ES2275304T3 - Nuevas composiciones de delta-3 humana y usos diagnosticos y terapeuticos para las mismas. - Google Patents

Abstract

La invención codifica ácidos nucleicos que codifican proteínas Delta3. También se suministran derivados de los ácidos nucleicos de Delta3, polipéptidos codificados por los mismos y anticuerpos. La invención también se refiere a agentes terapéuticos de Delta3, que son bien antagonistas o bien agonistas de una bioactividad de la Delta3 y que son capaces de modular el crecimiento y/o la diferenciación de una célula, por ejemplo una célula endotelial. Además se suministran procedimientos para el tratamiento de la prevención de las enfermedades asociadas con una actividad aberrante de la Delta3 y/o asociadas con un crecimiento y/o una diferenciación celular anormal, por ejemplo enfermedades neurológicas o enfermedades vasculares tales como la Agénesis del Corpus Callosum con Neuropatía Periférica (ACCPN), así como procedimientos de diagnóstico para la detección de estas enfermedades.

Description

Nuevas composiciones de Delta-3 humana y usos diagnósticos y terapéuticos para las mismas.

1. Fundamento de la invención

En países desarrollados, el infarto es la tercera causa principal de muerte y la causa principal de insuficiencia física adquirida o cognitiva. La demencia vascular es la segunda causa principal de demencia, luego de la enfermedad de Alzheimer. La CADASIL (sigla en inglés para: cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy, en español, Arteriopatía Dominante Autosomal Cerebral con Infartos Subcorticales y Leucoencefalopatía) provoca un tipo de infarto y demencia cuyas características clave incluyen eventos isquémicos sub-corticales recurrentes, demencia vascular progresiva, parálisis cráneo-facial, migraña y trastornos en el estado de ánimo con depresión severa (Chabriat, H. et al., (1995) Lancet 346: 934-939). Estos síntomas usualmente comienzan a aparecer aproximadamente a los 45 años de edad, y los pacientes normalmente mueren alrededor de los 65. Se cree que la afección no está diagnosticada en gran medida y por lo tanto, la frecuencia no se conoce en forma precisa.

La CADASIL está asociada con anormalidades difusas de la materia blanca o las neuro-imágenes (Tournier-Lasserve, E. et. al., (1991) Stroke 22:1297-1302). El examen patológico revela múltiples infartos cerebrales profundos y pequeños, una leucoencefalopatía y una angiopatía no ateroesclerótica, no amiloide, que involucra principalmente las arterias cerebrales. (Baudrimont, M. et al., (1993) Stroke 24: 122-125). Son evidentes severas alteraciones de las células del músculo liso vascular a partir del análisis ultraestructural (Ruchoux, M. M. et al., (1995) Acta Neuropathol. 89:500-512).

Se ha demostrado recientemente que el gen Notch3 humano, ubicado en el cromosoma 19, está mutado en pacientes con CADASIL (Joutel. A. et al., (1996) Nature 383: 707-710). La mayoría de las mutaciones provocan cambios en los aminoácidos en el dominio extracelular. Por lo tanto, la interrupción de la vía de señalización de Notch resulta ser la responsable del infarto y la demencia producidos por CADASIL.

Los defectos en la vía de señalización de Notch también pueden involucrarse en otras enfermedades neurológicas, por ej. la enfermedad de Alzheimer. De hecho, aproximadamente el 10% de los casos de enfermedad de Alzheimer están asociados con mutaciones en genes que codifican las proteínas precursoras amiloides, la presenilina I (PSI) y presenilina 2 (PS2). Aproximadamente el 25% de los casos de enfermedad de Alzheimer familiar de comienzo temprano están asociados con una mutación en PS1. PS1 y PS2 son proteínas de transmembrana que son homólogas a la proteína C. elegans codificada por el gen sel-12, el cual, según se demostró, está genéticamente ligado al gen lin-12 de C. elegans, que codifica un receptor de la familia Notch (Levitan, D. and L. Greenwald (1995) Nature 377:351-354); PS1 y PS2 se describen en forma adicional en la Solicitud por PCT WO 96/34099; Sel12 se describe en forma adicional en la Solicitud por PCT 97/11956). Además, la supresión dirigida de PS1 en ratones produce la expresión de ARNm que codifica el gen 1 tipo Delta (DII1) y Notch1, un ligando Notch de los vertebrados, en el mesodermo presomítico comparado con ratones de control (Wong et al. (1997) Nature 387:288). Esto indica que se requiere PS1 para la expresión espacio-temporal de los genes implicados en la vía de señalización de Notch.

La vía de señalización de Notch comprende proteínas Notch, que son proteínas de membrana, y proteínas que interactúan con proteínas Notch, denominadas proteínas Delta. El producto del gen Delta, que actúa como ligando, y el del gen Notch, que actúa como receptor, son componentes clave en la vía de señalización de inhibición lateral que regula la caracterización detallada de muchos tejidos diferentes en Drosophila (Vassin, H., et al., (1987) EMBO 16:3431-3440; Kopczynski, C. et al., (1988) Genes Dev. 2:1723-1735; Fehon, R. G. et al., (1990) Cell 61:523-534; Artavanis-Tsakonas, S. et., al., (1991) Trends, Genet. Sci. 7:403-407; Heitzler, P. et. al., (1991) Cell 64: 1083-1092; Greenwald, I. et al., (1992) Cell 68: 271-281; Fortini, M et al., (1993) Cell 75: 124501247; y Muskavitch, M. (1994) DevI. Biol. 166:415-430). Durante la neurogénesis en particular, los precursores neuronales, al expresar a Delta, inhiben el hecho de que las células vecinas que expresan el Notch terminen en un destino neural. Las mutaciones que conducen a una falla en la inhibición lateral provocan una superproducción de neuronas, dando lugar a un fenotipo denominado "fenotipo neurogénico" en Drosophila. Por ejemplo, La pérdida de Notch 1 conduce a defectos de somita y muerte embrionaria en ratones, mientras que las formas mutantes constitutivamente activas de Notch 1 inhiben la diferenciación celular en Xenopus y en células cultivadas de mamíferos (Swiatek et al. (1994) Genes Dev. 8:707; Conlon et al. (1995) J. Development 121:1533; Lopan et al. (1994) Development 120:2385; y Nye et al. (1994) Development 120:2421). De manera similar, la actividad reducida de X-Delta1 hace que más células se conviertan en neuronas primarias, mientras que una elevada actividad produce que menos células se conviertan en neuronas primarias (Chitnis et al. (1995) Nature 375:761). Además, la pérdida de la función de DII1 en ratones conduce a una excesiva diferenciación neuronal, produciendo defectos severos en la caracterización en el mesoderma paraxial y un sistema nervioso central (SNC) hiperplásico (Hrabe de Angelis et al. (1997) Nature 386:717). De este modo, la vía de señalización de Notch, en particular las proteínas Delta, median la inhibición lateral durante la neurogénesis de manera tal que sólo una proporción limitada de células que tienen el potencial de convertirse en neuronas de hecho se diferenciarán en neuronas.

La familia de proteínas Notch son receptores transmembrana que contienen varios motivos de péptidos conservados. Los dominios extracelulares contienen muchas copias repetidas en tánden de un motivo similar al factor de crecimiento epidérmico (FCE). Los dominios intracelulares contienen seis copias de otro motivo conservado, denominado repetición de Cdc10/ancrina. Tanto los motivos de FCE como de ancrina se encuentran en muchas proteínas diferentes y en por lo menos algunos casos, han demostrado tener implicancia en las interacciones proteína-
proteína.

La proteína Notch de Drosophila codifica un receptor de transmembrana glicosilado que tiene una masa molecular de 350KD, que está involucrado en la especificación del destino de la célula durante el desarrollo (Wharton, K.A. et al., (1985) Cell 43:567-581); Artavanis-Tsakonas, S. et al., (1995) Science 268: 225-232). En base al análisis de los mutantes de Drosophila, se considera que Notch es un receptor que tiene dominios funcionales diferentes, donde el dominio intracelular tiene actividad de transducción de señal intrínseca de la proteína intacta y el dominio extracelular una actividad reguladora (Rebay, I et al., (1993) Cell 74: 319329).

Se han identificado varios homólogos de Notch en vertebrados (Larsson, C., et al., (1994) Genomics 24: 253-258). Tres proteínas Notch (Notch1, también llamada TAN1, Notch2, y Notch3) se han caracterizado en los seres humanos (Ellisen, L. W. et al., (1991) Cell 66:649-661; Stifani, S. et al., (1992) Nature Genet. 2: 119-127). Las translocaciones en el gen Notch1 se han asociado con una minoría de leucemias linfoblásticas de células T (Aster, 7. (1994) Cold Spring Herb. Symp. Quart. Biol. 59:125-136) y Notch3 se ha ligado con la CADASIL.

Una proteína que interactúa con Notch se descubrió en Drosophila y se denominó proteína Delta. Esta proteína codifica un ligando de proteína transmembrana, que contiene ordenamientos en tánden de repeticiones del tipo factor de crecimiento epidérmico en el dominio extracelular. Las proteínas Delta y Notch pueden unirse directamente entre sí y otras repeticiones del tipo FCE específicas son suficientes y necesarias para esta unión (Fehon, R.G. et al., (1990) Cell 61:523-534; Rebay I., et al., (1991) Cell 67:687-699; y Lieber, T., et al., (1992) Neuron 9: 847-859).

Además de la proteína Delta de Drosophila, se han identificado un homólogo de Delta del pollo, la proteína Delta-C (Henrique, D et al, (1995) Nature 375: 787-790 y No. de Acceso al GenBank U26590) dos homólogos de Xenopus, X-Delta-1 y X-Delta-2 (Chitnis, A et al., (1995) Nature 375:761-766 y Nos. de Acceso al GenBank L42229 y U70843), un homólogo de ratón (No. de Acceso al GenBank X80903), un gen humano similar al delta (D1k) (Bettenhausen, B. et al., (1995) Development 121:2407-2418) un homólogo de rata (No. de Acceso al GenBank U78889), y un homólogo de pez cebra (No. de Acceso al GenBank Yl 1760). Los genes Delta de Xenopus, pollo y ratón también se revelan en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US96/11178 (Publicación No. W097/01571. La solicitud de patente también revela un homólogo Delta humano propenso al error y parcial (hD1). La secuencia de nucleótidos de los genes Notch humanos se revelan en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US92/03651 (Publicación No. WO 92/19734) y Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US93/09338 (Publicación No. WO 94107474).

Los productos terapéuticos, que modulan (agonizan o antagonizan) la vía de señalización Delta/Notch serían útiles para la prevención y el tratamiento de varias enfermedades y trastornos, incluyendo trastornos neurológicos y vasculares. Además, las mutaciones en los genes Delta que se correlacionan con la existencia de o una predisposición al desarrollo de una enfermedad pueden proveer diagnósticos útiles.

2. Síntesis de la invención

En un primer aspecto de la presente invención, se provee una molécula de ácido nucleico aislado seleccionada del grupo formado por

a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es, por lo menos, 75% idéntica a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 3, la inserción de ADNc del plásmido depositado con el Número de Acceso al ATCC 98348, o uno de sus complementos;

b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es, por lo menos, 85% idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o la SEC ID NO:3, la inserción del ADNc del plásmido depositado en el ATCC como Número de Acceso 98348, o uno de sus complementos;

c) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es, por lo menos, 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO:3, la inserción del ADNc del plásmido depositado en el ATCC como Número de Acceso 98348, o uno de sus complementos;

d) una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de por lo menos 150 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO:3, la inserción del ADNc del plásmido depositado en el ATCC como Número de Acceso 98348, o uno de sus complementos;

e) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 1, SEQ ID NO:3 o la inserción del ADNc del plásmido depositado en el ATCC como Número de Acceso 98348, o uno de sus complementos;

f) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 o una secuencia de aminoácidos codificada por la inserción del ADNc del plásmido depositado en el ATCC como Número de Acceso 98348; y

g) una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2, o la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la inserción del ADNc del plásmido depositado en el ATCC con el Número de Acceso 98348, en la cual el fragmento comprende por lo menos 50 aminoácidos contiguos de la SEC ID NO:2, o el polipéptido codificado por la inserción del ADNc del plásmido depositado en el ATCC como Número de Acceso 98348.

La invención se basa por lo menos en parte en el descubrimiento de un gen humano que codifica una nueva proteína Delta que difiere sustancialmente de las proteínas Delta descritas anteriormente. En consecuencia, la nueva proteína Delta de la invención se denomina aquí Delta3. De este modo, la invención provee proteínas Delta3, y ácidos nucleicos que codifican las proteínas Delta3. Una hDelta3 ejemplificativa se incluye en un plásmido que se depositó en el American Type Culture Collection (ATCC) el 5 de marzo de 1997, y se le ha asignado el número de acceso al ATCC 98348.

En base al análisis de transferencia Northern de ARN preparado a partir de una cantidad de tejidos humanos, se expresó un mensaje de 35kb en cerebro, hígado, pulmón y riñón fetal; y corazón, placenta, pulmón, músculo esquelético, riñón, páncreas, bazo, timo, próstata, testículos, ovario, intestino delgado y colon de adultos. Además, se encontró que el gen Delta3 se expresaba a niveles relativamente altos en por lo menos algunas células tumorales (por ej. carcinoma de colon) y su expresión podría regularse por aumento en respuesta a varios factores de crecimiento (por ej., bFGF y VFCE). Además, la expresión de hDelta3 también demostró aumentar en respuesta a una diferenciación inducida por la señal de células endoteliales, indicando una función para hDelta3 en la modulación de las células de crecimiento y/o diferenciación, en particular células endoteliales.

Como se describe aquí, el gen hDelta3 se ha localizado en el cromosoma humano 15, cerca de los marcadores de marco D15S1244 y D115S144, una región cromosómica que se ha asociado con la enfermedad neurológica Agénesis del Cuerpo Calloso con Neuropatía Periférica (ACCNP) (Casaubon et al. (1996) Am J. Hum).

En un aspecto, la invención caracteriza moléculas de ácido nucleico de Delta3 aislado, por ej., ácidos nucleicos de Delta3 humana. Las moléculas reveladas pueden ser no codificadoras, (por ej., sonda, moléculas antisentido o ribozimas) o pueden codificar un polipéptido Delta 3 funcional, por ej. un polipéptido que puede modular por lo menos una bioactividad de un polipéptido Delta3. En una realización, las moléculas de ácido nucleico pueden hibridarse al gen Delta3 contenido en el plásmido que tiene No. de Acceso al ATCC 98348. En otra realización, el ácido nucleico reivindicado es capaz de hibridarse a la secuencia de nucleótidos que se menciona en la SEC ID No. 1 y/o la SEC ID No: 3 o a uno de sus complementos. En una realización preferida, las hibridaciones conducidas en condiciones rigurosas o levemente rigurosas.

En realizaciones adicionales, la molécula de ácido nucleico es un ácido nucleico Delta3 que es por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, con preferencia 80%, con mayor preferencia 85%, e incluso con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 95% homóloga en su secuencia a los ácidos nucleicos que se muestran como SEC ID No: 1 y/o 3 o al complemento de los ácidos nucleicos que se muestran como SEC ID Nos: 1 y/o 3. En otra realización la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que es por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, con preferencia 80%, con mayor preferencia 85%, e incluso con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 90 o 95% similar o idéntica en su secuencia al polipéptido que se muestra en la SEC ID No. 2. En una realización adicional, la molécula de ácido nucleico es un ácido nucleico que es por lo menos aproximadamente 70%, con preferencia 80%, con mayor preferencia 85% e incluso con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 90% o 95% similar en su secuencia al gen hDelta3 incluido en el plásmido que tiene Número de Acceso al ATCC 98348.

Los ácidos nucleicos preferidos de la invención comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica por lo menos un dominio o motivo de una proteína Delta3, es decir, un dominio o motivo seleccionado del grupo formado por un péptido señal, un dominio con similitud delta (DSL), repetición 1 similar al Factor de Crecimiento Epidérmico (FCE), repetición 2 similar al FCE, repetición 3 similar al FCE, repetición 4 similar al FCE, repetición 5 similar al FCE, repetición 6 similar al FCE, repetición 7 similar al FCE, y repetición 8 similar al FCE, un dominio de transmembrana (DT), y un dominio citoplasmático. Otros ácidos nucleicos preferidos codifican proteínas Delta3 proteínas solubles, por ej. proteínas Delta3 que comprenden por lo menos una porción del dominio extracelular de una proteína Delta3. Estos polipéptidos solubles pueden o no comprender un péptido señal. Incluso los ácidos nucleicos más preferidos codifican proteínas de fusión formadas por proteínas Delta3 y un péptido heterólogo, por ej., una región constante de inmunoglobulina.

La invención provee, además, sondas y cebadores que comprenden oligonucleótidos sustancialmente purificados, que corresponden a una región de la secuencia de nucleótidos que se hibrida a por lo menos aproximadamente 6 nucleótidos consecutivos de las secuencias indicadas como SEC ID Nos: 1 o 3 o los complementos de las secuencias indicadas como SEC ID Nos 1 o 3, o sus mutantes naturales. En realizaciones preferidas, la sonda/el cebador incluye además un grupo rotulador adherido a éste/a, que es capaz de detectarse.

Para la expresión, los ácidos nucleicos Delta3 de la invención pueden incluir una secuencia reguladora de transcripción, por ej. por lo menos uno de un promotor de transcripción (por ej., para expresión consecutiva o expresión inducible) o secuencia potenciadora de la transcripción, la secuencia reguladora está ligada en forma funcional a la secuencia del gen Delta3. Dichas secuencias reguladoras con moléculas de ácido nucleico Delta3 pueden ser útiles en vectores para expresión génica. Esta invención también describe células huésped transfectadas con dichos vectores de expresión ya sea procariotas o eucariotas, también métodos in vitro (por ej. cultivo celular) e in vivo (por ej. transgénico) para producir proteínas Delta3 empleando dichos vectores de expresión.

En otro aspecto, la invención presenta polipéptidos Delta3 aislados, con preferencia preparaciones sustancialmente puras, por ej. de polipéptidos Delta3 purificados con plasma o producidos de manera recombinante. En realizaciones preferidas, los polipéptidos de la invención son capaces de modular una actividad de un polipéptido Delta3, por ej., crecimiento celular y/o diferenciación o inducción de apoptosis. En realizaciones preferidas, los polipéptidos Delta3 de la invención pueden modular la neurogénesis (por ej. inhibiendo que las células que expresan a Notch desencadenen en un destino neural). Además, los polipéptidos Delta3 que antagonizan específicamente la actividad de un polipéptido Delta3 nativo, tal como pueden proveerse truncando mutantes o otros mutantes negativos dominantes, también se proveen específicamente aquí.

En una realización, el polipéptido es idéntico o sustancialmente similar a una proteína Delta3 representada en la SEC ID No. 2. Con preferencia, un polipéptido Delta3 tiene una secuencia de aminoácidos, que es, por lo menos, aproximadamente 50%, 60%, 70%, con preferencia por lo menos aproximadamente 80%, con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 90%, e incluso con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 95% homóloga o idéntica al polipéptido representado por la SEC ID No. 2. En una realización preferida, el polipéptido Delta3 es codificado por un ácido nucleico que se hibrida con una secuencia de ácido nucleico representada en una de las SEC ID Nos. 1 o 3 o con el ácido nucleico incluido en el plásmido que tiene No. de Acceso al ATCC 98348. Las proteínas Delta3 de la invención, incluyen además proteínas modificadas, que son resistentes a la modificación luego de la transcripción, como por ejemplo, debido a mutaciones que alteran sitios de modificación (tales como residuos de tirosina, treonina, serina o asparagina), o que evitan la glucosilación de la proteína, o que evitan la interacción de la proteína con proteínas intracelulares implicadas en la transducción de señales.

El polipéptido Delta3 puede comprender una proteína de longitud completa, tal como se representa en la SEC ID No. 2, o puede comprender un fragmento correspondiente a uno o más motivos/dominios particulares, o a tamaños arbitrarios, por ej., por lo menos 5, 10, 25, 50, 100. 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 o 650 aminoácidos de longitud.

Otro aspecto de la invención caracteriza moléculas quiméricas (por ej. proteínas de fusión) formadas por una proteína Delta3. Por ejemplo, la proteína Delta3 puede proporcionarse como proteína de fusión recombinante que incluye una segunda porción del polipéptido, por ej., un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos no relacionada (heteróloga) con el polipéptido Delta3, (por ej. la segunda porción del polipéptido es glutationa-S-transferasa, una actividad enzimática tal como fosfatasa alcalina o un marcador de epítope).

Las proteínas de fusión preferidas son las proteínas de fusión Delta3-inmunoglobulina (Delta3-Ig). Por ejemplo, una proteína de fusión Delta3 puede comprender la porción extracelular de la proteína Delta3 fusionada a la región constante de una molécula de inmunoglobulina. Las porciones extracelulares preferidas comprenden por lo menos un dominio seleccionado del grupo formado por un péptido señal, un dominio de DSL y las ocho repeticiones similares al FCE de una proteína Delta3. Un dominio extracelular incluso más preferido comprende una secuencia de aminoácidos desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 529 de la SEC ID No. 2. Incluso las otras proteínas de fusión Delta3 preferidas comprenden una porción de una proteína Delta3 que es suficiente para unirse a una segunda proteína, por ej., una proteína Notch.

Incluso otro aspecto de la presente invención se refiere a un inmunógeno que comprende un polipéptido Delta3 en una preparación inmunogénica, el inmunógeno es capaz de generar una respuesta inmune específica para un polipéptido Delta3, por ej. una respuesta humoral, una respuesta de anticuerpo y/o respuesta celular. En realizaciones preferidas, el inmunógeno comprende un determinante antigénico; por ej. un determinante único de la proteína representada por la SEC ID No. 2.

Incluso en otro aspecto de la presente invención caracteriza anticuerpos y preparaciones de anticuerpos específicamente reactivas con un epítope de la proteína Delta3. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se une específicamente a un epítope representado en la SEC ID No 2.

Incluso en otro aspecto, la invención provee ensayos, por ej., para explorar compuestos experimentales para identificar agonistas, o alternativamente, antagonistas, de una bioactividad. Por ejemplo, el compuesto de prueba puede influir positiva o negativamente sobre una interacción entre una proteína Delta3 y una molécula blanco de Delta3, por ejemplo una proteína Notch. Un método ejemplificativo incluye los pasos de (i) combinar un polipéptido Delta3 o uno de sus fragmentos bioactivos, una molécula blanco Delta3, por ej., Notch, y un compuesto de prueba, por ej., en condiciones en las cuales, aunque para el compuesto experimental, la proteína Delta3 y la molécula blanco son capaces de interactuar; y (ii) detectar la formación de un complejo que incluye la proteína Delta3 y la molécula blanco ya sea por cuantificación directa del complejo, o por medición de efectos inductivos de la proteína Delta3, o, en el caso de un sustrato, la medición de la conversión en el producto. Un cambio estadísticamente significativo, tal como una reducción, en la interacción de la molécula Delta3 y la molécula blanco en presencia de un compuesto experimental (relativo a lo que se detecta en ausencia del compuesto de prueba) es indicativo de una modulación (por ej., la supresión de la interacción entre la proteína Delta3 y la molécula blanco).

La invención provee incluso otros métodos para identificar compuestos que modulan una actividad Delta. Por ejemplo, un Compuesto que interactúa con una proteína Delta3 puede identificarse contactando una proteína Delta3 con un compuesto de prueba. Tanto el compuesto de prueba o la proteína Delta3 pueden rotularse y/o unirse en forma opcional a un soporte de fase sólida. La unión del compuesto de prueba con la proteína Delta3 puede determinarse, entonces, midiendo la cantidad de etiqueta. Dicha molécula que se une a Delta3 puede ser un agonista o un antagonista. En una realización, un agonista de una actividad de Delta3 se identifica por contacto de una célula que tiene una proteína Delta3 con un compuesto de prueba y la medición de una actividad de Delta3, por ej., expresión de un gen que está regulado por la unión de una proteína, por ej., una proteína Notch, a Delta3. Una expresión aumentada del gen cuando se incuba la célula con el compuesto de prueba relativo a la incubación en ausencia del compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba es un agonista de Delta3. El gen que se monitorea puede ser, también un gen indicador transfectado a una célula, el gen indicador se encuentra bajo control de un promotor de un gen que está regulado por Delta3.

Incluso otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para tratar enfermedades o afecciones causadas o contribuidas por una actividad aberrante de Delta3, por ej. proliferación, degeneración o diferenciación celular aberrante en un sujeto, administrando al sujeto una cantidad efectiva de un agonista o antagonista de una actividad de Delta3. En una realización, un agonista o antagonista puede modular los niveles de proteína Delta, por ej., modulando la expresión de un gen Delta3. Por ejemplo, la administración de un producto terapéutico formado por un agonista de Delta3 puede ser útil para promover la regeneración de tejidos o la reparación necesaria para tratar en forma efectiva una lesión a un nervio, una enfermedad neurodegenerativa o un trastorno del desarrollo neurológico. Alternativamente, puede administrarse un antagonista de Delta3 para tratar efectivamente una enfermedad neoplásica o hiperplásica, en particular de tejido endotelial.

La invención provee, además, métodos para tratar enfermedades o afecciones asociadas con uno o más alelos Delta específicos, por ej. alelo mutante, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un compuesto terapéutico. En una realización, el compuesto terapéutico es capaz de compensar el efecto del alelo específico de Delta. En otra realización, el compuesto terapéutico es capaz de modular una actividad de Delta3. En una realización preferida, el alelo Delta es un alelo Delta3.

Un aspecto adicional de la presente invención provee un método para determinar si un sujeto presenta riesgo de desarrollar una enfermedad o afección, que es causada por o a la que contribuye una actividad aberrante de Delta3, por ej. proliferación, degeneración o diferenciación celular aberrante. El método incluye detectar, en un tejido del sujeto, la presencia o ausencia de una lesión genética caracterizada por, por lo menos, una de (i) una mutación de un gen que codifica una proteína Delta3, por ej. representada por una de las SEC ID Nos: 1 o 3 o uno de sus homólogos o (ii) la expresión errónea de un gen Delta3. En realizaciones preferidas, la detección de la lesión genética incluye asegurar la existencia de por lo menos uno de los siguientes: una eliminación de uno o más nucleótidos de un gen Delta3; una incorporación de uno o más nucleótidos al gen, una sustitución de uno o más nucleótidos del gen, un reordenamiento cromosómico general del gen, una alteración en el nivel de una transcripción de ARN mensajero del gen; la presencia de un patrón de empalme del tipo no salvaje de una transcripción de ARN mensajero del gen; y/o un nivel del tipo no salvaje de la proteína.

Por ejemplo, detectar la lesión genética o determinar la identidad de un alelo Delta, por ej., un alelo Delta3, pueden incluir (i) proveer una sonda/cebador formado por un oligonucleótido que se hibrida a una secuencia homosentido o antisentido de un gen Delta3 o sus mutantes naturales o secuencias que flanquean la región 5' o 3' asociadas naturalmente con el gen Delta3; (ii) poner en contacto la sonda/el cebador con una muestra que contiene el ácido nucleico apropiado; y (iii) detectar, por hibridación de la sonda/el cebador al ácido nucleico, la presencia o ausencia de la lesión genética; por ej. donde el paso de detectar la lesión comprende utilizar la sonda/el cebador para determinar la secuencia de nucleótidos del gen Delta3 y, opcionalmente, de las secuencias de ácido nucleico flanqueantes. Por ejemplo, el cebador puede emplearse en una reacción de la cadena de polimerasa (PCR) o en una reacción de la cadena de ligación (LCK) y el producto de amplificación puede analizarse para determinar la presencia de una lesión.

En otro método de diagnóstico de la invención, por lo menos una porción de un gen Delta3 de un sujeto se secuencia y la secuencia de nucleótidos se compara con la de un gen Delta3 del tipo salvaje; para determinar la presencia de una lesión genética. Otro método de diagnóstico preferido de la invención es un polimorfismo de conformación de hebra simple (SSCP) que detecta diferencias en la movilidad electroforética entre ácidos nucleicos mutantes y de tipo salvaje.

En realizaciones alternativas, los métodos de diagnóstico comprenden determinar nivel de una proteína Delta3 en un inmunoensayo usando un anticuerpo que es específicamente inmunorreactivo con una proteína Delta3 del tipo salvaje o mutante.

Otras características y ventajas de la invención resultarán obvias a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.

3. Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una secuencia de ADN del gen Delta3 humano incluyendo secuencias no codificadoras 5' y 3' (SEC ID No 1), como también la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína Delta3 humana (SEC ID No: 2). Se indican los diversos dominios de la proteína.

La Figura 2 muestra una alineación de secuencia múltiple de la proteína novedosa Delta3 humana (h-Delta3) (SEC ID No: 2) con la proteína Delta1 de ratón (m-Delta1) (SEC ID No: 4), la proteína Delta1 de rata (r-Delta1) (SEC ID No 5), la proteína Delta1 parcial humana (WO 97/01571) (SEC ID No 6), la proteína Delta1 de Xenopus (x-Delta1) (SEC ID No 7), la proteína Delta1 del pollo (c-Delta1) (SEC ID No 8), la proteína Delta1 del pez cebra (z-Delta1) (SEC ID No 9), la proteína Delta2 de Xenopus (x-delta2) (SEC ID No 10) y la proteína Delta1 de Drosophila (d-Delta1) (SEC ID No 11). Se indican la conservación de la similitud con el dominio Delta3 (DSL), las repeticiones similares al factor de crecimiento epidérmico (FCE) y el dominio transmembrana (TM). Se indica en la Tabla el No. de Acceso al GenBank de cada una de estas proteínas Delta (con excepción de la secuencia humana parcial, que no se encuentra en el GenBank).

La Figura 3 muestra un árbol filogénico que indica la relación de hDelta3 con la proteína Delta1 parcial humana (WO 97/01571), la proteína Delta1 de ratón (m-Delta1), la proteína Delta1 de rata (r-Delta1), la proteína Delta1 de Xenopus (x-Delta1), la proteína Delta1 del pollo (c-Delta1), la proteína Delta2 de Xenopus (x-delta2), la proteína Delta1 del pez cebra (z-Delta1), y la proteína Delta1 de Drosophila (d-Delta1). Se indica en la Tabla el No. de Acceso al GenBank de cada una de estas proteínas Delta (con excepción de la secuencia humana parcial, que no se encuentra en el GenBank).

4. Descripción detallada de la invención 4.1 General

La presente invención se basa por lo menos en parte en el descubrimiento de un novedoso gen que codifica una proteína Delta humana, a la cual nos referimos aquí como polipéptido "hDelta3". Un hDelta3 ejemplificativo se ha depositado en el American Type Culture Collection (ATCC) el 5 de marzo de 1997 y se le ha asignado el número de acceso al ATCC 98348. El gen Delta 3 humano se ubica en el cromosoma humano 15.

La Figura 1 muestra la secuencia de ADN del gen Delta3 humano incluyendo secuencias no codificadoras 5' y 3' (SEC ID No. 1), la secuencia codificadora (SEC ID No. 3), como también la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína Delta3 humana (SEC ID No. 2).

Delta3 humana se expresa en células endoteliales y de hecho se clonó a partir de una biblioteca de células endoteliales microvasculares humanas. El análisis de Northern blot de ARN preparado a partir de una cantidad de tejidos humanos diferentes, indica que una transcripción de ARNm de Delta3 de 3,5kb se encuentra presente en cerebro, pulmón, hígado y riñón fetales, y corazón, placenta, pulmón; músculo esquelético, riñón, páncreas, bazo, timo, próstata, testículos, ovario, intestino delgado y colon adultos. También se detectaron niveles bajos de ARNm de ARNm en cerebro adulto e hígado adulto. Sin embargo, no se detectó ARNm de Delta3 en leucocitos de sangre periférica. Estos resultados indican que Delta3 se expresa en un modo específico del tejido. Además, se encontró que la expresión en células endoteliales MV humanas estaba regulada hacia arriba (aproximadamente 2-3 veces) en células que se habían estimulado con ciertos factores de crecimiento (por ej. factor del crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) o factor del crecimiento endotelial vascular (VFCE)). Además, la fuerte expresión de Delta3 humana se observó en la línea celular de carcinoma colo-rectal, SW480. Además, la expresión de hDelta3 ha demostrado ser inducida en respuesta a la proliferación y señales de diferenciación (Ver Ejemplos). De este modo, el gen hDelta3 es un gen cuya expresión en una célula cambia con el estado proliferativo y/o de diferenciación.

Como se anticipa a partir de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico que codifica hDelta3, el polinucleótido hDelta3 de longitud completa comprende 685 aminoácidos y es similar en su secuencia y estructura a las proteínas Delta obtenidas de otros organismos (Ver Figura 2 y discutida a continuación). Un análisis de la secuencia de aminoácidos de la proteína Delta3 humana predice que la proteína comprende por lo menos los siguientes dominios estructurales: un péptido señal, correspondiente a aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 17 de SEC ID No. 2, un motivo de Similitud Delta (DSL) correspondiente a aproximadamente el aminoácido 173 hasta aproximadamente el aminoácido 217 de la SEC ID NO: 2 (Figura 2), ocho repeticiones similares al factor de crecimiento epidérmico (FCE) que corresponden en esencia a las secuencias indicadas en la Figura 2, un dominio de transmembrana correspondiente a aproximadamente el aminoácido 530 hasta aproximadamente el aminoácido 553 de SEC ID No. 2 (Figura 2), y un dominio citoplasmático correspondiente desde aproximadamente el aminoácido 554 hasta aproximadamente el aminoácido 685 de SEC ID No. 2 (Figura 2). En consecuencia, la secuencia de aminoácidos de hDelta3 predice que la proteína es una proteína de transmembrana que tiene un dominio extracelular correspondiente a aproximadamente el aminoácido 1 o el aminoácido 18 hasta aproximadamente el aminoácido 529 de SEC ID No. 2 (Figura 2) que comprende el motivo de DSL y las repeticiones similares a FCE, un dominio de transmembrana y un dominio citoplasmático. Es posible que el péptido señal comprenda más de 17 aminoácidos de SEC ID No. 2, ya que la región del aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 20 forman una región hidrofóbica.

Es posible que también existan formas solubles de la proteína. Dichas formas solubles pueden surgir a través del empalme variable del gen Delta3 o en forma alternativa como resultado de proteólisis de una isoforma de la membrana. De hecho, una variante de empalme de una proteína Delta del pollo se ha descrito en la Solicitud PCT/US96/11178 que tiene No. de Publicación WO 97/01571. Además, el polipéptido tipo Delta humano Dlk es una proteína soluble (Jansen et al. [1994] Eur. J. Biochem. 225:83.92).

La proteína Delta3 humana es similar en estructura y en secuencia a las proteínas Delta identificadas en Drosophila, Xenopus, pez cebra, pollo, rata, ratón y humanos. Una alineación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas Delta conocidas hasta la fecha se muestra en la Figura 2. Esta alineación contiene las siguientes proteínas Delta, codificadas por genes para los cuales los Nos. de Acceso al GenBank se muestran en la Tabla I: una proteína Delta1 de ratón (m-Delta1), proteína Delta1 de la rata (r-Delta1), una proteína Delta-1 humana (h-Delta1), una proteína Delta1 de Xenopus (x-Delta1), una proteína Delta1 de pollo (c-Delta1), una proteína Delta1 de pez cebra (z-Delta1), una segunda proteína Delta de Xenopus (x-delta2), la proteína Delta3 humana (h-delta3), y una proteína Delta1 de Drosophila (d-Delta1). La secuencia de aminoácidos de h-Delta1 es la secuencia de aminoácidos publicada en la solicitud de PCT WO 97/01571 que es incompleta y contiene numerosos errores, como se indica en la memoria descriptiva. Dado que la alineación de la secuencia de aminoácidos se ha realizado usando el programa de computadoras pileup (Paquete GCG), el orden de las secuencias de aminoácidos en la figura refleja la homología entre las diferentes proteínas Delta. En consecuencia, la proteína Drosophila, que corresponde a la secuencia de la base en la alineación está muy distante de otras proteínas Delta. De este modo, la Figura 2 muestra que hDelta3, que se enumera segundo a último en la Figura 2, es la segunda a la proteína Delta más distante de la proteína Delta previamente identificada de ratón, rata, humana, Xenopus, pez cebra, y pollo. En consecuencia, la proteína hDelta3 es significativamente diferente de la proteína Delta humana descrita con anterioridad, como también las proteínas Delta de otras especies. Es interesante notar que la proteína hDelta3 tiene una secuencia de aminoácidos que es equidistante de ambas proteínas Xenopus, es decir, Delta1 y Delta2, lo que indica que hDelta3 no corresponde con ninguna de las proteínas Delta de Xenopus. Por lo tanto, el polipéptido recientemente aislado se ha denominado hDelta3 y las proteínas Delta previamente identificadas de ratón, rata, humano, pez cebra, y Xenopus se denominan proteínas Delta1 aquí y las dos proteínas de Xenopus se denominan proteínas Delta1 y Delta2. La diferencia entre la proteína hDelta3 las proteínas Delta previamente aisladas también pueden visualizarse comparando la homología porcentual o identidad entre hDelta3 y las proteínas Delta1 y Delta2 previamente identificadas por un lado (Tabla I), y la homología porcentual o identidad de una proteína Delta1 con las otras proteínas Delta1 y Delta2 (Tabla II).

TABLA I

	No. de Acceso al	% de Identidad	% de similitud
	GenBank
Delta1 humana		50	66
Delta1 de ratón	X80903	53	70
Delta1 de rata	U78889	54	70
Delta1 de pollo	U26590	52	68
Delta1 de Xenopus	L42229	51	68
Delta1 de pez cebra	Y11760	48	67
Delta2 de Xenopus	U70843	47	65
Delta1 de Drosophila	AA142228	40	58
similar a delta (dlk)	U15979	33	55

La Tabla II indica el porcentaje de similitud e identidad entre la Delta1 humana revelada en la solicitud de PCT PCT/US96/11178 (Publicación No. WO 97/01571) y proteínas Delta1 no humanas. Dado que la secuencia de aminoácidos de la proteína Delta1 humana que se revela en esta solicitud de PCT es incompleta, el porcentaje de similitud e identidad se determinó usando una porción de la secuencia de aminoácidos Delta1 humana que parece más confiable. La porción de la secuencia de aminoácidos usada corresponde a los aminoácidos 214-370 de la secuencia de aminoácidos Delta1 humana que se muestran en la Figura 14A de la solicitud de PCT.

TABLA II Porcentaje de similitud entre Delta1 y las diferentes proteínas Delta1 o Delta2 no humanas

	No. de Acceso	% de identidad	% de similitud
	al GenBank
Delta1 humana		100	100
Delta1 de ratón	X80903	86	95
Delta1 de rata	U78889	88	94
Delta1 de pollo	U26590	85	89
Delta1 de Xenopus	L42229	78	84
Delta1 de pez cebra	YI1760	69	80
Delta2 de Xenopus	U70843	57	70
Delta1 de Drosophila	AA142228	45	62
tipo hDelta (dlk)	U15979	37	55

En consecuencia, la Tabla I indica que hDelta3 solo es aproximadamente 66% similar a la proteína Delta1 humana; aproximadamente 70% similar a la proteína Delta1 de ratón; aproximadamente 70% similar a la proteína Delta1 de rata; aproximadamente 68% similar a la proteína Delta1 del pollo; aproximadamente 68% similar a la proteína Delta1 de Xenopus, aproximadamente 70% similar a la proteína Delta2 de Xenopus y aproximadamente 58% similar a la proteína Delta1 de Drosophila. Sin embargo, como se muestra en la Tabla II, la proteína Delta1 humana es muy similar a la proteína Delta1 de ratón, rata, pollo, Xenopus, pez cebra, y Drosophila y las proteínas Delta2 de Xenopus. Además, las proteínas Delta1 de ratón y rata son aproximadamente 95% similares. De este modo, la secuencia de aminoácidos de las proteínas Delta1 comparten más homología entre sí que con la proteína Delta3 humana de la invención, lo que indica que existen por lo menos dos familias de proteínas Delta.

La diferencia entre la proteína hDelta3 recientemente aislada y las proteínas Delta1 y proteínas Delta2 previamente identificadas también pueden observarse creando un árbol filogénico usando el programa para computadoras Growtree Phylogram (Paquete GCG). El resultado de este análisis, que se muestra en la Figura 3, indican que h-Delta3 está en una "rama" diferente en el árbol filogénico de las otras proteínas Delta, confirmando de este modo que la proteína hDelta3 está más distante de las otras proteínas Delta1 y Delta2 de lo que están distantes entre sí. De acuerdo con el análisis, y como se anticipa a partir de la alineación de la secuencia, sólo la Proteína Delta de Drosophila está relacionada en forma más distante con relación a las proteínas Delta previamente identificadas de ratón, rata, Xenopus, pollo, pez cebra y humanas que hDelta3. De este modo, la proteína hDelta3 recientemente aislada es un miembro de una sub-especie diferente de la familia de las proteínas Delta.

A pesar de que cada especie animal probablemente tenga por lo menos dos o tres miembros (por ej. Delta1, Delta2, y DeIta3), puede observarse a partir de la Figura 2, que la región DSL, las ocho repeticiones de FCE y el TM parecen estar altamente conservados en su totalidad. Sin embargo, como se observa en la Figura 2, estos dominios de la proteína hDelta3 difieren más de los dominios correspondientes en otras proteínas Delta que los correspondientes dominios en las otras Delta difieren entre sí.

La región o motivo de DSL es compartido por todos los miembros conocidos de la familia de ligandos supuestos de las proteínas tipo Notch (Delta1 y Serrate en Drosophila; Lag-2 y Apx-1 en Caenorhabditis elegans) (Headerson et al. (1994) Development 1202913; Tax et al. (1994) Nature 368:150; Fleming et al. (1990) Genes Dev. 4:2188; Thomas et al. (1991) Development 10749; Mello et al. (1994) Cell 77:95). El motivo de DSL está ubicado en la porción terminal amino de la proteína que está estrechamente relacionado con un dominio similar en la proteína Delta1 de Drosophila y que se ha descrito como necesario y suficiente para una unión in vitro a Notch (Henrique et al. (1995) Nature 375:787; Muskavitch (1994) Dev. Biol. 166:415).

Además, como se menciona en el Ejemplo, 5.5., Delta3 se ha localizado en el cromosoma humano 15 en una región cercana a los marcadores de marco D15S1244 y D159144. Es interesante notar que la región en el cromosoma 15 que está flanqueada por los marcadores D15S1040 y D15S118 ha demostrado estar genéticamente ligada con la enfermedad llamada Agénesis del Cuerpo Calloso con Neuropatía Periférica (ACCNP) (Casaubon et al., referencia anterior). Ningún gen específico se ha vinculado hasta ahora a esta enfermedad.

En consecuencia, ciertos aspectos de la presente invención se relacionan con las proteínas Delta3, moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas Delta3, anticuerpos inmuno-reactivos con las proteínas Delta3, y preparaciones de dichas composiciones. Además, se proveen ensayos de descubrimiento de fármacos para identificar agentes que modulan la función biológica de las proteínas Delta, por ej., proteínas Delta3, tales como la unión a Delta3 o alterando la interacción de Delta3 con elementos tanto descendentes como ascendentes en la vía de transducción de señal Delta/Notch, por ej. alterando la interacción entre la proteína Delta3 y una proteína de unión a Delta3. Dichos agentes pueden ser útiles desde el punto de vista terapéutico, por ejemplo, para altera el crecimiento celular y/o diferenciación o inducción de apoptosis. Más aun, la presente invención provee ensayos de diagnóstico y terapéuticos y reactivos para detectar y tratar trastornos que implican una actividad aberrante de Delta3, por ejemplo, expresión aberrante (o una pérdida de ésta) del gen Delta3 o que están asociados con un alelo específico de Delta, por ej.,. un alelo de Delta3. Otros aspectos de la invención se describen a continuación o resultarán obvios para una persona con experiencia en la técnica en vista de la presente descripción.

4.2 Definiciones

Por conveniencia, a continuación se provee el significado de ciertos términos y frases empleados en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones anexas.

El término "alelo", que se usa aquí en forma indistinta con "variante alélica" se refiere a formas alternativas de un gen o sus porciones. Los alelos ocupan el mismo lugar o posición en cromosomas homólogos. Cuando un sujeto tiene dos alelos idénticos de un gen, se dice que el sujeto es homócigo para el gen o alelo. Cuando un sujeto tiene dos alelos diferentes de un gen, se dice que el sujeto es heterócigo para el gen. Los alelos de un gen específico pueden diferir entre sí en un nucleótido único, o varios nucleótidos, y pueden incluir sustituciones, eliminaciones, y inserciones de nucleótidos. Un alelo de un gen también puede ser una forma de un gen que contiene una mutación.

El término "variante alélica de una región polimórfica de un gen Delta" se refiere a una región de un gen Delta que tiene una de varias secuencias de nucleótidos encontradas en esa región del gen en otros individuos.

El término "agonista", como se usa aquí, pretende referirse a un agente que regula hacia arriba (por ej. potencia o suplementa) una bioactividad de Delta3. Un agonista de Delta3 puede ser un compuesto que regula hacia arriba la expresión de un gen Delta3. En forma alternativa, un agonista de Delta3 puede ser un compuesto que aumenta la señalización de una proteína Delta3, por ej., un compuesto unido a Delta3, tal como una forma estimulante de una proteína toporítmica o una molécula pequeña. Un agonista de Delta3 también puede ser un compuesto que modula la expresión o actividad de una proteína que está ubicada hacia abajo de Delta3 o que interactúa con Delta3.

"Antagonista" como se usa aquí pretende referirse a un agente que regula hacia abajo (por ej. suprime o inhibe) una bioactividad Delta3. Un antagonista de Delta3 puede ser un compuesto que regula hacia abajo la expresión de un gen Delta3. En forma alternativa, el antagonista de Delta3 puede ser un compuesto que reduce la señalización de una proteína Delta3, por ej., un compuesto que se une a Delta3 tal como una forma inhibidora de la proteína toporrítmica, o una molécula pequeña. Un antagonista preferido de Delta3 inhibe la interacción entre una proteína Delta3 y otra molécula, por ej. una proteína toporrítmica. Un antagonista de Delta3 también puede ser un compuesto que modula la expresión o actividad de una proteína que está ubicada hacia abajo de Delta3 o que interactúa con Delta3.

"Actividad biológica", usada en forma indistinta con los términos "bioactividad" o "actividad" para los fines de la invención se refiere a un efector o función antigénica que es realizada directa o indirectamente por un polipéptido Delta3 (ya sea en su conformación nativa o desnaturalizada), o por cualquier sub-secuencia de éstos. Las funciones efectoras incluyen unión o activación del receptor, inducción de diferenciación, actividad mitogénica o promotora del crecimiento, inducción de apoptosis, transducción de señales, modulación inmune, funciones reguladoras de ADN y similares, ya sea actualmente conocidos o inherentes. Funciones antigénicas incluyen posesión de un epítope o sitio antigénico que es capaz de reaccionar en forma cruzada con anticuerpos generados contra un polipéptido Delta3 natural o desnaturalizado o sus fragmentos. En consecuencia, la actividad biológica de una proteína Delta3 puede ser unirse a un receptor, tal como Notch. Una actividad biológica de una proteína Delta3 puede ser también la modulación de la proliferación y/o diferenciación celular, o muerte celular en una célula blanco que tiene un receptor apropiado. Una célula blanco puede ser, por ej., una célula neural, una célula endotelial, o una célula cancerosa.

Los polipéptidos Delta3 biológicamente activos incluyen polipéptidos que tienen una función tanto efectora como antigénica, o sólo una de dichas funciones. Delta3 incluye polipéptidos antagonistas y Delta3 nativa, siempre que dichos antagonistas incluyan un epítope de una Delta3 nativa o antagonicen una actividad biológica de Delta3 nativa.

El término "actividad aberrante de Delta3" o "actividad anormal de Delta3" pretende abarcar una actividad de Delta3 que difiere de la misma actividad de Delta3 en un sujeto sano. Una actividad aberrante de Delta3 puede ser el resultado, por ej., de una mutación en la proteína, que produce, por ej., una menor o mayor afinidad de unión a un receptor. Una actividad aberrante de Delta3 también puede provenir de un nivel menor o mayor de Delta3 en las células, que pueden generarse, por ej., de la transcripción aberrante, empalme o traducción del gen Delta3. Por ejemplo, una actividad aberrante de Delta3 puede generarse de una actividad promotora anormal. Una actividad aberrante de Delta3 también puede generarse de una señalización aberrante a través del dominio citoplasmático de la proteína Delta3, tal que, por ej., se traduce una señal aberrante. La señalización aberrante puede generarse de una mutación en el dominio citoplasmático de Delta3 o, en forma alternativa, del contacto con una proteína citoplasmática anormal. Una actividad aberrante de Delta3 también puede generarse a partir del contacto de una proteína Delta3 con un receptor aberrante, por ej. una proteína Notch anormal.

"Células,""células huésped" o "células huésped recombinantes" son términos usados aquí en forma indistinta. Se entiende que dichos términos no solo se refieren a la célula sujeto particular sino a la progenie o potencial progenie de dicha célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones posteriores en cualquier mutación o influencias en el medio ambiente, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula original, aunque aún se incluye dentro del alcance del término como se usa aquí.

Una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" es una fusión de una primera secuencia de aminoácidos que codifica uno de los polipéptidos Delta3 de la invención con una segunda secuencia de aminoácidos que define un dominio (por ej. porción de polipéptido) extraña a y no sustancialmente homóloga con cualquier dominio de una de las proteínas Delta3. Una proteína quimérica puede presentar un dominio extraño que se encuentra (aunque en una proteína diferente) en un organismo que también expresa la primera proteína, o puede ser una fusión "interespecies", "intergénica", por ej. de estructuras de proteínas expresadas por diferentes clases de organismos. En general, una proteína de fusión puede estar representada por la fórmula general X- Delta3-Y, donde Delta3 representa una porción de la proteína que deriva de una de las proteínas Delta3, y X e Y están independientemente ausentes o representan secuencias de aminoácidos que no están relacionadas con una de las secuencias Delta3 en un organismo, incluyendo mutantes naturales. Una proteína de fusión Delta3 preferida es una proteína de fusión Delta3-Ig.

Secuencias "complementarias" como se usa aquí se refieren a secuencias que tienen suficiente complementariedad para ser capaces de hibridarse, formando un dúplex estable.

Un "complejo de administración" significará un medio de orientación (por ej. una molécula que produce una mayor unión por afinidad de un gen, proteína, polipéptido o péptido a la superficie de una célula blanco y/o mayor captación celular por una célula blanco). Los ejemplos de medios de orientación incluyen: esteroles (por ej. colesterol), lípidos (por ej. un lípido catiónico, virosoma, o liposoma), virus (por ej. adenovirus, virus adeno-asociado, y retrovirus) o agentes de unión específicos de una célula blanco (por ej. ligandos reconocidos por receptores específicos de la célula blanco). Los complejos preferidos son lo suficientemente estables in vivo para evitar la falta de acoplamiento significativa antes de la internalización por la célula blanco. Sin embargo, el complejo es susceptible de escindirse en condiciones apropiadas dentro de la célula de modo tal que el gen, la proteína, el polipéptido o el péptido se libere en forma funcional.

Como se sabe, los genes para un polipéptido particular pueden existir en una única o en múltiples copias dentro del genoma de un individuo. Dichos genes duplicados pueden ser idénticos o pueden tener ciertas modificaciones, incluyendo sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos, que incluso codifican los polipéptidos que tienen sustancialmente la misma actividad. El término "Secuencia de ADN que codifica un polipéptido Delta3" puede referirse de este modo a uno o más genes dentro de un individuo particular. Más aún, ciertas diferencias en las secuencias de nucleótidos pueden existir entre organismos individuales, que se llaman alelos. Dichas diferencias alélicas pueden o no generar diferencias en la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado que incluso codifica una proteína con la misma actividad biológica.

El término "producto terapéutico que contiene Delta3" se refiere a varias composiciones de polipéptidos Delta3, como también peptidomiméticos, moléculas pequeñas y ácidos nucleicos que son capaces de imitar o potenciar (actuar como agonistas) o inhibir (antagonizar) los efectos de una proteína Delta3 natural. Un producto terapéutico que contiene Delta3 que imita o potencia la actividad de una proteína Delta3 del tipo salvaje es un "agonista de Delta3". Por el contrario, un producto terapéutico que contiene Delta3 que inhibe la actividad de una proteína Delta3 del tipo salvaje es un "antagonista de Delta3".

Los términos "Polipéptido Delta3" y " Proteína Delta3" pretenden abarcar polipéptidos Delta3 que tienen por lo menos una actividad biológica, es decir, antagonizan por lo menos una actividad biológica de un polipéptido Delta3 nativo.

Como se usa aquí, el término "gen" o "gen recombinante", aplicado a Delta3, se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende un marco abierto de lectura que codifica uno de los polipéptidos Delta3 de la presente invención, incluyendo tanto secuencias de axones y (opcionalmente) secuencias de intrones. Un "gen Delta3 recombinante" se refiere a ácido nucleico que codifica un polipéptido Delta3 y que comprende secuencias de axones que codifican a Delta, aunque opcionalmente puede incluir secuencias que derivan de un gen Delta3 cromosómico o de un gen cromosómico no relacionado. Los genes recombinantes ejemplificativos que codifican los polipéptidos Delta3 de la invención están representados en el Listado de Secuencias anexo. El término "intrón" se refiere a una secuencia de ADN presente en un gen Delta3 determinado que no se traduce en proteína y generalmente se encuentra entre
exones.

El término "estado de crecimiento" de una célula se refiere al estado proliferativo de una célula como también a su estado de diferenciación. En consecuencia, el término se refiere a la fase del ciclo de la célula en el cual la célula es, por ej., G0, G1, G2, profase, metafase, o telofase, como también a su estado de diferenciación, por ej. no diferenciada, parcialmente diferenciada o totalmente diferenciada. Sin intentar poner un límite, la diferenciación de una célula usualmente va acompañada de una reducción en el índice proliferativo de una célula.

"Homología" o "identidad" o "similitud" se refiere a la similitud de secuencias entre dos péptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. La homología puede determinarse comparando una posición en cada respuesta que pueda alinearse para fines comparativos. Cuando una posición en la secuencia está ocupada por la misma base o aminoácido, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Un grado de homología o similitud o identidad entre secuencias de ácido nucleico es una función del número de nucleótidos idénticos o equivalentes compartidos por las secuencias de ácido nucleico. Un grado de identidad de las secuencias de aminoácidos es una función del número de aminoácidos idénticos en las posiciones compartidas por las secuencias de aminoácidos. Un grado de identidad de las secuencias de aminoácidos es una función del número de aminoácidos conservados en las posiciones compartidas por las secuencias de aminoácidos. Una secuencia que es "no relacionada" o "no homóloga" con una de las secuencias hDelta3 de la presente invención es una secuencia que comparte menos del 40% de identidad, aunque con preferencia menos del 25% de identidad con una de las secuencias hDelta3 de la presente invención.

El término "interactuar" como se usa aquí, pretende incluir interacciones detectables entre moléculas, tales como pueden detectarse usando, por ejemplo, un ensayo de dos híbridos de levadura. El término interactuar también pretende incluir interacciones de "unión" entre moléculas. Las interacciones pueden ser proteína-proteína, proteína-ácido nucleico, proteína-molécula pequeña o ácido nucleico-molécula pequeña en la naturaleza.

El término "aislado" como se usa aquí con respecto a ácidos nucleicos, tales como ARN o ARN, se refiere a moléculas separadas de otros ADN o ARN respectivamente, que están presentes en la fuente natural de la macromolécula. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado que codifica uno de los polipéptidos Delta3 de la invención incluye, con preferencia, no más de 10 kilobases (kb) de la secuencia de ácido nucleico que inmediatamente flanquea en forma natural el gen Delta3 en el ADN genómico; con mayor preferencia, no más de 5 kb de dichas secuencias flanqueantes naturales, y con mayor preferencia, no más de 1 kb de dichas secuencias flanqueantes naturales. El término aislado, como se usa aquí, también se refiere a un péptido o ácido nucleico que sustancialmente no contiene material celular, material viral, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetizan por medios químicos. Más aun, un "ácido nucleico aislado" pretende incluir fragmentos de ácido nucleico no naturales como fragmentos y que no se encontrarían en estado natural. El término "aislado" también se usa aquí con referencia a péptidos que se encuentran en forma aislada de otras proteínas celulares y pretende abarcar polipéptidos tanto purificados como recombinantes.

El término "modulación" como se usa aquí, se refiere a la regulación por aumento, es decir estimulación, y la regulación por disminución, es decir supresión, de una respuesta.

El término "gen mutado" se refiere a una forma alélica de un gen, que es capaz de alterar el fenotipo de un sujeto que tiene un gen mutado con relación a un sujeto que no tiene el gen mutado. Si un sujeto debe ser homócigo para que esta modulación tenga un fenotipo alterado, se dice que la mutación es recesiva. Si una copia del gen mutado es suficiente para alterar el genotipo del sujeto, se dice que la mutación es dominante. Si un sujeto tiene una copia del gen mutado y tiene un fenotipo que es intermedio entre el de un sujeto homócigo y el de un sujeto heterócigo (para ese gen), se dice que la mutación es co-dominante.

Los "animales no humanos" de la invención incluyen mamíferos tal como roedores, primates no humanos, ovejas, perro, vaca, pollos, anfibios, reptiles, etc. Los animales no humanos preferidos se seleccionan de la familia de roedores, incluyendo rata y ratón, con la mayor preferencia ratón, aunque los anfibios transgénicos, tales como miembros del género Xenopus, y pollos transgénicos, también pueden brindar herramientas importantes para comprender e identificar agentes que pueden afectar, por ejemplo, la embriogénesis y la formación de tejidos. El término "animal quimérico " se usa aquí para referirse a animales en los cuales se encuentra el gen recombinante, o en los cuales el gen recombinante se expresa en algunas aunque no en todas las células del animal. El término "animal quimérico específico de los tejidos " indica que uno de los genes Delta3 recombinantes se encuentran presentes y/o expresados o interrumpidos en algunos tejidos aunque no en otros.

Como se usa aquí, el término "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos tales como ácido desoxiribonucleico (ADN), y, donde corresponda, ácido ribonucleico (ARN). Debe comprenderse que el término también incluye, como equivalentes, análogos tanto de ARN o ARN que surgen de análogos nucleotídicos, y, como se aplica a la realización descrita, polinucleótidos de hebra simple (sentido o antisentido) y de doble hebra.

El término "polimorfismo" se refiere a la coexistencia de más de una forma de un gen o porción de éste. Una porción de un gen del cual hay por lo menos dos formas diferentes, es decir, dos secuencias de nucleótidos diferentes, se denominan "región polimórfica de un gen". Una región polimórfica puede ser un nucleótido simple, cuya identidad difiere en alelos diferentes. Una región polimórfica también puede tener una longitud de varios nucleótidos.

Un "gen polimórfico" se refiere a un gen que tiene por lo menos una región polimórfica.

Los términos "proteína", "polipéptido" y "péptido" se usan aquí de manera indistinta cuando se refieren a un producto génico.

El término "proteína recombinante" se refiere a un polipéptido de la presente invención que es producido por técnicas de ARN recombinante, en las cuales en general, el ARN que codifica un polipéptido Delta3 se inserta en un vector de expresión apropiado que a su vez se usa para transformar una célula huésped para producir la proteína heteróloga. Más aún, la frase "derivado de", con respecto a un gen Delta3 recombinante, pretende incluir dentro del significado de "proteína recombinante" aquellas proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos de una proteína Delta nativa, o una secuencia de aminoácidos similar a ésta que se genera por mutaciones que incluyen sustituciones y eliminaciones (incluyendo truncamiento) de una forma natural de la proteína.

Como se usa aquí, el término "se hibrida específicamente" o "detecta específicamente" se refiere a la capacidad de una molécula de ácido nucleico de la invención de hibridarse a por lo menos aproximadamente 6, 12, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 300, 350, 400 o 425 nucleótidos consecutivos de un gen Delta3 de un vertebrado, con preferencia mamífero, tal como una secuencia Delta3 designada en una de las SEC ID Nos: 1 o 3, o una secuencia complementaria a ésta, o sus mutantes naturales tal que muestre más de 10 veces más hibridación, con preferencia más de 100 veces más hibridación, e incluso con mayor preferencia más de 100 veces más hibridación de lo que lo hace un ácido nucleico celular (por ej., ARNm o ADN genómico) que codifica una proteína distinta de un vertebrado, con preferencia proteína Delta3 como se define aquí.

Como se usa aquí, el término "promotor específico de tejido" se refiere a una secuencia de ADN que sirve como promotor, es decir, regula la expresión de una secuencia de ADN seleccionada ligada de manera funcional al promotor, y que efectúa la expresión de la secuencia de ADN seleccionada en células específicas de un tejido, tales como células de origen hepático o pancreático, células neuronales, o células inmunes. El término también cubre los denominados "de filtración", que regulan la expresión de un ADN seleccionado principalmente en un tejido, aunque provocan la expresión en otros tejidos también.

"Secuencia reguladora de la transcripción" es un término genérico usado en toda la memoria descriptiva para referirse a secuencias de ADN, tales como señales de inicio, potenciadores y promotores, que inducen o controlan la transcripción de secuencias que codifican las proteínas con las cuales están ligadas de manera funcional. En realizaciones preferidas, la transcripción de uno de los genes Delta3 recombinantes se encuentra bajo el control de una secuencia promotora (u otra secuencia reguladora de la transcripción) que controla la expresión del gen recombinante en un tipo de célula en la cual se busca la expresión. También se entenderá que el gen recombinante puede estar bajo el control de secuencias reguladoras de la transcripción que son iguales o que son diferentes de aquellas secuencias que controlan la transcripción de las formas naturales de proteínas Delta3.

Como se usa aquí, el término "transfección" significa la introducción de un ácido nucleico, por ej., un vector de expresión, en una célula receptora por transferencia génica mediada por ácido nucleico. "Transformación", como se usa aquí, se refiere a un proceso en el cual el genotipo de una célula se cambia como resultado de la captación celular de ADN o ARN exógeno, y, por ejemplo, la célula transformada expresa una forma recombinante de un polipéptido Delta3 o, en el caso de la expresión antisentido del gen transferido, la expresión de una forma natural de la proteína Delta está interrumpida.

Como se usa aquí, el término "transgén" se refiere a una secuencia de ácido nucleico (que codifica por ej., uno de los polipéptidos Delta3, o una transcripción antisentido de ésta), que es parcial o completamente heteróloga, es decir, extraña, al animal transgénico o célula en los cuales se introduce, o, es homóloga a un gen endógeno del animal o célula transgénicos en los cuales se introduce, aunque está diseñado para ser insertado, o se inserta en el genoma del animal de modo tal que se altera el gen de la célula en la cual se inserta (por ej., se inserta en una ubicación que difiere de la del gen natural o su inserción produce un knockout). Un transgen puede incluir una o más secuencias reguladoras de la transcripción y cualquier otro ácido nucleico, tal como intrones, que puedan ser necesarios para la expresión óptima de un ácido nucleico seleccionado.

Como se usa aquí, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha ligado. Un tipo de vector preferido es un episoma, es decir, un ácido nucleico capaz de replicación extracromosómica. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación autónoma y expresión de ácidos nucleicos a los cuales están ligados. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están ligados operativamente se denominan aquí "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante se encuentran, con preferencia, en la forma de "plásmidos" que en general se refieren a bucles de ADN de doble hebra circulares que, en su forma de vector, no se unen al cromosoma. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se usan en forma indistinta ya que el plásmido es la forma de vector usada más comúnmente. Sin embargo, la invención pretende incluir dichas otras formas de vectores de expresión que tienen funciones equivalentes y que se conocerán en la técnica posterior a éste.

El término "tratar" como se usa aquí pretende abarcar curar como también atenuar por lo menos un síntoma de la afección o la enfermedad.

4.3 Ácidos nucleicos de la presente invención

Como se describirá a continuación, un aspecto de la invención se refiere a ácidos nucleicos aislados que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos Delta3, y/o equivalentes de dichos polipéptidos o ácidos nucleicos. El término equivalente busca incluir las secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos Delta3 funcionalmente equivalentes o péptidos funcionalmente equivalentes que tienen una actividad de una proteína Delta3 tal como se describe aquí. Las secuencias de nucleótidos equivalentes incluirán secuencias que difieren en una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos, tales como variantes alélicas; y, por lo tanto, incluirán secuencias que difieren de la secuencia de nucleótidos del gen Delta3 que se muestra en cualquiera de las SEC ID Nos: 1 o 3 debido a la degeneración del código genético.

Los ácidos nucleicos Delta3 preferidos codifican polipéptidos que son por lo menos 55% idénticos o similares a una secuencia de aminoácidos de la SEC ID No. 2. Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que son por lo menos aproximadamente 70%, e incluso con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, o 98% idénticos o similares con una secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID No: 2 también se encuentran dentro del alcance de la invención. En una realización particularmente preferida, el ácido nucleico de la presente invención codifica un polipéptido que tiene una homología o identidad general con la secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 98%, o por lo menos aproximadamente 99% con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID No: 2. En una realización preferida, el ácido nucleico codifica una proteína que comprende el aminoácido que se menciona en la SEC ID No. 2. Con preferencia, el ácido nucleico incluye la totalidad o una porción de la secuencia de nucleótidos correspondiente a la región codificadora de la SEC ID Nos: 1 o 3.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden codificar una proteína Delta3 de cualquier especie, incluyendo insectos. Los ácidos nucleicos preferidos codifican proteínas Delta3 de vertebrados. Los ácidos nucleicos incluso más preferidos codifican proteínas Delta3 de primates incluyendo proteínas Delta3 de mamífero, por ej., proteínas Delta3 humanas. Otros ácidos nucleicos de la invención pueden codificar proteínas Delta3 de aves, equinos, caninos, felinos, bovinos o porcinos.

En una realización preferida de la invención, el ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende un dominio extracelular de Delta3 , por ej., Delta3 que tiene SEC ID No. 2. En consecuencia, los ácidos nucleicos preferidos codifican un polipéptido que comprende aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 529 o la SEC ID No. 2. Otros ácidos nucleicos preferidos codifican un polipéptido correspondiente a un dominio extracelular de Delta3 que esencialmente carece del péptido señal, por ej., un polipéptido que comprende aproximadamente el aminoácido 18 hasta aproximadamente el aminoácido 529 de la SEC ID No. 2. Incluso otros ácidos nucleicos preferidos codifican un polipéptido que comprende por lo menos uno de los motivos conservados en el dominio extracelular de Delta3, por ej., un motivo DSL o un motivo tipo FCE tal como aquellos que se muestran en la Figura 2 (SEC ID No. 2). En una realización, el ácido nucleico codifica una proteína que tienen por lo menos un motivo tipo FCE. En otras realizaciones, el ácido nucleico codifica proteínas que tienen por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6, por lo menos 7, o 8 repeticiones tipo FCE, tal como aquellas que se muestran en la Figura 2 (SEC ID No.2). El polipéptido codificado por un ácido nucleico que codifica cualquiera de estos números de repeticiones tipo FCE puede comprender además una secuencia de aminoácidos que codifica un motivo DSL.

Los polipéptidos codificados por cualquiera de los ácidos nucleicos descritos anteriormente pueden ser solubles. Los péptidos solubles preferidos comprenden por lo menos una porción del dominio extracelular de una proteína Delta3. Los polipéptidos solubles incluso más preferidos comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 529 de la SEC ID No. 2 o sus homólogos. Incluso otros polipéptidos Delta3 solubles preferidos comprenden por lo menos una repetición tipo FCE. Dichos polipéptidos pueden, además, comprender un dominio DSL y opcionalmente un péptido señal.

Los ácidos nucleicos incluso más preferidos codifican un polipéptido Delta3 que es una proteína de fusión. Una proteína de fusión preferida es una proteína de fusión Delta3-Ig. Dichas proteínas de fusión pueden comprender por lo menos una porción del dominio extracelular de un dominio Delta3. Una porción puede ser cualquier porción de por lo menos aproximadamente 10 aminoácidos, tal como las porciones descritas con anterioridad. Los ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas de fusión pueden prepararse como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5.434.131.

En forma alternativa, los polipéptidos codificados por el ácido nucleico de la invención pueden unirse a la membrana. Los polipéptidos unidos a la membrana de la invención con preferencia comprenden un dominio transmembrana. El dominio transmembrana puede ser de una proteína Delta3, tal como un dominio transmembrana que comprende aproximadamente desde el aminoácido 530 hasta aproximadamente el aminoácido 553 de la SEC ID No. 2, que se muestra en la Figura 2. En forma alternativa, el dominio transmembrana puede ser de otra proteína de membrana, tal como para producir una proteína Delta3 de membrana quimérica. Incluso otros polipéptidos de la invención pueden ser proteínas intracelulares. En consecuencia, también se encuentran dentro del alcance de la invención las proteínas que no comprenden un dominio transmembrana. Otras proteínas de la invención no incluyen un dominio extracelular. Las proteínas adicionales de la invención no incluyen un dominio extracelular ni un dominio de transmembrana.

Los polipéptidos codificados por el ácido nucleico de la invención pueden comprender un dominio citoplasmático. En una realización preferida, un ácido nucleico de la invención codifica un polipéptido que comprende un dominio citoplásmico Delta3. En una realización incluso más preferida, el dominio citoplasmático tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia desde aproximadamente el aminoácido 554 hasta aproximadamente el aminoácido 685 de la SEC ID No. 2 (Figura 2), o una de sus porciones.

Incluso en otras realizaciones preferidas, el ácido nucleico de la invención codifica un polipéptido que comprende por lo menos un dominio de una proteína Delta3 seleccionado del grupo formado por un péptido señal, un motivo DSL una repetición tipo FCE, un dominio de transmembrana, y un dominio citoplasmático. El polipéptido de la invención puede comprender varios de estos dominios de una proteína Delta3. En forma alternativa, un polipéptido de la invención puede ser una proteína quimérica, es decir, que comprende varios de estos dominios conservados, por lo menos algunos de los cuales derivan de una proteína distinga de una proteína Delta3. En consecuencia, en una realización, un ácido nucleico de la invención codifica un polipéptido que tienen un motivo DSL que tiene una secuencia de aminoácidos de una proteína Delta3 distinta de Delta3 . Dicha secuencia de aminoácidos puede ser cualquier secuencia que se muestra en la Figura 2 como un motivo DSL. Incluso en otra realización, el ácido nucleico codifica una proteína Delta3 que tiene un péptido señal de una proteína distinta de una proteína Delta3. Se incluyen además dentro del alcance de la invención ácidos nucleicos que codifican un polipéptido Delta3 que tiene un dominio citoplasmático de una proteína distinta de una proteína Delta3 y ácidos nucleicos que codifican un dominio citoplásmico Delta3 y un dominio extracelular de una proteína distinta de una proteína Delta3. Las proteínas distintas de las proteínas Delta3 pueden ser, por ej., proteínas toporrítmicas. "Proteínas toporrítmicas" pretenden incluir Notch, Delta, Serrate, Potenciador de Split, Deltex, y otros miembros de esta familia de proteínas que comparten similitudes estructurales. (Ver por ej. las Solicitudes de Patente Internacional Nos. WO 97/01571; WO 92/19734 y WO 92/19734 y WO 94/07474, referencia anterior).

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es homóloga a cualquiera de las porciones descritas con anterioridad de la SEC ID No. 2 también se encuentran dentro del alcance de la invención. Los ácidos nucleicos preferidos de la invención codifican polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que es, por lo menos, aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, o por lo menos aproximadamente 85% homóloga o idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los dominios Delta3 que se muestran en la Figura 2. Los ácidos nucleicos aun más preferidos de la invención codifican polipéptidos que comprende una secuencia de aminoácidos que es, por lo menos, aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 98%, o por lo menos aproximadamente 99% homóloga o idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los dominios Delta3 que se muestran en la Figura 2.

En una realización, el ácido nucleico, por ej. ADNc, codifica un péptido que tienen por lo menos una bioactividad del presente polipéptido Delta3, tal como la capacidad de unirse a un receptor de Delta3, por ej. Notch. Las proteínas o péptidos capaces de interactuar con una proteína Delta3 o sus fragmentos pueden identificarse por varios métodos, por ej. métodos en base a ensayos de unión. Por ejemplo, varios tipos de bibliotecas de expresión pueden explorarse con una proteína Delta3 o una de sus porciones. Un sistema de 2 híbridos puede usarse para aislar proteínas citoplasmáticas que interactúan con el dominio citoplasmático de Delta3. Las porciones de proteínas Delta3 que son capaces de interactuar con un ligando pueden determinarse preparando fragmentos de proteínas Delta3 y explorar estos fragmentos para determinar aquellos que son capaces de interactuar con el ligando. En base por lo menos en parte a la observación de que la porción N-terminal de la proteína Delta de Drosophila, que contiene un dominio de DSL y dominio del tipo FCE, es necesaria y suficiente para la unión in vitro a Notch (Henrique et al, referencia anterior, Muskavitch et al., referencia anterior), es probable que el dominio de las proteínas Delta3 capaz de interactuar con un ligando incluya el dominio DSL y/o por lo menos una porción del dominio del tipo FCE. Sin embargo, otras porciones del dominio extracelular de Delta3 podrían ser necesarias para unirse a por lo menos algunos ligandos Delta3.

En otras realizaciones preferidas, el sujeto polipéptido Delta3 puede modular la proliferación y/o diferenciación o muerte celular de células blanco específicas, por ej. células neurales o células endoteliales. Los ensayos para determinar que un polipéptido Delta3 tiene por lo menos una bioactividad de una proteína Delta3 se describen más adelante.

Incluso otros ácidos nucleicos preferidos de la presente invención codifican un polipéptido Delta3 que incluye una secuencia de polipéptidos correspondiente a la totalidad o una porción de residuos de aminoácidos de la SEC ID NO: 2, por ej. por lo menos 2, 5, 10, 25, 50, 100, 150 o 200 residuos de aminoácidos de esa región. Los ácidos nucleicos preferidos codifican un polipéptido que comprende por lo menos dos residuos consecutivos de aminoácidos de aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 570 de la secuencia de aminoácidos que se menciona en la SEC ID No. 2. Incluso otros ácidos nucleicos preferidos codifican un polipéptido que comprende por lo menos aproximadamente 3, por lo menos aproximadamente 5, por lo menos aproximadamente 10, por lo menos aproximadamente 15, por lo menos aproximadamente 20, o por lo menos aproximadamente 25 aminoácidos consecutivos de aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 575 que se expone en la SEC ID No. 2. La invención provee, además, ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que tienen una secuencia de aminoácidos que es, por lo menos, aproximadamente 70%, con preferencia por lo menos aproximadamente 80%, y con la mayor preferencia por lo menos aproximadamente 90% a por lo menos aproximadamente 10 aminoácidos consecutivos que se menciona en la SEC ID No. 2, o por lo menos aproximadamente 10 aminoácidos consecutivos de una porción de la SEC ID No. 2. En una realización, la porción corresponde a aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 575 de la SEC ID No. 2. La codificación de moléculas de ácido nucleico de la invención con preferencia comprende por lo menos aproximadamente 200, 250, 300, 350, 400, 410, 420, 430, 435 o 440 pares de bases.

La invención se refiere además a moléculas de ácido nucleico para usar como sondas/cebador o moléculas antisentido (es decir moléculas de ácido nucleico no codificadoras), que pueden comprender por lo menos aproximadamente 6, 12, 20, 30, 50, 100, 125, 150 o 200 nucleótidos o pares de bases. Incluso otros ácidos nucleicos preferidos de la invención comprenden por lo menos aproximadamente 300, por lo menos aproximadamente 350, por lo menos aproximadamente 400, por lo menos aproximadamente 450, por lo menos aproximadamente 500, o por lo menos aproximadamente 600 nucleótidos de la SEC ID No. 1 o 3. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de la invención corresponden a una porción 5' de la secuencia de ácido nucleico SEC ID No. 1. Por ejemplo, un ácido nucleico de la invención can corresponden a una porción de aproximadamente el nucleótido 1 hasta aproximadamente el nucleótido 2000 de la secuencia de ácido nucleico SEC ID No. 1.

Los ácidos nucleicos preferidos para usar como sonda de acuerdo con los métodos de la invención incluyen ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que tienen por lo menos aproximadamente 6, con preferencia por lo menos aproximadamente 9, con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 12 e incluso con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos consecutivos de la SEC ID No. 1 o de una de sus porciones. En una realización preferida, la porción corresponde a aproximadamente el nucleótido 1 hasta aproximadamente el nucleótido 2060 de la SEC ID No. 1. En forma alternativa una porción puede ser una secuencia de nucleótidos que codifica un motivo conservado de la proteína hDelta3. En forma alternativa, la porción puede ser una secuencia de nucleótidos ubicada entre las secuencias de ácido nucleico que codifican motivos conservados de proteína hDelta3.

La invención provee, además, una combinación de por lo menos dos ácidos nucleicos correspondiente a por lo menos una porción de la SEC ID No. 1 o uno de sus homólogos. En consecuencia, en una realización, la invención provee una combinación de dos ácidos nucleicos de por lo menos aproximadamente 6, con preferencia por lo menos aproximadamente 9, con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 12 e incluso con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos consecutivos de la SEC ID No. 1 o de una de sus porciones. En una realización preferida, por lo menos uno de los ácidos nucleicos está marcado.

Otro aspecto de la invención provee un ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas a un ácido nucleico representado por una de las SEC ID Nos: 1 o 3. Las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación de ADN, por ejemplo, 6,0 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido de un lavado de 2,0 x SSC a 50°C, son conocidas por aquellas personas con experiencia en la técnica o pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración de sales en el paso de lavado puede seleccionarse a partir de una rigurosidad baja de aproximadamente 2,0 x SSC a 50°C hasta una rigurosidad alta de aproximadamente 0,2 x SSC a 50°C o a 65°C. Además, la temperatura en el paso de lavado puede aumentarse desde condiciones de rigurosidad baja a temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, hasta condiciones de rigurosidad alta a aproximadamente 65°C. Tanto la temperatura como las sales pueden variarse o la temperatura o la concentración de sales pueden mantenerse constantes mientras que se cambian otras variables. En una realización preferida, un ácido nucleico conservador de la presente invención se unirá a una de las SEC ID Nos 1 o 3 en condiciones moderadamente rigurosas, por ejemplo a aproximadamente 2,0 x SSC y aproximadamente 40°C. En una realización particularmente preferida, un ácido nucleico Delta3 de la presente invención se unirá a una de las SEC ID Nos: 1 o 3 en condiciones de rigurosidad alta.

Los ácidos nucleicos preferidos tienen una secuencia por lo menos aproximadamente 75% homóloga y con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 80% e incluso con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 85% homóloga con una secuencia de ácido nucleico de un gen Delta3, tal como gen Delta3 humano, por ej., tal como una secuencia que se muestran en una de las SEC ID Nos: 1 y 3. Los ácidos nucleicos por lo menos aproximadamente 90%, con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 95%, y con la mayor preferencia por lo menos aproximadamente 98-99% homóloga con una secuencia de ácidos nucleicos representada en una de las SEC ID Nos: 1 y 3 se encuentran por supuesto también dentro del alcance de la invención. En realizaciones preferidas, el ácido nucleico es un gen Delta3 humano y en realizaciones particularmente preferidas, incluye la totalidad o una porción de la secuencia de nucleótidos correspondiente a la región codificadora de una de las SEC ID Nos: 1 o 3.

Los ácidos nucleicos que tienen una secuencia que difiere de las secuencias de nucleótidos que se muestran en una de las SEC ID Nos: 1 o 3 debido una degeneración en el código genético también se encuentran dentro del alcance de la invención. Dichos ácidos nucleicos codifican péptidos funcionalmente equivalentes (es decir, un péptido que tienen una actividad biológica de un polipéptido Delta3) pero difieren en su secuencia de la secuencia que se muestra en el listado de secuencias debido a la degeneración del código genético. Por ejemplo, una cantidad de aminoácidos son designados por más de un triplete. Los codones que especifican el mismo aminoácido o los sinónimos (por ejemplo, CAU y CAC cada uno codifican histidina) pueden producir mutaciones "silenciosas" que no afectan la secuencia de aminoácidos de un polipéptido Delta3. Sin embargo, se espera que existan polimorfismos de la secuencia de ADN que sí conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos Delta3 de la invención. Una persona con experiencia en la técnica apreciará que estas variaciones en uno o más nucleótidos (por ej., hasta aproximadamente 3-5% de los nucleótidos) de los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen una actividad de un polipéptido Delta3 pueden existir entre los individuos de una especie determinada debido a una variación alélica natural.

Como se indica en los ejemplos que se exponen más adelente, los ácidos nucleicos que codifican la proteína Delta3 pueden obtenerse del ARNm presente en cualquiera de una cantidad de células eucariotas. También debe ser posible obtener ácidos nucleicos que codifican polipéptidos Delta3 de la presente invención del ADN genómico tanto de adultos como embriones. Por ejemplo, un gen que codifica una proteína Delta3 puede clonarse a partir de un ADNc o una biblioteca genómica de acuerdo con protocolos descritos aquí, como también aquellos generalmente conocidos para personas con experiencia en la técnica. Ejemplos de tejidos y/o bibliotecas apropiadas para aislamiento de ácidos nucleicos de la invención incluyen bibliotecas celulares endoteliales. Un ADNc que codifica una proteína Delta3 puede obtenerse aislando ARNm total de una célula, por ej. una célula de vertebrado, una célula de mamíferos, o una célula humana, incluyendo células embrionarias. Los ADNc de doble hebra pueden prepararse entonces a partir del ARNm total, y posteriormente insertarse en un plásmido apropiado o vector de bacteriofago usando cualquiera de una cantidad de técnicas conocidas. El gen que codifica una proteína Delta3 también puede clonarse usando técnicas establecidas de reacción en cadena de la polimerasa de acuerdo con la información de la secuencia de nucleótidos provista por la invención. El ácido nucleico de la invención pueden ser ADN o ARN. Un ácido nucleico preferido es un ADNc representado por una secuencia seleccionada del grupo formado por las SEC ID Nos: 1 y 3.

4.3.1 Vectores

Esta invención provee, además, vectores de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido Delta3, ligado en forma funcional a por lo menos una secuencia reguladora de la transcripción. "Ligado en forma funcional" pretende significar que la secuencia de nucleótidos está ligada a una secuencia reguladora de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos. Las secuencias reguladoras están reconocidas en la técnica y se seleccionan para dirigir la expresión de las proteínas Delta3 de la invención. En consecuencia, el término "secuencia reguladora de transcripción" incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión. Dichas secuencias reguladoras se describen en Goeddel; Gene Expression Technology: Methodos in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). En una realización, el vector de expresión incluye un gen recombinante que codifica un péptido que tienen una actividad agonista de un polipéptido Delta3 de la invención, o en forma alternativa, que codifica un péptido que es una forma antagonista de la proteína Delta3. Dichos vectores de expresión pueden usarse para transfectar células y producir de este modo polipéptidos, incluyendo proteínas de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe aquí. Más aún, las construcciones génicas de la presente invención también pueden usarse como parte de un protocolo de terapia génica para administrar ácidos nucleicos que codifican tanto una forma agonística como antagonística de una de las proteínas Delta3 de la invención. De este modo, otro aspecto de la invención caracteriza vectores de expresión para transfección y expresión in vivo o in vitro de un polipéptido Delta3 en particular tipos de células para reconstituir la función de, o en forma alternativa, abrogar la función de la señalización de Delta en un tejido. Esto podría desearse, por ejemplo, cuando la forma natural de la proteína se expresa en forma errónea; o para aplicar una forma de la proteína que altera la diferenciación de tejidos. Los vectores de expresión también pueden emplearse para inhibir la transformación neoplásica.

Además de los métodos de transferencia viral, tales como aquellos ilustrados con anterioridad, los métodos no virales también pueden emplearse para provocar la expresión de un polipéptido Delta3 de la invención en el tejido de un animal. La mayoría de los métodos no virales de transferencia génica se basan en mecanismos normales usados por las células de mamífero para la captación y transporte intracelular de macromoléculas. En realizaciones preferidas, los medios blanco no virales de la presente invención se basan en vías endocíticas para la captación del gen del polipéptido Delta3 de la invención por la célula buscada. Los medios de determinar blancos ejemplificativos de este tipo incluyen sistemas derivados de liposomas, conjugados de polilisina, y envolturas virales artificiales.

4.3.2. Sondas y Cebadores

Más aun, las secuencias de nucleótidos determinadas a partir de la clonación de los genes hDelta3 permitirán además la generación de sondas y cebadores diseñados para usar en la identificación y/o clonación de homólogos Delta3 en otros tipos de células, por ej. de otros tejidos, como también homólogos de Delta3 de otros organismos de mamíferos. Las sondas y los cebadores de la invención también pueden usarse para determinar la identidad de un alelo Delta y/o la presencia o ausencia de una o más mutaciones en un gen Delta3 de un sujeto. En una realización preferida, una sonda o un cebador de la invención pueden usarse para determinar si un sujeto tiene o presenta un riesgo de desarrollar una enfermedad o afección asociada con un alelo Delta3 específico, tal como un alelo que transporta una mutación.

En una realización preferida, la presente invención provee, además, una sonda/un cebador que comprende un oligonucleótido sustancialmente purificado, oligonucleótido que comprende una región de la secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas a por lo menos aproximadamente 12, con preferencia aproximadamente 25, con mayor preferencia aproximadamente 40, 50 o 75 nucleótidos consecutivos de secuencia homosentido o anti-sentido seleccionada del grupo formado por la SEC ID NO: 1 y 3, o sus mutantes naturales. Por ejemplo, los cebadores en base al ácido nucleico representado en las SEC ID Nos: 1 y 3 pueden usarse en reacciones por PCR para clonar homólogos Delta3, por ej. alelos específicos Delta3. Dichos cebadores se seleccionan con preferencia en una región que no comparte homología significativa con otros genes, por ej., otros genes Delta. Los cebadores preferidos de la invención se describen como SEC ID Nos. 4-8 expuestos a continuación:

Cebadores de extremo 5'

5' AGCGCCTCTGGCTGGGCGCT 3' (SEC ID No. 12; correspondiente a los nucleótidos 356 a 375 de la SEC ID No. 1);

5' CGGCCAGAGGCCTTGCCACC 3' (SEC ID No. 13; correspondiente a los nucleótidos 725 a 744 de la SEC ID No.1);

\vskip1.000000\baselineskip

Cebadores de extremo 3'

5' TTGCGCTCCCGGCTGGAGCC 3' (SEC ID No. 14; correspondiente al complemento de los nucleótidos 1460 a 1479 de la SEC ID No. 1); y

5' ATGCGGCTTGGACCTCGGTT 3' (SEC ID No. 15; correspondiente al complemento de los nucleótidos 1592 a 2611 de la SEC ID No. 1).

Del mismo modo, las sondas en base a las presentes secuencias Delta3 pueden usarse para detectar transcripciones o secuencias genómicas que codifican las mismas proteínas u otras homólogas. En realizaciones preferidas, la sonda comprende, además, un grupo marcador unido a ésta y capaz de detectarse, por ej. el grupo marcador se selecciona de entre radioisótopos, compuestos fluorescentes, enzimas, y co-factores enzimáticos.

Como se trata con mayor detalle a continuación, dichas sondas también pueden usarse como parte de un kit de evaluación diagnóstica para identificar células o un tejido que expresan en forma equívoca una proteína Delta3, tal como midiendo el nivel de un ácido nucleico que codifica a Delta en una muestra de células de un paciente; por ej. detectar niveles de ARNm de Delta3 o determinar si un gen genómico Delta3 se ha mutado o suprimido. En síntesis, pueden generarse sondas de nucleótidos a partir de los genes Delta3 de la invención que facilitan la exploración histológica de tejido intacto y muestras de tejido para determinar la presencia (o ausencia) de transcripciones que codifican a Delta. En forma similar a los usos diagnósticos de los anticuerpos anti-Delta3, el uso de sondas dirigidas a los mensajes de Delta3, o a secuencias genómicas Delta3, pueden usarse tanto para la evaluación predictiva como terapéutica de mutaciones alélicas que pudieran manifestarse en, por ejemplo, trastornos neoplásicos o hiperplásicos (por ej. crecimiento celular no deseado) o diferenciación anormal de tejido. Usado en conjunción con immunoensayos como se describe aquí, las sondas de oligonucleótidos pueden facilitar la determinación de la base molecular para un trastorno en el desarrollo que puede implicar cierta anormalidad asociada con la expresión (o carencia de ésta) de una proteína Delta3. Por ejemplo, la variación en la síntesis de polipéptidos puede diferenciarse de una mutación en una secuencia codificadora.

Se incluyen además dentro del alcance de la invención kits para determinar si un sujeto presenta riesgo de desarrollar una enfermedad o afección causada por o a la que contribuye una bioactividad aberrante de Delta3 y/o que está asociada con uno o más alelos Delta3 específicos. En una realización preferida, el kit puede usarse para determinar si un sujeto presenta riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno neurológico, por ej., una neuropatía periférica, por ej., ACCNP.

4.3.3. Técnicas Antisentido, con Ribozimas y Tríplex

Un aspecto de la invención se refiere al uso del ácido nucleico aislado en terapia "antisentido". Como se usa aquí, terapia "antisentido" se refiere a administración o generación in situ de moléculas de oligonucleótidos o sus derivados que se hibridan específicamente (por ej. se unen) en condiciones celulares, con el ARNm celular y/o ADN genómico que codifica una o más de las proteínas Delta3 de la invención para inhibir expresión de esa proteína, por ej. inhibiendo la transcripción y/o traducción. La unión puede ser por complementariedad de pares de bases convencional, o, por ejemplo, en el caso de la unión a dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en la grieta mayor de la doble hélice. En general, terapia "antisentido" se refiere al rango de técnicas generalmente empleadas en la técnica, e incluye cualquier terapia que se base que se basa en la unión específica a secuencias de oligonucleótidos.

Una construcción antisentido de la presente invención puede administrarse, por ejemplo, como plásmido de expresión que, cuando se transcribe en la célula, produce ARN que es complementario a por lo menos una porción única del ARNm celular que codifica una proteína Delta3. En forma alternativa, la construcción antisentido es una sonda de oligonucleótidos que se genera ex vivo y la cual, cuando se introduce en la célula, produce inhibición de expresión por hibridación con el ARNm y/o secuencias genómicas de un gen Delta3. Dichas sondas de oligonucleótidos son con preferencia oliginucleótidos modificados que son resistentes a nucleasas endógenas, por ej. exonucleasas y/o endonucleasas, y son por lo tanto estables in vivo. Las de ácido nucleico ejemplificativas para usar como oligonucleótidos antisentido son análogos de ADN de fosforamidato, fosfotioato y metilfosfonato (ver también Patentes de los Estados Unidos 5.176.996; 5.264.564; y 5.256.775). En forma adicional, se han revisado métodos generales para construir oligómeros útiles en la terapia antisentido, por ejemplo, en el texto de Van der Krol et al. (1988) Biotechniques 6: 958-976; y Stein et al. (1988) Cancer Res 48:2659-2668. Con respecto al ADN antisentido, se prefieren oligodesoxiribonucleótidos derivados del sitio de inicio de la traducción, por ej., entre las regiones -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos Delta3 de interés. Las moléculas antisentido particularmente preferidas se muestran a continuación:

5' TGCCGCCATCCCTCGGGGCGT 3' (SEC ID NO.16) (complemento para los nucleótidos 326-346 de la SEC ID NO: 1)

5' GGACGCTGCCGCCATCCCCT 3' (SEC ID NO: 17) (complemento para los nucleótidos 333-352 de la SEC ID NO: 1)

5' GGACGCTGCCGCCATCCCCTCGGGGCGT 3' (SEC ID NO: 18) (complemento para los nucleótidos 326-352 de la SEC ID NO: 1)

Los enfoques antisentido implican el diseño de oligonucleótidos (ya sea de ADN o ARN) que son complementarios al ARNm de Delta3 Los oligonucleótidos antisentido se unirán a las transcripciones de ARNm de Delta3 y evitarán la traducción. Aunque se prefiere, la complementariedad absoluta no es necesaria. Una "complementariedad" con la secuencia a una porción de un RNA, como se denomina aquí, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad para ser capaz de hibridarse con RNA, formando un dúplex estable; en el caso de ácidos nucleicos antisentido de doble hebra, puede evaluarse de este modo una hebra individual del dúplex de ARN, o puede evaluarse la formación de tríplex. La capacidad de hibridación dependerá tanto en el grado de complementariedad como en la longitud del ácido nucleico antisentido. Generalmente, cuanto más largo es el ácido nucleico que se hibrida, mayor cantidad de errores de bases tendrá con un ARN que pueda contener y aun formar un dúplex estable (o tríplex, según sea el caso). Una persona con experiencia en la técnica puede asegurar un grado tolerable de error con el uso de procedimientos estándar para determinar el punto de fusión del complejo hibridado.

Los oligonucleótidos que son complementarios al extremo 5' del mensaje, por ej., la secuencia no traducida 5' hasta el codón de inicio AUG inclusive, deberían funcionar con la mayor eficiencia en la inhibición de la traducción. Sin embargo, se ha demostrado recientemente que las secuencias complementarias a las secuencias 3' no traducidas ARNm son efectivas en la inhibición también de los ARNm. (Wagner, R. 1994. Nature 372:333). Por lo tanto, los oligonucleótidos complementarios a cualquiera de las regiones no codificadoras, no traducidas 5' o 3' de un gen Delta3 podrían usarse en un método antisentido para inhibir la traducción de ARNm endógeno de Delta3. Los oligonucleótidos complementarios a la región no traducida 5' del ARNm deben incluir el complemento del codón de inicio AUG. Los oligonucleótidos antisentidos complementarios a las regiones codificadoras de ARNm son inhibidores menos eficientes de traducción pero podrían usarse de acuerdo con la invención. Ya sea si se diseñan para hibridarse a la región codificadora de 5', 3' o la región codificadora de ARNm de Delta3, los ácidos nucleicos antisentido deben tener por lo menos seis nucleótidos de longitud, y son con preferencia oligonucleótidos con un rango de desde 6 hasta aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido tiene por lo menos 10 nucleótidos, por lo menos 17 nucleótidos, por lo menos 25 nucleótidos, o por lo menos 50 nucleótidos.

Sin importar la elección de la secuencia blanco, se prefiere que primero se realicen estudios in vitro para cuantificar la capacidad del oligonucleótido antisentido para inhibir la expresión del gen. Se prefiere que estos estudios utilicen controles que distingan entre inhibición del gen antisentido y efectos biológicos no específicos de los oligonucleótidos. También se prefiere que estos estudios comparen los niveles del ARN blanco o proteína con los de un ARN o proteína de control interno. En forma adicional, se observa que los resultados obtenidos usando el oligonucleótido antisentido se comparan con aquellos obtenidos usando un oligonucleótido de control. Se prefiere que el oligonucleótido de control tenga aproximadamente la misma longitud que el oligonucleótido experimental y que la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido difiera de la secuencia antisentido no más de lo necesario para evitar la hibridación específica a la secuencia blanco.

Los oligonucleótidos pueden ser ADN o ARN o mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de éstos, de hebra simple o de doble hebra. El oligonucleótido puede modificarse en el resto base, resto de azúcar, cadena principal de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molécula, hibridación, etc. El oligonucleótido puede incluir otros grupos anexos tales como péptidos (por ej., para orientar los receptores de las células huésped in vivo), o agentes que faciliten el transporte a través de la membrana celular (ver, por ej., Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; Publicación por PCT No. WO 88/09810, publicada el 15 de diciembre de 1988) o la barrera hematoenfecálica (ver, por ej., Publicación por PCT No. WO 89/10134, publicada el 25 de abril de 1988), agentes de disociación desencadenada por hibridación. (Ver, por ej., Krol et al., 1988, BioTechniques 6:958-976) o agentes de intercalación. (Ver, por ej., Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549). Con este fin, el oligonucleótido puede conjugarse a otra molécula, por ej., un péptido, agente de entrecruzamiento desencadenado por hibridación, agente de transporte, agente de disociación desencadenada por hibridación, etc.

El oligonucleótido antisentido puede comprender por lo menos un resto de base modificada que se selecciona del grupo que incluye, sin carácter limitativo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metil éster del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w y 2,6-diaminopurina.

El oligonucleótido antisentido también puede comprender por lo menos un resto de azúcar modificado seleccionado del grupo que incluye, sin carácter limitativo, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y hexosa.

Incluso en otra realización, el oligonucleótido antisentido comprende por lo menos una cadena principal de fosfato modificada seleccionada del grupo formado por un fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforamidato, un fosforodiamidato, un metilfosfonato, un fosfotriéster de alquilo, y un formacetal o análogo de los anteriores.

Incluso en otra realización, el oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido \alpha-anomérico. Un oligonucleótido \alpha-anomérico forma híbridos específicos de doble hebra con ARN complementario en el cual, al contrario con lo que ocurre con las unidades \beta usuales, las hebras corren en paralelo entre sí (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641). El oligonucleótido es un 2'-O-metilribonucleótido (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148), o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330).

Los oligonucleótidos de la invención pueden sintetizarse por métodos estándares conocidos en la técnica, por ej. con el uso de un sintetizador automático de ARN (tal como los provistos al mercado por Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como ejemplos, pueden sintetizarse oligonucleótidos con fosforotioato por el método de Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16:3209), oligonucleótidos de metilfosfonato pueden prepararse con el uso de soportes poliméricos vítreos de poro controlado (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85:7448-7451), etc.

Aunque podrían usarse ácidos nucleicos antisentido complementarios a la secuencia de la región codificadora, se prefieren aquellos complementarios con la región no traducida transcripta. Los ácidos nucleicos antisentido que se superponen al sitio de inicio de la traducción son incluso más preferidos. Por ejemplo, oligonucleótidos antisentido como los expuestos a continuación pueden utilizarse de acuerdo con la invención.

5' TCAATCTGGCTCTGTTCGCG 3' (SEC ID NO: 19) (complemento para los nucleótidos 284-3030 de la SEC ID NO: 1)

5' CGCTCTCTCCACCCGCGGGCCCTCAA 3' (SEC ID NO: 20) (complemento para los nucleótidos 300-325 de la SEC ID NO: 1)

Las moléculas antisentido deben administrarse a células que expresan la Delta3 in vivo. Se ha desarrollado una cantidad de métodos para administrar ADN o ARN antisentido a las células; por ej. las moléculas antisentido pueden inyectarse directamente en el sitio del tejido, o moléculas antisentido modificadas, diseñadas para células blanco deseadas (por ej., el antisentido ligado a péptidos o anticuerpos que se unen específicamente a receptores o antígenos expresados en la superficie de células blanco) pueden administrarse sistemáticamente.

Sin embargo, con frecuencia es difícil lograr concentraciones intracelulares del antisentido suficientes para suprimir la traducción en ARNm endógenos. Por lo tanto un método preferido utiliza una construcción de ARN recombinante en la cual el oligonucleótido antisentido se coloca bajo control de un promotor pol III o pol II fuerte. El uso de dicha construcción para transfectar células blanco en el paciente producirá la transcripción de cantidades suficientes de ARN de hebra simple que formarán pares de bases complementarios con las transcripciones de Delta3 endógenas y evitar de este modo la traducción del ARNm de Delta3. Por ejemplo, puede introducirse un vector in vivo tal que sea absorbido por una célula y dirija la transcripción de un ARN antisentido. Dicho vector puede permanecer episomal o integrarse cromosómicamente, en tanto pueda transcribirse para producir el ARN antisentido deseado. Dichos vectores pueden construirse por métodos de tecnología de ADN recombinante estándares en la técnica. Los vectores pueden ser plásmidos, virales u otros conocidos en la técnica, usados para replicación y expresión en células de mamífero. La expresión de la secuencia que codifica el ARN antisentido puede ser por cualquier promotor conocido en la técnica que actúe en células de mamífero, con preferencia células humanas. Dichos promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Dichos promotores incluyen sin carácter limitativo: la región promotora de inicio SV40 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor incluido en la repetición terminal extensa 3' del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de timidina quinasa del herpes (Wagner et al, 1981, Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU. 79:1441-1445). Las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster et al, 1982, Nature 296:39-42), etc. Puede usarse cualquier tipo de plásmido, cósmido, YAC o vector viral para preparar la construcción de ADN recombinante que puede introducirse directamente o en el sitio del tejido; por ej. el plexo coroide o hipotálamo. En forma alternativa, pueden usarse vectores virales que infecten selectivamente el tejido deseado, (por ej., para el cerebro, pueden usarse vectores de herpesvirus), en cuyo caso la administración puede lograrse por otra vía (por ej., sistemáticamente).

Del mismo modo, las construcciones antisentido de la presente invención, al antagonizar la actividad biológica normal de una de las proteínas Delta3, pueden usarse en la modulación de la actividad celular tanto in vivo como para cultivos de tejido ex vivo.

Además, pueden usarse las técnicas anti-sentido (por ej. microinyección de moléculas antisentido, o transfección con plásmidos cuyas transcripciones son antisentido con respecto al ARNm de Delta3 o la secuencia génica) para investigar la función de Delta3 en eventos del desarrollo, como también la función celular normal de Delta3 en tejido de adultos. Dichas técnicas pueden utilizarse en cultivo celular.

Pueden usarse también moléculas de ribozina diseñadas para producir la ruptura catalítica de transcripciones de ARNm de Delta3 para evitar la traducción de ARNm y la expresión de Delta3 (Ver, por ej., Publicación Internacional por PCT WO 94/11364, publicada el 4 de octubre de 1990; Salver et al, 1990, Science 247:1722-1225). Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la ruptura específica de RNA. El mecanismo de acción de las ribozimas implica la hibridación específica de la secuencia de la molécula de ribozima al ARN blanco complementario, seguido de una ruptura endonucleolítica. La composición de moléculas de ribozima debe incluir una o más secuencias complementarias al ARNm del gen blanco, y debe incluir la secuencia catalítica conocida responsable de la ruptura del ARNm. Para esta secuencia, ver Pat. de los Estados Unidos No. 5.093.246, que se incorpora aquí a modo de referencia en su totalidad. Dentro del alcance de la invención se encuentran las moléculas de ribozima de motivo de cabeza de martillo diseñadas que catalizan en forma específica y eficiente la ruptura endonucleolítica de las secuencias de ARN que codifican las proteínas Delta3.

Los sitios de ruptura de ribozima específicos dentro de cualquier ARN blanco potencial se identifican inicialmente por barrido de la molécula de interés para encontrar sitios de ruptura de ribozima que incluyen las siguientes secuencias: GUA, GUU y GUC. Una vez identificadas, pueden evaluarse secuencias cortas de ARN de entre 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del gen blanco que contiene el sitio de disociación para determinar las características estructurales previstas, tal como la estructura secundaria, que pueden hacer que la secuencia de oligonucleótidos sea inapropiada. La aptitud de las secuencias candidatas también puede evaluarse sometiendo a prueba su accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios, usando ensayos de protección de ribonucleasa.

Aunque los ribozimas que disocian el ARNm en las secuencias de reconocimiento específicas del sitio pueden usarse para destruir el ARNm de Delta3, se prefiere el uso de ribozimas con cabeza tipo martillo. Las ribozimas con cabeza tipo martillo disocian los ARNm en ubicaciones dictadas por las regiones flanqueantes que forman pares de bases complementarios con el ARNm blanco. El único requerimiento es que el ARNm blanco tenga la siguiente secuencia de dos bases: 5'-UG-3'. La construcción y producción de ribozimas con cabeza tipo martillo son muy conocidas en la técnica y se describe más completamente en Haseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591. Existen cientos de sitios disociación de ribozima potenciales del tipo de cabeza de martillo dentro de la secuencia de nucleótidos de ADNc de Delta3 humana (Fig. 1). Con preferencia la ribozima se diseña tal que el sitio de reconocimiento de disociación se ubica cerca del extremo 5' del ARNm de Delta3; es decir, aumente la eficacia y minimice la acumulación intracelular de transcripciones no funcionales de ARNm.

Las ribozimas de la presente invención incluyen además ARN endoribonucleasas (de aquí en adelante "Ribozimas del tipo Cech") tales como la que ocurre en la naturaleza en Tetrahymena Thermophila (conocida como ARN de IVS, o L-19 IVS) y que se ha descrito extensivamente en el texto escrito por Thomas Cech y sus colaboradores (Zaug, et al., 1984, Science, 224:574-578; Zaug and Cech, 1986, Science, 231:470475; Zaug et al., 1986, Nature, 324:429.433; publicada en la solicitud de Patente Internacional No. W088/04300 por University Patents Inc.; Been and Cech, 1986, Cell, 47:207-216). Las ribozimas del tipo Cech tienen un sitio activo de ocho pares de bases que se hibrida a una secuencia blanco de ADN donde tiene lugar la ruptura del ARN blanco a partir de entonces. La invención abarca esas ribozi-
mas del tipo Cech que se orientan a secuencias de sitio activo de ocho pares de bases que están presentes en Delta3.

Como ocurre en el enfoque antisentido, las ribozimas pueden estar compuestas por oligonucleótidos modificados (por ej., para mejor estabilidad, orientación, etc.) y deben aplicarse a células que expresan la Delta3 in vivo por ej., hipotálamo y/o el plexo coroide. Un método preferido de administración incluye el uso de una construcción de ADN "que codifica" la ribozima bajo el control de un promotor constitutivo fuerte pol III o pol II, tal que las células transfectadas producirán cantidades suficientes de la ribozima para destruir los mensajes de Delta3 endógenos e inhibir la traducción. Dado que las ribozimas, a diferencia de las moléculas antisentido, son catalíticas, se requiere una concentración intracelular más baja para lograr eficiencia.

La expresión del gen Delta3 endógeno también puede reducirse inactivando o haciendo "knock out" el gen Delta3 o su promotor usando recombinación homóloga orientada. (por ej., ver Smithies et al., 1985, Nature 317:230-234; Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51:503-512; Thompson et al., 1989 Cell 5:313-321; cada una de las cuales se incorpora aquí a modo de referencia en su totalidad). Por ejemplo, puede usarse una Delta3 mutante, no funcional (o una secuencia de ADN totalmente sin relación) flanqueada por ADN homólogo al gen Delta3 endógeno (ya sea las regiones codificadoras o regiones reguladoras del gen Delta3), con o sin un marcador seleccionable y/o un marcador seleccionable negativo, para transfectar las células que expresan Delta3 in vivo. La inserción de la construcción de ADN, a través de la recombinación homóloga orientada, produce la inactivación del gen Delta3. Dichos métodos son particularmente aptos en el campo agrícola donde pueden usarse modificaciones a las células de TE (tallo embrionario) para generar crías de animales con Delta3 inactivo (por ej., ver Thomas & Capecchi 1987 y Thompson 1989, referencia anterior). Sin embargo este método puede adaptarse para usar en humanos siempre que las construcciones de ADN recombinante se administren directamente o se orienten al sitio requerido in vivo usando los vectores virales apropiados, por ej. vectores del herpes virus.

En forma alternativa, la expresión del gen Delta3 endógeno puede reducirse orientando las secuencias de desoxiribonucleótidos complementarios a la región reguladora del gen Delta3 (es decir., el promotor Delta3 y/o potenciadores) para formar estructuras de triple hélice que evitan la transcripción del gen Delta3 en células blanco en el cuerpo. (Ver generalmente, Helene, C. 1991, Anticancer Drug Des., 6(6):569-84; Helene, C., et al., 1992, Ann, N.Y. Acad. Sci., 660:27-36; y Maher, L.J., 1992, Bioassays 14(12):807-15).

Las moléculas de ácido nucleico que se usarán en la formación de triple hélice para la inhibición de la transcripción son, con preferencia, de hebra simple y están compuestas por desoxirribonucleótidos. La composición básica de estos oligonucleótidos debe promover la formación de triple hélice a través de normas de equivalencia de bases de
Hoogsteen, que generalmente requieren la presencia de tramos mensurables de purinas o pirimidinas en una hebra del dúplex. Las secuencias de nucleótidos pueden ser de base de pirimidina, que producirán tripletes TAT y CGC en las tres hebras asociadas de la triple hélice resultante. Las moléculas con alto contenido de pirimidina proveen complementariedad de bases a una región con alto contenido de purifica de de una hebra simple del dúplex en una orientación en paralelo a esa hebra. Además, pueden elegirse moléculas de ácido nucleico pueden que tengan gran contenido de purina, por ejemplo, que contengan un tramo de residuos de G. Estas moléculas formarán una triple hélice con un dúplex de ADN que tiene gran contenido de pares GC, en los cuales la mayoría de los residuos de purina están ubicados en una hebra simple del duplex buscado, generando tripletes CGC en las tres hebras del tríplex.

En forma alternativa, las potenciales secuencias que pueden buscarse para la formación de la hélice triple pueden aumentarse creando la denominada molécula de ácido nucleico "switchback". Las moléculas switchback se sintetizan en un modo alternante 5'-3', 3'-5', tal que formen pares de bases con la primer hebra de un dúplex y luego la otra, eliminando la necesidad de la presencia de un tramo mensurable tanto de purinas como pirimidinas en una hebra de un dúplex.

El ARN antisentido y ADN, ribozima y las moléculas de hélice triple de la invención pueden prepararse por cualquier método conocidos en la técnica para la síntesis de moléculas de ADN y ARN. Estos incluyen técnicas para sintetizar químicamente los oligodesoxiribonucleótidos y oligoribonucleótidos conocidos en la técnica tales como por ejemplo la síntesis química de fosforamidita de fase sólida. En forma alternativa, las moléculas de ARN pueden generarse por transcripción in vitro e in vivo de secuencias de ARN que codifican la molécula de ARN antisentido. Dichas secuencias de ARN pueden incorporarse en una amplia variedad de vectores que incorporan promotores apropiados de la ARN polimerasa tales como los promotores de polimerasa T7 o SP6. En forma alternativa, las construcciones de ADNc antisentido que sintetizan el ARN antisentido en forma constitutiva o inducible, dependiendo del promotor usado, pueden introducirse en forma estable en líneas celulares.

Más aun, varias modificaciones conocidas a las moléculas de ácido nucleico pueden introducirse como medio de aumentar la estabilidad intracelular y la vida media. Las posibles modificaciones incluyen sin carácter limitativo el agregado de secuencias flanqueantes de ribonucleótidos o desoxiribonucleótidos a los extremos 5' y/o 3' de la molécula o el uso de fosforotioato o 2' O-metilo en lugar de enlaces fosfodiesterasa dentro del esqueleto del oligodesoxirribonucleótido.

4.4 Polipéptidos de la presente invención

La presente invención también pone a disposición polipéptidos Delta3 que se aíslan de, o sustancialmente, de otro modo, no contienen otras proteínas celulares, especialmente otros factores de transducción de señales y/o factores de transcripción que normalmente se asociarían con el polipéptido Delta3. El término "sustancialmente no contiene otras proteínas celulares" (a la cual nos referimos también aquí como "proteínas contaminantes") o "preparaciones sustancialmente puras o purificadas" se definen como abarcativas de preparaciones de polipéptidos Delta3 que tienen menos de aproximadamente 20% (en peso seco) de proteína contaminante, y con preferencia que tienen menos de aproximadamente 5% de proteína contaminante. Las formas funcionales de los polipéptidos de la invención pueden prepararse, por primera vez, como preparaciones purificadas mediante el uso de un gen clonado como se describe aquí. Por "purificado", se entiende, cuando se hace referencia a un péptido o secuencia de ADN o ARN, que la molécula indicada se encuentra presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas, tales como otras proteínas. El término "purificado" como se usa aquí con preferencia significa por lo menos 80% en peso seco, con mayor preferencia en el rango de 95-99% en peso, y con la mayor preferencia por lo menos 99,8% en peso, de macromoléculas biológicas del mismo tipo presentes (aunque el agua, buffers y otras moléculas pequeñas, especialmente moléculas que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 5000, pueden estar presentes). El término "puro" como se usa aquí con preferencia tiene los mismos límites numéricos que "purificado" inmediatamente anterior. "Aislado" y "purificado" no abarcan materiales naturales o en su estado nativo que se han separado en componentes (por ej., en un gel de acrilamida) aunque no obtenidos tanto puros (por ej. que carecen de proteínas contaminantes, o reactivos para cromatografía tales como sustancias o soluciones con agentes desnaturalizantes y polímeros, por ej. acrilamida o agarosa). En realizaciones preferidas, las preparaciones con Delta3 purificadas carecerán de cualquier proteína contaminante del mismo animal del cual Delta3 normalmente se produce, como puede lograrse por expresión recombinante de, por ejemplo, una proteína Delta3 humana en una célula no humana.

Las proteínas o fragmentos de longitud completa correspondientes a uno o más motivos y/o dominios particulares o a tamaños arbitrarios, por ejemplo, por lo menos de aproximadamente 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150 aminoácidos de longitud se encuentran dentro del alcance de la presente invención. La invención abarca todas las proteínas codificadas por los ácidos nucleicos descritos en la sección anterior que describe los ácidos nucleicos de la invención.

Por ejemplo, los polipéptidos Delta3 aislados pueden incluir la totalidad o una porción de una secuencia de aminoácidos correspondiente a un polipéptido Delta3 representado en la SEC ID No: 2. Las porciones de peptidilo aisladas de proteínas Delta3 pueden obtenerse evaluando los péptidos producidos por medios recombinantes del correspondiente fragmento del ácido nucleico que codifica dichos péptidos. Además, los fragmentos pueden sintetizarse por medios químicos usando técnicas conocidas en la técnica tales como química convencional de f-Moc o t-Boc de fase sólida de Merrifield. Por ejemplo, un polipéptido Delta3 de la presente invención puede dividirse arbitrariamente en fragmentos de la longitud deseada sin superposiciones de los fragmentos, o con preferencia dividirse en fragmentos superpuestos de una longitud deseada. Los fragmentos pueden producirse (por medios recombinantes o por síntesis química) y evaluarse para identificar aquellos fragmentos de peptidilo que pueden funcionar tanto como agonistas o antagonistas de una proteína Delta3 de tipo salvaje (por ej., "auténtica").

Otro aspecto de la presente invención se refiere a formas recombinantes de las proteínas Delta3. Los polipéptidos recombinantes preferidos por la presente invención, además de proteínas Delta3 nativas, son por lo menos aproximadamente 90% homólogos y con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 92% o 94% homólogos y con la mayor preferencia por lo menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% homólogos con una secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID No: 2. En una realización, el polipéptido delta de la invención tiene una homología o identidad general con la secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 98%, o por lo menos aproximadamente 99% con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 2. En una realización particularmente preferida una proteína Delta3 tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID No: 2. En otras realizaciones particularmente preferidas, la proteína Delta3 tiene una bioactividad de Delta3.

La presente invención se refiere además a formas recombinantes de uno de los polipéptidos Delta3 de la invención que están codificadas por genes derivados de un organismo mamífero, y que tienen secuencias de aminoácidos relacionadas evolutivamente con la proteína Delta3 representada en la SEC ID No: 2. Dichos polipéptidos recombinantes Delta3 con preferencia son capaces de funcionar en uno de los roles de agonista o antagonista de por lo menos una actividad biológica de una proteína Delta3 de tipo salvaje ("auténtica") del listado de secuencias anexo. El término "relacionado evolutivamente con", con respecto a secuencias de aminoácidos de proteínas Delta3 humanas, se refiere tanto a polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que se han generado naturalmente, y también a variantes mutacionales de los polipéptidos Delta3 que derivan, por ejemplo, por mutagénesis combinatoria. Dichos polipéptidos Delta3 derivados evolutivamente por la presente invención tienen una bioactividad de Delta3 y son por lo menos 80% homólogos y con mayor preferencia 85% homólogos y con la mayor preferencia 90% homólogos con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2. En una realización particularmente preferida, una proteína Delta3 comprende la secuencia codificadora de aminoácidos de la SEC ID NO: 2.

En general, los polipéptidos a los cuales nos referimos aquí como que tienen una actividad (por ej., "bioactividad") de una proteína Delta3 se definen como polipéptidos que incluyen una secuencia de aminoácidos correspondientes (por ej., idénticos o sustancialmente idénticos) a la totalidad o una porción de las secuencias de aminoácidos de una proteína Delta3 que se muestran en la SEC ID No: 2 y que imitan o antagonizan la totalidad o una porción de las actividades biológicas/bioquímicas de una proteína Delta3 natural. En realizaciones preferidas una proteína Delta3 de la presente invención interactúa específicamente con un polipéptido Notch.

La invención provee varias formas de proteínas Delta3, que incluyen específicamente todas las proteínas Delta3 descritas en la sección "4.3" con relación a ácidos nucleicos de la invención.

La presente invención se refiere además a métodos para producir los polipéptidos Delta3 de la invención. Por ejemplo, una célula huésped transfectada con un vector de ácido nucleico que dirige expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica los polipéptidos de la invención puede cultivarse en las condiciones apropiadas para permitir que ocurra la expresión del péptido. Las células pueden cosecharse, lisarse y la proteína aislares. Un cultivo celular incluye células huésped, medios y otros productos secundarios. Los medios apropiados para cultivo celular se conocen en la técnica. El polipéptido Delta3 recombinante puede aislares de medio de cultivo celular, células huésped, o tanto usando técnicas conocidas en la técnica para purificar proteínas incluyendo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía con filtración de gel, ultrafiltración, electroforesis, purificación por inmunoafinidad con anticuerpos específicos para dicho péptido. En una realización preferida, el polipéptido Delta3 recombinante es una proteína de fusión que contiene un dominio que facilita su purificación, tal como la proteína de fusión GST o proteína de fusión poli(His).

Más aun, se apreciará en general que, bajo ciertas circunstancias, puede ser ventajoso proveer variantes de uno de los polipéptidos Delta3 de la invención que funcionan en una capacidad limitada como un agonista de Delta3 (mimético) o un antagonista de Delta3, para promover o inhibir solamente un sub-grupo de las actividades biológicas de la forma natural de la proteína. De este modo, los efectos biológicos específicos pueden generarse por tratamiento con una variante que tiene función limitada, y con pocos efectos colaterales con relación al tratamiento con agonistas o antagonistas que se dirigen a todas las actividades biológicas de las formas naturales de las proteínas Delta3.

Las variantes y/o mutantes de cada una de las proteínas Delta3 de la invención pueden generarse por mutagénesis, tal como por mutación(es) a un punto específico, o por truncamiento. Por ejemplo, la mutación puede dar lugar a los homólogos que mantienen sustancialmente el mismo, o simplemente un sub-grupo de la actividad biológica del polipéptido Delta3 del cual deriva. En forma alternativa, pueden generarse formas antagónivas de la proteína que son capaces de inhibir la función de la forma natural de la proteína, tal como por unión competitiva a un miembro ascendente o descendente de la cascada de Delta3 que incluye la proteína Delta3. Además, pueden generarse formas agonistas de la proteína que son constitutivamente activas.

Los polipéptidos recombinantes Delta3 de la presente invención incluyen además homólogos de las proteínas Delta3 auténticas, tal como versiones de esas proteínas que son resistentes a la ruptura proteolítica, tal por ejemplo, debido a mutaciones que alteran la ubiquitinación de otro blanco enzimático asociado con la proteína.

Los polipéptidos Delta3 también pueden modificarse químicamente para crear derivados de Delta3 formando conjugados covalentes o agregados con otros restos químicos, tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Los derivados covalentes de las proteínas Delta3 pueden prepararse ligando los restos químicos a grupos funcionales en las cadenas laterales de aminoácidos de la proteína o en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal del polipéptido.

La modificación de la estructura de los polipéptidos Delta3 de la invención pueden ser para tales fines como potenciar la eficacia terapéutica o profiláctica, estabilidad (por ej., vida útil ex vivo y resistencia a la degradación proteolítica in vivo), o modificaciones post-traducción (por ej., para alterar el patrón de fosforilación de la proteína). Dichos péptidos modificados, cuando se diseñan para mantener por lo menos una actividad de la forma natural de la proteína, o para producir sus antagonistas específicos; se consideran equivalentes funcionales de los polipéptidos Delta3 descritos en mayor detalle aquí. Dichos péptidos modificados pueden producirse, por ejemplo, por sustitución, supresión o adición de aminoácidos.

Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido con estructura relacionada (es decir, mutaciones isostéricas y/o isoeléctricas) no tendrán un efecto importante sobre la actividad biológica de la molécula resultante. Los reemplazos conservadores son aquellos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos genéticamente codificados pueden dividirse en cuatro familias: (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) no polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, pralina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polares sin carga = glicina, asparagina, glutamato, cisteína, serina, treonina, tirosina. De modo similar, el repertorio de aminoácidos puede agruparse como (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina histidina, (3) alifáticos = glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, pudiendo la serina y la treonina opcionalmente agruparse por separado como hidroxilados alifáticos; (4) aromáticos = fenilalanina, tirosina, triptofano (5) con grupo amida = asparagina, glutamina; y (6) azufrados = cisteína y metionina. (ver, por ejemplo, Biochemistry, 2nd ed., Ed. by L Stryer, WH Freeman y Co.; 1981). Si un cambio en la secuencia de aminoácidos de un péptido produce un homólogo de Delta3 funcional (por ej. funcional en el sentido que el polipéptido resultante imita o antagoniza la forma de tipo salvaje) puede determinarse fácilmente evaluando la capacidad del péptido variante para producir una respuesta en células de un modo similar a una proteína de tipo salvaje, o inhibir competitivamente dicha respuesta. Los polipéptidos en los cuales ha tenido lugar más de un reemplazo pueden evaluarse del mismo modo.

Esta invención contempla además un método para generar grupos de mutantes combinatorios de las proteínas Delta3 de la invención como también mutantes de truncación, y es especialmente útil para identificar potenciales secuencias variantes funcionales (por ej. homólogos). La finalidad de la exploración de dichas bibliotecas combinatorias es generar, por ejemplo, homólogos de Delta3 novedosos que pueden actuar como agonistas o antagonistas, o en forma alternativa, poseen actividades totalmente nuevas.

En una realización, se genera la biblioteca variegata de variantes de Delta3 por mutagénesis combinatoria en el nivel de ácido nucleico, y está codificada por una biblioteca génica variada. Por ejemplo, una mezcla de oligonucleótidos sintéticos puede ligarse enzimáticamente en secuencias génicas tales que el grupo degenerado de las secuencias potenciales de Delta3 pueden expresarse como polipéptidos individuales, o en forma alternativa, como un conjunto más extenso de proteínas de fusión (por ej. para despliegue de fagos que contiene el conjunto de secuencias de Delta3 de la misma.

Hay muchos modos por los cuales dichas bibliotecas de potenciales homólogos de Delta3 o variantes pueden generarse a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de una secuencia génica degenerada puede llevarse a cabo en un sintetizador automático de ADN, y los genes sintéticos se ligan luego en un vector de expresión apropiado. La finalidad de un conjunto de genes degenerados es proveer, en una mezcla, todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de potenciales secuencias de Delta3. La síntesis de los oligonucleótidos degenerados se conoce bien en la técnica (ver por ejemplo, Naming, SA (1983) Tetrahedron 393; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proc 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Waited, Amsterdam: Elsevier ppg. 273-289; Itakurs, et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477. Dichas técnicas se han empleado en la evolución dirigida de otras proteínas (ver, por ejemplo, Scott et al. (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87: 6378-6382; como también Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.223.409. 5.198.346. y 5.096.815).

Del mismo modo, puede proveerse una biblioteca de fragmentos de secuencias de codificación para un clon de Delta3 para generar una población variegata de fragmentos de Delta3 para exploración y posterior selección de fragmentos bioactivos. En la técnica se conoce una variedad de técnicas para generar dichas bibliotecas, incluyendo síntesis química. En una realización, una biblioteca de fragmentos de la secuencia de codificación puede generarse (i) tratando un fragmento de PCR de hebra doble de una secuencia codificadora de Delta3 con una nucleasa en condiciones en las cuales ocurre mellado sólo aproximadamente una vez por molécula; (ii) desnaturalizando el ADN de doble hebra; (iii) renaturalizando el ADN para formar ADN de doble hebra que puede incluir pares homosentido/antisentido de diferentes productos mellados; (iv) eliminar porciones de hebra simple de dúplex reformados por tratamiento con SI nucleasa; y (v) ligar la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. A través de este método ejemplificativo, puede derivarse una biblioteca de expresión que codifique fragmentos N-terminales, C-terminales e internos de varios tamaños.

Se conoce una amplia gama de técnicas en la técnica para explorar productos génicos de bibliotecas combinatorias hechas por mutaciones de punto o truncamiento, y para explorar bibliotecas de ADNc para productos génicos que tienen una determinada propiedad. Dichas técnicas generalmente se adaptarán para una rápida exploración de bibliotecas génicas generadas por mutagénesis combinatoria de los homólogos de Delta3. Las técnicas usadas más ampliamente para explorar extensas bibliotecas génicas normalmente comprenden la clonación de la biblioteca génica en vectores de expresión replicables, transformando las células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante, y expresando los genes combinatorios en condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilita relativamente el fácil aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. Cada uno de los ensayos ilustrativos descritos a continuación son dóciles a análisis de alto rendimiento según la necesidad de explorar grandes números de secuencias Delta3 degeneradas creadas por técnicas de mutagénesis combinatoria. La mutagénesis combinatoria tiene el potencial de generar bibliotecas muy extensas de proteínas mutantes, por ej., en el orden de las moléculas 10^{26}. Las bibliotecas combinatorias de este tamaño pueden provocarse técnicamente para explorar incluso con ensayos de exploración de alto rendimiento. Para superar este problema, se ha desarrollado una nueva técnica recientemente: mutagénesis recursiva de conjunto (MRC), que permite evitar la proporción muy alta de proteínas no funcionales en una biblioteca aleatoria y simplemente potencia la frecuencia de las proteínas funcionales, reduciendo de este modo la complejidad requerida para lograr una obtención de muestras útiles de espacio de secuencia. MRC es un algoritmo que potencia la frecuencia de mutantes funcionales en una biblioteca cuando se emplea un método de selección o exploración apropiado (Adds and Yourvan, 1992, PNAS USA 89:7811-7815; Yourvan et al., 1992, Parallel Problem Solving from Nature, 2., In Maenner and Manderick, eds., Elsevir Publishing Co., Amsterdam, pp. 401-410; Delgrave et al., 1993, Protein Engineering 6(3)327-331).

La invención también proporciona reducción de las proteínas Delta3 para generar miméticos, por ej. agentes peptídicos o no peptídicos, que son capaces de unirse a una proteína Delta3 y/o interrumpir la unión de un polipéptido Delta3 de la presente invención con componentes secuencia arriba o secuencia abajo de una cascada señalizadora Delta/Notch, tales como proteínas de unión o interactores. Así, técnicas mutagénicas como las descritas anteriormente son también útiles para cartografiar los determinantes de las proteínas Delta3 que participan en interacciones proteína-proteína implicadas en, por ejemplo, la unión del polipéptido Delta3 objeto a proteínas que pueden funcionar secuencia arriba (incluyendo tanto activadores como represores de su actividad) o a proteínas o ácidos nucleicos que pueden funcionar secuencia abajo del polipéptido Delta3, ya estén regulados positiva o negativamente por él, por ejemplo, Notch. Para ilustrar, los restos críticos de un polipéptido Delta3 objeto que están implicados en el reconocimiento molecular de, por ejemplo, el producto del gen Notch u otro componente secuencia arriba o secuencia abajo de un gen Delta3 se pueden determinar y usar para generar péptidomiméticos derivados de Delta que inhiben de forma competitiva la unión de la proteína Delta3 auténtica con ese resto. Empleando, por ejemplo, mutagénesis de exploración para cartografiar los restos de aminoácidos de cada una de las proteínas Delta3 objeto que están implicadas en la unión de otras proteínas extracelulares, se pueden generar peptidomiméticos que imitan a los restos de la proteína Delta3 que facilitan la interacción. Después, pueden utilizarse tales mimétictos para interferir con la función normal de una proteína Delta3. Por ejemplo, los análogos peptídicos no hidrolizables de tales restos se pueden generar utilizando benzodiazepina (por ej., véase Freidinger et al. en Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Países Bajos, 1988), azepina (p. ej. véase Huffman et al. en Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher, Leiden, Países Bajos, 1988), anillos de gamma-lactama sustituidos (Garvey et al. en Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Países Bajos, 1988), peusopéptidos ceto-metilénicos (Ewenson et al. (1986) J. Med Chem 29:295; y Ewenson et al. en Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Co., Rockland, IL, 1985), núcleos dipeptídicos con vuelta b (Nagai et al. (1985) Tetrahedron Lett 26:647; y Sato et al. (1986) J Chem Soc Perkin Trans 1:1231), y b-aminoalcoholes (Gordon et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126:419; y Dann et al. (1986) Biochem Biophys Res Commun 134:71).

4.4.1 Células que expresan polipéptidos Delta3 recombinantes

Esta invención además se refiere a una célula huésped transfectada para expresar una forma recombinante de los polipéptidos Delta3 de la invención. La célula huésped puede ser una célula procariota o eucariota. De este modo una secuencia de nucleótidos derivada de la clonación de proteínas Delta3, que codifican la totalidad o una porción seleccionada de la proteína de longitud completa, puede usarse para producir una forma recombinante de un polipéptido Delta3 a través de procesos celulares microbianos o eucarióticos. La ligación de la secuencia de polinucleótido en una construcción génica, tal como un vector de expresión, y transformación o transfección en huéspedes, ya sea células eucariotas (levadura, aves, insectos o mamíferos) o células procariotas (bacterianas), son procedimientos estándares usados en la producción de otras proteínas conocidas, por ej. quinasa MAP, pg. 53, WTI, PTP fosfatasas, SRC, y similares. Procedimientos similares, o sus modificaciones, pueden emplearse para preparar polipéptidos Delta3 recombinantes por medios microbianos o tecnología de cultivo de tejidos de acuerdo con la presente
invención.

Los genes Delta3 recombinantes pueden producirse ligando un ácido nucleico que codifica una proteína Delta3, o una porción del mismo en un vector apropiado para expresión de células procariotas, células eucariotas, o ambas. Los vectores de expresión para la producción de formas recombinantes de los polipéptidos Delta3 de la invención incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, los vectores apropiados para la expresión de un polipéptido Delta3 incluyen plásmidos de los tipos: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac y plásmidos derivados de pUC para la expresión de células procariotas, tales como E. coli.

Existe una cantidad de vectores para la expresión de proteínas recombinantes en la levadura. Por ejemplo, YEP24, YIP5, YEP51, YEP52, pYES2, y YRP17 son vehículos de clonación y expresión útiles en la introducción de construcciones genéticas en S. cerevisiae (ver, por ejemplo, Broach et al. (1983) en Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye Academic Press, p. 83, incorporado aquí como referencia). Estos vectores pueden replicarse en E. coli debido a la presencia del pBR322 ori, y en S. cerevisiae debido a la replicación determinante del plásmido de levadura de 2 micrones. Además, pueden usarse creadores de resistencia a fármacos tales como ampicilina. En una realización ilustrativa, un polipéptido Delta3 se produce por medios recombinantes usando un vector de expresión generado subclonando el gen Delta3 representado en la SEC ID NO: 1.

Los vectores de expresión preferidos de mamíferos contienen secuencias procariotas, para facilitar la propagación del vector en bacterias, y una o más unidades eucariotas de transcripción que se expresan en células eucariotas. Los vectores derivados de pADNcI/amp, pADNcI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamíferos apropiados para la transfección de células eucariotas. Algunos de estos vectores se modifican con secuencias de plásmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicación y selección de resistencia a los fármacos tanto en células procariotas como células eucariotas. En forma alternativa, los derivados de virus tales como el papilomavirus de bovino (BPV-1), o virus de Epstein-Barr (pHEBo, derivados de pREP y p205) puede usarse para la expresión transitoria de proteínas en células eucariotas. Los varios métodos empleados en la preparación de los plásmidos y transformación de organismos huésped son conocidos en la técnica. Para otros sistemas de expresión apropiados para células procariotas y células eucariotas, como también procedimientos recombinantes generales, ver Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ad. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) Capítulos 16 y 17.

En algunos casos, puede ser deseable expresar el polipéptido Delta3 recombinante con el uso de un sistema de expresión de baculovirus. Algunos ejemplos de dichos sistemas de expresión de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (tal como pAcUW1), y vectores derivados de pBlueBac (tales como el \beta-gal que contiene pBlueBac III).

Cuando se desea expresar sólo una porción de una proteína Delta3, tal como una forma que carece de una porción del extremo N-terminal, es decir un mutante de truncamiento que carece del péptido señal, puede ser necesario agregar un codón de inicio (ATG) al fragmento de oligonucleótidos que contiene la secuencia expresada que se expresará. Se sabe bien en la técnica que una metionina en la posición N-terminal puede disociarse enzimáticamente por el uso de aminopeptidasa enzimática de metionina (MAP). La MAP se ha clonado de E. coli (Ben-Bassat et al. (1987) J. Bacteriol. 169:751-757) y Salmonella typhimurium y su actividad in vitro se ha demostrado en las proteínas recombinantes (Miller et al. (1987) PNAS 84:2718-1722). Por lo tanto, la eliminación de una metionina N-terminal, si se desea, puede lograrse o bien in vivo expresando polipéptidos derivados de Delta en un huésped que produce MAP (por ej., E. coli o CM89 o S. cerevisiae), o in vitro con el uso de MAP purificada (por ej., el procedimiento de Miller et al., referencia anterior).

En otras realizaciones podrían usarse animales transgénicos, descritos a continuación en más detalle, para producir proteínas recombinantes.

4.4.2 Proteínas de fusión e inmunógenos

En otra realización, las secuencias codificadoras para el polipéptido pueden incorporarse como parte de un gen de fusión incluyendo una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido diferente.

En una realización preferida, el polipéptido Delta3 es un polipéptido Delta3-Ig. El polipéptido Delta3-Ig puede comprender el dominio extracelular completo de Delta3, por ej., Delta3 humana, o una de sus variantes. Por ejemplo, un polipéptido Delta3-Ig puede comprender una secuencia de aminoácidos desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 529 de la SEC ID NO: 2. Otras proteínas Delta3-Ig no comprenden un péptido señal y de este modo, con preferencia no comprenden aproximadamente desde el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 17 de la SEC ID NO: 2. En forma alternativa, una proteína de fusión Delta3-Ig puede comprender una porción del dominio extracelular de una proteína Delta3 o una variante de una porción del dominio extracelular de una proteína Delta3. Las porciones preferidas del dominio extracelular incluyen porciones que tienen por lo menos un motivo que se muestran en la Figura 2. Por ejemplo una proteína de fusión Delta3-Ig puede comprender por lo menos una repetición del tipo FCE. Una proteína de fusión Delta3-Ig puede comprender además un dominio de DSL. Una proteína de fusión Delta3-Ig también puede comprender un péptido señal. Las proteínas de fusión Delta3-Ig pueden prepararse como se describe por ej., en la Patente de los Estados Unidos No. 5.434.131.

Este tipo de sistema de expresión puede ser útil en condiciones donde es deseable producir un fragmento inmunogénico de una proteína Delta3. Por ejemplo, la proteína de cápside VP6 del rotavirus puede usarse como proteína vehículo inmunológico para porciones del polipéptido Delta3, ya sea en forma monoméica o en forma de partícula viral. Las secuencias de ácido nucleico correspondientes a la porción de una proteína Delta3 de la invención para las cuales se generarán anticuerpos pueden incorporarse en una construcción de un gen de fusión que incluye secuencias codificadoras para una proteína estructural del virus de vaccinia tardío para producir un conjunto de virus recombinantes que expresan las proteínas de fusión que comprenden epítopes Delta3 como parte del virión. Se ha demostrado con el uso de proteínas de fusión inmunogénicas que utilizan las proteínas de fusión del antígeno de superficie de la Hepatitis B que los viriones recombinantes de la Hepatitis B también se pueden usar en esta función. De manera similar, las construcciones quiméricas que codifican las proteínas de fusión que contienen una porción de una proteína Delta3 y la proteína de cápside del poliovirus puede crearse para potenciar la inmunogenicidad del conjunto de antígenos polipeptídicos (ver, por ejemplo, Publicación de la EP No: 0259149; y Evans et al. (1989) Nature 339:385; Hung et al. (1988) J. Virol. 62:3855; y Schhenger et al. (1992) J. Virol. 66:2).

El sistema de Péptido con Antígenos Múltiples para inmunización basada en péptidos también puede usarse para generar un inmunógeno, donde una porción deseada de un polipéptido DeIta3 se obtiene directamente de la síntesis química orgánica del péptido sobre un núcleo de lisina con ramificación oligomérica (ver, por ejemplo, Posnett et al. (1988) JBC 263:1719 y Nardelli et al (1992) J. Immunol 148:914). Los determinantes antigénicos de las proteínas Delta3 también pueden expresarse y presentarse a través de células bacterianas.

Además de utilizar las proteínas de fusión para potenciar la inmunogenicidad, se apreciará ampliamente que las proteínas de fusión también pueden facilitar la expresión de las proteínas, y en consecuencia, pueden usarse en la expresión de los polipéptidos Delta3 de la presente invención. Por ejemplo, los polipéptidos Delta3 pueden generarse como proteínas glutatión-S-transferasa (fusión con GST). Dichas proteínas de fusión con GST pueden permitir la fácil purificación del polipéptido Delta3, como por ejemplo mediante el uso de matrices derivadas de glutatión (ver, por ejemplo, Current Protocolos in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. (N.Y.: John Wiley & Sons, 1991)).

En otra realización, un gen de fusión que codifica una secuencia líder de purificación, tal como una secuencia del sitio de ruptura de poli-(His)/enteroquinasa en el extremo N-terminal de la porción deseada de la proteína recombinante, puede permitir la purificación de la proteína de fusión expresada por cromatografía de afinidad usando una resina con catión metálico Ni^{2+}. La secuencia líder de purificación puede posteriormente eliminarse por tratamiento con enteroquinasa para proveer la proteína purificada (por ej., ver Hochuli et al. (1987) J. Chromatography 411:177; y Janknecht et al. PNAS 88:8972).

Las técnicas para preparar genes de fusión son conocidas por aquellas personas con experiencia en la técnica. Esencialmente, la unión de varios fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias de polipéptidos se realiza de acuerdo con técnicas convencionales, empleando términos con extremo truncado o extremo escalonado para la ligación, digestión de la enzima de restricción para proveer extremos apropiados, llenando los extremos cohesivos según corresponda, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable y ligación enzimática. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores automáticos de ADN. En forma alternativa, la amplificación por PCR de fragmentos génicos puede llevarse a cabo usando cebadores ancla que dan lugar a salientes complementarias entre dos fragmentos génicos consecutivos que posteriormente pueden templarse para generar una secuencia génica quimérica (ver, por ejemplo, Current Protocolos in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992).

4.4.3. Anticuerpos

Otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo específicamente reactivo con una proteína Delta3. Por ejemplo, usando inmunógenos derivados de una proteína Delta3, por ej. en base a las secuencias de ADNc, pueden realizarse anticuerpos monoclonales o antisuero anti-proteína/anti-péptido a través de protocolos estándar (Ver, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual ed, escrito por Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Un mamífero, tal como un ratón, un hámster o un conejo pueden inmunizarse con una forma inmunogénica del péptido (por ej., un polipéptido Delta3 o un fragmento antigénico que es capaz de generar una respuesta al anticuerpo, o una proteína de fusión como se describió con anterioridad). Las técnicas para conferir inmunogenicidad sobre una proteína o un péptido incluyen conjugación a vehículos u otras técnicas conocidas en la técnica. Una porción inmunogénica de una proteína Delta3 puede administrarse en presencia de un adyuvante. El progreso de la inmunización puede monitorearse por detección de títulos de anticuerpos en plasma o suero. Pueden usarse inmunoensayos estándar tipo ELISA u otros immunoensayos con el inmunógeno como antígeno para evaluar los niveles de anticuerpos. En una realización preferida, los anticuerpos de la invención son inmunoespecíficos para determinantes antigénicos de una proteína Delta3 de un mamífero, por ej. determinantes antigénicos de una proteína representada por la SEC ID No: 2 o los homólogos estrechamente relacionados (por ej. por lo menos 92% homóloga, y con mayor preferencia por lo menos 94% homóloga).

Luego de la inmunización de un animal con una preparación antigénica de un polipéptido Delta3, pueden obtenerse antisueros anti-Delta3 y, si se desea, los anticuerpos policlonales anti-Delta3 pueden aislarse del suero. Para producir anticuerpos monoclonales, pueden cultivarse células que producen anticuerpos (linfocitos) de un animal inmunizado y fusionarse por procedimientos de fusión celular somática con células inmortalizantes tales como células de mieloma para producir células de hibridoma. Dichas técnicas se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, la técnica de hibridomas (desarrollada originalmente por Kohler and Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497), la técnica de hibridomas de células B humanas (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72), y la técnica de hibridomas de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan K. Liss, Inc. pp. 77-96). Las células de hibridoma pueden explorarse inmunoquímicamente para determinar la producción de anticuerpos específicamente reactivos con un polipéptido Delta3 de la presente invención y pueden aislarse anticuerpos monoclonales de un cultivo que comprende dichas células de hibridoma. En una realización los anticuerpos anti-Delta3 humanos específicamente reaccionan con las proteínas codificadas por el ADN de Número de Acceso al Depósito en ATCC 98348.

El término anticuerpo como se usa aquí pretende incluir sus fragmentos que también son específicamente reactivos con uno de los polipéptidos Delta3 de la invención. Los anticuerpos pueden fragmentarse técnicas convencionales y los fragmentos pueden explorarse para determinar la utilidad del mismo modo que se describió anteriormente para los anticuerpos completos. Por ejemplo, los fragmentos F(ab)2 pueden generarse tratando el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab)2 resultante puede tratarse para reducir los puentes de disulfuro para producir fragmentos Fab. El anticuerpo de la presente invención pretende incluir además moléculas quiméricas y biespecíficas que tienen afinidad por una proteína Delta3 conferida por, al menos, una región de CDR del anticuerpo.

Los anticuerpos que se unen específicamente a epítopes Delta3 también pueden usarse en la tinción inmuno-histoquímica de muestras de tejido para evaluar la abundancia y el patrón de expresión de cada uno de los polipéptidos Delta3 de la invención. Los anticuerpos anti-Delta3 pueden usarse para diagnóstico en inmuno-precipitación e inmuno-tinción para detectar y evaluar los niveles de proteína Delta3 en tejido como parte de un procedimiento de evaluación clínica. Por ejemplo, dichas mediciones pueden ser útiles en valuaciones predictivas del inicio o la progresión de trastornos neurodegenerativos, neoplásicos o hiperplásicos. Del mismo modo, la capacidad de monitorear los niveles de proteína Delta3 en un individuo pueden permitir la determinación de la eficacia de un régimen de tratamiento determinado para un individuo afectado con dicho trastorno. El nivel de polipéptidos Delta3 puede medirse a partir de las células presentes en los líquidos corporales, tales como en muestras de líquido céfalo-raquídeo o líquido amniótico, o pueden medirse en el tejido, tal como el producido por biopsia. Los ensayos de diagnóstico con el uso de anticuerpos anti-Delta3 pueden incluir, por ejemplo, immunoensayos diseñados para ayudar en el diagnóstico precoz de un trastorno neurodegenerativo, en particular aquellos que se manifiestan al nacer. Los ensayos de diagnóstico que utilizan anticuerpos anti-Polipéptido Delta3 pueden incluir además immunoensayos diseñados para ayudar en el diagnóstico precoz y la formación de fenotipos de trastornos neurodegenerativos, neoplásicos o hiperplásicos.

Otra aplicación de los anticuerpos anti-Delta3 de la presente invención se encuentra en la exploración inmunológica de bibliotecas de ADNc construidas en vectores de expresión tales como \lambdagt11, \lambdagt18-23, \lambdaZAP, y ORF8. Las bibliotecas mensajeras de este tipo, que tienen secuencias codificadoras insertadas en el marco de lectura y orientación correctos, pueden producir proteínas de fusión. Por ejemplo, \lambdagt11 producirá proteínas de fusión cuyos extremos amino terminales están formados por secuencias de aminoácidos de \beta-galactosidasa y cuyos extremos carboxilo terminales están formados por un polipéptido extraño. Los epítopes antigénicos de una proteína Delta3, por ej. otros ortólogos de una proteína Delta3 particular u otros parálogos de la misma especie, pueden detectarse entonces con anticuerpos, como, por ejemplo, haciendo reaccionar filtros de nitrocelulosa levantados de placas infectadas con anticuerpos anti-Delta3. Los fagos positivos detectados por este ensayo pueden aislarse luego de la placa infectada. De este modo, la presencia de homólogos de Delta3 puede detectarse y clonarse de otros animales, como las isoformas alternativas (incluyendo variantes de empalme) de humanos.

4.5 Métodos de Tratamiento de la Enfermedad

Basado por lo menos en parte en el hecho de que la vía de señalización de Notch se ha vinculado con el desarrollo del sistema nervioso, en particular en la regulación de la diferenciación neuronal y la vasculatura, por ej. la vasculatura del SNC, una amplia variedad de enfermedades o afecciones patológicas pueden beneficiarse con el tratamiento con productos terapéuticos con Delta3. La vía de señalización de Notch cumple una función en el desarrollo de la vasculatura. Por ejemplo, la pérdida de mutantes con función de Dll1 se torna severamente hemorrágica luego del día 10 del período embrionario. Además, las mutaciones en Notch3 producen CADASIL, una enfermedad caracterizada por el accidente cerebrovascular. Además, los ratones con un gen de PSI funcionalmente eliminado exhiben hemorragias en el cerebro y/o la médula espinal luego del día 11,5 del período embrionario (Wong et al, referencia anterior). Además, dado que la vía de señalización de Notch está implicada en la determinación del destino de la célula por lo menos en el sistema nervioso y el sistema endotelial, es probable que la vía de señalización de Notch, y en particular Delta3, esté implicada en la determinación del destino celular de sistemas biológicos adicionales. En consecuencia, la invención provee, además, métodos para tratar enfermedades o trastornos que surgen de una proliferación y/o diferenciación celular anormal de células distintas de las células del sistema nervioso y la vasculatura.

Los trastornos preferidos que pueden tratarse o prevenirse de acuerdo con los métodos de la invención incluyen afecciones neurogénicas, neoplásicas o hiperplásicas patológicas.

Los trastornos de la vasculatura, también denominados "trastornos vasculares", además de la CADASIL y el accidente cerebrovascular, que pueden tratarse o prevenirse de acuerdo con los métodos de la invención, incluyen ateroma, angiogénesis de tumores, cicatrización de heridas, retinopatía diabética, hemangioma, psoriasis, y restenosis, por ej. restenosis generada por angioplastía con globo.

En una realización, las enfermedades o trastornos causados o a los que contribuye una actividad aberrante de Delta3, tal como niveles de proteína Delta3 aberrantes o una actividad biológica aberrante o que están asociados con uno o más alelos específicos de Delta3, por ej. un alelo de mutante de Delta3, pueden tratarse con productos terapéuticos de Delta3. Los niveles de proteínas aberrantes pueden ser causados, por ej., por la expresión génica aberrante. Dicha actividad aberrante puede producir, por ejemplo, proliferación celular y/o diferenciación o muerte celular aberrante. Por ejemplo, la actividad de Delta3 aberrante en un sujeto puede producir una mayor proliferación de ciertas células en el sujeto. Los sujetos que tienen un trastorno caracterizado por la proliferación celular anormal puede tratarse con la administración de un producto terapéutico que contiene Delta3 que inhiba o disminuya dicha proliferación. El producto terapéutico que contiene Delta3 específico usado puede variar dependiendo del tipo de célula que se prolifera de manera aberrante. El producto con Delta3 apropiado para usar, puede determinarse, por ej., por cultivo in vitro de una muestra de dichas células que pueden obtenerse del sujeto, en presencia y ausencia de productos terapéuticos que contienen Delta3.

Las enfermedades o afecciones asociadas con la proliferación celular aberrante que pueden tratarse o prevenirse con productos terapéuticos que contienen Delta3 incluyen cánceres, afecciones malignas, afecciones premalignas, afecciones benignas. La afección que debe tratarse o prevenirse puede ser un tumor sólido, tal como un tumor que surge de un tejido epitelial. Por ejemplo, el cáncer puede ser cáncer de colon o de cervix. En realidad se ha encontrado que el cáncer de colon y cervix tienen niveles mayores de expresión de Notch comparado con tejido normal (Solicitud de PCT WO/07474). En consecuencia, el tratamiento de dicho cáncer podría comprender la administración al sujeto de un producto terapéutico con Delta3 que reduce la interacción de Notch con Delta3. Otros cánceres que pueden tratarse o prevenirse con una proteína Delta3 incluyen sarcomas y carcinomas, por ej., cáncer de pulmón, cáncer del esófago, cáncer de pulmón, melanoma, seminoma, y adenocarcinoma escamoso. Los tumores sólidos adicionales dentro del alcance de la invención incluyen aquellos que pueden encontrarse en un libro de textos médicos. La afección que debe tratarse o prevenirse también puede ser un tumor soluble, tal como leucemia, ya sea crónica o aguda, incluyendo leucemia mielógena crónica o aguda, leucemia linfocítica crónica o aguda, leucemia promielocítica, leucemia monocítica, leucemia mielomonocítica, y eritroleucemia. Incluso otros trastornos proliferativos que pueden tratarse con un producto terapéutico con Delta3 de la invención incluyen enfermedad de cadena pesada, mieloma múltiple, linfoma, por ej., linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin, macroglobulemia de Waldenstroem, y trastornos fibroproliferativos, en particular del tejido cerebravascular.

Las enfermedades o afecciones caracterizadas por un tumor sólido o soluble pueden tratarse administrando un producto terapéutico con Delta3 ya sea en forma local o sistémica, tal que la proliferación de las células que tienen una proliferación aberrante se inhibe o se reduce. Los métodos para administrar los compuestos de la invención se describen a continuación en mayor detalle.

La invención provee, además, métodos para prevenir la formación y/o desarrollo de tumores. Por ejemplo, el desa-
rrollo de un tumor puede precederse con la presencia de una lesión específica, tal como una lesión pre-neoplásica, por ej., hiperplasia, metaplasia, y displasia. Dichas lesiones pueden encontrarse, por ej., en tejido epitelial. De este modo, la invención provee un método para inhibir la progresión de dicha lesión en una lesión neoplásica, que comprende administrar al sujeto que tiene una lesión pre-neoplásica una cantidad de un producto terapéutico con Delta3 suficiente para inhibir la progresión de la lesión pre-neoplásica en una lesión neoplásica.

En una realización preferida, la invención provee un método para inhibir la proliferación y/o diferenciación de células endoteliales, que comprende poner en contacto un producto terapéutico con Delta3 con a tejido en el cual las células endoteliales son proliferativas, tal como un tumor en desarrollo o una enfermedad hiperproliferativa, es decir una enfermedad asociada con la proliferación celular anormal. El bloqueo de la proliferación de células endoteliales producirá la inhibición del desarrollo del endotelio y vasos sanguíneos, limitando de este modo el acceso al tumor de los compuestos necesarios para el desarrollo del tumor.

La invención provee, además, métodos para tratar o prevenir enfermedades o afecciones asociadas con la proliferación celular insuficiente. Por ejemplo, los productos terapéuticos que contienen Delta3 pueden usarse para estimular la reparación de tejidos, regeneración y/o cicatrización de heridas, por ej. de tejido neural, tal como luego de la cirugía o para estimular la cicatrización del tejido que sufrió quemaduras. Otra enfermedad en la cual la proliferación de las células se desea son las enfermedades hipoproliferativas, es decir, enfermedades caracterizadas por una proliferación anormalmente baja en ciertas células.

Incluso en otra realización, la invención provee un método para tratar o prevenir enfermedades o afecciones caracterizadas por diferenciación celular aberrante. En consecuencia, la invención provee métodos para estimular la diferenciación celular en afecciones caracterizadas por una inhibición de diferenciación celular normal que puede o no acompañarse por proliferación excesiva. En forma alternativa, los productos terapéuticos que contienen Delta3 pueden usarse para inhibir diferenciación de células específicas.

En un método preferido, la célula que prolifera y/o se diferencia de manera aberrante es una célula presente en el sistema nervioso. En consecuencia, la invención provee métodos para tratar enfermedades o afecciones asociadas con el sistema nervioso central o periférico. Por ejemplo, la invención provee métodos para tratar lesiones del sistema nervioso que implica una actividad aberrante de Delta3 en las neuronas, en células de Schwann, células gliales, u otros tipos de células neurales. Los trastornos del sistema nervioso se indicaron con anterioridad.

En otra realización, la invención provee un método para potenciar la sobrevida y/o estimular la proliferación y/o diferenciación de células y tejidos in vitro. Por ejemplo, los tejidos de un sujeto pueden obtenerse y cultivarse in vitro en presencia de un producto terapéutico que contiene Delta3, tal que las células del tejido se estimulan para proliferar y/o diferenciarse. El tejido puede re-administrarse luego al sujeto.

Dado que, en algunos casos, los genes pueden regularse por aumento en un estado patológico y en otros casos pueden regularse por disminución, se deseará activar y/o potenciar o suprimir y/o modular hacia abajo la bioactividad de Delta3 dependiendo de la afección que desea tratarse usando las técnicas, los compuestos y métodos descritos aquí. Algunos genes pueden expresarse hacia abajo en ciertos estados patológicos. La actividad de los productos génicos con Delta3 puede perjudicarse en cierto modo, conduciendo al desarrollo de síntomas de enfermedades neurodegenerativas. La regulación hacia abajo de la expresión génica de Delta3 o la reducción en la actividad de una proteína Delta3 puede tener un efecto causante o exacerbante del estado patológico.

Entre los enfoques que pueden usarse para atenuar los síntomas de la enfermedad que implican la expresión errónea de un gen Delta3 son, por ejemplo, moléculas antisentido, de ribozimas, y de triple hélice descritas con anterioridad. Los compuestos que compiten con una proteína Delta3 para unirse a elementos ascendentes o descendentes en la cascada de señalización de Delta/Notch antagonizarán una proteína Delta3, induciendo de este modo un efecto terapéutico. Algunos ejemplos de compuestos apropiados incluyen los antagonistas o homólogos descritos anteriormente en detalle. En otros casos, la aumentada expresión o bioactividad de una proteína Delta3 puede ser deseable y puede lograrse, por ejemplo, por el uso de agonistas o miméticos de Delta3 o por terapia de reemplazo génico, como se describe aquí.

Incluso otros productos terapéuticos que contienen Delta3 consisten en un primer péptido que comprende un péptido Delta3 capaz de unirse a un receptor, por ej., un receptor de Notch, y un segundo péptido que es citotóxico. Dichos productos terapéuticos pueden usarse para buscar específicamente y lisar células que expresan o sobre-expresan un receptor para Delta3. Por ejemplo, una proteína de fusión que contiene un péptido Delta3 fusionada a un péptido citotóxico puede usarse para eliminar o reducir un tumor que sobre-expresa Notch, por ej., tumores neoplásicos de colon y cuello. En forma alternativa, las células que expresan o que sobreexpresan Delta3 pueden orientarse para lisis, por ejemplo, orientando a la célula un anticuerpo que se une específicamente a una proteína Delta3 ligada a un péptido citotóxico.

Basado por lo menos en parte en la similitud de la estructura de la proteína, es probable que los productos terapéuticos que contienen Delta3 también puedan usarse para tratar enfermedades o afecciones causadas por o a las que contribuyen una actividad aberrante de Delta, por ej. una actividad aberrante de Delta1 o Delta2 o enfermedades o trastornos que están asociados con uno o más alelos específicos de Delta, por ej., alelos de Delta1 o Delta2. Dichas enfermedades o afecciones podrían incluir enfermedades neurológicas y cáncer. De manera similar, los productos terapéuticos que contienen Delta, por ej., productos terapéuticos con Delta1 o Delta2, podrían usarse para prevenir o tratar enfermedades o trastornos causados por o a los que contribuyen una actividad aberrante de Delta3, o enfermedades o trastornos que están asociados con un alelo específico de Delta3. Los productos terapéuticos que contienen Delta pueden prepararse usando, por ej., la información sobre secuencia de nucleótidos o proteínas revelada en la Solicitud de Patente por PCT WO 97/01571 y evaluarse usando los ensayos descritos aquí para evaluar productos terapéuticos que contienen Delta3.

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Los compuestos identificados como que aumentan o reducen la expresión del gen Delta3 o la actividad de la proteína puede administrarse a un sujeto a una dosis terapéuticamente efectiva para tratar o atenuar una enfermedad cardiovascular. Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a esa cantidad del compuesto suficiente para producir el alivio de los síntomas asociados con la enfermedad particular.

4.5.1 Dosis Efectiva

La toxicidad y la eficacia terapéutica de dichos compuestos puede determinarse por procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o animales experimentales, por ej., para determinar la LD_{50} (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED_{50} (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD_{50}/ED_{50}. Los compuestos que exhiben grandes índices terapéuticos son los preferidos. Mientras que los compuestos que exhiben efectos colaterales tóxicos pueden usarse, debe tenerse cuidado para diseñar un sistema de administración que oriente dichos compuestos al sitio de tejido afectado para minimizar el daño potencial a células no infectadas y, de este modo, reducir los efectos colaterales.

Los datos obtenidos de ensayos en cultivo celular y estudios en animales pueden usarse en la formulación de un rango de dosificación para usar en humanos. La dosificación de dichos compuestos se encuentra con preferencia dentro de un rango de concentraciones en circulación que incluyen la ED_{50} con escasa o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente de ensayos de cultivo celular. Una dosis puede formularse en modelos en animales para lograr una concentración plasmática en circulación que incluye la IC_{50} (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) según se determinó en cultivo celular. Dicha información puede usarse para determinar más precisamente las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, por cromatografía líquida de alta resolución.

5.2. Formulación y uso

Las composiciones farmacéuticas para usar de acuerdo con la presente invención pueden formularse de manera convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. De este modo, los compuestos y sus sales y solvatos fisiológicamente aceptables pueden formularse para administración por, por ejemplo, inyección, inhalación o insuflación (ya sea a través de la boca o la nariz) o administración oral, bucal, parenteral o rectal.

Para dicha terapia, los oligómeros de la invención pueden formularse para una variedad de cargas de administración, incluyendo administración sistémica y tópica o localizada. Las técnicas y formulaciones generalmente pueden encontrarse en Remmington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PA. Para administración sistémica, se prefiere la inyección, incluyendo intramuscular, endovenosa, intraperitoneana, y subcutánea. Para inyección, los oligómeros de la invención pueden formularse en soluciones líquidas, con preferencia en buffers fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank o solución de Ringer. Además, los oligómeros pueden formularse en forma sólida y re-disolverse o suspenderse inmediatamente antes de usar. También se incluyen las formas liofilizadas.

Para administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden adoptar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparados por medios convencionales con excipientes aceptables desde el punto de vista farmacéutico tal como agentes aglutinantes (por ej., almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); rellenos (por ej., lactosa, celulosa microcristalina o hidrógeno fosfato de calcio); lubricantes (por ej., estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (por ej., almidón de papa o almidón glicolato de sodio); o agentes humectantes (por ej., laurilsulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse por métodos conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como producto anhidro para constitución con agua u otro vehículo apropiado antes de usar. Dichas preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos aceptables desde el punto de vista farmacéutico tales como agentes de suspensión (por ej., jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ej., lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ej., aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ej., p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales reguladoras del pH, agentes saborizantes, colorantes y edulcorantes, según resulte apropiado.

Las preparaciones para administración oral pueden formularse en forma apropiada para dar una liberación controlada del compuesto activo.

Para administración bucal las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.

Para administración por inhalación, los compuestos para usar de acuerdo con la presente invención se administran de manera conveniente en la forma de un aerosol en presentación en rocío de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente apropiado, por ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas apropiado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede determinarse suministrando una válvula para administrar una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de por ej. gelatina para usar en un inhalador o insuflador que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo apropiada tal como lactosa o almidón.

Los compuestos pueden formularse para administración parenteral por inyección, por ej., por inyección en bolo o por infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ej., en ampollas o en recipientes de dosis múltiples, con un conservante agregado. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. En forma alternativa, el componente activo puede encontrarse en forma de polvo para constitución con un vehículo apropiado, por ej., agua estéril sin contenido de pirógenos, antes de usar.

Los compuestos pueden formularse también en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, por ej., que contiene bases convencionales para supositorios tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos también pueden formularse como preparación de depósito. Dichas formulaciones de acción prolongada puede administrarse por implante (por ejemplo por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. De este modo, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrofóbicos apropiados (por ejemplo como una emulsión en un aceite apropiado) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera que desea traspasarse. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa sales biliares y derivados de ácido fusídico. Además, pueden usarse detergentes para facilitar la penetración. La administración transmucosa puede ser a través de aerosoles nasales o con el uso de supositorios. Para administración tópica, los oligómeros de la invención se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas, como se conoce generalmente en la técnica.

En el marco clínico, los sistemas de administración de genes para el gen terapéutico Delta3 pueden introducirse en un paciente a través de una cantidad de métodos, cada uno de los cuales es familiar en la técnica. Por ejemplo, una preparación farmacéutica del sistema de administración de genes puede introducirse sistémicamente, por ej. por inyección endovenosa, y la transducción específica de la proteína en las células blanco ocurre en forma predominante a partir de la especificidad de la transfección provista por el vehículo de administración de genes, el tipo de célula la expresión del tipo de tejido debido a las secuencias reguladoras de la transcripción que controlan la expresión del gen receptor, una combinación de los anteriores. En otras realizaciones, la administración inicial del gen recombinante se limita aun más con la introducción en el animal resultando bastante localizada. Por ejemplo, el vehículo de administración de genes puede introducirse por catéter (ver Patente de los Estados Unidos 5.328.470) o por inyección estereotáctica (por ej. Chen et al. (1994) PNAS 91: 30543057). Un gen Delta3, tal como cualquiera de las secuencias representadas en el grupo formado por la SEC ID NO: 1 o 3, o una secuencia homóloga a ésta puede administrarse en una construcción de terapia génica por electroporación usando técnicas descritas, por ejemplo, por Dev et al. ((1994) Cáncer Treat Rev 20:105-115).

La preparación farmacéutica de la construcción de terapia génica puede consistir, en esencia, en el sistema de administración de genes en un diluyente aceptable o puede comprender una matriz de liberación lenta en la cual el vehículo de administración de genes está embebido. En forma alternativa, donde puede producirse el sistema de administración de genes completo intacto a partir de células recombinantes, por ej. vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede comprender una o más células que producen el sistema de administración de genes.

Las composiciones pueden, si se desea, estar presentes en un paquete o dispositivo de administración que puede contener una o más formas de dosificación que contienen el componente activo. El paquete puede comprender, por ejemplo, una película de plástico o metal, tal como un envase tipo blister. El envase o dispositivo dispensador puede acompañarse de instrucciones para administración.

4.6 Ensayos de Diagnóstico y Pronóstico

Los presentes métodos proveen medios para determinar si un sujeto presenta riesgo de desarrollar un trastorno caracterizado por una actividad aberrante de Delta3, tal como proliferación celular aberrante, degeneración y/o diferenciación que producen, por ejemplo, una enfermedad neurodegenerativa o cáncer. La invención provee, además, métodos para determinar si un sujeto presenta riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con uno o más alelos específicos de un gen Delta3. De hecho, los alelos específicos de Delta3 pueden asociarse con enfermedades o trastornos específicos. En consecuencia, la invención provee métodos para determinar si un sujeto tiene o presenta riesgo de desarrollar una enfermedad neurológica, por ejemplo, ACCNP. En otra realización, la invención provee métodos para determinar si un sujeto tiene o presenta riesgo de desarrollar un trastorno vascular asociado con la determinación del destino de la célula.

En una realización, la invención provee un método para determinar si un sujeto tiene lesión genética en un gen Delta3 una variante alélica específica de una región polimórfica en un gen Delta3. El alelo específico puede ser un alelo mutante. En otra realización, la invención provee métodos para determinar si un sujeto tiene una proteína Delta3 aberrante, como resultado de modificaciones post-traducción aberrantes de la proteína, tales como la fosforogulación o glicosilación aberrantes. Además, dentro del alcance de la invención se encuentran los métodos para determinar si un sujeto tiene un nivel de expresión aberrante de una proteína Delta3, que podría deberse a una lesión genética en el gen Delta3 o debido a un nivel aberrante o actividad de una proteína que regula la expresión de un gen
Delta3.

En realizaciones preferidas, pueden caracterizarse métodos que comprenden detectar, en una muestra de células del sujeto, la presencia o ausencia de una lesión genética caracterizada por, por lo menos una de: (i) una alteración que afecta la integridad de un gen que codifica una proteína Delta, o (d) la expresión equivocada de un gen Delta3. Para ilustrar, dichas lesiones genéticas pueden detectarse asegurando la existencia de por lo menos una de: (i) una supresión de uno o más nucleótidos de un gen Delta3, (ii) una incorporación de uno o más nucleótidos a un gen Delta3, (iii) una sustitución de uno o más nucleótidos de un gen Delta3, (iv) un reordenamiento cromosómico general de un gen Delta3, (v) una alteración general en el nivel de una transcripción de ARN mensajero de un gen Delta3, (vii) modificación aberrante de un gen Delta3, tal como el del patrón de metilación del ADN genómico, (vii) la presencia de un patrón de empalme del tipo no salvaje de una transcripción de ARN mensajero de un gen Delta3, (viii) un nivel de tipo no salvaje de una proteína Delta, (ix) pérdida alélica de un gen Delta3, y (x) modificación inapropiada post-traducción de una proteína delta. Como se indica a continuación, la presente invención provee un extenso número de técnicas de ensayo para detectar lesiones en un gen Delta3, y lo que es importante, provee la capacidad de discernir entre diferentes causas moleculares que subyacen a la proliferación celular aberrante y/o diferenciación dependiente de Delta3.

Para determinar si un sujeto tiene o presenta riesgo de desarrollar una enfermedad o afección asociada con un alelo específico de un gen Delta3, pueden realizarse experimentos preliminares para determinar la identidad del alelo asociado con una enfermedad. Por ejemplo, para determinar la identidad del alelo hDelta3 asociado con ACCNP, se puede realizar estudios de detección de mutaciones del gen Delta3 en poblaciones que tienen un alto riesgo de desarrollar ACCNP. Por ejemplo, se puede realizar análisis de detección de mutaciones del ADN genómico de sujetos en la población Franco-Canadiense en las regiones de Charlevoix y Saguenay-Lac St Jean de la provincia de Quebec (Casaubon et al., referencia anterior). Dicho análisis revelará la identidad del alelo Delta3 o alelos asociados con ACCNP. La comparación del alelo Delta3 de un sujeto con este alelo o alelos asociados con ACCNP indicará si un sujeto tiene un alelo Delta3 asociado con ACCNP y de este modo si el sujeto tiene o es probable que desarrolle ACCNP. De manera similar, el análisis de detección de mutaciones también puede llevarse a cabo para determinar la identidad de alelos Delta3 asociados con otras enfermedades o afecciones.

En una realización ejemplificativa, se provee una composición con ácido nucleico que comprende una sonda de oligonucleótido (purificada) que incluye una región de la secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse a una secuencia homosentido o antisentido de un gen Delta3, tal como se representa a través de cualquiera de las SEC ID Nos: 1 y 3, sus alelos; sus mutantes naturales o secuencias que flanquean la región 5' o 3' o secuencias intrónicas asociadas naturalmente con los genes Delta3 de la invención o sus mutantes naturales. El ácido nucleico de una célula se torna accesible para hibridación, la sonda se expone al ácido nucleico de la muestra, y se detecta la hibridación de la sonda a la muestra de ácido nucleico. Dichas técnicas puede usarse para detectar lesiones tanto a nivel de ARNm o genómico, incluyendo supresiones, sustituciones, etc., como también para determinar los niveles de transcripción de ARNm.

Como se indicó con anterioridad, un aspecto de la presente invención se refiere a ensayos de diagnóstico para determinar en el contexto de células aisladas de un paciente, si han surgido mutaciones en uno o más genes Delta3 de las células de la muestra. El presente método provee un método para determinar si un sujeto presenta riesgo de un trastorno caracterizado por la actividad de Delta3 aberrante, por ej., proliferación y/o diferenciación celular. En realizaciones preferidas, el método puede caracterizarse generalmente porque comprende detectar, en una muestra de células del sujeto, la presencia o ausencia de una lesión genética caracterizada por una alteración que afecta la integridad de un gen que codifica una proteína Delta. Para ilustrar, dichas lesiones genéticas pueden detectarse asegurando la existencia de por lo menos una de (i) una supresión de uno o más nucleótidos from a Delta-gene, (u) una incorporación de uno o más nucleótidos a un gen Delta, (iii) una sustitución de uno o más nucleótidos de un gen Delta, y (v) la presencia de un patrón de empalme de tipo no salvaje de una transcripción de ARN mensajero de un gen Delta. Como se indica a continuación, la presente invención provee un extenso número de técnicas de ensayo para detectar lesiones en genes Delta3, y lo que es importante, provee la capacidad de discernir entre diferentes causas moleculares que subyacen a la diferenciación y/o proliferación aberrante dependiente de Delta.

En ciertas realizaciones, la detección de la lesión en un gen Delta o la identidad de una variante alélica de una región polimórfica de un gen Delta comprende utilizar la sonda/el cebador en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (ver, por ej. Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.683.195 y 4.683.202), tal como PCR ancla o RACE PCR, o, en forma alternativa, en una reacción en cadena de ligación (LCR) (ver, por ej., Landegran et al. (1988) Science 241:1077-1080; y Nakazawa et al. (1994) PNAS 91:360-364), la último de los cuales puede ser particularmente útil para detectar mutaciones de punto en el gen Delta (ver Abravaya et al. (1995) Nuc Acid Res 23:675-682). En una realización meramente ilustrativa, el método incluye los pasos de (i) obtener una muestra de células de un paciente, (ii) aislar ácido nucleico (por ej., genómico, ARNm o ambos) de las células de la muestra, (iii) poner en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores que se hibridan específicamente a un gen Delta en condiciones tales que ocurre la hibridación y amplificación del gen Delta (si está presente), y (iv) detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación, o detectar el tamaño del producto de amplificación y comparar la longitud con una muestra de control. Se anticipa que la PCR y/o LCR pueden ser deseables para usar como paso de amplificación preliminar en conjunción con cualquiera de las técnicas usadas para detectar mutaciones descritas aquí.

Los métodos de amplificación alternativos incluyen: replicación auto-sostenida de secuencias (Guatelli, J.C. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificación de la transcripción (Kwoh, D. Y. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-Beta Replicasa (Lizardi, P.M. et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), o cualquier otro método de amplificación del ácido nucleico, seguido de la detección de estas moléculas amplificadas usando técnicas conocidas por aquellas personas con experiencia en la técnica. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si dichas moléculas están presentes en cantidades muy bajas.

En una realización preferida del ensayo de la invención, las mutaciones en un gen Delta3 o alelos específicos de un gen Delta3 de una célula de muestra se identifican por las alteraciones en los patrones de ruptura de la enzima de restricción. Por ejemplo, se aísla ADN de muestra y de control, se amplifica (opcionalmente), se digiere con una o más endonucleasas de restricción, y se determinan las longitudes de los fragmentos por electroforesis en gel. Más aun, el uso de ribozimas específicos de la secuencia (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5.498.531) puede usarse para calificar la presencia de mutaciones específicas por el desarrollo o pérdida de un sitio de ruptura de la ribozima.

Incluso en otra realización, puede usarse cualquiera de una variedad de reacciones de secuenciación conocidas en la técnica para secuenciar directamente el gen Delta3 y detectar mutaciones o variantes alélicas de regiones polimórficas comparando la secuencia de la muestra Delta3 con la correspondiente secuencia de tipo salvaje (control). Las reacciones de secuenciación ejemplificativas incluyen aquellas basadas en las técnicas desarrolladas por Maxim y Gilbert (Proc. Natl Acad Sci USA (1977) 74:560) o Sanger (Sanger et al (1977) Proc. Nat. Acad. Sci 74:5463). También se contempla que cualquiera de una variedad de procedimientos automáticos de secuenciación pueden utilizarse cuando se realizan ensayos de la invención (Biotécnicas (1995) 19:448), incluyendo secuenciación por espectrometría de masa (ver, por ejemplo Publicación por PCT WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv Chromatogr 36:127-162; y Griffin et al. (1993) Appl Biochem Biotechnol 38:147 159). Será evidente para una persona con experiencia en la técnica que, para ciertas realizaciones, la aparición de sólo una, dos o tres de las bases de ácido nucleico debe determinarse en la reacción de secuenciación. Por ejemplo, puede llevarse a cabo A-tract o similar, por ej., donde sólo se detecta un ácido nucleico.

En una realización adicional, puede usarse la protección de agentes de ruptura (tales como una nucleasa, hidroxilamina o tetróxido de osmio y con piperidina) para detectar bases sin equivalencia en heterodúplex ARN/ARN o ARN/ADN (Myers, et al. (1985) Science 230:1242). En general, la técnica de "ruptura sin equivalencias" se inicia proveyendo héteroduplex formados por hibridación (marcados) de ADN o ARN que contienen la secuencia Delta3 de tipo salvaje con ADN o ARN potencialmente mutantes obtenidos de una muestra de tejido. Los dúplex de doble hebra se tratan con un agente que disocia regiones de hebra simple del dúplex tales como las que existirán debido a no correspondencias en los pares de bases entre las hebras de control y de muestra. Por ejemplo, los dúplex de ARN/DNA pueden tratarse con RNasa y los híbridos de ADN/ADN tratarse con S1 nucleasa para digerir enzimáticamente las regiones sin equivalencias. En otras realizaciones, puede tratarse cualquiera de los dúplex ADN/ADN o ARN/ADN con hidroxilamina o tetróxido de osmio y con piperidina para digerir regiones sin equivalencias. Luego de la digestión de las regiones no equivalentes, el material resultante se separa por tamaños en geles de poliacrilamida desnaturalizantes para determinar el sitio de mutación. Ver, por ejemplo, Cotton et al (1988) Proc. Natl Acad Sci USA 85:4397; Saleeba et al (1992) Methods Enzymod. 217:286-295. En una realización preferida, el ADN o ARN de control puede marcarse para la detección.

Incluso en otra realización, la reacción de disociación no equivalente emplea una o más proteínas que reconocen los pares no equivalentes en ADN de doble hebra (llamado enzimas "de reparación de no correspondencia de ADN") en sistemas definidos para detectar y mapear mutaciones puntuales en ADNc de Delta3 obtenidos de muestras de células. Por ejemplo, la enzima mutY de E. coli disocia A en las no correspondencias G/A y la glicosilasa de SDN timidina de las células HeLa disocian T en las no correspondencias G/T (Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662). De acuerdo con una realización ejemplificativa, una sonda basada en una secuencia de Delta3, por ej. una secuencia de Delta3 de tipo salvaje, se hibrida a un ADNc o u otro producto de ADN de la(s) célula(s) evaluadas. El dúplex se trata con la enzima de reparación de no correspondencia de ADN, y los productos de disociación, si los hay, pueden detectarse a partir de protocolos de electroforesis o similares. Ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos 5.459.039.

En otras realizaciones, se usarán alteraciones en la movilidad electroforética para identificar mutaciones en los genes Delta3 o para determinar la identidad del alelo Delta3. Por ejemplo, puede usarse polimorfismo de conformación de hebra simple (SSCP) para detectar diferencias en la movilidad electroforética entre ácidos nucleicos mutantes y de tipo salvaje (Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA 86:2766, ver también Cotton (1993) Mutat Res 285:125-144; y Hayashi (1992) Genet Anal Tech AppI 9:73-79). Los fragmentos de ADN de hebra simple de los ácidos nucleicos Delta3 de muestra y de control se desnaturalizarán y se les permitirá renaturalizarse. La estructura secundaria de los ácidos nucleicos de hebra simple varía de acuerdo con la secuencia, la alteración resultante en la movilidad electroforética permite la detección de incluso un cambio en una única base. Los fragmentos de ADN pueden marcarse o detectarse con sondas marcadas. La sensibilidad del ensayo puede potenciarse usando ARN (en lugar de ADN), en la cual la estructura es más sensible a un cambio en su secuencia. En una realización preferida, el método de la invención utiliza análisis de héteroduplex para separar moléculas de heterodúplex sobre la base de los cambios en la movilidad electroforética (Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5).

Incluso en otra realización el movimiento de fragmentos mutantes o de tipo salvaje en los geles de poliacrilamida que contienen un gradiente de desnaturalizador se evalúa usando electroforesis en gel con gradiente desnaturalizador (DGGE) (Myers et al (1985) Nature 313:495). Cuando se usa DGGE como método de análisis, el ADN se modificará para asegurar que no se desnaturalice completamente, por ejemplo, agregando un clamp de GC de aproximadamente 40 pb de ADN rico en GC de alto punto de fusión por PCR. En una realización adicional, se usa un gradiente de temperatura en lugar de un agente desnaturalizante para identificar diferencias en la movilidad del ADN de muestra y de control (Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys Chem 265:12753).

Ejemplos de otras técnicas para detectar mutaciones puntuales incluyen, sin carácter limitativo, hibridación selectiva de oligonucleótidos, amplificación selectiva, o extensión de cebador selectiva. Por ejemplo, pueden prepararse los cebadores de oligonucleótidos en los cuales la mutación conocida se coloca centralmente y luego se hibrida a un ADN blanco en condiciones que permiten la hibridación sólo si se encuentra una equivalencia perfecta (Saiki et al. (1986) Nature 324:163); Saiki et al (1989) Proc. Natl Acad. Sci USA 86:6230). Dichas técnicas de hibridación de oligonucleótidos específicas del alelo pueden usarse para evaluar una mutación por reacción cuando los oligonucleótidos se hibridan a un ADN blanco amplificado por PCR o una cantidad de diferentes mutaciones cuando los oligonucleótidos se unen a la membrana de hibridación y se hibridan con el ADN blanco marcado.

En forma alternativa, puede usarse la tecnología de amplificación específica del alelo que depende de la amplificación selectiva por PCR en conjunción con la presente invención. Los oligonucleótidos usados como cebadores para amplificación específica pueden transportar la mutación de interés en el centro de la molécula (tal que la amplificación dependa de hibridación diferencial) (Gibbs et al (1989) Nucleic Acid Res. 17:2437-2448) o en el extremo terminal 3' de un cebador en el cual, en las condiciones apropiadas, la no correspondencia pueda evitar o reducir la extensión de la polimerasa (Prossner (1993) Tibtech 11:238. Además puede desearse introducir un nuevo sitio de restricción de la mutación para crear la detección basada en la ruptura (Gasparini et al (1992) Mol. Cell Probes 6:1). Se anticipa que en ciertas realizaciones puede realizarse amplificación también usando ligasa Taq para amplificación (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189). En dichos casos, ocurrirá ligación si hay una perfecta correspondencia en el extremo 3' de la secuencia 5' haciendo posible detectar la presencia de una mutación conocida en un sitio específico buscando la presencia o ausencia de amplificación.

Otra realización de la invención provee una composición con ácido nucleico que comprende una sonda de oligonucleótidos (purificada) que incluye una región de la secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse a una secuencia homosentido o antisentido de un gen Delta, o sus mutantes naturales, o secuencias que flanquean la región 5' o 3' o secuencias intrónicas asociadas naturalmente con los genes Delta de la invención o sus mutantes naturales. El ácido nucleico de una célula se torna accesible para hibridación, la sonda se expone al ácido nucleico de la muestra, y se detecta la hibridación de la sonda a la muestra ácido nucleico. Dichas técnicas pueden usarse para detectar lesiones tanto a nivel genómico como de ARNm, incluyendo supresiones, sustituciones, etc., como también para determinar niveles de transcripción de ARNm. Dichas sondas de oligonucleótidos pueden usarse tanto para la evaluación predictiva como terapéutica de mutaciones alélicas que podrían manifestarse, por ejemplo, en trastornos neurodegenerativos, neoplásicos o hiperplásicos (por ej. crecimiento celular aberrante).

Los métodos descritos aquí pueden realizarse, por ejemplo, utilizando kits de diagnóstico pre-envasados que comprenden por lo menos una sonda de ácido nucleico o reactivo de anticuerpo descritos aquí, que pueden usarse en forma conveniente, por ej., en marcos clínicos para diagnosticar pacientes que exhiben síntomas o antecedentes familiares de de una enfermedad o dolencia que involucra a un gen Delta3.

Cualquier tipo de célula o tejido, con preferencia pueden utilizarse células neurales o células endoteliales, en las cuales la Delta3 se expresa en los diagnósticos descritos a continuación. Por ejemplo, puede obtenerse el líquido corporal de un sujeto (por ej. sangre) por técnicas conocidas (por ej. punción en la vena). En forma alternativa, pueden realizarse pruebas del ácido nucleico en muestras secas (por ej. cabello o piel). Pueden obtenerse muestras de ácido nucleico fetal de sangre materna como se describe en la Solicitud de Patente Internacional No. W09/107660 concedida a Bianchi. En forma alternativa, pueden obtenerse amniocitos o vello coriónico para realizar evaluación prenatal, por ej., de ACCNP, que es una enfermedad que usualmente es fatal en la tercera década de vida.

También pueden realizarse procedimientos de diagnóstico in situ directamente sobre secciones de tejido (fijas y/o congeladas) de tejido de un paciente obtenido de biopsias o resecciones, tal que no es necesaria la purificación del ácido nucleico. Pueden usarse reactivos de ácido nucleico como sondas y/o cebadores para procedimientos in situ (ver, por ejemplo, Nuovo, G.J., 1992, PCR in situ hibridation: protocols and applications, Raven Press, NY).

Además de métodos que se centran principalmente en la detección de una secuencia de ácido nucleico, también pueden evaluarse los perfiles en dichos esquemas de detección. Los perfiles de huellas digitales pueden generarse, por ejemplo, usando un procedimiento de visualización diferencial, análisis tipo Northern y/o RT-PCR.

Los anticuerpos dirigidos contra proteínas Delta3 mutantes o de tipo salvaje que se describieron anteriormente, también pueden usarse en diagnósticos y pronósticos de enfermedades. Dichos métodos de diagnóstico pueden usarse para detectar anormalidades en el nivel de expresión de proteína Delta3, o anormalidades en la estructura y/o tejido, ubicación celular o subcelular de proteínas Delta3. Las diferencias estructurales incluyen, por ejemplo, diferencias en el tamaño, electronegatividad, o antigenicidad de la proteína Delta3 mutante relativa a la proteína Delta3 normal. La proteína del tejido o tipo de célula que se analizará puede detactarse o aislarse muy fácilmente usando técnicas que son conocidas para aquellas personas con experiencia en la técnica, incluyendo, sin carácter limitativo, análisis de transferencia western. Para obtener una explicación detallada de métodos para llevar a cabo análisis de western blot, ver Sambrook et al, 1989, referencia anterior, en el Capítulo 18. La detección de la proteína y métodos de aislamiento empleados aquí también pueden ser tales como los que se describen en Harlow and Lane, por ejemplo, (Harlow, E and Lane, D., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), que se incorpora aquí a modo de referencia en su totalidad.

Esto puede lograrse, por ejemplo, por técnicas de inmunofluorescencia empleando un anticuerpo marcado en forma fluorescente (ver abajo) acoplado con microscopía luminosa, citometría de flujo, o detección fluorimétrica. Los anticuerpos (o sus fragmentos) útiles en la presente invención pueden, en forma adicional, pueden emplearse histológicamente, como en el caso de microscopía por inmunofluorescencia o inmunoelectrones, para la detección in situ de proteínas Delta3. La detección in situ puede lograrse eliminando un espécimen histológico de un paciente, y aplicando a éste un anticuerpo marcado de la presente invención. El anticuerpo (o fragmento) se aplica con preferencia superponiendo el anticuerpo (o fragmento) marcado sobre una muestra biológica. A través del uso de dicho procedimiento, es posible determinar no solo la presencia de la proteína Delta3, aunque también su distribución en el tejido examinado. Usando la presente invención, una persona con experiencia normal en la técnica percibirá ampliamente que cualquiera de una variedad de métodos histológicos (tales como procedimientos de manchado) puede modificarse para lograr dicha detección in situ.

Con frecuencia se usa un soporte o vehículo de fase sólida como soporte capaz de unirse a un antígeno o un anticuerpo. Los soportes o vehículos conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabbros, y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser tanto soluble hasta cierto grado o insoluble para los fines de la presente invención. El material soporte puede tener virtualmente cualquier configuración estructural posible en tanto la molécula acoplada sea capaz de unirse a un antígeno o anticuerpo. De este modo, la configuración de soporte puede ser esférica, como en una perla, o cilíndrica, como dentro de la superficie de un tubo de ensayo, o la superficie externa de una varilla. En forma alternativa, la superficie puede ser plana tal como una hoja, una tira de prueba, etc. Los soportes preferidos incluyen perlas de poliestireno. Aquellas personas con experiencia en la técnica conocerán muchos otros vehículos apropiados para unirse al anticuerpo o antígeno, o serán capaces de determinarlos con el uso de experimentación de
rutina.

Un medio para marcar el anticuerpo específico de la proteína anti-Delta3 es a través de ligadura a una enzima y uso de un inmunoensayo enzimático (EIA) (Voter, "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", Diagnostic Horizons 2:1-7, 1978, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD; Volley, et al., J. Clin.
Pathol. 31:507520 (1978); Butler, Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981); Maggio, (ed.) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL, 1980; Ishikawa, et al., (eds.) Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo, 1981). La enzima que se une al anticuerpo reaccionará con un sustrato apropiado, con preferencia un sustrato cromogénico, en un modo tal que produzca un resto químico que pueda detectarse, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorimétricos o visuales. Las enzimas que pueden usarse para marcar el anticuerpo en forma detectable incluyen, sin carácter limitativo, malato deshidrogenasa, nucleasa de staphilococco, delta-5-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa. La detección puede lograrse por métodos colorimétricos que emplean un sustrato cromogénico para la enzima. La detección también puede lograrse por comparación visual del grado de reacción enzimática de un sustrato en comparación con estándares preparados de manera similar.

La detección también puede lograrse usando cualquiera de una variedad de otros immunoensayos. Por ejemplo, por rotulación radiactiva de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, es posible detectar péptidos mutantes o tipo salvaje del gen de huellas digitales a través del uso de un radioinmunoensayo (RIA) (ver, por ejemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, que se incorpora aquí a modo de referencia). El isótopo radiactivo puede detectarse por medio del uso de un contador gamma o un contador de centelleo o por auto-radiografía.

También es posible marcar el anticuerpo con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado en forma fluorescente se expone a luz de longitud de onda apropiada, su presencia puede detectarse luego debido a la fluorescencia. Entre los compuestos de marcación fluorescentes usados más comúnmente se encuentran el isotiocianato fluorescente, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, \Omega-ftaldehído y fluorescamina.

El anticuerpo puede marcarse en forma detectable usando metales que emiten fluorescencia tales como ^{152}Eu, u otros de la serie de los lantánidos. Estos metales pueden unirse al anticuerpo usando grupos secuestrantes de metales tales como ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

El anticuerpo también puede marcarse en forma detectable acoplándolo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo marcado en forma quimioluminiscente se determina luego detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el curso de una reacción química. Ejemplos de compuestos marcados en forma quimioluminiscente útiles en particular son luminol, isoluminol, éster teromático de acridinio, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato.

Del mismo modo, un compuesto bioluminiscente puede usarse para marcar el anticuerpo de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrada en sistemas biológicos en los cuales la proteína catalítica aumenta la eficiencia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes importantes para los fines de la marcación son la luciferina, luciferasa y acuorina.

Más aun, se entenderá que cualquiera de los métodos anteriores para detectar alteraciones, en un gen de Delta3 o producto génico, puede usarse para monitorear el curso de un tratamiento o terapia.

4.7 Ensayos de Exploración Farmacológica

La invención provee compuestos, por ej., compuestos terapéuticos, para tratar enfermedades o afecciones causadas por o a las que contribuye una actividad anormal de Delta3. Los compuestos que pueden usarse para este fin pueden ser cualquier tipo de compuesto, incluyendo una proteína, un péptido, peptidomimético, molécula pequeña y ácido nucleico. Un ácido nucleico puede ser, por ej., un gen, un ácido nucleico antisentido, una ribozima o una molécula tríplex. Un compuesto de la invención puede ser un agonista o un antagonista. Un compuesto puede actuar sobre un gen Delta3, por ejemplo, modular su expresión. Un compuesto también puede actuar sobre una proteína Delta3, por ejemplo, modular la transducción de señales del receptor. En consecuencia, un compuesto de la invención puede ser un compuesto que se une a Delta3 e induce la transducción de señales del receptor, tal que, por ejemplo, se induzca la actividad de Delta3. En forma alternativa, un compuesto de la invención puede ser un compuesto que inhibe la interacción de una proteína Delta3 con una proteína toporrítmica, por ej., Notch.. En una realización, un compuesto de la invención que interactúa con una proteína Delta, que es tanto un antagonista como un agonista, u otra proteína que interactúa con Delta3. En una realización incluso más preferida, el compuesto es una proteína toporrítmica soluble u otra proteína que interactúa con Delta3. En consecuencia, una proteína toporrítmica soluble puede ser estimuladora de una proteína toporrítmica o una forma inhibidora de una toporrítmica, dependiendo si la proteína toporrítmica particular estimula o inhibe una actividad de Delta3.

De manera similar, una proteína Delta3 soluble, por ej. Delta3-Ig, puede usarse para modular la actividad de una proteína toporrítmica, por ej. Notch. Por ejemplo, una proteína Delta3 soluble puede ser una forma estimuladora de una proteína Delta3, es decir una proteína Delta3 que es capaz de estimular una actividad de una proteína toporrítmica. En una realización, dicha proteína actúa esencialmente del mismo modo que Delta3 de tipo salvaje. En otra realización, una proteína Delta3 soluble es inhibidora de una proteína Delta3, es decir, una proteína Delta3 que es capaz de inhibir una actividad de una proteína toporrítmica. Por ejemplo, dicha proteína Delta3 podría inhibir la interacción de Delta3 de tipo salvaje con la proteína toporrítmica. En una realización preferida, una forma inhibidora de una proteína Delta3 inhibe la interacción de varias proteínas que normalmente interactúan con una proteína toporrítmica, por ej., uniéndose a un sitio de la proteína toporrítmica que también es un sitio de unión a varias otras proteínas, por ej. otras proteínas Delta. En consecuencia, un producto terapéutico con Delta3 puede afectar generalmente la interacción de varias proteínas toporrítmicas entre sí. De manera similar, en base a por lo menos en parte la secuencia y similitudes estructurales entre proteínas Delta, un producto terapéutico que contiene Delta, distinto de un producto terapéutico que contiene Delta3, también puede usarse para modular la interacción entre una proteína Delta3 y una molécula de unión que interactúa con Delta3.

Los compuestos de la invención pueden identificarse usando varios ensayos dependiendo del tipo de compuesto y actividad del compuesto que se desea. A continuación se indican por lo menos algunos ensayos que pueden usarse para identificar productos terapéuticos que contienen Delta3. Se encuentra dentro de la habilidad de la técnica diseñar ensayos adicionales para identificar los productos terapéuticos que contienen Delta, por ej. productos terapéuticos que contienen Delta3.

Al poner a disposición polipéptidos Delta3 purificados y recombinantes, la presente invención facilita el desarrollo de ensayos que se usan para explorar fármacos, incluyendo variantes de Delta3, que son tanto agonistas o antagonistas de la función celular normal de los polipéptidos Delta3 de la invención, o de su función en la patogénesis de la diferenciación y/o proliferación celular y trastornos relacionados con éstas. En una realización, el ensayo evalúa la capacidad que tiene un compuesto de modular la unión entre un polipéptido Delta3 y una molécula, ya sea proteína o ADN, que interactúa tanto corriente arriba o corriente debajo de la vía de señalización Delta/Notch. Una variedad de formatos de ensayo serán suficientes y, en vista de la presente invención, serán comprendidos por el experto en la técnica.

4.7.1 Ensayos que no Utilizan Células

Pueden usarse ensayos que no utilizan células para identificar compuestos que interactúan con una proteína Delta3. Dichos ensayos se encuentran disponibles para evaluar los compuestos que son proteínas, por ej. proteínas toporrítmicas o sus variantes; como también para evaluar compuestos que son peptidomiméticos, moléculas pequeñas o ácidos nucleicos. El ensayo específico usado para evaluar estos compuestos puede variar con el tipo de compuesto.

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En una realización, un compuesto que interactúa con una proteína Delta3 se identifica explorando, por ej., una biblioteca de compuestos, para determinar la unión a una proteína Delta3 recombinante o purificada o por lo menos una de sus porciones. Dichos ensayos pueden involucrar la marcación de uno o los dos componentes y medición del grado de interacción, por ej., determinando el nivel de uno o los dos marcadores. En estos ensayos, puede ser preferible unir la proteína Delta3 a una superficie de fase sólida. Los métodos para lograr esto se describen en mayor detalle más adelante. En una realización, la biblioteca de compuestos es una biblioteca de moléculas pequeñas. En otra realización, la biblioteca de compuestos es una biblioteca de variantes de Delta3, que pueden producirse de acuerdo con métodos descritos anteriormente.

La identificación de un compuesto que inhibe una interacción entre una proteína Delta3 y una proteína toporrítmica también puede realizarse explorando compuestos que usan ensayos de agregación, como se describe, por ej., en Fehon et al. (1990) Cell 61:523-534.

En otra realización, la invención provee métodos para identificar compuestos que inhiben la interacción de una proteína Delta3 con una molécula, por ej. una proteína toporrítmica o una proteína que interactúa con el dominio citoplasmático de una proteína Delta3. Dichos métodos, que se usan con preferencia en ensayos de alta resolución pueden realizarse de la siguiente manera.

En muchos programas de exploración farmacológica que evalúan bibliotecas de compuestos y extractos naturales, los ensayos de alto rendimiento son deseables para maximizar la cantidad de compuestos encuestados en un período dado de tiempo. Los ensayos que se realizan en sistemas que no utilizan células, tales como los que pueden derivarse con proteínas purificadas o semi-purificadas, con frecuencia se prefieren como pantallas "primarias" en el sentido que pueden generarse para permitir el rápido desarrollo y la detección relativamente fácil de una alteración en un blanco molecular mediada por un compuesto de prueba. Más aun, los efectos de toxicidad celular y/o biodisponibilidad del compuesto de prueba pueden ignorarse generalmente en el sistema in vitro, el ensayo en su lugar se centra principalmente en el efecto del fármaco sobre el blanco molecular como puede manifestarse en una alteración de afinidad de unión con elementos corriente arriba o corriente abajo. En consecuencia, en un ensayo de exploración ejemplificativo de la presente invención, el compuesto de interés se contacta con proteínas que pueden funcionar en sentido corriente arriba (incluyendo tanto activadores como represores de su actividad) o a las proteínas o ácidos nucleicos que pueden funcionar corriente abajo del polipéptido Delta3, si están regulados positiva o negativamente por éste. Por ejemplo, una proteína que funciona corriente arriba de un polipéptido Delta3 puede ser un compuesto que interactúa con la porción extracelular de la molécula de Delta3. Una proteína que funciona corriente abajo de un polipéptido Delta3 puede ser una proteína que interactúa con el dominio citoplasmático de Delta3 y, por ej., transduce una señal al núcleo. A la mezcla del compuesto y el elemento corriente arriba o corriente abajo se agrega luego una composición que contiene un polipéptido Delta3. La detección y cuantificación de complejos de Delta3 con sus elementos corriente arriba o corriente abajo provee un medio para determinar la eficacia de un compuesto en la inhibición (o potenciación) de formación de complejos entre Delta3 y los elementos de unión a Delta. La eficacia del compuesto puede evaluarse generando curvas de respuesta a la dosis a partir de los datos obtenidos usando varias concentraciones del compuesto de prueba. Más aun, también puede realizarse un ensayo de control para proveer una base de comparación. En el ensayo de control, el polipéptido Delta3 aislado y purificado se agrega a una composición que contiene el elemento de unión a Delta, y la formación de un complejo se cuantifica en ausencia del compuesto de prueba.

La formación de complejos entre el polipéptido Delta3 y un elemento de unión a Delta3 puede detectarse a través de una variedad de técnicas. La modulación de formación de complejos puede cuantificarse usando proteínas marcadas tales como polipéptidos Delta3 radiomarcados, marcados en forma fluorescente, o en forma enzimática, con inmunoensayos o por detección cromatográfica.

Normalmente, será deseable inmovilizar tanto la proteína Delta3 o su proteína de unión para facilitar la separación de formas complejas de no complejas de una o ambas proteínas, como también para acomodar la automatización del ensayo. La unión de Delta3 a un elemento corriente arriba o corriente abajo, en presencia y ausencia de un agente candidato, puede lograrse en un recipiente apropiado que contiene los reactivos. Algunos ejemplos incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo, y tubos de microcentrífuga. En una realización, puede proveerse una proteína de fusión que agregue un dominio que permita que la proteína se una a una matriz. Por ejemplo, las proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa/Delta3 (GST/Delta) pueden absorberse sobre perlas de glutatión sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación derivatizadas con glutatión, que luego se combinan con los lisados celulares, por ej. uno marcado con ^{35}S, y el compuesto de prueba, y la mezcla se incuba en condiciones que conducen a la formación de complejos, por ej. en condiciones fisiológicas de salinidad y pH, aunque pueden ser convenientes condiciones levemente menos rigurosas. Luego de la incubación, las perlas se lavan para eliminar cualquier marcador no unido, se inmoviliza la matriz y se radio-marca directamente (por ej. perlas colocadas en un aparato de centelleo), o en el sobrenadante luego de que los complejos se disocian posteriormente. En forma alternativa, los complejos pueden disociarse de la matriz, separarse por SDS-PAGE, y el nivel de proteína de unión Delta encontrado en la fracción de perla se cuantifica del gel usando técnicas estándar de electroforesis tal como se describe en los ejemplos anexos.

Otras técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices también se encuentran disponibles para usar en el ensayo de la invención. Por ejemplo, tanto Delta3 como su proteína de unión relacionada puede inmovilizarse usando conjugación con biotina y estreptoavidina. Por ejemplo, pueden prepararse moléculas de Delta3 biotiniladas a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) usando técnicas muy conocidas en la técnica (por ej., kit para biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL), e inmovilizarse en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertos con estreptoavidina (Pierce Chemical). En forma alternativa, los anticuerpos reactivos con Delta3 pero que no interfieren con la unión de elementos corriente arriba o corriente abajo pueden derivatizrse a los pocillos de la placa, y Delta3 puede atraparse en los pocillos por conjugación del anticuerpo. Como se indicó anteriormente, las preparaciones de proteína de unión a Delta y un compuesto de prueba se incuban en los pocillos de la placa que presentan Delta, y puede cuantificarse la cantidad de complejo atrapado en el pocillo. Los métodos ejemplificativos para detectar dichos complejos, además de aquellos descritos con anterioridad para los complejos inmovilizados con GST, incluyen inmunodetección de complejos usando anticuerpos reactivos con el elemento de unión a Delta3, o que son reactivos con la proteína Delta3 y compiten con el elemento de unión; como así también ensayos ligados a enzimas que se basan en detectar una actividad enzimática asociada con el elemento de unión, ya sea actividad intrínseca o extrínseca. En el último caso, la enzima puede conjugarse por medios químicos o proveerse como una proteína de fusión con el Delta-BP. Para ilustrar, el Delta-BP puede entrecruzarse químicamente o fusionarse genéticamente con peroxidasa de rábano, y la proporción de polipéptido atrapado en el complejo puede evaluarse con el sustrato cromogénico de la enzima, por ej. tetrahidrocloruro de 3,3'-diamino-benzadina o 4-cloro-1-naftol. Del mismo modo, puede proveerse una proteína de fusión que comprende el polipéptido y glutatión-S-transferasa, y cuantificarse la formación de complejos detectando la actividad de GST utilizando 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (Habig et al (1974) J Biol Chem 249:7130).

Para procesos que se basan en la inmunodetección para cuantificar una de las proteínas atrapadas en el complejo, pueden usarse anticuerpos contra la proteína, tales como anticuerpos anti-Delta3. En forma alternativa, la proteína que desea detectarse en el complejo puede tener "marca de epítope" en la forma de una proteína de fusión que incluye, además de la secuencia de Delta3, un segundo polipéptido para el cual los anticuerpos se encuentran fácilmente disponibles (por ej. de fuentes comerciales). Por ejemplo, las proteínas de fusión GST descritas con anterioridad también pueden usarse para la cuantificación de la unión usando anticuerpos contra el resto GST. Otras marcas de epítopes útiles incluyen epítopes myc (por ej., ver Ellison et al. (1991) J Biol Chem 266:21150-21157) que incluye una secuencia de 10 residuos de c-myc, como también el sistema pFLAG (International Biotechnologies, Inc.) o el sistema pEZZ-proteína A (Pharmacia, NJ).

4.7.2 Ensayos basados en células

Además de los ensayos que no utilizan células, tal como se describió con anterioridad, la fuente fácilmente disponible de proteínas Delta3 provistas por la presente invención también facilita la generación de ensayos basados en células para identificar agonistas/antagonistas de moléculas pequeñas y similares. Por ejemplo, las células que son sensibles a bFGF/VEGF o matrigel pueden inducirse a sobreexpresar una proteína Delta3 recombinante en presencia y ausencia de un agente de prueba de interés, con el puntaje del ensayo para la modulación en respuestas a Delta3 producidas por la célula mediadas por el agente experimental. Como ocurre con los ensayos que no utilizan células, los agentes que producen un cambio estadísticamente significativo en las respuestas que dependen de Delta (ya sea inhibición o potenciación) pueden identificarse. En una realización ilustrativa, la expresión o actividad de una Delta3 se modula en embriones o células y se miden los efectos de compuestos de interés sobre la lectura de interés (tal como diferenciación de tejido, proliferación, tumorigénesis). Por ejemplo, puede evaluarse la expresión de genes que se regulan corriente arriba o corriente abajo en respuesta a una cascada de señales dependiente de Delta. En realizaciones preferidas, las regiones reguladoras de dichos genes, por ej., el promotor que flanquea a 5' y regiones potenciadoras, están ligadas en forma funcional a un marcador detectable (tal como luciferasa) que codifica un producto génico que puede detectarse fácilmente.

Las líneas celulares ejemplificativas pueden incluir células endoteliales tales como MVEC y células endoteliales aórticas de bovino (BAEC); como también líneas celulares genéricas de mamífero tales como células HeLa y células COS, por ej. COS-7 (ATCC#CRL-1651).

En una realización, un compuesto de prueba que modifica una actividad de Delta3 puede identificarse incubando una célula que tiene una proteína Delta3 con el compuesto de prueba y midiendo la transducción de señales de la proteína Delta3. La comparación de la transducción de señales en las células incubadas con o sin el compuesto revelarán si el compuesto de prueba es un producto terapéutico con Delta3. De manera similar, un compuesto de prueba que modifica una actividad de Delta3 puede identificarse incubando una célula que tiene un ligando de Delta3 con el compuesto de prueba, por ej. un compuesto derivado de Delta3, y midiendo la transducción de señales del ligando de Delta3. La comparación de la transducción de señales en las células incubadas con o sin el compuesto de prueba revelará si el compuesto de prueba es un producto terapéutico con Delta3.

En el caso que las proteínas Delta3 en sí mismas, o en complejos con otras proteínas, sean capaces de unirse al ADN y/o modificar la transcripción de un gen, podría usarse un ensayo basado en la transcripción, por ejemplo, en el cual una secuencia reguladora que responde a Delta3 está ligada en forma funcional a un gen marcador detectable, por ej., un gen de luciferasa. De manera similar, los productos terapéuticos que contienen Delta3 podrían identificarse también usando un ensayo en el cual se monitorea la expresión de genes que se modulan luego de la unión de una proteína Delta3 a un ligando Delta3 en una célula. Los genes que responden a la interacción con una proteína Delta3 o un ligando Delta3 pueden identificarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ej., hibridación diferencial o visualización diferencial.

En otra realización, un dispositivo basado en silicio, llamado microfisiómetro, puede usarse para detectar y medir la respuesta de las células que tienen una proteína Delta3 a compuestos experimentales para identificar productos terapéuticos que contienen Delta3. Este instrumento mide la velocidad a la cual las células acidifican su entorno, lo que es indicativo del crecimiento y/o diferenciación celular (McConnel et al. (1992) Science 257:1906).

El monitoreo de la influencia de compuestos en las células puede aplicarse no sólo en la exploración de fármacos básicos, sino también en ensayos clínicos. En dichos ensayos clínicos puede usarse la expresión de un panel de genes como "lectura" de un efecto terapéutico de un fármaco en particular.

Incluso en otro aspecto de la invención, los polipéptidos Delta3 de la invención pueden usarse para generar un ensayo de "dos híbridos" (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; y Brent W094/10300), para aislar secuencias codificadoras para otras proteínas celulares que se unen a o interactúan con Delta3 ("proteínas que se unen a Delta" o "Delta-bp"), tales como Notch, y similares. En síntesis, el ensayo de dos híbridos se basa en la reconstitución in vivo de una proteína activadora de la transcripción funcional de dos proteínas de fusión separadas. En particular, el método hace uso de genes quiméricos que expresan las proteínas híbridas. Para ilustrar, un primer gen híbrido comprende la secuencia codificadora para un dominio de unión al ADN de un activador de transcripción fusionado en marco a la secuencia codificadora para un polipéptido Delta3. La segunda proteína híbrida codifica un dominio de activación de la transcripción en marco con una muestra de gen de una biblioteca de ADNc. Si las proteínas híbridas anzuelo y de muestra son capaces de interactuar, por ej., formar un complejo dependiente de Delta, aproximan los dos dominios del activador de transcripción. Esta proximidad es suficiente para provocar la transcripción de un gen indicador que está ligado en forma funcional a un sitio regulador de la transcripción que responde al activador de transcripción, y la expresión del gen indicador puede detectarse y usarse para calificar la interacción de Delta3 y las proteínas de muestra. Este sistema puede usarse para identificar compuestos que modifican, por ej. inhiben, la interacción entre una proteína Delta3 y otra proteína, agregando un compuesto de prueba a una célula que contiene los plásmidos antes descritos. El efecto del compuesto de prueba sobre la expresión del gen indicador se mide entonces para determinar el efecto del compuesto de prueba sobre la interacción.

En otra realización, la invención provee ordenamientos para identificar compuestos que pueden inducir la apoptosis de células a través de una proteína Delta3. Los ordenamientos apoptóticos son conocidos en la técnica y se describen, por ej., en Grimm et al (1996) Bras. Natl. Acad. Sci. USA 93:10923.

5. Ejemplos 5.1 Aislamiento de un ADNc de longitud completa que codifica hDelta3

Se separaron células endoteliales microvasculares humanas (Catálogo de HMVEC #CC2543; Clonetics, San Diego, CA) en cuatro muestras de células que se trataron de la siguiente manera. La primera muestra no se trató. La segunda muestra se trató con TGF-\beta1 humano (hTGF-\beta1) (10 ng/ml) (Upstate Biotechnology, Lake Placid, N.Y., No. de Catálogo 01-134). La tercera muestra se trató con bFGF (10 ng/ml)/VFGF (25ng/ml) (Upstate Biotechnology, Lake Placid, N.Y., No. de Catálogo 01-134, Nos. de Catálogo 01-106 y 01-185, respectivamente). La cuarta muestra se diferenció sobre Matrigel (Collaborative Biomedical Products, Decton Dickinson Labware, Bedford, MA). Las células se trataron como se indicó durante 24 horas, se reunieron las 4 muestras, y se extrajo el ARN de las células reunidas usando el kit QIAGEN RNeasy. La biblioteca de ADNc resultante se sometió a secuenciación aleatoria de alto rendimiento. Esto permitió la identificación de un fragmento de ADNc que comprende la siguiente secuencia de 171 nucleótidos de longitud:

GCCCAGGCNGACCCTGGTGTGGACTGTGAGCTGGAGCTCAGCGAGTGTGACAGCAACCCCTG TCGCANTGGAGGCAGCTGTAAGGACCANGAGGATGGCTACCACTGCCTGTGTCCTCCGGGCTA CTACGGCNTCCATCGTGAACACNGCACCTCTTAGCTGNGCCGACTC (SEC ID NO: 21).

La comparación de la secuencia de nucleótidos de este ADNc parcial con las secuencias del GenBank usando el programa BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403) reveló que la secuencia de nucleótidos codificó un fragmento de proteínas que tiene una homología significativa con las proteínas Delta. De hecho, la secuencia de aminoácidos presentó significativa homología con una proteína Delta1 de pollo (No. de Acceso al GenBank U26590), una proteína Delta1 de Xenopus (No. de acceso al GenBank L42229), una proteína Delta1 de rata (No. de Acceso al GenBank U78989), una proteína Delta 2 de Xenopus (No de acceso al GenBank U70843) como también proteínas Notch.

Un ADNc de longitud completa de aproximadamente 3,2 kb se aisló luego explorando una biblioteca de ADNc de células endoteliales vasculares humanas (HMVEC) usando ADNc parcial (SEC ID NO: 21). Este ácido nucleico se depositó en el American Type Culture Collection (ATCC) el 5 de marzo de 1997, y se le asignó el No. de Acceso al ATCC 98348. La secuencia de nucleótidos del ADNc aislado se muestra en la Figura 1 y tiene la SEC ID NO: 1.

Una comparación de las bases de datos de la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 1 contra la secuencia EST usando el programa BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol. Biol. 215:403) indicó que 5 EST tienen una homología con las porciones de la SEC ID NO: 1. Estos están todos ubicados en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de transmbembrana, es decir corriente abajo del nucleótido 1996 de la SEC ID NO: 1. Tres de estos EST (que tienen Nos. de acceso T33770, T33811, y T07963) tienen una secuencia de nucleótidos que comienza en aproximadamente el nucleótido 2044 de la SEC ID NO: 1. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos de los tres EST es significativamente diferente de la secuencia de nucleótidos de hDelta3 en aproximadamente los primeros 50 nucleótidos 3' del nucleótido 2044 de la SEC ID NO: 1. Dos EST (que tienen Nos. de Acceso 832717 y T07962) están ubicados además corriente abajo de los tres EST.

El ácido nucleico que tiene la SEC ID NO: 1 codifica una proteína de 685 aminoácidos que tiene la SEC ID NO: 2. Una comparación de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 con secuencias del GenBank usando BLASTP (Altschul et al. (1990)1. Mol. Biol. 215:403) revela que esta proteína tiene una cierta homología con las proteínas Delta descritas con anterioridad. La Figura 2 muestra una alineación de la proteína Delta3 humana que tiene la SEC ID NO: 2 con la secuencia de aminoácidos de la proteína Delta1 de ratón (No. de Acceso X80903), la proteína Delta1 de la rata (No. de Acceso U78889), la proteína Delta1 de pollo (No. de Acceso U26590), dos proteínas Delta1 de Xenopus (Nos. de Acceso L42229 y U70843) y la Proteína Delta1 de Drosophila (No. de Acceso AA142228). La comparación de secuencias indica que la proteína Delta3 humana tiene la estructura general de una proteína Delta3. En particular, la proteína Delta3 humana tiene un péptido señal correspondiente a aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 17 de la SEC ID NO: 2, un motivo DSL correspondiente a la secuencia desde aproximadamente el aminoácido 173 hasta aproximadamente el aminoácido 217, una primera repetición tipo FCE correspondiente a la secuencia desde aproximadamente el aminoácido 222 hasta aproximadamente el aminoácido 250, una segunda repetición tipo FCE correspondiente a la secuencia desde aproximadamente el aminoácido 253 hasta aproximadamente el aminoácido 281, una tercera repetición tipo FCE correspondiente a la secuencia desde aproximadamente el aminoácido 288 hasta aproximadamente el aminoácido 321, una cuarta repetición tipo FCE correspondiente a la secuencia desde aproximadamente el aminoácido 328 hasta aproximadamente el aminoácido 359, una quinta repetición tipo FCE correspondiente a la secuencia desde aproximadamente el aminoácido 366 hasta aproximadamente el aminoácido 399, una sexta repetición tipo FCE correspondiente a la secuencia desde aproximadamente el aminoácido 411 hasta aproximadamente el aminoácido 437, una séptima repetición tipo FCE correspondiente a la secuencia desde aproximadamente el aminoácido 444 hasta aproximadamente el aminoácido 475, una octava repetición tipo FCE correspondiente a la secuencia desde aproximadamente el aminoácido 484 hasta aproximadamente el aminoácido 517, un dominio de transmembrana correspondiente a la secuencia desde aproximadamente el aminoácido 530 hasta aproximadamente el aminoácido 553, y un dominio citoplasmático correspondiente a la secuencia desde aproximadamente el aminoácido 554 hasta aproximadamente el aminoácido 685 de la SEC ID NO: 2.

Una comparación entre la secuencia de aminoácidos y de nucleótidos entre los miembros de la familia de proteínas Delta1 y Delta3, y Delta3 humana por un lado y entre los miembros de la familia de Delta1 revela que la homología entre los miembros de la familia Delta3 es más fuerte que la homología entre Delta3 humana y cualquiera de los miembros de la familia Delta1. Por ejemplo, aunque hDelta3 es sólo aproximadamente 58% similar a la proteína Delta1 de Drosophila; aproximadamente 70% similar a la proteína Delta1 de ratón; aproximadamente 70% similar a la proteína Delta1 de rata; aproximadamente 68% similar a la proteína Delta1 del pollo; y aproximadamente 68% similar a las proteínas Delta1 de Xenopus; las proteínas Delta1 de drosophila, ratón, rata, pollo y Xenopus son muy similares entre sí (por ej. el ratón y la rata son aproximadamente 96% similares). La solicitud publicada de PCT W097/01571 revela un nucleótido parcial y la secuencia de aminoácidos de una proteína que tienen homología significativa con los miembros de la familia Delta1, indicando que es probable que sea una proteína Delta1 humana. La homología entre la secuencia de aminoácidos parcial de Delta1 humana y la secuencia de aminoácidos de Delta3 humana se indica en la Tabla 1 y muestra que las proteínas son codificadas por genes diferentes. Todas estas comparaciones entre las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos indican que Delta3 humana es una especie adicional de proteína Delta, que comparte parte de la homología de secuencia y estructura con las proteínas Delta1.

5.2 Expresión en Tejidos del gen hDelta3

Este Ejemplo describe la distribución en los tejidos de la proteína Delta3, según la determinación realizada por hibridación con transferencia Northern con un fragmento de 1,6 kb de ADNc de Delta3 humana correspondiente al extremo terminal 3' de la SEC ID NO: 1.

Las hibridaciones por transferencia Northern con las diferentes muestras de ARN se realizaron en condiciones estándar y se lavaron en condiciones rigurosas, es decir, en 0,2 x SSC a 65ºC. En cada muestra, la sonda se hibridó a un único ARN de aproximadamente 3,5 kb. Los resultados de la hibridación de la sonda a varias muestras de ARNm se describen a continuación.

La hibridación de una transferencia Northern de Tejido Fetal Múltiple (MTN) Clontech (Clontech, LaJolla, CA) que contenía ARN de cerebro, pulmón, hígado, y riñón fetal indicó la presencia de ARN de Delta3 en cada uno de los tejidos fetales. La expresión fue significativamente más alta en el pulmón y riñón fetales que en el cerebro e hígado fetales. La hibridación de transferencias Northern I de Tejido Humano Múltiple (MTNI) Clontech y Northern II de Tejido Múltiple (MTNII) (Clontech, LaJolls, CA) que contenían ARN de corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón, páncreas, bazo, timo, próstata, testículos, ovario, intestino delgado, mucosa que recubre el colon y leucocitos de sangre periférica de adultos con la sonda humana de Delta3 de 1,6 kb indicó la expresión en corazón, placenta, pulmón, músculo esquelético, riñón, páncreas, bazo, timo, próstata, testículos, ovario, intestino delgado y colon. La expresión fue particularmente fuerte en corazón, placenta, pulmón, y músculo esquelético de adultos. También se encontró la expresión en cerebro, hígado y testículos de adultos. Sin embargo, no se detectó cantidad significativa de hARNm de Delta3 en leucocitos de sangre periférica de adultos.

Además, la hibridación por transferencia Northern de ARNm total de células HMVEC tratadas con TGF-\beta1 a razón de 10 ng/ml durante 24 horas, bFGF a razón de 10 ng/ml, VFCE a razón de 25 ng/ml durante 24 horas, o sin tratar durante 24 horas indicó que la expresión de Delta3 se indujo luego de la inducción con bFGF/VFCE. En consecuencia, la expresión de Delta3 es regulada por aumento en células endoteliales HMV en respuesta a ciertos factores de crecimiento.

La hibridación de una transferencia Northern "de cáncer" que contenía ARN de células HL60, HeLa, K562, MoLT4, Raji, SW480, A549, y 0361, reveló que Delta3 se expresa a niveles altos en la línea celular de carcinoma colo-rectal SW480. De este modo, la expresión de Delta3 es alta en por lo menos ciertas células tumorales.

De este modo, este Ejemplo muestra que el gen Delta3 se expresa en numerosos tejidos, pero que no se detecta en ciertos tejidos, por ej. leucocitos de sangre periférica y tejido de corazón de adultos (por lo menos cuando se utiliza hibridación con transferencia Northern), que se expresa a niveles relativamente altos en por lo menos algunas células tumorales, por ej. células de carcinoma de colon, y que su expresión puede regularse por aumento en respuesta a ciertos factores de crecimiento, por ej. bFGF y VFCE.

5.3 Localización cromosómica del gen hDelta3

Una transferencia Southern que contenía ARN de un panel de híbridos de células somáticas monocromosómicas de humanos/hámster se sondeó con una sonda de ADNc de hDelta1. Los resultados obtenidos indican claramente que el gen Delta 3 humano reside en el cromosoma 15.

5.4. Aumento de la expresión de hDelta3 en la diferenciación de células endoteliales

Este Ejemplo muestra que la expresión del gen hDelta3 aumenta en células endoteliales en proceso de diferenciación con relación a células endoteliales que no se encuentran en proceso de diferenciación.

Se separaron células HMVEC en 5 cultivos y se trataron de la siguiente manera: (1) se indujeron las células a la quiescencia mediante cultivo en medio de cultivo endotelial basal (EGM) (Clontech) que contenía 10% de suero fetal de cabra (FCS); (2) se cultivaron las células en medio de cultivo endotelial completo (EGM-MV) (Clontech, No. de Catálogo CC-3125) que contenía 10% de FCS y factores de crecimiento; (3) se estimularon las células para proliferar por cultivo en EGM-MV en presencia de bFGF a razón de 10 ng/ml y VFCE a razón de 25 ng/ml; (4) se estimularon las células para proliferar por cultivo en EGM-MV en presencia de TGF-\beta1 a razón de 10 ng/ml; y (5) se estimularon las células para diferenciarse por cultivo en EGM-MV sobre Matrigel. Luego de 24 horas de cultivo, se cosecharon las células, se extrajo el ADN y se sometió a análisis de transferencia Northern. La hibridación se realizó con la sonda de 1,6 kb de hDelta3 descrita con anterioridad. Los resultados indican que entre las condiciones de cultivo evaluadas, las células quiescentes expresan la cantidad más baja de hDelta3 (a un nivel apenas detectable). Las células que son proliferativas expresan un nivel más alto de hDelta3. Es interesante notar que el nivel de ARNm de hDelta3 aumentó fuertemente en células inducidas para diferenciarse al colocarse en placas sobre Matrigel.

De este modo, este Ejemplo demuestra claramente que la expresión de hDelta3 se aumenta fuertemente en células inducidas a diferenciarse y también en células inducidas a proliferar.

5.5 hDelta3 está ubicado en una región cromosómica asociada con ACCPN

La ubicación de hDelta3 en el cromosoma humano 15 se determinó usando mapeo de híbridos con radiación (HR).

Un sitio marcado de la secuencia (STS) se generó a partir de la región no traducida 3' del gen usando un cebador delantero que tenía la secuencia de nucleótidos GTTTACATTGCATCCTGGAT (SEC ID NO: 21) y un cebador inverso que tenía la secuencia de nucleótidos CTCTTCTGTTCCTCTGGTTG (SEC ID NO: 22). El STS se usó para explorar el panel de híbrido con radiación Genebridge 4 (Gyapay et al. (1996) Human Molecular Genetics 5:339) y Standford G3 (Stewart et al. (1997) Genome Res. 7:422). Estos paneles se derivaron por fusión de células donantes humanas irradiadas con células receptoras de roedores (referencia) y pueden usarse para posicionar marcadores de STS dentro de mapas de marco existentes, ordenando los marcadores en la región de interés como así también estableciendo la distancia entre los marcadores.

El mapeo de HR se realizó por PCR en las siguientes condiciones: 25 ng de DNA/20\mul de reacción, 0,5 \muM de cada cebador, 0,2mM de cada nucleótido, 1,5mM de MgCl_{2}, 1 x buffer provisto por el fabricante de la enzima, 35 ciclos a 94°C, 55°C, 72°C durante 30 segundos cada uno.

Los resultados del mapeo de HR indicaron que hDelta3 se mapea en 15q12-15 cerca del marcador de marco D15S1244 en el panel Stanford G3 y cerca del marcador de marco D15S144 en el panel Genebridge 4 con un puntaje de LOD>3. La búsqueda de la base de datos OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man; http://www.ncbi.nlm.nih.gob/
Omim/searchomim.html) indicó que esta región se ha vinculado genéticamente con anterioridad a un trastorno neurológico llamado Agénesis del Cuerpo Calloso con Neuropatía Periférica (ACCNP) (Casaubon et al. (1996) Am. J. Hum. Genet. 58:28).

5.6 Identificación de los productos terapéuticos que contienen Delta

Este Ejemplo describe un ensayo simple para aislar los productos terapéuticos que contienen Delta, (por ej. agonista o antagonista de una bioactividad de Delta), por ej., productos terapéuticos que contienen Delta3. Basados por lo menos en parte en los resultados descritos en los Ejemplos anteriores, los productos terapéuticos que contienen Delta pueden usarse para tratar varias enfermedades, incluyendo enfermedades neurológicas, y/o enfermedades hiper- o hipoproliferativas, y enfermedades o afecciones asociadas con defectos en la vasculatura. Además, en base por lo menos en parte a la similitud de la secuencia de aminoácidos y la estructura entre las diferentes proteínas Delta, los productos terapéuticos que contienen Delta3 pueden usarse para tratar enfermedades o afecciones asociadas con una actividad aberrante de Delta3 o una actividad aberrante de Delta3 distinta de una actividad de Delta3. De manera similar, los productos terapéuticos que contienen Delta3 como así también los productos terapéuticos que contienen Delta distinta de productos terapéuticos que contienen Delta3 pueden usarse para tratar enfermedades o afecciones asociadas con una actividad aberrante de Delta3. El ensayo que se indica a continuación puede aplicarse a las proteínas Delta distintas de las proteínas Delta3.

Un producto terapéutico con Delta3 puede identificarse usando un ensayo in vitro, en el cual la interacción entre una proteína Delta3 y una proteína que se une a Delta3, por ej. una proteína Notch, se determina en presencia y en ausencia de un compuesto de prueba. Un fragmento de unión soluble de una proteína Delta3 puede prepararse por expresión de la porción extracelular de Delta3 humana, por ej. aproximadamente los aminoácidos 1-529 de la SEC ID NO: 2, en E. coli de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. En forma alternativa, el fragmento de la proteína Delta3 puede ser desde aproximadamente el aminoácido 173 hasta aproximadamente el aminoácido 517 de la SEC ID NO: 2. De manera similar, un fragmento que se une a Delta3 de una proteína de unión a Delta3 (es decir, compañera de unión a Delta3) puede producirse en forma recombinante. Una proteína de unión a Delta3 puede ser una proteína Notch y puede identificarse, por ej., determinando si la proteína es capaz de unirse a una proteína Delta3. Un ácido nucleico que codifica una proteína Notch pueden obtenerse, por ej., por amplificación de una porción de un gen Notch que codifica por lo menos un dominio del tipo FCE, usando cebadores que tienen una secuencia de nucleótidos derivada de la secuencia de nucleótidos de un gen Notch presente en GenBank o revelado en la solicitud de PCT No. PCT/US92/03651 o PCT/US93/09338.

Los compuestos experimentales pueden evaluarse para determinar si inhiben la interacción entre la proteína Delta3 y la proteína de unión Delta3 usando un ensayo del tipo ELISA. En consecuencia, una de las proteínas Delta3 y la proteína Delta3 de unión producidas por medios recombinantes, por ej. la proteína Notch, se une a una superficie de fase sólida y la otra proteína se marca, por ej., tal como marcando la proteína con un epítope, para la cual está disponible un anticuerpo (por ej., epítope FLAG, provisto por International Biotechnologies, Inc.). Por ejemplo, la proteína Delta3 puede ligarse a los pocillos de una placa de microtitulación (96 pocillos) por incubación durante toda la noche de la proteína a una concentración de 10 \mug/ml en PBS. Luego de bloquear los sitios no ocupados en la placa con una solución de BSA, se agregan a los pocillos diversas cantidades de compuestos experimentales y la proteína de unión a Delta3 producida por medios recombinantes en un buffer apropiado para la interacción específica entre las proteínas. Luego de un tiempo de incubación de varias horas, los pocillos se enjuagan con buffer, y se determina la cantidad de proteína de unión a Delta3 unida a los pocillos. La cantidad de proteína unida puede determinarse incubando los pocillos con un anticuerpo anti-etiqueta, por ej., anti-myc, que puede detectarse por inmunoensayo enzimático. La cantidad de proteínas unidas puede determinarse entonces determinando la densidad óptica usando una lectora para ELISA. Una cantidad más baja de proteína de unión a Delta3 en un pocillo que contenía compuesto de prueba con relación al pocillo que no contenía un compuesto de prueba es indicativo de que el compuesto de prueba inhibe la interacción entre Delta3 y una proteína de unión a Delta3.

Un producto terapéutico que contiene Delta3 también puede identificarse usando un ensayo indicador en el cual se mide el nivel de expresión de una construcción indicadora bajo el control de un promotor de Delta3 en presencia o ausencia de compuesto de prueba. Un promotor de Delta3 puede aislarse explorando una biblioteca genómica con un ADNc de Delta3 que con preferencia contiene el extremo 5' del ADNc. Una porción del promotor de Delta3, normalmente de aproximadamente 50 hasta aproximadamente 500 pares de bases de longitud se clona entonces corriente arriba de un gen indicador, por ej. un gen de luciferasa, en un plásmido. Esta construcción indicadora se transfecta luego a células, por ej. células neurales o células endoteliales. Las células transfectadas se distribuyen luego en los pocillos de una placa de múltiples pocillos y se agregan varias concentraciones de compuestos de prueba a los pocillos. Luego de varias horas de incubación, se determina el nivel de expresión de la construcción indicadora de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Una diferencia en el nivel de expresión de la construcción indicadora en las células transfectadas incubadas con el compuesto de prueba con relación a las células transfectadas incubadas sin el compuesto de prueba indicará que el compuesto de prueba es capaz de modular la expresión del gen Delta3 y es, de este modo, un producto terapéutico con Delta3.

Depósito de Microorganismos

Un ácido nucleico que codifica una proteína Delta humana de longitud completa se incluye en un plásmido que se depositó en el American Type Culture Collection (ATCC) el 5 de marzo de 1997 y se le asignó el número de acceso al ATCC 98348.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: McCarthy, Sean A.

\hskip3.9cm

Gearing, David P.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVAS COMPOSICIONES CON DELTA3 HUMANA Y SUS USOS TERAPÉUTICOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 23

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DOMICILIO PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: FOLEY, HOAG & ELIOT LLP

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: One Post Office Square

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Boston

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: MA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EEUU

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 02109-2170

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMATO DE LECTURA POR COMPUTADORA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

COMPUTADORA: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 6-Abril-1998

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/872.855

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 11-Junio-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/832.633

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 4-Abril-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Arnold, Beth E.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE MATRÍCULA: 35.430

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/CASO: MAA-003.25

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 617-832-1000

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 617-832-7000

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2800 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.500000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDs

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 338..2392

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

3

4

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 685 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2055 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3:

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 720 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 713 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO; aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 157 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 721 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:

23

24

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 729 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 717 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 642 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

35

36

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 830 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIAS SEC ID NO: 11:

39

40

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIAS SEC ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCGCCTCTG GCTGGGCGCT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DER SEC ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGCCAGAGG CCTTGCCACC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGCGCTCCC GGCTGGAGCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGCGGCTTG GACCTCGGTT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 par de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: l6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCCGCCATC CCTCGGGGCG T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACGCTGCC GCCATCCCCT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACGCTGCC GCCATCCCCT CGGGGCGT

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAATCTGGC TCTGTTCGCG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCTCTCTCC ACCCGCGGGC CCTCAA

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 171 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTTACATTG CATCCTGGAT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CANTIDAD DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCTTCTGTT CCTCTGGTTG

\hfill

20

Claims (34)

1. Una molécula de ácido nucleico aislado seleccionada del grupo formado por:

a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es, por lo menos, 75% idéntica a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 3, la inserción del ADNc del plásmido depositado en el ATCC como Número de Acceso 98348, o uno de sus complementos;

b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es, por lo menos, 85% idéntica a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 3, la inserción del ADNc del plásmido depositado en el ATCC como Número de Acceso 98348, o uno de sus complementos;

c) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es, por lo menos, 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 3, la inserción del ADNc del plásmido depositado en el ATCC como Número de Acceso 98348, o uno de sus complementos;

d) una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de por lo menos 150 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 3, la inserción de ADNc del plásmido depositado en el ATCC como Número de Acceso 98348, o uno de sus complementos;

e) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3 o la inserción del ADNc del plásmido depositado en el ATCC como Número de Acceso 98348, o uno de sus complementos;

f) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos codificada por la inserción del ADNc del plásmido depositado en el ATCC como Número de Acceso 98348; y

g) una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2, o la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la inserción del ADNc del plásmido depositado en el ATCC con el Número de Acceso 98348, donde el fragmento comprende por lo menos 50 aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 2, o el polipéptido codificado por la inserción del ADNc del plásmido depositado en el ATCC como Número de Acceso 98348.

2. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, donde el polipéptido es soluble.

3. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 2, donde el polipéptido comprende, además, polipéptidos heterólogos.

4. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, donde el fragmento de polipéptido comprende del aminoácido 554 al aminoácido 685 de la SEC ID NO: 2.

5. Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es, por lo menos, 80% homóloga a una secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al aminoácido 529 de la SEC ID NO: 2.

6. Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es, por lo menos, 80% homóloga a una secuencia de aminoácidos del aminoácido 554 al aminoácido 685 de la SEC ID NO: 2.

7. Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es, por lo menos, 90% homóloga a una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 aminoácidos consecutivos que se expone en la SEC ID NO: 2.

8. El ácido nucleico aislado de las reivindicaciones 1, 5, 6 o 7, donde el polipéptido tiene por lo menos una bioactividad.

9. Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que es, por lo menos, 90% idéntica a una secuencia de por lo menos 150 nucleótidos de la SEC ID NO: 1, que no está presente en las secuencias de ácido nucleico que tienen Nos. de Acceso al GenBank X80903, U78889, U26590, L42229, U70843, AA142228, X80903, T33770, T33811, T07963, R32717 o T07962.

10. El ácido nucleico aislado de las reivindicaciones 1, 5, 6 o 7, que comprende además un marcador.

11. Un vector que comprende un ácido nucleico aislado de las reivindicaciones 1, 5, 6 o 7.

12. Una célula huésped que comprende un vector de la reivindicación 11.

13. Un polipéptido aislado seleccionado del grupo formado por:

a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es, por lo menos, 75% homóloga a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2;

b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es, por lo menos, 85% homóloga a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2;

c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es, por lo menos, 95% homóloga a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2;

d) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2; y

e) un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2, donde el fragmento comprende por lo menos 50 aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 2.

14. El polipéptido aislado de la reivindicación 13, donde el polipéptido comprende por lo menos una porción del dominio extracelular de la SEC ID NO: 2, siendo la porción del aminoácido 173 al aminoácido 217 de la SEC ID NO: 2.

15. El polipéptido aislado de la reivindicación 14, donde el polipéptido es una proteína de fusión con un polipéptido heterólogo.

16. El polipéptido aislado de la reivindicación 13, donde el polipéptido está formado por un dominio citoplasmático del aminoácido 554 al aminoácido 685 de la SEC ID NO: 2.

17. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que es, por lo menos, 80% homóloga a una secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al aminoácido 529 de la SEC ID NO: 2.

18. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que es, por lo menos, 80% homóloga a una secuencia de aminoácidos del aminoácido 554 al aminoácido 685 de la SEC ID NO: 2.

19. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que es, por lo menos, 90% homóloga a una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 aminoácidos consecutivos que se expone en la SEC ID NO: 2.

20. El polipéptido aislado de la reivindicación 13, donde el polipéptido tiene por lo menos una bioactividad.

21. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une selectivamente al polipéptido de las reivindicaciones 13, 17, 18 o 19.

22. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 21, que se selecciona del grupo formado por:

(a)

anticuerpos policlonales;

(b)

anticuerpos monoclonales;

(c)

fragmentos F(ab);

(d)

fragmentos F(ab')2.

23. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 21 o 22 que está conjugado a una sustancia detectable o a un fármaco citotóxico.

24. El anticuerpo de la reivindicación 23, en el cual la sustancia detectable se selecciona del grupo formado por:

(a)

enzimas;

(b)

materiales fluorescentes;

(c)

materiales quimioluminiscentes;

(d)

materiales bioluminiscentes.

25. El uso del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 21 o 22, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos de proliferación y/o diferenciación celular.

26. El uso de acuerdo con la reivindicación 25, en el cual el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende, además, un péptido citotóxico.

27. El uso de una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada de una de las SEC ID Nos: 16, 17, 18, 19 o 20 capaz de modular la expresión del polipéptido de la reivindicación 13, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos de proliferación y/o diferenciación celular.

28. El uso de los péptidos de las reivindicaciones 13, 17, 18 o 19 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos de proliferación y/o diferenciación celular.

29. Un método para identificar un producto terapéutico del polipéptido de la reivindicación 13, que comprende poner en contacto dicho polipéptido con un compuesto de prueba y determinar si el compuesto de prueba se une específicamente a dicho polipéptido.

30. Un método para identificar un producto terapéutico del polipéptido de la reivindicación 13, que comprende los pasos de:

(i) combinar dicho polipéptido, un compañero de unión de dicho polipéptido, y un compuesto de prueba en condiciones en las cuales, excepto el compuesto de prueba, dicho polipéptido y dicho compañero de unión son capaces de interactuar; y

(ii) detectar la formación de un complejo entre dicho polipéptido y dicho compañero de unión, tal que una diferencia en la formación de un complejo entre dicho polipéptido y dicho compañero de unión en presencia del compuesto de prueba con relación a la ausencia del compuesto de prueba es indicativa de que el compuesto de prueba es un producto terapéutico de dicho polipéptido.

31. Un método para identificar un producto terapéutico del polipéptido de la reivindicación 13, que comprende poner en contacto una célula, que comprende, además, el polipéptido de la reivindicación 13, con un compuesto de prueba y comparar una actividad de dicho polipéptido en la célula incubada en presencia del compuesto de prueba con relación a la actividad de dicho polipéptido en la célula incubada en ausencia del compuesto de prueba, tal que una diferencia en la actividad de dicho polipéptido es indicativa de que el compuesto de prueba es un producto terapéutico de dicho polipéptido.

32. Un método para determinar si un sujeto presenta riesgo de desarrollar un trastorno de proliferación y/o diferenciación celular, causado o al que contribuye una bioactividad aberrante del polipéptido de la reivindicación 13, que comprende medir en una muestra obtenida del sujeto por lo menos una bioactividad de dicho polipéptido, donde una diferencia en la bioactividad de dicho polipéptido relativa a la bioactividad de dicho polipéptido en una muestra de un sujeto normal indica que el sujeto presenta riesgo de desarrollar un trastorno de proliferación y/o diferenciación celular causado por o al que contribuye una bioactividad aberrante de dicho polipéptido.

33. El método de la reivindicación 31, en el cual una bioactividad del polipéptido de la reivindicación 13 se determina midiendo la expresión de un gen que codifica dicho polipéptido.

34. Un método para determinar si un gen que codifica el polipéptido de la reivindicación 13 de un sujeto contiene una lesión genética, que comprende los pasos de:

(i) poner en contacto un ácido nucleico que comprende por lo menos una porción del gen que codifica dicho polipéptido de una muestra obtenida del sujeto con por lo menos un ácido nucleico sonda capaz de interactuar con un gen de tipo salvaje que codifica dicho polipéptido; y

(ii) detectar la formación de un híbrido entre la porción del gen que codifica dicho polipéptido de la muestra obtenida del sujeto y el por lo menos un ácido nucleico sonda, tal que el grado de formación de un híbrido entre la porción del gen que codifica dicho polipéptido de la muestra obtenida del sujeto y el por lo menos un ácido nucleico indica si el gen que codifica dicho polipéptido del sujeto contiene una lesión genética.