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1. Technischer
Hintergrund der Erfindung
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In
den entwickelten Ländern
ist der Schlaganfall die dritthäufigste
Todesursache und der Hauptgrund für eine erworbene Körper- oder
Geistesbehinderung. Bei der vaskulären Demenz handelt es sich
nach Morbus Alzheimer um die zweithäufigste Ursache für Demenz.
CADASIL (für: „Cerebral
Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical Infarcts and Leukoencephalopathy") verursacht einen
Typ von Schlaganfall und Demenz, dessen Schlüsselmerkmale wiederkehrende
subkortikale ischämische
Ereignisse, fortschreitende vaskuläre Demenz, das Kranium und
Gesicht betreffende Lähmung,
Migräne
sowie Gemütserkrankungen
mit schwerer Depression beinhalten (Chabriat, H. Et al., (1995)
Lancet 346: 934–939).
Diese Symptome treten üblicherweise
zuerst im Alter von etwa 45 Jahren auf, und Patienten sterben typischerweise
vor Erreichen des 65. Lebensjahrs. Es wird vermutet, daß das Leiden
weitgehend nicht diagnostiziert wird, weswegen die Prävalenz nicht
genau bekannt ist.
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CADASIL
ist mit diffusen Abnormalitäten
der weißen
Materie bei der Neuroimaging-Technik [bildliche Darstellung von
Nervenstrukturen und -funktionen] assoziiert (Tournier-Lasserve,
E. et al., (1991) Stroke 22:1297–1302). Die pathologische Untersuchung
zeigt mehrere kleine, tiefe Hirninfarkte, eine Leukoencephalopathie
sowie eine hauptsächlich
die kleinen Hirnarterien betreffende nichtatherosklerotische, nichtamyloide Angiopathie
auf (Baudrimont, M. et al., (1993) Stroke 24: 122–125). Bei
der Ultrastrukturanalyse sind starke Veränderungen der vaskulären glatten
Muskelzellen zu sehen (Ruchoux, M. M, et al., (1995) Acta. Neuropathol.
89:500–512).
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Es
konnte kürzlich
gezeigt werden, daß das
menschliche Notch3-Gen, das auf Chromosom 19 lokalisiert ist, in
CADASIL-Patienten mutiert ist (Joutel. A. et al., (1996) Nature
383: 707–710).
Die meisten dieser Mutationen führen
zu Aminosäureaustauschen
in der extrazellulären
Domäne.
Daher scheint die Unterbrechung des Notch-Signalisierungswegs für CADASIL-Schlaganfall
und -Demenz verantwortlich zu sein.
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Defekte
im Notch-Signalisierungsweg können
auch an anderen neurologischen Erkrankungen, beispielsweise Morbus
Alzheimer, beteiligt sein. Tatsächlich
sind ungefähr
10% der Fälle
von Morbus Alzheimer mit Mutationen in die Amyloidvorläuferproteine
Präsenilin
1 (PS1) und Präsenilin
2 (PS2) codierenden Genen assoziiert. Etwa 25% der früh auftretenden
familiären
Alzheimer-Fälle
sind mit einer Mutation in PS1 assoziiert. Bei PS1 und PS2 handelt
es sich um Transmembranproteine, die zu dem vom Gen sel-12 codierten
Protein aus C. elegans, von dem gezeigt werden konnte, daß es mit
dem Gen lin-12 aus C. elegans, das einen Rezeptor der Notch-Familie
codiert, genetisch verknüpft
ist (Levitan, D. und I. Greenwald (1995) Nature 377:351–354), homolog
sind; PS1 und PS2 sind ferner in der PCT-Anmeldung WO 96/34099 beschrieben; Sel12
ist ferner in der PCT-Anmeldung WO 97/11956 beschrieben). Weiterhin
führt eine
gezielte Unterbrechung von PS1 in Mäusen zu einer reduzierten Expression
der Notch1 codierenden mRNA und des Delta-ähnlichen Gen 1 (Dll1), einem
Notch-Liganden in Vertebraten, im präsomitischen Mesoderm im Vergleich
zu Kontrollmäusen
(Wong et al. (1997) Nature 387–288).
Dies deutet darauf hin, daß PS1
für die
räumlich-zeitliche Expression
von am Notch-Signalisierungsweg beteiligten Genen benötigt wird.
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Der
Notch-Signalisierungsweg umfaßt
Notch-Proteine, bei denen es sich um Membranproteine handelt, sowie
mit Notch-Proteinen wechselwirkende Proteine, die als Delta-Proteine
bezeichnet werden. Das als Ligand wirkende Produkt des Delta-Gens
und das als Rezeptor wirkende Produkt des Notch-Gens sind Schlüsselkomponenten
in einem Signalisierungsweg der lateralen Hemmung, der die detaillierte
Strukturierung für unterschiedliche
Gewebe in Drosophila reguliert (Vassin, H., et al., (1987) EMBO
J 6:3431–3440;
Kopczynski, C. et al., (1988) Genes Dev. 2:1723–1735; Fehon, R.G. et al.,
(1990) Cell 61:523–534;
Artavanis-Tsakonas,
S. et al., (1991) Trends, Genet. Sci. 7:403–407; Heitzler, P. et al.,
(1991) Cell 64: 1083–1092;
Greenwald, I. et al., (1992) Cell 68: 271–281; Fortini, M. et al., (1993)
Cell 75: 1245–1247;
und Muskavitch, M. (1994) Devl. Biol. 166:415–430). Insbesondere während der
Neurogenese hindern neurale Vorläufer
durch Expression von Delta benachbarte, Notch exprimiertende Zellen
daran, auf eine neurale Bestimmung festgelegt zu werden. Zu einem
Versagen der lateralen Hemmung führende
Mutationen verursachen eine Überproduktion
an Neuronen, was zu einem Phänotyp
mit der Bezeichnung „neurogener
Phänotyp" in Drosophila führt. So
führt beispielsweise
der Verlust von Notch1 zu Somitdefekten und embryonalem Tod in Mäusen, wohingegen
konstitutiv aktive mutante Formen von Notch1 die Zelldifferenzierung
bei Xenopus- und bei kultivierten Säugerzellen zu hemmen scheinen
(Swiatek et al. (1994) Genes Dev. 8:707; Conlon et al. (1995) J.
Development 121:1533; Lopan et al. (1994) Development 120:2385;
und Nye et al. (1994) Development 120:2421). In ähnlicher Weise führt eine
reduzierte Aktivität
von X-Delta1 dazu, daß mehr
Zellen zu primären
Neuronen werden, wohingegen eine erhöhte Aktivität dazu führt, daß weniger Zellen zu primären Neuronen
werden (Chitnis et al. (1995) Nature 375:761). Weiterhin führt der
Verlust der Dll1-Funktion in Mäusen
zu übermäßiger neuronaler
Differenzierung, wodurch schwere Strukturierungsdefekte im paraxialen
Mesoderm sowie ein hyperplastisches zentrales Nervensystem (ZNS)
entstehen (Hrabe de Angelis et al. (1997) Nature 386:717). Somit
wird durch den Notch-Signalisierungsweg, insbesondere durch Delta-Proteine,
während
der Neurogenese laterale Hemmung vermittelt, so daß nur ein
begrenzter Anteil an Zellen mit dem Potential, zu Neuronen zu werden,
tatsächlich zu
Neuronen ausdifferenziert.
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Bei
der Notch-Proteinfamilie handelt es sich um Transmembranrezeptoren,
die mehrere konservierte Peptidmotive enthalten. Die extrazellulären Domänen enthalten
viele in Tandemform wiederholte Kopien eines EGF (Epidermal Growth
Factor)-ähnlichen
Motivs. Die intrazellulären
Domänen
enthalten sechs Kopien eines weiteren konservierten Motivs mit der
Bezeichnung Cdc10/Ankyrin-Wiederholung. Sowohl die EDF- als auch die
Ankyrin-Wiederholungsmotive finden sich in vielen unterschiedlichen
Proteinen, und es konnte zumindest in einigen Fällen gezeigt werden, daß sie an
Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind.
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Das
Drosophila-Notch-Protein codiert einen glycosylierten Transmembranrezeptor
mit einem Molekulargewicht von 350 KD, der an der Bestimmung des
Zellschicksals während
der Entwicklung beteiligt ist (Wharton, K.A. et al., (1985) Cell
43:567–581);
Artavanis-Tsakonas, S. et al., (1995) Science 268: 225–232). Auf Grundlage
der Analyse von Drosophila-Mutanten wird angenommen, daß es sich
bei Notch um einen Rezeptor mit unterschiedlichen funktionellen
Domänen
handelt, wobei die intrazelluläre
Domäne
die intrinsische Signaltransduktionsaktivität des intakten Proteins und
die extrazelluläre
Domäne
eine Regulationsaktivität
aufweist (Rebay, I. et al., (1993) Cell 74: 319–329).
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In
Vertebraten konnten mehrere Notch-Homologe identifiziert werden
(Larsson, C., et al., (1994) Genomics 24: 253–258). Beim Menschen wurden
drei Notch-Proteine (Notch1, auch TAN1 genannt, Notch2 und Notch3)
charakterisiert (Ellisen, L.W. et al., (1991) Cell 66:649–661; Stifani,
S. et al., (1992) Nature Genet. 2: 119–127). Notch1-Gentranslokationen
wurden mit einem kleineren Teil der T-Zellen-Lymphoblastenleukämien assoziiert
(Aster, J. (1994) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 59:125–136), und
Notch3 wurde mit CADASIL in Verbindung gebracht.
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Ein
mit Notch wechselwirkendes Protein wurde zuerst in Drosophila entdeckt
und Delta-Protein genannt. Dieses Protein codiert einen Transmembranproteinliganden,
dessen extrazelluläre
Domäne
Tandem-Anordnungen
von EGF-ähnlichen
Wiederholungen enthält.
Die Delta- und Notch-Proteine können
direkt aneinander binden, wobei spezifische EGF-ähnliche
Wiederholungen für
diese Bindung hinreichend und notwendig sind (Fehon, R.G. et al.,
(1990) Cell 61:523–534;
Rebay I., et al., (1991) Cell 67:687–699; und Lieber, T., et al.,
(1992) Neuron 9: 847–859).
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Neben
dem Drosophila-Delta-Protein wurden ein Delta-Homolog aus Huhn,
das C-Delta-Protein (Henrique, D. et al., (1995) Nature 375: 787–790 und
GenBank Accession No. U26590), zwei Xenopus-Homologe, X-Delta-1
und X-Delta-2 (Chitnis,
A. et al., (1995) Nature 375:761–766 und GenBank Accession
Nos. L42229 und U70843), ein Maus-Homolog (GenBank Accession No.
X80903), ein menschliches deltaähnliches
Gen 1(Dlk) (Bettenhausen, B. et al., (1995) Development 121:2407–2418),
ein Ratte-Homolog (GenBank Accession No. U78889) sowie ein Zebrafisch-Homolog
(GenBank Accession No. Y11760) identifiziert. Die Delta-Gene aus
Xenopus, Huhn und Maus sind auch in der internationalen Patentanmeldung
Nr. PCT/US96/11178 (Veröffentlichungsnr.
WO 97/01571) offenbart. Ebenso offenbart die Patentanmeldung ein
partielles und fehlerhaftes menschliches Delta-Homolog (hDl). Nukleotidsequenzen menschlicher
Notch-Gene sind aus der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US92/03651
(Veröffentlichungsnr.
WO 92/19734) sowie der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US93/09338
(Veröffentlichungsnr.
WO 94/07474) bekannt.
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Therapeutika,
die den Delta/Notch-Signalisierungsweg modulieren (agonisieren oder
antagonisieren), würden
sich zur Vorbeugung und Behandlung verschiedener Krankheiten und
Störungen,
einschließlich neurologischer
und vaskulärer
Störungen,
eignen. Darüber
hinaus können
durch Mutationen in Delta-Genen, die mit der Existenz einer oder
einer Prädisposition
für die
Entwicklung einer Krankheit korrelieren, geeignete Diagnostika bereitgestellt
werden.
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2. Kurze Beschreibung
der Erfindung
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In
einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes
Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus:
- a) einem Nukleinsäuremolekül, das eine
Nukleotidsequenz umfaßt,
welche zu wenigstens 75% mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:1
oder SEQ ID NO:3, der cDNA-Insertion des bei der ATCC als Accession Number
98348 hinterlegten Plasmids, oder einem Komplement davon identisch
ist;
- b) einem Nukleinsäuremolekül, das eine
Nukleotidsequenz umfaßt,
welche zu wenigstens 85% mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:1
oder SEQ ID NO:3, der cDNA-Insertion des bei der ATCC als Accession Number
98348 hinterlegten Plasmids, oder einem Komplement davon identisch
ist;
- c) einem Nukleinsäuremolekül, das eine
Nukleotidsequenz umfaßt,
welche zu wenigstens 95% mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:1
oder SEQ ID NO:3, der cDNA-Insertion des bei der ATCC als Accession Number
98348 hinterlegten Plasmids, oder einem Komplement davon identisch
ist;
- d) einem Nukleinsäuremolekül, das ein
Fragment von wenigstens 150 Nukleotiden der Nukleotidsequenz der
SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:3, der cDNA-Insertion des bei der ATCC
als Accession Number 98348 hinterlegten Plasmids, oder eines Komplements
davon umfaßt;
- e) einem Nukleinsäuremolekül, das die
Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 oder der cDNA-Insertion
des bei der ATCC als Accession Number 98348 hinterlegten Plasmids,
oder ein Komplement davon umfaßt;
- f) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid
codiert, welches die Aminosäuresequenz
der SEQ ID NO:2 oder eine von der cDNA-Insertion des bei der ATCC als Accession
Number 98348 hinterlegten Plasmids codierte Aminosäuresequenz
umfaßt;
und
- g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Fragment
eines Polypeptids codiert, welches die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:2
oder die Aminosäuresequenz
des von der cDNA-Insertion des bei der ATCC unter der Zugangsnummer
98348 hinterlegten Plasmids codierten Polypeptids umfaßt, wobei
das Fragment wenigstens 50 zusammenhängende Aminosäuren der
SEQ ID NO:2 oder des von der cDNA-Insertion des bei der ATCC als
Accession Number 98348 hinterlegten Plasmids codierten Polypeptids
umfaßt,
bereitgestellt.
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Die
Erfindung beruht zumindest teilweise auf der Entdeckung eines menschlichen
Gens, das für
ein neues Delta-Protein codiert, das sich wesentlich von den bereits
beschriebenen Delta-Proteinen unterscheidet. Entsprechenderweise
wird das erfindungsgemäße neue
Delta-Protein hier mit Delta3 bezeichnet. Somit sind Delta3-Proteine
sowie für
Delta3-Proteine
codierende Nukleinsäuren
Gegenstand der Erfindung. Ein beispielhaftes hDelta3 ist in einem
Plasmid enthalten, das bei der American Type Culture Collection
(ATCC) am 5. März
1997 hinterlegt wurde und der die ATCC Zugangsnummer 98348 zugeordnet
wurde.
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Auf
Grundlage einer Northern-Blot-Analyse von aus einer Anzahl menschlicher
Gewebe präparierter RNA
wurde eine 3,5 kb große „Message" in fötalem Hirn,
fötaler
Lunge, Leber und Niere, sowie in adultem Herz, adulter Plazenta,
Lunge, adultem Skelettmuskel, adulter Niere, Bauchspeicheldrüse, Milz,
adultem Thymus, adulter Prostata, adultem Hoden, Eierstock, Dünndarm und
Dickdarm exprimiert. Darüber
hinaus stellte sich heraus, daß das
hDelta3-Gen in wenigstens einigen Tumorzellen (z.B. Kolonkarzinom)
auf relativ hohem Niveau exprimiert wurde, und seine Expression
ließ sich
als Reaktion auf verschiedene Wachstumsfaktoren (z.B. bFGF und VEGF)
herauf regulieren. Es konnte weiterhin ebenso gezeigt werden, daß die Expression
von hDelta3 als Reaktion auf eine signalinduzierte Differenzierung
von Endothelzellen erhöht
war, was auf eine Rolle für
hDelta3 bei der Modulation des Wachstums und/oder der Differenzierung
von Zellen, insbesondere Endothelzellen, hinweist.
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Wie
hier beschrieben, wurde das hDelta3-Gen auf dem menschlichen Chromosom
15 in der Nähe
der Grundgerüstmarker
D15S1244 und D15S144, einem chromosomalen Bereich, der mit der neurologischen
Erkrankung ACCPN (Agenesis of the Corpus Callosum with Peripheral
Neuropathy) assoziiert worden ist (Casaubon et al. (1996) Am. J.
Hum. Genet. 58:28), lokalisiert.
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In
einem Aspekt betrifft die Erfindung isolierte Delta3-Nukleinsäuremoleküle, beispielsweise
menschliche Delta3-Nukleinsäuren.
Dabei können
die offenbarten Moleküle
nichtcodierend sein (z.B. Sonden-, Antisense- oder Ribozymmoleküle) oder
für ein
funktionelles Delta3-Polypeptid,
beispielsweise ein Polypeptid, das wenigstens eine Bioaktivität eines
Delta3-Polypeptids modulieren kann, codieren. In einer Ausführungsform können die
Nukleinsäuremoleküle an das
in dem Plasmid mit ATCC Accession No. 98348 enthaltene Delta3-Gen
hybridisieren. In einer weiteren Ausführungsform ist die beanspruchte
Nukleinsäure
dazu in der Lage, an die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 und/oder SEQ
ID NO: 3 oder an das Komplement davon zu hybridisieren. In einer
bevorzugten Ausführungsform
wird die Hybridisierung unter schwach stringenten oder stringenten
Bedingungen durchgeführt.
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In
weiteren Ausführungsformen
handelt es sich bei dem Nukleinsäuremolekül um eine
Delta3-Nukleinsäure,
die in ihrer Sequenz wenigstens etwa 50%, 60%, 70%, vorzugsweise
80%, stärker
bevorzugt 85% und noch stärker
bevorzugt wenigstens etwa 95%, homolog zu den als SEQ ID Nos: 1
und/oder 3 dargestellten Nukleinsäuren oder zu dem Komplement
der als SEQ ID Nos: 1 und/oder 3 dargestellten Nukleinsäuren homolog
ist. In einer weiteren Ausführungsform
codiert das Nukleinsäuremolekül für ein Polypeptid,
das in seiner Sequenz wenigstens etwa 50%, 60%, 70%, vorzugsweise
80%, stärker
bevorzugt 85% und noch stärker
bevorzugt wenigstens etwa 90 oder 95%, ähnlich oder identisch zu dem
in SEQ ID No. 2 dargestellten Polypeptid ist. In einer weiteren
Ausführungsform
handelt es sich bei dem Nukleinsäuremolekül um eine
Nukleinsäure,
die in ihrer Sequenz wenigstens etwa 70%, vorzugsweise 80%, stärker bevorzugt
85% und noch stärker
bevorzugt wenigstens etwa 90% oder 95%, ähnlich zu dem im Plasmid mit
ATCC Accession Number 98348 enthaltenen hDelta3-Gen ist.
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Bevorzugte
erfindungsgemäße Nukleinsäuren umfassen
eine Nukleotidsequenz, die für
wenigstens eine Domäne
oder ein Motiv eines Delta3-Proteins, d.h. eine Domäne bzw.
ein Motiv, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus einem Signalpeptid, einer DSL (Delta
Similarity)-Domäne, einer
EGF (Epidermal Growth Factor)-ähnlichen
Wiederholung 1, EGF-ähnlichen
Wiederholung 2, EGF-ähnlichen
Wiederholung 3, EGF-ähnlichen
Wiederholung 4, EGF-ähnlichen
Wiederholung 5, EGF-ähnlichen Wiederholung
6, EGF-ähnlichen
Wiederholung 7 und EGF-ähnlichen
Wiederholung 8, einer Transmembrandomäne (TM) sowie einer zytoplasmatischen
Domäne,
codiert. Weitere bevorzugte Nukleinsäuren codieren für lösliche Delta3-Proteine, beispielsweise
Delta3-Proteine, die wenigstens einen Anteil der extrazellulären Domäne eines
Delta3-Proteins umfassen.
Diese löslichen
Polypeptide können
gegebenenfalls ein Signalpeptid umfassen. Noch stärker bevorzugte
Nukleinsäuren
codieren für
lösliche
Fusionsproteine, die Delta3-Proteine sowie ein heterologes Peptid,
beispielsweise einen konstanten Immunglobulinbereich, umfassen.
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Gegenstand
der Erfindung sind ebenso Sonden und Primer, die weitgehend gereinigte
Oligonukleotide umfassen, welche einem Nukleotidsequenzbereich,
der an wenigstens etwa 6 aufeinanderfolgende Nukleotide der Sequenzen
gemäß SEQ ID
Nos: 1 oder 3 oder von Komplementen der Sequenzen gemäß SEQ ID
Nos 1 oder 3 hybridisiert, oder natürlich vorkommenden Mutanten
davon entsprechen. In bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die
Sonde/der Primer ferner eine daran gegebundene Markierungsgruppe,
die nachgewiesen werden kann.
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Zur
Expression können
die betreffenden Delta3-Nukleinsäuren
eine Transkriptionsregulationssequenz, beispielsweise mindestens
einen Transkriptionspromotor (z.B. zur konstitutiven Expression
oder induzierbaren Expression) oder eine Transkriptionsenhancersequenz,
beinhalten, wobei die Regulationssequenz mit der Delta3-Gensequenz
operativ verknüpft
ist. Solche Regulationssequenzen können in Verbindung mit Delta3-Nukleinsäuremolekülen in Vektoren
zur Genexpression geeignet sein. Ebenso beschreibt die vorliegende
Erfindung mit den Expressionsvektoren transfizierte Wirtszellen,
die entweder prokaryontisch oder eukaryontisch sein können, sowie
In-vitro-Verfahren (z.B. Zellkultur) und In-vivo-Verfahren (z.B.
Transgenverfahren) zur Produktion von Delta3-Proteinen unter Einsatz
der Expressionsvektoren.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung isolierte Delta3-Polypeptide, vorzugsweise
weitgehend reine Präparationen,
beispielsweise von plasmagereinigten oder rekombinant hergestellten
Delta3-Polypeptiden.
In bevorzugten Ausführungsformen
sind die betreffenden Polypeptide in der Lage, eine Aktivität eines Delta3-Polypeptids,
beispielsweise Zellwachstum und/oder -differenzierung oder Apoptoseinduktion,
zu modulieren. In bevorzugten Ausführungsformen können die
betreffenden Delta3-Polypeptide die Neurogenese modulieren (z.B.
indem sie Notch exprimierende Zellen daran hindern, auf eine neurale
Bestimmung festgelegt zu werden). Darüber hinaus werden hier auch
spezifisch Delta3-Polypeptide bereitgestellt, die die Aktivität eines
nativen Delta3-Polypeptids spezifisch antagonisieren, so wie es
beispielsweise durch Verkürzungsmutanten
oder andere dominant-negative Mutanten bewerkstelligt werden kann.
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In
einer Ausführungsform
ist das Polypeptid identisch oder weitgehend ähnlich zu einem in SEQ ID No.
2 dargestellten Delta3-Protein. Vorzugsweise weist ein Delta3-Polypeptid
eine Aminosäuresequenz
auf, die wenigstens etwa 50%, 60%, 70%, vorzugsweise wenigstens
etwa 80%, stärker
bevorzugt wenigstens etwa 90% und noch stärker bevorzugt wenigstens etwa
95%, homolog oder identisch zu dem von SEQ ID No. 2 dargestellten
Polypeptid ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Delta3-Polypeptid von einer
Nukleinsäure
codiert, die mit einer in einer der SEQ ID Nos. 1 oder 3 dargestellten
Nukleinsäuresequenz
oder mit der im Plasmid mit ATCC Accession No. 98348 enthaltenen
Nukleinsäure
hybridisiert. Die betreffenden Delta3-Proteine enthalten ebenso
modifizierte Proteine, die gegenüber
posttranslationaler Modifikation resistent sind, wie beispielsweise
aufgrund von Mutationen, die Modifikationsstellen (wie z.B. Tyrosin-,
Threonin-, Serin- oder Asparaginreste) verändern oder die die Glycosylierung
des Proteins verhindern oder die die Wechselwirkung des Proteins
mit an der Signaltransduktion beteiligten intrazellulären Proteinen
verhindern.
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Das
Delta3-Polypeptid kann ein Vollängenprotein
umfassen, wie es beispielsweise in der SEQ ID No. 2 dargestellt
ist, oder es kann ein einem oder mehreren bestimmten Motiven bzw.
einer oder mehreren Domänen
oder willkürlichen
Größen, beispielsweise
mit einer Länge
von wenigstens 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400,
450, 500, 550, 600 oder 650 Aminosäuren, entsprechendes Fragment
umfassen.
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Ein
weiterer erfindungsgemäßer Aspekt
betrifft chimäre
Moleküle
(z.B. Fusionsproteine), die ein Delta3-Protein umfassen. So kann
beispielsweise das Delta3-Protein als ein rekombinantes Fusionsprotein bereitgestellt
werden, das einen zweiten Polypeptidanteil, beispielsweise ein zweites
Polypeptid mit einer nicht mit dem Delta3-Polypeptid verwandten (heterologen)
Aminosäuresequenz,
beinhaltet (beispielsweise handelt es sich bei dem zweiten Polypeptidanteil
um Glutathion-S-Transferase, eine enzymatische Aktivität, wie z.B. alkalische
Phosphatase, oder ein Epitop-Tag).
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Als
Fusionsproteine sind Delta3-Immunglobulin (Delta3-Ig)-Fusionsproteine bevorzugt.
So kann beispielsweise ein Delta3-Fusionsprotein den extrazellulären Anteil
eines an den konstanten Bereich eines Immunglobulinmoleküls fusionierten
Delta3-Proteins umfassen. Bevorzugte extrazelluläre Anteile umfassen wenigstens
eine Domäne,
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus einem Signalpeptid, einer DSL-Domäne sowie
den acht AGF-ähnlichen
Wiederholungen eines Delta3-Proteins. Eine noch stärker bevorzugte
extrazelluläre
Domäne
umfaßt
eine Aminosäuresequenz
von etwa Aminosäure
1 bis etwa Aminosäure
529 der SEQ ID No. 2. Noch weitere bevorzugte Delta3-Fusionsproteine
umfassen einen Anteil eines Delta3-Proteins, der zur Bindung an
ein zweites Protein, z.B. ein Notch-Protein, ausreicht.
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Noch
ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein ein
Delta3-Polypeptid umfassendes Immunogen in einer immunogenen Präparation,
wobei das Immunogen dazu in der Lage ist, eine für ein Delta3-Polypeptid spezifische
Immunantwort, beispielsweise eine humorale Antwort, eine Antikörperantwort und/oder
eine zelluläre
Antwort, auszulösen.
In bevorzugten Ausführungsformen
umfaßt
das Immunogen eine antigene Determinante, beispielsweise eine einzigartige
Determinante, aus dem von SEQ ID No. 2 dargestellten Protein.
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Ein
noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Antikörper und
Antikörperpräparationen, die
spezifisch mit einem Epitop des Delta3-Proteins reaktiv sind. In bevorzugten
Ausführungsformen
bindet der Antikörper
spezifisch an ein in SEQ ID No: 2 dargestelltes Epitop.
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In
noch einem weiteren Aspekt sind Tests, beispielsweise zum Screening
von Testverbindungen zur Identifizierung von Agonisten, oder als
Alternative Antagonisten, einer Bioaktivität Gegenstand der Erfindung. So
kann die Testverbindung beispielsweise auf positive oder negative
Weise eine Wechselwirkung zwischen einem Delta3-Protein und einem Delta3-Zielmolekül, beispielsweise
einem Notch-Protein, beeinflussen. Ein beispielhaftes Verfahren
beinhaltet die Schritte der (i) Kombination eines Delta3-Polypeptids
oder bioaktiven Fragments davon, eines Delta3-Zielmoleküls, z.B. Notch, und einer Testverbindung
beispielsweise unter Bedingungen, bei denen ohne die Testverbindung
das Delta3-Protein und das Zielmolekül eine Wechselwirkung eingehen
können,
und des (ii) Nachweises der Ausbildung eines Komplexes, der das
Delta3-Protein sowie das Zielmolekül enthält, indem entweder der Komplex
direkt quantifiziert wird, induktive Effekte des Delta3-Proteins
gemessen werden oder im Falle eines Substrats die Umwandlung in
Produkt gemessen wird. Eine statistisch signifikante Änderung,
wie beispielsweise eine Abnahme, der Wechselwirkung des Delta3 und
des Zielmoleküls
in Gegenwart einer Testverbindung (gegenüber dem, was in Abwesenheit
der Testverbindung nachgewiesen wird) deutet auf eine Modulation
(z.B. Suppression oder Potenzierung der Wechselwirkung zwischen dem
Delta3-Protein und dem Zielmolekül)
hin.
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Gegenstand
der Erfindung sind noch weitere Verfahren zur Identifizierung von
Verbindungen, die eine Delta-Aktivität modulieren. So läßt sich
beispielsweise eine mit einem Delta3-Protein wechselwirkende Verbindung
identifizieren, indem ein Delta3-Protein mit einer Testverbindung
in Kontakt gebracht wird. Dabei kann entweder die Testverbindung
oder das Delta3-Protein markiert und/oder gegebenenfalls an einen
Festphasenträger
gebunden werden. Die Bindung der Testverbindung an das Delta3-Protein
läßt sich
dann bestimmen, indem beispielsweise die Menge an Markierung gemessen
wird. Bei einem solchen Delta3-bindenden Molekül kann es sich um einen Agonisten
oder einen Antagonisten handeln. In einer Ausführungsform wird ein Agonist einer
Delta3-Aktivität
identifiziert, indem eine ein Delta3-Protein enthaltende Zelle mit
einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird und man eine Delta3-Aktivität, beispielsweise
die Expression eines Gens, das durch die Bindung eines Proteins,
z.B. eines Notch-Proteins, an Delta3 reguliert wird, mißt. Eine
erhöhte
Expression des Gens bei Inkubation der Zelle mit der Testverbindung
gegenüber
der Inkubation in Abwesenheit der Testverbindung deutet darauf hin,
daß es
sich bei der Testverbindung um einen Delta3-Agonisten handelt. Bei
dem beobachteten Gen kann es sich auch um ein in eine Zelle transfiziertes
Reportergen handeln, wobei das Reportergen unter der Kontrolle eines
Promotors eines von Delta3 regulierten Gens steht.
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Noch
ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren
zur Behandlung von Krankheiten oder Leiden, die durch eine anomale
Delta3-Aktivität
verursacht werden oder an denen eine solche anomale Delta3-Aktivität beteiligt
ist, beispielsweise anomale Zellproliferation, -degeneration oder
-differenzierung in einer Untersuchungsperson, indem der Untersuchungsperson
eine wirksame Menge eines Agonisten oder Antagonisten einer Delta3-Bioaktivität verabreicht
wird. In einer Ausführungsform
kann ein Agonist oder Antagonist Delta3-Proteinniveaus modulieren, indem beispielsweise
die Expression eines Delta3-Gens moduliert wird. So kann beispielsweise
die Verabreichung eines einen Delta3-Agonisten umfassenden Therapeutikums für die Förderung
der Geweberegeneration oder -reparatur, die zur wirksamen Behandlung
einer Nervenverletzung, einer neurogenerativen Erkrankung oder einer
Neuroentwicklungsstörung
benötigt
wird, nützlich
sein. Als Alternative kann ein Delta3-Antagonist zur wirksamen Behandlung
einer neoplastischen oder hyperplastischen Erkrankung, insbesondere
von Endothelgewebe, verabreicht werden.
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Gegenstand
der Erfindung sind ebenso Verfahren zur Behandlung von Krankheiten
oder Leiden, die mit einem oder mehreren spezifischen Delta-Allelen, beispielsweise
mutanten Allelen, assoziiert sind, wobei man der Untersuchungsperson
eine wirksame Menge einer therapeutischen Verbindung verabreicht.
Dabei ist in einer Ausführungsform
die therapeutische Verbindung in der Lage, die Wirkung des spezifischen
Delta-Allels auszugleichen. In einer weiteren Ausführungsform
ist die therapeutische Verbindung zur Modulation einer Delta3-Aktivität in der
Lage. In einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei dem Delta-Allel um ein Delta3-Allel.
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In
einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren
zur Bestimmung, ob für
eine Untersuchungsperson die Gefahr der Entwicklung einer Krankheit
oder eines Leidens, die bzw. das von einer anomalen Delta3-Aktivität verursacht
wird oder an der bzw. dem eine anomale Delta3-Aktivität beteiligt
ist, beispielsweise anomale Zellproliferation, -degeneration oder
-differenzierung, besteht, bereitgestellt. Bei dem Verfahren wird
in einem Gewebe der Untersuchungsperson das Vorhandensein oder die
Abwesenheit einer genetischen Läsion,
die durch mindestens eine (i) Mutation eines für ein Delta3-Protein codierenden
Gens, dargestellt beispielsweise in einer der SEQ ID Nos: 1 oder
3, oder eines Homologs davon oder (ii) Fehlexpression eines Delta3-Gens
gekennzeichnet ist, nachgewiesen. In bevorzugten Ausführungsformen
wird beim Nachweis der genetischen Läsion die Existenz mindestens
eines der folgenden ermittelt: einer Deletion eines oder mehrerer
Nukleotide aus einem Delta3-Gen; einer Addition eines oder mehrerer
Nukleotide zu dem Gen, einer Substitution eines oder mehrerer Nukleotide
des Gens, einer groben chromosomalen Umordnung des Gens, einer Veränderung
des Niveaus eines Messenger-RNA-Transkripts des Gens, dem Vorhandensein
eines Nicht-Wildtyp-Spleißmusters
eines Messenger-RNA-Transkripts
des Gens und/oder eines Nicht-Wildtyp-Niveaus des Proteins.
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So
kann der Nachweis der genetischen Läsion oder die Bestimmung der
Identität
eines Delta-Allels, z.B. eines Delta3-Allels, beispielsweise (i)
das Bereitstellen einer Sonde bzw. eines Primers, die bzw. der ein Oligonukleotid
umfaßt,
das an eine Sense- oder Antisense-Sequenz eines Delta3-Gens oder
natürlich
vorkommende Mutanten davon oder natürlicherweise mit dem Delta3-Gen
assoziierte 5'-
oder 3'-flankierende
Sequenzen hybridisiert; (ii) das Inkontaktbringen der Sonde bzw.
des Primers mit einer entsprechenden nukleinsäurehaltigen Probe; und (iii)
den Nachweis des Vorhandenseins oder der Abwesenheit der genetischen
Läsion
mittels Hybridisierung der Sonde bzw. des Primers an die Nukleinsäure, wobei
man beispielsweise beim Nachweis der Läsion die Sonde bzw. den Primer
nutzt, um die Nukleotidsequenz des Delta3-Gens und gegebenenfalls
der flankierenden Nukleinsäuresequenzen
zu bestimmen, beinhalten. So läßt sich
der Primer beispielsweise in einer Polymerasekettenreaktion (PCR)
oder in einer Ligationskettenreaktion (LCR) einsetzen und das Amplifikationsprodukt
auf das Vorhandensein einer Läsion
analysieren.
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In
einem weiteren erfindungsgemäßen diagnostischen
Verfahren wird wenigstens ein Anteil eines Delta3-Gens einer Untersuchungsperson
sequenziert und die Nukleotidsequenz mit der eines Wildtyp-Delta3-Gens
verglichen, um das Vorhandensein einer genetischen Läsion zu
bestimmen. Ein weiteres bevorzugtes erfindungsgemäßes diagnostisches
Verfahren ist der Einzelstrangkonformationspolymorphismus (Single
Strand Conformation Polymorphism, SSCP), mit dem Unterschiede in
der elektrophoretischen Mobilität zwischen
mutanten und Wildtyp-Nukleinsäuren
nachgewiesen werden.
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In
alternativen Ausführungsformen
umfassen die diagnostischen Verfahren das Bestimmen des Niveaus
eines Delta3-Proteins in einem Immunoassay unter Verwendung eines
Antikörpers,
der in spezifischer Weise mit einem Wildtyp- oder mutanten Delta3-Protein
eine Immunreaktion eingeht.
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Weitere
Merkmale und Vorteile der Erfindung sind aus der folgenden ausführlichen
Beschreibung sowie den Ansprüchen
ersichtlich.
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3. Kurze Beschreibung
der Figuren
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In 1 ist eine DNA-Sequenz des menschlichen
Delta3-Gens, einschließlich
5'- und 3'-nichtcodierender
Sequenzen (SEQ ID No 1) ebenso wie die abgeleitete Aminosäuresequenz
des menschlichen Delta3-Proteins
(SEQ ID No 2) gezeigt. Dabei sind die verschiedenen Domänen des
Proteins angedeutet.
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In 2 ist eine mehrere Sequenzen umfassende
Anordnung des neuen menschlichen Delta3-Proteins (h-delta3)(SEQ
ID No 2) mit dem Maus-Deltal-Protein
(m-delta1)(SEQ ID No 4), dem Ratte-Delta1-Protein (r-delta1)(SEQ ID No
5), dem menschlichen Delta1-Teilprotein (WO 97/01571)(SEQ ID No
6), dem Xenopus-Delta1-Protein (x-delta1)(SEQ ID No 7), dem Huhn-Delta1-Protein
(c-delta1)(SEQ ID No 8), dem Zebrafisch-Delta1-Protein (z-delta1)(SEQ ID No
9), dem Xenopus-Delta2-Protein (x-delta2)(SEQ ID No 10) und dem Drosophila-Delta1-Protein
(d-delta1)(SEQ ID No 11) gezeigt. Die Konservierung der DSL (Delta3
Similarity)-Domäne,
der EGF (Epidermal Growth Factor-like)-Wiederholungen sowie der
Transmembrandomäne
(TM) ist angedeutet. Für
jedes dieser Delta-Proteine (mit Ausnahme der menschlichen Teilsequenz,
die nicht in GenBank vorhanden ist) ist die GenBank Accession No.
in Tabelle I angegeben.
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In 3 ist
ein phylogenetischer Stammbaum gezeigt, der die Verwandtschaft von
hDelta3 mit dem menschlichen Delta1-Teilprotein (WO 97/01571), dem
Maus-Delta1-Protein (m-delta1), dem Ratte-Delta1-Protein (r-delta1),
dem Xenopus-Delta1-Protein (x-delta1), dem Huhn-Delta1-Protein (c-delta1),
dem Xenopus-Delta2-Protein (x-delta2), dem Zebrafisch-Delta1-Protein
(z-delta1) und dem Drosophila-Delta1-Protein (d-delta1) angibt.
Für jedes
dieser Delta-Proteine (mit Ausnahme der menschlichen Teilsequenz,
die nicht in GenBank vorhanden ist) ist die GenBank Accession No.
in Tabelle I angegeben.
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4. Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
-
Allgemeine
Bemerkungen
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Die
vorliegende Erfindung beruht zumindest teilweise auf der Entdeckung
eines neuen Gens, das für ein
menschliches Delta-Protein codiert, welches hier mit „hDelta3"-Polypeptid bezeichnet
wird. Ein beispielhaftes hDelta3 wurde bei der American Type Culture
Collection (ATCC) am 5. März
1997 hinterlegt und der ATCC Zugangsnummer 98348 zugeordnet. Die
Kartierung plaziert das menschliche Delta3-Gen auf das menschliche Chromosom
15.
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In 1 ist die DNA-Sequenz des menschlichen
Delta3-Gens, einschließlich
5'- und 3'-nichtcodierender
Sequenzen (SEQ ID No. 1), der codierenden Sequenz (SEQ ID No. 3),
ebenso wie die abgeleitete Aminosäuresequenz des menschlichen
Delta3-Proteins (SEQ ID No. 2) gezeigt.
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Menschliches
Delta3 wird in Endothelzellen exprimiert und wurde in der Tat aus
einer menschlichen mikrovaskulären
Endothelzellenbank kloniert. Eine Northern-Blot-Analyse von aus
einer Reihe unterschiedlicher menschlicher Gewebe präparierter
RNA deutet darauf hin, daß ein
3,5 kb großes
Delta3-mRNA-Transkript in fötalem
Hirn, fötaler
Lunge, Leber und Niere, sowie in adultem Herz, adulter Plazenta,
Lunge, adultem Skelettmuskel, adulter Niere, Bauchspeicheldrüse, Milz,
adultem Thymus, adulter Prostata, adultem Hoden, Eierstock, Dünndarm und
Dickdarm vorhanden ist. Niedrige Niveaus an Delta3-mRNA wurden auch
in adultem Hirn und adulter Leber nachgewiesen. Allerdings wurde
keine Delta3-mRNA in peripheren Blutleukozyten nachgewiesen. Diese
Ergebnisse deuten darauf hin, daß Delta3 auf eine gewebespezifische
Weise exprimiert wird.
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Ferner
wurde festgestellt, daß die
Expression in menschlichen MV-Endothelzellen
in Zellen, die mit bestimmten Wachstumsfaktoren (z.B. bFGF (basic
fibroblast growth factor) oder VEGF (vascular endothelial growth
factor)) stimuliert worden waren, herauf reguliert (etwa 2–3fach)
war. Darüber
hinaus wurde eine starke Expression von menschlichem Delta3 in der
Kolorektalkarzinom-Zellinie SW480 beobachtet. Weiterhin konnte gezeigt
werden, daß die
Expression von hDelta3 als Reaktion auf Proliferations- und Differenzierungssignale induziert
wird (siehe Beispiele). Somit handelt es sich bei dem hDelta3-Gen
um ein Gen, dessen Expression in einer Zelle sich mit dem Proliferations-
und/oder Differenzierungszustand ändert.
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Wie
aus der Nukleotidsequenz der hDelta3 codierenden Nukleinsäure vorhergesagt,
umfaßt
das Vollängen-hDelta3-Polypeptid
685 Aminosäuren
und ist in seiner Sequenz und Struktur von anderen Organismen erhaltenen
Delta-Proteinen ähnlich
(siehe 2 und Diskussion unten). Eine
Aminosäuresequenzanalyse
des menschlichen Delta3-Proteins sagt voraus, daß das Protein mindestens die
folgenden Strukturdomänen
umfaßt:
ein Signalpeptid, das etwa Aminosäure 1 bis Aminosäure 17 der
SEQ ID No. 2 entspricht, ein DSL (Delta Similarity)-Motiv, das etwa
Aminosäure
173 bis etwa Aminosäure
217 der SEQ ID NO: 2 entspricht (2),
acht EGF (epidermal growth factor)-ähnliche Wiederholungen, die
im wesentlichen den in 2 angegebenen
Sequenzen entsprechen, eine Transmembrandomäne, die etwa Aminosäure 530
bis etwa Aminosäure
553 der SEQ ID No. 2 (2) entspricht
sowie eine zytoplasmatische Domäne,
die etwa Aminosäure 554
bis etwa Aminosäure
685 der SEQ ID No. 2 (2) entspricht.
Entsprechenderweise wird durch die Aminosäuresequenz von hDelta3 vorhergesagt,
daß es
sich bei dem Protein um ein Transmembranprotein mit einer extrazellulären Domäne, die
etwa Aminosäure
1 oder Aminosäure
18 bis etwa Aminosäure
529 der SEQ ID No. 2 (2) entspricht
und die das DSL-Motiv sowie die EGF-ähnlichen Wiederholungen umfaßt, einer Transmembrandomäne sowie
einer zytoplasmatischen Domäne
handelt. Dabei ist es möglich,
daß das
Signalpeptid mehr als 17 Aminosäuren
der SEQ ID No. 2 umfaßt,
da der Bereich von Aminosäure
1 bis etwa Aminosäure
20 einen hydrophoben Bereich bildet.
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Möglicherweise
existieren auch lösliche
Formen des Proteins. Solche löslichen
Isoformen können durch
variables Spleißen
des Delta3-Gens oder alternativ als Ergebnis der Proteolyse einer
membranständigen
Isoform entstehen. Tatsächlich
wurde eine Spleiß-Variante
eines Delta-Proteins aus Huhn in der PCT-Anmeldung PCT/US96/11178
mit der Veröffentlichungsnr.
WO 97/01571 beschrieben. Weiterhin handelt es sich bei dem menschlichen
Delta-ähnlichen
Polypeptid Dlk um ein lösliches
Protein (Jansen et al. [1994] Eur. J. Biochem. 225:83–92).
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In
seiner Struktur und Sequenz ist das menschliche Delta3-Protein den
in Drosophila, Xenopus, Zebrafisch, Huhn, Ratte, Maus und Mensch
identifizierten Delta-Proteinen ähnlich.
Eine vergleichende Anordnung der Aminosäuresequenzen der bislang bekannten
Delta-Proteine ist in 2 gezeigt. Diese
vergleichende Anordnung enthält
die folgenden Delta-Proteine, die von Genen, deren GenBank Accession
Nos. In Tabelle I gezeigt sind, codiert werden: ein Maus-Delta1-Protein
(m-delta1), Ratte-Delta1-Protein
(r-delta1), ein menschliches Delta1-Protein (h-delta1), ein Xenopus-Delta1-Protein
(x-delta1), ein Huhn-Delta1-Protein (c-delta1), ein Zebrafisch-Delta1-Protein
(z-delta1), ein zweites Xenopus-Delta2-Protein
(x-delta2), das menschliche Delta3-Protein (h-delta3) sowie ein
Drosophila-Delta1-Protein (d-delta1). Bei der Aminosäuresequenz
von h-delta1 handelt es sich um die in der PCT-Anmeldung WO 97/01571 veröffentlichte
Aminosäuresequenz,
die unvollständig
ist und zahlreiche Fehler enthält,
wie in der Anmeldung angegeben ist. Da die vergleichende Anordnung
der Aminosäuresequenzen
unter Verwendung des Computerprogramms pileup (GCG Package) durchgeführt wurde,
spiegelt die Reihenfolge der Aminosäuresequenzen in der Figur die
Homologie zwischen den unterschiedlichen Delta-Proteinen wider.
Dementsprechend ist das Drosophila-Protein, das der untersten Sequenz
in der vergleichenden Anordnung entspricht, am weitesten von den
anderen Delta-Proteinen entfernt. Somit zeigt 2,
daß hDelta3,
das an zweitletzter Stelle in 2 aufgeführt ist,
das von den bereits identifizierten Delta-Proteinen aus Maus, Ratte,
Mensch, Xenopus, Zebrafisch und Huhn am zweitweitesten entfernte
Delta-Protein ist. Dementsprechend unterscheidet sich das hDelta3-Protein
in signifikanter Weise von dem bereits beschriebenen menschlichen
Delta-Protein ebenso wie von den Delta-Proteinen aus den anderen
Spezies. Interessanterweise weist das hDelta3-Protein eine Aminosäuresequenz
auf, die von beiden Xenopus-Proteinen, d.h. Delta1 und Delta2, gleich
weit entfernt ist, was darauf hindeutet, daß hDelta3 keinem der Xenopus-Delta-Proteine
entspricht. Daher wurde das neu isolierte Polypeptid hDelta3 genannt,
wobei die bereits identifizierten Delta-Proteine aus Maus, Ratte,
Mensch, Zebrafisch und Xenopus hier als Delta1-Proteine und die
beiden Xenopus-Proteine als Delta1- und Delta2-Proteine bezeichnet
werden. Der Unterschied zwischen dem hDelta3-Protein und bereits
isolierten Delta-Proteinen
läßt sich
auch anhand eines Vergleichs der prozentualen Homologie oder Identität zwischen
hDelta3 und den bereits identifizierten Delta1- und Delta2-Proteinen
einerseits (Tabelle I) und der prozentualen Homologie oder Identität eines
Delta1-Proteins mit den anderen Delta1- bzw. Delta2-Proteinen (Tabelle
II) veranschaulichen.
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Tabelle
I: Prozentuale Ähnlichkeit
zwischen der Aminosäuresequenz
von menschlichem Delta3 (SEQ ID No. 2) und den Sequenzen der verschiedenen
Delta-Proteine
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In
der Tabelle II sind die prozentuale Ähnlichkeit und Identität zwischen
dem in der PCT-Anmeldung PCT/US96/11178 (Veröffentlichungsnr. WO 97/01571)
offenbarten menschlichen Delta1 und nichtmenschlichen Delta1-Proteinen
angegeben. Da die Aminosäuresequenz
des in dieser PCT-Anmeldung
offenbarten menschlichen Delta1-Proteins unvollständig ist, wurde
die prozentuale Ähnlichkeit
bzw. Identität
unter Verwendung eines Anteils der menschlichen Delta1-Aminosäuresequenz,
der am zuverlässigsten
erschien, bestimmt. Der verwendete Anteil der Aminosäuresequenz
entspricht den Aminosäuren
214–370
der menschlichen Delta1-Aminosäuresequenz,
die in 14A der PCT-Anmeldung gezeigt
ist.
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Tabelle
II: Prozentuale Ähnlichkeit
zwischen menschlichem Delta1 und den verschiedenen nichtmenschlichen
Delta1- oder Delta2-Proteinen
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Entsprechenderweise
deutet Tabelle I an, daß hDelta3
nur eine Ähnlichkeit
von ungefähr
66% mit dem menschlichen Delta1-Protein, eine Ähnlichkeit von ungefähr 70% mit
dem Maus-Delta1-Protein, eine Ähnlichkeit
von ungefähr
70% mit dem Ratte-Delta1-Protein, eine Ähnlichkeit von ungefähr 68% mit
dem Huhn-Delta1-Protein, eine Ähnlichkeit
von ungefähr
68% zu dem Xenopus-Delta1-Protein, eine Ähnlichkeit von ungefähr 70% zu
dem Xenopus-Delta2-Protein und eine Ähnlichkeit von ungefähr 58% zu
dem Drosophila-Delta1-Protein aufweist. Das menschliche Delta1-Protein
weist jedoch, wie in Tabelle II gezeigt, eine sehr hohe Ähnlichkeit
zu den Delta1-Proteinen aus Maus, Ratte, Huhn, Xenopus, Zebrafisch
und Drosophila sowie zu dem Xenopus-Delta2-Protein auf. Darüber hinaus besitzen die Delta1-Proteine
aus Maus und Ratte eine Ähnlichkeit
von etwa 95%. Somit teilen die Aminosäuresequenzen der Delta1-Proteine
eine größere Homologie
miteinander als mit dem erfindungsgemäßen menschlichen Delta3-Protein,
was darauf hindeutet, daß mindestens
zwei Familien von Delta-Proteinen existieren.
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Der
Unterschied zwischen dem neu isolierten hDelta3-Protein und den
bereits identifizierten Delta1- und Delta2-Proteinen läßt sich
auch mittels Erzeugung eines phylogenetischen Stammbaums unter Verwendung
des Computerprogramms Growtree Phylogram (GCG Package) sehen. Das
Ergebnis dieser Analyse, das in 3 gezeigt
ist, deutet an, daß hDelta3
auf einem von den anderen Delta-Proteinen verschiedenen „Ast" im phylogenetischen
Stammbaum liegt, womit bestätigt
wird, daß das
hDelta3-Protein
von den anderen Delta1- und Delta2-Proteinen weiter entfernt ist
als diese voneinander entfernt sind. Gemäß der Analyse und wie durch
die vergleichende Sequenzanordnung vorhergesagt weist lediglich
das Drosophila-Delta-Protein eine weiter entfernte Verwandtschaft
mit den bereits identifizierten Delta-Proteinen aus Maus, Ratte,
Xenopus, Huhn, Zebrafisch und Mensch als hDelta3 auf. Somit handelt
es sich bei dem neu isolierten hDelta3-Protein um ein Mitglied einer
unterschiedlichen Subspezies der Familie von Delta-Proteinen.
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Ungeachtet
der Tatsache, daß jede
Tierspezies wahrscheinlich mindestens zwei oder drei Mitglieder (z.B.
Delta1, Delta2 und Delta3) aufweist, läßt sich aus 2 erkennen,
daß der
DSL-Bereich, die acht EGF-Wiederholungen
sowie die TM durchgehend hoch konserviert zu sein scheinen. Allerdings
unterscheiden sich diese Domänen
des hDelta3-Proteins,
wie in 2 ersichtlich ist, stärker von
den entsprechenden Domänen
in den anderen Delta-Proteinen als sich die entsprechenden Domänen in dem
anderen Delta voneinander unterscheiden.
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Der
DSL-Bereich bzw. das DSL-Motiv wird von allen bekannten Mitgliedern
der Familie der vermuteten Liganden Notch-ähnlicher Proteine geteilt (Delta1
und Serrate in Drosophila; Lag-2 und Apx-1 in Caenorhabditis elegans)
(Henderson et al. (1994) Development 120:2913; Tax et al. (1994)
Nature 368:150; Fleming et al. (1990) Genes Dev. 4:2188; Thomas et
al. (1991) Development 11:749; Mello et al. (1994) Cell 77:95).
Das DSL-Motiv ist im aminoterminalen Teil des Proteins lokalisiert,
der mit einer ähnlichen
Domäne
im Drosophila-Delta1-Protein eng verwandt ist und der als notwendig
und hinreichend für
die In-vitro-Bindung an Notch beschrieben wurde (Henrique et al.
(1995) Nature 375:787; Muskavitch (1994) Dev. Biol. 166:415).
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Weiterhin
wurde, wie in Beispiel 5.5 dargelegt ist, Delta3 auf dem menschlichen
Chromosom 15 in einem Bereich in der Nähe der Grundgerüstmarker
D15S1244 und D15S144 lokalisisert. Interessanterweise konnte gezeigt
werden, daß der
Bereich auf Chromosom 15, der von den Markern D15S1040 und D15S118 flankiert
wird, genetisch mit der unter dem Namen ACCPN (Agenesis of the Corpus
Callosum with Peripheral Neuropathy) bekannten Krankheit in Verbindung
steht (Casaubon et al., supra). Bislang wurde kein spezifisches
Gen mit dieser Krankheit in Verbindung gebracht.
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Dementsprechend
betreffen bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung Delta3-Proteine,
für Delta3-Proteine
codierende Nukleinsäuremoleküle, mit
Delta3-Proteinen immunreaktive Antikörper sowie Präparationen
solcher Zusammensetzungen. Darüber
hinaus werden Tests zur Entdeckung von Arzneistoffen zur Identifizierung
von Agentien, die die biologische Funktion von Delta-Proteinen,
z.B. Delta3-Proteinen, modulieren, indem sie beispielsweise an Delta3
binden oder die Wechselwirkung von Delta3 mit entweder nachgeschalteten
oder vorgeschalteten Elementen im Delta/Notch-Signaltransduktionsweg
verändern,
z.B. die Wechselwirkung zwischen Delta3 und einem Delta3 bindenden
Protein verändern,
bereitgestellt. Solche Agentien können sich therapeutisch beispielsweise
zur Veränderung
des Zellwachstums und/oder der Zelldifferenzierung oder zur Apoptoseinduktion
eignen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind zudem diagnostische und
therapeutische Tests sowie Reagentien zum Nachweis und zur Behandlung
von Störungen,
an denen eine anomale Delta3-Aktivität, beispielsweise
eine anomale Expression (oder deren Verlust) des Delta3-Gens, beteiligt
ist oder die mit einem spezifischen Delta-Allel, z.B. einem Delta3-Allel, assoziiert
sind. Weitere erfindungsgemäße Aspekte
sind unten beschrieben oder werden dem Fachmann im Licht der vorliegenden
Offenbarung ersichtlich.
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4.2 Definitionen
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Aus
Gründen
der Zweckmäßigkeit
sind die Bedeutungen bestimmter in der Beschreibung, den Beispielen
sowie den beigefügten
Ansprüchen
verwendeter Begriffe und Phrasen nachfolgend aufgeführt.
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Der
Begriff „Allel", der hier zusammen
mit „allelische
Variante" gegeneinander
austauschbar verwendet wird, bezieht sich auf alternative Formen
eines Gens oder Anteile davon. Allele nehmen den gleichen Lokus
bzw. die gleiche Position auf homologen Chromosomen ein. Besitzt
eine Untersuchungsperson zwei identische Allele eines Gens, so sagt
man, daß die
Untersuchungsperson homozygot für
das Gen bzw. Allel ist. Besitzt eine Untersuchungsperson zwei unterschiedliche
Allele eines Gens, so sagt man, daß die Untersuchungsperson heterozygot
für das
Gen ist. Allele eines spezifischen Gens können sich voneinander in einem einzigen
Nukleotid oder mehreren Nukleotiden unterscheiden und können Substitutionen,
Deletionen und Insertionen von Nukleotiden beinhalten. Bei einem
Allel eines Gens kann es sich auch um eine eine Mutation enthaltende
Form eines Gens handeln.
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Der
Begriff „allelische
Variante eines polymorphen Bereichs eines Delta-Gens" bezieht
sich auf einen Bereich eines Delta-Gens mit einer von mehreren Nukleotidsequenzen,
die in diesem Bereich des Gens in anderen Individuen angetroffen
werden.
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Der
Begriff „Agonist", wie er hier verwendet
wird, soll sich auf ein Agens beziehen, das eine Delta3-Bioaktivität heraufreguliert
(z.B. potenziert oder ergänzt).
Bei einem Delta3-Agonisten kann es sich um eine Verbindung handeln,
die die Expression eines Delta3-Gens heraufreguliert. Alternativ
kann es sich bei einem Delta3-Agonisten um eine Verbindung handeln,
die die Signalgebung von einem Delta3-Protein erhöht, beispielsweise
eine an Delta3 gebundene Verbindung, wie z.B. eine stimulierende
Form eines toporythmischen Proteins oder ein kleines Molekül. Bei einem
Delta3-Agonisten kann es sich auch um eine Verbindung handeln, die
die Expression oder Aktivität
eines Proteins, das Delta3 nachgeschaltet ist oder das mit Delta3
wechselwirkt, moduliert.
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„Antagonist", wie hier verwendet,
soll sich auf ein Agens beziehen, das eine Delta3-Bioaktivität herunterreguliert
(z.B. supprimiert oder hemmt). Bei einem Delta3-Antagonisten kann
es sich um eine Verbindung handeln, die die Expression eines Delta3-Gens
herunterreguliert. Alternativ kann es sich bei einem Delta3-Antagonisten
um eine Verbindung handeln, die die Signalgebung von einem Delta3-Protein
reduziert, beispielsweise eine an Delta3 bindende Verbindung, wie
z.B. eine inhibitorische Form eines toporythmischen Proteins oder
ein kleines Molekül.
Ein bevorzugter Delta3-Antagonist hemmt die Wechselwirkung zwischen
einem Delta3-Protein und einem weiteren Molekül, z.B. einem toporythmischen
Protein. Bei einem Delta3-Antagonisten kann es sich auch um eine
Verbindung handeln, die die Expression oder Aktivität eines
Proteins, das Delta3 nachgeschaltet ist oder das mit Delta3 wechselwirkt,
moduliert.
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Unter „biologische
Aktivität", gegeneinander austauschbar
mit den Begriffen „Bioaktivität" bzw. „Aktivität" verwendet, versteht
man im hier vorliegenden Sinne eine Effektor- oder antigene Funktion,
die direkt oder indirekt von einem Delta3-Polypeptid (das entweder
in seiner nativen oder in einer denaturierten Konformation vorliegen
kann) oder von einer beliebigen Teilsequenz davon ausgeführt wird.
Zu den Effektorfunktionen gehören
Rezeptorbindung oder -aktivierung, Induktion der Differenzierung,
mitogene oder wachstumsfördernde Aktivität, Apoptoseinduktion,
Signaltransduktion, Immunmodulation, DNA-Regulationsfunktionen und dergleichen,
gleichgültig
ob sie gegenwärtig
bekannt oder inhärent
sind. Zu den antigenen Funktionen gehört der Besitz eines Epitops
oder einer antigenen Stelle, die zur Kreuzreaktion mit gegen ein
natürlich
vorkommendes oder denaturiertes Delta3-Polypeptid oder ein Fragment davon produzierten
Antikörpern
fähig ist.
Dementsprechend kann es sich bei einer biologische Aktivität eines
Delta3-Proteins um die Bindung an einen Rezeptor, wie beispielsweise
Notch, handeln. Ebenso kann es sich bei der biologischen Aktivität eines
Delta3-Proteins um die Modulation der Zellproliferation und/oder
-differenzierung oder Zelltod in einer Zielzelle mit einem entsprechenden
Rezeptor handeln. Bei einer Zielzelle kann es sich beispielsweise
um eine Nervenzelle, eine Endothelzelle oder eine Krebszelle handeln.
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Zu
den biologisch aktiven Delta3-Polypeptiden gehören Polypeptide, die sowohl
eine Effektor- als auch eine antigene Funktion oder nur eine derartige
Funktion aufweisen. Delta3 umfaßt
Antagonistenpolypeptide und natives Delta3, vorausgesetzt, daß solche
Antagonisten ein Epitop eines nativen Delta3 beinhalten oder eine
biologische Aktivität
von nativem Delta3 antagonisieren.
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Der
Begriff „anomale
Delta3-Aktivität" oder „abnormale
Delta3-Aktivität" soll eine Aktivität von Delta3 umfassen,
die sich von der gleichen Delta3-Aktivität in einer gesunden Untersuchungsperson
unterscheidet. Eine anomale Delta3-Aktivität kann beispielsweise von einer
Mutation in dem Protein herrühren,
die beispielsweise zu einer geringeren oder höheren Bindungsaffinität für einen
Rezeptor führt.
Eine anomale Delta3-Aktivität kann auch
von einem geringeren oder höheren
Niveau von Delta3 auf Zellen herrühren, was beispielsweise durch
eine anomale Transkription, ein anomales Spleißen oder eine anomale Translation
des Delta3-Gens verursacht werden kann. So kann beispielsweise eine
anomale Delta3-Aktivität
von einer anomalen Promotoraktivität herrühren. Eine anomale Delta3-Aktivität kann auch
von einer anomalen Signalgebung durch die zytoplasmatische Domäne des Delta3-Proteins
hindurch, so daß beispielsweise
ein anomales Signal transduziert wird, herrühren. Eine anomale Signalgebung
kann das Ergebnis einer Mutation in der zytoplasmatischen Domäne von Delta3
oder alternativ des Kontakts mit einem abnormalen zytoplasmatischen
Protein sein. Eine anomale Delta3-Aktivität kann auch vom Kontakt eines
Delta3-Proteins mit einem anomalen Rezeptor, beispielsweise einem
abnormalen Notch-Protein, herrühren.
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Die
Begriffe „Zellen", „Wirtszellen" bzw. „rekombinante
Wirtszellen" werden
hier gegeneinander austauschbar verwendet. Dabei versteht sich,
daß sich
solche Begriffe nicht nur auf die jeweilige Zelle der Untersuchungsperson,
sondern auch auf die Nachkommenschaft oder potentielle Nachkommenschaft
einer solchen Zelle beziehen. Da aufgrund entweder von Mutation
oder von Umwelteinflüssen
gewisse Modifikationen in nachfolgenden Generationen auftreten können, kann
es sein, daß eine
solche Nachkommenschaft nicht mit der Elternzelle identisch ist,
doch ist sie dennoch im Rahmen des Begriffs, wie er hier verwendet
wird, enthalten.
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Bei
einem „chimärischen
Protein" oder „Fusionsprotein" handelt es sich
um eine Fusion einer ersten, für
eines der betreffenden Delta3- Polypeptide
codierenden Aminosäuresequenz
mit einer zweiten, eine Domäne
(z.B. Polypeptidanteil), die gegenüber einer beliebigen Domäne eines
der Delta3-Proteine fremd und nicht wesentlich homolog dazu ist,
definierenden Aminosäuresequenz.
Ein chimärisches
Protein kann eine Fremddomäne
präsentieren,
die in einem Organismus, der auch das erste Protein exprimiert,
angetroffen wird (wenn auch in einem anderen Protein), oder es kann
sich dabei um ein „Interspezies"-, „intergenes" Molekül handeln, beispielsweise
die Fusion von von unterschiedlichen Arten von Organismen exprimierten
Proteinstrukturen. Im allgemeinen läßt sich ein Fusionsprotein
durch die allgemeine Formel X-Delta3-Y darstellen, wobei Delta3
für einen
Anteil des Proteins steht, der aus einem der Delta3-Proteine stammt,
und X und Y unabhängig
voneinander fehlen oder für
Aminosäuresequenzen
stehen, die nicht mit einem der Delta3-Sequenzen in einem Organismus,
einschließlich
natürlich
vorkommender Mutanten, verwandt sind. Als Delta3-Fusionsprotein
ist ein Delta3-Ig-Fusionsprotein bevorzugt.
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„Komplementäre" Sequenzen, wie sie
hier verwendet werden, beziehen sich auf Sequenzen, die eine hinreichende
Komplementarität
aufweisen, um hybridisieren zu können,
wobei ein stabiler Duplex gebildet wird.
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Unter
einem „Zuführungskomplex" ist ein zielgerichtetes
Mittel zu verstehen (z.B. ein Molekül, das zu einer höheren Affinitätsbindung
eines Gens, Proteins, Polypeptids oder Peptids an eine Zielzellenoberfläche und/oder
zu einer erhöhten
zellulären
Aufnahme durch eine Zielzelle führt).
Zu zielgerichteten Mitteln gehören beispielsweise:
Sterole (z.B. Cholesterin), Lipide (z.B. ein kationisches Lipid,
Virosom oder Liposom), Viren (z.B. Adenovirus, Adeno-assoziiertes
Virus und Retrovirus) oder Zielzellen-spezifische Bindungsagentien
(z.B. von Zielzellen-spezifischen Rezeptoren erkannte Liganden).
Die Komplexe sind vorzugsweise hinreichend stabil in vivo, um ein
signifikantes Entkoppeln vor der Internalisierung durch die Zielzelle
zu verhindern. Allerdings ist der Komplex unter geeigneten Bedingungen
in der Zelle spaltbar, so daß das
Gen, Protein, Polypeptid oder Peptid in einer funktionellen Form
freigesetzt wird.
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Wie
allgemein bekannt ist, können
Gene für
ein bestimmtes Polypeptid in einer oder mehreren Kopien im Genom
eines Individuums existieren. Solche Genduplikate können identisch
sein oder gewisse Modifikationen aufweisen, einschließlich Nukleotidsubstitutionen,
Additionen oder Deletionen, die allesamt noch für Polypeptide mit weitgehend
der gleichen Aktivität
codieren. Der Begriff „für ein Delta3-Polypeptid
codierende DNA-Sequenz" kann
sich somit auf eines oder mehrere Gene in einem bestimmten Individuum
beziehen. Zudem können
gewisse Unterschiede in den Nukleotidsequenzen zwischen individuellen
Organismen bestehen, die Allele genannt werden. Solche allelischen
Unterschiede können
gegebenenfalls zu Unterschieden in der Aminosäuresequenz des codierten Polypeptids
führen,
aber dennoch ein Protein mit der gleichen biologischen Aktivität codieren.
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Der
Begriff „Delta3-Therapeutikum" bezieht sich auf
verschiedene Zusammensetzungen von Delta3-Polypeptiden ebenso wie
auf Peptidomimetika, kleine Moleküle und Nukleinsäuren, die
zur Nachahmung oder Potenzierung (Agonisierung) oder Hemmung (Antagonisierung)
der Effekte eines natürlich
vorkommenden Delta3-Proteins in der Lage sind. Ein Delta3-Therapeutikum,
das die Aktivität
eines Wildtyp-Delta3-Proteins
imitiert oder potenziert, ist ein „Delta3-Agonist". Umgekehrt ist ein
Delta3-Therapeutikum, das die Aktivität eines Wildtyp-Delta3-Proteins hemmt, ein „Delta3-Antagonist".
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Die
Begriffe „Delta3-Polypeptid" und „Delta3-Protein" sollen Delta3-Polypeptide, die
wenigstens eine biologische Aktivität aufweisen, d.h. wenigstens
eine biologische Aktivität
eines nativen Delta3-Polypeptids antagonisieren, umfassen.
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Der
Begriff „Gen" oder „rekombinantes
Gen", wie er hier
verwendet und auf Delta3 angewandt wird, bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül, das ein
für eines
der Delta3-Polypeptide der vorliegenden Erfindung codierendes offenes
Leseraster, einschließlich
sowohl Exon- als auch (gegebenenfalls) Intronsequenzen, umfaßt. Ein „rekombinantes
Delta3-Gen" bezieht
sich auf eine für
ein Delta3-Polypeptid codierende und für Delta codierende Exonsequenzen
umfassende Nukleinsäure,
obwohl diese gegebenenfalls Intronsequenzen enthalten kann, die
entweder aus einem chromosomalen Delta3-Gen oder aus einem nicht
verwandten chromosomalen Gen stammen. Beispielhafte rekombinante
Gene, die für
die betreffenden Delta3-Polypeptide codieren, sind im beigefügten Sequenzprotokoll dargestellt.
Der Begriff „Intron" bezieht sich auf
eine DNA-Sequenz, die in einem gegebenen Delta3-Gen vorhanden ist
und die nicht in Protein translatiert und im allgemeinen zwischen
Exons angetroffen wird.
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Der
Begriff „Wachstumszustand" einer Zelle bezieht
sich auf den Proliferationszustand einer Zelle ebenso wie auf ihren
Differenzierungszustand. Dementsprechend bezieht sich der Begriff
auf die Phase des Zellzyklus, in der sich die Zelle befindet, beispielsweise
G0, G1, G2, Prophase, Metaphase oder Telophase, ebenso wie auf ihren
Differenzierungszustand, beispielsweise undifferenziert, teilweise
differenziert oder voll ausdifferenziert. Ohne darauf beschränkt sein
zu wollen, wird die Differenzierung einer Zelle normalerweise von
einer Abnahme der Proliferationsgeschwindigkeit einer Zelle begleitet.
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„Homologie" oder „Identität" oder „Ähnlichkeit" bezieht sich auf
die Sequenzähnlichkeit
zwischen zwei Peptiden oder zwischen zwei Nukleinsäuremolekülen. Die
Homologie läßt sich
dadurch bestimmen, daß man in
jeder Sequenz, die für
Vergleichszwecke vergleichend angeordnet werden kann, eine Position
vergleicht. Wird eine Position in der verglichenen Sequenz von der
gleichen Base bzw. Aminosäure
besetzt, so sind die Moleküle
an dieser Position identisch. Dabei ist ein Grad an Homologie oder Ähnlichkeit
oder Identität
zwischen Nukleinsäuresequenzen
eine Funktion der Anzahl identischer oder übereinstimmender Nukleotide
an von den Nukleinsäuresequenzen
geteilten Positionen. Ein Grad an Identität von Aminosäuresequenzen
ist eine Funktion der Anzahl identischer Aminosäuren an von den Aminosäuresequenzen
geteilten Positionen. Ein Grad an Homologie oder Ähnlichkeit
von Aminosäuresequenzen
ist eine Funktion der Anzahl konservierter Aminosäuren an
von den Aminosäuresequenzen
geteilten Positionen. Bei einer Sequenz, die mit einer der hDelta3-Sequenzen
der vorliegenden Erfindung „nicht
verwandt" oder „nicht
homolog" ist, handelt
es sich um eine Sequenz, die weniger als 40% Identität, jedoch
vorzugsweise weniger als 25% Identität, mit einer der hDelta3-Sequenzen
der vorliegenden Erfindung teilt.
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Der
Begriff „wechselwirken", wie er hier verwendet
wird, soll nachweisbare Wechselwirkungen zwischen Molekülen umfassen,
so wie sie beispielsweise unter Verwendung eines Hefe-„Two-Hybrid-Assay" nachgewiesen werden
können.
Der Begriff wechselwirken soll auch „Bindungs"-Wechselwirkungen zwischen Molekülen umfassen.
Die Art der Wechselwirkungen kann Protein-Protein, Protein-Nukleinsäure, Protein-kleines Molekül oder Nukleinsäure-kleines
Molekül
sein.
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Der
Begriff „isoliert", wie er hier bezüglich Nukleinsäuren, wie
beispielsweise DNA oder RNA verwendet wird, bezieht sich auf Moleküle, die
von anderen DNAs bzw. RNAs getrennt sind, die in der natürlichen Quelle
des Makromoleküls
vorhanden sind. So enthält
beispielsweise eine für
eines der betreffenden Delta3-Polypeptide codierende isolierte Nukleinsäure vorzugsweise
nicht mehr als 10 Kilobasen (kb) Nukleinsäuresequenz, die in der genomischen
DNA natürlicherweise
das Delta3-Gen flankiert, wobei die isolierte Nukleinsäure stärker bevorzugt
nicht mehr als 5 kb solcher natürlich
vorkommender flankierender Sequenzen und am meisten bevorzugt weniger
als 1,5 kb solcher natürlich
vorkommender flankierender Sequenz enthält. Der Begriff isoliert, wie
er hier verwendet wird, bezieht sich auch auf eine Nukleinsäure oder
ein Peptid, die bzw. das bei der Herstellung mittels rekombinanter
DNA-Techniken weitgehend
frei von Zellmaterial, Virusmaterial oder Kulturmedium ist oder
bei der chemischen Synthese weitgehend frei von chemischen Vorläufermolekülen oder
anderen Chemikalien ist. Zudem soll eine „isolierte Nukleinsäure" Nukleinsäurefragmente
umfassen, die nicht natürlicherweise
als Fragmente vorkommen und nicht im natürlichen Zustand angetroffen
würden.
Der Begriff „isoliert" wird hier ebenso
mit Bezug auf Polypeptide verwendet, die von anderen zellulären Proteinen isoliert
werden, und soll sowohl gereinigte als auch rekombinante Polypeptide
umfassen.
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Der
Begriff „Modulation", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich sowohl auf Heraufregulierung, d.h. Stimulierung,
als auch Herunterregulierung, d.h. Suppression, einer Antwort.
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Der
Begriff „mutiertes
Gen" bezieht sich
auf eine allelische Form eines Gens, die zur Veränderung des Phänotyps einer
Untersuchungsperson mit dem mutierten Gen gegenüber einer Untersuchungsperson
ohne das mutierte Gen in der Lage ist. Falls eine Untersuchungsperson,
um einen geänderten
Phänotyp
aufzuweisen, für
diese Mutation homozygot sein muß, so sagt man, daß die Mutation
rezessiv ist. Falls eine Kopie des mutierten Gens ausreicht, um
den Genotyp der Untersuchungsperson zu ändern, so sagt man, daß die Mutation
dominant ist. Falls eine Untersuchungsperson eine Kopie des mutierten
Gens sowie einen Phänotyp
aufweist, der zwischen dem einer (für dieses Gen) homozygoten und
dem einer heterozygoten Untersuchungsperson liegt, so sagt man,
daß die
Mutation codominant ist.
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Zu
den „nichtmenschlichen
Tieren" der Erfindung
gehören
Säuger,
wie beispielsweise Nager, nichtmenschliche Primaten, Schafe, Hunde,
Rinder, Hühner,
Amphibien, Reptilien usw. Nichtmenschliche Tiere sind bevorzugt
ausgewählt
aus der Nagerfamilie, einschließlich
Ratte und Maus, am stärksten
bevorzugt Maus, obwohl transgene Amphibien, wie beispielsweise Mitglieder
der Gattung Xenopus, sowie transgene Hühner ebenso als wichtige Werkzeuge
zum Verständnis
und zur Identifizierung von Agentien, die beispielsweise die Embryogenese
und Gewebsbildung beeinflussen können,
dienen können.
Der Begriff „chimärisches Tier", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf Tiere, in denen das rekombinante Gen angetroffen
wird oder in denen die Rekombinante in einigen, aber nicht allen
Zellen des Tiers, exprimiert wird. Der Begriff „gewebespezifisches chimärisches
Tier" deutet darauf
hin, daß eines
der rekombinanten Delta3-Gene in einigen Geweben, jedoch nicht in
anderen vorhanden ist und/oder exprimiert wird oder unterbrochen
ist.
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Der
Begriff „Nukleinsäure", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf Polynukleotide, wie beispielsweise Desoxyribonukleinsäure (DNA)
und gegebenenfalls Ribonukleinsäure
(RNA). Dabei ist der Begriff auch so zu verstehen, daß er als Äquivalente
aus Nukleotidanalogen aufgebaute Analoge entweder von RNA oder DNA
sowie, wie auf die beschriebene Ausführungsform anwendbar, einzel-
(Sense- oder Antisense-) und doppelsträngige Polynukleotide umfaßt.
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Der
Begriff „Polymorphismus" bezieht sich auf
die Koexistenz von mehr als einer Form eines Gens oder eines Anteils
davon. Ein Anteil eines Gens, von dem wenigstens zwei unterschiedliche
Formen, d.h. zwei unterschiedliche Nukleotidsequenzen, vorliegen,
wird als ein „polymorpher
Bereich eines Gens" bezeichnet. Bei
einem polymorphen Bereich kann es sich um ein Einzelnukleotid handeln,
dessen Identität
in unterschiedlichen Allelen unterschiedlich ist. Ebenso kann ein
polymorpher Bereich eine Länge
von mehreren Nukleotiden aufweisen.
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Ein „polymorphes
Gen" bezieht sich
auf ein Gen mit wenigstens einem polymorphen Bereich.
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Die
Begriffe „Protein", „Polypeptid" und „Peptid" werden hier mit
Bezug auf ein Genprodukt gegeneinander austauschbar verwendet.
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Der
Begriff „rekombinantes
Protein" bezieht
sich auf ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung, das mit rekombinanten
DNA-Techniken hergestellt wird, wobei im allgemeinen für ein Delta3-Polypeptid
codierende DNA in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert wird,
der wiederum zur Transformation einer Wirtszelle verwendet wird,
so daß das
heterologe Protein produziert wird. Zudem soll die Phrase „stammt
aus" bezüglich eines
rekombinanten Delta3-Gens innerhalb der Bedeutung „rekombinantes
Protein" diejenigen
Proteine umfassen, die eine Aminosäuresequenz eines nativen Delta3-Proteins
oder eine dazu ähnliche
Aminosäuresequenz,
die durch Mutationen, einschließlich
Substitutionen und Deletionen (einschließlich Verkürzung) einer natürlich vorkommenden
Form des Proteins erzeugt wird, aufweisen.
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Der
Begriff „spezifisch
hybridisiert" oder „spezifisch
nachweist" bezieht
sich auf die Fähigkeit
eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, an wenigstens
ungefähr
6, 12, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 300, 350, 400 oder 425 aufeinanderfolgende
Nukleotide eines Delta3-Gens aus Vertebraten, vorzugsweise Säugern, wie beispielsweise
einer in einer der SEQ ID Nos:1 oder 3 genannten Delta3-Sequenz,
oder einer dazu komplementären
Sequenz oder natürlich
vorkommenden Mutanten davon zu hybridisieren, so daß es mehr
als 10mal mehr Hybridisierung, vorzugsweise mehr als 100mal mehr
Hybridisierung und noch stärker
bevorzugt mehr als 100mal mehr Hybridisierung als zu einer zellulären Nukleinsäure (z.B.
mRNA oder genomischer DNA), die für ein anderes Protein als ein
Vertebraten-, vorzugsweise Delta3-Protein, wie es hier definiert
ist, codiert, zeigt.
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Unter
dem Begriff „gewebespezifischer
Promotor", wie er
hier verwendet wird, versteht man eine DNA-Sequenz, die als Promotor
dient, d.h. die die Expression einer mit dem Promotor operativ verknüpften ausgewählten DNA-Sequenz
reguliert und die sich auf die Expression der ausgewählten DNA-Sequenz
in spezifischen Zellen eines Gewebes, wie beispielsweise Zellen
aus der Leber oder der Bauchspeicheldrüse, neuronalen Zellen oder
Immunzellen, auswirkt. Der Begriff deckt ebenso sogenannte „leaky" [„undichte"] Promotoren ab,
die die Expression einer ausgewählten
DNA hauptsächlich
in einem Gewebe regulieren, aber auch ebenso zu einer Expression
in anderen Geweben führen.
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Bei
der „Transkriptionsregulationssequenz" handelt es sich
um einen Oberbegriff, der in der gesamten Beschreibung in bezug
auf DNA-Sequenzen,
wie beispielsweise Initiationssignale, Enhancer und Promotoren, die
die Transkription von proteincodierenden Sequenzen, mit denen sie
operativ verknüpft
sind, induzieren oder kontrollieren, verwendet wird. In bevorzugten
Ausführungsformen
steht die Transkription eines der rekombinanten Delta3-Gene unter
der Kontrolle einer Promotorsequenz (oder einer anderen Transkriptionsregulationssequenz),
die die Expression des rekombinanten Gens in einem Zelltyp, in dem
die Expression durchgeführt
werden soll, kontrolliert. Ebenso versteht sich, daß das rekombinante
Gen unter der Kontrolle von Transkriptionsregulationssequenzen stehen
kann, bei denen es sich um die gleichen Sequenzen wie diejenigen, die
die Transkription der natürlich
vorkommenden Formen von Delta3-Proteinen kontrollieren, oder um
davon verschiedene Sequenzen handeln kann.
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Unter
dem Begriff „Transfektion", wie er hier verwendet
wird, versteht man die Einführung
einer Nukleinsäure,
beispielsweise eines Expressionsvektors, in eine Empfängerzelle
mittels nukleinsäurevermitteltem Gentransfer. „Transformation", wie hier verwendet,
bezieht sich auf einen Vorgang, bei dem der Genotyp einer Zelle
als Ergebnis der zellulären
Aufnahme exogener DNA oder RNA verändert wird und bei dem beispielsweise
die transformierte Zelle eine rekombinante Form eines Delta3-Polypeptids
exprimiert oder, im Fall einer Antisense-Expression von dem übertragenen
Gen, die Expression einer natürlich
vorkommenden Form des Delta3-Proteins unterbrochen wird.
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Unter
dem Begriff „Transgen", wie er hier verwendet
wird, versteht man eine Nukleinsäuresequenz
(die beispielsweise für
eines der Delta3-Polypeptide
oder für
ein Antisense-Transkript davon codiert), die für das transgene Tier oder die
transgene Zelle, in das bzw. die sie eingeführt wird, teilweise oder vollständig heterolog,
d.h. fremd, ist oder für
ein endogenes Gen des transgenen Tiers oder der transgenen Zelle,
in das bzw. die sie eingeführt
wird, homolog ist, die jedoch so zur Insertion in das Genom des
Tiers vorgesehen ist bzw. darin inseriert wird, daß das Genom
der Zelle, in das sie inseriert wird, verändert wird (z.B. sie wird an
einem Ort inseriert, der sich von dem des natürlichen Gens unterscheidet,
oder ihre Insertion führt
zu einem Knockout). Ein Transgen kann eine oder mehrere Transkriptionsregulationssequenzen
sowie beliebige weitere Nukleinsäuren,
wie beispielsweise Introns, die für die optimale Expression einer
ausgewählten
Nukleinsäure
notwendig sein können,
beinhalten.
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Der
Begriff ,Vektor",
wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül, das zum Transport
einer anderen Nukleinsäure,
mit der es verknüpft
wurde, in der Lage ist. Bei einer bevorzugten Art von Vektor handelt
es sich um ein Episom, d.h. eine zur extrachromosomalen Replikation
fähige
Nukleinsäure. Als
Vektoren sind solche bevorzugt, die zur autonomen Replikation und
Expression von Nukleinsäuren,
mit denen sie verknüpft
sind, in der Lage sind. Zur Steuerung der Expression von Genen,
mit denen sie operativ verknüpft
sind, fähige
Vektoren werden hier mit „Expressionsvektoren" bezeichnet. Im allgemeinen
liegen Expressionsvektoren mit Nutzung in rekombinanten DNA-Techniken
häufig
in Form von „Plasmiden" vor, die sich im allgemeinen
auf zirkuläre
doppelsträngige
DNA-Schleifen beziehen, die in ihrer Vektorform nicht an das Chromoson
gebunden sind. In der vorliegenden Beschreibung werden „Plasmid" und „Vektor" gegeneinander austauschbar
verwendet, da es sich bei dem Plasmid um die am häufigsten
verwendete Vektorform handelt. Die Erfindung soll jedoch auch solche
weiteren Formen von Expressionsvektoren umfassen, die gleichwertige Funktionen
ausüben
und die im Anschluß hieran
im Fachgebiet bekannt werden.
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Der
Begriff „Behandeln", wie er hier verwendet
wird, soll die Heilung ebenso wie die Linderung wenigstens eines
Symptons des Leidens oder der Krankheit umfassen.
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4.3 Nukleinsäuren der
vorliegenden Erfindung
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Wie
nachfolgend beschrieben, betrifft ein Aspekt der Erfindung isolierte
Nukleinsäuren,
die für Delta3-Polypeptide
codierende Nukleotidsequenzen umfassen, und/oder Äquivalente
derartiger Polypeptide oder Nukleinsäuren. Dabei soll der Begriff äquivalent
Nukleotidsequenzen umfassen, die für funktionell äquivalente
Delta3-Polypeptide oder funktionell äquivalente Peptide mit einer
Aktivität
eines Delta3-Proteins,
wie sie hier beschrieben ist, codieren, umfassen. Äquivalente
Nukleotidsequenzen umfassen Sequenzen, die sich um eine oder mehrere
Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen unterscheiden,
wie beispielsweise allelische Varianten, und umfassen daher Sequenzen,
die sich von der in einer der SEQ ID Nos: 1 oder 3 gezeigten Nukleotidsequenz
des Delta3-Gens aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes
unterscheiden.
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Bevorzugte
Delta3-Nukleinsäuren
codieren für
Polypeptide, die wenigstens 55% identisch oder ähnlich zu einer Aminosäuresequenz
der SEQ ID No. 2 sind. Nukleinsäuren,
die für
Polypeptide codieren, die wenigstens etwa 70% und noch stärker bevorzugt
wenigstens etwa 80%, 85%, 90%, 95% oder 98%, identisch oder ähnlich zu
einer in SEQ ID No: 2 dargestellten Aminosäuresequenz sind, liegen ebenso
im Umfang der Erfindung. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
codiert die Nukleinsäure
der vorliegenden Erfindung für
ein Polypeptid mit einer Gesamtaminosäuresequenzhomologie oder -identität von wenigstens
etwa 70%, wenigstens etwa 80%, wenigstens etwa 85%, wenigstens etwa
90%, wenigstens etwa 95%, wenigstens etwa 98% oder wenigstens etwa
99%, mit der in SEQ ID No: 2 gezeigten Aminosäuresequenz. In einer bevorzugten
Ausführungsform
codiert die Nukleinsäure
für ein
Protein, das die Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID No.
2 umfaßt.
Vorzugsweise beinhaltet die Nukleinsäure die gesamte oder einen
Teil der Nukleotidsequenz, die dem codierenden Bereich der SEQ ID
Nos: 1 oder 3 entspricht.
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Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können für ein Delta3-Protein
aus einer beliebigen Spezies, einschließlich Insekten, codieren. Bevorzugte
Nukleinsäuren
codieren für
Delta3-Proteine aus Vertebraten. Noch stärker bevorzugte Nukleinsäuren codieren
für Primaten-Delta3-Proteine,
einschließlich
Säuger-Delta3-Proteine,
z.B. menschliche Delta3-Proteine. Weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuren können für Delta3-Proteine
aus Vögeln,
Pferd, Hund, Katze, Rind oder Schwein codieren.
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In
einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform
codiert die Nukleinsäure
für ein
eine extrazelluläre
Domäne
von Delta3, z.B. Delta3 mit der SEQ ID No. 2, umfassendes Polypeptid.
Entsprechenderweise codieren bevorzugte Nukleinsäuren für ein Polypeptid, das etwa
Aminosäure
1 bis etwa Aminosäure
529 der SEQ ID No. 2 umfaßt.
Andere bevorzugte Nukleinsäuren
codieren für
ein Polypeptid, das einer extrazellulären Domäne von Delta3 entspricht, der
im wesentlichen das Signalpeptid fehlt, beispielsweise ein Polypeptid, das
etwa Aminosäure
18 bis etwa Aminosäure
529 der SEQ ID No. 2 umfaßt.
Wiederum andere bevorzugte Nukleinsäuren codieren für ein Polypeptid,
das wenigstens eine der konservierten Motive in der extrazellulären Domäne von Delta3
umfaßt,
beispielsweise ein DSL-Motiv oder ein EGF-ähnliches Motiv, wie beispielsweise die
in 2 gezeigten (SEQ ID No. 2). In
einer Ausführungsform
codiert die Nukleinsäure
für ein
Protein mit wenigstens einem EGF-ähnlichen Motiv. In weiteren
Ausführungsformen
codiert die Nukleinsäure
für Proteine mit
wenigstens 2, wenigstens 3, wenigstens 4, wenigstens 5, wenigstens
6, wenigstens 7 oder 8 EGF-ähnlichen
Wiederholungen, wie beispielsweise den in 2 gezeigten
(SEQ ID No. 2). Das von einer eine beliebige Anzahl dieser EGF-ähnlichen
Wiederholungen codierenden Nukleinsäure codierte Polypeptid kann
ferner eine ein DSL-Motiv codierende Aminosäuresequenz umfassen.
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Alle
von den oben beschriebenen Nukleinsäuren codierten Polypeptide
können
löslich
sein. Bevorzugte lösliche
Peptide umfassen wenigstens einen Teil der extrazellulären Domäne eines
Delta3-Proteins. Noch stärker
bevorzugte lösliche
Polypeptide umfassen eine Aminosäuresequenz,
die etwa Aminosäure
1 bis etwa Aminosäure
529 der SEQ ID No. 2 oder einem Homolog davon entspricht. Noch weitere
bevorzugte lösliche Delta3-Polypeptide umfassen
wenigstens eine EGF-ähnliche
Wiederholung. Solche Polypeptide können zusätzlich eine DSL-Domäne und gegebenenfalls
ein Signalpeptid umfassen.
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Noch
stärker
bevorzugte Nukleinsäuren
codieren für
ein Delta3-Polypeptid,
bei dem es sich um ein Fusionsprotein handelt. Ein bevorzugtes Fusionsprotein
ist ein Delta3-Ig-Fusionsprotein. Solche Fusionsproteine können wenigstens
einen Anteil der extrazellulären
Domäne
einer Delta3-Domäne
umfassen. Bei einem Anteil kann es sich um einen beliebigen Anteil
von wenigstens etwa 10 Aminosäuren,
wie etwa die oben beschriebenen Anteile, handeln. Derartige Fusionsproteine
codierende Nukleinsäuren
lassen sich wie im US-Patent Nr. 5,434,131 herstellen.
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Alternativ
können
von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure codierte
Polypeptide membrangebunden sein. Erfindungsgemäße membrangebundene Polypeptide
umfassen vorzugsweise eine Transmembrandomäne. Die Transmembrandomäne kann
dabei aus einem Delta3-Protein stammen, wie beispielsweise eine Transmembrandomäne, die
etwa Aminosäure
530 bis Aminosäure
553 der in 2 gezeigten SEQ ID No.
2 umfaßt.
Als Alternative kann die Transmembrandomäne aus einem anderen Membranprotein
stammen, so daß ein
chimärisches
membranständiges
Delta3-Protein gebildet wird. Bei noch weiteren erfindungsgemäßen Polypeptiden
kann es sich um intrazelluläre
Proteine handeln. Dementsprechend sind auch Proteine, die keine Transmembrandomäne umfassen,
von der Erfindung umfaßt.
Andere erfindungsgemäße Proteine
enthalten keine extrazelluläre
Domäne.
Weitere erfindungsgemäße Proteine
enthalten weder eine extrazelluläre
Domäne
noch eine Transmembrandomäne.
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Von
der erfindungsgemäßen Nukleinsäure codierte
Polypeptide können
eine zytoplasmatische Domäne
umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform codiert eine erfindungsgemäße Nukleinsäure für ein eine zytoplasmatische
Delta3-Domäne
umfassendes Polypeptid. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform
weist die zytoplasmatische Domäne
eine Aminosäuresequenz
auf, die einer Sequenz von etwa Aminosäure 554 bis etwa Aminosäure 685
der SEQ ID No. 2 (2) oder einem Anteil
davon entspricht.
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In
noch weiteren bevorzugten Ausführungsformen
codiert die erfindungsgemäße Nukleinsäure für ein Polypeptid,
das wenigstens eine Domäne
eines Delta3-Proteins, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus: einem Signalpeptid, einem DSL-Motiv,
einer EGF-ähnlichen
Wiederholung, einer Transmembrandomäne sowie einer zytoplasmatischen
Domäne,
umfaßt.
Dabei kann das erfindungsgemäße Polypeptid
mehrere dieser Domänen
aus einem Delta3-Protein umfassen. Als Alternative kann es sich
bei einem erfindungsgemäßen Polypeptid
um ein chimärisches
Protein, d.h. ein Protein, das mehrere dieser konservierten Domänen umfaßt, von denen
wenigstens einige aus einem anderen Protein als einem Delta3-Protein stammen,
handeln. Dementsprechend codiert in einer Ausführungsform eine erfindungsgemäße Nukleinsäure für ein Polypeptid
mit einem DSL-Motiv, das eine Aminosäuresequenz aus einem von Delta3
verschiedenen Delta3-Protein
aufweist. Bei einer solchen Aminosäuresequenz kann es sich um
eine beliebige in 2 gezeigte Sequenz
als ein DSL-Motiv handeln. In noch einer weiteren Ausführungsform
codiert die Nukleinsäure
für ein
Delta3-Protein, das ein Signalpeptid aus einem anderen Protein als
einem Delta3-Protein aufweist. Ebenso sind erfindungsgemäß Nukleinsäuren umfaßt, die
für ein
Delta3-Polypeptid mit einer zytoplasmatischen Domäne aus einem
anderen Protein als einem Delta3-Protein codieren, sowie Nukleinsäuren, die
für eine
zytoplasmatische Delta3-Domäne
sowie eine extrazelluläre
Domäne
aus einem anderen Protein als einem Delta3-Protein codieren. Bei
von Delta3-Proteinen verschiedenen Proteinen kann es sich beispielsweise
um toporythmische Proteine handeln. Unter „toporythmische Proteine" sollen Notch, Delta,
Serrate, Enhancer of Split, Deltex sowie weitere Mitglieder dieser
Familie von Proteinen, die strukturelle Ähnlichkeiten teilen, fallen
(siehe z.B. internationale Patentanmeldungen Nr. WO 97/01571; WO
92/19734 und WO 92/19734 und WO 94/07474, supra).
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Erfindungsgemäß ebenso
umfaßt
sind Nukleinsäuren,
die für
Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz,
die homolog zu einem der oben beschriebenen Anteile der SEQ ID No.
2 ist, codieren. Bevorzugte erfindungsgemäße Nukleinsäuren codieren für Polypeptide,
die eine Aminosäuresequenz
umfassen, die mindestens etwa 70%, mindestens etwa 75%, mindestens
etwa 80% oder mindestens etwa 85% homolog oder identisch zu der
Aminosäuresequenz
einer der in 2 gezeigten Delta3-Domänen ist.
Noch stärker
bevorzugte erfindungsgemäße Nukleinsäuren codieren
für Polypeptide,
die eine Aminosäuresequenz
umfassen, die mindestens etwa 90%, mindestens etwa 95%, mindestens
etwa 98% oder mindestens etwa 99% homolog oder identisch zu der
Aminosäuresequenz
einer der in 2 gezeigten Delta3-Domänen ist.
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In
einer Ausführungsform
codiert die Nukleinsäure,
z.B. cDNA, für
ein Peptid mit wenigstens einer Bioaktivität des betreffenden Delta3-Polypeptids, wie
beispielsweise der Fähigkeit,
an einen Delta3-Rezeptor, z.B. Notch, zu binden. Zur Wechselwirkung
mit einem Delta3-Protein oder Fragment davon fähige Proteine oder Peptide
lassen sich mit verschiedenen Verfahren, beispielsweise auf Bindungstests
beruhenden Verfahren, identifizieren. So können beispielsweise verschiedene
Arten von Expressionsbibliotheken einem Screening mit Delta3-Protein
oder einem Anteil davon unterzogen werden. Zur Isolierung mit der
zytoplasmatischen Domäne
von Delta3 wechselwirkender zytoplasmatischer Proteine läßt sich
ein 2-Hybrid-System verwenden. Anteile von Delta3-Proteinen, die zur
Wechselwirkung mit einem Liganden in der Lage sind, lassen sich
bestimmen, indem man Fragmente von Delta3-Proteinen präpariert
und diese Fragmente einem Screening auf solche Fragmente, die zur
Wechselwirkung mit dem Liganden in der Lage sind, unterzieht. Wenigstens
zum Teil aufgrund der Beobachtung, daß der N-terminale Anteil des
Drosophila-Delta-Proteins, der eine DSL-Domäne sowie eine EGF-ähnliche Domäne enthält, notwendig und hinreichend
für eine
In-vitro-Bindung
an Notch ist (Henrique et al., supra; Muskavitch et al., supra),
ist es wahrscheinlich, daß die
zur Wechselwirkung mit einem Liganden fähige Domäne von Delta3-Proteinen die
DSL-Domäne
und/oder mindestens einen Anteil der EGF-ähnlichen Domäne enthält. Allerdings
könnten
auch andere Anteile der extrazellulären Domäne von Delta3 für die Bindung
zumindest an einige Delta3-Liganden notwendig sein.
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In
weiteren bevorzugten Ausführungsformen
kann das betreffende Delta3-Polypeptid
die Proliferation und/oder Differenzierung oder den Zelltod spezifischer
Zielzellen, beispielsweise Nervenzellen oder Endothelzellen, modulieren.
Tests zur Bestimmung davon, daß ein
Delta3-Polypeptid
mindestens eine Bioaktivität
eines Delta3-Proteins aufweist, sind unten beschrieben.
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Noch
weitere bevorzugte Nukleinsäuren
der vorliegenden Erfindung codieren für ein Delta3-Polypeptid, das
eine Polypeptidsequenz enthält,
welche allen oder einem Teil der Aminosäurereste der SEQ ID No: 2, beispielsweise
mindestens 2, 5, 10, 25, 50, 100, 150 oder 200 Aminosäureresten
dieses Bereichs, entspricht. Bevorzugte Nukleinsäuren codieren für ein Polypeptid,
das mindestens zwei aufeinanderfolgende Aminosäurereste von etwa Aminosäure 1 bis
etwa Aminosäure
570 der Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
No. 2 umfaßt.
Noch weitere bevorzugte Nukleinsäuren
codieren für
ein Polypeptid, das wenigstens etwa 3, wenigstens etwa 5, wenigstens
etwa 10, wenigstens etwa 15, wenigstens etwa 20 oder wenigstens
etwa 25 aufeinanderfolgende Aminosäuren von etwa Aminosäure 1 bis
etwa Aminosäure
575 gemäß SEQ ID
No. 2 umfaßt.
Gegenstand der Erfindung sind ferner Nukleinsäuren, die für ein Polypeptid mit einer
Aminosäuresequenz,
die mindestens etwa 70%, vorzugsweise mindestens etwa 80% und am
meisten bevorzugt mindestens etwa 90% zu wenigstens etwa 10 aufeinanderfolgenden
Aminosäuren
gemäß SEQ ID
No. 2 oder wenigstens etwa 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren aus
einem Anteil der SEQ ID No. 2 ist, codieren. In einer Ausführungsform entspricht
der Anteil etwa Aminosäure
1 bis etwa Aminosäure
575 der SEQ ID No. 2. Erfindungsgemäße codierende Nukleinsäuremoleküle umfassen
vorzugsweise wenigstens etwa 200, 250, 300, 350, 400, 410, 420, 430,
435 oder 440 Basenpaare.
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Die
Erfindung sieht ferner Nukleinsäuremoleküle zur Verwendung
als Sonden/Primer oder Antisense-Moleküle (d.h. nichtcodierende Nukleinsäuremoleküle), die
wenigstens etwa 6, 12, 20, 30, 50, 100, 125, 150 oder 200 Nukleotide
oder Basenpaare umfassen, vor. Noch weitere erfindungsgemäße bevorzugte
Nukleinsäuren
umfassen wenigstens etwa 300, wenigstens etwa 350, wenigstens etwa
400, wenigstens etwa 450, wenigstens etwa 500 oder wenigstens etwa
600 Nukleotide der SEQ ID No. 1 oder 3. In gewissen Ausführungsformen
entsprechen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren einem
5'-Anteil der Nukleinsäuresequenz SEQ
ID No. 1. So kann beispielsweise eine erfindungsgemäße Nukleinsäure einem
Anteil von etwa Nukleotid 1 bis etwa Nukleotid 2000 der Nukleinsäuresequenz
SEQ ID No. 1 entsprechen.
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Zu
den als Sonde gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendeten bevorzugten Nukleinsäuren
gehören
Nukleinsäuren,
die eine Nukleotidsequenz mit wenigstens etwa 6, vorzugsweise wenigstens
etwa 9, stärker
bevorzugt wenigstens etwa 12 und noch stärker bevorzugt wenigstens etwa
15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden aus SEQ ID No. 1 oder einem
Anteil davon umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform entspricht der Anteil
etwa Nukleotid 1 bis etwa Nukleotid 2060 der SEQ ID No. 1. Als Alternative
kann es sich bei einem Anteil um eine für ein konserviertes Motiv des
hDelta3-Proteins codierende Nukleotidsequenz handeln. Andererseits
kann es sich bei dem Anteil um eine Nukleotidsequenz handeln, die
zwischen für
konservierte Motive des hDelta3-Proteins codierende Nukleinsäuresequenzen
lokalisiert ist.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Kombination aus wenigstens
zwei Nukleinsäuren,
die wenigstens einem Anteil der SEQ ID No. 1 oder einem Homolog
davon entsprechen. Dementsprechend wird in einer Ausführungsform
erfindungsgemäß eine Kombination
aus zwei Nukleinsäuren
mit wenigstens etwa 6, vorzugsweise wenigstens etwa 9, stärker bevorzugt
wenigstens etwa 12 und noch stärker
bevorzugt wenigstens etwa 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden aus
SEQ ID No. 1 oder aus einem Anteil davon bereitgestellt. In einer
bevorzugten Ausführungsform
ist wenigstens eine der Nukleinsäuren
markiert.
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In
einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt
wird eine Nukleinsäure
bereitgestellt, die unter stringenten Bedingungen an eine durch
eine der SEQ ID Nos:1 oder 3 dargestellte Nukleinsäure hybridisiert.
Geeignete Stringenzbedingungen, die die DNA-Hybridisierung fördern, beispielsweise
6,0 × Natriumchlorid/Natriumcitrat
(SSC) bei etwa 45°C
mit einem anschließenden
Waschschritt mit 2,0 × SSC
bei 50°C,
sind dem Fachmann bekannt oder lassen sich den Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons,
N.Y. (1989), 6.3.1–6.3.6
entnehmen. So läßt sich
beispielsweise die Salzkonzentration im Waschschritt von einer niedrigen Stringenz
von etwa 2,0 × SSC
bei 50°C
bis zu einer hohen Stringenz von etwa 0,2 × SSC bei 50°C oder bei 65°C auswählen. Darüber hinaus
kann die Temperatur im Waschschritt von niedrigstringenten Bedingungen bei
Raumtemperatur, etwa 22°C,
bis zu hochstringenten Bedingungen bei etwa 65°C erhöht werden. Sowohl Temperatur
als auch Salz können
verändert
werden, oder man kann die Temperatur und Salzkonzentration konstant
halten, während
die andere Variable verändert
wird. In einer bevorzugten Ausführungsform
bindet eine konservierende Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung
an eine der Sequenzen SEQ ID Nos 1 oder 3 unter mäßigstringenten
Bedingungen, beispielsweise bei etwa 2,0 × SSC und etwa 40°C. In einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
bindet eine Delta3-Nukleinsäure der
vorliegenden Erfindung unter hochstringenten Bedingungen an eine
der Sequenzen SEQ ID Nos: 1 oder 3.
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Bevorzugte
Nukleinsäuren
weisen eine Sequenz auf, die wenigstens etwa 75% homolog und stärker bevorzugt
wenigstens 80% und noch stärker
bevorzugt wenigstens 85% homolog mit einer Nukleinsäuresequenz
eines Delta3-Gens, wie beispielsweise des menschlichen Delta3-Gens,
z.B. wie etwa einer in einer der SEQ ID Nos: 1 und 3 gezeigten Sequenz,
homolog ist. Natürlich
sind erfindungsgemäß ebenso
Nukleinsäuren umfaßt, die
wenigstens etwa 90%, stärker
bevorzugt wenigstens etwa 95% und am stärksten bevorzugt wenigstens
etwa 98–99%
homolog mit einer in einer der SEQ ID Nos: 1 und 3 dargestellten
Nukleinsequenz sind. In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich
bei der Nukleinsäure
um ein menschliches Delta3-Gen, wobei sie in besonders bevorzugten
Ausführungsformen
die gesamte oder einen Anteil der dem codierenden Bereich einer
der SEQ ID Nos: 1 oder 3 entsprechenden Nukleotidsequenz enthält.
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Erfindungsgemäß ebenso
umfaßt
sind Nukleinsäuren
mit einer Sequenz, die sich von den in einer der SEQ ID Nos: 1 oder
3 gezeigten Nukleotidsequenzen aufgrund der Degeneriertheit des
genetischen Codes unterscheidet. Derartige Nukleinsäuren codieren
funktionell äquivalente
Peptide (d.h. ein Peptid mit einer biologischen Aktivität eines
Delta3-Polypeptids),
unterscheiden sich jedoch in ihrer Sequenz aufgrund der Degeneriertheit
des genetischen Codes von der im Sequenzprotokoll aufgeführten Sequenz.
So werden beispielsweise eine Reihe von Aminosäuren durch mehr als ein Triplett
beschrieben. Codons, die die gleiche Aminosäure bezeichnen, oder Synonyme
(beispielsweise codieren CAU und CAC jeweils für Histidin) können zu „stillen" Mutationen führen, die
die Aminosäuresequenz
eines Delta3-Polypeptids nicht beeinflussen. Es wird jedoch erwartet,
daß DNA-Sequenzpolymorphismen
existieren, die zu Veränderungen
in den Aminosäuresequenzen
der betreffenden Delta3-Polypeptide
führen.
Einem Fachmann ist ersichtlich, daß diese Variationen bei einem
oder mehreren Nukleotiden (z.B. bis zu etwa 3–5% der Nukleotide) der Polypeptide
mit einer Aktivität eines
Delta3-Polypeptids
codierenden Nukleinsäuren
aufgrund natürlicher
allelischer Variation zwischen Individuen einer gegebenen Spezies
existieren können.
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Wie
in den unten aufgeführten
Beispielen angedeutet, lassen sich für Delta3-Protein codierende
Nukleinsäuren
aus in einer aus einer Reihe von eukaryontischen Zellen vorhandener
mRNA erhalten. Dabei sollte es auch möglich sein, Nukleinsäuren, die
für Delta3-Polypeptide
der vorliegenden Erfindung codieren, aus genomischer DNA sowohl
aus Erwachsenen als auch aus Embryos zu erhalten. So läßt sich
beispielsweise ein für
ein Delta3-Protein
codierendes Gen entweder von einer cDNA oder einer genomischen Bank
gemäß den hier
beschriebenen ebenso wie den dem Fachmann allgemein bekannten Vorschriften
klonieren. Zu den zur Isolierung der betreffenden Nukleinsäuren geeigneten
Geweben und/oder Bibliotheken gehören beispielsweise unter anderem
Endothelzellenbibliotheken. Eine für ein Delta3-Protein codierende
cDNA läßt sich
erhalten, indem man Gesamt-mRNA von einer Zelle, beispielsweise
einer Vertebratenzelle, einer Säugerzelle
oder einer menschlichen Zelle, einschließlich embryonaler Zellen, isoliert.
Anschließend
lassen sich aus der Gesamt-mRNA doppelsträngige cDNAs präparieren
und daraufhin mit einer aus einer Reihe bekannter Techniken in einen
geeigneten Plasmid- oder Bakteriophagenvektor inserieren. Das für ein Delta3-Protein
codierende Gen kann auch unter Verwendung etablierter Polymerasekettenreaktionstechniken
im Sinne der von der Erfindung bereitgestellten Nukleotidsequenzangaben
kloniert werden. Bei der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kann
es sich um DNA oder RNA handeln. Eine bevorzugte Nukleinsäure ist
eine cDNA, die durch eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus SEQ ID Nos: 1 und 3 dargestellt ist.
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4.3.1 Vektoren
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind ebenso Expressionsvektoren, die
eine für
ein Delta3-Polypeptid codierende Nukleinsäure in operativer Verknüpfung mit
wenigstens einer Transkriptionsregulationssequenz enthalten. Dabei
soll unter „operativer
Verknüpfung" verstanden werden,
daß die
Nukleotidsequenz mit einer Regulationssequenz auf eine Weise verknüpft ist,
die die Expression der Nukleotidsequenz gestattet. Regulationssequenzen
sind im Fachgebiet bekannt und werden zur Steuerung der Expression
der betreffenden Delta3-Proteine ausgewählt. Dementsprechend fallen
unter den Begriff „Transkriptionsregulationssequenz" Promotoren, Enhancer
und andere Expressionskontrollelemente. Derartige Regulationssequenzen
sind bei Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology
185, Academic Press, San Diego, CA (1990) beschrieben. In einer
Ausführungsform
beinhaltet der Expressionsvektor ein für ein Peptid mit einer agonistischen
Aktivität
eines betreffenden Delta3-Polypeptids oder alternativ für ein Peptid,
bei dem es sich um eine antagonistische Form des Delta3-Proteins
handelt, codierendes rekombinantes Gen. Derartige Expressionsvektoren
können
zur Transfektion von Zellen verwendet werden, wodurch Polypeptide,
einschließlich
Fusionsproteine, die von den Nukleinsäuren, wie sie hier beschrieben
sind, codiert werden, produziert werden. Zudem können die Genkonstrukte der
vorliegenden Erfindung auch als Teil eines Gentherapieprotokolls
zur Zuführung von
entweder eine agonistische oder eine antagonistische Form eines
der betreffenden Delta3-Proteine codierenden Nukleinsäuren verwendet
werden. Somit betrifft ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt
Expressionsvektoren zur In-vivo- oder In-vitro-Transfektion und
Expression eines Delta3-Polypeptids
in bestimmten Zellarten, so daß die
Funktion der Delta-induzierten
Signalgebung in einem Gewebe wiederhergestellt oder alternativ aufgehoben
wird. Dies könnte
beispielsweise wünschenswert
sein, wenn die natürlich
vorkommende Form des Proteins fehlexprimiert wird, oder um eine
Form des Proteins, die die Differenzierung von Gewebe verändert, zuzuführen. Expressionsvektoren
können
auch zur Hemmung neoplastischer Transformation eingesetzt werden.
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Neben
viralen Transferverfahren, wie beispielsweise den oben dargestellten,
lassen sich auch nichtvirale Verfahren zur Herbeiführung der
Expression eines betreffenden Delta3-Polypeptids im Gewebe eines Tiers
einsetzen. Die meisten nichtviralen Gentransferverfahren beruhen
auf den von Säugerzellen
verwendeten normalen Mechanismen für die Aufnahme und den intrazellulären Transport
von Makromolekülen.
In bevorzugten Ausführungsformen
beruhen nichtvirale zielgerichtete Mittel der vorliegenden Erfindung
auf endozytischen Wegen zur Aufnahme des betreffenden Delta3-Polypeptid-Gens
durch die Zielzelle. Zu den beispielhaften zielgerichteten Mitteln
dieser Art gehören
von Liposomen abgeleitete Systeme, Polylysinkonjugate sowie künstliche
Virushüllen.
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4.3.2 Sonden und Primer
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Zudem
gestatten die aus der Klonierung von hDelta3-Genen bestimmten Nukleotidsequenzen
ferner die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Verwendung
bei der Identifizierung und/oder Klonierung von Delta3-Homologen in anderen
Zellarten, beispielsweise aus anderen Geweben, ebenso wie von Delta3-Homologen
aus anderen Säugerorganismen
vorgesehen sind. Erfindungsgemäße Sonden
und Primer können
auch zur Bestimmung der Identität
eines Delta3-Allels und/oder des Vorhandenseins oder der Abwesenheit
einer oder mehrerer Mutationen in einem Delta3-Gen einer Untersuchungsperson
verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform läßt sich
eine erfindungsgemäße Sonde
bzw. ein erfindungsgemäßer Primer
zur Bestimmung davon, ob eine Untersuchungsperson eine Krankheit
bzw. ein Leiden, die bzw. das mit einem spezifischen Delta3-Allel,
wie beispielsweise einem eine Mutation tragenden Allel, assoziiert
ist, aufweist oder in Gefahr ist, eine derartige Krankheit bzw.
ein derartiges Leiden zu entwickeln, verwenden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird durch die vorliegende Erfindung ebenso eine Sonde/ein Primer,
die bzw. der ein weitgehend gereinigtes Oligonukleotid umfaßt, wobei
das Oligonukleotid einen Nukleotidsequenzbereich umfaßt, der
unter stringenten Bedingungen an wenigstens etwa 12, vorzugsweise
etwa 25, stärker
bevorzugt etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide von
Sense- oder Antisense-Sequenz,
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No: 1 und 3, oder natürlich vorkommende
Mutanten davon hybridisiert, bereitgestellt. So lassen sich beispielsweise
auf der in SEQ ID Nos: 1 und 3 dargestellten Nukleinsäure beruhende
Primer in PCR-Reaktionen zur Klonierung von Delta3-Homologen, beispielsweise spezifischen
Delta3-Allelen,
verwenden. Derartige Primer werden vorzugsweise in einem Bereich
ausgewählt, der
keine signifikante Homologie mit anderen Genen, beispielsweise anderen
Delta-Genen, teilt. Bevorzugte erfindungsgemäße Primer sind gemäß SEQ ID
Nos. 4–8
nachfolgend angegeben: 5'-Ende-Primer
5'AGCGCCTCTGGCTGGGCGCT3' | (SEQ
ID No. 12; entsprechend den Nukleotiden 356 bis 375 der SEQ ID No.
1); |
5'CGGCCAGAGGCCTTGCCACC3' | (SEQ
ID No. 13; entsprechend den Nukleotiden 725 bis 744 der SEQ ID No.1); |
3'-Ende-Primer
5'TTGCGCTCCCGGCTGGAGCC3' | (SEQ
ID No. 14; entsprechend dem Komplement der Nukleotide 1460 bis 1479
der SEQ ID No.1); und |
5'ATGCGGCTTGGACCTCGGTT3' | (SEQ
ID No. 15; entsprechend dem Komplement der Nukleotide 1592 bis 2611
der SEQ ID No. 1). |
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Gleichfalls
lassen sich auf den betreffenden Delta3-Sequenzen beruhende Sonden
zum Nachweis von Transkripten oder genomischen Sequenzen, die für die gleichen
oder homologe Proteine codieren, verwenden. In bevorzugten Ausführungsformen
umfaßt
die Sonde ferner eine daran gebundene Markierungsgruppe, die nachgewiesen
werden kann; beispielsweise ist die Markierungsgruppe ausgewählt unter
Radioisotopen, Fluoreszenzverbindungen, Enzymen und Enzym-Cofaktoren.
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Derartige
Sonden können
auch, wie nachfolgend ausführlicher
erörtert,
als Teil eines diagnostischen Testkits zur Identifizierung von Zellen
oder Gewebe, worin ein Delta3-Protein fehlexprimiert wird, verwendet werden,
indem man beispielsweise ein Niveau einer für Delta codierenden Nukleinsäure in einer
Probe von Zellen aus einem Patienten mißt, beispielsweise Delta3-mRNA-Niveaus
nachweist oder bestimmt, ob ein genomisches Delta3-Gen mutiert oder
deletiert wurde. Kurz gesagt lassen sich dafür Nukleotidsonden aus den betreffenden
Delta3-Genen erzeugen, mit denen das histologische Screening von
intaktem Gewebe sowie Gewebsproben auf das Vorhandensein (bzw. die
Abwesenheit) von für
Delta codierenden Transkripten erleichtert wird. Ähnlich wie
die diagnostischen Anwendungen von Anti-Delta3-Antikörpern kann
die Verwendung von gegen Delta3-Messages oder gegen genomische Delta3-Sequenzen gerichteten
Sonden sowohl zur prognostischen als auch zur therapeutischen Bewertung
allelischer Mutationen, die sich beispielsweise in neoplastischen
oder hyperplastischen Erkrankungen (z.B. unerwünschtem Zellwachstum) oder
einer abnormalen Gewebedifferenzierung äußern könnten, einsetzen. In Verbindung
mit Immunoassays, wie sie hier beschrieben sind, können die
Oligonukleotidsonden dazu verwendet werden, bei der Erleichterung
der Bestimmung der molekularen Basis für eine Entwicklungsstörung, an
der eine gewisse, mit der Expression (oder dem Fehlen davon) eines
Delta3-Proteins
assoziierte Abnormalität
beteiligt sein kann, zu helfen. So läßt sich beispielsweise eine
Variation in der Polypeptidsynthese von einer Mutation in einer
codierenden Sequenz unterscheiden.
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Ebenso
erfindungsgemäß umfaßt sind
Kits zur Bestimmung, ob bei einer Untersuchungsperson die Gefahr
der Entwicklung einer Krankheit bzw. eines Leidens, die bzw. das
von einer anomalen Delta3-Bioaktivität verursacht wird oder an der
bzw. an dem eine anomale Delta3-Bioaktivität beteiligt ist und/oder die
bzw. das mit einem oder mehreren spezifischen Delta3-Allelen assoziiert
ist, besteht. In einer bevorzugten Ausführungsform läßt sich
der Kit zur Bestimmung, ob bei einer Untersuchungsperson die Gefahr
der Entwicklung einer neurologischen Erkrankung oder Störung, beispielsweise
einer peripheren Neuropathie, z.B. ACCPN, besteht, verwenden.
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4.3.3 Antisense-, Ribozym-
und Triplex-Techniken
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Ein
erfindungsgemäßer Aspekt
betrifft die Verwendung der isolierten Nukleinsäure in der „Antisense"-Therapie. „Antisense"-Therapie, wie hier verwendet, bezieht
sich auf die Verabreichung oder In-situ-Erzeugung von Oligonukleotidmolekülen oder
ihren Derivaten, die mit der zellulären mRNA und/oder genomischen DNA,
die für
eines oder mehrere der betreffenden Delta3-Proteine codiert, spezifisch
unter zellulären
Bedingungen hybridisieren (z.B. binden), so daß die Expression dieses Proteins,
beispielsweise durch Hemmung der Transkription und/oder Translation,
gehemmt wird. Die Bindung kann über
herkömmliche
Basenpaarkomplementarität
oder beispielsweise im Fall der Bindung an DNA-Duplexe über spezifische
Wechselwirkungen in der großen
Furche der Doppelhelix erfolgen. Im allgemeinen bezieht sich „Antisense"-Therapie auf den
Bereich von allgemein im Fachgebiet eingesetzten Techniken und umfaßt alle
Therapien, die auf der spezifischen Bindung an Oligonukleotidsequenzen
beruhen.
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Beispielsweise
läßt sich
ein Antisense-Konstrukt der vorliegenden Erfindung als ein Expressionsplasmid
zuführen,
das, wenn es in der Zelle transkribiert wird, RNA produziert, welche
wenigstens zu einem einzigartigen Anteil der zellulären mRNA,
die für
ein Delta3-Protein codiert, komplementär ist. Alternativ handelt es
sich bei dem Antisense-Konstrukt
um eine Oligonukleotidsonde, die ex vivo erzeugt wird und die bei
ihrer Einführung
in die Zelle die Hemmung der Expression durch Hybridisierung mit
der mRNA und/oder genomischen Sequenzen eines Delta3-Gens herbeiführt. Bei
derartigen Oligonukleotidsonden handelt es sich vorzugsweise um
modifizierte Oligonukleotide, die gegenüber endogenen Nukleasen, beispielsweise
Exonukleasen und/oder Endonukleasen, resistent und daher in vivo
stabil sind. Als Antisense-Oligonukleotide verwendbare Nukleinsäuremoleküle sind
bespielsweise Phosphoramidat-, Phosphothioat- und Methylphosphonat-DNA-Analoge (siehe
auch US-Patente 5,176,996; 5,264,564 und 5,256,775). Darüber hinaus
wurden allgemeine Ansätze
zur Konstruktion von bei der Antisense-Therapie geeigneten Oligomeren
in Übersichtsartikeln
behandelt, beispielsweise von Van der Krol et al. (1988) Biotechniques
6:958–976;
und Stein et al. (1988) Cancer Res 48:2659–2668. In bezug auf Antisense-DNA
sind von der Translationsinitiationsstelle, beispielsweise zwischen
den –10-
und +10-Bereichen
der interessierenden Delta3-Nukleotidsequenz, abgeleitete Oligodesoxyribonukleotide
bevorzugt. Besonders bevorzugte Antisense-Moleküle sind nachfolgend aufgeführt:
5'TGCCGCCATCCCTCGGGGCGT3' (SEQ ID NO.16)
(Komplement
zu den Nukleotiden 326–346
der SEQ ID NO.1)
5'GGACGCTGCCGCCATCCCCT3' (SEQ ID NO.17)
(Komplement
zu den Nukleotiden 333–352
der SEQ ID NO.1)
5'GGACGCTGCCGCCATCCCCTCGGGGCGT3' (SEQ ID NO.18)
(Komplement
zu den Nukleotiden 326–352
der SEQ ID NO.1)
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Antisense-Ansätze beinhalten
die Konstruktion von Oligonukleotiden (entweder DNA oder RNA), die zu
Delta3-mRNA komplementär
sind. Die Antisense-Oligonukleotide binden an die Delta3-mRNA-Transkripte und
verhindern die Translation. Daher ist eine absolute Komplementarität, obwohl
bevorzugt, nicht erforderlich. Unter einer zu einem Anteil einer
RNA „komplementären" Sequenz, auf die
hier verwiesen wird, versteht man eine Sequenz mit ausreichender
Komplementarität,
so daß sie
an die RNA unter Ausbildung eines stabilen Duplexes hybridisieren
kann; im Fall doppelsträngiger
Antisense-Nukleinsäuren
kann somit ein Einzelstrang der Duplex-DNA oder eine Triplexformation
getestet werden. Die Fähigkeit
zur Hybridisierung hängt
sowohl vom Grad der Komplementarität als auch der Menge der Antisense-Nukleinsäure ab.
Im allgemeinen gilt, je länger die
hybridisierende Nukleinsäure
ist, desto mehr Basenfehlpaarungen mit einer RNA kann sie enthalten
und immer noch einen stabilen Duplex (oder Triplex, je nach Fall)
bilden. Ein Fachmann kann einen tolerierbaren Grad an Fehlpaarung
durch Verwendung von Standardverfahren zur Bestimmung des Schmelzpunkts
des hybridisierten Komplexes ermitteln.
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Am
wirksamsten bei der Hemmung der Translation sollten Oligonukleotide
arbeiten, die zum 5'-Ende der
Message, beispielsweise der 5'-nichttranslatierten
Sequenz bis zum und einschließlich
des AUG-Initiationscodons,
komplementär
sind. Allerdings konnte kürzlich
gezeigt werden, daß zu
den 3'-nichttranslatierten Sequenzen
von mRNAs komplementäre
Sequenzen ebenso bei der Hemmung der Translation von mRNAs wirksam
sind (Wagner, R. 1994. Nature 372:333). Daher könnten in einem Antisense-Ansatz
zur Hemmung der Translation endogener Delta3-mRNA Oligonukleotide
verwendet werden, die entweder zu den 5'- oder den 3'-nichttranslatierten,
nicht codierenden Bereichen eines Delta3-Gens komplementär sind.
Zum 5'-nichttranslatierten
Bereich der mRNA komplementäre
Oligonukleotide sollten das Komplement des AUG-Startcodons beinhalten.
Zu codierenden mRNA-Bereichen komplementäre Antisense-Oligonukleotide sind
weniger wirksame Inhibitoren der Translation, könnten aber im erfindungsgemäßen Sinne
verwendet werden. Gleichgültig,
ob sie zur Hybridisierung an den 5'-, 3'-
oder codierenden Bereich von Delta3-mRNA vorgesehen sind, sollten
Antisense-Nukleinsäuren
eine Länge
von wenigstens sechs Nukleotiden aufweisen, wobei es sich dabei
vorzugsweise um Oligonukleotide mit einer Länge im Bereich von 6 bis etwa
50 Nukleotiden handelt. In bestimmten Ausführungsformen besteht das Oligonukleotid
aus wenigstens 10 Nukleotiden, wenigstens 17 Nukleotiden, wenigstens
25 Nukleotiden oder wenigstens 50 Nukleotiden.
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Ungeachtet
der Wahl der Zielsequenz ist es bevorzugt, daß zunächst In-vitro-Untersuchungen zur Quantifizierung
der Fähigkeit
des Antisense-Oligonukleotids
zur Hemmung der Genexpression durchgeführt werden. Dabei ist es bevorzugt,
daß bei
diesen Untersuchungen Kontrollen verwendet werden, die zwischen der
Antisense-Genhemmung und nichtspezifischen biologischen Effekten
von Oligonukleotiden unterscheiden. Ebenso ist es bevorzugt, daß in diesen
Untersuchungen Niveaus der Ziel-RNA oder des Zielproteins mit dem
einer internen Kontroll-RNA oder eines internen Kontrollproteins
verglichen werden. Darüber
hinaus ist vorgesehen, daß mit
dem Antisense-Oligonukleotid erhaltene Ergebnisse mit den mit einem
Kontrolloligonukleotid erhaltenen Ergebnissen verglichen werden.
Dabei ist bevorzugt, daß das
Kontrolloligonukleotid ungefähr die
gleiche Länge
wie das Testoligonukleotid aufweist und daß sich die Nukleotidsequenz
des Oligonukleotids von der Antisense-Sequenz um nicht mehr als
zur Verhinderung der spezifischen Hybridisierung an die Zielsequenz
notwendig ist unterscheidet.
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Bei
den Oligonukleotiden kann es sich um einzelsträngige oder doppelsträngige DNA
oder RNA oder chimärische
Gemische oder Derivate oder modifizierte Versionen davon handeln.
Dabei kann das Oligonukleotid an der Basengruppierung, der Zuckergruppierung
oder dem Phosphatrückgrat
modifiziert sein, um beispielsweise die Stabilität des Moleküls, die Hybridisierung usw.
zu verbessern. Das Oligonukleotid kann weitere angehängte Gruppen,
wie beispielsweise Peptide (z.B. zum Abzielen auf Wirtszellenrezeptoren
in vivo) oder Agentien, die den Transport durch die Zellmembran
(siehe z.B. Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
86:6553–6556;
Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648–652; PCT-Veröffentlichung
Nr. WO 88/09810, veröffentlicht
am 15. Dezember 1988) oder die Blut-Hirn-Schranke (siehe z.B. PCT-Veröffentlichung
Nr. WO 89/10134, veröffentlicht
am 25. April 1988), erleichtern, durch Hybridisierung ausgelöste Spaltungsagentien
(siehe z.B. Krol et al., 1988, BioTechniques 6:958–976) oder
interkalierende Agentien (siehe z.B. Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539–549), enthalten.
Hierzu kann das Oligonukleotid mit einem weiteren Molekül, beispielsweise
einem Peptid, einem durch Hybridisierung ausgelösten Quervernetzungsmittel,
einem Transportmittel, einem durch Hybridisierung ausgelösten Spaltungsagens
usw. konjugiert sein.
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Das
Antisense-Oligonukleotid kann wenigstens eine modifizierte Basengruppierung,
die ausgewählt ist
aus der Gruppe, einschließend,
ohne darauf beschränkt
zu sein, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil,
Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin,
5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, beta-D-Galactosylcheosin,
Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin,
2-Methylguanin, 3-Methylcytosin,
5-Methylcytosin, N6-adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil,
beta-D-Mannosylcheosin,
5'-Methoxycarboxymethyluracil,
5-Methoxyuracil, 2- Methylthio-N6-isopentenyladenin,
Uracil-5-oxyessigsäure
(v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Cheosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil,
4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v),
5-Methyl-2-thiouracil,
3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin, umfassen.
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Das
Antisense-Oligonukleotid kann auch wenigstens eine modifizierte
Zuckergruppierung, ausgewählt aus
der Gruppe, einschließend,
ohne darauf beschränkt
zu sein, Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose, umfassen.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
umfaßt
das Antisense-Oligonukleotid
wenigstens ein modifiziertes Phosphatrückgrat, ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus einem Phosphorothioat, einem Phosphorodithioat,
einem Phosphoramidothioat, einem Phosphoramidat, einem Phosphordiamidat,
einem Methylphosphonat, einem Alkylphosphotriester sowie einem Formacetal
oder einem Analog davon.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
handelt es sich bei dem Antisense-Oligonukleotid um ein α-anomeres
Oligonukleotid. Ein α-anomeres Oligonukleotid
bildet spezifische doppelsträngige
Hybride mit komplementärer
RNA, bei denen im Gegensatz zu den üblichen β-Einheiten die Stränge parallel
zueinander verlaufen (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625–6641).
Bei dem Oligonukleotid handelt es sich um ein 2'-0-Methylribonukleotid (Inoue et al.,
1987, Nucl. Acids Res. 15:6131–6148)
oder ein chimärisches RNA-DNA-Analog
(Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327–330).
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Erfindungsgemäße Oligonukleotide
können
mit im Fachgebiet bekannten Standardverfahren, beispielsweise unter
Verwendung eines DNA-Syntheseautomaten
(wie er beispielsweise kommerziell von den Firmen Biosearch, Applied
Biosystems, usw. erhältlich
ist), synthetisiert werden. So können
beispielsweise Phosphorothioat-Oligonukleotide nach dem Verfahren
von Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16:3209) synthetisiert
und Methylphosphonat-Oligonukleotide unter Verwendung von CPG (controlled
pore glass)-Polymerträgern
(Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448–7451) usw.
hergestellt werden.
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Obschon
zur Sequenz des codierenden Bereichs komplementäre Antisense-Nukleinsäuren verwendet
werden könnten,
sind solche bevorzugt, die zu dem transkribierten nichttranslatierten
Bereich komplementär
sind. Noch stärker
bevorzugt sind Antisense-Nukleinsäuren, die mit der Translationsinitiationsstelle überlappen.
So lassen sich beispielsweise Antisense-Oligonukleotide, wie sie
nachfolgend aufgeführt
sind, im erfindungsgemäßen Sinne
nutzen.
5'TCAATCTGGCTCTGTTCGCG3' (SEQ ID NO.19)
(Komplement
zu den Nukleotiden 284–3030
der SEQ ID NO.1)
5'CGCTCTCTCCACCCGCGGGCCCTCAA3' (SEQ ID NO.20)
(Komplement
zu den Nukleotiden 300–325
der SEQ ID NO.1)
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Die
Antisense-Moleküle
sollten Zellen zugeführt
werden, die das Delta3 in vivo exprimieren. Zur Zuführung von
Antisense-DNA oder -RNA an Zellen wurden eine Reihe von Verfahren
entwickelt; beispielsweise können
Antisense-Moleküle
direkt in die Gewebestelle injiziert werden, oder zur Abzielung
auf die gewünschten
Zellen vorgesehene modifizierte Antisense-Moleküle (z.B. Antisense in Verknüpfung mit
Peptiden oder Antikörpern,
die spezifisch Rezeptoren oder Antigene, die auf der Zielzellenoberfläche exprimiert
werden, binden) können
systematisch verabreicht werden.
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Häufig ist
es jedoch schwierig, intrazelluläre
Konzentrationen des Antisense zu erzielen, die ausreichen, um die
Translation auf endogenen mRNAs zu unterdrücken. Daher wird in einem bevorzugten
Ansatz ein rekombinantes DNA-Konstrukt verwendet, in dem das Antisense-Oligonukleotid unter
die Kontrolle eines starken polIII- oder polII-Promotors gestellt wird. Die Verwendung
eines solchen Konstrukts zur Transfektion von Zielzellen im Patienten
führt zur
Transkription ausreichender Mengen an einzelsträngigen RNAs, die mit den endogenen
Delta3-Transkripten komplementäre
Basenpaare ausbilden und dadurch die Translation der Delta3-mRNA
verhindern. So läßt sich
beispielsweise ein Vektor in vivo so einführen, daß er von einer Zelle aufgenommen
wird und die Transkription einer Antisense-RNA steuert. Ein solcher
Vektor kann episomal bleiben oder kann chromosomal integriert werden,
solange wie er zur Produktion der gewünschten Antisense-RNA transkribiert
werden kann. Derartige Vektoren lassen sich mit im Fachgebiet bekannten
Standardverfahren der rekombinanten DNA-Technologie konstruieren.
Bei den Vektoren kann es sich um Plasmid-, Virus- oder andere im
Fachgebiet bekannte Vektoren, die zur Replikation und Expression
in Säugerzellen
verwendet werden, handeln. Die Expression der die Antisense-RNA
codierenden Sequenz kann mittels eines beliebigen im Fachgebiet
für die
Wirkung in Säuger-,
vorzugsweise menschlichen Zellen bekannten Promotors erfolgen. Solche
Promotoren können
induzierbar oder konstitutiv sein. Zu derartigen Promotoren gehören, ohne
darauf beschränkt
zu sein: der frühe
Promotorbereich des SV40 (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290:304–310), der
im 3'-LTR (long
terminal repeat) des Rous Sarkoma-Virus enthaltene Promotor (Yamamoto
et al., 1980, Cell 22:787–797),
der Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 78:1441–1445),
die regulatorischen Sequenzen des Metallothionein-Gens (Brinster
et al., 1982, Nature 296:39–42),
usw. Zur Herstellung des rekombinanten DNA-Konstrukts, das direkt
in die Gewebestelle, z.B. den Plexus choroideus oder den Hypothalamus,
eingeführt
werden kann, können
alle Arten von Plasmid-, Cosmid-, YAC- oder Virusvektoren verwendet werden.
Als Alternative können
Virusvektoren verwendet werden, die das gewünschte Gewebe selektiv infizieren
(beispielsweise können
für das
Gehirn Herpesvirusvektoren verwendet werden), wobei in diesem Fall
die Verabreichung über
einen anderen Weg (z.B. systematisch) bewerkstelligt werden kann.
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Ebenso
lassen sich die Antisense-Konstrukte der vorliegenden Erfindung
bei der Mcdulation zellulärer Aktivität sowohl
in vivo als auch bei Ex-vivo-Gewebekulturen
einsetzen, indem sie die normale biologische Aktivität eines
der Delta3-Proteine antagonisieren.
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Weiterhin
können
die Antisense-Techniken (z.B. Mikroinjektion von Antisense-Molekülen oder
Transfektion mit Plasmiden, deren Transkripte im Hinblick auf eine
Delta3-mRNA oder -Gensequenz antisense sind) zur Untersuchung der
Rolle von Delta3 bei Entwicklungsereignissen ebenso wie die normale
zelluläre
Funktion von Delta3 in adultem Gewebe verwendet werden. Solche Techniken
lassen sich in der Zellkultur einsetzen.
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Ebenso
können
zur katalytischen Spaltung von Delta3-mRNA-Transkripten vorgesehene
Ribozymmoleküle
zur Verhinderung der Translation von mRNA und der Expression von
Delta3 verwendet werden. (Siehe z.B. PCT International Publication
WO 94/11364, veröffentlicht
am 4. Oktober 1990; Sarver et al., 1990, Science 247:1222–1225).
Bei Ribozymen handelt es sich um enzymatische RNA-Moleküle, die
zur Katalyse der spezifischen Spaltung von RNA in der Lage sind.
Am Mechanismus der Ribozymwirkung ist eine sequenzspezifische Hybridisierung
des Ribozymmoleküls
an die komplementäre
Ziel-RNA mit anschließender
endonukleolytischer Spaltung beteiligt. Die Zusammensetzung von
Ribozymmolekülen
muß dabei
eine oder mehrere zur Zielgen-mRNA komplementäre Sequenzen und ebenso die
für mRNA-Spaltung
verantwortliche allgemein bekannte katalytische Sequenz enthalten.
Hinsichtlich dieser Sequenz siehe US-Patent Nr. 5,093,246, die hiermit vollinhaltlich
durch Bezugnahme aufgenommen ist. Als solches sind erfindungsgemäß ebenso
gentechnisch hergestellte Hammerhead-Motiv-Ribozymmoleküle umfaßt, die die endonukleolytische
Spaltung von für Delta3-Proteine
codierenden RNA-Sequenzen spezifisch und wirksam katalysieren.
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Spezifische
Ribozymspaltstellen innerhalb eines potentiellen RNA-Ziels werden
zunächst
durch Scanning des interessierenden Moleküls auf Ribozymspaltstellen,
die die nachfolgenden Sequenzen GUA, GUU und GUC umfassen, identifiziert.
Nach der Identifizierung können
kurze RNA-Sequenzen
mit einer Länge
zwischen 15 und 20 Ribonukleotiden, die dem die Spaltstelle enthaltenden
Bereich des Zielgens entsprechen, hinsichtlich vorhergesagter Strukturmerkmale,
wie beispielsweise Sekundärstruktur,
durch die die Oligonukleotidsequenz unbrauchbar werden kann, beurteilt
werden. Die Eignung von Kandidatensequenzen kann auch durch Testen
ihrer Zugänglichkeit
für eine
Hybridisierung mit komplementären
Oligonukleotiden unter Verwendung von Ribonuklease-Protection Assays,
beurteilt werden.
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Obschon
zur Zerstörung
von Delta3-mRNAs Ribozyme, die mRNA an stellenspezifischen Erkennungssequenzen
spalten, verwendet werden können,
ist die Verwendung von Hammerhead-Ribozymen bevorzugt. Hammerhead-Ribozyme
spalten mRNAs an Orten, die von den komplementäre Basenpaare mit der Ziel-mRNA
bildenden flankierenden Bereichen diktiert werden. Die einzige Anforderung
besteht darin, daß die Ziel-mRNA
die folgende Sequenz aus zwei Basen aufweist: 5'-UG-3'. Die Konstruktion und Produktion von Hammerhead-Ribozymen
ist im Fachgebiet allgemein bekannt und ausführlicher bei Haseloff und Gerlach, 1988,
Nature, 334:585–591
beschrieben. Es gibt hunderte potentieller Hammerhead-Ribozym-Spaltstellen in der
Nukleotidsequenz der menschlichen Delta3-cDNA (1).
Vorzugsweise wird das Ribozym gentechnisch so hergestellt, daß die Erkennungsspaltstelle
in der Nähe
des 5'-Endes der
Delta3-mRNA lokalisiert ist; d.h. um die Effizienz zu erhöhen und
die intrazelluläre
Anhäufung
nichtfunktioneller mRNA-Transkripte zu minimieren.
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Zu
den Ribozymen der vorliegenden Erfindung gehören auch RNA-Endoribonukleasen
(nachfolgend „Ribozyme
vom Cech-Typ"),
wie beispielsweise diejenige, die natürlicherweise in Tetrahymena
Thermophila vorkommt (als IVS oder L-19-IVS-RNA bekannt) und die
umfassend von Thomas Cech und Mitarbeitern beschrieben wurde (Zaug,
et al., 1984, Science, 224:574–578;
Zaug und Cech, 1986, Science, 231:470–475; Zaug, et al., 1986, Nature,
324: 429–433;
veröffentlichte
internationale Patentanmeldung Nr. WO88/04300 von University Patents
Inc.; Been und Cech, 1986, Cell, 47:207–216). Die Ribozyme vom Cech-Typ
weisen eine aktive Stelle von acht Basenpaaren auf, die an eine
Ziel-RNA-Sequenz
hybridisiert, wonach die Spaltung der Ziel-RNA erfolgt. Von der
Erfindung sind diejenigen Ribozyme vom Cech-Typ umfaßt, die
auf die acht Basenpaare großen
Sequenzen der aktiven Stelle, die in Delta3 vorhanden sind, abzielen.
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Wie
beim Antisense-Ansatz können
die Ribozyme aus modifizierten Oligonukleotiden zusammengesetzt
sein (z.B. für
verbesserte Stabilität,
verbessertes Abzielen usw.) und sollten Zellen zugeführt werden,
die das Delta3 in vivo exprimieren, z.B. Hypothalamus und/oder Plexus
choroidius. Bei einem bevorzugten Zuführungsverfahren wird ein DNA-Konstrukt verwendet,
das das Ribozym unter der Kontrolle eines starken konstitutiven
polIII- oder polII-Promotors „codiert", so daß transfizierte
Zellen ausreichende Mengen des Ribozyms produzieren, um endogene
Delta3-Messages zu zerstören
und die Translation zu hemmen. Da Ribozyme im Gegensatz zu Antisense-Molekülen katalytisch
sind, ist für
die Effizienz eine geringere intrazelluläre Konzentration erforderlich.
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Eine
endogene Delta3-Genexpression kann auch durch Inaktivierung oder „Knocking
out" des Delta3-Gens
oder seines Promotors unter Verwendung der zielgerichteten homologen
Rekombination reduziert werden (z.B. siehe Smithies et al., 1985,
Nature 317:230–234;
Thomas & Capecchi,
1987, Cell 51:503–512;
Thompson et al., 1989 Cell 5:313–321, die jeweils hiermit vollinhaltlich
durch Bezugnahme aufgenommen sind). So läßt sich beispielsweise ein
von zum endogenen Delta3-Gen (entweder den codierenden Bereichen
oder den regulatorischen Bereichen des Delta3-Gens) homologer DNA flankiertes mutantes
nichtfunktionelles Delta3 (oder eine vollkommen unverwandte DNA-Sequenz)
verwenden, und zwar mit oder ohne einen selektionierbaren Marker
und/oder einen negativen selektionierbaren Marker, um Zellen, die
Delta3 in vivo exprimieren, zu transfizieren. Die Insertion des
DNA-Konstrukts über
eine zielgerichtete homologe Rekombination führt zur Inaktivierung des Delta3-Gens.
Solche Ansätze
eignen sich insbesondere im landwirtschaftlichen Bereich, wo Modifikationen
an ES-Zellen (embryonalen Stammzellen) zur Erzeugung von Tiernachkommen
mit einem inaktiven Delta3 verwendet werden können (z.B. siehe Thomas & Capecchi 1987
und Thompson 1989, supra). Allerdings läßt sich dieser Ansatz zur Verwendung
beim Menschen anpassen, vorausgesetzt, daß die rekombinanten DNA-Konstrukte
direkt der erforderlichen Stelle in vivo unter Verwendung entsprechender
Virusvektoren, z.B. Herpesvirusvektoren, verabreicht werden oder
darauf abzielen.
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Als
Alternative läßt sich
eine endogene Delta3-Genexpression reduzieren, indem man auf zum
regulatorischen Bereich des Delta3-Gens (d.h. dem Delta3-Promotor
und/oder -Enhancern) komplementäre
Desoxyribonukleotidsequenzen abzielt, so daß Dreifachhelixstrukturen gebildet
werden, durch die die Transkription des Delta3-Gens in Zielzellen
im Körper
verhindert wird. (Siehe allgemein Helene, C. 1991, Anticancer Drug Des.,
6(6):569–84;
Helene, C., et al., 1992, Ann, N.Y. Acad. Sci., 660:27–36; und
Maher, L.J., 1992, Bioassays 14(12):807–15).
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Bei
den Nukleinsäuremolekülen, die
bei der Dreifachhelixbildung zur Hemmung der Transkription verwendet
werden, handelt es sich vorzugsweise um Einzelstrangmoleküle, die
aus Desoxyribonukleotiden bestehen. Die Basenzusammensetzung dieser
Oligonukleotide sollte nach den Basenpaarungsregeln von Hoogsteen,
die im allgemeinen das Vorhandensein relativ großer Abschnitte aus entweder
Purinen oder Pyrimidinen auf einem Strang eines Duplex erfordern,
die Dreifachhelixbildung fördern.
Die Nukleotidsequenzen können
auf Pyrimidinen beruhen, was zu TAT- und CGC-Tripletts über die
drei zusammengelagerten Stränge der
erhaltenen Dreifachhelix führt.
Die pyrimidinreichen Moleküle
sorgen für
die Basenkomplementarität
mit einem purinreichen Bereich eines Einzelstrangs des Duplex in
einer parallelen Orientierung zu diesem Strang. Daneben können Nukleinsäuremoleküle gewählt werden,
die purinreich sind und beispielsweise einen Abschnitt aus G-Resten
enthalten. Diese Moleküle
formen eine Dreifachhelix mit einem DNA-Duplex, der reich an GC-Paaren
ist, wobei die Mehrzahl der Purinreste auf einem Einzelstrang des
Zielduplex lokalisiert ist, was zu CGC-Tripletts über die
drei Stränge
im Triplex führt.
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Alternativ
kann die Anzahl der potentiellen Sequenzen, die als Ziel für die Dreifachhelixbildung
dienen können,
durch Erzeugung eines sogenannten „Switchback"-Nukleinsäuremoleküls erhöht werden.
Switchback-Moleküle werden
abwechselnd 5'-3', 3'-5' synthetisiert, so
daß sie
eine Basenpaarung mit zunächst
einem Strang eines Duplex und dann dem anderen Strang eingehen,
wodurch die Notwendigkeit für
das Vorhandensein eines relativ großen Abschnitts aus entweder
Purinen oder Pyrimidinen auf einem Strang eines Duplexes entfällt.
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Erfindungsgemäße Antisense-RNA
und -DNA-, Ribozym- und Dreifachhelixmoleküle können mit einem beliebigen im
Fachgebiet zur Synthese von DNA- und RNA-Molekülen bekannten Verfahren hergestellt werden.
Dazu gehören
Techniken zur chemischen Synthese von Oligodesoxyribonukleotiden
und Oligoribonukleotiden, die im Fachgebiet allgemein bekannt sind,
wie beispielsweise die chemische Festphasen-Phosphoramiditsynthese. Alternativ können RNA-Moleküle durch
In-vitro- und In-vivo-Transkription
von für
das Antisense-RNA-Molekül
codierenden DNA-Sequenzen erzeugt werden. Derartige DNA-Sequenzen
können
in eine große
Vielfalt von Vektoren, in denen geeignete RNA-Polymerase-Promotoren, wie beispielsweise
die T7- oder SP6-Polymerase-Promotoren enthalten sind, eingebaut
werden. Alternativ können
Antisense-cDNA-Konstrukte,
mit denen je nach dem verwendeten Promotor Antisense-RNA konstitutiv
oder induzierbar synthetisiert wird, stabil in Zellinien eingeführt werden.
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Zudem
können
verschiedene allgemein bekannte Modifikationen an Nukleinsäuremolekülen als
Mittel zur Erhöhung
der intrazellulären Stabilität und Halbwertszeit
eingeführt
werden. Zu möglichen
Modifikationen gehören,
ohne darauf beschränkt
zu sein, die Addition flankierender Sequenzen aus Ribonukleotiden
oder Desoxyribonukleotiden an die 5'- und/oder 3'-Enden des Moleküls oder die Verwendung von
Phosphorothioat- oder 2'-O-Methyl-
statt Phosphodiesterase-Verknüpfungen
im Oligodesoxyribonukleotidrückgrat.
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4.4 Polypeptide der vorliegenden
Erfindung
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Durch
die vorliegende Erfindung werden auch Delta3-Polypeptide zur Verfügung gestellt,
die von anderen zellulären
Proteinen, vor allem anderen Signaltransduktionsfaktoren und/oder
Transkriptionsfaktoren, die normalerweise mit dem Delta3-Polypeptid
assoziiert sein können,
isoliert werden oder ansonsten weitgehend frei davon sind. Der Begriff „weitgehend
frei von anderen zellulären
Proteinen" (hier
auch als „verunreinigende
Proteine" bezeichnet)
bzw. „weitgehend
reine oder gereinigte Präparationen" ist so definiert,
daß er Präparationen
von Delta3-Polypeptiden mit weniger als etwa 20% (an Trockengewicht)
verunreinigendem Protein und vorzugsweise mit weniger als etwa 5%
verunreinigendem Protein umfaßt.
Funktionelle Formen der betreffenden Polypeptide lassen sich zum
ersten Mal als gereinigte Präparationen
unter Verwendung eines wie hier beschriebenen klonierten Gens präparieren.
Unter „gereinigt" versteht man in
bezug auf ein Peptid oder eine DNA- oder RNA-Sequenz, daß das angegebene
Molekül
bei weitgehender Abwesenheit anderer biologischer Makromoleküle, wie
z.B. anderer Proteine, vorliegt. Dabei versteht man unter dem Begriff „gereinigt", wie er hier verwendet
wird, daß vorzugsweise
wenigstens 80% Trockengewicht, stärker bevorzugt im Bereich von 95–99 Gew.-%
und am meisten bevorzugt wenigstens 99,8 Gew.-% biologische Makromoleküle des gleichen Typs
vorliegen (wobei jedoch Wasser, Puffer und andere kleine Moleküle, vor
allem Moleküle
mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 5000 vorhanden sein
können).
Der Begriff „rein", wie er hier verwendet
wird, weist vorzugsweise die gleichen numerischen Beschränkungen
auf wie „gereinigt" unmittelbar oberhalb. „Isoliert" und „gereinigt" umfassen weder natürliche Materialien
in ihrem nativen Zustand noch natürliche Materialien, die in
Bestandteile getrennt wurden (z.B. in einem Acrylamidgel), die jedoch
weder als reine (z.B. ohne verunreinigende Proteine oder Chromatographiereagentien,
wie z.B. Denaturierungsmitteln und Polymeren, z.B. Acrylamid oder
Agarose) Substanzen oder Lösungen
erhalten wurden. In bevorzugten Ausführungsformen fehlen gereinigten
Delta3-Präparationen
jegliche verunreinigende Proteine aus dem gleichen Tier, von dem
Delta3 normalerweise produziert wird, wie sich beispielsweise durch
rekombinante Expression eines menschlichen Delta3-Proteins in einer
nichtmenschlichen Zelle bewerkstelligen läßt.
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Erfindungsgemäß umfaßt sind
Vollängen-Proteine
oder -Fragmente, die einem oder mehreren bestimmten Motiven und/oder
einer oder mehreren Domänen
oder willkürlichen
Größen, beispielsweise
wenigstens etwa 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150 Aminosäuren in
der Länge
entsprechen. Dabei umfaßt
die Erfindung alle Proteine, die von den im obigen, die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren beschreibenden
Abschnitt beschriebenen Nukleinsäuren
codiert werden.
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So
können
beispielsweise isolierte Delta3-Polypeptide die gesamte oder einen
Anteil der Aminosäuresequenz,
die einem in SEQ ID No: 2 dargestellten Delta3-Polypeptid entspricht,
enthalten. Isolierte Peptidylanteile von Delta3-Proteinen lassen
sich durch das Screening von Peptiden, die von dem entsprechenden Fragment
der für
derartige Peptide codierenden Nukleinsäure rekombinant hergestellt
wurden, erhalten. Darüber
hinaus können
Fragmente mit im Fachgebiet bekannten Techniken, wie beispielsweise
herkömmlicher f-Moc-
oder t-Boc-Festphasenchemie nach Merrifield chemisch synthetisiert
werden. So kann beispielsweise ein Delta3-Polypeptid der vorliegenden
Erfindung willkürlich
in Fragmente der gewünschten
Länge ohne Überlappung
der Fragmente oder vorzugsweise in überlappende Fragmente einer
gewünschten
Länge aufgeteilt werden.
Die Fragmente lassen sich (rekombinant oder durch chemische Synthese)
herstellen und testen, um diejenigen Peptidylfragmente zu identifizieren,
die entweder als Agonisten oder Antagonisten eines Wildtyp-(z.B. „authentischen")Delta3-Proteins
fungieren können.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft rekombinante
Formen der Delta3-Proteine. Von der vorliegenden Erfindung bevorzugte
rekombinante Polypeptide sind neben nativen Delta3-Proteinen wenigstens
etwa 90% homolog oder stärker
bevorzugt wenigstens etwa 92% oder 94% homolog und am meisten bevorzugt
wenigstens etwa 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% homolog zu einer durch
SEQ ID No: 2 dargestellten Aminosäuresequenz. In einer Ausführungsform
weist das erfindungsgemäße Delta-Polypeptid
eine Gesamtaminosäuresequenzhomologie
oder -identität
von wenigstens etwa 70%, wenigstens etwa 75%, wenigstens etwa 80%,
wenigstens etwa 85%, wenigstens etwa 90%, wenigstens etwa 95%, wenigstens
etwa 98% oder wenigstens etwa 99% zur Aminosäuresequenz SEQ ID No. 2 auf.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist ein Delta3-Protein
die Aminosäuresequenz
SEQ ID No: 2 auf. In weiteren besonders bevorzugten Ausführungsformen
weist das Delta3-Protein eine Delta3-Bioaktivität auf.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner rekombinante Formen eines
der betreffenden Delta3-Polypeptide, die von aus einem Säugerorganismus
stammenden Genen codiert werden und die Aminosäuresequenzen aufweisen, die
evolutionsmäßig mit
dem in SEQ ID No: 2 dargestellten Delta3-Protein verwandt sind.
Solche rekombinanten Delta3-Polypeptide sind vorzugsweise dazu in
der Lage, entweder in der Rolle eines Agonisten oder der eines Antagonisten
mindestens einer biologischen Aktivität eines Wildtyp-(„authentischen")Delta3-Proteins
des beigefügten
Sequenzprotokolls zu fungieren. Der Begriff „evolutionsmäßig verwandt
mit" bezieht sich
in bezug auf Aminosäuresequenzen
des menschlichen Delta3-Proteins sowohl auf Polypeptide mit Aminosäuresequenzen,
die natürlich
entstanden sind, als auch auf Mutationsvarianten der Delta3-Polypeptide,
die beispielsweise mittels kombinatorischer Mutagenese abgeleitet
sind. Derartige von der vorliegenden Erfindung bevorzugte evolutionsmäßig abgeleitete
Delta3-Polypeptide weisen eine Delta3-Bioaktivität auf und sind wenigstens 80%
homolog und stärker
bevorzugt 85% homolog und am meisten bevorzugt 90% homolog zur Aminosäuresequenz
der SEQ ID No: 2. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein Delta3-Protein
die codierende Aminosäuresequenz
der SEQ ID No: 2.
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Im
allgemeinen sind Polypeptide, auf die hier so verwiesen wird, daß sie eine
Aktivität
(z.B. „Bioaktivität") eines Delta3-Proteins
aufweisen, als Polypeptide definiert, die eine allen oder einem
Anteil der Aminosäuresequenzen
eines in SEQ ID No: 2 gezeigten Delta3-Proteins entsprechende (z.B.
identische oder weitgehend identische) Aminosäuresequenz beinhalten und die
die gesamten oder einen Anteil der biologischen/biochemischen Aktivitäten eines
natürlich
vorkommenden Delta3-Proteins imitieren oder antagonisieren. In bevorzugten Ausführungsformen
wechselwirkt ein Delta3-Protein der vorliegenden Erfindung spezifisch
mit einem Notch-Polypeptid.
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Gegenstand
der Erfindung sind verschiedene Formen von Delta3-Proteinen, die
insbesondere alle im sich auf erfindungsgemäße Nukleinsäuren beziehenden Abschnitt „4.3" beschriebenen Delta3-Proteine
umfassen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Produktion der
betreffenden Delta3-Polypeptide. So läßt sich beispielsweise eine
mit einem die Expression einer die betreffenden Polypeptide codierenden Nukleotidsequenz
steuernden Nukleinsäurevektor
transfizierte Wirtszelle unter entsprechenden Bedingungen kultivieren,
um die Expression des Peptids stattfinden zu lassen. Die Zellen
können
geerntet und lysiert werden, und das Protein kann isoliert werden.
Eine Zellkultur beinhaltet Wirtszellen, Medien und weitere Nebenprodukte.
Geeignete Medien zur Zellkultur sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
Das rekombinante Delta3-Polypeptid läßt sich aus Zellkulturmedium
und/oder aus Wirtszellen unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten
Techniken zur Reinigung von Proteinen, einschließlich Ionenaustauschchromatographie,
Gelfiltrationschromatographie, Ultrafiltration, Elektrophorese und
Immunaffinitätsreinigung
mit für
ein solches Peptid spezifischen Antikörpern, isolieren. In einer
bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei dem rekombinanten Delta3-Polypeptid um ein Fusionsprotein,
das eine Domäne
enthält,
die seine Reinigung erleichtert, wie z.B. ein GST-Fusionsprotein oder
ein Poly(His)-Fusionsprotein.
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Zudem
ist allgemein ersichtlich, daß es
unter gewissen Umständen
vorteilhaft sein kann, Varianten für eines der betreffenden Delta3-Polypeptide bereitzustellen,
die mit beschränkter
Kapazität
entweder als ein Delta3-Agonist (imitierend) oder ein Delta3-Antagonist
fungieren, um lediglich eine Teilmenge der biologischen Aktivitäten der
natürlich
vorkommenden Form des Proteins zu fördern bzw. zu hemmen. Somit
lassen sich spezifische biologische Effekte durch Behandlung mit
einer Variante mit beschränkter
Funktion und mit weniger Nebenwirkungen im Vergleich zur Behandlung
mit Agonisten oder Antagonisten, die auf alle biologischen Aktivitäten von
natürlich
vorkommenden Formen von Delta3-Proteinen
gerichtet sind, hervorrufen.
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Varianten
und/oder Mutanten lassen sich für
jedes der betreffenden Delta3-Proteine durch Mutagenese, wie beispielsweise
durch diskrete Punktmutation(en) oder durch Verkürzung erzeugen. So kann beispielsweise
eine Mutation Homologe ergeben, die weitgehend die gleiche oder
lediglich eine Teilmenge der biologischen Aktivität des Delta3-Polypeptids, von
dem es abgeleitet wurde, behalten. Alternativ lassen sich antagonistische
Formen des Proteins erzeugen, die zur Hemmung der Funktion der natürlich vorkommenden
Form des Proteins fähig
sind, indem sie beispielsweise kompetitiv an ein nachgeschaltetes
oder vorgeschaltetes Mitglied der Delta3-Kaskade, die das Delta3-Protein
umfaßt,
binden. Darüber
hinaus können
agonistische Formen des Proteins erzeugt werden, die konstitutiv
aktiv sind.
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Die
rekombinanten Delta3-Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen
auch Homologe der authentischen Delta3-Proteine, wie beispielsweise
Versionen jenes Proteins, die gegenüber proteolytischer Spaltung
resistent sind, wie beispielsweise aufgrund von Mutationen, die
die Ubiquitinierung oder andere mit dem Protein assoziierte enzymatische
Zielmechanismen verändern.
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Delta3-Polypeptide
können
auch chemisch modifiziert werden, um Delta3-Derivate durch Ausbildung kovalenter
oder zusammengelagerter Konjugate mit anderen chemischen Gruppierungen,
wie z.B. Glycosylgruppen, Lipiden, Phosphat-, Acetylgruppen und
dergleichen, zu erzeugen. Kovalente Derivate von Delta3-Proteinen
lassen sich auch herstellen, indem man die chemischen Gruppierungen
mit funktionellen Gruppen auf Aminosäureseitenketten des Proteins
oder am N-Terminus oder am C-Terminus
des Polypeptids verknüpft.
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Die
Modifikation der Struktur der betreffenden Delta3-Polypeptide kann
solchen Zwecken wie der Verbesserung der therapeutischen oder prophylaktischen
Wirksamkeit, der Stabilität
(z.B. Ex-vivo-Haltbarkeit und Resistenz gegenüber proteolytischem Abbau in
vivo) oder posttranslationalen Modifikationen (z.B. zur Veränderung
des Phosphorylierungsmusters des Proteins) dienen. Derartige modifizierte
Peptide werden, wenn sie zur Beibehaltung mindestens einer Aktivität der natürlich vorkommenden
Form des Proteins oder zur Produktion spezifischer Antagonisten
davon vorgesehen sind, als funktionelle Äquivalente der hier ausführlicher
beschriebenen Delta3-Polypeptide betrachtet. Solche modifizierten
Polypeptide können
beispielsweise durch Aminosäuresubstitution,
-deletion oder -addition hergestellt werden.
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Beispielsweise
kann man vernünftigerweise
erwarten, daß ein
isolierter Austausch eines Leucins gegen ein Isoleucin oder Valin,
eines Aspartats gegen ein Glutamat, eines Threonins gegen ein Serin
oder ein ähnlicher
Austausch einer Aminosäure
gegen eine strukturverwandte Aminosäure (d.h. isosterische und/oder isoelektrische
Mutationen) keinen größeren Effekt
auf die biologische Aktivität
des entstandenen Moleküls
aufweist. Bei konservativen Austauschen handelt es sich um Austausche,
die innerhalb einer Familie von Aminosäuren, die in ihren Seitenketten
miteinander verwandt sind, stattfinden. Genetisch codierte Aminosäuren lassen
sich in vier Familien aufteilen: (1) sauer = Aspartat, Glutamat;
(2) basisch = Lysin, Arginin, Histidin; (3) unpolar = Alanin, Valin,
Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan;
und (4) ungeladen polar = Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystein,
Serin, Threonin, Tyrosin. In ähnlicher
Weise kann das Aminosäurenrepertoir
in (1) sauer = Aspartat, Glutamat; (2) basisch = Lysin, Arginin,
Histidin, (3) aliphatisch = Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin,
Serin, Threonin, wobei Serin und Threonin gegebenenfalls getrennt
als aliphatischhydroxyl gruppiert werden können; (4) aromatisch = Phenylalanin,
Tyrosin, Tryptophan; (5) Amid = Asparagin, Glutamin; und (6) schwefelhaltig
= Cystein und Methionin, gruppiert werden (siehe beispielsweise
Biochemistry, 2. Aufl., hrsg. von L. Stryer, WH Freeman and Co.:
1981). Ob eine Änderung
der Aminosäuresequenz
eines Peptids zu einem funktionellen Delta3-Homolog führt (z.B.
funktionell im Sinne, daß das
entstandene Polypeptid die Wildtypform imitiert oder antagonisiert),
läßt sich
leicht bestimmen, indem man die Fähigkeit der Peptidvariante,
in Zellen eine Antwort in ähnlicher
Weise wie das Wildtypprotein zu produzieren oder eine solche Antwort
kompetitiv zu hemmen, beurteilt. Polypeptide, in denen mehr als
ein Austausch stattgefunden hat, können leicht auf die gleiche
Weise getestet werden.
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Die
vorliegende Erfindung sieht ferner ein Verfahren zur Erzeugung von
Sätzen
von kombinatorischen Mutanten der betreffenden Delta3-Proteine ebenso
wie von Verkürzungsmutanten
vor und eignet sich vor allem zur Identifizierung potentieller funktioneller
Sequenzvarianten (z.B. Homologe). Der Zweck des Screening solcher
kombinatorischer Bibliotheken besteht beispielsweise in der Erzeugung
neuer Delta3-Homologe, die entweder als Agonisten oder Antagonisten
wirken können
oder alternativ vollkommen neuartige Aktivitäten besitzen.
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In
einer Ausführungsform
wird die variegierte Bibliothek von Delta3-Varianten durch kombinatorische Mutagenese
auf dem Nukleinsäureniveau
erzeugt und durch eine variegierte Genbank codiert. Beispielsweise läßt sich
ein Gemisch aus synthetischen Oligonukleotiden enzymatisch in Gensequenzen
ligieren, so daß der degenerierte
Satz potentieller Delta3-Sequenzen
in Form individueller Polypeptide oder alternativ als Satz größerer Fusionsproteine
(z.B. für
Phagen-Display), die den Satz der Delta3-Sequenzen darin enthalten,
exprimierbar ist.
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Es
gibt viele Wege, mit denen solche Bibliotheken potentieller Delta3-Homologe oder -Varianten
von einer degenerierten Oligonukleotidsequenz erzeugt werden können. Die
chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz läßt sich
in einem DNA-Syntheseautomaten durchführen, wonach die synthetisierten Gene
in einen entsprechenden Expressionsvektor ligiert werden. Der Zweck
eines degenerierten Satzes von Genen besteht darin, in einem einzigen
Gemisch alle für
den gewünschten
Satz potentieller Delta3-Sequenzen codierende Sequenzen bereitzustellen.
Die Synthese degenerierter Oligonukleotide ist im Fachgebiet allgemein
bekannt (siehe beispielsweise Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3;
Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proc 3rd Cleveland Sympos.
Macromolecules, Hrsg. AG Walton, Amsterdam: Elsevier S. 273–289; Itakura
et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984)
Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477. Solche
Techniken wurden bei der direkten Evolution anderer Proteine eingesetzt
(siehe beispielsweise Scott et al. (1990) Science 249:386–390; Roberts
et al. (1992) PNAS 89:2429–2433;
Devlin et al. (1990) Science 249: 404–406; Cwirla et al. (1990)
PNAS 87: 6378–6382;
ebenso wie US-Patente Nr. 5,223,409, 5,198,346 und 5,096,815).
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Gleichfalls
kann eine Bibliothek aus codierenden Sequenzfragmenten für einen
Delta3-Klon bereitgestellt werden, um eine variegierte Population
von Delta3-Fragmenten zum Screening und zur nachfolgenden Selektion
bioaktiver Fragmente zu erzeugen. Zur Erzeugung solcher Bibliotheken sind
verschiedenartige Techniken im Fachgebiet bekannt, einschließlich chemischer
Synthese. In einer Ausführungsform
lassen sich codierende Sequenzfragmente erzeugen, indem man (i)
ein doppelsträngiges
PCR-Fragment einer
codierenden Delta3-Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen,
bei denen ein Stammbruch nur etwa einmal pro Molekül stattfindet,
behandelt; (ii) die doppelsträngige
DNA denaturiert; (iii) die DNA unter Bildung doppelsträngiger DNA
renaturiert, die Sense/Antisense-Paare aus unterschiedlichen Produkten
mit Stammbruch enthalten kann; (iv) einzelsträngige Anteile aus wieder gebildeten
Duplexen durch Behandlung mit S1-Nuklease entfernt und (v) die erhaltene
Fragmentbibliothek in einen Expressionsvektor ligiert. Mit diesem
beispielhaften Verfahren läßt sich
eine Expressionsbibliothek ableiten, die für N-terminale, C-terminale
und interne Fragmente verschiedener Größe codiert.
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Im
Fachgebiet ist eine große
Bandbreite an Techniken zum Screening von Genprodukten aus durch Punktmutationen
oder Verkürzung
hergestellten kombinatorischen Bibliotheken sowie zum Screening
von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer bestimmten Eigenschaft
bekannt. Derartige Techniken lassen sich im allgemeinen an das schnelle
Screening der durch die kombinatorische Mutagenese von Delta3-Homologen
erzeugten Genbanken anpassen. Die am häufigsten verwendeten Techniken
zum Screening großer
Genbanken umfassen typischerweise die Klonierung der Genbank in
replizierbare Expressionsvektoren, die Transformation entsprechender
Zellen mit der erhaltenen Vektorbank und die Expression der kombinatorischen
Gene unter Bedingungen, bei denen der Nachweis einer gewünschten
Aktivität
die relativ einfache Isolierung des für das Gen, dessen Produkt nachgewiesen
wurde, codierenden Vektors erleichtert. Alle der zur Veranschaulichung unten
beschriebenen Tests sind einer Analyse mit hohem Durchsatz zugänglich,
wie sie zum Screening einer großen
Anzahl von degenerierten Delta3-Sequenzen, die durch kombinatorische
Mutagenesetechniken erzeugt wurden, benötigt wird. Mit der kombinatorischen
Mutagenese können
sehr große
Bibliotheken von mutanten Proteinen, beispielsweise in der Größenordnung
von 1026 Molekülen, erzeugt werden. Das Screening von
kombinatorischen Bibliotheken dieser Größe kann selbst mit Screening-Tests
mit hohem Durchsatz eine technische Herausforderung darstellen.
Zur Überwindung
dieses Problems wurde kürzlich
eine neue Technik unter dem Namen REM (recrusive ensemble mutagenesis)
entwickelt, die es gestattet, den sehr hohen Anteil an nichtfunktionellen
Proteinen in einer Zufallsbibliothek zu vermeiden, und mit der einfach
die Häufigkeit
funktioneller Proteine erhöht
wird, womit die zur Erzielung eines geeigneten Querschnitts des
Sequenzraums benötigte
Komplexität
verringert wird. Bei REM handelt es sich um einen Algorithmus, mit
dem die Häufigkeit funktioneller
Mutanten in einer Bibliothek bei Einsatz eines entsprechenden Selektions-
oder Screening-Verfahrens
erhöht
wird (Arkin und Yourvan, 1992, PNAS USA 89:7811–7815; Yourvan et al., 1992,
Parallel Problem Solving from Nature, 2., In Maenner und Manderick,
Hrsg., Elsevir Publishing Co., Amsterdam, S. 401–410; Delgrave et al., 1993,
Protein Engineering 6(3):327–331).
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Ebenso
sieht die Erfindung die Reduktion der Delta3-Proteine vor, um Mimetika
zu erzeugen, beispielsweise Peptid- oder Nichtpeptidagentien, die
in der Lage sind, an ein Delta3-Protein zu binden und/oder die Bindung
eines Delta3-Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit entweder
vorgeschalteten oder nachgeschalteten Komponenten einer Delta/Notch-Signalisierungskaskade,
wie beispielsweise Bindungsproteinen oder Interaktoren, zu stören. Somit
eignen sich derartige mutagene Techniken, wie sie oben beschrieben
sind, auch zur Kartierung der Determinanten der Delta3-Proteine,
die an Protein-Protein-Wechselwirkungen, beispielsweise im Zusammenhang
mit der Bindung des betreffenden Delta3-Polypeptids an Proteine,
die eine vorgeschaltete Funktion ausüben können (einschließlich sowohl
Aktivatoren als auch Repressoren seiner Aktivität), oder an Proteine oder Nukleinsäuren, die
eine dem Delta3-Polypeptid
nachgeschaltete Funktion ausüben können, gleichgültig, ob
sie von diesem positiv oder negativ reguliert werden, beispielsweise
Notch, teilnehmen. Zur Veranschaulichung lassen sich die kritischen
Reste eines betreffenden Delta3-Polypeptids, die an der molekularen
Erkennung beispielsweise des Notch-Genprodukts oder einer anderen,
einem Delta3-Gen vor-
oder nachgeschalteten Komponente beteiligt sind, bestimmen und zur
Erzeugung von von Delta abgeleiteten peptidomimetischen Verbindungen,
die die Bindung des authentischen Delta3-Proteins mit jener Gruppierung
kompetitiv hemmen, verwenden. Durch Einsatz beispielsweise von Rastermutagenese
zur Kartierung der Aminosäurereste
eines jeden der betreffenden Delta3-Proteine, die an der Bindung
anderer extrazellulärer Proteine
beteiligt sind, können
peptidomimetische Verbindungen erzeugt werden, die diejenigen Reste
des Delta3-Proteins, welche die Wechselwirkung erleichtern, imitieren.
Solche Mimetika können
dann zur Störung der
normalen Funktion eines Delta3-Proteins eingesetzt werden. Beispielsweise
lassen sich nichthydrolysierbare Peptidanaloge solcher Reste unter
Verwendung von Benzodiazepin (siehe z.B. Freidinger et al. in Peptides:
Chemistry and Biology, G.R. Marshall Hrsg., ESCOM Publischer: Leiden,
Niederlande, 1988), Azepin (siehe z.B. Huffman et al. in Peptides:
Chemistry and Biology, G.R. Marshall Hrsg., ESCOM Publischer: Leiden, Niederlande,
1988), substituierten gamma-Lactam-Ringen (Garvey et al. in Peptides: Chemistry
and Biology, G.R. Marshall Hrsg., ESCOM Publischer: Leiden, Niederlande,
1988), Ketomethylen-Pseudopeptiden
(Ewenson et al. (1986) J Med Chem 29:295; und Ewenson et al. in
Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American
Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, USA, 1985),
b-Turn-Dipeptidkernen (Nagai
et al. (1985) Tetrahedron Lett 26:647; und Sato et al. (1986) J
Chem Soc Perkin Trans 1:1231) sowie b-Aminoalkoholen (Gordon et
al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126:419; und Dann et al. (1986)
Biochem Biophys Res Commun 134:71) erzeugen.
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4.4.1 Zellen, die rekombinante
Delta3-Polypeptide exprimieren
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine zur Expression einer
rekombinanten Form der betreffenden Delta3-Polypeptide transfizierte
Wirtszelle. Bei der Wirtszelle kann es sich um eine beliebige prokaryontische
oder eukaryontische Zelle handeln. Somit läßt sich eine aus der Klonierung
von Delta3-Proteinen stammende Nukleotidsequenz, die für das gesamte
Vollängenprotein
oder einen ausgewählten
Anteil davon codiert, zur Produktion einer rekombinanten Form eines
Delta3-Polypeptids über mikrobielle
oder eukaryontische zelluläre
Prozesse verwenden. Bei dem Ligieren der Polynukleotidsequenz in
ein Genkonstrukt, wie beispielsweise einen Expressionsvektor, sowie
dem Transformieren oder Transfizieren in Wirte, und zwar eukaryontische
(Hefe-, Vogel-, Insekten- oder Säuger-)
oder prokaryontische (Bakterien-)Zellen,
handelt es sich um Standardverfahren, die bei der Produktion anderer
allgemein bekannter Proteine, z.B. MAP-Kinase, S. 53, WTI, PTP-Phosphotasen, SRC
und dergleichen, verwendet werden. Ähnliche Verfahren oder Modifikationen davon
lassen sich zur Herstellung rekombinanter Delta3-Polypeptide mit
mikrobiellen Mitteln oder Gewebekulturtechnologie gemäß der vorliegenden
Erfindung einsetzen.
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Die
rekombinanten Delta3-Gene lassen sich durch Ligieren einer für ein Delta3-Protein
oder einen Anteil davon codierenden Nukleinsäure in einen zur Expression
in prokaryontischen Zellen oder/und eukaryontischen Zellen geeigneten
Vektor herstellen. Expressionsvektoren zur Produktion rekombinanter
Formen der betreffenden Delta3-Polypeptide umfassen Plasmide und
andere Vektoren. So gehören
beispielsweise zu den für
die Expression eines Delta3-Polypeptids geeigneten Vektoren Plasmide
der folgenden Arten: von pBR322 abgeleitete Plasmide, von pEMBL
abgeleitete Plasmide, von pEX abgeleitete Plasmide, von PBTac abgeleitete Plasmide
sowie von pUC abgeleitete Plasmide zur Expression in prokaryontischen
Zellen, wie z.B. E. coli.
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Für die Expression
rekombinanter Proteine in Hefe gibt es eine Reihe von Vektoren.
So sind beispielsweise YEP24, YIP5, YEP51, YEP52, pYES2 und YRP17
Klonierungs- und Expressionsvehikel, die sich bei der Einführung genetischer
Konstrukte in S. cerevisiae eignen (siehe z.B. Broach et al. (1983)
in Experimental Manipulation of Gene Expression, Hrsg. M. Inouye
Academic Press, S. 83, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen). Diese
Vektoren können
in E. coli aufgrund des Vorhandenseins des pBR322 ori und in S.
cerevisiae aufgrund der Replikationsdeterminante des 2-Mikron-Plasmids der Hefe
replizieren. Darüber
hinaus können
Arzneistoffresistenzmarker wie beispielsweise Ampicillin verwendet
werden. In einer der Veranschaulichung dienenden Ausführungsform
wird ein Delta3-Polypeptid unter rekombinanter Verwendung eines
durch Subklonieren des in SEQ ID No:1 dargestellten Delta3-Gens
erzeugten Expressionsvektors hergestellt.
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Die
bevorzugten Säugerexpressionsvektoren
enthalten sowohl prokaryontische Sequenzen, um die Vermehrung des
Vektors in Bakterien zu erleichtern, sowie eine oder mehrere eukaryontische
Transkriptionseinheiten, die in eukaryontischen Zellen exprimiert
werden. Beispiele für
zur Transfektion eukaryontischer Zellen geeignete Säugerexpressionsvektoren
sind die von pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo,
pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo und pHyg abgleiteten
Vektoren. Einige dieser Vektoren sind mit Sequenzen von Bakterienplasmiden,
wie z.B. pBR322 modifiziert, um die Replikation und Arzneistoffresistenzselektion
sowohl in prokaryontischen als auch eukaryontischen Zellen zu erleichtern.
Als Alternative lassen sich Derivate von Viren, wie beispielsweise
dem Rinderpapillomavirus (BPV-1) oder dem Epstein-Barr-Virus (pHEBo,
von pREP abgeleitet und p205) zur transienten Expression von Proteinen
in eukaryontischen Zellen verwenden. Die verschiedenen bei der Herstellung
der Plasmide und der Transformation der Wirtsorganismen eingesetzten
Verfahren sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Hinsichtlich weiterer
geeigneter Expressionssysteme sowohl für prokaryontische als auch
eukaryontische Zellen ebenso wie allgemeiner rekombinanter Vorgehensweisen,
siehe Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. Auflage, hrsg. von Sambrook,
Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)
Kapitel 16 und 17.
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In
einigen Fällen
kann es wünschenswert
sein, das rekombinante Delta3-Polypeptid
unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystems zu exprimieren.
Zu derartigen Baculovirus-Expressionssystemen gehören beispielsweise
von pVL abgeleitete Vektoren (wie z.B. pVL1392, pVL1393 und pVL941,
von pAcUW abgeleitete Vektoren (wie z.B. pAcUW1) sowie von pBlueBac
abgeleitete Vektoren (wie z.B. das β-gal enthaltende pBlueBac III).
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Ist
die Expression nur eines Anteils eines Delta3-Proteins wünschenswert,
wie beispielsweise einer Form, der ein Teil des N-Terminus fehlt, d.h.
einer Verkürzungsmutante,
der das Signalpeptid fehlt, so kann es notwendig sein, das die gewünschte zu
exprimierende Sequenz enthaltende Oligonukleotidfragment mit einem Startcodon
(ATG) zu versehen. Es ist im Fachgebiet allgemein bekannt, daß sich ein
Methionin in der N-terminalen Stellung durch die Verwendung des
Enzyms Methionin-Aminopeptidase
(MAP) enzymatisch abspalten läßt. MAP
wurde aus E. coli (Ben-Bassat et al. (1987) J. Bacteriol. 169:751–757) und
Salmonella typhimurium kloniert und seine In-vitro-Aktivität anhand
rekombinanter Proteine demonstriert (Miller et al. (1987) PNAS 84:2718–2722).
Daher kann, falls gewünscht,
die Entfernung eines N-terminalen Methionins entweder in vivo durch
Expression von Delta abgeleiteter Polypeptide in einem MAP produzierenden
Wirt (z.B. E. coli oder CM89 oder S. cerevisiae) oder in vitro durch
Verwendung von gereinigtem MAP (z.B. Verfahren nach Miller et al.,
supra) erreicht werden.
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In
weiteren Ausführungsformen
könnten
zur Produktion rekombinanter Proteine transgene Tiere, die ausführlicher
unten beschrieben sind, verwendet werden.
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4.4.2 Fusionsproteine
und Immunogene
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
können
die für
das Polypeptid codierenden Sequenzen als Teil eines Fusionsgens,
das eine ein anderes Polypeptid codierende Nukleotidsequenz enthält, eingebaut
werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei dem Delta3-Polypeptid
um ein Delta3-Ig-Polypeptid. Dabei kann das Delta3-Ig-Polypeptid die gesamte
extrazelluläre
Domäne
von Delta3, z.B. menschliches Delta3, oder eine Variante davon umfassen.
So kann beispielsweise ein Delta3-Ig-Polypeptid eine Aminosäuresequenz
von etwa Aminosäure
1 bis etwa Aminosäure
529 der SEQ ID No. 2 umfassen. Andere bevorzugte Delta3-Ig-Proteine
umfassen kein Signalpeptid und somit vorzugsweise nicht etwa Aminosäure 1 bis
etwa Aminosäure
17 der SEQ ID No. 2. Alternativ kann ein Delta3-Ig-Fusionsprotein
einen Teil der extrazellulären
Domäne
eines Delta3-Proteins oder eine Variante eines Teils der extrazellulären Domäne eines Delta3-Proteins
umfassen. Zu den bevorzugten Teilen der extrazellulären Domäne gehören Anteile
mit wenigstens einem in 2 gezeigten
Motiv. So kann ein Delta3-Ig-Fusionsprotein
beispielsweise wenigstens eine EGF-ähnliche Wiederholung umfassen.
Ein Delta3-Ig-Fusionsprotein kann ferner eine DSL-Domäne umfassen.
Ferner kann ein Delta3-Ig-Fusionsprotein auch ein Signalpeptid umfassen.
Delta3-Ig-Fusionsproteine lassen sich wie beispielsweise im US-Patent
Nr. 5,434,131 beschrieben herstellen.
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Diese
Art von Expressionssystem kann unter Bedingungen, bei denen es wünschenswert
ist, ein immunogenes Fragment eines Delta3-Proteins zu produzieren,
geeignet sein. So läßt sich
beispielsweise das VP6-Capsidprotein
aus Rotavirus als immunologisches Trägerprotein für Anteile
des Delta3-Polypeptids entweder in der monomeren Form oder in Form
eines Viruspartikels verwenden. Die dem Anteil eines betreffenden
Delta3-Proteins, gegen den Antikörper
produziert werden sollen, entsprechenden Nukleinsäuresequenzen
können
in ein Fusionsgenkonstrukt, das codierende Sequenzen für ein spätes Vacciniavirus-Strukturprotein enthält, eingebaut
werden, so daß ein
Satz rekombinanter Viren, die Delta3-Epitope als Teil des Virions umfassende
Fusionsproteine exprimieren, produziert wird. Unter Verwendung immunogener
Fusionsproteine, bei denen die Fusionsproteine mit dem Hepatitis-B-Oberflächenantigen
genutzt werden, konnte demonstriert werden, daß sich rekombinante Hepatitis-B-Virionen
ebenso in dieser Rolle einsetzen lassen. In ähnlicher Weise können für Fusionsproteine,
die einen Anteil eines Delta3-Proteins sowie das Poliovirus-Capsidprotein
enthalten, codierende chimärische
Konstrukte erzeugt werden, um die Immunogenität des Satzes von Polypeptidantigenen
zu verbessern (siehe beispielsweise EP-Veröffentlichung Nr.: 0259149;
und Evans et al. (1989) Nature 339:385; Huang et al. (1988) J. Virol.
62:3855; und Schlienger et al. (1992) J. Virol. 66:2).
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Das
Multiple Antigen Peptide-System für die Immunisierung auf Peptidbasis
kann ebenso zur Erzeugung eines Immunogens genutzt werden, wobei
ein gewünschter
Anteil eines Delta3-Polypeptids direkt aus der organochemischen
Synthese des Peptids an einen oligomeren Verzweigungslysinkern erhalten
wird (siehe z.B. Posnett et al. (1988) JBC 263:1719 und Nardelli
et al. (1992) J. Immunol. 148:914). Ebenso können antigene Determinanten
von Delta3-Proteinen von Bakterienzellen exprimiert und präsentiert
werden.
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Zusätzlich zur
Nutzung von Fusionsproteinen zur Verbesserung der Immunogenität ist es
weithin ersichtlich, daß Fusionsproteine
auch die Expression von Proteinen erleichtern können und sich dementsprechend
bei der Expression der Delta3-Polypeptide der vorliegenden Erfindung
verwenden lassen. So können Delta3-Polypeptide
beispielsweise als Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsproteine
erzeugt werden. Solche GST-Fusionsproteine können die leichte Reinigung
des Delta3-Polypeptids, wie beispielsweise unter Verwendung von
mit Glutathion derivatisierten Matrices, ermöglichen (siehe beispielsweise
Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al. (N.Y.:
John Wiley & Sons,
1991)).
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann ein für
eine Reinigungsleitsequenz, wie beispielsweise eine Poly-(His)/Enterokinase-Spaltstellensequenz
am N-Terminus des gewünschten
Anteils des rekombinanten Proteins, codierendes Fusionsgen die Reinigung
des exprimierten Fusionsproteins mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung
eines Ni2+-Metall-Harzes gestatten. Die Reinigungsleitsequenz kann
anschließend dann
durch Behandlung mit Enterokinase abgetrennt werden, so daß das gereinigte
Protein erhalten wird (siehe z.B. Hochuli et al. (1987) J. Chromatography
411:177; und Janknecht et al. PNAS 88:8972).
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Techniken
zur Herstellung von Fusionsgenen sind dem Fachmann bekannt. Im wesentlichen
wird dabei die Verbindung verschiedener DNA-Fragmente, die für unterschiedliche
Polypeptidsequenzen codieren, gemäß herkömmlichen Techniken durchgeführt, wobei
zur Ligation stumpfendige oder versetztendige Termini, gegebenenfalls
das Auffüllen
kohäsiver
Enden, Behandlung mit alkalischer Phosphatase zur Vermeidung einer unerwünschten
Zusammenfügung
sowie enzymatische Ligation eingesetzt werden. In einer weiteren
Ausführungsform
läßt sich
das Fusionsgen mittels herkömmlicher
Techniken, einschließlich
DNA-Syntheseautomaten, synthetisieren. Alternativ kann die PCR-Amplifikation
von Genfragmenten unter Verwendung von Ankerprimern, durch die komplementäre Überhänge zwischen
zwei aufeinanderfolgenden Genfragmenten entstehen, wobei die Fragmente
anschließend
einem Annealing unter Erzeugung einer chimärischen Gensequenz unterzogen
werden, durchgeführt
werden (siehe z.B. Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg.
Ausubel et al. John Wiley & Sons:
1992).
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4.4.3 Antikörper
-
Ein
weiterer erfindungsgemäßer Aspekt
betrifft einen Antikörper,
der spezifisch gegenüber
einem Delta3-Protein reaktiv ist. Beispielsweise können unter
Verwendung von von einem Delta3-Protein beispielsweise aufgrund
der cDNA-Sequenzen abgeleiteten Immunogenen Anti-Protein/Anti-Peptid-Antiseren
oder monoklonale Antikörper
nach Standardvorschriften hergestellt werden (siehe z.B. Antibodies:
A Laboratory Manual hrsg. von Harlow und Lane (Cold Spring Harbor
Press: 1988)). Ein Säuger,
wie beispielsweise eine Maus, ein Hamster oder ein Kaninchen, läßt sich
mit einer immunogenen Form des Peptids (z.B. einem Delta3-Polypeptid
oder einem antigenen Fragment, das eine Antikörperantwort hervorrufen kann,
oder einem wie oben beschriebenen Fusionsprotein) immunisieren.
Zu den Techniken zur Vermittlung von Immunogenität an einem Protein oder Peptid
gehören
die Konjugation an Träger
bzw. weitere im Fachgebiet bekannte Techniken. Ein immunogener Anteil
eines Delta3-Proteins läßt sich
in Gegenwart eines Adjuvans verabreichen. Der Verlauf der Immunisierung
läßt sich
durch Nachweis von Antikörpertitern
im Plasma oder Serum verfolgen. Zur Beurteilung der Antikörperspiegel
können
Standard-ELISA- oder
andere Immunoassays. mit dem Immunogen als Antigen verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform
sind die betreffenden Antikörper
für antigene
Determinanten eines Delta3-Proteins eines Säugers, beispielsweise antigene
Determinanten eines durch SEQ ID No: 2 dargestellten Proteins oder
nahe verwandter Homologe (z.B. wenigstens 92% homolog und stärker bevorzugt
wenigstens 94% homolog), immunspezifisch.
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Nach
Immunisierung eines Tiers mit einer antigenen Präparation eines Delta3-Polypeptids
lassen sich Anti-Delta3-Antiseren erhalten und, falls gewünscht, polyklonale
Anti-Delta3-Antikörper
aus dem Serum isolieren. Zur Herstellung monoklonaler Antikörper können Antikörper produzierende
Zellen (Lymphozyten) einem immunisierten Tier entnommen und nach
Standardfusionsverfahren für
somatische Zellen mit immortalisierten Zellen, wie beispielsweise
Myelomzellen, unter Erhalt von Hybridomzellen fusioniert werden.
Derartige Techniken sind im Fachgebiet allgemein bekannt und umfassen
beispielsweise die Hybridomtechnik (ursprünglich von Kohler und Milstein
(1975) Nature, 256: 495–497
entwickelt), die menschliche B-Zellen-Hybridomtechnik (Kozbar et
al., (1983) Immunology Today, 4:72) sowie die EBV-Hybridomtechnik
zur Herstellung menschlicher monoklonaler Antikörper (Cole et al., (1985) Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96). Hybridomzellen
lassen sich einem immunchemischen Screening auf die Produktion von
gegenüber
einem Delta3-Polypeptid der vorliegenden Erfindung spezifisch reaktiven
Antikörpern
unterziehen und monoklonale Antikörper aus einer solche Hybridomzellen
enthaltenden Kultur isolieren. In einer Ausführungsform reagieren Anti-Mensch-Delta3-Antikörper spezifisch
mit den von der DNA der ATCC Deposit Accession Number 98348 codierten
Proteinen.
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Der
Begriff Antikörper,
wie er hier verwendet wird, soll Fragmente davon umfassen, die auch
spezifisch gegenüber
einem der betreffenden Delta3-Polypeptide
reaktiv sind. Antikörper
können
unter Verwendung herkömmlicher
Techniken in Fragmente zerlegt und die Fragmente einem Screening
auf Verwendbarkeit auf die gleiche Weise wie oben für ganze
Antikörper
beschrieben unterzogen werden. So lassen sich beispielsweise F(ab)2-Fragmente durch Behandlung von Antikörper mit
Pepsin erzeugen. Das erhaltene F(ab)2-Fragment kann
dann zur Reduktion der Disulfidbrücken behandelt werden, so daß Fab-Fragmente
entstehen. Der Antikörper
der vorliegenden Erfindung soll ferner wie bispezifische und chimärische Moleküle mit einer
Affinität
für ein
Delta3-Protein, die von mindestens einem CDR-Bereich des Antikörpers verliehen
wird, umfassen.
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Antikörper, die
spezifisch Delta3-Epitope binden, lassen sich auch bei der immunhistochemischen
Anfärbung
von Gewebsproben einsetzen, um jeweils die vorhandene Menge und
das Muster der Expression eines jeden der betreffenden Delta3-Polypeptide
zu beurteilen. Anti-Delta3-Antikörper lassen
sich diagnostisch bei der Immunpräzipitation und dem Immunoblotting
verwenden, um Delta3-Proteinniveaus in Gewebe als Teil eines klinischen
Testverfahrens nachzuweisen und zu beurteilen. So können derartige
Messungen beispielsweise bei prognostischen Schätzungen des Ausbruchs oder
des Verlaufs neurodegenerativer, neoplastischer oder hyperplastischer
Erkrankungen sinnvoll sein. Gleichfalls kann die Fähigkeit
zur Überwachung
von Delta3-Proteinspiegeln in einem Individuum die Bestimmung der
Wirksamkeit eines gegebenen Behandlungsplans für ein an einer derartigen Erkrankung
leidendes Individuum gestatten. Das Niveau der Delta3-Polypeptide
kann von Zellen in einer Körperflüssigkeit,
wie beispielsweise in Proben von Liquor oder Fruchtwasser, aus gemessen
werden oder läßt sich
in Gewebe, wie es beispielsweise durch eine Biopsie erhalten wird,
messen. Diagnostische Tests unter Verwendung von Anti-Delta3-Antikörpern können beispielsweise
Immunoassays, die zur Unterstützung
bei der frühen
Diagnose einer neurodegenerativen Störung, insbesondere solcher,
die sich bei der Geburt manifestieren, vorgesehen sind, umfassen.
Ebenso können
diagnostische Tests unter Verwendung von Anti-Delta3-Polypeptid-Antikörpern Immunoassays
umfassen, die zur Unterstützung
bei der frühen
Diagnose und Phänotypisierung
neurodegenerativer, neoplastischer oder hyperplastischer Erkrankungen vorgesehen
sind.
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Eine
weitere Anwendung von Anti-Delta3-Antikörpern der vorliegenden Erfindung
besteht im immunologischen Screening von in Expressionsvektoren,
wie z.B. λgt11, λgt18–23, λZAP und ORF8,
konstruierten cDNA-Banken. Mit derartigen Messenger-Bibliotheken,
die im korrekten Leseraster und in korrekter Orientierung inserierte
codierende Sequenzen aufweisen, lassen sich Fusionsproteine herstellen.
So produziert beispielsweise λgt11
Fusionsproteine, deren Aminotermini aus β-Galactosidase-Aminosäuresequenzen
und deren Carboxy-Termini aus einem Fremdpolypeptid bestehen. Antigene
Epitope eines Delta3-Proteins, beispielsweise andere Orthologe eines
bestimmten Delta3-Proteins oder andere Paraloge aus der gleichen
Spezies, können dann
mit Antikörpern
nachgewiesen werden, indem man beispielsweise von infizierten Platten
abgehobene Nitrocellulosefilter mit Anti-Delta3-Antikörpern reagiert.
Anschließend
lassen sich mit diesen Tests nachgewiesene positive Phagen von der
infizierten Platte isolieren. Somit läßt sich das Vorhandensein von
Delta3-Homologen nachweisen und von anderen Tieren, ebenso wie alternative
Isoformen (einschließlich
Spleißvarianten) aus
dem Menschen, klonieren.
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4.5 Verfahren zur Krankheitsbehandlung
-
Wenigstens
teilweise aufgrund der Tatsache, daß der Notch-Signalisierungsweg mit der Entwicklung des
Nervensystems, insbesondere der Regulation neuronaler Differenzierung
und Gefäßversorgung,
z.B. ZNS-Gefäßversorgung,
in Verbindung gebracht wurde, kann eine Behandlung mit Delta3-Therapeutika
Vorteile für
eine große
Vielfalt pathologischer Krankheiten oder Leiden bringen. Der Notch-Signalisierungsweg
spielt eine Rolle bei der Entwicklung der Gefäßversorgung. So werden beispielsweise
Mutanten mit dem Verlust der Dll1-Funktion nach Embryotag 10 stark
hämorrhagisch.
Weiterhin führen
Mutationen in Notch3 zu CADASIL, einer durch Schlaganfall gekennzeichneten
Erkrankung. Darüber
hinaus zeigen Mäuse
mit einem funktionell ablatierten PS1-Gen Blutungen im Gehirn und/oder
dem Rückenmark
nach Embryotag 11,5 (Wong et al., supra). Weiterhin ist es, da der
Notch-Signalisierungsweg an der Bestimmung des Zellschicksals wenigstens
im Nervensystem und Endothelsystem beteiligt ist, wahrscheinlich,
daß der
Notch-Signalisierungsweg
und insbesondere Delta3 an der Bestimmung des Zellschicksals in
weiteren biologischen Systemen beteiligt ist. Dementsprechend sind
auch Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen,
die aus einer abnormalen Zellproliferation und/oder Differenzierung
von anderen Zellen als den Zellen des Nervensystems und der Gefäßversorgung
entstehen, Gegenstand der Erfindung.
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Zu
den bevorzugten Störungen,
die sich gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren
behandeln oder verhindern lassen, gehören pathologische neurogene,
neoplastische oder hypoplastische Leiden.
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Zu
den Störungen
des Gefäßversorgungssystems,
die auch als „vaskuläre Störungen" bezeichnet werden
und die sich gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren
behandeln oder verhindern lassen, gehören neben CADASIL und Schlaganfall
auch Atheroma, Tumorangiogenese, Wundheilung, diabetische Retinopathie,
Hämangioma,
Psoriasis und Restenose, beispielsweise durch Ballon-Angioplastie
entstandene Restenose.
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In
einer Ausführungsform
lassen sich Krankheiten oder Störungen,
die von einer anomalen Delta3-Aktivität, wie beispielsweise anomalen
Delta3-Proteinspiegeln
oder einer anomalen biologischen Aktivität, verursacht werden oder zu
denen eine solche Aktivität
beiträgt
oder die mit einem oder mehreren spezifischen Delta3-Allelen, beispielsweise
einem mutanten Delta3-Allel, assoziiert sind, mit Delta3-Therapeutika
behandeln. Anomale Proteinspiegel können beispielsweise durch anomale
Genexpression verursacht werden. Eine solche anomale Aktivität kann beispielsweise
zu einer anomalen Zellproliferation und/oder -differenzierung oder
zum Zelltod führen.
So kann beispielsweise eine anomale Delta3-Aktivität in einer
Untersuchungsperson zu einer erhöhten
Proliferation bestimmter Zellen in dieser Untersuchungsperson führen. Untersuchungspersonen
mit einer durch abnormale Zellproliferation gekennzeichneten Störung können mittels
Verabreichung eines eine derartige Proliferation hemmenden oder
verringernden Delta3-Therapeutikums behandelt werden. Das spezifische
verwendete Delta3-Therapeutikum kann je nach Art der anomal proliferierenden
Zelle variieren. Das zur Verwendung geeignete Delta3-Therapeutikum läßt sich
beispielsweise durch In-vitro-Kultur einer Probe solcher Zellen,
die der Untersuchungsperson entnommen werden können, in Gegenwart und Abwesenheit
von Delta3-Therapeutika bestimmen.
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Zu
den mit einer anomalen Zellproliferation assoziierten Krankheiten
oder Leiden, die sich mit Delta3-Therapeutika behandeln oder verhindern
lassen, gehören
Krebserkrankungen, maligne Leiden, prämaligne Leiden und gutartige
Leiden. Bei dem zu behandelnden oder zu verhindernden Leiden kann
es sich um einen soliden Tumor, wie beispielsweise in einem Epithelgewebe
entstehenden Tumor handeln. Bei der Krebserkrankung kann es sich
beispielsweise um Dickdarm- oder Gebärmutterhalskrebs handeln. In
der Tat konnte festgestellt werden, daß Dickdarm- und Gebärmutterhalskrebs
jeweils erhöhte
Notch-Expressionsniveaus im Vergleich mit normalem Gewebe aufweisen
(PCT-Anmeldung WO/07474). Dementsprechend könnte die Behandlung einer solchen
Krebserkrankung die Verabreichung eines die Wechselwirkung von Notch
mit Delta3 verringernden Delta3-Therapeutikums an die Untersuchungsperson
umfassen. Weitere Krebserkrankungen, die sich mit einem Delta3-Protein
behandeln oder verhindern lassen, umfassen Sarkome und Karzinome,
beispielsweise Lungenkrebs, Speiseröhrenkrebs, Melanom, Seminom
und Schuppenzell-Adenokarzinom.
Weiterhin sind erfindungsgemäß u.a. solide
Tumoren, die sich in einem Lehrbuch der Medizin finden lassen, umfaßt. Bei
dem zu behandelnden oder zu verhindernden Leiden kann es sich auch
um einen löslichen Tumor
handeln, wie beispielsweise Leukämie,
entweder chronisch oder akut, einschließlich chronischer oder akuter
myelogener Leukämie,
chronischer oder akuter lymphozytärer Leukämie, promyelozytärer Leukämie, monozytärer Leukämie, myelomonozytärer Leukämie und
Erythroleukämie.
Zu den proliferativen Störungen, die
sich mit einem erfindungsgemäßen Delta3-Therapeutikum
behandeln lassen, gehören
weiterhin auch die Schwerkettenkrankheit, multiples Myelom, Lymphom,
beispielsweise Hodgkin-Lymphom und Nicht-Hodgkin-Lymphom, Morbus
Waldenström
sowie fibroproliferative Störungen,
insbesondere des zerebrovaskulären Gewebes.
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Durch
einen soliden oder löslichen
Tumor gekennzeichnete Krankheiten oder Leiden lassen sich behandeln,
indem man ein Delta3-Therapeutikum entweder lokal oder systemisch
verabreicht, so daß die
Proliferation der eine anomale Proliferation aufweisenden Zellen
gehemmt oder verringert wird. Verfahren zur Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen
werden unten genauer beschrieben.
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Gegenstand
der Erfindung sind ebenso Verfahren zur Verhinderung der Bildung
und/oder Entwicklung von Tumoren. So kann der Entwicklung eines
Tumors beispielsweise das Vorhandensein einer spezifischen Läsion, wie
beispielsweise einer präneoplastischen
Läsion,
z.B. Hyperplasie, Metaplasie und Dysplasie, vorangehen. Solche Läsionen finden
sich beispielsweise in Epithelgewebe. Somit ist ein Gegenstand der
Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der Entwicklung einer solchen
Läsion
zu einer neoplastischen Läsion,
wobei man der Untersuchungsperson mit einer präneoplastischen Läsion eine
zur Hemmung der Entwicklung der präneoplastischen Läsion zu
einer neoplastischen Läsion
ausreichende Menge eines Delta3-Therapeutikums verabreicht.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird durch die Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der Proliferation
und/oder Differenzierung von Endothelzellen bereitgestellt, bei
dem man ein Delta3-Therapeutikum mit einem Gewebe, in dem Endothelzellen
proliferieren, wie beispielsweise ein sich entwickelnder Tumor oder eine
hyperproliferative Erkrankung, d.h. einer mit einer abnormalen Zellproliferation
assoziierten Krankheit, in Kontakt bringt. Die Blockierung der Proliferation
von Endothelzellen führt
zur Hemmung der Entwicklung von Endothel und Blutgefäßen, womit
der Zugang von für
die Tumorentwicklung notwendigen Verbindungen zu dem Tumor beschränkt wird.
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Ein
weiterer Erfindungsgegenstand sind Verfahren zur Behandlung oder
Vorbeugung von mit unzureichender Zellproliferation assoziierten
Krankheiten oder Leiden. So lassen sich beispielsweise Delta3-Therapeutika zur
Stimulierung von Gewebereparatur, -regeneration und/oder Wundheilung,
beispielsweise von Nervengewebe, wie etwa nach einer Operation oder
zur Stimulierung der Heilung von Gewebe nach Verbrennungen, verwenden.
Andere Krankheiten, bei denen die Proliferation von Zellen gewünscht ist,
sind hypoproliferative Krankheiten, d.h. Krankheiten, die durch
eine abnormal niedrige Proliferation bestimmter Zellen gekennzeichnet
sind.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
wird durch die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung
von Krankheiten oder Leiden, die durch anomale Zelldifferenzierung
gekennzeichnet sind, bereitgestellt. Dementsprechend sind Verfahren
zur Stimulierung der Zelldifferenzierung bei Leiden, die durch eine Hemmung
der normalen Zelldifferenzierung, die gegebenenfalls von übermäßiger Proliferation
begleitet sein kann, gekennzeichnet sind, Gegenstand der Erfindung.
Als Alternative können
Delta3-Therapeutika zur Hemmung der Differenzierung spezifischer
Zellen verwendet werden.
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Bei
einem bevorzugten Verfahren handelt es sich bei der anomal proliferierenden
und/oder differenzierenden Zelle um eine im Nervensystem vorhandene
Zelle. Entsprechenderweise werden durch die Erfindung Verfahren
zur Behandlung von mit einem zentralen oder peripheren Nervensystem
assoziierten Krankheiten oder Leiden bereitgestellt. So sind beispielsweise
Verfahren zur Behandlung von Läsionen
des Nervensystems, an denen eine anomale Delta3-Aktivität in Neuronen,
in Schwann-Zellen, Gliazellen oder anderen Arten von Nervenzellen
beteiligt ist, Gegenstand der Erfindung. Erkrankungen des Nervensystems
sind oben angegeben.
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In
einer weiteren Ausführungsform
wird durch die Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung des Überlebens
und/oder zur Stimulierung der Proliferation und/oder Differenzierung
von Zellen und Geweben in vitro bereitgestellt. So können beispielsweise
einer Untersuchungsperson Gewebe entnommen und in vitro in Gegenwart
eines Delta3-Therapeutikums angezogen werden, so daß die Gewebezellen
zur Proliferation und/oder Differenzierung angeregt werden. Anschließend kann
das Gewebe dann wieder der Untersuchungsperson verabreicht werden.
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Da
Gene in einigen Fällen
bei einem Krankheitszustand herauf reguliert und in anderen Fällen herunterreguliert
sein können,
ist es wünschenswert,
je nach dem zu behandelnden Leiden die Delta3-Bioaktivität unter Verwendung der hier
beschriebenen Techniken, Verbindungen und Verfahren zu aktivieren
und/oder zu potenzieren oder zu supprimieren und/oder herunterzumodulieren.
Einige Gene können
bei bestimmten Krankheitszuständen
unterexprimiert sein. Die Aktivität von Delta3-Genprodukten kann
in gewisser Weise beeinträchtigt
sein, was zur Entwicklung neurodegenerativer Krankheitssymptome
führt.
Eine derartige Herunterregulierung der Delta3-Genexpression oder
Abnahme der Aktivität
eines Delta3-Proteins kann einen ursächlichen oder verstärkenden
Effekt auf den Krankheitszustand haben.
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Unter
den Ansätzen,
die zur Linderung von Krankheitssymptomen, an denen die Fehlexpression
eines Delta3-Gens beteiligt ist, verwendet werden können, befinden
sich beispielsweise die oben beschriebenen Antisense-, Ribozym-
und Dreifachhelixmoleküle.
Verbindungen, die mit einem Delta3-Protein um die Bindung an vorgeschaltete
oder nachgeschaltete Elemente in einer Delta-Notch-Signalisierungskaskade
konkurrieren, antagonisieren ein Delta3-Protein, wodurch ein therapeutischer
Effekt induziert wird. Zu geeigneten Verbindungen gehören beispielsweise
die oben ausführlich
beschriebenen Antagonisten oder Homologen. In anderen Fällen kann
die erhöhte
Expression oder Bioaktivität
eines Delta3-Proteins erwünscht
sein und beispielsweise durch die Verwendung der Delta3-Agonisten
oder -Mimetika oder durch Genaustauschtherapie bewerkstelligt werden,
wie hier beschrieben.
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Noch
weitere Delta3-Therapeutika bestehen aus einem ersten Peptid, das
ein zur Bindung an einen Rezeptor, z.B. einen Notch-Rezeptor, fähiges Delta3-Peptid
umfaßt,
und einem zweiten Peptid, das zytotoxisch ist. Solche Therapeutika
lassen sich zum spezifischen Abzielen auf und zur spezifischen Lyse
von einen Rezeptor für
Delta3 exprimierenden oder überexprimierenden
Zellen verwenden. Beispielsweise kann ein ein an ein zytotoxisches
Peptid fusioniertes Delta3-Peptid enthaltendes Fusionsprotein zur
Eliminierung oder Reduktion eines Notch überexprimierenden Tumors, beispielsweise
von neoplastischen Dickdarm- und
Gebärmutterhalstumoren,
verwendet werden. Alternativ kann auf Delta3 exprimierende oder überexprimierende
Zellen zu deren Lyse abgezielt werden, indem man beispielsweise
einen spezifisch an ein mit einem zytotoxischen Peptid verknüpftes Delta3-Protein
bindenden Antikörper
auf die Zelle richtet.
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Es
ist zumindest teilweise aufgrund der Ähnlichkeit der Proteinstruktur
wahrscheinlich, daß Delta3-Therapeutika
auch zur Behandlung von Krankheiten oder Leiden, die durch eine
anomale Delta-Aktivität,
beispielsweise eine anomale Delta1- oder Delta2-Aktivität, verursacht
werden oder zu denen eine solche anomale Delta-Aktivität beiträgt, oder
von Krankheiten oder Störungen,
die mit einem oder mehreren spezifischen Delta-Allelen, beispielsweise
Delta1- oder Delta2-Allelen, assoziiert sind, verwendet werden können. Solche
Krankheiten oder Leiden könnten
neurologische Krankheiten und Krebserkrankungen umfassen. In ähnlicher
Weise könnten
Delta-Therapeutika, beispielsweise Delta1- oder Delta2-Therapeutika, dazu
verwendet werden, Krankheiten oder Störungen, die durch eine anomale
Delta3-Aktivität
verursacht werden oder zu denen eine anomale Delta3-Aktivität beiträgt, oder
Krankheiten oder Störungen,
die mit einem spezifischen Delta3-Allel assoziiert sind, vorzubeugen
oder zu behandeln. Delta-Therapeutika lassen sich beispielsweise unter
Verwendung der in der PCT-Patentanmeldung WO 97/01571 offenbarten
Nukleotid- und Proteinsequenzangaben herstellen und unter Verwendung
der hier beschriebenen Tests zum Testen von Delta3-Therapeutika
testen.
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Verbindungen,
für die
nachgewiesen wurde, daß sie
die Delta3-Genexpression
oder -Proteinaktivität erhöhen oder
reduzieren, können
einer Untersuchungsperson in einer therapeutisch wirksamen Dosis
zur Behandlung oder Linderung einer kardiovaskulären Krankheit verabreicht werden.
Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf diejenige Menge
der Verbindung, die ausreicht, um eine Linderung von mit der jeweiligen
Krankheit assoziierten Symptomen herbeizuführen.
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4.5.1 Wirksame Dosis
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Die
Toxizität
und therapeutische Wirksamkeit solcher Verbindungen läßt sich
mit pharmazeutischen Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren
beispielsweise zur Bestimmung des LD50-Werts
(der für 50%
der Population letalen Dosis) und des ED50-Werts
(der bei 50% der Population therapeutisch wirksamen Dosis), bestimmen.
Das Dosisverhältnis
zwischen toxischen und therapeutischen Effekten stellt den therapeutischen
Index dar und läßt sich
als LD50/ED50-Verhältnis ausdrücken. Verbindungen,
die große
therapeutische Indices zeigen, sind bevorzugt. Obschon Verbindungen,
die toxische Nebenwirkungen zeigen, verwendet werden können, sollte
dafür Sorge
getragen werden, daß ein
Zuführungssystem
vorgesehen ist, mit dem solche Verbindungen zielgerichtet der Stelle
des betroffenen Gewebes zugeführt
werden, um eine mögliche
Schädigung
nicht infizierter Zellen zu minimieren und dadurch Nebenwirkungen
zu reduzieren.
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Die
aus den Zellkulturtests und Tierstudien erhaltenen Daten lassen
sich bei der Formulierung eines Dosierungsbereichs zur Verwendung
beim Menschen verwenden. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise
in einem Bereich zirkulierender Konzentrationen, die den ED50-Wert einschließen, wobei nur eine geringe
oder keine Toxizität
vorhanden ist. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs je nach
der eingesetzten Dosierungsform und dem benutzten Verabreichungsweg
variieren. Für
alle im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendeten Verbindungen läßt sich
die therapeutisch wirksame Dosis zunächst aus Zellkulturtests abschätzen. Eine
Dosis kann in Tiermodellen formuliert werden, um einen zirkulierenden
Plasmakonzentrationsbereich zu erzielen, der den IC50-Wert
(d.h. die Konzentration der Testverbindung, mit der eine halbmaximale
Hemmung der Symptome erzielt wird), wie er in der Zellkultur bestimmt
wurde, einschließt.
Solche Angaben können
dazu verwendet werden, geeignete Dosen beim Menschen genauer zu
bestimmen. Plasmaspiegel können
beispielsweise mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen
werden.
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5.2 Formulierung und Verwendung
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung
können auf
herkömmliche
Weise unter Verwendung eines oder mehrerer physiologisch unbedenklicher
Träger-
oder Hilfsstoffe formuliert werden. Somit können die Verbindungen und ihre
physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate zur Verabreichung
mittels beispielsweise Injektion, Inhalation oder Insufflation (entweder
durch den Mund oder die Nase) oder zur oralen, bukkalen, parenteralen
oder rektalen Verabreichung formuliert werden.
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Für eine derartige
Therapie lassen sich die erfindungsgemäßen Oligomere für viele
verschiedene Verabreichungen, einschließlich systemischer und topischer
oder örtlicher
Verabreichung, formulieren. Techniken und Formulierungen finden
sich allgemein bei Remmington's
Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PA. Zur systemischen
Verabreichung wird die Injektion, einschließlich intramuskuläre, intravenöse, intraperitoneale
und subkutane Injektion, bevorzugt. Zur Injektion können die
erfindungsgemäßen Oligomere
in flüssigen
Lösungen,
vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern, wie z.B. Hank's Lösung oder
Ringer-Lösung,
formuliert werden. Darüber
hinaus können
die Oligomere in fester Form formuliert und unmittelbar vor Gebrauch
wieder aufgelöst
oder suspendiert werden. Ebenso sind lyophilisierte Formen umfaßt.
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Zur
oralen Verabreichung können
die pharmazeutischen Zusammensetzungen in Form von beispielsweise
Tabletten oder Kapseln, die mit herkömmlichen Mitteln mit pharmazeutisch
unbedenklichen Hilfsstoffen, wie z.B. Bindemitteln (z.B. vorgelatinisierte
Maisstärke,
Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose), Füllstoffen
(z.B. Lactose, mikrokristalline Cellulose oder Calciumhydrogenphosphat),
Schmiermitteln (z.B. Magnesiumstearat, Talkum oder Kieselsäure), Sprengmitteln
(z.B. Kartoffelstärke
oder Natriumstärkeglykolat) oder
Benetzungsmitteln (z.B. Natriumlaurylsulfat), zubereitet werden.
Die Tabletten können
mit im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren beschichtet werden.
Flüssigzubereitungen
zur oralen Verabreichung können in
Form von beispielsweise Lösungen,
Sirupen oder Suspensionen vorliegen oder als Trockenprodukt zur
Konstituierung mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel
vor Gebrauch präsentiert
werden. Solche Flüssigzubereitungen
können
mit herkömmlichen
Mitteln zusammen mit pharmazeutisch unbedenklichen Additiven, wie
z.B. Suspensionsmitteln (z.B. Sorbitsirup, Cellulosederivate oder
hydrierte Speisefette), Emulgatoren (z.B. Lecithin oder Akaziengummi),
nichtwäßrigen Vehikeln
(z.B. Mandelöl, ölige Ester,
Ethylalkohol oder fraktionierte Pflanzenöle) sowie Konservierungsstoffen
(z.B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate
oder Sorbinsäure),
zubereitet werden. Die Zubereitungen können auch gegebenenfalls Puffersalze,
Geschmacks-, Farb- und Süßstoffe
enthalten.
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Zubereitungen
für die
orale Verabreichung können
zur kontrollierten Freisetzung des Wirkstoffs in geeigneter Weise
formuliert werden.
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Zur
bukkalen Verabreichung können
die Zusammensetzungen in Form von auf herkömmliche Weise formulierten
Tabletten oder Lutschtabletten vorliegen.
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Zur
Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen zur Verwendung
gemäß der vorliegenden
Erfindung zweckmäßigerweise
in Form einer Aerosolspray-Darstellung aus Druckpackungen oder einem Vernebler
unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels, z.B. Dichlordifluormethan,
Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder einem
anderen geeigneten Gas, zugeführt.
Im Fall eines Druckaerosols kann die Dosierungseinheit durch Bereitstellung
eines Ventils zur Zuführung
einer abgemessenen Menge bestimmt werden. Kapseln und Patronen aus
z.B. Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können mit
einer Pulvermischung aus der Verbindung und einer geeigneten Pulvergrundlage,
wie z.B. Lactose oder Stärke,
formuliert werden.
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Die
Verbindungen können
zur parenteralen Verabreichung mittels Injektion, beispielsweise
mittels Bolusinjektion oder Dauerinfusion, formuliert werden. Formulierungen
zur Injektion können
in Dosiseinheitsform, beispielsweise in Ampullen oder in Mehrfachdosisbehältern, zusammen
mit einem beigefügten
Konservierungsstoff präsentiert
werden. Dabei können
die Zusammensetzungen in Form von Suspensionen, Lösungen oder
Emulsionen in öligen
oder wäßrigen Vehikeln
vorliegen und können
Formulierungsmittel, wie z.B. Suspendierungs-, Stabilisierungs-
und/oder Dispersionsmittel enthalten. Alternativ kann der wirksame
Inhaltsstoff in Pulverform zur Konstituierung mit einem geeigneten
Vehikel, z.B. sterilem pyrogenfreiem Wasser, vor Gebrauch vorliegen.
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Die
Verbindungen können
auch zu Rektalzusammensetzungen, wie etwa Suppositorien oder Bleibeklistieren,
die beispielsweise herkömmliche
Suppositoriengrundlagen wie etwa Kakaobutter oder andere Glyceride
enthalten, formuliert werden.
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Neben
den bereits beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch
in Form einer Depotzubereitung formuliert werden. Derartige Formulierungen
mit Langzeitwirkung können
mittels Implantation (beispielsweise subkutan oder intramuskulär) oder
mittels intramuskulärer
Injektion verabreicht werden. So kann man die Verbindungen beispielsweise
mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Stoffen (beispielsweise
als Emulsion in einem unbedenklichen Öl) oder Ionenaustauschern oder
als schwerlösliche
Derivate, beispielsweise als schwerlösliches Salz, formulieren.
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Die
systemische Verabreichung kann auch mit transmukosalen oder transdermalen
Mitteln erfolgen. Zur transmukosalen oder transdermalen Verabreichung
werden für
die zu überwindende
Schranke geeignete Penetrationsmittel in der Formulierung verwendet.
Derartige Penetrationsmittel sind im Fachgebiet allgemein bekannt
und umfassen beispielsweise Gallensalze und Fusidinsäurederivate
für die
transmukosale Verabreichung. Um die Durchlässigkeit zu erleichtern, können darüber hinaus
auch Detergentien verwendet werden. Die transmukosale Verabreichung
kann über
Nasensprays oder unter Verwendung von Suppositorien erfolgen. Für die topische
Verabreichung werden die erfindungsgemäßen Oligomere zu Salben, Balsamen,
Gelen oder Cremes formuliert, wie es im Fachgebiet allgemein bekannt
ist.
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Im
klinischen Rahmen lassen sich die Genzuführungssysteme für das therapeutische
Delta3-Gen mit einem aus einer Reihe von Verfahren, die jeweils
im Fachgebiet geläufig
sind, in einen Patienten einführen.
So kann man beispielsweise eine pharmazeutische Zubereitung des
Genzuführungssystems
systemisch, z.B. durch intravenöse
Injektion, einführen,
wobei die spezifische Weiterleitung des Proteins in den Zielzellen
vorwiegend aufgrund der vom Genzuführungsvehikel bereitgestellten
Transfektionsspezifität,
der zelltypischen oder gewebetypischen Expression aufgrund der die
Expression des Rezeptorgens kontrollierenden Transkriptionsregulationssequenzen
oder einer Kombination davon erfolgt. In weiteren Ausführungsformen
ist die anfängliche
Zuführung
des rekombinanten Gens relativ begrenzt, wobei die Einführung in
das Tier ziemlich lokalisiert erfolgt. So kann das Genzuführungsvehikel
beispielsweise mit einem Katheter (siehe US-Patent 5,328,470) oder
mittels stereotaktischer Injektion (z.B. Chen et al. (1994) PNAS
91:3054–3057)
eingeführt
werden. Ein Delta3-Gen, wie beispielsweise eine der in der Gruppe
bestehend aus SEQ ID NO:1 oder 3 dargestellten Sequenzen oder eine
dazu homologe Sequenz, kann mittels Elektroporation unter Verwendung
von beispielsweise von Dev et al. ((1994) Cancer Treat Rev 20:105–115) beschriebenen
Techniken in einem Gentherapiekonstrukt zugeführt werden.
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Die
pharmazeutische Zubereitung des Gentherapiekonstrukts kann im wesentlichen
aus dem Genzuführungssystem
in einem unbedenklichen Verdünnungsmittel
bestehen oder kann eine Retardmatrix, in der das Genzuführungsvehikel
eingebettet ist, umfassen. Andererseits kann dort, wo das vollständige Genzuführungssystem
in intakter Form von rekombinanten Zellen, beispielsweise retroviralen
Vektoren, produziert werden kann, die pharmazeutische Zubereitung
eine oder mehrere Zellen, die das Genzuführungssystem produzieren, umfassen.
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Falls
gewünscht,
können
die Zusammensetzungen in einer Packung oder einer Spendervorrichtung, die
eine oder mehrere den wirksamen Inhaltsstoff enthaltende Dosiseinheitsformen
enthalten kann, präsentiert werden.
Die Packung kann beispielsweise eine Metall- oder Kunststoffolie,
wie beispielsweise eine Blisterverpackung, umfassen. Der Packung
oder Spendervorrichtung können
Anweisungen zur Verabreichung beigelegt sein.
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4.6 Diagnostische und
prognostische Tests
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Durch
die vorliegenden Verfahren werden Mittel zur Bestimmung davon, ob
bei einer Untersuchungsperson die Gefahr der Entwicklung einer von
einer anomalen Delta3-Aktivität
gekennzeichneten Störung,
wie beispielsweise einer zum Beispiel zu einer neurodegenerativen
Krankheit oder Krebs führenden
anomalen Zellproliferation, -degeneration und/oder -differenzierung,
besteht, bereitgestellt. Gegenstand der Erfindung sind ebenso Verfahren
zur Bestimmung, ob bei einer Untersuchungsperson die Gefahr der
Entwicklung einer mit einem oder mehreren spezifischen Allelen eines
Delta3-Gens assoziierten Krankheit oder Störung besteht. Tatsächlich können spezifische
Delta3-Allele mit spezifischen Krankheiten oder Störungen assoziiert
sein. Dementsprechend werden erfindungsgemäß Verfahren zur Bestimmung,
ob bei einer Untersuchungsperson eine neurologische Krankheit, z.B.
ACCPN, vorliegt oder die Gefahr der Entwicklung einer solchen Krankheit besteht,
bereitgestellt. In einer weiteren Ausführungsform werden durch die
Erfindung Verfahren zur Bestimmung, ob bei einer Untersuchungsperson
eine vaskuläre
Störung
oder eine mit der Bestimmung des Zellschicksals assoziierte Störung vorliegt
oder die Gefahr der Entwicklung einer solchen Störung besteht, bereitgestellt.
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In
einer Ausführungsform
wird durch die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung, ob bei einer
Untersuchungsperson eine genetische Läsion in einem Delta3-Gen oder
eine spezifische allelische Variante eines polymorphen Bereichs
in einem Delta3-Gen vorliegt, bereitgestellt. Bei dem spezifischen
Allel kann es sich um ein mutantes Allel handeln. In einer weiteren
Ausführungsform
werden durch die Erfindung Verfahren zur Bestimmung, ob bei einer
Untersuchungsperson ein anomales Delta3-Protein aufgrund anomaler
posttranslationaler Modifikationen des Proteins, wie beispielsweise
anomaler Phosphoregulation oder Glycosylierung, vorliegt, bereitgestellt.
Erfindungsgemäß ebenso
umfaßt
sind Verfahren zur Bestimmung, ob bei einer Untersuchungsperson
ein anomales Expressionsniveau eines Delta3-Proteins, was an einer
genetischen Läsion
im Delta3-Gen oder an einem anomalen Niveau oder einer anomalen
Aktivität
eines die Expression eines Delta3-Gens regulierenden Proteins liegen
könnte,
vorliegt.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
können
die Verfahren dadurch gekennzeichnet sein, daß man dabei in einer Probe
von Zellen aus der Untersuchungsperson das Vorhandensein oder die
Abwesenheit einer genetischen Läsion,
die wenigstens entweder durch (i) eine sich auf die Integrität eines
für ein
Delta-Protein codierenden Gens auswirkende Veränderung oder (ii) die Fehlexpression
eines Delta3-Gens gekennzeichnet ist, nachweist. Zur Veranschaulichung:
Solche genetischen Läsionen
können
nachgewiesen werden, indem man wenigstens ein Ereignis aus (i) einer
Deletion eines oder mehrerer Nukleotide aus einem Delta3-Gen, (ii) einer Addition
eines oder mehrerer Nukleotide an ein Delta3-Gen, (iii) einer Substitution eines
oder mehrerer Nukleotide eines Delta3-Gens, (iv) einer gesamtchromosomalen
Umordnung eines Delta3-Gens, (v) einer Gesamtänderung im Niveau eines Messenger-RNA-Transkripts
eines Delta3-Gens, (vi) einer anomalen Modifikation eines Delta3-Gens,
wie beispielsweise des Methylierungsmusters der genomischen DNA,
(vii) dem Vorhandensein eines Nicht-Wildtyp-Spleißmusters
eines Messenger-RNA-Transkripts
eines Delta3-Gens, (viii) einem Nicht-Wildtyp-Niveau eines Delta-Proteins,
(ix) dem allelischen Verlust eines Delta3-Gens und (x) einer ungeeigneten
posttranslationalen Modifikation eines Delta-Proteins ermittelt.
Wie nachfolgend dargestellt, wird durch die vorliegende Erfindung
eine große
Anzahl von Testtechniken zum Nachweis von Läsionen in einem Delta3-Gen
und, was wichtig ist, die Fähigkeit
zwischen unterschiedlichen molekularen Ursachen, die der Delta-abhängigen anomalen
Zellproliferation und/oder -differenzierung zugrundeliegen, unterscheiden
zu können, bereitgestellt.
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Um
zu bestimmen, ob bei einer Untersuchungsperson eine Krankheit oder
ein Leiden, die bzw. das mit einem spezifischen Allel eines Delta3-Gens
assoziiert ist, vorliegt oder die Gefahr der Entwicklung einer solchen Krankheit
bzw. eines solchen Leidens besteht, können zur Bestimmung der Identität des mit
einer Krankheit assoziierten Allels Vorversuche durchgeführt werden.
So kann man beispielsweise zur Bestimmung der Identität des mit
ACCPN assoziierten hDelta3-Allels Mutationsnachweisuntersuchungen
des Delta3-Gens in Populationen mit einem hohen Risiko der Entwicklung
von ACCPN durchführen.
So kann man beispielsweise eine Mutationsnachweisanalyse der genomischen
DNA aus Untersuchungspersonen in der französisch-kanadischen Bevölkerung
in den Regionen Charlevoix und Saguenay-Lac St Jean der Provinz
Quebec durchführen (Casaubon
et al., supra). Aus einer solchen Analyse ergibt sich die Identität des bzw.
der mit ACCPN assoziierten Delta3-Allels bzw. Delta3-Allele. Der
Vergleich des Delta3-Allels einer Untersuchungsperson mit diesem mit
ACCPN assoziierten Allel bzw. diesen mit ACCPN assoziierten Allelen
liefert einen Hinweis darauf, ob bei einer Untersuchungsperson ein
mit ACCPN assoziiertes Delta3-Allel vorliegt, und somit, ob bei
der Untersuchungsperson ACCPN vorliegt oder die Wahrscheinlichkeit
der Entwicklung von ACCPN besteht. Auf ähnliche Weise läßt sich
eine Mutationsnachweisanalyse auch durchführen, um die Identität von mit
anderen Krankheiten oder Leiden assoziierten Delta3-Allelen zu bestimmen.
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In
einer beispielhaften Ausführungsform
wird eine Nukleinsäurezusammensetzung
bereitgestellt, die eine (gereinigte) Oligonukleotidsonde umfaßt, welche
einen Nukleotidsequenzbereich enthält, der zur Hybridisierung
an eine Sense- oder Antisense-Sequenz eines Delta3-Gens, wie es
durch eine der SEQ ID Nos: 1 und 3 dargestellt ist, von Allelen
davon, natürlich
vorkommenden Mutanten davon oder an natürlicherweise mit den betreffenden
Delta3-Genen oder natürlich
vorkommenden Mutanten davon assoziierte 5'- oder 3'-flankierende Sequenzen oder Intronsequenzen
in der Lage ist. Dabei wird die Nukleinsäure einer Zelle für die Hybridisierung
zugänglich
gemacht, die Sonde Nukleinsäure
der Probe ausgesetzt und die Hybridisierung der Sonde an die Probennukleinsäure nachgewiesen.
Derartige Techniken lassen sich zum Nachweis von Läsionen entweder
auf dem genomischen oder dem mRNA-Niveau, einschließlich Deletionen, Substitutionen
usw., ebenso wie zur Bestimmung von mRNA-Transkriptniveaus verwenden.
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Wie
oben dargelegt, betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung diagnostische
Tests zur Bestimmung im Zusammenhang mit aus einem Patienten isolierten
Zellen, ob Mutationen in einem oder mehreren Delta3-Genen der Probenzellen
entstanden sind. Mit dem vorliegenden Verfahren wird ein Verfahren
zur Bestimmung, ob bei einer Untersuchungsperson die Gefahr einer
durch anomale Delta3-Aktivität,
beispielsweise Zellproliferation und/oder -differenzierung, gekennzeichnete
Störung
besteht, bereitgestellt. In bevorzugten Ausführungsformen läßt sich
das Verfahren allgemein dadurch kennzeichnen, daß man dabei in einer Probe von
Zellen aus der Untersuchungsperson das Vorhandensein oder die Abwesenheit
einer durch eine sich auf die Integrität eines für ein Delta-Protein codierenden
Gens auswirkende Änderung
gekennzeichneten genetischen Läsion
nachweist. Zur Veranschaulichung: Solche genetischen Läsionen können nachgewiesen
werden, indem man wenigstens ein Ereignis aus (i) einer Deletion
eines oder mehrerer Nukleotide aus einem Delta-Gen, (ii) einer Addition
eines oder mehrerer Nukleotide an ein Delta-Gen, (iii) einer Substitution
eines oder mehrerer Nukleotide eines Delta-Gens und (iv) dem Vorhandensein
eines Nicht-Wildtyp-Spleißmusters
eines Messenger-RNA-Transkripts
eines Delta-Gens ermittelt. Wie nachfolgend dargestellt, wird durch
die vorliegende Erfindung eine große Anzahl von Testtechniken
zum Nachweis von Läsionen
in Delta3-Genen und, was wichtig ist, die Fähigkeit zwischen unterschiedlichen
molekularen Ursachen, die der Delta-abhängigen anomalen Zellproliferation
und/oder -differenzierung zugrundeliegen, unterscheiden zu können, bereitgestellt.
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In
bestimmten Ausführungsformen
umfaßt
der Nachweis der Läsion
in einem Delta-Gen oder der Identität einer allelischen Variante
eines polymorphen Bereichs eines Delta-Gens die Nutzung der Sonde/des
Primers in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) (siehe z.B. US-Patente
Nr. 4,683,195 und 4,683,202), wie beispielsweise Anker-PCR oder
RACE-PCR, oder als Alternative in einer Ligationskettenreaktion
(LCR) (siehe z.B. Landegran et al. (1988) Science 241:1077–1080; und
Nakazawa et al. (1999) PNAS 91:360–364), wobei die letztere besonders
zum Nachweis von Punktmutationen im Delta-Gen geeignet sein kann
(siehe Abravaya et al. (1995) Nuc Acid Res 23:675–682). In
einer lediglich veranschaulichenden Ausführungsform beinhaltet das Verfahren
die Schritte: (i) Sammeln einer Probe von Zellen aus einem Patienten,
(ii) Isolieren von Nukleinsäure
(z.B. genomische Nukleinsäure
oder/und mRNA) aus den Zellen der Probe, (iii) Inkontaktbringen
der Nukleinsäureprobe
mit einem oder mehreren spezifisch an ein Delta-Gen hybridisierenden
Primern unter solchen Bedingungen, daß die Hybridisierung und Amplifikation
des Delta-Gens (falls vorhanden) stattfindet, und (iv) Nachweisen
des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Amplifikationsprodukts
oder Nachweisen der Größe des Amplifikationsprodukts
und Vergleichen der Länge
mit einer Kontrollprobe. Man darf erwarten, daß die Verwendung der PCR und/oder
LCR als Voramplifikationsschritt in Verbindung mit einer der zum
Nachweis der hier beschriebenen Mutationen verwendeten Techniken
wünschenswert
ist.
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Zu
alternativen Amplifikationsverfahren gehören: die sich selbst erhaltende
Sequenzreplikation (Guatelli, J.C. et al., 1990, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87:1874–1878),
das transkriptionale Amplifikationssystem (Kwoh, D.Y. et al., 1989,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173–1177), Q-Beta-Replikase (Lizardi, P.M. et al., 1988,
Bio/Technology 6:1197) oder alle anderen Nukleinsäureamplifikationsverfahren,
wobei die amplifizierten Moleküle
anschließend
unter Verwendung von dem Fachmann allgemein bekannten Techniken
nachgewiesen werden. Diese Nachweisprotokolle eignen sich vor allem
zum Nachweis von Nukleinsäuremolekülen, wenn derartige
Moleküle
in einer sehr geringen Anzahl vorliegen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des betreffenden Tests werden Mutationen in einem Delta3-Gen oder
spezifischen Allelen eines Delta3-Gens aus einer Probenzelle anhand von
Veränderungen
in den Restriktionsenzymspaltmustern identifiziert. So wird beispielsweise
Proben- und Kontroll-DNA isoliert, (gegebenenfalls) amplifiziert,
mit einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen verdaut und die
Länge der Fragmente
durch Gelelektrophorese bestimmt. Zudem läßt sich die Verwendung sequenzspezifischer
Ribozyme (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,498,531) zum Aufzeichnen des
Vorhandenseins spezifischer Mutationen über die Entwicklung oder den
Verlust einer Ribozymspaltstelle einsetzen.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
kann eine von verschiedenen im Fachgebiet bekannten Sequenzierreaktionen
zur direkten Sequenzierung des Delta3-Gens und zum Nachweis von
Mutationen oder allelischen Varianten polymorpher Bereiche durch
Vergleichen der Sequenz des Proben-Delta3 mit der entsprechenden
Wildtyp(Kontroll-)Sequenz verwendet werden. Zu diesen Sequenzierreaktionen
gehören
beispielsweise die auf den von Maxam und Gilbert (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1977) 74:560) bzw. Sanger (Sanger et al. (1977) Proc.
Natl. Acad. Sci. 74:5463) entwickelten Techniken beruhenden Reaktionen.
Ebenso ist vorgesehen, daß eines
von verschiedenen automatisierten Sequenzierverfahren bei der Durchführung der
betreffenden Tests benutzt werden kann (Biotechniques (1995) 19:448),
einschließlich
durch Sequenzieren mittels Massenspektrometrie (siehe z.B. PCT-Veröffentlichung
WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv Chromatogr 36:127–162; und
Griffin et al. (1993) Appl Biochem Biotechnol 38:147–159). Dem
Fachmann ist ersichtlich, daß bei
gewissen Ausführungsformen
lediglich das Auftreten von einer, zwei oder drei Nukleinsäurebasen
in der Sequenzierreaktion bestimmt zu werden braucht. So kann man
beispielsweise A-tract oder dergleichen, wo zum Beispiel nur eine
Nukleinsäure
nachgewiesen wird, durchführen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann der Schutz vor Spaltungsagentien (wie z.B. einer Nuklease, Hydroxylamin
oder Osmiumtetroxid und mit Piperidin) zum Nachweis fehlgepaarter
Basen in RNA/RNA- oder RNA/DNA-Heteroduplexen
verwendet werden (Myers, et al. (1985) Science 230:1242). Im allgemeinen
beginnt die im Fachgebiet bekannte Technik der „Fehlpaarungsspaltung" („mismatch
cleavage") damit,
daß man durch
Hybridisierung von die Wildtyp-Delta3-Sequenz enthaltender (markierter)
RNA oder DNA mit aus einer Gewebsprobe gewonnenen potentiellen mutanten
RNA oder DNA gebildete Heteroduplexe bereitstellt. Die doppelsträngigen Duplexe
werden mit einem Agens behandelt, das einzelsträngige Bereiche des Duplexes, so
wie sie aufgrund von Basenpaarfehlpaarungen zwischen dem Kontroll-
und dem Probenstrang existieren, spaltet. So können beispielsweise RNA/DNA-Duplexe
mit RNase und DNA/DNA-Hybride mit S1-Nuklease zur enzymatischen Verdauung
der fehlgepaarten Bereiche behandelt werden. In weiteren Ausführungsformen können entweder
DNA/DNA- oder RNA/DNA-Duplexe
mit Hydroxylamin oder Osmiumtetroxid und mit Piperidin behandelt
werden, um fehlgepaarte Bereiche zu verdauen. Nach Verdauung der
fehlgepaarten Bereiche wird das erhaltene Material dann auf denaturierenden
Polyacrylamidgelen nach Größe getrennt,
um die Stelle der Mutation zu bestimmen. Siehe beispielsweise Cotton
et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397; Saleeba et al.
(1992) Methods Enzymod. 217:286–295.
In einer bevorzugten Ausführungsform
kann die Kontroll-DNA oder -RNA zum Nachweis markiert werden.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
werden bei der Fehlpaarungsspaltreaktion ein oder mehrere Proteine,
die fehlgepaarte Basenpaare in doppelsträngiger DNA erkennen (sogenannte „DNA mismatch
repair"-Enzyme),
in definierten Systemen zum Nachweis und zur Kartierung von Punktmutationen
in aus Proben von Zellen gewonnenen Delta3-cDNAs eingesetzt. So
spaltet beispielsweise das Enzym mutY aus E. coli A bei G/A-Fehlpaarungen
und die Thymidin-DNA-Glycosylase aus HeLa-Zellen T bei G/T-Fehlpaarungen
(Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15:1657–1662). Gemäß einer beispielhaften Ausführungsform
wird eine auf einer Delta3-Sequenz, z.B. einer Wildtyp-Delta3-Sequenz,
beruhende Sonde an eine cDNA oder ein anderes DNA-Produkt aus einer
Testzelle(n) hybridisiert. Der Duplex wird mit einem DNA-Fehlpaarungsreparaturenzym behandelt,
und die Spaltprodukte, falls vorhanden, lassen sich nach Elektrophoresevorschriften
oder dergleichen nachweisen. Siehe beispielsweise US-Patent Nr.
5,459,039.
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In
weiteren Ausführungsformen
werden Veränderungen
in der elektrophoretischen Mobilität zur Identifizierung von Mutationen
in Delta3-Genen oder zur Bestimmung der Identität des Delta3-Allels verwendet.
So kann beispielsweise ein Einzelstrangkonformationspolymorphismus
(SSCP) zum Nachweis von Unterschieden in der elektrophoretischen
Mobilität
zwischen mutanten und Wildtyp-Nukleinsäuren verwendet werden (Orita
et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766, siehe auch Cotton
(1993) Mutat Res 285:125–144;
und Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:73–79). Dabei denaturiert man
einzelsträngige
DNA-Fragmente von Proben- und Kontroll-Delta3-Nukleinsäuren und läßt sie dann denaturieren. Die
Sekundärstruktur
einzelsträngiger
Nukleinsäuren
variiert entsprechend der Sequenz, und die erhaltene Veränderung
in der elektrophoretischen Mobilität ermöglicht den Nachweis selbst
eines einzelnen Basenaustauschs. Die DNA-Fragmente können mit markierten Sonden
markiert oder nachgewiesen werden. Die Empfindlichkeit des Tests
kann durch Verwendung von RNA (statt DNA), bei der die Sekundärstruktur
gegenüber
einer Sequenzänderung
empfindlicher ist, erhöht
werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird bei dem betreffenden
Verfahren eine Heteroduplexanalyse benutzt, um doppelsträngige Heteroduplexmoleküle auf Grundlage
von Änderungen
in der elektrophoretischen Mobilität zu trennen (Keen et al. (1991)
Trends Genet 7:5).
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
wird die Bewegung von mutanten oder Wildtyp-Fragmenten in Polyacrylamidgelen,
die einen Denaturierungsmittelgradienten enthalten, mit der denaturierenden
Gradientengelelektrophorese (DGGE) getestet (Myers et al (1985)
Nature 313:495). Bei Verwendung von DGGE als Analyseverfahren wird
die DNA modifiziert, um sicherzustellen, daß sie nicht vollständig denaturiert,
indem man beispielsweise eine GC-Klammer von ungefähr 40 bp
hochschmelzender GC-reicher DNA mittels PCR hinzufügt. In einer
weiteren Ausführungsform
wird zur Identifizierung von Unterschieden in der Mobilität der Kontroll-
und Proben-DNA statt eines Denaturierungsmittelgradienten ein Temperaturgradient
verwendet (Rosenbaum und Reissner (1987) Biophys Chem 265:12753).
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Zu
weiteren Techniken zum Nachweis von Punktmutationen gehören beispielsweise,
ohne darauf beschränkt
zu sein, selektive Oligonukleotidhybridisierung, selektive Amplifikation
oder selektive Primerverlängerung.
Beispielsweise kann man Oligonukleotidprimer, bei denen die bekannte
Mutation in der Mitte plaziert ist, herstellen und anschließend an
Ziel-DNA hybridisieren, und zwar unter Bedingungen, bei denen die
Hybridisierung nur dann gestattet ist, wenn eine perfekte Paarung
gefunden wird (Saiki et al. (1986) Nature 324:163); Saiki et al.
(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230). Derartige allelspezifische
Oligonukleotidhybridisierungstechniken können zum Testen einer Mutation
pro Reaktion bei Hybridisierung der Oligonukleotide an PCR-amplifizierte
Ziel-DNA oder einer Reihe unterschiedlicher Mutationen bei Bindung
der Oligonukleotide an die Hybridisierungsmembran und Hybridisierung
mit markierter Ziel-DNA verwendet werden.
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Als
Alternative kann eine allelspezifische Amplifikationstechnologie,
die auf selektiver PCR-Amplifikation beruht, in Verbindung mit der
vorliegenden Erfindung verwendet werden. Als Primer für die spezifische Amplifikation
verwendete Oligonukleotide können
die interessierende Mutation im Zentrum des Moleküls (so daß die Amplifikation
von differentieller Hybridisierung abhängt) (Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids
Res. 17:2437–2448)
oder am äußersten
3'-Ende des einen
Primers tragen, wo eine Fehlpaarung unter entsprechenden Bedingungen
die Verlängerung
durch die Polymerase verhindern oder reduzieren kann (Prossner (1993) Tibtech
11:238. Darüber
hinaus kann es wünschenswert
sein, eine neue Restriktionsstelle im Bereich der Mutation einzuführen, um
einen auf Spaltung beruhenden Nachweis zu erzeugen (Gasparini et
al. (1992) Mol. Cell Probes 6:1). Es wird erwartet, daß in gewissen
Ausführungsformen
eine Amplifikation auch unter Verwendung der Taq-Ligase zur Amplifikation durchgeführt werden
kann (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189). In solchen
Fällen
findet eine Ligation nur dann statt, wenn am 3'-Ende der 5'-Sequenz eine perfekte Paarung vorhanden
ist, die es ermöglicht,
das Vorhandensein einer bekannten Mutation an einer spezifischen
Stelle nachzuweisen, indem man nach dem Vorhandensein oder der Abwesenheit
einer Amplifikation sucht.
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Eine
weitere erfindungsgemäße Ausführungsform
sieht eine Nukleinsäurezusammensetzung
vor, die eine (gereinigte) Oligonukleotidsonde umfaßt, welche
einen Nukleotidsequenzbereich enthält, der zur Hybridisierung
an eine Sense- oder Antisense-Sequenz eines Delta-Gens oder natürlich vorkommender
Mutanten davon oder an natürlicherweise
mit den betreffenden Delta-Genen oder natürlich vorkommenden Mutanten
davon assoziierte 5'-
oder 3'-flankierende
Sequenzen oder Intronsequenzen in der Lage ist. Dabei wird die Nukleinsäure einer
Zelle für
die Hybridisierung zugänglich
gemacht, die Sonde Nukleinsäure
der Probe ausgesetzt und die Hybridisierung der Sonde an die Probennukleinsäure nachgewiesen.
Derartige Techniken lassen sich zum Nachweis von Läsionen entweder
auf dem genomischen oder dem mRNA-Niveau, einschließlich Deletionen, Substitutionen
usw., ebenso wie zur Bestimmung von mRNA-Transkriptniveaus verwenden.
Solche Oligonukleotidsonden können
sowohl zur prognostischen als auch therapeutischen Bewertung allelischer
Mutationen, die sich beispielsweise in einer neurodegenerativen,
in neoplastischen oder hyperplastischen Störungen (z.B. anomales Zellwachstum)
manifestieren könnten,
verwendet werden.
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Die
hier beschriebenen Verfahren können
beispielsweise unter Nutzung fertig abgepackter Kits, die wenigstens
eine Sondennukleinsäure
oder wenigstens ein Antikörperreagens,
wie hier beschrieben, umfassen und die zweckmäßigerweise beispielsweise im
klinischen Rahmen zur Diagnose von Symptome zeigenden Patienten
oder der Familiengeschichte einer Krankheit oder Erkrankung, an
der ein Delta3-Gen beteiligt ist, verwendet werden können, durchgeführt werden.
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In
den unten beschriebenen Diagnostika können alle Zellarten oder Gewebe,
vorzugsweise Nerven- oder Endothelzellen, in denen das Delta3 exprimiert
wird, verwendet werden. So kann beispielsweise die Körperflüssigkeit
einer Untersuchungsperson (z.B. Blut) mit bekannten Techniken (z.B.
Venenpunktur) gewonnen werden. Als Alternative lassen sich Nukleinsäuretests
an trockenen Proben (z.B. Haare oder Haut) durchführen. Fötale Nukleinsäureproben
lassen sich aus dem mütterlichen
Blut, wie in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO91/07660
an Bianchi beschrieben, gewinnen. Als Alternative können zur
Durchführung
von pränatalen
Tests, beispielsweise auf ACCPN, bei der es sich um eine Krankheit
handelt, die normalerweise im dritten Lebensjahrzehnt tödlich verläuft, Amniozyten
oder Chorionzotten gewonnen werden.
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Diagnostische
Verfahren können
auch in situ direkt auf Gewebeschnitten (fixiert und/oder gefroren) von
aus Biopsien oder Resektionen erhaltenem Patientengewebe durchgeführt werden,
so daß keine
Nukleinsäurereinigung
notwendig ist. Dabei können
Nukleinsäurereagentien
als Sonden und/oder Primer für
derartige In-situ-Verfahren eingesetzt werden (siehe z.B. Nuovo,
G.J., 1992, PCR in situ hybridization: protocols and applications,
Raven Press, NY).
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Neben
Verfahren, die sich hauptsächlich
auf den Nachweis einer Nukleinsäuresequenz
konzentrieren, können
in derartigen Nachweisprotokollen auch Profile beurteilt werden.
Dabei können
beispielsweise Fingerabdruckprofile unter Nutzung eines differentiellen
Display-Verfahrens, einer Northern-Analyse und/oder RT-PCR erzeugt
werden.
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Gegen
Wildtyp- oder mutante Delta3-Proteine gerichtete Antikörper, die
oben erörtert
sind, können ebenso
bei der Krankheitsdiagnose und -prognose verwendet werden. Derartige
prognostische Verfahren können
zum Nachweis von Abnormalitäten
auf der Ebene der Delta3-Proteinexpression oder von Abnormalitäten in der
Struktur und/oder der Gewebe-, zellulären oder subzellulären Lokalisation
von Delta3-Proteinen verwendet werden. Zu den strukturellen Unterschieden
gehören
beispielsweise Unterschiede in der Größe, der Elektronegativität oder Antigenität des mutanten
Delta3-Proteins gegenüber
dem normalen Delta3-Protein. Protein aus dem zu analysierenden Gewebe
oder der zu analysierenden Zellart kann leicht mit Techniken, die
dem Fachmann allgemein bekannt sind, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein,
der Western-Blot-Analyse, nachgewiesen oder isoliert werden. Für eine ausführliche
Erläuterung
von Verfahren zur Durchführung
der Western-Blot-Analyse, siehe Sambrook et al., 1989, supra, unter
Kapitel 18. Bei den hier verwendeten Proteinnachweis- und Isolierungsverfahren
kann es sich auch um solche Verfahren handeln, wie sie beispielsweise bei
Harlow und Lane (Harlow, E. und Lane, D., 1988, „Antibodies: A Laboratory
Manual", Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), hiermit
vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen, beschrieben sind.
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Dies
läßt sich
beispielsweise mit Immunfluoreszenztechniken bewerkstelligen, bei
denen ein fluoreszenzmarkierter Antikörper (siehe unten) zusammen
mit einem lichtmikroskopischen, durchflußzytometrischen oder fluorimetrischen
Nachweis eingesetzt wird. Die bei der vorliegenden Erfindung geeigneten
Antikörper (oder
Fragmente davon) können
zusätzlich
histologisch, wie bei der Immunfluoreszenz- oder Immunelektronenmikroskopie,
zum In-situ-Nachweis von Delta3-Proteinen eingesetzt werden. Der
In-situ-Nachweis kann bewerkstelligt werden, indem man einem Patienten
eine histologische Probe entnimmt und diese mit einem markierten
Antikörper
der vorliegenden Erfindung versieht. Der Antikörper (bzw. das Fragment) wird
vorzugsweise durch Überlagerung
einer biologischen Probe mit dem markierten Antikörper (bzw.
Fragment) aufgetragen. Durch die Verwendung eines solchen Verfahrens
ist es möglich,
nicht nur das Vorhandensein des Delta3-Proteins, sondern auch seine
Verteilung in dem untersuchten Gewebe zu bestimmen. Bei der Verwendung
der vorliegenden Erfindung ist es dem Fachmann leicht ersichtlich,
daß zur
Erreichung eines solchen In-situ-Nachweises eines von vielen verschiedenen
histologischen Verfahren (wie etwa Anfärbeverfahren) modifiziert werden
können.
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Häufig wird
eine Festphasenstütze
bzw. ein Festphasenträger
als zur Bindung eines Antigens oder eines Antikörpers fähige Stütze verwendet.
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Zu
allgemein bekannten Stützen
bzw. Trägern
gehören
Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen,
natürliche
und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Gabbros und Magnetit.
Der Träger
kann in seiner Beschaffenheit für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung entweder zu einem gewissen Grad
löslich
oder unlöslich
sein. Das Trägermaterial
kann praktisch alle möglichen
Strukturkonfigurationen aufweisen, solange wie das gekoppelte Molekül zur Bindung
an ein Antigen oder einen Antikörper
fähig ist.
Somit kann die Trägerkonfiguration
kugelförmig,
wie in einer Perle, oder zylindrisch, wie bei der inneren Oberfläche eines
Teströhrchens
oder der äußeren Oberfläche eines
Stabs, sein. Andererseits kann die Oberfläche flach sein, wie etwa bei
einem Blatt, Teststreifen usw. Zu den bevorzugten Trägern gehören Polystyrolperlen.
Dem Fachmann sind viele andere geeignete Träger zur Bindung von Antikörper oder
Antigen bekannt oder er kann diese unter Verwendung von Routineversuchen
ermitteln.
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Ein
Mittel zur Markierung eines Anti-Delta3-Protein-spezifischen Antikörpers besteht
in der Verknüpfung
mit einem Enzym und der Verwendung in einem Enzym-Immunoassay (EIA)
(Voller, „The
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", Diagnostic Horizons 2:1–7, 1978,
Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville,
MD; Voller, et al., J. Clin. Pathol. 31:507–520 (1978); Butler, Meth.
Enzymol. 73:482–523 (1981);
Maggio, (Hrsg.) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL, 1980;
Ishikawa, et al., (Hrsg.) Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo,
1981). Das an den Antikörper
gebundene Enzym reagiert mit einem entsprechenden Substrat, vorzugsweise
einem chromogenen Substrat, so daß eine chemische Gruppierung
produziert wird, die sich beispielsweise mit spektrophotometrischen,
fluorimetrischen oder optischen Mitteln nachweisen läßt. Zu den
Enzymen, die zur nachweisbaren Markierung des Antikörpers verwendet
werden können,
gehören,
ohne darauf beschränkt
zu sein, Malatdehydrogenase, Staphylokokken-Nuklease, delta-5-Steroid-Isomerase,
Hefe-Alkoholdehydrogenase,
alpha-Glycerophosphat-Dehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettich-Peroxidase,
alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, beta-Galactosidase,
Ribonuklease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase,
Glucoamylase sowie Acetylcholinesterase. Der Nachweis läßt sich
mit kolorimetrischen Verfahren, bei denen ein chromogenes Substrat für das Enzym
eingesetzt wird, bewerkstelligen. Der Nachweis kann ebenso durch
optischen Vergleich des Ausmaßes
der enzymatischen Reaktion eines Substrats im Vergleich mit auf ähnliche
Weise hergestellten Standards bewerkstelligt werden.
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Der
Nachweis kann ebenso unter Verwendung eines von verschiedenen weiteren
Immunotests bewerkstelligt werden. So ist es beispielsweise durch
radioaktive Markierung der Antikörper
oder Antikörperfragmente
möglich,
Fingerabdruck-Gen-Wildtyp- oder -mutante Peptide über die
Verwendung eines Radioimmunoassays (RIA) nachzuweisen (siehe z.B.
Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course
on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, März 1986,
hiermit durch Bezugnahme aufgenommen). Das radioaktive Isotop läßt sich
mit solchen Mitteln wie beispielsweise der Verwendung eines Gammazählers oder
eines Szintillationszählers
oder durch Autoradiographie nachweisen.
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Ebenso
besteht die Möglichkeit,
den Antikörper
mit einer Fluoreszenzverbindung zu markieren. Wird der fluoreszenzmarkierte
Antikörper
Licht der korrekten Wellenlänge
ausgesetzt, so läßt sich
sein Vorhandensein dann aufgrund der Fluoreszenz nachweisen. Unter
den am häufigsten
verwendeten Verbindungen zur Fluoreszenzmarkierung befinden sich
Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin,
Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und Fluorescamin.
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Der
Antikörper
kann auch unter Verwendung fluoreszenzabgebender Metalle, wie z.B. 152Eu oder anderen Metallen der Lanthanidenreihe,
nachweisbar markiert werden. Diese Metalle lassen sich an den Antikörper unter
Verwendung solcher Metallkomplexbildnergruppen wie etwa Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA)
oder Ethylendiamintetraessigsäure
(EDTA) binden.
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Der
Antikörper
läßt sich
ebenso nachweisbar markieren, indem er an eine Chemilumineszenzverbindung
gekoppelt wird. Das Vorhandensein des mit einem Chemilumineszenz-Tag
versehenen Antikörpers
wird dann bestimmt, indem man das Vorhandensein der während des
Verlaufs einer chemischen Reaktion entstehenden Lumineszenz nachweist.
Zu den besonders geeigneten Verbindungen für die Chemilumineszenzmarkierung
gehören
beispielsweise Luminol, Isoluminol, theromatische Acridiniumester,
Imidazol, Acridiniumsalz und Oxalsäureester.
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Gleichfalls
kann eine Biolumineszenzverbindung zur Markierung des Antikörpers der
vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bei der Biolumineszenz
handelt es sich um eine Art der Chemilumineszenz, die in biologischen
Systemen angetroffen wird, und bei der ein katalytisches Protein
die Effizienz der Chemilumineszenzreaktion erhöht. Das Vorhandensein eines
Biolumineszenzproteins wird durch den Nachweis des Vorhandenseins
der Lumineszenz bestimmt. Im Sinne der Markierung wichtige Biolumineszenzverbindungen
sind Luciferin, Luciferase und Äquorin.
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Zudem
versteht es sich, daß alle
obigen Verfahren zum Nachweis von Veränderungen in einem Delta3-Gen
oder -Genprodukt zur Überwachung
des Verlaufs einer Behandlung oder Therapie eingesetzt werden können.
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4.7 Arzneistoff-Screening-Tests
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Gegenstand
der Erfindung sind Verbindungen, beispielsweise therapeutische Verbindungen,
zur Behandlung von Krankheiten oder Leiden, die durch eine anomale
Delta3-Aktivität
verursacht werden oder zu denen eine solche anomale Aktivität beiträgt. Bei
den Verbindungen, die für
diesen Zweck verwendet werden können,
kann es sich um eine beliebige Art von Verbindung, einschließlich eines
Proteins, eines Peptids, eines Peptidomimetikums, eines kleinen
Moleküls
und einer Nukleinsäure,
handeln. Bei einer Nukleinsäure
kann es sich beispielsweise um ein Gen, eine Antisense-Nukleinsäure, ein
Ribozym oder ein Triplexmolekül
handeln. Bei einer erfindungsgemäßen Verbindung
kann es sich um einen Agonisten oder einen Antagonisten handeln. Eine
Verbindung kann auf ein Delta3-Gen wirken, beispielsweise um dessen
Expression zu modulieren. Eine Verbindung kann auch auf ein Delta3-Protein
wirken, um beispielsweise die Signaltransduktion vom Rezeptor zu
modulieren. Entsprechenderweise kann es sich bei einer erfindungsgemäßen Verbindung
um eine Verbindung handeln, die an Delta3 bindet und die die Signaltransduktion
vom Rezeptor induziert, so daß beispielsweise
eine Delta3-Aktivität
induziert wird. Als Alternative kann es sich bei einer erfindungsgemäßen Verbindung
um eine Verbindung handeln, die die Wechselwirkung eines Delta3-Proteins
mit einem toporhythmischen Protein, z.B. Notch, hemmt. In einer
Ausführungsform
handelt es sich bei einer erfindungsgemäßen Verbindung, die mit einem
Delta-Protein wechselwirkt, bei der es sich entweder um einen Agonisten
oder einen Antagonisten handelt, um ein anderes, mit Delta3 wechselwirkendes
Protein. In einer noch stärker
bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei der Verbindung um ein lösliches toporhytmisches Protein
oder ein anderes mit Delta3 wechselwirkendes Protein. Dementsprechend
kann es sich bei einem löslichen
toporhythmischen Protein um eine stimulatorische Form eines toporhythmischen
Proteins oder eine inhibitorische Form eines toporhythmischen Proteins
handeln, je nachdem, ob das jeweilige toporhythmische Protein eine Delta3-Aktivität stimuliert
oder hemmt.
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Auf ähnliche
Weise kann ein lösliches
Delta3-Protein, z.B. Delta3-Ig, zur Modulation einer Aktivität eines
toporhythmischen Proteins, z.B. Notch, verwendet werden. Beispielsweise
kann es sich bei einem löslichen
Delta3-Protein um eine stimulatorische Form eines Delta3-Proteins,
d.h. ein Delta3-Protein, das zur Stimulierung einer Aktivität eines
toporhythmischen Proteins in der Lage ist, handeln. In einer Ausführungsform wirkt
ein solches Protein im wesentlichen auf die gleiche Weise wie Wildtyp-Delta3.
In einer weiteren Ausführungsform
handelt es sich bei einem löslichen
Delta3-Protein um eine inhibitorische Form eines Delta3-Proteins,
d.h. ein Delta3-Protein, das zur Hemmung einer Aktivität eines
toporhythmischen Proteins in der Lage ist. Beispielsweise könnte ein
solches Delta3-Protein die Wechselwirkung von Wildtyp-Delta3 mit
dem toporhythmischen Protein hemmen. In einer bevorzugten Ausführungsform
hemmt eine inhibitorische Form eines Delta3-Proteins die Wechselwirkung mehrerer
Proteine, die normalerweise mit einem toporhythmischen Protein beispielsweise
durch Bindung an eine Stelle des toporhythmischen Proteins, die
auch eine Bindungsstelle für
verschiedene andere Proteine, z.B. andere Delta-Proteine darstellt,
wechselwirken. Dementsprechend kann ein Delta3-Therapeutikum im
allgemeinen eine Wirkung auf die Wechselwirkung verschiedener toporhythmischer
Proteine miteinander ausüben.
Auf ähnliche
Weise kann wenigstens teilweise aufgrund der Sequenz- und Strukturähnlichkeiten
zwischen Delta-Proteinen ein anderes Delta-Therapeutikum als ein Delta3-Therapeutikum ebenso
zur Modulierung der Wechselwirkung zwischen einem Delta3-Protein
und einem mit Delta3 wechselwirkenden Bindungsmolekül verwendet
werden.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
lassen sich unter Verwendung verschiedener Tests, je nach Art der
Verbindung und gewünschten
Aktivität
der Verbindung, identifizieren. Wenigstens einige Tests, die sich
zur Identifizierung von Delta3-Therapeutika verwenden lassen, sind
unten aufgeführt.
Es liegt im fachmännischen Können, zusätzliche
Tests zur Identifizierung von Delta-Therapeutika, beispielsweise
Delta3-Therapeutika,
zu entwerfen.
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Durch
das Zurverfügungstellen
gereinigter und rekombinanter Delta3-Polypeptide erleichtert die vorliegende
Erfindung die Entwicklung von Tests, die zum Screening auf Arzneistoffe,
einschließlich
Delta3-Varianten,
bei denen es sich entweder um Agonisten oder Antagonisten der normalen
zellulären
Funktion der betreffenden Delta3-Polypeptide oder deren Rolle bei
der Pathogenese der Zelldifferenzierung und/oder -proliferation
sowie damit verwandten Störungen
handelt, verwendet werden können.
In einer Ausführungsform
beurteilt der Test die Fähigkeit
einer Verbindung, die Bindung zwischen einem Delta3-Polypeptid und
einem Molekül,
bei dem es sich um ein Protein oder DNA handeln kann und dessen
Wechselwirkung dem Delta/Notch-Signalisierungsweg entweder vorgeschaltet
oder nachgeschaltet ist, zu modulieren. Verschiedene Testformate genügen hier
und sind im Licht der vorliegenden Erfindungen der Fachkraft ersichtlich.
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4.7.1 Zellfreie Tests
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Zellfreie
Tests können
zur Identifizierung von Verbindungen, die mit einem Delta3-Protein
wechselwirken, verwendet werden. Solche Tests stehen zum Testen
von Verbindungen, bei denen es sich um Proteine, beispielsweise
toporhythmische Proteine oder Varianten davon, handelt ebenso zur
Verfügung
wie zum Testen von Verbindungen, bei denen es sich um Peptidomimetika,
kleine Moleküle
oder Nukleinsäuren
handelt. Der zum Testen dieser Verbindungen spezifische Test kann
mit der Art der Verbindung variieren.
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In
einer Ausführungsform
wird eine mit einem Delta3-Protein wechselwirkende Verbindung durch
das Screening beispielsweise einer Bibliothek von Verbindungen auf
die Bindung an ein rekombinantes oder gereinigtes Delta3-Protein
oder wenigstens einen Anteil davon identifiziert. Solche Tests können die
Markierung einer oder beider Komponenten sowie die Messung des Ausmaßes ihrer
Wechselwirkung beispielsweise durch Bestimmen des Niveaus der einen
bzw, der beiden Markierungen beinhalten. In diesen Tests kann es bevorzugt
sein, das Delta3-Protein an eine Festphasenoberfläche zu binden.
Verfahren, um dieses zu erreichen, sind unten weiter beschrieben.
In einer Ausführungsform
handelt es sich bei der Bibliothek von Verbindungen um eine Bibliothek
kleiner Moleküle.
In einer weiteren Ausführungsform
handelt es sich bei der Bibliothek von Verbindungen um eine Bibliothek
von Delta3-Varianten, die gemäß unten
beschriebener Verfahren hergestellt werden kann.
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Die
Identifizierung einer Verbindung, die eine Wechselwirkung zwischen
einem Delta3-Protein und einem toporhythmischen Protein hemmt, läßt sich
auch durch das Screening von Verbindungen unter Verwendung von Aggregationstests,
wie beispielsweise bei Fehon et al. (1990) Cell 61:523–534 beschrieben,
durchführen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
werden durch die Erfindung Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen,
die die Wechselwirkung eines Delta3-Proteins mit einem Molekül, beispielsweise
einem toporhythmischen Protein oder einem mit der zytoplasmatischen
Domäne
eines Delta3-Proteins
wechselwirkenden Protein, hemmen, bereitgestellt. Derartige Verfahren,
die vorzugsweise in Tests mit hohem Durchsatz verwendet werden,
lassen sich wie folgt durchführen.
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Bei
vielen Arzneistoff-Screening-Programmen, bei denen Bibliotheken
von Verbindungen und natürlichen
Extrakten getestet werden, sind Tests mit hohem Durchsatz wünschenswert,
um die Anzahl der über
einen gegebenen Zeitraum untersuchten Verbindungen zu maximieren.
Tests, die in zellfreien Systemen durchgeführt werden, wie sie beispielsweise
mit gereinigten oder halbgereinigten Proteinen erhalten werden können, sind
häufig
als „primäre" Screens bevorzugt,
da sie erzeugt werden können,
um eine schnelle Entwicklung und einen relativ einfachen Nachweis
einer Veränderung
in einem Zielmolekül,
die durch eine Testverbindung vermittelt wird, zu gestatten. Zudem
können
die Effekte der zellulären
Toxizität
und/oder Bioverfügbarkeit
der Testverbindung im allgemeinen im In-vitro-System ignoriert werden,
wohingegen der Test hauptsächlich
auf die Wirkung des Arzneistoffs auf das Zielmolekül wie sie
in einer Veränderung
der Bindungsaffinität
mit vorgeschalteten oder nachgeschalteten Elementen manifestiert
sein kann, ausgerichtet ist. Dementsprechend wird in einem beispielhaften
Screening-Test der vorliegenden Erfindung die interessierende Verbindung
mit Proteinen, die eine vorgeschaltete Funktion ausüben können (einschließlich sowohl
Aktivatoren als auch Repressoren ihrer Aktivität) oder mit Proteinen oder
Nukleinsäuren,
die eine dem Delta3-Polypeptid nachgeschaltete Funktion ausüben können, gleichgültig ob
sie durch letzteres positiv oder negativ reguliert werden, in Kontakt gebracht.
So kann es sich beispielsweise bei einem Protein mit einer einem
Delta3-Polypeptid vorgeschalteten Funktion um eine Verbindung handeln,
die mit dem extrazellulären
Anteil des Delta3-Moleküls
wechselwirkt. Bei einem Protein mit einer einem Delta3-Polypeptid
nachgeschalteten Funktion kann es sich um ein Protein handeln, das
mit der zytoplasmatischen Domäne
von Delta3 wechselwirkt und beispielsweise ein Signal an den Zellkern
weiterleitet. Zu dem Gemisch aus der Verbindung und dem vorgeschalteten
bzw. nachgeschalteten Element wird dann eine ein Delta3-Polypeptid
enthaltende Zusammensetzung gegeben. Mit dem Nachweis und der Quantifizierung
von Komplexen von Delta3 mit seinen vorgeschalteten oder nachgeschalteten Elementen
stehen Mittel zur Bestimmung der Wirksamkeit einer Verbindung bei
der Hemmung (oder Potenzierung) der Komplexbildung zwischen Delta3
und den Delta-bindenden Elementen bereit. Die Wirksamkeit der Verbindung
läßt sich
beurteilen, indem man Dosis-Wirkungskurven
von mit verschiedenen Konzentrationen der Testverbindung erhaltenen
Daten erstellt. Zudem kann auch ein Kontrolltest durchgeführt werden,
um eine Basislinie als Vergleich zu liefern. Im Kontrolltest wird
ein isoliertes und gereinigtes Delta3-Polypeptid zu einer das Delta-bindende
Element enthaltenden Zusammensetzung gegeben und die Bildung eines
Komplexes in Abwesenheit der Testverbindung quantifiziert.
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Die
Komplexbildung zwischen dem Delta3-Polypeptid und einem Delta3-bindenden Element
kann mit verschiedenen Techniken nachgewiesen werden. Die Modulation
der Ausbildung von Komplexen läßt sich
beispielsweise unter Verwendung nachweisbar markierter Proteine,
wie beispielsweise radioaktiv markierter, fluoreszenzmarkierter
oder enzymatisch markierter Delta3-Polypeptide, mittels Immunoassay
oder mittels chromatographischem Nachweis quantifizieren.
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Typischerweise
ist es wünschenswert,
entweder Delta3 oder sein Bindungsprotein zu immobilisieren, um
die Trennung der Komplexe von nicht komplexierten Formen eines oder
beider Proteine zu erleichtern ebenso wie der Automatisierung des
Tests entgegenzukommen. Die Bindung von Delta3 an ein vorgeschaltetes
oder nachgeschaltetes Element in Gegenwart und Abwesenheit eines
Kandidatenagens läßt sich
in einem beliebigen zur Aufnahme der Reaktanden geeigneten Gefäß bewerkstelligen.
Als Gefäß dienen
beispielsweise u.a. Mikrotiterplatten, Teströhrchen und Mikrozentrifugenröhrchen.
In einer Ausführungsform
kann ein Fusionsprotein bereitgestellt werden, das eine Domäne hinzufügt, die
die Bindung des Proteins an eine Matrix gestattet. So können beispielsweise
Glutathion-S-Transferase/Delta3 (GST/Delta)-Fusionsproteine an Glutathion-Sepharoseperlen
(Sigma Chemicals, St. Louis, MO) oder Glutathion-derivatisierte
Mikrotiterplatten adsorbiert werden, die dann mit den Zellysaten,
beispielsweise mit einem 35S-markierten
Lysat, und der Testverbindung kombiniert werden, wobei das Gemisch
unter Bedingungen inkubiert wird, die der Komplexbildung förderlich
sind, beispielsweise unter hinsichtlich Salz und pH-Wert physiologischen
Bedingungen, obwohl etwas stringentere Bedingungen erwünscht sein
können.
Nach der Inkubation werden die Perlen zur Abtrennung eventuell vorhandener
nicht gebundener Markierung gewaschen und die Matrix immobilisiert
und die radioaktive Markierung direkt bestimmt (indem z.B. die Perlen
in einen Szintillator gegeben werden) oder im Überstand nach anschließender Dissoziation
der Komplexe bestimmt. Als Alternative können die Komplexe von der Matrix
dissoziiert und mittels SDS-PAGE getrennt werden und das in der
Perlenfraktion vorgefundene Niveau des Delta-bindenden Proteins
aus dem Gel unter Verwendung von Standardelektrophoresetechniken,
wie beispielsweise den in den angefügten Beispielen beschriebenen,
quantifiziert werden.
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Ebenso
stehen andere Techniken zur Immobilisierung von Proteinen auf Matrices
für die
Verwendung im betreffenden Test zur Verfügung, So kann beispielsweise
entweder Delta3 oder sein zugehöriges
Bindungsprotein unter Nutzung der Konjugation von Biotin und Streptavidin
immobilisiert werden. Biotinylierte Delta3-Moleküle lassen sich beispielsweise
aus Biotin-NHS (N-Hydroxy-succinimid) mit im Fachgebiet allgemein
bekannten Techniken (z.B. Biotinylierungskit, Pierce Chemicals,
Rockford, IL) herstellen und in den Vertiefungen von mit Streptavidin
beschichteten 96-Loch-Platten (Pierce Chemical) immobilisieren.
Alternativ können
Antikörper,
die mit Delta3 reagieren, jedoch nicht die Bindung vorgeschalteter
oder nachgeschalteter Elemente stören, in die Vertiefungen der
Platte derivatisiert werden und Delta3 durch Antikörperkonjugation
in den Vertiefungen eingefangen werden. Wie oben werden Präparationen
eines Delta-bindenden Proteins sowie einer Testverbindung in den
Delta-präsentierenden
Vertiefungen der Platte inkubiert, wonach die Menge an in der Vertiefung
eingefangenem Komplex quantifiziert werden kann. Zu den Verfahren
zum Nachweis derartiger Komplexe gehören neben den oben für die GST-immobilisierten
Komplexe beschriebenen Verfahren beispielsweise der Immunnachweis
von Komplexen unter Verwendung von Antikörpern, die mit dem Delta3-bindenden Element
reagieren oder die mit Delta3-Protein reagieren und mit dem Bindungselement
konkurrieren, ebenso wie enzymverknüpfte Tests, die auf den Nachweis
einer mit dem Bindungselement assoziierten enzymatischen Aktivität, bei der
es sich entweder um eine intrinsische oder extrinsische Aktivität handeln
kann, beruhen. Im Fall der letzteren kann das Enzym chemisch konjugiert
sein oder als Fusionsprotein mit dem Delta-BP bereitgestellt werden.
Zur Veranschaulichung: Das Delta-BP läßt sich chemisch mit Meerrettich-Peroxidase
quervernetzen oder genetisch damit fusionieren, und die Menge an
im Komplex gefangenem Polypeptid kann mit einem chromogenen Substrat
des Enzyms, z.B. 3,3'-Diaminobenzadin-tetrahydrochlorid
oder 4-Chlor-1-naphthol, beurteilt werden. Gleichfalls kann ein
das Polypeptid und Glutathion-S-Transferase umfassendes Fusionsprotein
bereitgestellt und die Komplexbildung durch Nachweisen der GST-Aktivität unter
Verwendung von 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol
quantifiziert werden (Habig et al. (1974) J Biol Chem 249:7130).
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Für Verfahren,
die auf dem Immunnachweis zur Quantifizierung eines der im Komplex
gefangenen Proteine beruhen, können
Antikörper
gegen das Protein, wie beispielsweise Anti-Delta3-Antikörper, verwendet werden.
Alternativ läßt sich
das im Komplex nachzuweisende Protein in Form eines Fusionsproteins
mit einem „Epitop-Tag" versehen, wobei
das Fusionsprotein neben der Delta3-Sequenz ein zweites Polypeptid
beinhaltet, für
das Antikörper
leicht verfügbar
sind (z.B. aus kommerziellen Quellen). Beispielsweise lassen sich
die oben beschriebenen GST-Fusionsproteine auch zur Quantifizierung
der Bindung unter Verwendung von Antikörpern gegen die GST-Gruppierung
verwenden. Zu weiteren geeigneten Epitop-Tags gehören myc-Epitope (z.B.
siehe Ellison et al. (1991) J. Biol Chem 266:21150–21157),
die eine Sequenz aus 10 Resten von c-myc enthalten, ebenso wie das
pFLAG-System (International Biotechnologies, Inc.) oder das pEZZ-Protein-A-System
(Pharamacia, NJ).
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4.7.2 Tests auf Zellbasis
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Neben
zellfreien Tests, wie den oben beschriebenen, erleichtert die leicht
verfügbare
Quelle von durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Delta3-Proteinen
ebenso die Entwicklung von Tests auf Zellbasis zur Identifizierung
kleiner Molekülagonisten/-antagonisten
und dergleichen. So können
beispielsweise Zellen, die gegenüber
bFGF/VEGF oder Matrigel empfindlich sind, zur Überexpression eines rekombinanten
Delta3-Proteins in Gegenwart und Abwesenheit eines interessierenden
Testagens veranlaßt
werden, wobei der Test die von dem Testagens vermittelte Modulation
der Delta3-Antworten durch die Zielzelle aufzeichnet. Wie bei den zellfreien
Tests lassen sich Agentien, die eine statistisch signifikante Änderung
der Delta-abhängigen
Antworten (entweder Hemmung oder Potenzierung) produzieren, identifizieren.
In einer veranschaulichenden Ausführungsform wird die Expression
oder Aktivität
eines Delta3 in Embryos oder Zellen moduliert, wobei die Auswirkungen
interessierender Verbindungen auf das interessierende Ableseereignis
(wie z.B. Gewebedifferenzierung, Proliferation, Tumorigenese) gemessen
werden. So läßt sich
beispielsweise die Expression von Genen, die als Antwort auf eine
Delta-abhängige
Signalkaskade herauf- oder herunterreguliert werden, testen. In
bevorzugten Ausführungsformen
sind die regulatorischen Bereiche solcher Gene, beispielsweise die
5'-flankierenden
Promotor- und Enhancer-Bereiche,
mit einem nachweisbaren Marker (wie z.B. Luciferase), der für ein Genprodukt,
das leicht nachgewiesen werden kann, codiert, operativ verknüpft.
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Beispielhafte
Zellinien können
Endothelzellen, wie z.B. MVECs, sowie aortische Endothelzellen aus Rindern
(BAECs) ebenso wie generische Säugerzellinien,
wie z.B. HeLa-Zellen und COS-Zellen, z.B. COS-7(ATCC#- CRL-1651), umfassen.
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In
einer Ausführungsform
läßt sich
eine Testverbindung, die eine Delta3-Aktivität modifiziert, durch Inkubieren
einer ein Delta3-Protein aufweisenden Zelle mit der Testverbindung
sowie Messen der Signaltransduktion von dem Delta3-Protein identifizieren.
Ein Vergleich der Signaltransduktion in den mit oder ohne die Testverbindung
inkubierten Zellen zeigt, ob es sich bei der Testverbindung um ein
Delta3-Therapeutikum handelt. Auf ähnliche Weise läßt sich
eine Testverbindung, die eine Delta3-Aktivität modifiziert, durch Inkubieren einer
einen Delta3-Liganden aufweisenden Zelle mit der Testverbindung,
z.B. einer von Delta3 abgeleiteten Verbindung, und Messen der Signaltransduktion
von dem Delta3-Liganden identifizieren. Ein Vergleich der Signaltransduktion
in den mit der oder ohne die Testverbindung inkubierten Zellen zeigt,
ob es sich bei der Testverbindung um ein Delta3-Therapeutikum handelt.
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Für den Fall,
daß die
Delta3-Proteine selbst oder in Komplexen mit anderen Proteinen zur
Bindung von DNA und/oder Modifikation der Transkription eines Gens
in der Lage sind, könnte
ein Test auf Transkriptionsbasis verwendet werden, bei dem beispielsweise
eine auf Delta3 reagierende regulatorische Sequenz mit einem nachweisbaren
Markergen, z.B. einem Luciferase-Gen, operativ verknüpft ist.
Auf ähnliche
Weise könnten
auch Delta3-Therapeutika unter Verwendung eines Tests identifiziert
werden, bei dem die Expression von Genen, die nach Bindung eines
Delta3-Proteins an einen Delta3-Liganden auf einer Zelle moduliert
werden, befolgt wird. Gene, die auf eine Wechselwirkung mit einem
Delta3-Protein oder Delta3-Liganden reagieren, können gemäß im Fachgebiet bekannten Verfahren,
beispielsweise Differentialhybridisierung oder differentiellem Display,
identifiziert werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann eine Vorrichtung auf Siliciumbasis, die als Mikrophysiometer bezeichnet
wird, zum Nachweis und zur Messung der Antwort von Zellen mit einem
Delta3-Protein verwendet werden, um Verbindungen zur Identifizierung
von Delta3-Therapeutika
zu testen. Dabei mißt
dieses Gerät
die Geschwindigkeit, mit der Zellen ihre Umgebung ansäuern, was
ein Hinweis auf Zellwachstum und/oder -differenzierung ist (McConnel
et al. (1992) Science 257:1906).
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Die
Verfolgung des Einflusses von Verbindungen auf Zellen kann nicht
nur beim grundlegenden Arzneistoff-Screening, sondern auch in klinischen
Versuchen angewandt werden. In solchen klinischen Versuchen kann
die Expression einer Reihe von Genen als ein „Read out" der therapeutischen Wirkung eines bestimmten Arzneistoffs
verwendet werden.
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In
noch einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt können die
betreffenden Delta3-Polypeptide zur Entwicklung eines „Two hybrid"-Tests (siehe z.B.
US-Patent Nr. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223–232; Madura
et al. (1993) J Biol Chem 268:12046–12054; Bartel et al. (1993)
Biotechniques 14:920–924;
Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693–1696; und Brent WO94/10300),
zur Isolierung codierender Sequenzen für andere zelluläre Proteine,
die an Delta3 binden oder damit wechselwirken („Delta-bindende Proteine" bzw. „Delta-bp"), wie z.B. Notch,
und dergleichen verwendet werden. In Kürze: der Two-hybrid-Test beruht
auf der In-vivo-Rekonstituierung eines funktionellen Transkriptionsaktivatorproteins
aus zwei getrennten Fusionsproteinen. Insbesondere werden bei dem
Verfahren chimärische
Gene, die Hybridproteine exprimieren, verwendet. Zur Veranschaulichung:
ein erstes Hybridgen umfaßt
die codierende Sequenz für
eine DNA bindende Domäne
eines Transkriptionsaktivators, die im Leseraster mit der codierenden
Sequenz für
ein Delta3-Polypeptid fusioniert ist. Das zweite Hybridprotein codiert
für eine
Transkriptionsaktivierungsdomäne, die
im Leseraster mit einem Probegen aus einer cDNA-Bank fusioniert
ist. Falls das Köder-
und das Proben-Hybridprotein miteinander wechselwirken können, beispielsweise
unter Ausbildung eines Delta-abhängigen
Komplexes, so bringen sie dadurch die beiden Domänen des Transkriptionsaktivators
in enge Nachbarschaft zueinander. Diese Nähe zueinander reicht aus, um
die Transkription eines Reportergens auszulösen, das mit einer auf den
Transkriptionsaktivator reagierenden Transkriptionsregulationsstelle
operativ verknüpft ist,
und die Expression des Reportergens läßt sich nachweisen und zum
Aufzeichnen der Wechselwirkung der Delta3- und Probenproteine verwenden.
Dieses System läßt sich
zur Identifizierung von Verbindungen, die die Wechselwirkung zwischen
einem Delta3-Protein und einem anderen Protein modifizieren, z.B.
hemmen, verwenden, indem man die Testverbindung zu einer die oben beschriebenen
Plasmide enthaltenden Zelle gibt. Die Wirkung der Testverbindung
auf die Expression des Reportergens wird dann gemessen, um die Wirkung der
Testverbindung auf die Wechselwirkung zu bestimmen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
werden durch die Erfindung Arrays zur Identifizierung von Verbindungen,
die über
ein Delta3-Protein Zellapoptose induzieren können, bereitgestellt. Apoptotische
Arrays sind im Fachgebiet bekannt und beispielsweise bei Grimm et
al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10923 beschrieben.
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5. BEISPIELE
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5.1 Isolierung einer hDelta3
codierenden Vollängen-cDNA
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Menschliche
mikrovaskuläre
Endothelzellen (MVEC, Katalog-Nr. CC2543; Clonetics, San Diego,
CA) wurden in vier Proben von Zellen getrennt, die wie folgt behandelt
wurden. Bei der ersten Probe handelte es sich um eine unbehandelte
Probe. Die zweite Probe wurde mit menschlichem TGF-β1 (hTGF-β1) (10 ng/ml) (Upstate
Biotechnology, Lake Placid, N.Y., Katalog-Nr. 01-134) behandelt. Die dritte Probe
wurde mit bFGF (10 ng/ml)/VEGF (25 ng/ml) (Upstate Biotechnology,
Lake Placid, N.Y., Katalog-Nr. 01-134, Katalog-Nr. 01-106 bzw. 01-185)
behandelt. Die vierte Probe wurde auf Matrigel (Collaborative Biomedical
Products, Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) differenziert.
Die Zellen wurden wie angegeben 24 Stunden behandelt, die vier Proben
wurden vereinigt, und RNA wurde aus den vereinigten Zellen unter
Verwendung eines RNeasy-Kits der Firma QIAGEN extrahiert. Die erhaltene
cDNA-Bank wurde einer Zufallssequenzierung mit hohem Durchsatz ausgesetzt.
Dies gestattete die Identifizierung eines cDNA-Fragments, das die
folgende 171 Nukleotide lange Sequenz umfaßt:
GCCCAGGCNGACCCTGGTGTGGACTGTGAGCTGGAGCTCAGCGAGTGTGACAGCAACCCCTGTCGCANTGGAGGCAGCTGTAAGGACCANGAGGATGGCTACCACTGCCTGTGTCCTCCGGGCTACTACGGCNTGCATCGTGAACACNGCACCTCTTAGCTGNGCCGACTC
(SEQ ID NO. 21).
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Ein
Vergleich der Nukleotidsequenz dieser partiellen cDNA mit den Sequenzen
in GenBank unter Verwendung des Programms BLAST (Altschul et al.
(1990) J. Mol. Biol. 215:403) zeigte, daß die Nukleotidsequenz für ein Proteinfragment
codierte, das eine signifikante Homologie mit Delta-Proteinen aufweist.
In der Tat wies die Aminosäuresequenz
eine signifikante Homologie mit einem Delta1-Protein aus Huhn (GenBank Accession
No. U26590), einem Delta1-Protein aus Xenopus (GenBank Accession
No. L42229), einem Delta1-Protein aus Ratte (GenBank Accession No.
U78889), einem Delta2-Protein aus Xenopus (GenBank Accession No.
U70843) ebenso wie mit Notch-Proteinen auf.
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Anschließend wurde
eine etwa 3,2 kb große
Vollängen-cDNA
durch Screening einer cDNA-Bank aus menschlichen mikrovaskulären Endothelzellen
(HMVEC) unter Verwendung der partiellen cDNA (SEQ ID NO. 21) isoliert.
Diese Nukleinsäure
wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 5. März 1997
hinterlegt und ATCC Accession No. 98348 zugeordnet. Die Nukleotidsequenz
der isolierten cDNA ist in 1 gezeigt
und weist die SEQ ID No. 1 auf.
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Ein
Nukleinsäuresequenzvergleich
der SEQ ID No. 1 gegen EST-Sequenzdatenbanken
unter Verwendung des Programms BLAST (Altschul et al. (1990) J.
Mol. Biol. 215:403) deutete an, daß 5 ESTs eine Homologie zu
Anteilen der SEQ ID No. 1 aufweisen. Diese sind allesamt 3' von der für die Transmembrandomäne codierenden
Nukleotidsequenz, d.h. stromabwärts
von Nukleotid 1996 der SEQ ID No. 1 lokalisiert. Drei dieser ESTs
(mit den Zugangsnr. T33770, T33811 und T07963) weisen eine Nukleotidsequenz
auf, die bei etwa Nukleotid 2044 der SEQ ID No. 1 beginnt. Allerdings
unterscheidet sich die Nukleotidsequenz der drei EST in signifikanter
Weise von der Nukleotidsequenz von hDelta3 in etwa den ersten 50
Nukleotiden 3' von
Nukleotid 2044 der SEQ ID No. 1. Zwei ESTs (mit Accession Nos. R32717
und T07962) sind weiter stromabwärts
von den drei ESTs lokalisiert.
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Die
Nukleinsäure
mit der SEQ ID No. 1 codiert für
ein Protein aus 685 Aminosäuren
mit der SEQ ID No. 2. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz der SEQ ID No. 2
mit Sequenzen in GenBank unter Verwendung von BLASTP (Altschul et
al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403) zeigt, daß dieses Protein eine gewisse
Homologie zu bereits beschriebenen Delta-Proteinen aufweist. 2 zeigt eine vergleichende Gegenüberstellung
des menschlichen Delta3-Proteins mit der SEQ ID No. 2 mit der Aminosäuresequenz
des Maus-Delta1-Proteins (Accession No. X80903), des Ratte-Delta1-Proteins
(Accession No. U78889), des Huhn-Delta1-Proteins (Accession No.
U26590), der zwei Xenopus-Delta1-Proteine (Accession Nos. L42229
und U70843) und des Drosophila-Delta1-Proteins (Accession No. AA142228).
Der Sequenzvergleich deutet an, daß das menschliche Delta3-Protein die allgemeine
Struktur eines Delta3-Proteins aufweist. Insbesondere weist das
menschliche Delta3-Protein ein Signalpeptid, das etwa Aminosäure 1 bis
etwa Aminosäure
17 der SEQ ID No. 2 entspricht, ein DSL-Motiv, das der Sequenz von
etwa Aminosäure
173 bis etwa Aminosäure
217 entspricht, eine erste EGF-ähnliche
Wiederholung, die der Sequenz von etwa Aminosäure 222 bis etwa Aminosäure 253
entspricht, eine zweite EGF-ähnliche
Wiederholung, die der Sequenz von etwa Aminosäure 253 bis etwa Aminosäure 281 entspricht,
eine dritte EGF-ähnliche
Wiederholung, die der Sequenz von etwa Aminosäure 288 bis etwa Aminosäure 321
entspricht, eine vierte EGF-ähnliche
Wiederholung, die der Sequenz von etwa Aminosäure 328 bis etwa Aminosäure 359
entspricht, eine fünfte
EGF-ähnliche
Wiederholung, die der Sequenz von etwa Aminosäure 366 bis etwa Aminosäure 399
entspricht, eine sechste EGF-ähnliche
Wiederholung, die der Sequenz von etwa Aminosäure 411 bis etwa Aminosäure 437
entspricht, eine siebte EGF-ähnliche
Wiederholung, die der Sequenz von etwa Aminosäure 444 bis etwa Aminosäure 475
entspricht, eine achte EGF-ähnliche
Wiederholung, die der Sequenz von etwa Aminosäure 484 bis etwa Aminosäure 517
entspricht, eine Transmembrandomäne,
die der Sequenz von etwa Aminosäure
530 bis etwa Aminosäure
553 entspricht, sowie eine zytoplasmatische Domäne, die der Sequenz von etwa
Aminosäure
554 bis etwa Aminosäure
685 der SEQ ID No. 2 entspricht, auf.
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Ein
Aminosäure-
und Nukleotidsequenzvergleich zwischen den Mitgliedern der Delta1-
und Delta3-Proteinfamilie und dem menschlichen Delta3 einerseits
und zwischen den Mitgliedern der Delta1-Familie zeigt, daß die Homologie
zwischen den Delta3-Familienmitgliedern stärker ist als die Homologie
zwischen menschlichem Delta3 und einem der Delta1-Familienmitglieder.
Obwohl beispielsweise hDelta3 nur ungefähr 58% Ähnlichkeit mit dem Drosophila-Delta1-Protein,
ungefähr
70% Ähnlichkeit
mit dem Maus-Delta1-Protein, ungefähr 70% Ähnlichkeit mit dem Ratte-Delta1-Protein, ungefähr 68% Ähnlichkeit
mit dem Huhn-Delta1-Protein und ungefähr 68% Ähnlichkeit mit den Xenopus-Delta1-Proteinen
aufweist, sind die Delta1-Proteine aus Drosophila, Maus, Ratte,
Huhn und Xenopus sehr ähnlich
zueinander (z.B. die Proteine aus Maus und Ratte weisen etwa 96% Ähnlichkeit
auf). Aus der veröffentlichten
PCT-Anmeldung WO97/01571 ist eine partielle Nukleotid- und Aminosäuresequenz
eines Proteins mit einer signifikanten Homologie zu Delta1-Familienmitgliedern
bekannt, was darauf hindeutet, daß es sich dabei wahrscheinlich
um ein menschliches Delta1-Protein handelt. Die Homologie zwischen
der partiellen Aminosäuresequenz
von menschlichem Delta1 und der Aminosäuresequenz des menschlichen
Delta3 ist in Tabelle I angedeutet und zeigt, daß die Proteine von unterschiedlichen
Genen codiert werden. Alle diese Aminosäure- und Nukleotidsequenzvergleiche
deuten an, daß es
sich bei dem menschlichen Delta3 um eine zusätzliche Spezies von Delta-Proteinen handelt,
die eine gewisse Sequenz- und Strukturhomologie mit den Delta1-Proteinen teilt.
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5.2 Gewebeexpression des
hDelta3-Gens
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In
diesem Beispiel wird die Verteilung des Delta3-Proteins in Gewebe
beschrieben, wie sie mittels Northern-Blot-Hybridisierung mit einem
1,6 kb großen
Fragment menschlicher Delta3-cDNA, das dem äußersten 3'-Ende der SEQ ID No. 1 entspricht, bestimmt
wurde.
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Northern-Blot-Hybridisierungen
mit den verschiedenen RNA-Proben wurden unter Standardbedingungen
durchgeführt
und unter stringenten Bedingungen, d.h. in 0,2 × SSC bei 65°C, gewaschen.
Bei jeder Probe wurde die Sonde jeweils an eine etwa 3,5 kb große einzelne
RNA hybridisiert. Die Ergebnisse der Hybridisierung der Sonde an
verschiedene mRNA-Proben sind nachfolgend beschrieben.
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Die
Hybridisierung eines RNA aus fötalem
Hirn, fötaler
Lunge, Leber und Niere enthaltenden Clontech Fetal Multiple Tissue
Northern (MTN)-Blots (Clontech, LaJolla, CA) deutete auf das Vorhandensein
von Delta3-RNA in jedem dieser fötalen
Gewebe hin. Dabei war die Expression in fötaler Lunge und Niere deutlich höher als
in fötalem
Hirn und fötaler
Leber. Die Hybridisierung eines RNA aus adultem Herz, Hirn, adulter
Plazenta, Lunge, Leber, adultem Skelettmuskel, adulter Niere, Bauchspeicheldrüse, Milz,
adultem Thymus, adulter Prostata, adultem Hoden, Eierstock, Dünndarm,
adulter Dickdarmschleimhaut und adulten peripheren Blutleukozyten
enthaltenden menschlichen MTNI (Multiple Tissue Northern I)-Blots
bzw. MTNII (Multiple Tissue Northern II)-Blots, jeweils von Clontech
(Clontech, LaJolla, CA), mit der menschlichen 1,6 kb großen Delta3-Sonde
wies auf eine Expression in Herz, Plazenta, Lunge, Skelettmuskel,
Niere, Bauchspeicheldrüse, Milz,
Thymus, Prostata, Hoden, Eierstock, Dünndarm und Dickdarm hin. Die
Expression war besonders stark in adultem Herz, adulter Plazenta,
Lunge und adultem Skelettmuskel. Eine Expression wurde auch in adultem Hirn,
adulter Leber und adultem Hoden festgestellt. Dagegen wurde keine
signifikante Menge an hDelta3-mRNA in adulten peripheren Blutleukozyten
nachgewiesen.
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Ferner
wurde durch eine Northern-Blot-Hybridisierung von Gesamt-mRNA aus
jeweils über
einen Zeitraum von 24 Stunden mit 10 ng/ml TGF-β1, 10 ng/ml bFGF/25 ng/ml VEGF
behandelten oder unbehandelten HMVEC-Zellen angedeutet, daß die Delta3-Expression
nach Induktion mit bFGF/VEGF induziert wurde. Dementsprechend wird
die Expression von Delta3 in HMV-Endothelzellen
als Antwort auf gewisse Wachstumsfaktoren heraufreguliert.
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Die
Hybridisierung eines RNA aus HL-60-, HeLa-, K562-, MoLT4-, Raji-,
SW480-, A549- und G361-Zellen enthaltenden „Krebs"-Northern-Blots zeigte, daß Delta3
in der Kolorektalkarzinomzellinie SW480 auf hohem Niveau exprimiert
wird. Somit liegt wenigstens in bestimmten Tumorzellen eine hohe
Delta3-Expression vor.
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Somit
zeigt dieses Beispiel, daß das
Delta3-Gen in zahlreichen Geweben exprimiert wird, daß es jedoch
in gewissen Geweben, beispielsweise peripheren Blutleukozyten und
adultem Herzgewebe (wenigstens bei Verwendung einer Northern-Blot-Hybridisierung)
nicht nachweisbar ist, daß es
wenigstens in einigen Tumorzellen, beispielsweise Kolonkarzinomzellen,
auf relativ hohem Niveau exprimiert wird und daß seine Expression als Antwort
auf einige Wachstumsfaktoren, beispielsweise bFGF und VEGF, heraufreguliert
werden kann.
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5.3 Chromosomale Lokalisierung
des hDelta3-Gens
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Ein
Southern-Blot mit DNA aus einer Reihe monochromosomaler somatischer
Mensch/Hamster-Zellhybride wurde mit einer hDelta1cDNA-Sonde sondiert.
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Die
erhaltenen Ergebnisse weisen eindeutig darauf hin, daß das menschliche
Delta3-Gen auf Chromosom 15 liegt.
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5.4 Erhöhte Expression
von hDelta3 in differenzierenden Endothelzellen
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Mit
diesem Beispiel wird gezeigt, daß die Expression des hDelta3-Gens
in differenzierenden Endothelzellen gegenüber nicht differenzierenden
Endothelzellen erhöht
ist.
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HMVEC-Zellen
wurden in 5 Kulturen getrennt und wie folgt behandelt: (1) Zellen
wurden durch Wachstum in basalem Endothelwachstumsmedium (EGM) (Clontech),
das 10% fötales
Kälberserum
(FCS) enthält, in
den Ruhezustand versetzt; (2) Zellen wurden in komplettem Endothelwachstumsmedium
(EGM-MV) (Clontech, Katalog-Nr. CC-3125), das 10% FCS und Wachstumsfaktoren
enthält,
kultiviert; (3) Zellen wurden durch Kultivierung in EGM-MV in Gegenwart
von 10 ng/ml bFGF und 25 ng/ml VEGF zur Proliferation angeregt;
(4) Zellen wurden durch Kultivierung in EGM-MV in Gegenwart von
10 ng/ml TGF-β1
zur Proliferation angeregt; und (5) Zellen wurden durch Kultivierung
in EGM-MV auf Matrigel zur Differenzierung angeregt. Nach 24stündiger Kultivierung
wurden die Zellen geerntet, die RNA wurde extrahiert und einer Northern-Blot-Analyse unterzogen.
Die Hybridisierung wurde mit der oben beschriebenen 1,6 kb großen hDelta3-Sonde
durchgeführt.
Die Ergebnisse deuten an, daß unter
den getesteten Kulturbedingungen ruhende Zellen die geringste Menge
an hDelta3 (auf einem kaum nachweisbaren Niveau) exprimieren. Proliferierende
Zellen exprimieren ein höheres
Niveau an hDelta3. Interessanterweise wurde der hDelta3-mRNA-Spiegel
in Zellen, die durch Ausplattieren auf Matrigel zur Differenzierung
induziert worden waren, stark erhöht.
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Somit
wird durch dieses Beispiel eindeutig demonstriert, daß die hDelta3-Expression
in zur Differenzierung induzierten Zellen und ebenso in zur Proliferation
induzierten Zellen stark erhöht
ist.
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5.5 hDelta3 ist in einem
mit ACCPN assoziierten chromosomalen Bereich lokalisiert
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Die
Lokalisation von hDelta3 auf dem menschlichen Chromosom 15 wurde mittels
RH (Radiation Hybrid)-Kartierung bestimmt.
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Dabei
wurde unter Verwendung eines Vorwärtsprimers mit der Nukleotidsequenz
GTTTACATTGCATCCTGGAT (SEQ ID NO. 21) und eines Rückwärtsprimers mit der Nukleotidsequenz
CTCTTCTGTTCCTCTGGTTG (SEQ ID NO. 22) vom 3'-nichtranslatierten Bereich des Gens
eine STS (Sequence Tagged Site) erzeugt. Die STS wurde zum Screening
der RH (Radiation Hybrid)-Reihen Genebridge 4 (Gyapay et al. (1996)
Human Molecular Genetics 5:339) und Stanford G3 (Stewart et al.
(1997) Genome Res. 7:422) verwendet. Diese Reihen wurden aus der
Fusion bestrahlter menschlicher Donorzellen mit Nager-Empfängerzellen (Referenz)
erhalten und lassen sich zur Positionierung von STS-Markern innerhalb
existierender Grundgerüstkarten,
zum Ordnen von Markern im interessierenden Bereich ebenso wie zur
Ermittlung des Abstands zwischen Markern verwenden.
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Die
RH-Kartierung wurde mittels PCR unter den folgenden Bedingungen
durchgeführt:
25 ng DNA/20 μl
Reaktion, 0,5 μM
von jedem Primer, 0,2 mM von jedem Nukleotid, 1,5 mM MgCl2, 1 × Puffer,
wie vom Hersteller des Enzyms bereitgestellt, 35 Zyklen über jeweils
30 Sekunden bei 94°C,
55°C, 72°C.
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Die
Ergebnisse der RH-Kartierung deuteten an, daß hDelta3 bei 15q12-15, in
der Nähe
des Grundgerüstmarkers
D15S1244 der Stanford-G3-Reihe und in der Nähe des Grundgerüstmarkers
D15S144 der Genebridge-4-Reihe, mit einem LOD-Wert von >3 kartiert ist. Eine
Durchsuchung der OMIM-Datenbank (Online Mendelian Inheritence in
Man; http://www.ncbi.nlm.nih.gob/Omim/searchomim.html) wies darauf
hin, daß dieser
Bereich bereits genetisch mit einer neurologischen Störung unter
dem Namen Agenesis of the Corpus Callosum with Peripheral Neuropathy
(ACCPN) in Verbindung gebracht wurde (Casaubon et al. (1996) Am.
J. Hum. Genet. 58:28).
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5.6 Identifizierung von
Delta-Therapeutika
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In
diesem Beispiel wird ein einfacher Test zur Isolierung von Delta-Therapeutika (z.B.
Agonist oder Antagonist einer Delta-Bioaktivität), z.B. Delta3-Therapeutika,
beschrieben. Wenigstens teilweise aufgrund der in den vorhergehenden
Beispielen beschriebenen Ergebnisse können Delta-Therapeutika zur Behandlung verschiedener
Krankheiten, einschließlich
neurologischer Krankheiten und/oder hyper- oder hypoproliferativer Krankheiten
sowie mit Defekten der Gefäßversorgung
assoziierten Krankheiten oder Leiden eingesetzt werden. Darüber hinaus
lassen sich Delta3-Therapeutika zumindest teilweise aufgrund der Ähnlichkeit
der Aminosäuresequenz
und Struktur zwischen den verschiedenen Delta-Proteinen zur Behandlung von mit einer
anomalen Delta3-Aktivität
oder einer anomalen anderen Delta-Aktivität als der Delta3-Aktivität assoziierten
Krankheiten oder Leiden einsetzen. In ähnlicher Weise lassen sich
Delta3-Therapeutika ebenso wie andere Delta-Therapeutika als Delta3-Therapeutika
zur Behandlung von mit einer anomalen Delta3-Aktivität assoziierten Krankheiten
oder Leiden einsetzen. Der unten angegebene Test läßt sich
auf andere Delta-Proteine als Delta3-Proteine anwenden.
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Ein
Delta3-Therapeutikum läßt sich
unter Verwendung eines In-vitro-Tests,
bei dem die Wechselwirkung zwischen einem Delta3-Protein und einem
Delta3-bindenden Protein, z.B. einem Notch-Protein, in Gegenwart
und in Abwesenheit einer Testverbindung bestimmt wird, identifizieren.
Dabei kann ein lösliches
Bindungsfragment eines Delta3-Proteins durch Expression des extrazellulären Anteils
von menschlichem Delta3, beispielsweise etwa Aminosäuren 1-529
der SEQ ID No. 2, in E. coli gemäß im Fachgebiet
bekannten Verfahren hergestellt werden. Alternativ kann es sich
bei dem Delta3-Proteinfragment etwa um Aminosäure 173 bis etwa Aminosäure 517
der SEQ ID NO. 2 handeln. In ähnlicher
Weise läßt sich
ein Delta3 bindendes Fragment eines Delta3 bindenden Proteins (d.h.
eines Delta3-Bindungspartners) rekombinant produzieren. Bei einem Delta3
bindenden Protein kann es sich um ein Notch-Protein handeln, das
identifiziert werden kann, indem man beispielsweise bestimmt, ob
das Protein zur Bindung an ein Delta3-Protein in der Lage ist. Eine
für ein Notch-Protein
codierende Nukleinsäure
läßt sich
erhalten, indem man beispielsweise einen für wenigstens eine EGF-ähnliche
Domäne
codierenden Anteil eines Notch-Gens unter Verwendung von Primern
mit einer von der Nukleotidsequenz eines in GenBank vorhandenen
oder aus der PCT-Anmeldung Nr. PCT/US92/03651 oder PCT/US93/09338
bekannten Notch-Gens abgeleiteten Nukleotidsequenz PCR-amplifiziert.
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Die
Testverbindungen können
dann getestet werden, um zu bestimmen, ob sie die Wechselwirkung zwischen
dem Delta3 und dem Delta3 bindenden Protein hemmen, indem man einen
Test vom ELISA-Typ verwendet. Dementsprechend wird entweder das
rekombinant produzierte Delta3-Protein oder das Delta3 bindende
Protein, z.B. Notch-Protein, an eine Festphasenoberfläche gebunden
und das jeweils andere Protein markiert, indem man beispielsweise
das Protein mit einem Epitop-Tag versieht, für das ein Antikörper zur
Verfügung
steht (z.B. FLAG-Epitop, erhältlich
von International Biotechnologies, Inc.). So kann man beispielsweise
das Delta3-Protein an die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (96-Loch-Platte) durch Inkubation
des Proteins über
Nacht bei einer Konzentration von 10 μg/ml in PBS binden. Nach Blockierung
unbesetzter Stellen auf der Platte mit einer BSA-Lösung werden
verschiedene Mengen an Testverbindungen und dem rekombinant produzierten
Delta3 bindenden Protein in einem für eine spezifische Wechselwirkung
zwischen den Proteinen geeigneten Puffer in die Vertiefungen gegeben.
Nach einer Inkubationszeit von mehreren Stunden werden die Vertiefungen
mit Puffer gespült
und die Menge an an die Vertiefungen gebundenem Delta3 bindendem
Protein bestimmt. Die Menge an gebundenem Protein läßt sich
bestimmen, indem man die Vertiefungen mit einem Anti-Tag-, bzw.
Anti-myc-, Antikörper
inkubiert, der dann mittels Enzym-Immunoassay nachgewiesen werden kann.
Die Menge an gebundenem Protein wird dann durch Bestimmen der optischen
Dichte unter Verwendung eines ELISA-Ablesegeräts bestimmt. Eine geringere
Menge an Delta3 bindendem Protein in einer Vertiefung, die eine
Testverbindung enthielt, gegenüber
einer Vertiefung, die keine Testverbindung enthielt, deutet darauf hin,
daß die
Testverbindung die Wechselwirkung zwischen Delta3 und einem Delta3
bindendem Protein hemmt.
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Ein
Delta3-Therapeutikum läßt sich
ebenso identifizieren, indem man einen Reportertest verwendet, bei
dem das Niveau der Expression eines Reporterkonstrukts unter der
Kontrolle eines Delta3-Promotors in Gegenwart oder Abwesenheit einer
Testverbindung gemessen wird. Ein Delta3-Promotor läßt sich
durch das Screening einer genomischen Bank mit einer Delta3-cDNA,
die vorzugsweise das 5'-Ende
der cDNA enthält, isolieren.
Ein Teil des Delta3-Promotors, der typischerweise eine Länge von
etwa 50 bis etwa 500 Basenpaare aufweist, wird dann stromaufwärts von
einem Reportergen, beispielsweise einem Luciferase-Gen, in einem Plasmid
kloniert. Dieses Reporterkonstrukt wird dann in Zellen, beispielsweise
Nervenzellen oder Endothelzellen transfiziert. Die transfizierten
Zellen werden anschließend
in Vertiefungen einer Multiwell-Platte verteilt und verschiedene
Konzentrationen von Testverbindungen in die Vertiefungen gegeben.
Nach mehrstündiger
Inkubation wird das Expressionsniveau des Reporterkonstrukts gemäß im Fachgebiet
bekannten Verfahren bestimmt. Ein Unterschied im Niveau der Expression
des Reporterkonstrukts in mit der Testverbindung inkubierten transfizierten
Zellen gegenüber
ohne die Testverbindung inkubierten transfizierten Zellen deutet
darauf hin, daß die
Testverbindung zur Modulation der Expression des Delta3-Gens fähig ist
und es sich somit um ein Delta3-Therapeutikum handelt.
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Hinterlegung
von Mikroorganismen
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Eine
für ein
menschliches Vollängen-Delta-Protein
codierende Nukleinsäure
ist in einem Plasmid enthalten, das bei der American Type Culture
Collection (ATCC) am 5. März
1997 hinterlegt und der ATCC Accession Number 98348 zugeordnet wurde.
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