CN112710755A - 一种血清/血浆蛋白质组分析新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血清/血浆蛋白质组分析新方法。本发明采用不同基团修饰的混合纳米颗粒可有效吸附不同种类的血清/血浆蛋白，实现血清/血浆中低丰度蛋白的选择性富集，有效避免了质谱鉴定时血清/血浆中高丰度蛋白对低丰度蛋白鉴定的干扰，结合反相C18柱在线分离与质谱数据非依赖型数据采集模式，可实现100min色谱梯度下对大于1500种血清/血浆蛋白的定性定量分析。本发明方法具有如下优势：不需要昂贵的商业化血清/血浆高丰度蛋白去除装置，只需要使用廉价易得的纳米颗粒，就可以完成血清/血浆中低丰度蛋白的选择性富集；操作简单：该方法只需要通过孵育‑离心‑清洗‑离心4个环节就可完成血清/血浆中低丰度蛋白的富集，避免人为复杂操作导致的误差。

Description

一种血清/血浆蛋白质组分析新方法
技术领域
本发明涉及一种血清/血浆蛋白质组分析新方法，属于蛋白质组分析领域。
背景技术
血清/血浆是唯一可以在身体各器官间内自由流动的液体，血清/血浆中不仅包括维持血清/血浆自身功能的蛋白，还含有全身其它组织器官释放的蛋白，目前推测血清/血浆中包含的蛋白种类已经超过10000余种，血清/血浆中蛋白的种类及丰度变化蕴藏着巨大的临床生理或病理信息，因此血清/血浆已经成为临床生物标志物研究的主要研究对象。国际人类血浆蛋白质组计划(Human Plasma Proteome Project，HUPO HPPP)的发起，就是要实现人类血浆蛋白成分的全面分析，确定不同人种间血浆蛋白组的差异或不同病理与生理状态的个体差异。目前基于液相色谱-质谱技术的血清/血浆蛋白质组学研究飞速发展，可以实现一次性对几百种血浆/血清蛋白的同时定性/定量分析，然而血浆/血清蛋白具有丰度差异大、动态范围宽等特点，血浆中含量最高的18种蛋白总含量达到了血浆总蛋白含量的97％～99％，因此给血浆/血清蛋白的分离、检测带来了巨大的挑战。不去除高丰度蛋白的情况下，目前的质谱技术仅能达到300个左右血浆protein groups的鉴定规模，去除血浆/血清高丰度蛋白后可检测400～700个左右血浆protein groups，检测到其中大部分是血清/血浆功能相关的蛋白，这些蛋白能否真实代表疾病状态，还有待研究。基于液相色谱-质谱方法的血浆/血清蛋白分析前，需要高丰度蛋白的去除或多级分离来增加低丰度蛋白的鉴定规模，目前的血浆/血清高丰度蛋白去除方法包括：有机溶剂沉淀、免疫亲和、多级色谱分离等，目前使用最多的还是基于免疫亲和的高丰度蛋白去除技术，如：染料亲和层析法是利用辛巴蓝或其它修饰形式的染料作为配基，亲和捕获血浆/血清中高丰度的清蛋白。免疫亲和层析是利用免疫球蛋白作为配基，与血浆/血清中的目标高丰度蛋白结合而将其去除。然而作为临床诊疗生物标志物的筛选来源，血清/血浆样本是否需要去除高丰度，目前仍是争议不断。尽管高丰度蛋白的高效去除可以提高质谱检测的蛋白鉴定深度，但去除操作时与高丰度蛋白相互结合/相互作用的蛋白也会随之损失，因此处理后的样品无法代表血液蛋白真实的生理状态，同时复杂的操作步骤也会引入额外人为误差。因此，血浆/血清样品不去除高丰度蛋白是最理想的选择。然而，不去除高丰度蛋白的情况下，目前的质谱技术所鉴定的血清/血浆蛋白数有限，目前所发现的23％的生物标志物主要集中在这300个高丰度蛋白中。如果需要筛选更多与疾病直接相关，而非血清/血浆活动相关的蛋白，则需要发展更好的血清/血浆蛋白制备及检测方法，实现对血清/血浆蛋白质组样品的定性及定量深度覆盖研究。
发明内容
本发明针对目前血清/血浆蛋白质组样品制备方法的局限性，系统优化了基于不同表面基团修饰的纳米颗粒对血清/血浆蛋白的选择性吸附能力，实现了不采用商业化产品去除高丰度血清/血浆蛋白的情况下，结合质谱数据非依赖型采集模式，实现了对血清/血浆蛋白质组的定性与定量深度覆盖研究。
本发明所提供的血清/血浆蛋白质组样品的制备方法，包括如下步骤：
S1、将血清/血浆样品进行低温低速离心，去除细胞碎片等沉淀，保留上清液；
S2、向所述上清液中加入表面基团修饰的纳米颗粒，得到混悬液；
所述表面基团修饰的纳米颗粒为表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒、表面氨基修饰的SiO2纳米颗粒、表面兼性离子修饰的SiO2和TiO2纳米颗粒的混合物；
S3、将所述混悬液进行高速离心，去除上清液，保留沉淀Ⅰ；
S4、采用清洗缓冲液重悬所述沉淀Ⅰ重悬得到重悬液，将所述重悬液高速离心后去除上清，保留沉淀Ⅱ；
S5、采用消化缓冲液重新溶解所述沉淀Ⅱ，然后加入测序级的胰蛋白酶，经酶解即得血清/血浆蛋白质组样品；
所述消化缓冲液中包含能打开二硫键的还原剂以及烷基化巯基的烷基化试剂物。
上述的制备方法中，步骤S1中，所述血清/血浆样品的用量为100μl～10000μl；
所述低温低速离心的条件如下：
离心力为800～1500RCF，温度为2～8℃，时间为5～20分钟。
上述的制备方法中，步骤S2中，各种表面基团修饰的纳米颗粒可根据现有方法进行制备，也可根据下述方法进行制备：
请确认下述制备过程：
可按照stober法制备表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒，可按照下述步骤进行：将正硅酸乙酯(TEOS)乙醇溶液迅速加入到氨水、乙醇和水的混合溶液中，搅拌后密封条件下室温反应，将得到的混悬液离心收集生成的SiO2，采用乙醇洗涤后真空干燥所得白色粉末即为表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒；具体地，可将9mL28％的氨水、16.25mL乙醇、24.75mL去离子水混合；将体系分数为9％的正硅酸乙酯(TEOS)乙醇溶液50ml迅速加入到上述混合液中，搅拌1分钟，将搅拌速度降低至300rpm后用胶塞封口，室温下继续反应2小时，将生成的混悬液取出后2000RCF离心。
可按照下述方法制备表面氨基修饰的SiO2纳米颗粒：将表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒加入到硅烷偶联剂的乙醇溶液中进行反应即得；具体地，所述硅烷偶联剂可为3-氨基丙基三乙氧基硅烷(((3-Aminopropyl)triethoxysilane，APTES)，所述硅烷偶联剂的用量可为1mL/50mg表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒；可在室温下反应24h；反应结束后，可采用无水乙醇反复离心洗涤SiO2颗粒以除去未反应的硅烷偶联剂，并进行真空干燥。
可按照下述方法制备TiO2纳米颗粒：将四氯化钛(TiCl4)水溶液缓慢滴加至氨水溶液中，至体系pH值为8.0，反应结束后收集白色沉淀；将白色沉淀分散于无水乙醇中，置于聚四氟乙烯内衬不锈钢高压反应釜中进行反应即得；具体地，所述将四氯化钛(TiCl4)水溶液的摩尔浓度为0.2mol/L，氨水溶液的浓度为0.5mol/L，滴加过程中保持磁力搅拌；将所述聚四氟乙烯内衬不锈钢高压反应釜放置在鼓风干燥箱中150℃反应10小时；可将所得产物过325目筛。
可按照下述方法制备表面兼性离子修饰的SiO2纳米颗粒：表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒与2-溴-2-甲基-N-(3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基)丙酰胺(SI-ATRP引发剂)反应(可于37℃反应12h)后，加入SI-ATRP聚合反应液，经反应(密闭反应4小时)即得；具体地，所述SI-ATRP聚合反应液的配比如下：N,N-二甲基-N-丙烯酰氧乙基-N-丙基磺酸铵：氯化亚铜：氯化铜：1，1，4，7，7-五甲基二亚乙基三胺的摩尔比为：200：1：0.1：1.5。
所述表面基团修饰的纳米颗粒中，所述表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒、所述氨基修饰的SiO2纳米颗粒、所述表面兼性离子修饰的SiO2与所述TiO2纳米颗粒的质量比为1：1～2：1～2：1～2，优选1：1：1：1；
所述表面基团修饰的纳米颗粒的用量为0.5～2μg/μl所述血清/血浆样品；
所述表面基团修饰的纳米颗粒的粒径可为200～500nm。
上述的制备方法中，步骤S2中，加入所述表面基团修饰的纳米颗粒后于25～37℃下孵育30～120分钟。
上述的制备方法中，步骤S3中，所述高速离心的条件如下：
离心力为8000～22000RCF，温度为2～8℃，时间为60～120分钟。
上述的制备方法中，步骤S4中，所述清洗缓冲液为含有质量浓度为0.05％的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate，CHAPS)的PBS缓冲液，pH值为7～8；
加入所述清洗缓冲液后用移液枪头反复吹打4～6次。
所述高速离心的条件如下：
离心力为8000～22000RCF，温度为2～8℃，时间为60～120分钟。
上述的制备方法中，步骤S5中，所述消化缓冲液为含有0.01～1％的脱氧胆酸钠(Sodium Deoxycholate，SDC)、5～20mM三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP)和30～45mM氯乙酰氨(2-Chloroacetamide，CAA)的碳酸氢铵缓冲液或TAEB缓冲液，pH值为8.0～8.5；
所述还原试剂为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦；
所述烷基化试剂为碘乙酰胺或氯乙酰胺；
加入所述消化缓冲液后于45～95℃条件下反应10～45分钟；
所述胰蛋白酶的加入量为1～10ng/μl所述血清/血浆样品；
所述酶解的条件为：
温度为25～37℃，时间为6～16小时。
本发明提供的血清/血浆蛋白质组样品可用于血清/血浆中低丰度蛋白的检测。
本发明进一步提供了血清/血浆蛋白质组样品的质谱分析方法，包括在多肽水平的分离、质谱鉴定：
首先按照上述方法制备血清/血浆蛋白质组样品，然后采用液相色谱-串联质谱(数据非依赖型采集)法进行检测；
其中，液相条件为：分离为使用柱长30cm的C18反相色谱柱(内径150μm，填料直径1.9μm)；
质谱鉴定为质谱数据非依赖型采集模式，扫描方式为正离子扫描模式，一级质谱采用Orbitrap检测，分辨率12,000/60,000@m/z 200，最大注入时间为40～80ms，扫描范围为400～1200；DIA扫描分辨率设为60,000、30,000@m/z 200，起始扫描质量(Fixed firstmass)为200m/z，最大离子注入时间为45～50ms；每次采集的DIA隔离窗口为10～25m/z，隔离窗口数目为32～60，HCD相对碰撞能量为27％。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明所涉及的血清/血浆蛋白质组样品制备方法过程简单，方法通过四种表面不同基团修饰的纳米颗粒混合使用，就可在短时间完成血清/血浆中低丰度蛋白的富集，如图1所示。使用本发明方法富集血清/血浆样品的低丰度蛋白后，在质谱检测结果中可以明显看到血清/血浆高丰度蛋白去除效果，经纳米颗粒富集后，质谱图中未见明显的高丰度肽段峰出现，如图2所示。4种不同基团的纳米课题混合使用效果，高于单个纳米颗粒使用效果，如图3所示。并且每种基团的纳米颗粒都可以按各自特性吸附不同种类的血清蛋白，如图4所示。本发明方法在血清/血浆蛋白鉴定深度方面，高于市售的血清/血浆高丰度蛋白去除方法，如图5所示。在血清/血浆蛋白质组检测中，新方法具有高通量、深度定性、定量血清/血浆蛋白质组的特点，并且质谱检测时间短(每个血样的检测时间为100分钟，而现有技术同等蛋白鉴定规模需要12～24小时)。
附图说明
图1为本发明方法与商业化去高丰度试剂盒对人血清/血浆样品处理后的电泳图。
图2为本发明方法对血清蛋白的吸附质谱鉴定结果一级总离子流图与二级总离子流图。
图3为本发明方法中不同表面基团修饰的纳米颗粒对血清蛋白的吸附质谱鉴定结果。
图4为本发明方法中4种不同表面基团修饰的纳米颗粒吸附血清蛋白实验的三次技术重复蛋白种类的文氏图。
图5本发明所述方法与实验室常用的两种血清去高丰度固相萃取柱的血清蛋白质组质谱鉴定结果比较。
图6为本发明方法在9例样品鉴定的蛋白丰度热图聚类分析。
图7为本发明方法在9例样品血清蛋白鉴定数量在样本中的分布图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供了一种血清/血浆蛋白质组的样本制备方法，包括如下步骤：
(1)将血清样品低温低速离心后去除底部沉淀，保留上清；
血清为100μl至1000μl，优选200μl，低温为2～8℃，优选4℃，离心力为1200～2000RCF，优选1500RCF，离心时间为5～10分钟，优选5分钟；
(2)向上清中加入4种表面不同基团修饰的混合纳米颗粒，37℃孵育30～120分钟，4种不同表面基团修饰的纳米颗粒为表面氨基修饰的SiO2纳米颗粒、表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒、表面兼性离子修饰的SiO2纳米颗粒、TiO2纳米颗粒共计100μg，质量比为1:1:1:1。
其中，表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒按照下述方法制备：将9mL28％的市售氨水、16.25mL乙醇、24.75mL去离子水加入到烧瓶中，1000rpm搅拌混合均匀。将体积分数为9％的正硅酸乙酯(TEOS)乙醇溶液50ml迅速加入到烧瓶中搅拌1分钟，将搅拌速度降低至300rpm后用胶塞封口，室温下继续反应2小时，将生成的混悬液取出后2000RCF离心收集生成的SiO2，用20ml乙醇溶液清洗3次后60℃真空干燥后收集的白色粉末即为表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒，粒径为300～500nm。
表面氨基修饰的SiO2纳米颗粒按照下述方法制备：将1mL的硅烷偶联剂(3-氨丙基)三乙氧基硅烷((3-AMinopropyl)triethoxysilane，APTES)加入到50mL的乙醇溶液中室温1000rpm搅拌10分钟。将50mg表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒加入到上述混合溶液中，在室温条件下继续磁力搅拌24h。反应结束后，用无水乙醇反复离心洗涤SiO2颗粒以除去未反应的APTES，并将制得的氨基改性SiO2颗粒进行真空干燥，粒径为300～500nm。
TiO2纳米颗粒按照下述方法制备：在冰水浴中配制浓度为0.2mol/L的酸性四氯化钛(TiCl4)水溶液，将该溶液缓慢滴加至50mL0.5mol/L的氨水溶液中,加入体积至整个体系pH为8.0，整个过程持续磁力搅拌，滴加完毕后，继续磁力搅拌30分钟。将反应后的溶液离心收集白色沉淀，用20ml去离子水洗涤沉淀3次后，将沉淀超声分散在50mL无水乙醇中，置于100mL聚四氟乙烯内衬不锈钢高压反应釜中。将反应釜放置在鼓风干燥箱中150℃反应10小时，将得到的白色固体产物研磨，过325目筛后即为TiO2纳米颗粒，粒径为200～500nm。
表面兼性离子修饰的SiO2纳米颗粒按照下述方法制备：称取50mg制备的表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒，用甲醇清洗3次后加入200μl浓度为2mM的2-溴-2-甲基-N-(3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基)丙酰胺(SI-ATRP引发剂)，37℃反应12h，离心去除上清后，加入500μl甲醇清洗3次，将SI-ATRP聚合反应液加入到处理后的SiO2纳米颗粒中(SI-ATRP聚合反应液配比如下：N,N-二甲基-N-丙烯酰氧乙基-N-丙基磺酸铵：氯化亚铜：氯化铜：1，1，4，7，7-五甲基二亚乙基三胺以200：1：0.1：1.5的摩尔比例，溶于700μl的无水甲苯中涡旋混合)，密闭反应4小时后，加入500μl无水甲苯清洗3次，真空干燥后收集白色粉末即为表面兼性离子修饰的SiO2，粒径为200～500nm。
(3)将混有纳米颗粒的血清低温高速离心，去除上清后，底部沉淀使用清洗缓冲液清洗，使用移液枪头头反复吹打。将清洗后的纳米颗粒及沉淀继续低温高速离心后去除上清。高速离心为8000～22000RCF，离心60～120分钟，优选11000RCF，90分钟。
清洗缓冲液为含有0.05％CHAPS、100mM PBS缓冲液(PH＝7.4)，加入缓冲液后用移液枪头反复吹打4～6次，优选5次；
(4)在上述沉淀物中加入消化缓冲液，高温反应一定时间后，加入测序级胰蛋白酶，37℃旋转混合过夜，制备得到血清蛋白质组样品。
消化缓冲液为含有1％脱氧胆酸钠(Sodium Deoxycholate,SDC)的50mM TEAB缓冲液(pH8.5)，还原试剂为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦，烷基化试剂为碘乙酰胺或氯乙酰胺，高温为45～95℃，优选三(2-羧乙基)膦与氯乙酰胺，95℃反应10分钟；
本发明进一步对血清蛋白进行了液相-质谱分离及检测，检测可按下面的方法进行：包括在多肽水平的分离、质谱鉴定，在线分离-质谱分析为液相色谱-质谱联用鉴定，分离使用柱长30cm的C18反相色谱柱(内径150μm，填料直径1.9μm)，质谱鉴定为质谱数据非依赖型采集模式。
实施例1、血清/血浆蛋白质组的制备
(1)从冰箱中取200μl血清于37℃解冻，4℃、1500RCF离心10分钟，去除底部沉淀后上清转移至新管。
(2)上清中加入100μg混合纳米颗粒(四种不同表面基团修饰的纳米颗粒等量混合)在37℃旋转孵育1h。
(3)孵育完成后11000RCF离心90分钟去掉上清溶液，沉淀用500μl 0.05％CHAPS吹打5次后，11000RCF离心90分钟去掉上清。
(4)加入20μl 1％SDC，10mM TECP，40mM CAA的50mM TEAB的消化缓冲液(pH8.5)，95℃反应10分钟，加入测序级胰蛋白酶500ng，37℃反应16小时。
(5)向步骤(4)的体系中加入20％TFA使溶液中TFA终浓度为1％，冰上放置10分钟，15700RCF离心10分钟，分别收集底物沉淀与上清，用0.5％TFA清洗沉淀两次后收集上清，上清合并后低温冷冻干燥、脱盐即可进行后续质谱分析检测。
实施例2、血清蛋白质组的质谱检测
血清蛋白质组样品的制备方法同实施例1。
在样品种加入20％甲酸至终浓度为1％终止反应，冰上放置10分钟，15700RCF离心10分钟，分别收集底物沉淀与上清，用0.5％TFA清洗沉淀两次后收集上清，3次上清合并后低温冷冻干燥、脱盐。
然后采用20μl的上样缓冲液(0.1％甲酸)溶解，然后取2μl质谱检测，利用ThermoScientific的纳升级液相色谱串联高分辨质谱(nLC-Easy1000-Q Exactive-HF)进行数据采集。
纳升液相色谱预柱及分析柱规格如下：
预柱：3μm粒径C18填料，2cm×100μm内径(填料为Dr.Maisch GmbH公司)。
分析柱：1.9μm粒径C18填料，30cm×150μm内径(填料为Dr.Maisch GmbH公司)。
流动相A为0.1％甲酸，流速为600nl/min；流动相B为乙腈及0.1％甲酸(体积比为1000:1)。
肽分离洗脱梯度如下：0-6min，7-12％B；6-72min，12-30％B；72-94min，30-42％B；94-95min，42-95％B and 95-100min，95％B。
谱图库建立采用Data dependent Acquisition(DDA)模式，条件如下：扫描方式为正离子扫描模式，一级质谱采用Orbitrap检测，分辨率m/z 120,000@200，最大注入时间为80ms，扫描范围400-1400；二级扫描分辨率设为15,000@m/z 200，起始扫描质量(Fixedfirst mass)120m/z，最大离子注入时间为45ms，HCD相对碰撞能量为27％，数据采集时采用18s动态排除
血清/血浆质谱数据采用Data Independent Acquisition(DIA)模式，扫描方式为正离子扫描模式，一级质谱采用Orbitrap检测，分辨率m/z 60,000@200，最大注入时间为80ms，扫描范围400-1200；DIA扫描分辨率设为30,000@m/z 200，起始扫描质量(Fixedfirst mass)200m/z，最大离子注入时间为45ms；每次采集的DIA隔离窗口为10m/z，隔离窗口数目为60，HCD相对碰撞能量为27％。
所得质谱数据利用Spectronaut 14.5 200813.47784搜索引擎进行谱图库建立及DIA数据搜索。在Spectronaut软件模板中对数据库搜索的各项参数进行设定：library谱图库建立，“Protein Database”选用Uniprot数据库的人蛋白质序列数据库(下载日期2020.08.19，数据库蛋白条目为20385)；在“Enzymes/cleavage rule”中选取Trypsin/p；在“Digest Type”中选取Specific；在“Missed Cleavages”中选取2；在“Precursor MassTolerance”中填20ppm；在“Variable Modifications”中选取Acetyl(Protein N-term)、Oxidation(M)；在“Fixed Modifications”中选取Carbamidomethyl(C)。DIA数据搜索选取上述建立的library谱图库，参数设置选取“BGS Factory Settings(default)”。
表1的血清蛋白质组质谱鉴定结果表明，实施例2的质谱鉴定方法结合实施例1的样本制备过程，可以实现血清蛋白质组的深度覆盖研究，其结果与不处理的血清及两种常用商业化血清高丰度蛋白去除方法相比，可以达到更深的鉴定规模。
表1实施例2质谱鉴定的血清蛋白结果
Figure BDA0002850593000000081
图1为采用商品化去高丰度试剂盒(赛默飞世尔HSA/Immunoglobulin去除小柱/安捷伦多重亲和Human 14去除小柱)与本发明方法制备的血清蛋白质组样品的电泳图，其中，泳道M：为蛋白分子量marker，泳道E：经本发明方法处理的样品取20μg蛋白上样，泳道H1：赛默飞世尔HSA/Immunoglobulin去除小柱处理的样品取20μg蛋白上样,泳道H2：安捷伦多重亲和Human 14去除小柱处理的样品取20μg蛋白上样,泳道S：未经处理的人血清样品20μg蛋白上样。可以看出，本发明可以在短时间完成血清/血浆中低丰度蛋白的富集。
图2为本发明方法对血清蛋白的吸附质谱鉴定结果一级总离子流图与二级总离子流图，可以看出，使用本发明方法富集血清/血浆样品的低丰度蛋白后，在质谱检测结果中可以明显看到血清/血浆高丰度蛋白去除效果，经纳米颗粒富集后，质谱图中未见明显的高丰度肽段峰出现。
本发明方法采用的不同表面基团修饰的纳米颗粒对血清蛋白的吸附质谱鉴定结果如图3所示，可以看出，4种不同基团的纳米颗粒混合使用效果，高于单个纳米颗粒使用效果。并且每种基团的纳米颗粒都可以按各自特性吸附不同种类的血清蛋白，如图4所示。
本发明方法与商业化常用的两种去血清去高丰度固相萃取柱的血清蛋白质组质谱鉴定结果如图5所示(赛默飞世尔HSA/Immunoglobulin去除小柱/安捷伦多重亲和Human14去除小柱)，可以看出，在血清/血浆蛋白鉴定深度方面，本发明方法高于现有的血清/血浆高丰度蛋白去除方法。
由上述分析结果可以看出，在血清/血浆蛋白质组检测中，新方法具有高通量、深度定性、定量血清/血浆蛋白质组的特点，并且质谱检测时间短(每个血样的检测时间为100分钟，而现有技术同等蛋白鉴定规模需要12～24小时)。
利用实施例2中的方法，采用3个操作人，对同一例健康人血清，每个操作人独立方法重复3次，利用9个数据评价方法的稳定性与操作的重复性。
图6表明三个操作人采用本发明方法，对同一来源血清中蛋白的定量结果一致，相关性可达0.993。
图7表明采用本发明方法对血清中蛋白的定性结果稳定，9次实验中共鉴定到1655个protein goups，其中1335个protein goups(占总数的81％)在9个样品中重复鉴定到。

Claims (10)

1.一种血清/血浆蛋白质组样品的制备方法，包括如下步骤：
S1、将血清/血浆样品进行低温低速离心，去除沉淀，保留上清液；
S2、向所述上清液中加入表面基团修饰的纳米颗粒，得到混悬液；
所述表面基团修饰的纳米颗粒为表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒、表面氨基修饰的SiO2纳米颗粒、表面兼性离子修饰的SiO2和TiO2纳米颗粒的混合物；
S3、将所述混悬液进行高速离心，去除上清液，保留沉淀Ⅰ；
S4、采用清洗缓冲液重悬所述沉淀Ⅰ重悬得到重悬液，将所述重悬液高速离心后去除上清，保留沉淀Ⅱ；
S5、采用消化缓冲液重新溶解所述沉淀Ⅱ，然后加入测序级的胰蛋白酶，经酶解即得血清/血浆蛋白质组样品；
所述消化缓冲液中包含能打开二硫键的还原剂以及烷基化巯基的烷基化试剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述血清/血浆样品的用量为100μl～10000μl；
所述低温低速离心的条件如下：
离心力为800～1500RCF，温度为2～8℃，时间为5～20分钟。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述表面基团修饰的纳米颗粒中，所述表面羟基修饰的SiO2纳米颗粒、所述氨基修饰的SiO2纳米颗粒、所述表面兼性离子修饰的SiO2与所述TiO2纳米颗粒的质量比为1：1～2：1～2：1～2；
所述表面基团修饰的纳米颗粒的用量为0.5～2μg/μl所述血清/血浆样品；
所述表面基团修饰的纳米颗粒的粒径为200～500nm。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，加入所述表面基团修饰的纳米颗粒后于25～37℃下孵育30～120分钟。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述高速离心的条件如下：
离心力为8000～22000RCF，温度为2～8℃，时间为60～120分钟。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤S4中，所述清洗缓冲液为含有质量浓度为0.05％的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸的PBS缓冲液，pH值为7～8；
加入所述清洗缓冲液后用移液枪头反复吹打4～6次。
所述高速离心的条件如下：
离心力为8000～22000RCF，温度为2～8℃，时间为60～120分钟。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤S5中，所述消化缓冲液为含有0.01～1％的脱氧胆酸钠、5～20mM三(2-羧乙基)膦、30～45mM氯乙酰氨的碳酸氢铵缓冲液或TAEB缓冲液，pH值为8.0～8.5；
所述还原试剂为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦；
所述烷基化试剂为碘乙酰胺或氯乙酰胺；
加入所述消化缓冲液后于45～95℃条件下反应10～45分钟；
所述胰蛋白酶的加入量为1～10ng/μl所述血清/血浆样品；
所述酶解的条件为：
温度为25～37℃，时间为6～16小时。
8.权利要求1-7中任一项所述方法制备的血清/血浆蛋白质组样品。
9.权利要求8所述血清/血浆蛋白质组样品在检测血清/血浆中低丰度蛋白中的应用。
10.一种血清/血浆蛋白质组的检测方法，包括如下步骤：
1)按照权利要求1-7中任一项所述方法制备所述血清/血浆蛋白质组样品；
2)采用液相色谱-串联质谱法进行检测。
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