CN117571844A - 一种检测人体三羧酸循环中有机酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测三羧酸循环中有机酸的方法,所述方法使用衍生剂对生物样本进行衍生化并使用液相色谱‑质谱联用技术进行检测;所示衍生剂包括苯甲醇和三甲基氯硅烷。通过该方法能同时、快速测定尿液、血清/血浆、头发、粪便、唾液、脑脊液、卵泡液或组织等多种生物样本中的参与三羧酸循环的7种有机酸。该方法的准确度和精密度高、稳定性好,对疾病诊断或风险预测生物标志物研发开发具有重要意义。
Description
本发明主张在先中国申请,申请号:202210943760.0,申请日:2022年08月08日,的优先权,该在先申请作为本申请的一部分;本申请是在先申请,申请号:202211172580.3,申请,2022年9月26日的分案申请。
技术领域
本发明涉及代谢组学及仪器分析技术领域,尤其涉及代谢物的检测方法,具体的说是一种检测三羧酸循环中有机酸的方法。
背景技术
三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA Cycle)由德国科学家Hans Krebs于1973年正式提出,在动、植物和微生物细胞内普遍存在。TCA Cycle是营养物质代谢的核心途径,糖类、脂肪和蛋白质的碳链降解产物都进入TCA Cycle,最终被分解为二氧化碳。TCA Cycle主要包括柠檬酸生成、氧化脱羧、草酰乙酸再生等阶段,在此过程中形成了多种重要的中间产物,包括柠檬酸(Citrate)、乌头酸[(Z)-Aconitate]、异柠檬酸(Isocitrate)、α-酮戊二酸(2-Ketoglutarate)、琥珀酸(Succinate)、富马酸(Fumarate)和苹果酸(Malate)等。该过程不仅为生物分子的合成提供原料,同时还释放大量ATP,为各种生化反应供能,是物质和能量代谢的联系枢纽。
TCA Cycle具有重要的生理意义,其中间产物的定性定量分析是基础及应用代谢研究的核心工具。目前在临床上对TCA Cycle中多种有机酸进行评估可以间接反应是否存在能量代谢异常,尤其是在儿童成长期间。能量代谢异常是由于代谢路径不畅,摄入的食物无法被高效转化为能量,以致无法满足基本生命及生理的活动,从而引发一系列的行为、心理、生理、甚至疾病的问题。近期国内外多项研究表明TCA Cycle有机酸可作为代谢组学研究的重要生物标志物,如早期糖尿病肾病以及肿瘤等。因此开发一种能够精确定量分析TCACycle有机酸的检测方法是当务之急。
TCA Cycle有机酸包括单羧酸、二羧酸及三羧酸,常用气相色谱法、液相色谱法等方法检测。其中,气相色谱法衍生程序操作繁琐,仪器分析时间长,不适用于大批量样本分析;而液相色谱法虽然操作简便,但依然存在很多问题。有机酸的强极性使其难以在传统的反相柱上保留,且不同有机酸包含多个pKa值,分析物电荷状态的变化会导致峰型异常,同时存在同分异构体、杂质等难以分离的问题,为色谱分析带来挑战。目前,已有一些液相色谱方法成功应用于TCA Cycle有机酸的检测,但大多采用HILIC或离子对色谱法。HILIC方法稳健性较差,保留时间时常漂移,不利于质量控制管理,离子对色谱法使用的离子对试剂会污染设备,影响其他项目的检测,需要耗费大量时间清洗仪器。鉴于上述情形,急需开发一种通量更高、更稳健的检测方法。
发明内容
针对上述问题,本发明提供了一种检测三羧酸循环中有机酸的方法,该方法可以同时定量检测三羧酸循环中的7种有机酸;方法的准确度和精确度高,检测时间短且耐用性好;同时,所述方法不需要使用不挥发性盐类,有效减少了盐对质谱系统的污染。
本发明的目的是通过以下技术方案解决的:
一种检测三羧酸循环中有机酸的方法,所述方法使用衍生剂对生物样本进行衍生化并使用液相色谱-质谱联用技术进行检测;所述衍生剂包括苯甲醇和三甲基氯硅烷。
本发明使用苯甲醇和三甲基氯硅烷作衍生剂,对生物样本的有机酸进行检测,衍生效果更优。如在本发明的一些实施例中,使用苯甲醇和三甲基氯硅烷能同时衍生生物样本中的顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸这7种有机酸以使其被检测到;而使用丹磺酰肼衍生尿液样本未能达到理想的效果。
在一些方式中,所述衍生剂由苯甲醇和三甲基氯硅烷组成;所述衍生化的步骤包括:
S1向生物样本中加入内标溶液和苯甲醇,再加入三甲基氯硅烷,混匀;
S2控温一段时间进行衍生反应。
可以通过手动振摇、仪器振摇、涡旋震荡等方式使生物样本、内标溶液、苯甲醇及三甲基氯硅烷的体系充分混合均匀。再控制反应温度,使有利于衍生反应的进行。
此处,仅使用苯甲醇和三甲基氯硅烷作为衍生试剂,不添加其他的非挥发性盐类试剂,可以有效减少盐类对液相-质谱系统的污染、干扰,尤其是减少或避免对质谱的污染或抑制效应。如中国专利202110790654.9(CN113624862A)使用3-硝基苯肼进行衍生时会使用到1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺等盐类试剂会产生离子抑制,影响电离效率,特别是在临床大批量的样本检测时,随着进样次数的增加,对质谱的抑制作用增强,最终会导致质谱灵敏度大大降低致使目标物可能检测不出。使用本发明的苯甲醇和三甲基氯硅烷进行衍生则可以避免该问题。
在一些方式中,在衍生化前向所述生物样本中加入内标溶液并进行干燥处理。生物样本可能含有大量水,如尿液,这些水可能和衍生剂反应从而影响衍生效果。干燥去水可减少衍生剂与水反应。
优选地,苯甲醇和三甲基氯硅烷的体积比为5~7:3~5。最优地,苯甲醇和三甲基氯硅烷的体积比为5:3。
优选地,步骤S2中控制反应温度为40℃~80℃,衍生反应时间不低于15min。经干燥处理的样本更易于衍生化,其在较低的温度和较短的时间下即具有很好的衍生效果。控制反应温度为40℃~80℃指控制反应温度为恒温,该恒温的温度为40℃~80℃中的一个温度点;也指控制反应温度在40℃~80℃范围内,可以是变温过程。下述的控制反应温度在某一个温度范围内具有相同的意义。
在一些方式中,在衍生化前对所述生物样本不进行干燥处理,所述生物样本为液体状态。虽然对生物样本进行干燥处理,可以减少水与衍生剂反应,但生物样本的稳定性较低,干燥处理过程一方面耗费人力和物力,一方面容易造成待测物的损失,同时也可能影响待测物,使最终检测结果偏离实际值,或者造成漏检。因此,优选不进行干燥处理,直接使用液态的生物样本进行衍生。这里的液态或液体状态主要是在对样品衍生化前处理前、或者处理后,样本为溶液的状态,而需要检测的目标物质,例如7种有机酸存在于溶液中,在溶液的状态下进行衍生,这样可以一方面减少目标物质的损失,另外不会造成漏检。
此外,本发明的研究发现使用液态样本有利于生物样本中富马酸的检出。在本申请的一个实施例中,对于一些需要前处理的样本,例如头发,前处理获得的提取液中待测有机酸浓度太低可能会难以检出,此时将提取液进行浓缩,取浓缩液进行衍生;相比于将提取液完全干燥,取干燥后固体衍生,取浓缩液衍生能检测到富马酸,而取干燥后固体衍生不能检测到富马酸。
使用液体状态的生物样本直接进行衍生时,优选地,步骤S1中生物样本、内标溶液、苯甲醇及三甲基氯硅烷的体积比为2:2~5:5~7:3~5。最优地,生物样本、内标溶液、苯甲醇及三甲基氯硅烷的体积比为2:2:5:3。
优选地,步骤S2控制反应温度为60℃~80℃,衍生反应时间不低于75min。
在一些方式中,所述内标溶液中含有以下一种或多种化合物:α-酮戊二酸-13C5、琥珀酸-d4、富马酸-13C4、苹果酸-d3、柠檬酸-d4。
在一些方式中,所述液相色谱的条件包括:色谱柱为Phenomenex Kinetex C18Column,2.6μm,100A,3.0×50mm;柱温为40℃;进样量为2~5μL;
采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱,流速为0.6mL/min,流动相A为0.1%甲酸-2mM乙酸铵-水溶液;流动相B为乙腈,梯度洗脱程序包括:0至0.5min 40%流动相A和60%流动相B,0.5min至2.2min流动相A由40%至0%、流动相B由60%至100%;2.2min至3.2min100%流动相B;3.2min至3.25min流动相B由100%至60%、流动相A由0%至40%;3.25min至4.00min 40%流动相A和60%流动相B。
该液相洗脱条件可以实现在4min内对上述7种待测有机酸的分离,特别是同时能实现柠檬酸和异柠檬酸这两个同分异构体的完全分离。
在一些方式中,所述液相色谱的条件还包括:强洗溶液为甲醇;弱洗溶液为0.5%乙腈水溶液。强洗溶液和弱洗溶液用于清洗液相的进样系统,可避免进样系统的污染和堵塞。
在一些方式中,所述生物样本为尿液、血清、血浆、唾液、脑脊液、卵泡液、头发、粪便等中的一种或多种,也可以是这些样本经过前处理获得的溶液或固体物质。前处理包括沉淀蛋白、提取、粉碎等等。例如在本申请的一个实施例中,生物样本为头发时,需要进行研磨和提取过程。
在一些方式中,所述有机酸包括以下的一种或多种:顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸。这些有机酸均为三羧酸循环过程中的有机酸,对其实现同时检测,对三羧酸循环及相关的代谢研究具有重要意义。例如当某种疾病可能影响机体某一组织三羧酸循环中有机酸间的相互转化时,若能同时检测出该生物组织中的这7种有机酸,则可判断有机酸的转化情况,进而明确哪一步转化过程可能出现了问题,反之也可以通过这7种有机酸的变化情况反应疾病的进程。
在一些方式中,所述方法的质谱条件包括:采用电喷雾电离源和正离子模式;喷雾电压:5500V;温度:350℃;雾化气:55psi;辅助加热气:55psi;气帘气:25psi;碰撞气:6psi;采用多反应监测扫描方式。
在一些方式中,采用多反应监测扫描方式(MRM模式)对所述有机酸进行定量检测;顺式乌头酸的定量离子对为445.2→271.2,定性离子对为445.2→265.2;α-酮戊二酸的定量离子对为344.1→147.1,定性离子对为344.1→101.1;琥珀酸的定量离子对为316.1→101.1,定性离子对为299.0→101.1;富马酸的定量离子对为314.0→181.1,定性离子对为314.0→91.1;苹果酸的定量离子对为332.1→89.0,定性离子对为315.1→135.1;柠檬酸的定量离子对为463.1→237.1,定性离子对为463.1→283.1;异柠檬酸的定量离子对463.1→283.1,定性离子对为463.1→237.1。
这里的定量和定性离子对是发明人通过待测物的结构特征以及大量实验优化得到的最优的离子对。
其中,柠檬酸和异柠檬酸为同分异构体且结构类似,其母离子和子离子相同,发明人在实验过程意外发现,MRM模式检测时,463.1→283.1通道的异柠檬酸响应比463.1→237.1通道的高,而463.1→237.1通道的柠檬酸的质谱峰面积比463.1→283.1通道的高。因此,选择463.1→237.1作为柠檬酸的定量离子对,同时作为异柠檬的定性离子对;选择463.1→283.1作为异柠檬酸的定量离子对,同时作为柠檬酸的定性离子对。
另一方面,本发明提供了一种试剂盒,所述试剂盒用于上述检测三羧酸循环中有机酸的方法。
在一些方式中,所述试剂盒中含有衍生化试剂,如苯甲醇和三甲基氯硅烷。
在一些方式中,所述试剂盒含有标准品溶液和内标溶液;所述标准品溶液含有顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸中的一种或多种化合物;所述内标溶液含有α-酮戊二酸-13C5、琥珀酸-d4、富马酸-13C4、苹果酸-d3、柠檬酸-d4中的一种或多种化合物。这里的标准品溶液可以是配制完成可以直接使用的不同浓度的线性标准溶液;也可以是标准储备液,在使用时用稀释剂稀释使用即可。优选地,标准溶液或内标溶液可以是固体标准品与稀释剂分开的状态,在使用时再将二者混合。
在一些方式中,所述试剂盒用于检测某些需要前处理的头发样本时,所述试剂盒中还包括前处理试剂,如乙腈等有机试剂。
再一方面,本申请提供了笨甲醇和三甲基氯硅烷这两个化合物组成的衍生剂在检测样本中三羧酸循环中有机酸方面的用途,所述的样本为液态样本,所述的有机酸为顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸。在一些方式中,所述的样本为尿液、血液以及头发。
本发明的另外一个突出的特点,就是衍生试剂可以适应不同的样本,采用同样的衍生方法对目标物质进行衍生,这样操作简单。
可利用该衍生剂通过上述的方法对生物样本进行衍生再用液相色谱-质谱联用技术进行检测,以实现三羧酸循环中7种有机酸的同时定量检测。
本发明提供一种检测三羧酸循环中有机酸的方法,所述方法使用衍生剂对生物样本进行衍生化并使用液相色谱-质谱联用技术进行检测;所示衍生剂包括苯甲醇和三甲基氯硅烷。
在一些方式中,所述衍生剂由苯甲醇和三甲基氯硅烷组成;所述衍生化的步骤包括:
S1向生物样本中加入内标溶液和苯甲醇,再加入三甲基氯硅烷,混匀;
S2控温一段时间进行衍生反应。
在一些方式中,在衍生化前向所述生物样本中加入内标溶液并进行干燥处理。
在一些方式中,步骤S1中苯甲醇和三甲基氯硅烷的体积比为5~7:3~5。
在一些方式中,步骤S1中苯甲醇和三甲基氯硅烷的体积比为5:3。
在一些方式中,步骤S2中控制反应温度为40℃~80℃,衍生反应时间不低于15min。
在一些方式中,在衍生化前对所述生物样本不进行干燥处理,所述生物样本为液体状态。
在一些方式中,步骤S1中生物样本、内标溶液、苯甲醇及三甲基氯硅烷的体积比为2:2~5:5~7:3~5。
在一些方式中,步骤S1中生物样本、内标溶液、苯甲醇及三甲基氯硅烷的体积比为2:2:5:3。
在一些方式中,步骤S2中控制反应温度为60℃~80℃,衍生反应时间不低于75min。在一些方式中,所述内标溶液中含有以下一种或多种化合物:α-酮戊二酸-13C5、琥珀酸-d4、富马酸-13C4、苹果酸-d3、柠檬酸-d4。
在一些方式中,所述液相色谱的条件包括:色谱柱为Phenomenex Kinetex C18Column,2.6μm,100A,3.0×50mm;柱温为40℃;进样量为2~5μL;
采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱,流速为0.6mL/min,流动相A为0.1%甲酸-2mM乙酸铵-水溶液;流动相B为乙腈;梯度洗脱程序包括:0至0.5min 40%流动相A和60%流动相B,0.5min至2.2min流动相A由40%至0%、流动相B由60%至100%;2.2min至3.2min100%流动相B;3.2min至3.25min流动相B由100%至60%、流动相A由0%至40%;3.25min至4.00min 40%流动相A和60%流动相B。
在一些方式中,所述液相色谱的条件还包括:强洗溶液为甲醇;弱洗溶液为0.5%乙腈水溶液。
在一些方式中,所述生物样本为尿液、血清、血浆、唾液、脑脊液、卵泡液、头发、粪便中的一种或多种。
在一些方式中,所述有机酸包括以下的一种或多种:顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸。
在一些方式中,所述方法的质谱条件包括:采用电喷雾电离源和正离子模式;喷雾电压:5500V;温度:350℃;雾化气:55psi;辅助加热气:55psi;气帘气:25psi;碰撞气:6psi;采用多反应监测扫描方式。
在一些方式中,采用多反应监测扫描方式对所述有机酸进行定量和定性检测;顺式乌头酸的定量离子对为445.2→271.2,定性离子对为445.2→265.2;α-酮戊二酸的定量离子对为344.1→147.1,定性离子对为344.1→101.1;琥珀酸的定量离子对为316.1→101.1,定性离子对为299.0→101.1;富马酸的定量离子对为314.0→181.1,定性离子对为314.0→91.1;苹果酸的定量离子对为332.1→89.0,定性离子对为315.1→135.1;柠檬酸的定量离子对为463.1→237.1,定性离子对为463.1→283.1;异柠檬酸的定量离子对463.1→283.1,定性离子对为463.1→237.1。
本发明的优势在于:本发明提供了一种检测三羧酸循环中有机酸的方法,所述方法可以对有机酸进行定性和定量检测,方法的准确度高,稳定性好。可同时检测尿液、血清/血浆、头发、粪便、唾液、脑脊液或卵泡液等生物样本中的顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸。此外,本发明的方法不需要使用不挥发性盐类,有效减少了盐对质谱系统的污染。
附图说明
图1标准溶液的苹果酸的XIC图;
图2标准溶液的琥珀酸的XIC图;
图3标准溶液的α-酮戊二酸的XIC图;
图4标准溶液的富马酸的XIC图;
图5标准溶液的异柠檬酸和柠檬酸的XIC图;
图6标准溶液的顺式乌头酸的XIC图;
图7对比例1中柠檬酸和异柠檬酸的XIC图;
图8对比例2条件下苹果酸的XIC图;
图9对比例2条件下富马酸的XIC图;
图10对比例2条件下琥珀酸的XIC图;
图11对比例2条件下顺式乌头酸(d)的XIC图;
图12对比例2条件下α-酮戊二酸(f)的XIC图;;
图13对比例3条件下苹果酸的XIC图;
图14对比例3条件下富马酸的XIC图;
图15对比例3条件下琥珀酸的XIC图;
图16对比例3条件下顺式乌头酸的XIC图;
图17对比例3条件下α-酮戊二酸的XIC图;
图18对比例4中丹磺酰肼衍生时空白样品的目标柠檬酸衍生物的XIC图;
图19对比例4中丹磺酰肼衍生时低浓度标准溶液的目标柠檬酸衍生物的XIC图;
图20对比例4中丹磺酰肼衍生时高浓度标准溶液的目标柠檬酸衍生物的XIC图;
图21干燥衍生和不干燥衍生时峰面积(柠檬酸,Cit)随衍生温度的变化趋势图;
图22干燥衍生和不干燥衍生时峰面积(柠檬酸,Cit)随衍生时间的变化趋势图;
图23尿液样本的苹果酸的XIC图;
图24尿液样本的琥珀酸的XIC图;
图25尿液样本的α-酮戊二酸的XIC图;
图26尿液样本的富马酸的XIC图;
图27尿液样本的异柠檬酸和柠檬酸的XIC图;
图28尿液样本的顺式乌头酸的XIC图;
图29血清样本的苹果酸的XIC图;
图30血清样本的琥珀酸的XIC图;
图31血清样本的α-酮戊二酸的XIC图;
图32血清样本的富马酸的XIC图;
图33血清样本的异柠檬酸和柠檬酸的XIC图;
图34血清样本的顺式乌头酸的XIC图;
图35头发样本的苹果酸的XIC图;
图36头发样本的琥珀酸的XIC图;
图37头发样本的α-酮戊二酸的XIC图;
图38头发样本的富马酸的XIC图;
图39头发样本的异柠檬酸和柠檬酸的XIC图;
图40头发样本的顺式乌头酸的XIC图;
图中:XIC图即提取离子流图;*表示内标峰,箭头指向的为待测有机酸衍生物峰(目标峰)。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步的说明。应当指出的是,实施例只是对本发明的详细阐述,不能以此限定本发明的保护范围,本发明的实施例中公开的所有特征,或公开的所有方法或过程中的步骤,除了互相排斥的特征和/或步骤以外,均能够以任何方式组合,均在本实发明的保护范围之内。本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。
实施例1一种检测三羧酸循环中7种有机酸的方法
1、溶液配制
(1)内标溶液
称取α-酮戊二酸-13C5、琥珀酸-d4、富马酸-13C4、苹果酸-d3、柠檬酸-d4,配制成理论浓度为20μg/mL、20μg/mL、20μg/mL、4μg/mL和10μg/mL的溶液。
(2)标准溶液
称取顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸,配制成顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸计理论浓度分别在0.5~100μg/mL、0.5~100μg/mL、0.5~100μg/mL、0.5~100μg/mL、0.5~100μg/mL、0.1~20μg/mL和4~800μg/mL范围内的一种或多种溶液。
(3)质控品(QC)
取混合人尿液/混合人血清等生物样本按正常做样流程检测,得到各个化合物的本底值。将该份本底样本均分成3份,一份作为质控LQC(低浓度质控品),另外两份分别添加不同量的标准溶液作为质控MQC(中浓度质控品)和HQC(高浓度质控品)。
(4)样本前处理
根据生物样本主要成分的不同,采用不同的前处理策略。尿液样本无需前处理,血清/血浆样本富含蛋白,需要先用有机试剂沉淀蛋白;头发样本需要先低温研磨,再用有机试剂超声萃取;其他样本在此不一一列举,这样得到不同样本的衍生前的处理样本,可以进行干燥或者液态下进行衍生。
(5)衍生程序
取经前处理的样本的上清液或浓缩液或直接取未经前处理的液体样本(如尿液)、空白溶液(60%乙腈)、标准溶液、质控品各20μL分别至各个1.5mL EP管中,分别向各个管中加入30μL内标溶液和50μL苯甲醇,再加入30μL三甲基氯硅烷,涡旋震荡5min;60℃下衍生75min;加入180μL 80%乙腈溶液,涡旋震荡5min。
2、液相色谱条件
液相色谱系统高压泵A流动相:0.1%甲酸-2mM乙酸铵-水溶液
液相色谱系统高压泵B流动相:乙腈
强洗溶液:甲醇
弱洗溶液:0.5%乙腈水溶液
流速:0.6mL/min
色谱柱:Phenomenex Kinetex C18 Column,2.6μm,100A,3.0×50mm
柱温:40℃
进样量:2μL
梯度洗脱参数如下表:
表1梯度洗脱条件
时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0.00 | 40 | 60 |
0.50 | 40 | 60 |
2.20 | 0 | 100 |
3.20 | 0 | 100 |
3.25 | 40 | 60 |
4.00 | 40 | 60 |
在该液相色谱条件下,顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸的保留时间分别约为:1.74min、1.44min、1.23min、1.28min、1.55min、0.84min、1.58min。
3、质谱条件
电喷雾电离(ESI)源,正离子模式;
喷雾电压:5500V;
温度:350℃;
雾化气:55psi;
辅助加热气:55psi;
气帘气:25psi;
碰撞气(CAD):6psi;
多反应监测(MRM)扫描方式;
离子对参数如下表:
表2离子对参数列表
备注:顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸这7种待测有机酸与琥珀酸-d4等内标经衍生化后其中羧基与苯甲醇的羟基结合生成酯,表中为这些酯的母离子和子离子的离子对,用于这些有机酸的定性或定量检测;*表示定量用离子对;Q1 Mass母离子;Q3 Mass子离子;DP去簇电压;CE碰撞电压;CXP碰撞室射出电压。
4、进样和计算方法
取上述的衍生后的空白溶液、质控品、标准溶液、样品溶液分别进液相-色谱联用仪,按上述液相色谱和质谱条件进行检测,通过外标法或标准曲线法计算样本溶液中7种有机酸的浓度。
5、代表图谱
通过上述条件获得7种有机酸标准品的XIC图见图1-6,由图中结果可知,通过上述的衍生程序以及液相色谱和质谱条件可以进行7种有机酸的同时检测。
在进行上述实施例子1之前,我们用标准品和样本进行过很多优化实验,希望对7种有机酸进行准确检测,不漏检,同时可以进行有效的区分。分别进行如下的阐述。
对比例1
取一定浓度7种有机酸的混合标准品溶液进行衍生化(同实施例1),按下述的液相梯度进样,其他条件同实施例1。
表3梯度洗脱条件
时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0.00 | 40 | 60 |
0.50 | 40 | 60 |
1.50 | 30 | 70 |
2.20 | 30 | 70 |
2.70 | 0 | 100 |
3.70 | 0 | 100 |
3.75 | 40 | 60 |
4.50 | 40 | 60 |
结果发现柠檬酸和异柠檬酸不能完全分离,柠檬酸和异柠檬酸的XIC图如图7所示。柠檬酸和异柠檬酸为同分异构体,其分子式相同、结构相似,具有相同的母离子和子离子。若不能通过色谱条件将柠檬酸和异柠檬酸分离开,则不能通过质谱检测实现二者的分别定量。
对比例2
取尿液样本,加入含7种有机酸的标准溶液,配制成MQC并进行衍生化,对各有机酸选择其他离子对通道进行采集(柠檬酸和异柠檬酸除外),离子对参数条件如下表,其他条件同实施例1。
表4离子对参数列表
各待测有机酸的XIC图如图8-12所示。由图中结果可知,按实施例1的离子对通道检测的待测有机酸的峰面积远高于按表4条件检测到的峰面积。说明,在需要同时检测7种有机酸的时候,离子对通道的选择也是非常关键的。
对比例3
取一定浓度7种有机酸的混合标准品溶液进行衍生化(同实施例1),按下述的液相和质谱条件进样。
①液相色谱条件
液相色谱系统高压泵A流动相:0.1%甲酸-2mM乙酸铵-水溶液
液相色谱系统高压泵B流动相:乙腈
强洗溶液:甲醇
弱洗溶液:0.5%乙腈水溶液
流速:0.6mL/min
色谱柱:Phenomenex Kinetex C18 Column,2.6μm,100A,3.0×50mm
柱温:40℃
进样量:2μL
梯度洗脱参数如下表:
表5梯度洗脱条件
时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0.00 | 50 | 50 |
0.50 | 50 | 50 |
1.50 | 30 | 70 |
2.20 | 30 | 70 |
2.70 | 0 | 100 |
3.70 | 0 | 100 |
3.75 | 40 | 60 |
4.50 | 40 | 60 |
②质谱条件
电喷雾电离(ESI)源,正离子模式;
喷雾电压:5500V;
温度:350℃;
雾化气:55psi;
辅助加热气:55psi;
气帘气:25psi;
碰撞气(CAD):6psi;
多反应监测(MRM)扫描方式;
离子对参数如下表:
表6离子对参数列表
各待测有机酸的XIC图如图13-17所示。由图中结果可知,该条件下待测有机酸的响应低且峰型较差,其中α-酮戊二酸的XIC的色谱峰还存在前沿变形。这说明,虽然样本前处理相同(衍生前的处理以及衍生处理),但是对于液相色谱以及质谱条件都需要进行相应的调整,才能最大限度的对7种有机酸进行分离,而且检测的精度更高。
对比例4
采用丹磺酰肼进行衍生,具体流程如下:分别取20μL60%乙腈(空白)、低浓度和高浓度标准溶液(7种有机酸的混合标准品溶液),于1.5mL各个离心管中,向每个离心管加入20μL 0.1M EDC(1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)propyl)carbodiimide)溶液和20μL 10mMHOAT(1-hydroxy-7-azabenzotriazole)溶液,涡旋混匀后再加入20μL 10mg/mL丹磺酰肼溶液,20℃震荡衍生90min,然后再加入20μL 0.1M氯化铜溶液(终止),40℃孵育30min淬灭反应,离心后稀释上样【参考文献Dansylhydrazine Isotope Labeling LC-MS forComprehensive Carboxylic Acid Submetabolome Profiling,Shuang Zhao,Liang Li,Analytical Chemistry,2018Nov 20;90(22):13514-13522】。
优化MRM,并寻找柠檬酸衍生物,空白(Cit-DB)、低浓度标准溶液(Cit-3.2μg/mL)和高浓度标准溶液(Cit-320μg/mL)的XIC图如图18-20,标准溶液和空白的色谱图几乎相同,均未寻找到目标峰。进一步寻找其他有机酸的衍生物的离子色谱峰,仅发现了3个峰面积很小且有干扰的疑似衍生化的母离子,未找到相应的子离子。该结果说明使用丹磺酰肼未能成功衍生7种有机酸。
实施例2衍生条件的优化
苯甲醇与三甲基氯硅烷衍生羧酸的反应实质上是酯化反应,酯化反应在有水的条件下效率低,而一些液态的生物样本(如尿液、血清等)中富含水,理论上来说干燥后衍生的效果更优,但是在临床检测场景中,样本干燥后衍生耗费时间和人力,不利于检测效率的提高,同时干燥过程会引起样品损失。为了直接使用液体状态的生物样本进行衍生,而不经过干燥过程,我们对比了吹干衍生和不吹干衍生的效果,并进一步对其他衍生条件进行了优化,获得了适用于液体状态的生物样本衍生的最佳程序,具体过程如下。
柠檬酸(Cit)在生物样本中含量很高,且含有3个羧基,较难完全衍生,因此选用柠檬酸的检测值对衍生效果进行对比。优化过程选用尿液样本为代表。
1、衍生温度的优化
采用相同的尿液样本,加入等量衍生试剂,分别在室温(RT=25)、40、50、60、70和80℃下衍生相同时间,分别记录吹干(Dry)/不吹干(Wet)条件下目标物峰面积随衍生温度的变化趋势,同时比较各时间点的目标物峰面积和内标峰面积比(Area Ratio)的差异,其他条件同实施例1。
试验结果如图21和下表:
表7不同衍生温度下目标峰面积和内标峰面积比
温度(℃) | Cit Wet | Cit Dry |
RT=25 | N/A | 22.558 |
40 | 18.166 | 21.629 |
50 | 23.211 | 20.745 |
60 | 20.606 | 20.311 |
70 | 20.460 | 20.004 |
80 | 20.275 | 20.478 |
平均值(Average) | 20.543 | 20.954 |
标准差(SD) | 1.793 | 0.961 |
变异系数(CV)% | 8.726 | 4.585 |
结果表明:(1)吹干衍生时,峰面积随着温度的升高呈先增大后减小的趋势,在50~70℃时峰面积更大,60℃时峰面积最大,则在尿液吹干的情况下,更优的衍生温度为50~70℃,60℃最优。
(2)不吹干衍生时,随着温度的升高,峰面积呈增大趋势。在RT~50℃时,增大趋势较缓,在50~80℃,增大趋势明显加快。
(3)不吹干衍生峰面积明显低于吹干衍生,但不同温度下的峰面积比CV<10%,表明内标可以校正尿液中水带来的不利影响。特别是,温度在60℃~80℃时,不吹干衍生峰面积比与吹干衍生峰面积比更为接近,且在该温度范围下,峰面积更高,则不吹干衍生的较优温度为60~80℃。
2、衍生时间优化
采用尿液样本,加入等量衍生试剂,在相同温度下衍生15~180min,每隔15min设置一个点,分别记录吹干(Dry)/不吹干(Wet)条件下目标物峰面积随衍生时间的变化趋势,同时比较各时间点的目标物峰面积和内标峰面积比值(AreaRatio)差异,其他条件同实施例1。
试验结果如下表和图22:
表8不同衍生时间下目标峰面积和内标峰面积比
时间(min) | Cit Wet | Cit Dry |
15 | 55.679 | 54.889 |
30 | 54.2875 | 52.195 |
45 | 61.177 | 53.511 |
60 | 50.807 | 58.625 |
75 | 54.364 | 54.232 |
90 | 56.547 | 56.7385 |
105 | 55.138 | 54.4865 |
120 | 55.843 | 55.451 |
135 | 55.745 | 55.838 |
150 | 54.6675 | 55.3905 |
165 | 57.499 | 55.434 |
180 | 58.0905 | 54.208 |
Average | 55.820 | 55.083 |
SD | 2.498 | 1.621 |
CV% | 4.474 | 2.943 |
结果表明:(1)吹干衍生时,随着衍生时间增加,目标峰面积先升高再略有下降至基本保持不变,则衍生时间优选60min以上,60~70min更优。
(2)不吹干衍生时,随着衍生时间增加,目标峰面积不断升高,并在75min后峰面积的增加速度变慢,即衍生速率有所降低。
(3)不吹干衍生峰面积明显低于吹干衍生,但不同时间点的峰面积比CV<5%,表明内标可以校正衍生时间带来的不完全衍生。特别地,在75~150min时,不吹干衍生峰面积比与吹干衍生峰面积比更为接近。综合考虑峰面积大小,不吹干衍生时间大于75min,优选75~150min。
3、衍生试剂用量优化
取20μL尿液样本,分别加入不同体积的内标溶液(WIS)、苯甲醇(BnOH)和三甲基氯硅烷(TMCS),按照相同温度和时间条件衍生,比较目标物峰面积的差异。试验结果如下表。
表9不同体积下目标峰面积
由表中结果可知:20μL尿液样本时,加入20~50μL内标溶液、50~70μL苯甲醇和30~50μL三甲基氯硅烷时,目标峰面积较大;加入20μL内标溶液、50μL苯甲醇和30μL三甲基氯硅烷,目标峰面积较大。因此,样本溶液、内标溶液、苯甲醇及三甲基氯硅烷的体积比优选2:2~5:5~7:3~5,最优2:2:5:3。
综上,生物样本除了可以先吹干再用苯甲醇和三甲基氯硅烷衍生外,也可以在不吹干的情况下直接用苯甲醇和三甲基氯硅烷进行衍生。这里仅仅是采用尿液进行衍生的结果,似乎吹干与不吹干的效果差异不大,相对,不吹干的操作步骤更加简单,节约成本。
实施例3尿液样本中三羧酸循环7种有机酸的测定(液体样本衍生)
1、溶液配制
(1)内标溶液
按下表配制内标储备液。
表10内标储备液的配制
按下表配制内标溶液。
表11内标溶液的配制
(2)标准溶液:称取顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸,按下表配制标准品储备液,再稀释获得一系列浓度梯度的标准溶液。
表12标准品储备液的配制
按下表配制混合工作储备液(Mix)的制备。
表13混合工作储备液(Mix)的配制
注:1)在保证比例不变的前提下,可以适当调节体积。
2)储备液和混合储备液放置于-80℃冰箱。
按照下表标准溶液,具体浓度见下表。
表14标准溶液配制方式
标准曲线 | 储备液名称 | 储备液加入量(μL) | 60%乙腈溶液加入量(μL) |
STD 1 | STD 4 | 50 | 450 |
STD 2 | STD 6 | 10 | 490 |
STD 3 | STD 6 | 20 | 480 |
STD 4 | STD 6 | 50 | 450 |
STD 5 | Mix | 10 | 490 |
STD 6 | Mix | 50 | 450 |
STD 7 | Mix | 100 | 400 |
按上表配制的各标准溶液中7种有机酸浓度如下表。
表15各分析物的标准曲线浓度
序号 | 分析物 | 标准曲线浓度(μg/mL) |
1 | 顺式乌头酸 | 0.5,1,2,5,10,50,100 |
2 | 异柠檬酸 | 05,1,2,5,10,50,100 |
3 | α-酮戊二酸 | 05,1,2,5,10,50,100 |
4 | 琥珀酸 | 0.5,1,2,5,10,50,100 |
5 | 富马酸 | 0.5,1,2,5,10,50,100 |
6 | 苹果酸 | 0.1,02,04,1,2,10,20 |
7 | 柠檬酸 | 4,8,16,40,80,400,800 |
(3)质控品
按下表配制LQC、MQC和HQC。
表16质控品的配制
表17质控品配制浓度
注:1)在保证比例不变的前提下,可以适当调节体积。
2)LQC:低浓度质控品;MQC:中浓度质控品;HQC:高浓度质控品
(4)衍生程序
取尿液、双空白(60%乙腈)、单空白(60%乙腈)、标准溶液、质控品20μL分别至1.5mL EP管中;双空白(60%乙腈)加入20μL60%乙腈,其他分别加入20μL内标溶液;分别加入50μL苯甲醇,再加入30μL三甲基氯硅烷,涡旋震荡5min;60℃下衍生75min;加入180μL80%乙腈溶液,涡旋震荡5min。
2液相色谱条件
同实施例1。
3质谱条件
同实施例1。
4、进样和计算方法
取衍生后的空白溶液、质控品、标准溶液、样品溶液分别进液相-色谱联用仪,按上述液相色谱和质谱条件进行检测,通过标准曲线法计算样本溶液中7种有机酸的浓度。
实施例4尿液样本中三羧酸循环7种有机酸的测定(固体样本衍生)
取尿液、双空白(60%乙腈)、单空白(60%乙腈)、标准溶液、质控品20μL分别至1.5mL EP管中;除双空白(60%乙腈)外,其他分别加入20μL内标溶液;氮气吹干,加入50μL苯甲醇,再加入30μL三甲基氯硅烷,涡旋震荡5min;40℃下衍生60min;加入220μL 80%乙腈溶液,涡旋震荡5min。其他同实施例3。
实施例5血清样本中三羧酸循环7种有机酸的测定(液体样本衍生)
标准溶液、内标溶液配制同实施例3。
质控品:除用血清代替尿液外,其他同实施例3。
取血清用乙腈沉淀蛋白,离心取上清液。
取上清液、双空白(60%乙腈)、单空白(60%乙腈)、标准溶液、质控品20μL分别至1.5mL EP管中;双空白样本中加入20μL 60%乙腈,其他样本中加入20μL内标溶液;加入50μL苯甲醇,再加入30μL三甲基氯硅烷,涡旋震荡5min;60℃下衍生75min;加入180μL 80%乙腈溶液,涡旋震荡5min。
取衍生后的双空白、单空白、质控品、标准溶液、样品溶液(血清)分别进液相-质谱联用仪,按实施例1液相色谱和质谱条件进行检测,通过标准曲线法计算样本溶液中7种有机酸的浓度。
实施例6血清样本中三羧酸循环7种有机酸的测定(固体样本衍生)
取血清用乙腈沉淀蛋白,离心取上清液。
取20μL上清液、双空白(60%乙腈)、单空白(60%乙腈)、标准溶液、质控品20μL分别至1.5mL EP管中;除双空白(60%乙腈)外,其他分别加入20μL内标溶液;氮气吹干,加入50μL苯甲醇,再加入30μL三甲基氯硅烷,涡旋震荡5min;40℃下衍生60min;加入220μL 80%乙腈溶液,涡旋震荡5min。其他同实施例3。
实施例7头发样本中三羧酸循环7种有机酸的测定(液体样本衍生)
头发样本前处理:a)将头发样本切碎成小段,称取10mg置于2.0mL研磨管中,加入研磨珠后置于冷冻研磨机中研磨成粉末;
b)向研磨好的头发样本中加入1mL乙腈溶液,涡旋混匀后冰水浴超声1h;
c)14000rpm离心10min,取上清液,低温浓缩至20μL左右的浓缩液。
标准溶液、内标溶液配制同实施例3。
质控品:除用血清代替尿液外,其他同实施例3。
取浓缩液、双空白(60%乙腈)、单空白(60%乙腈)、标准溶液、质控品各20μL分别至1.5mL EP管中;双空白样本中加入20μL 60%乙腈,其他样本中加入20μL内标溶液;分别加入50μL苯甲醇,再加入30μL三甲基氯硅烷,涡旋震荡5min;60℃下衍生75min;加入180μL80%乙腈溶液,涡旋震荡5min。
取衍生后的各溶液分别进液相-色谱联用仪,按实施例1液相色谱和质谱条件进行检测,通过标准曲线法计算样本溶液中7种有机酸的浓度。
实施例8头发样本中三羧酸循环7种有机酸的测定(固体样本衍生)
将头发样本切碎成小段,称取10mg置于2.0mL研磨管中,加入研磨珠后置于冷冻研磨机中研磨成粉末;向研磨好的头发样本中加入1mL乙腈溶液,涡旋混匀后冰水浴超声1h;14000rpm离心10min,取上清液。
取上清液,加入20μL内标溶液,氮气吹干;取双空白(60%乙腈)、单空白(60%乙腈)、标准溶液、质控品各20μL;除双空白(60%乙腈)外,加入20μL内标溶液;再氮气吹干;向吹干后样本中分别加入50μL苯甲醇,再加入30μL三甲基氯硅烷,涡旋震荡5min;40℃下衍生60min;加入220μL 80%乙腈溶液,涡旋震荡5min。其他同实施例3。
实验结果:
尿液、血清和头发样本测得的典型图谱分别如图23-40,实施例3至实施例8按标准曲线法计算样品溶液衍生后的溶液中7种有机酸的浓度值,具体实验结果如下表:
表18:7种有机酸的检测结果汇总表
由表中结果可知,使用不干燥衍生(或液体样本衍生)的方法(实施例3、5和7)能同时检测出尿液、头发和血清中的7种有机酸;采用干燥衍生(或固体样本衍生)的方法能检测出尿液和血清中的顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸,富马酸未检出,采用干燥衍生(或固体样本衍生)的方法能检测出头发中的顺式乌头酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸,异柠檬酸和富马酸未检出;采用不干燥衍生与干燥衍生检测到的各样本中顺式乌头酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸的结果是一致的。
由实施例2衍生条件的优化研究可知,样品干燥后衍生时柠檬酸衍生物的峰面积是大于未干燥衍生的,然而,使用未干燥衍生能检测到生物样本中的富马酸,而干燥后衍生却不能检测到富马酸。有机酸在与苯甲醇和三甲基氯硅烷的衍生反应时,三甲基氯硅烷(TMSCl)在其中能直接与苯甲醇(BnOH)反应生成TMS-OBn和盐酸(HCl),TMS-OBn再与有机酸的羧基(R-COOH)反应生成酯;同时,TMSCl能与水(H2O)反应生成TMS-OH和HCl,TMS-OH与BnOH反应生成TMS-OBn,TMS-OBn进一步与R-COOH反应生成酯(R-COOBn,即目标衍生物);此外,生成的HCl也有利于酯化反应的进行,即HCl可以催化R-COOH与TMS-OBn生成R-COOBn。
TMSCl+BnOH→TMS-OBn+HCl;
R-COOH+TMS-OBn→R-COOBn+TMS-OH;
TMSCl+H2O→TMS-OH+HCl;
TMS-OH+BnOH→TMS-OBn+H2O。
因此,生物样本中的少量水可能有利于富马酸的衍生化反应,则未干燥衍生时能同时检测到尿液、血清、头发提取液中的7种有机酸,而干燥衍生时检测不到富马酸。另外,上述生物样本中富马酸的含量是最低的,在干燥过程可能存在一定的损失,不干燥衍生时是不会存在干燥损失的。除上述以外,生物样本比较复杂,除了这7种有机酸外,还含有其他小分子代谢物,这些代谢物均可能在干燥过程及衍生过程对富马酸的衍生情况产生影响,具体原因仍有待进一步研究。
实施例9分析方法验证
对实施例1的分析方法进行验证,方法验证样本为尿液,验证项目包括:线性、批内准确度和精密度、批间准确度和精密度,试验结果如下。
1、线性
(1)异柠檬酸的线性范围
(2)柠檬酸的线性范围
(3)顺式乌头酸的线性范围
(4)α-酮戊二酸的线性范围
(5)琥珀酸的线性范围
(6)富马酸的线性范围
(7)苹果酸的线性范围
线性验证结论:各化合物标曲相关系数r≥0.995(r2≥0.99);SD1偏倚在±20%以内,其余浓度点偏倚均在±15%以内,验证通过。
2、批内准确度和精密度
(1)异柠檬酸的批内准确度和精密度
(2)柠檬酸的批内准确度和精密度
(3)顺式乌头酸的批内准确度和精密度
(4)α-酮戊二酸的批内准确度和精密度
(5)琥珀酸的批内准确度和精密度
(6)富马酸的批内准确度和精密度
(7)苹果酸的批内准确度和精密度
批内准确度和精密度验证结论:各化合物偏差在±15%以内,CV%<15%,验证通过。
3、批间准确度和精密度
(1)异柠檬酸的批间准确度和精密度
(2)柠檬酸的批间准确度和精密度
(3)顺式乌头酸的批间准确度和精密度
(4)α-酮戊二酸的批间准确度和精密度
(5)琥珀酸的批间准确度和精密度
(6)富马酸的批间准确度和精密度
(7)苹果酸的批间准确度和精密度
批间准确度和精密度验证结论:各化合物3个分析批的偏差在±15%以内,CV%<15%,验证通过。
由上述方法验证的结果可知,实施例1的方法线性良好,精密度和准确度高,适用于对尿液中顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸进行定量检测。
同理,使用血清和头发样本,进行分析方法验证,其试验结果类似,在此不一一赘叙。
Claims (10)
1.一种检测人体三羧酸循环中有机酸的方法,其特征在于,所述方法使用衍生剂对生物样本进行衍生化并使用液相色谱-质谱联用技术进行检测;所述衍生剂由苯甲醇和三甲基氯硅烷组成,其中,所述衍生化的步骤包括:S1:向生物液体样本中直接加入内标溶液和苯甲醇,再加入三甲基氯硅烷,混匀;S2:控温一段时间进行衍生反应;其中,步骤S1中生物样本、内标溶液、苯甲醇及三甲基氯硅烷的体积比为2:2~5:5~7:3~5;其中,所述的有机酸为:顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤S1中生物样本、内标溶液、苯甲醇及三甲基氯硅烷的体积比为2:2:5:3。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤S2中控制反应温度为60℃~80℃,衍生反应时间不低于75min。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述内标溶液中含有以下化合物:α-酮戊二酸-13C5、琥珀酸-d4、富马酸-13C4、苹果酸-d3、柠檬酸-d4。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述液相色谱的条件包括:色谱柱为Phenomenex Kinetex C18 Column,2.6μm,100A,3.0×50mm;柱温为40℃;进样量为2~5μL;
采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱,流速为0.6mL/min,流动相A为0.1%甲酸-2mM乙酸铵-水溶液;流动相B为乙腈;梯度洗脱程序包括:0至0.5min 40%流动相A和60%流动相B,0.5min至2.2min流动相A由40%至0%、流动相B由60%至100%;2.2min至3.2min 100%流动相B;3.2min至3.25min流动相B由100%至60%、流动相A由0%至40%;3.25min至4.00min 40%流动相A和60%流动相B。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述生物样本为尿液的时候,直接进行衍生,如果是血液的时候,对液体进行处理获得液体样本进行直接衍生,如果样本为头发的时候,对头发进行前处理获得液体样本进行直接衍生。
7.一种试剂盒,包括用于对液体样品中7种有机酸进行衍生的试剂,所述的试剂由苯甲醇和三甲基氯硅烷组成;其中,所述试剂盒还含有标准品溶液和内标溶液;所述标准品溶液含有顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸;所述内标溶液含有α-酮戊二酸-13C5、琥珀酸-d4、富马酸-13C4、苹果酸-d3、柠檬酸-d4。
8.衍生剂在用于制备检测液体样本中三羧酸循环中有机酸方面的用途,其特征在于,所述衍生剂由苯甲醇和三甲基氯硅烷组成;所述有机酸为顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸。
9.根据权利要求14所述的用途,所述的液体样本与苯甲醇、三甲基氯硅烷之间的体积比为2:5:3。
10.根据权利要求15所述的用途,其中,当所述的液体样本为尿液的时候,直接向尿液中加入衍生试剂;当液态样本为血液的时候,需要在衍生前对血液样本进行处理;当样本为头发样本的时候,需要对头发样品进行衍生前的处理步骤。
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