ES2284214T3 - Nuevas moleculas de la familia de las proteinas tango-77 y usos de las mismas. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína que tiene la capacidad de inhibir la inflamación seleccionada la molécula de ácido nucleico del grupo formado por: a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 75% a la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, o el SEQ ID NO:10, el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el Número de Acceso 98807, o un complemento del mismo; b) una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 300 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, o el SEQ ID NO:10, el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el Número de Acceso 98807, o un complemento del mismo; c) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:4, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:8, el SEQ ID NO:9,el SEQ ID NO:11, el SEQ ID NO:12, o el SEQ ID NO:13, o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el Número de Acceso 98807. d) una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:4, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:8, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11, el SEQ ID NO:12, o el SEQ ID NO:13, donde el fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:4, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:8, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11, el SEQ ID NO:12, o el SEQ ID NO:13, o el polipéptido codificado por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el Número de Acceso 98807; y e) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:4, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:8, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11, el SEQ ID NO:12, o el SEQ ID NO:13, o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el Número de Acceso 98807; donde la secuencia de ácido nucleico hibrida con una molécula de ácido nucleico que comprende el SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, o el SEQ ID NO:10, o un complemento de la misma en condiciones restrictivas.

Description

Nuevas moléculas de la familia de las proteínas Tango-77 y usos de las mismas.

Antecedentes de la invención

La citoquina polipeptídica interleuquina 1 (IL-1) es un mediador crítico de la respuesta inflamatoria e inmunitaria global. Hasta la fecha, se han aislado y clonado tres miembros de la familia IL-1, IL-1\alpha, IL-1\beta e IL-1ra (antagonista del receptor de Interleuquina 1). La IL-1\alpha y la IL-1\beta son citoquinas proinflamatorias que logran respuestas biológicas, mientras que IL-1ra es un antagonista de la actividad de IL-1\alpha e IL-1\beta. Dos tipos distintos de receptores de la superficie celular han sido identificados para estos ligandos, el receptor de IL-1 de tipo 1 (IL-1RTI) y el receptor de IL-1 de tipo II (IL-1RTII). Los recientes resultados sugieren que IL-1RTI es el receptor responsable de la transducción de una señal y de la producción de efectos biológicos.

Como se ha mencionado antes, la IL-1 es un mediador clave de la respuesta inflamatoria en el huésped. Si bien la inflamación es un mecanismo homeostático importante, la inflamación aberrante tiene el potencial de inducir deterioro en el huésped. Se sabe que los niveles elevados de IL-1 están asociados con varias enfermedades, particularmente enfermedades autoinmunitarias y trastornos inflamatorios.

Puesto que IL-1ra es un inhibidor de origen natural de IL-1, IL-1ra puede ser utilizado para limitar los efectos aberrantes y potencialmente deletéreos de IL-1. En animales experimentales, se ha demostrado que el pretratamiento con IL-1ra evita la muerte resultante de la sepsis inducida mediante lipopolisacáridos. También se ha sugerido que la ausencia relativa de IL-1ra juega un papel en la enfermedad inflamatoria del intestino de humanos.

Compendio de la invención

La presente invención está basada, al menos en parte, en el descubrimiento de un gen que codifica Tango-77, una proteína secretada que se pronostica que es un miembro de la superfamilia de las citoquinas. El ADNc Tango-77 descrito más abajo (SEQ ID NO:1) tiene tres posibles marcos de lectura abiertos. El primer marco de lectura abierto potencial abarca 534 nucleótidos que se extienden del nucleótido 356 al nucleótido 889 del SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO:3) y codifica una proteína de 178 aminoácidos (SEQ ID NO:2). Esta proteína puede incluir una secuencia señal pronosticada de aproximadamente 63 aminoácidos (de aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 63 del SEQ ID NO:2 (SEQ ID NO:4) y una proteína madura pronosticada de aproximadamente 115 aminoácidos (de aproximadamente el aminoácido 64 al aminoácido 178 del SEQ ID NO:2 (SEQ ID NO:5)).

El segundo marco de lectura abierto potencial abarca 498 nucleótidos que se extienden del nucleótido 389 al nucleótido 889 del SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO:6) y codifica una proteína de 167 aminoácidos (SEQ ID NO:7). Esta proteína puede incluir una secuencia señal pronosticada de aproximadamente 52 aminoácidos (de aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 52 del SEQ ID NO:7 (SEQ ID NO:8)) y una proteína madura pronosticada de aproximadamente 115 aminoácidos (de aproximadamente el aminoácido 52 al aminoácido 167 del SEQ ID NO:7 (SEQ ID NO:9).

El tercer marco de lectura abierto potencial abarca 408 nucleótidos que se extienden del nucleótido 481 al nucleótido 889 del SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO:10) y codifica una proteína de 136 aminoácidos (SEQ ID NO:11). Esta proteína incluye una secuencia señal pronosticada de aproximadamente 21 aminoácidos (de aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 21 del SEQ ID NO:11 (SEQ ID NO:12)) y una proteína madura pronosticada de aproximadamente 115 aminoácidos (de aproximadamente el aminoácido 22 al aminoácido 136 del SEQ ID NO:11 (SEQ ID NO:13).

Según se utiliza en la presente memoria, los términos "Tango-77", "proteína Tango-77", "Polipéptido Tango-77" y similares, pueden hacer referencia al polipéptido producido por el ADNc del SEQ ID NO:1 incluyendo todos y cada uno de los productos génicos Tango-77 descritos antes.

Se espera que Tango-77 inhiba la inflamación y juegue un papel funcional similar al de IL-1ra secretado. Por ejemplo, se espera que Tango-77 pueda unirse al receptor de IL-1, bloqueando de este modo la activación del receptor mediante la inhibición de la unión de IL-1\alpha e IL-1\beta al receptor. Alternativamente, Tango-77 puede inhibir la inflamación a través de otra ruta, por ejemplo, mediante la unión a un receptor novedoso. Por consiguiente, Tango-77 puede ser útil como agente modulador en la regulación de una variedad de procesos celulares incluyendo la inflamación aguda y crónica, por ejemplo, el asma, la leucemia mielógena crónica, la artritis reumatoide, la psoriasis y la enfermedad inflamatoria del intestino.

En un aspecto, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas como se define en la reivindicación 1.

Los autores de la presente invención describen métodos para diagnosticar y tratar pacientes que padecen un trastorno inflamatorio asociado con niveles anómalos (indeseablemente altos o indeseablemente bajos) de inflamación, actividad anómala de complejo de receptores de IL-1, o la actividad anómala de IL-1, mediante la administración de un compuesto que modula la expresión de Tango-77 (a nivel de ADN, ARNm o proteína, por ejemplo. alterando el empalme del ARNm) o mediante la alteración de la actividad de Tango-77. Entre los ejemplos de tales compuestos se incluyen moléculas pequeñas, moléculas de ácido nucleico antisentido, ribozimas y polipéptidos.

La invención caracteriza una molécula de ácido nucleico que es idéntica al menos en un 75% a la secuencia de ácido nucleico mostrada en el SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con un Número de Acceso (el "ADNc de ATCC 98807"), o un complemento de la misma.

La invención caracteriza una molécula de ácido nucleico que incluye un fragmento de al menos 300 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10, la secuencia de nucleótidos del ADNc ATCC 98807, o un complemento de la misma.

La invención también caracteriza una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 75% a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11, el SEQ ID NO:13, o la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de ATCC 98807.

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico Tango-77 tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10 o la secuencia de nucleótidos del ADNc de ATCC 98807.

También se encuentra dentro de la invención una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:4, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:8, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11, el SEQ ID NO:12, el SEQ ID NO:13, donde el fragmento incluye al menos 15 aminoácidos contiguos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:4, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:8, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11, el SEQ ID NO:12, el SEQ ID NO:13, o el polipéptido codificado por el ADNc con el Número de Acceso 98807 de la ATCC.

La invención incluye una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:4, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:8, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11, el SEQ ID NO:12, el SEQ ID NO:13, o la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc con el Número de Acceso 98807 de la ATCC; donde la molécula de ácido nucleico hibrida con una molécula de ácido que comprende el SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10, o un complemento de la misma en condiciones restrictivas.

También se encuentra dentro de la invención: una proteína Tango-77 aislada que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 75% a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:9 o el SEQ ID NO:13 (Tango-77 humana madura), o la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:7 o el SEQ ID NO:11 (Tango-77 humana inmadura).

También se encuentran dentro de la invención: una proteína Tango-77 aislada que está codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 75% al SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6 o el SEQ ID NO:10 o al ADNc de ATCC 98807; y una proteína Tango-77 que es codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones de hibridación restrictivas con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10, la hebra no codificadora del ADNc de ATCC 98807, o el complemento de la misma.

También se encuentra dentro de la invención un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:4, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:8, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11, el SEQ ID NO:12, el SEQ ID NO:13, o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el Número de Acceso 98807, donde el polipéptido está codificado por una molécula de ácido nucleico que hibrida con una molécula de ácido nucleico que comprende el SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10 o el complemento de la misma en condiciones restrictivas.

Los autores de la presente invención describen moléculas de ácido nucleico Tango-77 que detectan específicamente moléculas de ácido nucleico Tango-77 relacionadas con moléculas de ácido nucleico que codifican otros miembros de la superfamilia de las citoquinas. Por ejemplo, en una realización, una molécula de ácido nucleico Tango-77 hibrida en condiciones restrictivas con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10, el ADNc de ATCC 98807, o un complemento de la misma. En otra realización, la molécula de ácido nucleico Tango-77 tiene una longitud de al menos 300 (325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, o 989) nucleótidos e hibrida en condiciones restrictivas con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10, el ADNc de ATCC 98807, o un complemento de la misma. En otra realización más, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que es antisentido a la hebra codificadora de un ácido nucleico Tango-77.

En otro aspecto de la invención se proporciona un vector, por ejemplo, un vector de expresión recombinante, que comprende una molécula de ácido nucleico Tango-77 de la invención. En otra realización, la invención proporciona una célula huésped que contiene semejante vector. La invención también proporciona un método para producir la proteína Tango-77 cultivando, en un medio adecuado, una célula huésped de la invención que contiene un vector de expresión recombinante de manera que se produce una proteína Tango-77.

Otro aspecto de esta invención caracteriza proteínas y polipéptidos Tango-77 aislados o recombinantes. Las proteínas y polipéptidos Tango-77 preferidos poseen al menos la actividad biológica poseída por Tango-77 humana de origen natural, por ejemplo, (i) la capacidad de interactuar con proteínas en la ruta de señalización de Tango-77, (ii) la capacidad de interactuar con un ligando o receptor de Tango-77; o (iii) la capacidad para interactuar con una proteína diana intracelular, (iv) la capacidad para interactuar con una proteína implicada en la inflamación y (v) la capacidad para unirse al receptor de IL-1. Entre otras actividades se incluyen la inducción y la supresión de interleuquinas, citoquinas y factores de crecimiento polipeptídicos.

Las proteínas Tango-77 de la presente invención, o porciones biológicamente activas de las mismas, pueden ser conectadas operablemente a un polipéptido no Tango-77 (por ejemplo secuencias de aminoácidos heterólogas) para formar proteínas de fusión con Tango-77. La invención caracteriza adicionalmente anticuerpos que se unen específicamente a proteínas Tango-77, tales como anticuerpos monoclonales o policlonales. Por añadidura, las proteínas Tango-77 o las porciones biológicamente activas de las mismas pueden ser incorporadas a composiciones farmacéuticas, que incluyen opcionalmente portadores farmacéuticamente aceptables.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para detectar la presencia de la actividad o expresión de Tango-77 en una muestra biológica poniendo en contacto la muestra biológica con un agente capaz de detectar un indicador de la actividad o la expresión de Tango-77 de manera que se detecte presencia de actividad o expresión de Tango-77 en la muestra biológica.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para modular la actividad de Tango-77 que comprende poner en contacto una célula con un agente que modula (inhibe o estimula) la actividad o la expresión de Tango-77 de manera que se modula la actividad o la expresión de Tango-77. En una realización, el agente es un anticuerpo que se une específicamente a la proteína Tango-77. En otra realización, el agente modula la expresión de Tango-77 modulando la transcripción de un gen Tango-77, el empalme de un ARNm Tango-77 o la traducción de un ARNm Tango-77. En otra realización más, el agente es una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que es antisentido a la hebra codificadora del ARNm Tango-77 del gen Tango-77.

Los autores de la presente invención describen que los métodos de la presente invención pueden ser utilizados para tratar a un sujeto que tiene un trastorno caracterizado por la actividad o la expresión aberrante del ácido nucleico de la proteína Tango-77 administrando un agente que es un modulador de Tango-77 al sujeto. En una realización, el modulador de Tango-77 es una proteína Tango-77. En otra realización, el modulador de Tango-77 es una molécula de ácido nucleico Tango-77. En otras realizaciones, el modulador de Tango-77 es un péptido, peptidomimético, u otra molécula pequeña. En una realización preferida, el trastorno caracterizado por la actividad o la expresión aberrante del ácido nucleico de la proteína Tango-77 puede incluir la inflamación crónica y aguda.

Los autores de la presente invención también describen un análisis de diagnóstico para identificar la presencia o ausencia de una lesión genética o mutación caracterizada por al menos uno de: (i) la modificación o mutación aberrante de un gen que codifica una proteína Tango-77; (ii) la regulación errónea de un gen que codifica la proteína Tango-77; y (iii) la modificación post-traduccional aberrante de una proteína Tango-77, donde una forma de tipo salvaje del gen codifica una proteína con una actividad Tango-77.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para identificar un compuesto que se une a, o modula la actividad de, una proteína Tango-77. En general, tales métodos acarrean la medición de una actividad biológica de una proteína Tango-77 en presencia y ausencia de un compuesto de ensayo y la identificación de aquellos compuestos que alteran la actividad de la proteína Tango-77.

La invención también caracteriza los métodos para identificar un compuesto que modula la expresión de Tango-77 midiendo la expresión de Tango-77 en presencia y ausencia de un compuesto.

Otras características y ventajas de la invención se harán evidentes a partir de la descripción detallada y las reivindicaciones siguientes.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 describe la secuencia de ADNc (SEQ ID NO:1) de Tango-77. El ADNc de Tango-77 tiene tres posibles marcos de lectura abiertos que codifican la secuencia de aminoácido (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:11 de Tango-77 humana. Los tres marcos de lectura abiertos potenciales del SEQ ID NO:1 se extienden de: (1) el nucleótido 356 al nucleótido 889 (SEQ ID NO:3); (2) del nucleótido 389 al nucleótido 889 (SEQ ID NO:6); y (3) del nucleótido 481 al nucleótido 889 (SEQ ID NO:10).

La Figura 2 describe un alineamiento de una secuencia de aminoácidos Tango-77 (T77; SEQ ID NO:2) con IL-1RA (SEQ ID NO:14), e IL-1\beta (SEQ ID NO:15).

La Figura 3 describe la secuencia genómica de BAC1 (SEQ ID NO:16).

La Figura 4 describe la secuencia genómica de BAC2 (SEQ ID NO:17).

La Figura 5 describe una secuencia de aminoácidos de una forma empalmada alternativamente de Tango-77 (SEQ ID NO:2) pronosticada por Procrustes (T77-procrustes; SEQ ID NO:18).

La Figura 6 describe un alineamiento de una secuencia de aminoácidos de una forma empalmada alternativamente de Tango-77 (T77-procrustes; SEQ ID NO:18) con Tango-77 (SEQ ID NO:2).

La Figura 7 describe un alineamiento de una secuencia de aminoácidos de una forma empalmada alternativamente de Tango-77 (T77-procrustes; SEQ ID NO:18) con IL-1ra (SEQ ID NO:14), e IL-1\beta (SEQ ID NO:15).

Descripción detallada de la invención

La presente invención está basada en el descubrimiento de una molécula de ADNc que codifica Tango-77 humana, un miembro de la superfamilia de las citoquinas. La molécula de ADNc que codifica Tango-77 humana tiene tres posibles marcos de lectura abiertos. Los tres posibles marcos de lectura abiertos de nucleótidos para la proteína Tango-77 humana se muestran en la Figura 1 (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, y SEQ ID NO:10). La secuencia de aminoácidos pronosticada para las tres posibles proteínas inmaduras Tango-77 también se muestran en la Figura 1 (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:11) y las tres posibles proteínas maduras también se muestran en la Figura 1 (SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:13).

El ADNc de Tango-77 de la Figura 1 (SEQ ID NO:1), que tiene aproximadamente 989 nucleótidos de longitud incluyendo las regiones no traducidas, codifica una proteína con aminoácidos que tiene un peso molecular de aproximadamente 19 kDa, 18 kDa, o 14,9 kDa (excluyendo las modificaciones post-traduccionales) y la posible forma madura de la proteína tiene un peso molecular de 13 kDa. Un plásmido que contiene un ADNc que codifica Tango-77 humana (con el nombre de inserto de ADNc fthx077) fue depositado en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 el 2 de Julio de 1.988 y se le asignó el Número de Acceso 98807. Este depósito se mantendrá bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos del Procedimiento de Patente. Este depósito se realizó meramente por conveniencia de los expertos en la técnica y no se admite que se requiera un depósito bajo 35 U.S.C. \NAK112.

Tango-77 humana es un miembro de una familia de moléculas (la familia "Tango-77") que tiene ciertas características estructurales y funcionales conservadas. Se desea que el término "familia", cuando hace referencia a las proteínas y moléculas de ácido nucleico de la invención, signifique dos o más proteínas o moléculas de ácido nucleico que tienen un dominio estructural común y tienen una identidad de la secuencia de aminoácidos o nucleótidos suficiente como se define en la presente memoria. Semejantes miembros de la familia pueden ser de origen natural y pueden ser de la misma especie o de especies diferentes. Por ejemplo, una familia puede contener una primera proteína de origen humano y un homólogo de esa proteína de origen murino, así como una segunda proteína distinta de origen humano y un homólogo murino de esa proteína. Los miembros de una familia pueden tener también características funcionales comunes.

Según se utiliza indistintamente en la presente memoria una "actividad Tango-77" "actividad biológica Tango-77" o "actividad funcional Tango-77", hace referencia a una actividad ejercida por una proteína, polipéptido o molécula de ácido nucleico Tango-77 sobre una célula sensible a Tango-77 como se determina in vivo, o in vitro, según técnicas normalizadas. Una actividad Tango-77 puede ser una actividad directa, tal como una asociación con una segunda proteína, o una actividad indirecta, tal como una actividad de señalización celular mediada por la interacción de la proteína Tango-77 con una segunda proteína. En una realización preferida, una actividad Tango-77 incluye al menos una o más de las siguientes actividades: (i) la capacidad para interactuar con proteínas en la ruta de señalización de Tango-77, (ii) la capacidad de interactuar con un ligando o receptor de Tango-77; o (iii) la capacidad para interactuar con una proteína diana intracelular, (iv) la capacidad para interactuar con una proteína implicada en la inflamación y (v) la capacidad para unirse al receptor de IL-1.

Por consiguiente, los autores de la presente invención describen proteínas y polipéptidos Tango-77 aislados que tienen una actividad Tango-77.

En otra realización más de la presente invención se caracterizan moléculas Tango-77 que contienen una secuencia señal. Generalmente, una secuencia señal (o péptido señal) es un péptido que contiene aproximadamente de 21 a 63 aminoácidos que se encuentran en el extremo N-terminal de una proteína secretora. La secuencia señal de Tango-77 natural (SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:12) se puede eliminar y reemplazar por la secuencia señal de otra proteína. En algunas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero), se puede incrementar la expresión, la secreción o ambas de Tango-77 a través del uso de una secuencia señal heteróloga. Por ejemplo, la secuencia secretora gp67 de la proteína de la envuelta de baculovirus se puede utilizar como secuencia señal heteróloga. Alternativamente, se puede utilizar la propia secuencia señal de Tango-77 natural como secuencia señal heteróloga en sistemas de expresión, por ejemplo, para facilitar la secreción de una proteína de interés.

Se describen diferentes aspectos de la invención con más detalle en las siguientes subsecciones.

I. Moléculas de Ácidos Nucleicos Aisladas

Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican proteínas Tango-77 o porciones biológicamente activas de las mismas, así como a moléculas de ácido nucleico suficientes para su uso como sondas de hibridación para identificar ácidos nucleicos que codifican Tango-77 (por ejemplo, ARNm Tango-77) y fragmentos para su uso como cebadores de la PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico Tango-77. Según se utiliza en la presente memoria, se desea que el término "molécula de ácido nucleico" incluya moléculas de ADN (por ejemplo , ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos de los ADN o ARN generados utilizando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es bicatenaria.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una que está separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" carece de secuencias (preferiblemente secuencias que codifican proteínas) que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico Tango-77 aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que deriva el ácido nucleico. Por otra parte, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o estar sustancialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetiza químicamente.

Se puede aislar una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10, el ADNc de ATCC 98807, o un complemento de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos utilizando técnicas de biología molecular normalizadas y la información de las secuencias proporcionada en la presente memoria. Utilizando todas o una porción de las secuencias de ácido nucleico del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10, el ADNc de ATCC 98807, o el complemento de las mismas como sonda de hibridación, se pueden aislar las moléculas de ácido nucleico Tango-77 utilizando técnicas de hibridación y clonación normalizadas (por ejemplo, como describen Sambrook y otros, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Se puede amplificar un ácido nucleico de la invención utilizando ADNc, ARNm o ADN genómico como molde y los cebadores oligonucleotídicos apropiados según las técnicas de amplificación mediante PCR normalizadas. El ácido nucleico amplificado de este modo se puede clonar en un vector apropiado y caracterizar mediante análisis de la secuencia de ADN. Además, los oligonucleótidos correspondientes a las secuencias de nucleótidos Tango-77 pueden ser preparados mediante técnicas sintéticas normalizadas, por ejemplo, utilizando un sintetizador de ADN automatizado.

En otra realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10, el ADNc de ATCC 98807, o una porción de la misma. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de nucleótidos dada es una que es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos dada que puede hibridar con la secuencia de nucleótidos dada formando de este modo un dúplex estable.

Por otra parte, una molécula de ácido nucleico puede comprender sólo una porción de una secuencia de ácido nucleico que codifica Tango-77, por ejemplo, un fragmento que puede ser utilizado como sonda o cebador o un fragmento que codifica una porción biológicamente activa de Tango-77. La secuencia de nucleótidos determinada a partir de la clonación del gen Tango-77 humano permite la formación de sondas y cebadores diseñados para su uso en la identificación y/o clonación de homólogos de Tango-77 de otros tipos de células, por ejemplo, de otros tejidos, así como homólogos de Tango-77 de otros mamíferos. La sonda/cebador comprende típicamente oligonucleótidos purificados sustancialmente. El oligonucleótido comprende típicamente una región de la secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones restrictivas con al menos aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 25, más preferiblemente aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 o 400 nucleótidos consecutivos de la secuencia efectora o anti-sentido del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10, o el ADNc de ATCC 98807. Alternativamente, el oligonucleótido puede comprender típicamente una región de la secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones restrictivas con al menos aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 25, más preferiblemente aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 o 400 nucleótidos consecutivos de la secuencia efectora o anti-sentido de un mutante de origen natural del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10, o el ADNc de ATCC 98807.

Las sondas basadas en la secuencia de nucleótidos Tango-77 humana pueden ser utilizadas para detectar transcritos o secuencias genómicas que codifican las mismas proteínas o proteínas idénticas. La sonda comprende un grupo marcador anclado a ella, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. Tales sondas pueden ser utilizadas como parte de un estuche para ensayos de diagnóstico para identificar células o tejidos que expresan erróneamente una proteína Tango-77, por ejemplo midiendo un nivel de un ácido nucleico que codifica Tango-77 en una muestra de células de un sujeto, por ejemplo, detectando los niveles de ARNm Tango-77 o determinado si un gen Tango-77 genómico ha sido mutado o suprimido.

Se puede preparar un fragmento de ácido nucleico que codifica una "porción biológicamente activa de Tango-77" aislando una porción del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10, o la secuencia de nucleótidos del ADNc de ATCC 98807 que codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica Tango-77, expresando la porción codificada de la proteína Tango-77 (por ejemplo mediante expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la porción codificada de Tango-77.

La invención abarca adicionalmente moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10, o el ADNc de ATCC 98807 debido a la degeneración del código genético y de este modo codifican la misma proteína Tango-77 que la codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10, o el ADNc de ATCC 98807.

Además de la secuencia de nucleótidos Tango-77 humana mostrada en el SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10, o el ADNc de ATCC 98807, los expertos en la técnica apreciarán que pueden existir polimorfismos de la secuencia de ADN que conducen a los cambios en las secuencias de aminoácidos de Tango-77 en una población (por ejemplo, la población humana). Semejantes polimorfismos genéticos en el gen Tango-77 pueden existir entre individuos de una población debido a la variación alélica natural. Un alelo es uno de un grupo de genes que se encuentran alternativamente en un locus genético dado. Según se utiliza en la presente memoria, el término "variante alélica" hace referencia a una secuencia de nucleótidos que se encuentra en un locus Tango-77 o un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos. Según se utilizan en la presente memoria, los términos "gen" y "gen recombinante" hacen referencia a moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco de lectura abierto que codifica una proteína Tango-77, preferiblemente una proteína Tango-77 de mamífero. Semejantes variaciones alélicas naturales pueden dar lugar típicamente a una variación del 1-5% en la secuencia de nucleótidos del gen Tango-77. Alternativamente los alelos pueden ser identificados secuenciando el gen de interés en varios individuos diferentes. Esto se puede llevar a cabo fácilmente utilizando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético en una variedad de individuos. Se desea que todas y cada una de tales variaciones de nucleótidos y polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes en Tango-77 que son el resultado de una variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional de Tango-77 estén dentro del alcance de la invención.

Por otra parte, se desea que las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas Tango-77 de otras especies (homólogos de Tango-77), que tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de la de Tango-77 humana, estén dentro del alcance de la invención. Las moléculas de ácido nucleico correspondientes a las variantes alélicas naturales y homólogos del ADNc Tango-77 de la invención se pueden aislar basándose en su identidad con los ácidos nucleicos Tango-77 humanos descritos en la presente memoria utilizando los ADNc humanos, o una porción de los mismos, como sonda de hibridación según las técnicas de hibridación normalizadas en condiciones de hibridación restrictivas.

Por consiguiente, en otra realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención tiene una longitud de al menos 300 (325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, o 989) nucleótidos e hibrida en condiciones restrictivas con la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos, preferiblemente la secuencia codificadora, del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10, o el ADNc de ATCC 98807.

Según se utiliza en la presente memoria, se desea que el término "hibrida en condiciones restrictivas" describa las condiciones para la hibridación y el lavado bajo las cuales las secuencias de nucleótidos idénticas en al menos un 60% (65%, 70%, preferiblemente 75%) entre sí permanecen típicamente hibridadas entre sí. Semejantes condiciones restrictivas son conocidas por los expertos en la técnica y pueden ser encontradas en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo preferido, no limitante de condiciones de hibridación restrictivas es hibridación en 6x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido de uno o más lavados en 0,2x SSC, SDS al 0,1% a 50-65ºC. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención que hibrida en condiciones restrictivas con la secuencia del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10, el ADNc de ATCC 98807, o el complemento de las misma, corresponde a una molécula de ácido nucleico de origen natural. Según se utiliza en la presente memoria, una molécula de ácido nucleico de "origen natural" hace referencia a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína natural).

Además de las variantes alélicas de origen natural de la secuencia Tango-77 que pueden existir en la población, el artesano experto apreciará que se pueden introducir cambios mediante mutación en la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10 o el ADNc de ATCC 98807, conduciendo de ese modo a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína Tango-77 codificada, sin alterar la actividad biológica de la proteína Tango-77. Los restos aminoácido que no son conservados o sólo son semiconservados entre Tango-77 de diferentes especies pueden ser no esenciales para la actividad y de este modo podrían ser probablemente dianas para la alteración. Alternativamente, se pueden realizar sustituciones de nucleótidos que conduzcan a sustituciones de aminoácidos en restos "no esenciales". Un resto aminoácido "no esencial" es un resto que puede ser alterado en la secuencia de tipo salvaje de Tango-77 (por ejemplo, la secuencia del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11 o el SEQ ID NO:13) sin alterar la actividad biológica, mientras que se requiere un resto aminoácido "esencial" para la actividad biológica. Por ejemplo, los restos aminoácidos que son conservados entre las proteínas Tango-77 de diferentes especies pueden ser esenciales para la actividad y de este modo podrían no ser probablemente dianas para la alteración, a no ser que se desee reducir o alterar la actividad de Tango-77.

Por consiguiente, otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas Tango-77 que contienen cambios en los restos aminoácido que no son esenciales para su actividad. Semejantes proteínas Tango-77 difieren en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11 o el SEQ ID NO:13 que todavía conservan la actividad biológica. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 45%, idéntica en un 65%, 75%, 85%, 95%, o 98% a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11 o el SEQ ID NO:13.

Se puede crear una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína Tango-77 que tiene una secuencia que difiere de la del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11 o el SEQ ID NO:13 introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, el SEQ ID NO:10, o el ADNc de ATCC 98807 de manera que se introduzcan una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteína codificada. Las mutaciones se pueden introducir mediante técnicas normalizadas, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos conservativas se realizan en uno o más restos aminoácido no esenciales pronosticados. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en la que el resto aminoácido se reemplaza por un resto aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de restos aminoácido que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales alcalinas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparragina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, un resto aminoácido no esencial pronosticado en Tango-77 se reemplaza preferiblemente por otro resto aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Alternativamente, las mutaciones se pueden introducir al azar junto con todo o parte de una secuencia codificadora Tango-77, por ejemplo mediante mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes se pueden rastrear en cuanto a la actividad biológica de Tango-77 para identificar los mutantes que conservan la actividad. Siguiente a la mutagénesis, la proteína codificada puede ser expresada recombinantemente y se puede determinar la actividad de la proteína.

En una realización preferida, se puede someter a ensayo una proteína Tango-77 mutante en cuanto a: (1) la capacidad para formar interacciones proteína:proteína con proteínas en la ruta de señalización de Tango-77; (2) la capacidad para unirse a un ligando o receptor Tango-77; o (3) la capacidad para unirse a una proteína diana intracelular o (4) la capacidad para interactuar con una proteína implicada en la inflamación o (5) la capacidad para unirse al receptor de IL-1. En otra realización preferida más, se puede someter a ensayo un mutante Tango-77 en cuanto a la capacidad para modular la inflamación, el asma, las enfermedades autoinmunitarias, y la sepsis.

La presente invención abarca moléculas de ácido nucleico antisentido, es decir, moléculas que son complementarias a un ácido nucleico efector que codifica una proteína, por ejemplo, complementaria a la hebra codificadora de una molécula de ADNc bicatenaria o complementaria a una secuencia de ARNm. Por consiguiente, un ácido nucleico antisentido puede unirse mediante enlaces de hidrógeno a un ácido nucleico efector. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una hebra codificadora de Tango-77, o sólo a una porción de la misma, por ejemplo, toda o parte de la región codificadora de la proteína (o marco de lectura abierto). Una molécula de ácido nucleico antisentido puede ser antisentido a una región no codificadora de la hebra codificadora de una secuencia de nucleótidos que codifica Tango-77. Las regiones no codificadoras ("regiones no traducidas 5' y 3'") son las secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificadora y no están traducidas a aminoácidos.

Dadas las secuencias de la hebra codificadora que codifica Tango-77 descrita en la presente memoria (por ejemplo, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:5, o el SEQ ID NO:8), los ácidos nucleicos antisentido de la invención pueden ser diseñados según las reglas de emparejamiento de bases de Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la región codificadora completa del ARNm Tango-77, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es antisentido sólo a una porción de la región codificadora o no codificadora del ARNm Tango-77. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que circunda el sitio de comienzo de la traducción del ARNm Tango-77, por ejemplo, un oligonucleótido que tiene la secuencia

	5'-TGCAACTTTTACAGGAAACAC-3'	(SEQ ID NO:19) o
	5'-CCTCACTTTTACCCGAGACTC-3'	(SEQ ID NO:20) o
	5'-GACGGGTGGTACTTAAAACAA-3'	(SEQ ID NO:21).

Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, una longitud de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos. Un ácido nucleico antisentido de la invención se puede construir utilizando síntesis química y reacciones de ligadura enzimática utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) se puede sintetizar químicamente utilizando nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados de diferentes maneras para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y efectores, por ejemplo, se pueden utilizar derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos de acridina. Entre los ejemplos de los nucleótidos modificados que se pueden utilizar para generar el ácido nucleico antisentido se incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)-uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)-uracilo (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, el ácido nucleico antisentido se puede producir biológicamente utilizando un vector de expresión en el que se ha subclonado un ácido nucleico en orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito del ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido a un ácido nucleico diana de interés, descrito adicionalmente en la siguiente subsección).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención se administran típicamente a un sujeto o se generan in situ de manera que hibriden con, o se unan a, un ARNm celular y/o un ADN genómico que codifica una proteína Tango-77 para de ese modo inhibir la expresión de la proteína, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o la traducción. La hibridación puede ser por complementariedad de nucleótidos convencional para formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se une a dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco principal de la doble hélice. Un ejemplo de una ruta de administración de las moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención incluye la inyección directa en un lugar del tejido. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico antisentido se pueden modificar en las células seleccionadas como diana y después administrar sistémicamente. Por ejemplo, para la administración sistémica, las moléculas antisentido se pueden modificar de manera que se unan específicamente a los receptores o antígenos expresados sobre una superficie celular seleccionada, por ejemplo, conectando las moléculas de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a los receptores o antígenos de la superficie celular. Las moléculas de ácido nucleico antisentido se pueden liberar también en las células utilizando los vectores descritos en la presente memoria. Para lograr suficientes concentraciones intracelulares de las moléculas antisentido, se prefieren constructos vectores en los que la molécula de ácido nucleico antisentido se coloca bajo el control de un promotor pol II o pol III fuerte.

Una molécula de ácido nucleico antisentido de la invención puede ser una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica. Una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario en los que, al contrario de las unidades \beta usuales, las hebras corren en paralelo entre sí (Gaultier y otros (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido puede comprender también un 2'-o-metilrribonucleótido (Inoue y otros (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue y otros (1987) FEBS Lett. 215:327-330).

En otras realizaciones, el oligonucleótido puede incluir otros grupos anclados tales como péptidos (por ejemplo, para buscar receptores de células huésped in vivo), o agentes que faciliten el transporte a través de la membrana celular (ver, por ejemplo Letsinger y otros (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre y otros (1987); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; Publicación PCT Núm. WO 88/09810) o la barrera hematoencefálica (ver, por ejemplo, la Publicación PCT Núm. WO 89/10134). Por añadidura, los oligonucleótidos pueden ser modificados con agentes de escisión desencadenada por la hibridación (ver, por ejemplo, Krol y otros (1988) Bio/Techniques 6:958-976) o agentes intercalantes (ver, por ejemplo, Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549). Para este fin, el oligonucleótido se puede conjugar con otra molécula, por ejemplo, un péptido, un agente de entrecruzamiento desencadenado por hibridación, un agente de transporte, un agente de escisión desencadenada por hibridación, etc.

II. Proteínas Tango-77 Aisladas y Anticuerpos Anti-Tango-77

Un aspecto de la invención se refiere a proteínas Tango-77 aisladas, y porciones biológicamente activas de las mismas, así como fragmentos de polipéptidos adecuados para su uso como inmunógenos para aumentar los anticuerpos anti-Tango-77. En una realización, las proteínas Tango-77 naturales se pueden aislar de fuentes de células o tejidos mediante un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas de purificación de proteínas normalizadas. En otra realización, las proteínas Tango-77 se producen mediante técnicas de ADN recombinante. Como alternativa a la expresión recombinante, se pueden sintetizar químicamente una proteína o un polipéptido Tango-77 utilizando técnicas de síntesis de péptidos normalizadas.

Una proteína "aislada" o "purificada" o una porción biológicamente activa de la misma están sustancialmente libres de material celular o de otras proteínas contaminantes de la fuente de células o tejidos de la que deriva la proteína Tango-77, o sustancialmente libres de precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetizan químicamente. El lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de la proteína Tango-77 en las que la proteína se separa de los componentes celulares de las células de las que se aísla o produce recombinantemente. De este modo, la proteína Tango-77 que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de la proteína Tango-77 que tienen menos de aproximadamente el 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de proteína que no es Tango-77 (también referida en la presente memoria como "proteína contaminante"). Cuando la proteína Tango-77 o una porción biológicamente activa de la misma se producen recombinantemente, también están sustancialmente libres preferiblemente de medio de cultivo, esto es, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20%, 10%, o 5% del volumen de la preparación de proteína. Cuando la proteína Tango-77 se produce mediante síntesis química, está sustancialmente libre preferiblemente de precursores químicos u otros agentes químicos, es decir, se separa de los precursores químicos u otros agentes químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. Por consiguiente tales preparaciones de la proteína Tango-77 tienen menos de aproximadamente el 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de precursores químicos o agentes químicos que no son Tango-77.

Las porciones biológicamente activas de una proteína Tango-77 incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a, o derivadas de, la secuencia de aminoácidos de la proteína Tango-77 (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11 o el SEQ ID NO:13), que incluye menos aminoácidos que las proteínas Tango-77 completas, y muestran al menos una actividad de una proteína Tango-77. Típicamente, las porciones biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la proteína Tango-77. Una porción biológicamente activa de una proteína Tango-77 puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de longitud.

Por otra parte, se pueden preparar otras porciones biológicamente activas, en las que se suprimen otras regiones de la proteína mediante técnicas recombinantes y evaluar en cuanto a una o más de las actividades funcionales de la proteína Tango-77 natural.

La proteína Tango-77 preferida tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11 o el SEQ ID NO:13. Otras proteínas Tango-77 útiles son sustancialmente idénticas al SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:13 y conservan la actividad funcional de la proteína del SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:13 difiriendo no obstante en la secuencia de aminoácidos debido a la variación alélica natural o mutagénesis. Por consiguiente, una proteína Tango-77 útil es una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 45%, preferiblemente 55%, 65%, 75%, 85%, 95%, o 99% a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:13 y conserva la actividad funcional de las proteínas Tango-77 del SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:13. En una realización preferida, la proteína Tango-77 conserva una actividad funcional de la proteína Tango-77 del SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:13.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean con fines de comparación óptimos (por ejemplo, se pueden introducir huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos para el alineamiento óptimo con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos). Después se comparan los restos aminoácido o los nucleótidos en las posiciones de los aminoácidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en esta posición. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = Núm. de posiciones idénticas/total Núm. de posiciones, por ejemplo, solapamiento x 100). Preferiblemente, las dos secuencias tienen la misma longitud.

La determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido, no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificado por Karlin y Altschul (1993) en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Semejante algoritmo se incorpora a los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, y otros (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Las búsquedas de nucleótidos con BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico Tango-77 de la invención. Las búsquedas de proteínas con BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína Tango-77 de la invención. Para obtener alineamientos con huecos con fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST como describen Altschul, y otros (1997) en Nucleic Acid Res. 25:3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo preferido, no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Semejante algoritmo se incorpora al programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de soporte lógico de alineamiento de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede utilizar una tabla de restos por pesos PAM120, una penalización de la longitud del hueco de 12, y una penalización del hueco de 4.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede ser determinado utilizando técnicas similares a las descritas antes, permitiendo o sin permitir huecos. Al calcular el porcentaje de identidad, sólo se cuentan los emparejamientos exactos.

La invención también proporciona proteínas quiméricas o de fusión Tango-77. Según se utiliza en la presente memoria, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" Tango-77 comprende un polipéptido Tango-77 conectado operablemente a un polipéptido que no sea Tango-77. Un "polipéptido Tango-77" hace referencia a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a los polipéptidos Tango-77, mientras que un "polipéptido que no sea Tango-77" hace referencia a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína que no es sustancialmente idéntica a la proteína Tango-77, por ejemplo, una proteína que es diferente de la proteína Tango-77 y que está derivada del mismo organismo o de un organismo diferente. En una proteína de fusión Tango-77 el polipéptido Tango-77 puede corresponder a toda o a una porción de la proteína Tango-77, preferiblemente al menos a una porción biológicamente activa de la proteína Tango-77. En la proteína de fusión, se desea que el término "conectado operablemente" indique que el polipéptido Tango-77 y el polipéptido que no sea Tango-77 estén fusionados en marco entre sí. El polipéptido que no sea Tango-77 puede ser fusionado al extremo N o al extremo C del polipéptido Tango-77.

Una proteína de fusión útil es una proteína de fusión GST-Tango-77 en la que las secuencias Tango-77 están fusionadas al extremo C de las secuencias GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de Tango-77 recombinante.

En otra realización, la proteína de fusión es una proteína Tango-77 que contiene una secuencia señal heteróloga en su extremo N. Por ejemplo, la secuencia señal Tango-77 natural (es decir, aproximadamente los aminoácidos 1 a 63 del SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:4; o aproximadamente los aminoácidos 1 a 52 del SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; o aproximadamente los aminoácidos 1 a 21 del SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:12) se puede eliminar y reemplazar por una secuencia señal de otra proteína. En algunas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero), la expresión, la secreción, o ambas de Tango-77 pueden aumentar mediante el uso de una secuencia señal heteróloga. Por ejemplo, la secuencia secretora gp67 de la proteína de la envuelta de baculovirus se puede utilizar como secuencia señal heteróloga (Ausubel y otros., supra). Otros ejemplos de secuencias señal heterólogas eucarióticas incluyen las secuencias secretoras de la melitina y la fosfatasa alcalina de placenta humana (Stratagene; La Jolla, California). En otro ejemplo más, las secuencias señal heterólogas procarióticas útiles incluyen la señal secretora phoA (Sambrook y otros., supra) y la señal secretora de la proteína A (Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey).

En otra realización más, la proteína de fusión es una proteína de fusión Tango-77-inmunoglobulina en la que toda o parte de Tango-77 está fusionada a secuencias derivadas de un miembro de la familia de proteínas de inmunoglobulina. Las proteínas de fusión Tango-77-inmunoglobulina de la invención se pueden incorporar a composiciones farmacéuticas y administrar a un sujeto para inhibir una interacción entre un ligando Tango-77 y un receptor de Tango-77 en la superficie de una célula, suprimiendo de ese modo la transducción de la señal mediada por Tango-77 in vivo. Las proteínas de fusión Tango-77-inmunoglobulina se pueden utilizar para afectar a la biodisponibilidad de un ligando cognado de Tango-77. La inhibición de la interacción ligando Tango-77/Tango-77 puede ser terapéuticamente útil para el tratamiento de los trastornos tanto inflamatorios como autoinmunitarios. Por otra parte, las proteínas de fusión Tango-77-inmunoglobulina de la invención se pueden utilizar como inmunógenos para producir anticuerpos anti-Tango-77 en un sujeto, para purificar ligandos Tango-77 y para rastrear análisis para identificar moléculas que inhiben la interacción de Tango-77 con un receptor de Tango-77.

Preferiblemente, una proteína quimérica o de fusión Tango-77 de la invención se produce mediante técnicas de ADN recombinante normalizadas. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de polipéptidos se ligan entre sí en marco según técnicas convencionales, por ejemplo empleando extremos romos o extremos escalonados para la ligadura, digestión con enzimas de restricción para proporcionar los extremos apropiados, rellenado de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar empalmes no deseados, y ligadura enzimática. En otra realización, el gen de fusión puede ser sintetizado mediante técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación mediante PCR de los fragmentos génicos se puede llevar a cabo utilizando cebadores en ancla que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que se pueden hibridar y reamplificar subsiguientemente para generar una secuencia génica quimérica (ver, por ejemplo Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y otros, eds., John Wiley & Sons: 1992). Además, están disponibles muchos vectores de expresión que ya codifican un radical de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST). Se puede clonar un ácido nucleico que codifica Tango-77 en dicho vector de expresión de manera que el radical de fusión se conecte en marco a la proteína Tango-77.

La presente invención también se refiere a variantes de las proteínas Tango-77 (es decir, proteínas que tienen una secuencia que difiere de la de la secuencia de aminoácidos Tango-77). Tales variantes pueden funcionar como agonistas de Tango-77 (miméticos) o como antagonistas de Tango-77. Las variantes de la proteína Tango-77 se pueden generar mediante mutagénesis, por ejemplo, mutación puntual discreta o truncamiento de la proteína Tango-77. Un agonista de la proteína Tango-77 puede conservar sustancialmente las mismas, o un subgrupo, de actividades biológicas de la forma de origen natural de la proteína Tango-77. Un antagonista de la proteína Tango-77 puede inhibir una o más de las actividades de la forma de origen natural de la proteína Tango-77, por ejemplo, uniéndose competitivamente a un miembro aguas arriba o aguas abajo de una cascada de señalización celular que incluye la proteína Tango-77. Se este modo, se pueden lograr efectos biológicos específicos mediante tratamiento con una variante de función limitada. El tratamiento de un sujeto con una variante que tiene un subgrupo de actividades biológicas de la forma de origen natural de la proteína puede tener menos efectos secundarios en un sujeto respecto a un tratamiento con la forma de origen natural de proteínas Tango-77.

Se pueden identificar las variantes de la proteína Tango-77 que funcionan como agonistas de Tango-77 (miméticos) o como antagonistas de Tango-77 rastreando genotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes por truncamiento, de la proteína Tango-77 en cuanto a la actividad agonística o antagónica de la proteína Tango-77. En una realización, se genera una genoteca variegada de variantes Tango-77 mediante mutagénesis combinatoria a nivel de ácido nucleico y se codifica mediante una genoteca génica variegada. Se puede producir una genoteca variegada de variantes Tango-77, por ejemplo, ligando enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en las secuencias génicas de manera que sea expresable un grupo degenerado de secuencias Tango-77 potenciales en forma de polipéptidos individuales, o alternativamente en forma de un grupo de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo, para la presentación en fagos) que contienen el grupo de secuencias Tango-77. Existen una variedad de métodos que pueden ser utilizados para producir genotecas de variantes Tango-77 potenciales a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de una secuencia génica degenerada se puede realizar en un sintetizador de ADN automático, y ligar después el gen sintético en un vector de expresión apropiado. El uso de un grupo degenerado de genes permite la provisión, en una mezcla, de todas las secuencias que codifican el grupo deseado de secuencias Tango-77 potenciales. Los métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura y otros (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura y otros (1984) Science 198:1056; Ike y otros (1983) Nucleic Acid Res. 11:477).

Además, las genotecas de fragmentos de la secuencia codificadora de la proteína Tango-77 se pueden utilizar para generar una población variegada de fragmentos de Tango-77 para el rastreo y la subsiguiente selección de variantes de una proteína Tango-77. En una realización, se puede generar una genoteca de fragmentos de la secuencia codificadora tratando un fragmento de PCR bicatenario de una secuencia que codifica Tango-77 con una nucleasa en condiciones en las que la formación de muescas tiene lugar sólo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN bicatenario, renaturalizando el ADN para formar un ADN bicatenario que puede incluir pares efectores/antisentido a partir de diferentes productos con muescas, separando las porciones monocatenarias de los dúplex reformados mediante tratamiento con nucleasa S1, y ligando la genoteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Mediante este método, se puede obtener una genoteca de expresión que codifica fragmentos N-terminales e internos de diferentes tamaños de la proteína Tango-77.

Se conocen en la técnica varios mecanismos para rastrear productos génicos de genotecas combinatorias elaboradas mediante mutaciones puntuales o truncamiento, y para rastrear genotecas de ADNc en cuanto a los productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Tales técnicas son adaptables al rastreo rápido de las genotecas génicas generadas mediante la mutagénesis combinatoria de proteínas Tango-77. Las técnicas más ampliamente utilizadas, que son susceptibles de análisis de alto rendimiento total, para rastrear grandes genotecas génicas incluyen típicamente clonar esta genoteca génica en vectores de expresión replicables, transformar las células apropiadas con la genoteca de vectores resultante, y expresar los genes combinatorios en las condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilite el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto fue detectado. La mutagénesis de conjunto recursiva ("REM" en sus siglas en Inglés), una técnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en las genotecas, se puede utilizar combinada con los análisis de rastreo para identificar las variantes Tango-77 (Arkin y Youran (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave y otros (1993) Protein Engineering
6(3):327-331).

Una proteína Tango-77 aislada, o una porción o fragmento de la misma, se puede utilizar como inmunógeno para generar anticuerpos que se unen a Tango-77 utilizando técnicas normalizadas para la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales. Se puede utilizar la proteína Tango-77 completa o, alternativamente, la invención proporciona fragmentos peptídicos antigénicos de Tango-77 para su uso como inmunógenos. El péptido antigénico de Tango-77 comprende al menos 8 (preferiblemente 10, 15, 20, ó 30) restos de aminoácido de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:13 y abarca un epítopo de Tango-77 de manera que un anticuerpo originado contra el péptido forma un complejo inmunitario específico con Tango-77.

Un inmunógeno Tango-77 se utiliza típicamente para preparar anticuerpos mediante la inmunización de un sujeto adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, ratón u otro mamífero) con el inmunógeno. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, la proteína Tango-77 expresada recombinantemente o un polipéptido Tango-77 sintetizado químicamente. La preparación puede incluir adicionalmente un coadyuvante, tal como coadyuvante de Freund completo o incompleto, o un agente inmunoestimulador similar. La inmunización de un sujeto adecuado con una preparación Tango-77 inmunogénica induce una respuesta de anticuerpos anti-Tango-77 policlonales.

Por consiguiente, otro aspecto de la invención se refiere a anticuerpos anti-Tango-77. El término "anticuerpo" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se unen específicamente a un antígeno, tal como Tango-77. Una molécula que se une específicamente a Tango-77 es una molécula que se une a Tango-77, pero no se une sustancialmente a otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica, que contiene naturalmente Tango-77. Los ejemplos de las porciones inmunológicamente activas de las moléculas de inmunoglobulina incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')_{2} que se pueden generar tratando el anticuerpo con una enzima tal como pepsina. La invención proporciona anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen a Tango-77. El término "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solamente una especie de un sitio de unión al antígeno susceptible de experimentar reacción inmunitaria con un epítopo concreto de Tango-77. Una composición de anticuerpo monoclonal despliega así típicamente una sola afinidad de unión para una proteína Tango-77 concreta con la que experimenta reacción inmunitaria.

Los anticuerpos anti-Tango-77 policlonales se pueden preparar como se ha descrito antes inmunizando un sujeto adecuado con un inmunógeno Tango-77. El título del anticuerpo anti-Tango-77 en el sujeto inmunizado puede ser verificado a lo largo del tiempo mediante técnicas normalizadas, por ejemplo con un análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA) utilizando Tango-77 inmovilizado. Si se desea, las moléculas de anticuerpo dirigidas a Tango-77 se pueden aislar del mamífero (por ejemplo, de la sangre) y purificar adicionalmente mediante técnicas bien conocidas, tales como cromatografía con proteína A para obtener una fracción IgG. En un momento apropiado tras la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos de anticuerpo anti-Tango-77 son los más altos, se pueden obtener las células que producen anticuerpos del sujeto y utilizarlas para preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas normalizadas, tales como la técnica del hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor y otros (1983) Inmmuno Today 4:72), la técnica del hibridoma EBV (Cole y otros (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pág. 77-96) o las técnicas del trioma. La tecnología para producir hibridomas es bien conocida (ver generalmente Current Protocols in Immunology (1994) Coligan y otros, (eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Brevemente, una línea celular inmortal (típicamente un mieloma) se fusiona con los linfocitos (típicamente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con un inmunógeno Tango-77 como se ha descrito antes, y los sobrenadantes de cultivo de las células de los hibridomas resultantes se rastrean para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une a Tango-77.

Se puede aplicar cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos utilizados para fusionar linfocitos y líneas celulares inmortalizadas con el fin de generar un anticuerpo monoclonal anti-Tango-77 (ver, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, supra; Galfre y otros (1977) Nature 266:55052; R.H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); y Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54387-402. Por otra parte, el operario normalmente experto apreciará que existen muchas variaciones de tales métodos que también podrían ser útiles. Típicamente, la línea celular inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma) está derivada de las mismas especies de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, se pueden elaborar hibridomas murinos fusionando linfocitos de un ratón inmunizado con una preparación inmunogénica de la presente invención con una línea celular de ratón inmortalizada, por ejemplo, una línea celular de mieloma que sea sensible a medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Se puede utilizar una cualquiera de varias líneas celulares de mieloma como par de fusión según técnicas normalizadas, por ejemplo, las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas líneas de mieloma son asequibles de la ATCC. Típicamente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT se fusionan con esplenocitos de ratón utilizando polietilenglicol ("PEG"). Las células de hibridoma resultantes de la fusión se seleccionan después utilizando medio HAT, que destruye las células de mieloma no fusionadas e improductivamente fusionadas (los esplenocitos no fusionados mueren al cabo de varios días puesto que no son transformados). Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención son detectadas rastreando los sobrenadantes de cultivo del hibridoma en cuanto a los anticuerpos que se unen a Tango-77, por ejemplo, utilizando un análisis ELISA normalizado.

Como alternativa para preparar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales, se puede identificar y aislar un anticuerpo anti-Tango-77 monoclonal rastreando una genoteca de inmunoglobulinas combinatoria recombinante (por ejemplo, una genoteca para la presentación de anticuerpos en fagos) con Tango-77 para aislar de ese modo los miembros de la genoteca de inmunoglobulinas que se unen a Tango-77. Los estuches para generar y rastrear genotecas de presentación en fagos son asequibles comercialmente (por ejemplo, Recombinant Phage Antibody System de Pharmacia, Núm. de Catálogo 27-9400-01; y SurfZAP®Phage Display Kit de Stratagene, Núm. de Catálogo 240612). Adicionalmente, los ejemplos de los métodos y los reactivos particularmente susceptibles de ser utilizados para la generación y el rastreo de genotecas de presentación de anticuerpos se pueden encontrar, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.223.409; la Publicación PCT Núm. WO 92/18619; la Publicación PCT Núm. WO 91/17271; la Publicación PCT Núm. WO 92/20791; la Publicación PCT Núm. WO 92/15679; la Publicación PCT Núm. WO 93/01288; la Publicación PCT Núm. WO 92/01047; la Publicación PCT Núm. WO 92/09690; la Publicación PCT Núm. WO 90/02809; Fuchs y otros (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay y otros (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse y otros (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths y otros (1993) EMBO J 12:725-734.

Adicionalmente, los anticuerpos anti-Tango-77 recombinantes, tales como los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden porciones tanto humanas como no humanas, que pueden ser elaborados utilizando técnicas de ADN recombinante normalizadas, se encuentran dentro del alcance de la invención. Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados se pueden producir mediante mecanismos de ADN recombinante conocidos en la técnica, por ejemplo utilizando los métodos descritos en la Publicación PCT Núm. WO 87/02671; la Solicitud de Patente Europea 184.187; la Solicitud de Patente Europea 171.496; la Solicitud de Patente Europea 173.494; la Publicación PCT Núm. WO 86/01533; la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567; la Solicitud de Patente Europea 125.023; Better y otros (1988) Science 240:1041-1043; Liu y otros (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu y otros (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun y otros (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura y otros (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood y otros (1985) Nature 314:446-449; y Shaw y otros (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi y otros (1986) Bio/Techniques 4:214; la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.225.539; Jones y otros (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan y otros (1988) Science 239:1534; y Beidler y otros (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.

Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Semejantes anticuerpos pueden ser producidos utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar genes de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas endógenas, pero que pueden expresar genes de las cadenas pesada y ligera humanos. Los ratones transgénicos son inmunizados de la manera normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, todo o una porción de Tango-77. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno se pueden obtener utilizando tecnología de hibridomas convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humanos alojados en el ratón transgénico se reorganizan durante la diferenciación de las células B, y con posterioridad experimentan mutación de cambio de clase y somática. De este modo, utilizando semejante técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA e IgE terapéuticamente útiles. Para una visión de conjunto de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, ver Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para un estudio detallado de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y los protocolos para producir semejantes anticuerpos, ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.625.126; la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.633.425; la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.569.825; la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.661.016; y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.545.806. Por añadidura, compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA), pueden estar comprometidas para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado utilizando tecnología similar a la descrita antes.

Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado pueden ser generados utilizando una técnica referida como "selección guiada". En este enfoque se utiliza un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo murino, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo.

Primero, se identifica un anticuerpo monoclonal no humano que se une a un antígeno seleccionado (epítopo), por ejemplo, un anticuerpo que inhibe la actividad de Tango-77. La cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo no humano se clonan y se utilizan para crear fragmentos Fab de presentación en fagos. Por ejemplo, el gen de la cadena pesada se puede clonar en un vector plasmídico de manera que la cadena pesada pueda ser secretada desde bacterias. El gen de la cadena ligera puede ser clonado en un gen de la proteína de la envuelta del fago de manera que la cadena ligera pueda ser expresada sobre la superficie del fago. Se utiliza un repertorio (colección al azar) de cadenas ligeras humanas fusionadas a un fago para infectar las bacterias que expresan la cadena pesada no humana. Los fagos de la progenie resultante presentan anticuerpos híbridos (cadena ligera humana/cadena pesada no humana). El antígeno seleccionado se utiliza en un rastreo por inmunopurificación para seleccionar los fagos que se unen al antígeno seleccionado. Se pueden requerir varias rondas de selección para identificar semejante fago. A continuación, los genes de la cadena ligera humana se aíslan a partir del fago seleccionado que se une al antígeno seleccionado. Estos genes de la cadena ligera humana seleccionados se utilizan después para guiar la selección de los genes de la cadena pesada humana como sigue. Los genes de la cadena ligera humana seleccionados se insertan en vectores de expresión mediante bacterias. Las bacterias que expresan las cadenas ligeras humanas seleccionadas se infectan con un repertorio de cadenas pesadas humanas fusionadas al fago. Los fagos de la progenie resultante presentan anticuerpos humanos (cadena ligera humana/cadena pesada humana).

A continuación, el antígeno seleccionado se utiliza en un rastreo por inmunopurificación para seleccionar los fagos que se unen al antígeno seleccionado. El fago seleccionado en esta etapa presenta anticuerpos completamente humanos que reconocen el mismo epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal no humano seleccionado original. Los genes que codifican las cadenas tanto pesada como ligera se aíslan fácilmente y se manipulan adicionalmente para la producción del anticuerpo humano. Esta tecnología es descrita por Jespers y otros (1994, Bio/techonology 12:899-903).

Se puede utilizar un anticuerpo anti-Tango-77 (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) para aislar Tango-77 mediante técnicas normalizadas, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Un anticuerpo anti-Tango-77 puede facilitar la purificación de Tango-77 de las células y de Tango-77 producido recombinantemente expresado en células huésped. Por otra parte, se puede utilizar un anticuerpo anti-Tango-77 para detectar la proteína Tango-77 (por ejemplo, en un producto lisado celular o sobrenadante celular) con el fin de evaluar la abundancia y el patrón de expresión de la proteína Tango-77. Los anticuerpos anti-Tango-77 pueden ser utilizados diagnosticamente para verificar los niveles de proteína en tejido como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. Se puede facilitar la detección acoplando el anticuerpo a una sustancia deseable. Los ejemplos de las sustancias detectables incluyen diferentes enzimas, grupos prostéticos, sustancias fluorescentes, sustancias luminiscentes, sustancias bioluminiscentes, y sustancias radiactivas. Los ejemplos de las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de los complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de las sustancias fluorescentes adecuadas incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamino-fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de una sustancia luminiscente incluye luminol; los ejemplos de las sustancias bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina, y los ejemplos de la sustancia radiactiva incluyen I^{125}, I^{131}, S^{35} o H^{3};

III. Vectores de Expresión Recombinantes y Células Huésped

Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen una molécula de ácido nucleico que codifica Tango-77 (o una porción de la misma). Según se utiliza en la presente memoria, el término "vector" hace referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha conectado. Un tipo de vector es un "plásmido", que hace referencia a un bucle de ADN bicatenario circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Algunos vectores son susceptibles de replicación autónoma en una célula huésped en la que se han introducido (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamíferos episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episómicos) se integran en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y de este modo replican junto con el genoma del huésped. Por otra parte, algunos vectores, vectores de expresión, son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están conectados operablemente. En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos (vectores). No obstante, se desea que la invención incluya semejantes otras formas de los vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus carentes de replicación, adenovirus y virus adeno-asociados), que cumplan funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células huésped que se van a utilizar para la expresión, que está conectado operablemente a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. En un vector de expresión recombinante, se desea que "conectado operablemente" signifique que la secuencia de nucleótidos de interés está conectada a la secuencia o a las secuencias reguladoras de una manera que permita la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped). Se desea que el término "secuencia reguladora" incluya los promotores, los potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Semejantes secuencias reguladoras las describe, por ejemplo, Goeddel; en Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos únicamente en ciertas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño de los vectores de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en células huésped para producir de ese modo proteínas o péptidos, incluyendo proteínas de fusión o péptidos, codificados por ácidos nucleicos como los descritos en la presente memoria (por ejemplo, proteínas Tango-77, formas mutantes de Tango-77, proteínas de fusión, etc.).

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden ser diseñados para la expresión de Tango-77 en células procarióticas y eucarióticas, por ejemplo, células bacterianas tales como E. coli, células de insectos (que utilizan vectores de expresión de baculovirus), células de levaduras o células de mamíferos. Las células huésped adecuadas son tratadas adicionalmente por Goeddel, en Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo utilizando secuencias reguladoras promotoras de T7 y polimerasa de T7.

La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo muy a menudo en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas ya sean de fusión o de no fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a una proteína codificada allí, usualmente al extremo amino de la proteína recombinante. Semejantes vectores de fusión sirven típicamente para tres propósitos: 1) para incrementar la expresión de la proteína recombinante; 2) para incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) para ayudar a la purificación de la proteína recombinante actuando como ligando en la purificación de afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítico en el empalme del radical de fusión y la proteína recombinante para posibilitar la separación de la proteína recombinante del subsiguiente radical de fusión para la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen el Factor Xa, la trombina y la enteroquinasa. Los vectores de expresión de fusión incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith y Johnson (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan la glutation S-transferasa (GST), la proteína de unión a maltosa E, o la proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana.

Los ejemplos de los vectores de expresión de E. coli de no fusión inducibles incluyen pTrc (Ammam y otros (1988) Gene 69:301-315) y pET 11d (Studier y otros, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). La expresión del gen diana del vector pTrc cuenta con la transcripción de la ARN polimerasa del huésped de un promotor de fusión trp-lac híbrido. La expresión del gen diana del vector pET 11d cuenta con la transcripción de un promotor de fusión gn10-lac de T7 mediada por una ARN polimerasa viral expresada simultáneamente (T7 gn1). Esta polimerasa viral es suministrada por las cepas huésped BL21(DE3) o HMS174(DE3)
de un profago \lambda residente que alberga el gen gn1 de T7 bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5.

Una estrategia para maximizar la expresión de una proteína recombinante en E. coli es para expresar la proteína en una bacteria huésped con una capacidad deteriorada para escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Otra estrategia consiste en alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico que se va a insertar en un vector de expresión de manera que los codones individuales de cada aminoácido sean los utilizados preferentemente en E. coli (Wada y otros (1992) Nucleic Acid Res. 20:2111-2118). Semejante alteración de las secuencias de ácido nucleico de la invención se pueden llevar a cabo mediante técnicas de síntesis de ADN normalizadas.

En otra realización, el vector de expresión de Tango-77 es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de los vectores para la expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari y otros (1987) EMBO J. 6:229-234) pMFa (Kurjan y Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88/Schultz y otros (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), y picZ (InVitrogen Corp, San Diego, CA).

Alternativamente, Tango-77 puede ser expresada en células de insecto utilizando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células Sf 9) incluyen la serie pAc (Smith y otros (1983) Mol. Cel. Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170:31-39).

En otra realización más, un ácido nucleico de la invención se expresa en células de mamífero utilizando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de los vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman y otros (1987) EMBO J. 6:187-195). Cuando se utilizan en células de mamífero, las funciones de control de los vectores de expresión son proporcionadas a menudo por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores utilizados comúnmente están derivados de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y Virus de Simio 40. Para otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procarióticas como eucarióticas ver los capítulos 16 y 17 de Sambrook y otros (supra).

En otra realización, el vector de expresión de mamífero recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo celular concreto (por ejemplo, los elementos reguladores específicos de los tejidos son utilizados para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos de los tejidos son conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de los promotores específicos de los tejidos adecuados incluyen el promotor de la albúmina (específico del hígado; Pinkert y otros (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos linfoides (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), en concreto los promotores de los receptores de las células T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) y las inmunoglobulinas (Banerji y otros (1983) Cell 33:729-740; Queen y Baltimore Cell 33:741-748, los promotores específicos de las neuronas (por ejemplo el promotor del neurofilamento; Byrne y Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), los promotores específicos del páncreas (Edlun y otros (1985) Science 230:912-916), y los promotores específicos de las glándulas mamarias (por ejemplo, promotor del suero de leche; Patente de los Estados Unidos Núm. 4.873.316 y Publicación de la Solicitud Europea Núm. 264.166). También están abarcados los promotores regulados evolutivamente, por ejemplo, los promotores hox murinos (Kessel y Gruss (1990) Science 249:374-379) y el promotor de la \alpha-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).

La invención proporciona adicionalmente un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Esto es, la molécula de ADN es conectada operablemente a una secuencia reguladora de una manera que permite la expresión (mediante transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido al ARNm Tango-77. Se pueden elegir secuencias reguladoras conectadas operablemente a un ácido nucleico clonado en la orientación antisentido que dirigen la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en una variedad de tipos celulares, por ejemplo promotores y/o potenciadores virales, o se pueden elegir secuencias reguladoras que dirigen la expresión específica del tejido o específica del tipo celular del ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de un plásmido, fagémido o virus atenuado recombinante, en los que se producen ácidos nucleicos antisentido bajo el control de una región reguladora de alta eficacia, cuya actividad puede ser determinada por el tipo celular en el que se introduce el vector. Para un estudio de la regulación de la expresión génica utilizando genes antisentido ver Weintraub y otros (Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986).

Otro aspecto de la invención se refiere a células huésped en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se utilizan en la presente memoria indistintamente. Se entiende que tales términos hacen referencia no solo a la célula sujeto concreta sino a la progenie o progenie potencial de semejante célula. Puesto que se pueden producir ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutación o a influencias medioambientales, semejante progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula de origen, pero todavía está incluida en el alcance de los términos utilizados en la presente memoria.

Una célula huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, la proteína Tango-77 se puede expresar en células bacterianas tales como E. coli, células de insectos, células de levaduras o mamíferos (tales como células de ovario de hámster Chino (CHO) o células COS). Otras células huésped adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica.

Se puede introducir un ADN vector en células procarióticas o eucarióticas a través de técnicas de transformación o transfección convencionales. Según se utilizan en la presente memoria, se desea que los términos "transformación" y "transfección" hagan referencia a una variedad de mecanismos reconocidos en la técnica para introducir ácido nucleico foráneo (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, incluyendo precipitación simultánea con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células huésped se pueden encontrar en Sambrook, y otros (supra), y otros manuales de laboratorio.

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Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección utilizada, sólo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN foráneo en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce generalmente un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, para la resistencia a antibióticos) en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. El ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable se puede introducir en el mismo vector que el que codifica Tango-77 o se puede introducir en un vector separado. Las células transfectadas establemente con el ácido nucleico introducido se pueden identificar mediante la selección del fármaco (por ejemplo, las células en las que se ha incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).

Una célula huésped de la invención, tal como una célula huésped procariótica o eucariótica en cultivo, se puede utilizar para producir (es decir, expresar) la proteína Tango-77. Por consiguiente, la invención proporciona adicionalmente métodos para producir la proteína Tango-77 utilizando las células huésped de la invención. En una realización, el método comprende cultivar la célula huésped de la invención (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica Tango-77). En otra realización, el método comprende adicionalmente aislar Tango-77 del medio o de la célula huésped.

Las células huésped de la invención se pueden utilizar también para producir animales transgénicos no humanos. Por ejemplo, en una realización, una célula huésped de la invención es un oocito no-humano fertilizado o una célula pluripotencial embriónica no humana en las que se han introducido secuencias que codifican Tango-77. Tales células huésped se pueden utilizar después para crear animales transgénicos no humanos en los que se han introducido secuencias Tango-77 exógenas en su genoma o animales recombinantes homólogos en los que se han alterado las secuencias Tango-77 endógenas. Semejantes animales son útiles para estudiar la función y/o la actividad de Tango-77 y para identificar y/o evaluar los moduladores de la actividad de Tango-77. Según se utiliza en la presente memoria, un "animal transgénico" es un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un roedor tal como una rata o un ratón, en el que una o más de las células del animal incluyen un transgen. Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, pollos, anfibios, etc. Un transgen es un ADN exógeno que está integrado en el genoma de una célula a partir del cual se desarrolla un animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro, dirigiendo de ese modo la expresión de un producto génico modificado en uno o más tipos celulares o tejidos del animal transgénico. Según se utiliza en la presente memoria, un "animal recombinante homólogo" es un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ratón, en el que se ha alterado un gen Tango-77 endógeno mediante recombinación homóloga entre el gen endógeno y una molécula de ADN exógeno introducida en una células del animal, por ejemplo, una célula embriónica del animal, antes del desarrollo del animal.

IV. Composiciones Farmacéuticas

Las moléculas de ácido nucleico Tango-77, las proteínas Tango-77, y los anticuerpos anti-Tango-77 (también referidos en la presente memoria como "compuestos activos") de la invención se pueden incorporar a las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración. Tales composiciones comprenden típicamente la molécula de ácido nucleico, la proteína, o el anticuerpo y un portador farmacéuticamente aceptable. Según se utiliza en la presente memoria se desea que la redacción "portador farmacéuticamente aceptable" incluya todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto cuando cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones. También se pueden incorporar a las composiciones compuestos activos suplementarios.

Una composición farmacéutica se formula para que sea compatible con su ruta de administración deseada. Los ejemplos de las rutas de administración incluyen la administración parenteral (por ejemplo intravenosa, intradérmica, subcutánea), (por ejemplo, inhalación oral), transdérmica (tópica), transmucosal, y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica, o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyectables, solución salina, aceites fijados, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede estar incluida en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis elaborados con vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles (cuando sean solubles en agua) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL® (BASF; Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el extremo de que exista una fácil aplicación mediante jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe preservar de la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr mediante diferentes agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede ocasionar incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo (por ejemplo, una proteína Tango-77 o un anticuerpo anti-Tango-77) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o con una combinación de los ingredientes enumerados antes, según se requiera, seguido de esterilización mediante filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión alcalino y los otros ingredientes requeridos de los enumerados antes. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado a vacío y la liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada en condiciones estériles de los mismos.

Las composiciones orales incluyen generalmente un diluyente inerte o un portador comestible. Estos pueden estar incluidos en cápsulas de gelatina o comprimidos en tabletas. Para el propósito de la administración terapéutica oral, al compuesto activo se le pueden incorporar excipientes y se puede utilizar en forma de tabletas, trociscos, o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar utilizando un portador fluido para su uso como enjuague bucal, donde el compuesto en el portador fluido se aplica oralmente y se sacude y se expectora o se traga. Se pueden incluir agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles, y/o sustancias coadyuvantes como parte de la composición. Las tabletas, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un antiapelmazante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como pipermín, salicilato de metilo, o aroma de naranja.

Para la administración mediante inhalación, los compuestos son liberados en forma de una pulverización en aerosol desde un recipiente presurizado o dispensador que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración transmucosal o transdérmica, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados de la barrera que va a ser penetrada. Semejantes penetrantes son generalmente conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosal, detergentes, sales biliares, y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosal se puede lograr a través del uso de pulverizaciones nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos son formulados en pomadas, ungüentos, geles, o cremas como es conocido generalmente en la técnica.

Los compuestos también se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con bases para supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéricos) o enemas de retención para la liberación rectal.

En una realización, los compuestos activos son preparados con portadores que protegerán el compuesto de la rápida eliminación desde el organismo, por ejemplo en forma de una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de liberación microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como vinilacetato de etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones pueden resultar evidentes para los expertos en la técnica. Las sustancias también pueden ser obtenidas comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También se pueden utilizar suspensiones liposómicas (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.522.811.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones orales o parenterales en una forma unitaria de dosificación para facilitar la administración e igualar la dosificación. Las formas unitarias de dosificación según se utilizan en la presente memoria hacen referencia a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto que se vaya a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el compuesto farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención está dictada por, y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico concreto que se quiere lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica para la composición de semejante compuesto activo para el tratamiento de individuos.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden insertar en vectores y utilizar como vectores para la terapia génica. Los vectores para la terapia génica se pueden liberar en un sujeto, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, administración local (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.328.470) o mediante inyección estereotáctica (ver, por ejemplo, Chen y otros (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector para la terapia génica puede incluir el vector para la terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que está embebido el vehículo de liberación génica. Alternativamente, cuando el vector de liberación génica completo se puede producir intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de liberación génica.

Las composiciones farmacéuticas pueden ser incluidas en un recipiente, paquete, o dispensador junto con las instrucciones para su administración.

V. Usos y Métodos de la Invención

Las moléculas de ácido nucleico, las proteínas, los homólogos de proteínas, y los anticuerpos descritos en la presente memoria se pueden utilizar en uno o más de los siguientes métodos: a) análisis de rastreo; b) análisis de detección (por ejemplo, mapeo cromosómico, tipaje de tejidos, biología forense); c) medicina predictiva (por ejemplo, análisis de diagnóstico, análisis de pronóstico, pruebas clínicas de verificación, y farmacogenómica); y d) métodos de tratamiento (por ejemplo, terapéuticos y profilácticos). Una proteína Tango-77 interactúa con otras proteínas celulares y de este modo se puede utilizar para la regulación de la inflamación. Los polipéptidos de la invención se pueden utilizar en análisis para determinar la actividad biológica. Por ejemplo se podrían utilizar en un panel de proteínas para el rastreo de alto rendimiento.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención se pueden utilizar para expresar la proteína Tango-77 (por ejemplo, a través de un vector de expresión recombinante en una célula huésped en aplicaciones de terapia génica), para detectar ARNm Tango-77 (por ejemplo, en una muestra biológica) o una lesión genética en un gen Tango-77, y para modular la actividad de Tango-77. Además, las proteínas Tango-77 se pueden utilizar para rastrear fármacos o compuestos que modulan la actividad o la expresión de Tango-77 así como para tratar trastornos caracterizados por una producción insuficiente o excesiva de la proteína Tango-77 o la producción de formas de la proteína Tango-77 que tienen una actividad disminuida o aberrante en comparación con la proteína Tango-77 de tipo salvaje. Por añadidura, los anticuerpos anti-Tango-77 de la invención se pueden utilizar para detectar y aislar las proteínas Tango-77 y modular la actividad de Tango-77.

Los autores de la presente invención describen adicionalmente agentes novedosos identificados mediante los análisis de rastreo anteriormente descritos y los usos de los mismos para los tratamientos descritos en la presente memoria.

A. Análisis de Rastreo

La invención proporciona un método (también referido en la presente memoria como "análisis de rastreo") para identificar los moduladores, es decir, los compuestos de ensayo o agentes candidato (por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas u otros fármacos) que se unen a las proteínas Tango-77 o tienen un efecto estimulador o inhibidor, por ejemplo, sobre la expresión de Tango-77 o la actividad de Tango-77.

Los ejemplos de los métodos para la síntesis de genotecas moleculares se pueden encontrar en la técnica, por ejemplo: DeWitt y otros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb y otros (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckerman y otros, J. Med. Chem. 37:2678; Cho y otros (1993) Science 261:1303: Carrell y otros (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell y otros (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; y Gallop y otros (1994) J. Med. Chem. 37:1233.

Las genotecas de compuestos se pueden presentar en solución (por ejemplo, Houghten (1992) Bio/Techniques 13:412-421), o sobre cuentas (Lam (1991) Nature 354:82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bacterias (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.223.409), esporas (Patentes Núms. 5.571.698; 5.403.484; y 5.223.409), plásmidos (Cull y otros, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869) o fagos (Scott y Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla y otros (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; y Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310).

En otra realización, se utiliza un análisis para determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de Tango-77 o una porción biológicamente activa de la misma, por ejemplo, determinando la capacidad de la proteína Tango-77 para unirse o interactuar con una molécula diana Tango-77. Según se utiliza en la presente memoria, una "molécula diana" es una molécula a la que se une o con la que interactúa la proteína Tango-77 en la naturaleza, por ejemplo, una molécula sobre la superficie de una célula. Una molécula diana de Tango-77 puede ser una molécula no Tango-77 o una proteína o polipéptido Tango-77 de la presente invención. En una realización, una molécula diana de Tango-77 es un componente de una ruta de transducción de la señal, por ejemplo, Tango-77 se puede unir a un receptor de IL-1 u otro receptor bloqueando de ese modo el receptor e inhibiendo la futura transducción de la señal. La determinación de la capacidad de la proteína Tango-77 para unirse o interactuar con una molécula diana de Tango-77 se puede lograr mediante uno de los métodos descritos antes. En una realización preferida, la determinación de la capacidad de la proteína Tango-77 para unirse o interactuar con una molécula diana de Tango-77 se puede lograr determinando la actividad de la molécula diana. Por ejemplo, la actividad de la molécula diana se puede determinar detectando la inducción de un segundo mensajero celular de la diana (por ejemplo Ca^{2+} intracelular, diacilglicerol, IP3, etc.), detectando la actividad catalítica/enzimática de la diana en un sustrato apropiado, detectando la inducción de un gen informador (por ejemplo, un elemento regulador sensible a Tango-77 conectado operablemente a un ácido nucleico que codifica un marcador detectable, por ejemplo luciferasa), o detectando una respuesta celular, por ejemplo, inflamación.

En otra realización más, un análisis de la presente invención es un análisis sin proteínas que comprende detectar una proteína Tango-77 o una porción biológicamente activa de la misma con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse a la proteína Tango-77 o a una porción biológicamente activa de la misma. La unión del compuesto de ensayo a la proteína Tango-77 se puede determinar directamente o indirectamente como se ha descrito antes. En una realización preferida, el análisis incluye poner en contacto la proteína Tango-77 o una porción biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une a Tango-77 para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de análisis con un compuesto de ensayo, y determinan la capacidad del compuesto de ensayo para interactuar con la proteína Tango-77, donde la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interactuar con una proteína Tango-77 comprende determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse preferentemente a Tango-77 o una porción biológicamente activa de la misma en comparación con el compuesto conocido.

En otra realización, un análisis es un análisis sin células que comprende poner en contacto la proteína Tango-77 o una porción biológicamente activa de la misma con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad de la proteína Tango-77 o de una porción biológicamente activa de la misma. La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de Tango-77 se puede lograr, por ejemplo, determinando la capacidad de la proteína Tango-77 para unirse a una molécula diana de Tango-77 mediante uno de los métodos descritos antes para determinar la unión directa. En una realización alternativa, la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de Tango-77 se puede lograr determinando la capacidad de la proteína Tango-77 para modular adicionalmente una molécula diana de Tango-77. Por ejemplo, la actividad catalítica/enzimática de la molécula diana en un sustrato apropiado se puede determinar como se ha descrito previamente.

En otra realización más, el análisis sin células comprende poner en contacto la proteína Tango-77 o una porción biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une a Tango-77 para formar una mezcla de análisis, poner en contacto la mezcla de análisis con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interactuar con una proteína Tango-77, donde la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interactuar con una proteína Tango-77 comprende determinar la capacidad de la proteína Tango-77 para unirse preferentemente o modular la actividad de una molécula diana de Tango-77.

Es posible que existan formas unidas a membrana de Tango-77. Los análisis sin células de la presente invención son susceptibles de uso de ambas formas Tango-77. En el caso de los análisis sin células que comprenden una forma unida a la membrana de Tango-77, puede ser deseable utilizar un agente solubilizante de manera que la forma unida a la membrana de Tango-77 se mantenga en solución. Los ejemplos de tales agentes solubilizantes incluyen detergentes no iónicos tales como n-octilglucósido, n-dodecilglucósido, n-dodecilmaltósido, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, Triton® X-100, Triton® X-114, Thesit®, Isotridecipoli (éter de etilenglicol)n, 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS), 3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-2-hidroxi-1-propanosulfonato (CHAPSO), o N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato.

En más de una realización de los métodos de ensayo anteriores de la presente invención, puede ser deseable inmovilizar Tango-77 o sus moléculas diana para facilitar la separación de las formas que forman complejos de las que no forman complejos de una o de las dos proteínas, así como para acomodar la automatización del análisis. La unión de un compuesto de ensayo a Tango-77, o la interacción de Tango-77 con una molécula diana en presencia o ausencia de un compuesto candidato, se puede lograr en cualquier recipiente adecuado para contener los reaccionantes. Entre los ejemplos de semejantes recipientes se incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo, y tubos de microcentrífuga. En una realización, se puede proporcionar una proteína de fusión que añade un dominio que permite que una o ambas proteínas se unan a una matriz. Por ejemplo, las proteínas de fusión glutation-S-transferasa/Tango-77 o las proteínas de fusión glutation-S-transferasa/diana pueden ser adsorbidas sobre cuentas de glutation sefarosa (Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO) o placas de microtitulación transformadas con glutation, que después se combinan con el compuesto de ensayo o con el compuesto de ensayo y la proteína diana no adsorbida o la proteína Tango-77, y la mezcla se incuba en condiciones que conduzcan a la formación de complejos (por ejemplo en condiciones fisiológicas para las sales y el pH). Siguiente a la incubación, las cuentas o los pocillos de las placas de microtitulación se lavan para eliminar cualquier componente no unido y se mide la formación de complejos directamente o indirectamente, por ejemplo, como se ha descrito antes. Alternativamente, los complejos se pueden disociar de la matriz, y se puede determinar el nivel de unión o la actividad de Tango-77 utilizando técnicas normalizadas.

También se pueden utilizar otras técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices en los análisis de rastreo de la invención. Por ejemplo, se pueden inmovilizar Tango-77 o su molécula diana utilizando la conjugación de biotina y estreptavidina. Se pueden preparar Tango-77 o moléculas diana biotiniladas a partir de biotin-NHS (N-hidroxisuccinimida) utilizando mecanismos bien conocidos en la técnica (por ejemplo estuche de biotinilación, Pierce Chemicals; Rockford, IL), e inmovilizar en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertos con estreptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, los anticuerpos reactivos con Tango-77 o con las moléculas diana pero que no interfieren en la unión de la proteína Tango-77 a su molécula diana se pueden derivar a los pocillos de la placa, y la diana no unida o Tango-77 se pueden inmovilizar en los pocillos mediante conjugación con el anticuerpo. Los métodos para detectar tales complejos, además de los descritos antes para los complejos inmovilizados con GST, incluyen la inmunodetección de los complejos utilizando anticuerpos reactivos con Tango-77 o con su molécula diana, así como análisis con enzima ligada que se basan en la detección de una actividad enzimática asociada con Tango-77 o la molécula diana.

En otra realización, se identifican los moduladores de la expresión de Tango-77 en un método en el que se pone en contacto una célula con un compuesto candidato y se determina la expresión del ARNm o de la proteína Tango-77 en la célula. El nivel de expresión del ARNm o de la proteína Tango-77 en presencia del compuesto candidato se compara con el nivel de expresión del ARNm o de la proteína Tango-77 en ausencia del compuesto candidato. El compuesto candidato puede ser identificado después como un modulador de la expresión de Tango-77 basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión del ARNm o de la proteína Tango-77 es mayor (significativamente mayor estadísticamente) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato es identificado como un estimulador de la expresión del ARNm o de la proteína Tango-77. Alternativamente, cuando la expresión del ARNm o de la proteína Tango-77 es menor (significativamente menor estadísticamente) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato es identificado como un inhibidor de la expresión del ARNm o de la proteína Tango-77. El nivel de expresión del ARNm o de la proteína Tango-77 en las células se puede determinar mediante los métodos descritos en la presente memoria para detectar el ARNm o la proteína Tango-77.

En otro aspecto más de la invención, las proteínas Tango-77 se pueden utilizar como "proteínas cebo" en un análisis de dos híbridos o en un análisis de tres híbridos (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.283.317; Zervos y otros (1993) Cell 72:223-232; Madura y otros (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel y otros (1993) Bio/Techniques 14:920-924; Iwabuchi y otros (1993) Oncogene 8:1693-1696; y Publicación PCT Núm. WO 94/10300), para identificar otras proteínas, que se unen o interactúan con Tango-77 ("proteínas de unión a Tango-77" o "Tango-77-bp") y modular la actividad Tango-77. Semejantes proteínas de unión a Tango-77 también están implicadas probablemente en la propagación de las señales por las proteínas Tango-77 como, por ejemplo, elementos aguas arriba o aguas abajo de la ruta Tango-77.

El sistema de dos híbridos está basado en la naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción, que constan de dominios de unión al ADN y de activación separables. Brevemente, el análisis utiliza dos constructos de ADN diferentes. En un constructo, el gen que codifica Tango-77 se fusiona a un gen que codifica el dominio de unión al ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En el otro constructo, una secuencia de ADN, de una genoteca de secuencias de ADN, que codifica una proteína no identificada ("presa" o "muestra") se fusiona a un gen que codifica el dominio de activación del factor de transcripción conocido. Si las proteínas "cebo" y "presa" son capaces de interactuar in vivo, formando un complejo dependiente de Tango-77, los dominios de unión al ADN y de activación del factor de transcripción se ponen en íntima proximidad. Esta proximidad permite la transcripción de un gen informador (por ejemplo, lacZ) que está conectado operablemente a un sitio regulador de la transcripción sensible al factor de transcripción. La expresión del gen informador se puede detectar y se pueden aislar las colonias de células que contienen el factor de transcripción funcional y utilizar para obtener el gen clonado que codifica la proteína que interactúa con Tango-77.

B. Análisis de Detección

Las porciones o fragmentos de la secuencia de ADNc identificada en la presente memoria (y las secuencias génicas completas correspondientes) se pueden utilizar de numerosas maneras como reactivos polinucleotídicos. Por ejemplo, la secuencia se puede utilizar para: (i) mapear los respectivos genes sobre un cromosoma y, de este modo, localizar las regiones génicas asociadas con la enfermedad genética; (ii) identificar un individuo de una muestra biológica diminuta (tipaje de tejidos); y (iii) coadyuvar a la identificación forense de una muestra biológica. Estas aplicaciones se describen en las subsecciones a continuación.

1. Mapeo Cromosómico

Una vez que se ha aislado la secuencia (o una porción de la secuencia) de un gen, esta secuencia se puede utilizar para mapear la localización del gen sobre un cromosoma. Por lo tanto, los moléculas de ácido nucleico Tango-77 descritas en la presente memoria o fragmentos de las mismas, se pueden utilizar para mapear la localización del gen o los genes Tango-77 sobre un cromosoma. El mapeo de las secuencias Tango-77 en los cromosomas es una primera etapa importante para correlacionar estas secuencias con los genes asociados con la enfermedad.

Brevemente, se puede mapear un gen Tango-77 en los cromosomas preparando cebadores de PCR (preferiblemente de 15-25 pb de longitud) de las secuencias Tango-77. El análisis mediante ordenador de las secuencias Tango-77 se puede utilizar para seleccionar rápidamente cebadores que no abarquen más de un exón en el ADN genómico, complicando de este modo el procedimiento de amplificación. Estos cebadores se pueden utilizar después para el rastreo mediante PCR de los híbridos celulares somáticos que contienen los cromosomas humanos individuales. Sólo aquellos híbridos que contienen el gen humano correspondiente a las secuencias Tango-77 producirán un fragmento amplificado.

Los híbridos celulares somáticos se preparan fusionando células somáticas de diferentes mamíferos (por ejemplo, células humanas y de ratón). A medida que los híbridos de células humanas y de ratón crecen y se dividen, pierden gradualmente los cromosomas humanos en orden aleatorio, pero conservan los cromosomas de ratón. Utilizando medios en los que las células de ratón no se pueden desarrollar (puesto que carecen de una enzima concreta) pero en los que las células humanas pueden, se conservará el cromosoma humano uno que contiene el gen que codifica la enzima necesaria. Utilizando diferentes medios, se pueden establecer paneles de líneas celulares híbridas. Cada línea celular de un panel contiene un solo cromosoma humano o un pequeño número de cromosomas humanos, y un juego completo de cromosomas de ratón, posibilitando el fácil mapeo de los genes individuales en los cromosomas humanos específicos. (D'Eustachio y otros (1983) Science 220:919-924). También se pueden producir híbridos de células somáticas que contienen sólo fragmentos de cromosomas humanos utilizando cromosomas humanos con translocaciones y deleciones.

El mapeo mediante PCR de híbridos celulares somáticos es un procedimiento rápido para asignar una secuencia concreta a un cromosoma concreto. Se pueden asignar tres o más secuencias por día utilizando un solo ciclador térmico. Utilizando las secuencias Tango-77 para diseñar cebadores oligonucleotídicos, se puede lograr la sublocalización con paneles de fragmentos de cromosomas específicos. Otras estrategias de mapeo que se pueden utilizar de un modo similar, para mapear la secuencia Tango-77 en su cromosoma incluyen la hibridación in situ (descrita por Fan y otros (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6223-27), el rastreo previo con cromosomas clasificados por flujo marcados, y pre-selección mediante hibridación a las genotecas de ADNc específicas del cromosoma.

Se puede utilizar adicionalmente hibridación in situ mediante fluorescencia (FISH) de una secuencia de ADN a una diseminación cromosómica en metafase para la localización cromosómica precisa en una etapa. Las diseminaciones cromosómicas se pueden elaborar utilizando células cuya división ha sido bloqueada en metafase mediante un agente químico, por ejemplo, colcemida que rompe el uso mitótico. Los cromosomas se pueden tratar brevemente con tripsina, y colorear después con Giemsa. Se desarrolla un patrón de bandas claras y oscuras sobre cada cromosoma, de manera que los cromosomas pueden ser identificados individualmente. La técnica FISH se puede utilizar con una secuencia de ADN tan corta como de 500 o 600 bases. No obstante, los clones mayores de 1.000 bases tienen una mayor probabilidad de unirse a una localización cromosómica única con suficiente intensidad de la señal para su simple detección. Preferiblemente, serán suficientes 1.000 bases, y más preferiblemente 2.000 bases para obtener buenos resultados en una cantidad de tiempo razonable. Para una revisión de esta técnica, ver Verma y otros (Human Chrmomosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamos Press, New York, 1988)).

Los reactivos para el mapeo cromosómico se pueden utilizar individualmente para marcar un solo cromosoma o un solo sitio sobre ese cromosoma, o se pueden utilizar paneles de reactivos para marcar múltiples sitios y/o múltiples cromosomas. Los reactivos correspondientes a las regiones no codificadoras de los genes se prefieren actualmente con fines de mapeo. Es más probable que las secuencias codificadoras estén conservadas en las familias de genes, aumentando de ese modo la probabilidad de hibridaciones cruzadas durante el mapeo cromosómico.

Una vez que una secuencia ha sido mapeada en una localización cromosómica precisa, la posición física de la secuencia sobre el cromosoma se puede correlacionar con los datos del mapeo genético. (Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, disponible en la red a través de la Johns Hopkins University Welch Medical Library). La relación entre genes y enfermedad, mapeados en la misma región cromosómica, se puede identificar a través de análisis de conexión (herencia simultánea de genes físicamente adyacentes), descritos por ejemplo, por Egeland y otros (1987) Nature 325:783-787.

Por otra parte, se pueden determinar las diferencias en las secuencias de ADN entre los individuos afectados y no afectados con una enfermedad asociada con el gen Tango-77. Si se observa una mutación en alguno o en todos los individuos afectados pero no en ningún individuo no afectado, es probable que la mutación sea el agente causante de la enfermedad concreta. La comparación de los individuos afectados y no afectados implica generalmente buscar primero alteraciones estructurales en los cromosomas tales como deleciones o traslocaciones que son visibles a partir de las diseminaciones cromosómicas o detectables utilizando PCR basándose en esa secuencia de ADN. Por último, se puede realizar la secuenciación completa de los genes a partir de varios individuos para confirmar la presencia de una mutación y para distinguir las mutaciones de los polimorfismos.

C. Medicina Predictiva

La presente invención también se refiere al campo de la medicina predictiva en la que se utilizan análisis de diagnóstico, análisis de pronóstico, farmacogenómica, y verificación de pruebas clínicas con fines pronósticos (predictivos) para de ese modo tratar a un individuo profilácticamente. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se refiere a análisis de diagnóstico para determinar la expresión de una proteína y/o un ácido nucleico Tango-77 así como la actividad de Tango-77, en el contexto de una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, células, tejido) para determinar de ese modo si un individuo está afectado por una enfermedad o trastorno, o tiene riesgo de desarrollar un trastorno, asociado con la expresión o la actividad aberrante de Tango-77. La invención también proporciona análisis de pronóstico (o predictivos) para determinar si un individuo tiene riesgo de desarrollar un trastorno asociado con la expresión o la actividad de la proteína, el ácido nucleico Tango-77. Por ejemplo, se pueden analizar las mutaciones en un gen Tango-77 en una muestra biológica. Semejantes análisis se pueden utilizar para fines de pronóstico o predictivos para tratar de ese modo profilácticamente a un individuo antes del comienzo de un trastorno caracterizado por o asociado con la expresión o la actividad de una proteína, ácido nucleico Tango-77.

Otro aspecto de la invención proporciona los métodos para determinar la expresión de una proteína, ácido nucleico Tango-77 o la actividad Tango-77 en un individuo para seleccionar de ese modo los agentes terapéuticos o profilácticos apropiados para ese individuo (referidos en la presente memoria como "farmacogenómica"). La farmacogenómica permite la selección de agentes (por ejemplo, fármacos) para el tratamiento terapéutico o profiláctico de un individuo basándose en el genotipo del individuo (por ejemplo, el genotipo de individuo examinado para determinar la capacidad del individuo para responder al agente concreto).

Otro aspecto más de la invención se refiere a la verificación de la influencia de los agentes (por ejemplo, fármacos u otros compuestos) sobre la expresión o la actividad de Tango-77 en pruebas clínicas.

Estos y otros agentes se describen con más detalle en las siguientes secciones.

1. Análisis de Diagnóstico

Un método ejemplar para detectar la presencia o ausencia de Tango-77 en una muestra biológica implica obtener una muestra biológica de un sujeto de ensayo y poner en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente capaz de detectar la proteína o el ácido nucleico Tango-77 (por ejemplo, ARNm, ADN genómico) que codifica la proteína Tango-77 de manera que se detecte la presencia de Tango-77 en la muestra biológica. Un agente preferido para detectar ARNm o ADN genómico de Tango-77 es una sonda de ácido nucleico marcada capaz de hibridar con el ARNm o el ADN genómico de Tango-77. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico Tango-77 completo, tal como el ácido nucleico del SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10 o una porción del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 15, 30, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridar específicamente en condiciones restrictivas con el ARNm o el ADN genómico de Tango-77. Otras sondas adecuadas para su uso en análisis de diagnóstico de la invención se describen en la presente memoria.

Un agente preferido para detectar la proteína Tango-77 es un anticuerpo capaz de unirse a la proteína Tango-77, preferiblemente un anticuerpo con una marca detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o más preferiblemente monoclonales. Se puede utilizar un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab o F(ab')_{2}). Se desea que el término "marcado", con respecto a la sonda o al anticuerpo, abarque el marcaje directo de la sonda o del anticuerpo acoplando (es decir, conectando físicamente) una sustancia detectable a la sonda o al anticuerpo, así como mediante marcaje indirecto de la sonda o del anticuerpo con radiactividad con otro reactivo que se une directamente. Los ejemplos del marcaje indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente y marcaje de los extremos de una sonda de ADN con biotina de manera que se pueda detectar con estreptavidina marcada fluorescentemente. Se desea que el término "muestra biológica" incluya los tejidos, las células y los fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como los tejidos, las células y los fluidos presentes en un sujeto. Esto es, se puede utilizar el método de detección de la invención para detectar el ARNm, la proteína, o el ADN genómico Tango-77 en una muestra biológica in vitro así como in vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para la detección del ARNm Tango-77 incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para la detección de la proteína Tango-77 incluyen análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA), transferencias Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para la detección del ADN genómico Tango-77 incluyen las hibridaciones Southern. Además, las técnicas in vivo para la detección de una proteína Tango-77 incluyen la introducción en un sujeto de un anticuerpo anti-Tango-77 marcado. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar con un marcador radiactivo cuya presencia y localización en un sujeto pueda ser detectada mediante técnicas de formación de imágenes convencionales.

En una realización, la muestra biológica contiene moléculas de proteína del sujeto de ensayo. Alternativamente, la muestra biológica contiene moléculas de ARNm del sujeto de ensayo o moléculas de ADN genómico del sujeto de ensayo. Una muestra biológica preferida es una muestra de leucocitos de sangre periférica aislada mediante métodos convencionales de un sujeto.

En otra realización, los métodos implican adicionalmente obtener una muestra biológica de control a partir de un sujeto de control, poner en contacto la muestra de control con un compuesto o agente capaz de detectar la proteína, el ARNm, o el ADN genómico Tango-77, de manera que la proteína, Tango-77 se detecte en la muestra biológica, y comparar la presencia de la proteína, el ARNm o el ADN genómico Tango-77 en la muestra de control con la presencia de la proteína, el ARNm o el ADN genómico Tango-77 en la muestra de ensayo.

La invención también abarca los estuches para detectar la presencia de Tango-77 en una muestra biológica (una muestra de ensayo). Tales estuches se pueden utilizar para determinar si un sujeto padece de, o tiene un riesgo aumentado de desarrollar, un trastorno asociado con la expresión aberrante de Tango-77 (por ejemplo, un trastorno inmunológico). Por ejemplo, el estuche puede comprender un compuesto marcado o un agente capaz de detectar la proteína o el ARNm Tango-77 en una muestra biológica y los medios para determinar la cantidad de Tango-77 en la muestra (por ejemplo, un anticuerpo anti-Tango-77 o una sonda oligonucleotídica que se une a un ADN que codifica Tango-77, por ejemplo, el SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10). Los estuches también pueden incluir las instrucciones para observar que el sujeto sometido a ensayo padece o tiene el riesgo de desarrollar un trastorno asociado con la expresión aberrante de Tango-77 si la cantidad de la proteína o el ARNm Tango-77 está por encima o por debajo del nivel normal.

Para los estuches basados en anticuerpos, el estuche puede comprender, por ejemplo: (1) un primer anticuerpo (por ejemplo, anclado a un soporte sólido) que se une a la proteína Tango-77; y, opcionalmente (2) un segundo anticuerpo, diferente que se une a la proteína Tango-77 o al primer anticuerpo y está conjugado con un agente detectable.

Para los estuches basados en oligonucleótidos, el estuche puede comprender, por ejemplo: (1) un oligonucleótido, por ejemplo, un oligonucleótido marcado detectablemente, que hibrida con una secuencia de ácido nucleico Tango-77 o (2) un par de cebadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico Tango-77;

El estuche también puede comprender, por ejemplo, un agente tamponador, un conservante, o un agente estabilizador de proteínas. El estuche también puede comprender los componentes necesarios para detectar el agente detectable (por ejemplo, una enzima o un sustrato). El estuche también puede contener una muestra de control o una serie de muestras de control que se pueden someter a ensayo y comparar con la muestra de ensayo contenida. Cada componente del estuche está encerrado usualmente en un contenedor individual y todos los diferentes contenedores están dentro de un solo paquete junto con las instrucciones para observar si el sujeto sometido a ensayo padece o tiene riesgo de desarrollar un trastorno asociado con la expresión aberrante de Tango-77.

2. Análisis de Pronóstico

Los métodos descritos en la presente memoria pueden ser utilizados además como análisis de diagnóstico o de pronóstico para identificar sujetos que tienen una enfermedad o un trastorno asociados con la expresión o la actividad aberrante de Tango-77 o el riesgo de desarrollarlos. Por ejemplo, los análisis descritos en la presente memoria, tales como los análisis de diagnóstico anteriores o los siguientes análisis, se pueden utilizar para identificar un sujeto que tiene un trastorno asociado con la expresión o la actividad aberrante o el riesgo de desarrollarlo. De este modo, la presente invención proporciona un métodos en el que se obtiene una muestra de ensayo de un sujeto y se detecta una proteína o ácido nucleico Tango-77 (por ejemplo, ARNm, ADN genómico), donde la presencia de la proteína o del ácido nucleico Tango-77 es diagnóstica de un sujeto que tiene una enfermedad o un trastorno asociados con la expresión o la actividad aberrante de Tango-77 o el riesgo de desarrollarlos. Según se utiliza en la presente memoria, una "muestra de ensayo" hace referencia a una muestra biológica obtenida de un sujeto de interés. Por ejemplo, la muestra de ensayo puede ser un fluido biológico (por ejemplo suero), una muestra celular, o un tejido.

Además, los ensayos de pronóstico descritos en la presente memoria se pueden utilizar para determinar si a un sujeto se le pueda administrar un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña, u otro fármaco candidato) para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o la actividad aberrante de Tango-77. Por ejemplo, tales métodos se pueden utilizar para determinar si un sujeto puede ser tratado eficazmente con un agente o una clase de agentes específicos (por ejemplo, agentes de un tipo que disminuye la actividad de Tango-77). Así, la presente invención proporciona métodos para determinar si un sujeto puede ser tratado eficazmente con un agente para un trastorno asociado con la expresión o la actividad aberrante de Tango-77 en el que se obtiene una muestra de ensayo y se detecta la proteína o el ácido nucleico Tango-77 (por ejemplo, donde la presencia de la proteína o el ácido nucleico Tango-77 es diagnóstica para un sujeto al que se le puede administrar el agente para tratar un trastorno asociado con la expresión o la actividad aberrante de Tango-77).

Los métodos de la invención también se pueden utilizar para detectar lesiones genéticas o mutaciones en un gen Tango-77, determinando de ese modo si un sujeto con el gen lesionado tiene el riesgo de un trastorno caracterizado por la inflamación aberrante. En realizaciones preferidas, los métodos incluyen detectar, en una muestra de células del sujeto, la presencia o ausencia de una lesión genética o mutación caracterizada por al menos uno de una alteración que afecta a la integridad de un gen que codifica la proteína Tango-77, o de la expresión errónea del gen Tango-77. Por ejemplo, tales lesiones genéticas o mutaciones se pueden detectar determinando la existencia de al menos uno de: 1) una deleción de uno o más nucleótidos de un gen Tango-77; 2) una adición de uno o más nucleótidos a un gen Tango-77; 3) una sustitución de uno o más nucleótidos de un gen Tango-77; 4) una transposición cromosómica de un gen Tango-77; 5) una alteración del nivel de un transcrito de ARN mensajero de un gen Tango-77; 6) una modificación aberrante de un gen Tango-77, por ejemplo del patrón de metilación del ADN genómico; 7) la presencia de un patrón de empalme de tipo no salvaje de un transcrito de ARN mensajero de un gen Tango-77; 8) un nivel de tipo no salvaje de una proteína Tango-77; 9) una pérdida alélica de un gen Tango-77, y 10) una modificación post-traduccional de una proteína Tango-77. Según se describe en la presente memoria, existen un gran número de mecanismos de análisis conocidos en la técnica que se pueden utilizar para detectar lesiones o mutaciones en un gen Tango-77. Una muestra biológica preferida es una muestra de leucocitos de sangre periférica aislada de un sujeto mediante métodos convencionales.

En algunas realizaciones, la detección de la lesión implica el uso de una sonda/cebador en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.683.195 y 4.683.202), tal como PCR ancla o PCR RACE, o, alternativamente, en una reacción de ligadura en cadena (LCR) (ver, por ejemplo, Landegran y otros (1988) Science 241:1077-1080; y Nakazawa y otros (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:360-364), la última de las cuales puede ser particularmente útil para detectar mutaciones puntuales en el gen Tango-77 (ver, por ejemplo, Abravaya y otros (1995) Nucleic Acid Res. 23:675-682). Este método puede incluir las etapas de recoger una muestra de células de un paciente, aislar el ácido nucleico de las células (por ejemplo, genómico, ARNm o ambos) de las células de la muestra, poner en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores que hibridan específicamente con un gen Tango-77 en condiciones en las que se producen la hibridación y la amplificación del gen Tango-77 (si estuviera presente), y detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación, o detectar el tamaño del producto de la amplificación y comparar la longitud con una muestra de control. Se prevé que puede ser deseable utilizar la PCR y/o la LCR como etapa de amplificación preliminar junto con cualquiera de las técnicas utilizadas para detectar las mutaciones descritas en la presente memoria.

Entre los métodos de amplificación alternativos se incluyen: la replicación autosostenida de la secuencia (Guatelli y otros (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), el sistema de amplificación transcripcional (Kwoh, y otros (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), la replicasa Q-Beta (Lizardi y otros (1988) Bio/Tecnology 6:1197), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos, seguido de la detección de las moléculas amplificadas utilizando mecanismos bien conocidos por los expertos en la técnica. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si tales moléculas están presentes en muy bajo número.

En una realización alternativa, las mutaciones en un gen Tango-77 de una célula muestra se pueden identificar por las alteraciones de los patrones de escisión con las enzimas de restricción. Por ejemplo, se aísla el ADN de muestra y de control, se amplifica (opcionalmente), se digiere con una o más endonucleasas de restricción, y se determinan las dimensiones de longitud de los fragmentos mediante electroforesis en gel y se comparan. Las diferencias en las dimensiones de longitud de los fragmentos entre los ADN de muestra y de control indican mutaciones en el ADN de muestra. Por otra parte, el uso de ribozimas específicas de la secuencia (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.498.531) se puede utilizar para puntuar la presencia de mutaciones específicas por el desarrollo o la pérdida de un sitio de escisión de la ribozima.

En otras realizaciones, se pueden identificar las mutaciones genéticas en Tango-77 hibridando una muestra y los ácidos nucleicos de control, por ejemplo, ADN o ARN, en matrices de alta densidad que contienen cientos o miles de sondas oligonucleotídicas (Cronin y otros (1996) Human Mutation 7:244-255; Kozal y otros (1996) Nature Medicine 2:753-759). Por ejemplo, se pueden identificar las mutaciones genéticas en Tango-77 en matrices bidimensionales que contienen sondas de ADN generadas con luz como describen Cronin y otros supra. Brevemente, se puede utilizar una primera matriz de hibridación de sondas para rastrear largos tramos de ADN en una muestra y un control para identificar los cambios de bases entre las secuencias elaborando matrices lineales de sondas de solapamiento sucesivas. Esta etapa permite la identificación de mutaciones puntuales. Esta etapa está seguida de una segunda matriz de hibridación que permite la caracterización de mutaciones específicas utilizando matrices de sondas especializadas, más pequeñas complementarias a todas las variantes o mutaciones detectadas. Cada matriz de mutación está compuesta de grupos de sondas en paralelo, una complementaria al gen de tipo salvaje y la otra complementaria al gen mutante.

En otra realización más, se puede utilizar una cualquiera de una variedad de reacciones de secuenciación conocidas en la técnica para secuenciar directamente el gen Tango-77 y detectar mutaciones comparando la secuencia de la muestra de Tango-77 con la correspondiente secuencia de tipo salvaje (control). Los ejemplos de las reacciones de secuenciación se incluyen aquellas basadas en las técnicas desarrolladas por Maxim y Gilbert ((1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560) o Sanger ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463). También se contempla que se puedan utilizar una variedad de procedimientos de secuenciación automatizados cuando se realizan los análisis de diagnóstico (1995) Bio/Techniques 19:448), incluyendo secuenciación mediante espectrometría de masas (ver, por ejemplo, la Publicación PCT Núm. WO 94/16101; Cohen y otros (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162; y Griffin y otros (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159).

Otros métodos para detectar mutaciones en el gen Tango-77 incluyen los métodos en los que se utiliza la protección de los agentes de escisión para detectar bases con emparejamientos erróneos en heterodúplex de ARN/ARN o ARN/ADN (Myers y otros (1985) Science 230:1242). En general, la técnica de "escisión del emparejamiento erróneo" comprende proporcionar heterodúplex formados hibridando ARN o ADN (marcado) que contienen la secuencia Tango-77 de tipo salvaje con el ARN o el ADN potencialmente mutante obtenido de una muestra de tejido. Los dúplex bicatenarios se tratan con un agente que escinde regiones monocatenarias del dúplex tales como las que existirán debido a los emparejamientos erróneos de pares de bases entre el control y las hebras de muestra. Los dúplex de ARN/ADN se pueden tratar con ARNasa para digerir las regiones con emparejamientos erróneos, y los híbridos de ADN/ADN se pueden tratar con nucleasa S1 para digerir las regiones con emparejamientos erróneos. En otras realizaciones, los dúplex de ADN/ADN o de ARN/ADN se pueden tratar con hidroxilamina o tetróxido de osmio y con piperidina con el fin de digerir las regiones con emparejamientos erróneos. Tras la digestión de las regiones desemparejadas, la sustancia resultante se separa después por tamaños sobre geles de poliacrilamida desnaturalizados para determinar el sitio de mutación. Ver, por ejemplo, Cotton y otros (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397; Saleeba y otros (1992) Methods Enzymol. 217:286-295. En una realización preferida, el ADN o el ARN de control se pueden marcar para su detección.

En otra realización más, en la reacción de escisión del emparejamiento erróneo se emplean una o más proteínas que reconocen los pares de bases desemparejados en el ADN bicatenario (denominadas enzimas "reparadoras de ADN con emparejamientos erróneos") en sistemas definidos para detectar y mapear mutaciones puntuales de los ADNc Tango-77 obtenidos de las muestras de células. Por ejemplo, la enzima mutY de E. coli escinde la A en emparejamientos erróneos G/A y la timidina DNA glicosilasa de las células HeLa escinde la T en emparejamientos erróneos G/T (Hsu y otros (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662). Según una realización ejemplar, una sonda basada en una secuencia Tango-77, por ejemplo una secuencie Tango-77 de tipo salvaje, hibrida con un ADNc u otro producto de ADN de una o varias células sometidas a ensayo. El dúplex se trata con una enzimas reparadora de ADN con emparejamientos erróneos, y los productos de escisión, si los hubiera, se pueden detectar a partir de protocolos de electroforesis o similares. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.459.039.

En otras realizaciones, se utilizarán las alteraciones de la movilidad electroforética para identificar las mutaciones en los genes Tango-77.Por ejemplo, se puede utilizar un polimorfismo conformacional monocatenario (SSCP) para detectar las diferencias en la movilidad electroforética entre los ácidos nucleicos de tipo mutante y salvaje (Orita y otros (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766; ver también Cotton (1993) Mutat. Res. 285:125-144; Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:73-79). Los fragmentos de ADN monocatenarios de los ácidos nucleicos Tango-77 de muestra y de control se desnaturalizarán y se dejarán renaturalizar. La estructura secundaria de los ácidos nucleicos monocatenarios varía según la secuencia, y la alteración resultante de la movilidad electroforética posibilita la detección incluso de un solo cambio de base. Los fragmentos de ADN se pueden marcar o detectar con sondas marcadas. La sensibilidad del análisis se puede aumentar utilizando ARN (en lugar de ADN), en el que la estructura secundaria es más sensible a un cambio en la secuencia. En una realización preferida, en el método sujeto se utiliza el análisis de los heterodúplex para separar las moléculas de heterodúplex bicatenarias basándose en los cambios en la movilidad electroforética (Keen y otros (1991) Trends Genet 7:5).

En otra realización más, se analiza el movimiento de los fragmentos mutantes o de tipo salvaje en geles de poliacrilamida que contienen un gradiente de un desnaturalizante utilizando electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (Myers y otros (1985) Nature 313:495). Cuando se utiliza DGGE como método de análisis, el ADN se modificará para asegurar que no se desnaturaliza completamente, por ejemplo, añadiendo una pinza GC de aproximadamente 40 pb de ADN rico en GC de alto punto de fusión mediante PCR. En una realización adicional, se utiliza un gradiente de temperatura en lugar de un gradiente desnaturalizante para identificar las diferencias de movilidad del ADN de control y de muestra (Rosenbaum y Reissner (1987) Biophys. Chem. 265:12753).

Los ejemplos de las otras técnicas para detectar mutaciones puntuales incluyen, pero no están limitados a, hibridación de oligonucleótidos selectiva, amplificación selectiva, o extensión del cebador selectiva. Por ejemplo, se pueden preparar cebadores oligonucleotídicos en los que la mutación conocida se coloca centralmente y después se hibrida con el ADN diana en condiciones que permiten sólo la hibridación si se encuentra un emparejamiento perfecto (Saiki y otros (1986) Nature 324:163); Saiki y otros (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230). Semejantes oligonucleótidos específicos de los alelos son hibridados a un ADN diana amplificado mediante PCR o a varias mutaciones diferentes cuando los oligonucleótidos se anclan a la membrana de hibridación e hibridan con el ADN diana marcado.

Alternativamente, se puede utilizar la tecnología de amplificación específica de los alelos que depende de la amplificación mediante PCR selectiva junto con la presente invención. Los oligonucleótidos utilizados como cebadores para la amplificación específica pueden portar la mutación de interés en el centro de la molécula (de manera que la amplificación depende de la hibridación diferencial) (Gibbs y otros (1989) Nucleic Acid Res. 17:2437-2448) o en el extremo 3' de un cebador donde, en condiciones apropiadas, el emparejamiento erróneo puede evitar o reducir la extensión mediante la polimerasa (Prossner (1993) Tibtech 11:238). Además, puede ser deseable introducir un sitio de restricción novedoso en la región de la mutación para crear la detección basada en la escisión (Gasparini y otros (1992) Mol. Cell. Probes 6:1). Se prevé que en ciertas realizaciones también se puede realizar la amplificación utilizando ligasa Taq para la amplificación (Barany 1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189). En tales casos, la ligadura tendrá lugar sólo si hay un emparejamiento perfecto en el extremo 3' de la secuencia 5' haciendo posible detectar la presencia de una mutación conocida de un sitio específico observando la presencia o ausencia de amplificación.

Los métodos descritos en la presente memoria se pueden realizar, por ejemplo, utilizando los estuches de diagnóstico pre-empaquetados que comprenden al menos una sonda de ácido nucleico o el reactivo antigénico descrito en la presente memoria, que se pueden utilizar convenientemente, por ejemplo, en el marco clínico para diagnosticar pacientes que manifiestan síntomas o historial familiar de enfermedades o dolencias que implican al gen Tango-77.

Además, se puede utilizar cualquier tipo celular o tejido, preferiblemente leucocitos de sangre periférica, en el que se expresa Tango-77 en los análisis de pronóstico descritos en la presente memoria.

3. Farmacogenómica

Los agentes, o moduladores que tienen un efecto estimulador o inhibidor sobre la actividad de Tango-77 (por ejemplo, expresión del gen Tango-77) según se identifica mediante un análisis de rastreo descrito en la presente memoria se puede administrar a los individuos para tratar (profilácticamente o terapéuticamente) trastornos (por ejemplo, inflamación aguda o crónica y asma) asociados con la actividad aberrante de Tango-77. Junto con semejante tratamiento, se puede considerar la farmacogenómica (por ejemplo, el estudio de la relación entre un genotipo de un individuo y la respuesta de ese individuo a un compuesto foráneo o fármaco) del individuo. Las diferencias en el metabolismo de los agentes terapéuticos pueden conducir a toxicidad severa o al fracaso terapéutico alterando la relación entre la dosis y la concentración en sangre del fármaco farmacológicamente activo. De ese modo, la farmacogenómica del individuo permite la selección de agentes eficaces (por ejemplo, fármacos), para los tratamientos profilácticos o terapéuticos basados en la consideración del genotipo del individuo. Semejante farmacogenómica puede ser utilizada adicionalmente para determinar las dosificaciones y los regímenes terapéuticos apropiados. Por consiguiente, se pueden determinar la actividad de la proteína Tango-77, la expresión del ácido nucleico Tango-77, o el contenido de mutación de los genes Tango-77 en un individuo para así seleccionar el agente o los agentes apropiados para el tratamiento terapéutico o profiláctico del individuo.

La farmacogenómica se ocupa de las variaciones hereditarias clínicamente significativas en la respuesta a los fármacos debido a la disposición al fármaco alterada y la acción anómala en personas afectadas. Ver, por ejemplo, Linder (1997) Clin. Chem. 43(2):254-266. En general, se pueden diferenciar dos tipos de condiciones farmacogenéticas. Las condiciones genéticas transmitidas como un solo factor que altera el modo en que actúan los fármacos en el organismo son referidas como "acción alterada del fármaco". Las condiciones genéticas transmitidas como factores únicos que alteran el modo en que el organismo actúa sobre los fármacos son referidas como "metabolismo alterado del fármaco". Estas condiciones farmacogenéticas pueden ocurrir como defectos raros o como polimorfismos. Por ejemplo, la carencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) es una enzimopatía heredada corriente en la que la complicación clínica principal es la hemólisis tras la ingestión de fármacos oxidantes (anti-maláricos, sulfonamidas, analgésicos, nitrofuranos) y el consumo de habas.

Como realización ilustrativa, la actividad de las enzimas que metabolizan fármacos es un determinante principal tanto de la intensidad como de la duración de la acción de un fármaco. El descubrimiento de polimorfismos genéticos de las enzimas que metabolizan fármacos (por ejemplo, N-acetiltransferasa 2 (NAT 2) y las enzimas del citrocromo P450 CYP2D6 y CYP2C19) ha proporcionado una explicación en cuanto a por qué algunos pacientes no obtienen los efectos esperados del fármaco o muestran una respuesta exagerada al fármaco y una toxicidad grave tras tomar la dosis de normal y segura de un fármaco. Estos polimorfismos se expresan en dos fenotipos en la población, el metabolizador rápido (EM) y el metabolizador lento (PM). La prevalencia de PM es diferente entre las diferentes poblaciones. Por ejemplo, el gen que codifica CYP2D6 es altamente polimórfico y se han identificado algunas mutaciones en PM, que conducen todas a la ausencia de CYP2D6 funcional. Los metabolizadores lentos de CYP2D6 y CYP2C19 experimentan bastante frecuentemente una respuesta exagerada a los fármacos y efectos secundarios cuando reciben dosis normales. Si un metabolito es el radical terapéutico activo, PM no muestra respuesta terapéutica, como se demuestra para el efecto analgésico de la codeína mediado por su metabolito morfina formado a partir de CYP2F6. El otro extremo son los denominados metabolizadores ultra-rápidos que no responden a las dosis normales. Recientemente, se ha identificado que la base molecular del metabolismo ultra-rápido es debida a la amplificación del gen CYP2D6.

Así, la actividad de la proteína Tango-77, la expresión del ácido nucleico Tango-77, o el contenido de mutación de los genes Tango-77 en un individuo puede ser determinada para seleccionar de ese modo el agente o los agentes apropiados para el tratamiento terapéutico o profiláctico del individuo. Por añadidura, los estudios farmacogenéticos se pueden utilizar para aplicar el genotipaje de alelos polimórficos que codifican enzimas que metabolizan fármacos para la identificación de un fenotipo de un individuo con sensibilidad a un fármaco. Este conocimiento, cuando se aplica a la dosificación o a la selección de un fármaco, puede evitar reacciones adversas o el fracaso terapéutico y aumentar en este modo la eficacia terapéutica o profiláctica cuanto se trata a un sujeto con un modulador de Tango-77, tal como un modulador identificado mediante uno de los análisis de rastreo ejemplares descritos en la presente memoria.

4. Verificación de los Efectos Durante las Pruebas Clínicas

La verificación de la influencia de los agentes (por ejemplo fármacos, compuestos) sobre la expresión de la actividad de Tango-77 (por ejemplo, la capacidad para modular la inflamación aberrante) se puede aplicar no sólo en el rastreo de fármacos básico, sino también en pruebas clínicas. Por ejemplo, la eficacia de un agente, según se determina mediante un análisis de rastreo como se describe en la presente memoria, para incrementar la expresión del gen Tango-77, incrementar los niveles de proteína, o aumentar reguladamente la actividad de Tango-77, se puede verificar en pruebas clínicas de sujetos que manifiestan disminución de la expresión del gen Tango-77, disminución de los niveles de proteínas, o disminución regulada de la actividad de Tango-77. Alternativamente, la eficacia de un agente, según se determina mediante un análisis de rastreo, para disminuir la expresión génica de Tango-77, disminuir los niveles de proteína, o para disminuir reguladamente la actividad de Tango-77, se puede verificar en pruebas clínicas de sujetos que manifiestan aumento de la expresión del gen Tango-77, aumento de los niveles de proteína, o aumento regulado de la actividad de Tango-77.

Por ejemplo, y no a modo de limitación, se pueden identificar los genes, incluyendo Tango-77, que están modulados en las células mediante tratamiento con un agente (por ejemplo, compuesto, fármaco o molécula pequeña) que modula la actividad de Tango-77 (por ejemplo, según se identifica en un análisis de rastreo descrito en la presente memoria). De este modo, para estudiar el efecto de los agentes sobre los trastornos de proliferación celular, por ejemplo, en una prueba clínica, se pueden aislar las células y preparar y analizar el ARN en cuanto a los niveles de expresión de Tango-77 y de otros genes implicados en el trastorno. Los niveles de expresión génica (es decir, el patrón de expresión génica) se puede cuantificar mediante análisis de transferencia Northern o RT-PCR, como se describe en la presente memoria, o alternativamente midiendo la cantidad de proteína producida, mediante uno de los métodos descritos en la presente memoria, o midiendo los niveles de la actividad de Tango-77 o de otros genes. De este modo, el patrón de expresión génica puede servir como un marcador, indicativo de la respuesta fisiológica de las células al agente. Por consiguiente, este estado de respuesta puede ser determinado antes, y en diferentes momentos durante, el tratamiento del individuo con el agente.

Los autores de la presente invención describen un método para verificar la eficacia del tratamiento de un sujeto con un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña, u otro fármaco candidato identificado mediante los análisis de rastreo descritos en la presente memoria) que comprende las etapas de (i) obtener una muestra de pre-administración de un sujeto antes de la administración del agente; (ii) detectar el nivel de expresión de una proteína, ARNm, o ADN genómico Tango-77 en la muestra de pre-administración; (iii) obtener una o más muestras de pre-administración del sujeto; (iv) detectar en nivel de expresión o actividad de la proteína, el ARNm, o el ADN genómico Tango-77 en las muestras de post-administración; (v) comparar el nivel de expresión o actividad de la proteína, el ARNm, o el ADN genómico Tango-77 en la muestra de pre-administración con la proteína, el ARNm, o el ADN genómico Tango-77 en las muestras de post-administración; y (vi) alterar en conformidad la administración del agente al sujeto. Por ejemplo, puede ser deseable el aumento de administración del agente para incrementar la expresión o la actividad de Tango-77 a niveles mayores de los detectados, esto es, para incrementar la eficacia del agente. Alternativamente, puede ser deseable disminuir la administración del agente para disminuir la expresión o la actividad de Tango-77 a niveles inferiores a los detectados, esto es, para disminuir la eficacia del agente.

C. Métodos de Tratamiento

Los autores de la presente invención describen métodos profilácticos y terapéuticos para tratar a un sujeto en riesgo de (o susceptible de) desarrollar o que tiene un trastorno asociado con la expresión o la actividad aberrante de Tango-77. Alternativamente, los trastornos asociados con la producción aberrante de IL-1 se pueden tratar con Tango-77. Tales trastornos incluyen la inflamación aguda y crónica, el asma, algunas clases de artritis, la diabetes autoinmunitaria, el lupus eritrematoide generalizado y la enfermedad inflamatoria del intestino.

1. Métodos Profilácticos

En un aspecto, los autores de la presente invención describen un método para prevenir en un sujeto, una enfermedad o condición asociadas con una expresión o actividad aberrante de Tango-77 (o expresión o actividad aberrante de IL-1), administrando al sujeto un agente que modula la expresión de Tango-77 o al menos una actividad de Tango-77. Los sujetos en riesgo de una enfermedad que esté ocasionada o a la que contribuya la expresión o la actividad aberrante de Tango-77, por ejemplo, cualquiera de una combinación de análisis de diagnóstico o de pronóstico descritos aquí. La administración de un agente profiláctico puede producirse antes de la manifestación de los síntomas característicos de aberración de Tango-77, de manera que se prevenga una enfermedad o un trastorno o, alternativamente, se retrase su progreso. Dependiendo del tipo de aberración de Tango-77, por ejemplo, se puede utilizar un agente agonista de Tango-77 o un agente antagonista de Tango-77 para tratar al sujeto. El agente apropiado puede ser determinado basándose en los análisis de rastreo descritos en la presente memoria.

2. Métodos Terapéuticos

Los autores de la presente invención describen métodos para modular la expresión o la actividad de Tango-77 con fines terapéuticos. El método modulador de la invención implica poner en contacto una célula con un agente que modula una o más de las actividades de la actividad de la proteína Tango-77 asociada con la célula. Un agente que modula la actividad de la proteína Tango-77 puede ser un agente como se ha descrito aquí, tal como un ácido nucleico o una proteína, un ligando cognado de origen natural de una proteína Tango-77, un péptido, un peptidomimético de Tango-77, u otra molécula pequeña. En una realización, el agente estimula una o más de las actividades biológicas de la proteína Tango-77. Los ejemplos de tales agentes estimuladores incluyen la proteína Tango-77 activa y una molécula de ácido nucleico que codifica Tango-77 que ha sido introducida en la célula. En otra realización, el agente inhibe una o más de las actividades biológicas de la proteína Tango-77. Entre los ejemplos de tales agentes inhibidores se incluyen moléculas de ácido nucleico Tango-77 antisentido y anticuerpos anti-Tango-77. Estos métodos moduladores se pueden realizar in vitro (por ejemplo, cultivando la célula con el agente) o, alternativamente, in vivo (por ejemplo, administrando el agente al sujeto). Como tal, la presente invención proporciona métodos para tratar a un individuo aquejado de una enfermedad o un trastorno caracterizado por la expresión o la actividad aberrante de una proteína o una molécula de ácido nucleico Tango-77. En una realización, el método implica administrar un agente (por ejemplo, un agente identificado mediante un análisis de rastreo descrito aquí), o una combinación de agentes que modulan (por ejemplo aumento regulado o disminución regulada) la expresión o la actividad de Tango-77. En otra realización, el método implica administrar una proteína o una molécula de ácido nucleico Tango-77 como terapia para compensar la expresión o la actividad aberrante de Tango-77.

La estimulación de la actividad Tango-77 es deseable en situaciones en las que hay una disminución regulada anómalamente de Tango-77 y/o en las que es probable que el aumento de la actividad Tango-77 tenga un efecto beneficioso.

Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben ser considerados limitantes.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento y Caracterización de los ADNc Tango-77 Humanos

Se ha encontrado que los genes de las citoquinas IL-1\alpha, IL-1\beta e IL-1ra están agrupados íntimamente en el cromosoma 2, es decir, IL-1\alpha, IL-1\beta e IL-1ra están localizados a 450 kb entre sí. Los clones BAC que contienen IL-1\alpha, IL-1\beta se utilizan para identificar otros genes de citoquinas desconocidos proximales. Para hacer esto, se seleccionó el clon BAC que contenía IL-1\alpha e IL-1\beta de una genoteca BAC (Research Genetics, Huntsville, Alabama) utilizando cebadores específicos diseñados para IL-1\alpha e IL-1\beta. El ADN de BAC se extrajo y se utilizó para elaborar una genoteca genómica cortada al azar. A partir de esta genoteca BAC, se seleccionaron 4.000 clones para la secuenciación. Las secuencias genómicas resultante se ensamblaron después en contigs y se utilizaron para rastrear bases de datos privadas y públicas. Se encontró que un contig genómico contenía dos segmentos o secuencias que parecían IL-1ra. Estos dos segmentos son exones potenciales del gen Tango-77. Después se diseñaron dos cebadores de PCR a partir de dos exones potenciales y se utilizaron para rastrear un panel de genotecas de ADNc para la expresión de un mensaje Tango-77. Una genoteca de ADNc de epitelios de pulmón humano tratado con TNF-\alpha mostró una banda positiva del tamaño pronosticado (es decir, si se empalman los dos exones). Utilizando el fragmento de la PCR como sonda, se aisló un solo clon de ADNc a partir de la misma genoteca. Este ADNc contiene un inserto de 989 pb. El clon de ADNc contiene tres marcos de lectura abiertos posibles. El primer marco de lectura abierto abarca 534 nucleótidos (nucleótidos 356-889 del SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3) y codifica una proteína de 178 aminoácidos (SEQ ID NO:2). Esta proteína puede incluir una secuencia señal de aproximadamente 63 aminoácidos (del aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 63 del SEQ ID NO:2 (SEQ ID NO:4)) y una proteína madura pronosticada de aproximadamente 115 aminoácidos (de aproximadamente el aminoácido 64 al aminoácido 178 del SEQ ID NO:2 (SEQ ID NO:5)).

El segundo supuesto marco de lectura abierto nucleotídico abarca 498 nucleótidos (nucleótidos 389-889 del SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:6) y codifica una proteína de 167 aminoácidos (SEQ ID NO:7). Esta proteína incluye una secuencia señal pronosticada de aproximadamente 52 aminoácidos (del aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 52 del SEQ ID NO:7 (SEQ ID NO:8)) y una proteína madura pronosticada de aproximadamente 115 aminoácidos (de aproximadamente el aminoácido 53 al aminoácido 167 del SEQ ID NO:7 (SEQ ID NO:9)).

El tercer marco de lectura abierto (nucleótidos 372-889 del SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:10) abarca 408 nucleótidos y codifica una proteína de 136 aminoácidos (SEQ ID NO:11). Esta proteína incluye una secuencia señal pronosticada de aproximadamente 21 aminoácidos (del aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 21 del SEQ ID NO:11 (SEQ ID NO:12)) y una proteína madura pronosticada de aproximadamente 115 aminoácidos (de aproximadamente el aminoácido 22 al aminoácido 136 del SEQ ID NO:11 (SEQ ID NO:13)).

Se pronostica que Tango-77 es idéntica en un 35% a IL-1ra humano a nivel de aminoácidos.

Ejemplo 2 Expresión del ARNm Tango-77 en Tejidos Humanos

La expresión de Tango-77 se analizó utilizando hibridación mediante transferencia Northern. Una PCR generada del producto Tango-77 de 989 pb se marcó radiactivamente con dCTP^{32} utilizando el estuche Prime-It (Stratagene; La Jolla, CA) conforme a las instrucciones del fabricante. Los filtros que contenían ARNm humano (MTNI y MTNII: Clontech; Palo Alto, CA) se sondearon en solución de hibridación ExpressHyb (Clontech) y se lavaron en condiciones muy restrictivas conforme a las recomendaciones del fabricante.

No se detectó ARNm Tango-77 en ninguno de los ARNm de los tejidos no estimulados (cerebro, hígado, bazo, músculo esquelético, testículos, páncreas, corazón, riñón y leucocitos de sangre periférica) en las transferencias Northern de Clontech.

Después se sometieron a ensayo más de 96 genotecas de ADNc en cuanto a la presencia de Tango-77 utilizando la amplificación mediante PCR. Unicamente tres genotecas presentaron una señal positiva. Estas genotecas fueron el broncoepitelio tratado con TNF-\alpha, la línea celular SSC tratada con TNF-\alpha y las células T tratadas con anti-CD3.

Ejemplo 3 Caracterización de las Proteínas Tango-77

En este ejemplo, la secuencia de aminoácidos pronosticada de la proteína Tango-77 humana se comparó con la secuencia de aminoácidos de la proteína IL-1ra conocida. Además, se pronosticó el peso molecular de las proteínas Tango-77 humanas.

El ADNc Tango-77 humano (Figura 1; SEQ ID NO:1) aislado como se ha descrito antes codifica una proteína de 178 aminoácidos (Figura 1; SEQ ID NO:2) o una proteína de 167 aminoácidos (Figura 1; SEQ ID NO:7) o una proteína de 136 aminoácidos (Figura 1; SEQ ID NO:11). El programa de predicción de péptidos señal SIGNAL P Optimized Tool (Nielsen y otros (1997) Protein Engineering 10:1-6) pronosticó que Tango-77 incluye un péptido señal de 63 aminoácidos del SEQ ID NO:2 (SEQ ID NO:4)) precediendo a la proteína madura de 115; o precediendo a la proteína madura de 115 (de aproximadamente el aminoácido 52 al aminoácido 167 del SEQ ID NO:7 (SEQ ID NO:8)); o precediendo a la proteína madura de 115 (de aproximadamente el aminoácido 21 al aminoácido 136 del SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:12).

Como ha mostrado en la Figura 2, Tango-77 tiene una región de homología con IL-1ra (SEQ ID NO:14).

Tango-77 madura tiene un peso molecular pronosticado de aproximadamente 13 kDa y el PM pronosticado para Tango-77 inmadura es de 19,6 kDa, 18,5 kDa o 15,2 kDa, sin incluir las modificaciones post-traduccionales.

Ejemplo 4 Preparación de las proteínas Tango-77

Se puede producir Tango-77 recombinante en una variedad de sistemas de expresión. Por ejemplo, el péptido Tango-77 maduro puede ser expresado como una proteína de fusión con glutation-S-transferasa (GST) recombinante en E. coli y la proteína de fusión se puede aislar y caracterizar. Específicamente, como se ha descrito antes, Tango-77 se puede fusionar a GST y esta proteína de fusión se puede expresar en la cepa PEB199 de E. coli. La expresión de la proteína de fusión GST-Tango-77 en PEB199 se puede inducir con IPTG. La proteína de fusión recombinante se puede purificar a partir de productos lisados bacterianos brutos de la cepa PEB199 mediante cromatografía de afinidad sobre cuentas de glutation.

Ejemplo 5 Formas empalmadas alternativamente de IL-1ra y Tango-77

El programa de ordenador Procrustes (Gelfand y otros, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:9061-9066) es un algoritmo de alineamiento que pronostica la presencia de exones empalmados alternativamente para una proteína de interés en un tramo de ADN genómico. Utilizando la secuencia IL-1ra, se utilizó Procrustes para buscar la presencia de secuencias adicionales que pudieran codificar formas empalmadas alternativamente de IL-1ra en las dos secuencias genómicas BAC solapantes (ver la Fig. 3 y la Fig. 4). Se identificaron las secuencias potenciales que codifican los exones variantes para IL-1ra. Estos exones pronosticados se alineaban bien con la región N-terminal de IL-1ra, pero no estaban presentes en Tango-77. Los resultados de Procrustes pronostican la existencia de más formas empalmadas de IL-1ra.

Además, Procrustes también pronostica una secuencia adicional en BAC1 y BAC2 que codifica un exón empalmado alternativamente para Tango-77 (T77-Procrustes; Fig. 5). Esta forma variante de empalme pronosticada de Tango-77, T77-Procrustes, se alineó con Tango-77 (Fig. 6) y con IL-1ra e IL-1\beta (Fig. 7).

Los cebadores para la PCR en esta secuencia se pueden utilizar para generar un producto que se puede utilizar para rastrear un panel de genotecas de ADNc utilizando técnicas normalizadas. Las genotecas de ADNc adecuadas incluyen genotecas formadas a partir de broncoepitelio tratado con TNF-\alpha, línea celular SSC tratada con TNF-\alpha y células T tratadas con anti-CD3. El clon o los clones de ADNc resultantes se pueden aislar a partir de la genoteca y secuenciar para identificar los ADNc Tango-77 adicionales.

<110> Millennium Biotherapeutics, Inc.

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<120> MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO TANGO-77 Y POLIPÉPTIDOS

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<130> 09404/052WO1

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<140> PCT/US98/16102

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<141> 1998-08-03

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<150> US 09/128, 155

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<151> 1998-08-03

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<150> US 60/091,650

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<151> 1998-07-02

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<150> US 60/054, 646

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<151> 1997-08-04

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 18

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<170> FastSEQ para la Versión de Windows 3.0

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 989

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (356)...(889)

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<400> 1

1

2

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 178

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 534

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 501

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)...(501)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 167

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 408

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(408)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 136

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

15

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 177

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

18

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

19

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

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<211> 152331

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(152331)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, C o G

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<400> 16

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 176373

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(176373)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

97

98

99

100

101

102

103

104

105

106

107

108

109

110

111

112

113

114

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Generado Sintéticamente

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<222> (1)...(185)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia humana pronosticada utilizando un algoritmo de alineamiento que pronostica la presencia de exones empalmados alternativamente para una proteína de interés en un tramo de ADN genómico

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

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<222> (1)...(185)

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<223> Xaa = Cualquier Aminoácido

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<400> 18

115

Claims (28)

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína que tiene la capacidad de inhibir la inflamación seleccionada la molécula de ácido nucleico del grupo formado por:

a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 75% a la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, o el SEQ ID NO:10, el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el Número de Acceso 98807, o un complemento del
mismo;

b) una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 300 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, o el SEQ ID NO:10, el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el Número de Acceso 98807, o un complemento del mismo;

c) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:4, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:8, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11, el SEQ ID NO:12, o el SEQ ID NO:13, o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el Número de Acceso 98807.

d) una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:4, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:8, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11, el SEQ ID NO:12, o el SEQ ID NO:13, donde el fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:4, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:8, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11, el SEQ ID NO:12, o el SEQ ID NO:13, o el polipéptido codificado por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el Número de Acceso 98807; y

e) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:4, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:8, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11, el SEQ ID NO:12, o el SEQ ID NO:13, o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el Número de Acceso 98807; donde la secuencia de ácido nucleico hibrida con una molécula de ácido nucleico que comprende el SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, o el SEQ ID NO:10, o un complemento de la misma en condiciones restrictivas.

2. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 95% a la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, o el SEQ ID NO:10, el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el número de acceso 98807, o un complemento del mismo.

3. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, que se selecciona del grupo formado por:

a) un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, o el SEQ ID NO:10 o el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el Número de Acceso 98807, o un complemento del mismo; y

b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:4, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:8, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11, el SEQ ID NO:12, o el SEQ ID NO:13, o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el Número de Acceso 98807.

4. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente secuencias de ácido nucleico vectoras.

5. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende adicionalmente secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido heterólogo.

6. Una célula huésped que contiene la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. La célula huésped de la reivindicación 6, que es una célula huésped de mamífero.

8. La célula huésped de la reivindicación 7, que es una célula huésped de mamífero no humano.

9. Un polipéptido aislado que tiene la capacidad de inhibir la inflamación, seleccionado el polipéptido del grupo formado por:

a) un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:4, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:8, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11, el SEQ ID NO:12, o el SEQ ID NO:13, donde el fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:4, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:8, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11, el SEQ ID NO:12, o el SEQ ID NO:13;

b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:4, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:8, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11, el SEQ ID NO:12, o el SEQ ID NO:13, o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el Número de Acceso 98807; donde el polipéptido es codificado por una molécula de ácido nucleico que hibrida con una molécula de ácido nucleico que comprende el SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, o el SEQ ID NO:10, o un complemento de la misma en condiciones restrictivas; y

c) un polipéptido que es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 75% a un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, o el SEQ ID NO:10.

10. El polipéptido aislado de la reivindicación 9, que es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 85% a un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, o el SEQ ID NO:10.

11. El polipéptido aislado de la reivindicación 9, que es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 95% a un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:1, el SEQ ID NO:3, el SEQ ID NO:6, o el SEQ ID NO:10.

12. El polipéptido aislado de la reivindicación 9, que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2, el SEQ ID NO:4, el SEQ ID NO:5, el SEQ ID NO:7, el SEQ ID NO:8, el SEQ ID NO:9, el SEQ ID NO:11, el SEQ ID NO:12, o el SEQ ID NO:13, o una secuencia de aminoácidos codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado en la ATCC con el Número de Acceso 98807.

13. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que comprende adicionalmente secuencias de aminoácidos heterólogas.

14. Un anticuerpo o porción inmunológicamente activa del mismo que se une selectivamente a un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.

15. El anticuerpo o porción inmunológicamente activa del mismo de la reivindicación 14, que se selecciona del grupo formado por:

(a) anticuerpos policlonales;

(b) anticuerpos monoclonales;

(c) fragmentos F(ab);

(d) fragmentos F(ab')2.

16. El anticuerpo o porción inmunológicamente activa del mismo de la reivindicación 14 o 15, que se selecciona del grupo formado por:

(a) anticuerpos humanizados; y

(b) anticuerpos quiméricos;

17. El anticuerpo o porción inmunológicamente activa del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, que es acoplado a una sustancia detectable, o a un segundo anticuerpo.

18. El anticuerpo o porción inmunológicamente activa del mismo de la reivindicación 17, donde la sustancia detectable se selecciona del grupo formado por:

(a) enzimas;

(b) grupos prostéticos;

(c) sustancias fluorescentes;

(d) sustancias luminiscentes;

(e) sustancias bioluminiscentes; y

(f) sustancias radiactivas.

19. Un método para producir un polipéptido como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, o codificado por un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende cultivar la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico.

20. Un método para detectar la presencia de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 en una muestra, que comprende:

a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo o porción inmunológicamente activa del mismo que se une selectivamente a un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12; y

b) determinar si el anticuerpo o porción inmunológicamente activa del mismo se une al polipéptido en la muestra.

21. Un estuche que comprende un anticuerpo o porción inmunológicamente activa del mismo que se une selectivamente a un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 y las instrucciones para su uso.

22. Un método para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en una muestra, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto la muestra con una sonda de ácido nucleico o un cebador que hibrida selectivamente con la molécula de ácido nucleico; y

b) determinar si la sonda de ácido nucleico o el cebador se une a una molécula de ácido nucleico en la muestra.

23. El método de la reivindicación 22, donde la muestra comprende moléculas de ARNm y se pone en contacto con una sonda de ácido nucleico.

24. Un estuche que comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que es antisentido a la hebra codificadora de una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y las instrucciones para su uso.

25. Un método para identificar un compuesto que se une a un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 que comprende las etapas de:

a) poner en contacto un polipéptido, o una célula que expresa un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 con un compuesto de ensayo; y

b) determinar si el polipéptido se une al compuesto de ensayo.

26. El método de la reivindicación 25, donde la unión del compuesto de ensayo al polipéptido se detecta mediante un método seleccionado del grupo formado por:

a) detección de la unión mediante detección directa de la unión compuesto de ensayo/polipéptido.

b) detección de la unión utilizando un análisis de unión competitiva;

c) detección de la unión utilizando un análisis para la transducción de la señal mediada por Tango-77.

27. Un método para identificar un compuesto que modula la actividad de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que comprende:

a) poner en contacto un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 con un compuesto de ensayo; y

b) determinar el efecto del compuesto de ensayo sobre la actividad del polipéptido para identificar de ese modo un compuesto que modula la actividad del polipéptido.

28. Un método para modular la actividad de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que comprende poner en contacto un polipéptido o una célula que expresa un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 con un anticuerpo o proteína inmunológicamente activa del mismo que se une al polipéptido a una concentración suficiente para modular la actividad del polipéptido.