CN109298115B - 生物样品中多种代谢物定量检测方法及代谢芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物样品中多种代谢成分定量检测方法及用于该方法的代谢芯片。所述检测方法是对生物样品进行衍生化处理后采用液相色谱质谱联用检测衍生化后的生物样品。在衍生化处理中，采用3‑硝基苯肼作为衍生化试剂，以1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺作为衍生化反应催化剂。本发明检测方法可以实现高灵敏度检测且检测可覆盖跨量级的多个代谢成分，简单快捷，适合应用于临床和科研检验。本发明代谢芯片包括芯片载体微量滴定板和相关试剂，可以实现在同一微量滴定板上对生物样品中的多个跨量级的代谢物如氨基酸、酚类、苯基或苄基衍生物、吲哚、有机酸、脂肪酸、糖及胆汁酸进行定量检测。

Description

生物样品中多种代谢物定量检测方法及代谢芯片
技术领域
本发明涉及生物样品检测领域，具体地涉及生物样品中多个代谢成分如氨基酸、酚类、苯基或苄基衍生物、吲哚、有机酸、脂肪酸、糖及胆汁酸的定量测定方法，更具体涉及一种采用化学衍生法串联质谱测定生物样品的检测方法及用于该方法的代谢芯片。
背景技术
代谢组学涉及对细胞、体液和组织中存在的全套代谢物(代谢组)的无偏分析。目前，基于核磁共振(NMR)或质谱(MS)的代谢组学平台检测到许多小分子(MW<1500)代谢物但仅在生物流体(血清/血浆或尿液)和患有代谢疾病的受试者的组织中提供相对(非绝对)浓度，以确定它们与对照组的浓度不同。代谢组的巨大化学多样性对这些代谢物的全谱的定量测量提出了巨大的挑战。由于缺乏定量代谢组学平台以实现大规模生物样品分析，代谢组学的临床实用性和应用尚未实现。
定量代谢组学专注于识别和定量生物样品中尽可能多的代谢物。与传统的靶向和非靶向方法相比，定量代谢组学有许多优点，包括最小的跨平台变异性，改善的稳健性，维持全谱代谢特征以及关于特定代谢物身份和浓度的更详细信息。
关于代谢物浓度的定量，可靠的分析数据是开发基于代谢的临床试验或在转化研究中对生物体和生物系统的功能进行透彻理解的先决条件。
技术挑战之一是代谢物的浓度范围跨越十几个数量级，例如血液中的葡萄糖在毫摩尔范围内，以及在飞摩尔范围内的一些类二十烷酸等化合物中存在。化合物的大小和极性差异也存在不同平台的挑战。为了克服这些挑战，已应用气相色谱-质谱(GC-MS)和液相色谱-质谱(LC-MS)来最大化覆盖率。但仍未解决同时对多个指标进行定量检测的难题。
只有少数主要代谢途径，如糖酵解、有氧呼吸、三羧酸(TCA)循环、脂肪酸氧化(β-氧化)及糖异生等，细胞用于转移能量和维持代谢稳态，储存和处置主要类别的分子(如氨基酸，碳水化合物和脂类)的这些关键途径中的缺陷将导致代谢紊乱。因此，这些代谢物的定量测定应该能够反映生物系统中代谢的独特特征。
氨基酸、酚类、苯基或苄基衍生物、吲哚、有机酸、脂肪酸、糖和胆汁酸是参与人体生理代谢的重要物质，这类物质在人体内正常代谢保持一定的水平。这类物质的浓度改变往往提示人体代谢途径发生异常。通过检测这些物质的浓度，结合临床表现，帮助临床疾病的判断。
针对现有技术之不足，在本发明中，我们目的在于提供一种能够同时定量检测生物样本中多种成分的代谢芯片及检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够同时定量检测生物样本中多种代谢成分的定量检测方法及应用于此方法的代谢芯片。所述多种代谢成分包括但不限于多种氨基酸、酚类、苯基或苄基衍生物、吲哚、有机酸、脂肪酸、糖及胆汁酸。
本发明生物样本中多种代谢成分定量检测方法通过如下方案实现：对生物样品进行衍生化处理后采用液相色谱-质谱联用检测衍生化后的生物样品；在衍生化处理中，采用3-硝基苯肼作为衍生化试剂，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺作为衍生化反应催化剂；所述生物样本选自哺乳动物的尿液、血液、脑脊液、组织、细胞、唾液和粪便样本；所述生物样本中的多种代谢成分选自生物样品中的氨基酸、酚类、苯基或苄基衍生物、吲哚、有机酸、脂肪酸、糖及胆汁酸中之一种或多种，这些代谢成分在生物样本中的含量是跨数量级的。
本发明检测方法具体包括以下步骤：
a)收集生物样本；
b)将生物样本以甲醇、氯仿和水的混合溶剂萃取，离心后取上清液，即为生物样本提取物；
c)将b)中得到的生物样本提取物中加入相同体积的3-硝基苯肼甲醇溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺吡啶溶液，漩涡混匀，加热进行衍生化；所用的3-硝基苯肼浓度为100-320毫摩尔/升(本专利申请中亦以“mM”表示“毫摩尔/升”)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为50-200毫摩尔/升；反应温度为20-60℃，反应时长10-120分钟；
d)在上述c)中得到的衍生后生物样本提取物中加入经碳13标记的3-硝基苯肼和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺反应得到的同位素内标液；
e)将d)中样品加入甲醇水混合溶液稀释，以液相色谱-质谱联用进行氨基酸、酚类、苯基或苄基衍生物、吲哚、有机酸、脂肪酸、糖及胆汁酸的测定。
优选地，上述步骤c)中，所用的3-硝基苯肼浓度为150-220mM，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为80-120mM；反应温度为20-40℃，反应时长30-60分钟。
优选地，上述步骤e)中甲醇水的体积比为1:1。
生物样本为尿液、血液、唾液或脑脊液时，步骤b)生物样本的处理方式优选为：取适量生物样本，用冷甲醇：氯仿：水混合溶剂(体积比3：1：1)萃取，摇动数秒钟，将样品在10000-20000转/分钟的转速和低温下离心5-15分钟，将上清液转移到自动进样器玻璃小瓶中用于随后的衍生化测定。
生物样本为粪便样本时，步骤b)生物样本的处理方式优选为：将粪便样品进行冻干处理；将适量冻干的粪便样品用适量冷甲醇：氯仿：水混合溶剂(体积比3：1：1)匀浆，样品在10000-20000转/分钟的转速和低温下离心15-30分钟，将上清液转移到自动进样器玻璃小瓶用于随后的衍生化处理。
生物样本为组织或细胞样本时，步骤b)生物样本的处理方式优选为：在样本中加入适量冷甲醇：氯仿：水混合溶剂(体积比3：1：1)匀浆处理，样品在10000-20000转/分钟的转速和4℃下离心15-30分钟，将上清液转移到自动进样器玻璃小瓶用于随后的衍生化处理。
本发明提供的检测方法采用3-硝基苯肼在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺存在的环境下与样品中的氨基酸、酚类、苯基或苄基衍生物、吲哚、有机酸、脂肪酸、糖以及胆汁酸进行衍生化反应，生成相应的衍生物，提高检测的灵敏度，降低检测难度，能够对生物样本中多个不同量级的物质进行定量检测，克服了现有技术的缺陷，达到了高通量定量检测的效果。此外，本发明采用了普通标记以及碳13标记的衍生试剂与标准品以及样本溶液进行反应，所以色谱行为、质谱的离子化效率和基质效应均能完全一致，避免了系统误差。
发明提供了生物样品中多种跨量级代谢成分的定量检测方法。如一般技术人员所能理解的，本发明可通过制备标准曲线计算样品中指标成分的含量。申请人在此基础上进一步提供用于该检测方法的的代谢芯片，所述代谢芯片包括
本发明进一步提供用于上述检测方法的代谢芯片。本发明所述代谢芯片指结合本发明检测方法高效率定量检测多个代谢成分的装置，包括芯片载体、过滤装置、标准品和质控品的干燥固体粉末。其中所述芯片载体为微量滴定板，微量滴定板可以是市售的适用于液相色谱测定的48孔板、96孔板和384孔板微量滴定板。在微量滴定板的每个孔设置一个独立的过滤装置，所述过滤装置为孔径为0.20-0.45微米(μm)的聚偏二氟乙烯、乙酸纤维素或尼龙为材料的过滤膜。过滤装置将微量滴定板的每个孔分隔为上下两部分。
标准品和质控品的干燥粉末系由其溶液脱水或冷冻干燥得到的粉末，这些固体粉末置于微量滴定板的每个孔中的过滤装置之上。按照本领域一般技术人员可理解的，标准品粉末制备时，先按照制备标准曲线所需的标准品浓度梯度配制不同的标准品溶液，然后经脱水或冷冻干燥得到粉末，放置于代谢芯片的相应孔中的过滤装置之上。以及按照本领域一般技术人员所理解的，质控品配制成相应溶液，经脱水或冷冻干燥得到粉末，放置于代谢芯片的每个孔中的过滤装置之上。
所述的标准品选自氨基酸，酚类、苯基或苄基衍生物、吲哚、有机酸，脂肪酸，糖类与胆汁酸标准品之一种或多种；所述的质控品选自与上述标准品对应的氨基酸，酚类、苯基或苄基衍生物、吲哚、有机酸，脂肪酸，糖类与胆汁酸标准品之一种或多种。
具体地，标准品和质控品可以选自如下所述的成分：1，6-二磷酸果糖，10Z-十九碳烯酸，11-反式十八碳烯酸，11-顺式十八碳烯酸，12-去氢胆酸，12-羟基硬脂酸，12-酮石胆酸，1-甲基组氨酸，2，2-二甲基琥珀酸，2，3-二氨基丙酸，24-葡萄糖苷鹅脱氧胆酸，2-丁烯酸，2-氧代己二酸，2-甲基-4-戊烯酸，2-甲基-β-丙氨酸，2-甲基丁酸，2-甲基己酸，2-甲基戊二酸，2-甲基谷氨酸，2-糠酸，2-羟基-2-甲基丁酸，2-羟基-3-甲基丁酸，2-羟基丁酸，2-羟基己酸，2-羟基肉桂酸，2-羟基苯乙酸，2-羟基马尿酸，2-苯基丙酸，2-苯甘氨酸，3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸，3-(4-羟基苯基)乳酸，3,4-二羟基杏仁酸，3,4-二羟苯基丙酸，3，4-脱氢-DL-脯氨酸，3,5-二碘-L-甲状腺素，3β-胆酸，3-吡啶乙酸，3-吲哚丙烯酸，3-吲哚丙酸，3-吲哚乙酰胺，3-氧基丙氨酸，3-氨基水杨酸，3-氯-L-酪氨酸，3-甲基-2-氧代丁酸，3-甲基-2-氧基戊酸，3-甲基吲哚，3-甲基己二酸，3-甲基谷氨酸，3-硝基酪氨酸，3-硫酸牛磺石胆酸，3-硫酸石胆酸，3-羟基-2-氨基苯甲酸，3-羟基丁酸，3-羟基丙酸，3-羟基异戊酸，3-羟基苯乙酸，3-羟基马尿酸，3-脱氢胆酸，3-苯基丁酸，4-甲基-2-氧基戊酸，4-甲基己酸，4-甲氧基苯乙酸，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸，4-羟基肉桂酸，4-羟基苯甲酸，4-羟基马尿酸，4-羟苯乳酸，4-羟苯基丙酮酸，4-苯基丁酸，5-氨基酮戊酸，5-羟色氨酸，5-羟色胺，5-羟赖氨酸，6，7-二酮石胆酸，6-磷酸葡萄糖酸，6-酮石胆酸，7，12-二酮石胆酸，7-酮石胆酸，7-酮脱氧胆酸，9，11-共轭亚油酸，D-2-羟基戊二酸，D-半乳糖，D-木糖，D-木酮糖，D-果糖，D-核糖，D-核糖-5-磷酸，D-核酮糖，D-核酮糖-5-磷酸，D-甘露糖，D-葡萄糖，D-麦芽糖，L-2-氨基丁酸，L-3-苯基乳酸，L-丙氨酸，L-丝氨酸，L-乙酰肉碱，L-乳酸，L-别苏氨酸，L-半胱氨酸，L-同型丝氨酸，L-同型半胱氨酸，L-同型瓜氨酸，L-哌啶酸，L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-山梨糖，L-木质酸，L-正亮氨酸，L-犬尿氨酸，L-甲状腺原氨酸，L-精氨酸，L-组氨酸，L-缬氨酸，L-胱氨酸，L-胱硫醚，L-脯氨酸，L-色氨酸，L-苏氨酸，L-苯丙氨酸，L-苹果酸，L-蛋氨酸，L-谷氨酰胺，L-谷氨酸，L-赖氨酸，L-酪氨酸，L-阿拉伯糖，N-(3-苯基丙酰基)甘氨酸，N-乙酰-L丙氨酸，N-乙酰-L-天冬氨酸，N-乙酰-L-苯基丙氨酸，N-乙酰-L-蛋氨酸，N-乙酰-L-酪氨酸，N-乙酰丝氨酸，N-乙酰基-D-葡糖胺，N-乙酰基-L苯丙氨酸，N-乙酰甘露糖胺，N-乙酰神经氨酸，N-乙酰组氨酸，N-乙酰羟色胺，N-乙酰色氨酸，N-乙酰谷氨酰胺，N-乙酰赖氨酸，N-乙酰鸟氨酸，N-甲基烟酰胺，N-苯乙酰基-谷氨酰胺，N-苯乙酰苯丙氨酸，S-腺苷同型半胱氨酸，α-D-葡萄糖，α-乳糖，α-亚麻酸，α-羟基异丁酸，α-酮戊二酸，α-鼠胆酸，β-D-海藻糖，β-丙氨酸，β-熊胆酸，β-鼠胆酸，γ-L-谷氨酰-L-丙氨酸，γ-亚麻酸，γ-氨基丁酸，ω-鼠胆酸，丁酸，三甲胺氮氧化物，三磷酸腺苷，丙二酸，丙酸，乙酰乙酸，乙酰半胱氨酸，乙酰甘氨酸，乙酰鸟氨酸，乙酸，乙酸胍，乙醇酸，乳果糖，乳酰谷胱甘肽，二十一烷酸，二十一碳烯酸(顺-12)，二十七烷酸，二十三烷酸，二十三碳烯酸(顺-14)，二十二烷酸，二十二碳三烯酸，二十二碳二烯酸(顺-13,16)，二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸，二十二碳四烯酸，二十二碳烯酸(反-13)，二十二碳烯酸(顺-13)，二十五烷酸，二十八烷酸，二十六烷酸，二十四烷酸，二十烷酸，二十碳三烯酸，二十碳二烯酸，二十碳五烯酸，二十碳烯酸(反-11)，二十碳烯酸(顺-11)，二十碳烯酸(顺-5)，二十碳烯酸(顺-8)，二甲基甘氨酸，二磷酸腺苷，亚油酸，亮氨酸，别异亮氨酸，别石胆酸，别胆酸，十一烯酸，十七烷酸，十三酸，十九烷酸，十九碳二烯酸，十五烷酸，半乳糖酸，半乳糖醇，半胱氨酸甲酯，原儿茶酸，原胆酸，去氢石胆酸，去甲脱氧胆酸，反-9-十四烯酸，反乌头酸，反式-4-羟基脯氨酸，反式-9-十七烯酸，反式-9-十五烯酸，反式-9-十六烯酸，反式亚麻酸，反式肉桂酸，反油酸，同型半胱氨酸，吡咯-2-羧酸，吡啶甲酸，吲哚，吲哚-3-乙酸甲酯，吲哚-3-羧酸，吲哚乙酸，嘌呤，壬二酸，壬酸，多巴，多巴胺，密二糖，富马酸，对乙酰氨基酚，对氨基马尿酸，对甲酚硫酸盐，对称型二甲基精氨酸，对羟基扁桃酸，对羟基苯乙酸，尿黑酸，己二酸，庚二酸，异丁酸，异亮氨酸，异戊酸，柠檬酸，异熊脱氧胆酸，异猪脱氧胆酸，异石胆酸，异胆酸，异脱氧胆酸，戊二酸，戊烯二酸，戊酸，扁桃酸，月桂酸，果糖-6-磷酸，柠槺酸，柠檬酸，柠苹酸，核糖内脂，核糖酸，棉子糖，棕榈油酸，棕榈酸，正缬氨酸，正-羟基苯乙酸，氧化型谷胱甘肽，氨基己二酸，氨基己酸，水杨尿酸，油酸，海藻糖，烟酸，焦谷氨酸，熊胆酸，熊脱氧胆酸，牛磺-a-鼠胆酸，牛磺-b-鼠胆酸，牛磺-w-鼠胆酸，牛磺熊脱氧胆酸，牛磺猪胆酸，牛磺猪脱氧胆酸，牛磺石胆酸，牛磺胆酸，牛磺脱氢胆酸，牛磺鹅脱氧胆酸，猪胆酸，猪脱氧胆酸，琥珀酰丙酮，琥珀酸，瓜氨酸，甘氨去氢胆酸，甘氨石胆酸，甘氨脱氧胆酸，甘氨酸，甘氨鹅脱氧胆酸，甘油醛，甘油醛-3-磷酸，甘磷酸胆碱，甘胺熊脱氧胆酸，甘胺猪胆酸，甘胺猪脱氧胆酸，甘胺胆酸，甘胺脯氨酸，甘胺酰-L-亮氨酸，甘露糖-6-磷酸，甘露醇，甲基丙二酸，甲基琥珀酸，甲酸，癸酸，石胆酸，硒代蛋氨酸，硫胺，硫酸甘氨石胆酸，硬脂酸，碘噻罗宁，磷酸二羟丙酮，磷酸核糖焦磷酸，磷酸肌酸，羟基丙酮酸，羟基苯乙酸甘氨酸，肉桂酸，肌氨酸，肌肽，肌酸，肌醇，肾上腺素，胆碱，胆酸，脱氢胆酸，脱甲胆酸，腺苷一磷酸，花生四烯酸，苯丙酮酸，苯乙胺，苯基丙酸，苯基乳酸，苯甲酰胺，苯甲酸，草酸，莽草酸，葡糖二酸，葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖内脂，葵二酸，蓖麻油酸，蔗糖，蛋氨酸亚砜，衣康酸，褪黑素，谷胱甘肽，豆蔻酸，赤糖酸，赤藓糖，辛二酸，辛酸，邻苯二甲酸，酒石酸，酪胺，金鸡纳酸，间氨基苯甲酸，非对称型二甲基精氨酸，鞣酸，顺-10，12-十八碳二烯酸，顺-12，15-二十一碳二烯酸，顺-12-十三烯酸，顺-15-二十四碳烯酸，顺-2-羟基肉桂酸，顺-9-十四烯酸，顺式-10-十七烯酸，顺式-11-十二碳烯酸，顺式-4-羟基脯氨酸，顺式-5-十二碳烯酸，顺式-7-十六烯酸，顺式-9-十七烯酸，顺式乌头酸，香草酸，马尿酸，马来酸，高香草酸，鸟氨酸，鸟苷一磷酸，鸟苷三磷酸，鹅肌肽，鹅脱氧胆酸，麦芽三糖，麦芽糖醇，鼠李糖，鼠脱氧胆酸。
本发明代谢芯片的使用方法，包括如下步骤：
1.收集生物样本；
2.根据样本类型，按照前述相应方法制备相应生物样本提取物；
3.将制得的生物样本提取物等量添加于代谢芯片的各个孔中，在各孔中加入相同体积的3-硝基苯肼甲醇溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺吡啶溶液，漩涡混匀，加热进行衍生化；所用的3-硝基苯肼浓度为100-320mM，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为50-200mM；反应温度为20-60℃，反应时长10-120分钟；
4.在上述3中得到的衍生后生物样本提取物中加入经碳13标记的3-硝基苯肼和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺反应得到的同位素内标液；
5.将4中代谢芯片中各孔加入甲醇水混合溶液稀释，将代谢芯片置于串联质谱仪器以液相色谱质谱联用进行氨基酸、酚类、苯基或苄基衍生物、吲哚、有机酸、脂肪酸、糖及胆汁酸的测定，根据结果计算得到样本中目标代谢产物的浓度。
如本领域一般技术人员所理解的，根据测试结果，结合标准曲线可以计算得到各目标检测物质的含量。也可将代谢芯片得到的检测结果使用深圳市绘云生物科技有限公司开发的代谢物批量定量软件进行计算，快速得到各目标成分的含量。计算软件与本发明代谢芯片相结合，更大地提高工作效率。
附图说明
附图为实施例血液样本中检测到的典型氨基酸、有机酸、脂肪酸、糖以及胆汁酸的色谱图。由此可见多种目标检测成分能够被有效分离并检测到，从而实现高通量定量检测。
图1为典型短链脂肪酸的色谱图
图2为典型氨基酸的色谱图
图3为典型有机酸色谱图
图4为典型糖色谱图
图5为典型胆汁酸色谱图
具体实施方式
代谢芯片测定10个人体血液和粪便样本中多个指标成分
1、仪器
液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)，配备电喷雾离子源(ESI)。
2、样本的制备
血清样本：采集静脉全血样本，置于抗凝管中，采血后立即颠倒混匀5～6次，于30min以内离心分离血浆置于离心管中，在离心管中用冷甲醇：氯仿：水混合溶剂(体积比3：1：1)萃取，摇动数秒钟，将样品在10000-20000转速和4℃下离心5-15分钟获得上清液，将上清液转移到自动进样器玻璃小瓶中；将所有含水血清或尿液样本提取物用于随后的衍生化处理。
粪便样本：将粪便样品进行冻干处理；将适量冻干的粪便样品用适量冷甲醇：氯仿：水混合溶剂(体积比3：1：1)匀浆，样品在10000-20000转速和4℃下离心15-30分钟获得上清液，将上清液转移到自动进样器玻璃小瓶用于随后的衍生化处理。
3、试剂配制
标准品溶液的配制：取前述说明书中所述代谢物的标准品包括氨基酸、酚类、苯基或苄基衍生物、吲哚、有机酸、脂肪酸、糖及胆汁酸，用甲醇充分溶解，混匀，配制成1毫克/毫升溶液，即为浓缩储备液，配制成系列浓度用以制备标准曲线。
质控品溶液的配制：取相应的质控品，用甲醇充分溶解，混匀，配制成1毫克/毫升溶液，即为浓缩储备液，稀释成一定浓度，经与碳13标记的3-硝基苯肼和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺反应得到。
衍生化试剂的配制(3-硝基苯肼)的配制：衍生化试剂用75％甲醇水溶液配制成200mM的溶液，混匀，密封4℃保存待用。
衍生用反应催化剂(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)的配制：反应催化剂用吡啶配制成120毫摩尔的溶液，混匀，密封4℃保存待用。
4检验方法
取5μL处理好的生物样本，加入衍生化试剂20微升，衍生化催化剂20微升，在30℃下反应60分钟，反应液加入甲醇水混合溶液稀释，13200转/分的转速下离心15分钟，取上清液，进样5μL进行LC-MS/MS分析。
质谱条件：
离子源：串联质谱检测多种物质的多反应监测条件见表1。电喷雾离子源采用负离子扫描模式(ESI-)，具体条件如下：毛细管电压1.2kV,锥孔电压55V,萃取锥孔电压4V,离子源温度150℃,脱溶剂气温度550℃,反向锥孔气流50L/h,脱溶剂气650L/h,低质量区分辨率4.7,高质量区分辨率15,多反应检测模式采集数据。
梯度洗脱条件：采用UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm)；柱温40℃；流动相A：水(0.1％甲酸)，B：乙腈(0.1％甲酸，)：异丙醇，乙腈和异丙醇的比例为1-2：1；流速为0.4mL/min；进样量为5微升；梯度洗脱条件：0-1min(5％B),1-5min(5-30％B),5-9min(30-50％B),9-12min(50-75％B),12-15min(75-95％B),15-16min(95-100％B),16-8min(100％B)，18-20min(5％B)。
5.测定结果
采用本发明检测方法，测定了10个人体血液和粪便样本中物质的浓度(分别见表1和表2)。可见本发明方法通过测定单个样品，可以一次性的定量跨量级的多种不同性质的物质。
表1正常人血液中物质浓度测定结果
Figure BDA0001835364580000081
Figure BDA0001835364580000091
Figure BDA0001835364580000101
Figure BDA0001835364580000111
表2正常人粪便中物质浓度测定结果
Figure BDA0001835364580000121
Figure BDA0001835364580000131
Figure BDA0001835364580000141
Figure BDA0001835364580000151
Figure BDA0001835364580000161

Claims (11)

1.生物样本中多种代谢成分定量检测方法，其特征在于，对生物样品进行衍生化处理后采用液相色谱-质谱联用检测衍生化后的生物样品；在衍生化处理中，采用3-硝基苯肼作为衍生化试剂，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺作为衍生化反应催化剂；所述生物样本选自哺乳动物的尿液、血液、脑脊液、组织、细胞、唾液和粪便样本；所述生物样本中的多种代谢成分包括生物样品中的氨基酸、酚类、苯基或苄基衍生物、吲哚、有机酸、糖，所述有机酸包括脂肪酸和胆汁酸，这些代谢成分在生物样本中的含量是跨数量级的；
所述液相色谱采用UPLC BEH C18色谱柱；流动相包括：A：含0.1%甲酸的水，B：含0.1%甲酸的乙腈：异丙醇，其中乙腈和异丙醇的比例为1-2：1；梯度洗脱条件为：
0-1分钟，5% B；
1-5 分钟，5-30% B；
5-9 分钟，30-50% B；
9-12 分钟，50-75% B；
12-15 分钟，75-95% B；
15-16 分钟，95-100% B；
16-18 分钟，100% B；
18-20 分钟，5% B。
2.如权利要求1所述的检测方法，包括以下步骤：
a) 收集生物样本；
b) 将生物样本以甲醇、氯仿和水的混合溶剂萃取，离心后取上清液，即为生物样本提取物；
c) 将b)中得到的生物样本提取物中加入相同体积的3-硝基苯肼甲醇溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺吡啶溶液，漩涡混匀，加热进行衍生化；所用的3-硝基苯肼浓度为100-320毫摩尔/升，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为50-200毫摩尔/升；反应温度为20-60℃，反应时长10-120分钟；
d) 在上述c)中得到的衍生后生物样本提取物中加入经碳13标记的3-硝基苯肼和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺反应得到的同位素内标液；
e) 将d)中样品加入甲醇水混合溶液稀释，以液相色谱-质谱联用进行氨基酸、酚类、苯基或苄基衍生物、吲哚、有机酸和糖的测定，所述有机酸包括脂肪酸和胆汁酸。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤c)中，所用的3-硝基苯肼浓度为150-220 毫摩尔/升，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为80-120 毫摩尔/升；反应温度为20-40℃，反应时长30-60分钟。
4.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，生物样本为尿液、血液、唾液或脑脊液时，步骤b)生物样本的处理方式为：取适量生物样本，用冷甲醇：氯仿：水混合溶剂萃取，所述冷甲醇：氯仿：水混合溶剂的体积比3：1：1；摇动数秒钟， 将样品在10000-20000转/分钟的转速和低温下离心5-15分钟，将上清液转移到自动进样器玻璃小瓶中用于随后的衍生化处理。
5.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，生物样本为粪便样本时，步骤b)生物样本的处理方式为：将粪便样品进行冻干处理；将适量冻干的粪便样品用适量冷甲醇：氯仿：水混合溶剂匀浆，所述冷甲醇：氯仿：水混合溶剂的体积比3：1：1；样品在10000-20000转/分钟的转速和低温下离心15-30分钟，将上清液转移到自动进样器玻璃小瓶用于随后的衍生化处理。
6.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，生物样本为组织或细胞样本时，步骤b)生物样本的处理方式为：在样本中加入适量冷甲醇：氯仿：水混合溶剂匀浆处理，所述冷甲醇：氯仿：水混合溶剂的体积比3：1：1；样品在10000-20000转/分钟的转速和4℃下离心15-30分钟，将上清液转移到自动进样器玻璃小瓶用于随后的衍生化处理。
7.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤e)中甲醇水的体积比为1：1。
8.如权利要求1至7任一所述的检测方法，所述生物样品的多种代谢成分可以选自如下所述的多种代谢物：1，6-二磷酸果糖， 10Z-十九碳烯酸，11-反式十八碳烯酸， 11-顺式十八碳烯酸， 12-去氢胆酸，12-羟基硬脂酸， 12-酮石胆酸， 1-甲基组氨酸， 2，2-二甲基琥珀酸，2，3-二氨基丙酸，24-葡萄糖苷鹅脱氧胆酸，2-丁烯酸， 2-氧代己二酸， 2-甲基-4-戊烯酸，2-甲基-β-丙氨酸， 2-甲基丁酸， 2-甲基己酸， 2-甲基戊二酸， 2-甲基谷氨酸，2-糠酸， 2-羟基-2-甲基丁酸， 2-羟基-3-甲基丁酸， 2-羟基丁酸， 2-羟基己酸， 2-羟基肉桂酸，2-羟基苯乙酸， 2-羟基马尿酸， 2-苯基丙酸， 2-苯甘氨酸， 3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸， 3-(4-羟基苯基)乳酸，3,4-二羟基杏仁酸， 3,4-二羟苯基丙酸，3，4-脱氢-DL-脯氨酸， 3,5-二碘-L-甲状腺素，3β-胆酸， 3-吡啶乙酸， 3-吲哚丙烯酸， 3-吲哚丙酸， 3-吲哚乙酰胺， 3-氧基丙氨酸， 3-氨基水杨酸，3-氯-L-酪氨酸， 3-甲基-2-氧代丁酸， 3-甲基-2-氧基戊酸， 3-甲基吲哚， 3-甲基己二酸， 3-甲基谷氨酸， 3-硝基酪氨酸， 3-硫酸牛磺石胆酸， 3-硫酸石胆酸，3-羟基-2-氨基苯甲酸，3-羟基丁酸， 3-羟基丙酸， 3-羟基异戊酸，3-羟基苯乙酸，3-羟基马尿酸，3-脱氢胆酸， 3-苯基丁酸， 4-甲基-2-氧基戊酸， 4-甲基己酸， 4-甲氧基苯乙酸， 4-羟基-3-甲氧基扁桃酸， 4-羟基肉桂酸， 4-羟基苯甲酸， 4-羟基马尿酸， 4-羟苯乳酸， 4-羟苯基丙酮酸， 4-苯基丁酸， 5-氨基酮戊酸， 5-羟色氨酸，5-羟色胺， 5-羟赖氨酸， 6，7-二酮石胆酸， 6-磷酸葡萄糖酸， 6-酮石胆酸， 7，12-二酮石胆酸，7-酮石胆酸， 7-酮脱氧胆酸， 9，11-共轭亚油酸， D-2-羟基戊二酸， D-半乳糖， D-木糖， D-木酮糖， D-果糖， D-核糖，D-核糖-5-磷酸， D-核酮糖， D-核酮糖-5-磷酸， D-甘露糖， D-葡萄糖， D-麦芽糖， L-2-氨基丁酸，L-3-苯基乳酸， L-丙氨酸， L-丝氨酸， L-乙酰肉碱， L-乳酸， L-别苏氨酸， L-半胱氨酸，L-同型丝氨酸， L-同型半胱氨酸， L-同型瓜氨酸， L-哌啶酸， L-天冬氨酸， L-天冬酰胺， L-山梨糖， L-木质酸，L-正亮氨酸，L-犬尿氨酸，L-甲状腺原氨酸， L-精氨酸，L-组氨酸， L-缬氨酸， L-胱氨酸，L-胱硫醚，L-脯氨酸，L-色氨酸， L-苏氨酸， L-苯丙氨酸， L-苹果酸， L-蛋氨酸， L-谷氨酰胺， L-谷氨酸， L-赖氨酸， L-酪氨酸， L-阿拉伯糖， N-(3-苯基丙酰基)甘氨酸， N-乙酰-L丙氨酸， N-乙酰-L-天冬氨酸， N-乙酰-L-苯基丙氨酸， N-乙酰-L-蛋氨酸， N-乙酰-L-酪氨酸， N-乙酰丝氨酸， N-乙酰基-D-葡糖胺， N-乙酰基-L苯丙氨酸， N-乙酰甘露糖胺， N-乙酰神经氨酸， N-乙酰组氨酸， N-乙酰羟色胺， N-乙酰色氨酸， N-乙酰谷氨酰胺， N-乙酰赖氨酸， N-乙酰鸟氨酸， N-甲基烟酰胺， N-苯乙酰基-谷氨酰胺， N-苯乙酰苯丙氨酸， S-腺苷同型半胱氨酸， α-D-葡萄糖， α-乳糖， α-亚麻酸， α-羟基异丁酸， α-酮戊二酸， α-鼠胆酸， β-D-海藻糖， β-丙氨酸， β-熊胆酸， β-鼠胆酸， γ-L-谷氨酰-L-丙氨酸， γ-亚麻酸， γ-氨基丁酸， ω-鼠胆酸， 丁酸， 三甲胺氮氧化物， 三磷酸腺苷， 丙二酸， 丙酸， 乙酰乙酸， 乙酰半胱氨酸， 乙酰甘氨酸， 乙酰鸟氨酸， 乙酸， 乙酸胍， 乙醇酸， 乳果糖， 乳酰谷胱甘肽， 二十一烷酸， 二十一碳烯酸（顺-12）， 二十七烷酸， 二十三烷酸， 二十三碳烯酸（顺-14）， 二十二烷酸， 二十二碳三烯酸， 二十二碳二烯酸（顺-13,16）， 二十二碳五烯酸， 二十二碳六烯酸， 二十二碳四烯酸， 二十二碳烯酸（反-13）， 二十二碳烯酸（顺-13）， 二十五烷酸， 二十八烷酸， 二十六烷酸， 二十四烷酸， 二十烷酸， 二十碳三烯酸， 二十碳二烯酸， 二十碳五烯酸， 二十碳烯酸（反-11）， 二十碳烯酸（顺-11）， 二十碳烯酸（顺-5），二十碳烯酸（顺-8）， 二甲基甘氨酸， 二磷酸腺苷， 亚油酸， 亮氨酸， 别异亮氨酸， 别石胆酸， 别胆酸， 十一烯酸， 十七烷酸， 十三酸， 十九烷酸， 十九碳二烯酸， 十五烷酸，半乳糖酸， 半乳糖醇， 半胱氨酸甲酯， 原儿茶酸， 原胆酸， 去氢石胆酸， 去甲脱氧胆酸，反-9-十四烯酸， 反乌头酸， 反式-4-羟基脯氨酸， 反式-9-十七烯酸， 反式-9-十五烯酸，反式-9-十六烯酸， 反式亚麻酸， 反式肉桂酸， 反油酸， 同型半胱氨酸， 吡咯-2-羧酸，吡啶甲酸， 吲哚， 吲哚-3-乙酸甲酯， 吲哚-3-羧酸， 吲哚乙酸， 嘌呤， 壬二酸， 壬酸，多巴， 多巴胺， 密二糖， 富马酸， 对乙酰氨基酚， 对氨基马尿酸， 对甲酚硫酸盐， 对称型二甲基精氨酸， 对羟基扁桃酸， 对羟基苯乙酸， 尿黑酸， 己二酸， 庚二酸， 异丁酸，异亮氨酸， 异戊酸， 柠檬酸， 异熊脱氧胆酸， 异猪脱氧胆酸， 异石胆酸， 异胆酸， 异脱氧胆酸， 戊二酸， 戊烯二酸， 戊酸， 扁桃酸， 月桂酸， 果糖-6-磷酸， 柠槺酸， 柠檬酸，柠苹酸， 核糖内脂， 核糖酸， 棉子糖， 棕榈油酸， 棕榈酸， 正缬氨酸， 正-羟基苯乙酸，氧化型谷胱甘肽， 氨基己二酸， 氨基己酸， 水杨尿酸， 油酸， 海藻糖， 烟酸， 焦谷氨酸，熊胆酸， 熊脱氧胆酸， 牛磺-a-鼠胆酸， 牛磺-b-鼠胆酸， 牛磺-w-鼠胆酸， 牛磺熊脱氧胆酸， 牛磺猪胆酸， 牛磺猪脱氧胆酸， 牛磺石胆酸， 牛磺胆酸， 牛磺脱氢胆酸， 牛磺鹅脱氧胆酸， 猪胆酸， 猪脱氧胆酸， 琥珀酰丙酮， 琥珀酸， 瓜氨酸， 甘氨去氢胆酸， 甘氨石胆酸， 甘氨脱氧胆酸， 甘氨酸， 甘氨鹅脱氧胆酸， 甘油醛， 甘油醛-3-磷酸， 甘磷酸胆碱， 甘胺熊脱氧胆酸， 甘胺猪胆酸， 甘胺猪脱氧胆酸， 甘胺胆酸， 甘胺脯氨酸， 甘胺酰-L-亮氨酸， 甘露糖-6-磷酸， 甘露醇， 甲基丙二酸， 甲基琥珀酸， 甲酸， 癸酸， 石胆酸，硒代蛋氨酸， 硫胺， 硫酸甘氨石胆酸， 硬脂酸， 碘噻罗宁， 磷酸二羟丙酮， 磷酸核糖焦磷酸， 磷酸肌酸， 羟基丙酮酸， 羟基苯乙酸甘氨酸， 肉桂酸， 肌氨酸， 肌肽， 肌酸， 肌醇， 肾上腺素， 胆碱， 胆酸， 脱氢胆酸， 脱甲胆酸， 腺苷一磷酸， 花生四烯酸， 苯丙酮酸， 苯乙胺， 苯基丙酸， 苯基乳酸， 苯甲酰胺， 苯甲酸， 草酸， 莽草酸， 葡糖二酸， 葡萄糖-6-磷酸， 葡萄糖内脂， 葵二酸， 蓖麻油酸， 蔗糖， 蛋氨酸亚砜， 衣康酸， 褪黑素，谷胱甘肽， 豆蔻酸， 赤糖酸， 赤藓糖， 辛二酸， 辛酸， 邻苯二甲酸， 酒石酸， 酪胺， 金鸡纳酸， 间氨基苯甲酸， 非对称型二甲基精氨酸， 鞣酸， 顺-10，12-十八碳二烯酸， 顺-12，15-二十一碳二烯酸， 顺-12-十三烯酸， 顺-15-二十四碳烯酸， 顺-2-羟基肉桂酸，顺-9-十四烯酸， 顺式-10-十七烯酸， 顺式-11-十二碳烯酸， 顺式-4-羟基脯氨酸， 顺式-5-十二碳烯酸， 顺式-7-十六烯酸， 顺式-9-十七烯酸， 顺式乌头酸， 香草酸， 马尿酸，马来酸， 高香草酸， 鸟氨酸， 鸟苷一磷酸， 鸟苷三磷酸， 鹅肌肽， 鹅脱氧胆酸， 麦芽三糖， 麦芽糖醇，鼠李糖， 鼠脱氧胆酸。
9.一种用于权利要求1至8任一所述检测方法的代谢芯片的使用方法，其特征在于，所述代谢芯片包括芯片载体、过滤装置、标准品和质控品的干燥固体粉末，其中所述芯片载体为微量滴定板，微量滴定板每个孔设置一个独立的过滤装置，标准品和质控品溶液脱水或冷冻干燥得到粉末置于微量滴定板的每个孔中的过滤装置之上；所述的标准品包含氨基酸，酚类、苯基或苄基衍生物、吲哚、有机酸和糖类标准品；所述的质控品选自与上述标准品对应的氨基酸，酚类、苯基或苄基衍生物、吲哚、有机酸和糖类；上述有机酸均包括脂肪酸和胆汁酸；
所述使用方法包括下列步骤：
a)收集生物样本；
b)根据样本类型，按照权利要求4或5或6所述相应方法制备相应生物样本提取物；
c)将制得的生物样本提取物等量添加于代谢芯片的各个孔中，在各孔中加入相同体积的3-硝基苯肼甲醇溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺吡啶溶液，漩涡混匀，加热进行衍生化；所用的3-硝基苯肼浓度为100-320毫摩尔/升，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为50-200毫摩尔/升；反应温度为20-60℃，反应时长10-120分钟；
d)在上述c)中得到的衍生后生物样本提取物中加入经碳13标记的3-硝基苯肼和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺反应得到的同位素内标液；
e)将d)中代谢芯片中各孔加入甲醇水混合溶液稀释，将代谢芯片置于串联质谱仪器以液相色谱质谱联用进行氨基酸、酚类、苯基或苄基衍生物、吲哚、有机酸、糖的测定，所述有机酸包括脂肪酸和胆汁酸；根据结果计算得到样本中目标代谢产物的浓度；
所述液相色谱采用UPLC BEH C18色谱柱；流动相包括：A：含0.1%甲酸的水，B：含0.1%甲酸的乙腈：异丙醇，其中乙腈和异丙醇的比例为1-2：1；梯度洗脱条件为：
0-1分钟，5% B；
1-5 分钟，5-30% B；
5-9 分钟，30-50% B；
9-12 分钟，50-75% B；
12-15 分钟，75-95% B；
15-16 分钟，95-100% B；
16-18 分钟，100% B；
18-20 分钟，5% B。
10.如权利要求9所述的代谢芯片的使用方法，其特征在于，所述微量滴定板选自48孔板、96孔板和384孔板，所述过滤装置为孔径为0.20-0.45微米的聚偏二氟乙烯、乙酸纤维素或尼龙为材料的过滤膜。
11.如权利要求9所述的代谢芯片的使用方法，其特征在于，标准品和质控品可以选自如下所述的多种代谢物：1，6-二磷酸果糖， 10Z-十九碳烯酸，11-反式十八碳烯酸， 11-顺式十八碳烯酸， 12-去氢胆酸，12-羟基硬脂酸， 12-酮石胆酸， 1-甲基组氨酸， 2，2-二甲基琥珀酸，2，3-二氨基丙酸，24-葡萄糖苷鹅脱氧胆酸，2-丁烯酸， 2-氧代己二酸， 2-甲基-4-戊烯酸，2-甲基-β-丙氨酸， 2-甲基丁酸， 2-甲基己酸， 2-甲基戊二酸， 2-甲基谷氨酸，2-糠酸， 2-羟基-2-甲基丁酸， 2-羟基-3-甲基丁酸， 2-羟基丁酸， 2-羟基己酸， 2-羟基肉桂酸，2-羟基苯乙酸， 2-羟基马尿酸， 2-苯基丙酸， 2-苯甘氨酸， 3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸， 3-(4-羟基苯基)乳酸，3,4-二羟基杏仁酸， 3,4-二羟苯基丙酸，3，4-脱氢-DL-脯氨酸， 3,5-二碘-L-甲状腺素，3β-胆酸， 3-吡啶乙酸， 3-吲哚丙烯酸， 3-吲哚丙酸， 3-吲哚乙酰胺， 3-氧基丙氨酸， 3-氨基水杨酸，3-氯-L-酪氨酸， 3-甲基-2-氧代丁酸， 3-甲基-2-氧基戊酸， 3-甲基吲哚， 3-甲基己二酸， 3-甲基谷氨酸， 3-硝基酪氨酸， 3-硫酸牛磺石胆酸， 3-硫酸石胆酸，3-羟基-2-氨基苯甲酸，3-羟基丁酸， 3-羟基丙酸， 3-羟基异戊酸，3-羟基苯乙酸，3-羟基马尿酸，3-脱氢胆酸， 3-苯基丁酸， 4-甲基-2-氧基戊酸， 4-甲基己酸， 4-甲氧基苯乙酸， 4-羟基-3-甲氧基扁桃酸， 4-羟基肉桂酸， 4-羟基苯甲酸， 4-羟基马尿酸， 4-羟苯乳酸， 4-羟苯基丙酮酸， 4-苯基丁酸， 5-氨基酮戊酸， 5-羟色氨酸，5-羟色胺， 5-羟赖氨酸， 6，7-二酮石胆酸， 6-磷酸葡萄糖酸， 6-酮石胆酸， 7，12-二酮石胆酸，7-酮石胆酸， 7-酮脱氧胆酸， 9，11-共轭亚油酸， D-2-羟基戊二酸， D-半乳糖， D-木糖， D-木酮糖， D-果糖， D-核糖，D-核糖-5-磷酸， D-核酮糖， D-核酮糖-5-磷酸， D-甘露糖， D-葡萄糖， D-麦芽糖， L-2-氨基丁酸，L-3-苯基乳酸， L-丙氨酸， L-丝氨酸， L-乙酰肉碱， L-乳酸， L-别苏氨酸， L-半胱氨酸，L-同型丝氨酸， L-同型半胱氨酸， L-同型瓜氨酸， L-哌啶酸， L-天冬氨酸， L-天冬酰胺， L-山梨糖， L-木质酸，L-正亮氨酸，L-犬尿氨酸，L-甲状腺原氨酸， L-精氨酸，L-组氨酸， L-缬氨酸， L-胱氨酸，L-胱硫醚，L-脯氨酸，L-色氨酸， L-苏氨酸， L-苯丙氨酸， L-苹果酸， L-蛋氨酸， L-谷氨酰胺， L-谷氨酸， L-赖氨酸， L-酪氨酸， L-阿拉伯糖， N-(3-苯基丙酰基)甘氨酸， N-乙酰-L丙氨酸， N-乙酰-L-天冬氨酸， N-乙酰-L-苯基丙氨酸， N-乙酰-L-蛋氨酸， N-乙酰-L-酪氨酸， N-乙酰丝氨酸， N-乙酰基-D-葡糖胺， N-乙酰基-L苯丙氨酸， N-乙酰甘露糖胺， N-乙酰神经氨酸， N-乙酰组氨酸， N-乙酰羟色胺， N-乙酰色氨酸， N-乙酰谷氨酰胺， N-乙酰赖氨酸， N-乙酰鸟氨酸， N-甲基烟酰胺， N-苯乙酰基-谷氨酰胺， N-苯乙酰苯丙氨酸， S-腺苷同型半胱氨酸， α-D-葡萄糖， α-乳糖， α-亚麻酸， α-羟基异丁酸， α-酮戊二酸， α-鼠胆酸， β-D-海藻糖， β-丙氨酸， β-熊胆酸， β-鼠胆酸， γ-L-谷氨酰-L-丙氨酸， γ-亚麻酸， γ-氨基丁酸， ω-鼠胆酸， 丁酸， 三甲胺氮氧化物， 三磷酸腺苷， 丙二酸， 丙酸， 乙酰乙酸， 乙酰半胱氨酸， 乙酰甘氨酸， 乙酰鸟氨酸， 乙酸， 乙酸胍， 乙醇酸， 乳果糖， 乳酰谷胱甘肽， 二十一烷酸， 二十一碳烯酸（顺-12）， 二十七烷酸， 二十三烷酸， 二十三碳烯酸（顺-14）， 二十二烷酸， 二十二碳三烯酸， 二十二碳二烯酸（顺-13,16）， 二十二碳五烯酸， 二十二碳六烯酸， 二十二碳四烯酸， 二十二碳烯酸（反-13）， 二十二碳烯酸（顺-13）， 二十五烷酸， 二十八烷酸， 二十六烷酸， 二十四烷酸， 二十烷酸， 二十碳三烯酸， 二十碳二烯酸， 二十碳五烯酸， 二十碳烯酸（反-11）， 二十碳烯酸（顺-11）， 二十碳烯酸（顺-5），二十碳烯酸（顺-8）， 二甲基甘氨酸， 二磷酸腺苷， 亚油酸， 亮氨酸， 别异亮氨酸， 别石胆酸， 别胆酸， 十一烯酸， 十七烷酸， 十三酸， 十九烷酸， 十九碳二烯酸， 十五烷酸，半乳糖酸， 半乳糖醇， 半胱氨酸甲酯， 原儿茶酸， 原胆酸， 去氢石胆酸， 去甲脱氧胆酸，反-9-十四烯酸， 反乌头酸， 反式-4-羟基脯氨酸， 反式-9-十七烯酸， 反式-9-十五烯酸，反式-9-十六烯酸， 反式亚麻酸， 反式肉桂酸， 反油酸， 同型半胱氨酸， 吡咯-2-羧酸，吡啶甲酸， 吲哚， 吲哚-3-乙酸甲酯， 吲哚-3-羧酸， 吲哚乙酸， 嘌呤， 壬二酸， 壬酸，多巴， 多巴胺， 密二糖， 富马酸， 对乙酰氨基酚， 对氨基马尿酸， 对甲酚硫酸盐， 对称型二甲基精氨酸， 对羟基扁桃酸， 对羟基苯乙酸， 尿黑酸， 己二酸， 庚二酸， 异丁酸，异亮氨酸， 异戊酸， 柠檬酸， 异熊脱氧胆酸， 异猪脱氧胆酸， 异石胆酸， 异胆酸， 异脱氧胆酸， 戊二酸， 戊烯二酸， 戊酸， 扁桃酸， 月桂酸， 果糖-6-磷酸， 柠槺酸， 柠檬酸，柠苹酸， 核糖内脂， 核糖酸， 棉子糖， 棕榈油酸， 棕榈酸， 正缬氨酸， 正-羟基苯乙酸，氧化型谷胱甘肽， 氨基己二酸， 氨基己酸， 水杨尿酸， 油酸， 海藻糖， 烟酸， 焦谷氨酸，熊胆酸， 熊脱氧胆酸， 牛磺-a-鼠胆酸， 牛磺-b-鼠胆酸， 牛磺-w-鼠胆酸， 牛磺熊脱氧胆酸， 牛磺猪胆酸， 牛磺猪脱氧胆酸， 牛磺石胆酸， 牛磺胆酸， 牛磺脱氢胆酸， 牛磺鹅脱氧胆酸， 猪胆酸， 猪脱氧胆酸， 琥珀酰丙酮， 琥珀酸， 瓜氨酸， 甘氨去氢胆酸， 甘氨石胆酸， 甘氨脱氧胆酸， 甘氨酸， 甘氨鹅脱氧胆酸， 甘油醛， 甘油醛-3-磷酸， 甘磷酸胆碱， 甘胺熊脱氧胆酸， 甘胺猪胆酸， 甘胺猪脱氧胆酸， 甘胺胆酸， 甘胺脯氨酸， 甘胺酰-L-亮氨酸， 甘露糖-6-磷酸， 甘露醇， 甲基丙二酸， 甲基琥珀酸， 甲酸， 癸酸， 石胆酸，硒代蛋氨酸， 硫胺， 硫酸甘氨石胆酸， 硬脂酸， 碘噻罗宁， 磷酸二羟丙酮， 磷酸核糖焦磷酸， 磷酸肌酸， 羟基丙酮酸， 羟基苯乙酸甘氨酸， 肉桂酸， 肌氨酸， 肌肽， 肌酸， 肌醇， 肾上腺素， 胆碱， 胆酸， 脱氢胆酸， 脱甲胆酸， 腺苷一磷酸， 花生四烯酸， 苯丙酮酸， 苯乙胺， 苯基丙酸， 苯基乳酸， 苯甲酰胺， 苯甲酸， 草酸， 莽草酸， 葡糖二酸， 葡萄糖-6-磷酸， 葡萄糖内脂， 葵二酸， 蓖麻油酸， 蔗糖， 蛋氨酸亚砜， 衣康酸， 褪黑素，谷胱甘肽， 豆蔻酸， 赤糖酸， 赤藓糖， 辛二酸， 辛酸， 邻苯二甲酸， 酒石酸， 酪胺， 金鸡纳酸， 间氨基苯甲酸， 非对称型二甲基精氨酸， 鞣酸， 顺-10，12-十八碳二烯酸， 顺-12，15-二十一碳二烯酸， 顺-12-十三烯酸， 顺-15-二十四碳烯酸， 顺-2-羟基肉桂酸，顺-9-十四烯酸， 顺式-10-十七烯酸， 顺式-11-十二碳烯酸， 顺式-4-羟基脯氨酸， 顺式-5-十二碳烯酸， 顺式-7-十六烯酸， 顺式-9-十七烯酸， 顺式乌头酸， 香草酸， 马尿酸，马来酸， 高香草酸， 鸟氨酸， 鸟苷一磷酸， 鸟苷三磷酸， 鹅肌肽， 鹅脱氧胆酸， 麦芽三糖， 麦芽糖醇，鼠李糖， 鼠脱氧胆酸。
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