ES2279833T3 - 13245, proteina quinasa de tipo distrofia miotonica humana novedosa y usos de la misma. - Google Patents
13245, proteina quinasa de tipo distrofia miotonica humana novedosa y usos de la misma. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2279833T3 ES2279833T3 ES01985157T ES01985157T ES2279833T3 ES 2279833 T3 ES2279833 T3 ES 2279833T3 ES 01985157 T ES01985157 T ES 01985157T ES 01985157 T ES01985157 T ES 01985157T ES 2279833 T3 ES2279833 T3 ES 2279833T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- polypeptide
- cell
- nucleic acid
- seq
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 55
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 title claims description 39
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 title claims description 39
- 230000003274 myotonic effect Effects 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 486
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 306
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 253
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 231
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 231
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 203
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 191
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 51
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims abstract description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 298
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 180
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 179
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 168
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 154
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 129
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 119
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 118
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 114
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 110
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 90
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 75
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 62
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 60
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 54
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 48
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 41
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 41
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 40
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 30
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 29
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 24
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 23
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 23
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 21
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 claims description 21
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 20
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 20
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 19
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 19
- 102000013446 GTP Phosphohydrolases Human genes 0.000 claims description 18
- 108091006109 GTPases Proteins 0.000 claims description 18
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 claims description 18
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 17
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 15
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 14
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 14
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 14
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 14
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 13
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 13
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 claims description 12
- 230000021953 cytokinesis Effects 0.000 claims description 12
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 11
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 11
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 claims description 11
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims description 11
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 6
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 6
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 3
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 claims description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- WWTBZEKOSBFBEM-SPWPXUSOSA-N (2s)-2-[[2-benzyl-3-[hydroxy-[(1r)-2-phenyl-1-(phenylmethoxycarbonylamino)ethyl]phosphoryl]propanoyl]amino]-3-(1h-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)O)C(=O)C(CP(O)(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)OCC=1C=CC=CC=1)CC1=CC=CC=C1 WWTBZEKOSBFBEM-SPWPXUSOSA-N 0.000 claims 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims 1
- 229940126208 compound 22 Drugs 0.000 claims 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 35
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 27
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 25
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 25
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 abstract description 13
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 abstract description 13
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 13
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract description 11
- 206010068871 Myotonic dystrophy Diseases 0.000 abstract description 8
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 296
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 99
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 72
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 55
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 54
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 52
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 49
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 45
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 45
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 42
- 239000000047 product Substances 0.000 description 41
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 37
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 37
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 33
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 28
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 27
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 26
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 26
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 25
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 25
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 24
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 22
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 22
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 21
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 20
- 230000004044 response Effects 0.000 description 20
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 19
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 18
- 230000002974 pharmacogenomic effect Effects 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 17
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 17
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 17
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 16
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 15
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 15
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 15
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 15
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 15
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 15
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 14
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 241000894007 species Species 0.000 description 13
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 13
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 108010052185 Myotonin-Protein Kinase Proteins 0.000 description 11
- 102000018658 Myotonin-Protein Kinase Human genes 0.000 description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 11
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 11
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 10
- 102100029100 Hematopoietic prostaglandin D synthase Human genes 0.000 description 10
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 10
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 10
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- -1 diacylglycerol ester Chemical class 0.000 description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 9
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 9
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- SYHGEUNFJIGTRX-UHFFFAOYSA-N methylenedioxypyrovalerone Chemical compound C=1C=C2OCOC2=CC=1C(=O)C(CCC)N1CCCC1 SYHGEUNFJIGTRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 7
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 7
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 7
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 6
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000003935 denaturing gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 5
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 5
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 4
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 4
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 108010043958 Peptoids Proteins 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 4
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 4
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 4
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010033674 rho GTP-Binding Proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 240000004307 Citrus medica Species 0.000 description 3
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 3
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 3
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 3
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 3
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 3
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 239000003150 biochemical marker Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 3
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 3
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 3
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 3
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 2
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000052052 Casein Kinase II Human genes 0.000 description 2
- 108010010919 Casein Kinase II Proteins 0.000 description 2
- 102100025051 Cell division control protein 42 homolog Human genes 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000004654 Cyclic GMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010003591 Cyclic GMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 2
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N Lomustine Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)NC1CCCCC1 GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100030264 Pleckstrin Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108010066717 Q beta Replicase Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- VGQOVCHZGQWAOI-YQRHFANHSA-N anthramycin Chemical compound N1[C@H](O)[C@@H]2CC(\C=C\C(N)=O)=CN2C(=O)C2=CC=C(C)C(O)=C12 VGQOVCHZGQWAOI-YQRHFANHSA-N 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 229950006345 antramycin Drugs 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000012707 chemical precursor Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 108010060348 citron-kinase Proteins 0.000 description 2
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 2
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 2
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 2
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- SLPJGDQJLTYWCI-UHFFFAOYSA-N dimethyl-(4,5,6,7-tetrabromo-1h-benzoimidazol-2-yl)-amine Chemical compound BrC1=C(Br)C(Br)=C2NC(N(C)C)=NC2=C1Br SLPJGDQJLTYWCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 2
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002169 hydrotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N methyl salicylate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1O OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N mithramycin Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@H]1O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@H](C)[C@@H](O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@H]1C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 2
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000011049 pearl Substances 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 108010026735 platelet protein P47 Proteins 0.000 description 2
- 229960003171 plicamycin Drugs 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 2
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N propranolol Chemical compound C1=CC=C2C(OCC(O)CNC(C)C)=CC=CC2=C1 AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 102000007268 rho GTP-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 2
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 2
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 2
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 2
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 1
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUBFWTUFPGFHOJ-UHFFFAOYSA-N 2-nitrofuran Chemical class [O-][N+](=O)C1=CC=CO1 FUBFWTUFPGFHOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 3-[dimethyl-[3-[[(4r)-4-[(3r,5s,7r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]propyl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CC(O)CS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066676 Abrin Proteins 0.000 description 1
- 102100033639 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 102100023995 Beta-nerve growth factor Human genes 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LWFDUMPGOAKHKC-UHFFFAOYSA-N C1=CC=C2C=C(C(=O)C(C(O)=C3O)=O)C3=CC2=C1 Chemical compound C1=CC=C2C=C(C(=O)C(C(O)=C3O)=O)C3=CC2=C1 LWFDUMPGOAKHKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101710113083 Carbamoyl-phosphate synthase Proteins 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N Carmustine Chemical compound ClCCNC(=O)N(N=O)CCCl DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000011068 Cdc42 Human genes 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 108020001738 DNA Glycosylase Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 102000028381 DNA glycosylase Human genes 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N Dansyl Chloride Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(Cl)(=O)=O XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N Daunomycin Natural products CCC1(O)CC(OC2CC(N)C(O)C(C)O2)c3cc4C(=O)c5c(OC)cccc5C(=O)c4c(O)c3C1 WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBYXEBXZARTUSS-QLWBXOBMSA-N Emetamine Natural products O(C)c1c(OC)cc2c(c(C[C@@H]3[C@H](CC)CN4[C@H](c5c(cc(OC)c(OC)c5)CC4)C3)ncc2)c1 MBYXEBXZARTUSS-QLWBXOBMSA-N 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102100030013 Endoribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 101710199605 Endoribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700004714 Gelonium multiflorum GEL Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 101000901659 Homo sapiens Myotonin-protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 101001110286 Homo sapiens Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 101000829171 Hypocrea virens (strain Gv29-8 / FGSC 10586) Effector TSP1 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 244000246386 Mentha pulegium Species 0.000 description 1
- 235000016257 Mentha pulegium Nutrition 0.000 description 1
- 235000004357 Mentha x piperita Nutrition 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 201000002169 Mitochondrial myopathy Diseases 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000608571 Murina Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000010316 Myotonia congenita Diseases 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 108010001441 Phosphopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 229920002685 Polyoxyl 35CastorOil Polymers 0.000 description 1
- 208000032236 Predisposition to disease Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 102100022122 Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000042463 Rho family Human genes 0.000 description 1
- 108091078243 Rho family Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- AUVVAXYIELKVAI-UHFFFAOYSA-N SJ000285215 Natural products N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2C1CC1CC2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2CC1CC AUVVAXYIELKVAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101710113029 Serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000018674 Sodium Channels Human genes 0.000 description 1
- 108010052164 Sodium Channels Proteins 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710172814 Sodium channel protein Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000223892 Tetrahymena Species 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N Thiotepa Chemical compound C1CN1P(N1CC1)(=S)N1CC1 FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZVNYJIZDIRKMBF-UHFFFAOYSA-N Vesnarinone Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C(=O)N1CCN(C=2C=C3CCC(=O)NC3=CC=2)CC1 ZVNYJIZDIRKMBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000006677 Vicia faba Species 0.000 description 1
- 235000010749 Vicia faba Nutrition 0.000 description 1
- 235000002098 Vicia faba var. major Nutrition 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 235000018936 Vitellaria paradoxa Nutrition 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 125000000641 acridinyl group Chemical group C1(=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3C=C12)* 0.000 description 1
- 229930183665 actinomycin Natural products 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000000787 affinity precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 description 1
- 230000000078 anti-malarial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 239000003080 antimitotic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 208000031375 autosomal dominant myotonia congenita Diseases 0.000 description 1
- JXLHNMVSKXFWAO-UHFFFAOYSA-N azane;7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole-4-sulfonic acid Chemical compound N.OS(=O)(=O)C1=CC=C(F)C2=NON=C12 JXLHNMVSKXFWAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- RSIHSRDYCUFFLA-DYKIIFRCSA-N boldenone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 RSIHSRDYCUFFLA-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960005243 carmustine Drugs 0.000 description 1
- 108010051348 cdc42 GTP-Binding Protein Proteins 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- NDAYQJDHGXTBJL-MWWSRJDJSA-N chembl557217 Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC=O)C(C)C)CC(C)C)C(=O)NCCO)=CNC2=C1 NDAYQJDHGXTBJL-MWWSRJDJSA-N 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 description 1
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- RSIHSRDYCUFFLA-UHFFFAOYSA-N dehydrotestosterone Natural products O=C1C=CC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)O)C4C3CCC2=C1 RSIHSRDYCUFFLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 230000036267 drug metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- AUVVAXYIELKVAI-CKBKHPSWSA-N emetine Chemical compound N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2[C@H]1C[C@H]1C[C@H]2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2C[C@@H]1CC AUVVAXYIELKVAI-CKBKHPSWSA-N 0.000 description 1
- 229960002694 emetine Drugs 0.000 description 1
- AUVVAXYIELKVAI-UWBTVBNJSA-N emetine Natural products N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2[C@H]1C[C@H]1C[C@H]2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2C[C@H]1CC AUVVAXYIELKVAI-UWBTVBNJSA-N 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940079360 enema for constipation Drugs 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000001050 hortel pimenta Nutrition 0.000 description 1
- 102000048595 human DMPK Human genes 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 208000023692 inborn mitochondrial myopathy Diseases 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 229950000038 interferon alfa Drugs 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 238000001948 isotopic labelling Methods 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 238000000670 ligand binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 229960002247 lomustine Drugs 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229960004961 mechlorethamine Drugs 0.000 description 1
- HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N mechlorethamine Chemical compound ClCCN(C)CCCl HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 1
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 229960001047 methyl salicylate Drugs 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000033607 mismatch repair Effects 0.000 description 1
- KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001156 mitoxantrone Drugs 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 239000002324 mouth wash Substances 0.000 description 1
- 229940051866 mouthwash Drugs 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000004220 muscle function Effects 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 101150029137 mutY gene Proteins 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- ZTLGJPIZUOVDMT-UHFFFAOYSA-N n,n-dichlorotriazin-4-amine Chemical compound ClN(Cl)C1=CC=NN=N1 ZTLGJPIZUOVDMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMWKZHPREXJQGR-XOSAIJSUSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]decanamide Chemical compound CCCCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO UMWKZHPREXJQGR-XOSAIJSUSA-N 0.000 description 1
- SBWGZAXBCCNRTM-CTHBEMJXSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]octanamide Chemical compound CCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO SBWGZAXBCCNRTM-CTHBEMJXSA-N 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 239000006218 nasal suppository Substances 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 125000002524 organometallic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- QUANRIQJNFHVEU-UHFFFAOYSA-N oxirane;propane-1,2,3-triol Chemical compound C1CO1.OCC(O)CO QUANRIQJNFHVEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000001696 pelvic girdle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011458 pharmacological treatment Methods 0.000 description 1
- 238000009519 pharmacological trial Methods 0.000 description 1
- 238000001050 pharmacotherapy Methods 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008389 polyethoxylated castor oil Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000009609 prenatal screening Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 229960003712 propranolol Drugs 0.000 description 1
- 229940076376 protein agonist Drugs 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229940064914 retrovir Drugs 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 231100000004 severe toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- JKPSVOHVUGMYGH-UHFFFAOYSA-M sodium;(4,6-dimethoxypyrimidin-2-yl)-[[3-methoxycarbonyl-6-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]sulfonylcarbamoyl]azanide Chemical compound [Na+].COC(=O)C1=CC=C(C(F)(F)F)N=C1S(=O)(=O)NC(=O)[N-]C1=NC(OC)=CC(OC)=N1 JKPSVOHVUGMYGH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002483 superagonistic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000012622 synthetic inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 description 1
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 description 1
- 238000012956 testing procedure Methods 0.000 description 1
- 229960002372 tetracaine Drugs 0.000 description 1
- GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N tetracaine Chemical compound CCCCNC1=CC=C(C(=O)OCCN(C)C)C=C1 GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 229960001196 thiotepa Drugs 0.000 description 1
- 238000003161 three-hybrid assay Methods 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960003087 tioguanine Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 238000003160 two-hybrid assay Methods 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Natural products Cc1cc2C=CC(=O)Oc2cc1OCC=CC(C)(C)O HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
- HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N zidovudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por: a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3, en la que la molécula de ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene actividad quinasa; b) una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 1400 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3, en la que la molécula de ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene actividad quinasa; c) una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; d) una molécula de ácido nucleico que codifica para un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en la que el fragmento comprende al menos 1000 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2 y tiene actividad quinasa; y e) una molécula de ácido nucleicoque codifica para una variante alélica que produce de manera natural de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en la que la molécula de ácido nucleico hibrida con una molécula de ácido nucleico que comprende una de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y un complemento de las mismas, en condiciones rigurosas, y en la que la molécula de ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene actividad quinasa.
Description
13245, proteína quinasa de tipo distrofia
miotónica humana novedosa y usos de la misma.
La fosforilación de proteínas, por ejemplo en
los residuos de serina, treonina y tirosina, es un mecanismo
regulador clave para una variedad de procesos celulares. La
fosforilación de proteínas está influida principalmente por enzimas
de dos tipos, concretamente proteína quinasas (PK) y proteína
fosfatasas (PP). Las PK catalizan la adición de un resto fosfato a
un residuo de aminoácido de una proteína (generalmente un residuo
de serina, treonina o tirosina), y las PP catalizan la eliminación
de tales restos. Las actividades catalíticas de las PK y las PP
están influidas, a su vez, por el estado de la célula y el entorno
en que se encuentra cada una.
Las PK de tipo distrofia miotónica (MDPK,
"myotonic dystrophy type PK") están asociadas con la
modulación de la morfología, forma y contractilidad celular.
También se sabe que las MDPK modulan la actividad de los canales de
sodio regulados por voltaje del músculo esquelético, pero no los
canales de sodio regulados por voltaje del músculo cardiaco. Por
tanto, las MDPK desempeñan un papel en una variedad de trastornos
musculodegenerativos y otros musculoesqueléticos incluyendo, por
ejemplo, distrofia muscular (DM) de diversos tipos (por ejemplo, DM
de Duchenne, DM de las cinturas escapulohumeral y pélvica, DM de
Becker, DM facioescapulohumeral, miopatía mitocondrial, y miopoatía
congénita) y distrofias miotónicas (por ejemplo, enfermedad de
Steinert y enfermedad de Thomsen).
Se han descrito numerosas MDPK (véase por
ejemplo Zhao et al. 1997. The Journal of Biological
Chemistry, 272:10013 y Bush et al. 2000, Biochemistry,
39:8480.) y se cree que existen muctiene más. En vista de la
naturaleza extendida y crítica de las actividades de las MDPK en
procesos fisiológicos normales y patológicos, existe una necesidad
de identificación de miembros adicionales de esta familia de
proteínas. La presente invención satisface esta necesidad
proporcionando una MDPK humana novedosa.
La presente invención se basa, en parte, en el
descubrimiento de un gen novedoso que codifica para una MDPK,
haciéndose referencia en el presente documento al gen como
"13245". La secuencia de nucleótidos de un ADNc que codifica
para 13245 se muestra en SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos
de un polipéptido 13245 se muestra en SEQ ID NO: 2. Además, la
secuencia de nucleótidos de la región codificante se representa en
SEQ ID NO: 3.
En consecuencia, en un aspecto, la invención se
caracteriza por una molécula de ácido nucleico que codifica para
una proteína o polipéptido 13245, por ejemplo, una parte
biológicamente activa de la proteína 13245. En una realización
preferida, la molécula aislada de ácido nucleico codifica para un
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
En otras realizaciones, la invención proporciona moléculas aisladas
de ácido nucleico de 13245 que tienen la secuencia de nucleótidos
de cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3.
Todavía en otras realizaciones, la invención
proporciona moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias que
son sustancialmente idénticas (por ejemplo, variantes alélicas que
se producen de manera natural) a la secuencia de nucleótidos de
cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3. En otras realizaciones, la
invención proporciona una molécula de ácido nucleico que híbrida en
condiciones de hibridación rigurosas con una molécula de ácido
nucleico que tiene una secuencia que comprende la secuencia de
nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO:1 y 3, en la que el ácido
nucleico codifica para una proteína 13245 de longitud completa o un
fragmento activo de la misma.
En un aspecto relacionado, la invención
proporciona además constructos de ácido nucleico que incluyen una
molécula de ácido nucleico de 13245 descrita en el presente
documento. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido
nucleico de la invención están unidas operativamente a secuencias
reguladoras nativas o heterólogas. También se incluyen vectores y
células huésped que contienen las moléculas de ácido nucleico 13245
de la invención, por ejemplo, vectores y células huésped adecuados
para producir moléculas de ácido nucleico y polipéptidos
13245.
13245.
En otro aspecto relacionado, la invención
proporciona fragmentos de ácido nucleico adecuados como cebadores o
sondas de hibridación para la detección de ácidos nucleicos que
codifican para 13245.
Todavía en otro aspecto relacionado, se
proporcionan moléculas aisladas de ácido nucleico que son
antisentido a una molécula de ácido nucleico que codifica para
13245.
En otro aspecto, la invención se caracteriza por
polipéptidos 13245, y fragmentos biológicamente activos o
antigénicos de los mismos que son útiles, por ejemplo, como
reactivos o dianas en ensayos aplicables al tratamiento y
diagnóstico de trastornos mediados por o relacionados con 13245 (por
ejemplo, trastornos mediados por MDPK tales como los descritos en el
presente documento). En otra realización, la invención proporciona
polipéptidos 13245 que tienen actividad proteína quinasa. Los
polipéptidos preferidos son proteínas 13245 que incluyen al menos
un dominio pquinasa, y que tienen preferiblemente una actividad de
13245, por ejemplo, una actividad de 13245 tal como se describe en
el presente documento. Los polipéptidos preferidos son proteínas
13245 que incluyen al menos un dominio CNH y al menos un dominio
pquinasa. Otros polipéptidos preferidos son proteínas 13245 que
incluyen al menos un dominio CNH, al menos un dominio pquinasa, al
menos un dominio de unión a éster de forbol/diacilglicerol, al
menos un dominio PH, y al menos un dominio de cremallera de
leucina.
En otras realizaciones, la invención proporciona
polipéptidos 13245, por ejemplo, un polipéptido 13245 que tiene la
secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, una secuencia de
aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de
aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2; o una secuencia de
aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene
una secuencia de nucleótidos que híbrida en condiciones de
hibridación rigurosas a una molécula de ácido nucleico que
comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1
y 3, en la que el ácido nucleico codifica para una proteína 13245
de longitud completa o un fragmento activo de la misma.
En un aspecto relacionado, la invención
proporciona además constructos de ácido nucleico que incluyen una
molécula de ácido nucleico de 13245 descrita en el presente
documento.
En un aspecto relacionado, la invención
proporciona polipéptidos 13245 o fragmentos operativamente unidos a
polipéptidos distintos a 13245 para formar proteínas de fusión.
En otro aspecto, la invención se caracteriza por
anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos, que
reaccipnan con, o más preferiblemente, se unen específicamente a,
polipéptidos 13245.
En otro aspecto, la invención proporciona
procedimientos de selección de compuestos que modulan la expresión
o actividad de los polipéptidos o ácidos nucleicos de 13245.
Todavía en otro aspecto, la invención
proporciona un procedimiento para modular la expresión o actividad
de un polipéptido o ácido nucleico de 13245, por ejemplo, usando
los compuestos seleccionados. En ciertas realizaciones, los
procedimientos suponen el tratamiento de estados relacionados con la
actividad o expresión aberrante de los polipéptidos o ácidos
nucleicos de 13245, tales como estados que suponen la fosforilación
aberrante o deficiente de proteínas o la regulación aberrante o
deficiente de procesos celulares (por ejemplo, señalización celular
aberrante o deficiente función muscular aberrante o deficiente).
La invención también proporciona ensayos para
determinar la actividad de o la presencia o ausencia de
polipéptidos o moléculas de ácido nucleico de 13245 en una muestra
biológica, incluyendo para el diagnóstico de enfermedades.
En aspecto adicional, la invención proporciona
ensayos para determinar la presencia o ausencia de una alteración
genética en un polipéptido o molécula de ácido nucleico de 13245,
incluyendo para el diagnóstico de enfermedades.
La invención también incluye un procedimiento de
modulación de la capacidad de una célula para catalizar la
interconversión de las formas fosforiladas y desfosforiladas una
proteína GTPasa. El procedimiento comprende modular la actividad de
la proteína 13245 en la célula. La actividad de la proteína 13245
puede modularse inhibiendo la expresión del gen 13245 en la célula,
por ejemplo administrando a la célula un oligonucleótido
antisentido que híbrida en condiciones rigurosas con un transcrito
(por ejemplo, un ARNm) del gen 13245, un oligonucleótido
antisentido que híbrida en condiciones rigurosas con un
polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:
1, o un oligonucleótido antisentido que híbrida en condiciones
rigurosas con un polinucleótido que tiene la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID NO: 3. Alternativamente, la actividad de la
proteína 13245 puede inhibirse sin afectar significativamente la
expresión del gen 13245 en la célula. Por ejemplo, la actividad de
la proteína 13245 puede inhibirse administrando a la célula un
agente que inhibe una actividad de la proteína 13245, tal como un
anticuerpo que se une específicamente con la proteína 13245. En un
aspecto relacionado, la actividad de 13245 puede modularse
potenciando la expresión de 13245 en la célula. Por ejemplo, la
expresión de 13245 en una célula puede potenciarse administrando a
la célula un agente que potencia la expresión de 13245, tal como un
vector de expresión que codifica para la proteína 13245.
La invención incluye además un procedimiento
para evaluar si un compuesto de prueba es útil para modular al
menos un fenómeno seleccionado del grupo constituido por (1)
interconversión de las formas fosforiladas y desfosforiladas de un
residuo de serina, treonina o tirosina de una proteína GTPasa; (2)
contractilidad celular; (3) crecimiento celular; (4) conductividad
celular; (5) entrada de una célula en el ciclo celular; (6)
progresión de una célula a través del ciclo celular; (7)
mitogénesis; (8) metabolismo celular; (9) transcripción génica;
(11) citocinesis; (12) forma celular; (13) movimiento celular; (14)
integración de un genoma viral en el genoma de una célula huésped;
(15) mantenimiento de un genoma viral en el genoma de una célula
huésped; (16) un cambio citológico en una célula huésped infectada
por virus; (17) producción viral en una célula huésped infectada
por virus; (18) interacción de un virión con una membrana de una
célula huésped infectada por virus; y (19) encapsulación de un
virión dentro de una parte de una membrana de una célula huésped
infectada por virus. El procedimiento comprende:
a) añadir el compuesto de prueba a una primera
composición que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos idéntica en al menos un 90% a SEQ ID NO: 2 y que
muestra una actividad de 13245; y
b) comparar la actividad de 13245 en la primera
composición y en una segunda composición que es sustancialmente
idéntica a la primera composición excepto en que no comprende el
compuesto de prueba.
\newpage
Una diferencia en la actividad de 13245 en la
primera y segunda composiciones es una indicación de que el
compuesto de prueba es útil para modular el fenómeno.
La invención también incluye otro procedimiento
para evaluar si un compuesto de prueba es útil para modular al
menos un fenómeno seleccionado del grupo constituido por (1)
interconversión de las formas fosforiladas y desfosforiladas de un
residuo de serina, treonina o tirosina de una proteína GTPasa; (2)
contractilidad celular; (3) crecimiento celular; (4) conductividad
celular; (5) entrada de una célula en el ciclo celular; (6)
progresión de una célula a través del ciclo celular; (7)
mitogénesis; (8) metabolismo celular; (9) transcripción génica;
(11) citocinesis; (12) forma celular; (13) movimiento celular; (14)
integración de un genoma viral en el genoma de una célula huésped;
(15) mantenimiento de un genoma viral en el genoma de una célula
huésped; (16) un cambio citológico en una célula huésped infectada
por virus; (17) producción viral en una célula huésped infectada
por virus; (18) interacción de un virión con una membrana de una
célula huésped infectada por virus; y (19) encapsulación de un
virión dentro de una parte de una membrana de una célula huésped
infectada por virus. Este procedimiento comprende:
a) añadir el compuesto de prueba a una primera
composición que comprende una célula que comprende un ácido
nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia
de aminoácidos idéntica en al menos un 90% a SEQ ID NO: 2 y que
muestra una actividad de 13245; y
b) comparar la actividad de 13245 en la primera
composición y en una segunda composición que es sustancialmente
idéntica a la primera composición excepto en que no comprende el
compuesto de prueba.
Una diferencia en la actividad de 13245 en la
primera y segunda composiciones es una indicación de que el
compuesto de prueba es útil para modular el fenómeno.
Pueden usarse los compuestos identificados
usando estos procedimientos para preparar una composición
farmacéutica para modular el fenómeno, por ejemplo combinándolo con
un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden
usarse para modular el fenómeno en un ser humano.
La invención incluye otro procedimiento para
identificar un compuesto útil para modular al menos un fenómeno
seleccionado del grupo constituido por (1) interconversión de las
formas fosforiladas y desfosforiladas de un residuo de serina,
treonina o tirosina de una proteína GTPasa; (2) contractilidad
celular; (3) crecimiento celular; (4) conductividad celular; (5)
entrada de una célula en el ciclo celular; (6) progresión de una
célula a través del ciclo celular; (7) mitogénesis; (8) metabolismo
celular; (9) transcripción génica; (11) citocinesis; (12) forma
celular; (13) movimiento celular; (14) integración de un genoma
viral en el genoma de una célula huésped; (15) mantenimiento de un
genoma viral en el genoma de una célula huésped; (16) un cambio
citológico en una célula huésped infectada por virus; (17)
producción viral en una célula huésped infectada por virus; (18)
interacción de un virión con una membrana de una célula huésped
infectada por virus; y (19) encapsulación de un virión dentro de
una parte de una membrana de una célula huésped infectada por
virus. Este procedimiento comprende:
a) poner en contacto el compuesto de prueba y un
polipéptido seleccionado del grupo constituido por
- i)
- un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una parte que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 90% a una de SEQ ID NO: 1 y 3; y
- ii)
- un fragmento de un polipéptido que tiene o bien una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 2, en la que el fragmento comprende al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2 o bien una célula que expresa el polipéptido; y
b) determinar si el polipéptido se une con el
compuesto de prueba.
La unión del polipéptido y el compuesto de
prueba es una indicación de que el compuesto de prueba es útil para
modular el fenómeno.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y a
partir de las reivindicaciones.
La figura 1 representa una secuencia de ADNc
(SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos prevista (SEQ ID NO:
2) de 13245 humana. El marco de lectura abierto iniciado por
metionina de 13245 humana (sin las regiones no traducidas en 3' y
5') comienza en el nucleótido 19 de SEQ ID NO: 1, y la región
codificante (sin incluir el codón de terminación; mostrado en SEQ ID
NO: 3) se extiende a través del nucleótido 6178 de SEQ ID NO:
1.
La figura 2 representa un perfil de hidropatía
de 13245 humana. Los residuos relativamente hidrófobos se muestran
por encima de la línea horizontal discontinua y los residuos
relativamente hidrófilos se muestran por debajo de la línea
horizontal discontinua. Los residuos de cisteína (cys) se indican
mediante líneas verticales cortas por debajo de la curva de
hidropatía. Se indican los números correspondientes a la secuencia
de aminoácidos de 13245 humana. Los polipéptidos de la invención
incluyen fragmentos que incluyen: toda o parte de una secuencia
hidrófoba, es decir, una secuencia por encima de la línea
discontinua, por ejemplo, la secuencia de aproximadamente los
residuos 195-210of SEQ ID NO: 2; todo o parte de
una secuencia hidrófila, es decir, una secuencia por debajo de la
línea discontinua, por ejemplo, la secuencia de residuos
455-475 de SEQ ID NO: 2; una secuencia que incluye
un residuo de cisteína; o un sitio de glucosilación.
La figura 3 es una alineación de la secuencia de
aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de 13245, citrón quinasa de interacción
con rho/rac murina ("AAC72823"; número de acceso GENBANK®
AAC72823; SEQ ID NO: 4), citrón-K quinasa murina
("AAC27933"; número de acceso GENBANK® AAC27933; SEQ ID NO: 5),
proteína citrón murina ("P49025"; número de acceso GENBANK®
P49025; SEQ ID NO: 6), y proteína citrón humana ("O14578";
número de acceso GENBANK® 014578; SEQ ID NO:7). Se realizó la
alienación usando el software Multalin versión 5.4.1 usando la tabla
de comparación de 62 símbolos Blosum, un valor de hueco ("gap
weight") de 12, y un valor de la longitud de hueco ("gap length
weight") de 2.
La secuencia de ADNc de 13245 humana (figura 1;
SEQ ID NO: 1), que tiene aproximadamente 6575 residuos de
nucleótidos de longitud incluyendo las regiones no traducidas,
contiene una secuencia codificante iniciada por metionina prevista
de aproximadamente 6160 residuos de nucleótidos, excluyendo el codón
de terminación (es decir, los residuos de nucleótidos
19-6178 de SEQ ID NO: 1; también mostrados en SEQ
ID NO: 3). La secuencia codificante codifica para una proteína de
2053 aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NO: 2.
13245 humana contiene las siguientes regiones u
otras características estructurales: un dominio pquinasa previsto
(PF00069) aproximadamente en los residuos de aminoácidos
97-360 de SEQ ID NO: 2, un dominio terminal de
proteína quinasa C previsto en los residuos 361-390
de SEQ ID NO: 2, una secuencia distintiva de sitio activo de
serina/treonina proteína quinasa en los residuos
217-229 de SEQ ID NO:2, dominios de cremallera de
leucina previstos en los residuos 838-859,
975-996, 1041-1062, y
1143-1164 de SEQ ID NO: 2, una secuencia distintiva
de subdominio de carbamoíl fosfato sintasa previsto en los residuos
1156-1163 de SEQ ID NO: 2, un dominio de unión a
éster de forbol/diacilglicerol previsto en los residuos
1389-1437 de SEQ ID NO: 2, un dominio de homología
con pleckstrina (PH) previsto en los residuos
1470-1525 de SEQ ID NO: 2, y un dominio CNH
previsto en los residuos 1568-1865 de SEQ ID NO:
2.
La proteína 13245 humana tienes sitios de
N-glucosilación previstos (número de acceso Pfam
PS00001) aproximadamente en los residuos de aminoácidos
819-822, 1571-1574,
1694-1697, 1717-1720, y
2026-2029 de SEQ ID NO: 2; sitios de fosforilación
de proteína quinasa dependiente de AMPc/GMPc previstos (número de
acceso Pfam PS00004) aproximadamente en los residuos de aminoácidos
78-81, 477-480,
579-582, 601-604,
680-683, 1322-1325, y
1366-1369 de SEQ ID NO: 2; sitios de fosforilación
de proteína quinasa C previstos (número de acceso Pfam PS00005)
aproximadamente en los residuos de aminoácidos
93-95, 248-250,
308-310, 378-380,
487-489, 498-500,
516-518, 546-548,
577-579, 824-826,
872-874, 1025-1027,
1033-1035, 1096-1098,
1144-1146, 1170-1172,
1215-1217, 1268-1270,
1314-1316, 1335-1337,
1363-1365, 1376-1378,
1542-1544, 1724-1726,
1892-1894, 1910-1912,
1963-1965, y 1977-1979 de SEQ ID
NO: 2; sitios de fosforilación de caseína quinasa II previstos
(número de acceso Pfam PS00006) ubicados aproximadamente en los
residuos de aminoácidos 83-86,
93-96, 140-143,
361-364, 381-384,
386-389, 410-413,
436-439, 445-448,
480-483, 487-490,
501-504, 529-532,
867-870, 908-911,
935-938, 940-943,
973-976, 1015-1018,
1025-1028, 1046-4049,
1081-1084, 1142-1145,
1170-1173, 1218-1221,
1308-1311, 1314-1317,
1370-1373, 1736-1739,
1794-1797, 1864-1867,
1882-1885, 1904-1907,
1964-1967, y 2012-2015 de SEQ ID
NO: 2; un sitio de fosforilación de tirosina quinasa previsto en los
residuos 741-747 de SEQ ID NO: 2; sitios de
N-miristoilación previstos (número de acceso Pfam
PS00008) aproximadamente en los residuos de aminoácidos
50-5, 1202-1207,
1532-1537, 1584-1589,
1675-1680, y 1999-2004 de SEQ ID NO:
2; un sitio de amidación previsto (número de acceso Pfam PS00009)
aproximadamente en los residuos de aminoácidos
134-136 de SEQ ID NO: 2.
Para información general referente a los
identificadores de PFAM, números de identificación de dominio de
prefijo PS y prefijo PF, véase Sonnhammer et al. (1997,
Protein 28:405-420) y
http://www.psc.edu/general/software/packages/
pfam/pfam.html.
pfam/pfam.html.
La proteína 13245 contiene un número
significativo de características estructurales en común con
miembros de la familia de MDPK. El término "familia" cuando se
refiere a la proteína y moléculas de ácido nucleico de la invención
significa dos o más proteínas o moléculas de ácido nucleico que
tiene un dominio o motivo estructural común y que tiene una
homología suficiente de la secuencia de aminoácidos o nucleótidos
tal como se define en el presente documento. Tales miembros de la
familia pueden producirse de manera natural o no natural y pueden
proceder de la misma o de especies diferentes. Por ejemplo, una
familia puede contener una primera proteína de origen humano así
como otras proteínas distintas de origen humano, o
alternativamente, pueden contener homólogos de origen no humano,
por ejemplo, proteínas MDPK proteínas para cualquier especie
descrita en la técnica. Los miembros de una familia también pueden
tener características funcionales comunes.
Un polipéptido 13245 puede incluir un dominio
pquinasa. Tal como se usa en el presente documento, el término
"dominio pquinasa" se refiere a un dominio de proteína que
tiene una secuencia de aminoácidos de aproximadamente
200-300 residuos de aminoácidos de longitud,
preferiblemente, al menos aproximadamente 225-300
aminoácidos, de manera más preferible aproximadamente 264 residuos
de aminoácidos y tiene una puntuación en bits para la alineación de
la secuencia con respecto al dominio pquinasa (HMM) de al menos 100
o superior, preferiblemente 150 o superior, y más preferiblemente
200 o superior. Al dominio pquinasa se le ha asignado el acceso
PFAM PF00069 (http://genome.wustl.edu/Pfam/html).
Un polipéptido 13245 puede incluir un dominio
pquinasa. Tal como se usa en el presente documento, el término
"dominio CNH" se refiere a un dominio de proteína que tiene
una secuencia de aminoácidos de aproximadamente
250-350 residuos de aminoácidos de longitud,
preferiblemente, al menos aproximadamente 275-325
aminoácidos, de manera más preferible aproximadamente 298 residuos
de aminoácidos y tiene una puntuación en bits para la alineación de
la secuencia con respecto al dominio pquinasa (HMM) de al menos 100
o superior, preferiblemente 200 o superior, y más preferiblemente
300 o superior. Al dominio pquinasa se le ha asignado el acceso
PFAM PF00780 (http:Ilgenome.wustI.edu/Pfam/html).
En una realización preferida, el polipéptido o
proteína 13245 tiene un dominio pquinasa o una región que incluye
al menos aproximadamente 200-300, de manera más
preferible aproximadamente 225-300, o 264 residuos
de aminoácidos y tiene al menos aproximadamente una homología del
60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, o el 100% con un dominio pquinasa,
por ejemplo, el dominio pquinasa de 13245 humana (por ejemplo, los
residuos 97-360 de SEQ ID NO: 2).
En otra realización preferida, el polipéptido o
proteína 13245 tiene un dominio CNH o una región que incluye al
menos aproximadamente 250-350, de manera más
preferible aproximadamente 275-325, o 298 residuos
de aminoácidos y tiene al menos aproximadamente una homología del
60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, o el 100% con un do-
minio CNH, por ejemplo, el dominio CNH de 13245 humana (por ejemplo, los residuos 568-1865 de SEQ ID NO: 2).
minio CNH, por ejemplo, el dominio CNH de 13245 humana (por ejemplo, los residuos 568-1865 de SEQ ID NO: 2).
Para identificar la presencia de un perfil de
dominio pquinasa o CNH en un receptor de 13245, la secuencia de
aminoácidos de la proteína se busca frente a una base de datos de
HMM (por ejemplo, la base de datos Pfam, versión 2.1) usando los
parámetros por defecto
(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/HMM_search). Por ejemplo, el
programa hmmsf, que está disponible como parte del paquete HMMER de
programas de búsqueda, es un programa por defecto específico de la
familia para PF00069 o PF00780 y una puntuación de 100 es la
puntuación umbral por defecto para determinar un resultado positivo
("hit"). Por ejemplo, usando un software ORFAnalyzer software,
se identificó un perfil de dominio pquinasa en la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (por ejemplo, aminoácidos
53-303 de SEQ ID NO: 2). En consecuencia, una
proteína 13245 que tiene al menos una homología de aproximadamente
el 60-70%, de manera más preferible aproximadamente
el 70-80%, o aproximadamente el
80-90% con el perfil de dominio pquinasa o el
perfil de dominio CNH de 13245 humana está dentro del alcance de la
invención.
Sin pretender quedar ligado a teoría particular
alguna de operación, se cree que la proteína 13245 es, en al menos
una realización, una proteína de membrana nuclear que tiene su
dominio carboxi-terminal orientado dentro de la
envuelta nuclear. En esta realización, la proteína 13245 puede
transmitir información de señalización desde el citoplasma hasta el
núcleo, mediante lo cual, por ejemplo, puede regularse la
transcripción génica.
En una realización de la invención, un
polipéptido 13245 incluye al menos un dominio pquinasa. En otra
realización, el polipéptido 13245 incluye al menos un dominio
pquinasa y al menos un dominio CNH. Las moléculas de 13245 de la
presente invención pueden incluir además uno o más de los dominios y
sitios de N-glucosilación, fosforilación de
proteína quinasa dependiente de AMPc/GMPc, fosforilación de
proteína quinasa C, fosforilación de caseína quinasa II,
fosforilación de tirosina quinasa, N-miristoilación,
amidación, cremallera de leucina, sitio activo de serinaltreonína
proteína quinasa, secuencia distintiva de subdominio de carbamoíl
fosfato sintasa, dominio C-terminal de proteína
quinasa C de unión a éster de forbol/diacilglicerol, y de homología
con pleckstrina descritos en el presente documento, y
preferiblemente comprende la mayor parte o todos ellos.
Tal como se muestra en la figura 3, la proteína
13245 muestra una homología de secuencia significativa con varias
proteínas relacionadas con la proteína citrón, que se sabe que
interacciona con enzimas GTPasa de la familia Rho. Estas GTPasas
incluyen, por ejemplo, Rho-A, B, y C,
Rac-1 y 2, y CDC42. Estas GTPasas regulan la
estructura celular, incluyendo la forma celular, contracción
celular, movimiento celular, distribución de proteínas estructurales
(por ejemplo, actina) dentro la célula, formación de adhesiones
focales, citocinesis y división celular. Estas GTPasas también se
sabe que modulan la expresión génica de manera dependiente de la
fosforilación. Las proteínas que pueden interaccionar con,
catalizar la interconversión de isoformas fosforiladas y no
fosforiladas de Rho GTPasa, o ambas, pueden modular estos procesos
celulares.
La aparición de pquinasa, pquinasa C, una
secuencia distintiva de región de unión a ATP de proteína quinasa,
una secuencia distintiva de sitio activo de serina/treonina
proteína quinasa, un sitio de fosforilación de tirosina quinasa,
múltiples sitios de fosforilación potenciales, y similitud con
proteínas citrón indica que la proteína 13245 puede interaccionar
con Rho GTPasas y catalizar la interconversión de sus formas
fosforiladas y no fosforiladas. La capacidad de 13245 para modular
el estado de fosforilación de las Rho GTPasas indica que 13245
puede modular una o más de la forma celular, contracción celular,
movimiento celular, distribución de proteínas estructurales (por
ejemplo, actina) dentro de la célula, formación de adhesiones
locales, citocinesis, y división celular en células en las que se
expresa. Además, estas características indican que la proteína
13245 participa en trastornos en los que uno o más de estos procesos
son aberrantes. Por tanto, las moléculas de 13245 descritas en el
presente documento pueden usarse para predecir, diagnosticar,
inhibir, prevenir, aliviar, o curar estos trastornos. Ejemplos de
trastornos en los que uno o más de estos procesos son aberrantes
incluyen tumorigénesis, crecimiento tumoral, metástasis tumoral e
infección viral de una célula.
La expresión de 13245 es superior en células de
sangre periférica que en muchos otros tipos de células, y se
observa la expresión aumentada de 13245 en células infectadas por
VIH-1, incluyendo células de la línea celular CCRF
que se han infectado con este virus. Las células infectadas por
VIH-1 experimentan diversos cambios morfológicos, y
el patrón de expresión génica en células infectadas por
VIH-1 difiere del patrón observado en células no
infectadas del mismo tipo. Estas observaciones indican que 13245
desempeña un papel en los efectos de la infección por
VIH-1 en células huésped (por ejemplo, células
mononucleares de sangre periférica). Modulando la expresión,
actividad de 13245, o ambas en células infectadas por
VIH-1 pueden modularse los procesos enumerados
anteriormente, aliviando o revirtiendo así los efectos de la
infección por VIH-1. A modo de ejemplo, las
moléculas de 13245 descritas en el presente documento pueden usarse
para inhibir la inserción del genoma de VIH-1 en el
genoma de una célula huésped, inhibir o revertir el mantenimiento
del genoma de VIH-1 en el genoma de la célula
huésped, inhibir o revertir cambios citológicos inducidos por la
infección por VIH-1, inhibir la producción viral de
VIH-1 en células infectadas, inhibir la interacción
de viriones de VIH-1 con la membrana citoplásmica
de la célula huésped, inhibir la encapsulación de partículas virales
de VIH-1 en partes de la membrana de la célula
huésped, o inhibir la liberación del virus VIH-1
desde las células infectadas. Por tanto, las moléculas de 13245
pueden usarse para tratar individuos que están infectados por
VIH-1 (por ejemplo, individuos que padecen el
síndrome de inmunodeficiencia adquirida) o con otros virus
patógenos o para inhibir la transmisión del virus de un individuo a
otro.
Dado que los polipéptidos 13245 de la invención
pueden modular actividades mediadas por 13245, pueden usarse para
desarrollar agentes terapéuticos o de diagnóstico novedosos para
trastornos mediados por o relacionados con 13245, tal como se
describe a continuación.
Tal como se usa en el presente documento, una
"actividad de 13245", "actividad biológica de 13245", o
"actividad funcional de 13245", se refiere a una actividad
ejercida por una proteína, polipéptido o molécula de ácido nucleico
de 13245 sobre, por ejemplo, una célula sensible a 13245 o sobre un
sustrato de 13245 (por ejemplo, un sustrato proteico tal como una
proteína de canal de sodio regulado por voltaje de músculo
esquelético) tal como se determina in vivo o in
vitro. En una realización, una actividad de 13245 es una
actividad directa, tal como una asociación con una molécula diana
de 13245. Una "molécula diana" o "pareja de unión" de una
proteína 13245 es una molécula (por ejemplo, una proteína o ácido
nucleico) con la que se une o interacciona la proteína 13245 en la
naturaleza. En una realización a modo de ejemplo, tal molécula diana
es un receptor de 13245. Una actividad de 13245 también puede ser
una actividad indirecta, tal como una activación de señalización
celular mediada por la interacción de la proteína 13245 con un
receptor de 13245.
Se prevé que las moléculas de 13245, de la
presente invención tienen actividades biológicas similares a los
miembros de la familia de MDPK. Por ejemplo, las proteínas 13245 de
la presente invención pueden tener una o más de las siguientes
actividades:
(1) catalizan la formación de un enlace
covalente en o entre un residuo de aminoácido y un resto
fosfato;
(2) modulan la contractilidad celular;
(3) modulan el crecimiento celular;
(4) modulan la conductividad celular;
(5) modulan la entrada de una célula en el ciclo
celular;
(6) modulan la progresión de una célula a través
del ciclo celular;
(7) modulan la mitogénesis;
(8) modulan el metabolismo celular;
(9) modulan la transcripción génica;
(10) catalizan la interconversión de formas
fosforiladas y no fosforiladas de una GTPasa, tal como una Rho
GTPasa;
(11) modulan la citocinesis;
(12) modulan la forma celular;
(13) modulan el movimiento celular (por ejemplo,
metástasis tumoral);
(14) modulan la integración de un genoma viral
en el genoma de una célula huésped;
(15) modulan el mantenimiento de un genoma vira)
en el genoma de una célula huésped;
(16) modulan cambios citológicos en una célula
huésped infectada por virus;
(17) modulan la producción viral en una célula
huésped infectada por virus;
(18) modulan la interacción de un virión con una
membrana de una célula huésped infectada por virus; y
(19) modulan la encapsulación de un virión
dentro de una parte de una membrana de una célula huésped infectada
por virus.
Por tanto, las moléculas de 13245 descritas en
el presente documento pueden actuar como dianas de diagnóstico y
agentes terapéuticos novedosos para pronosticar, diagnosticar,
prevenir, inhibir, aliviar o curar trastornos relacionados con
MDPK.
Otras actividades, tal como se describe a
continuación, incluyen la capacidad para modular la función,
supervivencia, morfología, proliferación y/o diferenciación de
células de tejidos en que las moléculas de 13245 se expresan. Por
tanto, las moléculas de 13245 pueden actuar como dianas de
diagnóstico y agentes terapéuticos novedosos para controlar
trastornos que suponen actividades aberrantes de estas células.
Las moléculas de 13245 también pueden actuar
como dianas de diagnóstico y agentes terapéuticos novedosos para
controlar diversos trastornos, incluyendo trastornos
musculoesqueléticos (por ejemplo, distrofias musculares y miotónicas
tal como se describe en el presente documento y en la técnica).
La proteína 13245, fragmentos de la misma, y
derivados y otras variantes de la secuencia en SEQ ID NO: 2 de la
misma se denominan colectivamente como "polipéptidos o proteínas
de la invención" o "polipéptidos o proteínas 13245". Las
moléculas de ácido nucleico que codifican para tales polipéptidos o
proteínas se denominan colectivamente como "ácidos nucleicos de la
invención" o "ácidos nucleicos de 13245". Las moléculas de
13245 se refieren a ácidos nucleicos, polipéptidos, y anticuerpos
de 13245.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "molécula de ácido nucleico" incluye moléculas de ADN
(por ejemplo, un ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por
ejemplo, un ARNm) y análogos del ADN o ARN generado, por ejemplo,
mediante el uso de análogos de nucleótido. La molécula de ácido
nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente
es ADN bicatenario.
El término "molécula aislada o purificada de
ácido nucleico" incluye moléculas de ácido nucleico que están
separadas de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes
en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, con respecto
al ADN genómico, el término "aislado" incluye moléculas de
ácido nucleico que están separadas del cromosoma con el que se
asocia de manera natural el ADN genómico. Preferiblemente, un ácido
nucleico "aislado" está libre de secuencias que flanquean de
manera natural al ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en
los extremos 5' y/o 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del
organismo del que se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en
diversas realizaciones, la molécula aislada de ácido nucleico puede
contener menos de aproximadamente 5 kilobases, 4 kilobases, 3
kilobases, 2 kilobases, 1 kilobase, 0,5 kilobases o 0,1 kilobases
de secuencias de nucleótidos en 5' y/o 3' que flanquean de manera
natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la
célula de la que se deriva el ácido nucleico. Además, una molécula
"aislada" de ácido nucleico, tal como una molécula de ADNc,
puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o medio
de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o
sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos
químicos cuando se sintetiza químicamente.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "híbrida en condiciones rigurosas" describe
condiciones para la hibridación y el lavado. Los expertos en la
técnica conocen condiciones rigurosas y pueden hallarse en la
bibliografía disponible (por ejemplo, Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989,
6.3.1-6.3.6). En esa referencia, se describen
procedimientos acuosos y no acuosos y puede usarse cualquiera de
ellos. Un ejemplo preferido de condiciones de hibridación rigurosas
son la hibridación en 6x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC)
aproximadamente a 45°C, seguido por uno o más lavados con 0,2x SSC,
0,1% (plv) de SDS a 50°C. Otro ejemplo de condiciones de
hibridación rigurosas son la hibridación en 6x SSC aproximadamente
a 45°C, seguido por uno o más lavados con 0,2x SSC, 0,1% (p/v) de
SDS a 55°C. Un ejemplo adicional de condiciones de hibridación
rigurosas son la hibridación en 6x SSC aproximadamente a 45°C,
seguido por uno o más lavados con 0,2x SSC, 0,1% (p/v) de SDS a
60°C. Preferiblemente, condiciones de hibridación rigurosas son la
hibridación en 6x SSC aproximadamente a 45°C, seguido por uno o más
lavados en 0,2x SSC, 0,1% (p/v) de SDS a 65°C. Condiciones de
rigurosidad particularmente preferidas (y las condiciones que deben
usarse si el médico de cabecera no está seguro sobre qué
condiciones deben aplicarse para determinar si una molécula está
dentro de una limitación de hibridación de la invención) son
fosfato de sodio 0,5 molar, 7% (p/v) de SDS a 65°C, seguido por uno
o más lavados con 0,2x SSC, 1% (p/v) de SDS a 65°C.
Preferiblemente, una molécula aislada de ácido nucleico de la
invención que híbrida en condiciones rigurosas con la
secuencia
de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, corresponde a una molécula de ácido nucleico que se produce de manera natural.
de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, corresponde a una molécula de ácido nucleico que se produce de manera natural.
Tal como se usa en el presente documento, una
molécula de ácido nucleico "que se produce de manera natural"
se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de
nucleótidos que se produce en la naturaleza (por ejemplo, codifica
para una proteína natural).
Tal como se usa en el presente documento, los
términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a
moléculas de ácido. nucleico que incluyen un marco de lectura
abierto que codifica para una proteína 13245, preferiblemente una
proteína 13245 de mamífero, y pueden incluir además intrones y
secuencias reguladoras no codificantes.
Un polipéptido o proteína "aislado" o
"purificado" está sustancialmente libre de material celular u
otras proteínas contaminantes de la fuente celular o de tejidos de
la que se deriva la proteína, o sustancialmente libre de precursores
químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza
químicamente. En una realización, las palabras "sustancialmente
libre" significa la preparación de la proteína 13245 que tiene
menos de aproximadamente el 30%, 20%, 10% y más preferiblemente el
5% (en peso seco), de proteína distinta a 13245 (también denominado
en el presente documento como una "proteína contaminante"), o
de precursores químicos o productos químicos distintos a 13245.
Cuando la proteína 13245 o parte biológicamente activa de la misma
se produce de manera recombinante, también está de manera
preferible sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el
medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, más
preferiblemente menos de aproximadamente el 10%, y lo más
preferiblemente menos de aproximadamente el 5% del volumen de la
preparación de proteína. La invención incluye preparaciones
aisladas o purificadas de al menos 0,01, 0,1, 1,0, y 10 miligramos
en peso seco.
Un residuo de aminoácido "no esencial" es
un residuo que puede alterarse desde la secuencia de tipo natural
de 13245 (por ejemplo, la secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 1 y
3) sin suprimir o, más preferiblemente, sin alterar sustancialmente
una actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido
"esencial" da como resultado tal cambio. Por ejemplo, se prevé
que los residuos de aminoácidos que se conservan entre los
polipéptidos de la presente invención, por ejemplo, aquellos
presentes en el dominio pquinasa no son particularmente adecuados
para la alteración.
Una "sustitución de aminoácido
conservativa" es una en la que el residuo de aminoácido se
sustituye por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral
similar. En la técnica, se han definido las familias de residuos de
aminoácidos que tiene cadenas laterales similares. Estas familias
incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo,
lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por
ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales
polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina,
serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales apolares
(por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina,
fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con
ramificaciones beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y
cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina,
triptófano, histidina). Por tanto, preferiblemente se sustituye un
residuo de aminoácido no esencial previsto en una proteína 13245 por
otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral.
Alternativamente, en otra realización, pueden introducirse
mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o una parte de la
secuencia codificante de 13245, tal como mediante mutagénesis de
saturación, y los mutantes resultantes pueden examinarse para
determinar la actividad biológica de 13245 para identificar
mutantes que conservan la actividad. Tras la mutagénesis de SEQ ID
NO: 1 o SEQ ID NO: 3, puede expresarse de manera recombinante la
proteína codificada y puede determinarse la actividad de la
proteína.
Tal como se usa en el presente documento, una
"parte biológicamente activa" de una proteína 13245 incluye un
fragmento de una proteína 13245 que participa en una interacción
entre una molécula de 13245 y una molécula distinta a 13245. Las
partes biológicamente activas de una proteína 13245 incluyen
péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente
homólogas a o derivadas de la secuencia de aminoácidos de la
proteína 13245, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada
en SEQ ID NO: 2, que incluyen menos aminoácidos que las proteínas
13245 de longitud completa, y muestran al menos una actividad de
una proteína 13245. Normalmente, las partes biológicamente activas
comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la
proteína 13245, por ejemplo, un dominio o motivo que puede catalizar
una actividad descrita en el presente documento, tal como la
adición covalente de un resto fosfato a un residuo de aminoácido de
la proteína (por ejemplo, a un grupo hidroxilo de una serina o
treonina).
Una parte biológicamente activa de una proteína
13245 puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50,
100, 200, 300, o 400, 500, 1000, 1500, ó 2000 o más aminoácidos de
longitud. Pueden usarse partes biológicamente activas de una
proteína 13245 como dianas para desarrollar agentes que modulan una
actividad mediada por 13245, por ejemplo, una actividad biológica
descrita en el presente documento.
Se realizan cálculos de homología o identidad de
secuencia entre secuencias (los términos se usan de manera
intercambiable en el presente documento) tal como sigue.
Para determinar la identidad en porcentaje de
dos secuencias de aminoácidos, o de dos secuencias de ácido
nucleico, se alinean las secuencias con fines de comparación óptima
(por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o en ambas de una
primera y una segunda secuencias de aminoácidos o ácido nucleico
para la alineación óptima y las secuencias no homólogas pueden no
tenerse en cuenta secuencias no homólogas con fines de comparación).
En una realización preferida, la longitud de una secuencia de
referencia alineada con fines de comparación es al menos el 30%,
preferiblemente al menos el 40%, más preferiblemente al menos el
50%, incluso más preferiblemente al menos el 60%, e incluso más
preferiblemente al menos el 70%, 80%, 90%, 100% de la longitud de
la secuencia de referencia (por ejemplo, cuando se alinea una
segunda secuencia con la secuencia de aminoácidos de 13245 de SEQ
ID NO: 2, se alinean 100 residuos de aminoácidos, preferiblemente
al menos 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, ó 2000 o más residuos de
aminoácidos). Se comparan entonces los residuos de aminoácidos o
nucleótidos en las posiciones de aminoácido o posiciones de
nucleótido correspondientes. Cuando una posición en la primera
secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o
nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia,
entonces las moléculas son idénticas en esa posición (tal como se
usa en el presente documento "identidad" aminoácido o ácido
nucleico es equivalente "homología" de aminoácido o ácido
nucleico). La identidad en porcentaje entre las dos secuencias es
función del número de posiciones idénticas compartidas por las
secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud
de cada hueco, que se necesitan introducir para la alineación
óptima de las dos secuencias.
La comparación de secuencias y determinación de
la identidad en porcentaje entre dos secuencias puede realizarse
usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, la
identidad en porcentaje entre dos secuencias de aminoácidos se
determina usando el algoritmo de Needleman et al. (1970, J.
Mol. Biol. 48:444-453) que se ha incorporado en el
programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en
http://www.gcg.com), o bien usando una matriz BLOSUM 62 o bien una
matriz PAM250, y un valor de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ó 4 y
un valor de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Aún en otra realización
preferida, la identidad en porcentaje entre dos secuencias de
nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de
software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz
NWSgapdna.CMP y un valor de hueco of 40, 50, 60, 70 u 80 y un valor
de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Un conjunto de parámetros
particularmente preferido (y el que debe usarse si el médico de
cabecera no está seguro de qué parámetros debe aplicar para
determinar si una molécula está dentro de una limitación de
homología o identidad de secuencia de la invención) son una matriz
de puntuación BLOSUM 62 con una penalización por hueco de 12, una
penalización por extensión de huecos de 4, y una penalización de
huecos en el marco de 5.
La identidad en porcentaje entre dos secuencias
de aminoácidos o nucleótidos puede determinarse usando el algoritmo
de Meyers et al. (1989, CABIOS, 4:11-17) que
se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una
tabla de residuos de valores PAM120, una penalización por longitud
del hueco de 12 y una penalización por hueco de 4.
Las secuencias de ácido nucleico y proteína
descritas en el presente documento pueden usarse como una
"secuencia de consulta" para realizar una búsqueda frente a
bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar otros
miembros de la familia o secuencias relacionadas. Tales búsquedas
pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (versión
2.0) de Altschul, et al. (1990, J. Mol. Biol.
215:403-410). Pueden realizarse búsquedas de
nucleótidos BLAST con el programa NBLAST, puntuación = 100,
longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos
homólogas a las moléculas de ácido nucleico de 13245 de la
invención. Pueden realizarse búsquedas de proteínas BLAST con el
programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para
obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de
proteína 13245 de la invención. Para obtener alineaciones con
huecos con fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST tal
como se describe en Altschul et al. (1997, Nucl. Acids Res.
25:3389-3402). Cuando se usan los programas BLAST y
Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los
respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov>.
"Una expresión errónea o expresión
aberrante", tal como se usa en el presente documento, se refiere
a un patrón no natural de la expresión génica, al nivel del ARN o
la proteína. Incluye: expresión a niveles no naturales, es decir,
sobre o subexpresión; un patrón de expresión que difiere del natural
en cuanto al tiempo o la fase en que se expresa el gen, por
ejemplo, un aumento o una disminución de la expresión (en
comparación con la natural) en un periodo o fase de desarrollo
predeterminado; un patrón de expresión que difiere del natural en
cuanto a una disminución de la expresión (en comparación con la
natural) en un tipo de célula o tipo de tejido predeterminado; un
patrón de expresión que difiere del natural en cuanto al tamaño de
corte y empalme, secuencia de aminoácidos, modificación tras la
transición, o actividad biológica del polipéptido expresado; un
patrón de expresión que difiere del natural en cuanto al efecto de
un estímulo ambiental o estímulo extracelular sobre la expresión del
gen, por ejemplo, un patrón de aumento o disminución de la
expresión (en comparación con la natural) en presencia de un
aumento o una disminución de la intensidad del estímulo.
"Sujeto", tal como se usa en el presente
documento, puede referirse a un mamífero, por ejemplo, un ser
humano, o a un modelo experimental o animal o de enfermedad. El
sujeto también puede ser un animal no humano, por ejemplo, un
caballo, vaca, cabra u otro animal doméstico.
Una "preparación purificada de células",
tal como se usa en el presente documento, se refiere a, en el caso
de células vegetales o animales, una preparación in vitro de
células y no un una planta o animal intacto completo. En el caso de
células cultivadas o células microbianas, está constituida por una
preparación de al menos el 10%, y más preferiblemente, el 50% de las
células del sujeto.
A continuación, se describen en mayor detalle
diversos aspectos de la invención.
En un aspecto, la invención proporciona una
molécula de ácido nucleico, aislada o purificada, que codifica para
un polipéptido 13245 descrito en el presente documento, por
ejemplo, una proteína 13245 de longitud completa o un fragmento de
la misma, por ejemplo, una parte biológicamente activa de la
proteína 13245. También se incluye un fragmento de ácido nucleico
adecuado para su uso como una sonda de hibridación, que puede
usarse, por ejemplo, para identificar una molécula de ácido
nucleico que codifica para un polipéptido de la invención, ARNm de
13245, y fragmentos adecuados para su uso como cebadores, por
ejemplo, cebadores de PCR para la amplificación o mutación de
moléculas de ácido nucleico.
En una realización, una molécula aislada de
ácido nucleico de la invención incluye la secuencia de nucleótidos
mostrada en SEQ ID NO: 1 o una parte de la misma. En una
realización, la molécula de ácido nucleico incluye secuencias que
codifican para la proteína 13245 humana (es decir, "la región
codificante", de los nucleótidos 19-6178 de SEQ
ID NO: 1), así como las secuencias no traducidas en 5' (nucleótidos
1-18 de SEQ ID NO: 1) o las secuencias no traducidas
en 3' (nucleótidos 6179-6575 de SEQ ID NO:1).
Alternativamente, la molécula de ácido nucleico puede incluir sólo
la región codificante de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, nucleótidos
19-6178, correspondientes a SEQ ID NO: 3) y, por
ejemplo, sin las secuencias flanqueantes que normalmente acompañan
a la secuencia objeto. En otra realización, la molécula de ácido
nucleico codifica para una secuencia correspondiente a la proteína
de 2053 residuos de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
En otra realización, una molécula aislada de
ácido nucleico de la invención incluye una molécula de ácido
nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos
mostrada en una de SEQ ID NO: 1 y 3, y una parte de cualquiera de
estas secuencias. En otras realizaciones, la molécula de ácido
nucleico de la invención es suficientemente complementaria a la
secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3
que puede hibridar con un ácido nucleico que tiene esa secuencia,
formando así un dúplex estable.
En una realización, una molécula aislada de
ácido nucleico de la invención incluye una secuencia de nucleótidos
que es homóloga en al menos aproximadamente el 60%, 65%, 70%, 75%,
80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% o más
con la longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada en
una de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, y una parte, preferiblemente de
la misma longitud, de cualquiera de estas secuencias de
nucleótidos.
Una molécula de ácido nucleico de la invención
puede incluir sólo una parte de la secuencia de ácido nucleico de
cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3. Por ejemplo, tal molécula de ácido
nucleico puede incluir un fragmento que puede usarse como una sonda
o cebador o un fragmento que codifica para una parte de una
proteína 13245, por ejemplo, una parte inmunogénica o biológicamente
activa de una proteína 13245. Un fragmento puede comprender los
nucleótidos correspondientes a los residuos 97-360
de SEQ ID NO: 2, que codifican para un dominio pquinasa de 13245
humana, o a los residuos 1568-1865 de SEQ ID NO: 2,
que codifican para un dominio CNH de 13245 humana. La secuencia de
nucleótidos determinada a partir de la clonación del gen 13245
facilita la generación de sondas y cebadores para su uso en la
identificación y/o clonación de miembros de la familia de 13245, o
fragmentos de los mismos, así como homólogos de 13245, o fragmentos
de los mismos, de otras especies.
En otra realización, un ácido nucleico incluye
una secuencia de nucleótidos que incluye parte de, o toda, la
región codificante y se extiende hacia cualquiera (o ambas) de las
regiones no codificantes en 5' o 3'. Otras realizaciones incluyen
un fragmento que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica
para un fragmento de aminoácidos descrito en el presente documento.
Fragmentos de ácido nucleico pueden codificar para un dominio o
sitio específicos descritos en el presente documento o fragmentos
de los mismos, particularmente fragmentos de los mismos que tienen
al menos aproximadamente 250 aminoácidos de longitud. Los
fragmentos también incluyen secuencias de ácido nucleico
correspondientes a secuencias de aminoácidos específicas descritas
anteriormente o fragmentos de las mismas. No debe considerarse que
los fragmentos de ácido nucleico engloban aquellos fragmentos que
pueden haberse descrito antes de la invención.
Un fragmento de ácido nucleico puede incluir una
secuencia correspondiente a un dominio, región, o sitio funcional
descritos en el presente documento. Un fragmento de ácido nucleico
también puede incluir uno o más dominios, regiones, o sitios
funcionales descritos en el presente documento.
Se proporcionan sondas y cebadores de 13245.
Normalmente una sonda/cebador es un oligonucleótido aislado o
purificado. El oligonucleótido normalmente incluye una región de la
secuencia de nucleótidos que híbrida en condiciones rigurosas con
al menos aproximadamente 7, 12 ó 15, de manera preferible
aproximadamente 20 ó 25, de manera más preferible aproximadamente
30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, ó 75 nucleótidos consecutivos de una
secuencia sentido o antisentido de cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3,
y una variante alélica que se produce de manera natural o mutante
de cualquiera de SEQ TD NO: 1 y 3.
En una realización preferida, el ácido nucleico
es una sonda que tiene al menos 5 ó 10, y menos de 200, más
preferiblemente menos de 100, o menos de 50, pares de bases de
longitud. Debe ser idéntico, o diferir en 1, o menos de 5 ó 10
bases, de una secuencia descrita en el presente documento. Si se
necesita la alineación para esta comparación, deben alinearse las
secuencias para su homología máxima. Las secuencias que sobresalen
"en bucles" ("looped out") procedentes de deleciones o
inserciones, o los apareamientos erróneos, se consideran
diferencias.
Una sonda o cebador puede derivarse de la hebra
sentido o antisentido de un ácido nucleico que codifica para un
dominio pquinasa aproximadamente en los residuos de aminoácidos 97 a
360 de SEQ ID NO: 2 o el dominio CNH previsto aproximadamente en los
residuos de aminoácidos 1568 a 1865 de SEQ ID NO: 2.
En otra realización, se proporciona un conjunto
de cebadores, por ejemplo, cebadores adecuados para su uso en una
PCR, que puede usarse para amplificar una región seleccionada de
una secuencia de 13245. Los cebadores deben tener al menos 5, 10 ó
50 pares de bases de longitud y menos de 100, o menos de 200, pares
de bases de longitud. Los cebadores deben ser idénticos, o diferir
en una base de una secuencia descrita en el presente documento o de
una variante que se produce de manera natural. Se proporcionan los
cebadores adecuados para amplificar toda o una parte de cualquiera
de las siguientes regiones: por ejemplo, uno o más dominios
pquinasa y el dominio CNH previsto, tal como se definió
anteriormente con respecto a SEQ ID NO: 2.
Un fragmento de ácido nucleico puede codificar
para un epítopo que lleva una región de un polipéptido descrito en
el presente documento.
Puede prepararse un fragmento de ácido nucleico
que codifica para una "parte biológicamente activa de un
polipéptido 13245" aislando una parte de la secuencia de
nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3, que codifica para un
polipéptido que tiene una actividad biológica de 13245 (por ejemplo,
las actividades biológicas de las proteínas 13245 se describen en
el presente documento), que expresa la parte codificada de la
proteína 13245 (por ejemplo, mediante expresión recombinante in
vitro) y evaluando la actividad de la parte codificada de la
proteína 13245. Por ejemplo, un fragmento de ácido nucleico que
codifica para una parte biológicamente activa de 13245 incluye un
dominio pquinasa, por ejemplo, los residuos de aminoácidos 97 a 360
de SEQ ID NO: 2, o un dominio CNH, por ejemplo, los residuos de
aminoácidos 1568 a 1865 de SEQ ID NO: 2. Un fragmento de ácido
nucleico que codifica para una parte biológicamente activa de un
polipéptido 13245 puede comprender una secuencia de nucleótidos que
es superior a 25 o más nucleótidos de longitud.
En una realización, un ácido nucleico incluye
uno que tiene una secuencia de nucleótidos que es superior a 260,
300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400,
1500, 2000, 2500, 3,000, 4000, 5000 ó 6000 o más nucleótidos de
longitud y que híbrida en condiciones de hibridación rigurosas con
una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de cualquiera
de SEQ ID NO: 1 y 3.
La invención engloba además moléculas de ácido
nucleico que tienen una secuencia que difiere de la secuencia de
nucleótidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3. Tales
diferencias pueden atribuirse a la degeneración del código genético
(es decir, diferencias que dan como resultado un ácido nucleico que
codifica para las mismas proteínas 13245 que las codificadas por la
secuencia de nucleótidos descrita en el presente documento). En otra
realización, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención
codifica para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos
que difiere en al menos 1, pero en menos de 5, 10, 20, 50 ó 100,
residuos de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Si se necesita la
alineación para esta comparación, deben alinearse las secuencias
para su homología máxima. Las secuencias que sobresalen "en
bucles" procedentes de deleciones o inserciones, o los
apareamientos erróneos, se consideran diferencias.
Puede elegirse que los ácidos nucleicos del
inventor tengan codones, que son preferidos, o no preferidos, para
un sistema de expresión particular. Por ejemplo, el ácido nucleico
puede ser uno en el que se ha alterado al menos un codón,
preferiblemente en al menos el 10%, o el 20% de los codones, de tal
manera que se optimiza la secuencia para la expresión en células de
E. coli, levaduras, ser humano, insecto o CHO.
Las variantes de ácido nucleico pueden
producirse de manera natural, tal como variantes alélicas (mismo
locus), homólogos (diferente locus), y ortólogos (diferente
organismo) o pueden no producirse de manera natural. Las variantes
que no se producen de manera natural pueden prepararse mediante
técnicas de mutagénesis, incluyendo las aplicadas a
polinucleótidos, células u organismos. Las variantes pueden
contener sustituciones, deleciones, inversiones e inserciones de
nucleótidos. La variación puede ocurrir en alguna o en ambas de las
regiones codificante y no codificante. Las variaciones pueden
producir tanto sustituciones de aminoácidos conservativas como no
conservativas (en comparación con el producto codificado).
En una realización preferida, el ácido nucleico
tiene una secuencia que difiere de la de cualquiera de SEQ ID NO: 1
y 3, por ejemplo, tal como sigue: en al menos uno, pero en menos de
10, 20, 30, ó 40, residuos de nucleótidos; o en al menos uno pero
en menos del 1%, 5%, 10% o 20% de los residuos de nucleótidos en el
ácido nucleico objeto. Si es necesario para este análisis, las
secuencias deben alinearse para una homología máxima. Las secuencias
que sobresalen "en bucles" procedentes de deleciones o
inserciones, o los apareamientos erróneos, se consideran
diferencias.
Pueden identificarse ortólogos, homólogos y
variantes alélicas usando procedimientos conocidos en la técnica.
Estas variantes comprenden una secuencia de nucleótidos que
codifica para un polipéptido que es idéntico en un 50%, al menos
aproximadamente el 55%, normalmente al menos aproximadamente el
70-75%, más normalmente al menos aproximadamente el
80-85%, y lo más normalmente al menos
aproximadamente el 90-95% o más a la secuencia de
nucleótidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3, o un
fragmento de una de estas secuencias. Tales moléculas de ácido
nucleico pueden identificarse fácilmente como pudiendo hibridar en
condiciones rigurosas, con la secuencia de nucleótidos mostrada en
cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3, o un fragmento de una de estas
secuencias. Pueden aislarse además moléculas de ácido nucleico
correspondientes a ortólogos, homólogos, y variantes alélicas de
los ADNc de 13245 de la invención mediante mapeo en el mismo
cromosoma o locus que el gen 13245.
Las variantes preferidas incluyen aquellas que
se correlacionan con cualquiera de las actividades biológicas de
13245 descritas en el presente documento, por ejemplo, catalizan la
formación de un enlace covalente entre un residuo de aminoácidos de
una proteína (por ejemplo, un residuo de serina o treonina) y un
resto fosfato.
Las variantes alélicas de 13245 (por ejemplo,
13245 humana) incluyen tanto proteínas funcionales como no
funcionales. Las variantes alélicas funcionales son variantes de la
secuencia de aminoácidos que se producen de manera natural de la
proteína 13245 dentro de una población que mantiene la capacidad
para mediar cualquiera de las actividades biológicas de 13245
descritas en el presente documento.
Las variantes alélicas funcionales contendrán
normalmente sólo la sustitución conservativa de uno o más
aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o la sustitución, deleción o inserción
de residuos no «críticos en regiones no críticas de la proteína.
Las variantes alélicas no funcionales son variantes de la secuencia
de aminoácidos que se producen de manera natural de la proteína
13245 (por ejemplo, 13245 humana) dentro de una población que no
tiene la capacidad para mediar ninguna de las actividades
biológicas de 13245 descritas en el presente documento. Las
variantes alélicas no funcionales contendrán normalmente una
sustitución no conservativa, una deleción, o inserción, o
truncamiento prematuro de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
2, o una sustitución, inserción o deleción en residuos críticos o
regiones críticas de la proteína.
Además, las moléculas de ácido nucleico que
codifican para otros miembros de la familia de 13245 y, por tanto,
que tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de las
secuencias de 13245 de cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3 están dentro
del alcance de la invención.
En otro aspecto, la invención se caracteriza por
una molécula aislada de ácido nucleico que es antisentido con
respecto a 13245. Un ácido nucleico "antisentido" puede
incluir una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un
ácido nucleico "sentido" que codifica para una proteína, por
ejemplo, complementaria a la hebra codificante de una molécula de
ADNc bicatenario o complementaria a una secuencia de ARNm. El ácido
nucleico antisentido puede ser complementario a una hebra
codificante de 13245 completa, o sólo a una parte de la misma (por
ejemplo, la región codificante de 13245 humana correspondiente a
SEQ ID NO: 3). En otra realización, la molécula de ácido nucleico
antisentido es antisentido con respecto a una "región no
codificante" de la hebra codificante de una secuencia de
nucleótidos que codifica para 13245 (por ejemplo, las regiones no
traducidas en 5' y 3').
Puede diseñarse un ácido nucleico antisentido de
tal manera que es complementario a la región codificante completa
del ARNm de 13245, pero más preferiblemente es un oligonucleótido
que es antisentido con respecto a sólo una parte de la región
codificante o no codificante del ARNm de 13245. Por ejemplo, el
oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que
rodea el sitio de inicio de la traducción del ARNm de 13245, por
ejemplo, entre las regiones -10 y +10 de la secuencia de
nucleótidos del gen diana de interés. Un oligonucleótido
antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 7, 10, 15,
20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70,75 u 80 o más residuos de
nucleótidos de longitud.
Puede construirse un ácido nucleico antisentido
de la invención usando síntesis química y reacciones de ligamiento
enzimático usando procedimientos conocidos en la técnica. Por
ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un
oligonucleótido antisentido) pueden sintetizarse químicamente usando
nucleótidos que se producen de manera natural o nucleótidos
modificados de manera diversa diseñados para aumentar la estabilidad
biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física
del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y
sentido, por ejemplo, pueden usarse derivados de fosforotioato y
nucleótidos sustituidos con acridina. El ácido nucleico antisentido
también puede producirse biológicamente usando un vector de
expresión en el que se ha subclonado un ácido nucleico en una
orientación antisentido (es decir, ARN transcrito a partir del
ácido nucleico insertado será de una orientación antisentido con
respecto a un ácido nucleico diana de interés, descrito
adicionalmente en la siguiente subsección).
Las moléculas de ácido nucleico antisentido de
la invención normalmente se administran a un sujeto (por ejemplo,
mediante la inyección directa a un sitio tisular), o se generan
in situ de tal manera que hibridan con o se unen al ARNm
celular y/o el ADNc genómico que codifica para una proteína 13245
para inhibir así la expresión de la proteína, por ejemplo, mediante
la inhibición de la transcripción y/o la traducción.
Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico antisentido
pueden modificarse para seleccionar como diana células
seleccionadas y después administrarse sistémicamente. Para la
administración sistémica, las moléculas antisentido pueden
modificarse de tal manera que se unen específicamente a receptores
o antígenos expresados sobre la superficie de una célula
seleccionada, por ejemplo, mediante la unión de las moléculas de
ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a
los receptores o antígenos de la superficie de la célula. Las
moléculas de ácido nucleico antisentido también pueden
administrarse a las células utilizando los vectores descritos en el
presente documento. Para lograr suficientes concentraciones
intracelulares de las moléculas antisentido, se prefieren los
constructos de vector en los que la molécula de ácido nucleico
antisentido se sitúan bajo el control de un promotor fuerte pol II
o pol III.
Aún en otra realización, la molécula de ácido
nucleico antisentido de la invención es una molécula de ácido
nucleico alfa-anomérica. La molécula de ácido
nucleico alfa-anomérica forma híbridos de doble
cadena específicos con ARN complementario en los que, al contrario
de las unidades beta usuales, las hebras se disponen paralelas
entre sí (Gaultier et al., 1987, Nucl. Acids. Res.
15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico
antisentido también puede comprender un
2'-o-metilrribonucleótido (Inoue
et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148)
o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et
al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330).
Todavía en otra realización, una molécula de
ácido nucleico antisentido de la invención es una ribozima. Una
ribozima que tiene especificidad por un ácido nucleico que codifica
para 13245 puede incluir una o más secuencias complementarias a la
secuencia de nucleótidos de un ADNc de 13245 descrito en el
presente documento (es decir, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3), y una
secuencia que tiene la secuencia catalítica conocida responsable de
la escisión del ARNm (véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU.
número 5.093.246 o Haselhoff et al. (1988, Nature
334:585-591). Por ejemplo, puede construirse un
derivado de un ARN de tipo L-19 IVS de
Tetrahymena en el que la secuencia de nucleótidos del sitio
activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos que va a
escindirse en un ARNm que codifica para 13245 (por ejemplo, patente
de los EE.UU. número 4.987.071; y patente de los EE.UU. número
5.116.742). Alternativamente, el ARNm de 13245 puede usarse para
seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad ribonucleasa
específica de un conjunto de moléculas de ARN (por ejemplo, Bartel
et al., 1993, Science 261:1411-1418).
La expresión del gen 13245 puede inhibirse
mediante secuencias de nucleótidos seleccionadas como diana
complementarias a la región reguladora de 13245 (por ejemplo, el
promotor y/o los potenciadores de 13245) para formar estructuras de
triple hélice que evitan la transcripción del gen 13245 en células
diana (Helene, 1991, Anticancer Drug Des. 6:569-584;
Helene, et al., 1992, Ann. N.Y. Acad.Sci.
660:27-36; Maher, 1992, Bioassays
14:807-815). Las posibles secuencias que pueden
seleccionarse como diana para la formación de la triple hélice
pueden aumentarse creando una molécula de ácido nucleico denominada
"switchback" (en zig-zag). Las moléculas
switchback se sintetizan de una manera que alterna de 5' a 3', 3' a
5', de tal manera que hibridan con la primera hebra de un dúplex y
después con la otra, eliminando la necesidad de un estiramiento
considerable de o bien purinas o bien pirimidinas que están
presentes en una hebra de un dúplex.
La invención también proporciona moléculas de
sonda y cebador de oligonucleótido marcadas de manera detectable.
Normalmente, tales marcadores son quimioluminiscentes,
fluorescentes, radiactivos o colorimétricos.
Una molécula de ácido nucleico de 13245 puede
modificarse en el resto de la base, resto de azúcar o en la
estructura principal de fosfatos para mejorar, por ejemplo, la
estabilidad, la hibridación o la solubilidad de la molécula. Por
ejemplo, la estructura principal de
desoxirribosa-fosfato de las moléculas de ácido
nucleico puede modificarse para generar ácidos nucleicos peptídicos
(Hyrup et al., 1996, Bioorg. Med. Chem.
4:5-23). Tal como se usa en el presente documento,
el término "ácido nucleido peptídico" (PNA) se refiere a una
molécula que imita a un ácido nucleico, por ejemplo, una molécula
que imita al ADN, en la que la estructura principal de
desoxirribosa-fosfato está sustituida por una
estructura principal de seudopéptido y sólo se conservan los cuatro
nucleobases naturales. La estructura principal neutra de un PNA
puede permitir la hibridación específica al ADN y al ARN en
condiciones de fuerza iónica baja. La síntesis de oligómeros de PNA
puede llevarse a cabo utilizando protocolos de síntesis de péptidos
en fase sólida convencionales, tal como se describe en Hyrup et
al. (1996, citado anteriormente; Perry-O'Keefe
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93:14670-14675).
Los PNA de las moléculas de ácido nucleico de
13245 pueden usarse en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas.
Por ejemplo, los PNA pueden usarse como agentes antisentido o
antigénicos para la modulación específica de secuencia de la
expresión génica mediante, por ejemplo, la inducción de la
detención de la transcripción o la traducción o la inhibición de la
replicación. Los PNA de las moléculas de ácido nucleico de 13245
también pueden utilizarse en el análisis de mutaciones de un único
par de bases en un gen, (por ejemplo, mediante anclaje por PCR
dirigido a PNA); como "enzimas de restricción artificiales"
cuando se utilizan en combinación con otras enzimas, (por ejemplo,
nucleasas S1, tal como se describe en Hyrup et al., 1996,
citado anteriormente); o como sondas o cebadores para la
secuenciación o la hibridación de ADN (Hyrup et al., 1996,
citado anteriormente; Perry-O'Keefe, citado
anteriormente).
En otras realizaciones, el oligonucleótido puede
incluir otros grupos adjuntos, tales como péptidos (por ejemplo,
para seleccionar como diana receptores de células huésped in
vivo), o agentes que facilitan el transporte a través de la
membrana de la célula (por ejemplo, Letsinger et al., 1989,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre
et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:648-652; publicación PCT número WO 88/09810) o de
la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, publicación PCT
número WO 89/10134). Además, los oligonucleótidos pueden
modificarse con agentes de escisión desencadenados por la
hibridación (por ejemplo, Krol et al., 1988,
Bio-Techniques 6:958-976) o agentes
de intercalación (por ejemplo, Zon, 1988, Pharm. Res.
5:539-549). Para este fin, el oligonucleótido puede
conjugarse con otra molécula, (por ejemplo, un péptido, agente de
reticulación desencadenado por la hibridación, agente de transporte
o agente de escisión desencadenado por la hibridación).
La invención también incluye moléculas de sonda
y cebador de oligonucleótido de baliza molecular que tienen al
menos una región que es complementaria al ácido nucleico de 13245
de la invención, dos regiones complementarias, una que tiene un
fluoróforo y otra que tiene una molécula de extinción, de tal
manera que la baliza molecular es útil para cuantificar la
presencia del ácido nucleico de 13245 de la invención en una
muestra. Los ácidos nucleicos de baliza molecular se describen, por
ejemplo, en la patente de los EE.UU. número 5.854.033, la patente
de los EE.UU. número 5.866.336, y la patente de los EE.UU. número
5.876.930.
En otro aspecto, la invención se caracteriza por
una proteína 13245 aislada, o fragmento, por ejemplo, una parte
biológicamente activa, para su uso como inmunógenos o antígenos
para obtener o probar (o más generalmente para unir) anticuerpos
anti-13245. La proteína 13245 puede aislarse de
fuentes celulares o tisulares utilizando técnicas de purificación
de proteínas convencionales. La proteína 13245 o fragmentos de la
misma pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante o
pueden sintetizarse químicamente.
Los polipéptidos de la invención incluyen los
que se obtienen como resultado de la existencia de múltiples genes,
acontecimientos de transcripción alternativos, acontecimientos de
corte y empalme de ARN alternativos, y acontecimientos de
traducción y posteriores a la traducción alternativos. El
polipéptido puede expresarse en sistemas, por ejemplo, células
cultivadas, que dan como resultado sustancialmente las mismas
modificaciones tras la traducción presentes cuando el polipéptido
se expresa en, una célula nativa, o en sistemas que dan como
resultado la alteración o la omisión de las modificaciones tras la
traducción, por ejemplo, glucosilación o escisión, presentes cando
se expresan en una célula nativa.
En una realización preferida, un polipéptido
13245 tiene una o más de las características siguientes:
(1) cataliza la formación de un enlace covalente
con o entre un residuo de aminoácido y un resto fosfato;
(2) modula la capacidad de contracción de la
célula;
(3) modula el crecimiento de la célula;
(4) modula la conductividad de la célula;
(5) modula la entrada de una célula en el ciclo
celular;
(6) modula la progresión de una célula a través
del ciclo celular;
(7) modula la mitogénesis;
(8) modula el metabolismo celular; y
(9) modula la transcripción génica;
(10) cataliza la interconversión de formas
fosforiladas y no fosforiladas de una GTPasa, tal como una GTPasa
Rho;
(11) modula la citocinesis;
(12) modula la forma celular;
(13) modula el movimiento celular (por ejemplo,
metástasis tumoral);
(14) modula la integración de un genoma viral en
el genoma de una célula huésped;
(15) modula el mantenimiento de un genoma viral
dentro del genoma de una célula huésped;
(16) modula los cambios citológicos en una
célula huésped infectada por virus;
(17) modula la producción de virus en una célula
huésped infectada por virus;
(18) modula la interacción de un virión con una
membrana de una célula huésped infectada por virus;
(19) modula la encapsulación de un virión dentro
de una parte de una membrana de una célula huésped infectada por
virus;
(20) tiene un peso molecular, una composición de
aminoácidos u otras características físicas de una proteína 13245
de SEQ ID NO: 2;
(21) tiene una similitud de secuencia global
(identidad) de al menos el 60-65%, preferiblemente
de al menos el 70%, más preferiblemente de al menos el 75, 80, 85,
86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% o más, con
una parte de SEQ ID NO: 2;
(22) tiene un dominio CNH que es preferiblemente
de aproximadamente el 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% o
más, idéntico a los residuos de aminoácidos
1568-1865 de SEQ ID NO: 2; o
(23) tiene al menos un dominio pquinasa que es
preferiblemente de aproximadamente el 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%,
98%, o 99% o más, idéntico a los residuos de aminoácidos
97-360 de SEQ ID NO: 2.
En una realización preferida, la proteína 13245
o el fragmento de la misma difiere sólo insustancialmente, si
acaso, de la secuencia correspondiente en SEQ ID NO: 2. En una
realización, difiere en al menos uno, pero en menos de 15, 10 ó 5
residuos de aminoácidos. En otra, difiere de la secuencia
correspondiente en la SEQ ID NO: 2 en al menos un residuo, pero
menos del 20%, 15%, 10% o 5% de los residuos difieren de la
secuencia correspondiente en SEQ ID NO: 2 (si esta comparación
requiere la alineación de las secuencias, deben alinearse para una
homología máxima. Las secuencias que sobresalen "en bucles"
("looped out") procedentes de deleciones o inserciones, o los
apareamientos erróneos, se consideran diferencias). Las diferencias
son, preferiblemente, diferencias o cambios en un residuo de
aminoácidos no esencial o suponen una sustitución conservativa de
un residuo por otro. En una realización preferida, las diferencias
no se producen en los residuos 97-360 ni en
1568-1865 de la SEQ ID NO: 2.
Otras realizaciones incluyen una proteína que
tiene uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos, con
respecto a la SEQ ID NO: 2 (por ejemplo, un cambio en un residuo de
aminoácido que no es esencial para la actividad). Tales proteínas
13245 que difieren en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,
todavía conservan su actividad biológica.
En una realización, la proteína incluye una
secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 60%, 65%,
70%, 75%, 80%,85%, 90%, 95%, 98% o más homóloga a la SEQ ID NO:
2.
Se proporciona una proteína 13245 o fragmento
que tiene una secuencia de aminoácidos que varía de la SEQ ID NO: 2
en una o ambas regiones correspondientes a los residuos
1-96, 361-1567, y
1866-2053 de la SEQ ID NO: 2 en al menos uno, pero
en menos de 15, 10 ó 5 residuos de aminoácidos, pero que no difiere
de la SEQ ID NO: 2 en la región correspondiente a los residuos
97-360 y 1568-1865 de la SEQ ID NO:
2 (si esta comparación requiere la alineación de las secuencias,
deben alinearse para una homología máxima. Las secuencias que
sobresalen "en bucles" ("looped out") procedentes de
deleciones o inserciones, o los apareamientos erróneos, se
consideran diferencias). En algunas realizaciones, la diferencia
está en un residuo no esencial o es una sustitución conservativa,
mientras que en otras, la diferencia está en un residuo esencial o
es una sustitución no conservativa.
Una parte biológicamente activa de una proteína
13245 debe incluir el dominio pquinasa de 13245, el dominio CNH de
13245, o ambos. Además, otras partes biológicamente activas, en las
que están delecionadas otras regiones de la proteína, pueden
prepararse mediante técnicas recombinantes y evaluarse para
determinar una o más de las actividades funcionales de una proteína
13245 nativa.
En una realización preferida, la proteína 13245
tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2. En otras
realizaciones, la proteína 13245 es sustancialmente idéntica a SEQ
ID NO: 2. Aún en otra realización, la proteína 13245 es
sustancialmente idéntica a SEQ ID NO: 2 y conserva la actividad
funcional de la proteína de SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la invención proporciona
proteínas de fusión o quiméricas 13245. Tal como se usa en el
presente documento, una "proteína quimérica" o "proteína de
fusión" 13245'' incluye un polipéptido 13245 unido a un
polipéptido distinto de 13245. Un "polipéptido distinto de
13245" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos correspondiente a una proteína que no es
sustancialmente homóloga a la proteína 13245, por ejemplo, una
proteína que es diferente de la proteína 13245 y que se deriva del
mismo organismo o uno diferente. El polipéptido 13245 de la
proteína de fusión puede corresponder a todo o a una parte, por
ejemplo, un fragmento descrito en el presente documento de una
secuencia de aminoácidos de 13245. En una realización preferida, una
proteína de fusión 13245 incluye al menos una o más partes
biológicamente activas de una proteína 13245. El polipéptido
distinto de 13245 puede unirse al extremo amino o carboxilo
terminal del polipéptido 13245.
La proteína de fusión puede incluir un resto que
tiene una alta afinidad por un ligando. Por ejemplo, la proteína de
fusión puede ser una proteína de fusión GST-13245
en la que las secuencias de 13245 se unen al extremo carboxilo
terminal de las secuencias de GST. Las proteínas de fusión de este
tipo pueden facilitar la purificación de 13245 recombinante.
Alternativamente, la proteína de fusión puede ser una proteína
13245 que contiene una secuencia señal heteróloga en su extremo
amino terminal. En ciertas células huésped (por ejemplo, células
huésped de mamífero), la expresión y/o la secreción de 13245 pueden
aumentarse mediante el uso de una secuencia señal heteróloga.
Las proteínas de fusión pueden incluir toda o
una parte de una proteína sérica, por ejemplo, una región constante
de la IgG, o albúmina sérica humana.
Las proteínas de fusión 13245 de la invención
pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas y administrarse
al sujeto in vivo. Las proteínas de fusión 13245 pueden
usarse para afectar a la biodisponibilidad de un sustrato 13245.
Las proteínas de fusión 13245 pueden ser útiles terapéuticamente y
para el tratamiento de los trastornos producidos, por ejemplo, por
(i) modificación o mutación aberrante de un gen que codifica para
una proteína 13245; (ii) regulación defectuosa del gen 13245; y
(iii) modificación aberrante tras la traducción de una proteína
13245.
Además, las proteínas de fusión 13245 de la
invención pueden usarse como inmunógenos para producir anticuerpos
anti-13245 en un sujeto, para purificar ligandos de
13245 y en ensayos de selección para identificar moléculas que
inhiben la interacción de 13245 con un sustrato de 13245.
Se dispone comercialmente de vectores de
expresión que ya codifican para un resto de fusión (por ejemplo, un
polipéptido GST). Un ácido nucleico que codifica para 13245 puede
clonarse en un vector de expresión de este tipo, de tal manera que
el resto de fusión está unido en marco a la proteína 13245.
En otro aspecto, la invención también se
caracteriza por una variante de un polipéptido 13245, por ejemplo,
que funciona como un agonista (miméticos) o como un antagonista.
Las variantes de las proteínas 13245 pueden generarse mediante
mutagénesis, por ejemplo, mutación puntual diferenciada, la
inserción o la deleción de secuencias o el truncamiento de una
proteína 13245. Un agonista de las proteínas 13245 puede conservar
sustancialmente las mismas, o un subconjunto, de las actividades
biológicas de la forma que se produce en la naturaleza de una
proteína 13245. Un antagonista de una proteína 13245 puede inhibir
una o más de las actividades de la forma que se produce en la
naturaleza de la proteína 13245 mediante, por ejemplo, modulando
competitivamente una actividad mediada por 13245 de una proteína
13245. Por tanto, pueden provocarse efectos biológicos específicos
mediante el tratamiento con una variante de función limitada.
Preferiblemente, el tratamiento de un sujeto con una variante que
tiene un subconjunto de las actividades biológicas de la forma que
se produce en la naturaleza de la proteína, tiene menos efectos
secundarios en un sujeto con respecto al tratamiento con la forma
que se produce en la naturaleza de la proteína 13245.
Las variantes de una proteína 13245 pueden
identificarse seleccionando bibliotecas combinatorias de mutantes,
por ejemplo, mutantes por truncamiento, de una proteína 13245 para
determinar su actividad agonista o antagonista.
Las bibliotecas de fragmentos por ejemplo,
fragmentos amino-terminal,
carboxilo-terminal, o fragmentos internos, de una
secuencia que codifica para la proteína 13245 pueden usarse para
generar una población variegada de fragmentos para la detección y
posterior selección de las variantes de una proteína 13245.
Se prefieren particularmente variantes en los
que se añade o se deleciona un residuo de cisteína o en los que se
añade o se deleciona un residuo que está glicosilado.
Procedimientos para seleccionar productos
génicos de bibliotecas combinatorias compuestas por mutaciones
puntuales o truncamiento, y para seleccionar bibliotecas de ADNc
para productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. La
mutagénesis conjunta recurrente (REM, recursive ensemble
mutagenesis), una técnica que aumenta la frecuencia de los mutantes
funcionales en las bibliotecas, puede usarse en combinación con los
ensayos de selección para identificar variantes de 13245 (Arkin
et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:7811-7815; Delgrave et al., 1993, Protein
Engr. 6:327-331).
Pueden aprovecharse ensayos basados en células
para analizar una biblioteca de 13245 variegada. Por ejemplo, una
biblioteca de vectores de expresión puede transfectarse a una línea
celular, por ejemplo, una línea celular que normalmente responde a
13245 en una manear dependiente del sustrato. Las células
transfectadas se ponen entonces en contacto con 13245 y el efecto de
la expresión del mutante sobre la señalización por el sustrato de
13245 puede detectarse, por ejemplo, midiendo los cambios, en el
crecimiento celular y/o la actividad enzimática. Entonces puede
recuperarse el ADN de plásmido de las células detectan para la
inhibición, o alternativamente, la potenciación de la señalización
por el sustrato de 13245, y los clones individuales caracterizados
adicionalmente.
En otro aspecto, la invención muestra un
procedimiento de preparación de un polipéptido 13245, por ejemplo,
un péptido que tiene una actividad de tipo no natural, por ejemplo,
un antagonista, agonista, o superagonista de un polipéptido 13245
que se produce de manera natural, por ejemplo, un polipéptido 13245
que se produce de manera natural. El procedimiento incluye: alterar
la secuencia de un polipéptido 13245, por ejemplo, alterar la
secuencia, por ejemplo, mediante sustitución o deleción de uno o
más residuos de una región no conservada, un dominio o residuo
descritos en el presente documento, y someter a prueba el
polipéptido alterado para determinar la actividad deseada.
En otro aspecto, la invención muestra un
procedimiento de preparación de un fragmento o análogo de un
polipéptido 13245, una actividad biológica de un polipéptido 13245
que se produce de manera natural. El procedimiento incluye: alterar
la secuencia, por ejemplo, mediante la sustitución o deleción de uno
o más residuos, de un polipéptido 13245, por ejemplo, alterar la
secuencia de una región no conservada, o un dominio o residuo
descritos en el presente documento, y someter a prueba el
polipéptido alterado para determinar la actividad deseada.
En otro aspecto, la invención proporciona un
anticuerpo anti-1 3245. El término
"anticuerpo" tal como se usa en el presente documento se
refiere a una molécula de inmunoglobulina o una parte
inmunológicamente activa de la misma, es decir, una parte que se
une a antigéno. Ejemplos de partes inmunológicamente activas de
moléculas de inmunoglobulina incluyen fragmentos F(ab) y
F(ab')_{2} que pueden generarse tratando el anticuerpo con
una enzima tal como la pepsina.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo
policlonal, monoclonal, recombinante, por ejemplo, uno quimérico o
humanizado, completamente humano, no humano, por ejemplo, murino, o
de monocatenario. En una realización preferida, tiene una función
efectora y puede fijar un complemento. El anticuerpo puede
acoplarse a una toxina o a un agente trazador.
Una proteína 13245 de longitud completa o, un
fragmento peptídico antigénico de 13245 pueden usarse como
inmunógeno o pueden usarse para identificar anticuerpos
anti-13245 formados por otros inmunógenos, por
ejemplo, células, preparaciones de membrana, y similares. El
péptido antigénico de 13245 debe incluir al menos 8 residuos de
aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQID NO:
2 y engloba un epítopo de 13245. Preferiblemente, el péptido
antigénico incluye al menos 10 residuos de aminoácidos, más
preferiblemente al menos 15 residuos de aminoácidos, aún más
preferiblemente al menos 20 residuos de aminoácidos, y lo más
preferiblemente al menos 30 residuos de aminoácidos.
\newpage
Los fragmentos de 13245 que incluyen
aproximadamente los residuos 195-210 de la SEQ ID
NO: 2 pueden usarse para preparar anticuerpos, por ejemplo, para su
uso como inmunógenos o para caracterizar la especificidad de un
anticuerpo, contra regiones hidrófobas de la proteína 13245. De
manera similar, un fragmento de 13245 que incluye aproximadamente
los residuos 455-475 de la SEQ ID NO: 2 puede
usarse para preparar un anticuerpo contra una región hidrófila de
la proteína 13245.
Se proporcionan anticuerpos reactivos con, o
específicos para, cualquiera de estas regiones, u otras regiones o
dominios descritos en el presente documento.
Los epítopos preferidos englobados para el
péptido antigénico son regiones de 13245 situadas en la superficie
de la proteína, por ejemplo, regiones hidrófilas, así como regiones
con una alta antigenicidad. Por ejemplo, puede usarse un análisis
de probabilidad de superficie de Emini de la secuencia de proteínas
humanas 13245 para indicar las regiones que tienen una probabilidad
particularmente alta de estar situadas en la superficie de la
proteína 13245 y por tanto, es probable que constituyan los
residuos superficiales útiles para seleccionar como diana la
producción de anticuerpos.
En una realización preferida, el anticuerpo se
une a un epítopo en cualquier dominio o región sobre proteínas
13245 descritas en el presente documento.
Los anticuerpos quiméricos, humanizados, pero lo
más preferiblemente, completamente humanos son deseables para
aplicaciones que incluyen una administración repetida, por ejemplo,
tratamiento terapéutico (y algunas aplicaciones diagnósticas) de
pacientes humanos.
El anticuerpo anti-13245 puede
ser un anticuerpo monocatenario. Un anticuerpo monocatenario (scFV)
puede modificarse mediante ingeniería genética (por ejemplo,
Colcher et al., 1999, Ann. N.Y. Acad. Sci.
880:263-280; Reiter, 1996, Clin. Cancer Res.
2:245-252). El anticuerpo monocatenario puede
dimerizarse o multimerizarse para generar anticuerpos multivalentes
que tienen especificidades para diferentes epítopos de la misma
proteína 13245 diana.
En una realización preferida, el anticuerpo
tiene una capacidad reducida o ninguna capacidad para unirse a un
receptor Fc. Por ejemplo, puede ser un isótopo, subtipo, fragmento
u otro mutante, que no contribuye a la unión a un receptor Fc, por
ejemplo, puede tener una región de unión a receptor Fc mutada o
delecionada.
Un anticuerpo anti-13245 (por
ejemplo, anticuerpo monoclonal) puede usarse para aislar 13245
mediante técnicas convencionales, tal como cromatografía de
afinidad o inmunoprecipitación. Además, un anticuerpo
anti-13245 puede usarse para detectar la proteína
13245 (por ejemplo, en un lisado celular o sobrenadante celular)
con el fin de evaluar la abundancia y el patrón de expresión de la
proteína. Los anticuerpos anti-13245 pueden usarse
de manera diagnóstica para monitorizar los niveles de proteína en
el tejido como parte de un procedimiento de pruebas clínicas, por
ejemplo, para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de
tratamiento dado. La detección puede facilitarse acoplando (es
decir, uniendo físicamente) el anticuerpo a una sustancia
detectable (es decir, etiquetado de anticuerpo). Ejemplos de
sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos,
materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales
bioluminiscentes y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas
adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina,
beta-galactosidasa, o acetil colinesterasa; ejemplos
de complejos de grupo prostético adecuados incluyen
estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales
fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína,
isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina
fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un
material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales
bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y ecuorina, y
ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen ^{125}I,
^{131}I, ^{35}S o ^{3}H.
En otro aspecto, la invención incluye, vectores,
preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido
nucleico que codifica para un polipéptido descrito en el presente
documento. Tal como se usa en el presente documento, el término
"vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede
transportar otro ácido nucleico al que se ha unido y puede incluir
un plásmido, cósmido o vector viral. El vector puede llevar a cabo
una replicación autónoma o puede integrarse en un ADN huésped. Los
vectores virales incluyen, por ejemplo, virus adenoasociados,
adenovirus o retrovirus con replicación defectuosa.
Un vector puede incluir un ácido nucleico de
13245 en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en
una célula huésped. Preferiblemente el vector de expresión
recombinante incluye una o más secuencias reguladoras unidas de
manera funcional a la secuencia de ácidos nucleicos que va a
expresarse. El término "secuencia reguladora" incluye
promotores, potenciadores y otros elementos de control de la
expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Las secuencias
reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva
de una secuencia de nucleótidos, así como secuencias inducibles y/o
reguladoras específicas de tejido. El diseño del vector de expresión
puede depender de tales factores como la elección de la célula
huésped que va a transformarse, el nivel de expresión deseado de la
proteína, y similares. Los vectores de expresión de la invención
pueden introducirse en las células huésped para producir de este
modo proteínas o polipéptidos, incluyendo proteínas o polipéptidos
de fusión, codificados por ácidos nucleicos tal como se describe en
el presente documento (por ejemplo, proteínas 13245, formas
mutantes de proteínas 13245, proteínas de fusión, y similares).
Los vectores de expresión recombinantes de la
invención pueden diseñarse para la expresión de proteínas 13245 en
células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, los polipéptidos de
la invención pueden expresarse en E. coli, células de
insecto (por ejemplo, usando vectores de expresión de baculovirus),
células de levadura o células de mamífero. Las células huésped
adecuadas se tratan adicionalmente en Goeddel (1990, Gene Expression
Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego).
Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede
transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo usando
secuencias reguladoras del promotor de T7 y polimerasa de T7.
La expresión de proteínas en procariotas se
lleva a cabo en la mayoría de los casos en E. coli con
vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que
dirigen la expresión de cualquier proteína de fusión o no de fusión.
Los vectores de fusión añaden un número de aminoácidos a una
proteína codificada en los mismos, normalmente al extremo
aminoterminal de la proteína recombinante. Tales vectores de fusión
sirven normalmente para tres fines: 1) aumentar la expresión de
proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína
recombinante; y 3) ayudar en la purificación de la proteína
recombinante actuando como un ligando en la purificación por
afinidad. Con frecuencia, se introduce un sitio de escisión
proteolítica en la zona de empalme del resto de fusión y la proteína
recombinante para permitir la separación de la proteína
recombinante del resto de fusión posterior a la purificación de la
proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de
reconocimiento relacionadas, incluyen Factor Xa, trombina y
enteroquinasa. Vectores de expresión de fusión típicos incluyen
pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith et al., 1988, Gene
67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA)
y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan la glutatión
S-transferasa (GST), proteína de unión a la maltosa
E, o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante
diana.
Las proteínas de fusión purificadas pueden
usarse en ensayos de actividad de 13245, (por ejemplo, ensayos
directos o ensayos competitivos descritos en detalle a
continuación), o para generar anticuerpos específicos para proteínas
13245. En una realización preferida, puede usarse una proteína de
fusión expresada en una vector de expresión retroviral de la
presente invención para infectar células de la médula espinal que
se trasplantan posteriormente en receptores irradiados. Se examina
entonces la patología del receptor objeto tras haber pasado un
tiempo suficiente (por ejemplo, seis semanas).
Para maximizar la expresión de proteína
recombinante en E. coli, se expresa la proteína en una cepa
bacteriana huésped con una capacidad alterada para escindir de
manera proteolítica la proteína recombinante (Gottesman, 1990, Gene
Expresión Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San
Diego, 119-128). Otra estrategia es alterar la
secuencia de ácidos nucleicos del ácido nucleico que va a
insertarse en un vector de expresión de modo que los codones
individuales para cada aminoácido son los utilizados preferentemente
en E. coli (Wada et al., 1992, Nucl. Acids Res.
20:2111-2118). Tal alteración de las secuencias de
ácidos nucleicos de la invención puede llevarse a cabo mediante
técnicas de síntesis de ADN convencionales.
El vector de expresión de 13245 puede ser un
vector de expresión de levadura, a vector para la expresión en
células de insectos, por ejemplo, un vector de expresión de
baculovirus, o un vector adecuado para la expresión en células de
mamífero.
Cuando se usan en células de mamíferos, las
funciones de control del vector de expresión se proporcionan con
frecuencia por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los
promotores virales usados comúnmente se derivan de polioma,
adenovirus 2, citomegalovirus y virus del simio 40 (SV40).
En otra realización, el vector de expresión
recombinante de mamífero puede dirigir la expresión del ácido
nucleico preferentemente en un tipo de células particular (por
ejemplo, se usan elementos reguladores específicos de tejido para
expresar el ácido nucleico). Ejemplos no limitativos de promotores
específicos de tejido adecuados incluyen el promotor de albúmina
(específico del hígado; Pinkert et al., 1987, Genes Dev.
1:268-277), promotores específicos de linfoides
(Calame et al., 1988, Adv. Immunol.
43:235-275), en particular promotores de receptores
de célula T (Winoto et al., 1989, EMBO J.
8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et
al., 1983, Cell 33:729-740; Queen et al.,
1983, Cell 33:741-748), promotores específicos de
neurona (por ejemplo, el promotor de neurofilamentos; Byrne et
al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:5473-5477), promotores específicos del páncreas
(Edlund et al., 1985, Science 230:912-916), y
promotores específicos de glándulas mamarias (por ejemplo, promotor
de la proteína del lactosuero; patente de los EE.UU. número
4.873.316 y solicitud de patente europea número de publicación
264.166). También se engloban promotores reguladores de desarrollo,
por ejemplo, los promotores hox murinos (Kessel et al., 1990,
Science 249:374-379) y el promotor de la
alfa-fetoproteína (Campes et al., 1989, Genes
Dev. 3:537-546).
La invención proporciona además un vector de
expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de la
invención clonada en el vector de expresión en una orientación
antisentido. Pueden elegirse secuencias reguladoras (por ejemplo,
potenciadores y/o promotores virales) unidas de manera funcional a
un ácido nucleico clonado en la orientación antisentido que dirigen
la expresión constitutiva, específica de tejido o específica de
tipo de célula de ARN antisentido en una variedad de tipo de
células. El vector de expresión antisentido puede estar en la forma
de un plásmido recombinante, fagómido o virus atenuado. Para una
discusión de la regulación de la expresión génica usando genes
antisentido, véase Weintraub, H. et al. (1986, Trends Genet.
1:Review).
Otro aspecto la invención proporciona una célula
huésped que incluye una molécula de ácido nucleico descrita en el
presente documento, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de
13245 dentro de un vector de expresión recombinante o una molécula
de ácido nucleico de 13245 que contiene secuencias que le permiten
recombinarse de manera homóloga en un sitio específico del genoma
de la célula huésped. Los términos "célula huésped" y
"célula huésped recombinante" se usan de manera intercambiable
en el presente documento. Tales términos no sólo se refieren a la
célula sujeto particular, sino también a la progenie o progenie
potencial de una célula de este tipo. Debido a que pueden
producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido
o bien a una mutación o bien a influencias ambientas, tal progenie
puede no ser, de hecho, idéntica a la célula madre, pero se
incluyen en el alcance del término tal como se usa en el presente
documento.
Una célula huésped puede ser cualquier célula
procariota o eucariota. Por ejemplo, una proteína 13245 puede
expresarse en células bacterianas tal como E. coli, células
de insecto, células de levadura o de mamífero (tal como células de
ovario de hámster chino (CHO)) o células COS. Otras células huésped
adecuadas se conocen por los expertos en la técnica.
Puede introducirse un vector de ADN en células
huésped por medio de técnicas de transfección o transformación
convencional. Tal como se usan en el presente documento, los
términos "transformación" y "transfección" pretenden
hacer referencia a una variedad de técnicas reconocidas en la
técnica para introducir ácido nucleico foráneo (por ejemplo, ADN)
en una célula huésped, incluyendo coprecipitación con fosfato de
calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por
DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación.
Una célula huésped de la invención puede usarse
para producir (es decir, expresar) una proteína 13245. En
consecuencia, la invención proporciona además procedimientos para
producir una proteína 13245 usando las células huésped de la
invención. En una realización, el procedimiento incluye cultivar la
célula huésped de la invención (en la que se ha introducido un
vector de expresión recombinante que codifica para una proteína
13245) en un medio adecuado de tal modo que se produce una proteína
13245. En otra realización, el procedimiento incluye además aislar
una proteína 13245 del medio o de la célula huésped.
En otro aspecto, la invención muestra, una
célula o preparación purificada de células que incluye un transgén
13245, o que de otra manera expresa erróneamente 13245. La
preparación celular puede consistir en células humanas o no
humanas, por ejemplo, células de roedor, por ejemplo, células de
ratón o de rata, células de conejo o células de cerdo. En
realizaciones preferidas, la célula o células incluyen un transgén
13245, por ejemplo, una forma heteróloga de un 13245, por ejemplo,
un gen derivado de humanos (en el caso de una célula no humana). El
transgén 13245 puede expresarse erróneamente, por ejemplo,
sobreexpresarse o subexpresarse. En otras realizaciones preferidas,
la célula o células incluyen un gen que expresa erróneamente un
13245 endógeno, por ejemplo, un gen cuya expresión está alterada,
por ejemplo, una desactivación. Tales células pueden servir como
modelo para trastornos que están relacionados con alelos de 13245
expresados erróneamente o mutados o para su uso en la selección de
fármacos.
En otro aspecto, la invención incluye, una
célula humana, por ejemplo, una célula madre hematopoyética,
transformada con ácido nucleico que codifica para un polipéptido
13245 objeto.
También se proporcionan células, preferiblemente
células humanas, por ejemplo, células de fibroblasto o
hematopoyéticas humanas, en las que un 13245 endógeno está bajo el
control de una secuencia reguladora que no controla normalmente la
expresión del gen 13245 endógeno. Las características de expresión
de un gen endógeno dentro de una célula, por ejemplo, una línea
celular o microorganismo, puede modificarse insertando un elemento
regulador de ADN heterólogo en el genoma de la célula de tal modo
que el elemento regulador insertado está unido operativamente al
gen 13245 endógeno. Por ejemplo, un gen 13245 endógeno que es
"transcripcionalmente silencioso", por ejemplo, no se expresa
normalmente, o se expresa sólo a niveles muy bajos, puede activarse
insertando un elemento regulador que puede promover la expresión de
un producto génico expresado normalmente en esa célula. Pueden
usarse técnicas tales como la recombinación homóloga seleccionada
como diana para insertar el ADN heterólogo tal como se describe
(por ejemplo, patentes de los EE.UU. número 5.272.071; PCT número
de publicación WO 91/06667).
La invención proporciona animales transgénicos
no humanos. Tales animales son útiles para estudiar la función y/o
actividad de una proteína 13245 y para identificar y/o evaluar
moduladores de la actividad de 13245. Tal como se usa en el
presente documento, un "animal transgénico" es un animal no
humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un roedor
tal como una rata o un ratón, en el que una o más de las células
del animal incluye un transgén. Otros ejemplos de animales
transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas,
cabras, pollos, anfibios y similares. Un transgén es ADN exógeno o
una transposición, por ejemplo una deleción de ADN cromosómico
endógeno, que preferiblemente se integra dentro o se produce en el
genoma de las células de un animal transgénico. Un transgén puede
dirigir la expresión de un producto génico codificado en uno o más
tipos de células o tejidos del animal transgénico, otros
transgenes, por ejemplo uno noqueado, reducen la expresión. Por
tanto, un animal transgénico puede ser uno en el que se ha alterado
un gen 13245 endógeno, por ejemplo, mediante recombinación homóloga
entre los genes endógenos y una molécula de ADN exógeno introducida
en una célula del animal (por ejemplo, una célula embrionaria del
animal, antes del desarrollo del animal).
También pueden incluirse las secuencias
intrónicas y las señales de poliadenilación en el transgén para
aumentar la eficacia de la expresión del transgén. Una(s)
secuencia(s) reguladora(s) específica(s) de
tejidos, puede unirse de manera operable a un transgén de la
invención para dirigir la expresión de una proteína 13245 hacia las
células particulares. Puede identificarse un animal fundador
transgénico basándose en la presencia de un transgén 13245 en su
genoma y/o la expresión de ARNm de 13245 en tejidos o células del
animal. Entonces puede utilizarse un animal fundador transgénico
para reproducir animales adicionales que porten el transgén.
Además, los animales transgénicos que portan un transgén que
codifica para una proteína 13245 pueden reproducirse además para
obtener otros animales transgénicos que portan otros
transgenes.
Las proteínas 13245 o los polipéptidos pueden
expresarse en plantas o animales transgénicos, por ejemplo un ácido
nucleico que codifica para una proteína o polipéptido puede
introducirse dentro del genoma de un animal. En las realizaciones
preferidas el ácido nucleico se coloca bajo el control de un
promotor específico de tejido, por ejemplo, un promotor específico
de huevos o leche, y se recupera a partir de la leche o huevos
producidos por el animal. Los animales adecuados son ratones,
cerdos, vacas, cabras y ovejas.
La invención también incluye una población de
células a partir de un animal transgénico, tal como se trata, por
ejemplo a continuación.
Las moléculas de ácido nucleico, proteínas,
homólogos de proteínas, y anticuerpos descritos en el presente
documento, pueden usarse en uno o más de los siguientes
procedimientos: a) ensayos de selección; b) medicina predictiva
(por ejemplo, ensayos de diagnóstico, ensayos de pronóstico, ensayos
clínicos de monitorización, y farmacogenéticas); y c)
procedimientos de tratamiento (por ejemplo, terapéutico y
profiláctico). Las moléculas aisladas de ácido nucleico de la
invención pueden usarse, por ejemplo, para expresar una proteína
13245 (por ejemplo, a través de un vector de expresión recombinante
en una célula huésped en aplicaciones de terapia génica), para
detectar un ARNm de 13245 (por ejemplo, en una muestra biológica),
para detectar una alteración genética en un gen 13245 y para
modular la actividad de 13245, tal como se describe más adelante.
Las proteínas 13245 pueden usarse para tratar trastornos
caracterizados por la producción excesiva o insuficiente de un
sustrato de 13245 o la producción de inhibidores de 13245. Además,
las proteínas 13245 pueden usarse para seleccionar los sustratos de
13245 que se producen de manera natural, para seleccionar fármacos
o compuestos que modulan la actividad de 13245, así como para
tratar trastornos caracterizados por una producción excesiva o
insuficiente de proteína 13245 o la producción de formas de proteína
13245 que tienen actividad disminuida, aberrante o no deseada en
comparación con la proteína 13245 de tipo natural. Los trastornos a
modo de ejemplo incluyen aquellos en los que la fosforilación de
proteínas es aberrante (por ejemplo, distrofias miotónicas y
musculares). Además, los anticuerpos anti-13245 de
la invención pueden usarse para detectar y aislar proteínas 13245,
regular la biodisponibilidad de las proteínas 13245, y modular la
actividad de 13245.
Se proporciona un procedimiento de evaluación de
un compuesto para determinar la capacidad de interaccionar con, por
ejemplo, unirse a, un polipéptido 13245 de un sujeto. Los
procedimientos incluyen: poner en contacto el compuesto con el
polipéptido 13245 de un sujeto; y evaluar la capacidad del
compuesto de interaccionar con, por ejemplo, unirse a o formar un
complejo con, el polipéptido 13245 de un sujeto. Este procedimiento
puede realizarse in vitro, por ejemplo, en un sistema libre
de células, o in vivo, por ejemplo en un ensayo trampa de
interacción de dos híbridos. Este procedimiento puede usarse para
identificar moléculas que se producen de manera natural que
interaccionan con un polipéptido 13245 de un sujeto. También puede
usarse para encontrar inhibidores naturales o sintéticos de un
polipéptido 13245 de un sujeto. Los procedimientos de selección se
tratan en más detalle a continuación.
La invención proporciona procedimientos de
selección (también denominados en lo sucesivo en el presente
documento como "ensayos") para identificar moduladores, es
decir agentes o compuestos candidatos o de prueba (por ejemplo,
proteínas, péptidos, miméticos de péptidos, peptoides, moléculas
pequeñas u otros fármacos), que unidos con las proteínas 13245,
tienen un efecto estimulador o inhibidor sobre, por ejemplo, la
expresión de 13245 o la actividad de 13245, o tienen un efecto
estimulador o inhibidor sobre, por ejemplo, la expresión o
actividad de un sustrato de 13245. Los compuestos así identificados
pueden usarse para modular la actividad de productos génicos dianas
(por ejemplo genes 13245) en un protocolo terapéutico, para
elaborar la función biológica del producto génico diana, o para
identificar compuestos que interrumpen las interacciones del gen
diana.
En una realización, la invención proporciona
ensayos para seleccionar compuestos candidatos o de prueba que son
sustratos de una proteína o polipéptido 13245 o una parte
biológicamente activa de la misma. En otra realización, la
invención proporciona ensayos para seleccionar compuestos
candidatos o de prueba que se unen a o modulan la actividad de una
proteína o polipéptido 13245 o una parte biológicamente activa de
la misma.
Los compuestos de prueba de la presente
invención pueden obtenerse utilizando cualquiera de los numerosos
enfoques en los procedimientos de bibliotecas combinatorias
conocidos en la técnica, que incluyen: bibliotecas biológicas;
bibliotecas de peptoides (bibliotecas de moléculas que tienen las
funcionalidades de péptidos, pero con un esqueleto no peptídico
novedoso que son resistentes a la degradación enzimática, pero que
sin embargo siguen siendo bioactivas; por ejemplo, Zuckermann et
al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678-2685);
bibliotecas en fase de disolución o en fase sólida paralela
espacialmente direccionables; procedimientos de bibliotecas
sintéticas que requieren deconvolución; el procedimiento de
bibliotecas de "una perla, un compuesto"; y los procedimientos
de bibliotecas sintéticas que utilizan la selección por
cromatografía de afinidad. Los enfoques de la biblioteca biológica y
la biblioteca de peptoides se limitan a las bibliotecas de
péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques pueden aplicarse a
bibliotecas de compuestos de péptidos, oligómeros no peptídidos o
moléculas pequeñas (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145).
Se han descrito ejemplos de procedimientos para
la síntesis de bibliotecas moleculares (por ejemplo, DeWitt et
al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et
al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et
al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al., 1993,
Science 261:1303; Carrell et al., 1994, Angew. Chem. Int.
Ed. Engl. 33:2059; Careil et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed.
Engl. 33:2061; y Gallop et al., 1994, J. Med. Chem.
37:1233).
Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse
en disolución (por ejemplo, Houghten, 1992, Biotechniques
13:412-421), o en perlas (Lam, 1991, Nature
354:82-84), chips (Fodor, 1993, Nature
364:555-556), bacterias (patente de los EE.UU.
número 5.223.409), esporas (patente de los EE.UU. número
5.223.409), plásmidos (Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89: 1865-1869), o en fagos (Scott et
al., 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990,
Science 249:404-406; Cwirla et al., 1990,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; Felici,
1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; patente de los
EE.UU. número 5.223.409).
En una realización, un ensayo es un ensayo
basado en células en el que una célula que expresa una proteína
13245 o parte biológicamente activa de la misma se pone en contacto
con un compuesto de prueba, se determina la capacidad del compuesto
de prueba de modular la actividad de 13245. La determinación de la
capacidad del compuesto de prueba de modular la actividad de 13245
puede realizarse monitorizando, por ejemplo, los cambios en la
actividad enzimática. La célula, por ejemplo, puede ser de origen
mamífero.
También puede evaluarse la capacidad del
compuesto de prueba de modular la unión de 13245 a un compuesto,
por ejemplo un sustrato de 13245, o de unirse a 13245. Esto puede
realizarse, por ejemplo, mediante acoplamiento del compuesto, por
ejemplo, el sustrato, con un radioisótopo o etiqueta enzimática de
tal modo que la unión del compuesto, por ejemplo el sustrato, a
13245 puede determinarse detectando el compuesto marcado, por
ejemplo, sustrato, en un complejo. Alternativamente, 13245 puede
acoplarse con un radioisótopo o etiqueta enzimática para
monitorizar la capacidad del compuesto de prueba de modular la
unión de 13245 a un sustrato de 13245 en un complejo. Por ejemplo,
los compuestos (por ejemplo, sustratos de 13245) pueden marcarse con
^{125}I, ^{35}S, ^{14}C, o ^{3}H, o bien directa o bien
indirectamente, y el radioisótopo se detecta mediante recuento
directo de radioemisión o mediante recuento de centelleo.
Alternativamente, los compuestos pueden marcarse enzimáticamente
con, por ejemplo, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, o
luciferasa, y la etiqueta enzimática se detecta mediante la
determinación de conversión de un sustrato apropiado para el
producto.
Puede evaluarse la capacidad de un compuesto
(por ejemplo, un sustrato de 13245) de interaccionar con 13245 con
o sin la marcación de cualquiera de los compuestos que
interaccionan. Por ejemplo, puede usarse un microfisiómetro para
detectar la interacción de un compuesto con 13245 sin la marcación
del compuesto ni de 13245 (McConnell et al., 1992, Science
257:1906-1912). Tal como se usa en el presente
documento, un "microfisiómetro" (por ejemplo, Cytosensor) es
un instrumento analítico que mide la tasa a la que una célula
acidifica su medio usando un sensor potenciométrico direccionable
con la luz (LAPS). Pueden usarse los cambios en esta tasa de
acidificación como un indicador de la interacción entre un
compuesto y 13245.
En todavía otra realización, se proporciona un
ensayo libre de células en el que una proteína 13245 o parte
biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un
compuesto de prueba y se evalúa la capacidad del compuesto de
prueba de unirse a la proteína 13245 o parte biológicamente activa
de la misma. Las partes biológicamente activas preferidas de las
proteínas 13245 que van a usarse en los ensayos de la presente
invención, incluyen fragmentos que participan en las interacciones
con moléculas que no son 13245, por ejemplo fragmentos con altas
puntaciones de probabilidad superficial.
Las formas solubles y/o unidas a la membrana de
las proteínas aisladas (por ejemplo, proteínas 13245 o partes
biológicamente activas de las mismas) pueden usarse en los ensayos
libres de células de la invención. Cuándo se usan las formas unidas
a la membrana de la proteína, puede ser deseable utilizar un agente
de solubilización. Ejemplos de tales agentes de solubilización
incluyen detergentes no iónicos tales como
n-octilglucósido,
n-dodecilglucósido,
n-dodecilmaltósido,
octanoil-N-metilglucamida,
decanoil-N-metilglucamida, Triton®
X-100, Triton® X-114, Thesit®,
isotridecipoli(etilenglicol éter)n, sulfonato de
3-{(3-colamidopropil)dimetilamino}-1-propano
(CHAPS), sulfonato de
3-{(3-colamidopropil)dimetilamino}-2-hidroxi-1-propano
(CHAPSO), o sulfonato de
N-dodecil-N,
N-dimetil-3-amonio-1-propano.
Los ensayos libres de células implican preparar
una mezcla de reacción de la proteína génica diana y el compuesto
de prueba en condiciones y durante un tiempo suficiente para
permitir que los dos componentes interaccionen y se unan, formando
así un complejo que puede eliminarse y/o detectarse.
También puede detectarse la interacción entre
dos moléculas, por ejemplo, usando la transferencia de energía de
fluorescencia (FET; por ejemplo la patente de los EE.UU. número
5.631.169; la patente de los EE.UU. número 4.868.103). Una etiqueta
de fluoróforo se selecciona de tal modo que una primera energía de
fluorescencia emitida por una molécula donadora se absorberá
mediante una etiqueta fluorescente sobre una segunda molécula
"aceptora" que a su vez puede fluorescer debido a la energía
absorbida. Alternativamente, la molécula de proteína
"donadora" puede utilizar simplemente la energía de
fluorescencia natural de los residuos de triptófano. Las etiquetas
se seleccionan para que emitan diferentes longitudes de onda de
luz, de tal modo que la etiqueta de la molécula "aceptora"
puede diferenciarse de la de la "donadora". Puesto que la
eficacia de la transferencia de energía entre las etiquetas se
relaciona con la distancia de separación de las moléculas, puede
evaluarse la relación espacial entre las moléculas. En una
situación en la que se produce la unión entre las moléculas, la
emisión de fluorescencia de la etiqueta de la molécula
"aceptora" en el ensayo debe ser máxima. Un acontecimiento de
unión puede medirse por FET de manera conveniente a través de los
medios de detección fluorimétricos habituales bien conocidos en la
técnica (por ejemplo, utilizando un fluorímetro).
En otra realización, la determinación de la
capacidad de la proteína 13245 de unirse a la molécula diana puede
realizarse usando un análisis de interacción biomolecular en tiempo
real (BIA "biomolecular interaction analysis"; por ejemplo,
Sjolander et al., 1991, Anal. Chem.
63:2338-2345; Szabo et al., 1995, Curr. Opin.
Struct. Biol. 5:699-705). La "resonancia de
plasmón superificial" (SPR, "Surface plasmon resonance") o
"BIA" detecta interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin
marcar ninguno de los compuestos que interaccionan (por ejemplo,
BIAcore). Los cambios en la masa en la superficie de unión
(indicativos de un acontecimiento de unión) da como resultado
alteraciones del índice de refracción de la luz cerca de la
superficie (el fenómeno óptico de SPR), dando como resultado una
señal que puede detectarse que puede usarse como una indicación de
las reacciones en tiempo real entre moléculas
biológicas.
biológicas.
En una realización, el producto génico diana o
la sustancia de prueba se ancla en una fase sólida. Los complejos
de producto génico diana/compuesto de prueba anclados en la fase
sólida pueden detectarse al final de la reacción. Preferiblemente,
el producto génico diana puede anclarse en una superficie sólida, y
el compuesto de prueba, (que no está anclado), puede marcarse, o
bien directa o bien indirectamente, con etiquetas que pueden
detectarse tratadas en el presente documento.
Puede ser deseable inmovilizar o bien 13245, un
anticuerpo anti-13245 o bien su molécula diana para
facilitar la separación de las formas complejadas de las no
complejadas de una o ambas proteínas, así como para adaptar la
automatización del ensayo. La unión de un compuesto de prueba a una
proteína 13245, o interacción de una proteína 13245 con una
molécula diana en presencia y ausencia de un compuesto candidato,
puede realizarse en cualquier recipiente adecuado para contener los
reactivos. Ejemplos de tales recipientes incluyen placas de
microtitulación, tubos de ensayo y tubos de microcentrífuga. En una
realización, puede proporcionarse una proteína de fusión que añade
un dominio que permite que una o ambas proteínas se unan a una
matriz. Por ejemplo, las proteínas de fusión
13245/glutatión-S-transferasa o
proteínas de fusión
diana/glutatión-S-transferasa pueden
adsorberse en perlas de glutatión Sepharose^{TM} (Sigma Chemical,
St. Louis, MO) o placas de microtitulación derivadas de glutatión,
que se combinan después con el compuesto de prueba o el compuesto
de prueba y o bien la proteína diana no adsorbida o bien la proteína
13245, y se incuba la mezcla en condiciones que conducen a la
formación de complejo (por ejemplo, en condiciones fisiológicas de
sal y pH). Tras la incubación, las perlas o pocillos de la placa de
microtitulación se lavan para eliminar cualquier compuesto no
unido, se inmoviliza la matriz en el caso de las perlas, se
determina el complejo o bien directa o bien indirectamente, por
ejemplo, tal como se describió anteriormente. Alternativamente, los
complejos pueden disociarse de la matriz, y determinarse el nivel
de unión o actividad de 13245, usando técnicas habituales.
Otras técnicas para inmovilizar o bien una
proteína 13245 o bien una molécula diana sobre matrices, incluyen
el uso de conjugación de biotina y estreptavidina. Las moléculas
diana o la proteína 13245 biotiniladas pueden prepararse a partir
de biotin-N-hidroxisuccinimida
usando técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de
biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL), y se inmovilizan en
los pocillos de las placas de 96 pocillos recubiertos con
estreptavidina (Pierce Chemical).
Con el fin de llevar a cabo el ensayo, se añade
el componente no inmovilizado a la superficie recubierta que
contiene el componente anclado. Tras completarse la reacción, se
eliminan los componentes que no han reaccionado (por ejemplo,
mediante lavado) en condiciones tales que cualquiera de los
complejos formados siga estando inmovilizado sobre la superficie
sólida. La detección de complejos anclados sobre la superficie
sólida puede realizarse de diversas maneras. Si el componente
previamente no inmovilizado se marca previamente, la detección de
la etiqueta inmovilizada sobre la superficie indica que se formaron
los complejos. Si el componente previamente no inmovilizado no se
marca previamente, puede usarse una etiqueta indirecta para detectar
complejos anclados sobre la superficie; por ejemplo, usando un
anticuerpo marcado específico frente al componente inmovilizado (el
anticuerpo, a su vez, puede marcarse directamente o marcarse
indirectamente con por ejemplo, un anticuerpo
anti-Ig marcado).
En una realización, este ensayo se realiza
utilizando anticuerpos reactivos con la proteína 13245 o las
moléculas diana, pero que no interfiere con la unión de la proteína
13245 a su molécula diana. Tales anticuerpos pueden derivarse a los
pocillos de la placa y atraparse la proteína 13245 o diana no unida,
en los pocillos mediante la conjugación con anticuerpos. Los
procedimientos para detectar tales complejos, además de los
descritos anteriormente para los complejos inmovilizados con GST,
incluyen la inmunodetección de complejos usando anticuerpos
reactivos con la proteína 13245 o la molécula diana, así como
ensayos de unión a enzimas que se basan en detectar una actividad
enzimática asociada con la proteína 13245 o la molécula diana.
Alternativamente, los ensayos libres de células
pueden llevarse a cabo en una fase líquida. En un ensayo de este
tipo, los productos de reacción se separan de los componentes que
no han reaccionado, mediante cualquiera de las diversas técnicas
habituales, incluyendo, pero no se limita a: centrifugación
diferencial (por ejemplo, Rivas et al., 1993, Trends
Biochem. Sci. 18:284-287); cromatografía (por
ejemplo, cromatografía de filtración en gel o cromatografía de
intercambio iónico); electroforesis (por ejemplo, Ausubel et
al., eds., 1999, Current Protocolsin Molecular Biology, J.
Wiley, Nueva York); e inmunoprecipitación (por ejemplo, Ausubel,
anteriormente). Tales resinas y técnicas cromatográficas se conocen
bien por un experto en la técnica (por ejemplo, Heegaard, 1998, J.
Mol. Recognit. 11:141-148; Hage et al.,
1997, J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl.
699:499-525). Además, la transferencia de energía
de fluorescencia también puede utilizarse de manera conveniente,
tal como se describe en el presente documento, para detectar la
unión sin la purificación adicional del complejo de la
disolución.
En una realización preferida, el ensayo incluye
poner en contacto la proteína 13245 o una parte biológicamente
activa de la misma con un compuesto conocido que se une a 13245
para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de
ensayo con un compuesto de prueba, y determinar la capacidad del
compuesto de prueba de interaccionar con una proteína 13245, en el
que la determinación de la capacidad del compuesto de prueba de
interaccionar con una proteína 13245 incluye determinar la capacidad
del compuesto de prueba para unirse de manera preferente a 13245 o
a una parte biológicamente activa de la misma, o para modular la
actividad de una molécula diana, en comparación con el compuesto
conocido.
Los productos génicos diana de la invención
pueden interaccionar, in vivo, con una o más macromoléculas
celulares o extracelulares, tales como proteínas. Para los fines de
este estudio, tales macromoléculas celulares y extracelulares se
denominan en lo sucesivo en el presente documento como "parejas de
unión". Los compuestos que interrumpen tales interacciones
pueden ser útiles en la regulación de la actividad del producto
génico diana. Tales compuestos pueden incluir, pero no se limitan a
moléculas tales como anticuerpos, péptidos y moléculas pequeñas.
Los productos/genes diana preferidos para su uso en esta
realización son los genes 13245 identificados en el presente
documento. En una realización alternativa, la invención proporciona
procedimientos para determinar la capacidad del compuesto de prueba
de modular la actividad de una proteína 13245 a través de la
modulación de la actividad de un efector en el sentido de 3' de una
molécula diana de 13245. Por ejemplo, puede determinarse la
actividad de la molécula efectora en una diana apropiada, o puede
determinarse la unión del efector a una diana apropiada, tal como
se describió anteriormente.
Para identificar a los compuestos que
interfieren con la interacción entre el producto génico diana y
su(s) pareja(s) de unión celular o extracelular, se
prepara una mezcla de reacción que contiene el producto génico
diana y la pareja de unión, en condiciones y durante un tiempo
suficiente, para permitir que los dos productos formen un complejo.
Con el fin de probar un agente inhibidor, se proporciona la mezcla
de reacción en presencia y ausencia del compuesto de prueba. El
compuesto de prueba puede incluirse inicialmente en la mezcla de
reacción, o puede añadirse en un momento posterior a la adición del
gen diana y su pareja de unión celular o extracelular. Las mezclas
de reacción control se incuban sin el compuesto de prueba o con un
placebo. Entonces se detecta la formación de cualquiera de los
complejos entre el producto génico diana y la pareja de unión
celular o extracelular. La formación de un complejo en la reacción
control, pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto
de prueba, indica que el compuesto interfiere con la interacción
del producto génico diana y la pareja de unión interactiva.
Adicionalmente, la formación de complejos dentro de las mezclas de
reacción que contienen el compuesto de prueba y el producto génico
diana normal, también pueden compararse con la formación de
complejos dentro de las mezclas de reacción que contienen el
compuesto de prueba y producto génico diana mutante. Esta
comparación puede ser importante en los casos en los que se desea
identificar los compuestos que interrumpen las interacciones de los
productos génicos diana mutantes pero no los normales.
Estos ensayos pueden llevarse a cabo en un
formato heterogéneo u homogéneo. Los ensayos heterogéneos implican
anclar o bien el producto génico diana o bien la pareja de unión
sobre una fase sólida, y detectar complejos anclados sobre la fase
sólida al final de la reacción. En los ensayos homogéneos, se lleva
a cabo la reacción completa en una fase líquida. En cualquier
enfoque, el orden de adición de los reactivos puede variar para
obtener información diferente sobre los compuestos que se someten a
prueba. Por ejemplo, los compuestos de prueba que interfieren con
la interacción entre los productos génicos diana y las parejas de
unión, por ejemplo, mediante competencia, pueden identificarse
llevando a cabo la reacción en presencia de la sustancia de prueba.
Alternativamente, los compuestos de prueba que interrumpen que se
formen previamente los complejos, por ejemplo los compuestos con
constantes de unión superiores, que desplazan uno de los
componentes del complejo, pueden someterse a prueba añadiendo el
compuesto de prueba a la mezcla de reacción después de que se hayan
formado los complejos. Los diversos formatos se describen
brevemente a continuación.
En un sistema de ensayo heterogéneo, o bien el
producto génico diana o bien la pareja de unión celular o
extracelular, se ancla sobre una superficie sólida (por ejemplo,
una placa de microtitulación), mientras que se marcan las especies
que no ancladas, o bien directa o bien indirectamente. Las especies
ancladas pueden inmovilizarse mediante uniones covalentes o no
covalentes. Alternativamente, puede usarse un anticuerpo
inmovilizado específico contra las especies que van a anclarse,
para anclar las especies a la superficie sólida.
Con el fin de llevar a cabo el ensayo, se expone
la pareja de las especies inmovilizadas a la superficie recubierta
con o sin el compuesto de prueba. Tras completarse la reacción se
eliminan los componentes que no han reaccionado (por ejemplo,
mediante lavado) y cualquier complejo formado seguirá estando
inmovilizado sobre la superficie sólida. Si las especies no
inmovilizadas se marcan previamente, la detección de la etiqueta
inmovilizada sobre la superficie sólida indica que se formaron los
complejos, Si las especies no inmovilizadas no se marcan
previamente, puede usarse una etiqueta indirecta para detectar los
complejos anclados sobre la superficie; por ejemplo, usando un
anticuerpo marcado específico contra las especies no inmovilizadas
inicialmente (el anticuerpo, a su vez, puede marcarse directamente
o marcarse indirectamente con, por ejemplo un anticuerpo
anti-lg marcado). Dependiendo del orden de adición
de los componentes de reacción, pueden detectarse los compuestos de
prueba que inhiben la formación de complejos o que interrumpen que
se formen previamente los complejos.
\newpage
Alternativamente, la reacción puede llevarse a
cabo en una fase líquida en presencia o ausencia del compuesto de
prueba, se separan los productos de reacción de los componentes que
no han reaccionado, y se detectan los complejos; por ejemplo usando
un anticuerpo inmovilizado específico contra uno de los componentes
de unión, para anclar cualquiera de los complejos formados en la
disolución, y un anticuerpo marcado específico contra la otra
pareja, para detectar los complejos anclados. Otra vez, dependiendo
del orden de adición de los reactivos a la fase líquida, pueden
identificarse los compuestos de prueba que inhiben al complejo o
que interrumpen que se formen previamente los complejos.
En una realización alternativa de la invención,
puede usarse un ensayo homogéneo. Por ejemplo, se prepara un
complejo que se forma previamente del producto génico diana y la
pareja de unión celular o extracelular interactiva, en el que están
marcados o bien los productos génicos diana o bien sus parejas de
unión, pero se extingue la señal generada por la etiqueta debido a
la formación de complejos (por ejemplo, la patente de los EE.UU.
número 4.109.496 que utiliza este enfoque para los inmunoensayos).
La adición de una sustancia de prueba que compite con y desplaza
una de las especies del complejo que se forma previamente, dará
como resultado la generación de una señal por encima del fondo. De
esta manera, pueden identificarse las sustancias de prueba que
interrumpen la interacción de producto génico diana - pareja de
unión.
En todavía otro aspecto, pueden usarse las
proteínas 13245 como "proteínas cebo" en un ensayo de dos
híbridos o ensayo de tres híbridos (por ejemplo, patente de los
EE.UU. número 5.283.317; Zervos et al., 1993, Cell
72:223-232; Madura et al., 1993, J. Biol.
Chem.268:12046-12054; Bartel et al., 1993,
Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al.,
1993, Oncogene 8:1693-1696; la publicación PCT
número WO 94/10300), para identificar otras proteínas, que se unen
a o interaccionan con 13245 ("proteínas de unión a 13245" o
"pu-13245") y están implicadas en la actividad
de 13245. Tales pu-13245 pueden ser activadores o
inhibidores de señales mediante las proteínas 13245 o dianas 13245
como, por ejemplo, elementos en el sentido 3' de una ruta de
señalización mediada por 13245.
El sistema de dos híbridos se basa en la
naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción,
que se constituyen por dominios de activación y de unión a ADN que
puede separase. En resumen, el ensayo utiliza dos constructos de ADN
diferentes. En un constructo, el gen que codifica para una proteína
13245 se une a un gen que codifica para el dominio de unión a ADN de
un factor de transcripción conocido (por ejemplo,
GAL-4). En el otro constructo, una secuencia de ADN,
de una biblioteca de secuencias de ADN, que codifica para una
proteína no identificada ("presa" o "muestra") se une a un
gen que codifica para el dominio de activación del factor de
transcripción conocido. (Alternativamente, la proteína 13245 puede
unirse al dominio activador). Si las proteínas "cebo" y
"presa" pueden interaccionar in vivo, formando un
complejo dependiente de 13245, los dominios de activación y de unión
a ADN del factor de transcripción se llevan a proximidad cercana.
Esta proximidad permite la transcripción de un gen indicador (por
ejemplo, LacZ) que se une de manera operable a un sitio de
regulación transcripcional sensible al factor de transcripción.
Puede detectarse la expresión del gen indicador y pueden aislarse
las colonias celulares que contienen el factor transcripcional
funcional y usarse para obtener el gen clonado que codifica para la
proteína que interacciona con la proteína 13245.
En otra realización, se identifican los
moduladores de la expresión de 13245. Por ejemplo, una célula o una
mezcla libre de células se pone en contacto con un compuesto
candidato y se evalúa la expresión de proteína o ARNm de 13245 en
relación con el nivel de expresión de proteína o ARNm de 13245 en
ausencia del compuesto candidato. Cuando la expresión de proteína o
ARNm de 13245 es mayor en presencia del compuesto candidato que en
su ausencia, se identifica el compuesto candidato como un
estimulador de la expresión de proteína o ARNm de 13245.
Alternativamente, cuando la expresión de proteína o ARNm de 13245 es
menor (es decir, menor de manera estadísticamente significativa) en
presencia del compuesto candidato que en su ausencia, se identifica
el compuesto candidato como un inhibidor de la expresión de proteína
o ARNm de 13245. Puede determinarse el nivel de expresión de
proteína o ARNm de 13245 mediante procedimientos descritos en el
presente documento para detectar proteína o ARNm de 13245.
En otro aspecto, la invención está relacionada
con una combinación de dos o más de los ensayos descritos en el
presente documento. Por ejemplo, puede identificarse un agente de
modulación usando un ensayo libre de células o basado en células, y
puede confirmarse la capacidad del agente de modular la actividad
de una proteína 13245, in vivo, por ejemplo, en un animal tal
como un modelo animal de una enfermedad.
Esta invención además está relacionada con
agentes novedosos identificados mediante los ensayos de selección
descritos anteriormente. En consecuencia, está dentro del alcance
de esta invención usar además un agente identificado tal como se
describe en el presente documento (por ejemplo, un agente de
modulación de 13245, una molécula de ácido nucleico de 13245
antisentido, un anticuerpo específico contra 13245, o una pareja de
unión a 13245) en un modelo animal apropiado para determinar la
eficacia, la toxicidad, los efectos secundarios, o mecanismo de
acción, del tratamiento con un agente de este tipo. Además, pueden
usarse los agentes novedosos identificados mediante los ensayos de
selección descritos anteriormente, para los tratamientos tal como
se describe en el presente documento.
Pueden usarse las partes o fragmentos de las
secuencias de ácido nucleico identificadas en el presente
documento, como reactivos de polinucleótidos. Por ejemplo, estas
secuencias pueden usarse para: (i) mapear sus respectivos genes en
un cromosoma, por ejemplo, para localizar regiones génicas
asociadas con enfermedades genéticas o para asociar 13245 con una
enfermedad; (ii) identificar un individuo a partir de una muestra
biológica mínima (tipificación tisular); y (iii) ayudar en la
identificación forense de una muestra biológica. Estas aplicaciones
se describen en las secciones posteriores a continuación.
Las secuencias de nucleótidos de 13245 o partes
de las mismas pueden usarse para mapear la localización de los
genes 13245 en un cromosoma. Este proceso se denomina mapeo
cromosómico. El mapeo cromosómico es útil para la correlación de
las secuencias de 13245 con genes asociados con la enfermedad.
En resumen, los genes 13245 pueden mapearse para
determinar cromosomas preparando cebadores para PCR
(preferiblemente de 15-25 pares de base de
longitud) a partir de la secuencia de nucleótidos de 13245 (por
ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3). Estos cebadores pueden usarse
para la selección por PCR de híbridos de células somáticas que
contienen cromosomas humanos individuales. Sólo los híbridos que
contienen el gen humano correspondiente a las secuencias de 13245
darán un fragmento amplificado.
Un panel de híbridos de células somáticas en las
que cada línea celular contiene o bien un único cromosoma humano o
bien un número pequeño de cromosomas humanos, y un conjunto
completo de cromosomas de ratón, puede permitir el mapeo fácil de
genes individuales para determinar cromosomas humanos específicos
(D'Eustachio et al., 1983, Science
220:919-924).
Otras estrategias de mapeo, por ejemplo la
hibridación in situ tal como se describe (Fan et al.,
1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:6223-6227), la
selección previa con cromosomas clasificados por citometría de
flujo, marcados, y selección previa mediante hibridación para
determinar bibliotecas de ADNc específicas cromosómicas, pueden
usarse para mapear 13245 para determinar una ubicación
cromosómica.
Puede usarse además la hibridación in
situ por fluorescencia (FISH fluorescence in situ
hybridization) de una secuencia de ADN para determinar una
extensión cromosómica de metafase, para proporcionar una ubicación
cromosómica precisa en una etapa. La técnica FISH puede usarse con
una secuencia de ADN tan corta como 500 ó 600 bases. Sin embargo,
clones más grandes de 1.000 bases tienen una probabilidad superior
de unirse a una única posición cromosómica con suficiente
intensidad de señal para la detección simple. Preferiblemente, será
suficiente 1.000 bases, y más preferiblemente 2.000 bases, para
obtener buenos resultados en una cantidad de tiempo razonable. Para
una revisión de FISH, véase Verma et al. (1988, Human
Chromosomes: A Manual de Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva
York).
Pueden usarse individualmente reactivos para el
mapeo cromosómico para marcar un único cromosoma o un único sitio
en ese cromosoma, o pueden usarse paneles de reactivos para marcar
múltiples sitios y/o múltiples cromosomas. Normalmente se prefieren
los reactivos correspondientes a las regiones no codificantes de
los genes para los fines de mapeo. Las secuencias codificantes van
a conservarse más probablemente dentro de las familias génicas,
aumentando así la posibilidad de dar hibridaciones cruzadas durante
el mapeo cromosómico.
Una vez que se ha mapeado una secuencia para
determinar una ubicación cromosómica precisa, puede correlacionarse
la posición física de la secuencia en el cromosoma con los datos
del mapa genético (tales datos se encuentran por ejemplo, en V.
McKusick, Mendelian Inheritance in Man, disponible en línea por
Johns Hopkins University Welch Medical Library). Entonces puede
identificarse la relación entre una gen y una enfermedad, mapeado
para determinar la misma región cromosómica, a través de análisis
de unión (herencia conjunta de genes físicamente adyacentes), tal
como se describe (por ejemplo, Egeland et al., 1987, Nature,
325:783-787).
Además, pueden determinarse las diferencias en
las secuencias de ADN entre individuos afectados y no afectados con
una enfermedad asociada con el gen 13245. Si una mutación se
observa en alguno o todos los individuos afectados pero no en
ninguno de los individuos no afectados, entonces la mutación va a
ser probablemente el agente causante de la enfermedad particular.
La comparación de los individuos afectados y no afectados implica en
primer lugar buscar alteraciones estructurales en los cromosomas,
tales como deleciones o translocaciones que pueden verse a partir
de las extensiones cromosómicas o detectarse usando PCR basada en
esa secuencia de ADN. Por último, puede realizarse la secuenciación
completa de genes a partir de varios individuos, para confirmar la
presencia de una mutación y para distinguir mutaciones de
polimorfismos.
La secuencias de 13245 pueden usarse para
identificar individuos a partir de muestras biológicas usando, por
ejemplo polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción
(RFLP, restriction fragment length polimorphism). En esta técnica
se digiere ADN genómico de un individuo con una o más enzimas de
restricción, se separan los fragmentos, por ejemplo en una
inmunotransferencia de tipo Southern, y se sondean para dar bandas
de identificación. Las secuencias de la presente invención son
útiles como marcadores de ADN adicionales para RFLP (descrito en la
patente de los EE.UU. número 5.272.057).
Además, las secuencias de la presente invención
pueden usarse también para determinar la secuencia de ADN base por
base real de partes seleccionadas de un genoma de un individuo. Por
tanto, la secuencia de nucleótidos de 13245 descrita en el presente
documento puede usarse para preparar cebadores para PCR homólogos a
los extremos 5' y 3' de la secuencia. Estos cebadores pueden usarse
entonces para amplificar ADN de un individuo y posteriormente
secuenciarlo. Los paneles de secuencias de ADN correspondientes de
individuos, preparados de esta manera, pueden proporcionar
identificaciones de individuos únicas, así como cada individuo
tendrá un único conjunto de tales secuencias de ADN debido a
diferencias alélicas.
La variación alélica se produce en algún grado
en las regiones codificantes de estas secuencias, y en un grado
superior en las regiones no codificantes. Cada una de las
secuencias descritas en el presente documento, pueden usarse, en
algún grado, como un patrón frente al que puede comparase ADN de un
individuo para fines de identificación. Debido a que se producen
grandes números de polimorfismos en las regiones no codificantes,
son necesarias menos secuencias para diferenciar individuos. Las
secuencias no codificantes de SEQ ID NO: 1 pueden proporcionar una
identificación de individuos positiva con un panel de quizás 10 a
1.000 cebadores que cada uno da una secuencia amplificada no
codificante de 100 bases. Si se usan las secuencias codificantes
predichas, tales como las de SEQ ID NO: 3, un número más apropiado
de cebadores para la identificación de individuos positiva sería
500-2.000.
Si un panel de reactivos de las secuencias de
nucleótidos de 13245 descritas en el presente documento, se usa
para generar una base de datos de identificación única para un
individuo, pueden usarse más tarde los mismos reactivos para
identificar tejidos de ese individuo. Usando la base de datos de
identificación única, puede realizarse la identificación positiva,
de vida o muerte, a partir de muestras titulares extremadamente
pequeñas.
Uso de secuencias de 13245 parciales en biología
forense.
También pueden usarse las técnicas de
identificación basada en ADN en biología forense. Para realizar una
identificación de este tipo, puede usarse la tecnología de PCR para
amplificar secuencias de ADN tomadas de muestras biológicas muy
pequeñas tales como tejidos, por ejemplo, pelo o piel, o fluidos
corporales, por ejemplo, por ejemplo, sangre, saliva o semen
encontrados en la escena del crimen. Entonces puede comparase la
secuencia amplificada con un patrón, permitiendo así la
identificación del origen de las muestra biológica.
Las secuencias de la presente invención pueden
usarse para proporcionar reactivos de polinucleótidos, por ejemplo
cebadores para PCR, marcados para determinar loci específicos en el
genoma humano, que puede mejorar la fiabilidad de las
identificaciones forenses basadas en ADN proporcionando, por
ejemplo, otro "marcador de identificación" (es decir, otra
secuencia de ADN que es única para un individuo particular). Tal
como se mencionó anteriormente, la información de la secuencia de
nucleótidos real puede usarse para la identificación como una
alternativa exacta a patrones que se forman mediante fragmentos
generados por enzimas de restricción. Las secuencias marcadas para
determinar regiones no codificantes de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo,
fragmentos que tienen una longitud de al menos 20 residuos de
nucleótidos, preferiblemente al menos 30 residuos de nucleótidos)
son particularmente apropiadas para este uso.
Las secuencias de nucleótidos de 13245 descritas
en el presente documento pueden usarse además para proporcionar
reactivos de polinucleótidos, por ejemplo, sondas marcadas o que
pueden marcarse, que pueden usarse en, por ejemplo, en la técnica
de hibridación in situ, para identificar un tejido
específico, por ejemplo un tejido que contienen células
hematopoyéticas. Esto puede ser muy útil en casos en los que se
presenta un patólogo forense con un tejido de origen desconocido,
Los paneles de tales sondas de 13245 pueden usarse para identificar
tejido por especies y/o por tipo de órgano.
De modo similar, estos reactivos, por ejemplo
pueden usarse sondas o cebadores de 13245 para examinar la
contaminación de cultivos titulares (es decir, examinar la
presencia de una mezcla de diferentes tipos de células en un
cultivo).
La presente invención también está relacionada
con el campo de la medicina predictiva en la que se usan ensayos de
diagnóstico, ensayos de pronóstico y ensayos clínicos de
monitorización para fines de pronóstico (predictivos) para tratar
así a un individuo.
Generalmente, la invención proporciona un
procedimiento de determinación si un sujeto está en riesgo de
padecer un trastorno relacionado con una lesión en, o la expresión
errónea de, un gen que codifica para polipéptido 13245.
Tales trastornos incluye, por ejemplo, un
trastorno asociado con la expresión errónea de un polipéptido
13245, por ejemplo un trastorno inmunitario o un trastorno
neoplásico.
El procedimiento incluye uno o más de lo
siguiente:
(i) detectar, en un tejido del sujeto, la
presencia o ausencia de una mutación que afecta a la expresión del
gen 13245, o detectar la presencia o ausencia de una mutación en
una región que controla la expresión del gen, por ejemplo, una
mutación en la región de control en 5';
(ii) detectar, en un tejido del sujeto, la
presencia o ausencia de una mutación que altera la estructura del
gen 13245;
(iii) detectar, en un tejido del sujeto, la
expresión errónea del gen 13245 en el nivel de ARNm, por ejemplo
detectar un nivel de tipo no natural de un ARNm; y
(iv) detectar, en un tejido del sujeto, la
expresión errónea del gen en el nivel de proteínas, por ejemplo,
detectar un nivel de tipo no natural de un polipéptido 13245.
En realizaciones preferidas el procedimiento
incluye: determinar la existencia de al menos una de: una deleción
de uno o más nucleótidos del gen 13245; una inserción de uno o más
nucleótidos en el gen, una mutación puntual, por ejemplo, una
sustitución de uno o más nucleótidos del gen, una transposición
cromosómica visible del gen, por ejemplo una translocación,
inversión o deleción.
Por ejemplo, la detección de la lesión genética
puede incluir: (i) proporcionar una sonda/cebador que incluye un
oligonucleótido que contiene una región de la secuencia de
nucleótidos que híbrida con una secuencia sentido o antisentido de
SEQ ID NO: 1, o mutantes que se producen naturalmente de los
mismos, o secuencias flanqueantes en 5' o 3' asociadas naturalmente
con el gen 13245; (ii) exponer la sonda/cebador al ácido nucleico
del tejido; y detectar la presencia o ausencia de la lesión
genética mediante hibridación de la sonda/cebador del ácido
nucleico, por ejemplo, mediante hibridación in situ.
En realizaciones preferidas, la detección de la
expresión errónea incluye determinar la existencia de al menos uno
de. Una alteración en el nivel de un transcrito de ARN mensajero
del gen 13245; la presencia de un patrón de corte y empalme de tipo
no natural de un trascrito de ARN mensajero del gen; o un nivel de
tipo no natural de proteína o ARN de 13245.
Los procedimientos de la invención pueden usarse
para la selección prenatal o para determinar si un vástago del
sujeto estará en riesgo de padecer un trastorno.
En realizaciones preferidas, el procedimiento
incluye determinar la estructura de un gen 13245, siendo una
estructura aberrante indicativa del riesgo de padecer el
trastorno.
En realizaciones preferidas, el procedimiento
incluye poner en contacto una muestra del sujeto con un anticuerpo
contra la proteína 13245 o un ácido nucleico, que se híbrida
específicamente con el gen. Estas y otras realizaciones se tratan a
continuación.
La presencia, nivel o ausencia de la proteína
ácido nucleico de 13245 en una muestra biológica, puede evaluarse
obteniendo una muestra biológica de un sujeto de prueba y poniendo
en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente que
puede detectar la proteína ácido nucleico de 13245 (por ejemplo
ARNm, ADN genómico) que codifica para la proteína 13245 de tal modo
que la presencia de la proteína ácido nucleico de 13245 se detecta
en la muestra biológica. El término "muestra biológica"
incluye tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un
sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un
sujeto. Una muestra biológica preferida es suero. El nivel de
expresión del gen 13245 puede medirse de diversas maneras,
incluyendo, pero no se limita a: medir el ARNm codificado por los
genes 13245; medir la cantidad de proteína codificada por los genes
13245; o medir la actividad de la proteína codificada por los genes
13245.
El nivel de ARNm que corresponde al gen 13245 en
una célula puede determinarse tanto mediante formatos in
situ como in vitro.
El ARNm aislado puede usarse en ensayos de
hibridación o amplificación que incluyen, pero no se limitan a,
análisis de inmunotransferencia de tipo Southern o Northern,
análisis de reacción en cadena de la polimerasa y ensayos de sonda.
Un procedimiento de diagnóstico preferido para la detección de
niveles de ARNm implica poner en contacto el ARNm aislado con una
molécula de ácido nucleico (sonda) que puede hibridarse con el ARNm
codificado por el gen que se está detectando. La sonda de ácido
nucleico puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico de 13245 de
cadena completa, tal como el ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, o una
parte del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 7, 15, 30,
50, 100, 250 ó 500 nucleótidos de longitud y suficiente para
hibridarse específicamente en condiciones restrictivas con el ADN
genómico o ARNm de 13245. Otras sondas adecuadas para su uso en los
ensayos de diagnóstico se describen en el presente documento.
En un formato, ARNm (o ADNc) se inmoviliza sobre
una superficie y se pone en contacto con las sondas, por ejemplo,
haciendo pasar el ARNm aislado en un gel de agarosa y transfiriendo
el ARNm del gel a una membrana, tal como nitrocelulosa. En un
formato alternativo, las sondas se inmovilizan sobre una superficie
y el ARNm (o ADNc) se pone en contacto con las sondas, por ejemplo,
en una matriz de chip génica bidimensional. Un experto en la técnica
puede adaptar los procedimientos de detección de ARNm conocidos
para su uso para detectar el nivel de ARNm codificado por los genes
13245.
Puede evaluarse el nivel de ARNm en una muestra
que se codifica por 13245, con la amplificación de ácido nucleico,
por ejemplo mediante RT-PCR (patente de los EE.UU.
4.683.202), reacción en cadena de la ligasa (Barany, 1991, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), replicación de
secuencias autosostenida (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de
amplificación transcripcional (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86:1173-1177),
Q-beta replicasa (Lizardi et al., 1988,
Bio/Technology 6:1197), replicación por circulo rodador (patente de
los EE.UU. número 5.854.033) o cualquier otro procedimiento de
amplificación de ácido nucleico, seguido de la detección de las
moléculas amplificadas usando técnicas conocidas en la técnica. Tal
como se usa en el presente documento, se definen los cebadores de
amplificación como que son un par de moléculas de ácido nucleico que
pueden hibridar con las regiones en 5' o en 3' de una gen 13245.
(hebras positiva y negativa, respectivamente, o viceversa) y
contienen una región corta intermedia. En general, los cebadores de
amplificación son de desde aproximadamente 10 hasta 30 nucleótidos
de longitud y flanquean una región de desde aproximadamente 50
hasta 200 nucleótidos de longitud. En condiciones apropiadas y con
reactivos apropiados, tales cebadores permiten la amplificación de
una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de
nucleótidos entre los cebadores.
Para los procedimientos in situ, puede
prepararse/elaborarse una muestra celular o tisular e inmovilizarse
sobre un soporte, normalmente un portaobjeto de vidrio, y entonces
ponerse en contacto con una sonda que puede hibridarse con ARNm que
codifica para el gen 13245 que se está analizando.
En otra realización, los procedimientos incluyen
además poner en contacto una muestra control con un compuesto o un
agente que puede detectar ARNm, o ADN genómico, y que compara la
presencia del ADN genómico o ARNm de 13245 en la muestra control
con la presencia de ADN genómico o ARNm de 13245 en la muestra de
prueba.
Pueden usarse una variedad de procedimientos
para determinar el nivel de proteína codificada por 13245. En
general, estos procedimientos incluyen poner en contacto un agente
que se une selectivamente a una proteína, tal como un anticuerpo
con una muestra, para evaluar el nivel de proteína en la muestra. En
una realización preferida, el anticuerpo lleva una etiqueta que
puede detectarse. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o más
preferiblemente, monoclonales. Puede usarse un anticuerpo intacto,
o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab o F(ab')_{2}).
El término "marcado", con respecto a la sonda o anticuerpo,
pretende abarcar la marcación directa de la sonda o anticuerpo
acoplando (es decir, unión física) una sustancia que puede
detectarse a la sonda o anticuerpo, así como la marcación indirecta
de la sonda o anticuerpo haciendo reaccionar con una sustancia que
puede detectarse. Ejemplos de sustancias que pueden detectarse se
proporcionan en el presente documento.
Los procedimientos de detección pueden usarse
para detectar proteínas 13245 en una muestra biológica in
vitro así como in vivo. Las técnicas in vitro para
detectar a la proteína 13245 incluyen los ensayos de
inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) inmunoprecipitaciones,
inmunofluorescencia, inmunoensayo enzimático (EIA),
radioinmunoensayo (RIA), y análisis de inmunotransferencia de tipo
Western. Las técnicas in vivo para detectar la proteína 13245
incluye introducir en un sujeto un anticuerpo
anti-13245 marcado. Por ejemplo, el anticuerpo
puede marcarse con un marcador radioactivo cuya presencia y
ubicación puede detectarse en un sujeto mediante técnicas de imagen
habituales.
En otra realización, los procedimientos además
incluyen poner en contacto la muestra control con un compuesto o
agente que puede detectar a la proteína 13245, y que compara la
presencia de proteína 13245 en la muestra control con la presencia
de la proteína 13245 en la muestra de prueba.
La invención también incluye kits para detectar
la presencia de 13245 en una muestra biológica. Por ejemplo, el kit
puede incluir un compuesto o agente que puede detectar a la
proteína o ARNm de 13245 en una muestra biológica, y un patrón. El
compuesto o agente puede envasarse en un recipiente adecuado. El
kit puede comprender además instrucciones de uso del kit para
detectar a la proteína o ácido nucleico de 13245.
Para un kits basados en anticuerpos, el kit
puede incluir: (1) un primer anticuerpo (por ejemplo, unido a un
soporte sólido) que se une a un polipéptido que corresponde a un
marcador de la invención; y, opcionalmente, (2) un segundo,
anticuerpo diferente que se une o bien al polipéptido o bien al
primer anticuerpo y se conjuga con un agente que puede
detectarse.
Para los kits basados en oligonucleótidos, el
kit puede incluir: (1) un oligonucleótido, por ejemplo, un
oligonucleótido marcado de manera detectable, que se híbrida con
una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido
que corresponde a un marcador de la invención o (2) un par de
cebadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico que
corresponde a un marcador de la invención. El kit también puede
incluir un agente tampón, un conservante, o un agente de
estabilización de proteína. El kit también puede incluir
componentes necesarios para detectar al agente que puede detectarse
(por ejemplo, una enzima o un sustrato). El kit también puede
contener una muestra control o una serie de muestras control que
puede someterse a ensayo y compararse con el contenido de la
muestra de prueba. Cada componente del kit puede encerrarse dentro
de un recipiente individual y todos los diversos recipientes pueden
estar dentro de un único envase, junto con las instrucciones para
interpretar los resultados de los ensayos realizados usando el
kit.
Los procedimientos de diagnóstico descritos en
el presente documento pueden identificar sujetos que tienen, o en
riesgo de desarrollar, una enfermedad o trastorno asociado con la
actividad o expresión de 13245 expresada de forma errónea,
aberrante o no deseada. Tal como se usa en el presente documento, el
término "no deseada" incluye un fenómeno no deseado implicado
en una respuesta biológica tal como la inducción de una respuesta
inmunitaria inapropiada o proliferación celular desregulada.
\newpage
En una realización, se identifica una enfermedad
o trastorno asociado con la actividad o expresión de 13245
aberrante p no deseada. Una muestra de prueba se obtiene a partir
de un sujeto y se evalúa la proteína o ácido nucleico de 13245 (por
ejemplo, ARNm o ADN genómico) en el que el nivel, por ejemplo la
presencia o ausencia de proteína o ácido nucleico de 13245 es un
diagnóstico para un sujeto que tiene o en riesgo de desarrollar una
enfermedad o trastorno asociado con la actividad o expresión de
13245 aberrante o no deseada. Tal como se usa en el presente
documento, una "muestra de prueba" se refiere a una muestra
biológica que se obtiene a partir de un sujeto de interés,
incluyendo un fluido biológico (por ejemplo, suero), muestra celular
o tejidos.
Los ensayos de pronóstico descritos en el
presente documento pueden usarse para determinar si puede
administrarse un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista,
mimético peptídico, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula
pequeña u otro candidato a fármaco) a un sujeto para tratar una
enfermedad o trastorno asociado con una actividad o expresión de
13245 aberrante o no deseada. Por ejemplo, tales procedimientos
pueden usarse si puede tratarse de manera eficaz a un sujeto con un
agente que modula la actividad o expresión de 13245.
Los procedimientos de la invención también
pueden usarse para detectar alteraciones genéticas en un gen 13245,
determinando así si un sujeto con el gen alterado está en riesgo de
padecer un trastorno caracterizado por la regulación errónea en la
expresión del ácido nucleico o actividad de la proteína 13245, tal
como un trastorno asociado con la génesis tumoral o inducción de una
respuesta inmunitaria inapropiada. En realizaciones preferidas, los
procedimientos incluyen detectar, en una muestra del sujeto, la
presencia o ausencia de una alteración genética caracterizada por
al menos una de una alteración que afecta la integridad de un gen
que codifica para una proteína 13245, o la expresión errónea del
gen 13245. Por ejemplo, tales alteraciones genéticas pueden
detectarse determinando la existencia de al menos uno de 1) una
deleción de uno o más nucleótidos de un gen 13245; 2) una adición
de uno o más nucleótidos a un gen 13245; 3) una sustitución de uno
o más nucleótidos de un gen 13245, 4) una transposición cromosómica
de un gen 13245; 5) una alteración en el nivel de un transcrito de
ARN mensajero de un gen 13245, 6)modificación aberrante de un
gen 13245, tal como del patrón de metilación del ADN genómico, 7)
la presencia de un patrón de corte y empalme de tipo no natural de
un transcrito de ARN mensajero de un gen 13245, 8) un nivel de tipo
no natural de una proteína 13245, 9) pérdida alélica de un gen
13245, y 10) modificación post-traduccional
inapropiada de una proteína 13245.
Puede detectarse una alteración sin una
sonda/cebador en una reacción en cadena de la polimerasa, tal como
PCR de ancla o RACE-PCR, o alternativamente, en una
reacción en cadena de la ligasa (LCR), de las que la última puede
ser particularmente útil para detectar mutaciones puntuales en el
gen 13245. Este procedimiento puede incluir las etapas de recoger
una muestra de células de un sujeto, aislar ácido nucleico (por
ejemplo, genómico, ARNm o ambos) de la muestra, poner en contacto la
muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores que se hibridan
de manera específica a un gen 13245 en condiciones tales que se
producen la hibridación y amplificación del gen 13245 (si está
presente), y detectar la presencia o ausencia de un producto de
amplificación, o detectar el tamaño del producto de amplificación y
comparar la longitud con una muestra control. Se espera que PCR y/o
LCR puedan desearse para usarse como una etapa de amplificación
preliminar junto con cualquiera de las técnicas usadas para
detectar mutaciones descritas en el presente documento.
Los procedimientos de amplificación alternativos
incluyen: replicación de secuencias autosostenida (Guatelli et
al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:1874-1878), sistema de amplificación
transcripcional (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86:1173-1177), Q-beta replicasa
(Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), u otros
procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos, seguido de la
detección de las moléculas amplificadas usando técnicas conocidas
por los expertos en la técnica.
En otra realización, pueden identificarse
mutaciones en un gen 13245 de una célula de muestra, detectando
alteraciones en los patrones de escisión, mediante enzimas de
restricción. Por ejemplo, se aisla ADN control y de muestra, se
amplifica (opcionalmente), se digiere con una o más endonucleasas de
restricción, y se determinan los tamaños de longitud de fragmentos,
por ejemplo, mediante electroforesis en gel, y se comparan. Las
diferencias en los tamaños de longitud de fragmentos entre el ADN
control y de muestra, indica mutaciones en el ADN de muestra.
Además, el uso de ribozimas específicos de secuencia (por ejemplo,
patente de los EE.UU. número 5.498.531) puede usarse para detectar
la presencia de mutaciones específicas mediante el desarrollo o
pérdida de un sitio de escisión de ribozima.
En otras realizaciones, pueden identificarse las
mutaciones genéticas en 13245 hibridando ácidos nucleicos control o
de muestra, por ejemplo, ADN o ARN, mediante, por ejemplo, matrices
bidimensionales, o por ejemplo, matrices basadas en chip. Tales
matrices incluyen una pluralidad de direcciones, cada una de las
cuales puede distinguirse posicionalmente entre sí. Se coloca una
sonda diferente en cada dirección de la pluralidad. Las matrices
pueden tener una alta densidad de direcciones, por ejemplo, pueden
contener cientos o miles de sondas de oligonucleótidos (Cronin
et al., 1996, Hum. Mutat. 7:244-255; Kozal
et al., 1996, Nature Med. 2:753-759). Por
ejemplo, pueden identificarse mutaciones genéticas en 13245 en
matrices bidimensionales que contienen sondas de ADN generadas por
luz tal como se describe (Cronin et al., anteriormente). En
resumen, puede usarse una primera matriz de hibridación de sondas
para explorar extensiones largas de ADN en una muestra y control
para identificar los cambios de bases entre las secuencias haciendo
matrices lineales de sondas de solapamiento secuencial. Esta etapa
permite la identificación de mutaciones puntuales. Esta etapa va
seguida de una segunda matriz de hibridación que permite la
caracterización de mutaciones específicas usando matrices de sondas
especializadas, más pequeñas, complementarias a todas las variantes
o mutaciones detectadas. Cada matriz de mutación se compone de
conjuntos de sondas paralelos, uno complementario al gen de tipo
natural y el otro complementario al gen mutante.
Aún en otra realización, cualquiera de las
diversas reacciones de secuenciación conocidas en la técnica, puede
usarse para secuenciar directamente el gen 13245 y detectar
mutaciones comparando la secuencia de 13245 de muestra con la
correspondiente secuencia (control) de tipo natural. Pueden
utilizarse procedimientos de secuenciación automatizados cuando se
realizan los ensayos de diagnóstico (1995, Biotechniques 19:448),
incluyendo la secuenciación por espectrometría de masas.
Otros procedimientos para detectar mutaciones en
el gen 13245 incluyen procedimientos en los que se usa la
protección de agentes de escisión para detectar bases de
apareamiento erróneo en heterodúplex ARN/ADN o ARN/ARN (Myers et
al., 1985, Science 230:1242; Cotton et al., 1988, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85:4397; Saleeba et al., 1992, Meth.
Enzymol. 217:286-295).
Todavía en otra realización, la reacción de
escisión de apareamiento erróneo emplea una o más proteínas que
reconocen los pares de bases de apareamiento erróneo en ADN de
cadena doble (denominadas enzimas de "reparación de apareamiento
erróneo de ADN") en sistemas definidos para detectar y mapear
mutaciones puntuales en ADNc de 13245 obtenidos a partir de
muestras de células. Por ejemplo, la enzima mutY de E. coli
escinde A en apareamientos erróneos G/A y la timidina ADN
glicosilasa de las células HeLa escinde T de los apareamientos
erróneos G/T (Hsu et al., 1994, Carcinogenesis
15:1657-1662; patente de los EE.UU. número
5.459.039).
En otras realizaciones, se usarán las
alteraciones en la movilidad electroforética para identificar las
mutaciones en los genes 13245. Por ejemplo, puede usarse el
polimorfismo de conformación monocatenario (SSCP single strand
conformation polimorphism) para detectar diferencias en la movilidad
electroforética entre ácidos nucleicos mutantes y de tipo natural
(Orita et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766;
Cotton.1993, Mutat. Res. 285:125-144; Hayashi,
1992, Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79). Los
fragmentos de ADN monocatenarios de los ácidos nucleicos de 13245
control y de muestra se desnaturalizarán y podrán renaturalizarse.
La estructura secundaria de ácidos nucleicos monocatenarios varía
según la secuencia, la alteración resultante en la movilidad
electroforética permite la detección de incluso un cambio de una
única base. Los fragmentos de ADN pueden marcarse o detectarse con
sondas marcadas. La sensibilidad del ensayo puede mejorarse usando
ARN (más que ADN), en el que la estructura secundaria es más
sensible a un cambio en la secuencia. En una realización preferida,
el procedimiento objeto utiliza el análisis de heterodúplex para
separar moléculas de heterodúplex bicatenarias basándose en los
cambios en la movilidad electroforética (Keen et al., 1991,
Trends Genet 7:5).
Aún en otra realización, se somete a ensayo el
movimiento de fragmentos mutantes o de tipo natural en geles de
poliacrilamida que contienen un gradiente de desnaturalizante
usando electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE
denaturing gradient gel electrophoresis DGGE) (Myers et al.,
1985, Nature 313:495). Cuando se usa DGGE como el procedimiento de
análisis, se modificará ADN para garantizar que no se desnaturalice
completamente, por ejemplo añadiendo una pinza GC de
aproximadamente 40 pares de bases de ADN rico en GC de alta fusión
mediante PCR. En una realización adicional, se usa un gradiente de
temperatura en lugar de un gradiente desnaturalizante para
identificar diferencias en la movilidad del ADN de muestra y control
(Rosenbaum y Reissner (1987) Biophys Chem 265:12753).
Ejemplos de otras técnicas para detectar las
mutaciones puntuales incluyen, pero no se limitan a, hibridación de
oligonucleótidos selectiva, amplificación selectiva, o extensión de
cebadores selectiva (Saiki et al., 1986, Nature 324:163;
Saiki et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230).
Alternativamente, la tecnología de amplificación
específica de alelos que depende de la amplificación por PCR
selectiva puede usarse junto con la presente invención. Los
oligonucleótidos usados como cebadores para la amplificación
específica pueden portar la mutación de interés en el centro de la
molécula (de tal modo que la amplificación depende de la
hibridación diferencial; Gibbs et al., 1989, Nucl. Acids
Res. 17:2437-2448) o en el extremo 3' de un cebador
en el que, en condiciones apropiadas, puede evitar el apareamiento
erróneo o reducir la extensión de la polimerasa (Prossner, 1993,
Tibtech 11:238). Además, puede desearse introducir un sitio de
restricción novedoso en la región de la mutación para crear la
detección basada en escisión (Gasparini et al., 1992, Mol.
Cell Probes 6: 1). Se espera que en ciertas realizaciones, también
pueda realizarse la amplificación usando Taq ligasa para la
amplificación (Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189). En
tales casos, la ligación se producirá sólo si existe un
apareamiento perfecto en el extremo 3' de la secuencia en 5'
haciendo posible detectar la presencia de una mutación conocida en
un sitio específico buscando la presencia o ausencia de
amplificación.
Los procedimientos descritos en el presente
documento pueden realizarse, por ejemplo, usando kits de
diagnóstico envasados que contienen al menos un ácido nucleico de
sonda o reactivo de anticuerpo descritos en el presente documento,
que pueden usarse de manera conveniente, por ejemplo, en la
práctica clínica para diagnosticar pacientes que muestran síntomas o
historial familiar de una enfermedad o dolencia que implica un gen
13245.
Las moléculas de 13245 de la invención también
son útiles como marcadores de trastornos o fases de la enfermedad,
como marcadores para determinar precursores de fases de la
enfermedad, como marcadores para determinar la predisposición de
fases de la enfermedad, como marcadores de la actividad del
fármaco, o como marcadores del perfil farmacogenómico de un sujeto.
Usando los procedimientos descritos en el presente documento, puede
detectarse la presencia, ausencia y/o cantidad de las moléculas de
13245 de la invención, y puede correlacionarse con una o más fases
biológicas in vivo. Por ejemplo, las moléculas de 13245 de
la invención pueden servir como marcadores sustitutos para
determinar uno o más trastornos o fases de la enfermedad o para
determinar estados que conducen a fases de la enfermedad. Tal como
se usa en el presente documento, "un marcador sustituto" es un
marcador bioquímico objetivo que se correlaciona con la ausencia o
presencia de una enfermedad o trastorno, o con la evolución de una
enfermedad o trastorno (por ejemplo, con la presencia o ausencia de
un tumor). La presencia o cantidad de tales marcadores es
independiente de la enfermedad. Por tanto, estos marcadores pueden
servir para indicar si un curso particular de tratamiento es eficaz
para disminuir una fase de la enfermedad o trastorno. Los
marcadores sustitutos son de uso particular cuando la presencia o
extensión de una fase de la enfermedad o trastorno es difícil de
evaluar a través de las metodologías habituales (por ejemplo,
tumores de fase temprana), o cuando se desea una evaluación de la
evolución de la enfermedad antes de que se consiga un punto final
clínico posiblemente peligroso (por ejemplo, una evaluación de
enfermedad cardiovascular puede realizarse usando niveles de
colesterol como un marcador sustituto, y puede realizarse un
análisis de infección por VIH usando niveles de ARN de VIH como
marcador sustituto, muchos antes de los desenlaces clínicos no
deseados del infarto de miocardio o SIDA completamente
desarrollado). Se han descrito ejemplos del uso de marcadores
sustitutos (por ejemplo, Koomen et al., 2000, J. Mass.
Spectrom. 35:258-264; James, 1994, AIDS Treat. News
Arch. 209).
Las moléculas de 13245 de la invención también
son útiles como marcadores farmacodinámicos. Tal como se usa en el
presente documento, un "marcador farmacodinámico" es un
marcador bioquímico objetivo que se correlaciona específicamente
con efectos del fármaco. La presencia o cantidad de un marcador
farmacodinámico no se relaciona con la fase de la enfermedad o
trastorno para la que se está administrando el fármaco; por tanto,
la presencia o cantidad del marcador es indicativa de la presencia
o actividad del fármaco en un sujeto. Por ejemplo, un marcador
farmacodinámico puede ser indicativo de la concentración del
fármaco en un tejido biológico, en el que el marcador o bien se
expresa o transcribe o bien ni se expresa ni se transcribe en ese
tejido en relación con el nivel del fármaco. De este modo, la
distribución o absorción del fármaco puede monitorizarse mediante
marcadores farmacodinámicos. De manera similar, la presencia o
cantidad del marcador farmacodinámico puede relacionarse con la
presencia o cantidad del producto metabólico de un fármaco, tal como
la presencia o cantidad del marcador es indicativa de la tasa de
descomposición relativa del fármaco in vivo. Los marcadores
farmacodinámicos son de uso particular para aumentar la
sensibilidad de detección de efectos farmacológicos,
particularmente cuando el fármaco se administra en dosis bajas.
Puesto que incluso una cantidad pequeña del fármaco puede ser
suficiente para activar múltiples ciclos de transcripción o
expresión del marcador (por ejemplo, un marcador de 13245), el
marcador amplificado puede estar en una cantidad que puede
detectarse más fácilmente que el propio fármaco. También, el
marcador puede detectarse más fácilmente debido a la naturaleza del
propio marcador; por ejemplo, usando los procedimientos descritos
en el presente documento, pueden emplearse anticuerpos
anti-13245 en un sistema de detección basado en la
inmunización para determinar un marcador de proteína 13245, o pueden
usarse sondas radiomarcadas específicas de 13245 para detectar un
marcador de ARNm de 13245. Además, el uso de un marcador
farmacodinámico puede ofrecer una predicción de riesgo basada en el
mecanismo debido al tratamiento farmacológico más allá del
intervalo de posibles observaciones directas. Se han descrito
ejemplos del uso de marcadores farmacodinámicos (por ejemplo, la
patente de los EE.UU. número 6.033.862; Hattis et al., 1991,
Env. Health Perspect. 90: 229-238; Schentag, 1999,
Am. J. Health-Syst. Pharm. 56 supl. 3:
S21-S24; Nicolau, 1999, Am, J.
Health-Syst. Pharm. 56 supl. 3:
S16-S20).
Las moléculas de 13245 de la invención también
son útiles como marcadores farmacogenómicos. Tal como se usa en el
presente documento, un "marcador farmacogenómico" es un
marcador bioquímico objetivo que se correlaciona con una
susceptibilidad o respuesta farmacológica clínicamente específica
en un sujeto (por ejemplo, McLeod et al., 1999, Eur. J.
Cancer 35:1650-1652). La presencia o cantidad del
marcador farmacogenómico se relaciona con la respuesta predicha del
sujeto a un fármaco específico o clase de fármacos antes de la
administración del fármaco. Mediante la evaluación de la presencia o
cantidad de uno o más marcadores farmacogenómicos en un sujeto,
puede seleccionarse una farmacoterapia que es la más apropiada para
el sujeto, o que se predice que tiene un grado más grande de éxito.
Por ejemplo, basándose en la presencia o cantidad de ARN, o
proteína (por ejemplo, ARN o proteína 13245) para determinar
marcadores específicos de tumor en un sujeto, puede seleccionarse
un fármaco o curso de tratamiento que se optimiza para el
tratamiento del tumor específico que probablemente está presente en
el sujeto. De manera similar, la presencia o ausencia de una
mutación de la secuencia específica en el ADN de 13245 puede
correlacionarse con la respuesta farmacológica de 13245. Por tanto,
el uso de marcadores farmacogenómicos permite la aplicación del
tratamiento más apropiado para cada sujeto sin tener que
administrar la terapia.
El ácido nucleico y polipéptidos, fragmentos de
los mismos, así como anticuerpos anti-13245
(también denominados en el presente documento como "compuestos
activos") de la invención pueden incorporarse en las
composiciones farmacéuticas. Tales composiciones incluyen
normalmente la molécula de ácido nucleico, proteína, o anticuerpo y
un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el
presente documento, las palabras "vehículo farmacéuticamente
aceptable" incluyen disolventes, medios de dispersión,
recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes
isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles
con la administración farmacéutica. También pueden incorporarse a
las composiciones compuestos activos complementarios.
Se formula una composición farmacéutica para que
sea compatible con su vía de administración pretendida. Ejemplos de
vías de administración incluyen administración parenteral, por
ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo,
inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las
disoluciones o suspensiones usadas para la aplicación parenteral,
intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes
componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección,
solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina,
propileneglicol u otros disolventes sintéticos; agentes
antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos;
antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio;
agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético;
tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el
ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. Se
puede ajustar el pH con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico
o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede encerrarse en
ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis
compuestos por vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
uso inyectable incluyen disoluciones acuosas estériles (cuando son
solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la
preparación extemporánea de disoluciones o una dispersión
inyectables estériles. Para administración intravenosa, los
vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua
bacteriostática, Cremophor EL^{TM} (BASF, Parsippany, NJ) o
solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la
composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el extremo de
que pueda administrarse fácilmente con jeringuilla. Debe estable en
las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe protegerse
frente a la acción contaminante de los microorganismos tales como
bacteria y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de
dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por
ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y
similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse la
fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento
tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de
partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de
tensioactivos. Puede lograrse la prevención de la acción de
microorganismos mediante varios agentes antibacterianos y
antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido
ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible
incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes
tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición.
Puede lograrse la absorción prolongada de las composiciones
inyectables incluyendo un agente en la composición que retrasa la
absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Pueden prepararse disoluciones inyectables
estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida
en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los
componentes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido
por esterilización por filtración. Generalmente, se preparan las
dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo que
contiene un medio de dispersión básico y los otros componentes
requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos
estériles para la preparación de disoluciones inyectables
estériles, los procedimientos de preparación preferidos son secado
a vacío y liofilización, lo que produce un polvo del principio
activo junto cualquier componente deseado adicional de una
disolución previamente filtrada estéril del mismo.
Las composiciones orales generalmente incluyen
un diluyente inerte o un vehículo comestible. Con el fin de la
administración terapéutica oral, puede incorporarse el compuesto
activo con excipientes y puede usarse en la forma de comprimidos,
trociscos o cápsulas, por ejemplo, cápsulas de gelatina. También
pueden prepararse composiciones orales usando un vehículo fluido
para su uso como un enjuague bucal. Pueden incluirse agentes de
unión compatibles farmacéuticamente y/o materiales adyuvantes como
parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas,
trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes
componentes, o compuestos de una naturaleza similar: un
aglutinante, tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o
gelatina; un excipiente, tal como almidón o lactosa; un agente
disgregante, tal como ácido algínico, Primogel^{TM}, o almidón de
maíz; un lubricante, tal como estearato de magnesio o
Sterotes^{TM}; un agente deslizante, tal como dióxido de silicio
coloidal; un agente edulcorante, tal como sacarosa o sacarina; o un
agente aromatizante, tal como menta, salicilato de metilo o aroma
de naranja.
Para la administración por inhalación, los
compuestos se suministran en la forma de un aerosol pulverizado de
un envase o dispensador presurizado que contiene un propelente
adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono o un
nebulizador.
La administración sistémica también puede ser
mediante medios transmucosos o transdérmicos. Para la
administración transmucosa o transdérmica se usan en la formulación
agentes penetrantes apropiados para la barrera que debe
atravesarse. Tales agentes penetrantes generalmente se conocen en
la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración
transmucosa, detergentes, sales biliares, y derivados del ácido
fusídico. La administración transmucosa puede realizarse a través
del uso de pulverizaciones nasales o supositorios. Para la
administración transdérmica, se formulan los compuestos activos en
pomadas, ungüentos, geles o cremas tal como generalmente se conocen
en la técnica.
También pueden prepararse los compuestos en la
forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio
convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o
enemas de retención para la administración rectal.
En una realización, se preparan los compuestos
activos con vehículos que protegerán el compuesto frente a una
rápida eliminación del cuerpo, tal como una formulación de
liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de
liberación microencapsulados. Pueden usarse polímeros
biodegradables, biocompatibles, tales como
etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido
poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido pdiláctico. Los
procedimientos para la preparación de tales formulaciones serán
evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también
pueden obtenerse comercialmente de Alza Corporation y
NovaPharmaceuticals, Inc. También pueden usarse suspensiones
liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas
usando anticuerpos monoclonales dirigidos hacia antígenos virales)
como vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstos pueden
prepararse según los procedimientos descritos (por ejemplo, patente
de los EE.UU. número 4.522.811).
\newpage
Resulta ventajoso formular composiciones orales
o parenterales en formas farmacéuticas unitarias por la facilidad
de administración y uniformidad de dosificación. La forma
farmacéutica unitaria, tal como se usa en el presente documento, se
refiere a unidades diferenciadas físicamente adecuadas como
dosificaciones unitarias para el sujeto que va a tratarse; cada
unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo
calculada para producir el efecto terapéutico deseado junto con el
vehículo farmacéutico requerido.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales
compuestos pueden determinarse mediante procedimientos
farmacéuticos habituales en cultivos celulares o animales de
experimentación, por ejemplo, para determinar la DL_{50} (la
dosis letal para el 50% de la población) y la DE_{50} (la dosis
terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La razón de
dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico
y puede expresarse como la razón DL_{50}/DE_{50}. Se prefieren
los compuestos que muestran altos índices terapéuticos. Mientras que
pueden usarse compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos,
debe tenerse cuidado al diseñar un sistema de administración que
dirige tales compuestos al sitio de tejido afectado con el fin de
minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, por
tanto, reducir los efectos secundarios.
Pueden usarse los datos obtenidos a partir de
ensayos de cultivo celular y estudios con animales en la
formulación de un intervalo de dosificación para uso en seres
humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra
preferiblemente en un intervalo de concentraciones circulantes que
incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación
puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma
farmacéutica empleada y de la vía de administración utilizada. Para
cualquier compuesto usado en el procedimiento de la invención,
puede estimarse inicialmente la dosis terapéuticamente eficaz a
partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en
modelos animales para lograr un intervalo de concentración en
plasma circulante que incluye la CI_{50} (es decir, la
concentración del compuesto de prueba que alcanza una inhibición de
los síntomas que es la mitad de la máxima) tal como se determina en
cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar de
manera más precisa las dosis útiles en seres humanos. Pueden medirse
los niveles en plasma, por ejemplo, mediante cromatografía líquida
de alta resolución.
Tal como se define en el presente documento, una
cantidad terapéuticamente eficaz de proteína o polipéptido (es
decir, una dosificación eficaz) oscila desde aproximadamente 0,001
hasta 30 miligramos por kilogramo de peso corporal, preferiblemente
desde aproximadamente 0,01 hasta 25 miligramos por kilogramo de
peso corporal, más preferiblemente desde aproximadamente 0,1 hasta
20 miligramos por kilogramo de peso corporal, e incluso más
preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta 10 miligramos por
kilogramo, desde 2 hasta 9 miligramos por kilogramo, desde 3 hasta 8
miligramos por kilogramo, desde 4 hasta 7 miligramos por kilogramo,
o desde 5 hasta 6 miligramos por kilogramo de peso corporal. Puede
administrarse la proteína o el polipéptido una vez a la semana
durante aproximadamente de 1 a 10 semanas, preferiblemente entre 2
y 8 semanas, más preferiblemente entre aproximadamente 3 y 7
semanas, e incluso más preferiblemente durante aproximadamente 4, 5
ó 6 semanas. El experto en la técnica apreciará que algunos
factores pueden influir en la dosificación y el tiempo requerido
para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo pero sin limitarse
a la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos
anteriores, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras
enfermedades presentes. Es más, el tratamiento de un sujeto con una
cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína, polipéptido, o
anticuerpo puede incluir un único tratamiento o, preferiblemente
una serie de tratamientos.
Para anticuerpos, la dosificación preferida es
de 0,1 miligramos por kilogramo de peso corporal (generalmente de
10 a 20 miligramos por kilogramo). Si el anticuerpo va a actuar en
el cerebro, normalmente es adecuada una dosificación de 50 a 100
miligramos por kilogramo. Generalmente, los anticuerpos
parcialmente humanos y los anticuerpos totalmente humanos tienen una
semivida más prolongada dentro del cuerpo humano que otros
anticuerpos. En consecuencia, a menudo son posibles menores
dosificaciones y administraciones menos frecuentes. Pueden usarse
modificaciones tales como lipidación para estabilizar anticuerpos y
para aumentar la captación y penetración tisular (por ejemplo, en
el cerebro). Un procedimiento para la lipidación de anticuerpos se
describe por Cruikshank et al. (1997, J. AIDS Hum. Retrovir.
14:193).
La presente invención engloba agentes que
modulan la expresión o actividad. Un agente puede ser, por ejemplo,
una molécula pequeña. Tales moléculas pequeñas incluyen, pero no se
limitan a, por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos (por ejemplo,
peptoides), aminoácidos, análogos de aminoácidos, polinucleótidos,
análogos de polinucleótidos, nucleótidos, análogos de nucleótidos,
compuestos orgánicos o inorgánicos (es decir, incluyendo compuestos
hetero-orgánicos y organometálicos) que tienen un
peso molecular inferior a aproximadamente 10.000 gramos por mol,
compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular
inferior a aproximadamente 5.000 gramos por mol, compuestos
orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular inferior a
aproximadamente 1.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o
inorgánicos que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente
500 gramos por mol, y sales, ésteres, y otras formas
farmacéuticamente aceptables de tales compuestos.
Dosis a modo de ejemplo incluyen cantidades de
miligramos o microgramos de la molécula pequeña por kilogramo de
sujeto o peso de la muestra (por ejemplo, de aproximadamente 1
microgramo por kilogramo a aproximadamente 500 miligramos por
kilogramo, de aproximadamente 100 microgramos por kilogramo a
aproximadamente 5 miligramos por kilogramo, o de aproximadamente 1
microgramo por kilogramo a aproximadamente 50 microgramos por
kilogramo. También se entiende que las dosis adecuadas de una
molécula pequeña dependen de la potencia de la molécula pequeña con
respecto a la expresión o actividad que va a modularse. Cuando una o
más de estas moléculas pequeñas va a administrarse a un animal (por
ejemplo, un ser humano) con el fin de modular la expresión o
actividad de un polipéptido o ácido nucleico de la invención, un
médico, veterinario, o investigador puede, por ejemplo, prescribir
una dosis relativamente baja al principio, aumentando
posteriormente la dosis hasta que se obtiene una respuesta adecuada.
Además, se entiende que el nivel de dosis específica para cualquier
sujeto animal particular dependerá de una variedad de factores que
incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la edad,
peso corporal, salud general, género y dieta del sujeto, el tiempo
de administración, la vía de administración, la tasa de excreción,
cualquier combinación de fármacos y el grado de expresión o
actividad que va a modularse.
Puede conjugarse un anticuerpo (o fragmento del
mismo) a un resto terapéutico tal como una citotoxina, un agente
terapéutico o ion metálico radiactivo. Una citotoxina o agente
citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para las
células. Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D,
bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido,
vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina,
dihidroxiantracenodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D,
1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína,
tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u
homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no
se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato,
6-mercaptopurina, 6-tioguanina,
citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes
alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tiotepa clorambucilo,
melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida,
busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y
cis-diclorodiaminoplatino (II) (DDP) cisplatino),
antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente
daunomicina) y doxorubicina), antibióticos (por ejemplo,
dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina,
y antramicina (AMC)), y agentes antimitóticos (por ejemplo,
vincristina y vinblastina).
Pueden usarse los conjugados de la invención
para modificar una respuesta biológica dada, y el resto de fármaco
no debe interpretarse como limitado a agentes terapéuticos químicos
clásicos. Por ejemplo, el resto de fármaco puede ser una proteína o
un polipéptido que tiene una actividad biológica deseada. Tales
proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina,
ricina A, gelonina, exotoxina de pseudomonas, o toxina diftérica;
una proteína tal como factor de necrosis tumoral, interferón alfa,
interferón beta, factor de crecimiento nervioso, factor de
crecimiento derivado de plaquetas, activador del plasminógeno
tisular; o, modificadores de la respuesta biológica tales como, por
ejemplo, linfocinas, interleucinas 1, 2, y 6, factor estimulante de
colonias de macrófagos y granulocitos, factor estimulante de
colonias de granulocitos, u otros factores de crecimiento.
Alternativamente, puede conjugarse un anticuerpo
con un segundo anticuerpo para formar un anticuerpo heteroconjugado
tal como se describe por Segal en la patente de los EE.UU. número
4.676.980.
Pueden insertarse las moléculas de ácido
nucleico de la invención en vectores y usarse como vectores de
terapia génica. Los vectores de terapia génica pueden administrarse
a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección intravenosa,
administración local (véase la patente de los EE.UU. número
5.328.470) o mediante inyección estereotáctica (por ejemplo, Chen
et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:3054-3057). La preparación farmacéutica del
vector de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica
en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de
liberación lenta en la que se incluye el vehículo de inserción
génica. Alternativamente, cuando el vector de inserción génica
completo puede producirse intacto a partir de células recombinantes,
por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica
puede incluir una o más células que produce el sistema de inserción
génica.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse
en un envase, paquete, o dispensador junto con las instrucciones
para la administración.
La presente invención proporciona procedimientos
tanto terapéuticos como profilácticos de tratar un sujeto con
riesgo de (o propenso a) un trastorno o que tiene un trastorno
asociado con la actividad o expresión de 13245 no deseada o
aberrante. Con respecto a procedimientos de tratamiento tanto
profilácticos como terapéuticos, tales tratamientos pueden
adaptarse o modificarse específicamente, basándose en el
conocimiento obtenido del campo de la farmacogenómica. La
"farmacogenética" tal como se usa en el presente documento, se
refiere a la aplicación de tecnologías genómicas tales como
secuenciación génica, genética estadística, y análisis de expresión
génica en fármacos en desarrollo clínico y en el mercado. Más
específicamente, el término se refiere al estudio de cómo los genes
de un paciente determinan su respuesta a un fármaco (por ejemplo,
"fenotipo de respuesta a fármaco" o "genotipo de respuesta a
fármaco" de un paciente). Por tanto, otro aspecto de la
invención proporciona procedimientos para adaptar un tratamiento
profiláctico o terapéutico de un individuo con o bien las moléculas
de 13245 de la presente invención o moduladores de 13245 según el
genotipo de respuesta a fármaco del individuo. La farmacogenómica
permite a un internista o médico dirigir los tratamientos
profilácticos o terapéuticos a pacientes que más se beneficiarán
del tratamiento y para evitar el tratamiento de pacientes que
experimentarán efectos secundarios relacionados con el fármaco.
Se define el tratamiento como la aplicación o
administración de un agente terapéutico a un paciente, o la
aplicación ó administración de un agente terapéutico a un tejido o
línea celular aislado de un paciente, que tiene una enfermedad, un
síntoma de enfermedad o una predisposición a una enfermedad, con el
fin de curar, cicatrizar, aliviar, calmar, alterar, remediar,
producir una mejoría, mejorar, o influir en la enfermedad, los
síntomas de la enfermedad o la predisposición a la enfermedad.
Un agente terapéutico incluye, pero no está
limitado a, moléculas pequeñas, péptidos, anticuerpos, ribozimas y
oligonucleótidos antisentido.
\newpage
En un aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para prevenir una enfermedad o un estado en el que un
sujeto asociado con una actividad o expresión de 13245 no deseada o
aberrante, administrando al sujeto una 13245 o un agente que modula
la expresión de 13245, o al menos una actividad de 13245. Pueden
identificarse los sujetos en riesgo de una enfermedad que está
causada o a la que contribuye la actividad o expresión de 13245 no
deseada o aberrante mediante, por ejemplo, cualquiera o una
combinación de ensayos de pronóstico o diagnóstico tal como se
describe en el presente documento. La administración de un agente
profiláctico puede producirse antes de la manifestación de los
síntomas característicos de la aberración de 13245, de tal manera
que se previene una enfermedad o trastorno o, alternativamente, se
retrasa en su evolución. Dependiendo del tipo de aberración de
13245 puede usarse, por ejemplo, una proteína 13245, un agente
agonista de 13245 o un antagonista de 13245 para tratar al sujeto.
Puede determinarse el agente apropiado basándose en los ensayos de
selección descritos en el presente documento.
Es posible que algunos trastornos de 13245
puedan estar causados, al menos en parte, por un nivel anómalo de
producto génico, o por la presencia de un producto génico que
muestra actividad anómala. Como tal, la reducción en el nivel y/o
actividad de tales productos génicos supondrán la mejoría de los
síntomas del trastorno.
Tal como se trata, el tratamiento satisfactorio
de trastornos de 13245 puede lograrse mediante técnicas que sirven
para inhibir la expresión o actividad de productos génicos diana.
Por ejemplo, compuestos, por ejemplo, un agente identificado usando
un ensayo descrito anteriormente, que demuestra que presenta
actividad moduladora negativa, puede usarse según la invención para
prevenir y/o mejorar síntomas de trastornos de 13245. Tales
moléculas pueden incluir, pero no se limitan a péptidos,
fosfopéptidos, moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas, o
anticuerpos (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos policlonales,
monoclonales, humanizados, anti-idiotípicos,
quiméricos o monocatenarios, y, fragmentos de biblioteca de
expresión Fab, F(ab')_{2} y Fab, moléculas scFV, y
fragmentos de unión a epítopos de los mismos).
Además, moléculas antisentido y de ribozima que
inhiben la expresión del gen diana también pueden usarse según la
invención para reducir el nivel de expresión génica diana,
reduciendo así eficazmente el nivel de actividad génica diana.
Todavía adicionalmente, pueden usarse moléculas de triple hélice
para reducir el nivel de actividad génica diana. Las moléculas
antisentido, de ribozima y triple hélice se trataron
anteriormente.
Es posible que el uso de moléculas antisentido,
de ribozima, y/o triple hélice que reducen o inhiben la expresión
génica mutante también pueda reducir o inhibir la transcripción
(triple hélice) y/o traducción (antisentido, ribozima) de ARNm
producido por alelos génicos diana normales, de tal manera que la
concentración de producto génico diana normal presente pueda ser
menor de lo que es necesario para un fenotipo normal. En tales
casos, pueden introducirse moléculas de ácido nucleico que
codifican para y expresan polipéptidos génicos diana que muestran
actividad génica diana normal, en las células por medio de un
procedimiento de terapia génica. Alternativamente, en casos en los
que el gen diana codifica para una proteína extracelular, puede ser
preferible coadministrar proteína génica diana normal dentro de la
célula o tejido con el fin de mantener el nivel requerido de
actividad génica diana celular o tisular.
Otro procedimiento mediante el que pueden
utilizarse moléculas de ácido nucleico para tratar o prevenir una
enfermedad caracterizada por la expresión de 13245 es a través del
uso de moléculas de aptámero específicas para la proteína 13245.
Los aptámeros son moléculas de ácido nucleico que tienen una
estructura terciaria que les permite unirse específicamente a
ligandos de proteína (por ejemplo, Osborne et al., 1997,
Curr. Opin. Chem. Biol. 1:5-9; Patel, 1997, Curr.
Opin. Chem. Biol. 1:32-46). Dado que las moléculas
de ácido nucleico pueden, en muchos casos, introducirse más
convenientemente en células diana de lo que pueden las moléculas de
proteína terapéuticas, los aptámeros ofrecen un procedimiento
mediante el que puede disminuirse específicamente la actividad de
la proteína 13245 sin la introducción de fármacos u otras moléculas
que pueden tener efectos pluripotentes.
Pueden generarse anticuerpos que son específicos
para el producto génico diana y para reducir la actividad de
producto génico diana. Tales anticuerpos pueden, por tanto,
administrarse en casos en los que las técnicas moduladoras
negativas sean apropiadas para el tratamiento de trastornos de
13245.
En circunstancias en las que la inyección a un
sujeto humano o animal de una proteína de 13245 o epítopo para
estimular la producción de anticuerpos es dañina para el sujeto, es
posible generar una respuesta inmunitaria frente a 13245 mediante
el uso de anticuerpos anti-idiotípicos (por ejemplo,
Herlyn, 1999, Ann. Med. 31:66-78;
Bhattacharya-Chatterjee et al., 1998, Cancer
Treat. Res. 94:51-68). Si se introduce un
anticuerpo anti-idiotípico en un sujeto humano o
mamífero, debe estimular la producción de anticuerpos
anti-idiotípicos, que deben ser específicos de la
proteína 13245. También pueden generarse de esta manera, vacunas
dirigidas contra una enfermedad caracterizada por la expresión de
13245.
En casos en los que el antígeno diana es
intracelular y se usan anticuerpos completos, pueden preferirse
anticuerpos de internalización. Puede usarse lipofectina o
liposomas para administrar el anticuerpo o un fragmento de la región
Fab que se une al antígeno diana en las células. Cuando se usan
fragmentos de anticuerpo, se prefiere el fragmento inhibidor más
pequeños que se une al antígeno diana. Por ejemplo, pueden usarse
péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que corresponde a
la región Fv del anticuerpo. Alternativamente, también pueden
administrarse anticuerpos neutralizantes monocatenarios que se unen
a antígenos diana intracelulares. Pueden administrarse tales
anticuerpos monocatenarios, por ejemplo, expresando secuencias de
nucleótidos que codifican para anticuerpos monocatenarios dentro de
la población celular diana (por ejemplo, Marasco et al.,
1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893).
Los compuestos identificados que inhiben la
actividad, síntesis y/o expresión génica diana, pueden
administrarse a un paciente a dosis terapéuticamente eficaces para
prevenir, tratar o mejorar trastornos de 13245. Una dosis
terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad del compuesto
suficiente para dar como resultado una mejoría de los síntomas de
los trastornos.
Puede determinarse la toxicidad y la eficacia
terapéutica de tales compuestos mediante procedimientos
farmacéuticos habituales en cultivos celulares o animales de
experimentación, por ejemplo, para determinar la DL_{50} (la
dosis letal para el 50% de la población) y la DE_{50} (la dosis
terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La razón de
dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice
terapéutico y puede expresarse como la razón DL_{50}/DE_{50}.
Se prefieren los compuestos que muestran altos índices terapéuticos.
Aunque pueden usarse los compuestos que muestran efectos
secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado para diseñar un sistema
de administración que dirige tales compuestos al sitio de tejido
afectado con el fin de minimizar el daño potencial a células no
infectadas y, por tanto, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos a partir de los ensayos de
cultivo celular y estudios con animales pueden usarse en la
formulación de un intervalo de dosificación para uso en humanos. La
dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente en un
intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE_{50}
con muy poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar
dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica
empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier
compuesto en el procedimiento de la invención, puede estimarse
inicialmente la dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos
de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales
para lograr un intervalo de concentración de plasma circulante que
incluye la CI_{50} (es decir, la concentración del compuesto
prueba que alcanza una inhibición de los síntomas que es la mitad
de la máxima) tal como se determina en cultivo celular. Tal
información puede usarse para determinar, de manera más precisa,
dosis útiles en seres humanos. Pueden medirse niveles de plasma, por
ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Otro ejemplo de determinación de la dosis eficaz
para un individuo es la habilidad capacidad para someter a ensayo
directamente los niveles de compuesto "libre" y "unido"
en el suero del sujeto a prueba. Tales ensayos pueden usar
anticuerpos miméticos y/o "biosensores" que se han creado a
través de técnicas de huella molecular ("molecular
imprinting"). El compuesto que puede modular la actividad de
13245 se usa como un molde o " molécula de huella" para
organizar espacialmente los monómeros polimerizables antes de su
polimerización con reactivos catalíticos. La posterior eliminación
de la molécula de huella, deja una matriz polimérica que contiene
una "imagen negativa" repetida del compuesto y que puede
volverse a unir a la molécula en condiciones de ensayo biológico.
Revisiones detalladas de esta técnica aparecen en la técnica
(Ansell et al., 1996, Curr. Opin. Biotechnol.
7:89-94; Shea, 1994, Trends Polymer Sci.
2:166-173). Tales matrices de afinidad "con
huella" son adecuadas para ensayos de unión a ligandos, mediante
los cuales el componente de anticuerpo monoclonal inmovilizado se
sustituye por una matriz con huella de manera apropiada (por
ejemplo, una matriz descrita en Vlatakis et al., 1993, Nature
361:645-647. Mediante el uso de marcado con
isótopos, la concentración "libre" de compuesto que modula la
expresión o actividad de 13245 puede monitorizarse fácilmente y
usarse en cálculos de CI_{50}.
Tales matrices de afinidad "con huella"
también pueden diseñarse para incluir grupos fluorescentes cuyas
propiedades de emisión de fotones cambien de manera medible frente
a la unión local y selectiva de compuesto diana. Estos cambios
pueden someterse a ensayo fácilmente en tiempo real usando
dispositivos de fibra óptica apropiada, permitiendo a su vez, que se
optimice rápidamente la dosis en un sujeto a prueba basándose en su
CI_{50} individual. Un ejemplo rudimentario de tal
"biosensor" se trata en Kriz et al. (1995, Anal. Chem.
67:2142-2144).
Otro aspecto de la invención se refiere a
procedimientos de modulación de la expresión o actividad de 13245
con fines terapéuticos. En consecuencia, en una realización a modo
de ejemplo, el procedimiento modulador de la invención implica
poner en contacto una célula con una 13245 o agente que modula una o
más de las actividades de la actividad de proteína de 13245
asociada con la célula. Un agente que modula la actividad de la
proteína 13245 puede ser un agente, tal como se describe en el
presente documento, tal como un ácido nucleico o una proteína, una
molécula diana que se produce de manera natural de una proteína
13245 (por ejemplo, un sustrato o receptor de 13245), un anticuerpo
de 13245, un agonista o antagonista de 13245, un peptidomimético de
un agonista o antagonista de 13245, u otra molécula pequeña.
En una realización, el agente estimula una o
actividades de 13245. Ejemplos de tales agentes estimuladores
incluyen proteína 13245 activa y una molécula de ácido nucleico que
codifica para 13245. En otra realización, el agente inhibe una o
más actividades de 13245. Ejemplos de tales agentes inhibidores
incluyen moléculas de ácido nucleico antisentido de 13245,
anticuerpos anti-13245 e inhibidores de 13245. Estos
procedimientos moduladores pueden realizarse in vitro (por
ejemplo, cultivando la célula con el agente) o, alternativamente,
in vivo (por ejemplo, administrando el agente a un sujeto).
Como tal, la presente invención proporciona procedimientos para
tratar a un individuo aquejado de una enfermedad o trastorno
caracterizado por actividad o expresión aberrante o no deseada de
una proteína o molécula de ácido nucleico de 13245. En una
realización, el procedimiento implica administrar un agente (por
ejemplo, un agente identificado mediante un ensayo de selección
descrito en el presente documento), o una combinación de agentes
que modula (por ejemplo, regula por incremento o regula por
disminución) la actividad o expresión de 13245. En otra
realización, el procedimiento implica administrar una proteína o
molécula de ácido nucleico de 13245 como terapia para compensar la
actividad o expresión reducida, anómala, o no deseada de 13245.
\newpage
La estimulación de la actividad de 13245 puede
desearse en situaciones en las que 13245 se regula de manera anómala
por disminución y/o en las que un aumento de la actividad de 13245
es probable que tenga un efecto beneficioso. Por ejemplo, la
estimulación de la actividad de 13245 puede desearse en situaciones
en las que una 13245 se regula por disminución y/o en las que un
aumento de la actividad es probable que tenga un efecto beneficioso.
De la misma manera, la inhibición de la actividad de 13245 puede
desearse en situaciones en las que 13245 se regula de manera
anómala por incremento y/o en las que la actividad de 13245 es
probable que tenga un efecto beneficioso.
Las moléculas de 13245 de la presente invención,
así como los agentes, o moduladores que tienen efecto estimulador o
inhibidor sobre la actividad de 13245 (por ejemplo, expresión
génica 13245) tal como se identifica mediante un ensayo de
selección descrito en el presente documento, pueden administrarse a
individuos para tratar (profilácticamente o terapéuticamente)
trastornos asociados a 13245 asociados con la actividad de 13245
aberrante o no deseada (por ejemplo, trastornos asociados con
tumorigenesis o inducción de una respuesta inmunitaria
inapropiada). Junto con tal tratamiento, puede considerarse la
farmacogenómica (es decir, el estudio de la relación entre el
genotipo de un individuo y la respuesta de ese individuo frente a
un compuesto foráneo o fármaco). Diferencias en el metabolismo de
terapéuticos pueden conducir a toxicidad severa o fallo terapéutico
mediante la alteración de la relación entre la dosis y la
concentración sanguínea del fármaco farmacológicamente activo. Por
tanto, un médico o un internista puede considerar aplicar el
conocimiento adquirido en estudios farmacogenómicos relevantes para
determinar si administrar una molécula de 13245 o un modulador de
13245 así como confeccionar la dosificación y/o régimen terapéutico
del tratamiento con una molécula de 13245 o modulador de 13245.
La farmacogenómica trata con variaciones
hereditarias clínicamente significativas en la respuesta a fármacos
debido a la disposición alterada del fármaco y acción anómala en
personas afectadas (por ejemplo, Eichelbaum et al., 1996,
Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23:983-985; Linder
et al., 1997, Clin. Chem. 43:254-266). En
general, pueden distinguirse dos tipos de condiciones
farmacogenéticas. Las condiciones genéticas transmitidas como un
factor sencillo que altera la forma en que los fármacos actúan
sobre el cuerpo (acción de fármaco alterada) o condiciones genéticas
transmitidas como factores sencillos que alteran la forma en que el
cuerpo actúa sobre los fármacos (metabolismo del fármaco alterado).
Estas condiciones farmacogenéticas pueden producirse o bien como
defectos genéticos raros o polimorfismos que se producen de manera
natural. Por ejemplo, la deficiencia de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(G6PD) es una enzimopatía heredada común en la que la principal
complicación clínica es la hemólisis tras la ingestión de fármacos
oxidantes (anti-malaria, sulfonamidas, analgésicos,
nitrofuranos) y consumo de habas.
Un enfoque farmacogenómico para identificar
genes que predicen la respuesta a fármaco, conocida como
"asociación amplia a genoma", se basa principalmente en un
mapa de alta resolución del genoma humano constituido por
marcadores relacionados con genes ya conocidos (por ejemplo, un mapa
de marcador génico "bi-alélico" constituido
por 60.000-100.000 sitios polimórficos o variables
en el genoma humano, cada uno de los cuales tiene dos variantes).
Tal mapa genético de alta resolución puede comprarse con un mapa
del genoma de cada uno de los diversos pacientes estadísticamente
significativos que participan en el ensayo farmacológico en la fase
II/III para identificar marcadores asociados con una respuesta
farmacológica observado particular o efecto secundario.
Alternativamente, un mapa de alta resolución de este tipo puede
generarse a partir de una combinación de algunos diez millones de
polimorfismos de un único nucelótido (SNP, single nucleotide
polymorphism) conocidos en el genoma humano. Tal como se usa en el
presente documento un "SNP" es una alteración común que se
produce en una base de nucleótidos sencilla en una extensión de
ADN. Por ejemplo, puede producirse un SNP una vez por cada 1000
bases de ADN. Un SNP puede estar implicado en un proceso
patológico, sin embargo, la gran mayoría puede no estar asociada
con enfermedad. Dado un mapa genético basado en la producción de
tales SNP, pueden agruparse los individuos en categorías genéticas
dependiendo del patrón particular de los SNP en su genoma
individual. De tal manera, regímenes de tratamiento pueden
confeccionarse en grupos de individuos genéticamente similares,
teniendo en cuenta las características comunes entre individuos
genéticamente similares.
Alternativamente, puede utilizarse un
procedimiento denominado con el término "enfoque génico del
candidato" para identificar genes que predicen una respuesta al
fármaco. Según este procedimiento, si se conoce un gen que codifica
para una diana de fármaco (por ejemplo, una proteína de 13245 de la
presente invención), todas las variantes habituales de ese gen
pueden identificarse fácilmente en la población y puede
determinarse si tener una versión del gen frente otra está asociado
con una respuesta al fármaco particular.
Alternativamente, puede utilizarse un
procedimiento denominado con el término "perfiles de la expresión
génica", para identificar genes que predicen la respuesta al
fármaco. Por ejemplo, la expresión génica de un animal al que se le
ha dado una dosis con un fármaco (por ejemplo, una molécula de 13245
o un modulador de 13245 de la presente invención) puede dar
indicación si se han activado las rutas génicas relacionadas con la
toxicidad.
Puede usarse la información generada a partir de
más de uno de los enfoques farmacogenómicos anteriores para
determinar dosificaciones adecuadas y regímenes de tratamiento para
tratamiento profiláctico o terapéutico de un individuo. Este
conocimiento, cuando se aplica a la dosificación o a la selección
del fármaco, puede evitar reacciones adversas o fallo terapéutico y
por tanto mejora la eficacia terapéutica o profiláctica cuando se
trata a un sujeto con una molécula de 13245 o un modulador de
13245, tal como un modulador identificado mediante los ensayos de
selección a modo de ejemplo descritos en el presente documento.
La presente invención proporciona además
procedimientos para identificar agentes nuevos, o combinaciones,
que están basadas en agentes de identificación que modulan la
actividad de uno o más de los productos génicos que están
codificados por uno o más de los genes 13245 de la presente
invención, en los que estos productos pueden asociarse con la
resistencia de las células frente a un agente terapéutico.
Específicamente, puede usarse la actividad de las proteínas que se
codifican por los genes 13245 de la presente invención como base
para determinar los agentes de identificación para superar la
resistencia del agente. Bloqueando la actividad de una o más de las
proteínas resistentes, células diana, por ejemplo, células del
sistema inmunitario, se volverán sensibles al tratamiento con un
agente frente al que las células no modificadas diana eran
resistentes.
Puede aplicarse la monitorización de la
influencia de los agentes (por ejemplo, fármacos) sobre la
expresión o actividad de una proteína 13245 en ensayos clínicos.
Por ejemplo, puede monitorizarse la eficacia de un agente
determinado mediante un ensayo de selección tal como se describe en
el presente documento para aumentar la expresión del gen 13245, los
niveles de proteína, o la actividad de 13245 regulada por
incremento, en ensayos clínicos de sujetos que muestran expresión
del gen 13245, niveles de proteína, o actividad de 13245 regulada
por disminución disminuidas. Alternativamente, puede monitorizarse
la eficacia de un agente determinado mediante un ensayo de
selección para disminuir la expresión génica 13245, los niveles de
proteína, o la actividad de 13245 regulada por disminución, en
ensayos clínicos de sujetos que muestran un aumento en la expresión
de gen 13245, niveles de proteína, o actividad de 13245 regulada
por incremento. En tales ensayos clínicos, la expresión o actividad
de un gen 13245, y preferiblemente, de otros genes que se han
implicado en, por ejemplo, un trastorno asociado a 13245 puede
usarse como una "lectura" o marcadores de fenotipo de una
célula particular.
En otro aspecto, la invención se caracteriza por
un procedimiento para analizar una pluralidad de sondas de captura.
El procedimiento puede usarse, por ejemplo, para analizar la
expresión génica. El procedimiento incluye: proporcionar una matriz
bidimensional que tiene una pluralidad de direcciones, pudiéndose
distinguir posicionalmente cada dirección de la pluralidad de cada
otra dirección de la pluralidad, y teniendo cada dirección de la
pluralidad una única sonda de captura, por ejemplo, una secuencia
de péptidos o ácido nucleico; poner en contacto la matriz con un
ácido nucleico, preferiblemente purificado, polipéptido,
preferiblemente purificado, o anticuerpo de 13245, y evaluando así
la pluralidad de sondas de captura. Se detecta la unión, por
ejemplo, en el caso de un ácido nucleico, la hibridación con una
sonda de captura en una dirección de la pluralidad, por ejemplo,
por una señal generada a partir de una etiqueta unida al ácido
nuleico, polipéptido o anticuerpo de 13245.
Las sondas de captura pueden ser un conjunto de
ácidos nucleicos de una muestra seleccionada, por ejemplo, una
muestra de ácidos nucleicos derivados de una célula o tejido no
estimulado o de control.
El procedimiento puede incluir poner en contacto
el ácido nucleico, polipéptido o anticuerpo de 13245 con una
primera matriz que tiene una pluralidad de sondas de captura y una
segunda matriz que tiene una pluralidad distinta de sondas de
captura. Pueden compararse los resultados de la hibridación, por
ejemplo, para analizar las diferencias en la expresión entre una
primera y segunda muestra. La primera pluralidad de sondas de
captura puede ser de una muestra control, por ejemplo, una muestra
de tipo natural, normal, o sin enfermedad, no estimulada, por
ejemplo, una muestra celular, tisular o de fluido biológico. La
segunda pluralidad de sondas de captura puede ser de una muestra
experimental, por ejemplo, una muestra de tipo mutante, en riesgo,
en fase de la enfermedad o en fase del trastorno, o estimulado, por
ejemplo, una muestra celular, tisular o de fluido biológico.
La pluralidad de sondas de captura puede ser una
pluralidad de sondas de ácidos nucleicos cada uno de los cuales
híbrida específicamente con un alelo de 13245. Tales procedimientos
pueden usarse para diagnosticar a un sujeto, por ejemplo, para
evaluar el riesgo de padecer una enfermedad o trastorno, para
evaluar la idoneidad de un tratamiento seleccionado para un sujeto,
para evaluar si un sujeto tiene una enfermedad o un trastorno.
13245 está asociado con la fosforilación de proteínas, por tanto es
útil para evaluar trastornos relacionados con la fosforilación de
proteínas aberrante, tal como tumorigenesis y señalización de
células inadecuada.
Puede usarse el procedimiento para detectar SNP,
tal como se describe anteriormente.
En otro aspecto, la invención se caracteriza por
un procedimiento para analizar una pluralidad de sondas. El
procedimiento es útil, por ejemplo, para analizar la expresión
génica. El procedimiento incluye: proporcionar una matriz de
bidimensionales que tiene una pluralidad de direcciones, pudiéndose
distinguir posicionalmente cada dirección de la pluralidad de cada
otra dirección de la pluralidad que tiene un única sonda de
captura, por ejemplo, en el que las sondas de captura son de una
célula o sujeto que expresa 13245 o de una célula o sujeto en el
que se ha provocado una respuesta mediada por 13245, por ejemplo,
mediante el contacto de la célula con el proteína o ácido nucleico
de 13245 o administración a la célula o sujeto de la proteína o
ácido nucleico de 13245; poner en contacto la matriz con una o más
sondas de investigación, en la que una sonda de investigación puede
ser un ácido nucleico, polipéptido, o anticuerpo (que es
preferiblemente otro distinto de un ácido nucleico, polipéptido o
anticuerpo de 13245); proporcionar una matriz bidimensional que
tiene una pluralidad de direcciones, pudiéndose distinguir
posicionalmente cada dirección de la pluralidad de cada otra
dirección de la pluralidad, y teniendo cada dirección de la
pluralidad una única sonda de captura, por ejemplo, en la que las
sondas de captura son de una célula o sujeto que no expresa 13245
(o no expresa tanto como en el caso de pluralidad positiva de sondas
de captura de 13245) o de una célula o sujeto cuya respuesta
mediada por 13245 no ha sido provocada (o se ha provocado en menor
grado que en la primera muestra); poner en contacto la matriz con
una o más sondas de investigación (que es preferiblemente otra
distinta de un ácido nucleico, polipéptido o anticuerpo de 13245), y
evaluando así la pluralidad de sondas de captura. Se detecta la
unión, por ejemplo, en el caso de un ácido nucleico, la hibridación
con una sonda de captura en una dirección de la pluralidad, por
ejemplo, mediante una señal generada a partir de una etiqueta unida
al ácido nucleico o anticuerpo.
En otro aspecto, la invención se caracteriza por
un procedimiento para analizar una pluralidad de sondas o una
muestra. Este procedimiento es útil, por ejemplo, para analizar la
expresión génica. El procedimiento incluye: proporcionar una matriz
bidimensional que tiene una pluralidad de direcciones, pudiéndose
distinguir posicionalmente cada dirección de la pluralidad de cada
otra dirección de la pluralidad que tiene un única sonda de
captura, poner en contacto la matriz con una primera muestra de la
célula o sujeto que expresa o se expresa de manera errónea 13245 o
a partir de una célula o sujeto en el que se provoca una respuesta
mediada por 13245, por ejemplo, poniendo en contacto la célula con
la proteína o ácido nucleico 13245, o administrando a la célula o
al sujeto la proteína o ácido nucleico de 13245; proporcionar una
matriz bidimensional que tiene una pluralidad de direcciones,
pudiéndose distinguir posicionalmente cada dirección de la
pluralidad de cada otra dirección de la pluralidad, y teniendo cada
dirección de la pluralidad una única sonda de captura, y poner en
contacto la matriz con una segunda muestra de una célula o sujeto
que no expresa 13245 (o no expresa tanto como en el caso de
pluralidad positiva de sondas de captura de 13245) o de una célula
o sujeto en el que no se ha provocado una respuesta mediada por
13245 (o se ha provocado en menor grado que en la primera muestra);
y comparar la unión de la primera muestra con la unión de la
segunda muestra. Se detecta la unión, por ejemplo, en el caso de un
ácido nucleico, la hibridación con una sonda de captura en una
dirección de la pluralidad, por ejemplo, por una señal generada a
partir de una etiqueta unida al ácido nucleico, polipéptido, o
anticuerpo. Puede usarse la misma matriz para ambas muestras o
pueden usarse distintas matrices. Si se usan distintas matrices, la
pluralidad de direcciones con sondas de captura tendrá que estar
presente en ambas matrices.
En otro aspecto, la invención se caracteriza por
un procedimiento para analizar 13245, por ejemplo, analizar la
estructura, la función o la relación con otras secuencias de
aminoácidos o ácidos nucleicos. El procedimiento incluye:
proporcionar una secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de
13245, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de 13245 o una
parte de la misma; comparar la secuencia de 13245 con una o más,
preferiblemente una pluralidad de secuencias de un conjunto de
secuencias, por ejemplo, una base de datos de secuencias de
proteínas o ácidos nucleico; para analizar de esta manera 13245.
El procedimiento puede incluir evaluar la
identidad de secuencia entre una secuencia de 13245 y una secuencia
de base de datos. El procedimiento puede realizarse accediendo a la
base de datos en un segundo sitio, por ejemplo, a través de
Internet.
En otro aspecto, la invención se caracteriza por
un conjunto de oligonucleótidos, útiles, por ejemplo, para
identificar los SNP, o identificar alelos específicos de 13245. El
conjunto incluye una pluralidad de oligonucleótidos, cada uno de
los cuales tiene un nucleótido diferente en una posición de
interrogación, por ejemplo, un SNP o el sitio de una mutación. En
una realización preferida, la pluralidad de oligonucleótidos es
idéntica en secuencia con las otras (excepto por las diferencias en
longitud). Los oligonucleótidos pueden estar dotados con etiquetas
diferenciales, de manera que un oligonucleótido que híbrida con un
alelo proporciona una señal que es distinguible de un
oligonucleótido que híbrida con un segundo alelo.
La secuencia de moléculas de 13245 se
proporciona en una variedad de medios para facilitar el uso de la
misma. Puede proporcionarse una secuencia como una fabricación,
distinto de un ácido nucleico aislado o molécula de ácido nucleico,
que contiene un 13245. Una fabricación de este tipo puede
proporcionar una secuencia de aminoácidos o nucleótidos, por
ejemplo, un marco de lectura abierto, en una forma que permite el
examen de la fabricación usando medios no aplicables directamente
para examinar las secuencias de aminoácidos o nucleótidos, o un
subconjunto de las mismas, dado que existen en la naturaleza o en
forma purificada.
Una secuencia de aminoácidos o nucleótidos de
13245 puede grabarse en medios legibles en ordenador. Tal como se
usa en el presente documento, "medios legibles en ordenador"
se refiere a cualquier medio que puede leerse y al cual se puede
acceder directamente en un ordenador. Un medio de este tipo
incluye, pero no se limita a: medio de almacenamiento magnético,
tales como disquetes, medio de almacenamiento de disco duro, y cinta
magnética; medio de almacenamiento óptico tal como
CD-ROM; medio de almacenamiento eléctrico tales
como RAM y ROM; e híbridos de estas categorías tales como medios de
almacenamiento magnético/óptico.
Una variedad de estructuras de almacenamiento de
datos, está disponible para los expertos en la técnica para crear
un medios legible en ordenador que tiene grabados sobre ellos una
secuencia de aminoácidos o nucleótidos de la presente invención. La
elección de la estructura de almacenamiento de datos estará basada
generalmente en los medios elegidos para acceder a la información
almacenada. Además, pueden usarse una variedad de programas de
procesamiento de datos y formatos para almacenar la información de
la secuencia de nucleótidos de la presente invención en medios
legibles en ordenador. La información de la secuencia puede
representarse en un archivo de procesador de texto, formateado en
un software disponible comercialmente tal como WordPerfect^{TM} y
Microsoft Word^{TM}, o representado en la forma de un archivo
ASCII, almacenado en una aplicación de base de datos, tales como
DB2, Sybase^{TM}, Oracle^{TM}, o similares. El experto en la
técnica puede adaptar fácilmente cualquier número de formatos de
estructuración de procesadores de datos (por ejemplo, archivo de
texto o base de datos) con el fin de obtener un medio legible en
ordenador que tiene grabado en el mismo información de la secuencia
de nucleótidos de la presente invención.
Proporcionando las secuencias de aminoácidos o
nucleótidos de la invención en forma legible en ordenador, el
experto en la técnica puede acceder de manera rutinaria a la
información de secuencia para varios fines. Por ejemplo, un experto
en la técnica, puede usar las secuencias de aminoácidos o
nucleótidos de la invención en forma legible en ordenador para
comparar una secuencia diana o motivo estructural diana con la
información de secuencia almacenada en los medios de almacenamiento
de datos. Se usa una búsqueda para identificar fragmentos o
regiones de las secuencias de la invención que se ajusta a una
secuencia diana o motivo diana.
Tal como se usa en el presente documento, una
"secuencia diana" puede ser cualquier secuencia de ADN o
aminoácidos de seis o más nucleótidos o dos o más aminoácidos. Un
experto en la técnica puede reconocer fácilmente que cuanto más
larga es la secuencia, menos probable es que la secuencia diana esté
presente como un acontecimiento aleatorio en la base de datos. Las
longitudes de secuencia típicas son desde aproximadamente 10 hasta
100 aminoácidos o desde aproximadamente 30 hasta 300 residuos de
nucleótido. Sin embargo, está más que reconocido que los fragmentos
comercialmente importantes, tales como fragmentos de secuencia
implicados en la expresión génica y el procesamiento de proteínas,
pueden ser más cortos.
El software de ordenador está disponible
públicamente, lo que permite a un experto en la técnica acceder a
la información de la secuencia facilitada en un medio legible en
ordenador para el análisis y comparación con otras secuencias. Una
variedad de algoritmos conocidos está descrita públicamente y una
variedad de software disponible comercialmente para realizar medios
de búsqueda puede usarse en los sistemas basados en ordenadores de
la presente invención. Ejemplos de un software de este tipo
incluyen, pero no se limitan a, MacPattem (EMBL), BLASTN y BLASTX
(NCBIA).
Por tanto, la invención se caracteriza por un
procedimiento de obtener un registro legible en ordenador de una
secuencia de 13245 que incluye grabar la secuencia en una matriz
legible en ordenador. En una realización preferida, el registro
incluye uno o mas de las siguientes: identificación de un marco de
lectura abierto; identificación de un dominio, región o sitio;
identificación del inicio de la transcripción; identificación del
terminador de la transcripción; la secuencia de aminoácidos de
longitud completa de la proteína o forma madura de la misma; el
extremo 5' de la región traducida; o las regiones reguladoras de los
extremos 5' y/o 3'.
En otro aspecto, la invención se caracteriza
por, un procedimiento para analizar una secuencia. El procedimiento
incluye: proporcionar una secuencia o registro de 13245, en forma
legible en ordenador; comparar una segunda secuencia con la
secuencia génica nombrada; analizando, de esta manera, una
secuencia. La comparación puede incluir comparar con secuencias para
determinar la identidad de la secuencia o determinar si una
secuencia está incluida dentro de otra, por ejemplo, determinar si
una secuencia de 13245 incluye una secuencia que se está
comparando. En una realización preferida, se almacena la segunda
secuencia o 13245 en un primer ordenador, por ejemplo, en un primer
sitio y se realiza la comparación, lectura o registro en un segundo
ordenador, por ejemplo, en un segundo sitio. Por ejemplo, la segunda
secuencia o 13245 puede almacenarse en una base de datos pública o
en propiedad en un ordenador, y los resultados de la comparación
realizada, leídos o registrados en un segundo ordenador. En una
realización preferida, el registro incluye una o más de las
siguientes: identificación de un ORF; identificación de un dominio,
región, o sitio; identificación del inicio de la transcripción;
identificación del terminador de la transcripción; la secuencia de
aminoácidos de longitud completa de la proteína, o una forma madura
de la misma; el extremo 5' de la región traducida; o las regiones
reguladoras de los extremos 5' y/o 3'.
Esta invención se ilustra además mediante los
siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes. Los
contenidos de todas las referencias, patentes y solicitudes de
patentes publicadas citadas a lo largo de esta solicitud se
incorporan al presente documento como referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de nucleótidos de 13245 humano
(figura 1; SEQ ID NO: 1), que tiene aproximadamente 6575
nucleótidos de longitud, incluyendo regiones no traducidas,
contiene una secuencia codificante iniciada por metionina predicha
en aproximadamente los residuos de nucleótido
19-6178. La secuencia codificante codifica para una
proteína de 2053 aminoácidos (SEQ ID NO: 2).
Se pueden realizar hibridaciones por
inmunotransferencia tipo Northern con varias muestras de ARN en
condiciones habituales y lavarse en condiciones rigurosas, es
decir, 0,2xSSC a 65°C. Puede usarse una sonda de ADN
correspondiente a todo o una parte del ADNc de 13245 (SEQ ID NO: 1).
Puede marcarse radiactivamente el ADN con, por ejemplo,
^{32}P-dCTP usando el kit
Prime-It^{TM} (Stratagene, La Jolla, CA) según
las instrucciones del proveedor. Pueden sondarse filtros que
contienen ARNm de tejidos endocrinos y hematopoyéticos de ratón, y
líneas celulares de cáncer (Clontech, Palo Alto, CA) en disolución
de hibridación ExpressHyb^{TM} (Clontech) y lavarse con alta
rigurosidad según las recomendaciones del fabricante.
En este ejemplo, se expresa 13245 como un
polipéptido de fusión recombinante
glutatión-S-transferasa (GST) en
E. coli y se aisla y se caracteriza el polipéptido de
fusión. Se fusionan secuencias de ácido nucleico de 13245
específicamente con secuencias de ácido nucleico de GST y se expresa
este constructo de fusión en E. coli, por ejemplo, en la
cepa PEB199. Se induce la expresión del constructo de fusión
GST-13245 en PEB199 con IPTG. Se purifica el
polipéptido de fusión recombinante a partir de lisados bacterianos
crudos de la cepa PEB199 inducida mediante cromatografía de
afinidad o lechos de glutatión. Se determina el peso molecular del
polipéptido de fusión resultante, usando un análisis por
electroforesis en gel de poliacrilamida del polipéptido purificado a
partir de los lisados bacterianos.
Para expresar el gen 13245 en células COS, se
usa el vector pcDNA/Amp de Invitrogen Corporation (San Diego, CA).
Este vector contiene un origen de replicación de SV40, un gen de
resistencia a ampicilina, un origen de replicación de E.
coli, un promotor de CMV seguido de una región de polilinker
(poliligador) y un intrón de SV40 y un sitio de poliadenilación. Se
clona un fragmento de ADN que codifica para la proteína entera de
13245 y una etiqueta de HA (Wilson et al., 1984, Cell
37:767) o una etiqueta FLAG® fusionada en marco a su extremo 3' del
fragmento en una región polilinker del vector, colocando de esta
manera, la expresión de la proteína recombinante bajo control del
promotor del CMV.
Para construir el plásmido, se amplifica la
secuencia ADN de 13245 mediante PCR usando dos cebadores. El
cebador en 5' contiene el sitio de restricción de interés seguido
por aproximadamente veinte nucleótidos de la secuencia codificante
de 13245 empezando desde el codón de iniciación; la secuencia del
extremo 3' contiene secuencias complementarias a los otros sitios
de restricción de interés, un codón de terminación de la traducción,
la etiqueta HA o la etiqueta FLAG® y los últimos 20 nucleótidos de
la secuencia codificante de 13245. Se digieren el fragmento
amplificado por PCR y el vector pcDNA/Amp con las enzimas de
restricción adecuadas y se desfosforila el vector usando la enzima
CIAP (New England Biolabs, Beverly, MA). Preferiblemente, los dos
sitios de restricción elegidos son diferentes de manera que el gen
13245 se inserta en la orientación deseada. Se transforma la mezcla
de ligación en células E. coli (pueden usarse cepas HB101,
DH5alfa, SURE, disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla,
CA), se siembra en una placa el cultivo transformado en placas con
medio de ampicilina, y se seleccionan las colonias resistentes. Se
aisla el ADN del plásmido aislado a partir de transformantes y se
examina mediante análisis de restricción para determinar la
presencia del fragmento correcto.
Posteriormente se transfectan células COS con el
ADN de plásmido 13245-pcDNA/Amp usando
procedimientos de coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro
de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano,
lipofección, o electroporación. Otros procedimientos adecuados para
transfectar células huésped puede encontrarse en Sambrook et
al., (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2' ed.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Se
detecta la expresión del polipéptido 13245 mediante radiomarcación
(puede usarse ^{35}S-metionina o
^{35}S-cisteína, disponible de NEN, Boston, MA) e
inmunoprecipitación (Harlow et al., 1988, Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY) usando un anticuerpo monoclonal específico contra HA.
Brevemente, se marcan las células durante 8 horas con
^{35}S-metionina (o
^{35}S-cisteína). Se recogen entonces los medios
de cultivo y se lisan las células usando detergentes (tampón RIPA,
NaCl 150 milimolar, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, DOC al
0,5%, Tris 50 milimolar, pH 7,5). Tanto el lisado celular como los
medios de cultivo se precipitan con un anticuerpo monoclonal
específico contra HA. Entonces se analizan los polipéptidos
precipitados mediante SDS-PAGE.
Alternativamente, se clona el ADN que contiene
la secuencia codificante de 13245 directamente en el polilinker del
vector pcDNA/Amp usando los sitios de restricción adecuados. Se
transfecta el plásmido resultante dentro de células COS de la forma
anteriormente descrita, y se detecta la expresión del polipéptido de
13245 mediante radiomarcación e inmunoprecipitación usando un
anticuerpo monoclonal específico para 13245.
<110> KAPELLER-LIBERMANN,
Rosana
\hskip1cmMILLENIUM PHARMACEUTICALS, INC
\vskip0.400000\baselineskip
<120> 13245, proteína quinasa de tipo
distrofia miotónica humana novedosa y usos de la misma
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 10147-57WO
\vskip0.400000\baselineskip
<140> No asignado aún
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
23-10-2001
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento US 60/242.429
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
23-10-2001
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6574
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2053
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2055
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1641
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1597
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1286
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (42)
1. Una molécula aislada de ácido nucleico
seleccionada del grupo constituido por:
a) una molécula de ácido nucleico que comprende
una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a
la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3, en la que la
molécula de ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene
actividad quinasa;
b) una molécula de ácido nucleico que comprende
un fragmento de al menos 1400 nucleótidos contiguos de la secuencia
de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3, en la que la molécula de ácido
nucleico codifica para un polipéptido que tiene actividad
quinasa;
c) una molécula de ácido nucleico que codifica
para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO: 2;
d) una molécula de ácido nucleico que codifica
para un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en la que el fragmento comprende al
menos 1000 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2 y tiene actividad
quinasa; y
e) una molécula de ácido nucleico que codifica
para una variante alélica que produce de manera natural de un
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
2, en la que la molécula de ácido nucleico hibrida con una molécula
de ácido nucleico que comprende una de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y
un complemento de las mismas, en condiciones rigurosas, y en la que
la molécula de ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene
actividad quinasa.
2. Molécula aislada de ácido nucleico según la
reivindicación 1, que se selecciona del grupo constituido por:
a) una molécula de ácido nucleico que comprende
la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3; y
b) una molécula de ácido nucleico que codifica
para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO: 2.
3. Molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 1, que comprende además una secuencia de ácido
nucleico de vector.
4. Molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 1, que comprende además una secuencia de ácido
nucleico que codifica para un polipéptido heterólogo.
5. Una célula huésped que contiene la molécula
de ácido nucleico según la reivindicación 1.
6. Célula huésped según la reivindicación 5, en
la que la célula huésped es una célula huésped de mamífero.
7. Una célula huésped de mamífero no humano que
contiene la molécula de ácido nucleico según la reivindicación
1.
8. Un polipéptido aislado seleccionado del grupo
constituido por:
a) un polipéptido que está codificado por una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% al ácido nucleico
que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3, en
la que el polipéptido tiene actividad quinasa;
b) una variante alélica que se produce de manera
natural de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos
de SEQ ID NO: 2, en la que el polipéptido está codificado por una
molécula de ácido nucleico que hibrida con una molécula de ácido
nucleico que comprende una de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 en
condiciones rigurosas, y en la que el polipéptido tiene actividad
quinasa;
c) un fragmento de un polipéptido que comprende
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en el que el fragmento
comprende al menos 1000 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2, y en
el que el polipéptido tiene actividad quinasa; y
d) un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos que es idéntica en al menos un 80% a la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en el que el polipéptido tiene
actividad quinasa.
9. Polipéptido aislado según la reivindicación
8, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
10. Polipéptido según la reivindicación 8, que
comprende además una secuencia de aminoácidos heteróloga.
11. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa
del mismo que se une selectivamente con un polipéptido según la
reivindicación 8.
12. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa
del mismo según la reivindicación 11, en el que el anticuerpo está
marcado de manera que puede detectarse.
13. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa
del mismo según la reivindicación 12, en el que el marcador
detectable se selecciona del grupo constituido por:
a) enzimas;
b) grupos prostéticos;
c) materiales fluorescentes;
d) materiales luminiscentes;
e) materiales bioluminiscentes; y
f) materiales radiactivos.
14. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa
del mismo según la reivindicación 11, en el que el anticuerpo se
selecciona del grupo constituido por:
a) anticuerpo monoclonal;
b) anticuerpo policlonal;
c) fragmento Fab;
d) fragmento F(ab')_{2};
e) anticuerpo quimérico;
f) anticuerpo humanizado; y
g) anticuerpo humano
15. Un procedimiento para producir un
polipéptido seleccionado del grupo constituido por:
a) un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 2;
b) un polipéptido que comprende un fragmento de
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en el que el fragmento
comprende al menos 1000 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2, y en
el que el polipéptido tiene actividad quinasa; y
c) una variante alélica que se produce de manera
natural de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos
de SEQ ID NO: 2, en el que el polipéptido está codificado por una
molécula de ácido nucleico que hibrida con una molécula de ácido
nucleico que comprende una de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, en
condiciones rigurosas, y en el que el polipéptido tiene actividad
quinasa;
d) un polipéptido que está codificado por una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a una molécula de
ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID
NO: 1 ó 3, en el que el polipéptido tiene actividad quinasa; y
e) un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos que es idéntica en al menos un 80% a la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en el que el polipéptido tiene
actividad quinasa;
comprendiendo el procedimiento cultivar la
célula huésped según la reivindicación 5 en condiciones en las que
se expresa la molécula de ácido nucleico.
16. Un procedimiento para detectar la presencia
de un polipéptido según la reivindicación 8 en una muestra, que
comprende:
a) poner en contacto la muestra con un
anticuerpo que se une selectivamente con un polipéptido según la
reivindicación 8; y
b) determinar si el anticuerpo se une con el
polipéptido en la muestra.
17. Un kit que comprende un anticuerpo que se
une selectivamente con un polipéptido según la reivindicación 8 e
instrucciones de uso.
18. Un procedimiento para detectar la presencia
de una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 en una
muestra, que comprende las etapas de:
a) poner en contacto la muestra con una sonda de
ácido nucleico o cebador que hibrida selectivamente con la molécula
de ácido nucleico; y
b) determinar si la sonda de ácido nucleico o
cebador se une con una molécula de ácido nucleico en la
muestra.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, en
el que la muestra comprende moléculas de ARNm y se pone en contacto
con una sonda de ácido nucleico.
20. Un kit que comprende una sonda de ácido
nucleico o cebador que se hibrida selectivamente con una molécula
de ácido nucleico según la reivindicación 1 e instrucciones de
uso.
21. Un procedimiento para identificar un
compuesto que se une con un polipéptido según la reivindicación 8,
que comprende las etapas de:
a) poner en contacto un polipéptido o una célula
que expresa un polipéptido según la reivindicación 8 con un
compuesto de prueba; y
b) determinar si el polipéptido se une con el
compuesto de prueba.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que la unión del compuesto de prueba con el polipéptido se
detecta mediante un procedimiento seleccionado del grupo
constituido por:
a) detección de la unión mediante detección
directa de la unión del compuesto de prueba/polipéptido;
b) detección de la unión usando un ensayo de
unión competitiva; y
c) detección de la unión usando un ensayo para
determinar la transducción de señales mediada por 13245.
23. Un procedimiento in vitro para
modular la actividad de un polipéptido según la reivindicación 8,
que comprende poner en contacto un polipéptido o una célula que
expresa un polipéptido según la reivindicación 8 con un anticuerpo
que se une con el polipéptido en una concentración suficiente para
modular la actividad del polipéptido.
24. Un procedimiento para identificar un
compuesto que modula la actividad de un polipéptido según la
reivindicación 8, que comprende:
a) poner en contacto un polipéptido según la
reivindicación 8 con un compuesto de prueba; y
b) determinar el efecto del compuesto de prueba
sobre la actividad del polipéptido para identificar de ese modo un
compuesto que modula la actividad del polipéptido.
25. Uso de un anticuerpo que modula la actividad
de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es
idéntica en al menos un 80% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NO: 2 y que tiene actividad quinasa, en la fabricación de un
medicamento para modular la capacidad de una célula para catalizar
la interconversión de las formas fosforiladas y desfosforiladas de
una proteína GTPasa.
26. Uso de un ácido nucleico antisentido o una
ribozima que modula la expresión de una molécula de ácido nucleico
que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al
menos un 80% a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3 y
que codifica para un polipéptido que tiene actividad quinasa, en la
fabricación de un medicamento para modular la capacidad de una
célula para catalizar la interconversión de las formas fosforiladas
y desfosforiladas de una proteína GTPasa.
27. Uso según la reivindicación 26, en el que el
ácido nucleico antisentido hibrida en condiciones rigurosas con
transcrito del gen 13245.
28. Uso según la reivindicación 27, en el que el
ácido nucleico antisentido comprende al menos 15 residuos de
nucleótidos.
29. Uso según la reivindicación 27, en el que el
transcrito es un ARNm.
30. Uso según la reivindicación 26, en el que el
ácido nucleico antisentido hibride en condiciones rigurosas con un
polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que es
idéntica en al menos un 80% a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID
NO: 1.
31. Uso según la reivindicación 26, en el que el
ácido nucleico antisentido hibrida en condiciones rigurosas con un
polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que es
idéntica en al menos un 80% a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID
NO: 3.
32. Un procedimiento in vitro para
evaluar si un compuesto de prueba es útil para modular al menos un
fenómeno seleccionado del grupo constituido por (1) interconversión
de las formas fosforiladas y desfosforiladas de un residuo de
serina, treonina o tirosina de una proteína GTPasa; (2)
contractilidad celular; (3) crecimiento celular; (4) conductividad
celular; (5) entrada de una célula en el ciclo celular; (6)
progresión de una célula a través del ciclo celular; (7)
mitogénesis; (8) metabolismo celular; (9) transcripción génica;
(11) citocinesis; (12) forma celular; (13) movimiento celular; (14)
integración de un genoma viral en el genoma de una célula huésped;
(15) mantenimiento de un genoma viral en el genoma de una célula
huésped; (16) un cambio citológico en una célula huésped infectada
por virus; (17) producción viral en una célula huésped infectada
por virus; (18) interacción de un virión con una membrana de una
célula huésped infectada por virus; y (19) encapsulación de un
virión dentro de una parte de una membrana de una célula huésped
infectada por virus, comprendiendo el procedimiento:
a) añadir el compuesto de prueba a una primera
composición que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos idéntica en al menos un 80% a SEQ ID NO: 2 y que
muestra una actividad quinasa; y
b) comparar la actividad quinasa en la primera
composición y en una segunda composición que es sustancialmente
idéntica a la primera composición excepto en que no comprende el
compuesto de prueba,
mediante el cual una diferencia en
la actividad quinasa en la primera y segunda composiciones es una
indicación de que el compuesto de prueba es útil para modular el
fenómeno.
33. Procedimiento según la reivindicación 32, en
el que la actividad es actividad quinasa GTPasa.
34. Procedimiento según la reivindicación 32, en
el que la proteína tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
2.
35. Procedimiento según la reivindicación 32, en
el que la composición comprende una célula que comprende un ácido
nucleico que codifica para la proteína.
36. Procedimiento según la reivindicación 35, en
el que el ácido nucleico es el genoma de la célula.
37. Procedimiento según la reivindicación 35, en
el que el ácido nucleico comprende el gen 13245.
38. Un procedimiento in vitro, para
evaluar si un compuesto prueba es útil para modular al menos un
fenómeno seleccionado del grupo constituido por (1) interconversión
de las formas fosforiladas y desfosforiladas de un residuo de
serina, treonina o tirosina de una proteína GTPasa; (2)
contractilidad celular; (3) crecimiento celular; (4) conductividad
celular; (5) entrada de una célula en el ciclo celular; (6)
progresión de una célula a través del ciclo celular; (7)
mitogénesis; (8) metabolismo celular; (9) transcripción génica;
(11) citocinesis; (12) forma celular; (13) movimiento celular; (14)
integración de un genoma viral en el genoma de una célula huésped;
(15) mantenimiento de un genoma viral en el genoma de una célula
huésped; (16) un cambio citológico en una célula huésped infectada
por virus; (17) producción viral en una célula huésped infectada
por virus; (18) interacción de un virión con una membrana de una
célula huésped infectada por virus; y (19) encapsulación de un
virión dentro de una parte de una membrana de una célula huésped
infectada por virus, comprendiendo el procedimiento:
a) añadir el compuesto de prueba a una primera
composición que comprende una célula que comprende un ácido
nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia
de aminoácidos idéntica en al menos un 80% a SEQ ID NO: 2 y que
muestra una actividad quinasa; y
b) comparar la actividad quinasa en la primera
composición y en una segunda composición que es sustancialmente
idéntica a la primera composición excepto en que no comprende el
compuesto de prueba,
mediante el cual una diferencia en
la actividad quinasa en la primera y segunda composiciones es una
indicación de que el compuesto de prueba es útil para modular el
fenómeno.
39. Un procedimiento de preparación de una
composición farmacéutica para modular al menos un fenómeno
seleccionado del grupo constituido por (1) interconversión de las
formas fosforiladas y desfosforiladas de un residuo de serina,
treonina o tirosina de una proteína GTPasa; (2) contractilidad
celular; (3) crecimiento celular; (4) conductividad celular; (5)
entrada de una célula en el ciclo celular; (6) progresión de una
célula a través del ciclo celular; (7) mitogénesis; (8) metabolismo
celular; (9) transcripción génica; (11) citocinesis; (12) forma
celular; (13) movimiento celular; (14) integración de un genoma
viral en el genoma de una célula huésped; (15) mantenimiento de un
genoma viral en el genoma de una célula huésped; (16) un cambio
citológico en una célula huésped infectada por virus; (17)
producción vira) en una célula huésped infectada por virus; (18)
interacción de un virión con una membrana de una célula huésped
infectada por virus; y (19) encapsulación de un virión dentro de
una parte de una membrana de una célula huésped infectada por
virus, comprendiendo el procedimiento:
a) seleccionar un anticuerpo, una molécula de
ácido nucleico antisentido o una ribozima útil para modular al
menos uno de dichos fenómenos según el procedimiento de la
reivindicación 36; y
b) combinar el anticuerpo, la molécula de ácido
nucleico antisentido o la ribozima con un vehículo
farmacéuticamente aceptable para preparar la composición
farmacéutica.
40. Uso de la composición farmacéutica según la
reivindicación 41, en la fabricación de un medicamento para
modular, en un ser humano, al menos un fenómeno seleccionado del
grupo constituido por (1) interconversión de las formas
fosforiladas y desfosforiladas de un residuo de serina, treonina o
tirosina de una proteína GTPasa; (2) contractilidad celular; (3)
crecimiento celular; (4) conductividad celular; (5) entrada de una
célula en el ciclo celular; (6) progresión de una célula a través
del ciclo celular; (7) mitogénesis; (8) metabolismo celular; (9)
transcripción génica; (11) citocinesis; (12) forma celular; (13)
movimiento celular; (14) integración de un genoma vira) en el
genoma de una célula huésped; (15) mantenimiento de un genoma viral
en el genoma de una célula huésped; (16) un cambio citológico en
una célula huésped infectada por virus; (17) producción viral en
una célula huésped infectada por virus; (18) interacción de un
virión con una membrana de una célula huésped infectada por virus;
y (19) encapsulación de un virión dentro de una parte de una
membrana de una célula huésped infectada por virus.
41. Un procedimiento in vitro para
identificar un compuesto útil para modular al menos un fenómeno
seleccionado del grupo constituido por (1) interconversión de las
formas fosforiladas y desfosforiladas de un residuo de serina,
treonina o tirosina de una proteína GTPasa; (2) contractilidad
celular; (3) crecimiento celular; (4) conductividad celular; (5)
entrada de una célula en el ciclo celular; (6) progresión de una
célula a través del ciclo celular; (7) mitogénesis; (8) metabolismo
celular; (9) transcripción génica; (11) citocinesis; (12) forma
celular; (13) movimiento celular; (14) integración de un genoma
viral en el genoma de una célula huésped; (15) mantenimiento de un
genoma viral en el genoma de una célula huésped; (16) un cambio
citológico en una célula huésped infectada por virus; (17)
producción viral en una célula huésped infectada por virus; (18)
interacción de un virión con una membrana de una célula huésped
infectada por virus; y (19) encapsulación de un virión dentro de
una parte de una membrana de una célula huésped infectada por
virus, comprendiendo el procedimiento:
a) poner en contacto el compuesto de prueba y un
polipéptido seleccionado del grupo constituido por
- i)
- un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una parte que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos 80% a una de SEQ ID NO: 1 y 3 y que codifica para un polipéptido que tiene actividad quinasa; y
- ii)
- un fragmento de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 2, en el que el fragmento comprende al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2 o una célula que expresa el polipéptido; y
b) determinar si el polipéptido se une con el
compuesto de prueba, mediante el cual la unión del polipéptido y el
compuesto prueba es una indicación de que el compuesto de prueba es
útil para modular el fenómeno.
42. Procedimiento según la reivindicación 41, en
el que el polipéptido muestra un epítopo en común con un
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
2.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US24242900P | 2000-10-23 | 2000-10-23 | |
US242429P | 2000-10-23 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2279833T3 true ES2279833T3 (es) | 2007-09-01 |
Family
ID=22914754
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES01985157T Expired - Lifetime ES2279833T3 (es) | 2000-10-23 | 2001-10-23 | 13245, proteina quinasa de tipo distrofia miotonica humana novedosa y usos de la misma. |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6946274B2 (es) |
EP (1) | EP1328621B1 (es) |
AT (1) | ATE349515T1 (es) |
AU (1) | AU2002234132A1 (es) |
DE (1) | DE60125569T2 (es) |
DK (1) | DK1328621T3 (es) |
ES (1) | ES2279833T3 (es) |
PT (1) | PT1328621E (es) |
WO (1) | WO2002034896A2 (es) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6638745B1 (en) * | 2001-03-13 | 2003-10-28 | Applera Corporation | Isolated human kinase proteins, nucleic acid molecules encoding human kinase proteins, and uses thereof |
AU2003234717A1 (en) * | 2002-04-12 | 2003-10-27 | Bristol-Myers Squibb Company | Novel polynucleotides encoding the human citron kinase polypeptide, bmsnkc 0020/0021 |
CA2639412A1 (en) | 2007-09-11 | 2009-03-11 | Universite Laval | Prostaglandin e2 modulation and uses thereof |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1240194A2 (en) * | 1999-11-24 | 2002-09-18 | Sugen, Inc. | Novel human protein kinases and protein kinase-like enzymes |
-
2001
- 2001-10-23 AU AU2002234132A patent/AU2002234132A1/en not_active Abandoned
- 2001-10-23 DK DK01985157T patent/DK1328621T3/da active
- 2001-10-23 PT PT01985157T patent/PT1328621E/pt unknown
- 2001-10-23 US US10/017,216 patent/US6946274B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-23 ES ES01985157T patent/ES2279833T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-23 AT AT01985157T patent/ATE349515T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-10-23 DE DE60125569T patent/DE60125569T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-23 WO PCT/US2001/050636 patent/WO2002034896A2/en active IP Right Grant
- 2001-10-23 EP EP01985157A patent/EP1328621B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-06-21 US US11/158,218 patent/US20050233375A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20050233375A1 (en) | 2005-10-20 |
ATE349515T1 (de) | 2007-01-15 |
AU2002234132A1 (en) | 2002-05-06 |
US20020160483A1 (en) | 2002-10-31 |
DE60125569T2 (de) | 2007-10-04 |
EP1328621A2 (en) | 2003-07-23 |
DE60125569D1 (de) | 2007-02-08 |
EP1328621B1 (en) | 2006-12-27 |
DK1328621T3 (da) | 2007-04-10 |
WO2002034896A3 (en) | 2002-10-24 |
WO2002034896A2 (en) | 2002-05-02 |
PT1328621E (pt) | 2007-03-30 |
US6946274B2 (en) | 2005-09-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2320622T3 (es) | Metodos de uso de una proteina novedosa relacionada con la lisil oxidasa. | |
US7160693B2 (en) | Human hydrolase family members and uses thereof | |
US20050084884A1 (en) | MEKK1 molecules and uses thereof | |
ES2327815T3 (es) | 18477, proteina quinasa humana y usos de la misma. | |
ES2279833T3 (es) | 13245, proteina quinasa de tipo distrofia miotonica humana novedosa y usos de la misma. | |
US20050176671A1 (en) | 22437, a novel human sulfatase and uses therefor | |
US6740514B2 (en) | Nucleic acids corresponding to 46798 a novel human matrix metalloproteinase and uses thereof | |
US20020142464A1 (en) | 38646, a novel guanine nucleotide exchange factor and uses therefor | |
US6911335B2 (en) | 57316 and 33338, human ubiquitin carboxyl terminal hydrolases and uses therefor | |
US6984502B2 (en) | Methods and compositions of human 69087 nucleic acids and uses thereof | |
JP2002535962A (ja) | Cark核酸分子およびその使用 | |
US20030165845A1 (en) | 47647, a novel human lipase and uses therefor | |
US20050203049A1 (en) | 47169 and 33935, novel human glycosyl transferases and uses therefor | |
US20020137713A1 (en) | 55054, a novel human metalloprotease and uses therefor | |
US20020077312A1 (en) | 3700, a novel human protein kinase and uses therefor | |
US20020137712A1 (en) | 69109, a novel human tyrosine phosphatase and uses therefor | |
US20020172998A1 (en) | 32612, a novel human peptide transporter and uses therefor | |
US20030166242A1 (en) | 25828, a novel human aminopeptidase and uses therefor | |
US20020076764A1 (en) | 27877, a novel phospholipase and uses therefor | |
US20020119547A1 (en) | 58569 and 50111, human proteins and methods of use thereof | |
US20030055234A1 (en) | 26030, a human rho-GAP family member and uses therefor | |
EP1343878A2 (en) | 17903, a human aminopeptidase and uses therefor | |
EP1423538A2 (en) | Methods of using 5433, a human calcium channel family member |