WO2016098757A1 - アミノ酸またはアシルカルニチンの検出方法 - Google Patents

アミノ酸またはアシルカルニチンの検出方法 Download PDF

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WO2016098757A1
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column
mass spectrometer
sample
detection
acylcarnitine
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友義 城下
直子 大山
井手野　晃
利成 大原
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積水メディカル株式会社
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    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting an amino acid or acylcarnitine. More specifically, the present invention relates to a method for detecting amino acid or acylcarnitine with higher sensitivity.
  • amino acid and acylcarnitine are used as analysis items in the screening of inborn errors of metabolism in newborns (hereinafter sometimes simply referred to as neonatal mass screening).
  • neonatal mass screening tandem mass method (hereinafter sometimes simply referred to as a tandem mass screening method), which is a screening method using two mass spectrometers arranged in series, is being promoted.
  • amino acid and acylcarnitine in plasma are measured using a mass spectrometer, and these profiles are obtained, whereby amino acid metabolism disorders (phenylketonuria, homocystinuria, maple syrup urine disease, I Tyrosinemia, citrullinemia), fatty acid oxidation disorders (MCAD, VLCAD, SCAD, MAD, LCHAD, CPTII), as well as some organic acidemias (propionic acidemia, methylmalonic acidemia, Isoyoshi Herbal acidemia, type 1 glutaric acidemia, 3-methylcrotonyl CoA carboxylase deficiency, ⁇ -ketothiolase deficiency, etc.).
  • amino acid metabolism disorders phenylketonuria, homocystinuria, maple syrup urine disease, I Tyrosinemia, citrullinemia
  • organic acidemias propionic acidemia, methylmalonic acidemia
  • Non-patent document 1 describes amino acid metabolism abnormalities (phenylketonuria, homocystinuria, maple syrup urine disease, citrullinemia type 1, argininosuccinic acid urine as inborn errors of metabolism that can be detected by a tandem mass screening method.
  • Citrin deficiency (citrullinemia type 2), hypertyrosinemia type 1, hyperarginineemia), organic acid metabolism disorder (methylmalonic acidemia, propionic acidemia, isovaleric acidemia, methylcroto Nilglysinuria, hydroxymethylglutaric acidemia, complex carboxylase deficiency, glutaric acidemia type 1, ⁇ -ketothiolase deficiency), and fatty acid metabolism abnormalities (MCAD deficiency, VLCAD deficiency, triple head enzyme deficiency, CPT) -1 deficiency, CPT-2 deficiency, CACT deficiency, systemic carnitine deficiency, glutaric acidemia type 2, SCAD And include 25 types of disease loss syndrome), it is described that a single test can be screened.
  • organic acid metabolism disorder methylmalonic acidemia, propionic acidemia, isovaleric acidemia, methylcroto Nilglysinuria, hydroxymethylglutaric acidemia, complex
  • Non-Patent Document 2 describes a method in which amino acid or acylcarnitine is extracted from dried filter paper blood, and the extract is introduced into a mass spectrometer by FIA (Flow Injection Analysis) and detected.
  • FIA Flow Injection Analysis
  • FIA refers to an analysis method that does not include separation of a substance to be measured by an analytical column.
  • samples measurement samples obtained by extracting amino acid or acylcarnitine from dried filter paper blood (hereinafter sometimes simply referred to as “samples”) contain a large amount of contaminants derived from living organisms such as proteins, phospholipids, and salts. In many cases, these contaminants are introduced into the mass spectrometer, which contaminates the ionization part of the mass spectrometer, resulting in a problem that the detection sensitivity of the detection target amino acid or acylcarnitine decreases.
  • tandem mass screening method it is not necessary to separate a detection target substance (amino acid or acylcarnitine) in order to determine a metabolic abnormality.
  • a detection target substance amino acid or acylcarnitine
  • the analysis time is several times to several tens of times longer than that of FIA, and there is a problem that throughput is reduced. It was happening.
  • an object of the present invention is to provide a high-throughput detection method that prevents contamination of a mass spectrometer.
  • the present inventors pass the measurement sample through a column carrying weak cation exchange groups before the measurement sample extracted from the biological sample is introduced into the mass spectrometer, thereby contaminating the mass spectrometer. Has been found to be reduced.
  • the present inventors have found that the amino acid or acylcarnitine to be detected can be analyzed in the same analysis time as FIA because the amino acid or acylcarnitine to be detected is not retained in the column more than necessary.
  • the present inventors have found that the detection sensitivity of the amino acid or acylcarnitine is approximately the same as or higher than that in the absence of the column.
  • the present inventors have found that even when a column carrying a weak cation exchange group simultaneously introduces a plurality of amino acid species or acylcarnitine species described later into the column, the introduced detection target substance passes through the column and has a mass. It was possible to detect with an analyzer, and it was found that it was detected at the same level or with higher sensitivity compared to the case without the column, and the present invention was completed.
  • the present invention relates to the following contents.
  • a detection method for detecting an amino acid or acylcarnitine in a sample with a mass spectrometer comprising introducing a sample treated by passing through a column carrying a weak cation exchange group into the mass spectrometer The detection method.
  • a detection method for detecting an amino acid or acylcarnitine in a sample by a mass spectrometer the step of passing the sample through a column carrying a weak cation exchange group, and the sample processed by the above step
  • the detection method comprising a step of introducing a mass spectrometer into the mass spectrometer.
  • ⁇ 3> The detection method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the sample is extracted from blood with a solvent.
  • ⁇ 4> The detection method according to ⁇ 3>, wherein the blood is dry filter paper blood.
  • ⁇ 5> The detection method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the mass spectrometer is a tandem mass spectrometer.
  • ⁇ 6> The detection method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the weak cation exchange group is a carboxy group.
  • ⁇ 7> The detection method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the column has a length of 5 mm to 50 mm.
  • a sample pretreatment method in a method for detecting an amino acid or acylcarnitine in a sample by a mass spectrometer comprising the following steps.
  • the pretreatment method according to ⁇ 10> which comprises a step of obtaining a sample by extracting amino acid or acylcarnitine from dried filter paper blood with a solvent before the step of (1).
  • ⁇ 12> The pretreatment method according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 11>, wherein the mass spectrometer is a tandem mass spectrometer.
  • ⁇ 13> The pretreatment method according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 12>, wherein the weak cation exchange group is a carboxy group.
  • ⁇ 14> The pretreatment method according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 13>, wherein the column has a length of 5 mm to 50 mm.
  • a device for detecting an amino acid or acylcarnitine in a sample An injector for injecting a sample; A column carrying a weak cation exchange group; A mass spectrometer, and A column carrying a weak cation exchange group is placed between the injector and the mass spectrometer, And the sample passing through the column is configured to be introduced into the mass spectrometer.
  • the detection device. ⁇ 16> The detection device according to ⁇ 15>, wherein the mass spectrometer is a tandem mass spectrometer.
  • the weak cation exchange group is a carboxy group.
  • ⁇ 18> The detection device according to any one of ⁇ 15> to ⁇ 17>, wherein the column has a length of 5 mm to 50 mm.
  • the mass spectrometer is a tandem mass spectrometer.
  • the weak cation exchange group is a carboxy group.
  • ⁇ 22> The detection kit according to any one of ⁇ 19> to ⁇ 21>, wherein the column has a length of 5 mm to 50 mm.
  • ⁇ 23> A method for increasing detection sensitivity when detecting an amino acid or acylcarnitine in a sample with a mass spectrometer, The said detection sensitivity increasing method including the process processed before the sample is introduce
  • a method for detecting an amino acid or acylcarnitine with reduced mass spectrometer contamination, high throughput and high sensitivity is provided.
  • the method for detecting an amino acid or acylcarnitine of the present invention is useful for clinical tests such as screening for inborn errors of metabolism.
  • an amino acid refers to an amino acid that is an analysis item in an amino acid metabolism abnormality screening, and refers to one or more listed in Table 1.
  • the present detection method can be applied to amino acids labeled with stable isotopes.
  • amino acid stable isotopes As various amino acids labeled with stable isotopes (hereinafter also referred to as amino acid stable isotopes), 2 H4-Aline, 2 H4, 13 C-Arginine, 2 H2-Citrulline, 2 H3-Leucine, 2 H3-Methionine , 2 H2-Ornithine, 13 C6 -Phenylalanine, 13 C6-Tyrosine, 2 H8-Valine, 15 N, 2- 13 C-Glycine, 2 H3-Aspartic Examples thereof include acid and 2 H3-Glutamic acid.
  • isotope labeling examples include deuterium labeling, carbon labeling, and nitrogen labeling. However, labeling with radioisotopes, labeling with other elements such as oxygen, the number of atoms to be replaced, the position to be replaced, etc. Absent.
  • Acylcarnitine is composed of acetylcarnitine, propionylcarnitine, stearoylcarnitine, oleylcarnitine, depending on the carbon chain length of the fatty acid moiety, the presence or absence and number of unsaturated bonds, substitution of the hydrogen atom bonded to the carbon chain with an oxygen atom or hydroxy group, etc. , Linoleyl carnitine, malonyl carnitine, 3-hydroxycarnitine, etc., but in the present specification they are generically described as acylcarnitine. Note that free carnitine to which no fatty acid is bound is also included in the acylcarnitine.
  • acylcarnitine refers to a group of compounds represented by Formula 1.
  • Formula 1 (CH 3) 3 N + CH 2 CH (OR 1) CH 2 COO -
  • R 1 represents a hydrogen atom or a saturated or unsaturated fatty acid residue having 2 to 30 carbon atoms, and the hydrogen atom bonded to the fatty acid residue is substituted with an oxygen atom or a hydroxy group. May be.
  • saturated or unsaturated fatty acid residues having 2 to 30 carbon atoms include those listed in Table 2.
  • Table 3 shows the main acylcarnitines used in clinical evaluation items such as screening for inborn errors of metabolism.
  • the detection method can be applied to isotopically labeled acylcarnitines.
  • acyl carnitine labeled with a stable isotope hereinafter also referred to as “acyl carnitine stable isotope”
  • 2 H3-palmitoyl carnitine can be exemplified.
  • Deuterium labeling was given as an example of isotope labeling,
  • the label is not limited to the exemplified labels, such as a label with a radioisotope, a label with another element such as carbon, nitrogen, oxygen, the number of atoms to be substituted, and a position to be substituted.
  • examples of biological samples include body fluids such as blood, serum, plasma, saliva and urine, feces and vomit, or a solution, suspension, and dried product thereof.
  • the organism from which the biological sample is collected is not limited to humans, and examples include mammals other than humans, such as monkeys, apes, dogs, mice, rats, pigs, goats, guinea pigs, and birds and fishes.
  • “dried filter paper blood (Dried Blood Filters, DBS)” means a filter paper impregnated with animal blood or human blood and then dried.
  • the preparation method include a method in which about 20 ⁇ L of whole blood is impregnated into a special filter paper and then dried at room temperature for 2 hours or more.
  • a commercially available filter paper such as an FTA DMPK card (GE Healthcare) is preferably used as the filter paper for preparing dry filter paper blood.
  • the blood impregnated portion of the filter paper can be punched out with a puncher or the like, the punched filter paper piece is immersed in an extraction solution, and components in the blood can be extracted from the dried blood filter paper.
  • a measurement sample means an amino acid and / or acylcarnitine extracted from a biological sample.
  • the solvent for extracting amino acids from a biological sample in the present invention is not particularly limited as long as it is widely used in biochemistry. From the viewpoint of efficiently extracting a plurality of types of amino acids having different structures, and easy handling and availability, purified water, buffers commonly used in biochemistry, or highly polar organic solvents such as methanol and ethanol are preferred. This is because amino acids have a carboxy group and an amino group in the basic structure.
  • the solvent for extracting acylcarnitine from a biological sample is not particularly limited as long as it is widely used in biochemistry. From the viewpoint of efficiently dissolving a mixture of acylcarnitines having different carbon numbers, and easy handling and availability, organic solvents having 1 to 5 carbon atoms are preferable, alcohols having 1 to 5 carbon atoms and acetonitrile are more preferable, and methanol. Further preferred are ethanol, isopropanol. Since acylcarnitine is hydrolyzed, it is preferable that the solvent does not contain water. These organic solvents may contain organic acids such as formic acid, acetic acid, oxalic acid, citric acid and lactic acid.
  • the solvent for extracting amino acids and acylcarnitine from a biological sample at the same time is preferably a highly polar organic solvent such as methanol or ethanol.
  • the weak cation exchange column means a column packed with a filler carrying a weak cation exchange group (also referred to as a weakly acidic cation exchange group) as a stationary phase (support).
  • a weak cation exchange group also referred to as a weakly acidic cation exchange group
  • the weak cation exchange group include a carboxy group (—COOH), a phosphinic acid (—PH ( ⁇ O) OH), and a phosphonic acid (—P ( ⁇ O) (OH) 2 ). Used.
  • a base material for supporting a weak cation exchange group known materials can be used, and examples thereof include silica gel (Si), polymers (acrylic acid resins, methacrylic acid resins, styrene divinylbenzene, etc., including mixtures thereof) and the like.
  • a suitable base material may be appropriately selected depending on an environment in which a filler carrying a weak cation exchange group is used, for example, pH.
  • the weak cation exchange group may be supported directly on the matrix, or may be supported on the matrix via a carbon chain or the like.
  • a filler combining methylcarboxy group and silica gel, a filler combining ethylcarboxy group and silica gel, and a propylcarboxy group and silica gel are combined.
  • the filler etc. which were done can be illustrated.
  • the filler means a material in which a stationary phase is supported on a base material.
  • the carboxy group may be abbreviated as CBA.
  • the filler carrying a carboxy group may be referred to as a CBA column.
  • the column inner diameter is preferably 1.0 mm to 10 mm. If the column inner diameter is thinner than 1.0 mm, the pressure applied to the column may be too high unless the flow rate of the mobile phase is slower than 0.05 mL / min. On the other hand, if the inner diameter of the column is larger than 10 mm, the diffusion of the measurement target substance in the column increases, and the detection sensitivity may decrease.
  • the lower limit of the column inner diameter is more preferably 1.0 mm or more, 1.2 mm or more, or 1.4 mm or more.
  • the upper limit of the column inner diameter is 10.0 mm or less, 8.0 mm or less, 6.0 mm or less, 5.0 mm or less, 4.6 mm or less, 4.0 mm or less, 3.0 mm or less, 2.0 mm or 1.8 mm or less. Is more preferable.
  • the range of the column inner diameter includes a combination of the above upper limit and lower limit, among which 1.0 to 3.0 mm, 1.0 to 2.0 mm, 1.2 to 1.8 mm, 1.4 to 1.8 mm, 1.5 to 1.8 is more preferable, and 1.5 mm is most preferable.
  • the column length of the column is preferably 5 mm to 50 mm. If the column length is shorter than 5 mm, there is a possibility that the removal of impurities by the column is not sufficiently performed. On the other hand, if the column length is longer than 50 mm, the diffusion of the measurement target substance in the column increases, and the detection sensitivity may decrease. Also, the measurement target substance is held in the column more than necessary, and the analysis time is long. There is a fear.
  • the lower limit of the column length is preferably 5 mm or more, 7 mm or more, 8 mm or more, 9 mm or more.
  • the upper limit of the column length is preferably 50 mm or less, 40 mm or less, 30 mm or less, 25 mm or less, 20 mm or less, 18 mm or less, 15 mm or less, or 12 mm or less.
  • Examples of the column length range include combinations of the above upper limit and lower limit. Among them, 5 to 30 mm, 7 to 20 mm, 8 to 18 mm, 9 to 15 mm, and 9 to 12 mm are mentioned, and 10 mm is most preferable.
  • the column according to the present invention is preferably installed between an injector and a mass spectrometer in FIA (Flow Injection Analysis).
  • a mass spectrometer that can automatically introduce a sample is desirable.
  • a liquid chromatograph apparatus equipped with a liquid feed pump and an autoinjector is connected in front of the mass spectrometer and used.
  • An apparatus configuration is mentioned.
  • the form which further provides an analysis column behind the column of this invention can also be taken.
  • a method of attaching an analytical column between the injector and the detector can be mentioned.
  • Examples include a method of loading the column of the present invention in a column holder in which the column can be loaded, and connecting to a flow path connecting the injector and the mass spectrometer.
  • a method of connecting to the flow path a method of installing a pre-column filter or a guard column in the flow path, that is, a so-called cartridge type guard column mounting method in which a cartridge column is mounted on a column holder can be exemplified.
  • a method of connecting a general analytical column to the flow path that is, a method of connecting a column equipped with an end fitting to the flow path by fitting or ferrule can be employed.
  • the column according to the present invention can have a similar arrangement to a so-called conventional precolumn filter or guard column.
  • the pre-column filter protects the analytical column by removing solids (for example, precipitated salts, additive compounds that were not sufficiently dissolved) in the mobile phase with, for example, a sintered stainless steel filter.
  • the guard column is generally filled with the same type of packing material as the analytical column connected to the back of the flow path from the guard column, and contaminants (proteins, phospholipids, etc.) dissolved in the measurement sample are filled. The purpose is to trap and protect the analytical column.
  • the precolumn filter or guard column since the precolumn filter or guard column is intended to protect the analytical column, the precolumn filter or guard column is disposed upstream of the configuration in which the analytical column is essential. Therefore, the precolumn filter or guard column is arranged in the order of the injector, precolumn filter and / or guard column, analysis column, and mass spectrometer from the upstream of the flow path.
  • the column according to the present invention is for maintaining or increasing the detection sensitivity of amino acids or acylcarnitines by preventing introduction of biologically derived contaminants into the mass spectrometer. Therefore, the column of the present invention is arranged in the order of the injector, the column of the present invention, and the mass spectrometer.
  • the purpose of the column according to the present invention is different from that of the conventional precolumn filter or guard column, the configuration and arrangement of the system are different.
  • the column of the present invention can be used in combination with the conventional pre-column filter or guard column as long as it does not depart from its purpose.
  • an injector, a precolumn filter, a column of the present invention, a mass spectrometer, and the like can be arranged in this order from the upstream of the flow path.
  • the mobile phase may further contain an organic acid such as formic acid and acetic acid. Examples of the concentration range of the organic acid include 0.05% to 5% (v / v).
  • a salt for eluting a substance retained in the filler such as sodium chloride or sodium carbonate in the mobile phase has a concentration effective for elution (for example, 10 mmol). / L or more and 2000 mmol / L or less) is also one of the features of the present invention.
  • concentration effective for elution for example, 10 mmol.
  • / L or more and 2000 mmol / L or less is also one of the features of the present invention.
  • some or all of the components to be measured may be eluted from the column at different elution times by the column of the present invention.
  • the amino acid or acylcarnitine detection method of the present invention provides sufficient detection sensitivity for a plurality of types of amino acids or acylcarnitines, which are evaluation items for neonatal inborn errors of metabolism. It can be suitably used for screening for sexual metabolic disorders.
  • the method for detecting an amino acid or acylcarnitine of the present invention also has an effect of enhancing the detection sensitivity thereof, and is therefore a method for enhancing detection sensitivity in a method of detecting an amino acid or acylcarnitine in a sample with a mass spectrometer.
  • kits for realizing the amino acid or acylcarnitine detection method of the present invention a kit containing a stable isotope of amino acid or acylcarnitine and a column carrying a weak cation exchange group can be mentioned.
  • the kit can include necessary instructions such as instruction manuals, solvents used for detection, reagents for sample preparation, and instruments.
  • Example 1 Confirmation of contamination reduction effect of mass spectrometer by column supporting weak cation exchange group About sample containing amino acid or acylcarnitine extracted from dried filter paper blood, introduced into mass spectrometer without passing through column And the case where it was introduced into the mass spectrometer after passing through a column carrying a weak cation exchange group, the accumulation level of dirt on the mass spectrometer was compared.
  • Test method ⁇ Create column> A carboxy group (CBA) was selected as a weak cation exchange group to prepare a column carrying a carboxy group (CBA column).
  • the CBA column was prepared by packing a silica gel-supported filler having an average particle size of 45 ⁇ m (GL Science Co., Ltd.) by a known method so as to form a column having an inner diameter of 1.5 mm and a length of 10 mm.
  • Example 2 Comparison of detection sensitivity of amino acid or acylcarnitine without column (conventional method) and when using CBA column Test method Detection of samples containing amino acid or acylcarnitine extracted from dried filter paper blood when introduced into the mass spectrometer without passing through the column and when introduced into the mass spectrometer after passing through the CBA column The sensitivity was compared. The measurement conditions were the same as in Example 1 except that the sample injection amount was 5 ⁇ L and the number of sample injections was one.
  • Peak area ratio (peak area without column or peak area with column) / (peak area without column)
  • FIG. 1 is a graph comparing the peak area ratios in amino acid detection.
  • FIG. 2 is a graph comparing the peak area ratios in acylcarnitine detection.
  • Table 7 shows the calculated peak area ratio.
  • Isoleucine is a structural isomer of Leucine, and Q1 / Q3 is the same value under the MS conditions of this example. Since Leucine and Isoleucine are detected without distinction, the detection results of Leucine and Isoleucine are indicated as “Leucine / Isoleucine” in this specification.
  • Example 3 Comparison of detection sensitivity of amino acid or acylcarnitine with no column (conventional method) and when using a CBA column with a changed mass spectrometer Mass spectrometer API 4000 (AB SCIEX, Inc.) used in Example 2 Whether the same effect as in Example 2 can be obtained with a mass spectrometer manufactured by a different manufacturer from the above, the difference between the devices was examined. 1. Test method The same column as in Example 1 was used as the CBA column. The test conditions were the same as in Example 2 except for the mass spectrometer and MS conditions. As the mass spectrometer, LCMS-8040 (Shimadzu Corporation) was used. Regarding MS conditions, Serine was further added to the amino acids detected in Examples 1 and 2. 2. Test results Table 8 shows Q1 / Q3 of Serine. Table 9 shows the calculated peak area ratio.
  • Example 4 Comparison of detection sensitivity of amino acid and acylcarnitine when using CBA column, Zircosphere, PRS column, and SCX column
  • the type of filler was changed and weak cations were used.
  • the difference in effect between the column carrying the exchange group other than the exchange group and the column of the present invention was examined.
  • the test conditions were the same as the measurement using the CBA column of Example 1.
  • Serine was also detected in the same manner as in Example 3.
  • Test method ⁇ Create column> As the CBA column, the same column as in Example 1 was used.
  • the Zircosphere column was prepared by packing by a known method so as to be a column having an inner diameter of 1.5 mm and a length of 10 mm using a zirconium oxide carrier having an average particle size of 10 ⁇ m as a filler (GL Sciences Inc.).
  • the PRS column was prepared by packing a packing material (GL Science Co., Ltd.) having an average particle diameter of 45 ⁇ m carrying sulfonylpropyl groups on silica gel by a known method so as to form a column having an inner diameter of 1.5 mm and a length of 10 mm.
  • the SCX column was prepared by packing a packing material (GL Science Co., Ltd.) having an average particle diameter of 5 ⁇ m carrying propylbenzenesulfonyl group on silica gel by a known method so as to be a column having an inner diameter of 1.5 mm and a length of 10 mm. .
  • a packing material GL Science Co., Ltd.
  • Peak area ratio (peak area obtained using various columns) / (peak area obtained using CBA column) 2.
  • FIG. 5 is a graph comparing the peak area ratios in amino acid detection.
  • FIG. 6 is a graph comparing the peak area ratios in acylcarnitine detection. Table 10 shows the calculated peak area ratio.
  • Example 2 (Table 7 and FIG. 1) Discussion of results Regarding amino acid detection using a CBA column, Glycin had a peak area ratio of 0.96, Alanine of 1.17, no column The detection sensitivity was comparable. As for the detection sensitivity of other amino acids, the peak area ratio was 1.24 to 2.42, which was about 1.2 to 2.4 times higher than that without the column.
  • Palmitoylcarnitine and Octadecanoylcarnitine had a peak area ratio of 0.77 and 0.76, respectively, indicating a slight decrease in detection sensitivity compared to the case without a column, but they were detection sensitivity sufficient for evaluating metabolic abnormalities.
  • Example 3 (Table 9 and FIG. 3) Discussion of results Aminoine, Citrulline, Leucine / Isoleucine, Methionine, Phenylalanine, Tyrosine, Valine, and Aspartic acid for detection of amino acids using a CBA column The peak area ratio of 1.22 to 2.69 was about 1.2 to 2.7 times higher than that without the column. Next, the detection sensitivity of Arginine, Glycin, Glutamic acid, and Serine showed a peak area ratio of 0.94 to 1.09, similar to that without the column.
  • Ornithine had a peak area ratio of 0.74, showing a slight decrease in detection sensitivity compared to the case without a column, but was sufficient for evaluation of metabolic abnormalities. It was shown that sufficient detection sensitivity can be obtained by using a CBA column with any apparatus, although API4000 and LCMS-8040 have some difference in peak area ratio.
  • Example 4 (1) Consideration of results of amino acid detection of Example 4 (Table 10 and FIG. 5) First, Alanine, Citrulline, Glycine, and Glutamic acid are detected from the detection results obtained by passing the measurement sample through the Zircosphere column. However, although Arginine and Aspartic acid were detected, the peak area ratios were 0.10 and 0.18, respectively, and the sensitivity was significantly reduced compared to the CBA column. For other amino acids, the peak area ratio was 0.72 to 1.77. Next, Arginine and Citrulline were not detected in the detection results obtained by passing the measurement sample through the PRS column, and Ornithine and Tyrosine obtained only low detection sensitivity compared to the CBA column, and the peak area ratio was They were 0.08 and 0.35, respectively.
  • the peak area ratio was 0.61 to 8.43.
  • Alanine, Methionine, Aspartic acid, and Glutamic acid have a peak area ratio of 0.01 to 0.03, which is very low compared to the CBA column. Detected in Other amino acids were not detected.
  • the method for detecting an amino acid or acylcarnitine according to the present invention can be suitably used for high sensitivity and high throughput analysis in measuring amino acid or acylcarnitine using a mass spectrometer.

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Abstract

血液などの生体試料から抽出されたアミノ酸またはアシルカルニチンの検出において、質量分析計への汚染の蓄積を防止し、且つスループットを低下させない検出方法の提供を課題とする。 試料中のアミノ酸またはアシルカルニチンを質量分析計により検出する方法であって、試料が質量分析計に導入される前に、弱陽イオン交換基を担持したカラムで処理される工程を含む、前記方法を提供する。

Description

アミノ酸またはアシルカルニチンの検出方法
　本発明は、アミノ酸またはアシルカルニチンの検出方法に関する。より詳しくは、アミノ酸またはアシルカルニチンを、より高感度に検出する方法に関する。
　医療の分野においては代謝異常の評価を行うために、血液や尿などの生体試料中のアミノ酸およびアシルカルニチンを分析することは極めて有用である。例えば、新生児を対象とした先天性代謝異常スクリーニング（以下、単に新生児マススクリーニングということがある）においてアミノ酸およびアシルカルニチンは分析項目とされている。特に、質量分析計を直列に２つ並べて用いるスクリーニング法である、新生児マススクリーニングタンデムマス法（以下、単にタンデムマス・スクリーニング法ということがある）の普及が進められている。
　特許文献１には、質量分析計を用いて血漿中のアミノ酸及びアシルカルニチンを測定し、これらのプロファイルを得ることで、アミノ酸代謝障害（フェニルケトン尿症、ホモシスチン尿症、カエデシロップ尿症、Ｉ型チロシン血症、シトルリン血症）、脂肪酸酸化障害（ＭＣＡＤ、ＶＬＣＡＤ、ＳＣＡＤ、ＭＡＤ、ＬＣＨＡＤ、ＣＰＴＩＩ）に加え、一部の有機酸血症（プロピオン酸血症、メチルマロン酸血症、イソ吉草酸血症、１型グルタル酸血症、３－メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症、βケトチオラーゼ欠損症など）の診断に利用できると記載されている。
　非特許文献１には、タンデムマス・スクリーニング法で発見しうる先天性代謝異常症として、アミノ酸代謝異常（フェニルケトン尿症、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、シトルリン血症１型、アルギニノコハク酸尿症、シトリン欠損症（シトルリン血症２型）、高チロシン血症１型、高アルギニン血症）、有機酸代謝異常（メチルマロン酸血症、プロピオン酸血症、イソ吉草酸血症、メチルクロトニルグリシン尿症、ヒドロキシメチルグルタル酸血症、複合カルボキシラーゼ欠損症、グルタル酸血症１型、βケトチオラーゼ欠損症）、及び脂肪酸代謝異常（ＭＣＡＤ欠損症、ＶＬＣＡＤ欠損症、三頭酵素欠損症、ＣＰＴ－１欠損症、ＣＰＴ－２欠損症、ＣＡＣＴ欠損症、全身性カルニチン欠乏症、グルタル酸血症２型、ＳＣＡＤ欠損症）の２５種の疾患が挙げられており、１回の検査でスクリーニング可能であることが記載されている。
　非特許文献２には、乾燥ろ紙血から、アミノ酸またはアシルカルニチンを抽出し、前記抽出液をＦＩＡ（Flow Injection Analysis：フローインジェクション分析）により質量分析計に導入し、検出する方法が記載されている。一般に、ＦＩＡとは分析カラムによる測定対象物質の分離を含まない分析方法を指す。
特表２００７－５０３８７８号公報
「新しい新生児マススクリーニング　タンデムマスＱ＆Ａ２０１２」厚生労働科学研究（成育疾患克服等次世代育成基盤研究事業）山口清次、２０１２年 「Screening blood spots for inborn errors of metabolism by electrospray tandem mass spectrometry with a microplate batch process and a computer algorithm for automated flagging of abnormal profiles」M. S. Rashed、et al.,Clinical Chemistry,43(7),p.1129-1141,1997
　タンデムマス・スクリーニング法における検出方法は、非特許文献２に記載の方法で行われることが一般的である。しかしながら、乾燥ろ紙血からアミノ酸またはアシルカルニチンを抽出した測定試料（以降、単に試料と記載することもある。）には、タンパク質、リン脂質、塩類などの生体由来の夾雑物質が多量に含まれることが多く、これら夾雑物質が質量分析計に導入されることにより、質量分析計のイオン化部が汚染され、検出対象であるアミノ酸またはアシルカルニチンの検出感度が低下するという課題があった。
　また、測定を何度も繰り返すことにより、前記夾雑物質が質量分析計の質量分離部にまで及ぶと装置の故障の原因となり、故障を回避するためには質量分析計の真空を解除しての大掛かりなメンテナンスが必要となることから、時間とコストが問題となっていた。
　前記タンデムマス・スクリーニング法において、代謝異常を判定するためには検出対象物質（アミノ酸またはアシルカルニチン）の分離は不要とされている。前記夾雑物の影響を回避するために分離カラムによる分離工程を加えることも技術的に可能であるが、ＦＩＡに比べ分析時間が数倍から数十倍程度長くなり、スループットが低下するという課題が生じていた。
　すなわち、血液などの生体試料から抽出されたアミノ酸またはアシルカルニチンの検出において、質量分析計への汚染の蓄積を防止し、且つスループットを低下させない検出方法は見出されていない。
　以上より、本発明は質量分析計の汚染を防止し、且つハイスループットな検出方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、生体試料から抽出された測定試料が質量分析計に導入される前に、弱陽イオン交換基が担持されたカラムに前記測定試料を通過させることにより、質量分析計の汚染が低減されることを見出した。
　本発明者らは、検出対象のアミノ酸またはアシルカルニチンが前記カラムに必要以上に保持されることがないことから、ＦＩＡと同等の分析時間でアミノ酸またはアシルカルニチンが分析できることを見出した。
　本発明者らは、前記アミノ酸またはアシルカルニチンの検出感度が、前記カラムがない場合と比較して同程度または高感度化されることを見出した。
　さらに本発明者らは、弱陽イオン交換基を担持したカラムが、後述するアミノ酸複数種、またはアシルカルニチン複数種を同時にカラムに導入した場合でも、これら導入した検出対象物質がカラムを通過し質量分析計で検出することが可能であり、前記カラムがない場合と比較して同程度または高感度に検出されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　本発明は以下の内容に関する。
＜１＞試料中のアミノ酸またはアシルカルニチンを質量分析計により検出する検出方法であって、弱陽イオン交換基を担持したカラムを通過させて処理した試料を、質量分析計に導入する工程を含む、前記検出方法。
＜２＞試料中のアミノ酸またはアシルカルニチンを質量分析計により検出する検出方法であって、試料を弱陽イオン交換基を担持したカラムを通過させて処理する工程と、前記工程により処理された試料を質量分析計に導入する工程を含む、前記検出方法。
＜３＞試料が、血液から溶媒により抽出されたものである＜１＞または＜２＞に記載の検出方法。
＜４＞血液が、乾燥ろ紙血である、＜３＞に記載の検出方法。
＜５＞質量分析計がタンデム質量分析計である、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の検出方法。
＜６＞弱陽イオン交換基がカルボキシ基である＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の検出方法。
＜７＞カラムの長さが５ｍｍ～５０ｍｍである＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の検出方法。
＜８＞試料中のアミノ酸またはアシルカルニチンを質量分析計により検出する方法における試料の前処理方法であって、以下の工程を含む前記前処理方法。
（１）試料を、弱陽イオン交換基を担持したカラムに通過させて処理する工程
＜９＞試料が、血液から溶媒により抽出されたものである＜８＞に記載の前処理方法。
＜１０＞血液が、乾燥ろ紙血である、＜９＞に記載の前処理方法。
＜１１＞（１）の工程の前に、乾燥ろ紙血からアミノ酸またはアシルカルニチンを溶媒により抽出することにより試料を得る工程、を含む＜１０＞に記載の前処理方法。
＜１２＞質量分析計がタンデム質量分析計である、＜８＞～＜１１＞のいずれかに記載の前処理方法。
＜１３＞弱陽イオン交換基がカルボキシ基である＜８＞～＜１２＞のいずれかに記載の前処理方法。
＜１４＞カラムの長さが５ｍｍ～５０ｍｍである＜８＞～＜１３＞のいずれかに記載の前処理方法。
＜１５＞試料中のアミノ酸またはアシルカルニチンの検出装置であって、
試料をインジェクションするインジェクターと、
弱陽イオン交換基を担持したカラムと、
質量分析計と、を含み、
弱陽イオン交換基を担持したカラムはインジェクターと質量分析計との間に配置され、
かつ、当該カラムを通過した試料が質量分析計へと導入されるように構成される、
前記検出装置。
＜１６＞質量分析計がタンデム質量分析計である、＜１５＞に記載の検出装置。
＜１７＞弱陽イオン交換基がカルボキシ基である＜１５＞または＜１６＞に記載の検出装置。
＜１８＞カラムの長さが５ｍｍ～５０ｍｍである＜１５＞～＜１７＞のいずれかに記載の検出装置。
＜１９＞アミノ酸またはアシルカルニチンの質量分析計による検出キットであって、アミノ酸またはアシルカルニチンの安定同位体と、
弱陽イオン交換基を担持したカラムとを含む、前記検出キット。
＜２０＞質量分析計がタンデム質量分析計である、＜１９＞に記載の検出キット。
＜２１＞弱陽イオン交換基がカルボキシ基である＜１９＞または＜２０＞に記載の検出キット。
＜２２＞カラムの長さが５ｍｍ～５０ｍｍである＜１９＞～＜２１＞のいずれかに記載の検出キット。
＜２３＞試料中のアミノ酸またはアシルカルニチンを質量分析計により検出する場合の検出感度増加方法であって、
試料が質量分析計に導入される前に、弱陽イオン交換基を担持したカラムで処理される工程を含む、前記検出感度増加方法。
＜２４＞アミノ酸またはアシルカルニチンの安定同位体、
及び弱陽イオン交換基を担持したカラムの、
アミノ酸またはアシルカルニチンの質量分析計による検出のための使用。
　本発明によれば、質量分析計の汚染が低減され、ハイスループットで、高感度化されたアミノ酸またはアシルカルニチンの検出方法が提供される。本発明のアミノ酸またはアシルカルニチンの検出方法は、先天性代謝異常スクリーニング等の臨床検査に有用である。
実施例２で得られた、カラムなし（従来法）とＣＢＡカラム使用時とのアミノ酸の検出感度を比較したグラフ 実施例２で得られた、カラムなし（従来法）とＣＢＡカラム使用時とのアシルカルニチンの検出感度を比較したグラフ 実施例３で得られた、カラムなし（従来法）とＣＢＡカラム使用時とのアミノ酸の検出感度を比較したグラフ 実施例３で得られた、カラムなし（従来法）とＣＢＡカラム使用時とのアシルカルニチンの検出感度を比較したグラフ 実施例４で得られた、ＣＢＡカラム、ジルコスフィア、ＰＲＳカラム、およびＳＣＸカラム使用時のアミノ酸の検出感度を比較したグラフ 実施例４で得られた、ＣＢＡカラム、ジルコスフィア、ＰＲＳカラム、およびＳＣＸカラム使用時のアシルカルニチンの検出感度を比較したグラフ
　本明細書においてアミノ酸とは、アミノ酸代謝異常スクリーニングでの分析項目とされているアミノ酸をいい、表１に記載の１以上をいう。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明は、安定同位体標識されたアミノ酸についても当該検出方法を適用できる。例えば、安定同位体で標識された各種アミノ酸（以下、アミノ酸安定同位体ともいう。）として２Ｈ４－Ａｌａｎｉｎｅ、２Ｈ４，１３Ｃ－Ａｒｇｉｎｉｎｅ、２Ｈ２－Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ、２Ｈ３－Ｌｅｕｃｉｎｅ、２Ｈ３－Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ、２Ｈ２－Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ、１３Ｃ６－Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、１３Ｃ６－Ｔｙｒｏｓｉｎｅ、２Ｈ８－Ｖａｌｉｎｅ、１５Ｎ，２－１３Ｃ－Ｇｌｙｃｉｎｅ、２Ｈ３－Ａｓｐａｒｔｉｃ
　ａｃｉｄ、及び２Ｈ３－Ｇｌｕｔａｍｉｃ　ａｃｉｄなどが例示できる。同位体標識の例として重水素標識、炭素標識、窒素標識を挙げたが、放射性同位体による標識や、酸素など他の元素による標識、置換する原子数、置換する位置など、例示した標識に限らない。
　アシルカルニチンは、その脂肪酸部分の炭素鎖長、不飽和結合の有無と数、炭素鎖に結合する水素原子の酸素原子又はヒドロキシ基への置換などにより、アセチルカルニチン、プロピオニルカルニチン、ステアロイルカルニチン、オレイルカルニチン、リノレイルカルニチン、マロニルカルニチン、３－ヒドロキシカルニチンなどに細分化されるが、本明細書中においては、それらを総称してアシルカルニチンと記述する。なお、脂肪酸が結合していない遊離カルニチンについても、アシルカルニチンに含めるものとする。
　すなわち、本発明においてアシルカルニチンとは、式１で表される化合物群をいう。
式１：（ＣＨ３）３Ｎ+ＣＨ２ＣＨ（ＯＲ１）ＣＨ２ＣＯＯ-　
（式１中、Ｒ１は水素原子、もしくは炭素数２～３０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を表し、該脂肪酸残基に結合する水素原子は、酸素原子又はヒドロキシ基で置換されていてもよい。）
　炭素数２～３０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基としては、表２に記載のものが挙げられる。先天性代謝異常スクリーニングなど臨床での評価項目に使用される主なアシルカルニチンを表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明によれば、同位体標識されたアシルカルニチンについても当該検出方法を適用できる。例えば、安定同位体で標識されたアシルカルニチン（以下、アシルカルニチン安定同位体ともいう。）として２Ｈ９－カルニチン、２Ｈ３－アセチルカルニチン、２Ｈ３－プロピオニルカルニチン、２Ｈ３－ブチリルカルニチン、２Ｈ９－イソ吉草酸カルニチン、２Ｈ３－オクタノイルカルニチン、２Ｈ９－ミリストイルカルニチン、及び２Ｈ３－パルミトイルカルニチンなどが例示できる。同位体標識の例として重水素標識を挙げたが、
放射性同位体による標識や、炭素、窒素、酸素など他の元素による標識、置換する原子数、置換する位置など、例示した標識に限らない。
　本明細書において、生体試料としては、血液、血清、血漿、唾液、尿等の体液、糞便や吐物、またはこれらの溶解液、懸濁液、乾燥品などが挙げられる。前記生体試料が採取される生物はヒトに限定されず、ヒト以外の哺乳動物、例えば、サル、類人猿、イヌ、マウス、ラット、ブタ、ヤギ、モルモット、さらには鳥類、魚類等が挙げられる。
　本明細書において、「乾燥ろ紙血（乾燥血液ろ紙、Ｄｒｉｅｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｓｐｏｔｓ、ＤＢＳ）」とは、動物やヒトの血液をろ紙に含浸した後、乾燥させたものを意味する。作成方法として、全血約２０μLを専用のろ紙に含浸した後、室温で２時間以上乾燥させる方法が例示できる。乾燥ろ紙血作成用のろ紙は、ＦＴＡ　ＤＭＰＫカード（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）など、市販されているものが好適に用いられる。乾燥ろ紙血から試料を採取するには、ろ紙の血液含浸部分をパンチャーなどで打ち抜き、打ち抜いたろ紙片を抽出溶液に浸漬し、乾燥血液ろ紙から血液中の成分を抽出することで採取できる。
　本明細書において、測定試料（以降、単に試料と記載することもある。）とは、生体試料からアミノ酸及び／またはアシルカルニチンを抽出したものを意味する。本発明で生体試料からアミノ酸を抽出する溶媒は、生化学で汎用されるものであれば特に制限されない。構造の異なる複数種のアミノ酸を効率よく抽出する点や，取り扱いや入手のし易さから、精製水、生化学で汎用される緩衝液、またはメタノール、エタノールなどの極性の高い有機溶媒が好ましい。アミノ酸は基本構造にカルボキシ基およびアミノ基を有するためである。
　本発明で生体試料からアシルカルニチンを抽出する溶媒は、生化学で汎用されるものであれば特に制限されない。炭素数の異なるアシルカルニチンの混合物を効率よく溶解する点や，取り扱いや入手のし易さから、炭素数１～５の有機溶媒が好ましく、炭素数１～５のアルコール及びアセトニトリルがより好ましく、メタノール、エタノール、イソプロパノールがさらに好ましい。アシルカルニチンは加水分解することから、溶媒には水を含まないことが好ましい。これらの有機溶媒に、ギ酸、酢酸、シュウ酸、クエン酸、乳酸などの有機酸を含有してもよい。
　本発明において、生体試料からアミノ酸とアシルカルニチンを同時に抽出する場合の溶媒は、メタノール、エタノールなどの極性の高い有機溶媒が好ましい。
　本発明において、弱陽イオン交換カラムとは弱陽イオン交換基（弱酸性陽イオン交換基ともいう。）を固定相（担体）として担持した充填剤を充填したカラムを意味する。弱陽イオン交換基としては、カルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、ホスフィン酸（－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨ）、ホスホン酸（－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２）が例示でき、カルボキシ基が好適に用いられる。
　弱陽イオン交換基を担持させる母体としては公知のものが使用でき、シリカゲル（Ｓｉ）、ポリマー（アクリル酸系樹脂、メタクリル酸系樹脂、スチレンジビニルベンゼンなど。これらの混合物も含む）などが例示できる。これら母体は、弱陽イオン交換基を担持した充填剤が使用される環境、例えばｐＨなどによって適した母体を適宜選択すればよい。
弱陽イオン交換基は、母体に直接担持されてもよいし、炭素鎖などを介して母体に担持されてもよい。弱陽イオン交換基にカルボキシ基、母体にシリカゲルを選択する場合を例にすると、メチルカルボキシ基とシリカゲルを結合した充填剤、エチルカルボキシ基とシリカゲルを結合した充填剤、プロピルカルボキシ基とシリカゲルを結合した充填剤などが例示できる。なお、本明細書において充填剤とは、母体に固定相を担持させたものを意味する。以降、カルボキシ基をＣＢＡと省略する場合がある。また、カルボキシ基が担持された充填剤をＣＢＡカラムということもある。
　弱陽イオン交換基を担持した充填剤をカラムボディへ充填し、弱陽イオン交換カラムを作成する方法は公知の方法が適用できる。
カラム内径としては、１．０ｍｍ～１０ｍｍが好ましい。カラム内径が１．０ｍｍより細いと移動相の流速を０．０５ｍＬ／ｍｉｎよりも遅くしないとカラムにかかる圧力が高くなりすぎる恐れがある。一方、カラム内径が１０ｍｍよりも大きいと、カラム内における測定対象物質の拡散が大きくなり、検出感度が低下する恐れがある。カラム内径の下限としては、１．０ｍｍ以上、１．２ｍｍ以上、１．４ｍｍ以上、がより好ましい。カラム内径の上限としては、１０．０ｍｍ以下、８．０ｍｍ以下、６．０ｍｍ以下、５．０ｍｍ以下、４．６ｍｍ以下、４．０ｍｍ以下、３．０ｍｍ以下、２．０ｍｍ、１．８ｍｍ以下がより好ましい。カラム内径の範囲としては上記上限と下限の組み合わせが挙げられ、そのうちでも１．０～３．０ｍｍ、１．０～２．０ｍｍ、１．２～１．８ｍｍ、１．４～１．８ｍｍ、１．５～１．８がより好ましく、１．５ｍｍがもっとも好ましい。
前記カラムのカラム長としては５ｍｍ～５０ｍｍが好ましい。カラム長が５ｍｍより短いと、カラムによる夾雑物の除去が充分に行われない恐れがある。一方、カラム長が５０ｍｍより長いと、カラム内における測定対象物質の拡散が大きくなり、検出感度が低下する恐れがあり、また、測定対象物質が必要以上にカラムに保持されて、分析時間が長くなる恐れがある。
　カラム長の下限としては、５ｍｍ以上、７ｍｍ以上、８ｍｍ以上、９ｍｍ以上が好ましい。カラム長の上限としては、５０ｍｍ以下、４０ｍｍ以下、３０ｍｍ以下、２５ｍｍ以下、２０ｍｍ以下、１８ｍｍ以下、１５ｍｍ以下、１２ｍｍ以下が好ましい。カラム長の範囲としては上記上限と下限の組み合わせが挙げられ、そのうちでも５～３０ｍｍ、７～２０ｍｍ、８～１８ｍｍ、９～１５ｍｍ、９～１２ｍｍが挙げられ、１０ｍｍがもっとも好ましい。
　本発明に係るカラムは、ＦＩＡ（Ｆｌｏｗ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ：フローインジェクション分析）においてインジェクターと質量分析計との間に設置されるのが好ましい。
　質量分析計としては、自動的に試料を導入できるようなものが望ましい。この場合、検出器である質量分析計には、移動相とともにサンプルを導入する必要があることから送液ポンプ及びオートインジェクターを備えた液体クロマトグラフ装置を質量分析計の前に接続して使用する装置構成が挙げられる。液体クロマトグラフ装置と質量分析計を接続した装置としては、それぞれの装置を配管で接続することもできるが、あらかじめ接続された装置構成であるＬＣ/ＭＳ/ＭＳを本発明の検出装置として使用することもできる。このような装置構成において、本発明のカラムは、液体クロマトグラフの下流であって、質量分析計の上流の接続することになる。
また、本発明のカラムの後方に分析カラムをさらに備える形態も採り得る。
　本発明に係るカラムを、インジェクターと質量分析計との間に設置する方法としては、例えば、液体クロマトグラフにおいて、インジェクターと検出器の間で分析カラムを取り付ける方法が挙げられ、具体的には、カラムが装填可能なカラムホルダーに本発明のカラムを装填し、インジェクターと質量分析計を接続する流路に接続する方法が挙げられる。流路に接続するための公知の方法としては、プレカラムフィルターやガードカラムを流路に設置する方法、すなわちカラムホルダーにカードリッジカラムを装着する、いわゆるカートリッジ式ガードカラムの設置方法が例示できる。また、別の例として、一般的な分析カラムを流路へ接続する方法、すなわちエンドフィッティングを具備したカラムをフィッティングやフェラルにより流路へ接続する方法も採り得る。
　本発明に係るカラムは、上述のとおり、いわゆる従来のプレカラムフィルターまたはガードカラムと類似した配置を採り得る。
ここで、プレカラムフィルターは、例えば焼結ステンレス製フィルター等により移動相中の固形物（例えば析出した塩類、溶解が不十分であった添加化合物など）を除去することにより、分析カラムを保護することが目的である。
　また、ガードカラムは、ガードカラムより流路の後方に接続された分析カラムと同種の充填剤を充填することが一般的であり、測定試料中に溶解した夾雑物（タンパク質、リン脂質など）をトラップし、分析カラムを保護することが目的である。
このように、プレカラムフィルターまたはガードカラムは分析カラムの保護が目的であるから、分析カラムを必須とした構成においてその上流に配置されることになる。したがって、プレカラムフィルターまたはガードカラムの配置は、流路の上流より、インジェクター、プレカラムフィルター及び／またはガードカラム、分析カラム、質量分析計の順に配置される。
一方、本発明に係るカラムは、生体由来の夾雑物質が質量分析計に導入されるのを防いでアミノ酸またはアシルカルニチンの検出感度を維持あるいは高めるためのものである。したがって、本発明のカラムの配置は、インジェクター、本発明のカラム、質量分析計の順に配置される。このように、本発明に係るカラムと従来のプレカラムフィルターまたはガードカラムとはその目的が異なるからシステムの構成と配置が異なる。
　なお、本発明のカラムはその目的を逸脱しない範囲で、前記従来のプレカラムフィルターやガードカラムと併用して用いることもできる。例えば、流路の上流より、インジェクター、プレカラムフィルター、本発明のカラム、質量分析計などの順に配置することもできる。
　本発明の測定に用いる移動相としては、おおよそ有機溶媒と水の混合比率が有機溶媒：Ｈ２Ｏ＝８０：２０（ｖ／ｖ）が好適である。有機溶媒の種類は、一般的にＬＣ／ＭＳ分析に用いられるものであれば特に制限されず、メタノール：Ｈ２Ｏ＝８０：２０（ｖ／ｖ）、アセトニトリル：Ｈ２Ｏ＝８０：２０（ｖ／ｖ）、あるいはメタノール：アセトニトリル：Ｈ２Ｏ＝４０：４０：２０が（ｖ／ｖ）が例示できる。前記の移動相に、さらにギ酸、酢酸などの有機酸を含んでいてもよく、有機酸の濃度範囲として０．０５％～５％（ｖ／ｖ）が例示できる。
　イオン交換基を有する充填剤を使用しているにも関わらず、移動相に塩化ナトリウムや炭酸ナトリウム等、充填剤に保持された物質を溶出するための塩を、溶出に有効な濃度（例えば１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、２０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下）で含んでいないことも、本発明の特徴のひとつである。なお、アミノ酸及びアシルカルニチンの一斉分析の際、本発明のカラムにより、一部あるいは全ての測定対象成分が、異なる溶出時間にカラムから溶出されてもよい。
　本発明のアミノ酸またはアシルカルニチン検出方法は、新生児の先天性代謝異常の評価項目である複数種類のアミノ酸またはアシルカルニチンについて十分に必要な検出感度が得られることから、前記質量分析計を用いた先天性代謝異常症のスクリーニングに好適に使用することができる。
　本発明のアミノ酸またはアシルカルニチン検出方法は、これらの検出感度が増強されるという効果も奏することから、試料中のアミノ酸またはアシルカルニチンを質量分析計により検出する方法における検出感度増強方法でもある。
　本発明のアミノ酸またはアシルカルニチン検出方法を実現するためのキットとして、アミノ酸またはアシルカルニチンの安定同位体と、弱陽イオン交換基を担持したカラムとを含む、キットが挙げられる。キットとしては、他に、取扱い説明書や、検出に使用される溶媒、試料調製用の試薬、器具など必要なものを含むことができる。
〔実施例１〕弱陽イオン交換基を担持したカラムによる質量分析計の汚染低減効果の確認
　乾燥ろ紙血から抽出したアミノ酸またはアシルカルニチンを含む試料について、カラムを通過させずに質量分析計に導入した場合と、弱陽イオン交換基を担持したカラムを通過させた後に質量分析計に導入した場合とで、質量分析計への汚れの蓄積レベルを比較した。
１．試験方法
＜カラムの作成＞
　弱陽イオン交換基としてカルボキシ基（ＣＢＡ）を選択し、カルボキシ基を担持したカラム（ＣＢＡカラム）を作成した。ＣＢＡカラムは、シリカゲルにエチルカルボキシ基を担持した平均粒径４５μｍの充填剤（ジーエルサイエンス社）を、内径１．５ｍｍ×長さ１０ｍｍのカラムとなるよう、公知の方法でパッキングし作成した。
＜測定試料の調製＞
　まず、乾燥ろ紙血よりアミノ酸およびアシルカルニチンを抽出した。乾燥ろ紙血として先天性代謝異常症用検査試薬（シーメンス社）の精度管理用ろ紙血を用いた。パンチャーで精度管理用ろ紙血を平底の９６ウェルマイクロプレートに打ち抜き、抽出溶媒としてメタノール１００μＬを添加した。メタノールを添加したマイクロプレートをシールし、室温（２０℃～３０℃）で４５分間、６５０ｒｐｍ～７５０ｒｐｍの範囲で振とうした。振とうには、マイクロプレート用ミニシェーカーＰＳＵ－２Ｔ（バイオサン社）を用いた。
得られた抽出液をＶ底の９６ウェルマイクロプレートに移し、測定試料とした。複数枚の９６ウェルマイクロプレートを使用し、測定に充分な量の抽出液を得た。
　＜質量分析計への測定試料導入条件＞
　（１）カラムなしの場合
前記測定試料を後述する測定条件で質量分析計へ導入し、導入後（５０μＬ、５００回導入後）の質量分析計のカーテンプレートに付着する汚れを目視にて確認した。
［システム］液体クロマトグラフ：ＬＣ－２０Ａシリーズ（島津製作所）
質量分析計：ＡＰＩ４０００ＴＭ（ＡＢ　ＳＣＩＥＸ社）
［ＬＣ条件］
　移動相：移動相Ａ　０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸水溶液：０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有メタノール＝８：２
　分析時間：１．５分
　溶出法：以下のフローグラジエント条件により移動相の流速（Ｔｏｔａｌ　ｆｌｏｗ）を直線的に増加させた。
　０．０分（０．１ｍＬ／ｍｉｎ）→０．１分（０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）
→０．６５分（０．１ｍＬ／ｍｉｎ）→０．６６分（１．０ｍＬ／ｍｉｎ）
→１．０分（１．０ｍＬ／ｍｉｎ）→１．５分（１．０ｍＬ／ｍｉｎ）
　試料注入量：５０μＬ
　試料注入回数：各５００回
［ＭＳ条件］
　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｍｏｄｅ：ＥＳＩ
　Ｉｏｎ　ｓｏｕｒｃｅ：Ｔｕｒｂｏ　ＩｏｎＳｐｒａｙ
　Ｓｃａｎ　ｔｙｐｅ：ＭＲＭ
　Ｐｏｌａｒｉｔｙ：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
　アミノ酸のＱ１／Ｑ３は表４に、アシルカルニチンのＱ１／Ｑ３は表５に記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（２）カラム有りの場合
前記測定試料を後述する条件で質量分析計へ導入し、質量分析計のカーテンプレートに付着する汚れを目視にて確認した。前記ＣＢＡカラムをカラムホルダーに装填し、インジェクターと質量分析計の間の流路に接続し、次いで、後述する測定条件で測定し、アミノ酸およびアシルカルニチンを検出した。システムはカラムなしの場合と同じものを使用し、ＬＣ条件、ＭＳ条件については、溶出法以外の条件はカラムなしの場合と同様の条件とした。
［ＬＣ条件］
溶出法：以下のフローグラジエント条件により移動相の流速（Ｔｏｔａｌ　ｆｌｏｗ）を直線的に増加させた。
　０．０分（０．１５ｍＬ／ｍｉｎ）→０．１分（０．１ｍＬ／ｍｉｎ）
→０．６５分（０．１５ｍＬ／ｍｉｎ）→０．６６分（１．０ｍＬ／ｍｉｎ）
→１．０分（１．０ｍＬ／ｍｉｎ）→１．５分（１．０ｍＬ／ｍｉｎ）
２．試験結果
カラムの有無による質量分析計のカーテンプレートへの汚れの付着状況を比較した。表６に、カーテンプレートへ付着した汚れを目視した結果を示す。なお、カーテンプレートへの汚れの蓄積状況を確認するため、質量分析計の感度上限を振り切るほど過剰に測定試料を質量分析計へ導入しているため、検出感度は評価しなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
〔実施例２〕カラムなし（従来法）とＣＢＡカラム使用時とのアミノ酸またはアシルカルニチンの検出感度の比較
１．試験方法
　乾燥ろ紙血から抽出したアミノ酸またはアシルカルニチンを含む試料について、カラムを通過させずに質量分析計に導入した場合と、ＣＢＡカラムを通過させた後に質量分析計に導入した場合とで、検出感度を比較した。測定条件は、試料注入量を５μＬ，試料注入回数を１回としたほかは、実施例１に準じた。
　それぞれのアミノ酸またはカルニチンにおいて、後述する式２に示すように、カラムなしの場合のピーク面積（Ｐｅａｋ　Ａｒｅａ）またはＣＢＡカラムを使用した場合のピーク面積を、カラムなしの場合のピーク面積で除算し、ピーク面積比（Ｐｅａｋ　Ａｒｅａ　Ｒａｔｉｏ）を得た。
式２：
ピーク面積比＝（カラムなしの場合のピーク面積　または　カラムを使用した場合のピーク面積）／（カラムなしのピーク面積）
２．試験結果
図１は、アミノ酸検出における前記ピーク面積比を比較したグラフである。図２は、アシルカルニチン検出における前記ピーク面積比を比較したグラフである。算出したピーク面積比を表７に示す。なお、IsoleucineはLeucineの構造異性体であり、本実施例のＭＳ条件においてはＱ１／Ｑ３が同じ値である。LeucineとIsoleucineとを区別なく検出することから、Leucine及びIsoleucineの検出結果について、本明細書においては「Leucine／Isoleucine」と表示する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
〔実施例３〕質量分析計を変更しての、カラムなし（従来法）とＣＢＡカラム使用時とのアミノ酸またはアシルカルニチンの検出感度の比較
　実施例２で用いた質量分析計ＡＰＩ４０００（ＡＢ　ＳＣＩＥＸ社）と異なるメーカーの質量分析計でも、実施例２と同様の効果が得られるか、機器間差を検討した。
１．試験方法
ＣＢＡカラムは、実施例１と同様のカラムを使用した。
　試験条件は、質量分析計とＭＳ条件を除き、実施例２と同様の条件を用いた。質量分析計は、ＬＣＭＳ－８０４０（島津製作所）を用いた。ＭＳ条件について、実施例１及び２で検出したアミノ酸に、さらにSerineを追加した。
２．試験結果
SerineのＱ１／Ｑ３を表８に示す。算出したピーク面積比を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
〔実施例４〕ＣＢＡカラム、ジルコスフィア、ＰＲＳカラム、およびＳＣＸカラム使用時のアミノ酸およびアシルカルニチンの検出感度の比較
　実施例２と同様の方法により、充填剤の種類を変更して、弱陽イオン交換基以外の交換基を担持したカラムと本発明のカラムとの効果の違いを検討した。試験条件は、実施例１のＣＢＡカラムを使用した測定と同様の条件を用いた。検出するアミノ酸について、実施例３と同様にＳｅｒｉｎｅについても検出した。
　１．試験方法
　＜カラムの作成＞
ＣＢＡカラムは、実施例１と同様のカラムを使用した。
　ジルコスフィアカラムは、平均粒径１０μｍの酸化ジルコニウム担体を充填剤（ジーエルサイエンス社）とし、内径１．５ｍｍ×長さ１０ｍｍのカラムとなるよう、公知の方法でパッキングし、作成した。
　ＰＲＳカラムは、シリカゲルにスルホニルプロピル基を担持した平均粒径４５μｍの充填剤（ジーエルサイエンス社）を、内径１．５ｍｍ×長さ１０ｍｍのカラムとなるよう、公知の方法でパッキングし、作成した。
　ＳＣＸカラムは、シリカゲルにプロピルベンゼンスルホニル基を担持した平均粒径５μｍの充填剤（ジーエルサイエンス社）を、内径１．５ｍｍ×長さ１０ｍｍのカラムとなるよう、公知の方法でパッキングし、作成した。
　それぞれのアミノ酸またはカルニチンにおいて、後述する式３に示すように、ＣＢＡカラムを使用したピーク面積、ジルコスフィアカラムを使用したピーク面積、ＰＲＳカラムを使用したピーク面積、またはＳＣＸカラムを使用したピーク面積を、ＣＢＡカラムを使用したピーク面積で除算し、ピーク面積比を得た。
式３： 
ピーク面積比＝（各種カラムを使用して得られたピーク面積）／（ＣＢＡカラムを使用して得られたピーク面積）
２．試験結果
図５は、アミノ酸検出における前記ピーク面積比を比較したグラフである。図６は、アシルカルニチン検出における前記ピーク面積比を比較したグラフである。算出したピーク面積比を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
[各試験結果の考察]
実施例１、２、３、及び４を通じての試験結果と考察を以下に示す。
１．実施例１の、カラムの有無による質量分析計の汚れの比較結果（表６）の考察
　カラムなしで測定試料を質量分析計に導入した場合に、質量分析計のカーテンプレートに褐色の汚れが明瞭に付着した。
　一方で、測定試料をＣＢＡカラムを通過させた後、質量分析計に導入した場合には、質量分析計のカーテンプレートには汚れがわずかに付着したのみであった。本結果より、測定試料をＣＢＡカラムに通過させることにより、質量分析計へ導入される汚れは有意に低下することが確認された。血液由来試料に含まれる夾雑物が前記カラムにより除去されているものと推測される。
２．（１）実施例２のアミノ酸検出（表７及び図１）結果の考察
ＣＢＡカラムを使用してのアミノ酸の検出について、Glycinがピーク面積比０．９６、Alanineが１．１７と、カラムなしと同程度の検出感度を示した。それ以外のアミノ酸の検出感度は、ピーク面積比が１．２４～２．４２と、カラムなしに比較し、約１．２倍～２．４倍高い検出感度を示した。
（２）実施例２のアシルカルニチン検出（表７及び図２）結果の考察
　ＣＢＡカラムを使用したアシルカルニチンの検出において、Carnitine、Acetylcarnitine、Propionylcarnitine、Butyrylcarnitine、及びIsovalerylcarnitineについては、ピーク面積比が１．３８～２．０１と、カラムなしに比較し約１．４倍～２．０倍高い検出感度を示した。
　次いで、3-Hydroxyisovaleryl-carnitine、Glutarylcarnitine、Octanoylcarnitine、Dodecanoylcarnitine、及びMyristoylcarnitineは、　ピーク面積比が０．８６～１．０７と、カラムなしと同程度の検出感度を示した。
　一方、Palmitoylcarnitine、及びOctadecanoylcarnitineは、ピーク面積比がそれぞれ０．７７、０．７６と、カラムなしと比較してやや検出感度の低下を示したが、代謝異常の評価に充分な検出感度であった。
（３）以上より、弱陽イオン交換基を担持したカラムを用いることで、質量分析計への汚れの導入を低減するとともに、タンデムマス・スクリーニングによる先天性代謝異常症の検査項目であるアミノ酸およびアシルカルニチンのうち、少なくとも表４及び表５に記載されているアミノ酸およびアシルカルニチンを、代謝異常の評価に必要な検出感度が得られる濃度で前記カラムから溶出されることを確認した。
　３．（１）実施例３のアミノ酸検出（表９及び図３）結果の考察
　ＣＢＡカラムを使用してのアミノ酸の検出について、Alanine、Citrulline、Leucine/Isoleucine、Methionine、Phenylalanine、Tyrosine、Valine、及びAspartic acidについて、ピーク面積比が１．２２～２．６９と、カラムなしに比較し約１．２倍～２．７倍高い検出感度を示した。
　次いで、Arginine、Glycin、Glutamic acid、及びSerineの検出感度は、　ピーク面積比が０．９４～１．０９と、カラムなしと同程度の検出感度を示した。
　一方、Ornithineは、ピーク面積比が０．７４と、カラムなしと比較してやや検出感度の低下を示したが、代謝異常の評価に充分な検出感度であった。ＡＰＩ４０００とＬＣＭＳ－８０４０とで、多少のピーク面積比の違いはあるものの、いずれの装置を用いた場合でも、ＣＢＡカラムを用いて充分な検出感度を得られることが示された。
　（２）実施例３のアシルカルニチン検出（表９及び図４）結果の考察
ＣＢＡカラムを使用してのアシルカルニチンの検出について、すべてのアシルカルニチンについて、ピーク面積比が２．１１～１０．２５と、カラムなしに比較し約２．１倍～１０．３倍高い検出感度を示した。ＡＰＩ４０００とＬＣＭＳ－８０４０とで、多少のピーク面積比の違いはあるものの、いずれの装置を用いた場合でも、ＣＢＡカラムを用いて充分な検出感度を得られることが示された。特に、ＬＣＭＳ－８０４０で検出感度の向上が顕著であった。
　４．（１）実施例４のアミノ酸検出（表１０及び図５）結果の考察
　まず、ジルコスフィアカラムに測定試料を通過させて得られた検出結果について、Alanine、Citrulline、Glycine、及びGlutamic acidを検出することができず、Arginine及びAspartic acidは検出されたものの、ピーク面積比がそれぞれ０．１０、０．１８と、ＣＢＡカラムと比較し大幅に感度が低下した。その他のアミノ酸について、ピーク面積比は０．７２～１．７７であった。
　次いで、ＰＲＳカラムに測定試料を通過させて得られた検出結果について、Arginine、及びCitrullineが検出されず、Ornithine、及びTyrosineは、ＣＢＡカラムと比較し低い検出感度しか得られず、ピーク面積比はそれぞれ０．０８、０．３５であった。その他のアミノ酸について、ピーク面積比は０．６１～８．４３であった。
　ＳＣＸカラムに測定試料を通過させて得られた検出結果について、Alanine、Methionine、Aspartic acid、及びGlutamic acidについて、　ピーク面積比が０．０１～０．０３と、ＣＢＡカラムと比較し非常に低い感度で検出された。その他のアミノ酸については、検出されなかった。
（２）実施例４のアシルカルニチン検出（表１０及び図６）結果の考察
　まず、ジルコスフィアカラムに測定試料を通過させて得られた検出結果について、Carnitineを検出することができず、Glutarylcarnitineは検出されたものの、ピーク面積比が０．４６と、ＣＢＡカラムと比較し感度が低下した。その他のアシルカルニチンについて、ピーク面積比は０．７４～１．７０であった。
　次いで、ＰＲＳカラムに測定試料を通過させて得られた検出結果について、すべてのアシルカルニチン検出項目について、検出されなかった。
　ＳＣＸカラムに測定試料を通過させて得られた検出結果について、Glutarylcarnitineが　ピーク面積比で０．１２と、ＣＢＡカラムと比較し低い感度で検出されたのみで、他のアミノ酸検出項目については検出されなかった。
５．まとめ
　試料を質量分析計に導入する前に、本発明の弱イオン交換基を担持したカラムを通過させて前処理を行うことにより、質量分析計のカーテンプレートの汚れを防止することが可能であることから、分析計内への汚れの導入を抑えることができ、繰り返し使用しても高い感度が維持される。
またさらに、本発明の弱陽イオン交換基を担持したカラムは本実施例のアミノ酸およびアシルカルニチンを網羅的に検出できており、アミノ酸およびアシルカルニチンの一斉分析に適用できることが確認された（実施例２，３）。
　一方、弱イオン交換基以外の交換基を担持したジルコスフィアカラム、ＰＲＳカラム、ＳＣＸカラムにおいては、検出可能な濃度にカラムから溶出されないアミノ酸またはカルニチンが１種類以上あることから、アミノ酸及びアシルカルニチンの一斉分析への適用が困難であることが確認された(実施例４)。
　本発明にかかるアミノ酸またはアシルカルニチンの検出方法は、質量分析計を用いたアミノ酸またはアシルカルニチン測定において、高感度かつハイスループットな分析などに好適に用いることができる。  

Claims (24)

  1. 試料中のアミノ酸またはアシルカルニチンを質量分析計により検出する検出方法であって、弱陽イオン交換基を担持したカラムを通過させて処理した試料を、質量分析計に導入する工程を含む、前記検出方法。
  2. 試料中のアミノ酸またはアシルカルニチンを質量分析計により検出する検出方法であって、試料を弱陽イオン交換基を担持したカラムを通過させて処理する工程と、前記工程により処理された試料を質量分析計に導入する工程を含む、前記検出方法。
  3. 試料が、血液から溶媒により抽出されたものである請求項１または２に記載の検出方法。
  4. 血液が、乾燥ろ紙血である、請求項３に記載の検出方法。
  5. 質量分析計がタンデム質量分析計である、請求項１～４のいずれかに記載の検出方法。
  6. 弱陽イオン交換基がカルボキシ基である請求項１～５のいずれかに記載の検出方法。
  7. カラムの長さが５ｍｍ～５０ｍｍである請求項１～６のいずれかに記載の検出方法。
  8. 試料中のアミノ酸またはアシルカルニチンを質量分析計により検出する方法における試料の前処理方法であって、以下の工程を含む前記前処理方法。
    （１）試料を、弱陽イオン交換基を担持したカラムに通過させて処理する工程
  9. 試料が、血液から溶媒により抽出されたものである請求項８に記載の前処理方法。
  10. 血液が、乾燥ろ紙血である、請求項９に記載の前処理方法。
  11. （１）の工程の前に、乾燥ろ紙血からアミノ酸またはアシルカルニチンを溶媒により抽出することにより試料を得る工程、を含む請求項１０に記載の前処理方法。
  12. 質量分析計がタンデム質量分析計である、請求項８～１１のいずれかに記載の前処理方法。
  13. 弱陽イオン交換基がカルボキシ基である請求項８～１２のいずれかに記載の前処理方法。
  14. カラムの長さが５ｍｍ～５０ｍｍである請求項８～１３のいずれかに前処理記載の方法。
  15. 試料中のアミノ酸またはアシルカルニチンの検出装置であって、
    試料をインジェクションするインジェクターと、
    弱陽イオン交換基を担持したカラムと、
    質量分析計と、を含み、
    弱陽イオン交換基を担持したカラムはインジェクターと質量分析計との間に配置され、
    かつ、当該カラムを通過した試料が質量分析計へと導入されるように構成される、
    前記検出装置。
  16. 質量分析計がタンデム質量分析計である、請求項１５に記載の検出装置。
  17. 弱陽イオン交換基がカルボキシ基である請求項１５または１６に記載の検出装置。
  18. カラムの長さが５ｍｍ～５０ｍｍである請求項１５～１７のいずれかに記載の検出装置。
  19. アミノ酸またはアシルカルニチンの質量分析計による検出キットであって、アミノ酸またはアシルカルニチンの安定同位体と、
    弱陽イオン交換基を担持したカラムとを含む、前記検出キット。
  20. 質量分析計がタンデム質量分析計である、請求項１９に記載の検出キット。
  21. 弱陽イオン交換基がカルボキシ基である請求項１９または２０に記載の検出キット。
  22. カラムの長さが５ｍｍ～５０ｍｍである請求項１９～２１のいずれかに記載の検出キット。
  23. 試料中のアミノ酸またはアシルカルニチンを質量分析計により検出する場合の検出感度増加方法であって、
    試料が質量分析計に導入される前に、弱陽イオン交換基を担持したカラムで処理される工程を含む、前記検出感度増加方法。
  24. アミノ酸またはアシルカルニチンの安定同位体、
    及び弱陽イオン交換基を担持したカラムの、
    アミノ酸またはアシルカルニチンの質量分析計による検出のための使用。
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