DE69837104T2 - An g-protein gekoppelte rezeptoren und deren verwendungen - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
  • G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden eine große Klasse von Proteinen, die für ein Übertragen eines Signals innerhalb einer Zelle verantwortlich sind. GPCRs weisen drei strukturelle Domänen auf: eine amino-terminale, extrazelluläre Domäne, eine sieben Transmembran-Segmente, drei extrazelluläre Schleifen und drei intrazelluläre Schleifen umfassende Transmembran-Domäne und eine carboxy-terminale, intrazelluläre Domäne. Nach Bindung eines Liganden an einen extrazellulären Teil bzw. Abschnitt eines GPCR, wird innerhalb der Zelle ein Signal übertragen, das zu einem Wechsel in einer biologischen oder physiologischen Eigenschaft der Zelle führt. GPCRs bilden, zusammen mit G-Proteinen und Effektoren (intrazelluläre Enzyme und durch G-Proteine modulierte Kanäle) die Komponenten eines modularen Signalisierungssystems, das den Status bzw. Zustand intrazellulärer, sekundärer Botenstoffe bzw. Messenger mit extrazelluläre Eingaben verbindet.
  • GPCR-Gene und Genprodukte sind potentiell ursächliche Agenzien von Erkrankungen (Spiegel et al. (1993), J. Clin. Invest. 92:1119-1125); McKusick et al. (1993), J. Med. Genet. 30:1-26). Es wurde gezeigt, das spezifische Defekte in dem Rhodopsin-Gen und dem V2-Vasopressin-Rezeptor-Gen verschiedene Formen von Retinitis pigmentosum (Nathans et al. (1992), Annu. Rev. Genet. 26:403-424) und nephrogener Diabetes insipidus (Holtzman et al. (1993), Hum. Mol. Genet. 2:1201-1204) verursachen. Diese Rezeptoren sind sowohl für das zentrale Nervensystem als auch periphere physiologischer Prozesse von entscheidender Bedeutung. Evolutionäre Analysen lassen vermuten, dass sich der Ursprung dieser Proteine ursprünglich in Übereinstimmung mit komplexen Körperplänen und Nervensystemen entwickelt hat.
  • Die GPCR-Protein-Superfamilie kann in fünf Familien unterteilt werden: Familie I, Rezeptoren, die durch Rhodopsin und β2-adrenergischen Rezeptor verkörpert werden und gegenwärtig durch über 200 einzelne Mitglieder vertreten sind (Dohlmann et al. (1991), Annu. Rev. Biochem. 60:653-688); Familie II, die Parathyroid-Hormon/Calcitonin/Secretin Rezeptor-Familie (Juppner et al. (1991), Science 254:1024-1026); Lin et al. (1991), Science 254:1022-1024); Familie III, die metabotrope Glutamat-Rezeptor-Familie (Nakanishi (1992), Science 258 597:603); Familie IV, die cAMP-Rezeptor-Familie, die in der Chemotaxie und in der Entwicklung von D. discoideum wichtig ist (Klein et al. (1988), Science 241:1467-1472); und Familie V, die Pilz-Paarungspheromon-Rezeptoren, wie STE2 (Kurjan (1992), Annu. Rev. Biochem. 61:1097-1129).
  • Es existiert ebenfalls eine kleine Anzahl anderer Proteine, die sieben putative hydrophobe Segmente präsentieren und mit GPCRs nicht verwandt zu sein scheinen; es wurde nicht gezeigt, dass sie an G-Proteine koppeln. Drosophila exprimiert ein Photorezeptorspezifisches Protein, eine Braut von sevenless (boss), ein Protein mit sieben Transmembran-Segmenten, das ausführlich studiert wurde und von dem keine Hinweise vorliegen, dass es ein GPCR ist (Hart et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5047-5051). Es wird ebenfalls angenommen, dass das Gen frizzled (fz) in Drosophila ein Protein mit sieben Transmembran-Segmenten ist. Wie boss, wurde für fz nicht gezeigt, dass es an G-Proteine koppelt (Vinson et al. (1989), Nature 338:263-264).
  • G-Proteine bilden eine Familie von heterotrimeren Proteinen, die aus α-, β- und γ-Untereinheiten zusammengesetzt sind, die Guanin-Nukleotide binden. Diese Proteine sind normalerweise mit Zelloberflächenrezeptoren verbunden, beispielsweise Rezeptoren, die sieben Transmembran-Segmente umfassen. Nach Binden eines Liganden an das GPCR wird eine konformationelle Änderung an das G-Protein übertragen, welche bewirkt, dass die α-Untereinheit ein gebundenes GDP-Molekül gegen ein GTP-Molekül austauscht und von den βγ-Untereinheiten dissoziiert. Die GTP-gebundene Form einer α-Untereinheit fungiert normalerweise als ein Effektor-modulierender Rest, der zur Produktion eines sekundären Botenstoffes, wie cAMP (beispielsweise durch Aktivierung einer Adenylcyclase), Diacylglycerin oder Inositolphosphaten führt. Im Menschen sind mehr als 20 unterschiedliche Typen von α-Untereinheiten bekannt. Diese Untereinheiten assoziieren mit einem kleineren Pool an β- und γ-Untereinheiten. Beispiele von G-Proteinen in Säugern umfassen Gi, Go, Gq, Gs und Gt. G-Proteine sind ausführlich in Lodish et al. (1995), Molecular Cell Biology (Scientific American Books Inc., New York, N.Y.) beschrieben.
  • GPCRs, G-Proteine und G-Protein-verbundener Effektor und sekundäre Botenstoffsysteme werden in The G-Protein Linked Receptor Fact Book (1994), Watson et al., Heraus geber, Academic Press besprochen.
  • GPCRs sind ein hauptsächliches Ziel für eine Arzneimittelwirkung und Entwicklung. Entsprechend ist es für das Gebiet der pharmazeutischen Entwicklung nützlich vorher unbekannte GPCRs zu identifizieren und zu charakterisieren. Die vorliegende Erfindung erweitert den Stand der Technik durch Bereitstellen eines vorher unidentifizierten menschlichen GPCRs.
  • Muscarin-Rezeptoren
  • Muscarin-Rezeptoren, so bezeichnet, da die Wirkungen von Acetylcholin auf derartige Rezeptoren gleichartig zu solchen sind, die durch das pilzliche Alkaloid Muscarin erzeugt werden, vermitteln im vegetativen Nervensystem und dem zentralen Nervensystem die meisten der inhibitorischen und exzitatorischen Wirkungen des Neurotransmitters Acetylcholin im Herzen, der glatten Muskulatur bzw. Muskeln, in Drüsen und in Neuronen (sowohl prä-synaptisch als auch post-synaptisch) (Eglen, R. und Watson, N. (1996), Pharmacology & Toxicology 78:59-68). Die Muscarin-Rezeptoren gehören zu der G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Superfamilie (Wess, J. et al. (1990), Comprehensive Medicinal Chemistry 3:423-491). Wie alle anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, wird vorhergesagt, dass Muscarin-Rezeptoren einer generischen Proteinfaltung entsprechen, die aus sieben hydrophoben, transmembranen Helices, die durch abwechselnde intrazelluläre und extrazelluläre Schleifen verbunden sind, einer extrazellulären, amino-terminalen Domäne und einer cytoplasmatischen, carboxy-terminalen Domäne besteht. Die Muscarin-Rezeptoren der Säuger zeigen, insbesondere in den Transmembran-Domänen, die ungefähr 145 unveränderliche Aminosäuren teilen, ein hohes Ausmaß an Sequenzidentität (Wess, J. (1993), TIPS 14:308-313). Desweiteren umfassen alle Muscarin-Rezeptoren der Säuger eine sehr große dritte cytoplasmatische Schleife, die mit Ausnahme für die Membran-nahen Teile, nahezu keine Sequenzidentität unter den verschiedenen Familienmitgliedern zeigt (Bonner, T.I. (1989), Trends Neurosci. 12:148-151). Es wird angenommen, dass das Binden eines Liganden an den Rezeptor konformationelle Änderungen in dem helikalen Bündel auslöst, die dann auf die cytoplasmatische Domäne übertragen werden, wo die Wechselwirkung mit spezifischen G-Proteinen stattfindet.
  • Molekulare Klonierungsstudien haben die Existenz von fünf molekular verschiedenen Muscarin-Rezeptor-Proteinen in Säugern gezeigt, die als M1-M5-Rezeptoren bezeichnet werden (Bonner, T.I. (1989), Trends Neurosci. 12:148-151; und Hulme, E.C. et al. (1990), Annu. Rev. Pharamcol. Toxicol. 30:633-673). Der M1-Rezeptor wird hauptsächlich im Gehirn (cerebraler Cortex, Riechkolben, olfaktorisches Tuberkel, basales Vorderhirn/Septum, Corpus amygdaloidum und Hippocampus) und in exokrinen Drüsen exprimiert (Buckley, N.J. et al. (1988), J. Neurosci. 8:4646-4652). Der M2-Rezeptor wird im Gehirn (Riechkolben, basales Vorderhirn/Septum, Thalamus und Corpus amygdaloidum) und im Ileum und dem Herzen exprimiert. Der M3-Rezeptor wird im Gehirn (cerebraler Cortex, olfaktorisches Tuberkel, Thalamus und Hippocampus), in der Lunge, dem Ileum und in exokrinen Drüsen exprimiert. Der M4-Rezeptor wird im Gehirn (Riechkolben, olfaktorisches Tuberkel, Hippocampus und Striatum) und in der Lunge exprimiert. Schließlich wird der M5-Rezeptor hauptsächlich im Gehirn exprimiert (substantia nigra) (Hulme, E.C. et al. (1990), A. Rev. Pharmac. Toxic. 30:633-673).
  • Die beiden Enzyme, die mit Muscarin-Rezeptoren am direktesten wechselwirken sind Adenylatcyclase und Phospholipase C. Studien mit klonierten Rezeptoren haben gezeigt, dass die M1, M3 und M5-Muscarin-Rezeptoren an die Typen von G-Proteinen gekoppelt sind, die als Go bekannt sind (ein mit Phospholipase C verbundenes, stimulatorisches Protein) oder Gq und, dass deren Aktivierung zur Aktivierung von Phospholipase C führt. Die M2- und M4-Muscarin-Rezeptoren sind an Gi-Protein gekoppelt (ein mit Adenylatcyclase verbundenes, inhibitorisches Protein), wobei deren Aktivierung zu der Inhibierung von Adenylatcyclase führt. Durch diese Signalübertragungswege sind Muscarin-Rezeptoren für eine Vielzahl von physiologischen Funktionen verantwortlich, umfassend die Regulation einer Freisetzung von Neurotransmitter (umfassend Acetylcholin-Freisetzung) vom Gehirn, die Regulation von Verdauungsenzym und Insulinabsonderung bzw. -sekretion in die Bauchspeicheldrüse und die Regulation von Amylaseabsonderung durch die Ohrspeicheldrüse, die Regulation einer Kontraktion im Herzmuskel und in glatter Muskulatur (Caulfield, M.P. (1993), Pharmac. Ther. 58:319-379).
  • Carnitin-Rezeptoren
  • L-Carnitin (4-N-Trimethylammonium-3-hydroxy-buttersäure) kommt eine wichtige Rolle in der Regulation des Metabolismus von langkettigen Fettsäuren in der Herzmuskulatur und in der Skelettmuskulatur zu (Bremer (1983), Pharmacol Rev. 63, 1420-1480; Bieber (1988), Annu. Rev. Biochem. 57, 261-283; Fritz und Arrigoni-Martelli (1993), Trends Pharmacol. Sci. 14, 355-360). L-Carnitin wird in allen Geweben, umfassend dem Gehirn, gefunden, wo dessen regionale Konzentrationen variieren, wobei die Höchsten im Kleinhirn und dem Hypothalamus gefunden werden (Bresolin et al. (1982), Exp. Neurol. 78:285-292; Shug et al. (1982), Life Sci. 31, 2869-2874). Es wurde ebenfalls gezeigt, dass ein aktiver Transport von L-Carnitin vom Blut ins Gehirn existiert (Brooks und McIntosh (1975), Biochem. J. 148:439-455). Da die mitochondriale Fettsäureoxidation, bei der L-Carnitin eine zentrale Rolle spielt (Bieber (1988), Annu. Rev. Biochem. 57:261-283), nicht der hauptsächliche metabolische Weg für biogenetische Prozesse im Gehirn ist, wurden alternative physiologische Funktionen entdeckt. Mehrere experimentelle Hinweise schlagen vor, dass diese Verbindung als ein potentieller Neuromodulator wirken kann (Blum et al. (1971), J. Pharmacol. Exp. Ther. 178:331-338; Falchetto et al. (1971), Can. J. Physiol. Pharmacol. 49:1-7; Fariello und Shug (1981), Biochem. Pharmacol. 30:1012-1013; Huth et al. (1981), J. Neurochem. 36, 715-723; Shug et al. (1982), Life Sci. 31, 2869-2874; Janiri und Tempesta (1983), Int. J. Clin. Pharmacol. Res. 3, 295-306; Zoccarato et al., (1983) Biochem. Biophys. Acta 734:381-383; Hanuniemi und Kontro (1988), Neurochem. Res. 3, 317-323; Janiri et al. (1991), J. Neural. Transm. 86, 135-146), obwohl eine direkte Funktion von L-Carnitin als ein Neurotransmitter im Gehirn ausgeschlossen wurde (Shug et al. (1982), Life Sci. 31:2869-2874). Ein in Scheiben von Rattenhirn durch GABA inhibierter aktiver Transport von Carnitin wurde von Fariello und Shug (1981), Biochem. Pharmacol. 30:1012-1013; und Huth et al. (1981), J. Neurochem. 36:715-723 vorgeschlagen; wobei durch Carnitin ebenfalls die Aufnahme von GABA inhibiert wurde (Hannuniemi und Kontro (1988), Neurochem. Res. 3:317-323). Es wurde ebenfalls gezeigt, dass L-Carnitin eine cholinomimetische Aktivität in cholinoceptiven Neuronen ausübt (Tempesta et al. (1982), Neuropharamcology 21:1207-1210; Janiri und Tempesta (1983), Int. J. Clin. Pharmacol. Res. 3:295-306; Janiri et al., (1991), J. Neural. Transm. 86:135-146). L-Carnitin ist ein wichtiger Co-Faktor der Carnitin-Acetyltransferase (CAT), ein Enzym, das die reversible Übertragung von Acetyl-Resten über mitochondriale Membranen von L-Carnitin auf CoA fördert (Bieber (1988), Annu. Rev. Biochem. 57:261-283); somit kann Carnitin an einer Acetylcholinbildung durch Regulation des Transports von Acetylgruppen von der mitochondrialen Matrix in das Cytosol beteiligt bzw. involviert sein (White und Scates (1990), Neurochem. Res. 15:597-601). Jedoch ist die CAT-Aktivität hauptsächlich in Mitochondrien lokalisiert und zeigt keine regionale bevorzugte Lokalisation im Gehirn (McCaman et al. (1996), J. Biol. Chem. 241, 930-934).
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung ist durch die angefügten Ansprüche definiert. Die Erfindung stellt ein neues Nukleinsäure-Molekül bereit, welches ein Polypeptid kodiert, das hier als das flh84g5-Polypeptid oder -Protein bezeichnet wird, das in der Lage ist beispielsweise die Wirkungen eines GPCR-Liganden, wie Acetylcholin oder eines Acetylcholin-ähnlichen Moleküls, wie Carnitin, auf flh84g5-Liganden-gesteuerten bzw. -reagierenden Zellen zu modulieren, beispielsweise durch Modulieren einer Phospholipase C-Signalisierung/Aktivität. Nukleinsäure-Moleküle, die ein flh84g5-Polypeptid kodieren, werden hier als flh84g5-Nukleinsäure-Moleküle bezeichnet. Diese Nukleinsäure-Moleküle weisen eine hohe Sequenzhomologie mit der Muscarin-Rezeptorfamilie auf. In einer bevorzugten Ausführungsform wechselwirkt das flh84g5-Polypeptid mit (beispielsweise bindet an) einem Protein, das ein Mitglied der G-Proteinfamilie ist. Beispiele derartiger Proteine umfassen Go, Gi, Gs, Gq und Gt. Diese Proteine sind in Lodish et al. (1995), Molecular Cell Biology, (Scientific American Books Inc., New York, N.Y.; Dolphin A.C. et al. (1987), Trends Neurosci. 10:53; und Birnbaumer L. et al. (1992), Cell 71:1069 beschrieben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wechselwirkt das flh84g5-Polypeptid (beispielsweise bindet an) mit einem flh84g5-Liganden. Acetylcholin ist beispielsweise der vorherrschende Neurotransmitter in den sympathetischen und parasympathetischen, präganglionären Synapsen, sowie in den parasympathetischen, post-ganglionären Synapsen und in einigen sympathetischen, post-ganglionären Synapsen. Synapsen, in denen Acetylcholin der Neurotransmitter sind, werden cholinergische Synapsen genannt. Acetylcholin wirkt durch Regulation einer Kontraktion der glatten Muskulatur, der Herzrate, Drüsenfunktion, wie Magensäureabsonderung, und einer neuralen Funktion, wie eine Freisetzung von Neurotransmittern aus dem Gehirn. Das erfindungsgemäße flh84g5-Polypeptid bindet an einen flh84g5-Liganden, wie Acetylcholin oder ein Acetylcholin-ähnliches Molekül, wie Carnitin, und dient das durch den flh84g5-Liganden induzierte Signal an die Zelle zu vermitteln. Somit können flh84g5-Moleküle als Ziele verwendet werden, um eine flh84g5-Liganden-induzierte Funktion zu modulieren und somit Störungen zu behandeln, die beispielsweise mit abnormalen flh84g5-Ligandenspiegeln oder abnormaler bzw. abnormer oder aberranter flh84g5-Polypeptidaktivität oder -Nukleinsäureexpression assoziiert sind.
  • Entsprechend betrifft ein erfindungsgemäßer Aspekt ein isoliertes flh84g5-Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32 umfasst.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Fragment eines Polypeptids, welches eine flh84g5-Aktivität aufweist, so dass es bei Expression in Oozyten L-Carnitin ermöglicht einen Calcium aktivierten Chlorid-Strom zu induzieren, wobei das Fragment umfasst die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2; worin das Fragment mindestens 15 aufeinanderfolgende bzw. benachbarte (contiguous) Aminosäuren von SEQ ID Nr. 2 umfasst; die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 5, worin das Fragment mindestens 15 aufeinanderfolgende Aminosäuren der Aminosäurereste 109-130, 152-174, 197-219, 360-380 oder 396-416 von SEQ ID Nr. 5 umfasst; oder die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 32; worin das Fragment mindestens 15 aufeinanderfolgende Aminosäuren von SEQ ID Nr. 32 umfasst. Das isolierte flh84g5-Polypeptid oder ein Teil davon kann eine flh84g5-Liganden-Antwort in einer flh84g5-Liganden-gesteuerten Zelle modulieren.
  • In einer noch weiteren Ausführungsform ist das Polypeptid zu mindestens 95% identisch zu der gesamten Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32.
  • Alternativ kann das isolierte flh84g5-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfassen, die durch eine Nukleotidsequenz kodiert ist, welche unter stringenten Bedingungen an SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 hybridisiert, und bei Expression in Oozyten einen Calcium aktivierten Chlorid-Strom induziert, oder mindestens zu 95% identisch mit der gesamten Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 ist, wie die Allel-Varianten bzw. allelischen Varianten und Homologe der hier beschriebenen flh84g5-Polypeptide, die nicht von Mensch oder Ratte stammen, sowie genetisch veränderte Varianten, die durch rekombinante DNA-Verfahren erzeugt werden. Ebenfalls ist es bevorzugt, dass die bevorzugten Formen von flh84g5 ebenfalls eine oder mehrere der hier beschriebenen flh84g5-Aktivitäten aufweisen.
  • Ein biologisch aktiver Teil des flh84g5-Polypeptids kann eine Domäne oder ein Motiv umfassen, vorzugsweise eine Domäne oder ein Motiv, die/das eine flh84g5-Aktivität aufweist. Die Domäne kann eine Transmembran-Domäne sein. Ein biologisch aktiver Teil eines flh84g5-Polypeptids, der eine Transmembran-Domäne umfasst, kann ebenfalls eine der folgenden flh84g5-Aktivitäten aufweisen: 1) er kann mit einem flh84g5-Liganden, wie Acetylcholin oder einem Acetylcholin-ähnlichen Molekül, wie Carnitin, wechselwirken (beispielsweise daran binden); 2) er kann mit einem G-Protein oder einem anderen Protein, das normalerweise an flh84g5 bindet, wechselwirken (beispielsweise daran binden); 3) er kann die Aktivität eines Ionenkanals modulieren (beispielsweise eines Calcium aktivierten Chlorid-Kanals oder eines Kalium- oder Calciumkanals); 4) er kann eine zytosolische Ionenkonzentration, beispielsweise Calcium, modulieren; 5) er kann die Freisetzung eines Neurotransmitters, beispielsweise Acetylcholin oder Carnitin, von einem Neuron, beispielsweise einem prä-synaptischen Neuron, modulieren; 6) er kann eine flh84g5-Liganden-Antwort in einer flh84g5-Liganden-gesteuerten Zelle (beispielsweise einer glatten Muskelzelle oder einer Drüsenzellen) modulieren, um beispielsweise die flh84g5-gesteuerte Zelle, beispielsweise ein Neuron, vorteilhaft zu beeinflussen; 7) er kann die Bindung eines Liganden über Phosphatidylinositol-Umsatz signalisieren; und 8) er kann eine Phospholipase C-Aktivität modulieren, beispielsweise aktivieren oder inhibieren.
  • Das flh84g5-Polypeptid (oder Protein) oder ein biologisch aktiver Teil davon, wie vorstehend definiert, kann mit einem nicht-flh84g5-Polypeptid funktionsfähig verbunden sein (beispielsweise einem Polypeptid, das heterologe Aminosäuresequenzen umfasst), um ein Fusionspolypeptid zu bilden. Zusätzlich kann das flh84g5-Polypeptid, oder ein biologisch aktiver Teil davon, in eine pharmazeutische Zusammensetzung inkorporiert werden, die das Polypeptid und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
  • Das erfindungsgemäße flh84g5-Polypeptid, oder Teile oder Fragmente davon, kann zum Herstellen bzw. Bereiten von anti-flh84g5-Antikörpern verwendet werden. Ein antigenisches flh84g5-Peptid kann mindestes 8, mindestens 10, mindestens 15, mindestens 20 oder mindestens 30 Aminosäurereste der in SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32 gezeigten Aminosäuresequenz umfassen und umfasst ein Epitop von flh84g5, so dass ein gegen das Peptid gerichteter Antikörper einen spezifischen Immunkomplex mit flh84g5 bildet. Die Erfindung stellt ferner einen Antikörper bereit, der spezifisch an flh84g5 bindet. Der Antikörper kann monoklonal sein. Der Antikörper kann an eine nachweisbare Substanz gekoppelt sein. Weiterhin kann der Antikörper in eine pharmazeutische Zusammensetzung inkorporiert werden, die den Antikörper und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
  • Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle (beispielsweise cDNAs), die eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die ein flh84g5-Polypeptid, wie vorstehend erläutert, kodieren. In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst das isolierte Nukleinsäuremolekül die/den kodierenden Region bzw. Bereich der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31. In anderen besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst das erfindungsgemäße isolierte Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die natürlich vorkommende Allel-Varianten, genetisch veränderte Varianten und Homologe der hier beschrieben flh84g5-Polypeptide kodiert, die nicht von Mensch oder Ratte stammen. Derartige Nukleinsäuremoleküle umfassen eine Nukleotidsequenz, die mindestens zu 95% mit der in SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 gezeigten Nukleotidsequenz oder einem Komplement davon identisch ist, und ein Polypeptid kodiert, das bei Expression von Oozyten L-Carnitin ermöglicht einen Calcium aktivierten Chlorid-Strom zu induzieren. Die bevorzugten, erfindungsgemäßen flh84g5-Polypeptide besitzen ebenfalls vorzugsweise mindestens eine der hier beschriebenen flh84g5-Aktivitäten.
  • In einer anderen Ausführungsform kodiert das isolierte Nukleinsäuremolekül ein Polypeptid, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 95% mit der gesamten Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32 identisch ist.
  • In einer noch weiteren Ausführungsform kodiert das isolierte Nukleinsäuremolekül ein Polypeptid, das bei Expression in Oozyten, L-Carnitin ermöglicht einen Calcium aktivierten Chlorid-Strom zu induzieren und das eine Transmembran-Domäne umfasst, die die Aminosäurereste 34-59, 73-91, 109-130, 152-174, 197-219, 360-380 oder 396-416 von SEQ ID Nr. 2 umfasst, die als separate Sequenzen gezeigt sind, die bezeichnet sind als SEQ ID Nr. 7, 8, 9, 10, 11, 12 bzw. 13 (menschliche Transmembran-Domänen) oder Aminosäurereste 34-59, 73-91, 109-130, 152-174, 197-219, 360-380 oder 396-416 von SEQ ID Nr. 5 (Transmembran-Domänen von Ratte), die als separate Sequenzen gezeigt sind, die bezeichnet sind als SEQ ID Nr. 14, 15, 16, 17, 18, 19 und 20, oder Aminosäurereste 1-8, 26-47, 69-91, 114-136, 277-297 oder 313-333 von SEQ ID Nr. 32, die als separate Sequenzen gezeigt sind, die als SEQ ID Nr. 34, 35, 36, 37, 38 bzw. 39 bezeichnet sind.
  • Das isolierte Nukleinsäuremolekül kann ein Polypeptid kodieren (beispielsweise ein flh84g5-Fusionspolypeptid, wie ein flh84g5-Polypeptid, das mit einem heterologen Polypeptid fusioniert ist), das eine oder mehrere der folgenden flh84g5-Aktivitäten aufweist: 1) es kann mit einem flh84g5-Liganden wechselwirken (beispielsweise daran binden); 2) es kann mit G-Protein oder einem anderen Protein, das natürlicherweise an flh84g5 bindet, wechselwirken (beispielsweise daran binden); 3) es kann die Aktivität eines Ionenkanals (beispielsweise eines Calcium aktivierten Chlorid-Kanals oder eines Kaliums- oder Calciumkanals) modulieren; 4) es kann eine zytosolische Ionenkonzentration modulieren (beispielsweise Calcium oder Chlorid); 5) es kann die Freisetzung eines Neurotransmitters, beispielsweise Acetylcholin oder eines Acetylcholin-ähnlichen Molekül, wie Carnitin, von einem Neuron, beispielsweise einem prä-synaptischen Neuron, modulieren; 6) es kann eine flh84g5-Liganden-Antwort in einer flh84g5-Liganden-gesteuerten Zelle modulieren (beispielsweise einer glatten Muskelzelle oder einer Drüsenzelle), um beispielsweise die flh84g5-Liganden-gesteuerte Zelle, beispielsweise ein Neuron, vorteilhaft zu beeinflussen; 7) es kann die Bindung eines Liganden über Phosphatidylinositol-Umsatz signalisieren; und 8) es kann eine Phospholipase C-Aktivität modulieren, beispielsweise aktivieren oder inhibieren.
  • Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft Vektoren, beispielsweise rekombinante Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle umfassen, und Wirtszellen, in die derartige Vektoren eingeführt wurden. In einer Ausführungsform wird eine derartige Wirtszelle verwendet, um ein flh84g5-Polypeptid durch Kultivieren der Wirtszelle in einem geeigneten Medium zu erzeugen. Falls gewünscht, kann das flh84g5-Polypeptid dann aus dem Medium oder der Wirtszelle isoliert werden.
  • Es können transgene, nicht-menschliche Tiere erzeugt werden, in denen ein flh84g5-Gen eingeführt oder verändert wurde. Das Genom des nicht-menschlichen Tiers kann durch Einführen eines erfindungsgemäßen flh84g5-kodierenden Nukleinsäuremoleküls als ein Transgen verändert werden, oder es kann ein endogenes flh84g5-Gen in dem Genom des nicht-menschlichen Tiers durch homologe Rekombination verändert, beispielsweise funktional bzw. funktionell unterbrochen, werden.
  • Ebenfalls offenbart sind Verfahren zum Modulieren einer Zellaktivität, die durch flh84g5 vermittelt wird, beispielsweise biologische Prozesse, die durch Phosphatidylinositol-Umsatz oder Signalisierung vermittelt werden; Absondern eines Moleküls, beispielsweise eines Neurotransmitter aus einer Gehirnzelle, oder eines Enzym von einer Drüsenzelle; oder Kontraktieren einer glatten Muskelzelle, beispielsweise einer glatten Muskelzelle des Ileums oder einer Herzzelle, beispielsweise einer Cardiomyozyte. Derartige Verfahren umfassen ein Inkontaktbringen mit einem Agens, welches eine flh84g5-Polypeptid-Aktivität oder eine flh84g5-Nukleinsäure-Expression moduliert, so dass eine flh84g5-vermittelte Zellaktivität relativ zu der gleichen zellulären Aktivität verändert wird, die in der Abwesenheit des Agens stattfindet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle (beispielsweise eine glatte Muskelzelle oder eine Nervenzelle) in der Lage auf einen flh84g5-Liganden durch einen Signalisierungsweg zu antworten, in dem ein flh84g5-Polypeptid beteiligt ist. Das Agens, welches eine flh84g5-Aktivität moduliert, kann ein Agens sein, welches eine flh84g5-Polypeptidaktivität oder eine flh84g5-Nukleinsäureexpression stimuliert. Beispiele von Agenzien, welche eine flh84g5-Polypeptidaktivität oder eine flh84g5-Nukleinsäure-Expression stimulieren, umfassen kleine Moleküle, aktive flh84g5-Polypeptide und Nukleinsäuren, die flh84g5 kodieren, die in die Zelle eingeführt wurden. Beispiele von Agenzien, welche eine flh84g5-Aktivität oder -Expression inhibieren, umfassen kleine Moleküle, antisense flh84g5-Nukleinsäuremoleküle und Antikörper, die spezifisch an flh84g5 binden. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Zelle in einer Testperson bzw. einem Subjekt vor, und das Agens wird dem Subjekt verabreicht.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung einer Verbindung, die in der Lage ist eine Zelle zu kontaktieren, die ein flh84g5-Polypeptid exprimiert, und passend ist an das Polypeptid in einer ausreichenden Konzentration zu binden, um die Aktivität des Polypeptids zu modulieren, in der Herstellung eines Medikaments zum Behandeln eines Subjekts, das eine Störung aufweist, die durch aberrante bzw. abweichende bzw. fehlerhafte flh84g5-Polypeptidaktivität oder -Nukleinsäureexpression gekennzeichnet, ausgewählt unter einer Störung des Nervensystems, beispielsweise einer kognitiven Störung, einer Schlafstörung, einer Bewegungsstörung, einer schizo-affektiven Störung, einer Störung, die Schmerzerzeugungsmechanismen beeinflusst bzw. betrifft, einer Drinkstörung oder einer Essstörung; einer mit der/die glatte(n) Muskulatur assoziierten bzw. betreffenden Störung, beispielsweise Reizdarmsyndrom, eine Herzmuskel assoziierte Störung, beispielsweise Bradykardie, oder einer Drüsen asoziierten Störung, beispielsweise Xerostomie. Die Verbindung ist ausgewählt unter einem Antikörper, der spezifisch bindet an ein hier erläutertes flh84g5-Polypeptid und ein flh84g5-Polypeptid, einen Teil oder eine natürlich vorkommende Allel-Variante davon, wie hier erläutert.
  • Ebenfalls offenbart sind Verfahren zum Nachweis natürlich vorkommender und rekombinant erzeugter genetischer Mutationen in einem flh84g5-Gen, wobei dadurch bestimmt wird, ob ein Subjekt mit dem mutierten Gen ein Risiko für eine Störung trägt (oder eine Prädisposition aufweist), die durch eine aberrante oder eine abnormale flh84g5-Nukleinsäureexpression oder flh84g5-Polypeptidaktivität gekennzeichnet ist, beispielsweise eine Störung des Nervensystems, eine mit der glatten Muskulatur assoziierten Störung, eine Herzmuskel assoziierte Störung oder eine Drüsen assoziierte Störung. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Verfahren in einer Zellprobe aus dem Subjekt das Vorliegen oder die Abwesenheit einer genetischen Mutation nachzuweisen, die durch eine Veränderung gekennzeichnet ist, welche die Integrität eines Gens, welches ein flh84g5-Polypeptid kodiert, oder die fehlerhafte Expression (misexpression) des flh84g5-Gens beeinflussen, wie solche, die durch eine Nukleinsäure-Basensubstitution, Deletion oder Addition, oder grobe Sequenzveränderungen verursacht werden, die durch eine genetische Translation, Inversion oder Insertion verursacht werden.
  • Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft Verfahren zum Nachweis des Vorliegens von flh84g5, oder Allel-Varianten davon, in einer biologischen Probe. In einer bevorzugten Ausführungsform beteiligen die Verfahren ein Inkontaktbringen einer biologischen Probe (beispielsweise einer Zellprobe des Gehirns oder der glatten Muskulatur) mit einer Verbindung oder einem Agens mit der/dem flh84g5-Polypeptid oder flh84g5-mRNA nachgewiesen werden kann, so dass das Vorliegen von flh84g5 in der biologischen Probe nachgewiesen wird. Die Verbindung oder das Agens kann beispielsweise eine markierte oder eine markierbare Nukleinsäuresonde sein, die an flh84g5-mRNA hybridisieren kann, oder ein markierter oder markierbarer Antikörper, der an ein flh84g5-Polypeptid binden kann. Die Erfindung ermöglicht, basierend auf einem Nachweis von flh84g5-Polypeptid oder -mRNA, Verfahren zum Diagnostizieren eines Subjekt mit beispielsweise einer Störung des Nervensystems, einer die mit der glatten Muskulatur assoziierten Störung, einer Herzmuskel assoziierten Störung oder eine Drüsen assoziierten Störung. Derartige Verfahren beteiligen ein Inkontaktbringen einer Zell- oder Gewebeprobe (beispielsweise einer Zellprobe aus dem Gehirn oder der glatter Muskulatur) von dem Subjekt mit einem Agens, das in der Lage ist flh84g5-Polypeptid oder -mRNA nachzuweisen, Bestimmen der Menge an flh84g5-Polypeptid oder -mRNA, das/die in der Zell- oder Gewebeprobe exprimiert wird, Vergleichen der Menge an flh84g5-Polypeptid oder -mRNA, die in der Zell- oder Gewebeprobe exprimiert wird, mit einer Kontrollprobe und Aufstellen einer Diagnose, die auf der Menge an flh84g5-Polypeptid oder -mRNA basiert, die in der Zell- oder Gewebeprobe, verglichen mit der Kontrollprobe, exprimiert wird. Die Zellprobe kann eine Gehirnzellprobe sein.
  • Kits zum Nachweis von flh84g5 in einer biologischen Probe, welche Agenzien umfassen, die in der Lage sind flh84g5-Polypeptid oder -mRNA nachzuweisen, sind im Umfang der Erfindung umfasst.
  • Ebenfalls umfasst sind Verfahren, beispielsweise Screening-Assays bzw. -Tests, zum Identifizieren einer Verbindung, beispielsweise einer Testverbindung, zum Behandeln einer Störung, die durch aberrante flh84g5-Nukleinsäure-Expression und/oder -Polypeptid-Aktivität gekennzeichnet ist, beispielsweise eine Störung des Nervensystems, eine mit der glatten Muskulatur assoziierten Störung, eine Herzmuskel assoziierte Störung oder eine Drüsen assoziierte Störung. Diese Verfahren umfassen normalerweise ein Testen der Fähigkeit der Verbindung oder des Agens die Expression des flh84g5-Gens oder die Aktivität des flh84g5-Polypeptids zu modulieren, wobei dadurch eine Verbindung zum Behandeln einer Störung identifiziert wird, die durch aberrante flh84g5-Nukleinsäure-Expression oder -Polypeptid-Aktivität gekennzeichnet ist. In einer bevorzugten Ausführungsform beteiligt das Verfahren ein Inkontaktbringen einer biologischen Probe, beispielsweise einer Zell- oder Gewebeprobe, beispielsweise einer Zellprobe des Gehirns oder der glatten Muskulatur, die von einem die Störung aufweisenden Subjekt erhalten wird, mit der Verbindung oder dem Agens, Bestimmen der Menge an exprimiertem flh84g5-Polypeptid und/oder Erfassen der Aktivität des flh84g5-Polypeptids in der biologischen Probe, Vergleichen der Menge an flh84g5-Polypeptid, das in der biologischen Probe exprimiert wird, und/oder der erfassbaren flh84g5-biologischen Aktivität in der Zelle mit der einer Kontrollprobe. Eine Änderung in der Menge an flh84g5-Polypeptid-Expression oder flh84g5-Aktivität in der an die Verbindung oder das Agens ausgesetzte Zelle im Vergleich mit der Kontrolle ist, ein Anzeichen für eine Modulation der flh84g5-Expression und/oder flh84g5-Aktivität.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung oder eines Agens, beispielsweise einer Testverbindung oder eines Testagens, welches mit einem flh84g5-Polypeptid wechselwirkt (beispielsweise daran bindet). Diese Verfahren können die Schritte umfassen von einem Inkontaktbringen des flh84g5-Polypeptids mit der Verbindung oder dem Agens unter Bedingungen, welche ein Binden der Verbindung an das flh84g5-Polypeptid ermöglichen, um einen Komplex zu bilden, und Nachweisen der Bildung eines Komplex aus dem flh84g5-Polypeptid und der Verbindung, wobei die Fähigkeit der Verbindung an das flh84g5-Polypeptid zu binden durch das Vorliegen der Verbindung in dem Komplex angezeigt wird.
  • Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung oder eines Agens, beispielsweise einer Testverbindung oder eines Testagens, welches die Wechselwirkung des flh84g5-Polypeptids mit einem Zielmolekül, beispielsweise Acetylcholin oder einem Acetycholin-ähnlichen Molekül, wie Carnitin, oder einem zellulären Protein, das am Phosphatidylinositol-Umsatz und -Signalisierung beteiligt ist, moduliert, beispielsweise stimuliert oder inhibiert. In diesen Verfahren wird das flh84g5-Polypeptid, in der Gegenwart der Verbindung oder des Agens mit einem Zielmolekül unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die ein Binden des Zielmoleküls an das flh84g5-Polypeptid ermöglichen, um einen Komplex zu bilden. Eine Veränderung, beispielsweise eine Zunahme oder Abnahme, in einer Komplexbildung zwischen dem flh84g5-Polypeptid und dem Zielmolekül, verglichen zu der Menge an in der Abwesenheit der Verbindung oder des Agens gebildeten Komplexes, ist ein Anzeichen für die Fähigkeit der Verbindung oder des Agens die Wechselwirkung des flh84g5-Polypeptids mit einem Zielmolekül zu modulieren.
  • Kurze Beschreibungen der Abbildungen
  • 1 zeigt die menschlichen flh84g5-Nukleotid-(SEQ ID Nr. 1) und Aminosäuresequenzen (SEQ ID Nr. 2). In SEQ ID Nr. 3 ist die kodierende Region ohne die 5' und 3' untranslatierte Region des menschlichen flh84g5-Gens gezeigt.
  • 2 zeigt die flh84g5-Nukleotid-(SEQ ID Nr. 4) und Aminosäuresequenzen (SEQ ID Nr. 5) von Ratte. In SEQ ID Nr. 6 ist die kodierende Region ohne die 5'- und 3'-untranslatierte Region des flh84g5-Gens von Ratte gezeigt.
  • 3 zeigt die teilweise flh84g5-Nukleotid-(SEQ ID Nr. 31) und Aminosäuresequenzen (SEQ ID Nr. 32) von Maus. In SEQ ID Nr. 33 ist ein Teil der kodierenden Region ohne die 3'-untranslatierte Region des flh84g5-Gens der Maus gezeigt.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Auffinden von neuen Molekülen, die hier als flh84g5-Nukleinsäure- und -Polypeptidmoleküle bezeichnet werden, welche eine Rolle spielen in oder fungieren in Signalisierungswegen mit einem flh84g5-Liganden. In einer Ausführungsform modulieren die flh84g5-Moleküle die Aktivität von einem oder mehreren Proteinen, die an einem Neurotransmitter-Signalisierungsweg beteiligt sind, beispielsweise an einem flh84g5-Liganden-Signalisierungsweg. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen flh84g5-Moleküle in der Lage die Aktivität von Proteinen zu modulieren, die an dem flh84g5-Liganden-Signalisierungsweg beteiligt sind, um dadurch die Wirkungen eines flh84g5-Liganden auf flh84g5-Liganden-gesteuerte Zellen zu modulieren.
  • Wie hier verwendet betrifft der Begriff bzw. die Formulierung "flh84g5-Liganden-gesteuerte Zellen" Zellen, die eine Funktion aufweisen, die durch einen flh84g5-Liganden, wie Acetylcholin oder einem Acetylcholin-ähnlichem Molekül, wie Carnitin, moduliert werden kann (beispielsweise stimuliert oder inhibiert). Beispiele derartiger Funktionen umfassen eine Mobilisierung intrazellulärer Moleküle, die an einem Signalübertragungsweg beteiligt sind, beispielsweise Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) oder Inositol-1,4,5,-Triphosphat (IP3), eine Polarisierung der Plasmamembran, Produktion oder Absonderung von Molekülen, Änderung in der Struktur einer zellulären Komponente, Zellproliferation, Zellmigration, Zelldifferenzierung und Zellüberleben. flh84g5-Liganden-gesteuerte Zellen exprimieren vorzugsweise einen flh85g5-Rezeptor. Beispiele von flh84g5-Liganden-gesteuerten Zellen, umfassen neurale Zellen, beispielsweise Zellen des zentralen Nervensystems und des peripheren Nervensystems (wie sympathetische und parasympathetische Neurone); Zellen der glatten Muskulatur, beispielsweise glatte Muskelzellen im Verdauungstrakt, dem Harntrakt, den Blutgefäßen, den Luftwegen und den Lungen, oder der Gebärmutter; Herzmuskelzellen, beispielsweise Cardiomyocyten; und Drüsenzellen, wie exokrine Drüsenzellen, beispielsweise pankreatische Drüsenzellen, beispielsweise pankreatische Beta-Zellen, Tränendrüsenzellen, Schweißdrüsenzellen oder Ohrspeicheldrüsenzellen.
  • In Abhängigkeit des Zelltyps ist die durch einen flh84g5-Liganden ausgelöste Antwort verschieden. So reguliert beispielsweise in neuralen Zellen ein flh84g5-Ligand, wie Acetylcholin oder ein Acetylcholin-ähnliches Molekül, wie Carnitin, Ionenkanäle und ein neurales Signal-zum-Hintergrund-Verhältnis. Eine Inhibierung oder Überstimulierung der Aktivität von Proteinen, die an dem flh84g5-Liganden-Signalisierungsweg beteiligt sind, oder eine fehlerhafte Expression eines flh84g5-Liganden kann zu einer Hypo- oder Hyperpolarisierung der neuralen Plasmamembran und zu einem gestörten neuralen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis führen, was wiederum zu Nervensystem assoziierten Störungen führen kann. Beispiele von Nervensystem assoziierten Störungen umfassen kognitive Störungen, beispielsweise Gedächtnis- und Lernstörungen, wie Amnesie, Apraxie, Agnosie, amnestische Dysnomie, amnestische räumliche Desorientierung, Kluver-Bucy-Syndrom, Alzheimer assoziierter Gedächtnisverlust (Eglen R.M. (1996), Pharmacol. and Toxicol 78(2):59-68; Perry E.K. (1995), Brain and Cognition 28(3):240-58) und Lernbehinderung bzw. -unfähigkeit; mit dem Bewusstsein assoziierte Störungen, beispielsweise visuelle Halluzinationen, Wahrnehmungsstörungen oder Delirium, das mit Lewy-Körperchen-Demenz assoziiert ist; schizo-affektive Störungen (Dean B. (1996), Mol. Psychiatry 1(1):54-8), Schizophrenie mit Stimmungsumschwüngen (Bymaster F.P. (1997), J. Clin. Psychiatry 58 (Suppl. 10):28-36; Yeomans J.S. (1995), Neuropharmacol. 12(1):3-16; Reimann D. (1994) J. Psychiatric Res. 28(3):195-210), depressive Erkrankung (primär oder sekundär); affektive Störungen (Janowsky D.S. (1994), Am. J. Med. Genetics 54(4):335-44), Schlaftstörungen (Kimura F. (1997), J. Neurophysiol. 77(2):709-16), beispielsweise REM-Schlafabnormalitäten in Patienten die beispielsweise an Depression leiden (Riemann D. (1994), J. Psychosomatic Res. 38, Suppl. 1:15-25; Bourgin P. (1995), Neuroreport 6(3):532-6), paradoxe Schlafabnormalitäten (Sakai K. (1997), Eur. J. Neuroscience 9(3):415-23), Schlaf-Schlaflosigkeit und Abnormalitäten im Abfall der Körpertemperatur oder Atmung während des Schlafs (Shuman S.L. (1995), Am. J. Physiol. 269(2Pt 2):R308-17; Mallick B.N. (1997), Brain Res. 750(1-2):311-7). Andere Beispiele von Nervensystem assoziierten Störungen umfassen Störungen, die Schmerzerzeugungs-Mechanismen betreffen, beispielsweise Schmerz, der mit Reizdarmsyndrom assoziiert ist (Mitch C.H. (1997), J. Med. Chem. 40(4):538-46; Shannon H.E. (1997), J. Pharmac. and Exp. Therapeutics 281(2):884-94; Bouaziz H. (1995) Anesthesia and Analgesia 80(6):1140-4; oder Guimaraes A.P. (1994), Brain Res. 647(2):220-30) oder Brustschmerz; Bewegungsstörungen (Monassi C.R. (1997) Physiol. and Behav. 62(1):53-9), beispielsweise mit Parkinson assoziierte Bewegungsstörungen (Finn M. (1997), Pharmacol. Biochem. & Behaviour 57(1-2):243-9; Mayorga A.J. (1997), Pharmacol. Biochem. & Behavior 56(2):273-9); Essstörungen, beispielsweise mit Hyperabsonderung von Insulin assoziierte Fettleibigkeit (Maccario M. (1997), J. Endocrinol. Invest. 20(1):8-12; Premawardhana L.D. (1994), Clin. Endocrinol. 40(5):617-21); oder Trinkstörungen, beispielsweise diabetische Polydipsie (Murzi E. (1997), Brain Res. 752(1-2):184-8; Yang X. (1994), Pharmacol. Biochem. & Behavior 49(1):1-6).
  • In glatter Muskulatur bzw. glatten Muskeln regulieren Acetycholin und Acetylcholin-ähnliches Molekül, wie Carnitin, die Kontraktion (beispielsweise stimulieren oder inhibieren). So kann eine Inhibierung oder Überstimulierung der Aktivität von Proteinen, die an dem Signalisierungsweg von Acetylcholin und Acetylcholin-ähnlichem Molekül, wie Carnitin, beteiligt sind oder eine fehlerhafte Expression von Acetylcholin und Acetylcholin-ähnlichem Molekül, wie Carnitin, zu mit der glatten Muskulatur assoziierten Störungen, wie Reizdarmsyndrom, divertikulare Erkrankung, Harninkontinenz, ösophageale Achalasie oder chronischen, behindernden Luftwegserkrankungen führen.
  • Im Herzmuskel induzieren Acetylcholin und Acetylcholin-ähnliches Molekül, wie Carnitin, eine Verringerung der Herzrate und der kardialen Kontraktilität. So kann eine Inhibierung oder Überstimulierung der Aktivität von Proteinen, die an dem Signalisierungsweg von Acetylcholin und Acetylcholin-ähnlichem Molekül, wie Carnitin, beteiligt sind oder eine fehlerhafte Expression von Acetylcholin und Acetylcholin-ähnlichem Molekül, wie Carnitin, zu mit dem Herzmuskel assoziierten Störungen führen, wie pathologische Bradykardie oder Tachykardie, Arrhythmie, Flattern oder Flimmern.
  • In Drüsen, wie exokrinen Drüsen, reguliert Acetylcholin und Acetylcholin-ähnliches Molekül, wie Carnitin, die Absonderung von Enzymen oder Hormonen, beispielsweise induziert Acetylcholin und Acetylcholin-ähnliches Molekül, wie Carnitin, in der Ohrspeicheldrüse die Freisetzung von Amylase, und in der Bauchspeicheldrüse induziert Acetylcholin und Acetylcholin-ähnliches Molekül, wie Carnitin, die Freisetzung von Verdauungsenzymen und Insulin. So kann eine Inhibierung oder Überstimulierung der Aktivität von Proteinen, die an dem Signalisierungsweg von Acetylcholin und Acetylcholin-ähnlichem Molekül, wie Carnitin, beteiligt sind oder eine fehlerhafte Expression von Acetylcholin und Acetylcholin-ähnlichem Molekül, wie Carnitin, zu Drüsen assoziierten Störungen, wie Xerostomie oder Diabetes mellitus führen.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die flh84g5-Moleküle in der Lage die Aktivität von G-Proteinen sowie einen Phosphatidylinositol-Metabolismus und -Umsatz in flh84g5-Liganden-gesteuerten Zellen zu modulieren. Wie hier verwendet, ist ein "G-Protein" ein Protein, welches als ein sekundäres Signal an einer Vielzahl von intrazellulären Signalübertragungswegen beteiligt ist, beispielsweise in dem Acetylcholin-Signalisierungsweg, hauptsächlich über Phosphatidylinositol-Metabolismus und -Umsatz. G-Proteine stellen eine Familie von heterotrimeren Proteinen dar, die aus α-, β- und γ-Untereinheiten zusammengesetzt sind, welche Guanin-Nukleotide binden. Diese Proteine sind üblicherweise mit Zelloberflächen-Rezeptoren verbunden, beispielsweise Rezeptoren, die sieben Transmembran-Domänen umfassen, wie die Muscarin-Rezeptoren. Nach Binden eines Liganden an den Rezeptor wird eine konformationelle Änderung auf das G-Protein übertragen, die bewirkt, dass die α-Untereinheit ein gebundenes GDP-Molekül gegen ein GTP-Molekül austauscht und von den βγ-Untereinheiten dissoziiert. Die GTP-gebundene Form der α-Untereinheit fungiert normalerweise als ein Effektor-modulierender Rest, der zur Produktion eines sekundären Botenstoffes führt, wie zyklisches AMP (beispielsweise durch Aktivierung einer Adenylatcyclase), Diacylglycerin oder Inositolphosphaten. Beim Menschen sind mehr als 20 verschiedenen Typen an α-Untereinheiten bekannt, die mit einem kleineren Pool an β- und γ-Untereinheiten assoziieren. Beispiele von G-Proteinen in Säugern umfassen Gi, Go, Gq, Gs und Gt. G-Proteinen sind ausführlich in Lodish H. et al. (1995), Molecular Cell Biology, (Scientific American Books Inc., New York, N.Y.) beschrieben.
  • Wie hier verwendet, betrifft "Phosphatidylinositol-Umsatz und -Metabolismus" die Moleküle, die an dem Umsatz und Metabolismus von Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphat (PIP2) beteiligt sind sowie die Aktivitäten dieser Moleküle. PIP2 ist ein Phospholipid, das in den cytosolischen Falten bzw. Blättchen (leaflet) der Plasmamembran gefunden wird. Ein Binden von Acetylcholin an einen Muscarin-Rezeptor aktiviert das Plasmamembran-Enzym Phospholipase C, welches wiederum PIP2 hydrolysieren kann, um 1,2-Diacylglycerin (DAG) und Inositol-1,4,5-Triphosphat (IP3) zu erzeugen. Einmal gebildet kann IP3 an die Oberfläche des endoplasmatischen Reticulums diffundieren, wo es an IP3-Rezeptor binden kann, beispielsweise ein Calciumkanal-Protein, welches eine IP3-Bindestelle umfasst. Ein Binden von IP3 kann ein Öffnen des Kanals induzieren, wodurch Calciumionen in das Cytoplasma freigesetzt werden können. IP3 kann ebenfalls durch eine spezifische Kinase phosphoryliert werden, um Inositol-1,3,4,5-Tetraphosphat (IP4) zu bilden, ein Molekül, das einen Calcium eintritt aus dem extrazellulären Medium in das Cytoplasma bewirken kann. IP3 und IP4 können anschließend sehr schnell in die inaktiven Produkte Inositol-1,4-Biphosphat (IP2) bzw. Inositol-1,3,4-Triphosphat hydrolisiert werden. Diese inaktiven Produkte können durch die Zelle wiederverwertet werden, um PIP2 zu synthetisieren. Der andere sekundäre Botenstoff, der durch die Hydrolyse von PIP2 erzeugt wird, nämlich 1,2-Diacylglycerin (DAG), verbleibt in der Zellmembran, wo er zur Aktivierung des Enzyms Proteinkinase C dienen kann. Proteinkinase C wird üblicherweise löslich im Cytoplasma der Zelle gefunden, wobei dieses Enzym jedoch nach einer Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration, zur Plasmamembran wandern kann, wo es durch DAG aktiviert werden kann. Die Aktivierung von Proteinkinase C in verschiedenen Zellen führt zu verschiedenen zellulären Antworten, wie die Phosphorylierung von Glycogensynthase oder die Phosphorylierung verschiedener Transkriptionsfaktoren, beispielsweise NF-kB. Der Begriff "Phosphatidylinosistol-Aktivität", wie hier verwendet, betrifft eine Aktivität von PIP2 oder eines seiner Metaboliten.
  • Die flh84g5-Nukleinsäuremoleküle wurden durch Durchmustern bzw. Screenen geeigneter cDNA-Banken identifiziert (im Detail in Beispiel 1 erläutert). Das flh84g5-Nukleinsäuremolekül aus Ratte wurde durch Durchmustern bzw. Screenen einer cDNA-Bank aus Rattengehirn identifiziert. Positive Klone wurden sequenziert und die teilweisen Sequenzen wurden durch Vergleich mit Sequenzen in einer Nukleinsäuresequenz-Datenbank analysiert. Diese Analyse zeigte, dass die Sequenzen mit Rezeptoren der Muscarin-Familie homolog waren. Es wurde dann ein längerer Klon aus Ratte isoliert und sequenziert. Das menschliche flh84g5-Nukleinsäuremolekül wurde durch Durchmustern einer cDNA-Bank des menschlichen Kleinhirns identifiziert, wobei Sonden verwendet wurden, die basierend auf der Rattensequenz gestaltet bzw. aufgebaut wurden.
  • Aufgrund seiner Fähigkeit mit einen flh84g5-Liganden, G-Proteinen und anderen Proteinen, die an dem flh84g5-Liganden-Signalisierungsweg beteiligt sind, wechselzuwirken bzw. in Wechselwirkung zu treten (beispielsweise daran zu binden), ist das flh84g5-Polypeptid ebenfalls ein Polypeptid, welches eine Funktion in dem flh84g5-Liganden-Signalisierungsweg hat.
  • In 1 und SEQ ID Nr. 1 bzw. 2 sind die Nukleotidsequenz der isolierten menschlichen flh84g5-cDNA und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des menschlichen flh84g5-Polypeptids gezeigt. Am 30. September 1998 wurde in der ATCC® ein Plasmid hinterlegt, welches die Volllängen-Nukleotidsequenz umfasst, welche das menschliche flh84g5 kodiert, und mit der Eintrittsnummer bzw. Accession-Nummer 98902 bezeichnet. Diese Hinterlegung wird unter den Bedingungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren aufrechterhalten. Diese Hinterlegung wurde lediglich der Einfachheit halber für den Fachmann getätigt und ist keine Einräumung, dass eine Hinterlegung nach 35 U.S.C. § 112 erforderlich ist.
  • In 2 und in SEQ ID Nr. 4 bzw. 5 sind die Nukleotidsequenz der isolierten flh84g5-cDNA aus Ratte und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des flh84g5-Polypeptids der Ratte gezeigt.
  • In 3 und in SEQ ID Nr. 31 bzw. 32 sind die Nukleotidsequenz der isolierten, teilweisen flh84g5-cDNA aus Maus und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des teilweisen flh84g5-Polypeptids aus Maus gezeigt.
  • Das menschliche flh84g5-Gen, welches ungefähr 2689 Nukleotide lang ist, kodiert ein Volllängen-Polypeptid, das ein Molekulargewicht von ungefähr 51,2 kDa aufweist und ungefähr 445 Aminosäurereste lang ist. Das menschliche flh84g5-Polypeptid wird zumindest im Gehirn exprimiert, und insbesondere in Regionen des Gehirns wie dem Kleinhirn, der Großhirnrinde, der Medulla, dem Okzipitalpol, dem Stirnlappen, dem Schläfenlappen, dem Putamen, dem Corpus callosum dem Corpus amygdaloideum bzw. der Amygdala, dem Nucleus caudatus, dem Hypocampus, der Substantia nigra, dem Nucleus subthalamicus und dem Thalamus; Rückenmark, Plazenta, Lungen, Milz, Leber, Skelettmuskulatur, Niere und Hoden. Basierend auf einer strukturellen Analyse umfassen die Aminosäurereste 34-59 (SEQ ID Nr. 7), 73-91 (SEQ ID Nr. 8), 109-130 (SEQ ID Nr. 9), 152-174 (SEQ ID Nr. 10), 197-219 (SEQ ID Nr. 11), 360-380 (SEQ ID Nr. 12), und 396-416 (SEQ ID Nr. 13) Transmembran-Domänen. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Transmembran-Domäne" ein strukturelles Aminosäuremotiv, welches eine hydrophobe Helix umfasst, die die Plasmamembran überspannt. Eine Transmembran-Domäne umfasst vorzugsweise ebenfalls eine Reihe an konservierten Serin-, Threonin- und Tyrosinresten. So umfassen beispielsweise die Transmembran-Domänen zwischen den Resten 109-130 (SEQ ID Nr. 9), 197-219 (SEQ ID Nr. 11), 360-380 (SEQ ID Nr. 12) und 396-416 (SEQ ID Nr. 13) Threonin- und Tyrosinreste (ungefähr ein bis zwei helikale Wendungen weg von der Membranoberfläche lokalisiert), die für eine Bindung eines Liganden, beispielsweise Acetylcholin oder ein Acetylcholin-ähnliches Molekül, wie Carnitin, wichtig sind. Andere wichtige Reste in den Transmembran-Domänen umfassen den konservierten Aspartatrest in der Transmembran-Domäne zwischen den Resten 109-130 (SEQ ID Nr. 9) und den konservierten Prolinrest in der Transmembran-Domäne zwischen Resten 152-174 (SEQ ID Nr. 10), welche ebenfalls für die Bindung eines Liganden, beispielsweise eines flh84g5-Liganden, wichtig sind. Ein Fachmann wird leicht erkennen, dass der beginnende und endende Aminosäurerest, der hier für verschiedene Domänen/Fragmente von flh84g5 genannt sind, auf einer strukturellen Analyse basiert sind, und dass die tatsächliche beginnende/endende Aminosäure für jeden durch ein paar Aminosäuren von den hier identifizierten variieren kann.
  • Das flh84g5-Gen der Ratte, welches ungefähr 3244 Nukleotide lang ist, kodiert ein Volllängen-Polypeptid, welches ein Molekulargewicht von ungefähr 51,2 kDA aufweist und ungefähr 445 Aminosäurereste lang ist. Das flh84g5-Polypeptid der Ratte wird im Gehirn exprimiert. Die Aminosäurereste 34-59 (SEQ ID Nr. 14), 73-91 (SEQ ID Nr. 15), 109-130 (SEQ ID Nr. 16), 152-174 (SEQ ID Nr. 17), 197-219 (SEQ ID Nr. 18), 360-380 (SEQ ID Nr. 19), und 396-416 (SEQ ID Nr. 20) umfassen Transmembran-Domänen.
  • Das flh84g5-Gen der Ratte, welches mindestens 2218 Nukleotide lang ist, kodiert ein Volllängen-Polypeptid, welches ein Molekulargewicht von mindestens ungefähr 41,6 kDa aufweist und welches mindestens ungefähr 362 Aminosäurereste lang ist. Das flh84g5-Polypeptid der Ratte wird im Gehirn exprimiert. Die Aminosäurereste 1-8 (SEQ ID Nr. 14), 26-47 (SEQ ID Nr. 15), 69-91 (SEQ ID Nr. 16), 114-136 (SEQ ID Nr. 17), 277-297 (SEQ ID Nr. 18) und 313-333 (SEQ ID Nr. 19) umfassen Transmembran-Domänen.
  • Das teilweise flh84g5-Gen der Maus, welches mindestens 2218 Nukleotide lang ist, kodiert ein Polypeptid, welches ein Molekulargewicht von mindestens ungefähr 41,6 kDa aufweist und welches mindestens ungefähr 362 Aminosäurereste lang ist. Das flh84g5-Polypeptid der Maus wird im Gehirn exprimiert. Die Aminosäurereste 1-8 (SEQ ID Nr. 34), 26-47 (SEQ ID Nr. 35), 69-91 (SEQ ID Nr. 36), 114-136 (SEQ ID Nr. 37), 277-297 (SEQ ID Nr. 38) und 313-333 (SEQ ID Nr. 39) umfassen Transmembran-Domänen.
  • Das flh84g5-Polypeptid, ein biologisch aktiver Teil bzw. Abschnitt oder Fragment des Polypeptids oder eine allelische Variante davon, kann eine oder mehrere der flh84g5- Aktivitäten aufweisen: 1) es kann mit einen flh84g5-Liganden wechselwirken (beispielsweise daran binden); 2) es kann mit einem G-Protein oder einem anderen Protein, welches natürlicherweise an flh84g5 bindet, wechselwirken (beispielsweise daran binden); 3) es kann die Aktivität eines Ionenkanals (beispielsweise eines Calcium aktivierten Chloridkanals) modulieren; 4) es kann eine cytosolische Ionenkonzentration, beispielsweise Calcium oder Chlorid, modulieren; 5) es kann die Freisetzung eines Neurotransmitters, beispielsweise eines flh84g5-Liganden, von einem Neuron, beispielsweise einem prä-synaptischen Neuron, modulieren; 6) es kann ein flh84g5-Ligandenantwort in einer flh84g5-Liganden-gesteuerten Zelle modulieren (beispielsweise einer glatten Muskelzelle oder einer Drüsenzelle), um beispielsweise die flh84g5-Liganden-gesteuerte Zelle, beispielsweise ein Neuron, vorteilhaft zu beeinflussen; 7) es kann die Bindung eines Liganden über Phosphatidylinosistol-Umsatz signalisieren; und 8) es kann eine Phospholipase C-Aktivität modulieren, beispielsweise aktivieren oder inhibieren.
  • Verschiedene Aspekte der Erfindung werden in den folgenden Unterabschnitten ausführlicher erläutert:
  • I. Isolierte Nukleinsäuremoleküle
  • Ein Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche flh84g5 oder biologisch aktive Teile davon kodieren, sowie Nukleinsäurefragmente, die zur Verwendung als Hybridisierungssonden zum Identifizieren von flh84g5-kodierender Nukleinsäure (beispielsweise flh84g5-mRNA) ausreichend sind. Wie hier verwendet soll der Begriff "Nukleinsäuremolekül" DNA-Moleküle (beispielsweise cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (beispielsweise mRNA) und Analoge der DNA oder RNA umfassen, die durch Verwendung von Nukleotidanaloga erzeugt wurden. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, ist jedoch vorzugsweise doppelsträngige DNA. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül ist eines, welches von anderen Nukleinsäuremolekülen getrennt ist, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorliegen. Vorzugsweise ist eine "isolierte" Nukleinsäure frei von Sequenzen, die die Nukleinsäure in der genomsichen DNA des Organismus natürlicherweise flankieren, von dem die Nukleinsäure abgeleitet ist (d. h. Sequenzen, die an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure lokalisiert sind). So kann beispielsweise in verschiedenen Ausführungsformen das isolierte flh84g5-Nukleinsäuremolekül weniger als ungefähr 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb an Nukleotidsequenzen umfassen, welche das Nukleinsäuremolekül in genomischer DNA der Zelle, von der die Nukleinsäure abgeleitet ist (beispielsweise eine hypocampale Zelle) natürlicherweise flankieren. Darüber hinaus kann ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül, im Wesentlichen frei sein von anderem zellulären Material oder von Kulturmedium, wenn es durch rekombinante Techniken erzeugt wird, oder von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wird.
  • Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, beispielsweise ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31, oder ein Teil davon, kann unter Verwendung von standardmäßigen, molekularbiologischen Techniken und der hier bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. So kann beispielsweise eine menschliche flh84g5-cDNA aus einer menschlichen Hippocampus-Bank isoliert werden, wobei alle oder Teile von SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 als eine Hybridisierungssonde und standardmäßige Hybridisierungstechniken verwendet werden (wie beispielsweise in Sambrook, J. Fritsh, E.F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben). Darüber hinaus kann ein Nukleinsäuremolekül, welches die gesamte oder einen Teil von SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 umfasst, durch die Polymerase-Kettenreaktion isoliert werden, wobei Oligonukleotid-Primer verwendet werden, die basierend auf der Sequenz von SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 gestaltet sind. So kann mRNA beispielsweise aus normalen Gehirnzellen isoliert werden (beispielsweise durch das Guanidinium-Thiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al. (1979), Biochemistry 18:5294-5299) und es kann cDNA unter Verwendung einer reversen Transkriptase hergestellt werden (beispielsweise Moloney-MLV-Reverse Transkriptase, verfügbar von Gibco/BRL, Bethesda, MD; oder AMV-Reverse Transkriptase erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Synthetische Oligonukleotid-Primer für eine PCR-Amplifikation können basierend auf der in SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 gezeigten Nukleotidsequenz gestaltet werden. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann unter Verwendung von cDNA oder alternativ von genomischer DNA als eine Vorlage (template) und geeigneten Oligonukleotid-Primern gemäß standardmäßiger PCR-Amplifikation-Techniken amplifiziert bzw. verstärkt werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und mittels einer DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Darüber hinaus können einer flh84g5-Nukleotidsequenz entsprechende Oligonukleotide durch standardmäßige Synthesetechniken hergestellt werden, beispielsweise unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesizers.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes, isoliertes Nukleinsäuremolekül die in SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 gezeigte Nukleotidsequenz.
  • Die Sequenz von SEQ ID Nr. 1 entspricht der menschlichen flh84g5-cDNA. Diese cDNA umfasst Sequenzen, die das menschliche flh84g5-Polypeptid (d. h. "die kodierende Region") von Nukleotiden 291-1628 von SEQ ID Nr. 1) sowie 5'-untranslatierte Sequenzen (Nukleotide 1-290 von SEQ ID Nr. 1) und 3'-untranslatierte Sequenzen (Nukleotide 1629-2689 von SEQ ID Nr. 1) kodieren. Alternativ kann das Nukleinsäuremolekül lediglich die kodierende Region von SEQ ID Nr. 1 umfassen (beispielsweise Nukleotide 291-1628 von SEQ ID Nr. 1, die separat als SEQ ID Nr. 3 gezeigt sind). Die Sequenz von SEQ ID Nr. 4 entspricht der flh84g5-cDNA von Ratte. Diese cDNA umfasst Sequenzen, die das flh84g5-Polypeptid der Ratte (d. h. "die kodierende Region" von Nukleotiden 778-2112 von SEQ ID Nr. 4) sowie 5'-untranslatierte Sequenzen (Nukleotide 1-777 von SEQ ID Nr. 4) und 3'-untranslatierte Sequenzen (Nukleotide 2113-3244 von SEQ ID Nr. 4) kodieren. Alternativ kann das Nukleinsäuremolekül lediglich die kodierende Region von SEQ ID Nr. 4 umfassen (beispielsweise Nukleotide 778-2112 von SEQ ID Nr. 4, die separat als SEQ ID Nr. 6 gezeigt sind). Die Sequenz von SEQ ID Nr. 31 entspricht der teilweisen flh84g5-cDNA von Maus. Diese cDNA umfasst Sequenzen, die einen Teil des flh84g5-Polypeptids aus Maus (d. h. einen Teil der "kodierenden Region" von Nukleotiden 1-1089 von SEQ ID Nr. 31) und 3'-untranslatierte Sequenzen (Nukleotide 1090-2218 von SEQ ID Nr. 31) kodieren. Alternativ kann das Nukleinsäuremolekül lediglich die teilweise kodierende Region von SEQ ID Nr. 31 umfassen (beispielsweise Nukleotide 1-1089, die separat als SEQ ID Nr. 33 gezeigt sind).
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Komplement der in SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 gezeigten Nukleotidsequenz ist.
  • Ein Nukleinsäuremolekül, welches zu der in SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 gezeigten Nukleotidsequenz komplementär ist, ist eines, welches ausreichend komplementär zu der in SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 gezeigten Nukleotidsequenz ist, so dass es entsprechend an die in SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 gezeigte Nukleotidsequenz hybridisieren kann und dadurch ein stabiles Duplex bildet.
  • In einer noch anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes, isoliertes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz die mindestens zu 95% mit der in SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 gezeigten Nukleotidsequenz identisch ist. Derartige Nukleinsäuremolekül kodieren vorzugsweise funktional aktive oder inaktive allelische Varianten von flh84g5. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes, isoliertes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, welche an die in SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 gezeigte Nukleotidsequenz oder die Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, das bei der ATCC® mit der Eintrittsnummer 98902 hinterlegt ist, oder einen Teil von beiden dieser Nukleotidsequenzen, hybridisiert, beispielsweise unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
  • So kann ein Nukleinsäuremolekül, als ein Beispiel, lediglich einen Teil der kodierenden Region von SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 umfassen, beispielsweise ein Fragment, welches als eine Sonde oder ein Primer verwendet werden kann oder ein Fragment, welches einen biologisch aktiven Teil von flh84g5 kodiert. Die Nukleotidsequenz, welche durch das Klonieren des flh84g5-Gens aus einem Säuger bestimmt wird, ermöglicht die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Verwendung zum Identifizieren und/oder Klonieren von flh84g5-Homologen in anderen Zelltypen, beispielsweise von anderen Geweben, sowie von flh84g5-Homologen aus anderen Säugern gestaltet werden. Die Sonde/der Primer umfasst normalerweise im Wesentlichen gereinigte Oligonukleotide. Die Oligonukleotide umfassen normalerweise eine Region einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen hybridisiert an mindestens ungefähr 12, vorzugsweise ungefähr 25 und mehr bevorzugt ungefähr 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide von SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 sense, eine antisense-Sequenz von SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31, oder natürlich vorkommenden Mutanten davon. Die auf der Nukleotidsequenz in SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 basierenden Primer können in PCR-Reaktionen zum Klonieren von flh84g5-Homologen verwendet werden. Auf der flh84g5-Nukleotidsequenz basierende Sonden können zum Nachweis von Transkripten oder genomische Sequenzen verwendet werden, welche die gleichen oder homologen Polypeptide kodieren. Die Sonde kann ferner eine Markierungsgruppe umfassen die daran angefügt ist, beispielsweise kann eine Markierungsgruppe ein Radioisotop sein, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder ein Enzym-Cofaktor. Derartige Sonden können als ein Teil in einem diagnostischen Testkit verwendet werden, um Zellen oder Gewebe zu identifizieren, welche ein flh84g5-Polypeptid fehlerhaft exprimieren, wie durch Erfassen eines Spiegels an flh84g5-kodierender Nukleinsäure in einer Zellprobe aus einem Subjekt, beispielsweise durch Nachweisen von flh84g5-mRNA-Spiegeln oder Bestimmen, ob ein genomisches flh84g5-Gen mutiert oder deletiert wurde.
  • In einer Ausführungsform kodiert das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ein Polypeptid oder einen Teil davon, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 95% identisch zu der gesamten Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32 ist, so dass das Polypeptid oder ein Teil davon die Fähigkeit beibehält eine flh84g5-Ligandenantwort in einer flh84g5-Liganden-gesteuerten Zelle zu modulieren (beispielsweise natürlich vorkommende Allel-Varianten der hier beschriebenen flh84g5-Polypeptide aus Ratte und Mensch.)
  • Vorzugsweise sind Teile des Polypeptids, welche durch das erfindungsgemäße flh84g5-Nukleinsäuremolekül kodiert werden, biologisch aktive Teile des flh84g5-Polypeptids. Wie hier verwendet, soll der Begriff "biologisch aktiver Teil von flh84g5" einen Teil umfassen, beispielsweise eine Domäne/Motiv von flh84g5, der eine oder mehrere der folgenden flh84g5-Aktivitäten aufweist: 1) er kann mit einen flh84g5-Liganden wechselwirken (beispielsweise daran binden); 2) er kann mit einem G-Protein oder anderem Protein, welches natürlicherweise an flh84g5 bindet, wechselwirken (beispielsweise daran binden); 3) er kann die Aktivität eines Ionenkanals modulieren (beispielsweise eines Calcium aktivierten Chloridkanals oder eines Kalium- oder Calciumkanals); 4) er kann eine zytosolische Ionenkonzentration, beispielsweise Calcium oder Chlorid, modulieren; 5) er kann die Freisetzung eines Neurotransmitters, beispielsweise Acetylcholin oder eines Acetylcholin-ähnlichen Moleküls, wie Carnitin, von einem Neuron, beispielsweise einem prä-synaptisches Neuron modulieren; 6) er kann eine flh84g5-Liganden-Antwort in einer flh84g5-Liganden-gesteuerten Zelle (beispielsweise einer glatten Muskelzelle oder einer Drüsenzelle) modulieren, um beispielsweise die flh84g5-Liganden-gesteuerte Zelle, beispielsweise ein Neuron, vorteilhaft zu beeinflussen; 7) er kann das Binden eines Liganden über Phophatidylinositol-Umsatz signalisieren; und 8) er kann eine Phospholipase C-Aktivität modulieren, beispielsweise aktivieren oder inhibieren.
  • Es können standardmäßige Bindungsassays, beispielsweise wie hier erläutert Immunopräzipitationen und Hefe-Zwei-Hybrid-Assays, durchgeführt werden, um die Fähigkeit eines flh84g5-Polypeptids, oder eines biologisch aktiven Teil davon, zu bestimmen mit einem Bindungspartner, wie einem G-Protein in Wechselwirkung zu treten (beispielsweise daran zu binden). Um zu bestimmen, ob ein flh84g5-Polypeptid oder ein biologisch aktiver Teil davon eine flh84g5-Liganden-Antwort in einer flh84g5-Liganden-gesteuerten Zellen modulieren kann, können derartige Zellen mit einem Konstrukt transfiziert werden, welches die Überexpression eines flh84g5-Polypeptids oder eines biologische aktiven Teils davon antreibt. Verfahren zum Herstellen von flh84g5-Liganden-gesteuerten Zellen, beispielsweise intakte glatte Muskelzellen oder Extrakte aus derartigen Zellen, sind im Stand der Technik bekannt und in Glukhova et al. (1987), Tissue Cell 19 (5):657-63, Childs et al. (1992), J. Biol. Chem. 267 (32):22853-9 und in White et al. (1996), J. Biol. Chem. 271 (25):15008-17 beschrieben. Die Zellen können nachfolgend mit einem flh84g5-Liganden behandelt werden und es kann eine biologische Wirkung eines flh84g5-Liganden auf die Zellen, wie ein Phosphatidylinositol-Umsatz oder zytosolische Calciumkonzentration, unter Verwendung von im Stand der Technik bekannter Verfahren erfasst werden (siehe Hartzell H.C. et al. (1988), Prog. Biophys. Mol. Biol. 52:165-247). Alternativ können transgene Tiere, beispielsweise Mäuse, die ein flh84g5-Polypeptid oder einen biologisch aktivierten Teil davon überexprimieren, verwendet werden. Es können Gewebe aus derartigen Tieren erhalten werden und mit einem flh84g5-Liganden behandelt werden. Beispielsweise sind Verfahren zum Herstellen von mit Detergenz enthäuteter bzw. -entmantelter Muskelfaserbündel im Stand der Technik bekannt (Strauss et al. (1992), Am. J. Physiol. 262:1437-45). Die Kontraktilität dieser Gewebe als Antwort auf einen flh84g5-Liganden kann beispielsweise unter Verwendung isometrischer Krafterfassungen bestimmt werden, wie in Strauss et al., wie vorstehend aufgeführt, erläutert ist. Um zu bestimmen, ob ein flh84g5-Polypeptid oder ein biologisch aktiver Teil davon eine flh84g5-Liganden-Antwort in einer flh84g5-Liganden-gesteuerten Zelle, wie einer Drüsenzelle, modulieren kann, können in gleicher Art und Weise Drüsenzellen, beispielsweise Ohrspeicheldrüsenzellen, die in Gewebekultur wachsen gelassen wurden, mit einem Konstrukt transfiziert werden, welches die Überexpression eines flh84g5-Polypeptids oder eines biologisch aktiven Teil davon antreibt. Die Zellen können nachfolgend mit einem flh84g5-Liganden behandelt werden und es kann die Wirkung des flh84g5-Liganden auf eine Amylaseabsonderung aus derartigen Zellen beispielsweise unter Verwendung eines enzymatischen Assays mit einem markierten Substrat bestimmt werden. Die bevorzugten Assays, die für flh84g5-Aktivität verwendet werden, basieren auf einem Phosphotidylinositol-Umsatz, wie solche, die für die M1-, M3- und M5-Klassen der Rezeptoren entwickelt wurden (siehe E. Watson et al. (1994), The G Protein Linked Receptor: FactsBook, Academic Press, Boston, MA).
  • In einer Ausführungsform umfasst der biologisch aktive Teil von flh84g5 eine Transmembran-Domäne. Vorzugsweise wird die Transmembran-Domäne durch ein vom Menschen abgeleitetes Nukleinsäuremolekül kodiert und umfasst die Aminosäurerest 34-59, 109-130, 152-174, 197-219 oder 396-416 von SEQ ID Nr. 2, die als separate Sequenzen gezeigt sind, die als SEQ ID Nr. 7, 9, 10, 11 bzw. 13 bezeichnet sind, oder die Transmembran-Domänen aus Ratte (d. h. Aminsäurereste 34-59, 73-91, 109-130, 152-174, 197-219, 360-380 oder 396-416 von SEQ ID Nr. 5, welche als separate Sequenzen gezeigt sind, die als SEQ ID Nr. 14, 15, 16, 17, 18, 19 bzw. 20 bezeichnet sind, oder Aminosäure Reste 1-8, 26-47, 69-91, 114-136, 277-297 oder 313-333 von SEQ ID Nr. 32, welche als separate Sequenzen gezeigt sind, die als SEQ ID Nr. 34, 35, 36, 37, 38 bzw. 39 bezeichnet sind.) Noch bevorzugter umfasst die durch das menschliche Nukleinsäuremolekül kodierte Transmembran-Domäne die Aminosäurereste von 360-380 von SEQ ID Nr. 2, welche als eine separate Sequenz gezeigt sind, die als SEQ ID Nr. 12 bezeichnet ist, oder Aminosäurereste 73-91 von SEQ ID Nr. 2, welche als eine separate Sequenz gezeigt sind, die als SEQ ID Nr. 8 bezeichnet ist. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der biologisch aktive Teil des Polypeptids, welcher die Transmembran-Domäne umfasst, die Aktivität eines G-Proteins oder anderen Bindepartners in einer Zelle modulieren und/oder eine flh84g5-Liganden-Antwort in einer flh84g5-Liganden-gesteuerten Zelle, beispielsweise einer Gehirnzelle, modulieren, um dadurch die Zelle vorteilhaft zu beeinflussen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der biologisch aktive Teil eine Transmembran-Domäne des menschlichen flh84g5, wie dargestellt durch die Aminosäurereste 34-59 (SEQ ID Nr. 7), 73-91 (SEQ ID Nr. 8), 109-130 (SEQ ID Nr. 9), 152-174 (SEQ ID Nr. 10), 197-219 (SEQ ID Nr. 11), 360-380 (SEQ ID Nr. 12), und 396-416 (SEQ ID Nr. 13), eine Transmembran-Domäne des Volllängen-flh84g5 aus Ratte, wie dargestellt durch Aminosäureresten 34-59 (SEQ ID Nr. 14) 73-91 (SEQ ID Nr. 15), 109-130 (SEQ ID Nr. 16), 152-174 (SEQ ID Nr. 17), 197-219 (SEQ ID Nr. 18), 360-380 (SEQ ID Nr. 19), und 396-416 (SEQ ID Nr. 20) oder eine Transmembran-Domäne des teilweisen flh84g5 aus Maus, wie dargestellt durch Aminosäurereste 1-8 (SEQ ID Nr. 34), 26-47 (SEQ ID Nr. 35), 69-91 (SEQ ID Nr. 36), 114-136 (SEQ ID Nr. 37), 277-297 (SEQ ID Nr. 38), und 313-333 (SEQ ID Nr. 39). Zusätzlich können Nukleinsäurefragmente, welche biologisch aktive Teile von flh84g5 kodieren, durch Isolieren eines Teils von SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31, Exprimieren des kodierten Teils des flh84g5-Polypeptid oder -Peptid (beispielsweise durch rekombinante Expression in vitro) und Bewerten der Aktivität des kodierten Teils des flh84g5-Polypeptids oder -Peptids hergestellt werden.
  • Die Erfindung umfasst ferner Nukleinsäuremoleküle, die sich von der in SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 gezeigten Nukleotidsequenz (und Teilen davon) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheiden und somit das gleiche flh84g5-Polypeptid kodieren, wie das, welches durch die in SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 gezeigte Nukleotidsequenz kodiert wird. In einer anderen Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz auf, die ein Polypeptid kodiert, das eine in SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
  • Zusätzlich zu der SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 gezeigten flh84g5-Nukleotidsequenz, ist dem Fachmann klar, dass in einer Population (beispielsweise der menschlichen Population) ein DNA-Sequenzpolymorphismus existieren kann, der zu Veränderungen in den Aminosäuresequenzen von flh84g5 führt. Innerhalb einer Population kann ein derartiger Polymorphismus in dem flh84g5-Gen aufgrund einer natürlichen allelischen Variation unter Individuen entstehen. Wie hier verwendet, betreffen die Begriffe "Gen" und "rekombinantes Gen" Nukleinsäuremoleküle, welche einen offenen Leserahmen umfassen, der ein flh84g5-Polypeptid kodiert, vorzugsweise ein flh84g5-Polypeptid eines Säugers. Derartige natürliche allelische Variationen können normalerweise zu einer 1% bis 5%igen Varianz in der Nukleotidsequenz des flh84g5-Gens führen. Derartige allelische Variationen umfassen sowohl aktive allelische Varianten sowie allelische Variante, die nicht aktiv sind oder eine verringerte Aktivität zeigen, wobei die beiden letzteren Typen normalerweise zu einer pathologischen Störung führen. Darüber hinaus weisen Nukleinsäuremoleküle, die flh84g5-Polypeptide aus anderen Spezies kodieren, eine Nukleotidsequenz auf, die sich von der menschlichen Sequenz aus SEQ ID Nr. 1 unterscheidet. Nukleinsäuremoleküle, die natürlichen allelischen Varianten und nicht-menschlichen Homologen der erfindungsgemäßen, menschlichen flh84g5-cDNA entsprechen, können basierend auf deren Homologie zu der hier offenbarten menschlichen flh84g5-Nukleinsäure gemäß standardmäßiger Hybridisierungstechniken unter strigenten Hybridisierungsbedingungen, unter Verwendung der menschlichen cDNA oder eines Teils davon als eine Hybridisierungssonde isoliert werden.
  • Wie hier verwendet, soll die Formulierung "hybridisiert unter strigenten Bedingungen" Hybridisierungs- und Waschbedingungen beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen, die mindestens zu 60% zueinander homolog sind, normalerweise aneinander hybridisiert bleiben. Vorzugsweise sind die Bedingungen derart, dass Sequenzen, die mindestens ungefähr 65%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 70% und noch mehr bevorzugt mindestens ungefähr 75% oder mehr homolog zueinander sind, normalerweise aneinander hybridisiert bleiben. Derartige strigente Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und können in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 gefunden werden. Ein bevorzugtes, nicht beschränkendes Beispiel strigenter Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierung in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei ungefähr 45°C, gefolgt von einer oder mehreren Waschungen in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50-65°C. Vorzugsweise entspricht ein erfindungsgemäßes, isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches unter strigenten Bedingungen an die Sequenz von SEQ ID Nr. 1 hybridisiert, einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül. Wie hier verwendet, betrifft ein "natürlich vorkommendes" Nukleinsäuremolekül ein RNA- oder DNA-Molekül mit einer Nukleotidsequenz, die in der Natur auftritt (beispielsweise kodiert sie ein natürliches Polypeptid). In einer Ausführungsform kodiert die Nukleinsäure ein natürliches, menschliches flh84g5.
  • Zusätzlich zu natürlich vorkommenden allelischen Varianten der flh84g5-Sequenz, die in der Population existieren können, ist dem Fachmann ferner klar, dass durch Mutation in der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 Veränderungen eingeführt werden können, die dadurch zu Veränderungen in der Aminosäuresequenz des kodierten flh84g5-Polypeptids führen ohne die funktionale bzw. funktionelle Fähigkeit des flh84g5-Polypeptids zu verändern. So können beispielsweise in der Sequenz von SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 Nukleotidsubstitutionen getätigt werden, die zu Aminosäuresubstitutionen von "nicht essentiellen" Aminosäureresten führen. Ein "nicht essentieller" Aminosäurerest ist ein Rest, der in der Wildtyp-Sequenz von flh84g5 (beispielsweise der Sequenz von SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32) verändert werden kann ohne die Aktivität von flh84g5 zu verändern, wohingegen ein "essentieller" Aminosäurerest für eine flh84g5-Aktivität erforderlich ist. So sind beispielsweise konservierte Aminosäurereste, beispielsweise Aspartate, Proline, Threonine und Tyrosine, in den Transmembran-Domänen von flh84g5 am wahrscheinlichsten für ein Binden an einen flh84g5-Liganden wichtig und sind somit essentielle Reste des flh84g5. Andere Aminosäurereste (beispielsweise solche, die in der Transmembran-Domäne nicht konserviert oder lediglich halb-konserviert sind) können jedoch für eine Aktivität nicht essentiell sein und somit wahrscheinlich für eine Änderung offen ohne eine flh84g5-Aktivität zu verändern.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die flh84g5-Polypeptide kodieren, die Veränderungen in Aminosäureresten umfassen, die für eine flh84g5-Aktivität nicht essentiell sind. Derartige flh84g5-Polypeptide unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32, behalten jedoch mindestens eine der hier beschriebenen flh84g5-Aktivitäten bei und umfassen eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, worin das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 95% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32 identisch ist.
  • Um den Prozentsatz der Identität zweier Aminosäuresequenzen oder zweier Nukleinsäuresequenzen (beispielsweise SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32 und einer mutanten Form davon) zu bestimmen, werden die Sequenzen für optimale Vergleichszwecke ausgerichtet (so können beispielsweise in einer oder beiden einer ersten und zweiten Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz für eine optimale Ausrichtung Lücken eingeführt werden und es können nicht homologe Sequenzen können für Vergleichszwecke vernachlässigt werden). In einer Ausführungsform beträgt die Länge einer für Vergleichszwecke ausgerichteten Referenzsequenz mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 40%, noch bevorzugter mindestens 50%, noch mehr bevorzugt mindestens 60% und noch mehr bevorzugt mindestens 70%, 80% oder 90% der Länge der Referenzsequenz (wenn beispielsweise eine zweite Sequenz mit mindestens 177 Aminosäureresten an die flh84g5-Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32 ausgerichtet wird, werden mindestens 80, vorzugsweise 100, noch bevorzugter mindestens 120, noch mehr bevorzugt mindestens 140 und noch mehr bevorzugt mindestens 150, 160 oder 170 Aminosäurereste ausgerichtet). Die Aminosäurereste oder Nukleotide an entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wird eine Position in der ersten Sequenz durch den gleichen Aminosäurerest oder das gleiche Nukleotid besetzt wie in der entsprechenden Position in der zweiten Sequenz, dann sind die Moleküle an dieser Position identisch (wie hier verwendet ist eine Aminosäure- oder Nukleinsäure-"Identität" gleichbedeutend mit einer Aminosäure- oder Nukleinsäure-"Homologie"). Der Prozentsatz an Identität zwischen zwei Sequenzen ist eine Funktion einer Anzahl an identischen Positionen, die durch die Sequenzen geteilt werden, wobei die Anzahl an Lücken und die Länge jeder Lücke berücksichtigt werden, die eingeführt werden müssen, um die beiden Sequenzen optimal auszurichten.
  • Der Vergleich von Sequenzen und die Bestimmung eines Prozentsatzes an Identität zwischen zwei Sequenzen kann unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus durchgeführt werden. In einer Ausführungsform wird der Prozentsatz an Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen unter Verwendung des Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970, J. Mol. Biol. (48):444-453) bestimmt, der in das GAP-Programm in dem GCG-Software-Paket aufgenommen wurde (verfügbar unter http://www.gcg.com), wobei entweder eine Blossom 62-Matrix oder eine PAM250-Matrix und ein Lückengewicht von 16, 14, 12, 10, 8, 6 oder 4 und ein Längengewicht von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 verwendet wird. In einer noch anderen Ausführungsform wird der Prozentsatz an Identität zwischen zwei Nukleotidsequenzen unter Verwendung des GAP-Programms in dem GCG-Software-Paket (verfügbar unter http://www.gcg.com) bestimmt, wobei eine NWSgapdna.CMP-Matrix und ein Lückengewicht von 40, 50, 60, 70 oder 80 und ein Längengewicht von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 verwendet wird. In einer anderen Ausführungsform wird der Prozentsatz an Identität zwischen zwei Aminosäure- oder Nukleotidsequenzen unter Verwendung des Algorithmus von E. Meyers und W. Miller (CABIOS, (1989) 4:11-17) bestimmt, der in das ALIGN-Programm (Version 2.0) aufgenommen wurde, wobei eine PAM120-Gewichtsreste-Tabelle verwendet wird, eine Lücken-Längenstrafe (penalty) von 12 und eine Lückenstrafe von 4.
  • Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinsequenzen können ferner als ein "Abfrage-Sequenz" verwendet werden, um eine Suche gegen öffentliche Datenbanken durchzuführen, um beispielsweise andere Familiemitglieder und verwandte Sequenzen zu identifizieren. Derartige Suchen können unter Verwendung der NBLAST- und XBLAST-Programme (Version 2.0) von Altschul, et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10 durchgeführt werden. BLAST-Nukleotid-Suchen können mit dem NBLAST-Programm durchgeführt werden, Punktebewertung bzw. Punktezahl (score) = 100, Wortlänge (wordlength) = 12, um Nukleotidsequenzen zu erhalten, die zu erfindungsgemäßen flh84g5-Nukleinsäuremolekülen homolog sind. BLAST-Protein-Suchen können mit dem XBLAST-Programm durchgeführt werden, Punktebewertung = 50, Wortlänge = 3, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die zu den erfindungsgemäßen flh84g5-Proteinmolekülen homolog sind. Um für Vergleichszwecke Ausrichtungen mit Lücken zu erhalten, kann Gapped BLAST eingesetzt werden, wie in Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25 (17):3389-3402 erläutert. Werden BLAST- und Gapped-BLAST-Programme eingesetzt, können die Standardparameter der jeweiligen Programme (beispielsweise XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
  • Durch Einführen einer oder mehrerer Nukleotid-Substitutionen, -Additionen oder -Deletionen in die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1, 4, bzw. 31, so dass eine oder mehrer Aminosäure-Substitutionen, -Additionen oder -Deletionen in dem kodierten Polypeptid eingeführt werden, kann ein isoliertes Nukleinsäuremolekül erzeugt werden, das ein flh84g5-Polypeptid kodiert, das zu dem Polypeptid von SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32 homolog ist. Mutationen können in SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 durch Standardtechniken, wie ortsgerichtete Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese, eingeführt werden. Vorzugsweise werden an einer oder mehreren vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäureresten konservative Aminosäuresubstitutionen durchgeführt. Eine "konservative Aminosäuresubstitution" ist eine, in der der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest ausgetauscht wird, der eine ähnliche Seitenkette aufweist. Im Stand der Technik sind Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (beispielsweise Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (beispielsweise Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen, polaren Seitenketten (beispielsweise Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), nicht-polaren Seitenketten (beispielsweise Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Trytophan), beta-verzweigten Seitenketten (beispielsweise Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (beispielsweise Tyrosin, Pheylalanin, Tryptophan, Histidin). Somit wird ein vorhergesagter, nicht-essentieller Aminosäurerest in flh84g5 vorzugsweise mit einem anderen Aminosäurerest aus der gleichen Seitenkettenfamilie ausgetauscht. Alternativ können in einer anderen Ausführungsform Mutationen zufällig entlang der gesamten oder eines Teils einer flh84g5-kodierenden Sequenz, wie durch Sättigungsmutagenese, eingeführt werden, wobei die so erhaltenen Mutanten hinsichtlich einer hier beschrieben flh84g5-Aktivität durchmustert werden können, um Mutanten zu identifizieren, die eine flh84g5-Aktivität beibehalten. Nach einer Mutagenase von SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 kann das kodierte Polypeptid rekombinant exprimiert werden (beispielsweise wie in Beispielen 3 und 4 beschrieben) und die Aktivität des Polypeptids kann beispielsweise unter Verwendung der hier beschriebenen Assays bestimmt werden.
  • Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Nukleinsäuremolekülen, die flh84g5-Polypeptide kodieren, werden isolierte Nukleinsäuremoleküle bereitgestellt, die dazu antisense sind. Eine "antisense"-Nukleinsäure umfasst eine Nukleotidsequenz, die zu einer "sense"-Nukleinsäure komplementär ist, die ein Polypeptid kodiert, beispielsweise komplementär zu dem kodierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Sequenz. Entsprechend kann eine antisense-Nukleinsäure über Wasserstoffbrücken an eine sense-Nukleinsäure gebunden werden. Die antisense-Nukleinsäure kann zu dem gesamten flh84g5-kodierenden Strang oder lediglich zu einem Teil davon komplementär sein. In einer Ausführungsform ist ein antisense-Nukleinsäuremolekül antisense zu einer "kodierenden Region" des kodierenden Strangs einer Nukleotidsequenz, die flh84g5 kodiert.
  • Der Begriff "kodierende Region" betrifft die Region der Nukleotidsequenz, die Codons umfasst, die in Aminosäurereste übersetzt werden, beispielsweise umfasst die gesamte kodierende Region von SEQ ID Nr. 1 die Nukleotide 291 bis 1628 (separat gezeigt als SEQ ID Nr. 3) und die kodierende Region von SEQ ID Nr. 4 umfasst die Nukleotide 778 bis 2112 (separat gezeigt als SEQ ID Nr. 6). In einer Ausführungsform ist das antisense-Nukleinsäuremolekül antisense zu einer "nicht-kodierenden Region" des kodierenden Strangs einer flh84g5-kodierenden Nukleotidsequenz. Der Begriff "nicht-kodierende Region" betrifft die 5'- und 3'-Sequenzen, welche die kodierende Region flankieren, die nicht in Aminosäuren übersetzt werden (d. h. ebenfalls als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen bezeichnet).
  • Anhand der hier offenbarten gegebenen Sequenzen des kodierenden Strangs, welche flh84g5 kodieren, (beispielsweise SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31) können erfindungsgemäße antisense Nukleinsäuren gemäß den Regeln der Watson und Crick Basenpaarung gestaltet werden. Das antisense-Nukleinsäuremolekül kann komplementär zu der gesamten kodierenden Region einer flh84g5 mRNA sein, ist jedoch vorzugsweise ein Oligonukleotid, welches lediglich zu einem Teil der kodierenden oder nicht-kodierenden Region einer flh84g5-mRNA antisense ist. Beispielsweise kann das antisense Oligonukleotid komplementär zu der die Translationsstartstelle der flh84g5-mRNA umgebenden Region sein.
  • Beispielsweise kann ein antisense Oligonukleotid ungefähr 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide lang sein. Eine antisense Nukleinsäure kann unter Verwendung einer chemischen Synthese und enzymatischen Ligationsreaktionen konstruiert werden, wobei im Stand der Technik bekannte Verfahren verwendet werden. So kann beispielsweise eine antisense Nukleinsäure (beispielsweise ein antisense Oligonukleotid) chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschiedenartig modifizierte Nukleotide verwendet werden, die gestaltet sind, um die biologische Stabilität der Moleküle zu erhöhen oder um die physische Stabilität des zwischen den antisense und sense Nukleinsäuren gebildeten Duplex zu erhöhen, so können beispielsweise Phosphorthioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele modifizierter Nukleotide, die zum Erzeugen der antisense Nukleinsäure verwendet werden können, umfassen 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, beta-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäure-methylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w, und 2,6-Diaminopurin. Alternativ kann die antisense Nukleinsäure biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in den eine Nukleinsäure in einer antisense Orientierung subkloniert wurde (d. h. eine RNA, die von der inserierten Nukleinsäure transkribiert wird, wird eine antisense Orientierung zu einer interessierenden Zielnukleinsäure aufweisen, wie in dem folgenden Unterabschnitt ausführlicher erläutert wird).
  • Die antisense Nukleinsäuremoleküle werden normalerweise einem Subjekt verabreicht oder in situ erzeugt, so dass sie hybridisieren mit oder bindet an zelluläre mRNA und/oder genomischen DNA, welche ein flh84g5-Polypeptid kodieren, um dadurch eine Expression des Polypeptids zu inhibieren, beispielsweise durch Inhibierung der Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität durch Bildung eines stabilen Duplexes erfolgen oder, beispielsweise in dem Fall eines antisense Nukleinsäuremoleküls, welches an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Ein Beispiel einer Verabreichungsroute eines erfindungsgemäßen antisense Nukleinsäuremoleküls umfasst eine direkte Injektion an eine Gewebestelle. Alternativ kann ein antisense Nukleinsäuremolekül modifiziert werden, um auf ausgewählte Zellen abzuzielen, und dann systemisch verabreicht werden. Beispielsweise kann zur systemischen Verabreichung ein antisense Molekül modifiziert werden, so dass es spezifisch an einen Rezeptor oder ein Antigen bindet, welcher/welches an einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert wird, beispielsweise durch Verbinden des antisense Nukleinsäuremoleküls an ein Peptid oder einen Antikörper, das/der an einen Zelloberflächen-Rezeptor oder ein Antigen bindet. Das antisense Nukleinsäuremolekül kann an Zellen ebenfalls unter Verwendung der hier beschriebenen Vektoren geliefert werden. Um ausreichende intrazellulare Konzentrationen der antisense Moleküle zu erreichen, sind Vektorkonstrukte bevorzugt, in denen das antisense Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken pol II- oder pol III-Promoters platziert ist.
  • Ein antisense Nukleinsäuremolekül kann ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül sein. Ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in denen, im Gegensatz zu den üblichen β-Einheiten die Stränge parallel zueinander laufen (Gaultier et al. (1987), Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641). Das antisense Nukleinsäuremolekül kann ebenfalls ein 2'-o-Methylribonukleotid umfassen (Inoue et al. (1987), Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al. (1987), FEBS Lett. 215:327-330).
  • Eine antisense Nukleinsäure kann ein Ribozym sein. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, die in der Lage sind eine einzelsträngige Nukleinsäure, wie eine mRNA, zu spalten, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen. Somit können Ribozyme (beispielsweise hammerhead-Ribozyme (beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988), Nature 334:585-591)) verwendet werden, um flh84g5-mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, um dadurch eine Translation von flh84g5-mRNA zu inhibieren. Ein Ribozym mit einer Spezifität für eine flh84g5-kodierende Nukleinsäure kann basierend auf der hier offenbarten Nukleotidsequenz einer flh84g5-cDNA aufgebaut werden (d. h. SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31). So kann beispielsweise ein Derivat einer Tetrahymena L-19 IVS-RNA konstruiert werden, in der die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle komplementär zu der Nukleotidsequenz ist, die in einer flh84g5-kodierenden mRNA gespalten werden soll. Siehe beispielsweise Cech et al. US-P-4,987,071 und Cech et al. US-P-5,116,742. Alternativ kann eine flh84g5-mRNA verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen auszuwählen. Siehe beispielsweise Bartel D. und Szostak J. W. (1993), Science 261:1411-1418.
  • Alternativ kann ein flh84g5-Genexpression durch Abzielen von Nukleotidsequenzen inhibiert werden, die komplementär zu der regulierenden Region von flh84g5 sind (beispielsweise den flh84g5-Promoter und/oder Enhancer bzw. Verstärker), um dreifach helikale Strukturen zu bilden, welche eine Transkription des flh84g5-Gens in Zielzellen verhindern. Siehe allgemein Helene C. (1991), Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene C. et al. (1992), Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; und Maher, L.J. (1992), Bioassays 14 (12):807-15.
  • II. Rekombinante Expressionsvektoren und Wirtszellen
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäure umfassen, die flh84g5 (oder einen Teil davon) kodiert. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das in der Lage ist eine andere Nukleinsäure, mit der es verbunden ist, zu transponieren. Eine Art eines Vektors ist ein "Plasmid", welches eine zirkuläre, doppelsträngige DNA-Schleife betrifft, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. Ein anderer Typ eines Vektors ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können sich in der Wirtszelle, in die sie eingeführt wurden, autonom replizieren (beispielsweise bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Replikationsursprung und episomale Säugetier-Vektoren). Andere Vektoren (beispielsweise nicht-episomale Säugetier-Vektoren) werden nach Einführung in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle integriert, und werden dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Darüber hinaus sind bestimmte Vektoren in der Lage die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden sind, zu leiten bzw. zu lenken. Derartige Vektoren werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Im Allgemeinen liegen Expressionsvektoren, die in rekombinanten DNA-Techniken verwendet werden, oftmals in der Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" synonym bzw. austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form eines Vektors darstellt. Jedoch beabsichtigt die Erfindung solch andere Formen von Expressionsvektoren, wie virale Vektoren (beispielsweise replikationsdefiziente Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren) zu umfassen, welche äquivalente Funktionen liefern.
  • Die erfindungsgemäßen, rekombinanten Expressionsvektoren umfassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer zur Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeigneten Form, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulierende Sequenzen umfassen, die basierend auf den zur Expression verwendeten Wirtszellen ausgewählt sind, die funktionsfähig mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verbunden sind. Im Rahmen eines rekombinanten Expressionsvektors soll "funktionsfähig verbunden" bedeuten, dass die interessierende Nukleotidsequenz an die regulatorische(n) Sequenz(en) in einer Art und Weise verbunden ist, welche eine Expression der Nukleotidsequenz ermöglicht (beispielsweise in einem in vitro-Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle geführt wird). Der Begriff "regulatorische Sequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionsregelelemente umfassen (beispielsweise Polyadenylierungssignale). Derartige regulierende Sequenzen sind beispielsweise in Goeddel (1990), Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA beschrieben. Regulatorische Sequenzen umfassen solche, die eine konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen leiten bzw. lenken und solche, welche eine Expression der Nukleotidsequenz lediglich in bestimmten Wirtszellen lenken (beispielsweise Gewebe-spezifische regulatorische Sequenzen). Dem Fachmann ist klar, dass die Gestaltung des Expressionsvektors von derartigen Faktoren abhängen kann, wie die Wahl der Wirtszelle, die transformiert wird, die gewünschte Expressionshöhe des Polypeptids, etc. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in Wirtszellen eingeführt werden, um dadurch Polypeptide oder Peptide, umfassend Fusionspolypeptide oder -peptide, zu erzeugen, welche durch hier beschriebene Nukleinsäuren kodiert werden (beispielsweise flh84g5-Polypeptide, mutante Formen von flh84g5, Fusionspolypeptide und dergleichen).
  • Die erfindungsgemäßen, rekombinanten Expressionsvektoren können für eine Expression von flh84g5 in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen gestaltet sein. So kann flh84g5 beispielsweise in bakteriellen Zellen, wie E. coli, Insektenzellen (beispielsweise unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefezellen oder Säugetierzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden ferner in Goeddel (1990), Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA erläutert. Alternativ kann der rekombinante Expressionsvektor, beispielsweise unter Verwendung von T7-Promoter regulatorischen Sequenzen und T7-Polymerase, in vitro transkripiert und translatiert werden.
  • Eine Expression von Polypeptiden in Prokaryonten wird am häufigsten in E. coli mit Vektoren ausgeführt, welche konstitutive oder induzierbare Promotoren umfassen, die die Expression von entweder Fusions- oder nicht-Fusionspolypeptiden lenken. Fusionsvektoren fügen eine Anzahl von Aminosäuren an ein darin kodiertes Polypeptid an, üblicherweise an den Aminoterminus des rekombinanten Polypeptids. Derartige Fusionsvektoren dienen üblicherweise drei Zwecken: 1) um die Expression rekombinanter Polypeptide zu erhöhen; 2) um die Löslichkeit des rekombinanten Polypeptids zu erhöhen; und 3) um in der Reinigung des rekombinanten Polypeptids zu unterstützten, indem sie als ein Ligand in einer Affinitätsreinigung wirken. In Fusionsexpressionsvektoren wird oftmals eine proteolytische Spaltungsstelle an der Verbindung des Fusionsrestes und des rekombinanten Polypeptids eingeführt, um eine Abtrennung des rekombinanten Polypeptids von dem Fusionsrest nach einer Reinigung des Fusionspolypeptids zu ermöglichen. Derartige Enzyme und die zugehörigen Erkennungssequenzen umfassen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase. Übliche Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. und Johnson, K.S. (1988), Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), welche entsprechend Glutathion-S-transferase (GST), Maltose E-bindendes Protein oder Protein-A an das rekombinante Zielpolypeptid fusionieren. In einer Ausführungsform wird die kodierende Sequenz des flh84g5 in einen pGEX-Expressionsvektor kloniert, um einen Vektor zu erzeugen, der ein Fusionspolypeptid kodiert, das vom N-Terminus zum C-Terminus umfasst, GST-Thrombin-Spaltungsstelle-flh84g5. Das Fusionspolypeptid kann unter Verwendung eines Glutathion-Agarose-Harzes durch Affinitätschromatographie gereinigt werden. Durch Spaltung des Fusionspolypeptids durch Thrombin kann rekombinantes flh84g5 gewonnen werden, das nicht mit GST fusioniert ist.
  • Beispiele geeigneter induzierbarer nicht-Fusions-Expressionsvektoren für E. coli umfassen pTrc (Amann et al. (1988), Gene 69:301-315) und pET 11d (Studier et al. (1990), Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California 60-89). Eine Expression des Zielgens von dem pTrc-Vektor beruht auf einer Wirts-RNA-Polymerase-Transkription von einem Hybrid trp-lac-Fusionspromoter. Eine Expression des Zielgens in dem pET 11d-Vektor beruht auf einer Transkription von einem T7 gn10-lac-Fusionspromoter, die durch eine co-exprimierte virale RNA-Polymerase (T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird durch Wirtsstämme BL21(DE3) oder HMS174(DE3) von einem sesshaften λ-Prophagen bereitgestellt, der ein T7 gn1-Gen unter der transkriptionellen Kontrolle des lavUV 5-Promoters beherbergt.
  • Eine Strategie um eine rekombinante Polypeptid-Expression in E. coli zu maximieren ist es, das Polypeptid in einem Wirtsbakterium mit einer beeinträchtigten Fähigkeit zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Polypeptids zu exprimieren (Gottesmann S., (1990), Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California, 119-128). Eine andere Strategie ist es, die Nukleinsäuresequenz der Nukleinsäure, die in einem Expressionsvektor eingeführt wird, so zu ändern, dass die individuellen Codons für jede Aminosäure jene sind, die vorzugsweise in E. coli verwendet werden (Wada et al. (1992), Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Derartige Änderungen von erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können durch standardmäßige DNA-Synthese-Techniken durchgeführt werden.
  • In einer anderen Ausführungsform ist der flh84g5-Expressionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele von Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerivisae umfassen pYepSec1 (Baldari et al. (1987), Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz, (1982), Cell 30:933-943, pJRY88 (Schultz et al. (1987), Gene 54:113-123), und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
  • Alternativ kann flh84g5 in Insektenzellen exprimiert werden, wobei beispielsweise Baculovirus-Expressionsvektoren verwendet werden. Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Polypeptiden in kultivierten Insektenzellen (beispielsweise Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Serien (Smith et al. (1983), Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) und die pVL-Serien (Lucklow und Summers (1989), Virology 170:31-39).
  • In einer noch weiteren Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in Säugetierzellen unter Verwendung eines Säugetier-Expressionsvektor exprimiert. Beispiele von Säugetier-Expressionsvektoren umfassen pCDM8 (Seed B. (1987), Nature 329:840) und pMT2PC (Kaufmann et al. (1987), EMBO J. 6:187-195). Bei Verwendung in Säugetierzellen werden die Kontroll- bzw. Regelfunktionen des Expressionsvektors oftmals durch virale regulatorische Elemente bereitgestellt. Beispielsweise sind allgemein verwendete Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus und Simian-Virus 40 abgeleitet. Hinsichtlich anderer geeigneter Expressionssysteme für sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen siehe Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsh, E. F., und Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY.
  • In einer anderen Ausführungsform ist der rekombinante Säugetier-Expressionsvektor in der Lage eine Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in einem bestimmten Zelltyp zu lenken bzw. zu leiten (so werden beispielsweise Gewebe-spezifische regulatorische Elemente verwendet, um die Nukleinsäure zu exprimieren). Gewebe-spezifische regulatorische Elemente sind im Stand der Technik bekannt. Nicht begrenzende Beispiele geeigneter Gewebe-spezifischer Promotoren umfassen den Albumin-Promoter (Leber spezifisch; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), Lymph-spezifische Promotoren (Calame und Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), insbesondere Promotoren von T-Zell-Rezeptoren (Winoto und Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) und Immunoglobuline (Banerji et al. (1983), Cell 33:729-740; Queen und Baltimore (1983) Cell 33:741-748), Neuron- spezifische Promotoren (d. h. der Neurofilament-Promotor; Byrne und Ruddle (1989), PNAS 86:5473-5477), Bauchspeicheldrüsen-spezifische Promotoren (Edlund et al. (1985), Science 230:912-916) und Milchdrüsen-spezifische Promotoren (beispielsweise Milchmolke-Promotor (milk whey promotor); US-P-4,873,316 und Europäische Patentanmeldung Nr. 264,166). Ebenfalls sind entwicklungsregulierte Promotoren umfasst, beispielsweise die hox-Promotoren der Maus (Kessel und Gruss (1990), Science 249:374-379) und der α-Fetoprotein-Promotor (Campes und Tilghman (1989), Genes Dev. 3:537-546).
  • Die Erfindung stellt ferner einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül umfasst, das in den Expressionsvektor in einer antisense Orientierung kloniert ist. Das heißt, das DNA-Molekül ist an eine regulatorische Sequenz in einer Art und Weise funktionsfähig verbunden, welche eine Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls ermöglicht, welches zur flh84g5-mRNA antisense ist. Es können regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die funktionsfähig an eine Nukleinsäure verbunden sind, die in der antisense Orientierung kloniert ist, welche die kontinuierliche Expression des antisense RNA-Moleküls in einer Vielzahl von Zelltypen lenkt, beispielsweise virale Promotoren und/oder Enhancer, oder es können regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, welche eine konstitutive, Gewebe-spezifische oder Zelltyp-spezifische Expression einer antisense RNA lenken. Der antisense Expressionsvektor kann in der Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder abgeschwächten Virus vorliegen, in den antisense Nukleinsäuren der Regulation bzw. Kontrolle einer hochwirksamen regulatorischen Region erzeugt, wobei die Aktivität von dieser durch den Zelltyp bestimmt werden kann, in den der Vektor eingeführt wird. Hinsichtlich einer Erläuterung der Regulation der Genexpression unter Verwendung von antisense Genen siehe Weintraub H. et al. (1986), Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol 1(1).
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Wirtszellen, in die ein erfindungsgemäßer, rekombinanter Expressionsvektor eingeführt wurde. Die Begriffe "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden hier synonym verwendet. Es ist klar, dass derartige Begriffe nicht nur die bestimmten betroffenen Zellen bzw. Subjekt-Zellen, sondern auch die Nachfahren oder potentiellen Nachfahren einer derartigen Zelle betreffen. Da in nachfolgenden Generationen aufgrund von entweder Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte Modifikationen auftreten können, können derartige Nachfahren tatsächlich nicht identisch zur Elternzelle sein, sie sind jedoch im Umfang der Begriffe, wie hier verwendet, umfasst.
  • Eine Wirtszelle kann eine beliebige prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Beispielsweise kann ein flh84g5-Polypeptid in bakteriellen Zellen, wie E. coli, Insektenzellen, Hefe oder Säugetierzellen (wie Chinese-Hamster-Ovary-Zellen (CHO) oder COS-Zellen) exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt.
  • Vektor-DNA kann in prokaryotische oder eukaryotische Zellen über herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken eingeführt werden. Wie hier verwendet, sollen die Begriffe "Transformation" und "Transfektion" eine Vielzahl im Stand der Technik bekannter Techniken zum Einführen von Fremdnukleinsäure (beispielsweise DNA) in eine Wirtszelle betreffen, umfassend Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation. Geeignete Verfahren zum Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen können in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Labor-Handbüchern gefunden werden.
  • Es ist bekannt, dass zur stabilen Transfektion von Säugetier-Zellen in Abhängigkeit des verwendeten Expressionsvektors und der verwendeten Transfektionstechnik, lediglich ein geringer Anteil an Zellen die Fremd-DNA in ihr Genom integrieren wird. Um diese Integranten zu identifizieren und auszuwählen wird im Allgemeinen ein Gen, das einen selektionierbaren Marker kodiert (beispielsweise eine Antibiotika-Resistenz) zusammen mit dem interessierenden Gen in die Wirtszellen eingeführt. Bevorzugte selektionierbare Marker umfassen solche, welche eine Resistenz gegen Arzneimittel, wie G418, Hygromycin und Methotrexat, verleihen. Eine Nukleinsäure, die einen selektionierbaren Marker kodiert, kann auf dem gleichen Vektor wie der, der flh84g5 kodiert, in eine Wirtszelle eingeführt werden, oder er kann auf einem separaten Vektor eingeführt werden. Zellen, die mit der eingeführten Nukleinsäure stabile transfiziert sind, können durch eine Arzneimittelselektion identifiziert werden (so werden beispielsweise Zellen, die das selektionierbare Markergen inkorporiert haben, überleben, während die anderen Zellen sterben).
  • Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle in Kultur, kann zum Erzeugen (d.h. zum Exprimieren) eines flh84g5-Polypeptids verwendet werden. Entsprechend stellt die Erfindung ferner Verfahren zum Herstellen von flh84g5-Polypeptid bereit, welche die erfindungsgemäßen Wirtszellen verwenden. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren ein Kultivieren der erfindungsgemäßen Wirtszelle (in die ein rekombinanter, flh84g5-kodierender Expressionsvektor eingeführt wurde) in einem geeigneten Medium bis flh84g5 hergestellt bzw. erzeugt ist. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner ein Isolieren von flh84g5 aus dem Medium oder der Wirtszelle.
  • Die erfindungsgemäßen Wirtszellen können ebenfalls verwendet werden, um nichtmenschliche, transgene Tiere zu erzeugen. Nicht-menschliche, transgene Tiere können in Screening-Assays verwendet werden, die zum Identifizieren von Agenzien oder Verbindungen, beispielsweise Arzneimittel, Apothekerwaren etc., gestaltet sind, die nachteilige Symptome ausgewählter Störungen, wie Störungen des Nervensystems, mit glatter Muskulatur assoziierte Störungen, Herzmuskel assoziierte Störungen und Drüsen assoziierte Störungen verbessern können. So ist in einer Ausführungsform eine erfindungsgemäße Wirtszelle beispielsweise eine befruchtete Oozyte oder eine embryonale Stammzelle, in die flh84g5-kodierende Sequenzen eingeführt wurden. Derartige Wirtszellen können dann verwendet werden, um nicht-menschliche, transgene Tiere zu erzeugen, bei denen in deren Genom exogene flh84g5-Sequenzen eingeführt wurden, oder homologe, rekombinante Tiere, bei denen endogene flh84g5-Sequenzen verändert wurden. Derartige Tiere sind nützlich, um die Funktion und/oder Aktivität von flh84g5 zu studieren und um Modulatoren einer flh84g5-Aktivität zu identifizieren und/oder zu bewerten. Wie hier verwendet, ist ein "transgenes Tier" ein nicht-menschliches Tier, vorzugsweise ein Säugetier, noch bevorzugter ein Nagetier, wie eine Ratte oder eine Maus, wobei eine oder mehrere Zellen des Tiers ein Transgen umfassen. Andere Beispiele transgener Tiere umfassen nicht-menschliche Primaten, Schaf, Hunde, Kühe, Ziegen, Hühnchen, Amphibien und dergleichen. Ein Transgen ist exogene DNA, die in das Genom einer Zelle integriert wurde, aus der sich ein transgenes Tier entwickelt und die in dem Genom des ausgereiften Tiers verbleibt, um dadurch die Expression eines kodierten Genprodukts in einer oder mehreren Zelltypen oder Geweben des transgenen Tiers zu lenken. Wie hier verwendet, ist ein "homologes, rekombinantes Tier" ein nicht-menschliches Tier, vorzugsweise ein Säugetier, noch bevorzugter eine Maus, in dem/der ein endogenes flh84g5-Gen durch homologe Rekombination zwischen dem endogenen Gen und einem exogenen DNA-Molekül, welches in eine Zelle des Tiers, beispielsweise eine embryonale Zelle des Tiers, vor der Entwicklung des Tiers eingeführt wurde, verändert wurde.
  • Ein transgenes Tier kann dadurch erzeugt werden, dass flh84g5-kodierende Nukleinsäure in den männlichen Vorkern einer befruchteten Oozyte, beispielsweise durch Mikroinjektion, retrovirale Infektion, eingeführt wird und sich die Oozyte in einem pseudoträchtigen, weiblichen Zieh- bzw. Pflegetier entwickeln kann. So kann die menschliche flh84g5-cDNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 als ein Transgen in das Genom eines nicht-menschlichen Tiers eingeführt werden. Weiterhin kann die flh84g5-cDNA-Sequenz der Ratte von SEQ ID Nr. 4 als ein Transgen in das Genom eines Tiers, das keine Ratte ist, eingeführt werden. Darüber hinaus kann ein nicht-menschliches Homolog des menschlichen flh84g5-Gens, wie ein flh84g5-Gen der Maus, basierend auf einer Hybridisierung mit der flh84g5-cDNA aus Mensch oder Ratte isoliert (nachstehend ausführlicher in Unterabschnitt I erläutert) und als ein Transgen verwendet werden. Ebenfalls können intronische Sequenzen und Polyadenylierungssignale in das Transgen eingeschlossen werden, um die Wirksamkeit einer Expression des Transgens zu erhöhen. So kann/können (ein) Gewebe-spezifische regulatorische Sequenz/Sequenzen funktionsfähig an das flh84g5-Transgen verbunden werden, um eine Expression des flh84g5-Polypeptids in bestimmten Zellen zu lenken. Verfahren zum Erzeugen transgener Tiere über embryonale Manipulation und Mikroinjektion, insbesondere Tiere wie Maus, sind im Stand der Technik gebräuchlich geworden und sind beispielsweise erläutert in US-P-4,736,866 und 4,870,009, beide von Leder et al., US-P-4,873,191 von Wagner et al. und in Hogan B. (1986), Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Ähnliche Verfahren werden zur Herstellung anderer transgener Tiere verwendet. Ein transgenes Founder- bzw. Begründer-Tier kann basierend auf dem Vorliegen des flh84g5-Transgens in dessen Genom und/oder einer Expression von flh84g5-mRNA in Geweben oder Zellen des Tiers identifiziert werden. Ein transgenes Founder-Tier kann dann verwendet werden, um zusätzliche Tiere zu züchten, welche das Transgen tragen. Darüber hinaus können transgene, ein flh84g5-kodierendes Transgen tragende Tiere ferner mit anderen transgenen Tieren, die andere Transgene tragen, in der Züchtung verwendet werden.
  • Um ein homologes, rekombinantes Tier zu erzeugen, wird ein Vektor hergestellt, der mindestens einen Teil eines flh84g5-Gens umfasst, in das eine Deletion, Addition oder Substitution eingeführt wurde, um dadurch das flh84g5-Gen zu verändern, beispielsweise funktional zu unterbrechen. Das flh84g5-Gen kann ein menschliches Gen sein (beispielsweise von einem menschlichen, genomischen Klon, der aus einer menschlichen genomischen Bank isoliert wurde, die mit der cDNA von SEQ ID Nr. 1 durchmustert wurde), vorzugsweise ist es jedoch ein flh84g5-Gen der Ratte von SEQ ID Nr. 4 oder 31, oder ein anderes nicht-menschliches Homolog eines menschlichen flh84g5-Gens. So kann beispielsweise ein flh84g5-Gen der Maus aus einer genomischen DNA-Bank der Maus isoliert werden, wobei die flh84g5-cDNA von SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 als Sonde verwendet wird. Das flh84g5-Gen der Maus kann dann verwendet werden, um einen homologen Rekombinationsvektor zu konstruieren, der geeignet ist ein endogenes flh84g5-Gen im Genom der Maus zu verändern. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor so gestaltet, dass nach homologer Rekombination, das endogene flh84g5-Gen funktional unterbrochen ist (d. h. nicht länger ein funktionales Polypeptid kodiert; ebenfalls als ein "knock-out"-Vektor bezeichnet). Alternativ kann der Vektor so gestaltet sein, dass nach homologer Rekombination, das endogene flh84g5-Gen mutiert oder anders verändert ist, aber noch funktionales Polypeptid kodiert (so kann beispielsweise die stromaufwärts gelegene regulatorische Region verändert sein, um dadurch die Expression des endogenen flh84g5-Polypeptids zu verändern). In dem homologen Rekombinationsvektor ist der veränderte Teil des flh84g5-Gens an dessen 5'- und 3'-Enden durch zusätzliche Nukleinsäuren des flh84g5-Gens flankiert, um so zu ermöglichen, dass in einer embryonalen Stammzelle eine homologe Rekombination zwischen dem durch den Vektor getragenen, exogenen flh84g5-Gen und einem endogenen flh84g5-Gen stattfinden kann. Die zusätzlich flankierende flh84g5-Nukleinsäure ist von ausreichender Länge für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen. Normalerweise werden einige Kilobasen an flankierender DNA (sowohl an den 5'- als auch an den 3'-Enden) in den Vektor eingeschlossen (hinsichtlich einer Erläuterung homologer Rekombinationsvektoren siehe beispielsweise Thomas, K.R. und Capecchi, M.R. (1987), Cell 51:503). Der Vektor wird in eine embryonale Stammzelllinie (beispielsweise durch Elektroporation) eingeführt und Zellen, in denen das eingeführt flh84g5-Gen homolog mit dem endogenen flh84g5-Gen rekombiniert wurde, werden ausgewählt bzw. selektioniert (siehe beispielsweise Li, E. et al. (1992), Cell 69:915). Die ausgewählten Zellen werden dann in einen Blastozysten eines Tiers (beispielsweise einer Maus) injiziert, um Aggregationschimere zu bilden (siehe beispielsweise Bradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, Herausgeber, (IRL, Oxford, 1987), Seiten 113-152). Ein chimerer Embryo kann dann in ein geeignetes pseudoträchtiges, weibliches Pflegetier implantiert werden und der Embryo wird ausgetragen. Nachkommen, welche die homolog rekombinierte DNA in deren Keimzellen beherbergen, können verwendet werden, um Tiere zu züchten, bei denen alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA durch Keimlinien-Übertragung des Transgens umfassen. Verfahren zum Konstruieren homologer Rekombinationsvektoren und homologer, rekombinanter Tiere sind ferner in Bradley A. (1991), Current Opinion in Biotechnology 2:823-829 und der PCT-Publikation Nr. WO 90/11354; WO 91/01140; WO 92/0968 und WO 93/04169 beschrieben.
  • Es können transgene, nicht-menschliche Tiere erzeugt werden, welche ausgewählte Systeme umfassen, die eine regulierte Expression des Transgens ermöglichen. Ein Beispiel eines derartigen Systems ist das cre/loxP-Rekombinase-System des Bakteriophagen P1. Hinsichtlich einer Erläuterung des cre/loxP-Rekombinase-System siehe beispielsweise Lakso et al. (1992), PNAS 89:6232-6236. Ein anderes Beispiel eines Rekombinase-Systems ist das FLP-Rekombinase-System von Saccharomyces cerevisiae (O'Gorman et al. (1991), Science 251:1351-1355). Wird ein cre/loxP-Rekombinase-System verwendet, um die Expression des Transgens zu regulieren, werden Tiere benötigt, die Transgene umfassen, die sowohl die Cre-Rekombinase als auch ein ausgewähltes Polypeptid kodieren. Derartige Tiere können durch die Konstruktion von "doppelt" transgenen Tieren, beispielsweise durch Paaren zweier transgener Tiere, bereitgestellt werden, wobei eines ein Transgen umfasst, welches ein ausgewähltes Polypeptid kodiert, und das andere ein Transgen umfasst, welches eine Rekombinase kodiert.
  • Klone der hier beschriebenen, nicht-menschlichen, transgenen Tiere können ebenfalls gemäß der in Wilmut, I. et al. (1997), Nature 385:810-813 und in den PCT-Publikation Nr. WO 97/07668 und WO 97/07669 beschriebenen Verfahren erzeugt werden. In Kürze, es kann eine Zelle, beispielsweise eine somatische Zelle, von einem transgenen Tier isoliert und induziert werden den Wachstumszyklus zu verlassen und in die G0-Phase einzutreten. Die ruhende Zelle kann dann, beispielsweise durch die Verwendung eines elektrischen Pulses, mit einer entkernten Oozyte von einem Tier der gleichen Spezies, von dem die ruhende Zelle isoliert wurde, fusioniert werden. Die rekonstruierte Oozyte wird dann kultiviert, so dass sie sich zur Morula oder zum Blastozyst entwickelt und dann in ein pseudoträchtiges, weibliches Pflegetier übertragen. Das von diesem weiblichen Pflegetier geborene Nachkommen ist ein Klone des Tiers von dem die Zelle, beispielsweise die somatische Zelle, isoliert wurde.
  • III. Isolierte flh84g5-Polypeptide und anti-flh84g5-Antikörper
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte flh84g5-Polypeptide und biologisch aktive Teile davon. Die Erfindung ermöglicht ebenfalls Peptidfragmente, die zur Verwendung als Immunogene geeignet sind, um anti-flh84g5-Antikörper bereitzustellen. Ein "isoliertes" oder "gereinigtes" Polypeptid, oder ein biologisch aktiver Teil davon, ist im Wesentlichen frei von zellulärem Material, wenn es durch rekombinante DNA-Techniken erzeugt wurde, oder chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wurde. Der Begriff "im Wesentlichen frei von zellulärem Material" umfasst Präparationen bzw. Darstellungen von flh84g5-Polypeptid, in denen das Polypeptid von zellulären Komponenten der Zellen getrennt ist, in denen es natürlich oder rekombinant erzeugt wurden. In einer Ausführungsform umfasst der Begriff "im Wesentlichen frei von zellulärem Material" Präparationen eines flh84g5-Polypeptids, das weniger als ungefähr 30% (bezogen auf Trockengewicht) von nicht-flh84g5-Polypeptid (hier ebenfalls als ein "kontaminierendes Polypeptid" bezeichnet) umfasst, noch bevorzugter weniger als ungefähr 20% von nicht-flh84g5-Polypeptid, noch mehr bevorzugt weniger als ungefähr 10% von nicht-flh84g5-Polypeptid und am meisten bevorzugt weniger als ungefähr 5% von nicht-flh84g5-Polypeptid. Wird das flh84g5-Polypeptid oder ein biologisch aktiver Teil davon rekombinant erzeugt, ist es vorzugsweise ebenfalls frei von Kulturmedium, d. h. das Kulturmedium stellt weniger als ungefähr 20%, noch bevorzugter weniger als ungefähr 10% und am meisten bevorzugt weniger als ungefähr 5% des Volumens der Polypeptid-Präparation dar. Die Formulierung "im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien" umfasst Präparationen eines flh84g5-Polypeptids, in denen das Polypeptid von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien getrennt wurde, die an der Synthese des Polypeptids beteiligt sind. In einer Ausführungsform umfasst die Formulierung "im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien" Präparationen eines flh84g5-Polypeptids, welches weniger als ungefähr 30% (bezogen auf Trockengewicht) von chemischen Vorstufen oder von nicht-flh84g5-Chemikalien aufweisen, noch bevorzugter weniger als ungefähr 20% von chemischen Vorstufen oder von nicht-flh84g5-Chemikalien, noch mehr bevorzugt weniger als ungefähr 10% von chemischen Vorstufen oder von nicht-flh84g5-Chemikalien und am meisten bevorzugt weniger als ungefähr 5% von chemischen Vorstufen oder von nicht-flh84g5-Chemikalien. In bevorzugten Ausführungsformen fehlen isolierten Polypeptiden oder biologisch aktiver Teilen davon kontaminierende Polypeptide aus dem gleichen Tier, von dem das flh84g5-Polypeptid abgeleitet ist. Normalerweise werden derartige Polypeptide durch rekombinante Expression eines beispielsweise menschlichen flh84g5-Polypeptids in einer nicht-menschlichen Zelle erzeugt.
  • Ein erfindungsgemäßes, isoliertes flh84g5-Polypeptid oder ein Teil davon kann eine flh84g5-Ligandenantwort in einer flh84g5-Liganden-gesteuerten Zelle modulieren oder kann eine natürlich vorkommende, nicht funktionale allelische Variante eines flh84g5-Polypeptids sein. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Polypeptid oder ein Teil davon eine Aminosäuresequenz, die ausreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32 ist, so dass das Polypeptid oder ein Teil davon die Fähigkeit beibehält eine flh84g5-Liganden-Antwort in einer flh84g5-Liganden-gesteuerten Zelle zu modulieren. Dieser Teil des Polypeptids ist vorzugsweise ein biologisch aktiver Teil, wie hier beschrieben. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist das menschliche flh84g5-Polypeptid (d. h. Aminosäurereste 1-398 von SEQ ID Nr. 2) oder das flh84g5-Polypeptid der Ratte (d. h. Aminosäurereste 1-445 von SEQ ID Nr. 5 oder Aminosäurereste 1-401 von SEQ ID Nr. 32) eine entsprechend in SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32 gezeigte Aminosäuresequenz auf, oder eine Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids kodiert ist, welches bei der ATTC® mit der Eintrittsnummer 98902 hinterlegt ist. In einer noch anderen bevorzugten Ausführungsform weist das flh84g5-Polypeptid eine Aminosäuresequenz auf, die durch eine Nukleotidsequenz kodiert ist, die an die Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, welches bei der ATTC® mit der Eintrittsnummer 98902 hinterlegt ist, hybridisiert, beispielsweise unter stringenten Bedingungen hybridisiert. In einer noch anderen bevorzugten Ausführungsform weist das flh84g5-Polypeptid eine Aminosäuresequenz auf, die durch eine Nukleotidsequenz kodiert ist, die mindestens ungefähr 30-35%, vorzugsweise mindestens ungefähr 40-45%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 50-55%, noch mehr bevorzugt mindestens ungefähr 60-65%, noch mehr bevorzugt mindestens ungefähr 70-75%, noch mehr bevorzugt mindestens ungefähr 80-85% und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 90-95% oder mehr zu der Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids homolog ist, das bei der ATTC® mit der Eintrittsnummer 98902 hinterlegt ist. Die bevorzugten, erfindungsgemäßen flh84g5-Polypeptide weisen ebenfalls vorzugsweise mindestens eine der hier beschriebenen flh84g5-Aktivitäten auf. Beispielsweise umfasst ein bevorzugtes, erfindungsgemäßes flh84g5-Polypeptid eine Aminosäuresequenz, welche durch eine Nukleotidsequenz kodiert ist, die an die Nukleotidsequenz des DNA-Inserts des Plasmids, welches bei der ATTC® mit der Eintrittsnummer 98902 hinterlegt ist, hybridisiert, beispielsweise unter stringenten Bedingungen hybridisiert, und welches eine flh84g5-Ligandenantwort in einer flh84g5-Liganden-gesteuerten Zelle modulieren kann.
  • In anderen Ausführungsformen ist das flh84g5-Polypeptid im Wesentlichen homolog zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32 und behält die funktionale Aktivität des Polypeptids von SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32 bei, unterscheidet sich jedoch in der Aminosäuresequenz aufgrund einer natürlichen, allelischen Variation oder Mutagenese, wie vorstehend im Detail in Unterabschnitt I erläutert. Entsprechend ist das flh84g5-Polypeptid ein Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 95% identisch zu der gesamten Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32 ist, und welche mindestens eine der hier beschriebenen flh84g5-Aktivitäten aufweist.
  • Biologisch aktive Teile des flh84g5-Polypeptids umfassen Peptide, die Aminosäuresequenzen umfassen, die abgeleitet sind von der Aminosäuresequenz des flh84g5-Polypeptids, beispielsweise der in SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32 gezeigten Aminosäuresequenz oder der Aminosäuresequenz eines Polypeptids, welches homolog zu dem flh84g5-Polypeptid ist, die weniger Aminosäuren umfassen als das Volllängen-flh84g5-Polypeptid oder das Volllängen-Polypeptid, welches homolog zu dem flh84g5-Polypeptid ist, und mindestens eine Aktivität des flh84g5-Polypeptids zeigen. Normalerweise umfassen biologisch aktive Teile (Peptide, beispielsweise Peptide, die beispielsweise 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren lang sind) eine Domäne oder ein Motiv, beispielsweise eine Transmembran-Domäne, mit mindestens einer Aktivität des flh84g5-Polypeptids. Vorzugsweise ist die Domäne eine Transmembran-Domäne, die von einem Menschen, dargestellt durch SEQ ID Nr. 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder 13, oder den entsprechenden Sequenzen von Ratte abgeleitet ist. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der biologisch aktive Teil des Polypeptids, der die Transmembran-Domäne umfasst, die Aktivität eines G-Proteins in einer Zelle modulieren und/oder kann eine flh84g5-Ligandenantwort in einer Zelle, beispielsweise einer flh84g5-Liganden-gesteuerten Zelle, beispielsweise einer Gehirnzelle, modulieren, um dadurch die flh84g5-Liganden-gesteuerte Zelle vorteilhaft zu beeinflussen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der biologisch aktive Teil eine Transmembran-Domäne von flh84g5, wie durch Aminosäurereste 34-59 (SEQ ID Nr. 7), 73-91 (SEQ ID Nr. 8), 109-130 (SEQ ID Nr. 9), 152-174 (SEQ ID Nr. 10), 197-219 (SEQ ID Nr. 11), 360-380 (SEQ ID Nr. 12) und 396-416 (SEQ ID Nr. 13) dargestellt, oder die entsprechenden Sequenzen von Ratte, die in SEQ ID Nr. 14-20 und 34-39 gezeigt sind. Darüber hinaus können andere biologisch aktive Teile, in denen andere Regionen bzw. Bereiche des Polypeptids deletiert sind, durch rekombinante Techniken hergestellt werden und hinsichtlich einer oder mehrerer der hier beschriebenen Aktivitäten bewertet werden. Vorzugsweise umfassen die biologisch aktiven Teile des flh84g5-Polypeptids eine oder mehrere ausgewählte Domänen/Motive, oder Teile davon, die eine biologische Aktivität aufweisen.
  • Vorzugsweise werden flh84g5-Polypeptide durch rekombinante DNA-Techniken erzeugt. So wird beispielsweise ein Nukleinsäuremolekül, welches das Polypeptid kodiert, in einen Expressionsvektor (wie vorstehend beschrieben) kloniert, der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle (wie vorstehend beschrieben) eingeführt und das flh84g5-Polypeptid wird in der Wirtszelle exprimiert. Das flh84g5-Polypeptid kann dann von den Zellen durch ein geeignetes Reinigungsschema unter Verwendung von standardmäßigen Polypeptidreinigungstechniken isoliert werden. Alternativ zur rekombinanten Expression, kann ein flh84g5-Polypeptid, -Protein oder -Peptid chemisch synthetisiert werden, wobei standardmäßige Peptidsynthesetechniken verwendet werden. Darüber hinaus kann natives flh84g5-Polypeptid von Zellen isoliert werden (beispielsweise hippocampale Zellen, Zellen der Substantia nigra, Zellen der Ohrspeicheldrüse), wobei beispielsweise ein anti-flh84g5-Antikörper verwendet wird (nachstehend im Detail erläutert).
  • Die Erfindung stellt ebenfalls flh84g5-Chimere oder Fusionspolypeptide bereit. Wie hier verwendet umfasst ein flh84g5-"chimeres Polypeptid" oder "Fusionspolypeptid" ein flh84g5-Polypeptid, das funktionsfähig an ein nicht-flh84g5-Polypeptid verbunden ist. Ein "flh84g5-Polypeptid" betrifft ein Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz entsprechend zu flh84g5 aufweist, wohingegen ein "nicht-flh84g5-Polypeptid" ein heterologes Polypeptid betrifft, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die einem Polypeptid entspricht, welches im Wesentlichen nicht homolog zu dem flh84g5-Polypeptid ist, beispielsweise ein Polypeptid, das von dem flh84g5-Polypeptid verschieden ist und das von dem gleichen oder einem unterschiedlichen Organismus abgeleitet ist. Im Rahmen des Fusionspolypeptids, soll die Formulierung "funktionsfähig verbunden" anzeigen, dass das flh84g5-Polypeptid und das nicht-flh84g5-Polypeptid im Leserahmen miteinander fusioniert sind. Das nicht-flh84g5-Polypeptid kann an den N-Terminus oder C-Terminus des flh84g5-Polypeptids fusioniert werden. So ist in einer Ausführungsform das Fusionspolypeptid beispielsweise ein GST-flh84g5-Fusionspolypeptid, bei dem die flh84g5-Sequenzen an den C-Terminus der GST-Sequenzen fusioniert sind. Andere Typen von Fusionspolypeptiden umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, enzymatische Fusionspolypeptide, beispielsweise beta-Galactosidase-Fusionen, Hefe-Zwei-Hybrid-GAL-Fusionen, Poly-His-Fusionen und Ig-Fusionen. Derartige Fusionspolypeptide, insbesondere Poly-His-Fusionen, können die Reinigung von rekombinantem flh84g5 erleichtern. In einer anderen Ausführungsform ist das Fusionspolypeptid ein flh84g5-Polypeptid, welches eine heterologe Signalsequenz an dessen N-Terminus umfasst. In bestimmten Wirtszellen (beispielsweise Säugetier-Wirtszellen) kann eine Expression und/oder Absonderung von flh84g5 durch Verwendung einer heterologen Signalsequenz erhöht werden.
  • Vorzugsweise wird ein erfindungsgemäßes flh84g5-chimeres Polypeptid oder -Fusionspolypeptid durch standardmäßige, rekombinante DNA-Techniken erzeugt. So werden beispielsweise DNA-Fragmente, die für verschiedene Polypeptidsequenzen kodieren, gemäß den herkömmlichen Techniken zusammen im Leserahmen ligiert, beispielsweise unter Verwendung von Endpunkten mit stumpfen Enden oder versetzten Enden zur Ligation, Verdau mit Restriktionsenzym, um geeignete Endpunkte bereitzustellen, soweit erforderlich Auffüllen von kohäsiven Enden, Behandlung mit alkaliner Phosphatase, um ein ungewünschtes Zusammenfügen zu verhindern, und enzymatische Ligation. In einer anderen Ausführungsform kann das Fusionsgen durch herkömmliche Techniken synthetisiert werden, welche automatisierte DNA-Synthesizer umfassen. Alternativ kann eine PCR-Amplifikation bzw. -Verstärkung der Genfragmente durchgeführt werden, wobei Ankerprimer verwendet werden, die zu komplementären Überhängen zwischen zwei aufeinanderfolgenden Fragmenten führen, welche nachfolgend angelagert (annealen) und reamplifiziert werden können, um eine chimere Gensequenz zu erzeugen (siehe beispielsweise Current Protocols in Molecular Biology (1992). Ausubel et al., Herausgeber, John Wiley & Sons). Darüber hinaus sind im Handel viele Expressionsvektoren verfügbar, die bereits einen Fusionsrest kodieren (beispielsweise ein GST-Polypeptid). Eine flh84g5-kodierende Nukleinsäure kann in einen derartigen Expressionsvector kloniert werden, so dass der Fusionsrest im Leserahmen an das flh84g5-Polypeptid verbunden wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Homologe der flh84g5-Polypeptide, die entweder als ein flh84g5-Agonist (mimetisch) oder als ein flh84g5-Antagonist fungieren. In einer bevorzugten Ausführungsform stimulieren bzw. inhibieren die flh84g5-Agonisten und -Antagonisten eine Teilmenge der biologischen Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des flh84g5-Polypeptids. Somit können durch Behandlung mit einem Homolog mit begrenzter Funktion spezifische biologische Wirkungen ausgelöst werden. In einer Ausführungsform weist eine Behandlung eines Subjekts mit einem Homolog, welches eine Teilmenge der biologischen Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des Polypeptids aufweist, weniger Nebenwirkungen bezogen zu einer Behandlung mit der natürlich vorkommenden Form des flh84g5-Polypeptids in einem Subjekt auf.
  • Homologe des flh84g5-Polypeptids können durch Mutagenese, beispielsweise diskrete Punktmutation, oder Verkürzung des flh84g5-Polypeptids erzeugt werden. Wie hier verwendet betrifft der Begriff "homolog" eine variante Form des flh84g5-Polypeptids, welches als ein Agonist oder Antagonist der Aktivität des flh84g5-Polypeptids fungiert. Ein Agonist des flh84g5-Polypeptids kann im Wesentlichen die gleichen oder eine Teilmenge der biologischen Aktivitäten des flh84g5-Polypeptids beibehalten. Ein Antagonist des flh84g5-Polypeptids kann eine oder mehrere der Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des flh84g5-Polypeptids inhibieren, beispielsweise durch kompetitives Binden an ein stromabwärtiges oder stromaufwärtiges Element der flh84g5-Kaskade, die das flh84g5-Polypeptid umfasst. Somit können erfindungsgemäße flh84g5-Polypeptide aus Säugetieren, und Homologe davon, entweder positive oder negative Regulatoren der flh84g5-Liganden-Antworten in flh84g5-Liganden-gesteuerten Zellen sein.
  • In einer alternativen Ausführungsform können Homologe des flh84g5-Polypeptids durch Durchmustern kombinatorische Banken von Mutanten, beispielsweise Verkürzungsmutanten, des flh84g5-Polypeptids nach flh84g5-Polypeptid-Agonisten oder -Antagonisten-Aktivität identifiziert werden. In einer Ausführungsform wird eine vielfältige Bank von flh84g5-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Höhe der Nukleinsäure erzeugt und wird durch eine vielfältige Genbank kodiert. Eine vielfältige Bank von flh84g5-Varianten kann beispielsweise durch enzymatische Ligation eines Gemisches von synthetischen Oligonukleotiden in Gensequenzen erzeugt werden, so dass ein degenerierter Satz an potentiellen flh84g5-Sequenzen als individuelle Polypeptide exprimiert werden kann, oder alternativer als ein Satz an längeren Fusionspolypeptiden (beispielsweise zum Phagen-Display), welche den Satz an flh84g5-Sequenzen darin umfassen. Es existiert eine Vielzahl an Verfahren, die verwendet werden können, um Banken von potentiellen flh84g5-Homologen aus einer degenerierten Oligonukleotid-Sequenz zu erzeugen. Es kann eine chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz in einem automatisierten DNA-Synthesizer durchgeführt werden, wobei das synthetische Gen dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert wird. Die Verwendung eines degenerierten Satzes an Genen ermöglicht die Bereitstellung von allen der Sequenzen, die den gewünschten Satz an potentiellen flh84g5-Sequenzen kodieren, in einem Gemisch. Verfahren zum Synthetisieren degenerierter Oligonukleotide sind im Stand der Technik bekannt (siehe beispielsweise Narang, S.A. (1983), Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984), Annu Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984), Science 198:1056; Ike et al. (1983), Nucleic Acid Res. 11:477).
  • Zusätzlich können Banken von Fragmenten des flh84g5-Polypeptids kodierende verwendet werden, um eine vielfältige Populationen an flh84g5-Fragmenten zum Durchmustern und zur nachfolgender Auswahl bzw. Selektion von Homologen eines flh84g5-Polypeptids zu erzeugen. In einer Ausführungsform kann eine Bank von kodierenden Sequenzfragmenten durch Behandlung eines doppelsträngigen PCR-Fragments einer flh84g5-kodierenden Sequenz mit einer Nuclease unter Bedingungen erzeugt werden, in denen es lediglich ungefähr einmal pro Molekül zu einem Einzelstrangbruch (nicking) kommt, Denaturieren der doppelsträngigen DNA, Renaturieren der DNA um doppelsträngige DNA zu bilden, die sense/antisense-Paare aus verschiedenen Produkten mit Einzelstrangbruch umfassen kann, Entfernen einzelsträngiger Teile von wieder gebildeten Duplexen durch Behandlung mit S1-Nuclease und Ligation der so erhaltenen Fragmentbank in einen Expressionsvektor. Durch dieses Verfahren kann eine Expressionsbank abgeleitet werden, welche N-Terminale, C-Terminale und innere Fragmente mit verschiedenen Größen des flh84g5-Polypeptids kodiert.
  • Im Stand der Technik sind mehrer Techniken zum Durchmustern von Genprodukten von kombinatorischen Banken bekannt, die durch Punktmutationen oder Verkürzung bzw. Abschneiden erzeugt wurden, und zum Durchmustern von cDNA-Banken nach Genprodukten, welche eine ausgewählte Eigenschaft aufweisen. Derartige Techniken können für ein schnelles Durchmustern von Gen-Banken angepasst werden, die durch kombinatorische Mutagenese von flh84g5-Homologen erzeugt wurden. Die am häufigsten zum Durchmustern großer Genbanken verwendeten Techniken, die für eine Analyse im Hochdurchsatz zugänglich sind, umfassen normalerweise Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren geeigneter Zellen mit der so erhaltenen Bank an Vektoren, und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, in denen ein Nachweis einer gewünschten Aktivität eine Isolierung des Vektors erleichtert, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde. So kann Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine neue Technik, welche die Häufigkeit an funktionalen Mutanten in den Banken erhöht, in Kombination mit den Screening-Assays verwendet werden, um flh84g5-Homologe zu identifizieren (Arkin and Yourvan (1992), PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993), Protein Engineering 6(3):327-331).
  • In einer Ausführungsform können zellbasierende Assays ausgenutzt werden, um eine vielfältige flh84g5-Bank zu analysieren. So kann beispielsweise eine Bank von Expressionsvektoren in eine Zelllinie transfiziert werden, die gewöhnlich auf flh84g5 Liganden reagieren ist. Die transfizierten Zellen werden dann mit flh84g5-Ligand kontaktiert, wobei die Wirkung der flh84g5-Mutanten auf eine Signalisierung durch flh84g5-Ligand nachgewiesen werden kann, beispielsweise durch Erfassen einer intrazellulären Calciumkonzentration. Von den Zellen, die eine Inhibierung oder alternativ eine Potenzierung der flh84g5-Liganden-Induktion zeigen, kann dann Plasmid-DNA gewonnen werden, und die individuellen Klone können weiter charakterisiert werden.
  • Ein isoliertes flh84g5-Polypeptid oder ein Teil oder ein Fragment davon kann als ein Immunogen verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, welche flh84g5 binden, wobei Standardtechniken zum Herstellen polyklonaler und monoklonaler Antikörper verwendet werden. Es kann das Volllängen-flh84g5-Polypeptid verwendet werden, oder alternativ stellt die Erfindung antigenische Peptidfragmente des flh84g5 zur Verwendung als Immunogene bereit. Das antigenische Peptid von flh84g5 umfasst mindestens acht Aminosäurereste der in SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32 gezeigten Aminosäuresequenz und umfasst ein Epitop von flh84g5, so dass ein gegen das Peptid gerichteter Antikörper einen spezifischen Immunkomplex mit flh84g5 bildet. Vorzugsweise umfasst das antigenische Peptid mindestens 10 Aminosäurereste, noch bevorzugter mindestens 15 Aminosäurereste, noch mehr bevorzugt mindestens 20 Aminosäurereste und am meisten bevorzugt mindestens 30 Aminosäurereste. Bevorzugte Epitope, die durch das antigenische Peptid umfasst sind, sind Regionen von flh84g5, die auf der Oberfläche des Polypeptids lokalisiert sind, beispielsweise hydrophile Regionen.
  • Ein flh84g5-Immunogen wird normalerweise verwendet, um Antikörper durch Immunisierung eines geeigneten Subjekts (beispielsweise Kaninchen, Ziege, Maus oder ein anderes Säugetier) mit dem Immunogen herzustellen. Eine geeignete immunologische Präparation kann beispielsweise rekombinant exprimiertes flh84g5-Polypeptid oder ein chemisch synthetisiertes flh84g5-Peptid umfassen. Die Präparation kann ferner ein Adjuvans umfassen, wie vollständiges Freund's Adjuvans oder unvollständiges Freund's Adjuvans, oder ähnliche immunstimulatorische Agenzien. Eine Immunisierung eines geeigneten Subjekts mit einer immunogenen flh84g5-Präparation induziert eine polyklonale anti-flh84g5-Antikörperantwort.
  • Entsprechend betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung anti-flh84g5-Antikörper. Der Begriff "Antikörper", wie hier verwendet, betrifft Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen, d. h. Molekül, die eine Antigenbindestelle umfassen, welche ein Antigen, wie flh84g5, spezifisch bindet (damit immunreagiert). Beispiele von immunologisch aktiven Teilen eines Immunglobulinmoleküls umfassen F(ab)- und F(ab')2-Fragmente, die durch Behandlung des Antikörpers mit einem Enzym, wie Pepsin, erzeugt werden können. Die Erfindung stellt polyklonale und monoklonale Antikörper bereit, die flh84g5 binden. Der Begriff "monoklonaler Antikörper" oder "monoklonale Antikörperzusammensetzung", wie hier verwendet, betrifft eine Population von Antikörper-Molekülen, die lediglich eine Spezies an Antigenbindestelle umfassen, die in der Lage ist eine Immunreaktion mit einem bestimmten Epitop von flh84g5 zu zeigen. Somit zeigt eine monoklonale Antikörperzusammensetzung normalerweise eine einzige Bindeaffinität für ein bestimmtes flh84g5-Polypeptid, mit dem es immunreagiert.
  • Polyklonale anti-flh84g5-Antikörper können, wie vorstehend beschrieben, durch Immunisieren eines geeigneten Subjekts mit einem flh84g5-Immunogen hergestellt werden. Der anti-flh84g5-Antikörper-Titer in dem immunisierten Subjekt kann über die Zeit durch Standardtechniken beobachtet werden, wie mit einen Enzym-gekoppelten Immunoabsorptionsassay (ELISA), wobei immobilisiertes flh84g5 verwendet wird. Falls gewünscht, können die Antikörper-Moleküle, die gegen flh84g5 gerichtet sind, aus dem Säugetier isoliert werden (beispielsweise aus dem Blut) und weiter durch wohlbekannte Techniken, wie Protein-A-Chromatographie, gereinigt werden, um die IgG-Fraktion zu erhalten. Zu einem geeignetem Zeitpunkt nach der Immunisierung, beispielsweise wenn die anti-flh84g5-Antikörper-Titer am höchsten sind, können von dem Subjekt Antikörper-produzierende Zellen erhalten werden und zur Herstellung monoklonaler Antikörper durch Standardtechniken verwendet werden, wie die Hybridomtechnik, die ursprünglich durch Kohler und Milstein (1975), Nature 256:495-497) beschrieben wurde (siehe ebenfalls Brown et al. (1981), J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980), J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927-31 und Yeh et al. (1982), Int. J. Cancer 29:269-75), die mehr gegenwärtige menschliche B-Zell-Hybridom-Technik (Kozbor et al. (1983), Immunol Today 4:72), die EBV-Hybridom-Technik (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy; Alan R. Liss, Inc., 77-96) oder Triom-Techniken. Die Techniken zum Erzeugen monoklonaler Antikörper-Hybridome sind wohlbekannt (siehe im Allgemeinen R.H. Kenneth (1980), in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York; E.A. Lerner (1981), Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M.L. Gefter et al. (1977), Somatic Cell Genet. 3:231-36). In Kürze, es wird eine unsterbliche Zelllinie (normalerweise ein Myelom) mit Lymphozyten (normalerweise Splenozyten) von einem Säugetier, das mit einem vorstehend beschriebenen flh84g5-Immunogen immunisiert wurde, fusioniert und die Kulturüberstände der so erhaltenen Hybridomzellen werden durchmustert um Hybridome zu identifizieren, die einen monoklonalen Antikörper produzieren, der flh84g5 bindet.
  • Zum Fusionieren von Lymphozyten und unsterblichen Zelllinien kann ein beliebiges der vielen wohlbekannten Protokolle verwendet werden, um so einen anti-flh84g5-monoklonalen Antikörper zu erzeugen (siehe beispielsweise G. Galfre et al. (1977), Nature 266:55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet., vorstehend zitiert; Lerner, Yale J. Biol. Med., vorstehend zitiert; Kenneth, Monoclonal Antibodies, vorstehend zitiert). Darüber hinaus ist dem Fachmann klar, dass viele Variationen derartiger Verfahren existieren, die ebenfalls nützlich sind. Normalerweise wird die unsterbliche Zelllinie (beispielsweise eine Myelom-Zelllinie) von der gleichen Säugetierspezies wie die Lymphozyten abgeleitet. So können beispielsweise Hybridome von Maus durch Fusionieren von Lymphozyten aus einer Maus, die mit einer erfindungsgemäßen immunogenen Präparation immunisiert wurde, mit einer immortalisierten Mauszelllinie fusioniert werden. Bevorzugte unsterbliche Zelllinien sind Myelomzelllinien von Maus, die sensitiv bzw. empfindlich auf Kulturmedium sind, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin umfasst ("HAT-Medium"). Gemäß der Standardtechniken kann als ein Fusionspartner eine Vielzahl an Myelomzelllinien verwendet werden, beispielsweise die P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 oder Sp2/O-Ag14-Myelomlinien. Diese Myelomlinien sind von der ATCC® verfügbar. Normalerweise werden HAT-sensitive Myelomzellen der Maus mit Splenozyten der Maus fusioniert, wobei Polyethylenglycol ("PEG") verwendet wird. Die aus der Fusion erhaltenen Hybridomzellen werden dann unter Verwendung eines HAT-Mediums selektioniert, welches nicht fusionierte und unergiebig fusionierte Myelomzellen tötet (unfusionierte Splenozyten sterben nach wenigen Tagen, da sie nicht transformiert sind). Durch ein Durchmustern der Überstände der Hybridomkultur nach Antikörpern, welche flh84g5 binden, beispielsweise unter Verwendung eines standardmäßigen ELISA-Assays, werden Hybridomzellen nachgewiesen, die einen erfindungsgemäßen, monoklonalen Antikörper produzieren.
  • Alternativ zur Herstellung monoklonaler Antikörper-absondernder Hybridome, kann ein monoklonaler anti-flh84g5-Antikörper durch Durchmustern einer rekombinanten, kombinatorischen Immunglobulin-Bank (beispielsweise einer Antikörper-Phagendisplay-Bank) mit flh84g5 identifiziert und isoliert werden, um somit Mitglieder der Immunglobulin-Bank zu isolieren, die flh84g5 binden. Kits zum Erzeugen und Durchmustern von Phagendisplay-Banken sind im Handel verfügbar (beispielsweise das Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Katalog-Nr. 27-9400-01; und der Stratagene SurfZAPTM Phage Display Kit, Katalog-Nr. 240612). Zusätzlich können Beispiele von Verfahren und Reagenzien, die insbesondere zur Verwendung im Erzeugen und Durchmustern von Antikörper-Display-Banken zugänglich sind, beispielsweise gefunden werden in Ladner et al. US-P-5,223,409; Kang et al. PCT-Publikation Nr. WO 92/18619; Dower et al. PCT-Publikation Nr. WO 91/17271; Winter et al. PCT-Publikation Nr. WO 92/20791; Markland et al. PCT-Publikation Nr. WO 92/15679; Breitling et al. PCT-Publikation Nr. 93/01288; McCafferty et al. PCT-Publikation Nr. WO 92/01047; Garrard et al. PCT-Publikation Nr. WO 92/09690; Ladner et al. PCT-Publikation Nr. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid. Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982 und McCafferty et al. (1990), Nature 348:552-554 gefunden werden.
  • Zusätzlich sind im Umfang der Erfindung rekombinante anti-flh84g5-Antikörper umfasst, wie chimere und humanisierte monoklonale Antikörper, die sowohl menschliche als auch nicht-menschliche Teile umfassen und unter Verwendung von standardmäßigen rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden können. Derartige chimere und humanisierte monoklonale Antikörper können durch im Stand der Technik bekannte DNA-Techniken hergestellt werden, beispielsweise durch Verwendung von Verfahren, die beschrieben sind in Robinson et al., PCT-Publikation Nr. PCT/US86/02269; Akira et al. Europäische Patentanmeldung 184,187; Taniguchi, M., Europäische Patentanmeldung 171,496; Morrison et al. Europäische Patentanmeldung 173,494; Neuberger et al. PCT-Publikation Nr. WO 86/01533; Cabilly et al. US-P-4,816,567; Cabilly et al. Europäische Patentanmeldung 125,023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449 und Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S.L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Bio Techniques 4:214; Winter US-P-5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; und Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.
  • Ein anti-flh84g5-Antikörper (beispielsweise ein monoklonaler Antikörper) kann verwendet werden, um flh84g5 mittels Standardtechniken, wie Affinitätschromatographie oder Immunopräzipitation, zu isolieren. Ein anti-flh84g5-Antikörper kann die Reinigung von natürlichem flh84g5 aus Zellen und von rekombinant hergestelltem flh84g5, das in Wirtszellen exprimiert wird, erleichtern. Darüber hinaus kann ein anti-flh84g5-Antikörper verwendet werden, um flh84g5-Polypeptid nachzuweisen (beispielsweise in einem zellulären Lysat oder einem Zellüberstand), um die Menge und das Muster einer Expression des flh84g5-Polypeptids oder eines Fragments eines flh84g5-Polypeptids zu bewerten. Der Nachweis von im Umlauf befindlicher bzw. zirkulierender Fragmente eines flh84g5-Polypeptids kann verwendet werden, um einen flh84g5-Umsatz in einem Subjekt zu identifizieren. anti-flh84g5-Antikörper können diagnostisch verwendet werden, um Polypeptid-Spiegel in Gewebe als Teil eines klinischen Testverfahrens zu beobachten, beispielsweise, um die Wirksamkeit eines gegebenen Behandlungsregimes zu bestimmen. Ein Nachweis kann durch Koppeln (d. h. physisch verbinden) des Antikörpers an eine nachweisbare Substanz erleichtert werden. Beispiele von nachweisbaren Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszierende Materialien, lumineszierende Materialien, biolumineszierende Materialien und radioaktive Materialien. Beispiele geeigneter Enzyme umfassen Meerrettich-Peroxidase, alkaline Phosphatase, β-Galactosidase oder Acetylcholinesterase; Beispiele geeigneter prosthetischer Gruppenkomplexe umfassen Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin; Beispiele geeigneter fluoreszierender Materialien umfassen Umbelliferon, Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlorotriazinylaminfluorescein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin; ein Beispiel eines lumineszierenden Materials umfasst Luminol; Beispiele biolumineszierender Materialien umfassen Luciferase, Luciferin und Aequorin und Beispiele geeigneter radioaktiver Materialien umfassen 125I, 131I, 35S oder 3H.
  • IV. Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Die erfindungsgemäßen flh84g5-Nukleinsäuremoleküle, flh84g5-Polypeptide (insbesondere Fragmente von flh84g5), flh84g5-Modulatoren und anti-flh84g5-Antikörper (hier ebenfalls als "aktive Verbindungen" bezeichnet) können in pharmazeutische Zusammensetzungen inkorporiert werden, die zur Verabreichung an ein Subjekt, beispielsweise an einen Menschen, geeignet sind. Derartige Zusammensetzungen umfassen normalerweise das Nukleinsäuremolekül, das Polypeptid, den Modulator oder Antikörper und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Wie hier verwendet, soll der Begriff "pharmazeutisch annehmbarer Träger" ein beliebiges und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Ummantelungen, antibakterielle und antifungale Agenzien, isotonische Agenzien und Absorptions-verzögernde Agenzien und dergleichen umfassen, die mit einer pharmazeutischen Verabreichung kompatibel sind. Die Verwendung derartiger Medien und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Stand der Technik wohlbekannt. Mit der Ausnahme, dass ein beliebiges, herkömmliches Medium oder Agens mit der aktiven Verbindung nicht kompatibel ist, können derartige Medien in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden. Ebenfalls können zusätzliche aktive Verbindungen in die Zusammensetzungen inkorporiert werden.
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung wird so formuliert, das sie mit deren beabsichtigter Verabreichungsroute kompatibel ist. Beispiele von Verabreichungsrouten umfassen eine parenterale, beispielsweise intravenös, intradermale, subkutane, orale (beispielsweise Inhalation), transdermale (topisch), transmukosale und rektale Verabreichung. Lösungen oder Suspensionen, die zur parenteralen, intradermalen oder subkutanen Anwendung verwendet werden, können die folgenden Komponenten umfassen: ein steriles Verdünnungsmittel bzw. Streckmittel, wie Wasser zur Injektion, Salzlösung, fette Öle, Polyethylenglycole, Glycerin, Propylenglycol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Agenzien, wie Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidantien, wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Komplexbildner, wie Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer, wie Acetate, Citrate oder Phosphate, und Agenzien, um den Tonus (tonicity) einzustellen, wie Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH-Wert kann mit Säuren oder Basen, wie Salzsäure oder Natriumhydroxid, eingestellt werden. Die parenterale Präparation bzw. das parenterale pharmazeutische Erzeugnis kann in Ampullen, Einwegspritzen oder Gefäßen bzw. Fläschchen zur mehrfachen Dosierung, die aus Glas oder Kunststoff hergestellt sind, eingeschlossen sein.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Injektion geeignet sind, umfassen sterile, wässrige Lösungen (im Fall einer Wasserlöslichkeit) oder Dispersionen und sterile Pulver, für die improvisierte Herstellung von sterilen, injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. Für eine intravenöse Verabreichung umfassen geeignete Träger physiologische Salzlösung bzw. Kochsalzlösung, bakteriostatisches Wasser, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) oder Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS). In allen Fällen muss die Zusammensetzungen steril sein und sollte zu dem Ausmaß flüssig sein, dass sie leicht gespritzt werden kann. Sie muss unter den Bedingungen der Herstellung und der Lagerung stabil sein und muss gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilze, geschützt sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium sein, welcher beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (beispielsweise Glycerin, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und dergleichen) und geeignete Gemische davon umfasst. Die angemessene Fluidität kann beispielsweise durch die Verwendung einer Ummantelung, wie Lecithin, beibehalten werden, wobei die benötigte Teilchengröße im Falle einer Dispersion beibehalten wird und durch Verwendung von oberflächenaktiven Stoffen. Die Verhinderung einer Aktivität von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antifungale Agenzien, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und dergleichen, geleistet werden. In vielen Fällen ist es bevorzugt, dass die Zusammensetzungen isotonische Agenzien, beispielsweise Zucker, Polyalkohole, wie Manitol, Sorbitol, Natriumchlorid umfasst. Indem in der Zusammensetzung ein Agens umfasst ist, welches eine Absorption verzögert, beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine, kann eine anhaltende Absorption der injizierbaren Zusammensetzung geleistet werden.
  • Sterile, injizierbare Lösungen können durch Inkorporieren der aktiven Verbindung (beispielsweise eines flh84g5-Polypeptids oder eines anti-flh84g5-Antikörpers) in der benötigten Menge in einem geeigneten Lösungsmittel mit einem oder einer Kombination von vorstehend aufgeführten Bestandteil(en), wie benötigt, hergestellt werden, gefolgt von einer Sterilfiltration. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Inkorporieren der aktiven Verbindungen in ein steriles Vehikel hergestellt, welches ein basisches bzw. Basis-Dispersionsmedium und die benötigten anderen der vorstehend aufgeführten Bestandteile umfasst. Im Falle von sterilen Pulvern für die Präparation bzw. Herstellung steriler, injizierbarer Lösungen sind die bevorzugten Verfahren zum Herstellen ein Vakuumtrocken und Gefriertrocknen, was zu einem Pulver des aktiven Bestandteils mit beliebigen zusätzlichen gewünschten Bestandteilen von dessen vorher sterilfiltrierter Lösung führt.
  • Orale Zusammensetzungen umfassen im Allgemeinen ein inertes Verdünnungsmittel oder einen essbaren Träger. Sie können in Gelatinekapseln eingeschlossen oder in Tabletten komprimiert werden. Zu oralen therapeutischen Verabreichungen kann die aktive Verbindung mit Arzneimittelträgern inkorporiert werden und in Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln verwendet werden. Orale Zusammensetzungen können ebenfalls unter Verwendung eines flüssigen Trägers zur Verwendung als ein Mundwasser hergestellt werden, wobei die Verbindung in dem flüssigen Träger oral angewendet und im Mund gespült (swishes) und ausgehustet oder hinuntergeschluckt wird. Pharmazeutisch kompatibele bindende Agenzien und/oder Adjuvanz-Materialien können als ein Teil der Zusammensetzung umfasst sein. Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und dergleichen können einen beliebigen der folgenden Bestandteile oder Verbindungen mit einer gleichartigen Natur umfassen; ein Bindemittel, wie mikrokristalline Cellulose, Tragantgummi (gum tragacanth) oder Gelatine; einen Arzneimittelträger, wie Stärke oder Lactose, ein Aufschlussmittel, wie Alginsäure, Primogel oder Maisstärke; ein Schmiermittel (lubricant), wie Magnesiumstearat oder Sterotes; ein Gleitmittel (glidant), wie kolloidales Siliziumdioxid; ein süßendes Mittel, wie Saccharose oder Saccharin; oder einen Aromastoff wie Pfefferminz, Methylsalicylat oder Orangenaroma.
  • Zur Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen in der Form eines Aerosolsprays aus einem unter Druck stehenden Behälter oder Dispenser, welcher ein geeignetes Treibmittel, beispielsweise ein Gas wie Kohlendioxid, umfasst, oder einem Zerstäuber geliefert.
  • Eine systemische Verabreichung kann ebenfalls durch transmucosale oder transdermale Mittel erfolgen. Zur transmucosalen oder transdermalen Verabreichung werden in der Formulierung Penetriermittel verwendet, die für die zu durchdringende Barriere geeignet sind. Derartige Penetriermittel sind allgemein im Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise zur transmucosalen Verabreichung Detergenzien, Gallensalze und Fusidinsäurederivate (fusidic acid derivatives). Eine transmucosale Verabreichung kann durch die Verwendung eines nasalen Sprays oder von Zäpfchen geleistet werden. Zur transdermalen Verabreichung werden die aktiven Verbindungen in Heilsalben (ointments), Salben (salves), Gelen oder Creme, wie allgemein im Stand der Technik bekannt, formuliert.
  • Die Verbindungen können ebenfalls in der Form von Zäpfchen hergestellt werden (beispielsweise mit herkömmlichen Zäpfchenbasen, wie Kakaobutter und anderen Glyceriden) oder von Rückhalteeinläufen zur rektalen Abgabe.
  • In einer Ausführungsform werden die aktiven Verbindungen mit Trägern hergestellt, welche die Verbindung gegen eine schnelle Eliminierung durch den Körper schützen werden, wie ein Formulierung mit gesteuerter Freisetzung (controlled release formulation), umfassend Implantate und mikroverkapselte Abgabesysteme. Es können biologisch abbaubare, biokompatible Polymere verwendet werden, wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Kollagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Verfahren zum Herstellen derartiger Formulierungen sind dem Fachmann klar. Die Materialien können ebenfalls im Handel von Alza Corporation und Nova Pharmaceuticals, Inc. bezogen werden. Liposomale Suspensionen (umfassend Liposomen, die gerichtet sind, um Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen virale Antigene zu infizieren) können ebenfalls als pharmazeutisch annehmbare Träger verwendet werden. Diese können gemäß dem Fachmann bekannter Verfahren hergestellt werden, beispielsweise wie beschrieben in US-P-4,522,811.
  • Zur Einfachheit einer Verabreichung und Einheitlichkeit einer Dosierung ist es besonders vorteilhaft orale oder parenterale Zusammensetzungen in Dosierungseinheitsform zu formulieren. Dosierungseinheitsform, wie hier verwendet, betrifft physisch diskrete Einheiten, die als einzelne Dosierungen für das zu behandelnde Subjekt geeignet sind; jede Einheit umfasst eine bestimmte Menge an aktiver Verbindung, die berechnet ist, um die gewünschte therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem benötigten pharmazeutischen Träger zu erzeugen. Die Spezifizierungen der erfindungsgemäßen Dosierungseinheitsformen sind bestimmt durch und direkt abhängig von den einzigartigen Merkmalen der aktiven Verbindung und der bestimmten, zu erzielenden therapeutischen Wirkung, und den in der Technik innewohnenden Beschränkungen beim Zusammensetzen einer derartigen aktiven Verbindung zur Behandlung von Individuen.
  • Erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle können in Vektoren eingeführt werden und als Vektoren zur Gentherapie verwendet werden. Vektoren zur Gentherapie können an ein Subjekt verabreicht werden, beispielsweise durch intravenöse Injektion, lokale Verabreichung (siehe US-P-5,328,470) oder durch stereotaktische Injektion (siehe beispielsweise Chen et al. (1994), PNAS 91:3054-3057). Das pharmazeutische Erzeugnis des Vektors zur Gentherapie kann den Vektor zur Gentherapie bzw. Gentherapievektor in einem annehmbaren Verdünnungsmittel umfassen oder kann eine Matrix mit langsamer Freisetzung umfassen, in die das Gen-Abgabevehikel eingebettet ist. Alternativ kann das pharmazeutische Erzeugnis ein oder mehrere Zellen umfassen, welche das Gen-Abgabesystem erzeugen, wenn der vollständige Gen-Abgabe-Vektor intakt von rekombinanten Zellen, beispielsweise retrovirale Vektoren, erzeugt werden kann.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einem Behälter, einem Päckchen oder Spender zusammen mit Instruktionen zur Verabreichung umfasst sein.
  • V. Verwendungen und Verfahren der Erfindung
  • Die hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Polypeptide, Polypetidhomologe, Modulatoren und Antikörper können in einer oder mehreren der folgenden Verfahren verwendet werden: a) Arzneimittel-Screeningassays; b) diagnostische Assay, insbesondere zur Identifizierung von Erkrankungen, allelisches Screening und pharmokogenetisches Testen; c) Verfahren zum Behandeln; d) Pharmakogenomik; und e) Beobachten von Wirkungen während klinischer Versuche. Ein erfindungsgemäßes flh84g5-Polypeptid weist eine oder mehrere der hier beschriebenen Aktivitäten auf und kann somit verwendet werden, um beispielsweise eine flh84g5-Ligandenantwort in einer flh84g5-Liganden-gesteuerten Zelle zu modulieren, beispielsweise durch Binden an einen flh84g5-Liganden oder einen flh84g5-Bindungspartner, um ihn für ein Binden durch das natürlich vorliegende flh84g5-Polypeptid nicht mehr verfügbar zu machen. Die erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäuremoleküle können verwendet werden, um flh84g5-Polypeptide zu exprimieren (beispielsweise mittels eines rekombinanten Expressionsvektors in einer Wirtszelle oder in Gentherapie-Anwendungen), um flh84g5-mRNA nachzuweisen (beispielsweise in einer biologischen Probe) oder eine natürlich vorkommende oder rekombinant erzeugte Mutation in einem flh84g5-Gen, und um eine flh84g5-Aktivität zu modulieren, wie nachstehend ausführlicher erläutert. Zusätzlich können die flh84g5-Polypeptide verwendet werden, um Arzneimittel oder Verbindungen zu durchmustern, die eine flh84g5-Polypeptid-Aktivität modulieren sowie um Störungen zu behandeln, die durch ungenügende Produktion eines flh84g5-Polypeptids oder Produktion von flh84g5-Polypeptidformen gekennzeichnet sind, welche verglichen mit der Wildtypform des flh84g5 eine verminderte Aktivität aufweisen. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen anti-flh84g5-Antikörper verwendet werden, um ein flh84g5-Polypeptid nachzuweisen und zu isolieren, insbesondere Fragmente von flh84g5, die in einer biologischen Probe vorliegen, und um eine flh84g5-Polypeptid-Aktivität zu modulieren.
  • a. Arzneimitel-Screening-Assays
  • Die Erfindung stellt Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen oder Agenzien bereit, welche verwendet werden können, um Störungen zu behandeln, die gekennzeichnet sind durch (oder assoziiert sind mit) einer aberranten oder abnormalen flh84g5-Nukleinsäure-Expression und/oder flh84g5-Polypeptidaktivität. Diese Verfahren werden hier ebenfalls als Arzneimittel-Screening-Assays bezeichnet und umfassen normalerweise die Schritte eines Durchmustern bzw. Screenens einer Kandidaten/Test-Verbindung oder eines -Agens, ob es ein Agonist oder Antagonist von flh84g5 ist, und insbesondere hinsichtlich der Fähigkeit mit einem flh84g5-Polypeptid wechselzuwirken bzw. in Wechselwirkung zu treten (beispielsweise daran zu binden), um die Wechselwirkung eines flh84g5-Polypeptids und eines Zielmoleküls zu modulieren und/oder um eine flh84g5-Nukleinsäureexpression und/oder eine flh84g5-Polypeptidaktivität zu modulieren. Kandidaten/Test-Verbindungen oder -Agenzien mit einer oder mehrerer dieser Fähigkeiten können als Arzneimittel verwendet werden, um Störungen zu behandeln, die durch eine aberrante oder abnormale flh84g5-Nukleinsäureexpression und/oder flh84g5-Polypeptidaktivität gekennzeichnet sind. Kandidaten/Test-Verbindungen umfassen beispielsweise 1) Peptide, wie lösliche Peptide, umfassend Fusionspeptide mit Ig-Schwanz und Mitglieder von zufälligen Peptidbanken (siehe beispielsweise Lam, K.S. et al. (1991), Nature 354:82-84; Houghten, R. et al. (1991), Nature 354:84-86) und kombinatorische, chemisch abgeleitete molekulare Banken, die aus Aminosäuren mit D- und/oder L-Konfiguration hergestellt sind; 2) Phosphopeptide (beispielsweise Mitglieder zufälliger und teilweise degenerierte, gerichteter Phosphopeptidbanken, siehe beispielsweise Songyang, Z. et al. (1993), Cell 72:767-778); 3) Antikörper (beispielsweise polyklonale, monoklonale, humanisierte, anti-idiotypische, chimere und einzelkettige Antikörper sowie Fab, F(ab')2, Fab-Expressionsbankfragmente und Epitop-bindende Fragmente von Antikörpern); und 4) kleine organische und anorganische Moleküle (beispielsweise Moleküle, die aus kombinatorischen und natürlichen Produktbanken erhalten werden).
  • In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Assays zum Durchmustern von Kandidaten/Test-Verbindungen bereit, welche mit flh84g5-Polypeptid wechselwirken (beispielsweise daran binden). Normalerweise basieren die Assays auf rekombinanten Zellen oder sind zellfreie Assays, welche die Schritte umfassen von Kombinieren eines flh84g5-Polypeptids oder eines bioaktiven Fragments davon und einer Kandidaten/Test-Verbindung, beispielsweise unter Bedingungen, die eine Wechselwirkung (beispielsweise ein Binden) der Kandidaten/Test-Verbindung an das flh84g5-Polypeptid oder ein -Fragment davon ermöglichen, um einen Komplex zu bilden, und Nachweisen der Bildung eines Komplexes, wobei die Fähigkeit der Kandidaten/Test-Verbindung mit dem flh84g5-Polypeptid oder dessen Fragment wechselzuwirken (beispielsweise daran zu Binden) durch das Vorliegen den Kandidatenverbindung in dem Komplex gezeigt ist. Die Bildung eines Komplexes zwischen dem flh84g5-Polypeptid und der Kandidatenverbindung kann quantifiziert werden, beispielsweise unter Verwendung von standardmäßigen Immunoassays.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung einen Screening-Assay bereit, um Kandidaten/Test-Verbindungen zu identifizieren, welche die Wechselwirkung (und wahrscheinlich auch eine flh84g5-Aktivität) zwischen einem flh84g5-Polypeptid und einem Molekül (Zielmolekül), mit dem das flh84g5-Polypeptid normalerweise in Wechselwirkung tritt, moduliert (beispielsweise stimuliert oder inhibiert). Beispiele derartiger Zielmoleküle umfassen Polypeptide in dem gleichen Signalisierungsweg wie das flh84g5-Polypeptid, beispielsweise Polypeptide die stromaufwärts (umfassend sowohl Stimulatoren als auch Inhibitoren einer Aktivität) oder stromabwärts zu dem flh84g5-Polypeptid fungieren, in beispielsweise einem Signalisierungsweg mit kognitiver Funktion oder in einem Weg, an dem eine flh84g5-Aktivität beteiligt ist, beispielsweise ein G-Protein oder andere Interaktoren, die an einem Phosphatidylinositol-Umsatz beteiligt sind und/oder Phospholipase C-Aktivierung. Normalerweise basieren die Assays auf rekombinanten Zellen oder sind zellfreie Assays, welche die Schritte umfassen von Kombinieren einer Zelle, die ein flh84g5-Polypeptid, oder ein bioaktives Fragment davon, exprimiert, einem flh84g5-Zielmolekül (beispielsweise ein flh84g5-Ligand) und einer Kandidaten/Test-Verbindung, beispielsweise unter Bedingungen unter denen jedoch aufgrund des Vorliegens der Testverbindung, das flh84g5-Polypeptid oder ein biologisch aktiver Teil davon mit dem Zielmolekül wechselwirkt (beispielsweise daran bindet), und Nachweisen der Bildung eines Komplex, der das flh84g5-Polypeptid und das Zielmolekül umfasst, oder Nachweisen der Wechselwirkung/Reaktion des flh84g5-Polypeptids und des Zielmoleküls. Ein Nachweis der Komplexbildung kann eine direkte Quantifizierung des Komplexes umfassen, beispielsweise durch Erfassen induktiver Wirkungen des flh84g5-Polypeptids. Eine statistisch signifikante Veränderung, wie eine Abnahme in der Wechselwirkung des flh84g5 und des Zielmoleküls (beispielsweise bei der Bildung eines Komplexes zwischen dem flh84g5 und dem Zielmolekül) in der Gegenwart einer Kandidatenverbindung (relativ zu dem was in der Abwesenheit der Kandidatenverbindung nachgewiesen wird) ist ein Anzeichen für eine Modulation (beispielsweise Stimulierung oder Inhibierung) der Wechselwirkung zwischen dem flh84g5-Polypeptid und dem Zielmolekül. Eine Modulation der Bildung von Komplexen zwischen dem flh84g5-Polypeptid und dem Zielmolekül kann unter Verwendung von beispielsweise einem Immunoassay quantifiziert werden.
  • Um zellfreie Arzneimittel-Screening-Assays durchzuführen, ist es wünschenswert entweder das flh84g5 oder dessen Zielmolekül zu immobilisieren, um eine Abtrennung eines Komplexes von nicht komplexierten Formen von einem oder beiden der Polypeptide zu erleichtern sowie um eine Automatisierung des Assays aufzunehmen. Eine Wechselwirkung (beispielsweise ein Binden) des flh84g5 an ein Zielmolekül in der Gegenwart und Abwesenheit einer Kandidatenverbindung kann in einem beliebigen Behälter bzw. Gefäß durchgeführt werden, der/das geeignet ist die Reaktanten zu enthalten. Beispiele derartiger Behälter umfassen Mikrotiterplatten, Teströhrchen und Mirkrozentrifugationsröhrchen. In einer Ausführungsform kann ein Fusionspolypeptid bereitgestellt werden, welches eine Domäne hinzufügt, durch die das Polypeptid an eine Matrix gebunden werden kann. So können beispielsweise Glutathion-S-Transferase/flh84g5-Fusionspolypeptide an Glutathion-Sepharose-Kügelchen adsorbiert werden (Sigma Chemical, St. Louis, MO) oder an Glutathion-derivatisierte Mikrotiterplatten, die dann mit den Zelllysaten (beispielsweise 35S-markiert) und der Kandidatenverbindung kombiniert werden, wobei das Gemisch, unter Bedingungen die einer Komplexbildung zuträglich sind, inkubiert wird (beispielsweise unter physiologischen Bedingungen für Salz und pH-Wert). Nach einer Inkubation werden die Kügelchen gewaschen, um jegliche nicht gebundene Markierung zu entfernen und die Matrix wird immobilisiert, wobei radioaktive Markierungen direkt oder in dem Überstand bestimmt werden nachdem die Komplexe dissoziiert sind. Alternativ können die Komplexe von der Matrix dissoziiert, durch SDS-PAGE getrennt und die Höhe bzw. der Spiegel an flh84g5-bindendem Polypeptid, das in der Kügelchenfraktion gefunden werden, kann aus dem Gel unter Verwendung von standardmäßigen Elektrophoresetechniken quantifiziert werden.
  • In den erfindungsgemäßen Arzneimittel-Screening-Assays können ebenfalls andere Techniken zum Immobilisieren von Polypeptiden auf Matrixen verwendet werden. So kann beispielsweise entweder flh84g5 oder dessen Zielmolekül unter Verwendung einer Konjugation von Biotin und Streptavidin immobilisiert werden. Biotinylierte flh84g5-Moleküle können aus Biotin-NHS (N-Hydroxysuccinimid) unter Verwendung von im Stand der Technik wohlbekannter Techniken hergestellt werden (beispielsweise Biotinylierungskit, Pierce Chemicals, Rockford, IL) und in den Vertiefungen einer Streptavisin-beschichteten Platte mit 96 Vertiefungen immobilisiert werden (Pierce Chemicals). Alternativ können an die Vertiefungen der Platte Antikörper derivatisiert werden, die mit flh84g5 reaktiv sind, jedoch eine Bindung des Polypeptids an dessen Zielmolekül nicht beeinträchtigen, wobei flh84g5 in den Vertiefungen durch Antikörperkonjugation zurückgehalten bzw. gefangen wird. Wie vorstehend beschrieben werden in den flh84g5-präsentierenden Vertiefungen der Platte Präparationen eines flh84g5-bindenden Polypeptids und einer Kandidatenverbindung inkubiert, wobei die Menge an Komplex, der in der Vertiefung zurückgehalten wird, quantifiziert werden kann. Verfahren zum Nachweis derartiger Komplexe, zusätzlich zu den vorstehend für die GST-immobilisierten Komplexe beschriebenen, umfassen eine Immunodetektion/-nachweis der Komplexe unter Verwendung von Antikörpern, die mit dem flh84g5-Zielmolekül reagieren, oder die mit flh84g5-Polypeptid reagieren und mit dem Zielmolekül konkurrieren; sowie Enzym-gekoppelte Assays, die auf einem Nachweis einer enzymatischen, mit dem Zielmolekül assoziierten Aktivität beruhen.
  • In einer noch anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung bereit (beispielsweise einen Screening-Assay), die in der Behandlung einer Störung verwendet werden kann, die gekennzeichnet ist durch (oder assoziiert ist mit) eine aberranten oder abnormalen flh84g5-Nukleinsäureexpression oder flh84g5-Polypeptidaktivität. Dieses Verfahren umfasst normalerweise die Schritte eines Testen der Fähigkeit der Verbindung oder des Agens die Expression der flh84g5-Nukleinsäure oder die Aktivität des flh84g5-Polypeptids zu modulieren, um dadurch eine Verbindung zur Behandlung einer Störung zu identifizieren, die durch aberrante oder abnormale flh84g5-Nukleinsäureexpression oder flh84g5-Polypeptidaktivität gekennzeichnet ist. Störungen, die durch eine aberrante oder abnormale flh84g5-Nukleinsäureexpression oder flh84g5-Polypeptidaktivität gekennzeichnet sind, sind hier beschrieben. Verfahren zum Testen der Fähigkeit der Verbindung oder eines Agens die Expression der flh84g5-Nukleinsäure oder Aktivität des flh84g5-Polypeptids zu modulieren, sind normalerweise zellbasierte Assays. Beispielsweise können Zellen, die sensitiv für Liganden sind, die Signale über einen Weg übertragen, an dem flh84g5 beteiligt ist, induziert werden ein flh84g5-Polypeptid in der Gegenwart und Abwesenheit einer Kandidatenverbindung überzuexprimieren. So können Kandidatenverbindungen, die eine statistisch signifikante Änderung in flh84g5-abhänigen Antworten erzeugen (entweder Stimulierung oder Inhibierung) identifiziert werden. In einer Ausführungsform wird die Expression der flh84g5-Nukleinsäure oder Aktivität eines flh84g5-Polypeptids in Zellen moduliert und es werden die Wirkungen von Kandidatenverbindungen auf das ausgelesene bzw. ausgewählte Interesse (wie Phosphatidylinositol-Umsatz) erfasst. Beispielsweise kann die Expression von Genen, die als Antwort auf eine flh84g5-abhängige Signalkaskade hoch- oder herunterreguliert werden, getestet werden. In bevorzugten Ausführungsformen sind die regulatorischen Regionen derartiger Gene, beispielsweise die 5'-flankierende Promoter- und Enhancer-Region, funktionsfähig an einen nachweisbaren Marker (wie Luciferase) verbunden, der ein Genprodukt kodiert, das leicht nachgewiesen werden kann. Ebenfalls kann eine Phosphorylisierung von flh84g5 oder von flh84g5-Zielmolekülen beispielsweise durch Immunoblotting erfasst werden.
  • Alternativ können in einem Verfahren, bei dem eine Zelle mit einer Kandidatenverbindung kontaktiert wird und die Expression einer flh84g5-mRNA oder eines Polypeptids in der Zelle bestimmt wird, Modulatoren einer flh84g5-Expression identifiziert werden (beispielsweise Verbindungen, die verwendet werden können, um eine Störung zu behandeln, die durch aberrante oder abnormale flh84g5-Nukleinsäureexpression oder flh84g5-Polypeptidaktivität gekennzeichnet ist. Die Höhe der Expression einer flh84g5-mRNA oder eines -Polypeptids in der Gegenwart der Kandidatenverbindung wird mit der Höhe einer Expression an flh84g5-mRNA oder eines -Polypeptids in der Abwesenheit der Kandidatenverbindung verglichen. Die Kandidatenverbindung kann dann basierend auf diesem Vergleich als ein Modulator einer flh84g5-Nukleinsäureexpression identifiziert werden und verwendet werden, um eine Störung zu behandeln, die durch aberrante flh84g5-Nukleinsäureexpression gekennzeichnet ist. Ist beispielsweise eine Expression von flh84g5-mRNA oder eines -Polypeptids in der Gegenwart der Kandidatenverbindung größer (statistisch signifikant größer) als in dessen Abwesenheit, ist die Kandidatenverbindung als ein Stimulator einer flh84g5-Nukleinsäureexpression identifiziert. Ist alternativ eine flh84g5-Nukleinsäureexpression in der Gegenwart der Kandidatenverbindung geringer (statistisch signifikant geringer) als in deren Abwesenheit, ist die Kandidatenverbindung als ein Inhibitor einer flh84g5-Nukleinsäureexpression identifiziert. Die Höhe an flh84g5-Nukleinsäureexpression in den Zellen kann durch hier beschriebene Verfahren zum Nachweis von flh84g5-mRNA oder -Polypeptid bestimmt werden.
  • In einem noch anderen Aspekt der Erfindung können die flh84g5-Polypeptide, oder Fragmente davon, als "Köderproteine" in einem Zwei-Hybridassay verwendet werden (siehe beispielsweise US-P-5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993), J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993), Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; und Brent WO 94/10300), um andere Protein zu identifizieren, die an flh84g5 binden oder damit in Wechselwirkung treten ("flh84g5 bindende Proteine" oder "flh84g5-bp") und eine flh84g5-Polypeptidaktivität modulieren. Es ist ebenfalls wahrscheinlich, dass derartige flh84g5-bindende Proteine in der Fortpflanzung von Signalen durch die flh84g5-Polypeptide beteiligt sind, wie beispielsweise stromaufwärtige oder stromabwärtige Elemente des flh84g5-Wegs.
  • Das Zwei-Hybridsystem basiert auf der modularen Natur vieler Transkriptionsfaktoren, die aus trennbaren DNA-Binde- und Aktivierungsdomänen bestehen. Bartel, P. et al. "Using the Two-Hybrid-System to Detect Protein-Protein Interactions" in Cellular Interactions in Development: A Practical Approach, Hartley, D.A. Herausgeber (Oxford University Press, Oxford, 1993) Seiten 153-179. In Kürze, der Assay verwendet zwei unterschiedliche DNA-Konstrukte. In einem Konstrukt ist das Gen, welches für flh84g5 kodiert, an ein Gen fusioniert, das eine DNA-Bindedomäne eines bekannten Transkriptionsfaktors (beispielsweise GAL-4) kodiert. In dem anderen Konstrukt ist eine DNA-Sequenz aus einer Bank von DNA-Sequenzen, die ein unidentifiziertes Protein ("Beute" oder "Probe") kodiert, an ein Gen fusioniert, das für die Aktivierungsdomäne des bekannten Transkriptionsfaktors kodiert. Können der "Köder"- und die "Beute"-Proteine in vivo in Wechselwirkung treten, um einen flh84g5-abhängigen Komplex zu bilden, werden die DNA-Binde- und Aktivierungsdomänen des Transkriptionsfaktor in nahe Nachbarschaft gebracht. Diese Nachbarschaft ermöglicht eine Transkription eines Reportergens (beispielsweise LacZ), welches funktionsfähig an eine die Transkription-regulierende Stelle verbunden ist, die auf den Transkriptionsfaktor reagiert. Es kann eine Expression des Reportergens nachgewiesen werden und es können Zellkolonien, die den funktionalen Transkriptionsfaktor umfassen, isoliert werden und verwendet werden, um das geklonte Gen zu erhalten, welches das mit flh84g5 wechselwirkende Protein kodiert.
  • Modulatoren einer flh84g5-Polypeptidaktivität und/oder flh84g5-Nukleinsäureexpression, die gemäß dieser Arzneimittel-Screening-Assays identifiziert wurde, können verwendet werden, um beispielsweise Nervensystemstörungen, mit glatter Muskulatur assoziierte Störungen, Herzmuskel assoziierte Störungen und Drüsen assoziierte Störungen zu behandeln. Diese Behandlungsverfahren umfassen die Schritte eines Verabreichens der Modulatoren einer flh84g5-Polypeptidaktivität und/oder -Nukleinsäureexpression, beispielsweise in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie hier vorstehend in Unterabschnitt IV erläutert, an ein Subjekt, das eine derartigen Behandlung benötigt, beispielsweise ein Subjekt mit einer hier erläuterten Störung.
  • b) Diagnostische Assays
  • Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens des flh84g5, oder eines Fragments davon, in einer biologischen Probe bereit. Das Verfahren umfasst ein Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einer Verbindung oder einem Agens, die/das flh84g5-Polypeptid oder -mRNA nachweisen kann, so dass das Vorliegen von flh84g5 in der biologischen Probe nachgewiesen wird. Ein bevorzugtes Agens zum Nachweis von flh84g5-mRNA ist eine markierte oder eine markierbare Nukleinsäuresonde, die in der an flh84g5-mRNA hybridisieren kann. Die Nukleinsäuresonde kann beispielsweise die Volllängen-flh84g5-cDNA von SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 sein oder ein Teil davon, wie ein Oligonukleotid das mindestens 15, 30, 50, 100, 250 oder 500 Nukleotide lang ist und ausreichend ist, um unter stringenten Bedingungen an flh84g5-mRNA spezifisch zu hybridisieren. Ein bevorzugtes Agens zum Nachweisen eines flh84g5-Polypeptids ist ein markierter oder markierbarer Antikörper, der an flh84g5-Polypeptid binden kann. Antikörper können polyklonal sein oder noch bevorzugter monoklonal. Es kann ein intakter Antikörper, oder ein Fragment davon (beispielsweise Fab oder F(ab')2), verwendet werden. Der Begriff "markiert oder markierbar" in Bezug auf die Sonde oder den Antikörper soll ein direktes Markieren der Probe oder des Antikörper durch Koppeln (d. h. physisches Verbinden) einer nachweisbaren Substanz an die Sonde oder den Antikörper umfassen, sowie indirektes Markieren der Probe oder des Antikörpers durch eine Reaktivität mit einem anderen Reagenz, das direkt markiert ist. Beispiele eines indirekten Markierens umfassen Nachweis eines primären Antikörpers unter Verwendung eines Fluoreszenz-markierten sekundären Antikörpers und Endmarkierung einer DNA-Sonde mit Biotin, so dass sie mit Fluoreszenz-markierten Streptavidin nachgewiesen werden kann. Der Begriff "biologische Probe" soll Gewebe, Zellen und biologische Fluide umfassen, die von einem Subjekt isoliert werden, sowie Gewebe, Zellen und Fluide, die in einem Subjekt vorliegen. D. h. das erfindungsgemäße Nachweisverfahren kann verwendet werden, um flh84g5-mRNA oder -Polypeptid in einer biologischen Probe in vitro sowie in vivo nachzuweisen. Beispielsweise umfassen in vitro-Techniken zum Nachweis von flh84g5-mRNA Northern-Hybridisierungen und in situ-Hybridisierungen. In vitro-Techniken zum Nachweisen von flh84g5-Polypeptid umfassen Enzym-gekoppelte Immunoabsorptions-Assays (ELISAs), Westernblots, Immunopräzipitationen und Immunofluoreszenz. Alternativ kann flh84g5-Polypeptid in vivo in einem Subjekt durch Einführen eines markierten anti-flh84g5-Antikörpers in das Subjekt nachgewiesen werden. Beispielsweise kann der Antikörper mit einem radioaktiven Marker markiert werden, dessen Vorliegen und Lokalisation in einem Subjekt durch standardmäßige bildgebende Techniken nachgewiesen werden kann. Insbesonders nützlich sind Verfahren, die die allelische Variante von flh84g5 nachweisen, die in einem Subjekt exprimiert ist, und Verfahren, die Fragmente eines flh84g5-Polypeptids in einer Probe nachweisen. Die Erfindung umfasst ebenfalls Kits zum Nachweisen des Vorliegens von flh84g5 in einer biologischen Probe. So kann der Kit beispielsweise eine markierte oder markierbare Verbindung oder Agens umfassen, das in der Lage ist flh84g5-Polypeptid oder -mRNA in einer biologischen Probe nachzuweisen; Mittel zum Bestimmen der Menge von flh84g5 in der Probe; und Mittel zum Vergleichen der Menge an flh84g5 in der Probe mit einem Standard. Die Verbindung oder das Agens kann in einem geeigneten Behälter verpackt sein. Der Kit kann ferner Instruktionen zur Verwendung des Kits zum Nachweisen der flh84g5-mRNA oder des -Polypeptids umfassen.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können ebenso verwendet werden, um natürlich vorkommende genetische Mutationen in einem flh84g5-Gen nachzuweisen, um dadurch zu bestimmen, ob ein Subjekt mit dem mutierten Gen ein Risiko für eine Störung besteht, die durch aberrante oder abnormale flh84g5-Nukleinsäureexpression oder flh84g5-Polypeptidaktivität, wie hier beschrieben, gekennzeichnet ist. Bei bevorzugten Ausführungsform, umfassen die Verfahren Nachweisen des Vorliegens oder der Abwesenheit einer genetischen Mutation in einer Zellprobe aus dem Subjekt, die durch mindestens eine von einer Veränderung, die die Integrität eines ein flh84g5-Polypeptid kodierendes Gens beeinflusst, oder die fehlerhafte Expression des flh84g5-Gens gekennzeichnet ist. Beispielsweise können derartige genetische Mutationen durch Ermitteln des Vorliegens von mindestens einem von 1) einer Deletion eines oder mehrerer Nukleotiden von einem flh84g5-Gen nachgewiesen werden; 2) eine Addition von einem oder mehreren Nukleotiden an ein flh84g5-Gen; 3.) einer Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden eines flh84g5-Gens; 4) eine chromosomalen Umlagerung eines flh84g5-Gens; 5) eine Veränderung in der Höhe eines Messenger-RNA-Transkripts eines flh84g5-Gens, 6) Aberrante Modifikation eines flh84g5-Gens, wie das Methylierungsmuster der genomischen DNA; 7) Vorliegen eines nicht Wildtyp-Spleißmusters eines Messenger-RNA-Transkripts eines flh84g5-Gens; 8) nicht Wildtypspiegel eines flh84g5-Polypeptids; 9) allelischer Verlust eines flh84g5-Gens und 10) ungeeignete post-translationale Modifikationen eines flh84g5-Polypeptids. Wie hier beschrieben gibt es eine große Anzahl an im Stand der Technik bekannter Assay-Techniken, die zum Nachweis von Mutationen in einem flh84g5-Gen verwendet werden können.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist beim Nachweis der Mutation die Verwendung einer Sonde/eines Primers in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (siehe beispielsweise US-P-4,683,195 und 4,683,202), wie Anker-PCR oder RACE-PCR oder alternativ in einer Ligationskettenreaktion (LCR) (siehe beispielsweise, Landegran et al. (1988) Science 241:1077-1080; und Nakazawa et al. (1994) PNAS 91:360-364) beteiligt, die letztere kann insbesondere für den Nachweis von Punktmutationen in dem flh84g5-Gen nützlich sein (siehe Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:675-682). Dieses Verfahren kann die Schritte umfassen von Sammeln einer Zellprobe von einem Patienten, Isolieren von Nukleinsäure (beispielsweise genomisch, mRNA oder beides) von den Zellen der Probe, Inkontaktbringen der Nukleinsäureprobe mit einem oder mehreren Primern, die spezifisch an das flh84g5-Gen unter Bedingungen hybridisieren, so dass eine Hybridisierung und Amplifikation des flh84g5-Gens (falls vorhanden) stattfindet, und Nachweisen des Vorliegens oder der Abwesenheit eines Amplifikationsprodukts oder Nachweis der Größe des Amplifikationsprodukts und Vergleich der Länge mit einer Kontrollprobe.
  • In einer alternativen Ausführungsform können Mutationen in einem flh84g5-Gen von einer Zellprobe durch Veränderungen in Restriktionsenzym-Spaltungsmustern identifiziert werden. Beispielsweise wird Proben- und Kontroll-DNA isoliert, amplifiziert (optional), mit einem oder mehreren Restriktionsendonukleasen verdaut, und die Größen der Fragmentlänge werden durch Gelelektrophorese bestimmt und verglichen. Unterschiede in Größen der Fragmentlänge zwischen Proben- und Kontroll-DNA zeigen Mutationen in der Proben-DNA an. Darüber hinaus kann die Verwendung von Sequenz-spezifischen Ribozymen (siehe beispielsweise US-P-5,498,531) verwendet werden, um das Vorliegen von spezifischen Mutationen durch Entwicklung oder Verlust einer Ribozym-Spaltungsstelle zu bewerten.
  • In einer noch anderen Ausführungsform kann eine beliebige einer Vielzahl von im Stand der Technik bekannter Sequenzierungsreaktionen verwendet werden, um das flh84g5-Gen direkt zu sequenzieren; und Mutationen durch Vergleichen der Sequenz des flh84g5 der Probe mit der entsprechenden Wildtyp-(Kontroll)-Sequenz nachzuweisen. Beispiele von Sequenzierungsreaktionen umfassen solche, die auf Techniken basieren, die von Maxim und Gilbert ((1977) PNAS 74:74-560) oder Sanger ((1977) PNAS 74:5463) entwickelt wurden. Zum Durchführen der diagnostischen Assays kann eine Vielzahl von automatisierten Sequenzierungsverfahren eingesetzt werden ((1995) Biotechniques 19:448), umfassend eine Sequenzierung durch Massenspektrometrie (siehe beispielsweise PCT-Publikation Nr. WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162; und Griffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159).
  • Andere Verfahren zum Nachweis von Mutationen in dem flh84g5-Gen umfassen Verfahren, in welchen ein Schutz vor Spaltungsagenzien verwendet wird, um fehlgepaarte Basen in RNA/RNA- oder RNA/DNA-Duplexen nachzuweisen (Myers et al. (1985) Science 230:1242); Cotton et al. (1988) PNAS 85:4397; Saleeba et al. (1992) Meth. Enzymol. 217:286-295), die elektrophoretische Mobilität von Nukleinsäure der Mutanten und der Wildtyp Nukleinsäure wird verglichen (Orita et al. (1989) PNAS 86:2766; Cotton (1993) Mutat Res 285:125-144; und Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:73-79), und es wird die Bewegung von Fragmenten von Mutanten oder Wildtyp Fragmenten in Polyacrylamid-Gelen, die einen Gradienten eines Denaturanten umfassen, unter Verwendung denaturierender Gradienten Gelelektrophorese getestet (Myers et al. (1985) Nature 313:495). Beispiele anderer Techniken zum Nachweis von Punktmutationen umfassen selektive Oligonukleotid-Hybridisierung, selektive Amplifizierung und selektive Primerverlängerung.
  • c. Behandlungsverfahren
  • In einem anderen Aspekt ermöglicht die Erfindung Verfahren zur Behandlung eines Subjekts, beispielsweise eines Menschen, das eine Erkrankung oder Störung aufweist, die gekennzeichnet ist durch (oder assoziiert ist mit) aberranter oder abnormaler flh84g5-Nukleinsäureexpression und/oder flh84g5-Polypeptidaktivität. Diese Verfahren umfassen die Schritte eines Verabreichens eines flh84g5-Modulators (Agonist oder Antagonist) an das Subjekt, so dass eine Behandlung stattfindet. Der Begriff "aberrante oder abnormale flh84g5-Expression" betrifft die Expression eines nicht-Wildtyp-flh84g5-Polypeptids oder einen nicht-Wildtyp-Spiegel der Expression eines flh84g5-Polypeptids. Aberrante oder abnormale flh84g5-Aktivität betrifft eine nicht-Wildtyp-flh84g5-Aktivität oder einen nicht-Wildtypspiegel einer flh84g5-Aktivität. Da das flh84g5-Polypeptid an einem Weg beteiligt ist, an dem beteiligt ist eine Modulation einer Freisetzung eines Neurotransmitters, beispielsweise Acetylcholin oder eines Acetylcholin-ähnlichen Moleküls, wie Carnitin; Modulation der Kontraktion glatter Muskulatur; Modulation der Herzmuskelkontraktion; und Modulation von Drüsen, beispielsweise exokrine Drüsenfunktion, eine aberrante oder abnormale flh84g5-Aktivität oder -Expression interferiert mit der normalen Freisetzung des Neurotransmitters, wie Acetylcholin oder eines Acetylcholin-ähnlichen Moleküls, wie Carnitin; normaler Kontraktion der glatten Muskulatur und der Herzmuskulatur; und normaler Drüsenfunktion, beispielsweise exokriner Drüsen. Nicht beschränkende Beispiele von Störungen oder Erkrankungen, die gekennzeichnet sind durch oder assoziiert sind mit abnormaler oder aberranter flh84g5-Aktivität oder -Expression umfassen Nervensystem assoziierte Störungen, beispielsweise mit dem zentralen Nervensystem assoziierte Störungen. Beispiele von mit dem zentralen Nervensystem assoziierten Störungen umfassen kognitive Störungen, beispielsweise Gedächtnis- und Lernstörungen, wie Amnesie, Apraxie, Agnosie, amnestische Dysomie, amnestische räumlich Desorientierung, Kluver-Bucy-Syndrom, Alzheimer assoziierter Gedächtnisverlust (Eglen, R.M. (1996) Pharmacol. and Toxicol. 78(2):59-68; Perry E.K. (1995) Brain and Cognition 28(3):240-58) und Lernunvermögen; Störungen, die das Bewusstsein beeinflussen, beispielsweise visuelle Halluzinationen, Wahrnehmungsstörungen oder mit Lewy-Körper-Demenz assoziiertes Delirium; schizo-affektive Störungen (Dean B. (1996) Mol. Psychiatry 1(1):54-8), Schizophrenie mit Stimmungsumschwüngen (Bymaster F.P. (1997) J. Clin. Psychiatry 58 (Anhang 10):28-36; Yeomans J.S. (1995) Neuropharmacol. 12(1):3-16; Reimann D. (1994) J. Psychiatric Res. 28(3):195-210), Depressive Erkrankung (primär oder sekundär), affektive Störungen (Janowsky D.S. (1994) Am. J. Med. Genetics 54(4):335-44); Schlafstörungen (Kimura F. (1997) J. Neurophysiol. 77(2):709-16) beispielsweise REM-Schalfabnormalitäten bei Patienten, die beispielsweise an Depression leiden (Riemann D. (1994) J. Psychosomatic Res. 38 Anhang 1:15-25; Bourgin P. (1995) Neuroreport 6(3):532-6), paradoxe Schlafabnormalitäten (Sakai K. (1997) Eur. J. Neuroscience 9(3):415-23), Schlaf-Schlaflosigkeit und Abnormalitäten im Abfall der Körpertemperatur oder Atmung während des Schlafs (Shuman S.L. (1995) Am. J. Physiol. 269(2 Pt 2): R308-17; Mallick B.N. (1997) Brain Res. 750(1-2):311-7). Andere Beispiele von mit dem Nervensystem assoziierten Störungen umfassen Störungen, die Schmerzerzeugungsmechanismen beeinflussen, beispielsweise Schmerz der mit Reizdarmsyndrom assoziiert ist (Mitch C.H. (1997) J. Med. Chem. 40(4):538-46; Shannon H.E. (1997) J. Pharmac. And Exp. Therapeutics 281(2):884-94; Bouaziz H. (1995) Anesthesia and Analgesia 80(6):1140-4; oder Guimares A.P. (1994) Brain Res. 647(2):220-30) oder Brustschmerz, Bewegungsstörungen (Monassi C.R. (1997) Physiol. and Behav. 62(1):53-9), beispielsweise mit Parkinson assoziierte Bewegungsstörungen (Finn M. (1997) Pharmacol. Biochem. & Behaviour 57(1-2):243-9; Mayorga A.J. (1997) Pharmacol. Biochem. & Behaviour 56(2):273-9); Essstörungen; beispielsweise Insulinhypersekretion assoziierte Fettleibigkeit (Maccario M. (1997) J. Endocrinol. Invest. 20(1):8-12; Premawardhana L.D. (1994) Clin. Endocrinol. 40(5):617-21); oder Trinkstörungen, beispielsweise diabetische Polydipsie (Murzi E. (1997) Brain Res. 752 (1-2):184-8; Yang X. (1994) Pharmacol. Biochem. & Behaviour 49(1):1-6). Noch weitere Beispiele von Störungen oder Erkrankungen, die gekennzeichnet sind durch oder assoziiert sind mit abnormaler oder aberranter flh84g5-Aktivität oder -Expression umfassen mit glatter Muskulatur assoziierte Störungen, wie Reizdarmsyndrom, diverticulare Erkrankung, Harninkontinenz, ösophageale Achalasie oder chronisch behindernde Luftwegserkrankungen; Herzmuskel assoziierte Störungen, wie pathologische Tachykardie, Arrhythmie, Flattern oder Flimmern; oder Drüsen assoziierte Störungen, wie Xerostomie oder Diabetes mellitus. Die Begriffe "behandeln" oder "Behandlung" betreffen, wie hier verwendet, die Verringerung oder Linderung von mindestens einer nachteiligen Wirkung oder eines Symptoms einer Störung oder Erkrankung, beispielsweise einer Störung oder Erkrankung, die gekennzeichnet ist durch oder assoziiert ist mit abnormaler oder aberranter flh84g5-Polypeptidaktivität oder flh84g5-Nukleinsäureexpression.
  • Wie hier verwendet ist ein flh84g5-Modulator ein Molekül, welches die flh84g5-Nukleinsäureexpression und/oder flh84g5-Polypeptidaktivität modulieren kann. So kann ein flh84g5-Modulator beispielsweise die flh84g5-Nukleinsäureexpression modulieren, beispielsweise hochregulieren (aktivieren/als Agonist fungieren) oder herunterregulieren (unterdrücken/als Antagonist fungieren). In einem anderen Beispiel kann ein flh84g5-Modulator eine flh84g5Polypeptidaktivität modulieren (beispielsweise Stimulieren/als Agonist fungieren oder inhibieren/als Antagonist fungieren). Falls es gewünscht ist eine Störung oder Erkrankung, die gekennzeichnet ist durch (oder assoziiert ist mit) aberranter oder abnormaler (nicht Wildtyp) flh84g5-Nukleinsäureexpression und/oder flh84g5-Polypeptidaktivität, durch Inhibieren einer flh84g5-Nukleinsäureexpression zu behandeln, kann ein flh84g5-Modulator ein antisense Molekül sein, beispielsweise ein Ribozym, wie hier beschrieben. Beispiele von antisense Molekülen, die verwendet werden können, um eine flh84g5-Nukleinsäureexpression zu inhibieren, umfassen antisense Moleküle, die zu einem Teil der 5'-untranslatierten Region von SEQ ID Nr. 1 komplementär sind, die ebenfalls das Startcodon umfasst, und antisense Moleküle, die zu einem Teil der 3'-untranslatierten Region von SEQ ID Nr. 1, 4 oder 31 komplementär sind. Ein Beispiel eines antisense Moleküls, das zu einem Teil der 5'-untranslatierten Region von SEQ ID Nr. 1 komplementär ist und das ebenfalls das Startcodon umfasst, ist ein Nukleinsäuremolekül, welches Nukleotide umfasst die komplementär zu den Nukleotiden 280-296 von SEQ ID Nr. 1 sind. Dieses antisense Molekül weist die folgende Nukleotidsequenz auf: 5' CCTGCGGGGCCATGGAG 3'(SEQ ID Nr. 21). Ein Beispiel eines antisense Moleküls, das zu einem Teil der 3'-untranslatierten Region von SEQ ID Nr. 1 komplementär ist, ist ein Nukleinsäuremolekül, welches Nukleotide umfasst, die komplementär zu den Nukleotiden 1629 bis 1645 von SEQ ID Nr. 1 sind. Dieses antisense Molekül weist die folgende Sequenz auf: 5' GTGGCCCACCAGAGCCT 3' (SEQ ID Nr. 22). Ein weiteres Beispiel eines antisense Moleküls, das zu einem Teil der 3' untranslatierten Region von SEQ ID Nr. 1 komplementär ist, ist ein Nukleinsäuremolekül welches Nukleotide umfasst, die komplementär zu den Nukleotiden 1650 bis 1666 von SEQ ID Nr. 1 sind. Dieses antisense Molekül weist die folgende Sequenz auf: 5' CAGCCACGCCTCTCTCA 3' (SEQ ID Nr. 23). Ein Beispiel eines antisense Moleküls, das zu einem Teil der 5'-untranslatierten Region von SEQ ID Nr. 4 komplementär ist, und ebenfalls das Startcodon umfasst, ist ein Nukleinsäuremolekül, welches Nukleotide umfasst, die komplementär zu den Nukleotiden 766 bis 783 von SEQ ID Nr. 4 sind. Dieses antisense Molekül weist die folgende Sequenz auf: 5' GCCTGCTGGGCCATGGAG 3' (SEQ ID Nr. 24). Ein Beispiel eines antisense Moleküls, das zu einem Teil der 3'-untranslatierten Region von SEQ ID Nr. 4 komplementär ist, ist ein Nukleinsäuremolekül welches Nukleotide umfasst, die komplementär zu den Nukleotiden 2113 bis 2128 von SEQ ID Nr. 4 sind. Dieses antisense Molekül weist die folgende Sequenz auf: 5' TGAGCAGCTGCCCCAC 3' (SEQ ID Nr. 25). Ein zusätzliches Beispiel eines antisense Moleküls, welches zu einem Teil der 3'-untranslatierten Region von SEQ ID Nr. 4 komplementär ist, ist ein Nukleinsäuremolekül welches Nukleotide umfasst, die komplementär zu den Nukleotiden 2133 bis 2148 von SEQ ID Nr. 4 sind. Dieses antisense Molekül weist die folgende Sequenz auf 5' CTGAGGCCAGGCCCTT 3' (SEQ ID Nr. 26).
  • Ein flh84g5-Modulator, der eine flh84g5 Nukleinsäureexpression inhibiert, kann ebenfalls ein kleines Molekül oder ein anderes Arzneimittel sein, beispielsweise ein kleines Molekül oder Arzneimittel, das unter Verwendung der hier beschriebenen Screening-Assays identifiziert wurde, welches eine flh84g5-Nukleinsäureexpression inhibiert. Ist es gewünscht eine Erkrankung oder Störung, die gekennzeichnet ist durch (oder assoziiert mit) aberranter oder abnormaler (nicht Wildtyp) flh84g5-Nukleinsäureexpression und/oder flh84g5-Polypeptidaktivität durch Stimulierung einer flh84g5-Nukleinsäureexpression zu behandeln, kann ein flh84g5-Modulator, beispielsweise ein Nukleinsäuremolekül sein, das flh84g5 kodiert (beispielsweise ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz homolog zu der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr., 1, 4 oder 31 umfasst) oder ein kleines Molekül oder anderes Arzneimittel, beispielsweise ein kleines Molekül (Peptid) oder Arzneimittel, das unter Verwendung der hier beschriebenen Screening-Assays identifiziert wurde, welches eine flh84g5-Nukleinsäureexpression stimuliert.
  • Alternativ kann ein flh84g5-Modulator, wenn es gewünscht wird eine Erkrankung oder Störung, die gekennzeichnet ist durch (oder assoziiert mit) aberranter oder abnormaler (nicht Wildtyp) flh84g5-Nukleinsäureexpression und/oder flh84g5-Polypeptidaktivität durch Inhibieren einer flh84g5-Polypeptidaktivität zu behandeln, ein anti-flh84g5-Antikörper oder ein kleines Molekül oder anderes Arzneimittel sein, beispielsweise ein kleines Molekül oder Arzneimittel, das unter Verwendung der hier beschriebenen Screening-Assays identifiziert wurde, welches eine flh84g5-Polypeptidaktivität inhibiert. Falls es gewünscht ist eine Erkrankung oder Störung, die gekennzeichnet ist durch (oder assoziiert mit) aberranter oder abnormaler (nicht Wildtyp) flh84g5-Nukleinsäureexpression und/oder flh84g5-Polypeptidaktivität, durch Stimulierung einer flh84g5-Polypeptidaktivität zu behandeln, kann ein flh84g5-Modulator ein aktives flh84g5-Polypeptid, oder ein Teil davon, sein (beispielsweise ein flh84g5-Polypeptid oder ein Teil davon, der eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, 5 oder 32 oder einem Teil davon homolog ist) oder ein kleines Molekül oder anderes Arzneimittel, beispielsweise ein kleines Molekül oder Arzneimittel das unter Verwendung der hier beschriebenen Screening-Assays identifiziert wurde, welches eine flh84g5-Polypeptidaktivität stimuliert.
  • Andere Aspekte der Erfindung betreffen Verfahren zum Modulieren einer zellassoziierten Aktivität. Diese Verfahren umfassen Inkontaktbringen einer Zelle mit einem Agens (oder einer Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge eines Agens umfasst), welches eine flh84g5-Polypeptidaktivität oder flh84g5-Nukleinsäureexpression moduliert, so dass eine zellassoziierte Aktivität relativ zu einer zellassoziierten Aktivität (beispielsweise Phosphatidylinositol-Metabolismus) der Zelle in der Abwesenheit des Agens verändert wird. Wie hier verwendet betrifft "eine zellassoziierte Aktivität" eine normale oder abnormale Aktivität oder Funktion einer Zelle. Beispiele zellassoziierter Aktivitäten umfassen Phosphatidylinositol-Umsatz, Produktion oder Absonderung von Molekülen, wie Proteinen, Kontraktion, Proliferation, Differenzierung und Zellüberleben. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine neurale Zelle des Gehirns, beispielsweise eine hippocampale Zelle. Der Begriff "verändert", wie hier verwendet, betrifft eine Änderung, beispielsweise eine Zunahme oder Abnahme einer zellassoziierten Aktivität, insbesondere Phosphatidylinositol-Umsatz und Phospholipase C-Aktivierung. In einer Ausführungsform stimuliert das Agens flh84g5-Polypeptidaktivität oder flh84g5-Nukleinsäureexpression. Beispiele derartiger stimulierender Agenzien umfassen ein aktives flh84g5-Polypeptid, ein in eine Zelle eingeführtes Nukleinsäuremolekül, das flh84g5 kodiert, und ein modulatorisches Agens, welches eine flh84g5-Polypeptidaktivität oder eine flh84g5-Nukleinsäureexpression stimuliert und welches unter Verwendung der hier beschriebenen Arzneimittel-Screening-Assays identifiziert wurde. In einer anderen Ausführungsform inhibiert das Agens eine flh84g5-Polypeptidaktivität oder flh84g5-Nukleinsäureexpression. Beispiele derartiger inhibierender Agenzien umfassen ein antisense flh84g5-Nukleinsäuremolekül, einen anti-flh84g5-Antikörper und ein modulatorisches Agens, welches eine flh84g5-Polypeptidaktivität oder flh84g5-Nukleinsäureexpression inhibiert und welches unter Verwendung der hier beschriebenen Arzneimittel-Screening-Assays identifiziert wurde. Diese modulatorischen Verfahren können in vitro durchgeführt werden (beispielsweise durch Kultivieren der Zelle mit dem Agens) oder alternativ in vivo (beispielsweise durch Verabreichen des Agens an ein Subjekt). In einer bevorzugten Ausführungsform werden die modulatorischen Verfahren in vivo durchgeführt, d. h. die Zelle liegt in einem Subjekt, beispielsweise einem Säugetier, beispielsweise einem Menschen, vor und das Subjekt weist eine Störung oder Erkrankung auf, die gekennzeichnet ist durch oder assoziiert ist mit abnormaler oder aberranter flh84g5-Polypeptidaktivität oder flh84g5-Nukleinsäureexpression.
  • Ein Nukleinsäuremolekül, ein Polypeptid, ein flh84g5-Modulator, eine Verbindung etc., die in den Behandlungsverfahren verwendet werden, kann in eine hier erläuterte geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen inkorporiert werden und dem Subjekt mittels einer Route verabreicht werden, die es dem Molekül, Polypeptid, Modulator oder der Verbindung etc. ermöglicht seine/ihre beabsichtigte Funktion durchzuführen. Beispiele von Verabreichungsrouten sind hier ebenfalls im Unterabschnitt IV erläutert.
  • d. Pharmakogenomik
  • Test/Kandidaten-Verbindungen oder Modulatoren, die eine stimulatorische oder inhibitorische Wirkung auf eine flh84g5-Aktivität (beispielsweise flh84g5-Genexpression) aufweisen, wie durch einen hier beschriebenen Screening-Assay identifiziert, können an Individuen verabreicht werden, um Störungen (beispielsweise ZNS-Störungen), die mit einer aberranten flh84g5-Aktivität assoziiert sind, zu behandeln (prophylaktisch oder therapeutisch). In Verbindung mit einer derartigen Behandlung kann die Pharmakogenetik (d. h. das Studium der Beziehung zwischen dem Genotyp eines Individuums und der Antwort dieses Individuums auf eine fremde Verbindung oder Arzneimittel) betrachtet werden. Unterschiede im Metabolismus von Therapeutika können zu einer ernsten Toxizität und einem therapeutischen Fehler bzw. Versagen durch Ändern der Beziehung zwischen Dosis bzw. Dosierung und Blutkonzentration des pharmakologisch aktiven Arzneimittels führen. Somit ermöglichen die Pharmakogenomiken eines Individuums effektive Verbindungen (beispielsweise Arzneimittel) für prophylaktische oder therapeutische Behandlungen basierend auf einer Betrachtung des Genotyps des Individuums auszuwählen. Derartige Pharmakogenomiken können ferner verwendet werden, um geeignete Dosierungen und therapeutische Regime zu bestimmen. Entsprechend kann die Aktivität eines flh84g5-Polypeptids, die Expression von flh84g5-Nukleinsäure oder der Mutationsgehalt von flh84g5-Genen in einem Individuum bestimmt werden, um dadurch (eine) geeignete Verbindung(en) für eine therapeutische oder prophylaktische Behandlung des Individuums auszuwählen.
  • Pharmakogenomik beschäftigt sich mit klinisch signifikanten erblichen Variationen in der Antwort auf Arzneimittel aufgrund von veränderter Arzneimitteldisposition und abnormaler Wirkung in betroffenen Personen. Siehe beispielsweise Eichelbaum, M. (1996) Clin. Exp. Pharmacol Physiol. 23(10-11):983-985 und Lindner, M.W. (1997) Clin. Chem. 43(2):254-266. Allgemein können zwei Typen von pharmakogenetischen Bedingungen unterschieden werden. Genetische Bedingungen, die als ein einzelner Faktor übertragen werden, die den Weg ändern, wie Arzneimittel auf den Körper wirken (veränderte Arzneimittelwirkung) oder genetische Bedingungen, die als einzelne Faktoren übertragen werden, die den Weg ändern, wie der Körper auf Arzneimittel reagiert (veränderter Arzneimittelmetabolismus). Diese pharmakogenetischen Bedingungen können entweder als seltene Defekte oder als Polymorphismen auftreten. Beispielsweise ist ein Glucose-6-Phosphat-D-Hydrogenase-Mangel (G6PD) eine übliche erbliche Enzymopathie bei der die hauptsächliche klinische Komplikation eine Hämolyse nach Aufnahme von oxidierenden Arzneimitteln (Antimalaria-Mittel, Sulfonamide, Analgetika, Nitrofurane) und nach Verzehr von dicken Bohnen (fava beans) ist.
  • In einer gezeigten Ausführungsform ist die Aktivität von Arzneimittel-metabolisierender Enzyme ein hauptsächlich bestimmender Faktor für sowohl die Intensität als auch die Dauer der Arzneimittelwirkung. Die Entdeckung eines genetischen Polymorphismus von Arzneimittel-metabolisierenden Enzymen (beispielsweise N-Acetyltransferase 2 (NAT2) und Cytochrom-P450-Enzyme CYP2D6 und CYP2C19) hat eine Erklärung geliefert warum einige Patienten die erwarteten Arzneimittelwirkungen nicht erhalten oder eine erhöhte Arzneimittelantwort und ernsthafte Toxizität nach Aufnahme der Standard- und sicheren Dosierung eines Arzneimittels zeigen. Diese Polymorphismen werden in der Population in zwei Phänotypen exprimiert, der starke Metabolisierer (EM) und der schwache Metabolisierer (PM). Die Verbreitung von PM ist in verschiedenen Populationen unterschiedlich. Beispielsweise ist das Gen, das für CYP2D6 kodiert hoch polymorph und es wurden mehrere Mutationen in PM identifiziert, die alle zu der Abwesenheit eines funktionalen CYP2D6 führen. Schwache Metabolisierer von CYP2D6 und CYP2C19 erfahren ziemlich häufig eine überhöhte Arzneimittelantwort und Nebenwirkungen, wenn sie Standarddosierungen empfangen. Ist der therapeutisch aktive Rest ein Metabolit, zeigen PM keine therapeutische Antwort, wie für die analgetische Wirkung von Kodein gezeigt wurde, die durch dessen CYP2D6-gebildeten Metaboliten Morphin vermittelt wird. Das andere Extrem sind so genannte ultraschnelle Metabolisierer, die auf Standarddosierung nicht reagieren. Kürzlich wurde gefunden, dass die molekulare Basis eines ultraschnellen Metabolismus durch eine CYP2D6-Genamplifikation bedingt ist.
  • Somit kann die Aktivität eines flh84g5-Polypeptids, die Expression von flh84g5-Nukleinsäure oder der Mutationsgehalt von flh84g5-Genen in einem Individuum bestimmt werden, um dadurch (ein) geeignete(s) Agens/Agenzien für eine therapeutische oder prophylaktische Behandlung eines Subjekts auszuwerten. Zusätzlich können pharmakogenetische Studien verwendet werden, um eine Genotypisierung von polymorphen Allelen, die Arzneimittel-metabolisierende Enzyme kodieren, für die Identifizierung eines Arzneimittels-reagierenden Phänotyps eines Individuums anzuwenden. Wird dieses Wissen auf die Dosierung oder Arzneimittelauswahl angewendet, können nachteilige Reaktionen oder therapeutische Fehler vermieden werden und somit eine therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit erhöht werden, wenn ein Subjekt mit einem flh84g5-Modulator, wie einen durch einen, der hier beschriebenen exemplarischen Screening-Assays identifizieren Modulator behandelt wird.
  • e. Beobachtung von Wirkungen während klinischer Studien
  • Ein Beobachten des Einflusses von Verbindungen (beispielsweise Arzneimittel) auf die Expression oder Aktivität von flh84g5 (beispielsweise die Fähigkeit die Wirkungen eines flh84g5-Liganden auf flh84g5-Liganden-gesteuerte Zellen zu modulieren) kann nicht nur in einem grundlegenden Arzneimittel-Screening angewendet werden, sondern ebenfalls in klinischen Studien. Beispielsweise kann die Wirksamkeit eines mittels eines hier beschriebenen Screening-Assays bestimmten Agens eine flh84g5-Genexpression, -Polypeptidspiegel zu erhöhen oder eine flh84g5-Aktivität hoch zu regulieren in klinischen Studien von Subjekten beobachtet werden, die eine verringerte flh84g5-Genexpression, -Polypeptidspiegel oder herunter regulierte flh84g5-Aktivität zeigen. Alternativ kann die Wirksamkeit eines mittels eines Screening-Assays bestimmten Agens eine flh84g5-Genexpression, -Polypeptidspiegel zu verringern oder flh84g5 Aktivität herunter regulierte in klinischen Studien von Subjekten beobachtet werden, die ein erhöhte flh84g5-Genexpression, -Polypeptidspiegel oder hoch regulierte flh84g5-Aktivität zeigen. In derartigen klinischen Studien kann die Expression oder Aktivität von flh84g5 und vorzugsweise von anderen Genen, die beispielsweise in einer Nervensystem assoziierten Störung einbezogen sind, als ein "Auslesen" oder Marker der flh84g5 Liganden-Empfindlichkeit einer bestimmten Zelle verwendet werden.
  • Beispielsweise, und nicht beschränkend, können Gene, umfassend flh84g5, die in Zellen durch Behandlung mit einer Verbindung moduliert werden (beispielsweise einem Arzneimittel oder kleinem Molekül), welches eine flh84g5-Aktivität moduliert (beispielsweise in einem hier beschriebenen Screening-Assay identifiziert), identifiziert werden. Um die Wirkung einer Verbindung auf ZNS-Störungen, beispielsweise in einer klinischen Studie, zu studieren, können somit Zellen isoliert werden und RNA hergestellt werden und hinsichtlich der Höhen der Expression von flh84g5 und anderen Genen, die in diese Störung einbezogen sind, analysiert werden. Die Höhen an Genexpression (d. h. ein Genexpressionsmuster) können durch Northerblot-Analysen oder RT-PCR, wie hier beschrieben, quantifiziert werden oder alternativ durch Erfassen der Menge an erzeugtem Polypeptid durch eines der hier beschriebenen Verfahren oder durch Erfassen der Höhe der Aktivität von flh84g5 oder anderer Gene. Auf diese Weise kann das Genexpressionsmuster als ein Marker dienen, der anzeigend bzw. identikativ für die physiologische Antwort der Zelle ist. Entsprechend kann dieser Antwortzustand vor und zu verschiedenen Zeitpunkten während einer Behandlung des Individuums mit der Verbindung bestimmt werden.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht ein Verfahren zum Beobachten der Wirksamkeit einer Behandlung mit einer Verbindung (beispielsweise einem Agonisten, Antagonisten, Peptidmimetikum, Polypeptid, Peptid, Nukleinsäure, kleinem Molekül oder anderen Arzneimittelkandidaten, die durch die hier beschriebenen Screening-Assays identifiziert wurden) auf ein Subjekt, wobei die Schritte umfasst sind von (i) Erhalten einer Vor-Verabreichungs-Probe von einem Subjekt vor einer Verabreichung der Verbindung; (ii) Erfassen der Expressionshöhe eines flh84g5-Polypeptids, mRNA oder genomischer DNA in der Vor-Verabreichungs-Probe; (iii) Erhalten von einem oder mehrerer Nach-Verabreichungs-Proben von dem Subjekt; (iv) Erfassen der Expressionshöhe oder Aktivität des flh84g5-Polypeptids, mRNA oder genomischer DNA in der Nach-Verabreichungs-Probe; (v) Vergleich der Höhen der Expression oder Aktivität des flh84g5-Polypeptids, -mRNA oder genomischer DNA in der Vor-Verabreichungs-Probe mit dem flh84g5-Polypeptid, -mRNA oder genomischer DNA in der Nach-Verabreichungs-Probe oder den Proben; und (vi) entsprechendes Ändern der Verabreichung der Verbindung an das Subjekt. Beispielsweise kann eine erhöhte Verabreichung der Verbindung wünschenswert sein, um die Expression oder Aktivität von flh84g5 auf höhere Spiegel als die erfassten zu erhöhen d. h. die Wirksamkeit des Mittels zu erhöhen. Alternativ kann eine verringerte Verabreichung des Agens wünschenswert sein, um eine Expression oder Aktivität von flh84g5 auf niedrigere Spiegel als erfasst zu verringern, d. h. die Wirksamkeit der Verbindung zu verringern.
  • VI. Verwendung teilweiser flh84g5 Sequenzen
  • Teile oder Fragmente der hier identifizierten cDNA Sequenzen (und die entsprechenden vollständigen Gensequenzen) können in verschiedenen Wegen als Polynukleotidagenzien verwendet werden. Beispielsweise können diese Sequenzen verwendet werden um: (a) ihre entsprechenden Gene auf einem Chromosom zu kartieren; und somit Genregionen zu lokalisieren, die mit einer genetischen Erkrankung assoziiert sind; (b) ein Individuum ausgehend von einer winzigen biologischen Probe zu identifizieren (Gewebetypifizierung); und (c) in einer forensischer Identifizierung einer biologischen Probe behilflich zu sein. Diese Anwendungen werden in den nachfolgenden Unterabschnitten erläutert.
  • a. Chromosomen-Kartierung
  • Sobald die Sequenz (oder ein Teil der Sequenz) eines Gens isoliert wurde, kann diese Sequenz verwendet werden, um die Lokalisation des Gens auf einem Chromosom zu kartieren. Dieses Verfahren wird Chromosomen-Kartierung genannt. Entsprechend können Teile oder Fragmente der hier beschriebenen flh84g5-Sequenz verwendet werden, um die Lokalisierung des flh84g5-Gens auf einem Chromosom jeweils zu kartieren. Diese Kartierung der flh84g5-Sequenz auf Chromosomen ist ein erster wichtiger Schritt, um diese Sequenzen mit Genen zu korrelieren, die mit einer Erkrankung assoziiert sind.
  • In Kürze, kann das flh84g5-Gen auf einem Chromosom kartiert werden, indem PCR-Primer (vorzugsweise 15-25 bp in der Länge) von der flh84g5-Sequenz hergestellt werden. Um schnell Primer auszuwählen, die nicht über mehr als ein Exon in der genomischen DNA spannen, was den Amplifizierungsprozess kompliziert, kann eine Computeranalyse der flh84g5-Sequenz verwendet werden. Diese Primer können dann für eine PCR-Screenen bzw. -Durchmustern somatischer Zellhybride verwendet werden, die einzelne menschliche Chromosome umfassen. Lediglich solche Hybride, die ein menschliches Gen umfassen, das der flh84g5 Sequenz entspricht, werden zu einem amplifizierten Fragment führen.
  • Somatische Zellhybride werden durch Fusionieren somatischer Zellen aus verschiedenen Säugern (beispielsweise Mensch und Mauszellen) hergestellt. Wachsen Hybride aus Mensch und Mauszellen und teilen sich, verlieren sie in zufälliger Ordnung schrittweise menschliche Chromosomen, behalten jedoch die Mauschromosomen. Durch Verwendung von Medien, in denen Mauszellen nicht wachsen können, da ihnen ein bestimmtes Enzym fehlt, menschliche Zellen jedoch wachsen können, wird das eine menschliche Chromosom, welches das das benötigte Enzym kodierende Gen umfasst, beibehalten. Durch Verwendung verschiedener Medien können Panele von Hybridzelllinien etabliert werden. Jede Zelllinie in einem Panel umfasst entweder ein einzelnes menschliches Chromosom oder eine geringe Anzahl an menschlichen Chromosomen und einen vollen Satz an Mauschromosomen, was ein einfaches Kartieren individueller Gene auf spezifischen menschlichen Chromosomen ermöglicht. (D'Eustachio P. et al. (1983) Science 220:919-924). Somatische Zellhybride, die lediglich Fragment von menschlichen Chromosomen umfassen, können ebenfalls unter Verwendung menschlicher Chromosomen mit Translokationen und Deletionen hergestellt werden.
  • Eine PCR-Kartierung somatischer Zellhybride ist ein schnelles Verfahren, um bestimmte Sequenzen einem bestimmten Chromosom zuzuordnen. Wird ein einzelner Thermocycler bzw. eine PCR-Maschine verwendet, können pro Tag drei oder mehr Sequenzen zugeordnet werden. Wird die flh84g5-Sequenz verwendet, um Oligonukleotid-Primer zu gestalten, kann eine Unterlokalisierung mit Panelen von Fragmenten spezifischer Chromosomen erhalten werden. Andere Kartierungsstrategien, die gleichwertig verwendet werden können, um eine flh84g5-Sequenz zu dessen Chromosom zu kartieren, umfassen in situ Hybridisierungen (beschrieben in Fan, Y. et al. (1990) PNAS, 87:6223-27), Vorfärben mit markierten fluss-sortierten Chromosomen, und Vorauswahl durch Hybridisierung an Chromosomen-spezifische cDNA-Banken.
  • Ferner kann Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) einer DNA-Sequenz an einer Ausbreitung von Metaphase-Chromosomen verwendet werden, um eine konkrete chromosomale Lokalisation in einem Schritt bereitzustellen. Chromosomenausbreitungen können hergestellt werden, indem Zellen verwendet werden, deren Teilung in der Metaphase durch eine Chemikalie, wie Colcemid, blockiert wurden, das die mitotische Spindel unterbricht. Die Chromosomen können kurz mit Trypsin behandelt werden, und dann mit Giemsa gefärbt werden kann. Auf jedem Chromosom entwickelt sich ein Muster aus hellen und dunklen Banden, so dass die Chromosomen einzeln identifiziert werden können. Die FISH-Technik kann mit einer DNA-Sequenz verwendet werden, die so kurz wie 500 oder 600 Basen ist. Für einen einfachen Nachweis weisen jedoch Klone, die größer als 1000 Basen sind, eine höhere Bindungswahrscheinlichkeit an eine einzige chromosomale Lokalisation mit ausreichender Signalintensität auf. Vorzugsweise reichen 1000 Basen und noch bevorzugter 2000 Basen aus, um gute Ergebnisse bei angemessenen Zeitaufwand zu erhalten. Hinsichtlich eines Überblicks dieser Technik, siehe Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, New York, 1988).
  • Reagenzien zur Chromosomen-Kartierung können einzeln verwendet werden, um ein einzelnes Chromosom oder eine einzelne Stelle auf dem Chromosom zu markieren, oder es können Panele von Reagenzien zum Markieren mehrerer Stellen und/oder mehrerer Chromosomen verwendet werden. Reagenzien, die nicht-kodierenden Regionen der Gene entsprechen, sind für Kartierungszwecke tatsächlich bevorzugt. Es ist wahrscheinlicher, das kodierende Sequenzen innerhalb von Genfamilien konserviert sind, womit sich die Chance von Kreuzhybridisierungen während einer Chromosomen-Kartierung erhöhen.
  • Sobald eine Sequenz an einer konkreten chromosomalen Lokalisation kartiert wurde, kann die physische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit genetischen Kartendaten korreliert werden (derartige Daten werden beispielsweise gefunden in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, online verfügbar durch Johns Hopkins University Welch Medical Library). Die Beziehung zwischen Genen und Erkrankung, die in der gleichen chromosomalen Region kartiert sind, kann dann durch Verbindungsanalyse identifiziert werden (Co-Vererbung von physisch benachbarten Genen), beispielsweise beschrieben in Egeland, J. et al. (1987) Nature, 325:783-787).
  • Darüber hinaus können Unterschiede in den DNA-Sequenzen zwischen den Individuen bestimmt werden, die von einer mit dem flh84g5-Gen assoziierten Krankheit betroffen und nicht betroffen sind. Wird in einigen oder allen der betroffenen Individuen eine Mutation beobachtet, jedoch nicht in irgendwelchen nicht-betroffenen Individuen, ist es wahrscheinlich, dass die Mutation das ursächliche Agenz der bestimmten Erkrankung ist. Im Allgemeinen beteiligt ein Vergleich von betroffenen und nicht-betroffenen Individuen zu erst ein Ausschauhalten nach strukturellen Veränderungen in den Chromosomen, wie Deletionen oder Translokationen, die in Chromosomen Ausbreitungen sichtbar sind, oder unter Verwendung von PCR, basierend auf der DNA-Sequenz, nachgewiesen werden können. Schlussendlich kann eine komplette Sequenzierung der Gene von mehreren Individuen durchgeführt werden, um das Vorliegen einer Mutation zu bestätigen, und um Mutationen von Polymorphismen zu unterscheiden.
  • b. Gewebetypisierung
  • Die erfindungsgemäßen flh84g5-Sequenzen können ebenfalls verwendet werden, um Individuen aufgrund von winzigen biologischen Proben zu identifizieren. Das Militär der Vereinigten Staaten erwägt beispielsweise die Verwendung von Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) zur Identifizierung von dessen Personal. Bei dieser Technik wird genomische DNA eines Individuums mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen verdaut und auf einem Southernblot beprobt bzw. sondiert, um so einzigartige Banden für eine Identifizierung zu ergeben. Dieses Verfahren zeigt nicht die gegenwärtigen Beschränkungen von "Hundemarken", die verloren, ausgetauscht oder gestohlen werden können, was eine positive Identifizierung schwierig macht. Die erfindungsgemäßen Sequenzen sind als zusätzliche DNA-Marker für RFLP nützlich (beschrieben in US-P-5,272,057).
  • Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Sequenzen verwendet werden, um alternative Techniken bereitzustellen, welche die tatsächliche Base-an-Base-DNA-Sequenz von ausgewählten Teilen eine Genoms eines Individuums bestimmt. Somit können die hier beschriebenen flh84g5-Sequenzen verwendet werden, um zwei PCR-Primer von den 5'- und 3'-Enden der Sequenzen herzustellen. Diese Primer können dann verwendet werden, um eine DNA eines Individuums zu amplifizieren und nachfolgend zu sequenzieren.
  • Panele entsprechender DNA-Sequenzen von Individuen, die in dieser Art und Weise hergestellt wurden, können einzigartige Identifikationen bereitstellen, da jedes Individuum, aufgrund von allelischen Unterschieden, einen einzigartigen Satz derartiger DNA Sequenzen aufweisen wird. Die erfindungsgemäßen Sequenzen können verwendet werden, um derartige Identifizierungssequenzen von Individuen und von Gewebe zu erhalten. Die erfindungsgemäßen flh84g5-Sequenzen stellen einzigartige Teile des menschlichen Genoms dar. Eine allelische Variation tritt in diesen Sequenzen zu einem gewissen Maß in den kodierenden Regionen und zu einem größeren Maß in den nicht kodierenden Regionen auf. Es wird geschätzt, dass eine allelische Variation zwischen individuellen Menschen mit einer Frequenz von ungefähr einmal je 500 Basen auftritt. Jede der hier beschriebenen Sequenzen kann, zu einem gewissen Ausmaß, als ein Standard verwendet werden, gegen den DNA von einem Individuum zu Identifizierungszwecken verglichen werden kann. Da in den nicht kodierenden Regionen mehr Polymorphismen auftreten, werden weniger Sequenzen zum Unterscheiden von Individuen benötigt. Die nicht kodierenden Sequenzen von SEQ ID Nr. 1, 4 und 31 können bequem eine positive individuelle Identifizierung mit einem Panel von ungefähr 10 bis 1000 Primern bereitstellen, die jeweils zu einer nicht kodierenden amplifizierten Sequenz von 100 Basen führen. Werden vorhergesagte kodierende Sequenzen, wie solche in SEQ ID Nr. 3, 6 und 33, verwendet beträgt eine besser geeignete Anzahl an Primern für eine positive individuelle Identifizierung 500 bis 2000.
  • Wird ein Panel von Reagenzien aus hier beschriebenen flh84g5-Sequenzen zum Erzeugen einer einzigartigen Identifizierungsdatenbasis für ein Individuum verwendet, können diese Reagenzien später verwendet werden, um Gewebe von diesem Individuum zu identifizieren. Wird die einzigartige Identifizierungsdatenbasis verwendet, kann eine positive Identifizierung des Individuums, lebend oder tod, aus extrem kleinen Gewebeproben erfolgen.
  • c. Verwendung teilweiser flh84g5-Sequenzen in forensischer Biologie
  • DNA-basierende Identifizierungstechniken können ebenfalls in der forensischen Biologie verwendet werden. Forensische Biologie ist ein Wissenschaftsgebiet, das eine genetische Typisierung von biologischen Indizien, die an einem Tatort gefunden werden, als ein Mittel einsetzt, um beispielsweise den Täter eines Verbrechens positiv zu identifizieren. Um eine derartige Identifizierung durchzuführen kann die PCR-Technologie verwendet werden, um DNA-Sequenzen zu amplifizieren, die aus sehr geringen biologischen Proben wie Geweben, beispielsweise Haar oder Haut, oder Körperfluiden, beispielsweise Blut, Speichel oder Sperma, die an einem Tatort gefunden wurden, genommen wurden. Die amplifizierte Sequenz kann dann mit einem Standard verglichen werden, um dadurch eine Identifizierung des Ursprungs der biologischen Probe zu ermöglichen.
  • Die erfindungsgemäßen Sequenzen können verwendet werden, um Polynukleotidreagenzien, beispielsweise PCR-Primer, bereitzustellen, die auf spezifische Orte in menschlichem Genom gerichtet sind, welche die Zuverlässigkeit von DNA-basierenden, forensischen Identifizierungen fördern, indem sie beispielsweise einen anderen ("Identifizierungsmarker") bereitstellen (beispielsweise eine andere DNA-Sequenz, die für ein bestimmtes Individuum einzigartig ist). Wie vorstehend erläutert kann eine tatsächliche Basensequenzinformation zur Identifizierung als eine genaue Alternative zu Mustern verwendet werden, die durch von Restriktionsenzymen erzeugten Fragmenten gebildet werden. Sequenzen, die auf die nicht kodierenden Regionen von SEQ ID Nr. 1, 4 und 31 gerichtet sind, sind besonders für diese Verwendung geeignet, da größere Anzahlen an Polymorphismen in den nicht kodierenden Regionen auftreten, was es einfacher macht Individuen unter Verwendung dieser Technik zu unterscheiden. Beispiele von Polynukleotidagenzien umfassen die flh84g5-Sequenzen oder Teile davon, beispielsweise Fragmente, die von den nicht kodierenden Regionen von SEQ ID Nr. 1, 4 und 31 abgeleitet sind, und eine Länge von mindestens 20 Basen, vorzugsweise mindestens 30 Basen aufweisen.
  • Die hier beschriebenen flh84g5-Sequenzen können ferner verwendet werden, um Polynukleotidagenzien bereitzustellen, beispielsweise markierte oder markierbare Sonden, die beispielsweise in einer in situ Hybridisierungstechnik verwendet werden können, um ein spezifisches Gewebe, beispielsweise Gehirngewebe, zu identifizieren. Dies kann in den Fällen sehr nützlich sein, wo einem forensischen Pathologen ein Gewebe von unbekanntem Ursprung vorliegt. Panele derartiger flh84g5-Sonden können verwendet werden, um Gewebe durch Spezies und/oder durch Organtyp zu identifizieren.
  • In einer gleichartigen Art und Weise können diese Reagenzien, beispielsweise flh84g5-Primer und -Sonden, verwendet werden, um Gewebekulturen nach einer Kontamination zu durchmustern (d.h. Durchmustern nach dem Vorliegen eines Gemisches unterschiedlicher Zelltypen in einer Kultur).
  • Diese Erfindung ist weiter durch die folgenden Beispiele erläutert, die nicht als begrenzend anzusehen sind.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Identifizierung von flh84g5-cDNA aus Ratte und Mensch
  • In diesem Beispiel wurden flh84g5-Nukleinsäuremoleküle durch Durchmustern bzw. Screenen geeigneter cDNA-Banken identifiziert. Insbesondere wurde ein cDNA-Bank mit oligo-dT-Rest des frontalen Kortex einer Ratte ausplattiert, und es wurden Kolonien in Platten mit 96 Vertiefungen gepickt. Diese Kolonien wurden kultiviert, aus jeder Vertiefung wurden Plasmide hergestellt und es wurde das 5'-Ende jedes Inserts sequenziert. Nach automatisiertem "Stutzen" von Sequenzen ohne Insert, wurden die Nukleotidsequenzen gegen die öffentliche Proteindatenbank unter Verwendung des BLAST-Sequenzvergleichsprogramm (BLASTN1,3MP, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403) verglichen. Nach Erhalt der Ergebnisse von diesem Sequenzvergleich wurde ein einzelner Klon identifiziert, bezeichnet als 84g5, dessen höchste Ähnlichkeit mit dem Muscarin-Acetylcholin-Rezeptor M1 der Ratte war (mACHR M1; GenBankTM Accession Nummer P08482). Der diese Sequenz umfassende Klon wurde von der Platte mit 96 Vertiefungen gewonnen, Plasmid wurde unter Verwendung von Standardverfahren bereitet, und das Insert wurde vollständig unter Verwendung von standardmäßigen "Aufeinanderfolgen (contigging)" Techniken sequenziert. Eine wiederholte BLAST-Analyse unter Verwendung der gesamten Insert sequenz zeigte wiederum, dass die Sequenz in der Proteindatenbank mit der größten Ähnlichkeit der GenBankTM-Accession-Nummer 08482 entspricht. Diese Sequenz und die Insertsequenz wurden unter Verwendung des GAP-Programms in dem GCG-Software-Paket unter Verwendung eine Lückengewichtung von 5,000 und einer Längengewichtung von 0,100 verglichen. Diese Ergebnisse zeigten eine 27.97%ige Identität und 49,01%ige Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen, wobei für eine optimierte Sequenzausrichtung vier Lücken eingeführt wurden. Die Ausrichtung zeigte, dass sich der 84g5-Klon nicht vollständig über die P08482-Sequenz erstreckt, da offensichtlich ungefähr 30 Aminosäurereste in der N-terminalen Region des Moleküls fehlen. Es wurde dann eine Sonde, die die Reste 143-249 von SEQ ID Nr. 31 überspannt, verwendet, um die gleiche Bank des frontalen Kortex erneut zu durchmustern. Dies führte zur Identifizierung einer Volllängen-flh84g5-Sequenz der Ratte, die in SEQ ID Nr. 4 gezeigt ist. Eine BLAST-Analyse der öffentlichen Nukleotiddatenbanken zeigten keine äquivalente menschlichen Sequenzen. Es wurde lediglich ein einziger EST der Maus identifiziert (GenBankTM Accession-Nummer AA118949), der zwischen Resten 1101 und 1650 ähnlich zu dem 84g5-Klon ist.
  • Das menschliche flh84g5-Nukleinsäuremolekül wurde durch Durchmustern einer menschlichen cDNA-Bank des Kleinhirns identifiziert, wobei ein NciI/NotI-Restriktionsfragment der Ratten-cDNA als eine Sonde verwendet wurde. Eine BLAST-Analyse von Protein- und Nukleinsäuredatenbanken in der öffentlichen Domäne zeigte wiederum, dass das flh84g5-Nukleinsäuremolekül am ähnlichsten zu mACHR M1 Sequenzen ist. Diese Ausrichtungen zeigten ebenfalls, dass ein mAChR-6-Nukleinsäuremolekül ein Volllängen-mACHR-Polypeptid kodiert.
  • Beispiel 2: Gewebeexpression des flh84g5 Gens
  • Northern-Analysen unter Verwendung von RNA aus Gewebe von Mensch und Ratte
  • Multiple Gewebe Northernblots (MTN) des menschlichen Gehirns, menschliche MTN I-, II- und III-Blots und MTN-Blots der Ratte (Clontech, Palo Alto, CA), die 2 μg poly A + RNA pro Spur umfassten, wurden mit der flh84g5-Nukleotidsequenz der Ratte (NciI/NotI-Restriktionsfragment) beprobt. Die Filter wurden in 10 ml Express Hyb-Hybridisierungslösung (Clontech, Palo Alto, CA) bei 68°C für 1 Stunde vorhybridisiert, anschließend wurde 100 ng einer 32P-markierten Sonde zugesetzt. Die Sonde wurde unter Verwendung des Stratagen Primer-It Kits, Catalog Nr. 300392 (Clontech, Palo Alto, CA) erzeugt. Die Hybridisierung konnte bei 68°C für ungefähr 2 Stunden erfolgen. Die Filter wurden in einer 0,05% SDS/2 × SSC Lösung bei Raumtemperatur für 15 Minuten gewaschen und dann zweimal mit einer 0,1% SDS/1 × SSC Lösung bei 50°C für 20 Minuten, und dann bei 80°C über Nacht einem Audioradiographiefilm mit einem Schirm bzw. einer Überprüfung exponiert. Die getesteten menschlichen Gewebe umfassten: Herz, Gehirn (wobei getestete Region des Gehirns umfassten: Kleinhirn, Corpus callosum, cerebraler Kortex, Medulla, Ozipitalpol, Stirnlappen, Schläfenlappen, Putamen, Corpus amygdaloidum, Nukleus caudatus, Hippocampus, Substantia nigra, Nucleus subthalamicus und Thalamus), Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskulatur, Niere, Bauchspeicheldrüse, Milz, Thymus, Prostata, Hoden, Eierstock, Dünndarm, Darm, peripheren Blutleukozyten, Magen, Schilddrüse, Rückenmark, Lymphknoten, Luftröhre, Nebennierendrüse bzw. Nebenniere und Knochenmark. Die getesteten Rattengewebe umfassten: Herz, Gehirn, Milz, Lunge, Leber, Skelettmuskulatur, Niere und Hoden.
  • Es gab eine starke Hybridisierung an menschliches, gesamtes Gehirn, die folgenden Regionen des menschlichen Gehirns: Kleinhirn, Corpus callosum, Großhirnrinde, Medulla, Okzipitalpol, Stirnlappen, Schläfenlappen, Putamen, Corpus amygdaloidum, Nucleus caudatus, Hippocampus, Substantia nigra, Nucleus subthalamicus und Thalamus; und das Rattenhirn zeigte, dass in diesen Geweben das ungefähr 3 kb flh84g5-Gentranskript exprimiert wird. Es wurde ebenfalls eine Hybridisierung an menschliches Rückenmark gezeigt.
  • In situ Hybridisierung
  • Für eine in situ-Analyse wurde das Gehirn einer erwachsenen Sprague-Dawley-Ratte entfernt und auf Trockeneis gefroren. 10 μm dicke koronale Schnitte des Hirns wurden mit 4% Formaldehyd in DEPC, behandelt mit 1 × Phosphat-gepufferter Salzlösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur, nachfixiert, bevor sie zweimal in DEPC 1 × Phosphat-gepufferter Salzlösung und 1 × in 0,1 M Triethanolamin-HCL (pH-Wert 8,0) gespült wurden. Nach einer Inkubation in 0,25% Essigsäureanhydrid, 0,1 M Triethanolamin-HCL für 10 Minuten wurden die Schnitte in DEPC 2 × SSC (1 × SSC ist 0,15 M NaCl plus 0,015 M Natriumcitrat) gespült. Das Gewebe wurde dann durch eine Serie von Ethanolwaschungen dehydriert, in 100% Chloroform für 5 Minuten inkubiert und dann für 1 Minute in 100% Ethanol und für 1 Minute in 95% Ethanol gespült und an Luft getrocknet.
  • Hybridisierungen wurden mit 35S-radiomarkierter (5 × 107 cpm/ml) cRNA-Sonden durchgeführt, die ein 474-Basenpaar-Fragment des Rattengens kodieren (erzeugt mit PCR-Primern F, 5'-CAAGAACCCTTTAAGCCAAG (SEQ ID Nr. 27) und R, 5'-GAAGAAGGTAACGCTGAGGA (SEQ ID Nr. 28) und 529-bp Fragment der Rattengene (erzeugt mit PCR-Primer F, 5'-CAGAACCCCCACCAGATGCC (SEQ ID Nr. 29) und R, 5'-TAGTGGCACAGTGGGTAGAG (SEQ ID Nr. 30)). Die Sonden wurden in der Gegenwart einer Lösung inkubiert, die umfasste 600 mM NaCl, 10 mM Tris (pH-Wert 7,5), 1 mM EDTA, 0,01% gescherte Heringssperma-DNA, 0,01% Hefe tRNA, 0,05% Hefe Gesamt-RNA Typ X1, 1 × Denhardt's Lösung, 50% Formamid, 10% Dextran Sulfat, 100 mM Dithiothreitol, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 0,1% Natriumthiosulfat für 18 Stunden bei 45°C.
  • Nach Hybridisierung wurden die Objektträger mit 2 × SSC gewaschen. Die Schnitte wurden dann sequentiell bei 37°C in TNE inkubiert (ein Lösung, die 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6) 500 mM NaCl, und 1 mM EDTA umfasst) für 10 Minuten, in TNE mit 10 μg RNase A pro ml für 30 Minuten und schließlich in TNE für 10 Minuten. Die Objektträger wurden dann mit 2 × SSC bei Raumtemperatur gespült, mit 2 × SSC bei 50°C für eine Stunde gewaschen, mit 0,2 × SSC für eine Stunde bei 55°C gewaschen und mit 0,2 × SSC für eine Stunde bei 60°C. Die Schnitte wurden dann schnell dehydriert durch serielle Ethanol-0,3 M Natriumacetat-Konzentrationen, bevor sie Luft getrocknet wurden und einem Kodak Biomax MR wissenschaftlichen bildgebenden Film für 24 Stunden exponiert wurden und nachfolgend in NB-2 Photoemulsion getaucht und bei 4°C für 7 Tage exponiert wurden bevor sie gewickelt und gegen gefärbt wurden.
  • In mehreren Regionen des Gehirns wurde ein signifikante Hybridisierung gesehen. Diese umfassten den Cortex, Putamen, Hippocampus, Thalamus und Kleinhirn. Eine Analyse der Regionen bei hoher Auflösung zeigte, das eine signifikante Markierung über die Zellkörper der Neuronen zu sehen war.
  • Beispiel 3: Expression rekombinanter flh84g5-Polypeptide in bakteriellen Zellen
  • In diesem Beispiel wird flh84g5 als ein rekombinantes Glutathion-S-transferase (GST)-Fusionspolypeptid in E. coli exprimiert und das fusionierte Polypeptid wird isoliert und charakterisiert. Im Speziellen wird flh84g5 an GST fusioniert und dieses fusionierte Polypeptid wird in E. coli, beispielsweise Stamm PEB199, exprimiert. Da die vorhergesagten Molekulargewichte der flh84g5-Polypeptide aus Mensch und Ratte ungefähr 51,3 kDa bzw. 51,2 kDa betragen, und das vorhergesagte Molekulargewicht von GST 26 kDa ist, beträgt das vorhergesagte Molekulargewicht der Fusionspolypeptide ungefähr 77,3 kDa bzw. 77,2 kDa. Eine Expression des GST-flh84g5-Fusionpolypeptids in PEB199 wird durch IPTG induziert. Das rekombinante Polypeptid wird von bakteriellen Rohlysaten des induzierten PEB199 Stamms durch Affinitätschromatographie auf Gluthation-Kügelchen gereinigt. Unter Verwendung von einer elektrophoretischen Analyse mit Polyacrylamid-Gel des aus den bakteriellen Lysaten gereinigten Polypeptids wird das Molekulargewicht des so erhaltenen Fusionspolypeptids bestimmt.
  • Beispiel 4: Expression rekombinanter flh84g5-Polypeptide in COS-Zellen
  • Um das flh84g5-Gen in COS-Zellen zu exprimieren, wird des pcDNA/Amp-Vektor von Invitrogen Corporation (San Diego, CA) verwendet. Dieser Vektor umfasst einen SV40 Replikationsursprung, ein Ampicilin-Resistenzgen, einen E. coli Replikationsursprung, einen CMV-Promoter gefolgt von einer Polylinker-Region, und ein SV40 Intron und eine Polyadenylierungsstelle. Ein DNA-Fragment, welches das gesamte flh84g5-Polypeptid und einen HA-Tag, (Wilson et al (1984) Cell 37:767) der im Leserahmen an dessen 3'-Ende des Fragments fusioniert ist, kodiert, wird in die Polylinker-Region des Vektors kloniert, wobei dadurch die Expression des rekombinanten Polypeptids unter die Kontrolle des CMV-Promoters gestellt wird.
  • Um das Plasmid zu konstruieren wird die flh84g5-DNA-Sequenz durch PCR unter Verwendung von zwei Primern amplifiziert. Der 5'-Primer umfasst die Restriktionsschnittstelle von Interesse, gefolgt von ungefähr 20 Nukleotiden der flh84g5-kodierenden Sequenz, beginnend von dem Start-Codon; die Sequenz des 3'-Endes umfasst komplementäre Sequenzen zu der anderen Restriktionsschnittstelle von Interesse, ein Translationsstopp-Codon, den HA-Tag und die letzten 20 Nukleotide der flh84g5-kodierenden Sequenz. Das PCR-amplifizierte Fragment und der pCDNA/Amp-Vektor werden mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und der Vektor wird unter Verwendung des CIAP-Enzyms (New England Biolabs, Beverly, MA) dephosphoryliert. Vorzugsweise sind die beiden ausgewählten Restriktionsstellen unterschiedlich, so dass das flh84g5-Gen in der korrekten Orientierung inseriert wird. Das Ligationsgemisch wird in E. coli-Zellen transformiert (es können die Stämme Hb101, DH5a, SURE verwendet werden, die von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA erhältlich sind), die transformierte Kultur wird auf Medienplatten mit Ampicillin ausplatiert, und es werden resistente Kolonien ausgewählt. Aus den Transformanten wird Plasmid-DNA isoliert und durch Restriktionsanalyse für das Vorliegen des korrekten Fragments untersucht.
  • Nachfolgend werden COS-Zellen mit der flh84g5-pcDNA/Amp – Plasmid-DNA transfiziert, wobei die Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Co-Präzipitationsverfahren, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, oder Elektroporation verwendet werden. Andere geeignete Verfahren zum Transfizieren von Wirtszellen können von Sambrook J., Fritsh, E.F. und Maniatis T. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) gefunden werden. Die Expression des flh84g5-Polypeptids wird durch Radiomakierung nachgewiesen (es kann 35S-Methionin oder 35S-Cystein verwendet werden, die von NEN, Boston, MA erhältlich sind) und Immunopräzipitation (Harlow E. und Lane, D. (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) unter Verwendung eines HA-spezifischen monoklonalen Antikörpers. In Kürze, werden die Zellen für 8 Stunden mit 35S-Methionin (oder 35S-Cystein) markiert. Das Kulturmedium wird dann gesammelt und die Zellen werden unter Verwendung von Detergentien lysiert (RIPA-Puffer, 150 mN NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% DOC, 50 mM Tris, pH-Wert 7,5). Sowohl das Zelllysat als auch die Kulturmedien werden mit einem HA-spezifischen monoklonalen Antikörper präzipitiert. Präzipitierte Polypeptide werden dann durch SDS-PAGE analysiert.
  • Alternativ wird DNA, die die flh84g5-kodierende Sequenz umfasst, direkt in den Polylinker des pcDNA/Amp-Vektors unter Verwendung der geeigneten Restriktionsstellen kloniert. Das so erhaltene Plasmid wird in COS-Zellen in der vorstehend beschriebenen Art und Weise transfiziert und die Expression des flh84g5-Polypeptids wird durch Radiomarkierung und Immunopräzipitation unter Verwendung eines flh84g5-spezifischen monoklonalen Antikörpers nachgewiesen.
  • Beispiel 5: Charakterisierung der flh84g5-Polypeptide des Menschen und der Ratte
  • Zum Beispiel werden die Aminosäuresequenzen der flh84g5-Polypeptide des Menschen und der Ratte mit Aminosäuresequenzen von bekannten Polypeptiden verglichen und es werden verschiedene Motive identifiziert.
  • Das menschliche flh84g5-Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz die in 1 (SEQ ID Nr. 1, 2) gezeigt ist, ist ein neues Polypeptid, das 445 Aminosäurereste umfasst. Das menschliche flh84g5-Polypeptid umfasst 7 Transmembran-Domänen zwischen den Aminosäureresten 34-59 (SEQ ID Nr. 7), 73-91 (SEQ ID Nr. 8), 109-130 (SEQ ID Nr. 9), 152-174 (SEQ ID Nr. 10), 197-219 (SEQ ID Nr. 11), 360-380 (SEQ ID Nr. 12) und 396-416 (SEQ ID Nr. 13). Die Nukleotidsequenz des menschlichen flh84g5 wurde als eine Datenbankabfrage unter Verwendung des BLASTN-Programms verwendet (BLASTN 1.3MP, Altschul et al. (1990), J. Mol Biol. 215:403). Die nächsten Treffer waren mACHR M1 von Ratte, Maus und Schwein (GenbankTM Accession- bzw. Eintrittsnummern P11229, P08482, P12657, und P,04791). Die höchste Ähnlichkeit beträgt 32/70 Aminosäure-Identitäten.
  • Das flh84g5-Polypeptid der Ratte, dessen Aminosäuresequenz in 2 (SEQ ID Nr. 5) gezeigt ist, ist ein neues Polypeptid, welches 445 Aminosäurereste umfasst. Das flh84g5-Polypeptid der Ratte umfasst 7 Transmembran-Domänen zwischen den Aminosäureresten 34-59 (SEQ ID Nr. 14), 73-91 (SEQ ID Nr. 15), 109-130 (SEQ ID Nr. 16), 152-174 (SEQ ID Nr. 17), 197-219 (SEQ ID Nr. 18), 360-380 (SEQ ID Nr. 19) und 396-416 (SEQ ID Nr. 20), die den Transmembran-Domänen 1-7 (SEQ ID Nr. 7-13) des menschlichen flh84g5-Polypeptids entsprechen. Die Nukleotidsequenz von flh84g5 der Ratte wurde als eine Datenbankabfrage unter Verwendung des BLASTN-Programms verwendet (BLASTN 1.3MP, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403). Die nächsten Treffer waren mACHR M1 von Mensch, Ratte, Maus und Schwein (GenbankTM Accession-Nummern P11229, P08482, P12657, und P04761). Die höchste Ähnlichkeit betrug 33/70 Aminosäure-Identitäten. Hydropathie-Plots zeigten, dass die Transmembran-Domänen des flh84g5-Polypeptids der Ratte ähnlich zu den mACHR M1 der Ratte waren. Die Cysteine (Reste 63 und 44 von SEQ ID Nr. 5), die intramolekulare Disulfid-Brücken ermöglichen, sind ebenso konserviert.
  • Beispiel 6: Elektrophysiologische Studien von flh84g5 in Xenopus-Oozyten
  • Verfahren
  • Plasmid-cDNA des flh84g5 der Ratte wurde in pGEMHEA subkloniert. Die cDNA in PGEMHEA wurde dann mit AflII linearisiert und in vitro unter Verwendung der T7 RNA-Polymerase transkripiert. Isolierte Follikel-freie Xenopus-Oozyten wurden mit 10 ng flh84g5-cRNA (in einem Volumen von 10 nl) mikroinjiziert. Die Oozyten wurden vor Verwendung für mindestens 48 Stunden in einer ND96-Lösung gehalten, welche 96 mM NaCl, 2 mM KC, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES (pH-Wert = 7,6) umfasste. Unter Verwendung eines standardmäßigen Zwei Elektroden-Voltage-Clamp-Verfahrens (TEC-03 Verstärker, npi) wurden bei einem Haltepotential von –80 mV endogene Ca2+ aktivierte Cl– Ströme in Oozyten erfasst, die durch Carnitin ausgelöst wurden. Die Elektroden wurden mit 3 M KCl gefüllt und wiesen einen Widerstand von 0,5 bis 3,0 MΩ. Die Aufzeichnungskammer (ungefähr 100 μl Volumen) wurden mittels Schwerkraft kontinuierlich mit ND96 durchschwemmt. An die Oozyten wurden durch Perfusion bei 30-60 Sekunden verschiedenen Konzentrationen von Carnitin angewendet.
  • Ergebnisse
  • Eine Erhöhung des zytosolischen Ca2+ in Oozyten durch GPCRs gekoppelt an PI-Umsatz wird zu einer Aktivierung von endogenen Ca2+-aktivierten Cl–-Strömen führen. Die so erhaltenen Cl–-Ströme nach außen hängen ebenfalls von extrazellulären Ca2+-Konzentrationen ab. In Oozyten, in die flh84g5-cRNA injiziert wurde, induziert L-Carnitin einen derartigen Ca2+-aktivierten Cl–-Strom (Imax = 3-6 μA) in einer konzentrationsabhängigen Art und Weise mit einem EC50 von 3 mM. Während in Wasser injizierte Oozyten hohe Konzentrationen von L-Carnitin (bis zu 10 mM) keine Ströme induzierten. Durch Entfernen von extrazellulären Ca2+ können durch 10 mM L-Carnitin hervorgerufene Ströme in flh84g5-exprimierenden Oozyten inhibiert werden. 10 mM D-Carnitin induziert geringer Ströme als jene, die mit L-Carnitin beobachtet werden. Das Carnitin-Analog, L-Acetylcarnitin (10 mM) induziert ebenfalls geringere Ströme.
  • 0,1-1 mM Ach, GABA, 5-HT, NE, Glu und DA induzieren keine Ströme in mit flh84g5-RNA injizierten Oozyten. Zusätzlich können durch L-Carnitin ausgelöste Ströme in Oozyten durch den Muscarin-Antagonisten Atropin (100 μM) nicht blockiert werden. SEQUENCE LISTING
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Claims (16)

  1. Isoliertes Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2 umfasst; (b) ein Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 5 umfasst; (c) einem Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 32 umfasst; (d) einem Fragment eines Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2 umfasst; worin das Fragment mindestens 15 aufeinanderfolgende Aminosäuren der SEQ ID NR: 2 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist; (e) einem Fragment eines Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 5 umfasst, worin das Fragment mindestens 15 aufeinanderfolgende Aminosäuren der Aminosäurereste 109-130, 152-174, 197-219, 360-380 oder 396-416 der SEQ ID NR: 5 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist; (f) einem Fragment eines Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 32 umfasst, worin das Fragment mindestens 15 aufeinanderfolgen de Aminosäuren der SEQ ID NR: 32 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist; (g) einer natürlich vorkommenden Allel-Variante eines Poypeptids, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 5 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, worin das Polypeptid von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches an ein Nukleinsäuremolekühl mit der SEQ ID NR: 1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert; (h) einer natürlich vorkommenden Allel-Variante eines Polypeptids, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 5 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, worin das Polypeptid von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches an ein Nukleinsäuremolekül mit der SEQ ID NR: 4 unter stringenten Bedingungen hybridisiert; (i) einer natürlich vorkommenden Allel-Variante eines Polypeptids, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 32 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, worin das Polypeptid von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches an ein Nukleinsäuremolekül mit der SEQ ID NR: 31 unter stringenten Bedingungen hybridisiert; (j) einem Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 95% identisch zu der gesamten Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2, 5 oder 32 ist; (k) einem Polypeptid, welches von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die mindestens 95% identisch zu der gesamten Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR: 1, 4 oder 31 ist; worin ein Polypeptid dann eine flh84g5-Aktivität aufweist, wenn es bei Expression in Oozyten eine Induktion eines Calcium aktivierten Chlorid-Stroms durch L-Carnitin ermöglicht.
  2. Polypeptid nach Anspruch 1, welches weiter eine heterologe Aminosäuresequenz umfasst.
  3. Antikörper, der selektiv an ein Polypeptid nach Anspruch 2 bindet.
  4. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid gemäß einem der Abschnitte (a) bis (i) von Anspruch 1 kodiert.
  5. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 4, weiter umfassend, entweder Vektor-Nukleinsäuresequenzen oder Nukleinsäuresequenzen, welche ein heterologes Polypeptid kodieren.
  6. Wirtzelle, welche das Nukleinsäuremolekül von Anspruch 4 oder 5 enthält, wobei die Wirtzelle wahlweise eine Säugezelle ist, beispielsweise eine nichtmenschliche Säuger-Wirtszelle.
  7. Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 4, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Nukleinsäuremolekül, welches den kodierenden Bereich der SEQ ID NR: 1 umfasst; (b) einem Nukleinsäuremolekül, welches den kodierenden Bereich der SEQ ID NR: 4 umfasst; (c) einem Nukleinsäuremolekül, welches den kodierenden Bereich der SEQ ID NR: 31 umfasst; (d) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 7 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (e) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 8 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (f) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 9 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (g) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 10 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (h) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 11 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (i) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 12 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (j) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 13 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (k) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 14 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (l) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 15 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (m) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 16 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (n) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 17 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (o) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 18 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (p) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 19 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (q) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 20 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (r) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 34 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (s) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 35 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (t) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 36 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (u) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 37 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (v) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 38 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (w) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, dass die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 39 umfasst und eine flh84g5-Aktivität aufweist, (x) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, welches eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die mindestens 95% identisch ist zu der gesamten Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR: 1, 4 oder 31, oder ein Komplement davon, worin das Nukleinsäuremolekül ein Polypeptid kodiert, welches eine flh84g5-Aktivität aufweist, und (y) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, welches eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die mindestens 95% identisch ist zu der gesamten Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2, 5 oder 32, worin ein Polypeptid dann eine flh84g5-Aktivität aufweist, wenn es bei Expression in Oozyten eine Induktion eines Calcium aktivierten Chlorid-Stroms durch L-Carnitin ermöglicht.
  8. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 1, wobei das Verfahren den Schritt umfasst, Züchten der Wirtszellen nach Anspruch 6 unter Bedingungen, bei denen das Nukleinsäuremolekül exprimiert wird.
  9. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Polypeptid nach Anspruch 1 in einer Probe, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) Inkontaktbringen der Probe mit einem Antikörper, der an das Polypeptid selektiv bindet, und (ii) Bestimmen, ob der Antikörper an das Polypeptid in der Probe bindet.
  10. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 4 in einer Probe, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) Inkontaktbringen der Probe mit einer Nukleinsäuresonde oder einem Primer, welcher selektiv an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, und (ii) Bestimmen, ob die Nukleinsäureprode oder der Primer an das Nukleinsäuremolekül bindet, wahlweise, worin die Probe mRNA-Moleküle umfasst und mit einer Nukleinsäuresonde in Kontakt gebracht wird.
  11. Kit, welcher umfasst: a) Reagenzien, welche für die Verfahren nach Anspruch 9 oder 10 eingesetzt werden, wobei die Reagenzien eine Verbindung umfassen, welche ein Antikörper ist, der an ein Polypeptid nach Anspruch 1 selektiv bindet, oder b) ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 4 oder 7 oder ein vollständiges Komplement davon, und Instruktionen zur Verwendung.
  12. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welches an ein Polypeptid nach Anspruch 1 bindet, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) Inkontaktbringen des Polypeptids oder einer Zelle, welche das Polypeptid exprimiert, mit einer Testverbindung, und (ii) Bestimmen, ob das Polypeptid an die Testverbindung bindet.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Bindung der Testverbindung an das Polypeptid durch ein Verfahren nachgewiesen wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehen aus: (a) Bestimmen der Bindung durch direktes Erfassen der Bindung der Testverbindung/des Polypeptids, (b) Erfassen der Bindung unter Verwendung eines kompetetiven Bindungsassays, und (c) Erfassen der Bindung unter Verwendung eines Assays unter flh84g5-Aktivität.
  14. Verbindung, welche mit einer Zelle in Kontakt treten kann, welche ein Polypeptid nach Anspruch 1 exprimiert, und angepasst ist, an das Polpeptid in einer ausreichenden Konzentration zu binden, um die Aktivität des Polypeptids zu verändern, zur Verwendung als ein Medikament, worin die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, der an ein Polypetid nach Anspruch 1 spezifisch bindet und einem flh84g5-Polypeptid, einem Teil oder einer natürlich vorkommenden allellischen Variante davon, wie in Anspruch 1 definiert.
  15. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 14 zur der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustands ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Störung des Nervensystems, einer kognitiven Störung, einer Schlafstörung, einer Bewegungsstörung, einer Schizo-wirksamen Störung, einer Störung des schmerzerzeugenden Mechanismuses, einer Trinkstörung, einer Essstörung, einer mit der glatten Muskulatur assoziierten Störung, Reizdarmsyndrom, einer mit dem Herzmuskel assoziierten Störung, verlangsamter Herzschlag, einer Drüsen-assoziierten Störung und Xerostomie.
  16. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Verwendung zu einem Anstieg oder einer Senkung des Phosphatidylinositol-Metabolismus führt.
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