CN114593979A - 一种基于质谱检测体液样本里中低丰度蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于质谱检测样品中低丰度蛋白的方法，包括：1)仅对一组样品中的高丰度蛋白去除，实现低丰度蛋白的富集，作为后续检测的增强通道样品；2)将增强通道样品和普通通道样本采用高通量标记法进行质谱分析，得到体液中各类蛋白的定量结果。本发明在高通量标记法的基础上，在保留样本高丰度蛋白的前提下，利用增强通道大幅提高血液低丰度蛋白质谱检测覆盖率。此方法能帮助更多的研究者找到真正与疾病相关的血液蛋白标志物，助力各类疾病的诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体的说涉及一种检测或辅助检测体液样品里面的中低丰度蛋白的方法。
背景技术
疾病的早期诊断对于控制疾病发展及预后至关重要，在实际的临床检测中，人们采用无创的体液检测方法对多种疾病进行早期诊断。血液是最常用的体液检验样本，其中的蛋白质是常用疾病诊断标志物。目前已有一百多种基于血液蛋白标志物的体外诊断方法得到临床应用，包括传染病，神经系统疾病，癌症，糖尿病，心血管疾病的诊断和产前诊断等。近年来质谱技术的快速发展及对医疗精准化的需求，使得通过质谱检测发现血液蛋白诊断标志物的相关研究越来越受重视。TMT(Tandem Mass Tag)是蛋白质组学领域最常用的高通量多肽标记定量技术，采用多种同位素的标签，标记不同样本中多肽的氨基基团，可同时在质谱上比较多达18种样品之间的蛋白质表达量，已被广泛应用于血液蛋白质组学领域。
但血液蛋白组分析一直面临着困难，其根本原因在于在血液中的蛋白质浓度差异很大，达1012数量级，质谱检测难以覆盖浓度范围如此之大的样品检测。血液中14种高丰度蛋白占血液中蛋白总量的95％，极大影响了其余低丰度蛋白的检测。质谱需要增加覆盖率，深入到低丰度区，才能检测到在疾病初期有诊断意义的蛋白。为了增加蛋白检出率，人们采用去除血液样本中高丰度蛋白的预处理方法，实现血液中低丰度蛋白的检测。但是该方法操作繁琐，增加成本，极大限制了血液蛋白质组的检测效率和应用范围。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于质谱检测体液样品里中低丰度蛋白的方法。
本发明提供一种基于质谱检测样品里中低丰度蛋白的方法，包括：
1)仅对一组样品中的高丰度蛋白去除，实现低丰度蛋白的富集，作为后续检测的增强通道样品；
2)将增强通道样品和普通通道样本采用高通量标记法进行质谱分析，得到体液中各类蛋白的定量结果。
对于所述步骤1
在血液中浓度高于1E7 pg/mL的蛋白为高丰度蛋白,其余为中低丰度蛋白。所述方法的高丰度蛋白去除柱中可以去除14种血液中的高丰度蛋白，占血液蛋白总量的95％，每种蛋白的浓度在1E7至5E10 pg/mL。下表中列举了一些高丰度蛋白：
所述样品为体液样品，所述体液样品可以为血液、唾液、脑脊液、关节液或尿液等多种体液类型。
所述样品为血液样品，所述血液样品可以为血浆或血清。
所述样品为血液样品，所述步骤1)中去除血液高丰度蛋白方法包括但不限于使用Top14高丰度蛋白去除离心柱。其他高丰度蛋白去除方法也可使用，需保证去除95％以上的高丰度蛋白。其他提高中低丰度蛋白的方法也可使用，比如采用纳米粒子富集中低丰度蛋白,需保证总富集率大于20倍，或者采用合成的单一蛋白或几种蛋白的混合物作为增强通道样本，需保证合成样品中蛋白的浓度与血样中蛋白的浓度比不高于100倍。
本发明还提供一种低丰度蛋白检测系统，包括预处理装置和蛋白检测装置；所述预处理装置用于去除样品中的高丰度蛋白并富集低丰度蛋白；所述蛋白检测装置通过高通量标记法进行蛋白的检测。
所述检测系统可以依托液相色谱与质谱联用系统实现。
所述系统的样品为液体样品。
所述液体样品为血液样品。
所述样品为血液样品，所述预处理装置包括Top14高丰度蛋白去除离心柱。
所述高通量标记法包括但不限于TMT6plex、TMT10plex、TMT11plex、TMTpro16plex、TMTpro18plex和iTRAQ等。
所述蛋白检测装置还包括质谱仪。
上述低丰度蛋白检测系统在检测或辅助检测样品中低丰度蛋白中的应用也应在本发明的保护范围之内。
本发明的有益效果在于：在高通量标记法的基础上，在保留样本高丰度蛋白的前提下，利用增强通道大幅提高血液低丰度蛋白质谱检测覆盖率。此方法能帮助更多的研究者找到真正与疾病相关的血液蛋白标志物，助力各类疾病的诊断。
附图说明
图1为增强通道提高低丰度蛋白覆盖率的原理示意图。
图2为有无增强通道法的实验技术路线图对比。
图3为实施例1中的实验设计示意图；
图4为实施例2中的实验设计示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明涉及一种检测血液样品中低丰度蛋白的方法，通过增强通道提高血液中低丰度蛋白的质谱检测覆盖率，这是增强通道法首次被应用于血液蛋白质组学。创新点还包括增强通道的样本采用去除高丰度蛋白后的实际检测样本制备。
增强通道的原理如下：TMT高通量标记法通过质谱对蛋白进行定量分析时，不同样本中的同一种肽段被标记后具有相同的质荷比，可被同时选择进行二级甚至三级碎裂，产生质量不同的报告离子来定量。质谱检测时，通常只能检测相对丰度高的肽段，而忽略相对丰度低的肽段。新增的增强通道样本中的肽段，可以极大增加混合样本中低丰度肽段的相对丰度，从而大幅增加被检测到的概率，最后通过报告离子将其他通道中低丰度肽段统一定量(如图1所示)。
本实施例提供一种检测体液样本里中低丰度蛋白的方法，如图2所示，图2中的黑色部分为普通经典的TMT多通道血液蛋白质组学的步骤，灰色部分为增强通道法特有的步骤，具体包括：
1)将n个血液样本，按照常规的方法，分别取1μL，经过尿素裂解后检测蛋白浓度，每个样本取样A，依次进行还原烷基化、胰酶酶解、脱盐、旋干、复溶，然后用TMT试剂标记得到普通通道样本。
2)将n个血液样本每个取1-2μL，合并得到混合样本，取10μL混合样本用高丰度蛋白去除柱去除高丰度蛋白，将去除高丰度蛋白的混合样本，经过尿素裂解，取样B，同样进行还原烷基化、胰酶酶解、脱盐、旋干、复溶，然后用TMT试剂标记得到增强通道样本。
3)将普通通道样本与增强通道样本混合，随后进行脱盐，并使用LC-MS进行分析。
其中，A与B的样本量:若用14种高丰度蛋白去除柱除去约95％蛋白，则B中蛋白量是A的1-5倍，富集程度为20-100倍。换句话说，普通通道与增强通道起始血清用量比值为1：20-1：100，即如果普通通道蛋白量为20μg，对应起始血清用量为0.2μL，则增强通道为4-20μL合并血清去除14种高丰度蛋白的产物。
实施例1
通过本发明的方法，对正常人血清样本进行检测，具体方法如下：
1.增强通道样品的制备
取10μL来自临床健康体检志愿者的血清样本，用High-SelectTMTop14高丰度蛋白去除中型离心柱(Thermo Scientific#A36371)去除高丰度蛋白。将10μL血清样品直接添加到色谱柱中的树脂浆液中，在室温下轻轻颠倒混合，并孵育10分钟后离心收集滤液。
2.质谱检测样品的制备
取1μL与步骤1相同的血清样本，溶解在200μL尿素裂解液(9M尿素，20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸)中。取步骤1中样本滤液，添加2mL尿素裂解液。所有样本用Pierce BCA试剂盒测定蛋白浓度，之后取适量溶解的血清蛋白溶液，加入二硫苏糖醇至4.5mM室温反应1小时，加入碘乙酰胺至10mM，避光室温反应半小时。按照质量比胰酶：蛋白＝1:20(w:w)加入胰酶，室温过夜。溶液中加入甲酸至0.1％，使用Stagetip C18脱盐后备用。
3.样品的TMTpro试剂标记
分别取1μg及3μg步骤2中获得的肽段，及步骤1中获得的增强通道样本的肽段(从100μg混合血清中去除高丰度蛋白后得到的大约3μg蛋白)，按照下面的方法进行TMTpro试剂标记：
将肽段样本加入100mM四乙基溴化铵缓冲液100μL，随后加入30μL的乙腈及相应通道的TMTpro试剂，混匀后在室温反应1个小时。在各样本中加入羟胺至0.3％浓度终止反应。按图3所示，将1μg，3μg肽段样本混合，或将各通道样本和增强通道样本进行混合，之后使用StagetipC18脱盐，得到无增强通道及有增强通道的样本
4.LC-MS检测
分别将步骤3的得到的样品旋干后，使用0.1％甲酸溶液复溶。使用UltiMate3000nanoUHPLC串联Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪(Thermo Scientific)进行检测。液相中溶液A为0.1％甲酸水溶液，B为80％乙腈、0.1％甲酸水溶液。液相梯度为B(80％乙腈，0.1％甲酸)溶液在300分钟内从4％升至50％，流速0.3μL/min。质谱方法采用Thermo TMT实时搜索方法，使用离子阱检测二级谱图,实时搜索后进行SPS3MultinotchMS3检测。质谱数据用Proteome Discoverer2.4软件(Thermo Scientific)进行分析。
上述方法中，在增强通道中，取用100μg血清蛋白富集纯化后的产物(本实验用抗体离心柱去除14种高丰度蛋白，纯化后蛋白量约为5μg)，经酶解制成增强通道样本(具体方法如步骤2所示)。将步骤2制备的增强通道样本进行TMT标记后与TMT标记后的普通通道样本混合，将混合后的样本进行LC-MS分析。
本实施例用Thermo Orbitrap Eclipse质谱仪的multinotch MS3方法分析肽段，最后用Proteome Discoverer(PD)软件搜索数据库，并进行报告碎片离子定量。结果如表1-3所示。
表1中展示了两种方法鉴定蛋白数量的结果，定量蛋白数只包括所有通道都被定量的蛋白。增强通道法在相同条件下能显著提高血液蛋白质组定性定量深度。
表1：有无增强通道对蛋白对蛋白定性及定量数量对比表。
| 鉴定血清蛋白数量 | 定量血清蛋白数量 | |
| 无增强通道 | 160 | 70 |
| 增强通道 | 249 | 162 |
如表2所示，用增强通道法及无增强通道的方法对1μg与3μg血清蛋白进行三次平行实验检测。所有共同定量的蛋白CV中间值都在20％之内，有增强通道和没有增强通道的方法进行对比，可以说明两种方法定量精确度没有显著差别。
表2.有无增强通道对蛋白定量的重复性对比。
如表3所示，样本中血清蛋白量为3μg及1μg，比率预期为3：1。对所有共同定量的蛋白比率做统计，有增强通道的方法测得的蛋白比率中位值为3.6：1，而用无增强通道法测得比率中位值为3.5：1。这证明了增强通道法能保持定量数据的准确性。
表3.有无增强通道对相对定量准确度的比较。
| 方法 | 比率中间值 | q value | |
| 3μg:1μg | 无增强通道 | 3.5 | 0.038 |
| 增强通道 | 3.6 | 0.039 |
实施例2
通过本发明的方法，对7例肝癌病人及7例正常人血清样本进行检测，具体方法如下：
1.增强通道样本的制备
将14例患者及健康人的血清样本进行等比例混合。取10μL混合血清样品，用High-SelectTMTop14高丰度蛋白去除中型离心柱(Thermo Scientific#A36371)去除高丰度蛋白。将10μL血清样品直接添加到色谱柱中的树脂浆液中，在室温下轻轻颠倒混合，孵育10分钟后离心搜集滤液。
2.质谱检测样品的制备
分别取7例肝癌病人及7例正常人血清样本各1μL溶解在200μL尿素裂解液(9M尿素，20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸)中。取步骤1中增强通道样本滤液，添加2mL尿素裂解液。所有样本用Pierce BCA试剂盒测定蛋白浓度，之后取适量溶解的血清蛋白溶液，加入二硫苏糖醇至4.5mM室温反应1小时，加入碘乙酰胺至10mM，避光室温反应半小时。按照质量比胰酶：蛋白＝1:20(w:w)加入胰酶，室温过夜。溶液中加入甲酸至0.1％，使用Stagetip C18脱盐后备用。
3.样品的TMTpro试剂标记
分别取相应14例血清样品及增强通道样品，按照下面的方法进行TMTpro试剂标记：
将肽段样本加入100mM四乙基溴化铵缓冲液100μL，随后加入30μL的乙腈及相应通道的TMTpro试剂，在室温反应1个小时。在各样本中加入羟胺至0.3％浓度终止反应。按图4所示，将各通道样本和增强通道样本进行混合，之后使用StagetipC18脱盐，得到无增强通道及有增强通道的样本。
4.LC-MS检测
分别将步骤3的得到的样品旋干后复溶在0.1％甲酸溶液中，进行高pH反相HPLC预分离，随后用stagetipC18脱盐。使用UltiMate3000 nanoUHPLC串联Orbitrap EclipseTribrid质谱仪(Thermo Scientific)进行检测。液相中溶液A为0.1％甲酸水溶液，B为80％乙腈、0.1％甲酸水溶液。液相梯度为B溶液(80％乙腈，0.1％甲酸)在300分钟内从4％升至50％，流速0.3μL/min。质谱方法采用Thermo TMT实时搜索方法，使用离子阱检测二级谱图,实时搜索后进行SPS3 Multinotch MS3检测。质谱数据用Proteome Discoverer2.4软件(Thermo Scientific)进行分析。
结果如表4所示，在实际血液蛋白质组学应用研究中，增强通道可显著提高蛋白检出率。
表4:不同方法对7例肝癌病人与7例正常人组血液蛋白检测结果对比
从表4可以看出，通过本发明的方法，能够检测出552种血清蛋白(是普通检测的2.75倍)，其中能够定量的血清蛋白为210种(是普通检测的2.5倍)；同时肝癌病人与正常人的特异性蛋白的检出数量为28种(普通检测仅有18种)。这一数据表明，本发明的方法能够显著增加蛋白的检出数量，并为中低丰度蛋白的研究提供检测保障和便利条件。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种检测或辅助检测样品中低丰度蛋白的方法，其特征在于，包括：
1)通过对待测样品中的一组进行预处理，将样品中的高丰度蛋白去除，使低丰度蛋白富集，得到增强通道样品；
2)将增强通道样品与其余的待测样品混合，采用高通量标记法进行质谱分析，得到蛋白的定量结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本为液体样本。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样本为血液样本或者尿液样本等体液样本。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述样本为血液样本，所述步骤1)中通过高丰度蛋白去除离心柱去除高丰度蛋白。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高通量标记法包括TMT6plex、TMT10plex、TMT11plex、TMTpro16plex、TMTpro18plex、iTRAQ中的至少一种。
6.一种低丰度蛋白检测系统在检测样品中低丰度蛋白中的应用，所述低丰度蛋白检测系统包括预处理装置和蛋白检测装置；所述预处理装置用于去除样品中的高丰度蛋白并富集低丰度蛋白；所述蛋白检测装置通过高通量标记法进行蛋白的检测。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述样品为液体样品；所述液体样品为血液样本或尿液样本等体液样本。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述样品为血液样品，所述预处理装置包括高丰度蛋白去除中型离心柱。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述蛋白检测装置包括用于TMT高通量标记法的装置。
10.根据权利要求6-9任一所述的应用，其特征在于，所述蛋白检测装置还包括质谱仪。
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