CN110487946A - 一种尿液中外泌体的提取及其蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析方法 - Google Patents

一种尿液中外泌体的提取及其蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种尿液中外泌体的提取及其蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析方法。本发明首先提供一种表面螯合金属离子的磁性纳米材料：在氧化石墨烯的表面修饰磁性纳米颗粒，得到产物1；在产物1的表面包覆二氧化硅层，得到产物2；在产物2的二氧化硅层表面修饰带有氨基的硅烷偶联剂，得到产物3；在产物3的表面修饰金属螯合剂，得到产物4；在产物4的表面螯合金属离子即得。本发明磁性纳米材料可用于提取尿液中外泌体，并用于外泌体中蛋白质或磷酸化蛋白质组学分析。通过利用外泌体膜磷脂双分子层表面裸露的磷酸根与金属离子之间通过双配位的化学作用结合，同时结合静电吸附的作用，实现对尿液外泌体的高特异性提取，提取速度快，回收率高。

Description

一种尿液中外泌体的提取及其蛋白质组学和磷酸化蛋白质组 学分析方法
技术领域
本发明涉及一种尿液中外泌体的提取及其蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析方法，涉及生物技术及分析化学领域。
背景技术
磷酸化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，磷酸化蛋白参与了许多重要的生理过程，如细胞凋亡、细胞增殖和细胞迁移等。肽段的磷酸化水平的变化与许多疾病的发生发展密切相关，具有作为疾病生物标志物的潜在应用前景。然而，由于蛋白质磷酸化状态不稳定，并且体液中存在高丰度的磷酸酶，给磷酸化蛋白质及磷酸化肽段的检测带来极大的困难，从而限制了磷酸化蛋白在疾病早期诊断中的应用。外泌体是由细胞分泌的一种具有完整膜结构、粒径约30～150nm的微囊泡，携带有蛋白质、DNA、RNA和脂质等。在完整囊泡结构的保护作用下，外泌体携带的生物分子可以避免直接与体液中各种酶接触，从而可以稳定的存在于外泌体中。尿液作为一种重要的体液，不仅具有取样容易、无创性等优点，而且研究发现，尿液中含有大量的外泌体，因此，对疾病相关的尿液外泌体的磷酸化蛋白质分析在早期诊断中有重要应用价值。
在进行尿液中外泌体磷酸化蛋白质分析前，首先需要从尿液中提取外泌体。目前常用的外泌体提取方法有超速离心法、沉淀试剂盒法、免疫亲合法和微流控芯片法等，这些方法存在提取时间长、步骤繁琐、提取效率低等不足。因此，开发快速、高效、高特异性的外泌体提取方法是尿液外泌体磷酸化蛋白质研究的首要任务。此外，外泌体中磷酸化蛋白的丰度相对较低，进行质谱分析时，磷酸化肽段信号容易受到大量非磷酸化肽段的干扰和抑制，在进行尿液外泌体磷酸化蛋白质分析时，还需要对磷酸肽进行选择性富集。
发明内容
本发明的目的是提供一种尿液中外泌体的提取及其蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析方法，通过本发明方法能够从尿液中提取外泌体，并且对其中的磷酸化蛋白/肽段进行选择性的分离富集。
本发明首先提供一种表面螯合金属离子的磁性纳米材料，其按照包括如下步骤的的方法制备：
1)在氧化石墨烯的表面修饰磁性纳米颗粒，得到产物1；
2)在所述产物1的表面包覆二氧化硅层，得到产物2；
3)在所述产物2的二氧化硅层表面修饰带有氨基的硅烷偶联剂，得到表面修饰有氨基的产物3；
4)在所述产物3的表面修饰金属螯合剂，得到产物4；
5)在所述产物4的表面螯合金属离子，即得到所述表面螯合金属离子的磁性纳米材料。
上述的制备方法中，所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒(直径为20～200nm)；
所述硅烷偶联剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷；
所述金属螯合剂为琥珀酰亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA-NHS-ester)，其一端可与氨基结合，另一端可螯合金属离子；
所述金属离子为Ti4+、Zr4+或Sn4+，能与磷酸根基团发生双配位作用。
上述的制备方法中，步骤1)中，可采用常规的方法在所述氧化石墨烯表面修饰所述磁性纳米颗粒；在本发明的具体实施例中，通过如下步骤进行修饰：将氧化石墨烯分散在乙二醇中，超声使其分散成粒径为微米级的单层片状氧化石墨烯，随后加入三氯化铁和柠檬酸钠，继续超声至三氯化铁和柠檬酸钠充分溶解，加入无水乙酸钠后剧烈搅拌30分钟后，将混合物转移至高压反应釜，200℃反应8小时，即可得到所述产物1。
上述的制备方法中，步骤2)中，可采用常规方法包覆所述二氧化硅层；在本发明的具体实施例中，通过如下步骤进行包覆：将所述产物1分散在由乙醇、水和浓氨水组成的混合液中，经搅拌后加入正硅酸乙酯，继续搅拌反应，即可得到所述产物2。
上述的制备方法中，步骤3)中，可采用常规的方法在修饰末端带有氨基的硅烷偶联试剂；在本发明的具体实施例中，通过如下步骤进行修饰：在氮气的保护条件下，以异丙醇为溶剂，所述产物2和所述末端带有氨基的硅烷偶联试剂进行反应，即可得到所述产物3。
上述的制备方法中，步骤5)中，可采用常规的螯合方法在所述产物4表面螯合所述金属离子；在本发明的具体实施例中，所采用的金属离子为钛离子。
本发明制备的面螯合金属离子的磁性纳米材料可用于提取尿液中外泌体，并用于外泌体中蛋白质或磷酸化蛋白质组学分析。
具体递，本发明提供了尿液中外泌体的提取方法，包括如下步骤：
向尿液中加入碱式磷酸酶进行酶解，然后经浓缩得到浓缩尿液；向所述浓缩尿液中加入所述表面螯合金属离子的磁性纳米材料，进行孵育；然后通过磁铁分离，所述尿液中外泌体进入沉淀中，收集沉淀即可。
上述的提取方法中，在所述酶解之前，所述方法还包括对所述尿液进行梯度低速离心和/或滤膜过滤饼的步骤，以除去所述尿液中的死细胞或细胞残渣；
所述梯度低速离心可为：：300g离心10分钟，2000g离心10分钟，10000g离心30分钟；
所述滤膜的孔径可为0.2μm。
且在所述梯度低速离心前进行孵育：所述孵育的时间可为1～10分钟，具体可为2～5分钟(如5分钟)；所述孵育可在1000～2500rpm下进行，如1500rpm；所述孵育可在室温(25℃)或低温下进行，低温可为4℃。
上述的提取方法中，所述碱式磷酸酶与所述尿液的配比为：1U：1mL～10mL；
其中，1U指的是在实验规定的条件下(温度、最适pH、最适底物浓度时)，1min内催化1μmol底物发生反应所需要的酶量；
所述尿液与所述浓缩尿液的配比为：10mL：0.1～1mL；
所述表面螯合金属离子的磁性纳米材料与所述浓缩尿液的配比为10mg：0.1～1mL。
上述的提取方法中，所述方法还包括采用洗脱液洗涤所述沉淀得到所述外泌体的步骤(洗脱吸附在所述表面螯合金属离子的磁性纳米材料表面的外泌体)，所述洗脱液为3％～20％(质量浓度)的氨水。
所述洗涤步骤之后，采用PBS缓冲液洗涤所述沉淀，洗涤次数可为3～5次，每次体积可为0.1mL～1mL。
进一步，本发明还提供了尿液中外泌体磷酸化蛋白质组学分析的方法，包括如下步骤：
采上述的方法提取尿液中外泌体；采用裂解液裂解所述外泌体；通过磁铁分离，收集上清液，向所述上清液中加入尿素和二硫苏糖醇进行孵育，然后加入碘乙酰胺进行反应；所述反应结束后加入胰蛋白酶进行酶切，对所得反应液进行用液相色谱串联质谱分析，即可实现对所述外泌体蛋白质组学的分析。
本发明还提供了尿液中外泌体磷酸化蛋白质组学分析的方法，包括如下步骤：
采用上述的方法提取尿液中外泌体；采用裂解液裂解所述外泌体，加入二硫苏糖醇和碘乙酰胺进行孵育，然后加入胰蛋白酶进行酶切，所述酶切结束后，加入乙腈和三氟乙酸进行孵育，所述孵育结束后，通过磁铁分离吸附有磷酸肽的所述表面螯合金属离子的磁性纳米材料，实现对所述外泌体中磷酸化肽段的选择性富集，经洗脱液洗脱吸附的所述磷酸肽后，采用液相色谱串联质谱进行分析，即可实现对所述外泌体磷酸化蛋白质组学的分析。
具体地，所述裂解液可为SDS裂解液、尿素或RIPA裂解液。
具体地，将乙腈和三氟乙酸加入含有表面螯合金属离子的磁性纳米材料的外泌体蛋白酶解液中，使得溶液组成为水：乙腈：三氟乙酸为20：74：6。
具体地，所述洗脱液可为5％～15％的氨水溶液，体积可为50～200μL，具体可为100μL10％的氨水溶液。
本发明具有如下有益效果：
1、通过利用外泌体膜磷脂双分子层表面裸露的磷酸根与金属离子之间通过双配位的化学作用结合，同时结合静电吸附的作用，实现对尿液外泌体的高特异性提取，操作简单，提取速度快，回收率高。
2、通过添加碱式磷酸酶和超滤的方式对尿液进行预处理，避免尿液中内源性磷酸化蛋白和磷酸化肽段对外泌体富集及后续尿液外泌体磷酸化蛋白质组学分析造成干扰，并且经过超滤以后的浓缩尿液，提高了外泌体的浓度，从而提高了外泌体的提取效率。
3、通过在线裂解的方式，可以直接对提取的外泌体成分进行后续分析，如蛋白质，RNA等。
4、通过直接改变溶液组成的方式，可以用所述的材料直接从提取的外泌体蛋白质裂解液中高选择性的富集磷酸肽，进而对尿液外泌体的磷酸化蛋白质组学进行分析。
附图说明
图1为本发明GO-Fe3O4/SiO2/DOTA/Ti4+纳米材料的制备流程图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、制备表面螯合金属离子的磁性纳米材料并用于尿液外泌体富集及其蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析
一、制备表面螯合金属离子的磁性纳米材料
按照图1所示合成路线示意图制备表面螯合金属离子的磁性纳米材料，具体步骤如下：
步骤1、制备修饰磁性纳米颗粒的氧化石墨烯
称取30mg氧化石墨烯，分散于30mL乙二醇中，100W功率超声2h至氧化石墨烯呈均匀分散状态。加入160mg三氯化铁和30mg柠檬酸三钠，继续超声至完全溶解状态，加入700mg无水乙酸钠，室温下机械搅拌30min，将所得均匀溶液转移至容量为50mL的Teflon内衬不锈钢高压反应釜，200℃加热反应6h。反应完，取出反应釜冷却至室温，所得材料用乙醇和纯水清洗3次，60℃干燥12h，得修饰磁性纳米颗粒的氧化石墨烯(GO-Fe3O4)。
步骤2、制备表面包覆二氧化硅层并修饰带有氨基的硅烷偶联试剂的磁性纳米颗粒的氧化石墨烯
将30mg步骤1所得产物均匀分散于25mL乙醇、4mL水和0.7mL浓氨水的混合溶液中，逐滴加入1mL正硅酸乙酯，室温下机械搅拌反应6h，反应结束后通过外加磁场收集制备的材料，用纯水和异丙醇分别清洗3次，重悬于50mL异丙醇中，在氮气保护下，逐滴加入1mL3-氨基丙基三甲氧基硅烷，室温下机械搅拌反应24h，得到表面包覆二氧化硅层并修饰带有氨基的硅烷偶联试剂的磁性纳米颗粒的氧化石墨烯(GO-Fe3O4/SiO2-NH2)。
步骤3、制备表面螯合金属离子的磁性纳米材料
将30mg步骤2所得GO-Fe3O4/SiO2-NH2均匀分散于10mL DOTA乙腈溶液中(1mg/mL)，室温下震荡反应6h，反应结束后，产物通过外加磁场分离，用乙腈和水分别洗3次，重悬于10mL硫酸钛的25％乙醇溶液中(10mg/mL)，70℃震荡反应12h，通过外加磁场分离反应后所得产物，用水和乙醇清洗3次，60℃烘干过夜得表面螯合金属离子的磁性纳米材料(GO-Fe3O4/SiO2/DOTA/Ti4+)。
二、表面螯合金属离子的磁性纳米材料用于尿外泌体富集及蛋白质组学分析，具体步骤如下：
步骤1、尿液样本预处理
取10mL尿液，分别经300g离心10分钟，2000g离心10分钟，10000g离心30分钟，经0.2μm滤膜过滤后，收集滤液，加入1U碱式磷酸酶，37℃孵育1小时后，转至15mL 30KDa超滤管，经5000g离心10分钟浓缩体积至200μL，从超滤管中取出即为预处理后的尿液样本。
步骤2、尿液样本中外泌体提取
称取2mg GO-Fe3O4/SiO2/DOTA/Ti4+，分别用纯水和DMEM润洗2次，加入上述经过预处理的尿液，4℃震荡孵育5分钟，通过磁铁分离孵育后的材料，并用PBS缓冲液洗涤3次，可得表面吸附有外泌体的GO-Fe3O4/SiO2/DOTA/Ti4+材料。
步骤3、外泌体裂解及其蛋白质的LC-MS/MS分析
将步骤2所得表面吸附有外泌体的GO-Fe3O4/SiO2/DOTA/Ti4+材料置于冰上，加入18μL4％SDS裂解液，超声裂解20分钟，用磁铁将材料与上清液分离后，吸取全部上清，加入82μL 8M尿素溶液、二硫苏糖醇(终浓度20mmol/L)，37℃反应4小时后，将所得溶液转移至FASP管中，用8M尿素溶液洗涤2次，加入碘乙酰胺(终浓度50mmol/L)，室温下避光反应1小时，用50mM碳酸氢铵溶液洗涤3次，加入1μg胰蛋白酶，37℃酶切12小时，将所得溶液45℃热干，用0.1％甲酸水溶液定容后，质谱上样分析，上样量1μg。
采集的质谱数据使用MAXQUANT搜库检索。目标数据库为uniprot.human。检索参数设置为胰蛋白酶全酶切，设定2个蛋白酶漏切位点，蛋白质固定修饰选取Carbamidomethyl(C)，可变修饰为Oxidation(M)。质谱一级质量误差为15ppm，二级质量误差为0.6Da，假阳性率设为1％。
通过数据库搜索获得的尿液外泌体蛋白质鉴定数，表明该材料对外泌体具有良好的提取效果，蛋白鉴定数为1004。
三、表面螯合金属离子的磁性纳米材料用于尿外泌体富集及其磷酸化蛋白质组学分析，具体步骤如下：
步骤1、尿液样本预处理
取10mL尿液，分别经300g离心10分钟，2000g离心10分钟，10000g离心30分钟，经0.2μm滤膜过滤后，收集滤液，加入1U碱式磷酸酶，37℃孵育1小时后，转至15mL 30KDa超滤管，经5000g离心10分钟浓缩体积至200μL，从超滤管中取出即为预处理后的尿液样本。
步骤2、尿液样本中外泌体提取
称取2mg GO-Fe3O4/SiO2/DOTA/Ti4+，分别用纯水和DMEM润洗2次，加入上述经过预处理的尿液，4℃震荡孵育5分钟，通过磁铁分离孵育后的材料，并用PBS缓冲液洗涤3次，可得表面吸附有外泌体的GO-Fe3O4/SiO2/DOTA/Ti4+材料。
步骤3、外泌体裂解及其磷酸化蛋白质组学分析
将步骤2所得表面吸附有外泌体的GO-Fe3O4/SiO2/DOTA/Ti4+材料置于冰上，加入20μL 4％SDS裂解液，超声裂解20分钟，加入20μL0.1 M碳酸氢铵溶液、二硫苏糖醇(终浓度20mmol/L)，37℃反应4小时后，加入碘乙酰胺(终浓度50mmol/L)，室温下避光反应1小时，加入1μg胰蛋白酶，37℃酶切12小时，酶切结束后加入148μL乙腈和12μL三氟乙酸，震荡孵育30分钟，孵育结束后用200μL清洗液(H2O:ACN:TFA，20:74:6)清洗3次，清洗结束后，用100μL10％氨水洗脱，洗脱液热干后，用0.1％甲酸水溶液定容，质谱上样分析。
采集的质谱数据使用MAXQUANT搜库检索。目标数据库为uniprot.human。检索参数设置为胰蛋白酶全酶切，设定2个蛋白酶漏切位点，蛋白质固定修饰选取Carbamidomethyl(C)，可变修饰为Oxidation(M)和Phosphorylation(S,T,Y)。质谱一级质量误差为15ppm，二级质量误差为0.6Da，假阳性率设为1％。
通过外泌体蛋白质谱鉴定结果，表明该材料对外泌体具有良好的提取效果，并且将提取时间缩短至30分钟以内，通过搜库鉴定到磷酸化位点的鉴定数为115。

Claims (10)

1.一种表面螯合金属离子的磁性纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
1)在氧化石墨烯的表面修饰磁性纳米颗粒，得到产物1；
2)在所述产物1的表面包覆二氧化硅层，得到产物2；
3)在所述产物2的二氧化硅层表面修饰带有氨基的硅烷偶联剂，得到表面修饰有氨基的产物3；
4)在所述产物3的表面修饰金属螯合剂，得到产物4；
5)在所述产物4的表面螯合金属离子，即得到所述表面螯合金属离子的磁性纳米材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒；
所述硅烷偶联剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷；
所述金属螯合剂为琥珀酰亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸；
所述金属离子为Ti4+、Zr4+或Sn4+。
3.权利要求1或2所述方法制备的表面螯合金属离子的磁性纳米材料。
4.权利要求3所述表面螯合金属离子的磁性纳米材料在下述1)或2)或3)中的应用：
1)提取尿液中外泌体；
2)尿液中外泌体蛋白质组学分析；
3)尿液中外泌体磷酸化蛋白质组学分析。
5.一种尿液中外泌体的提取方法，包括如下步骤：
向尿液中加入碱式磷酸酶进行酶解，然后经浓缩得到浓缩尿液；向所述浓缩尿液中加入权利要求3所述表面螯合金属离子的磁性纳米材料，进行孵育；然后通过磁铁分离，所述尿液中外泌体进入沉淀中，收集沉淀即可。
6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于：在所述酶解之前，所述方法还包括对所述尿液进行梯度低速离心和/或滤膜过滤饼的步骤；
所述碱式磷酸酶与所述尿液的配比为：1U：1mL～10mL；
所述尿液与所述浓缩尿液的配比为：10mL：0.1～1mL；
所述表面螯合金属离子的磁性纳米材料与所述浓缩尿液的配比为10mg：0.1～1mL。
7.根据权利要求5或6所述的提取方法，其特征在于：所述方法还包括采用洗脱液洗涤所述沉淀得到所述外泌体的步骤，所述洗脱液为3％～20％的氨水。
所述洗涤步骤之后，采用PBS缓冲液洗涤所述沉淀。
8.一种尿液中外泌体磷酸化蛋白质组学分析的方法，包括如下步骤：
采用权利要求5-7中任一项所述的方法提取尿液中外泌体；采用裂解液裂解所述外泌体；通过磁铁分离，收集上清液，向所述上清液中加入尿素和二硫苏糖醇进行孵育，然后加入碘乙酰胺进行反应；所述反应结束后加入胰蛋白酶进行酶切，对所得反应液进行用液相色谱串联质谱分析，即可实现对所述外泌体蛋白质组学的分析。
9.一种尿液中外泌体磷酸化蛋白质组学分析的方法，包括如下步骤：
采用权利要求57中任一项所述的方法提取尿液中外泌体；采用裂解液裂解所述外泌体，加入二硫苏糖醇和碘乙酰胺进行孵育，然后加入胰蛋白酶进行酶切，所述酶切结束后，加入乙腈和三氟乙酸进行孵育，所述孵育结束后，通过磁铁分离吸附有磷酸肽的所述表面螯合金属离子的磁性纳米材料，实现对所述外泌体中磷酸化肽段的选择性富集，经洗脱液洗脱吸附的所述磷酸肽后，采用液相色谱串联质谱进行分析，即可实现对所述外泌体磷酸化蛋白质组学的分析。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述裂解液为SDS裂解液、尿素或RIPA裂解液。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111351879A (zh) * 2020-04-01 2020-06-30 上海中科新生命生物科技有限公司 一种基于lc-ms的细胞外泌体脂质组学分析方法
CN112710755A (zh) * 2020-12-22 2021-04-27 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种血清/血浆蛋白质组分析新方法
CN113024673A (zh) * 2020-07-21 2021-06-25 上海交通大学 磷脂酰丝氨酸多肽配体修饰的二氧化硅微球
CN113652391A (zh) * 2021-07-14 2021-11-16 大连民族大学 基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法
CN114459877A (zh) * 2021-12-17 2022-05-10 中国计量科学研究院 用于富集外泌体的dna四面体复合磁性纳米材料及制备

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106011861A (zh) * 2015-03-26 2016-10-12 东友精细化工有限公司 用于蚀刻含银薄层的蚀刻剂组合物和用其制造显示装置的阵列基板的方法
US20170143856A1 (en) * 2014-05-22 2017-05-25 Snu R&Db Foundation Method for labeling exosomes with radioactive substance and use thereof
US20170335312A1 (en) * 2014-06-24 2017-11-23 Aj Innuscreen Gmbh Method for enriching microvesicles
WO2018221271A1 (ja) * 2017-05-29 2018-12-06 国立大学法人神戸大学 検出対象の分析用センサ作製用基材、検出対象の分析用センサ、及び検出対象の分析法
CN109576207A (zh) * 2018-12-17 2019-04-05 贺川江 一种基于金属离子络合剂的细胞外囊泡的分离方法
CN110118765A (zh) * 2018-02-05 2019-08-13 武汉大学 一种sers基底的制备及其在癌症检测方面的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170143856A1 (en) * 2014-05-22 2017-05-25 Snu R&Db Foundation Method for labeling exosomes with radioactive substance and use thereof
US20170335312A1 (en) * 2014-06-24 2017-11-23 Aj Innuscreen Gmbh Method for enriching microvesicles
CN106011861A (zh) * 2015-03-26 2016-10-12 东友精细化工有限公司 用于蚀刻含银薄层的蚀刻剂组合物和用其制造显示装置的阵列基板的方法
WO2018221271A1 (ja) * 2017-05-29 2018-12-06 国立大学法人神戸大学 検出対象の分析用センサ作製用基材、検出対象の分析用センサ、及び検出対象の分析法
CN110118765A (zh) * 2018-02-05 2019-08-13 武汉大学 一种sers基底的制备及其在癌症检测方面的应用
CN109576207A (zh) * 2018-12-17 2019-04-05 贺川江 一种基于金属离子络合剂的细胞外囊泡的分离方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FANGYUAN GAO ET AL: "A novel strategy for facile serum exosome isolation based on specific interactions between phospholipid bilayers and TiO2", 《CHEM. SCI》 *
HOUJIANG ZHOU ET AL: "Specific Phosphopeptide Enrichment with Immobilized Titanium Ion Affinity Chromatography Adsorbent for Phosphoproteome Analysis", 《JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH》 *
NIANRONG SUN ET AL: "Size-Exclusive Magnetic Graphene Mesoporous Silica Composites with Titanium(IV)-Immobilized Pore Walls for Selective Enrichment of Endogenous Phosphorylated Peptides", 《ACS APPL. MATER. INTERFACES》 *
RUI ZHAI ET AL: "Metal ion-immobilized magnetic nanoparticles for global enrichment and identification of phosphopeptides by mass spectrometry", 《RSC ADV.》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111351879A (zh) * 2020-04-01 2020-06-30 上海中科新生命生物科技有限公司 一种基于lc-ms的细胞外泌体脂质组学分析方法
CN113024673A (zh) * 2020-07-21 2021-06-25 上海交通大学 磷脂酰丝氨酸多肽配体修饰的二氧化硅微球
CN112710755A (zh) * 2020-12-22 2021-04-27 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种血清/血浆蛋白质组分析新方法
CN113652391A (zh) * 2021-07-14 2021-11-16 大连民族大学 基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法
CN114459877A (zh) * 2021-12-17 2022-05-10 中国计量科学研究院 用于富集外泌体的dna四面体复合磁性纳米材料及制备
CN114459877B (zh) * 2021-12-17 2024-05-10 中国计量科学研究院 用于富集外泌体的dna四面体复合磁性纳米材料及制备

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