DE69837085T2

DE69837085T2 - Crsp-proteine (cystein-reiche, sekretierte proteine), die dafür kodierenden nukleinsäuren und ihre verwendungen

Info

Publication number: DE69837085T2
Application number: DE69837085T
Authority: DE
Inventors: A. Sean Boston MCCARTHY
Original assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1998-04-16
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2018-04-17
Also published as: EP1852507B1; AU2009227915A1; EP2298899A3; JP2010011853A; PT975755E; ES2285768T3; AU7137398A; ES2285768T5; EP0975755B9; DE69842225D1; JP2001524824A; ATE505543T1; EP2298899A2; EP0975755A1; JP2006166917A; DE69837085T3; CA2288430A1; CY1107629T1; JP2010227110A; DK0975755T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Sekretierte Proteine spielen bei der Bildung, der Differenzierung und der Erhaltung von Zellen in mehrzelligen Organismen eine wichtige Rolle. So ist beispielsweise im Stand der Technik bekannt, dass sekretorische Proteine bei der Signalübermittlung, bzw. bei der Signalisierung zwischen Zellen, die nicht unmittelbar in Kontakt stehen, beteiligt sind. Derartige sekretierte Signalmoleküle sind bei der Entwicklung von Vertebratengeweben während der Embryogenese als auch bei der Erhaltung des Differenzierungszustands/stadiums adulter/erwachsener Gewebe besonders wichtig. In dem sich entwickelnden Embryo sind beispielsweise induktive Wechselwirkungen, die zwischen benachbarten Zellschichten und Geweben auftreten, weitgehend von dem Auftreten und der Regulation sekretierter Signalmoleküle abhängig. Bei induktiven Wechselwirkungen beeinflussen durch eine Zellpopulation sekretierte biochemische Signale das entwicklungsgemäße Schicksal einer zweiten Zellpopulation, indem gewöhnlich das Schicksal der zweiten Zellpopulation geändert wird. So sind beispielsweise die Wnt-Proteine nun als eine der wichtigen Familien von für die Entwicklung bedeutsamer Signalmoleküle in Organismen, die von Drosophila bis zur Maus reichen, anerkannt. Zur Übersicht siehe Cadigan, K.M. and R. Nusse Genes & Development, 11 (1997), 3286-3305.
Weiter ist wohlbekannt, dass wichtigen Familien von Signalmolekülen bei sowohl der Entwicklung eines Organismus als auch bei der Förderung oder Erhaltung des differenzierten Zustands von Geweben in einem erwachsen Tier eine zweifache Rolle spielen müssen. Die wichtigen Darüber hinaus wurde Familien der Signalmoleküle mit einer Steuerung der Zellproliferation in reifen adulten Geweben, beispielsweise während des/der normalen Zellstoffumsatzes/-erneuerung (turnover) in dem adulten Organismus als auch bei Geweberegeneration in Beziehung gebracht, die als Ergebnis einer Schädigung des adulten Gewebes aktiviert wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung gründet, zumindest teilweise, auf dem Auffinden von Nukleinsäuremolekülen, die eine neue Familie von sekretierten/sezernierten Proteinen co dieren, welche hier als die sekretierten Cystein-reichen Proteine ("CRSP" oder CRSP-Proteine") bezeichnet werden. Die CRSP-Moleküle der vorliegenden Erfindung sind als modulierende Mittel bei der Regulation einer Vielzahl zellulärer Vorgänge nützlich. Demgemäß stellt diese Erfindung in einer Ausführungsform isolierte Nukleinsäuremoleküle bereit, die CRSP-Proteine oder biologisch aktive Bereiche davon codieren, sowie auch Nukleinsäurefragmente, die als Primer oder Hybridisierungssonden für die Detektion von durch CRSP codierten Nukleinsäuren geeignet sind.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein CRSP-Nukleinsäuremolekül bereit, das wie in den beigefügten Ansprüchen definiert ist.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Vektor bereitgestellt, der ein CRSP-Nukleinsäuremolekül umfasst. In bestimmten Ausführungsformen ist der Vektor ein rekombinanter Expressionsvektor. In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Wirtszelle bereit, die einen erfindungsgemässen Vektor beinhaltet. Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines CRSP-Proteins bereit, bei dem eine erfindungsgemässe Wirtszelle, die einen rekombinanten Expressionsvektor beinhaltet in einem geeigneten Medium gezüchtet wird, so dass CRSP-Protein hergestellt wird.
Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft diese Erfindung isolierte oder rekombinante CRSP-Proteine und Polypeptide. In einer Ausführungsform weist ein isoliertes CRSP-Protein eine Signalsequenz und mindestens eine Cystein-reiche Domäne, vorzugsweise einen Cystein-reichen Bereich, auf, und wird sekretiert. In einer anderen Ausführungsform weist ein isoliertes Protein eine Aminosäuresequenz auf, wie sie in den beigefügten Ansprüchen definiert ist.
Die CRSP-Proteine der vorliegenden Erfindung oder biologisch aktive Bereiche davon können an ein Nicht-CRSP-Polypeptid betriebsbereit gekoppelt werden, um CRSP-Fusionsproteine zu bilden. Die Erfindung betrifft weiter Antikörper, wie beispielsweise monoklonale oder polyklonale Antikörper, die CRSP-Proteine spezifisch binden. Außerdem können die CRSP-Proteine oder biologisch aktiven Bereiche davon in pharmazeutische Zusammensetzungen eingebracht werden, die wahlweise pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Detektion einer CRSP-Expression in einer biologischen Probe bereit, bei dem die biologische Probe mit einem Mittel in Kontakt gebracht wird, das ein CRSP-Nukleinsäuremolekül, Protein oder Polypeptid detektieren kann, so dass die Anwesenheit eines CRSP-Nukleinsäuremoleküls, Proteins oder Polypeptids in einer biologische Probe detektiert wurde.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Detektieren einer CRSP-Aktivität in einer biologischen Probe bereit, bei dem die biologische Probe mit einem Mittel in Kontakt gebracht wird, das einen Indikator einer CRSP-Aktivität detektieren kann, so dass die Anwesenheit einer CRSP-Aktivität in der biologischen Probe detektiert wurde.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Modulieren einer CRSP-Aktivität bereit, welches umfasst, Inkontaktbringen der Zelle mit einem Mittel, das CRSP-Aktivität moduliert, so dass CRSP-Aktivität in der Zelle moduliert wird. In einer Ausführungsform hemmt das Mittel die CRSP-Aktivität. In einer anderen Ausführungsform stimuliert das Mittel die CRSP-Aktivität. In einer Ausführungsform liegt das Mittel als ein Antikörper vor, der an ein CRSP-Protein spezifisch bindet. In einer anderen Ausführungsform moduliert das Mittel eine CRSP-Expression, indem die Transkription eines CRSP-Gens oder die Translation einer CRSP-mRNA moduliert wird. In noch einer anderen Ausführungsform liegt das Mittel als ein Nukleinsäuremolekül vor, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die in zu dem codierenden Strang einer CRSP-mRNA oder eines CRSP-Gens antisense ist.
Die Verfahren, die auf der vorliegenden Erfindung basieren, können dazu verwendet werden, um ein Subjekt mit einer Störung zu behandeln, die durch anormales CRSP-Protein oder Nukleinsäureexpression oder Aktivität gekennzeichnet ist, indem einem Subjekt ein Mittel, das ein CRSP-Modulator ist, verabreicht wird. In einer Ausführungsform liegt der CRSP-Modulator als ein CRSP-Protein vor. In einer anderen Ausführungsform liegt der CRSP-Modulator als ein CRSP-Nukleinsäuremolekül vor. In noch einer anderen Ausführungsform liegt der CRSP-Modulator als ein Peptid, Peptidomimetikum oder anderes kleines Molekül vor. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die durch ein anormales CRSP-Protein oder Nukleinsäureexpression eine Entwicklungs-, Differenzierungs- oder proliferative Störung.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls einen Diagnose-Assay zum Identifizieren der Anwesenheit oder Abwesenheit einer genetischen Veränderung bereit, die durch mindestens eines von (i) anormaler Modifikation oder Mutation eines Gens, das ein CRSP-Protein codiert, (ii) der Fehlregulation des Gens und (iii) anormaler post-translationaler Modifikation eines CRSP-Proteins gekennzeichnet ist, worin ein Wildtyp des Gens ein Protein mit einer CRSP-Aktivität codiert.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung bereit, die an ein CRSP-Protein bindet oder die Aktivität davon moduliert, indem eine Indikatorzusammensetzung bereitgestellt wird, die ein CRSP-Protein mit CRSP-Aktivität umfasst, Inkontaktbringen der Indikatorzusammensetzung mit einer Testverbindung, und Bestimmen der Wirkung der Testverbindung auf die CRSP-Aktivität in der Indikatorzusammensetzung, um eine Verbindung zu identifizieren, die die Aktivität eines CRSP-Protein moduliert.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und Ansprüchen offenbar werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt die cDNA-Sequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des humanen CRSP-1 dar. Die Nukleotidsequenz entspricht den Nukleinsäuren 1 bis 2479 der SEQ ID NO:1. Die Aminosäuresequenz entspricht den Aminosäuren 1 bis 350 der SEQ ID NO:2.
2 stellt die cDNA-Sequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des humanen CRSP-2 dar. Die Nukleotidsequenz entspricht den Nukleinsäuren 1 bis 848 der SEQ ID NO:4. Die Aminosäuresequenz entspricht den 1 bis 224 der SEQ ID NO:5.
3 stellt die cDNA-Sequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des humanen CRSP-3 dar. Die Nukleotidsequenz entspricht den Nukleinsäuren 1 bis 1529 der SEQ ID NO:7. Die Aminosäuresequenz entspricht den Aminosäuren 1 bis 266 der SEQ ID NO:8.
4 stellt die cDNA-Sequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des humanen CRSP-4 dar. Die Nukleinsäuresequenz entspricht den Nukleinsäuren 1 bis 702 der SEQ ID NO: 10. Die Aminosäuresequenz entspricht den Aminosäuren 1 bis 179 der SEQ ID NO: 11.
5 stellt die cDNA-Sequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des humanen CRSP-ähnlichen-N dar. Die Nukleinsäuresequenz entspricht den Nukleinsäuren 1 bis 928 der SEQ ID NO:13. Die Aminosäuresequenz entspricht den Aminosäuren 1 bis 242 der SEQ ID NO:14.
6 stellt die Aminosäuresequenzen von CRSP-1 des Menschen, CRSP-2 des Menschen, CRSP-3 des Menschen und CRSP-4 des Menschen dar, als auch die Konsensussequenz, die aus der Ausrichtung/Angleichung dieser Sequenzen erzeugt wurde. Die Figur zeigt das Verhältnis zwischen den CRSP-Proteinen der vorliegenden Erfindung aus.
7 stellt ein schematisches Diagramm dar, das die Beziehung zwischen den CRSP-Proteinen der vorliegenden Erfindung darstellt. Die Figur stellt die biologische und funktionelle Domäne des humanen CRSP dar. Die Signalpeptide sind durch gefüllte Boxen gezeigt. Die Cystein-reichen Domänen eines Cystein-reichen CRSP-Bereichs sind als CRD-1 and CRD-2 dargestellt.
8 stellt die cDNA-Sequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des CRSP-1 der Maus dar. Die Nukleotidsequenz entspricht den Nukleinsäuren 1 bis 928 der SEQ ID NO:16. Die Aminosäuresequenz entspricht den Aminosäuren 1 bis 349 der SEQ ID NO:17.
9 ist ein schematisches Diagramm, das die Beziehung zwischen der CRSP- 1 Nukleotidsequenz und jenen von RIG und RIG-ähnlichem 7-1 (Hinterlegungsnummer. U32331 beziehungsweise AF034208).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Auffinden von neuen Molekülen, die hier als CRSP-Protein und Nukleinsäuremolekül bezeichnet werden, die eine Molekülfamilie umfasst, die bestimmte konservierte strukturelle und funktionelle Merkmale aufweist. Der Begriff "Familie" soll, wenn er sich auf die Protein- und Nukleinsäuremoleküle der Erfindung bezieht, bedeuten, dass zwei oder mehr Proteine oder Nukleinsäuremoleküle eine gemeinsame strukturelle Domäne aufweisen und eine wie hier definierte ausreichende Aminosäure- oder Nukleotidsequenz-Homologie aufweisen. Derartige Familienmitglieder können natürlich vorkommen und können entweder von der gleichen oder unterschiedlichen Spezies abgeleitet sein. Beispielweise kann eine Familie ein erstes Protein menschlichen Ursprungs als auch andere, unterschiedliche Proteine menschlichen Ursprungs beinhalten, oder kann alternativer Homologe nicht menschlichen Ursprungs beinhalten. Die Mitglieder einer Familie können gemeinsame funktionelle Eigenschaften aufweisen.
In einer Ausführungsform wird, basierend auf der Anwesenheit von mindestens einer "Cystein-reichen Domäne" in dem Protein oder dem entsprechenden Nukleinsäuremolekül, ein CRSP-Familienmitglied identifiziert. Wie hier definiert, betrifft eine "Cystein-reiche Domäne" einen Bereich eines CRSP-Proteins (beispielsweise CRSP-1), das reich an Cystein resten ist, d.h. in dem mindestens ungefähr 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, oder 20 Aminosäuren Cysteinreste sind. Vorzugsweise ist eine "Cystein-reiche Domäne" eine Proteindomäne, die eine Aminosäuresequenz von ungefähr 30-100 Aminosäuren aufweist, vorzugsweise ungefähr 35-95 Aminosäuren, noch bevorzugter ungefähr 40-90 Aminosäuren, noch bevorzugter ungefähr 45-85 Aminosäuren, sogar noch bevorzugter ungefähr 50-80 Aminosäuren und sogar noch bevorzugter ungefähr 55-75, 60-70, oder 65 Aminosäuren, von denen mindestens ungefähr 3-20, vorzugsweise ungefähr 5-15, oder noch bevorzugter ungefähr 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, oder 20 Aminosäuren Cysteinreste sind.
Eine bevorzugte Cystein-reiche Domäne weist mindestens ungefähr 10, mindestens ungefähr 15, 16, 17, 18, 19 oder vorzugsweise 20 Cysteinreste auf, die an der gleichen relativen Aminosäureposition, wie die Cysteinreste in CRSP-1 des Menschen mit SEQ ID NO:2, lokalisiert sind. So weist beispielsweise, wie in 6 gezeigt, CRSP-2 mindestens ungefähr 10 Cysteinreste auf, die an der gleichen relativen Aminosäureposition lokalisiert ist, wie die Cysteinreste in CRSP-1 des Menschen mit SEQ ID NO:2 (beispielsweise Cys151 in CRSP-2, SEQ ID NO:5, ist an der gleichen relativen Aminosäureposition wie Cys214 in CRSP-1, SEQ ID NO:2 lokalisiert; Cys156 in CRSP-2, SEQ ID NO:5, ist an der gleichen relativen Aminosäureposition wie Cys219 in CRSP-1, SEQ ID NO:2 lokalisiert; und Cys157 in CRSP-2, SEQ ID NO:5, ist an der gleichen relativen Aminosäureposition wie Cys220 in CRSP-1, SEQ ID NO:2 lokalisiert). In vergleichbarer Art und Weise weist, wie in 6 gezeigt, CRSP-3 mindestens ungefähr 10 Cysteinreste auf, die an der gleichen relativen Aminosäureposition, wie die Cysteinreste in CRSP-1 des Menschen mit SEQ ID NO:2, lokalisiert sind. Wie in 6 gezeigt, weist CRSP-4 mindestens ungefähr 10 Cysteinreste auf, die an der gleichen relativen Aminosäureposition, wie die Cysteinreste in CRSP-1 des Menschen mit SEQ ID NO:2, lokalisiert sind.
Ein bevorzugtes CRSP-Protein der vorliegenden Erfindung liegt als ein menschliches Protein (beispielsweise durch eine Nukleotidsequenz codiert, die einem natürlich vorkommenden Gen entspricht) vor. So beinhaltet beispielsweise in einer Ausführungsform ein CRSP-1 Protein (CRSP-1 des Menschen) eine erste Cystein-reiche Domäne, die ungefähr 147-195 Aminosäuren der SEQ ID NO:2 mit 10 Cysteinresten umfasst und eine zweite Cystein-reiche Domäne, die ungefähr 201-284 Aminosäuren der SEQ ID NO:2 mit 10 Cysteinresten (die Positionen der Cysteinreste sind in 6 dargestellt) umfasst. in einer anderen Ausführungsform beinhaltet ein CRSP-2 Protein (CRSP-2 des Menschen) eine erste Cystein-reiche Domäne, die ungefähr die Aminosäuren 41-90 der SEQ ID NO:2 mit 10 Cysteinresten umfasst, und eine zweite Cystein-reiche Domäne, die ungefähr die Aminosäuren 41-218 der SEQ ID NO:5 mit 10 Cysteinresten (die Positionen der Cysteinreste sind in 6 dargestellt) umfasst. In einer anderen Ausführungsform beinhaltet ein CRSP-3 Protein (CRSP-3 des Mensachen) eine erste Cystein-reiche Domäne, die ungefähr die Aminosäuren 85-138 der SEQ ID NO:8 mit 10 Cysteinresten umfasst, und eine zweite Cystein-reiche Domäne beinhaltet, die ungefähr die Aminosäuren 182-2163 der SEQ ID NO:8 mit 10 Cysteinresten (die Positionen der Cysteinreste sind in 6 dargestellt) umfasst. In einer anderen Ausführungsform beinhaltet ein CRSP-4 Protein (CRSP-4 des Menschen) eine erste Cystein-reiche Domäne, die ungefähr die Aminosäuren 1-47 der SEQ ID NO:11 mit 8 Cysteinresten umfasst, und eine zweite Cystein-reiche Domäne, die ungefähr die Aminosäuren 96-176 der SEQ ID NO:11 mit 10 Cysteinresten (die Positionen des Cysteinreste sind in 6 dargestellt) umfasst.
Bevorzugte CRSP-Proteine weisen mehr als eine Cystein-reiche Domäne auf, noch bevorzugter mindestens zwei Cystein-reiche Domänen, wobei sie damit einen Cystein-reichen Bereich aufweisen. Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Cystein-reicher Bereich" auf eine Proteindomäne, die mindestens zwei Cystein-reiche Domänen umfasst und eine Aminosäuresequenz von ungefähr 120-200, vorzugsweise ungefähr 130-190, noch bevorzugter ungefähr 140-180 Aminosäureresten, aufweist und sogar noch bevorzugter mindestens ungefähr 135-175 Aminosäuren, von denen mindestens ungefähr 10-30, vorzugsweise ungefähr 15-20 und noch bevorzugter ungefähr 16, 17, 18, oder 19 der Aminosäuren Cysteinreste sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Cystein-reicher Bereich/Region in der C-Terminalen Region eines CRSP-Proteins lokalisiert. Beispielsweise beinhaltet in einer Ausführungsform ein CRSP-1 Protein eine Cystein-reiche Region, die ungefähr die Aminosäuren 147-284 der SEQ ID NO:2 mit 20 Cysteinresten an den in 6 gezeigten Positionen umfasst. In einer anderen Ausführungsform beinhaltet ein CRSP-2 Protein eine Cystein-reiche Region, die ungefähr die Aminosäuren 41-218 der SEQ ID NO:5 mit 20 Cysteinresten an den in 6 gezeigten Positionen umfasst. In einer anderen Ausführungsform beinhaltet ein CRSP-3 Protein eine Cystein-reiche Region, die ungefähr die Aminosäuren 85-263 der SEQ ID NO:8 mit 20 Cysteinresten an den in 6 gezeigten Positionen umfasst. In einer anderen Ausführungsform beinhaltet ein CRSP-4 Protein eine Cystein-reiche Region, die ungefähr die Aminosäuren 1-76 der SEQ ID NO:2 mit 18 Cysteinresten an den in 6 gezeigten Positionen umfasst.
In einer anderen Ausführungsform beinhaltet die Cystein-reiche Region zusätzlich zu der Cystein-reichen Domäne eine Spacer- beziehungsweise Abstands-Region, die die erste und zweite Cystein-reiche Domäne trennt. Wie hier verwendet, bezieht sich die "Spacerregion" auf Aminosäurereste, die zwischen der ersten und der zweiten Cystein-reichen Domäne einer Cystein-reichen Region lokalisiert sind und Aminosäurereste umfassen, die C-terminal zu der ersten Cystein-reichen Domäne und N-terminal zu der zweiten Cysteinreichen Domäne lokalisiert ist. Wie hier definiert, bezieht sich eine "Spacerregion" auf eine Proteindomäne von ungefähr 5-70 Aminosäuren, vorzugsweise ungefähr 10-65 Aminosäuren, noch bevorzugter ungefähr 15-60 Aminosäuren, sogar noch bevorzugter ungefähr 20-55 Aminosäuren und sogar noch bevorzugter ungefähr 25-50, 30-45 oder 35-40 Aminosäuren. Das CRSP-1 Protein beinhaltet beispielsweise eine Spacerregion von ungefähr den Aminosäuren 196-200 der SEQ ID NO:2, das CRSP-2 Protein beinhaltet eine Spacerregion von ungefähr den Aminosäuren 91-137 von SEQ IDNO:5, das CRSP-3 Protein beinhaltet eine Spacerregion von ungefähr den Aminosäuren 139-181 der SEQ ID NO:8, und das CRSP-4 Protein beinhaltet eine Spacerregion von ungefähr den Aminosäuren 48-95 der SEQ ID NO:11.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung weist das CRSP-Protein mindestens eine Cystein-reiche Domäne auf, vorzugsweise eine Cystein-reiche Region und eine Signalsequenz. Wie hier verwendet, betrifft eine "Signalsequenz" ein Peptid, das ungefähr 20 Aminosäuren umfasst, die an dem N-Terminus von sekretorischen und integralen Membranproteinen vorkommen und die eine große Anzahl hydrophober Aminosäurereste beinhalten. Eine Signalsequenz beinhaltet beispielsweise mindestens ungefähr 14-28 Aminosäurereste, vorzugsweise ungefähr 16-26 Aminosäurereste, noch bevorzugter ungefähr 18-24 Aminosäurereste und noch bevorzugter ungefähr 20-22 Aminosäurereste, und weist mindestens ungefähr 40-70%, vorzugsweise ungefähr 50-65% und noch bevorzugter ungefähr 55-60% hydrophobe Aminosäurereste (beispielsweise Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, oder Prolin) auf. Eine derartige "Signalsequenz" wird im Stand der Technik auch als "Signalpeptid" bezeichnet, das dazu dient, ein eine derartige Sequenz umfassendes Protein auf eine Lipid-Doppeaschicht auszurichten. In einer Ausführungsform beinhaltet beispielsweise ein CRSP-1 Protein eine Signalsequenz von ungefähr den Aminosäuren 1-23 der SEQ ID NO:2. I einer anderen Ausführungsform beinhaltet ein CRSP-2 Protein eine Signalsequenz von ungefähr den Aminosäuren 1-19 der SEQ ID NO:5. In einer anderen Ausführungsform beinhaltet ein CRSP-3 Protein eine Signalsequenz von ungefähr den Aminosäuren 1-20 der SEQ ID NO:8.
CRSP-Proteine der vorliegenden Erfindung können dazu verwendet werden, zusätzliche CRSP-Familienmitglieder zu identifizieren. So wurde beispielsweise ein Protein mit einer Homologie zu CRSP-1 identifiziert, indem die Nukleotidsequenz verwendet wurde, die die einzigartige N-terminale Region von CRSP-1 codiert, um eine Proteinsequenzdatenbank zu durchsuchen. Ein derartiges Protein, das hier als "CRSP-ähnliches-N" bezeichnet wird, ist in 5 dargestellt. Die Nukleotidsequenz von CRSP-ähnlichem-N (SEQ ID NO:13) codiert ein Protein mit 242 Aminosäuren (SEQ ID NO:14). Die Nukleotidsequenz von CRSP-ähnlichem-N umfasst eine 5' nicht-translatierte Region, die die Nukleotide 1-74 der SEQ ID NO:13 umfasst, eine codierende Region, die die Nukleotide 75-800 der SEQ ID NO:13 (entsprechend den Nukleotiden 1-726 der SEQ ID NO:15) umfasst und eine 3' nichttranslatierte Region, die die Nukleotide 801-928 der SEQ ID NO:13 umfasst.
Demgemäß betrifft eine Ausführungsform der Erfindung ein CRSP-Protein, das mindestens eine Cystein-reiche Domäne aufweist, vorzugsweise mindestens eine Cystein-reiche Region. Eine andere Ausführungsform betrifft ein CRSP-Protein, das mindestens eine Cystein-reiche Region aufweist, worin die Cystein-reiche Region mindestens eine Cystein-reiche Domäne umfasst. Eine andere Ausführungsform betrifft ein CRSP-Protein, das mindestens eine Cystein-reiche Region aufweist, worin die Cystein-reiche Region mindestens zwei Cystein-reiche Domänen umfasst. Eine andere Ausführungsform betrifft ein Protein mit 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, oder 99% Homologie zu einer Cystein-reiche Domäne von einem CRSP-Protein der Erfindung (beispielsweise, CRSP-1, CRSP-2, CRSP-3, oder CRSP-4).
Noch eine andere Ausführungsform betrifft ein CRSP-Protein, das mindestens eine Cystein-reiche Domäne aufweist, vorzugsweise mindestens eine Cystein-reiche Region und ein Signalpeptid. Eine andere Ausführungsform betrifft ein CRSP-Protein, das mindestens eine Cystein-reiche Domäne aufweist, vorzugsweise mindestens eine Cystein-reiche Region und ein Signalpeptid, worin die Cystein-reiche Region mindestens zwei Cystein-reiche Domänen umfasst. Eine andere Ausführungsform betrifft ein CRSP-Protein, das mindestens eine Cystein-reiche Domäne, vorzugsweise min eine Cystein-reiche Region und ein Signalpeptid umfasst, worin die Cystein-reiche Region mindestens zwei Cystein-reiche Domänen und einen Spacer/Abstandshalter umfasst.
Bevorzugte CRSP-Moleküle der vorliegenden Erfindung sind in den beigefügten Ansprüchen definiert. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "geeignet homolog" auf eine erste Aminosäure oder Nukleotidsequenz, die eine geeignete oder minimale Anzahl zu einer zweiten Aminosäure oder Nukleotidsequenz identischer oder äquivalenter (beispielsweise einen Aminosäurerest, der eine ähnliche Seitenkette aufweist) Aminosäurereste oder Nukleotide umfasst, so dass die erste und zweite Aminosäure- oder Nukleotidsequenz gemeinsame strukturelle Domänen und/oder eine gemeinsame funktionelle Aktivität teilen. Aminosäure- oder Nukleotidsequenzen, die gemeinsame strukturelle Domänen teilen, weisen beispielsweise mindestens ungefähr 40% Homologie, vorzugsweise 50% Homologie, noch bevorzugter 60%–70% Homologie über die Aminosäuresequenzen der Domänen auf und beinhalten mindestens eine, vorzugsweise zwei, noch bevorzugter drei, und wobei sogar noch bevorzugter vier, fünf oder sechs strukturelle Domänen hier als geeignet homolog definiert sind. Weiterhin werden Aminosäure- oder Nukleotidsequenzen, die mindestens 40%, vorzugsweise 50%, noch bevorzugter 60, 70, oder 80% Homologie teilen und eine gemeinsame funktionelle Aktivität teilen, wie hier als geeignet homolog definiert.
Wie hier untereinander austauschbar verwendet, betrifft der Ausdruck eine "CRSP-Aktivität", "biologische Aktivität von CRSP" oder "funktionelle Aktivität von CRSP", eine Aktivität, die durch ein CRSP-Protein, Polypeptid oder Nukleinsäuremolekül auf eine CRSP reagierende Zelle, wie in vivo oder in vitro gemäß von Standardverfahren bestimmt, ausgeübt wird. In einer Ausführungsform liegt eine CRSP-Aktivität als eine direkte Aktivität vor, die beispielsweise mit einem CRSP-Zielmolekül assoziiert ist. Wie hier verwendet ist das "Zielmolekül" ein Molekül, an das ein CRSP-Protein bindet oder in der Natur mit diesem wechselwirkt, so dass eine CRSP vermittelte Funktion erreicht wird. Ein CRSP-Zielmolekül kann ein nicht CRSP-Molekül oder ein CRSP-Protein oder Polypeptid der vorliegenden Erfindung sein. In einer beispielhaften Ausführungsform liegt das CRSP-Zielmolekül als ein an der Membran gebundenes Protein (beispielsweise ein Zell-Oberflächenrezeptor oder "CRSP-Rezeptor") vor, oder als eine modifizierte Form eines derartigen Proteins, das so geändert wurde, dass das Protein löslich ist (beispielsweise rekombinant hergestellt, so dass das Protein keine Membran-bindende Domäne exprimiert). In einer anderen Ausführungsform ist ein CRSP-Ziel ein zweites lösliches Proteinmolekül (beispielsweise ein "CRSP-Bindungspartner" oder "CRSP-Substrat"). In einer derartigen beispielhaften Ausführungsform kann ein CRSP-Bindungspartner ein zweites lösliches nicht-CRSP-Protein oder ein zweites CRSP-Proteinmolekül der vorliegenden Erfindung sein.
Alternativerweise ist eine CRSP-Aktivität eine indirekte Aktivität, wie beispielsweise eine durch eine Zelle signalisierende Aktivität, die durch Wechselwirkung des CRSP-Proteins mit einem zweiten Protein (beispielsweise einem CRSP-Rezeptor) vermittelt wird. Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck "CRSP-Rezeptor" ein Protein oder einen Proteinkomplex, an den ein CRSP-Protein, beispielsweise ein humanes CRSP, binden kann. Ein Rezeptor kann ein Zell-Oberflächenrezeptor, beispielsweise ein im Kern befindlicher Hormonrezeptor, sein. CRSP-Rezeptoren können durch im Stand der Technik bekannte und weiter hier beschriebene Verfahren isoliert werden. Eine Wechselwirkung eines CRSP-Proteins mit einem CRSP-Rezeptor kann zu einer Transduktion/Übertragung eines Signals von der Zell-Oberfläche in den Kern führen. Das transduzierte Signal kann ein Anstieg in intrazellulärem Calcium, ein Anstieg in Phosphatidylinositol oder einem anderen Molekül bestehen, und kann beispielsweise zur Phosphorylierung eines spezifischen Proteins, einer Modulation einer Gentranskription und einer beliebigen anderen hier dargestellten biologischen Aktivität führen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform besteht eine CRSP-Aktivität aus mindestens einer oder mehreren der folgenden Aktivitäten: (i) Wechselwirkung eines CRSP-Proteins mit und/oder Bindung an ein zweites Molekül (beispielsweise ein Protein, wie beispielsweise einen CRSP-Rezeptor, eine lösliche Form eines CRSP-Rezeptors, einen Rezeptor für ein Mitglied der wnt-Familie der Signalmoleküle, oder ein Nicht-CRSP-Signalmolekül), (ii) Wechselwirkung eines CRSP-Proteins mit einem intrazellulären Protein über ein an eine Membran gebundenen CRSP-Rezeptor, (iii) Komplexbildung zwischen einem löslichen CRSP-Protein und einem zweiten löslichen CRSP-Bindungspartner (beispielsweise einem Nicht-CRSP-Proteinmolekül oder einem zweiten CRSP-Proteinmolekül), (iv) Wechselwirkung mit anderen extrazellulären Proteinen (beispielsweise Regulation von wnt-abhängiger Zelladhäsion an extrazelluläe Matrixbestandteile), (v) Bindung an und Eliminierung eines unerwünschten Moleküls (beispielsweise eine detoxifizierende/entgiftende Aktivität oder Abwehrfunktion), und/oder (vi) einer enzymatischen Aktivität. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist eine CRSP-Aktivität mindestens eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten: (1) Modulation einer entweder in vitro oder in vivo zellulären Signaltransduktion (beispielsweise Antagonismus der Aktivität von Mitgliedern der wnt-Familie von sekretierten Proteinen oder Unterdrückung von wnt-abhängiger Signaltransduktion), (2) Regulation einer Kommunikation zwischen Zellen (beispielsweise Regulation von wnt-abhängigen Zell-Zell-Wechselwirkungen), (3) Regulation einer Expression von Genen, deren Expression durch Bindung von CRSP (beispielsweise CRSP-1) an einen Rezeptor moduliert wird), (4) Regulation einer Gentranskription in einer Zelle, die entweder in vitro oder in vivo an der Entwicklung oder Differenzierung (beispielsweise Induktion von zellulärer Differenzierung) beteiligt ist, (5) Regulation einer Gentranskription in einer Zelle, die an der Entwicklung oder Differenzierung beteiligt ist, wobei mindestens ein Gen ein für die Differenzierung spezifisches Protein codiert, (6) Regulation einer Gentranskription in einer Zelle, die an der Entwicklung oder Differenzierung, wobei mindestens ein Gen ein zweites sekretiertes Protein codiert, (7) Regulation einer Gentranskription in einer Zelle, die an der Entwicklung oder Differenzierung beteiligt ist, wobei mindestens ein Gen ein Signaltransduktionsmolekül codiert; (8) Regulation einer zellulären Proliferation entweder in vitro oder in vivo (beispielsweise Induktion einer zellulären Proliferation oder Hemmung einer Proliferation, wie im Fall einer Unterdrückung einer Tumorgenese (beispielsweise Unterdrückung beziehungsweise Suppression einer Glioblastombildung), (9) Bildung und Erhaltung von geordnetem räumlichem Aufbau/Anordnung von sowohl adulten als auch embryonalen differenzierten Geweben in Vertebraten, (beispielsweise Induktion einer Kopfbildung während der Vertebratenentwicklung oder Erhaltung hämatopetischer Vorläuferzellen), (10) Modulation von Zelltod, wie beispielsweise Stimulation eines Überlebens von Zellen, (11) Regulation von Zellmigration, und/oder (12) Immunmodulation.
Wie hier bezeichnet, umfasst "für eine Differenzierung spezifische Proteine" Proteine, die an der Transition dem Übergang einer Zelle von dem undifferenzierten zu dem differenzierten Phänotyp beteiligt ist. Derartige Proteine können beispielsweise für die Differenzierung spezifische Strukturproteine oder für die Differenzierung spezifische Transkriptionsfaktoren sein. Derartige, für die Differenzierung spezifischen Proteine werden allgemein in den Zellen mit höheren Spiegeln exprimiert, die die Transition von dem nicht differenzierten zu dem differenzierten Phänotyp (beispielsweise während der embryonalen Entwicklung oder während einer Regeneration reifen Gewebes in dem adulten Tier) ausführen/richten, oder mit höheren Spiegeln verglichen zu deren nicht differenzierten Gegenstücken in vollständig differenzierten oder enddifferenzierten Zellen exprimiert werden. Ebenfalls wie hier bezeichnet, umfasst "für die Differenzierung spezifische Gene" Nukleinsäuremoleküle, die für die Differenzierung spezifische Proteine codieren.
Demgemäß betrifft die Erfindung in einer anderen Ausführungsform isolierte CRSP-Proteine und Polypeptide mit einer CRSP-Aktivität. Bevorzugte CRSP-Proteine weisen mindestens eine Cystein-reiche Region und eine CRSP-Aktivität auf. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist das CRSP-Protein mindestens eine Cystein-reiche Region auf, worin die Cystein-reiche Region mindestens eine Cystein-reiche Domäne und eine CRSP-Aktivität umfasst. in einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist das CRSP-Protein mindestens eine Cystein-reiche Region auf, worin die Cystein-reiche Region mindestens zwei Cystein-reiche Domänen und ein CRSP-Aktivität umfasst. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist das CRSP-Protein eine Cystein-reiche Region, ein CRSP-Aktivität und eine Aminosäuresequenz auf, wie sie in den beigefügten Ansprüchen definiert ist.
Die menschliche CRSP-1 cDNA, die ungefähr 2479 Nukleotide lang ist, codiert ein Protein, das ungefähr 350 Aminosäurereste lang ist. Das CRSP-Protein des Menschen umfasst eine N-terminale Signalsequenz und eine Cystein-reiche Region, die zwei Cysteinreiche Domänen umfasst. Eine Cystein-reiche CRSP-Region kann beispielsweise mindestens bei ungefähr den Aminosäuren 147-284 der SEQ ID NO:2 aufgefunden werden. Die Cysteinreiche CRSP-Region umfasst eine erste Cystein-reiche Domäne bei ungefähr den Aminosäuren 147-195 der SEQ ID NO:2 und eine zweite Cystein-reiche Domäne bei ungefähr den Aminosäuren 201-284 der SEQ ID NO:2. Das CRSP-1 Protein des Menschen ist ein sekretiertes Protein, das weiter eine Signalsequenz bei ungefähr den Aminosäuren 1-23 der SEQ ID NO:2 umfasst. Die Vorhersage eines derartigen Signalpeptids kann, beispielsweise unter Verwendung des Computeralgorithmus SIGNALP (Henrick, et al., Protein Engineering 10 (1997), 1-6), gemacht werden.
Die ungefähr 848 Nukleotide lange menschliche CRSP cDNA codiert ein Protein, das ungefähr 224 Aminosäurereste lang ist. Das CRSP-Protein des Menschen umfasst eine N-terminale Signalsequenz und eine Cystein-reiche Region, die zwei Cystein-reiche Domänen umfasst. Eine Cystein-reiche CRSP-Region kann beispielsweise zumindest von ungefähr den Aminosäuren 41-218 der SEQ ID NO:5 aufgefunden werden. Die Cystein-reiche Region von CRSP-2umfasst eine erste Cystein-reiche Domäne von ungefähr den Aminosäuren 138-218 der SEQ ID NO:5. Das CRSP-2 Protein des Menschen ist ein sekretiertes Protein, das weiterhin eine Signalsequenz bei ungefähr den Aminosäuren 1-19 der SEQ ID NO:5 umfasst.
Die ungefähr 1529 Nukleotide in der Länge umfassende CRSP-3 cDNA des Menschen codiert ein Protein mit ungefähr 266 Aminosäureresten in der Länge. Das CRSP-Protein des Menschen umfasst eine N-terminale Signalsequenz und eine Cystein-reiche Region, die zwei Cystein-reiche Domänen umfasst. Eine CRSP-Cystein-reiche Region kann beispielsweise zumindest von ungefähr den Aminosäuren 85-263 der SEQ ID NO:8 aufgefunden werden. Die Cystein-reiche Region von CRSP-3 umfasst eine erste Cystein-reiche Domäne von ungefähr den Aminosäuren 85-138 der SEQ ID NO:8 und eine zweite Cystein-reiche Domäne von ungefähr den Aminosäuren 182-263 der SEQ ID NO:2. Das CRSP-3 Protein des Menschen ist ein sekretiertes Protein, das weiterhin eine Signalsequenz bei ungefähr den Aminosäuren 1-20 der SEQ ID NO:8 umfasst.
Die ungefähr 702 Nukleotide in der Länge umfassende CRSP-4 cDNA des Menschen, codiert ein Protein, das ungefähr 179 Aminosäurereste in der Länge umfasst. Das CRSP-Protin des Menschen umfasst eine Cystein-reiche Region, die zwei Cystein-reiche Domänen umfasst. Eine CRSp-Cystein-reiche Region kann beispielsweise zumindest von ungefähr den Aminosäuren 1-176 der SEQ ID NO:11 aufgefunden werden. Die Cystein-reiche Region von CRSP-4 umfasst eine erste Cystein-reiche Domäne von ungefähr den Aminosäuren 1-47 der SEQ ID NO:11 und eine zweite Cystein-reiche Domäne von ungefähr den Aminosäuren 96-176 der SEQ ID NO:11.
Verschiedene Ausführungsformen der Erfindung werden in den folgenden Unterabschnitten ausführlicher beschrieben:
I. Isolierte Nukleinsäuremoleküle
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle, die CRSP-Proteine oder biologisch aktive Bereich davon codieren, als auch Nukleinsäurefragmente, die zur Verwendung als Hybridisierungssonden geeignet sind, um CRSP-codierende Nukleinsäuren (beispielsweise CRSP-mRNA) zu identifizieren und Fragmente zur Verwendung als PCR-Primer für die Vermehrung oder Mutation von CRSP-Nukleinsäuremolekülen. Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck "Nukleinsäuremolekül" DNA-Moleküle (beispielsweise cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (beispielsweise mRNA) und Analoge der DNA oder RNA, die unter Verwendung von Nukelotidanalogen hergestellt werden. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, wobei es jedoch vorzugsweise doppelsträngig vorliegt.
Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül ist eines, das von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt wurde, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäuren vorhanden sind. Vorzugsweise liegt eine "isolierte" Nukleinsäure frei von Sequenzen vor, die die Nukleinsäure (d.h. Sequenzen, die an den 5' und 3' Enden der Nukleinsäure lokalisiert sind) natürlicherweise in der genomischen DNA des Organismus von dem die Nukleinsäure abgeleitet ist, flankieren. In verschiedenen Ausführungsform kann beispielsweise das isolierte CRSP Nukleinsäuremolekül weniger als ungefähr 5 Kb, 4 Kb, 3 Kb, 2 Kb, 1 Kb, 0,5 Kb oder 0,1 Kb von Nukleotidsequenzen umfassen, die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in genomischer DNA der Zelle flankieren, von der die Nukleinsäure abgeleitet ist. Außerdem kann ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie beispielsweise ein cDNA-Molekül, von anderem zellulärem Material oder Kulturmedium im Wesentlichen frei sein, falls es durch rekombinante Verfahren hergestellt wurde, oder im Wesentlichen frei sein von chemischen Precursoren oder anderen Chemikalien, falls es chemisch synthetisiert wurde.
Ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, beispielsweise ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz wie es in den beigefügten Ansprüchen definiert ist, kann unter Verwendung von Standardverfahren der Molekularbiologie isoliert und die hierin befindliche Sequenzinformation bereitgestellt werden. Unter Verwendung aller oder eines Teils der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, oder SEQ ID NO:10, oder der Nukleinsäuresequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98634 hinterlegt wurde, der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98633 hinterlegt wurde, oder der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98452 als eine Hybridisierungssonde hinerlegt wurde, wobei CRSP- Nukleinsäuremoleküle unter Verwendung von Standardhybridisierung und Klonierungsverfahren (beispielsweise, wie beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) isoliert werden können.
Außerdem kann ein Nukleinsäuremolekül, das alle oder eine Teil von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, oder SEQ ID NO:10 umfasst, oder die Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmid, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98634 hinterlegt wurde, oder die Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98633 hinterlegt wurde, oder die Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98452 hinterlegt wurde durch die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) unter Verwendung synthetischer Oligonukleotidprimer isoliert werden, die basierend auf der Sequenz von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, oder SEQ ID NO:10, oder der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmid, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98634 hinterlegt wurde, oder der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98633 hinterlegt wurde, oder der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98452 hinterlegt wurde gestaltet wurden.
Eine Nukleinsäure der Erfindung kann unter Verwendung von cDNA, mRNA oder, alternativ, von genomischer DNA als einer Matrize und geeigneten Oligonukleotidprimern entsprechend Standardverfahren der PCR-Vermehrung vermehrt werden. Die so vermehrte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Weiterhin können Oligonukleotide durch Standardsyntheseverfahren, beispielsweise unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers hergestellt werden, die CRSP-Nukleotidsequenzen entsprechen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung die in den Ansprüchen definierte Nukleotidsequenz.
Die Sequenz der SEQ ID NO:1 entspricht der CRSP-cDNA des Menschen. Diese cDNA umfasst Sequenzen, die das CRSP-1 Protein des Menschen (d.h. "die codierende Region" von Nukleotiden 38-1087) codieren, als auch 5' nicht translatierte Sequenzen (Nukleotide 1 bis 37) und 3' nicht translatierte Sequenzen (Nukleotide 1088 bis 2479). Alternativ kann das Nukleinsäuremolekül lediglich die codierende Region von SEQ ID NO:1 (beispielsweise Nukleotide 38 bis 1087, entsprechend zu SEQ ID NO:3) umfassen. Ein Plasmid, das die Volllängen-Nukleotidsequenz umfasst, die CRSP-1 codiert, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia, U.S.A. 20110-2209 am 11. Juni 1997 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer 98452. Ein Plasmid, das die Volllängen-Nukleotidsequenz umfasst, die CRSP-1 codiert, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia, U.S.A. 20110-2209 am 16. Januar 1998 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer 98634.
Die Sequenz der SEQ ID NO:4 entspricht der CRSP-2 cDNA des Menschen. Diese cDNA umfasst Sequenzen, die das CRSP-2 Protein des Menschen (d.h. "die codierende Region" von Nukleotiden 126-796) codiert, als auch 5' nicht translatierte Sequenzen (Nukleotide 1 bis 125) und 3' nicht translatierte Sequenzen (Nukleotide 797 bis 848). Alternativ kann das Nukleinsäuremolekül lediglich die codierende Region von SEQ ID NO:4 (beispielsweise Nukleotide 126 bis 796 entsprechend zu SEQ ID NO:6) umfassen.
Die Sequenz der SEQ ID NO:7 entspricht der CRSP-3 cDNA des Menschen. Diese cDNA umfasst Sequenzen, die das CRSP-3 Protein des Menschen (d.h. "die codierende Region" von Nukleotiden 93 bis 890), als auch 5' nicht translatierte Sequenzen (Nukleotide 1 bis 92) und 3' nicht translatierte Sequenzen (Nukleotide 891 bis 1529) umfassen. Alternativ kann das Nukleinsäuremolekül lediglich die codierende Region von SEQ ID NO:7 (beispielsweise Nukleotide 93 bis 890 entsprechend von SEQ ID NO:9) umfassen. Ein Plasmid, das die CRSP-3 codierende Volllängen-Nukleotidsequenz umfasst wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia, U.S.A. 20110-2209 am 16 Januar 1998 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer 98633.
Die Sequenz der SEQ ID NO:10 entspricht der CRSP-4 cDNA des Menschen. Diese cDNA umfasst Sequenzen, die das CRSP-4 Protein (d.h. "die codierende Region" von Nukleotiden 1-537) als auch 3' nicht translatierte Sequenzen (nukleotide 538 bis 702) codiert. Alternativ kann das Nukleinsäuremolekül lediglich die codierende Region von SEQ ID NO:10 (beispielsweise Nukleotide 1 bis 537 entsprechend der SEQ ID NO:12) umfassen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, das ein Komplement der beanspruchten Nukleotidsequenz ist. Ein Nukleinsäuremolekül, das komplementär zu der beanspruchten Nukleinsäuresequenz ist, ist eine die zu der beanspruchten Nukleotidsequenz ausreichend komplementär ist, so dass sie an die beanspruchte Nukleotidsequenz hybridisieren kann, wodurch ein stabiler Doppelstrang gebildet wird.
Nützliche isolierte Nukleinsäuremoleküle umfassen eine Nukleotidsequenz, die mindestens ungefähr 30-35%, vorzugsweise ungefähr 40-45%, noch bevorzugter 50-55%, sogar noch bevorzugter ungefähr 60-65% und sogar noch bevorzugter mindestens ungefähr 70-755, 80-85%, 90-95% oder höher homolog zu der beanspruchten Nukleotidsequenz oder einem Bereich einer beliebigen dieser Nukleotidsequenzen sind.
Außerdem ein nützliches Nukleinsäuremolekül lediglich einen Bereich der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98634 hinterlegt wurde, der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98633 hinterlegt wurde oder der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98452 hinterlegt wurde, beispielsweise ein Fragment umfassen, das als eine Sonde oder ein Primer oder Fragment verwendet werden kann, das einen biologisch aktiven Bereich eines CRSP-Proteins codiert. Die aus der Klonierung der menschlichen CRSP-Gene bestimmte Nukleotidsequenz ermöglicht die Herstellung von Sonden und Primern, die bei der Identifizierung und/oder Klonierung von CRSP-Homologen in anderen Zelltypen, beispielsweise aus anderen Geweben, als auch CRSP-Homologen von anderen Tieren, eingesetzt werden. Die/der Sonde/Primer umfassen gewöhnlich im Wesentliche gereinigte Oligonukleotide. Die Oligonukleotide umfassen gewöhnlich eine Region einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen an mindestens ungefähr 12, vorzugsweise ungefähr 25, noch bevorzugter ungefähr 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide einer Sense-Sequenz von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98634 hinterlegt wurde, der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98633 hinterlegt wurde oder der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98452 hinterlegt wurde, einer Antisense-Sequenz von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98634 hinterlegt wurde, der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98633 hinterlegt wurde oder der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98452 hinterlegt wurde, oder einer natürlich vorkommenden Mutante von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98634 hinterlegt wurde, der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98633 hinterlegt wurde oder der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98452 hinterlegt wurde, hybridisiert. In einer beispielhaften Ausführungsform umfasst ein nützliches Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an ein Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotide 470-2479 von SEQ ID NO:1 umfasst oder an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das die Nukleotide 1-475 von SEQ ID NO:4 umfasst.
Sonden. die auf der menschlichen CRSP-Nukleotidsequenz basieren, können verwendet werden, um Transkripte oder genomische Sequenzen zu erfassen, die die gleichen oder homologe Proteine codieren. Beispielsweise können Primer, die auf der Nukleinsäure basieren, die in SEQ ID NO:1 oder 3 dargestellt sind, in PCR-Reaktionen verwendet werden, um CRSP-Homologe (beispielsweise CRSP-1 Homologe) zu klonieren. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden CRSP-Homologe durch PCR-Vermehrung (beispielsweise RT-PCR) unter Verwendung von Primern kloniert, die an einen Bereich der Nukleotidsequenz, der die CRSP-Cystein-reiche Domäne codiert, hybridisieren. Auf ähnliche Weise können Sonden, die auf den Proben-(subject) CRSP-Sequenzen basieren, verwendet werden, um Transkripte oder genomische Sequenzen zu erfassen, die die gleichen oder homologe Proteine codieren. In einer bevorzugter Ausführungsform umfasst die Sonde eine daran angebrachte Markergruppe, beispielsweise kann Markergruppe ein Radioisotop, eine fluoreszente Verbindung, ein Enzym oder ein Enzym-Ko-Faktor sein. Derartige Sonden können als ein Teil eines Diagnose-Kits verwendet werden, um ein CRSP-Protein fehlerhaft exprimierende Zellen oder Geweben zu identifizieren, beispielsweise durch Erfassen eines Spiegels einer CRSP-codierenden Nukleinsäure in einer Zellprobe eines Subjektes, beispielsweise durch Erfassen von CRSP-mRNA-Spiegeln oder Bestimmen ob ein genomisches CRSP-Gen mutiert oder deletiert wurde.
Ein Nukleinsäurefragment, das einen "biologisch aktiven Bereich eines CRSP- Proteins" codiert, kann durch Isolieren eines Bereichs/Anteils einer in den beigefügten Ansprüchen definierten Sequenz bereitgestellt werden, die ein Polypeptid mit einer biologischen CRSP-Aktivität (die biologische Aktivität der CRSP-Proteine wurde vorher beschrieben) codiert, Exprimieren des codierten Bereich des CRSP-Proteins (beispielsweise durch rekombinante Expression in vitro) und Bestimmen der Aktivität des codierten Bereichs des CRSP-Proteins.
Die Erfindung umfasst weiterhin Nukleinsäuremoleküle, die sich von der in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98634 hinterlegt wurde, der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98633 hinterlegt wurde oder der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98452 hinterlegt wurde, gezeigten Nukleotidsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterschiedlich sind und daher die gleichen CRSP-Proteine codieren wie jene durch die in den beigefügten Ansprüchen definierten Nukleotidsequenzen. In einer anderen Ausführungsform weist ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung eine Nukleotidsequenz auf, die ein Protein mit einer Aminosäuresequenz codiert, die in den beigefügten Ansprüchen definiert ist.
Zusätzlich zu den in den Ansprüchen gezeigten CRSP-Nukleotidsequenzen des Menschen, wird dem Fachmann klar sein, dass ein Sequenzpolymorphismus in der DNA zu Änderungen in den Aminosäuresequenzen der CRSP-Proteine führen, die in einer Population (beispielsweise der menschlichen Population) vorkommen können. Ein derartiger genetischer Polymorphismus in den CRSP-Genen kann aufgrund natürlicher allelischer Variation unter den Individuen in einer Population vorkommen. Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Gen" und "rekombinantes Gen" auf Nukleinsäuremoleküle, die ein offenes Leseraster umfassen, das ein CRSP-Protein, vorzugsweise ein CRSP-Protein vom Säugetier, codiert. Derartige natürlich vorkommende allelische Variationen können gewöhnlich zu einer Varianz in der Nukleotidsequenz eines CRSP-Gens von 1-5% führen. Jegliche und alle derartigen Nukleotidvariationen und so erhaltenen Aminosäurepolymorphismen in CRSP-Genen, die das Ergebnis einer natürlichen allelischen Variation sind und die nicht die funktionelle Aktivität eines CRSP-Protein ändern sind vorgesehen in dem Umfang der Erfindung zu liegen.
Außerdem sind die Nukleinsäuremoleküle, die CRSP-Proteine von anderen Spezies codieren und daher eine Nukleotidsequenz aufweisen, die verschieden zu der Nukleinsäuresequenz des Menschen ist, vorgesehen innerhalb des Umfangs der Erfindung zu liegen. Beispielsweise wurde basierend auf der Nukleotidsequenz von CRSP-1 des Menschen ein CRSP-1 der Maus identifiziert. Die Nukleotidsequenz des Maus-CRSP-1 (SEQ ID NO:16) codiert ein CRSP-1-Protein mit 349 Aminosäuren. Die Nukleotide und Aminosäuresequenz von Maus-CRSP-1 sind in 8 dargestellt. Der codierende Bereich des Maus-CRSP-1 wird durch SEQ ID NO:18 dargestellt.
Nukleinsäuremoleküle, die natürlichen allelischen Variationen und Homologen der CRSP-cDNAs der Erfindung entsprechen, können basierend auf deren Homologie zu den hier offenbarten menschlichen CRSP-Nukleinsäuren isoliert werden, die die menschliche cDNA, oder einen Bereich davon als eine Hybridisierungssonde gemäß Standardhybridisierungsverfahren unter stringenten Hybridisierungsbedingungen verwenden. Beispiele von Geweben und/oder Bibliotheken, die für eine Isolierung der TEST/Proben-(subject) Nukleinsäuren geeignet sind, umfassen Thymus, Lymphknoten und entzündliches Gewebe. Eine cDNA, die ein CRSP-Protein (beispielsweise ein CRSP-1 Protein) codiert, kann durch Isolieren der gesamten mRNA aus einer Zelle, beispielsweise einer Vertebratenzelle, einer Säugerzelle, oder einer menschlichen Zelle, einschließlich einer embryonalen Zelle, erhalten werden. Dann kann doppelsträngige cDNA aus der gesamten mRNA hergestellt und anschließend in ein geeignetes Plasmid oder Bakteriophagenvektor, unter Verwendung einer beliebigen Anzahl bekannter Verfahren, eingefügt werden. Das ein CRSP-1-Protein codierende Gen kann ebenfalls unter Verwendung eingeführter Polymerase-Ketten-Reaktionsverfahren in Übereinstimmung mit der durch die Erfindung bereitgestellte Nukleotidsequenzinformation kloniert werden. Die Nukleinsäure der Erfindung kann DNA oder RNA oder Analoge davon sein.
Demgemäß liegt ein nützliches isoliertes Nukleinsäuremolekül mit mindestens 15 Nukleotiden vor und hybridisiert unter stringenten Badingungen an das Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, oder SEQ ID NO:10, oder der Nukleinsäuresequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98634 hinterlegt wurde, der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98633 hinterlegt wurde, oder der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98452 als eine Hybridisierungssonde hinerlegt wurde, umfasst. In einer anderen Ausführungsform ist die Nukleinsäure mindestens 30, 50, 100, 250 oder 500 Nukleotide in der Länge. Wie hier verwendet, soll der Ausdruck "hybridisiert unter stringenten Bedingungen" Bedingungen zur Hybridisierung und dem Waschen beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen mit mindestens 60% Homologie zueinander gewöhnlich mit einander hybridisiert bleiben. Vorzugsweise sind die Bedingungen derart, dass die Sequenzen, die mindestens ungefähr 70%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 80%, sogar noch bevorzugter mindestens ungefähr 85% oder 90% zueinander homolog sind gewöhnlich miteinander hybridisiert bleiben. Derart stringente Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und können in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 gefunden werden. Ein bevorzugtes nicht beschränkendes Beispiel stringenter Hybridisierungsbedingungen bestehen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei ungefähr 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschgängen in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50-65°C. Vorzugsweise entspricht ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung, das unter stringenten Bedingungen an die Sequenz SEQ ID NO:1 hybridisiert einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül. Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "natürlich vorkommendes" Nukleinsäuremolekül auf ein RNA- oder DNA-Molekül mit einer Nukleotidsequenz, die in der Natur (beispielsweise codiert ein natürliches Protein) vorkommt.
Zusätzlich zu den natürlich vorkommenden allelischen Varianten der CRSP-Sequenzen, die in der Population vorkommen können, wird dem Fachmann klar sein, dass Änderungen durch Mutation in die Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, oder SEQ ID NO:10, oder der Nukleinsäuresequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98634 hinterlegt wurde, der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98633 hinterlegt wurde, oder der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98452 als eine Hybridisierungssonde hinerlegt wurde, eingeführt werden können, was zu Änderungen in der Aminosäuresequenz der codierten CRSP-Proteine führt, ohne dass die funktionelle Fähigkeit der CRSP-Proteine geändert wird. Beispielsweise können Nukleotidsubstitutionen, die bei "nicht essentiellen" Aminosäureresten zu Aminosäuresubstitutionen (besonders konservative Aminosäuresub stitutionen) führen, in der Sequenz von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, oder SEQ ID NO:10, oder der Nukleinsäuresequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98634 hinterlegt wurde, der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98633 hinterlegt wurde, oder der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98452 als eine Hybridisierungssonde hinerlegt wurde, ausgeführt werden. Ein "nicht-essentieller" Aminosäurerest ist ein Rest, der von der Wildtyp-Sequenz von CRSP (beispielsweise der Sequenz von SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, or SEQ IDNO:11) geändert werden, ohne die biologische Aktivität zu ändern, wohingegen ein "essentieller" Aminosäurerest für die biologische Aktivität erforderlich ist. Beispielsweise wird vorhergesagt, dass Aminosäurereste, die unter den CRSP-Proteinen der vorliegenden Erfindung (beispielsweise Cysteinreste innerhalb der Cystein-reiche Domänen) konserviert sind, besonders unzugänglich für Änderungen sind. Weiterhin sind Aminosäurereste, die zwischen CRSP-Protein und anderen Proteinen konservierte Cystein-reiche Domänen aufweisen, für Änderungen nur unwahrscheinlich zugänglich.
Demgemäß betrifft eine andere Ausführungsform der Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die CRSP-Proteine codieren, die Änderungen in Aminosäureresten aufweisen, die nicht für die Aktivität essentiell sind. Derartige CRSP-Proteine unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, oder SEQ ID NO:11, wobei sie dennoch biologische Aktivität beibehalten. In einer Ausführungsform umfasst das isolierte Nukleinsäuremolekül eine ein Protein codierende Nukleotidsequenz, worin das Protein eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens ungefähr 60% homolog zu der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, oder SEQ ID NO:11 ist. Vorzugsweise ist das durch das Nukleinsäuremolekül codierte Protein mindestens ungefähr 65-70% homolog zu SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, oder SEQ ID NO:11, noch bevorzugter mindestens ungefähr 75-80% homolog zu SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, oder SEQ IDNO:11, sogar noch bevorzugter mindestens ungefähr 85-90% homolog zu SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, oder SEQ IDNO:11, und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 95% homolog zu SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, oder SEQ ID NO:11.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein CRSP-Protein codiert, das homolog zu dem Protein von SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8 oder SEQ ID NO:11 ist, kann durch Einfügen einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, Additionen oder Deletionen in die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98634 hinterlegt wurde, der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98633 hinterlegt wurde, oder der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98452 hinterlegt wurde, hergestellt werden, so dass eine oder mehrere Substitutionen, Additionen oder Deletionen in das codierte Protein eingefügt werden. Mutationen können in die SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, die Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98634 hinterlegt wurde, die Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98633 hinterlegt wurde, oder die Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98452 hinterlegt wurde, durch Standardverfahren, wie beispielsweise ortspezifische Mutagenese und PCR vermittelte Mutagenese eingefügt werden. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einer oder mehrerer vorhergesagter nicht essentieller Aminosäurereste ausgeführt. Eine "konservative Aminosäuresubstitution" ist eine, bei der der Aminosäurerest gegen einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ersetzt wird. Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten wurden im Stand der Technik definiert. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (beispielsweise Lysin, Arginin, Histidin), saure Seitenketten (beispielsweise Asparaginsäure, Glutaminsäure), nicht geladene polare Seitenketten (beispielsweise Glycin, Asparagin Glutamin; Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), nicht polare Seitenketten (beispielsweise Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigte Seitenketten (beispielsweise Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatische Seitenketten (beispielsweise Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Daher wird ein vorhergesagte nicht essentielle Aminosäurerest in einem CRSP-Protein (beispielsweise eine die nicht in einer Cystein-reichen Domäne lokalisier ist) vorzugsweise mit einem anderen Aminosäurerest aus der gleichen Seitenkettefamilie ersetzt. Alternativerweise können in einer anderen Ausführungsform Mutationen zufällig entlang der gesamten oder eines Teils einer CRSP-codierenden Sequenz, wie beispielsweise durch Sätti gungsmutagenese, eingefügt werden, wobei die so erhaltenen Mutanten auf eine biologische CRSP-Aktivität durchmustert werden können, um Mutanten mit beibehaltener Aktivität zu identifizieren. Nach Mutagenese von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98634 hinterlegt wurde, der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98633 hinterlegt wurde, oder der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98452 hinterlegt wurde, kann das codierte Protein rekombinant exprimiert und die Aktivität des Proteins bestimmt werden.
Ein mutantes CRSP-Protein kann für intrazelluläres Calcium, einen Anstieg in Phosphatidylinositol oder andere Moleküle getestet werden, und kann beispielsweise zur Phosphorylierung von spezifischen Proteinen, einer Modulation der Gentranskription und beliebig anderen hier ausgeführten biologischen Aktivitäten führen.
Ein mutantes CRSP-Protein kann ebenfalls auf die Fähigkeit getestet werden, (1) die zelluläre Signaltransduktion entweder in vitro oder in vivo zu modulieren, (2) die Kommunikation zwischen Zellen zu regulieren, (3) die Expression von Genen zu regulieren, deren Expression durch Bindung von CRSP (beispielsweise CRSP-1) an einen Rezeptor moduliert wird, (4) die Gentranskription in einer Zelle entweder in vitro oder in vivo zu regulieren, die an der Entwicklung oder Differenzierung beteiligt ist, (5) die Zellprolferation entweder in vitro oder in vivo zu regulieren, (6) die geordnete räumliche Anordnung von differenziertem Gewebe in Vertebraten zu bilden und/oder zu erhalten, (7) den Zelltod (beispielsweise Zellüberleben) zu modulieren, (8) die Zellmigration zu regulieren, und/oder die Funktion des Immunsystems zu modulieren.
Zusätzlich zu den der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, die CRSP-Proteine codieren, betrifft die Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle, die dazu in Antisense vorliegen. Eine "Antisense" Nukleinsäure umfasst eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu einer "Sense" Nukleinsäure ist, die ein Protein codiert, beispielsweise komplementär zu dem codierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA.Sequenz. Dementsprechend kann eine Antisense-Nukleinsäure Wasserstoffbrückenbindung zu einer Sense-Nukleinsäure ausbilden. Die Antisense-Nukleinsäure kann zu einem gesamten codierenden Strang des CRSP oder lediglich einem Teil davon komplementär sein. In einer Ausführungsform liegt ein Antisense-Nukleinsäuremolekül zu einer "codierenden Region" des codierenden Strangs einer eine CRSP codierende Nukleotidsequenz in Antisense vor. Der Ausdruck "codierende Region" bezieht sich auf die Region der Nukleotidsequenz, die Codons umfasst, die in Aminosäurereste (beispielsweise die codierende Region des menschlichen CRSP-1 entspricht SEQ ID NO:3, die codierende Region von menschlichem CRSP-2 entspricht SEQ ID NO:6, die codierende Region de menschlichen CRSP-3 entspricht SEQ ID NO:9, die codierende Region des menschlichen CRSP-4 entspricht SEQ ID NO:12, und die codierende Region des menschlichen CRSPähnlichen-N entspricht SEQ ID NO:15) übersetzt wird. In einer anderen Ausführungsform liegt das Antisense-Nukleinsäuremolekül zu einer "nicht-codierenden Region" des codierenden Strangs einer ein CRSP codierenden Nukleotidsequenz in Antisense vor. Der Ausdruck "nicht-codierende Region" bezieht sich auf die 5'- und 3'-Sequenzen, die die codierende Region flankieren, die nicht in Aminosäuren (d.h. ebenfalls als 5'- und 3'- nicht-translatierte Regionen bezeichnet) codieren.
Mit der Maßgabe, dass die codierenden Strangsequenzen, die die hier offenbarten CRSP codieren (beispielsweise SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, oder SEQ ID NO:12) können Antisense-Nukleinsäuren gemäß den Regeln der Watson und Crick Basenpaarung gestaltet werden. Dias Antisense-Nukleinsäuremolekül kann zu der gesamten codierenden Region der CRSP-mRNA komplementär sein, wobei jedoch bevorzugt wird, dass ein Oligonukleotid lediglich für einen Teilbereich der codierenden oder nicht-codierenden Region der CRSP-mRNA in Antisense vorliegt. Beispielsweise kann das Antisense-Oligonukleotid zu der den Translationsstartstelle der CRSP-mRNA umgebenden Region komplementär sein. Ein Antisense-Oligonukleotid kann beispielsweise 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide umfassen. Ein Antisense-Olgonukleotid kann unter Verwendung einer chemischen Synthese und einer enzymatischen Ligationsreaktion unter Verwendung der im Stand der Technik bekannten Verfahren gestaltet werden. Beispielsweise kann ein Antisense Nukleinsäure (beispielsweise ein Antisense-Oligonukleotid) unter Verwendung natürlich vorkommender Nukleotide oder unterschiedlich modifizierter Nukleotide chemisch synthetisiert werden, die so gestaltet sind, um die biologische Stabilität der Moleküle zu erhöhen oder die physikalische Stabilität des Duplex zu erhöhen, der zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuren gebildet wird, wobei beispielsweise Phosphorothioat- Derivate und mit Acridin substituierte Nukleotide können verwendet werden. Beispiele modifizierter Nukleotide, die verwendet werden können, um die Antisense-Nukleinsäure zu erzeugen, umfassen 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)Uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, beta-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, 2-Methythio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-Oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methlyuracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiourail, 3-(3-Amino-3N-2-carboxypropyl) uacil, (scp3)w und 2,6-Diaminopurin. Alternativ kann die Antisense-Nukleinsäure unter Verwendung eines Expressionsvektors biologisch erzeugt werden, in dem eine Nukleinsäure in einer Antisenseorientierung (d.h. RNA, die von der eingefügten Nukleinsäure transkribiert wurde, wird eine Antisenseorientierung zu einer Zielnukleinsäure von Interesse aufweisen, was in den folgenden Abschnitten beschrieben wird) subkloniert wurde.
Die Antisense-Nukleinsäuremoleküle werden gewöhnlich einem Subjekt verabreicht oder in situ erzeugt, so dass sie mit zellulärer mRNA und/oder genomischer DNA, die ein CRSP-Protein codieren, hybridisieren oder daran binden, um dadurch eine Expression des Proteins, beispielsweise durch Hemmung der Transkription und/oder der Translation, zu hemmen. Die Hybridisierung kann gewöhnliche Nukleotidkomplementarität sein, um einen stabilen Doppelstrang zu bilden, oder beispielsweise im Falle eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls, das durch spezifische Wechselwirkungen in der Hauptfurche der Doppelhelix, an DNA-Duplexe bindet. Ein Beispiel einer Verabreichungsroute eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls umfasst direkte Injektion an einer Gewebestelle. In alternativer Weise können die Antisense-Nukleinsäuremoleküle modifiziert sein, um auf ausgewählte Zellen gerichtet zu sein (targetten) und dann systemisch verabreicht werden. Zur systemischen Verabreichung können die Antisensemoleküle beispielsweise so modifiziert sein, dass sie an auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimierte Rezeptoren oder Antigene spezifisch binden, die beispielsweise durch Verbinden/Linken der Antisense-Nukleinsäuremoleküle an Peptide oder Antikörper an Zelloberflächenrezeptoren oder Antigene binden. Die Antisense Nukleinsäuremoleküle können ebenfalls unter Verwendung der her beschriebenen Vektoren an Zellen ausgegeben/geliefert werden. Um eine ausreichende intrazelluläre Konzentration der Antisensemoleküle zu erreichen, wird bevorzugt, dass die Vektorkonstrukte, in denen die Antisense Nukleinsäuremoleküle angeordnet sind, unter der Kontrolle eines starken Pol II oder Pol III-Promotors stehen.
Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann ein α-anomerisches Nukleinsäuremolekül sein. Ein α-anomerisches Nukleinsäuremolekül bildet mit komplementärer RNA, in der entgegen den gewöhnlichen β-Einheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gautier et al., Nucleic Acids Res. 15 (1987), 6625-6641) spezifische doppelsträngige Hybride. Das Antisense Nukleinsäuremolekül kann ebenfalls ein 2'-o-Methylribonukleosid (Inoue et al., Nucleic Acids Res. 15 (1987), 613-6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al., FEBS Lett. 215 (187), 327-330) umfassen.
In immer noch einer anderen Ausführungsform liegt die Antisense Nukleinsäure der Erfindung als ein Ribozym vor. Ribozyme sind katalytisch aktive RNA-Moleküle mit Ribonukleaseaktivität, die eine einzelsträngige Nukleinsäure, wie beispielsweise eine RNA, für die sei eine komplementäre Region aufweisen spalten. Daher können Ribozyme (beispielsweise Hammerkopf-Ribozyme (in Halselhoff and Gerlach, Nature 334 (1988), 585-591, beschrieben) verwendet werden, um CRSP mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, um dadurch eine Translation von CRSP mRNA zu hemmen. Ein Ribozym mit einer Spezifität für eine Nukleinsäure, die CRSP codiert, kann basierend auf der Nukleotidsequenz einer hier offenbarten CRSP-cDNA (d.h. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, die Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das mit der Hinterlegungsnummer 98634 bei ATCC hinterlegt wurde, oder die Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das mit der Hinterlegungsnummer 98633 bei ATCC hinterlegt wurde) gestaltet werden. Beispielsweise kann ein Derivat einer Tetrahymena L-19IVS RNA konstruiert werden, in der die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle komplementär zu der zu spaltenden Nukleotidsequenz in einer ein CRSP codierenden mRNA ist. Siehe beispielsweise Cech et al. U.S.-P-4,987,071, und Cech et al. U.S.-P-5,116,742. In alternativer Weise kann, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA- Molekülen auszuwählen CRSP-mRNA verwendet werden. Siehe beispielsweise Bartel, D. and Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418.
Alternativ kann eine CRSP-Genexpression durch zielende Nukleotidsequenzen, die zu der regulatorischen Region des CRSP komplementär sind (beispielsweise den CRSP-Promotoren und/oder Enhancern), gehemmt werden, um dreifach helikale Strukturen auszubilden, die die Transkription des CRSP-Gens in den Zielzellen verhindert. Siehe allgemein Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84, Helene, C. et al. (1992) Ann.N. Y. Acad. Sci. 660:27-36, und Maher, L.J. (1992) Bioassays14(12):807-15.
Die CRSP-Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können an dem Grundbestandteil (base moiety), Zuckerbstandteil oder Phosphatrückgrat modifiziert werden, um beispielsweise die Stabilität, Hybridisierung oder Löslichkeit des Moleküls zu verbessern. Beispielsweise kann das Desoxyribosephosphatrückgrat der Nukleinsäuremoleküle dadurch modifiziert werden, um Peptodnukleinsäuren (siehe Hyrup B. et al., Bioorganic & Medical Chemistry 4 (1) (1996), 5-23) zu erzeugen. Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Peptidnukleinsäuren" oder "PNAs" Nukleinsäuremimetika, beispielsweise DNA-Mimetika, in denen das Desoxyribosephosphatrückgrat durch ein Pseudopeptidrückgrat ersetzt wird, wobei lediglich die vier natürlichen Nukleobasen erhalten bleiben. Es konnte gezeigt werden, dass das neutrale Rückgrat von PNAs unter Verwendung von Protokollen einer standardisierter Festphasenpeptidsynthese, wie sie in Hyrup et al., supra (1996); Perry-O'Keefe et al., PNAS 93, 14670-14675 beschrieben wird, spezifisch an DNA und RNA hybridisieren kann.
PNAs von CRSP-Nukleinsäuremolekülen können in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen verwendet werden. Beispielsweise können PNAs als Antisense oder Antigene-Mittel für eine Sequenz spezifische Modulation einer Genexpression verwendet werden, die beispielsweise Transkriptions-Arrest oder Translations-Arrest oder Replikations-Hemmung hervorruft. PNAs von CRSP-Nukleinsäuremolekülen können ebenfalls bei der Analyse von Mutationen in Einzelbasenpaaren in einem Gen (beispielsweise durch PNA gerichtetes PCR-Klamping) als ,künstliche Restriktionsenzyme' verwendet werden, falls sie in Kombination mit anderen Enzymen (beispielsweise S1 Nukleasen (Hyrup B. (1996) Supra), oder als Sonden oder Primer für eine DNA-Sequenzierung oder Hybridisierung (Hyrup B. et al., Suprs (1996), Perry-O'Keefe supra) verwendet werden.
PNAs von CRSP können durch Anheften lipophiler oder anderer Helfergruppen an PNA modifiziert werden, indem PNA-DNA-Chimären gebildet, oder Liposomen oder anderen von im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Arzneimittelzuführung verwendet werden. So können beispielsweise PNA-DNA-Chimären von CRSP-Nukleinsäuremolekülen erzeugt werden, die die vorteilhaften Eigenschaften von PNA und DNA kombinieren. Derartige Chimären ermöglichen DNA-Erkennungsenzymen (beispielsweise RNAse H und DNA-Polymerase) mit dem DNA-Teilbereich zu wechselwirken, während der PNA-Teilbereich hohe Bindungsaffinität und Spezifität bereitstellen würde. PNA-DNA-Chimären können unter Verwendung von Linkern ungefährer Längen verbunden werden, die in Begriffen von Basenstacking/Basenstapelung, Anzahl von Bindungen zwischen den Nukleobasen und Orientierung (Hyrup B.(1996) supra) ausgewählt werden. Die Synthese von PNA-DNA-Chimären kann wie in Hyrup B (1996) supra und Finn P.J. et al., Nucleic Acids Res. 24(17) (1996), 3357-63 beschrieben, ausgeführt werden. Beispielsweise kann eine DNA-Kette an einem festen Träger/Matrize unter Verwendung von Standard Phosphoamidit-Chemie synthetisiert werden, wobei modifizierte Nukleosidanaloge, beispielsweise 5'-(4-Methoxytrityl)amino-5'-desoxy.thymidin-phosphoamidit, als Zwischenglied) der PNA und der 5'-Enden von DNA (Mag, M. et al., Nucleic Acids Res. 17 (1989), 5973-88) verwendet werden. PNA-Monomere werden anschießend schrittweise gekoppelt, um ein chimäres Molekül mit einem 5'-PNA-Segment und einem 3'-DNA-Segment (Finn P.J. et al., (1996) supra) herzustellen. Alternativ können chimäre Moleküle mit einem 5'-DNA-Segment und einem 3'-PNA-Sehgment (Peterser, K.H. et al., Biorganic Med Chem Lett. 5 (1975), 1119-1124) synthetisiert werden.
Das Oligonukleotid kann andere angehängte Gruppen, wie beispielsweise Peptide (beispielsweise zum Targetten/Abzielen auf von Wirtszellrezeptoren in vivo) umfassen, oder Mittel, die den Transport über die Zellmembran fördern (siehe beispielsweise Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556, Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652, WO 88/09810, veröffentlicht Dezember 15, 1988), oder die Blut-Hirn-Schranke (siehe beispielsweise WO 89/10134, veröffentlicht April 25. 1988). Außerdem können Oligonukleotide mit durch eine Hybridisierung ausgelösten Spaltmitteln modifiziert (siehe beispielsweise Krol et al. (1988) BioTechniques 6:958-976) oder interkalierenden Mitteln modifiziert sein (Siehe beispielsweise Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549). Zu diesem Zweck können die Oligonukleotide an andere Moleküle (beispielsweise Peptide durch Hybridisierung ausgelöste Vernetzungsmittel, Transportmittel oder durch Hybridisierung ausgelöst Spaltungsmittel) konjugiert werden.
II. Isolierte CRSP-Proteine und Anti-CRSP-Antikörper
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft isolierte CRSP-Proteine und biologisch aktive Anteile davon, sowie auch Polypeptidefragmente, die eine Verwendung als Immunogene geeignetsind, um Anti-CRSP-Antikörper zu züchten. In einer Ausführungsform können die nativen C RSP-Proteine von Zell- oder Gewebequellen durch geeignete Reinigungsschemata unter Verwendung von standardisierten Proteineinigungsverfahren isoliert werden. In einer anderer Ausführungsform werden die CRSP-Proteine durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt. Alternativ zur rekombinanten Expression kann das CRSP-Protein oder Polypeptid unter Verwendung von Standardpeptidsyntheseverfahren chemisch synthetisiert werden.
Ein "isoliertes" oder "gereinigtes" Protein oder biologisch aktiver Anteil davon liegt im Wesentlichen frei von zellulärem Material oder anderen verunreinigenden Proteinen von der Zelle oder dem Gewebe von dem das CRSP-Protein abgeleitet wurde, oder im Wesentlichen frei von chemischen PRECURSOREN oder anderen Chemikalien, falls es chemisch synthetisiert wurde. Der Ausdruck "im Wesentlichen frei von zellulärem Material" umfasst Präparationen von CRSP-Protein, in denen das Protein von Zellkomponenten der Zelle, von der es isoliert oder rekombinant hergestellt wurde, getrennt wurde. In einer Ausführungsform umfasst der Ausdruck "im Wesentlichen frei von zellulärem Material" Präparationen von CRSP-Protein mit weniger als ungefähr 30% (Trockengewicht) Nicht-CRSP-Protein (ebenfalls hier als "verunreinigendes Protein" bezeichnet), noch bevorzugter weniger ungefähr 20% Nicht-CRSP-Protein, immer noch mehr bevorzugt weniger als ungefähr 10% Nicht-CRSP-Protein und am meisten bevorzugt weniger als ungefähr 5% Nicht-CRSP-Protein. Wird das CRSP-Protein oder ein biologisch aktiver Anteil davon rekombinant hergestellt, dann ist es ebenfalls vorzugsweise im Wesentlichen frei von Kulturmedium, d.h. Kulturmedium stellt weniger als ungefähr 20%, noch bevorzugter weniger als ungefähr 10% und am meisten bevorzugt weniger als ungefähr 5% des Volumens der Proteinpräparation dar.
Der Ausdruck "im Wesentliche frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien" umfasst Präparationen von CRSP-Protein, in denen das Protein von chemischen Vor stufen oder anderen Chemikalien getrennt wird, die an der Synthese des Proteins beteiligt sind. In einer Ausführungsform umfasst der Ausdruck "im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien" Präparationen von CRSP-Protein mit weniger als ungefähr 30% (Trockengewicht) von chemischen Vorstufen oder Nicht-CRSP-Chemikalien, noch bevorzugter weniger als ungefähr 20% chemischer Vorstufen oder Nicht-CRSP-Chemikalien, immer noch mehr bevorzugt weniger als ungefähr 10% chemischer Vorstufen oder Nicht-CRSP-Chemikalien und am meisten bevorzugt weniger als ungefähr 5% chemischer Vorstufen oder Nicht-CRSP-Chemikalien.
Biologisch aktive Teilbereiche eines CRSP-Proteins umfassen Peptide, die Aminosäuresequenzen umfassen, die ausreichend homolog oder von der Aminsäuresequenz des CRSF-Protein, beispielsweise der in SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8 oder SEQ ID NO:11 gezeigten Aminosäuresequenz, abgeleitet sind, welch weniger Aminosäuren umfassen als die Volllängen-CRSP-Proteine und mindestens eine Aktivität eines CRSP-Protein zeigen. Gewöhnlich umfassen biologisch aktive Teilbereiche eine Domäne oder Motiv mit mindestens einer Aktivität des CRSP-Proteins. Ein biologisch aktiver Teilbereich eines CRSP-Proteins kann ein Polypeptid mit beispielsweise 10, 25, 50, 100 oder mehr Aminosäuren in der Länge sein.
In einer Ausführungsform umfasst ein biologisch aktiver Teilbereich eines CRSP-Proteins mindestens eine Cystein-reiche Region. In einer anderen Ausführungsform umfasst ein biologisch aktiver Teilbereich eines CRSP-Proteins mindestens eine Cystein-reiche Region, worin die Cystein-reiche Region mindestens eine Cystein-reiche Domäne umfasst. In noch einer anderen Ausführungsform umfasst ein biologisch aktiver Teilbereich eines CRSP-Protein mindestens ein Signalpeptid.
In einer alternativen Ausführungsform umfasst ein biologisch aktiver Teilbereich eine Aminosäuresequenz des CRSP, der eine Signalsequenz fehlt.
Es sollte klar sein, dass ein bevorzugter biologisch aktiver Teilbereich eines CRSP-Protein der vorliegenden Erfindung mindestens eine der vorstehend identifizierten strukturellen Domänen umfassen kann. Ein mehr bevorzugter biologisch aktiver Teilbereich eines CRSP-Protein kann mindestens zwei der vorstehend identifizierten strukturellen Domänen umfassen. Eine sogar noch bevorzugterer biologisch aktiver Teilbereich eines CRSP-Protein kann mindestens drei der vorstehend identifizierten strukturellen Domänen umfassen. Eine besonders bevorzugter biologisch aktiver Teilbereich eines CRSP-Protein der vorliegenden Erfindung kann mindestens vier der vorstehend identifizierten strukturellen Domänen umfassen.
Außerdem können andere biologisch aktive Teilbereiche, in denen andere Regionen des Proteins deletiert sind, durch rekombinante Verfahren hergestellt und für eine oder mehrere der funktionellen Aktivitäten eines nativen CRSP-Protein beurteilt werden.
Das CRSP-Protein der vorliegenden Erfindung weist eine Aminosäuresequenz auf, wie sie in den beigefügten Ansprüchen gezeigt ist.
Um die prozentuale Homologie von zwei Aminosäuresequenzen oder von zwei Nukleinsäuren zu bestimmen, werden die Sequenzen zu optimalen Vergleichszwecken (beispielsweise können Lücken in die Sequenz einer ersten Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz für eine optimale Angleichung mit einer zweiten Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz eingefügt werden) ausgerichtet beziehungsweise angeglichen. Die Aminosäurereste oder Nukleotide an entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Ist eine Position in der ersten Sequenz durch den gleichen Aminosäurerest oder das Nukleotid, wie in der entsprechenden Position der zweiten Sequenz besetzt, dann sind die Moleküle in dieser Position homolog (d.h. wie hier verwendet ist Aminosäure oder Nukleinsäure "Homologie" äquivalent zu Aminosäure oder Nukleinsäure "Identität"). Die zwischen den zwei Sequenzen vorhandene Homologie ist eine Funktion der Anzahl identischer Positionen geteilt durch die Sequenzen (d.h.% Homologie = # identischer Positionen/Gesamt # Positionen × 100). Die Bestimmung einer prozentualen Homologie zwischen zwei Sequenzen kann unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus erzielt werden. Ein bevorzugtes, nicht beschränkendes Beispiel eines zum Vergleich verwendeten mathematischen Algorithmus von zwei Sequenzen ist der Algorithmus von Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 2264-2268, der wie in Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 5873-77, modifiziert wurde. Ein derartiger Algorithmus ist in die NBLAST- und XBLAST-Programme von Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (990) 403-410 eingebaut. Nukleotidsuchen mit BLAST können mit dem NBLAST-Programm, Score = 100, Wortlänge = 12 ausgeführt werden, um Nukleotidsequenzen zu erhalten, die zu CRSP-Nukleinsäuremolekülen der Erfindung homolog sind. Proteinsuchen mit BLAST können mit dem XBLAST-Programm, Score = 50, Wortlänge 3 ausgeführt werden, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die zu CRSP-Proteinmolekülen der Erfindung homolog sind. Um mit Lücken versehene Amgleichungen zu Vergleichszwecken zu erhalten, kann Gapped-BLAST, wie durch Altschul et al., Nucleic Acids RES. 25(17) 1997), 3389-3402 beschrieben, verwendet werden. Werden BLAST und Gapped BLAST-Programme verwendet, dann können Standardparameterprofile der entsprechenden Programme (beispielsweise XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Ein anderes nicht beschränkendes Beispiel eines für den Sequenzvergleich verwendeten mathematischen Algorithmus ist der Algorithmus von Myers und Miller CABIOS (1989). Ein derartiger Algorithmus ist in dem ALIGN-Programm (Version 2.0) eingebaut, das Teil des GCG-Sequenz-Angleichungs-Softwarepakets ist. Wird das ALIGN-Programm zum Vergleich von Aminosäuresequenzen verwendet, dann kann eine PAM120 Gewichtsreste-Tabelle, eine Lückenlängenstrafe von 12 und eine Lückenstrafe von 4 verwendet werden.
Die Erfindung kann dazu verwendet werden, chimäre oder fusionierte CRSP-Proteine bereitzustellen. Wie hier verwendet, umfasst ein CRSP "chimäres Protein" oder "Fusionsprotein" ein CRSP-Polypeptid, das betriebsbereit an ein Nicht-CRSP-Polypeptid verknüpft ist. Ein "CRSP-Polypeptid" bezieht sich auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die einem CRSP entspricht, wohingegen sich ein "Nicht-CRSP-Polypeptid" auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz bezieht, die einem Protein entspricht, das zu dem CRSP-Protein nicht wesentlich homolog ist, beispielsweise ein Protein, das von dem CRSP-Protein verschieden und das von dem gleichen oder einem unterschiedlichen Organismus abgeleitet ist. In einem Fusionsprotein kann das CRSP-Polypeptid allen oder einem Teilbereich eines CRSP-Proteins entsprechen. Ein CRSP-Fusionsprotein umfasst mindestens einen biologisch aktiven Teilbereich eines CRSP-Protein. Ein anderes CRSP-Fusionsprotein umfasst mindestens zwei biologisch aktive Teilbereiche eines CRSP-Proteins. Ein anderes CRSP-Fusionsprotein umfasst mindestens drei biologisch aktive Teilbereiche eines CRSP-Proteins. In dem Fusionsprotein soll der Ausdruck "betriebsbereit verknüpft" anzeigen, dass das CRSP-Polypeptid und das Nicht-CRSP-Polypeptid im Leseraster zueinander fusioniert sind. Das Nicht-CRSP-Polypeptid kann an den N-Terminus oder C-Terminus des CRSP-Polypeptids fusioniert sein.
Ein Fusionsprotein ist beispielsweise ein GST-CRSP-Fusionsprotein, in dem die CRSP-Sequenzen an dien C-Terminus der GST-Sequenzen fusioniert wurden. Derartige Fusionsproteine können die Aufreinigung von rekombinantem CRSP fördern.
Ein anderes Fusionsprotein ist ein CRSP-Protein, das eine heterologe Signalsequenz an dessen N-Terminus umfasst. Beispielsweise kann die native CRSP-Signalsequenz (d.h. Aminosäuren 1 bis 23 von SEQ ID NO:2) entfernt, und mit einer Signalsequenz eines anderen Proteins ersetzt werden. In bestimmten Wirtszellen (beispielsweise Wirtszellen vom Säugetier) kann die Expression und/oder Sekretion von CRSP durch die Verwendung einer heterologen Signalsequenz erhöht werden.
Noch ein anderes Fusionsprotein ist ein CRSP Immunglobulin-Fusionsprotein, in dem die CRSP-Sequenzen, die hauptsächlich die Cystein-reiche Regionen umfassen, mit Sequenzen fusioniert sind, die von einem Mitglied der Proteinfamilie der Immunglobuline abgeleitet ist. Es wurden ebenfalls lösliche Abkömmlinge beziehungsweise Derivate von Zelloberflächenglycoproteinen in der Immunglobulingen-Superfamilie hergestellt, die eine extrazelluläre Domäne des Zelloberflächenglycoproteins umfasst, die an eine konstante Immunglobulin (Fc)-Region fusioniert wurde (siehe beispielsweise, Capon, D.J. et al. Nature 337 (1989), 525-531 und Capon U.S.-P-5,116,964 und 5,428,130 [CD4-IgGI Konstrukte]; Linsley, P.S. et al. J. Exp. Med. 173 (1991), 721-730 [a CD28 IgGl Konstrukt und ein B7-1-IgG1 Konstrukt]; und Linsley, P.S. et al. J. Exp. Med. 174 (1991), 561-569 und U.S.-P-5,434,131 [ein CTLA4-IgG1]). Derartige Fusionsproteine erwiesen sich für die Modulation von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen als nützlich. Es wurden lösliche Derivate von Zelloberflächenproteinen der Superfamilie des Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptors (TNFR) hergestellt, die eine extrazelluläre Domäne des Zelloberflächenrezeptors umfassen, der an eine konstante Immunglobulin (Fc) Region fusioniert ist (siehe beispielsweise Moreland et al. N. Engl. J. Med. 337(3) (1997), 141-147; van der Poll et al. Blood 89(10) (1997), 3727-3734; und Ammann et al. J. Clin. Invest. 99(7) (1997), 1699-1703.) CRSP-Immunglobulin-Fusionsproteine können in pharmazeutische Zusammensetzungen eingefügt und an ein Subjekt verabreicht werden, um eine Wechselwirkung zwischen einem CRSP-Liganden und einem CRSP-Rezeptor auf der Zelloberfläche zu hemmen, wodurch die durch CRSP vermittelte Signaltransduktion in vivo unterdrückt wird. Die CRSP-Immunglobulin-Fusionsproteine können verwendet werden, um die Bioverfügbarkeit eines CRSP erkennenden (cognate) Rezeptors zu beeinflussen. Hemmung des/der CRSP- Liganden/CRSP-Wechselwirkung kann für sowohl die Behandlung von Störungen der Differenzierung oder Proliferation als auch der Modulierung (beispielsweise Fördern oder Hemmen) von Entwicklungsantworten, Zelladhäsion und/oder Zellschicksal therapeutisch nützlich sein. Außerdem können die CRSP-Immunglobulin Fusionsproteine der Erfindung als Immunogene verwendet werden, um Anti-CRSP-Antikörper in einem zu erzeugen, die CRSP-Liganden zu reinigen und bei Durchmusterungstests Moleküle zu identifizieren, die die Wechselwirkung von CRSP mit einem CRSP-Liganden hemmen.
Vorzugsweise wird ein chimäres oder Fusionsprotein von CRSP durch rekombinante Standard-DNA-Verfahren hergestellt. Beispielsweise werden DNA-Fragmente, die für unterschiedliche Polypeptidsequenzen codieren, entsprechen herkömmlicher Verfahren zusammen im Leseraster ligiert, beispielsweise um abgestumpft endende oder versetzt endende Termini zu ligieren, Restriktionsenzymverdau, um geeignete Termini bereitzustellen, Auffüllen kohäsiver Enden wie erforderlich, Behandlung mit alkalischer Phosphatase, um unerwünschte Verbindung zu vermeiden und enzymatische Ligation. Das Fusionsgen kann durch herkömmliche Verfahren einschließlich automatisierten DNA-Synthesizern synthetisiert werden. Alternativ kann eine PCR-Vermehrung von Genfragmenten unter Verwendung von Ankerprimern ausgeführt werden, die zu komplementären Überhängen zwischen zwei aufeinanderfolgenden Genfragmenten führen, die anschließend annealed und wieder vermehrt werden können, um eine chimäre Gensequenz (siehe beispielsweise Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons, 1992) zu erzeugen. Außerdem sind zahlreiche Expressionsvektoren im Handel erhältlich, die bereit einen Fusions-Rest beziehungsweise -Bestandteil (beispielsweise ein GST-Polypeptid) codieren. Eine ein CRSP codierende Nukleinsäure kann in einen Expressionsvektor kloniert werden, um den Fusionsbestandteil im Leseraster mit dem CRSP-Protein zu verknüpfen.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter Varianten der CRSP-Proteine, die entweder als CRSP-Agonisten (Mimetika) oder als CRSP-Antagonisten funktionieren. Varianten der CRSP-Proteine können durch Mutagenese, beispielsweise diskrete Punktmutation oder Verkürzung eines CRSP-Proteins hergestellt werden. Ein Agonist der CRSP-Proteine kann im Wesentlichen die gleichen oder eine Teilmenge/Untergruppe der biologischen Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form eines CRSP-Protein beibehalten. Ein Antagonist eines CRSP-Proteins kann eine oder mehrere der Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des CRSP-Proteins hemmen, beispielsweise durch kompetitives Binden an ein stromabwärts oder -aufwärts gelegenes Mitglied einer das CRSP-Protein umfassende zelluläre Signalkaskade.
Daher können spezifische biologische Wirkungen durch Behandlung mit einer Variante mit begrenzter Funktion beseitigt werden. In einer Ausführungsform weist die Behandlung eines Subjekts mit einer Variante, die eine Untergruppe der biologischen Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des Proteins aufweist, zu der Behandlung mit der natürlich vorkommenden Form des CRSP-Protein relativ weniger Nebenwirkungen in einem Subjekt auf.
Varianten des CRSP-Protein, die entweder als CRSP-Agonisten (Mimetika) oder als CRSP-Antagonisten funktionieren, können durch Durchmustern von kombinatorischen Bibliotheken von Mutanten, beispielsweise Verkürzungsmutanten, eines CRSP-Proteins für CRSP-Proteinagonisten oder -antagomnistenaktivität identifiziert werden. In einer Ausführungsform wird eine abgewandelte Bibliothek von CRSP-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf dem Nukleinsäureniveau erzeugt und durch eine abgewandelte Genbibliothek codiert. Eine abgewandelte Bibliothek von CRSP-Varianten kann beispielsweise durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide in Gensequenzen erzeugt werden, so dass ein degenerierter Satz möglicher CRSP-Sequenzen als individuelle Polypeptide, oder alternativ als ein Satz großer Fusionsproteine (beispielsweise für Phagendisplay) exprimiert werden können, die den Satz von CRSP-Sequenzen darin umfassen. Es können eine Anzahl von Verfahren verwendet werden, um Bibliotheken von möglichen CRSP-Varianten von einer degenerierten Oligonukleotidsequenz zu erzeugen. Chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem automatisierten DNA-Synthesizer ausgeführt werden, wobei das synthetische Gen anschließend in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert wird. Die Verwendung eines Satzes degenerierter Gene ermöglicht, dass in einem Gemisch alle die Sequenzen bereitgestellt werden, die den erwünschten Satz möglicher CRSP-Sequenzen codieren. Verfahren zum Synthetisieren degenerierter Oligonukleotide sind im Stand der Technik bekannt (siehe beispielsweise Narang, S.A. Tetrahedron 39 (1983), 3; Itakura et al. Annu. Rev. Biochem.53 (1984), 323; Itakura et al. Science 198 (1984), 1056; Ike et al. Nucleic Acid Res. 11 (1983), 477).
Außerdem können Bibliotheken von Fragmenten einer ein CRSP-Protein codierenden Sequenz verwendet werden, um eine abgewandelte Population von CRSP-Fragmenten zum Durchmustern und anschließendem Selektionieren von Varianten eines CRSP-Proteins verwendet werden. In einer Ausführungsform kann eine Bibliothek von codierenden Sequenzfragmenten durch Behandlung eines doppelsträngigen PCR-Fragments einer CRSP codierenden Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen erzeugt werden, worin Nicking beziehungsweise Brechen lediglich einmal pro Molekül auftritt, Denaturieren der doppelsträngigen DNA, Renaturieren der DNA, um doppelsträngige DNA zu bilden, die Sense/Antisense Paare von unterschiedlich genickten Produkten umfassen kann, Entfernen einzelsträngiger Bereiche von erneut gebildeten Duplexen durch Behandlung mit S1 Nuklease und Ligieren des erhaltenen Fragmentbibliothek in einen Expressionsvektor. Durch dieses Verfahren kann eine Expressionsbibliothek abgeleitet werden, die N-terminale, C-terminale und interne Fragmente unterschiedlicher Größen des CRSP-Proteins codiert.
Im Stand der Technik sind einige Verfahren zum Durchmustern von Genprodukten von kombinatorischen Bibliotheken bekannt, die durch Punktmutationen oder Verkürzung erzeugt wurden, und zum Durchmustern von cDNA Bibliotheken für Genprodukte mit einer selektionierten Eigenschaft. Derartige Verfahren können für ein schnelles Durchmustern der durch die kombinatorische Mutagenese der CRSP-Proteine erzeugten Genbibliotheken angepasst werden. Die am weitesten verbreitete Verfahren, die einer Analyse mit hohem Durchsatz zugänglich sind, um große Genbibliotheken zu durchmustern, umfassen gewöhnlich Klonieren der Genbibliothek in vermehrbare Expressionsvektoren, Transformieren geeigneter Zellen mit der erhaltenen Bibliothek von Vektoren und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, bei denen Detektion einer erwünschten Aktivität eine Isolation des Vektors fördert, der das Gen codiert, dessen Produkt detektiert wurde. Rekursive Ensemble Mutagenese (REM), ein neues Verfahren, das die Frequenz funktioneller Mutanten in Bibliotheken erhöht, kann in Kombination mit den Durchmusterungsassays verwendet werden, um CRSP-Varianten (Arkin and Yourvan PNAS 89 (1992), 7811-7815; Delgrave et al., Protein Engineering 6(3) (1993), 327-331) zu identifizieren.
Zell-basierende Assays können ausgenutzt werden, um eine abgewandelte CRSP-Bibliothek zu analysieren. Beispielsweise kann eine Bibliothek von Expressionsvektoren in eine Zelllinie transfiziert werden, die normal auf einen besonderen Liganden in einer CRSP abhängigen Weise antwortet. Die transfizierten Zellen werden dann mit dem Liganden in Kontakt gebracht, wobei die Wirkung einer Expression des Mutanten auf sie Signalweitergabe durch den Liganden, beispielsweise durch Erfassen einer beliebigen Anzahl von Immunzellantworten, detektiert werden kann. Plasmid-DNA kann anschließend von den um Hemmung oder alternativ Steigerung einer Ligandeninduktion punktenden Zellen wiedergewonnen werden, wobei die individuellen Klone weiter charakterisiert werden.
Ein isoliertes CRSP-Protein oder ein Teilbereich oder Fragment davon kann als ein Immunogen verwendet werden, um CRSP bindende Antikörper unter Verwendung von Standardverfahren für polyklonale und monoklonale Antikörperpräparation zu erzeugen. Ein Volllängen CRSP-Protein kann verwendet werden oder alternativ stellt die Erfindung antigene Peptidfragmente von CRSP zur Verwendung als Immunogene bereit. Die antigenen Peptidfragmente von CRSP umfassen mindestens 8 Aminosäurereste und umfassen ein Epitop von CRSP, so dass ein Antikörper, der gegen das Peptid gezüchtet wurde, einen spezifischen Immunkomplex mit CRSP bildet. Vorzugsweise umfasst das antigene Peptid min 10 Aminosäurereste, noch bevorzugter mindestens 15 Aminosäurereste, sogar noch bevorzugter mindestens 20 Aminosäurereste und am meisten bevorzugt mindestens 30 Aminosäurereste.
Bevorzugte Epitope, die von dem antigenen Peptid umfasst sind, sind Regionen von CRSP, die an der Oberfläche des Proteins, beispielsweise hydrophile Regionen, lokalisiert sind.
Ein CRSP-Immungen wird gewöhnlich verwendet, um durch Immunisierung eines geeigneten Subjekts (beispielsweise Kaninchen, Ziege, Maus oder anderes Säugetier) mit dem Immunogen Antikörper zu erzeugen. Eine geeignete immunogene Präparation beinhaltet beispielsweise rekombinant exprimiertes CRSP-Protein oder chemisch synthetisiertes CRSP-Polypeptid. Die Präparation kann weiterhin ein Adjuvans, wie beispielsweise Freund's komplettes oder unvollständiges Adjuvans oder ähnliche immunstimulatorische Mittel beinhalten. Immunisierung eines geeigneten Subjekts mit einer immunogenen CRSP-Präparation ruft eine polyklonale Anti-CRSP Antikörperantwort hervor.
Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung Anti-CRSP-Antikörper. Der wie hier verwendete Ausdruck "Antikörper" bezieht sich auf Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teilbereiche von Immunglobulinmolekülen, d.h. Molekülen, die eine Antigenbindungsstelle aufweisen, die ein Antigen, wie beispielsweise CRSP, spezifisch bindet (damit immunreagiert). Beispiel immunologisch aktiver Teilbereiche von Immunglo bulinmolekülen beinhalten F(ab) und F(ab')2 Fragmente, die durch Behandlung der Antikörper mit einem Enzym, wie beispielsweise Pepsin, erzeugt werden können. Die Erfindung stellt polyklonale und monoklonale CRSP bindende Antikörper bereit. Der wie hier verwendete Begriff "monoklonaler Antikörper" oder "monoklonale Antikörper-Zusammensetzung" bezieht sich auf eine Population von Antikörpermolekülen, die lediglich eine Spezies von einer antigenen Bindungsstelle aufweisen, die mit einem bestimmten Epitop von CRSP immunologisch reagieren kann. Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung zeigt folglich gewöhnlich eine einzige Bindungsaffinität für ein bestimmtes CRSP-Protein mit dem er immunologisch reagiert.
Polyklonale Anti-CRSP-Antikörper können, wie vorstehend beschrieben, durch Immunisieren eines geeigneten Subjekts mit einem CRSP-Immunogen hergestellt werden. Der Anti-CRSP-Antikörpertiter in dem immunisierten Subjekt kann durch Standardverfahren, wie beispielsweise mit einem Enzymimmuntest (ELISA) unter Verwendung von immobilisiertem CRSP, über die Zeit überwacht werden. Falls erwünscht köennen die Antikörpermoleküle, die gegen CRSP gerichtet sind von dem Säugetier (beispielsweise von dem Blut) isoliert und weiterhin durch wohl bekannte Verfahren, wie beispielsweise Protein A Chromatographie gereinigt werden, um die IgG-Fraktion zu erhalten. Zu einem geeigneten Zeitpunkt nach der Immunisierung, beispielsweise wenn die Anti-CRSP-Antikörpertiter am höchsten sind, können die den Antikörper produzierenden Zellen von dem Subjekt erhalten, wobei sie dazu verwendet werde, um monoklonale Antikörper durch Standardverfahren, wie beispielsweise dem Hybridomverfahren zu präparieren, das ursprünglich durch Kohler and Milstein, Nature 256 (1975), 495-497, beschrieben wurde (siehe ebenfalls Brown et al. J. Immunol. 127 (1981), 539-46; Brown et al. J. Biol. Chem .255 (1980), 4980-83; Yeh et al. PNAS 76 (1976), 2927-31; und Yeh et al. Int. J. Cancer 29 (1982), 269-75), das jüngere menschliche B Zellen umfassende Hybridomverfahren (Kozbor et al. Immunol Today 4 (1983), 72), das EBV-Hybridomverfahren (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., (1985) pp. 77-96) oder Triomaverfahren. Das Verfahren zum Herstellen monoklonaler Antikörperhybridome ist wohlbekannt (siehe allgemein R. H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M. L. Gefter et al. Somatic Cell Genet. 3 (1977), 231-36). kurz, eine immortali sierte Zelllinie (gewöhnlich ein Myelom) wird mit Lymphozyten (gewöhnlich Milzzellen) von einem Säugetier fusioniert, die, wie vorstehend beschrieben, mit einem CRSP-Immunogen immunisiert wurden, wobei die Kulturüberstände der erhaltenen Hybridomzellen durchmustert wurden, um ein Hybridom zu identifizieren, das einen monoklonalen Antikörper hergestellt, der CRSP bindet.
Irgendeines der wohlbekannten Protokolle, die zum Fusionieren von Lymphozyten und immortalisierten Zelllinien verwendet werden, können für den Zweck zum Erzeugen eines monoklonalen Anti-CRSP Antikörpers (siehe G. Galfre et al. Nature 266 (1977), 55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet., cited supra; Lerner, Yale J. Biol. Med., cited supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, cited supra) angewendet werden. Außerdem wird dem Fachmann klar sein, dass es zahlreiche derartiger Verfahren gibt, die ebenfalls nützlich wären. Gewöhnlich wird die immortalisierte Zelllinie (beispielsweise Myelom-Zelllinie) von der gleichen Säugerspezies wie die Lyphozyten abgeleitet. Beispielsweise können Hybridome von der Maus durch Fusionieren von Lymphozyten von einer mit einer immunogenen Präparation der vorliegenden Erfindung immuninsierter Lymphozyten mit einer immortalisierten Mauszelllinie hergestellt werden. Bevorzugte immortalisierte Zelllinien sind Myelomzelllinien der Maus, die empfindlich gegenüber dem Kulturmedium sind, das Hypoxyanthin, Aminopterin und Thymidin ("HAT-Medium") sind. Eine beliebige Anzahl von Myelomzelllinien kann gemäß von Standardverfahren als Fusionspartner verwendet werden, beispielsweise die P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 oder Sp2/O-Ag14 Myelomlinien. Diese Myelomlinien sind von ATCC erhältlich. Gewöhnlich werden HAT-empfindliche Myelomzellen der Maus mit Maus-Milzzellen unter Verwendung von Polyethylenglycol ("PEG") fusioniert. Aus der Fusion erhaltene Hybridomzellen werden anschließend unter Verwendung von HAT-Medium selektioniert, das nicht fusionierte und unproduktiv fusionierte Myelomzellen (nicht fusionierte Milzzellen sterben nach einigen Tagen, da sie nicht transformiert sind) abtötet. Hybridomzellen, die einen monoklonalen Antikörper der Erfindung herstellen, werden durch Durchmustern der Hybridomkulturüberstände auf CRSP bindende Antikörper, beispielsweise unter Verwendung eines Standard-ELISA-Assays, detektiert.
Alternativ zum Herstellen von monoklonale Antikörper sezernierenden Hybridomen, kann ein monoklonaler Anti-CRSP-Antikörper durch Durchmustern einer rekombinanten kombinatorischen Bibliothek (beispielsweise eine Antikörper Phagendisplay-Bibliothek) mit CRSP identifiziert und isoliert werden, um dadurch Immunglobulinbibliotheksmitgleider zu isolieren, die CRSP binden. Kits zum Erzeugen und Durchmustern von Phagendisplaybibliotheken sind im Handel erhältlich (beispielsweise Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; und der Stratagene SurfZAP^TM Phage Display Kit, Catalog No. 240612). Zusätzliche Beispiel von Verfahren und Reagenzien, die für eine Verwendung beim Erzeugen und Durchmustern von Antikörper-Display Bibliothek zugänglich sind, können beispielsweise bei Ladner et al. U.S.-P-5,223,409; Kang et al. WO 92/18619; Dower et al.. WO 91/17271; Winter et al. WO 92/20791; Markland et al. WO 92/15679; Breitling et al. WO 93/01288; McCafferty et al.. WO 92/01047; Garrard et al. WO 92/09690; Ladner et al. WO 90/02809; Fuchs et al. Bio/Technology 9 (1991), 1370-1372; Hay et al. Hum. Antibod. Hybridomas 3 (1992), 81-85; Huse et al. Science 246 (1989), 1275-1281; Griffiths et al. EMBO J 12 (1993), 725-734; Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226 (1992), 889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:35763580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. Nuc. Acid Res. 19 (1991), 4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982; und McCafferty et al. Nature 348 (1990), 552-554 gefunden werden.
Zusätzlich sind rekombinante Anti-CRSP-Antikörper, wie beispielsweise chimäre und humanisierte monoklonale Antikörper umfassend sowohl menschliche als auch nicht menschliche Bereiche, die unter Verwendung von standardisierten DNA-Rekombinationstechniken hergestellt werden können, liegen im Umfang der Erfindung.Derartige chimäre und humanisierte monoklonalen Antikörper können durch im Stand der Technik bekannte DNA-Rekombinationstechniken hergestellt werden, beispielsweise unter Verwendung der Verfahren, die beschrieben sind in Robinson et al. PCT/LJS86/02269; Akira, et al. EP-A-184 187; Taniguchi, M., EP-A 171,496; Morrison et al. EP-A-173,494; Neuberger et al. WO 86/01533;Cabillyetal. U.S.-P-4,816,567; Cabilly et al. EP-A-125,023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; und Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:15531559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; Winter U.S. Patent 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; und Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141: 4053-4060.
Ein Anti-CRSP-Antikörper (beispielsweise monoklonaler Antikörper) kann dazu verwendet werden, um CRSP durch Standardverfahren, wie beispielsweise Affinitätschromatographie oder Immunpräzipitation zu isolieren. Ein Anti-CRSP Antikörper kann die Aufreinigung von natürlichem CRSP von Zellen und von rekombinant hergestelltem CRSP, das in Wirtszellen exprimiert wird, fördern. Außerdem kann ein Anti-CRSP-Antikörper dazu verwendet werden, um CRSP-Protein (beispielsweise in einem Zelllysat oder Zellüberstand) zu detektieren, um das Ausmaß und Muster einer Expression des CRSP-Proteins auszuwerten. Anti-CRSP-Antikörper können diagnostisch verwendet werden, um Proteinspiegel im Gewebe als Teil eines klinischen Testverfahrens zu überwachen, beispielsweise um die Wirksamkeit eines gegebenen Behandlungsregimen zu bestimmen. Detektion kann durch Koppeln (beispielsweise physikalisches Verbinden/Verknüpfen) des Antikörpers mit einer nachweisbaren Substanz. Beispiele nachweisbarer Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszente Materialien, lumineszente Materialien, biolumineszente Materialien und radioaktive Materialien. Beispiele geeigneter Enzyme umfassen Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Acetylcholinesterase, Beispiele geeigneter prothetischer Gruppenkomplexe umfassen Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin, Beispiele geeigneter fluoreszenter Materialien umfassen Umbelliferon, Fluoreszein, Fluoreszeinisothiozyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylamin-Fluoreszein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin, ein Beispiel eines lumineszenten Matertials umfasst Luminol, Beispiele biolumineszenter Materialien umfassen Luciferase, Luciferin und Aequorin, und Beispiele geeigneter radioaktiver Materialien umfassen ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S oder ³H.
III. Rekombinante Expressionsvektoren und Wirtszellen
Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäure umfassen, die CRSP (oder einen Teilbereich davon) codieren. Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Vektor" auf ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an die sie geknüpft wurde. Ein Typ eines Vektors ist ein "Plasmid", das sich auf eine kreisförmigen doppelsträngige DNA-Schleife bezieht, in der zusätzliche DNA-Segmente in dem viralen Genom ligiert sein können. Bestimmte Vektoren können sich in einer Wirtszelle, in die sie eingefügt wurden (beispielsweise bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Replikationsursprung und episomale Säugetiervektoren) autonom vermehren. Andere Vektoren (beispielsweise nicht episomale Säugetiervektoren) werden in ein Wirtszellgenom auf Einbringen in die Wirtszelle eingebaut und dadurch zusammen mit dem Wirtszellegnom repliziert. Außerdem können bestimmte Vektoren die Expression von Genen lenken, an die sie betriebsbereit geknüpft sind. Derartige Vektoren werden hhier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Im Allgemeinen liegen nützliche Expressionvektoren bei DNA-Rekombinationsverfahren häufig in der Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Erfindung können "Plasmide" und "Vektoren" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die allgemein am häufigsten verwendete Form eines Vektors darstellt. Die Erfindung soll jedoch derartige andere Formen von Expressionsvektoren umfassen, wie beispielsweise virale Vektoren (beispielsweise Replikations-defiziente Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren), die äquivalenten Funktionen dienen.
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung umfassen eine Nukleinsäure der Erfindung in einer Form, die zur Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeignet ist, was heißt, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen umfassen, ausgewählt auf der Basis der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen, die mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz betriebsbereit verknüpft ist. In einem rekombinanten Expressionsvektor soll "betriebsbereit verknüpft" bedeuten, dass die Nukleotidsequenz von Interesse mit der regulatorischen Sequenzen) auf eine Art verbunden sind, das eine Expression der Nukleotidsequenz (beispielsweise in einem in vitro Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, falls der Vektor in die Wirtszelle eingefügt wird) ermöglicht wird. Der Ausdruck "regulatorische Sequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionsteuerungselemente (beispielsweise polyadenylierungssignale) einschließen. Derartige regulatorische Sequenzen sind beispielsweise beschrieben in Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulatorische Sequenzen umfassen jene, die eine konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in zahlreichen Wirtszelltypen lenken und jenen, die die Expression der Nukleotidsequenz lediglich in bestimmten Wirtszellen (beispielsweise Gewebe-spezifische regulatorische Sequenzen) lenken. Es wird dem Fachmann klar sein, dass die Gestaltung des Expressionsvektoren von derartigen Faktoren, wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Grad einer erwünschten Proteinexpression, etc. abhängig sind. Die Expressionsvektoren der Erfindung können in Wirtszellen eingefügt werden, um dadurch Proteine oder Peptide, einschließlich Fusionsproteinen oder -peptiden herzustellen, die durch die hier beschriebenen Nukleinsäuren (beispielsweise CRSP-Proteine, mutante Formen von CRSP, Fusionsproteine, etc) codiert werden.
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können für die Expression von CRSP in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen gestaltet sein. CRSP kann beispielsweise in Bakterienzellen, wie beispielsweise E, coli, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefezellen und Säugetierzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden weiter in Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) ausgeführt. Alternativ kann der rekombinante Expressionsvektor beispielsweise unter Verwendung von T7-Promotor regulatorischen Sequenzen und T7 Polymerase in vitro transkribiert und translatiert werden.
Eine Expression von Proteinen in Prokaryoten wird häufig in E. coli mit Vektoren ausgeführt, die konstitutive oder induzierbare Promotoren umfassen, die die Expression von sowohl Fusions- oder Nicht-Fusionsproteinen lenken. Fusionsvektoren fügen eine Anzahl von Aminosäuren zu einem darin codierten Protein gewöhnlich an den Aminoterminus des rekombinanten Proteins hinzu. Derartige Fusionsvektoren dienen normalerweise drei Zwecken: 1) die Expression von rekombinantem Protein zu erhöhen, 2) die Löslichkeit des rekombinanten Proteins zu erhöhen, und 3) die Reinigung des rekombinanten Proteins zu fördern, indem es als ein Ligand bei einer Affinitätschromatographie wirkt. Häufig wird in Fusionsexpressionsvektoren eine proteolytische Spaltstelle an der Verbindung des Fusionsrestes und dem rekombinanten Protein eingeführt, um eine Trennung des rekombinanten Proteins von dem Fusionsrest durch nachfolgende Reinigung des Fusionsproteins zu ermöglichen. Derartige Enzyme und deren verwandte (cognate) Erkennungssequenzen umfassen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase. Gewöhnliche Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharmacia Biotech Inc., Smith D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 76:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Fharmacia, Piscataway, NJ), die Glutathion S-Transferase (GST), Maltose E Bindungsprotein beziehungsweise Protein A an das rekombinante Zielprotein fusionieren.
Gereinigte Fusionsproteine können beispielsweise in CRSP-Aktivitätsassays, in CRSP-Ligandenbindung (beispielsweise direkte Assays oder hier ausführlich beschriebene kompetitive Assays) und um CRSP-Protein spezifische Antikörper zu erzeugen, verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine CRSP-Fusion, die in einem retroviralen Expressionvektor der Erfindung exprimiert wird, verwendet werden, um Knochenmarkszellen zu infizieren, die anschließend in bestrahlte Empfänger transplantiert werden. Die Pathologie des Testempfängers (subject recipient) wird anschließend nach ausreichend vergangener Zeit (beispielsweise sechs (6) Wochen) untersucht.
Beispiele geeigneter induzierbarer Nicht-Fusions E. coli Expressionsvektoren umfassen pTrc (Amann et al., Gene 69 (1988), 301-315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 Academic Press, San Diego, California (1940, 60-89). Zielgenexpression von dem pTrc-vektor beruht auf einer Wirts-RNA Polymerase-Transkription von einem Hybrid trp-lac Fusionspromotor. Die Zielgenexpression des pET 11d-Vektors beruht auf der Transkription von einem T7 gn10-lac Fusionspromotor, die durch eine ko-exprimierte virale RNA-Polymerase (T7 gnl) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird durch den Wirtsstamm BL21 (DE3) oder HMS 174 (DE3) von einem residenten λ Prophagen geliefert, der ein T7 gnl Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUVS-Promotors beherbergt.
Eine Strategie die rekombinante Proteinexpression in E. coli zu steigern, besteht darin das Protein in einem Wirtsbakterium zu exprimieren, das eine gestörte Fähigkeit das rekombinante Protein (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990)119-128) zu spalten aufweist. Eine andere Strategie besteht darin die Nukleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor einzufitgende Nukleinsäure zu ändern, so dass die individuellen Codone für jede Aminosäure die in E. coli bevorzugt verwendeten sind (Wada et al., Nucleic Acids Res. 20 (1992), 2111-2118). Derartige Änderungen von Nukleinsäuresequenzen der Erfindung können durch DNA-Standard-Syntheseverfahren ausgeführt werden.
In einer anderen Ausführungsform liegt der CRSP-Expressionsvektor als ein Hefe-Expressionsvektor vor. Beispiele von Expressionsvektoren in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYepSec1 (Baldari et al., EMBO J. 6 (1987), 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz Cell 30 (1982), 933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) und picZ (Invitrogen Corp. San Diego, CA).
Alternativ kann CRSP in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren sind für eine Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (beispielsweise Sf9 Zellen) einschließlich der pAc Serie (Smith et al., Mol. Cell Bioh 3 (1983), 2156-2165) und der pVL Serie (Lucklow and Summers, Virology 170 (1989), 31-39) erhältlich.
In noch einer anderen Ausführungsform wird eine Nukleinsäure der Erfindung in Säugetierzellen unter Verwendung eines Säugetier-Expressionsvektars exprimiert. Beispiele von Säugetier-Expressionsvektoren umfassen pCDM8 (Seed, B. (198?) Nature 329:844) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195). Werden sie in Säugetierzellen verwendet, dann werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors häufig durch virale regulatorische Elemente bereitgestellt. Beispielsweise sind allgemein verwendete Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2, Zytomegalievirus und Simian Virus 40 abgeleitet. Für andere geeignete Expressionssysteme für sowohl prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
In einer anderen Ausführungsform kann der rekombinante Säugetierexpressionsvektor die Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in einem bestimmten Zelltyp (beispielsweise Gewebe-spezifische regulatorische Elemente werden verwendet, um die Nukleinsäure zu exprimieren) lenken. Gewebe-spezifische regulatorische Elemente sind im Stand der Technik bekannt. Nicht beschränkende Beispiele von geeigneten Gewebe-spezifischen Promotoren umfassen Albumin-Promoter (Leber-spezifisch; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), lymphoid-spezifischer Promotoren (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), insbesondere Promotoren von T-Zellreceptoren (Winoto and Baltimare (1989) EMBO J. 8:729-733) und Immunoglobulinen (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen and Baltimore (1983) Gell 33:741-748), Neuronen-spezifische Promotoren (beispielsweise der Neurofilamentpromotor; Byrne and Ruddle (1989) PNAS 86:5473-5477), Pankreasspezifische Promotoren (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916), und Brustdrüsenspezifische Promotoren (beispielsweise Milchserumpromotor; U.S.-P-4,873,316 und EP-A-264,166). Ebenfalls sind über die Entwicklung regulierte Promotoren umfasst, beispielsweise die hox Promotoren der Maus (Kessel and Gruss (1990) Science 249:374-379) und der α- Fetoproteinpromotor (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).
Die Erfindung stellt weiterhin einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der ein DNA-Molekül der Erfindung umfasst, das in den Expressionsvektor in einer Antisense Orientierung kloniert wurde. Das Heißt, das DNA-Molekül ist an eine regulatorische Sequenz in einer Weise betriebsbereit geknüpft, die eine Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls, das Antisense zu CRSP-mRNA vorliegt, ermöglicht. Regulatorische Sequenzen, die an eine Nukleinsäure betriebsbereit geknüpft sind, die in der Antisense-Orientierung kloniert wurde, können gewählt werden, die die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in einer Anzahl von Zelltypen lenken, beispielsweise können virale Promotoren und/oder Enhancer, oder regulatorische Sequenzen gewählt werden, die die Expression von Antisense-RNA konstitutiv, Gewebe-spezifisch oder Zelltyp-spezifisch lenken. Der Antisense-Expessionsvektor kann in der Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemid oder von attenuiertem Virus vorliegen, in dem Antisense Nukleinsäuren unter der Kontrolle einer hoch effizienten regulatorischen Region hergestellt werden, wobei die Aktivität davon durch den Zelltyp bestimmt werden kann, in den der Vektor eingefügt wurde. Für eine Erläuterung der Regulation einer Genexpression unter Verwendung von Antisense-Genen siehe Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis; Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1 (1) (1986).
Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft Wirtszellen, in die ein rekombinanter Expressionsvektor der Erfindung eingefügt wurde. Der Ausdruck "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden hier austauschbar verwendet. Es ist klar, dass derartige Ausdrücke sich nicht lediglich auf die bestimmte Test (SUBJECT)zelle bezieht, sondern auf die Nachkommen oder möglichen Nachkommen einer derartigen Zelle. Da bestimmte Modifikationen in nachfolgenden Generationen aufgrund von entweder Mutation oder umweltbedingten Einflüssen auftreten können, können derartige Nachkommen in der Tat nicht identisch zu der Elternzelle sein, wobei sie jedoch innerhalb des Umfangs des hier verwendeten Ausdrucks verwendet werden.
Eine Wirtszelle kann eine beliebige prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. So kann beispielsweise das CRSP-Protein in Bakterienzellen, wie beispielsweise E. coli, Insektenzellen, Hefe oder Säugetierzellen (beispielsweise Ovariarzellen des chinesischen Hamsters (CHO) oder COS-Zellen) exprimiert werden. Andere Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt.
Vektor-DNA kann in prokaryotische oder eukaryotische Zellen über herkömmliche Transformations- oder Transfektions-Verfahren eingefügt werden. Wie hier verwendet sollen sich die Ausdrücke "Transformation" und "Transfektion" auf eine Vielzahl vom im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einfügen fremder Nukleinsäure (beispielsweise DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich von Calciumphosphat oder Calciumchlorid Ko-Präzipitation, DEAE-Dextran vermittelte Transfektion, Lipofectin oder Elektroporation beziehen. Geeignete Verfahren zum Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen können in Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989) und anderen Laborhandbüchern gefunden werden.
Zur stabilen Transfektion von Säugetierzellen ist bekannt, dass abhängig von dem verwendeten Expressionsvektor und dem Transfektionsverfahren lediglich eine kleine Zellfraktion die Fremd-DNA in deren Genom integrieren kann. Um diese Integranten zu identifizieren und zu selektionieren, wird allgemein ein Gen, das einen Selektionsmarker (beispielsweise Resistenz gegenüber Antibiotika) codiert, zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingefügt. Bevorzugte Marker umfassen jene, die eine Resistenz gegenüber Arzneimitteln, wie beispielsweise G418, Hygromycin und Methotrexat übertragen. Nukleinsäuren, die einen Selektionsmarker codieren können auf dem gleichen Vektor wie dem, der das CRSP codiert, in eine Wirtszelle eingefügt oder können auf einem getrennten Vektor eingefügt werden. Die Zellen, die stabil mit der eingefügten Nukleinsäure transfiziert sind, können durch Arzneimittelselektion (beispielsweise werden Zellen, die das Selektionsmarkergen eingebaut beinhalten überleben, während die anderen Zellen sterben) identifiziert werden.
Eine Wirtszelle der Erfindung, beispielsweise eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle in Kultur, kann verwendet werden, um CRSP-Protein herzustellen (d.h. exprimieren). Demgemäß stellt die Erfindung weiterhin Verfahren zur Herstellung von CRSP-Protein unter Verwendung der Wirtszellen der Erfindung bereit. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren Kultivieren der Wirtszelle der Erfindung (in die ein CRSP codierender rekombinanter Expressionsvektor eingefügt wurde) in einem geeigneten Medium, so dass CRSP-Protein hergestellt wird. In einer anderen Ausführungsformumfasst das Verfahren weiterhin Isolieren von CRSP aus dem Medium oder der Wirtszelle.
Die Wirtszellen der Erfindung können verwendet werden, um nicht menschliche transgene Tiere herzustellen. Beispielsweise ist in einer Ausführungsform eine Wirtszelle der Erfindung eine nicht menschliche befruchtete Eizelle oder eine nicht menschliche embryonale Stammzelle, in die CRSP- codierende Sequenzen eingefügt wurden. Derartige Wirtszellen können dann dazu verwendet werden, um nicht-menschliche transgene Tiere, in denen exogene CRSP-Sequenzen in deren Genom eingefügt wurden oder homolog rekombinante Tiere zu erzeugen, in denen endogene CRSP-Sequenzen geändert wurden. Derartige Tiere sind zur Untersuchung der Funktion und/oder Aktivität von CRSP und zum Identifizieren und/oder Evaluieren von Modulatoren einer CRSP-Aktivität nützlich. Wie hier verwendet, ist ein "transgenes Tier" ein nicht-menschliches Tier, vorzugsweise ein Säuger, noch bevorzugter ein Nager, wie beispielsweise eine Ratte oder Maus, in der eine oder mehrere Zellen des Tieres ein Transgen umfassen. Andere Beispiele transgener Tiere umfassen nichtmenschliche Primaten, Schafe, Hunde, Kühe, Ziegen, Hühner, Amphibien, etc.. Ein Transgen ist exogene DANN, die in das Genom einer Zelle integriert ist, aus der sich ein transgenes Tier entwickelt und das in dem Genom des reifen Tieres verbleibt, wodurch die Expression eines codierten Genprodukts in einer oder mehreren Zelltypen oder Geweben des transgenen Tiers gelenkt wird. Wie hier verwendet, ist ein "homolog rekombinantes Tier" ein nichtmenschliches Tier, vorzugsweise ein Säuger, noch bevorzugter eine Maus, in der ein endogenes CRSP-Gen durch homologe Rekombination zwischen dem endogenen Gen und einem exogenen DNA-Molekül geändert wurde, das in eine Zelle des Tiers, beispielsweise eine embryonale Zelle des Tiers, vor der Entwieklung des Tiers eingefügt wurde.
Ein nicht-menschliches transgenes Tier der Erfindung kann durch Einfügen von CRSP codierender Nukleinsäure in den männlichen Pronukleus einer befruchteten Einzelle, beispielsweise durch Mikroinjektion, retrovirale Infektion, erzeugt werden, wobei sich die Eizelle in einen pseudoschwangeres weibliches Nährtier beziehungsweise Ammentier entwickeln kann. Die menschliche CRSP-cDNA Sequenz der Erfindung kann als ein Transgen in das Genom eines nicht-menschlichen Tiers eingefügt werden. Alternativ kann ein nichtmenschliches Homolog eines menschlichen CRSP-Gens, beispielsweise ein CRSP-Gen der Maus, basierend auf einer Hybridisierung an die menschliche CRSP-cDNA (Vorstehend ausführlicher beschrieben in Abschnitt I) isoliert und als ein Transgen verwendet werden.
Intronsequenzen und Polyadenylierungssignale können ebenfalls in das Transgen eingefügt werden, um die Effizienz einer Expression des Transgens zu erhöhen. Eine Gewebespezifische Regulatorsequenz(en) kann/können an das CRSP-Transgen betriebsbereit geknüpft sein, um die Expression von CRSP-Protein an/auf bestimmten Zellen zu lenken. Verfahren zum Herstellen nicht-menschlicher transgener Tiere über Embryonenmanipulation und Mikroinjektion, insbesondere Tieren wie beispielsweise Mäusen, wurden im Stand der Technik allgemein und sind beispielsweise beschrieben in US-P-4,736,866 und 4,870,009, beide von Leder et al.„US-P-4,873,191 von Wagner et al., und in Hogan, B. Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986). Ähnliche Verfahren werden zur Herstellung anderer nicht-menschlicher transgener Tiere verwendet. Ein nichtmenschliches transgenes Gründertier kann basierend auf der Anwesenheit des CRSP-Gens in dessen Genom und/oder Expression von CRSP-mRNA in Geweben oder Zellen des Tieres identifiziert werden. Ein nicht-menschliches transgenes Gründertier kann dann verwendet werden, um zusätzliche das Transgen tragende Tiere zu züchten. Außerdem können die nicht-menschlichen das CRSP codierende Transgen tragenden transgenen Tiere weiterhin mit anderen nicht-menschlichen transgenen Tieren, die andere Transgene tragen, gezüchtet werden.
Um ein homolog rekombinantes nicht-menschliches Tier zu erzeugen, wird ein Vektor, der mindestens einen Teilbereich eines CRSP-Gens beinhaltet, präpariert, in das eine Deletion, Addition oder Substitution eingefügt wurde, um dadurch das CRSP-Gen zu ändern, beispielsweise funktionell zu zerstören. Das CRSP-GEN kann ein menschliches Gen (beispielsweise die cDNA von SEEQ ID:3, SEQ ID: 5:6, SEQ ID NO:9 oder SEQ IO:12), jedoch vorzugsweise ein nicht-menschliches Homolog eines menschlichen CRSP-Gens sein. Beispielsweise kann ein CRSP-Gen der Maus von SEQ ID NO:16 verwendet werden, um einen homologen rekombinanten Vektor zu konstruieren, der zum Ändern eis endogenen CRSP-Gens in dem Mausgenom geeignet ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor so gestaltet, das auf homologe Rekombination das endogene CRSP-Gen funktionell zerstört (d.h. nicht länger ein funktionelles Protein codiert, was ebenfalls als ein "Knock out" Vektor bezeichnet wird) wird. Alternativ kann der Vektor so gestaltet sein, dass auf homologe Rekombination das endogene CRSP-Gen mutiert oder auf andere Weise geändert wird, wobei es jedoch immer noch Funktionelles Protein (beispielsweise kann die stromaufwärts gelegene Region geändert sein, um dadurch die Expression des endogenen CRSP-Proteins zu ändern) codiert. In dem homologen Rekombinationsvektor ist das geänderte CRSP-Gen an dessen 5'- und 3'-Enden durch zusätzliche Nukleinsäure des CRSP-gens flankiert, um zwischen dem durch den Vektor getragenen exogenen CRSP-Gen und einem endogenen CRSP-Gen in einer nicht-menschlichen embryonalen Stammzelle eine homologe Rekombination zustande kommen zu lassen. Die zusätzliche flankierende CRSP-Nukleinsäure weist eine ausreichende Länge auf, um mit dem endogenen Gen erfolgreich homolog zu rekombinieren. Gewöhnlich werden einige Kilobasen flankierender DNA (sowohl an dem 5'-als auch dem 3'-Ende) in den Vektor eingefügt (siehe Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. Cell 51 (1987), 503 für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren). Der Vektor wird in eine nicht-menschliche embryonale Stammzelllinie (beispielsweise durch Elektroporation) eingefügt, wobei die Zellen, in denen das eingefügte CRSP-Gen mit dem endogenen CRSP-Gen homolog rekombinierte, selektioniert werden (siehe beispielsweise Li, E. et al., Cell 69 (1992), 915). Die selektionierten Zellen werden dann in eine Blastozyste eines nicht-menschlichen Tieres (beispielsweise einer Maus) injiziert, um Aggregationschimären (siehe beispielsweise Bradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells A practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1978) pp. 113-152). Ein nichtmenschlicher Embryo kann dann in eingeeignetes pseudoschwangeres weibliches nichtmenschliches Nährtier implantiert, wobei der Embryo zur Geburt gebracht wird. Nachkommen, die die homolog rekombinierte DNA in deren Keimzellen aufweisen, können zum Züchten von Tieren verwendet werden, in denen alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA durch Keimbahnübermittlung des Transgens beinhalten. Verfahren zum konstruieren homologer Rekombinationsvektoren und homolog rekombinanter Tiere werden weiter in Bradley, A. Cunent Opinion in Biotechnology 2 (1991), 823-829 und in WO 90/11354 von Le Mouellec et al, WO 91/01140 von Smithies et al., WO 92/0968 von Zijlstra e al., und WO 93/04169 von Berns et al., beschrieben.
In einer anderen Ausführungsform können transgene, nicht-menschliche Tiere hergestellt werden, die ein ausgewähltes System beinhalten, das das Transgen reguliert exprimieren kann. Ein Beispiel eines derartigen Systems ist das cre/loxP Rekombinasesystem des Bakteriophagen P1. Für eine Beschreibung des cre/loxP Rekombinasesystems siehe beispielsweise Lakso et al., PNAS 89 (1992) 6232-6236. Ein anderes Beispiel eines Rekom binasesystems ist das FLP-Rekombinasesystem von Saccharomyces cerevisiae (o'Gorman et al., Science 251 (1991), 1351-1355. Falls ein cre/loxP Rekombinasesystem verwendet wird, um eine Transgenexpression zu regulieren, dann ist es erforderlich, dass die die Transgene aufweisenden Tiere sowohl die Cre-rekombinase als auch ein ausgewähltes Protein codieren. Derartige Tiere können durch die Konstruktion von nicht-menschlichen "doppelt" trangenen Tieren, beispielsweise durch paaren zweier nicht-menschlicher Tiere bereitgestellt werden, wobei eines ein Transgen aufweist, das ein ausgewähltes Protein codiert und das andere ein Transgen aufweist, das eine Rekombinase codiert.
Klone der hier beschriebenen nicht-menschlichen transgenen Tiere können ebenfalls entsprechend der in Wilmut, I. et al., Nature 385 (1997), 810-813 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Kurz, eine Zelle, beispielsweise eine somatische Zelle von dem transgenen Tier, kann isoliert und induziert werden Den Wachstumszyklus zu verlassen und in die Go-Phase einzutreten. Die ruhende Zelle kann dann, beispielsweise durch die Verwendung elektrischer Pulse, mit einer nicht-menschlichen Eizelle von einem Tier der gleichen Spezies von dem die ruhende Zelle isoliert wurde, fusioniert werden. Die rekonstruierte nichtmenschliche Eizelle wird dann derart kultiviert, das sie sich zur Morula oder Blastozyte entwickelt und anschließend auf ein pseudoschwangeres weibliches Nährtier übertragen wird. Die von diesem weiblichen Nährtier geborenen Nachkommen werden ein Klon des Tieres sein, von dem die Zelle, beispielsweise die somatische Zelle, isoliert wurde.
IV. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die CRSP-Nukleinsäuremoleküle, CRSP-Proteine und Anti-CRSP-Antikörper (hier auch als "aktive Verbindungen" bezeichnet) der Erfindung können in pharmazeutische Zusammensetzungen eingefügt werden, die zur Verabreichung geeignet sind. Derartige Zusammensetzungen umfassen gewöhnlich das Nukleinsäuremolekül, Protein oder Antikörper und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Wie hier verwendet, soll der Ausdruck "pharmazeutisch verträglicher Träger" beliebige und alle Lösungsmittel, Dispersionsmittel, Beschichtungen, antibakterielle und Anti-Pilz-Mittel, isotonische und eine Absorption verzögernde Mittel und dergleichen umfassen, die mit einer pharmazeutischen Verabreichung verträglich sind. Die Verwendung derartiger Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Stand der Technik wohl bekannt. Abgesehen davon, dass irgendwelche herkömmlichen Medien oder Mittel mit der aktiven Verbindung unverträglich sind, wird eine Verwendung davon in der Zusammensetzung in Betracht gezogen. Ergänzende aktive Substanzen können in die Zusammensetzungen eingefügt werden.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung wird so formuliert, dass sie mit der vorgesehenen Verabreichungsroute verträglich ist. Beispiele von Routen der Verabreichung umfassen parenterale, beispielsweise intravenöse, intradermale, subkutane, orale (beispielsweise Inhalation), transdermale (topikale), transmukosale und rektale Verabreichung. Lösungen oder Suspensionen, die zur parenteralen, intradermalen oder subkutanen Anwendung verwendet werden, können die folgenden Bestandteile umfassen: ein steriles Verdünnungsmittel, wie beispielsweise Wasser zur Injektion, Salzlösung, fette Öle, Polyethylenglycole, Glycerin, Propylenglycol oder andere synthetische Lösungsmittel, antibakterielle Mittel, wie beispielsweise Benzylalkohol oder Methylparabene, Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit, chelatierende Mittel, wie beispielsweise Ethylendiamintetraessigsäure, Puffer, wie beispielsweise Acetate, Citrate oder Phosphate und Mittel zum Einstellen der Tonizität, wie beispielsweise Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH-Wert kann mit Säuren oder Basen, wie beispielsweise Salzsäure oder Natriumhydroxid eingestellt werden. Die parenterale Präparation kann in Ampullen, Einwegspritzen oder Mehrfachdosisgefäßen aus Glas oder Kunststoff verschlossen sein.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur injizierbaren Verwendung geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen (wo wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Pulver für die unvorhergesehene Präparation von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. Für eine intravenöse Verabreichung umfassen geeignete Träger physiologische Salzlösung, bakteriostatisches Wasser, Cremophor EL^TM (BASF, Parippany, NJ) oder Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS). In allen Fällen muss die Zusammensetzung steril sein und sollte bis zu dem Ausmaß flüssig sein, dass ein einfache Spritzennutzbarkeit existiert. Sie muss unter den Herstellungs- und Lagerbedingungen stabil und muss gegen die verunreinigende Wirkung von Mikroorganismen, wie beispielsweise Bakterien und Pilzen, bewahrt werden. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein, das beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (beispielsweise Glycerol, Propylenglycol, und flüssiges Polyethylenglycol, und dergleichen) und geeignete Gemische davon. Die genaue Fluidität kann beispielsweise durch die Verwendung einer Beschichtung wie Lecithin, durch Erhaltung der erforderlichen Teilchengröße in dem Fall einer Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln, erhalten werden. Eine Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und Anti-Pilzmittel, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und dergleichen erreicht werden. In zahlreichen Fällen wird es vorzugsweise isotonische Mittel, beispielsweise Zucker, Polyalkohole wie beispielsweise Manitol, Sorbitol, Natriumchlorid in der Zusammensetzung umfassen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann dadurch erreicht werden, das die Zusammensetzung ein Mittel aufweist, das die Absorption verzögert, beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine.
Sterile Injektionslösungen können durch Einfügen der nativen Verbindung (beispielsweise ein CRSP-Protein oder Anti-CRSP-Antikörper) in der erforderlichen Menge in einem geeigneten Lösungsmittel, wie erforderlich mit einem oder einer Kombination von vorstehend aufgezählten Bestandteilen präpariert werden, gefolgt durch Filtersterilisation. Allgemein werden Dispersionen durch Einfügen der aktiven Verbindung in ein steriles Vehikel hergestellt, das ein basisches beziehungsweise BASIS-Dispersionsmedium, und die erforderlichen anderen Bestandteile jener vorstehend Aufgezählten. In dem Fall von sterilen Pulvern zur Herstellung von sterilen Injektionslösungen sind die bevorzugten Verfahren zur Herstellung Vakuumtrocknen und Gefriertrocknen, was ein Pulver des aktiven Bestandteils plus eines beliebigen zusätzlich erwünschten Bestandteils von einer vorher steril gefilterten Lösung davon ergibt.
Orale Zusammensetzungen umfassen allgemein ein inertes Verdünnungsmittel oder einen essbaren Träger. Sie können in Gelatinekapseln eingeschlossen oder in Tabletten zusammengepresst sein. Zum Zweck einer oralen therapeutischen Verabreichung kann die aktive Verbindung Arzneimittelträgern umfassen und in der Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln verwendet werden. Orale Zusammensetzungen können ebenfalls unter Verwendung eines fluiden Trägers zur Verwendung als eine Mundwäsche hergestellt werden, wobei die Verbindung in dem fluiden Träger oral angewendet und geraschelt (swished) und ausgespieen oder geschluckt wird. Pharmazeutisch verträgliche Bindemittel und/oder adjuvante Materialien können als Teil der Zusammensetzung eingefügt werden. Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und dergleichen beinhalten einen beliebigen der folgenden Bestandteile, oder Verbindungen einer ähnlichen Beschaffenheit; ein Bindemittel, wie beispielsweise mikrokristalline Zellulose, Gum-Tragacanth oder Gelatine, eine Arznei mittelträger, wie beispielsweise Stärke oder Lactose, ein disintegrierendes Mittel, wie beispielsweise Alginsäure, Primogel oder Maisstärke, ein Schmiermittel, wie beispielsweise Magnesiumstearat oder Steroten, ein Glidant, wie beispielsweise kolloidales Siliciumdioxid, ein Süßmittel, wie beispielsweise Sucrose oder Saccharin, oder ein Geschmacksmittel, wie beispielsweise Pfefferminze, Methylsalicylat oder Orangegeschmack.
Zur Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen in der Form eines Aerosolsprays von unter Druck stehenden Gefäßen oder Spender zugeführt, die ein geeignetes Treibmittel, beispielsweise ein Gas, wie beispielsweise Kohlendioxid oder einen Zerstäuber umfassen.
Eine systemische Verabreichung kann ebenfalls durch transmukosale oder transdermale Mittel erfolgen. Bei transmukosaler oder transdermaler Verabreichung werden für die zu durchdringende Barriere geeignete Durchdringungsmittel in der Formulierung verwendet. Derartige Durchdringungsmittel sind allgemein im Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise für eine transmukosale Verabreichung Detergenzien, Gallensalze und Fusidinsäure-Derivate. Eine transmukosale Verabreichung kann durch die Verwendung von Nasensprays oder Zäpfchen erreicht werden. Für eine transdermale Verabreichung werden die aktiven Verbindungen in Heilsalben, Salben, Gelen oder Cremen, wie im Stand der Technik bekannt ist formuliert.
Die Verbindungen können in der Form von Zäpfchen (beispielsweise mit herkömmlichen Zäpfchengrundstoffen wie Kakaobutter und anderen Glyceriden) oder Retentionsenemas zur rektalen Zufuhr.
In einer Ausführungsform werden die Verbindungen mit Trägern hergestellt, die die Verbindung gegen schnelle Beseitigung aus dem Körper schützt, wie beispielsweise eine kontrollierte Freisetzungsformulierung, einschließlich Implantaten und mikroverkapselten Zuführsystemen. Biologisch abbaubare, biologisch verträgliche Polymere, wie beispielsweise Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Kollagen, Polyorthoester und Polylactische Säure können verwendet werden. Verfahren zur Herstellung derartiger Formulierungen werden dem Fachmann offenbar werden. Die Materialien können ebenfalls im Handel von Alza Corporation und Nova Pharmaceuticals, Inc. erhalten werden. Liposomale Suspensionen (einschließlich Liposomen, die mit monoklonalen Antikörpern gegen virale Antigene auf infizierte Zellen zielen) können ebenfalls als pharmazeutisch verträgliche
Träger verwendet werden. Diese können entsprechend der dem Fachmann bekannten Verfahren, beispielsweise wie in US-P-4,522,811 beschrieben, hergestellt werden.
Es ist insbesondere vorteilhaft orale oder parenterale Zusammensetzungen in einer Dosierungseinheitenform zur Erleichterung und Einheitlichkeit einer Dosierung zu formulieren. Dosierungseinheitenform wie hier verwendet bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als einheitliche Dosierungen für das zu behandelnde Subjekt geeignet sind, wobei jede Einheit eine bestimmte Menge aktiver Verbindung aufweist, die so berechnet ist, dass die erwünschte therapeutische Wirkung in Assoziation mit dem erforderliche pharmazeutischen Träger erzeugt wird. Die Spezifikation der Dosierungseinheitenformen der Erfindung wird durch die einzigartigen Charakteristiken der aktiven Verbindung und der besonders zu erreichenden therapeutischen Wirkung und den inhärenten Beschränkungen in der Kunst des Zusammenstellens einer derartigen aktiven Verbindung zur Behandlung von Individuen diktiert und ist davon unmittelbar abhängig.
Die Toxizität und therapeutische Effizienz derartiger Verbindungen kann durch standardisierte pharmazeutische Verfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren, beispielsweise zum Bestimmen der LD50 (die Dosis, die für 50% der Population tödlich ist) und die ED 50 (die Dosis, die in 50% der Population therapeutisch wirksam ist) bestimmt werden. Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index und kann als das Verhältnis LD50/ED50 ausgedrückt werden. Verbindungen, die hohe therapeutische Indices zeigen werden bevorzugt. Während Verbindungen mit toxischen Nebenwirkungen verwendet werden, sollte bei Gestaltung eines Zuführsystems, das derartige Verbindungen zu der Stelle betroffenen Gewebes ausrichtet, Vorsicht walten, um eine mögliche Schädigung nicht infizierter Zellen zu minimieren und dadurch die Nebenwirkungen zu verringern.
Die von den Zellkulturassays und Tieruntersuchungen erhaltenen Daten können bei der Formulierung eines Dosierungsbereichs zur Verwendeung in Menschen verwendet werden. Die Dosierung derartiger Verbindungen liegt vorzugsweise in einem Bereich zirkulierender Konzentrationen, die die ED50 mit kleiner oder keiner Toxizität einschließt. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs abhängig von der angewendeten Dosierungsform und der angewendeten Verabreichungsroute variieren. Für eine beliebige Verbindung, die in dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann die therapeutisch wirksame Dosierung anfänglich aus Zellkulturassays berechnet werden. Eine Dosierung kann in Tiermodellen formuliert werden, um einen im Plasma zirkulierenden Konzentrationsbereich zu erreichen, der die IC50 (d.h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Hemmung von Symptomen erreicht) wie in der Zellkultur bestimmt, umfasst. Derartige Information können verwendet werden, um die in Menschen nützlichen Dosierungen noch genauer zu bestimmen. Plasmaspiegel können beispielsweise durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie erfasst werden.
Die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung können in Vektoren eingefügt und als Gentherapievektoren verwendet werden. Gentherapievektoren können einem Subjekt beispielsweise durch intravenöse Injektion, lokale Verabreichung (siehe US-P-5,328,470) oder durch stereotaktische Injektion (siehe beispielsweise Chen et al., PNAS 91 (1994), 3054-3057) zugeführt werden. Die pharmazeutische Präparation des Gentherapievektors kann den Gentherapievektor in einem verträgliche Verdünnungsmittel umfassen oder kann eine langsame Freisetzungsmatrix umfassen, in der das Genzuführvehikel eingebettet ist. Alternativ können, wo der gesamte Genzuführvektor von rekombinanten Zellen intakt, beispielsweise durch retrovirale Vektoren hergestellt werden kann, die pharmazeutische Präparation eine oder mehrere Zellen einschließen, die das Genzuführsystem herstellen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können einen Behälter, eine Packung oder Spender zusammen mit Instruktionen zur Verabreichung umfassen.
V. Verwendungen und Verfahren der Erfindung
Die Moleküle der Erfindung (beispielsweise hier beschriebene Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Proteinhomologe und Antikörper) können in einem oder mehreren der folgenden Verfahren verwendet werden: a) Durchmusterungsassays, b) vorhersagende Medizin (beispielsweise diagnostische Assays, prognostische Assays, Überwachung klinischer Studien und Pharmakogenetik), c) Verfahren einer Behandlung (beispielsweise therapeutische und prophylaktische). Wie hier beschrieben, weist ein CRSP-Protein der Erfindung eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten auf intrazelluläres Calcium, einen Anstieg in Phosphatidylinositol oder anderem Molekül, und beispielsweise zu einer hier ausgeführten Phosphorylierung von spezifischen Proteinen, einer Modulation einer Gentranskription und einer beliebigen anderen biologischen Aktivitäten führen kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine CRSP-Aktivität mindestens eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten: (i) Wechselwirkung eines CRSP-Protein mit und/oder Bindung an ein zweites Molekül (beispielsweise ein Protein, wie ein CRSP (beispielsweise CRSP-1)-Rezeptor, eine lösliche Form eines löslichen CRSP-Rezeptors, eines Rezeptors für ein Mitglied der wnt-Familie der Signalproteine, oder ein Nicht-CRSP Signalmolekül (ii) Wechselwirkung eines CRSP-Protein mit einem intrazellulären Protein üver einen Membrangebundenen CRSP-Rezeptor, (iii) Komplexbildung zwischen einem löslichen CRSP-Protein und einem zweiten löslichen CRSP-Bindungspartner (beispielsweise einem Nicht-CRSP-Proteinmolekül oder einem zweiten CRSP-Proteinmolekül), (iv) Wechselwirkung mit anderen extrazellulären Proteinen (beispielsweise Regulation von wnt-abhängiger Zelladhäsion an extrazelluläre Matrixbestandteile), (v) Bindung an und Beseitigung eines unerwünschten Moleküls (beispielsweise eine detoxifizierende Aktivität oder Abwehrfunktion) und/oder (vi) eine Enzymaktivität und kann folglich beispielsweise verwendet werden bei (1) der Modulatoion zellulärer Signaltransduktion, entweder in vivo oder in vitro (beispielsweise Antagonismus der Aktivität von Mitgliedern der wnt-Familie von sekretierten Proteinen oder Unterdrückung von wnt-abhängiger Signaltransduktion), (2) Regulation einer Kommunikation zwischen Zellen (beispielsweise Regulation von wnt-abhängiger Zell-Zell Wechselwirkungen), (3) Regulation der Expression von Genen, deren Expression durch Bindung von CRSP (beispielsweise CRSP-1) an einen Rezeptor moduliert wird, (4) Regulation der Gentranskription in einer Zelle, die an der Entwicklung oder Differenzierung entweder in vivo oder in vitro beteiligt ist (beispielsweise Induktion von Zelldifferenzierung), (5) Regulation der Gentranskription in einer Zelle, die an der Entwicklung oder Differenzierung beteiligt ist, wobei mindestens ein Gen ein für die Differenzierung spezifisches Gen codiert, (6) Regulation der Gentranskription in einer Zelle, die an der Entwicklung oder Differenzierung beteiligt ist, wobei mindestens ein Gen ein zweites sekretiertes Protein codiert, (7) Regulation der Gentranskription in einer Zelle, die an der Entwicklung oder Differenzierung beteiligt ist, wobei mindestens ein Gen ein Signaltransduktionsmolekül codiert, (8) Regulation der Zellproliferation entweder on vitro oder in vivo (beispielsweise Induktion einer Zellproliferation oder Hemmung einer Proliferation wie im Fall einer Unterdrückung der Tumorgenese (beispielsweise Unterdrückung einer Glioblastombildung), (9) Bildung und Erhaltung geordneter räumlicher Anordnungen von differenzierten Geweben sowohl in adulten als auch embryonalen Vertebraten (beispielsweise Induktion der Kopfbildung während der Vertebratenentwicklung oder Erhaltung von hämatopoetischen Stammzellen), (10) Modulation von Zelltod, wie beispielsweise Stimulation von Zellüberleben, (11) Regulation der Zellmigration, und/oder (12) Immunmodulation.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein Verwendungsverfahren (beispielsweise Diagnose-Assay, Prognoseassay oder ein prophylaktisches/therapeutisches Behandlungsverfahren), wobei ein Molekül der vorliegenden Erfindung (beispielsweise ein CRSP-Protein, eine CRSP-Nukleinsäure oder ein CRSP-Modulatior) verwendet wird, um beispielsweise eine Erkrankung und/oder einen Zustand zu diagnostizieren, zu prognostizieren und/oder zu behandeln, in der/dem irgendwelche der vorstehend erwähnten Aktivitäten (d.h. Aktivitäten (i)-(vi) und (1)-(12) in den vorherigen Paragraphen) angezeigt sind. In einer anderen Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein Verwendungsverfahren (beispielsweise einen Diagnoseassay, Prognoseassay oder Herstellung eines Medikaments für ein prophylaktisches/therapeutisches Behandlungsverfahren) wobei ein Moleküle der Erfindung. (beispielsweise CRSP-Protein, CRSP-Nukleinsäure oder ein CRSP-Modulator) beispielsweise in der Herstellung eines Medikaments für die Diagnose, Prognose und/oder Behandlung eines Subjekts, vorzugsweise eines menschlichen Subjekts, verwendet wird, in dem irgendeine der vorstehend erwähnten Aktivitäten pathologisch gestört vorliegt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Verwendungsverfahren (beispielsweise Diagnoseassays, Prognoseassays oder eine Herstellung von Medikamenten zur prophylaktischen/therapeutischen Behandlung) Herstellung eines Medikaments zum Verabreichen an ein Subjekt, vorzugsweise ein menschliches Subjekt, von einem Molekül der vorliegenden Erfindung (beispielsweise CRSP-Protein, CRSP-Nukleinsäure oder einen CRSP-Modulator) zur Diagnose, Prognose und/oder therapeutischen Behandlung. In einer anderen Ausführungsform umfassen die Verwendungsverfahren (beispielsweise Diagnoseassays, Prognoseassays oder eine Herstellung von Medikamenten zur prophylaktischen/therapeutischen Behandlung) Herstellung eines Medikaments zum Verabreichen an ein menschliches Subjekt von einem Molekül der vorliegenden Erfindung (beispielsweise CRSP-Protein, CRSP-Nukleinsäure oder einen CRSP-Modulator).
Andere Ausführungsformen der Erfindung betreffen die Verwendung von isolierten Nukleinsäuremolekülen der Erfindung, die verwendet werden können, um beispielsweise CRSP-Protein (beispielsweise über einen rekombinanten Expressionsvektor in einer Wirtszelle in Gentherapieanwendungen) zu exprimieren, um CRSP-mRNA zu detektieren (beispielsweise in einer biologischen Probe), oder einer genetischen Veränderung in einem CRSP-Gen und um eine CRSP-Aktivität, wie nachfolgend beschrieben, zu modulieren. Zusätzlich können die CRSP-Proteine verwendet werden, um Arzneimittel oder Verbindungen zu durchmustern, die die CRSP-Aktivität modulieren als auch um Störungen zu behandeln, die durch unzureichende oder übermäßige Herstellung von CRSP-Protein oder Herstellung von CRSP-Proteinformen, die verglichen zu CRSP-Wildtypprotein (beispielsweise Entwicklungsstörungen oder proliferative Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs als auch Erkrankungen, Zustände oder Störungen, die durch eine abnorme Zelldifferenzierung und/oder Überleben, eine abnorme extrazelluläre Struktur oder eine Anormalität in einem Abwehrmechanismus) eine verringerte oder aberrante Aktivität aufweisen. Außerdem können die Anti-CRSP-Antikörper der Erfindung verwendet werden, um CRSP-Proteine zu detektieren und zu isolieren, die Bioverfügbarkeit von CRSP-Proteinen zu regulieren und die CRSP-Aktivität zu modulieren. Der Ausdruck "eine aberrante Aktivität", wie er auf eine Aktivität eines Proteins, wie sbp CRSP (beispielsweise CRSP-1) angewendet wird, bezieht sich auf eine Aktivität, die von der Aktivität des Wildtyps oder nativen Proteins verschieden ist, oder die von der Aktivität des Proteins in einem gesunden Subjekt verschieden ist. Eine Aktivität eines Proteins kann aberrant sein, da es stärker als die Aktivität dessen nativen Gegenspielers ist. Alternativ kann eine Aktivität aberrant sein, da sie relativ schwächer oder abwesend zu der Aktivität dessen nativen Gegenspielers ist. Eine aberrante Aktivität kann ebenfalls eine Änderung in einer Aktivität sein. Beispielsweise kann ein aberrantes Protein relativ zu dessen nativen Gegenspieler mit einem unterschiedlichen Protein wechselwirken. Eine Zelle kann eine aberrante CRSP (beispielsweise CRSP-1)-Aktivität aufgrund einer Überexpression oder Unterexpression des CRSP codierenden Gens aufweisen.
A. Durchmusterungsassays:
Die Erfindung stellt ein Verfahren (ebenfalls hier als ein "Durchmusterungsassay" bezeichnet) zum Identifizieren von Modulatoren bereit, d.h. Kandidaten oder Testverbindungen oder Mitteln (beispielsweise Peptiden, Peptidomimetika, kleine Moleküle oder andere Arz neimittel), die an CRSP-Proteine binden oder eine stimulatorische oder hemmende Wirkung auf, beispielsweise die CRSP-Expression oder die CRSP-Aktivität, aufweisen. Modulatoren können beispielsweise CRSP-Agonist und/oder CRSP-Antagonisten umfassen. Der wie hier verwendete Ausdruck "Agonist" bedeutet, dass er sich auf ein Mittel bezieht, das eine CRSP (beispielsweise CRSP-1) biologische Aktivität nachahmt oder aufreguliert (beispielsweise potenziert oder ergänzt). Ein CRSP-Agonist kann eine Verbindung sein, die eine biologische Aktivität eines CRSP-Protein nachahmt, wie beispielsweise Transduktion eines Signals von einem CRSP-Rezeptor, durch beispielsweise Wechselwirken mit einem CRSP-1-Rezeptor. Ein CRSP-Agonist kann ebenfalls eine Verbindung sein, die die Expression eines CRSP-Gens aufreguliert. Ein CRSP-Agonist kann ebenfalls eine Verbindung sein, die Expression oder Aktivität eines Proteins moduliert, das stromabwärts von einem CRSP-Rezeptor lokalisiert ist, wodurch die Wirkung einer Bindung von CRSP an einen CRSP-Rezeptor nachgeahmt wird.
"Antagonist" bedeutet, wie hier verwendet, dass es sich auf ein Mittel bezieht, das eine biologische CRSP (beispielsweise CRSP-1)-Aktivität hemmt, verringert oder unterdrückt. Ein Antagonist kann eine Verbindung sein, die ein Signalisieren von einem CRSP-Protein verringert, beispielsweise eine Verbindung, die an CRSP-1 oder an CRSP-1-Rezeptor binden kann. Ein bevorzugter CRSP-Antagonist hemmt die Wechselwirkung zwischen einem CRSP-Protein und einem andren Molekül, beispielsweise einem CRSP-Rezeptor. Alternativ kann ein CRSP-Antagonist eine Verbindung sein, die die Expression eines CRSP-Gens nach unten reguliert. Ein CRSP-Antagonist kann ebenfalls eine Verbindung sein, die die Expression oder Aktivität eines Proteins moduliert, das stromabwärts eines CRSP-Rezeptor lokalisiert ist, wodurch die Wirkung einer Bindung von CRSP an einen CRSP-Rezeptor antagonisiert wird.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Assays zum Durchmustern von Kanndidaten oder Testverbindungen bereit, die an die Aktivität eines CRSP-Proteins oder Polypeptids oder biologisch aktiven Bereichs davon binden oder diese modulieren können. In einer anderen Ausführungsformstellt die Erfindung Assays zum Durchmustern von Kanndidaten oder Testverbindungen bereit, die an die Aktivität eines CRSP-Rezeptor binden oder diese modulieren. Die Testverbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung irgendwelcher zahlreichen Ansätze bei im Stand der Technik bekannten Verfahren von kombinatorischen Bibliotheken, einschließlich biologischer Bibliotheken, räumlich addressierbarer paralleler Festphasen- oder Lösungsphasen-Bibliotheken, synthetischen Bibliotheksverfahren, die eine Entfaltung erfordern, das ein Kügelchen eine Verbindung Bibliotheksverfahren und synthetische Bibliotheksverfahren unter Verwendung einer Affinitätschromatographieselektion. Der Ansatz mit einer biologischen Bibliothek ist auf Peptidbibliotheken beschränkt, während die anderen vier Ansätze auf Peptide, Nicht-Peptid-Oligomere oder kleines Molekül Bibliotheken von Verbindungen anwendbar sind (Lam, K.S. Anticancer Drug 12 (1997), 145).
Beispiele von Verfahren für die Synthese von molekularen Bibliotheken können im Stand der Technik beispielsweise gefunden werden in DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909, Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422, Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678, Cho et al. (1993) Science261:1303, Canell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059, Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 und in Gallop et al. (1994) J: Med. Chem.37:1233.
Bibliotheken von Verbindungen können in Lösungen dargestellt werden (beispielsweise Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), oder an Kügelchen (Lam (1991) Nature 354:82-84), Chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), Bakterien (Ladner USP 5,223,409), Sporen (Ladner USP '409), Plasmiden (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) oder an Phage (Scott and Smith (1990) Science 249:386-390), (Devlin (1990) Science 249:404-406), (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382), (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310), (Ladner supra.).
In einer Ausführungsform ist der Assay ein auf Zellen basierender Assay, in dem eine Zelle, die einen CRSP-Rezeptor auf der Zelloberfläche exprimiert mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird, wobei die Fähigkeit der Testverbindung an einen CRSP-Rezeptor zu binden bestimmt wird. Die Zelle kann beispielsweise Säugetierursprung aufweisen oder eine Hefezelle sein. Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung an einen CRSP-Rezeptor zu binden kann beispielsweise durch Kopplung der Testverbindung mit einem Radioisotop oder einem enzymatischen Marker erreicht werden, so dass eine Bindung der Testverbindung an den CRSP-Rezeptor durch Detektieren der markierten Verbindung in einem Komplex bestimmt werden kann. Beispielsweise können Testverbindungen mit ¹²⁵I ³⁵S, ¹⁴C oder ³H entweder direkt oder indirekt markiert sein, wobei das Radioisotop durch Direktzählung der Radioemission oder durch Szintillationszählung detektiert. Alternativ können Testverbindungen beispielsweise mit Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Luciferase enzymatisch markiert sein, wobei der enzymatische Marker durch Bestimmung einer Umwandlung eines geeigneten Substrats in Produkt detektiert wird.
Im Bereich dieser Erfindung liegt ebenfalls, dass die Fähigkeit einer Testverbindung mit einem CRSP-Rezeptor zu interagieren, ohne die Markierung irgendeines der wechselwirkenden Mittel, bestimmt wird. So kann beispielsweise ein Mikrophysiometer verwendet werden, um die Wechselwirkung einer Testverbindung mit einem CRSP-Rezeptor ohne die Markierung von entweder der Testverbindung oder dem Rezeptor zu detektieren. McConnell, H.M. et al., Science 257 (1992), 1906-1912. Wie hier verwendet ist ein "Mikrophysiometer" (beispielsweise Cytosensor^TM) ein analytischer Instrument, das unter Verwendung eines Licht addressierbaren potentiometrischen Sensors (LAPS) die Rate mit der eine Zelle deren Umgebung ansäuert erfasst. Änderungen in dieser Ansäuerungsgeschwindigkeit können als ein Indikator der Wechselwirkung zwischen Ligand und Rezeptor verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Assay Inkontaktbringen einer Zelle, die einen CRSP-Rezeptor auf der Zelloberfläche exprimiert, mit einem CRSP-Protein oder einem bilogisch aktiven Teilbereich davon, um ein Assaygemisch zu bilden, Kontaktieren des Assaygemisches mit einer Testverbindung und Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung mit einem CRSP-Rezeptor wechselzuwirken, wobei eine Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung mit einem CRSP-Rezeptor zu wechselwirken, Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung umfasst, verglichen zu der Fähigkeit von CRSP oder eines biologisch aktiven Teilbereichs davon an den Rezeptor zu binden vorzugsweise an den CRSP-Rezeptor zu binden.
In einer anderen Ausführungsform ist der Assay ein auf Zellen basierender Assay, der Inkontaktbringen einer Zelle, die ein CRSP-Zielmolekül exprimiert, mit einer Testverbindung und Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung die Aktivität des CRSP-Zielmoleküls zu modulieren (beispielsweise zu stimulieren oder zu hemmen). Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung die Aktivität eines CRSP-Zielmoleküls zu modulieren, kann beispielsweise durch Bestimmen der Fähigkeit des CRSP-Protein an das CRSP-Zielmolekül zu binden oder damit zu Wechselwirken, erreicht werden.
Bestimmen der Fähigkeit des CRSP-Protein an ein CRSP-Zielmolekül zu binden oder damit zu wechselwirken kann durch eines der vorstehend zum Bestimmen einer direkten Bindung beschriebenen Verfahren, erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann Bestimmen der Fähigkeit des CRSP-Proteins an ein CRSP-Zielmolekül zu binden oder damit zu wechselwirken, durch Bestimmen der Aktivität des Zielmoleküls erreicht werden. Beispielsweise kann die Aktivität des Zielmoleküls durch Detektieren einer Induktion eines zellulären zweiten Boten des Ziels (d.h. intrazelluläres Calcium, Diacylglycerol, IP₃, etc.) bestimmt werden, Detektieren katalytischer/enzymatischer Aktivität des Ziels eines geeigneten Substrats, Detektieren der Induktion eines Reportergens (umfassend ein auf CRSP reaktionsfähiges regulatorisches Element, das mit einer einen detektierbaren Marker codierenden Nukleinsäure betriebsbereit verknüpft ist, beispielsweise Luciferase), oder Detektieren einer zellulären Antwort, beispielsweise Entwicklung, Differenzierung oder Proliferationsrate.
In noch einer anderen Ausführungsform ist ein Assay der vorliegenden Erfindung ein Zellfreier Assay, in dem ein CRSP-Protein oder eine biologisch aktiver Teilbereich davon mit einer Testverbindung in kontakt gebracht wird, wobei die Fähigkeit des Testverbindung an das CRSP-Protein oder den biologisch aktiven Teilbereich davon zu binden bestimmt wird. Eine Bindung der Testverbindung an das CRSP-Protein kann, wie vorstehend beschrieben, entweder direkt oder indirekt bestimmt werden. In einer Ausführungsform umfasst der Assay Inkontaktbringen des CRSP-Proteins oder biologisch aktiven Teilbereichs davon mit einer bekannten Verbindung, die an CRSP- bindet, um ein Assaygemisch auszubilden, das Assaygemisch mit einer Testverbindung in Kontakt zu bringen, und Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung mit einem CRSP-Protein zu wechselwirken, wobei ein Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung mit einem CRSP-Protein zu wechselwirken ein Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung umfasst, verglichen zu der bekannten Verbindung vorzugsweise an CRSP oder biologisch aktiven Teilbereich davon zu binden.
In einer anderen Ausführungsform ist der Assay ein Zellfreier Assay, in dem ein CRSP-Protein oder eine biologisch aktiver Teilbereich davon mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird, wobei die Fähigkeit der Testverbindung die Aktivität des CRSP-Proteins oder des biologisch aktiven Teilbereichs davon zu modulieren (beispielsweise zu stimulieren oder zu hemmen), bestimmt wird. Ein Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung die Aktivität eines CRSP-Proteins zu modulieren, kann beispielsweise dadurch erreicht werden, das die Fähigkeit des CRSP-Proteins an ein CRSP-Zielmolekül zu binden durch eines der vorstehend beschriebenen Verfahren zum Bestimmen eines direkten Bindens, bestimmt werden kann. Bestimmen der Fähigkeit des CRSP-Protein an eine CRSP-Zielmolekül zu binden, kann ebenfalls dadurch erreicht werden, dass ein Verfahren, wie beispielsweise Echtzeit-Biomolecular-Interaction-Analysis (BIA) verwendet wird. Sjolander, S. and Urbaniczky, C. Anal. Chem. 63 (1991), 2338-2345 und Szabo et al., Cun. Opin. Struct. Biol. 5 (1995), 699-705. Wie hier verwendet, ist "BIA" ein Verfahren zum Untersuchen biospezifischer Wechselwirkungen in Echtzeit, ohne dass irgendeiner der Wechselwirkenden (beispielsweise BIAcore^TM) markiert wird. Änderungen in dem optischen Phänomen der Oberflächenplasmonresonanz (SPR) kann als eine Anzeige von Echtzeitreaktionen zwischen Biomolekülen verwendet werden.
In einer alternativen Ausführungsform kann Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung die Aktivität eines CRSP-Protein zu modulieren durch Bestimmen der Fähigkeit des CRSP-Proteins weiterhin die Aktivität eines CRSP-Zielmoleküls zu modulieren, erreicht werden. Beispielsweise kann die katalytische/enzymatische Aktivität des Zielmoleküls an einem geeigneten Substrat, wie vorstehend beschrieben, bestimmt werden.
In noch einer anderen Ausführungsform umfasst der Zellfreie Assay Inkontaktbringen eines CRSP-Proteins oder eines biologisch aktiven Teilbereichs davon mit einer bekannten Verbindung, die das CRSP-Protein bindet, um ein Assaygemisch zu bilden, Kontaktieren des Assaygemisches mit einer Testverbindung, und Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung mit dem CRSP-Protein wechselzuwirken, wobei das Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung mit dem CRSP-Protein zu wechselwirken ein Bestimmen der Fähigkeit des CRSP-Protein umfasst, vorzugsweise die Aktivität eines CRSP-Zielmoleküls zu binden oder zu modulieren.
In zahlreichen Arzneimitteldurchmusterungs-Programmen, die Bibliotheken von Verbindungen und natürliche Extrakte testen, sind Assays mit hohem Durchsatz wünschenswert, um die Anzahl von getesteten Verbindungen in einer gegebenen Zeitperiode zu maximieren. Assays, die in Zellfreien Systemen, beispielsweise abgeleitet mit gereinigten oder halb gereinigten Proteinen, ausgeführt werden, werden deswegen häufig als "primäre" Durchmusterungen bevorzugt, da sie erzeugt werden können, um eine schnelle Entwicklung und relativ einfache Detektion einer Änderung, die durch eine Testverbindung in einem molekularen Ziel vermittelt wird, zu ermöglichen. Außerdem können die Wirkungen einer zellulären Toxizität und/oder biologischen Verfügbarkeit der Testverbindung in dem in vitro System im Allgemeinen ignoriert werden, wobei der Assay anstelle davon hauptsächlich auf die Wirkung des Arzneimittels auf das molekulare Ziel gerichtet ist, wie bei einer Änderung einer Bindungsaffinität gegenüber stromaufwärts oder stromabwärts Elementen ersichtlich werden kann. Dementsprechend wird in einem beispielhaften Durchmusterungsassay der vorliegenden Erfindung die Verbindung von Interesse mit einem CRSP (beispielsweise CRSP-1)-Protein oder einem CRSP (beispielsweise CRSP-1)-Bindungspartner, beispielsweise einem Rezeptor, in Kontakt gebracht. Der Rezeptor kann löslich sein oder der Rezeptor kann auf einer Zelloberfläche vorhanden sein. Zu dem Gemisch aus Verbindung und CRSP-Protein oder CRSP-Bindungspartner wird dann eine Zusammensetzung zugegeben, die einen CRSP-Bindungspartner beziehungsweise ein CRSP-Protein umfasst. Detektion und Quantifizierung von Komplexen von CRSP-Proteinen und CRSP-Bindungspartnern stellt ein Mittel zum Bestimmen der Wirksamkeit der Verbindung die Komplexbildung zwischen CRSP und einem Bindungspartner zu hemmen (oder zu potenzieren) bereit. Die Wirksamkeit der Verbindung kann dadurch beurteilt werden, dass Dosis-Antwort-Kurven aus den erhaltenen Daten unter Verwendung verschiedener Konzentrationen der Testverbindung, erzeugt werden. Außerdem kann ein Kontrollassay ebenfalls ausgeführt werden, um eine Grundlinie zum Vergleich bereitzustellen. In einem Kontrollassay wird isoliertes und gereinigtes CRSP-Polypeptid oder Bindungspartner zu einer Zusammensetzung zugegeben, die den CRSP-Bindungspartner oder das CRSP-Polypeptid beinhalten, wobei die Bildung eines Komplexes in der Abwesenheit der Testverbindung quantifiziert wird.
Die Zell-freien Assays der vorliegenden Erfindung sind für eine Verwendung von sowohl löslichen und/oder membrangebundenen Formen isolierter Proteine (beispielsweise CRSP-Proteine oder biologisch aktiven Teilbereich davon oder CRSP-Zielmoleküle) zugänglich. In dem Fall von Zell-freien Assays in denen eine Membran gebundene Form eines isolierten Proteins verwendet wird (beispielsweise ein CRSP-Zielmolekül oder Rezeptor) kann es wünschenswert sein ein auflösendes Mittel zu verwendet, so dass die Membrangebundene Form des isolierten Proteins in Lösung gehalten wird. Beispiele derartiger auflösender Mittel umfassen nicht-ionische Detergenzien wie beispielsweise n-Octylglucosid, n-Dodecylglucosid, n-Dodecylmaltosid, Octanoyl-N-methylglucamid, Decanoyl-N-methylglucamid, Tritort^®X-100, Triton^®X-114, Thesit^®, Isotridecylpoly(ethylenglycolether), 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylamminio]-1-propansulfonat (CHAPS), 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethyamino]-2-hydroxy-1-propansulfonat (CHAPSO), oder N-Dodecyl=N,N-dimethyl-3-ammonium-1-propansulfonat.
In mehr als einer Ausführungsform der vorstehend erwähnten Assayverfahren der vorliegenden Erfindung kann es wünschenswert sein entweder CRSP oder dessen Zielmolekül zu immobilisieren, um eine Trennung komplexierten von nicht komplexierten Formen von einem oder beiden Proteinen zu fördern, als auch die Automation des Assays anzupassen. Bindung einer Testverbindung an ein CRSP-Protein, oder eine Wechselwirkung eines CRSP-Protein mit einem Zielmolekül in der Anwesenheit und Abwesenheit einer Kanndidatenvebindung, kann in einem beliebigen Gefäß erreicht werden, das zum Aufnehmen der Reaktanden geeignet ist. Beispiele derartiger Gefäße umfassen Mikrotiterplatten, Teströhrchen und Mikro-Zentrifugenröhrchen. In einer Ausführungsform kann eine Fusionsprotein bereitgestellt werden, das eine Domäne hinzufügt, die einem oder beiden der Proteine ermöglicht, an eine Matrix zu binden. Beispielsweise können Glutathion-S-transferase/CRSP Fusionsproteine oder Glutathion-S-Transferase/Ziel-Fusionsproteine an Glutathionsepharosekügelchen (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) oder Glutathion derivatisierte Mikrotiterplatte absorbiert werden, die anschließend mit der Testverbindung oder der Testverbindung und entweder dem nicht absorbierten Zielprotein oder CRSP-Protein kombiniert werden, wobei das Gemisch unter Bedingungen, die konduktiv für eine Komplexbildung (beispielsweise bei physiologischen Bedingungen für Salz und pH-Wert) sind, inkubiert wird. Nach Inkubation werden die Kügelchen oder Mikrotiterplatten gewaschen, um irgendwelches nicht gebunden Bestandteile zu entfernen, wobei im Fall von Kügelchen die Matrix immobilisiert wird, wobei Komplex entweder direkt oder indirekt, beispielsweise wie vorstehend beschrieben, bei stimmt wird. Alternativ können die Komplexe von der Matrix gelöst werden, und der Grad einer CRSP-Bindung oder Aktivität unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt werden.
Andere Verfahren zum Immobilisieren von Proteinen an Matrices können ebenfalls bei Durchmusterungsassays der Erfindung verwendet werden. Beispielsweise kann entweder ein CRSP-Protein oder ein CRSP-Zielmolekül unter Verwendung von Konjugation vor Biotin und Streptavidin immobilisiert werden. Biotinyliertes CRSP-Protein oder Zielmole küle kann/können von Biotin-NHS (N-Hydroxysuccinimid) unter Verwendung von im Stand der Technik wohlbekannten (beispielsweise Biotinylierungs-Kit, Pierce Chemicals, Rockford, IL) Verfahren präpariert und in den Vertiefungen beziehungsweise Löchern von mit Streptavidin beschichteten 96 Loch-Platten (Pierce Chemicals) immobilisiert werden. Alternativ können mit CRSP-Protein oder Zielmolekülen reaktive Antikörper, die jedoch nicht mit der Bindung von dem CRSP-Protein an dessen Zielmolekül stören, zu/mit den Löchern der Platte derivatisiert werden, wobei nicht gebundenes Ziel oder CRSP-Protein durch Antikörperkonjugation in den Löchern gefangen wird. Verfahren zum Detektieren derartiger Komplexe umfassen zusätzlich zu jenen vorstehend beschriebenen für die GST-immobilisierten Komplexe, unter Verwendung von Antikörpern, die gegenüber dem CRSP-Protein oder Zielmolekül reaktiv sind, eine Immundetektion, als auch Enzym gebundene Assays, die auf einem Detektieren einer Enzymaktivität beruhen, die mit dem CRSP-Protein oder dem Zielmolekül assoziiert ist.
In einer anderen Ausführungsform werden Modulatoren einer CRSP-Expression in einem Verfahren identifiziert, wobei eine Zelle mit einer Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht wird, und die Expression von CRSP-mRNA oder Protein in der Zelle bestimmt wird. Der Grad einer Rexpression von CRSP-mRNA oder Protein in der Anwesenheit der Kandidatenverbindung wird mit dem Grad einer Expression von CRSP-mRNA oder Protein in der Abwesenheit der Kandidatenverbindung verglichen. Die Kandidatenverbindung kann dann basierend auf diesem Vergleich als ein Modulator einer CRSP-Expression identifiziert werden. Ist beispielsweise die Expression von CRSP-mRNA oder Protein in der Anwesenheit der Kandidatenverbindung größer (statistisch signifikant größer) als in dessen Abwesenheit, dann ist die Kandidatenverbindung als ein Stimulator von CRSP-mRNA- oder Proteinexpression identifiziert. Ist alternativ die Expression von CRSP-mRNA oder Protein in der Anwesenheit der Kandidatenverbindung geringer (statistisch signifikant geringer) als in deren Abwesenheit, dann ist die Kandidatenverbindung als ein Hemmstoff von CRSP-mRNA oder Proteinexpression identifiziert. Der Expressionsgrad von CRSP-mRNA oder Protein kann in diesem Fall durch hier beschriebene Verfahren zum Bestimmen von CRSP-mRNA oder Protein bestimmt werden.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung können die CRSP-Proteine in einem Zwei-Hybrid-Assay oder Drei-Hybrid-Assay als "Köder-Proteine" verwendet werden (siehe U.S.-P-5,283,317, Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054, Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924, Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696, und Brent WO94/10300), um andere Proteine zu identifizieren, die an CRSP binden oder damit wechselwirken ("CRSP-bindende Proteine" oder "CRSP-bp") und die CRSP-Aktivität modulieren. Derartige CRSP-bindende Proteine sind ebenfalls wahrscheinlich an der Propagierung von Signalen durch die CRSP-Proteine beteiligt, wie beispielsweise stromabwärts Elemente eines CRSP vermittelten Signalweges. Alternativ sind derartige CRSP-bindende Proteine wahrscheinlich Zelloberflächenmoleküle, die mit nicht-CRSP exprimierenden Zellen assoziiert sind, wobei derartige CRSP-bindende Proteine in der Signaltransduktion beteiligt sind.
Das Zwei-Hybrid-System basiert auf der modularen Beschaffenheit der meisten Transkriptionsfaktoren, die aus trennbaren DNA-Bindungs- und Aktivierungsdomänen bestehen. Kurz, der Assay verwendet zwei unterschiedliche DNA-Konstrukte. In einem Konstrukt ist das Gen, das ein CRSP-Protein codiert mit einem Gen fusioniert, das die DNA-Bindungsdomäne eines bekannten Transkriptionsfaktors (beispielsweise GAL-4) codiert. In dem anderen Konstrukt ist eine DNA-Sequenz aus einer Bibliothek von DNA-Sequenzen, die ein nicht identifiziertes Protein ("Beute" oder "Probe") codieren mit einem Gen fusioniert, das die Aktivierungsdomäne des bekannten Transkriptionsfaktors codiert. Falls der "Köder-" und die "Beute-" Proteine in vivo miteinander wechselwirken können, wobei ein CRSP-abhängiger Komplex gebildet wird, dann werden die DNA-Bindungs- und Aktivierungsdomänen des Transkriptionsfaktors in enge Nachbarschaft gebracht (close proximity). Die Nachbarschaft ermöglicht die Transkription eines Reportergens (beispielsweise LacZ), das mit einer transkriptionellen Regulatorstelle, auf den Transkriptionsfaktor reagieren kann, betriebsbereit verknüpft ist. Eine Expression des Reportergens kann detektiert und Zellkolonien, die den funktionellen Transkriptionsfaktor aufweisen, können isoliert werden, wobei sie dazu verwendet werden, das klonierte Gen, das das Protein codiert, welches mit dem CRSP-Protein wechselwirkte, zu erhalten.
Die Erfindung betrifft weiterhin neue Mittel, die durch die vorstehend beschriebenen Durchmusterungsassays identifiziert wurden, und Verfahren zum Herstellen derartiger Mittel durch Verwendung dieser Assays. Demgemäß umfasst in einer Ausführungsform die vorliegende Erfindung eine Verbindung oder Mittel, das durch ein Verfahren erhältlich ist, das die Schritte von jedem (any one) der vorstehend erwähnten Durchmusterungsassays (beispielsweise Zell-basierende Assays oder Zell-freie Assays) umfasst. Beispielsweise umfasst in einer Ausführungsform die Erfindung eine Verbindung oder Mittel, das durch ein Verfahren erhältlich ist, das Inkontaktbringen einer Zelle, die ein CRSP-Zielmolekül exprimiert, mit einer Testverbindung umfasst, und Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung an das CRSP-Zielmolekül zu binden oder die Aktivität davon zu modulieren. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Erfindung eine Verbindung oder Mittel, das durch ein Verfahren erhältlich ist, das Inkontaktbringen einer ein CRSP-Zielmolekül exprimierende Zelle mit einem CRSP-Protein oder einem biologisch aktiven Teilbereich davon umfasst, um ein Assaygemisch zu bilden, Inkontaktbringen des Assaygemischs mit einer Testverbindung, und Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung mit dem CRSP-Zielmolekül zu wechselwirken oder die Aktivität davon zu modulieren. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Erfindung eine Verbindung oder Mittel, das durch ein Verfahren erhältlich ist, das Inkontaktbringen eines CRSP-Protein oder eines biologisch aktiven Teilbereichs davon mit einer Testverbindung umfasst, und Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung an das CRSP-Protein oder den biologisch aktiven Teilbereich davon zu binden oder die Aktivität davon zu modulieren (beispielsweise zu stimulieren oder zu hemmen). In noch einer anderen Ausführungsform umfasst der vorliegende Erfindung eine Verbindung oder Mittel, das durch ein Verfahren erhältlich ist, das Inkontaktbringen eines CRSP-Proteins oder eines biologisch aktiven Teilbereichs davon mit einer bekannten Verbindung umfasst, die das CRSP-Protein bindet, um ein Assaygemisch zu bilden, Inkontaktbringen des Assaygemischs mit einer Testverbindung, und Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung mit dem CRSP-Protein zu wechselwirken oder die Aktivität davon zu modulieren.
Dementsprechend liegt die Verwendung eines hier beschriebenen identifizierten Mittels in einem geeigneten Tiermodell im Umfang dieser Erfindung. Beispielsweise kann ein hier beschriebenes identifiziertes Mittel (beispielsweise ein CRSP-modulierendes Mittel, eine Antisense-CRSP Nukleinsäuremolekül, ein CRSP- spezifischer Antikörper oder ein CRSP-bindender Partner) in einem Tiermodell verwendet erden, um die Wirksamkeit, Toxizität oder Nebenwirkungen einer Behandlung mit einem derartigen Mittel zu bestimmen. Alternativ kann ein Mittel, das wie hier beschrieben identifiziert wurde in einem Tiermodell verendet werden, um den Mechanismus der Wirkung eines derartigen Mittels zu bestimmen.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter Verwendungen von neuen Mitteln, die durch die vorstehend beschriebenen Durchmusterungsassays identifiziert wurden, für hier beschriebene Diagnosen, Prognosen und Behandlungen. Dementsprechend liegt es innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung derartige Mittel für die Gestaltung, Formulierung, Synthese, Herstellung, und/oder Produktion eines Arzneimittels oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zu verwenden, dass sie, wie hier beschrieben, in der Diagnose, Prognose oder Behandlung verwendet werden. Beispielsweise umfasst die vorliegende Erfindung in eine Ausführungsform ein Verfahren zum Synthetisieren oder Produzieren eines Arzneimittels oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung durch Bezugnahme auf die Struktur und/oder Eigenschaften einer durch eines der vorstehend beschriebenen Durchmusterungsassays erhältlichen Verbindung. Beispielsweise kann ein Arzneimittel oder eine pharmazeutische Zusammensetzung basierend auf der Struktur und/oder den Eigenschaften einer durch ein Verfahren erhältlichen Verbindung synthetisiert werden, bei dem eine Zelle, die ein CRSP-Zielmolekül exprimiert mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird, und die Fähigkeit der Testverbindung an das CRSP-Zielmolekül zu binden oder die Aktivität davon zu modulieren, bestimmt wird. In einer beispielhaften Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Synthetisieren oder Produzieren eines Arzneimittels oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das auf der Struktur oder den Eigenschaften einer Verbindung basiert, die durch eine Verfahren erhältlich ist, bei dem ein CRSP-Protein oder ein biologisch aktiver Teilbereich davon mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird und die Fähigkeit der Testverbindung an das CRSP-Protein oder einen biologisch aktiven Teilbereich davon zu binden oder die Aktivität davon zu modulieren (beispielsweise zu stimulieren oder zu hemmen), bestimmt wird.
B. Detektionsassays
Teilbereiche oder Fragmente von cDNA-Sequenzen, die hier identifiziert wurden (und die entsprechenden vollständigen Gensequenzen) können auf vielseitige Weise als Polynukleotidreagenzien verwendet werden. Beispielsweise können diese Sequenzen verwendet werden, um (i) deren entsprechenden Gene auf einem Chromosom zu kartieren, und somit Genregionen, die mit genetischen Erkrankungen assoziiert sind zu lokalisieren; (ii) ein Individuum aus einer kleinen biologischen Probe (Gewebetypisierung) zu identifizieren, und (iii) bei der forensische Identifikation von biologischen Proben hilfreich zu sein. Diese Anwendungen werden in den nachstehenden Abschnitten beschrieben.
I. Chromosomenkartierung
Sobald die Sequenz (oder ein Teilbereich der Sequenz) eines Gens isoliert wurde, kann diese Sequenz dazu verwendet werden, den Ort des Gens auf dem Chromosom zu kartieren. Dieser Vorgang wird Chromosomenkartierung genannt. Dementsprechend können, hier beschriebene, Teilbereiche oder Fragmente der CRSP-Nukleotidsequenzen dazu verwendet werden den Ort der CRSP-Gene auf einem Chromosom zu kartieren. Die Kartierung der CRSP-Sequenzen auf Chromosomen stellt einen ersten wichtigen Schritt bei einer Korrelation dieser Sequenzen mit Erkrankung assoziierten Genen dar.
Kurz, CRSP-Gene können durch Präparieren von PCR-Primern (vorzugsweise 15-25 bp Länge) von den CRSP-Nukleotidsequenzen auf Chromosomen kartiert werden. Eine Computeranalyse der CRSP-Sequenzen kann verwendet werden, um Primer vorherzusagen, die nicht mehr als ein Exon in der genomischen DNA überspannen, wodurch der Vermehrungsvorgang verkompliziert wird. Diese Primer können dann für eine PCR-Durchmusterung somatischer Zellhybride verwendet werden, die individuelle menschliche Chromosomen aufweisen. Lediglich jene Hybride, die das menschliche Gen aufweisen, das den CRSP-Sequenzen entspricht, wird ein amplifiziertes Fragment ergeben.
Somatische Zellhybride werden durch Fusionieren somatischer Zellen aus unterschiedlichen Säugetieren (beispielsweise Mensch- und Mauszellen) präpariert. Werden Hybride von Menschen- und Mauszellen gezüchtet und aufgeteilt, dann verlieren sie schrittweise zufallsmäßig menschliche Chromosomen, wobei sie die Mauschromosomen behalten. Unter Verwendung von Medien in denen Mauszellen nicht wachsen können, da ihnen ein spezielles Enzym fehlt, jedoch menschliche Zellen wachsen können, wird das eine menschliche Chromosom, das das Gen aufweist, das das benötigte Enzym codiert, erhalten bleiben. Durch Verwendung unterschiedlicher Medien, können Panels von Hybridzelllinien hergestellt beziehungsweise etabliert werden. Jede Zelllinie in einem Panel weist entweder ein einzelnes menschliches Chromosom oder eine kleine Anzahl menschlicher Chromosomen auf, und einen vollständigen Satz von Mauschromosomen, was ein einfaches Kartieren individueller Gene auf spezifischen menschlichen Chromosomen ermöglicht. (D'Eustachio P. et al., Science 220 (1983), 919-924). Somatische Zellhybride, die lediglich Fragmente menschlicher Chromosomen aufweisen, können ebenfalls unter Verwendung menschlicher Chromosomen mit Translokationen und Deletionen hergestellt werden.
PCR-Kartieren von somatischen Zellhybriden stellt ein schnelles Verfahren zur Beurteilung einer besonderen Sequenz auf einem besonderen Chromosom dar. Drei oder mehr Sequenzen können pro tag unter Verwendung eines einzelnen Temperaturzyklers zugeordnet werden. Werden die CRSP-Nukleotidsequenzen verwendet, um Oligonukleotidprimer zu gestalten, dann kann eine Unterlokalisierung spezifischer Chromosomen mit Panels von Fragmenten erreicht werden. Andere Kartierungsstrategien, die auf ähnliche Wiese verwendet werden können, um ein 9o, 1p, oder 1v Sequenz auf dessen Chromosom zu kartieren, umfassen in situ Hybridisierung (beschrieben in Fan et al., PNAS 87 (1990), 6223-27), Prä-Dwchmustern beziehungsweise Prä-Screening mit Durchfluss-sortierten Chromosomen und Prä-Selektion durch Hybridisierung an Chromosomen spezifische cDNA-Bibliotheken.
Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) einer DNA-Sequenz an einer Chromosomenausbreitung einer Metaphase kann weiterhin verwendet werden, um eine genaue Chromosomenlokalisation in einem Schritt bereitzustellen. Chromosomenausbreitungen können unter Verwendung von Zellen, deren Teilung in der Metaphase durch eine Chemikalie, wie beispielsweise Colemid, das die Mitosespindel zerstört, blockiert wird, ausgeführt werden. Die Chromosomen können kurz mit Trypsin behandelt, und anschließend mit Giemsa gefärbt werden. Ein Muster von hellen und dunklen Banden entwickelt sich auf dem Chromosom, so dass die Chromosomen individuell identifiziert werden können. Das FISH-Verfahren kann mit einer DNA-Sequenz so kurz wie 500 oder 600 Basen verwendet werden. Jedoch weisen für eine einfache Detektion Klone mit mehr als 1.000 Basen eine höhere Wahrscheinlichkeit auf mit ausreichender Signalintensität an eine einzigartige Chromosomenstelle zu binden. Vorzugsweise werden 1.000 Basen, und noch bevorzugter 2.000 Basen ausreichen, um gute Ergebnisse bei einem vernünftigen Zeitaufwand zu erhalten. Zur Übersicht dieses Verfahrens siehe Verma, et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, New York 1988).
Reagenzien für eine Chromosomenkartierung können einzeln dazu verwendet werden, um ein einzelnes Chromosom oder eine einzelne Stelle auf dem Chromosom zu markieren, oder es können Panels von Reagenzien verwendet werden, um mehrere Stellen und/oder mehrere Chromosomen zu markieren. Reagenzien, die nicht-codierenden Regionen auf den Genen entsprechen werden für Kartierungszwecke tatsächlich bevorzugt. Wahrscheinlich werden codierende Sequenzen innerhalb von Genfamilien stärker konserviert, was somit die Chance einer Kreuzhybridisierung während einer Chromosomenkartierung erhöht.
Sobald eine Sequenz auf eine genaue Chromosomenstelle kartiert wurde, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit den genetischen Kartendaten korreliert werden. (Derartige Daten sind beispielsweise in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, erhältlich, on-line durch Johns Hopkins University Welch Medical Library). Die Beziehung zwischen einem Gen und einer Erkrankung, die auf die gleiche Chromosomenregion kartiert sind, können anschließend durch eine Kopplungsanalyse (Co-Vererbung physikalisch benachbarter Gene), die beispielsweise in Egeland, et al., Nature 325 (1987), 783-787, beschrieben wurde, identifiziert werden.
Außerdem können Unterschiede in den DNA-Sequenzen zwischen Individuen, die von einer Erkrankung, die mit CRSP-Gen assoziiert ist, betroffenen und nicht betroffen sind, bestimmt werden. Falls eine Mutation in einigen oder allen der betroffenen Individuen beobachtet wird, jedoch in keinem der nicht betroffenen Individuen, dann stellt die Mutation wahrscheinlich das ursächliche/verursachende Mittel der besonderen Erkrankung dar. Ein Vergleich von betroffenen und nicht betroffenen Individuen schließt allgemein einen ersten Blick auf strukturelle Änderungen, wie beispielsweise Deletionen oder Translokationen, die aus Chromosomenausbreitungen sichtbar sind, in den Chromosomen ein oder die unter Verwendung von auf dieser DNA-Sequenz basierender PCR detektierbar sind. Schließlich kann vollständiges Sequenzieren von Genen von einigen Individuen ausgeführt werden, um die Anwesenheit einer Mutation zu bestätigen und um Mutationen von Polymorphismen zu unterscheiden.
2. Gewebetypisierung
Die CRSP-Sequenzen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls dazu verwendet werden, um aus kleinen biologischen Proben Individuen zu identifizieren. Das Militär der Vereinigten Staaten überlegt beispielsweise die Verwendung eines Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) zur Identifizierung ihres Personals. Bei diesem Verfahren wird die genomische DNA eines Individuums mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen verdaut, und auf einem Southern-Blot aufgetrennt, um einzelne Banden zur Identifikation zu erhalten. Dieses Verfahren leidet nicht unter den gegenwärtigen Beschränkungen von "Dog Tags", die verloren gehen, umgeschaltet beziehungsweise geswitched oder gestohlen werden können, was eine genaue beziehungsweise genaue Identifikation erschwert. Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind als zusätzliche DNA-Marker für RFLP (beschrieben in US-P-5,272,057) nützlich.
Weiterhin können die Sequenzen der vorliegende Erfindung verwendet werden, um ein alternatives Verfahren bereitzustellen, das die tatsächliche/wirkliche Basen-zu-Basen DNA-Sequenz ausgewählter Teilbereiche eines individuellen Genoms bestimmt. Daher können die hier beschriebenen CRSP-Nukleotidsequenzen verwendet werden, um zwei PCR-Primer von dem 5'- und 3'-Enden der Sequenzen zu vermehren. Diese Primer können anschließend verwendet eine individuelle DNA zu vermehren und nachfolgend diese zu sequenzieren.
Panels entsprechender DNA-Sequenzen von Individuen, die auf diese Weise präpariert wurden, können einzigartige individuelle Identifikationen bereitstellen, da jedes Individuum einen einzigartigen Satz derartiger DNA-Sequenzen aufgrund allelischer Unterschiede aufweisen wird. Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um derartige Identifikationssequenzen von Individuen und von Geweben zu erhalten. Die CRSP-Nukleotidsequenzen der Erfindung stellt einzigartige Teilbereiche des Menschlichen Genoms bereit. Allelische Variation ereignet sich zu einem gewissen Grad in den codierenden Regionen dieser Sequenzen, und zu einem höheren Grad in den nicht-codierenden Regionen. Es wird berechnet, dass allelische Variation zwischen einzelnen Menschen mit einer Frequenz von ungefähr einmal pro 500 Basen auftritt. Jede der hier beschriebenen Sequenzen können zu einem gewissen Grad als ein Standard verwendet werden, gegenüber denen DNA von einem Individuum für Identifikationszwecke verglichen werden kann. Da eine größere Anzahl von Polymorphismen in nicht codierenden Regionen auftreten, sind zum Unterscheiden von Individuen weniger Sequenzen erforderlich. Die nicht codierenden Sequenzen von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:$, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:10 können bequem genaue individuelle Identifikation mit einem Panel von möglicherweise 10 bis 1.000 Primern bereitstellen, die jeweils eine nicht codierende amplifizierte Sequenz von 100 Basen ergeben. Falls vorhergesagte codierenden Sequenzen, wie beispielsweise jene in SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NOO oder SEQ ID NO:12 verwendet werden, dann würde eine mehr geeignete Anzahl von Primern für eine genaue individuelle Identifikation 500-2.000 betragen.
Falls ein Panel von Reagenzien von hier beschriebenen CRSP-Nukleotidsequenzen verwendet wird, um eine einzigartige Identifikationsdatenbank für ein Individuum zu erzeugen, dann können jene gleichen Reagenzien später verwendet werden, um Gewebe von dem Individuum zu identifizieren. Wird die einzigartige Identifikationsdatenbank verwendet, dann kann eine genaue Identifikation des Individuums, ob lebend oder tot, von extrem kleinen Gewebeproben ausgeführt werden.
3. Verwendung von teilweisen CRSP-Sequenzen in der forensischen Biologie
Auf DNA-basierende Identifikationsverfahren könne ebenfalls in der forensischen Biologie verwendet werden. Die forensische Biologie stellt ein wissenschaftliches Gebiet dar, das genetisches Typisieren von biologischem Beweismaterial anwendet, das an dem Tatort als ein Mittel für genaues Identifizieren, beispielsweise eines Täters eines Verbrechens, aufgefunden wurde. Um eine derartige Identifikation auszuführen, können PCR-Verfahren verwendet werden, um DNA-Sequenzen zu vermehren, die von kleinen biologischen Proben, wie beispielsweise Geweben, beispielsweise Haar oder Haut, oder Körperflüssigkeiten, beispielsweise Blut, Speichel oder Samen, die am Tatort aufgefunden werden, genommen wurden. Die vermehrten Sequenzen können anschließend mit einem Standard verglichen werden, wodurch eine Identifikation des Ursprungs der biologischen Probe ermöglicht wird.
Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Polynukleotidreagenzien, beispielsweise PCR-Primer bereitzustellen, die auf spezifische Loci in dem menschlichen Gemon gerichtet sind, wobei die Verlässlichkeit von auf DNA basierenden forensischen Identifikationen erhöht werden, durch beispielsweise Bereistellen anderer "Identifikationsmarker" (d.h. andere DNA-Sequenz, die einzigartig für ein Individuum ist). Wie vorstehend erwähnt, kann die aktuelle DNA-Sequenzinformation für die Identifikation als eine akkurate Alternative zu Mustern verwendet werden, die durch von Restriktionsenzymen erzeugten Fragmenten, gebildet werden. Sequenzen, die auf nicht-codierende Regionen der Nukleotidsequenzen der Erfindung abzielen sind für diese Verwendung besonders geeignet, da eine größere Anzahl von Polymorphismen in den nichtcodierenden Regionen vorkommen, was eine Unterscheidung von Individuen unter Verwendung dieses Verfahrens erleichtert. Beispiele von Polynukeotidreagenzien umfassen die CRSP-Nukleotidsequenzen oder Teilbereich davon, beispielsweise Fragmente, die von den nichtcodierenden Regionen der Nukleotidsequenzen der Erfindung abgeleitet sind, die mindestens eine Länge von 20 Basen, vorzugsweise mindestens 30 Basen aufweisen.
Die hier beschriebenen CRSP-Nukleotidsequenzen können weiterhin verwendet werden, um Polynukleotidreagenzien, beispielsweise markierte oder markierbare Sonden bereitzustellen, die beispielsweise in einem in situ Hybridisierungsverfahren verwendet werden können, um ein spezifisches Gewebe, beispielsweise Hirngewebe zu identifizieren. Dies kann in Fällen sehr nützlich sein, in denen einem forensischen Pathologen Gewebe unbekannten Ursprungs übergeben werden. Panels derartiger CRSP-Sonden können verwendet werden, um Gewebe art- und/oder gewebe-spezifisch zu identifizieren.
Auf ähnliche Art und Weise können diese Reagenzien, beispielsweise CRSP-Primer oder Sonden, dazu verwendet werden, um Gewebekulturen auf Verunreinigungen (d.h. Durchmusterung auf die Anwesenheit eines Gemisches unterschiedlicher Zelltypen in einer Kultur) zu durchmustern.
C. prädikative Medizin
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls das Gebiet der prädikativen Medizin, in der Diagnoseassays, Prognoseassays und Überwachen klinischer Studien für prognostische (prädikative) Zwecke verwendet werden, um dadurch ein Individuum prophylaktisch zu behandeln. Dementsprechend betrifft eine Ausführungsform der Erfindung Diagnoseassays zum Bestimmen von CRSP-Protein- und/oder Nukleinsäurexpression als auch CRSP-Aktivität im Zusammenhang mit einer biologischen Probe (beispielsweise Blut, Serum, Zellen, Gewebe), um dadurch zu bestimmen, ob ein Individuum an einerkrankheit oder Störung leidet, oder Gefahr läuft eine Störung zu entwickeln, die mit aberranter CRSP-Expression oder Aktivität, beispielsweise aberrante Zellproliferation, Differenzierung und/oder Überleben assoziiert ist, was beispielsweise zu einer neurodegenerativen Krankheit oder Krebs führen kann. Die Erfindung stellt ebenfalls Prognose (oder prädikative)-assays bereit, um zu bestimmen, ob ein Individuum gefährdet ist eine Störung, die mit einer CRSP-Protein-, Nukleinsäureexpression oder Aktivität assoziiert ist, zu entwickeln. Beispielsweise können in einer biologische Probe Mutationen in einem CRSP-Gen getestet werden. Derartige Assays können zu prognostischen oder prädikativen Zwecken verwendet werden, um dadurch ein Individuum vor den Beginn einer Störung, die durch CRSP-Protein-, Nukleinsäureexpression oder Aktivität charakterisiert ist, prophylaktisch zu behandeln.
Eine andere Verwendung der Erfindung betrifft das Überwachen des Einflusses von Mitteln (beispielsweise Arzneimitteln, Verbindungen) auf die Expression oder Aktivität von CRSP in klinischen Studien.
Diese und andere Mittel werden in den folgenden Abschnitten ausführlicher beschrieben.
1. Diagnoseassays
Ein beispielhaftes Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit oder Abwesenheit von CRSP-Protein oder Nukleinsäure in einer biologischen Probe umfasst, Erhalten einer biologischen Probe von einem Testsubjekt und Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einer Verbindung oder einem Mittel, das CRSP-Protein oder Nukleinsäure (beispielsweise mRNA, genomische DNA), die CRSP-Protein codiert, detektieren kann, so dass die Anwesenheit von CRSP-Protein oder Nukleinsäure in der biologische Probe detektiert wurde. Ein bevorzugtes Mittel zum Detektieren von CRSP-mRNA oder genomischer DNA liegt als eine markierte Nukleinsäuresonde vor, die an CRSP-mRNA oder genomische DNA hybridisieren kann. Die Nukleinsäuresonde kann beispielsweise eine Volllängen-CRSP-Nukleinsäure, wie beispielsweise eine Nukleinsäure der Erfindung sein, oder ein Teilbereich davon, wie beispielsweise ein Oligonukleotid von mindestens 15, 30, 50, 100, 250 oder 500 Nukleotiden in der Länge, und dazu geeignet ist unter stringenten Bedingungen mit CRSP-mRNA oder genomischer DNA spezifisch zu hybridisieren. Andere geeignete Sonden, die in den Diagnoseassays der Erfindung verwendet werden, werden hier beschreiben.
Ein bevorzugtes Mittel zum Detektieren von CRSP-Protein liegt als ein Antikörper vor, der CRSP-Protein binden kann, wobei ein Antikörper mit einer detektierbaren Markierung bevorzugt wird. Ein intakter Antikörper oder ein Fragment davon (beispielsweise Fab oder F(ab')2) können verwendet werden, Der Ausdruck "markiert", der sich auf die Sonde oder den Antikörper bezieht, soll eine direkte Markierung der Sonde oder des Antikörpers durch Koppeln (beispielsweise körperliches Verbinden) einer detektierbaren Substanz an die Sonde oder den Antikörper umfassen, als auch eine indirekte Markierung der Sonde oder des Antikörpers durch Reagieren mit einem anderen direkt markierten Reagenz. Beispiele einer indirekten Markierung umfassen Detektion eines primären Antikörpers unter Verwendung fluoreszenzmarkierter sekundärer Antikörper und Endmarkierung einer DNA-Sonde mit Biotin, so dass sie mit Fluoreszenzmarkiertem Streptavidin detektiert werden kann. Der Ausdruck "biologische Probe" soll Gewebe, Zellen und biologische Fluide umfassen, die von einem Subjekt isoliert werden können, als auch Geweben, Zellen und Fluiden, die in einem Subjekt vorkommen. Das heißt, das Detektionsverfahren der Erfindung kann verwendet werden, um CRSP-mRNA, Protein oder genomische DNA in einer biologischen Probe in vitro oder in vivo zu detektieren. Beispielsweise umfassen in vitro Verfahren zur Detektion von CRSP-mRNA Northern-Hybridisierungen und in situ Hybridisierungen. In vitro Verfahren zur Detektion von genomischer DNA von CRSP umfassen Southern-Hybridisierungen. Weiterhin umfassen in vivo Verfahren zur Detektion von CRSP-Protein ein Einbringen eines markierten Anti-CRSP-Antikörpers in ein Subjekt. Beispielsweise kann der Antikörper mit einer radioaktiven Markierung markiert sein, dessen Anwesenheit und Lokalisation in einem Subjekt durch standardisierte bildgebende Verfahren detektiert werden können In einer Ausführungsform umfasst die biologische Probe Proteinmoleküle von dem Testsubjekt. Alternativ kann die biologische Probe mRNA-Moleküle von einem Testsubjekt oder genomische DNA-Moleküle von dem Testsubjekt umfassen. Eine bevorzugte biologische Probe stellt eine Serumprobe dar, die durch herkömmliche Mittel von einem Subjekt isoliert wurde.
In einer anderen Ausführungsform umfassen die Verfahren weiterhin, Erhalten einer biologischen Kontrollprobe von einem Kontrollsubjekt, Inkontaktbringen der Kontrollprobe mit einer Verbindung oder einem Mittel, das CRSP-Protein, mRNA oder genomische DNA detektieren kann, so dass die Anwesenheit von CRSP-Protein, mRNA oder genomischer DNA in der biologischen Probe detektiert wird, und Vergleichen der Anwesenheit von CRSP-Protein, mRNA oder genomischer DNA in der Kontrollprobe mit der Anwesenheit von CRSP-Protein, mRNA oder genomischer DNA in der Testprobe.
Die Erfindung umfasst ebenfalls Kits zum Detektieren der Anwesenheit von CRSP in einer biologischen Probe. Beispielsweise kann der Kit eine markierte Verbindung oder Mittel umfassen, die/das CRSP-Protein oder mRNA in einer biologischen Probe detektieren kann, Mittel zum Bestimmen der Menge von CRSP in der Probe, und Mittel zum Vergleichen der Menge von CRSP in der Probe mit einem Standard. Die Verbindung oder das Mittel können in einem geeigneten Behälter verpackt sein. Der Kit umfasst weiterhin Anwendungsinstruktionen des Kits, um CRSP-Protein oder Nukleinsäure zu detektieren.
2. Prognoseassays
Die hierin beschriebenen Diagnoseverfahren können weiterhin verwendet werden, um Subjekte zu identifizieren, welche eine Entwicklung einer Erkrankung oder Krankheit aufweisen oder ein Risiko dazu besteht, welche mit einer abnormalen CRSP Expression oder Aktivität zusammenhängt bzw. assoziiert. Die hierin beschriebenen Assays, wie beispielsweise die vorstehenden Diagnoseassays oder die nachstehenden Assays, können beispielsweise verwendet werden, um ein Subjekt zu identifizieren, welches eine Entwicklung einer Erkrankung oder ein Risiko dazu aufweist, welche mit CRSP Protein, Nukleinsäureexpression oder Aktivität zusammenhängt, wie beispielsweise eine proliferative Erkrankung, eine differentiative oder entwicklungsgemäße Erkrankung, eine blutbildende Erkrankung, ebenso wie Erkrankungen, Zustände oder Krankheiten, welche durch ein abnormales Zellüberleben, abnormale extrazelluläre Struktur oder eine Abnormalität in einem Verteidigungsmechanismus gekennzeichnet sind. Die Prognoseassays können alternativ verwendet werden, um ein Subjekt zu identifizieren, welches eine Entwicklung einer differentiativen oder proliferativen Erkrankung oder ein Risiko dazu aufweist (beispielsweise Krebs). Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Identifizierung einer Erkrankung oder Krankheit bereit, welche mit einer abnormalen CRSP Expression oder Aktivität zusammenhängt, bei welcher eine Testprobe von einem Subjekt erhalten wird und CRSP Protein oder Nukleinsäure (beispielsweise mRNA, genomische DNA) nachgewiesen wird, worin die Anwesenheit von CRSP Protein oder Nukleinsäure für ein Subjekt diagnostisch ist, welches eine Entwicklung einer Erkrankung oder Krankheit oder ein Risiko dazu aufweist, welche mit einer abnormalen CRSP Expression oder Aktivität zusammenhängt. Wie hierin verwendet betrifft eine "Testprobe" eine biologische Probe, welche von einem Subjekt von Interesse erhalten wird. Eine Testprobe kann beispielsweise eine biologische Flüssigkeit sein (beispielsweise Serum), Zellprobe oder Gewebe.
Darüber hinaus können die hierin beschriebenen Prognoseassays verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Subjekt ein Agens verabreicht werden kann (beispielsweise ein Agonist, Antagonist, Peptidomimetikum, Protein, Peptid, Nukleinsäure, kleines Molekül, oder ein anderer Arzneimittelkandidat), um eine Erkrankung oder Krankheit zu behandeln, welche mit einer abnormalen CRSP Expression oder Aktivität zusammenhängt. Derartige Verfahren können beispielsweise verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Subjekt mit einem Agens für eine Erkrankung wirksam behandelt werden kann, wie beispielsweise eine proliferative Erkrankung, eine differentiative oder entwicklungsgemäße Erkrankung, eine blutbildende Erkrankung, ebenso wie Erkrankungen, welche durch abnormales Zellüberleben, eine abnormale extrazelluläre Struktur, oder eine Abnormalität in einem Verteidigungsmechanismus gekennzeichnet sind. Derartige Verfahren können alternativ verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Subjekt mit einem Agens für eine differentiative oder proliferative Erkrankung (beispielweise Krebs) wirksam behandelt werden kann. Die vorliegende Erfindung stellt daher Verfahren bereit, um zu bestimmen, ob ein Subjekt wirksam mit einem Agens für eine Erkrankung behandelt werden kann, welche mit einer abnormalen CRSP Expression oder Aktivität zusammenhängt, in welcher eine Testprobe auch erhalten wird und CRSP Protein oder Nukleinsäureexpression oder Aktivität nachgewiesen wird (beispielswiese, worin die Häufigkeit von CRSP Protein oder Nukleinsäureexpression oder Aktivität für ein Subjekt diagnostisch ist, welchem das Agens verabreicht werden kann, um eine Erkrankung zu behandeln, welche mit einer abnormalen CRSP Expression oder Aktivität zusammenhängt).
Die Verfahren der Erfindung können ebenso verwendet werden, um genetische Änderungen in einem CRSP Gen nachzuweisen, um dadurch zu bestimmen, ob für ein Subjekt mit dem geänderten Gen ein Risiko für eine Erkrankung besteht, welche durch eine abnormale Entwicklung, abnormale zelluläre Differenzierung, abnormale zelluläre Proliferation oder eine abnormale blutbildende Reaktion gekennzeichnet ist. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Verfahren Nachweisen, in einer Probe von Zellen von dem Subjekt, die Anwesenheit oder Abwesenheit einer genetischen Änderung, welche durch zumindest eine einer Änderung gekennzeichnet ist, welche die Integrität eines Gens beeinflusst, welches ein CRSP Protein kodiert, oder die Fehlexpression des CRSP Gens. Derartige genetische Änderungen können beispielsweise durch Vergewissern des Vorliegens von zumindest eines von 1) einer Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden von einem CRSP Gen; 2) einer Addition von einem oder mehreren Nukleotiden zu einem CRSP Gen; 3) einer Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden eines CRSP Gens; 4) einer chromosomalen Neuanordnung eines CRSP Gens; 5) einer Änderung in dem Niveau eines Messenger RNA Transkripts eines CRSP Gens; 6) abnormale Modifizierung eines CRSP Gens, wie beispielsweise das Methylierungsmuster der genomischen DNA; 7) das Vorliegen eines Nichtwildtyp Splicing-Musters eines Messenger RNA Transkripts eines CRSP Gens; 8) ein Nichtwildtyp Niveau eines CRSP Proteins; 9) allelischer Verlust eines CRSP Gens und 10) ungeeignete post-translationale Modifizierung eines CRSP Proteins, nachgewiesen werden. Wie hierin beschrieben sind im Stand der Technik eine große Anzahl von Assaytechniken bekannt, welche für ein Nachweisen von Änderungen in einem CRSP Gen verwendet werden können. Eine bevorzugte biologische Probe ist ein Gewebe oder eine Serumprobe, welche mittels herkömmlicher Mittel von einem Subjekt isoliert wurde.
Bei bestimmten Auswirkungsformen umfasst ein Nachweisen der Änderung die Verwendung einer Sonde/Primers in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) (siehe beispielsweise US-P. 4,683,195 und 4,683,202), wie beispielsweise Anker PCR oder RACE PCR, oder alternativ in einer Ligationskettenreaktion (LCR) (siehe beispielsweise Landegran et al., Science, 241 (1988) 1077-1080; und Nakazawa et al., PNAS, 91 (1994) 360-364), wobei die letztere davon insbesondere für ein Nachweisen von Punktmutationen in dem CRSP Gen von Nutzen ist (siehe Abravaya et. al., Nucleic Acids Res., 23 (1995) 675-682). Dieses Verfahren kann die Schritte umfassen von Sammeln einer Probe von Zellen von einem Patienten, Isolieren von Nukleinsäure (beispielsweise genomischer; mRNA oder von beiden) von den Zellen der Probe, in Kontakt bringen der Nukleinsäureprobe – mit einem oder mehreren Primern, welche spezifisch an ein CRSP Gen unter Bedingungen hybridisieren, so dass eine Hybridisierung und Amplifikation des CRSP Gens (falls vorliegend) auftritt, und Nachweisen des Vorliegens oder der Abwesenheit eines Amplifikationsprodukts, oder Nachweisen der Größe des Amplifikationsprodukts und Vergleichen der Länge mit einer Kontrollprobe. Es wird angenommen, dass PCR und/oder LCR wünschenswert bei einer Verwendung als ein erster Amplifikationsschritt in Zusammenhang mit einer der Techniken wünschenswert sein kann, welche für einen Nachweis von Mutationen wie hierin beschrieben, verwendet wird.
Alternative Amplifikationsverfahren umfassen: selbst genügende Sequenzreplikation (Guatelli, J. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990) 1874-1878), transkriptionales Amplifikationssystem (Kwoh, D.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 (1989), 1173-1177), Q-Beta Replikase (Lizardi, P. M. et al., Bio/Technology, 6 (1988) 1197) oder irgendeine andere Nukleinsäureamplifikationsverfahren, gefolgt durch den Nachweis der amplifizierten Moleküle unter Verwendung von Techniken, welche dem Fachmann gut bekannt sind. Diese Nachweisschemata sind insbesondere für den Nachweis von Nukleinsäuremolekülen von Nutzen, falls derartige Moleküle in sehr geringer Zahl vorhanden sind.
In einer alternativen Ausführungsform können Mutationen in einem CRSP Gen von einer Probenzelle durch Änderungen in Restriktionsenzym Schnittmustern identifiziert werden. Proben und Kontroll-DNA wird beispielsweise isoliert, amplifiziert (optional), mit einem oder mehreren Restriktionsendonukleasen verdaut, und Fragmentlängengrößen werden durch Gelelektrophorese bestimmt und verglichen. Unterschiede bei Fragmentlängengrößen zwischen Probe und Kontroll-DNA zeigt Mutationen in der Proben-DNA an. Darüber hinaus kann die Verwendung von sequenzspezifischen Ribozymen (siehe beispielsweise US-P. 5,498,531) verwendet werden, um auf das Vorliegen von spezifischen Mutationen durch Entwicklung oder Verlust einer Ribozymschnittstelle zu bewerten.
In anderen Ausführungsformen können genetische Mutationen in CRSP durch Hybridisierung einer Probe und Kontrollnukleinsäuren, beispielsweise DNA oder RNA, zu bzw. an Arrays hoher Dichte identifiziert werden, welche hunderte oder tausende von Oligonukleotidsonden umfassen (Cronin, M.T. et al., Human Mutation, 7 (1996) 244-255; Kozal, M.J. et al., Nature Medicine, 2 (1996) 753-759). Genetsche Mutationen in CRSP können beispielsweise in zweidimensionalen Arrays identifiziert werden, welche licht-erzeugte DNA-Sonden umfassen, wie in Conin, M.T. et al., supra, beschrieben. In Kürze kann ein erster Hybridisierungsarray von Sonden verwendet werden, um durch lange Stränge von DNA in einer Probe zu durchmustern und zu kontrollieren, um Basenänderungen zwischen den Sequenzen durch Erstellen linearer Arrays von sequentiell überlappenden Sonden zu identifizieren. Dieser Schritt ermöglicht die Identifizierung von Punktmutation. Dieser Schritt wird gefolgt von einem zweiten Hybridisierungsarray, welcher die Charakterisierung von spezifischen Mutationen durch ein Verwenden kleinerer, spezialisierter Sondenarrays ermöglicht, welche komplementär zu allen Varianten oder nachgewiesenen Mutationen sind. Jeder Mutationsarray ist aus parallelen Sondensätzen zusammengesetzt, einer komplementär zu dem Wildtypgen und der andere komplementär zu dem Mutantengen.
In noch einer anderen Ausführungsform kann irgendeine aus einer Vielzahl von Sequenzierungsreaktionen, welche im Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden, um das CRSP Gen direkt zu sequenzieren und Mutationen durch Vergleichen der Sequenz des Proben CRSP mit der entsprechenden Wildtyp (Kontroll) Sequenz nachgewiesen werden. Beispiele von Sequenzierungsreaktionen umfassen jene, welche auf Techniken basieren, welche von Maxim und Gilbert (PNAS 74 (1977) 560) oder Sanger (PNAS, 74 (1977) 5463) entwickelt wurden. Es ist ebenso umfasst, dass irgendeine einer Vielzahl von automatisierten Sequenzierungsvorgängen verwendet werden kann, wenn die Diagnoseassays durchgeführt werden (Biotechniques 19 (1995), 448), einschließlich ein Sequenzieren durch Massenspektrometrie (siehe beispielsweise PCT WO 94/16101; Cohen et al., Adv. Chromatogr., 36 (1996) 127-162; und Griffin et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 38 (1993) 147-159).
Andere Verfahren zum Nachweisen von Mutationen in dem CRSP Gen umfassen Verfahren, bei welchen ein Schutz vor Schnittagenzien verwendet wird, um nicht passende Basen in RNA/RNA oder RNA/DNA Heteroduplexen nachzuweisen (Myers et al., Science, 230 (1985) 1242). Im Allgemeinen fängt die Technik gemäß dem Stand der Technik von "nicht passendem Schnitt" (Mismatch Cleavage) an durch Bereitstellen von Heteroduplexen von durch Hybridisierung (markierter) gebildeter RNA oder DNA, welche die Wildtyp CRSP Sequenz mit möglicherweise Mutant-RNA oder DNA umfasst, welche von einer Gewebeprobe erhalten wurde. Die doppelsträngigen Duplexe werden mit einem Agens behandelt, welches einzelsträngige Bereiche des Duplex schneidet, wie beispielsweise jene, welche aufgrund von Basenpaare Mismatches bzw. Fehlpassen zwischen der Kontrolle und Probensträngen vorliegen. RNA/DNA Duplexe können beispielsweise mit RNase behandelt werden, und DNA/DNA Hybride werden mit S 1 Nuklease behandelt, um die nicht passenden bzw. Mismatch Bereiche enzymatisch zu verdauen. In anderen Ausführungsformen können entweder DNA/DNA oder RNA/DNA Duplexe mit Hydroxylamin oder Osmiumtetroxyd und mit Piperidin behandelt werden, um nicht passende Bereiche zu verdauen. Nach Verdauen der nicht passenden Bereiche wird das erhaltene Material nach Größe auf denaturierenden Polyacrylamidgelen getrennt, um die Stelle einer Mutation zu bestimmen. Siehe beispielsweise Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 4397; Saleeba et al., Methods Enzymol. 217 (1992), 286-295). In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Kontroll-DNA oder RNA für einen Nachweis markiert sein.
In noch einer anderen Ausführungsform wird in der nicht passenden Schnittreaktion ein oder mehrere Proteine verwendet, welches) nicht passende Basenpaare in doppelsträngiger DNA (sog. "DNA mismatch Reparatur" Enzyme) in bestimmten Systemen zum Nachweisen und kartografieren von Punktmutationen in CRSP cDNAs erkennt, welche von Proben von Zellen erhalten wurden. Beispielsweise schneidet das mutY Enzym von E. coli A bei G/A Mismatches und die Thymidin DNA Glycosylase von HeLa-Zellen schneidet T bei G/T Mismatches (Hsu et al., Carcinogenesis 15 (1994), 1657-1662). Gemäß einer beispielhaften Ausführungsform wird eine Sonde, welche auf einer CRSP Sequenz, beispielsweise einer Wildtyp CRSP Sequenz, basiert, an eine cDNA oder ein anderes DNA Produkt von (einer) Testzelle(n) hybridisiert. Das Duplex wird mit einem DNA Mismatch Reparaturenzym behandelt und die Schnittprodukte, falls irgendwelche, können mittels Elektrophoreseprotokollen oder durch ähnliches nachgewiesen werden (siehe beispielsweise US-P-5,459,039).
In anderen Ausführungsformen werden Änderungen bei elektrophoretischer Mobilität verwendet, um Mutationen in CRSP Genen zu identifizieren. Beispielsweise kann einzelsträngiger Konformationspolymorphismus (SSCP) verwendet werden, um Unterschiede bei elektrophoretischer Mobilität zwischen Mutant und Wildtypnukleinsäuren nachzuweisen (Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 2766, siehe ebenso Cotton, Mutat. Res., 285 (1993), 125-144; und Hayashi, Genet. Anal. Tech. Appl. 9 (1992), 73-79). Einzelsträngige DNA-Fragmente von Probe- und Kontroll CRSP Nukleinsäuren werden denaturiert werden und ermöglicht zu renaturieren. Die Sekundärstruktur von einzelsträngigen Nukleinsäuren unterscheidet sich aufgrund von Sequenz, wobei die resultierende Änderung bei elektrophoretischer Mobilität den Nachweis von sogar einer einzelnen Basenänderung ermöglicht. Die DNA-Fragmente können mit markierten Sonden markiert oder nachgewiesen werden. Die Sensitivität des Assays kann durch Verwenden von RNA (eher als DNA) erhöht werden, bei welcher die Sekundärstruktur sensitiver auf eine Änderung bei einer Sequenz ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird in dem Subjekt- bzw. gegenständlichen Verfahren eine Heteroduplexanalyse verwendet, um doppelsträngige Heteroduplexmoleküle auf der Basis von Änderungen bei elektrophoretischer Mobilität zu trennen (Keen et al., Trends Genet. 7 (1991), 5).
In noch einer anderen Ausführungsform wird die Behebung von Mutanten oder Wildtypfragmenten in Polyacrylamidgelen, welche einen Gradient von Denaturierungsmittel enthalten. unter Verwendung von denaturierender Gradientengelelektrophorese (DGGE) (Myers et al. Nature 313 (1985), 495) untersucht. Falls DGGE als das Analyseverfahren verwendet wird, wird DNA modifiziert werden, um sicherzustellen, dass sie nicht vollständig denaturiert, beispielsweise durch Zugabe eines GC Clamps bzw. Klammer von ungefähr 40 bp von hoch-schmelzender GC reicher DNA durch PCR. In einer weiteren Ausführungsform wird ein Temperaturgradient anstelle eines denaturierenden Gradienten verwendet, um Unterschiede bei der Mobilität von Kontroll und Proben-DNA zu-identifizieren (Rosenbaum und Reissner, Biophys. Chem. 265 (1987), 12753).
Beispiele und andere Techniken zum Nachweisen von Punktmutationen umfassen, sind aber nicht darauf begrenzt, selektive Oligonukleotidhybridisierung, selektive Amplifikation, oder selektive Primerverlängerung. Beispielsweise können Olionukleotidprimer hergestellt werden, bei welchen die bekannte Mutation zentral platziert wird, und anschließend an eine Ziel DNA unter Bedingungen hybridisiert wird, welche eine Hybridisierung ausschließlich ermöglichen, falls ein perfektes Passen gefunden wird (Saiki et al., Nature 324 (1986), 163); Siki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 (1989) 6230). Derartige Allel spezifische Oligonukleotide werden an PCR amplifiziert Ziel DNA oder eine Zahl von verschiedenen Mutationen hybridisiert, falls sie Oligonukleotide an die Hybridisierungsmembran haften und mit markierter Ziel DNA hybridisiert werden.
Alternativ kann allelspezifische Amplifikationstechnologie, welche von selektiver PCR Amplifikation abhängt, in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Oligonukleotide, welche als Primer für eine spezifische Amplifikation verwendet werden, können die Mutation von Interesse in dem Zentrum des Moleküls tragen (so dass eine Amplifikation von einer differenziellen Hybridisierung abhängt) (Gibbs et al., Nucleic Acids Res. 17 (1989), 2437-2448) oder an dem äußeren 3'Ende von einem Primer, wo, unter geeigneten Bedingungen, ein Mismatch eine Polymeraseverlängerung verhindern oder vehningern kann (Prossner, Tbtech. 11 (1993), 238). Darüber hinaus kann es wünschenswert sein, eine neue Schnittstelle in dem Bereich der Mutation einzufügen, um einen schnittbasierenden Nachweis zu erzeugen (Gasparini et al., Mol. Cell Probes 6 (1992), 1). Es wird angenommen, dass bei bestimmten Ausführungsformen eine Amplifikation ebenso durch ein Verwenden von Taq Ligase für eine Amplifikation durchgeführt werden kann (Barany, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88 (1991) 189). In derartigen Fällen wird eine Ligation ausschließlich dann auftreten, falls ein perfektes Passen an dem 3'Ende der 5'Sequenz vorliegt, was es möglich macht die Anwesenheit einer bekannten Mutation an einer spezifischen Stelle durch Überprüfen auf die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Amplifikation nachzuweisen.
Die hierin beschriebenen Verfahren können beispielsweise durch Verwenden bereits abgepackter diagnostischer Kits durchgeführt werden, welche zumindest eine Sondennukleinsäure oder Antikörperreagenz, welche hierin beschrieben ist, umfassen, welche bequem verwendet werden können, wie beispielsweise bei klinischen Einrichtungen, um Patienten zu diagnostizieren, welche Symptome oder eine Familiengeschichte einer Erkrankung oder Krankheit aufweisen, welche ein CRSP Gen einbeziehen.
Darüber hinaus kann irgendeine Zellart oder Gewebe, bei welchem CRSP exprimiert wird, in den hierin beschriebenen Prognoseassays verwendet werden.
3. Beobachten von Wirkungen während klinischer Versuche
Ein Beobachten der Wirkung von Agenzien (beispielsweise Arzneimittel, Verbindungen) auf die Expression oder Aktivität von CRSP (beispielsweise eine Modulieren einer zellulären Signaltransduktion, Regulation von Gentranskription in einer Zelle, welche in Entwicklung oder Differenzierung, Regulation von zellulärer Proliferation einbezogen ist) kann nicht nur bei einem grundlegenden Arzneimittel Durchmustern angewendet werden, aber ebenso bei klinischen Versuchen. Die Wirksamkeit eines Agens, wie es durch einen hierin beschriebenen Durchmusterungsassay bestimmt wird, um CRSP Genexpression, Proteinniveaus zu erhöhen, oder eine CRSP Aktivität heraufzuregulieren, kann beispielsweise in klinischen Versuchen von Subjekten beobachtet werden, welche eine Abnahme bei einer CRSP Genexpression, Proteinniveaus oder eine herunterregulierte CRSP Aktivität aufwiesen. Alternativ kann die Wirksamkeit eines Agens, welches durch ein Durchmusterungsassay bestimmt wird, um eine CRSP Genexpression, Proteinniveaus zu senken, oder eine CRSP Aktivität herunterzuregulieren, bei klinischen Versuchen von Subjekten beobachtet werden, welche eine erhöhte CRSP Genexpression, Proteinniveaus oder eine heraufregulierte CRSP Aktivität aufweisen. Bei derartigen klinischen Versuchen kann die Expression oder Aktivität von CRSP und vorzugsweise anderen Genen, welche beispielsweise bei einer proliferativen Erkrankung impliziert wurden, als ein "Auslesen" oder Marker des Phänotyps einer bestimmten Zelle verwendet werden.
Beispielsweise, und nicht mittels Begrenzung können Gene einschließlich CRSP identifiziert werden, welche in Zellen durch Behandlung mit einem Agens moduliert werden (beispielsweise eine Verbindung, Arzneimittel oder kleines Molekül), welches eine CRSP Aktivität moduliert (beispielsweise in einem Durchmusterungsassay wie hierin beschrieben identifiziert). Um daher die Wirksamkeit von Agenzien auf proliferative Erkrankungen, entwicklungsgemäße oder differentiative Erkrankung, blutbildende Erkrankung ebenso wie Erkrankungen zu untersuchen, welche durch eine abnormale Zelldifferenzierung und/oder Überleben, eine abnormale extrazelluläre Struktur oder eine Abnormalität bei einem Verteidigungsmechanismus gekennzeichnet sind, können beispielsweise Zellen bei einem klinischen Versuch isoliert werden und RNA hergestellt und auf die Niveaus einer Expression von CRSP und anderen Genen analysiert werden, welche in die proliferative Erkrankung, entwicklungsgemäße oder differentiative Erkrankung, blutbildende Erkrankung, ebenso wie Erkrankungen einbezogen sind, welche jeweils durch ein abnormale Zelldifferenzierung und/oder Überleben, eine abnormale extrazelluläre Struktur, oder eine Abnormalität in einem Verteidigungsmechanismus gekennzeichnet sind. Die Niveaus einer Genexpression (d. h. ein Genexpressionsmuster) kann durch Nothern Blot Analyse oder RT-PCR, wie hierin beschrieben, quantifziert werden oder alternativ durch Bestimmen der Menge an Protein, welches durch eines der hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, oder durch Bestimmen der -Niveaus einer Aktivität von CRSP oder anderer Gene. Dadurch kann das Genexpressionsmuster als ein Marker dienen, welcher die physiologische Reaktion der Zellen auf das Agens anzeigt. Demgemäß kann dieser Reaktionszustand zuvor bestimmt werden und zu verschiedenen Punkten während einer Behandlung des Individuums mit dem Agens.
Die vorliegende Erfindung kann als die Grundlage für ein Verfahren für ein Beobachten der Wirksamkeit einer Behandlung eines Subjekts mit einem Agens verwendet werden (beispielsweise einem Agonisten, Antagonisten, Peptidomimetikum, Protein, Peptid, Nukleinsäure, kleine Moleküle, oder einem anderem Arzneimittelkandidat, welcher durch die hierin beschriebenen Durchmusterungsassays bestimmt wurde), umfassend die Schritte von (i) Erhalten einer Vorverabreichungsprobe von einem Subjekt vor einer Verabreichung des Agens; (ii) Nachweisen des Niveaus einer Expression eines CRSP Proteins, mRNA, oder genomischen DNA in der Vorverabreichungsprobe; (iii) Erhalten einer oder mehrerer Nachverabreichungsproben von dem Subjekt; (iv) Nachweisen des Niveaus einer Expression oder Aktivität des CRSP Proteins, mRNA, oder genomischen RNA in den Nachverabreichungsproben; (v) Vergleichen des Niveaus einer Expression oder Aktivität des CRSP Proteins, mRNA, oder genomischen DNA in der Vorverabreichungsprobe mit dem CRSP Protein, mRNA oder genomischen DNA in der Nachverabreichungsprobe oder -proben; und (vi) demgemäß Ändern der Verabreichung des Agens an das Subjekt. Eine erhöhte Verabreichung des Agens kann beispielsweise wünschenswert sein, um die Expression oder Aktivität von CRSP zu höheren Niveaus als nachgewiesen zu erhöhten, d. h. um die Wirksamkeit des Agens zu erhöhen. Alternativ kann eine erniedrigte Verabreichung des Agens wünschenswert sein, um eine Expression oder Aktivität von CRSP auf geringere Niveaus als nachgewiesen zu verringern, d. h. um die Wirksamkeit des Agens zu erniedrigen. Gemäß einer derartigen Ausführungsform kann eine CRSP Expression oder Aktivität als ein Indikator der Wirksamkeit eines Agens selbst in der Abwesenheit einer beobachtbaren phänotypischen Reaktion verwendet werden.
C. Verfahren zur Behandlung:
Die vorliegende Erfindung kann als die Grundlage für sowohl prophylaktische als auch therapeutische Verfahren zur Behandlung eines Subjekts verwendet werden, für welches ein Risiko besteht (oder empfänglich ist) für eine Erkrankung oder eine Erkrankung aufweist, welche mit einer abnormalen CRSP Expression oder Aktivität zusammenhängt. Hinsichtlich sowohl prophylaktischer als auch therapeutischer Verfahren einer Behandlung können derartige Behandlungen spezifisch zurecht geschnitten oder modifiziert werden, basierend auf Wissen, welches aus dem Gebiet von Pharmacogenomics erhalten wurde. "Pharmacogenomics", wie hierin verwendet, betrifft die Anwendung von Genomtechnologien, wie beispielsweise Gensequenzieren, statistische Genetik, und Genexpressionsanalyse auf Arzneimittel in klinischer Entwicklung und auf dem Markt. Der Ausdruck betrifft insbesondere die Studie wie Gene eines Patienten seine oder ihre Reaktion auf ein Arzneimittel bestimmen (beispielsweise ein "Arzneimittelreaktionsphänotyp" oder "Arzneimittelreaktionsgenotyp" eines Patienten. Daher stellt die Erfindung die Grundlage von Verfahren zum Zurechtschneiden einer prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung eines Individuum mit entweder den CRSP Molekülen der vorliegenden Erfindung oder CRSP Modulatoren gemäß zu jenen eines Arzneimittelreaktionsgenotyps eines Individuums bereit. Pharmocogenomics ermöglichen einem Kliniker oder Arzt, prophylaktische oder therapeutische Behandlungen auf Patienten zu zielen, welche am meisten aus der Behandlung Nutzen ziehen, und eine Behandlung von Patienten zu vermeiden, welche toxische Arzneimittel bezogene Nebeneffekte durchlaufen.
1. Prophylaktische Verfahren
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung die Herstellung eines Medikaments zum Vorbeugen einer Krankheit oder eines Zustand in einem Subjekt bereit, welcher) mit einer abnormalen CRSP Expression oder Aktivität zusammenhängt. Das Medikament umfasst ein Agens, welches eine CRSP Expression oder zumindest eine CRSP Aktivität moduliert. Subjekte für welche ein Risiko für eine Krankheit besteht, welche durch eine abnormale CRSP Expression oder Aktivität verursacht oder dazu beigetragen wird, kann beispielsweise durch irgendeine oder eine Kombination von diagnostischen oder Prognoseassays, wie hierin beschrieben, identifiziert werden. Eine Verabreichung eines prophylaktischen Agens kann vor der Manifestierung von Symptomen auftreten, welche die CRSP Abnormalität kennzeichnen, derartig, dass eine Erkrankung oder Krankheit verhindert oder alternativ in ihrem Voranschreiten verzögert wird. In Abhängigkeit von der Art einer CRSP-Abnormalität kann beispielsweise ein CRSP Agonist oder ein CRSP Antagonistagens zur Behandlung des Subjekts verwendet werden. Das geeignete Agens kann basierend auf hierin beschriebenen Durchmusterungsassays bestimmt werden. Die prophylaktischen Verfahren werden weiterhin in den nachfolgenden Unterabschnitten erörtert.
2. Therapeutische Verfahren
Eine andere Ausführungsform der Erfindung stellt eine Herstellung eines Medikaments für eine Modulierung einer CRSP Expression oder Aktivität für therapeutische Zwecke bereit. Das modulatorische Verfahren der Erfindung umfasst ein in Kontakt bringen einer Zelle mit einem Agens, welches eine oder mehrere der Aktivitäten einer CRSP Proteins Aktivität, welche mit der Zelle zusammenhängt, moduliert. Ein Agens, welches eine CRSP Proteinaktivität moduliert, kann ein Agens wie hierin beschrieben sein, wie beispielsweise eine Nukleinsäure oder ein Protein, ein natürlich auftretendes Zielmolekül eines CRSP Proteins, ein Peptid, ein CRSP Peptidominetikum, oder ein anderes kleines Molekül. In einer Ausführungsform stimuliert das Agens eine oder mehrere einer CRSP Proteinaktivität. Beispiele von derartigen stimulatorischen Agenzien umfassen aktives CRSP Protein und ein Nukleinsäuremolekül, welches CRSP codiert, welches in die Zelle eingefügt wurde. In einer anderen Ausführungsform inhibiert das Agens eine oder mehrere einer CRSP Proteinaktivität. Beispiele für derartige inhibitorische Agenzien umfassen Antisens CRSP Nukleinsäuremoleküle und Anti-CRSP Antikörper. Diese modulatorischen Verfahren können in vitro durchgeführt werden (beispielsweise durch Kultivieren der Zelle mit dem Agens) oder alternativ in vivo (beispielsweise durch Verabreichung des Agens an ein Subjekt). Als solches stellt die vorliegende Erfindung eine Herstellung von Medikamenten für ein Behandeln eines Individuums bereit, welches durch eine Erkrankung oder Krankheit beeinträchtigt ist, welche durch eine abnormale Expression oder Aktivität eines CRSP Proteins oder Nukleinsäuremoleküls gekennzeichnet ist. In einer Ausführungsform umfasst das Medikament ein Agens (beispielsweise ein Agens, welches durch einen hierin beschriebenen Durchmusterungsassay identifiziert wurde), oder eine Kombination von Agenzien, welche eine CRSP Expression oder Aktivität modulieren (beispielsweise herauf- oder herunterregulieren). Ein CRSP Protein oder Nukleinsäuremolekül kann als Therapie verabreicht werden, um eine verringerte oder abnormale CRSP Expression oder Aktivität zu kompensieren.
Eine Stimulierung einer CRSP Aktivität ist bei Situationen wünschenswert, bei welchen CRSP abnormal herunterreguliert ist und/oder bei welchen eine erhöhte CRSP Aktivität wahrscheinlich ist eine gute Wirkung aufzuweisen. Ähnlich dazu ist eine Inhibierung einer CRSP Aktivität bei Situationen wünschenswert, bei welchen CRSP abnormal heraufreguliert und/oder bei welchen eine verringerte CRSP Aktivität wahrscheinlich ist eine gute Wirkung aufzuweisen. Ein Beispiel für eine derartige Situation ist, wo ein Subjekt eine Erkrankung aufweist, welche durch eine abnormale Entwicklung oder zelluläre Differenzierung gekennzeichnet ist. Ein anderes Beispiel für eine derartige Situation ist, wo das Subjekt eine poliferative Erkrankung (beispielsweise Krebs) aufweist oder eine Erkrankung, welche durch eine abnormale blutbildende Reaktion gekennzeichnet ist. Ein noch anderes Beispiel für eine derartige Situation ist, wo es wünschenswert ist, eine Geweberegenerierung in einem Subjekt zu erzielen (beispielsweise wo ein Subjekt eine Gehirn- oder Ruckenmarksverletzung erlitten hat und es wünschenswert ist, neuronales Gewebe auf eine regulierte Art zu regenerieren).
Demgemäß ist in einer Ausführungsform die Erkrankung eine Erkrankung, welche durch eine abnormale Zellproliferation, Differenzierung und/oder Überleben gekennzeichnet ist. Beispielsweise kann die Erkrankung eine hyper- oder hypoproliferative Erkrankung sein. Die Erfindung stellt ebenso eine Herstellung eines Medikaments für eine Behandlung von Erkrankungen bereit, welche durch eine abnormale Zellproliferation, Differenzierung und/oder Überleben in einem Subjekt gekennzeichnet sind, welche nicht durch eine abnormale CRSP Aktivität (beispielsweise CRSP-1 Aktivität) gekennzeichnet sind. Da CRSP wahrscheinlich den proliferativen Zustand einer Zelle modulieren kann (d. h. den Zustand einer Proliferation, Differenzierung, und/oder Überleben einer Zelle), kann CRSP eine Erkrankung regulieren, worin der abnormale proliferative Zustand einer Zelle von einem Defekt anders als einer abnormalen CRSP Aktivität herrührt.
Hyperproliferative Erkrankungen können mit CRSP (beispielsweise CRSP-1) Therapeutika behandelt werden, einschließlich von neoplastischen und hyperplastischen Erkrankungen, wie beispielsweise mehrere Formen von Krebs und Leukämie, und fibroproliferative Erkrankungen. Andere Hyperproliferative Erkrankungen, welche mit den gegenständlichen CRSP Therapeutika (beispielsweise CRSP-1 Therapeutika) behandelt oder vorgebeugt bzw. verhindert werden können, umfassen bösartige Zustände, prämaligne Zustände und gutartige Zustände. Der zu behandelnde oder vorzubeugende Zustand kann ein fester Tumor sein, wie beispielsweise ein Tumor, welcher in einem Epithelgewebe entsteht. Eine Behandlung eines derartigen Krebses könnte demgemäß eine Verabreichung an das Subjekt eines CRSP Therapeutikums umfassen, welches die Wechselwirkung von CRSP mit einem CRSP Rezeptor verringert. Andere Krebse, welche mit einem CRSP Protein behandelt oder vorgebeugt werden können, umfassen Sarcoma und Karzinome, beispielsweise Lungenkrebs, Krebs des Darms, Prostata, Brust, Eierstock, Speiseröhre, Lungenkrebs, Melanome, Seminome und squamose bzw. schuppenartige Adenocarcinome. Darüber hinaus umfassen feste Tumore im Bereich der Erfindung jene, welche in einem medizinischen Fachbuch bzw. Lehrbuch gefunden werden können.
Der zu behandelnde oder vorzubeugende Zustand kann ebenso ein löslicher Tumor sein, wie beispielsweise Leukämie, der entweder chronisch oder akut ist, umfassend chronische oder akute myelogene Leukämie, chronische oder akute lymphocytische Leukäme, promyelocytische Leukämie, monocytische Leukämie, myelomonocytische Leukämie und Erythroleukämie. Noch andere proliferative Erkrankungen, welche mit einem CRSP Therapeutikum der Erfindung behandelt werden können, umfassen schwere Kettenerkrankung, multiple Myelome, Lymphome, beispielsweise Hodgkin's Lymphome und nicht-Hodgkin's Lymphome und Waldenstroem's Macroglobulemie.
Krankheiten oder Zustände, welche durch einen festen oder löslichen Tumor gekennzeichnet sind, können durch Verabreichung eines CRSP Therapeutikums entweder lokal oder systemisch behandelt werden, so dass eine abnormale Zellproliferation inhibiert oder veningert wird. Verfahren zur Verabreichung der Verbindungen der Erfindung sind weiterhin nachstehend beschrieben.
Die Erfindung stellt ebenso die Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung der Bildung und/oder Entwicklung von Tumoren bereit. Die Entwicklung eines Tumors kann beispielsweise die Anwesenheit einer spezifischen Läsion vorausgegangen sein, wie beispielsweise einer prä-neoplastischen Läsion, beispielsweise Hyperplasie, Metaplasie und Dysplasie, welche beispielsweise durch cytologische Verfahren nachgewiesen werden können. Derartige Läsionen können beispielsweise in Epitelgewebe gefunden werden. Die Erfindung stellt daher die Herstellung eines Medikaments für ein Inhibieren eines Voranschreitens einer derartigen Läsion in eine neoplastische Läsion bereit. Dem Subjekt, welches eine prä-neoplastische Läsion aufweist, kann eine Menge eines CRSP-1 Therapeutikums verabreicht werden, welche ausreichend ist, ein Voranschreiten der prä-neoplastischen Läsion in eine neoplastische Läsion zu inhibieren.
Die Erfindung stellt ebenso die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verhindern von Erkrankungen oder Zuständen bereit, bei welchen eine Proliferation von Zellen erwünscht ist. CRSP Therapeutika können beispielsweise verwendet werden, um Gewebereparatur oder Wundheilung zu stimulieren, wie beispielsweise nach einer Operation oder um eine Gewebeheilung nach Verbrennungen zu stimulieren. Andere Erkrankungen, bei welchen eine Proliferation von Zellen erwünscht ist, sind hypoproliferative Erkrankungen, d.h. Erkrankungen, welche durch eine abnormal geringe Proliferation von bestimmten Zellen gekennzeichnet sind.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen oder Zuständen bereit, welche durch eine abnormale Zelldifferenzierung gekennzeichnet sind. Demgemäß sind Verfahren zur Stimulierung einer zellulären Differenzierung in Zustände durch eine Inhibierung gekennzeichnet, welche durch eine exzessive Proliferation begleitet sind oder nicht. Alternativ dazu können CRSP Therapeutika verwendet werden, um eine Differenzierung von spezifischen Zellen zu inhibieren.
In einem bevorzugten Verfahren ist die abnormal proliferierende und/oder differenzierende Zelle eine Zelle, welche in dem Nervensystem vorliegt. Eine Rolle für CRSP in dem Nervensystem ist vorgeschlagen, zumindest zum Teil aufgrund der Tatsache, dass menschliches CRSP-1 in menschlichem fötalem Gehirn exprimiert ist. Die Erfindung stellt daher die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen bereit, welche mit einem zentralen oder peripheren Nervensystem zusammenhängen. Die Erfindung stellt beispielsweise die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Läsionen des Nervensystems bereit, welche mit einer abnormalen Proliferation, Differenzierung oder Überleben von irgendeiner der nachstehenden Zellen zusammenhängen: Neuronen, Schwannzellen, Glialzellen, und andere Arten von neuralen Zellen. Erkrankungen des Nervensystems umfassen, sind aber nicht darauf begrenzt auf Verletzungen des Rückenmarks, Verletzungen des Gehirns, Läsionen, welche mit einer Operation zusammenhängen, ischemische Läsionen, maligne Läsionen, infektiöse Läsionen, degenerative Läsionen (Parkinsons-Erkrankung, Alzheimer-Erkrankung, Huntington-Chorea, amyotropische laterale Sklerose), demyelierende Erkrankungen (Multiple Sklerose, mit menschlicher Immunschwäche zusammenhängende Myelopatie, transversale Myelopatie, voranschreitende multifocale Leukoencephalopathie, Pontinmyelionolyse), motorische neuronale Verletzungen, voranschreitende spinale muskuläre Arthropie, voranschreitende Bulbärparalyse, primäre laterale Sklerose, infantile und juvenile muskuläre Arthropie, voranschreitende Bulbärparalyse in der Kindheit (Fazio-Londe-Syndrom), Poliomyelitis und vererbte motorsensorische Newopathie (Charcot-Marie-Zahnerkrankung).
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Herstellung eines Medikaments zum Erhöhen des Überlebens und/oder Stimulieren einer Proliferation und/oder Differenzierung von Zellen und Geweben in vitro bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform werden CRSP Therapeutika verwendet, um eine Geweberegenerierung und/oder Reparatur (beispielsweise um Nervengewebe zu behandeln) zu fördern. Gewebe von einem Subjekt können beispielsweise erhalten werden und in vitro in der Anwesenheit eines CRSP Therapeutikums wachsen gelassen werden, so dass die Gewebezellen zur Proliferation und/oder Differenzierung stimuliert werden. Das Gewebe kann anschließend dem Subjekt wieder verabreicht werden.
Unter den Ansätzen, welche verwendet werden können, um Erkrankungssymptome zu verbessern, welche eine abnormale CRSP Aktivität und/oder abnormale Zellproliferation, Differenzierung und/oder Überleben einbeziehen, sind beispielsweise Antisens, Ribozym und Dreifachhelixmoleküle, wie vorstehend beschrieben. Beispiele für geeignete Verbindungen umfassen die Antagonisten, Agonisten oder Homologe, welche detailliert vorstehend beschrieben wurden.
Noch andere CRSP Therapeutika bestehen aus einem ersten Peptid, welches ein CRSP Peptid umfasst, welches an ein CRSP Rezeptor binden kann, und ein zweites Peptid, welches cytotoxisch ist. Derartige Therapeutika können verwendet werden, um Zellen spezifisch zu zielen und zu lysieren, welche einen Rezeptor für CRSP exprimieren oder überexprimieren.
3. Pharmocogenomics
Die CRSP-Moleküle der vorliegenden Erfindung, ebenso wie Agenzien oder Modulatoren, welche einen stimulatorischen oder inhibitorischen Effekt auf eine CRSP Aktivität (beispielsweise CRSP Genexpression) wie durch einen Durchmusterungsassay, wie hierin beschrieben, identifiziert wurden, aufweisen, können Individuen verabreicht werden, um (beispielsweise proliferative oder entwicklungsgemäße) Erkrankungen (prophylaktisch oder therapeutisch) zu behandeln, welche mit einer abnormalen CRSP Aktivität zusammenhängen. Im Zusammenhang mit einer derartigen Behandlung können Pharmacogenomics (d. h. die Studie des Verhältnisses zwischen einem Genotyp eines Individuums und der Reaktion von jenem Individuum auf eine fremde Verbindung oder Arzneimittel) in Betracht gezogen werden. Unterschiede bei der Metabolisierung von Therapeutika können zu schwerer Toxizität oder zu Versagen der Therapie durch Änderung des Verhältnisses zwischen Dosis und Blutkonzentration des pharmakologisch aktiven Arzneimittels führen. Daher kann ein Arzt oder Kliniker in Erwägung ziehen, Wissen anzuwenden, welches in relevanten pharmacogenomischen Studien bei einer Bestimmung erhalten wurde, ob ein CRSP Molekül oder CRSP Modulator zu verabreichen, ebenso wie Zurechtschneiden der Dosierung und/oder therapeutischen Regimen einer Behandlung mit einem CRPS Molekül oder CRSP Modulator.
Pharmacogenomics behandeln klinisch bedeutsame vererbte Variationen bei der Reaktion auf Arzneimittel aufgrund einer geänderten Arzneimitteldisposition und abnormale Wirkung bei betroffenen Personen. Siehe beispielsweise Eichelbaum, M., Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23 (10-11) (1996), 983-985 und Lindner, M.W., Clin. Chem. 43 (2) (1997), 254-266. Im Allgemeinen können zwei Arten von pharmacogenetischen Zuständen differenziert werden. Genetische Zustände, welche als ein einzelner Faktor übertragen werden, und den Weg von Arzneimitteln ändern, welche auf den Körper wirken (geänderte Arzneimittelwirkung), oder genetische Zustände, welche als einzelne Faktoren übertragen werden, und den Weg ändern, wie der Körper auf Arzneimittel wirkt (geänderter Arzneimittelmetabolismus). Diese pharmacogenetischen Zustände können entweder als seltene genetische Defekte oder als natürlich auftretende Polymorphismen auftreten. Glucose-6-Phosphatat der Dehydrogenase Defizienz (G6PD) ist beispielsweise eine übliche vererbte Enzymopathie, bei welcher die hauptsächliche klinische Komplikation Haemolyse nach Aufnahme von oxidierenden Arzneimitteln (Anti-Malariamitteln, Sulfonamiden, Analgetika, Nitrofuranen) und Verzehr von Favabohnen ist.
Eine pharmacogenomische Annäherung zur Identifizierung von Genen, welche eine Arzneimittelreaktion vorhersagen, welche als "genamübergreifende Assoziierung" bekannt ist, beruht in erster Linie auf einer Karte von hoher Auflösung des menschlichen Genoms, welche aus bereits bekannten genbezogenen Markern besteht (beispielsweise eine "biallelische" Genmarkerkarte, welche aus 60.000-100.000 polymorphischen oder variablen Stellen auf dem menschlichen Genom besteht, wobei jede von denen zwei Varianten aufweist). Eine derartige genetische Karte hoher Auflösung kann mit einer Karte des Genoms von jeweils einer statistisch bedeutenden Zahl von Patienten verglichen werden, welche an einem Phase II/III. Arzneimittelversuch teilnehmen, um Marker zu identifizieren, welche mit einer bestimmten beobachteten Arzneimittelreaktion oder Nebeneffekt zusammenhängen. Alternativ dazu kann eine derartige Karte hoher Auflösung aus einer Kombination von einigen Zehn-Millionen-bekannten einzelnen Nukleotidpolymorphismen (SNPs) in dem menschlichen Genom erzeugt werden. Wie hierin verwendet ist ein "SNP" eine übliche Veränderung, welche in einer einzelnen Nukleotidbasis in einem DNA-Strang auftritt. Ein SNP kann beispielsweise einmal in jeden 1000 DNA-Basen auftreten. Ein SNP kann in einen Erkrankungsvorgang einbezogen sein, wobei jedoch die überwiegende Mehrheit nicht mit einer Erkrankung zusammenhängen kann. Angesichts einer genetischen Karte, basierend auf dem Auftreten derartiger SNPs, können Individuen in genetische Kategorien kopiert werden, in Abhängigkeit von einem bestimmten Muster von SNPs in ihrem individuellen Genom. Auf eine derartige Art können Behandlungsregimen auf Gruppen von genetisch ähnlichen Individuen zurechtgeschnitten werden, unter Berücksichtigung von Charakteristika, welche unter derartigen genetisch ähnlichen Individuen gemeinsam sind.
Alternativ dazu kann ein Verfahren verwendet werden, das die "Kandidaten-Gennäherung" genannt wird, um Gene zu identifizieren, welche eine Arzneimittelreaktion vorhersagen. Gemäß zu diesem Verfahren, falls ein Gen, welches ein Ziel eines Arzneimittel codiert, bekannt ist (beispielsweise ein CRSP Protein oder ein CRSP Rezeptor der vorliegenden Erfindung), können alle gemeinsamen Varianten von jedem Gen in der Population ziemlich einfach identifiziert werden wobei bestimmt werden kann, ob eine Anwesenheit einer Version des Gens gegenüber einer anderen mit einer bestimmten Arzneimittelreaktion zusammenhängt.
Als eine darstellende Ausführungsform ist die Aktivität von Arzneimittel metabolisierenden Enzymen eine Hauptdeterminante von sowohl der Intensität als auch Dauer einer Arzneimittelwirkung. Die Entdeckung von genetischen Polymorphismen von Arzneimittel metabolisierenden Enzymen (beispielsweise N-Acetyltransferase 2 (NAT2) und Cytochrom P450 Enzymen CYP2D6 und CYP2C19) hat eine Erklärung bereitgestellt, warum einige Patienten die erwarteten Arzneimittelwirkungen nicht erhalten oder eine übermäßige Arzneimittelwirkung und schwerwiegende Toxizität nach Aufnahme der Standard -und sicheren Dosis eines Arzneimittels zeigen. Diese Polymorphismen sind in zwei Phänotypen in der Population exprimiert, den extensiven Metabolizer bzw. umfassenden Entgifter (EM) und armen Metabolizer bzw. schwachen Entgifter (PM). Die Prävalenz von PM ist verschieden unter verschiedenen Populationen. Das Gen, welches für CYP2D6 codiert, ist beispielsweise hoch polymorph und verschiedene Mutationen wurden in PM identifizier, welche alle zu der Abwesenheit von funktionellem CYP2D6 führen. Arme Metabolizer von CYP2D6 und CYP2C19 erfahren ziemlich häufig eine übermäßige Arzneimittelreaktion und Nebeneffekte, wenn sie Standarddosen empfangen. Falls ein Metabolit der aktive therapeutische Rest ist, zeigt PM keine therapeutische Reaktion, wie für die analgetische Wirkung von Kodein gezeigt wird, welches durch sein CYP2D6-gebildeten Metaboliten Morphium mediiert wird. Das andere Extrem sind die sog. ultra-schnellen Metabolizer, welche nicht auf Standarddosen reagieren. Jüngst wurde die molekulare Grundlage von ultraschnellem Metabolismus identifiziert aufgrund einer CYP2D6 Genamplifikation vorzuliegen.
Alternativ kann ein Verfahren verwendet werden, welches das "Genexpressionsprofilieren" genannt wird, um Gene zu identifizieren, welche eine Arzneimittelreaktion vorhersagen. Die Genexpression von beispielsweise einem Tier, welches mit einem Arzneimittel (beispielsweise einem CRSP Molekül oder CRSP Modulator der vorliegenden Erfindung) dosiert wurde, kann eine Anzeige geben, ob auf eine Toxizität bezogene Genwege angeschaltet wurden.
Die Information, welche von mehreren als einem der vorstehenden pharmacogenomischen Näherungen erzeugt wurde, kann verwendet werden, um eine geeignete Dosierung und Behandlungsregimen für prophylaktische oder therapeutische Behandlung eines Individuums zu bestimmen. Dieses Wissen, falls auf eine Dosierung oder Arzneimittelauswahl angewandt, kann nachteilige Reaktionen oder Therapieversagen vermeiden und daher therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit erhöhen, falls ein Subjekt mit einem CRSP Molekül oder CRSP Modulator behandelt wird, wie beispielsweise einen Modulator, welcher durch einen der beispielhaften Durchmusterungsassays, wie hierin beschrieben, identifiziert wird.
Diese Erfindung wird weiterhin durch die nachstehenden Beispiele illustriert, welche nicht als limitierend angesehen werden sollten.
Beispiele
Beispiel 1: Isolierung und Charakterisierung von menschlicher CRSP-1 cDNA
In diesem Beispiel wird die Isolierung und Charakterisierung des Gens beschrieben, welches menschliches CRSP-1 codiert (ebenso als "CRISPY-1" oder "TANGO 59" bezeichnet).
Isolierung der menschlichen CRSP 1 cDNA
Die Erfindung basiert zumindest zum Teil auf der Entdeckung eines menschlichen Gens, welches ein sekretiertes bzw. sezerniertes Protein codiert, was hierin als Cysteinreiches sekretiertes Protein-1 (CRSP-1) bezeichnet wird. Eine Teil cDNA wurde unter Verwendung eines Signalsequenz Fang (Trap) Verfahrens isoliert. Diese Methodik zieht Nutzen aus der Tatsache, dass Moleküle wie beispielsweise CRSP eine Amino-terminale Signalsequenz aufweisen, welche bestimmte sekretierte und membrangebundene Proteine durch das zelluläre sekretorische System lenkt.
In Kürze wurde eine mit zufälligen Primern versehene cDNA Bibliothek unter Verwendung von mRNA, welche aus menschlichem fötalen Gehirngewebe hergestellt wurde (Clontech, Palo Alto CA), wurde unter Verwendung des Stratagen-ZAP-cDNA Synthese^TM Kit hergestellt (Katalog # 20041). Die cDNA wurde in den Säugerexpressionsvektor pTrap angrenzend an eine cDNA ligiert, welche alkalische Phosphatase der Placenta codiert, welche kein sekretorisches Signal aufweist. Die Plasmide wurden in E. coli transformiert und DNA wurde unter Verwendung des Wizard^TM DNA Reinigungskits (Promega) hergestellt. DNA wurde in COS-7 Zellen mit Lipofektamin^TM (Gibco-BRL) transfiziert. Die COS Zellüberstände wurden nach 48 Inkubation auf alkalische Phosphatase auf einem Wallac Micro-Beta Scintillationszähler unter Verwendung des Phospha-Light Kit (Tropix Inc., Katalog #BP300) untersucht. Die einzelnen Plasmid DNAs, welche als positiv in den COS Zellen alkalischen Phosphatasesekretionsassays bewertet wurden, wurden weiterhin durch DNA Sequenzierung unter Verwendung von herkömmlichen Prozeduren analysiert.
Unter Verwendung einer Teil cDNA, welche durch vorstehend genanntes Verfahren isoliert wurde, wurde ein Volllängen cDNA kloniert, welche menschliches CRSP-1 codiert. Die Nukleotidsequenz, welche das volllängenmenschliche CRSP-1 Protein codiert, wird in 1 gezeigt und als SEQ ID NO:1 dargelegt. Das durch diese Nukleinsäure codierte Volllängenrotein umfasst ungefähr 350 Aminosäuren und weist die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz auf und ist als SEQ ID NO:2 dargelegt. Der codierende Abschnitt (offene Leseraster) von SEQ ID NO:1 ist als SEQ ID NO:3 dargelegt.
Analyse von menschlichem CRSP-1
Eine Bestimmung des Hydrophobizitätsprofils von menschlichem CRSP-1, welches die in SEQ ID NO:2 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist, zeigt die Anwesenheit eines hydrohobischen Bereichs von ungefähr Aminosäure 1 bis ungefähr Aminosäure 23 von SEQ ID NO:2 an. Eine weitere Analyse der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 unter Verwendung von Programmen zur Signalpeptidvorhersage sagten die Anwesenheit eines Signalpeptids von ungefähr Aminosäure 1 bis ungefähr Aminosäure 19, 21 oder 23 von SEQ ID NO:2 vor. Demgemäß umfasst das reife CRSP-1 Protein ungefähr 327; 329 oder 321 Aminosäuren, welche von ungefähr Aminosäure 20, 22 oder 24 bis ungefähr Aminosäure 350 von SEQ ID NO:2 umspannen. Die Anwesenheit der Signalsequenz, zusätzlich zu der Tatsache, dass CRSP-1 unter Verwendung eines Signalsequenzierung Fangsystems identifiziert wurde, zeigt an, dass CRSP-1 ein sekretiertes Protein ist. Darüber hinaus kann die Vorhersage eines derartigen Signalpeptids und Signalpeptidschnittstelle unter Verwendung von beispielsweise dem Computeralgorithmus SIGNALP (Hendrik et al., Protein Engineering, 10 (1997) 1-6) getroffen werden.
Darüber hinaus wurde das FLAG-getagte CRSP-1 Proteinprodukt gefunden, in das zelluläre Medium sekretiert zu werden, falls die cDNA, welches menschliches CRSP-1 codiert, in Bakterienzellen mit einem C-terminalen FLAG tag exprimiert wurde.
Eine Untersuchung der in 1 gezeigten cDNA Frequenz zeigt, dass menschliches CRSP-1 insbesondere reich an Cysteinresten ist. Wie in 1 gezeigt enthält CRSP-1 20 Cysteinreste, welche zwischen Aminosäure 147 und Aminosäure 284 von SEQ ID NO:2 lokalisiert sind. Diese Cysteinreste können möglicherweise 10 Disulfidbrücken bilden.
Eine BLAST Suche (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215 (1990) 403) der Nukleotid und Aminosäuresequenzen von CRSP-1 zeigte, dass CRSP-1 zu einer Hühner cDNA signifikant ähnlich ist, welche ein Protein einer unbekannten Funktion mit GenBank Hinterlegungsnummer D26311 codiert. Diese cDNA wurde von einer Hühnerlinse cDNA Bibliothek isoliert und wurde gezeigt, in Linsenfasern und Linsenepithel exprimiert zu werden, aber weder in neuronales Retina oder in Leberzellen (Sawada et al., Int. J. Dev. Biol. 40 (1996) 531). CRSP-1 und das Hühnerprotein weisen 56% Aminosäuresequenzidentität und 72% Aminosäuresequenzähnlichkeit auf. Die Aminosäuresequenzähnlichkeit zwischen dem Hühnerprotein und menschlichem CRSP-1 ist insbesondere hoch in der Cystein-reichen Domäne von CRSP-1, welche zwischen Aminosäuren 147 und 284 von SEQ ID NO:2 lokalisiert ist. Insbesondere liegen die 20 Cysteinreste von CRSP-1, welche in diesem Bereich vorliegen, in dem Hühnerprotein vor (siehe 3).
Zwei Gene, welche jüngst in einer Durchmusterung auf Supprässoren von Gliobastomenildung identifiziert wurden (Ligon et al., Oncogene, 14 (1997) 1075-1081), zeigen ebenso eine signifikante Homologie zu hCRSP-1. Diese Gene, RIG ("Reguliert In Glioblastomen" und RIG-ähnliches 7-1 (GenBank Hinterlegungsnummer U32331 und AF034208 jeweils), wurden in einer differentiellen Durchmusterung für mRNA identifiziert, welche durch das Einfügen einer gewöhnlichen Kopie von Chromosom 10 in eine Glioblastomzelllinie reguliert wurden, welche eine Deletion in Chromosom 10 beherbergen, welche eine Tumorgenese fördern. Ein schematisches Diagramm, welches das Verhältnis zwischen den Sequenzen von dem CRSP-1 und den RIG Genen aufzählt, wird in 9 dargelegt. Der angezeigte Identitätsbereich zwischen CRSP-1, RIG und RIG-ähnlichem 7-1 umfasst einen Bereich von dem 3'UTR der menschlichen CRSP-1 mRNA. Diese cDNA wurde anfänglich in der beschriebenen differentiellen Durchmusterung isoliert und anschließend verwendet, um Volllängen RIG und RIG-ähnliches 7-1 Botschaften (messages), wie gezeigt, zu isolieren. RIG-ähnliches 7-1 ist hoch homolog (96,8% ähnlich, wie bestimmt unter Verwendung des Lipman-Pearson Protein Ausrichtungprogramms, Ktuple: 2; Lückenstrafe: 4, Lückenlängenstrafe: 12; und 64,7% homolog unter Verwendung der Wilbur Lipman DNA Ausrichtungprogramms, Ktuple: 3; Lückenstrafe: 3, Fenster: 20) zu CRSP-1, obgleich das codierte Protein die N-terminale Signalsequenz nicht aufweist und daher nicht als ein sekretiertes Protein vorhergesagt ist. Die Volllängen RIG mRNA zeigt nur eine Homologie zu CRSP-1 in dem Bereich der anfänglichen cDNA auf. Diese Daten assoziieren CRSP-1 mit menschlichem Glioblastom und legen nahe, dass CRSP-1 bei der Suppression des tumorgenischen Phänotyps von Wichtigkeit ist. Eine Rolle bei Glioblastomen stimmt ebenso mit dem hohen Niveau einer CRSP-1 mRNA Expression überein, welche in menschlichem Gehirngewebe beobachtet wird. Darüber hinaus zeigt die Co-Lokalisierung der CRSP-1 RIG und RIG-ähnlichen Gene zu einem Bereich von Chromosm 11 (11p15.1), welches in die Entwicklung von menschlichem bösartigen Astrocytom impliziert ist (Ligon et al., Oncogene, 14 (1997) 1075-1081), weiterhin eine Rolle für diese Gene bei einer Tumorgenese an.
Humanes CRSP-1 Protein weist ebenso eine gewisse Aminosäuresequenzähnlichkeit zu Metallothionein, insbesondere in der Cystein-reichen Domäne, auf.
Gewebeverteilung CRSP-1 mRNA
Dieses Beispiel beschreibt die Gewebeverteilung von CRSP-1 mRNA, wie durch Northern Blot Hybridisierung bestimmt.
Nothern Blot Hybridisierungen mit den verschiedenen RNA Proben wurden unter Standardbedingungen durchgeführt und bei stringenten Bedingungen gewaschen, d. h. 0,2×SSC bei 65°C. In jeder Probe hybridisierte die Sonde an eine einzelne RNA von ungefähr 2,5 kb. Die Ergebnisse einer Hybridisierung der Sonde an verschiedene mRNA Proben sind nachstehend beschrieben.
Eine Hybridisierung eines Clontech fötalen Multiplen Gewebe Northern (MTN) Blots (Clontech, LaJolla, CA), welcher RNA von fötalem Gehirn, Lunge, Leber und Niere enthält, zeigte die Anwesenheit von hohen Niveaus von CRSP-1 mRNA in fötalem Gehirn, Lunge an und geringfügig niedrigere Niveaus von CRSP-1 mRNA in fötaler Niere an. Allerdings wurde kein signifikantes Niveau einer CRSP-1 mRNA in fötaler Leber gefunden.
Eine Hybridisierung eines Clontech menschlicher Multipler Gewebe Northern (MTN) Blots (Clontech, LaJolla, CA), welcher RNA von erwachsenem Herz, Gehirn, Placenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Pankreas enthält, mit einer menschlichen CRSP-1 Sonde, zeigte die Anwesenheit von hohen Niveaus von CRSP-1 mRNA in Herzen, geringfügig geringere Niveaus in Gehirn und deutlich geringere Niveaus in Placenta und Lunge an. Etwas CRSP-1 mRNA wurde ebenso in erwachsenem Skelettmuskel gefunden. Allerdings wurden keine bedeutende Niveaus von CRSP-1 mRNA in erwachsenen Leber, Niere, oder Pankreas beobachtet. Von Interesse ist, dass das Hühnergen, welches zu CRSP-1 homolog ist, nicht in nachweisbaren Niveaus in Leber beider exprimiert wurde (Sawada et al., Int. J. Dev. Biol. 40 (1996), 531).
Eine weitere Hybridisierung eines Clontech menschlichen Multiplen Gewebe Northern (MTN) Blots (Clontech, LaJolla, CA), welcher RNA von erwachsenem Rückenmark enthielt, zeigte hohe Niveaus einer Expression von CRSP-1 in mRNA, welche von erwachsenem Rückenmark isoliert wurde.
Eine In-Situ-Analyse zeigte weiterhin die nachstehenden Expressionsmuster, falls Gewebeschnitte mit CRSP-1 Sonden hybridisiert wurden. CRSP-1 mRNA wurde in Herzen, Lunge, Aorta, Auge (Retina und Linse) und Gehirn (Cortex) in 14,5 Tage alten Mausembyos exprimiert. CRSP-1 mRNA wurde in Herzen, Lunge, Auge (Retina und Linse), Gehirn (Cortex) und Knorpel (Fuß, Trachea, Larynx, Kopf, Sternum und Wirbelsäule) in 1,5 Tage alten postnatalen Mausgeweben exprimiert. CRSP-1 mRNA wurde in Gehirn (Cortex, Hippocampus, Gehirnstamm), Herz (ausschließlich Atria), Auge (äußere Schicht von Retina und Linse) in erwachsenem Mausgewebe exprimiert.
Daher wird CRSP-1 auf eine gewebespezifische Art exprimiert, wobei die stärkste Expression in Gehirn, Herz und Rückenmark beobachtet wurde.
CRSP-1 Proteinexpressionsdaten
Konstrukte
Expressionskonstrukte von zwei Formen von CRSP-1 wurden unter Verwendung des Säugerexpressionsvektors pMET-stop hergestellt. Form-1 umfasste eine cDNA, welche die vollständige 350aa CRSP-1 Protein codierende Sequenz (CRSP-1 flag.long) enthält, und Form-2 umfasste die gesamte CRSP-1 Protein codierende Sequenz mit Ausnahme der letzten 18 Aminosäuren (CRSP-1 flag.short). Eine C-terminate Sequenz, welche das FLAG Epitop (DYKDDDDK) codiert, wurde zu beiden CRSP-1 Formen für eine Vereinfachung eines Nachweises und Aufreinigung hinzugegeben. CRSP-1 FLAG cDNAs wurden durch PCR aus einem Volllängen CRSP-1 cDNA Templat erzeugt und in pMET-Stop unter Verwendung von EcoR1 und Sall Schnittstellen legiert.
Versuchstransfektion–Expression in kleinem Maßstab
Expressionskonstrukte für CRSP-1 flag.long und CRSP-1 flag.short wurden in 293 T-Zellen unter Verwendung von 10 μl Lipofectamin (GIBCO/BRL) und 2 μg von DNA pro Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen von Zellen transfiziert, welche zu 70-80% konfluent waren. Nach 5 Stunden bei 37°C wurden Zellen mit 1 ml von 20% FCS/DMEM gefüttert bzw. beschickt. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden Zellen in 1 ml OptiMEM für 48 Stunden bei 37°C konditioniert. Proben von Überstand und Zellpellets wurden in kochendem SDS-PAGE Gelpuffer solubilisiert, auf einem 4-20% SDS-PAGE Gel auslaufen gelassen, auf eine Nylonmembran transferiert und mit dem anti-FLAG monoklonalen Antikörper M2 untersucht. Proben von sowohl Überstand als auch Pelletproben zeigten eine bedeutende Immunoreaktivität in einem Molekulargewichtsbereich von 40-65 kDa auf einem autoradiografischen Film unter Verwendung von HRP konjugiertem sekundären Antikörper und ECL Nachweisreagenzien. Daher werden beide getestete Formen von CRSP-1 von 293 T-Zellen sekretiert, wodurch experimentell bestätigt wird, dass CRSP-1 ein sekretiertes Protein ist. Es sollte angemerkt werden, dass die Molekulargewichte von beiden Formen von getestetem CRSP-1 größer sind, als von der Aminosäuresequenz vorhergesagt, was nahe legt, dass die durch 293T Zellen sekretierten CRSP-1 Proteine glycosyliert sein können. Dies stimmt mit dem vorliegen von vier möglichen Stellen für eine N-verknüpfte Glycolysierung in dem CRSP-1 Protein überein.
CRSP-1 Protein Herstellung im großen Maßstab
Für eine CRSP-1 flag. long Expression im größeren Maßstab wurden 30 × 150mM Platten von 293T Zellen bei 70%-80% Konfliudiät mit 27 μg DNA, 100 μl Lipofectamin in 18ml OptiMEM für 5 Stunden bei 37°C transfiziert. 18m1 von 10% FCS/DMEM wurden zu jeder Platte hinzugegeben und über Nacht bei 37°C inkubiert. 24 Stunden nach dem Anfang einer Transfektion, wurde Transfektionsüberstand abgesaugt und 35ml OptiMEM wurden zu jeder Platte hinzu gegeben und die Platten wurden bei 37°C für 72 Stunden inkubiert. Konditioniertes Medium wurde geerntet, bei 4000 rpm für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert und durch eine 0,45 Mikron Filtereinheit gefiltert. 1100ml wurden über eine 1,6 × 10cm Anti- Flag Affinitätssäule passiert, welche in PBS pH 7,4 Puffer bei einer Flussrate von 2.0ml pro Minute prä-equillibriert wurde. Nach Waschen mit 200ml PBS pH 7,4 Puffer wurde gebundenes Material durch einen Schritt von 200mM Glycine pH 3,0 Puffer eluiert und 0,5 ml Fraktionen wurden gesammelt. Bei Elution wurde ein bedeutendes Protein Peak durch Absorption bei 280nm nachgewiesen. Proben, welche konditioniertem Medium, Durchfluss und eluierten Fraktionen entsprächen, wurden durch Coomassieblau und Silber gefärbtes SDS-PAGE und durch Western Blot Analyse, wie vorstehend beschrieben, analysiert. Eine bedeutende Immunoaktivität in einem Molekulargewichtsbereich von 40-65 kDa wurde in konditioniertem Medium und eluierten Fraktionen aber nicht in der Durchflussprobe nachgewiesen, was anzeigt, dass das sekretierte CRSP-1 flag. long Protein spezifisch an die Affinitätssäule band und durch die beschriebenen Bedingungen wirksam eluiert wurde. Coomassieblau färben der SDS-PAGE Gele legten nahe, dass das hauptsächliche Immunoaktivitäts-Protein zu > 90% aus dem Protein bestand, welches in dem gebundenen und eluierten Protein Peak vorliegt. Peak Fraktionen von eluierten Protein wurden gepoolt und gegen Phosphat gepufferte Salzlösung dialysiert, was in einem 4ml Volumen von rekombinanten CRSP-1 flag. long Protein bei einer Konzentration von ungefähr 1 mg/ml führt.
Beispiel 2: Isolierung und Charakterisierung von menschlichen CRSP-2, CRSP-3 und CRSP-4 cDNA
Um neue Proteine zu identifizieren, welche sich auf das CRSP-1 beziehen, wurde die menschliche CRSP-1 Aminosäuresequenz verwendet, um die privaten und die dbEST Datenbanken unter Verwendung von TBLASTIN (WashUversion, 2.0, BLOSUM62 Suchmatrix) zu durchsuchen. Von diesen Suchen wurden vier verschiedene Teil Proteinsequenzen identifiziert, welche eine bedeutende Homologie von menschlichen CRSP-1 zeigten. Diese Sequenzen wurden als Teil Sequenzen für die neuen hCRSPs bezeichnet; hCRSP-2, h-CRSP-3, h-CRSP-4 und h-CRSP-ähnliches-n.
hCRSP-2 Teil Sequenzen wurden von einem einzelnen dbEST Klon mit der Hinterlegungsnummer AA565546 abgeleitet. Dieser Klon wurde anschließend von der IMAGE Sammlung erhalten und vollständig sequenziert, um die gesamte hCRSP-2 Sequenz festzulegen, welche in 2 gezeigt ist.
hCRSP-3 Teil Proteinsequenz wurde einem jthKb075a10 Klon mit einem Sequenz Identifikations-Code jthKb075a10 abgeleitet. Dieser Klon wurde weiterhin sequenziert und diese Sequenzinformation wurde mit zusätzlichen Sequenzen von dbESt unter Verwendung des Aufbau Programms Phrap kombiniert (P. Green, U. Washington), um die gesamte hCRSP-3 Sequenz festzulegen, welche in 3 gezeigt wird. DNA für den Klon jthKb075a10 wurde mit der ATCC Hinterlegungsnummer 98633 hinterlegt. Northern Blot Analyse von verschiedenen Geweben unter Verwendung einer für hCRSP-3 spezifischen Sonde zeigte, dass CRSP-3 Expression auf Plazenta beschränkt war. CRSP-3 mRNA Expression wurde bisher noch nicht in anderen gewöhnlichen menschlichen Geweben gezeigt.
Ein Maus- und Xenopus-Homolog von CRSP-3 wurde jüngst beschrieben und dkk-1 („dickkopf", Deutsch, thickhead) genannt, von denen es vorgeschlagen wird, ein sekretiertes Signalmolekül (Nature, 391, 357-368) zu kodieren. dkk-1 wird als ein starker Induzierer einer Kopfbildung während einer frühen Xenopus Entwicklung beschrieben, wobei sein Wirkungsmechanismus offenkundig eine Inhibierung der wnt Familie von sekretierten Faktoren einbezieht.
Angesichts der Homologie zwischen CRSP-3 und dkk-1 wurde vorgeschlagen, dass hCRSP-3 eine: tief greifende Kopf induzierende Wirkung während früherer menschlicher embryonaler Entwicklung zeigen kann. Darüber hinaus wird angenommen, dass die Wirkungsmechanismen von dkk-1 einen Antagonismus mit Mitgliedern der wnt Familie von sekretierten Proteinen einbeziehen. Eine Überexpression von wnt Proteinen wurde mit bestimmten bösartigen Erkrankungen assoziiert. Beispielsweise verursacht eine Aktivierung von wnt-1 Expression durch provirale Insertion von mMTV Brustkrebs bei der Maus (siehe Cadigan und Nusse, Gene und Dev. 11 (1197) 3286-3305). Daher können zumindest CRSP-3 und möglicher andere andere CRSP Familienmitglieder ebenso eine Rolle bei der Suppression einer wnt Signalisierung bei Krebs spielen.
h-CRSP-4 Teil Proteinsequenz wurde von einem einzelnen dbEST Klon mit Hinterlegungsnummer W55979 abgeleitet. Dieser Klon wurde anschließend von der IMAGE Sammlung erhalten und vollsfändig sequenziert, um eine h-CRSP-4 Sequenz, welche in 4 gezeigt wird, festzulegen. Northern Blot Analysen von verschiedenen Geweben unter Verwendung einer spezifischen Sonde für h-CRSP-4 zeigte, dass CRSP-4 mRNA in verschiedenen erwachsenen menschlichen Geweben exprimiert war. CRSP-4 mRNA Expression war im Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge und Skelett Muskel am höchsten.
h-CRSP-ähnliche-n Teil Protein Sequenz wurden von einem einzelnen dbESt Klon mit der Hinterlegungsnummer AA397836 abgeleitet. Dieser Klon wurde anschließend von der IMAGE Sammlung erhalten und vollständig sequenziert, um die gesamte h-CRSP-ähnliche-n Sequenz, wie in 5 gezeigt, festzulegen.
Struktur der CRSP Familien Proteine
Eine Angleichung bzw. Alignment der Aminosäurensequenzen von menschlichen CRSP-1, menschlichem CRSP-2, menschlichem CRSP-3 und menschlichem CRSP-4 wird in 6 gezeigt. Aminosäurereste, welche zwischen menschlichen CRSP Familienmitgliedern konserviert sind, sind im Kasten gezeigt. Die 20 konservierten Cystinreste sind durch ein Sternchen gezeigt. Die Cysteinreichen Domänen sind als CRD-1 und CRD-2 angezeigt. Die Domänenstruktur der Volllängen CRSP Proteine der vorliegenden Erfindung werden in 7 gezeigt. Die Aminosäure und die Nukleotid Homologie zwischen CRSP Familienmitgliedern ist wie nachstehend in Tabellen 1 und 2.
Tabelle 1:
Prozentuale Aminosäure Homologie wurden unter Verwendung des ALIGN Programms bestimmt (Version 2,0) (GCG Software Packet) unter Verwendung einer PAM120 Reste Gewichtungstabelle, einer Lückenlängenstrafe von 12 und einer Lückenstrafe von 4.
Tabelle 2:
Prozentuale Nukleotid Homologie wurden unter Verwendung des Wilbur Lipman DNA Angleichungsprogrammms bestimmt, Ktuple: 3; Lückenstrafe 3; Fenster: 20.
Sequenzliste

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Nukleinsäure, welche die SEQ. ID. Nr: 3 oder SEQ. ID. Nr: 9 umfasst; b) einer Nukleinsäure, welche ein Polypeptid codiert, dass die Aminosäuresequenz der Aminosäurereste 24-350 der SEQ. ID. Nr: 2 oder die Aminosäuresequenz der Aminosäurereste 21-266 der SEQ. ID. Nr: 8 umfasst; c) einer Nukleinsäure, welche ein Polypeptid codiert, die eine natürlich vorkommende allelische Variante der Aminosäuresequenz der Aminosäurereste 20-224 der SEQ. ID. Nr: 5, SEQ. ID. Nr: 11 oder SEQ. ID. Nr: 14 umfasst, worin die natürlich vorkommende allelische Variante die zelluläre Signalübertragung oder zelluläre Proliferation moduliert, und worin (i) die Nukleinsäure, welche eine natürlich vorkommende allelische Variante der Aminosäuresequenz der Aminosäurereste 20-224 der SEQ. ID. Nr: 5 codiert, an das Komplement der SEQ. ID. Nr: 6 unter stringenten Waschbedingungen hybridisiert, (ii) die Nukleinsäure, welche eine natürliche vorkommende allelische Variante der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr: 11 codiert, an das Komplement der SEQ. ID. Nr: 12 unter stringenten Waschbedingungen hybridisiert, (iii) de Nukleinsäure, welche eine natürlich vorkommende allelische Variante der Aminosäuresequenz SEQ. ID. Nr: 14 codiert, an das Komplement der SEQ. ID. Nr: 15 unter stringenten Waschbedingungen hybridisiert, wobei stringente Waschbedingungen 0,2 XSSC, 0,1% SDS bei 50-65°C sind; d) einer Nukleinsäure, welche eine Peptidsequenz umfasst, die das Komplement von a), b), oder c) ist; und e) einem rekombinanten eukaryotischen Zellexpressions-Vektor, welcher die Nukleinsäure von a), b), c) oder d) umfasst.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, worin das isolierte Nukleinsäuremolekül eine Nukleinsäure umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr:1 und SEQ. ID. Nr: 3.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, worin das isolierte Nukleinsäuremolekül ein Nukleotidsequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr: 7, SEQ. ID. Nr: 9 und der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, welches bei der ATCC mit der Hinterlegungsnummer 98633 hinterlegt wurde.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, worin das isolierte Nukleinsäuremolekül ein Polypeptid codiert, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr: 2, den Aminosäureresten 20-350 der SEQ. ID. Nr: 2, den Aminosäureresten 20-350 der SEQ. ID. Nr: 2, den Aminosäureresten 20-350 der SEQ. ID. Nr: 2 und den Aminosäureresten 24-350 der SEQ. ID. Nr: 2.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, worin das isolierte Nukleinsäuremolekül ein Polypeptid codiert, welche eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr: 8 und den Aminosäureresten 21-266 der SEQ. ID. Nr: 8.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1a), 1b) oder 1c), worin das isolierte Nukleinsäuremolekül weiter umfasst: (i) eine Vektor-Nukleinsäuresequenz; und/oder (ii) eine Nukleinsäuresequenz, welche ein heterologes Polypeptid codiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1e), worin das isolierte Nukleinsäuremolekül weiter eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche ein heterologes Polypeptid codiert.
Wirtzelle, welche den rekombinanten eukaryotischen Zellexpressions-Vektor von Anspruch 1e) umfasst.
Wirtszelle, welche einen Vektor enthält, der die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1a), 1 b), 2, 3, 4 oder 5 umfasst, worin die Nukleinsäure eine rekombinante Nukleinsäure ist.
Isoliertes Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Polypeptid, welches mindestens 15 aufeinanderfolgende Aminosäuren der SEQ. ID. Nr: 5, SEQ. ID. Nr: 8, SEQ. ID. Nr: 11 oder SEQ. ID. Nr: 14 umfasst, welches die zelluläre Signalübertragung oder zelluläre Proliferation moduliert; b) einem Polypeptid, welches eine natürlich vorkommende allelische Variante der Aminosäuresequenz der Aminosäurereste 20-224 der SEQ. ID. Nr: 5, der Aminosäurereste 21-266 der SEQ. ID. Nr: 8, SEQ. ID. Nr: 11 oder SEQ. ID. Nr: 14 ist, worin die natürlich vorkommende allelische Variante die zelluläre Signalübertragung oder zelluläre Proliferation moduliert und worin (i) die natürlich vorkommende allelische Variante der Aminosäuresequenz der Aminosäurereste 20-224 der SEQ. ID. Nr: 5 von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, welches an das Komplement der SEQ. ID. Nr: 6 unter stringenten Waschbedingungen hybridisiert, (ii) die natürlich vorkommende allelische Variante der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr: 8 von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, welches an das Komplement der SEQ. ID. Nr: 9 unter stringenten Waschbedingungen hybridisiert, (iii) die natürlich vorkommende allelische Variante der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr: 11 von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, welches an das Komplement der SEQ. ID. Nr: 12 unter stringenten Waschbedingungen hybridisiert, und (iv) die natürlich vorkommende allelische Variante der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr: 14 von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, welches an das Komplement der SEQ. ID. Nr: 15 unter stringenten Waschbedingungen hybridisiert, und wobei stringente Waschbedingungen 0,2 XSSC, 0,1% SDS bei 50-65°C sind; c) einem Polypeptid, welches die Aminosäurereste 20-350 der SEQ. ID. Nr: 2 umfasst; und d) einem Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 80% Aminosäure-Identität mit der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr: 5, SEQ. ID. Nr: 8 oder SEQ. ID. Nr: 11 über jeweils die gesamte Länge der SEQ. ID. Nr: 5, SEQ. ID. Nr: 8 oder SEQ. ID. Nr: 11 aufweist, und die die zelluläre Signalübertragung oder zelluläre Proliferation moduliert.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 10, worin das Polypeptid mindestens 15 aufeinanderfolgende Aminosäuren der SEQ. ID. Nr: 8 umfasst, und worin das Polypeptid die zelluläre Signalübertragung oder zelluläre Proliferation moduliert.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 10, worin das Polypeptid mindestens 20 aufeinanderfolgende Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr: 5, der SEQ. ID. Nr: 11 oder SEQ. ID. Nr: 14 umfasst, und worin das Polypeptid die zelluläre Signalübertragung oder zelluläre Proliferation moduliert.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 10, worin das Polypeptid mindestens 30 aufeinanderfolgende Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr: 5, SEQ. ID. Nr: 11 oder SEQ. ID. Nr: 14 umfasst, und worin das Polypeptid die zelluläre Signalübertragung oder zelluläre Proliferation moduliert.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 10, worin das Polypeptid mindestens 50 aufeinanderfolgende Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr: 5, SEQ. ID. Nr: 11 oder SEQ. ID. Nr: 14 umfasst, und worin das Polypeptid die zelluläre Signalübertragung oder zelluläre Proliferation moduliert.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 10, worin das Polypeptid mindestens 100 aufeinanderfolgende Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr: 5, SEQ. ID. Nr: 11 oder SEQ. ID. Nr: 14 umfasst, und worin das Polypeptid die zelluläre Signalübertragung oder zelluläre Proliferation moduliert.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 10, worin das Polypeptid mindestens 20 aufeinanderfolgende Aminosäuren der SEQ. ID. Nr: 8 umfasst, und worin das Polypeptid die zelluläre Signalübertragung oder zelluläre Proliferation moduliert.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 10, worin das Polypeptid mindestens 30 aufeinanderfolgende Aminosäuren der SEQ. ID. Nr: 8 umfasst, und worin das Polypeptid die zelluläre Signalübertragung oder zelluläre Proliferation moduliert.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 10, worin das Polypeptid mindestens 50 aufeinanderfolgende Aminosäuren der SEQ. ID. Nr: 8 umfasst, und worin das Polypeptid die zelluläre Signalübertragung oder zelluläre Proliferation moduliert.
isoliertes Polypeptid nach Anspruch 10, worin das Polypeptid mindestens 100 aufeinanderfolgende Aminosäuren der SEQ. ID. Nr: 8 umfasst, und worin das Polypeptid die zelluläre Signalübertragung oder zelluläre Proliferation moduliert.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 10, worin das isolierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr: 8 und den Aminosäureresten 21-226 der SEQ. ID. Nr: 8.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 10, worin das isolierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr: 2, den Aminosäureresten 20-350 der SEQ. ID. Nr: 2, den Aminosäureresten 22-350 der SEQ. ID. Nr: 2 und den Aminosäureresten 24-350 der SEQ. ID. Nr: 2.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 10, worin das isolierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr: 5, den Aminosäureresten 20-224 der SEQ. ID. Nr: 5, SEQ. ID. Nr: 11 und SEQ. ID. Nr: 14.
Isoliertes Polypeptid nach einem der Ansprüche 10 bis 22, welche weiter ein heterologes Polypeptid umfasst.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon, welche spezifisch an ein Polypeptid bindet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Polypeptid, welches mindestens 15 aufeinanderfolgende Aminosäuren der SEQ. ID. Nr: 5, SEQ. ID. Nr: 8, SEQ. ID. Nr: 11 oder SEQ. ID. Nr: 14 umfasst, welches die zelluläre Signalübertragung oder zelluläre Proliferation moduliert; b) einem Polypeptid, welches eine natürlich vorkommende allelische Variante der Aminosäuresequenz der Aminosäurereste 20-224 der SEQ. ID. Nr: 5, der Aminosäurereste 21-266 der SEQ. ID. Nr: 8, SEQ. ID. Nr: 11 oder SEQ. ID. Nr: 14 ist, worin die natürlich vorkommende allelische Variante die zelluläre Signalübertragung oder zelluläre Proliferation moduliert und worin (i) die natürlich vorkommende allelische Variante der Aminosäuresequenz der Aminosäurereste 20-224 der SEQ. ID. Nr: 5 von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, welches an das Komplement der SEQ. ID. Nr: 6 unter stringenten Waschbedingungen hybridisiert, (ii) die natürlich vorkommende allelische Variante der Aminosäuresequenz der Aminosäuren 21-226 der SEQ. ID. Nr: 8 von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, welches an das Komplement der SEQ. ID. Nr: 9 unter stringenten Waschbedingungen hybridisiert, (iii) die natürlich vorkommende allelische Variante der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr: 11 von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, welches an das Komplement der SEQ. ID. Nr: 12 unter stringenten Waschbedingungen hybridisiert, und (iv) die natürlich vorkommende allelische Variante der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. Nr: 14 von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, welches an das Komplement der SEQ. ID. Nr: 15 unter stringenten Waschbedingungen hybridisiert, und worin stringente Waschbedingungen 0,2 XSSC, 0,1% STS bei 50-65°C sind
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach Anspruch 24, worin der Antikörper oder der immunologisch aktive Teil davon spezifisch an ein Polypeptid bindet, welches aus 15 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der SEQ. ID. Nr: 5, SEQ. ID. Nr: 8, SEQ. ID. Nr: 11 oder SEQ. ID. Nr: 14 besteht.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach Anspruch 24, worin der Antikörper oder der immunologisch aktive Teil davon spezifisch an ein Polypeptid bindet, das aus 20 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der SEQ. ID. Nr: 5, der SEQ. ID. Nr: 8, der SEQ. ID. Nr: 11 oder der SEQ. ID. Nr: 14 besteht.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach Anspruch 24, worin der Antikörper oder der immunologisch aktive Teil davon spezifisch an ein Polypeptid bindet, das aus 30 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der SEQ. ID. Nr: 5, der SEQ. ID. Nr: 8, der SEQ. ID. Nr: 11 oder der SEQ. ID. Nr: 14 besteht.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach Anspruch 24, worin der Antikörper oder der immunologisch aktive Teil davon spezifisch an ein Polypeptid bindet, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr: 5, SEQ. ID. Nr: 8, SEQ. ID. Nr: 11, und SEQ. ID. Nr: 14.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach Anspruch 28, worin der Antikörper oder der immunologisch aktive Teil davon spezifisch an ein Polypeptid bindet, das aus der Aminosäuresequenz der Aminosäurereste 21-226 der SEQ. ID. Nr: 8 besteht.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach Anspruch 28, worin der Antikörper oder der immunologisch aktive Teil davon spezifisch an ein Polypeptid bindet, das aus der Aminosäuresequenz der Aminosäurereste 20-224 der SEQ. ID. Nr: 5 besteht.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach einem der Ansprüche 24-30, worin der Antikörper oder der immunologisch aktive Teil davon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus, einem menschlichen Antikörper, einem humanisierten monoklonalen Antikörper, einem chimären monoklonalen Antikörper und einem immunologisch aktiven Teil von einem der vorstehenden.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach einem der Ansprüche 24-30, worin der Antikörper oder immunologisch aktive Teil davon ein monoklonaler Antikörper oder ein immunologisch aktiver Teil eines monoklonalen Antikörpers ist.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach einem der Ansprüche 24-30, worin der Antikörper oder immunologisch aktive Teil davon ein immunologisch aktiver Teil davon ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Fab-Fragment und einem F(ab)₂- Fragment.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach einem der Ansprüche 24-33, worin der Antikörper oder immunologisch aktive Teil davon einen nachweisbaren Marker umfasst.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach Anspruch 34, worin der nachweisbare Marker ein Enzym, eine prosthetische Gruppe, ein fluoreszierendes Material, ein lumineszierendes Material, ein biolumineszierendes Material oder ein radioaktives Material ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 10, welches umfasst, Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 8 und Bedingungen, bei denen der rekombinante Expressionsvektor exprimiert wird, und wobei das Polypeptid hergestellt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, welches umfasst, Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 9 unter Bedingungen, bei denen die rekombinante Nukleinsäure exprimiert wird, und wobei das Polypeptid hergestellt wird.
Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 10-23 in einer Probe, umfassend: a) Inkontaktbringen der Probe mit einem Antikörper oder immunologisch aktiven Teil davon nach einem der Ansprüche 24-35; und b) Bestimmen, ob der Antikörper an das Polypeptid in der Probe bindet, um dadurch die Anwesenheit des Polypeptids nach einem der Ansprüche 10-23 in der Probe zu erfassen.
Kit, welcher umfasst, einen Antikörper oder immunologisch aktiven Teil davon nach einem der Ansprüche 24-35 und Instruktionen zur Verwendung.
Verwendung eines Kits zum Nachweis eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 10-23 in einer Probe, worin der Kit einen Antikörper oder immunologisch aktiven Teil davon nach einem der Ansprüche 24-35 und Instruktionen zur Verwendung umfasst.
Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1-5 in einer Probe, welches umfasst: a) Inkontaktbringen der Probe mit einer Nukleinsäuresonde oder einem Primer, die/der spezifisch an ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1-5 hybridisiert; und b) Bestimmen, ob die Nukleinsäurensonde oder der Primer an das Nukleinsäuremolekül in der Probe bindet, um die Anwesenheit oder die Abwesenheit eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1-5 in der Probe zu erfassen.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Probe mRNA-Moleküle umfasst und mit einer Nukleinsäuresonde in Kontakt gebracht wird.
Verwendung eines Kits zum Nachweis eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1-5 in einer Probe, wobei der Kit umfasst, eine Nukleinsäuresonde oder einen Primer, die/der spezifisch an ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1-5 hybridisiert, und Instruktionen zur Verwendung.
In vitro Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche an ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 10-23 bindet, umfassend: a) Inkontaktbringen eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 10-23, oder einer Zelle, welche das Polypeptid exprimiert, mit einer Testverbindung; und b) Bestimmen, ob das Polypeptid an die Testverbindung bindet.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Bindung der Testverbindung an das Polypeptid durch ein Verfahren erfaßt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) Bestimmen der Bindung durch direktes Erfassen der Bindung der Testverbindung/des Polypeptids, (b) Erfassen der Bindung unter Verwendung eines kompetetiven Bindungsassays, und (c) Erfassen der Bindung unter Verwendung eines Assays zum Nachweis der zellulären Signalübertragung und zellulären Proliferation.
In vitro Verfahren zur Modulierung der Aktivität eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 10-23 bei der zellulären Signalübertragung oder zellulären Proliferation, umfassend: Inkontaktbringen eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 10-23 oder einer Zelle, die das Polypeptid exprimiert mit einem Antikörper oder immunologisch aktiven Teil davon nach einem der Ansprüche 24-35 in einer ausreichenden Konzentration, um die Aktivität des Polypeptids hinsichtlich zellulärer Signalübertragung und zellulärer Proliferation zu modulieren.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, welche die Aktivität eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 10-23 hinsichtlich zellulärer Signalübertragung oder zellulärer Proliferation moduliert, umfassend: a) Inkontaktbringen eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 10-23 mit einer Testverbindung; und b) Bestimmen der Auswirkungen der Testverbindung auf die Aktivität des Polypeptids hinsichtlich zellulärer Signalübertragung oder zellulärer Proliferation, wobei eine verbunden identifiziert wird, welche die Aktivität des Polypeptids hinsichtlich zellulärer Signalübertragung oder zellulärer Proliferation moduliert.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach einem der Ansprüche 24-35 zur Verwendung in der Therapie oder Diagnose.
Verwendung eines Antikörpers oder immunologisch aktiven Teils davon nach einem der Ansprüche 24-35 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Störung der Entwicklung, Differentiation oder Proliferation.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 10-23 zur Verwendung in der Therapie oder Diagnose.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 10-23 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Störung der Entwicklung, Differentiation oder Proliferation.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 10-23 zur Herstellung eines Medikaments oder diagnostischen Mittels zur Behandlung, Prophylaxe oder Diagnose von Krebs.
Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1-7 zur Verwendung in der Therapie oder Diagnose.
Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1-7 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Störung der Entwicklung, Differentiation oder Proliferation.
Verwendung eines Antikörpers oder immunologisch aktiven Teils davon nach einem der Ansprüche 24-35 zur Herstellung eines Medikaments oder diagnostischen Mittels zur Behandlung, Prophylaxe, oder Diagnose von Krebs.
Verwendung eines Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1-7 zur Herstellung eines Medikaments oder diagnostischen Mittels zur Behandlung, Prophylaxe oder Diagnose von Krebs.
Nicht-menschliche Wirtszelle, welche ein Transgen umfasst, das das Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1a), 1b), 2, 3, 4 oder 5 umfasst.