CN107621500A - 氨基酸与肉碱串联质谱衍生化检测法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种氨基酸与肉碱串联质谱衍生化检测法，包括氨基酸同位素标准品和肉碱及酰基肉碱同位素标准品、质控品、提取液、转化液、复溶液。本试剂盒可以分别检测氨基酸与肉碱，灵敏度和准确度高、简单快捷，适合应用于临床检验。

Description

氨基酸与肉碱串联质谱衍生化检测法

技术领域

本发明涉及质谱检测领域，具体地涉及氨基酸与肉碱串联质谱衍生化检测法。

背景技术

遗传性代谢病又称先天性代谢缺陷(inborn error of metabolism，IEM)，是由基因突变导致遗传性生化代谢功能缺陷所造成的一类遗传病，涉及氨基酸、有机酸、脂肪酸、碳水化合物、溶酶体、类固醇等多种物质代谢的异常。其单一病种患病率较低，但由于种类繁多，总体发病率较高。该类疾病发病后常呈进行性加重，如未能早期识别诊断、干预、治疗，常导致早期夭折或终身残疾，且以神经、智力残疾为最多，会严重影响人口素质，造成家庭和社会的沉重负担。因此开展IEM的早期筛查，实现早期诊断，成为IEM防治的关键，对避免和减少残疾儿童的发生，提高人口素质，推动国民经济发展有着重要的意义。目前，IEM的诊断方法主要有枯草杆菌抑制试验、酶活性测定、气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)、单基因分析等。这些诊断方法用于IEM筛查具有局限性：(1)普遍通量低，一般一次只能检测一种至几十种，不能满足IEM可检出病种的逐年增多，并且需要对遗传性代谢病有准确的预判；(2)不同IEM的检测方法各异，且样本多样，如一些疾病检测蛋白水平、而另一些疾病则检测基因水平，有些疾病需要尿液样本、而另一些则需要血液样本。因此不太适合开展大规模的遗传性代谢病的筛查，亟需要一种能高通量检测IEM多种疾病的技术。LC-MS/MS技术的发展使得这类疾病在发病前进行干预成为可能。它通过同位素内标对新生儿滤纸干血片样本中的氨基酸、酰基肉碱的浓度进行分析，能在2～3min内对1个标本进行几十种代谢产物分析，通过对这些产物的分析，可以对40种左右遗传性代谢病(包括氨基酸代谢紊乱、有机酸代谢紊乱和脂肪酸代谢紊乱性疾病)进行筛查和诊断，大大提高了检测效率。

然而，现有技术中虽然有一些针对氨基酸、肉碱的检测方法，但是往往存在较大的系统误差(如转移过程中移液器移液偏差造成体积不准确)、检测灵敏度较低，并且难以同时定量检测氨基酸、肉碱。

因此，本领域迫切需要开发新的检测灵敏度较高并且能够同时定量检测氨基酸、肉碱的技术。

发明内容

本发明的目的就是提供一种检测灵敏度较高并且能够同时定量检测多种氨基酸和酰基肉碱的技术。

在本发明的第一方面，提供了一种串联质谱检测试剂盒，其特征在于，包括：

(1)同位素标准品，所述的同位素标准品包括(i)氨基酸同位素标准品和(ii)肉碱标准品；

(2)质控品，所述的质控品；所述的同位素标准品包括(i)氨基酸同位素标准品和(ii)肉碱标准品；

(3)提取液；

(4)转化液；

(5)复溶液；

在另一优选例中，所述的串联质谱检测试剂盒包括：

(1)同位素标准品，所述的同位素标准品包括(i)氨基酸同位素标准品和(ii)肉碱标准品；

(2)质控品，所述的质控品；所述的同位素标准品包括(i)氨基酸同位素标准品和(ii)肉碱标准品；

(3)提取液，所述的稀释液为乙腈；

(4)转化液，所述的转化液为PTAD(4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮)；

(5)复溶液，所述的复溶液为甲醇；

在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的部件：

(6)96孔蛋白过滤板，

(7)96孔板。

在另一优选例中，所述的96孔板为深孔板。

在另一优选例中，所述的氨基酸同位素标准品包括选自下组的n种同位素标准品：d10-亮氨酸、¹⁵N4-精氨酸、d3-丙氨酸、d8-缬氨酸、d3-蛋氨酸、d8-苯基丙氨酸、d7-酪氨酸、d7-鸟氨酸、d7-瓜氨酸、d3-脯氨酸，¹³C2,¹⁵N-甘氨酸，

其中，n为1-11的正整数。

在另一优选例中，n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11。

在另一优选例中，n为8、9、10、或11。

在另一优选例中，所述的肉碱同位素标准品包括选自下组的m种同位素标准品：d3-游离肉碱、d3-乙酰基肉碱、d3-丙酰基肉碱、d3-丁酰基肉碱、d3-异戊酰基肉碱、d3-己酰肉碱、d3-辛酰基肉碱、d3-癸酰基肉碱、d3-月桂酰肉碱、d3-肉豆蔻酰肉碱、d3-棕榈酰肉碱、d3-十八酰基肉碱；

其中，m为1-12的正整数。

在另一优选例中，m为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。

在另一优选例中，m为8、9、10、11或12。

本发明的第二方面，提供了一种通过串联质谱法测定所取的生物样品中一种或多种氨基酸与肉碱的方法，其包括：

(i)采用串联质谱仪电喷雾阳离子方式对所述一种或多种氨基酸同位素标准品与肉碱标准品和内标进行电离，分别产生所述一种或多种氨基酸与肉碱和所述内标的至少一种母离子；

(ii)分别产生所述一种或多种氨基酸与肉碱和所述内标的所述母离子的一种或多种子离子；和

(iii)比较步骤(i)或(ii)或两者中产生的所述一种或多种氨基酸与肉碱和所述内标的一种或多种所述离子的量以确定所述生物样品中的所述一种或多种氨基酸与肉碱的量。

在另一优选例中，所述的氨基酸同位素标准品包括选自下组的n种同位素标准品：d10-亮氨酸、¹⁵N4-精氨酸、d3-丙氨酸、d8-缬氨酸、d3-蛋氨酸、d8-苯基丙氨酸、d7-酪氨酸、d7-鸟氨酸、d7-瓜氨酸、d3-脯氨酸，¹³C2,¹⁵N-甘氨酸，

其中，n为1-11的正整数。

在另一优选例中，n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11。

在另一优选例中，n为8、9、10、或11。

在另一优选例中，所述的肉碱同位素标准品包括选自下组的m种同位素标准品：d3-游离肉碱、d3-乙酰基肉碱、d3-丙酰基肉碱、d3-丁酰基肉碱、d3-异戊酰基肉碱、d3-己酰肉碱、d3-辛酰基肉碱、d3-癸酰基肉碱、d3-月桂酰肉碱、d3-肉豆蔻酰肉碱、d3-棕榈酰肉碱、d3-十八酰基肉碱；

其中，m为1-12的正整数。

在另一优选例中，m为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。

在另一优选例中，m为8、9、10、11或12。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1患儿丙酰肉碱的峰和丙酰肉碱内标准品的峰。

图2正常人丙酰肉碱的峰和丙酰肉碱内标准品的峰。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次开发了一种串联质谱法，所述方法采用特定的质谱检测条件，不仅简化操作，并且可以在一次检测中同时定量检测出多种氨基酸和酰基肉碱，且检测结果的灵敏度高，检测结果准确性高。在此基础上完成了本发明。

检测方法

如本文所用，“质谱法”(MS)是指通过它们的质量鉴定化合物的分析技术。MS技术一般包括(1)使化合物电离以形成带电化合物；和(2)检测带电化合物的分子量并计算质荷比(m/z)。化合物可通过任何合适的方式电离并检测。“质谱仪”一般包括电离器和离子检测器。

术语“电子电离”如本文所用是指这样的方法，其中气态或蒸汽相中的感兴趣分析物与电子流相互作用。电子与分析物的相互作用产生分析物离子，其然后可用于质谱法技术。

术语“化学电离”如本文所用是指这样的方法，其中试剂气体(例如氨)用于电子碰撞，并且分析物离子通过试剂气体离子与分析物分子相互作用而形成。

术语“电离”如本文所用是指产生具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子，而正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的离子。

术语“大约”如本文所用在提及定量测量时是指所示值加上或减去10％。

材料

本试剂盒的氨基酸同位素标准品包含11种氨基酸，分别为：d10-亮氨酸、d3-丙氨酸、d8-缬氨酸、d3-蛋氨酸、d8-苯基丙氨酸、d7-酪氨酸、d7-鸟氨酸、d7-瓜氨酸、15N4-精氨酸、d3-脯氨酸，13C2,15N-甘氨酸。

肉碱及酰基肉碱同位素标准品包含12种肉碱，分别为：d3-游离肉碱、d3-乙酰基肉碱、d3-丙酰基肉碱、d3-丁酰基肉碱、d3-异戊酰基肉碱、d3-己酰肉碱、d3-辛酰基肉碱、d3-癸酰基肉碱、d3-月桂酰肉碱、d3-肉豆蔻酰肉碱、d3-棕榈酰肉碱、d3-十八酰基肉碱。

串联质谱检测多种氨基酸和酰基肉碱新生儿筛查质控品、提取液、转化液、复溶液、96孔蛋白过滤板，96孔深孔板。

典型地，检测方法包括以下：

一、样本处理方法：

(1)干血片的制作

新生儿在出生后喂饱母乳72小时后进行血样采集。用穿刺针进行足跟采血，滴在S&S 903滤纸片上，让血液均匀扩散，并在室温下风干4小时以上，及时送检，如不能及时送检，套入有封口的塑料袋内密封后放2-8℃冰箱保存。

(2)实验操作

内标液制备：使用1.0ml的萃取液加入氨基酸和肉碱、酰基肉碱内标的冻干粉小瓶中，盖紧瓶盖，震荡，超声，使其中的粉末完全溶解。

工作液制备：将内标液置于室温20分钟；以每孔100μL提取液用量，计算当日测定样本和指控所需的萃取液总量；按1:100浓度将浓缩的内标标准品用样本稀释溶液稀释，注意充分混匀。

取样：用3.0mm直径打孔器分别从质控血片、样本血片上打下血点，放入到上层96孔蛋白过滤板样品盘相应孔中。

样品提取：每个QC样品、待测样品分别添加100μL提取液到上层96孔蛋白过滤板的反应孔中，用保护薄膜密封蛋白过滤板，确保密封良好，将挥发量降低到最小；将上层96孔蛋白过滤板、下层样品盘置于30℃的振荡器上，750rpm/min振荡30分钟；揭去密封膜，先将氮气阀打开，检查氮气余量及压力是否正常，将板放置于正压仪上正压3min。

吹干：将下层96孔样品盘置于氮吹仪上避光吹干，设置温度60℃，流量40L/min，吹干时间为6-8min。

样品衍生：目测U型底微孔板已经吹干，每孔加入50uL的转化液，用纸膜封板；置于振荡器上750rpm/min振荡30min，温度为60℃，避光反应。

吹干：样品混匀结束后，撕去纸膜，置于氮吹仪上进行避光吹干，温度60℃，流量40L/min，吹干时间为6-8min；

复溶：取出完全吹干的96孔板，每孔加入100μL的复溶液，用铝膜包足，恒温振荡，温度设定为27℃，频率为750rpm/min，振荡20分钟。放入质谱自动进样器托盘，供质谱检测。

二、色谱条件

液相系统：LC-20AD XR(Shimadzu,Japan)

质谱系统：API 3200MD(AB SCIEX,America)

进样10μL，进样速度：0～0.05min为180μL/min，0.05～0.06min为180μL/min～20μL/min，0.06～1.2min为20μL/min，1.2～1.22min为20μL/min～350μL/min，1.22～1.6min为350μL/min，1.6～1.61min为350μL/min～180μL/min，1.61～1.81min为180μL/min。

三、质谱条件

串联质谱检测多种氨基酸和酰基肉碱的多反应监测条件见表1

表1：质谱参数

采用串联质谱仪电喷雾阳离子方式，离子源温度120℃，解离温度350℃，喷雾电压3.5KV，氮气650L/h，锥孔气50L/h；多反应监测模式收集数据，每个离子对0.05ms依次循环检测离子对，每份样本采集0.2-2min时间段的检测信号，叠加信号强度供定量

四、定量分析

采用软件ChemoView 3.0版本，根据同位素内标和各种丁酯化的氨基酸和酰基肉碱的离子峰强度，由已知浓度的内标，根据软件设定程序自动计算出所测样品中各种氨基酸和酰基肉碱的浓度。通过对质控样本氨基酸和酰基肉碱的检测，回收率和精密度达到筛查检测的要求，见表1 2。

表1质控品回收率

表2精密度分析

化合物名称

Ala

Cit

Leu

Met

Phe

Tyr

Val

Orn

Arg

Pro

精密度RSD

6.04％

6.08％

5.61％

4.84％

5.26％

5.13％

5.63％

5.38％

8.08％

4.84％

化合物名称

Gly

C0

C2

C3

C4

C5

C6

C8

C10

C12

精密度RSD

5.24％

5.11％

6.56％

7.16％

5.21％

5.91％

7.64％

7.71％

7.28％

5.24％

化合物名称

C14

C16

C18

C3DC

C5DC

C4OH

C5OH

C16OH

C18OH

精密度RSD

6.53％

5.81％

6.43％

5.38％

4.82％

5.80％

5.43％

6.10％

5.70％

本发明的主要优点包括：

(a)本方法用正丁醇在乙酰氯存在的环境下与样品中的氨基酸、肉碱进行衍生化反应，生成相应的衍生物，提高分子量并将氨基酸碎片离子从低分辨率的背景中脱离出来，提高检测的灵敏度，降低检测难度。

(b)实验条件较易控制，采用96孔板处理，提高工作效率。由于采用了同位素内标，与样本中需要检测的氨基酸、肉碱进行平行同步处理，所以色谱行为、质谱的离子化效率和基质效应均能完全一致，避免了系统误差。

(c)使用蛋白过滤板，利用正压仪使提取液流到底层样品盘中，省略样品提取液转移一步，避免了移液器移液偏差造成体积不准确的风险。

实施例1

通过如本申请所述的方法，对35070余例新生儿血样标本进行检测，累计检测出甲基丙二酸血症/丙酸血症18例，高苯丙氨酸血症12例，枫糖尿症2例，瓜氨酸血症3例等。

甲基丙二酸血症患儿及正常人的质谱分析图谱结果分别参见图1、图2中，丙酰肉碱的峰和丙酰肉碱内标准品的峰分别表示的是样本中的丙酰肉碱和丙酰肉碱内标准品的离子丰度，与他们的浓度成正比。

在正常人图谱中，样本的丙酰肉碱与内标准品相比其浓度低，在正常范围内，在甲基丙二酸血症患者的图谱中，样本的丙酰肉碱与内标准品相比其浓度高出很多，超出正常范围。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种串联质谱检测试剂盒，其特征在于，包括：

(1)同位素标准品，所述的同位素标准品包括(i)氨基酸同位素标准品和(ii)肉碱标准品；

(2)质控品，所述的质控品；所述的同位素标准品包括(i)氨基酸同位素标准品和(ii)肉碱标准品；

(3)提取液；

(4)转化液；

(5)复溶液。

2.如权利要求1中所述的串联质谱检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括选自下组的部件：

(6)96孔蛋白过滤板，

(7)96孔板。

3.如权利要求1中所述的串联质谱检测试剂盒，其特征在于，所述的氨基酸同位素标准品包括选自下组的n种同位素标准品：d10-亮氨酸、¹⁵N4-精氨酸、d3-丙氨酸、d8-缬氨酸、d3-蛋氨酸、d8-苯基丙氨酸、d7-酪氨酸、d7-鸟氨酸、d7-瓜氨酸、d3-脯氨酸，¹³C2,¹⁵N-甘氨酸，其中，n为1-11的正整数。

4.如权利要求1中所述的串联质谱检测试剂盒，其特征在于，所述的肉碱同位素标准品包括选自下组的m种同位素标准品：d3-游离肉碱、d3-乙酰基肉碱、d3-丙酰基肉碱、d3-丁酰基肉碱、d3-异戊酰基肉碱、d3-己酰肉碱、d3-辛酰基肉碱、d3-癸酰基肉碱、d3-月桂酰肉碱、d3-肉豆蔻酰肉碱、d3-棕榈酰肉碱、d3-十八酰基肉碱；其中，m为1-12的正整数。

5.如权利要求1中所述的串联质谱检测试剂盒，其特征在于，m为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。

6.通过串联质谱法测定所取的生物样品中一种或多种氨基酸与肉碱的方法，其包括：

(i)采用串联质谱仪电喷雾阳离子方式对所述一种或多种氨基酸同位素标准品与肉碱标准品和内标进行电离，分别产生所述一种或多种氨基酸与肉碱和所述内标的至少一种母离子；

(ii)分别产生所述一种或多种氨基酸与肉碱和所述内标的所述母离子的一种或多种子离子；和

(iii)比较步骤(i)或(ii)或两者中产生的所述一种或多种氨基酸与肉碱和所述内标的一种或多种所述离子的量以确定所述生物样品中的所述一种或多种氨基酸与肉碱的量。

7.如权利要求6中所述的方法，其特征在于，所述的氨基酸同位素标准品包括选自下组的n种同位素标准品：d10-亮氨酸、¹⁵N4-精氨酸、d3-丙氨酸、d8-缬氨酸、d3-蛋氨酸、d8-苯基丙氨酸、d7-酪氨酸、d7-鸟氨酸、d7-瓜氨酸、d3-脯氨酸，¹³C2,¹⁵N-甘氨酸，其中，n为1-11的正整数。

8.如权利要求6中所述的方法，其特征在于，n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11。

9.如权利要求6中所述的方法，其特征在于，所述的肉碱同位素标准品包括选自下组的m种同位素标准品：d3-游离肉碱、d3-乙酰基肉碱、d3-丙酰基肉碱、d3-丁酰基肉碱、d3-异戊酰基肉碱、d3-己酰肉碱、d3-辛酰基肉碱、d3-癸酰基肉碱、d3-月桂酰肉碱、d3-肉豆蔻酰肉碱、d3-棕榈酰肉碱、d3-十八酰基肉碱；其中，m为1-12的正整数。

10.如权利要求6中所述的方法，其特征在于，m为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。