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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine neu identifizierte, zyklische
menschliche Nucleotidphosphodiesterase, die zu der Überfamilie
der Säugetier-Phosphodiesterasen
gehört.
Die Erfindung betrifft ebenso Polynucleotide, die für die Phosphodiesterase
kodieren. Die Erfindung betrifft weiters Verfahren, welche die Phosphodiesterase-Polypeptide und -Polynucleotide
als Ziel für
die Diagnose und Behandlung bei phosphodiesterase-vermittelten oder
-bezogenen Erkrankungen verwenden. Die Erfindung betrifft weiters
Arzneimittelscreeningverfahren, welche die Phosphodiesterase-Polypeptide
und -Polynucleotide verwenden, um Agonisten und Antagonisten für Diagnose
und Behandlung zu identifizieren. Die Erfindung umfasst weiters
Agonisten und Antagonisten, die auf den Phosphodiesterase-Polypeptiden
und -Polynucleotiden basieren. Weiters betrifft die Erfindung Verfahren
zur Herstellung von Phosphodiesterase-Polypeptiden und -Polynucleotiden.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Zyklische
Nucleotidphosphodiesterasen zeigen eine Spezifität für zyklische Purin-Nucleotidsubstrate und
katalysieren die Hydrolyse von zyklischem AMP (CAMP) und zyklischem
GMP (cGMP) (W. J. Thompson, Pharma. Ther. 51, 13-33 (1991)). Zyklische
Nucleotidphosphodiesterasen regulieren die stationären Mengen an
cAMP und cGMP und modulieren sowohl die Amplitude als auch die Dauer
des zyklischen Nucleotidsignals. Im Moment ist die Existenz von
zumindest acht verschiedenen, jedoch homologen Genfamilien in Säugetiergeweben
bekannt. Die meisten Familien enthalten unterschiedliche Gene, von
denen viele in verschiedenen Geweben als funktionell einzigartige
alternative Spleißvarianten
exprimiert werden (Beavo, Physiological Reviews 75, 725-748 (1995),
Dousa, Kidney Int. 55, 29-62 (1999), und U.S. 5.798.246).
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Alle
zyklischen Nucleotidphosphodiesterasen enthalten einen Kern von
etwa 270 konservierten Aminosäuren
in der COOH-terminalen Hälfte
des Proteins, das als die katalytische Domäne des Enzyms angenommen wird.
Ein konserviertes Motiv der Sequenz HDXXHXX wurde in der katalytischen
Domäne
aller bis zum jetzigen Zeitpunkt isolierten zyklischen Nucleotidphosphodiesterasen
identifiziert. Die zyklischen Nucleotidphosphodiesterasen innerhalb
jeder Familie weisen etwa 65 % Aminosäure-Homologie auf, und die Ähnlichkeit
fällt auf
unter 40 % im Vergleich verschiedener Familien untereinander, wobei
die meiste Ähnlichkeit
in den katalytischen Domänen
auftritt.
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Die
meisten zyklischen Nucleotidphosphodiesterase-Gene besitzen mehr
als eine alternativ gespleißte
mRNA, die aus ihnen transkribiert wird, und in vielen Fällen scheint
die Alternativspleißung
hochgradig gewebespezifisch zu sein, wodurch ein Mechanismus für die selektive
Expression verschiedener zyklischer Nucleotidphosphodiesterasen
bereitgestellt wird (Beavo, s.o.). Aus der zelltypspezifischen Expression
geht hervor, dass die verschiedenen Isozyme wahrscheinlich verschiedene
zelltypspezifische Eigenschaften besitzen.
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Zyklische
Typ-1-Nucleotidphosphodiesterasen sind Ca2+/Calmodulin-abhängig, Berichten
zufolge enthalten sie drei verschiedene Gene, von denen jedes zumindest
zwei verschiedene Spleißvarianten
zu enthalten scheint, und sie wurden in Lunge, Herz und Gehirn gefunden.
Einige der calmodulinabhängigen
Phosphodiesterasen werden in vitro durch Phosphorylierungs/Dephosphorylierungs-Vorkommnisse
reguliert. Die Wirkung der Phosphorylierung soll die Affinität des Enzyms
für Calmodulin
verringern, das die Phosphodiesterase-Aktivität herabsetzt, wodurch die stationäre Menge
an cAMP erhöht
wird. Zyklische Typ-2-Nucleotidphosphodiesterasen werde cGMP-stimuliert,
im Gehirn lokalisiert, und es wird angenommen, dass sie die Wirkungen
von CAMP auf die Catecholaminsekretion vermitteln. Zyklische Typ-3-Nucleotidphosphodiesterasen
sind cGMP-inhibiert, besitzen eine hochgradige Spezifität für cAMP als
Substrat und sind eines der Haupt-Phosphodiesterase-Isozyme, die
in vaskulären
glatten Muskeln vorhanden sind, und spielen eine Rolle in der Herzfunktion.
Ein Isozym vom Typ 3 wird durch eine oder mehrere insulinabhängige Kinasen
reguliert. Zyklische Typ-4-Nucleotidphosphodiesterasen sind das
vorherrschende Isoenzym in den meisten Entzündungszellen, wobei einige
der Mitglieder durch die cAMP-abhängige Phosphorylierung aktiviert
werden. Zyklische Typ-5-Nucleotidphosphodiesterasen
wurden typischerweise als Regulatoren der cGMP-Funktion angesehen, können jedoch
auch die cAMP-Funktion beeinflussen. Große Mengen an zyklischen Typ-5-Nucleotidphosphodiesterasen
sind in den meisten Präparaten
für glatte
Muskeln sowie in Plättchen
und der Niere zu finden. Zyklische Typ-6-Nucleotidphosphodiesterase-Familienmitglieder
spielen beim Sehen eine Rolle und werden durch Licht und cGMP reguliert.
Ein zyklisches Typ-7-Nucleotidphosphodiesterase-Familienmitglied
ist in hohen Konzentrationen in Skelettmuskeln zu finden. Eine Liste
der zyklischen Nucleotidphosphodiesterase-Familien 1-7, ihrer Lokalisierung
und ihrer physiologischen Rolle ist in Beavo, s.o., zu finden. Eine
Typ-8-Familie wird
im US-Patent Nr. 5.798.246 beschrieben.
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Zahlreiche
Funktionen der Immun- und der Entzündungsreaktionen werden durch
Agenzien inhibiert, die intrazelluläre cAMP-Mengen erhöhen (Verghese,
Mol. Pharmacol. 47, 1164-1171 (1995)), während der Metabolismus von
cGMP in die Funktion der Zellen glatter Muskeln, der Lunge und des
Gehirns involviert ist (W. Thompson, Pharma. Ther. 51. 13-33 (1991)).
Eine Reihe an Krankheiten wurde einer erhöhten zyklischen Nucleotidphosphodiesterase-Aktivität zugesprochen,
was zu verringerten Mengen an zyklischen Nucleotiden führt. Eine
Form der Diabetes insipidus bei Mausen wurde z.B. mit einer erhöhten Phosphodiesterase-Aktivität der Familie
4 assoziiert, und es wurde über
einen Anstieg der cAMP-Phosphodiesterase-Aktivität mit niedriger Km wurde
in Leukozyten atopischer Patienten berichtet. Defekte in zyklischen
Nucleotidphosphodiesterasen wurden auch mit retinalen Erkrankungen
assoziiert. Eine retinale Degradation bei der rd-Maus, menschliche autosomale
rezessive Retinitis pigmentosa und Stäbchen/Zapfen-Dysplasie 1 bei
Irischen Setter-Hunden wurde auf Mutationen in der Familie 6 der
Phosophodiesterase, Gen B, zurückgeführt. Phosphodiesterase
der Familie 3 wurde mit Herzerkrankungen assoziiert.
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Zahlreiche
Inhibitoren verschiedener zyklischer Nucleotidphosphodiesterasen
wurden identifiziert, und einige wurden klinisch evaluiert. Inhibitoren
der Familie-3-Phosphodiesterase
werden z. B. als antithrombotische Agenzien, als antihypertensive
Agenzien und als kardiotonische Agenzien entwickelt, die in der
Behandlung von kongestivem Herzversagen zweckdienlich sind. Rolipram,
ein Familie-4-Phosphodiesterase-Inhibitor, wurde bei der Behandlung
von Depression verwendet, und andere Inhibitoren der Familie-4-Phosphodiesterase
werden als entzündungshemmende
Agenzien evaluiert. Von Rolipram wurde ebenfalls gezeigt, dass es
das lipopolysaccharid-(LPS-)induzierte TNF-α inhibierte, von dem gezeigt
wurde, dass es in vitro zu einer Verstärkung der HIV-1-Replikation
führte.
Daher könnte
Rolipram die HIV-1-Replikation inhibieren (Angel et al., AIDS 9,
1137-44 (1995)). Zusätzlich
dazu wurde von Rolipram gezeigt, dass es, basierend auf seiner Fähigkeit,
die Produktion von TNF-α und
-β sowie
Interferon-γ zu
unterdrücken,
bei der Behandlung von Enzephalomyelitis, dem experimentellen Tiermodell
für multiple
Sklerose, wirksam ist (Sommer et al., Nat. Med. 1, 244-248 (1995))
und bei der Behandlung von Dyskinesia tarda wirksam sein kann (Sasaki
et al., Eur. J. Pharmacol. 282, 72-76 (1995)).
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Es
gibt weiters auch nichtspezifische Phosphodiesterase-Inhibitoren,
wie z.B. Theophyllin, das bei der Behandlung von Bronchialasthma
und anderen Atemwegserkrankungen verwendet wird, sowie Pentoxifyllin, das
bei der Behandlung von intermittierendem Hinken und diabetesinduziertem
peripherem Gefäßerkrankungen
verwendet wird. Von Theophyllin wird eine Wirkung auf die Funktion
der glatten Muskulatur des Luftkanals sowie bei entzündungshemmender
oder immunmodulatorischer Fähigkeit
in der Behandlung von Atemwegserkrankungen angenommen (Banner et
al., Eur. Respir. J. 8, 996-1000 (1995)), wo angenommen wird, dass
es über
eine Inhibierung sowohl der zyklischen Nucleotidphosphodiesterase-cAMP-
als auch der -cGMP-Hydrolyse wirkt (Banner et al., Monaldi Arch.
Chest Dis. 50, 286-292 (1995)). Pentoxifyllin, von dem auch eine
blockierende Wirkung auf die TNF-α-Produktion
bekannt ist, kann die HIV-1-Replikation inhibieren (Angel et al.,
s.o.). Eine Liste an zyklischen Nucleotidphosphodiesterase-Inhibitoren
wird in Beavo, s.o., angeführt.
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Von
zyklischen Nucleotidphosphodiesterasen wurde weiters berichtet,
dass sie die Zellproliferation einer Reihe von Zelltypen beeinflussen
und dass sie in die Behandlung verschiedener Krebsarten involviert
sind. Bang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5330-5334 (1994),
berichteten darüber,
dass die Prostatakarzinom-Zelllinien DU 145 und LNCaP durch die
Abgabe von cAMP-Derivaten und Phosphodiesterase-Inhibitoren im Wachstum inhibiert wurden,
und beobachteten eine permanente Umwandlung des Phänotypen
von einer Epithel- zu einer neuronalen Morphologie; Matousovic et
al. (J. Clin. Invest. 96, 401-410 (1995)) schlagen vor, dass die
zyklischen Nucleotidphosphodiesterase-Isozym-Inhibitoren das Potential
besitzen, die Mesangiumzellproliferation zu regulieren; Joulain
et al. (J. Mediat. Cell Signal 11, 63-79 (1995)) berichten, dass
von zyklischer Nucleotidphosphodiesterase gezeigt wurde, dass sie
ein wichtiges Ziel darstellt, das in die Steuerung der Lymphozytenproliferation
involviert ist; und Deonarain et al. (Brit. J. Cancer 70, 786-94
(1994)) schlagen einen Ansatz des Abzielens auf Tumoren bezüglich der
Krebstherapie vor, der die intrazelluläre Abgabe von Phosphodiesterasen
an bestimmte Zellkompartimente involviert, was zum Zelltod führt.
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Dementsprechend
sind zyklische Nucleotidphosphodiesterasen ein Hauptziel für die Wirkung
und Entwicklung von Arzneimitteln. Dementsprechend ist es für das Gebiet
der pharmazeutischen Entwicklung von Bedeutung, zuvor unbekannte
Phosphodiesterasen zu identifizieren und zu charakterisieren. Die
vorliegende Erfindung erweitert den Stand der Technik, indem sie
eine zuvor unidentifizierte, zyklische menschliche Nucleotidphosphodiesterase
bereitstellt.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Es
ist ein Ziel der Erfindung, neue zyklische Nucleotidphosphodiesterasen
zu identifizieren.
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Ein
weiteres Ziel der Erfindung ist es, neue zyklische Nucleotidphosphodiesterase-Polypeptide bereitzustellen,
die als Reagenzien oder als Ziele in Phosphodiesterase-Tests von Nutzen
sind, die auf die Behandlung und Diagnose zyklischer nucleotidphosphodiesterase-vermittelter
oder -bezogener Erkrankungen anwendbar sind.
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Ein
weiteres Ziel der Erfindung ist es, Polynucleotide bereitzustellen,
die den neuen Phosphodiesterase-Polypeptiden entsprechen, die als
Ziele und Reagenzien in Phosphodiesterase-Tests von Nutzen sind,
die auf die Behandlung und Diagnose phosphodiesterase-vermittelter
oder -bezogener Erkrankungen anwendbar sind, sowie die für die Herstellung
neuer Phosphodiesterase-Polypeptide mittels Rekombinationsverfahren
von Nutzen sind.
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Ein
spezifisches Ziel der Erfindung ist es, Verbindungen zu identifizieren,
die als Agonisten und Antagonisten wirken und die Expression der
neuen Phosphodiesterase modulieren.
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Ein
weiteres spezifisches Ziel der Erfindung ist es, Verbindungen, welche
die Expression der Phosphodiesterase modulieren, für die Behandlung
und die Diagnose von phosphodiesterase-bezogenen Erkrankungen bereitzustellen.
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Die
Erfindung basiert daher auf der Identifikation einer neuen menschlichen,
zyklischen Nucleotidphosphodiesterase. Die Erfindung umfasst eine
lange und eine kurze Form der Phosphodiesterase. Die Aminosäuresequenz
der längeren
Form wird in Seq.-ID Nr. 1 gezeigt, und die Aminosäuresequenz
der kürzeren Form
wird in Seq.-ID
Nr. 3 gezeigt. Die Nucleotidsequenz der längeren Form wird als Seq.-ID
Nr. 2 oder die Aminosäuresequenz,
die von der unter der ATCC-Hinterlegungsnummer PTA-1644 am 5. April
2000 bei der American Type Culture Collection, 10801 University
Blvd., Manassas, VA 20110-2209 US, hinterlegten cDNA („die hinterlegte
cDNA") kodiert wird,
gezeigt, und die Nucleotidsequenz der kürzeren Form wird als Seq.-ID Nr.
4 dargestellt.
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Die
Erfindung stellt isolierte Phosphodiesterase-Polypeptide bereit,
unter anderem ein Polypeptid mit der in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID
Nr. 3 dargestellten Aminosäuresequenz.
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Die
Erfindung stellt weiters isolierte Phosphodiesterase-Nucleinsäuremoleküle mit der.
in Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 4 oder mit der in der hinterlegten
cDNA dargestellten Sequenz bereit.
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Die
Erfindung beschreibt weiters Polypeptidvarianten mit einer Aminosäuresequenz,
die im Wesentlichen homolog zu der in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID
Nr. 3 dargestellten Aminosäuresequenz
ist oder von der hinterlegten cDNA kodiert wird.
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Die
Erfindung beschreibt weiters Nucleinsäuresequenzvarianten, die im
Wesentlichen homolog zu der in Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 4
oder der in der hinterlegten cDNA dargestellten Nucleotidsequenz
sind.
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Die
Erfindung beschreibt weiters Fragmente des in Seq.-ID Nr. 1 oder
Seq.-ID Nr. 3 dargestellten Polypeptids und der in Seq.-ID Nr. 2
oder Seq.-ID N. 4 dargestellten Nucieotidsequenz sowie im Wesentlichen homologe
Fragmente des Polypeptids oder der Nucleinsäure.
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Die
Erfindung stellt weiters Nucleinsäurekonstrukte bereit, welche
die hierin beschriebenen Nucleinsäuremoleküle umfassen. In einer bevorzugten
Ausführungsform
sind die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung operativ
an eine Regulationssequenz gebunden.
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Die
Erfindung stellt weiters Vektoren und Wirtszellen zur Expression
der Phosphodiesterase-Nucleinsäuremoleküle und -polypeptide
bereit sowie insbesondere rekombinante Vektoren und Wirtszellen.
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Die
Erfindung stellt weiters Verfahren zur Herstellung der Vektoren
und Wirtszellen und Verfahren zur Verwendung dieser zur Herstellung
der Phosphodiesterase-Nucleinsäuremoleküle und -polypeptide
bereit.
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Die
Erfindung stellt auch Antikörper
oder antigenbindende Fragmente dieser bereit, welche die Phosphodiesterase-Polypeptide
und -Fragmente selektiv binden.
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Die
Erfindung stellt weiters Verfahren zum Screening auf Verbindungen
bereit, welche die Expression oder Aktivität der Phosphodiesterase-Polypeptide
oder -Nucleinsäure
(RNA oder DNA) modulieren.
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Die
Erfindung zieht ebenso ein Verfahren zur Modulation der Phosphodiesterase-Polypeptid- oder -Nucleinsäure-Expression
oder -Aktivität
in Betracht, und zwar im Speziellen unter Verwendung der gescreenten
Verbindungen. Die Modulation kann verwendet werden, um Erkrankungen
zu behandeln, die mit einer abnormen Aktivität oder Expression der Phosphodiesterase-Polypeptide
oder -Nucleinsäuren
in Zusammenhang stehen.
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Die
Erfindung stellt ebenso Tests zur Bestimmung der Aktivität der oder
der Gegenwart oder Abwesenheit der Phosphodiesterase-Polypeptide
oder -Nucleinsäure-Moleküle in einer
biologischen Probe bereit, unter anderem für die Diagnose von Erkrankungen.
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Die
Erfindung stellt weiters Tests für
die Bestimmung der Gegenwart einer Mutation in den Polypeptiden
oder Nucleinsäuremolekülen bereit,
unter anderem für
die Diagnose von Erkrankungen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
beschreibt die Erfindung ein computerlesbares Mittel, das die Nucleotid-
und/oder Aminosäure-Sequenzen
der Nucleinsäuren
bzw. Polypeptide der Erfindung enthält.
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BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt die lange Phosphodiesterasenucleotidsequenz
(Seq.-ID Nr. 2) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 1).
Es wird prognostiziert, dass die Aminosäuren 1-223 die aminoterminale
Regulationsdomäne
darstellen, dass die Aminosäuren
224-462 die katalytische Domäne
darstellen und dass die Aminosäuren
463-502 die carboxyterminale Domäne
darstellen.
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2 zeigt
einen Vergleich der langen Phosphodiesterase gegenüber der
Prosite-Datenbank
an Proteinmustern, wobei im Spezifischen ein hoher Wert gegenüber der
zyklischen 3'-5'-Nucleotidphosphodiesterase-Familie
7 dargestellt wird. Der unterstrichene Bereich zeigt eine Phosphodiesterase-Signatur.
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3 zeigt
eine Analyse der langen Phosphodiesterase-Aminosäuresequenz: αβ-Schleifen- und Knäuel-Regionen;
Hydrophilie; amphipathische Regionen; flexible Regionen; antigener
Index; sowie Oberflächenwahrscheinlichkeitsskizze.
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4 zeigt
eine Hydrophobie-Skizze der langen Phosphodiesterase.
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5 zeigt eine Analyse des offenen Leserasters
der langen Phosphodiesterase für
Aminosäuren,
die spezifischen funktionellen Stellen entsprechen. Glykosylierungsstellen
sind etwa von Aminosäure
107 bis etwa Aminosäure
110, etwa von Aminosäure
290 bis etwa Aminosäure
293 und etwa von Aminosäure
447 bis etwa Aminosäure
450 zu finden. Eine Glykosaminoglycan-Bindungsstelle ist etwa von
Aminosäure
479 bis etwa Aminosäure
482 zu finden. Zyklische AMP- und zyklische GMP-abhängige Proteinkinase-Phosphorylierungsstellen
sind etwa von Aminosäure
15 bis etwa Aminosäure
18 und etwa von Aminosäure
94 bis etwa Aminosäure
97 zu finden. Proteinkinase-C-Phosphorylierungsstellen sind etwa
von Aminosäure
117 bis etwa Aminosäure
119 und etwa von Aminosäure
390 bis etwa Aminosäure
392 zu finden. Caseinkinase-Il-Phosphorylierungsstellen sind etwa
von Aminosäure
18 bis etwa Aminosäure
21, etwa von Aminosäure
56 bis etwa Aminosäure
59, etwa von Aminosäure
251 bis etwa Aminosäure
254, etwa von Aminosäure
292 bis etwa Aminosäure 295,
etwa von Aminosäure
449 bis etwa Aminosäure
452, etwa von Aminosäure
481 bis etwa Aminosäure
484 und etwa von Aminosäure
492 bis etwa Aminosäure
495 zu finden. Eine Tyrosinkinase-Phosphorylierungsstelle ist etwa
von Aminosäure
392 bis etwa Aminosäure
398 zu finden. N-Myristoylierungsstellen sind etwa von Aminosäure 22 bis
etwa Aminosäure
27, etwa von Aminosäure
29 bis etwa Aminosäure
34, etwa von Aminosäure
67 bis etwa Aminosäure
72, etwa von Aminosäure
258 bis etwa Aminosäure
263 und etwa von Aminosäure
477 bis etwa Aminosäure
482 zu finden. Eine Amidierungsstelle ist etwa von Aminosäure 13 bis
etwa Aminosäure
16 zu finden. Zusätzlich
dazu sind Aminosäuren,
die der Phosphodiesterase-Signatur,
HDXXHXX, entsprechen, in der Sequenz HDVDHPG an den Aminosäuren 265-271
zu finden.
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6 zeigt die kurze Phosphodiesterasenucleotidsequenz
(Seq.-ID Nr. 4) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 3).
Es wird prognostiziert, dass die Aminosäuren 1-223 die aminoterminale
Regulationsdomäne
darstellen und dass die Aminosäuren
224-320 die katalytische Domäne
darstellen.
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7 zeigt
einen Vergleich der kurzen Phosphodiesterase gegenüber der
Prosite-Datenbank
an Proteinmustern, wobei im Spezifischen ein hoher Wert gegenüber der
zyklischen 3'-5'-Nucleotidphosphodiesterase-Familie
7 dargestellt wird. Der unterstrichene Bereich zeigt eine Phosphodiesterase-Signatur.
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8 zeigt
eine Hydrophobie-Skizze der kurzen Phosphodiesterase.
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9 zeigt
eine Analyse des offenen Leserasters der kurzen Phosphodiesterase
für Aminosäuren, die spezifischen
funktionellen Stellen entsprechen. Glykosylierungsstellen sind etwa
von Aminosäure
107 bis etwa Aminosäure
110 und etwa von Aminosäure
290 bis etwa Aminosäure
293 zu finden. Zyklische AMP- und zyklische GMP-abhängige Proteinkinase-Phosphorylierungsstellen
sind etwa von Aminosäure
15 bis etwa Aminosäure
18 und etwa von Aminosäure
94 bis etwa Aminosäure
97 zu finden. Proteinkinase-C-Phosphorylierungsstellen sind etwa
von Aminosäure
117 bis etwa Aminosäure
119 zu finden. Caseinkinase-II-Phosphorylierungsstellen sind etwa
von Aminosäure
18 bis etwa Aminosäure
21, etwa von Aminosäure
56 bis etwa Aminosäure
59, etwa von Aminosäure
251 bis etwa Aminosäure
254 und etwa von Aminosäure
292 bis etwa Aminosäure
295 zu finden. N-Myristoylierungsstellen sind etwa von Aminosäure 22 bis
etwa Aminosäure
27, etwa von Aminosäure
29 bis etwa Aminosäure
34, etwa von Aminosäure
67 bis etwa Aminosäure
72, etwa von Aminosäure
258 bis etwa Aminosäure
263 zu finden, und eine Amidierungsstelle ist etwa von Aminosäure 13 bis etwa
Aminosäure
16 zu finden. Zusätzlich
dazu sind Aminosäuren,
die der Phosphodiesterase-Signatur, HDXXHXX, entsprechen, in der
Sequenz HDVDHPG an den Aminosäuren
265-271 zu finden.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich ein „Signalweg" auf die Modulierung (z.B. Stimulierung
oder Inhibierung) einer zellulären
Funktion/Aktivität
bei Bindung eines Liganden an einen Rezeptor. Beispiele solcher Funktonen
umfassen die Mobilisierung intrazellulärer Moleküle, die an einem Signalübertragungsweg
beteiligt sind, z.B. Phosphatidylinosit-4,5-biphosphat (PIP2), Inosit-1,4,5-triphosphat (IP3)
und Adenylatcyclase; an der Polarisierung der Plasmamembran; an
der Produktion oder Sekretion von Molekülen; an der Veränderung
der Struktur einer Zellkomponente; an der Zellproliferation, z.B.
DNA-Synthese; an der Zellmigration; an der Zelldifferenzierung und
dem Zellüberleben
beteiligt sind.
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Die
Reaktion hängt
von der Art der Zelle ab. In einigen Zellen kann die Bindung eines
Liganden an den Rezeptor eine Aktivität stimulieren, wie z.B. die
Freisetzung von Verbindungen, den Schleusenmechanismus eines Kanals,
die zelluläre
Adhäsion,
Migration, Differenzierung etc., und zwar durch Phosphatidylinosit
oder den zyklischen-AMP-Metabolismus und -Umsatz, während die
Bindung in anderen Zellen zu einem anderen Resultat führt.
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Der
cAMP-Umsatzweg ist ein Signalweg. Wie hierin verwendet, bezieht
sich „zyklischer-AMP-Umsatz und
-Metabolismus" auf
die Moleküle,
die in den Umsatz und den Metabolismus von cAMP involviert sind,
sowie auf die Aktivitäten
dieser Moleküle.
Zyklisches AMP ist ein zweiter Messenger, der als Reaktion auf die ligandeninduzierte
Stimulierung gewisser Rezeptoren produziert wird. Im cAMP-Signalweg
kann die Bindung eines Liganden zu der Aktivierung des Enzyms Adenylcyclase
führen,
das die Synthese von CAMP katalysiert. Neu synthetisiertes CAMP
kann wiederum eine cAMP-abhängige
Proteinkinase aktivieren. Diese aktivierte Kinase kann ein spannungsgesteuertes
Kaliumkanalprotein oder ein assoziiertes Protein phosphorylieren
und zu der Unfähigkeit
des Kaliumkanals führen,
sich während
eines Aktionspotentials zu öffnen.
Die Unfähigkeit des
Kaliumkanals, sich zu öffnen,
führt zu
einer Verringerung des nach außen
gerichteten Kaliumstroms, der normalerweise die Membran eines Neurons
repolarisiert, was zu einer verlängerten
Membran-Depolarisierung führt.
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Polypeptide
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Die
Erfindung basiert auf der Entdeckung einer neuen menschlichen zyklischen
Nucleotidphosphodiesterase. Im Speziellen wurde eine exprimierte
Sequenzmarkierung (EST) basierend auf der Homologie mit Phosphodiesterasesequenzen
ausgewählt.
Diese EST wurde verwendet, um Primer basierend auf Sequenzen zu
kreieren, die in ihr enthalten sind, und sie wurde verwendet, um
eine cDNA aus einer Nieren- und Nebennieren-cDNA-Bibliothek zu identifizieren.
Positive Klone wurden sequenziert, und die überlappenden Fragmente wurden
angeordnet. Die Analyse der angeordneten Sequenz zeigte, dass das
klonierte cDNA-Molekül
für eine
zyklische Nucleotidphosphodiesterase kodiert. Nucleinsäure, die
für eine
trunkierte Form des Enzyms kodiert, wurde ebenso aus einer Osteoblasten-cDNA-Bibliothek
isoliert.
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Die
Erfindung betrifft daher eine neue Phosphodiesterase mit der abgeleiteten
Aminosäuresequenz, die
in 1 oder 6 gezeigt
wird (Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3).
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Die
Hinterlegung wird unter den Bedingungen des Budapester Vertrags über die
Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
aufrechterhalten. Die hinterlegte Sequenz sowie die Polypeptide,
die durch die Sequenzen kodiert werden, sind hierin mittels Verweis
und Kontrollen im Falle eines etwaigen Konflikts, wie z.B. eines
Sequenzierungsfehlers, mit Beschreibung in dieser Anmeldung aufgenommen.
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„Phosphodiesterase-Polypeptid" oder „Phosphodiesterase-Protein" bezieht sich auf
die Polypeptide in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3. Der Ausdruck „Phosphodiesterase-Protein" oder „Phosphodiesterase-Polypeptid" umfasst jedoch weiters
die zahlreichen, hierin beschriebenen Varianten sowie Fragmente,
die von den Phosphodiesterasen voller Länge und Varianten abstammen.
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Gewebe
und/oder Zellen, in denen die Phosphodiesterasen zu finden sind,
umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Herz (unter anderem
des Fötus),
Eierstöcke,
Gehirn, Pankreas, Nieren, Brust, Leber, Hoden, Prostata, Skelettmuskeln
und Osteoblasten. Zusätzlich
dazu werden die Phosphodiesterasen in erkrankten Geweben exprimiert,
umfassend, jedoch nicht eingeschränkt auf, jene, die bei kongestivem
Herzversagen und Brustkrebs involviert sind. Die Expression wurde
durch Northern-Blot-Analyse
und zusätzlich
dazu bei Osteoblasten durch In-situ-Hybridisierung bestätigt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt daher ein isoliertes oder gereinigtes
Phosphodiesterase-Polypeptid sowie Varianten und Fragmente davon
bereit.
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Die
Phosphodiesterasen umfassen eine katalytische Signatur, HDVDHPG,
an den Resten 265-271. Die Sequenz umfasst HXXDHXX, eine Consensus-Aminosäuresequenz
in zyklischen Nucleotidphosphodiesterasen.
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Basierend
auf einer BLAST-Suche wurde die höchste Homologie mit Familie
7 gezeigt. Die lange Form ist mit B2 und die kurze Form ist mit
B1 benannt.
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Wie
hierin verwendet, wird von einem „isolierten" oder „gereinigten" Polypeptid gesprochen,
wenn es im Wesentlichen frei von zellulärem Material ist, wenn es aus
rekombinanten und nicht rekombinanten Zellen isoliert wird, oder
frei von chemischen Vorläufern
oder anderen Chemikalien ist, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein Polypeptid kann jedoch an ein anderes Polypeptid gebunden sein,
mit dem es normalerweise nicht in einer Zelle assoziiert ist, und
kann trotzdem als „isoliert" oder „gereinigt" angesehen werden.
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Die
Phosphodiesterase-Polypeptide können
bis zur Homogenität
gereinigt werden. Es ist jedoch davon auszugehen, dass Präparate,
in denen das Polypeptid nicht bis zur Homogenität gereinigt ist, nützlich sind, und
es wird davon ausgegangen, dass sie eine isolierte Form des Polypeptids
enthalten. Das entscheidende Merkmal ist, dass das Präparat die
gewünschte
Funktion des Polypeptids möglich
macht, sogar in Gegenwart beachtlicher Mengen anderer Komponenten.
Daher umfasst die Erfindung verschiedene Reinheitsgrade.
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In
einer Ausführungsform
umfasst der Ausdruck „im
Wesentlichen frei von zellulärem
Material" Phosphodiesterase-Präparate mit
weniger als etwa 30 % (nach Trockengewicht) anderen Proteinen (d.h.
kontaminierenden Proteinen), weniger als etwa 20 % anderen Proteinen,
weniger als etwa 10 % anderen Proteinen oder weniger als etwa 5
% anderen Proteinen. Wird das Polypeptid rekombinant hergestellt,
so kann es auch im Wesentlichen frei vom Kulturmedium sein, d.h.
das Kulturmedium stellt weniger als etwa 20 %, weniger als etwa
10 % oder weniger als etwa 5 % des Volumens des Proteinpräparats dar.
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Ein
Phosphodiesterase-Polypeptid wird auch als isoliert angesehen, wenn
es Teil eines Membranpräparats
ist oder gereinigt ist und anschließend erneut mit Membranvesikeln
oder Liposomen rekonstituiert wird.
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Der
Ausdruck „im
Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien" umfasst Präparate des
Phosphodiesterase-Polypeptids, in denen es von chemischen Vorläufern oder
anderen Chemikalien, die in seine Synthese involviert sind, getrennt
ist. In einer Ausführungsform
umfasst der Ausdruck „im Wesentlichen
frei von chemischen Vorläufern
oder anderen Chemikalien" Präparate des
Polypeptids mit weniger als etwa 30 % (nach Trockengewicht) an chemischen
Vorläufern
oder anderen Chemikalien, weniger als etwa 20 % chemischer Vorläufer oder
anderer Chemikalien, weniger als etwa 10 % chemischer Vorläufer oder anderer
Chemikalien oder weniger als etwa 5 % chemischer Vorläufer oder
anderer Chemikalien.
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In
einer Ausführungsform
umfasst das Phosphodiesterase-Polypeptid die Aminosäuresequenz,
die in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 dargestellt wird. Die Erfindung
beschreibt jedoch auch Sequenzvarianten. Die Varianten umfassen
ein im Wesentlichen homologes Protein, das vom selben genetischen
Locus in einem Organismus kodiert wird, d.h. eine Allelvariante.
Die Phosphodiesterase wurde an das menschliche Chromosom 6 (6q21-q23.2)
mit den flankierenden Markern AFMA074ZG9 (2.6cR) und AFM214ZF6 (7.9cR)
kartiert. Mutationen in der Nähe
dieses Locus umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf,
die Folgenden: PPAC, Arthropathie, infantiles progressives Pseudorheumatoid;
ODDD, Oculodentodigitale Dysplasie; heterozelluläre vererbliche Beständigkeit
von fötalem
Hämoglobin;
DFNA10, Taubheit, autosomal dominant, nichtsyndromisch, sensorisch-neural
10; CMD1F, Kardiomyopathie, dilatiert, 1F; sowie Diabetes mellitus,
vorübergehend, neonatal.
Bei der Maus ist dieser Locus mit Folgendem assoziiert: gl, grau-letal;
dl, downless; Cat5, dominanter Katarakt 5; Lwq3, Lebergewicht QTL
3; mshi; männliche
Sterilität
und Histoinkompatibilität;
Mop2, Morphinpräferenz
2; H60, Histokompatibilität
60; Daq4, Richtungsasymmetrie QTL 4; Daq5, Richtungsasymmetrie QTL
5; und kd/Nierenerkrankung. Gene in der Nähe dieses Locus umfassen PDNP1
(Phosphodiesterase 1/Nucleotidpyrophosphatase 1 (homolog mit Maus-Ly-41-Antigen)),
MACS, PTPRK, ARG1, PCMT1, DFNA10, MEKK5, CTGF, SGK, HIVEP2, CMD1F,
EPB41 L2, HPFH, UTRN, IFNGR1 und ESR1.
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Hierin
beschriebene Varianten umfassen auch Proteine, die von anderen genetischen
Loci in einem Organismus abstammen, jedoch eine wesentliche Homologie
mit der Phosphodiesterase aus Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 aufweisen.
Varianten umfassen auch Proteine, die im Wesentlichen homolog zu
der Phosphodiesterase sind, jedoch aus einem anderen Organismus
stammen, d.h. ein Ortholog. Varianten umfassen weiters Proteine,
die im Wesentlichen homolog zu der Phosphodiesterase sind, die durch
chemische Synthese hergestellt werden. Varianten umfassen auch Proteine,
die im Wesentlichen homolog zu der Phosphodiesterase sind, die mittels
Rekombinationsverfahren hergestellt werden.
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Wie
hierin verwendet, sind zwei Proteine (oder eine Region an Proteinen)
im Wesentlichen homolog, wenn die Aminosäuresequenzen eine Homologie
von zumindest etwa 70-75 %, typischerweise zumindest etwa 80-85
% und typischerweise meist zumindest etwa 90-95 %, oder mehr aufweisen.
Eine im Wesentlichen homologe Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden
Erfindung wird von einer Nucleinsäuresequenz kodiert, die an
die in Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 4 dargestellte Sequenz der
Nucleinsäuresequenz
oder einen Abschnitt dieser unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
und zwar wie ausführlich
unten stehend beschrieben.
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Um
den Prozentsatz der Identität
von zwei Aminosäuresequenzen
oder zwei Nucleinsäuresequenzen zu
bestimmen, werden die Sequenzen für Zwecke des optimalen Vergleichs
angeordnet (z.B. können
Lücken in
eine oder beide einer ersten und einer zweiten Aminosäure- oder
Nucleinsäuresequenz
zur optimalen Anordnung eingeführt
werden, und nicht homologe Sequenzen können für Vergleichszwecke außer Acht
gelassen werden). In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Länge einer
für Vergleichszwecke
angeordneten Referenzsequenz zumindest 30 %, vorzugsweise zumindest
40 %, noch bevorzugter zumindest 50 %, noch bevorzugter zumindest
60 % und noch bevorzugter zumindest 70 %, 80 % oder 90 %, der Länge der
Referenzsequenz (z.B. bei Anordnung einer zweiten Sequenz an die
hierin beschriebenen Aminosäuresequenzen
mit 502 Aminosäureresten
werden zumindest 165, vorzugsweise zumindest 200, noch bevorzugter
zumindest 250, noch bevorzugter zumindest 300 und noch bevorzugter
zumindest 350, 400 und 500, Aminosäurereste angeordnet). Die Aminosäurereste
oder Nucleotide an korrespondierenden Aminosäurepositionen oder Nucleotidpositionen
werden anschließend
verglichen. Wird eine Position in der ersten Sequenz von demselben
Aminosäurerest
oder Nucleotid wie in der korrespondierenden Position in der zweiten
Sequenz besetzt, so sind die Moleküle an dieser Position identisch
(wie hierin verwendet, entspricht die Aminosäure- oder Nucleinsäure-„Identität" der Aminosäure- oder
Nucleinsäure-„Homologie"). Der Prozentsatz
der Identität
zwischen den zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an identischen
Positionen, die von den Sequenzen geteilt werden, wobei die Anzahl
der Lücken
und die Länge
jeder Lücke,
die für
die optimale Anordnung der beiden Sequenzen eingeführt werden
müssen,
in Betracht gezogen werden.
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Die
Erfindung beschreibt ebenfalls Polypeptide mit einem geringeren
Ausmaß an
Identität,
jedoch mit ausreichender Ähnlichkeit,
um eine oder mehrere derselben Funktionen durchzuführen, die
von der Phosphodiesterase ausgeführt
werden. Die Ähnlichkeit
wird mittels konservierter Aminosäuresubstitution bestimmt. Solche
Substitutionen sind jene, die eine bestimmte Aminosäure in einem
Polypeptid durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen Merkmalen ersetzen.
Konservative Substitutionen sind mit großer Wahrscheinlichkeit phänotypisch
stumm. Typischerweise als konservative Substitutionen gesehen werden
die Ersetzungen, einer durch die andere, unter den aliphatischen
Aminosäuren
Ala, Val, Leu und Ile; der Austausch der Hydroxyl-Reste Ser und
Thr, der Austausch der sauren Reste Asp und Glu, die Substitution
zwischen den Amidresten Asn und Gln, der Austausch der basischen
Reste Lys und Arg und die Substitutionen unter den aromatischen
Resten Phe, Tyr. Anleitungen darüber,
welche Aminosäureveränderungen
wahrscheinlich phänotypisch
stumm sind, sind in Bowie et al., Science 247, 1306-1310 (1990),
zu finden. TABELLE 1. Konservative Aminosäuresubstitutionen
| aromatisch | Tyrosin |
| | Tryptophan |
| | Phenylalanin |
| | |
| hydrophob | Leucin |
| | Isoleucin |
| | Valin |
| | |
| polar | Glutamin |
| | Asparagin |
| | |
| basisch | Arginin |
| | Lysin |
| | Histidin |
| | |
| sauer | Asparaginsäure |
| | Glutaminsäure |
| | |
| klein | Alanin |
| | Serin |
| | Threonin |
| | Methionin |
| | Glycin |
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Der
Vergleich der Sequenzen und die Bestimmung des Prozentsatzes der
Identität
und Ähnlichkeit zwischen
zwei Sequenzen kann unter Verwendung eines mathema tischen Algorithmus
erreicht werden (Computational Molecular Biology, A. M. Lesk (Hrsg.),
Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics
and Genome Projects, D. W. Smith (Hrsg.), Academic Press, New York
(1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, A. M. Griffin
und H. G. Griffin (Hrsg.), Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis
in Molecular Biology, G. von Heinje, Academic Press (1987); sowie
Sequence Analysis Primer, M. Gribskov und J. Devereux (Hrsg.), M
Stockton Press, New York (1991)).
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Ein
bevorzugtes, nicht einschränkendes
Beispiel solch eines mathematischen Algorithmus wird in Karlin et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5877 (1993), beschrieben.
Solch ein Algorithmus wird in die Programme NBLAST und XBLAST (Version
2.0) aufgenommen, wie von Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402
(1997), beschrieben. Bei der Verwendung der Programme BLAST und
Gapped BLAST können
die Standardparameter der jeweiligen Programme (z.B. NBLAST) verwendet
werden. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov. In einer Ausführungsform
können
die Parameter für
den Sequenzvergleich mit Score = 100, Wortlänge = 12 festgelegt werden
oder können
variieren (z.B. W = 5 oder W = 20).
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird der Prozentsatz der Identität
zwischen zwei Aminosäuresequenzen
unter Verwendung des Algorithmus von Needleman et al., J. Mol. Biol.
48, 444-453 (1970), bestimmt, der in das GAP-Programm im GCG-Softwarepaket aufgenommen
wurde (erhältlich
unter http://www.gcg.com), und zwar unter Verwendung entweder einer
BLOSUM-62-Matrix oder einer PAM250-Matrix sowie eines Lückengewichts
von 16, 14, 12, 10, 8, 6 oder 4 und eines Längengewichts von 1, 2, 3, 4,
5 oder 6. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Prozentsatz
der Identität
zwischen zwei Nucleotidsequenzen unter Verwendung des GAP-Programms
im GCG-Softwarepaket bestimmt (Devereux et al., Nucleic Acids Res.
12(1), 387 (1984)) (erhältlich
unter http://www.gcg.com), und zwar unter Verwendung einer NWSgapdna.CMP-Matrix
und eines Lückengewichts
von 40, 50, 60, 70 oder 80 und eines Längengewichts von 1, 2, 3, 4,
5 oder 6.
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Ein
weiteres bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel eines mathematischen
Algorithmus, der für den
Vergleich von Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von
Myers und Miller, CABIOS (1989). Solch ein Algorithmus ist in das
ALIGN-Programm (Version
2.0) aufgenommen, das Teil des CGC-Sequenzanordnungs-Softwarepakets ist.
Wird das ALIGN-Programm für
den Vergleich von Aminosäuresequenzen
verwendet, so können
eine PAM120-Gewichtsrest-Tabelle, eine Lückenlängen-Strafe von 12 und eine
Lückenstrafe von
4 verwendet werden. Zusätzliche
Algorithmen für
die Sequenzanalyse sind nach dem Stand der Technik bekannt und umfassen
ADVANCE und ADAM, wie in Torellis et al., Comput. Appl. Biosci.
10, 3-5 (1994), beschrieben, sowie FASIA, beschrieben von Pearson
et al., PNAS 85, 2444-8
(1988).
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Eine
Polypeptidvariante kann sich in der Aminosäuresequenz durch eine oder
mehrere Substitutionen, Deletionen, Insertionen, Inversionen, Fusionen
und Trunkierungen oder eine Kombination dieser unterscheiden.
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Polypeptidvarianten
können
voll funktionsfähig
sein, oder es kann ihnen eine Funktion in einer oder mehreren Aktivitäten fehlen.
Daher können
im vorliegenden Fall Variationen die Funktion von z.B. einer oder mehreren
Regionen beeinflussen, die der konservierten katalytischen Region
sowie carboxyterminalen Regulationsregionen, aminoterminalen Regulationsregionen,
aminoterminalen Zielregionen, Regionen, die in die Membranassoziation
involviert sind, Regionen, die in die Enzymaktivierung involviert
sind, z.B. durch Phosphorylierung, sowie Regionen entsprechen, die
in eine Wechselwirkung mit Komponenten anderer zyklischer nucleotidabhängiger (z.B.
AMP-, GMP-abhängiger)
Signalübertragungswege
involviert sind.
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Voll
funktionsfähige
Varianten enthalten typischerweise nur eine konservative Variation
oder eine Variation in nicht entscheidenden Resten oder in nicht
entscheidenden Regionen. Funktionelle Varianten können auch
eine Substitution ähnlicher
Aminosäuren
enthalten, was zu keiner Veränderung
oder einer insignifikanten Veränderung
der Funktion führt.
Alternativ dazu können
solche Substitutionen die Funktion in einem gewissen Ausmaß positiv
oder negativ beeinflussen.
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Nicht
funktionelle Varianten enthalten typischerweise eine oder mehrere
nicht konservative Aminosäuresubstitutionen,
-deletionen, -insertionen, -inversionen oder eine Trunkierung oder
eine Substitution, Insertion, Inversion oder Deletion in einem entscheidenden
Rest oder einer entscheidenden Region.
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Wie
angegeben, können
Varianten natürlich
auftreten oder können
mittels Rekombinationsverfahren oder chemischer Synthese hergestellt
werden, um nützliche
und neue Eigenschaften für
das Phosphodiesterase-Polypeptid bereitzustellen. Dies umfasst das
Verhindern der Immunogenität
von pharmazeutischen Formulierungen durch das Verhindern der Proteinaggregation.
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Nützliche
Variationen umfassen weiters die Veränderung der katalytischen Aktivität. Eine
Ausführungsform
umfasst weiters eine Variation an der Bindungsstelle, die zu einer
Bindung, jedoch nicht zur Hydrolyse, oder zu einer langsameren Hydrolyse
von CAMP führt.
Eine weitere nützliche
Variation an derselben Stelle kann zu einer veränderten Affinität für CAMP führen. Nützliche
Variationen umfassen auch Veränderungen, die
zu einer Affinität
für ein
anderes zyklisches Nucleotid führen.
Eine weitere nützliche
Variation umfasst eine, welche die Aktivierung durch Proteinkinase
A verhindert. Eine weitere nützliche
Variation stellt ein Fusionsprotein bereit, in dem eine oder mehrere
Domänen
oder Subregionen operativ an eine oder mehrere Domänen oder
Subregionen einer anderen Phosphodiesterase-Isoform oder -Familie
fusioniert sind.
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Aminosäuren, die
für die
Funktion essentiell sind, können
durch nach dem Stand der Technik bekannte Verfahren identifiziert
werden, wie z.B. ortsspezifische Mutagenese oder Alaninscanning-Mutagenese
(Cunningham et al., Science 244, 1081-1085 (1985)). Das letztere
Verfahren führt
einzelne Alaninmutationen an jedem Rest im Molekül ein. Die resultierenden Mutantenmoleküle werden
anschließend
auf ihre biologische Aktivität
getestet, wie z.B. cAMP-Hydrolyse in vitro oder cAMP-abhängige In-vitro-Aktivität, wie z.B.
proliferative Aktivität.
Stellen, die für
die CAMP- oder Proteinkinase-A-Bindung entscheidend sind, können mittels Strukturanalyse,
wie z.B. Kristallisation, kernmagnetischer Resonanz oder Photoaffinitätsmarkierung,
bestimmt werden (Smith et al., J. Mol. Biol. 224, 899-904 (1992);
de Vos et al., Science 255, 306-312 (1992)).
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Eine
wesentliche Homologie kann zu der gesamten Nucleinsäure- oder
Aminosäuresequenz
oder zu Fragmenten dieser Sequenzen bestehen.
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Die
Erfindung beschreibt daher auch Polypeptidfragmente der Phosphodiesterase.
Fragmente können von
der in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 dargestellten Aminosäuresequenz
abstammen. Die Erfindung umfasst daher auch, wie hierin beschrieben,
Fragmente der Varianten der Phosphodiesterasen.
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Die
Fragmente, welche die Erfindung betreffen, sind jedoch nicht als
Fragmente umfassend auszulegen, die vor der vorliegenden Erfindung
offenbart sein können.
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Dementsprechend
kann ein Fragment zumindest etwa 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,
50 oder mehr zusammenhängende
Aminosäuren
umfassen. Fragmente können
eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten des Proteins beibehalten,
wie z.B. die Fähigkeit,
cAMP zu binden oder zu hydrolysieren, sowie Fragmente, die als ein
Immunogen verwendet werden können,
um Phosphodiesterase-Antikörper
zu erzeugen.
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Biologisch
aktive Fragmente (Peptide, die z.B. 5, 7, 10, 12, 15, 20, 30, 35,
36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren lang sind) können eine
Domäne
oder ein Motiv umfassen, z.B. eine katalytische Stelle, Phosphodiesterase-Signatur,
sowie Stellen zur Glykosylierung, cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinase-Phosphorylierung,
Proteinkinase-C-Phosphorylierung, Caseinkinase-II-Phosphorylierung,
Tyrosinkinase-Phosphorylierung, N-Myristoylierung, Amidierung und
Glycosaminoglycan-Bindung. Weitere mögliche Fragmente umfassen die
katalytische Stelle oder Domäne,
umfassend HDXXHXX, eine allosterische Bindungsstelle, Stellen, die
für das
zelluläre
und das subzelluläre
Zielen von Bedeutung sind, Stellen, die für die Wechselwirkung mit Komponenten
anderer cAMP-abhängiger
Signalübertragungswege
funktionell sind, sowie aminoterminale und carboxyterminale Regulationsstellen.
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Solche
Domänen
oder Motive können
durch computerisierte Routine-Homologie-Suchverfahren identifiziert werden.
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Fragmente
können
sich z.B. in eine oder beide Richtungen von der funktionellen Steile
erstrecken, um 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 oder bis zu 100 Aminosäuren zu
umfassen. Weiters können
Fragmente Subfragmente der spezifischen, oben erwähnten Domänen umfassen,
wobei die Subfragmente die Funktion der Domäne, von der sie abstammen,
beibehalten.
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Diese
Regionen können
durch wohlbekannte Verfahren identifiziert werden, welche die computerisierte
Homologie-Analyse involvieren.
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Die
Erfindung stellt auch Fragmente mit immunogenen Eigenschaften bereit.
Diese enthalten einen epitoptragenden Teil der Phosphodiesterase
und der Varianten. Diese epitoptragenden Peptide sind von Nutzen,
um Antikörper
zu züchten,
die spezifisch an ein(e) Phosphodiesterase-Polypeptid oder -Region
oder -Fragment binden. Diese Peptide können zumindest 10, 12, zumindest
14 oder zwischen zumindest etwa 15 bis etwa 30 Aminosäuren enthalten.
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Nicht
einschränkende
Beispiele antigener Polypeptide, die verwendet werden können, um
Antikörper zu
erzeugen, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Peptide, die von einer
extrazellulären
Stelle abstammen. Regionen mit einem hohen Antigenitätsindex
werden in den 3 und 8 dargestellt.
Intrazellulär
hergestellte Antikörper
(„Intrakorper"), die intrazelluläre Peptidregionen
erkennen würden,
sind jedoch auch mit eingeschlossen.
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Die
epitoptragenden Phosphodiesterase-Polypeptide können durch jedes beliebige
herkömmliche Verfahren
hergestellt werden (R. A. Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82,
5131-5135 (1985)). Die gleichzeitig erfolgende, multiple Peptidsynthese
wird in US-Patent Nr. 4.631.211 beschrieben.
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Fragmente
können
einzeln (nicht an andere Aminosäuren
oder Polypeptide fusioniert) sein oder können sich innerhalb eines größeren Polypeptids
befinden. Weiters können
mehrere Fragmente innerhalb eines einzelnen, größeren Polypeptids inkludiert
sein. In einer Ausführungsform
kann ein Fragment, das für
die Expression in einem Wirt kreiert wurde, heterologe Prä- und Pro-Polypeptidregionen
besitzen, die an den Aminoterminus des Phosphodiesterase-Fragments
fusioniert sind, und eine zusätzliche
Region, die an den Carboxylterminus des Fragments fusioniert ist.
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Die
Erfindung stellt daher chimäre
oder Fusionsproteine bereit. Diese umfassen eine Phosphodiesterasepeptidsequenz,
die operativ an ein heterologes Peptid gebunden ist, das eine Aminosäuresequenz
besitzt, die im Wesentlichen nicht homolog zu der Phosphodiesterase
ist. „Operativ
gebunden" gibt an,
dass das Phosphodiesterase-Peptid
und das heterologe Peptid im Raster fusioniert sind. Das heterologe
Peptid kann an den N-Terminus oder den C-Terminus der Phosphodiesterase
fusioniert sein, oder es kann sich im Inneren befinden.
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In
einer Ausführungsform
beeinträchtigt
das Fusionsprotein die Phosphodiesterasefunktion per se nicht. Das
Fusionsprotein kann z.B. ein GST-Fusionsprotein sein, in dem die
Phosphodiesterasesequenzen an den C-Terminus der GST-Sequenzen fusioniert
sind. Andere Typen an Fusionsproteinen umfassen, sind jedoch nicht
eingeschränkt
auf, enzymatische Fusionsproteine, z.B. β-Galactosidasefusionen, Hefe-Doppelhybrid-GAL-4-Fusionen,
Poly-His-Fusionen und Ig-Fusionen. Solche Fusionsproteine, insbesondere
Poly-His-Fusionen, können
die Reinigung rekombinanter Phosphodiesterase erleichtern. In gewissen
Wirtszellen (z. B. Säugetier-Wirtszellen)
kann die Epxression und/oder die Sekretion eines Proteins unter
Verwendung einer heterologen Signalsequenz erhöht werden. Daher enthält das Fusionsprotein
in einer anderen Ausführungsform
eine heterologe Signalsequenz an seinem N-Terminus.
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EP-A-0 464 533 offenbart
Fusionsproteine, die verschiedene Teile der konstanten Immunglobulinregionen
umfassen. Die Fc ist für
die Therapie und die Diagnose von Nutzen und führt daher z.B. zu verbesserten pharmakokinetischen
Eigenschaften (
EP-A 0232 262 ).
Bei der Entdeckung von Arzneimitteln wurden z.B. menschliche Proteine
mit Fc-Abschnitten zum Zweck von Screening-Tests mit hohem Durchsatz
fusioniert, um Antagonisten zu identifizieren (Bennett et al., J.
Mol. Recog. 8, 52-58 (1995), und Johanson et al., J. Biol. Chem.
270, 9459-9471). Diese Erfindung umfasst daher auch lösliche Fusionsproteine,
die ein Phosphodiesterase-Polypeptid und verschiedene Abschnitte
der konstanten Regionen von schweren oder leichten Ketten von Immunglobulinen
verschiedener Subklassen (IgG, IgM, IgA, IgE) enthalten. Als Immunglobulin
bevorzugt ist der konstante Teil der schweren Kette des menschlichen
IgG, insbesondere IgG1, wobei die Fusion an der Gelenkregion stattfindet.
Für manche
Verwendungen ist es wünschenswert,
die Fc zu entfernen, nachdem das Fusionsprotein für den gedachten
Zweck verwendet wurde, z.B. wenn das Fusionsprotein als Antigen
für Immunisierungen
verwendet werden soll. In einer besonderen Ausführungsform kann der Fc-Teil
auf eine einfache Art und Weise durch eine Spaltungssequenz entfernt
werden, die auch inkorporiert ist und die mit dem Faktor Xa gespalten
werden kann.
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Ein
chimäres
oder ein Fusionsprotein kann mittels Standard-DNA-Rekombinationsverfahren
hergestellt werden. DNA-Fragmente, die z.B. für die verschiedenen Proteinsequenzen
kodieren, werden gemäß herkömmlichen
Verfahren im Raster zusammen ligiert. In einer anderen Ausführungsform
kann das Fusionsgen mittels herkömmlicher
Verfahren, inkludierend das automatisierte DNA-Synthesegerät, synthetisiert
werden. Alternativ dazu kann die PCR-Amplifikation der Genfragmente
unter Verwendung von Primern mit einer Region hoher Sequenzhomologie
durchgeführt
werden, die zu komplementären Überhängen zwischen
zwei konsekutiven Genfragmenten führen, die anschließend durch
Annealing verbunden und erneut amplifiziert werden können, um
eine chimäre
Gensequenz zu erzeugen (siehe Ausubel et al., Current Protocols
in Molecular Biology (1992)). Weiters sind zahlreiche Expressionsvektoren
im Handel erhältlich,
die bereits für
eine Fusionsgruppierung kodieren (z.B. ein GST-Protein). Eine phosphodiesterase-kodierende
Nucleinsäure
kann in solch einen Expressionsvektor kloniert werden, so dass die
Fusionsgruppierung im Raster an die Phosphodiesterase gebunden ist.
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Eine
weitere Form des Fusionsproteins ist eine, welche die Phosphodiesterase-Funktionen direkt
beeinflusst. Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung ein
Phosphodiesterase-Polypeptid, in dem eine oder mehrere der Phosphodiesterase-Domänen (oder
Teile davon) durch homologe Domänen
(oder Teile davon) aus einer anderen Familie-7-Phosphodiesterase
oder einer anderen Phosphodiesterase-Familie ersetzt wurden. Dementsprechend
sind verschiedene Permutationen möglich. Die aminoterminale Regulationsdomäne oder
eine Subregion davon kann z.B. mit der Domäne oder der Subregion einer
anderen Familie-7-Isoform oder einer Phosphodiesterase-Familie ersetzt
werden. Als weiteres Beispiel kann die katalytische Domäne oder
Teile davon ersetzt werden; die carboxyterminale Domäne oder
Subregion können
ersetzt werden. Chimäre
Phosphodiesterasen können
daher gebildet werden, in denen eine oder mehrere der nativen Domänen oder
Subregionen durch eine andere ersetzt wurde(n).
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Zusätzlich dazu
können
chimäre
Phosphodiesteraseproteine hergestellt werden, in denen eine oder mehrere
funktionelle Stellen von einer anderen Familie-7-Isoform oder von
einer anderen Phosphodiesterase-Familie, wie z.B. 1-6 und 8, abstammt/abstammen.
Es ist jedoch davon auszugehen, dass Stellen von Phosophodiesterase-Familien
stammen könnten,
die im Säugetiergenom
vorkommen, jedoch noch nicht entdeckt oder charakterisiert wurden.
Solche Stellen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf,
die katalytische Stelle, die aminoterminale Regulationsstelle, die
carboxyterminale Regulationsstelle, Stellen, die für das Zielen auf
subzelluläre
und zelluläre
Lokationen von Bedeutung sind, Stellen, die für die Wechselwirkung mit Komponenten
anderer zyklischer AMP-abhängiger
Signalübertragungswege
funktionell sind, Proteinkinase-A-Phosphorylierungsstellen, Glykosylierungsstellen
und andere, hierin offenbarte funktionelle Stellen.
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Die
isolierten Phosphodiesterasen können
aus Zellen gereinigt werden, die sie natürlich exprimieren, wie z.B.
unter anderem aus Herz (unter anderem des Fötus), Eierstöcken, Gehirn,
Pankreas, Nieren, Brust, Leber, Hoden, Prostata, Skelettmuskeln
und Osteoblasten, insbesondere gereinigt aus Zellen, die verändert wurden,
um sie zu exprimieren (rekombinant), oder unter Verwendung bekannter
Proteinsyntheseverfahren synthetisiert wurden.
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In
einer Ausführungsform
wird das Protein mittels DNA-Rekombinationsverfahren produziert.
Ein Nucleinsäuremolekül, das für das Phosphodiesterase-Polypeptid
kodiert, wird z.B. in einen Expressionsvektor kloniert, der Expressionsvektor
wird in eine Wirtszelle eingeführt,
und ein Protein wird in der Wirtszelle exprimiert. Das Protein kann
anschließend
aus den Zellen mittels eines geeigneten Reinigungsverfahrens unter Verwendung
von Standard-Proteinreinigungsverfahren isoliert werden.
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Polypeptide
enthalten oftmals andere Aminosäuren
als die 20 Aminosäuren,
die normalerweise als die 20 natürlich
vorkommenden Aminosäuren
bezeichnet werden. Weiters können
viele Aminosäuren,
unter anderem die terminalen Aminosäuren, durch natürliche Verfahren,
wie z.B. Verarbeitung und andere Posttranslationsmodifikationen,
oder durch chemische Modifikationsverfahren modifiziert werden,
die nach dem Stand der Technik wohlbekannt sind. Häufig vorkommende
Modifikationen, die natürlich
in Polypeptiden vorkommen, werden in Basistexten, ausführlichen
Monographien und Forschungsliteratur beschrieben und sind dem Fachmann
wohlbekannt.
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Dementsprechend
beschreibt das Patent Polypeptide, Derivate oder Analoga, in denen
ein substituierter Aminosäurerest
nicht einer ist, der durch den genetischen Code kodiert wird, in
denen eine Substituentengruppe inkludiert ist, in denen das reife
Polypeptid mit einer anderen Verbindung fusioniert ist, wie z.B.
eine Verbindung, um die Halbwertszeit des Polypeptids zu erhöhen (z.B.
Polyethylenglykol), oder in denen die zusätzlichen Aminosäuren an
das reife Polypeptid fusioniert sind, wie z.B. eine Leader- oder
Sekretions-Sequenz oder eine Sequenz für die Reinigung des reifen
Polypeptids oder einer Pro-Proteinsequenz.
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Bekannte
Modifikationen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf,
Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalente
Bindung von Flavin, kovalente Bindung einer Häm-Gruppierung, kovalente Bindung
eines Nucleotids oder Nucleotidderivats, kovalente Bindung eines
Lipids oder Lipidderivats, kovalente Bindung von Phosphatidylinosit,
Vernetzung, Zyklisierung, Disulfidbindungs-Bildung, Demethylierung,
Bildung kovalenter Vernetzungen, Bildung von Cystin, Bildung von
Pyroglutamat, Formylierung, γ-Carboxylierung,
Glykosylierung, GPI-Ankerbildung, Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung,
Myristoylierung, Oxidation, proteolytische Verarbeitung, Phosphorylierung,
Prenylierung, Racemisierung, Selenoylierung, Sulfatierung, Transfer-RNA-vermittelte
Addition von Aminosäuren
an Proteine, wie z.B. Arginylierung, und Ubiquitinierung.
-
Solche
Modifikationen sind dem Fachmann wohlbekannt und wurden in der wissenschaftlichen
Literatur ausführlich
beschrieben. Einige besonders häufige
Modifikationen, Glykosylierung, Lipidbindung, Sulfatierung, γ-Carboxylierung
von Glutaminsäureresten,
Hydroxylierung und ADP-Ribosylierung z.B., werden in den grundlegendsten
Texten beschrieben, wie z.B. Proteins – Structure and Molecular Properties,
2. Auflage, T. E. Creighton, W. H. Freeman und Company, New York
(1993). Zahlreiche ausführliche Übersichtsartikel
sind zu diesem Thema erhältlich,
wie z.B. von F. Wold, Posttranslational Covalent Modification of
Proteins, B. C. Johnson (Hrsg.), Academic Press, New York 1-12 (1983);
Seifter et al., Meth. Enzymol. 182, 626-646 (1990), und Rattan et
al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 663, 48-62 (1992)).
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Wie
weiters wohlbekannt ist, sind Polypeptide nicht immer ganz linear.
Polypeptide können
z.B. als Resultat der Ubiquitinierung verzweigt sein und können, mit
oder ohne Verzweigung, zirkulär
sein, im Allgemeinen als Resultat von Posttranslationsvorkommnissen,
unter anderem natürliche
Verarbeitungsvorkommnisse und Vorkommnisse, die durch natürliche Manipulation
herbeigeführt
werden, die nicht natürlich
vorkommen. Zirkuläre,
verzweigte und verzweigte zirkuläre
Polypeptide können
mittels nicht translationaler, natürlicher Verfahren sowie mittels
Syntheseverfahren synthetisiert werden.
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Modifikationen
können überall in
einem Polypeptid auftreten, unter anderem in der Peptidhauptkette, den
Aminosäure-Seitenketten
oder den Amino- oder Carboxylter mini. Die Blockade der Amino- oder
Carboxyl-Gruppe in einem Polypeptid, oder beider, durch eine kovalente
Modifikation kommt in natürlich
vorkommenden und synthetischen Polypeptiden häufig vor. Der aminoterminale
Rest von Polypeptiden, die z.B. vor der proteolytischen Verarbeitung
in E. coli hergestellt wurden, ist beinahe immer N-Formylmethionin.
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Die
Modifikationen können
eine Funktion dessen sein, wie das Protein hergestellt wird. Bei
rekombinanten Polypeptiden werden die Modifikationen z.B. durch
die posttranslationale Modifikationskapazität der Wirtszelle und die Modifikationssignale
in der Polypeptid-Aminosäuresequenz
bestimmt. Dementsprechend sollte, wenn eine Glykosylierung gewünscht wird,
ein Polypeptid in einem glykosylierenden Wirt, im Allgemeinen einer
eukaryotischen Zelle, exprimiert werden. Insektenzellen führen oftmals
dieselben posttranslationalen Glykosylierungen wie Säugetierzellen
aus, und aus diesem Grund wurden Insektenzellen-Expressionssysteme
entwickelt, um Säugetierproteine
mit nativen Glykosylierungsmustern wirksam zu exprimieren. Ähnliche Überlegungen
treffen auf andere Modifikationen zu.
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Dieselbe
Art der Modifikation kann im selben oder einem variierenden Ausmaß an mehreren
Stellen in einem bestimmten Polypeptid vorhanden sein. Ein bestimmtes
Polypeptid kann weiters mehr als eine Art der Modifikation enthalten.
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Polypeptid-Verwendungen
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Die
Proteinsequenzen der vorliegenden Erfindung können als „Abfragesequenz" verwendet werden, um
eine Suche gegen öffentliche
Datenbanken durchzuführen,
um z.B. andere Familienmitglieder oder verwandte Sequenzen zu identifizieren.
Solche Suchen können
unter Verwendung der NBLAST- und XBLAST-Programme (Version 2.0)
von Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-10 (1990), durchgeführt werden. BLAST-Nucleotidsuchen
können
mit dem NBLAST-Programm, Score = 100, Wortlänge = 12, durchgeführt werden,
um Nucleotidsequenzen zu erhalten, die homolog zu den Nucleinsäuremolekülen der
Erfindung sind. BLAST-Proteinsuchen können mit dem XBLAST-Programm,
Score = 50, Wortlänge
= 3, durchgeführt
wer den, um Aminosäuresequenzen
zu erhalten, die homolog zu den Proteinen der Erfindung sind. Um
für Vergleichszwecke
Anordnungen mit Lücken
zu erhalten, kann Gapped BLAST verwendet werden, wie von Altschul
et al., Nucleic Acids Res. 25 (17), 3389-3402 (1997), beschrieben
wurde. Bei der Verwendung von BLAST- und Gapped-BLAST-Programmen
können
die Standardparameter der jeweiligen Programme (z.B. XBLAST und NBLAST)
verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
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Die
Phosphodiesterase-Polypeptide sind für die Produktion von Antikörpern von
Nutzen, die für
die Phosphodiesterase, Regionen oder Fragmente spezifisch sind.
Regionen mit einem hohen Antigenitätsindex sind in den 3 und 8 dargestellt.
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Die
Phosphodiesterase-Polypeptide sind für biologische Tests von Nutzen,
die mit Phosphodiesterasen in Zusammenhang stehen, insbesondere
mit jenen der Familie 7. Solche Tests involvieren beliebige der bekannten
Phosphodiesterase-Funktionen oder -Aktivitäten oder -Eigenschaften, die
für die
Diagnose und die Behandlung von phosphodiesteraseverwandten Leiden
von Nutzen sind.
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Die
Phosphodiesterase-Polypeptide sind ebenfalls in Arzneimittelscreening-Tests
in zellbasierten oder zellfreien Systemen von Nutzen. Zellbasierte
Systeme können
nativ sein, d.h. Zellen, welche die Phosphodiesterase normalerweise
exprimieren, als Biopsie oder in Zellkultur expandiert vorliegen.
In einer Ausführungsform
umfassen zellbasierte Tests jedoch rekombinante Wirtszellen, welche
die Phosphodiesterase exprimieren.
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Die
Bestimmung der Fähigkeit
der Testverbindung, mit der Phosphodiesterase wechselzuwirken, kann auch
die Bestimmung der Fähigkeit
der Testverbindung umfassen, vorzugsweise an das Polypeptid zu binden, im
Vergleich zu der Fähigkeit
eines bekannten Bindungsmoleküls
(z.B. CAMP), an das Polypeptid zu binden.
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Die
Polypeptide können
verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, welche die
Phosphodiesterase-Aktivität
modulieren. Solche Verbindungen können z.B. die Affinität oder die
Bindungsrate an CAMP erhöhen
oder verringern, mit cAMP um die Bindung an die Phosphodiesterase
konkurrieren oder cAMP, das an die Phosphodiesterase gebunden ist,
verdrängen.
Sowohl Phosphodiesterase als auch geeignete Varianten und Fragmente
können
bei Screenings mit hohem Durchsatz verwendet werden, um Kandidatenverbindungen
auf die Fähigkeit
zu testen, an die Phosphodiesterase zu binden. Diese Verbindungen
können
weiter gegen eine funktionelle Phosphodiesterase gescreent werden,
um die Wirkung der Verbindung auf die Phosphodiesterase-Aktivität zu bestimmen.
Verbindungen können
identifiziert werden, welche die Phosphodiesterase zu einem gewünschten
Ausmaß aktivieren
(Agonist) oder inaktivieren (Antagonist). Modulationsverfahren können in
vitro durchgeführt
werden (z.B. durch Züchten
der Zelle mit dem Agens) oder, alternativ dazu, in vivo (z.B. durch
Verabreichung des Agens an ein Individuum).
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Die
Phosphodiesterase-Polypeptide können
verwendet werden, um eine Verbindung auf die Fähigkeit zu screenen, die Wechselwirkung
zwischen dem Phosphodiesterase-Protein und einem Ziel-Molekül zu stimulieren
oder zu inhibieren, das normalerweise mit dem Phosphodiesterase-Protein
wechselwirkt. Das Ziel kann ein zyklisches Nucleotid oder eine andere
Komponente des Signalwegs sein, mit dem das Phosphodiesterase-Protein
normalerweise wechselwirkt (z.B. Proteinkinase-A oder ein anderer
Wechselwirkungspartner, der in den cAMP-Umsatz involviert ist).
Der Test umfasst die Schritte des Kombinierens des Phosphodiesterase-Proteins
mit einer Kandidatenverbindung, und zwar unter Bedingungen, die
es dem Phosphodiesterase-Protein oder -Fragment ermöglichen,
mit dem Zielmolekül
wechselzuwirken und die Bildung eines Komplexes zwischen dem Phosphodiesterase-Protein
und dem Ziel zu detektieren oder um die biochemische Konsequenz
der Wechselwirkung mit der Phosphodiesterase und dem Ziel zu detektieren,
wie z.B. eine beliebige der assoziierten Wirkungen der Signalweiterleitung,
wie z.B. Proteinkinase-A-Phosphorylierung,
cAMP-Umsatz und biologische Endpunkte des Wegs.
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Die
Bestimmung der Fähigkeit
der Phosphodiesterase, an ein Target-Molekül zu binden, kann auch unter
Verwendung eines Verfahrens erreicht werden, wie z.B. der Echtzeit-Bimolekular-Wechselwirkungsanalyse
(BIA). Sjolander et al., Anal. Chem. 63, 2338-2345 (1991), und
Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699-705 (1995). Wie hierin
verwendet, ist „BIA" ein Verfahren für das Studieren
biospezifischer Wechselwirkungen in Echtzeit, und zwar ohne das
Markieren etwaiger Wechselwirkungspartner (z.B. BIAcoreTM).
Veränderungen
im optischen Phänomen
der Oberflächen-Plasmonresonanz
(SPR) können
als Indikator für
Echtzeit-Reaktionen zwischen biologischen Molekülen verwendet werden.
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Die
Testverbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung eines
beliebigen der zahlreichen Ansätze
der kombinatorischen Bibliotheksverfahren, die nach dem Stand der
Technik bekannt sind, erhalten werden, unter anderem: biologische
Bibliotheken; räumlich
adressierbare, parallele Festphasen- oder Lösungsphasen-Bibliotheken; Synthese-Bibliotheksverfahren,
die eine Dekonvolution erfordern; die „Eine-Perle-Eine-Verbindung"-Bibliotheksmethode;
sowie Synthese-Bibliotheksverfahren unter Verwendung der Affinitätschromatographieselektion.
Der Ansatz der biologischen Bibliothek ist auf Polypeptid-Bibliotheken
beschränkt,
während
die anderen vier Ansätze
auf Polypeptid-, Nicht-Peptid-Oligomer- oder Kleinmolekül-Bibliotheken von
Verbindungen anwendbar sind (K. S. Lam, Anticancer Drug Des. 12,
145 (1997)).
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Beispiele
von Verfahren für
die Synthese von Molekularbibliotheken sind nach dem Stand der Technik z.B.
in De Witt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6909 (1993); Erb
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11422 (1994); Zuckermann
et al., J. Med. Chem. 37, 2678 (1994); Cho et al., Science 261,
1303 (1993); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059
(1994); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 33, 2061 (1994); sowie
in Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233 (1994), zu finden. Bibliotheken
an Verbindungen können
in Lösung
dargestellt werden (z.B. Houghten, Biotechniques 13, 412-421 (1992))
oder auf Perlen (Lam, Nature 354, 82-84 (1991)), Chips (Fodor, Nature
364, 555-556 (1993)), Bakterien (Ladner, USP 5.223.409), Sporen
(Ladner USP '409),
Plasmiden (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1865-1869
(1992)) oder auf Phagen (Scott und Smith, Science 249, 386-390 (1990));
(Devlin, Science 249, 404-406 (1990)); (Cwirla et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 97, 6378-6382
(1990)); (Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310 (1991)); (Ladner, s.o.).
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Kandidatenverbindungen
inkludieren z.B. 1) Peptide, wie z.B. lösliche Peptide, unter anderem
Ig-geschwänzte
Fusionspeptide und Mitglieder von Zufalls-Peptidbibliotheken (siehe
z.B. Lam et al., Nature 354, 82-84 (1991); Houghten et al., Nature
354, 84-86 (1991)) sowie von kombinatorischer Chemie abstammende Molekularbibliotheken,
die aus Aminosäuren
mit D- und/oder L-Konfiguration bestehen; 2) Phosphopeptide (z.B.
Mitglieder von zufälligen
und partiell degenerierten, gerichteten Phosphopeptidbibliotheken,
siehe z.B. Songyang et al., Cell 72, 767-778 (1993)); 3) Antikörper (z.B.
polyklonale, monoklonale, humanisierte, anti-idiotypische, chimäre und Einzelketten
Antikörper
sowie Fab-, F(ab')2-, Fab-Expressionsbibliothek-Fragmente und
epitopbindende Fragmente von Antikörpern); sowie 4) kleine organische
und anorganische Moleküle
(z.B. Moleküle,
die aus kombinatorischen und natürlichen
Produktbibliotheken erhalten wurden).
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Eine
Kandidatenverbindung ist eine lösliche
Phosphodiesterase voller Länge
oder ein Fragment, das um die cAMP-Bindung konkurriert. Weitere
Kandidatenverbindungen umfassen Mutanten-Phosphodiesterasen oder
geeignete Fragmente, die Mutationen enthalten, welche die Phosphodiesterasefunktion
beeinträchtigen
und daher um cAMP konkurrieren. Dementsprechend umfasst die Erfindung
ein Fragment, das um cAMP konkurriert, z.B. mit einer höheren Affinität, oder
ein Fragment, das cAMP bindet, es jedoch nicht abbaut.
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Die
Erfindung stellt andere Endpunkte bereit, um Verbindungen zu identifizieren,
welche die Phosphodiesteraseaktivität modulieren (stimulieren oder
inhibieren). Die Tests umfassen typischerweise einen Test an Vorkommnissen
im Signalübertragungsweg,
die auf eine Phosphodiesteraseaktivität hinweisen. Daher kann die
Expression von Genen, die in Reaktion auf die phosphodiesteraseabhängige Signalkaskade
hinauf- oder hinunterreguliert werden, getestet werden. In einer
Ausführungsform
kann die Regulationsregion solcher Gene operabel an einen Marker
gebunden sein, der leicht detektierbar ist, wie z.B. Luciferase.
Alternativ dazu konnte die Phosphorylierung der Phosphodiesterase
oder eines Phosphodiesterase-Ziels auch gemessen werden.
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Jede
der biologischen oder biochemischen Funktionen, die durch die Phosphodiesterase
vermittelt wird, kann als Endpunkt-Test verwendet werden. Diese
umfassen alle der hierin beschriebenen, hierin in den Verweisen
zitierten, für
diese Endpunkt-Testziele
mittels Verweis aufgenommenen biochemischen oder biochemischen/biologischen
Vorkommnisse sowie andere Funktionen, die dem Fachmann bekannt sind.
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Im
Fall der Phosphodiesterase können
spezifische Endpunkte die cAMP-Hydrolyse umfassen sowie eine Verringerung
der Proteinkinase-A-Aktivierung.
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Bindende
und/oder aktivierende Verbindungen können auch unter Verwendung
chimärer
Phosphodiesteraseproteine gescreent werden, in denen eine oder mehrere
Domäne(n),
Stelle(n) und dergleichen, wie hierin beschrieben, oder Teile davon
durch ihre heterologen Gegenstücke
ersetzt werden können,
die aus anderen Familie-7-Phosphodiesterasen oder aus Phosphodiesterase-Isoformen
einer beliebigen anderen Phosphodiesterase-Familie abstammen. Es
kann z.B. eine katalytische Region verwendet werden, die mit einer
anderen zyklischen Nucleotid-Spezifität und/oder -Affinität wechselwirkt
als die native Phosphodiesterase. Dementsprechend ist eine andere
Gruppe an Signalübertragungskomponenten
als Endpunkt-Test für
die Aktivierung erhältlich.
Alternativ dazu kann eine heterologe Targeting-Sequenz die native
Targeting-Sequenz ersetzen. Dies führt zu einer anderen subzellulären oder
zellulären
Lokalisierung und kann dementsprechend zu einer Wirkung auf einen
anderen Signalübertragungsweg
führen.
Dementsprechend ist eine andere Gruppe an Signalübertragungskomponenten als
Endpunkt-Test für
die Aktivierung erhältlich.
Als weitere Alternative kann die Stelle der Modifikation durch ein
Effektorprotein, z.B. Phosphorylierung durch Proteinkinase-A, durch die
Stelle aus einem anderen Effektorprotein ersetzt werden. Dadurch
könnte
auch die Verwendung eines anderen Signalübertragungswegs für die Bestimmung
des Endpunkts bereitgestellt werden. Die Aktivierung kann auch durch
ein Reportergen detektiert werden, das eine leicht detektierbare
kodierende Region enthält,
die operabel an eine Transkriptions-Regulationssequenz gebunden ist, die
Teil des nativen Signalübertragungswegs
ist.
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Die
Phosphodiesterase-Polypeptide sind auch bei kompetitiven Bindungstests
in Verfahren von Nutzen, die kreiert wurden, um Verbindungen zu
entdecken, die mit der Phosphodiesterase Wechselwirken. Daher wird
eine Verbindung gegenüber
einem Phosphodiesterase-Polypeptid unter Bedingungen ausgesetzt,
die es der Verbindung ermöglichen,
mit dem Polypeptid eine Bindung einzugehen oder auf andere Weise
mit ihm wechselzuwirken. Lösliches
Phosphodiesterase-Polypeptid wird auch zum Gemisch zugegeben. Falls
die Testverbindung mit dem löslichen
Phosphodiesterase-Polypeptid wechselwirkt, so verringert es die
Menge des gebildeten Komplexes oder die Aktivität des Phosphodiesterase-Ziels.
Diese Art von Test ist besonders in Fällen von Nutzen, in denen Verbindungen
gesucht werden, die mit spezifischen Regionen der Phosphodiesterase
Wechselwirken. Das lösliche
Polypeptid, das mit der Ziel-Phosphodiesteraseregion konkurriert,
wurde kreiert, um Peptidsequenzen zu enthalten, die der Region von
Interesse entsprechen.
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Eine
andere Art von kompetitivem Bindungstest kann verwendet werden,
um Verbindungen zu entdecken, die mit spezifischen funktionellen
Stellen Wechselwirken. Als Beispiel kann Proteinkinase-A und eine Kandidatenverbindung
zu einer Probe der Phosphodiesterase hinzugefügt werden. Verbindungen, die
mit der Phosphodiesterase an derselben Stelle wie die Proteinkinase-A
Wechselwirken, reduzieren die Menge des zwischen der Phosphodiesterase
und der Proteinkinase-A gebildeten Komplexes. Dementsprechend ist
es möglich,
eine Verbindung zu entdecken, welche die Wechselwirkung zwischen
der Phosphodiesterase und der Protein-A-Kinase spezifisch verhindert.
Ein weiteres Beispiel umfasst das Hinzufügen einer Kandidatenverbindung
zu einer Probe an Phosphodiesterase und cAMP. Eine Verbindung, die
mit cAMP konkurriert, reduziert das Ausmaß der Hydrolyse oder der Bindung
von CAMP an die Phosphodiesterase. Dementsprechend können Verbindungen
entdeckt werden, die direkt mit der Phosphodiesterase Wechselwirken
und mit CAMP konkurrieren. Solche Analysen können eine beliebige andere
Komponente involvieren, die mit der Phosphodiesterase wechselwirkt.
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Um
zellfreie Arzneimittelscreening-Tests durchzuführen, ist es wünschenswert,
entweder die Phosphodiesterase oder das Fragment oder ihr Zielmolekül zu immobili sieren,
um die Trennung von Komplexen aus unkomplexierten Formen eines oder
beider der Proteine zu erleichtern sowie um die Automatisierung
des Tests zu ermöglichen.
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Verfahren
zur Immobilisierung von Proteinen auf Matrizen können in den Arzneimittelscreening-Tests verwendet
werden. In einer Ausführungsform
kann ein Fusionsprotein bereitgestellt werden, das eine Domäne hinzufügt, die
es dem Protein ermöglicht,
an eine Matrize gebunden zu werden. Glutathion-S-Transferase/Phosphodiesterase-Fusionsproteine
können
z.B. auf Glutathion-Sepharose-Perlen (Sigma Chemical, St. Louis,
MO) oder Glutathion-derivatisierte Mikrotiter-Platten adsorbiert
werden, die anschließend
mit den Zelllysaten (z.B. 35S-markiert)
und der Kandidatenverbindung kombiniert werden, und das Gemisch
kann unter Bedingungen inkubiert werden, die zu einer Komplexbildung
führen
(z.B. bei physiologischen Bedingungen für Salz und pH). Nach der Inkubation
werden die Perlen gewaschen, um jegliche ungebundene Markierung
zu entfernen, und die Matrix wird immobilisiert und die Radiomarkierung
direkt bestimmt oder im Überstand,
nachdem die Komplexe dissoziiert wurden. Alternativ dazu können die
Komplexe aus der Matrix dissoziiert werden, durch SDS-PAGE getrennt
werden, und das Ausmaß des
phosphodiesterasebindenden Proteins, das in der Perlenfraktion zu
finden ist, wird aus dem Gel unter Verwendung von Standard-Elektrophoreseverfahren
quantifiziert. Entweder das Polypeptid oder sein Zielmolekül können z.B.
unter Verwendung der Konjugation von Biotin und Streptavidin durch
Verfahren, die nach dem Stand der Technik wohlbekannt sind, immobilisiert
werden. Alternativ dazu können
Antikörper,
die mit dem Protein reaktiv sind, die jedoch nicht die Bindung des
Proteins an sein Ziel-Molekül
stören,
an die Wells der Platte derivatisiert werden, und das Protein kann
in den Wells durch Antikörper-Konjugation
gefangen werden. Präparate
einer phosphodiesterasebindenden Zielkomponente, wie z.B. cAMP oder
Proteinkinase-A, sowie eine Kandidatenverbindung werden in den phosphodiesteraseaufweisenden
Wells inkubiert, und die Menge des im Well eingefangenen Komplexes
kann quantifiziert werden. Verfahren zur Detektion solcher Komplexe,
zusätzlich
zu jenen, die oben für
die GST-immobilisierten Komplexe beschrieben wurden, umfassen die
Immundetektion von Komplexen unter Verwendung von Antikörpern, die
mit dem Phosphodiesterase- Zielmolekül reaktiv
sind oder die mit Phosphodiesterase reaktiv sind und mit dem Zielmolekül konkurrieren,
sowie enzymgekoppelte Tests, die auf der Detektion einer enzymatischen Aktivität basieren,
die mit dem Zielmolekül
assoziiert ist.
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Modulatoren
der Phosphodiesteraseaktivität,
die nach diesen Arzneimittelscreening-Tests identifiziert wurden, können zur
Behandlung eines Individuums mit einer Erkrankung verwendet werden,
die durch den Phosphodiesteraseweg vermittelt wird, und zwar durch
Behandeln der Zellen, welche die Phosphodiesterase exprimieren,
wie z.B. Herz, Eierstöcke,
Gehirn, Pankreas, Nieren, Brust, Leber, Hoden, Prostata, Skelettmuskeln,
und von osteoblasten-hältigem
Gewebe, wie z.B. Knochen. Diese Behandlungsverfahren umfassen die Schritte
der Verabreichung der Modulatoren der Phosphodiesteraseaktivität in einer
pharmazeutischen Zusammensetzung, wie hierin beschrieben, an ein
Individuum, das eine solche Behandlung benötigt.
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Die
Phosphodiesterase wird in Osteoblasten exprimiert und ist in die
Osteoblastendifferenzierung involviert. Dementsprechend ist sie
in die Knochenmatrix-Deposition und daher in die Knochenbildung
involviert. Das Gen ist als solches besonders für die Behandlung von Erkrankungen
relevant, die Knochengewebe involvieren, sowie insbesondere bei
Osteoporose.
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Erkrankungen,
in denen die Phosphodiesterase-Expression relevant ist, umfassen,
sind jedoch nicht eingeschränkt
auf, Demenz, Gedächtnisverlust,
kongestives Herzversagen, Thrombose, pulmonale Hypertonie, Glomerulonephritis,
bipolare Depression, Bronchialasthma, atopische Erkrankungen, Autoimmun-Encephalomyelitis,
Organtransplantation, Salzretention bei nephrotischem Syndrom und
erektile Dysfunktion.
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Die
Phosphodiesterasen sind weiters auch spezifisch bei Herzerkrankungen,
wie z.B. kongestivem Herzversagen, und Brustkrebs involviert.
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Die
Phosphodiesterase-Polypeptide sind daher für die Behandlung einer phosphodiesteraseassoziierten
Erkrankung von Nutzen, die durch abnormale Expression o der Aktivität einer
Phosphodiesterase charakterisiert ist. In einer Ausführungsform
umfasst das Verfahren die Verabreichung eines Agens (z.B. eines
Agens, das durch einen hierin beschriebenen Screeningtest identifiziert
wurde) oder einer Kombination an Agenzien, der/die die Expression
oder Aktivität
des Proteins moduliert (z.B. hinaufreguliert oder hinunterreguliert).
In einer anderen Ausführungsform
umfasst das Verfahren die Verabreichung der Phosphodiesterase als
Therapie, um für
die reduzierte oder abnormale Expression oder Aktivität des Proteins
zu kompensieren.
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Verfahren
zur Behandlung umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf,
die Verwendung von löslicher
Phosphodiesterase oder Fragmenten des Phosphodiesterase-Proteins, die um
cAMP oder Proteinkinase-A konkurrieren. Diese Phosphodiesterasen
oder Fragmente können
eine größere Affinität für das Ziel
aufweisen, um eine wirksame Konkurrenz darzustellen.
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Die
Stimulierung der Aktivität
ist in Situationen wünschenswert,
in denen das Protein abnormal hinunterreguliert ist und/oder in
denen eine erhöhte
Aktivität
wahrscheinlich eine positive Wirkung hat. Auf dieselbe Art und Weise
ist eine Inhibierung der Aktivität
in Situationen wünschenswert,
in denen das Protein abnormal hinaufreguliert ist und/oder in denen
eine verringerte Aktivität
wahrscheinlich eine positive Wirkung hat. In einem Beispiel einer
solchen Situation leidet ein Individuum unter einer Erkrankung,
die durch eine abnormale Entwicklung oder zelluläre Differenzierung charakterisiert
ist. In einem anderen Beispiel leidet das Individuum unter einer
proliferativen Erkrankung (z.B. Krebs) oder einer Erkrankung, die
durch eine abnormale hämatopoetische
Reaktion charakterisiert ist. In einem weiteren Beispiel ist es
wünschenswert,
eine Geweberegeneration in einem Individuum zu erreichen (z.B. wenn
ein Individuum sich eine Gehirn- oder Rückenmarks-Verletzung zugezogen
hat und es wünschenswert
ist, das neuronale Gewebe auf regulierte Art und Weise zu regenerieren).
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In
einem weiteren Aspekt der Erfindung können die Proteine der Erfindung
als „Köder-Proteine" in einem Doppelhybrid-Test
oder einem Dreifachhybrid-Test verwendet werden (siehe z.B. US-Patent
Nr. 5.283.317; Zervos et al., Cell 72, 223-232 (1993); Madura et
al., J. Biol. Chem. 268, 12046-12054 (1993); Bartel et al., Biotechniques
14, 920-924 (1993); Iwabuchi et al., Oncogene 8, 1693-1696 (1993);
sowie Brent,
WO 94/10300 ),
um andere Proteine (gefangene Proteine) zu identifizieren, die mit
den Proteinen der Erfindung eine Bindung eingehen oder welchselwirken
und ihre Aktivität
modulieren.
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Die
Phosphodiesterase-Polypeptide sind ebenso von Nutzen, um ein Ziel
für die
Diagnose einer Erkrankung oder Prädisposition für eine Erkrankung
bereitzustellen, die durch die Phosphodiesterase vermittelt wird,
unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Erkrankungen, die
Gewebe involvieren, in denen die Phosphodiesterasen, wie hierin
offenbart, exprimiert werden, sowie insbesondere bei Osteoporose,
Brustkrebs und kongestivem Herzversagen. Dementsprechend werden
Verfahren zur Detektion der Gegenwart oder des Ausmaßes der
Phosphodiesterase in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organismus
bereitgestellt. Das Verfahren umfasst das Kontaktieren einer biologischen
Probe mit einer Verbindung, die in der Lage ist, mit der Phosphodiesterase
wechselzuwirken, so dass die Wechselwirkung detektiert werden kann.
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Ein
Agens zur Detektion der Phosphodiesterase ist ein Antikörper, der
in der Lage ist, selektiv an Phosphodiesterase zu binden. Eine biologische
Probe umfasst Gewebe, Zellen und biologische Flüssigkeiten, die aus einem Individuum
isoliert wurden, sowie Gewebe, Zellen und Flüssigkeiten, die in einem Individuum
vorhanden sind.
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Die
Phosphodiesterase stellt auch ein Ziel zur Diagnose aktiver Erkrankungen
oder einer Prädisposition
von Erkrankungen bei einem Patienten mit einer Phosphodiesterase-Variante
bereit. Daher kann die Phosphodiesterase aus einer biologischen
Probe isoliert werden und auf die Gegenwart einer genetischen Mutation getestet
werden, die zu einem abnormalen Protein führt. Dies umfasst Aminosäure-Substitution,
-Deletion, -Insertion, -Neuanordnung (als Resultat fehlerhafter
Spleißvorkommnisse)
sowie ungeeignete Postranslationsmodifikationen. Analyseverfahren
umfassen eine veränderte
elektrophoretische Mobilität,
einen veränderten tryptischen
Peptidverdau, eine veränderte
Phosphodiesteraseaktivität
in zellbasierten oder zellfreien Tests, ei ne Veränderung der/des cAMP-Bindung
oder -Abbaus, Proteinkinase-A-Bindung oder -Phosphorylierung oder
Antikörperbindungs-Muster,
einen veränderten
isoelektrischen Punkt, direkte Aminosäuresequenzierung sowie jedes
andere der bekannten Testverfahren, die für die Detektion von Mutationen
in einem Protein im Allgemeinen oder in Phosphodiesterase im Speziellen
von Nutzen sind.
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In-vitro-Verfahren
zur Detektion von Phosphodiesterase umfassen enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmungstests
(ELISAs), Western-Blots, Immunpräzipitationen
und Immunfluoreszenz. Alternativ dazu kann das Protein in vivo in
einem Individuum durch Einführung
eines markierten Anti-Phosphodiesterase-Antikörpers in das Individuum detektiert
werden. Z.B. kann der Antikörper
mit einem radioaktiven Marker markiert werden, dessen Gegenwart
und Positionierung durch Standard-Bildgebungsverfahren detektiert
werden kann. Besonders nützlich
sind Verfahren, welche die Allelvarianten der Phosphodiesterase
detektieren, die in einem Individuum exprimiert wird, sowie Verfahren,
die Fragmente der Phosphodiesterase in einer Probe detektieren.
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Die
Phosphodiesterase-Polypeptide sind ebenso in pharmakogenomischen
Analysen von Nutzen. Die Pharmakogenomik beschäftigt sich mit klinisch signifikanten
Erbvariationen in Bezug auf die Reaktion auf Arzneimittel aufgrund
einer veränderten
Arzneimitteldisposition sowie einer abnormalen Wirkung bei den betroffenen
Personen. Siehe z.B. M. Eichelbaum, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.
23 (10-11), 983-985 (1996); sowie M. W. Linder, Clin. Chem. 43 (2),
254-266 (1997). Die klinischen Resultate dieser Variationen resultieren
in der schweren Toxizität
therapeutischer Arzneimittel in bestimmten Individuen oder therapeutischem
Versagen von Arzneimitteln in bestimmten Individuen als Resultat
der einzelnen Variationen im Metabolismus. Daher kann der Genotyp
eines Individuums die Art und Weise bestimmen, wie eine therapeutische
Verbindung auf den Körper
wirkt, oder die Art und Weise, wie der Körper die Verbindung metabolisiert.
Weiters beeinflusst die Aktivität
arzneimittelmetabolisierender Enzyme sowohl die Intensität als auch
die Dauer der Wirkung des Arzneimittels. Daher ermöglicht die
Pharmakogenomik des Individuums die Auswahl wirksamer Verbindungen
und wirksamer Dosierungen solcher Verbindungen für eine prophylaktische oder
therapeutische Behandlung, und zwar basierend auf dem Genotyp des
Individuums. Die Entdeckung genetischer Polymorphismen in einigen arzneimittelmetabolisierenden
Enzymen erklärte,
warum es bei einigen Patienten nicht zu den erwarteten Arzneimittelwirkungen,
zu einer übertriebenen
Arzneimittelwirkung oder bei Standard-Arzneimitteldosierungen zu schwerwiegender
Toxizität
kommt. Polymorphismen können
im Phänotyp
der übermäßigen Metabolisierung und
im Phänotyp
der schlechten Metabolisierung ausgedrückt werden. Dementsprechend
können
genetische Polymorphismen zu Allelproteinvarianten der Phosphodiesterase
führen,
in denen sich eine oder mehrere der Phosphodiesterase-Funktionen
in einer Population von jenen in einer anderen Population unterscheiden.
Die Polypeptide ermöglichen
es daher einem Ziel, eine genetische Prädisposition festzustellen,
welche die Behandlungsmodalität
beeinflussen kann. Daher kann bei einer cAMP-basierten Behandlung der Polymorphismus
zu katalytischen Regionen führen,
die mehr oder weniger aktiv sind. Dementsprechend würde die
Dosierung notwendigerweise modifiziert werden, um die therapeutische
Wirkung innerhalb einer bestimmten Population, die den Polymorphismus
enthält,
zu maximieren. Als Alternative zur Genotypisierung konnten spezifische
polymorphe Polypeptide identifiziert werden.
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Die
Phosphodiesterase-Polypeptide sind auch für die Beobachtung der therapeutischen
Wirkungen während
klinischer Versuche und anderer Behandlungen von Nutzen. Daher können die
therapeutische Wirksamkeit eines Agens, das kreiert wurde, um die
Genexpression zu erhöhen
oder zu verringern, Proteinmengen oder Phosphodiesterase-Aktivität während des
Verlaufs einer Behandlung unter Verwendung von Phosphodiesterase-Polypeptiden
als Endpunkt-Ziel beobachtet werden. Die Beobachtung kann z.B. folgendermaßen erfolgen:
(i) Erhalt einer Prä-Verabreichungsprobe
eines Individuums vor der Verabreichung des Agens; (ii) Detektion
des Ausmaßes
der Expression oder Aktivität
des Proteins in der Probe vor der Verabreichung; (iii) Erhalt einer
oder mehrerer Proben des Individuums nach der Verabreichung; (iv)
Detektion des Ausmaßes
der Expression oder Aktivität
des Proteins in den Proben nach der Verabreichung; (v) Vergleichen
des Ausmaßes der
Expression oder Aktivität
des Proteins in den Proben vor der Verabreichung mit dem Protein
in der/den Probe(n) nach der Verabreichung; sowie (vi) dementsprechende
Erhöhung
oder Verringerung der Verabreichung des Agens an das Individuum.
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Antikörper
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Die
Erfindung stellt auch Antikörper
bereit, die selektiv an die Phosphodiesterase und ihre Varianten und
Fragmente binden. Ein Antikörper
wird als selektiv bindend betrachtet, sogar wenn er auch an andere
Proteine bindet, die nicht im Wesentlichen homolog mit der Phosphodiesterase
sind. Diese anderen Proteine teilen eine Homologie mit einem Fragment
oder einer Domäne
der Phosphodiesterase. Diese Konservierung in spezifischen Regionen
führt zu
Antikörpern,
die aufgrund der homologen Sequenz an beide Proteine binden. In diesem
Fall ist davon auszugehen, dass die Antikörperbindung an die Phosphodiesterase
immer noch selektiv ist.
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Um
Antikörper
zu erzeugen, wird ein isoliertes Phosphodiesterase-Polypeptid als
Immunogen verwendet, um Antikörper
unter Verwendung von Standardverfahren für die Herstellung polyklonaler
und monoklonaler Antikörper
zu erzeugen. Es kann entweder das Protein voller Länge oder
das antigene Peptid-Fragment verwendet werden. Regionen mit einem
hohen Antigenitätsindex
sind in 3 oder 8 dargestellt.
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Antikörper werden
vorzugsweise aus diesen Regionen oder aus separaten Fragmenten in
diesen Regionen hergestellt. Antikörper können jedoch aus einer beliebigen
Region des Peptids, wie hierin beschrieben, hergestellt werden.
Ein bevorzugtes Fragment produziert einen Antikörper, der die cAMP-Hydrolyse
oder -Bindung verringert oder vollständig verhindert. Antikörper können gegen
die gesamte Phosphodiesterase oder Domänen der Phosphodiesterase,
wie hierin beschrieben, entwickelt werden. Antikörper können auch gegen spezifische
funktionelle Stellen, wie hierin offenbart, entwickelt werden.
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Das
antigene Peptid kann eine zusammenhängende Sequenz von zumindest
12, 14, 15 oder 30 Aminosäureresten
umfassen. In einer Ausführungsform
entsprechen Fragmente Regionen, die sich auf der Oberfläche des
Proteins befinden, z.B. hydrophilen Regionen. Diese Fragmente sind
jedoch nicht als etwaige Fragmente umfassend anzusehen, die vor
der Erfindung offenbart werden können.
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Die
Antikörper
können
polyklonal oder monoklonal sein. Ein intakter Antikörper oder
ein Fragment davon (z.B. Fab oder F(ab')2) können verwendet
werden.
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Die
Detektion kann durch Koppeln (d.h. physisches Verbinden) des Antikörpers an
eine detektierbare Substanz erleichtert werden. Beispiele detektierbarer
Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen,
fluoreszierende Materialien, lumineszierende Materialien, biolumineszierende
Materialien und radioaktive Materialien. Beispiele geeigneter Enzyme
umfassen Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase
oder Acetylcholinesterase; Beispiele geeigneter Komplexe prostethischer
Gruppen umfassen Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin; Beispiele
geeigneter fluoreszierender Materialien umfassen Umbelliferon, Fluorescein,
Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluorescein,
Dansylchlorid oder Phycoerythrin; ein Beispiel eines lumineszierenden
Materials umfasst Luminol; Beispiele biolumineszierender Materialien
umfassen Luciferase, Luciferin und Aequorin, und Beispiele geeigneter
radioaktiver Materialien umfassen 125I, 131I, 35S oder 3H.
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Ein
geeignetes immunogenes Präparat
kann von nativen, rekombinant exprimierten oder chemisch synthetisierten
Peptiden abstammen.
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Antikörper-Verwendungen
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Die
Antikörper
können
verwendet werden, um eine Phosphodiesterase mittels Standardverfahren
zu isolieren, z.B. durch Affinitätschromatographie
oder Immunpräzipitation.
Die Antikörper
können
die Reinigung der natürlichen
Phosphodiesterase aus Zellen und rekombinant produzierter Phosphodiesterase,
die in Wirtszellen exprimiert wird, erleichtern.
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Die
Antikörper
sind von Nutzen, um die Gegenwart der Phosphodiesterase in Zellen
oder Geweben zu detektieren, um das Expressionsmuster der Phosphodiesterase
unter verschiedenen Geweben in einem Organismus und während des
Verlaufs der normalen Entwicklung zu bestimmen.
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Die
Antikörper
können
verwendet werden, um die Phosphodiesterase in situ, in vitro oder
in einem Zelllysat oder Überstand
zu detektieren, um die Menge und das Muster der Expression zu evaluieren.
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Die
Antikörper
können
verwendet werden, um die abnormale Gewebeverteilung oder die abnormale Expression
während
der Entwicklung zu untersuchen.
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Die
Antikörperdetektion
zirkulierender Fragmente der Phosphodiesterase voller Länge kann
verwendet werden, um den Phosphodiesterase-Umsatz zu identifizieren.
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Weiters
können
die Antikörper
verwendet werden, um die Phosphodiesterase-Expression bei Erkrankungszuständen, wie
z.B. in aktiven Stadien der Erkrankung, oder in einem Individuum
mit einer Prädisposition für eine Erkrankung,
die in Zusammenhang mit der Phosphodiesterasefunktion steht, zu
untersuchen. Wird eine Erkrankung durch ein(e) ungeeignete Gewebeverteilung,
entwicklungsbedingte Expression oder Ausmaß der Expression des Phosphodiesterase-Proteins
hervorgerufen, so kann der Antikörper
gegen das normale Phosphodiesterase-Protein hergestellt werden.
Wird eine Erkrankung durch eine spezifische Mutation in der Phosphodiesterase
charakterisiert, so können
die für
dieses Mutantenprotein spezifischen Antikörper verwendet werden, um auf
die Gegenwart der spezifischen Mutantenphosphodiesterase zu testen.
Intrazellulär
hergestellte Antikörper
(„Intrakörper"), die intrazelluläre Phosphodiesterase-Peptidregionen
erkennen würden, sind
ebenso eingeschlossen.
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Die
Antikörper
können
auch verwendet werden, um normale und abnormale subzelluläre Lokalisierungen
von Zellen in den verschiedenen Geweben eines Organismus zu untersuchen.
Antikörper
können
gegen die gesamte Phosphodiesterase oder gegen Teile der Phosphodiesterase
entwickelt werden.
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Die
diagnostischen Verwendungen können
angewandt werden, nicht nur beim genetischen Testen, sondern auch
bei der Beobachtung einer Behandlungsmodalität. Dementsprechend können, wenn
die Behandlung letztendlich auf die Korrektur des Phosphodiesterase-Expressionsausmaßes oder
der Gegenwart abnormaler Phosphodiesterasen und abnormaler Gewebeverteilungen
oder entwicklungsbedingter Expression abzielt, Antikörper, die
gegen die Phosphodiesterase oder relevante Fragmente gerichtet sind,
verwendet werden, um die therapeutische Wirksamkeit zu beobachten.
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Antikörper können dementsprechend
diagnostisch verwendet werden, um die Proteinausmaße in Gewebe
als Teil eines klinischen Testverfahrens zu beobachten, z.B. um
die Wirksamkeit eines bestimmten Behandlungsregimes zu bestimmen.
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Zusätzlich dazu
sind die Antikörper
in der pharmakogenomischen Analyse von Nutzen. Daher können Antikörper, die
gegen polymorphe Phosphodiesterase hergestellt wurden, verwendet
werden, um Individuen zu identifizieren, die modifizierte Behandlungsmodalitäten erfordern.
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Die
Antikörper
sind auch als diagnostische Werkzeuge als immunologische Marker
für abnormale Phosphodiesterase
von Nutzen, die mittels elektrophoretischer Mobilitat, isoelektrischem
Punkt, tryptischem Peptid-Verdau und anderen physikalischen Tests
analysiert werden, die dem Fachmann bekannt sind.
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Die
Antikörper
sind auch für
die Gewebe-Typisierung von Nutzen. Wo eine spezifische Phosphodiesterase
mit der Expression in einem spezifischen Gewebe in Zusammenhang
gebracht wurde, können
daher Antikörper,
die für
diese Phosphodiesterase spezifisch sind, verwendet werden, um einen
Gewebetyp zu identifizieren.
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Die
Antikörper
sind auch in der forensischen Identifikation von Nutzen. Dementsprechend
kann in jenen Fällen,
in denen ein Individuum mit einem spezifischen genetischen Polymorphismus
in Zusammenhang gebracht wurde, der zu einem spezifischen polymorphen
Protein führt,
ein Antikörper,
der für
das polymorphe Protein spezifisch ist, als Hilfe bei der Identifikation
verwendet werden.
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Die
Antikörper
sind auch für
die Inhibierung der Phosphodiesterase-Funktion von Nutzen, Z.B.
für das Blockieren
von cAMP, Proteinkinase-A oder der katalytischen Stelle.
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Diese
Verwendungen können
auch in einem therapeutischen Kontext angewandt werden, in dem die Behandlung
die Inhibierung der Phosphodiesterasefunktion inhibiert. Ein Antikörper kann
z.B. für
das Blockieren der cAMP-Bindung verwendet werden. Antikörper können gegen
spezifische Fragmente hergestellt werden, die Stellen enthalten,
die für
die Funktion erforderlich sind, oder gegen intakte Phosphodiesterase,
die mit einer Zelle assoziiert ist.
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Vollkommen
menschliche Antikörper
sind für
die therapeutische Behandlung menschlicher Patienten besonders erwünscht. Für einen Überblick über dieses
Verfahren zur Herstellung menschlicher Antikörper siehe Lonberg et al.,
Int. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995). Für eine detaillierte Diskussion
dieses Verfahrens zur Herstellung menschlicher Antikörper und
monoklonaler menschlicher Antikörper
sowie Arbeitsvorschriften zur Herstellung solcher Antikörper siehe
z.B. US-Patent Nr. 5.625.126; US-Patent Nr. 5.633.425; US-Patent
Nr. 5.569.825; US-Patent Nr. 5.661.016 und US-Patent Nr. 5.545.806.
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Die
Erfindung umfasst auch Sets zur Verwendung von Antikörpern, um
die Gegenwart eines Phosphodiesterase-Proteins in einer biologischen
Probe zu detektieren. Das Set kann Antikörper wie z.B. markierte oder
markierbare Antikörper
sowie eine Verbindung oder ein Agens zur Detektion von Phosphodiesterase
in einer biologischen Probe; Mittel zur Bestimmung der Menge von
Phosphodiesterase in der Probe; sowie Mittel zum Vergleichen der
Menge an Phosphodiesterase in der Probe mit einem Standard umfassen.
Die Verbindung oder das Agens kann in einen geeigneten Behälter gepackt
sein. Das Set kann weiters Anweisungen zur Verwendung des Sets zur
Detektion von Phosphodiesterase umfassen.
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Polynucleotide
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Die
Nucleotidsequenzen in Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 4 wurden durch
Sequenzierung der menschlichen cDNA erhalten. Dementsprechend steuert
für Seq.-ID
Nr. 2 die Sequenz des hinterlegten Klons in Bezug auf etwaige Diskrepanzen
zwischen den beiden, und jeglicher Verweis auf die Sequenz von Seq.-ID
Nr. 2 umfasst einen Verweis auf die Sequenzen der hinterlegten cDNA.
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Die
spezifisch offenbarten cDNAs umfassen die kodierende Region sowie
untranslatierte 5'-
und 3'-Sequenzen
in Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 4.
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Die
Erfindung stellt isolierte Polynucleotide bereit, die für die neuen
Phosphodiesterasen kodieren. Der Ausdruck „Phosphodiesterase-Polynucleotid" oder „Phosphodiesterase-Nucleinsäure" bezieht sich auf
die in Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 4 oder die in den hinterlegten
cDNAs gezeigten Sequenzen. Der Ausdruck „Phosphodiesterase-Polynucleotid" oder „Phosphodiesterase-Nucleinsäure" umfasst weiters
Varianten und Fragmente der Phosphodiesterase-Polynucleotide.
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Eine „isolierte" Phosphodiesterase-Nucleinsäure ist
eine, die von anderen Nucleinsäuren,
die in der natürlichen
Quelle der Phosphodiesterase-Nucleinsäure vorhanden sind, getrennt
ist. Eine „isolierte" Nucleinsäure ist
vorzugsweise frei von Sequenzen, welche die Phosphodiesterase-Nucleinsäure in der
genomischen DNA des Organismus natürlich flankieren (d.h. Sequenzen,
die an den 5'- und
den 3'-Enden der
Nucleinsäure positioniert
sind), aus dem die Nucleinsäure
stammt. Es kann jedoch einige flankierenden Nucleotidsequenzen geben,
z.B. bis zu etwa 5 KB. Der wichtige Punkt ist, dass die Phosphodiesterase-Nucleinsäure von
flankierenden Sequenzen so isoliert ist, dass sie den spezifischen,
hierin beschriebenen Manipulationen, wie z.B. rekombinante Expression,
Herstellung von Sonden und Primern, und anderen spezifische Verwendungen
für die Phosphodiesterase-Nucleinsäure-Sequenzen
unterzogen werden kann.
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Weiters
kann ein „isoliertes" Nuleinsäuremolekül, wie z.B.
ein cDNA- oder RNA-Molekül, im Wesentlichen
frei von anderem zellulärem
Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch Rekombinationsverfahren hergestellt
wird, oder frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien
sein, wenn es chemisch synthetisiert wird. Das Nucleinsäuremolekül kann jedoch
an andere kodierende oder Regulationssequenzen fusioniert sein und
trotzdem als isoliert betrachtet werden.
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In
einigen Fallen ist das isolierte Material Teil einer Zusammensetzung
(z.B. eines rohen Extrakts, der andere Substanzen enthält), eines
Puffersystems oder Reagenziengemisches. Unter anderen Umständen kann
das Material bis zur wesentlichen Homogenität gereinigt werden, z.B. wie
durch PAGE oder Säulenchromatographie,
wie z.B. HPLC, bestimmt. Eine isolierte Nucleinsäure umfasst vorzugsweise zumindest
etwa 50, 80 oder 90 % (auf molarer Basis) aller vorhandenen makromolaren
Spezies.
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Es
werden z.B. rekombinante DNA-Moleküle, die in einem Vektor enthalten
sind, als isoliert betrachtet. Weitere Beispiele isolierter DNA-Moleküle umfassen
rekombinante DNA-Moleküle,
die in heterologen Wirtszellen enthalten sind, oder (partiell oder
im Wesentlichen) gereinigte DNA-Moleküle in Lösung. Isolierte RNA-Moleküle umfassen
In-vivo- oder In-vitro-RNA-Transkripte der isolierten DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung.
Isolierte Nucleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden
Erfindung umfassen weiters solche Moleküle, die synthetisch hergestellt
wurden.
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In
einigen Fallen ist das isolierte Material Teil einer Zusammensetzung
(z.B. eines rohen Extrakts, der andere Substanzen enthält), eines
Puffersystems oder Reagenziengemisches. Unter anderen Umständen kann
das Material bis zur wesentlichen Homogenität gereinigt werden, z.B. wie
durch PAGE oder Säulenchromatographie,
wie z.B. HPLC, bestimmt. Eine isolierte Nucleinsäure umfasst vorzugsweise zumin dest
etwa 50, 80 oder 90 % (auf molarer Basis) aller vorhandenen makromolaren
Spezies.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide können für das reife Protein plus zusätzliche
Amino- oder carboxyterminale Aminosäuren oder für Aminosäuren, die sich im Inneren des
reifen Polypeptids befinden (z.B. wenn die reife Form mehr als eine
Polypeptidkette besitzt), kodieren. Solche Sequenzen können, neben
anderen Dingen, eine Rolle bei der Verarbeitung eines Proteins vom
Vorläufer
zur reifen Form spielen, den Handel mit Proteinen erleichtern, die
Proteinhalbwertszeit verlängern
oder verkürzen
oder die Manipulierung eines Proteins für einen Test oder die Produktion
erleichtern. Wie es im Allgemeinen in situ der Fall ist, können die zusätzlichen
Aminosäuren
weg vom reifen Protein verarbeitet werden, und zwar durch zelluläre Enzyme.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf,
die Sequenz, die für
das reife Polypeptid alleine kodiert, die Sequenz, die für das reife
Polypeptid kodiert, und zusätzliche kodierende
Sequenzen, wie z.B. eine Leader- oder Sekretionssequenz (z.B. eine
Pre-Pro- oder Pro-Protein-Sequenz), die Sequenz, die für das reife
Polypeptid kodiert, mit den oder ohne die zusätzlichen kodierenden Sequenzen,
sowie zusätzliche
nichtkodierende Sequenzen, z.B. Introns und nichtkodierende 5'- und 3'-Sequenzen, wie z.B.
transkribierte, jedoch nicht translatierte Sequenzen, die in der
Transkription, mRNA-Verarbeitung (umfassend Spleiß- und Polyadenylierungssignale),
Ribosomenbindung und mRNA-Stabilität eine Rolle spielen. Zusätzlich dazu
kann das Polynucleotid an eine Markersequenz fusioniert sein, die
z.B. für
ein Peptid kodiert, das die Reinigung erleichtert.
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Phosphodiesterase-Polynucleotide
können
die Form von RNA aufweisen, wie z.B. mRNA, oder sie können die
Form von DNA aufweisen, umfassend cDNA und genomische DNA, die durch
Klonieren erhalten wurde oder durch chemische Syntheseverfahren
oder eine Kombination dieser hergestellt wurde. Die Nucleinsäure, insbesondere
DNA, kann doppelsträngig
oder einzelsträngig
sein. Bei der einzelsträngigen
Nucleinsäure
kann es sich um den kodierenden Strang (Sense-Strang) oder den nicht
kodierenden Strang (Anti-Sense-Strang) handeln.
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Phosphodiesterase-Nucleinsäure kann
die in Seq.-ID Nr. 3 oder Seq.-ID Nr. 4 dargestellten Nucleotidsequenzen
umfassen, die der cDNA der menschlichen Osteoblasten (kurze Form)
und der Niere und Nebennierendrüsen
(lange Form) entsprechen.
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In
einer Ausführungsform
umfasst die Phosphodiesterase-Nucleinsäure nur die kodierende Region.
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Die
Erfindung stellt weiters Phosphodiesterase-Polynucleotid-Varianten
und Fragmente davon bereit, die sich von den in Seq.-ID Nr. 2 oder
Seq.-ID Nr. 4 dargestellten Nucleotidsequenzen aufgrund der Degeneration
des genetischen Codes unterscheiden und daher für dasselbe Protein kodieren
wie jenes, das von den in Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 4 dargestellten
Nucleotidsequenzen kodiert wird.
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Die
Erfindung beschreibt auch Phosphodiesterase-Nucleinsäuremoleküle, die
für die
Polypeptidvarianten, die hierin beschrieben werden, kodieren. Solche
Polynucleotide können
natürlich
vorkommen, wie z.B. Allelvarianten (selber Locus), Homologe (anderer
Locus) und Orthologe (verschiedene Organismen), oder sie können mittels
DNA-Rekombinationsverfahren oder durch chemische Synthese konstruiert
werden. Solche nicht natürlich
vorkommenden Varianten können
durch Mutageneseverfahren hergestellt werden, unter anderem jene,
die auf Polynucleotide, Zellen oder Organismen angewandt wurden.
Dementsprechend können
die Varianten, wie oben beschrieben, Nucleotid-Substitutionen, -Deletionen,
-Inversionen und -Insertionen enthalten.
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Typischerweise
besitzen die Varianten eine wesentliche Identität mit Nucleinsäuremolekülen aus Seq.-ID
Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 4 und Komplementen davon. Die Variation kann
entweder in den kodierenden oder den nicht kodierenden Regionen
oder in beiden auftreten. Die Variationen können sowohl konservative als
auch nicht konservative Aminosäuresubstitutionen
herstellen.
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Orthologe,
Homologe und Allelvarianten können
unter Verwendung von Verfahren, die nach dem Stand der Technik wohlbekannt
sind, identifiziert werden. Diese Varianten umfassen eine Nucleotidsequenz, die
für eine
Phosphodiesterase kodiert, die zumindest etwa 60-65 %, 65-70 %,
typischerweise zumindest etwa 70-75 %, noch typischer zumindest
etwa 80-85 % und besonders typisch zumindest etwa 90-95 %, oder
mehr Homologie zu der in Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 4 dargestellten
Nucleotidsequenz oder einem Fragment dieser Sequenz aufweist. Solche
Nucleinsäuremoleküle können leicht
identifiziert werden als jene, die in der Lage sind, unter stringenten
Bedingungen an die in Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 4 dargestellte
Nucleotidsequenz oder ein Fragment der Sequenz zu hybridisieren.
Es ist davon auszugehen, dass eine stringente Hybridisierung keine
wesentliche Homologie angibt, wo diese auf allgemeiner Homologie
beruht, wie z.B. Poly-A-Sequenzen oder Sequenzen, die alle oder
die meisten Proteine gemeinsam haben, alle zyklischen Nucleotid-Phosphodisterasen
oder alle Familie-7-Phosphodiesterasen. Weiters ist davon auszugehen,
dass die Varianten keine der Nucleinsäuresequenzen inkludieren, die
vor der Erfindung offenbart sein worden könnten.
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Wie
hierin verwendet, sollen mit dem Ausdruck „hybridisiert unter stringenten
Bedingungen" Bedingungen
zur Hybridisierung und zum Waschen beschrieben werden, unter denen
Nucleotidsequenzen, die für
ein Polypeptid kodieren, von zumindest etwa 60-65 % Homologie gegenüber einander
typischerweise aneinander hybridisiert bleiben. Die Bedingungen
können
so sein, dass Sequenzen mit einer Identität gegenüber einander von zumindest
65 %, zumindest etwa 70 %, zumindest etwa 75 %, zumindest etwa 80
%, zumindest etwa 90 %, zumindest etwa 95 % oder mehr aneinander
hybridisiert bleiben. Solche stringenten Bedingungen sind dem Fachmann
bekannt und sind in Current Protocols in Molecular Biology, 6.3.1.-6.3.6.,
John Wiley & Sons,
N. Y. (1989), zu finden, hierin durch Verweis aufgenommen. Ein Beispiel
stringenter Hybridisierungsbedingungen ist die Hybridisierung in
6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat
(SSC) bei etwa 45 °C,
gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1
% SDS bei 50-65 °C.
In einem anderen, nicht einschränkenden
Beispiel wird es Nucleinsäuremolekülen ermöglicht,
in 6 × Natriumchlo rid/Natriumcitrat
(SSC) bei etwa 45 °C
zu hybridisieren, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten
mit niedriger Stringenz in 0,2 × SSC/0,1
% SDS bei Raumtemperatur oder von einem oder mehreren Waschschritten
mit moderater Stringenz in 0,2 × SSC/0,1
% SDS bei 42 °C
oder von einem oder mehreren Waschschritten mit hoher Stringenz
in 0,2 × SSC/0,1
% SDS bei 65 °C.
In einer Ausführungsform
entspricht ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen
an die Sequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 hybridisiert,
einem natürlich
vorkommenden Nucleinsäuremolekül. Wie hierin
verwendet, bezieht sich ein „natürlich vorkommendes" Nucleinsäuremolekül auf ein
RNA- oder ein DNA-Molekül
mit einer Nucleotidsequenz, die in der Natur vorkommt (z.B. es kodiert
für ein
natürliches
Protein).
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Wie
für den
Fachmann verständlich
ist, können
die genauen Bedingungen empirisch bestimmt werden und hängen von
der Ionenstärke,
der Temperatur und der Konzentration der destabilisierenden Agenzien,
wie z.B. Formamid, oder der denaturierenden Agenzien, wie z.B. SDS,
ab. Andere Faktoren, die bei der Bestimmung der gewünschten
Hybridisierungsbedingungen berücksichtigt
werden, umfassen die Länge
der Nucleinsäuresequenzen,
die Basenzusammensetzung, den Prozentsatz der Fehlpaarung zwischen
den Hybridisierungssequenzen und die Häufigkeit des Auftretens von
Subgruppen der Sequenzen innerhalb anderer nicht identischer Sequenzen.
Daher können äquivalente
Bedingungen durch Variieren einer oder mehrerer dieser Parameter
bestimmt werden, während
ein ähnliches
Ausmaß an
Identität
oder Ähnlichkeit
zwischen den zwei Nucleinsäuremolekülen beibehalten
wird.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt auch isolierte Nucleinsäuren, die
ein einzel- oder
doppelsträngiges
Fragment oder einen Abschnitt enthalten, das/der unter stringenten
Bedingungen an die Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID
Nr. 4 oder das Komplement aus Seq-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 4 hybridisiert.
In einer Ausführungsform
besteht die Nucleinsäure
aus einem Abschnitt der Nucleotidsequenz aus Seq.-ID Nr. 2 oder
Seq.-ID Nr. 4 und dem Komplement von Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID
Nr. 4. Die Nucleinsäurefragmente
der Erfindung sind zumindest etwa 15, vorzugsweise zumindest etwa
18, 20, 23 oder 25 Nucleotide lang und können 30, 40, 50, 100, 200,
500 oder mehr Nucleotide lang sein. Längere Fragmente, z.B. 30 oder
mehr Nucleotide lang, die für
antigene Proteine oder Polypeptide kodieren, wie sie hierin beschrieben
werden, sind von Nutzen.
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Weiters
beschreibt die Erfindung Polynucleotide, die ein Fragment der Volllängen-Phosphodiesterase-Polynucleotide
umfassen. Das Fragment kann einzel- oder doppelsträngig sein
und DNA oder RNA umfassen. Das Fragment kann entweder von der kodierenden
oder von der nicht kodierenden Sequenz abstammen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kodiert eine isolierte Phosphodiesterase-Nucleinsäure für die gesamte kodierende Region.
In einer anderen Ausführungsform
kodiert die isolierte Phosphodiesterase-Nucleinsäure für eine Sequenz, die dem reifen
Protein entspricht, das von etwa Aminosäure 6 bis zur letzten Aminosäure reichen
kann. Andere Fragmente umfassen Nucleotidsequenzen, die für die hierin
beschriebenen Aminosäurefragmente
kodieren.
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Daher
umfassen Phosphodiesterase-Nucleinsäurefragmente weiters Sequenzen,
die den hierin beschriebenen Domänen
entsprechen, ebenso beschriebene Subregionen und die spezifischen
funktionellen Stellen. Phosphodiesterase-Nucleinsäure-Fragmente
umfassen auch Kombinationen der Domänen, Segmente und anderer funktioneller
Stellen, die oben beschrieben wurden. Ein Fachmann ist sich der
vielen Permutationen bewusst, die möglich sind.
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Wo
die Position der Domänen
oder der Stellen durch Computeranalyse prognostiziert wurde, würde es ein
Fachmann zu schätzen
wissen, dass die Aminosäurereste,
die diese Domänen
bilden, in Abhängigkeit von
den zur Definition der Domänen
verwendeten Kriterien variieren können.
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Es
ist jedoch davon auszugehen, dass ein Phosphodiesterase-Fragment
jede Nucleinsäuresequenz umfasst,
die nicht die gesamte Region inkludiert.
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Die
Erfindung beschreibt auch Phosphodiesterase-Nucleinsäurefragmente,
die für
epitoptragende Regionen der hierin beschriebenen Phosphodiesterase-Proteine
kodieren.
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Polynucleotid-Verwendungen
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Die
Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können als „Abfrage-Sequenz" verwendet werden,
um eine Suche gegen öffentliche
Datenbanken durchzuführen,
z.B. um andere Familienmitglieder oder verwandte Sequenzen zu identifizieren.
Solche Suchen können
unter Verwendung der NBLAST- und XBLAST-Programme (Version 2.0)
von Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-10 (1990), durchgeführt werden. BLAST-Proteinsuchen
können
mit dem XBLAST-Programm, Score = 50, Wortlänge = 3, durchgeführt werden, um
Aminosäuresequenzen
zu erhalten, die homolog zu den Proteinen der Erfindung sind. Um
für Vergleichszwecke
Anordnungen mit Lücken
zu erhalten, kann Gapped BLAST verwendet werden, wie von Altschul
et al., Nucleic Acids Res. 25 (17), 3389-3402 (1997), beschrieben
wurde. Bei der Verwendung der BLAST- und Gapped-BLAST-Programme
können
die Standardparameter der jeweiligen Programme (z.B. XBLAST und NBLAST)
verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
-
Die
Nucleinsäurefragmente
der Erfindung stellen Sonden oder Primer in Tests bereit, wie jene,
die unten stehend beschrieben werden. „Sonden" sind Oligonucleotide, die auf eine
basenspezifische Art an einen komplementären Strang der Nucleinsäure hybridisieren.
Solche Sonden umfassen Polypeptid-Nucleinsäuren, wie in Nielsen et al.,
Science 254, 1497-1500 (1991), beschrieben. Typischerweise umfasst
eine Sonde eine Region einer Nucleotidsequenz, die unter hochgradig
stringenten Bedingungen an zumindest etwa 15, typischerweise etwa
20-25 und noch typischer etwa 40, 50 oder 75 konsekutive Nucleotide
der in Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 4 dargestellten Nucleinsäure und
der Komplemente dieser hybridisiert. Noch typischer umfasst die
Sonde weiters eine Markierung, z.B. ein Radioisotop, eine fluoreszierende
Verbindung, ein Enzym oder einen Enzym-Co-Faktor.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Primer" auf ein einzelsträngiges Oligonucleotid, das unter
Verwendung wohlbekannter Verfahren (z.B. PCR, LCR) als Initiationspunkt
der matrizengerichteten DNA-Synthese dient, und zwar umfassend,
jedoch nicht eingeschränkt
auf, jene, die hierin beschrieben sind. Die geeignete Länge des
Primers hängt
von der spezifischen Verwendung ab, reicht jedoch typischerweise von
etwa 15 bis 30 Nucleotide. Der Ausdruck „Primer-Stelle" bezieht sich auf
ein Gebiet der Ziel-DNA, an die ein Primer hybridisiert. Der Ausdruck „Pimer-Paar" bezieht sich auf
ein Set von Primern, umfassend einen 5'-(Stromauf-)Primer, der mit dem 5'-Ende der Nucleinsäuresequenz,
die zu amplifizieren ist, hybridisiert, und einen 3'-(Stromab-)Primer,
der mit dem Komplement der zu amplifzierenden Sequenz hybridisiert.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide sind daher für Sonden, Primer und in biologischen
Tests von Nutzen.
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Werden
die Polynucleotide verwendet, um die Phosphodiesterase-Eigenschaften
oder -Funktionen, wie z.B. in den hierin beschriebenen Tests, zu
untersuchen, so kann die gesamte oder weniger als die gesamte cDNA
von Nutzen sein. Tests, die spezifisch auf Phosphodiesterase-Funktionen
gerichtet sind, z. B. das Untersuchen der Agonisten- oder Antagonisten-Aktivität, umfassen
die Verwendung bekannter Fragmente. Weiters können diagnostische Verfahren
zur Untersuchung der Phosphodiesterase-Funktion auch mit einem beliebigen
Fragment durchgeführt
werden, umfassend jene Fragmente, die vor der Erfindung bekannt
gewesen sein mögen.
Auf ähnliche
Art und Weise werden bei Verfahren, welche die Behandlung einer
Phosphodiesterase-Dysfunktion umfassen, alle Fragmente eingeschlossen,
einschließlich
jener, die nach dem Stand der Technik bekannt gewesen sein mögen.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide sind als Hybridisierungsonde für cDNA und
genomische DNA von Nutzen, um eine cDNA voller Länge und genomische Klone zu
isolieren, die für
die in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 beschriebenen Polypeptide
kodieren, und um cDNA und genomische Klone zu isolieren, die Varianten
entsprechen, die dieselben Polypeptide erzeugen, die in Seq.-ID
Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 dargestellt sind, oder den anderen, hierin
beschriebenen Varianten entsprechen. Varianten können aus demselben Gewebe und
Organismus, aus dem die Polypeptide, die in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID
Nr. 3 dargestellt sind, isoliert wurden, aus anderen Geweben desselben
Organismus oder aus verschiedenen Organismen isoliert werden. Dieses
Verfahren ist zur Isolation von Genen und cDNA von Nutzen, die entwicklungsbedingt
gesteuert werden/wird und daher in demselben Gewebe oder in verschiedenen
Geweben an verschiedenen Punkten in der Entwicklung eines Organismus
exprimiert werden können/kann.
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Die
Sonde kann jeder Sequenz entlang der gesamten Länge des Gens entsprechen, das
für die
Phosphodiesterase kodiert. Dementsprechend könnte sie von nicht kodierenden
5'-Regionen, der
kodierenden Region und nicht kodierenden 3'-Regionen abstammen.
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Die
Nucleinsäure-Sonde
kann z.B. die cDNA voller Länge
aus Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 4 oder ein Fragment dieser sein,
wie z.B. ein Oligonucleotid mit einer Länge von zumindest 12, 15, 30,
50, 100, 250 oder 500 Nucleotiden sowie ausreichend, um spezifisch
unter stringenten Bedingungen an mRNA oder DNA zu hybridisieren.
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Fragmente
der hierin beschriebenen Polynucleotide sind auch für die Synthese
der hierin beschriebenen, größeren Fragmente
oder Polynucleotide voller Länge
von Nutzen. Ein Fragment kann z.B. an einen beliebigen Abschnitt
einer mRNA hybridisiert werden, und es kann eine größere cDNA
oder eine cDNA voller Länge
hergestellt werden.
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Die
Fragmente sind auch von Nutzen, um Antisense-Moleküle der gewünschten
Länge und
Sequenz zu synthetisieren.
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Antisense-Nucleinsäuren der
Erfindung können
unter Verwendung der Nucleotidsequenzen aus Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID
Nr. 4 kreiert werden und unter Verwendung chemischer Synthese und
enzymatischer Ligationsreaktionen mittels Verfahren, die nach dem
Stand der Technik bekannt sind, konstruiert werden. Eine Antisense-Nucleinsäure (z.B.
ein Antisense-Oligonucleotid) kann z.B. unter Verwendung natürlich vorkommender
Nucleotide oder verschiedenartig modifizierter Nucleotide, die kreiert
wurden, um die biologische Stabilität der Moleküle zu erhöhen oder um die physikalische
Stabilität
des Duplexes zu erhöhen,
der sich zwischen den Antisense- und
den Sense-Nucleinsäuren
gebildet hatte, chemisch synthetisiert werden, z.B. können Thiophosphat-Derivate
und acridinsubstituierte Nucleotide verwendet werden. Beispiele
modifizierter Nucleotide, die verwendet werden können, um die Antisense-Nucleinsäure zu erzeugen,
umfassen 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin,
Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin,
5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, β-D-Galactosylqueosin,
Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanidin,
1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanidin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanidin, 3-Methylcytosin,
5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, β-D-Mannosylqueosin,
5'-Methoxycarboxymethyluracil,
5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v),
Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil,
2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester,
Uracil-5-oxyessigsäure
(v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-Carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin.
Alternativ dazu kann die Antisense-Nucleinsäure unter Verwendung eines
Expressionsvektors biologisch hergestellt werden, in den eine Nucleinsäure in einer
Antisense-Ausrichtung subkloniert wurde (d.h. besitzt aus der insertierten
Nucleinsäure
transkribierte RNA eine Antisense-Ausrichtung gegenüber der
Ziel-Nucleinsäure
von Interesse).
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Zusätzlich dazu
können
die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung
an der Basengruppierung, Zuckergruppierung oder der Phosphat-Hauptkette
modifiziert werden, um z.B. die Stabilität, die Hybridisierung oder die
Löslichkeit
des Moleküls
zu verbessern. Die Desoxyribosephosphat-Hauptkette der Nucleinsäuren kann z.B.
modifiziert werden, um Peptid-Nucleinsäuren zu erzeugen (siehe Hyrup
et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry
4, 5 (1996)). Wie hierin verwendet, beziehen sich die Ausdrücke „Peptid-Nucleinsäuren” oder „PNAs" auf Nucleinsäure-Mimetika,
z.B. DNA-Mimetika, in denen die Desoxyribosephosphat-Hauptkette
durch eine Pseudopeptid-Hauptkette ersetzt ist und nur die vier
natürlichen
Nucleobasen beibehalten werden. Von der neutralen Hauptkette der
PNAs wurde gezeigt, dass sie eine spezifische Hybridisierung an
DNA und RNA unter Bedingungen niedriger Ionenstärke ermöglicht. Die Synthese von PNA-Oligomeren
kann unter Verwendung von Standard-Festphase-Peptid-Synthese-Arbeitsvorschriften
durchgeführt
werden, wie in Hyrup et al. (1996), s.o., Perry-O'Keefe et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 93, 14670 (1996), beschrieben. PNAs können weiter
modifiziert werden, z.B. um ihre Stabilität, Spezifität oder zelluläre Aufnahme
zu verbessern, und zwar durch das Binden lipophiler oder anderer
Helfergruppen an PNA, durch die Bildung von PNA-DNA-Chimären oder
durch die Verwendung von Liposomen oder anderen Verfahren der Arzneimittelabgabe,
die nach dem Stand der Technik bekannt sind. Die Synthese von PNA-DNA-Chimären kann
durchgeführt
werden, wie in Hyrup et al. (1996), s.o., Finn et al., Nucleic Acids
Res. 24 (17), 3357-63 (1996); Mag et al., Nucleic Acids Res. 17,
5973 (1989), und Peterser et al., Bioorganic Med. Chem. Lett. 5,
1119 (1975), beschrieben.
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Die
Nucleinsäure-Moleküle und -Fragmente
der Erfindung können
auch andere angehängte
Gruppen inkludieren, wie z.B. Peptide (z.B. zum Abzielen auf Wirtszellen-Phosphodiesterasen
in vivo), oder aber Agenzien, die den Transport über die Zellmembran (siehe
z.B. Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (6553-6556
(1989); Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 648-652
(1987); PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO 88/0918 ) oder
die Blut-Gehirn-Barriere (siehe z.B. PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO 89/10134 ) erleichtern. Zusätzlich dazu
können
Oligonucleotide mit hybridisierungsgesteuerten Spaltungsagenzien
(siehe z.B. Krol et al., Bio-Techniques
6, 958-976 (1988)) oder interkalierenden Agenzien (siehe z.B. Zon,
Pharm. Res. 5, 539-549 (1988)) modifiziert werden.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide sind auch als Primer für die PCR
von Nutzen, um eine beliebige Region eines Phosphodiesterase-Polynucleotids
zu amplifizieren.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide sind auch für die Konstruktion rekombinanter
Vektoren von Nutzen. Solche Vektoren umfassen Expressionsvektoren,
die einen Abschnitt der oder die gesamten Posphodiesterase-Polypeptide
exprimieren. Die Vektoren umfassen auch Insertionsvektoren, die
verwendet werden, um in eine andere Polynucleotidsequenz zu integrieren,
wie z.B. in das zelluläre
Genom, um die In-situ-Expression der Phosphodiesterase-Gene und
-Genprodukte zu verändern.
Eine endogene kodierende Phosphodiesterase-Sequenz kann mittels
homologer Rekombination mit der gesamten oder einem Teil der kodierenden Region
ersetzt werden, die eine oder mehrere spezifisch eingeführte Mutationen
enthält.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide sind auch für die Expression antigener
Abschnitte der Phosphodiesterase-Proteine nützlich.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide sind weiters als Sonden zur Bestimmung
der Chromosomenpositionen der Phosphodiesterase-Polynucleotide mittels
In-situ-Hybridisierungsverfahren,
wie z.B. FISH, von Nutzen (für
eine Besprechung dieses Verfahrens siehe Verma et al., Human Chromosomes:
A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988)) und
PCR-Kartierung somatischer Zellhybride. Die Kartierung der Sequenzen
an Chromosomen ist ein wichtiger erster Schritt bei der Korrelation
dieser Sequenzen mit Genen, die mit Erkrankungen assoziiert sind.
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Reagenzien
für die
Chromosomenkartierung können
individuell verwendet werden, um ein einzelnes Chromosom oder eine
einzelne Steile auf diesem Chromosom zu markieren, oder es können Gruppen
an Reagenzien verwendet werden, um mehrere Stellen und/oder mehrere
Chromosomen zu markieren. Reagenzien, die den nicht kodierenden
Regionen der Gene entsprechen, sind tatsächlich für Kartierungszwecke bevorzugt.
Kodierende Sequenzen besitzen eine höhere Wahrscheinlichkeit der
Konservierung innerhalb von Genfamilien, wodurch die Chance einer
Kreuzhybridisierung während
der Chromosomenkartierung erhöht
wird.
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Wurde
einmal eine Sequenz an eine genaue Chromosomenposition kartiert,
so kann die physische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit
genetischen Kartierungsdaten in Verbindung gebracht werden. (Solche
Daten sind z.B. in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, online
erhältlich über die
Johns Hopkins University Welch Medical Library, zu finden.) Das
Verhältnis
zwischen einem Gen und einer Erkrankung, die an dieselbe Chromsomenregion
kartiert ist, kann anschließend
durch eine Bindungsanalyse identifiziert werden (Co-Vererbung physisch
nebeneinanderliegender Gene), z.B. beschrieben von Egeland et al.,
Nature 325, 783-787 (1987).
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Weiters
können
Unterschiede in den DNA-Sequenzen zwischen Individuen bestimmt werden,
die an einer Krankheit leiden oder nicht, die mit einem spezifischen
Gen assoziiert ist. Wird eine Mutation bei einigen oder allen der
betroffenen Individuen, jedoch bei keinem der nicht betroffenen
Individuen beobachtet, so ist die Mutation wahrscheinlich die Ursache
der spezifischen Erkrankung. Ein Vergleich der betroffenen und nicht
betroffenen Individuen umfasst im Allgemeinen zuerst das Suchen
nach Strukturveränderungen
in den Chromosomen, wie z.B. Deletionen oder Translokationen, die
aus Chromsomen-Spreads sichtbar sind oder unter Verwendung einer
PCR, die auf dieser DNA-Sequenz basiert, detektierbar sind. Letztendlich
kann die vollständige Sequenzierung
der Gene aus mehreren Individuen durchgeführt werden, um die Gegenwart
einer Mutation zu bestätigen
und um Mutationen von Polymorphismen zu unterscheiden.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotid-Sonden sind auch von Nutzen, um
Muster der Gegenwart des Gens, das für die Phosphodiesterasen und
ihre Varianten kodiert, in Bezug auf die Gewebsverteilung zu bestimmen,
z.B. ob es zu einer Genduplikation gekommen ist und ob die Duplikation
in allen oder nur einer Subreihe an Geweben auftritt. Die Gene können natürlich auftreten
oder können
exogen in eine Zelle, ein Gewebe oder einen Organismus eingeführt worden
sein.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide sind auch für die Kreation von Ribozymen
von Nutzen, die der gesamten oder einem Teil der mRNA entsprechen,
die aus Genen produziert wird, die für die hierin beschriebenen
Polynucleotide kodieren.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide sind auch für die Konstruktion von Wirtszellen
von Nutzen, die einen Teil oder alle der Phosphodiesterase-Polynucleotide
und -Polypeptide exprimieren.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide sind auch für die Konstruktion transgener
Tiere von Nutzen, die alle oder einen Teil der Phosphodiesterase-Polynucleotide
und -Polypeptide exprimieren.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide sind auch für die Herstellung von Vektoren
von Nutzen, die einen Teil oder alle der Phosphodiesterase-Polypeptide
exprimieren.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide sind auch als Hybridisierungssonden
zur Bestimmung des Ausmaßes
der Phosphodiesterase-Nucleinsäureexpression
von Nutzen. Dementsprechend können
die Sonden verwendet werden, um die Gegenwart der Phosphodiesterase-Nucleinsäure in Zellen,
Geweben und in Organismen zu detektieren oder ihre Menge in Zellen,
Geweben und in Organismen zu bestimmen. Bei der Nucleinsäure, deren
Menge bestimmt wird, kann es sich um DNA oder RNA handeln. Dementsprechend
können
Sonden, die den hierin beschriebenen Polypeptiden entsprechen, verwendet
werden, um die Genkopie-Anzahl in einer/einem spezifischen Zelle,
Gewebe oder Organismus zu untersuchen. Dies ist besonders in Fällen relevant,
in denen es eine Amplifikation der Phosphodiesterase-Gene gegeben
hat.
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Alternativ
dazu kann die Sonde im Kontext einer In-situ-Hybridisierung verwendet
werden, um die Position von Extrakopien der Phosphodiesterase-Gene
zu untersuchen, wie auf extrachromosomalen Elementen oder wie in
Chromosome integriert, in denen das Phosphodiesterase-Gen normalerweise
nicht zu finden ist, z.B. als eine homogen färbende Region.
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Diese
Verwendungen sind für
die Diagnose von Erkrankungen, die eine Erhöhung oder eine Verringerung
der Phosphodiesterase-Expression im Verhältnis zum Nor malwert involvieren,
z.B. eine Proliferationsstörung,
eine Differenzierungsstörung
oder eine Entwicklungsstörung
oder eine hämatopoetische
Erkrankung, relevant.
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Die
Phosphodiesterasen werden in Osteoblasten exprimiert und sind in
die Osteoblastendifferenzierung involviert. Dementsprechend sind
sie in die Knochenmatrix-Deposition
und daher in die Knochenbildung involviert. Als solches ist das
Gen besonders für
die Behandlung von Erkrankungen relevant, die Knochengewebe involvieren,
und insbesondere bei Osteoporose.
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Die
Phosphodiesterasen sind auch spezifisch bei Herzerkrankungen, wie
z.B. kongestivem Herzversagen, und bei Brustkrebs involviert.
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Erkrankungen,
bei denen die Phosphodiesterase-Expression von Bedeutung ist, umfassen,
sind jedoch nicht eingeschränkt
auf, Demenz, Gedächtnisverlust,
kongestives Herzversagen, Thrombose, pulmonale Hypertonie, Glomerulonephiritis,
bipolare Depression, Bronchialasthma, atopische Erkrankungen, Autoimmun-Encephalomyelitis,
Organtransplantation, Salzretention bei nephrotischem Syndrom und
erektile Dysfunktion.
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Daher
stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation einer Erkrankung
oder einer Störung
bereit, die mit einer abnormalen Expression oder Aktivität der Phosphodiesterase-Nucleinsäure assoziiert
ist, in dem eine Testprobe aus einem Individuum erhalten wird und
Nucleinsäure
(z.B. mRNA, genomische DNA) detektiert wird, wobei die Gegenwart
der Nucleinsäure
diagnostisch dafür
ist, dass ein Individuum unter einer Krankheit oder Störung leidet
oder ein Risiko besitzt, diese zu entwickeln, wobei die Krankheit
oder Störung
mit der abnormalen Expression oder Aktivität der Nucleinsäure assoziiert
ist.
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Ein
Aspekt der Erfindung betrifft diagnostische Tests zur Bestimmung
der Nucleinsäureexpression
sowie der Aktivität
in einem Kontext einer biologischen Probe (z.B. Blut, Serum, Zellen,
Gewebe), um zu bestimmen, ob ein Individuum an einer Krankheit oder
Störung
leidet oder ein Risiko besitzt, eine Krankheit oder Störung zu
ent wickeln, die mit abnormaler Nucleinsäure-Expression oder -Aktivität assoziiert
ist. Solche Tests können
für prognostische
oder vorhersagende Zwecke verwendet werden, um dadurch ein Individuum
vor dem Auftreten einer Störung
prophylaktisch zu behandeln, die durch die Expression oder die Aktivität der Nucleinsäuremoleküle charakterisiert
ist oder damit assoziiert ist.
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In-vitro-Verfahren
zur Detektion von mRNA umfassen Northern-Hybridisierungen und In-situ-Hybridisierungen.
In-vitro-Verfahren zur Detektion von DNA umfassen Southern-Hybridisierungen
und In-situ-Hybridisierungen.
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Sonden
können
als Teil eines diagnostischen Testsets zur Identifikation von Zellen
oder Geweben verwendet werden, welche die Phosphodiesterase exprimieren,
wie z.B. durch das Messen der Menge einer phosphodiesterasekodierenden
Nucleinsäure
in einer Probe an Zellen eines Individuums, z.B. mRNA oder genomische
DNA, oder das Bestimmen, ob das Phosphodiesterase-Gen mutiert wurde.
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Nucleinsäure-Expressionstests
sind für
das Screening von Arzneimitteln von Nutzen, um Verbindungen zu identifizieren,
welche die Phosphodiesterase-Nucleinsäureexpression modulieren (z.B.
Antisense, Polypeptide, Peptidomimetika, kleine Moleküle oder
andere Arzneimittel). Eine Zelle wird mit einer Kandidatenverbindung
kontaktiert und die Expression der mRNA bestimmt. Das Ausmaß der Expression
der mRNA in Gegenwart der Kandidatenverbindung wird mit dem Ausmaß der Expression
der mRNA in Abwesenheit der Kandidatenverbindung verglichen. Die
Kandidatenverbindung kann anschließend als Modulator der Nucleinsäure-Expression,
basierend auf diesem Vergleich, identifiziert werden und kann z.B.
zur Behandlung einer Störung
verwendet werden, die durch abnormale Nucleinsäure-Expression charakterisiert
ist. Der Modulator kann an die Nucleinsäure binden oder indirekt die
Expression modulieren, z.B. durch Wechselwirkung mit anderen zellularen
Komponenten, welche die Nucleinsäure-Expression
beeinflussen.
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Modulationsverfahren
können
in vitro (z.B. durch Züchten
der Zelle mit dem Agens) oder, alternativ dazu, in vivo (z.B. durch
Verabreichen des Agens an ein Individuum) bei Patienten oder in
transgenen Tieren durchgeführt
werden.
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Die
Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Identifikation einer Verbindung
bereit, die verwendet werden kann, um eine Störung zu behandeln, die mit
der Nucleinsäure-Expression des Phosphodiesterase-Gens assoziiert
ist. Das Verfahren umfasst typischerweise das Testen der Fähigkeit
der Verbindung, die Expression der Phosphodiesterase-Nucleinsäure zu modulieren,
und dadurch das Identifizieren einer Verbindung, die verwendet werden
kann, um eine Störung
zu behandeln, die durch ungewünschte
Phosphodiesterase-Nucleinsäure-Expression
charakterisiert ist.
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Die
Tests können
in zellbasierten und zellfreien Systemen durchgeführt werden.
Zellbasierte Tests umfassen Zellen, die natürlich die Phosphodiesterase-Nucleinsäure exprimieren,
oder rekombinante Zellen, die gentechnisch verändert wurden, um spezifische
Nucleinsäure-Sequenzen
zu exprimieren.
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Alternativ
dazu können
Kandidatenverbindungen in vivo in Patienten oder in transgenen Tieren
getestet werden.
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Der
Test für
die Phosphodiesterase-Nucleinsäure-Expression
kann einen direkten Test der Nucleinsäure-Mengen involvieren, wie
z.B. mRNA-Mengen, oder der kollateralen Verbindungen, die in den
Signalweg involviert sind (wie z.B. zyklischer AMP-Umsatz). Weiters
kann die Expression von Genen, die als Reaktion auf den Phosphodiesterase-Signalweg
hinauf- oder hinunterreguliert sind, auch getestet werden. In dieser Ausführungsform
können
die Regulationsregionen dieser Gene operabel an ein Reportergen,
wie z.B. Luciferase, gebunden sein.
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Daher
können
Modulatoren der Phosphodiesterase-Genexpression in einem Verfahren
identifiziert werden, worin eine Zelle mit einer Kandidatenverbindung
kontaktiert wird und die Expression der mRNA bestimmt wird. Das
Ausmaß der
Expression der Phosphodiesterase-mRNA in Gegenwart der Kandidatenverbindung
wird mit dem Ausmaß der
Expression der Phosphodiesterase-mRNA in Abwesenheit der Kandidatenverbindung
verglichen. Die Kandidatenverbindung kann anschließend als
Modulator der Nucleinsäure-Expression,
basierend auf diesem Vergleich, identifiziert werden und z.B. zur
Behandlung einer Störung
verwendet werden, die durch abnormale Nucleinsäure-Expression charakterisiert
ist. Ist die Expression der mRNA statistisch signifikant größer in Gegenwart
der Kandidatenverbindung als in ihrer Abwesenheit, so wird die Kandidatenverbindung
als Stimulator der Nucleinsäure-Expression
identifiziert. Ist die Expression der Nucleinsäure statistisch signifikant
geringer in Gegenwart der Kandidatenverbindung als in ihrer Abwesenheit,
so wird die Kandidatenverbindung als Inhibitor der Nucleinsäure-Expression
identifiziert.
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Dementsprechend
stellt die Erfindung Behandlungsverfahren mit der Nucleinsäure als
Ziel bereit, und zwar unter Verwendung einer Verbindung, die durch
das Arzneimittel-Screening als Genmodulator identifiziert wurde,
um die Phosphodiesterase-Nucleinsäure-Expression
zu modulieren. Die Modulation umfasst sowohl die Hinauf-Regulation (d.h.
Aktivierung oder Agonisierung) oder die Herab-Regulation (Unterdrückung oder Antagonisierung)
oder die Wirkungen auf die Nucleinsäureaktivität (z.B. wenn die Nucleinsäure mutiert
oder inkorrekt modifiziert ist). Die Behandlung erfolgt bei Störungen,
die durch eine abnormale Expression oder Aktivität der Nucleinsäure charakterisiert
sind.
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Das
Gen ist besonders für
die Behandlung von Störungen
von Bedeutung, die Knochengewebe involvieren, sowie insbesondere
bei Osteoporose. Das Gen ist auch bei Herzerkrankungen, wie z.B.
kongestivem Herzversagen, und bei Brustkrebs involviert. Weitere
Erkrankungen, in denen die Expression relevant ist, umfassen, sind
jedoch nicht eingeschränkt
auf, Demenz, Gedächtnisverlust,
kongestives Herzversagen, Thrombose, pulmonale Hypertonie, Glomerulonephritis,
bipolare Depression, Bronchialasthma, atopische Erkrankungen, Autoimmun-Encephalomyelitis,
Organtransplantation, Salzretention bei nephrotischem Syndrom und erektile
Dysfunktion.
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Alternativ
dazu kann es sich bei einem Modulator der Phosphodiesterase-Nucleinsäure-Expression um
ein kleines Molekül
oder ein Arzneimittel handeln, das mittels der hierin beschriebenen
Screening-Tests identifiziert wurde, solange das Arzneimittel oder
das kleine Molekül
die Phosphodiesterase-Nucleinsäure-Expression
inhibiert.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide sind auch für die Beobachtung der Wirksamkeit
der Modulation von Verbindungen auf die Expression oder die Aktivität des Phosphodiesterase-Gens
in klinischen Versuchen oder in einem Behandlungsregime von Nutzen.
Daher kann das Genexpressionsmuster als Barometer für die andauernde
Wirksamkeit der Behandlung mit der Verbindung dienen, insbesondere
mit Verbindungen, gegen die ein Patient eine Resistenz entwickeln
kann. Das Genexpressionsmuster kann auch als Marker dienen, der als
Indikator für
eine physiologische Reaktion der betroffenen Zellen auf die Verbindung
gilt. Dementsprechend würde
eine solche Beobachtung entweder eine erhöhte Verabreichung der Verbindung
oder die Verabreichung alternativer Verbindungen ermöglichen,
gegen die der Patient nicht resistent geworden ist. Auf ähnliche
Art und Weise könnte
die Verabreichung der Verbindung entsprechend verringert werden,
wenn das Ausmaß der
Nucleinsäure-Expression
unter ein gewünschtes
Ausmaß fällt.
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Die
Beobachtung kann z. B. folgendermaßen erfolgen: (i) Erhalt einer
Prä-Verabreichungsprobe
eines Individuums vor der Verabreichung des Agens; (ii) Detektion
des Ausmaßes
der Expression einer spezifizierten mRNA oder genomischen DNA der
Erfindung in der Probe vor der Verabreichung; (iii) Erhalt einer
oder mehrerer Proben des Individuums nach der Verabreichung; (iv)
Detektion des Ausmaßes
der Expression oder der Aktivität
der mRNA oder der genomischen DNA in den Proben nach der Verabreichung;
(v) Vergleichen des Ausmaßes
der Expression oder der Aktivität
der mRNA oder der genomischen DNA in der Probe vor der Verabreichung
mit der mRNA oder der genomischen DNA in der/den Probe(n) nach der
Verabreichung; sowie (vi) dementsprechende Erhöhung oder Verringerung der
Verabreichung des Agens an das Individuum.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide sind auch für diagnostische Tests bezüglich qualitativer
Veränderungen
in der Phosphodiesterase-Nucleinsäure und insbesonde re für qualitative
Veränderungen,
die zu Pathologien führen,
von Nutzen. Die Polynucleotide können
verwendet werden, um Mutationen in Phosphodiesterase-Genen und Genexpressionsprodukten,
wie z.B. mRNA, zu detektieren. Die Polynucleotide können als Hybridisierungssonden
verwendet werden, um natürlich
vorkommende genetische Mutationen im Phosphodiesterase-Gen zu detektieren
und dadurch zu bestimmen, ob für
ein Individuum mit einer Mutation ein Risiko einer Störung, die
durch die Mutation hervorgerufen wird, besteht. Die Mutationen umfassen
die Deletion, Addition oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide
in dem Gen, die Chromosomenneuanordnung, wie z.B. Inversion oder
Transposition, die Modifikation genomischer DNA, wie z.B. abnormale
Methylierungsmuster oder Veränderungen
bezüglich
der Genkopie-Anzahl, wie z.B. Amplifikation. Die Detektion einer
mutierten Form des Phosphodiesterase-Gens, das mit einer Dysfunktion
assoziiert ist, stellt ein diagnostisches Werkzeug für eine aktive
Erkrankung oder eine Anfälligkeit
für eine
Erkrankung dar, wenn die Erkrankung das Resultat einer Überexpression,
Unterexpression oder geänderten
Expression einer Phosphodiesterase ist.
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Mutationen
im Phosphodiesterase-Gen können
auf der Ebene der Nucleinsäure
mittels einer Reihe an Verfahren detektiert werden. Die genomische
DNA kann direkt analysiert werden oder kann mittels PCR vor der
Analyse amplifiziert werden. RNA oder cDNA können auf dieselbe Art und Weise
verwendet werden.
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In
gewissen Ausführungsformen
involviert die Detektion der Mutation die Verwendung einer/eines Sonde/Primers
in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (siehe z.B. US-Patent Nr.
4.683.195 und 4.683.202), wie z.B. Anker-PCR oder RACE-PCR, oder,
alternativ dazu, in einer Ligations-Kettenreaktion (LCR) (siehe
z.B. Landegran et al., Science 241, 1077-1080 (1988); und Nakazawa
et al., PNAS 91, 360-364 (1994)), wobei Letztere der beiden besonders
für die
Detektion von Punktmutationen in dem Gen von Nutzen sein kann (siehe
Abravaya et al., Nucleic Acids Res. 23, 675-682 (1995)). Dieses
Verfahren kann die Schritte des Sammelns einer Zellprobe eines Patienten
umfassen sowie des Isolierens der Nucleinsäure (z.B. genomisch, mRNA,
oder beide) aus den Zellen der Probe, des Kontaktierens der Nucleinsäureprobe
mit einem oder mehreren Primern, die unter Bedingungen, so dass
es zur Hybridisierung und Amplifikation des Gens (falls vorhanden)
kommt, spezifisch an ein Gen hybridisieren, sowie des Detektierens
der Gegenwart oder der Abwesenheit eines Amplifikationsprodukts
oder des Detektierens der Größe des Amplifikationsprodukts
sowie des Vergleichens der Länge
mit einer Kontrollprobe. Deletionen und Insertionen können durch
eine Veränderung in
der Größe des amplifizierten
Produkts im Vergleich zum normalen Genotyp detektiert werden. Punktmutationen
können
durch Hybridisieren amplifizierter DNA an normale RNA- oder Antisense-DNA-Sequenzen identifiziert
werden.
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Es
wird erwartet, dass die Verwendung der PCR und/oder der LCR als
vorläufiger
Amplifikationsschritt zusammen mit einem beliebigen der Verfahren,
die zur Detektion der hierin beschriebenen Mutationen verwendet
werden, wünschenswert
sein kann.
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Alternative
Amplifikationsverfahren umfassen: sich selbst erhaltende Sequenzreplikation
(Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878 (1990)),
Transkriptionsamplifikationssystem (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86, 1173-1177 (1989)), Q-β-Replicase (Lizardi et al.,
Bio/Technology 6, 1197 (1988)) oder eine beliebige andere Nucleinsäureidentifikationsmethode,
gefolgt von der Detektion der amplifizierten Moleküle unter
Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Diese
Detektionsschemen sind besonders für die Detektion von Nucleinsäure-Molekülen von
Nutzen, wenn diese Moleküle
in sehr geringer Anzahl vorhanden sind.
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Alternativ
dazu können
Mutationen in einem Phosphodiesterase-Gen direkt identifiziert werden,
z.B. durch Veränderungen
in den Restriktionsenzym-Verdaumustern, die durch Gelelektrophorese
bestimmt werden.
-
Weiters
können
sequenzspezifische Ribozyme (US-Patent Nr. 5.498.531) verwendet
werden, um die Gegenwart spezifischer Mutationen durch die Entwicklung
oder den Verlust einer Ribozym-Spaltstelle zu bewerten.
-
Perfekt übereingestimmte
Sequenzen können
von fehlgepaarten Sequenzen durch Nuclease-Spaltungs-Verdautests
oder durch Unterschiede in der Schmelztemperatur unterschieden werden.
-
Sequenzänderungen
an spezifischen Positionen können
auch durch Nuclease-Schutz-Tests,
wie z.B. RNase- und S1-Schutz, oder durch die chemische Spaltungsmethode
untersucht werden.
-
Weiters
können
Sequenzunterschiede zwischen einem Mutanten-Phosphodiesterase-Gen
und einem Wildtyp-Gen durch direkte DNA-Sequenzierung bestimmt werden.
Eine Reihe an automatisierten Sequenzierungsverfahren kann bei der
Durchführung
der diagnostischen Tests verwendet werden (Biotechniques 19, 448
(1995)), unter anderem Sequenzierung durch Massenspektrometrie (siehe
z.B. internationale PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO 94/16101 ; Cohen
et al., Adv. Chromatogr. 36, 127-162 (1996); sowie Griffin et al.,
Appl. Biochem. Biotechnol. 38, 147-159 (1993)).
-
Andere
Verfahren zur Detektion von Mutationen im Gen umfassen Verfahren,
bei denen der Schutz vor Spaltungsagenzien verwendet wird, um fehlgepaarte
Basen in RNA/RNA- oder RNA/DNA-Duplexen zu detektieren (Myers et
al., Science 230, 1242 (1985); Cotton et al., PNAS 85, 4397 (1988);
Saleeba et al., Meth. Enzymol. 217, 286-295 (1992)), die elektrophoretische
Mobilität
von Mutanten- und Wildtyp-Nucleinsäure wird verglichen
(Orita et al., PNAS 86, 2766 (1989); Cotton et al., Mutat. Res.
285, 125-144 (1993); und Hayashi et al., Genet. Anal. Tech. Appl.
9, 73-79 (1992)), und die Bewegung der Mutanten- oder Wildtyp-Fragmente
in Polyacrylamid-Gelen,
enthaltend einen Gradienten des denaturierenden Agens, wird unter
Verwendung der denaturierenden Gradienten-Gelelektrophorese getestet
(Myers et al., Nature 313, 495 (1985)). Die Empfindlichkeit des
Tests kann durch Verwendung von RNA (anstelle von DNA), bei der
die Sekundärstruktur
empfindlicher auf die Veränderung
der Sequenz ist, verstärkt
werden. In einer Ausführungsform
verwendet das beschriebene Verfahren eine Heteroduplex-Analyse,
um doppelsträngige
Heteroduplex-Moleküle
auf der Basis der Veränderungen
der elektrophoretischen Mobilität zu
trennen (Keen et al., Trends Genet. 7, 5 (1991)). Beispiele anderer
Verfahren zur Detektion von Punktmutationen umfassen die selektive
Oligonucleotid-Hybridisierung, die selektive Amplifikation und die
selektive Primer-Extension.
-
In
anderen Ausführungsformen
können
genetische Mutationen durch Hybridisieren einer Probe und von Kontrollnucleinsäuren, z.B.
DNA oder RNA, an Anordnungen mit großer Dichte, die Hunderte oder
Tausende an Oligonucleotid-Sonden enthalten, identifiziert werden
(Cronin et al., Human Mutation 7, 244-255 (1996); Kozal et al.,
Nature Medicine 2, 753-759 (1996)). Genetische Mutationen können z.B.
in zweidimensionalen Anordnungen identifiziert werden, die lichterzeugte
DNA-Sonden enthalten, wie in Cronin et al., s.o., beschrieben. Kurz
gesagt, kann eine erste Hybridisierungsanordnung der Sonden verwendet
werden, um durch lange Abschnitte von DNA in einer Probe und Kontrolleinheit
zu scannen, um Rasenveränderungen
zwischen den Sequenzen durch Herstellung linearer Anordnungen sequenziell überlappender
Sonden zu identifizieren. Dieser Schritt ermöglicht die Identifikation von
Punktmutationen. Dieser Schritt wird von einer zweiten Hybridisierungsanordnung
gefolgt, welche die Charakterisierung spezifischer Mutationen unter
Verwendung kleinerer, spezialisierter Sondenanordnungen ermöglicht,
die zu allen detektierten Varianten oder Mutationen komplementär sind.
Jede Mutationsanordnung besteht aus parallelen Sondenreihen, wobei
eine komplementär
zu dem Wildtyp-Gen ist und die andere komplementär zu dem Mutanten-Gen ist.
-
Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide sind auch für das Testen eines Individuums
auf einen Genotyp von Nutzen, der, obwohl er nicht notwendigerweise
die Krankheit hervorrufen muss, trotzdem die Behandlungsmodalität beeinflusst.
Daher können
die Polynucleotide verwendet werden, um die Beziehung zwischen dem
Genotyp eines Individuums und der Reaktion eines Individuums auf
eine Verbindung, die für
die Behandlung verwendet wird, zu untersuchen (pharmakogenomische
Beziehung). Beim vorliegenden Fall könnte z.B. eine Mutation im
Phosphodiesterase-Gen, die zu einer veränderten Affinität für cAMP führt, eine
exzessive oder verringerte Arzneimittelwirkung bei Standardkonzentrationen
an cAMP bewirken, welche die Phosphodiesterase aktiviert. Dementsprechend
können
die hierin beschriebenen Phosphodiesterase- Polynucleotide verwendet werden, um
den Mutationsgehalt des Gens in einem Individuum zu untersuchen,
um eine/ein geeignete(s) Verbindung oder Dosierungsregime für die Behandlung
auszuwählen.
-
Daher
können
Polynucleotide, die genetische Variationen aufweisen, welche die
Behandlung beeinflussen, ein diagnostisches Ziel bereitstellen,
das verwendet werden kann, um die Behandlung in einem Individuum
maßzuschneidern.
Dementsprechend ermöglicht
die Produktion rekombinanter Zellen und Tiere, die diese Polymorphismen
enthalten, das wirksame klinische Design von Behandlungsverbindungen
und Dosierungsregimes.
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Die
Verfahren können
den Erhalt einer biologischen Kontrollprobe aus einem Kontrollindividuum
umfassen sowie das Kontaktieren der Kontrollprobe mit einer Verbindung
oder einem Agens, der in der Lage ist, mRNA oder genomische DNA
zu detektieren, so dass die Gegenwart von mRNA oder genomischer
DNA in der biologischen Probe detektiert wird, und das Vergleichen
der Gegenwart von mRNA oder genomischer DNA in der Kontrollprobe
mit der Gegenwart der mRNA oder der genomischen DNA in der Testprobe.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide sind auch für die Chromosomen-Identifikation
von Nutzen, wenn die Sequenz mit einem einzelnen Chromosom und gegen
eine bestimmte Position auf dem Chromosom identifiziert wird. Erst
wird die DNA-Sequenz
mit dem Chromosom mittels In-situ- oder anderer chromosomenspezifischer
Hybridisierung übereingestimmt.
Sequenzen können
auch an spezifische Chromosomen korreliert werden, und zwar durch
Herstellung von PCR-Primern, die für das PCR-Screening somatischer
Zellhybride verwendet werden können,
die einzelne Chromosome aus den gewünschten Spezies enthalten.
Nur Hybride, die das Chromosom enthalten, welches das zum Primer
homologe Gen enthält,
ergeben ein amplifiziertes Fragment. Die Sublokalisierung kann unter
Verwendung von Chromosomenfragmenten erreicht werden. Andere Strategien
umfassen das vorhergehende Screening mit markierten, durchflusssortierten
Chromosomen und das vorherige Selektieren mittels Hybridisierung
an chromosomenspezifische Bibliotheken. Weitere Kartierungsstrategien
umfassen die Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung, die eine Hybridisierung
mit Sonden ermöglicht,
die kürzer
sind als jene, die traditionellerweise verwendet werden. Reagenzien
für die
Chromosomenkartierung können
einzeln verwendet werden, um ein einzelnes Chromosom oder eine einzelne
Stelle auf dem Chromosom zu markieren, oder es können Gruppen an Reagenzien
verwendet werden, um mehrere Stellen und/oder mehrere Chromosomen
zu markieren. Reagenzien, die den nicht kodierenden Regionen der Gene
entsprechen, werden tatsächlich
für Kartierungszwecke
bevorzugt. Kodierende Sequenzen besitzen eine höhere Wahrscheinlichkeit der
Konservierung innerhalb von Genfamilien, wodurch die Möglichkeit
von Kreuzhybridisierungen während
der Chromosomenkartierung erhöht
wird.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide können auch verwendet werden,
um Individuen aus kleinen biologischen Proben zu identifizieren.
Dies kann z.B. unter Verwendung des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus
(RFLP) durchgeführt
werden, um ein Individuum zu identifizieren. Daher sind die hierin
beschriebenen Polynucleotide als DNA-Marker für die RFLP von Nutzen (Siehe
US-Patent Nr. 5.272.057).
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Weiters
kann die Phosphodiesterase-Sequenz verwendet werden, um ein Alternativverfahren
bereitzustellen, das die tatsächliche
DNA-Sequenz der ausgewählten
Fragmente im Genom eines Individuums bestimmt. Daher können die
hierin beschriebenen Phosphodiesterase-Sequenzen verwendet werden,
um zwei PCR-Primer
aus den 5'- und
den 3'-Enden der
Sequenzen herzustellen. Diese Primer können anschließend verwendet
werden, um DNA aus einem Individuum für darauf folgendes Sequenzieren
zu amplifizieren.
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Gruppen
korrespondierender DNA-Sequenzen aus Individuen, die auf diese Art
und Weise hergestellt wurden, können
für eine
einzigartige Identifikation von Individuen sorgen, da jedes Individuum
ein einzigartiges Set solcher DNA-Sequenzen besitzt. Es wird geschätzt, dass
eine Allelvariation bei Menschen mit einer Häufigkeit von etwa einem Fall
pro 500 Basen auftritt. Die Allelvariation tritt in einem gewissen
Aus maß in
den kodierenden Regionen dieser Sequenzen auf und in einem größeren Ausmaß in den
nicht kodierenden Regionen. Die Phosphodiesterase-Sequenzen können verwendet
werden, um solche Identifikationssequenzen von Individuen und aus
Gewebe zu erhalten. Die Sequenzen stellen einzigartige Fragmente
des menschlichen Genoms dar. Jede der hierin beschriebenen Sequenzen
kann, in einem gewissen Ausmaß,
als Standard verwendet werden, mit dem DNA aus einem Individuum
für Identifikationszwecke
verglichen werden kann.
-
Wird
eine Gruppe an Reagenzien aus den Sequenzen verwendet, um eine einzigartige
Identifikations-Datenbank für
ein Individuum zu erzeugen, so können
dieselben Reagenzien später
verwendet werden, um Gewebe von diesem Individuum zu identifizieren.
Unter Verwendung der einzigartigen Identifikations-Datenbank kann
die positive Identifikation des Individuums, lebend oder tot, durch
extrem kleine Gewebeproben erfolgen.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide können auch bei forensischen
Identifikationsverfahren verwendet werden. Die PCR-Technologie kann
verwendet werden, um DNA-Sequenzen zu amplifizieren, die aus sehr
kleinen biologischen Proben, wie z.B. aus einem einzigen Haarfollikel,
Körperflüssigkeiten
(z.B. Blut, Speichel oder Samen), entnommen wurden. Die amplifizierte
Sequenz kann anschließend
mit einem Standard verglichen werden, was eine Identifikation des
Ursprungs der Probe ermöglicht.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide können daher verwendet werden,
um Polynucleotid-Reagenzien bereitzustellen, z.B. PCR-Primer, die
auf spezifische Loci im menschlichen Genom abzielen, welche die Verlässlichkeit
DNA-basierter forensischer Identifikationen erhöhen können, z.B. durch das Bereitstellen
eines weiteren „Identifikationsmarkers" (d.h. einer anderen
DNA-Sequenz, die für
ein bestimmtes Individuum einzigartig ist). Wie oben stehend beschrieben,
kann die tatsächliche
Basen-Sequenzinformation für
die Identifikation als akkurate Alternative zu Mustern verwendet
werden, die durch restriktionsenzymgenerierte Fragmente gebildet
werden. Sequenzen, die auf die nicht kodierende Region abzielen,
sind besonders nütz lich,
da ein größerer Polymorphismus
in den nicht kodierenden Regionen auftritt, was es leichter macht,
Individuen unter Verwendung dieses Verfahrens voneinander zu unterscheiden.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide können weiters verwendet werden,
um Polynucleotid-Reagenzien bereitzustellen, z. B. markierte oder
markierbare Sonden, die z.B. im In-situ-Hybridisierungsverfahren
verwendet werden können,
um ein spezifisches Gewebe zu identifizieren. Dies ist in Fällen nützlich,
in denen ein forensischer Pathologe ein Gewebe unbekannten Ursprungs
erhält.
Es können
Gruppen an Phosphodiesterase-Sonden verwendet werden, um Gewebe
nach der Spezies und/oder dem Organtyp zu identifizieren.
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Auf ähnliche
Art und Weise können
diese Primer und Sonden verwendet werden, um eine Gewebekultur auf
Kontamination zu screenen (d.h. um auf die Gegenwart eines Gemisches
verschiedener Zelltypen in einer Kultur zu screenen).
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Alternativ
dazu können
die Phosphodiesterase-Polynucleotide direkt verwendet werden, um
die Transkription oder die Translation von Phosphodiesterase-Gensequenzen
mittels Antisense- oder Ribozym-Konstrukten zu blockieren. Daher
können
Nucleinsauren bei einer Störung,
die durch abnormal hohe oder unerwünschte Phosphodiesterase-Genexpression
charakterisiert ist, direkt für
die Behandlung verwendet werden.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide sind daher als Antisense-Konstrukte
von Nutzen, um die Phosphodiesterase-Genexpression in Zellen, Geweben
und Organismen zu kontrollieren. Ein DNA-Antisense-Polynucleotid
wird komplementär
zu einer Region des Gens, das in die Transkription involviert ist,
kreiert, wodurch die Transkription und daher die Produktion des
Phosphodiesterase-Proteins verhindert wird. Ein Antisense-RNA- oder
-DNA-Polynucleotid würde
an die mRNA hybridisieren und dadurch die Translation von mRNA in
das Phosphodiesterase-Protein blockieren.
-
Beispiele
an Antisense-Molekülen,
die für
die Inhibierung der Nucleinsäure-Expression
von Nutzen sind, umfassen Antisense-Moleküle, die zu einem Fragment der
untranslatierten 5'-Region
aus Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 4 komplementär sind, die auch das Startcodon
einschließt,
und Antisense-Moleküle,
die komplementär
zu einem Fragment der untranslatierten 3'-Region aus Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID
Nr. 4 sind.
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Alternativ
dazu kann eine Klasse an Antisense-Molekülen verwendet werden, um mRNA
zu deaktivieren, um die Expression der Phosphodiesterase-Nucleinsäure zu verringern.
Dementsprechend können
diese Moleküle
eine Störung
behandeln, die durch abnormale oder unerwünschte Phosphodiesterase-Nucleinsäure-Expression
charakterisiert ist. Dieses Verfahren umfasst die Spaltung durch
Ribozyme, die Nucleotidsequenzen enthalten, die komplementär zu einer
oder mehreren Regionen in der mRNA sind, welche die Fähigkeit
der mRNA abschwächen,
translatiert zu werden. Mögliche
Regionen umfassen kodierende Regionen und insbesondere kodierende
Regionen, die den katalytischen und anderen funktionellen Aktivitäten des
Phosphodiesterase-Proteins entsprechen.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide stellen weiters Vektoren für die Gentherapie
bei Patienten bereit, die Zellen enthalten, die bezüglich der
Phosphodiesterase-Genexpression
abnormal sind. Daher werden rekombinante Zellen, welche die Zellen
des Patienten umfassen, die ex vivo gentechnisch verändert wurden und
dem Patienten wieder eingesetzt wurden, in ein Individuum eingeführt, in
dem die Zellen das gewünschte Phosphodiesterase-Protein
exprimieren, um das Individuum zu behandeln.
-
Die
Erfindung umfasst auch Sets zur Detektion der Gegenwart einer Phosphodiesterase-Nucleinsäure in einer
biologischen Probe. Das Set kann z.B. Reagenzien, wie z.B. eine
markierte oder markierbare Nucleinsäure oder ein Agens, die/das
in der Lage ist, die Phosphodiesterase-Nucleinsäure in einer biologischen Probe
zu detektieren; Mittel zur Bestimmung der Menge der Phosphodiesterase-Nucleinsäure in der
Probe; sowie Mittel zum Vergleichen der Menge der Phosphodiesterase-Nuclein säure in der
Probe mit einem Standard umfassen. Die Verbindung oder das Agens
kann in einen geeigneten Behälter
gepackt werden. Das Set kann weiters Anweisungen zur Verwendung
des Sets zur Detektion von Phosphodiesterase-mRNA oder -DNA umfassen.
-
Computerlesbare Mittel
-
Die
Nucleotid- oder Aminosäure-Sequenzen
der Erfindung werden auch in einer Reihe an Medien beschrieben,
um ihre Verwendung zu erleichtern. Dies bezieht sich auf eine andere
Herstellung als eines isolierten Nucleinsäure- oder Aminosäure-Moleküls, das
eine Nucleotid- oder Aminosäuresequenz
der vorliegenden Erfindung enthält.
Solch eine Herstellung stellt die Nucleotid- oder Aminosäure-Sequenzen
oder eine Subgruppe dieser bereit (z.B. eine Subgruppe an offenen
Leserastern (ORFs)), und zwar in einer Form, die es einem Fachmann
ermöglicht,
die Herstellung unter Verwendung von Mitteln zu untersuchen, die
nicht direkt auf die Untersuchung der Nucleotid- oder der Aminosäuresequenzen,
oder einer Untergruppe dieser, wie sie in der Natur oder in einer
gereinigten Form vorhanden sind, anwendbar sind.
-
In
einer Anwendung kann eine Nucleotid- oder Aminosäure-Sequenz der vorliegenden
Erfindung auf computerlesbaren Medien gespeichert werden. Wie hierin
verwendet, bezieht sich „computerlesbare
Medien" auf jedes
Medium, das direkt von einem Computer gelesen und auf das direkt
von diesem zugegriffen werden kann. Solche Medien umfassen, sind
jedoch nicht eingeschränkt
auf: magnetische Speichermedien, wie z.B. Floppy-Disks, Festplatten-Speichermedien
und Magnetbänder;
optische Speichermedien, wie z.B. CD-ROM; elektrische Speichermedien,
wie z.B. RAM und ROM; sowie Hybride dieser Kategorien, wie z.B.
magnetische/optische Speichermedien. Dem Fachmann ist schnell bewusst,
wie alle der im Moment bekannten computerlesbaren Medien verwendet
werden können,
um eine Herstellung zu kreieren, die ein computerlesbares Medium
umfasst, auf dem eine Nucleotid- oder Aminosäure-Sequenz der vorliegenden
Erfindung gespeichert ist.
-
Wie
hierin verwendet, bezieht sich „gespeichert" auf ein Verfahren
zum Speichern von Informationen auf einem computerlesbaren Medium.
Der Fachmann kann auf leichte Art und Weise jedes der im Moment
bekannten Verfahren zum Speichern von Informationen auf einem computerlesbaren
Medium verwenden, um Herstellungsprodukte zu erzeugen, welche die
Information der Nucleotid- oder der Aminosäure-Sequenz der vorliegenden Erfindung umfassen.
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Eine
Reihe an Datenspeicherstrukturen sind für den Fachmann zur Herstellung
eines computerlesbaren Mediums erhältlich, auf dem eine Nucleotid-
oder Aminosäure-Sequenz der vorliegenden
Erfindung gespeichert ist. Die Wahl der Datenspeicherstruktur basiert
im Allgemeinen auf dem Mittel, das ausgewählt wurde, um auf die gespeicherte
Information zuzugreifen. Zusätzlich
dazu kann eine Reihe an Datenverarbeitungsprogrammen und -formaten
verwendet werden, um die Nucleotid-Sequenzinformationen der vorliegenden
Erfindung auf einem computerlesbaren Medium zu speichern. Die Sequenzinformation
kann in einer Textdatei einer Textverarbeitung dargestellt werden,
die mit kommerziell erhältlicher
Software, wie z.B. Word-Perfect
und Microsoft Word, formatiert wurde, oder in Form einer ASCII-Datei
dargestellt werden, die in einer Datenbank-Anwendung, wie z.B. DB2,
Sybase, Oracle oder dergleichen, gespeichert werden. Der Fachmann
kann leicht eine beliebige Anzahl an Datenverarbeitungsstrukturformaten
(z.B. Textdatei oder Datenbank) adaptieren, um ein computerlesbares
Medium zu erhalten, auf dem die Information der Nucleotidsequenz
der vorliegenden Erfindung gespeichert ist.
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Durch
das Bereitstellen der Nucleotid- oder Aminosäure-Sequenzen der Erfindung
in computerlesbarer Form kann der Fachmann routinemäßig auf
die Sequenzinformation für
eine Vielzahl an Zwecken zugreifen. Ein Fachmann kann z.B. die Nucleotid- oder Aminosäure-Sequenzen
der vorliegenden Erfindung in computerlesbarer Form verwenden, um
eine Zielsequenz oder ein Ziel-Strukturmotiv mit der auf dem Datenspeichermedium
gespeicherten Sequenzinformation zu vergleichen. Suchverfahren werden
verwendet, um Fragmente oder Regionen der Sequenzen der Erfindung
zu identifizieren, die mit einer bestimmten Zielsequenz oder einem
Zielmotiv übereinstimmen.
-
Wie
hierin verwendet, kann eine „Zielsequenz" eine beliebige DNA-
oder Aminosäure-Sequenz
von sechs oder mehr Nucleotiden oder zwei oder mehr Aminosäuren sein.
Für einen
Fachmann ist leicht erkennbar, dass, je länger eine Zielsequenz ist,
desto weniger wahrscheinlich es ist, dass die Zielsequenz zufällig in der
Datenbank vorhanden ist. Die am meisten bevorzugte Sequenzlänge einer
Zielsequenz beträgt
von etwa 10 bis 100 Aminosäuren
oder von etwa 30 bis 300 Nucleotid-Reste. Es ist jedoch allgemein
anerkannt, dass kommerziell bedeutende Fragmente, wie z.B. Sequenzfragmente,
die in die Genexpression und die Proteinverarbeitung involviert
sind, kürzer
sein können.
-
Wie
hierin verwendet, bezieht sich „ein Zielstrukturmotiv" oder „Zielmotiv" auf eine beliebige,
rational ausgesuchte Sequenz oder Kombination von Sequenzen, bei
der/denen die Sequenz(en) basierend auf einer dreidimensionalen
Konfiguration ausgewählt
werden, die nach dem Falten des Zielmotivs gebildet wird. Es gibt eine
Reihe an Zielmotiven, die nach dem Stand der Technik bekannt sind.
Protein-Zielmotive
umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, enzymaktive Stellen
und Signalsequenzen. Nucleinsäure-Zielmotive
umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Promotorsequenzen,
Haarnadelstrukturen und induzierbare Expressionselemente (proteinbindende
Sequenzen).
-
Computer-Software
ist allgemein erhältlich,
die es dem Fachmann ermöglicht,
auf Sequenzinformationen zuzugreifen, die auf einem computerlesbaren
Medium zur Analyse von und zum Vergleich mit anderen Sequenzen bereitgestellt
werden. Eine Reihe bekannter Algorithmen werden öffentlich offenbart und eine
Reihe kommerziell erhältlicher
Softwareprogramme zum Durchführen
von Durchsuchungsaufgaben ebenfalls und können in den computerbasierten
Systemen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispiele
solcher Software umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf,
MacPattern (EMBL), BLASTN und BLASTX (NCBIA).
-
Software,
die z.B. die BLAST- (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410
(1990)) und die BLAZE-Suchalgorithmen (Brutlag et al., Corp. Chem.
17, 203-207 (1993)) auf einem Sybase-System implementiert, kann verwendet
werden, um offene Leseraster (ORFs) der Sequenzen der Erfindung
zu identifizieren, die eine Homologie zu den ORFs oder zu Proteinen
anderer Bibliotheken enthalten. Solche ORFs sind proteinkodierende Fragmente
und sind von Nutzen bei der Herstellung von kommerziell wichtigen
Proteinen, wie z.B. Enzymen, die in verschiedenen Reaktionen und
in der Produktion kommerziell nützlicher
Metabolite verwendet werden.
-
Vektoren/Wirtszellen
-
Die
Erfindung stellt auch Vektoren bereit, welche die Phosphodiesterase-Polynucleotide enthalten. Der
Begriff „Vektor" bezieht sich auf
ein Vehikel, vorzugsweise ein Nucleinsäure-Molekül, das die Phosphodiesterase-Polynucleotide
transportieren kann. Ist der Vektor ein Nucleinsäure-Molekül, so sind die Phosphodiesterase-Polynucleotide
kovalent an die Vektor-Nucleinsäure
gebunden. Mit diesem Aspekt der Erfindung umfasst der Vektor ein
Plasmid, einen einzel- oder doppelsträngigen Phagen, einen einzel-
oder doppelsträngigen
viralen RNA- oder DNA-Vektor oder ein künstliches Chromosom, wie z.B.
ein BAC, PAC, YAC oder MAC.
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Ein
Vektor kann in der Wirtszelle als extrachromosomales Element beibehalten
werden, wo er sich repliziert und zusätzliche Kopien der Phosphodiesteras-Polynucleotide
erzeugt. Alternativ dazu kann sich der Vektor in das Wirtszell-Genom
integrieren und zusätzliche
Kopien der Phosphodiesterase-Polynucleotide erzeugen, wenn sich
die Wirtszelle repliziert.
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Die
Erfindung stellt Vektoren zum Erhalt (Klonierungsvektoren) oder
Vektoren zur Expression (Expressionsvektoren) der Phosphodiesterase-Polynucleotide
bereit. Die Vektoren können
in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen oder in beiden (Shuttle-Vektoren)
funktionieren.
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Expressionsvektoren
enthalten cis-agierende Regulationsregionen, die im Vektor operabel
an die Phosphodiesterase-Polynucleotide gebunden sind, so dass die
Transkription der Polynucleotide in einer Wirtszelle ermöglicht wird.
Die Polynucleotide können
in die Wirtszelle mit einem separaten Polynucleotid eingeführt werden, das
in der Lage ist, die Transkription zu beeinflussen. Daher kann das
zweite Polynucleotid einen trans-agierenden Faktor bereitstellen,
der mit der cis-Regulations-Kontrollregion
wechselwirkt, um eine Transkription der Phosphodiesterase-Polynucleotide aus
dem Vektor zu ermöglichen.
Alternativ dazu kann ein trans-agierender
Faktor durch die Wirtszelle bereitgestellt werden. Schließlich kann
ein trans-agierender Faktor aus dem Vektor selbst produziert werden.
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Es
ist jedoch davon auszugehen, dass in einigen Ausführungsformen
die Transkription und/oder die Translation der Phosphodiesterase-Polynucleotide
in einem zellfreien System erfolgen kann.
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Die
Regulationssequenz, an die die hierin beschriebenen Polynucleotide
operabel gebunden werden können,
umfasst Promotoren zur Steuerung der mRNA-Transkription. Diese umfassen,
sind jedoch nicht eingeschränkt
auf, den linken Promotor aus Bakteriophagen λ, die lac-, TRP- und TAC-Promotoren
aus E. coli, die frühen
und die späten
Promotoren von SV40, den unmittelbaren frühen CMV-Promotor, die frühen und
die späten
Adenovirus-Promotoren und lange terminale Retrovirus-Wiederholungen.
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Zusätzlich zu
Kontrollregionen, welche die Transkription fördern, können Expressionsvektoren auch Regionen
umfassen, welche die Transkription modulieren, wie z.B. Repressorbindungsstellen
und Enhancer. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer, den unmittelbaren
frühen
Zytomegalievirus-Enhancer, Polyoma-Enhancer, Adenovims-Enhancer
und LTR-Retrovirus-Enhancer.
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Zusätzlich dazu,
dass Expressionsvektoren Stellen zur Transkriptionsinitiation und
-kontrolle enthalten, können
sie auch Sequenzen enthalten, die für die Transkriptionstermination
notwendig sind, sowie in der transkribierten Region eine Ribosomenbindungsstelle
für die
Translation. Andere Regulationskontrollelemente für die Expression
umfassen Initiations- und Terminationscodons sowie Polyadenylierungssignale.
Einem Fachmann wären
die zahlreichen Regulationssequenzen bewusst, die bei Expressionsvektoren
von Nutzen sind. Solche Regulationssequenzen werden z.B. in Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Aufl., Cold Spring
Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), beschrieben.
-
Eine
Reihe an Expressionsvektoren kann verwendet werden, um ein Phosphodiesterase-Polynucleotid
zu exprimieren. Solche Vektoren umfassen chromosomale, episomale
und virusabstammende Vektoren, z.B. Vektoren, die von bakteriellen
Plasmiden, von Bakteriophagen, von Hefe-Episomen, von chromosomalen Hefeelementen,
unter anderem künstlichen
Hefechromosomen, von Viren, wie z.B. Baculoviren, Papovaviren, wie
z.B. SV40, Vakziniaviren, Adenoviren, Pockenviren, Pseudorabies-Viren und Retroviren,
abstammen. Vektoren können
auch aus Kombinationen dieser Quellen stammen, wie z.B. jene, die
von genetischen Plasmid- und Bakteriophagen-Elementen abstammen, z.B. Cosmide und
Phagemide. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren für prokaryotische
und eukaryotische Wirte werden in Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laborstory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laborstory Press,
Cold Spring Harbor, NY (1989), beschrieben.
-
Die
Regulationssequenz kann eine konstitutive Expression in einer oder
mehreren Wirtszellen (d.h. gewebespezifisch) bereitstellen, oder
sie kann für
die induzierbare Expression in einer oder mehreren Zelltypen sorgen,
z.B. durch Temperatur, Nährstoffzusatz
oder den exogenen Faktor, wie z.B. ein Hormon oder einen anderen
Liganden. Eine Reihe an Vektoren, die für die konstitutive Expression
und die induzierbare Expression in prokaryotischen und eukaryotischen
Wirten sorgt, ist dem Fachmann wohlbekannt.
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide können in die Vektor-Nucleinsäure durch
wohlbekannte Verfahren eingeführt
werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz, die schließlich exprimiert
wird, durch Spalten der DNA-Sequenz und des Expressionsvektors mit
einem oder mehreren Restriktionsenzymen und darauf folgendes Aneinariderligieren
der Fragmente an einen Expressionsvektor gebunden. Verfahren zu
Restriktionsenzym-Verdau und Ligation sind dem Fachmann wohlbekannt.
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Der
Vektor, der das geeigente Polynucleotid enthält, kann in eine geeignete
Wirtszelle unter Verwendung wohlbekannter Verfahren zur Vermehrung
oder Expression eingeführt
werden. Bakterienzellen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf,
E. coli, Streptomyces und Salmonella typhimurium. Eukaryotische Zellen
umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Hefe, Insektenzellen,
wie z.B. Drosophila, Tierzellen, wie z.B. COS- und CHO-Zelien, sowie
Pflanzenzellen.
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Wie
hierin beschrieben, kann es erwünscht
sein, das Polypeptid als Fusionsprotein zu exprimieren. Dementsprechend
stellt die Erfindung Fusionsvektoren bereit, welche die Produktion
der Phosphodiesterase-Polypeptide ermöglichen. Fusionsvektoren können die
Expression eines rekombinanten Proteins erhöhen, die Löslichkeit des rekombinanten
Proteins steigern und bei der Reinigung des Proteins, z.B. durch
ihre Wirkung als Ligand für
die Affinitätsreinigung,
helfen. Eine proteolytische Spaltungsstelle kann am Verbindungspunkt
der Fusionsgruppierung eingeführt
werden, so dass das gewünschte
Polypeptid schließlich
von der Fusionsgruppierung getrennt werden kann. Proteolytische
Enzyme umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Faktor Xa, Thrombin
und Enterokinase. Typische Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX
(Smith et al., Gene 67, 31-40 (1988)), pMAL (New England Biolabs,
Berverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), die Glutathion-S-Transferase
(GST), Maltose-E-Bindungsprotein bzw. Protein-A an das rekombinante Zielprotein
fusionieren. Beispiele geeigneter induzierbarer Nicht-Fusions-E.-coli-Expressionsvektoren
umfassen pTrc (Amann et al., Gene 69, 301-315 (1988)) und pET-11d
(Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology
185, 60-89 (1990)).
-
Die
rekombinante Proteinexpression kann in einem Wirtsbakterium durch
das Bereitstellen eines genetischen Hintergrunds maximiert werden,
worin die Wirtszelle eine eingeschränkte Fähigkeit zur proteolytischen
Spaltung des rekombinanten Proteins besitzt. (S. Gottesman, Gene
Expression Technology: Methods in Enzymology 185, 119-128, Academic
Press, San Diego, Kalifornien (1990)). Alternativ dazu kann die
Sequenz des Polynucleotids von Interesse verändert werden, um eine bevorzugte Codonverwendung
für eine spezifische
Wirtszelle bereitzustellen, z.B. E. coli. (Wada et al., Nucleic
Acids Res. 20, 2111-2118 (1992)).
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide können auch durch Expressionsvektoren,
die in Hefe operativ sind, exprimiert werden. Beispiele von Vektoren
für die
Expression in Hefe, z.B. S. cerevisiae, umfassen pYepSec1 (Baldari
et al., EMBO J. 6, 229-234 (1987)), pMFa (Kurjan et al., Cell 30,
933-943 (1982)), pJRY88 (Schultz et al., Gene 54, 113-123 (1987))
und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
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Die
Phosphodiesterase-Polynucleotide können auch in Insektenzellen
exprimiert werden, z.B. unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren.
Baculovirusvektoren, die für
die Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (z.B.
Sf9-Zellen) erhältlich
sind, umfassen pAc-Serien (Smith et al., Mol. Cell Biol. 3, 2156-2165 (1983)) sowie
die pVL-Serien (Lucklow et al., Virology 170, 31-39 (1989)).
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In
gewissen Ausführungsformen
der Erfindung werden die hierin beschriebenen Polynucleotide in Säugetierzellen
unter Verwendung von Säugetier-Expressionsvektoren
exprimiert. Beispiele an Säugetier-Expressionsvektoren
umfassen pCDM8 (B. Seed, Nature 329, 840 (1987)) und pMT2PC (Kaufman
et al., EMBO J. 6, 187-195 (1987)).
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Die
hierin aufgelisteten Expressionsvektoren dienen lediglich als Beispiel
der wohlbekannten Vektoren, die dem Fachmann zugänglich sind und die von Nutzen
wären,
um die Phosphodiesterase-Polynucleotide zu exprimieren. Dem Fachmann
wäre dabei
die Tatsache bewusst, dass andere Vektoren für den Erhalt der Vermehrung
oder Expression der hierin beschriebenen Polynucleotide geeignet
sind. Diese sind z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory
Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor
Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), zu finden.
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Die
Erfindung umfasst auch Vektoren, in denen die hierin beschriebenen
Nucleinsäure-Sequenzen
in den Vektor in umgekehrter Ausrichtung kloniert sind, jedoch opera bel
an eine Regulationssequenz gebunden sind, welche die Transkription
von Antisense-RNA ermöglicht.
Daher kann ein Antisense-Transkript für alle oder einen Teil der
hierin beschriebenen Polynucleotid-Sequenzen erzeugt werden, umfassend
sowohl die kodierenden als auch die nicht kodierenden Regionen.
Die Expression dieser Antisense-RNA unterliegt jedem der oben stehend
beschriebenen Parameter bezüglich
der Expression der Sense-RNA (Regulationssequenzen, konstitutive
oder induzierbare Expression, gewebespezifische Expression).
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Die
Erfindung betrifft auch rekombinante Wirtszellen, welche die hierin
beschriebenen Vektoren enthalten. Wirtszellen umfassen daher prokaryotische
Zellen, niedere eukaryotische Zellen, wie z.B. Hefe, andere eukaryotische
Zellen, wie z.B. Insektenzellen, und höhere eukaryotische Zellen,
wie z.B. Säugetierzellen.
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Die
rekombinanten Wirtszellen werden durch Einführen der hierin beschriebenen
Vektorkonstrukte in die Zellen hergestellt, und zwar durch Verfahren,
die dem Fachmann leicht zugänglich
sind. Diese umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf,
Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, kationische
lipidvermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Infektion,
Lipofektion und andere Verfahren, wie z.B. jene, die in Sambrook
et al. zu finden sind (Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2.
Aufl., Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor Laborstory
Press, Cold Spring Harbor, NY).
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Wirtszellen
können
mehr als einen Vektor enthalten. Daher können unterschiedliche Nucleotidsequenzen
auf verschiedenen Vektoren derselben Zelle eingeführt werden.
Auf ähnliche
Art und Weise können
die Phosphodiesterase-Polynucleotide entweder alleine oder mit anderen
Polynucleotiden eingeführt
werden, die nicht mit den Phosphodiesterase-Polynucleotiden verwandt
sind, wie z.B. jenen, die trans-agierende Faktoren für Expressionsvektoren
bereitstellen. Wird mehr als ein Vektor in eine Zelle eingeführt, so
können
die Vektoren unabhängig
voneinander eingeführt
werden, co-eingeführt
werden oder an den Phosphodiesterase-Polynucleotid-Vektor gebunden
werden.
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Im
Fall von Bakteriophagen- und viralen Vektoren können diese als verpacktes oder
eingekapseltes Virus in Zellen eingeführt werden, und zwar mittels
Infektions- und Transduktions-Standardverfahren. Virale Vektoren
können
replikationskompetent oder replikationsdefekt sein. Sollte die virale
Replikation defekt sein, so kommt es in Wirtszellen, die Funktionen
bereitstellen, welche die Defekte ergänzen, zu der Replikation.
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Vektoren
umfassen im Allgemeinen selektierbare Marker, welche die Selektion
der Subpopulation von Zellen ermöglichen,
welche die rekombinanten Vektorkonstrukte enthalten. Der Marker
kann im selben Vektor enthalten sein, der die hierin beschriebenen
Polynucleotide enthält,
oder er kann sich auf einem separaten Vektor befinden. Marker umfassen
Tetrazyklin- oder Ampicillin-Resistenzgene für prokaryotische Wirtszellen und
Dihydrofolat-Reduktase oder Neomycin-Resistenz für eukaryotische Wirtszellen.
Es ist jedoch jeder Marker, der eine Selektion nach einem phänotypischen
Merkmal ermöglicht,
wirksam.
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Während die
reifen Proteine in Bakterien, Hefe, Säugetierzellen und anderen Zellen
unter der Kontrolle der geeigneten Regulationssequenzen hergestellt
werden können,
können
auch zellfreie Transkriptions- und Translationssysteme verwendet
werden, um diese Proteine zu erzeugen, und zwar unter Verwendung
von RNA, die von den hierin beschriebenen DNA-Konstrukten abstammt.
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Wird
die Sekretion des Polypeptids gewünscht, so werden geeignete
Sekretionssignale in den Vektor inkorporiert. Die Signalsequenz
kann zu den Phosphodiesterase-Polypeptiden
endogen sein oder heterolog zu diesen Polypeptiden sein.
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Wird
das Polypeptid nicht in das Medium sekretiert, so kann das Protein
aus der Wirtszelle mittels Standard-Aufschlussverfahren isoliert
werden, umfassend Frieren/Auftauen, Beschallung, mechanischen Aufschluss,
die Verwendung von Lysieragenzien und dergleichen. Das Polypeptid
kann anschließend
gewonnen werden und mittels wohlbekannter Reinigungsverfharen gereinigt
werden, umfassend Ammoniumsulfatpräzipitation, Säureextraktion,
Anionen- oder Kationen-Austauschchroma tographie, Phosphozellulosechromatographie,
Hydrophob-Chromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapaptitchromatographie,
Lectinchromatographie oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie.
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Es
ist weiters davon auszugehen, dass, in Abhängigkeit von der Wirtszelle
bei der rekombinanten Produktion der hierin beschriebenen Polypeptide,
die Polypeptide verschiedene Glykosylierungsmuster aufweisen können, je
nach Zelle, oder dass sie nicht glykosyliert sein können, wie
etwa wenn sie in Bakterien produziert wurden. Zusätzlich dazu
können
die Polypeptide ein anfängliches
modifiziertes Methionin umfassen, in einigen Fällen als Resultat eines wirtvermittelten
Prozesses.
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Verwendung von Vektoren und
Wirtszellen
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Es
ist davon auszugehen, dass sich „Wirtszellen" und „rekombinante
Wirtszellen" nicht
nur auf die spezifische, erwähnte
Zelle bezieht, sondern auch auf die Nachkommenschaft oder die potentielle
Nachkommenschaft solch einer Zelle. Da gewisse Modifikationen in
nachfolgenden Generationen aufgrund von Mutationen oder Umwelteinflüssen auftreten
können,
muss diese Nachkommenschaft tatsächlich
nicht identisch mit der Stammzelle sein, ist jedoch trotzdem im
Umfang des Begriffs, wie er hierin verwendet wird, eingeschlossen.
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Die
Wirtszellen, welche die hierin beschriebenen Polypeptide exprimieren,
und insbesondere rekombinante Wirtszellen, können für eine Reihe an Zwecken verwendet
werden. Erstens sind die Zellen für die Herstellung von Phosphodiesterase-Proteinen
oder -Polypeptiden von Nutzen, die weiter gereinigt werden können, um
die gewünschten
Mengen des Phosphodiesterase-Proteins oder der Fragmente zu erzeugen.
Daher sind Wirtszellen, die Expressionsvektoren enthalten, für die Polypeptidproduktion
von Nutzen.
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Wirtszellen
sind auch für
die Durchführung
von zellbasierten Tests nützlich,
welche die Phosphodiesterase oder Phosphodiesterase-Fragmente involvieren.
Daher ist eine rekombinante Wirtszelle, die eine native Phosphodiesterase
exprimiert, nützlich, um
auf Verbindungen zu testen, welche die Phosphodiesterase-Funktion
stimulieren oder inhibieren. Dies umfasst die cAMP-Bindung, die
Genexpression auf der Ebene der Transkription oder der Translation,
die Proteinkinase-A-Wechselwirkung sowie Komponenten des Signalübertragungswegs.
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Wirtszellen
sind auch für
die Identifikation von Phosphodiesterase-Mutanten nützlich,
bei denen diese Funktionen betroffen sind. Treten die Mutanten natürlich auf
und führen
zu einer Pathologie, so sind Wirtszellen, welche die Mutationen
enthalten, von Nutzen, um Verbindungen zu testen, die eine gewünschte Wirkung auf
die Mutanten-Phosphodiesterase
haben (z.B. stimulierende oder inhibitierende Funktion), wobei diese nicht
durch ihre Wirkung auf die native Phosphodiesterase angegeben sein
muss.
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Rekombinante
Wirtszellen sind auch für
die Expression der hierin beschriebenen chimären Polypeptide von Nutzen,
um Verbindungen zu untersuchen, welche die Aktivierung durch eine/ein
heterologe(s) Domäne,
Segment, Stelle oder dergleichen, wie hierin offenbart, aktivieren
oder unterdrücken.
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Weiters
können
Mutanten-Phosphodiesteasen kreiert werden, in denen eine oder mehrere
der verschiedenen Funktionen gentechnisch verändert ist, um verstärkt oder
verringert zu sein (z.B. cAMP-Bindung oder Kinase-A-Bindung), und
verwendet werden, um Phosphodiesterase-Proteine in einem Individuum
zu vermehren oder zu ersetzen. Daher können Wirtszellen eine therapeutische,
positive Wirkung erzielen, und zwar durch Ersetzen einer abnormalen
Phosphodiesterase oder durch Bereitstellen einer abnormalen Phosphodiesterase,
die ein therapeutisches Resultat erbringt. In einer Ausführungsform
stellen die Zellen Phosphodiesterasen bereit, die in einem abnormalen
Ausmaß aktiv
sind.
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In
einer anderen Ausführungsform
stellen die Zellen Phosphodiesterasen bereit, die in einem abnormalen
Ausmaß inaktiv
sind. Diese Phosphodiesterasen können
mit endogenen Phosphodiesterasen in dem Individuum konkurrieren.
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In
einer anderen Ausführungsform
werden Zellen, die Phosphodiesterasen exprimieren, die nicht aktiviert
werden können,
in ein Individuum eingeführt,
um mit endogenen Phosphodiesterasen um cAMP zu konkurrieren. Sollte
z.B. ein Überschuß an cAMP
Teil einer Behandlungsmodalität
sein, so kann es notwendig sein, dieses Molekül in einem spezifischen Moment
der Behandlung zu deaktivieren. Die Bereitstellung von Zellen, die
um das Molekül
konkurrieren, jedoch durch die Phosphodiesterase-Aktivierung nicht
beeinträchtigt werden
können,
wäre von
Vorteil.
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Homolog
rekombinante Wirtszellen, welche die In-situ-Veränderung endogener Phosphodiesterase-Polynucleotidsequenzen
in einem Wirtszell-Genom ermöglichen,
können
auch hergestellt werden. Dieses Verfahren wird ausführlicher
in
WO 93/09222 ,
WO 91/12650 und US-Patent
Nr. 5.641.670 beschrieben. Kurz gesagt, wird es spezifischen Polynucleotidsequenzen,
die den Phosphodiesterase-Polynucleotiden
entsprechen, oder Sequenzen, die proximal oder distal zu einem Phosphodiesterase-Gen
zu finden sind, ermöglicht, sich
in ein Wirtszellen-Genom mittels homologer Rekombination zu integrieren,
wo die Expression des Gens beeinfusst werden kann. In einer Ausführungsform
werden Regulationssequenzen eingeführt, welche die Expression
einer endogenen Sequenz entweder erhöhen oder verringern. Dementsprechend
kann ein Phosphodiesterase-Protein in einer Zelle produziert werden,
die es normalerweise nicht produziert, oder eine erhöhte Expression
des Phosphodiesterase-Proteins kann zu einer Zelle führen, die
das Protein normalerweise in einem spezifischen Ausmaß produziert.
Alternativ dazu kann das gesamte Gen deletiert werden. Weiters können auch
spezifische Mutationen in eine beliebige gewünschte Region des Gens eingeführt werden,
um Mutanten-Phosphodiesterase-Proteine zu erzeugen. Solche Mutationen
könnten
z.B. in die spezifischen, hierin offenbarten Regionen eingeführt werden.
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In
einer Ausführungsform
kann die Wirtszelle eine befruchtete Oozyte oder eine embryonale
Stammzelle sein, die verwendet werden kann, um ein transgenes Tier
zu erzeugen, welches das veränderte
Phosphodiesterase-Gen enthält.
Alternativ dazu kann die Wirtszelle eine Stammzelle sein oder ein
anderer früher Gewebevorläufer, der
zu einem spezifischen Subset an Zellen führt, und kann verwendet werden,
um transgene Gewebe in einem Tier zu erzeugen. Siehe auch Thomas
et al., Cell 51, 503 (1987), für
eine Beschreibung homologer Rekombinationsvektoren. Der Vektor wird
in eine embryonale Stammzellenlinie (z.B. durch Elektroporation)
eingeführt,
und Zellen, in denen das eingeführte
Gen homolog eine Rekombination mit dem endogenen Phosphodiesterase-Gen
eingegangen ist, werden ausgewählt
(siehe z.B. E. Li et al., Cell 69, 915 (1992)). Die ausgewählten Zellen
werden anschließend
in eine Blastozyte eines Tieres (z.B. einer Maus) injiziert, um Aggregationschimären zu bilden
(siehe z.B. A. Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:
A Practical Approach, 113-152, E. J. Robertson (Hrsg.), IRL, Oxford
(1987)). Ein chimärer
Embryo kann anschließend in
ein geeignetes weibliches scheinträchtiges Leihmutter-Tier eingesetzt
werden und der Embryo ausgetragen werden. Nachkommen, welche die
homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen in sich tragen, können verwendet
werden, um Tiere zu züchten,
bei denen alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA durch Keimbahn-Transmission
des Transgens enthalten. Verfahren zur Konstruktion homologer Rekombinationsvektoren
und homologer rekombinanter Tiere werden weiter in A. Bradley, Current
Opinion in Biotechnology 2, 823-829 (1991), und in den internationalen
PCT-Veröffentlichungen
Nr.
WO 90/11354 ;
WO 91/01140 und
WO 93/04169 beschrieben.
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Die
gentechnisch veränderten
Wirtszellen können
verwendet werden, um nicht menschliche transgene Tiere zu erzeugen.
Ein transgenes Tier ist vorzugsweise ein Säugetier, z.B. ein Nagetier,
wie z.B. eine Ratte oder eine Maus, in dem/der eine oder mehrere
der Zellen des Tiers ein Transgen umfassen. Ein Transgen ist exogene
DNA, die in das Genom einer Zelle integriert ist, aus der sich ein
transgenes Tier entwickelt, und die im Genom des erwachsenen Tiers
in einer/einem oder mehreren Zelltypen oder Geweben des transgenen Tiers
verbleibt. Diese Tiere sind für
das Studieren der Funktion eines Phosphodiesterase-Proteins und
die Identifikation und Evaluierung von Modulatoren der Phosphodiesterase-Proteinaktivität von Nutzen.
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Andere
Beispiele transgener Tiere umfassen nicht menschliche Primaten,
Schafe, Hunde, Kühe,
Katzen, Hühner
und Amphibien.
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In
einer Ausführungsform
ist die Wirtszelle eine befruchtete Oozyte oder eine embryonale
Stammzelle, in die Phosphodiesterase-Polynucleotidsequenzen eingeführt wurden.
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Ein
transgenes Tier kann durch Einführen
einer Nucleinsäure
in die männlichen
Vorkerne einer befruchteten Oozyte, z.B. durch Mikroinjektion, retrovirale
Infektion, und das Ermöglichen
der Oozyte, sich in einem scheinträchtigen weiblichen Leihmutter-Tier zu entwickeln,
erzeugt werden. Jede beliebige der Phosphodiesterase-Nucleotidsequenzen
kann als ein Transgen in das Genom eines nicht menschlichen Tiers,
z.B. einer Maus, eingeführt
werden.
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Jede
der Regulations- oder der anderen Sequenzen, die in Expressionsvektoren
von Nutzen sind, können
Teil einer transgenen Sequenz darstellen. Dies umfasst Intron-Sequenzen und Polyadenylierungssignale,
falls diese noch nicht inkludiert sind. (Eine) gewebespezifische
Regulationssequenz(en) kann/können operabel
an das Transgen gebunden sein, um die Expression des Phosphodiesterase-Proteins
an bestimmte Zellen zu steuern.
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Verfahren
zur Erzeugung transgener Tiere durch Embryo-Manipulation und Mikroinjektion,
insbesondere von Tieren, wie z.B. Mäusen, gehören nach dem Stand der Technik
bereits zu den traditionellen Verfahren und werden z.B. im US-Patent
Nr. 4.736.866 und 4.870.099, beide von Leder et al., US-Patent Nr.
4.873.191 von Wagner et al. und in B. Hogan, Manipulating the Mouse
Embryo, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor,
N. Y. (1986), beschrieben. Ähnliche
Verfahren werden für
die Erzeugung anderer transgener Tiere verwendet. Ein transgenes
Gründertier
kann basierend auf der Gegenwart des Tansgens in seinem Genom und/oder
der Expression transgener mRNA in Geweben oder Zellen der Tiere
identifiziert werden. Ein transgenes Gründertier kann anschließend verwendet
werden, um zusätzliche
Tiere, die das Transgen in sich tragen, zu züchten. Weiters können transgene
Tiere, die ein Transgen in sich tragen, weiters zu anderen transgenen
Tieren, die andere Transgene in sich tragen, gezüchtet werden. Ein transgenes
Tier umfasst auch Tiere, in denen das gesamte Tier oder Gewebe in
dem Tier unter Ver wendung der homolog rekombinanten Wirtszellen,
die hierin beschrieben wurden, erzeugt wurde(n).
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In
einer anderen Ausführungsform
können
transgene nicht menschliche Tiere erzeugt werden, die ausgewählte Systeme
enthalten, welche eine regulierte Expression des Transgens ermöglichen.
Ein Beispiel eines solchen Systems ist das cre/loxP-Rekombinase-System
des Bakteriophagen P1. Für
eine Beschreibung des cre/loxP-Rekombinase-Systems
siehe z.B. Lakso et al., PNAS 89, 6232-6236 (1992). Ein weiteres
Beispiel eines Rekombinase-Systems ist das FLP-Rekombinase-System
von S. cerevisiae (O'Gorman
et al., Science 251, 1351-1355 (1991)). Wird ein cre/loxP-Rekombinase-System
verwendet, um die Expression des Transgens zu regulieren, so sind
Tiere erforderlich, die Transgene enthalten, die sowohl für die Cre-Rekombinase als auch
ein ausgewähltes
Protein kodieren. Solche Tiere können
durch die Konstruktion von „doppelten" transgenen Tieren,
z.B. durch Paarung zweier transgener Tiere, bereitgestellt werden,
wobei eines ein Transgen enthält,
das für
ein ausgewähltes
Protein kodiert, und das andere ein für eine Rekombinase kodierendes Transgen
enthält.
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Klone
der hierin beschriebenen nicht menschlichen Tiere können auch
gemäß den in
Wilmut et al., Nature 385, 810-813 (1997), und internationalen PCT-Veröffentlichungen
Nr.
WO 97/07668 und
WO 97/07669 beschriebenen
Verfahren hergestellt werden. Kurz gesagt, kann eine Zelle, z.B.
eine Somazelle, aus dem transgenen Tier isoliert werden und dazu
induziert werden, den Wachstumszyklus zu verlassen und in die G
o-Phase einzutreten. Die ruhende Zelle kann
anschließend
z.B. durch die Verwendung elektrischer Impulse an die entkernte
Oozyte eines Tiers derselben Spezies fusioniert werden, aus der
die ruhende Zelle isoliert wurde. Die rekonstruierte Oozyte wird
anschließend
gezüchtet,
so dass sie sich zur Morula oder Blastozyste entwickelt, und wird
anschließend
in ein scheinträchtiges
weibliches Leihmutter-Tier transferiert. Die Nachkommenschaft, die
dieses weibliche Leihmutter-Tier zur Welt bringt, ist ein Klon des
Tieres, aus dem die Zelle, z.B. die Somazelle, isoliert wurde.
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Transgene
Tiere, die rekombinante Zellen enthalten, welche die hierin beschriebenen
Polypeptide exprimieren, sind nützlich,
um die hierin beschriebenen Tests in einer In-vivo-Kontext durchzuführen. Dementsprechend
kann es sein, dass die verschiedenen physiologischen Faktoren, die
in vivo vorhanden sind und welche die cAMP-Bindung, die Phosphodiesterase-Aktivierung
und die Signalweiterleitung beeinflussen könnten, aus den zellfreien oder
den zellbasierten In-vitro-Tests nicht sichtbar sind. Dementsprechend
ist es von Nutzen, nicht menschliche transgene Tiere bereitzustellen,
um in vivo die Phosphodiesterase-Funktion, unter anderem die cAMP-Wechselwirkung,
die Wirkung spezifischer Mutanten-Phosphodiesterasen auf die Phosphodiesterase-Funktion
und die cAMP Wechselwirkung, sowie die Wirkung chimärer Phosphodiesterasen
zu testen. Es ist auch möglich,
die Wirkung von Null-Mutationen
zu untersuchen, d.h. Mutationen, die eine oder mehrere Phosphodiesterase-Funktionen
im Wesentlichen oder vollständig
eliminieren.
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Pharmazeutische Zusammensetzungen
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Die
Phosphodiesterase-Nucleinsäuremoleküle, das
Protein (wie z.B. eine extrazelluläre Schleife), Modulatoren des
Proteins und Antikörper
(hierin auch als „aktive
Verbindungen" bezeichnet)
können
in pharmazeutische Zusammensetzungen inkorporiert werden, die zur
Verabreichung an ein Individuum, z.B. einen Menschen, geeignet sind.
Solche Zusammensetzungen umfassen typischerweise das Nucleinsäuremolekül, das Protein,
den Modulator oder den Antikörper
und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
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Der
Ausdruck „verabreichen" wird im weitesten
Sinn verwendet und umfasst ein beliebiges Verfahren zur Einführung von
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in ein Individuum.
Dies umfasst die In-vivo-Erzeugung von Polypeptiden oder Polynucleotiden,
wie etwa durch die Transkription oder die Translation von Polynucleotiden
in vivo, die exogen in ein Individuum eingeführt wurden. Daher sind Polypeptide
oder Nucleinsäuren,
die in dem Individuum aus den exogenen Zusammensetzungen hergestellt
werden, in dem Ausdruck „verabreichen" eingeschlossen.
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Wie
hierin verwendet, soll der Ausdruck „pharmazeutisch annehmbarer
Träger" beliebige und alle
Lösungsmittel,
Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakteriellen und antimykotischen
Agenzien, isotonischen und absorptionsverzögernden Agenzien und dergleichen
umfassen, die mit der pharmazeutischen Verabreichung kompatibel
sind. Die Verwendung solcher Medien und Agenzien für pharmazeutisch
aktive Substanzen ist nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Jedoch
mit folgender Ausnahme: Alle herkömmlichen Medien oder Agenzien,
die mit der aktiven Verbindung inkompatibel sind, können in
den Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden. Ergänzende aktive
Verbindungen können
auch in die Zusammensetzungen inkorporiert werden.
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Eine
pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung wird so formuliert,
dass sie mit dem geplanten Verabreichungsweg kompatibel ist. Beispiele
für Verabreichungswege
umfassen parenterale wie z.B. intravenöse, intradermale, subkutane,
orale (z.B. Inhalation), transdermale (topische) Verabreichung sowie
eine Verabreichung über
die Schleimhaut und rektale Verabreichung. Lösungen oder Suspensionen, die
für die
parenterale, intradermale oder subkutane Anwendung verwendet werden,
können
die folgenden Komponenten umfassen: ein steriles Verdünnungsmittel,
wie z.B. Wasser zur Injektion, Salzlösung, fette Öle, Polyethylenglykole,
Glycerin, Propylenglykol oder andere synthetische Lösungsmittel;
antibakterielle Agenzien, wie z.B. Benzylalkohol oder Methylparabene;
Antioxidanzien, wie z.B. Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Chelatbildner,
wie z.B. Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer, wie z.B. Acetate,
Citrate oder Phosphate, und Agenzien zur Anpassung der Tonizität, wie z.B.
Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH kann mit Säuren oder Basen, wie z.B. Salzsäure oder
Natriumhydroxid, angepasst werden. Das parenterale Präparat kann
in Ampullen, Einwegspritzen oder Mehrfach-Dosierungsphiolen aus
Glas oder Kunststoff eingeschlossen sein.
-
Pharmazeutische
Zusammensetzungen, die zur Verwendung als Injektion geeignet sind,
umfassen sterile wässrige
Lösungen
(falls wasserlöslich)
oder Dispersionen und sterile Pulver zur extemporierten Herstellung
steriler injizierbarer Lösungen
oder Dispersionen. Zur intravenösen
Verabreichung umfassen geeignete Träger physiolo gische Salzlösung, bakteriostatisches
Wasser, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany,
NJ) oder phosphatgepufferte Salzlösung (PBS). In allen Fällen muss
die Zusammensetzung steril sein und sollte in einem Ausmaß flüssig sein,
so dass eine leichte Injizierbarkeit mittels einer Spritze gegeben
ist. Sie muss unter Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil
sein und muss gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen,
wie z.B. Bakterien und Pilze, geschützt sein. Der Träger kann
ein Lösungsmittel
oder ein Dispersionsmedium sein, das z.B. Wasser, Ethanol, Polyol
(z.B. Glycerin, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol und
dergleichen) sowie geeignete Gemische dieser enthält. Die
richtige Fluidität
kann z.B. durch die Verwendung einer Beschichtung, wie z.B. Lecithin,
durch den Erhalt der erforderten Partikelgröße im Fall einer Dispersion
und durch die Verwendung von Tensiden erhalten werden. Die Prävention
der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle
und antifungale Agenzien, z.B. Parabene, Chlorobutanol, Phenol,
Ascorbinsäure,
Thimerosal und dergleichen, erreicht werden. In vielen Fällen wird
es bevorzugt, isotonische Agenzien, z.B. Zucker, Polyalkohole, wie
z.B. Mannit, Sorbit, Natriumchlorid, in die Zusammensetzung zu inkludieren.
Die verlängerte
Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch das Inkludieren
eines Agens in die Zusammensetzung erreicht werden, das die Absorption
verzögert,
z.B. Aluminiummonostearat und Gelatine.
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Sterile
injizierbare Lösungen
können
durch Inkorporieren der aktiven Verbindung (z.B. eines Phosphodiesterase-Proteins
oder eines Anti-Phosphatase-Antikörpers) in der erforderlichen
Menge in ein geeignetes Lösungsmittel
hergestellt werden, und zwar mit einem oder einer Kombination an
Bestandteilen, die oben stehend aufgezahlt wurden, wie erfordert,
gefolgt von filtrierter Sterilisierung. Im Allgemeinen werden Dispersionen
durch Inkorporieren der aktiven Verbindung in ein steriles Vehikel
hergestellt, das ein basisches Dispersionsmedium und die erforderlichen
anderen Bestandteile jener, wie sie oben stehend aufgezählt wurden,
enthält.
Im Fall von sterilen Pulvern zur Herstellung steriler injizierbarer
Lösungen
sind die bevorzugten Herstellungsverfahren das Vakuumtrocknen und
das Gefriertrocknen, wodurch ein Pulver des aktiven Bestandteils
sowie jedes beliebigen Bestandteils aus einer zuvor sterilfiltrierten
Lösung
davon erhalten wird.
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Orale
Zusammensetzungen umfassen im Allgemeinen ein inertes Verdünnungsmittel
oder einen essbaren Träger.
Sie können
in Gelatinekapseln eingeschlossen sein oder zu Tabletten komprimiert
sein. Zur oralen Verabreichung kann das Agens in enterischen Formen
enthalten sein, um im Magen überleben
zu können, oder
es kann weiter beschichtet sein oder gemischt sein, um durch bekannte
Verfahren in einer bestimmten Region des GI-Trakts freigesetzt zu
werden. Zum Zweck der oralen therapeutischen Verabreichung kann
die aktive Verbindung mit Exzipienten inkorporiert werden und in
Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln verwendet werden. Orale
Zusammensetzungen können
auch unter Verwendung einer Trägerflüssigkeit
zur Verwendung als Mundspülung
hergestellt werden, worin die Verbindung in der Trägerflüssigkeit
oral aufgetragen wird, damit gespült wird und anschließend ausgespuckt
oder geschluckt wird. Pharmazeutisch kompatible Bindungsagenzien
und/oder Hilfsmaterialien können
als Teil der Zusammensetzung inkludiert werden. Die Tabletten, Pillen,
Kapseln, Pastillen und dergleichen können einen beliebigen der folgenden
Bestandteile enthalten oder Verbindungen einer ähnlichen Art: ein Bindemittel,
wie z.B. mikrokristalline Zellulose, Tragantgummi oder Gelatine;
einen Exzipienten, wie z.B. Starke oder Lactose, ein Aufschlussmittel
wie z.B. Alginsäure;
Primogel oder Maisstarke; ein Schmiermittel, wie z.B. Magnesiumstearat
oder Sterote; ein Gleitmittel, wie z.B. kolloidales Siliziumdioxid;
einen Süßstoff,
wie z.B. Saccharose oder Saccharin; oder einen Geschmacksstoff,
wie z.B. Pfefferminz, Methylsalicylat oder Orangengeschmack.
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Zur
Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen in Form eines
Aerosol-Sprays aus
einem unter Druck stehenden Behälter
oder Spender verabreicht, der ein geeignetes Treibmittel enthält, z.B.
ein Gas, wie z.B. Kohlendioxid, oder durch einen Zerstäuber.
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Die
systemische Verabreichung kann auch mittels durch die Schleimhaut
dringender oder transdermaler Mittel erfolgen. Für die Verabreichung durch die
Schleimhaut oder die transdermale Verabreichung werden in der Formulierung
durchdringende Stoffe verwendet, die für die zu durchdringende Barriere
geeignet sind. Solche durchringenden Stoffe sind im Allgemeinen
nach dem Stand der Technik bekannt und umfassen z.B. für die Verabreichung über die
Schleimhaut Detergenzien, Gallensalze sowie Fusidinsäure-Derivate.
Verabreichungen über
die Schleimhaut können
durch die Verwendung von Nasensprays oder Suppositorien erreicht werden.
Zur transdermalen Verabreichung werden die aktiven Verbindungen
zu Salben, Heilsalben, Gelen oder Cremen formuliert, wie im Allgemeinen
nach dem Stand der Technik bekannt ist.
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Die
Verbindungen können
auch in Form von Suppositorien hergestellt werden (z.B. mit herkömmlichen Suppositorienbasen,
wie z.B. Cacaobutter und anderen Glyceriden) oder Retentionsklistieren
zur rektalen Verabreichung.
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In
einer Ausführungsform
werden die aktiven Verbindungen mit Trägern hergestellt, die die Verbindung gegen
die schnelle Elimination aus dem Körper schützen, wie z.B. eine Formulierung
mit verzögerter
Freisetzung, inkludierend Implantate und Abgabesysteme, die in Mikrokapseln
eingeschlossen sind. Biologisch abbaubare, biokompatible Polymere
können
verwendet werden, wie z.B. Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglykolsäure, Collagen,
Polyorthoester und Polymilchsäure.
Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen sind dem Fachmann
bekannt. Die Materialien sind auch im Handel bei Alza Corporation
und Nova Pharmaceuticals, Inc., erhältlich. Liposomale Suspensionen
(unter anderem Liposomen, die auf infizierte Zellen abzielen, und
zwar mit monoklonalen Antikörpern
auf virale Antigene) können
auch als pharmazeutisch annehmbare Träger verwendet werden. Sie können gemäß den nach
dem Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden, z.B.
wie im US-Patent Nr. 4.522.811 beschrieben.
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Es
ist besonders von Vorteil, orale oder parenterale Zusammensetzungen
in Form von Dosierungseinheiten zu formulieren, um die Verabreichung
zu erleichtern und um die Dosierung zu vereinheitlichen. „In Form von
Dosierungseinheiten",
wie hierin verwendet, bezieht sich auf physisch abgetrennte Einheiten,
die für
das zu behandelnde Individuum als Einzeldosierungen geeignet sind,
wobei jede Einheit eine zuvor festgelegte Menge der aktiven Verbindung
enthält,
von der berechnet wurde, dass sie zusammen mit dem erforderlichen pharmazeutischen
Träger
die gewünsch te
therapeutische Wirkung erzielt. Die Spezifizierung der Dosierungseinheitsformen
der Erfindung wird von den einzigartigen Merkmalen der aktiven Verbindung
und der spezifischen therapeutischen Wirkung, die erreicht werden
soll, sowie von den innewohnenden Einschränkungen nach dem Stand der
Technik der Erstellung von Zusammensetzungen solch einer aktiven
Verbindung zur Behandlung von Individuen bestimmt und ist direkt
von diesen abhängig.
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Die
Nucleinsäuremoleküle der Erfindung
können
in Vektoren insertiert werden und als Gentherapievektoren verwendet
werden. Die Gentherapievektoren können einem Individuum z.B.
durch intravenöse
Injektion, lokale Verabreichung (US-Patent Nr. 5.328.470) oder durch
stereotaktische Injektion verabreicht werden (siehe z.B. Chen et
al., PNAS 91, 3054-3057 (1994)). Die pharmazeutische Herstellung
des Gentherapievektors kann den Gentherapievektor in einem annehmbaren
Verdünnungsmittel
umfassen oder eine Matrix mit verzögerter Freisetzung umfassen,
in welche das Genanlieferungsvehikel eingebettet ist. Alternativ
dazu kann das pharmazeutische Präparat
eine oder mehrere Zellen umfassen, die das Genanlieferungssystem
produzieren, wenn der vollständige
Genanlieferungsvektor intakt aus rekombinanten Zellen produziert
werden kann, z.B. retrovirale Vektoren.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einem Behälter, einer
Packung oder einem Spender zusammen mit Anweisungen zur Verabreichung
inkludiert sein.
