CN115004025A - 通过气相沉积涂覆的表面减轻lc/ms加合物 - Google Patents

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Abstract

本公开讨论了一种分离样品(例如，小有机酸代谢物)的方法，该方法包括涂覆色谱系统的流动路径。沿该流动路径的涂层被气相沉积并防止或大大降低金属色谱系统与样品之间的金属相互作用。

Description

通过气相沉积涂覆的表面减轻LC/MS加合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年1月31日提交的美国临时申请号62/968,639和2020年8月28日提交的美国临时申请号63/071,643的优先权，每一项临时申请的内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及使用气相沉积涂覆的流动路径来改进TCA(三羧酸)循环代谢物的色谱和样品分析。更具体地，本技术涉及使用具有涂覆的流动路径的色谱装置来分离样品中的分析物、使用包括涂覆的流动路径的流体系统来分离样品中的分析物(例如TCA代谢物，诸如羧酸)的方法，以及定制用于分离和分析TCA循环代谢物的流体流动路径的方法。本技术的方法和装置可以用于增加分离的选择性，从而得到改进的分析，这在癌症样品的分析中极为重要。
背景技术
TCA循环是能量代谢的最终命运，其中乙酰辅酶A以及由碳水化合物、蛋白质和脂肪分解形成的其他分子经过酶氧化以产生辅助因子诸如ATP，从而为细胞生长和功能提供能量。由于TCA循环在代谢过程中具有核心作用，因此对其进行了相当广泛的研究以帮助深入了解某些疾病的病因。然而，小有机酸代谢物存在许多分析挑战，诸如保留性差、选择性差以及在分析系统中经常与金属离子螯合。
与金属相互作用的分析物通常被证明分离极具挑战性。期望具有分散程度最低的高效色谱系统，这要求流动路径的直径减小并且能够承受越来越快的流速下的越来越高的压力。因此，色谱流动路径选择的材料本质上通常是金属的。尽管存在以下事实：已知某些分析物(例如，生物分子、蛋白质、聚糖、肽、寡核苷酸、杀虫剂、双膦酸、阴离子代谢物和两性离子比如氨基酸和神经递质)的特性与金属表面具有不利的相互作用(所谓的色谱次级相互作用)。
所提出的用于金属特异性结合相互作用的机制需要理解路易斯酸碱化学理论。纯金属和金属合金(连同它们的对应氧化物层)具有末端金属原子，该末端金属原子具有路易斯酸特性。更简单地，这些金属原子显示出接受供体电子的倾向。对于带有正电荷的任何表面金属离子而言，这种倾向甚至更为明显。具有足够的路易斯碱特性的分析物(可提供非成键电子的任何物质)可潜在地吸附到这些位点，从而形成有问题的非共价络合物。正是这些物质被定义为与金属相互作用的分析物。
例如，羧酸根基团具有与金属螯合的能力。然而，羧酸根官能团普遍存在于例如生物分子中，从而为累积的基于多配位基的吸附损失或不合需要的色谱性能提供了机会。
来自TCA循环的代谢物是含有羧基基团的小极性化合物。这些羧酸根基团具有表现出多配位基特性和与金属螯合的能力。这些小(有时异构)化合物的分析存在许多分析挑战，诸如获得足够的保留性和选择性。另外，许多羧酸可以充当金属螯合剂。耦合生物基质中存在的各种可能浓度，分析物在这些金属相互作用和/或加合物中的损失可能会给出该样品的代谢状态的错误图像。
使用金属流动路径的替代方案是使用由聚合物材料诸如聚醚醚酮(PEEK)构成的流动路径。PEEK管材与大多数聚合物材料一样，通过挤出方法形成。利用聚合物树脂，该制造方法可导致高度可变的内径。因此，PEEK柱硬件在保留时间中产生了不利的差异，如可从一根柱和下一根柱之间的切换所观察到的。通常，这种变化可以比金属构造的柱高三倍。此外，用于制造基于聚合物的玻璃料的技术尚未充分优化，无法为商业HPLC柱提供合适的坚固部件。例如，可商购获得的PEEK玻璃料往往表现出不可接受的低渗透性。
因此，需要进行持续的努力，以减少分析物与金属色谱表面的螯合和次级色谱相互作用，从而有利于具有较高分离度的色谱分离。另外，化合物的分离和检测的可变性可能由许多因素引起。一个此类因素是化合物与分析柱的分析物/表面相互作用。此类相互作用可能是有问题的，尤其是在分析物浓度非常低的情况下。
发明内容
小有机酸代谢物(诸如与TCA循环相关的有机酸代谢物)存在许多分析挑战，诸如保留性差、选择性差以及在分析系统中经常与金属离子螯合。为了解决在金属流体系统中分离时遇到的问题，已开发出使用气相沉积涂层的柱硬件来限定低结合表面(LBS)。具有LBS的柱硬件可以在增加或保持适当保留性、改善选择性和减少金属加合物的螯合/形成方面对色谱性能产生积极影响。
本技术包括涂层，诸如烷基甲硅烷基涂层，该涂层可以提供LBS以通过使可能导致样品损失的分析物/表面相互作用最小化来减少金属相互作用、增加分析物回收率、增加灵敏度以及再现性。
本技术还包括使用混合模式色谱法和专用表面以减少金属相互作用来分析TCA循环代谢物的方法。
包含本公开的涂层的色谱柱已被设计成使化合物的负分析物/表面相互作用最小化。分析物(诸如TCA代谢物)含有羧酸根基团形式的酸性残基。在本公开中，在柱硬件上有和没有涂层的情况下测试了金属敏感性化合物，诸如柠檬酸、衣康酸和2-羟基戊二酸(均为TCA代谢物)。
限定色谱系统的流动路径的表面区域上的烷基甲硅烷基涂层可以使TCA代谢物与色谱流动路径的金属表面之间的相互作用最小化。因此，涂覆的金属表面改善了小有机酸代谢物的液相色谱分离。在金属流动路径上使用烷基甲硅烷基涂层允许使用金属色谱流动路径，所述金属色谱流动路径能够承受快流速下的高压、使用具有小颗粒的固定相(其也可以是缓流)产生的高压以及由较长柱床产生的高压，同时使小有机酸代谢物与金属之间的相互作用最小化。这些由高压材料制成并且用涂层改性的部件可以被定制成使得内部流动路径减少金属相互作用。涂层覆盖暴露于流体路径的金属表面，并且可以使用气相沉积来沉积。
在某些实施方案中，在混合模式阴离子交换柱(例如，苯基-己基柱)上使用烷基甲硅烷基涂层改进了色谱法和对小有机酸代谢物(诸如与TCA循环相关的有机酸代谢物)的MS检测。
在一个方面，本技术涉及一种分离和分析样品的方法。该方法包括将样品注入到在金属表面上具有流体接触涂层的色谱系统中，其中涂层包含烷基甲硅烷基，并且样品包含一种或多种三羧酸循环代谢物；使所注入的样品流过色谱系统；用色谱系统分离流动的样品；以及用质谱仪分析所分离的样品。在一个实施方案中，一种或多种三羧酸循环代谢物包含羧基基团。在一个实施方案中，一种或多种三羧酸循环代谢物包括选自由以下项组成的组的至少一种三羧酸代谢物：柠檬酸、衣康酸或2-羟基戊二酸。在一个实施方案中，涂层防止三羧酸循环代谢物与金属相互作用，涂层包含双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。在一个实施方案中，分离样品包括使用混合模式阴离子交换色谱法。在一个实施方案中，使用混合模式阴离子交换色谱法包括使用各自含有甲酸的水和乙腈的流动相。在一个实施方案中，使用混合模式阴离子交换色谱法包括使用苯基-己基色谱柱。在一个实施方案中，金属表面包括柱壁和玻璃料表面，并且其中金属表面上的涂层相对于未涂覆的金属表面增加代谢物峰面积。
在另一方面，本技术涉及一种当使用色谱系统时增加包含一种或多种三羧酸循环代谢物的样品的分离度的方法。该方法包括提供在金属表面上具有流体接触涂层的所述色谱系统，其中涂层包含烷基甲硅烷基；将样品注入到色谱系统中；使所注入的样品流过色谱系统；用色谱系统分离流动的样品；以及使所分离的样品通过质谱仪以分析所分离的样品。在一个实施方案中，选择涂层的烷基甲硅烷基包括评估样品的极性；基于极性评估来选择期望的接触角和涂层材料；以及通过烷基甲硅烷基的气相沉积来调节样品流动路径的疏水性。在一个实施方案中，一种或多种三羧酸循环代谢物包含羧基基团。在一个实施方案中，一种或多种三羧酸循环代谢物包括选自由以下项组成的组的至少一种三羧酸代谢物：柠檬酸、衣康酸或2-羟基戊二酸。在一个实施方案中，金属表面包括柱壁和玻璃料表面，并且其中金属表面上的涂层相对于未涂覆的金属表面增加代谢物峰面积。在一个实施方案中，涂层防止三羧酸循环代谢物与金属相互作用，涂层包含双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。
在另一方面，本技术涉及一种研究疾病的病因的方法。该方法包括将样品注入到在金属表面上具有流体接触涂层的色谱系统中，其中涂层包含烷基甲硅烷基，并且样品包含一种或多种三羧酸循环代谢物；使所注入的样品流过色谱系统；用色谱系统分离流动的样品；以及用质谱仪分析所分离的样品。在一个实施方案中，一种或多种三羧酸循环代谢物包含羧基基团。在一个实施方案中，一种或多种三羧酸循环代谢物包括选自由以下项组成的组的至少一种三羧酸循环代谢物：柠檬酸、衣康酸或2-羟基戊二酸。在一个实施方案中，涂层防止三羧酸循环代谢物与金属相互作用，涂层包含双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。在一个实施方案中，金属表面包括柱壁和玻璃料表面，并且其中金属表面上的涂层相对于未涂覆的金属表面增加代谢物峰面积。在一个实施方案中，涂层覆盖样品流动路径的表面的90％。
附图说明
通过以下结合附图所作的详细描述，将更充分地理解本技术，在附图中：
图1是根据本技术的例示性实施方案的包括色谱柱和各种其他部件的色谱流动系统的示意图。流体被载送通过色谱流动系统，其中流体流动路径从流体管理器延伸到检测器，诸如MS检测器。
图2A和图2B示出了如在标准未涂覆的柱(顶部)和涂覆的柱(底部)上分离的柠檬酸的低能(图2A)和高能(图2B)光谱。图2C提供了Fe-柠檬酸盐物质形成(图2A、图2B和图2C统称为图2)。
图3A示出了ML2离子的理论同位素模型。图3B和图3C示出了如在标准未涂覆的柱(图3B)和涂覆的柱(图3C)上分离的衣康酸的低能光谱。图3D示出了Fe-衣康酸盐物质形成(图3A、图3B、图3C和图3D统称为图3)。
图4A示出了M2L3离子的理论同位素模型。图4B示出了ML2离子的理论同位素模型。图4C和图4D示出了如在标准未涂覆的柱(图4C)和涂覆的柱(图4D)上分离的2-羟基戊二酸的低能光谱。图4E示出了Fe-2-羟基戊二酸盐物质形成(图4A、图4B、图4C、图4D和图4E统称为图4)。
图5A示出了根据本技术的标准混合物中的尿代谢物在涂覆的带电表面苯基-己基柱上的分离色谱图。图5B示出了合并的尿液样品中的尿代谢物的分离色谱图。图5C提供了具有图5A和图5B的峰鉴别的表。
图6A示出了关键的异柠檬酸和柠檬酸对的分离；图6B示出了关键的甲基丙二酸和琥珀酸对的分离；图6C示出了关键的衣康酸、2-羟基戊二酸和顺式乌头酸对的分离；并且图6D示出了关键的苹果酸和富马酸对的分离。
图7提供了健康对照(蓝色·)、乳腺癌阳性样品(紫色X)和质量对照(合并样品)(橙色◇)中每一者的5次重复进样的PCA得分图。
图8A是将健康尿液样品、乳腺癌阳性尿液样品和合并尿液样品进行比较的琥珀酸的丰度图；图8B是将健康尿液样品、乳腺癌阳性尿液样品和合并尿液样品进行比较的乌头酸的丰度图；图8C是将健康尿液样品、乳腺癌阳性尿液样品和合并尿液样品进行比较的异柠檬酸的丰度图；图8D是将健康尿液样品、乳腺癌阳性尿液样品和合并尿液样品进行比较的柠檬酸的丰度图；图8E是将健康尿液样品、乳腺癌阳性尿液样品和合并尿液样品进行比较的3-磷酸甘油酸的丰度图；并且图8F是将健康尿液样品、乳腺癌阳性尿液样品和合并尿液样品进行比较的2-羟基戊二酸的丰度图。
具体实施方式
一般来将，本公开涉及具有低结合表面(LBS)的涂覆柱，以通过使可能导致样品损失的负分析物/表面相互作用最小化来增加分析物回收率、再现性和灵敏度。本公开解决了羧酸与金属硬件的有问题的相互作用。许多羧酸充当金属螯合剂。耦合生物基质中存在的各种可能浓度，分析物在这些金属相互作用和/或加合物中的损失可能会给出该样品的代谢状态的错误图像。
涂覆LBS的一种方法是使用烷基甲硅烷基涂层。在一些方面，烷基甲硅烷基涂层充当生物惰性低结合涂层以改变流动路径，从而解决流动路径与分析物(诸如金属敏感性分析物)的相互作用。也就是说，生物惰性低结合涂层使与金属相互作用化合物的表面反应最小化，并允许样品沿流动路径通过而不阻塞、不附着到表面或不改变分析物特性。这些相互作用的减少/消除是有利的，因为它允许对含有肽化合物或其他金属敏感性化合物的样品进行准确的定量和分析。沿流动路径产生LBS的涂层防止/显著最小化分析物损失到金属表面壁上，从而减少金属相互作用。
图1是可以用于分离样品中的分析物(诸如肽化合物)的色谱流动系统/装置100的代表性示意图。色谱流动系统100包括若干部件，包括流体管理器系统105(例如，控制流动通过系统的流动相)；管材110(其也可以被微加工流体导管替换或与微加工流体导管一起使用)；流体连接器115(例如，流体帽)；玻璃料120；色谱柱125；进样器135，包括用于将样品插入或注入流动相中的针(未示出)；用于在进样之前盛装样品的小瓶、沉降器或样品贮存器130；检测器150，诸如质谱仪；以及用于控制流动压力的压力调节器140。色谱系统/装置的部件的内表面形成具有润湿表面的流体流动路径。流体流动路径可具有至少20、至少25、至少30、至少35或至少40的长度与直径比率。
通过用烷基甲硅烷基涂层涂覆，润湿表面的至少一部分可以是LBS。可以通过气相沉积来施加涂层。因此，本技术的方法和装置提供以下优点：能够使用耐高压材料(例如，不锈钢)来形成流动系统，但也能够定制流体流动路径的润湿表面以提供适当的疏水性，因此对样品的不利相互作用或不期望的化学效应可被最小化。在一些示例中，流动路径的涂层相对于分析物(诸如金属敏感性化合物)是非结合或非相互作用的。
烷基甲硅烷基涂层可以在整个系统中由从流体管理器系统105一直延伸到检测器150的管材或流体导管110提供。也可以将涂层施加到流体路径的部分(例如，流体路径的至少一部分)。即，可选择涂覆一个或多个部件或部件的部分而不是整个流体路径。例如，可以涂覆柱125的内部部分及其玻璃料120和端盖115，而可以保持流动路径的其余部分不被改性。此外，可以涂覆可移除/可替换的部件。例如，可以涂覆含有样品贮存器的小瓶或沉降器130以及玻璃料120。
在一个方面，本文所述的流体系统的流动路径至少部分地由管材的内表面限定。在另一方面，本文所述的流体系统的流动路径至少部分地由微加工流体导管的内表面限定。在另一方面，本文所述的流体系统的流动路径至少部分地由柱的内表面限定。在另一方面，本文所述的流体系统的流动路径至少部分地由通过玻璃料的通道限定。在另一方面，本文所述的流体系统的流动路径至少部分地由进样针的内表面限定。在另一方面，本文所述的流体系统的流动路径在柱的整个内表面上从进样针的内表面延伸。在另一方面，流动路径从设置在整个流体系统中的进样针的内表面上游并与其流体连通的样品贮存器容器(例如，沉降器)延伸到连接器/检测器的端口。也就是说，所有的管材、连接器、玻璃料、膜、样品贮存器和沿该流体路径的流体通道(润湿表面)都被涂覆。
在一些实施方案中，仅色谱柱的润湿表面和位于色谱柱上游的部件是涂覆有本文所述的烷基甲硅烷基涂层的LBS，而位于柱下游的润湿表面未被涂覆。在其他实施方案中，所有润湿表面都被涂覆，包括柱下游的那些表面。并且在某些实施方案中，柱上游、穿过柱和柱下游到检测器入口的润湿表面被涂覆。可以经由气相沉积将涂层施加到润湿表面。类似地，实验室器具或其他流体处理装置的“润湿表面”可受益于本文所述的烷基甲硅烷基涂层。这些装置的“润湿表面”不仅包括流体流动路径，而且包括位于流体流动路径内的元件。例如，固相提取装置内的玻璃料和/或膜与流体样品接触。因此，不仅固相提取装置内的内壁而且任何玻璃料/膜都包括在“润湿表面”的范围内。所有“润湿表面”或“润湿表面”的至少一些部分可以通过包括本文所述的涂层中的一种或多种来改进或定制以用于特定分析或程序。术语“润湿表面”是指分离装置(例如色谱柱、进样系统、色谱流体处理系统、玻璃料等)内的所有表面。该术语还可以应用于实验室器具或其他样品制备装置(例如提取装置)内与流体、尤其是含有感兴趣的分析物的流体接触的表面。
关于根据本技术的涂层和涂层沉积的进一步信息可在US 2019/0086371中获得，其据此以引用方式并入。US 2019/0086371还描述了定制涂层以满足特定样品/分析物的需要。
在一些示例中，涂覆流动路径包括将涂层均匀地分布在流动路径周围，使得限定流动路径的壁被完全涂覆。在一些实施方案中，均匀地分布涂层可以在流动路径周围提供均匀厚度的涂层。一般来讲，涂层均匀地覆盖润湿表面，使得没有“裸露的”或未涂覆的斑点。限定色谱系统的流动路径的表面区域上的涂层可以覆盖所有或基本上所有的表面区域。在一些示例中，烷基甲硅烷基涂层可以覆盖90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或更多的暴露于流体的表面区域。流动路径可以被限定为包括柱壁和玻璃料表面，但不包括固定相。
可商购获得的气相沉积涂层可以用于所公开的系统、装置和方法中，包括但不限于
Figure BDA0003757902180000081
和
Figure BDA0003757902180000082
(可从SilcoTek Corporation,Bellefonte,PA商购获得)。
上述涂层可以用于产生LBS，并且可以定制用于分离样品的色谱系统的流体流动路径。涂层可以是气相沉积的。一般来讲，沉积的涂层可用于调节与流体接触的流体流动路径的内表面(即，润湿表面或与流动相和/或样品/分析物接触的表面)的疏水性。通过涂覆色谱系统内的流动路径的一个或多个部件的润湿表面，用户可以定制润湿表面以提供流动路径与其中的流体(包括流体内的任何样品，诸如含有生物分子的样品)之间的所需相互作用(即，缺乏相互作用)。
TCA循环是碳代谢的一个重要过程。它减少了酶促反应的辅因子，并为生物合成途径(诸如氨基酸、蛋白质、脂肪酸、胆固醇和核苷酸合成)产生了前体。它位于合成代谢和分解代谢通量的中心，对其成分进行测量可以深入了解某些疾病的机制。来自TCA循环的代谢物是含有羧基基团的小极性化合物(例如，柠檬酸、衣康酸和2-羟基戊二酸)。这些小(有时异构)化合物的分析存在许多分析挑战，诸如获得足够的保留性和选择性。另外，许多羧酸充当金属螯合剂。耦合生物基质中存在的各种可能浓度，分析物在这些金属相互作用和/或加合物中的损失可能会给出该样品的代谢状态的错误图像。为了解决保留性和选择性，本技术利用使用各自含有甲酸的水和乙腈的简单流动相的混合模式阴离子交换色谱法。为了解决对金属的敏感性，将混合模式吸附剂填充到专门的柱管材中，这可防止分析物与金属相互作用。在实施方案中，专门的柱管材和相关硬件包括湿润表面上的烷基甲硅烷基涂层，以防止分析物与金属相互作用。
该新分析方法提供了优异的峰形和分析物回收率，同时提供了改进的MS质量。使用专用的柱表面，已知金属螯合剂柠檬酸的分析物峰面积增加了3.3倍，而10％处的峰不对称性从1.99降低到1.55。关键的异柠檬酸和柠檬酸对在10％高度处的分离度从2.36到3.10增加了24％。总之，所研究化合物的峰面积从1.2倍增加到4.2倍。
方法和实施例
标准样品方法
在水溶液中以100μM制备标准样品以用于分析。在具有ACQUITY UPLC CSH苯基-己基柱的ACQUITY I-Class LC上使用0.1％甲酸的水溶液和ACN溶液的浅梯度分离样品。将LC连接到Xevo TQ-Smicro串联质谱仪。使用MassLynx v4.2获取并处理数据。
通过将10mM分析物与1mM Fe2(SO)3一起孵育来进行Fe分析物物质形成，从而产生摩尔比为1:5的Fe：分析物。将无缓冲水中的各个溶液用水按1:10v/v稀释并在室温下孵育12小时，然后通过质谱仪直接分析。
方法：
Xevo G2-XS Q TOF
-ESI负电
-温度–500℃
-去溶剂化–1000L/hr
-源温度–120℃
ACQUITY I-Class LC
-CSH苯基-己基2.1×100mm，1.7um柱
ο标准和涂覆
-流动相A–0.1％甲酸的H2O溶液
-流动相A–0.1％甲酸的ACN溶液
-柱温–50℃
-进样体积–3uL
样品是100uM分析物的H2O水溶液
-使用硅烷化小瓶
[梯度表]
Figure BDA0003757902180000101
标准样品的比较例
使用上述方法，在使用未涂覆的硬件和根据本技术涂覆的硬件的系统中分离柠檬酸、衣康酸和2-羟基戊二酸中的每一者。在每个实施例中，比较光谱表明Fe加合物大大减少。
在图2中，呈现了柠檬酸的低能光谱(光谱图2A)和高能光谱(光谱图2B)。标准柱(即，未涂覆的柱和系统管材等)结果显示在顶部，并且涂覆的柱结果(即，根据本技术涂覆的柱和系统)直接显示在下面。应当注意，标准柱与涂覆柱之间的唯一区别是涂层的存在。结果表明，随着使用涂覆的色谱柱，Fe加合物(例如，435.958m/z、462.413m/z和680.897m/z)大大减少并且光谱质量增加。
在图3中，呈现了衣康酸的低能光谱。标准柱(即，未涂覆的柱和系统管材等)结果显示在图3B的光谱中，而涂覆的柱结果显示在图3C的光谱中。ML2离子的理论同位素模型(311.957＝[ML2]1-)显示在图3A的光谱中。结果表明，随着使用涂覆的柱，Fe加合物(例如，311.95m/z)大大减少。
在图4中，呈现了2-羟基戊二酸的低能光谱。标准柱(即，未涂覆的柱和系统管材等)结果显示在图4C的光谱中，而涂覆的柱结果显示在图4D的光谱中。ML2离子的理论同位素模型(347.978＝[ML2]1-)显示在图4B的光谱中；而M2L3离子的理论同位素模型(548.927＝[M2L3]1-)显示在图4A的光谱中。结果表明，随着使用涂覆的柱，Fe加合物(例如，347.978m/z和548.927m/z)大大减少。
合并样品和比较样品方法
在超纯水中以50mM游离酸制备分析物的储备溶液。通过吸取50μL每种分析物，然后在硅烷化样品小瓶中用超纯水稀释以得到2.5mM/分析物的最终浓度来制备储备溶液。将样品储存在4℃。分析物购自Sigma Aldrich(3-磷酸甘油酸、6-磷酸葡萄糖酸、顺式乌头酸、柠檬酸、富马酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异柠檬酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸)。D-α-羟基戊二酸(2-羟基戊二酸)分析物购自Cayman Chemical。
将尿液样品在冰上解冻，然后用超纯水稀释3倍。然后将样品在4℃和21,130rcf下离心10分钟。将上清液转移到硅烷化小瓶中以用于分析，将50微升每种乳腺癌阳性样品(BioIVT,Westbury,NY)和对照尿液样品添加到新的小瓶中以用于实验合并。立即分析样品。
在具有ACQUITY PREMIER CSH苯基-己基柱(涂覆柱)的ACQUITY I-Class PLUSFTN二元色谱系统上使用0.1％甲酸的水溶液和ACN溶液的浅梯度分离样品。将LC连接到Xevo G2-XS TOF质谱仪。使用MassLynx v4.2获取并处理数据。
方法：
Xevo G2-XS Q TOF
-ESI负电
-温度–500℃
-去溶剂化–1000L/hr
-源温度–120℃
-锥孔电压–10V
-毛细管电压–2kV
-低能碰撞能量设为6
-高能碰撞能量设为10-40
ACQUITY I-Class LC
-CSH苯基-己基2.1×100mm，1.7um柱
ο涂覆(PREMIER)
-流动相A–0.1％甲酸的H2O溶液
-流动相A–0.1％甲酸的ACN溶液
-柱温–50℃
-进样体积–3μL
样品是100uM分析物的H2O水溶液
-使用硅烷化小瓶
[梯度表]
Figure BDA0003757902180000121
合并样品和比较样品的实施例
使用上述方法，在使用根据本技术涂覆的硬件的系统中分离每种分析物(3-磷酸甘油酸、6-磷酸葡萄糖酸、顺式乌头酸、柠檬酸、富马酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异柠檬酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸和2-羟基戊二酸)。在每个实施例中，数据表明，Fe加合物是无关紧要的，从而允许改进尿液样品中分析物的分离、检测和分析。
有机酸的分离可能具有挑战性，因为它们具有小而极性的性质以及存在许多同量异位物质。为了确保样品复杂性不会妨碍基质中的分离，在方法开发过程中采用水性标准品以及掺有分析物使最终浓度为100μM的稀释尿液样品。尿代谢物的分离在ACQUITYPREMIER CSH苯基-己基柱上进行。图5A提供了标准中有机酸的分离，并且图5B提供了尿液样品内的分离。图5A和图5B中所示的结果说明了利用本技术的方法(即，具有苯基-己基柱的涂覆硬件)的色谱分离能力。每个峰是可分辨的。图5C提供了鉴别峰的表。
生物样品中有机酸分析的选择性很重要，因为许多化合物的结构相似，甚至同量异位。对具有共同片段的化合物进行色谱分离确保了测量的置信度。衣康酸具有两种主要鉴别离子，129.019m/z的[M-H]-1和85.029m/z处的片段。异柠檬酸、柠檬酸、顺式乌头酸和2-羟基戊二酸在它们的断裂模式中也含有这两种离子，并且用于文库匹配。确认衣康酸与这些化合物中的任一种共洗脱的存在即使不是不可能也很困难。异柠檬酸和柠檬酸是分子式为C6H8O7的结构异构体。尽管它们各自具有一些独特的片段，但是在不进行色谱分离的情况下，它们的绝对区别或定量不能得到保证。类似地，琥珀酸和甲基丙二酸是结构异构体，然而它们的断裂几乎相同，并且需要色谱分离进行分析。苹果酸和富马酸具有不同的结构，然而已经表明苹果酸经历源内断裂和碰撞胞分解，从而含有与富马酸相同的片段。使用如图6A-图6D的标准中所示的当前技术的方法实现这些关键对的分离。在图6A中，示出了关键的异柠檬酸和柠檬酸对的分离。在图6B中，实现了关键的琥珀酸和甲基丙二酸对的分离。在图6C中，可见衣康酸、顺式乌头酸和2-羟基戊二酸的分离。并且在图6D中，示出了关键的苹果酸和富马酸对的分离。
使用以下方法评价乳腺癌阳性样品与非患病(或对照)阴性样品。样品组进样顺序是随机的，每种疾病、对照和合并尿液样品具有5个重复。为了确保分析性能，制备了两种系统适用性样品。第一种是在超纯水中浓度为100μM的所有分析物的标准物，第二种是掺加到如上制备的尿液样品中的最终浓度为100μM的所有分析物的标准物。在样品组开始时并在结束时再次运行两种系统适用性样品。
将该分析方法应用于四个非患病女性尿液样品和四个乳腺癌阳性女性尿液样品的比较分析。在用水稀释后，将每个样品的部分5次重复进样并随机化。将样品组导入Progenesis Q1中进行特征处理。
无监督PCA分析显示出乳腺癌阳性和健康对照尿液样品的分离，这两种情况具有不同的分组。重复进样的紧密簇显示出优异的方法再现性，如图7所示。
在图8中，分析物的丰度图示出了它们在健康对照与患病尿液样品中的差异。这些图可以用于说明健康患者与活动性乳腺癌个体中不同有机酸的丰度。具体地，图8A示出了琥珀酸的丰度图(健康左图、患病中心图和合并右图)。图8B示出了乌头酸的丰度图(健康左图、患病中心图和合并右图)。图8C示出了异柠檬酸的丰度图(健康左图、患病中心图和合并右图)。图8D示出了柠檬酸的丰度图(健康左图、患病中心图和合并右图)。图8E示出了3-磷酸甘油酸的丰度图(健康左图、患病中心图和合并右图)。图8F示出了2-羟基戊二酸的丰度图(健康左图、患病中心图和合并右图)。
通过利用本技术获得不受金属加合物影响的良好分离的可再现结果，该数据可以用于研究疾病的病因。图8的丰度图提供了可用于乳腺癌的病因的数据。

Claims (20)

1.一种分离和分析样品的方法，所述方法包括：
将所述样品注入到在金属表面上具有流体接触涂层的色谱系统中，其中所述涂层包含烷基甲硅烷基，并且所述样品包含一种或多种三羧酸循环代谢物；
使所注入的样品流过所述色谱系统；
用所述色谱系统分离流动的样品；以及
用质谱仪分析所分离的样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种三羧酸循环代谢物包含羧基基团。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种三羧酸循环代谢物包括选自由以下项组成的组的至少一种三羧酸代谢物：柠檬酸、衣康酸或2-羟基戊二酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述涂层防止三羧酸循环代谢物与金属相互作用，所述涂层包含双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。
5.根据权利要求1所述的方法，其中分离所述样品包括使用混合模式阴离子交换色谱法。
6.根据权利要求5所述的方法，其中使用混合模式阴离子交换色谱法包括使用各自含有甲酸的水和乙腈的流动相。
7.根据权利要求5所述的方法，其中使用混合模式阴离子交换色谱法包括使用苯基-己基色谱柱。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述金属表面包括柱壁和玻璃料表面，并且其中所述金属表面上的所述涂层相对于未涂覆的金属表面增加代谢物峰面积。
9.一种当使用色谱系统时增加包含一种或多种三羧酸循环代谢物的样品的分离度的方法，所述方法包括：
提供在金属表面上具有流体接触涂层的所述色谱系统，其中所述涂层包含烷基甲硅烷基；
将所述样品注入到所述色谱系统中；
使所注入的样品流过所述色谱系统；
用所述色谱系统分离流动的样品；以及
使所分离的样品通过质谱仪以分析所分离的样品。
10.根据权利要求9所述的方法，其中选择所述涂层的所述烷基甲硅烷基包括评估所述样品的极性；基于所述极性评估来选择期望的接触角和涂层材料；以及通过烷基甲硅烷基的气相沉积来调节样品流动路径的疏水性。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种三羧酸循环代谢物包含羧基基团。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种三羧酸循环代谢物包括选自由以下项组成的组的至少一种三羧酸代谢物：柠檬酸、衣康酸或2-羟基戊二酸。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述金属表面包括柱壁和玻璃料表面，并且其中所述金属表面上的所述涂层相对于未涂覆的金属表面增加代谢物峰面积。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述涂层防止三羧酸循环代谢物与金属相互作用，所述涂层包含双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。
15.一种研究疾病的病因的方法，所述方法包括：
将所述样品注入到在金属表面上具有流体接触涂层的色谱系统中，其中所述涂层包含烷基甲硅烷基，并且所述样品包含一种或多种三羧酸循环代谢物；
使所注入的样品流过所述色谱系统；
用所述色谱系统分离流动的样品；以及
用质谱仪分析所分离的样品。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述一种或多种三羧酸循环代谢物包含羧基基团。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述一种或多种三羧酸循环代谢物包括选自由以下项组成的组的至少一种三羧酸循环代谢物：柠檬酸、衣康酸或2-羟基戊二酸。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述涂层防止三羧酸循环代谢物与金属相互作用，所述涂层包含双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述金属表面包括柱壁和玻璃料表面，并且其中所述金属表面上的所述涂层相对于未涂覆的金属表面增加代谢物峰面积。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述涂层覆盖所述样品流动路径的表面的90％。
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