CN115420825B - 一种胆汁酸的检测方法及胆汁酸衍生物 - Google Patents

一种胆汁酸的检测方法及胆汁酸衍生物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种胆汁酸的检测方法及胆汁酸衍生物，该检测方法包括将待测样品与衍生试剂反应后通过液相色谱和质谱进行分离及检测；其中，所述待测样品包括一种或多种胆汁酸，且所述一种或多种胆汁酸中的至少部分胆汁酸包含羧基，所述衍生试剂包括2‑二甲氨基乙胺、3‑二甲氨基‑1‑丙胺及4‑二甲氨基‑1‑丁胺中的一种或多种。本发明一实施方式的胆汁酸的检测方法，具有较高的灵敏度和宽的覆盖度，能够同时对多种胆汁酸进行定量分析。

Description

一种胆汁酸的检测方法及胆汁酸衍生物
技术领域
本发明涉及胆汁酸的检测，尤其涉及一种基于液质联用技术的胆汁酸的检测方法。
背景技术
胆汁酸与肝胆系统疾病以及能引起胆汁酸代谢异常的其它疾病都有着密切的关系，一旦肝脏或胆囊等发生病变，如肝炎、肝硬化、胆石症、妊娠期胆汁淤积症(ICP)等，胆汁酸的“肠肝循环”就会受阻，体液中的胆汁酸水平升高。这些疾病的总胆汁酸(TBA)升高水平可能接近，但由于胆汁酸谱的成分不同，测定TBA水平对肝胆疾病的鉴别有局限性。
具体而言，根据结构的不同可将胆汁酸分为两大类，一类是游离型胆汁酸，包括羟基胆酸和酮基胆酸；另一类是结合型胆汁酸，其是游离型胆汁酸与甘氨酸、牛磺酸、硫酸、葡萄糖醛酸等的结合物。最新研究发现，生物体液中的胆汁酸结合物类型多样，既有单结合物，也有双结合物；并且不同体液样本中胆汁酸的亚型分布也存在显著差异，如人体血液样本中，甘氨结合型胆汁酸、二羟基胆汁酸最为丰富，人体尿液样本中胆汁酸的硫酸化程度最高，而人体粪便样本中酮基胆汁酸含量最高。因此，建立一种能同时覆盖不同生物基质类型的高灵敏度胆汁酸代谢谱方法，可更全面地阐释疾病影响下胆汁酸代谢谱的变化，对相关疾病的诊断、鉴别及发病机理的研究具有重要价值。
目前,生物基质中胆汁酸的分类检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱/质谱法(GC/MS)和液相色谱/质谱法(HPLC-MS/MS)法等。GC/MS法需对胆汁酸按类别进行水解和衍生，HPLC法也需进行荧光衍生，且牛磺结合型胆汁酸还需水解后再衍生。
而HPLC-MS/MS法灵敏、特异，可同时测定血尿中各亚型胆汁酸。在过去的十多年中，虽然液质联用方法(HPLC-MS/MS)已经较为广泛地用于分离和检测人体及动物样本中的胆汁酸代谢谱，但大部分方法对胆汁酸亚型的检测灵敏度和覆盖度较低。10分钟以内的色谱分析方法仅能覆盖到15种以内有限的胆汁酸，即使色谱分析时间超过30分钟的方法也仅能达到中等程度的覆盖度(检测50余种胆汁酸亚型)，并且缺少硫酸结合型、葡萄糖醛酸结合型等重要类型，不能同时满足多种生物基质类型样本的检测需求。
发明内容
为克服上述现有技术的至少一种缺陷，第一方面，本发明一实施方式提供了一种胆汁酸的检测方法，包括将待测样品与衍生试剂反应后通过液相色谱和质谱进行分离及检测；其中，所述待测样品包括一种或多种胆汁酸，且所述一种或多种胆汁酸中的至少部分胆汁酸包含羧基，所述衍生试剂包括2-二甲氨基乙胺、3-二甲氨基-1-丙胺及4-二甲氨基-1-丁胺中的一种或多种。
根据本发明一实施方式，所述待测样品中的包含羧基的所述胆汁酸与所述衍生试剂发生反应，所述反应的反应温度为15～35℃。
根据本发明一实施方式，将所述待测样品与包含衍生试剂的溶液混合后进行反应；所述反应的反应体系还包括催化剂和偶联剂。
根据本发明一实施方式，所述待测样品包括血清、尿液、粪便中的一种或多种；和/或，
所述催化剂包括O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯，所述偶联剂包括1-羟基苯并三唑；和/或，
在所述反应体系中，所述衍生试剂、所述催化剂和所述偶联剂的摩尔比为(60～600):(10～100):(10～100)。
根据本发明一实施方式，所述方法包括如下步骤：
提供包含一种或多种同位素胆汁酸的内标溶液；
提供包含一种或多种胆汁酸的具有浓度梯度的多种标准品溶液；
将所述内标溶液和所述多种标准品溶液混合后通过液相色谱和质谱进行分离及检测，根据检测结果及所述内标溶液、所述标准品溶液中胆汁酸的浓度得到各胆汁酸的定量校正方程；
提供包含衍生试剂的溶液；
将所述包含衍生试剂的溶液与所述待测样品混合并进行反应，制得检测样本；以及
将所述检测样本通过液相色谱和质谱进行分离及检测，结合检测结果及各胆汁酸的定量校正方程，得到各胆汁酸的检测结果；
其中，所述标准品溶液中的胆汁酸的种类与所述待测样品中的胆汁酸的种类相同，所述内标溶液中的胆汁酸的种类为所述待测样品中的至少部分胆汁酸的同位素标记物。
根据本发明一实施方式，在所述液相色谱中，采用反相C18色谱柱，柱温为30～45℃，流速为0.2～0.4mL/min，流动相A为甲酸铵和醋酸的混合水溶液，流动相B为乙腈溶液。
根据本发明一实施方式，所述多种胆汁酸包括能够与所述衍生试剂发生反应的含羧基的胆汁酸和不能与所述衍生试剂发生反应的其他胆汁酸；
在所述质谱检测中，采用电喷雾电离正离子检测模式对所述含羧基的胆汁酸进行扫描，采用电喷雾电离负离子检测模式对所述其他胆汁酸进行扫描。
根据本发明一实施方式，在所述质谱检测中，离子源温度为500～600℃，雾化气压为30～50psi，辅助气压为40～60psi，气帘气的压力为25～45psi，喷雾电压为4000～5000V或-4000～-5000V。
根据本发明一实施方式，所述一种或多种胆汁酸包括游离羟基化胆汁酸、游离酮基化胆汁酸、硫酸/葡萄糖醛酸结合型胆汁酸、甘氨结合型胆汁酸、甘氨硫酸双结合型胆汁酸、牛磺结合型胆汁酸中的一种或多种。
根据本发明一实施方式，所述游离羟基化胆汁酸包括：3β,5α,6β-羟基-胆烷酸、3α,7α,12β-羟基-5β-胆烷酸、3α,7β,12α-羟基-5β-胆烷酸、ω-鼠胆酸、α-鼠胆酸、β-鼠胆酸、3β-胆酸、3β,7β-羟基-5β-胆烷酸、3α,6β-羟基-5β-胆烷酸、3β,6α-羟基-5β-胆烷酸、猪胆酸、熊去氧胆酸、猪去氧胆酸、3β,7α-羟基-5β-胆烷酸、胆酸、3β,12β-羟基-5β-胆烷酸、3α,12β-羟基-5β-胆烷酸、3β,12α-羟基-5β-胆烷酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、3β-羟基-5α-胆烷酸、3β-羟基-5β-胆烷酸、7α,12α-羟基-5β-胆烷酸、石胆酸、12α-羟基-5β-胆烷酸；
所述游离酮基化胆汁酸包括：3α,7β-羟基-12-酮基-5β-胆烷酸、脱氢胆酸、3α-羟基-7,12-酮基-5β-胆烷酸、3α,6α-羟基-7-酮基-5β-胆烷酸、3α,12α-羟基-7-酮基-5β-胆烷酸、3α,7β-羟基-6-酮基-5α-胆烷酸、3α-羟基-6-酮基-5α-胆烷酸、3α-羟基-7-酮基-5β-胆烷酸、3α-羟基-6,7-酮基-5β-胆烷酸、3,7-酮基-5β-胆烷酸、3α-羟基-12-酮基-5β-胆烷酸；
所述硫酸/葡萄糖醛酸结合型胆汁酸包括：熊去氧胆酸-3-葡糖苷、胆酸-3-葡糖苷、熊去氧胆酸-3-硫酸、胆酸-3-硫酸、胆酸-7-硫酸、甘氨鹅脱氧胆酸-3-葡糖苷、甘氨去氧胆酸-3-葡糖苷、鹅去氧胆酸-3-葡糖苷、去氧胆酸-3-葡糖苷、鹅去氧胆酸-3-硫酸、去氧胆酸-3-硫酸、石胆酸-3-葡糖苷、石胆酸-3-硫酸；
所述甘氨结合型胆汁酸包括：甘氨脱氢胆酸、3β-甘氨胆酸、甘氨-β-鼠胆酸、甘氨猪胆酸、甘氨熊去氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸、甘氨胆酸、12-酮基-甘氨石胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、甘氨去氧胆酸、甘氨石胆酸；
所述甘氨硫酸双结合型胆汁酸包括：甘氨熊去氧胆酸-3-硫酸、甘氨胆酸-3-硫酸、甘氨鹅去氧胆酸-3-硫酸、甘氨去氧胆酸-3-硫酸、甘氨石胆酸-3-硫酸；
所述牛磺结合型胆汁酸包括：牛磺熊去氧胆酸-3-硫酸、牛磺胆酸-3-葡糖苷、牛磺胆酸-3-硫酸、牛磺-ω-鼠胆酸、牛磺-α-鼠胆酸、牛磺-β-鼠胆酸、牛磺鹅去氧胆酸-3-葡糖苷、牛磺鹅去氧胆酸-3-硫酸、牛磺猪胆酸、牛磺去氧胆酸-3-硫酸、牛磺熊去氧胆酸、牛磺猪去氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺石胆酸-3-硫酸、12-酮基牛磺石胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺去氧胆酸、牛磺石胆酸。
第二方面，本发明一实施方式提供了一种胆汁酸衍生物，由胆汁酸与衍生试剂反应制得，所述衍生试剂包括2-二甲氨基乙胺、3-二甲氨基-1-丙胺及4-二甲氨基-1-丁胺中的一种或多种，所述胆汁酸包含羧基。
本发明一实施方式的胆汁酸的检测方法，具有较高的灵敏度和宽的覆盖度，能够同时对多种胆汁酸进行定量分析。
本发明中，上述各技术方案之间还可以相互组合，以实现更多的优选组合方案。本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分优点可从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过说明书以及附图中所特别指出的内容中来实现和获得。
附图说明
附图仅用于示出具体实施例的目的，而并不认为是对本发明的限制。其中：
图1为本发明实施例1的游离羟基化胆汁酸的色谱洗脱图；其中，图1中的标号所对应的胆汁酸如下：
1：3β,5α,6β-羟基-胆烷酸；2：3α,7α,12β-羟基-5β-胆烷酸；3：3α,7β,12α-羟基-5β-胆烷酸；4：ω-鼠胆酸；5：α-鼠胆酸；6：β-鼠胆酸；7：3β-胆酸；8：3β,7β-羟基-5β-胆烷酸；9：3α,6β-羟基-5β-胆烷酸；10：3β,6α-羟基-5β-胆烷酸；11：猪胆酸；12：熊去氧胆酸；13：猪去氧胆酸；14：3β,7α-羟基-5β-胆烷酸；15：胆酸；16：3β,12β-羟基-5β-胆烷酸；17：3α,12β-羟基-5β-胆烷酸；18：3β,12α-羟基-5β-胆烷酸；19：鹅去氧胆酸；20：去氧胆酸；21：3β-羟基-5α-胆烷酸；22：3β-羟基-5β-胆烷酸；23：7α,12α-羟基-5β-胆烷酸；24：石胆酸；25：12α-羟基-5β-胆烷酸。
图2为本发明实施例1的游离酮基化胆汁酸的色谱洗脱图；其中，图2中的标号所对应的胆汁酸如下：
1：3α,7β-羟基-12-酮基-5β-胆烷酸；2：脱氢胆酸；3：3α-羟基-7,12-酮基-5β-胆烷酸；4：3α,6α-羟基-7-酮基-5β-胆烷酸；5：3α,12α-羟基-7-酮基-5β-胆烷酸；6：3α,7β-羟基-6-酮基-5α-胆烷酸；7：3α-羟基-6-酮基-5α-胆烷酸；8：3α-羟基-7-酮基-5β-胆烷酸；9：3α-羟基-6,7-酮基-5β-胆烷酸；10：3,7-酮基-5β-胆烷酸；11：3α-羟基-12-酮基-5β-胆烷酸。
图3为本发明实施例1的硫酸、葡萄糖醛酸结合型胆汁酸色谱洗脱图；其中，图3中的标号所对应的胆汁酸如下：
1：熊去氧胆酸-3-葡糖苷；2：胆酸-3-葡糖苷；3：熊去氧胆酸-3-硫酸；4：胆酸-3-硫酸：5：胆酸-7-硫酸；6：甘氨鹅脱氧胆酸-3-葡糖苷；7：甘氨去氧胆酸-3-葡糖苷；8：鹅去氧胆酸-3-葡糖苷；9：去氧胆酸-3-葡糖苷；10：鹅去氧胆酸-3-硫酸；11：去氧胆酸-3-硫酸；12：石胆酸-3-葡糖苷；13：石胆酸-3-硫酸。
图4为本发明实施例1的甘氨结合型胆汁酸的色谱洗脱图；其中，图4中的标号所对应的胆汁酸如下：
1：甘氨脱氢胆酸；2：3β-甘氨胆酸；3：甘氨-β-鼠胆酸；4：甘氨猪胆酸；5：甘氨熊去氧胆酸；6：甘氨猪去氧胆酸；7：甘氨胆酸；8：12-酮基-甘氨石胆酸；9：甘氨鹅去氧胆酸；10：甘氨去氧胆酸；11：甘氨石胆酸。
图5为本发明实施例1的甘氨硫酸双结合型胆汁酸的色谱洗脱图；其中，图5中的标号所对应的胆汁酸如下：
1：甘氨熊去氧胆酸-3-硫酸；2：甘氨胆酸-3-硫酸；3：甘氨鹅去氧胆酸-3-硫酸；4：甘氨去氧胆酸-3-硫酸；5：甘氨石胆酸-3-硫酸。
图6为本发明实施例1的牛磺结合型胆汁酸的色谱洗脱图；其中，图6中的标号所对应的胆汁酸如下：
1：牛磺熊去氧胆酸-3-硫酸；2：牛磺胆酸-3-葡糖苷；3：牛磺胆酸-3-硫酸；4：牛磺-ω-鼠胆酸；5：牛磺-α-鼠胆酸；6：牛磺-β-鼠胆酸；7：牛磺鹅去氧胆酸-3-葡糖苷；8：牛磺鹅去氧胆酸-3-硫酸；9：牛磺猪胆酸；10：牛磺去氧胆酸-3-硫酸；11：牛磺熊去氧胆酸；12：牛磺猪去氧胆酸；13：牛磺胆酸；14：牛磺石胆酸-3-硫酸；15：12-酮基牛磺石胆酸；16：牛磺鹅去氧胆酸；17：牛磺去氧胆酸；18：牛磺石胆酸。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施方式进行具体描述，其中，附图构成本发明一部分，并与本发明的实施方式一起用于阐释本发明的原理，并非用于限定本发明的范围。
本发明一实施方式提供了一种胆汁酸的检测方法，包括将待测样品与衍生试剂反应后通过液相色谱进行分离并通过质谱进行检测；其中，待测样品包括一种或多种胆汁酸，衍生试剂包括2-二甲氨基乙胺(DMEN)、3-二甲氨基-1-丙胺及4-二甲氨基-1-丁胺中的一种、两种或三种。
于一实施方式中，在衍生试剂与胆汁酸的反应体系中还可以包括催化剂和偶联剂，催化剂例如可以是O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HAUT)，偶联剂例如可以是1-羟基苯并三唑(HOBt)。
于一实施方式中，衍生试剂与胆汁酸的反应如下，所生成的产物可称为“衍生胆汁酸”。
其中，n可以为2、3或4；n为2时，所对应的衍生试剂为2-二甲氨基乙胺；n为3时，所对应的衍生试剂为3-二甲氨基-1-丙胺；n为4时，所对应的衍生试剂为4-二甲氨基-1-丁胺。另外，上述衍生试剂仅与含羧基的胆汁酸发生反应，不会与含磺酸基的胆汁酸发生反应，例如不会与牛磺结合型胆汁酸进行反应。
于一实施方式中，衍生试剂与胆汁酸的反应温度可以为15～35℃，例如20℃、22℃、24℃、25℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃；反应时间可以为5分钟以内，进一步为2分钟以内，再进一步可以为1～2分钟。
本发明一实施方式的方法通过衍生试剂将胆汁酸的羧酸基团进行改性，提高了胆汁酸的质谱响应强度，使得对胆汁酸的检测具有高灵敏度、高通量、宽覆盖度的特点，可同时检测多种(例如83种)各亚型胆汁酸，从而实现宽覆盖度、高灵敏度的胆汁酸代谢谱全定量检测。
本发明一实施方式的衍生试剂与胆汁酸的反应速率快，例如反应时间可以为1～2分钟，且反应条件温和，在常温常压下即能进行反应，不用进行加热、光照等特殊处理，简化了工艺。
本发明一实施方式的胆汁酸的检测方法，包括如下步骤：
提供包含多种同位素胆汁酸的内标溶液；
提供包含多种胆汁酸的具有浓度梯度的一系列标准品溶液；
将内标溶液和标准品溶液混合后通过液相色谱和质谱进行分离及检测，根据检测结果及内标溶液、标准品溶液中胆汁酸的浓度得到各胆汁酸的定量校正方程；
提供衍生试剂溶液；
将衍生试剂与待测样品混合进行反应，制得检测样本；以及
将检测样本通过液相色谱和质谱进行分离及检测，结合检测结果及各胆汁酸的定量校正方程，得到各胆汁酸的检测结果；
其中，标准品溶液中的胆汁酸的种类与待测样品中的胆汁酸的种类相同，内标溶液中的胆汁酸的种类为待测样品中的部分胆汁酸的同位素标记物。
于一实施方式中，内标溶液及标准品溶液的溶剂均可以为甲醇、甲醇与水的混合物(即甲醇的水溶液)，其中，甲醇的水溶液中甲醇的体积百分比浓度可以为50％(体积比1:1)。
于一实施方式中，衍生试剂与胆汁酸的反应体系还包括催化剂和偶联剂。其中，催化剂可以是O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯，偶联剂可以是1-羟基苯并三唑。
于一实施方式中，分别配置衍生试剂溶液、催化剂溶液和偶联剂溶液，将三种溶液与待测样品混合进行反应；其中，三种溶液的溶剂可以为三乙醇胺和/或二甲基亚砜。
于一实施方式中，在衍生试剂溶液中，衍生试剂的浓度可以为60～600mM，进一步可以为30～300mM，例如50mM、80mM、100mM、150mM、200mM、250mM、350mM、400mM、450mM、500mM、550mM；在催化剂溶液中，催化剂的浓度可以为10～100mM，进一步可以为10～60mM，例如20mM、30mM、50mM、80mM；在偶联剂溶液中，偶联剂的浓度可以为10～100mM，进一步可以为10～60mM，例如20mM、30mM、50mM、80mM；三种溶液可以按照1:1:1的体积比进行混合。
于一实施方式中，在衍生试剂与胆汁酸的反应体系中，衍生试剂、催化剂和偶联剂的摩尔比可以为(60～600):(10～100):(10～100)，进一步可以为(30～300):(10～60):(10～60)。
于一实施方式中，待测样品可以是血清、尿液、粪便中的一种或多种。
于一实施方式中，在进行检测前可将待测样本进行前处理，待测样本为血清或尿液，前处理包括：
取Ostro样品制备板，加入血清和/或尿液样品以及内标溶液，再加入乙腈和/或含甲酸的乙腈溶液；用移液枪吹打数次使混合液混合均匀，然后通过96孔正压装置收集淋洗液，氮气吹干，再向混合溶液中加入衍生试剂溶液，混合均匀，室温反应1～2分钟后，可作为检测样本。
于一实施方式中，在血清或尿液的前处理步骤中，血清与乙腈和/或含甲酸的乙腈溶液的体积比可以为1:3。
于一实施方式中，在进行检测前可将待测样本进行前处理，待测样本为粪便(冻干粉)，前处理包括：
将粪便(冻干粉)样品按1:10的质量比例加入甲醇和/或含甲酸的甲醇溶液中涡旋振荡5分钟，按照相同的操作萃取3次，加入内标溶液，合并提取液，氮气吹干，加入衍生试剂溶液，混合均匀，室温反应1～2分钟，作为检测样本。
于一实施方式中，待测样品中的胆汁酸包括游离羟基化胆汁酸、游离酮基化胆汁酸、硫酸/葡萄糖醛酸结合型胆汁酸、甘氨结合型胆汁酸、甘氨硫酸双结合型胆汁酸、牛磺结合型胆汁酸中的一种或多种。
于一实施方式中，游离羟基化胆汁酸包括：3β,5α,6β-羟基-胆烷酸、3α,7α,12β-羟基-5β-胆烷酸、3α,7β,12α-羟基-5β-胆烷酸、ω-鼠胆酸、α-鼠胆酸、β-鼠胆酸、3β-胆酸、3β,7β-羟基-5β-胆烷酸、3α,6β-羟基-5β-胆烷酸、3β,6α-羟基-5β-胆烷酸、猪胆酸、熊去氧胆酸、猪去氧胆酸、3β,7α-羟基-5β-胆烷酸、胆酸、3β,12β-羟基-5β-胆烷酸、3α,12β-羟基-5β-胆烷酸、3β,12α-羟基-5β-胆烷酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、3β-羟基-5α-胆烷酸、3β-羟基-5β-胆烷酸、7α,12α-羟基-5β-胆烷酸、石胆酸、12α-羟基-5β-胆烷酸。
于一实施方式中，游离酮基化胆汁酸包括：3α,7β-羟基-12-酮基-5β-胆烷酸、脱氢胆酸、3α-羟基-7,12-酮基-5β-胆烷酸、3α,6α-羟基-7-酮基-5β-胆烷酸、3α,12α-羟基-7-酮基-5β-胆烷酸、3α,7β-羟基-6-酮基-5α-胆烷酸、3α-羟基-6-酮基-5α-胆烷酸、3α-羟基-7-酮基-5β-胆烷酸、3α-羟基-6,7-酮基-5β-胆烷酸、3,7-酮基-5β-胆烷酸、3α-羟基-12-酮基-5β-胆烷酸。
于一实施方式中，硫酸/葡萄糖醛酸结合型胆汁酸包括：熊去氧胆酸-3-葡糖苷、胆酸-3-葡糖苷、熊去氧胆酸-3-硫酸、胆酸-3-硫酸、胆酸-7-硫酸、甘氨鹅脱氧胆酸-3-葡糖苷、甘氨去氧胆酸-3-葡糖苷、鹅去氧胆酸-3-葡糖苷、去氧胆酸-3-葡糖苷、鹅去氧胆酸-3-硫酸、去氧胆酸-3-硫酸、石胆酸-3-葡糖苷、石胆酸-3-硫酸。
于一实施方式中，甘氨结合型胆汁酸包括：甘氨脱氢胆酸、3β-甘氨胆酸、甘氨-β-鼠胆酸、甘氨猪胆酸、甘氨熊去氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸、甘氨胆酸、12-酮基-甘氨石胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、甘氨去氧胆酸、甘氨石胆酸。
于一实施方式中，甘氨硫酸双结合型胆汁酸包括：甘氨熊去氧胆酸-3-硫酸、甘氨胆酸-3-硫酸、甘氨鹅去氧胆酸-3-硫酸、甘氨去氧胆酸-3-硫酸、甘氨石胆酸-3-硫酸。
于一实施方式中，牛磺结合型胆汁酸包括：牛磺熊去氧胆酸-3-硫酸、牛磺胆酸-3-葡糖苷、牛磺胆酸-3-硫酸、牛磺-ω-鼠胆酸、牛磺-α-鼠胆酸、牛磺-β-鼠胆酸、牛磺鹅去氧胆酸-3-葡糖苷、牛磺鹅去氧胆酸-3-硫酸、牛磺猪胆酸、牛磺去氧胆酸-3-硫酸、牛磺熊去氧胆酸、牛磺猪去氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺石胆酸-3-硫酸、12-酮基牛磺石胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺去氧胆酸、牛磺石胆酸。
于一实施方式中，液相色谱所采用的色谱柱可以是反相C18色谱柱；柱温可以是30～45℃，例如32℃、35℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃；流速可以是0.2～0.4mL/min，例如0.25mL/min、0.3mL/min、0.35mL/min。流动相A为甲酸铵和醋酸的混合水溶液，在混合水溶液中，甲酸铵的浓度可以为1～5mmol/L，例如2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L；醋酸的质量百分含量可以为0.02～0.05％，例如0.03％、0.04％。流动相B可以为乙腈溶液。
于一实施方式中，在质谱检测中采用正负模式同扫的方式。在电喷雾电离负离子(ESI-)检测模式下，采用多反应监测(MRM)的质谱扫描模式；离子源温度(sourcetemperature)可以为500～600℃，例如520℃、540℃、550℃、560℃、580℃、600℃；雾化气压(ion Source Gas1(Gas1))可以为30～50psi，例如32psi、34psi、35psi、36psi、38psi、40psi、42psi、44psi、45psi、46psi、48psi；辅助气压(Ion Source Gas2(Gas2))可以为40～60psi，例如50psi；气帘气(Curtain gas(CUR))的压力可以为25～45psi，例如26psi、28psi、30psi、32psi、35psi、38psi、40psi、42psi；喷雾电压(IonSpray Voltage)可以为-4000～-5000V，例如-4200V、-4500V、-4600V、-4800V。在电喷雾电离正离子(ESI+)检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；气流参数可与负离子模式扫描相同，喷雾电压可以为4000～5000V，例如4200V、4500V、4600V、4800V。
本发明一实施方式的胆汁酸的检测方法，能同时对80多种胆汁酸亚型进行检测，所能检测的胆汁酸例如可以包括游离胆汁酸、甘氨结合型胆汁酸、牛磺酸结合型胆汁酸、硫酸结合型胆汁酸、葡萄糖醛酸结合型胆汁酸以及双结合型等，使得可满足不同生物基质样本的检测需求。
本发明一实施方式的胆汁酸的检测方法，灵敏度高、覆盖度宽，能够同时对血、尿、粪便中的多种胆汁酸进行定量分析。
本发明一实施方式的胆汁酸的检测方法，通过化学衍生法结合同位素内标定量，可同时对血、尿、粪便中的多种游离型和结合型胆汁酸准确定量，方法精密度和准确度均较高，可用于临床血、尿、粪便样本的定量分析，为临床疾病提供了一种无创疾病诊断的方法，并为疾病发病机制的研究提供了一种有效的技术手段，具有方法覆盖度宽、灵敏度高、特异性强、准确且前处理方法简单的优点。
本发明一实施方式提供了一种胆汁酸衍生物，由胆汁酸与衍生试剂反应制得，衍生试剂包括2-二甲氨基乙胺、3-二甲氨基-1-丙胺及4-二甲氨基-1-丁胺中的一种或多种，胆汁酸包含羧基。
本发明一实施方式的胆汁酸衍生物，可用于胆汁酸的检测；其中，胆汁酸的种类及胆汁酸与衍生试剂反应适用前述限定。
以下，结合附图及具体实施例对本发明一实施方式的胆汁酸的检测方法进行进一步说明。
实施例1
S1：配制内标溶液
分别精密称取多种同位素胆汁酸，加入甲醇溶解，将各同位素胆汁酸的甲醇溶液混合均匀，再用体积含量为50％的甲醇水溶液配制成内标溶液，其中石胆酸-3-硫酸-d4、熊脱氧胆酸-3-硫酸-d4、去氧胆酸-3-硫酸-d4、胆酸-3-硫酸-d4和甘氨鹅去氧胆酸-3-葡糖苷-d5的浓度为2.5μg/mL，其余胆汁酸的内标浓度为500ng/mL；内标溶液中胆汁酸的种类参见表2中序号为84～110的胆汁酸。
S2：配制标准品溶液
分别精密称取83种胆汁酸标准品，加入甲醇溶解，制成浓度为1mg/mL的标准品甲醇溶液。
将各胆汁酸标准品的甲醇溶液混合均匀，再用体积含量为50％的甲醇水溶液配制成系列浓度梯度的混合标准品溶液(0.01～2000ng/mL)，将系列浓度梯度的混合标准品溶液加入步骤S1制得的内标溶液后进行下述步骤S6的色谱分析和步骤S7的质谱分析(进样2μL分析)。
根据信号噪音比计算得到各胆汁酸的定量检测限与鉴定检测限；以各待测物峰面积与内标峰面积比值为纵坐标y，相应的浓度为横坐标x，绘制标准曲线，得到定量校正方程y＝ax+b，具体参见表3。
S3：配制衍生试剂溶液
分别精密称取O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HAUT)和1-羟基苯并三唑(HOBT)，加入二甲基亚砜溶解，分别配制成浓度为60mM的溶液；另精密吸取2-二甲氨基乙胺(DMEN)和三乙醇胺，加入二甲基亚砜溶剂混匀，配制成浓度为300mM的溶液；将这三种溶液作为衍生试剂溶液备用。
S4：血清样品的处理
取人血清50mL，用活性炭进行吸附处理，室温放置过夜，取0.22μm滤膜过滤后的血清，其中的内源性胆汁酸已被除去，再将步骤S2的胆汁酸标准品按照1:10的体积比添加到血清中，进行萃取衍生处理。
取Ostro样品制备板，加入50μL上述血清样品以及100μL步骤S1制得的内标溶液，依次加入总体积为150μL的乙腈、含1％甲酸的乙腈溶液；用移液枪吹打数次使混合液混合均匀，然后通过96孔正压装置收集淋洗液，氮气吹干，依次加入步骤S3配制的三种溶液(三种溶液的体积分别为5μL)，混合均匀，室温反应1～2分钟后，作为检测样本。
S5：高效液相色谱分析
将步骤S4制得的检测样品及步骤S1的内标溶液、步骤S2的标准品溶液进行液相色谱分析，具体色谱条件为：
采用Xselect HSS T3色谱柱(2.1×150mm,2.5μm)，柱温为40℃，流速为0.3mL/min；流动相A采用甲酸铵和醋酸的混合水溶液，在混合水溶液中，甲酸铵的浓度为2mmol/L，醋酸的质量百分含量为0.02％；流动相B采用乙腈溶液，相关液相梯度参见表1。
表1
序号 时间(min) 流速(mL/min) A％ B％
1 - 0.3 76 24
2 13.0 0.3 70 30
3 18.0 0.3 60 40
4 22.0 0.3 20 80
5 24.0 0.3 2 98
6 26.0 0.3 2 98
7 26.1 0.3 76 24
8 30.0 0.3 76 24
S6：质谱分析
将经步骤S5处理后所得的样本进行质谱分析，具体条件如下：
采用正负模式同扫(衍生胆汁酸采用正模式扫描、牛磺酸结合型胆汁酸采用负模式扫描)，两级质谱的条件是：电喷雾电离负离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；离子源温度为600℃，雾化气压为40psi，辅助气压为50psi，气帘气的压力为35psi，喷雾电压为-4500V。
电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；气流参数与负离子模式扫描相同，喷雾电压为4500V。同时检测目标胆汁酸离子对以及同位素内标胆汁酸离子对，各离子对及其对应的去簇电压、碰撞电压和碰撞池出口电压参数如表2所示。
样品经过液相色谱分离后，不同的胆汁酸在不同的洗脱时间出峰，并且被质谱检测得到胆汁酸与内标的比值，将比值带入到定量校正方程，计算可得到生物基质中胆汁酸的含量。
表3所列为实施例1的胆汁酸的色谱保留时间、方法检测限、方法定量限、可定量的浓度范围和定量校正方程，以及与对比例的未进行衍生反应的检测方法的灵敏度对比结果。
表2
表3
NQ：代表该化合物在不衍生直接检测时未与其他胆汁酸分离，不能定量。
实施例2
本实施例采用与实施例1的步骤S3～S6相同的方式进行检测，区别仅在于：所检测的胆汁酸仅为3α-羟基-5β-胆烷酸和12α-羟基-5β-胆烷酸，所采用的衍生试剂为3-二甲氨基-1-丙胺，而非2-二甲氨基乙胺；且质谱分析中的去簇电压、碰撞电压和碰撞池出口电压参数如表4所示。
表4
对比例
本例采用与实施例1的步骤S4～S6相同的方式进行检测，区别仅在于：所使用的胆汁酸均为与实施例1相同的含羧基的胆汁酸。即，在检测过程中，未采用衍生试剂与胆汁酸进行反应，胆汁酸仍是以自身的形式而非衍生胆汁酸的形式被检测，相关定量限结果参见表3。
结合表2的检测结果，以序号为1的3β-羟基-5α-胆烷酸为例，若未进行与衍生试剂的反应，3β-羟基-5α-胆烷酸的母离子m/z应为375.3，电离模式应为“-”。而表2中3β-羟基-5α-胆烷酸的母离子m/z为447.3，电离模式应为“+”，充分表明3β-羟基-5α-胆烷酸与衍生试剂之间的反应已经发生，3β-羟基-5α-胆烷酸以反应产物衍生胆汁酸的形式存在。
根据表3的结果可知，各待测物的线性相关系数R在0.9866～0.9981之间，即83种胆汁酸在各自浓度线性范围内呈良好的线性关系，满足定量要求。
另一方面，从表3的结果可以看出，经过衍生修饰的胆汁酸(牛磺酸结合型胆汁酸未衍生)在质谱仪中的响应信号与未衍生的胆汁酸相比，获得了不同程度的提高。以石胆酸(对应表3中的序号3)为例，与衍生试剂发生反应后，衍生石胆酸的定量限为0.1ng/mL，而对比例的未通过衍生反应直接进行检测的石胆酸的定量限仅为10ng/mL；相比较可以看出，通过与衍生试剂的反应，使得石胆酸的检测灵敏度提高了100倍。由此，使得本发明一实施方式的胆汁酸的检测方法，能够更灵敏地检测出生物样本中低丰度的胆汁酸成分，获得更精细的体内胆汁酸代谢图谱。
从表4的结果可以看出，使用3-二甲氨基-1-丙胺作为衍生试剂，仍能够完成胆汁酸的衍生化反应。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种胆汁酸的检测方法，包括将待测样品与衍生试剂反应后通过液相色谱和质谱进行分离及检测；其中，所述胆汁酸中的至少部分胆汁酸包含羧基，所述衍生试剂包括3-二甲氨基-1-丙胺及4-二甲氨基-1-丁胺中的一种或多种；
其中，所述待测样品中的包含羧基的所述胆汁酸与所述衍生试剂发生反应，所述反应的反应温度为15～35℃，反应时间为1~2分钟；
所述反应的反应体系还包括催化剂和偶联剂；
所述待测样品包括血清、尿液、粪便中的一种或多种；
所述催化剂包括O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯，所述偶联剂包括1-羟基苯并三唑；
在所述反应体系中，所述衍生试剂、所述催化剂和所述偶联剂的摩尔比为(60～600):(10～100):(10～100)，形成的催化衍生试剂溶液为衍生试剂、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三唑和三乙醇胺的二甲基亚砜溶液；
其中，所述胆汁酸包括游离羟基化胆汁酸、游离酮基化胆汁酸、硫酸/葡萄糖醛酸结合型胆汁酸、甘氨结合型胆汁酸、甘氨硫酸双结合型胆汁酸和牛磺结合型胆汁酸。
2.根据权利要求1所述的方法，包括如下步骤：
提供包含一种或多种同位素胆汁酸的内标溶液；
提供包含一种或多种胆汁酸的具有浓度梯度的多种标准品溶液；
将所述内标溶液和所述多种标准品溶液混合后通过液相色谱和质谱进行分离及检测，根据检测结果及所述内标溶液、所述标准品溶液中胆汁酸的浓度得到各胆汁酸的定量校正方程；
提供包含衍生试剂的溶液；
将所述包含衍生试剂的溶液与所述待测样品混合并进行反应，制得检测样本；以及
将所述检测样本通过液相色谱和质谱进行分离及检测，结合检测结果及各胆汁酸的定量校正方程，得到各胆汁酸的检测结果；
其中，所述标准品溶液中的胆汁酸的种类与所述待测样品中的胆汁酸的种类相同，所述内标溶液中的胆汁酸为所述待测样品中的至少部分胆汁酸的同位素标记物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述液相色谱中，采用反相C18色谱柱，柱温为30～45°C，流速为0.2～0.4mL/min，流动相A为甲酸铵和醋酸的混合水溶液，流动相B为乙腈溶液。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述多种胆汁酸包括能够与所述衍生试剂发生反应的含羧基的胆汁酸和不能与所述衍生试剂发生反应的其他胆汁酸；
在所述质谱检测中，采用电喷雾电离正离子检测模式对所述含羧基的胆汁酸进行扫描，采用电喷雾电离负离子检测模式对所述其他胆汁酸进行扫描。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，在所述质谱检测中，离子源温度为500～600°C，雾化气压为30～50psi，辅助气压为40～60psi，气帘气的压力为25～45psi，喷雾电压为4000～5000V或-4000～-5000V。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述游离羟基化胆汁酸包括：3β,5α,6β-羟基-胆烷酸、3α,7α,12β-羟基-5β-胆烷酸、3α,7β,12α-羟基-5β-胆烷酸、ω-鼠胆酸、α-鼠胆酸、β-鼠胆酸、3β-胆酸、3β,7β-羟基-5β-胆烷酸、3α,6β-羟基-5β-胆烷酸、3β,6α-羟基-5β-胆烷酸、猪胆酸、熊去氧胆酸、猪去氧胆酸、3β,7α-羟基-5β-胆烷酸、胆酸、3β,12β-羟基-5β-胆烷酸、3α,12β-羟基-5β-胆烷酸、3β,12α-羟基-5β-胆烷酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、3β-羟基-5α-胆烷酸、3β-羟基-5β-胆烷酸、7α,12α-羟基-5β-胆烷酸、石胆酸、12α-羟基-5β-胆烷酸中的一种或多种；
所述游离酮基化胆汁酸包括：3α,7β-羟基-12-酮基-5β-胆烷酸、脱氢胆酸、3α-羟基-7,12-酮基-5β-胆烷酸、3α,6α-羟基-7-酮基-5β-胆烷酸、3α,12α-羟基-7-酮基-5β-胆烷酸、3α,7β-羟基-6-酮基-5α-胆烷酸、3α-羟基-6-酮基-5α-胆烷酸、3α-羟基-7-酮基-5β-胆烷酸、3α-羟基-6,7-酮基-5β-胆烷酸、3,7-酮基-5β-胆烷酸、3α-羟基-12-酮基-5β-胆烷酸中的一种或多种；
所述硫酸/葡萄糖醛酸结合型胆汁酸包括：熊去氧胆酸-3-葡糖苷、胆酸-3-葡糖苷、熊去氧胆酸-3-硫酸、胆酸-3-硫酸、胆酸-7-硫酸、甘氨鹅脱氧胆酸-3-葡糖苷、甘氨去氧胆酸-3-葡糖苷、鹅去氧胆酸-3-葡糖苷、去氧胆酸-3-葡糖苷、鹅去氧胆酸-3-硫酸、去氧胆酸-3-硫酸、石胆酸-3-葡糖苷、石胆酸-3-硫酸中的一种或多种；
所述甘氨结合型胆汁酸包括：甘氨脱氢胆酸、3β-甘氨胆酸、甘氨-β-鼠胆酸、甘氨猪胆酸、甘氨熊去氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸、甘氨胆酸、12-酮基-甘氨石胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、甘氨去氧胆酸、甘氨石胆酸中的一种或多种；
所述甘氨硫酸双结合型胆汁酸包括：甘氨熊去氧胆酸-3-硫酸、甘氨胆酸-3-硫酸、甘氨鹅去氧胆酸-3-硫酸、甘氨去氧胆酸-3-硫酸、甘氨石胆酸-3-硫酸中的一种或多种；
所述牛磺结合型胆汁酸包括：牛磺熊去氧胆酸-3-硫酸、牛磺胆酸-3-葡糖苷、牛磺胆酸-3-硫酸、牛磺-ω-鼠胆酸、牛磺-α-鼠胆酸、牛磺-β-鼠胆酸、牛磺鹅去氧胆酸-3-葡糖苷、牛磺鹅去氧胆酸-3-硫酸、牛磺猪胆酸、牛磺去氧胆酸-3-硫酸、牛磺熊去氧胆酸、牛磺猪去氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺石胆酸-3-硫酸、12-酮基牛磺石胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺去氧胆酸、牛磺石胆酸中的一种或多种。
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