他の技法が含まれるが、それらに限定されない。

【０２８４】 宿主細胞は2つ以上のベクターを含有してもよい。従って、異なるヌクレオチ
ド配列が同じ細胞の異なるベクターに導入されることがある。同様に、ホスホジ
エステラーゼポリヌクレオチドは単独で導入されても、または発現ベクターのた
めにトランス-作用型因子を提供するものなどのホスホジエステラーゼポリヌク
レオチドに関連しない他のポリヌクレオチドと共に導入されてもよい。1つ以上
のベクターが細胞に導入される場合には、ベクターは独立に導入されても、同時
に導入されてもまたはホスホジエステラーゼポリヌクレオチドベクターに結合さ
れてもよい。

【０２８５】 バクテリオファージおよびウィルスベクターの場合には、これらは、感染およ
びトランスダクションのための標準的な手法によってパッケージングされたウィ
ルスまたは封入されたウィルスとして細胞に導入することができる。ウィルスベ
クターは、複製能力型または複製欠損型であってもよい。ウィルス複製が欠損し
ている場合には、複製は、欠損を補う機能を提供した宿主細胞において生じる。

【０２８６】 ベクターは、一般に、組換えベクター構築物を含有する細胞の亜集団の選択を
可能にする選択可能なマーカーを含む。マーカーは本明細書において記載するポ
リヌクレオチドを含有する同じベクターに含有されても、または別個のベクター
上にあってもよい。マーカーには、原核宿主細胞のテトラサイクリンまたはアン
ピシリン耐性遺伝子並びに真核宿主細胞のジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイ
シン耐性が上げられる。しかし、表現型の特徴を選択するいかなるマーカーも有
効である。

【０２８７】 成熟タンパク質は細菌、酵母、哺乳類細胞および他の細胞中で適当な調節配列
のコントロール下において作製することができるが、細胞不含転写および翻訳系
も、本明細書において記載するDNA構築物から誘導されるRNAを使用してこれらの
タンパク質を作製するために使用することができる。

【０２８８】 ポリペプチドの分泌が望ましい場合には、適当な分泌シグナルをベクターに導
入する。シグナル配列はホスホジエステラーゼポリヌクレオチドの内因性であっ
ても、これらのポリペプチドの異種であってもよい。

【０２８９】 ポリペプチドが培地中に分泌されない場合には、タンパク質は、凍結融解、超
音波処理、機械的破壊、融解剤の使用等を含む標準的な破壊手法によって宿主細
胞から単離することができる。次いで、ポリペプチドを回収し、硫酸アンモニウ
ム沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセル
ロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティ
クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロ
マトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーを含む周知の精製方法によっ
て精製することができる。

【０２９０】 本明細書において記載するポリヌクレオチドの組換え作製における宿主細胞に
応じて、ポリペプチドは、細胞に応じて種々のグリコシル化パターンを有しても
よく、細菌中で作製される場合にはグリコシル化されなくてもよい。また、ポリ
ペプチドは、宿主媒介過程の結果としてある場合には初期の修飾(initial modif
ied )メチオニンを含んでもよい。

【０２９１】ベクターおよび宿主細胞の使用 「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、特定の被検者細胞だけでなく、こ
のような細胞の子孫または可能な子孫もいうことが理解される。ある種の修飾は
、突然変異または環境的な影響により次の世代に生ずることがあるので、このよ
うな子孫は実際には親細胞と同一でないことがあるが、それでも本明細書中で使
用される用語の範囲内に含まれる。

【０２９２】 本明細書において記載するポリペプチドを発現する宿主細胞、特に組換え宿主
細胞は種々の用途を有する。第一に、細胞は、望ましい量のホスホジエステラー
ゼタンパク質または断片を作製するためにさらに精製することができるホスホジ
エステラーゼタンパク質またはポリペプチドを作製するのに有用である。従って
、発現ベクターを含有する宿主細胞はポリペプチド作製に有用である。

【０２９３】 宿主細胞はまた、ホスホジエステラーゼまたはホスホジエステラーゼ断片に関
係する細胞系アッセイを実施するのに有用である。従って、天然のホスホジエス
テラーゼを発現する組換え宿主細胞は、ホスホジエステラーゼ機能を刺激または
阻害する化合物のアッセイに有用である。これはcAMP結合、転写または翻訳レベ
ルでの遺伝子発現、プロテインキナーゼA相互作用および信号伝達経路の成分を
含む。

【０２９４】 宿主細胞はまた、これらの機能が影響されているホスホジエステラーゼ突然変
異体を同定するのに有用である。突然変異体が天然に生じ、異常を生ずる場合に
は、突然変異を含有する宿主細胞は、天然のホスホジエステラーゼに対する影響
によっては示されない突然変異ホスホジエステラーゼに対する望ましい影響（例
えば、機能を刺激または阻害する）を有する化合物をアッセイするのに有用であ
る。

【０２９５】 組換え宿主細胞はまた、本明細書に開示されている異種ドメイン、セグメント
、部位等によって活性を活性化または抑制する化合物を評価するために、本明細
書において記載するキメラポリペプチドを発現するのに有用である。

【０２９６】 さらに、種々の機能の1つ以上が増加または減少されるように操作される（例
えば、cAMP結合またはキナーゼA結合）突然変異ホスホジエステラーゼを設計す
ることができ、個人のホスホジエステラーゼタンパク質を増加または交換するた
めに使用することができる。従って、宿主細胞は、異常なホスホジエステラーゼ
を交換することによって、または治療結果を提供する異常なホスホジエステラー
ゼを提供することによって、治療的恩恵を提供することができる。一実施態様に
おいて、細胞は、異常に活性であるホスホジエステラーゼを提供する。

【０２９７】 別の実施態様において、細胞は、異常に不活性であるホスホジエステラーゼを
提供する。これらのホスホジエステラーゼは個人において内因性ホスホジエステ
ラーゼと競合することができる。

【０２９８】 別の実施態様において、cAMPに対して内因性ホスホジエステラーゼと競合する
ために、活性化されることができないホスホジエステラーゼを発現する細胞を個
人に導入する。例えば、過剰なcAMPが治療法の一部である場合には、治療のある
時点においてこの分子を不活性化することが必要になる場合がある。この分子に
対して競合するが、ホスホジエステラーゼ活性化によって影響されえない細胞を
提供することが有用であると思われる。

【０２９９】 宿主細胞ゲノムの内因性ホスホジエステラーゼポリヌクレオチド配列のインサ
イチュー変更を可能にする相同組換え宿主細胞を作製することもできる。この技
術は国際公開公報第93/09222号、国際公開公報第91/12650号および米国特許第5,
641,670号にさらに詳細に記載されている。簡単に説明すると、遺伝子の発現に
影響を与えることができる相同組換えによって、ホスホジエステラーゼポリヌク
レオチドまたはホスホジエステラーゼ遺伝子の近位もしくは遠位配列に対応する
特定のポリヌクレオチド配列を宿主細胞ゲノムに導入することが可能である。一
実施態様において、内因性配列の発現を増加または減少する調節配列が導入され
る。従って、通常ではホスホジエステラーゼタンパク質を産生しない細胞におい
てホスホジエステラーゼタンパク質を作製することができ、またはホスホジエス
テラーゼタンパク質の発現の増加により、特定レベルのタンパク質を通常に産生
する細胞を生ずることができる。または、遺伝子全体が欠損することがある。突
然変異ホスホジエステラーゼタンパク質を作製するために、遺伝子の任意の望ま
しい領域にさらに別の特定の突然変異を導入することができる。このような突然
変異は、例えば、本明細書に開示される特定の領域に導入されてもよい。

【０３００】 一実施態様において、宿主細胞は、改変されたホスホジエステラーゼ遺伝子を
含有するトランスジェニック動物を作製するために使用することができる受精卵
母細胞または胚性幹細胞であってもよい。または、宿主細胞は、特定のサブセッ
トの細胞を生じ、動物においてトランスジェニック組織を形成することができる
幹細胞または他の早期組織前駆体であってもよい。相同組換えベクターの記載は
Thomas et al.,Cell 51: 503(1987)も参照。ベクターは（例えば、エレクトロポ
レーションによって）胚性幹細胞系統に導入され、導入した遺伝子が内因性ホス
ホジエステラーゼ遺伝子と相同組換えした細胞を選択する（例えば、Li. E. et
al.(1992)Cell 69: 915)。次いで、キメラ集合体を形成するために、選択した細
胞を動物（例えば、マウス）の胚盤胞に挿入する（例えば、Bradley, A. in Tet
racarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Rober
toson, ed.(IRL, Oxford, 1987) pp. 113-152を参照）。次いで、キメラ胚を好
適な擬似妊娠した雌里親動物に植え込み、胚を満期まで生育させることができる
。生殖細胞に相同組換えDNAを保有する子孫を使用して、トランスジーンの生殖
細胞系統伝達によって動物の全ての細胞が相同組換えDNAを含有する動物を繁殖
させることができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するため
の方法はBradley, A. (1991)Current Opinion in Biotechnology 2: 823-829お
よび国際公開公報第90/11354号、国際公開公報第91/01140号および国際公開公報
第93/04169号にさらに記載されている。

【０３０１】 遺伝的に操作された宿主細胞を使用して、ヒト以外のトランスジェニック動物
を作製することができる。トランスジェニック動物は、好ましくは、動物の細胞
の1つ以上がトランスジーンを含む、哺乳類、例えば、ラットまたはマウスなど
のげっ歯類である。トランスジーンは、トランスジェニック動物が発生する細胞
のゲノムに導入され、トランスジェニック動物の1つ以上の細胞種または組織の
成熟動物のゲノムに保持される外因性DNAである。これらの動物は、ホスホジエ
ステラーゼタンパク質の機能を検討するため、並びにホスホジエステラーゼタン
パク質活性の調節物質を同定および評価するために有用である。

【０３０２】 トランスジェニック動物の他の例には、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウ
シ、ヤギ、ニワトリおよび両生類が含まれる。

【０３０３】 一実施態様において、宿主細胞は、ホスホジエステラーゼポリヌクレオチド配
列が導入されている受精卵母細胞または胚性幹細胞である。

【０３０４】 トランスジェニック動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウィ
ルス感染によって受精卵母細胞の雄前核に核酸を導入し、擬似妊娠した雌里親度
物内で卵母細胞を発生させることによって作製することができる。ホスホジエス
テラーゼヌクレオチド配列のどれもトランスジーンとしてマウスなどのヒト以外
の動物のゲノムに導入されうる。

【０３０５】 発現ベクターに有用な調節配列または他の配列のいずれかがトランスジーン配
列の一部を形成してもよい。すでに含まれていない場合には、これらにはイント
ロン配列およびポリアデニル化シグナルが含まれる。組織特異的調節配列が、特
定の細胞にホスホジエステラーゼタンパク質を発現させるためにトランスジーン
に作動的に結合してもよい。

【０３０６】 胚操作およびマイクロインジェクションによりトランスジェニック動物、特に
マウスなどの動物を作製するための方法は当技術上では通常であり、例えば、共
にLeder et alによる米国特許第4,736,866号および同第4,870,009号、Wagner et
al.による米国特許第4,873,191号並びにHogan, B., Manipulating the Mouse E
mbyo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY., 198
6)に記載されている。同様の方法が他のトランスジェニック動物を作製するため
に使用される。トランスジェニック始祖動物は、動物の組織または細胞における
ゲノム内のトランスジーンの存在および/またはトランスジェニックmRNAの発現
に基づいて同定することができる。次いで、トランスジェニック始祖動物を使用
して、トランスジーンを保有する別の動物を繁殖させることができる。さらに、
トランスジーンを保有するトランスジェニック動物を、他のトランスジーンを保
有する他のトランスジェニック動物にさらに繁殖させることができる。トランス
ジェニック動物はまた、本明細書において記載する相同組換え宿主細胞を使用し
て、動物全体または動物の組織が作製されている動物を含む。

【０３０７】 別の実施態様において、トランスジーンの発現の調節が可能になる選択された
系を含有するトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。このよう
な系の一例は、バクテリオファージP1のcre/loxPリコンビナーゼ系である。cre/
loxPリコンビナーゼ系の記載は、例えば、Lakso et al.(1992) PNA 89: 6232-62
36を参照。リコンビナーゼ系の別の例はS. セレビシエ(S. cerevisiae)のFLPリ
コンビナーゼ系である（O'Gorman et al. (1991)Science 251: 1351-1335である
。cre/loxPリコンビナーゼ系をトランスジーンの発現を調節するために使用する
場合には、Creリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする
トランスジーンを含有する動物が必要である。このような動物は、例えば、一方
が選択されたタンパク質をコードするトランスジーンを含有し、他方がリコンビ
ナーゼをコードするトランスジーンを含有する2匹のトランスジェニック動物を
交配することによって、「ダブル」トランスジェニック動物を構築することによ
り提供することができる。

【０３０８】 本明細書において記載するヒト以外のトランスジェニック動物のクローンも、
Wilmut et al. (1997)Nature 385: 810-813および国際公開公報第97/07668号お
よび国際公開公報第97/07669号に記載されている方法により作製することができ
る。簡単に説明すると、トランスジェニック動物の細胞、例えば、体細胞を単離
し、増殖期を出て、G₀期に入るように誘導することができる。静止期の細胞を単
離した同じ種の動物の脱核卵母細胞に、例えば、電気パルスを使用することによ
り、静止期の細胞を融合することができる。次いで、再構築した卵母細胞が桑実
胚または胚盤胞まで発生するように培養し、擬似妊娠した雌里親動物に移す。こ
の雌里親動物から生まれる子孫は、細胞、例えば、体細胞が単離される動物のク
ローンである。

【０３０９】 本明細書において記載するポリペプチドを発現する組換え細胞を含有するトラ
ンスジェニック動物は、インビボにおいて本明細書において記載するアッセイを
実施するのに有用である。従って、インビボにおいて存在し、cAMP結合、ホスホ
ジエステラーゼ活性化およびシグナル伝達に影響を与えると思われる種々の生理
学的因子は、インビトロにおける細胞不含アッセイまたは細胞系アッセイからは
明らかにならない可能性がある。従って、cAMP相互作用、ホスホジエステラーゼ
機能およびcAMP相互作用に対する特定の突然変異ホスホジエステラーゼの影響並
びにキメラホスホジエステラーゼの影響を含むホスホジエステラーゼ機能をイン
ビボにおいてアッセイすることは、ヒト以外のトランスジェニック動物を提供す
るのに有用である。また、ヌル(nul)突然変異、すなわち、1つ以上のホスホジエ
ステラーゼ機能を実質的にまたは完全に排除する突然変異の影響を評価すること
も可能である。

【０３１０】製薬学的組成物 ホスホジエステラーゼ核酸分子、タンパク質（細胞外ループ）、タンパク質
の調節物質および抗体（「作用化合物」と本明細書においていわれる）を、被検
者、例えば、ヒトに投与するのに好適な製薬学的組成物に組み入れることができ
る。このような組成物は、典型的には、核酸分子、タンパク質、調節物質または
抗体および製薬学的に許容されうる担体を含む。

【０３１１】 「投与する」という用語は広義に使用され、被検者に本発明の組成物を導入す
る任意の方法を含む。これは、被検者に外因的に導入されているポリヌクレオチ
ドのインビボにおける転写または翻訳によるようにポリペプチドまたはポリヌク
レオチドをインビボにおいて作製することを含む。従って、外因性組成物から被
検者において作製されるポリペプチドまたは核酸は「投与する」という用語に含
まれる。

【０３１２】 本明細書中で使用される「製薬学的に許容されうる担体」という用語は、製剤
の投与に適合される、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、
等張剤および吸収遅延剤等のいずれかおよび全てを含むことが意図されている。
製薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当技術上周知
である。任意の従来の媒体または薬剤が作用化合物と適合性でない場合を除いて
、このような媒体は本発明の組成物に使用することができる。追加の作用化合物
を組成物に組み入れることもできる。

【０３１３】 本発明の製薬学的組成物は、意図された投与経路に適合性であるように製剤化
される。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例え
ば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与が含まれる。非経口、皮内ま
たは皮下適用に使用される溶液または懸濁液は以下の成分を含んでもよい：注射
用水などの滅菌希釈液、生理食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グ
リセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒、ベンジルアルコールまた
はメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムな
どの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩
またはリン酸塩などの緩衝剤および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの
浸透圧を調節するために薬剤。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸また
は塩基で調節することができる。非経口用製剤は、ガラスまたはプラスチックか
ら製造されるアンプル、ディスポーサブルシリンジまたは多数回投与用バイアル
内に封入されてもよい。

【０３１４】 注射用用途に好適な製薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分
散剤および滅菌注射用溶液または分散剤の即時調製用の滅菌粉末を含む。静脈内
投与のためには、好適な担体には生理食塩液、静菌水、登録商標Cremophor EL(B
ASF, Parsippany, NJ)またはリン酸緩衝生理食塩液(PBS)が含まれる。全ての場
合において、組成物は滅菌されていなければならず、容易なシリンジ性(syringa
bility)が存在する程度に流動性でなければならない。組成物は、製造および保
存条件下において安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作
用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオー
ル（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコールおよび液体ポリエチレング
リコール等）並びにそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒体であっ
てもよい。例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散
剤の場合には必要な粒子サイズを維持することによっておよび界面活性剤を使用
することによって適切な流動性を維持することができる。微生物の活動の防止は
、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロ
サール等のような種々の抗菌剤および抗真菌剤によって実施することができる。
多数の場合において、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアル
コール、塩化ナトリウムを組成物に含むことが好ましい。注射用組成物の吸収の
延長は、組成物中に、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの
ような吸収を遅延する薬剤を含ませることによって生じることができる。

【０３１５】 滅菌注射用溶液は、適当な溶媒中に必要な量の作用化合物（例えば、ホスホジ
エステラーゼタンパク質または抗-ホスホジエステラーゼ抗体）を適宜上記に列
挙した成分の1つまたは組合せと共に組み入れ、その後ろ過滅菌することによっ
て調製することができる。一般に、分散剤は、基本的な分散媒体および上記に列
挙したもののうち必要な他の成分を含有する滅菌基剤に作用化合物を組み入れる
ことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合には
、好ましい調製方法は、以前に滅菌ろ過した溶液から作用成分プラス任意の追加
の望ましい成分を得る真空乾燥および凍結乾燥である。

【０３１６】 経口組成物は、一般に不活性な希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチ
ンカプセルに封入されても、錠剤に打錠されてもよい。経口投与のためには、薬
剤は胃で分解されないように腸溶形態で含有されても、既知の方法によって消化
管の特定の領域で放出されるようにコーティングまたは混合されてもよい。経口
治療投与の目的のためには、作用化合物は賦形剤と共に組み入れてもよく、錠剤
、トローチまたはカプセルの形態で使用してもよい。経口組成物はまた、液体担
体中の化合物が経口的に適用され、ブクブクして(swished)、吐き出すまたは飲
み込むうがい薬として使用するための液体の担体を使用して調製することができ
る。製薬学的に適合可能な結合剤および/または補助物質を組成物の一部として
含ませることができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチ等は以下の成分のいず
れかまたは同様の性質の化合物を含有してもよい：微結晶セルロース、トラガカ
ントゴムまたはゼラチンなどの結合剤、デンプンまたは乳糖などの賦形剤、アル
ギン酸、Primogelまたはコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウ
ムまたはSterotesなどの潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素などの滑り剤(glidant
)、ショ糖またはサッカリンなどの甘味剤またはペパーミント、サリチル酸メチ
ルもしくはオレンジ香料などの香味剤。

【０３１７】 吸入による投与のためには、化合物は、二酸化炭素などのガスのような好適な
プロペラントを含有する加圧容器もしくはディスペンサーまたはネブライザーか
らエアゾールスプレーの形態で送達される。

【０３１８】 全身投与は、経粘膜または経皮敵手段によってもよい。経粘膜または経皮投与
のためには、浸透予定の障壁に適当な浸透剤が製剤に使用される。このような浸
透剤は、一般に、当技術上周知で、経粘膜投与のために、例えば、界面活性剤、
胆汁酸およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、経鼻的スプレーまたは坐
剤の使用により実施することができる。経皮的投与のためには、作用化合物は、
一般に当技術上周知の軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに製剤化される。

【０３１９】 化合物はまた、直腸送達用の坐剤（例えば、カカオ脂および他のグリセリドな
どの従来の坐剤基剤と共に）または停留型浣腸剤の形態に調製することができる
。

【０３２０】 一実施態様において、作用化合物は、植込み物およびマイクロカプセル封入型
送達系を含む、放出制御製剤などの、体内から化合物を迅速に排出させない担体
を用いて調製される。エチレンビニルアセテート、ポリアンハイドライド、ポリ
グリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの、生物分
解性で生体適合性のポリマーを使用することができる。このような製剤を調製す
るための方法は当業者に明らかである。材料はAlza CorporationおよびNova Pha
rmaceuticals, Inc.からも購入可能である。リポソーム懸濁液（感染細胞に標的
化するリポソームおよびウィルス抗原に対するモノクローナル抗体を含む）も製
薬学的に許容されうる担体として使用することができる。これらは、例えば、米
国特許第4,522,811号に記載されているように、当業者に周知の方法により調製
することができる。

【０３２１】 投与を容易にし、用量を均一にするために、経口または非経口組成物を投与単
位形態に製剤化することが特に有利である。本明細書中で使用される「投与単位
形態」は、被治療被検者のための単位投与として好適な物理的に別個の単位をい
い、各単位は、必要な製薬学的担体に関連して望ましい治療効果を生ずるように
算出された所定の量の作用化合物を含有する。本発明の投与単位形態の仕様は、
作用化合物の独自の特徴および達成される特定の治療効果、並びに個人を治療す
るためにこのような作用化合物を化合する当技術上本質的な限界によって要求さ
れ、直接依存する。

【０３２２】 本発明の核酸分子はベクターに挿入されて、遺伝子治療ベクターとして使用す
ることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所適用（米国
特許第5,328,470号）または定位注射（例えば、Chen et al.(1994)PNA 91: 3054
-3057を参照）によって被検者に送達することができる。遺伝子治療ベクターの
製薬学的調製物は許容されうる希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含んでもよく、
または遺伝子送達基剤が埋設される徐放性基質を含んでもよい。または、完全な
遺伝子送達ベクターを組換え細胞、例えば、レトロウィルスベクターから無傷で
作製することができる場合には、製薬学的調製物は、遺伝子送達系を作製する1
つ以上の細胞を含んでもよい。

【０３２３】 製薬学的組成物は、投与の説明書と共に容器、パックまたはディスペンサーに
含まれてもよい。

【０３２４】 本発明は多数の異なる形態で具体化することができ、本明細書において記載す
る実施態様に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施態様
は、本発明の開示内容が当業者に本発明を詳細に伝えるように提供されている。
本発明の多数の改良および他の実施態様は、本発明が関係し、上記の明細書に提
供される教示の利益を有する当業者に明らかである。具体的な用語が使用されて
いるが、特に示さない限りそれらは当技術と同様に使用される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 長鎖ホスホジエステラーゼヌクレオチド配列（配列番号2）および推定アミノ
酸配列（配列番号1）を示す。アミノ酸1〜223はアミノ末端調節領域を構成し、
アミノ酸224〜462は触媒領域を構成し、アミノ酸463〜502はカルボキシ末端領域
を構成する。

【図２】 タンパク質パターンのPrositeデータベースに対する長鎖ホスホジエステラー
ゼの比較を示し、具体的には3'5'環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼファミ
リー7に対する高スコアーを示す。下線部はホスホジエステラーゼ識別特性を示
す。

【図３】 長鎖ホスホジエステラーゼアミノ酸配列の分析、αβターンおよびコイル領域
、親水性、両親媒性領域、可撓性領域、抗原性指数および表面確率プロットを示
す。

【図４】 長鎖ホスホジエステラーゼの疎水性プロットを示す。

【図５】 特異的な機能部位に対応するアミノ酸の長鎖ホスホジエステラーゼオープンリ
ーディングフレームの分析を示す。グリコシル化部位はアミノ酸約107〜アミノ
酸約110、アミノ酸約290〜アミノ酸約293およびアミノ酸約447〜アミノ酸約450
で見出されている。グリコサミノグリカン結合部位はアミノ酸約479〜アミノ酸
約482で見出されている。環状AMPおよび環状GMP依存的プロテインキナーゼリン
酸化部位はアミノ酸約15〜アミノ酸約18およびアミノ酸約94〜アミノ酸約97で見
出されている。プロテインキナーゼCリン酸化部位はアミノ酸約117〜アミノ酸約
119およびアミノ酸約390〜アミノ酸約392で見出されている。カゼインキナーゼI
Iリン酸化部位はアミノ酸約18〜アミノ酸約21、アミノ酸約56〜アミノ酸約59、
アミノ酸約251〜アミノ酸約254、アミノ酸約292〜アミノ酸約295、アミノ酸約44
9〜アミノ酸約452、アミノ酸約481〜アミノ酸約484およびアミノ酸約492〜アミ
ノ酸約495で見出されている。チロシンキナーゼリン酸化はアミノ酸約392〜アミ
ノ酸約398で見出されている。ミリストイル化部位はアミノ酸約22〜アミノ酸約2
7、アミノ酸約29〜アミノ酸約34、アミノ酸約67〜アミノ酸約72、アミノ酸約258
〜アミノ酸約263およびアミノ酸約477〜アミノ酸約482で見出されている。アミ
ド化部位は約13〜アミド化約16で見出されている。また、ホスホジエステラーゼ
識別特性に相当するアミノ酸HDXXHXXは、アミノ酸265〜271の配列HDVDHPGにおい
て見出されている。

【図６】 短鎖ホスホジエステラーゼヌクレオチド配列（配列番号4）および推定アミノ
酸配列（配列番号3）を示す。アミノ酸1〜223はアミノ末端調節領域を構成し、
アミノ酸224〜320は触媒領域を構成することが予測される。

【図７】 タンパク質パターンのPrositeデータベースに対する短鎖ホスホジエステラー
ゼの比較を示し、具体的には3'5'環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼファミ
リー7に対する高スコアーを示す。下線部はホスホジエステラーゼ識別特性を示
す。

【図８】 短鎖ホスホジエステラーゼの疎水性プロットを示す。

【図９】 特異的な機能部位に対応するアミノ酸の短鎖ホスホジエステラーゼオープンリ
ーディングフレームの分析を示す。グリコシル化部位はアミノ酸約107〜アミノ
酸約110およびアミノ酸約290〜アミノ酸約293で見出されている。グリコサミノ
グリカン結合部位はアミノ酸約479〜アミノ酸約482で見出されている。環状AMP
および環状GMP依存的プロテインキナーゼリン酸化部位はアミノ酸約15〜アミノ
酸約18およびアミノ酸約94〜アミノ酸約97で見出されている。プロテインキナー
ゼCリン酸化部位はアミノ酸約117〜アミノ酸約119で見出されている。カゼイン
キナーゼIIリン酸化部位はアミノ酸約18〜アミノ酸約21、アミノ酸約56〜アミノ
酸約59、アミノ酸約251〜アミノ酸約254およびアミノ酸約292〜アミノ酸約295で
見出されている。ミリストイル化部位はアミノ酸約22〜アミノ酸約27、アミノ酸
約29〜アミノ酸約34、アミノ酸約67〜アミノ酸約72、アミノ酸約258〜アミノ酸
約263で見出されており、アミド化部位は約13〜アミド化約16で見出されている
。また、ホスホジエステラーゼ識別特性に相当するアミノ酸HDXXHXXは、アミノ
酸265〜271の配列HDVDHPGにおいて見出されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 11/06 Ａ６１Ｐ 15/08 ４Ｈ０４５ 13/12 19/00 15/08 19/10 19/00 25/24 19/10 25/28 25/24 29/00 25/28 37/06 29/00 37/08 37/06 43/00 １１１ 37/08 Ｃ０７Ｋ 16/40 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 1/44 9/16 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 1/44 Ｍ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ｂ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ホワイト，デイヴィッド アメリカ合衆国マサチューセッツ州02184， ブレイントゥリー，ホリングズワース ア ヴェニュー 35 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA11 CA04 DA02 EA02 EA04 FA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD11 LL01 4B063 QA01 QQ08 QQ32 QQ43 QR13 QR24 QR32 QR55 QS02 QS34 4B065 AA90X AA99Y AB01 BA02 CA31 CA44 4C084 AA02 AA06 BA03 DC50 NA14 ZA122 ZA152 ZA162 ZA362 ZA402 ZA422 ZA542 ZA592 ZA812 ZA892 ZB082 ZB112 ZB132 ZC202 4H045 AA11 CA40 DA75 EA55 FA74

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 a)配列番号2または4に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分
   子と、 b)Patent Deposit Number PTA-1644としてATCCに寄託されているプラスミドの
   いずれかのcDNA挿入断片を含む核酸分子またはその相補鎖と、 c)配列番号2もしくは4のヌクレオチド配列に少なくとも70％同一であるヌクレ
   オチド配列、またはPatent Deposit Number PTA-1644としてATCCに寄託されてい
   るプラスミドのいずれかのcDNA挿入断片を含む核酸分子またはその相補鎖と、 d)配列番号2または4のヌクレオチド配列の少なくとも15ヌクレオチドの断片、
   またはPatent Deposit Number PTA-1644としてATCCに寄託されているプラスミド
   のいずれかのcDNA挿入断片を含む核酸分子,またはそれらの相補鎖と、 e)配列番号1もしくは3のアミノ酸配列、またはPatent Deposit Number PTA-16
   44としてATCCに寄託されているプラスミドのいずれかのcDNA挿入断片によってコ
   ードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子と、 f)配列番号1もしくは3のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然型対立遺伝子
   変異体、またはPatent Deposit Number PTA-1644としてATCCに寄託されているプ
   ラスミドのいずれかのcDNA挿入断片によってコードされるアミノ酸配列をコード
   する核酸分子と からなる群から選択される単離された核酸分子。
2. 【請求項２】 ベクター核酸配列をさらに含む請求項1に記載の核酸分子。
3. 【請求項３】 異種ポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む請求項
   1に核酸分子。
4. 【請求項４】 請求項1に核酸分子を含有する宿主細胞。
5. 【請求項５】 哺乳類宿主細胞である請求項4に記載の宿主細胞。
6. 【請求項６】 請求項1に記載の核酸分子を含有するヒト以外の哺乳類宿主
   細胞。
7. 【請求項７】 a)配列番号1もしくは3のアミノ酸配列、またはPatent Depos
   it Number PTA-1644としてATCCに寄託されているプラスミドのいずれかのcDNA挿
   入断片によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片であって、
   配列番号1もしくは3の少なくとも15個の連続したアミノ酸またはPatent Deposit Number PTA-1644としてATCCに寄託されているプラスミドのいずれかのcDNA挿入
   断片によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片と、 b) 配列番号1もしくは3のアミノ酸配列、またはPatent Deposit Number PTA-1
   644としてATCCに寄託されているプラスミドのいずれかのcDNA挿入断片によって
   コードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然型対立遺伝子変異体であっ
   て、配列番号2もしくは4を含む核酸分子またはその相補鎖にストリンジェントな
   条件下においてハイブリダイゼーションする核酸分子によってコードされるポリ
   ペプチドの天然型対立遺伝子変異体と、 c)配列番号2もしくは4のヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む核酸と少な
   くとも45％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポ
   リペプチドと からなる群から選択される単離ポリペプチド。
8. 【請求項８】 配列番号1もしくは3のアミノ酸配列、またはPatent Deposit Number PTA-1644としてATCCに寄託されているプラスミドのいずれかのcDNA挿入
   断片によってコードされるアミノ酸配列を含む請求項7に記載の単離ポリペプチ
   ド。
9. 【請求項９】 異種アミノ酸配列をさらに含む請求項7に記載のポリペプチ
   ド。
10. 【請求項１０】 請求項7に記載のポリペプチドに選択的に結合する抗体。
11. 【請求項１１】 a) 配列番号1もしくは3のアミノ酸配列、またはPatent De
    posit Number PTA-1644としてATCCに寄託されているプラスミドのいずれかのcDN
    A挿入断片によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、 b) 配列番号1もしくは3のアミノ酸配列の断片、またはPatent Deposit Number PTA-1644としてATCCに寄託されているプラスミドのいずれかのcDNA挿入断片に
    よってコードされるアミノ酸配列の断片を含むポリペプチドであって、配列番号
    1もしくは3の少なくとも12個の連続したアミノ酸またはPatent Deposit Number
    PTA-1644としてATCCに寄託されているプラスミドのいずれかのcDNA挿入断片によ
    ってコードされるアミノ酸配列を含む断片を含むポリペプチドと、 c) 配列番号1もしくは3のアミノ酸配列、またはPatent Deposit Number PTA-1
    644としてATCCに寄託されているプラスミドのいずれかのcDNA挿入断片によって
    コードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然型対立遺伝子変異体であっ
    て、配列番号2もしくは4を含む核酸分子またはその相補鎖にストリンジェントな
    条件下においてハイブリダイゼーションする核酸分子によってコードされるポリ
    ペプチドの天然型対立遺伝子変異体と からなる群から選択されるポリペプチドを作製するための方法であって、 請求項4に記載の宿主細胞を、核酸分子が発現される条件下において培養するス
    テップを含む方法。
12. 【請求項１２】 前記ポリペプチドが配列番号1、3、5または7のアミノ酸配
    列を含む請求項11に記載の方法。
13. 【請求項１３】 a)請求項7に記載のポリペプチドに選択的に結合する化合
    物に試料を接触させるステップと、 b)化合物が試料中のポリペプチドと結合するかどうかを判定するステップと を含む、試料中において請求項7に記載のポリペプチドの存在を検出するための
    方法。
14. 【請求項１４】 ポリペプチドに結合する化合物が抗体である請求項13に記
    載の方法。
15. 【請求項１５】 請求項7に記載のポリペプチドに選択的に結合する化合物
    と使用説明書とを含むキット。
16. 【請求項１６】 a)核酸分子に選択的にハイブリダイゼーションする核酸プ
    ローブまたはプライマーに試料を接触させるステップと、 b)核酸プローブまたはプライマーが試料中の核酸分子に結合するかどうかを判
    定するステップと を含む、試料中の請求項1に記載の核酸分子の存在を検出するための方法。
17. 【請求項１７】 試料がmRNA分子を含み、かつ、試料を核酸プローブに接触
    させる請求項16に記載の方法。
18. 【請求項１８】 請求項1に記載の核酸分子に選択的にハイブリダイゼーシ
    ョンする化合物と使用説明書とを含むキット。
19. 【請求項１９】 a)ポリペプチドまたは請求項7に記載のポリペプチドを発
    現する細胞を試験化合物に接触させるステップと、 b)ポリペプチドが試験化合物に結合するかどうかを判定するステップと を含む請求項7に記載ののポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法
    。
20. 【請求項２０】 試験化合物のポリペプチドへの結合が、 a)試験化合物/ポリペプチド結合の直接検出による結合の検出と、 b)競合結合アッセイを使用した結合の検出と、 c)GPCR様媒介型信号伝達のアッセイを使用した結合の検出と からなる群から選択される方法によって検出される請求項19に記載の方法。
21. 【請求項２１】 ポリペプチドまたは請求項7に記載のポリペプチドを発現
    する細胞に、ポリペプチドに結合し、ポリペプチドの活性を調節するのに十分な
    濃度の化合物を接触させるステップを含む請求項7に記載のポリペプチドの活性
    を調節するための方法。
22. 【請求項２２】 a)請求項7に記載のポリペプチドを試験化合物に接触させ
    るステップと、 b)ポリペプチドの活性に対する試験化合物の影響を判定し、それによってポリ
    ペプチドの活性を調節する化合物を同定するステップと を含む請求項7に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を同定するための
    方法。
23. 【請求項２３】 請求項1に記載の核酸分子の細胞中での発現レベルを調節
    する薬剤を同定するための方法であって、前記核酸分子を発現する細胞において
    前記核酸分子の前記発現レベルが前記薬剤によって調節されうるように、前記薬
    剤に前記細胞を接触させるステップと、前記核酸分子の前記発現レベルを測定す
    るステップとを含む方法。
24. 【請求項２４】 請求項1に記載の核酸分子の発現レベルを調節するための
    方法であって、薬剤が核酸分子の発現レベルを調節できる条件下において前記核
    酸分子に薬剤を接触させるステップを含む方法。
25. 【請求項２５】 製薬学的に許容されうる担体中に請求項7に記載のポリペ
    プチドのいずれかを含有する製薬学的組成物。