DE60125569T2

DE60125569T2 - 13245, eine neue, humane protein kinase vom typ myotonische dystrophie protein kinase und anwendungen davon

Info

Publication number: DE60125569T2
Application number: DE60125569T
Authority: DE
Inventors: Rosana Chestnut Hill KAPELLER-LIBERMANN
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2000-10-23
Filing date: 2001-10-23
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2021-10-24
Also published as: US20050233375A1; ATE349515T1; AU2002234132A1; US20020160483A1; EP1328621A2; DE60125569D1; EP1328621B1; DK1328621T3; WO2002034896A3; WO2002034896A2; PT1328621E; ES2279833T3; US6946274B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Proteinphosphorylierung, beispielsweise an Serin-, Threonin- und Tyrosinresten, stellt einen Hauptregulationsmechanismus für eine Reihe von Zellvorgängen dar. Proteinphosphorylierung wird hauptsächlich von zwei Arten von Enzymen beeinflusst, nämlich von Proteinkinasen (PKs) und Proteinphosphatasen (PPs). PKs katalysieren die Addition einer Phosphatgruppierung an einen Proteinaminosäurerest (im Allgemeinen einen Serin-, Threonin- oder Tyrosinrest), und PPs katalysieren die Entfernung solcher Gruppierungen. Die katalytische Wirkung von PKs und PPs wird wiederum vom Zustand der Zelle und der Umgebung, in der sie sich befindet, beeinflusst.
PKs vom myotonen Dystrophietyp (MDPKs) stehen in Zusammenhang mit der Modulierung von Zellmorphologie, -form und -kontraktilität. MDPKs sind auch dafür bekannt, die Aktivität von spannungsgesteuerten Skelettmuskel-Natriumkanälen, nicht jedoch von spannungsgesteuerten Herzmuskel-Natriumkanälen, zu modulieren. MDPKs spielen daher bei einer Reihe von muskeldegenerativen und anderen Skelettmuskelerkrankungen wie etwa verschiedenen Arten von Muskeldystrophie (MD) (z.B. Duchenne-MD, Gliedergürteld-MD, Becker-MD, facioscapulohumerale MD, mytochondrialer Myopathie und angeborener Myopathie) sowie myotonischen Dystrophien (Curschmann-Steiner-Batten-Syndrom und Thomsensyndrom) eine Rolle.
Bisher wurden zahlreiche MDPKs beschrieben (siehe beispielsweise Zhao et al., The Journal of Biological Chemistry 272, 10013 (1997); und Bush et al., Biochemistry 39, 8480 (2000)) und es wird angenommen, dass es noch viel mehr gibt. In Anbetracht der weiten Verbreitung und der entscheidenden Rolle von MDPK-Aktivitäten in normalen und pathologischen physiologischen Vorgängen besteht Bedarf an der Identifizierung weiterer Mitglieder dieser Proteinfamilie. Die vorliegende Erfindung deckt diesen Bedarf durch Bereitstellung einer neuen Human-MDPK.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung eines neuen Gens, das für eine MDPK kodiert, wobei das Gen hierin als "13245" bezeichnet wird. Die Nucleotidsequenz einer cDNA, die für 13245 kodiert, ist in Seq.-ID Nr. 1 und die Aminosäuresequenz eines 13245-Polypeptids in Seq.-ID Nr. 2 dargestellt. Zudem ist die Nucleotidsequenz der kodierenden Region in Seq.-ID Nr. 3 abgebildet.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein Nucleinsäuremolekül bereit, das für ein 13245-Protein oder -Polypeptid kodiert, wie beispielsweise einen biologisch aktiven Teil des 13245-Proteins. In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert das isolierte Nucleinsäuremolekül für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2. In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung isolierte 13245-Nucleinsäuremoleküle mit der Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder 3 bereit.
In weiteren Ausführungsformen stellt die Erfindung Nucleinsäuremoleküle mit Sequenzen bereit, die mit der Nucleotidsequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 3 im Wesentlichen identisch sind (z.B. natürlich vorkommende Allelvarianten). In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Nucleinsäuremolekül bereit, das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an ein Nucleinsäuremolekül hybridsiert, das eine Sequenz aufweist, welche die Nucleotidsequenz von entweder Seq.-ID Nr. 1 oder 3 umfasst, worin die Nucleinsäure für ein 13245-Protein voller Länge oder ein aktives Fragment davon kodiert.
In einem damit zusammenhängenden Aspekt stellt die Erfindung ferner Nucleinsäurekonstrukte bereit, die ein hierin beschriebenes 13245-Nucleinsäuremolekül umfassen. In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle operativ mit den nativen oder heterologen Regulationssequenzen verbunden. Vektoren oder Wirtszellen, welche die erfindungsgemäßen 13245-Nucleinsäuremoleküle enthalten, wie z.B. Vektoren und Wirtszellen, die sich zur Herstellung von 13245-Nucleinsäuremolekülen oder -Polypeptiden eignen, sind ebenfalls enthalten.
In einem weiteren damit in Zusammenhang stehenden Aspekt stellt die Erfindung Nucleinsäurefragmente bereit, die sich als Primer oder Hybridisierungssonden zur Detektion von für 13245 kodierenden Nucleinsäuren eignen.
In einem weiteren damit in Zusammenhang stehenden Aspekt werden isolierte Nucleinsäuremoleküle bereitgestellt, die Antisense zu einem für 13245 kodierenden Nucleinsäuremolekül darstellen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung 13245-Polypeptide und biologisch aktive oder antigene Fragmente davon, die sich beispielsweise als Reagenzien oder Targets in Tests eignen, die zur Behandlung und Diagnose von 13245-vermittelten oder damit in Zusammenhang stehenden Erkrankungen (z.B. MDPK-vermittelten Erkrankungen, wie sie hierin beschriebenen sind) angewandt werden können. In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung 13245-Polypeptide mit Proteinkinase-Aktivität bereit. Als bevorzugte Polypeptide gelten 13245-Proteine mit zumindest einer Pkinase-Domäne, die vorzugsweise 13245-Aktivität aufweisen, beispielsweise eine hierin beschriebene 13245-Aktivität. Bevorzugte Polypeptide sind 13245-Proteine mit zumindest einer CNH-Domäne und zumindest einer Pkinase-Domäne. Weitere bevorzugte Polypeptide sind 13245-Proteine mit zumindest einer CNH-Domäne, zumindest einer Pkinase-Domäne, zumindest einer Phorbolester/Diacylglycerin-Bindungsdomäne, zumindest einer PH-Domäne und zumindest einer Leucin-Zipperdomäne.
In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung 13245-Polypeptide bereit, wie beispielsweise ein 13245-Polypeptid mit der in Seq.-ID Nr. 2 angegebenen Aminosäuresequenz, einer Aminosäuresequenz, die mit der in Seq.-ID Nr. 2 angeführten Aminosäuresequenz im Wesentlichen identisch ist, oder einer Aminosäuresequenz, für die ein Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz kodiert, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an ein Nucleinsäuremolekül hybridisiert, das die Nu cleotidsequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 3 umfasst, worin die Nucleinsäure für ein 13245-Protein voller Länge oder ein aktives Fragment davon kodiert.
In einem damit in Zusammenhang stehenden Aspekt stellt die Erfindung weiters Nucleinsäurekonstrukte bereit, die ein hierin beschriebenes 13245-Nucleinsäuremolekül umfassen.
In einem damit in Zusammenhang stehenden Aspekt stellt die Erfindung 13245-Polypeptide oder -Fragmente bereit, die operativ an Nicht-13245-Polypeptide gebunden sind, um Fusionsproteine zu bilden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Antikörper und antigenbindende Fragmente davon, die mit 13245-Polypeptiden reagieren oder noch bevorzugter spezifisch daran binden.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zum Screenen von Verbindungen bereit, welche die Expression oder Aktivität von 13245-Polypeptiden oder -Nucleinsäuren modulieren.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Modulierung der Expression oder Aktivität von 13245-Polypeptiden oder -Nucleinsäuren, beispielsweise unter Verwendung der gescreenten Verbindungen, bereit. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Verfahren die Behandlung von Erkrankungen, die mit aberrierender Aktivität oder Expression der 13245-Polypeptide oder -Nucleinsäuren zusammenhängen, wie z.B. Erkrankungen, die eine aberrierende oder mangelhafte Proteinphosphorylierung oder eine aberrierende oder mangelhafte Zellvorgangsregulation (z.B. aberrierende oder mangelhafte Zellsignal- oder aberrierende oder mangelhafte Muskelfunktionen) umfassen.
Die Erfindung stellt auch Tests zur Bestimmung der Aktivität oder der Gegenwart oder Abwesenheit von 13245-Polypeptiden oder -Nucleinsäuremolekülen in einer biologischen Probe, einschließlich zur Krankheitsdiagnose, bereit.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Tests zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit einer genetischen Veränderung in einem 13245-Polypeptid oder -Nucleinsäuremolekül, einschließlich zur Krankheitsdiagnose, bereit.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Modulation der Fähigkeit einer Zelle, die Interkonversion der phosphorylierten und dephosphorylierten Formen eines GTPase-Proteins zu katalysieren. Das Verfahren umfasst die Modulation von 13245-Proteinaktivität in der Zelle. Die Aktivität von 13245-Proteinen kann moduliert werden, indem die Expression des 13245-Gens in der Zelle gehemmt wird, beispielsweise durch Zuführen eines Antisense-Oligonucleotids, das unter stringenten Bedingungen an ein Transkript (beispielsweise eine mRNA) des 13245-Gens hybridisiert, eines Antisense-Oligonucleotids, das unter stringenten Bedingungen an ein Polynucleotid mit der Nucieotidsequenz der Seq.-ID Nr. 1 hybridisiert, oder eines Antisense-Oligonucleotids, das unter stringenten Bedingungen an ein Polynucleotid mit der Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 3 hybridisiert, zur Zelle. Alternativ dazu kann die Aktivität von 13245-Proteinen gehemmt werden, ohne die 13245-Genexpression in der Zelle signifikant zu beeinflussen. Die Aktivität des 13245-Proteins kann beispielsweise gehemmt werden, indem der Zelle ein Mittel verabreicht wird, das die Aktivität des 13245-Proteins hemmt, wie z.B. ein Antikörper, der spezifisch an das 13245-Protein bindet. In einem damit in Zusammenhang stehenden Aspekt kann die Aktivität von 13245 moduliert werden, indem die Expression von 13245 in der Zelle verstärkt wird. Die Expression von 13245 in einer Zelle kann beispielsweise verstärkt werden, indem zur Zelle ein Mittel zugeführt wird, das die Expression von 13245 verstärkt, wie z.B. ein Expressionsvektor, der für ein 13245-Protein kodiert.
Die Erfindung umfasst ferner ein Verfahren zur Beurteilung, ob eine Testverbindung zur Modulation zumindest eines Phänomens zweckdienlich ist, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (1) Interkonversion der phosphorylierten und dephosphorylierten Formen eines Serin-, Threonin- oder Tyrosinrests eines GTPase-Proteins; (2) Zellkontraktilität; (3) Zellwachstum; (4) Zellleitfähigkeit; (5) Eintritt einer Zelle in den Zellzyklus; (6) Progression einer Zelle durch den Zellzyklus; (7) Mitogenese; (8) Zellmetabolismus; (9) Gentranskription; (11) Zytokinese; (12) Zell form; (13) Zellbewegung; (14) Integration eines Virusgenoms in ein Wirtszellengenom; (15) Haltung eines Virusgenoms in einem Wirtszellengenom; (16) zytologische Veränderungen in einer virusinfizierten Wirtszelle; (17) Virusproduktion in einer virusinfizierten Wirtszelle; (18) Wechselwirkung eines Virions mit einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle; und (19) Einkapselung eines Virions in einem Abschnitt einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle. Dieses Verfahren umfasst:

a) das Zusetzen der Testverbindung zu einer ersten Zusammensetzung, die ein Polypeptid umfasst, das eine zu zumindest 90% mit der Seq.-ID Nr. 2 identische Aminosäuresequenz und 13245-Aktivität aufweist; und
b) das Vergleichen der 13245-Aktivität in der ersten Zusammensetzung mit der in der zweiten Zusammensetzung, die im Wesentlichen identisch mit der ersten Zusammensetzung ist, mit der Ausnahme, dass sie die Testverbindung nicht enthält.

Dabei weist ein Unterschied der 13245-Aktivität zwischen der ersten und der zweiten Zusammensetzung darauf hin, dass die Testverbindung zur Modulation des Phänomens zweckdienlich ist.
Die Erfindung umfasst auch ein weiteres Verfahren zur Beurteilung, ob eine Testverbindung zur Modulation zumindest eines Phänomens zweckdienlich ist, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (1) Interkonversion der phosphorylierten und dephosphorylierten Formen eines Serin-, Threonin- oder Tyrosinrests eines GTPase-Proteins; (2) Zellkontraktilität; (3) Zellwachstum; (4) Zellleitfähigkeit; (5) Eintritt einer Zelle in den Zellzyklus; (6) Progression einer Zelle durch den Zellzyklus; (7) Mitogenese; (8) Zellmetabolismus; (9) Gentranskription; (11) Zytokinese; (12) Zellform; (13) Zellbewegung; (14) Integration eines Virusgenoms in ein Wirtszellengenom; (15) Haltung eines Virusgenoms in einem Wirtszellengenom; (16) zytologische Veränderungen in einer virusinfizierten Wirtszelle; (17) Virusproduktion in einer virusinfizierten Wirtszelle; (18) Wechselwirkung eines Virions mit einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle; und (19) Einkapselung eines Virions in einem Abschnitt einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle. Dieses Verfahren umfasst:

a) das Zusetzen der Testverbindung zu einer ersten Zusammensetzung, die eine Zelle umfasst, welche eine Nucleinsäure umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, das eine zu zumindest 90% mit der Seq.-ID Nr. 2 identische Aminosäuresequenz und 13245-Aktivität aufweist; und
b) das Vergleichen der 13245-Aktivität in der ersten Zusammensetzung mit der in der zweiten Zusammensetzung, die im Wesentlichen identisch mit der ersten Zusammensetzung ist, mit der Ausnahme, dass sie die Testverbindung nicht enthält.

Ein Unterschied der 13245-Aktivität zwischen der ersten und der zweiten Zusammensetzung weist darauf hin, dass die Testverbindung zur Modulation des Phänomens zweckdienlich ist.
Verbindungen, die unter Anwendung dieser Verfahren identifiziert wurden, können verwendet werden, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Modulation dieses Phänomens herzustellen, indem diese beispielsweise mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger kombiniert wird. Solche Zusammensetzungen können verwendet werden, um das Phänomen in einem Menschen zu modulieren.
Die Erfindung umfasst ein weiteres Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, die zur Modulation zumindest eines Phänomens zweckdienlich ist, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (1) Interkonversion der phosphorylierten und dephosphorylierten Formen eines Serin-, Threonin- oder Tyrosinrests eines GTPase-Proteins; (2) Zellkontraktilität; (3) Zellwachstum; (4) Zellleitfähigkeit; (5) Eintritt einer Zelle in den Zellzyklus; (6) Progression einer Zelle durch den Zellzyklus; (7) Mitogenese; (8) Zellmetabolismus; (9) Gentranskription; (11) Zytokinese; (12) Zellform; (13) Zellbewegung; (14) Integration eines Virusgenoms in ein Wirtszellengenom; (15) Haltung eines Virusgenoms in einem Wirtszellengenom; (16) zytologische Veränderungen in einer virusinfizierten Wirtszelle; (17) Virusproduktion in einer virusinfizierten Wirtszelle; (18) Wechselwirkung eines Virions mit einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle; und (19) Einkapselung eines Virions in einem Abschnitt einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle. Dieses Verfahren umfasst:

a) das Kontaktieren der Testverbindung mit einem Polypeptid, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: i) Polypeptid, für das ein Nucleinsäuremolekül kodiert, das einen Abschnitt mit einer Nucleotidsequenz umfasst, die zu zumindest 80% mit einer von Seq.-ID Nr. 1 und 3 identisch ist und für ein Polypeptid mit Kinaseaktivität kodiert; und ii) Fragment eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz, die Seq.-ID Nr. 2 umfasst, worin das Fragment zumindest 25 zusammenhängende Aminosäurereste von Seq.-ID Nr. 2 umfasst, oder mit einer Zelle, die das Polypeptid exprimiert; und
b) das Bestimmen, ob das Polypeptid an die Testverbindung bindet.

Die Bindung des Polypeptids an die Testverbindung weist darauf hin, dass die Testverbindung zur Modulation des Phänomens zweckdienlich ist.
Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt eine cDNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 1) und eine vorhergesagte Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) von menschlichem 13245 dar. Der Methionin-initiierte offene Leseraster von menschlichem 13245 (ohne die nichttranslatierten 5'- und 3'- Regionen) beginnt an Nucleotid 19 von Seq.-ID Nr. 1, und die kodierende Region (ohne Terminationscodon; dargestellt in Seq.-ID Nr. 3) erstreckt sich bis zu Nucleotid 6178 von Seq.-ID Nr. 1.
2 zeigt ein Hydropathiediagramm von menschlichem 13245. Relativ hydrophobe Reste sind über der horizontalen Strichlinie angeführt, und relativ hydrophile Reste sind unter der horizontalen Strichlinie angegeben. Die Cysteinreste (cys) sind durch kurze vertikale Linien unter der Hydropathiespur angezeigt. Die Zahlen, die der Aminosäuresequenz von menschlichem 13245 entsprechen, sind gekennzeichnet. Polypeptide der Erfindung umfassen Fragmente, die Folgendes umfassen: eine vollständige hydrophobe Sequenz oder Teile davon, d.h. eine Sequenz über der Strichlinie, z.B. die Sequenz aus ungefähr den Resten 195-210 von Seq.-ID Nr. 2; eine vollstän dige hydrophile Sequenz oder Teile davon, d.h. eine Sequenz unter der Strichlinie, z.B. die Sequenz aus ungefähr den Resten 455-475 von Seq.-ID Nr. 2; eine Sequenz, die einen Cysteinrest umfasst; oder eine Glykosylierungsstelle.
3 ist ein Abgleich der Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) von 13245, Mausrho/rac-Interaktions-Citron-Kinase ("AAC72823"; GENBANK^® Zugriffsnummer AAC 72823; Seq.-ID Nr. 4), Maus-Citron-K-Kinase ("AAC27933"; GENBANK^® Zugriffsnummer AAC7933; Seq.-ID Nr. 5), Maus-Citron-Protein ("P49025"; GENBANK^® Zugriffsnummer P49025; Seq.-ID Nr. 6) und menschlichem Citron-Protein ("014578"; GENBANK^® Zugriffsnummer 014578; Seq.-ID Nr. 7). Der Abgleich wurde mithilfe der Multalin-Software Version 5.4.1 unter Verwendung der Blosum62-Symbolvergleichstabelle, einem "gap weight" von 12 und einem "gap length weight" von 2 erstellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die cDNA-Sequenz von menschlichem 13245 (1; Seq.-ID Nr. 1), die etwa 6575 Nucleotidreste lang ist und nichttranslatierte Regionen umfasst, enthält eine vorhergesagte Methionin-initiierte kodierende Sequenz aus etwa 6160 Nucleotidresten ohne Terminationscodon (d.h. die Nucleotidreste 19-6178 von Seq.-ID Nr. 1; auch in Seq.-ID Nr. 3 dargestellt). Die kodierende Sequenz kodiert für ein 2053 Aminosäuren langes Protein mit der Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2.
Menschliches 13245 enthält die nachstehenden Regionen oder andere Strukturmerkmale: eine vorhergesagte Pkinase-Domäne (PF00069) an etwa den Aminosäureresten 97-360 von Seq.-ID Nr. 2, eine vorhergesagte Proteinkinase-C-Terminusdomäne an den Resten 361-390 von Seq.-ID Nr. 2, eine Serin/Threonin-Proteinkinase-Antigenbindungsstellen-Signatursequenz an den Resten 217-229 von Seq.-ID Nr. 2, vorhergesagte Leucin-Zipperdomänen an den Resten 838-859, 975-996, 1041-1062 und 1143-1164 von Seq.-ID Nr. 2, eine vorhergesagte Carbamoyl-Phosphatsynthase-Subdomänen-Signatursequenz an den Resten 1156-1163 von Seq.-ID Nr. 2, eine vorhergesagte Phorbolester/Diacylglycerin-Bindungsdomäne an den Resten 1389-1437 von Seq.-ID Nr. 2, eine vorhergesagte Pleckstrin-Homologie-Domäne (PH-Do mäne) an den Resten 1470-1525 von Seq.-ID Nr. 2 und eine vorhergesagte CNH-Domäne an den Resten 1568-856 von Seq.-ID Nr. 2.
Das menschliche 13245-Protein weist vorhergesagte N-Glykosylierungsstellen (Pfam-Zugriffsnummer PS00001) an etwa den Aminosäureresten 819-822, 1571-1574, 1694-1697, 1717-1720 und 2026-2029 von Seq.-ID Nr. 2; vorhergesagte cAMP-/cGMP-abhängige Proteinkinasephosphorylierungsstellen (Pfam-Zugriffsnummer PS00004) bei etwa den Aminosäureresten 78-81, 477-480, 579-582, 601-604, 680-683, 1322-1325 und 1366-1369 von Seq.-ID Nr. 2; vorhergesagte Proteinkinase-C-Phosphorylierungsstellen (Pfam-Zugriffsnummer PS00005) an etwa den Aminosäureresten 93-95, 248-250, 308-310, 378-380, 498-500, 516-518, 546-548, 577-579, 824-826, 872-874, 1025-1027, 1033-1035, 1069-1098, 1144-1146, 1170-1172, 1215-1217, 1268-1270, 1314-1316, 1335-1337, 1363-1365, 1376-1378, 1542-1544, 1724-1726, 1892-1894, 1910-1912, 1963-1965 und 1977-1979 von Seq.-ID Nr. 2; vorhergesagte Caseinkinase-II-Phosphorylierungsstellen (Pfam-Zugriffsnummer PS 00006) an etwa den Aminosäureresten 83-86, 93-96, 140-143, 361-364, 381-384, 386-389, 410-413, 436-439, 445-448, 480-483, 487-490, 501-504, 529-532, 867-870, 908-911, 935-938, 940-943, 973-976, 1015-1018, 1025-1028, 1046-4049, 1081-1084, 1142-1145, 1170-1173, 1218-1221, 1308-1311, 1314-1317, 1370-1373, 1736-1739, 1794-1797, 1864-1867, 1882-1885, 1904-1907, 1964-1967 und 2012-2015 von Seq.-ID Nr. 2; eine vorhergesagte Tyrosinkinase-Phosphorylierungsstelle an den Resten 741-747 von Seq.-ID Nr. 2; vorhergesagte N-Myristoylierungsstellen (Pfam-Zugriffsnummer PS00008) an etwa den Aminosäureresten 50-5, 1202-1207, 1532-1537, 1584-1537, 1584-1589, 1678-1680 und 1999-2004 von Seq.-ID Nr. 2; und eine vorhergesagte Amidierungsstelle (Pfam-Zugriffsnummer PS00009) an etwa den Aminosäureresten 134-136 von Seq.-ID Nr. 2 auf.
Für allgemeine Informationen hinsichtlich PFAM-Identifikatoren, PS-Präfix und PF-Präfix-Domänenidentifikationsnummern siehe Sonnhammer et al., Protein 28, 405-420 (1997), und http://www.psc.edu/general/software/packages/pfam/pfam.html.
Das 13245-Protein weist eine signifikante Anzahl an Strukturmerkmalen auf, die es mit den Mitgliedern der MDPK-Familie gemein hat. Die Bezeichnung "Familie" steht, bezogen auf die Protein- und Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung, für zwei oder mehr Proteine oder Nucleinsäuremoleküle mit einer gemeinsamen Strukturdomäne oder einem gemeinsamen Motiv und ausreichender Aminosäure- oder Nucleotidsequenzhomologie, wie hierin definiert. Solche Familienmitglieder können natürlich oder nicht natürlich vorkommen und von entweder der gleichen oder von unterschiedlichen Spezies stammen. Eine Familie kann beispielsweise ein erstes Protein menschlichen Ursprungs sowie andere unterschiedliche Proteine menschlichen Ursprungs umfassen, oder alternativ dazu Homologe mit nichtmenschlichem Ursprung, z.B. MDPK-Proteine für jegliche auf dem Gebiet der Erfindung beschriebene Spezies, umfassen. Mitglieder einer Familie können auch gemeinsame funktionelle Eigenschaften haben.
Ein 13245-Polypeptid kann eine Pkinase-Domäne umfassen. Die Bezeichnung "Pkinase-Domäne" steht hierin für eine Proteindomäne mit einer Aminosäuresequenz einer Länge von etwa 200-300 Aminosäureresten, vorzugsweise zumindest etwa 225-300 Aminosäuren, noch bevorzugter etwa 264 Aminosäureresten, und weist einen Bitwert für den Abgleich der Sequenz mit der Pkinase-Domäne (HMM) von zumindest 100 oder mehr, vorzugsweise 150 oder mehr, noch bevorzugter 200 oder mehr, auf. Der Pkinase-Domäne wurde die PFAM-Zugriffsnummer PF00069 zugewiesen (http://genome.wustl.edu/Pfam/html).
Ein 13245-Polypeptid kann eine Pkinase-Domäne umfassen. Die Bezeichnung "CNH-Domäne" steht hierin für eine Proteindomäne mit einer Aminosäuresequenz einer Länge von etwa 250-350 Aminosäureresten, vorzugsweise zumindest etwa 275-325 Aminosäureresten, noch bevorzugter etwa 298 Aminosäureresten, und weist einen Bitwert für den Abgleich der Sequenz mit der Pkinase-Domäne (HMM) von zumindest 100 oder mehr, vorzugsweise 200 oder mehr, noch bevorzugter 300 oder mehr, auf. Der Pkinase-Domäne wurde die PFAM-Zugriffsnummer PF00780 zugewiesen (http://genome.wustl.edu/Pfam/html).
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das 13245-Polypeptid oder -Protein eine Pkinase-Domäne oder eine Region auf, die zumindest etwa 200-300, noch bevorzugter etwa 225-300, oder 264 Aminosäurereste umfasst, sowie zumindest 60-, 70-, 80-, 90-, 95-, 99- oder 100%ige Homologie mit einer Pkinase-Domäne, wie z.B. der Pkinase-Domäne von menschlichem 13245 (z.B. Reste 97-360 von Seq.-ID Nr. 2).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das 13245-Polypeptid oder -Protein eine Pkinase-Domäne oder eine Region auf, die zumindest etwa 250-350, noch bevorzugter etwa 275-325, oder 298 Aminosäurereste umfasst, sowie zumindest 60-, 70-, 80-, 90-, 95-, 99- oder 100%ige Homologie mit einer CNH-Domäne, wie z.B. der CNH-Domäne von menschlichem 13245 (z.B. Reste 1568-1865 von Seq.-ID Nr. 2).
Zur Identifikation der Gegenwart eines Pkinase- oder CNH-Domänenprofils in einem 13245-Rezeptor wird die Aminosäuresequenz des Proteins in einer HMM-Datenbank (z.B. der Pfam-Datenbank, Version 2.1) unter Verwendung der Standardparameter (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/HMM_search) gesucht. Das Hmmsf-Programm, das beispielsweise als Teil des HMMER-Suchprogrammpakets erhältlich ist, ist ein familienspezifisches Standardprogramm für PF00069 oder PF00780, und der Wert 100 stellt den Standardschwellenwert zur Bestimmung eines Treffers dar. Unter Verwendung einer ORF-Analysesoftware wurde beispielsweise ein Pkinase-Domänenprofil in der Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 identifiziert (z.B. Aminosäuren 53-303 von Seq.-ID Nr. 2). Folglich liegt ein 13245-Protein mit zumindest 60- bis 70-, noch bevorzugter etwa 70- bis 80- oder etwa 80- bis 90%iger Homologie mit dem Pkinase-Domänenprofil oder dem CNH-Domänenprofil von menschlichem 13245 im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
Ohne sich auf eine bestimmte Theorie beschränken zu wollen wird angenommen, dass das 13245-Protein in zumindest einer Ausführungsform ein Kernmembranprotein ist, dessen carboxyterminale Domäne in der Zellkernhülle angeordnet ist. In dieser Ausführungsform ist das 13245-Protein fähig, Signalinformationen aus dem Cyto plasma in den Kern zu übertragen, wodurch beispielsweise die Gentranskription gesteuert werden kann.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein 13245-Polypeptid zumindest eine Pkinase-Domäne. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das 13245-Polypeptid zumindest eine Pkinase-Domäne und zumindest eine CNH-Domäne. Die 13245-Moleküle der vorliegenden Erfindung können ferner eine oder mehrere der hierin beschriebenen N-Glykosylierungs-, cAMP-/cGMP-abhängigen Kinasephosphorylierungs-, Proteinkinase-C-Phosphorylierungs-, Caseinkinase-II-Phosphorylierungs-, Tyrosinkinasephosphorylierungs-, N-Myristoylierungs-, Amidierungs-, Leucin-Zipper-, Serin/Threonin-Proteinkinase-Wirk-, Carbamoyl-Phosphatsynthase-Subdomänen-Signatur-, Proteinkinase-C-terminaldomänen-Phorboester/Diacylgycerinbindungs- und Pleckstrinhomologiedomänen und -stellen, die hierin beschrieben sind, umfassen und beinhalten vorzugsweise die meisten oder alle davon.
Wie in 3 zu sehen ist, weist das 13245-Protein signifikante Sequenzhomologie mit mehreren Proteinen auf, die mit dem Citron-Protein in Zusammenhang stehen, das dafür bekannt ist, mit GTPase-Enzymen der Rho-Familie wechselzuwirken. Diese GTPasen umfassen beispielsweise Rho-A, -B und -C, Rac-1 und -2 sowie CDC42. Diese GTPasen steuern die Zellstruktur, einschließlich Zellform, Zellkontraktion, Zellbewegung, Verteilung der Strukturproteine (z.B. Actin) in der Zelle, Bildung von Fokaladhäsion, Zytokinese und Zellteilung. Diese GTPasen sind auch dafür bekannt, die Genexpression auf phosphorylierungsabhängige Weise zu modulieren. Proteine, die in der Lage sind, mit phosphorylierten und nichtphosphorylierten Rho-GTPase-Isoformen wechselzuwirken oder deren Interkonversion zu katalysieren oder beides, können diese zellulären Prozesse modulieren.
Das Vorhandensein einer Pkinase, Pkinase-C, einer Proteinkinase-ATP-Bindungsregionsignatur, einer Serin/Threonin-Proteinkinase-Wirkstellenstellensignatur, einer Tyrosinkinasephosphorylierungsstelle, mehrerer potenzieller Phosphorylierungsstellen und von Ähnlichkeit mit Citron-Proteinen weist darauf hin, dass das 13245-Protein mit Rho-GTPasen wechselwirken und Interkonversionen ihrer phosphorylierten und nichtphosphorylierten Formen katalysieren kann. Die Fähigkeit von 13245, den Phosphorylierungszustand von Rho-GTPasen zu modulieren, deutet darauf hin, dass 13245 eine oder mehrere von Zellform, Zellkontraktion, Zellbewebung, Verteilung der Strukturproteine (z.B. Actin) in der Zelle, Bildung von Fokaladhäsion, Zytokinese und Zellteilung in Zellen, in denen es exprimiert wird, zu modulieren. Ferner sind diese Eigenschaften ein Hinweis darauf, dass das 13245-Protein mit Erkrankungen in Verbindung steht, bei denen einer oder mehrere dieser Vorgänge aberrieren. Hierin beschriebene 13245-Moleküle können daher dazu verwendet werden, diese Erkrankungen vorherzusagen, zu diagnostizieren, zu hemmen, vorzubeugen, zu lindern oder zu heilen. Beispiele für Erkrankungen, bei denen einer oder mehrere dieser Vorgänge aberrierend ist/sind, umfassen Tumorgenese, Tumorwachstum, Tumormetastasen und Virusinfektionen einer Zelle.
Die Expression von 13245 ist in peripheren Blutzellen höher als in vielen anderen Zelltypen, und bei HIV-1-infizierten Zellen, einschließlich der Zellen der CCRF-Zelllinie, die mit diesem Virus infiziert worden sind, ist eine verstärkte 13245-Expression zu beobachten. HIV-1-infizierte Zellen durchlaufen verschiedene morphologische Veränderungen, und das Muster der Genexpression in HIV-1-infizierten Zellen unterscheidet sich vom Muster, das in nicht nichtinfizierten Zellen vom gleichen Typ zu beobachten ist. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass 13245 eine Rolle bei der Auswirkung von HIV-1-Infektionen auf Wirtszellen (z.B. mononukleären Peripherblutzellen) spielt. Die Modulation der 13245-Expression, -Aktivität oder von beidem in HIV-1-infizierten Zellen kann die oben angeführten Vorgänge modulieren, wodurch die Auswirkungen einer HIV-1-Infektion gemildert oder umgekehrt werden. Die hierin beschriebenen 13245-Moleküle können beispielsweise zur Hemmung der Insertion des HIV-1-Genoms in das Wirtszellengenom, zur Hemmung oder Umkehrung der Haltung des HIV-1-Genoms innerhalb des Wirtszellengenoms, zur Hemmung oder Umkehrung von durch HIV-1-Infektion induzierten zytologischen Veränderungen, zur Hemmung von HIV-1-Virusproduktion in infizierten Zellen, zur Hemmung der Wechselwirkung zwischen HIV-1-Virionen mit der Wirtszellen-Zytoplasmamembran, zur Hemmung der Einkapselung von HIV-1-Virusteilchen in Abschnitten der Wirtszellenmembran oder zur Hemmung der Freisetzung eines HIV-1-Virus aus infizierten Zel len. 13245-Moleküle können somit zur Behandlung von Individuen eingesetzt werden, die mit HIV-1 (z.B. Individuen, die an AIDS leiden) oder mit anderen pathogenen Viren infiziert sind, oder zur Hemmung der Übertragung des Virus von einem Individuum auf ein anderes.
Da die 13245-Polypeptide der Erfindung 13245-vermittelte Aktivitäten modulieren können, können sie zur Entwicklung von neuen Diagnostika und Therapeutika für 13245-vermittelte oder damit zusammenhängende Erkrankungen verwendet werden, wie nachstehend beschrieben wird.
"13245-Aktivität", "biologische Aktivität von 13245" oder "funktionelle Aktivität von 13245" bezieht sich hierin auf eine Wirkung von 13245-Proteinen, -Polypeptiden oder -Nucleinsäuremolekülen auf beispielsweise eine auf 13245 reagierende Zelle oder ein 13245-Substrat (z.B. ein Proteinsubstrat wie ein spannungsgesteuertes Skelettmuskel-Natriumkanalprotein), die in vivo oder in vitro bestimmbar ist. In einer Ausführungsform ist die 13245-Aktivität eine direkte Aktivität, wie z.B. eine Assoziation mit einem 13245-Zielmolekül. Ein "Zielmolekül" oder "Bindungspartner" eines 13245-Proteins ist ein Molekül (z.B. ein Protein oder eine Nucleinsäure), an welches das 13245-Protein von Natur aus bindet oder mit dem es wechselwirkt. In einer exemplarischen Ausführungsform ist solch ein Zielmolekül ein 13245-Rezeptor. 13245-Aktivität kann auch eine indirekte Aktivität sein, wie z.B. eine zelluläre Signalaktivität, die durch die Wechselwirkung des 13245-Proteins mit einem 13245-Rezeptor vermittelt wird.
Es wurde vorhergesagt, dass die 13245-Moleküle der vorliegenden Erfindung ähnliche biologische Aktivität aufweisen wie die Mitglieder der MDPK-Familie. Die 13245-Proteine der vorliegenden Erfindung können beispielsweise eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten aufweisen:

(1) Katalyse der Bildung einer kovalenten Bindung in oder zwischen einem Aminosäurerest und einer Phosphatgruppierung;
(2) Modulation der Zellkontraktilität;
(3) Modulation des Zellwachstums;
(4) Modulation der Zellleitfähigkeit;
(5) Modulation des Eintritts einer Zelle in den Zellzyklus;
(6) Modulation der Progression einer Zelle durch den Zellzyklus;
(7) Modulation der Mitogenese;
(8) Modulation des Zellmetabolismus;
(9) Modulation der Gentranskription;
(10) Katalyse der Interkonversion von phosphorylierten und dephosphorylierten Formen einer GTPase, wie z.B. einer Rho-GTPase;
(11) Modulation der Zytokinese;
(12) Modulation der Zellform;
(13) Modulation der Zellbewegung (z.B. Tumormetastasen);
(14) Modulation der Integration eines Virusgenoms in ein Wirtszellengenom;
(15) Modulation der Haltung eines Virusgenoms in einem Wirtszellengenom;
(16) Modulation der zytologischen Veränderungen in einer virusinfizierten Wirtszelle;
(17) Modulation der Virusproduktion in einer virusinfizierten Wirtszelle;
(18) Modulation der Wechselwirkung eines Virions mit einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle; und
(19) Modulation der Einkapselung eines Virions in einem Abschnitt einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle.

Somit können die hierin beschriebenen 13245-Moleküle als neue diagnostische Ziele und Therapeutika zur Vorhersage, Diagnose, Vorbeugung, Hemmung, Linderung oder Heilung von mit MDPK zusammenhängenden Erkrankungen dienen.
Andere Aktivitäten, wie sie nachstehend beschrieben sind, umfassen die Fähigkeit zur Modulation der Funktion, des Überlebens, der Morphologie, der Proliferation und/oder der Differenzierung von Zellen von Geweben, in denen 13245-Moleküle exprimiert werden. Somit können die 13245-Moleküle als neue diagnostische Ziele und Therapeutika zur Kontrolle verschiedener Erkrankungen, einschließlich Skelettmuskelerkrankungen (z.B. Muskel- und myotonischen Dystrophien, wie hierin und gemäß dem Stand der Technik beschrieben) eingesetzt werden.
Das 13245-Protein, Fragmente davon sowie Derivate und andere Varianten der Sequenz mit Seq.-ID Nr. 2 werden gemeinsam als "Polypeptide oder Proteine der Erfindung" oder "13245-Polypeptide oder -proteine" bezeichnet. Nucleinsäuremoleküle, die für solche Polypeptide oder Proteine kodieren, werden gemeinsam als "Nucleinsäuren der Erfindung" oder "13245-Nucleinsäuren" bezeichnet. 13245-Moleküle beziehen sich auf 13245-Nucleinsäuren, -Polypeptide und -Antikörper.
Die Bezeichnung "Nucleinsäuremolekül" umfasst hierin DNA-Moleküle (z.B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z.B. eine mRNA) sowie Analoga der DNA oder RNA, die beispielsweise durch Einsatz von Nucleotidanaloga erzeugt wurden. Das Nucleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, aber vorzugsweise handelt es sich um doppelsträngige DNA.
Die Bezeichnung "isoliertes oder gereinigtes Nucleinsäuremolekül" umfasst Nucleinsäuremoleküle, die von anderen, in der natürlichen Quelle der Nucleinsäure vorhandenen Nucleinsäuremolekülen getrennt sind. In Bezug auf genomische DNA umfasst der Begriff "isoliert" beispielsweise Nucleinsäuremoleküle, die vom Chromosom getrennt sind, mit dem die genomische DNA von Natur aus assoziiert ist. Vorzugsweise ist eine "isolierte" Nucleinsäure frei von Sequenzen, welche die Nucleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, von dem die Nucleinsäure stammt, normalerweise flankieren (d.h. Sequenzen am 5'- und/oder 3'-Ende der Nucleinsäure). In verschiedenen Ausführungsformen kann das isolierte Nucleinsäuremolekül beispielsweise weniger als etwa 5 Kilobasen, 4 Kilobasen, 3 Kilobasen, 2 Kilobasen, 1 Kilobase, 0,5 Kilobasen oder 0,1 Kilobasen an 5'- und/oder 3'-Nucleotidsequenzen enthalten, die das Nucleinsäuremolekül normalerweise in genomischer DNA aus der Zelle flankieren, von der die Nucleinsäure stammt. Außerdem kann ein "isoliertes" Nucleinsäuremolekül, wie z.B. ein cDNA-Molekül, im Wesentlichen frei von anderem Zellmaterial oder, wenn es durch Rekombinationsverfahren hergestellt wurde, Kulturmedium oder, im Falle chemischer Synthese, im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien sein.
Die Bezeichnung "hybridisiert unter stringenten Bedingungen" beschreibt hierin Hybridisierungs- und Waschbedingungen. Stringente Bedingungen sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und finden sich in allgemein verfügbaren Referenzwerken (z.B. Current Protocols in Molecular Biology 6.3.1-6.3.6, John Wiley & Sons, N.Y. (1989)). Darin sind wässrige und nichtwässrige Verfahren beschrieben, und beide können eingesetzt werden. Ein bevorzugtes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist eine Hybridisierung in 6× Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschdurchgängen in 0,2 × SSC, 0,1% (Gew./Vol.) SDS bei 50 °C. Ein weiteres Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist eine Hybridisierung in 6 × SSC bei etwa 45 °C, gefolgt von einem oder mehreren Waschdurchgängen in 0,2 × SSC, 0,1% (Gew./Vol.) SDS bei 55 °C. Ein weiteres Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist eine Hybridisierung in 6 × SSC bei etwa 45 °C, gefolgt von einem oder mehreren Waschdurchgängen in 0,2 × SSC, 0,1% (Gew./Vol.) SDS bei 65 °C. Besonders bevorzugte Stringenzbedingungen (und die Bedingungen, die herrschen sollten, wenn sich ein Arzt nicht sicher ist, welche Bedingungen eingesetzt werden sollen, um zu bestimmen, ob ein Molekül innerhalb der Hybridisierungsgrenzen der vorliegenden Erfindung liegt) sind 0,5 M Natriumphosphat, 7% (Gew./Vol.) SDS bei 65 °C, gefolgt von einem oder mehreren Waschdurchgängen bei 0,2 × SSC, 1% (Gew./Vol.) SDS bei 65 °C. Vorzugsweise entspricht ein isoliertes Nucleinsäuremolekül der Erfindung, das unter stringenten Bedingungen an die Sequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 hybridisiert, einem natürlich vorkommenden Nucleinsäuremolekül.
Ein "natürlich vorkommendes" Nucleinsäuremolekül ist hierin ein RNA- oder DNA-Molekül mit einer Nucleotidsequenz, die in der Natur vorkommt (d.h. beispielsweise für ein natürliches Protein kodiert).
Die Bezeichnungen "Gen" und "rekombinantes Gen" beziehen sich hierin auf Nucleinsäuremoleküle, die einen für ein 13245-Protein, vorzugsweise ein Säugetier-13245-Protein, kodierenden offenen Leseraster umfassen und weiters nichtkodierende Regulationssequenzen und Introns enthalten können.
Ein "isoliertes" oder "gereinigtes" Polypeptid oder Protein ist im Wesentlichen frei von zellulärem Material oder anderen verunreinigenden Proteinen aus der Zelle oder dem Gewebe, von dem das Protein stammt, oder, im Falle chemischer Synthese, im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien. In einer Ausführungsform bedeutet "im Wesentlichen frei" die Herstellung eines 13245-Proteins mit weniger als etwa 30%, 20%, 10% und noch bevorzugter 5% (Trockengewicht) an Nicht-13245-Protein (hierin auch als "verunreinigendes Protein" bezeichnet) oder chemischen Vorläufern von 13245-Chemikalien. Wenn das 13245-Protein oder ein biologisch aktiver Teil davon durch Rekombination hergestellt wird, sind sie vorzugsweise auch im Wesentlichen frei von Kulturmedium, d.h. das Kulturmedium macht weniger als etwa 20%, noch bevorzugter weniger als etwa 10%, insbesondere weniger als etwa 5%, des Volumens des Proteinpräparats aus. Die Erfindung umfasst auch isolierte oder gereinigte Präparate mit einem Trockengewicht von zumindest 0,01, 0,1, 1,0 und 10 mg.
Ein "nichtessenzieller" Aminosäurerest ist ein Rest, der im Vergleich zur Wildtypsequenz von 13245 (beispielsweise der Sequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder 3) geändert werden kann, ohne die biologische Aktivität aufzuheben oder, noch bevorzugter, wesentlich zu verändern, während ein "essenzieller" Aminosäurerest zu solch einer Veränderung führt. Von Aminosäureresten, die bei den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung konserviert sind, z.B. den in der Pkinase-Domäne vorhandenen, wurde vorhergesagt, dass sie besonders unzugänglich für Veränderungen sind.
Eine "konservative Aminosäuresubstitution" ist eine, bei welcher der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ersetzt wird. Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten wurden auf dem Gebiet der Erfindung bereits definiert. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), apolaren Seitenketten (z.B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), β-verzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phe nylalanin, Tryptophan, Histidin). Somit wird ein vorhergesagter nichtessenzieller Aminosäurerest in einem 13245-Protein vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest aus der gleichen Seitenkettenfamilie ersetzt. Alternativ dazu können in einer anderen Ausführungsform Mutationen zufällig über die gesamte oder einen Teil der 13245-Kodierungssequenz eingeführt werden, beispielsweise durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können auf biologische 13245-Aktivität gescreent werden, um Mutanten zu identifizieren, die ihre Aktivität beibehalten. Nach Mutagenese von Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 kann das kodierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann bestimmt werden.
Die Bezeichnung "biologisch aktiver Teil" eines 13245-Proteins umfasst ein Fragment eines 13245-Proteins, das an der Wechselwirkung zwischen einem 13245-Molekül und einem Nicht-13245-Molekül teilnimmt. Biologisch aktive Teile eines 13245-Proteins umfassen Peptide mit Aminosäuresequenzen mit ausreichender Homologie zur Aminosäuresequenz des 13245-Proteins oder davon abgeleitet, z.B. die in Seq.-ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz, die weniger Aminosäuren umfassen als das 13245-Protein voller Länge und die zumindest eine Aktivität eines 13245-Proteins aufweisen. Typischerweise umfassen biologisch aktive Teile eine Domäne oder ein Motiv mit zumindest einer Aktivität des 13245-Proteins, beispielsweise eine Domäne oder ein Motiv, das zur Katalyse einer hierin beschriebenen Aktivität in der Lage ist, wie z.B. der kovalenten Addition einer Phosphatgruppierung an einen Protein-Aminosäuresequenzrest (z.B. eine Serin- oder Threonin-Hydroxylgruppe).
Ein biologisch aktiver Teil eines 13245-Proteins kann ein Polypeptid sein, das beispielsweise 10, 25, 50, 100, 200, 300 oder 400, 500, 1000 oder 2000 oder mehr Aminosäuren lang ist. Biologisch aktive Teile eines 13245-Proteins können als Ziele zur Entwicklung von Mitteln eingesetzt werden, die eine 13245-vermittelte Aktivität, z.B. eine hierin beschriebene biologische Aktivität, modulieren.
Berechnungen der Homologie oder Sequenzidentität zwischen Sequenzen (die Begriffe werden hierin austauschbar gebraucht) werden wie folgt durchgeführt.
Um die prozentuelle Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen oder zwischen zwei Nucleinsäuresequenzen zu bestimmen, werden die Sequenzen zum Zwecke des optimalen Vergleichs abgeglichen (z.B. können Lücken in eine oder in beide einer ersten und einer zweiten Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenz eingeführt werden, um einen optimalen Abgleich zu erzielen, und nichthomologe Sequenzen können zu Vergleichszwecken ignoriert werden). In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Länge einer Bezugssequenz, die zu Vergleichzwecken abgeglichen wird, zumindest 30%, vorzugsweise zumindest 40%, noch bevorzugter zumindest 50%, noch bevorzugter zumindest 60%, noch bevorzugter zumindest 70%, 80%, 90% oder 100% der Länge der Bezugssequenz (wenn z.B. eine zweite Sequenz in Bezug zur 13245-Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 angeordnet bzw. abgeglichen wird, werden zumindest 100 Aminosäurereste, vorzugsweise zumindest 200, 300, 400, 500, 1000, 1500 oder 2000 oder mehr, Aminosäurereste abgeglichen). Die Aminosäurereste oder Nucleotide an entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nucleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in der ersten Sequenz vom gleichen Aminosäurerest oder gleichen Nucleotid besetzt ist wie die entsprechende Position in der zweiten Sequenz, dann sind die Moleküle an dieser Position identisch (Aminosäure- oder Nucleinsäure-"Identität" wird hierin gleichbedeutend mit Aminosäure- oder Nucleinsäure-"Homologie" verwendet). Die prozentuelle Identität zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an identischen Positionen zwischen den beiden Sequenzen, wobei auch die Anzahl an Lücken und die Länge jeder einzelnen Lücke berücksichtigt wird, die für einen optimalen Abgleich dieser beiden Sequenzen eingefügt werden müssen.
Der Vergleich von Sequenzen und die Bestimmung der prozentuellen Identität zwischen zwei Sequenzen kann mithilfe eines mathematischen Algorithmus erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die prozentuelle Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen unter Anwendung des Algorithmus nach Needleman et al. (J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)) bestimmt, der in das GAP-Programm des GCG-Software-Pakets miteinbezogen wurde (verfügbar auf http://www.gcg.com), wobei entweder eine BLOSUM62-Matrix oder ein PAM250-Matrix und ein "gap weight" von 16, 14, 13, 10, 8, 6 oder 4 sowie ein "length weight" von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 eingesetzt werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die prozentuelle Identität zwischen zwei Nucleotidsequenzen unter Verwendung des GAP-Programms des GCG-Software-Pakets (verfügbar auf httpa/www.gcg.com) bestimmt, wobei eine NWSgapdna.CMP-Matrix und ein "gap weight" von 40, 50, 60, 70 oder 80 sowie ein "length weight" von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 eingesetzt werden. Eine besonders bevorzugte Gruppe von Parametern (die auch eingesetzt werden sollte, wenn sich der Arzt nicht sicher ist, welche Bedingungen eingesetzt werden sollen, um zu bestimmen, ob ein Molekül innerhalb der Sequenzidentitäts- oder Homologiegrenzen der vorliegenden Erfindung liegt) umfasst eine BLOSUM62-Bewertungsmatrix mit einem Lückenstrafpunktewert von 12, einem Lückenerweiterungspunktewert von 4 und einem Rasterverschiebungsstrafpunktewert von 5.
Die prozentuelle Identität zwischen zwei Aminosäuren oder Nucleotidsequenzen kann unter Anwendung des Algorithmus nach Meyers et al. (CABIOS 4, 11-17 (1989)) bestimmt werden, der in das ALIGN-Programm (Version 2.0) miteinbezogen wurde, wobei eine PAM120-Weight-Residue-Tabelle, ein Lückenlängen-Strafpunktewert von 12 und ein Lückenstrafpunktewert von 4 eingesetzt werden.
Die hierin beschriebene(n) Nucleinsäure und Proteinsequenzen können als "Query"-Sequenz verwendet werden, um öffentliche Datenbanken zu durchsuchen und beispielsweise andere Familienmitglieder oder verwandte Sequenzen zu identifizieren. Solche Suchen können mithilfe des NBLAST- und XBLAST-Programms (Version 2.0) von Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215, 402-410 (1990)) durchgeführt werden. BLAST-Nucleotidsuchen können mithilfe des NBLAST-Programms, Score = 100, Wortlänge = 12, durchgeführt werden, um Nucleotidsequenzen zu erhalten, die homolog zu 13245-Nucleinsäuremolekülen der Erfindung sind. BLAST-Proteinsuchen können mit dem XBLAST-Programm, Score = 50, Wortlänge = 3, durchgeführt werden, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die homolog zu 13245-Molekülen der Erfindung sind. Um Abgleiche mit Lücken zu Vergleichszwecken zu erhalten, kann Gapped BLASDT eingesetzt werden, wie es von Altschul et al. (Nucl. Acids. Res. 25, 3389-3402 (1997)) beschrieben wird. Wenn BLAST- und Gapped-BLAST-Programme eingesetzt werden, können die Standardparameter des jeweiligen Programms (z.B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Siehe <http://www.ncbi.nlm.nih.gov>.
"Mangelhafte oder aberrierende Expression" bezieht sich hierin auf ein Nichtwildtyp-Genexpressionsmuster auf RNA- oder Proteinebene. Diese umfasst: Expression in Nicht-Wwildtyp-Ausmaß, d.h. Über- oder Unterexpression; ein Expressionsmuster, das sich in Bezug auf den Zeitpunkt oder das Stadium der Expression des Gens vom Wildtyp unterscheidet, z.B. verstärkte oder verringerte Expression (im Vergleich zum Wildtyp) in einer vorbestimmten Entwicklungsperiode oder -phase; ein Expressionsmuster, das sich im Sinne einer verringerten Expression (im Vergleich zum Wildtyp) in einem vorbestimmten Zelltyp oder Gewebetyp vom Wildtyp unterscheidet; ein Expressionsmuster, das sich in Bezug auf die Spleißgröße, Aminosäuresequenz, posttranslationale Modifikation oder biologische Aktivität des exprimierten Polypeptids vom Wildtyp unterscheidet; ein Expressionsmuster, das sich in Bezug auf die Auswirkung eines Umweltreizes oder extrazellulären Reizes auf die Expression des Gens vom Wildtyp unterscheidet, z.B. ein Muster mit verstärkter oder verringerter Expression (im Vergleich zum Wildtyp) in Gegenwart einer Steigerung oder Verringerung der Reizstärke.
"Subjekt" kann sich hierin auf ein Säugetier, z.B. einen Menschen, oder auf ein Versuchs-, Tier- oder Krankheitsmodell beziehen. Das Subjekt kann auch ein anderes Tier als der Mensch, z.B. ein Pferd, eine Kuh, eine Ziege oder ein anderes Haustier sein.
Ein "gereinigtes Zellpräparat" bezieht sich hierin, im Falle von Pflanzen- oder Tierzellen, auf ein In-vitro-Präparat von Zellen und nicht auf eine ganze intakte Pflanze oder ein ganzes intaktes Tier. Im Falle von kultivierten Zellen oder Mikrobenzellen besteht es aus einem Präparat aus zumindest 10%, noch bevorzugter 50%, der Subjektzellen.
Nachstehend werden verschiedene Aspekte der Erfindung genauer beschrieben.
Isolierte Nucleinsäuremoleküle
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes oder gereinigtes Nucleinsäuremolekül bereit, das für ein hierin beschriebenes 13245-Polypeptid, beispielsweise ein 13245-Protein voller Länge oder ein Fragment davon, wie etwa einen biologisch aktiven Teil eines 13245-Proteins, kodiert. Außerdem umfasst sie ein Nucleinsäurefragment, das zur Verwendung als Hybridisierungssonde geeignet ist, die beispielsweise zu Identifikation von für ein Polypeptid der Erfindung kodierenden Nucleinsäuremolekülen eingesetzt werden kann, 13245-mRNA und Fragmente, die als Primer, z.B. PCR-Primer für die Amplifikation oder Mutation von Nucleinsäuremolekülen, geeignet sind.
In einer Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nucleinsäuremolekül der Erfindung die in Seq.-ID Nr. 1 dargestellte Nucleotidsequenz oder einen Teil davon. In einer Ausführungsform umfasst das Nucleinsäuremolekül Sequenzen, die für das menschliche 13245-Protein kodieren (d.h. "die kodierende Region" der Nucleotide 19-6178 aus Seq.-ID Nr. 1), sowie nichttranslatierte 5'-Sequenzen (Nucleotide 6179-6575 von Seq.-ID Nr. 1). Alternativ dazu kann das Nucleinsäuremolekül auch nur die kodierende Region von Seq.-ID Nr. 1 (z.B. die Nucleotide 19-6178, die der Seq.-ID Nr. 3 entsprechen) und beispielsweise keine flankierenden Sequenzen umfassen, die normalerweise die Subjektsequenz begleiten. In einer weiteren Ausführungsform kodiert das Nucleinsäuremolekül für eine Sequenz, die dem 2053-Aminosäurerest-Proteind er Seq.-ID Nr. 2 entspricht.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nucleinsäuremolekül der Erfindung ein Nucleinsäuremolekül, das ein Komplement der in einer aus Seq.-ID Nr. 1 und 3 dargestellten Nucleotidsequenz ist, und einen Teil einer dieser Sequenzen. In anderen Ausführungsformen weist das Nucleinsäuremolekül der Erfindung ausreichende Komplementarität zu einer in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 dargestellten Nucleotidsequenz auf, sodass es mit einer Nucleinsäure mit dieser Sequenz hybridisieren und einen stabilen Duplex bilden kann.
In einer Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nucleinsäuremolekül der Erfindung eine Nucleotidsequenz, die zumindest zu etwa 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% oder mehr zur Gesamtlänge einer in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 dargestellten Nucleotidsequenz sowie zu einem Teil, vorzugsweise mit der gleichen Länge, einer dieser Nucleotidsequenzen homolog ist.
13245-Nucleinsäurefragmente
Ein Nucleinsäuremolekül der Erfindung kann auch nur einen Teil der Nucleinsäuresequenz von Seq.-ID Nr. 1 und 3 enthalten. Solch ein Nucleinsäuremolekül kann beispielsweise ein Fragment enthalten, das als Sonde oder Primer verwendet werden kann, oder ein Fragment, das für eine Teil eines 13245-Proteins, z.B. einen immunogenen oder biologisch aktiven Teil eines 13245-Proteins, kodiert. Ein Fragment kann Nucleotide umfassen, die den Resten 97-360 von Seq.-ID Nr. 2 entsprechen, die für eine Pkinase-Domäne von menschlichem 13245 kodieren, oder den Resten 1568-1865 von Seq.-ID Nr. 2, die für eine CNH-Domäne von menschlichem 13245 kodieren. Die aus der Klonierung des 13245-Gens bestimmte Nucleotidsequenz erleichtert die Bildung von Sonden und Primern zur Verwendung bei der Identifikation und/oder Klonierung anderer 13245-Familienmitglieder oder von Fragmenten davon sowie von 13245-Homologen oder Fragmenten davon von anderen Spezies.
In einer anderen Ausführungsform umfasst eine Nucleinsäure eine Nucleotidsequenz, die einen Teil der oder die gesamte kodierende(n) Region umfasst und sich in die nichtkodierende 5'- oder 3'-Region oder in beide erstreckt. Andere Ausführungsform umfassen ein Fragment, das eine für ein hierin beschriebenes Aminosäurefragment kodierende Nucleotidsequenz enthält. Nucleinsäurefragmente können für eine spezifische Domäne oder Stelle, wie sie hierin beschrieben sind, oder Fragmente davon kodieren, insbesondere Fragmente davon, die zumindest etwa 250 Aminosäuren lang sind. Fragmente umfassen auch Nucleinsäuresequenzen, die bestimmten Aminosäuresequenzen, wie sie oben beschrieben sind, oder Fragmenten davon entsprechen. Nucleinsäurefragmente sollten jedoch nicht so verstanden werden, dass sie jene Fragmente umfassen, die schon vor der vorliegenden Erfindung geoffenbart wurden.
Ein Nucleinsäurefragment kann eine Sequenz enthalten, die einer hierin beschriebenen Domäne, Region oder funktionellen Stelle entspricht. Ein Nucleinsäurefragment kann auch eine oder mehrere der hierin beschriebenen Domänen, Regionen oder funktionellen Stellen enthalten.
13245-Sonden und -Primer werden ebenfalls bereitgestellt. Typischerweise ist eine Sonde/ein Primer ein isoliertes oder gereinigtes Oligonucleotid. Das Oligonucleotid umfasst typischerweise eine Region einer Nucleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen an zumindest etwa 7, 12 oder 15, vorzugsweise etwa 20 oder 25, noch bevorzugter etwa 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 oder 75 zusammenhängende Nucleotide einer Sense- oder Antisense-Sequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder 3 hybridisieren, sowie natürlich vorkommende Allelvarianten oder -mutanten von Seq.-ID Nr. 1 oder 3.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nucleinsäure eine Sonde, die zumindest 5 oder 10 und weniger als 200, noch bevorzugter weniger als 100, oder weniger als 50 Basenpaare lang ist. Sie sollte mit einer hierin geoffenbarten Sequenz identisch sein oder sich um 1 oder weniger als 5 oder 10 Basen von dieser unterscheiden. Wenn zum Vergleich der Sequenzen ein Abgleich erforderlich ist, sollte auf maximale Homologie abgeglichen werden. "Looped-out"-Sequenzen aufgrund von Deletionen oder Insertionen oder Fehlpaarungen werden als Unterschiede angesehen.
Eine Sonde oder ein Primer kann vom Sense- oder Antisense-Strang einer Nucleinsäure abgeleitet sein, die für eine Pkinase-Domäne an etwa den Aminosäureresten 97-360 von Seq.-ID Nr. 2 oder die vorhergesagte CNH-Domäne an etwa den Aminosäureresten 1568-1865 von Seq.-ID Nr. 2 kodiert.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Satz Primer bereitgestellt, beispielsweise Primer, die zur Verwendung in einer PCR geeignet sind, die zur Amplifikation einer ausgewählten Region einer 13245-Sequenz eingesetzt werden können. Die Primer sollten zumindest 5, 10 oder 50 Basenpaare lang sein und weniger als 100, oder weniger als 200, Basenpaare lang sein. Die Primer sollten identisch sein oder sich um eine Base von einer hierin geoffenbarten Sequenz oder von einer natürlich vorkommenden Variante unerscheiden. Primer, die zur Amplifikation aller oder eines Teil der folgenden Regionen geeignet sind, werden ebenfalls bereitgestellt: z.B. eine oder mehrere Pkinase-Domänen und die vorhergesagte CNH-Domäne, wie oben in Bezug auf Seq.-ID Nr. 2 definiert.
Ein Nucleinsäurefragment kann für eine epitoptragende Region eines hierin beschriebenen Polypeptids kodieren.
Ein Nucleinsäurefragment, das für einen "biologisch aktiven Teil eines 13245-Polypeptids" kodiert, kann durch Isolierung eines Abschnitts der Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder 3, der für ein Polypeptid mit biologischer 13245-Aktivität (z.B. die hierin beschriebenen biologischen Aktivitäten des 13245-Proteins) kodiert, Expression des kodierten Teils des 13245-Proteins (z.B. durch rekombinante Expression in vitro) und Beurteilung der Aktivität des kodierten Abschnitts des 132345-Proteins hergestellt werden. Ein Nucleinsäurefragment, das für einen biologisch aktiven Teil von 13245 kodiert, umfasst beispielsweise eine Pkinase-Domäne, z.B. die Aminosäurereste 97-360 von Seq.-ID Nr. 2, oder eine CNH-Domäne, z.B. die Aminosäurereste 1568-1865 von Seq.-ID Nr. 2. Ein Nucleinsäurefragment, das für einen biologisch aktiven Teil eines 13245-Polypeptids kodiert, kann eine Nucleotidsequenz umfassen, die 25 Nucleotide lang oder länger ist.
In einer Ausführungsform umfasst die Nucleinsäure solche, die eine Nucleotidsequenz mit einer Länge von mehr als 260, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000 oder 6000 aufweisen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an ein Nucleinsäuremolekül mit der Sequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder 3 hybridisiert.
13245-Nucleinsäurevarianten
Die Erfindung umfasst weiters Nucleinsäuremoleküle mit einer Sequenz, die sich von den in Seq.-ID Nr. 1 und 3 dargestellten Nucleotidsequenzen unterscheidet. Solche Unterschiede können auf eine Degeneration des genetischen Codes zurückzuführen sein (d.h. Unterschiede, die eine Nucleinsäure ergeben, die für die gleichen 13245-Proteine kodiert wie die hierin geoffenbarte Nucleotidsequenz). In einer weiteren Ausführungsform kodiert ein isoliertes Nucleinsäuremolekül der Erfindung für ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die sich um zumindest 1, aber weniger als 5, 10, 20, 50 oder 100 Aminosäurereste von Seq.-ID Nr. 2 unterscheidet. Wenn zum Vergleich der Sequenzen ein Abgleich erforderlich ist, sollten sie auf maximale Homologie abgeglichen werden. "Looped-out"-Sequenzen aufgrund von Deletionen oder Insertionen oder Fehlpaarungen werden als Unterschiede angesehen.
Nucleinsäuren des Erfinders können aufgrund des Vorhandenseins von Codons ausgewählt werden, die für ein bestimmtes Expressionssystem bevorzugt oder nicht bevorzugt sein können. Die Nucleinsäure kann beispielsweise eine solche sein, in der zumindest ein Codon, vorzugsweise zumindest 10% oder 20% der Codons, so verändert ist/sind, dass die Sequenz für die Expression in E.-coli-, Hefe-, Menschen-, Insekten- oder CHO-Zellen optimiert ist.
Nucleinsäurevarianten können natürlich vorkommen, wie z.B. Allelvarianten (gleicher Locus), Homologe (anderer Locus) und Orthologe (anderer Organismus), oder nicht natürlich vorkommen. Nicht natürlich vorkommende Varianten können durch Mutageneseverfahren hergestellt werden, einschließlich jener, die für Polynucleotide, Zellen oder Organismen eingesetzt werden. Die Varianten können Nucleotidsubstitutionen, -deletionen, -inversionen und -insertionen enthalten. Eine Variation kann in den kodierenden oder in den nichtkodierenden Regionen oder in beiden vorkommen. Die Variationen können sowohl konservative als auch nichtkonservative Aminosäuresubstitutionen (bei Vergleich der kodierten Produkte) erzeugen.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Nucleinsäure eine Sequenz auf, die sich von Seq.-ID Nr. 1 und 2 beispielsweise wie folgt unterschiedet: um zumindest einen, aber weniger als 10, 20, 30 oder 40, Nucleotidreste; oder um zumindest einen, aber weniger als 1%, 5%, 10% oder 20%, der Nucleotidreste in der jeweiligen Nucleinsäure. Falls für diese Analyse erforderlich, sollten die Sequenzen auf maximale Homologie abgeglichen werden. "Looped-out"-Sequenzen aufgrund von Deletionen oder Insertionen oder Fehlpaarungen werden als Unterschiede angesehen.
Orthologe, Homologe und Allelvarianten können mithilfe von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren identifiziert werden. Diese Varianten umfassen eine Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das zu 50%, zumindest etwa 55%, typischerweise zumindest etwa 70-75%, häufiger zumindest etwa 80-85%, meist zumindest etwa 90-95% oder mehr mit einer der Nucleotidsequenzen von Seq.-ID Nr. 1 und 3 identisch ist, oder ein Fragment einer dieser Sequenzen. Solche Nucleinsäuremoleküle können leicht identifiziert werden, da sie in der Lage sind, unter stringenten Bedingungen an die Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder 3 oder ein Fragment einer dieser Sequenzen zu hybridisieren. Nucleinsäuremoleküle, die Orthologen, Homologen und Allelvarianten der 13245-cDNAs der Erfindung entsprechen, können weiters isoliert werden, indem sie bei der Kartierung dem gleichen Chromosom oder gleichen Locus wie das 13245-Gen zugeordnet werden.
Bevorzugte Varianten umfassen jene, die mit einer der hierin beschriebenen biologischen 13245-Aktivitäten zusammenhängen, z.B. die Katalyse der Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Aminosäurerest eines Proteins (z.B. eines Serin- oder Threoninrests) und einer Phosphatgruppierung.
Allelvarianten von 13245 (z.B. menschlichem 13245) umfassen sowohl funktionelle als auch nichtfunktionelle Proteine. Funktionelle Allelvarianten sind natürlich vorkommende Aminosäuresequenzvarianten des 13245-Proteins innerhalb einer Population, welche die Fähigkeit beibehalten, eine der hierin beschriebenen biologischen 13245-Aktivitäten zu vermitteln.
Funktionelle Allelvarianten enthalten typischerweise nur konservative Substitutionen einer oder mehrerer der Aminosäuren von Seq.-ID Nr. 2 oder Substitutionen, Deletionen oder Insertionen von nicht entscheidenden Resten in nicht entscheidenden Regionen des Proteins. Nichtfunktionelle Allelvarianten sind natürlich vorkommende Aminosäuresequenzvarianten des 13245- (z.B. menschlichen 13245-) Proteins innerhalb einer Population, die nicht in der Lage sind, eine der hierin beschriebenen biologischen 13245-Aktivitäten zu vermitteln. Nichtfunktionelle Allelvarianten enthalten typischerweise eine nichtkonservative Substitution, eine Deletion oder eine Insertion oder eine vorzeitige Trunkierung der Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 oder eine Substitution, Insertion oder Deletion in entscheidenden Resten oder entscheidenden Regionen des Proteins.
Außerdem liegen Nucleinsäuremoleküle, die für andere Mitglieder der 13245-Familie kodieren und somit eine Nucleotidsequenz aufweisen, die sich von den 13245-Sequenzen von Seq.-ID Nr. 1 und 3 unterscheidet, innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung.
Antisense-Nucleinsäuremoleküle Ribozyme und modifizierte 13245-Nucleinsäuremoleküle
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das antisense zu 13245 ist. Eine "Antisense-Nucleinsäure" kann ein Nucleotidsequenz enthalten, die komplementär zu einer "Sense-Nucleinsäure" ist, die für ein Protein kodiert, beispielsweise komplementär zum kodierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Sequenz. Die Antisense-Nucleinsäure kann komplementär zu einem gesamten für 13245 kodierenden Strang oder nur zu einem Abschnitt davon sein (z.B. zur kodierenden Region von menschlichem 13245, die der Seq.-ID Nr. 3 entspricht). In einer anderen Ausführungsform ist die Antisense-Nucleinsäure antisense zu einer "nichtkodierenden Region" des kodierenden Strangs einer Nucleotidsequenz, die für 13245 kodiert (z.B. die nichttranslatierten 5'- und 3'-Regionen).
Eine Antisense-Nucleinsäure kann so aufgebaut sein, dass sie komplementär zur gesamten kodierenden Region von 13245-mRNA ist, aber noch bevorzugter handelt es sich um ein Oligonucleotid, das antisense zu nur einem Abschnitt der kodierenden oder nichtkodierenden Region von 13245-mRNA ist. Das antisense Oligonucleotid kann beispielsweise komplementär zur Region sein, die die Translationsinitiationsstelle von 13245-mRNA umgibt, beispielsweise zwischen den -10- und +10-Regionen der Zielgen-Nucleotidsequenz von Interesse. Ein Antisense-Oligonucleotid kann beispielsweise etwa 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 oder 80 oder mehr Nucleotidreste lang sein.
Eine Antisense-Nucleinsäure der Erfindung kann mithilfe chemischer Synthese- und enzymatischer Ligationsreaktionen unter Einsatz von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren konstruiert werden. Eine Antisense-Nucleinsäure (z.B. ein Antisense-Oligonucleotid) kann beispielsweise unter Verwendung von natürlich vorkommenden Nucleotiden oder auf verschiedene Arten modifizierten Nucleotiden chemisch synthetisiert werden, die so aufgebaut sind, dass sie die biologische Stabilität der Moleküle erhöhen oder die physikalische Stabilität des Duplex erhöhen, der zwischen den Antisense- und Sense-Nucleinsäuren gebildet wird, und es können z.B. Thiophosphatderivate und acridinsubstituierte Nucleotide eingesetzt werden. Die Antisense-Nucleinsäure kann auch biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in den eine Nucleinsäure in Antisense-Orientierung subkloniert wurde (d.h. die von der insertierten Nucleinsäure transkribierte RNA weist Antisense-Orientierung in Bezug auf eine Zielnucleinsäure von Interesse auf, wie im nachstehenden Abschnitt erläutert wird).
Die Antisense-Nucleinsäuremoleküle der Erfindung werden typischerweise einem Individuum verabreicht (beispielsweise durch Injektion an einer Gewebestelle) oder in situ gebildet, sodass sie mit zellulärer mRNA und/oder genomischer DNA, die für ein 13245-Protein kodiert, hybridisiert oder daran bindet, um die Expression des Proteins zu hemmen, beispielsweise durch Hemmung der Transkription und/oder Translation. Alternativ dazu können Antisense-Nucleinsäuremoleküle modifiziert werden, um auf ausgewählte Zellen abzuzielen, und dann systemisch verabreicht werden.
Für eine systemische Verabreichung können Antisense-Moleküle so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene binden, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, beispielsweise indem die Antisense-Nucleinsäuremoleküle an Peptide oder Antikörper gebunden werden, die an Zelloberflächenrezeptoren oder -antigene binden. Die Antisense-Nucleinsäuremoleküle könne auch Zellen zugeführt werden, indem die hierin beschriebenen Vektoren verwendet werden. Um ausreichende intrazelluläre Konzentrationen der Antisense-Moleküle zu erreichen, werden Vektorkonstrukte bevorzugt, in denen das Antisense-Nucleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken pol-II- oder pol-III-Promotors stehen.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Antisense-Nucleinsäuremolekül der Erfindung ein α-anomeres Nucleinsäuremolekül. Ein α-anomeres Nucleinsäuremolekül bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in der, im Gegensatz zu den üblichen β-Einheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al., Nucl. Acids Res. 15, 6625-6641 (1987)). Das Antisense-Nucleinsäuremolekül kann auch ein 2'-o-Methylribonucleotid (Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15, 6131-6148 (1987)) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon (Inoue et al., FEBS Lett. 215, 327-330 (1987)) umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Antisense-Nucleinsäure der Erfindung ein Ribozym. Ein Ribozym mit Spezifität für eine für 13245 kodierende Nucleinsäure kann eine oder mehrere Sequenzen umfassen, die komplementär zur Nucleotidsequenz einer 13245-cDNA sind, wie sie hierin geoffenbart ist (d.h. Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3), sowie eine Sequenz mit einer bekannten katalytischen Sequenz, die für mRNA-Spaltung verantwortlich ist (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5.093.246 oder Haselhoff et al., Nature 334, 585-591 (1988)). Es kann beispielsweise ein Derivat einer Tetrahymena-L-19-IVS-RNA hergestellt werden, in dem die Nucleotidsequenz der aktiven Stelle komplementär zur Nucleotidsequenz ist, die in einer für 13245 kodierenden mRNA gespalten werden soll (z.B. US-Patent Nr. 4.987.071; und US-Patent Nr. 5.116.742). Alternativ dazu kann 13245-mRNA eingesetzt werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonucleasenaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen auszuwählen (z.B. Bartel et al., Science 261, 1411-1418 (1993)).
Die 132445-Genexpression kann gehemmt werden, indem auf Nucleotidsequenzen abgezielt wird, die zur Regulationsregion von 13245 komplementär sind (z.B. der 13235-Promotor und/oder -Enhancer), um Tripelhelixstrukturen zu bilden, welche die Transkription des 13245-Gens in Zielzellen verhindern (Helene, Anticancer Drug Des. 6, 569-584 (1991); Helene et al., Ann. N.Y. Acad. Sci 660, 27-36 (1992); Maher Bioassays 14,807-815 (1992)). Die Zahl der Sequenzen, auf die für eine Tripelhelixbildung abgezielt werden kann, kann durch Schaffung eines so genannten "Switchback"-Nucleinsäuremolekül erhöht werden. Switchback-Moleküle werden auf alternierende 5'-3', 3'-5'-Weise synthetisiert, sodass sie zuerst an einen Strang eines Duplex und dann an den anderen hybridisieren, wodurch keine größere Gruppe von entweder Purinen oder Pyrimidinen mehr auf einem Strang eines Duplex vorhanden sein muss.
Die Erfindung stellt weiters einen detektierbar markierten Oligonucleotidprimer und Sondenmoleküle bereit. Typischerweise sind solche Markierungen chemolumineszierend, fluoreszierend, radioaktiv oder kolorimetrisch.
Ein 1245-Nucleinsäuremolekül kann an der Basengruppierung, an der Zuckergruppierung oder am Phosphatrückgrat modifiziert werden, um beispielsweise die Stabilität, Hybridisierung oder Löslichkeit des Moleküls zu verbessern. Das Desoxyribosephosphat-Rückgrat der Nucleinsäuremoleküle kann beispielsweise so modifiziert werden, dass Peptidnucleinsäuren erzeugt werden (Hyrup et al., Bioorg. Med. Chem. 4, 5-23 (1996)). Die Bezeichnung "Peptidnucleinsäure" bezieht sich auf ein Nucleinsäuremimetikum, beispielsweise ein DNA-Mimetikum, in dem das Desoxyribosephosphat-Rückgrat durch ein Pseudopeptid-Rückgrat ersetzt ist und nur die vier natürlichen Nucleobasen erhalten bleiben. Das neutrale Rückgrat einer PNA kann unter Bedingungen geringer Ionenstärke eine spezifische Hybridisierung an DNA und RNA ermöglichen. Die Synthese von PNA-Oligomeren kann unter Anwendung einer herkömmlichen Festphasen-Peptidsynthesevorschrift durchgeführt werden, wie von Hyrup et al. (w.o. (1996); Perry-O'Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14671-14675) beschrieben.
PNAs von 13245-Nucleinsäuremolekülen können in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen eingesetzt werden. Beispielsweise können PNAs als Antisense- oder Antigenmittel für eine sequenzspezifische Modulation von Genexpression eingesetzt werden, beispielsweise durch Induktion von Transkriptions- oder Translationsarretierung oder Hemmung von Replikation. PNAs von 13245-Nucleinsäuremolekülen können auch bei der Analyse von Mutationen eines einzelnen Basenpaares in einem Gen eingesetzt werden (z.B. durch PNA-gesteuertes PCR-Clamping); als ,künstliches Restriktionsenzym', wenn sie in Kombination mit anderen Enzymen verwendet werden (z.B. S1-Nucleasen, wie in Hyrup et al., w.o. (1996) beschrieben); oder als Sonden oder Primer für DNA-Sequenzierung oder -Hybridisierung (Hyrup et al., w.o. (1996); Perry-O'Keefe, w.o.).
In anderen Ausführungsformen kann das Oligonucleotid andere angebundene Gruppen, wie z.B. Peptide, (beispielsweise zum Targeting von Wirtszellerezeptoren in vivo) oder Stoffe, die den Transport durch die Zellmembran (z.B. Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553-6556 (1989); Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 648-652 (1987); PCT-Veröffentlichung Nr. WO 88/09810) oder die Blut-Hirn-Schranke (siehe z.B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/10134) erleichtern, umfassen. Außerdem können Oligonucleotide mit durch Hybridisierung ausgelösten Spaltmitteln (z.B. Krol et al., Bio-Techniques 6, 958-976 (1988)) oder interkalierenden Mitteln (z.B. Zon, Pharm. Res. 5, 539-549 (1988)) modifiziert werden. Zu diesem Zweck kann das Oligonucleotid an ein anderes Molekül konjugiert werden (z.B. ein Peptid, ein durch Hybridisierung ausgelöstes Vernetzungsmittel, ein Transportmittel oder ein durch Hybridisierung ausgelöstes Spaltmittel).
Die Erfindung umfasst weiters Oligonucleotidprimer und -sondenmoleküle als Hybridisierungssonden mit zumindest einer Region, die komplementär zu einer 13245-Nucleinsäure der Erfindung ist, zwei komplementären Regionen, wobei eine ein Fluorophor und die andere einen Quencher aufweist, sodass die Hybridisierungssonde zur Quantifizierung der Gegenwart der 13245-Nucleinsäure der Erfindung in einer Probe zweckdienlich ist.
Isolierte 13245-Polypeptide
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes 13245-Protein oder ein Fragment, z.B. einen biologisch aktiven Teil, zur Verwendung als Immunogen oder Antigen zur Provokation oder zum Testen (oder häufiger zum Binden) von Anti-13245-Antikörpern. Ein 13245-Protein kann mithilfe von herkömmlichen Proteinreinigungsverfahren aus Zellen oder Gewebequellen isoliert werden. Ein 13245-Protein oder Fragmente davon können durch DNA-Rekombinationsverfahren produziert oder chemisch synthetisiert werden.
Polypeptide der Erfindung umfassen solche, die als Ergebnis des Vorhandenseins von mehreren Genen, von alternativen Transkriptionsvorgängen, alternativen RNA-Spleißvorgängen und alternativen Translations- und Posttranslationsvorgängen entstehen. Das Polypeptid kann in Systemen, z.B. kultivierten Zellen, exprimiert werden, die zu im Wesentlichen den gleichen posttranslationalen Modifikationen führen wie die Expression des Polypeptids in einer nativen Zelle, oder in Systemen, die zu einer Änderung oder Unterlassung von posttranslationalen Modifikationen, z.B. Glykosylierung oder Spaltung, führen, die bei einer Expression in einer nativen Zelle vorkommen.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist ein 13245-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Merkmale auf:

(1) es katalysiert die Bildung einer kovalenten Bindung in oder zwischen einem Aminosäurerest und einer Phosphatgruppierung;
(2) es moduliert die Zellkontraktilität;
(3) es moduliert das Zellwachstum;
(4) es moduliert die Zellleitfähigkeit;
(5) es moduliert den Eintritt einer Zelle in den Zellzyklus;
(6) es moduliert die Progression einer Zelle durch den Zellzyklus;
(7) es moduliert die Mitogenese;
(8) es moduliert den Zellmetabolismus;
(9) es moduliert die Gentranskription;
(10) es katalysiert die Interkonversion von phosphorylierten und dephosphorylierten Formen einer GTPase, wie z.B. einer Rho-GTPase;
(11) es moduliert die Zytokinese;
(12) es moduliert die Zellform;
(13) es moduliert die Zellbewegung (z.B. Tumormetastasen);
(14) es moduliert die Integration eines Virusgenoms in ein Wirtszellengenom;
(15) es moduliert die Haltung eines Virusgenoms in einem Wirtszellengenom;
(16) es moduliert die zytologischen Veränderungen in einer virusinfizierten Wirtszelle;
(17) es moduliert die Virusproduktion in einer virusinfizierten Wirtszelle;
(18) es moduliert die Wechselwirkung eines Virions mit einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle;
(19) es moduliert die Einkapselung eines Virions in einem Abschnitt einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle;
(20) es weist ein Molekulargewicht, eine Aminosäurezusammensetzung oder andere physikalische Merkmale eines 13245-Proteins der Seq.-ID Nr. 2 auf;
(21) es weist eine Gesamtsequenzähnlichkeit (Identität) von zumindest 60-65%, vorzugsweise zumindest 70%, noch bevorzugter zumindest 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 oder 99% oder mehr, mit einem Abschnitt von Seq.-ID Nr. 2 auf;
(22) es weist eine CNH-Domäne auf, die vorzugsweise zu etwa 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr mit den Aminosäureresten 1568-1865 von Seq.-ID Nr. 2 identisch ist; oder
(23) es weist zumindest eine Pkinase-Domäne auf, de vorzugsweise zu etwa 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr mit den Aminosäureresten 97-360 von Seq.-ID Nr. 2 identisch ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform unterschiedet sich das 13245-Protein oder Fragment davon nur unwesentlich, wenn überhaupt, von der entsprechenden Se quenz in Seq.-ID Nr. 2. In einer Ausführungsform unterscheidet es sich um zumindest einen, aber weniger als 15, 10 oder 5 Aminosäuren. In einer weiteren unterscheidet es sich von der entsprechenden Sequenz in Seq.-ID Nr. 2 um zumindest einen Rest, aber weniger als 20%, 15%, 10% oder 5% der Reste unterscheiden sich von der entsprechenden Sequenz in Seq.-ID Nr. 2 (wenn dieser Vergleich einen Abgleich erfordert, sollten die Sequenzen auf maximale Homologie abgeglichen werden. "Looped-out"-Sequenzen aufgrund von Deletionen oder Insertionen oder Fehlpaarungen werden als Unterschiede betrachtet). Die Unterschiede sind vorzugsweise Unterschiede oder Veränderungen an nichtessenziellen Aminosäureresten oder umfassen eine konservative Substitution eines Rests durch einen anderen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Unterschiede nicht an den Resten 97-360 oder 1568-1865 von Seq.-ID Nr. 2 zu finden.
Andere Ausführungsformen umfassen ein Protein, das eine oder mehrere Änderungen der Aminosäuresequenz im Vergleich zu Seq.-ID Nr. 2 aufweist (z.B. eine Änderung an einem Aminosäurerest, der für die Aktivität nicht essenziell ist). Die Aminosäuresequenz solcher 13245-Proteine unterscheidet sich von Seq.-ID Nr. 2, obwohl die biologische Aktivität erhalten bleibt.
In einer Ausführungsform umfasst das Protein eine Aminosäuresequenz mit zumindest etwa 60%, 65 5, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% oder mehr Homologie zu Seq.-ID Nr. 2.
Ein 13245-Protein oder ein Fragment mit einer Aminosäuresequenz wird bereitgestellt, die sich von Seq.-ID Nr. 2 in einer oder in beiden der Regionen, die den Resten 1-96, 361-1567 und 1866-2053 von Seq.-ID Nr. 2 entsprechen, um zumindest einen, aber weniger als 15, 10 oder 5 Aminosäurereste, unterscheidet, in der Region, die den Resten 97-360 und 1568-1865 von Seq.-ID Nr. 2 entspricht, jedoch nicht von Seq.-ID Nr. 2 (wenn dieser Vergleich einen Abgleich erfordert, sollten die Sequenzen auf maximale Homologie abgeglichen werden. "Looped-out"-Sequenzen aufgrund von Deletionen oder Insertionen oder Fehlpaarungen werden als Unterschiede angesehen). In manchen Ausführungsformen finden sich die Unterschiede vorzugsweise an nichtessenziellen Resten, oder es handelt sich um eine konservative Substitution, während sich der Unterschied in anderen an einem essenziellen Rest befindet oder eine nichtkonservative Substitution ist.
Ein biologisch aktiver Teil eines 13245-Proteins sollte die 13245-Pkinase-Domäne, die 13245-CNH-Domäne oder beide enthalten. Außerdem können andere biologisch aktive Teile, in denen andere Regionen des Proteins deletiert sind, durch Rekombinationsverfahren produziert und bezüglich einer oder mehrerer der funktionellen Aktivitäten eines nativen 13245-Proteins bewertet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das 13245-Protein die Aminosäuresequenz Seq.-ID Nr. 2 auf. In anderen Ausführungsformen ist das 13245-Protein im Wesentlichen identisch mit Seq.-ID Nr. 2. In einer weiteren Ausführungsform ist das 13245-Protein im Wesentlichen identisch mit Seq.-ID Nr. 2 und behält die funktionelle Aktivität des Proteins der Seq.-ID Nr. 2 bei.
Chimäre 13245-Proteine oder 13245-Fusionsproteine
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung chimäre 13245-Proteine oder 13245-Fusionsproteine bereit. "Chimäre 13245-Proteine" oder "13245-Fusionsproteine" umfassen hierin ein 13245-Polypeptid, das an ein Nicht-13245-Polypeptid gebunden ist. Ein "Nicht-13245-Polypeptid" ist ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die einem Protein entspricht, das zum 13245-Protein im Wesentlichen nicht homolog ist, beispielsweise einem Protein, das sich vom 13245-Protein unterscheidet und vom gleichen oder einem anderen Organismus stammt. Das 13245-Polypeptid des Fusionsproteins kann der gesamten oder einem Teil der, z.B. einem hierin beschriebenen Fragment der 13245-Aminosäuresequenz entsprechen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein 13245-Fusionsprotein zumindest einen oder mehrere biologisch aktive Abschnitte eines 13245-Proteins. Das Nicht-13245-Polypeptid kann an den Amino- oder Carboxylterminus des 13245-Polypeptids fusioniert sein.
Das Fusionsprotein kann eine Gruppierung umfassen, die hohe Affinität für einen Liganden aufweist. Beispielsweise kann das Fusionsprotein ein GST-13246-Fusionsprotein sein, in dem die 13245-Sequenzen an den Carboxylterminus der GST-Sequenzen fusioniert sind. Solche Fusionsproteine können die Reinigung von rekombinantem 13245 erleichtern. Alternativ dazu kann das Fusionsprotein ein 13245-Protein sein, das eine heterologe Signalsequenz am Aminoterminus enthält. In bestimmten Wirtszellen (z.B. Säugetier-Wirtszellen) kann die Expression und/oder Sekretion von 13245 durch Einsatz einer heterologen Signalsequenz gesteigert werden.
Fusionsproteine können ein ganzes oder einen Teil eines Serumproteins, z.B. eine konstante IgG-Region, oder menschlichen Serumalbumins enthalten.
Die 13245-Fusionsproteine der Erfindung können in pharmazeutische Zusammensetzungen miteinbezogen und in vivo an ein Individuum verabreicht werden. Die 13245-Fusionsproteine könne auch eingesetzt werden, um die Bioverfügbarkeit eines 13245-Substrats zu beeinflussen. 13245-Fusionsproteine sind eventuell in Therapien zur Behandlung von Erkrankungen zweckdienlich, die durch beispielsweise (i) eine aberrierende Modifikation oder Mutation eines für ein 13245-Protein kodierenden Gens; (ii) Fehlregulierung des 13245-Gens; und (iii) aberrierende posttranslationale Modifikation eines 13245-Proteins ausgelöst wird.
Weiters können die 13245-Fusionsproteine der Erfindung als Immunogene eingesetzt werden, um Anti-13245-Antikörper in einem Individuum zu erzeugen, 13245-Liganden zu reinigen und Screening-Tests durchzuführen, um Moleküle zu identifizieren, welche die Wechselwirkung von 13245 mit einem 13245-Substrat hemmen.
Im Handel sind Expressionsvektoren erhältlich, die bereits für eine Fusionsgruppierung kodieren (z.B. ein GST-Polypeptid). Eine für 13245 kodierende Nucleinsäure kann in solch einen Expressionsvektor so kloniert werden, dass die Fusionsgruppierung im Leseraster an das 13245-Protein gebunden wird.
Varianten von 13245-Proteinen
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch Varianten eines 13245-Polypeptids, die beispielsweise als Agonisten (Mimetika) oder als Antagonisten dienen. Varianten der 13245-Proteine können durch Mutagenese, z.B. einzelne Punktmutationen, Insertion oder Deletion von Sequenzen oder Verkürzung eines 13245-Proteins, erzeugt werden. Ein Agonist der 13245-Proteine kann im Wesentlichen die gleichen oder eine Untergruppe der biologischen Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form eines 13245-Proteins beibehalten. Ein Antagonist eines 13245-Proteins kann eine oder mehrere der Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des 13245-Proteins hemmen, beispielsweise durch kompetitive Modulation einer 13245-vermittelten Aktivität eines 13245-Proteins. Somit können bestimmte biologische Wirkungen durch Behandlung mit einer Variante mit eingeschränkter Funktion hervorgehoben werden. Vorzugsweise führt eine Behandlung eines Individuums mit einer Variante mit einer Untergruppe von biologischen Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des Proteins zu weniger Nebenwirkungen im Individuum als eine Behandlung mit der natürlich vorkommenden Form des 13245-Proteins.
Varianten eines 13245-Proteins können durch Screenen von kombinatorischen Bibliotheken von Mutanten, z.B. Verkürzungsmutanten, eines 13245-Proteins auf Agonisten- oder Antagonistenaktivität identifiziert werden.
Bibliotheken von Fragmenten, z.B. aminoterminalen, carboxylterminalen oder internen Fragmenten, einer für ein 13245-Protein kodierenden Sequenz können eingesetzt werden, um eine variantenreiche Population von Fragmenten zum Screenen und für die darauf folgende Auswahl von Varianten eines 13245-Proteins zu erzeugen.
Varianten, in denen ein Cysteinrest addiert oder deletiert ist oder in denen ein glykosylierter Rest addiert oder deletiert ist, sind besonders bevorzugt.
Verfahren zum Screenen von Genprodukten aus kombinatorischen Bibliotheken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung erzeugt wurden, und zum Screenen von cDNA-Bibliotheken auf Genprodukte mit ausgewählten Eigenschaften. Recursive Ensemble Mutagenesis (REM), ein Verfahren, das die Häufigkeit von funktionellen Mutanten in den Bibliotheken erhöht, kann in Kombination mit den Screening-Tests eingesetzt werden, um 13245-Varianten zu identifizieren (Arkin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 7811-7815; Delgrave et al., Protein Engr. 6, 327-331 (1993)).
Auf Zellen basierende Tests können genutzt werden, um eine variantenreiche 13245-Bibliothek zu analysieren. Eine Bibliothek von Expressionsvektoren kann beispielsweise in eine Zelllinie transfiziert werden, z.B. eine Zelllinie, die normalerweise auf 13245 auf substratabhängige Weise reagiert. Die transfizierten Zellen werden dann mit 13245 kontaktiert, und die Auswirkung der Expression der Mutante auf die Signalgebung durch das 13245-Substrat kann detektiert werden, z.B. durch die Messung von Veränderungen im Zellwachstum und/oder in der enzymatischen Aktivität. Plasmid-DNA kann dann aus den Zellen gewonnen werden, für die eine Inhibierung, oder alternativ dazu eine Verstärkung, der Signalgebung durch das 13245-Substrat bestimmt wurde, und die einzelnen Klone können näher charakterisiert werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines 13245-Polypeptids, beispielsweise eines Peptids mit Nichtwildtypaktivität, z.B. eines Antagonisten, Agonisten oder Superagonisten eines natürlich vorkommenden 13245-Polypeptids, z.B. eines natürlich vorkommenden 13245-Polypeptids. Das Verfahren umfasst: eine Veränderung der Sequenz eines 13245-Polypeptids, beispielsweise eine Veränderung der Sequenz, z.B. durch Substitution oder Deletion eines oder mehrerer Reste einer nichtkonservierten Region, einer Domäne oder eines Rests, wie sie hierin geoffenbart sind, und das Testen des veränderten Polypeptids auf die gewünschte Aktivität.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Versehen eines Fragments oder Analogons eines 13245-Polypeptids mit einer biologischen Aktivität eines natürlich vorkommenden 13245-Polypeptids. Das Verfahren umfasst: das Ver ändern der Sequenz, beispielsweise durch Substitution oder Deletion eines oder mehrerer Reste, eines 13245-Polypeptids, beispielsweise durch Veränderung der Sequenz einer nichtkonservierten Region oder einer Domäne oder eines Rests, wie sie hierin beschrieben sind, und das Testen des veränderten Polypeptids auf die gewünschte Aktivität.
Anti-13245-Antikörper
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Anti-13245-Antikörper bereit. Der Begriff "Antikörper" bezieht sich hierin auf ein Immunglobulinmolekül oder einen immunologisch aktiven Teil davon, d.h. einen antigenbindenden Teil. Beispiele für immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen umfassen F(ab)- und F(ab')₂-Fragmente, die durch Behandlung des Antikörpers mit einem Enzym wie Pepsin erzeugt werden können.
Der Antikörper kann ein polyklonaler, monoklonaler, rekombinanter, z.B. ein chimärer oder humanisierter, voll menschlicher, nicht menschlicher, z.B. von einer Maus stammender, oder einkettiger Antikörper sein. In einer bevorzugten Ausführungsform weist er Effektorfunktion auf und kann ein Komplement fixieren. Der Antikörper kann an ein Toxin oder ein Bildgebungsmittel gekuppelt sein.
Ein 13245-Protein voller Länge oder ein antigenes Peptidfragment von 13245 kann als Immunogen verwendet werden oder zur Identifikation von 13245-Antikörpern eingesetzt werden, die mit anderen Immunogenen hergestellt wurden, z.B. Zellen, Membranpräparate und dergleichen. Das antigene Peptid von 13245 sollte zumindest 8 Aminosäurereste der in Seq.-ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz umfassen und ein Epitop von 13245 aufweisen. Vorzugsweise umfasst das antigene Peptid zumindest 10 Aminosäurereste, noch bevorzugter zumindest 15 Aminosäurereste, noch bevorzugter zumindest 20 Aminosäurereste, und insbesondere zumindest 30 Aminosäurereste.
Fragmente von 13245, die etwa die Reste 195-210 von Seq.-ID Nr. 2 umfassen, können zur Herstellung von Antikörpern, beispielsweise zur Verwendung als Immunogene oder zur Charakterisierung der Spezifität eines Antikörpers, gegen hydrophobe Regionen des 13245-Proteins eingesetzt werden. Gleichermaßen kann ein Fragment von 13245, das etwa die Reste 455-475 von Seq.-ID Nr. 2 umfasst, zur Herstellung eines Antikörpers gegen einen hydrophile Region des 13245-Proteins eingesetzt werden.
Antikörper, die mit einer dieser Regionen oder anderen hierin beschriebenen Regionen oder Domänen reaktiv sind oder für solche spezifisch sind, werden ebenfalls bereitgestellt.
Bevorzugte Epitope, die vom antigenen Peptid enthalten sind, sind Regionen von 13245, sie sich auf der Oberfläche des Proteins befinden, z.B. hydrophile Regionen, sowie Regionen mit hoher Antigenität. Eine Emini-Oberflächenwahrscheinlichkeitsanalyse der menschlichen 13245-Proteinsequenz kann beispielsweise verwendet werden, um die Regionen aufzuzeigen, die sich mit besonders hoher Wahrscheinlichkeit auf der Oberfläche des 13245-Proteins befinden und somit sehr wahrscheinlich Oberflächereste darstellen, die als Ziele für eine Antikörperproduktion zweckdienlich sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform bindet der Antikörper ein Epitop in einer beliebigen hierin beschriebenen Domäne oder Region von 13245-Proteinen.
Chimäre, humanisierte, aber insbesondere vollständig menschliche Antikörper sind für Anwendungen wünschenswert, die eine wiederholte Verabreichung umfassen, z.B. eine therapeutische Behandlung (und einige diagnostische Behandlungen) von menschlichen Patienten.
Der Anti-13245-Antikörper kann ein einkettiger Antikörper sein. Ein einkettiger Antikörper (scFv) kann gentechnisch verändert sein (z.B. Colcher et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 880, 263-280 (1999); Reiter, Clin. Cancer Res. 2, 245-252 (1996)). Der einketti ge Antikörper kann dimerisiert oder multimerisiert werden, um mehrwertige Antikörper mit Spezifitäten für unterschiedliche Epitope desselben Ziel-13245-Proteins herzustellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist der Antikörper verringerte oder keine Fähigkeit auf, an einen Fc-Rezeptor zu binden. Beispielsweise kann es sich um einen Isotyp, einen Subtyp, ein Fragment oder eine andere Mutante handelt, die die Bindung an einen Fc-Rezeptor nicht unterstützt, es kann also beispielsweise eine mutierte oder deletierte Fc-Rezeptor-Bindungsregion aufweisen.
Ein Anti-13245-Antikörper (z.B. monoklonaler Antikörper) kann eingesetzt werden, um 13245 durch Standardverfahren wie Affinitätschromatographie oder Immunfällung zu isolieren. Außerdem kann ein Anti-13245-Antikörper zur Detektion eines 13245-Proteins (z.B. in einem Zelllysat oder Zellüberstand) verwendet werden, um das Ausmaß und Muster der Expression des Proteins zu bewerten. Anti-13245-Antikörper können als Teil eines klinischen Testverfahrens, z.B. zur Bestimmung der Wirksamkeit eines bestimmten Behandlungsschemas diagnostisch zur Überwachung des Proteingehalts in Gewebe eingesetzt werden. Die Detektion kann durch Kupplung (z.B. physikalische Bindung) des Antikörpers an eine detektierbare Substanz (z.B. Antikörpermarkierung) vereinfacht werden. Beispiele für detektierbare Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszierende Materialien, lumineszierende Materialien, biolumineszierende Materialien und radioaktive Materialien. Beispiele für geeignete Enzyme umfassen Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Acetylchlolinesterase; Beispiele für geeignete prosthetische Gruppenkomplexe umfassen Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin; Beispiele für geeignete fluoreszierende Materialien umfassen Umbelliferon, Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluorescein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin; ein Beispiel für ein lumineszierendes Material ist Luminol; Beispiele für biolumineszierende Materialien umfassen Luciferase, Luciferin und Äquorin, und Beispiele für geeignete radioaktive Materialien umfassen ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S und ³H.
Rekombinante Expressionsvektoren Wirtszellen und gentechnisch veränderte Zellen
In einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, die eine für ein hierin beschriebenes Polypeptid kodierende Nucleinsäure enthalten. Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich hierin auf ein Nucleinsäuremolekül, das in der Lage ist, eine andere Nucleinsäure, an die es gebunden ist, zu transportieren, und es kann ein Plasmid, ein Cosmid oder einen viralen Vektor umfassen. Der Vektor kann zu autonomer Replikation in der Lage sein oder in eine Wirts-DNA integriert werden. Virale Vektoren umfassen beispielsweise replikationsdefekte Retroviren, Adenoviren und adenoassoziierte Viren.
Ein Vektor kann eine 13245-Nucleinsäure in einer Form enthalten, die eine Expression der Nucleinsäure in einer Wirtszelle erlaubt. Vorzugsweise umfasst der rekombinante Expressionsvektor eine oder mehrere Regulationssequenzen, die operativ an die zu exprimierende Nucleinsäuresequenz gebunden sind. Die Bezeichnung "Regulationssequenz" umfasst Promotoren, Enhancer und andere Expressionssteuerelemente (z.B. Polyadenylierungssignale). Regulationssequenzen umfassen jene, welche die konstitutive Expression einer Nucleotidsequenz steuern, sowie gewebespezifische regulatorische und/oder induzierbare Sequenzen. Die Erstellung von Expressionsvektoren kann von Faktoren wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, der Expressionsstärke des gewünschten Proteins und dergleichen abhängen. Die Expressionsvektoren der Erfindung können in Wirtszellen eingeführt werden, um so Proteine oder Polypeptide, einschließlich von Fusionsproteinen oder -polypeptiden herzustellen, für die hierin beschriebene Nucleinsäuren kodieren (z.B. 13245-Proteine, Mutantenformen von 13245-Proteinen, Fusionsproteine und dergleichen).
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können für die Expression von 13245-Proteinen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen entworfen sein. Polypeptide der Erfindung können beispielsweise in E. coli, Insektenzellen (z.B. unter Einsatz von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefezellen oder Säugetierzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen sind in Goeddel (Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, USA (1990)) genauer erläutert. Alternativ dazu kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro transkribiert und translatiert werden, beispielsweise unter Einsatz von T7-Promotorregulationssequenzen und T7-Polymerase.
Die Expression von Proteinen in Prokaryoten wird meist in E. coli durchgeführt, und zwar mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren zur Steuerung der Expression von entweder Fusions- oder Nichtfusionsproteinen enthalten. Fusionsvektoren addieren eine Reihe von Aminosäuren an ein darin kodiertes Protein, üblicherweise am Aminoterminus des rekombinanten Proteins. Solche Fusionsvektoren dienen typischerweise drei Zwecken: 1) zur Steigerung der Expression eines rekombinanten Proteins; 2) zur Steigerung der Löslichkeit des rekombinanten Proteins; und 3) zur Unterstützung der Reinigung des rekombinanten Proteins, indem es als Ligand in Affinitätsreinigungen agiert. Häufig wird eine proteolytische Spaltstelle an der Verbindungsstelle zwischen der Fusionsgruppierung und dem rekombinanten Protein eingeführt, um eine Trennung des rekombinanten Proteins von der Fusionsgruppierung nach der Reinigung des Fusionsproteins zu ermöglichen. Solche Enzyme und ihre zugehörigen Erkennungssequenzen umfassen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase. Typische Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharmacia Biotech Inc.; Smith et al., Gene 67, 31-40 (1988)), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA), die Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose-E-Bindungsproteine bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusionieren.
Gereinigte Fusionsproteine können in 13245-Aktivitätstests (z.B. direkten Testes oder kompetitiven Tests, die nachstehend genauer beschrieben sind) eingesetzt werden, oder zur Erzeugung von für 13245-Proteine spezifischen Antikörpern. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein in einem retroviralen Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung exprimiertes Fusionsprotein verwendet werden, um Knochenmarkszellen zu infizieren, die dann in bestrahlte Rezipienten transplantiert werden. Die Pathologie des Rezipienten wird dann nach einem angemessenen Zeitraum (z.B. sechs Wochen) untersucht.
Um die rekombinante Proteinexpression in E. coli zu maximieren, wird das Protein in einem bakteriellen Wirtsstamm mit einer eingeschränkten Fähigkeit zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins exprimiert (Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, 119-128, Academic Press, San Diego, USA (1990)). Eine weitere Strategie basiert auf der Veränderung der Nucleinsäuresequenz der Nucleinsäure, die in einen Expressionsvektor insertiert werden soll, sodass die einzelnen Codons für jede Aminosäure den in E. coli verwendeten entsprechen (Wada et al., Nucl. Acids Res. 20, 2111-2118 (1992)). Solche Veränderungen einer Nucleinsäuresequenz der Erfindung können durch herkömmliche DNA-Syntheseverfahren erfolgen.
Der 13245-Expressionsvektor kann ein Hefe-Expressionsvektor, ein Vektor zur Expression in Insektenzellen, z.B. ein Baculovirus-Expressionsvektor, oder ein zur Expression in Säugetierzellen geeigneter Vektor sein.
Bei Verwendung in Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors häufig durch virale regulatorische Elemente bereitgestellt. Herkömmlicherweise eingesetzte virale Promotoren sind beispielsweise von Polyoma, Adenovirus 2, Zytomegalievirus und Simian-Virus 40 (SV40) abgeleitet.
In einer weiteren Ausführungsform ist der rekombinante Säugetier-Expressionsvektor in der Lage, die Expression der Nucleinsäure präferentiell in einem bestimmten Zelltyp zu steuern (z.B. werden gewebespezifische regulatorische Elemente zur Expression der Nucleinsäure eingesetzt). Nichteinschränkende Beispiele für geeignete gewebespezifische Promotoren umfassen den Albumin-Promotor (leberspezifisch; Pinkert et al., Genes Dev. 1, 268-277 (1987)), lymphoidspezifische Promotoren (Calame et al., Adv. Immunol. 43, 235-275 (1988)), insbesondere Promotoren von T-Zell-Rezeptoren (Winoto et al., EMBO J. 8, 729-733 (1989)) und Immunglobuline (Banerji et al., Cell 33, 729-740 (1983); Queen et al., Cell 33, 741-748 (1983)), neuronenspezifische Promotoren (z.B. den Neurofilamentpromotor; Byrneet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5473-5477 (1989)), pankreasspezifische Promotoren (Edlund et al., Science 230, 912-916 (1985)) und brustdrüsenspezifische Promotoren (z.B. Milkenpromotor; US-Patent Nr. 4.873.316 und Europäische Patentanmeldung Nr. 264.166). Durch die Entwicklung gesteuerte Promotoren sind ebenfalls eingeschlossen, wie beispielsweise die Maus-Hox-Promotoren (Kessel et al., Science 249, 374-379 (1990)) und der α-Fetoprotein-Promotor (Campes et al., Genes Dev. 3, 537-546, (1989)).
Die Erfindung stellt weiters einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der ein DNA-Molekül der Erfindung in Antisense-Orientierung in den Expressionsvektor kloniert umfasst. Operativ an eine in Antisense-Orientierung klonierte Nucleinsäure gebundene Regulationssequenzen (z.B. virale Promotoren und/oder Enhancer) können ausgewählt werden, welche die konstitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische Expression von Antisense-RNA in verschiedensten Zelltypen steuern. Der Antisense-Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder attenuierten Virus vorliegen. Für eine Erläuterung der Steuerung der Genexpression unter Verwendung der Antisense-Gene siehe H. Weintraub et al. (Trends Genet. 1: Review (1986)).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine Wirtszelle bereit, die ein hierin beschriebenes Nucleinsäuremolekül umfasst, z.B. ein 13245-Nucleinsäuremolekül mit Sequenzen, die ihm eine homologe Rekombination in eine spezifische Stelle des Wirtszellengenoms erlauben. Die Bezeichnungen "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden hierin austauschbar verwendet. Solche Begriffe beziehen sich nicht nur auf die jeweilige Zelle, sondern auch auf die Nachkommenschaft oder mögliche Nachkommenschaft einer solchen Zelle. Da aufgrund von Mutationen oder Umwelteinflüssen bestimmte Modifikationen in nachfolgenden Generationen auftreten können, muss eine solche Nachkommenschaft zwar nicht unbedingt identisch mit den Ausgangszellen sein, ist aber hierin im Umfang des Begriffs enthalten.
Die Wirtszelle kann jede beliebige prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Ein 13245-Protein kann beispielsweise in Bakterienzellen, wie z.B. E. coli, Insektenzellen, Hefezellen oder Säugetierzellen (wie z.B. Chinahamster-Ovarialzellen (CHO-Zellen) oder COS-Zellen exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Vektor-DNA kann mittels herkömmliche Transformations- oder Transfektionsverfahren in Wirtszellen eingeführt werden. Die Bezeichnungen "Transformation" und "Transfektion" beziehen sich hierin auf verschiedene auf dem Gebiet der Erfindung anerkannte Verfahren zur Einführung fremder Nucleinsäure (z.B. DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelter Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation.
Eine Wirtszelle der Erfindung kann zur Herstellung (z.B. Expression) eines 13245-Proteins verwendet werden. Demgemäß stellt die Erfindung weiters Verfahren zur Herstellung eines 13245-Proteins unter Einsatz der Wirtszellen der Erfindung bereit. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Kultivieren der Wirtszelle der Erfindung (in die ein für ein 13245-Protein kodierender rekombinanter Expressionsvektor eingeführt wurde) in einem geeigneten Medium, sodass ein 13245-Protein gebildet wird. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren weiters das Isolieren eines 13245-Proteins aus dem Medium oder der Wirtszelle.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Zelle oder ein gereinigtes Präparat von Zellen, die ein 13245-Transgen enthalten oder 13245 auf andere Weise mangelhaft exprimieren. Das Zellpräparat kann aus menschlichen oder nichtmenschlichen Zellen, beispielsweise Nagetierzellen, wie z.B. Maus- oder Rattenzellen, Kaninchenzellen, oder Schweinezellen, bestehen. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Zellen ein 13245-Transgen, beispielsweise eine heterologe Form eines 13245-Gens, wie z.B. ein von Menschen stammendes Gen (im Falle einer nichtmenschlichen Zelle). Das 13245-Transgen kann mangelhaft exprimiert, beispielsweise überexprimiert oder unterexprimiert, sein. In anderen Ausführungsformen umfassen die Zellen ein Gen, das endogenes 13245 mangelhaft exprimiert, beispielsweise ein Gen, dessen Expression unterbrochen wird, z.B. durch seine Zerstörung. Solche Zellen können als Modell zur Untersuchung von Erkrankungen, die mit mutierten oder mangelhaft exprimierten 13245-Allelen zusammenhängen, oder zum Einsatz beim Arzneimittel-Screenen dienen.
In einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung eine menschliche Zelle, beispielsweise eine hämatopoetische Stammzelle, die mit für ein vorliegendes 13245-Polypeptid kodierender Nucleinsäure transformiert ist.
Außerdem werden Zellen bereitgestellt, vorzugsweise menschliche Zellen, beispielsweise menschliche hämatopoetische oder Fibroblastenzellen, in denen endogenes 13245 von einer Regulationssequenz gesteuert wird, die normalerweise nicht die Expression des endogenen 13245-Gens regelt. Die Expressionscharakteristika eines endogenen Gens innerhalb einer Zelle, beispielsweise einer Zelllinie oder eines Mikroorganismus, kann modifiziert werden, indem ein heterologisches regulatorisches DNA-Element in das Genom der Zelle eingeführt wird, sodass das insertierte regulatorische Element operabel an das endogene 13245-Gen gebunden ist. Ein endogenes 13245-Gen, das "transkriptionell still" ist, z.B. normalerweise nicht oder nur sehr schwach exprimiert wird, kann beispielsweise aktiviert werden, indem ein. regulatorisches Element insertiert wird, das zur Förderung der Expression eines normalerweise exprimierten Genprodukts in dieser Zelle in der Lage ist. Verfahren wie gezielte homologe Rekombination können ebenfalls zur Insertion der heterologen DNA wie beschrieben eingesetzt werden (z.B. US-Patent Nr. 5.272.071; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/06667).
Transgene Tiere
Die Erfindung stellt auch nichtmenschliche transgene Tiere bereit. Solche Tiere sind zur Untersuchung der Funktion und/oder Aktivität eines 13245-Proteins und zur Identifikation und/oder Evaluierung von Modultoren von 13245-Aktivität zweckdienlich. "Transgenes Tier" bezieht sich hierin auf ein nichtmenschliches Tier, vorzugsweise ein Säugetier, noch bevorzugter ein Nagetier, wie z.B. eine Ratte oder Maus, worin eine oder mehrere der Zellen des Tiers ein Transgen umfassen. Weitere Beispiele für transgene Tiere umfassen nichtmenschliche Primaten, Schafe, Hunde, Kühe, Ziegen, Hühner, Amphibien und dergleichen. Ein Transgen ist exogene DNA oder eine Neuordnung, z.B. eine Deletion von endogener chromosomaler DNA, die vorzugsweise in das Genom der Zellen eines transgenen Tiers integriert wird oder darin vor kommt. Ein Transgen kann die Expression eines kodierten Genprodukts in einem oder mehreren Zelltypen oder Geweben des transgenen Tiers, steuern, andere Transgene, z.B. ein Knockout, verringern die Expression. Somit kann ein transgenes Tier ein solches sein, in dem ein endogenes 13245-Gen verändert wurde, beispielsweise durch homologe Rekombination zwischen dem endogenen Gen und einem exogenen DNA-Molekül, das in eine Zelle des Tiers eingeführt wurde (z.B. eine embryonale Zelle des Tiers, vor der Entwicklung des Tiers).
Intronische Sequenzen und Polyadenylierungssignale können ebenfalls im Transgen enthalten sein, um die Effizienz der Expression des Transgens zu erhöhen. Eine oder mehrere gewebespezifische Regulationssequenzen können operabel an ein Transgen der Erfindung gebunden sein, um die Expression eines 13245-Proteins auf bestimmte Zellen auszurichten. Ein transgenes Gründertier kann ausgehend von der Gegenwart eines 13245-Transgens in seinem Genom und/oder die Expression von 13245-mRNA in Geweben oder Zellen des Tiers identifiziert werden. Ein transgenes Stammtier kann dann eingesetzt werden, um weitere Tiere zu züchten, die das Transgen in sich tragen. Außerdem können transgene Tiere, die ein für ein 13245-Protein kodierendes Transgen in sich tragen, mit anderen transgenen Tieren gekreuzt werden, die andere Transgene tragen.
13245-Proteine oder -Polypeptide können in transgenen Tieren oder Pflanzen exprimiert werden, so kann beispielsweise eine für das Protein oder Polypeptid kodierende Nucleinsäure in das Genom eines Tiers eingeführt werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Nucleinsäure unter Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors, z.B. eines milch- oder eispezifischen Promotors, gestellt und aus der vom Tier produzierten Milch oder den vom Tier produzierten Eiern gewonnen. Geeignete Tiere sind Mäuse, Schweine, Kühe, Ziegen und Schafe.
Die Erfindung umfasst auch eine Population von Zellen von einem trangsenen Tier, wie beispielsweise nachstehend erläutert.
Anwendungen
Die hierin beschriebenen Nucleinsäuremoleküle, Proteine, Proteinhomologe und Antikörper können in einem oder mehreren der folgenden Verfahren eingesetzt werden: a) Screening-Tests; b) prognostische Medizin (z.B. diagnostische Tests, prognostische Tests, Überwachung von klinischen Versuchen und Pharmakogenetik); und c) Behandlungsverfahren (z.B. Therapie und Prophylaxe). Die isolierten Nucleinsäuremoleküle der Erfindung können beispielsweise zur Expression eines 13245-Proteins (beispielsweise mittels eines rekombinanten Expressionsvektors in einer Wirtszelle bei gentherapeutischen Anwendungen) eingesetzt werden, um eine genetische Veränderung in einem 13245-Gen zu detektieren und 13245-Aktivität zu modulieren, wie nachstehend genauer beschrieben ist. Die 13245-Proteine können zu Behandlung von Erkrankungen verwendet werden, die durch unzureichende oder übermäßige Produktion eines 13245-Substratks oder Produktion von 13245-Inhibitoren gekennzeichnet sind. außerdem können die 13245-Proteine eingesetzt werden, um auf natürlich vorkommende 13245-Substrate zu screenen, auf Arzneimittel oder Verbindungen zu screenen, die 13245-Aktivität modulieren, sowie Erkrankungen zu behandeln, die durch unzureichende oder übermäßige Produktion eines 13245-Proteins oder Produktion von 13245-Proteinformen gekennzeichnet sind die verringerte, aberrierende oder unerwünschte Aktivität im Vergleich zum 13245-Wildtypprotein aufweisen. Beispiele für Erkrankungen umfassen jene, bei denen die Proteinphosphorylierung aberrierend ist (z.B. Muskeldystrophien und myotonische Dystrophien). Weiters können die Anti-13245-Antikörper der Erfindung zur Detektion und Isolierung von 13245-Proteinen, Steuerung der Bioverfügbarkeit von 13245-Proteinen und Modulierung von 13245-Aktivität eingesetzt werden.
Ein Verfahren zur Bewertung einer Verbindung in Bezug auf ihre Fähigkeit, mit einem vorliegenden 13245-Polypeptid wechselzuwirken, z.B. daran zu binden, wird ebenfalls bereitgestellt. Das Verfahren umfasst: das Kontaktieren der Verbindung mit dem vorliegenden 13245-Polypeptid; und das Bewerten der Fähigkeit der Verbindung, mit dem vorliegenden 13245-Polypeptid wechselzuwirken, beispielsweise daran zu binden. Dieses Verfahren kann in vitro, z.B. in einem zellfreien System, oder in vivo, z.B. in einem Zwei-Hybrid-Wechselwirkungseinfangtest, durchgeführt werden. Außerdem kann dieses Verfahren zur Identifikation von natürlich vorkommenden Molekülen eingesetzt werden, die mit einem vorliegenden 13245-Polypeptid wechselwirken. Es kann auch dazu verwendet werden, natürliche oder synthetische Inhibitoren eines vorliegenden 13245-Polypeptids zu finden. Screening-Verfahren werden nachstehend genauer beschrieben.
Screening-Tests
Die Erfindung stellt auch Screening-Verfahren (hierin auch als "Tests" bezeichnet) zur Identifikation von Modulatoren, d.h. Kandidaten- oder Testverbindungen oder -mitteln (z.B. Proteinen, Peptiden, Peptidomimetika, Peptoiden, kleinen Molekülen oder anderen Arzneimitteln) bereit, die an 13245-Proteine binden, eine stimulierende oder inhibierende Wirkung auf beispielsweise 13245-Expression oder 13245-Aktivität aufweisen oder stimulierende oder inhibierende Wirkung auf beispielsweise die Expression oder Aktivität eines 13245-Substrats aufweisen. So identifizierte Verbindungen können zur Modulation der Aktivität von Zielgenprodukten (z.B. 13245-Genen) in einem Therapieprotokoll eingesetzt werden, um die biologische Funktion des Zielgenprodukts genau auszuarbeiten oder Verbindungen zu identifizieren, die normale Zielgen-Wechselwirkungen stören.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Tests zum Screenen von Kandidaten- oder Testverbindungen bereit, die Substrate eines 13245-Proteins oder -Polypeptids oder einen biologisch aktiven Teil davon darstellen. In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung Tests zum Screenen von Kandidaten- oder Testverbindungen bereit, die an ein 13245-Protein oder -Polypeptid oder einen biologisch aktiven Teil davon binden oder deren Aktivität modulieren.
Die Testverbindungen der vorliegenden Erfindung können mithilfe verschiedenster Ansätze der auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren unter Einsatz kombinatorischer Bibliotheken erhalten werden, einschließlich: biologischer Bibliotheken (Bibliotheken von Molekülen mit den Funktionalitäten von Peptiden, aber mit einem neuen Nichtpeptidrückgrat, die gegen enzymatischen Abbau resistent sind, aber dennoch bioaktiv bleiben; z.B. Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678-2685 (1994)); räumlich ansteuerbaren parallelen Festphasen- oder Lösungsphasenbibliotheken; auf synthetischen Bibliotheken basierenden Verfahren, die eine Entknäuelung erfordern; das auf einer "1-Kügelchen-1-Verbindung-Bibliothek" basierende Verfahren; und auf synthetischen Bibliotheken basierende Verbindung unter Anwendung von chromatographischer Selektion. Die auf biologischen Bibliotheken und Peptoidbibliotheken basierenden Verfahren sind auf Peptidbibliotheken beschränkt, während die anderen vier Ansätze für Peptid-, Nichtpeptidoligomer- oder Kleinmolekülbibliotheken von Verbindungen geeignet sind (Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145 (1997)).
Beispiele für Verfahren zur Synthese von molekularen Bibliotheken wurden bereits beschrieben (z.B. DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6909 (1993); Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11422 (1994); Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678 (1994); Cho et al., Science 261, 1303 (1993); Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059 (1994); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061 (1994); und Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233 (1994)).
Bibliotheken von Verbindungen können in Lösung vorliegen (z.B. Houghten, Biotechniques 13, 412-421 (1992)) oder auf Kügelchen (Lam, Nature 354, 82-84 (1991)), Chips (Fodor, Nature 364, 555-556 (1993)), Bakterien (US-Patent Nr. 5.223.409), Sporen (US-Patent Nr. 5.223.409), Plasmiden (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1865-1869 (1992)), oder auf Phagen (Scott et al., Science 249, 386-390 (1990); Devlin, Science 249, 404-406 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-6382 (1990); Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310 (1991); US-Patent Nr. 5.223.409).
In einer Ausführungsform ist der Test ein auf Zellen basierender Test, bei dem eine Zelle, die ein 13245-Protein oder einen biologisch aktiven Teil davon exprimiert, mit einer Testverbindung kontaktiert und die Fähigkeit der Testverbindung bestimmt wird, 13245-Aktivität zu modulieren. Die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, 13245-Aktivität zu modulieren, kann erfolgen, indem beispielsweise Verände rungen der enzymatischen Aktivität überwacht werden. Die Zelle kann beispielsweise von einem Säugetier stammen.
Die Fähigkeit der Testverbindung, 13245-Bindung an eine Verbindung, z.B. ein 13245-Substrat, zu binden oder 13245 zu binden, kann ebenfalls bewertet werden. Dies kann beispielsweise durchgeführt werden, indem die Verbindung, z.B. das Substrat, mit einem Radioisotop oder einer enzymatischen Markierung gekuppelt wird, sodass die Bindung der Verbindung, z.B. des Substrats, an 13245 durch Detektion der markierten Verbindung, z.B. Substrats, in einem Komplex bestimmt werden kann. Alternativ dazu könnte 13245 mit einem Radioisotop oder einer enzymatischen Markierung gekuppelt werden, um die Fähigkeit einer Testverbindung zu überwachen, 13245-Bindung an ein 13245-Substrat in einem Komplex zu modulieren. Verbindungen (z.B. 13245-Substrate) können beispielsweise mit ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C oder ³H markiert werden, entweder direkt oder indirekt, und das Radioisotop wird durch direkte Zählung der Radioemission oder durch Szintillationszählung detektiert. Alternativ dazu können Verbindungen enzymatisch markiert werden, beispielsweise mit Meerrettichperoxidase, alkalischer Phosphatase oder Luciferase, und die enzymatische Markierung kann durch Bestimmung der Umsetzung eines geeigneten Substrats in ein Produkt detektiert werden.
Die Fähigkeit einer Verbindung (z.B. eines 13245-Substrats), mit 13245 wechselzuwirken, mit oder ohne Markierung der wechselwirkenden Substanzen, kann beurteilt werden. Beispielsweise kann ein Mikrophysiometer eingesetzt werden, um die Wechselwirkung einer Verbindung mit 13245 zu detektieren, ohne dass die Verbindung oder 13245 markiert wird (McConnell et al., Science 257, 1906-1912 (1992)). Ein "Mikrophysiometer (z.B. Cytosensor) ist hierin ein Analysegerät, das die Geschwindigkeit misst, mit der eine Zelle ihre Umgebung ansäuert, und zwar mithilfe eines lichtsteuerbaren potentiometrischen Sensors (LAPS). Änderungen dieser Ansäuerungsgeschwindigkeit können als Indikator für die Wechselwirkung zwischen einer Verbindung und 13245 genutzt werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein zellfreier Test bereitgestellt, bei dem ein 13245-Protein oder biologisch aktiver Teil davon mit einer Testverbindung kontaktiert und dann die Fähigkeit der Testverbindung, das 13245-Protein oder einen biologisch aktiven Teil davon zu binden, bewertet wird. Bevorzugte biologisch aktive Teile der 13245-Proteine, die für Tests der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Fragmente, die an Wechselwirkungen mit Nicht-13245-Molekülen teilnehmen, z.B. Fragmente mit hohen Oberflächenwahrscheinlichkeitswerten.
Lösliche und/oder membrangebundene Formen von isolierten Proteinen (z.B. 13245-Proteinen oder biologisch aktiven Teilen davon) können in den zellfreien Tests der Erfindung eingesetzt werden. Wenn membrangebundene Formen des Proteins eingesetzt werden, kann es wünschenswert sein, ein Solubilisierungsmittel zu verwenden. Beispiele für solche Solubilisierungsmittel umfassen nichtionische Tenside, wie z.B. n-Octylglucosid, n-Dodecylglucosid, n-Dodecylmaltosid, Octanoyl-N-methylglucamid, Decanoyl-N-methylglucamid, Triton^® X-100, Triton^® X-114, Thesit^®, Isotridecylpoly(ethylenglykolether)n, 3-{(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio}-1-propansulfonat (CHAPS), 3-{(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio}-2-hydroxy-1-propansulfonat (CHAPSO) oder N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat.
Zellfreie Tests umfassen die Herstellung eines Reaktionsgemischs aus dem Zielgenprotein und der Testverbindung unter Bedingungen und über eine Zeit, die eine Wechselwirkung und Bindung zwischen den beiden Komponenten erlauben, wodurch ein Komplex gebildet wird, der entfernt und/oder detektiert werden kann.
Die Wechselwirkung zwischen den beiden Molekülen kann auch beispielsweise mithilfe von Fluoreszenzenergietransfer (FET; z.B. US-Patent Nr. 5.631.169; US-Patent Nr. 4.868.103) detektiert werden. Eine Fluorophormarkierung wird so gewählt, dass die von einem ersten Donatormolekül emittierte Fluoreszenzenergie von einer Fluoreszenzmarkierung auf einem zweiten, dem "Akzeptor"-Molekül", absorbiert wird, das wiederum in der Lage ist, aufgrund der absorbierten Energie zu fluoreszieren. Alternativ dazu kann das "Donator"-Proteinmolekül" einfach die natürliche Fluoreszenzenergie von Tryptophanresten nutzen. Es werden Markierungen gewählt, die unter schiedliche Wellenlängen von Licht emittieren, sodass die "Akzeptor"-Molekülmarkierung" von der des "Donators" unterschieden werden kann. Da die Wirksamkeit der Energieübertragung zwischen den Markierungen mit dem Abstand zwischen den Molekülen zusammenhängt, kann die räumliche Beziehung zwischen den Molekülen beurteilt werden. Wenn eine Bindung zwischen den Molekülen erfolgt, sollte die Fluoreszenzemission der "Akzeptor"-Molekülmarkierung im Test maximal sein. Ein FET-Bindungsvorgang kann herkömmlicherweise durch fluorimetrische Standarddetektion gemessen werden, die auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt ist (z.B. unter Verwendung eines Fluorimeters).
In einer weiteren Ausführungsform kann die Bestimmung der Fähigkeit des 13245-Proteins, an ein Zielmolekül zu binden, mithilfe einer biomolekularen Echtzeit-Wechselwirkungsanalyse (BIA; z.B. Sjolander et al., Anal. Chem. 63, 2338-2345 (1991); Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol 5, 699-705 (1995)) erfolgen. "Oberflächen-Plasmonresonanz" (SPR) oder "BIA" detektiert biospezifische Wechselwirkungen in Echtzeit, ohne dass einer der Wechselwirkungspartner markiert werden muss (z.B. BIA-core). Änderungen in der Masse an der Bindungsoberfläche (die auf eine Bindung hinweist) führen zu Änderungen des Brechungsindex von Licht nahe der Oberfläche (das optische Phänomen von SPR), was wiederum in einem detektierbaren Signal resultiert, das als Hinweis auf Echtzeitreaktionen zwischen biologischen Molekülen genutzt werden kann.
In einer Ausführungsform ist das Zielgenprodukt oder die Testsubstanz an einer Festphase verankert. Die Zielgenprodukt/Testverbindung-Komplexe, die auf der Festphase verankert sind, können am Ende der Reaktion detektiert werden. Vorzugsweise ist das Zielgenprodukt auf einer festen Oberfläche verankert, und die Testverbindung (die nicht verankert ist) ist, entweder direkt oder indirekt, mit hierin erläuterten detektierbaren Markierungen markiert.
Es kann wünschenswert sein, entweder 13245, einen Anti-13245-Antikörper oder dessen Zielmolekül zu immobilisieren, um die Trennung von komplexierten und nichtkomplexierten Formen eines der Proteine oder beider Proteine zu vereinfachen und eine Automation des Tests zu ermöglichen. Die Bindung einer Testverbindung an ein 13245-Protein oder die Wechselwirkung eines 13245-Proteins mit einem Zielmolekül in Gegenwart und Abwesenheit einer Kandidatenverbindung kann in jedem beliebigen Gefäß erfolgen, das zur Aufnahme der Reaktanten geeignet ist. Beispiele für solche Behälter umfassen Mikrotiterplatten, Reagenzgläser und Mikrozentrifugengläser. In einer Ausführungsform kann ein Fusionsprotein bereitgestellt werden, das eine Domäne hinzufügt, die eine Bindung eines oder beider Proteine an eine Matrix erlaubt. Beispielsweise können Glutathion-S-Transferase/13245-Fusionsproteine oder Glutathion-S-Transferase/Zielfusionsproteine an Glutathion-Sepharose^TM-Kügelchen (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) oder Gutathion-derivatisierte Mikrotiterplatten adsorbiert werden, die dann mit der Testverbindung, oder der Testverbindung und entweder dem nichtadsorbierten Zielprotein oder 13245-Protein, kombiniert werden, wonach das Gemisch unter Bedingungen inkubiert wird, die für eine Komplexbildung förderlich sind (z.B. physiologische Bedingungen bezüglich Salz und pH). Nach der Inkubation werden die Kügelchen oder Mikrotiterplatten-Wells gewaschen, um jegliche ungebundene Komponenten zu entfernen, im Falle von Kügelchen wird die Matrix immobilisiert, und die Komplexe werden direkt oder indirekt, beispielsweise wie oben beschrieben, bestimmt. Alternativ dazu können die Komplexe auch von der Matrix dissoziiert werden, und das Ausmaß der 13245-Bindung oder -Aktivität kann mithilfe von Standardverfahren bestimmt werden.
Andere Verfahren zur Immobilisierung eines 13245-Proteins oder eines Zielmoleküls auf Matrizen umfassen die Konjugation von Biotin und Streptavidin. Biotinylierte 13245-Proteine oder Zielmoleküle können mithilfe von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren (z.B. Biotinylierungsset, Pierce Chemicals, Rockford, IL, USA) aus Biotin-N-hydroxysuccinimid hergestellt und in den Wells von Streptavidinbeschichteten 96-Well-Platten (Pierce Chemical) immobilisiert werden.
Um den Test durchzuführen, wird die nichtimmobilisierte Komponente zur beschichteten Oberfläche zugesetzt, welche die verankerte Komponente enthält. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, werden nichtumgesetzte Komponenten unter Bedingungen entfernt (z.B. durch Waschen), unter denen alle gebildeten Komplexe auf der festen Oberfläche immobilisiert bleiben. Die Detektion von Komplexen, die auf der festen Oberfläche verankert sind, kann auf verschiedene Arten erfolgen. Wenn die vorher nichtimmobilisierte Komponente vormarkiert ist, zeigt die Detektion einer auf der Oberfläche immobilisierten Markierung an, dass Komplexe gebildet wurden. Wenn die vorher nichtimmobilisierte Komponente nicht vormarkiert ist, kann eine indirekte Markierung verwendet werden, um auf der Oberfläche verankerte Komplexe zu detektieren; z.B. mithilfe eines für die immobilisierte Komponente spezifischen markierten Antikörpers (der Antikörper kann wiederum direkt oder indirekt mit z.B. einem markierten Anti-Ig-Antikörper, markiert sein).
In einer Ausführungsform wird der Test unter Einsatz von Antikörpern durchgeführt, die mit einem 13245-Protein oder mit Zielmolekülen reagieren, die Bindung des 13245-Proteins an sein Zielmolekül jedoch nicht beeinträchtigen. Solche Antikörper können in die Wells der Platte derivatisiert werden, und ein ungebundenes Ziel oder 13245-Protein kann durch Antikörperkonjugation in den Wells festgehalten werden. Verfahren zur Detektion solcher Komplexe umfassen neben den oben für GST-immobilisierte Komplexe beschriebenen die Immundetektion von Komplexen unter Einsatz von Antikörpern, die mit dem 13245-Protein oder Zielmolekül reaktiv sind, sowie enzymgekoppelte Tests, die auf der Detektion einer enzymatischen Aktivität in Zusammenhang mit dem 13245-Protein oder Zielmolekül beruhen.
Alternativ dazu können zellfreie Tests auch in flüssiger Phase durchgeführt werden. In solch einem Test werden die Reaktionsprodukte von nichtumgesetzten Komponenten getrennt, was mit verschiedenen Standardverfahren möglich ist, die folgende umfassen, nicht jedoch darauf beschränkt sind: differenzielle Zentrifugation (z.B. Rivas et al., Trends Biochem. Sci. 18, 284-287 (1993)); Chromatographie (z.B. Gelfiltrationschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie); Elektrophorese (z.B. Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley, New York, USA (1999)); und Immunfällung (z.B. Ausubel, w.o.). Solche Harze und Chromatographieverfahren sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt (z.B. Heegaard, J. Mol. Recognit. 11, 141-148 (1998); Hage et al., J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 699, 499-525 (1997)). Auch Fluoreszenzenergieübertragung, wie sie hierin beschrieben ist, ist geeignet, um Bindung ohne weitere Reinigung des Komplexes aus der Lösung zu detektieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Test das Kontaktieren des 13245-Proteins oder eines biologisch aktiven Teils davon mit einer bekannten Verbindung, die 13245 bindet, um ein Testgemisch zu bilden, das Kontaktieren des Testgemischs mit einer Testverbindung und das Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung, mit einem 13245-Protein wechselzuwirken, worin das Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung, mit einem 13245-Protein wechselzuwirken das Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung umfasst, präferenziell an 13245 oder einen biologisch aktiven Teil davon zu binden oder die Aktivität eines Zielmoleküls im Vergleich zur bekannten Verfahren zu modulieren.
Die Zielgenprodukte der Erfindung können in vivo mit einem oder mehreren zellulären oder extrazellulären Makromolekülen, wie z.B. Proteinen, wechselwirken. Zum Zwecke dieser Erläuterung werden solche zellulären und extrazellulären Makromoleküle hierin als "Bindungspartner" bezeichnet. Verbindungen, die solche Wechselwirkungen stören, können zur Regulierung der Aktivität des Zielgenprodukts zweckdienlich sein. Solche Verbindungen können Moleküle wie Antikörper, Peptide und kleine Moleküle umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. In einer alternativen Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung bereit, die Aktivität eines 13245-Proteins durch Modulation der Aktivität eines stromabwärtigen Effektors eines 13245-Zielmoleküls zu bestimmen. Beispielsweise kann die Aktivität des Effektormoleküls auf ein geeignetes Ziel bestimmt werden, oder die Bindung des Effektors an ein geeignete Ziel kann bestimmt werden, wie oben beschrieben wurde.
Um Verbindungen zu identifizieren, welche die Wechselwirkung zwischen dem Zielgenprodukt und seinem/seinen zellulären oder extrazellulären Bindungspartner(n) beeinträchtigen, wird ein Reaktionsgemisch hergestellt, welches das Zielgenprodukt und den Bindungspartner enthält, und zwar unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die es den beiden Produkten ermöglichen, einen Komplex zu bilden. Um einen Inhibitor zu testen, wird das Reaktionsgemisch in Gegenwart und Abwesenheit einer Testverbindung bereitgestellt. Die Testverbindung kann anfänglich im Reaktionsgemisch enthalten sein, oder sie kann zu einem Zeitpunkt nach Zusatz des Zielgens und seines zellulären oder extrazellulären Bindungspartners zugesetzt werden. Vergleichsreaktionsgemische werden ohne Testverbindung oder mit einem Placebo inkubiert. Die Bildung beliebiger Komplexe zwischen dem Zielgenprodukt und dem zellulären oder extrazellulären Bindungspartner wird dann detektiert. Die Bildung eines Komplexes in der Vergleichsreaktion, nicht jedoch im Reaktionsgemisch, das die Testverbindung enthält, weist darauf hin, dass die Verbindung die Wechselwirkung des Zielgenprodukts und des interaktiven Bindungsparners stört. Außerdem kann die Komplexbildung in Reaktionsgemischen, welche die Testverbindung und ein normales Zielgenprodukt enthalten, auch mit der Komplexbildung in Reaktionsgemischen verglichen werden, welche die Testverbindung und ein mutiertes Zielgenprodukt enthalten. Dieser Vergleich kann in jenen Fällen von Bedeutung sein, in denen Verbindungen identifiziert werden sollen, die Wechselwirkungen von mutierten, nicht jedoch von normalen Zielgenprodukten stören.
Diese Tests können in einem heterogenen oder homogenen Format durchgeführt werden. Heterogene Tests umfassen die Verankerung des Zielgenprodukts oder des Bindungspartners auf einer Festphase und das Detektieren von Komplexen, die auf der Festphase verankert sind, am Ende der Reaktion. In homogenen Tests wird die gesamte Reaktion in einer Flüssigphase durchgeführt. Bei beiden Ansätzen kann die Reihenfolge, in der die Reaktanten zugesetzt werden, variiert werden, um unterschiedliche Informationen über die getesteten Verbindungen zu erhalten. Testverbindungen, welche die Wechselwirkung zwischen den Zielgenprodukten und den Bindungspartnern stören, beispielsweise durch Konkurrenz, können beispielsweise identifiziert werden, indem die Reaktion in Gegenwart der Testsubstanz durchgeführt wird. Alternativ dazu können Testverbindungen, die vorgeformte Komplexe aufbrechen, z.B. Verbindungen mit höheren Bindungskonstanten, die eine der Komponenten aus dem Komplex verdrängen, getestet werden, indem die Testverbindung nach der Bildung der Komplexe zum Reaktionsgemisch zugesetzt wird. Die unterschiedlichen Formate werden nachstehend kurz beschrieben.
In einem heterogenen Testsystem wird entweder das Zielgenprodukt oder der interaktive zelluläre oder extrazelluläre Bindungspartner auf einer festen Oberfläche (z.B. einer Mikrotiterplatte) verankert, während die nicht verankerte Spezies markiert wird, entweder direkt oder indirekt. Die verankerte Spezies kann durch nichtkovalente oder kovalente Bindung immobilisiert werden. Alternativ dazu kann ein für die zur verankernde Spezies spezifischer immobilisierter Antikörper eingesetzt werden, um die Spezies auf der festen Oberfläche zu verankern.
Um den Test durchzuführen, wird der Partner der immobilisierten Spezies der beschichteten Oberfläche mit oder ohne Testverbindung ausgesetzt. Nachdem die Reaktion beendet ist, werden nichtumgesetzte Komponenten (z.B. durch Waschen) entfernt, und alle gebildeten Komplexe bleiben auf der festen Oberfläche immobilisiert. Wenn die nichtimmobilisierte Spezies vormarkiert ist, zeigt die Detektion einer auf der Oberfläche immobilisierten Markierung an, dass Komplexe gebildet wurden. Wenn die nichtimmobilisierte Spezies nicht vormarkiert ist, kann indirekte Markierung eingesetzt werden, um auf der Oberfläche verankerte Komplexe zu detektieren, beispielsweise unter Einsatz eines markierten Antikörpers, der für die anfangs nicht immobilisiertes Spezies spezifisch ist (der Antikörper kann wiederum direkt markiert oder indirekt markiert sein, z.B. mit einem Anti-Ig-Antikörper). Je nach Reihenfolge, in der die Reaktionskomponenten zugesetzt werden, können Testverbindungen detektiert werden, die eine Komplexbildung hemmen oder vorgebildete Komplexe aufbrechen.
Alternativ dazu kann die Reaktion auch in einer Flüssigphase in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindung durchgeführt werden, wobei die Reaktionsprodukte von nichtumgesetzten Komponenten abgetrennt und Komplexe detektiert werden, beispielsweise unter Einsatz eines immobilisierten Antikörpers, der für eine der Bindungskomponenten spezifisch ist, um beliebige in der Lösung gebildete Komplexe zu verankern, und unter Einsatz eines markierten Antikörpers, der für den anderen Partner spezifisch ist, um verankerte Komplexe zu detektieren. Wiederum können je nach der Reihenfolge, in der die Reaktanten zur Flüssigphase zugesetzt werden, Testverbindungen identifiziert werden, die Komplexe verhindern oder vorgebildete Komplexe aufbrechen.
In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann ein homogener Test eingesetzt werden. Beispielsweise wird ein vorgebildeter Komplex aus dem Zielgenprodukt und dem interaktiven zellulären oder extrazellulären Bindungspartnerprodukt hergestellt, indem entweder die Zielgenprodukte oder ihre Bindungspartner markiert werden, aber das durch die Markierung erzeugte Signal wird aufgrund der Komplexbildung gelöscht (z.B. US-Patent Nr. 4.109.496, worin dieser Ansatz für Immuntests verwendet wird). Der Zusatz einer Testsubstanz, die mit einer der Spezies aus dem vorgebildeten Komplex konkurriert und diese verdrängt, führt zur Erzeugung eines Signals über dem Hintergrund. Auf diese Weise können Testsubstanzen identifiziert werden, welche die Wechselwirkung zwischen einem Zielgenprodukt und einem Bindungspartner stören.
In einem weiteren Aspekt können die 13245-Proteine als "Köder"-Proteine in einem Zwei-Hybrid-Test oder Drei-Hybrid-Test eingesetzt werden (z.B. US-Patent Nr. 5.283.317; Zervos et al., Cell 72, 223-232 (1993); Madura et al., J. Biol. Chem. 268, 12046-12054 (1993); Barel et al., Biotechniques 14, 920-924 (1993); Iwabuchi et al., Oncogene 8, 1693-1696 (1993); PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/10300), um andere Proteine zu identifizieren, die 13245 ("13245-Bindungsproteine" oder "13245-bp") binden oder damit wechselwirken und an 13245-Aktivität beteiligt sind. Solche 13245-bps können Aktivatoren oder Inhibitoren von Signalen der 13245-Proteine oder 13245-Ziele sein, wie beispielsweise stromabwärtige Elemente eines 13245-vermittelten Signalstoff-Stoffwechselwegs.
Das Zwei-Hybrid-System basiert auf der modularen Natur der meisten Transkriptionsfaktoren, die aus trennbaren DNA-Bindungs- und Aktivierungsdomänen bestehen. Kurz gesagt nutzt der Test zwei unterschiedliche DNA-Konstrukte. In einem Konstrukt ist das Gen, das für ein 13245-Protein kodiert, an ein Gen fusioniert, das für die DNA-Bindungsdomäne eines bekannten Transkriptionsfaktors (z.B. GAL-4) kodiert. Im anderen Konstrukt ist eine DNA-Sequenz aus einer Bibliothek von DNA- Sequenzen, die für ein nichtidentifiziertes Protein kodiert ("Beute" oder "Probe") an ein Gen fusioniert, das für die Aktivierungsdomäne des bekannten Transkriptionsfaktors kodiert. (Alternativ dazu kann das 13245-Protein an die Aktivatordomäne fusioniert sein.) Wenn die "Köder"- und "Beute"-Proteine in der Lage sind, in vivo wechselzuwirken und einen 13245-abhängigen Komplex zu bilden, werden die DNA-Bindungs- und Aktivierungsdomänen der Transkriptionsfaktoren nahe zueinander gebracht. Diese Nähe erlaubt die Transkription eines Reportergens (z.B. LacZ), das operabel an eine Transkriptionsregulationsstelle gebunden ist, die auf den Transkriptionsfaktor reagiert. Die Expression des Reportergens kann detektiert werden, und die Zellkolonien, die den funktionellen Transkriptionsfaktor enthalten, können isoliert und dazu eingesetzt werden, das klonierte Gen zu erhalten, das für das mit dem 13245-Protein wechselwirkende Protein kodiert.
In einer anderen Ausführungsform werden Modulatoren der 13245-Expression identifiziert. Beispielsweise wird ein Zellen enthaltendes oder ein zellfreies Gemisch mit einer Kandidatenverbindung kontaktiert, und die Expression der 13245-mRNA oder eines 13245-Proteins wird in Bezug auf das Expressionsausmaß von 13245-mRNA oder -Proteinen in Abwesenheit der Kandidatenverbindung bewertet. Wenn die Expression von 13245-mRNA oder -Proteinen in Gegenwart der Kandidatenverbindung stärker ist als in ihrer Abwesenheit, dann wird die Kandidatenverbindung als Stimulator der 13245-mRNA- oder -Proteinexpression identifiziert. Alternativ dazu wird, wenn die Expression von 13245-mRNA oder -Proteinen in Gegenwart der Kandidatenverbindung schwächer (d.h. statistisch gesehen signifikant schwächer) ist als in ihrer Abwesenheit, dann wird die Kandidatenverbindung als Inhibitor von 13245-mRNA- oder -Proteinexpression identifiziert. Das Ausmaß der 13245-mRNA- oder -Proteinexpression kann durch Verfahren bestimmt werden, die hierin für die Detektion von 13245-mRNA oder -Proteinen beschrieben werden.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung eine Kombination aus zwei oder mehr der hierin beschriebenen Tests. Ein Modulator kann beispielsweise unter Einsatz eines zellbasierten oder zellfreien Tests identifiziert werden, und die Fähigkeit des Mittels, die Aktivität eines 13245-Proteins zu modulieren, kann in vivo bestätigt werden, beispielsweise in einem Tier, wie z.B. einem Tiermodell für eine Krankheit.
Diese Erfindung betrifft weiters neue Mittel, die in den oben beschriebenen Screening-Tests identifiziert wurden. Demgemäß umfasst der Schutzumfang dieser Erfindung weiters den Einsatz eines wie hierin beschrieben identifizierten Mittels (z.B. eines 13245-Modulators, eines Antisense-13245-Nucleinsäuremoleküls, eines 13245-spezifischen Antikörpers oder eines 13245-Bindungspartners) in einem geeigneten Tiermodell zur Bestimmung der Wirksamkeit, Toxizität, Nebenwirkungen oder Wirkmechanismen bei der Behandlung mit solch einem Mittel. Außerdem können neue Mittel, die durch die oben beschriebenen Screening-Tests identifiziert wurden, zur Behandlung, wie hierin beschrieben, verwendet werden.
Detektionstests
Teile oder Fragmente der hierin identifizierten Nucleinsäuresequenzen können als Polynucleotidreagenzien verwendet werden. Diese Sequenzen können beispielsweise eingesetzt werden, um (i) ihre jeweiligen Gene auf einem Chromosom zu kartieren, beispielsweise um Genregionen zu lokalisieren, die mit einer genetischen Erkrankung zusammenhängen oder um 13245 mit einer Krankheit in Verbindung zu setzen; (ii) ein Individuum aufgrund einer winzigen biologischen Probe zu identifizieren (Gewebetypisierung); und (iii) die forensische Identifikation einer biologischen Probe zu unterstützen. Diese Anwendungen sind in den nachstehenden Abschnitten näher erläutert.
Chromosomenkartierung
Die 13245-Nucleotidsequenzen oder Abschnitte davon können zur Kartierung der Positionen der 13245-Gene auf einem Chromosom eingesetzt werden. Dieser Vorgang wird Chromosomenkartierung genannt. Chromosomenkartierung ist dazu geeignet, 13245-Sequenzen mit Genen zu korrelieren, die mit einer Erkrankung zusammenhängen.
Kurz gesagt können 13245-Gene auf Chromosomen kartiert werden, indem PCR-Primer (vorzugsweise mit einer Länge von 15-25 Basenpaaren) aus der 13245-Nucleotidsequenz (z.B. Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3) hergestellt werden. Diese Primer können dann zum PCR-Screenen von Somazellhybriden verwendet werden, die einzelne menschliche Chromosome enthalten. Nur jene Hybride mit dem menschlichen Gen, die den 13245-Sequenzen entsprechen, ergeben ein amplifiziertes Fragment.
Eine Gruppe von Somazellhybriden, worin jede Zelllinie entweder ein einzelnes menschliches Chromosom oder eine kleine Anzahl an menschlichen Chromosomen und einen vollständigen Satz von Mauschromosomen enthält, ermöglichen eine einfache Zuordnung einzelner Gene zu spezifischen menschlichen Chromosomen (D'Eustachio et al., Science 220, 919-924 (1983)).
Andere Kartierungsstrategien, z.B. die beschriebene In-situ-Hybridisierung (Fan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6223-6227 (1990)), Vorscreenen mit markierten durchflusssortierten Chromosomen und Vorselektion durch Hybridisierung an chromosomenspezifische cDNA-Bibliotheken, können eingesetzt werden, um 13245 bestimmten Chromosomenorten zuzuordnen.
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) einer DNA-Sequenz an einen chromosomalen Metaphasenausstrich kann weiters dazu genutzt werden, eine präzise chromosomale Lokalisation in einem Schritt bereitzustellen. Das FISH-Verfahren kann sogar mit einer DNA-Sequenz durchgeführt werden, die nur 500 oder 600 Basen lang ist. Bei Klonen mit mehr als 1.000 Basen ist die Wahrscheinlichkeit der Bindung an eine einzigartige Chromosomenstelle mit ausreichender Signalintensität für eine einfache Detektion jedoch höher. Vorzugsweise reichen 1.000 Basen, noch bevorzugter 2.000 Basen, aus, um in einem vernünftigen Zeitraum gute Ergebnisse zu erzielen. Für einen Überblick über FISH siehe Verma et al. (Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, USA (1988)).
Reagenzien für die Chromosomenkartierung können individuell eingesetzt werden, um ein einzelnes Chromosom oder eine einzelne Stelle auf diesem Chromosom zu markieren, oder es können Gruppen von Reagenzien eingesetzt werden, um mehrere Stellen und/oder mehrere Chromosomen zu markieren. Reagenzien, die nichtkodierenden Regionen dieser Gene entsprechen, sind typischerweise für Kartierungszwecke bevorzugt. Bei kodierenden Sequenzen ist die Wahrscheinlichkeit höher, dass sie innerhalb von Genfamilien konserviert sind, wodurch die Häufigkeit von Kreuzhybridisierungen während der Chromosomenkartierung größer ist.
Sobald eine Sequenz einer bestimmten Chromosomenstelle zugeordnet wurde, kann die physische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit genetischen Kartendaten korreliert werden (solche Daten finden sich beispielsweise in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, online an der John Hopkins University Welch Medical Library verfügbar). Die Beziehung zwischen einem Gen und einer Erkrankung, die der gleichen Chromosomenregion zugeordnet wurde, kann dann durch Kopplungsanalysen identifiziert werden (gemeinsame Vererbung von physikalisch benachbarten Genen), wie dies bereits beschrieben wurde (z.B. Egeland et al., Nature 325, 783-787 (1987)).
Außerdem können Unterschiede zwischen den DNA-Sequenzen von Individuen bestimmt werden, die von einer mit dem 13245-Gen assoziierten Krankheit betroffen bzw. nicht betroffen sind. Wenn in einigen oder allen Individuen eine Mutation vorhanden ist, in nicht betroffenen Individuen jedoch nicht, dann ist die Mutation wahrscheinlich der Verursacher der jeweiligen Erkrankung. Ein Vergleich zwischen betroffenen und nicht betroffenen Individuen umfasst im Allgemeinen zuerst die Suche nach Strukturveränderungen in den Chromosomen, wie z.B. Deletionen oder Translokationen, die im Chromosomenausstrich erkennbar oder durch auf dieser DNA-Sequenz basierende PCR detektierbar sind. Schließlich kann eine komplette Sequenzierung der Gene von verschiedenen Individuen durchgeführt werden, um die Gegenwart einer Mutation zu bestätigen und Mutationen von Polymorphismen zu unterscheiden.
Gewebetypisierung
13245-Sequenzen können zur Identifikation von Individuen anhand von biologischen Proben, beispielsweise unter Anwendung von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP), eingesetzt werden. Bei diesem Verfahren wird die genomische DNA eines Individuums mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen verdaut, die Fragmente werden getrennt, beispielsweise in einem Southern-Blot, und sondiert, um Banden für die Identifikation zu erhalten. Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind als zusätzliche DNA-Marker für RFL geeignet (beschrieben im US-Patent Nr. 5.272.057).
Weiters können die Sequenzen der vorliegenden Erfindung auch zur basenweisen Bestimmung der tatsächlichen DNA-Sequenz von ausgewählten Abschnitten des Genoms eines Individuums eingesetzt werden. Die hierin beschriebene 13245-Nucleotidsequenz kann somit dazu eingesetzt werden, PCR-Primer herzustellen, die zum 5'- und 3'-Ende der Sequenz homolog sind. Diese Primer können dann zur Amplifikation der DNA eines Individuums und danach zu ihrer Sequenzierung verwendet werden. Gruppen von entsprechenden DNA-Sequenzen von Individuen, die auf diese Weise hergestellt wurden, können einzigartige individuelle Identifikationsmerkmale bereitstellen, da jedes Individuum aufgrund der Allelunterschiede eine einzigartige Gruppen von solchen DNA-Sequenzen aufweist.
Allelvariationen finden in gewissem Ausmaß in den kodierenden Regionen dieser Sequenzen statt, und in stärkerem Maße in den nichtkodierenden Regionen. Jede der hierin beschriebenen Sequenzen kann, in gewissen Ausmaß, als Standard eingesetzt werden, mit dem DNA von einem Individuum zu Identifikationszwecken verglichen werden kann. Da in den nichtkodierenden Regionen mehr Polymorphismen vorhanden sind, sind weniger Sequenzen notwendig, um Individuen zu unterscheiden. Die nichtkodierenden Sequenzen von Seq.-ID Nr. 1 können mit einer Gruppe von vielleicht 10 bis 1.000 Primern, die jeweils eine nichtkodierende amplifizierte Sequenz aus 100 Basen ergeben, die positive Identifikation eines Individuums ermöglichen. Wenn vorhergesagte kodierende Sequenzen eingesetzt werden, wie beispiels weise jene in Seq.-ID Nr. 3, dann wäre eine geeignetere Anzahl an Primern für die positive Identifikation eines Individuums 500-2.000.
Wenn eine Gruppe von Reagenzien von 13245-Nucleotidsequenzen, wie sie hierin beschrieben sind, zur Erstellung einer Datenbank einzigartiger Identifikationsmerkmale verwendet wird, können dieselben Reagenzien später zur Identifikation von Gewebe von diesem Individuum genutzt werden. Mithilfe der Datenbank einzigartiger Identifikationsmerkmale ist eine positive Identifikation des Individuums, egal ob lebend oder tot, anhand von extrem kleinen Gewebeproben möglich.
Einsatz partieller 13245-Sequenzen in forensischer Biologie
Auf DNA basierende Identifikationsverfahren können auch in forensischer Biologie verwendet werden. Um solch eine Identifikation durchzuführen, kann PCR-Technologie zur Amplifikation von DNA-Sequenzen eingesetzt werden, die aus sehr kleinen biologischen Proben vom Tatort erhalten wurden, wie beispielsweise Gewebe, z.B. Haare oder Haut, oder Körperflüssigkeiten, z.B. Blut, Speichel oder Samen. Die amplifizierte Sequenz kann dann mit einem Standard verglichen werden, wodurch der Ursprung der biologische Probe bestimmt werden kann.
Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung können zur Bereitstellung von Polynucleotidreagenzien, z.B. PCR-Primern, verwendet werden, die auf bestimmte Loci im menschlichen Genom abzielen, wodurch die Verlässlichkeit von auf DNA basierender forensischer Identifikation erhöht wird, indem beispielsweise ein weiterer "Identifikationsmarker" (d.h. eine weitere DNA-Sequenz, die für ein bestimmtes Individuum einzigartig ist) bereitgestellt wird. Wie oben erwähnt können Informationen über eine tatsächliche Nucleotidsequenz zur Identifikation als genaue Alternative zu Mustern eingesetzt werden, die durch restriktionsenzymerzeugte Fragmente gebildet werden. Sequenzen, die auf nichtkodierende Regionen von Seq.-ID Nr. 1 abzielen (z.B. Fragmente mit einer Länge von zumindest 20 Nucleotidresten, vorzugsweise zumindest 30 Nucleotidresten), sind für diesen Zweck besonders gut geeignet.
Die hierin beschriebenen 13245-Nucleotidsequenzen können weiters zur Bereitstellung von Polynucleotidreagenzien eingesetzt werden, beispielsweise von markierten oder markierbaren Sonden, die z.B. für ein In-situ-Hybridisierungsverfahren geeignet sind, um ein bestimmtes Gewebe zu identifizieren, beispielsweise ein Gewebe mit hämatopoetischen Zellen. Dies kann vor allem in Fällen von großem Nutzen sein, in denen ein forensischer Pathologe mit Gewebe unbekannten Ursprungs zu tun hat. Gruppen solcher 13245-Sonden können zur Identifikation von Gewebe nach Spezies und/oder Organtyp eingesetzt werden.
Gleichermaßen können diese Reagenzien, z.B. 13245-Primer oder -Sonden, zum Screenen von Gewebekulturen auf Verunreinigungen verwendet werden (z.B. um auf die Gegenwart eines Gemischs aus verschiedenen Zelltypen in einer Kultur zu screenen).
Prognostische Medizin
Die vorliegende Erfindung betrifft auch das Gebiet der prognostischen Medizin, bei dem Diagnosetests, Prognosetests und die Überwachung von klinischen Tests für Prognosezwecke genutzt werden, um so ein Individuum zu behandeln.
Im Allgemeinen stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung bereit, ob ein Risiko für ein Individuum besteht, an einem bestimmten Leiden zu erkranken, die mit einer Schädigung oder der mangelhaften Expression eines Gens zusammenhängt, das für ein 13245-Polypeptid kodiert.
Solche Leiden umfassen beispielsweise Leiden, die mit der mangelhaften Expression eines 13245-Polypeptids zusammenhängen, z.B. eine Immunerkrankung oder eine neoplastische Erkrankung.
Das Verfahren umfasst einen oder mehre der folgenden Schritte:

(i) Detektieren, in einem Gewebe des Individuums, der Gegenwart oder Abwesenheit einer Mutation, welche die Expression des 13245-Gens beeinflusst, oder De tektieren der Gegenwart oder Abwesenheit einer Mutation in einer Region, welche die Expression des Gens beeinflusst, z.B. einer Mutation in der 5'-Kontrollregion;
(ii) Detektieren, in einem Gewebe des Individuums, der Gegenwart oder Abwesenheit einer Mutation, welche die Struktur des 13245-Gens verändert;
(iii) Detektieren, in einem Gewebe des Individuums, der mangelhaften Expression des 13245-Gens auf mRNA-Ebene, z.B. Detektieren der Menge an mRNA vom Nicht-Wildtyp; und
(iv) Detektieren, in einem Gewebe des Individuums, der mangelhaften Expression des Gens auf Proteinebene, z.B. Detektieren der 13245-Polypeptid-Menge vom Nicht-Wildtyp.

In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren: die Feststellung des Vorhandenseins zumindest eines der Folgenden: eine Deletion eines oder mehrerer Nucleotide aus dem 13245-Gen; eine Insertion eines oder mehrerer Nucleotide in das Gen, eine Punktmutation, z.B. eine Substitution eines oder mehrer Nucleotide des Gens, eine starke chromosomale Umordnung des Gens, z.B. eine Translokation, Inversion oder Deletion.
Die Detektion der genetische Schädigung kann beispielsweise Folgendes umfassen: (i) das Bereitstellen einer Sonde/eines Primers mit einem Oligonucleotid, das eine Region einer Nucleotidsequenz umfasst, die an eine Sense- oder Antisense-Sequenz aus Seq.-ID Nr. 1 hybridisiert, oder einer natürlich vorkommenden Mutante davon, oder von 5'- oder 3'-flankierenden Sequenzen, die von Natur aus mit dem 13245-Gen assoziiert sind; (ii) das Aussetzen der Sonde/des Primers gegenüber einer Nucleinsäure vom Gewebe; und das Detektieren der Gegenwart oder Abwesenheit der genetischen Schädigung durch Hybridisierung der Sonde/des Primers an die Nucleinsäure, z.B. durch In-situ-Hybridisierung.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Detektion der mangelhaften Expression die Feststellung des Vorhandenseins zumindest eines von: einer Änderung der Menge eines Messenger-RNA-Transkripts des 13245-Gens; der Gegenwart eines Nicht-Wildtyp-Spleißmusters eines Messenger-RNA-Transkripts des Gens; oder einer der Menge an 13245-RNA oder eines 13245-Proteins vom Nicht-Wildtyp.
Verfahren der Erfindung können zum pränatalen Screenen oder zur Bestimmung eingesetzt werden, ob für die Nachkommen eines Individuums das Risiko besteht, an einem Leiden zu erkranken.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren die Bestimmung der Struktur eines 13245-Gens, wobei eine abnormale Struktur auf ein Risiko für die Erkrankung hinweist.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Kontaktieren einer Probe vom Individuum mit einem Antikörper gegen das 13245-Protein oder die Nucleinsäure, die spezifisch an das Gen hybridisiert. Diese und andere Ausführungsformen werden nachstehend näher erläutert.
Diagnostische und prognostische Tests
Die Gegenwart, Menge oder Abwesenheit eines 13245-Proteins oder einer 13245-Nucleinsäure in einer biologischen Probe kann beurteilt werden, indem eine biologische Probe von einem Testindividuum erhalten wird und die biologische Probe mit einer Verbindung oder einem Mittel kontaktiert wird, die/das zur Detektion eines 13245-Proteins oder einer Nucleinsäure, die für ein 13245-Protein kodiert (z.B. mRNA, genomische DNA), in der Lage ist, sodass die Gegenwart des 13245-Proteins oder der Nucleinsäure in der biologische Probe detektiert wird. Der Begriff "biologische Probe" umfasst Gewebe, Zellen und biologische Flüssigkeiten, die aus einem Individuum isoliert wurden, sowie Gewebe, Zellen und Flüssigkeiten, die in einem Individuum vorhanden sind. Eine bevorzugte biologische Probe ist Serum. Das Expressionsausmaß des 13245-Gens kann auf verschiedene Arten gemessen werden, einschließlich, nicht jedoch beschränkt auf: Messung der mRNA, für welche die 13245-Gene kodieren; Messung der Menge des Proteins, für welches die 13245-Gene ko dieren; oder Messung der Aktivität des Proteins, für welche die 13245-Gene kodieren.
Die Menge an mRNA, die dem 13245-Gen in einer Zelle entspricht, kann sowohl durch In-situ- als auch In-vitro-Formate bestimmt werden.
Die isolierte mRNA kann in Hybridisierungs- oder Amplifikationstest verwendet werden, die Southern- und Northern-Tests, Polymerasekettenreaktionsanalysen und Sondenarrays umfassen, nicht jedoch darauf beschränkt sind. Andere bevorzugte diagnostische Verfahren zur Detektion von mRNA-Mengen umfassen das Kontaktieren der isolierten mRNA mit einem Nucleinsäuremolekül (Sonde), das an die mRNA hybridisieren kann, für die das zu detektierende Gen kodiert. Die Nucleinsäuresonde kann beispielsweise eine 13245-Nucleinsäure voller Länge, wie z.B. die Nucleinsäure der Seq.-ID Nr. 1, oder ein Teil davon sein, wie z.B. ein Oligonucleotid mit einer Länge von zumindest 7, 15, 30, 50, 100, 250 oder 500 Nucleotiden, die ausreicht, um unter stringenten Bedingungen spezifisch an 13245-mRNA oder genomische DNA zu hybridisieren. Andere geeignete Sonden zum Einsatz in den diagnostischen Tests werden ebenfalls hierin beschrieben.
In einem Format wird mRNA (oder cDNA) auf einer Oberfläche immobilisiert und mit den Sonden kontaktiert, beispielsweise indem die isolierte mRNA auf einem Agarosegel laufen gelassen und die mRNA vom Gel auf eine Membran, wie z.B. Nitrocellulose, transferiert wird. In einem alternativen Format werden die Sonden auf einer Oberfläche immobilisiert, und die mRNA (oder cDNA) wird beispielsweise in einem zweidimensionalen DNA-Chip mit den Sonden kontaktiert. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können bekannte mRNA-Detektionsverfahren leicht für den Einsatz zur Detektion der Menge an mRNA anpassen, für welche die 13245-Gene kodieren.
Die Menge mRNA, für die 13245 kodiert, in einer Probe kann durch Nucleinsäureamplifikation, z.B. durch RT-PCR (US-Patent Nr. 4.683.202), Ligase-Kettenreaktion (Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 189-193 (1991)), selbsterhaltende Sequenzreplikation (Gutaelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878 (1990)), ein transkriptionelles Amplifikationssystem (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1173-1177 (1989)), Q-β-Replicase (Lizardi et al., Bio/Technology 6, 1197 (1988)), Rollender-Kreis-Replikation (US-Patent Nr. 5.854.033) oder ein beliebiges anderes Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren, gefolgt von Detektion der amplifizierten Moleküle durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren bestimmt werden. Amplifikationsprimer sind hierin so definiert, dass sie ein Paar von Nucleinsäuremolekülen darstellen, die an die 5'- oder 3'-Region eines 13245-Gens (Plus- bzw. Minus-Strang oder umgekehrt) binden können (Annealing) und eine kurze Region dazwischen aufweisen. Im Allgemeinen sind Amplifikationsprimer etwa 10 bis 30 Nucleotide lang und flankieren eine Region, die etwa 50 bis 200 Nucleotide lang ist. Unter geeigneten Bedingungen und mit geeigneten Reagenzien erlauben solche Primer die Amplifikation eines Nucleinsäuremoleküls mit der Nucleotidsequenz zwischen den Primern.
Für In-situ-Verfahren kann eine Zell- oder Gewebeprobe hergestellt/verarbeitet und auf einem Träger, typischerweise einem Deckglas, immobilisiert und dann mit einer Sonde kontaktiert werden, die an mRNA hybridisieren kann, welche für das analysierte 13245-Gen kodiert.
In einer weiteren Ausführungsform umfassen die Verfahren außerdem das Kontaktieren einer Vergleichsprobe mit einer Verbindung oder einem Mittel, die in der Lage sind, 13245-mRNA oder genomische DNA zu detektieren, und das Vergleichen der Gegenwart von 13245-mRNA oder genomischer DNA in der Vergleichsprobe mit der Gegenwart von 13245-mRNA oder genomischer DNA in der getesteten Probe.
Verschiedene Verfahren können eingesetzt werden, um die Menge eines Proteins zu bestimmen, für das 13245 kodiert. Im Allgemeinen umfassen diese Verfahren das Kontaktieren eines Mittel, das selektiv an das Protein bindet, wie z.B. eines Antikörpers, mit einer Probe, um die Proteinmenge in der Probe zu beurteilen. In einer bevorzugten Ausführungsform trägt der Antikörper einer detektierbare Markierung. Antikörper können polyklonal oder, noch bevorzugter, monoklonal sein. Ein intakter Antikörper oder ein Fragment davon (z.B. Fab oder F(ab')₂) kann eingesetzt werden. Die Bezeichnung "markiert" in Bezug auf die Sonde oder den Antikörper umfasst direkte Markierung der Sonde oder des Antikörpers durch Kupplung (z.B. physikalische Bindung) einer detektierbaren Substanz an die Sonde oder den Antikörper sowie indirekte Markierung der Sonde oder des Antikörpers durch Reaktivität mit einer detektierbaren Substanz. Beispiele für detektierbare Substanzen sind hierin angeführt.
Die Detektionsverfahren können zur Detektion eines 13245-Proteins in einer biologischen Probe in vitro als auch in vivo eingesetzt werden. In-vitro-Verfahren zur Detektion eines 13245-Proteins umfassen enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmungen (ELISAs), Immunfällungen, Immunfluoreszenz, Enzymimmunoassays (EIA), Radioimmunoassays (RIA) und Western-Blot-Analysen. In-vivo-Verfahren zur Detektion eines 13245-Proteins umfassen die Einführung eines markierten Anti-13245-Antikörpers in ein Individuum. Der Antikörper kann beispielsweise mit einer radioaktiven Markierung versehen werden, deren Gegenwart und Position in einem Individuum durch herkömmliche Bildgebungsverfahren detektiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform umfassen die Verfahren außerdem das Kontaktieren der Vergleichsprobe mit einer Verbindung oder einem Mittel, die zur Detektion eines 13245-Proteins in der Lage sind, und das Vergleichen der Gegenwart eines 13245-Proteins in der Vergleichsprobe mit der Gegenwart eines 13245-Proteins in der getesteten Probe.
Die Erfindung umfasst auch Sets zur Detektion der Gegenwart von 13245 in einer biologischen Probe. Das Set kann beispielsweise eine Verfahren oder ein Mittel, die zur Detektion eines 13245-Proteins oder von mRNA in einer biologischen Probe in der Lage sind, und einen Standard enthalten. Die Verbindung oder das Mittel können in einen geeigneten Behälter gepackt werden. Das Set kann weiters Anleitungen zum Einsatz des Sets zur Detektion von 13245-Proteinen oder -Nucleinsäure enthalten.
Bei auf Antikörpern basierenden Sets kann das Set Folgendes umfassen: (1) einen (z.B. an einen festen Träger gebundenen) ersten Antikörper, der an ein Polypeptid bindet, das einem Marker der Erfindung entspricht; und gegebenenfalls (2) einen zweiten, anderen Antikörper, der an entweder das Polypeptid oder den ersten Antikörper bindet und an ein detektierbares Mittel konjugiert ist.
Bei auf Oligonucleotiden basierenden Sets kann das Set Folgendes umfassen: (1) ein Oligonucleotid, z.B. ein detektierbar markiertes Oligonucleotid, das an eine Nucleinsäuresequenz hybridisiert, die für ein einem Marker der Erfindung entsprechendes Polypeptid kodiert, oder (2) ein Primerpaar, die zur Amplifikation eines Nucleinsäuremoleküls zweckdienlich sind, das einem Marker der Erfindung entspricht. Das Set kann weiters einen Puffer, ein Konservierungsmittel oder einen Proteinstabilisator enthalten. Außerdem kann das Set Komponenten enthalten, die zur Detektion des detektierbaren Mittels (z.B. eines Enzyms oder Substrats) erforderlich sind. Weiters kann das Set einen Vergleichsprobe oder eine Reihe von Vergleichsproben enthalten, die getestet und mit der enthaltenen Testprobe verglichen werden. Jede Komponente des Sets kann in einem separaten Behälter enthalten sein, und jeder der Behälter kann separat verpackt sein, gemeinsam mit Anleitungen zur Auslegung der Ergebnisse des mithilfe des Sets durchgeführten Tests.
Die hierin beschriebenen diagnostischen Verfahren können Individuen identifizieren, die an einer mit mangelhafter, aberrierender oder unerwünschter 13245-Expression oder -Aktivität zusammenhängenden Krankheit oder Störung leiden oder für die das Risiko besteht, daran zu erkranken. Die Bezeichnung "unerwünscht" umfasst hierin ein unerwünschtes Phänomen im Zusammenhang mit einer biologischen Reaktion, beispielsweise die Induktion einer unangemessenen Immunantwort oder deregulierten Zellproliferation.
In einer Ausführungsform wird eine Erkrankung oder ein Leiden in Zusammenhang mit aberrierender oder unerwünschter 13245-Expression oder -Aktivität identifiziert. Eine Testprobe wird von einem Individuum erhalten, und ein 13245-Protein oder einer 13245-Nucleinsäure (z.B. mRNA oder genomische DNA) wird beurteilt, worin der Gehalt, z.B. die Gegenwart oder Abwesenheit, von 13245-Proteinen oder -Nucleinsäuren als Diagnose dafür dient, ob für ein Individuum das Risiko besteht, eine Erkrankung oder ein Leiden in Zusammenhang mit aberrierender oder unerwünschter 13245-Expression oder -Aktivität zu entwickeln. Die Bezeichnung "Testprobe" bezieht sich hierin auf eine biologische Probe, die von einem Individuum von Interesse erhalten wurde, einschließlich einer biologischen Flüssigkeit (z.B. Serum), einer Zellprobe oder eines Gewebes.
Die hierin beschriebenen prognostischen Tests können eingesetzt werden, um zu bestimmen, ob ein Mittel (z.B. ein Agonist, Antagonist, Peptidomimetikum, Protein, Peptid, eines Nucleinsäure, ein kleines Molekül oder ein anderer Arzneimittelkandidat) einem Individuum verabreicht werden kann, um eine Krankheit oder ein Leiden in Zusammenhang mit aberrierender oder unerwünschter 13245-Expression oder -Aktivität zu behandeln. Solche Verfahren können beispielsweise eingesetzt werden, um zu bestimmen, oben beschrieben ein Individuum wirksam mit einem Mittel behandelt werden kann, das 13245-Expression oder -Aktivität moduliert.
Die Verfahren der Erfindung können auch eingesetzt werden, um genetische Veränderungen in einem 13245-Gen zu detektieren, wodurch bestimmt wird, ob für ein Individuum mit dem veränderten Gen das Risiko besteht, an einem Leiden zu erkranken, das durch eine Fehlregulierung der 13245-Proteinaktivität oder -Nucleinsäureexpression gekennzeichnet ist, wie z.B. eine Erkrankung im Zusammenhang mit Tumorgenese oder der Induktion einer unangemessenen Immunantwort. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Verfahren das Detektieren der Gegenwart oder Abwesenheit einer genetischen Veränderung, die durch zumindest eines aus einer Veränderung, die sich auf die Integrität eines für ein 13245-Protein kodierenden Gens auswirkt, oder der mangelhaften Expression des 13245-Gens gekennzeichnet ist, in einem Individuum. Solche genetischen Veränderungen können beispielsweise detektiert werden, indem das Vorhandensein zumindest eines aus 1) einer Deletion eines oder mehrerer Nucleotide in einem 13245-Gen; 2) einer Addition eines oder mehrerer Nucleotide zu einem 13245-Gen; 3) einer Substitution eines oder mehrerer Nucleotide eines 13245-Gens; 4) einer chromosomalen Umordnung eines 13245-Gens; 5) einer Veränderung auf der Ebene des Messenger-RNA-Transkripts eines 13245-Gens; 6) einer aberrierenden Modifikation eines 13245-Gens, wie z.B. des Methylierungsmusters der genomischen DNA; 7) der Gegenwart eines Nichtwildtyp-Spleißmusters eines Messenger-RNA-Transkripts eines 13245-Gens; 8) einem Nichtwildtyp-Gehalt eines 13245-Proteins; 9) einem Allelverlust eines 13245-Gens; und 10) einer ungeeigneten posttranslationalen Modifikation eines 13245-Proteins festgestellt wird.
Eine Veränderung kann ohne Sonde/Primer in einer Polymerasekettenreaktion, z.B. Anchored-PCR oder RACE-PCR, detektiert werden, oder alternativ dazu in einer Ligationskettenreaktion (LCR), wobei Letztere vor allem für die Detektion von Punktmutationen im 13245-Gen zweckdienlich ist. Dieses Verfahren kann die Schritte des Gewinnens einer Zellprobe von einem Individuum, des Isolierens von Nucleinsäure (z.B. genomisch, mRNA oder beides) aus der Probe, des Kontaktierens der Nucleinsäureprobe mit einem oder mehreren Primern, die unter Bedingungen, die für solch eine Hybridisierung und eine Amplifikation des 13245-Gens (falls vorhanden) förderlich sind, spezifisch an ein 13245-Gen hybridisieren, und des Detektierens der Gegenwart oder Abwesenheit eines Amplifikationsprodukts oder des Detektierens der Größe des Amplifikationsprodukts und des Vergleichens der Länge mit einer Vergleichsprobe umfassen. Es ist zu erwarten, dass PCR und/oder LCR als vorläufiger Amplifikationsschritt zusammen mit einem der Verfahren, die zur Detektion von hierin beschriebenen Mutationen eingesetzt werden, zweckdienlich ist.
Alternative Amplifikationsverfahren umfassen: selbsterhaltende Sequenzreplikation (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878 (1990)), ein transkriptionelles Amplifikationssystem (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1173-1177 (1989)), Q-β-Replicase (Lizardi et al., Bio/Technology 6, 1197 (1988)), Rollender-Kreis-Replikation (US-Patent Nr. 5.854.033) oder andere Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren, gefolgt von Detektion der amplifizierten Moleküle durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren.
In einer anderen Ausführungsform können Mutationen in einem 13245-Gen aus einer Probezelle identifiziert werden, indem Veränderungen in Restriktionsenzym-Spaltmustern detektiert werden. Proben- und Vergleichs-DNA werden beispielsweise iso liert, amplifiziert (optional), mit einer oder mehreren Restriktionsendonucleasen verdaut, und die Fragmentlängen werden bestimmt, z.B. durch Gelelektrophorese) und verglichen. Unterschiede in der Fragmentlänge zwischen Proben- und Vergleichs-DNA weisen auf Mutationen in der Proben-DNA hin. Außerdem können sequenzspezifische Ribozyme (z.B. US-Patent Nr. 5.498.531) eingesetzt werden, um die Gegenwart von spezifischen Mutationen durch die Entwicklung oder den Verlust einer Ribozym-Spaltstelle zu bewerten.
In anderen Ausführungsformen können genetische Mutationen in 13245 durch Hybridisieren einer Probe zur Kontrolle der Nucleinsäuren, z.B. DNA oder RNA, durch beispielsweise zweidimensionale Arrays oder auf Chips basierende Arrays identifiziert werden. Solche Arrays umfassen zahlreiche Adressen, die alle aufgrund ihrer Position voneinander unterscheidbar sind. An jeder Adresse der zahlreichen Adressen befindet sich eine andere Sonde. Diese Arrays können eine hohe Dichte an Adressen aufweisen, z.B. hunderte oder tausende von Oligonucleotidsonden (Cronin et al., Hum. Mutat. 7, 244-255 (1996); Kozal et al., Nature Med. 2, 753-759 (1996)). Genetische Mutationen in 13245 können beispielsweise in zweidimensionalen Arrays identifiziert werden, die lichtgenerierte DNA-Sonden enthalten, wie sie bereits beschrieben wurden (Cronin et al., w.o.). Kurz gesagt kann ein erstes Hybridisierungsarray von Sonden dazu verwendet werden, durch lange DNA-Teile in einer Probe zu scannen und das Ganze zur Identifikation von Basenänderungen zwischen Sequenzen zu kontrollieren, indem lineare Arrays von sequenziell überlappenden Sonden hergestellt werden. Dieser Schritt ermöglicht die Identifikation von Punktmutationen. Auf diesen Schritt folgt ein zweites Hybridisierungsarray, was die Charakterisierung von spezifischen Mutationen durch Verwendung kleinerer, spezialisierter Sondenarrays ermöglicht, die komplementär zu allen detektierten Varianten oder Mutationen sind. Jedes Mutationsarray besteht aus parallelen Sondengruppen, wovon eines zum Wildtyp-Gen komplementär ist und das andere zum mutierten Gen.
In einer weiteren Ausführungsform kann eine beliebige verschiedener Sequenzierungsreaktionen, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, zur direkten Sequenzierung des 13245-Gens und zur Detektion von Mutationen durch Vergleich der Sequenz des Proben-13245 mit der entsprechenden Wildtyp- (Vergleichs-) Sequenz eingesetzt werden. Automatisierte Sequenzierungsvorgänge können eingesetzt werden, wenn die diagnostischen Tests durchgeführt werden (BioTechniques 19, 448 (1995)), einschließlich Sequenzierung durch Massenspektrometrie.
Andere Verfahren zur Detektion von Mutationen im 13245-Gen umfassen Verfahren, bei denen der Schutz durch Spaltmittel zur Detektion von fehlgepaarten Basen in RNA/RNA- oder RNA/DNA-Heteroduplexen genutzt wird (Myers et al., Science 230, 1242 (1985); Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3297 (1988); Saleeba et al., Meth. Enzymol. 217, 286-295 (1992)).
In einer weiteren Ausführungsform nutzt die Fehlpaarungsspaltreaktion ein oder mehrere Proteine, die fehlgepaarte Basenpaare in doppelsträngiger DNA in definierten Systemen zur Detektion und Kartierung von Punktmutationen in 13245-cDNA aus Zellproben erkennen (so genannte "DNA-Fehlpaarungsreparaturenzyme"). Das mutY-Enzym von E. coli spaltet beispielsweise A bei G/A-Fehlpaarungen, und die Thymidin-DNA-Glykosylase von HeLa-Zellen spaltet T bei G/T-Fehlpaarungen (Hsu et al., Carcinogenesis 15, 1657-1662 (1994); US-Patent Nr. 5.459.039).
In anderen Ausführungsform werden Veränderungen der elektrophoretischen Mobilität zur Identifikation von Mutationen in 13245-Genen genutzt. Einzelstrang-Konformationspolymorphismen (SSCP) können zur Detektion von Unterschieden in der elektrophoretischen Mobilität zwischen mutierten und Wildtyp-Nucleinsäure genutzt werden (Orite et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2766 (1989); Cotton, Mutat. Res. 285, 125-144 (1993); Hayashi, Genet. Anal. Tech. Appl. 9, 73-79 (1992)). Einzelstrang-DNA-Fragmente von Proben- und Vergleichs-13245-Nucleinsäuren werden denaturiert und renaturieren gelassen. Die Sekundärstruktur von einzelsträngigen Nucleinsäuren variiert je nach Sequenz, und die resultierende Veränderung der elektrophoretischen Mobilität ermöglicht sogar die Detektion von Änderungen von nur einer Base. Die DNA-Fragmente können markiert oder mit markierten Sonden detektiert werden. Die Empfindlichkeit des Tests kann durch den Einsatz von RNA (anstelle von DNA) erhöht werden, in der die Sekundärstruktur empfindlicher gegenüber Se quenzänderungen ist. In einer bevorzugten Ausführungsform nutzt das vorliegende Verfahren Heteroduplexanalysen zur Trennung von doppelsträngigen Heteroduplexmolekülen auf Basis von Änderungen der elektrophoretischen Mobilität (Keen et al., Trends Genet. 7, 5 (1991)).
In einer weiteren Ausführungsform wird die Bewegung von mutierten oder Wildtyp-Fragmenten in Polyacrylamidgelen mit einem Denaturierungsmittelgradienten unter Verwendung von denaturierender Gradientengel-Elektrophorese (DGGE) (Myers et al., Nature 313, 495 (1985)) getestet. Wenn DGGE als Analyseverfahren eingesetzt wird, wird DNA modifiziert, um sicherzustellen, dass sie nicht vollständig denaturiert, beispielsweise durch Zusatz einer etwa 40 Basenpaaren großen GC-Klammer aus hochschmelzender GC-reicher DNA durch PCR. In einer weiteren Ausführungsform wird anstelle eines Denaturierungsgradienten ein Temperaturgradient eingesetzt, um Unterschiede in der Mobilität von Vergleichs- und Proben-DNA zu identifizieren (Rosenbaum und Reissner, Biophys. Chem. 265, 12753 (1987)).
Beispiele für andere Verfahren zur Detektion von Punktmutationen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf selektive Oligonucleotidhybridisierung, selektive Amplifikation oder selektive Primerverlängerung (Saiki et al., Nature 324, 153 (1986); Saiki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6230 (1989)).
Alternativ dazu kann ein allelspezifisches Amplifikationsverfahren, das auf einer selektiven PCR-Amplifikation basiert, gemeinsam mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Oligonucleotide, die als Primer für eine spezifische Amplifikation eingesetzt werden, können die Mutation von Interesse im Zentrum des Molekül aufweisen (sodass die Amplifikation von einer differenziellen Hybridisierung abhängt; Gibbs et al., Nucl. Acids Res. 17, 2437-2448 (1989)), oder ganz außen am 3'-Ende eines Primers, wo unter geeigneten Bedingungen einer Fehlpaarung eine Polymeraseverlängerung verhindern oder verringern kann (Prossner, Tibtech. 11, 238 (1993)). Weiters kann es wünschenswert sein, eine neue Restriktionsstelle in der Mutationsregion einzuführen, um eine auf Spaltung basierende Detektion zu ermöglichen (Gasparini et al., Mol. Cell Probes 6, 1 (1992)). Es wird davon ausgegangen, dass die Amplifika tion in bestimmten Ausführungsformen auch unter Einsatz von Taq-Ligase zur Amplifikation durchgeführt werden kann (Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 189 (1991)). In solchen Fällen findet eine Ligation nur dann statt, wenn eine vollkommene Übereinstimmung am 3'-Ende der 5'-Segeunz vorhanden ist, wodurch es möglich wird, die Gegenwart einer bekannten Mutation an einer bestimmten Stelle zu detektieren, indem nach der Gegenwart oder Abwesenheit einer Amplifikation gesucht wird.
Die hierin beschriebenen Verfahren können beispielsweise unter Verwendung von abgepackten Diagnosesets durchgeführt werden, die zumindest eine Sondennucleinsäure oder ein Antikörperreagens, wie sie hierin beschrieben sind, umfassen und gut für z.B. klinische Einsätze zur Diagnose bei Patienten mit Symptomen oder einer Familienanamnese für ein Leiden oder eine Krankheit im Zusammenhang mit einem 13245-Gen geeignet.
Einsatz von 13245-Molekülen als Ersatzmarker
Die 13245-Moleküle der Erfindung sind auch als Marker für Leiden oder Krankheitszustände, als Marker für Vorläufer von Krankheitszuständen, als Marker für eine Veranlagung für Krankheitszustände, als Marker für Arzneimittelaktivität oder als Marker für das pharmakogenomische Profil eines Individuums geeignet. Mithilfe der hierin beschriebenen Verfahren können die Gegenwart, Abwesenheit und/oder Menge der 13245-Moleküle der Erfindung detektiert und in vivo mit einem oder mehreren biologischen Zuständen korreliert werden. Die 13245-Moleküle der Erfindung können beispielsweise als Ersatzmarker für ein oder mehrere Leiden oder Krankheitszustände oder für Konditionen dienen, die zu Krankheitszuständen führen. Die Bezeichnung "Ersatzmarker" bezieht sich hierin auf einen objektiven biochemischen Marker, der mit der Abwesenheit oder Gegenwart einer Krankheit oder eines Leidens oder mit dem Fortschreiten einer Krankheit oder eines Leidens (z.B. mit dem Vorhandensein oder Fehlen eines Tumors) korreliert. Die Gegenwart oder Menge solcher Marker hängt von der Krankheit ab. Folglich können diese Marker dazu dienen zu bestimmen, ob ein bestimmtes Behandlungsverfahren einen Krankheitszustand oder ein Leiden wirksam mildert. Ersatzmarker sind vor allem dann geeignet, wenn das Vorhandensein oder Ausmaß eines Erkrankungszustands oder Leidens mithilfe von Standardverfahren schwer zu beurteilen ist (z.B. bei Tumoren im Frühstadium) oder wenn eine Beurteilung des Fortschreitens einer Krankheit erwünscht ist, bevor ein möglicherweise gefährlicher klinischer Punkt erreicht wird (z.B. kann eine Beurteilung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen erfolgen, indem Cholesterinwerte als Ersatzmarker genutzt werden, und eine HIV-Infektion kann analysiert werden, indem HIV-RNA-Werte als Ersatzmarker verwendet werden, und das lange vor unerwünschten klinischen Folgen wie Herzinfarkt oder voll ausgebrochenem AIDS). Beispiele für den Einsatz von Ersatzmarkern wurden schon beschrieben (z.B. Koomen et al., J. Mass. Spectrom. 35, 2 voll entwickeltem AIDS). Beispiele für den Einsatz von Ersatzmarkern wurden bereits beschrieben (z.B. Koomen et al., J. Mass. Spectrom. 35, 258-264 (2000); James, AIDS Treat. News Arch. 209 (1994)).
Die 13245-Moleküle der Erfindung sind auch als pharmakodynamische Marker geeignet. Die Bezeichnung "pharmakodynamischer Marker" bezieh sich hierin auf einen objektiven biochemischen Marker, der spezifisch mit Arzneimittelwirkungen korreliert. Die Gegenwart oder Menge eines pharmakodynamischen Markers hängt nicht mit dem Krankheitszustand oder Leiden zusammen, gegen welches das Arzneimittel verabreicht wird; folglich zeigt die Gegenwart oder Menge des Markers die Gegenwart oder Aktivität des Arzneimittels in einem Individuum an. Ein pharmakodynamischer Marker kann beispielsweise die Konzentration des Arzneimittels in einem biologischen Gewebe anzeigen, indem der Marker in diesem Gewebe in Abhängigkeit vom Gehalt des Arzneimittels entweder exprimiert oder transkribiert oder nicht exprimiert oder transkribiert wird. Auf diese Weise kann die Verteilung oder Aufnahme des Arzneimittels mithilfe des pharmakodynamischen Markers überwacht werden. Auf ähnliche Weise kann die Gegenwart oder Menge des pharmakodynamischen Markers mit der Gegenwart oder Menge des Stoffwechselprodukts eines Arzneimittels zusammenhängen, sodass die Gegenwart oder Menge des Markers die relative Abbaugeschwindigkeit des Arzneimittels in vivo anzeigt. Pharmakodynamische Marker sind vor allem für die Steigerung der Detektionsempfindlichkeit von Arzneimittelwirkungen geeignet, vor allem wenn das Arzneimittel in geringen Dosen verabreicht wird. Da sogar geringe Mengen eines Arzneimittel ausreichen können, um mehrere Transkriptions- oder Expressionsdurchgänge von Markern zu aktivieren (z.B. eines 13245-Markers), kann der amplifizierte Marker in einer Menge vorliegen, die leichter detektierbar ist als das Arzneimittel selbst. Außerdem kann der Marker aufgrund des Aufbaus des Markers selbst leichter detektiert werden; mithilfe des hierin beschriebenen Verfahrens können Anti-13245-Antikörper beispielsweise in einem immunbasierten Detektionssystem für einen 13245-Proteinmarker eingesetzt werden, oder 13245-spezifische radioaktiv markierte Sonden können zur Detektion eines 13245-mRNA-Markers verwendet werden. Weiters erlaubt der Einsatz eines pharmakodynamischen Markers eine auf dem Mechanismus basierende Risikovorhersage augrund einer Arzneimittelbehandlung über die Grenzen der möglichen direkten Beobachtungen hinaus. Beispiele für die Verwendung von pharmakodynamischen Markern wunden bereits beschrieben (z.B. US-Patent Nr. 6.033.862; Hattis et al., Env. Health Perspect. 90, 229-238 (1991); Schentag, Am. J. Health-Syst. Pharm. 56, Suppl. 3, 21-24 (1999); Nicolau, Am. J. Health Syst. Pharm. 56, Suppl.3, 16-20 (1999)).
Die 13245-Moleküle der Erfindung sind auch als pharmakogenomische Marker von Nutzen. Ein "pharmakogenomischer Marker" ist hierin ein objektiver biochemischer Marker, der mit einer bestimmten klinischen Arzneimittelreaktion oder -empfindlichkeit in einem Individuum korreliert (z.B. McLeod et al., Eur. J. Cancer 35, 1650-1652 (1999)). Die Gegenwart oder Menge des pharmakogenomischen Markers steht mit der vorhergesagten Reaktion des Individuum auf ein bestimmtes Arzneimittel oder eine bestimmte Arzneimittelklasse vor Verabreichung des Arzneimittels in Zusammenhang. Durch Beurteilung der Gegenwart oder Menge eines oder mehrerer pharmakogenomischer Marker in einem Individuum kann die Arzneimitteltherapie ausgewählt werden, die für das jeweilige Individuum am besten geeignet ist oder wahrscheinlich den größten Erfolg bringt. Ausgehend von der Gegenwart oder Menge von RNA oder eines Proteins (z.B. 13245-Protein oder -RNA) für spezifische Tumormarker in einem Individuum kann beispielsweise ein Arzneimittel oder ein Behandlungsverlauf ausgewählt werden, die für die Behandlung des jeweiligen Tumors, der vermutlich im Individuum vorhanden ist, am besten geeignet ist. Auf ähnliche Weise kann die Gegenwart oder Abwesenheit einer bestimmten Sequenzmutation in 13245- DNA mit einer 13245-Arzneimittelreaktion in Zusammenhang stehen. Die Verwendung von pharmakogenomischen Markern ermöglicht somit die Durchführung der am besten geeigneten Behandlung für das jeweilige Individuum, ohne dass die Therapien vorher getestet werden müssen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die Nucleinsäure und Polypeptide, Fragmente davon sowie Anti-13245-Antikörper (hierin auch als "aktive Verbindungen" bezeichnet) der Erfindung können in pharmazeutische Zusammensetzungen miteinbezogen werden. Solche Zusammensetzungen umfassen typischerweise das Nucleinsäuremolekül, das Protein oder den Antikörper und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Die Bezeichnung "pharmazeutisch annehmbarer Träger" umfasst hierin Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Überzüge, antibakterielle und antifungale Stoffe, Isotonisierungsmittel und Absorptionsverzögerer und dergleichen, die für pharmazeutische Verabreichung geeignet sind. In die Zusammensetzungen können auch zusätzliche aktive Verbindungen miteinbezogen werden.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung wird so formuliert, dass sie für den gewünschten Verabreichungsweg geeignet ist. Beispiele für Verabreichungswege umfassen parenterale, z.B. intravenöse, intradermale, subkutane, orale (z.B. durch Inhalation), transdermale (topische), transmukosale und rektale Verabreichung. Lösungen oder Suspensionen zur parenteralen, intradermalen oder subkutanen Anwendung können die folgenden Komponenten enthalten: ein steriles Verdünnungsmittel, wie z.B. Wasser für Injektionszwecke, Kochsalzlösung, gehärtete Öle, Polyethylenglykole, Glycerin, Propylenglykol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Mittel, wie z.B. Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidantien, wie z.B. Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Chelatbildner, wie z.B. Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer, wie z.B. Acetate, Citrate oder Phosphate; und Tonizitätsregler, wie z.B. Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH kann mit Säuren oder Basen, wie z.B. Salzsäure oder Natriumhydroxid, eingestellt werden. Das parenterale Präparat kann in Ampullen, Einwegspritzen oder Mehrfachdosenphiolen aus Glas oder Kunststoff enthalten sein.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Injektion geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen (wenn wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Pulver zur frischen Zubereitung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. Zur intravenösen Verabreichung geeignete Träger umfassen physiologische Kochsalzlösung, bakteriostatisches Wasser, Cremophor EL^TM (BASF, Parsippany, NJ, USA) oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). In allen Fällen muss die Zusammensetzung steril sein und sollte ausreichend fließfähig, um leicht mit einer Spritze verabreicht werden zu können. Sie sollte unter den Herstellungs- und Lagerbedingungen stabil sein und muss gegen Verunreinigung durch Mikroorganismen wie Bakterien und Pilze geschützt sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium sein, das beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (z.B. Glycerin, Propylenglykol, flüssiges Polyethylenglykol und dergleichen) und geeignete Gemische daraus enthält. Die geeignete Fließfähigkeit kann beispielsweise mithilfe eines Überzugs wie Lecithin, durch Beibehaltung der erwünschten Teilchengröße im Falle einer Dispersion oder durch den Einsatz von Tensiden beibehalten werden. Die Wirkung von Mikroorganismen kann verhindert werden, indem verschiedene antibakterielle und antifungale Mittel, wie z.B. Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und dergleichen, zugesetzt werden. In vielen Fällen werden vorzugsweise Isotonisierungsmittel, beispielsweise Zucker, Polyalkohole, wie z.B. Mannit, Sorbit, Natriumchlorid, zur Zusammensetzung zugesetzt. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann erreicht werden, indem ein Mittel zur Zusammensetzung zugesetzt wird, das die Absorption verzögert, wie z.B. Aluminiummonostearat und Gelatine.
Sterile Injektionslösungen können hergestellt werden, indem die aktive Verbindung in gewünschter Menge in ein geeignetes Lösungsmittel mit oder ohne eine(r) Kombination der oben beschriebenen Bestandteile miteinbezogen wird, gefolgt von Sterilfiltration. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Einführung der aktiven Verbindung in ein steriles Vehikel hergestellt, das ein Grunddispersionsmedium und die erforder lichen der oben genannten übrigen Bestandteile enthält. In Falle von sterilen Pulvern zur Herstellung von sterilen Injektionslösungen umfassen die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung, was ein Pulver des Wirkstoffs und eines beliebigen weiteren gewünschten Bestandteils der zuvor sterilfiltrierten Lösung ergibt.
Orale Zusammensetzungen umfassen im Allgemeinen einen inerten Verdünner oder einen essbaren Träger. Zum Zwecke von oraler therapeutischer Verabreichung kann die aktive Verbindung mit Exzipienten versetzt und in Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln, z.B. Gelatinekapseln, verwendet werden. Orale Zusammensetzungen können auch mithilfe eines flüssigen Trägers als Mundwasser hergestellt werden. Pharmazeutisch verträgliche Bindemittel und/oder Hilfsmaterialien können Teil der Zusammensetzung sein. Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und dergleichen können beliebige der folgenden Bestandteile oder Verbindungen ähnlicher Natur enthalten: ein Bindemittel, wie z.B. mikrokristalline Cellulose, Tragantgummi oder Gelatine; einen Exzipienten, wie z.B. Stärke oder Lactose; ein Aufschlussmittel, wie z.B. Alginsäure, Primogel^TM oder Maisstärke; ein Gleitmittel, wie z.B. Magnesiumstearat oder Sterotes^TM; ein Gleitmittel, wie z.B. kolloidale Kieselsäure; ein Süßungsmittel, wie z.B. Saccharose oder Saccharin; oder einen Geschmacksstoff, wie z.B. Pfefferminze, Methylsalicylat oder Orangenaroma.
Zur Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen in Form eines Aerosol-Sprays aus einem unter Druck stehenden Behälter oder Dispenser, der ein geeignetes Treibmittel, z.B. ein Gas wie Kohlendioxid, oder einen Vernebler enthält, abgegeben.
Systemische Verabreichung kann auch auf transmukosale oder transdermale weise erfolgen. Bei transmukosaler oder transdermaler Verabreichung werden für die zu überwindende Barriere geeignete Penetrationsverbesserer in der Formulierung eingesetzt. Solche Penetrationsverbesserer sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und umfassen zur transmukosalen Verabreichung beispielsweise Detergenzien, Gallensalze und Fusidinsäurederivate. Transmukosale Verabreichung kann unter Verwendung von Nasensprays oder Zäpfchen erfolgen. Bei transdermaler Verabreichung werden die aktiven Verbindungen zu Salben, Balsamen, Gelen oder Cremes formuliert, wie sie auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind.
Die Verbindungen können auch in Form von Zäpfchen (z.B. mit herkömmlichen Zäpfchenbasen wie Kakaobutter und anderen Glyceriden) oder Bleibeklistieren zur rektalen Zufuhr bereitgestellt werden.
In einer Ausführungsform werden die Wirkstoffverbindungen mit Trägern hergestellt, welche die Verbindung gegen eine rasche Ausscheidung aus dem Körper schützen, wie z.B. eine Retardformulierung, einschließlich von Implantaten und mikroverkapselten Zufuhrsystemen. Biologisch abbaubare, biokompatible Polymere können eingesetzt werden, wie z.B. Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglykolsäure, Collagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung gut bekannt. Die Materialien können auch im Handel von Alza Corporation und Nova Pharmaceuticals, Inc. bezogen werden. Liposomale Suspensionen (einschließlich von Liposomen, die mithilfe von monoklonalen Antikörpern gegen virale Antigene auf infizierte Zellen ausgerichtet sind) können auch als pharmazeutisch annehmbare Träger eingesetzt werden. Diese können gemäß bereits beschriebenen Verfahren hergestellt werden (z.B. US-Patent Nr. 4.522.811).
Es ist von Vorteil, orale oder parenterale Zusammensetzungen in Enheitsdosierungsformen bereitzustellen, um die Verabreichung und Gleichförmigkeit der Dosierung zu vereinfachen. Enheitsdosierungsformen beziehen sich hierin auf physikalisch getrennte Einheiten, die als Dosiseinheiten für das zu behandelnde Individuum geeignet sind; jede Einheit enthält eine vorgegebene Menge einer aktiven Verbindung, die so berechnet wurde, dass eine gewünschte therapeutische Wirkung erzielt wird, zusammen mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger.
Die Toxizität und therapeutische Wirksamkeit solcher Verbindungen können mithilfe von herkömmlichen pharmazeutischen Verfahren in Zellkulturen oder Versuchstie ren, z.B. zur Bestimmung der LD₅₀ (für 50% der Population letale Dosis) und der ED₅₀ (Dosis, die bei 50% der Population therapeutisch wirksam ist), bestimmt werden. Das Dosenverhältnis zwischen toxischer und therapeutischer Wirkung ist die therapeutische Breite und kann als Verhältnis LD₅₀:ED₅₀ ausgedrückt werden. Verbindungen mit hohen therapeutischen Breiten sind bevorzugt. Verbindungen mit toxischen Nebenwirkungen können zwar verwendet werden, es sollte aber darauf geachtet werden, ein Zufuhrsystem zu konzipieren, das solche Verbindungen auf die betroffene Gewebestelle ausrichtet, um mögliche Schäden an nichtinfizierten Zellen zu minimieren und so die Nebenwirkungen zu verringern.
Die aus den Zellkulturtests und Tieruntersuchungen erhaltenen Daten können zur Formulierung verschiedener Dosen zum Einsatz beim Menschen genutzt werden. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise im Bereich von Konzentrationen im Kreislauf, welche die ED₅₀ mit geringer oder keiner Toxizität umfassen. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs je nach verwendeter Dosierungsform und genutztem Verabreichungsweg variieren. Für jede im Verfahren der Erfindung eingesetzte Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfangs anhand der Zellkulturtests abgeschätzt werden. Eine Dosis kann dann in Tiermodellen formuliert werden, um einen Plasmakonzentrationsbereich im Kreislauf zu erhalten, der die IC₅₀ umfasst (d.h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Hemmung von Symptomen erreicht), die in einer Zellkultur bestimmt wurde. Solche Informationen können genutzt werden, um für Menschen nützliche Dosen genauer zu bestimmen. Plasmaspiegel können beispielsweise durch Hochleistungsflüssigchromatographie gemessen werden.
Eine therapeutisch wirksame Menge eines Proteins oder Polypeptids (d.h. eine wirksame Dosis) liegt gemäß der hierin verwendeten Definition bei etwa 0,001 bis 30 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht, vorzugsweise etwa 0,01 bis 25 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht, noch bevorzugter etwa 0,1 bis 20 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht, noch bevorzugter etwa 1 bis 10 Milligramm pro Kilogramm, 2 bis 9 Milligramm pro Kilogramm, 3 bis 8 Milligramm pro Kilogramm, 4 bis 7 Milligramm pro Kilogramm oder 5 bis 6 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht. Das Protein oder Polypeptid kann einmal pro Woche über einen Zeitraum von etwa 1 bis 10 Wochen, vorzugsweise etwa 2 bis 8 Wochen, noch bevorzugter etwa 3 bis 7 Wochen, noch bevorzugter etwa 4, 5 oder 6 Wochen, verabreicht werden. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist klar, dass bestimmte Faktoren die Dosierung und zeitliche Steuerung beeinflussen können, die für eine wirksame Behandlung eines Individuums erforderlich sind, einschließlich, nicht jedoch darauf beschränkt, der Schwere der Krankheit oder des Leidens, vorangegangener Behandlungen, des allgemeinen Gesundheitszustands und/oder des Alters des Individuums und anderer krankheitsbezogener Aspekte. Außerdem kann die Behandlung eines Individuums mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Proteins, Polypeptids oder Antikörpers eine einzige Behandlung oder vorzugsweise eine Reihe von Behandlungen umfassen.
In Bezug auf Antikörper liegt die bevorzugte Dosierung bei 0,1 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht (im Allgemeinen 10 bis 20 Milligramm pro Kilogramm). Wenn der Antikörper im Gehirn wirken soll, ist üblicherweise eine Dosierung von 50 bis 100 Milligramm pro Kilogramm geeignet. Im Allgemeinen weisen teilweise menschliche Antikörper und vollkommen menschliche Antikörper eine längere Halbwertszeit im menschlichen Körper auf als andere Antikörper. Demgemäß sind häufig niedrigere Dosierungen und weniger häufige Verabreichungen möglich. Modifikationen, wie z.B. eine Lipidierung, können verwendet werden, um Antikörper zu stabilisieren und die Aufnahme und Gewebepenetration (z.B. in das Gehirn) zu steigern. Ein Verfahren zur Lipidierung von Antikörpern wird von Cruikshank et al. (J. AIDS Hum. Retrovir. 14, 193 (1997)) beschrieben.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Mittel, die Expression oder Aktivität modulieren. Solch ein Mittel kann beispielsweise ein kleines Molekül sein. Solche kleine Moleküle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Peptide, Peptidomimetika (z.B. Peptoide), Aminosäuren, Aminosäureanaloga, Polynucleotide, Polynucleotidanaloga, Nucleotide, Nucleotidanaloga, organische oder anorganische Verbindungen (d.h. einschließlich heteroorganischer und organometallischer Verbindungen) mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 10.000 Gramm pro Mol, organische oder anor ganische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 5.000 Gramm pro Mol, organische oder anorganische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 1.000 Gramm pro Mol, organische oder anorganische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 500 Gramm pro Mol sowie Salze, Ester und andere pharmazeutisch annehmbare Formen solcher Verbindungen.
Beispiele für Dosen umfassen Milligramm- oder Mikrogrammmengen des kleinen Moleküls pro Kilogramm Körper- oder Probengewicht (z.B. etwa 1 Mikrogramm pro Kilogramm bis etwa 500 Milligramm pro Kilogramm, etwa 100 Mikrogramm pro Kilogramm bis etwa 5 Milligramm pro Kilogramm oder etwa 1 Mikrogramm pro Kilogramm bis etwa 50 Mikrogramm pro Kilogramm). Weiters versteht sich, dass geeignete Dosen eines kleinen Moleküls von der Wirkung des kleinen Moleküls auf die zu modulierende Expression oder Aktivität abhängen. Wenn eines oder mehrerer dieser kleinen Moleküle einem Tier (z.B. einem Menschen) verabreicht werden sollen, um die Expression oder Aktivität eines Polypeptids oder einer Nucleinsäure der Erfindung zu modulieren, kann der Arzt, Veterinär oder Forscher beispielsweise zu Beginn eine sehr niedrige Dosis verschreiben, und die Dosis dann erhöhen, bis eine geeignete Reaktion erzielt wird. Außerdem versteht sich, dass die für ein jeweiliges Tier spezifische Dosis von verschiedenen Faktoren, einschließlich der Aktivität der jeweiligen Verbindung, des Alters, des Körpergewichts, des allgemeinen Gesundheitszustands, des Geschlechts und der Ernährung des Individuums sowie der Dauer der Verabreichung, des Verabreichungswegs, der Ausscheidungsgeschwindigkeit, der Kombination mit anderen Arzneimitteln und des Modulationsgrads der Expression oder Aktivität abhängt.
Ein Antikörper (oder Fragment davon) kann an eine therapeutische Gruppierung, wie z.B. ein Zytotoxin, ein Therapeutikum oder ein radioaktives Metallion konjugiert werden. Ein Zytotoxin oder ein zytotoxisches Mittel umfasst jegliche Mittel, die schädlich für Zellen sind. Beispiele umfassen Taxol, Cytochalasin B, Gramicidin D, Ethidiumbromid, Emetin, Mitomycin, Etoposid, Tenoposid, Vincristin, Vinblastin, Colchicin, Doxorubicin, Daunorubicin, Dihydroxyanthracindion, Mitoxantron, Methramycin, Actino mycin D, 1-Dehydrotestosteron, Glucocorticoide, Procain, Tetracain, Lidocain, Propanolol und Puromycin und Analoga oder Homologe davon. Therapeutika umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Antimetabolite (z.B. Methotrexat, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin, Cytarabin, 5-Fluoruracildecarbazin), Alkylierungsmittel (z.B. Mechlorethamin, Thioepachlorambucil, Melphalan, Carmustin (BSNU) und Lomustin (CCNU), Cyclothosphamid, Busulfan, Dibrommannit, Streptozotocin, Mitomycin C und cis-Dichlordiamin-platin-(II) (DDP; Cisplatin), Anthracycline (z.B. Daunorubicin (früher Daunomycin) und Doxorubicin), Antibiotika (z.B. Dactinomycin (früher Actinomycin), Bleomycin, Mithramycin und Anthramycin (AMC)) und Antimitotika (z.B. Vincristin und Vinblastin).
Die Konjugate der Erfindung können zur Modifikation einer vorgegebenen biologischen Reaktion eingesetzt werden, und die Arzneimittelgruppierung ist nicht auf klassische chemische Therapeutika beschränkt. Die Arzneimittelgruppierung kann beispielsweise ein Protein oder ein Polypeptid sein, das eine gewünschte biologische Aktivität aufweist. Solche Proteine können beispielsweise Toxine, wie z.B. Abrin, Ricin A, Gelonin, Pseudomonasexotoxin oder Diphtherietoxin; Proteine, wie z.B. Tumornekrosefaktoren, α-Interferon, β-Interferon, Nervenwachstumsfaktoren, Blutplättchenaktivierungsfaktoren, Gewebeplasminogenaktivatoren; oder Modifikatoren von biologischen Reaktionen, wie z.B. Lymphokine, Interleukine-1, -2 und -6, Granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierende Faktoren, Granulozytenkolonie-stimulierende Faktoren oder andere Wachstumsfaktoren umfassen.
Alternativ dazu kann ein Antikörper an einen zweiten Antikörper konjugiert sein, um ein Antikörper-Heterokonjugat zu bilden, wie es von Segal im US-Patent Nr. 4.676.980 beschrieben wurde.
Die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung können in Vektoren insertiert und als Gentherapievektoren eingesetzt werden. Gentherapievektoren können einem Individuum beispielsweise durch intravenöse Injektion, lokale Verabreichung (siehe US-Patent Nr. 5.328.470) oder stereotaktische Injektion (z.B. Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3054-3057 (1994)) verabreicht werden. Die pharmazeutische Zusammen setzung des Gentherapievektors kann den Gentherapievektor in einem annehmbaren Verdünner umfassen oder eine Retardmatrix aufweisen, in der das Genzufuhrvehikel eingebettet ist. Alternativ dazu kann, wenn der gesamte Genzufuhrvektor intakt aus rekombinanten Zellen hergestellt werden kann, z.B. bei retroviralen Vektoren, das pharmazeutische Präparat eine oder mehrere Zellen umfassen, die das Genzufuhrsystem produzieren.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einem Behälter, einer Verpackung oder einem Dispenser zusammen mit Anleitungen zur Verabreichung enthalten sein.
Behandlungsverfahren
Die vorliegende Erfindung stellt sowohl prophylaktische als auch therapeutische Verfahren zur Behandlung eines Individuums bereit, das gefährdet ist, an einem Leiden im Zusammenhang mit aberrierender oder unerwünschter 13245-Expression oder -Aktivität zu erkranken (bzw. dafür anfällig ist), oder an solch einer Krankheit leidet. Sowohl bei prophylaktischen als auch bei therapeutischen Behandlungsverfahren kann eine solche Behandlung basierend auf den Kenntnissen auf dem Gebiet der Pharmakogenomik spezifisch zugeschnitten oder modifiziert sein. "Pharmakogenomik" bezieht sich hierin auf die Anwendung von genomischen Verfahren, wie z.B. Gensequenzierung, statistischer Genetik und Genexpressionsanalysen auf die Analyse von Arzneimitteln in der klinischen Entwicklung und auf dem Markt. Genauer gesagt bezieht sich der Begriff auf die Untersuchung darüber, wie die Gene eines Patienten seine Reaktion auf ein Arzneimittel bestimmen (z.B. den "Arzneimittelreaktionstyp" oder "Arzneimittelreaktionsgenotyp" eines Patienten). Somit stellt ein anderer Aspekt der Erfindung Verfahren zum Maßschneidern der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung eines Individuums mit entweder den 13245-Molekülen der vorliegenden Erfindung oder 13245-Modulatoren auf den Arzneimittelreaktionsgenotyp des Individuums bereit. Die Pharmakogenomik erlaubt es dem Kliniker oder Arzt, prophylaktische oder therapeutische Behandlungen auf Patienten auszurichten, die am meisten von der Behandlung profitieren, und die Behandlung von Patienten zu vermeiden, die an toxischen Nebenwirkungen der Arzneimittel leiden würden.
Behandlung ist als Anwendung oder Verabreichung eines Therapeutikums an einen Patienten oder als Anwendung oder Verabreichung eines Therapeutikums an isoliertes Gewebe oder eine Zelllinie von einem Patienten definiert, der an einer Krankheit, einem Symptom einer Krankheit oder einer Prädisposition für eine Krankheit leidet, und zwar mit dem Zweck, die Krankheit, die Symptome der Krankheit oder die Prädisposition für eine Krankheit zu kurieren, heilen, lindern, mildern, ändern, verbessern, mindern oder beeinflussen bzw. ihr abzuhelfen.
Therapeutika umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, kleine Moleküle, Peptide, Antikörper, Ribozyme und Antisense-Oligonucleotide.
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Vorbeugung gegen eine Krankheit oder ein Leiden in Zusammenhang mit aberrierender oder unerwünschter 13245-Expression oder -Aktivität in einem Individuum bereit, indem dem Individuum 13245 oder ein Mittel, das 13245-Expression oder zumindest eine 13245-Aktivität moduliert, verabreicht wird. Individuen, für die ein Risiko besteht, an einem Leiden zu erkranken, das durch aberrierende oder unerwünschte 13245-Expression oder -Aktivität verursacht wird oder zu dem diese beitragen, können beispielsweise durch einen beliebigen oder eine Kombination aus den hierin beschriebenen diagnostischen und prognostischen Tests identifiziert werden. Die Verabreichung eines prophylaktischen Mittel kann vor der Manifestation von Symptomen erfolgen, die charakteristisch für eine 13245-Abweichung sind, sodass eine Krankheit oder ein Leiden verhindert oder, alternativ dazu, ihr/sein Fortschreiten verzögert wird. Je nach Art der 13245-Abweichung kann beispielsweise ein 13245-Protein, 13245-Agonist oder 13245-Antagonsit zur Behandlung des Individuums verwendet werden. Das geeignete Mittel kann anhand von Screening-Tests, wie sie hierin beschrieben sind, bestimmt werden.
Es ist möglich, dass manche 13245-Leiden, zumindest teilweise, durch einen abnormalen Spiegel eines Genprodukts verursacht werden, oder durch die Gegenwart eines Genprodukts, das abnormale Aktivität aufweist. Somit würde die Verringerung des Spiegels und/oder der Aktivität solcher Genprodukte zu einer Linderung von Krankheitssymptomen führen.
Wie erläutert kann eine erfolgreiche Behandlung von 13245-Leiden durch Verfahren erfolgen, die dazu dienen, die Expression oder Aktivität von Zielgenprodukten zu hemmen. Beispielsweise können Verbindungen, z.B. ein Mittel, das durch einen oben beschriebenen Test identifiziert wurde und negative modulatorische Aktivität aufweist, gemäß der Erfindung eingesetzt werden, um Symptome von 13245-Leiden zu verhindern und/oder zu lindern. Solche Moleküle können Peptide, Phosphopeptide, kleine organische oder anorganische Moleküle oder Antikörper (einschließlich z.B. polyklonaler, monoklonaler, humanisierter, antiidiotypischer, chimärer oder einkettiger Antikörper sowie Fab, F(ab')₂ und Fab-Expressionsbibliothekfragmenten, scFV-Molekülen und epitopbindenden Fragmenten davon) umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Außerdem können auch Antisense- und Ribozym-Moleküle, welche die Expression des Zielgens hemmen, gemäß der Erfindung eingesetzt werden, um das Ausmaß der Zielgenexpression zu verringern, wodurch der Grad der Zielgenaktivität wirksam reduziert wird. Außerdem können Tripelhelix-Moleküle zur Verringerung der Zielgenaktivität eingesetzt werden. Antisense-, Ribozym- und Tripelhelix-Moleküle wurden zuvor erläutert.
Es ist möglich, dass der Einsatz von Antisense-, Ribozym- und Tripelhelix-Molekülen zur Verringerung oder Hemmung der Expression von mutierten Genen auch die Transkription (Tripelhelix) und/oder Translation (Antisense, Ribozym) von mRNA verringern oder hemmen kann, die durch normale Zielgenallele produziert wird, sodass die Konzentration des normalen Zielgenprodukts, das vorhanden ist, geringer sein kann, als dies für einen normalen Phänotyp erforderlich ist. In solchen Fällen können Nucleinsäuremoleküle, die für Genpolypeptide mit normaler Zielgenaktivität kodieren und diese exprimieren, mithilfe von gentherapeutischen Verfahren in Zellen eingeführt werden. Alternativ dazu kann es, wenn das Zielgen für ein extrazelluläres Protein kodiert, zu bevorzugen sein, gleichzeitig ein normales Zielgenprotein in die Zelle oder das Gewebe einzuführen, um den erforderlichen Grad an zellulärerer oder Gewebe-Zielgenaktivität aufrechtzuerhalten.
Ein weiteres Verfahren zur Verwendung von Nucleinsäuremolekülen bei der Behandlung einer oder Vorbeugung gegen eine Krankheit, die durch 13245-Expression charakterisiert ist, basiert auf der Verwendung von Aptamermolekülen, die für ein 13245-Protein spezifisch sind. Aptamere sind Nucleinsäuremoleküle mit einer Tertiärstruktur, die es ihnen erlaubt, spezifisch an Proteinliganden zu binden (z.B. Osborne et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1, 5-9 (1997); Patel, Curr. Opin. Chem. Biol., 1, 32-46 (1997)). Da Nucleinsäuremoleküle in vielen Fällen leichter in Zielzellen eingeführt werden können als therapeutische Proteinmoleküle, bieten Aptamere ein Verfahren, durch das 13245-Proteinaktivität spezifisch verringert werden kann, ohne dass Arzneimittel oder andere Moleküle eingeführt werden müssen, die pluripotente Wirkungen zeigen können.
Es können Antikörper erzeugt werden, die sowohl für ein Zielgenprodukt spezifisch sind als auch die Zielgenproduktaktivität verringern. Solche Antikörper können in manchen Fällen verabreicht werden, sodass negative modulatorische Verfahren zur Behandlung von 13245-Leiden geeignet sind.
In Fällen, in denen die Injektion eines 13245-Proteins oder -Epitops an ein Tier oder einen Menschen zur Stimulierung der Antikörperproduktion für das Individuum schädlich ist, kann durch den Einsatz von antiidiotypischen Antikörpern eine Immunantwort gegen 13245 erzeugt werden (z.B. Herlyn, Ann. Med. 31, 66-78 (1999); Bhattacharya-Chatterjee et al., Cancer Treat. Res. 94, 51-68 (1998)). Wenn ein antiidiotypischer Antikörper in ein Säugetier oder einen Menschen eingeführt wird, sollte dieser die Produktion von antiantiidiotypischen Antikörpern stimulieren, die für das 13245-Protein spezifisch sein sollten. Vakzinen, die gegen eine durch 13245-Expres sion gekennzeichnete Krankheit gerichtet sind, können ebenfalls auf diese Weise hergestellt werden.
In Fällen, in denen das Zielantigen intrazellulär ist und ganze Antikörper verwendet werden, kann eine Internalisierung von Antikörpern bevorzugt sein. Lipofectin oder Liposomen können eingesetzt werden, um den Antikörper oder ein Fragment der Fab-Region, das an das Zielantigen bindet, in Zellen einzuführen. Wenn Fragmente des Antikörpers eingesetzt werden, ist das kleinste hemmende Fragment bevorzugt, welches das Zielantigen bindet. Peptide mit einer Aminosäuresequenz, die der Fv-Region des Antikörpers entsprechen, können beispielsweise eingesetzt werden. Alternativ dazu können auch einkettige neutralisierende Antikörper, die an intrazelluläre Zielantigene binden, verabreicht werden. Solche einkettige Antikörper können beispielsweise durch Expression von Nucleotidsequenzen, die für einkettige Antikörper kodieren, innerhalb der Zielzellpopulation verabreicht werden (z.B. Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)).
Die identifizierten Verbindungen, die Zielgenexpression, -synthese und/oder -aktivität hemmen, können einem Patienten in therapeutisch wirksamen Dosen verabreicht werden, um 13245-Leiden zu verhindern, behandeln oder lindern. Eine therapeutisch wirksame Dosis entspricht jener Menge der Verbindung, die ausreicht, um eine Linderung der Symptome der Leiden zu erreichen.
Die Toxizität und therapeutische Wirksamkeit solcher Verbindungen können durch herkömmliche pharmazeutische Verfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden, beispielsweise solche zur Bestimmung der LD₅₀ (der für 50% der Population letalen Dosis) und der ED₅₀ (Dosis, die bei 50% der Population therapeutisch wirksam ist). Das Dosenverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Wirkungen ist die therapeutische Breite und kann als Verhältnis LD₅₀:ED₅₀ ausgedrückt werden. Verbindungen mit hohen therapeutischen Breiten sind bevorzugt. Verbindungen mit toxischen Nebenwirkungen können zwar verwendet werden, es sollte aber darauf geachtet werden, ein Zufuhrsystem zu konzipieren, das solche Verbin dungen auf die betroffene Gewebestelle ausrichtet, um mögliche Schäden an nichtinfizierten Zellen zu minimieren und so die Nebenwirkungen zu verringern.
Die aus den Zellkulturtests und Tieruntersuchungen erhaltenen Daten können zur Formulierung verschiedener Dosen zum Einsatz beim Menschen genutzt werden. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise im Bereich von Konzentrationen im Kreislauf, welche die ED₅₀ mit geringer oder keiner Toxizität umfassen. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs je nach verwendeter Dosierungsform und genutztem Verabreichungsweg variieren. Für jede im Verfahren der Erfindung eingesetzte Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfangs anhand von Zellkulturtests abgeschätzt werden. Eine Dosis kann dann in Tiermodellen formuliert werden, um einen Plasmakonzentrationsbereich im Kreislauf zu erhalten, der die IC₅₀ umfasst (d.h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Hemmung von Symptomen erreicht), die in einer Zellkultur bestimmt wurde. Solche Informationen können genutzt werden, um für Menschen nützliche Dosen genauer zu bestimmen. Plasmaspiegel können beispielsweise durch Hochleistungsflüssigchromatographie gemessen werden.
Ein weiteres Beispiel für die Bestimmung einer für ein Individuum wirksamen Dosis basiert auf der Möglichkeit, den Gehalt einer "freien" und "gebundenen" Verbindung im Serum des Testindividuums direkt zu testen. Für solche Tests können Antikörpermimetika und/oder "Biosensoren" eingesetzt werden, die durch molekulare Prägeverfahren erzeugt wurden. Die Verbindung, die zur Modulation von 13245-Aktivität in der Lage ist, wird als Matrize, oder "Prägemolekül", verwendet, um polymerisierbare Monomere vor ihrer Polymerisation mit katalytischen Reagenzien räumlich zu organisieren. Die nachfolgende Entfernung des geprägten Moleküls hinterlässt eine Polymermatrix, die ein wiederholtes "negatives Abbild" der Verbindung enthält und in der Lage ist, das Molekül unter biologischen Testbedingungen erneut selektiv zu binden. Detaillierte Erläuterungen dieses Verfahrens sind auf dem Gebiet der Erfindung vorhanden (Ansell et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7, 89-94 (1996); Shea, Trends Polymer Sci. 2, 166-173 (1994)). Solche "geprägten" Affinitätsmatrizen sind für Ligandenbindungstests geeignet, wodurch die immobilisierte monoklonale Antikörperkomponente durch eine passend geprägte Matrix ersetzt wird (z.B. durch eine in Vlatakis et al., Nature 361, 645-647 (1993) beschrieben Matrix). Durch den Einsatz von Isotopmarkierung kann die "freie" Konzentration einer Verbindung, welche die Expression oder Aktivität von 13245 moduliert, leicht überwacht und in IC₅₀-Berechnungen miteinbezogen werden.
Solche "geprägten" Affinitätsmatrizen können auch so konzipiert werden, dass sie fluoreszierende Gruppen enthalten, deren Photonenemissionseigenschaften sich bei lokaler und selektiver Bindung einer Zielverbindung messbar verändern. Diese Veränderungen können mithilfe von faseroptischen Vorrichtungen leicht in Echtzeit getestet werden, was wiederum eine rasche Optimierung der Dosis für ein Testindividuum, basierend auf seiner individuellen IC₅₀ ermöglicht. Ein rudimentäres Beispiel für solch eine "Biosensor" ist in Kriz et al. (Anal. Chem. 67, 2142-2144 (1995)) beschrieben.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Modulation der 13245-Expression oder -Aktivität für therapeutische Zwecke. Demgemäß umfasst das Modulationsverfahren in einem Ausführungsbeispiel das Kontaktieren einer Zelle mit 13245 oder einem Mittel, das eine oder mehrere der 13245-Proteinaktivitäten in Zusammenhang mit der Zelle moduliert. Ein Mittel, das 13245-Proteinaktivittä moduliert, kann ein hierin beschriebenes Mittel sein, wie z.B. eine Nucleinsäure oder ein Protein, ein natürlich vorkommendes Zielmolekül eines 13245-Proteins (z.B. ein 13245-Substrat oder -Rezeptor), ein 13245-Antikörper, ein 13245-Agonist oder -Antagonist, ein Peptidomimetikum eines 13245-Agonisten oder -Antagonisten oder ein anderes kleines Molekül.
In einer Ausführungsform stimuliert das Mittel eine der 13245-Aktivitäten. Beispiele für solche Stimulationsmittel umfassen ein aktives 13245-Protein und ein Nucleinsäuremolekül, das für 13245 kodiert. In einer weiteren Ausführungsform hemmt das Mittel eine oder mehrere 13245-Aktivitäten. Beispiele für solche Hemmstoffe umfassen Antisense-13245-Nucleinsäuremoleküle, Anti-13245-Antikörper und 13245-Inhibitoren. Diese Modulationsverfahren können in vitro (z.B. durch Kultivieren der Zelle mit dem Mittel) oder alternativ dazu in vivo (z.B. durch Verabreichung des Mittel an ein Individuum) durchgeführt werden. Somit stellt die Erfindung Verfahren zur Behandlung eines Individuums bereit, das von einer Erkrankung oder einem Leiden betroffen ist, die/das durch aberrierende oder unerwünschte Expression oder Aktivität eines 13245-Proteins oder -Nucleinsäuremoleküls gekennzeichnet ist. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung eines Mittels (z.B. eines durch ein hierin beschriebenes Screening-Verfahren identifizierten Mittels) oder einer Kombination von Mitteln, welche 13245-Expression oder -Aktivität modulieren (z.B. hochregulieren oder herabregulieren). In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung eines 13245-Proteins oder -Nucleinsäuremoleküls als Therapie, um verringerte, aberrierende oder unerwünschte 13245-Expression oder -Aktivität zu kompensieren.
Die Stimulierung einer 13245-Aktivität ist in Fällen wünschenswert, in denen 13245 abnormal herabreguliert wird und/oder in denen eine erhöhte 13245-Aktivität wahrscheinlich positive Wirkung hat. Beispielsweise ist die Stimulierung einer 13245-Aktivität in Fällen wünschenswert, in denen 13245 abnormal herabreguliert wird und/oder in denen eine erhöhte 13245-Aktivität wahrscheinlich positive Wirkung hat. Auf ähnliche Weise ist die Stimulierung einer 13245-Aktivität ist in Fällen wünschenswert, in denen 13245 abnormal hochreguliert wird und/oder in denen eine verringerte 13245-Aktivität wahrscheinlich positive Wirkung hat.
Pharmakogenomik
Die 13245-Moleküle der vorliegenden Erfindung sowie Mittel oder Modulatoren, die eine stimulierende oder hemmende Wirkung auf eine 13245-Aktivität (z.B. 13245-Genexpression) haben, wie durch einen hierin beschriebenen Screening-Test identifiziert wurde, können an Individuen verabreicht werden, um 13245-assoziierte Leiden in Zusammenhang mit aberrierender oder unerwünschter 13245-Aktivität (prophylaktisch oder therapeutisch) zu behandeln (z.B. Leiden in Zusammenhang mit Tumorgenese oder der Induktion einer geeigneten Immunantwort). In Zusammenhang mit solch einer Behandlung kann die Pharmakogenomik (d.h. die Untersuchung der Be ziehung zwischen dem Genotyp eines Individuums und seiner Reaktion auf eine Fremdverbindung oder ein Arzneimittel) berücksichtigt werden. Unterschiede im Metabolismus in Bezug auf Therapeutika können zu starker Toxizität oder therapeutischem Versagen führen, wenn die Beziehung zwischen Dosis und der Konzentration des pharmakologisch aktiven Arzneimittels im Blut nicht verändert wird. Somit kann ein Arzt oder Kliniker in Betracht ziehen, in relevanten pharmakogenomischen Studien gewonnene Erkenntnisse heranziehen, um zu bestimmen, ob ein 13245-Molekül oder ein 13245-Modulator verabreicht werden soll, sowie zur Anpassung der Dosierung und/oder des Therapieschemas der Behandlung mit einem 13245-Molekül oder 13245-Modulator.
Die Pharmakogenomik beschäftigt sich mit klinisch signifikanten erblichen Variationen in der Reaktion auf Arzneimittel aufgrund von verändertem Arzneimittelabbau und abnormaler Wirkungen in betroffenen Personen (z.B. Eichelbaum et al., Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23, 983-985 (1996); Linder et al., Clin. Chem. 43, 254-266 (1997)). Im Allgemeinen können zwei Arten von pharmakogenetischen Erkrankungen unterschieden werden. Genetische Erkrankungen, die als Einzelfaktor weitergegeben werden und die Weise ändern, wie Arzneimittel auf den Körper wirken (veränderte Arzneimittelwirkung), oder genetische Erkrankungen, die als Einzelfaktor weitergegeben werden und die Art und Weise ändern, wie der Körper auf Arzneimittel reagiert (veränderter Arzneimittelstoffwechsel). Diese pharmakogenetischen Erkrankungen können entweder als seltene genetische Defekte oder als natürlich vorkommenden Polymorphismen auftreten. Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase- (G6PD-) Defizienz ist beispielsweise eine häufig vererbte Enzymopathie, deren wichtigste klinische Komplikation eine Hämolyse nach der Einnahme von oxidierenden Arzneimitteln (z.B. Malariamittel, Sulfonamide, Analgetika, Nitrofurane) und dem Konsum von Ackerbohnen darstellt.
Ein pharmakogenomischer Ansatz zur Identifikation von Genen, welche die Reaktion auf ein Arzneimittel vorhersagen, bekannt als "genomweite Assoziation", beruht hauptsächlich auf einer hochaufgelösten Karte des menschlichen Genoms aus schon bekannten genbezogenen Markern (z.B. eine "biallelische" Genmarkerkarte, die aus 60.000-100.000 polymorphen oder variablen Stellen auf dem menschlichen Genom besteht, von denen jedes zwei Varianten aufweist). Solch eine hochaufgelöste genetische Karte kann mit den Genomkarte einer statistisch signifikanten Anzahl an Patienten verglichen werden, die an einer Phase-II/III-Arzneimittelprüfung zur Identifikation von Markern teilnehmen, die mit einer bestimmten beobachteten Arzneimittelreaktion oder Nebenwirkung zusammenhängen. Alternativ dazu kann solch eine hochaufgelöste Karte aus einer Kombination von etwa 10 Millionen bekannten Einzelnucleotidaustauschen (single nucleotide polymorphism, SNP) im Humangenom erzeugt werden. "SNP" steht hierin für eine häufige Veränderung, die in einer einzelnen Nucleotidbase einer DNA-Kette stattfindet. Ein SNP kann beispielsweise einmal alle 100 Basen einer DNA auftreten. Und eine SNP kann an einem Krankheitsprozess beteiligt sein, obwohl der Großteil nicht mit einer Krankheit in Verbindung stehen kann. Ausgehend von einer genetischen Karte, die auf der Häufigkeit von NSPs basiert, können Individuen je nach dem SNP-Muster in einem Genom in genetische Kategorien eingeteilt werden. Auf diese Weise können Behandlungsschemata für Gruppen aus genetisch ähnlichen Individuen maßgeschneidert werden, wobei Merkmale berücksichtigt werden, die bei solch genetisch ähnlichen Individuen häufig auftreten.
Alternativ dazu kann zur Identifikation von Genen, die eine Reaktion auf ein Arzneimittel voraussagen, ein Verfahren eingesetzt werden, das als "Kandidatengenansatz" bezeichnet wird. Gemäß diesem Verfahren können, wenn ein für das Arzneimittelziel kodierendes Gen (z.B. ein 14245-Protein der vorliegenden Erfindung) bekannt ist, alle häufigen Varianten dieses Gens relativ leicht in der Population identifiziert werden, und es kann bestimmt werden, ob das Vorhandensein einer Version des Gens eher mit einer bestimmten Reaktion auf ein Arzneimittel zusammenhängt als das einer anderen Version.
Alternativ dazu kann zur Identifikation von Genen, die eine Reaktion auf ein Arzneimittel voraussagen, ein Verfahren eingesetzt werden, das als "Genexpressionsprofiling" bezeichnet wird. Die Genexpression eines Tiers, dem eine Dosis eines Arzneimittels (z.B. eines 13245-Moleküls oder eines 13245-Modulators der vorliegenden Erfindung) verabreicht wurde, kann beispielsweise anzeigen, ob mit einer Toxizität zusammenhängende Genwege aktiviert wurden.
Informationen, die aus mehr als einem der oben genannten pharmakogenomischen Ansätze gewonnen wurden, können zur Bestimmung geeigneter Dosen und Behandlungsschemata zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung eines Individuums eingesetzt werden. Dieses Wissen kann, wenn es auf die Dosierung oder Auswahl des Arzneimittels angewandt wird, Nebenreaktionen oder therapeutisches Versagen verhindern und so die therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit bei der Behandlung eines Individuums mit einem 13245-Molekül oder 13245-Modulator, wie z.B. einem durch einen der hierin beschriebenen exemplarischen Screening-Tests identifizierten Modulator, erhöhen.
Die vorliegende Erfindung stellt weiters Verfahren zur Identifikation von neuen Mittel oder Kombinationen bereit, die auf der Identifikation von Mitteln basieren, welche die Aktivität eines oder mehrerer Genprodukte modulieren, für die eines oder mehrere der 13245-Gene der vorliegenden Erfindung kodieren, worin diese Produkte mit der Resistenz der Zellen gegenüber einem Therapeutikum in Verbindung gesetzt werden können. Genauer gesagt kann die Aktivität der Proteine, für welche die 13245-Gene der vorliegenden Erfindung kodieren, als Basis für die Identifikation von Mitteln zur Überwindung der Wirkstoffresistenz genutzt werden. Indem die Aktivität eines oder mehrerer der Resistenzproteine blockiert wird, werden Zielzellen, z.B. Zellen des Immunsystems, empfindlich für eine Behandlung mit einem Mittel, gegen das die unmodifizierten Zielzellen resistent waren.
Die Überwachung des Einflusses von Mitteln (z.B. Arzneimittel) auf die Expression oder Aktivität eines 13245-Proteins kann in klinischen Tests genutzt werden. Die Wirksamkeit eines durch einen hierin beschriebenen Screening-Tests bestimmten Mittel bei der Steigerung der 13245-Expression, der Proteinwerte oder der Hochregulierung der 13245-Aktivität kann in klinischen Studien an Individuen überwacht werden, die verringerte 13245-Genexpresison, Proteinwerte oder herabregulierte 13245-Aktivität aufweisen. Alternativ dazu kann die Wirksamkeit eines durch einen Scree ning-Test bestimmten Mittels bei der Verringerung der 13245-Expression, Proteinspiegel oder Herabregulierung der 13245-Aktivität in klinischen Studien an Individuen überwacht werden, die erhöhte 13245-Genexpresison, Proteinspiegel oder hochregulierte 13245-Aktivität aufweisen. In solchen klinischen Studien können die Expression oder Aktivität eines 13245-Gens und vorzugsweise auch anderer Gene, die beispielsweise von einem 13245-assoziierten Leiden betroffen sind als "Anzeige" oder Marker des Phänotyps einer bestimmten Zelle genutzt werden.
Weitere Ausführungsformen
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Analyse mehrerer Fangsonden. Das Verfahren kann beispielsweise zur Analyse von Genexpression eingesetzt werden. Das Verfahren umfasst: das Bereitstellen eines zweidimensionalen Arrays mit mehreren Adressen, wobei diese Adressen alle aufgrund ihrer Position voneinander unterscheidbar sind, und worin jede dieser Adressen ein einzigartige Fangsonde aufweist, z.B. eine Nucleinsäure- oder Peptidsequenz; das Kontaktieren des Arrays mit einer, vorzugsweise gereinigten, 13245-Nucleinsäure, einem, vorzugsweise gereinigten 13245-Polypeptid, einem, vorzugsweise gereinigten, Antikörper und dadurch das Beurteilen der Menge an Fangsonden. Bindung, im Falle einer Nucleinsäure beispielsweise die Hybridisierung an eine Fangsonde an einer dieser zahlreichen Adressen, wird detektiert, beispielsweise durch ein Signal, das durch eine an die 13245-Nucleinsäure, das 13245-Polypeptid oder den 13245-Antikörper gebundene Markierung erzeugt wird.
Die Fangsonden können eine Gruppe von Nucleinsäuren von einer ausgewählten Probe, z.B. einer Nucleinsäureprobe von Vergleichs- oder nichtstimulierten Geweben oder Zellen, sein.
Das Verfahren kann das Kontaktieren der 13245-Nucleinsäure, des 13245-Polypeptids oder des 13245-Antikörpers mit einem ersten Array mit zahlreichen Fangsonden und einem zweiten mit einer anderen großen Anzahl an Fangsonden umfassen. Die Ergebnisse der Hybridisierung können verglichen werden, beispielsweise um Unter schiede in der Expression zwischen einer ersten und einer zweiten Probe zu analysieren. Die erste Gruppe der Fangsonden kann von einer Vergleichsprobe stammen, beispielsweise einer Wildtyp-, normalen oder nicht erkrankten, nicht stimulierten Probe, z.B. einer biologischen Flüssigkeit, von Gewebe oder einer Zellprobe. Die zweite Gruppe von Fangsonden kann von einer Versuchsprobe stammen, beispielsweise einer mutierten, risikobelasteten, erkrankten oder stimulierten Probe, z.B. einer biologischen Flüssigkeit, von Gewebe oder einer Zellprobe.
Die zahlreichen Fangsonden können eine Reihe von Nucleinsäuresonden sein, von denen jede spezifisch an ein Allel von 13245 hybridisiert. Solche Verfahren können eingesetzt werden, um eine Diagnose an einem Individuum durchzuführen, beispielsweise um das Risiko für eine Erkrankung oder ein Leiden zu beurteilen, die Eignung einer ausgewählten Behandlungsform für ein Individuum zu beurteilen oder um zu beurteilen, ob ein Individuum von einer Erkrankung oder einem Leiden betroffen ist. 13245 steht in Verbindung mit Proteinphosphorylierung und ist somit zweckdienlich zur Beurteilung von Leiden in Zusammenhang mit aberrierender Proteinphosphorylierung, wie z.B. Tumorgenese und unangemessener Zellsignalgebung.
Das Verfahren kann verwendet werden, um SNPs zu detektieren, wie oben beschrieben wurde.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Analyse mehrerer Sonden. Das Verfahren ist beispielsweise zur Analyse von Genexpression geeignet. Dieses Verfahren umfasst: das Bereitstellen eines zweidimensionalen Arrays mit mehreren Adressen, wobei jede dieser Adressen aufgrund ihrer Position von jeder anderen dieser zahlreichen Adressen mit einer einzigartigen Fangsonde unterscheidbar ist, worin die Fangsonden z.B. von einer Zelle oder einem Individuum stammen, die 13245 exprimieren, oder von einer Zelle oder einem Individuum, worin eine 13245-vermittelte Reaktion aufgetreten ist, z.B. durch Kontakt der Zelle mit 13245-Nucleinsäure oder -Proteinen oder Verabreichung von 13245-Nucleinsäure oder Proteinen an die Zelle oder das Individuum; das Kontaktieren des Arrays mit einer oder mehreren Abfragesonden, worin eine Abfragesonde eine Nucleinsäure, ein Polypep tid oder ein Antikörper sein kann (die vorzugsweise keine 13245-Nucleinsäuren-, -Polypeptide oder -Antikörper sind); das Bereitstellen eines zweidimensionalen Arrays mit zahlreichen Adressen, wobei diese Adressen alle aufgrund ihrer Position voneinander unterscheidbar sind, und worin jede dieser Adressen ein einzigartige Fangsonde aufweist, worin die Fangsonden z.B. von einer Zelle oder einem Individuum stammen, die 13245 nicht exprimieren (oder nicht so stark exprimieren wie im Falle von zahlreichen 13245-positiven Fangsonden) oder von einer Zelle oder einem Individuum, worin keine 13245-vermittelte Reaktion aufgetreten ist (oder in geringerem Ausmaß aufgetreten ist als in der ersten Probe); das Kontaktieren des Arrays mit einer oder mehreren Abfragesonden (die vorzugsweise keine 13245-Nucleinsäuren, -Polypeptide oder -Antikörper sind) und dadurch das Beurteilen der Menge an Fangsonden. Bindung, in Falle einer Nucleinsäure beispielsweise die Hybridisierung an eine Fangsonde an einer dieser zahlreichen Adressen, wird detektiert, beispielsweise durch ein Signal, das durch eine an die Nucleinsäure, das Polypeptid oder den Antikörper gebundene Markierung erzeugt wird.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Analyse mehrerer Sonden oder Proben. Dieses Verfahren ist beispielsweise zur Analyse von Genexpression geeignet. Dieses Verfahren umfasst: das Bereitstellen eines zweidimensionalen Arrays mit mehreren Adressen, wobei jede dieser Adressen aufgrund ihrer Position von jeder anderen dieser zahlreichen Adressen mit einer einzigartigen Fangsonde unterscheidbar ist; das Kontaktieren des Arrays mit einer ersten Probe von einer Zelle oder einem Individuum, die 13245 exprimieren oder mangelhaft exprimieren, oder von einer Zelle oder einem Individuum, worin eine 13245-vermittelte Reaktion aufgetreten ist, z.B. durch Kontakt der Zelle mit 13245-Nucleinsäure oder einem 13245-Protein oder durch Verabreichung einer 13245-Nucleinsäure oder eines 13245-Proteins an die Zelle oder das Individuum; das Bereitstellen eines zweidimensionalen Arrays mit mehreren Adressen, wobei jede dieser Adressen aufgrund ihrer Position von jeder anderen dieser zahlreichen Adressen mit einer einzigartigen Fangsonde unterscheidbar ist; und das Kontaktieren des Arrays mit einer zweiten Probe von einer Zelle oder einem Individuum, die 13245 nicht exprimieren (oder nicht so stark exprimieren wie im Falle von zahlreichen 13245-positiven Fangsonden), oder von einer Zelle oder einem Individuum, worin keine 13245-vermittelte Reaktion aufgetreten ist (oder in geringerem Maße aufgetreten ist als in der ersten Probe), und das Vergleichen der Bindung der ersten Probe mit der Bindung der zweiten Probe. Bindung, in Falle einer Nucleinsäure beispielsweise die Hybridisierung an eine Fangsonde an einer dieser zahlreichen Adressen, wird detektiert, beispielsweise durch ein Signal, das durch eine an die Nucleinsäure, das Polypeptid oder den Antikörper gebundene Markierung erzeugt wird. Für die beiden Proben das gleiche Array verwendet, oder es können unterschiedliche Arrays verwendet werden. Wenn unterschiedliche Arrays eingesetzt werden, sollten die zahlreichen Adressen mit Fangsonden auf beiden Arrays vorhanden sein.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Analyse von 13245, z.B. zur Analyse der Struktur, Funktion oder Verwandtschaft mit anderen Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenzen. Dieses Verfahren umfasst: das Bereitstellen einer 13245-Nucleinsäure- oder -Aminosäuresequenz, z.B. einer Nucleotidsequenz von 13245 oder eines Teils davon; das Vergleichen der 13245-Sequenz mit einer oder mehreren, vorzugsweise zahlreichen Sequenzen aus einer Sequenzsammlung, z.B. einer Nucleinsäure- oder Proteinsequenz-Datenbank; um so 13245 zu analysieren.
Das Verfahren kann das Beurteilen der Sequenzidentität zwischen einer 13245-Sequenz und einer Sequenz aus der Datenbank umfassen. Durchgeführt kann das Verfahren durch Zugreifen auf die Datenbank an einem zweiten Ort, z.B. über das Internet, werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Gruppe von Oligonucleotiden, die z.B. für die Identifikation von SNPs oder die Identifikation von spezifischen Allelen von 13245 zweckdienlich sind. Die Gruppe umfasst zahlreiche Oligonucleotide, von denen jedes ein anderes Nucleotid an einer Abfrageposition, z.B. einem NSP oder an einer Mutationsstelle, aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die zahlreichen Oligonucleotide in ihrer Sequenz identisch miteinander (mit Ausnahme der Länge). Die Oligonucleotide können mit unterschiedlichen Markierungen verse hen sein, sodass ein Oligonucleotid, das an ein Allel hybridisiert, ein Signal liefert, das es von einem Oligonucleotid unterscheidet, das an ein zweites Allel hybridisiert.
Die Sequenz von 13245-Molekülen wird in verschiedenen Medien bereitgestellt, um ihre Nutzung zu vereinfachen. Eine Sequenz kann als Produkt bereitgestellt sein, und nicht als isoliertes Nucleinsäure- oder Aminosäuremolekül, das ein 13245 enthält. Solch ein Produkt kann eine Nucleotid- oder Aminosäuresequenz bereitstellen, beispielsweise ein offenes Leseraster, und zwar in einer Form, welche die Untersuchung des Produkts anhand von Mitteln erlaubt, die nicht direkt für die Untersuchung der Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen oder einer Untergruppe davon, wie sie in der Natur vorkommen oder in gereinigter Form, anwendbar sind.
Eine 13245-Nucleotid- oder -Aminosäuresequenz kann auf computerlesbaren Medien aufgezeichnet sein. "Computerlesbare Medien" bezieht sich hierin auf jedes Medium, das von einem Computer gelesen werden kann und auf das dieser direkt zugreifen kann. Solche Medien umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Magnetspeichermedien, wie z.B. Floppydisks, Festplattenspeichermedien und Magnetbänder; optische Speichermedien, wie z.B. CD-ROM; elektrische Speichermedien, wie z.B. RAM und ROM; und Mischbauarten dieser Kategorien, wie z.B. magnetisch/optische Speichermedien.
Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung stehen zahlreiche Datenspeicherstrukturen zur Verfügung, um ein computerlesbares Medium zu erzeugen, auf dem eine Nucleotid- oder Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung aufgezeichnet ist. Die Wahl der Datenspeicherstruktur hängt im Allgemeinen davon ab, wie auf die gespeicherten Informationen zugegriffen werden soll. Außerdem können unterschiedliche Datenverarbeitungsprogramme und -formate verwendet werden, um die Nucleotidsequenzinformationen der vorliegenden Erfindung auf einem computerlesbaren Medium zu speichern. Die Sequenzinformationen können in einer Textdatei eines Textverarbeitungsprogramms dargestellt sein, in einer handelsüblichen Software wie WordPerfect^TM und Microsoft Word^TM formatiert sein oder in Form einer ASCII-Datei vorliegen, die einer Datenbank wie DB2, Sybase^TM, Oracle^TM gespeichert ist, oder dergleichen.
Fachleute können Datenverarbeitungsformate (z.B. Textdateien oder Datenbanken) leicht anpassen, um computerlesbare Medien zu erhalten, auf denen die Nucleotidsequenzinformationen der vorliegenden Erfindung gespeichert sind.
Durch die Bereitstellung der Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen der Erfindung in computerlesbarer Form können Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung leicht für verschiedene Zwecke auf die Sequenzinformationen zugreifen. Beispielsweise können Fachleute die in computerlesbarer Form bereitgestellten Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen der Erfindung dazu verwenden, um eine Zielsequenz oder ein Zielstrukturmotiv mit den auf dem Datenspeichermedium bereitgestellten Sequenzinformationen zu vergleichen. Es kann beispielsweise eine Suche durchgeführt werden, um Fragmente oder Regionen der Sequenzen der Erfindung zu identifizieren, die mit einer bestimmte Zielsequenz oder einem bestimmten Zielmotiv übereinstimmen.
Eine "Zielsequenz" kann hierin jede beliebige DNA oder Aminosäuresequenz aus sechs oder mehr Nucleotiden oder zwei oder mehr Aminosäuren sein. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung wissen, dass, je länger die Zielsequenz ist, desto geringer die Wahrscheinlichkeit ist, dass eine Zielsequenz zufällig in der Datenbank enthalten ist. Typische Sequenzlängen einer Zielsequenz sind etwa 10 bis 100 Aminosäuren oder etwa 30 bis 300 Nucleotidreste. Es ist jedoch allgemein bekannt, dass kommerziell wichtige Fragmente, wie z.B. Sequenzfragmente, die an der Genexpression und Proteinreifung beteiligt sind, kürzer sein können.
Es gibt öffentlich zugängliche Computer-Software, mit der Fachleute auf Sequenzinformationen zugreifen können, die auf einem computerlesbaren Medium bereitgestellt sein, um Analysen und Vergleiche mit anderen Sequenzen vorzunehmen. Verschiedene Algorithmen sind allgemein bekannt, und verschiedene im Handel erhältliche Software-Produkte zur Durchführung von Suchen stehen zur Verfügung und können in den computerbasierten Systemen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Beispiele für eine solche Software umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf MacPattern (EMBL), BLASTN und BLASTX (NCBIA).
Somit betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Bereitstellung eines computerlesbaren Datensatzes einer 13245-Sequenz, welches das Speichern der Sequenz auf einer computerlesbaren Matrix umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Datensatz eines oder mehrere der Folgenden: Identifikation eines offenen Leserasters; Identifikation einer Domäne, Region oder Stelle; Identifikation der Startstelle der Transkription; Identifikation des Transkriptionsterminators; die Vollängen-Aminosäuresequenz des Proteins oder einer reifen Form davon; das 5'-Ende der translatierten Region; oder die 5'- und/oder 3'-regulatorische Region.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Analyse einer Sequenz. Dieses Verfahren umfasst: das Bereitstellen einer 13245-Sequenz oder eines Datensatzes davon in computerlesbarer Form; das Vergleichen einer zweiten Sequenz mit der Sequenz des bezeichneten Gens; wodurch die Sequenz analysiert wird. Der Vergleich kann das Vergleichen mit Sequenzen auf Sequenzidentität oder das Bestimmen umfassen, ob eine Sequenz in der anderen enthalten ist, beispielsweise das Bestimmen, ob die 13245-Sequenz eine Vergleichssequenz enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die 13245- oder die zweite Sequenz auf einem ersten Computer gespeichert, beispielsweise an einem ersten Ort, und der Vergleich wird auf einem zweiten Computer durchgeführt, abgelesen oder gespeichert, z.B. an einem zweiten Ort. Die 13245- oder zweite Sequenz kann beispielsweise in einer öffentlichen oder privaten Datenbank auf einem Computer gespeichert sein, und der Vergleich kann auf einem zweiten Computer durchgeführt werden und die Ergebnisse des Vergleichs auf diesem zweiten Computer abgelesen oder gespeichert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Datensatz eines oder mehrere der Folgenden: die Identifikation eines ORF; die Identifikation einer Domäne, Region oder Stelle; die Identifikation des Transkriptionsterminators; die Vollängen-Aminosäuresequenz des Proteins oder einer reifen Form davon; das 5'-Ende der translatierten Region; oder die 5'- und/oder 3'-regulatorische Region.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher veranschaulicht, die nicht als Einschränkung zu verstehen sind. Der Inhalt aller Literaturverweise, Pa tente und veröffentlichten Patentanmeldungen, die in dieser Anmeldung angeführt wurden, ist durch Verweis hierin aufgenommen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Identifikation und Charakterisierung von menschlicher 13245-cDNA
Die menschliche 13245-Nucleotidsequenz (1; Seq.-ID Nr. 1), die etwa 6575 Nucleotide lang ist und nichttranslatierte Regionen umfasst, enthält eine vorhergesagte methionininitiierte Kodierungssequenz an etwa den Nucleotidresten 19-6178. Die kodierende Sequenz kodiert für ein Protein aus 2053 Aminosäuren (Seq.-ID Nr. 2).
Beispiel 2
Gewebeverteilung von 13245-mRNA
Northern-Blot-Hybridisierungen mit verschiedenen RNA-Proben können unter Standardbedingungen durchgeführt und unter stringenten Bedingungen gewaschen werden, d.h. 0,2 × SSC bei 65°C. Eine DNA-Sonde, die der gesamten oder einem Teil der 13245-cDNA (Seq.-ID Nr. 1) entspricht, kann dabei eingesetzt werden. Die DNA kann beispielsweise mithilfe des Prime-It^TM Kits (Stratagene, La Jolla, CA, USA) gemäß den Anleitungen des Herstellers mit ³²P-dCTP radioaktiv markiert werden. Filter, die mRNA von hämatopoetischem und endokrinem Mausgewebe und Krebszelllinien (Clontech, Palo Alto, CA, USA) enthalten, können in einer ExpressHyb^TM-Hybridisierungslösung (Clontech) hybridisiert und unter hoher Stringenz gemäß den Empfehlungen des Herstellers gewaschen werden.
Beispiel 3
Rekombinante Expression von 13245 in Bakterienzellen
In diesem Beispiel wird 13245 als rekombinantes Glutation-S-Transferase- (GST-) Fusionspolypeptid in E. coli exprimiert, und das Fusionspolypeptid wird isoliert und charakterisiert. Genauer gesagt werden 13245-Nucleinsäuresequenzen an GST-Nucleinsäuresequenzen fusioniert, und dieses Fusionskonstrukt wird in E. coli, z.B. Stamm PEB199, exprimiert. Die Expression des GSDT-13245-Fusionskonstrukts in PEB199 wird mit IPTG induziert. Das rekombinante Fusionspolypeptid wird durch Affinitätschromatographie auf Glutathionkügelchen von rohen Bakterienlysaten des induzierten PEB199-Stamms gereinigt. Unter Einsatz von Polyacrylamidgelelektrophorese-Analyse des Polypeptids, das von den Bakterienlysaten gereinigt wurde, wird das Molekulargewicht des resultierenden Fusionspolypeptids bestimmt.
Beispiel 4
Expression eines rekombinanten 13245-Proteins in COS-Zellen
Um das 13245-Gen in COS-Zellen zu exprimieren, wird der Vektor pcDNA/Amp von der Invitrogen Corporation (San Diego, CA, USA) eingesetzt. Dieser Vektor enthält einen SV40-Replikationsstartpunkt, ein Ampicillinresistenzgen, einen E.-coli-Replikationsstartpunkt, einen CMV-Promotor gefolgt von einer Polylinkerregion und ein SV40-Intron und eine SV40-Polyadenylierungsstelle. Ein DNA-Fragment, welches für das gesamte 13245-Protein kodiert, mit einer HA-Markierung (Wilson et al., Cell 37, 767 (1984)) oder FLAG^®-Markierung, die in-frame an das 3'-Ende fusioniert ist, wird in die Polylinkerregion des Vektors kloniert, wodurch die Expression des rekombinanten Proteins unter Kontrolle des CMV-Promotors gestellt wird.
Um das Plasmid zu konstruieren, wird die 13245-DNA-Sequenz durch PCR unter Einsatz von zwei Primern amplifiziert. Der 5'-Primer enthält die Restriktionsstelle von Interesse, gefolgt von etwa zwanzig Nucleotiden der für 13245 kodierenden Sequenz, beginnend am Startcodon; die Sequenz am 3'-Ende enthält komplementäre Sequenzen zu anderen Restriktionsstellen von Interesse, ein Translationsstoppcodon, die HA-Markierung oder FLAG^®-Markierung und die letzten 20 Nucleotide der für 13245 kodierenden Sequenz. Das PCR-amplifizierte Fragment und der pcDNA/Amp-Vektor werden mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, und der Vektor wird mithilfe des CIAP-Enzyms (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) de phosphoryliert. Vorzugsweise sind die beiden gewählten Restriktionsstellen unterschiedlich, sodass das 13245-Gen in der gewünschten Orientierung insertiert wird. Das Ligationsgemisch wird in E.-coli-Zellen (die Stämme HB101, DH5alpha, SURE, erhältlich von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA können eingesetzt werden) transformiert, die transformierte Kultur wird auf einer Platte mit ampicillinhältigem Medium ausplattiert, und resistente Kolonien werden selektiert. Plasmid-DNA wird aus Transformanten isoliert und durch Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht.
COS-Zellen werden dann mit der 13245-pcDNA/Amp-Plasmid-DNA unter Anwendung des Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Kopräzipitationsverfahrens, von DEAE-Dextran-vermittelter Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation transfiziert. Andere geeignete Verfahren zur Transfektion von Wirtszellen finden sich bei Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA (1989)).
Die Expression des 13245-Polypeptids wird durch radioaktive Markierung (³⁵S-Methionin oder ³⁵S-Cystein, erhältlich von NEN, Boston, MA, USA, kann verwendet werden) und Immunfällung (Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA (1988)) unter Verwendung eines HA-spezifischen monoklonalen Antikörpers detektiert. Kurz gesagt werden die Zellen 8 h lang mit ³⁵S-Methionin (oder ³⁵S-Cystein) markiert. Dann wird das Kulturmedium gewonnen, und die Zellen werden unter Einsatz von Detergenzien (RIPA-Puffer, 150 mM NaCl, 1% NP-50, 0,1% SDS, 0,5% DOC, 50 mM Tris, pH 7,5) lysiert. Sowohl das Zelllysat als auch das Kulturmedium wird dann mit einem HA-spezifischen monoklonalen Antikörper gefällt. Ausgefällte Polypeptide werden anschließend durch SDS-PAGE analysiert.
Alternativ dazu kann DNA, welche die für 13245 kodierende Sequenz enthält, unter Verwendung der geeigneten Restriktionsstellen direkt in den Polylinker des pcDNA/Amp-Vektors kloniert werden. Das resultierende Plasmid wird dann wie oben beschrieben in COS-Zellen transfiziert, und die Expression des 13245-Polypeptids wird durch radioaktive Markierung und Immunfällung unter Einsatz eines 13245-spezifischen monoklonalen Antikörpers detektiert. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nucleinsäuremolekül, aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt: a) Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die zumindest zu 80% mit der Nucleotidsequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 3 identisch ist, worin das Nucleinsäuremolekül für ein Polypeptid mit Kinaseaktivität kodiert; b) Nucleinsäuremolekül, das ein Fragment aus zumindest 1.400 zusammenhängenden Nucleotiden der Nucleotidsequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 3 umfasst, worin das Nucleinsäuremolekül für ein Polypeptid mit Kinaseaktivität kodiert; c) Nucleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, welches die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 umfasst; d) Nucleinsäuremolekül, das für ein Fragment eines Polypeptids kodiert, welches die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 umfasst, worin das Fragment zumindest 1.000 zusammenhängende Aminosäuren der Seq.-ID Nr. 2 umfasst und Kinaseaktivität aufweist; und e) Nucleinsäuremolekül, das für eine natürlich vorkommende Allelvariante eines Polypeptids kodiert, welches die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 umfasst, worin das Nucleinsäuremolekül an ein Nucleinsäuremolekül hybridisiert, das eines aus Seq.-ID Nr. 1, Seq.-ID Nr. 3 umfasst, und ein Komplement davon, und zwar unter stringenten Bedingungen, und worin das Nucleinsäuremolekül für ein Polypeptid mit Kinaseaktivität kodiert.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt: a) Nucleinsäure, welche die Nucleotidsequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 3 umfasst; und b) Nucleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, welches die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 umfasst.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, weiters eine Vektor-Nucleinsäuresequenz umfassend.
Nucleinsäure Molekül nach Anspruch 1, weiters eine Nucleinsäuresequenz umfassend, die für ein heterologes Polypeptid kodiert.
Wirtszelle, das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 enthaltend.
Wirtszelle nach Anspruch 5, worin die Wirtszelle eine Säugetier-Wirtszelle ist.
Nichtmenschliche Säugetier-Wirtszelle, das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 enthaltend.
Isoliertes Polypeptid, aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt: a) Polypeptid, für das ein Nucleinsäuremolekül kodiert, welches eine Nucleinsäure umfasst, die zu zumindest 80% mit einer Nucleinsäure identisch ist, welche die Nucleotidsequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 3 umfasst, worin das Polypeptid Kinaseaktivität aufweist; b) natürlich vorkommende Allelvariante eines Polypeptids, welche die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 umfasst, worin für das Polypeptid ein Nucleinsäuremolekül kodiert, das an ein Nucleinsäuremolekül hybridisiert, welches eine aus Seq.-ID Nr. 1 und Seq.-ID Nr. 3 umfasst, und zwar unter stringenten Bedingungen, und worin das Polypeptid Kinaseaktivität aufweist; c) Fragment eines Polypeptids, das die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 umfasst, worin das Fragment zumindest 1.000 zusammenhängende Aminosäuren der Seq.-ID Nr. 2 umfasst und worin das Polypeptid Kinaseaktivität aufweist; und d) Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu zumindest 80 mit der Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 identisch ist, worin das Polypeptid Kinaseaktivität aufweist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 8, die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 umfassend.
Polypeptid nach Anspruch 8, weiters eine heterologe Aminosäuresequenz umfassend.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon, der selektiv an ein Polypeptid nach Anspruch 8 bindet.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach Anspruch 11, worin der Antikörper detektierbar markiert ist.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach Anspruch 12, worin die detektierbare Markierung aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: a) Enzyme; b) prosthetische Gruppen; c) fluoreszierende Materialien; d) lumineszierende Materialien; e) biolumineszierende Materialien; und f) radioaktive Materialien.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach Anspruch 11, worin der Antikörper aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: a) monoklonaler Antikörper; b) polyklonaler Antikörper; c) Fab-Fragment; d) F(ab')₂-Fragment; e) chimärer Antikörper; f) humanisierter Antikörper; und g) menschlicher Antikörper.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: a) Polypeptid, die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 umfassend; b) Polypeptid, ein Fragment der Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 umfassend, worin das Fragment zumindest 1.000 zusammenhängende Aminosäuren der Seq.-ID Nr. 2 umfasst und worin das Polypeptid Kinaseaktivität aufweist; c) natürlich vorkommende Allelvariante eines Polypeptids, welche die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 umfasst, worin für das Polypeptid ein Nucleinsäuremolekül kodiert, das an ein Nucleinsäuremolekül hybridisiert, das eine aus Seq.-ID Nr. 1 und Seq.-ID Nr. 3 umfasst, und zwar unter stringenten Bedingungen, und worin das Polypeptid Kinaseaktivität aufweist; d) Polypeptid, für das ein Nucleinsäuremolekül kodiert, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die zu zumindest 80% mit einer Nucleinsäure identisch ist, welche die Nucleotidsequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 3 umfasst, worin das Polypeptid Kinaseaktivität aufweist; und e) Polypeptid, eine Aminosäuresequenz umfassend, die zu zumindest 80 mit der Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 identisch ist, worin das Polypeptid Kinaseaktivität aufweist; wobei das Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 5 unter Bedingungen umfasst, unter denen das Nucleinsäuremolekül exprimiert wird.
Verfahren zur Detektion der Gegenwart eines Polypeptids nach Anspruch 8 in einer Probe, umfassend: a) das Kontaktieren der Probe mit einem Antikörper, der selektiv an ein Polypeptid nach Anspruch 8 bindet; und b) das Bestimmen, ob der Antikörper an das Polypeptid in der Probe bindet.
Set, umfassend einen Antikörper, der selektiv an ein Polypeptid nach Anspruch 8 bindet, und Gebrauchsanleitungen.
Verfahren zur Detektion der Gegenwart eines Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 in einer Probe, folgende Schritte umfassend: a) das Kontaktieren der Probe mit einer Nucleinsäuresonde oder einem Primer, die/der selektiv an das Nucleinsäuremolekül hybridisiert; und b) das Bestimmen, ob die Nucleinsäuresonde oder der Primer an das Nucleinsäuremolekül in der Probe bindet.
Verfahren nach Anspruch 18, worin die Probe mRNA-Moleküle umfasst und mit einer Nucleinsäuresonde kontaktiert wird.
Set, umfassend eine Nucleinsäuresonde oder einen Primer, die/der selektiv an ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 hybridisiert, und Gebrauchsanleitungen.
Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, die an ein Polypeptid nach Anspruch 8 bindet, folgende Schritte umfassend: a) das Kontaktieren eines Polypeptids oder einer Zelle, die ein Polypeptid nach Anspruch 8 exprimiert, mit einer Testverbindung; und b) das Bestimmen, ob das Polypeptid an die Testverbindung bindet.
Verfahren nach Anspruch 21, worin die Bindung der Testverbindung mit dem Polypeptid durch ein Verfahren detektiert wird, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: a) Detektion einer Bindung durch direkte Detektion einer Testverbindung/Polypeptid-Bindung; b) Detektion einer Bindung unter Einsatz eines Konkurrenzbindungstests; und c) Detektion einer Bindung unter Einsatz eines Tests für 13245-vermittelte Signaltransduktion.
In-vitro-Verfahren zur Modulation der Aktivität eines Polypeptids nach Anspruch 8, umfassend das Kontaktieren eines Polypeptids oder einer Zelle, die ein Polypeptid nach Anspruch 8 exprimiert, mit einem Antikörper, der an das Polypeptid bindet, in ausreichender Konzentration, um die Aktivität des Polypeptids zu modulieren.
Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, welche die Aktivität eines Polypeptids nach Anspruch 8 moduliert; umfassend: a) das Kontaktieren eines Polypeptids nach Anspruch 8 mit einer Testverbindung; und b) das Bestimmen der Wirkung der Testverbindung auf die Aktivität des Polypeptids, um so eine Verbindung zu identifizieren, welche die Aktivität des Polypeptids moduliert.
Verwendung eines Antikörpers, der die Aktivität eines Polypeptids moduliert, das eine zu zumindest 80% mit der Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 identische Aminosäuresequenz umfasst und Kinaseaktivität aufweist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Modulation der Fähigkeit einer Zelle, die Interkonversion der phosphorylierten und dephosphorylierten Formen eines GTPase-Proteins zu katalysieren.
Verwendung einer Antisense-Nucleinsäure oder eines Ribozyms, die/das die Expression eines Nucleinsäuremoleküls moduliert, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die zu zumindest 80% mit der Nucleotidsequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 3 identisch ist und für ein Polypeptid mit Kinaseaktivität kodiert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Modulation der Fähigkeit einer Zelle, die Interkonversion der phosphorylierten und dephosphorylierten Formen eines GTPase-Proteins zu katalysieren.
Verwendung nach Anspruch 26, worin die Antisense-Nucleinsäure unter stringenten Bedingungen an ein Transkript des 13245-Gens hybridisiert.
Verwendung nach Anspruch 27, worin die Antisense-Nucleinsäure zumindest 15 Nucleotidreste umfasst.
Verwendung nach Anspruch 27, worin das Transkript eine mRNA ist.
Verwendung nach Anspruch 26, worin die Antisense-Nucleinsäure unter stringenten Bedingungen an ein Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz hybridisiert, die zu zumindest 80% mit der Nucleotidsequenz der Seq.-ID Nr. 1 identisch ist.
Verwendung nach Anspruch 26, worin die Antisense-Nucleinsäure unter stringenten Bedingungen an ein Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz hybridisiert, die zu zumindest 80% mit der Nucleotidsequenz der Seq.-ID Nr. 3 identisch ist.
In-vitro-Verfahren zur Beurteilung, ob eine Testverbindung zur Modulation zumindest eines Phänomens zweckdienlich ist, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (1) Interkonversion der phosphorylierten und dephosphorylierten Formen eines Serin-, Threonin- oder Tyrosinrests eines GTPase-Proteins; (2) Zellkontraktilität; (3) Zellwachstum; (4) Zellleitfähigkeit; (5) Eintritt einer Zelle in den Zellzyklus; (6) Progression einer Zelle durch den Zellzyklus; (7) Mitogenese; (8) Zellmetabolismus; (9) Gentranskription; (11) Zytokinese; (12) Zellform; (13) Zellbewegung; (14) Integration eines Virusgenoms in ein Wirtszellengenom; (15) Haltung eines Virusgenoms in einem Wirtszellengenom; (16) zytologische Veränderung in einer virusinfizierten Wirtszelle; (17) Virusproduktion in einer virusinfizierten Wirtszelle; (18) Wechselwirkung eines Virions mit einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle; und (19) Einkapselung eines Virions in einem Abschnitt einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) das Zusetzen der Testverbindung zu einer ersten Zusammensetzung, die ein Polypeptid umfasst, das eine zu zumindest 80% mit Seq.-ID Nr. 2 identische Aminosäuresequenz und Kinaseaktivität aufweist; und b) das Vergleichen der Kinaseaktivität in der ersten Zusammensetzung mit der in der zweiten Zusammensetzung, die im Wesentlichen identisch mit der ersten Zusammensetzung ist, mit der Ausnahme, dass sie die Testverbindung nicht enthält, wobei ein Unterschied der Kinaseaktivität zwischen der ersten und der zweiten Zusammensetzung darauf hinweist, dass die Testverbindung zur Modulation des Phänomens zweckdienlich ist.
Verfahren nach Anspruch 32, worin die Aktivität GTPase-Kinaseaktivität ist.
Verfahren nach Anspruch 32, worin das Protein die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 32, worin die Zusammensetzung eine Zelle umfasst, welche eine für das Protein kodierende Nucleinsäure umfasst.
Verfahren nach Anspruch 35, worin die Nucleinsäure das Genom der Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 35, worin die Nucleinsäure das 13245-Gen umfasst.
In-vitro-Verfahren zur Beurteilung, ob eine Testverbindung zur Modulation zumindest eines Phänomens zweckdienlich ist, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (1) Interkonversion der phosphorylierten und dephosphorylierten Formen eines Serin-, Threonin- oder Tyrosinrests eines GTPase-Proteins; (2) Zellkontraktilität; (3) Zellwachstum; (4) Zellleitfähigkeit; (5) Eintritt einer Zelle in den Zellzyklus; (6) Progression einer Zelle durch den Zellzyklus; (7) Mitogenese; (8) Zellmetabolismus; (9) Gentranskription; (11) Zytokinese; (12) Zellform; (13) Zellbewegung; (14) Integration eines Virusgenoms in ein Wirtszellengenom; (15) Haltung eines Virusgenoms in einem Wirtszellengenom; (16) zytologische Veränderung in einer virusinfizierten Wirtszelle; (17) Virusproduktion in einer virusinfizierten Wirtszelle; (18) Wechselwirkung eines Virions mit einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle; und (19) Einkapselung eines Virions in einem Abschnitt einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) das Zusetzen der Testverbindung zu einer ersten Zusammensetzung, die eine für ein Polypeptid, das eine zu zumindest 80% mit Seq.-ID Nr. 2 identische Aminosäuresequenz und Kinaseaktivität aufweist, kodierende Nucleinsäure umfasst; und b) das Vergleichen der Kinaseaktivität in der ersten Zusammensetzung mit der in der zweiten Zusammensetzung, die im Wesentlichen identisch mit der ersten Zusammensetzung ist, mit der Ausnahme, dass sie die Testverbindung nicht enthält, wobei ein Unterschied der Kinaseaktivität zwischen der ersten und der zweiten Zusammensetzung darauf hinweist, dass die Testverbindung zur Modulation des Phänomens zweckdienlich ist.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Modulation zumindest eines Phänomens, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (1) Interkonversion der phosphorylierten und dephosphorylierten Formen eines Serin-, Threonin- oder Tyrosinrests eines GTPase-Proteins; (2) Zellkontraktilität; (3) Zellwachstum; (4) Zellleitfähigkeit; (5) Eintritt einer Zelle in den Zellzyklus; (6) Progression einer Zelle durch den Zellzyklus; (7) Mitogenese; (8) Zellmetabolismus; (9) Gentranskription; (11) Zytokinese; (12) Zellform; (13) Zellbewegung; (14) Integration eines Virusgenoms in ein Wirtszellengenom; (15) Haltung eines Virusgenoms in einem Wirtszellengenom; (16) zytologische Veränderung in einer virusinfizierten Wirtszelle; (17) Virusproduktion in einer virusinfizierten Wirtszelle; (18) Wechselwirkung eines Virions mit einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle; und (19) Einkapselung eines Virions in einem Abschnitt einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) das Auswählen eines Antikörpers, eines Antisense-Nucleinsäuremoleküls oder eines Ribozyms, der/das zur Modulation zumindest eines der Phänomene nach Anspruch 36 zweckdienlich ist; und b) das Kombinieren des Antikörpers, des Antisense-Nucleinsäuremoleküls oder des Ribozyms mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, um die pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 41 bei der Herstellung eines Medikaments zur Modulation, in einem Menschen, zumindest eines Phänomens, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (1) Interkonversion der phosphorylierten und dephosphorylierten Formen eines Serin-, Threonin- oder Tyrosinrests eines GTPase-Proteins; (2) Zellkontraktilität; (3) Zellwachstum; (4) Zellleitfähigkeit; (5) Eintritt einer Zelle in den Zellzyklus; (6) Progression einer Zelle durch den Zellzyklus; (7) Mitogenese; (8) Zellmetabolismus; (9) Gentranskription; (11) Zytokinese; (12) Zellform; (13) Zellbewegung; (14) Integration eines Virusgenoms in ein Wirtszellengenom; (15) Haltung eines Virusgenoms in einem Wirtszellengenom; (16) zytologische Veränderung in einer virusinfizierten Wirtszelle; (17) Virusproduktion in einer virusinfizierten Wirtszelle; (18) Wechselwirkung eines Virions mit einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle; und (19) Einkap selung eines Virions in einem Abschnitt einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle.
In-vitro-Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, die zur Modulation zumindest eines Phänomens zweckdienlich ist, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (1) Interkonversion der phosphorylierten und dephosphorylierten Formen eines Serin-, Threonin- oder Tyrosinrests eines GTPase-Proteins; (2) Zellkontraktilität; (3) Zellwachstum; (4) Zellleitfähigkeit; (5) Eintritt einer Zelle in den Zellzyklus; (6) Progression einer Zelle durch den Zellzyklus; (7) Mitogenese; (8) Zellmetabolismus; (9) Gentranskription; (11) Zytokinese; (12) Zellform; (13) Zellbewegung; (14) Integration eines Virusgenoms in ein Wirtszellengenom; (15) Haltung eines Virusgenoms in einem Wirtszellengenom; (16) zytologische Veränderung in einer virusinfizierten Wirtszelle; (17) Virusproduktion in einer virusinfizierten Wirtszelle; (18) Wechselwirkung eines Virions mit einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle; und (19) Einkapselung eines Virions in einem Abschnitt einer Membran einer virusinfizierten Wirtszelle, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) das Kontaktieren der Testverbindung mit einem Polypeptid, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: i) Polypeptid, für das ein Nucleinsäuremolekül kodiert, das einen Teil mit einer Nucleinsäure umfasst, die zu zumindest 80% mit einer aus Seq.-ID Nr. 1 und 3 identisch ist und für ein Polypeptid mit Kinaseaktivität kodiert; und ii) Fragment eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz, die Seq.-ID Nr. 2 umfasst, worin das Fragment zumindest 25 zusammenhängende Aminosäurereste der Seq.-ID Nr. 2 umfasst oder einer Zelle, die das Polypeptid exprimiert; und b) das Bestimmen, ob das Polypeptid an die Testverbindung bindet, wobei die Bindung des Polypeptids an die Testverbindung darauf hinweist, dass die Testverbindung zur Modulation des Phänomens zweckdienlich ist.
Verfahren nach Anspruch 41, worin das Polypeptid das gleiche Epitop aufweist wie ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2.