ES2279833T3 - 13245, proteina quinasa de tipo distrofia miotonica humana novedosa y usos de la misma. - Google Patents

13245, proteina quinasa de tipo distrofia miotonica humana novedosa y usos de la misma. Download PDF

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Abstract

Una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por: a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3, en la que la molécula de ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene actividad quinasa; b) una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 1400 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3, en la que la molécula de ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene actividad quinasa; c) una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; d) una molécula de ácido nucleico que codifica para un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en la que el fragmento comprende al menos 1000 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2 y tiene actividad quinasa; y e) una molécula de ácido nucleicoque codifica para una variante alélica que produce de manera natural de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en la que la molécula de ácido nucleico hibrida con una molécula de ácido nucleico que comprende una de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y un complemento de las mismas, en condiciones rigurosas, y en la que la molécula de ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene actividad quinasa.

Description

13245, proteína quinasa de tipo distrofia miotónica humana novedosa y usos de la misma.
Antecedentes de la invención
La fosforilación de proteínas, por ejemplo en los residuos de serina, treonina y tirosina, es un mecanismo regulador clave para una variedad de procesos celulares. La fosforilación de proteínas está influida principalmente por enzimas de dos tipos, concretamente proteína quinasas (PK) y proteína fosfatasas (PP). Las PK catalizan la adición de un resto fosfato a un residuo de aminoácido de una proteína (generalmente un residuo de serina, treonina o tirosina), y las PP catalizan la eliminación de tales restos. Las actividades catalíticas de las PK y las PP están influidas, a su vez, por el estado de la célula y el entorno en que se encuentra cada una.
Las PK de tipo distrofia miotónica (MDPK, "myotonic dystrophy type PK") están asociadas con la modulación de la morfología, forma y contractilidad celular. También se sabe que las MDPK modulan la actividad de los canales de sodio regulados por voltaje del músculo esquelético, pero no los canales de sodio regulados por voltaje del músculo cardiaco. Por tanto, las MDPK desempeñan un papel en una variedad de trastornos musculodegenerativos y otros musculoesqueléticos incluyendo, por ejemplo, distrofia muscular (DM) de diversos tipos (por ejemplo, DM de Duchenne, DM de las cinturas escapulohumeral y pélvica, DM de Becker, DM facioescapulohumeral, miopatía mitocondrial, y miopoatía congénita) y distrofias miotónicas (por ejemplo, enfermedad de Steinert y enfermedad de Thomsen).
Se han descrito numerosas MDPK (véase por ejemplo Zhao et al. 1997. The Journal of Biological Chemistry, 272:10013 y Bush et al. 2000, Biochemistry, 39:8480.) y se cree que existen muctiene más. En vista de la naturaleza extendida y crítica de las actividades de las MDPK en procesos fisiológicos normales y patológicos, existe una necesidad de identificación de miembros adicionales de esta familia de proteínas. La presente invención satisface esta necesidad proporcionando una MDPK humana novedosa.
Sumario de la invención
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de un gen novedoso que codifica para una MDPK, haciéndose referencia en el presente documento al gen como "13245". La secuencia de nucleótidos de un ADNc que codifica para 13245 se muestra en SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido 13245 se muestra en SEQ ID NO: 2. Además, la secuencia de nucleótidos de la región codificante se representa en SEQ ID NO: 3.
En consecuencia, en un aspecto, la invención se caracteriza por una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína o polipéptido 13245, por ejemplo, una parte biológicamente activa de la proteína 13245. En una realización preferida, la molécula aislada de ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones, la invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico de 13245 que tienen la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3.
Todavía en otras realizaciones, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias que son sustancialmente idénticas (por ejemplo, variantes alélicas que se producen de manera natural) a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3. En otras realizaciones, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que híbrida en condiciones de hibridación rigurosas con una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia que comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO:1 y 3, en la que el ácido nucleico codifica para una proteína 13245 de longitud completa o un fragmento activo de la misma.
En un aspecto relacionado, la invención proporciona además constructos de ácido nucleico que incluyen una molécula de ácido nucleico de 13245 descrita en el presente documento. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico de la invención están unidas operativamente a secuencias reguladoras nativas o heterólogas. También se incluyen vectores y células huésped que contienen las moléculas de ácido nucleico 13245 de la invención, por ejemplo, vectores y células huésped adecuados para producir moléculas de ácido nucleico y polipéptidos
13245.
En otro aspecto relacionado, la invención proporciona fragmentos de ácido nucleico adecuados como cebadores o sondas de hibridación para la detección de ácidos nucleicos que codifican para 13245.
Todavía en otro aspecto relacionado, se proporcionan moléculas aisladas de ácido nucleico que son antisentido a una molécula de ácido nucleico que codifica para 13245.
En otro aspecto, la invención se caracteriza por polipéptidos 13245, y fragmentos biológicamente activos o antigénicos de los mismos que son útiles, por ejemplo, como reactivos o dianas en ensayos aplicables al tratamiento y diagnóstico de trastornos mediados por o relacionados con 13245 (por ejemplo, trastornos mediados por MDPK tales como los descritos en el presente documento). En otra realización, la invención proporciona polipéptidos 13245 que tienen actividad proteína quinasa. Los polipéptidos preferidos son proteínas 13245 que incluyen al menos un dominio pquinasa, y que tienen preferiblemente una actividad de 13245, por ejemplo, una actividad de 13245 tal como se describe en el presente documento. Los polipéptidos preferidos son proteínas 13245 que incluyen al menos un dominio CNH y al menos un dominio pquinasa. Otros polipéptidos preferidos son proteínas 13245 que incluyen al menos un dominio CNH, al menos un dominio pquinasa, al menos un dominio de unión a éster de forbol/diacilglicerol, al menos un dominio PH, y al menos un dominio de cremallera de leucina.
En otras realizaciones, la invención proporciona polipéptidos 13245, por ejemplo, un polipéptido 13245 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2; o una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que híbrida en condiciones de hibridación rigurosas a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3, en la que el ácido nucleico codifica para una proteína 13245 de longitud completa o un fragmento activo de la misma.
En un aspecto relacionado, la invención proporciona además constructos de ácido nucleico que incluyen una molécula de ácido nucleico de 13245 descrita en el presente documento.
En un aspecto relacionado, la invención proporciona polipéptidos 13245 o fragmentos operativamente unidos a polipéptidos distintos a 13245 para formar proteínas de fusión.
En otro aspecto, la invención se caracteriza por anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos, que reaccipnan con, o más preferiblemente, se unen específicamente a, polipéptidos 13245.
En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos de selección de compuestos que modulan la expresión o actividad de los polipéptidos o ácidos nucleicos de 13245.
Todavía en otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para modular la expresión o actividad de un polipéptido o ácido nucleico de 13245, por ejemplo, usando los compuestos seleccionados. En ciertas realizaciones, los procedimientos suponen el tratamiento de estados relacionados con la actividad o expresión aberrante de los polipéptidos o ácidos nucleicos de 13245, tales como estados que suponen la fosforilación aberrante o deficiente de proteínas o la regulación aberrante o deficiente de procesos celulares (por ejemplo, señalización celular aberrante o deficiente función muscular aberrante o deficiente).
La invención también proporciona ensayos para determinar la actividad de o la presencia o ausencia de polipéptidos o moléculas de ácido nucleico de 13245 en una muestra biológica, incluyendo para el diagnóstico de enfermedades.
En aspecto adicional, la invención proporciona ensayos para determinar la presencia o ausencia de una alteración genética en un polipéptido o molécula de ácido nucleico de 13245, incluyendo para el diagnóstico de enfermedades.
La invención también incluye un procedimiento de modulación de la capacidad de una célula para catalizar la interconversión de las formas fosforiladas y desfosforiladas una proteína GTPasa. El procedimiento comprende modular la actividad de la proteína 13245 en la célula. La actividad de la proteína 13245 puede modularse inhibiendo la expresión del gen 13245 en la célula, por ejemplo administrando a la célula un oligonucleótido antisentido que híbrida en condiciones rigurosas con un transcrito (por ejemplo, un ARNm) del gen 13245, un oligonucleótido antisentido que híbrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, o un oligonucleótido antisentido que híbrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3. Alternativamente, la actividad de la proteína 13245 puede inhibirse sin afectar significativamente la expresión del gen 13245 en la célula. Por ejemplo, la actividad de la proteína 13245 puede inhibirse administrando a la célula un agente que inhibe una actividad de la proteína 13245, tal como un anticuerpo que se une específicamente con la proteína 13245. En un aspecto relacionado, la actividad de 13245 puede modularse potenciando la expresión de 13245 en la célula. Por ejemplo, la expresión de 13245 en una célula puede potenciarse administrando a la célula un agente que potencia la expresión de 13245, tal como un vector de expresión que codifica para la proteína 13245.
La invención incluye además un procedimiento para evaluar si un compuesto de prueba es útil para modular al menos un fenómeno seleccionado del grupo constituido por (1) interconversión de las formas fosforiladas y desfosforiladas de un residuo de serina, treonina o tirosina de una proteína GTPasa; (2) contractilidad celular; (3) crecimiento celular; (4) conductividad celular; (5) entrada de una célula en el ciclo celular; (6) progresión de una célula a través del ciclo celular; (7) mitogénesis; (8) metabolismo celular; (9) transcripción génica; (11) citocinesis; (12) forma celular; (13) movimiento celular; (14) integración de un genoma viral en el genoma de una célula huésped; (15) mantenimiento de un genoma viral en el genoma de una célula huésped; (16) un cambio citológico en una célula huésped infectada por virus; (17) producción viral en una célula huésped infectada por virus; (18) interacción de un virión con una membrana de una célula huésped infectada por virus; y (19) encapsulación de un virión dentro de una parte de una membrana de una célula huésped infectada por virus. El procedimiento comprende:
a) añadir el compuesto de prueba a una primera composición que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 90% a SEQ ID NO: 2 y que muestra una actividad de 13245; y
b) comparar la actividad de 13245 en la primera composición y en una segunda composición que es sustancialmente idéntica a la primera composición excepto en que no comprende el compuesto de prueba.
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Una diferencia en la actividad de 13245 en la primera y segunda composiciones es una indicación de que el compuesto de prueba es útil para modular el fenómeno.
La invención también incluye otro procedimiento para evaluar si un compuesto de prueba es útil para modular al menos un fenómeno seleccionado del grupo constituido por (1) interconversión de las formas fosforiladas y desfosforiladas de un residuo de serina, treonina o tirosina de una proteína GTPasa; (2) contractilidad celular; (3) crecimiento celular; (4) conductividad celular; (5) entrada de una célula en el ciclo celular; (6) progresión de una célula a través del ciclo celular; (7) mitogénesis; (8) metabolismo celular; (9) transcripción génica; (11) citocinesis; (12) forma celular; (13) movimiento celular; (14) integración de un genoma viral en el genoma de una célula huésped; (15) mantenimiento de un genoma viral en el genoma de una célula huésped; (16) un cambio citológico en una célula huésped infectada por virus; (17) producción viral en una célula huésped infectada por virus; (18) interacción de un virión con una membrana de una célula huésped infectada por virus; y (19) encapsulación de un virión dentro de una parte de una membrana de una célula huésped infectada por virus. Este procedimiento comprende:
a) añadir el compuesto de prueba a una primera composición que comprende una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 90% a SEQ ID NO: 2 y que muestra una actividad de 13245; y
b) comparar la actividad de 13245 en la primera composición y en una segunda composición que es sustancialmente idéntica a la primera composición excepto en que no comprende el compuesto de prueba.
Una diferencia en la actividad de 13245 en la primera y segunda composiciones es una indicación de que el compuesto de prueba es útil para modular el fenómeno.
Pueden usarse los compuestos identificados usando estos procedimientos para preparar una composición farmacéutica para modular el fenómeno, por ejemplo combinándolo con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden usarse para modular el fenómeno en un ser humano.
La invención incluye otro procedimiento para identificar un compuesto útil para modular al menos un fenómeno seleccionado del grupo constituido por (1) interconversión de las formas fosforiladas y desfosforiladas de un residuo de serina, treonina o tirosina de una proteína GTPasa; (2) contractilidad celular; (3) crecimiento celular; (4) conductividad celular; (5) entrada de una célula en el ciclo celular; (6) progresión de una célula a través del ciclo celular; (7) mitogénesis; (8) metabolismo celular; (9) transcripción génica; (11) citocinesis; (12) forma celular; (13) movimiento celular; (14) integración de un genoma viral en el genoma de una célula huésped; (15) mantenimiento de un genoma viral en el genoma de una célula huésped; (16) un cambio citológico en una célula huésped infectada por virus; (17) producción viral en una célula huésped infectada por virus; (18) interacción de un virión con una membrana de una célula huésped infectada por virus; y (19) encapsulación de un virión dentro de una parte de una membrana de una célula huésped infectada por virus. Este procedimiento comprende:
a) poner en contacto el compuesto de prueba y un polipéptido seleccionado del grupo constituido por
i)
un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una parte que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 90% a una de SEQ ID NO: 1 y 3; y
ii)
un fragmento de un polipéptido que tiene o bien una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 2, en la que el fragmento comprende al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2 o bien una célula que expresa el polipéptido; y
b) determinar si el polipéptido se une con el compuesto de prueba.
La unión del polipéptido y el compuesto de prueba es una indicación de que el compuesto de prueba es útil para modular el fenómeno.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 representa una secuencia de ADNc (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos prevista (SEQ ID NO: 2) de 13245 humana. El marco de lectura abierto iniciado por metionina de 13245 humana (sin las regiones no traducidas en 3' y 5') comienza en el nucleótido 19 de SEQ ID NO: 1, y la región codificante (sin incluir el codón de terminación; mostrado en SEQ ID NO: 3) se extiende a través del nucleótido 6178 de SEQ ID NO: 1.
La figura 2 representa un perfil de hidropatía de 13245 humana. Los residuos relativamente hidrófobos se muestran por encima de la línea horizontal discontinua y los residuos relativamente hidrófilos se muestran por debajo de la línea horizontal discontinua. Los residuos de cisteína (cys) se indican mediante líneas verticales cortas por debajo de la curva de hidropatía. Se indican los números correspondientes a la secuencia de aminoácidos de 13245 humana. Los polipéptidos de la invención incluyen fragmentos que incluyen: toda o parte de una secuencia hidrófoba, es decir, una secuencia por encima de la línea discontinua, por ejemplo, la secuencia de aproximadamente los residuos 195-210of SEQ ID NO: 2; todo o parte de una secuencia hidrófila, es decir, una secuencia por debajo de la línea discontinua, por ejemplo, la secuencia de residuos 455-475 de SEQ ID NO: 2; una secuencia que incluye un residuo de cisteína; o un sitio de glucosilación.
La figura 3 es una alineación de la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de 13245, citrón quinasa de interacción con rho/rac murina ("AAC72823"; número de acceso GENBANK® AAC72823; SEQ ID NO: 4), citrón-K quinasa murina ("AAC27933"; número de acceso GENBANK® AAC27933; SEQ ID NO: 5), proteína citrón murina ("P49025"; número de acceso GENBANK® P49025; SEQ ID NO: 6), y proteína citrón humana ("O14578"; número de acceso GENBANK® 014578; SEQ ID NO:7). Se realizó la alienación usando el software Multalin versión 5.4.1 usando la tabla de comparación de 62 símbolos Blosum, un valor de hueco ("gap weight") de 12, y un valor de la longitud de hueco ("gap length weight") de 2.
Descripción detallada
La secuencia de ADNc de 13245 humana (figura 1; SEQ ID NO: 1), que tiene aproximadamente 6575 residuos de nucleótidos de longitud incluyendo las regiones no traducidas, contiene una secuencia codificante iniciada por metionina prevista de aproximadamente 6160 residuos de nucleótidos, excluyendo el codón de terminación (es decir, los residuos de nucleótidos 19-6178 de SEQ ID NO: 1; también mostrados en SEQ ID NO: 3). La secuencia codificante codifica para una proteína de 2053 aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
13245 humana contiene las siguientes regiones u otras características estructurales: un dominio pquinasa previsto (PF00069) aproximadamente en los residuos de aminoácidos 97-360 de SEQ ID NO: 2, un dominio terminal de proteína quinasa C previsto en los residuos 361-390 de SEQ ID NO: 2, una secuencia distintiva de sitio activo de serina/treonina proteína quinasa en los residuos 217-229 de SEQ ID NO:2, dominios de cremallera de leucina previstos en los residuos 838-859, 975-996, 1041-1062, y 1143-1164 de SEQ ID NO: 2, una secuencia distintiva de subdominio de carbamoíl fosfato sintasa previsto en los residuos 1156-1163 de SEQ ID NO: 2, un dominio de unión a éster de forbol/diacilglicerol previsto en los residuos 1389-1437 de SEQ ID NO: 2, un dominio de homología con pleckstrina (PH) previsto en los residuos 1470-1525 de SEQ ID NO: 2, y un dominio CNH previsto en los residuos 1568-1865 de SEQ ID NO: 2.
La proteína 13245 humana tienes sitios de N-glucosilación previstos (número de acceso Pfam PS00001) aproximadamente en los residuos de aminoácidos 819-822, 1571-1574, 1694-1697, 1717-1720, y 2026-2029 de SEQ ID NO: 2; sitios de fosforilación de proteína quinasa dependiente de AMPc/GMPc previstos (número de acceso Pfam PS00004) aproximadamente en los residuos de aminoácidos 78-81, 477-480, 579-582, 601-604, 680-683, 1322-1325, y 1366-1369 de SEQ ID NO: 2; sitios de fosforilación de proteína quinasa C previstos (número de acceso Pfam PS00005) aproximadamente en los residuos de aminoácidos 93-95, 248-250, 308-310, 378-380, 487-489, 498-500, 516-518, 546-548, 577-579, 824-826, 872-874, 1025-1027, 1033-1035, 1096-1098, 1144-1146, 1170-1172, 1215-1217, 1268-1270, 1314-1316, 1335-1337, 1363-1365, 1376-1378, 1542-1544, 1724-1726, 1892-1894, 1910-1912, 1963-1965, y 1977-1979 de SEQ ID NO: 2; sitios de fosforilación de caseína quinasa II previstos (número de acceso Pfam PS00006) ubicados aproximadamente en los residuos de aminoácidos 83-86, 93-96, 140-143, 361-364, 381-384, 386-389, 410-413, 436-439, 445-448, 480-483, 487-490, 501-504, 529-532, 867-870, 908-911, 935-938, 940-943, 973-976, 1015-1018, 1025-1028, 1046-4049, 1081-1084, 1142-1145, 1170-1173, 1218-1221, 1308-1311, 1314-1317, 1370-1373, 1736-1739, 1794-1797, 1864-1867, 1882-1885, 1904-1907, 1964-1967, y 2012-2015 de SEQ ID NO: 2; un sitio de fosforilación de tirosina quinasa previsto en los residuos 741-747 de SEQ ID NO: 2; sitios de N-miristoilación previstos (número de acceso Pfam PS00008) aproximadamente en los residuos de aminoácidos 50-5, 1202-1207, 1532-1537, 1584-1589, 1675-1680, y 1999-2004 de SEQ ID NO: 2; un sitio de amidación previsto (número de acceso Pfam PS00009) aproximadamente en los residuos de aminoácidos 134-136 de SEQ ID NO: 2.
Para información general referente a los identificadores de PFAM, números de identificación de dominio de prefijo PS y prefijo PF, véase Sonnhammer et al. (1997, Protein 28:405-420) y http://www.psc.edu/general/software/packages/
pfam/pfam.html.
La proteína 13245 contiene un número significativo de características estructurales en común con miembros de la familia de MDPK. El término "familia" cuando se refiere a la proteína y moléculas de ácido nucleico de la invención significa dos o más proteínas o moléculas de ácido nucleico que tiene un dominio o motivo estructural común y que tiene una homología suficiente de la secuencia de aminoácidos o nucleótidos tal como se define en el presente documento. Tales miembros de la familia pueden producirse de manera natural o no natural y pueden proceder de la misma o de especies diferentes. Por ejemplo, una familia puede contener una primera proteína de origen humano así como otras proteínas distintas de origen humano, o alternativamente, pueden contener homólogos de origen no humano, por ejemplo, proteínas MDPK proteínas para cualquier especie descrita en la técnica. Los miembros de una familia también pueden tener características funcionales comunes.
Un polipéptido 13245 puede incluir un dominio pquinasa. Tal como se usa en el presente documento, el término "dominio pquinasa" se refiere a un dominio de proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 200-300 residuos de aminoácidos de longitud, preferiblemente, al menos aproximadamente 225-300 aminoácidos, de manera más preferible aproximadamente 264 residuos de aminoácidos y tiene una puntuación en bits para la alineación de la secuencia con respecto al dominio pquinasa (HMM) de al menos 100 o superior, preferiblemente 150 o superior, y más preferiblemente 200 o superior. Al dominio pquinasa se le ha asignado el acceso PFAM PF00069 (http://genome.wustl.edu/Pfam/html).
Un polipéptido 13245 puede incluir un dominio pquinasa. Tal como se usa en el presente documento, el término "dominio CNH" se refiere a un dominio de proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 250-350 residuos de aminoácidos de longitud, preferiblemente, al menos aproximadamente 275-325 aminoácidos, de manera más preferible aproximadamente 298 residuos de aminoácidos y tiene una puntuación en bits para la alineación de la secuencia con respecto al dominio pquinasa (HMM) de al menos 100 o superior, preferiblemente 200 o superior, y más preferiblemente 300 o superior. Al dominio pquinasa se le ha asignado el acceso PFAM PF00780 (http:Ilgenome.wustI.edu/Pfam/html).
En una realización preferida, el polipéptido o proteína 13245 tiene un dominio pquinasa o una región que incluye al menos aproximadamente 200-300, de manera más preferible aproximadamente 225-300, o 264 residuos de aminoácidos y tiene al menos aproximadamente una homología del 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, o el 100% con un dominio pquinasa, por ejemplo, el dominio pquinasa de 13245 humana (por ejemplo, los residuos 97-360 de SEQ ID NO: 2).
En otra realización preferida, el polipéptido o proteína 13245 tiene un dominio CNH o una región que incluye al menos aproximadamente 250-350, de manera más preferible aproximadamente 275-325, o 298 residuos de aminoácidos y tiene al menos aproximadamente una homología del 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, o el 100% con un do-
minio CNH, por ejemplo, el dominio CNH de 13245 humana (por ejemplo, los residuos 568-1865 de SEQ ID NO: 2).
Para identificar la presencia de un perfil de dominio pquinasa o CNH en un receptor de 13245, la secuencia de aminoácidos de la proteína se busca frente a una base de datos de HMM (por ejemplo, la base de datos Pfam, versión 2.1) usando los parámetros por defecto (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/HMM_search). Por ejemplo, el programa hmmsf, que está disponible como parte del paquete HMMER de programas de búsqueda, es un programa por defecto específico de la familia para PF00069 o PF00780 y una puntuación de 100 es la puntuación umbral por defecto para determinar un resultado positivo ("hit"). Por ejemplo, usando un software ORFAnalyzer software, se identificó un perfil de dominio pquinasa en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (por ejemplo, aminoácidos 53-303 de SEQ ID NO: 2). En consecuencia, una proteína 13245 que tiene al menos una homología de aproximadamente el 60-70%, de manera más preferible aproximadamente el 70-80%, o aproximadamente el 80-90% con el perfil de dominio pquinasa o el perfil de dominio CNH de 13245 humana está dentro del alcance de la invención.
Sin pretender quedar ligado a teoría particular alguna de operación, se cree que la proteína 13245 es, en al menos una realización, una proteína de membrana nuclear que tiene su dominio carboxi-terminal orientado dentro de la envuelta nuclear. En esta realización, la proteína 13245 puede transmitir información de señalización desde el citoplasma hasta el núcleo, mediante lo cual, por ejemplo, puede regularse la transcripción génica.
En una realización de la invención, un polipéptido 13245 incluye al menos un dominio pquinasa. En otra realización, el polipéptido 13245 incluye al menos un dominio pquinasa y al menos un dominio CNH. Las moléculas de 13245 de la presente invención pueden incluir además uno o más de los dominios y sitios de N-glucosilación, fosforilación de proteína quinasa dependiente de AMPc/GMPc, fosforilación de proteína quinasa C, fosforilación de caseína quinasa II, fosforilación de tirosina quinasa, N-miristoilación, amidación, cremallera de leucina, sitio activo de serinaltreonína proteína quinasa, secuencia distintiva de subdominio de carbamoíl fosfato sintasa, dominio C-terminal de proteína quinasa C de unión a éster de forbol/diacilglicerol, y de homología con pleckstrina descritos en el presente documento, y preferiblemente comprende la mayor parte o todos ellos.
Tal como se muestra en la figura 3, la proteína 13245 muestra una homología de secuencia significativa con varias proteínas relacionadas con la proteína citrón, que se sabe que interacciona con enzimas GTPasa de la familia Rho. Estas GTPasas incluyen, por ejemplo, Rho-A, B, y C, Rac-1 y 2, y CDC42. Estas GTPasas regulan la estructura celular, incluyendo la forma celular, contracción celular, movimiento celular, distribución de proteínas estructurales (por ejemplo, actina) dentro la célula, formación de adhesiones focales, citocinesis y división celular. Estas GTPasas también se sabe que modulan la expresión génica de manera dependiente de la fosforilación. Las proteínas que pueden interaccionar con, catalizar la interconversión de isoformas fosforiladas y no fosforiladas de Rho GTPasa, o ambas, pueden modular estos procesos celulares.
La aparición de pquinasa, pquinasa C, una secuencia distintiva de región de unión a ATP de proteína quinasa, una secuencia distintiva de sitio activo de serina/treonina proteína quinasa, un sitio de fosforilación de tirosina quinasa, múltiples sitios de fosforilación potenciales, y similitud con proteínas citrón indica que la proteína 13245 puede interaccionar con Rho GTPasas y catalizar la interconversión de sus formas fosforiladas y no fosforiladas. La capacidad de 13245 para modular el estado de fosforilación de las Rho GTPasas indica que 13245 puede modular una o más de la forma celular, contracción celular, movimiento celular, distribución de proteínas estructurales (por ejemplo, actina) dentro de la célula, formación de adhesiones locales, citocinesis, y división celular en células en las que se expresa. Además, estas características indican que la proteína 13245 participa en trastornos en los que uno o más de estos procesos son aberrantes. Por tanto, las moléculas de 13245 descritas en el presente documento pueden usarse para predecir, diagnosticar, inhibir, prevenir, aliviar, o curar estos trastornos. Ejemplos de trastornos en los que uno o más de estos procesos son aberrantes incluyen tumorigénesis, crecimiento tumoral, metástasis tumoral e infección viral de una célula.
La expresión de 13245 es superior en células de sangre periférica que en muchos otros tipos de células, y se observa la expresión aumentada de 13245 en células infectadas por VIH-1, incluyendo células de la línea celular CCRF que se han infectado con este virus. Las células infectadas por VIH-1 experimentan diversos cambios morfológicos, y el patrón de expresión génica en células infectadas por VIH-1 difiere del patrón observado en células no infectadas del mismo tipo. Estas observaciones indican que 13245 desempeña un papel en los efectos de la infección por VIH-1 en células huésped (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica). Modulando la expresión, actividad de 13245, o ambas en células infectadas por VIH-1 pueden modularse los procesos enumerados anteriormente, aliviando o revirtiendo así los efectos de la infección por VIH-1. A modo de ejemplo, las moléculas de 13245 descritas en el presente documento pueden usarse para inhibir la inserción del genoma de VIH-1 en el genoma de una célula huésped, inhibir o revertir el mantenimiento del genoma de VIH-1 en el genoma de la célula huésped, inhibir o revertir cambios citológicos inducidos por la infección por VIH-1, inhibir la producción viral de VIH-1 en células infectadas, inhibir la interacción de viriones de VIH-1 con la membrana citoplásmica de la célula huésped, inhibir la encapsulación de partículas virales de VIH-1 en partes de la membrana de la célula huésped, o inhibir la liberación del virus VIH-1 desde las células infectadas. Por tanto, las moléculas de 13245 pueden usarse para tratar individuos que están infectados por VIH-1 (por ejemplo, individuos que padecen el síndrome de inmunodeficiencia adquirida) o con otros virus patógenos o para inhibir la transmisión del virus de un individuo a otro.
Dado que los polipéptidos 13245 de la invención pueden modular actividades mediadas por 13245, pueden usarse para desarrollar agentes terapéuticos o de diagnóstico novedosos para trastornos mediados por o relacionados con 13245, tal como se describe a continuación.
Tal como se usa en el presente documento, una "actividad de 13245", "actividad biológica de 13245", o "actividad funcional de 13245", se refiere a una actividad ejercida por una proteína, polipéptido o molécula de ácido nucleico de 13245 sobre, por ejemplo, una célula sensible a 13245 o sobre un sustrato de 13245 (por ejemplo, un sustrato proteico tal como una proteína de canal de sodio regulado por voltaje de músculo esquelético) tal como se determina in vivo o in vitro. En una realización, una actividad de 13245 es una actividad directa, tal como una asociación con una molécula diana de 13245. Una "molécula diana" o "pareja de unión" de una proteína 13245 es una molécula (por ejemplo, una proteína o ácido nucleico) con la que se une o interacciona la proteína 13245 en la naturaleza. En una realización a modo de ejemplo, tal molécula diana es un receptor de 13245. Una actividad de 13245 también puede ser una actividad indirecta, tal como una activación de señalización celular mediada por la interacción de la proteína 13245 con un receptor de 13245.
Se prevé que las moléculas de 13245, de la presente invención tienen actividades biológicas similares a los miembros de la familia de MDPK. Por ejemplo, las proteínas 13245 de la presente invención pueden tener una o más de las siguientes actividades:
(1) catalizan la formación de un enlace covalente en o entre un residuo de aminoácido y un resto fosfato;
(2) modulan la contractilidad celular;
(3) modulan el crecimiento celular;
(4) modulan la conductividad celular;
(5) modulan la entrada de una célula en el ciclo celular;
(6) modulan la progresión de una célula a través del ciclo celular;
(7) modulan la mitogénesis;
(8) modulan el metabolismo celular;
(9) modulan la transcripción génica;
(10) catalizan la interconversión de formas fosforiladas y no fosforiladas de una GTPasa, tal como una Rho GTPasa;
(11) modulan la citocinesis;
(12) modulan la forma celular;
(13) modulan el movimiento celular (por ejemplo, metástasis tumoral);
(14) modulan la integración de un genoma viral en el genoma de una célula huésped;
(15) modulan el mantenimiento de un genoma vira) en el genoma de una célula huésped;
(16) modulan cambios citológicos en una célula huésped infectada por virus;
(17) modulan la producción viral en una célula huésped infectada por virus;
(18) modulan la interacción de un virión con una membrana de una célula huésped infectada por virus; y
(19) modulan la encapsulación de un virión dentro de una parte de una membrana de una célula huésped infectada por virus.
Por tanto, las moléculas de 13245 descritas en el presente documento pueden actuar como dianas de diagnóstico y agentes terapéuticos novedosos para pronosticar, diagnosticar, prevenir, inhibir, aliviar o curar trastornos relacionados con MDPK.
Otras actividades, tal como se describe a continuación, incluyen la capacidad para modular la función, supervivencia, morfología, proliferación y/o diferenciación de células de tejidos en que las moléculas de 13245 se expresan. Por tanto, las moléculas de 13245 pueden actuar como dianas de diagnóstico y agentes terapéuticos novedosos para controlar trastornos que suponen actividades aberrantes de estas células.
Las moléculas de 13245 también pueden actuar como dianas de diagnóstico y agentes terapéuticos novedosos para controlar diversos trastornos, incluyendo trastornos musculoesqueléticos (por ejemplo, distrofias musculares y miotónicas tal como se describe en el presente documento y en la técnica).
La proteína 13245, fragmentos de la misma, y derivados y otras variantes de la secuencia en SEQ ID NO: 2 de la misma se denominan colectivamente como "polipéptidos o proteínas de la invención" o "polipéptidos o proteínas 13245". Las moléculas de ácido nucleico que codifican para tales polipéptidos o proteínas se denominan colectivamente como "ácidos nucleicos de la invención" o "ácidos nucleicos de 13245". Las moléculas de 13245 se refieren a ácidos nucleicos, polipéptidos, y anticuerpos de 13245.
Tal como se usa en el presente documento, el término "molécula de ácido nucleico" incluye moléculas de ADN (por ejemplo, un ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, un ARNm) y análogos del ADN o ARN generado, por ejemplo, mediante el uso de análogos de nucleótido. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario.
El término "molécula aislada o purificada de ácido nucleico" incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, con respecto al ADN genómico, el término "aislado" incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas del cromosoma con el que se asocia de manera natural el ADN genómico. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias que flanquean de manera natural al ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5' y/o 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula aislada de ácido nucleico puede contener menos de aproximadamente 5 kilobases, 4 kilobases, 3 kilobases, 2 kilobases, 1 kilobase, 0,5 kilobases o 0,1 kilobases de secuencias de nucleótidos en 5' y/o 3' que flanquean de manera natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que se deriva el ácido nucleico. Además, una molécula "aislada" de ácido nucleico, tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.
Tal como se usa en el presente documento, el término "híbrida en condiciones rigurosas" describe condiciones para la hibridación y el lavado. Los expertos en la técnica conocen condiciones rigurosas y pueden hallarse en la bibliografía disponible (por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1-6.3.6). En esa referencia, se describen procedimientos acuosos y no acuosos y puede usarse cualquiera de ellos. Un ejemplo preferido de condiciones de hibridación rigurosas son la hibridación en 6x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) aproximadamente a 45°C, seguido por uno o más lavados con 0,2x SSC, 0,1% (plv) de SDS a 50°C. Otro ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas son la hibridación en 6x SSC aproximadamente a 45°C, seguido por uno o más lavados con 0,2x SSC, 0,1% (p/v) de SDS a 55°C. Un ejemplo adicional de condiciones de hibridación rigurosas son la hibridación en 6x SSC aproximadamente a 45°C, seguido por uno o más lavados con 0,2x SSC, 0,1% (p/v) de SDS a 60°C. Preferiblemente, condiciones de hibridación rigurosas son la hibridación en 6x SSC aproximadamente a 45°C, seguido por uno o más lavados en 0,2x SSC, 0,1% (p/v) de SDS a 65°C. Condiciones de rigurosidad particularmente preferidas (y las condiciones que deben usarse si el médico de cabecera no está seguro sobre qué condiciones deben aplicarse para determinar si una molécula está dentro de una limitación de hibridación de la invención) son fosfato de sodio 0,5 molar, 7% (p/v) de SDS a 65°C, seguido por uno o más lavados con 0,2x SSC, 1% (p/v) de SDS a 65°C. Preferiblemente, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención que híbrida en condiciones rigurosas con la secuencia
de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, corresponde a una molécula de ácido nucleico que se produce de manera natural.
Tal como se usa en el presente documento, una molécula de ácido nucleico "que se produce de manera natural" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que se produce en la naturaleza (por ejemplo, codifica para una proteína natural).
Tal como se usa en el presente documento, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido. nucleico que incluyen un marco de lectura abierto que codifica para una proteína 13245, preferiblemente una proteína 13245 de mamífero, y pueden incluir además intrones y secuencias reguladoras no codificantes.
Un polipéptido o proteína "aislado" o "purificado" está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente celular o de tejidos de la que se deriva la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. En una realización, las palabras "sustancialmente libre" significa la preparación de la proteína 13245 que tiene menos de aproximadamente el 30%, 20%, 10% y más preferiblemente el 5% (en peso seco), de proteína distinta a 13245 (también denominado en el presente documento como una "proteína contaminante"), o de precursores químicos o productos químicos distintos a 13245. Cuando la proteína 13245 o parte biológicamente activa de la misma se produce de manera recombinante, también está de manera preferible sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente el 10%, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente el 5% del volumen de la preparación de proteína. La invención incluye preparaciones aisladas o purificadas de al menos 0,01, 0,1, 1,0, y 10 miligramos en peso seco.
Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede alterarse desde la secuencia de tipo natural de 13245 (por ejemplo, la secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3) sin suprimir o, más preferiblemente, sin alterar sustancialmente una actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" da como resultado tal cambio. Por ejemplo, se prevé que los residuos de aminoácidos que se conservan entre los polipéptidos de la presente invención, por ejemplo, aquellos presentes en el dominio pquinasa no son particularmente adecuados para la alteración.
Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en la que el residuo de aminoácido se sustituye por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica, se han definido las familias de residuos de aminoácidos que tiene cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales apolares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificaciones beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, preferiblemente se sustituye un residuo de aminoácido no esencial previsto en una proteína 13245 por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, en otra realización, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o una parte de la secuencia codificante de 13245, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden examinarse para determinar la actividad biológica de 13245 para identificar mutantes que conservan la actividad. Tras la mutagénesis de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, puede expresarse de manera recombinante la proteína codificada y puede determinarse la actividad de la proteína.
Tal como se usa en el presente documento, una "parte biológicamente activa" de una proteína 13245 incluye un fragmento de una proteína 13245 que participa en una interacción entre una molécula de 13245 y una molécula distinta a 13245. Las partes biológicamente activas de una proteína 13245 incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente homólogas a o derivadas de la secuencia de aminoácidos de la proteína 13245, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, que incluyen menos aminoácidos que las proteínas 13245 de longitud completa, y muestran al menos una actividad de una proteína 13245. Normalmente, las partes biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la proteína 13245, por ejemplo, un dominio o motivo que puede catalizar una actividad descrita en el presente documento, tal como la adición covalente de un resto fosfato a un residuo de aminoácido de la proteína (por ejemplo, a un grupo hidroxilo de una serina o treonina).
Una parte biológicamente activa de una proteína 13245 puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100, 200, 300, o 400, 500, 1000, 1500, ó 2000 o más aminoácidos de longitud. Pueden usarse partes biológicamente activas de una proteína 13245 como dianas para desarrollar agentes que modulan una actividad mediada por 13245, por ejemplo, una actividad biológica descrita en el presente documento.
Se realizan cálculos de homología o identidad de secuencia entre secuencias (los términos se usan de manera intercambiable en el presente documento) tal como sigue.
Para determinar la identidad en porcentaje de dos secuencias de aminoácidos, o de dos secuencias de ácido nucleico, se alinean las secuencias con fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o en ambas de una primera y una segunda secuencias de aminoácidos o ácido nucleico para la alineación óptima y las secuencias no homólogas pueden no tenerse en cuenta secuencias no homólogas con fines de comparación). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada con fines de comparación es al menos el 30%, preferiblemente al menos el 40%, más preferiblemente al menos el 50%, incluso más preferiblemente al menos el 60%, e incluso más preferiblemente al menos el 70%, 80%, 90%, 100% de la longitud de la secuencia de referencia (por ejemplo, cuando se alinea una segunda secuencia con la secuencia de aminoácidos de 13245 de SEQ ID NO: 2, se alinean 100 residuos de aminoácidos, preferiblemente al menos 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, ó 2000 o más residuos de aminoácidos). Se comparan entonces los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácido o posiciones de nucleótido correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (tal como se usa en el presente documento "identidad" aminoácido o ácido nucleico es equivalente "homología" de aminoácido o ácido nucleico). La identidad en porcentaje entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que se necesitan introducir para la alineación óptima de las dos secuencias.
La comparación de secuencias y determinación de la identidad en porcentaje entre dos secuencias puede realizarse usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, la identidad en porcentaje entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman et al. (1970, J. Mol. Biol. 48:444-453) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), o bien usando una matriz BLOSUM 62 o bien una matriz PAM250, y un valor de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ó 4 y un valor de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Aún en otra realización preferida, la identidad en porcentaje entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un valor de hueco of 40, 50, 60, 70 u 80 y un valor de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Un conjunto de parámetros particularmente preferido (y el que debe usarse si el médico de cabecera no está seguro de qué parámetros debe aplicar para determinar si una molécula está dentro de una limitación de homología o identidad de secuencia de la invención) son una matriz de puntuación BLOSUM 62 con una penalización por hueco de 12, una penalización por extensión de huecos de 4, y una penalización de huecos en el marco de 5.
La identidad en porcentaje entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos puede determinarse usando el algoritmo de Meyers et al. (1989, CABIOS, 4:11-17) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuos de valores PAM120, una penalización por longitud del hueco de 12 y una penalización por hueco de 4.
Las secuencias de ácido nucleico y proteína descritas en el presente documento pueden usarse como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda frente a bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990, J. Mol. Biol. 215:403-410). Pueden realizarse búsquedas de nucleótidos BLAST con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico de 13245 de la invención. Pueden realizarse búsquedas de proteínas BLAST con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína 13245 de la invención. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST tal como se describe en Altschul et al. (1997, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402). Cuando se usan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase <http://www.ncbi.nlm.nih.gov>.
"Una expresión errónea o expresión aberrante", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un patrón no natural de la expresión génica, al nivel del ARN o la proteína. Incluye: expresión a niveles no naturales, es decir, sobre o subexpresión; un patrón de expresión que difiere del natural en cuanto al tiempo o la fase en que se expresa el gen, por ejemplo, un aumento o una disminución de la expresión (en comparación con la natural) en un periodo o fase de desarrollo predeterminado; un patrón de expresión que difiere del natural en cuanto a una disminución de la expresión (en comparación con la natural) en un tipo de célula o tipo de tejido predeterminado; un patrón de expresión que difiere del natural en cuanto al tamaño de corte y empalme, secuencia de aminoácidos, modificación tras la transición, o actividad biológica del polipéptido expresado; un patrón de expresión que difiere del natural en cuanto al efecto de un estímulo ambiental o estímulo extracelular sobre la expresión del gen, por ejemplo, un patrón de aumento o disminución de la expresión (en comparación con la natural) en presencia de un aumento o una disminución de la intensidad del estímulo.
"Sujeto", tal como se usa en el presente documento, puede referirse a un mamífero, por ejemplo, un ser humano, o a un modelo experimental o animal o de enfermedad. El sujeto también puede ser un animal no humano, por ejemplo, un caballo, vaca, cabra u otro animal doméstico.
Una "preparación purificada de células", tal como se usa en el presente documento, se refiere a, en el caso de células vegetales o animales, una preparación in vitro de células y no un una planta o animal intacto completo. En el caso de células cultivadas o células microbianas, está constituida por una preparación de al menos el 10%, y más preferiblemente, el 50% de las células del sujeto.
A continuación, se describen en mayor detalle diversos aspectos de la invención.
Moléculas aisladas de ácido nucleico
En un aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico, aislada o purificada, que codifica para un polipéptido 13245 descrito en el presente documento, por ejemplo, una proteína 13245 de longitud completa o un fragmento de la misma, por ejemplo, una parte biológicamente activa de la proteína 13245. También se incluye un fragmento de ácido nucleico adecuado para su uso como una sonda de hibridación, que puede usarse, por ejemplo, para identificar una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención, ARNm de 13245, y fragmentos adecuados para su uso como cebadores, por ejemplo, cebadores de PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico.
En una realización, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención incluye la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 o una parte de la misma. En una realización, la molécula de ácido nucleico incluye secuencias que codifican para la proteína 13245 humana (es decir, "la región codificante", de los nucleótidos 19-6178 de SEQ ID NO: 1), así como las secuencias no traducidas en 5' (nucleótidos 1-18 de SEQ ID NO: 1) o las secuencias no traducidas en 3' (nucleótidos 6179-6575 de SEQ ID NO:1). Alternativamente, la molécula de ácido nucleico puede incluir sólo la región codificante de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, nucleótidos 19-6178, correspondientes a SEQ ID NO: 3) y, por ejemplo, sin las secuencias flanqueantes que normalmente acompañan a la secuencia objeto. En otra realización, la molécula de ácido nucleico codifica para una secuencia correspondiente a la proteína de 2053 residuos de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
En otra realización, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención incluye una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos mostrada en una de SEQ ID NO: 1 y 3, y una parte de cualquiera de estas secuencias. En otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico de la invención es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3 que puede hibridar con un ácido nucleico que tiene esa secuencia, formando así un dúplex estable.
En una realización, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención incluye una secuencia de nucleótidos que es homóloga en al menos aproximadamente el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% o más con la longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada en una de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, y una parte, preferiblemente de la misma longitud, de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos.
Fragmentos de ácido nucleico de 13245
Una molécula de ácido nucleico de la invención puede incluir sólo una parte de la secuencia de ácido nucleico de cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3. Por ejemplo, tal molécula de ácido nucleico puede incluir un fragmento que puede usarse como una sonda o cebador o un fragmento que codifica para una parte de una proteína 13245, por ejemplo, una parte inmunogénica o biológicamente activa de una proteína 13245. Un fragmento puede comprender los nucleótidos correspondientes a los residuos 97-360 de SEQ ID NO: 2, que codifican para un dominio pquinasa de 13245 humana, o a los residuos 1568-1865 de SEQ ID NO: 2, que codifican para un dominio CNH de 13245 humana. La secuencia de nucleótidos determinada a partir de la clonación del gen 13245 facilita la generación de sondas y cebadores para su uso en la identificación y/o clonación de miembros de la familia de 13245, o fragmentos de los mismos, así como homólogos de 13245, o fragmentos de los mismos, de otras especies.
En otra realización, un ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que incluye parte de, o toda, la región codificante y se extiende hacia cualquiera (o ambas) de las regiones no codificantes en 5' o 3'. Otras realizaciones incluyen un fragmento que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de aminoácidos descrito en el presente documento. Fragmentos de ácido nucleico pueden codificar para un dominio o sitio específicos descritos en el presente documento o fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos de los mismos que tienen al menos aproximadamente 250 aminoácidos de longitud. Los fragmentos también incluyen secuencias de ácido nucleico correspondientes a secuencias de aminoácidos específicas descritas anteriormente o fragmentos de las mismas. No debe considerarse que los fragmentos de ácido nucleico engloban aquellos fragmentos que pueden haberse descrito antes de la invención.
Un fragmento de ácido nucleico puede incluir una secuencia correspondiente a un dominio, región, o sitio funcional descritos en el presente documento. Un fragmento de ácido nucleico también puede incluir uno o más dominios, regiones, o sitios funcionales descritos en el presente documento.
Se proporcionan sondas y cebadores de 13245. Normalmente una sonda/cebador es un oligonucleótido aislado o purificado. El oligonucleótido normalmente incluye una región de la secuencia de nucleótidos que híbrida en condiciones rigurosas con al menos aproximadamente 7, 12 ó 15, de manera preferible aproximadamente 20 ó 25, de manera más preferible aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, ó 75 nucleótidos consecutivos de una secuencia sentido o antisentido de cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3, y una variante alélica que se produce de manera natural o mutante de cualquiera de SEQ TD NO: 1 y 3.
En una realización preferida, el ácido nucleico es una sonda que tiene al menos 5 ó 10, y menos de 200, más preferiblemente menos de 100, o menos de 50, pares de bases de longitud. Debe ser idéntico, o diferir en 1, o menos de 5 ó 10 bases, de una secuencia descrita en el presente documento. Si se necesita la alineación para esta comparación, deben alinearse las secuencias para su homología máxima. Las secuencias que sobresalen "en bucles" ("looped out") procedentes de deleciones o inserciones, o los apareamientos erróneos, se consideran diferencias.
Una sonda o cebador puede derivarse de la hebra sentido o antisentido de un ácido nucleico que codifica para un dominio pquinasa aproximadamente en los residuos de aminoácidos 97 a 360 de SEQ ID NO: 2 o el dominio CNH previsto aproximadamente en los residuos de aminoácidos 1568 a 1865 de SEQ ID NO: 2.
En otra realización, se proporciona un conjunto de cebadores, por ejemplo, cebadores adecuados para su uso en una PCR, que puede usarse para amplificar una región seleccionada de una secuencia de 13245. Los cebadores deben tener al menos 5, 10 ó 50 pares de bases de longitud y menos de 100, o menos de 200, pares de bases de longitud. Los cebadores deben ser idénticos, o diferir en una base de una secuencia descrita en el presente documento o de una variante que se produce de manera natural. Se proporcionan los cebadores adecuados para amplificar toda o una parte de cualquiera de las siguientes regiones: por ejemplo, uno o más dominios pquinasa y el dominio CNH previsto, tal como se definió anteriormente con respecto a SEQ ID NO: 2.
Un fragmento de ácido nucleico puede codificar para un epítopo que lleva una región de un polipéptido descrito en el presente documento.
Puede prepararse un fragmento de ácido nucleico que codifica para una "parte biológicamente activa de un polipéptido 13245" aislando una parte de la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3, que codifica para un polipéptido que tiene una actividad biológica de 13245 (por ejemplo, las actividades biológicas de las proteínas 13245 se describen en el presente documento), que expresa la parte codificada de la proteína 13245 (por ejemplo, mediante expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la parte codificada de la proteína 13245. Por ejemplo, un fragmento de ácido nucleico que codifica para una parte biológicamente activa de 13245 incluye un dominio pquinasa, por ejemplo, los residuos de aminoácidos 97 a 360 de SEQ ID NO: 2, o un dominio CNH, por ejemplo, los residuos de aminoácidos 1568 a 1865 de SEQ ID NO: 2. Un fragmento de ácido nucleico que codifica para una parte biológicamente activa de un polipéptido 13245 puede comprender una secuencia de nucleótidos que es superior a 25 o más nucleótidos de longitud.
En una realización, un ácido nucleico incluye uno que tiene una secuencia de nucleótidos que es superior a 260, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000, 2500, 3,000, 4000, 5000 ó 6000 o más nucleótidos de longitud y que híbrida en condiciones de hibridación rigurosas con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3.
Variantes de ácido nucleico de 13245
La invención engloba además moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia que difiere de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3. Tales diferencias pueden atribuirse a la degeneración del código genético (es decir, diferencias que dan como resultado un ácido nucleico que codifica para las mismas proteínas 13245 que las codificadas por la secuencia de nucleótidos descrita en el presente documento). En otra realización, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención codifica para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere en al menos 1, pero en menos de 5, 10, 20, 50 ó 100, residuos de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Si se necesita la alineación para esta comparación, deben alinearse las secuencias para su homología máxima. Las secuencias que sobresalen "en bucles" procedentes de deleciones o inserciones, o los apareamientos erróneos, se consideran diferencias.
Puede elegirse que los ácidos nucleicos del inventor tengan codones, que son preferidos, o no preferidos, para un sistema de expresión particular. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser uno en el que se ha alterado al menos un codón, preferiblemente en al menos el 10%, o el 20% de los codones, de tal manera que se optimiza la secuencia para la expresión en células de E. coli, levaduras, ser humano, insecto o CHO.
Las variantes de ácido nucleico pueden producirse de manera natural, tal como variantes alélicas (mismo locus), homólogos (diferente locus), y ortólogos (diferente organismo) o pueden no producirse de manera natural. Las variantes que no se producen de manera natural pueden prepararse mediante técnicas de mutagénesis, incluyendo las aplicadas a polinucleótidos, células u organismos. Las variantes pueden contener sustituciones, deleciones, inversiones e inserciones de nucleótidos. La variación puede ocurrir en alguna o en ambas de las regiones codificante y no codificante. Las variaciones pueden producir tanto sustituciones de aminoácidos conservativas como no conservativas (en comparación con el producto codificado).
En una realización preferida, el ácido nucleico tiene una secuencia que difiere de la de cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3, por ejemplo, tal como sigue: en al menos uno, pero en menos de 10, 20, 30, ó 40, residuos de nucleótidos; o en al menos uno pero en menos del 1%, 5%, 10% o 20% de los residuos de nucleótidos en el ácido nucleico objeto. Si es necesario para este análisis, las secuencias deben alinearse para una homología máxima. Las secuencias que sobresalen "en bucles" procedentes de deleciones o inserciones, o los apareamientos erróneos, se consideran diferencias.
Pueden identificarse ortólogos, homólogos y variantes alélicas usando procedimientos conocidos en la técnica. Estas variantes comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que es idéntico en un 50%, al menos aproximadamente el 55%, normalmente al menos aproximadamente el 70-75%, más normalmente al menos aproximadamente el 80-85%, y lo más normalmente al menos aproximadamente el 90-95% o más a la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3, o un fragmento de una de estas secuencias. Tales moléculas de ácido nucleico pueden identificarse fácilmente como pudiendo hibridar en condiciones rigurosas, con la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3, o un fragmento de una de estas secuencias. Pueden aislarse además moléculas de ácido nucleico correspondientes a ortólogos, homólogos, y variantes alélicas de los ADNc de 13245 de la invención mediante mapeo en el mismo cromosoma o locus que el gen 13245.
Las variantes preferidas incluyen aquellas que se correlacionan con cualquiera de las actividades biológicas de 13245 descritas en el presente documento, por ejemplo, catalizan la formación de un enlace covalente entre un residuo de aminoácidos de una proteína (por ejemplo, un residuo de serina o treonina) y un resto fosfato.
Las variantes alélicas de 13245 (por ejemplo, 13245 humana) incluyen tanto proteínas funcionales como no funcionales. Las variantes alélicas funcionales son variantes de la secuencia de aminoácidos que se producen de manera natural de la proteína 13245 dentro de una población que mantiene la capacidad para mediar cualquiera de las actividades biológicas de 13245 descritas en el presente documento.
Las variantes alélicas funcionales contendrán normalmente sólo la sustitución conservativa de uno o más aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o la sustitución, deleción o inserción de residuos no «críticos en regiones no críticas de la proteína. Las variantes alélicas no funcionales son variantes de la secuencia de aminoácidos que se producen de manera natural de la proteína 13245 (por ejemplo, 13245 humana) dentro de una población que no tiene la capacidad para mediar ninguna de las actividades biológicas de 13245 descritas en el presente documento. Las variantes alélicas no funcionales contendrán normalmente una sustitución no conservativa, una deleción, o inserción, o truncamiento prematuro de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o una sustitución, inserción o deleción en residuos críticos o regiones críticas de la proteína.
Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican para otros miembros de la familia de 13245 y, por tanto, que tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de las secuencias de 13245 de cualquiera de SEQ ID NO: 1 y 3 están dentro del alcance de la invención.
Moléculas de ácido nucleico antisentido, ribozimas y moléculas de ácido nucleico de 13245 modificadas
En otro aspecto, la invención se caracteriza por una molécula aislada de ácido nucleico que es antisentido con respecto a 13245. Un ácido nucleico "antisentido" puede incluir una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico "sentido" que codifica para una proteína, por ejemplo, complementaria a la hebra codificante de una molécula de ADNc bicatenario o complementaria a una secuencia de ARNm. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una hebra codificante de 13245 completa, o sólo a una parte de la misma (por ejemplo, la región codificante de 13245 humana correspondiente a SEQ ID NO: 3). En otra realización, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido con respecto a una "región no codificante" de la hebra codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica para 13245 (por ejemplo, las regiones no traducidas en 5' y 3').
Puede diseñarse un ácido nucleico antisentido de tal manera que es complementario a la región codificante completa del ARNm de 13245, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es antisentido con respecto a sólo una parte de la región codificante o no codificante del ARNm de 13245. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que rodea el sitio de inicio de la traducción del ARNm de 13245, por ejemplo, entre las regiones -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos del gen diana de interés. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70,75 u 80 o más residuos de nucleótidos de longitud.
Puede construirse un ácido nucleico antisentido de la invención usando síntesis química y reacciones de ligamiento enzimático usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) pueden sintetizarse químicamente usando nucleótidos que se producen de manera natural o nucleótidos modificados de manera diversa diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ejemplo, pueden usarse derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. El ácido nucleico antisentido también puede producirse biológicamente usando un vector de expresión en el que se ha subclonado un ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado será de una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés, descrito adicionalmente en la siguiente subsección).
Las moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención normalmente se administran a un sujeto (por ejemplo, mediante la inyección directa a un sitio tisular), o se generan in situ de tal manera que hibridan con o se unen al ARNm celular y/o el ADNc genómico que codifica para una proteína 13245 para inhibir así la expresión de la proteína, por ejemplo, mediante la inhibición de la transcripción y/o la traducción. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico antisentido pueden modificarse para seleccionar como diana células seleccionadas y después administrarse sistémicamente. Para la administración sistémica, las moléculas antisentido pueden modificarse de tal manera que se unen específicamente a receptores o antígenos expresados sobre la superficie de una célula seleccionada, por ejemplo, mediante la unión de las moléculas de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a los receptores o antígenos de la superficie de la célula. Las moléculas de ácido nucleico antisentido también pueden administrarse a las células utilizando los vectores descritos en el presente documento. Para lograr suficientes concentraciones intracelulares de las moléculas antisentido, se prefieren los constructos de vector en los que la molécula de ácido nucleico antisentido se sitúan bajo el control de un promotor fuerte pol II o pol III.
Aún en otra realización, la molécula de ácido nucleico antisentido de la invención es una molécula de ácido nucleico alfa-anomérica. La molécula de ácido nucleico alfa-anomérica forma híbridos de doble cadena específicos con ARN complementario en los que, al contrario de las unidades beta usuales, las hebras se disponen paralelas entre sí (Gaultier et al., 1987, Nucl. Acids. Res. 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2'-o-metilrribonucleótido (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330).
Todavía en otra realización, una molécula de ácido nucleico antisentido de la invención es una ribozima. Una ribozima que tiene especificidad por un ácido nucleico que codifica para 13245 puede incluir una o más secuencias complementarias a la secuencia de nucleótidos de un ADNc de 13245 descrito en el presente documento (es decir, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3), y una secuencia que tiene la secuencia catalítica conocida responsable de la escisión del ARNm (véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 5.093.246 o Haselhoff et al. (1988, Nature 334:585-591). Por ejemplo, puede construirse un derivado de un ARN de tipo L-19 IVS de Tetrahymena en el que la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos que va a escindirse en un ARNm que codifica para 13245 (por ejemplo, patente de los EE.UU. número 4.987.071; y patente de los EE.UU. número 5.116.742). Alternativamente, el ARNm de 13245 puede usarse para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad ribonucleasa específica de un conjunto de moléculas de ARN (por ejemplo, Bartel et al., 1993, Science 261:1411-1418).
La expresión del gen 13245 puede inhibirse mediante secuencias de nucleótidos seleccionadas como diana complementarias a la región reguladora de 13245 (por ejemplo, el promotor y/o los potenciadores de 13245) para formar estructuras de triple hélice que evitan la transcripción del gen 13245 en células diana (Helene, 1991, Anticancer Drug Des. 6:569-584; Helene, et al., 1992, Ann. N.Y. Acad.Sci. 660:27-36; Maher, 1992, Bioassays 14:807-815). Las posibles secuencias que pueden seleccionarse como diana para la formación de la triple hélice pueden aumentarse creando una molécula de ácido nucleico denominada "switchback" (en zig-zag). Las moléculas switchback se sintetizan de una manera que alterna de 5' a 3', 3' a 5', de tal manera que hibridan con la primera hebra de un dúplex y después con la otra, eliminando la necesidad de un estiramiento considerable de o bien purinas o bien pirimidinas que están presentes en una hebra de un dúplex.
La invención también proporciona moléculas de sonda y cebador de oligonucleótido marcadas de manera detectable. Normalmente, tales marcadores son quimioluminiscentes, fluorescentes, radiactivos o colorimétricos.
Una molécula de ácido nucleico de 13245 puede modificarse en el resto de la base, resto de azúcar o en la estructura principal de fosfatos para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, la hibridación o la solubilidad de la molécula. Por ejemplo, la estructura principal de desoxirribosa-fosfato de las moléculas de ácido nucleico puede modificarse para generar ácidos nucleicos peptídicos (Hyrup et al., 1996, Bioorg. Med. Chem. 4:5-23). Tal como se usa en el presente documento, el término "ácido nucleido peptídico" (PNA) se refiere a una molécula que imita a un ácido nucleico, por ejemplo, una molécula que imita al ADN, en la que la estructura principal de desoxirribosa-fosfato está sustituida por una estructura principal de seudopéptido y sólo se conservan los cuatro nucleobases naturales. La estructura principal neutra de un PNA puede permitir la hibridación específica al ADN y al ARN en condiciones de fuerza iónica baja. La síntesis de oligómeros de PNA puede llevarse a cabo utilizando protocolos de síntesis de péptidos en fase sólida convencionales, tal como se describe en Hyrup et al. (1996, citado anteriormente; Perry-O'Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-14675).
Los PNA de las moléculas de ácido nucleico de 13245 pueden usarse en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas. Por ejemplo, los PNA pueden usarse como agentes antisentido o antigénicos para la modulación específica de secuencia de la expresión génica mediante, por ejemplo, la inducción de la detención de la transcripción o la traducción o la inhibición de la replicación. Los PNA de las moléculas de ácido nucleico de 13245 también pueden utilizarse en el análisis de mutaciones de un único par de bases en un gen, (por ejemplo, mediante anclaje por PCR dirigido a PNA); como "enzimas de restricción artificiales" cuando se utilizan en combinación con otras enzimas, (por ejemplo, nucleasas S1, tal como se describe en Hyrup et al., 1996, citado anteriormente); o como sondas o cebadores para la secuenciación o la hibridación de ADN (Hyrup et al., 1996, citado anteriormente; Perry-O'Keefe, citado anteriormente).
En otras realizaciones, el oligonucleótido puede incluir otros grupos adjuntos, tales como péptidos (por ejemplo, para seleccionar como diana receptores de células huésped in vivo), o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana de la célula (por ejemplo, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; publicación PCT número WO 88/09810) o de la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, publicación PCT número WO 89/10134). Además, los oligonucleótidos pueden modificarse con agentes de escisión desencadenados por la hibridación (por ejemplo, Krol et al., 1988, Bio-Techniques 6:958-976) o agentes de intercalación (por ejemplo, Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549). Para este fin, el oligonucleótido puede conjugarse con otra molécula, (por ejemplo, un péptido, agente de reticulación desencadenado por la hibridación, agente de transporte o agente de escisión desencadenado por la hibridación).
La invención también incluye moléculas de sonda y cebador de oligonucleótido de baliza molecular que tienen al menos una región que es complementaria al ácido nucleico de 13245 de la invención, dos regiones complementarias, una que tiene un fluoróforo y otra que tiene una molécula de extinción, de tal manera que la baliza molecular es útil para cuantificar la presencia del ácido nucleico de 13245 de la invención en una muestra. Los ácidos nucleicos de baliza molecular se describen, por ejemplo, en la patente de los EE.UU. número 5.854.033, la patente de los EE.UU. número 5.866.336, y la patente de los EE.UU. número 5.876.930.
Polipéptidos 13245 aislados
En otro aspecto, la invención se caracteriza por una proteína 13245 aislada, o fragmento, por ejemplo, una parte biológicamente activa, para su uso como inmunógenos o antígenos para obtener o probar (o más generalmente para unir) anticuerpos anti-13245. La proteína 13245 puede aislarse de fuentes celulares o tisulares utilizando técnicas de purificación de proteínas convencionales. La proteína 13245 o fragmentos de la misma pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante o pueden sintetizarse químicamente.
Los polipéptidos de la invención incluyen los que se obtienen como resultado de la existencia de múltiples genes, acontecimientos de transcripción alternativos, acontecimientos de corte y empalme de ARN alternativos, y acontecimientos de traducción y posteriores a la traducción alternativos. El polipéptido puede expresarse en sistemas, por ejemplo, células cultivadas, que dan como resultado sustancialmente las mismas modificaciones tras la traducción presentes cuando el polipéptido se expresa en, una célula nativa, o en sistemas que dan como resultado la alteración o la omisión de las modificaciones tras la traducción, por ejemplo, glucosilación o escisión, presentes cando se expresan en una célula nativa.
En una realización preferida, un polipéptido 13245 tiene una o más de las características siguientes:
(1) cataliza la formación de un enlace covalente con o entre un residuo de aminoácido y un resto fosfato;
(2) modula la capacidad de contracción de la célula;
(3) modula el crecimiento de la célula;
(4) modula la conductividad de la célula;
(5) modula la entrada de una célula en el ciclo celular;
(6) modula la progresión de una célula a través del ciclo celular;
(7) modula la mitogénesis;
(8) modula el metabolismo celular; y
(9) modula la transcripción génica;
(10) cataliza la interconversión de formas fosforiladas y no fosforiladas de una GTPasa, tal como una GTPasa Rho;
(11) modula la citocinesis;
(12) modula la forma celular;
(13) modula el movimiento celular (por ejemplo, metástasis tumoral);
(14) modula la integración de un genoma viral en el genoma de una célula huésped;
(15) modula el mantenimiento de un genoma viral dentro del genoma de una célula huésped;
(16) modula los cambios citológicos en una célula huésped infectada por virus;
(17) modula la producción de virus en una célula huésped infectada por virus;
(18) modula la interacción de un virión con una membrana de una célula huésped infectada por virus;
(19) modula la encapsulación de un virión dentro de una parte de una membrana de una célula huésped infectada por virus;
(20) tiene un peso molecular, una composición de aminoácidos u otras características físicas de una proteína 13245 de SEQ ID NO: 2;
(21) tiene una similitud de secuencia global (identidad) de al menos el 60-65%, preferiblemente de al menos el 70%, más preferiblemente de al menos el 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% o más, con una parte de SEQ ID NO: 2;
(22) tiene un dominio CNH que es preferiblemente de aproximadamente el 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% o más, idéntico a los residuos de aminoácidos 1568-1865 de SEQ ID NO: 2; o
(23) tiene al menos un dominio pquinasa que es preferiblemente de aproximadamente el 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% o más, idéntico a los residuos de aminoácidos 97-360 de SEQ ID NO: 2.
En una realización preferida, la proteína 13245 o el fragmento de la misma difiere sólo insustancialmente, si acaso, de la secuencia correspondiente en SEQ ID NO: 2. En una realización, difiere en al menos uno, pero en menos de 15, 10 ó 5 residuos de aminoácidos. En otra, difiere de la secuencia correspondiente en la SEQ ID NO: 2 en al menos un residuo, pero menos del 20%, 15%, 10% o 5% de los residuos difieren de la secuencia correspondiente en SEQ ID NO: 2 (si esta comparación requiere la alineación de las secuencias, deben alinearse para una homología máxima. Las secuencias que sobresalen "en bucles" ("looped out") procedentes de deleciones o inserciones, o los apareamientos erróneos, se consideran diferencias). Las diferencias son, preferiblemente, diferencias o cambios en un residuo de aminoácidos no esencial o suponen una sustitución conservativa de un residuo por otro. En una realización preferida, las diferencias no se producen en los residuos 97-360 ni en 1568-1865 de la SEQ ID NO: 2.
Otras realizaciones incluyen una proteína que tiene uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos, con respecto a la SEQ ID NO: 2 (por ejemplo, un cambio en un residuo de aminoácido que no es esencial para la actividad). Tales proteínas 13245 que difieren en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, todavía conservan su actividad biológica.
En una realización, la proteína incluye una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%,85%, 90%, 95%, 98% o más homóloga a la SEQ ID NO: 2.
Se proporciona una proteína 13245 o fragmento que tiene una secuencia de aminoácidos que varía de la SEQ ID NO: 2 en una o ambas regiones correspondientes a los residuos 1-96, 361-1567, y 1866-2053 de la SEQ ID NO: 2 en al menos uno, pero en menos de 15, 10 ó 5 residuos de aminoácidos, pero que no difiere de la SEQ ID NO: 2 en la región correspondiente a los residuos 97-360 y 1568-1865 de la SEQ ID NO: 2 (si esta comparación requiere la alineación de las secuencias, deben alinearse para una homología máxima. Las secuencias que sobresalen "en bucles" ("looped out") procedentes de deleciones o inserciones, o los apareamientos erróneos, se consideran diferencias). En algunas realizaciones, la diferencia está en un residuo no esencial o es una sustitución conservativa, mientras que en otras, la diferencia está en un residuo esencial o es una sustitución no conservativa.
Una parte biológicamente activa de una proteína 13245 debe incluir el dominio pquinasa de 13245, el dominio CNH de 13245, o ambos. Además, otras partes biológicamente activas, en las que están delecionadas otras regiones de la proteína, pueden prepararse mediante técnicas recombinantes y evaluarse para determinar una o más de las actividades funcionales de una proteína 13245 nativa.
En una realización preferida, la proteína 13245 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones, la proteína 13245 es sustancialmente idéntica a SEQ ID NO: 2. Aún en otra realización, la proteína 13245 es sustancialmente idéntica a SEQ ID NO: 2 y conserva la actividad funcional de la proteína de SEQ ID NO: 2.
Proteínas de fusión o quiméricas 13245
En otro aspecto, la invención proporciona proteínas de fusión o quiméricas 13245. Tal como se usa en el presente documento, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" 13245'' incluye un polipéptido 13245 unido a un polipéptido distinto de 13245. Un "polipéptido distinto de 13245" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína que no es sustancialmente homóloga a la proteína 13245, por ejemplo, una proteína que es diferente de la proteína 13245 y que se deriva del mismo organismo o uno diferente. El polipéptido 13245 de la proteína de fusión puede corresponder a todo o a una parte, por ejemplo, un fragmento descrito en el presente documento de una secuencia de aminoácidos de 13245. En una realización preferida, una proteína de fusión 13245 incluye al menos una o más partes biológicamente activas de una proteína 13245. El polipéptido distinto de 13245 puede unirse al extremo amino o carboxilo terminal del polipéptido 13245.
La proteína de fusión puede incluir un resto que tiene una alta afinidad por un ligando. Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser una proteína de fusión GST-13245 en la que las secuencias de 13245 se unen al extremo carboxilo terminal de las secuencias de GST. Las proteínas de fusión de este tipo pueden facilitar la purificación de 13245 recombinante. Alternativamente, la proteína de fusión puede ser una proteína 13245 que contiene una secuencia señal heteróloga en su extremo amino terminal. En ciertas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero), la expresión y/o la secreción de 13245 pueden aumentarse mediante el uso de una secuencia señal heteróloga.
Las proteínas de fusión pueden incluir toda o una parte de una proteína sérica, por ejemplo, una región constante de la IgG, o albúmina sérica humana.
Las proteínas de fusión 13245 de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas y administrarse al sujeto in vivo. Las proteínas de fusión 13245 pueden usarse para afectar a la biodisponibilidad de un sustrato 13245. Las proteínas de fusión 13245 pueden ser útiles terapéuticamente y para el tratamiento de los trastornos producidos, por ejemplo, por (i) modificación o mutación aberrante de un gen que codifica para una proteína 13245; (ii) regulación defectuosa del gen 13245; y (iii) modificación aberrante tras la traducción de una proteína 13245.
Además, las proteínas de fusión 13245 de la invención pueden usarse como inmunógenos para producir anticuerpos anti-13245 en un sujeto, para purificar ligandos de 13245 y en ensayos de selección para identificar moléculas que inhiben la interacción de 13245 con un sustrato de 13245.
Se dispone comercialmente de vectores de expresión que ya codifican para un resto de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST). Un ácido nucleico que codifica para 13245 puede clonarse en un vector de expresión de este tipo, de tal manera que el resto de fusión está unido en marco a la proteína 13245.
Variantes de proteínas 13245
En otro aspecto, la invención también se caracteriza por una variante de un polipéptido 13245, por ejemplo, que funciona como un agonista (miméticos) o como un antagonista. Las variantes de las proteínas 13245 pueden generarse mediante mutagénesis, por ejemplo, mutación puntual diferenciada, la inserción o la deleción de secuencias o el truncamiento de una proteína 13245. Un agonista de las proteínas 13245 puede conservar sustancialmente las mismas, o un subconjunto, de las actividades biológicas de la forma que se produce en la naturaleza de una proteína 13245. Un antagonista de una proteína 13245 puede inhibir una o más de las actividades de la forma que se produce en la naturaleza de la proteína 13245 mediante, por ejemplo, modulando competitivamente una actividad mediada por 13245 de una proteína 13245. Por tanto, pueden provocarse efectos biológicos específicos mediante el tratamiento con una variante de función limitada. Preferiblemente, el tratamiento de un sujeto con una variante que tiene un subconjunto de las actividades biológicas de la forma que se produce en la naturaleza de la proteína, tiene menos efectos secundarios en un sujeto con respecto al tratamiento con la forma que se produce en la naturaleza de la proteína 13245.
Las variantes de una proteína 13245 pueden identificarse seleccionando bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes por truncamiento, de una proteína 13245 para determinar su actividad agonista o antagonista.
Las bibliotecas de fragmentos por ejemplo, fragmentos amino-terminal, carboxilo-terminal, o fragmentos internos, de una secuencia que codifica para la proteína 13245 pueden usarse para generar una población variegada de fragmentos para la detección y posterior selección de las variantes de una proteína 13245.
Se prefieren particularmente variantes en los que se añade o se deleciona un residuo de cisteína o en los que se añade o se deleciona un residuo que está glicosilado.
Procedimientos para seleccionar productos génicos de bibliotecas combinatorias compuestas por mutaciones puntuales o truncamiento, y para seleccionar bibliotecas de ADNc para productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. La mutagénesis conjunta recurrente (REM, recursive ensemble mutagenesis), una técnica que aumenta la frecuencia de los mutantes funcionales en las bibliotecas, puede usarse en combinación con los ensayos de selección para identificar variantes de 13245 (Arkin et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al., 1993, Protein Engr. 6:327-331).
Pueden aprovecharse ensayos basados en células para analizar una biblioteca de 13245 variegada. Por ejemplo, una biblioteca de vectores de expresión puede transfectarse a una línea celular, por ejemplo, una línea celular que normalmente responde a 13245 en una manear dependiente del sustrato. Las células transfectadas se ponen entonces en contacto con 13245 y el efecto de la expresión del mutante sobre la señalización por el sustrato de 13245 puede detectarse, por ejemplo, midiendo los cambios, en el crecimiento celular y/o la actividad enzimática. Entonces puede recuperarse el ADN de plásmido de las células detectan para la inhibición, o alternativamente, la potenciación de la señalización por el sustrato de 13245, y los clones individuales caracterizados adicionalmente.
En otro aspecto, la invención muestra un procedimiento de preparación de un polipéptido 13245, por ejemplo, un péptido que tiene una actividad de tipo no natural, por ejemplo, un antagonista, agonista, o superagonista de un polipéptido 13245 que se produce de manera natural, por ejemplo, un polipéptido 13245 que se produce de manera natural. El procedimiento incluye: alterar la secuencia de un polipéptido 13245, por ejemplo, alterar la secuencia, por ejemplo, mediante sustitución o deleción de uno o más residuos de una región no conservada, un dominio o residuo descritos en el presente documento, y someter a prueba el polipéptido alterado para determinar la actividad deseada.
En otro aspecto, la invención muestra un procedimiento de preparación de un fragmento o análogo de un polipéptido 13245, una actividad biológica de un polipéptido 13245 que se produce de manera natural. El procedimiento incluye: alterar la secuencia, por ejemplo, mediante la sustitución o deleción de uno o más residuos, de un polipéptido 13245, por ejemplo, alterar la secuencia de una región no conservada, o un dominio o residuo descritos en el presente documento, y someter a prueba el polipéptido alterado para determinar la actividad deseada.
Anticuerpos anti-13245
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-1 3245. El término "anticuerpo" tal como se usa en el presente documento se refiere a una molécula de inmunoglobulina o una parte inmunológicamente activa de la misma, es decir, una parte que se une a antigéno. Ejemplos de partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')_{2} que pueden generarse tratando el anticuerpo con una enzima tal como la pepsina.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, monoclonal, recombinante, por ejemplo, uno quimérico o humanizado, completamente humano, no humano, por ejemplo, murino, o de monocatenario. En una realización preferida, tiene una función efectora y puede fijar un complemento. El anticuerpo puede acoplarse a una toxina o a un agente trazador.
Una proteína 13245 de longitud completa o, un fragmento peptídico antigénico de 13245 pueden usarse como inmunógeno o pueden usarse para identificar anticuerpos anti-13245 formados por otros inmunógenos, por ejemplo, células, preparaciones de membrana, y similares. El péptido antigénico de 13245 debe incluir al menos 8 residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQID NO: 2 y engloba un epítopo de 13245. Preferiblemente, el péptido antigénico incluye al menos 10 residuos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 15 residuos de aminoácidos, aún más preferiblemente al menos 20 residuos de aminoácidos, y lo más preferiblemente al menos 30 residuos de aminoácidos.
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Los fragmentos de 13245 que incluyen aproximadamente los residuos 195-210 de la SEQ ID NO: 2 pueden usarse para preparar anticuerpos, por ejemplo, para su uso como inmunógenos o para caracterizar la especificidad de un anticuerpo, contra regiones hidrófobas de la proteína 13245. De manera similar, un fragmento de 13245 que incluye aproximadamente los residuos 455-475 de la SEQ ID NO: 2 puede usarse para preparar un anticuerpo contra una región hidrófila de la proteína 13245.
Se proporcionan anticuerpos reactivos con, o específicos para, cualquiera de estas regiones, u otras regiones o dominios descritos en el presente documento.
Los epítopos preferidos englobados para el péptido antigénico son regiones de 13245 situadas en la superficie de la proteína, por ejemplo, regiones hidrófilas, así como regiones con una alta antigenicidad. Por ejemplo, puede usarse un análisis de probabilidad de superficie de Emini de la secuencia de proteínas humanas 13245 para indicar las regiones que tienen una probabilidad particularmente alta de estar situadas en la superficie de la proteína 13245 y por tanto, es probable que constituyan los residuos superficiales útiles para seleccionar como diana la producción de anticuerpos.
En una realización preferida, el anticuerpo se une a un epítopo en cualquier dominio o región sobre proteínas 13245 descritas en el presente documento.
Los anticuerpos quiméricos, humanizados, pero lo más preferiblemente, completamente humanos son deseables para aplicaciones que incluyen una administración repetida, por ejemplo, tratamiento terapéutico (y algunas aplicaciones diagnósticas) de pacientes humanos.
El anticuerpo anti-13245 puede ser un anticuerpo monocatenario. Un anticuerpo monocatenario (scFV) puede modificarse mediante ingeniería genética (por ejemplo, Colcher et al., 1999, Ann. N.Y. Acad. Sci. 880:263-280; Reiter, 1996, Clin. Cancer Res. 2:245-252). El anticuerpo monocatenario puede dimerizarse o multimerizarse para generar anticuerpos multivalentes que tienen especificidades para diferentes epítopos de la misma proteína 13245 diana.
En una realización preferida, el anticuerpo tiene una capacidad reducida o ninguna capacidad para unirse a un receptor Fc. Por ejemplo, puede ser un isótopo, subtipo, fragmento u otro mutante, que no contribuye a la unión a un receptor Fc, por ejemplo, puede tener una región de unión a receptor Fc mutada o delecionada.
Un anticuerpo anti-13245 (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) puede usarse para aislar 13245 mediante técnicas convencionales, tal como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Además, un anticuerpo anti-13245 puede usarse para detectar la proteína 13245 (por ejemplo, en un lisado celular o sobrenadante celular) con el fin de evaluar la abundancia y el patrón de expresión de la proteína. Los anticuerpos anti-13245 pueden usarse de manera diagnóstica para monitorizar los niveles de proteína en el tejido como parte de un procedimiento de pruebas clínicas, por ejemplo, para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse acoplando (es decir, uniendo físicamente) el anticuerpo a una sustancia detectable (es decir, etiquetado de anticuerpo). Ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetil colinesterasa; ejemplos de complejos de grupo prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y ecuorina, y ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S o ^{3}H.
Vectores de expresión recombinantes, células huésped y células modificadas mediante ingeniería genética
En otro aspecto, la invención incluye, vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica para un polipéptido descrito en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido y puede incluir un plásmido, cósmido o vector viral. El vector puede llevar a cabo una replicación autónoma o puede integrarse en un ADN huésped. Los vectores virales incluyen, por ejemplo, virus adenoasociados, adenovirus o retrovirus con replicación defectuosa.
Un vector puede incluir un ácido nucleico de 13245 en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped. Preferiblemente el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras unidas de manera funcional a la secuencia de ácidos nucleicos que va a expresarse. El término "secuencia reguladora" incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos, así como secuencias inducibles y/o reguladoras específicas de tejido. El diseño del vector de expresión puede depender de tales factores como la elección de la célula huésped que va a transformarse, el nivel de expresión deseado de la proteína, y similares. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en las células huésped para producir de este modo proteínas o polipéptidos, incluyendo proteínas o polipéptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, proteínas 13245, formas mutantes de proteínas 13245, proteínas de fusión, y similares).
Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden diseñarse para la expresión de proteínas 13245 en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención pueden expresarse en E. coli, células de insecto (por ejemplo, usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Las células huésped adecuadas se tratan adicionalmente en Goeddel (1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego). Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras del promotor de T7 y polimerasa de T7.
La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo en la mayoría de los casos en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de cualquier proteína de fusión o no de fusión. Los vectores de fusión añaden un número de aminoácidos a una proteína codificada en los mismos, normalmente al extremo aminoterminal de la proteína recombinante. Tales vectores de fusión sirven normalmente para tres fines: 1) aumentar la expresión de proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando en la purificación por afinidad. Con frecuencia, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la zona de empalme del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión posterior a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento relacionadas, incluyen Factor Xa, trombina y enteroquinasa. Vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith et al., 1988, Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan la glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a la maltosa E, o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana.
Las proteínas de fusión purificadas pueden usarse en ensayos de actividad de 13245, (por ejemplo, ensayos directos o ensayos competitivos descritos en detalle a continuación), o para generar anticuerpos específicos para proteínas 13245. En una realización preferida, puede usarse una proteína de fusión expresada en una vector de expresión retroviral de la presente invención para infectar células de la médula espinal que se trasplantan posteriormente en receptores irradiados. Se examina entonces la patología del receptor objeto tras haber pasado un tiempo suficiente (por ejemplo, seis semanas).
Para maximizar la expresión de proteína recombinante en E. coli, se expresa la proteína en una cepa bacteriana huésped con una capacidad alterada para escindir de manera proteolítica la proteína recombinante (Gottesman, 1990, Gene Expresión Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, 119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia de ácidos nucleicos del ácido nucleico que va a insertarse en un vector de expresión de modo que los codones individuales para cada aminoácido son los utilizados preferentemente en E. coli (Wada et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:2111-2118). Tal alteración de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención puede llevarse a cabo mediante técnicas de síntesis de ADN convencionales.
El vector de expresión de 13245 puede ser un vector de expresión de levadura, a vector para la expresión en células de insectos, por ejemplo, un vector de expresión de baculovirus, o un vector adecuado para la expresión en células de mamífero.
Cuando se usan en células de mamíferos, las funciones de control del vector de expresión se proporcionan con frecuencia por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores virales usados comúnmente se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus del simio 40 (SV40).
En otra realización, el vector de expresión recombinante de mamífero puede dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de células particular (por ejemplo, se usan elementos reguladores específicos de tejido para expresar el ácido nucleico). Ejemplos no limitativos de promotores específicos de tejido adecuados incluyen el promotor de albúmina (específico del hígado; Pinkert et al., 1987, Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos de linfoides (Calame et al., 1988, Adv. Immunol. 43:235-275), en particular promotores de receptores de célula T (Winoto et al., 1989, EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et al., 1983, Cell 33:729-740; Queen et al., 1983, Cell 33:741-748), promotores específicos de neurona (por ejemplo, el promotor de neurofilamentos; Byrne et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), promotores específicos del páncreas (Edlund et al., 1985, Science 230:912-916), y promotores específicos de glándulas mamarias (por ejemplo, promotor de la proteína del lactosuero; patente de los EE.UU. número 4.873.316 y solicitud de patente europea número de publicación 264.166). También se engloban promotores reguladores de desarrollo, por ejemplo, los promotores hox murinos (Kessel et al., 1990, Science 249:374-379) y el promotor de la alfa-fetoproteína (Campes et al., 1989, Genes Dev. 3:537-546).
La invención proporciona además un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Pueden elegirse secuencias reguladoras (por ejemplo, potenciadores y/o promotores virales) unidas de manera funcional a un ácido nucleico clonado en la orientación antisentido que dirigen la expresión constitutiva, específica de tejido o específica de tipo de célula de ARN antisentido en una variedad de tipo de células. El vector de expresión antisentido puede estar en la forma de un plásmido recombinante, fagómido o virus atenuado. Para una discusión de la regulación de la expresión génica usando genes antisentido, véase Weintraub, H. et al. (1986, Trends Genet. 1:Review).
Otro aspecto la invención proporciona una célula huésped que incluye una molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de 13245 dentro de un vector de expresión recombinante o una molécula de ácido nucleico de 13245 que contiene secuencias que le permiten recombinarse de manera homóloga en un sitio específico del genoma de la célula huésped. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se usan de manera intercambiable en el presente documento. Tales términos no sólo se refieren a la célula sujeto particular, sino también a la progenie o progenie potencial de una célula de este tipo. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido o bien a una mutación o bien a influencias ambientas, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula madre, pero se incluyen en el alcance del término tal como se usa en el presente documento.
Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, una proteína 13245 puede expresarse en células bacterianas tal como E. coli, células de insecto, células de levadura o de mamífero (tal como células de ovario de hámster chino (CHO)) o células COS. Otras células huésped adecuadas se conocen por los expertos en la técnica.
Puede introducirse un vector de ADN en células huésped por medio de técnicas de transfección o transformación convencional. Tal como se usan en el presente documento, los términos "transformación" y "transfección" pretenden hacer referencia a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico foráneo (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, incluyendo coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación.
Una célula huésped de la invención puede usarse para producir (es decir, expresar) una proteína 13245. En consecuencia, la invención proporciona además procedimientos para producir una proteína 13245 usando las células huésped de la invención. En una realización, el procedimiento incluye cultivar la célula huésped de la invención (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica para una proteína 13245) en un medio adecuado de tal modo que se produce una proteína 13245. En otra realización, el procedimiento incluye además aislar una proteína 13245 del medio o de la célula huésped.
En otro aspecto, la invención muestra, una célula o preparación purificada de células que incluye un transgén 13245, o que de otra manera expresa erróneamente 13245. La preparación celular puede consistir en células humanas o no humanas, por ejemplo, células de roedor, por ejemplo, células de ratón o de rata, células de conejo o células de cerdo. En realizaciones preferidas, la célula o células incluyen un transgén 13245, por ejemplo, una forma heteróloga de un 13245, por ejemplo, un gen derivado de humanos (en el caso de una célula no humana). El transgén 13245 puede expresarse erróneamente, por ejemplo, sobreexpresarse o subexpresarse. En otras realizaciones preferidas, la célula o células incluyen un gen que expresa erróneamente un 13245 endógeno, por ejemplo, un gen cuya expresión está alterada, por ejemplo, una desactivación. Tales células pueden servir como modelo para trastornos que están relacionados con alelos de 13245 expresados erróneamente o mutados o para su uso en la selección de fármacos.
En otro aspecto, la invención incluye, una célula humana, por ejemplo, una célula madre hematopoyética, transformada con ácido nucleico que codifica para un polipéptido 13245 objeto.
También se proporcionan células, preferiblemente células humanas, por ejemplo, células de fibroblasto o hematopoyéticas humanas, en las que un 13245 endógeno está bajo el control de una secuencia reguladora que no controla normalmente la expresión del gen 13245 endógeno. Las características de expresión de un gen endógeno dentro de una célula, por ejemplo, una línea celular o microorganismo, puede modificarse insertando un elemento regulador de ADN heterólogo en el genoma de la célula de tal modo que el elemento regulador insertado está unido operativamente al gen 13245 endógeno. Por ejemplo, un gen 13245 endógeno que es "transcripcionalmente silencioso", por ejemplo, no se expresa normalmente, o se expresa sólo a niveles muy bajos, puede activarse insertando un elemento regulador que puede promover la expresión de un producto génico expresado normalmente en esa célula. Pueden usarse técnicas tales como la recombinación homóloga seleccionada como diana para insertar el ADN heterólogo tal como se describe (por ejemplo, patentes de los EE.UU. número 5.272.071; PCT número de publicación WO 91/06667).
Animales transgénicos
La invención proporciona animales transgénicos no humanos. Tales animales son útiles para estudiar la función y/o actividad de una proteína 13245 y para identificar y/o evaluar moduladores de la actividad de 13245. Tal como se usa en el presente documento, un "animal transgénico" es un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un roedor tal como una rata o un ratón, en el que una o más de las células del animal incluye un transgén. Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, pollos, anfibios y similares. Un transgén es ADN exógeno o una transposición, por ejemplo una deleción de ADN cromosómico endógeno, que preferiblemente se integra dentro o se produce en el genoma de las células de un animal transgénico. Un transgén puede dirigir la expresión de un producto génico codificado en uno o más tipos de células o tejidos del animal transgénico, otros transgenes, por ejemplo uno noqueado, reducen la expresión. Por tanto, un animal transgénico puede ser uno en el que se ha alterado un gen 13245 endógeno, por ejemplo, mediante recombinación homóloga entre los genes endógenos y una molécula de ADN exógeno introducida en una célula del animal (por ejemplo, una célula embrionaria del animal, antes del desarrollo del animal).
También pueden incluirse las secuencias intrónicas y las señales de poliadenilación en el transgén para aumentar la eficacia de la expresión del transgén. Una(s) secuencia(s) reguladora(s) específica(s) de tejidos, puede unirse de manera operable a un transgén de la invención para dirigir la expresión de una proteína 13245 hacia las células particulares. Puede identificarse un animal fundador transgénico basándose en la presencia de un transgén 13245 en su genoma y/o la expresión de ARNm de 13245 en tejidos o células del animal. Entonces puede utilizarse un animal fundador transgénico para reproducir animales adicionales que porten el transgén. Además, los animales transgénicos que portan un transgén que codifica para una proteína 13245 pueden reproducirse además para obtener otros animales transgénicos que portan otros transgenes.
Las proteínas 13245 o los polipéptidos pueden expresarse en plantas o animales transgénicos, por ejemplo un ácido nucleico que codifica para una proteína o polipéptido puede introducirse dentro del genoma de un animal. En las realizaciones preferidas el ácido nucleico se coloca bajo el control de un promotor específico de tejido, por ejemplo, un promotor específico de huevos o leche, y se recupera a partir de la leche o huevos producidos por el animal. Los animales adecuados son ratones, cerdos, vacas, cabras y ovejas.
La invención también incluye una población de células a partir de un animal transgénico, tal como se trata, por ejemplo a continuación.
Usos
Las moléculas de ácido nucleico, proteínas, homólogos de proteínas, y anticuerpos descritos en el presente documento, pueden usarse en uno o más de los siguientes procedimientos: a) ensayos de selección; b) medicina predictiva (por ejemplo, ensayos de diagnóstico, ensayos de pronóstico, ensayos clínicos de monitorización, y farmacogenéticas); y c) procedimientos de tratamiento (por ejemplo, terapéutico y profiláctico). Las moléculas aisladas de ácido nucleico de la invención pueden usarse, por ejemplo, para expresar una proteína 13245 (por ejemplo, a través de un vector de expresión recombinante en una célula huésped en aplicaciones de terapia génica), para detectar un ARNm de 13245 (por ejemplo, en una muestra biológica), para detectar una alteración genética en un gen 13245 y para modular la actividad de 13245, tal como se describe más adelante. Las proteínas 13245 pueden usarse para tratar trastornos caracterizados por la producción excesiva o insuficiente de un sustrato de 13245 o la producción de inhibidores de 13245. Además, las proteínas 13245 pueden usarse para seleccionar los sustratos de 13245 que se producen de manera natural, para seleccionar fármacos o compuestos que modulan la actividad de 13245, así como para tratar trastornos caracterizados por una producción excesiva o insuficiente de proteína 13245 o la producción de formas de proteína 13245 que tienen actividad disminuida, aberrante o no deseada en comparación con la proteína 13245 de tipo natural. Los trastornos a modo de ejemplo incluyen aquellos en los que la fosforilación de proteínas es aberrante (por ejemplo, distrofias miotónicas y musculares). Además, los anticuerpos anti-13245 de la invención pueden usarse para detectar y aislar proteínas 13245, regular la biodisponibilidad de las proteínas 13245, y modular la actividad de 13245.
Se proporciona un procedimiento de evaluación de un compuesto para determinar la capacidad de interaccionar con, por ejemplo, unirse a, un polipéptido 13245 de un sujeto. Los procedimientos incluyen: poner en contacto el compuesto con el polipéptido 13245 de un sujeto; y evaluar la capacidad del compuesto de interaccionar con, por ejemplo, unirse a o formar un complejo con, el polipéptido 13245 de un sujeto. Este procedimiento puede realizarse in vitro, por ejemplo, en un sistema libre de células, o in vivo, por ejemplo en un ensayo trampa de interacción de dos híbridos. Este procedimiento puede usarse para identificar moléculas que se producen de manera natural que interaccionan con un polipéptido 13245 de un sujeto. También puede usarse para encontrar inhibidores naturales o sintéticos de un polipéptido 13245 de un sujeto. Los procedimientos de selección se tratan en más detalle a continuación.
Ensayos de selección
La invención proporciona procedimientos de selección (también denominados en lo sucesivo en el presente documento como "ensayos") para identificar moduladores, es decir agentes o compuestos candidatos o de prueba (por ejemplo, proteínas, péptidos, miméticos de péptidos, peptoides, moléculas pequeñas u otros fármacos), que unidos con las proteínas 13245, tienen un efecto estimulador o inhibidor sobre, por ejemplo, la expresión de 13245 o la actividad de 13245, o tienen un efecto estimulador o inhibidor sobre, por ejemplo, la expresión o actividad de un sustrato de 13245. Los compuestos así identificados pueden usarse para modular la actividad de productos génicos dianas (por ejemplo genes 13245) en un protocolo terapéutico, para elaborar la función biológica del producto génico diana, o para identificar compuestos que interrumpen las interacciones del gen diana.
En una realización, la invención proporciona ensayos para seleccionar compuestos candidatos o de prueba que son sustratos de una proteína o polipéptido 13245 o una parte biológicamente activa de la misma. En otra realización, la invención proporciona ensayos para seleccionar compuestos candidatos o de prueba que se unen a o modulan la actividad de una proteína o polipéptido 13245 o una parte biológicamente activa de la misma.
Los compuestos de prueba de la presente invención pueden obtenerse utilizando cualquiera de los numerosos enfoques en los procedimientos de bibliotecas combinatorias conocidos en la técnica, que incluyen: bibliotecas biológicas; bibliotecas de peptoides (bibliotecas de moléculas que tienen las funcionalidades de péptidos, pero con un esqueleto no peptídico novedoso que son resistentes a la degradación enzimática, pero que sin embargo siguen siendo bioactivas; por ejemplo, Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678-2685); bibliotecas en fase de disolución o en fase sólida paralela espacialmente direccionables; procedimientos de bibliotecas sintéticas que requieren deconvolución; el procedimiento de bibliotecas de "una perla, un compuesto"; y los procedimientos de bibliotecas sintéticas que utilizan la selección por cromatografía de afinidad. Los enfoques de la biblioteca biológica y la biblioteca de peptoides se limitan a las bibliotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques pueden aplicarse a bibliotecas de compuestos de péptidos, oligómeros no peptídidos o moléculas pequeñas (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145).
Se han descrito ejemplos de procedimientos para la síntesis de bibliotecas moleculares (por ejemplo, DeWitt et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al., 1993, Science 261:1303; Carrell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Careil et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; y Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37:1233).
Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse en disolución (por ejemplo, Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421), o en perlas (Lam, 1991, Nature 354:82-84), chips (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), bacterias (patente de los EE.UU. número 5.223.409), esporas (patente de los EE.UU. número 5.223.409), plásmidos (Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869), o en fagos (Scott et al., 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; patente de los EE.UU. número 5.223.409).
En una realización, un ensayo es un ensayo basado en células en el que una célula que expresa una proteína 13245 o parte biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de prueba, se determina la capacidad del compuesto de prueba de modular la actividad de 13245. La determinación de la capacidad del compuesto de prueba de modular la actividad de 13245 puede realizarse monitorizando, por ejemplo, los cambios en la actividad enzimática. La célula, por ejemplo, puede ser de origen mamífero.
También puede evaluarse la capacidad del compuesto de prueba de modular la unión de 13245 a un compuesto, por ejemplo un sustrato de 13245, o de unirse a 13245. Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante acoplamiento del compuesto, por ejemplo, el sustrato, con un radioisótopo o etiqueta enzimática de tal modo que la unión del compuesto, por ejemplo el sustrato, a 13245 puede determinarse detectando el compuesto marcado, por ejemplo, sustrato, en un complejo. Alternativamente, 13245 puede acoplarse con un radioisótopo o etiqueta enzimática para monitorizar la capacidad del compuesto de prueba de modular la unión de 13245 a un sustrato de 13245 en un complejo. Por ejemplo, los compuestos (por ejemplo, sustratos de 13245) pueden marcarse con ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C, o ^{3}H, o bien directa o bien indirectamente, y el radioisótopo se detecta mediante recuento directo de radioemisión o mediante recuento de centelleo. Alternativamente, los compuestos pueden marcarse enzimáticamente con, por ejemplo, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, o luciferasa, y la etiqueta enzimática se detecta mediante la determinación de conversión de un sustrato apropiado para el producto.
Puede evaluarse la capacidad de un compuesto (por ejemplo, un sustrato de 13245) de interaccionar con 13245 con o sin la marcación de cualquiera de los compuestos que interaccionan. Por ejemplo, puede usarse un microfisiómetro para detectar la interacción de un compuesto con 13245 sin la marcación del compuesto ni de 13245 (McConnell et al., 1992, Science 257:1906-1912). Tal como se usa en el presente documento, un "microfisiómetro" (por ejemplo, Cytosensor) es un instrumento analítico que mide la tasa a la que una célula acidifica su medio usando un sensor potenciométrico direccionable con la luz (LAPS). Pueden usarse los cambios en esta tasa de acidificación como un indicador de la interacción entre un compuesto y 13245.
En todavía otra realización, se proporciona un ensayo libre de células en el que una proteína 13245 o parte biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de prueba y se evalúa la capacidad del compuesto de prueba de unirse a la proteína 13245 o parte biológicamente activa de la misma. Las partes biológicamente activas preferidas de las proteínas 13245 que van a usarse en los ensayos de la presente invención, incluyen fragmentos que participan en las interacciones con moléculas que no son 13245, por ejemplo fragmentos con altas puntaciones de probabilidad superficial.
Las formas solubles y/o unidas a la membrana de las proteínas aisladas (por ejemplo, proteínas 13245 o partes biológicamente activas de las mismas) pueden usarse en los ensayos libres de células de la invención. Cuándo se usan las formas unidas a la membrana de la proteína, puede ser deseable utilizar un agente de solubilización. Ejemplos de tales agentes de solubilización incluyen detergentes no iónicos tales como n-octilglucósido, n-dodecilglucósido, n-dodecilmaltósido, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, Triton® X-100, Triton® X-114, Thesit®, isotridecipoli(etilenglicol éter)n, sulfonato de 3-{(3-colamidopropil)dimetilamino}-1-propano (CHAPS), sulfonato de 3-{(3-colamidopropil)dimetilamino}-2-hidroxi-1-propano (CHAPSO), o sulfonato de N-dodecil-N, N-dimetil-3-amonio-1-propano.
Los ensayos libres de células implican preparar una mezcla de reacción de la proteína génica diana y el compuesto de prueba en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que los dos componentes interaccionen y se unan, formando así un complejo que puede eliminarse y/o detectarse.
También puede detectarse la interacción entre dos moléculas, por ejemplo, usando la transferencia de energía de fluorescencia (FET; por ejemplo la patente de los EE.UU. número 5.631.169; la patente de los EE.UU. número 4.868.103). Una etiqueta de fluoróforo se selecciona de tal modo que una primera energía de fluorescencia emitida por una molécula donadora se absorberá mediante una etiqueta fluorescente sobre una segunda molécula "aceptora" que a su vez puede fluorescer debido a la energía absorbida. Alternativamente, la molécula de proteína "donadora" puede utilizar simplemente la energía de fluorescencia natural de los residuos de triptófano. Las etiquetas se seleccionan para que emitan diferentes longitudes de onda de luz, de tal modo que la etiqueta de la molécula "aceptora" puede diferenciarse de la de la "donadora". Puesto que la eficacia de la transferencia de energía entre las etiquetas se relaciona con la distancia de separación de las moléculas, puede evaluarse la relación espacial entre las moléculas. En una situación en la que se produce la unión entre las moléculas, la emisión de fluorescencia de la etiqueta de la molécula "aceptora" en el ensayo debe ser máxima. Un acontecimiento de unión puede medirse por FET de manera conveniente a través de los medios de detección fluorimétricos habituales bien conocidos en la técnica (por ejemplo, utilizando un fluorímetro).
En otra realización, la determinación de la capacidad de la proteína 13245 de unirse a la molécula diana puede realizarse usando un análisis de interacción biomolecular en tiempo real (BIA "biomolecular interaction analysis"; por ejemplo, Sjolander et al., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345; Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). La "resonancia de plasmón superificial" (SPR, "Surface plasmon resonance") o "BIA" detecta interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los compuestos que interaccionan (por ejemplo, BIAcore). Los cambios en la masa en la superficie de unión (indicativos de un acontecimiento de unión) da como resultado alteraciones del índice de refracción de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de SPR), dando como resultado una señal que puede detectarse que puede usarse como una indicación de las reacciones en tiempo real entre moléculas
biológicas.
En una realización, el producto génico diana o la sustancia de prueba se ancla en una fase sólida. Los complejos de producto génico diana/compuesto de prueba anclados en la fase sólida pueden detectarse al final de la reacción. Preferiblemente, el producto génico diana puede anclarse en una superficie sólida, y el compuesto de prueba, (que no está anclado), puede marcarse, o bien directa o bien indirectamente, con etiquetas que pueden detectarse tratadas en el presente documento.
Puede ser deseable inmovilizar o bien 13245, un anticuerpo anti-13245 o bien su molécula diana para facilitar la separación de las formas complejadas de las no complejadas de una o ambas proteínas, así como para adaptar la automatización del ensayo. La unión de un compuesto de prueba a una proteína 13245, o interacción de una proteína 13245 con una molécula diana en presencia y ausencia de un compuesto candidato, puede realizarse en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo y tubos de microcentrífuga. En una realización, puede proporcionarse una proteína de fusión que añade un dominio que permite que una o ambas proteínas se unan a una matriz. Por ejemplo, las proteínas de fusión 13245/glutatión-S-transferasa o proteínas de fusión diana/glutatión-S-transferasa pueden adsorberse en perlas de glutatión Sepharose^{TM} (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación derivadas de glutatión, que se combinan después con el compuesto de prueba o el compuesto de prueba y o bien la proteína diana no adsorbida o bien la proteína 13245, y se incuba la mezcla en condiciones que conducen a la formación de complejo (por ejemplo, en condiciones fisiológicas de sal y pH). Tras la incubación, las perlas o pocillos de la placa de microtitulación se lavan para eliminar cualquier compuesto no unido, se inmoviliza la matriz en el caso de las perlas, se determina el complejo o bien directa o bien indirectamente, por ejemplo, tal como se describió anteriormente. Alternativamente, los complejos pueden disociarse de la matriz, y determinarse el nivel de unión o actividad de 13245, usando técnicas habituales.
Otras técnicas para inmovilizar o bien una proteína 13245 o bien una molécula diana sobre matrices, incluyen el uso de conjugación de biotina y estreptavidina. Las moléculas diana o la proteína 13245 biotiniladas pueden prepararse a partir de biotin-N-hidroxisuccinimida usando técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL), y se inmovilizan en los pocillos de las placas de 96 pocillos recubiertos con estreptavidina (Pierce Chemical).
Con el fin de llevar a cabo el ensayo, se añade el componente no inmovilizado a la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Tras completarse la reacción, se eliminan los componentes que no han reaccionado (por ejemplo, mediante lavado) en condiciones tales que cualquiera de los complejos formados siga estando inmovilizado sobre la superficie sólida. La detección de complejos anclados sobre la superficie sólida puede realizarse de diversas maneras. Si el componente previamente no inmovilizado se marca previamente, la detección de la etiqueta inmovilizada sobre la superficie indica que se formaron los complejos. Si el componente previamente no inmovilizado no se marca previamente, puede usarse una etiqueta indirecta para detectar complejos anclados sobre la superficie; por ejemplo, usando un anticuerpo marcado específico frente al componente inmovilizado (el anticuerpo, a su vez, puede marcarse directamente o marcarse indirectamente con por ejemplo, un anticuerpo anti-Ig marcado).
En una realización, este ensayo se realiza utilizando anticuerpos reactivos con la proteína 13245 o las moléculas diana, pero que no interfiere con la unión de la proteína 13245 a su molécula diana. Tales anticuerpos pueden derivarse a los pocillos de la placa y atraparse la proteína 13245 o diana no unida, en los pocillos mediante la conjugación con anticuerpos. Los procedimientos para detectar tales complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados con GST, incluyen la inmunodetección de complejos usando anticuerpos reactivos con la proteína 13245 o la molécula diana, así como ensayos de unión a enzimas que se basan en detectar una actividad enzimática asociada con la proteína 13245 o la molécula diana.
Alternativamente, los ensayos libres de células pueden llevarse a cabo en una fase líquida. En un ensayo de este tipo, los productos de reacción se separan de los componentes que no han reaccionado, mediante cualquiera de las diversas técnicas habituales, incluyendo, pero no se limita a: centrifugación diferencial (por ejemplo, Rivas et al., 1993, Trends Biochem. Sci. 18:284-287); cromatografía (por ejemplo, cromatografía de filtración en gel o cromatografía de intercambio iónico); electroforesis (por ejemplo, Ausubel et al., eds., 1999, Current Protocolsin Molecular Biology, J. Wiley, Nueva York); e inmunoprecipitación (por ejemplo, Ausubel, anteriormente). Tales resinas y técnicas cromatográficas se conocen bien por un experto en la técnica (por ejemplo, Heegaard, 1998, J. Mol. Recognit. 11:141-148; Hage et al., 1997, J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 699:499-525). Además, la transferencia de energía de fluorescencia también puede utilizarse de manera conveniente, tal como se describe en el presente documento, para detectar la unión sin la purificación adicional del complejo de la disolución.
En una realización preferida, el ensayo incluye poner en contacto la proteína 13245 o una parte biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une a 13245 para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de prueba, y determinar la capacidad del compuesto de prueba de interaccionar con una proteína 13245, en el que la determinación de la capacidad del compuesto de prueba de interaccionar con una proteína 13245 incluye determinar la capacidad del compuesto de prueba para unirse de manera preferente a 13245 o a una parte biológicamente activa de la misma, o para modular la actividad de una molécula diana, en comparación con el compuesto conocido.
Los productos génicos diana de la invención pueden interaccionar, in vivo, con una o más macromoléculas celulares o extracelulares, tales como proteínas. Para los fines de este estudio, tales macromoléculas celulares y extracelulares se denominan en lo sucesivo en el presente documento como "parejas de unión". Los compuestos que interrumpen tales interacciones pueden ser útiles en la regulación de la actividad del producto génico diana. Tales compuestos pueden incluir, pero no se limitan a moléculas tales como anticuerpos, péptidos y moléculas pequeñas. Los productos/genes diana preferidos para su uso en esta realización son los genes 13245 identificados en el presente documento. En una realización alternativa, la invención proporciona procedimientos para determinar la capacidad del compuesto de prueba de modular la actividad de una proteína 13245 a través de la modulación de la actividad de un efector en el sentido de 3' de una molécula diana de 13245. Por ejemplo, puede determinarse la actividad de la molécula efectora en una diana apropiada, o puede determinarse la unión del efector a una diana apropiada, tal como se describió anteriormente.
Para identificar a los compuestos que interfieren con la interacción entre el producto génico diana y su(s) pareja(s) de unión celular o extracelular, se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto génico diana y la pareja de unión, en condiciones y durante un tiempo suficiente, para permitir que los dos productos formen un complejo. Con el fin de probar un agente inhibidor, se proporciona la mezcla de reacción en presencia y ausencia del compuesto de prueba. El compuesto de prueba puede incluirse inicialmente en la mezcla de reacción, o puede añadirse en un momento posterior a la adición del gen diana y su pareja de unión celular o extracelular. Las mezclas de reacción control se incuban sin el compuesto de prueba o con un placebo. Entonces se detecta la formación de cualquiera de los complejos entre el producto génico diana y la pareja de unión celular o extracelular. La formación de un complejo en la reacción control, pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba, indica que el compuesto interfiere con la interacción del producto génico diana y la pareja de unión interactiva. Adicionalmente, la formación de complejos dentro de las mezclas de reacción que contienen el compuesto de prueba y el producto génico diana normal, también pueden compararse con la formación de complejos dentro de las mezclas de reacción que contienen el compuesto de prueba y producto génico diana mutante. Esta comparación puede ser importante en los casos en los que se desea identificar los compuestos que interrumpen las interacciones de los productos génicos diana mutantes pero no los normales.
Estos ensayos pueden llevarse a cabo en un formato heterogéneo u homogéneo. Los ensayos heterogéneos implican anclar o bien el producto génico diana o bien la pareja de unión sobre una fase sólida, y detectar complejos anclados sobre la fase sólida al final de la reacción. En los ensayos homogéneos, se lleva a cabo la reacción completa en una fase líquida. En cualquier enfoque, el orden de adición de los reactivos puede variar para obtener información diferente sobre los compuestos que se someten a prueba. Por ejemplo, los compuestos de prueba que interfieren con la interacción entre los productos génicos diana y las parejas de unión, por ejemplo, mediante competencia, pueden identificarse llevando a cabo la reacción en presencia de la sustancia de prueba. Alternativamente, los compuestos de prueba que interrumpen que se formen previamente los complejos, por ejemplo los compuestos con constantes de unión superiores, que desplazan uno de los componentes del complejo, pueden someterse a prueba añadiendo el compuesto de prueba a la mezcla de reacción después de que se hayan formado los complejos. Los diversos formatos se describen brevemente a continuación.
En un sistema de ensayo heterogéneo, o bien el producto génico diana o bien la pareja de unión celular o extracelular, se ancla sobre una superficie sólida (por ejemplo, una placa de microtitulación), mientras que se marcan las especies que no ancladas, o bien directa o bien indirectamente. Las especies ancladas pueden inmovilizarse mediante uniones covalentes o no covalentes. Alternativamente, puede usarse un anticuerpo inmovilizado específico contra las especies que van a anclarse, para anclar las especies a la superficie sólida.
Con el fin de llevar a cabo el ensayo, se expone la pareja de las especies inmovilizadas a la superficie recubierta con o sin el compuesto de prueba. Tras completarse la reacción se eliminan los componentes que no han reaccionado (por ejemplo, mediante lavado) y cualquier complejo formado seguirá estando inmovilizado sobre la superficie sólida. Si las especies no inmovilizadas se marcan previamente, la detección de la etiqueta inmovilizada sobre la superficie sólida indica que se formaron los complejos, Si las especies no inmovilizadas no se marcan previamente, puede usarse una etiqueta indirecta para detectar los complejos anclados sobre la superficie; por ejemplo, usando un anticuerpo marcado específico contra las especies no inmovilizadas inicialmente (el anticuerpo, a su vez, puede marcarse directamente o marcarse indirectamente con, por ejemplo un anticuerpo anti-lg marcado). Dependiendo del orden de adición de los componentes de reacción, pueden detectarse los compuestos de prueba que inhiben la formación de complejos o que interrumpen que se formen previamente los complejos.
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Alternativamente, la reacción puede llevarse a cabo en una fase líquida en presencia o ausencia del compuesto de prueba, se separan los productos de reacción de los componentes que no han reaccionado, y se detectan los complejos; por ejemplo usando un anticuerpo inmovilizado específico contra uno de los componentes de unión, para anclar cualquiera de los complejos formados en la disolución, y un anticuerpo marcado específico contra la otra pareja, para detectar los complejos anclados. Otra vez, dependiendo del orden de adición de los reactivos a la fase líquida, pueden identificarse los compuestos de prueba que inhiben al complejo o que interrumpen que se formen previamente los complejos.
En una realización alternativa de la invención, puede usarse un ensayo homogéneo. Por ejemplo, se prepara un complejo que se forma previamente del producto génico diana y la pareja de unión celular o extracelular interactiva, en el que están marcados o bien los productos génicos diana o bien sus parejas de unión, pero se extingue la señal generada por la etiqueta debido a la formación de complejos (por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 4.109.496 que utiliza este enfoque para los inmunoensayos). La adición de una sustancia de prueba que compite con y desplaza una de las especies del complejo que se forma previamente, dará como resultado la generación de una señal por encima del fondo. De esta manera, pueden identificarse las sustancias de prueba que interrumpen la interacción de producto génico diana - pareja de unión.
En todavía otro aspecto, pueden usarse las proteínas 13245 como "proteínas cebo" en un ensayo de dos híbridos o ensayo de tres híbridos (por ejemplo, patente de los EE.UU. número 5.283.317; Zervos et al., 1993, Cell 72:223-232; Madura et al., 1993, J. Biol. Chem.268:12046-12054; Bartel et al., 1993, Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al., 1993, Oncogene 8:1693-1696; la publicación PCT número WO 94/10300), para identificar otras proteínas, que se unen a o interaccionan con 13245 ("proteínas de unión a 13245" o "pu-13245") y están implicadas en la actividad de 13245. Tales pu-13245 pueden ser activadores o inhibidores de señales mediante las proteínas 13245 o dianas 13245 como, por ejemplo, elementos en el sentido 3' de una ruta de señalización mediada por 13245.
El sistema de dos híbridos se basa en la naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción, que se constituyen por dominios de activación y de unión a ADN que puede separase. En resumen, el ensayo utiliza dos constructos de ADN diferentes. En un constructo, el gen que codifica para una proteína 13245 se une a un gen que codifica para el dominio de unión a ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En el otro constructo, una secuencia de ADN, de una biblioteca de secuencias de ADN, que codifica para una proteína no identificada ("presa" o "muestra") se une a un gen que codifica para el dominio de activación del factor de transcripción conocido. (Alternativamente, la proteína 13245 puede unirse al dominio activador). Si las proteínas "cebo" y "presa" pueden interaccionar in vivo, formando un complejo dependiente de 13245, los dominios de activación y de unión a ADN del factor de transcripción se llevan a proximidad cercana. Esta proximidad permite la transcripción de un gen indicador (por ejemplo, LacZ) que se une de manera operable a un sitio de regulación transcripcional sensible al factor de transcripción. Puede detectarse la expresión del gen indicador y pueden aislarse las colonias celulares que contienen el factor transcripcional funcional y usarse para obtener el gen clonado que codifica para la proteína que interacciona con la proteína 13245.
En otra realización, se identifican los moduladores de la expresión de 13245. Por ejemplo, una célula o una mezcla libre de células se pone en contacto con un compuesto candidato y se evalúa la expresión de proteína o ARNm de 13245 en relación con el nivel de expresión de proteína o ARNm de 13245 en ausencia del compuesto candidato. Cuando la expresión de proteína o ARNm de 13245 es mayor en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, se identifica el compuesto candidato como un estimulador de la expresión de proteína o ARNm de 13245. Alternativamente, cuando la expresión de proteína o ARNm de 13245 es menor (es decir, menor de manera estadísticamente significativa) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, se identifica el compuesto candidato como un inhibidor de la expresión de proteína o ARNm de 13245. Puede determinarse el nivel de expresión de proteína o ARNm de 13245 mediante procedimientos descritos en el presente documento para detectar proteína o ARNm de 13245.
En otro aspecto, la invención está relacionada con una combinación de dos o más de los ensayos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede identificarse un agente de modulación usando un ensayo libre de células o basado en células, y puede confirmarse la capacidad del agente de modular la actividad de una proteína 13245, in vivo, por ejemplo, en un animal tal como un modelo animal de una enfermedad.
Esta invención además está relacionada con agentes novedosos identificados mediante los ensayos de selección descritos anteriormente. En consecuencia, está dentro del alcance de esta invención usar además un agente identificado tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, un agente de modulación de 13245, una molécula de ácido nucleico de 13245 antisentido, un anticuerpo específico contra 13245, o una pareja de unión a 13245) en un modelo animal apropiado para determinar la eficacia, la toxicidad, los efectos secundarios, o mecanismo de acción, del tratamiento con un agente de este tipo. Además, pueden usarse los agentes novedosos identificados mediante los ensayos de selección descritos anteriormente, para los tratamientos tal como se describe en el presente documento.
Ensayos de detección
Pueden usarse las partes o fragmentos de las secuencias de ácido nucleico identificadas en el presente documento, como reactivos de polinucleótidos. Por ejemplo, estas secuencias pueden usarse para: (i) mapear sus respectivos genes en un cromosoma, por ejemplo, para localizar regiones génicas asociadas con enfermedades genéticas o para asociar 13245 con una enfermedad; (ii) identificar un individuo a partir de una muestra biológica mínima (tipificación tisular); y (iii) ayudar en la identificación forense de una muestra biológica. Estas aplicaciones se describen en las secciones posteriores a continuación.
Mapeo cromosómico
Las secuencias de nucleótidos de 13245 o partes de las mismas pueden usarse para mapear la localización de los genes 13245 en un cromosoma. Este proceso se denomina mapeo cromosómico. El mapeo cromosómico es útil para la correlación de las secuencias de 13245 con genes asociados con la enfermedad.
En resumen, los genes 13245 pueden mapearse para determinar cromosomas preparando cebadores para PCR (preferiblemente de 15-25 pares de base de longitud) a partir de la secuencia de nucleótidos de 13245 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3). Estos cebadores pueden usarse para la selección por PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Sólo los híbridos que contienen el gen humano correspondiente a las secuencias de 13245 darán un fragmento amplificado.
Un panel de híbridos de células somáticas en las que cada línea celular contiene o bien un único cromosoma humano o bien un número pequeño de cromosomas humanos, y un conjunto completo de cromosomas de ratón, puede permitir el mapeo fácil de genes individuales para determinar cromosomas humanos específicos (D'Eustachio et al., 1983, Science 220:919-924).
Otras estrategias de mapeo, por ejemplo la hibridación in situ tal como se describe (Fan et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:6223-6227), la selección previa con cromosomas clasificados por citometría de flujo, marcados, y selección previa mediante hibridación para determinar bibliotecas de ADNc específicas cromosómicas, pueden usarse para mapear 13245 para determinar una ubicación cromosómica.
Puede usarse además la hibridación in situ por fluorescencia (FISH fluorescence in situ hybridization) de una secuencia de ADN para determinar una extensión cromosómica de metafase, para proporcionar una ubicación cromosómica precisa en una etapa. La técnica FISH puede usarse con una secuencia de ADN tan corta como 500 ó 600 bases. Sin embargo, clones más grandes de 1.000 bases tienen una probabilidad superior de unirse a una única posición cromosómica con suficiente intensidad de señal para la detección simple. Preferiblemente, será suficiente 1.000 bases, y más preferiblemente 2.000 bases, para obtener buenos resultados en una cantidad de tiempo razonable. Para una revisión de FISH, véase Verma et al. (1988, Human Chromosomes: A Manual de Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York).
Pueden usarse individualmente reactivos para el mapeo cromosómico para marcar un único cromosoma o un único sitio en ese cromosoma, o pueden usarse paneles de reactivos para marcar múltiples sitios y/o múltiples cromosomas. Normalmente se prefieren los reactivos correspondientes a las regiones no codificantes de los genes para los fines de mapeo. Las secuencias codificantes van a conservarse más probablemente dentro de las familias génicas, aumentando así la posibilidad de dar hibridaciones cruzadas durante el mapeo cromosómico.
Una vez que se ha mapeado una secuencia para determinar una ubicación cromosómica precisa, puede correlacionarse la posición física de la secuencia en el cromosoma con los datos del mapa genético (tales datos se encuentran por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, disponible en línea por Johns Hopkins University Welch Medical Library). Entonces puede identificarse la relación entre una gen y una enfermedad, mapeado para determinar la misma región cromosómica, a través de análisis de unión (herencia conjunta de genes físicamente adyacentes), tal como se describe (por ejemplo, Egeland et al., 1987, Nature, 325:783-787).
Además, pueden determinarse las diferencias en las secuencias de ADN entre individuos afectados y no afectados con una enfermedad asociada con el gen 13245. Si una mutación se observa en alguno o todos los individuos afectados pero no en ninguno de los individuos no afectados, entonces la mutación va a ser probablemente el agente causante de la enfermedad particular. La comparación de los individuos afectados y no afectados implica en primer lugar buscar alteraciones estructurales en los cromosomas, tales como deleciones o translocaciones que pueden verse a partir de las extensiones cromosómicas o detectarse usando PCR basada en esa secuencia de ADN. Por último, puede realizarse la secuenciación completa de genes a partir de varios individuos, para confirmar la presencia de una mutación y para distinguir mutaciones de polimorfismos.
Tipificación tisular
La secuencias de 13245 pueden usarse para identificar individuos a partir de muestras biológicas usando, por ejemplo polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP, restriction fragment length polimorphism). En esta técnica se digiere ADN genómico de un individuo con una o más enzimas de restricción, se separan los fragmentos, por ejemplo en una inmunotransferencia de tipo Southern, y se sondean para dar bandas de identificación. Las secuencias de la presente invención son útiles como marcadores de ADN adicionales para RFLP (descrito en la patente de los EE.UU. número 5.272.057).
Además, las secuencias de la presente invención pueden usarse también para determinar la secuencia de ADN base por base real de partes seleccionadas de un genoma de un individuo. Por tanto, la secuencia de nucleótidos de 13245 descrita en el presente documento puede usarse para preparar cebadores para PCR homólogos a los extremos 5' y 3' de la secuencia. Estos cebadores pueden usarse entonces para amplificar ADN de un individuo y posteriormente secuenciarlo. Los paneles de secuencias de ADN correspondientes de individuos, preparados de esta manera, pueden proporcionar identificaciones de individuos únicas, así como cada individuo tendrá un único conjunto de tales secuencias de ADN debido a diferencias alélicas.
La variación alélica se produce en algún grado en las regiones codificantes de estas secuencias, y en un grado superior en las regiones no codificantes. Cada una de las secuencias descritas en el presente documento, pueden usarse, en algún grado, como un patrón frente al que puede comparase ADN de un individuo para fines de identificación. Debido a que se producen grandes números de polimorfismos en las regiones no codificantes, son necesarias menos secuencias para diferenciar individuos. Las secuencias no codificantes de SEQ ID NO: 1 pueden proporcionar una identificación de individuos positiva con un panel de quizás 10 a 1.000 cebadores que cada uno da una secuencia amplificada no codificante de 100 bases. Si se usan las secuencias codificantes predichas, tales como las de SEQ ID NO: 3, un número más apropiado de cebadores para la identificación de individuos positiva sería 500-2.000.
Si un panel de reactivos de las secuencias de nucleótidos de 13245 descritas en el presente documento, se usa para generar una base de datos de identificación única para un individuo, pueden usarse más tarde los mismos reactivos para identificar tejidos de ese individuo. Usando la base de datos de identificación única, puede realizarse la identificación positiva, de vida o muerte, a partir de muestras titulares extremadamente pequeñas.
Uso de secuencias de 13245 parciales en biología forense.
También pueden usarse las técnicas de identificación basada en ADN en biología forense. Para realizar una identificación de este tipo, puede usarse la tecnología de PCR para amplificar secuencias de ADN tomadas de muestras biológicas muy pequeñas tales como tejidos, por ejemplo, pelo o piel, o fluidos corporales, por ejemplo, por ejemplo, sangre, saliva o semen encontrados en la escena del crimen. Entonces puede comparase la secuencia amplificada con un patrón, permitiendo así la identificación del origen de las muestra biológica.
Las secuencias de la presente invención pueden usarse para proporcionar reactivos de polinucleótidos, por ejemplo cebadores para PCR, marcados para determinar loci específicos en el genoma humano, que puede mejorar la fiabilidad de las identificaciones forenses basadas en ADN proporcionando, por ejemplo, otro "marcador de identificación" (es decir, otra secuencia de ADN que es única para un individuo particular). Tal como se mencionó anteriormente, la información de la secuencia de nucleótidos real puede usarse para la identificación como una alternativa exacta a patrones que se forman mediante fragmentos generados por enzimas de restricción. Las secuencias marcadas para determinar regiones no codificantes de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, fragmentos que tienen una longitud de al menos 20 residuos de nucleótidos, preferiblemente al menos 30 residuos de nucleótidos) son particularmente apropiadas para este uso.
Las secuencias de nucleótidos de 13245 descritas en el presente documento pueden usarse además para proporcionar reactivos de polinucleótidos, por ejemplo, sondas marcadas o que pueden marcarse, que pueden usarse en, por ejemplo, en la técnica de hibridación in situ, para identificar un tejido específico, por ejemplo un tejido que contienen células hematopoyéticas. Esto puede ser muy útil en casos en los que se presenta un patólogo forense con un tejido de origen desconocido, Los paneles de tales sondas de 13245 pueden usarse para identificar tejido por especies y/o por tipo de órgano.
De modo similar, estos reactivos, por ejemplo pueden usarse sondas o cebadores de 13245 para examinar la contaminación de cultivos titulares (es decir, examinar la presencia de una mezcla de diferentes tipos de células en un cultivo).
Medicina predictiva
La presente invención también está relacionada con el campo de la medicina predictiva en la que se usan ensayos de diagnóstico, ensayos de pronóstico y ensayos clínicos de monitorización para fines de pronóstico (predictivos) para tratar así a un individuo.
Generalmente, la invención proporciona un procedimiento de determinación si un sujeto está en riesgo de padecer un trastorno relacionado con una lesión en, o la expresión errónea de, un gen que codifica para polipéptido 13245.
Tales trastornos incluye, por ejemplo, un trastorno asociado con la expresión errónea de un polipéptido 13245, por ejemplo un trastorno inmunitario o un trastorno neoplásico.
El procedimiento incluye uno o más de lo siguiente:
(i) detectar, en un tejido del sujeto, la presencia o ausencia de una mutación que afecta a la expresión del gen 13245, o detectar la presencia o ausencia de una mutación en una región que controla la expresión del gen, por ejemplo, una mutación en la región de control en 5';
(ii) detectar, en un tejido del sujeto, la presencia o ausencia de una mutación que altera la estructura del gen 13245;
(iii) detectar, en un tejido del sujeto, la expresión errónea del gen 13245 en el nivel de ARNm, por ejemplo detectar un nivel de tipo no natural de un ARNm; y
(iv) detectar, en un tejido del sujeto, la expresión errónea del gen en el nivel de proteínas, por ejemplo, detectar un nivel de tipo no natural de un polipéptido 13245.
En realizaciones preferidas el procedimiento incluye: determinar la existencia de al menos una de: una deleción de uno o más nucleótidos del gen 13245; una inserción de uno o más nucleótidos en el gen, una mutación puntual, por ejemplo, una sustitución de uno o más nucleótidos del gen, una transposición cromosómica visible del gen, por ejemplo una translocación, inversión o deleción.
Por ejemplo, la detección de la lesión genética puede incluir: (i) proporcionar una sonda/cebador que incluye un oligonucleótido que contiene una región de la secuencia de nucleótidos que híbrida con una secuencia sentido o antisentido de SEQ ID NO: 1, o mutantes que se producen naturalmente de los mismos, o secuencias flanqueantes en 5' o 3' asociadas naturalmente con el gen 13245; (ii) exponer la sonda/cebador al ácido nucleico del tejido; y detectar la presencia o ausencia de la lesión genética mediante hibridación de la sonda/cebador del ácido nucleico, por ejemplo, mediante hibridación in situ.
En realizaciones preferidas, la detección de la expresión errónea incluye determinar la existencia de al menos uno de. Una alteración en el nivel de un transcrito de ARN mensajero del gen 13245; la presencia de un patrón de corte y empalme de tipo no natural de un trascrito de ARN mensajero del gen; o un nivel de tipo no natural de proteína o ARN de 13245.
Los procedimientos de la invención pueden usarse para la selección prenatal o para determinar si un vástago del sujeto estará en riesgo de padecer un trastorno.
En realizaciones preferidas, el procedimiento incluye determinar la estructura de un gen 13245, siendo una estructura aberrante indicativa del riesgo de padecer el trastorno.
En realizaciones preferidas, el procedimiento incluye poner en contacto una muestra del sujeto con un anticuerpo contra la proteína 13245 o un ácido nucleico, que se híbrida específicamente con el gen. Estas y otras realizaciones se tratan a continuación.
Ensayos de diagnóstico y pronóstico
La presencia, nivel o ausencia de la proteína ácido nucleico de 13245 en una muestra biológica, puede evaluarse obteniendo una muestra biológica de un sujeto de prueba y poniendo en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente que puede detectar la proteína ácido nucleico de 13245 (por ejemplo ARNm, ADN genómico) que codifica para la proteína 13245 de tal modo que la presencia de la proteína ácido nucleico de 13245 se detecta en la muestra biológica. El término "muestra biológica" incluye tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto. Una muestra biológica preferida es suero. El nivel de expresión del gen 13245 puede medirse de diversas maneras, incluyendo, pero no se limita a: medir el ARNm codificado por los genes 13245; medir la cantidad de proteína codificada por los genes 13245; o medir la actividad de la proteína codificada por los genes 13245.
El nivel de ARNm que corresponde al gen 13245 en una célula puede determinarse tanto mediante formatos in situ como in vitro.
El ARNm aislado puede usarse en ensayos de hibridación o amplificación que incluyen, pero no se limitan a, análisis de inmunotransferencia de tipo Southern o Northern, análisis de reacción en cadena de la polimerasa y ensayos de sonda. Un procedimiento de diagnóstico preferido para la detección de niveles de ARNm implica poner en contacto el ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que puede hibridarse con el ARNm codificado por el gen que se está detectando. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico de 13245 de cadena completa, tal como el ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, o una parte del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridarse específicamente en condiciones restrictivas con el ADN genómico o ARNm de 13245. Otras sondas adecuadas para su uso en los ensayos de diagnóstico se describen en el presente documento.
En un formato, ARNm (o ADNc) se inmoviliza sobre una superficie y se pone en contacto con las sondas, por ejemplo, haciendo pasar el ARNm aislado en un gel de agarosa y transfiriendo el ARNm del gel a una membrana, tal como nitrocelulosa. En un formato alternativo, las sondas se inmovilizan sobre una superficie y el ARNm (o ADNc) se pone en contacto con las sondas, por ejemplo, en una matriz de chip génica bidimensional. Un experto en la técnica puede adaptar los procedimientos de detección de ARNm conocidos para su uso para detectar el nivel de ARNm codificado por los genes 13245.
Puede evaluarse el nivel de ARNm en una muestra que se codifica por 13245, con la amplificación de ácido nucleico, por ejemplo mediante RT-PCR (patente de los EE.UU. 4.683.202), reacción en cadena de la ligasa (Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), replicación de secuencias autosostenida (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-beta replicasa (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), replicación por circulo rodador (patente de los EE.UU. número 5.854.033) o cualquier otro procedimiento de amplificación de ácido nucleico, seguido de la detección de las moléculas amplificadas usando técnicas conocidas en la técnica. Tal como se usa en el presente documento, se definen los cebadores de amplificación como que son un par de moléculas de ácido nucleico que pueden hibridar con las regiones en 5' o en 3' de una gen 13245. (hebras positiva y negativa, respectivamente, o viceversa) y contienen una región corta intermedia. En general, los cebadores de amplificación son de desde aproximadamente 10 hasta 30 nucleótidos de longitud y flanquean una región de desde aproximadamente 50 hasta 200 nucleótidos de longitud. En condiciones apropiadas y con reactivos apropiados, tales cebadores permiten la amplificación de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos entre los cebadores.
Para los procedimientos in situ, puede prepararse/elaborarse una muestra celular o tisular e inmovilizarse sobre un soporte, normalmente un portaobjeto de vidrio, y entonces ponerse en contacto con una sonda que puede hibridarse con ARNm que codifica para el gen 13245 que se está analizando.
En otra realización, los procedimientos incluyen además poner en contacto una muestra control con un compuesto o un agente que puede detectar ARNm, o ADN genómico, y que compara la presencia del ADN genómico o ARNm de 13245 en la muestra control con la presencia de ADN genómico o ARNm de 13245 en la muestra de prueba.
Pueden usarse una variedad de procedimientos para determinar el nivel de proteína codificada por 13245. En general, estos procedimientos incluyen poner en contacto un agente que se une selectivamente a una proteína, tal como un anticuerpo con una muestra, para evaluar el nivel de proteína en la muestra. En una realización preferida, el anticuerpo lleva una etiqueta que puede detectarse. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o más preferiblemente, monoclonales. Puede usarse un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab o F(ab')_{2}). El término "marcado", con respecto a la sonda o anticuerpo, pretende abarcar la marcación directa de la sonda o anticuerpo acoplando (es decir, unión física) una sustancia que puede detectarse a la sonda o anticuerpo, así como la marcación indirecta de la sonda o anticuerpo haciendo reaccionar con una sustancia que puede detectarse. Ejemplos de sustancias que pueden detectarse se proporcionan en el presente documento.
Los procedimientos de detección pueden usarse para detectar proteínas 13245 en una muestra biológica in vitro así como in vivo. Las técnicas in vitro para detectar a la proteína 13245 incluyen los ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) inmunoprecipitaciones, inmunofluorescencia, inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA), y análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Las técnicas in vivo para detectar la proteína 13245 incluye introducir en un sujeto un anticuerpo anti-13245 marcado. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un marcador radioactivo cuya presencia y ubicación puede detectarse en un sujeto mediante técnicas de imagen habituales.
En otra realización, los procedimientos además incluyen poner en contacto la muestra control con un compuesto o agente que puede detectar a la proteína 13245, y que compara la presencia de proteína 13245 en la muestra control con la presencia de la proteína 13245 en la muestra de prueba.
La invención también incluye kits para detectar la presencia de 13245 en una muestra biológica. Por ejemplo, el kit puede incluir un compuesto o agente que puede detectar a la proteína o ARNm de 13245 en una muestra biológica, y un patrón. El compuesto o agente puede envasarse en un recipiente adecuado. El kit puede comprender además instrucciones de uso del kit para detectar a la proteína o ácido nucleico de 13245.
Para un kits basados en anticuerpos, el kit puede incluir: (1) un primer anticuerpo (por ejemplo, unido a un soporte sólido) que se une a un polipéptido que corresponde a un marcador de la invención; y, opcionalmente, (2) un segundo, anticuerpo diferente que se une o bien al polipéptido o bien al primer anticuerpo y se conjuga con un agente que puede detectarse.
Para los kits basados en oligonucleótidos, el kit puede incluir: (1) un oligonucleótido, por ejemplo, un oligonucleótido marcado de manera detectable, que se híbrida con una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que corresponde a un marcador de la invención o (2) un par de cebadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico que corresponde a un marcador de la invención. El kit también puede incluir un agente tampón, un conservante, o un agente de estabilización de proteína. El kit también puede incluir componentes necesarios para detectar al agente que puede detectarse (por ejemplo, una enzima o un sustrato). El kit también puede contener una muestra control o una serie de muestras control que puede someterse a ensayo y compararse con el contenido de la muestra de prueba. Cada componente del kit puede encerrarse dentro de un recipiente individual y todos los diversos recipientes pueden estar dentro de un único envase, junto con las instrucciones para interpretar los resultados de los ensayos realizados usando el kit.
Los procedimientos de diagnóstico descritos en el presente documento pueden identificar sujetos que tienen, o en riesgo de desarrollar, una enfermedad o trastorno asociado con la actividad o expresión de 13245 expresada de forma errónea, aberrante o no deseada. Tal como se usa en el presente documento, el término "no deseada" incluye un fenómeno no deseado implicado en una respuesta biológica tal como la inducción de una respuesta inmunitaria inapropiada o proliferación celular desregulada.
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En una realización, se identifica una enfermedad o trastorno asociado con la actividad o expresión de 13245 aberrante p no deseada. Una muestra de prueba se obtiene a partir de un sujeto y se evalúa la proteína o ácido nucleico de 13245 (por ejemplo, ARNm o ADN genómico) en el que el nivel, por ejemplo la presencia o ausencia de proteína o ácido nucleico de 13245 es un diagnóstico para un sujeto que tiene o en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con la actividad o expresión de 13245 aberrante o no deseada. Tal como se usa en el presente documento, una "muestra de prueba" se refiere a una muestra biológica que se obtiene a partir de un sujeto de interés, incluyendo un fluido biológico (por ejemplo, suero), muestra celular o tejidos.
Los ensayos de pronóstico descritos en el presente documento pueden usarse para determinar si puede administrarse un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, mimético peptídico, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña u otro candidato a fármaco) a un sujeto para tratar una enfermedad o trastorno asociado con una actividad o expresión de 13245 aberrante o no deseada. Por ejemplo, tales procedimientos pueden usarse si puede tratarse de manera eficaz a un sujeto con un agente que modula la actividad o expresión de 13245.
Los procedimientos de la invención también pueden usarse para detectar alteraciones genéticas en un gen 13245, determinando así si un sujeto con el gen alterado está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la regulación errónea en la expresión del ácido nucleico o actividad de la proteína 13245, tal como un trastorno asociado con la génesis tumoral o inducción de una respuesta inmunitaria inapropiada. En realizaciones preferidas, los procedimientos incluyen detectar, en una muestra del sujeto, la presencia o ausencia de una alteración genética caracterizada por al menos una de una alteración que afecta la integridad de un gen que codifica para una proteína 13245, o la expresión errónea del gen 13245. Por ejemplo, tales alteraciones genéticas pueden detectarse determinando la existencia de al menos uno de 1) una deleción de uno o más nucleótidos de un gen 13245; 2) una adición de uno o más nucleótidos a un gen 13245; 3) una sustitución de uno o más nucleótidos de un gen 13245, 4) una transposición cromosómica de un gen 13245; 5) una alteración en el nivel de un transcrito de ARN mensajero de un gen 13245, 6)modificación aberrante de un gen 13245, tal como del patrón de metilación del ADN genómico, 7) la presencia de un patrón de corte y empalme de tipo no natural de un transcrito de ARN mensajero de un gen 13245, 8) un nivel de tipo no natural de una proteína 13245, 9) pérdida alélica de un gen 13245, y 10) modificación post-traduccional inapropiada de una proteína 13245.
Puede detectarse una alteración sin una sonda/cebador en una reacción en cadena de la polimerasa, tal como PCR de ancla o RACE-PCR, o alternativamente, en una reacción en cadena de la ligasa (LCR), de las que la última puede ser particularmente útil para detectar mutaciones puntuales en el gen 13245. Este procedimiento puede incluir las etapas de recoger una muestra de células de un sujeto, aislar ácido nucleico (por ejemplo, genómico, ARNm o ambos) de la muestra, poner en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores que se hibridan de manera específica a un gen 13245 en condiciones tales que se producen la hibridación y amplificación del gen 13245 (si está presente), y detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación, o detectar el tamaño del producto de amplificación y comparar la longitud con una muestra control. Se espera que PCR y/o LCR puedan desearse para usarse como una etapa de amplificación preliminar junto con cualquiera de las técnicas usadas para detectar mutaciones descritas en el presente documento.
Los procedimientos de amplificación alternativos incluyen: replicación de secuencias autosostenida (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-beta replicasa (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), u otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos, seguido de la detección de las moléculas amplificadas usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
En otra realización, pueden identificarse mutaciones en un gen 13245 de una célula de muestra, detectando alteraciones en los patrones de escisión, mediante enzimas de restricción. Por ejemplo, se aisla ADN control y de muestra, se amplifica (opcionalmente), se digiere con una o más endonucleasas de restricción, y se determinan los tamaños de longitud de fragmentos, por ejemplo, mediante electroforesis en gel, y se comparan. Las diferencias en los tamaños de longitud de fragmentos entre el ADN control y de muestra, indica mutaciones en el ADN de muestra. Además, el uso de ribozimas específicos de secuencia (por ejemplo, patente de los EE.UU. número 5.498.531) puede usarse para detectar la presencia de mutaciones específicas mediante el desarrollo o pérdida de un sitio de escisión de ribozima.
En otras realizaciones, pueden identificarse las mutaciones genéticas en 13245 hibridando ácidos nucleicos control o de muestra, por ejemplo, ADN o ARN, mediante, por ejemplo, matrices bidimensionales, o por ejemplo, matrices basadas en chip. Tales matrices incluyen una pluralidad de direcciones, cada una de las cuales puede distinguirse posicionalmente entre sí. Se coloca una sonda diferente en cada dirección de la pluralidad. Las matrices pueden tener una alta densidad de direcciones, por ejemplo, pueden contener cientos o miles de sondas de oligonucleótidos (Cronin et al., 1996, Hum. Mutat. 7:244-255; Kozal et al., 1996, Nature Med. 2:753-759). Por ejemplo, pueden identificarse mutaciones genéticas en 13245 en matrices bidimensionales que contienen sondas de ADN generadas por luz tal como se describe (Cronin et al., anteriormente). En resumen, puede usarse una primera matriz de hibridación de sondas para explorar extensiones largas de ADN en una muestra y control para identificar los cambios de bases entre las secuencias haciendo matrices lineales de sondas de solapamiento secuencial. Esta etapa permite la identificación de mutaciones puntuales. Esta etapa va seguida de una segunda matriz de hibridación que permite la caracterización de mutaciones específicas usando matrices de sondas especializadas, más pequeñas, complementarias a todas las variantes o mutaciones detectadas. Cada matriz de mutación se compone de conjuntos de sondas paralelos, uno complementario al gen de tipo natural y el otro complementario al gen mutante.
Aún en otra realización, cualquiera de las diversas reacciones de secuenciación conocidas en la técnica, puede usarse para secuenciar directamente el gen 13245 y detectar mutaciones comparando la secuencia de 13245 de muestra con la correspondiente secuencia (control) de tipo natural. Pueden utilizarse procedimientos de secuenciación automatizados cuando se realizan los ensayos de diagnóstico (1995, Biotechniques 19:448), incluyendo la secuenciación por espectrometría de masas.
Otros procedimientos para detectar mutaciones en el gen 13245 incluyen procedimientos en los que se usa la protección de agentes de escisión para detectar bases de apareamiento erróneo en heterodúplex ARN/ADN o ARN/ARN (Myers et al., 1985, Science 230:1242; Cotton et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397; Saleeba et al., 1992, Meth. Enzymol. 217:286-295).
Todavía en otra realización, la reacción de escisión de apareamiento erróneo emplea una o más proteínas que reconocen los pares de bases de apareamiento erróneo en ADN de cadena doble (denominadas enzimas de "reparación de apareamiento erróneo de ADN") en sistemas definidos para detectar y mapear mutaciones puntuales en ADNc de 13245 obtenidos a partir de muestras de células. Por ejemplo, la enzima mutY de E. coli escinde A en apareamientos erróneos G/A y la timidina ADN glicosilasa de las células HeLa escinde T de los apareamientos erróneos G/T (Hsu et al., 1994, Carcinogenesis 15:1657-1662; patente de los EE.UU. número 5.459.039).
En otras realizaciones, se usarán las alteraciones en la movilidad electroforética para identificar las mutaciones en los genes 13245. Por ejemplo, puede usarse el polimorfismo de conformación monocatenario (SSCP single strand conformation polimorphism) para detectar diferencias en la movilidad electroforética entre ácidos nucleicos mutantes y de tipo natural (Orita et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766; Cotton.1993, Mutat. Res. 285:125-144; Hayashi, 1992, Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79). Los fragmentos de ADN monocatenarios de los ácidos nucleicos de 13245 control y de muestra se desnaturalizarán y podrán renaturalizarse. La estructura secundaria de ácidos nucleicos monocatenarios varía según la secuencia, la alteración resultante en la movilidad electroforética permite la detección de incluso un cambio de una única base. Los fragmentos de ADN pueden marcarse o detectarse con sondas marcadas. La sensibilidad del ensayo puede mejorarse usando ARN (más que ADN), en el que la estructura secundaria es más sensible a un cambio en la secuencia. En una realización preferida, el procedimiento objeto utiliza el análisis de heterodúplex para separar moléculas de heterodúplex bicatenarias basándose en los cambios en la movilidad electroforética (Keen et al., 1991, Trends Genet 7:5).
Aún en otra realización, se somete a ensayo el movimiento de fragmentos mutantes o de tipo natural en geles de poliacrilamida que contienen un gradiente de desnaturalizante usando electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE denaturing gradient gel electrophoresis DGGE) (Myers et al., 1985, Nature 313:495). Cuando se usa DGGE como el procedimiento de análisis, se modificará ADN para garantizar que no se desnaturalice completamente, por ejemplo añadiendo una pinza GC de aproximadamente 40 pares de bases de ADN rico en GC de alta fusión mediante PCR. En una realización adicional, se usa un gradiente de temperatura en lugar de un gradiente desnaturalizante para identificar diferencias en la movilidad del ADN de muestra y control (Rosenbaum y Reissner (1987) Biophys Chem 265:12753).
Ejemplos de otras técnicas para detectar las mutaciones puntuales incluyen, pero no se limitan a, hibridación de oligonucleótidos selectiva, amplificación selectiva, o extensión de cebadores selectiva (Saiki et al., 1986, Nature 324:163; Saiki et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230).
Alternativamente, la tecnología de amplificación específica de alelos que depende de la amplificación por PCR selectiva puede usarse junto con la presente invención. Los oligonucleótidos usados como cebadores para la amplificación específica pueden portar la mutación de interés en el centro de la molécula (de tal modo que la amplificación depende de la hibridación diferencial; Gibbs et al., 1989, Nucl. Acids Res. 17:2437-2448) o en el extremo 3' de un cebador en el que, en condiciones apropiadas, puede evitar el apareamiento erróneo o reducir la extensión de la polimerasa (Prossner, 1993, Tibtech 11:238). Además, puede desearse introducir un sitio de restricción novedoso en la región de la mutación para crear la detección basada en escisión (Gasparini et al., 1992, Mol. Cell Probes 6: 1). Se espera que en ciertas realizaciones, también pueda realizarse la amplificación usando Taq ligasa para la amplificación (Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189). En tales casos, la ligación se producirá sólo si existe un apareamiento perfecto en el extremo 3' de la secuencia en 5' haciendo posible detectar la presencia de una mutación conocida en un sitio específico buscando la presencia o ausencia de amplificación.
Los procedimientos descritos en el presente documento pueden realizarse, por ejemplo, usando kits de diagnóstico envasados que contienen al menos un ácido nucleico de sonda o reactivo de anticuerpo descritos en el presente documento, que pueden usarse de manera conveniente, por ejemplo, en la práctica clínica para diagnosticar pacientes que muestran síntomas o historial familiar de una enfermedad o dolencia que implica un gen 13245.
Uso de moléculas de 13245 como marcadores sustitutos
Las moléculas de 13245 de la invención también son útiles como marcadores de trastornos o fases de la enfermedad, como marcadores para determinar precursores de fases de la enfermedad, como marcadores para determinar la predisposición de fases de la enfermedad, como marcadores de la actividad del fármaco, o como marcadores del perfil farmacogenómico de un sujeto. Usando los procedimientos descritos en el presente documento, puede detectarse la presencia, ausencia y/o cantidad de las moléculas de 13245 de la invención, y puede correlacionarse con una o más fases biológicas in vivo. Por ejemplo, las moléculas de 13245 de la invención pueden servir como marcadores sustitutos para determinar uno o más trastornos o fases de la enfermedad o para determinar estados que conducen a fases de la enfermedad. Tal como se usa en el presente documento, "un marcador sustituto" es un marcador bioquímico objetivo que se correlaciona con la ausencia o presencia de una enfermedad o trastorno, o con la evolución de una enfermedad o trastorno (por ejemplo, con la presencia o ausencia de un tumor). La presencia o cantidad de tales marcadores es independiente de la enfermedad. Por tanto, estos marcadores pueden servir para indicar si un curso particular de tratamiento es eficaz para disminuir una fase de la enfermedad o trastorno. Los marcadores sustitutos son de uso particular cuando la presencia o extensión de una fase de la enfermedad o trastorno es difícil de evaluar a través de las metodologías habituales (por ejemplo, tumores de fase temprana), o cuando se desea una evaluación de la evolución de la enfermedad antes de que se consiga un punto final clínico posiblemente peligroso (por ejemplo, una evaluación de enfermedad cardiovascular puede realizarse usando niveles de colesterol como un marcador sustituto, y puede realizarse un análisis de infección por VIH usando niveles de ARN de VIH como marcador sustituto, muchos antes de los desenlaces clínicos no deseados del infarto de miocardio o SIDA completamente desarrollado). Se han descrito ejemplos del uso de marcadores sustitutos (por ejemplo, Koomen et al., 2000, J. Mass. Spectrom. 35:258-264; James, 1994, AIDS Treat. News Arch. 209).
Las moléculas de 13245 de la invención también son útiles como marcadores farmacodinámicos. Tal como se usa en el presente documento, un "marcador farmacodinámico" es un marcador bioquímico objetivo que se correlaciona específicamente con efectos del fármaco. La presencia o cantidad de un marcador farmacodinámico no se relaciona con la fase de la enfermedad o trastorno para la que se está administrando el fármaco; por tanto, la presencia o cantidad del marcador es indicativa de la presencia o actividad del fármaco en un sujeto. Por ejemplo, un marcador farmacodinámico puede ser indicativo de la concentración del fármaco en un tejido biológico, en el que el marcador o bien se expresa o transcribe o bien ni se expresa ni se transcribe en ese tejido en relación con el nivel del fármaco. De este modo, la distribución o absorción del fármaco puede monitorizarse mediante marcadores farmacodinámicos. De manera similar, la presencia o cantidad del marcador farmacodinámico puede relacionarse con la presencia o cantidad del producto metabólico de un fármaco, tal como la presencia o cantidad del marcador es indicativa de la tasa de descomposición relativa del fármaco in vivo. Los marcadores farmacodinámicos son de uso particular para aumentar la sensibilidad de detección de efectos farmacológicos, particularmente cuando el fármaco se administra en dosis bajas. Puesto que incluso una cantidad pequeña del fármaco puede ser suficiente para activar múltiples ciclos de transcripción o expresión del marcador (por ejemplo, un marcador de 13245), el marcador amplificado puede estar en una cantidad que puede detectarse más fácilmente que el propio fármaco. También, el marcador puede detectarse más fácilmente debido a la naturaleza del propio marcador; por ejemplo, usando los procedimientos descritos en el presente documento, pueden emplearse anticuerpos anti-13245 en un sistema de detección basado en la inmunización para determinar un marcador de proteína 13245, o pueden usarse sondas radiomarcadas específicas de 13245 para detectar un marcador de ARNm de 13245. Además, el uso de un marcador farmacodinámico puede ofrecer una predicción de riesgo basada en el mecanismo debido al tratamiento farmacológico más allá del intervalo de posibles observaciones directas. Se han descrito ejemplos del uso de marcadores farmacodinámicos (por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 6.033.862; Hattis et al., 1991, Env. Health Perspect. 90: 229-238; Schentag, 1999, Am. J. Health-Syst. Pharm. 56 supl. 3: S21-S24; Nicolau, 1999, Am, J. Health-Syst. Pharm. 56 supl. 3: S16-S20).
Las moléculas de 13245 de la invención también son útiles como marcadores farmacogenómicos. Tal como se usa en el presente documento, un "marcador farmacogenómico" es un marcador bioquímico objetivo que se correlaciona con una susceptibilidad o respuesta farmacológica clínicamente específica en un sujeto (por ejemplo, McLeod et al., 1999, Eur. J. Cancer 35:1650-1652). La presencia o cantidad del marcador farmacogenómico se relaciona con la respuesta predicha del sujeto a un fármaco específico o clase de fármacos antes de la administración del fármaco. Mediante la evaluación de la presencia o cantidad de uno o más marcadores farmacogenómicos en un sujeto, puede seleccionarse una farmacoterapia que es la más apropiada para el sujeto, o que se predice que tiene un grado más grande de éxito. Por ejemplo, basándose en la presencia o cantidad de ARN, o proteína (por ejemplo, ARN o proteína 13245) para determinar marcadores específicos de tumor en un sujeto, puede seleccionarse un fármaco o curso de tratamiento que se optimiza para el tratamiento del tumor específico que probablemente está presente en el sujeto. De manera similar, la presencia o ausencia de una mutación de la secuencia específica en el ADN de 13245 puede correlacionarse con la respuesta farmacológica de 13245. Por tanto, el uso de marcadores farmacogenómicos permite la aplicación del tratamiento más apropiado para cada sujeto sin tener que administrar la terapia.
Composiciones farmacéuticas
El ácido nucleico y polipéptidos, fragmentos de los mismos, así como anticuerpos anti-13245 (también denominados en el presente documento como "compuestos activos") de la invención pueden incorporarse en las composiciones farmacéuticas. Tales composiciones incluyen normalmente la molécula de ácido nucleico, proteína, o anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, las palabras "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluyen disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. También pueden incorporarse a las composiciones compuestos activos complementarios.
Se formula una composición farmacéutica para que sea compatible con su vía de administración pretendida. Ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las disoluciones o suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propileneglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. Se puede ajustar el pH con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis compuestos por vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o una dispersión inyectables estériles. Para administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL^{TM} (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el extremo de que pueda administrarse fácilmente con jeringuilla. Debe estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe protegerse frente a la acción contaminante de los microorganismos tales como bacteria y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Puede lograrse la prevención de la acción de microorganismos mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. Puede lograrse la absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo un agente en la composición que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Pueden prepararse disoluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los componentes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. Generalmente, se preparan las dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo que contiene un medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferidos son secado a vacío y liofilización, lo que produce un polvo del principio activo junto cualquier componente deseado adicional de una disolución previamente filtrada estéril del mismo.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Con el fin de la administración terapéutica oral, puede incorporarse el compuesto activo con excipientes y puede usarse en la forma de comprimidos, trociscos o cápsulas, por ejemplo, cápsulas de gelatina. También pueden prepararse composiciones orales usando un vehículo fluido para su uso como un enjuague bucal. Pueden incluirse agentes de unión compatibles farmacéuticamente y/o materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes componentes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente, tal como almidón o lactosa; un agente disgregante, tal como ácido algínico, Primogel^{TM}, o almidón de maíz; un lubricante, tal como estearato de magnesio o Sterotes^{TM}; un agente deslizante, tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante, tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante, tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.
Para la administración por inhalación, los compuestos se suministran en la forma de un aerosol pulverizado de un envase o dispensador presurizado que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser mediante medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica se usan en la formulación agentes penetrantes apropiados para la barrera que debe atravesarse. Tales agentes penetrantes generalmente se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares, y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa puede realizarse a través del uso de pulverizaciones nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, se formulan los compuestos activos en pomadas, ungüentos, geles o cremas tal como generalmente se conocen en la técnica.
También pueden prepararse los compuestos en la forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para la administración rectal.
En una realización, se preparan los compuestos activos con vehículos que protegerán el compuesto frente a una rápida eliminación del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de liberación microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido pdiláctico. Los procedimientos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente de Alza Corporation y NovaPharmaceuticals, Inc. También pueden usarse suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas usando anticuerpos monoclonales dirigidos hacia antígenos virales) como vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstos pueden prepararse según los procedimientos descritos (por ejemplo, patente de los EE.UU. número 4.522.811).
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Resulta ventajoso formular composiciones orales o parenterales en formas farmacéuticas unitarias por la facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma farmacéutica unitaria, tal como se usa en el presente documento, se refiere a unidades diferenciadas físicamente adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que va a tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado junto con el vehículo farmacéutico requerido.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos habituales en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL_{50} (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La razón de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la razón DL_{50}/DE_{50}. Se prefieren los compuestos que muestran altos índices terapéuticos. Mientras que pueden usarse compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado al diseñar un sistema de administración que dirige tales compuestos al sitio de tejido afectado con el fin de minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, por tanto, reducir los efectos secundarios.
Pueden usarse los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios con animales en la formulación de un intervalo de dosificación para uso en seres humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente en un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el procedimiento de la invención, puede estimarse inicialmente la dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante que incluye la CI_{50} (es decir, la concentración del compuesto de prueba que alcanza una inhibición de los síntomas que es la mitad de la máxima) tal como se determina en cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar de manera más precisa las dosis útiles en seres humanos. Pueden medirse los niveles en plasma, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Tal como se define en el presente documento, una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína o polipéptido (es decir, una dosificación eficaz) oscila desde aproximadamente 0,001 hasta 30 miligramos por kilogramo de peso corporal, preferiblemente desde aproximadamente 0,01 hasta 25 miligramos por kilogramo de peso corporal, más preferiblemente desde aproximadamente 0,1 hasta 20 miligramos por kilogramo de peso corporal, e incluso más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta 10 miligramos por kilogramo, desde 2 hasta 9 miligramos por kilogramo, desde 3 hasta 8 miligramos por kilogramo, desde 4 hasta 7 miligramos por kilogramo, o desde 5 hasta 6 miligramos por kilogramo de peso corporal. Puede administrarse la proteína o el polipéptido una vez a la semana durante aproximadamente de 1 a 10 semanas, preferiblemente entre 2 y 8 semanas, más preferiblemente entre aproximadamente 3 y 7 semanas, e incluso más preferiblemente durante aproximadamente 4, 5 ó 6 semanas. El experto en la técnica apreciará que algunos factores pueden influir en la dosificación y el tiempo requerido para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo pero sin limitarse a la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos anteriores, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Es más, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína, polipéptido, o anticuerpo puede incluir un único tratamiento o, preferiblemente una serie de tratamientos.
Para anticuerpos, la dosificación preferida es de 0,1 miligramos por kilogramo de peso corporal (generalmente de 10 a 20 miligramos por kilogramo). Si el anticuerpo va a actuar en el cerebro, normalmente es adecuada una dosificación de 50 a 100 miligramos por kilogramo. Generalmente, los anticuerpos parcialmente humanos y los anticuerpos totalmente humanos tienen una semivida más prolongada dentro del cuerpo humano que otros anticuerpos. En consecuencia, a menudo son posibles menores dosificaciones y administraciones menos frecuentes. Pueden usarse modificaciones tales como lipidación para estabilizar anticuerpos y para aumentar la captación y penetración tisular (por ejemplo, en el cerebro). Un procedimiento para la lipidación de anticuerpos se describe por Cruikshank et al. (1997, J. AIDS Hum. Retrovir. 14:193).
La presente invención engloba agentes que modulan la expresión o actividad. Un agente puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña. Tales moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos (por ejemplo, peptoides), aminoácidos, análogos de aminoácidos, polinucleótidos, análogos de polinucleótidos, nucleótidos, análogos de nucleótidos, compuestos orgánicos o inorgánicos (es decir, incluyendo compuestos hetero-orgánicos y organometálicos) que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 10.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 5.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 1.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 500 gramos por mol, y sales, ésteres, y otras formas farmacéuticamente aceptables de tales compuestos.
Dosis a modo de ejemplo incluyen cantidades de miligramos o microgramos de la molécula pequeña por kilogramo de sujeto o peso de la muestra (por ejemplo, de aproximadamente 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 500 miligramos por kilogramo, de aproximadamente 100 microgramos por kilogramo a aproximadamente 5 miligramos por kilogramo, o de aproximadamente 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 50 microgramos por kilogramo. También se entiende que las dosis adecuadas de una molécula pequeña dependen de la potencia de la molécula pequeña con respecto a la expresión o actividad que va a modularse. Cuando una o más de estas moléculas pequeñas va a administrarse a un animal (por ejemplo, un ser humano) con el fin de modular la expresión o actividad de un polipéptido o ácido nucleico de la invención, un médico, veterinario, o investigador puede, por ejemplo, prescribir una dosis relativamente baja al principio, aumentando posteriormente la dosis hasta que se obtiene una respuesta adecuada. Además, se entiende que el nivel de dosis específica para cualquier sujeto animal particular dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la edad, peso corporal, salud general, género y dieta del sujeto, el tiempo de administración, la vía de administración, la tasa de excreción, cualquier combinación de fármacos y el grado de expresión o actividad que va a modularse.
Puede conjugarse un anticuerpo (o fragmento del mismo) a un resto terapéutico tal como una citotoxina, un agente terapéutico o ion metálico radiactivo. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para las células. Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantracenodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tiotepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiaminoplatino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).
Pueden usarse los conjugados de la invención para modificar una respuesta biológica dada, y el resto de fármaco no debe interpretarse como limitado a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto de fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que tiene una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, gelonina, exotoxina de pseudomonas, o toxina diftérica; una proteína tal como factor de necrosis tumoral, interferón alfa, interferón beta, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador del plasminógeno tisular; o, modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucinas 1, 2, y 6, factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos, u otros factores de crecimiento.
Alternativamente, puede conjugarse un anticuerpo con un segundo anticuerpo para formar un anticuerpo heteroconjugado tal como se describe por Segal en la patente de los EE.UU. número 4.676.980.
Pueden insertarse las moléculas de ácido nucleico de la invención en vectores y usarse como vectores de terapia génica. Los vectores de terapia génica pueden administrarse a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (véase la patente de los EE.UU. número 5.328.470) o mediante inyección estereotáctica (por ejemplo, Chen et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que se incluye el vehículo de inserción génica. Alternativamente, cuando el vector de inserción génica completo puede producirse intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que produce el sistema de inserción génica.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un envase, paquete, o dispensador junto con las instrucciones para la administración.
Procedimientos de tratamiento
La presente invención proporciona procedimientos tanto terapéuticos como profilácticos de tratar un sujeto con riesgo de (o propenso a) un trastorno o que tiene un trastorno asociado con la actividad o expresión de 13245 no deseada o aberrante. Con respecto a procedimientos de tratamiento tanto profilácticos como terapéuticos, tales tratamientos pueden adaptarse o modificarse específicamente, basándose en el conocimiento obtenido del campo de la farmacogenómica. La "farmacogenética" tal como se usa en el presente documento, se refiere a la aplicación de tecnologías genómicas tales como secuenciación génica, genética estadística, y análisis de expresión génica en fármacos en desarrollo clínico y en el mercado. Más específicamente, el término se refiere al estudio de cómo los genes de un paciente determinan su respuesta a un fármaco (por ejemplo, "fenotipo de respuesta a fármaco" o "genotipo de respuesta a fármaco" de un paciente). Por tanto, otro aspecto de la invención proporciona procedimientos para adaptar un tratamiento profiláctico o terapéutico de un individuo con o bien las moléculas de 13245 de la presente invención o moduladores de 13245 según el genotipo de respuesta a fármaco del individuo. La farmacogenómica permite a un internista o médico dirigir los tratamientos profilácticos o terapéuticos a pacientes que más se beneficiarán del tratamiento y para evitar el tratamiento de pacientes que experimentarán efectos secundarios relacionados con el fármaco.
Se define el tratamiento como la aplicación o administración de un agente terapéutico a un paciente, o la aplicación ó administración de un agente terapéutico a un tejido o línea celular aislado de un paciente, que tiene una enfermedad, un síntoma de enfermedad o una predisposición a una enfermedad, con el fin de curar, cicatrizar, aliviar, calmar, alterar, remediar, producir una mejoría, mejorar, o influir en la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición a la enfermedad.
Un agente terapéutico incluye, pero no está limitado a, moléculas pequeñas, péptidos, anticuerpos, ribozimas y oligonucleótidos antisentido.
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En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para prevenir una enfermedad o un estado en el que un sujeto asociado con una actividad o expresión de 13245 no deseada o aberrante, administrando al sujeto una 13245 o un agente que modula la expresión de 13245, o al menos una actividad de 13245. Pueden identificarse los sujetos en riesgo de una enfermedad que está causada o a la que contribuye la actividad o expresión de 13245 no deseada o aberrante mediante, por ejemplo, cualquiera o una combinación de ensayos de pronóstico o diagnóstico tal como se describe en el presente documento. La administración de un agente profiláctico puede producirse antes de la manifestación de los síntomas característicos de la aberración de 13245, de tal manera que se previene una enfermedad o trastorno o, alternativamente, se retrasa en su evolución. Dependiendo del tipo de aberración de 13245 puede usarse, por ejemplo, una proteína 13245, un agente agonista de 13245 o un antagonista de 13245 para tratar al sujeto. Puede determinarse el agente apropiado basándose en los ensayos de selección descritos en el presente documento.
Es posible que algunos trastornos de 13245 puedan estar causados, al menos en parte, por un nivel anómalo de producto génico, o por la presencia de un producto génico que muestra actividad anómala. Como tal, la reducción en el nivel y/o actividad de tales productos génicos supondrán la mejoría de los síntomas del trastorno.
Tal como se trata, el tratamiento satisfactorio de trastornos de 13245 puede lograrse mediante técnicas que sirven para inhibir la expresión o actividad de productos génicos diana. Por ejemplo, compuestos, por ejemplo, un agente identificado usando un ensayo descrito anteriormente, que demuestra que presenta actividad moduladora negativa, puede usarse según la invención para prevenir y/o mejorar síntomas de trastornos de 13245. Tales moléculas pueden incluir, pero no se limitan a péptidos, fosfopéptidos, moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas, o anticuerpos (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, anti-idiotípicos, quiméricos o monocatenarios, y, fragmentos de biblioteca de expresión Fab, F(ab')_{2} y Fab, moléculas scFV, y fragmentos de unión a epítopos de los mismos).
Además, moléculas antisentido y de ribozima que inhiben la expresión del gen diana también pueden usarse según la invención para reducir el nivel de expresión génica diana, reduciendo así eficazmente el nivel de actividad génica diana. Todavía adicionalmente, pueden usarse moléculas de triple hélice para reducir el nivel de actividad génica diana. Las moléculas antisentido, de ribozima y triple hélice se trataron anteriormente.
Es posible que el uso de moléculas antisentido, de ribozima, y/o triple hélice que reducen o inhiben la expresión génica mutante también pueda reducir o inhibir la transcripción (triple hélice) y/o traducción (antisentido, ribozima) de ARNm producido por alelos génicos diana normales, de tal manera que la concentración de producto génico diana normal presente pueda ser menor de lo que es necesario para un fenotipo normal. En tales casos, pueden introducirse moléculas de ácido nucleico que codifican para y expresan polipéptidos génicos diana que muestran actividad génica diana normal, en las células por medio de un procedimiento de terapia génica. Alternativamente, en casos en los que el gen diana codifica para una proteína extracelular, puede ser preferible coadministrar proteína génica diana normal dentro de la célula o tejido con el fin de mantener el nivel requerido de actividad génica diana celular o tisular.
Otro procedimiento mediante el que pueden utilizarse moléculas de ácido nucleico para tratar o prevenir una enfermedad caracterizada por la expresión de 13245 es a través del uso de moléculas de aptámero específicas para la proteína 13245. Los aptámeros son moléculas de ácido nucleico que tienen una estructura terciaria que les permite unirse específicamente a ligandos de proteína (por ejemplo, Osborne et al., 1997, Curr. Opin. Chem. Biol. 1:5-9; Patel, 1997, Curr. Opin. Chem. Biol. 1:32-46). Dado que las moléculas de ácido nucleico pueden, en muchos casos, introducirse más convenientemente en células diana de lo que pueden las moléculas de proteína terapéuticas, los aptámeros ofrecen un procedimiento mediante el que puede disminuirse específicamente la actividad de la proteína 13245 sin la introducción de fármacos u otras moléculas que pueden tener efectos pluripotentes.
Pueden generarse anticuerpos que son específicos para el producto génico diana y para reducir la actividad de producto génico diana. Tales anticuerpos pueden, por tanto, administrarse en casos en los que las técnicas moduladoras negativas sean apropiadas para el tratamiento de trastornos de 13245.
En circunstancias en las que la inyección a un sujeto humano o animal de una proteína de 13245 o epítopo para estimular la producción de anticuerpos es dañina para el sujeto, es posible generar una respuesta inmunitaria frente a 13245 mediante el uso de anticuerpos anti-idiotípicos (por ejemplo, Herlyn, 1999, Ann. Med. 31:66-78; Bhattacharya-Chatterjee et al., 1998, Cancer Treat. Res. 94:51-68). Si se introduce un anticuerpo anti-idiotípico en un sujeto humano o mamífero, debe estimular la producción de anticuerpos anti-idiotípicos, que deben ser específicos de la proteína 13245. También pueden generarse de esta manera, vacunas dirigidas contra una enfermedad caracterizada por la expresión de 13245.
En casos en los que el antígeno diana es intracelular y se usan anticuerpos completos, pueden preferirse anticuerpos de internalización. Puede usarse lipofectina o liposomas para administrar el anticuerpo o un fragmento de la región Fab que se une al antígeno diana en las células. Cuando se usan fragmentos de anticuerpo, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeños que se une al antígeno diana. Por ejemplo, pueden usarse péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que corresponde a la región Fv del anticuerpo. Alternativamente, también pueden administrarse anticuerpos neutralizantes monocatenarios que se unen a antígenos diana intracelulares. Pueden administrarse tales anticuerpos monocatenarios, por ejemplo, expresando secuencias de nucleótidos que codifican para anticuerpos monocatenarios dentro de la población celular diana (por ejemplo, Marasco et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893).
Los compuestos identificados que inhiben la actividad, síntesis y/o expresión génica diana, pueden administrarse a un paciente a dosis terapéuticamente eficaces para prevenir, tratar o mejorar trastornos de 13245. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad del compuesto suficiente para dar como resultado una mejoría de los síntomas de los trastornos.
Puede determinarse la toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos mediante procedimientos farmacéuticos habituales en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL_{50} (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La razón de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la razón DL_{50}/DE_{50}. Se prefieren los compuestos que muestran altos índices terapéuticos. Aunque pueden usarse los compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado para diseñar un sistema de administración que dirige tales compuestos al sitio de tejido afectado con el fin de minimizar el daño potencial a células no infectadas y, por tanto, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo celular y estudios con animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación para uso en humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente en un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE_{50} con muy poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto en el procedimiento de la invención, puede estimarse inicialmente la dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración de plasma circulante que incluye la CI_{50} (es decir, la concentración del compuesto prueba que alcanza una inhibición de los síntomas que es la mitad de la máxima) tal como se determina en cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar, de manera más precisa, dosis útiles en seres humanos. Pueden medirse niveles de plasma, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Otro ejemplo de determinación de la dosis eficaz para un individuo es la habilidad capacidad para someter a ensayo directamente los niveles de compuesto "libre" y "unido" en el suero del sujeto a prueba. Tales ensayos pueden usar anticuerpos miméticos y/o "biosensores" que se han creado a través de técnicas de huella molecular ("molecular imprinting"). El compuesto que puede modular la actividad de 13245 se usa como un molde o " molécula de huella" para organizar espacialmente los monómeros polimerizables antes de su polimerización con reactivos catalíticos. La posterior eliminación de la molécula de huella, deja una matriz polimérica que contiene una "imagen negativa" repetida del compuesto y que puede volverse a unir a la molécula en condiciones de ensayo biológico. Revisiones detalladas de esta técnica aparecen en la técnica (Ansell et al., 1996, Curr. Opin. Biotechnol. 7:89-94; Shea, 1994, Trends Polymer Sci. 2:166-173). Tales matrices de afinidad "con huella" son adecuadas para ensayos de unión a ligandos, mediante los cuales el componente de anticuerpo monoclonal inmovilizado se sustituye por una matriz con huella de manera apropiada (por ejemplo, una matriz descrita en Vlatakis et al., 1993, Nature 361:645-647. Mediante el uso de marcado con isótopos, la concentración "libre" de compuesto que modula la expresión o actividad de 13245 puede monitorizarse fácilmente y usarse en cálculos de CI_{50}.
Tales matrices de afinidad "con huella" también pueden diseñarse para incluir grupos fluorescentes cuyas propiedades de emisión de fotones cambien de manera medible frente a la unión local y selectiva de compuesto diana. Estos cambios pueden someterse a ensayo fácilmente en tiempo real usando dispositivos de fibra óptica apropiada, permitiendo a su vez, que se optimice rápidamente la dosis en un sujeto a prueba basándose en su CI_{50} individual. Un ejemplo rudimentario de tal "biosensor" se trata en Kriz et al. (1995, Anal. Chem. 67:2142-2144).
Otro aspecto de la invención se refiere a procedimientos de modulación de la expresión o actividad de 13245 con fines terapéuticos. En consecuencia, en una realización a modo de ejemplo, el procedimiento modulador de la invención implica poner en contacto una célula con una 13245 o agente que modula una o más de las actividades de la actividad de proteína de 13245 asociada con la célula. Un agente que modula la actividad de la proteína 13245 puede ser un agente, tal como se describe en el presente documento, tal como un ácido nucleico o una proteína, una molécula diana que se produce de manera natural de una proteína 13245 (por ejemplo, un sustrato o receptor de 13245), un anticuerpo de 13245, un agonista o antagonista de 13245, un peptidomimético de un agonista o antagonista de 13245, u otra molécula pequeña.
En una realización, el agente estimula una o actividades de 13245. Ejemplos de tales agentes estimuladores incluyen proteína 13245 activa y una molécula de ácido nucleico que codifica para 13245. En otra realización, el agente inhibe una o más actividades de 13245. Ejemplos de tales agentes inhibidores incluyen moléculas de ácido nucleico antisentido de 13245, anticuerpos anti-13245 e inhibidores de 13245. Estos procedimientos moduladores pueden realizarse in vitro (por ejemplo, cultivando la célula con el agente) o, alternativamente, in vivo (por ejemplo, administrando el agente a un sujeto). Como tal, la presente invención proporciona procedimientos para tratar a un individuo aquejado de una enfermedad o trastorno caracterizado por actividad o expresión aberrante o no deseada de una proteína o molécula de ácido nucleico de 13245. En una realización, el procedimiento implica administrar un agente (por ejemplo, un agente identificado mediante un ensayo de selección descrito en el presente documento), o una combinación de agentes que modula (por ejemplo, regula por incremento o regula por disminución) la actividad o expresión de 13245. En otra realización, el procedimiento implica administrar una proteína o molécula de ácido nucleico de 13245 como terapia para compensar la actividad o expresión reducida, anómala, o no deseada de 13245.
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La estimulación de la actividad de 13245 puede desearse en situaciones en las que 13245 se regula de manera anómala por disminución y/o en las que un aumento de la actividad de 13245 es probable que tenga un efecto beneficioso. Por ejemplo, la estimulación de la actividad de 13245 puede desearse en situaciones en las que una 13245 se regula por disminución y/o en las que un aumento de la actividad es probable que tenga un efecto beneficioso. De la misma manera, la inhibición de la actividad de 13245 puede desearse en situaciones en las que 13245 se regula de manera anómala por incremento y/o en las que la actividad de 13245 es probable que tenga un efecto beneficioso.
Farmacogenómica
Las moléculas de 13245 de la presente invención, así como los agentes, o moduladores que tienen efecto estimulador o inhibidor sobre la actividad de 13245 (por ejemplo, expresión génica 13245) tal como se identifica mediante un ensayo de selección descrito en el presente documento, pueden administrarse a individuos para tratar (profilácticamente o terapéuticamente) trastornos asociados a 13245 asociados con la actividad de 13245 aberrante o no deseada (por ejemplo, trastornos asociados con tumorigenesis o inducción de una respuesta inmunitaria inapropiada). Junto con tal tratamiento, puede considerarse la farmacogenómica (es decir, el estudio de la relación entre el genotipo de un individuo y la respuesta de ese individuo frente a un compuesto foráneo o fármaco). Diferencias en el metabolismo de terapéuticos pueden conducir a toxicidad severa o fallo terapéutico mediante la alteración de la relación entre la dosis y la concentración sanguínea del fármaco farmacológicamente activo. Por tanto, un médico o un internista puede considerar aplicar el conocimiento adquirido en estudios farmacogenómicos relevantes para determinar si administrar una molécula de 13245 o un modulador de 13245 así como confeccionar la dosificación y/o régimen terapéutico del tratamiento con una molécula de 13245 o modulador de 13245.
La farmacogenómica trata con variaciones hereditarias clínicamente significativas en la respuesta a fármacos debido a la disposición alterada del fármaco y acción anómala en personas afectadas (por ejemplo, Eichelbaum et al., 1996, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23:983-985; Linder et al., 1997, Clin. Chem. 43:254-266). En general, pueden distinguirse dos tipos de condiciones farmacogenéticas. Las condiciones genéticas transmitidas como un factor sencillo que altera la forma en que los fármacos actúan sobre el cuerpo (acción de fármaco alterada) o condiciones genéticas transmitidas como factores sencillos que alteran la forma en que el cuerpo actúa sobre los fármacos (metabolismo del fármaco alterado). Estas condiciones farmacogenéticas pueden producirse o bien como defectos genéticos raros o polimorfismos que se producen de manera natural. Por ejemplo, la deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) es una enzimopatía heredada común en la que la principal complicación clínica es la hemólisis tras la ingestión de fármacos oxidantes (anti-malaria, sulfonamidas, analgésicos, nitrofuranos) y consumo de habas.
Un enfoque farmacogenómico para identificar genes que predicen la respuesta a fármaco, conocida como "asociación amplia a genoma", se basa principalmente en un mapa de alta resolución del genoma humano constituido por marcadores relacionados con genes ya conocidos (por ejemplo, un mapa de marcador génico "bi-alélico" constituido por 60.000-100.000 sitios polimórficos o variables en el genoma humano, cada uno de los cuales tiene dos variantes). Tal mapa genético de alta resolución puede comprarse con un mapa del genoma de cada uno de los diversos pacientes estadísticamente significativos que participan en el ensayo farmacológico en la fase II/III para identificar marcadores asociados con una respuesta farmacológica observado particular o efecto secundario. Alternativamente, un mapa de alta resolución de este tipo puede generarse a partir de una combinación de algunos diez millones de polimorfismos de un único nucelótido (SNP, single nucleotide polymorphism) conocidos en el genoma humano. Tal como se usa en el presente documento un "SNP" es una alteración común que se produce en una base de nucleótidos sencilla en una extensión de ADN. Por ejemplo, puede producirse un SNP una vez por cada 1000 bases de ADN. Un SNP puede estar implicado en un proceso patológico, sin embargo, la gran mayoría puede no estar asociada con enfermedad. Dado un mapa genético basado en la producción de tales SNP, pueden agruparse los individuos en categorías genéticas dependiendo del patrón particular de los SNP en su genoma individual. De tal manera, regímenes de tratamiento pueden confeccionarse en grupos de individuos genéticamente similares, teniendo en cuenta las características comunes entre individuos genéticamente similares.
Alternativamente, puede utilizarse un procedimiento denominado con el término "enfoque génico del candidato" para identificar genes que predicen una respuesta al fármaco. Según este procedimiento, si se conoce un gen que codifica para una diana de fármaco (por ejemplo, una proteína de 13245 de la presente invención), todas las variantes habituales de ese gen pueden identificarse fácilmente en la población y puede determinarse si tener una versión del gen frente otra está asociado con una respuesta al fármaco particular.
Alternativamente, puede utilizarse un procedimiento denominado con el término "perfiles de la expresión génica", para identificar genes que predicen la respuesta al fármaco. Por ejemplo, la expresión génica de un animal al que se le ha dado una dosis con un fármaco (por ejemplo, una molécula de 13245 o un modulador de 13245 de la presente invención) puede dar indicación si se han activado las rutas génicas relacionadas con la toxicidad.
Puede usarse la información generada a partir de más de uno de los enfoques farmacogenómicos anteriores para determinar dosificaciones adecuadas y regímenes de tratamiento para tratamiento profiláctico o terapéutico de un individuo. Este conocimiento, cuando se aplica a la dosificación o a la selección del fármaco, puede evitar reacciones adversas o fallo terapéutico y por tanto mejora la eficacia terapéutica o profiláctica cuando se trata a un sujeto con una molécula de 13245 o un modulador de 13245, tal como un modulador identificado mediante los ensayos de selección a modo de ejemplo descritos en el presente documento.
La presente invención proporciona además procedimientos para identificar agentes nuevos, o combinaciones, que están basadas en agentes de identificación que modulan la actividad de uno o más de los productos génicos que están codificados por uno o más de los genes 13245 de la presente invención, en los que estos productos pueden asociarse con la resistencia de las células frente a un agente terapéutico. Específicamente, puede usarse la actividad de las proteínas que se codifican por los genes 13245 de la presente invención como base para determinar los agentes de identificación para superar la resistencia del agente. Bloqueando la actividad de una o más de las proteínas resistentes, células diana, por ejemplo, células del sistema inmunitario, se volverán sensibles al tratamiento con un agente frente al que las células no modificadas diana eran resistentes.
Puede aplicarse la monitorización de la influencia de los agentes (por ejemplo, fármacos) sobre la expresión o actividad de una proteína 13245 en ensayos clínicos. Por ejemplo, puede monitorizarse la eficacia de un agente determinado mediante un ensayo de selección tal como se describe en el presente documento para aumentar la expresión del gen 13245, los niveles de proteína, o la actividad de 13245 regulada por incremento, en ensayos clínicos de sujetos que muestran expresión del gen 13245, niveles de proteína, o actividad de 13245 regulada por disminución disminuidas. Alternativamente, puede monitorizarse la eficacia de un agente determinado mediante un ensayo de selección para disminuir la expresión génica 13245, los niveles de proteína, o la actividad de 13245 regulada por disminución, en ensayos clínicos de sujetos que muestran un aumento en la expresión de gen 13245, niveles de proteína, o actividad de 13245 regulada por incremento. En tales ensayos clínicos, la expresión o actividad de un gen 13245, y preferiblemente, de otros genes que se han implicado en, por ejemplo, un trastorno asociado a 13245 puede usarse como una "lectura" o marcadores de fenotipo de una célula particular.
Otras realizaciones
En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para analizar una pluralidad de sondas de captura. El procedimiento puede usarse, por ejemplo, para analizar la expresión génica. El procedimiento incluye: proporcionar una matriz bidimensional que tiene una pluralidad de direcciones, pudiéndose distinguir posicionalmente cada dirección de la pluralidad de cada otra dirección de la pluralidad, y teniendo cada dirección de la pluralidad una única sonda de captura, por ejemplo, una secuencia de péptidos o ácido nucleico; poner en contacto la matriz con un ácido nucleico, preferiblemente purificado, polipéptido, preferiblemente purificado, o anticuerpo de 13245, y evaluando así la pluralidad de sondas de captura. Se detecta la unión, por ejemplo, en el caso de un ácido nucleico, la hibridación con una sonda de captura en una dirección de la pluralidad, por ejemplo, por una señal generada a partir de una etiqueta unida al ácido nuleico, polipéptido o anticuerpo de 13245.
Las sondas de captura pueden ser un conjunto de ácidos nucleicos de una muestra seleccionada, por ejemplo, una muestra de ácidos nucleicos derivados de una célula o tejido no estimulado o de control.
El procedimiento puede incluir poner en contacto el ácido nucleico, polipéptido o anticuerpo de 13245 con una primera matriz que tiene una pluralidad de sondas de captura y una segunda matriz que tiene una pluralidad distinta de sondas de captura. Pueden compararse los resultados de la hibridación, por ejemplo, para analizar las diferencias en la expresión entre una primera y segunda muestra. La primera pluralidad de sondas de captura puede ser de una muestra control, por ejemplo, una muestra de tipo natural, normal, o sin enfermedad, no estimulada, por ejemplo, una muestra celular, tisular o de fluido biológico. La segunda pluralidad de sondas de captura puede ser de una muestra experimental, por ejemplo, una muestra de tipo mutante, en riesgo, en fase de la enfermedad o en fase del trastorno, o estimulado, por ejemplo, una muestra celular, tisular o de fluido biológico.
La pluralidad de sondas de captura puede ser una pluralidad de sondas de ácidos nucleicos cada uno de los cuales híbrida específicamente con un alelo de 13245. Tales procedimientos pueden usarse para diagnosticar a un sujeto, por ejemplo, para evaluar el riesgo de padecer una enfermedad o trastorno, para evaluar la idoneidad de un tratamiento seleccionado para un sujeto, para evaluar si un sujeto tiene una enfermedad o un trastorno. 13245 está asociado con la fosforilación de proteínas, por tanto es útil para evaluar trastornos relacionados con la fosforilación de proteínas aberrante, tal como tumorigenesis y señalización de células inadecuada.
Puede usarse el procedimiento para detectar SNP, tal como se describe anteriormente.
En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para analizar una pluralidad de sondas. El procedimiento es útil, por ejemplo, para analizar la expresión génica. El procedimiento incluye: proporcionar una matriz de bidimensionales que tiene una pluralidad de direcciones, pudiéndose distinguir posicionalmente cada dirección de la pluralidad de cada otra dirección de la pluralidad que tiene un única sonda de captura, por ejemplo, en el que las sondas de captura son de una célula o sujeto que expresa 13245 o de una célula o sujeto en el que se ha provocado una respuesta mediada por 13245, por ejemplo, mediante el contacto de la célula con el proteína o ácido nucleico de 13245 o administración a la célula o sujeto de la proteína o ácido nucleico de 13245; poner en contacto la matriz con una o más sondas de investigación, en la que una sonda de investigación puede ser un ácido nucleico, polipéptido, o anticuerpo (que es preferiblemente otro distinto de un ácido nucleico, polipéptido o anticuerpo de 13245); proporcionar una matriz bidimensional que tiene una pluralidad de direcciones, pudiéndose distinguir posicionalmente cada dirección de la pluralidad de cada otra dirección de la pluralidad, y teniendo cada dirección de la pluralidad una única sonda de captura, por ejemplo, en la que las sondas de captura son de una célula o sujeto que no expresa 13245 (o no expresa tanto como en el caso de pluralidad positiva de sondas de captura de 13245) o de una célula o sujeto cuya respuesta mediada por 13245 no ha sido provocada (o se ha provocado en menor grado que en la primera muestra); poner en contacto la matriz con una o más sondas de investigación (que es preferiblemente otra distinta de un ácido nucleico, polipéptido o anticuerpo de 13245), y evaluando así la pluralidad de sondas de captura. Se detecta la unión, por ejemplo, en el caso de un ácido nucleico, la hibridación con una sonda de captura en una dirección de la pluralidad, por ejemplo, mediante una señal generada a partir de una etiqueta unida al ácido nucleico o anticuerpo.
En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para analizar una pluralidad de sondas o una muestra. Este procedimiento es útil, por ejemplo, para analizar la expresión génica. El procedimiento incluye: proporcionar una matriz bidimensional que tiene una pluralidad de direcciones, pudiéndose distinguir posicionalmente cada dirección de la pluralidad de cada otra dirección de la pluralidad que tiene un única sonda de captura, poner en contacto la matriz con una primera muestra de la célula o sujeto que expresa o se expresa de manera errónea 13245 o a partir de una célula o sujeto en el que se provoca una respuesta mediada por 13245, por ejemplo, poniendo en contacto la célula con la proteína o ácido nucleico 13245, o administrando a la célula o al sujeto la proteína o ácido nucleico de 13245; proporcionar una matriz bidimensional que tiene una pluralidad de direcciones, pudiéndose distinguir posicionalmente cada dirección de la pluralidad de cada otra dirección de la pluralidad, y teniendo cada dirección de la pluralidad una única sonda de captura, y poner en contacto la matriz con una segunda muestra de una célula o sujeto que no expresa 13245 (o no expresa tanto como en el caso de pluralidad positiva de sondas de captura de 13245) o de una célula o sujeto en el que no se ha provocado una respuesta mediada por 13245 (o se ha provocado en menor grado que en la primera muestra); y comparar la unión de la primera muestra con la unión de la segunda muestra. Se detecta la unión, por ejemplo, en el caso de un ácido nucleico, la hibridación con una sonda de captura en una dirección de la pluralidad, por ejemplo, por una señal generada a partir de una etiqueta unida al ácido nucleico, polipéptido, o anticuerpo. Puede usarse la misma matriz para ambas muestras o pueden usarse distintas matrices. Si se usan distintas matrices, la pluralidad de direcciones con sondas de captura tendrá que estar presente en ambas matrices.
En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para analizar 13245, por ejemplo, analizar la estructura, la función o la relación con otras secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. El procedimiento incluye: proporcionar una secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de 13245, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de 13245 o una parte de la misma; comparar la secuencia de 13245 con una o más, preferiblemente una pluralidad de secuencias de un conjunto de secuencias, por ejemplo, una base de datos de secuencias de proteínas o ácidos nucleico; para analizar de esta manera 13245.
El procedimiento puede incluir evaluar la identidad de secuencia entre una secuencia de 13245 y una secuencia de base de datos. El procedimiento puede realizarse accediendo a la base de datos en un segundo sitio, por ejemplo, a través de Internet.
En otro aspecto, la invención se caracteriza por un conjunto de oligonucleótidos, útiles, por ejemplo, para identificar los SNP, o identificar alelos específicos de 13245. El conjunto incluye una pluralidad de oligonucleótidos, cada uno de los cuales tiene un nucleótido diferente en una posición de interrogación, por ejemplo, un SNP o el sitio de una mutación. En una realización preferida, la pluralidad de oligonucleótidos es idéntica en secuencia con las otras (excepto por las diferencias en longitud). Los oligonucleótidos pueden estar dotados con etiquetas diferenciales, de manera que un oligonucleótido que híbrida con un alelo proporciona una señal que es distinguible de un oligonucleótido que híbrida con un segundo alelo.
La secuencia de moléculas de 13245 se proporciona en una variedad de medios para facilitar el uso de la misma. Puede proporcionarse una secuencia como una fabricación, distinto de un ácido nucleico aislado o molécula de ácido nucleico, que contiene un 13245. Una fabricación de este tipo puede proporcionar una secuencia de aminoácidos o nucleótidos, por ejemplo, un marco de lectura abierto, en una forma que permite el examen de la fabricación usando medios no aplicables directamente para examinar las secuencias de aminoácidos o nucleótidos, o un subconjunto de las mismas, dado que existen en la naturaleza o en forma purificada.
Una secuencia de aminoácidos o nucleótidos de 13245 puede grabarse en medios legibles en ordenador. Tal como se usa en el presente documento, "medios legibles en ordenador" se refiere a cualquier medio que puede leerse y al cual se puede acceder directamente en un ordenador. Un medio de este tipo incluye, pero no se limita a: medio de almacenamiento magnético, tales como disquetes, medio de almacenamiento de disco duro, y cinta magnética; medio de almacenamiento óptico tal como CD-ROM; medio de almacenamiento eléctrico tales como RAM y ROM; e híbridos de estas categorías tales como medios de almacenamiento magnético/óptico.
Una variedad de estructuras de almacenamiento de datos, está disponible para los expertos en la técnica para crear un medios legible en ordenador que tiene grabados sobre ellos una secuencia de aminoácidos o nucleótidos de la presente invención. La elección de la estructura de almacenamiento de datos estará basada generalmente en los medios elegidos para acceder a la información almacenada. Además, pueden usarse una variedad de programas de procesamiento de datos y formatos para almacenar la información de la secuencia de nucleótidos de la presente invención en medios legibles en ordenador. La información de la secuencia puede representarse en un archivo de procesador de texto, formateado en un software disponible comercialmente tal como WordPerfect^{TM} y Microsoft Word^{TM}, o representado en la forma de un archivo ASCII, almacenado en una aplicación de base de datos, tales como DB2, Sybase^{TM}, Oracle^{TM}, o similares. El experto en la técnica puede adaptar fácilmente cualquier número de formatos de estructuración de procesadores de datos (por ejemplo, archivo de texto o base de datos) con el fin de obtener un medio legible en ordenador que tiene grabado en el mismo información de la secuencia de nucleótidos de la presente invención.
Proporcionando las secuencias de aminoácidos o nucleótidos de la invención en forma legible en ordenador, el experto en la técnica puede acceder de manera rutinaria a la información de secuencia para varios fines. Por ejemplo, un experto en la técnica, puede usar las secuencias de aminoácidos o nucleótidos de la invención en forma legible en ordenador para comparar una secuencia diana o motivo estructural diana con la información de secuencia almacenada en los medios de almacenamiento de datos. Se usa una búsqueda para identificar fragmentos o regiones de las secuencias de la invención que se ajusta a una secuencia diana o motivo diana.
Tal como se usa en el presente documento, una "secuencia diana" puede ser cualquier secuencia de ADN o aminoácidos de seis o más nucleótidos o dos o más aminoácidos. Un experto en la técnica puede reconocer fácilmente que cuanto más larga es la secuencia, menos probable es que la secuencia diana esté presente como un acontecimiento aleatorio en la base de datos. Las longitudes de secuencia típicas son desde aproximadamente 10 hasta 100 aminoácidos o desde aproximadamente 30 hasta 300 residuos de nucleótido. Sin embargo, está más que reconocido que los fragmentos comercialmente importantes, tales como fragmentos de secuencia implicados en la expresión génica y el procesamiento de proteínas, pueden ser más cortos.
El software de ordenador está disponible públicamente, lo que permite a un experto en la técnica acceder a la información de la secuencia facilitada en un medio legible en ordenador para el análisis y comparación con otras secuencias. Una variedad de algoritmos conocidos está descrita públicamente y una variedad de software disponible comercialmente para realizar medios de búsqueda puede usarse en los sistemas basados en ordenadores de la presente invención. Ejemplos de un software de este tipo incluyen, pero no se limitan a, MacPattem (EMBL), BLASTN y BLASTX (NCBIA).
Por tanto, la invención se caracteriza por un procedimiento de obtener un registro legible en ordenador de una secuencia de 13245 que incluye grabar la secuencia en una matriz legible en ordenador. En una realización preferida, el registro incluye uno o mas de las siguientes: identificación de un marco de lectura abierto; identificación de un dominio, región o sitio; identificación del inicio de la transcripción; identificación del terminador de la transcripción; la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la proteína o forma madura de la misma; el extremo 5' de la región traducida; o las regiones reguladoras de los extremos 5' y/o 3'.
En otro aspecto, la invención se caracteriza por, un procedimiento para analizar una secuencia. El procedimiento incluye: proporcionar una secuencia o registro de 13245, en forma legible en ordenador; comparar una segunda secuencia con la secuencia génica nombrada; analizando, de esta manera, una secuencia. La comparación puede incluir comparar con secuencias para determinar la identidad de la secuencia o determinar si una secuencia está incluida dentro de otra, por ejemplo, determinar si una secuencia de 13245 incluye una secuencia que se está comparando. En una realización preferida, se almacena la segunda secuencia o 13245 en un primer ordenador, por ejemplo, en un primer sitio y se realiza la comparación, lectura o registro en un segundo ordenador, por ejemplo, en un segundo sitio. Por ejemplo, la segunda secuencia o 13245 puede almacenarse en una base de datos pública o en propiedad en un ordenador, y los resultados de la comparación realizada, leídos o registrados en un segundo ordenador. En una realización preferida, el registro incluye una o más de las siguientes: identificación de un ORF; identificación de un dominio, región, o sitio; identificación del inicio de la transcripción; identificación del terminador de la transcripción; la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la proteína, o una forma madura de la misma; el extremo 5' de la región traducida; o las regiones reguladoras de los extremos 5' y/o 3'.
Esta invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes. Los contenidos de todas las referencias, patentes y solicitudes de patentes publicadas citadas a lo largo de esta solicitud se incorporan al presente documento como referencia.
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Ejemplos Ejemplo 1 Identificación y caracterización de ADNc de 13245 humano
La secuencia de nucleótidos de 13245 humano (figura 1; SEQ ID NO: 1), que tiene aproximadamente 6575 nucleótidos de longitud, incluyendo regiones no traducidas, contiene una secuencia codificante iniciada por metionina predicha en aproximadamente los residuos de nucleótido 19-6178. La secuencia codificante codifica para una proteína de 2053 aminoácidos (SEQ ID NO: 2).
Ejemplo 2 Distribución tisular de ARNm de 13245
Se pueden realizar hibridaciones por inmunotransferencia tipo Northern con varias muestras de ARN en condiciones habituales y lavarse en condiciones rigurosas, es decir, 0,2xSSC a 65°C. Puede usarse una sonda de ADN correspondiente a todo o una parte del ADNc de 13245 (SEQ ID NO: 1). Puede marcarse radiactivamente el ADN con, por ejemplo, ^{32}P-dCTP usando el kit Prime-It^{TM} (Stratagene, La Jolla, CA) según las instrucciones del proveedor. Pueden sondarse filtros que contienen ARNm de tejidos endocrinos y hematopoyéticos de ratón, y líneas celulares de cáncer (Clontech, Palo Alto, CA) en disolución de hibridación ExpressHyb^{TM} (Clontech) y lavarse con alta rigurosidad según las recomendaciones del fabricante.
Ejemplo 3 Expresión recombinante de 13245 en células bacterianas
En este ejemplo, se expresa 13245 como un polipéptido de fusión recombinante glutatión-S-transferasa (GST) en E. coli y se aisla y se caracteriza el polipéptido de fusión. Se fusionan secuencias de ácido nucleico de 13245 específicamente con secuencias de ácido nucleico de GST y se expresa este constructo de fusión en E. coli, por ejemplo, en la cepa PEB199. Se induce la expresión del constructo de fusión GST-13245 en PEB199 con IPTG. Se purifica el polipéptido de fusión recombinante a partir de lisados bacterianos crudos de la cepa PEB199 inducida mediante cromatografía de afinidad o lechos de glutatión. Se determina el peso molecular del polipéptido de fusión resultante, usando un análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida del polipéptido purificado a partir de los lisados bacterianos.
Ejemplo 4 Expresión de proteína recombinante de 13245 en células COS
Para expresar el gen 13245 en células COS, se usa el vector pcDNA/Amp de Invitrogen Corporation (San Diego, CA). Este vector contiene un origen de replicación de SV40, un gen de resistencia a ampicilina, un origen de replicación de E. coli, un promotor de CMV seguido de una región de polilinker (poliligador) y un intrón de SV40 y un sitio de poliadenilación. Se clona un fragmento de ADN que codifica para la proteína entera de 13245 y una etiqueta de HA (Wilson et al., 1984, Cell 37:767) o una etiqueta FLAG® fusionada en marco a su extremo 3' del fragmento en una región polilinker del vector, colocando de esta manera, la expresión de la proteína recombinante bajo control del promotor del CMV.
Para construir el plásmido, se amplifica la secuencia ADN de 13245 mediante PCR usando dos cebadores. El cebador en 5' contiene el sitio de restricción de interés seguido por aproximadamente veinte nucleótidos de la secuencia codificante de 13245 empezando desde el codón de iniciación; la secuencia del extremo 3' contiene secuencias complementarias a los otros sitios de restricción de interés, un codón de terminación de la traducción, la etiqueta HA o la etiqueta FLAG® y los últimos 20 nucleótidos de la secuencia codificante de 13245. Se digieren el fragmento amplificado por PCR y el vector pcDNA/Amp con las enzimas de restricción adecuadas y se desfosforila el vector usando la enzima CIAP (New England Biolabs, Beverly, MA). Preferiblemente, los dos sitios de restricción elegidos son diferentes de manera que el gen 13245 se inserta en la orientación deseada. Se transforma la mezcla de ligación en células E. coli (pueden usarse cepas HB101, DH5alfa, SURE, disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), se siembra en una placa el cultivo transformado en placas con medio de ampicilina, y se seleccionan las colonias resistentes. Se aisla el ADN del plásmido aislado a partir de transformantes y se examina mediante análisis de restricción para determinar la presencia del fragmento correcto.
Posteriormente se transfectan células COS con el ADN de plásmido 13245-pcDNA/Amp usando procedimientos de coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación. Otros procedimientos adecuados para transfectar células huésped puede encontrarse en Sambrook et al., (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2' ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Se detecta la expresión del polipéptido 13245 mediante radiomarcación (puede usarse ^{35}S-metionina o ^{35}S-cisteína, disponible de NEN, Boston, MA) e inmunoprecipitación (Harlow et al., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) usando un anticuerpo monoclonal específico contra HA. Brevemente, se marcan las células durante 8 horas con ^{35}S-metionina (o ^{35}S-cisteína). Se recogen entonces los medios de cultivo y se lisan las células usando detergentes (tampón RIPA, NaCl 150 milimolar, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, DOC al 0,5%, Tris 50 milimolar, pH 7,5). Tanto el lisado celular como los medios de cultivo se precipitan con un anticuerpo monoclonal específico contra HA. Entonces se analizan los polipéptidos precipitados mediante SDS-PAGE.
Alternativamente, se clona el ADN que contiene la secuencia codificante de 13245 directamente en el polilinker del vector pcDNA/Amp usando los sitios de restricción adecuados. Se transfecta el plásmido resultante dentro de células COS de la forma anteriormente descrita, y se detecta la expresión del polipéptido de 13245 mediante radiomarcación e inmunoprecipitación usando un anticuerpo monoclonal específico para 13245.
<110> KAPELLER-LIBERMANN, Rosana
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MILLENIUM PHARMACEUTICALS, INC 
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<120> 13245, proteína quinasa de tipo distrofia miotónica humana novedosa y usos de la misma
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<130> 10147-57WO
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<140> No asignado aún
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<141> 23-10-2001
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<150> Documento US 60/242.429
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<151> 23-10-2001
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<160> 7
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 6574
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<212> ADN
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 1
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1
2
3 
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<210> 2
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<211> 2053
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 2
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4
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6
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8
9
10 
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<210> 3
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<211> 6159
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<212> ADN
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 3
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11
12
13 
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<210> 4
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<211> 2055
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
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<400> 4
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20 
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<210> 5
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<211> 1641
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 1597
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 1286
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 7
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37

Claims (42)

1. Una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por:
a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3, en la que la molécula de ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene actividad quinasa;
b) una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 1400 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3, en la que la molécula de ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene actividad quinasa;
c) una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;
d) una molécula de ácido nucleico que codifica para un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en la que el fragmento comprende al menos 1000 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2 y tiene actividad quinasa; y
e) una molécula de ácido nucleico que codifica para una variante alélica que produce de manera natural de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en la que la molécula de ácido nucleico hibrida con una molécula de ácido nucleico que comprende una de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y un complemento de las mismas, en condiciones rigurosas, y en la que la molécula de ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene actividad quinasa.
2. Molécula aislada de ácido nucleico según la reivindicación 1, que se selecciona del grupo constituido por:
a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3; y
b) una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
3. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende además una secuencia de ácido nucleico de vector.
4. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido heterólogo.
5. Una célula huésped que contiene la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1.
6. Célula huésped según la reivindicación 5, en la que la célula huésped es una célula huésped de mamífero.
7. Una célula huésped de mamífero no humano que contiene la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1.
8. Un polipéptido aislado seleccionado del grupo constituido por:
a) un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% al ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3, en la que el polipéptido tiene actividad quinasa;
b) una variante alélica que se produce de manera natural de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en la que el polipéptido está codificado por una molécula de ácido nucleico que hibrida con una molécula de ácido nucleico que comprende una de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 en condiciones rigurosas, y en la que el polipéptido tiene actividad quinasa;
c) un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en el que el fragmento comprende al menos 1000 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2, y en el que el polipéptido tiene actividad quinasa; y
d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 80% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en el que el polipéptido tiene actividad quinasa.
9. Polipéptido aislado según la reivindicación 8, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
10. Polipéptido según la reivindicación 8, que comprende además una secuencia de aminoácidos heteróloga.
11. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo que se une selectivamente con un polipéptido según la reivindicación 8.
12. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según la reivindicación 11, en el que el anticuerpo está marcado de manera que puede detectarse.
13. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según la reivindicación 12, en el que el marcador detectable se selecciona del grupo constituido por:
a) enzimas;
b) grupos prostéticos;
c) materiales fluorescentes;
d) materiales luminiscentes;
e) materiales bioluminiscentes; y
f) materiales radiactivos.
14. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según la reivindicación 11, en el que el anticuerpo se selecciona del grupo constituido por:
a) anticuerpo monoclonal;
b) anticuerpo policlonal;
c) fragmento Fab;
d) fragmento F(ab')_{2};
e) anticuerpo quimérico;
f) anticuerpo humanizado; y
g) anticuerpo humano
15. Un procedimiento para producir un polipéptido seleccionado del grupo constituido por:
a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;
b) un polipéptido que comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en el que el fragmento comprende al menos 1000 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2, y en el que el polipéptido tiene actividad quinasa; y
c) una variante alélica que se produce de manera natural de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en el que el polipéptido está codificado por una molécula de ácido nucleico que hibrida con una molécula de ácido nucleico que comprende una de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, en condiciones rigurosas, y en el que el polipéptido tiene actividad quinasa;
d) un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3, en el que el polipéptido tiene actividad quinasa; y
e) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 80% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en el que el polipéptido tiene actividad quinasa;
comprendiendo el procedimiento cultivar la célula huésped según la reivindicación 5 en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico.
16. Un procedimiento para detectar la presencia de un polipéptido según la reivindicación 8 en una muestra, que comprende:
a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se une selectivamente con un polipéptido según la reivindicación 8; y
b) determinar si el anticuerpo se une con el polipéptido en la muestra.
17. Un kit que comprende un anticuerpo que se une selectivamente con un polipéptido según la reivindicación 8 e instrucciones de uso.
18. Un procedimiento para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 en una muestra, que comprende las etapas de:
a) poner en contacto la muestra con una sonda de ácido nucleico o cebador que hibrida selectivamente con la molécula de ácido nucleico; y
b) determinar si la sonda de ácido nucleico o cebador se une con una molécula de ácido nucleico en la muestra.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la muestra comprende moléculas de ARNm y se pone en contacto con una sonda de ácido nucleico.
20. Un kit que comprende una sonda de ácido nucleico o cebador que se hibrida selectivamente con una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 e instrucciones de uso.
21. Un procedimiento para identificar un compuesto que se une con un polipéptido según la reivindicación 8, que comprende las etapas de:
a) poner en contacto un polipéptido o una célula que expresa un polipéptido según la reivindicación 8 con un compuesto de prueba; y
b) determinar si el polipéptido se une con el compuesto de prueba.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que la unión del compuesto de prueba con el polipéptido se detecta mediante un procedimiento seleccionado del grupo constituido por:
a) detección de la unión mediante detección directa de la unión del compuesto de prueba/polipéptido;
b) detección de la unión usando un ensayo de unión competitiva; y
c) detección de la unión usando un ensayo para determinar la transducción de señales mediada por 13245.
23. Un procedimiento in vitro para modular la actividad de un polipéptido según la reivindicación 8, que comprende poner en contacto un polipéptido o una célula que expresa un polipéptido según la reivindicación 8 con un anticuerpo que se une con el polipéptido en una concentración suficiente para modular la actividad del polipéptido.
24. Un procedimiento para identificar un compuesto que modula la actividad de un polipéptido según la reivindicación 8, que comprende:
a) poner en contacto un polipéptido según la reivindicación 8 con un compuesto de prueba; y
b) determinar el efecto del compuesto de prueba sobre la actividad del polipéptido para identificar de ese modo un compuesto que modula la actividad del polipéptido.
25. Uso de un anticuerpo que modula la actividad de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 80% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y que tiene actividad quinasa, en la fabricación de un medicamento para modular la capacidad de una célula para catalizar la interconversión de las formas fosforiladas y desfosforiladas de una proteína GTPasa.
26. Uso de un ácido nucleico antisentido o una ribozima que modula la expresión de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3 y que codifica para un polipéptido que tiene actividad quinasa, en la fabricación de un medicamento para modular la capacidad de una célula para catalizar la interconversión de las formas fosforiladas y desfosforiladas de una proteína GTPasa.
27. Uso según la reivindicación 26, en el que el ácido nucleico antisentido hibrida en condiciones rigurosas con transcrito del gen 13245.
28. Uso según la reivindicación 27, en el que el ácido nucleico antisentido comprende al menos 15 residuos de nucleótidos.
29. Uso según la reivindicación 27, en el que el transcrito es un ARNm.
30. Uso según la reivindicación 26, en el que el ácido nucleico antisentido hibride en condiciones rigurosas con un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.
31. Uso según la reivindicación 26, en el que el ácido nucleico antisentido hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3.
32. Un procedimiento in vitro para evaluar si un compuesto de prueba es útil para modular al menos un fenómeno seleccionado del grupo constituido por (1) interconversión de las formas fosforiladas y desfosforiladas de un residuo de serina, treonina o tirosina de una proteína GTPasa; (2) contractilidad celular; (3) crecimiento celular; (4) conductividad celular; (5) entrada de una célula en el ciclo celular; (6) progresión de una célula a través del ciclo celular; (7) mitogénesis; (8) metabolismo celular; (9) transcripción génica; (11) citocinesis; (12) forma celular; (13) movimiento celular; (14) integración de un genoma viral en el genoma de una célula huésped; (15) mantenimiento de un genoma viral en el genoma de una célula huésped; (16) un cambio citológico en una célula huésped infectada por virus; (17) producción viral en una célula huésped infectada por virus; (18) interacción de un virión con una membrana de una célula huésped infectada por virus; y (19) encapsulación de un virión dentro de una parte de una membrana de una célula huésped infectada por virus, comprendiendo el procedimiento:
a) añadir el compuesto de prueba a una primera composición que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 80% a SEQ ID NO: 2 y que muestra una actividad quinasa; y
b) comparar la actividad quinasa en la primera composición y en una segunda composición que es sustancialmente idéntica a la primera composición excepto en que no comprende el compuesto de prueba,
mediante el cual una diferencia en la actividad quinasa en la primera y segunda composiciones es una indicación de que el compuesto de prueba es útil para modular el fenómeno.
33. Procedimiento según la reivindicación 32, en el que la actividad es actividad quinasa GTPasa.
34. Procedimiento según la reivindicación 32, en el que la proteína tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
35. Procedimiento según la reivindicación 32, en el que la composición comprende una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para la proteína.
36. Procedimiento según la reivindicación 35, en el que el ácido nucleico es el genoma de la célula.
37. Procedimiento según la reivindicación 35, en el que el ácido nucleico comprende el gen 13245.
38. Un procedimiento in vitro, para evaluar si un compuesto prueba es útil para modular al menos un fenómeno seleccionado del grupo constituido por (1) interconversión de las formas fosforiladas y desfosforiladas de un residuo de serina, treonina o tirosina de una proteína GTPasa; (2) contractilidad celular; (3) crecimiento celular; (4) conductividad celular; (5) entrada de una célula en el ciclo celular; (6) progresión de una célula a través del ciclo celular; (7) mitogénesis; (8) metabolismo celular; (9) transcripción génica; (11) citocinesis; (12) forma celular; (13) movimiento celular; (14) integración de un genoma viral en el genoma de una célula huésped; (15) mantenimiento de un genoma viral en el genoma de una célula huésped; (16) un cambio citológico en una célula huésped infectada por virus; (17) producción viral en una célula huésped infectada por virus; (18) interacción de un virión con una membrana de una célula huésped infectada por virus; y (19) encapsulación de un virión dentro de una parte de una membrana de una célula huésped infectada por virus, comprendiendo el procedimiento:
a) añadir el compuesto de prueba a una primera composición que comprende una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 80% a SEQ ID NO: 2 y que muestra una actividad quinasa; y
b) comparar la actividad quinasa en la primera composición y en una segunda composición que es sustancialmente idéntica a la primera composición excepto en que no comprende el compuesto de prueba,
mediante el cual una diferencia en la actividad quinasa en la primera y segunda composiciones es una indicación de que el compuesto de prueba es útil para modular el fenómeno.
39. Un procedimiento de preparación de una composición farmacéutica para modular al menos un fenómeno seleccionado del grupo constituido por (1) interconversión de las formas fosforiladas y desfosforiladas de un residuo de serina, treonina o tirosina de una proteína GTPasa; (2) contractilidad celular; (3) crecimiento celular; (4) conductividad celular; (5) entrada de una célula en el ciclo celular; (6) progresión de una célula a través del ciclo celular; (7) mitogénesis; (8) metabolismo celular; (9) transcripción génica; (11) citocinesis; (12) forma celular; (13) movimiento celular; (14) integración de un genoma viral en el genoma de una célula huésped; (15) mantenimiento de un genoma viral en el genoma de una célula huésped; (16) un cambio citológico en una célula huésped infectada por virus; (17) producción vira) en una célula huésped infectada por virus; (18) interacción de un virión con una membrana de una célula huésped infectada por virus; y (19) encapsulación de un virión dentro de una parte de una membrana de una célula huésped infectada por virus, comprendiendo el procedimiento:
a) seleccionar un anticuerpo, una molécula de ácido nucleico antisentido o una ribozima útil para modular al menos uno de dichos fenómenos según el procedimiento de la reivindicación 36; y
b) combinar el anticuerpo, la molécula de ácido nucleico antisentido o la ribozima con un vehículo farmacéuticamente aceptable para preparar la composición farmacéutica.
40. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 41, en la fabricación de un medicamento para modular, en un ser humano, al menos un fenómeno seleccionado del grupo constituido por (1) interconversión de las formas fosforiladas y desfosforiladas de un residuo de serina, treonina o tirosina de una proteína GTPasa; (2) contractilidad celular; (3) crecimiento celular; (4) conductividad celular; (5) entrada de una célula en el ciclo celular; (6) progresión de una célula a través del ciclo celular; (7) mitogénesis; (8) metabolismo celular; (9) transcripción génica; (11) citocinesis; (12) forma celular; (13) movimiento celular; (14) integración de un genoma vira) en el genoma de una célula huésped; (15) mantenimiento de un genoma viral en el genoma de una célula huésped; (16) un cambio citológico en una célula huésped infectada por virus; (17) producción viral en una célula huésped infectada por virus; (18) interacción de un virión con una membrana de una célula huésped infectada por virus; y (19) encapsulación de un virión dentro de una parte de una membrana de una célula huésped infectada por virus.
41. Un procedimiento in vitro para identificar un compuesto útil para modular al menos un fenómeno seleccionado del grupo constituido por (1) interconversión de las formas fosforiladas y desfosforiladas de un residuo de serina, treonina o tirosina de una proteína GTPasa; (2) contractilidad celular; (3) crecimiento celular; (4) conductividad celular; (5) entrada de una célula en el ciclo celular; (6) progresión de una célula a través del ciclo celular; (7) mitogénesis; (8) metabolismo celular; (9) transcripción génica; (11) citocinesis; (12) forma celular; (13) movimiento celular; (14) integración de un genoma viral en el genoma de una célula huésped; (15) mantenimiento de un genoma viral en el genoma de una célula huésped; (16) un cambio citológico en una célula huésped infectada por virus; (17) producción viral en una célula huésped infectada por virus; (18) interacción de un virión con una membrana de una célula huésped infectada por virus; y (19) encapsulación de un virión dentro de una parte de una membrana de una célula huésped infectada por virus, comprendiendo el procedimiento:
a) poner en contacto el compuesto de prueba y un polipéptido seleccionado del grupo constituido por
i)
un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una parte que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos 80% a una de SEQ ID NO: 1 y 3 y que codifica para un polipéptido que tiene actividad quinasa; y
ii)
un fragmento de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 2, en el que el fragmento comprende al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2 o una célula que expresa el polipéptido; y
b) determinar si el polipéptido se une con el compuesto de prueba, mediante el cual la unión del polipéptido y el compuesto prueba es una indicación de que el compuesto de prueba es útil para modular el fenómeno.
42. Procedimiento según la reivindicación 41, en el que el polipéptido muestra un epítopo en común con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
ES01985157T 2000-10-23 2001-10-23 13245, proteina quinasa de tipo distrofia miotonica humana novedosa y usos de la misma. Expired - Lifetime ES2279833T3 (es)

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