KR102281722B1 - 건조점적혈액 중 트리메틸아민산화물계 화합물 분석을 위한 전처리 방법 - Google Patents

건조점적혈액 중 트리메틸아민산화물계 화합물 분석을 위한 전처리 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 건조점적혈액 중 트리메틸아민산화물계 화합물 분석을 위한 전처리 방법에 관한 것으로, 건조점적혈액(dried blood spots; DBS) 여과지를 준비하는 단계; 및 상기 여과지를 염산 처리하는 단계; 를 포함하는 DBS 여과지 전처리 방법에 의해 건조점적혈액 중 트리메틸아민(trimethylamine; TMA) 등과 같은 휘발성 아민류 화합물의 검출을 가능하게 할 수 있다.

Description

건조점적혈액 중 트리메틸아민산화물계 화합물 분석을 위한 전처리 방법{Sample preparation method for the analysis of trimethylamine N-oxide and its related compounds in dried blood spots}
본 발명은 건조점적혈액 중 트리메틸아민산화물계 화합물 분석을 위한 전처리 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 건조점적혈액 중 트리메틸아민 등 휘발성 화합물의 분석을 위한 전처리 방법에 관한 것이다.
최근 트리메틸아민 N-옥사이드(trimethylamine N-oxide; TMAO)와 죽상동맥경화증 (atherosclerosis)과의 관련성에 대한 연구가 발표된 이후 (2011년) 지금까지 TMAO 및 TMAO 대사에 관련된 다양한 화합물이 질병 기전에 관여하는 것으로 알려져 왔다. 또한, 심근경색 (myocardial infarction), 뇌졸중 (stroke), 혈전증 (thromobosis), 심부전 (heart failure), 심방세동 (atrial fibrillation)과 같은 부정맥 (arrhythmia) 등 다양한 심혈관계 질환이 이들 화합물과 밀접한 관련이 있는 것으로 새로이 밝혀지고 있다.
따라서 TMAO와 TMAO 대사에 관련된 주변 화합물인 트리메틸아민(trimethylamine; TMA), 카르니틴(carnitine; CAR), 콜린(choline; CHL), 베타인(betaine; BET), γ-부틸로베타인(γ-butyrobetaine; GBB), 트리메틸리신(trimethyllysine; TML), 호모시스테인(homocysteine; HCY), 디메틸글리신(dimethylglycine; DMG) 등이 심혈관계 질환과 관련이 있는 잠재적 바이오마커 (potential biomarker)로 보고되고 있으며, 특히, 이들의 대사에 인체 내 효소뿐만 아니라 장내 미생물 (gut microbiome)이 관여한다는 연구결과가 발표되면서 이들 화합물에 대한 관심도가 높아지고 있다.
이에, TMAO와 TMAO 대사에 관련된 다양한 화합물과 관련된 진단 및 진단키트의 수요 또한 점차 커질 것이며, 이와 관련된 지속적인 연구가 필요한 실정이다.
건조점적혈액(dried blood spots; DBS)은 규격화된 여과지에 혈액을 소량 점적하여 건조 시킨 형태의 시료로, 상기 건조 과정에서 혈액 중 분석 대상성분과 여과지의 충분한 상호작용을 통해 건조 후에도 대상성분이 여과지 위에 잔류하게 되고, 이 잔류물을 용출하여 분석하는 것이 DBS 전처리의 기본 골격이다.
그러나 TMA와 같은 휘발성 화합물은 상기와 같이 혈액을 건조하는 과정 중에 여과지에 잔류하지 못하고 휘발될 수 있는 문제점이 있다.
따라서 건조점적혈액 중 휘발성이 높은 화합물의 휘발을 저지하여 물질을 검출할 수 있는 건조점적혈액 여과지의 전처리 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
1. PCT 공개특허 PCT/EP2009/063470
본 발명의 목적은 트리메틸아민 N-옥사이드(trimethylamine N-oxide; TMAO) 및 TMAO 대사에 관련된 다양한 화합물 중 휘발성을 가진 아민류 화합물을 분석하기 위한 전처리 방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 전처리 방법에 의해 제조된 염산 처리된 페이퍼 스트립 및 이를 이용한 심혈관계 질환 진단키트를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 건조점적혈액(dried blood spots; DBS) 여과지를 준비하는 단계; 및 상기 여과지를 염산 처리하는 단계; 를 포함하는 DBS 여과지 전처리 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 건조점적혈액(DBS) 여과지를 염산 처리한 DBS용 페이퍼 스트립을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 염산 처리된 DBS용 페이퍼 스트립을 포함하는 심혈관계 질환 진단키트를 제공한다.
본 발명에 따른 건조점적혈액(DBS) 여과지 전처리 방법은 건조점적혈액 중 트리메틸아민(trimethylamine; TMA) 등과 같은 휘발성 아민류 화합물의 검출을 가능하게 할 수 있다.
또한, 상기 건조점적혈액(DBS) 여과지 전처리 방법은 트리메틸아민(trimethylamine; TMA)을 비롯한 심혈관계 질환 관련 화합물(트리메틸아민 N-옥사이드(trimethylamine N-oxide; TMAO), 카르니틴(carnitine; CAR), 콜린(choline; CHL), 베타인(betaine; BET), γ-부틸로베타인(γ-butyrobetaine; GBB), 트리메틸리신(trimethyllysine; TML), 호모시스테인(homocysteine; HCY), 디메틸글리신(dimethylglycine; DMG))에 대해 부작용 없이 모두 검출 가능하도록 한다.
또한, 건조점적혈액(DBS) 여과지를 염산 처리하여 제조된 DBS용 페이퍼 스트립은 심혈관계 질환 진단키트에 응용될 수 있을 것이다.
도 1은 5 가지 다른 조건에서 트리메틸아민(trimethylamine; TMA)에 대한 회수율 비교를 나타낸 도면이다.
도 2는 DBS 건조 시간에 따른 트리메틸아민(TMA) 회수율을 나타낸 도면이다.
도 3은 (A) Whatman 903 protein saver card, (B) Whatman FTA DMPK-A card 및 (C) Whatman FTA DMPK-C card의 3가지 건조혈액점적(DBS) 여과지에서 염산 농도에 따른 트리메틸아민(TMA)의 회수율 효과를 나타낸 도면이다.
도 4는 염산 농도에 따른 심혈관계 질환 화합물의 회수율 효과를 나타낸 도면이다.
이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 건조점적혈액(DBS) 전처리로서 혈액 점적 전 0.5 mol/L 농도의 염산 전처리 통해 휘발성분의 휘발이 저지되어 심혈관계 질환 관련 화합물인 트리메틸아민산화물 계 화합물의 검출이 가능함을 확인하였으며, 이로써 심근경색 (myocardial infarction), 뇌졸중 (stroke), 혈전증 (thromobosis), 심부전 (heart failure), 심방세동 (atrial fibrillation)과 같은 부정맥 (arrhythmia) 등 다양한 심혈관계 질환 진단 및 분석을 위한 진단키트에 유용하게 활용될 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 건조점적혈액(dried blood spots; DBS) 여과지를 준비하는 단계; 및 상기 여과지를 염산 처리하는 단계; 를 포함하는 DBS 여과지 전처리 방법을 제공한다.
이때, 상기 염산을 0.1 내지 1.0 mol/L의 농도로 처리할 수 있으나, 바람직하게는 0.5 mol/L의 농도로 처리할 수 있다.
상기와 같은 DBS 여과지 전처리 방법은 시료 내 휘발성 화합물의 휘발을 저지할 수 있으며, 상기 휘발성 화합물은 트리메틸아민(trimethylamine; TMA)과 같은 아민류 화합물일 수 있다.
상기 TMA는 분자 그 자체로는 염기성인 휘발성 성분이지만 염산인 산과 반응하게 되면 염을 생성하여 상온에서도 고상으로 존재할 수 있어 휘발성이 저지되는 것이다.
이때, 상기와 같은 여과지 전처리 조건을 벗어나면 건조점적혈액(dried blood spots; DBS) 중 휘발성 화합물이 휘발되어 회수율이 떨어지거나, 사용한 전처리 화합물 대비 회수율의 효과가 좋지 않아 경제적이지 못한 문제가 야기될 수 있다.
또한, 본 발명은 건조점적혈액(DBS) 여과지를 염산 처리한 DBS용 페이퍼 스트립을 제공한다.
이때, 상기 염산을 0.1 내지 1.0 mol/L의 농도로 처리할 수 있으나, 바람직하게는 0.5 mol/L의 농도로 처리할 수 있다.
상기와 같이 염산 처리된 DBS용 페이퍼 스트립은 시료 내 휘발성 화합물의 휘발을 저지할 수 있으며, 상기 휘발성 화합물은 트리메틸아민(trimethylamine; TMA)과 같은 아민류 화합물일 수 있다.
이때, 상기와 같은 여과지 전처리 조건을 벗어나면 건조점적혈액(dried blood spots; DBS) 중 휘발성 화합물이 휘발 되어 회수율이 떨어지거나, 사용한 전처리 화합물 대비 회수율의 효과가 좋지 않아 경제적이지 못한 문제가 야기될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기와 같이 염산 처리된 DBS용 페이퍼 스트립을 포함하는 심혈관계 질환 진단키트를 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1> DBS 여과지에서 TMA 화합물의 휘발성 측정
TMA 표준용액(standard; STD)과 TMA에 안정동위원소를 표지한 화합물 TMA-d9을 첨가한 혈액 각각을 DBS 여과지 3종 (Whatman 903 protein saver card, Whatman FTA DMPK-A card, Whatman FTA DMPK-C card)에 점적하고 건조하여 시료 전처리 및 LC-HRMS(Liquid chromatography-high resolution mass spectrometry) 분석을 수행하였다.
그 결과 도 1과 같이 TMA 표준용액(STD)을 점적한 시료는 양호한 회수율을 보였지만, TMA-d9를 첨가한 DBS는 거의 모든 성분이 회수되지 않았다. 또한, 여과지에 따라 회수율 편차를 보일 수 있으므로 3종의 여과지를 비교 시험해 보았지만, 모든 여과지(Whatman 903 protein saver card, Whatman FTA DMPK-A card, Whatman FTA DMPK-C card)에서 5% 미만의 회수율을 나타냈다.
게다가, 혈액 중 단백질 등 다른 간섭성분과 결합하여 회수가 안될 가능성도 고려하여, 별도로 TMA-d9가 첨가된 혈액(Whole blood)(여과지에 점적하지 않은 혈액 시료 자체)을 분석한 결과, 혈액 시료에서는 표준용액과 유사하게 양호한 회수율을 보였다.
따라서 TMA의 회수율 저하 문제는 DBS에서만 특징적으로 나타나며, 이는 여과지에서 혈액을 건조할 때 TMA도 같이 휘발되기 때문인 것으로 가정하였다. 다만, 여과지에 혈액을 점적했을 때와 달리 표준용액을 점적했을 때는 양호한 회수율을 나타냈는데, 이는 표준용액 중에는 대상성분만 존재하므로 여과지와 목적성분이 원활하게 상호작용하여 여과지에 TMA가 잔류할 수 있기 때문에 나타난 결과이다.
하지만, DBS는 목적성분뿐만 아니라 혈액 중 다양한 간섭성분들도 여과지와 경쟁적으로 상호작용하게 되고, 이런 간섭성분으로 인해 여과지의 수용력이 포화되어 휘발성이 큰 TMA는 건조 과정 중에 휘발·손실되는 것으로 판단하였다.
이를 실험적으로 확인하고자 DBS 건조 시간에 따른 TMA 회수율을 측정해보았다. TMA-d9를 첨가한 혈액을 여과지에 점적하고 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60분마다 각 DBS 디스크(disc)를 펀치(punch)하여 전처리한 후 분석하였다.
그 결과 도 2와 같이 혈액을 건조한지 채 5분도 되지 않아 40% 미만의 회수율을 보였으며, 약 20분 이후로는 거의 모든 TMA-d9이 회수되지 않는 양상을 보였다. 이를 통해 실제로 여과지 중 혈액 건조 과정에서 TMA가 휘발됨을 확인하였다.
< 실시예 2> DBS 여과지 전처리
본 발명에서는 혈액을 점적하기 전 여과지에 염산(hydrochloric acid)을 소량 도포하여 TMA의 휘발을 방지할 수 있는지 확인하였으며, 서로 다른 농도의 0.001, 0.05, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0 mol/L 염산(hydrochloric acid) 용액을 제조하여 비교 시험하였다.
먼저, 혈액 중 TMA-d9의 농도가 100 μmol/L가 되도록 제조하였다. DBS 여과지인 와트만 903 프로틴 세이버 카드(Whatman 903 protein saver card)의 홀 (hole)마다 0.001, 0.05, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0 mol/L의 염산 용액 40 μL를 점적하고 상온에서 2시간 건조한 후, 혈액 30 μL를 점적하고 다시 상온에서 2시간 건조하였다. 이후, 직경 6 mm 규격의 펀처(puncher)로 펀칭(punching)하여 만든 DBS 디스크(disc)를 1.5 mL 마이크로튜브(microtube)에 넣었다. 10 mmol/L 아세트산 암모늄(ammonium acetate) (pH 9.0) 380 μL와 5 mmol/L 다이티오트레이톨(dithiothreitol; DTT) 20 μL를 가하여 30분간 교반하고 상온에서 20분간 방치한 후 13,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 상징액(supernatant) 200 μL를 다른 1.5 mL 마이크로튜브(microtube)로 옮겼다. 여기에 1.0 mol/L 에틸 브로모아세테이트(ethyl bromoacetate;EtBAc) 용액 100 μL를 각각 가하여 5분간 교반하고 60˚C의 항온수조(water-bath)에서 1시간 동안 유도체화 반응을 진행한 후 마이크로튜브(microtube)를 항온수조(water-bath)에서 꺼냈다. 반응이 끝난 용액에 20 mmol/L 포름산(formic acid) (아세토니트릴(acetonitrile)에 용해) 200 μL를 가하고 5분간 교반한 후 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상징액을 취하여 실린지 필터(syringe filter)(0.2 μm, PTFE)로 여과한 후 LC-HRMS로 주입하여 분석하였다. 염산의 각 농도별로 3회 반복 시험하여 도출된 회수율을 비교 검토하여 TMA 회수 여부 및 최적의 염산 농도를 확인하였다.
< 실험예 1> 최적의 전처리 농도
상기 실시예 1에서와 같이 DBS에서 특이적으로 TMA의 회수율이 낮아지는 현상을 해결하고자 상기 실시예 2와 같이 여과지에 혈액을 점적하기 전에 염산 용액을 미리 처리하였다. 이는, 혈액을 점적했을 때 여과지 표면에 잔류하는 염산이 혈중 TMA와의 중화반응 (on-spot reaction)을 통해 TMA 염산염(hydrochloride)을 생성할 수 있고, 생성된 염이 상온에서 고체상태로 존재하여 TMA의 휘발을 방지할 수 있을 것이라 가정하여 최적의 염산 농도를 확인하고자 서로 다른 농도인 0.001, 0.05, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0 mol/L의 염산 수용액을 제조하여 비교 시험하였다. DBS 여과지로는 와트만 903 프로틴 세이버 카드(Whatman 903 protein saver card)를 사용하였다.
그 결과 도 3A와 같이 염산 수용액의 농도가 증가할수록 TMA 회수율이 점차 개선되었으며, 0.5 mol/L의 농도를 처리했을 때 약 100%에 가까운 회수율을 보였다. 추가로 2종의 여과지 (Whatman FTA DMPK-A card, Whatman FTA DMPK-C card)에도 시험한 결과, 모두 동일한 경향을 확인할 수 있었다 (도 3B, C).
결론적으로 TMA-염산 중화반응을 통해 DBS 중 TMA의 손실을 방지할 수 있었으며, 염산 0.5 mol/L 농도에서 최적의 효율을 나타냄을 알 수 있었다.
< 실험예 2> 심혈관계 질환 관련 화합물의 검출
염산은 강산으로서 여과지 표면의 성질을 변화시킬 수 있으며, 이를 통해 여과지와 목적성분의 상호작용을 방해하여 목적성분이 여과지 표면에 잔류하지 못하게 할 수도 있으며, 산에 불안정한 물질의 분해를 촉진하는 등의 부작용도 유발할 수 있을 것이다. 이를 확인하고자 TMA-d9외에 TMAO 및 TMAO 대사에 관련된 나머지 분석 대상성분 8종 (HCY(호모시스테인;homocysteine)-d4, DMG(디메틸글리신;dimethylglycine)-d6, BET(베타인;betaine)-d9, GBB(γ-부틸로베타인;γ-butyrobetaine)-d9, CAR(카르니틴;carnitine)-d3, CHL(콜린;choline)-d9, TML(트리메틸리신;trimethyllysine)-d9,T MAO(트리메틸아민 N-옥사이드;trimethylamine N-oxide)-d9)도 같이 시험하였다.
그 결과 도 4와 같이 TMAO 및 TMAO 대사에 관련된 나머지 분석 대상 성분 8종도 높은 회수율을 나타내었으며, 1.0 mol/L의 염산 용액을 처리하더라도 다른 성분의 분석에는 큰 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
따라서 최적의 효율을 나타낸 0.5 mol/L를 염산의 최종 농도로 선정하였다.
결과적으로 본 시험에서는 DBS 제작 시 먼저 여과지에 0.5 mol/L 염산 용액을 처리한 다음 혈액을 점적한 결과, 휘발성 아민 화합물의 휘발이 저지되어 심혈관계 질환 관련 화합물의 검출이 가능함을 확인하였다. 따라서 여과지 표면에서 간단한 산-염기 중화반응을 이용하여 휘발성 성분의 손실을 방지할 수 있을 것이다.

Claims (9)

  1. 건조점적혈액(dried blood spots; DBS) 여과지를 준비하는 단계; 및
    상기 여과지를 염산 처리하는 단계; 를 포함하여,
    시료 내 휘발성 화합물인 트리메틸아민(trimethylamine; TMA)의 휘발을 저지하는 것을 특징으로 하는 DBS 여과지 전처리 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    여과지를 염산 처리하는 단계는,
    염산을 0.1 내지 1.0 mol/L의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는 DBS 여과지 전처리 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항의 DBS 여과지 전처리 방법을 포함하여 제조된 DBS용 페이퍼 스트립을 포함하는 심혈관계 질환 진단키트.
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