CN113390978A - 平衡透析合并lc-ms/ms技术测定人血清样本中游离睾酮含量的分析方法 - Google Patents

平衡透析合并lc-ms/ms技术测定人血清样本中游离睾酮含量的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用平衡透析合并LC‑MS/MS技术测定人血清样本中游离睾酮含量的方法，通过将96孔板自行组装成96孔高通量平衡透析装置，实现高通量平衡透析装置的重复使用，从而降低透析成本；通过加热衍生化，实现平衡透析过程的质控和增强游离睾酮离子化效率；同时进一步优化了流动相和洗脱程序；使检测灵敏度显著提升至1pg/ml，实现更简单、低成本、高灵敏度、高准确性地检测游离睾酮，充分满足临床对于女性低游离睾酮含量精准检测的需求和挑战。

Description

平衡透析合并LC-MS/MS技术测定人血清样本中游离睾酮含量 的分析方法
技术领域
本发明涉及化学分析技术领域，具体而言，涉及平衡透析合并LC-MS/MS技术测定人血清样本中游离睾酮含量的检测分析方法。
背景技术
人体内的大部分睾酮是以与性激素结合蛋白(SHBG)结合的状态存在，小部分是与血清白蛋白结合，只有微量以游离睾酮的活性形式存在，而游离睾酮历来被认为是有生物活性的部分。在儿童中，游离睾酮过量会导致男孩性早熟和女孩男性化。在成年女性中，游离睾酮过量会导致代谢和生育方面的诸多问题，比如多毛、痤疮、肥胖、月经稀发或闭经、排卵减少或停止、不育等，如果未能及时诊治，甚至可进一步引发心血管疾病、二型糖尿病等不可逆转性疾病。成年男性受年龄、压力等因素影响，游离睾酮含量亦可能出现减低的情况，导致部分或完全的性腺机能减退，因此检测游离睾酮的含量对于多种疾病的诊疗具有非常重要的意义。
作为最重要的雄激素，总睾酮在女性体内的含量远低于成年男性，约为80-600pg/mL，其检测对于免疫学方法来说已然是一个非常大的挑战。人体内的游离睾酮含量，一般低于总睾酮含量的2％，在女性体内的正常含量范围为＜10.9pg/mL。因此，游离睾酮含量的检测，尤其是女性及儿童等低游离睾酮含量人群的精准检测，对现有检测技术来说是非常大的挑战。
目前国内游离睾酮含量的检测一般采用间接法，利用总睾酮、SHBG以及Albumin含量，通过计算法计算得到游离睾酮含量。正常情况下，临床结合LH和FSH的检测结果，根据总睾酮含量和游离睾酮含量的计算值，即可做出相应的临床判断。但是，对于最需要进行游离睾酮检测的人群，比如疑似多囊卵巢综合征(PCOS)的育龄女性，SHBG的含量通常呈减低状态，其与睾酮的结合能力与健康人群有所改变，此时再利用经验公式对病人进行游离睾酮含量计算，就无法得到准确的游离睾酮含量结果，从而影响诊断和治疗效果。
平衡透析，是分离游离激素的金标准；在利用平衡透析方法进行游离睾酮的分离后，再利用液相色谱串联质谱技术进行定量分析，是游离激素检测的金标准。但是，目前国内尚没有采用此金标准方法进行游离睾酮检测的实例，如对比文件(ClinicalBiochemistry, 2013,Vol.46,P656-664)中所示，样本平衡透析过程中采用的平衡透析板为Harvard Apparatus公司生产的即用即弃型96孔平衡透析板，此透析板在国内的售价超过八千元人民币，对于游离睾酮的单指标检测来说，耗材成本过于昂贵；除去平衡透析的耗材成本之外，对比文件中平衡透析后的操作步骤过于复杂：首先利用衍生化方法对平衡透析液中的游离睾酮进行衍生化反应，再利用液液萃取对衍生产物进行提取，液液萃取后的有机相用氮气吹干，再次复溶后进样分析。因此对比文件中的方法不仅成本昂贵，而且操作复杂，费时费力，不利于此项目的临床推广。
在对比文件2(Clinical Biochemistry,2010,Vol 43,P490-496)，采用了超滤法来取代游离激素分离的金标准透析法，此文献方法也存在多方面的问题：超滤法通过借助离心力在超滤管中分离游离激素和蛋白结合激素，这过程中涉及到外力的作用，学术界普遍认为外力会影响/破坏游离激素与蛋白结合的平衡条件，导致检测结果出现偏差，因此超滤法分离游离激素的方案并未在国外得到普遍认可和实施；在采用超滤法进行游离激素的分离之后，利用甲基叔丁基醚液液萃取对游离睾酮进行提取，但在有机溶剂吹干之后，再次用甲醇溶解，第二次用庚烷洗涤甲醇溶液，并在丢弃庚烷溶液后，再次吹干甲醇溶液，复溶后上机分析。这种超滤后的操作过于繁琐，时间成本高，而且没有进行衍生化，导致此方法的检测灵敏度不足，而且文献中仅仅检测了六十例男性样本的游离睾酮含量。男性的总睾酮及游离睾酮含量均远高于女性，依然无法满足对女性游离睾酮进行检测的挑战。
因此，急需建立一种前处理相对简单、检测成本低、检测灵敏度高、能够满足对于女性游离睾酮检测需求和挑战的游离睾酮分析检测方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种利用平衡透析法进行血清样本中游离睾酮的提取，并利用LC-MS/MS技术进行透析液中游离睾酮含量检测的方法，完全吻合对游离激素进行提取及检测的金标准。本方法通过将96孔板自行组装成96孔高通量平衡透析装置，不同批次样本间仅需更换透析膜，即可实现平衡透析装置重复使用，从而极大降低了平衡透析过程的耗材成本；通过向平衡透析液中添加少量的衍生化试剂进行加热衍生化，增强游离睾酮离子化效率，使检测灵敏度达到1pg/ml，可以充分满足对女性低游离睾酮含量检测的需求和挑战；加热衍生化过程，还可作为平衡透析过程中是否存在蛋白泄露的质控依据；衍生后即可上机进行检测，无需进行液液萃取等复杂的前处理，实现更简单、低成本、高灵敏度并且高效率的游离睾酮检测。
一方面，本发明提供了一种利用平衡透析合并LC-MS/MS技术测定人血清样本中游离睾酮含量的方法，包括以下步骤：
1)样本进行平衡透析，获得含游离睾酮的样本平衡透析液；
2)含游离睾酮的样本平衡透析液进行加热衍生化反应；
3)通过LC-MS/MS法检测游离睾酮含量。
在游离睾酮检测的样本前处理过程中，为提高检测灵敏度，在平衡透析过程完成之后，文献中通常需要对透析液中的游离睾酮进行富集，常用的富集过程主要包括液液萃取、提取剂的吹干以及样本的复溶等过程，需耗费大量的人工和时间成本。
本发明通过加热衍生化反应，提高游离睾酮在质谱检测器的离子化效率，无需复杂的液液萃取及吹干、复溶过程，即可实现游离睾酮的检测灵敏度提高五倍以上。由于无需进行富集过程，每个样本仅需要180uL血清，即可实现对游离睾酮的精准检测。
此外，衍生化过程需要加热，如果在前述平衡透析过程中存在蛋白泄露，那么在衍生化的加热过程中，平衡透析液中会出现蛋白受热变性形成的沉淀，因此，可以利用加热衍生化过程中是否形成蛋白沉淀来作为前述平衡透析过程的质控指标，填补了平衡透析过程缺乏质控的空白。
进一步地，步骤1)所述的平衡透析采用96孔板自行组装成96孔高通量平衡透析装置，透析膜为MWCO 10-30K纤维素膜。
文献中的游离激素高通量平衡透析法均使用即用即弃型96孔平衡透析板进行透析，单板国内售价超过八千元人民币(包括Harvard Apparatus和Thermo RED平衡透析装置)，使游离睾酮检测耗材成本过高。本发明采用可重复使用的自组装96孔高通量平衡透析装置进行平衡透析，不同批次间进行样本分析时，仅需更换平衡透析膜(单样本透析膜成本5元以下，96孔板耗材成本减至500元以下)。与成品96孔透析装置相比，节约了96孔板的耗材，减低了对环境污染的压力，并极大降低了游离睾酮检测的耗材成本，有利于此项目的临床推广。
发明人利用自组装96孔高通量平衡透析装置将透析膜装入96孔板中，从而组装成对游离睾酮进行平衡透析的96孔高通量平衡透析装置，所述装置可以实现重复使用；并经过大量实验，选出了更适合于提取游离睾酮，并能降低蛋白泄漏情况的自裁MWCO 10-30K纤维素膜作为透析膜，从而进一步提高了游离睾酮检测的准确性和灵敏度。
进一步地，步骤2)，所述衍生化反应采用的衍生化试剂为盐酸羟胺水溶液；所述的衍生化反应为加热衍生化反应，加热衍生化反应的反应条件为70～90℃。
不管是采用超滤法还是平衡透析法进行游离睾酮检测，均无法实现对单个样本前处理过程中平衡透析步骤的质量控制，无法检测可能的蛋白泄露导致游离睾酮检测结果偏高的现象。因为一旦发生蛋白泄漏，SHBG及与SHBG相结合的睾酮可能会进入平衡透析装置中透析缓冲液一侧，从而导致透析缓冲液中游离睾酮检测结果偏高。
本发明在衍生化的过程中采用了加热的条件，在此条件下，如果平衡透析过程中存在蛋白泄露，则在加热衍生化的过程中，泄漏到平衡透析装置中透析缓冲液一侧的蛋白会在加热过程中变性，形成沉淀析出。如果发现沉淀，只需重取样本再次平衡透析，若无沉淀，则可直接进样检测。
研究证明，采用盐酸羟胺水溶液作为加热衍生化试剂，可进一步提升检测灵敏度，同时，加热过程既能作为蛋白泄漏的质控，且不会对衍生化产生任何不利影响。
进一步地，步骤2)所述的衍生化试剂为10～20％的盐酸羟胺水溶液，衍生化反应时间为15～60分钟。
进一步地，所述的衍生化试剂与样本平衡透析液的体积比为1:10～1:20。
进一步地，步骤2)所述的衍生化反应结束后，需观察是否产生沉淀，如有沉淀，需重取样本再次进行步骤1)的平衡透析；如无沉淀，则进行步骤3)的LC-MS/MS法检测游离睾酮含量。
因此如果在衍生反应之后，观察到蛋白沉淀，则表明平衡透析过程中出现了蛋白泄露，从而提醒操作人员需要重新进行平衡透析；反之，如无沉淀产生，则表明平衡透析过程没有蛋白泄露，则可直接进样，进行游离睾酮的LC-MS/MS法检测。
进一步地，所述样本包含人血清样本和质控样本；所述质控样本采用三个质控浓度，分别为混合成年男性血清样本制备的高浓度质控样本，和混合成年女性血清样本制备的低浓度质控样本，以及成年男性与成年女性血清样本按照1：1比例混合得到的中浓度质控样本。
人体内大部分睾酮都以与性激素结合蛋白SHBG结合的形式存在，只有少量以游离睾酮形式存在。当向样本中添加游离睾酮时，添加的游离睾酮会与原内源睾酮达到动态的平衡，大部分添加睾酮仍然以与性激素结合蛋白SHBG相结合的形式存在，因此在进行游离睾酮检测时，无法通过直接向血清样本中添加游离睾酮，并计算其回收率来考察检验方法的准确度。
本发明在进行方法验证时，通过两套质控体系来考察检测方式的准确度和精密度。
质控体系一，通过分别混合健康成年女性及健康成年男性的血清来制备游离睾酮检测时的低浓度质控样本及高浓度质控样本，并将女性与男性样本按照1：1比例混合制备中浓度质控样本，利用低、中、高三个浓度的质控品进行精密度验证，保证检验方法在健康女性样本游离睾酮含量范围、中间含量范围以及成年男性游离睾酮含量范围，三个游离睾酮含量范围的检测结果的准确度和精密度。
质控体系二，通过向平衡透析后的透析缓冲液中进行不同浓度的睾酮添加，进行透析后的添加回收实验，评估透析后检测方法的准确度及精密度。
进一步地，步骤3)所述的LC-MS/MS法采用的流动相A为含甲酸的水溶液，流动相 B为含甲酸的甲醇溶液，进行梯度洗脱。
进一步地，采用反相色谱进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
时间(min) 流速(ml/min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.60 0.6 90 10
0.85 0.6 55 45
2.80 0.6 25 75
2.85 0.6 10 90
3.75 0.6 10 90
3.80 0.6 90 10
4.20 0.6 90 10
进一步地，流动相的流速为0.6mL/min。
进一步地，液相色谱柱类型为C18柱，填料粒径为2.6μm，内径为2.1mm，柱长为50mm。
进一步地，采用电喷雾离子源正离子模式(ESI+)和MRM检测模式，用于检测的分析物和内标的母离子/子离子检测离子对如下，Testosterone(T)，m/z 304.1>m/z 124.3和m/z 304.1>m/z 112.3；同位素内标Testosterone-d3(T-d3)，m/z 307.200>m/z 124.0和m/z 307.2>m/z 112.1。
另一方面，本发明提供了一种平衡透析合并LC-MS/MS技术测定人血清游离睾酮含量的检测试剂盒，包含标准曲线工作液、质控样本、内标工作液、透析缓冲液、衍生化试剂和液相洗脱溶液；其中所述衍生化试剂为10～20％的盐酸羟胺水溶液。
进一步地，所述质控样本采用三个质控浓度，分别为成年男性血清样本制备的高浓度质控样本，和成年女性血清样本制备的低浓度质控样本，以及成年男性与成年女性血清样本按照1：1比例混合得到中浓度质控样本；所述内标为游离睾酮同位素内标Testosterone-d3。
进一步地，所述液相洗脱溶液包括：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸甲醇溶液。
本发明具有以下有益效果：
(1)通过将96孔板自行组装成96孔高通量平衡透析装置，实现高通量平衡透析装置的重复使用，从而降低透析成本，并优化了透析条件；
(2)通过对平衡透析液的加热衍生化增强游离睾酮离子化效率，并提高了游离睾酮检测的灵敏度，避免了液液萃取、吹干、复溶等复杂的富集步骤；
(3)采用独特的质控体系来进一步保证检测的准确度和精密度；
(4)优化了优化流动相和洗脱程序；
(5)游离睾酮检测灵敏度显著提升至1pg/ml，充分满足女性游离睾酮含量检测的需求和挑战。
(6)与国内国际既有的公开方法相比，操作更简便、低成本、高准确性。
(7)游离睾酮的分离提取过程采用了游离激素提取的“金标准”平衡透析法，游离睾酮的检测过程亦采用了激素检测的“金标准”液相色谱串联质谱法。
名词解释
平衡透析(Equilibrium Dialysis)：
用于测定溶液中小分子或离子与大分子间结合的技术。将含有待测小分子及与其相结合的大分子溶液，置于只允许小分子透过而不允许大分子透过的半透膜一侧，透析膜另一侧放置不含大、小分子的透析缓冲液。当透析达到平衡时，测定膜两侧溶液中小分子的浓度，即可分析得大分子与小分子结合的数据。平衡透析过程示意图见图1所示。
附图说明
图1为平衡透析过程的示意图
图2为实施例1中的平衡透析合并LC-MS/MS技术测定人血清样本中游离睾酮含量的流程图
图3为文献中报道用于平衡透析的Thermo RED 96孔平衡透析板(左)、HarvardApparatus96孔平衡透析板(中)，以及本发明提供的自组装96孔平衡透析板(右)的照片
图4为实施例1中的标曲样品检测图谱，其中左图为标曲样品中待测游离睾酮色谱图，右图为对应同位素内标的色谱图
图5为实施例1中的标准曲线
图6为实施例3中进行衍生化处理的检测图谱
图7为实施例3中进行液液萃取前处理的检测图谱
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本实施例中使用的试剂均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1：本发明提供的人血清样本中游离睾酮含量的检测方法
本实施例提供的LC-MS/MS技术测定人血清样本中游离睾酮含量的方法，流程图如图 2所示，具体包括以下步骤：
1)样本进行平衡透析获得样本平衡透析液：
样本预处理：取180μL待测样本于96孔板中，加入20μL含HEPES的缓冲液，涡旋混匀后，室温静置，待用；分别取高浓度质控样本(成年男性血清样本)、低浓度质控样本(成年女性血清样本)各180μL于96孔板中，加入20μL含HEPES的缓冲液，涡旋混匀后，室温静置，待用。
②透析膜预处理：依据平衡透析装置的大小，将平衡透析膜剪裁为合适的尺寸(本实施例中搭配平衡透析装置使用的平衡透析膜尺寸为：12mm*22mm)，随后用去离子水泡膜10分钟，即可用于搭建平衡透析装置。
③平衡透析前准备：平衡透析装置搭建完成后，在单个透析孔的一侧加入150μL游离睾酮透析缓冲液，另一侧加入150μL经过步骤1预处理的样本。
其中平衡透析装置的搭建过程为：将自裁得到的MWCO 10-30K纤维素膜依次装入96 孔板中，从而组装成96孔高通量平衡透析装置。本发明组装的96孔高通量平衡透析装置如图3(最右图)所示。图3中从左到右依次为文献中报道过的用于游离睾酮平衡透析的Thermo RED 96孔平衡透析板、Harvard Apparatus 96孔平衡透析板，以及本发明提供的自组装96孔平衡透析板。
④平衡透析：用密封膜封闭平衡透析板，并将其置入37℃烘箱内旋转仪，进行平衡透析。
2)样本平衡透析液进行衍生化反应，所述衍生化反应采用的衍生化试剂为盐酸羟胺水溶液：
a、衍生化过程的准备：将平衡透析板从烘箱取出，并依次从平衡透析板的各孔分别移取平衡透析液100μL至96孔进样板，依次向每个样本的平衡透析液中加入睾酮的同位素内标工作液(250pg/mL的Testosterone-d3溶液10μL)；依次移取100μL不同浓度的标曲溶液至96孔进样板，并向每个标曲样本中加入与样本平衡透析液样本中等量的睾酮同位素内标工作液(250pg/mL的Testosterone-d3溶液10μL)；移取100μL空白平衡透析液至 96孔进样板作为双空白样本DB，并向其中加入10μL水；移取100μL空白平衡透析液至 96孔进样板作为单空白样本SB，并向其中加入睾酮的同位素内标工作液(250pg/mL的 Testosterone-d3溶液10μL)。
其中，游离睾酮标曲配制，标曲浓度见表1，游离睾酮标曲配制在平衡透析液中。
表1、游离睾酮标曲浓度
标曲 SD1 SD2 SD3 SD4 SD5 SD6 SD7
游离睾酮(pg/mL) 1 2 5 10 25 100 200
b、加热衍生化：依次向步骤a)中的所有样本中，包括血清平衡透析液样本、标曲以及DB和SB，加入5μL盐酸羟胺水溶液(10％)，充分混匀，用铝箔纸包裹，并置于80 ℃烘箱衍生15分钟。加热衍生化结束后，需观察各样本孔是否出现沉淀，如有沉淀产生，对应样本需重新进行平衡透析。
3)通过LC-MS/MS法分析检测游离睾酮含量：
衍生化结束后，将96孔板从烘箱取出并室温静置十分钟降温，后将96孔板转移至LC-MS/MS仪器，进样分析。
本实施例中，LC-MS/MS法采用的流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸甲醇溶液，采用反相色谱进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如表2所示：
表2、梯度洗脱程序
时间(min) 流速(ml/min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.60 0.6 90 10
0.85 0.6 55 45
2.80 0.6 25 75
2.85 0.6 10 90
3.75 0.6 10 90
3.80 0.6 90 10
4.20 0.6 90 10
流动相的流速为0.6mL/min，液相色谱柱类型为C18柱，填料粒径为2.6μm，内径为2.1mm，柱长为50mm。
质谱条件为采用电喷雾离子源正离子模式(ESI+)和MRM检测模式，用于检测的分析物和内标的母离子/子离子检测离子对如下，Testosterone(T)，m/z 304.1>m/z 124.3和m/z 304.1>m/z 112.3；同位素内标Testosterone-d3(T-d3)，m/z 307.200>m/z 124.0和m/z 307.2>m/z 112.1。
图4为标曲样品通过液相色谱分离后，通过MRM模式检测到，定量其含量，其中左图为标曲样品中待测游离睾酮色谱图，右图为对应同位素内标的色谱图。
根据游离睾酮标曲样品的检测结果，检测结果如表3所示；以标曲样品浓度为横坐标，以游离睾酮及其内标峰面积比为纵坐标，进行线性回归，获得标准曲线如图5所示。
表3、游离睾酮标曲样品的检测结果
Figure RE-GDA0003124290270000091
根据各样品的质谱检测得到游离睾酮与内标的比值，将比值代入到标曲方程，计算得到血清中游离睾酮的含量。
采用本实施例提供的人血清样本中游离睾酮的检测方法，对游离睾酮的灵敏度最高可达到1pg/ml(标曲浓度SD1)。
实施例2不同透析膜对检测结果的影响MWCO 10-30K纤维素膜
本实施例分别选用4种不同的透析膜，采用实施例1提供的检测方法进行血清样本中游离睾酮的检测，其中每组质控样本分别在平衡透析后再进行衍生化，并通过LC-MS/MS法分析检测游离睾酮含量，检测结果如表4所示。
表4、不同超滤膜对检测结果的影响
Figure RE-GDA0003124290270000092
Figure RE-GDA0003124290270000101
由表4可以看出，采用不同透析膜进行透析，LC-MS/MS法分析检测游离睾酮的检测结果存在较大差别，同时对蛋白泄漏情况也存在一定的影响，这可能是由于不同透析膜对血清样本中的游离睾酮和蛋白存在不同的吸附性，会严重影响检测结果的准确性。实验证明， MWCO 10-30K纤维素膜可以较好地解决这个问题，明显提升检测结果的准确性。
实施例3：不同前处理方法对检测结果的影响
本实施例选用标曲和低质控样本，采用实施例1提供的检测方法进行血清样本中游离睾酮的检测，其中每组质控样本在平衡透析完成之后，分别选用不同的前处理方法，第一组在平衡透析后采用乙酸乙酯作为萃取剂，对平衡透析液中的游离睾酮进行富集。为了通过减小体积达到富集的效果，进行液液萃取时，每个样本需要重复三组平衡透析实验，并在平衡透析完成之后，将每样本的三个重复合并到一起(450μL)利用乙酸乙酯进行液液萃取，并在将乙酸乙酯吹干后用80μL含20％甲醇水的溶液复溶，上机检测游离睾酮；第二组在平衡透析后采用10％的盐酸羟胺水溶液进行加热衍生化反应，80℃烘箱衍生15 分钟。前处理完成后分别通过LC-MS/MS法分析检测游离睾酮含量，每组重复5次，取平均值，检测结果如表5所示，检测图谱分别如图6和图7所示，其中图6为进行衍生化处理的检测图谱，图7为进行液液萃取后的检测图谱。
表5、不同衍生化试剂对检测结果的影响
序号 衍生化试剂 游离睾酮测定平均定量离子峰面积
第一组 液液萃取 6530
第二组 加热衍生化 40657
由表5和图6、图7可见，采用衍生化处理后，游离睾酮测的定量离子对离子响应峰面积比液液萃取时非衍生化的睾酮峰面积提高五倍以上，而且利用液液萃取的方法进行前处理时，单个样本检测需要重复三次平衡透析实验，对样本、人力和耗材都是很大的浪费，且难以提高通量；而采用衍生化进行前处理，单样本仅需要依次平衡透析实验，并且操作简便，检测的效率和通量大幅提升。
实施例4：不同衍生化试剂对检测结果的影响
本实施例选用低浓度质控样本，采用实施例1提供的检测方法进行血清样本中游离睾酮的检测，其中每组质控样本分别选用不同的衍生化试剂进行加热衍生化，80℃烘箱衍生15分钟。其中衍生化试剂与平衡透析液的比例为1:20，并通过LC-MS/MS法分析检测游离睾酮含量，每组重复5次，取平均值；另外对于盐酸羟胺这种衍生剂，考察了衍生剂与平衡透析液的不同比例对于衍生化效率的影响，每组重复5次，取平均值，检测结果如表 6所示。
表6、不同衍生化试剂对检测结果的影响
序号 衍生化试剂 游离睾酮测定平均峰面积g/ml)
1 5％O-(羧甲基)羟胺半盐酸盐水溶液 21540
2 5％O-盐酸甲氧基胺水溶液 30073
3 5％三甲基苯胺水溶液 27948
4 1％盐酸羟胺水溶液 33142
5 2％盐酸羟胺水溶液 38762
6 5％盐酸羟胺水溶液 40257
7 10％盐酸羟胺水溶液 41032
8 12％盐酸羟胺水溶液 35257
由表6可见，不同的衍生化试剂因加热衍生化效果不同，从而影响游离睾酮的检测灵敏度，相比较其他衍生化试剂，采用盐酸羟胺水溶液作为衍生化试剂时，检测得的游离睾酮响应值最高，其原因可能是不同衍生化试剂的衍生效率不同以及衍生产物离子化效率不同；同时比较不同质量浓度的盐酸羟胺水溶液可以看出，2-10％的盐酸羟胺水溶液相比其他浓度，可以进一步提高游离睾酮的检测灵敏度，其中10％盐酸羟胺水溶液的衍生化效果最好，游离睾酮的检测灵敏度最高。
实施例5：不同衍生化试剂与平衡透析液的比例关系对检测结果的影响
本实施例选用低浓度质控样本，采用实施例1提供的检测方法进行血清样本中游离睾酮的检测，其中每组质控样本采用10％羟胺水溶液进行衍生化时，衍生化试剂与平衡透析液分别选用不同的比例关系，80℃烘箱衍生15分钟，LC-MS/MS法分析检测游离睾酮含量，每组重复5次，取平均值，检测结果如表7所示。
表7、不同衍生化试剂与平衡透析液的比例关系对检测结果的影响
Figure RE-GDA0003124290270000111
Figure RE-GDA0003124290270000121
由表7可见，衍生化试剂与平衡透析液的比例不同，衍生化效率有比较大的偏差，衍生化试剂与平衡透析液的最佳比例关系为1:10～1:20。
实施例6：通过加热衍生化进行质控时的蛋白泄漏情况统计，以及平衡透析膜的优化
本实施例在衍生化的过程中采用了加热的条件，在此条件下，如果平衡透析过程中存在蛋白泄露，那么在加热衍生化的过程中，泄漏到平衡透析装置中透析缓冲液一侧的蛋白会在加热过程中变性，形成沉淀析出。如果在衍生反应之后，观察到蛋白沉淀，则表明平衡透析过程中出现了蛋白泄露，SHBG及与SHBG相结合的睾酮可能会进入平衡透析装置中透析缓冲液一侧，导致透析缓冲液中游离睾酮检测结果偏高，此时需要对待测样本进行复测；反之，如无沉淀产生，则表明平衡透析过程没有蛋白泄露。本实施例在方法开发初期采用购买的成品平衡透析膜进行平衡透析，经过统计，样本检测过程中的蛋白泄露率较高，如表8所示；后续将成品平衡透析膜更换为自裁式纤维素平衡透析膜，样本检测过程中的蛋白泄露率减低至0.27％，具体数据如表9所示。
表8、采用成品平衡透析膜进行平衡透析的蛋白泄漏情况统计
批次 衍生过程观察到絮状沉淀的样本数目 总测试数目 絮状沉淀百分比
第一批 55 237 23.2％
第二批 94 326 28.8％
第三批 127 284 44.7％
总计 276 847 32.6％
表9、自裁纤维素平衡透析膜进行平衡透析的蛋白泄露情况统计表
批次 衍生过程观察到絮状沉淀的样本数目 总测试数目 絮状沉淀百分比
第一批次 0 72 0
第二批次 0 96 0
第三批次 0 80 0
第四批次 1 103 0.97％
第五批次 0 24 0
总计 1 375 0.27％
由表8和9可见，采用购买的成品平衡透析膜进行平衡透析，出现蛋白泄漏的概率高达约30％，而采用本申请提供的自组装平衡透析装置，出现蛋白泄漏的概率大幅降低，约为0.27％；同时通过加热衍生化，精确指示蛋白泄漏情况，如发现泄漏则及时进行再次透析，从而避免了后续的液液萃取、提取剂的吹干以及样本的复溶等一系列进一步纯化过程，可见实现平衡透析过程的质量控制可以大大提高检测的准确性和精密性，并节省了大量的人工和时间成本。
实施例7：质控体系的方法验证
人体内大部分睾酮都以与性激素结合蛋白SHBG结合的形式存在，只有少量以游离睾酮形式存在。当向样本中添加游离睾酮时，添加的游离睾酮会与原内源睾酮达到动态的平衡，大部分添加游离睾酮仍然以与性激素结合蛋白SHBG相结合的形式存在，因此在进行游离睾酮检测时，无法通过直接向血清样本中添加游离睾酮，并计算其回收率来考察检验方法的准确度。
本实施例通过两套质控体系来考察检验方法的准确度和精密度。质控体系一，通过分别混合健康成年女性及健康成年男性的血清来制备游离睾酮项目的低质控及高质控样本，并将女性与男性样本按照1：1比例混合制备中质控样本，利用低、中、高三个浓度的质控品进行精密度验证；质控体系二，通过向平衡透析后的透析缓冲液中进行不同浓度的睾酮添加，进行透析后的添加回收实验，评估检验方法的准确度及精密度，结果分别如表10-12 所示。
表10、质控体系一的方法验证数据
Figure RE-GDA0003124290270000131
表11、女性样本平衡透析液的添加回收实验
Figure RE-GDA0003124290270000141
表12、男性样本平衡透析液的添加回收实验
Figure RE-GDA0003124290270000142
由表10、11、12可见，采用质控系统一或质控系统二时，不同水平样品的检测结果，CV小于15％，表明该评估检验方法的准确度及精密度完全满足要求。
实施例8：不同流动相对检测结果的影响
按实施例1提供的步骤完成样品制备，采用选用低浓度质控样本，进行前处理后，将 96孔板转移至LCMSMS仪器，进样分析，具体分析条件分两组，如下所示：
第一组：LC-MS/MS法采用的流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸甲醇溶液，采用反相色谱进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如表2所示，流动相的流速为0.6mL/min，液相色谱柱类型为C18柱，填料粒径为2.6μm，内径为2.1mm，柱长为50mm，进样量： 0.5μL。
第二组：LC-MS/MS法采用的流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％乙酸铵溶液，采用反相色谱进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如表2所示，流动相的流速为0.6mL/min，液相色谱柱类型为C18柱，填料粒径为2.6μm，内径为2.1mm，柱长为50mm，进样量：0.5μL。
以检测图谱中的峰高进行结果比对，对比结果见表13。
表13、流动相B分别为0.1％甲酸甲醇或时的检测逢高对比
Figure RE-GDA0003124290270000151
由表13可以看出，当流动相B为0.1％甲酸甲醇时，游离睾酮的峰面积为40850；当流动相B为0.1％乙酸铵时，游离睾酮的峰高为27560；可见流动相B为0.1％甲酸甲醇会显著提高游离睾酮检测的灵敏度。
实施例9：临床样本检测
本实施例采集临床多囊卵巢综合征患者血清样本进行游离睾酮检测，采用如实施例1 提供的检测方法，检测结果如表14所示，且CV小于15％，完全满足临床对血清样本中游离睾酮检测能力的实际需求。
表14、多囊卵巢综合征患者血清样本游离睾酮检测
样本编号 游离睾酮(pg/mL)
SA1 31.03
SA2 15
SA3 8.03
SA4 23.21
参考范围 ≤10.9pg/mL
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

Claims (10)

1.一种利用平衡透析合并LC-MS/MS技术测定人血清样本中游离睾酮含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)样本进行平衡透析，获得样本游离睾酮平衡透析液；
2)样本游离睾酮平衡透析液进行加热衍生化反应；
3)通过LC-MS/MS法检测游离睾酮含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的平衡透析采用96孔板自行组装成96孔高通量平衡透析装置，透析膜为自裁MWCO 10-30K纤维素膜。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述加热衍生化反应采用的衍生化试剂为盐酸羟胺水溶液；所述的加热衍生化反应条件为70～90℃。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的衍生化试剂为2～10％的盐酸羟胺水溶液，衍生化反应时间为15-60分钟。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的衍生化试剂与样本平衡透析液的体积比为1:10～1:20。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的加热衍生化反应结束后，需观察是否产生沉淀，如有沉淀，需对相应样本进行步骤1)的平衡透析；如无沉淀，则进行步骤3)的LC-MS/MS法检测游离睾酮含量。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的平衡透析条件为37℃，平衡透析缓冲液为pH7.4的HEPES缓冲液。
8.如权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的LC-MS/MS法采用的流动相A为含甲酸的水溶液，流动相B为含甲酸的甲醇溶液，进行梯度洗脱。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述样本包含人血清样本、质控样本和标准曲线；所述质控样本采用三个质控浓度，分别为混合成年男性血清样本制备的高浓度质控样本，和混合成年女性血清样本制备的低浓度质控样本，以及成年男性与成年女性血清样本按照1：1比例混合得到中浓度质控样本；采用睾酮的同位素内标对游离睾酮含量进行定量分析。
10.一种利用平衡透析合并LC-MS/MS技术测定人血清游离睾酮含量的检测试剂盒，其特征在于，包含标准曲线工作液，质控样本、内标工作液、透析缓冲液、加热衍生化试剂和液相洗脱溶液；其中所述加热衍生化试剂为2～10％的盐酸羟胺水溶液。
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