CN114674943B - 一种检测血清中25(oh)d2和25(oh)d3的液相色谱质谱串联检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测血清中25(OH)D2和25(OH)D3的液相色谱质谱串联检测方法，包括将待测血清样品与内标溶液混合，通过脂质去除分散固相萃取前处理得到检测液，采用超高效液相色谱质谱串联技术对所述检测液进行检测；本发明的方法操作简单，耗时少，灵敏度高，精密度高，有机试剂使用量少，对操作人员健康和环境友好，实际应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及医疗分析检测技术领域，更具体地，涉及一种检测血清中 25(OH)D2和25(OH)D3的液相色谱质谱串联检测方法。
背景技术
维生素D(VD)是人体必需的营养元素，随着人们对VD与健康的重要性认知的深入，对VD水平精准、快速、高效的测定的需求迅速增加。25羟基维生素D(25(OH)D)是VD在人体内的主要存在形式，由于其具有较长的半衰期及稳定性，通常被作为评价VD水平的指标。根据检测原理，现常用的测定血清25(OH)D的方法分为免疫分析法和色谱分析法。免疫分析法是利用抗原抗体的结合反应原理，不同类型的25(OH)D都能发生反应，因此不能准确定量单独一种羟基维生素D的浓度。由于色谱、质谱分析技术灵敏度高、特异性强，且能够同时检测多种物质，尤其是液相色谱质谱联用技术被公认为检测25(OH)D的“金标准”。
目前，液相色谱质谱测定血清中25(OH)D的方法分为直接测定法和高灵敏的衍生化法。由于现代质谱技术的进步和离子源技术的革新，直接测定法的灵敏度基本上可以满足一般的临床检测需求，当然前提是需辅以先进的样品预处理技术，降低基质效应，提高检测的灵敏度。
目前常见的预处理思路是采用甲醇、乙腈、丙酮或乙酸锌等沉淀蛋白，然后用正己烷、乙酸乙酯或两者不同比例混合溶剂萃取，氮气吹干用流动相复溶后检测。但这些提取和净化方法，操作较为繁琐；乙酸锌沉淀蛋白，不利于后续的质谱检测；用正己烷等有机溶剂萃取后氮气吹干，往往伴随着大量有机气体污染产生，既危害环境又损害分析者的身体健康；血清一般含有高浓度的盐、蛋白质、脂肪和磷脂等化合物，常见的预处理方式不能有效地去除磷脂、脂肪等有机化合物，由于脂类长链的疏水性，它们在反向色谱条件下会较晚被洗脱出来，更容易与羟基维生素D一起被洗脱，而造成质谱响应干扰。现有的技术缺乏简化前处理步骤、减少使用有机溶剂用量、净化效果好的高灵敏的环境友好型前处理方法。
上述2种羟基维生素D的结构式如图1所示，其中1为25(OH)D2；2为 25(OH)D3。
来自植物的麦角钙化醇，即维生素D2，或来自于动物的胆骨化醇，即维生素D3，或在紫外线照射下，皮肤将7-二氢胆固醇转化成的VD在肝脏 25-羟基化成25羟基维生素D2/D3，储存于脂肪组织，也在循环中与转运蛋白紧密结合。25(OH)D2和25(OH)D3对转运蛋白的亲和力不同，导致25(OH)D2和25(OH)D3对人体内VD状态的贡献不同。通过测定25(OH)D2和25(OH)D3来测定VD水平，在精准药物治疗与营养膳食理念方面具有重要意义。
25(OH)D水平低下的原因很多。常常包括缺乏阳光照射，摄入不足；吸收不足(乳糜泻)；继发于晚期肝病的肝脏VD的25羟基化酶活性低下；许多抗癫痫药，包括苯妥英钠、苯巴比妥和卡马西平等，可刺激肝脏酶形成，增加25(OH)D代谢。定量测定血清中25(OH)D2和25(OH)D3的浓度，能为临床医生辅助判断是否有VD水平异常相关的疾病提供依据。
在现有技术中，可以使用液相联用方法检测羟基维生素D，可对待测维生素进行分离富集，降低基质干扰，提高灵敏度。通常采用衍生化耗时长，氮气吹干有机试剂使用量大，造成人员伤害和环境污染。脂肪类杂质未去除，影响色谱柱和质谱仪器的使用寿命。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种检测血清中 25(OH)D2和25(OH)D3的液相色谱质谱串联检测方法，该方法具有前处理简单，检测速度快，精确度高，有机试剂使用少，对人员和设备友好的优点。
实现本发明目的的技术方案是：一种检测血清中25(OH)D2和25(OH)D3的液相色谱质谱串联检测方法，包括以下步骤：
S1将待测血清样品与内标溶液混合，通过脂质去除分散固相萃取得到检测液；
S2采用超高效液相色谱质谱串联技术结合同位素稀释法对检测液进行定量检测；
所述同位素内标溶液为含有25(OH)D2-d3和25(OH)D3-d6同位素内标物的甲醇溶液；
所述超高效液相条件为：
流动相A为0.1％(v:v)甲酸水溶液；
流动相B为0.1％(v:v)甲酸甲醇溶液；
柱温为40℃；
流动相梯度洗脱参数为：
高效液相色谱可以使用本领域中常用的色谱柱，为了提高分离效果和分离度，优选使用型号为HSS T3(1.8μm,2.1×100mm)的色谱柱；
质谱条件为：
离子化模式为正离子模式，检测采用多反应监测的质谱扫描模式。
上述技术方案所述高效液相色谱质谱串联技术采用三重四级杆质谱仪。
上述技术方案所述质谱条件具体为：
电离源为电喷雾离子源(ESI)，其中气帘气(CUR)流量为20psi，碰撞气(CAD)流量为9psi，喷雾气流量为55psi，辅助加热气流量为66psi，离子喷雾电压(IS)为5500V，加热温度(TEM)为600℃；
质谱检测参数为：
其中，*为定量离子。
上述技术方案的S1中，所述前处理为使用脂质去除分散固相萃取法进行前处理。
上述技术方案所述前处理具体包括：
(1)向100-300μL待测血清中加入20μL混合内标，涡旋后在避光处静置半小时；
(2)在混合液中加入600μL乙腈，涡旋后加入100-200μL饱和食盐水，震荡后在14000r/min离心3-8min得到样品上清液；
(3)在预称量50-200mg脂质分散固相萃取填料的EP管中加入50-200 μL水使填料活化，然后加入所述样品上清液500μL，涡旋后加入100μL 饱和食盐水，震荡后14000r/min离心3-8min；
(4)取上层清液，得到所述检测液。
上述技术方案结合S2得到检测结果和25(OH)D2、25(OH)D3的标准工作曲线，得到25(OH)D2和25(OH)D3在血清中的含量值。
上述技术方案所述25(OH)D2和25(OH)D3的标准工作曲线采用同位素内标定量法制得。
上述技术方案所述同位素内标定量法具体步骤包括：将已知且不同浓度的25(OH)D2和25(OH)D3的甲醇溶液和空白血清基质混合，经过前处理得到不同浓度的标准待测液，使用超高效液相色谱质谱串联技术对所述不同浓度的标准待测液分别进行检测，以标准检测液中25(OH)D2、25(OH)D3与内标物峰面积比为Y轴，标准检测液中25(OH)D2和25(OH)D3浓度为X轴，得到25(OH)D2和25(OH)D3的标准工作曲线；所述高效液相色谱质谱串联技术中的检测条件为步骤S2中的检测条件，前处理步骤与制备检测液的前处理步骤相同，标准待测液是将空白血清基质与不同浓度含有25(OH)D2和 25(OH)D3的标准混合液制得。
上述技术方案的高效液相色谱质谱串联技术中所有的参数与测定检测液的相应参数相同,标准待测液前处理中使用的内标混合液与制备检测液前处理步骤中使用的内标混合液相同。
上述技术方案所述空白血清基质为1％(质量体积浓度)牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液。
采用上述技术方案后，本发明具有以下积极的效果：
(1)本发明可以在较短时间内有效且准确地测定出25(OH)D2和 25(OH)D3，分离度好，质谱响应高。
(2)本发明通过脂质去除分散固相萃取法进行前处理，使得检测结果稳定性大大提高，与其他检测前处理方法相比，该方法操作简单，耗时少，有机试剂应用少，去除了氮吹步骤，减少了对人员伤害和环境污染，去除了脂肪类杂质，增加了色谱柱和质谱仪器的使用寿命。
(3)本发明使用高效液相色谱质谱串联检测技术，特异性强，选择性好，准确性远远高于传统的免疫分析法，可以真实反应人体内25(OH)D的水平，具有较高的应用价值，适合于临床医疗的生化检测。
(4)本发明灵敏度高，精密度高，有机试剂使用量少，对操作人员健康和环境友好，实际应用前景广阔。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为背景技术中的2种羟基维生素D的结构式示意图；
图2为本发明实施例2中流动相种类、是否添加甲酸、色谱柱种类对2 种羟基维生素色谱行为影响的离子流色谱峰图；
图3为本发明的实施例3中填料量对基质效应的影响结果柱状图。
具体实施方式
实施例1
本实施例所提供检测血清中25(OH)D2和25(OH)D3的液相色谱质谱串联检测方法，包括以下步骤：
1.材料和试剂
2.仪器设备
3.方法：
(1)色谱条件：
色谱柱为HSS T3(1.8μm,2.1×100mm)，流动相A为0.1％甲酸- 水溶液(超纯水)，B为0.1％甲酸甲醇溶液；流动相为0.4mL/min，柱温为 40℃，梯度洗脱；
流动相梯度洗脱参数为：
(2)质谱条件：
离子化模式为正离子模式，检测采用多反应监测的质谱扫描模式。电离源为电喷雾离子源(ESI)，其中气帘气(CUR)流量为20psi，碰撞气(CAD) 流量为9psi，喷雾气流量为55psi，辅助加热气流量为66psi，离子喷雾电压(IS)为5500V，加热温度(TEM)为600℃；
质谱检测参数为：
其中，*定量离子
(3)混合内标溶液配制：
分别准确称取1mg氘代同位素标品d3-25(OH)D2和d6-25(OH)D3，分别加入1mL甲醇完全溶解，得到浓度为1mg/mL的2种内标品母液，将其接着用甲醇稀释成所需浓度的混合内标溶液。
(4)混合标准溶液配制：
分别准确称取1mg 25(OH)D2和25(OH)D3的标准品分别加入1mL甲醇完全溶解，得到浓度为1mg/mL的标准品母液，将其用甲醇稀释成不同浓度的混合标准溶液。
(5)标准待测液配制：
称取10mg牛血清白蛋白，用磷酸缓冲溶液溶解后，定容至100mL，配置成1％牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液。取一定量牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液，分别加入不同浓度的混合标准溶液，得到不同浓度的标准待测液。
(6)样品前处理：
a.准备预活化的脂质分散固相萃取填料(Bond Elut EMR-Lipid)EP 管：在EP管中预称量200mg Bond Elut EMR-Lipid填料，加入100μL 纯水后涡旋5秒待用。
b.分别取200μL标准待测液和检测液，分别加入20μL混合内标，涡旋后在避光处静置半小时。在混合液中分别加入600μL乙腈，涡旋混合器上混合30s涡旋后分别加入100μL饱和食盐水，涡旋5s震荡后在 14000r/min离心5min，取500μL上清液到预活化的脂质分散固相萃取填料(Bond Elut EMR-Lipid)的EP管。涡旋混合器上混合30秒涡旋后再分别加入100μL饱和食盐水，涡旋5s震荡后在14000r/min离心5min，吸取300μL上清液于高效液相进样瓶，上机待测。
4.检测结果
采用同位素内标定量法，以标准物与内标峰面积比为Y轴，标准物浓度为X轴，建立标准工作曲线。
所得的25(OH)D2和25(OH)D3的线性方程和检测液中的浓度计算结果如下表1所示。
表1 2种羟基维生D的线性方程和检测液中的浓度结果计算结果
实施例2
本实施例所提供的检测血清中25(OH)D2和25(OH)D3的液相色谱质谱串联检测方法，其步骤与实施例1的步骤相同，区别仅在于：
色谱柱为BEH C18(1.8μm,2.1×100mm)，流动相A为0.1％甲酸 -水溶液(超纯水)，B为0.1％甲酸甲醇溶液。
2种羟基维生素完成检测，所测得灵敏度都降低了30％，分离度和实施例1相近。
对比例1
本实施例所提供的检测血清中25(OH)D2和25(OH)D3的液相色谱质谱串联检测方法，其步骤与实施例1的步骤相同，区别仅在于：
色谱柱为BEH C18(1.8μm,2.1×100mm)，流动相A为0.1％甲酸 -水溶液(超纯水)，B为0.1％甲酸乙腈溶液。
2种羟基维生素完成检测，所测得灵敏度都降低了60％，分离度和实施例1相近。
对比例2
本实施例所提供的检测血清中25(OH)D2和25(OH)D3的液相色谱质谱串联检测方法，其步骤与实施例1的步骤相同，区别仅在于：
色谱柱为BEH C18(1.8μm,2.1×100mm)，流动相A为水溶液(超纯水)，B为乙腈溶液。
2种羟基维生素完成检测，所测得灵敏度都降低了80％，分离度和实施例1相近。
具体检测结果如图1所示，T3 MeOH FA，表示色谱柱为HSS T3(1.8μm, 2.1×100mm)，流动相A为0.1％甲酸-水溶液(超纯水)，B为0.1％甲酸甲醇溶液；C18 MeOH，表示色谱柱为BEH C18(1.8μm,2.1×100mm)，流动相A为水溶液(超纯水)，B为甲醇溶液。C18 ACN，表示色谱柱为BEH C18(1.8μm,2.1×100mm)，流动相A为水溶液(超纯水)，B为乙腈溶液。C18ACN FA,表示色谱柱为BEH C18(1.8μm,2.1×100mm)，流动相A为0.1％甲酸-水溶液(超纯水)，B为0.1％甲酸乙腈溶液。C18 MeOH FA，表示色谱柱为BEH C18(1.8μm,2.1×100mm)，流动相A为0.1％甲酸-水溶液(超纯水)，B为0.1％甲酸甲醇溶液。
实施例3
本实施例所提供的检测血清中25(OH)D2和25(OH)D3的液相色谱质谱串联检测方法，其步骤与实施例1的步骤相同，区别仅在于：
准备预活化的脂质分散固相萃取填料(Bond Elut EMR-Lipid)EP管：在EP管中预称量不同质量的Bond Elut EMR-Lipid填料，分别是不添加填料，称量50mg，100mg和200mg填料，分别加入100μL纯水后涡旋5 秒待用。
不同填料对样品的净化程度，用基质效应评价。
基质效应的计算公式为：
具体结果如图2的(a)和(b)所示。图中none代表的是不添加填料， 50mg，100mg,和200mg分别代表称量50mg，100mg,和200mg。25(OH)D2的基质效应从61.3％减低至17.2％，25(OH)D3的基质效应从43.3％降低至 15.7％。
实验例1
对实施例1中检测血清中25(OH)D2和25(OH)D3的液相色谱质谱串联检测方法进行方法学验证实验。
1.精密度试验
取实际血清样品，加入一定浓度的标准品，进行精密度实验。日内精密度实验是在一天内，分5个时间点测量样品浓度，计算样品浓度的标准偏差；日间精密度是连续3天，分别测量样品浓度，计算样品浓度的标准偏差。方法学验证实验数据如表2所示。
2.加标回收率
制备一批混合血清，测得本底浓度，在样本中分别加入低、中、高三水平的浓度，进行加标回收实验，其中每个浓度检测6次。
3.定量限实验
制备一批混合血清，测得本底浓度，向样本中逐渐减少添加标准品浓度，直到添加的浓度的出峰响应为基线响应的十倍，该添加浓度则认定为定量限。
表2 25(OH)D2和25(OH)D3的精密度、添加回收和定量限实验数据
本发明采用脂质去除分散固相萃取法进行前处理，利用高效液相色谱质谱串联检测技术检测血清中25(OH)D2和25(OH)D3。该方法大大改善传统免疫分析法中交叉反应强，特异性差，准确度低等问题；且该发明方法与其他液相质谱串联检测前处理方法相比，该方法操作简单，耗时少，有机试剂应用少，去除了氮吹步骤，减少了对人员伤害和环境污染。去除了脂肪类杂质，增加了色谱柱和质谱仪器的使用寿命。
上述结果表明，本发明的检测方法日内精密度，日精精密度≤7.2％，说明该方法精密度良好，加标回收率在97.5-108.0％之间，回收率标准偏差小于6％，满足临床对于生物样本的回收率的要求。
综上所述，该方法精密度良好，特异性强，准确度高，操作简单，人机友好，满足临床检测要求。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种检测血清中25(OH)D2和25(OH)D3的液相色谱质谱串联检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1将待测血清样品与内标溶液混合，使用脂质去除分散固相萃取法进行前处理，得到检测液；所述脂质去除分散固相萃取法采用的填料为Bond Elut EMR填料；
S2采用超高效液相色谱质谱串联技术结合同位素稀释法对检测液进行定量检测；
所述内标溶液为含有25(OH)D2-d3和25(OH)D3-d6同位素内标物的甲醇溶液；
所述超高效液相条件为：
流动相A为体积比为0.1%的甲酸水溶液；
流动相B为体积比为0.1%的甲酸甲醇溶液；
柱温为40℃；
流动相梯度洗脱参数为：
；
质谱条件为：
离子化模式为正离子模式，检测采用多反应监测的质谱扫描模式；
所述质谱条件具体为：
电离源为电喷雾离子源，其中气帘气流量为20 psi，碰撞气流量为9 psi，喷雾气流量为55 psi，辅助加热气流量为66 psi，离子喷雾电压为5500 V，加热温度为600℃；
色谱柱是HSS T3。
2.根据权利要求1所述的检测血清中25(OH)D2和25(OH)D3的液相色谱质谱串联检测方法，其特征在于，质谱检测参数为：
；
其中，*为定量离子。
3.根据权利要求1所述的检测血清中25(OH)D2和25(OH)D3的液相色谱质谱串联检测方法，其特征在于，所述前处理具体包括：
（1）向100-300 μL待测血清中加入20 μL混合内标，涡旋后在避光处静置半小时；
（2）在混合液中加入600 μL乙腈，涡旋后加入100-200 μL饱和食盐水，震荡后在14000r/min离心3-8 min得到样品上清液；
（3）在预称量50-200 mg脂质分散固相萃取填料的EP管中加入50-200 μL水使填料活化，然后加入所述样品上清液500 μL，涡旋后加入100 μL饱和食盐水，震荡后14000 r/min离心3-8 min；
（4）取上层清液，得到所述检测液。
4.根据权利要求1或2所述的检测血清中25(OH)D2和25(OH)D3的液相色谱质谱串联检测方法，其特征在于，结合S2得到检测结果和25(OH)D2、25(OH)D3的标准工作曲线，得到25(OH)D2和25(OH)D3在血清中的含量值。
5.根据权利要求4所述的检测血清中25(OH)D2和25(OH)D3的液相色谱质谱串联检测方法，其特征在于，所述25(OH)D2和25(OH)D3的标准工作曲线采用同位素内标定量法制得。
6.根据权利要求5所述的检测血清中25(OH)D2和25(OH)D3的液相色谱质谱串联检测方法，其特征在于，所述同位素内标定量法具体步骤包括：将已知且不同浓度的25(OH)D2和25(OH)D3的甲醇溶液和空白血清基质混合，经过前处理得到不同浓度的标准待测液，使用超高效液相色谱质谱串联技术对所述不同浓度的标准待测液分别进行检测，以标准检测液中25(OH)D2、25(OH)D3与内标物峰面积比为Y轴，标准检测液中25(OH)D2和25(OH)D3浓度为X轴，得到25(OH)D2和25(OH)D3的标准工作曲线。
7.根据权利要求6所述的检测血清中25(OH)D2和25(OH)D3的液相色谱质谱串联检测方法，其特征在于，所述空白血清基质为质量体积浓度为1%的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液。
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| Title |
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