CN110220984A - 一种衍生化法检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种衍生化法检测试剂盒。具体地，本发明提供一种衍生化法检测试剂盒，所述试剂盒包括内标品、稀释液、转化液、复溶液。本发明所述的试剂盒与高效液相‑质谱联用能够准确、快速、高效和高灵敏的检测出生物样品中氨基酸和酰基肉碱的含量，从而对疾病进行筛查和预防治疗，且操作简洁快速，准确率和灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析检测技术领域，具体地，本发明涉及一种衍生化法检测试剂盒。
背景技术
遗传性代谢病又称先天性代谢缺陷(inborn error of metabolism，IEM)，常常是由基因突变导致遗传性生化代谢功能缺陷所造成的一类遗传病，涉及氨基酸、胆碱、有机酸、脂肪酸、碳水化合物、溶酶体、类固醇等多种物质代谢的异常。其单一病种患病率较低，但由于种类繁多，总体发病率较高。该类疾病发病后常呈进行性加重，如未能早期识别诊断、干预、治疗，常导致早期夭折或终身残疾，且以神经、智力残疾为最多，会严重影响人口素质，造成家庭和社会的沉重负担。因此开展IEM的早期筛查，实现早期诊断，成为IEM防治的关键，对避免和减少残疾儿童的发生，提高人口素质，推动国民经济发展有着重要的意义。目前，IEM的诊断方法主要有枯草杆菌抑制试验、酶活性测定、气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)、单基因分析等。这些诊断方法用于IEM筛查具有局限性：(1)普遍通量低，一般一次只能检测一种至几十种，不能满足IEM可检出病种的逐年增多，并且需要对遗传性代谢病有准确的预判；(2)不同IEM的检测方法各异，且样本多样，如一些疾病检测蛋白水平、而另一些疾病则检测基因水平，有些疾病需要尿液样本、而另一些则需要血液样本。因此不太适合开展大规模的遗传性代谢病的筛查，亟需要一种能高通量检测IEM多种疾病的技术。
综上，本领域亟需开发一种快速、高效、操作简洁、准确率和灵敏度高的检测方法，用来检测代谢物质，从而能够早期识别、诊断、干预、治疗遗传性代谢病。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、高效、操作简洁、准确率和灵敏度高的衍生化法检测试剂盒，用来检测代谢物质，从而能够早期识别、诊断、干预、治疗遗传性代谢病。
本发明的第一方面，提供了一种衍生化法检测试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)稀释液，所述的稀释液包括饱和一元醇；
(ii)转化液，所述的转化液包括：乙酰化试剂，和丁醇；
(iii)复溶液，所述复溶液包括：饱和一元醇，和水；和
(iv)任选的同位素内标品。
在另一优选例中，所述的内标品包括：同位素标记氨基酸内标品、同位素标记肉碱内标品、和/或同位素标记酰基肉碱内标品；
在另一优选例中，所述的同位素标记选自下组：D标记、13C标记、15N标记，或其组合。
在另一优选例中，所述同位素标记氨基酸包括D10-亮氨酸、D3-丙氨酸、D8-缬氨酸、D3-蛋氨酸、D8-苯基丙氨酸、D7-酪氨酸、D7-鸟氨酸、D7-瓜氨酸、15N4-精氨酸、D3-脯氨酸13C2,15N-甘氨酸、D3-天冬氨酸、D5-谷氨酸中的一种或多种。
在另一优选例中，所述的同位素标记肉碱为D3-游离肉碱。
在另一优选例中，所述的同位素标记酰基肉碱包括D3-乙酰基肉碱、D3-丙酰基肉碱、D3-丁酰基肉碱、D3-异戊酰基肉碱、D3-己酰肉碱、D3-辛酰基肉碱、D3-癸酰基肉碱、D3-十二烷酰基肉碱、D3-十四烷酰基肉碱、D3-十六烷酰基肉碱、D3-十八烷酰基肉碱中的一种或多种。
在另一优选例中，所述的饱和一元醇选自下组：甲醇、乙醇、丙醇、丁醇，或其组合。
在另一优选例中，所述的乙酰化试剂选自下组：乙酰氯、乙酸酐、冰醋酸，或其组合。
在另一优选例中，所述的丁醇为正丁醇。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括质控品，所述质控品包括：全血、氨基酸、肉碱、和/或酰基肉碱。
在另一优选例中，在所述质控品中，所述的氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、鸟氨酸和脯氨酸的一种或多种。
在另一优选例中，在所述质控品中，所述的酰基肉碱包括乙酰基肉碱、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、异戊酰基肉碱、己酰基肉碱、辛酰基肉碱、癸酰基肉碱、十二烷酰基肉碱、十四烷酰基肉碱、十六烷酰基肉碱、十八烷酰基肉碱、3-羟基丁酰基肉碱、3-羟基异戊酰基肉碱、3-羟基十六酰基肉碱、3-羟基十八酰基肉、碱丙二酰基肉碱和戊二酰基肉碱的一种或多种。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括选自下组的一种或多种组件：流动相、反应板、蛋白过滤板、板盖垫、板密封膜。
在另一优选例中，所述的流动相含有甲醇和水。
本发明第二方面，提供一种本发明所述试剂盒的用途，用于检测样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的含量。
在另一优选例中，所述的样品生物样品。
在另一优选例中，所述的生物样品来源于人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的样品为体液，优选为血液。
在另一优选例中，所述的样品为新生儿的体液或血液。
在另一优选例中，所述的氨基酸包括亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸中的一种或多种；
在另一优选例中，所述的酰基肉碱包括乙酰基肉碱、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、异戊酰基肉碱、己酰肉碱、辛酰基肉碱、癸酰基肉碱、十二烷酰基肉碱、十四烷酰基肉碱、十六烷酰基肉碱、十八烷酰基肉碱、3-羟基丁酰基肉碱、3-羟基异戊酰基肉碱、3-羟基十六酰基肉碱、3-羟基十八酰基肉碱、丙二酰基肉碱和戊二酰基肉碱的一种或多种。
本发明的第三方面提供了一种用本发明所述的试剂盒检测样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的方法，包括步骤：
(1)用待测样品与内标工作液进行反应，随后吹干，得到第一反应混合物；
(2)用转化液与所述第一反应混合物混匀进行衍生，得到第二反应混合物；
(3)在第二反应混合物中加入复溶液，得到预处理检测样本；
(4)用高效液相色谱-串联质谱仪对所述的预处理检测样本进行检测。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
(a)内标工作液制备
用稀释液与同位素标记氨基酸内标液、同位素标记肉碱内标液和/或同位素标记酰基肉碱内标液混合，得到含有同位素标记氨基酸内标工作液、同位素标记肉碱内标工作液，和/或同位素标记酰基肉碱内标工作液；
(b)取样：
将待测样品和任选的质控品置于蛋白过滤板中；
(c)提取
将蛋白过滤板对准深孔板中的孔位，将同位素内标品溶液加入到蛋白过滤板的反应孔中，震荡混匀，离心，吹干；
(d)衍生
在所述的深孔板的各个孔位中加入转化液，混匀，进行衍生。
(e)复溶
在所述的深孔板的各个孔位中加入复溶液。
(f)样本上机检测
高效液相色谱-串联质谱仪检测深孔板中样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的含量。
在另一优选例中，在所述步骤(a)中，所述氨基酸内标液：稀释液为1:30-200，优选为1:50-150(v/v)，更优选为1:80-120(v/v)；和/或
所述肉碱内标液：稀释液为1:30-200，优选为1:50-150(v/v)，更优选为1:80-120(v/v)；和/或
所述酰基肉碱内标液：稀释液为1:30-200，优选为1:50-150(v/v)，更优选为1:80-120(v/v)；
在另一优选例中，在所述步骤(a)中，所述的同位素标记氨基酸内标液、同位素标记肉碱内标液，和/或同位素标记酰基肉碱内标液是通过用超纯水、甲醇水或甲醇作为溶剂进行溶解同位素标记氨基酸内标品、同位素标记肉碱内标品，和/或同位素标记酰基肉碱内标品所制得。
在另一优选例中，在所述步骤(b)中，所述的待测样品的加入量为0.5-10μL，优选为1-5μL，优选为3.2μL。
在另一优选例中，在所述步骤(b)中，所述质控品的加入量量为0.5-10μL，优选为1-5μL，优选为3.2μL。
在另一优选例中，在所述步骤(d)中，所述转化液的加入量为20-100μl,优选为40-80μl，更优选为50μl。
在另一优选例中，在所述步骤(e)中，所述复溶液的加入量为为50-150μl,优选为80-120μl，更优选为100μl。
在另一优选例中，在所述步骤(f)中，所述的高效液相色谱条件如下：
流动相：甲醇：水为7-1:1(v/v)，优选为5-3:1(v/v)，更优选为8:2(v/v)。
进样量：5-20μL，优选为8-12μl，更优选为10μl；
流速：：0.2-0.5mL/min，优选为0.3-0.4mL/min，更优选为0.35mL/min；
梯度：0.01–0.1min 0.35ml/min；0.11–1.40min 0.02ml/min；1.41-1.59min0.60ml/min；1.60–1.79min 0.35ml/min；
运行时间：1.5-2.1min,优选为1.6-2.0min，更优选为1.8min。
在另一优选例中，在所述步骤(f)中，所述质谱条件如下：
采用串联质谱仪电喷雾(ESI)离子源，离子化电压4500-5500V，优选为5500V；辅助加热气温度：200-500℃，优选为300-400℃，更优选为350℃；雾化气(GAS1)：10-50psi，优选为20-40psi，更优选为30psi；辅助加热气(GAS2)：10-50psi，优选为20-40psi，更优选为30psi；气帘气(CUR)：10-40psi，优选为20-30psi，更优选为25psi；碰撞气(CAD)：1-10psi，优选为4-8psi，更优选为6psi。
在另一优选例中，在所述步骤(f)中，所述的质谱条件中，多反应监测离子对(MRM)及相应的电压参数如下：
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为本发明实施例1中多种氨基酸、肉碱和酰基肉碱峰图。
图2为本发明实施例1中丙氨酸化合物峰图。
图3为本发明实施例1中丙氨酸同位素内标峰图。
图4为本发明实施例1中精氨酸化合物峰图。
图5为本发明实施例1中精氨酸同位素内标峰图。
图6为本发明实施例1中亮氨酸化合物峰图。
图7为本发明实施例1中亮氨酸同位素内标峰图
具体实施方式
本发明人经过广泛而又深入的研究，开发了一种衍生化法检测试剂盒，所述试剂盒包括稀释液、转化液、复溶液和任选的同位素内标品。本发明开发的试剂盒结合能够准确、快速、高效和高灵敏的检测出生物样品(如新生儿的体液或血液)中氨基酸和酰基肉碱的含量，从而对疾病(如新生儿的遗传代谢病)进行筛查和预防治疗，且具有操作简洁快速，准确率和灵敏度高等优点。基于上述发现，发明人完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
衍生化法检测试剂盒
本发明提供一种衍生化法检测试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)稀释液，所述的稀释液包括饱和一元醇；
(ii)转化液，所述的转化液包括：乙酰化试剂，和丁醇；
(iii)复溶液，所述复溶液包括：饱和一元醇，和水；和
(iv)任选的同位素内标品。
本发明中的一个优选例中，所述的内标品包括：同位素标记氨基酸内标品、同位素标记肉碱内标品、和/或同位素标记酰基肉碱内标品；本发明中，所述的肉碱是游离肉碱。
优选地，所述的同位素标记选自下组：D标记、13C标记、15N标记，或其组合。
在另一优选例中，所述同位素标记氨基酸包括D10-亮氨酸、D3-丙氨酸、D8-缬氨酸、D3-蛋氨酸、D8-苯基丙氨酸、D7-酪氨酸、D7-鸟氨酸、D7-瓜氨酸、15N4-精氨酸、D3-脯氨酸13C2,15N-甘氨酸、D3-天冬氨酸、D5-谷氨酸中的一种或多种。
在另一优选例中，所述的同位素标记肉碱为D3-游离肉碱。
在另一优选例中，所述的同位素标记酰基肉碱包括D3-乙酰基肉碱、D3-丙酰基肉碱、D3-丁酰基肉碱、D3-异戊酰基肉碱、D3-己酰肉碱、D3-辛酰基肉碱、D3-癸酰基肉碱、D3-十二烷酰基肉碱、D3-十四烷酰基肉碱、D3-十六烷酰基肉碱和D3-十八烷酰基肉碱中的一种或多种。
发明人对所述试剂盒中的稀释液、转化液、复溶液的组分进行筛选和优选，使其符合本发明目的，在一个优选例中，所述的饱和一元醇选自下组：甲醇、乙醇、丙醇、丁醇，或其组合；在一个优选例中，所述的乙酰化试剂选自下组：乙酰氯、乙酸酐、冰醋酸，或其组合。在一个优选例中，所述的丁醇为正丁醇。
在另一优选例中，本发明所述的试剂盒还包括质控品，所述质控品包括：全血、氨基酸、肉碱、和/或酰基肉碱。
在另一优选例中，在所述质控品中，所述的氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、鸟氨酸和脯氨酸的一种或多种。
在另一优选例中，在所述质控品中，所述的酰基肉碱包括乙酰基肉碱、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、异戊酰基肉碱、己酰基肉碱、辛酰基肉碱、癸酰基肉碱、十二烷酰基肉碱、十四烷酰基肉碱、十六烷酰基肉碱、十八烷酰基肉碱、3-羟基丁酰基肉碱、3-羟基异戊酰基肉碱、3-羟基十六酰基肉碱、3-羟基十八酰基肉、碱丙二酰基肉碱和戊二酰基肉碱的一种或多种。
在本发明的另一优选例中，所述的试剂盒还包括选自下组的一种或多种组件：流动相、反应板、蛋白过滤板、板盖垫、板密封膜。
在另一优选例中，所述的流动相含有甲醇和水。
本发明试剂盒与华大基因氨基酸和肉碱检测试剂盒相比较，其中氨基酸多出5种指标，分别为：天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸；酰基肉碱多出4四种指标，分别为：3-羟基丁酰基肉碱、3-羟基十六酰基肉碱、3-羟基十八酰基肉碱、丙二酰基肉碱。
用途
本发明提供了一种所述试剂盒的用途，用于检测样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的含量。
在另一优选例中，所述的样品微生物样品。
在另一优选例中，所述的生物样品来源于人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的样品为体液，优选为血液。
在另一优选例中，所述的样品为新生儿的体液或血液。
在另一优选例中，所述的氨基酸包括亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸中的一种或多种；
在另一优选例中，所述的酰基肉碱包括乙酰基肉碱、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、异戊酰基肉碱、己酰肉碱、辛酰基肉碱、癸酰基肉碱、十二烷酰基肉碱、十四烷酰基肉碱、十六烷酰基肉碱、十八烷酰基肉碱、3-羟基丁酰基肉碱、3-羟基异戊酰基肉碱、3-羟基十六酰基肉碱、3-羟基十八酰基肉碱、丙二酰基肉碱和戊二酰基肉碱的一种或多种。
检测方法
本发明还提供一种用本发明所述的试剂盒检测样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的方法，包括步骤：
(1)用待测样品与内标工作液进行反应，随后吹干，得到第一反应混合物；
(2)用转化液与所述第一反应混合物混匀进行衍生，得到第二反应混合物；
(3)在第二反应混合物中加入复溶液，得到预处理检测样本；
(4)用高效液相色谱-串联质谱仪对所述的预处理检测样本进行检测。
在另一优选例中，所述的方法包括步骤：
(a)内标工作液制备
用稀释液与同位素标记氨基酸内标液、同位素标记肉碱内标液和/或同位素标记酰基肉碱内标液混合，得到含有同位素标记氨基酸内标工作液、同位素标记肉碱内标工作液，和/或同位素标记酰基肉碱内标工作液；
(b)取样：
将待测样品和任选的质控品置于蛋白过滤板中；
(c)提取
将蛋白过滤板对准深孔板中的孔位，将同位素内标品溶液加入到蛋白过滤板的反应孔中，震荡混匀，离心，吹干；
(d)衍生
在所述的深孔板的各个孔位中加入转化液，混匀，进行衍生。
(e)复溶
在所述的深孔板的各个孔位中加入复溶液。
(f)样本上机检测
高效液相色谱-串联质谱仪检测深孔板中样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的含量。
在另一优选例中，在所述步骤(a)中，所述氨基酸内标液：稀释液为1:30-200，优选为1:50-150(v/v)，更优选为1:80-120(v/v)；和/或
所述肉碱内标液：稀释液为1:30-200，优选为1:50-150(v/v)，更优选为1:80-120(v/v)；和/或
所述酰基肉碱内标液：稀释液为1:30-200，优选为1:50-150(v/v)，更优选为1:80-120(v/v)；
在另一优选例中，在所述步骤(a)中，所述的同位素标记氨基酸内标液、同位素标记肉碱内标液，和/或同位素标记酰基肉碱内标液是通过用超纯水、甲醇水或甲醇作为溶剂进行溶解同位素标记氨基酸内标品、同位素标记肉碱内标品，和/或同位素标记酰基肉碱内标品所制得。
在另一优选例中，在所述步骤(b)中，所述的待测样品的加入量为0.5-10μL，优选为1-5μL，优选为3.2μL。
在另一优选例中，在所述步骤(b)中，所述质控品的加入量量为0.5-10μL，优选为1-5μL，优选为3.2μL。
在另一优选例中，在所述步骤(d)中，所述转化液的加入量为20-100μl,优选为40-80μl，更优选为50μl。
在另一优选例中，在所述步骤(e)中，所述复溶液的加入量为为50-150μl,优选为80-120μl，更优选为100μl。
在另一优选例中，在所述步骤(f)中，所述的高效液相色谱条件如下：
流动相：甲醇：水为7-1:1(v/v)，优选为5-3:1(v/v)，更优选为8:2(v/v)。
进样量：5-20μL，优选为8-12μl，更优选为10μl；
流速：：0.2-0.5mL/min，优选为0.3-0.4mL/min，更优选为0.35mL/min；
梯度：0.01–0.1min 0.35ml/min；0.11–1.40min 0.02ml/min；1.41-1.59min0.60ml/min；1.60–1.79min 0.35ml/min；
运行时间：1.5-2.1min,优选为1.6-2.0min，更优选为1.8min。
在另一优选例中，在所述步骤(f)中，所述质谱条件如下：
采用串联质谱仪电喷雾(ESI)离子源，离子化电压4500-5500V，优选为5500V；辅助加热气温度：200-500℃，优选为300-400℃，更优选为350℃；雾化气(GAS1)：10-50psi，优选为20-40psi，更优选为30psi；辅助加热气(GAS2)：10-50psi，优选为20-40psi，更优选为30psi；气帘气(CUR)：10-40psi，优选为20-30psi，更优选为25psi；碰撞气(CAD)：1-10psi，优选为4-8psi，更优选为6psi。
在另一优选例中，在所述步骤(f)中，所述的质谱条件中，多反应监测离子对(MRM)及相应的电压参数如下：
本发明中一种优选的检测样品中氨基酸、肉碱和酰基肉碱的方法，包括步骤：
(a)内标工作液制备
提供同位素标记氨基酸内标液、同位素标记肉碱内标液和/或同位素标记酰基肉碱内标液，用稀释液对所述内标液进行稀释；其中氨基酸内标液：稀释液、肉碱内标液：稀释液和/或酰基肉碱内标液：稀释液为1:100。
(b)取样
将质控血片和待测血片在蛋白过滤板排序，用3.0mm直径打孔器分别从样本干血斑上打下血点，放入到上层96孔蛋白过滤板中，下层放置96孔板。
(d)提取
将带有血点的孔内分别加入100μL含同位素标记氨基酸内标液、同位素标记肉碱内标液，和同位素标记酰基肉碱内标液到上层96孔蛋白过滤板的反应孔中，用96孔板密封膜对蛋白过滤板进行密封，将上层96孔蛋白过滤板、下层96孔板放置振荡器上，室温30min,然后放置离心机中4000rpm/min离心2分钟，将96孔板中的样本进行氮气吹干。
(e)衍生
向吹干的96孔反应板中加入50μL的转化液，充分混匀后，60℃衍生30分钟。
(f)复溶
加入100μL复溶液，充分混匀。
(e)样本上机检测
高效液相色谱-串联质谱仪检测深孔板中样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的含量；
所述的高效液相色谱条件如下：
流动相：甲醇：水为8:2(v/v)
在线过滤器：Agilent 1260Infinity LC,2.1mm；
进样量：10μL；
流速：0.35mL/min。
梯度：0.01–0.1min 0.35ml/min；0.11–1.40min 0.02ml/min；1.41-1.59min0.60ml/min；1.60–1.79min 0.35ml/min；
运行时间：1.8min；
所述质谱条件如下：
采用串联质谱仪电喷雾(ESI)离子源，离子化电压：5500V；辅助加热气温度：350℃；雾化气(GAS1)：30psi；辅助加热气(GAS2)：30psi；气帘气(CUR)：25psi；碰撞气(CAD)：6psi。(发明人可提供数值的适当范围)；
多反应监测离子对(MRM)及相应的电压参数如下：
本发明的主要优点包括：
1、本发明所述的试剂盒能够准确、快速、高效和高灵敏的检测出生物样品(如新生儿的体液或血液)中氨基酸和酰基肉碱的含量，从而对疾病(如新生儿的遗传代谢病)进行筛查和预防治疗，且操作简洁快速，准确率和灵敏度高。
2、本发明是基于衍生化法的优势进行产品开发，开发出满足市场需求的简单、准确和高效的试剂盒，用于临床医生遗传代谢病筛查。
3、本发明的衍生化试剂盒能够对新生儿滤纸干血片样本中的氨基酸、肉碱、和/或酰基肉碱的浓度进行分析，能在2～3min内对1个标本进行几十种代谢产物分析，通过对这些产物的分析，可以对40种左右遗传性代谢病(包括氨基酸代谢紊乱、有机酸代谢紊乱和脂肪酸代谢紊乱性疾病)进行筛查和诊断，大大提高了检测效率。
4、本发明所述的试剂盒由于采用了同位素内标，与样本中需要检测的氨基酸、肉碱和酰基肉碱进行平行同步处理，所以色谱行为、质谱的离子化效率和基质效应均能完全一致，避免了系统误差。
5、本发明所述的试剂盒使用蛋白过滤板，利用离心机使提取液流到96孔板中，省略样品提取液转移一步，避免了操作误差，能够达到满意的灵敏度和准确度，为临床进行氨基酸、酰基肉碱分析提供了一项简便、快捷检测方法，适合应用于临床检验。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
使用试剂盒对90份样本中待测血片进行多种氨基酸、肉碱和酰基的检测，包括下列步骤：
(a)内标液工作液制备
将同位素标记氨基酸内标品(D10-亮氨酸、D3-丙氨酸、D8-缬氨酸、D3-蛋氨酸、D8-苯基丙氨酸、D7-酪氨酸、D7-鸟氨酸、D7-瓜氨酸、15N4-精氨酸、D3-脯氨酸、13C2,15N-甘氨酸、D3-天冬氨酸和D5-谷氨酸)同位素标记肉碱内标品(D3-游离肉碱)和同位素标记酰基肉碱内标品(D3-乙酰基肉碱、D3-丙酰基肉碱、D3-丁酰基肉碱、D3-异戊酰基肉碱、D3-己酰肉碱、D3-辛酰基肉碱、D3-癸酰基肉碱、D3-十二烷酰基肉碱、D3-十四烷酰基肉碱、D3-十六烷酰基肉碱和D3-十八烷酰基肉碱)分别用溶剂进行溶解，再将同位素标记氨基酸内标溶液、同位素标记肉碱内标溶液和同位素标记酰基肉碱内标溶液进行混合，制备含有同位素标记氨基酸、肉碱和酰基肉碱的内标液。
取100μL上述含有同位素标记氨基酸、肉碱和酰基肉碱的内标液，用9.9mL稀释液(甲醇)进行稀释，充分混匀。
(b)取样
质控血片和待测血片在蛋白过滤板排序，用3.0mm直径打孔器分别从90份样本干血斑上打下血点，放入到上层96孔蛋白过滤板中，下层放置96孔板；
(d)提取
将带有血点的孔内分别加入100μL含同位素标记氨基酸内标液、同位素标记肉碱内标液，和同位素标记酰基肉碱内标液到上层96孔蛋白过滤板的反应孔中，用96孔板密封膜对蛋白过滤板进行密封，将上层96孔蛋白过滤板、下层96孔板放置振荡器上，室温30min,然后放置离心机中4000rpm/min离心2分钟，将96孔板中的样本进行氮气吹干。
(e)衍生
向吹干的96孔反应板中加入50μL的转化液(乙酰氯和正丁醇混合液)，充分混匀后，60℃衍生30分钟。
(f)复溶
加入100μL复溶液(甲醇水混合液)，充分混匀。
(e)样本上机检测
高效液相色谱-串联质谱仪检测深孔板中样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的含量；
所述的高效液相色谱条件如下：
流动相：甲醇：水为8:2(v/v)
在线过滤器：Agilent 1260Infinity LC,2.1mm；
进样量：10μL；
流速：0.35mL/min。
梯度：0.01–0.1min 0.35ml/min；0.11–1.40min 0.02ml/min；1.41-1.59min0.60ml/min；1.60–1.79min 0.35ml/min；
运行时间：1.8min；
所述质谱条件如下：
采用串联质谱仪电喷雾(ESI)离子源，离子化电压：5500V；辅助加热气温度：350℃；雾化气(GAS1)：30psi；辅助加热气(GAS2)：30psi；气帘气(CUR)：25psi；碰撞气(CAD)：6psi。(发明人可提供数值的适当范围)；
多反应监测离子对(MRM)及相应的电压参数如下：
上机检测
取处理好的3.2μl质控品(氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、鸟氨酸和脯氨酸，肉碱包括游离肉碱，酰基肉碱包括乙酰基肉碱、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、异戊酰基肉碱、己酰基肉碱、辛酰基肉碱、癸酰基肉碱、十二烷酰基肉碱、十四烷酰基肉碱、十六烷酰基肉碱、十八烷酰基肉碱、3-羟基丁酰基肉碱、3-羟基异戊酰基肉碱、3-羟基十六酰基肉碱、3-羟基十八酰基肉、碱丙二酰基肉碱和戊二酰基肉碱)和待测样品样本溶液注入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，并记录色谱图与检测样本中多种氨基酸、肉碱和酰基肉碱的峰面积和多种同位素标记氨基酸内标品、同位素标记肉碱内标品和同位素标记酰基肉碱内标品的峰面积。
其中，图1显示多种氨基酸、肉碱和酰基肉碱峰图，图2和图3分别显示了丙氨酸化合物峰图和丙氨酸同位素内标峰图；图4和图5分别显示了精氨酸化合物峰图和精氨酸同位素内标峰图；图6和图7分别显示了亮氨酸化合物峰图和亮氨酸同位素内标峰图。
定量分析
采用软件ChemoView 3.0版本，根据同位素标记内标品和各种丁酯化的氨基酸、肉碱和酰基肉碱的离子峰强度，由已知浓度的内标，根据软件设定程序自动计算出所测样品中各种氨基酸、肉碱和酰基酰基肉碱的浓度。
计算公式：
上式中：
C：待测物浓度值
C1：内标浓度值
A：待测物质谱响应值
A1：内标质谱响应值
RRF：待测物对应的相对响应因子，RRF值＝31.25，通过100μl内标工作液加入到3.2μl滤纸干血片中计算的待测物稀释倍数。
其中，内标为同位素标记内标品。
检测样本结果的计算：将检测样本的质谱响应值与内标谱响应值代入上述公式中，计算检测样本中待测化合物的浓度，见表1。
表1三种氨基酸的浓度
对比例1
对比例1使用乙腈替换实施例1所使用的甲醇作为稀释液，其他测定条件相同，测定待测样品中氨基酸、肉碱和酰基肉碱的含量，结果如表1所示：
表1实施例1和对比例1使用不同稀释液测定待测样品中氨基酸、肉碱和酰基肉碱的含量
从表1中可以看出，与对比例1使用的乙腈作为稀释液相比，实施例1使用的甲醇作为稀释液，能够明显提高待测样品中氨基酸、肉碱和酰基肉碱的含量，表明使用甲醇作为稀释液能够提高明显的提高待测物氨基酸、肉碱和酰基肉碱的响应值，明显提高待测物的检测灵敏度。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种衍生化法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(i)稀释液，所述的稀释液包括饱和一元醇；
(ii)转化液，所述的转化液包括：乙酰化试剂，和丁醇；
(iii)复溶液，所述复溶液包括：饱和一元醇，和水；和
(iv)任选的同位素内标品。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的内标品包括：同位素标记氨基酸内标品、同位素标记肉碱内标品、和/或同位素标记酰基肉碱内标品。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的饱和一元醇选自下组：甲醇、乙醇、丙醇、丁醇，或其组合。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的乙酰化试剂选自下组：乙酰氯、乙酸酐、冰醋酸，或其组合。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的丁醇为正丁醇。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括质控品，所述质控品包括：全血、氨基酸、肉碱，和/或酰基肉碱。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括选自下组的一种或多种组件：流动相、反应板、蛋白过滤板、板盖垫、板密封膜。
8.一种如权利要求1所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于检测样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的含量。
9.一种用权利要求1所述的试剂盒检测样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)用待测样品与内标工作液进行反应，随后吹干，得到第一反应混合物；
(2)用转化液与所述第一反应混合物混匀进行衍生，得到第二反应混合物；
(3)在第二反应混合物中加入复溶液，得到预处理检测样本；
(4)用高效液相色谱-串联质谱仪对所述的预处理检测样本进行检测。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a)内标工作液制备
用稀释液与同位素标记氨基酸内标液、同位素标记肉碱内标液和/或同位素标记酰基肉碱内标液混合，得到含有同位素标记氨基酸内标工作液、同位素标记肉碱内标工作液，和/或同位素标记酰基肉碱内标工作液；
(b)取样：
将待测样品和任选的质控品置于蛋白过滤板中；
(c)提取
将蛋白过滤板对准深孔板中的孔位，将同位素内标品溶液加入到蛋白过滤板的反应孔中，震荡混匀，离心，吹干；
(d)衍生
在所述的深孔板的各个孔位中加入转化液，混匀，进行衍生；
(e)复溶
在所述的深孔板的各个孔位中加入复溶液；
(f)样本上机检测
高效液相色谱-串联质谱仪检测深孔板中样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的含量。
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