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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Proteinphosphorylierung,
beispielsweise an Serin-, Threonin- und Tyrosinresten, stellt einen
Hauptregulationsmechanismus für
eine Reihe von Zellvorgängen
dar. Proteinphosphorylierung wird hauptsächlich von zwei Arten von Enzymen
beeinflusst, nämlich
von Proteinkinasen (PKs) und Proteinphosphatasen (PPs). PKs katalysieren
die Addition einer Phosphatgruppierung an einen Proteinaminosäurerest
(im Allgemeinen einen Serin-, Threonin- oder Tyrosinrest), und PPs
katalysieren die Entfernung solcher Gruppierungen. Die katalytische
Wirkung von PKs und PPs wird wiederum vom Zustand der Zelle und
der Umgebung, in der sie sich befindet, beeinflusst.
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PKs
vom myotonen Dystrophietyp (MDPKs) stehen in Zusammenhang mit der
Modulierung von Zellmorphologie, -form und -kontraktilität. MDPKs
sind auch dafür
bekannt, die Aktivität
von spannungsgesteuerten Skelettmuskel-Natriumkanälen, nicht
jedoch von spannungsgesteuerten Herzmuskel-Natriumkanälen, zu modulieren.
MDPKs spielen daher bei einer Reihe von muskeldegenerativen und
anderen Skelettmuskelerkrankungen wie etwa verschiedenen Arten von
Muskeldystrophie (MD) (z.B. Duchenne-MD, Gliedergürteld-MD,
Becker-MD, facioscapulohumerale MD, mytochondrialer Myopathie und
angeborener Myopathie) sowie myotonischen Dystrophien (Curschmann-Steiner-Batten-Syndrom
und Thomsensyndrom) eine Rolle.
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Bisher
wurden zahlreiche MDPKs beschrieben (siehe beispielsweise Zhao et
al., The Journal of Biological Chemistry 272, 10013 (1997); und
Bush et al., Biochemistry 39, 8480 (2000)) und es wird angenommen, dass
es noch viel mehr gibt. In Anbetracht der weiten Verbreitung und
der entscheidenden Rolle von MDPK-Aktivitäten in normalen und pathologischen
physiologischen Vorgängen
besteht Bedarf an der Identifizierung weiterer Mitglieder dieser
Proteinfamilie. Die vorliegende Erfindung deckt diesen Bedarf durch
Bereitstellung einer neuen Human-MDPK.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung eines
neuen Gens, das für
eine MDPK kodiert, wobei das Gen hierin als "13245" bezeichnet wird. Die Nucleotidsequenz
einer cDNA, die für
13245 kodiert, ist in Seq.-ID Nr. 1 und die Aminosäuresequenz
eines 13245-Polypeptids in Seq.-ID Nr. 2 dargestellt. Zudem ist
die Nucleotidsequenz der kodierenden Region in Seq.-ID Nr. 3 abgebildet.
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Demgemäß stellt
die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein Nucleinsäuremolekül bereit,
das für ein
13245-Protein oder -Polypeptid kodiert, wie beispielsweise einen
biologisch aktiven Teil des 13245-Proteins. In einer bevorzugten
Ausführungsform
kodiert das isolierte Nucleinsäuremolekül für ein Polypeptid
mit der Aminosäuresequenz
von Seq.-ID Nr. 2. In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung
isolierte 13245-Nucleinsäuremoleküle mit der
Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder 3 bereit.
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In
weiteren Ausführungsformen
stellt die Erfindung Nucleinsäuremoleküle mit Sequenzen
bereit, die mit der Nucleotidsequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 3 im
Wesentlichen identisch sind (z.B. natürlich vorkommende Allelvarianten).
In anderen Ausführungsformen
stellt die Erfindung ein Nucleinsäuremolekül bereit, das unter stringenten
Hybridisierungsbedingungen an ein Nucleinsäuremolekül hybridsiert, das eine Sequenz
aufweist, welche die Nucleotidsequenz von entweder Seq.-ID Nr. 1
oder 3 umfasst, worin die Nucleinsäure für ein 13245-Protein voller
Länge oder
ein aktives Fragment davon kodiert.
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In
einem damit zusammenhängenden
Aspekt stellt die Erfindung ferner Nucleinsäurekonstrukte bereit, die ein
hierin beschriebenes 13245-Nucleinsäuremolekül umfassen. In bestimmten Ausführungsformen
sind die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle operativ
mit den nativen oder heterologen Regulationssequenzen verbunden.
Vektoren oder Wirtszellen, welche die erfindungsgemäßen 13245-Nucleinsäuremoleküle enthalten,
wie z.B. Vektoren und Wirtszellen, die sich zur Herstellung von
13245-Nucleinsäuremolekülen oder -Polypeptiden
eignen, sind ebenfalls enthalten.
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In
einem weiteren damit in Zusammenhang stehenden Aspekt stellt die
Erfindung Nucleinsäurefragmente
bereit, die sich als Primer oder Hybridisierungssonden zur Detektion
von für
13245 kodierenden Nucleinsäuren
eignen.
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In
einem weiteren damit in Zusammenhang stehenden Aspekt werden isolierte
Nucleinsäuremoleküle bereitgestellt,
die Antisense zu einem für
13245 kodierenden Nucleinsäuremolekül darstellen.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung 13245-Polypeptide und
biologisch aktive oder antigene Fragmente davon, die sich beispielsweise
als Reagenzien oder Targets in Tests eignen, die zur Behandlung und
Diagnose von 13245-vermittelten oder damit in Zusammenhang stehenden
Erkrankungen (z.B. MDPK-vermittelten Erkrankungen, wie sie hierin
beschriebenen sind) angewandt werden können. In einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung 13245-Polypeptide mit Proteinkinase-Aktivität bereit.
Als bevorzugte Polypeptide gelten 13245-Proteine mit zumindest einer
Pkinase-Domäne,
die vorzugsweise 13245-Aktivität aufweisen,
beispielsweise eine hierin beschriebene 13245-Aktivität. Bevorzugte
Polypeptide sind 13245-Proteine mit zumindest einer CNH-Domäne und zumindest
einer Pkinase-Domäne.
Weitere bevorzugte Polypeptide sind 13245-Proteine mit zumindest
einer CNH-Domäne,
zumindest einer Pkinase-Domäne,
zumindest einer Phorbolester/Diacylglycerin-Bindungsdomäne, zumindest
einer PH-Domäne
und zumindest einer Leucin-Zipperdomäne.
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In
anderen Ausführungsformen
stellt die Erfindung 13245-Polypeptide bereit, wie beispielsweise
ein 13245-Polypeptid mit der in Seq.-ID Nr. 2 angegebenen Aminosäuresequenz,
einer Aminosäuresequenz,
die mit der in Seq.-ID Nr. 2 angeführten Aminosäuresequenz
im Wesentlichen identisch ist, oder einer Aminosäuresequenz, für die ein
Nucleinsäuremolekül mit einer
Nucleotidsequenz kodiert, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen
an ein Nucleinsäuremolekül hybridisiert,
das die Nu cleotidsequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 3 umfasst, worin
die Nucleinsäure
für ein
13245-Protein voller Länge
oder ein aktives Fragment davon kodiert.
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In
einem damit in Zusammenhang stehenden Aspekt stellt die Erfindung
weiters Nucleinsäurekonstrukte
bereit, die ein hierin beschriebenes 13245-Nucleinsäuremolekül umfassen.
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In
einem damit in Zusammenhang stehenden Aspekt stellt die Erfindung
13245-Polypeptide oder -Fragmente bereit, die operativ an Nicht-13245-Polypeptide
gebunden sind, um Fusionsproteine zu bilden.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Antikörper und
antigenbindende Fragmente davon, die mit 13245-Polypeptiden reagieren
oder noch bevorzugter spezifisch daran binden.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zum Screenen
von Verbindungen bereit, welche die Expression oder Aktivität von 13245-Polypeptiden
oder -Nucleinsäuren
modulieren.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Modulierung
der Expression oder Aktivität
von 13245-Polypeptiden oder -Nucleinsäuren, beispielsweise unter
Verwendung der gescreenten Verbindungen, bereit. In bestimmten Ausführungsformen
umfassen die Verfahren die Behandlung von Erkrankungen, die mit
aberrierender Aktivität
oder Expression der 13245-Polypeptide oder -Nucleinsäuren zusammenhängen, wie
z.B. Erkrankungen, die eine aberrierende oder mangelhafte Proteinphosphorylierung
oder eine aberrierende oder mangelhafte Zellvorgangsregulation (z.B.
aberrierende oder mangelhafte Zellsignal- oder aberrierende oder
mangelhafte Muskelfunktionen) umfassen.
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Die
Erfindung stellt auch Tests zur Bestimmung der Aktivität oder der
Gegenwart oder Abwesenheit von 13245-Polypeptiden oder -Nucleinsäuremolekülen in einer
biologischen Probe, einschließlich
zur Krankheitsdiagnose, bereit.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Tests zur
Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit einer genetischen Veränderung
in einem 13245-Polypeptid oder -Nucleinsäuremolekül, einschließlich zur
Krankheitsdiagnose, bereit.
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Die
Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Modulation der Fähigkeit
einer Zelle, die Interkonversion der phosphorylierten und dephosphorylierten
Formen eines GTPase-Proteins zu katalysieren. Das Verfahren umfasst
die Modulation von 13245-Proteinaktivität in der
Zelle. Die Aktivität
von 13245-Proteinen kann moduliert werden, indem die Expression
des 13245-Gens in der Zelle gehemmt wird, beispielsweise durch Zuführen eines
Antisense-Oligonucleotids, das unter stringenten Bedingungen an
ein Transkript (beispielsweise eine mRNA) des 13245-Gens hybridisiert,
eines Antisense-Oligonucleotids, das unter stringenten Bedingungen
an ein Polynucleotid mit der Nucieotidsequenz der Seq.-ID Nr. 1
hybridisiert, oder eines Antisense-Oligonucleotids, das unter stringenten
Bedingungen an ein Polynucleotid mit der Nucleotidsequenz von Seq.-ID
Nr. 3 hybridisiert, zur Zelle. Alternativ dazu kann die Aktivität von 13245-Proteinen
gehemmt werden, ohne die 13245-Genexpression in der Zelle signifikant
zu beeinflussen. Die Aktivität
des 13245-Proteins kann beispielsweise gehemmt werden, indem der
Zelle ein Mittel verabreicht wird, das die Aktivität des 13245-Proteins hemmt,
wie z.B. ein Antikörper,
der spezifisch an das 13245-Protein bindet. In einem damit in Zusammenhang stehenden
Aspekt kann die Aktivität
von 13245 moduliert werden, indem die Expression von 13245 in der
Zelle verstärkt
wird. Die Expression von 13245 in einer Zelle kann beispielsweise
verstärkt
werden, indem zur Zelle ein Mittel zugeführt wird, das die Expression
von 13245 verstärkt,
wie z.B. ein Expressionsvektor, der für ein 13245-Protein kodiert.
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Die
Erfindung umfasst ferner ein Verfahren zur Beurteilung, ob eine
Testverbindung zur Modulation zumindest eines Phänomens zweckdienlich ist, das
aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (1) Interkonversion
der phosphorylierten und dephosphorylierten Formen eines Serin-,
Threonin- oder Tyrosinrests eines GTPase-Proteins; (2) Zellkontraktilität; (3) Zellwachstum;
(4) Zellleitfähigkeit;
(5) Eintritt einer Zelle in den Zellzyklus; (6) Progression einer
Zelle durch den Zellzyklus; (7) Mitogenese; (8) Zellmetabolismus; (9)
Gentranskription; (11) Zytokinese; (12) Zell form; (13) Zellbewegung;
(14) Integration eines Virusgenoms in ein Wirtszellengenom; (15)
Haltung eines Virusgenoms in einem Wirtszellengenom; (16) zytologische
Veränderungen
in einer virusinfizierten Wirtszelle; (17) Virusproduktion in einer
virusinfizierten Wirtszelle; (18) Wechselwirkung eines Virions mit
einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle; und (19) Einkapselung
eines Virions in einem Abschnitt einer Membran einer virusinfizierten
Wirtszelle. Dieses Verfahren umfasst:
- a) das
Zusetzen der Testverbindung zu einer ersten Zusammensetzung, die
ein Polypeptid umfasst, das eine zu zumindest 90% mit der Seq.-ID
Nr. 2 identische Aminosäuresequenz
und 13245-Aktivität
aufweist; und
- b) das Vergleichen der 13245-Aktivität in der ersten Zusammensetzung
mit der in der zweiten Zusammensetzung, die im Wesentlichen identisch
mit der ersten Zusammensetzung ist, mit der Ausnahme, dass sie die
Testverbindung nicht enthält.
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Dabei
weist ein Unterschied der 13245-Aktivität zwischen der ersten und der
zweiten Zusammensetzung darauf hin, dass die Testverbindung zur
Modulation des Phänomens
zweckdienlich ist.
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Die
Erfindung umfasst auch ein weiteres Verfahren zur Beurteilung, ob
eine Testverbindung zur Modulation zumindest eines Phänomens zweckdienlich
ist, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist:
(1) Interkonversion der phosphorylierten und dephosphorylierten
Formen eines Serin-, Threonin- oder Tyrosinrests eines GTPase-Proteins;
(2) Zellkontraktilität;
(3) Zellwachstum; (4) Zellleitfähigkeit;
(5) Eintritt einer Zelle in den Zellzyklus; (6) Progression einer
Zelle durch den Zellzyklus; (7) Mitogenese; (8) Zellmetabolismus;
(9) Gentranskription; (11) Zytokinese; (12) Zellform; (13) Zellbewegung;
(14) Integration eines Virusgenoms in ein Wirtszellengenom; (15)
Haltung eines Virusgenoms in einem Wirtszellengenom; (16) zytologische
Veränderungen
in einer virusinfizierten Wirtszelle; (17) Virusproduktion in einer
virusinfizierten Wirtszelle; (18) Wechselwirkung eines Virions mit
einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle; und (19) Einkapselung
eines Virions in einem Abschnitt einer Membran einer virusinfizierten
Wirtszelle. Dieses Verfahren umfasst:
- a) das
Zusetzen der Testverbindung zu einer ersten Zusammensetzung, die
eine Zelle umfasst, welche eine Nucleinsäure umfasst, die für ein Polypeptid
kodiert, das eine zu zumindest 90% mit der Seq.-ID Nr. 2 identische
Aminosäuresequenz
und 13245-Aktivität
aufweist; und
- b) das Vergleichen der 13245-Aktivität in der ersten Zusammensetzung
mit der in der zweiten Zusammensetzung, die im Wesentlichen identisch
mit der ersten Zusammensetzung ist, mit der Ausnahme, dass sie die
Testverbindung nicht enthält.
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Ein
Unterschied der 13245-Aktivität
zwischen der ersten und der zweiten Zusammensetzung weist darauf
hin, dass die Testverbindung zur Modulation des Phänomens zweckdienlich
ist.
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Verbindungen,
die unter Anwendung dieser Verfahren identifiziert wurden, können verwendet
werden, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Modulation dieses
Phänomens
herzustellen, indem diese beispielsweise mit einem pharmazeutisch
annehmbaren Träger
kombiniert wird. Solche Zusammensetzungen können verwendet werden, um das
Phänomen
in einem Menschen zu modulieren.
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Die
Erfindung umfasst ein weiteres Verfahren zur Identifikation einer
Verbindung, die zur Modulation zumindest eines Phänomens zweckdienlich
ist, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist:
(1) Interkonversion der phosphorylierten und dephosphorylierten
Formen eines Serin-, Threonin- oder Tyrosinrests eines GTPase-Proteins;
(2) Zellkontraktilität;
(3) Zellwachstum; (4) Zellleitfähigkeit;
(5) Eintritt einer Zelle in den Zellzyklus; (6) Progression einer
Zelle durch den Zellzyklus; (7) Mitogenese; (8) Zellmetabolismus; (9)
Gentranskription; (11) Zytokinese; (12) Zellform; (13) Zellbewegung;
(14) Integration eines Virusgenoms in ein Wirtszellengenom; (15)
Haltung eines Virusgenoms in einem Wirtszellengenom; (16) zytologische
Veränderungen
in einer virusinfizierten Wirtszelle; (17) Virusproduktion in einer
virusinfizierten Wirtszelle; (18) Wechselwirkung eines Virions mit
einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle; und (19) Einkapselung
eines Virions in einem Abschnitt einer Membran einer virusinfizierten
Wirtszelle. Dieses Verfahren umfasst:
- a) das
Kontaktieren der Testverbindung mit einem Polypeptid, das aus der
aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist:
i) Polypeptid,
für das
ein Nucleinsäuremolekül kodiert,
das einen Abschnitt mit einer Nucleotidsequenz umfasst, die zu zumindest
80% mit einer von Seq.-ID Nr. 1 und 3 identisch ist und für ein Polypeptid
mit Kinaseaktivität
kodiert; und
ii) Fragment eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz,
die Seq.-ID Nr.
2 umfasst, worin das Fragment zumindest 25 zusammenhängende Aminosäurereste
von Seq.-ID Nr. 2 umfasst,
oder mit einer Zelle, die das Polypeptid
exprimiert; und
- b) das Bestimmen, ob das Polypeptid an die Testverbindung bindet.
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Die
Bindung des Polypeptids an die Testverbindung weist darauf hin,
dass die Testverbindung zur Modulation des Phänomens zweckdienlich ist.
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Andere
Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus
der nachstehenden detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 stellt eine cDNA-Sequenz (Seq.-ID Nr.
1) und eine vorhergesagte Aminosäuresequenz
(Seq.-ID Nr. 2) von menschlichem 13245 dar. Der Methionin-initiierte
offene Leseraster von menschlichem 13245 (ohne die nichttranslatierten
5'- und 3'- Regionen) beginnt
an Nucleotid 19 von Seq.-ID Nr. 1, und die kodierende Region (ohne
Terminationscodon; dargestellt in Seq.-ID Nr. 3) erstreckt sich
bis zu Nucleotid 6178 von Seq.-ID Nr. 1.
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2 zeigt
ein Hydropathiediagramm von menschlichem 13245. Relativ hydrophobe
Reste sind über der
horizontalen Strichlinie angeführt,
und relativ hydrophile Reste sind unter der horizontalen Strichlinie
angegeben. Die Cysteinreste (cys) sind durch kurze vertikale Linien
unter der Hydropathiespur angezeigt. Die Zahlen, die der Aminosäuresequenz
von menschlichem 13245 entsprechen, sind gekennzeichnet. Polypeptide
der Erfindung umfassen Fragmente, die Folgendes umfassen: eine vollständige hydrophobe
Sequenz oder Teile davon, d.h. eine Sequenz über der Strichlinie, z.B. die
Sequenz aus ungefähr
den Resten 195-210 von Seq.-ID Nr. 2; eine vollstän dige hydrophile
Sequenz oder Teile davon, d.h. eine Sequenz unter der Strichlinie, z.B.
die Sequenz aus ungefähr
den Resten 455-475 von Seq.-ID Nr. 2; eine Sequenz, die einen Cysteinrest umfasst;
oder eine Glykosylierungsstelle.
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3 ist ein Abgleich der Aminosäuresequenz
(Seq.-ID Nr. 2) von 13245, Mausrho/rac-Interaktions-Citron-Kinase
("AAC72823"; GENBANK® Zugriffsnummer
AAC 72823; Seq.-ID Nr. 4), Maus-Citron-K-Kinase ("AAC27933"; GENBANK® Zugriffsnummer
AAC7933; Seq.-ID Nr. 5), Maus-Citron-Protein ("P49025"; GENBANK® Zugriffsnummer
P49025; Seq.-ID Nr. 6) und menschlichem Citron-Protein ("014578"; GENBANK® Zugriffsnummer
014578; Seq.-ID Nr. 7). Der Abgleich wurde mithilfe der Multalin-Software
Version 5.4.1 unter Verwendung der Blosum62-Symbolvergleichstabelle,
einem "gap weight" von 12 und einem "gap length weight" von 2 erstellt.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG
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Die
cDNA-Sequenz von menschlichem 13245 (1;
Seq.-ID Nr. 1), die etwa 6575 Nucleotidreste lang ist und nichttranslatierte
Regionen umfasst, enthält
eine vorhergesagte Methionin-initiierte kodierende Sequenz aus etwa
6160 Nucleotidresten ohne Terminationscodon (d.h. die Nucleotidreste
19-6178 von Seq.-ID Nr. 1; auch in Seq.-ID Nr. 3 dargestellt). Die
kodierende Sequenz kodiert für
ein 2053 Aminosäuren
langes Protein mit der Aminosäuresequenz
von Seq.-ID Nr. 2.
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Menschliches
13245 enthält
die nachstehenden Regionen oder andere Strukturmerkmale: eine vorhergesagte
Pkinase-Domäne
(PF00069) an etwa den Aminosäureresten
97-360 von Seq.-ID Nr. 2, eine vorhergesagte Proteinkinase-C-Terminusdomäne an den
Resten 361-390 von Seq.-ID Nr. 2, eine Serin/Threonin-Proteinkinase-Antigenbindungsstellen-Signatursequenz
an den Resten 217-229 von Seq.-ID Nr. 2, vorhergesagte Leucin-Zipperdomänen an den
Resten 838-859, 975-996, 1041-1062 und 1143-1164 von Seq.-ID Nr. 2,
eine vorhergesagte Carbamoyl-Phosphatsynthase-Subdomänen-Signatursequenz
an den Resten 1156-1163 von Seq.-ID Nr. 2, eine vorhergesagte Phorbolester/Diacylglycerin-Bindungsdomäne an den
Resten 1389-1437
von Seq.-ID Nr. 2, eine vorhergesagte Pleckstrin-Homologie-Domäne (PH-Do mäne) an den Resten
1470-1525 von Seq.-ID Nr. 2 und eine vorhergesagte CNH-Domäne an den
Resten 1568-856 von Seq.-ID Nr. 2.
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Das
menschliche 13245-Protein weist vorhergesagte N-Glykosylierungsstellen
(Pfam-Zugriffsnummer PS00001) an etwa den Aminosäureresten 819-822, 1571-1574, 1694-1697,
1717-1720 und 2026-2029 von Seq.-ID Nr. 2; vorhergesagte cAMP-/cGMP-abhängige Proteinkinasephosphorylierungsstellen
(Pfam-Zugriffsnummer PS00004) bei etwa den Aminosäureresten
78-81, 477-480, 579-582, 601-604, 680-683, 1322-1325 und 1366-1369
von Seq.-ID Nr. 2; vorhergesagte Proteinkinase-C-Phosphorylierungsstellen (Pfam-Zugriffsnummer
PS00005) an etwa den Aminosäureresten
93-95, 248-250, 308-310, 378-380, 498-500, 516-518, 546-548, 577-579, 824-826, 872-874,
1025-1027, 1033-1035, 1069-1098, 1144-1146, 1170-1172, 1215-1217, 1268-1270,
1314-1316, 1335-1337, 1363-1365, 1376-1378, 1542-1544, 1724-1726,
1892-1894, 1910-1912, 1963-1965 und 1977-1979 von Seq.-ID Nr. 2;
vorhergesagte Caseinkinase-II-Phosphorylierungsstellen (Pfam-Zugriffsnummer
PS 00006) an etwa den Aminosäureresten
83-86, 93-96, 140-143, 361-364, 381-384, 386-389, 410-413, 436-439,
445-448, 480-483, 487-490, 501-504, 529-532, 867-870, 908-911, 935-938, 940-943,
973-976, 1015-1018, 1025-1028, 1046-4049, 1081-1084, 1142-1145, 1170-1173, 1218-1221, 1308-1311,
1314-1317, 1370-1373, 1736-1739,
1794-1797, 1864-1867, 1882-1885, 1904-1907, 1964-1967 und 2012-2015
von Seq.-ID Nr. 2; eine vorhergesagte Tyrosinkinase-Phosphorylierungsstelle
an den Resten 741-747 von Seq.-ID Nr. 2; vorhergesagte N-Myristoylierungsstellen
(Pfam-Zugriffsnummer
PS00008) an etwa den Aminosäureresten
50-5, 1202-1207, 1532-1537,
1584-1537, 1584-1589, 1678-1680 und 1999-2004 von Seq.-ID Nr. 2;
und eine vorhergesagte Amidierungsstelle (Pfam-Zugriffsnummer PS00009)
an etwa den Aminosäureresten
134-136 von Seq.-ID Nr. 2 auf.
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Für allgemeine
Informationen hinsichtlich PFAM-Identifikatoren, PS-Präfix und
PF-Präfix-Domänenidentifikationsnummern
siehe Sonnhammer et al., Protein 28, 405-420 (1997), und http://www.psc.edu/general/software/packages/pfam/pfam.html.
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Das
13245-Protein weist eine signifikante Anzahl an Strukturmerkmalen
auf, die es mit den Mitgliedern der MDPK-Familie gemein hat. Die
Bezeichnung "Familie" steht, bezogen auf
die Protein- und Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden
Erfindung, für
zwei oder mehr Proteine oder Nucleinsäuremoleküle mit einer gemeinsamen Strukturdomäne oder
einem gemeinsamen Motiv und ausreichender Aminosäure- oder Nucleotidsequenzhomologie,
wie hierin definiert. Solche Familienmitglieder können natürlich oder
nicht natürlich
vorkommen und von entweder der gleichen oder von unterschiedlichen
Spezies stammen. Eine Familie kann beispielsweise ein erstes Protein
menschlichen Ursprungs sowie andere unterschiedliche Proteine menschlichen Ursprungs
umfassen, oder alternativ dazu Homologe mit nichtmenschlichem Ursprung,
z.B. MDPK-Proteine für
jegliche auf dem Gebiet der Erfindung beschriebene Spezies, umfassen.
Mitglieder einer Familie können auch
gemeinsame funktionelle Eigenschaften haben.
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Ein
13245-Polypeptid kann eine Pkinase-Domäne umfassen. Die Bezeichnung "Pkinase-Domäne" steht hierin für eine Proteindomäne mit einer
Aminosäuresequenz
einer Länge
von etwa 200-300 Aminosäureresten,
vorzugsweise zumindest etwa 225-300 Aminosäuren, noch bevorzugter etwa
264 Aminosäureresten, und
weist einen Bitwert für
den Abgleich der Sequenz mit der Pkinase-Domäne (HMM) von zumindest 100
oder mehr, vorzugsweise 150 oder mehr, noch bevorzugter 200 oder
mehr, auf. Der Pkinase-Domäne
wurde die PFAM-Zugriffsnummer PF00069 zugewiesen (http://genome.wustl.edu/Pfam/html).
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Ein
13245-Polypeptid kann eine Pkinase-Domäne umfassen. Die Bezeichnung "CNH-Domäne" steht hierin für eine Proteindomäne mit einer
Aminosäuresequenz
einer Länge
von etwa 250-350 Aminosäureresten,
vorzugsweise zumindest etwa 275-325 Aminosäureresten, noch bevorzugter
etwa 298 Aminosäureresten, und
weist einen Bitwert für
den Abgleich der Sequenz mit der Pkinase-Domäne (HMM) von zumindest 100
oder mehr, vorzugsweise 200 oder mehr, noch bevorzugter 300 oder
mehr, auf. Der Pkinase-Domäne
wurde die PFAM-Zugriffsnummer PF00780 zugewiesen (http://genome.wustl.edu/Pfam/html).
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
weist das 13245-Polypeptid oder -Protein eine Pkinase-Domäne oder
eine Region auf, die zumindest etwa 200-300, noch bevorzugter etwa
225-300, oder 264 Aminosäurereste
umfasst, sowie zumindest 60-, 70-, 80-, 90-, 95-, 99- oder 100%ige
Homologie mit einer Pkinase-Domäne,
wie z.B. der Pkinase-Domäne
von menschlichem 13245 (z.B. Reste 97-360 von Seq.-ID Nr. 2).
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
weist das 13245-Polypeptid oder -Protein eine Pkinase-Domäne oder
eine Region auf, die zumindest etwa 250-350, noch bevorzugter etwa
275-325, oder 298 Aminosäurereste
umfasst, sowie zumindest 60-, 70-, 80-, 90-, 95-, 99- oder 100%ige
Homologie mit einer CNH-Domäne,
wie z.B. der CNH-Domäne
von menschlichem 13245 (z.B. Reste 1568-1865 von Seq.-ID Nr. 2).
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Zur
Identifikation der Gegenwart eines Pkinase- oder CNH-Domänenprofils
in einem 13245-Rezeptor wird die Aminosäuresequenz des Proteins in
einer HMM-Datenbank (z.B. der Pfam-Datenbank, Version 2.1) unter
Verwendung der Standardparameter (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/HMM_search)
gesucht. Das Hmmsf-Programm, das beispielsweise als Teil des HMMER-Suchprogrammpakets
erhältlich
ist, ist ein familienspezifisches Standardprogramm für PF00069
oder PF00780, und der Wert 100 stellt den Standardschwellenwert
zur Bestimmung eines Treffers dar. Unter Verwendung einer ORF-Analysesoftware
wurde beispielsweise ein Pkinase-Domänenprofil in der Aminosäuresequenz
von Seq.-ID Nr. 2 identifiziert (z.B. Aminosäuren 53-303 von Seq.-ID Nr.
2). Folglich liegt ein 13245-Protein mit zumindest 60- bis 70-,
noch bevorzugter etwa 70- bis 80- oder etwa 80- bis 90%iger Homologie
mit dem Pkinase-Domänenprofil
oder dem CNH-Domänenprofil
von menschlichem 13245 im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
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Ohne
sich auf eine bestimmte Theorie beschränken zu wollen wird angenommen,
dass das 13245-Protein in zumindest einer Ausführungsform ein Kernmembranprotein
ist, dessen carboxyterminale Domäne
in der Zellkernhülle
angeordnet ist. In dieser Ausführungsform
ist das 13245-Protein fähig,
Signalinformationen aus dem Cyto plasma in den Kern zu übertragen,
wodurch beispielsweise die Gentranskription gesteuert werden kann.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst ein 13245-Polypeptid zumindest
eine Pkinase-Domäne.
In einer weiteren Ausführungsform
umfasst das 13245-Polypeptid zumindest eine Pkinase-Domäne und zumindest
eine CNH-Domäne.
Die 13245-Moleküle
der vorliegenden Erfindung können
ferner eine oder mehrere der hierin beschriebenen N-Glykosylierungs-,
cAMP-/cGMP-abhängigen
Kinasephosphorylierungs-, Proteinkinase-C-Phosphorylierungs-, Caseinkinase-II-Phosphorylierungs-,
Tyrosinkinasephosphorylierungs-, N-Myristoylierungs-, Amidierungs-,
Leucin-Zipper-,
Serin/Threonin-Proteinkinase-Wirk-, Carbamoyl-Phosphatsynthase-Subdomänen-Signatur-,
Proteinkinase-C-terminaldomänen-Phorboester/Diacylgycerinbindungs-
und Pleckstrinhomologiedomänen
und -stellen, die hierin beschrieben sind, umfassen und beinhalten
vorzugsweise die meisten oder alle davon.
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Wie
in 3 zu sehen ist, weist das 13245-Protein
signifikante Sequenzhomologie mit mehreren Proteinen auf, die mit
dem Citron-Protein in Zusammenhang stehen, das dafür bekannt
ist, mit GTPase-Enzymen der Rho-Familie wechselzuwirken. Diese GTPasen
umfassen beispielsweise Rho-A, -B und -C, Rac-1 und -2 sowie CDC42.
Diese GTPasen steuern die Zellstruktur, einschließlich Zellform,
Zellkontraktion, Zellbewegung, Verteilung der Strukturproteine (z.B.
Actin) in der Zelle, Bildung von Fokaladhäsion, Zytokinese und Zellteilung. Diese
GTPasen sind auch dafür
bekannt, die Genexpression auf phosphorylierungsabhängige Weise
zu modulieren. Proteine, die in der Lage sind, mit phosphorylierten
und nichtphosphorylierten Rho-GTPase-Isoformen
wechselzuwirken oder deren Interkonversion zu katalysieren oder
beides, können
diese zellulären
Prozesse modulieren.
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Das
Vorhandensein einer Pkinase, Pkinase-C, einer Proteinkinase-ATP-Bindungsregionsignatur,
einer Serin/Threonin-Proteinkinase-Wirkstellenstellensignatur, einer
Tyrosinkinasephosphorylierungsstelle, mehrerer potenzieller Phosphorylierungsstellen
und von Ähnlichkeit
mit Citron-Proteinen weist darauf hin, dass das 13245-Protein mit
Rho-GTPasen wechselwirken und Interkonversionen ihrer phosphorylierten und
nichtphosphorylierten Formen katalysieren kann. Die Fähigkeit
von 13245, den Phosphorylierungszustand von Rho-GTPasen zu modulieren,
deutet darauf hin, dass 13245 eine oder mehrere von Zellform, Zellkontraktion, Zellbewebung,
Verteilung der Strukturproteine (z.B. Actin) in der Zelle, Bildung
von Fokaladhäsion,
Zytokinese und Zellteilung in Zellen, in denen es exprimiert wird,
zu modulieren. Ferner sind diese Eigenschaften ein Hinweis darauf,
dass das 13245-Protein mit Erkrankungen in Verbindung steht, bei
denen einer oder mehrere dieser Vorgänge aberrieren. Hierin beschriebene
13245-Moleküle
können
daher dazu verwendet werden, diese Erkrankungen vorherzusagen, zu
diagnostizieren, zu hemmen, vorzubeugen, zu lindern oder zu heilen.
Beispiele für
Erkrankungen, bei denen einer oder mehrere dieser Vorgänge aberrierend
ist/sind, umfassen Tumorgenese, Tumorwachstum, Tumormetastasen und
Virusinfektionen einer Zelle.
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Die
Expression von 13245 ist in peripheren Blutzellen höher als
in vielen anderen Zelltypen, und bei HIV-1-infizierten Zellen, einschließlich der
Zellen der CCRF-Zelllinie, die mit diesem Virus infiziert worden
sind, ist eine verstärkte
13245-Expression zu beobachten. HIV-1-infizierte Zellen durchlaufen
verschiedene morphologische Veränderungen,
und das Muster der Genexpression in HIV-1-infizierten Zellen unterscheidet
sich vom Muster, das in nicht nichtinfizierten Zellen vom gleichen
Typ zu beobachten ist. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass
13245 eine Rolle bei der Auswirkung von HIV-1-Infektionen auf Wirtszellen
(z.B. mononukleären
Peripherblutzellen) spielt. Die Modulation der 13245-Expression,
-Aktivität
oder von beidem in HIV-1-infizierten Zellen kann die oben angeführten Vorgänge modulieren,
wodurch die Auswirkungen einer HIV-1-Infektion gemildert oder umgekehrt
werden. Die hierin beschriebenen 13245-Moleküle können beispielsweise zur Hemmung
der Insertion des HIV-1-Genoms in das Wirtszellengenom, zur Hemmung
oder Umkehrung der Haltung des HIV-1-Genoms innerhalb des Wirtszellengenoms,
zur Hemmung oder Umkehrung von durch HIV-1-Infektion induzierten
zytologischen Veränderungen,
zur Hemmung von HIV-1-Virusproduktion in infizierten Zellen, zur
Hemmung der Wechselwirkung zwischen HIV-1-Virionen mit der Wirtszellen-Zytoplasmamembran,
zur Hemmung der Einkapselung von HIV-1-Virusteilchen in Abschnitten
der Wirtszellenmembran oder zur Hemmung der Freisetzung eines HIV-1-Virus
aus infizierten Zel len. 13245-Moleküle können somit zur Behandlung von
Individuen eingesetzt werden, die mit HIV-1 (z.B. Individuen, die
an AIDS leiden) oder mit anderen pathogenen Viren infiziert sind,
oder zur Hemmung der Übertragung
des Virus von einem Individuum auf ein anderes.
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Da
die 13245-Polypeptide der Erfindung 13245-vermittelte Aktivitäten modulieren
können,
können
sie zur Entwicklung von neuen Diagnostika und Therapeutika für 13245-vermittelte
oder damit zusammenhängende
Erkrankungen verwendet werden, wie nachstehend beschrieben wird.
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"13245-Aktivität", "biologische Aktivität von 13245" oder "funktionelle Aktivität von 13245" bezieht sich hierin
auf eine Wirkung von 13245-Proteinen, -Polypeptiden oder -Nucleinsäuremolekülen auf
beispielsweise eine auf 13245 reagierende Zelle oder ein 13245-Substrat
(z.B. ein Proteinsubstrat wie ein spannungsgesteuertes Skelettmuskel-Natriumkanalprotein),
die in vivo oder in vitro bestimmbar ist. In einer Ausführungsform
ist die 13245-Aktivität
eine direkte Aktivität,
wie z.B. eine Assoziation mit einem 13245-Zielmolekül. Ein "Zielmolekül" oder "Bindungspartner" eines 13245-Proteins
ist ein Molekül
(z.B. ein Protein oder eine Nucleinsäure), an welches das 13245-Protein
von Natur aus bindet oder mit dem es wechselwirkt. In einer exemplarischen Ausführungsform
ist solch ein Zielmolekül
ein 13245-Rezeptor. 13245-Aktivität kann auch eine indirekte
Aktivität
sein, wie z.B. eine zelluläre
Signalaktivität,
die durch die Wechselwirkung des 13245-Proteins mit einem 13245-Rezeptor
vermittelt wird.
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Es
wurde vorhergesagt, dass die 13245-Moleküle der vorliegenden Erfindung ähnliche
biologische Aktivität
aufweisen wie die Mitglieder der MDPK-Familie. Die 13245-Proteine der vorliegenden
Erfindung können beispielsweise
eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten aufweisen:
- (1) Katalyse der Bildung einer kovalenten Bindung in oder zwischen
einem Aminosäurerest
und einer Phosphatgruppierung;
- (2) Modulation der Zellkontraktilität;
- (3) Modulation des Zellwachstums;
- (4) Modulation der Zellleitfähigkeit;
- (5) Modulation des Eintritts einer Zelle in den Zellzyklus;
- (6) Modulation der Progression einer Zelle durch den Zellzyklus;
- (7) Modulation der Mitogenese;
- (8) Modulation des Zellmetabolismus;
- (9) Modulation der Gentranskription;
- (10) Katalyse der Interkonversion von phosphorylierten und dephosphorylierten
Formen einer GTPase, wie z.B. einer Rho-GTPase;
- (11) Modulation der Zytokinese;
- (12) Modulation der Zellform;
- (13) Modulation der Zellbewegung (z.B. Tumormetastasen);
- (14) Modulation der Integration eines Virusgenoms in ein Wirtszellengenom;
- (15) Modulation der Haltung eines Virusgenoms in einem Wirtszellengenom;
- (16) Modulation der zytologischen Veränderungen in einer virusinfizierten
Wirtszelle;
- (17) Modulation der Virusproduktion in einer virusinfizierten
Wirtszelle;
- (18) Modulation der Wechselwirkung eines Virions mit einer Membran
einer virusinfizierten Wirtszelle; und
- (19) Modulation der Einkapselung eines Virions in einem Abschnitt
einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle.
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Somit
können
die hierin beschriebenen 13245-Moleküle als neue diagnostische Ziele
und Therapeutika zur Vorhersage, Diagnose, Vorbeugung, Hemmung,
Linderung oder Heilung von mit MDPK zusammenhängenden Erkrankungen dienen.
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Andere
Aktivitäten,
wie sie nachstehend beschrieben sind, umfassen die Fähigkeit
zur Modulation der Funktion, des Überlebens, der Morphologie,
der Proliferation und/oder der Differenzierung von Zellen von Geweben,
in denen 13245-Moleküle
exprimiert werden. Somit können
die 13245-Moleküle
als neue diagnostische Ziele und Therapeutika zur Kontrolle verschiedener
Erkrankungen, einschließlich
Skelettmuskelerkrankungen (z.B. Muskel- und myotonischen Dystrophien,
wie hierin und gemäß dem Stand
der Technik beschrieben) eingesetzt werden.
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Das
13245-Protein, Fragmente davon sowie Derivate und andere Varianten
der Sequenz mit Seq.-ID Nr. 2 werden gemeinsam als "Polypeptide oder
Proteine der Erfindung" oder "13245-Polypeptide
oder -proteine" bezeichnet.
Nucleinsäuremoleküle, die
für solche
Polypeptide oder Proteine kodieren, werden gemeinsam als "Nucleinsäuren der
Erfindung" oder "13245-Nucleinsäuren" bezeichnet. 13245-Moleküle beziehen
sich auf 13245-Nucleinsäuren,
-Polypeptide und -Antikörper.
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Die
Bezeichnung "Nucleinsäuremolekül" umfasst hierin DNA-Moleküle (z.B.
cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z.B. eine mRNA) sowie Analoga
der DNA oder RNA, die beispielsweise durch Einsatz von Nucleotidanaloga
erzeugt wurden. Das Nucleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder
doppelsträngig sein,
aber vorzugsweise handelt es sich um doppelsträngige DNA.
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Die
Bezeichnung "isoliertes
oder gereinigtes Nucleinsäuremolekül" umfasst Nucleinsäuremoleküle, die
von anderen, in der natürlichen
Quelle der Nucleinsäure
vorhandenen Nucleinsäuremolekülen getrennt sind.
In Bezug auf genomische DNA umfasst der Begriff "isoliert" beispielsweise Nucleinsäuremoleküle, die vom
Chromosom getrennt sind, mit dem die genomische DNA von Natur aus
assoziiert ist. Vorzugsweise ist eine "isolierte" Nucleinsäure frei von Sequenzen, welche
die Nucleinsäure
in der genomischen DNA des Organismus, von dem die Nucleinsäure stammt,
normalerweise flankieren (d.h. Sequenzen am 5'- und/oder 3'-Ende der Nucleinsäure). In verschiedenen Ausführungsformen
kann das isolierte Nucleinsäuremolekül beispielsweise
weniger als etwa 5 Kilobasen, 4 Kilobasen, 3 Kilobasen, 2 Kilobasen,
1 Kilobase, 0,5 Kilobasen oder 0,1 Kilobasen an 5'- und/oder 3'-Nucleotidsequenzen
enthalten, die das Nucleinsäuremolekül normalerweise
in genomischer DNA aus der Zelle flankieren, von der die Nucleinsäure stammt.
Außerdem
kann ein "isoliertes" Nucleinsäuremolekül, wie z.B.
ein cDNA-Molekül,
im Wesentlichen frei von anderem Zellmaterial oder, wenn es durch
Rekombinationsverfahren hergestellt wurde, Kulturmedium oder, im
Falle chemischer Synthese, im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder
anderen Chemikalien sein.
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Die
Bezeichnung "hybridisiert
unter stringenten Bedingungen" beschreibt
hierin Hybridisierungs- und Waschbedingungen. Stringente Bedingungen
sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und finden
sich in allgemein verfügbaren
Referenzwerken (z.B. Current Protocols in Molecular Biology 6.3.1-6.3.6, John
Wiley & Sons,
N.Y. (1989)). Darin sind wässrige
und nichtwässrige
Verfahren beschrieben, und beide können eingesetzt werden. Ein
bevorzugtes Beispiel für
stringente Hybridisierungsbedingungen ist eine Hybridisierung in
6× Natriumchlorid/Natriumcitrat
(SSC) bei etwa 45°C,
gefolgt von einem oder mehreren Waschdurchgängen in 0,2 × SSC, 0,1%
(Gew./Vol.) SDS bei 50 °C.
Ein weiteres Beispiel für
stringente Hybridisierungsbedingungen ist eine Hybridisierung in
6 × SSC
bei etwa 45 °C,
gefolgt von einem oder mehreren Waschdurchgängen in 0,2 × SSC, 0,1%
(Gew./Vol.) SDS bei 55 °C.
Ein weiteres Beispiel für
stringente Hybridisierungsbedingungen ist eine Hybridisierung in
6 × SSC
bei etwa 45 °C,
gefolgt von einem oder mehreren Waschdurchgängen in 0,2 × SSC, 0,1%
(Gew./Vol.) SDS bei 65 °C.
Besonders bevorzugte Stringenzbedingungen (und die Bedingungen,
die herrschen sollten, wenn sich ein Arzt nicht sicher ist, welche
Bedingungen eingesetzt werden sollen, um zu bestimmen, ob ein Molekül innerhalb
der Hybridisierungsgrenzen der vorliegenden Erfindung liegt) sind
0,5 M Natriumphosphat, 7% (Gew./Vol.) SDS bei 65 °C, gefolgt
von einem oder mehreren Waschdurchgängen bei 0,2 × SSC, 1%
(Gew./Vol.) SDS bei 65 °C.
Vorzugsweise entspricht ein isoliertes Nucleinsäuremolekül der Erfindung, das unter
stringenten Bedingungen an die Sequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID
Nr. 3 hybridisiert, einem natürlich
vorkommenden Nucleinsäuremolekül.
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Ein "natürlich vorkommendes" Nucleinsäuremolekül ist hierin
ein RNA- oder DNA-Molekül mit einer Nucleotidsequenz,
die in der Natur vorkommt (d.h. beispielsweise für ein natürliches Protein kodiert).
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Die
Bezeichnungen "Gen" und "rekombinantes Gen" beziehen sich hierin
auf Nucleinsäuremoleküle, die
einen für
ein 13245-Protein, vorzugsweise ein Säugetier-13245-Protein, kodierenden offenen Leseraster umfassen
und weiters nichtkodierende Regulationssequenzen und Introns enthalten
können.
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Ein "isoliertes" oder "gereinigtes" Polypeptid oder
Protein ist im Wesentlichen frei von zellulärem Material oder anderen verunreinigenden
Proteinen aus der Zelle oder dem Gewebe, von dem das Protein stammt, oder,
im Falle chemischer Synthese, im Wesentlichen frei von chemischen
Vorläufern
oder anderen Chemikalien. In einer Ausführungsform bedeutet "im Wesentlichen frei" die Herstellung
eines 13245-Proteins mit weniger als etwa 30%, 20%, 10% und noch
bevorzugter 5% (Trockengewicht) an Nicht-13245-Protein (hierin auch als "verunreinigendes
Protein" bezeichnet)
oder chemischen Vorläufern
von 13245-Chemikalien. Wenn das 13245-Protein oder ein biologisch
aktiver Teil davon durch Rekombination hergestellt wird, sind sie
vorzugsweise auch im Wesentlichen frei von Kulturmedium, d.h. das
Kulturmedium macht weniger als etwa 20%, noch bevorzugter weniger
als etwa 10%, insbesondere weniger als etwa 5%, des Volumens des
Proteinpräparats aus.
Die Erfindung umfasst auch isolierte oder gereinigte Präparate mit
einem Trockengewicht von zumindest 0,01, 0,1, 1,0 und 10 mg.
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Ein "nichtessenzieller" Aminosäurerest
ist ein Rest, der im Vergleich zur Wildtypsequenz von 13245 (beispielsweise
der Sequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder 3) geändert werden kann, ohne die
biologische Aktivität aufzuheben
oder, noch bevorzugter, wesentlich zu verändern, während ein "essenzieller" Aminosäurerest zu solch einer Veränderung
führt.
Von Aminosäureresten,
die bei den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung konserviert
sind, z.B. den in der Pkinase-Domäne vorhandenen, wurde vorhergesagt,
dass sie besonders unzugänglich
für Veränderungen
sind.
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Eine "konservative Aminosäuresubstitution" ist eine, bei welcher
der Aminosäurerest
durch einen Aminosäurerest
mit einer ähnlichen
Seitenkette ersetzt wird. Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen
Seitenketten wurden auf dem Gebiet der Erfindung bereits definiert.
Diese Familien umfassen Aminosäuren
mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren
Seitenketten (z.B. Asparaginsäure,
Glutaminsäure), ungeladenen
polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin,
Tyrosin, Cystein), apolaren Seitenketten (z.B. Alanin, Valin, Leucin,
Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), β-verzweigten
Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen
Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phe nylalanin, Tryptophan, Histidin).
Somit wird ein vorhergesagter nichtessenzieller Aminosäurerest
in einem 13245-Protein vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest
aus der gleichen Seitenkettenfamilie ersetzt. Alternativ dazu können in
einer anderen Ausführungsform
Mutationen zufällig über die
gesamte oder einen Teil der 13245-Kodierungssequenz eingeführt werden,
beispielsweise durch Sättigungsmutagenese,
und die resultierenden Mutanten können auf biologische 13245-Aktivität gescreent
werden, um Mutanten zu identifizieren, die ihre Aktivität beibehalten.
Nach Mutagenese von Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 kann das kodierte
Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins
kann bestimmt werden.
-
Die
Bezeichnung "biologisch
aktiver Teil" eines
13245-Proteins umfasst ein Fragment eines 13245-Proteins, das an
der Wechselwirkung zwischen einem 13245-Molekül und einem Nicht-13245-Molekül teilnimmt.
Biologisch aktive Teile eines 13245-Proteins umfassen Peptide mit
Aminosäuresequenzen
mit ausreichender Homologie zur Aminosäuresequenz des 13245-Proteins
oder davon abgeleitet, z.B. die in Seq.-ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz,
die weniger Aminosäuren
umfassen als das 13245-Protein voller Länge und die zumindest eine
Aktivität
eines 13245-Proteins aufweisen. Typischerweise umfassen biologisch
aktive Teile eine Domäne
oder ein Motiv mit zumindest einer Aktivität des 13245-Proteins, beispielsweise
eine Domäne
oder ein Motiv, das zur Katalyse einer hierin beschriebenen Aktivität in der
Lage ist, wie z.B. der kovalenten Addition einer Phosphatgruppierung
an einen Protein-Aminosäuresequenzrest
(z.B. eine Serin- oder Threonin-Hydroxylgruppe).
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Ein
biologisch aktiver Teil eines 13245-Proteins kann ein Polypeptid
sein, das beispielsweise 10, 25, 50, 100, 200, 300 oder 400, 500,
1000 oder 2000 oder mehr Aminosäuren
lang ist. Biologisch aktive Teile eines 13245-Proteins können als
Ziele zur Entwicklung von Mitteln eingesetzt werden, die eine 13245-vermittelte
Aktivität,
z.B. eine hierin beschriebene biologische Aktivität, modulieren.
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Berechnungen
der Homologie oder Sequenzidentität zwischen Sequenzen (die Begriffe
werden hierin austauschbar gebraucht) werden wie folgt durchgeführt.
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Um
die prozentuelle Identität
zwischen zwei Aminosäuresequenzen
oder zwischen zwei Nucleinsäuresequenzen
zu bestimmen, werden die Sequenzen zum Zwecke des optimalen Vergleichs
abgeglichen (z.B. können
Lücken
in eine oder in beide einer ersten und einer zweiten Aminosäure- oder
Nucleinsäuresequenz eingeführt werden,
um einen optimalen Abgleich zu erzielen, und nichthomologe Sequenzen
können
zu Vergleichszwecken ignoriert werden). In einer bevorzugten Ausführungsform
beträgt
die Länge
einer Bezugssequenz, die zu Vergleichzwecken abgeglichen wird, zumindest
30%, vorzugsweise zumindest 40%, noch bevorzugter zumindest 50%,
noch bevorzugter zumindest 60%, noch bevorzugter zumindest 70%,
80%, 90% oder 100% der Länge
der Bezugssequenz (wenn z.B. eine zweite Sequenz in Bezug zur 13245-Aminosäuresequenz
der Seq.-ID Nr. 2 angeordnet bzw. abgeglichen wird, werden zumindest
100 Aminosäurereste,
vorzugsweise zumindest 200, 300, 400, 500, 1000, 1500 oder 2000
oder mehr, Aminosäurereste
abgeglichen). Die Aminosäurereste
oder Nucleotide an entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nucleotidpositionen werden
dann verglichen. Wenn eine Position in der ersten Sequenz vom gleichen
Aminosäurerest
oder gleichen Nucleotid besetzt ist wie die entsprechende Position
in der zweiten Sequenz, dann sind die Moleküle an dieser Position identisch
(Aminosäure-
oder Nucleinsäure-"Identität" wird hierin gleichbedeutend
mit Aminosäure-
oder Nucleinsäure-"Homologie" verwendet). Die
prozentuelle Identität
zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an identischen
Positionen zwischen den beiden Sequenzen, wobei auch die Anzahl
an Lücken
und die Länge
jeder einzelnen Lücke
berücksichtigt
wird, die für
einen optimalen Abgleich dieser beiden Sequenzen eingefügt werden
müssen.
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Der
Vergleich von Sequenzen und die Bestimmung der prozentuellen Identität zwischen
zwei Sequenzen kann mithilfe eines mathematischen Algorithmus erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
wird die prozentuelle Identität
zwischen zwei Aminosäuresequenzen
unter Anwendung des Algorithmus nach Needleman et al. (J. Mol. Biol.
48, 444-453 (1970)) bestimmt, der in das GAP-Programm des GCG-Software-Pakets miteinbezogen
wurde (verfügbar
auf http://www.gcg.com), wobei entweder eine BLOSUM62-Matrix oder
ein PAM250-Matrix und ein "gap
weight" von 16,
14, 13, 10, 8, 6 oder 4 sowie ein "length weight" von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 eingesetzt werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die prozentuelle
Identität
zwischen zwei Nucleotidsequenzen unter Verwendung des GAP-Programms
des GCG-Software-Pakets (verfügbar
auf httpa/www.gcg.com) bestimmt, wobei eine NWSgapdna.CMP-Matrix
und ein "gap weight" von 40, 50, 60,
70 oder 80 sowie ein "length
weight" von 1, 2,
3, 4, 5 oder 6 eingesetzt werden. Eine besonders bevorzugte Gruppe
von Parametern (die auch eingesetzt werden sollte, wenn sich der
Arzt nicht sicher ist, welche Bedingungen eingesetzt werden sollen,
um zu bestimmen, ob ein Molekül
innerhalb der Sequenzidentitäts-
oder Homologiegrenzen der vorliegenden Erfindung liegt) umfasst
eine BLOSUM62-Bewertungsmatrix mit einem Lückenstrafpunktewert von 12,
einem Lückenerweiterungspunktewert
von 4 und einem Rasterverschiebungsstrafpunktewert von 5.
-
Die
prozentuelle Identität
zwischen zwei Aminosäuren
oder Nucleotidsequenzen kann unter Anwendung des Algorithmus nach
Meyers et al. (CABIOS 4, 11-17 (1989)) bestimmt werden, der in das
ALIGN-Programm (Version 2.0) miteinbezogen wurde, wobei eine PAM120-Weight-Residue-Tabelle,
ein Lückenlängen-Strafpunktewert
von 12 und ein Lückenstrafpunktewert
von 4 eingesetzt werden.
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Die
hierin beschriebene(n) Nucleinsäure
und Proteinsequenzen können
als "Query"-Sequenz verwendet werden, um öffentliche
Datenbanken zu durchsuchen und beispielsweise andere Familienmitglieder
oder verwandte Sequenzen zu identifizieren. Solche Suchen können mithilfe
des NBLAST- und XBLAST-Programms (Version 2.0) von Altschul et al.
(J. Mol. Biol. 215, 402-410 (1990)) durchgeführt werden. BLAST-Nucleotidsuchen können mithilfe
des NBLAST-Programms, Score = 100, Wortlänge = 12, durchgeführt werden, um
Nucleotidsequenzen zu erhalten, die homolog zu 13245-Nucleinsäuremolekülen der
Erfindung sind. BLAST-Proteinsuchen können mit dem XBLAST-Programm,
Score = 50, Wortlänge
= 3, durchgeführt
werden, um Aminosäuresequenzen
zu erhalten, die homolog zu 13245-Molekülen der Erfindung sind. Um
Abgleiche mit Lücken
zu Vergleichszwecken zu erhalten, kann Gapped BLASDT eingesetzt
werden, wie es von Altschul et al. (Nucl. Acids. Res. 25, 3389-3402
(1997)) beschrieben wird. Wenn BLAST- und Gapped-BLAST-Programme
eingesetzt werden, können
die Standardparameter des jeweiligen Programms (z.B. XBLAST und
NBLAST) verwendet werden. Siehe <http://www.ncbi.nlm.nih.gov>.
-
"Mangelhafte oder
aberrierende Expression" bezieht
sich hierin auf ein Nichtwildtyp-Genexpressionsmuster
auf RNA- oder Proteinebene. Diese umfasst: Expression in Nicht-Wwildtyp-Ausmaß, d.h. Über- oder Unterexpression;
ein Expressionsmuster, das sich in Bezug auf den Zeitpunkt oder
das Stadium der Expression des Gens vom Wildtyp unterscheidet, z.B.
verstärkte
oder verringerte Expression (im Vergleich zum Wildtyp) in einer
vorbestimmten Entwicklungsperiode oder -phase; ein Expressionsmuster,
das sich im Sinne einer verringerten Expression (im Vergleich zum
Wildtyp) in einem vorbestimmten Zelltyp oder Gewebetyp vom Wildtyp
unterscheidet; ein Expressionsmuster, das sich in Bezug auf die
Spleißgröße, Aminosäuresequenz, posttranslationale
Modifikation oder biologische Aktivität des exprimierten Polypeptids
vom Wildtyp unterscheidet; ein Expressionsmuster, das sich in Bezug
auf die Auswirkung eines Umweltreizes oder extrazellulären Reizes
auf die Expression des Gens vom Wildtyp unterscheidet, z.B. ein
Muster mit verstärkter
oder verringerter Expression (im Vergleich zum Wildtyp) in Gegenwart
einer Steigerung oder Verringerung der Reizstärke.
-
"Subjekt" kann sich hierin
auf ein Säugetier,
z.B. einen Menschen, oder auf ein Versuchs-, Tier- oder Krankheitsmodell
beziehen. Das Subjekt kann auch ein anderes Tier als der Mensch,
z.B. ein Pferd, eine Kuh, eine Ziege oder ein anderes Haustier sein.
-
Ein "gereinigtes Zellpräparat" bezieht sich hierin,
im Falle von Pflanzen- oder Tierzellen, auf ein In-vitro-Präparat von
Zellen und nicht auf eine ganze intakte Pflanze oder ein ganzes
intaktes Tier. Im Falle von kultivierten Zellen oder Mikrobenzellen
besteht es aus einem Präparat
aus zumindest 10%, noch bevorzugter 50%, der Subjektzellen.
-
Nachstehend
werden verschiedene Aspekte der Erfindung genauer beschrieben.
-
Isolierte
Nucleinsäuremoleküle
-
In
einem Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes oder gereinigtes
Nucleinsäuremolekül bereit,
das für ein
hierin beschriebenes 13245-Polypeptid, beispielsweise ein 13245-Protein
voller Länge
oder ein Fragment davon, wie etwa einen biologisch aktiven Teil
eines 13245-Proteins, kodiert. Außerdem umfasst sie ein Nucleinsäurefragment,
das zur Verwendung als Hybridisierungssonde geeignet ist, die beispielsweise
zu Identifikation von für
ein Polypeptid der Erfindung kodierenden Nucleinsäuremolekülen eingesetzt
werden kann, 13245-mRNA und Fragmente, die als Primer, z.B. PCR-Primer
für die
Amplifikation oder Mutation von Nucleinsäuremolekülen, geeignet sind.
-
In
einer Ausführungsform
umfasst ein isoliertes Nucleinsäuremolekül der Erfindung
die in Seq.-ID Nr. 1 dargestellte Nucleotidsequenz oder einen Teil
davon. In einer Ausführungsform
umfasst das Nucleinsäuremolekül Sequenzen,
die für
das menschliche 13245-Protein kodieren (d.h. "die kodierende Region" der Nucleotide 19-6178
aus Seq.-ID Nr. 1), sowie nichttranslatierte 5'-Sequenzen (Nucleotide 6179-6575 von
Seq.-ID Nr. 1). Alternativ dazu kann das Nucleinsäuremolekül auch nur
die kodierende Region von Seq.-ID Nr. 1 (z.B. die Nucleotide 19-6178,
die der Seq.-ID Nr. 3 entsprechen) und beispielsweise keine flankierenden
Sequenzen umfassen, die normalerweise die Subjektsequenz begleiten.
In einer weiteren Ausführungsform
kodiert das Nucleinsäuremolekül für eine Sequenz,
die dem 2053-Aminosäurerest-Proteind
er Seq.-ID Nr. 2 entspricht.
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In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst ein isoliertes Nucleinsäuremolekül der Erfindung
ein Nucleinsäuremolekül, das ein
Komplement der in einer aus Seq.-ID Nr. 1 und 3 dargestellten Nucleotidsequenz
ist, und einen Teil einer dieser Sequenzen. In anderen Ausführungsformen
weist das Nucleinsäuremolekül der Erfindung
ausreichende Komplementarität
zu einer in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 dargestellten Nucleotidsequenz
auf, sodass es mit einer Nucleinsäure mit dieser Sequenz hybridisieren
und einen stabilen Duplex bilden kann.
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In
einer Ausführungsform
umfasst ein isoliertes Nucleinsäuremolekül der Erfindung
eine Nucleotidsequenz, die zumindest zu etwa 60%, 65%, 70%, 75%,
80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99%
oder mehr zur Gesamtlänge
einer in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 dargestellten Nucleotidsequenz
sowie zu einem Teil, vorzugsweise mit der gleichen Länge, einer
dieser Nucleotidsequenzen homolog ist.
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13245-Nucleinsäurefragmente
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Ein
Nucleinsäuremolekül der Erfindung
kann auch nur einen Teil der Nucleinsäuresequenz von Seq.-ID Nr.
1 und 3 enthalten. Solch ein Nucleinsäuremolekül kann beispielsweise ein Fragment
enthalten, das als Sonde oder Primer verwendet werden kann, oder
ein Fragment, das für
eine Teil eines 13245-Proteins, z.B. einen immunogenen oder biologisch
aktiven Teil eines 13245-Proteins, kodiert. Ein Fragment kann Nucleotide umfassen,
die den Resten 97-360 von Seq.-ID Nr. 2 entsprechen, die für eine Pkinase-Domäne von menschlichem
13245 kodieren, oder den Resten 1568-1865 von Seq.-ID Nr. 2, die für eine CNH-Domäne von menschlichem
13245 kodieren. Die aus der Klonierung des 13245-Gens bestimmte
Nucleotidsequenz erleichtert die Bildung von Sonden und Primern
zur Verwendung bei der Identifikation und/oder Klonierung anderer 13245-Familienmitglieder
oder von Fragmenten davon sowie von 13245-Homologen oder Fragmenten
davon von anderen Spezies.
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In
einer anderen Ausführungsform
umfasst eine Nucleinsäure
eine Nucleotidsequenz, die einen Teil der oder die gesamte kodierende(n)
Region umfasst und sich in die nichtkodierende 5'- oder 3'-Region oder in beide erstreckt. Andere
Ausführungsform
umfassen ein Fragment, das eine für ein hierin beschriebenes
Aminosäurefragment
kodierende Nucleotidsequenz enthält.
Nucleinsäurefragmente
können
für eine
spezifische Domäne
oder Stelle, wie sie hierin beschrieben sind, oder Fragmente davon
kodieren, insbesondere Fragmente davon, die zumindest etwa 250 Aminosäuren lang
sind. Fragmente umfassen auch Nucleinsäuresequenzen, die bestimmten
Aminosäuresequenzen,
wie sie oben beschrieben sind, oder Fragmenten davon entsprechen.
Nucleinsäurefragmente
sollten jedoch nicht so verstanden werden, dass sie jene Fragmente
umfassen, die schon vor der vorliegenden Erfindung geoffenbart wurden.
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Ein
Nucleinsäurefragment
kann eine Sequenz enthalten, die einer hierin beschriebenen Domäne, Region
oder funktionellen Stelle entspricht. Ein Nucleinsäurefragment
kann auch eine oder mehrere der hierin beschriebenen Domänen, Regionen
oder funktionellen Stellen enthalten.
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13245-Sonden
und -Primer werden ebenfalls bereitgestellt. Typischerweise ist
eine Sonde/ein Primer ein isoliertes oder gereinigtes Oligonucleotid.
Das Oligonucleotid umfasst typischerweise eine Region einer Nucleotidsequenz,
die unter stringenten Bedingungen an zumindest etwa 7, 12 oder 15,
vorzugsweise etwa 20 oder 25, noch bevorzugter etwa 30, 35, 40,
45, 50, 55, 60, 65 oder 75 zusammenhängende Nucleotide einer Sense-
oder Antisense-Sequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder 3 hybridisieren, sowie
natürlich
vorkommende Allelvarianten oder -mutanten von Seq.-ID Nr. 1 oder
3.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Nucleinsäure
eine Sonde, die zumindest 5 oder 10 und weniger als 200, noch bevorzugter
weniger als 100, oder weniger als 50 Basenpaare lang ist. Sie sollte
mit einer hierin geoffenbarten Sequenz identisch sein oder sich
um 1 oder weniger als 5 oder 10 Basen von dieser unterscheiden.
Wenn zum Vergleich der Sequenzen ein Abgleich erforderlich ist,
sollte auf maximale Homologie abgeglichen werden. "Looped-out"-Sequenzen aufgrund
von Deletionen oder Insertionen oder Fehlpaarungen werden als Unterschiede
angesehen.
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Eine
Sonde oder ein Primer kann vom Sense- oder Antisense-Strang einer
Nucleinsäure
abgeleitet sein, die für
eine Pkinase-Domäne
an etwa den Aminosäureresten
97-360 von Seq.-ID Nr. 2 oder die vorhergesagte CNH-Domäne an etwa
den Aminosäureresten
1568-1865 von Seq.-ID Nr. 2 kodiert.
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In
einer weiteren Ausführungsform
wird ein Satz Primer bereitgestellt, beispielsweise Primer, die
zur Verwendung in einer PCR geeignet sind, die zur Amplifikation
einer ausgewählten
Region einer 13245-Sequenz eingesetzt werden können. Die Primer sollten zumindest
5, 10 oder 50 Basenpaare lang sein und weniger als 100, oder weniger
als 200, Basenpaare lang sein. Die Primer sollten identisch sein
oder sich um eine Base von einer hierin geoffenbarten Sequenz oder
von einer natürlich
vorkommenden Variante unerscheiden. Primer, die zur Amplifikation
aller oder eines Teil der folgenden Regionen geeignet sind, werden
ebenfalls bereitgestellt: z.B. eine oder mehrere Pkinase-Domänen und
die vorhergesagte CNH-Domäne,
wie oben in Bezug auf Seq.-ID Nr. 2 definiert.
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Ein
Nucleinsäurefragment
kann für
eine epitoptragende Region eines hierin beschriebenen Polypeptids
kodieren.
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Ein
Nucleinsäurefragment,
das für
einen "biologisch
aktiven Teil eines 13245-Polypeptids" kodiert, kann durch Isolierung eines
Abschnitts der Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder 3, der für ein Polypeptid mit
biologischer 13245-Aktivität
(z.B. die hierin beschriebenen biologischen Aktivitäten des
13245-Proteins) kodiert, Expression des kodierten Teils des 13245-Proteins
(z.B. durch rekombinante Expression in vitro) und Beurteilung der
Aktivität
des kodierten Abschnitts des 132345-Proteins hergestellt werden.
Ein Nucleinsäurefragment,
das für
einen biologisch aktiven Teil von 13245 kodiert, umfasst beispielsweise
eine Pkinase-Domäne,
z.B. die Aminosäurereste
97-360 von Seq.-ID Nr. 2, oder eine CNH-Domäne, z.B. die Aminosäurereste 1568-1865
von Seq.-ID Nr. 2. Ein Nucleinsäurefragment,
das für
einen biologisch aktiven Teil eines 13245-Polypeptids kodiert, kann
eine Nucleotidsequenz umfassen, die 25 Nucleotide lang oder länger ist.
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In
einer Ausführungsform
umfasst die Nucleinsäure
solche, die eine Nucleotidsequenz mit einer Länge von mehr als 260, 300,
400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500,
2000, 2500, 3000, 4000, 5000 oder 6000 aufweisen, die unter stringenten
Hybridisierungsbedingungen an ein Nucleinsäuremolekül mit der Sequenz von Seq.-ID
Nr. 1 oder 3 hybridisiert.
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13245-Nucleinsäurevarianten
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Die
Erfindung umfasst weiters Nucleinsäuremoleküle mit einer Sequenz, die sich
von den in Seq.-ID Nr. 1 und 3 dargestellten Nucleotidsequenzen
unterscheidet. Solche Unterschiede können auf eine Degeneration
des genetischen Codes zurückzuführen sein
(d.h. Unterschiede, die eine Nucleinsäure ergeben, die für die gleichen
13245-Proteine kodiert
wie die hierin geoffenbarte Nucleotidsequenz). In einer weiteren
Ausführungsform
kodiert ein isoliertes Nucleinsäuremolekül der Erfindung
für ein
Protein mit einer Aminosäuresequenz,
die sich um zumindest 1, aber weniger als 5, 10, 20, 50 oder 100
Aminosäurereste
von Seq.-ID Nr. 2 unterscheidet. Wenn zum Vergleich der Sequenzen
ein Abgleich erforderlich ist, sollten sie auf maximale Homologie
abgeglichen werden. "Looped-out"-Sequenzen aufgrund
von Deletionen oder Insertionen oder Fehlpaarungen werden als Unterschiede
angesehen.
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Nucleinsäuren des
Erfinders können
aufgrund des Vorhandenseins von Codons ausgewählt werden, die für ein bestimmtes
Expressionssystem bevorzugt oder nicht bevorzugt sein können. Die
Nucleinsäure
kann beispielsweise eine solche sein, in der zumindest ein Codon,
vorzugsweise zumindest 10% oder 20% der Codons, so verändert ist/sind,
dass die Sequenz für
die Expression in E.-coli-, Hefe-, Menschen-, Insekten- oder CHO-Zellen
optimiert ist.
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Nucleinsäurevarianten
können
natürlich
vorkommen, wie z.B. Allelvarianten (gleicher Locus), Homologe (anderer
Locus) und Orthologe (anderer Organismus), oder nicht natürlich vorkommen.
Nicht natürlich vorkommende
Varianten können
durch Mutageneseverfahren hergestellt werden, einschließlich jener,
die für Polynucleotide,
Zellen oder Organismen eingesetzt werden. Die Varianten können Nucleotidsubstitutionen, -deletionen,
-inversionen und -insertionen enthalten. Eine Variation kann in
den kodierenden oder in den nichtkodierenden Regionen oder in beiden
vorkommen. Die Variationen können
sowohl konservative als auch nichtkonservative Aminosäuresubstitutionen
(bei Vergleich der kodierten Produkte) erzeugen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
weist die Nucleinsäure
eine Sequenz auf, die sich von Seq.-ID Nr. 1 und 2 beispielsweise
wie folgt unterschiedet: um zumindest einen, aber weniger als 10,
20, 30 oder 40, Nucleotidreste; oder um zumindest einen, aber weniger
als 1%, 5%, 10% oder 20%, der Nucleotidreste in der jeweiligen Nucleinsäure. Falls
für diese
Analyse erforderlich, sollten die Sequenzen auf maximale Homologie abgeglichen
werden. "Looped-out"-Sequenzen aufgrund
von Deletionen oder Insertionen oder Fehlpaarungen werden als Unterschiede
angesehen.
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Orthologe,
Homologe und Allelvarianten können
mithilfe von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren identifiziert
werden. Diese Varianten umfassen eine Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid
kodiert, das zu 50%, zumindest etwa 55%, typischerweise zumindest
etwa 70-75%, häufiger
zumindest etwa 80-85%, meist zumindest etwa 90-95% oder mehr mit
einer der Nucleotidsequenzen von Seq.-ID Nr. 1 und 3 identisch ist,
oder ein Fragment einer dieser Sequenzen. Solche Nucleinsäuremoleküle können leicht
identifiziert werden, da sie in der Lage sind, unter stringenten
Bedingungen an die Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder 3 oder
ein Fragment einer dieser Sequenzen zu hybridisieren. Nucleinsäuremoleküle, die
Orthologen, Homologen und Allelvarianten der 13245-cDNAs der Erfindung
entsprechen, können
weiters isoliert werden, indem sie bei der Kartierung dem gleichen
Chromosom oder gleichen Locus wie das 13245-Gen zugeordnet werden.
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Bevorzugte
Varianten umfassen jene, die mit einer der hierin beschriebenen
biologischen 13245-Aktivitäten
zusammenhängen,
z.B. die Katalyse der Bildung einer kovalenten Bindung zwischen
dem Aminosäurerest
eines Proteins (z.B. eines Serin- oder Threoninrests) und einer
Phosphatgruppierung.
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Allelvarianten
von 13245 (z.B. menschlichem 13245) umfassen sowohl funktionelle
als auch nichtfunktionelle Proteine. Funktionelle Allelvarianten
sind natürlich
vorkommende Aminosäuresequenzvarianten
des 13245-Proteins innerhalb einer Population, welche die Fähigkeit
beibehalten, eine der hierin beschriebenen biologischen 13245-Aktivitäten zu vermitteln.
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Funktionelle
Allelvarianten enthalten typischerweise nur konservative Substitutionen
einer oder mehrerer der Aminosäuren
von Seq.-ID Nr. 2 oder Substitutionen, Deletionen oder Insertionen
von nicht entscheidenden Resten in nicht entscheidenden Regionen
des Proteins. Nichtfunktionelle Allelvarianten sind natürlich vorkommende
Aminosäuresequenzvarianten
des 13245- (z.B. menschlichen 13245-) Proteins innerhalb einer Population,
die nicht in der Lage sind, eine der hierin beschriebenen biologischen
13245-Aktivitäten
zu vermitteln. Nichtfunktionelle Allelvarianten enthalten typischerweise
eine nichtkonservative Substitution, eine Deletion oder eine Insertion
oder eine vorzeitige Trunkierung der Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr.
2 oder eine Substitution, Insertion oder Deletion in entscheidenden
Resten oder entscheidenden Regionen des Proteins.
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Außerdem liegen
Nucleinsäuremoleküle, die
für andere
Mitglieder der 13245-Familie kodieren und somit eine Nucleotidsequenz
aufweisen, die sich von den 13245-Sequenzen von Seq.-ID Nr. 1 und 3 unterscheidet,
innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung.
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Antisense-Nucleinsäuremoleküle Ribozyme
und modifizierte 13245-Nucleinsäuremoleküle
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In
einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das antisense
zu 13245 ist. Eine "Antisense-Nucleinsäure" kann ein Nucleotidsequenz
enthalten, die komplementär
zu einer "Sense-Nucleinsäure" ist, die für ein Protein
kodiert, beispielsweise komplementär zum kodierenden Strang eines
doppelsträngigen
cDNA-Moleküls
oder komplementär
zu einer mRNA-Sequenz. Die Antisense-Nucleinsäure kann komplementär zu einem
gesamten für
13245 kodierenden Strang oder nur zu einem Abschnitt davon sein
(z.B. zur kodierenden Region von menschlichem 13245, die der Seq.-ID
Nr. 3 entspricht). In einer anderen Ausführungsform ist die Antisense-Nucleinsäure antisense
zu einer "nichtkodierenden
Region" des kodierenden
Strangs einer Nucleotidsequenz, die für 13245 kodiert (z.B. die nichttranslatierten
5'- und 3'-Regionen).
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Eine
Antisense-Nucleinsäure
kann so aufgebaut sein, dass sie komplementär zur gesamten kodierenden
Region von 13245-mRNA ist, aber noch bevorzugter handelt es sich
um ein Oligonucleotid, das antisense zu nur einem Abschnitt der
kodierenden oder nichtkodierenden Region von 13245-mRNA ist. Das
antisense Oligonucleotid kann beispielsweise komplementär zur Region
sein, die die Translationsinitiationsstelle von 13245-mRNA umgibt,
beispielsweise zwischen den -10- und +10-Regionen der Zielgen-Nucleotidsequenz
von Interesse. Ein Antisense-Oligonucleotid kann beispielsweise
etwa 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 oder
80 oder mehr Nucleotidreste lang sein.
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Eine
Antisense-Nucleinsäure
der Erfindung kann mithilfe chemischer Synthese- und enzymatischer
Ligationsreaktionen unter Einsatz von auf dem Gebiet der Erfindung
bekannten Verfahren konstruiert werden. Eine Antisense-Nucleinsäure (z.B.
ein Antisense-Oligonucleotid) kann beispielsweise unter Verwendung
von natürlich
vorkommenden Nucleotiden oder auf verschiedene Arten modifizierten
Nucleotiden chemisch synthetisiert werden, die so aufgebaut sind,
dass sie die biologische Stabilität der Moleküle erhöhen oder die physikalische
Stabilität
des Duplex erhöhen,
der zwischen den Antisense- und Sense-Nucleinsäuren gebildet wird, und es
können
z.B. Thiophosphatderivate und acridinsubstituierte Nucleotide eingesetzt
werden. Die Antisense-Nucleinsäure
kann auch biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt
werden, in den eine Nucleinsäure
in Antisense-Orientierung subkloniert wurde (d.h. die von der insertierten
Nucleinsäure
transkribierte RNA weist Antisense-Orientierung in Bezug auf eine
Zielnucleinsäure
von Interesse auf, wie im nachstehenden Abschnitt erläutert wird).
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Die
Antisense-Nucleinsäuremoleküle der Erfindung
werden typischerweise einem Individuum verabreicht (beispielsweise
durch Injektion an einer Gewebestelle) oder in situ gebildet, sodass
sie mit zellulärer mRNA
und/oder genomischer DNA, die für
ein 13245-Protein kodiert, hybridisiert oder daran bindet, um die Expression
des Proteins zu hemmen, beispielsweise durch Hemmung der Transkription
und/oder Translation. Alternativ dazu können Antisense-Nucleinsäuremoleküle modifiziert
werden, um auf ausgewählte
Zellen abzuzielen, und dann systemisch verabreicht werden.
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Für eine systemische
Verabreichung können
Antisense-Moleküle
so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene
binden, die auf einer ausgewählten
Zelloberfläche
exprimiert werden, beispielsweise indem die Antisense-Nucleinsäuremoleküle an Peptide
oder Antikörper
gebunden werden, die an Zelloberflächenrezeptoren oder -antigene
binden. Die Antisense-Nucleinsäuremoleküle könne auch
Zellen zugeführt
werden, indem die hierin beschriebenen Vektoren verwendet werden.
Um ausreichende intrazelluläre Konzentrationen
der Antisense-Moleküle
zu erreichen, werden Vektorkonstrukte bevorzugt, in denen das Antisense-Nucleinsäuremolekül unter
der Kontrolle eines starken pol-II- oder pol-III-Promotors stehen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
ist das Antisense-Nucleinsäuremolekül der Erfindung
ein α-anomeres
Nucleinsäuremolekül. Ein α-anomeres
Nucleinsäuremolekül bildet
spezifische doppelsträngige
Hybride mit komplementärer
RNA, in der, im Gegensatz zu den üblichen β-Einheiten, die Stränge parallel
zueinander verlaufen (Gaultier et al., Nucl. Acids Res. 15, 6625-6641
(1987)). Das Antisense-Nucleinsäuremolekül kann auch ein
2'-o-Methylribonucleotid
(Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15, 6131-6148 (1987)) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon
(Inoue et al., FEBS Lett. 215, 327-330 (1987)) umfassen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
ist die Antisense-Nucleinsäure
der Erfindung ein Ribozym. Ein Ribozym mit Spezifität für eine für 13245
kodierende Nucleinsäure
kann eine oder mehrere Sequenzen umfassen, die komplementär zur Nucleotidsequenz
einer 13245-cDNA sind, wie sie hierin geoffenbart ist (d.h. Seq.-ID
Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3), sowie eine Sequenz mit einer bekannten
katalytischen Sequenz, die für mRNA-Spaltung
verantwortlich ist (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5.093.246
oder Haselhoff et al., Nature 334, 585-591 (1988)). Es kann beispielsweise
ein Derivat einer Tetrahymena-L-19-IVS-RNA hergestellt werden, in
dem die Nucleotidsequenz der aktiven Stelle komplementär zur Nucleotidsequenz
ist, die in einer für 13245
kodierenden mRNA gespalten werden soll (z.B. US-Patent Nr. 4.987.071;
und US-Patent Nr. 5.116.742). Alternativ dazu kann 13245-mRNA eingesetzt
werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonucleasenaktivität aus einem
Pool von RNA-Molekülen
auszuwählen
(z.B. Bartel et al., Science 261, 1411-1418 (1993)).
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Die
132445-Genexpression kann gehemmt werden, indem auf Nucleotidsequenzen
abgezielt wird, die zur Regulationsregion von 13245 komplementär sind (z.B.
der 13235-Promotor und/oder -Enhancer), um Tripelhelixstrukturen
zu bilden, welche die Transkription des 13245-Gens in Zielzellen
verhindern (Helene, Anticancer Drug Des. 6, 569-584 (1991); Helene
et al., Ann. N.Y. Acad. Sci 660, 27-36 (1992); Maher Bioassays 14,807-815
(1992)). Die Zahl der Sequenzen, auf die für eine Tripelhelixbildung abgezielt
werden kann, kann durch Schaffung eines so genannten "Switchback"-Nucleinsäuremolekül erhöht werden.
Switchback-Moleküle werden
auf alternierende 5'-3', 3'-5'-Weise synthetisiert,
sodass sie zuerst an einen Strang eines Duplex und dann an den anderen
hybridisieren, wodurch keine größere Gruppe
von entweder Purinen oder Pyrimidinen mehr auf einem Strang eines
Duplex vorhanden sein muss.
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Die
Erfindung stellt weiters einen detektierbar markierten Oligonucleotidprimer
und Sondenmoleküle bereit.
Typischerweise sind solche Markierungen chemolumineszierend, fluoreszierend,
radioaktiv oder kolorimetrisch.
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Ein
1245-Nucleinsäuremolekül kann an
der Basengruppierung, an der Zuckergruppierung oder am Phosphatrückgrat modifiziert
werden, um beispielsweise die Stabilität, Hybridisierung oder Löslichkeit
des Moleküls
zu verbessern. Das Desoxyribosephosphat-Rückgrat der Nucleinsäuremoleküle kann
beispielsweise so modifiziert werden, dass Peptidnucleinsäuren erzeugt
werden (Hyrup et al., Bioorg. Med. Chem. 4, 5-23 (1996)). Die Bezeichnung "Peptidnucleinsäure" bezieht sich auf
ein Nucleinsäuremimetikum,
beispielsweise ein DNA-Mimetikum, in dem das Desoxyribosephosphat-Rückgrat durch
ein Pseudopeptid-Rückgrat
ersetzt ist und nur die vier natürlichen
Nucleobasen erhalten bleiben. Das neutrale Rückgrat einer PNA kann unter
Bedingungen geringer Ionenstärke
eine spezifische Hybridisierung an DNA und RNA ermöglichen.
Die Synthese von PNA-Oligomeren kann unter Anwendung einer herkömmlichen
Festphasen-Peptidsynthesevorschrift durchgeführt werden, wie von Hyrup et
al. (w.o. (1996); Perry-O'Keefe
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14671-14675) beschrieben.
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PNAs
von 13245-Nucleinsäuremolekülen können in
therapeutischen und diagnostischen Anwendungen eingesetzt werden.
Beispielsweise können
PNAs als Antisense- oder Antigenmittel für eine sequenzspezifische Modulation
von Genexpression eingesetzt werden, beispielsweise durch Induktion
von Transkriptions- oder Translationsarretierung oder Hemmung von
Replikation. PNAs von 13245-Nucleinsäuremolekülen können auch bei der Analyse von
Mutationen eines einzelnen Basenpaares in einem Gen eingesetzt werden
(z.B. durch PNA-gesteuertes PCR-Clamping); als ,künstliches
Restriktionsenzym',
wenn sie in Kombination mit anderen Enzymen verwendet werden (z.B.
S1-Nucleasen, wie in Hyrup et al., w.o. (1996) beschrieben); oder
als Sonden oder Primer für
DNA-Sequenzierung oder -Hybridisierung (Hyrup et al., w.o. (1996);
Perry-O'Keefe, w.o.).
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In
anderen Ausführungsformen
kann das Oligonucleotid andere angebundene Gruppen, wie z.B. Peptide,
(beispielsweise zum Targeting von Wirtszellerezeptoren in vivo)
oder Stoffe, die den Transport durch die Zellmembran (z.B. Letsinger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553-6556 (1989); Lemaitre
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 648-652 (1987); PCT-Veröffentlichung
Nr. WO 88/09810) oder die Blut-Hirn-Schranke
(siehe z.B. PCT-Veröffentlichung
Nr. WO 89/10134) erleichtern, umfassen. Außerdem können Oligonucleotide mit durch
Hybridisierung ausgelösten
Spaltmitteln (z.B. Krol et al., Bio-Techniques 6, 958-976 (1988))
oder interkalierenden Mitteln (z.B. Zon, Pharm. Res. 5, 539-549
(1988)) modifiziert werden. Zu diesem Zweck kann das Oligonucleotid
an ein anderes Molekül
konjugiert werden (z.B. ein Peptid, ein durch Hybridisierung ausgelöstes Vernetzungsmittel,
ein Transportmittel oder ein durch Hybridisierung ausgelöstes Spaltmittel).
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Die
Erfindung umfasst weiters Oligonucleotidprimer und -sondenmoleküle als Hybridisierungssonden mit
zumindest einer Region, die komplementär zu einer 13245-Nucleinsäure der
Erfindung ist, zwei komplementären
Regionen, wobei eine ein Fluorophor und die andere einen Quencher
aufweist, sodass die Hybridisierungssonde zur Quantifizierung der
Gegenwart der 13245-Nucleinsäure
der Erfindung in einer Probe zweckdienlich ist.
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Isolierte 13245-Polypeptide
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes 13245-Protein
oder ein Fragment, z.B. einen biologisch aktiven Teil, zur Verwendung
als Immunogen oder Antigen zur Provokation oder zum Testen (oder
häufiger
zum Binden) von Anti-13245-Antikörpern. Ein
13245-Protein kann mithilfe von herkömmlichen Proteinreinigungsverfahren
aus Zellen oder Gewebequellen isoliert werden. Ein 13245-Protein
oder Fragmente davon können
durch DNA-Rekombinationsverfahren produziert oder chemisch synthetisiert
werden.
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Polypeptide
der Erfindung umfassen solche, die als Ergebnis des Vorhandenseins
von mehreren Genen, von alternativen Transkriptionsvorgängen, alternativen
RNA-Spleißvorgängen und
alternativen Translations- und Posttranslationsvorgängen entstehen.
Das Polypeptid kann in Systemen, z.B. kultivierten Zellen, exprimiert
werden, die zu im Wesentlichen den gleichen posttranslationalen
Modifikationen führen
wie die Expression des Polypeptids in einer nativen Zelle, oder
in Systemen, die zu einer Änderung
oder Unterlassung von posttranslationalen Modifikationen, z.B. Glykosylierung
oder Spaltung, führen,
die bei einer Expression in einer nativen Zelle vorkommen.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
weist ein 13245-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Merkmale
auf:
- (1) es katalysiert die Bildung einer kovalenten
Bindung in oder zwischen einem Aminosäurerest und einer Phosphatgruppierung;
- (2) es moduliert die Zellkontraktilität;
- (3) es moduliert das Zellwachstum;
- (4) es moduliert die Zellleitfähigkeit;
- (5) es moduliert den Eintritt einer Zelle in den Zellzyklus;
- (6) es moduliert die Progression einer Zelle durch den Zellzyklus;
- (7) es moduliert die Mitogenese;
- (8) es moduliert den Zellmetabolismus;
- (9) es moduliert die Gentranskription;
- (10) es katalysiert die Interkonversion von phosphorylierten
und dephosphorylierten Formen einer GTPase, wie z.B. einer Rho-GTPase;
- (11) es moduliert die Zytokinese;
- (12) es moduliert die Zellform;
- (13) es moduliert die Zellbewegung (z.B. Tumormetastasen);
- (14) es moduliert die Integration eines Virusgenoms in ein Wirtszellengenom;
- (15) es moduliert die Haltung eines Virusgenoms in einem Wirtszellengenom;
- (16) es moduliert die zytologischen Veränderungen in einer virusinfizierten
Wirtszelle;
- (17) es moduliert die Virusproduktion in einer virusinfizierten
Wirtszelle;
- (18) es moduliert die Wechselwirkung eines Virions mit einer
Membran einer virusinfizierten Wirtszelle;
- (19) es moduliert die Einkapselung eines Virions in einem Abschnitt
einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle;
- (20) es weist ein Molekulargewicht, eine Aminosäurezusammensetzung
oder andere physikalische Merkmale eines 13245-Proteins der Seq.-ID
Nr. 2 auf;
- (21) es weist eine Gesamtsequenzähnlichkeit (Identität) von zumindest
60-65%, vorzugsweise
zumindest 70%, noch bevorzugter zumindest 75, 80, 85, 86, 87, 88,
89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 oder 99% oder mehr, mit einem
Abschnitt von Seq.-ID Nr. 2 auf;
- (22) es weist eine CNH-Domäne
auf, die vorzugsweise zu etwa 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%
oder 99% oder mehr mit den Aminosäureresten 1568-1865 von Seq.-ID
Nr. 2 identisch ist; oder
- (23) es weist zumindest eine Pkinase-Domäne auf, de vorzugsweise zu
etwa 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr mit den
Aminosäureresten
97-360 von Seq.-ID Nr. 2 identisch ist.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
unterschiedet sich das 13245-Protein oder Fragment davon nur unwesentlich,
wenn überhaupt,
von der entsprechenden Se quenz in Seq.-ID Nr. 2. In einer Ausführungsform unterscheidet
es sich um zumindest einen, aber weniger als 15, 10 oder 5 Aminosäuren. In
einer weiteren unterscheidet es sich von der entsprechenden Sequenz
in Seq.-ID Nr. 2 um zumindest einen Rest, aber weniger als 20%,
15%, 10% oder 5% der Reste unterscheiden sich von der entsprechenden
Sequenz in Seq.-ID Nr. 2 (wenn dieser Vergleich einen Abgleich erfordert,
sollten die Sequenzen auf maximale Homologie abgeglichen werden. "Looped-out"-Sequenzen aufgrund
von Deletionen oder Insertionen oder Fehlpaarungen werden als Unterschiede
betrachtet). Die Unterschiede sind vorzugsweise Unterschiede oder
Veränderungen
an nichtessenziellen Aminosäureresten
oder umfassen eine konservative Substitution eines Rests durch einen
anderen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Unterschiede
nicht an den Resten 97-360 oder 1568-1865 von Seq.-ID Nr. 2 zu finden.
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Andere
Ausführungsformen
umfassen ein Protein, das eine oder mehrere Änderungen der Aminosäuresequenz
im Vergleich zu Seq.-ID Nr. 2 aufweist (z.B. eine Änderung
an einem Aminosäurerest,
der für
die Aktivität
nicht essenziell ist). Die Aminosäuresequenz solcher 13245-Proteine
unterscheidet sich von Seq.-ID Nr. 2, obwohl die biologische Aktivität erhalten
bleibt.
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In
einer Ausführungsform
umfasst das Protein eine Aminosäuresequenz
mit zumindest etwa 60%, 65 5, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%
oder mehr Homologie zu Seq.-ID Nr. 2.
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Ein
13245-Protein oder ein Fragment mit einer Aminosäuresequenz wird bereitgestellt,
die sich von Seq.-ID Nr. 2 in einer oder in beiden der Regionen,
die den Resten 1-96, 361-1567 und 1866-2053 von Seq.-ID Nr. 2 entsprechen,
um zumindest einen, aber weniger als 15, 10 oder 5 Aminosäurereste,
unterscheidet, in der Region, die den Resten 97-360 und 1568-1865
von Seq.-ID Nr. 2 entspricht, jedoch nicht von Seq.-ID Nr. 2 (wenn
dieser Vergleich einen Abgleich erfordert, sollten die Sequenzen
auf maximale Homologie abgeglichen werden. "Looped-out"-Sequenzen aufgrund von Deletionen oder
Insertionen oder Fehlpaarungen werden als Unterschiede angesehen).
In manchen Ausführungsformen
finden sich die Unterschiede vorzugsweise an nichtessenziellen Resten,
oder es handelt sich um eine konservative Substitution, während sich
der Unterschied in anderen an einem essenziellen Rest befindet oder
eine nichtkonservative Substitution ist.
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Ein
biologisch aktiver Teil eines 13245-Proteins sollte die 13245-Pkinase-Domäne, die 13245-CNH-Domäne oder
beide enthalten. Außerdem
können
andere biologisch aktive Teile, in denen andere Regionen des Proteins
deletiert sind, durch Rekombinationsverfahren produziert und bezüglich einer
oder mehrerer der funktionellen Aktivitäten eines nativen 13245-Proteins
bewertet werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
weist das 13245-Protein die Aminosäuresequenz Seq.-ID Nr. 2 auf.
In anderen Ausführungsformen
ist das 13245-Protein im Wesentlichen identisch mit Seq.-ID Nr.
2. In einer weiteren Ausführungsform
ist das 13245-Protein im Wesentlichen identisch mit Seq.-ID Nr.
2 und behält die
funktionelle Aktivität
des Proteins der Seq.-ID Nr. 2 bei.
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Chimäre 13245-Proteine oder 13245-Fusionsproteine
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung chimäre 13245-Proteine oder 13245-Fusionsproteine bereit. "Chimäre 13245-Proteine" oder "13245-Fusionsproteine" umfassen hierin
ein 13245-Polypeptid, das an ein Nicht-13245-Polypeptid gebunden
ist. Ein "Nicht-13245-Polypeptid" ist ein Polypeptid
mit einer Aminosäuresequenz,
die einem Protein entspricht, das zum 13245-Protein im Wesentlichen
nicht homolog ist, beispielsweise einem Protein, das sich vom 13245-Protein
unterscheidet und vom gleichen oder einem anderen Organismus stammt.
Das 13245-Polypeptid des Fusionsproteins kann der gesamten oder
einem Teil der, z.B. einem hierin beschriebenen Fragment der 13245-Aminosäuresequenz
entsprechen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein 13245-Fusionsprotein
zumindest einen oder mehrere biologisch aktive Abschnitte eines 13245-Proteins.
Das Nicht-13245-Polypeptid kann an den Amino- oder Carboxylterminus
des 13245-Polypeptids fusioniert sein.
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Das
Fusionsprotein kann eine Gruppierung umfassen, die hohe Affinität für einen
Liganden aufweist. Beispielsweise kann das Fusionsprotein ein GST-13246-Fusionsprotein
sein, in dem die 13245-Sequenzen an den Carboxylterminus der GST-Sequenzen
fusioniert sind. Solche Fusionsproteine können die Reinigung von rekombinantem
13245 erleichtern. Alternativ dazu kann das Fusionsprotein ein 13245-Protein
sein, das eine heterologe Signalsequenz am Aminoterminus enthält. In bestimmten
Wirtszellen (z.B. Säugetier-Wirtszellen) kann
die Expression und/oder Sekretion von 13245 durch Einsatz einer
heterologen Signalsequenz gesteigert werden.
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Fusionsproteine
können
ein ganzes oder einen Teil eines Serumproteins, z.B. eine konstante
IgG-Region, oder menschlichen Serumalbumins enthalten.
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Die
13245-Fusionsproteine der Erfindung können in pharmazeutische Zusammensetzungen
miteinbezogen und in vivo an ein Individuum verabreicht werden.
Die 13245-Fusionsproteine
könne auch
eingesetzt werden, um die Bioverfügbarkeit eines 13245-Substrats
zu beeinflussen. 13245-Fusionsproteine sind eventuell in Therapien
zur Behandlung von Erkrankungen zweckdienlich, die durch beispielsweise
(i) eine aberrierende Modifikation oder Mutation eines für ein 13245-Protein
kodierenden Gens; (ii) Fehlregulierung des 13245-Gens; und (iii)
aberrierende posttranslationale Modifikation eines 13245-Proteins
ausgelöst
wird.
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Weiters
können
die 13245-Fusionsproteine der Erfindung als Immunogene eingesetzt
werden, um Anti-13245-Antikörper
in einem Individuum zu erzeugen, 13245-Liganden zu reinigen und
Screening-Tests durchzuführen,
um Moleküle
zu identifizieren, welche die Wechselwirkung von 13245 mit einem
13245-Substrat hemmen.
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Im
Handel sind Expressionsvektoren erhältlich, die bereits für eine Fusionsgruppierung
kodieren (z.B. ein GST-Polypeptid). Eine für 13245 kodierende Nucleinsäure kann
in solch einen Expressionsvektor so kloniert werden, dass die Fusionsgruppierung
im Leseraster an das 13245-Protein gebunden wird.
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Varianten von 13245-Proteinen
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch Varianten eines
13245-Polypeptids, die beispielsweise als Agonisten (Mimetika) oder
als Antagonisten dienen. Varianten der 13245-Proteine können durch
Mutagenese, z.B. einzelne Punktmutationen, Insertion oder Deletion
von Sequenzen oder Verkürzung
eines 13245-Proteins, erzeugt werden. Ein Agonist der 13245-Proteine
kann im Wesentlichen die gleichen oder eine Untergruppe der biologischen
Aktivitäten
der natürlich
vorkommenden Form eines 13245-Proteins beibehalten. Ein Antagonist
eines 13245-Proteins kann eine oder mehrere der Aktivitäten der
natürlich
vorkommenden Form des 13245-Proteins hemmen, beispielsweise durch
kompetitive Modulation einer 13245-vermittelten Aktivität eines
13245-Proteins. Somit können
bestimmte biologische Wirkungen durch Behandlung mit einer Variante
mit eingeschränkter
Funktion hervorgehoben werden. Vorzugsweise führt eine Behandlung eines Individuums
mit einer Variante mit einer Untergruppe von biologischen Aktivitäten der
natürlich
vorkommenden Form des Proteins zu weniger Nebenwirkungen im Individuum
als eine Behandlung mit der natürlich
vorkommenden Form des 13245-Proteins.
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Varianten
eines 13245-Proteins können
durch Screenen von kombinatorischen Bibliotheken von Mutanten, z.B.
Verkürzungsmutanten,
eines 13245-Proteins auf Agonisten- oder Antagonistenaktivität identifiziert werden.
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Bibliotheken
von Fragmenten, z.B. aminoterminalen, carboxylterminalen oder internen
Fragmenten, einer für
ein 13245-Protein kodierenden Sequenz können eingesetzt werden, um
eine variantenreiche Population von Fragmenten zum Screenen und
für die
darauf folgende Auswahl von Varianten eines 13245-Proteins zu erzeugen.
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Varianten,
in denen ein Cysteinrest addiert oder deletiert ist oder in denen
ein glykosylierter Rest addiert oder deletiert ist, sind besonders
bevorzugt.
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Verfahren
zum Screenen von Genprodukten aus kombinatorischen Bibliotheken,
die durch Punktmutationen oder Verkürzung erzeugt wurden, und zum
Screenen von cDNA-Bibliotheken auf Genprodukte mit ausgewählten Eigenschaften.
Recursive Ensemble Mutagenesis (REM), ein Verfahren, das die Häufigkeit
von funktionellen Mutanten in den Bibliotheken erhöht, kann
in Kombination mit den Screening-Tests eingesetzt werden, um 13245-Varianten
zu identifizieren (Arkin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,
7811-7815; Delgrave et al., Protein Engr. 6, 327-331 (1993)).
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Auf
Zellen basierende Tests können
genutzt werden, um eine variantenreiche 13245-Bibliothek zu analysieren. Eine Bibliothek
von Expressionsvektoren kann beispielsweise in eine Zelllinie transfiziert
werden, z.B. eine Zelllinie, die normalerweise auf 13245 auf substratabhängige Weise
reagiert. Die transfizierten Zellen werden dann mit 13245 kontaktiert,
und die Auswirkung der Expression der Mutante auf die Signalgebung durch
das 13245-Substrat kann detektiert werden, z.B. durch die Messung
von Veränderungen
im Zellwachstum und/oder in der enzymatischen Aktivität. Plasmid-DNA
kann dann aus den Zellen gewonnen werden, für die eine Inhibierung, oder
alternativ dazu eine Verstärkung,
der Signalgebung durch das 13245-Substrat bestimmt wurde, und die
einzelnen Klone können
näher charakterisiert
werden.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
eines 13245-Polypeptids, beispielsweise eines Peptids mit Nichtwildtypaktivität, z.B.
eines Antagonisten, Agonisten oder Superagonisten eines natürlich vorkommenden
13245-Polypeptids,
z.B. eines natürlich
vorkommenden 13245-Polypeptids. Das Verfahren umfasst: eine Veränderung
der Sequenz eines 13245-Polypeptids, beispielsweise eine Veränderung
der Sequenz, z.B. durch Substitution oder Deletion eines oder mehrerer
Reste einer nichtkonservierten Region, einer Domäne oder eines Rests, wie sie
hierin geoffenbart sind, und das Testen des veränderten Polypeptids auf die
gewünschte
Aktivität.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Versehen
eines Fragments oder Analogons eines 13245-Polypeptids mit einer
biologischen Aktivität
eines natürlich
vorkommenden 13245-Polypeptids. Das Verfahren umfasst: das Ver ändern der
Sequenz, beispielsweise durch Substitution oder Deletion eines oder
mehrerer Reste, eines 13245-Polypeptids, beispielsweise durch Veränderung
der Sequenz einer nichtkonservierten Region oder einer Domäne oder
eines Rests, wie sie hierin beschrieben sind, und das Testen des
veränderten
Polypeptids auf die gewünschte
Aktivität.
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Anti-13245-Antikörper
-
In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Anti-13245-Antikörper bereit.
Der Begriff "Antikörper" bezieht sich hierin
auf ein Immunglobulinmolekül
oder einen immunologisch aktiven Teil davon, d.h. einen antigenbindenden
Teil. Beispiele für
immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen umfassen
F(ab)- und F(ab')2-Fragmente,
die durch Behandlung des Antikörpers
mit einem Enzym wie Pepsin erzeugt werden können.
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Der
Antikörper
kann ein polyklonaler, monoklonaler, rekombinanter, z.B. ein chimärer oder
humanisierter, voll menschlicher, nicht menschlicher, z.B. von einer
Maus stammender, oder einkettiger Antikörper sein. In einer bevorzugten
Ausführungsform
weist er Effektorfunktion auf und kann ein Komplement fixieren.
Der Antikörper
kann an ein Toxin oder ein Bildgebungsmittel gekuppelt sein.
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Ein
13245-Protein voller Länge
oder ein antigenes Peptidfragment von 13245 kann als Immunogen verwendet
werden oder zur Identifikation von 13245-Antikörpern eingesetzt werden, die
mit anderen Immunogenen hergestellt wurden, z.B. Zellen, Membranpräparate und
dergleichen. Das antigene Peptid von 13245 sollte zumindest 8 Aminosäurereste
der in Seq.-ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz umfassen und ein Epitop
von 13245 aufweisen. Vorzugsweise umfasst das antigene Peptid zumindest
10 Aminosäurereste,
noch bevorzugter zumindest 15 Aminosäurereste, noch bevorzugter
zumindest 20 Aminosäurereste,
und insbesondere zumindest 30 Aminosäurereste.
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Fragmente
von 13245, die etwa die Reste 195-210 von Seq.-ID Nr. 2 umfassen,
können
zur Herstellung von Antikörpern,
beispielsweise zur Verwendung als Immunogene oder zur Charakterisierung
der Spezifität
eines Antikörpers,
gegen hydrophobe Regionen des 13245-Proteins eingesetzt werden.
Gleichermaßen kann
ein Fragment von 13245, das etwa die Reste 455-475 von Seq.-ID Nr.
2 umfasst, zur Herstellung eines Antikörpers gegen einen hydrophile
Region des 13245-Proteins eingesetzt werden.
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Antikörper, die
mit einer dieser Regionen oder anderen hierin beschriebenen Regionen
oder Domänen reaktiv
sind oder für
solche spezifisch sind, werden ebenfalls bereitgestellt.
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Bevorzugte
Epitope, die vom antigenen Peptid enthalten sind, sind Regionen
von 13245, sie sich auf der Oberfläche des Proteins befinden,
z.B. hydrophile Regionen, sowie Regionen mit hoher Antigenität. Eine Emini-Oberflächenwahrscheinlichkeitsanalyse
der menschlichen 13245-Proteinsequenz kann beispielsweise verwendet
werden, um die Regionen aufzuzeigen, die sich mit besonders hoher
Wahrscheinlichkeit auf der Oberfläche des 13245-Proteins befinden
und somit sehr wahrscheinlich Oberflächereste darstellen, die als Ziele
für eine
Antikörperproduktion
zweckdienlich sind.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
bindet der Antikörper
ein Epitop in einer beliebigen hierin beschriebenen Domäne oder
Region von 13245-Proteinen.
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Chimäre, humanisierte,
aber insbesondere vollständig
menschliche Antikörper
sind für
Anwendungen wünschenswert,
die eine wiederholte Verabreichung umfassen, z.B. eine therapeutische
Behandlung (und einige diagnostische Behandlungen) von menschlichen
Patienten.
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Der
Anti-13245-Antikörper
kann ein einkettiger Antikörper
sein. Ein einkettiger Antikörper
(scFv) kann gentechnisch verändert
sein (z.B. Colcher et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 880, 263-280 (1999);
Reiter, Clin. Cancer Res. 2, 245-252 (1996)). Der einketti ge Antikörper kann
dimerisiert oder multimerisiert werden, um mehrwertige Antikörper mit
Spezifitäten
für unterschiedliche
Epitope desselben Ziel-13245-Proteins herzustellen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
weist der Antikörper
verringerte oder keine Fähigkeit
auf, an einen Fc-Rezeptor zu binden. Beispielsweise kann es sich
um einen Isotyp, einen Subtyp, ein Fragment oder eine andere Mutante
handelt, die die Bindung an einen Fc-Rezeptor nicht unterstützt, es
kann also beispielsweise eine mutierte oder deletierte Fc-Rezeptor-Bindungsregion
aufweisen.
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Ein
Anti-13245-Antikörper
(z.B. monoklonaler Antikörper)
kann eingesetzt werden, um 13245 durch Standardverfahren wie Affinitätschromatographie
oder Immunfällung
zu isolieren. Außerdem
kann ein Anti-13245-Antikörper
zur Detektion eines 13245-Proteins
(z.B. in einem Zelllysat oder Zellüberstand) verwendet werden,
um das Ausmaß und
Muster der Expression des Proteins zu bewerten. Anti-13245-Antikörper können als
Teil eines klinischen Testverfahrens, z.B. zur Bestimmung der Wirksamkeit
eines bestimmten Behandlungsschemas diagnostisch zur Überwachung
des Proteingehalts in Gewebe eingesetzt werden. Die Detektion kann durch
Kupplung (z.B. physikalische Bindung) des Antikörpers an eine detektierbare
Substanz (z.B. Antikörpermarkierung)
vereinfacht werden. Beispiele für
detektierbare Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, prosthetische
Gruppen, fluoreszierende Materialien, lumineszierende Materialien,
biolumineszierende Materialien und radioaktive Materialien. Beispiele
für geeignete
Enzyme umfassen Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase
oder Acetylchlolinesterase; Beispiele für geeignete prosthetische Gruppenkomplexe
umfassen Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin; Beispiele für geeignete
fluoreszierende Materialien umfassen Umbelliferon, Fluorescein,
Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluorescein, Dansylchlorid
oder Phycoerythrin; ein Beispiel für ein lumineszierendes Material
ist Luminol; Beispiele für
biolumineszierende Materialien umfassen Luciferase, Luciferin und Äquorin,
und Beispiele für
geeignete radioaktive Materialien umfassen 125I, 131I, 35S und 3H.
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Rekombinante
Expressionsvektoren Wirtszellen und gentechnisch veränderte Zellen
-
In
einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung Vektoren, vorzugsweise
Expressionsvektoren, die eine für
ein hierin beschriebenes Polypeptid kodierende Nucleinsäure enthalten.
Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich hierin
auf ein Nucleinsäuremolekül, das in
der Lage ist, eine andere Nucleinsäure, an die es gebunden ist,
zu transportieren, und es kann ein Plasmid, ein Cosmid oder einen
viralen Vektor umfassen. Der Vektor kann zu autonomer Replikation
in der Lage sein oder in eine Wirts-DNA integriert werden. Virale
Vektoren umfassen beispielsweise replikationsdefekte Retroviren,
Adenoviren und adenoassoziierte Viren.
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Ein
Vektor kann eine 13245-Nucleinsäure
in einer Form enthalten, die eine Expression der Nucleinsäure in einer
Wirtszelle erlaubt. Vorzugsweise umfasst der rekombinante Expressionsvektor
eine oder mehrere Regulationssequenzen, die operativ an die zu exprimierende
Nucleinsäuresequenz
gebunden sind. Die Bezeichnung "Regulationssequenz" umfasst Promotoren,
Enhancer und andere Expressionssteuerelemente (z.B. Polyadenylierungssignale).
Regulationssequenzen umfassen jene, welche die konstitutive Expression
einer Nucleotidsequenz steuern, sowie gewebespezifische regulatorische
und/oder induzierbare Sequenzen. Die Erstellung von Expressionsvektoren
kann von Faktoren wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, der
Expressionsstärke
des gewünschten
Proteins und dergleichen abhängen.
Die Expressionsvektoren der Erfindung können in Wirtszellen eingeführt werden,
um so Proteine oder Polypeptide, einschließlich von Fusionsproteinen
oder -polypeptiden herzustellen, für die hierin beschriebene Nucleinsäuren kodieren
(z.B. 13245-Proteine, Mutantenformen von 13245-Proteinen, Fusionsproteine
und dergleichen).
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Die
rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können für die Expression
von 13245-Proteinen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen
entworfen sein. Polypeptide der Erfindung können beispielsweise in E. coli,
Insektenzellen (z.B. unter Einsatz von Baculovirus-Expressionsvektoren),
Hefezellen oder Säugetierzellen
exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen sind in Goeddel (Gene Expression
Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,
USA (1990)) genauer erläutert.
Alternativ dazu kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro
transkribiert und translatiert werden, beispielsweise unter Einsatz von
T7-Promotorregulationssequenzen und T7-Polymerase.
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Die
Expression von Proteinen in Prokaryoten wird meist in E. coli durchgeführt, und
zwar mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren
zur Steuerung der Expression von entweder Fusions- oder Nichtfusionsproteinen
enthalten. Fusionsvektoren addieren eine Reihe von Aminosäuren an
ein darin kodiertes Protein, üblicherweise
am Aminoterminus des rekombinanten Proteins. Solche Fusionsvektoren
dienen typischerweise drei Zwecken: 1) zur Steigerung der Expression
eines rekombinanten Proteins; 2) zur Steigerung der Löslichkeit
des rekombinanten Proteins; und 3) zur Unterstützung der Reinigung des rekombinanten
Proteins, indem es als Ligand in Affinitätsreinigungen agiert. Häufig wird
eine proteolytische Spaltstelle an der Verbindungsstelle zwischen
der Fusionsgruppierung und dem rekombinanten Protein eingeführt, um
eine Trennung des rekombinanten Proteins von der Fusionsgruppierung
nach der Reinigung des Fusionsproteins zu ermöglichen. Solche Enzyme und
ihre zugehörigen
Erkennungssequenzen umfassen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase.
Typische Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharmacia Biotech
Inc.; Smith et al., Gene 67, 31-40 (1988)), pMAL (New England Biolabs,
Beverly, MA, USA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA), die
Glutathion-S-Transferase
(GST), Maltose-E-Bindungsproteine bzw. Protein A an das rekombinante
Zielprotein fusionieren.
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Gereinigte
Fusionsproteine können
in 13245-Aktivitätstests
(z.B. direkten Testes oder kompetitiven Tests, die nachstehend genauer
beschrieben sind) eingesetzt werden, oder zur Erzeugung von für 13245-Proteine
spezifischen Antikörpern.
In einer bevorzugten Ausführungsform
kann ein in einem retroviralen Expressionsvektor der vorliegenden
Erfindung exprimiertes Fusionsprotein verwendet werden, um Knochenmarkszellen
zu infizieren, die dann in bestrahlte Rezipienten transplantiert
werden. Die Pathologie des Rezipienten wird dann nach einem angemessenen
Zeitraum (z.B. sechs Wochen) untersucht.
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Um
die rekombinante Proteinexpression in E. coli zu maximieren, wird
das Protein in einem bakteriellen Wirtsstamm mit einer eingeschränkten Fähigkeit
zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins exprimiert
(Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,
119-128, Academic Press, San Diego, USA (1990)). Eine weitere Strategie
basiert auf der Veränderung
der Nucleinsäuresequenz
der Nucleinsäure,
die in einen Expressionsvektor insertiert werden soll, sodass die
einzelnen Codons für
jede Aminosäure
den in E. coli verwendeten entsprechen (Wada et al., Nucl. Acids
Res. 20, 2111-2118 (1992)). Solche Veränderungen einer Nucleinsäuresequenz
der Erfindung können
durch herkömmliche
DNA-Syntheseverfahren
erfolgen.
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Der
13245-Expressionsvektor kann ein Hefe-Expressionsvektor, ein Vektor
zur Expression in Insektenzellen, z.B. ein Baculovirus-Expressionsvektor,
oder ein zur Expression in Säugetierzellen
geeigneter Vektor sein.
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Bei
Verwendung in Säugetierzellen
werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors häufig durch
virale regulatorische Elemente bereitgestellt. Herkömmlicherweise
eingesetzte virale Promotoren sind beispielsweise von Polyoma, Adenovirus
2, Zytomegalievirus und Simian-Virus 40 (SV40) abgeleitet.
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In
einer weiteren Ausführungsform
ist der rekombinante Säugetier-Expressionsvektor
in der Lage, die Expression der Nucleinsäure präferentiell in einem bestimmten
Zelltyp zu steuern (z.B. werden gewebespezifische regulatorische
Elemente zur Expression der Nucleinsäure eingesetzt). Nichteinschränkende Beispiele für geeignete
gewebespezifische Promotoren umfassen den Albumin-Promotor (leberspezifisch;
Pinkert et al., Genes Dev. 1, 268-277 (1987)), lymphoidspezifische
Promotoren (Calame et al., Adv. Immunol. 43, 235-275 (1988)), insbesondere
Promotoren von T-Zell-Rezeptoren (Winoto et al., EMBO J. 8, 729-733
(1989)) und Immunglobuline (Banerji et al., Cell 33, 729-740 (1983);
Queen et al., Cell 33, 741-748 (1983)), neuronenspezifische Promotoren
(z.B. den Neurofilamentpromotor; Byrneet al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86, 5473-5477 (1989)), pankreasspezifische Promotoren (Edlund
et al., Science 230, 912-916 (1985)) und brustdrüsenspezifische Promotoren (z.B.
Milkenpromotor; US-Patent Nr. 4.873.316 und Europäische Patentanmeldung
Nr. 264.166). Durch die Entwicklung gesteuerte Promotoren sind ebenfalls
eingeschlossen, wie beispielsweise die Maus-Hox-Promotoren (Kessel
et al., Science 249, 374-379 (1990)) und der α-Fetoprotein-Promotor (Campes et
al., Genes Dev. 3, 537-546, (1989)).
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Die
Erfindung stellt weiters einen rekombinanten Expressionsvektor bereit,
der ein DNA-Molekül
der Erfindung in Antisense-Orientierung in den Expressionsvektor
kloniert umfasst. Operativ an eine in Antisense-Orientierung klonierte
Nucleinsäure
gebundene Regulationssequenzen (z.B. virale Promotoren und/oder Enhancer)
können
ausgewählt
werden, welche die konstitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische
Expression von Antisense-RNA in verschiedensten Zelltypen steuern.
Der Antisense-Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten
Plasmids, Phagemids oder attenuierten Virus vorliegen. Für eine Erläuterung
der Steuerung der Genexpression unter Verwendung der Antisense-Gene
siehe H. Weintraub et al. (Trends Genet. 1: Review (1986)).
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine Wirtszelle bereit, die
ein hierin beschriebenes Nucleinsäuremolekül umfasst, z.B. ein 13245-Nucleinsäuremolekül mit Sequenzen,
die ihm eine homologe Rekombination in eine spezifische Stelle des
Wirtszellengenoms erlauben. Die Bezeichnungen "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden hierin austauschbar
verwendet. Solche Begriffe beziehen sich nicht nur auf die jeweilige
Zelle, sondern auch auf die Nachkommenschaft oder mögliche Nachkommenschaft
einer solchen Zelle. Da aufgrund von Mutationen oder Umwelteinflüssen bestimmte
Modifikationen in nachfolgenden Generationen auftreten können, muss
eine solche Nachkommenschaft zwar nicht unbedingt identisch mit
den Ausgangszellen sein, ist aber hierin im Umfang des Begriffs
enthalten.
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Die
Wirtszelle kann jede beliebige prokaryotische oder eukaryotische
Zelle sein. Ein 13245-Protein kann beispielsweise in Bakterienzellen,
wie z.B. E. coli, Insektenzellen, Hefezellen oder Säugetierzellen
(wie z.B. Chinahamster-Ovarialzellen (CHO-Zellen) oder COS-Zellen
exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind Fachleuten
auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
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Vektor-DNA
kann mittels herkömmliche
Transformations- oder Transfektionsverfahren in Wirtszellen eingeführt werden.
Die Bezeichnungen "Transformation" und "Transfektion" beziehen sich hierin
auf verschiedene auf dem Gebiet der Erfindung anerkannte Verfahren
zur Einführung
fremder Nucleinsäure
(z.B. DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich Calciumphosphat- oder
Calciumchlorid-Copräzipitation,
DEAE-Dextran-vermittelter
Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation.
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Eine
Wirtszelle der Erfindung kann zur Herstellung (z.B. Expression)
eines 13245-Proteins
verwendet werden. Demgemäß stellt
die Erfindung weiters Verfahren zur Herstellung eines 13245-Proteins
unter Einsatz der Wirtszellen der Erfindung bereit. In einer Ausführungsform
umfasst das Verfahren das Kultivieren der Wirtszelle der Erfindung
(in die ein für
ein 13245-Protein kodierender rekombinanter Expressionsvektor eingeführt wurde)
in einem geeigneten Medium, sodass ein 13245-Protein gebildet wird.
In einer anderen Ausführungsform
umfasst das Verfahren weiters das Isolieren eines 13245-Proteins
aus dem Medium oder der Wirtszelle.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Zelle oder ein
gereinigtes Präparat
von Zellen, die ein 13245-Transgen enthalten oder 13245 auf andere
Weise mangelhaft exprimieren. Das Zellpräparat kann aus menschlichen
oder nichtmenschlichen Zellen, beispielsweise Nagetierzellen, wie
z.B. Maus- oder Rattenzellen, Kaninchenzellen, oder Schweinezellen,
bestehen. In bevorzugten Ausführungsformen
umfassen die Zellen ein 13245-Transgen, beispielsweise eine heterologe
Form eines 13245-Gens, wie z.B. ein von Menschen stammendes Gen
(im Falle einer nichtmenschlichen Zelle). Das 13245-Transgen kann
mangelhaft exprimiert, beispielsweise überexprimiert oder unterexprimiert,
sein. In anderen Ausführungsformen
umfassen die Zellen ein Gen, das endogenes 13245 mangelhaft exprimiert,
beispielsweise ein Gen, dessen Expression unterbrochen wird, z.B.
durch seine Zerstörung.
Solche Zellen können
als Modell zur Untersuchung von Erkrankungen, die mit mutierten
oder mangelhaft exprimierten 13245-Allelen zusammenhängen, oder
zum Einsatz beim Arzneimittel-Screenen dienen.
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In
einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung eine menschliche Zelle,
beispielsweise eine hämatopoetische
Stammzelle, die mit für
ein vorliegendes 13245-Polypeptid kodierender Nucleinsäure transformiert ist.
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Außerdem werden
Zellen bereitgestellt, vorzugsweise menschliche Zellen, beispielsweise
menschliche hämatopoetische
oder Fibroblastenzellen, in denen endogenes 13245 von einer Regulationssequenz
gesteuert wird, die normalerweise nicht die Expression des endogenen
13245-Gens regelt. Die Expressionscharakteristika eines endogenen
Gens innerhalb einer Zelle, beispielsweise einer Zelllinie oder
eines Mikroorganismus, kann modifiziert werden, indem ein heterologisches
regulatorisches DNA-Element in das Genom der Zelle eingeführt wird,
sodass das insertierte regulatorische Element operabel an das endogene
13245-Gen gebunden ist. Ein endogenes 13245-Gen, das "transkriptionell
still" ist, z.B.
normalerweise nicht oder nur sehr schwach exprimiert wird, kann
beispielsweise aktiviert werden, indem ein. regulatorisches Element
insertiert wird, das zur Förderung
der Expression eines normalerweise exprimierten Genprodukts in dieser
Zelle in der Lage ist. Verfahren wie gezielte homologe Rekombination
können
ebenfalls zur Insertion der heterologen DNA wie beschrieben eingesetzt
werden (z.B. US-Patent Nr. 5.272.071; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/06667).
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Transgene
Tiere
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Die
Erfindung stellt auch nichtmenschliche transgene Tiere bereit. Solche
Tiere sind zur Untersuchung der Funktion und/oder Aktivität eines
13245-Proteins und zur Identifikation und/oder Evaluierung von Modultoren
von 13245-Aktivität
zweckdienlich. "Transgenes
Tier" bezieht sich
hierin auf ein nichtmenschliches Tier, vorzugsweise ein Säugetier,
noch bevorzugter ein Nagetier, wie z.B. eine Ratte oder Maus, worin
eine oder mehrere der Zellen des Tiers ein Transgen umfassen. Weitere
Beispiele für
transgene Tiere umfassen nichtmenschliche Primaten, Schafe, Hunde,
Kühe, Ziegen,
Hühner,
Amphibien und dergleichen. Ein Transgen ist exogene DNA oder eine
Neuordnung, z.B. eine Deletion von endogener chromosomaler DNA,
die vorzugsweise in das Genom der Zellen eines transgenen Tiers
integriert wird oder darin vor kommt. Ein Transgen kann die Expression
eines kodierten Genprodukts in einem oder mehreren Zelltypen oder
Geweben des transgenen Tiers, steuern, andere Transgene, z.B. ein
Knockout, verringern die Expression. Somit kann ein transgenes Tier
ein solches sein, in dem ein endogenes 13245-Gen verändert wurde,
beispielsweise durch homologe Rekombination zwischen dem endogenen
Gen und einem exogenen DNA-Molekül,
das in eine Zelle des Tiers eingeführt wurde (z.B. eine embryonale
Zelle des Tiers, vor der Entwicklung des Tiers).
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Intronische
Sequenzen und Polyadenylierungssignale können ebenfalls im Transgen
enthalten sein, um die Effizienz der Expression des Transgens zu
erhöhen.
Eine oder mehrere gewebespezifische Regulationssequenzen können operabel
an ein Transgen der Erfindung gebunden sein, um die Expression eines 13245-Proteins
auf bestimmte Zellen auszurichten. Ein transgenes Gründertier
kann ausgehend von der Gegenwart eines 13245-Transgens in seinem
Genom und/oder die Expression von 13245-mRNA in Geweben oder Zellen
des Tiers identifiziert werden. Ein transgenes Stammtier kann dann
eingesetzt werden, um weitere Tiere zu züchten, die das Transgen in
sich tragen. Außerdem
können
transgene Tiere, die ein für
ein 13245-Protein
kodierendes Transgen in sich tragen, mit anderen transgenen Tieren
gekreuzt werden, die andere Transgene tragen.
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13245-Proteine
oder -Polypeptide können
in transgenen Tieren oder Pflanzen exprimiert werden, so kann beispielsweise
eine für
das Protein oder Polypeptid kodierende Nucleinsäure in das Genom eines Tiers eingeführt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen
wird die Nucleinsäure
unter Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors, z.B. eines milch-
oder eispezifischen Promotors, gestellt und aus der vom Tier produzierten
Milch oder den vom Tier produzierten Eiern gewonnen. Geeignete Tiere
sind Mäuse,
Schweine, Kühe,
Ziegen und Schafe.
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Die
Erfindung umfasst auch eine Population von Zellen von einem trangsenen
Tier, wie beispielsweise nachstehend erläutert.
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Anwendungen
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Die
hierin beschriebenen Nucleinsäuremoleküle, Proteine,
Proteinhomologe und Antikörper
können
in einem oder mehreren der folgenden Verfahren eingesetzt werden:
a) Screening-Tests; b) prognostische Medizin (z.B. diagnostische
Tests, prognostische Tests, Überwachung
von klinischen Versuchen und Pharmakogenetik); und c) Behandlungsverfahren
(z.B. Therapie und Prophylaxe). Die isolierten Nucleinsäuremoleküle der Erfindung
können
beispielsweise zur Expression eines 13245-Proteins (beispielsweise
mittels eines rekombinanten Expressionsvektors in einer Wirtszelle
bei gentherapeutischen Anwendungen) eingesetzt werden, um eine genetische
Veränderung
in einem 13245-Gen zu detektieren und 13245-Aktivität zu modulieren,
wie nachstehend genauer beschrieben ist. Die 13245-Proteine können zu
Behandlung von Erkrankungen verwendet werden, die durch unzureichende
oder übermäßige Produktion
eines 13245-Substratks oder Produktion von 13245-Inhibitoren gekennzeichnet
sind. außerdem
können
die 13245-Proteine eingesetzt werden, um auf natürlich vorkommende 13245-Substrate
zu screenen, auf Arzneimittel oder Verbindungen zu screenen, die 13245-Aktivität modulieren,
sowie Erkrankungen zu behandeln, die durch unzureichende oder übermäßige Produktion
eines 13245-Proteins oder Produktion von 13245-Proteinformen gekennzeichnet
sind die verringerte, aberrierende oder unerwünschte Aktivität im Vergleich
zum 13245-Wildtypprotein aufweisen. Beispiele für Erkrankungen umfassen jene,
bei denen die Proteinphosphorylierung aberrierend ist (z.B. Muskeldystrophien
und myotonische Dystrophien). Weiters können die Anti-13245-Antikörper der
Erfindung zur Detektion und Isolierung von 13245-Proteinen, Steuerung
der Bioverfügbarkeit
von 13245-Proteinen und Modulierung von 13245-Aktivität eingesetzt
werden.
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Ein
Verfahren zur Bewertung einer Verbindung in Bezug auf ihre Fähigkeit,
mit einem vorliegenden 13245-Polypeptid wechselzuwirken, z.B. daran
zu binden, wird ebenfalls bereitgestellt. Das Verfahren umfasst: das
Kontaktieren der Verbindung mit dem vorliegenden 13245-Polypeptid;
und das Bewerten der Fähigkeit
der Verbindung, mit dem vorliegenden 13245-Polypeptid wechselzuwirken,
beispielsweise daran zu binden. Dieses Verfahren kann in vitro,
z.B. in einem zellfreien System, oder in vivo, z.B. in einem Zwei-Hybrid-Wechselwirkungseinfangtest,
durchgeführt
werden. Außerdem
kann dieses Verfahren zur Identifikation von natürlich vorkommenden Molekülen eingesetzt
werden, die mit einem vorliegenden 13245-Polypeptid wechselwirken. Es
kann auch dazu verwendet werden, natürliche oder synthetische Inhibitoren
eines vorliegenden 13245-Polypeptids zu finden. Screening-Verfahren
werden nachstehend genauer beschrieben.
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Screening-Tests
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Die
Erfindung stellt auch Screening-Verfahren (hierin auch als "Tests" bezeichnet) zur
Identifikation von Modulatoren, d.h. Kandidaten- oder Testverbindungen
oder -mitteln (z.B. Proteinen, Peptiden, Peptidomimetika, Peptoiden,
kleinen Molekülen
oder anderen Arzneimitteln) bereit, die an 13245-Proteine binden,
eine stimulierende oder inhibierende Wirkung auf beispielsweise
13245-Expression oder 13245-Aktivität aufweisen oder stimulierende
oder inhibierende Wirkung auf beispielsweise die Expression oder
Aktivität
eines 13245-Substrats aufweisen. So identifizierte Verbindungen
können
zur Modulation der Aktivität
von Zielgenprodukten (z.B. 13245-Genen) in einem Therapieprotokoll
eingesetzt werden, um die biologische Funktion des Zielgenprodukts
genau auszuarbeiten oder Verbindungen zu identifizieren, die normale
Zielgen-Wechselwirkungen stören.
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In
einer Ausführungsform
stellt die Erfindung Tests zum Screenen von Kandidaten- oder Testverbindungen
bereit, die Substrate eines 13245-Proteins oder -Polypeptids oder
einen biologisch aktiven Teil davon darstellen. In einer anderen
Ausführungsform
stellt die Erfindung Tests zum Screenen von Kandidaten- oder Testverbindungen
bereit, die an ein 13245-Protein oder -Polypeptid oder einen biologisch
aktiven Teil davon binden oder deren Aktivität modulieren.
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Die
Testverbindungen der vorliegenden Erfindung können mithilfe verschiedenster
Ansätze
der auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren unter Einsatz
kombinatorischer Bibliotheken erhalten werden, einschließlich: biologischer
Bibliotheken (Bibliotheken von Molekülen mit den Funktionalitäten von
Peptiden, aber mit einem neuen Nichtpeptidrückgrat, die gegen enzymatischen
Abbau resistent sind, aber dennoch bioaktiv bleiben; z.B. Zuckermann
et al., J. Med. Chem. 37, 2678-2685 (1994)); räumlich ansteuerbaren parallelen Festphasen-
oder Lösungsphasenbibliotheken;
auf synthetischen Bibliotheken basierenden Verfahren, die eine Entknäuelung erfordern;
das auf einer "1-Kügelchen-1-Verbindung-Bibliothek" basierende Verfahren;
und auf synthetischen Bibliotheken basierende Verbindung unter Anwendung
von chromatographischer Selektion. Die auf biologischen Bibliotheken
und Peptoidbibliotheken basierenden Verfahren sind auf Peptidbibliotheken beschränkt, während die
anderen vier Ansätze
für Peptid-,
Nichtpeptidoligomer- oder Kleinmolekülbibliotheken von Verbindungen
geeignet sind (Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145 (1997)).
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Beispiele
für Verfahren
zur Synthese von molekularen Bibliotheken wurden bereits beschrieben
(z.B. DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6909 (1993);
Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11422 (1994); Zuckermann
et al., J. Med. Chem. 37, 2678 (1994); Cho et al., Science 261,
1303 (1993); Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059
(1994); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061 (1994);
und Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233 (1994)).
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Bibliotheken
von Verbindungen können
in Lösung
vorliegen (z.B. Houghten, Biotechniques 13, 412-421 (1992)) oder
auf Kügelchen
(Lam, Nature 354, 82-84 (1991)), Chips (Fodor, Nature 364, 555-556 (1993)),
Bakterien (US-Patent Nr. 5.223.409), Sporen (US-Patent Nr. 5.223.409),
Plasmiden (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1865-1869
(1992)), oder auf Phagen (Scott et al., Science 249, 386-390 (1990);
Devlin, Science 249, 404-406 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87, 6378-6382 (1990); Felici, J. Mol. Biol. 222,
301-310 (1991); US-Patent Nr. 5.223.409).
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In
einer Ausführungsform
ist der Test ein auf Zellen basierender Test, bei dem eine Zelle,
die ein 13245-Protein oder einen biologisch aktiven Teil davon exprimiert,
mit einer Testverbindung kontaktiert und die Fähigkeit der Testverbindung
bestimmt wird, 13245-Aktivität
zu modulieren. Die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung,
13245-Aktivität
zu modulieren, kann erfolgen, indem beispielsweise Verände rungen
der enzymatischen Aktivität überwacht
werden. Die Zelle kann beispielsweise von einem Säugetier
stammen.
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Die
Fähigkeit
der Testverbindung, 13245-Bindung an eine Verbindung, z.B. ein 13245-Substrat,
zu binden oder 13245 zu binden, kann ebenfalls bewertet werden.
Dies kann beispielsweise durchgeführt werden, indem die Verbindung,
z.B. das Substrat, mit einem Radioisotop oder einer enzymatischen
Markierung gekuppelt wird, sodass die Bindung der Verbindung, z.B.
des Substrats, an 13245 durch Detektion der markierten Verbindung,
z.B. Substrats, in einem Komplex bestimmt werden kann. Alternativ
dazu könnte
13245 mit einem Radioisotop oder einer enzymatischen Markierung
gekuppelt werden, um die Fähigkeit
einer Testverbindung zu überwachen,
13245-Bindung an ein 13245-Substrat in einem Komplex zu modulieren.
Verbindungen (z.B. 13245-Substrate) können beispielsweise mit 125I, 35S, 14C oder 3H markiert
werden, entweder direkt oder indirekt, und das Radioisotop wird
durch direkte Zählung
der Radioemission oder durch Szintillationszählung detektiert. Alternativ
dazu können
Verbindungen enzymatisch markiert werden, beispielsweise mit Meerrettichperoxidase,
alkalischer Phosphatase oder Luciferase, und die enzymatische Markierung
kann durch Bestimmung der Umsetzung eines geeigneten Substrats in
ein Produkt detektiert werden.
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Die
Fähigkeit
einer Verbindung (z.B. eines 13245-Substrats), mit 13245 wechselzuwirken,
mit oder ohne Markierung der wechselwirkenden Substanzen, kann beurteilt
werden. Beispielsweise kann ein Mikrophysiometer eingesetzt werden,
um die Wechselwirkung einer Verbindung mit 13245 zu detektieren,
ohne dass die Verbindung oder 13245 markiert wird (McConnell et
al., Science 257, 1906-1912 (1992)). Ein "Mikrophysiometer (z.B. Cytosensor) ist
hierin ein Analysegerät,
das die Geschwindigkeit misst, mit der eine Zelle ihre Umgebung
ansäuert,
und zwar mithilfe eines lichtsteuerbaren potentiometrischen Sensors
(LAPS). Änderungen
dieser Ansäuerungsgeschwindigkeit
können
als Indikator für
die Wechselwirkung zwischen einer Verbindung und 13245 genutzt werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
wird ein zellfreier Test bereitgestellt, bei dem ein 13245-Protein oder
biologisch aktiver Teil davon mit einer Testverbindung kontaktiert
und dann die Fähigkeit
der Testverbindung, das 13245-Protein oder einen biologisch aktiven
Teil davon zu binden, bewertet wird. Bevorzugte biologisch aktive
Teile der 13245-Proteine, die für
Tests der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Fragmente,
die an Wechselwirkungen mit Nicht-13245-Molekülen teilnehmen, z.B. Fragmente
mit hohen Oberflächenwahrscheinlichkeitswerten.
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Lösliche und/oder
membrangebundene Formen von isolierten Proteinen (z.B. 13245-Proteinen oder biologisch
aktiven Teilen davon) können
in den zellfreien Tests der Erfindung eingesetzt werden. Wenn membrangebundene
Formen des Proteins eingesetzt werden, kann es wünschenswert sein, ein Solubilisierungsmittel
zu verwenden. Beispiele für
solche Solubilisierungsmittel umfassen nichtionische Tenside, wie
z.B. n-Octylglucosid, n-Dodecylglucosid, n-Dodecylmaltosid, Octanoyl-N-methylglucamid,
Decanoyl-N-methylglucamid, Triton® X-100,
Triton® X-114,
Thesit®,
Isotridecylpoly(ethylenglykolether)n, 3-{(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio}-1-propansulfonat
(CHAPS), 3-{(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio}-2-hydroxy-1-propansulfonat (CHAPSO)
oder N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat.
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Zellfreie
Tests umfassen die Herstellung eines Reaktionsgemischs aus dem Zielgenprotein
und der Testverbindung unter Bedingungen und über eine Zeit, die eine Wechselwirkung
und Bindung zwischen den beiden Komponenten erlauben, wodurch ein
Komplex gebildet wird, der entfernt und/oder detektiert werden kann.
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Die
Wechselwirkung zwischen den beiden Molekülen kann auch beispielsweise
mithilfe von Fluoreszenzenergietransfer (FET; z.B. US-Patent Nr.
5.631.169; US-Patent Nr. 4.868.103) detektiert werden. Eine Fluorophormarkierung
wird so gewählt,
dass die von einem ersten Donatormolekül emittierte Fluoreszenzenergie von
einer Fluoreszenzmarkierung auf einem zweiten, dem "Akzeptor"-Molekül", absorbiert wird,
das wiederum in der Lage ist, aufgrund der absorbierten Energie
zu fluoreszieren. Alternativ dazu kann das "Donator"-Proteinmolekül" einfach die natürliche Fluoreszenzenergie von
Tryptophanresten nutzen. Es werden Markierungen gewählt, die
unter schiedliche Wellenlängen
von Licht emittieren, sodass die "Akzeptor"-Molekülmarkierung" von der des "Donators" unterschieden werden kann. Da die Wirksamkeit
der Energieübertragung
zwischen den Markierungen mit dem Abstand zwischen den Molekülen zusammenhängt, kann
die räumliche
Beziehung zwischen den Molekülen
beurteilt werden. Wenn eine Bindung zwischen den Molekülen erfolgt,
sollte die Fluoreszenzemission der "Akzeptor"-Molekülmarkierung im Test maximal
sein. Ein FET-Bindungsvorgang
kann herkömmlicherweise
durch fluorimetrische Standarddetektion gemessen werden, die auf
dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt ist (z.B. unter Verwendung
eines Fluorimeters).
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann die Bestimmung der Fähigkeit
des 13245-Proteins,
an ein Zielmolekül
zu binden, mithilfe einer biomolekularen Echtzeit-Wechselwirkungsanalyse
(BIA; z.B. Sjolander et al., Anal. Chem. 63, 2338-2345 (1991); Szabo
et al., Curr. Opin. Struct. Biol 5, 699-705 (1995)) erfolgen. "Oberflächen-Plasmonresonanz" (SPR) oder "BIA" detektiert biospezifische
Wechselwirkungen in Echtzeit, ohne dass einer der Wechselwirkungspartner
markiert werden muss (z.B. BIA-core). Änderungen
in der Masse an der Bindungsoberfläche (die auf eine Bindung hinweist)
führen
zu Änderungen
des Brechungsindex von Licht nahe der Oberfläche (das optische Phänomen von
SPR), was wiederum in einem detektierbaren Signal resultiert, das
als Hinweis auf Echtzeitreaktionen zwischen biologischen Molekülen genutzt
werden kann.
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In
einer Ausführungsform
ist das Zielgenprodukt oder die Testsubstanz an einer Festphase
verankert. Die Zielgenprodukt/Testverbindung-Komplexe, die auf der
Festphase verankert sind, können
am Ende der Reaktion detektiert werden. Vorzugsweise ist das Zielgenprodukt
auf einer festen Oberfläche
verankert, und die Testverbindung (die nicht verankert ist) ist,
entweder direkt oder indirekt, mit hierin erläuterten detektierbaren Markierungen
markiert.
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Es
kann wünschenswert
sein, entweder 13245, einen Anti-13245-Antikörper oder dessen Zielmolekül zu immobilisieren,
um die Trennung von komplexierten und nichtkomplexierten Formen
eines der Proteine oder beider Proteine zu vereinfachen und eine
Automation des Tests zu ermöglichen.
Die Bindung einer Testverbindung an ein 13245-Protein oder die Wechselwirkung
eines 13245-Proteins mit einem Zielmolekül in Gegenwart und Abwesenheit
einer Kandidatenverbindung kann in jedem beliebigen Gefäß erfolgen,
das zur Aufnahme der Reaktanten geeignet ist. Beispiele für solche
Behälter
umfassen Mikrotiterplatten, Reagenzgläser und Mikrozentrifugengläser. In
einer Ausführungsform
kann ein Fusionsprotein bereitgestellt werden, das eine Domäne hinzufügt, die
eine Bindung eines oder beider Proteine an eine Matrix erlaubt.
Beispielsweise können Glutathion-S-Transferase/13245-Fusionsproteine
oder Glutathion-S-Transferase/Zielfusionsproteine an Glutathion-SepharoseTM-Kügelchen
(Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) oder Gutathion-derivatisierte
Mikrotiterplatten adsorbiert werden, die dann mit der Testverbindung,
oder der Testverbindung und entweder dem nichtadsorbierten Zielprotein
oder 13245-Protein, kombiniert werden, wonach das Gemisch unter
Bedingungen inkubiert wird, die für eine Komplexbildung förderlich
sind (z.B. physiologische Bedingungen bezüglich Salz und pH). Nach der
Inkubation werden die Kügelchen
oder Mikrotiterplatten-Wells gewaschen, um jegliche ungebundene
Komponenten zu entfernen, im Falle von Kügelchen wird die Matrix immobilisiert,
und die Komplexe werden direkt oder indirekt, beispielsweise wie
oben beschrieben, bestimmt. Alternativ dazu können die Komplexe auch von
der Matrix dissoziiert werden, und das Ausmaß der 13245-Bindung oder -Aktivität kann mithilfe
von Standardverfahren bestimmt werden.
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Andere
Verfahren zur Immobilisierung eines 13245-Proteins oder eines Zielmoleküls auf Matrizen
umfassen die Konjugation von Biotin und Streptavidin. Biotinylierte
13245-Proteine oder Zielmoleküle
können
mithilfe von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren (z.B.
Biotinylierungsset, Pierce Chemicals, Rockford, IL, USA) aus Biotin-N-hydroxysuccinimid
hergestellt und in den Wells von Streptavidinbeschichteten 96-Well-Platten
(Pierce Chemical) immobilisiert werden.
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Um
den Test durchzuführen,
wird die nichtimmobilisierte Komponente zur beschichteten Oberfläche zugesetzt,
welche die verankerte Komponente enthält. Nachdem die Reaktion abgeschlossen
ist, werden nichtumgesetzte Komponenten unter Bedingungen entfernt
(z.B. durch Waschen), unter denen alle gebildeten Komplexe auf der festen
Oberfläche
immobilisiert bleiben. Die Detektion von Komplexen, die auf der
festen Oberfläche
verankert sind, kann auf verschiedene Arten erfolgen. Wenn die vorher
nichtimmobilisierte Komponente vormarkiert ist, zeigt die Detektion
einer auf der Oberfläche
immobilisierten Markierung an, dass Komplexe gebildet wurden. Wenn
die vorher nichtimmobilisierte Komponente nicht vormarkiert ist,
kann eine indirekte Markierung verwendet werden, um auf der Oberfläche verankerte
Komplexe zu detektieren; z.B. mithilfe eines für die immobilisierte Komponente
spezifischen markierten Antikörpers
(der Antikörper
kann wiederum direkt oder indirekt mit z.B. einem markierten Anti-Ig-Antikörper, markiert
sein).
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In
einer Ausführungsform
wird der Test unter Einsatz von Antikörpern durchgeführt, die
mit einem 13245-Protein oder mit Zielmolekülen reagieren, die Bindung
des 13245-Proteins an sein Zielmolekül jedoch nicht beeinträchtigen.
Solche Antikörper
können
in die Wells der Platte derivatisiert werden, und ein ungebundenes
Ziel oder 13245-Protein kann durch Antikörperkonjugation in den Wells
festgehalten werden. Verfahren zur Detektion solcher Komplexe umfassen
neben den oben für
GST-immobilisierte Komplexe beschriebenen die Immundetektion von
Komplexen unter Einsatz von Antikörpern, die mit dem 13245-Protein
oder Zielmolekül
reaktiv sind, sowie enzymgekoppelte Tests, die auf der Detektion
einer enzymatischen Aktivität
in Zusammenhang mit dem 13245-Protein oder Zielmolekül beruhen.
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Alternativ
dazu können
zellfreie Tests auch in flüssiger
Phase durchgeführt
werden. In solch einem Test werden die Reaktionsprodukte von nichtumgesetzten
Komponenten getrennt, was mit verschiedenen Standardverfahren möglich ist,
die folgende umfassen, nicht jedoch darauf beschränkt sind:
differenzielle Zentrifugation (z.B. Rivas et al., Trends Biochem.
Sci. 18, 284-287 (1993)); Chromatographie (z.B. Gelfiltrationschromatographie
oder Ionenaustauschchromatographie); Elektrophorese (z.B. Ausubel
et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley,
New York, USA (1999)); und Immunfällung (z.B. Ausubel, w.o.).
Solche Harze und Chromatographieverfahren sind Fachleuten auf dem
Gebiet der Erfindung bekannt (z.B. Heegaard, J. Mol. Recognit. 11,
141-148 (1998); Hage et al., J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl.
699, 499-525 (1997)). Auch Fluoreszenzenergieübertragung, wie sie hierin
beschrieben ist, ist geeignet, um Bindung ohne weitere Reinigung
des Komplexes aus der Lösung
zu detektieren.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Test das Kontaktieren des 13245-Proteins oder eines
biologisch aktiven Teils davon mit einer bekannten Verbindung, die
13245 bindet, um ein Testgemisch zu bilden, das Kontaktieren des
Testgemischs mit einer Testverbindung und das Bestimmen der Fähigkeit
der Testverbindung, mit einem 13245-Protein wechselzuwirken, worin
das Bestimmen der Fähigkeit
der Testverbindung, mit einem 13245-Protein wechselzuwirken das
Bestimmen der Fähigkeit
der Testverbindung umfasst, präferenziell
an 13245 oder einen biologisch aktiven Teil davon zu binden oder
die Aktivität
eines Zielmoleküls im
Vergleich zur bekannten Verfahren zu modulieren.
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Die
Zielgenprodukte der Erfindung können
in vivo mit einem oder mehreren zellulären oder extrazellulären Makromolekülen, wie
z.B. Proteinen, wechselwirken. Zum Zwecke dieser Erläuterung
werden solche zellulären
und extrazellulären
Makromoleküle
hierin als "Bindungspartner" bezeichnet. Verbindungen,
die solche Wechselwirkungen stören,
können
zur Regulierung der Aktivität
des Zielgenprodukts zweckdienlich sein. Solche Verbindungen können Moleküle wie Antikörper, Peptide
und kleine Moleküle
umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. In einer alternativen
Ausführungsform
stellt die Erfindung Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit
der Testverbindung bereit, die Aktivität eines 13245-Proteins durch
Modulation der Aktivität
eines stromabwärtigen
Effektors eines 13245-Zielmoleküls
zu bestimmen. Beispielsweise kann die Aktivität des Effektormoleküls auf ein
geeignetes Ziel bestimmt werden, oder die Bindung des Effektors
an ein geeignete Ziel kann bestimmt werden, wie oben beschrieben
wurde.
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Um
Verbindungen zu identifizieren, welche die Wechselwirkung zwischen
dem Zielgenprodukt und seinem/seinen zellulären oder extrazellulären Bindungspartner(n)
beeinträchtigen,
wird ein Reaktionsgemisch hergestellt, welches das Zielgenprodukt
und den Bindungspartner enthält,
und zwar unter Bedingungen und über
einen Zeitraum, die es den beiden Produkten ermöglichen, einen Komplex zu bilden.
Um einen Inhibitor zu testen, wird das Reaktionsgemisch in Gegenwart
und Abwesenheit einer Testverbindung bereitgestellt. Die Testverbindung
kann anfänglich
im Reaktionsgemisch enthalten sein, oder sie kann zu einem Zeitpunkt
nach Zusatz des Zielgens und seines zellulären oder extrazellulären Bindungspartners
zugesetzt werden. Vergleichsreaktionsgemische werden ohne Testverbindung
oder mit einem Placebo inkubiert. Die Bildung beliebiger Komplexe
zwischen dem Zielgenprodukt und dem zellulären oder extrazellulären Bindungspartner
wird dann detektiert. Die Bildung eines Komplexes in der Vergleichsreaktion,
nicht jedoch im Reaktionsgemisch, das die Testverbindung enthält, weist
darauf hin, dass die Verbindung die Wechselwirkung des Zielgenprodukts
und des interaktiven Bindungsparners stört. Außerdem kann die Komplexbildung
in Reaktionsgemischen, welche die Testverbindung und ein normales
Zielgenprodukt enthalten, auch mit der Komplexbildung in Reaktionsgemischen
verglichen werden, welche die Testverbindung und ein mutiertes Zielgenprodukt
enthalten. Dieser Vergleich kann in jenen Fällen von Bedeutung sein, in
denen Verbindungen identifiziert werden sollen, die Wechselwirkungen
von mutierten, nicht jedoch von normalen Zielgenprodukten stören.
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Diese
Tests können
in einem heterogenen oder homogenen Format durchgeführt werden.
Heterogene Tests umfassen die Verankerung des Zielgenprodukts oder
des Bindungspartners auf einer Festphase und das Detektieren von
Komplexen, die auf der Festphase verankert sind, am Ende der Reaktion.
In homogenen Tests wird die gesamte Reaktion in einer Flüssigphase
durchgeführt.
Bei beiden Ansätzen
kann die Reihenfolge, in der die Reaktanten zugesetzt werden, variiert
werden, um unterschiedliche Informationen über die getesteten Verbindungen
zu erhalten. Testverbindungen, welche die Wechselwirkung zwischen
den Zielgenprodukten und den Bindungspartnern stören, beispielsweise durch Konkurrenz,
können
beispielsweise identifiziert werden, indem die Reaktion in Gegenwart
der Testsubstanz durchgeführt
wird. Alternativ dazu können
Testverbindungen, die vorgeformte Komplexe aufbrechen, z.B. Verbindungen
mit höheren
Bindungskonstanten, die eine der Komponenten aus dem Komplex verdrängen, getestet
werden, indem die Testverbindung nach der Bildung der Komplexe zum
Reaktionsgemisch zugesetzt wird. Die unterschiedlichen Formate werden
nachstehend kurz beschrieben.
-
In
einem heterogenen Testsystem wird entweder das Zielgenprodukt oder
der interaktive zelluläre
oder extrazelluläre
Bindungspartner auf einer festen Oberfläche (z.B. einer Mikrotiterplatte)
verankert, während
die nicht verankerte Spezies markiert wird, entweder direkt oder
indirekt. Die verankerte Spezies kann durch nichtkovalente oder
kovalente Bindung immobilisiert werden. Alternativ dazu kann ein
für die
zur verankernde Spezies spezifischer immobilisierter Antikörper eingesetzt
werden, um die Spezies auf der festen Oberfläche zu verankern.
-
Um
den Test durchzuführen,
wird der Partner der immobilisierten Spezies der beschichteten Oberfläche mit
oder ohne Testverbindung ausgesetzt. Nachdem die Reaktion beendet
ist, werden nichtumgesetzte Komponenten (z.B. durch Waschen) entfernt,
und alle gebildeten Komplexe bleiben auf der festen Oberfläche immobilisiert.
Wenn die nichtimmobilisierte Spezies vormarkiert ist, zeigt die
Detektion einer auf der Oberfläche immobilisierten
Markierung an, dass Komplexe gebildet wurden. Wenn die nichtimmobilisierte
Spezies nicht vormarkiert ist, kann indirekte Markierung eingesetzt
werden, um auf der Oberfläche
verankerte Komplexe zu detektieren, beispielsweise unter Einsatz
eines markierten Antikörpers,
der für
die anfangs nicht immobilisiertes Spezies spezifisch ist (der Antikörper kann
wiederum direkt markiert oder indirekt markiert sein, z.B. mit einem
Anti-Ig-Antikörper).
Je nach Reihenfolge, in der die Reaktionskomponenten zugesetzt werden,
können Testverbindungen
detektiert werden, die eine Komplexbildung hemmen oder vorgebildete
Komplexe aufbrechen.
-
Alternativ
dazu kann die Reaktion auch in einer Flüssigphase in Gegenwart oder
Abwesenheit der Testverbindung durchgeführt werden, wobei die Reaktionsprodukte
von nichtumgesetzten Komponenten abgetrennt und Komplexe detektiert
werden, beispielsweise unter Einsatz eines immobilisierten Antikörpers, der für eine der
Bindungskomponenten spezifisch ist, um beliebige in der Lösung gebildete
Komplexe zu verankern, und unter Einsatz eines markierten Antikörpers, der
für den
anderen Partner spezifisch ist, um verankerte Komplexe zu detektieren.
Wiederum können
je nach der Reihenfolge, in der die Reaktanten zur Flüssigphase zugesetzt
werden, Testverbindungen identifiziert werden, die Komplexe verhindern
oder vorgebildete Komplexe aufbrechen.
-
In
einer alternativen Ausführungsform
der Erfindung kann ein homogener Test eingesetzt werden. Beispielsweise
wird ein vorgebildeter Komplex aus dem Zielgenprodukt und dem interaktiven
zellulären
oder extrazellulären
Bindungspartnerprodukt hergestellt, indem entweder die Zielgenprodukte
oder ihre Bindungspartner markiert werden, aber das durch die Markierung
erzeugte Signal wird aufgrund der Komplexbildung gelöscht (z.B.
US-Patent Nr. 4.109.496, worin dieser Ansatz für Immuntests verwendet wird).
Der Zusatz einer Testsubstanz, die mit einer der Spezies aus dem
vorgebildeten Komplex konkurriert und diese verdrängt, führt zur
Erzeugung eines Signals über
dem Hintergrund. Auf diese Weise können Testsubstanzen identifiziert
werden, welche die Wechselwirkung zwischen einem Zielgenprodukt
und einem Bindungspartner stören.
-
In
einem weiteren Aspekt können
die 13245-Proteine als "Köder"-Proteine in einem
Zwei-Hybrid-Test oder Drei-Hybrid-Test eingesetzt werden (z.B. US-Patent
Nr. 5.283.317; Zervos et al., Cell 72, 223-232 (1993); Madura et
al., J. Biol. Chem. 268, 12046-12054 (1993); Barel et al., Biotechniques
14, 920-924 (1993); Iwabuchi et al., Oncogene 8, 1693-1696 (1993);
PCT-Veröffentlichung
Nr. WO 94/10300), um andere Proteine zu identifizieren, die 13245
("13245-Bindungsproteine" oder "13245-bp") binden oder damit
wechselwirken und an 13245-Aktivität beteiligt sind. Solche 13245-bps
können
Aktivatoren oder Inhibitoren von Signalen der 13245-Proteine oder
13245-Ziele sein, wie beispielsweise stromabwärtige Elemente eines 13245-vermittelten Signalstoff-Stoffwechselwegs.
-
Das
Zwei-Hybrid-System basiert auf der modularen Natur der meisten Transkriptionsfaktoren,
die aus trennbaren DNA-Bindungs- und Aktivierungsdomänen bestehen.
Kurz gesagt nutzt der Test zwei unterschiedliche DNA-Konstrukte.
In einem Konstrukt ist das Gen, das für ein 13245-Protein kodiert,
an ein Gen fusioniert, das für
die DNA-Bindungsdomäne
eines bekannten Transkriptionsfaktors (z.B. GAL-4) kodiert. Im anderen Konstrukt
ist eine DNA-Sequenz aus einer Bibliothek von DNA- Sequenzen, die für ein nichtidentifiziertes
Protein kodiert ("Beute" oder "Probe") an ein Gen fusioniert,
das für
die Aktivierungsdomäne
des bekannten Transkriptionsfaktors kodiert. (Alternativ dazu kann
das 13245-Protein an die Aktivatordomäne fusioniert sein.) Wenn die "Köder"- und "Beute"-Proteine in der Lage sind, in vivo
wechselzuwirken und einen 13245-abhängigen Komplex zu bilden, werden
die DNA-Bindungs- und Aktivierungsdomänen der Transkriptionsfaktoren nahe
zueinander gebracht. Diese Nähe
erlaubt die Transkription eines Reportergens (z.B. LacZ), das operabel an
eine Transkriptionsregulationsstelle gebunden ist, die auf den Transkriptionsfaktor
reagiert. Die Expression des Reportergens kann detektiert werden,
und die Zellkolonien, die den funktionellen Transkriptionsfaktor
enthalten, können
isoliert und dazu eingesetzt werden, das klonierte Gen zu erhalten,
das für
das mit dem 13245-Protein wechselwirkende Protein kodiert.
-
In
einer anderen Ausführungsform
werden Modulatoren der 13245-Expression identifiziert. Beispielsweise
wird ein Zellen enthaltendes oder ein zellfreies Gemisch mit einer
Kandidatenverbindung kontaktiert, und die Expression der 13245-mRNA
oder eines 13245-Proteins wird in Bezug auf das Expressionsausmaß von 13245-mRNA
oder -Proteinen in Abwesenheit der Kandidatenverbindung bewertet.
Wenn die Expression von 13245-mRNA oder -Proteinen in Gegenwart
der Kandidatenverbindung stärker
ist als in ihrer Abwesenheit, dann wird die Kandidatenverbindung
als Stimulator der 13245-mRNA- oder -Proteinexpression identifiziert.
Alternativ dazu wird, wenn die Expression von 13245-mRNA oder -Proteinen
in Gegenwart der Kandidatenverbindung schwächer (d.h. statistisch gesehen
signifikant schwächer)
ist als in ihrer Abwesenheit, dann wird die Kandidatenverbindung
als Inhibitor von 13245-mRNA- oder
-Proteinexpression identifiziert. Das Ausmaß der 13245-mRNA- oder -Proteinexpression
kann durch Verfahren bestimmt werden, die hierin für die Detektion
von 13245-mRNA oder -Proteinen beschrieben werden.
-
In
einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung eine Kombination aus
zwei oder mehr der hierin beschriebenen Tests. Ein Modulator kann
beispielsweise unter Einsatz eines zellbasierten oder zellfreien
Tests identifiziert werden, und die Fähigkeit des Mittels, die Aktivität eines
13245-Proteins zu modulieren, kann in vivo bestätigt werden, beispielsweise
in einem Tier, wie z.B. einem Tiermodell für eine Krankheit.
-
Diese
Erfindung betrifft weiters neue Mittel, die in den oben beschriebenen
Screening-Tests identifiziert wurden. Demgemäß umfasst der Schutzumfang
dieser Erfindung weiters den Einsatz eines wie hierin beschrieben
identifizierten Mittels (z.B. eines 13245-Modulators, eines Antisense-13245-Nucleinsäuremoleküls, eines
13245-spezifischen
Antikörpers
oder eines 13245-Bindungspartners) in einem geeigneten Tiermodell zur
Bestimmung der Wirksamkeit, Toxizität, Nebenwirkungen oder Wirkmechanismen
bei der Behandlung mit solch einem Mittel. Außerdem können neue Mittel, die durch
die oben beschriebenen Screening-Tests identifiziert wurden, zur
Behandlung, wie hierin beschrieben, verwendet werden.
-
Detektionstests
-
Teile
oder Fragmente der hierin identifizierten Nucleinsäuresequenzen
können
als Polynucleotidreagenzien verwendet werden. Diese Sequenzen können beispielsweise
eingesetzt werden, um (i) ihre jeweiligen Gene auf einem Chromosom
zu kartieren, beispielsweise um Genregionen zu lokalisieren, die
mit einer genetischen Erkrankung zusammenhängen oder um 13245 mit einer
Krankheit in Verbindung zu setzen; (ii) ein Individuum aufgrund
einer winzigen biologischen Probe zu identifizieren (Gewebetypisierung);
und (iii) die forensische Identifikation einer biologischen Probe
zu unterstützen.
Diese Anwendungen sind in den nachstehenden Abschnitten näher erläutert.
-
Chromosomenkartierung
-
Die
13245-Nucleotidsequenzen oder Abschnitte davon können zur Kartierung der Positionen
der 13245-Gene auf einem Chromosom eingesetzt werden. Dieser Vorgang
wird Chromosomenkartierung genannt. Chromosomenkartierung ist dazu
geeignet, 13245-Sequenzen mit Genen zu korrelieren, die mit einer Erkrankung
zusammenhängen.
-
Kurz
gesagt können
13245-Gene auf Chromosomen kartiert werden, indem PCR-Primer (vorzugsweise
mit einer Länge
von 15-25 Basenpaaren) aus der 13245-Nucleotidsequenz (z.B. Seq.-ID
Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3) hergestellt werden. Diese Primer können dann
zum PCR-Screenen von Somazellhybriden verwendet werden, die einzelne
menschliche Chromosome enthalten. Nur jene Hybride mit dem menschlichen
Gen, die den 13245-Sequenzen entsprechen, ergeben ein amplifiziertes
Fragment.
-
Eine
Gruppe von Somazellhybriden, worin jede Zelllinie entweder ein einzelnes
menschliches Chromosom oder eine kleine Anzahl an menschlichen Chromosomen
und einen vollständigen
Satz von Mauschromosomen enthält,
ermöglichen
eine einfache Zuordnung einzelner Gene zu spezifischen menschlichen
Chromosomen (D'Eustachio
et al., Science 220, 919-924 (1983)).
-
Andere
Kartierungsstrategien, z.B. die beschriebene In-situ-Hybridisierung
(Fan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6223-6227 (1990)), Vorscreenen
mit markierten durchflusssortierten Chromosomen und Vorselektion
durch Hybridisierung an chromosomenspezifische cDNA-Bibliotheken,
können
eingesetzt werden, um 13245 bestimmten Chromosomenorten zuzuordnen.
-
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
(FISH) einer DNA-Sequenz an einen chromosomalen Metaphasenausstrich
kann weiters dazu genutzt werden, eine präzise chromosomale Lokalisation
in einem Schritt bereitzustellen. Das FISH-Verfahren kann sogar
mit einer DNA-Sequenz durchgeführt
werden, die nur 500 oder 600 Basen lang ist. Bei Klonen mit mehr
als 1.000 Basen ist die Wahrscheinlichkeit der Bindung an eine einzigartige
Chromosomenstelle mit ausreichender Signalintensität für eine einfache
Detektion jedoch höher.
Vorzugsweise reichen 1.000 Basen, noch bevorzugter 2.000 Basen,
aus, um in einem vernünftigen
Zeitraum gute Ergebnisse zu erzielen. Für einen Überblick über FISH siehe Verma et al.
(Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press,
New York, USA (1988)).
-
Reagenzien
für die
Chromosomenkartierung können
individuell eingesetzt werden, um ein einzelnes Chromosom oder eine
einzelne Stelle auf diesem Chromosom zu markieren, oder es können Gruppen
von Reagenzien eingesetzt werden, um mehrere Stellen und/oder mehrere
Chromosomen zu markieren. Reagenzien, die nichtkodierenden Regionen
dieser Gene entsprechen, sind typischerweise für Kartierungszwecke bevorzugt.
Bei kodierenden Sequenzen ist die Wahrscheinlichkeit höher, dass
sie innerhalb von Genfamilien konserviert sind, wodurch die Häufigkeit
von Kreuzhybridisierungen während
der Chromosomenkartierung größer ist.
-
Sobald
eine Sequenz einer bestimmten Chromosomenstelle zugeordnet wurde,
kann die physische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit genetischen
Kartendaten korreliert werden (solche Daten finden sich beispielsweise
in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, online an der John
Hopkins University Welch Medical Library verfügbar). Die Beziehung zwischen
einem Gen und einer Erkrankung, die der gleichen Chromosomenregion
zugeordnet wurde, kann dann durch Kopplungsanalysen identifiziert
werden (gemeinsame Vererbung von physikalisch benachbarten Genen),
wie dies bereits beschrieben wurde (z.B. Egeland et al., Nature
325, 783-787 (1987)).
-
Außerdem können Unterschiede
zwischen den DNA-Sequenzen von Individuen bestimmt werden, die von
einer mit dem 13245-Gen assoziierten Krankheit betroffen bzw. nicht
betroffen sind. Wenn in einigen oder allen Individuen eine Mutation
vorhanden ist, in nicht betroffenen Individuen jedoch nicht, dann
ist die Mutation wahrscheinlich der Verursacher der jeweiligen Erkrankung.
Ein Vergleich zwischen betroffenen und nicht betroffenen Individuen
umfasst im Allgemeinen zuerst die Suche nach Strukturveränderungen
in den Chromosomen, wie z.B. Deletionen oder Translokationen, die
im Chromosomenausstrich erkennbar oder durch auf dieser DNA-Sequenz
basierende PCR detektierbar sind. Schließlich kann eine komplette Sequenzierung
der Gene von verschiedenen Individuen durchgeführt werden, um die Gegenwart
einer Mutation zu bestätigen
und Mutationen von Polymorphismen zu unterscheiden.
-
Gewebetypisierung
-
13245-Sequenzen
können
zur Identifikation von Individuen anhand von biologischen Proben,
beispielsweise unter Anwendung von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen
(RFLP), eingesetzt werden. Bei diesem Verfahren wird die genomische
DNA eines Individuums mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen
verdaut, die Fragmente werden getrennt, beispielsweise in einem
Southern-Blot, und sondiert, um Banden für die Identifikation zu erhalten.
Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind als zusätzliche
DNA-Marker für
RFL geeignet (beschrieben im US-Patent Nr. 5.272.057).
-
Weiters
können
die Sequenzen der vorliegenden Erfindung auch zur basenweisen Bestimmung
der tatsächlichen
DNA-Sequenz von ausgewählten
Abschnitten des Genoms eines Individuums eingesetzt werden. Die
hierin beschriebene 13245-Nucleotidsequenz kann somit dazu eingesetzt
werden, PCR-Primer herzustellen, die zum 5'- und 3'-Ende der Sequenz homolog sind. Diese
Primer können
dann zur Amplifikation der DNA eines Individuums und danach zu ihrer
Sequenzierung verwendet werden. Gruppen von entsprechenden DNA-Sequenzen
von Individuen, die auf diese Weise hergestellt wurden, können einzigartige
individuelle Identifikationsmerkmale bereitstellen, da jedes Individuum
aufgrund der Allelunterschiede eine einzigartige Gruppen von solchen
DNA-Sequenzen aufweist.
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Allelvariationen
finden in gewissem Ausmaß in
den kodierenden Regionen dieser Sequenzen statt, und in stärkerem Maße in den
nichtkodierenden Regionen. Jede der hierin beschriebenen Sequenzen
kann, in gewissen Ausmaß,
als Standard eingesetzt werden, mit dem DNA von einem Individuum
zu Identifikationszwecken verglichen werden kann. Da in den nichtkodierenden
Regionen mehr Polymorphismen vorhanden sind, sind weniger Sequenzen
notwendig, um Individuen zu unterscheiden. Die nichtkodierenden
Sequenzen von Seq.-ID Nr. 1 können
mit einer Gruppe von vielleicht 10 bis 1.000 Primern, die jeweils
eine nichtkodierende amplifizierte Sequenz aus 100 Basen ergeben,
die positive Identifikation eines Individuums ermöglichen. Wenn
vorhergesagte kodierende Sequenzen eingesetzt werden, wie beispiels weise
jene in Seq.-ID Nr. 3, dann wäre
eine geeignetere Anzahl an Primern für die positive Identifikation
eines Individuums 500-2.000.
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Wenn
eine Gruppe von Reagenzien von 13245-Nucleotidsequenzen, wie sie
hierin beschrieben sind, zur Erstellung einer Datenbank einzigartiger
Identifikationsmerkmale verwendet wird, können dieselben Reagenzien später zur
Identifikation von Gewebe von diesem Individuum genutzt werden.
Mithilfe der Datenbank einzigartiger Identifikationsmerkmale ist
eine positive Identifikation des Individuums, egal ob lebend oder
tot, anhand von extrem kleinen Gewebeproben möglich.
-
Einsatz partieller 13245-Sequenzen
in forensischer Biologie
-
Auf
DNA basierende Identifikationsverfahren können auch in forensischer Biologie
verwendet werden. Um solch eine Identifikation durchzuführen, kann
PCR-Technologie zur Amplifikation von DNA-Sequenzen eingesetzt werden,
die aus sehr kleinen biologischen Proben vom Tatort erhalten wurden,
wie beispielsweise Gewebe, z.B. Haare oder Haut, oder Körperflüssigkeiten,
z.B. Blut, Speichel oder Samen. Die amplifizierte Sequenz kann dann
mit einem Standard verglichen werden, wodurch der Ursprung der biologische
Probe bestimmt werden kann.
-
Die
Sequenzen der vorliegenden Erfindung können zur Bereitstellung von
Polynucleotidreagenzien, z.B. PCR-Primern, verwendet werden, die
auf bestimmte Loci im menschlichen Genom abzielen, wodurch die Verlässlichkeit
von auf DNA basierender forensischer Identifikation erhöht wird,
indem beispielsweise ein weiterer "Identifikationsmarker" (d.h. eine weitere
DNA-Sequenz, die für
ein bestimmtes Individuum einzigartig ist) bereitgestellt wird.
Wie oben erwähnt
können
Informationen über
eine tatsächliche
Nucleotidsequenz zur Identifikation als genaue Alternative zu Mustern
eingesetzt werden, die durch restriktionsenzymerzeugte Fragmente
gebildet werden. Sequenzen, die auf nichtkodierende Regionen von
Seq.-ID Nr. 1 abzielen (z.B. Fragmente mit einer Länge von
zumindest 20 Nucleotidresten, vorzugsweise zumindest 30 Nucleotidresten),
sind für
diesen Zweck besonders gut geeignet.
-
Die
hierin beschriebenen 13245-Nucleotidsequenzen können weiters zur Bereitstellung
von Polynucleotidreagenzien eingesetzt werden, beispielsweise von
markierten oder markierbaren Sonden, die z.B. für ein In-situ-Hybridisierungsverfahren
geeignet sind, um ein bestimmtes Gewebe zu identifizieren, beispielsweise ein
Gewebe mit hämatopoetischen
Zellen. Dies kann vor allem in Fällen
von großem
Nutzen sein, in denen ein forensischer Pathologe mit Gewebe unbekannten
Ursprungs zu tun hat. Gruppen solcher 13245-Sonden können zur
Identifikation von Gewebe nach Spezies und/oder Organtyp eingesetzt
werden.
-
Gleichermaßen können diese
Reagenzien, z.B. 13245-Primer oder -Sonden, zum Screenen von Gewebekulturen
auf Verunreinigungen verwendet werden (z.B. um auf die Gegenwart
eines Gemischs aus verschiedenen Zelltypen in einer Kultur zu screenen).
-
Prognostische
Medizin
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch das Gebiet der prognostischen
Medizin, bei dem Diagnosetests, Prognosetests und die Überwachung
von klinischen Tests für
Prognosezwecke genutzt werden, um so ein Individuum zu behandeln.
-
Im
Allgemeinen stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung bereit,
ob ein Risiko für
ein Individuum besteht, an einem bestimmten Leiden zu erkranken,
die mit einer Schädigung
oder der mangelhaften Expression eines Gens zusammenhängt, das
für ein
13245-Polypeptid kodiert.
-
Solche
Leiden umfassen beispielsweise Leiden, die mit der mangelhaften
Expression eines 13245-Polypeptids zusammenhängen, z.B. eine Immunerkrankung
oder eine neoplastische Erkrankung.
-
Das
Verfahren umfasst einen oder mehre der folgenden Schritte:
- (i) Detektieren, in einem Gewebe des Individuums,
der Gegenwart oder Abwesenheit einer Mutation, welche die Expression
des 13245-Gens beeinflusst, oder De tektieren der Gegenwart oder
Abwesenheit einer Mutation in einer Region, welche die Expression
des Gens beeinflusst, z.B. einer Mutation in der 5'-Kontrollregion;
- (ii) Detektieren, in einem Gewebe des Individuums, der Gegenwart
oder Abwesenheit einer Mutation, welche die Struktur des 13245-Gens
verändert;
- (iii) Detektieren, in einem Gewebe des Individuums, der mangelhaften
Expression des 13245-Gens auf mRNA-Ebene, z.B. Detektieren der Menge
an mRNA vom Nicht-Wildtyp; und
- (iv) Detektieren, in einem Gewebe des Individuums, der mangelhaften
Expression des Gens auf Proteinebene, z.B. Detektieren der 13245-Polypeptid-Menge
vom Nicht-Wildtyp.
-
In
bevorzugten Ausführungsformen
umfasst das Verfahren: die Feststellung des Vorhandenseins zumindest
eines der Folgenden: eine Deletion eines oder mehrerer Nucleotide
aus dem 13245-Gen; eine Insertion eines oder mehrerer Nucleotide
in das Gen, eine Punktmutation, z.B. eine Substitution eines oder
mehrer Nucleotide des Gens, eine starke chromosomale Umordnung des
Gens, z.B. eine Translokation, Inversion oder Deletion.
-
Die
Detektion der genetische Schädigung
kann beispielsweise Folgendes umfassen: (i) das Bereitstellen einer
Sonde/eines Primers mit einem Oligonucleotid, das eine Region einer
Nucleotidsequenz umfasst, die an eine Sense- oder Antisense-Sequenz aus Seq.-ID
Nr. 1 hybridisiert, oder einer natürlich vorkommenden Mutante
davon, oder von 5'-
oder 3'-flankierenden
Sequenzen, die von Natur aus mit dem 13245-Gen assoziiert sind;
(ii) das Aussetzen der Sonde/des Primers gegenüber einer Nucleinsäure vom
Gewebe; und das Detektieren der Gegenwart oder Abwesenheit der genetischen
Schädigung
durch Hybridisierung der Sonde/des Primers an die Nucleinsäure, z.B.
durch In-situ-Hybridisierung.
-
In
bevorzugten Ausführungsformen
umfasst die Detektion der mangelhaften Expression die Feststellung
des Vorhandenseins zumindest eines von: einer Änderung der Menge eines Messenger-RNA-Transkripts des
13245-Gens; der Gegenwart eines Nicht-Wildtyp-Spleißmusters
eines Messenger-RNA-Transkripts des Gens; oder einer der Menge an
13245-RNA oder eines 13245-Proteins vom Nicht-Wildtyp.
-
Verfahren
der Erfindung können
zum pränatalen
Screenen oder zur Bestimmung eingesetzt werden, ob für die Nachkommen
eines Individuums das Risiko besteht, an einem Leiden zu erkranken.
-
In
bevorzugten Ausführungsformen
umfasst das Verfahren die Bestimmung der Struktur eines 13245-Gens,
wobei eine abnormale Struktur auf ein Risiko für die Erkrankung hinweist.
-
In
bevorzugten Ausführungsformen
umfasst das Verfahren das Kontaktieren einer Probe vom Individuum
mit einem Antikörper
gegen das 13245-Protein oder die Nucleinsäure, die spezifisch an das
Gen hybridisiert. Diese und andere Ausführungsformen werden nachstehend
näher erläutert.
-
Diagnostische
und prognostische Tests
-
Die
Gegenwart, Menge oder Abwesenheit eines 13245-Proteins oder einer
13245-Nucleinsäure in einer
biologischen Probe kann beurteilt werden, indem eine biologische
Probe von einem Testindividuum erhalten wird und die biologische
Probe mit einer Verbindung oder einem Mittel kontaktiert wird, die/das
zur Detektion eines 13245-Proteins oder einer Nucleinsäure, die
für ein
13245-Protein kodiert (z.B. mRNA, genomische DNA), in der Lage ist,
sodass die Gegenwart des 13245-Proteins oder der Nucleinsäure in der
biologische Probe detektiert wird. Der Begriff "biologische Probe" umfasst Gewebe, Zellen und biologische
Flüssigkeiten,
die aus einem Individuum isoliert wurden, sowie Gewebe, Zellen und
Flüssigkeiten,
die in einem Individuum vorhanden sind. Eine bevorzugte biologische
Probe ist Serum. Das Expressionsausmaß des 13245-Gens kann auf verschiedene
Arten gemessen werden, einschließlich, nicht jedoch beschränkt auf:
Messung der mRNA, für
welche die 13245-Gene
kodieren; Messung der Menge des Proteins, für welches die 13245-Gene ko dieren; oder
Messung der Aktivität
des Proteins, für
welche die 13245-Gene kodieren.
-
Die
Menge an mRNA, die dem 13245-Gen in einer Zelle entspricht, kann
sowohl durch In-situ- als auch In-vitro-Formate bestimmt werden.
-
Die
isolierte mRNA kann in Hybridisierungs- oder Amplifikationstest
verwendet werden, die Southern- und Northern-Tests, Polymerasekettenreaktionsanalysen
und Sondenarrays umfassen, nicht jedoch darauf beschränkt sind.
Andere bevorzugte diagnostische Verfahren zur Detektion von mRNA-Mengen
umfassen das Kontaktieren der isolierten mRNA mit einem Nucleinsäuremolekül (Sonde),
das an die mRNA hybridisieren kann, für die das zu detektierende
Gen kodiert. Die Nucleinsäuresonde
kann beispielsweise eine 13245-Nucleinsäure voller Länge, wie
z.B. die Nucleinsäure
der Seq.-ID Nr. 1, oder ein Teil davon sein, wie z.B. ein Oligonucleotid
mit einer Länge
von zumindest 7, 15, 30, 50, 100, 250 oder 500 Nucleotiden, die
ausreicht, um unter stringenten Bedingungen spezifisch an 13245-mRNA
oder genomische DNA zu hybridisieren. Andere geeignete Sonden zum
Einsatz in den diagnostischen Tests werden ebenfalls hierin beschrieben.
-
In
einem Format wird mRNA (oder cDNA) auf einer Oberfläche immobilisiert
und mit den Sonden kontaktiert, beispielsweise indem die isolierte
mRNA auf einem Agarosegel laufen gelassen und die mRNA vom Gel auf
eine Membran, wie z.B. Nitrocellulose, transferiert wird. In einem
alternativen Format werden die Sonden auf einer Oberfläche immobilisiert,
und die mRNA (oder cDNA) wird beispielsweise in einem zweidimensionalen
DNA-Chip mit den Sonden kontaktiert. Fachleute auf dem Gebiet der
Erfindung können
bekannte mRNA-Detektionsverfahren leicht für den Einsatz zur Detektion
der Menge an mRNA anpassen, für
welche die 13245-Gene kodieren.
-
Die
Menge mRNA, für
die 13245 kodiert, in einer Probe kann durch Nucleinsäureamplifikation,
z.B. durch RT-PCR (US-Patent Nr. 4.683.202), Ligase-Kettenreaktion
(Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 189-193 (1991)), selbsterhaltende
Sequenzreplikation (Gutaelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87, 1874-1878 (1990)), ein transkriptionelles Amplifikationssystem
(Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1173-1177 (1989)),
Q-β-Replicase
(Lizardi et al., Bio/Technology 6, 1197 (1988)), Rollender-Kreis-Replikation (US-Patent
Nr. 5.854.033) oder ein beliebiges anderes Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren,
gefolgt von Detektion der amplifizierten Moleküle durch auf dem Gebiet der
Erfindung bekannte Verfahren bestimmt werden. Amplifikationsprimer
sind hierin so definiert, dass sie ein Paar von Nucleinsäuremolekülen darstellen,
die an die 5'- oder
3'-Region eines
13245-Gens (Plus- bzw. Minus-Strang
oder umgekehrt) binden können
(Annealing) und eine kurze Region dazwischen aufweisen. Im Allgemeinen
sind Amplifikationsprimer etwa 10 bis 30 Nucleotide lang und flankieren
eine Region, die etwa 50 bis 200 Nucleotide lang ist. Unter geeigneten
Bedingungen und mit geeigneten Reagenzien erlauben solche Primer
die Amplifikation eines Nucleinsäuremoleküls mit der
Nucleotidsequenz zwischen den Primern.
-
Für In-situ-Verfahren
kann eine Zell- oder Gewebeprobe hergestellt/verarbeitet und auf
einem Träger, typischerweise
einem Deckglas, immobilisiert und dann mit einer Sonde kontaktiert
werden, die an mRNA hybridisieren kann, welche für das analysierte 13245-Gen
kodiert.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
umfassen die Verfahren außerdem
das Kontaktieren einer Vergleichsprobe mit einer Verbindung oder
einem Mittel, die in der Lage sind, 13245-mRNA oder genomische DNA
zu detektieren, und das Vergleichen der Gegenwart von 13245-mRNA
oder genomischer DNA in der Vergleichsprobe mit der Gegenwart von
13245-mRNA oder genomischer DNA in der getesteten Probe.
-
Verschiedene
Verfahren können
eingesetzt werden, um die Menge eines Proteins zu bestimmen, für das 13245
kodiert. Im Allgemeinen umfassen diese Verfahren das Kontaktieren
eines Mittel, das selektiv an das Protein bindet, wie z.B. eines
Antikörpers,
mit einer Probe, um die Proteinmenge in der Probe zu beurteilen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
trägt der
Antikörper
einer detektierbare Markierung. Antikörper können polyklonal oder, noch
bevorzugter, monoklonal sein. Ein intakter Antikörper oder ein Fragment davon
(z.B. Fab oder F(ab')2) kann eingesetzt werden. Die Bezeichnung "markiert" in Bezug auf die
Sonde oder den Antikörper
umfasst direkte Markierung der Sonde oder des Antikörpers durch
Kupplung (z.B. physikalische Bindung) einer detektierbaren Substanz
an die Sonde oder den Antikörper
sowie indirekte Markierung der Sonde oder des Antikörpers durch
Reaktivität
mit einer detektierbaren Substanz. Beispiele für detektierbare Substanzen
sind hierin angeführt.
-
Die
Detektionsverfahren können
zur Detektion eines 13245-Proteins in einer biologischen Probe in
vitro als auch in vivo eingesetzt werden. In-vitro-Verfahren zur
Detektion eines 13245-Proteins umfassen enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmungen
(ELISAs), Immunfällungen,
Immunfluoreszenz, Enzymimmunoassays (EIA), Radioimmunoassays (RIA)
und Western-Blot-Analysen. In-vivo-Verfahren zur Detektion eines 13245-Proteins
umfassen die Einführung
eines markierten Anti-13245-Antikörpers in
ein Individuum. Der Antikörper
kann beispielsweise mit einer radioaktiven Markierung versehen werden,
deren Gegenwart und Position in einem Individuum durch herkömmliche
Bildgebungsverfahren detektiert werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
umfassen die Verfahren außerdem
das Kontaktieren der Vergleichsprobe mit einer Verbindung oder einem
Mittel, die zur Detektion eines 13245-Proteins in der Lage sind,
und das Vergleichen der Gegenwart eines 13245-Proteins in der Vergleichsprobe
mit der Gegenwart eines 13245-Proteins in der getesteten Probe.
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Die
Erfindung umfasst auch Sets zur Detektion der Gegenwart von 13245
in einer biologischen Probe. Das Set kann beispielsweise eine Verfahren
oder ein Mittel, die zur Detektion eines 13245-Proteins oder von mRNA
in einer biologischen Probe in der Lage sind, und einen Standard
enthalten. Die Verbindung oder das Mittel können in einen geeigneten Behälter gepackt
werden. Das Set kann weiters Anleitungen zum Einsatz des Sets zur
Detektion von 13245-Proteinen oder -Nucleinsäure enthalten.
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Bei
auf Antikörpern
basierenden Sets kann das Set Folgendes umfassen: (1) einen (z.B.
an einen festen Träger
gebundenen) ersten Antikörper,
der an ein Polypeptid bindet, das einem Marker der Erfindung entspricht;
und gegebenenfalls (2) einen zweiten, anderen Antikörper, der
an entweder das Polypeptid oder den ersten Antikörper bindet und an ein detektierbares
Mittel konjugiert ist.
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Bei
auf Oligonucleotiden basierenden Sets kann das Set Folgendes umfassen:
(1) ein Oligonucleotid, z.B. ein detektierbar markiertes Oligonucleotid,
das an eine Nucleinsäuresequenz
hybridisiert, die für
ein einem Marker der Erfindung entsprechendes Polypeptid kodiert,
oder (2) ein Primerpaar, die zur Amplifikation eines Nucleinsäuremoleküls zweckdienlich
sind, das einem Marker der Erfindung entspricht. Das Set kann weiters
einen Puffer, ein Konservierungsmittel oder einen Proteinstabilisator
enthalten. Außerdem
kann das Set Komponenten enthalten, die zur Detektion des detektierbaren
Mittels (z.B. eines Enzyms oder Substrats) erforderlich sind. Weiters
kann das Set einen Vergleichsprobe oder eine Reihe von Vergleichsproben
enthalten, die getestet und mit der enthaltenen Testprobe verglichen
werden. Jede Komponente des Sets kann in einem separaten Behälter enthalten
sein, und jeder der Behälter
kann separat verpackt sein, gemeinsam mit Anleitungen zur Auslegung
der Ergebnisse des mithilfe des Sets durchgeführten Tests.
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Die
hierin beschriebenen diagnostischen Verfahren können Individuen identifizieren,
die an einer mit mangelhafter, aberrierender oder unerwünschter
13245-Expression oder -Aktivität
zusammenhängenden Krankheit
oder Störung
leiden oder für
die das Risiko besteht, daran zu erkranken. Die Bezeichnung "unerwünscht" umfasst hierin ein
unerwünschtes
Phänomen
im Zusammenhang mit einer biologischen Reaktion, beispielsweise
die Induktion einer unangemessenen Immunantwort oder deregulierten
Zellproliferation.
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In
einer Ausführungsform
wird eine Erkrankung oder ein Leiden in Zusammenhang mit aberrierender oder
unerwünschter
13245-Expression oder -Aktivität
identifiziert. Eine Testprobe wird von einem Individuum erhalten,
und ein 13245-Protein oder einer 13245-Nucleinsäure (z.B. mRNA oder genomische
DNA) wird beurteilt, worin der Gehalt, z.B. die Gegenwart oder Abwesenheit,
von 13245-Proteinen oder -Nucleinsäuren als Diagnose dafür dient,
ob für
ein Individuum das Risiko besteht, eine Erkrankung oder ein Leiden
in Zusammenhang mit aberrierender oder unerwünschter 13245-Expression oder
-Aktivität
zu entwickeln. Die Bezeichnung "Testprobe" bezieht sich hierin
auf eine biologische Probe, die von einem Individuum von Interesse
erhalten wurde, einschließlich
einer biologischen Flüssigkeit
(z.B. Serum), einer Zellprobe oder eines Gewebes.
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Die
hierin beschriebenen prognostischen Tests können eingesetzt werden, um
zu bestimmen, ob ein Mittel (z.B. ein Agonist, Antagonist, Peptidomimetikum,
Protein, Peptid, eines Nucleinsäure,
ein kleines Molekül
oder ein anderer Arzneimittelkandidat) einem Individuum verabreicht
werden kann, um eine Krankheit oder ein Leiden in Zusammenhang mit
aberrierender oder unerwünschter
13245-Expression oder -Aktivität
zu behandeln. Solche Verfahren können
beispielsweise eingesetzt werden, um zu bestimmen, oben beschrieben
ein Individuum wirksam mit einem Mittel behandelt werden kann, das
13245-Expression oder -Aktivität
moduliert.
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Die
Verfahren der Erfindung können
auch eingesetzt werden, um genetische Veränderungen in einem 13245-Gen
zu detektieren, wodurch bestimmt wird, ob für ein Individuum mit dem veränderten
Gen das Risiko besteht, an einem Leiden zu erkranken, das durch
eine Fehlregulierung der 13245-Proteinaktivität oder -Nucleinsäureexpression
gekennzeichnet ist, wie z.B. eine Erkrankung im Zusammenhang mit
Tumorgenese oder der Induktion einer unangemessenen Immunantwort.
In bevorzugten Ausführungsformen
umfassen die Verfahren das Detektieren der Gegenwart oder Abwesenheit
einer genetischen Veränderung,
die durch zumindest eines aus einer Veränderung, die sich auf die Integrität eines
für ein
13245-Protein kodierenden Gens auswirkt, oder der mangelhaften Expression
des 13245-Gens gekennzeichnet ist, in einem Individuum. Solche genetischen
Veränderungen
können
beispielsweise detektiert werden, indem das Vorhandensein zumindest
eines aus 1) einer Deletion eines oder mehrerer Nucleotide in einem
13245-Gen; 2) einer Addition eines oder mehrerer Nucleotide zu einem
13245-Gen; 3) einer Substitution eines oder mehrerer Nucleotide
eines 13245-Gens; 4) einer chromosomalen Umordnung eines 13245-Gens; 5) einer Veränderung
auf der Ebene des Messenger-RNA-Transkripts eines 13245-Gens; 6)
einer aberrierenden Modifikation eines 13245-Gens, wie z.B. des Methylierungsmusters
der genomischen DNA; 7) der Gegenwart eines Nichtwildtyp-Spleißmusters
eines Messenger-RNA-Transkripts eines 13245-Gens; 8) einem Nichtwildtyp-Gehalt
eines 13245-Proteins; 9) einem Allelverlust eines 13245-Gens; und
10) einer ungeeigneten posttranslationalen Modifikation eines 13245-Proteins
festgestellt wird.
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Eine
Veränderung
kann ohne Sonde/Primer in einer Polymerasekettenreaktion, z.B. Anchored-PCR oder
RACE-PCR, detektiert werden, oder alternativ dazu in einer Ligationskettenreaktion
(LCR), wobei Letztere vor allem für die Detektion von Punktmutationen
im 13245-Gen zweckdienlich ist. Dieses Verfahren kann die Schritte
des Gewinnens einer Zellprobe von einem Individuum, des Isolierens
von Nucleinsäure
(z.B. genomisch, mRNA oder beides) aus der Probe, des Kontaktierens
der Nucleinsäureprobe
mit einem oder mehreren Primern, die unter Bedingungen, die für solch
eine Hybridisierung und eine Amplifikation des 13245-Gens (falls
vorhanden) förderlich
sind, spezifisch an ein 13245-Gen hybridisieren, und des Detektierens der
Gegenwart oder Abwesenheit eines Amplifikationsprodukts oder des
Detektierens der Größe des Amplifikationsprodukts
und des Vergleichens der Länge
mit einer Vergleichsprobe umfassen. Es ist zu erwarten, dass PCR
und/oder LCR als vorläufiger
Amplifikationsschritt zusammen mit einem der Verfahren, die zur
Detektion von hierin beschriebenen Mutationen eingesetzt werden,
zweckdienlich ist.
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Alternative
Amplifikationsverfahren umfassen: selbsterhaltende Sequenzreplikation
(Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878 (1990)),
ein transkriptionelles Amplifikationssystem (Kwoh et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89, 1173-1177 (1989)), Q-β-Replicase (Lizardi et al.,
Bio/Technology 6, 1197 (1988)), Rollender-Kreis-Replikation (US-Patent Nr. 5.854.033)
oder andere Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren,
gefolgt von Detektion der amplifizierten Moleküle durch auf dem Gebiet der
Erfindung bekannte Verfahren.
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In
einer anderen Ausführungsform
können
Mutationen in einem 13245-Gen aus einer Probezelle identifiziert
werden, indem Veränderungen
in Restriktionsenzym-Spaltmustern detektiert werden. Proben- und
Vergleichs-DNA werden beispielsweise iso liert, amplifiziert (optional),
mit einer oder mehreren Restriktionsendonucleasen verdaut, und die
Fragmentlängen
werden bestimmt, z.B. durch Gelelektrophorese) und verglichen. Unterschiede
in der Fragmentlänge
zwischen Proben- und Vergleichs-DNA
weisen auf Mutationen in der Proben-DNA hin. Außerdem können sequenzspezifische Ribozyme
(z.B. US-Patent Nr. 5.498.531) eingesetzt werden, um die Gegenwart
von spezifischen Mutationen durch die Entwicklung oder den Verlust
einer Ribozym-Spaltstelle zu bewerten.
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In
anderen Ausführungsformen
können
genetische Mutationen in 13245 durch Hybridisieren einer Probe zur
Kontrolle der Nucleinsäuren,
z.B. DNA oder RNA, durch beispielsweise zweidimensionale Arrays
oder auf Chips basierende Arrays identifiziert werden. Solche Arrays
umfassen zahlreiche Adressen, die alle aufgrund ihrer Position voneinander
unterscheidbar sind. An jeder Adresse der zahlreichen Adressen befindet sich
eine andere Sonde. Diese Arrays können eine hohe Dichte an Adressen
aufweisen, z.B. hunderte oder tausende von Oligonucleotidsonden
(Cronin et al., Hum. Mutat. 7, 244-255 (1996); Kozal et al., Nature
Med. 2, 753-759 (1996)). Genetische Mutationen in 13245 können beispielsweise
in zweidimensionalen Arrays identifiziert werden, die lichtgenerierte
DNA-Sonden enthalten, wie sie bereits beschrieben wurden (Cronin
et al., w.o.). Kurz gesagt kann ein erstes Hybridisierungsarray
von Sonden dazu verwendet werden, durch lange DNA-Teile in einer
Probe zu scannen und das Ganze zur Identifikation von Basenänderungen
zwischen Sequenzen zu kontrollieren, indem lineare Arrays von sequenziell überlappenden
Sonden hergestellt werden. Dieser Schritt ermöglicht die Identifikation von
Punktmutationen. Auf diesen Schritt folgt ein zweites Hybridisierungsarray,
was die Charakterisierung von spezifischen Mutationen durch Verwendung
kleinerer, spezialisierter Sondenarrays ermöglicht, die komplementär zu allen
detektierten Varianten oder Mutationen sind. Jedes Mutationsarray
besteht aus parallelen Sondengruppen, wovon eines zum Wildtyp-Gen
komplementär
ist und das andere zum mutierten Gen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann eine beliebige verschiedener Sequenzierungsreaktionen, die auf
dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, zur direkten Sequenzierung
des 13245-Gens und zur Detektion von Mutationen durch Vergleich
der Sequenz des Proben-13245 mit der entsprechenden Wildtyp- (Vergleichs-) Sequenz
eingesetzt werden. Automatisierte Sequenzierungsvorgänge können eingesetzt
werden, wenn die diagnostischen Tests durchgeführt werden (BioTechniques 19,
448 (1995)), einschließlich
Sequenzierung durch Massenspektrometrie.
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Andere
Verfahren zur Detektion von Mutationen im 13245-Gen umfassen Verfahren,
bei denen der Schutz durch Spaltmittel zur Detektion von fehlgepaarten
Basen in RNA/RNA- oder RNA/DNA-Heteroduplexen genutzt wird (Myers
et al., Science 230, 1242 (1985); Cotton et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85, 3297 (1988); Saleeba et al., Meth. Enzymol. 217, 286-295
(1992)).
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In
einer weiteren Ausführungsform
nutzt die Fehlpaarungsspaltreaktion ein oder mehrere Proteine, die fehlgepaarte
Basenpaare in doppelsträngiger
DNA in definierten Systemen zur Detektion und Kartierung von Punktmutationen
in 13245-cDNA aus Zellproben erkennen (so genannte "DNA-Fehlpaarungsreparaturenzyme"). Das mutY-Enzym
von E. coli spaltet beispielsweise A bei G/A-Fehlpaarungen, und
die Thymidin-DNA-Glykosylase von HeLa-Zellen spaltet T bei G/T-Fehlpaarungen
(Hsu et al., Carcinogenesis 15, 1657-1662 (1994); US-Patent Nr.
5.459.039).
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In
anderen Ausführungsform
werden Veränderungen
der elektrophoretischen Mobilität
zur Identifikation von Mutationen in 13245-Genen genutzt. Einzelstrang-Konformationspolymorphismen
(SSCP) können
zur Detektion von Unterschieden in der elektrophoretischen Mobilität zwischen
mutierten und Wildtyp-Nucleinsäure
genutzt werden (Orite et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2766
(1989); Cotton, Mutat. Res. 285, 125-144 (1993); Hayashi, Genet.
Anal. Tech. Appl. 9, 73-79 (1992)). Einzelstrang-DNA-Fragmente von
Proben- und Vergleichs-13245-Nucleinsäuren werden denaturiert und
renaturieren gelassen. Die Sekundärstruktur von einzelsträngigen Nucleinsäuren variiert
je nach Sequenz, und die resultierende Veränderung der elektrophoretischen
Mobilität
ermöglicht
sogar die Detektion von Änderungen
von nur einer Base. Die DNA-Fragmente können markiert oder mit markierten
Sonden detektiert werden. Die Empfindlichkeit des Tests kann durch
den Einsatz von RNA (anstelle von DNA) erhöht werden, in der die Sekundärstruktur
empfindlicher gegenüber
Se quenzänderungen
ist. In einer bevorzugten Ausführungsform
nutzt das vorliegende Verfahren Heteroduplexanalysen zur Trennung
von doppelsträngigen
Heteroduplexmolekülen
auf Basis von Änderungen
der elektrophoretischen Mobilität
(Keen et al., Trends Genet. 7, 5 (1991)).
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In
einer weiteren Ausführungsform
wird die Bewegung von mutierten oder Wildtyp-Fragmenten in Polyacrylamidgelen mit
einem Denaturierungsmittelgradienten unter Verwendung von denaturierender
Gradientengel-Elektrophorese (DGGE) (Myers et al., Nature 313, 495
(1985)) getestet. Wenn DGGE als Analyseverfahren eingesetzt wird,
wird DNA modifiziert, um sicherzustellen, dass sie nicht vollständig denaturiert,
beispielsweise durch Zusatz einer etwa 40 Basenpaaren großen GC-Klammer
aus hochschmelzender GC-reicher DNA durch PCR. In einer weiteren
Ausführungsform
wird anstelle eines Denaturierungsgradienten ein Temperaturgradient
eingesetzt, um Unterschiede in der Mobilität von Vergleichs- und Proben-DNA
zu identifizieren (Rosenbaum und Reissner, Biophys. Chem. 265, 12753
(1987)).
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Beispiele
für andere
Verfahren zur Detektion von Punktmutationen umfassen, sind jedoch
nicht beschränkt
auf selektive Oligonucleotidhybridisierung, selektive Amplifikation
oder selektive Primerverlängerung (Saiki
et al., Nature 324, 153 (1986); Saiki et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86, 6230 (1989)).
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Alternativ
dazu kann ein allelspezifisches Amplifikationsverfahren, das auf
einer selektiven PCR-Amplifikation basiert, gemeinsam mit der vorliegenden
Erfindung eingesetzt werden. Oligonucleotide, die als Primer für eine spezifische
Amplifikation eingesetzt werden, können die Mutation von Interesse
im Zentrum des Molekül
aufweisen (sodass die Amplifikation von einer differenziellen Hybridisierung
abhängt;
Gibbs et al., Nucl. Acids Res. 17, 2437-2448 (1989)), oder ganz
außen
am 3'-Ende eines
Primers, wo unter geeigneten Bedingungen einer Fehlpaarung eine
Polymeraseverlängerung
verhindern oder verringern kann (Prossner, Tibtech. 11, 238 (1993)).
Weiters kann es wünschenswert
sein, eine neue Restriktionsstelle in der Mutationsregion einzuführen, um
eine auf Spaltung basierende Detektion zu ermöglichen (Gasparini et al.,
Mol. Cell Probes 6, 1 (1992)). Es wird davon ausgegangen, dass die
Amplifika tion in bestimmten Ausführungsformen
auch unter Einsatz von Taq-Ligase zur Amplifikation durchgeführt werden
kann (Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 189 (1991)). In solchen
Fällen
findet eine Ligation nur dann statt, wenn eine vollkommene Übereinstimmung am
3'-Ende der 5'-Segeunz vorhanden
ist, wodurch es möglich
wird, die Gegenwart einer bekannten Mutation an einer bestimmten
Stelle zu detektieren, indem nach der Gegenwart oder Abwesenheit
einer Amplifikation gesucht wird.
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Die
hierin beschriebenen Verfahren können
beispielsweise unter Verwendung von abgepackten Diagnosesets durchgeführt werden,
die zumindest eine Sondennucleinsäure oder ein Antikörperreagens,
wie sie hierin beschrieben sind, umfassen und gut für z.B. klinische
Einsätze
zur Diagnose bei Patienten mit Symptomen oder einer Familienanamnese
für ein
Leiden oder eine Krankheit im Zusammenhang mit einem 13245-Gen geeignet.
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Einsatz von 13245-Molekülen als
Ersatzmarker
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Die
13245-Moleküle
der Erfindung sind auch als Marker für Leiden oder Krankheitszustände, als
Marker für
Vorläufer
von Krankheitszuständen,
als Marker für
eine Veranlagung für
Krankheitszustände,
als Marker für
Arzneimittelaktivität
oder als Marker für
das pharmakogenomische Profil eines Individuums geeignet. Mithilfe
der hierin beschriebenen Verfahren können die Gegenwart, Abwesenheit
und/oder Menge der 13245-Moleküle
der Erfindung detektiert und in vivo mit einem oder mehreren biologischen
Zuständen
korreliert werden. Die 13245-Moleküle der Erfindung können beispielsweise
als Ersatzmarker für
ein oder mehrere Leiden oder Krankheitszustände oder für Konditionen dienen, die zu
Krankheitszuständen
führen.
Die Bezeichnung "Ersatzmarker" bezieht sich hierin
auf einen objektiven biochemischen Marker, der mit der Abwesenheit
oder Gegenwart einer Krankheit oder eines Leidens oder mit dem Fortschreiten
einer Krankheit oder eines Leidens (z.B. mit dem Vorhandensein oder
Fehlen eines Tumors) korreliert. Die Gegenwart oder Menge solcher
Marker hängt
von der Krankheit ab. Folglich können
diese Marker dazu dienen zu bestimmen, ob ein bestimmtes Behandlungsverfahren
einen Krankheitszustand oder ein Leiden wirksam mildert. Ersatzmarker
sind vor allem dann geeignet, wenn das Vorhandensein oder Ausmaß eines
Erkrankungszustands oder Leidens mithilfe von Standardverfahren
schwer zu beurteilen ist (z.B. bei Tumoren im Frühstadium) oder wenn eine Beurteilung
des Fortschreitens einer Krankheit erwünscht ist, bevor ein möglicherweise
gefährlicher
klinischer Punkt erreicht wird (z.B. kann eine Beurteilung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen
erfolgen, indem Cholesterinwerte als Ersatzmarker genutzt werden,
und eine HIV-Infektion kann analysiert werden, indem HIV-RNA-Werte als Ersatzmarker
verwendet werden, und das lange vor unerwünschten klinischen Folgen wie
Herzinfarkt oder voll ausgebrochenem AIDS). Beispiele für den Einsatz
von Ersatzmarkern wurden schon beschrieben (z.B. Koomen et al.,
J. Mass. Spectrom. 35, 2 voll entwickeltem AIDS). Beispiele für den Einsatz
von Ersatzmarkern wurden bereits beschrieben (z.B. Koomen et al.,
J. Mass. Spectrom. 35, 258-264
(2000); James, AIDS Treat. News Arch. 209 (1994)).
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Die
13245-Moleküle
der Erfindung sind auch als pharmakodynamische Marker geeignet.
Die Bezeichnung "pharmakodynamischer
Marker" bezieh sich
hierin auf einen objektiven biochemischen Marker, der spezifisch
mit Arzneimittelwirkungen korreliert. Die Gegenwart oder Menge eines
pharmakodynamischen Markers hängt
nicht mit dem Krankheitszustand oder Leiden zusammen, gegen welches
das Arzneimittel verabreicht wird; folglich zeigt die Gegenwart
oder Menge des Markers die Gegenwart oder Aktivität des Arzneimittels
in einem Individuum an. Ein pharmakodynamischer Marker kann beispielsweise
die Konzentration des Arzneimittels in einem biologischen Gewebe
anzeigen, indem der Marker in diesem Gewebe in Abhängigkeit
vom Gehalt des Arzneimittels entweder exprimiert oder transkribiert
oder nicht exprimiert oder transkribiert wird. Auf diese Weise kann
die Verteilung oder Aufnahme des Arzneimittels mithilfe des pharmakodynamischen
Markers überwacht
werden. Auf ähnliche
Weise kann die Gegenwart oder Menge des pharmakodynamischen Markers
mit der Gegenwart oder Menge des Stoffwechselprodukts eines Arzneimittels
zusammenhängen,
sodass die Gegenwart oder Menge des Markers die relative Abbaugeschwindigkeit
des Arzneimittels in vivo anzeigt. Pharmakodynamische Marker sind
vor allem für
die Steigerung der Detektionsempfindlichkeit von Arzneimittelwirkungen
geeignet, vor allem wenn das Arzneimittel in geringen Dosen verabreicht wird.
Da sogar geringe Mengen eines Arzneimittel ausreichen können, um
mehrere Transkriptions- oder Expressionsdurchgänge von Markern zu aktivieren
(z.B. eines 13245-Markers), kann der amplifizierte Marker in einer
Menge vorliegen, die leichter detektierbar ist als das Arzneimittel
selbst. Außerdem
kann der Marker aufgrund des Aufbaus des Markers selbst leichter
detektiert werden; mithilfe des hierin beschriebenen Verfahrens
können
Anti-13245-Antikörper
beispielsweise in einem immunbasierten Detektionssystem für einen
13245-Proteinmarker eingesetzt werden, oder 13245-spezifische radioaktiv
markierte Sonden können
zur Detektion eines 13245-mRNA-Markers
verwendet werden. Weiters erlaubt der Einsatz eines pharmakodynamischen
Markers eine auf dem Mechanismus basierende Risikovorhersage augrund
einer Arzneimittelbehandlung über
die Grenzen der möglichen
direkten Beobachtungen hinaus. Beispiele für die Verwendung von pharmakodynamischen
Markern wunden bereits beschrieben (z.B. US-Patent Nr. 6.033.862;
Hattis et al., Env. Health Perspect. 90, 229-238 (1991); Schentag,
Am. J. Health-Syst. Pharm. 56, Suppl. 3, 21-24 (1999); Nicolau,
Am. J. Health Syst. Pharm. 56, Suppl.3, 16-20 (1999)).
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Die
13245-Moleküle
der Erfindung sind auch als pharmakogenomische Marker von Nutzen.
Ein "pharmakogenomischer
Marker" ist hierin
ein objektiver biochemischer Marker, der mit einer bestimmten klinischen Arzneimittelreaktion
oder -empfindlichkeit in einem Individuum korreliert (z.B. McLeod
et al., Eur. J. Cancer 35, 1650-1652 (1999)). Die Gegenwart oder
Menge des pharmakogenomischen Markers steht mit der vorhergesagten
Reaktion des Individuum auf ein bestimmtes Arzneimittel oder eine
bestimmte Arzneimittelklasse vor Verabreichung des Arzneimittels
in Zusammenhang. Durch Beurteilung der Gegenwart oder Menge eines
oder mehrerer pharmakogenomischer Marker in einem Individuum kann
die Arzneimitteltherapie ausgewählt
werden, die für
das jeweilige Individuum am besten geeignet ist oder wahrscheinlich
den größten Erfolg
bringt. Ausgehend von der Gegenwart oder Menge von RNA oder eines
Proteins (z.B. 13245-Protein oder -RNA) für spezifische Tumormarker in
einem Individuum kann beispielsweise ein Arzneimittel oder ein Behandlungsverlauf
ausgewählt
werden, die für
die Behandlung des jeweiligen Tumors, der vermutlich im Individuum
vorhanden ist, am besten geeignet ist. Auf ähnliche Weise kann die Gegenwart
oder Abwesenheit einer bestimmten Sequenzmutation in 13245- DNA mit einer 13245-Arzneimittelreaktion
in Zusammenhang stehen. Die Verwendung von pharmakogenomischen Markern
ermöglicht
somit die Durchführung
der am besten geeigneten Behandlung für das jeweilige Individuum,
ohne dass die Therapien vorher getestet werden müssen.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen
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Die
Nucleinsäure
und Polypeptide, Fragmente davon sowie Anti-13245-Antikörper (hierin
auch als "aktive
Verbindungen" bezeichnet)
der Erfindung können
in pharmazeutische Zusammensetzungen miteinbezogen werden. Solche
Zusammensetzungen umfassen typischerweise das Nucleinsäuremolekül, das Protein oder
den Antikörper
und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Die Bezeichnung "pharmazeutisch annehmbarer
Träger" umfasst hierin Lösungsmittel,
Dispersionsmedien, Überzüge, antibakterielle
und antifungale Stoffe, Isotonisierungsmittel und Absorptionsverzögerer und
dergleichen, die für
pharmazeutische Verabreichung geeignet sind. In die Zusammensetzungen
können
auch zusätzliche
aktive Verbindungen miteinbezogen werden.
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Eine
pharmazeutische Zusammensetzung wird so formuliert, dass sie für den gewünschten
Verabreichungsweg geeignet ist. Beispiele für Verabreichungswege umfassen
parenterale, z.B. intravenöse,
intradermale, subkutane, orale (z.B. durch Inhalation), transdermale
(topische), transmukosale und rektale Verabreichung. Lösungen oder
Suspensionen zur parenteralen, intradermalen oder subkutanen Anwendung
können die
folgenden Komponenten enthalten: ein steriles Verdünnungsmittel,
wie z.B. Wasser für
Injektionszwecke, Kochsalzlösung,
gehärtete Öle, Polyethylenglykole,
Glycerin, Propylenglykol oder andere synthetische Lösungsmittel;
antibakterielle Mittel, wie z.B. Benzylalkohol oder Methylparabene;
Antioxidantien, wie z.B. Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Chelatbildner,
wie z.B. Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer, wie z.B. Acetate, Citrate
oder Phosphate; und Tonizitätsregler,
wie z.B. Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH kann mit Säuren oder
Basen, wie z.B. Salzsäure
oder Natriumhydroxid, eingestellt werden. Das parenterale Präparat kann
in Ampullen, Einwegspritzen oder Mehrfachdosenphiolen aus Glas oder
Kunststoff enthalten sein.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen, die zur Injektion geeignet sind, umfassen sterile
wässrige
Lösungen
(wenn wasserlöslich)
oder Dispersionen und sterile Pulver zur frischen Zubereitung von
sterilen injizierbaren Lösungen
oder Dispersionen. Zur intravenösen
Verabreichung geeignete Träger
umfassen physiologische Kochsalzlösung, bakteriostatisches Wasser,
Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ, USA)
oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). In allen Fällen muss
die Zusammensetzung steril sein und sollte ausreichend fließfähig, um
leicht mit einer Spritze verabreicht werden zu können. Sie sollte unter den
Herstellungs- und Lagerbedingungen stabil sein und muss gegen Verunreinigung
durch Mikroorganismen wie Bakterien und Pilze geschützt sein.
Der Träger
kann ein Lösungsmittel
oder ein Dispersionsmedium sein, das beispielsweise Wasser, Ethanol,
Polyol (z.B. Glycerin, Propylenglykol, flüssiges Polyethylenglykol und
dergleichen) und geeignete Gemische daraus enthält. Die geeignete Fließfähigkeit
kann beispielsweise mithilfe eines Überzugs wie Lecithin, durch
Beibehaltung der erwünschten
Teilchengröße im Falle
einer Dispersion oder durch den Einsatz von Tensiden beibehalten
werden. Die Wirkung von Mikroorganismen kann verhindert werden,
indem verschiedene antibakterielle und antifungale Mittel, wie z.B.
Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und dergleichen,
zugesetzt werden. In vielen Fällen
werden vorzugsweise Isotonisierungsmittel, beispielsweise Zucker,
Polyalkohole, wie z.B. Mannit, Sorbit, Natriumchlorid, zur Zusammensetzung
zugesetzt. Eine verlängerte
Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann erreicht werden,
indem ein Mittel zur Zusammensetzung zugesetzt wird, das die Absorption
verzögert,
wie z.B. Aluminiummonostearat und Gelatine.
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Sterile
Injektionslösungen
können
hergestellt werden, indem die aktive Verbindung in gewünschter Menge
in ein geeignetes Lösungsmittel
mit oder ohne eine(r) Kombination der oben beschriebenen Bestandteile
miteinbezogen wird, gefolgt von Sterilfiltration. Im Allgemeinen
werden Dispersionen durch Einführung
der aktiven Verbindung in ein steriles Vehikel hergestellt, das
ein Grunddispersionsmedium und die erforder lichen der oben genannten übrigen Bestandteile
enthält.
In Falle von sterilen Pulvern zur Herstellung von sterilen Injektionslösungen umfassen
die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung, was
ein Pulver des Wirkstoffs und eines beliebigen weiteren gewünschten
Bestandteils der zuvor sterilfiltrierten Lösung ergibt.
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Orale
Zusammensetzungen umfassen im Allgemeinen einen inerten Verdünner oder
einen essbaren Träger.
Zum Zwecke von oraler therapeutischer Verabreichung kann die aktive
Verbindung mit Exzipienten versetzt und in Form von Tabletten, Pastillen
oder Kapseln, z.B. Gelatinekapseln, verwendet werden. Orale Zusammensetzungen
können
auch mithilfe eines flüssigen
Trägers
als Mundwasser hergestellt werden. Pharmazeutisch verträgliche Bindemittel
und/oder Hilfsmaterialien können
Teil der Zusammensetzung sein. Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen
und dergleichen können
beliebige der folgenden Bestandteile oder Verbindungen ähnlicher
Natur enthalten: ein Bindemittel, wie z.B. mikrokristalline Cellulose,
Tragantgummi oder Gelatine; einen Exzipienten, wie z.B. Stärke oder
Lactose; ein Aufschlussmittel, wie z.B. Alginsäure, PrimogelTM oder Maisstärke; ein
Gleitmittel, wie z.B. Magnesiumstearat oder SterotesTM;
ein Gleitmittel, wie z.B. kolloidale Kieselsäure; ein Süßungsmittel, wie z.B. Saccharose
oder Saccharin; oder einen Geschmacksstoff, wie z.B. Pfefferminze,
Methylsalicylat oder Orangenaroma.
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Zur
Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen in Form eines
Aerosol-Sprays aus
einem unter Druck stehenden Behälter
oder Dispenser, der ein geeignetes Treibmittel, z.B. ein Gas wie
Kohlendioxid, oder einen Vernebler enthält, abgegeben.
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Systemische
Verabreichung kann auch auf transmukosale oder transdermale weise
erfolgen. Bei transmukosaler oder transdermaler Verabreichung werden
für die
zu überwindende
Barriere geeignete Penetrationsverbesserer in der Formulierung eingesetzt.
Solche Penetrationsverbesserer sind auf dem Gebiet der Erfindung
allgemein bekannt und umfassen zur transmukosalen Verabreichung
beispielsweise Detergenzien, Gallensalze und Fusidinsäurederivate.
Transmukosale Verabreichung kann unter Verwendung von Nasensprays
oder Zäpfchen
erfolgen. Bei transdermaler Verabreichung werden die aktiven Verbindungen
zu Salben, Balsamen, Gelen oder Cremes formuliert, wie sie auf dem
Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind.
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Die
Verbindungen können
auch in Form von Zäpfchen
(z.B. mit herkömmlichen
Zäpfchenbasen
wie Kakaobutter und anderen Glyceriden) oder Bleibeklistieren zur
rektalen Zufuhr bereitgestellt werden.
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In
einer Ausführungsform
werden die Wirkstoffverbindungen mit Trägern hergestellt, welche die
Verbindung gegen eine rasche Ausscheidung aus dem Körper schützen, wie
z.B. eine Retardformulierung, einschließlich von Implantaten und mikroverkapselten
Zufuhrsystemen. Biologisch abbaubare, biokompatible Polymere können eingesetzt
werden, wie z.B. Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglykolsäure, Collagen,
Polyorthoester und Polymilchsäure.
Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen sind Fachleuten
auf dem Gebiet der Erfindung gut bekannt. Die Materialien können auch
im Handel von Alza Corporation und Nova Pharmaceuticals, Inc. bezogen
werden. Liposomale Suspensionen (einschließlich von Liposomen, die mithilfe von
monoklonalen Antikörpern
gegen virale Antigene auf infizierte Zellen ausgerichtet sind) können auch
als pharmazeutisch annehmbare Träger
eingesetzt werden. Diese können
gemäß bereits
beschriebenen Verfahren hergestellt werden (z.B. US-Patent Nr. 4.522.811).
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Es
ist von Vorteil, orale oder parenterale Zusammensetzungen in Enheitsdosierungsformen
bereitzustellen, um die Verabreichung und Gleichförmigkeit
der Dosierung zu vereinfachen. Enheitsdosierungsformen beziehen
sich hierin auf physikalisch getrennte Einheiten, die als Dosiseinheiten
für das
zu behandelnde Individuum geeignet sind; jede Einheit enthält eine
vorgegebene Menge einer aktiven Verbindung, die so berechnet wurde,
dass eine gewünschte
therapeutische Wirkung erzielt wird, zusammen mit dem erforderlichen
pharmazeutischen Träger.
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Die
Toxizität
und therapeutische Wirksamkeit solcher Verbindungen können mithilfe
von herkömmlichen
pharmazeutischen Verfahren in Zellkulturen oder Versuchstie ren,
z.B. zur Bestimmung der LD50 (für 50% der
Population letale Dosis) und der ED50 (Dosis,
die bei 50% der Population therapeutisch wirksam ist), bestimmt
werden. Das Dosenverhältnis
zwischen toxischer und therapeutischer Wirkung ist die therapeutische Breite
und kann als Verhältnis
LD50:ED50 ausgedrückt werden.
Verbindungen mit hohen therapeutischen Breiten sind bevorzugt. Verbindungen
mit toxischen Nebenwirkungen können
zwar verwendet werden, es sollte aber darauf geachtet werden, ein
Zufuhrsystem zu konzipieren, das solche Verbindungen auf die betroffene Gewebestelle
ausrichtet, um mögliche
Schäden
an nichtinfizierten Zellen zu minimieren und so die Nebenwirkungen
zu verringern.
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Die
aus den Zellkulturtests und Tieruntersuchungen erhaltenen Daten
können
zur Formulierung verschiedener Dosen zum Einsatz beim Menschen genutzt
werden. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise im
Bereich von Konzentrationen im Kreislauf, welche die ED50 mit
geringer oder keiner Toxizität umfassen.
Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs je nach verwendeter
Dosierungsform und genutztem Verabreichungsweg variieren. Für jede im
Verfahren der Erfindung eingesetzte Verbindung kann die therapeutisch
wirksame Dosis anfangs anhand der Zellkulturtests abgeschätzt werden.
Eine Dosis kann dann in Tiermodellen formuliert werden, um einen
Plasmakonzentrationsbereich im Kreislauf zu erhalten, der die IC50 umfasst (d.h. die Konzentration der Testverbindung,
die eine halbmaximale Hemmung von Symptomen erreicht), die in einer
Zellkultur bestimmt wurde. Solche Informationen können genutzt
werden, um für
Menschen nützliche
Dosen genauer zu bestimmen. Plasmaspiegel können beispielsweise durch Hochleistungsflüssigchromatographie
gemessen werden.
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Eine
therapeutisch wirksame Menge eines Proteins oder Polypeptids (d.h.
eine wirksame Dosis) liegt gemäß der hierin
verwendeten Definition bei etwa 0,001 bis 30 Milligramm pro Kilogramm
Körpergewicht,
vorzugsweise etwa 0,01 bis 25 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht,
noch bevorzugter etwa 0,1 bis 20 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht,
noch bevorzugter etwa 1 bis 10 Milligramm pro Kilogramm, 2 bis 9
Milligramm pro Kilogramm, 3 bis 8 Milligramm pro Kilogramm, 4 bis
7 Milligramm pro Kilogramm oder 5 bis 6 Milligramm pro Kilogramm
Körpergewicht.
Das Protein oder Polypeptid kann einmal pro Woche über einen
Zeitraum von etwa 1 bis 10 Wochen, vorzugsweise etwa 2 bis 8 Wochen,
noch bevorzugter etwa 3 bis 7 Wochen, noch bevorzugter etwa 4, 5
oder 6 Wochen, verabreicht werden. Fachleuten auf dem Gebiet der
Erfindung ist klar, dass bestimmte Faktoren die Dosierung und zeitliche
Steuerung beeinflussen können,
die für
eine wirksame Behandlung eines Individuums erforderlich sind, einschließlich, nicht
jedoch darauf beschränkt,
der Schwere der Krankheit oder des Leidens, vorangegangener Behandlungen,
des allgemeinen Gesundheitszustands und/oder des Alters des Individuums
und anderer krankheitsbezogener Aspekte. Außerdem kann die Behandlung
eines Individuums mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines
Proteins, Polypeptids oder Antikörpers
eine einzige Behandlung oder vorzugsweise eine Reihe von Behandlungen
umfassen.
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In
Bezug auf Antikörper
liegt die bevorzugte Dosierung bei 0,1 Milligramm pro Kilogramm
Körpergewicht
(im Allgemeinen 10 bis 20 Milligramm pro Kilogramm). Wenn der Antikörper im
Gehirn wirken soll, ist üblicherweise
eine Dosierung von 50 bis 100 Milligramm pro Kilogramm geeignet.
Im Allgemeinen weisen teilweise menschliche Antikörper und
vollkommen menschliche Antikörper
eine längere
Halbwertszeit im menschlichen Körper
auf als andere Antikörper.
Demgemäß sind häufig niedrigere
Dosierungen und weniger häufige Verabreichungen
möglich.
Modifikationen, wie z.B. eine Lipidierung, können verwendet werden, um Antikörper zu
stabilisieren und die Aufnahme und Gewebepenetration (z.B. in das
Gehirn) zu steigern. Ein Verfahren zur Lipidierung von Antikörpern wird
von Cruikshank et al. (J. AIDS Hum. Retrovir. 14, 193 (1997)) beschrieben.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst auch Mittel, die Expression oder Aktivität modulieren.
Solch ein Mittel kann beispielsweise ein kleines Molekül sein.
Solche kleine Moleküle
umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Peptide, Peptidomimetika
(z.B. Peptoide), Aminosäuren,
Aminosäureanaloga,
Polynucleotide, Polynucleotidanaloga, Nucleotide, Nucleotidanaloga,
organische oder anorganische Verbindungen (d.h. einschließlich heteroorganischer
und organometallischer Verbindungen) mit einem Molekulargewicht
von weniger als etwa 10.000 Gramm pro Mol, organische oder anor ganische
Verbindungen mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 5.000
Gramm pro Mol, organische oder anorganische Verbindungen mit einem
Molekulargewicht von weniger als etwa 1.000 Gramm pro Mol, organische
oder anorganische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von weniger
als etwa 500 Gramm pro Mol sowie Salze, Ester und andere pharmazeutisch annehmbare
Formen solcher Verbindungen.
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Beispiele
für Dosen
umfassen Milligramm- oder Mikrogrammmengen des kleinen Moleküls pro Kilogramm
Körper-
oder Probengewicht (z.B. etwa 1 Mikrogramm pro Kilogramm bis etwa
500 Milligramm pro Kilogramm, etwa 100 Mikrogramm pro Kilogramm
bis etwa 5 Milligramm pro Kilogramm oder etwa 1 Mikrogramm pro Kilogramm
bis etwa 50 Mikrogramm pro Kilogramm). Weiters versteht sich, dass
geeignete Dosen eines kleinen Moleküls von der Wirkung des kleinen
Moleküls
auf die zu modulierende Expression oder Aktivität abhängen. Wenn eines oder mehrerer
dieser kleinen Moleküle
einem Tier (z.B. einem Menschen) verabreicht werden sollen, um die
Expression oder Aktivität
eines Polypeptids oder einer Nucleinsäure der Erfindung zu modulieren,
kann der Arzt, Veterinär
oder Forscher beispielsweise zu Beginn eine sehr niedrige Dosis
verschreiben, und die Dosis dann erhöhen, bis eine geeignete Reaktion
erzielt wird. Außerdem
versteht sich, dass die für
ein jeweiliges Tier spezifische Dosis von verschiedenen Faktoren,
einschließlich
der Aktivität
der jeweiligen Verbindung, des Alters, des Körpergewichts, des allgemeinen
Gesundheitszustands, des Geschlechts und der Ernährung des Individuums sowie
der Dauer der Verabreichung, des Verabreichungswegs, der Ausscheidungsgeschwindigkeit,
der Kombination mit anderen Arzneimitteln und des Modulationsgrads
der Expression oder Aktivität
abhängt.
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Ein
Antikörper
(oder Fragment davon) kann an eine therapeutische Gruppierung, wie
z.B. ein Zytotoxin, ein Therapeutikum oder ein radioaktives Metallion
konjugiert werden. Ein Zytotoxin oder ein zytotoxisches Mittel umfasst
jegliche Mittel, die schädlich
für Zellen
sind. Beispiele umfassen Taxol, Cytochalasin B, Gramicidin D, Ethidiumbromid,
Emetin, Mitomycin, Etoposid, Tenoposid, Vincristin, Vinblastin,
Colchicin, Doxorubicin, Daunorubicin, Dihydroxyanthracindion, Mitoxantron,
Methramycin, Actino mycin D, 1-Dehydrotestosteron, Glucocorticoide,
Procain, Tetracain, Lidocain, Propanolol und Puromycin und Analoga
oder Homologe davon. Therapeutika umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf
Antimetabolite (z.B. Methotrexat, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin,
Cytarabin, 5-Fluoruracildecarbazin), Alkylierungsmittel (z.B. Mechlorethamin,
Thioepachlorambucil, Melphalan, Carmustin (BSNU) und Lomustin (CCNU),
Cyclothosphamid, Busulfan, Dibrommannit, Streptozotocin, Mitomycin
C und cis-Dichlordiamin-platin-(II) (DDP; Cisplatin), Anthracycline
(z.B. Daunorubicin (früher
Daunomycin) und Doxorubicin), Antibiotika (z.B. Dactinomycin (früher Actinomycin),
Bleomycin, Mithramycin und Anthramycin (AMC)) und Antimitotika (z.B.
Vincristin und Vinblastin).
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Die
Konjugate der Erfindung können
zur Modifikation einer vorgegebenen biologischen Reaktion eingesetzt
werden, und die Arzneimittelgruppierung ist nicht auf klassische
chemische Therapeutika beschränkt. Die
Arzneimittelgruppierung kann beispielsweise ein Protein oder ein
Polypeptid sein, das eine gewünschte biologische
Aktivität
aufweist. Solche Proteine können
beispielsweise Toxine, wie z.B. Abrin, Ricin A, Gelonin, Pseudomonasexotoxin
oder Diphtherietoxin; Proteine, wie z.B. Tumornekrosefaktoren, α-Interferon, β-Interferon,
Nervenwachstumsfaktoren, Blutplättchenaktivierungsfaktoren,
Gewebeplasminogenaktivatoren; oder Modifikatoren von biologischen
Reaktionen, wie z.B. Lymphokine, Interleukine-1, -2 und -6, Granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierende
Faktoren, Granulozytenkolonie-stimulierende Faktoren oder andere
Wachstumsfaktoren umfassen.
-
Alternativ
dazu kann ein Antikörper
an einen zweiten Antikörper
konjugiert sein, um ein Antikörper-Heterokonjugat
zu bilden, wie es von Segal im US-Patent Nr. 4.676.980 beschrieben
wurde.
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Die
Nucleinsäuremoleküle der Erfindung
können
in Vektoren insertiert und als Gentherapievektoren eingesetzt werden.
Gentherapievektoren können
einem Individuum beispielsweise durch intravenöse Injektion, lokale Verabreichung
(siehe US-Patent Nr. 5.328.470) oder stereotaktische Injektion (z.B.
Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3054-3057 (1994)) verabreicht
werden. Die pharmazeutische Zusammen setzung des Gentherapievektors
kann den Gentherapievektor in einem annehmbaren Verdünner umfassen
oder eine Retardmatrix aufweisen, in der das Genzufuhrvehikel eingebettet
ist. Alternativ dazu kann, wenn der gesamte Genzufuhrvektor intakt
aus rekombinanten Zellen hergestellt werden kann, z.B. bei retroviralen
Vektoren, das pharmazeutische Präparat
eine oder mehrere Zellen umfassen, die das Genzufuhrsystem produzieren.
-
Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einem Behälter, einer
Verpackung oder einem Dispenser zusammen mit Anleitungen zur Verabreichung
enthalten sein.
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Behandlungsverfahren
-
Die
vorliegende Erfindung stellt sowohl prophylaktische als auch therapeutische
Verfahren zur Behandlung eines Individuums bereit, das gefährdet ist,
an einem Leiden im Zusammenhang mit aberrierender oder unerwünschter
13245-Expression oder -Aktivität
zu erkranken (bzw. dafür
anfällig
ist), oder an solch einer Krankheit leidet. Sowohl bei prophylaktischen
als auch bei therapeutischen Behandlungsverfahren kann eine solche
Behandlung basierend auf den Kenntnissen auf dem Gebiet der Pharmakogenomik
spezifisch zugeschnitten oder modifiziert sein. "Pharmakogenomik" bezieht sich hierin auf die Anwendung
von genomischen Verfahren, wie z.B. Gensequenzierung, statistischer
Genetik und Genexpressionsanalysen auf die Analyse von Arzneimitteln
in der klinischen Entwicklung und auf dem Markt. Genauer gesagt
bezieht sich der Begriff auf die Untersuchung darüber, wie
die Gene eines Patienten seine Reaktion auf ein Arzneimittel bestimmen (z.B.
den "Arzneimittelreaktionstyp" oder "Arzneimittelreaktionsgenotyp" eines Patienten).
Somit stellt ein anderer Aspekt der Erfindung Verfahren zum Maßschneidern
der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung eines Individuums
mit entweder den 13245-Molekülen
der vorliegenden Erfindung oder 13245-Modulatoren auf den Arzneimittelreaktionsgenotyp
des Individuums bereit. Die Pharmakogenomik erlaubt es dem Kliniker
oder Arzt, prophylaktische oder therapeutische Behandlungen auf
Patienten auszurichten, die am meisten von der Behandlung profitieren,
und die Behandlung von Patienten zu vermeiden, die an toxischen Nebenwirkungen
der Arzneimittel leiden würden.
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Behandlung
ist als Anwendung oder Verabreichung eines Therapeutikums an einen
Patienten oder als Anwendung oder Verabreichung eines Therapeutikums
an isoliertes Gewebe oder eine Zelllinie von einem Patienten definiert,
der an einer Krankheit, einem Symptom einer Krankheit oder einer
Prädisposition
für eine Krankheit
leidet, und zwar mit dem Zweck, die Krankheit, die Symptome der
Krankheit oder die Prädisposition für eine Krankheit
zu kurieren, heilen, lindern, mildern, ändern, verbessern, mindern
oder beeinflussen bzw. ihr abzuhelfen.
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Therapeutika
umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, kleine Moleküle, Peptide,
Antikörper,
Ribozyme und Antisense-Oligonucleotide.
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In
einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Vorbeugung gegen
eine Krankheit oder ein Leiden in Zusammenhang mit aberrierender
oder unerwünschter
13245-Expression oder -Aktivität
in einem Individuum bereit, indem dem Individuum 13245 oder ein
Mittel, das 13245-Expression oder zumindest eine 13245-Aktivität moduliert,
verabreicht wird. Individuen, für
die ein Risiko besteht, an einem Leiden zu erkranken, das durch
aberrierende oder unerwünschte
13245-Expression oder -Aktivität
verursacht wird oder zu dem diese beitragen, können beispielsweise durch einen
beliebigen oder eine Kombination aus den hierin beschriebenen diagnostischen
und prognostischen Tests identifiziert werden. Die Verabreichung
eines prophylaktischen Mittel kann vor der Manifestation von Symptomen
erfolgen, die charakteristisch für
eine 13245-Abweichung sind, sodass eine Krankheit oder ein Leiden
verhindert oder, alternativ dazu, ihr/sein Fortschreiten verzögert wird.
Je nach Art der 13245-Abweichung kann beispielsweise ein 13245-Protein,
13245-Agonist oder 13245-Antagonsit zur Behandlung des Individuums
verwendet werden. Das geeignete Mittel kann anhand von Screening-Tests,
wie sie hierin beschrieben sind, bestimmt werden.
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Es
ist möglich,
dass manche 13245-Leiden, zumindest teilweise, durch einen abnormalen
Spiegel eines Genprodukts verursacht werden, oder durch die Gegenwart
eines Genprodukts, das abnormale Aktivität aufweist. Somit würde die
Verringerung des Spiegels und/oder der Aktivität solcher Genprodukte zu einer
Linderung von Krankheitssymptomen führen.
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Wie
erläutert
kann eine erfolgreiche Behandlung von 13245-Leiden durch Verfahren
erfolgen, die dazu dienen, die Expression oder Aktivität von Zielgenprodukten
zu hemmen. Beispielsweise können
Verbindungen, z.B. ein Mittel, das durch einen oben beschriebenen
Test identifiziert wurde und negative modulatorische Aktivität aufweist,
gemäß der Erfindung
eingesetzt werden, um Symptome von 13245-Leiden zu verhindern und/oder
zu lindern. Solche Moleküle
können
Peptide, Phosphopeptide, kleine organische oder anorganische Moleküle oder
Antikörper
(einschließlich
z.B. polyklonaler, monoklonaler, humanisierter, antiidiotypischer,
chimärer
oder einkettiger Antikörper
sowie Fab, F(ab')2 und Fab-Expressionsbibliothekfragmenten,
scFV-Molekülen
und epitopbindenden Fragmenten davon) umfassen, sind jedoch nicht
darauf beschränkt.
-
Außerdem können auch
Antisense- und Ribozym-Moleküle,
welche die Expression des Zielgens hemmen, gemäß der Erfindung eingesetzt
werden, um das Ausmaß der
Zielgenexpression zu verringern, wodurch der Grad der Zielgenaktivität wirksam
reduziert wird. Außerdem
können
Tripelhelix-Moleküle
zur Verringerung der Zielgenaktivität eingesetzt werden. Antisense-,
Ribozym- und Tripelhelix-Moleküle
wurden zuvor erläutert.
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Es
ist möglich,
dass der Einsatz von Antisense-, Ribozym- und Tripelhelix-Molekülen zur
Verringerung oder Hemmung der Expression von mutierten Genen auch
die Transkription (Tripelhelix) und/oder Translation (Antisense,
Ribozym) von mRNA verringern oder hemmen kann, die durch normale
Zielgenallele produziert wird, sodass die Konzentration des normalen
Zielgenprodukts, das vorhanden ist, geringer sein kann, als dies für einen
normalen Phänotyp
erforderlich ist. In solchen Fällen
können
Nucleinsäuremoleküle, die
für Genpolypeptide
mit normaler Zielgenaktivität
kodieren und diese exprimieren, mithilfe von gentherapeutischen
Verfahren in Zellen eingeführt
werden. Alternativ dazu kann es, wenn das Zielgen für ein extrazelluläres Protein kodiert,
zu bevorzugen sein, gleichzeitig ein normales Zielgenprotein in
die Zelle oder das Gewebe einzuführen,
um den erforderlichen Grad an zellulärerer oder Gewebe-Zielgenaktivität aufrechtzuerhalten.
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Ein
weiteres Verfahren zur Verwendung von Nucleinsäuremolekülen bei der Behandlung einer
oder Vorbeugung gegen eine Krankheit, die durch 13245-Expression
charakterisiert ist, basiert auf der Verwendung von Aptamermolekülen, die
für ein
13245-Protein spezifisch
sind. Aptamere sind Nucleinsäuremoleküle mit einer
Tertiärstruktur,
die es ihnen erlaubt, spezifisch an Proteinliganden zu binden (z.B.
Osborne et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1, 5-9 (1997); Patel, Curr.
Opin. Chem. Biol., 1, 32-46 (1997)). Da Nucleinsäuremoleküle in vielen Fällen leichter
in Zielzellen eingeführt
werden können
als therapeutische Proteinmoleküle,
bieten Aptamere ein Verfahren, durch das 13245-Proteinaktivität spezifisch
verringert werden kann, ohne dass Arzneimittel oder andere Moleküle eingeführt werden
müssen,
die pluripotente Wirkungen zeigen können.
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Es
können
Antikörper
erzeugt werden, die sowohl für
ein Zielgenprodukt spezifisch sind als auch die Zielgenproduktaktivität verringern.
Solche Antikörper
können
in manchen Fällen
verabreicht werden, sodass negative modulatorische Verfahren zur
Behandlung von 13245-Leiden geeignet sind.
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In
Fällen,
in denen die Injektion eines 13245-Proteins oder -Epitops an ein
Tier oder einen Menschen zur Stimulierung der Antikörperproduktion
für das
Individuum schädlich
ist, kann durch den Einsatz von antiidiotypischen Antikörpern eine
Immunantwort gegen 13245 erzeugt werden (z.B. Herlyn, Ann. Med.
31, 66-78 (1999); Bhattacharya-Chatterjee et al., Cancer Treat.
Res. 94, 51-68 (1998)). Wenn ein antiidiotypischer Antikörper in
ein Säugetier
oder einen Menschen eingeführt
wird, sollte dieser die Produktion von antiantiidiotypischen Antikörpern stimulieren,
die für
das 13245-Protein spezifisch sein sollten. Vakzinen, die gegen eine durch
13245-Expres sion gekennzeichnete Krankheit gerichtet sind, können ebenfalls
auf diese Weise hergestellt werden.
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In
Fällen,
in denen das Zielantigen intrazellulär ist und ganze Antikörper verwendet
werden, kann eine Internalisierung von Antikörpern bevorzugt sein. Lipofectin
oder Liposomen können
eingesetzt werden, um den Antikörper
oder ein Fragment der Fab-Region, das an das Zielantigen bindet,
in Zellen einzuführen.
Wenn Fragmente des Antikörpers
eingesetzt werden, ist das kleinste hemmende Fragment bevorzugt,
welches das Zielantigen bindet. Peptide mit einer Aminosäuresequenz,
die der Fv-Region
des Antikörpers
entsprechen, können
beispielsweise eingesetzt werden. Alternativ dazu können auch
einkettige neutralisierende Antikörper, die an intrazelluläre Zielantigene
binden, verabreicht werden. Solche einkettige Antikörper können beispielsweise
durch Expression von Nucleotidsequenzen, die für einkettige Antikörper kodieren,
innerhalb der Zielzellpopulation verabreicht werden (z.B. Marasco
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)).
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Die
identifizierten Verbindungen, die Zielgenexpression, -synthese und/oder
-aktivität
hemmen, können
einem Patienten in therapeutisch wirksamen Dosen verabreicht werden,
um 13245-Leiden zu verhindern, behandeln oder lindern. Eine therapeutisch
wirksame Dosis entspricht jener Menge der Verbindung, die ausreicht,
um eine Linderung der Symptome der Leiden zu erreichen.
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Die
Toxizität
und therapeutische Wirksamkeit solcher Verbindungen können durch
herkömmliche
pharmazeutische Verfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt
werden, beispielsweise solche zur Bestimmung der LD50 (der
für 50%
der Population letalen Dosis) und der ED50 (Dosis,
die bei 50% der Population therapeutisch wirksam ist). Das Dosenverhältnis zwischen
toxischen und therapeutischen Wirkungen ist die therapeutische Breite
und kann als Verhältnis
LD50:ED50 ausgedrückt werden.
Verbindungen mit hohen therapeutischen Breiten sind bevorzugt. Verbindungen
mit toxischen Nebenwirkungen können
zwar verwendet werden, es sollte aber darauf geachtet werden, ein
Zufuhrsystem zu konzipieren, das solche Verbin dungen auf die betroffene
Gewebestelle ausrichtet, um mögliche
Schäden
an nichtinfizierten Zellen zu minimieren und so die Nebenwirkungen
zu verringern.
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Die
aus den Zellkulturtests und Tieruntersuchungen erhaltenen Daten
können
zur Formulierung verschiedener Dosen zum Einsatz beim Menschen genutzt
werden. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise im
Bereich von Konzentrationen im Kreislauf, welche die ED50 mit
geringer oder keiner Toxizität umfassen.
Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs je nach verwendeter
Dosierungsform und genutztem Verabreichungsweg variieren. Für jede im
Verfahren der Erfindung eingesetzte Verbindung kann die therapeutisch
wirksame Dosis anfangs anhand von Zellkulturtests abgeschätzt werden.
Eine Dosis kann dann in Tiermodellen formuliert werden, um einen
Plasmakonzentrationsbereich im Kreislauf zu erhalten, der die IC50 umfasst (d.h. die Konzentration der Testverbindung,
die eine halbmaximale Hemmung von Symptomen erreicht), die in einer
Zellkultur bestimmt wurde. Solche Informationen können genutzt
werden, um für
Menschen nützliche
Dosen genauer zu bestimmen. Plasmaspiegel können beispielsweise durch Hochleistungsflüssigchromatographie
gemessen werden.
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Ein
weiteres Beispiel für
die Bestimmung einer für
ein Individuum wirksamen Dosis basiert auf der Möglichkeit, den Gehalt einer "freien" und "gebundenen" Verbindung im Serum
des Testindividuums direkt zu testen. Für solche Tests können Antikörpermimetika
und/oder "Biosensoren" eingesetzt werden,
die durch molekulare Prägeverfahren
erzeugt wurden. Die Verbindung, die zur Modulation von 13245-Aktivität in der
Lage ist, wird als Matrize, oder "Prägemolekül", verwendet, um polymerisierbare
Monomere vor ihrer Polymerisation mit katalytischen Reagenzien räumlich zu
organisieren. Die nachfolgende Entfernung des geprägten Moleküls hinterlässt eine
Polymermatrix, die ein wiederholtes "negatives Abbild" der Verbindung enthält und in der Lage ist, das
Molekül
unter biologischen Testbedingungen erneut selektiv zu binden. Detaillierte
Erläuterungen
dieses Verfahrens sind auf dem Gebiet der Erfindung vorhanden (Ansell
et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7, 89-94 (1996); Shea, Trends Polymer
Sci. 2, 166-173 (1994)). Solche "geprägten" Affinitätsmatrizen
sind für
Ligandenbindungstests geeignet, wodurch die immobilisierte monoklonale
Antikörperkomponente durch
eine passend geprägte
Matrix ersetzt wird (z.B. durch eine in Vlatakis et al., Nature
361, 645-647 (1993) beschrieben Matrix). Durch den Einsatz von Isotopmarkierung
kann die "freie" Konzentration einer
Verbindung, welche die Expression oder Aktivität von 13245 moduliert, leicht überwacht
und in IC50-Berechnungen miteinbezogen werden.
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Solche "geprägten" Affinitätsmatrizen
können
auch so konzipiert werden, dass sie fluoreszierende Gruppen enthalten,
deren Photonenemissionseigenschaften sich bei lokaler und selektiver
Bindung einer Zielverbindung messbar verändern. Diese Veränderungen
können
mithilfe von faseroptischen Vorrichtungen leicht in Echtzeit getestet
werden, was wiederum eine rasche Optimierung der Dosis für ein Testindividuum,
basierend auf seiner individuellen IC50 ermöglicht.
Ein rudimentäres
Beispiel für
solch eine "Biosensor" ist in Kriz et al.
(Anal. Chem. 67, 2142-2144 (1995)) beschrieben.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Modulation
der 13245-Expression oder -Aktivität für therapeutische Zwecke. Demgemäß umfasst
das Modulationsverfahren in einem Ausführungsbeispiel das Kontaktieren
einer Zelle mit 13245 oder einem Mittel, das eine oder mehrere der
13245-Proteinaktivitäten in
Zusammenhang mit der Zelle moduliert. Ein Mittel, das 13245-Proteinaktivittä moduliert,
kann ein hierin beschriebenes Mittel sein, wie z.B. eine Nucleinsäure oder
ein Protein, ein natürlich
vorkommendes Zielmolekül eines
13245-Proteins (z.B. ein 13245-Substrat oder -Rezeptor), ein 13245-Antikörper, ein
13245-Agonist oder -Antagonist, ein Peptidomimetikum eines 13245-Agonisten
oder -Antagonisten oder ein anderes kleines Molekül.
-
In
einer Ausführungsform
stimuliert das Mittel eine der 13245-Aktivitäten. Beispiele für solche
Stimulationsmittel umfassen ein aktives 13245-Protein und ein Nucleinsäuremolekül, das für 13245
kodiert. In einer weiteren Ausführungsform
hemmt das Mittel eine oder mehrere 13245-Aktivitäten. Beispiele für solche
Hemmstoffe umfassen Antisense-13245-Nucleinsäuremoleküle, Anti-13245-Antikörper und
13245-Inhibitoren. Diese Modulationsverfahren können in vitro (z.B. durch Kultivieren
der Zelle mit dem Mittel) oder alternativ dazu in vivo (z.B. durch
Verabreichung des Mittel an ein Individuum) durchgeführt werden.
Somit stellt die Erfindung Verfahren zur Behandlung eines Individuums
bereit, das von einer Erkrankung oder einem Leiden betroffen ist, die/das
durch aberrierende oder unerwünschte
Expression oder Aktivität
eines 13245-Proteins oder -Nucleinsäuremoleküls gekennzeichnet ist. In einer
Ausführungsform
umfasst das Verfahren die Verabreichung eines Mittels (z.B. eines
durch ein hierin beschriebenes Screening-Verfahren identifizierten
Mittels) oder einer Kombination von Mitteln, welche 13245-Expression
oder -Aktivität
modulieren (z.B. hochregulieren oder herabregulieren). In einer
weiteren Ausführungsform
umfasst das Verfahren die Verabreichung eines 13245-Proteins oder
-Nucleinsäuremoleküls als Therapie,
um verringerte, aberrierende oder unerwünschte 13245-Expression oder
-Aktivität
zu kompensieren.
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Die
Stimulierung einer 13245-Aktivität
ist in Fällen
wünschenswert,
in denen 13245 abnormal herabreguliert wird und/oder in denen eine
erhöhte
13245-Aktivität
wahrscheinlich positive Wirkung hat. Beispielsweise ist die Stimulierung
einer 13245-Aktivität
in Fällen
wünschenswert,
in denen 13245 abnormal herabreguliert wird und/oder in denen eine
erhöhte
13245-Aktivität
wahrscheinlich positive Wirkung hat. Auf ähnliche Weise ist die Stimulierung
einer 13245-Aktivität
ist in Fällen
wünschenswert,
in denen 13245 abnormal hochreguliert wird und/oder in denen eine
verringerte 13245-Aktivität wahrscheinlich
positive Wirkung hat.
-
Pharmakogenomik
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Die
13245-Moleküle
der vorliegenden Erfindung sowie Mittel oder Modulatoren, die eine
stimulierende oder hemmende Wirkung auf eine 13245-Aktivität (z.B.
13245-Genexpression)
haben, wie durch einen hierin beschriebenen Screening-Test identifiziert
wurde, können
an Individuen verabreicht werden, um 13245-assoziierte Leiden in
Zusammenhang mit aberrierender oder unerwünschter 13245-Aktivität (prophylaktisch
oder therapeutisch) zu behandeln (z.B. Leiden in Zusammenhang mit
Tumorgenese oder der Induktion einer geeigneten Immunantwort). In
Zusammenhang mit solch einer Behandlung kann die Pharmakogenomik
(d.h. die Untersuchung der Be ziehung zwischen dem Genotyp eines
Individuums und seiner Reaktion auf eine Fremdverbindung oder ein
Arzneimittel) berücksichtigt
werden. Unterschiede im Metabolismus in Bezug auf Therapeutika können zu
starker Toxizität
oder therapeutischem Versagen führen,
wenn die Beziehung zwischen Dosis und der Konzentration des pharmakologisch
aktiven Arzneimittels im Blut nicht verändert wird. Somit kann ein
Arzt oder Kliniker in Betracht ziehen, in relevanten pharmakogenomischen
Studien gewonnene Erkenntnisse heranziehen, um zu bestimmen, ob
ein 13245-Molekül
oder ein 13245-Modulator verabreicht werden soll, sowie zur Anpassung
der Dosierung und/oder des Therapieschemas der Behandlung mit einem 13245-Molekül oder 13245-Modulator.
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Die
Pharmakogenomik beschäftigt
sich mit klinisch signifikanten erblichen Variationen in der Reaktion auf
Arzneimittel aufgrund von verändertem
Arzneimittelabbau und abnormaler Wirkungen in betroffenen Personen
(z.B. Eichelbaum et al., Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23, 983-985
(1996); Linder et al., Clin. Chem. 43, 254-266 (1997)). Im Allgemeinen
können
zwei Arten von pharmakogenetischen Erkrankungen unterschieden werden.
Genetische Erkrankungen, die als Einzelfaktor weitergegeben werden
und die Weise ändern,
wie Arzneimittel auf den Körper
wirken (veränderte
Arzneimittelwirkung), oder genetische Erkrankungen, die als Einzelfaktor
weitergegeben werden und die Art und Weise ändern, wie der Körper auf
Arzneimittel reagiert (veränderter
Arzneimittelstoffwechsel). Diese pharmakogenetischen Erkrankungen
können
entweder als seltene genetische Defekte oder als natürlich vorkommenden
Polymorphismen auftreten. Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase- (G6PD-)
Defizienz ist beispielsweise eine häufig vererbte Enzymopathie,
deren wichtigste klinische Komplikation eine Hämolyse nach der Einnahme von
oxidierenden Arzneimitteln (z.B. Malariamittel, Sulfonamide, Analgetika,
Nitrofurane) und dem Konsum von Ackerbohnen darstellt.
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Ein
pharmakogenomischer Ansatz zur Identifikation von Genen, welche
die Reaktion auf ein Arzneimittel vorhersagen, bekannt als "genomweite Assoziation", beruht hauptsächlich auf
einer hochaufgelösten Karte
des menschlichen Genoms aus schon bekannten genbezogenen Markern
(z.B. eine "biallelische" Genmarkerkarte,
die aus 60.000-100.000 polymorphen oder variablen Stellen auf dem
menschlichen Genom besteht, von denen jedes zwei Varianten aufweist).
Solch eine hochaufgelöste
genetische Karte kann mit den Genomkarte einer statistisch signifikanten
Anzahl an Patienten verglichen werden, die an einer Phase-II/III-Arzneimittelprüfung zur
Identifikation von Markern teilnehmen, die mit einer bestimmten
beobachteten Arzneimittelreaktion oder Nebenwirkung zusammenhängen. Alternativ
dazu kann solch eine hochaufgelöste
Karte aus einer Kombination von etwa 10 Millionen bekannten Einzelnucleotidaustauschen
(single nucleotide polymorphism, SNP) im Humangenom erzeugt werden. "SNP" steht hierin für eine häufige Veränderung,
die in einer einzelnen Nucleotidbase einer DNA-Kette stattfindet.
Ein SNP kann beispielsweise einmal alle 100 Basen einer DNA auftreten.
Und eine SNP kann an einem Krankheitsprozess beteiligt sein, obwohl
der Großteil
nicht mit einer Krankheit in Verbindung stehen kann. Ausgehend von
einer genetischen Karte, die auf der Häufigkeit von NSPs basiert,
können
Individuen je nach dem SNP-Muster in einem Genom in genetische Kategorien
eingeteilt werden. Auf diese Weise können Behandlungsschemata für Gruppen
aus genetisch ähnlichen
Individuen maßgeschneidert
werden, wobei Merkmale berücksichtigt
werden, die bei solch genetisch ähnlichen
Individuen häufig
auftreten.
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Alternativ
dazu kann zur Identifikation von Genen, die eine Reaktion auf ein
Arzneimittel voraussagen, ein Verfahren eingesetzt werden, das als "Kandidatengenansatz" bezeichnet wird.
Gemäß diesem
Verfahren können,
wenn ein für
das Arzneimittelziel kodierendes Gen (z.B. ein 14245-Protein der
vorliegenden Erfindung) bekannt ist, alle häufigen Varianten dieses Gens
relativ leicht in der Population identifiziert werden, und es kann
bestimmt werden, ob das Vorhandensein einer Version des Gens eher
mit einer bestimmten Reaktion auf ein Arzneimittel zusammenhängt als
das einer anderen Version.
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Alternativ
dazu kann zur Identifikation von Genen, die eine Reaktion auf ein
Arzneimittel voraussagen, ein Verfahren eingesetzt werden, das als "Genexpressionsprofiling" bezeichnet wird.
Die Genexpression eines Tiers, dem eine Dosis eines Arzneimittels
(z.B. eines 13245-Moleküls
oder eines 13245-Modulators der vorliegenden Erfindung) verabreicht
wurde, kann beispielsweise anzeigen, ob mit einer Toxizität zusammenhängende Genwege
aktiviert wurden.
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Informationen,
die aus mehr als einem der oben genannten pharmakogenomischen Ansätze gewonnen
wurden, können
zur Bestimmung geeigneter Dosen und Behandlungsschemata zur prophylaktischen
oder therapeutischen Behandlung eines Individuums eingesetzt werden.
Dieses Wissen kann, wenn es auf die Dosierung oder Auswahl des Arzneimittels
angewandt wird, Nebenreaktionen oder therapeutisches Versagen verhindern
und so die therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit bei der
Behandlung eines Individuums mit einem 13245-Molekül oder 13245-Modulator,
wie z.B. einem durch einen der hierin beschriebenen exemplarischen
Screening-Tests
identifizierten Modulator, erhöhen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiters Verfahren zur Identifikation
von neuen Mittel oder Kombinationen bereit, die auf der Identifikation
von Mitteln basieren, welche die Aktivität eines oder mehrerer Genprodukte
modulieren, für
die eines oder mehrere der 13245-Gene der vorliegenden Erfindung
kodieren, worin diese Produkte mit der Resistenz der Zellen gegenüber einem
Therapeutikum in Verbindung gesetzt werden können. Genauer gesagt kann die
Aktivität
der Proteine, für
welche die 13245-Gene der vorliegenden Erfindung kodieren, als Basis
für die
Identifikation von Mitteln zur Überwindung
der Wirkstoffresistenz genutzt werden. Indem die Aktivität eines
oder mehrerer der Resistenzproteine blockiert wird, werden Zielzellen,
z.B. Zellen des Immunsystems, empfindlich für eine Behandlung mit einem
Mittel, gegen das die unmodifizierten Zielzellen resistent waren.
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Die Überwachung
des Einflusses von Mitteln (z.B. Arzneimittel) auf die Expression
oder Aktivität
eines 13245-Proteins kann in klinischen Tests genutzt werden. Die
Wirksamkeit eines durch einen hierin beschriebenen Screening-Tests
bestimmten Mittel bei der Steigerung der 13245-Expression, der Proteinwerte
oder der Hochregulierung der 13245-Aktivität kann in klinischen Studien
an Individuen überwacht
werden, die verringerte 13245-Genexpresison, Proteinwerte oder herabregulierte
13245-Aktivität aufweisen.
Alternativ dazu kann die Wirksamkeit eines durch einen Scree ning-Test
bestimmten Mittels bei der Verringerung der 13245-Expression, Proteinspiegel
oder Herabregulierung der 13245-Aktivität in klinischen Studien an
Individuen überwacht werden,
die erhöhte
13245-Genexpresison, Proteinspiegel oder hochregulierte 13245-Aktivität aufweisen.
In solchen klinischen Studien können
die Expression oder Aktivität
eines 13245-Gens und vorzugsweise auch anderer Gene, die beispielsweise
von einem 13245-assoziierten Leiden betroffen sind als "Anzeige" oder Marker des
Phänotyps
einer bestimmten Zelle genutzt werden.
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Weitere Ausführungsformen
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Analyse
mehrerer Fangsonden. Das Verfahren kann beispielsweise zur Analyse
von Genexpression eingesetzt werden. Das Verfahren umfasst: das
Bereitstellen eines zweidimensionalen Arrays mit mehreren Adressen,
wobei diese Adressen alle aufgrund ihrer Position voneinander unterscheidbar
sind, und worin jede dieser Adressen ein einzigartige Fangsonde aufweist,
z.B. eine Nucleinsäure-
oder Peptidsequenz; das Kontaktieren des Arrays mit einer, vorzugsweise gereinigten,
13245-Nucleinsäure,
einem, vorzugsweise gereinigten 13245-Polypeptid, einem, vorzugsweise gereinigten,
Antikörper
und dadurch das Beurteilen der Menge an Fangsonden. Bindung, im
Falle einer Nucleinsäure
beispielsweise die Hybridisierung an eine Fangsonde an einer dieser
zahlreichen Adressen, wird detektiert, beispielsweise durch ein
Signal, das durch eine an die 13245-Nucleinsäure, das 13245-Polypeptid oder
den 13245-Antikörper
gebundene Markierung erzeugt wird.
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Die
Fangsonden können
eine Gruppe von Nucleinsäuren
von einer ausgewählten
Probe, z.B. einer Nucleinsäureprobe
von Vergleichs- oder nichtstimulierten Geweben oder Zellen, sein.
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Das
Verfahren kann das Kontaktieren der 13245-Nucleinsäure, des
13245-Polypeptids oder des 13245-Antikörpers mit einem ersten Array
mit zahlreichen Fangsonden und einem zweiten mit einer anderen großen Anzahl
an Fangsonden umfassen. Die Ergebnisse der Hybridisierung können verglichen
werden, beispielsweise um Unter schiede in der Expression zwischen
einer ersten und einer zweiten Probe zu analysieren. Die erste Gruppe
der Fangsonden kann von einer Vergleichsprobe stammen, beispielsweise
einer Wildtyp-, normalen oder nicht erkrankten, nicht stimulierten
Probe, z.B. einer biologischen Flüssigkeit, von Gewebe oder einer
Zellprobe. Die zweite Gruppe von Fangsonden kann von einer Versuchsprobe
stammen, beispielsweise einer mutierten, risikobelasteten, erkrankten
oder stimulierten Probe, z.B. einer biologischen Flüssigkeit,
von Gewebe oder einer Zellprobe.
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Die
zahlreichen Fangsonden können
eine Reihe von Nucleinsäuresonden
sein, von denen jede spezifisch an ein Allel von 13245 hybridisiert.
Solche Verfahren können
eingesetzt werden, um eine Diagnose an einem Individuum durchzuführen, beispielsweise
um das Risiko für
eine Erkrankung oder ein Leiden zu beurteilen, die Eignung einer
ausgewählten
Behandlungsform für
ein Individuum zu beurteilen oder um zu beurteilen, ob ein Individuum
von einer Erkrankung oder einem Leiden betroffen ist. 13245 steht
in Verbindung mit Proteinphosphorylierung und ist somit zweckdienlich
zur Beurteilung von Leiden in Zusammenhang mit aberrierender Proteinphosphorylierung,
wie z.B. Tumorgenese und unangemessener Zellsignalgebung.
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Das
Verfahren kann verwendet werden, um SNPs zu detektieren, wie oben
beschrieben wurde.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Analyse
mehrerer Sonden. Das Verfahren ist beispielsweise zur Analyse von
Genexpression geeignet. Dieses Verfahren umfasst: das Bereitstellen
eines zweidimensionalen Arrays mit mehreren Adressen, wobei jede
dieser Adressen aufgrund ihrer Position von jeder anderen dieser
zahlreichen Adressen mit einer einzigartigen Fangsonde unterscheidbar
ist, worin die Fangsonden z.B. von einer Zelle oder einem Individuum
stammen, die 13245 exprimieren, oder von einer Zelle oder einem
Individuum, worin eine 13245-vermittelte Reaktion aufgetreten ist,
z.B. durch Kontakt der Zelle mit 13245-Nucleinsäure oder -Proteinen oder Verabreichung
von 13245-Nucleinsäure
oder Proteinen an die Zelle oder das Individuum; das Kontaktieren
des Arrays mit einer oder mehreren Abfragesonden, worin eine Abfragesonde
eine Nucleinsäure,
ein Polypep tid oder ein Antikörper
sein kann (die vorzugsweise keine 13245-Nucleinsäuren-, -Polypeptide oder -Antikörper sind);
das Bereitstellen eines zweidimensionalen Arrays mit zahlreichen
Adressen, wobei diese Adressen alle aufgrund ihrer Position voneinander
unterscheidbar sind, und worin jede dieser Adressen ein einzigartige
Fangsonde aufweist, worin die Fangsonden z.B. von einer Zelle oder
einem Individuum stammen, die 13245 nicht exprimieren (oder nicht
so stark exprimieren wie im Falle von zahlreichen 13245-positiven
Fangsonden) oder von einer Zelle oder einem Individuum, worin keine 13245-vermittelte
Reaktion aufgetreten ist (oder in geringerem Ausmaß aufgetreten
ist als in der ersten Probe); das Kontaktieren des Arrays mit einer
oder mehreren Abfragesonden (die vorzugsweise keine 13245-Nucleinsäuren, -Polypeptide
oder -Antikörper
sind) und dadurch das Beurteilen der Menge an Fangsonden. Bindung, in
Falle einer Nucleinsäure
beispielsweise die Hybridisierung an eine Fangsonde an einer dieser
zahlreichen Adressen, wird detektiert, beispielsweise durch ein
Signal, das durch eine an die Nucleinsäure, das Polypeptid oder den
Antikörper
gebundene Markierung erzeugt wird.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Analyse
mehrerer Sonden oder Proben. Dieses Verfahren ist beispielsweise
zur Analyse von Genexpression geeignet. Dieses Verfahren umfasst: das
Bereitstellen eines zweidimensionalen Arrays mit mehreren Adressen,
wobei jede dieser Adressen aufgrund ihrer Position von jeder anderen
dieser zahlreichen Adressen mit einer einzigartigen Fangsonde unterscheidbar
ist; das Kontaktieren des Arrays mit einer ersten Probe von einer
Zelle oder einem Individuum, die 13245 exprimieren oder mangelhaft
exprimieren, oder von einer Zelle oder einem Individuum, worin eine 13245-vermittelte
Reaktion aufgetreten ist, z.B. durch Kontakt der Zelle mit 13245-Nucleinsäure oder
einem 13245-Protein oder durch Verabreichung einer 13245-Nucleinsäure oder
eines 13245-Proteins an die Zelle oder das Individuum; das Bereitstellen
eines zweidimensionalen Arrays mit mehreren Adressen, wobei jede dieser
Adressen aufgrund ihrer Position von jeder anderen dieser zahlreichen
Adressen mit einer einzigartigen Fangsonde unterscheidbar ist; und
das Kontaktieren des Arrays mit einer zweiten Probe von einer Zelle
oder einem Individuum, die 13245 nicht exprimieren (oder nicht so
stark exprimieren wie im Falle von zahlreichen 13245-positiven Fangsonden),
oder von einer Zelle oder einem Individuum, worin keine 13245-vermittelte
Reaktion aufgetreten ist (oder in geringerem Maße aufgetreten ist als in der
ersten Probe), und das Vergleichen der Bindung der ersten Probe
mit der Bindung der zweiten Probe. Bindung, in Falle einer Nucleinsäure beispielsweise
die Hybridisierung an eine Fangsonde an einer dieser zahlreichen
Adressen, wird detektiert, beispielsweise durch ein Signal, das
durch eine an die Nucleinsäure,
das Polypeptid oder den Antikörper
gebundene Markierung erzeugt wird. Für die beiden Proben das gleiche
Array verwendet, oder es können
unterschiedliche Arrays verwendet werden. Wenn unterschiedliche
Arrays eingesetzt werden, sollten die zahlreichen Adressen mit Fangsonden
auf beiden Arrays vorhanden sein.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Analyse
von 13245, z.B. zur Analyse der Struktur, Funktion oder Verwandtschaft
mit anderen Nucleinsäure-
oder Aminosäuresequenzen.
Dieses Verfahren umfasst: das Bereitstellen einer 13245-Nucleinsäure- oder
-Aminosäuresequenz,
z.B. einer Nucleotidsequenz von 13245 oder eines Teils davon; das
Vergleichen der 13245-Sequenz mit einer oder mehreren, vorzugsweise
zahlreichen Sequenzen aus einer Sequenzsammlung, z.B. einer Nucleinsäure- oder
Proteinsequenz-Datenbank; um so 13245 zu analysieren.
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Das
Verfahren kann das Beurteilen der Sequenzidentität zwischen einer 13245-Sequenz
und einer Sequenz aus der Datenbank umfassen. Durchgeführt kann
das Verfahren durch Zugreifen auf die Datenbank an einem zweiten
Ort, z.B. über
das Internet, werden.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Gruppe von Oligonucleotiden,
die z.B. für
die Identifikation von SNPs oder die Identifikation von spezifischen
Allelen von 13245 zweckdienlich sind. Die Gruppe umfasst zahlreiche
Oligonucleotide, von denen jedes ein anderes Nucleotid an einer
Abfrageposition, z.B. einem NSP oder an einer Mutationsstelle, aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform
sind die zahlreichen Oligonucleotide in ihrer Sequenz identisch
miteinander (mit Ausnahme der Länge).
Die Oligonucleotide können
mit unterschiedlichen Markierungen verse hen sein, sodass ein Oligonucleotid,
das an ein Allel hybridisiert, ein Signal liefert, das es von einem
Oligonucleotid unterscheidet, das an ein zweites Allel hybridisiert.
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Die
Sequenz von 13245-Molekülen
wird in verschiedenen Medien bereitgestellt, um ihre Nutzung zu vereinfachen.
Eine Sequenz kann als Produkt bereitgestellt sein, und nicht als
isoliertes Nucleinsäure-
oder Aminosäuremolekül, das ein
13245 enthält.
Solch ein Produkt kann eine Nucleotid- oder Aminosäuresequenz bereitstellen,
beispielsweise ein offenes Leseraster, und zwar in einer Form, welche
die Untersuchung des Produkts anhand von Mitteln erlaubt, die nicht
direkt für
die Untersuchung der Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen oder einer Untergruppe
davon, wie sie in der Natur vorkommen oder in gereinigter Form,
anwendbar sind.
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Eine
13245-Nucleotid- oder -Aminosäuresequenz
kann auf computerlesbaren Medien aufgezeichnet sein. "Computerlesbare Medien" bezieht sich hierin
auf jedes Medium, das von einem Computer gelesen werden kann und
auf das dieser direkt zugreifen kann. Solche Medien umfassen, sind
jedoch nicht beschränkt
auf: Magnetspeichermedien, wie z.B. Floppydisks, Festplattenspeichermedien
und Magnetbänder;
optische Speichermedien, wie z.B. CD-ROM; elektrische Speichermedien,
wie z.B. RAM und ROM; und Mischbauarten dieser Kategorien, wie z.B.
magnetisch/optische Speichermedien.
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Fachleuten
auf dem Gebiet der Erfindung stehen zahlreiche Datenspeicherstrukturen
zur Verfügung, um
ein computerlesbares Medium zu erzeugen, auf dem eine Nucleotid-
oder Aminosäuresequenz
der vorliegenden Erfindung aufgezeichnet ist. Die Wahl der Datenspeicherstruktur
hängt im
Allgemeinen davon ab, wie auf die gespeicherten Informationen zugegriffen
werden soll. Außerdem
können
unterschiedliche Datenverarbeitungsprogramme und -formate verwendet
werden, um die Nucleotidsequenzinformationen der vorliegenden Erfindung
auf einem computerlesbaren Medium zu speichern. Die Sequenzinformationen
können
in einer Textdatei eines Textverarbeitungsprogramms dargestellt
sein, in einer handelsüblichen
Software wie WordPerfectTM und Microsoft
WordTM formatiert sein oder in Form einer
ASCII-Datei vorliegen, die einer Datenbank wie DB2, SybaseTM, OracleTM gespeichert
ist, oder dergleichen.
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Fachleute
können
Datenverarbeitungsformate (z.B. Textdateien oder Datenbanken) leicht
anpassen, um computerlesbare Medien zu erhalten, auf denen die Nucleotidsequenzinformationen
der vorliegenden Erfindung gespeichert sind.
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Durch
die Bereitstellung der Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen der Erfindung
in computerlesbarer Form können
Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung leicht für verschiedene Zwecke auf die
Sequenzinformationen zugreifen. Beispielsweise können Fachleute die in computerlesbarer
Form bereitgestellten Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen der Erfindung
dazu verwenden, um eine Zielsequenz oder ein Zielstrukturmotiv mit
den auf dem Datenspeichermedium bereitgestellten Sequenzinformationen
zu vergleichen. Es kann beispielsweise eine Suche durchgeführt werden,
um Fragmente oder Regionen der Sequenzen der Erfindung zu identifizieren,
die mit einer bestimmte Zielsequenz oder einem bestimmten Zielmotiv übereinstimmen.
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Eine "Zielsequenz" kann hierin jede
beliebige DNA oder Aminosäuresequenz
aus sechs oder mehr Nucleotiden oder zwei oder mehr Aminosäuren sein.
Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung wissen, dass, je länger die
Zielsequenz ist, desto geringer die Wahrscheinlichkeit ist, dass
eine Zielsequenz zufällig
in der Datenbank enthalten ist. Typische Sequenzlängen einer
Zielsequenz sind etwa 10 bis 100 Aminosäuren oder etwa 30 bis 300 Nucleotidreste.
Es ist jedoch allgemein bekannt, dass kommerziell wichtige Fragmente,
wie z.B. Sequenzfragmente, die an der Genexpression und Proteinreifung
beteiligt sind, kürzer
sein können.
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Es
gibt öffentlich
zugängliche
Computer-Software, mit der Fachleute auf Sequenzinformationen zugreifen
können,
die auf einem computerlesbaren Medium bereitgestellt sein, um Analysen
und Vergleiche mit anderen Sequenzen vorzunehmen. Verschiedene Algorithmen
sind allgemein bekannt, und verschiedene im Handel erhältliche
Software-Produkte zur Durchführung
von Suchen stehen zur Verfügung
und können
in den computerbasierten Systemen der vorliegenden Erfindung eingesetzt
werden. Beispiele für
eine solche Software umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf
MacPattern (EMBL), BLASTN und BLASTX (NCBIA).
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Somit
betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Bereitstellung eines
computerlesbaren Datensatzes einer 13245-Sequenz, welches das Speichern
der Sequenz auf einer computerlesbaren Matrix umfasst. In einer
bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Datensatz eines oder mehrere der Folgenden: Identifikation
eines offenen Leserasters; Identifikation einer Domäne, Region
oder Stelle; Identifikation der Startstelle der Transkription; Identifikation
des Transkriptionsterminators; die Vollängen-Aminosäuresequenz des Proteins oder
einer reifen Form davon; das 5'-Ende
der translatierten Region; oder die 5'- und/oder 3'-regulatorische Region.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Analyse
einer Sequenz. Dieses Verfahren umfasst: das Bereitstellen einer
13245-Sequenz oder eines Datensatzes davon in computerlesbarer Form;
das Vergleichen einer zweiten Sequenz mit der Sequenz des bezeichneten
Gens; wodurch die Sequenz analysiert wird. Der Vergleich kann das
Vergleichen mit Sequenzen auf Sequenzidentität oder das Bestimmen umfassen,
ob eine Sequenz in der anderen enthalten ist, beispielsweise das
Bestimmen, ob die 13245-Sequenz eine Vergleichssequenz enthält. In einer
bevorzugten Ausführungsform
ist die 13245- oder die zweite Sequenz auf einem ersten Computer
gespeichert, beispielsweise an einem ersten Ort, und der Vergleich
wird auf einem zweiten Computer durchgeführt, abgelesen oder gespeichert,
z.B. an einem zweiten Ort. Die 13245- oder zweite Sequenz kann beispielsweise
in einer öffentlichen
oder privaten Datenbank auf einem Computer gespeichert sein, und
der Vergleich kann auf einem zweiten Computer durchgeführt werden
und die Ergebnisse des Vergleichs auf diesem zweiten Computer abgelesen
oder gespeichert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Datensatz eines oder mehrere der Folgenden: die Identifikation
eines ORF; die Identifikation einer Domäne, Region oder Stelle; die
Identifikation des Transkriptionsterminators; die Vollängen-Aminosäuresequenz
des Proteins oder einer reifen Form davon; das 5'-Ende der translatierten Region; oder
die 5'- und/oder
3'-regulatorische
Region.
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Die
vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher veranschaulicht,
die nicht als Einschränkung
zu verstehen sind. Der Inhalt aller Literaturverweise, Pa tente und
veröffentlichten
Patentanmeldungen, die in dieser Anmeldung angeführt wurden, ist durch Verweis
hierin aufgenommen.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Identifikation und Charakterisierung
von menschlicher 13245-cDNA
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Die
menschliche 13245-Nucleotidsequenz (1;
Seq.-ID Nr. 1), die etwa 6575 Nucleotide lang ist und nichttranslatierte
Regionen umfasst, enthält
eine vorhergesagte methionininitiierte Kodierungssequenz an etwa
den Nucleotidresten 19-6178. Die kodierende Sequenz kodiert für ein Protein
aus 2053 Aminosäuren (Seq.-ID
Nr. 2).
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Beispiel 2
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Gewebeverteilung von 13245-mRNA
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Northern-Blot-Hybridisierungen
mit verschiedenen RNA-Proben können
unter Standardbedingungen durchgeführt und unter stringenten Bedingungen
gewaschen werden, d.h. 0,2 × SSC
bei 65°C.
Eine DNA-Sonde, die der gesamten oder einem Teil der 13245-cDNA
(Seq.-ID Nr. 1) entspricht, kann dabei eingesetzt werden. Die DNA
kann beispielsweise mithilfe des Prime-ItTM Kits
(Stratagene, La Jolla, CA, USA) gemäß den Anleitungen des Herstellers
mit 32P-dCTP radioaktiv markiert werden.
Filter, die mRNA von hämatopoetischem und
endokrinem Mausgewebe und Krebszelllinien (Clontech, Palo Alto,
CA, USA) enthalten, können
in einer ExpressHybTM-Hybridisierungslösung (Clontech)
hybridisiert und unter hoher Stringenz gemäß den Empfehlungen des Herstellers
gewaschen werden.
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Beispiel 3
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Rekombinante Expression
von 13245 in Bakterienzellen
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In
diesem Beispiel wird 13245 als rekombinantes Glutation-S-Transferase-
(GST-) Fusionspolypeptid in E. coli exprimiert, und das Fusionspolypeptid
wird isoliert und charakterisiert. Genauer gesagt werden 13245-Nucleinsäuresequenzen
an GST-Nucleinsäuresequenzen
fusioniert, und dieses Fusionskonstrukt wird in E. coli, z.B. Stamm
PEB199, exprimiert. Die Expression des GSDT-13245-Fusionskonstrukts
in PEB199 wird mit IPTG induziert. Das rekombinante Fusionspolypeptid
wird durch Affinitätschromatographie
auf Glutathionkügelchen
von rohen Bakterienlysaten des induzierten PEB199-Stamms gereinigt.
Unter Einsatz von Polyacrylamidgelelektrophorese-Analyse des Polypeptids,
das von den Bakterienlysaten gereinigt wurde, wird das Molekulargewicht
des resultierenden Fusionspolypeptids bestimmt.
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Beispiel 4
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Expression eines rekombinanten
13245-Proteins in COS-Zellen
-
Um
das 13245-Gen in COS-Zellen zu exprimieren, wird der Vektor pcDNA/Amp
von der Invitrogen Corporation (San Diego, CA, USA) eingesetzt.
Dieser Vektor enthält
einen SV40-Replikationsstartpunkt, ein Ampicillinresistenzgen, einen
E.-coli-Replikationsstartpunkt, einen CMV-Promotor gefolgt von einer
Polylinkerregion und ein SV40-Intron und eine SV40-Polyadenylierungsstelle.
Ein DNA-Fragment, welches für
das gesamte 13245-Protein kodiert, mit einer HA-Markierung (Wilson
et al., Cell 37, 767 (1984)) oder FLAG®-Markierung,
die in-frame an das 3'-Ende
fusioniert ist, wird in die Polylinkerregion des Vektors kloniert,
wodurch die Expression des rekombinanten Proteins unter Kontrolle
des CMV-Promotors gestellt wird.
-
Um
das Plasmid zu konstruieren, wird die 13245-DNA-Sequenz durch PCR
unter Einsatz von zwei Primern amplifiziert. Der 5'-Primer enthält die Restriktionsstelle
von Interesse, gefolgt von etwa zwanzig Nucleotiden der für 13245
kodierenden Sequenz, beginnend am Startcodon; die Sequenz am 3'-Ende enthält komplementäre Sequenzen
zu anderen Restriktionsstellen von Interesse, ein Translationsstoppcodon,
die HA-Markierung oder FLAG®-Markierung und die letzten
20 Nucleotide der für
13245 kodierenden Sequenz. Das PCR-amplifizierte Fragment und der
pcDNA/Amp-Vektor werden mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut,
und der Vektor wird mithilfe des CIAP-Enzyms (New England Biolabs,
Beverly, MA, USA) de phosphoryliert. Vorzugsweise sind die beiden
gewählten
Restriktionsstellen unterschiedlich, sodass das 13245-Gen in der
gewünschten
Orientierung insertiert wird. Das Ligationsgemisch wird in E.-coli-Zellen
(die Stämme
HB101, DH5alpha, SURE, erhältlich
von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA können eingesetzt
werden) transformiert, die transformierte Kultur wird auf einer
Platte mit ampicillinhältigem
Medium ausplattiert, und resistente Kolonien werden selektiert.
Plasmid-DNA wird aus Transformanten isoliert und durch Restriktionsanalyse
auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht.
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COS-Zellen
werden dann mit der 13245-pcDNA/Amp-Plasmid-DNA unter Anwendung
des Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Kopräzipitationsverfahrens, von
DEAE-Dextran-vermittelter Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation
transfiziert. Andere geeignete Verfahren zur Transfektion von Wirtszellen
finden sich bei Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, USA (1989)).
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Die
Expression des 13245-Polypeptids wird durch radioaktive Markierung
(35S-Methionin oder 35S-Cystein,
erhältlich
von NEN, Boston, MA, USA, kann verwendet werden) und Immunfällung (Harlow
et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, USA (1988)) unter Verwendung eines
HA-spezifischen monoklonalen Antikörpers detektiert. Kurz gesagt
werden die Zellen 8 h lang mit 35S-Methionin
(oder 35S-Cystein) markiert. Dann wird das
Kulturmedium gewonnen, und die Zellen werden unter Einsatz von Detergenzien
(RIPA-Puffer, 150
mM NaCl, 1% NP-50, 0,1% SDS, 0,5% DOC, 50 mM Tris, pH 7,5) lysiert.
Sowohl das Zelllysat als auch das Kulturmedium wird dann mit einem
HA-spezifischen monoklonalen
Antikörper
gefällt.
Ausgefällte
Polypeptide werden anschließend
durch SDS-PAGE analysiert.
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Alternativ
dazu kann DNA, welche die für
13245 kodierende Sequenz enthält,
unter Verwendung der geeigneten Restriktionsstellen direkt in den
Polylinker des pcDNA/Amp-Vektors kloniert werden. Das resultierende
Plasmid wird dann wie oben beschrieben in COS-Zellen transfiziert,
und die Expression des 13245-Polypeptids wird durch radioaktive
Markierung und Immunfällung
unter Einsatz eines 13245-spezifischen monoklonalen Antikörpers detektiert. SEQUENZPROTOKOLL