CN113652391A - 基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法 - Google Patents

基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分析化学及临床检验领域,公开了一种基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法。包括制备Wulff型石墨相氮化碳、构建外泌体捕获分析一体化分析方法、外泌体的表型分析,实现基于单一材料的捕获/分析双单元同时启动的外泌体高效捕获与原位分析一体化分析,捕获效率上赶超现有的各种外泌体分离技术,对外泌体的原位分析具有良好的灵敏度,并且做到了捕获与分析机制的有效整合,将整个分析过程(包括捕获和分析)控制在37min之内,极大提高了外泌体表型分析的效率和准确率。

Description

基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法
技术领域
本发明属于分析化学及临床检验领域,具体涉及一种基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法。
背景技术
癌症一直以来都是人类社会致死率最高的疾病之一,尽管近几十年来相关诊疗技术不断发展,依然难以彻底治愈。近年,为提升癌症患者的生存率,人们提出了精准医学的概念。即依据患者内在生物学信息以及临床症状和体征,对患者实施分类分型并给出针对性临床诊疗方案的治疗策略。目前我国已陆续开展临床用基因组学、蛋白组学、精准医学大数据资源整合等多方面的研究。但由于疾病基因学的复杂性决定了单一的组学研究很难系统且完全地解释疾病的整体生物学行为,从而影响精准的疾病细分。因此,开发和完善新的组学信息分析方法,构建相应的疾病知识网络,对提高癌症先期诊断和分类分型的准确率至关重要。
外泌体因其分布广泛,且携有母源细胞丰富的生理信息,尤其是其表面蛋白的分化和表达能够与其母源细胞在疾病形成过程中发生的显著变化保持一致,是目前大受欢迎的非侵入性癌症诊断、预后的生物标志物,并已被应用于乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌的先期诊断中。因此,对外泌体的表型分析和数据整合有望构建疾病知识网络模型,进而探索组学数据整合的开发,为癌症的先期诊断及分类分型提供理论基础。
目前,对外泌体进行表型分析的流程主要分为捕获分离和分析检测两部分。高效和高选择性的外泌体分离技术是开展外泌体分析检测研究的前提。常见的外泌体分离技术基于其物理化学和生物化学性质差异建立,主要有超速离心、尺寸分离、免疫亲和捕获、微流控分离等。其中超速离心是目前使用最广的分离方法,但无法用于微量样品中外泌体的分离;微流控技术能够解决上述问题,但在制作工艺和成本等方面要求较高;其余如尺寸排阻、免疫磁珠等方法会存在耗时耗力等问题,这使得对外泌体的表型分析在实验初期就面临各种困难。因此,开发样品用量小、操作简便、分离效率高的外泌体分离方法十分必要。对于外泌体的分析检测,目前常用的方法包括表面增强拉曼、荧光法、比色法、电化学法等。但这些方法通常涉及复杂的化学反应机制和复杂的定量过程,仍有很大的空间需要改进。此外,在这类分步操作进行外泌体表型分析的过程中,不仅费时费力,而且过长的周期和过多的操作可能会影响外泌体的生物活性,进而影响分析结果的准确性,无法推广到临床检测上。因此,亟需开发外泌体捕获分析一体化的分析方法,以有效解决上述困难,进而实现对外泌体表型信息的高效分析与整合。
发明内容
为了克服现有技术进行外泌体表型分析过程费时费力、影响外泌体生物活性从而进一步影响分析结果的准确性的不足,本发明提供一种基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法,通过将硼酸亲和技术与基于抗原-抗体特异性识别的免疫分析结合极大提高了外泌体表型分析的效率和准确率。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的:基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法,其步骤为:
1.制备Wulff型石墨相氮化碳:将加入了尿素的氧化铝坩埚置于管式炉中,加热升温至600℃并保持4h后自然冷却至室温,得到的黄色粉末即为原始石墨相氮化碳;随后通过HBTU/DIEA酰胺反应将间-羧基苯硼酸修饰到上步制备出的原始石墨相氮化碳上得到Wulff型石墨相氮化碳,60℃下烘干,随后将Wulff型石墨相氮化碳置于去离子水中,液体辅助超声并离心,收集上清液即得Wulff型石墨相氮化碳分散液。
2.构建外泌体捕获分析一体化分析方法:将表面常见跨膜蛋白CD63用PBS缓冲液稀释至10-50μgmL-1,取20-100μL上述浓度CD63抗体与100μL步骤1所述Wulff型石墨相氮化碳分散液混合,在37℃条件下孵育20-45min后离心以除去未标记上的抗体,并将沉淀重新分散于120-200μLPBS中,即得到CD63抗体-Wulff型石墨相氮化碳;
取120-200μL上述CD63抗体-Wulff型石墨相氮化碳,并与MCF-7细胞来源的外泌体混合孵育30-60min,随后离心并将下层沉淀重悬于120-200μLPBS中。最后测试体系在320nm激发下的荧光光谱,记录其在440nm左右的荧光强度,带入标准曲线即可算出样本中目标外泌体的浓度。只需改变第一步标记的抗体,即可实现对外泌体表面不同靶蛋白的特异性结合与分析。
3.外泌体的表型分析:通过前期构建的外泌体捕获分析一体化分析方法,将不同外泌体表面膜蛋白对应的抗体标记到Wulff型石墨相氮化碳上,依次对不同细胞来源的外泌体表面的不同膜蛋白进行分析鉴定。根据不同来源外泌体表面各蛋白表达量的差异,体系对外泌体表面不同靶蛋白的荧光信号也会产生差异,对外泌体表面不同靶蛋白产生的荧光信号进行箱线图制作和分析,并采用双边studentt-test进行显著性分析,以考察对不同肿瘤来源的外泌体表面蛋白表达情况,基于此,可实现外泌体表型分析。
进一步的,所述步骤1中将间-羧基苯硼酸修饰到原始石墨相氮化碳上的具体步骤为:将间-羧基苯硼酸和HBTU依次加入无水DMF中,在50-80℃下连续搅拌30min后,加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA)和原始石墨相氮化碳固体粉末,继续搅拌24h。反应结束后,离心并依次用稀盐酸、无水乙醇和去离子水清洗2-3次,所得固体粉末即Wulff型石墨相氮化碳。其中所述HBTU/DIEA酰胺反应中间-羧基苯硼酸、HBTU和DIEA的摩尔比比例为1:1.2:1.2。
进一步的,所述步骤1中制备Wulff型石墨相氮化碳分散液过程中使用液体辅助超声10h,并于转速5000rpm下离心10min。
进一步的,所述步骤2中使用的PBS缓冲液pH为7.4,含质量分数为2%的BSA。
进一步的,所述步骤2中使用的Wulff型石墨相氮化碳分散液浓度为0.5mgmL-1
进一步的,所述步骤2中离心过程转速为12000rpm。
进一步的,所述步骤3中外泌体表面膜蛋白具体为CD63、EpCAM和HER2。
进一步的,所述步骤3中外泌体表面膜蛋白来源细胞为HeLa、HepG2、MCF-7和MCF-10A。
本发明与现有技术相比的有益效果是:该方法简单快速,能够实现基于单一材料的捕获/分析双单元同时启动的外泌体高效捕获与原位分析一体化分析。这不仅在捕获效率上赶超现有的各种外泌体分离技术,而且对外泌体的原位分析具有良好的灵敏度(2484particlesmL-1),最重要的是,捕获与分析机制的有效整合,将整个分析过程(包括捕获和分析)控制在37min之内,极大提高了外泌体表型分析的效率和准确率。
附图说明
图1是基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化分析方法示意图。
图2 A是CD63抗体-Wulff型石墨相氮化碳与0~5×106particlesmL-1浓度MCF-7来源外泌体混合后的荧光光谱图;B是CD63抗体-Wulff型石墨相氮化碳与不同浓度外泌体混合后的荧光强度变化图,插图为荧光强度与浓度的校准曲线。
图3三种目标蛋白(CD63、EpCAM、HER2)在四种细胞(HeLa、HepG2、MCF-7、MCF-10A)来源外泌体表面表达热度图(A);本发明与商品化ELISA试剂盒的检测结果对比图(B);HeLa、HepG2、MCF-7和MCF-10A细胞准确分类结果的典型评分图(C)。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明,但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明,本发明所采用的实验方法均为常规方法,所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法:将抗体标记到制备出的Wulff型石墨相氮化碳上,得到强荧光信号的抗体-Wulff型石墨相氮化碳复合材料(ON),随着目标外泌体的引入,复合材料的荧光发生猝灭(OFF)。利用石墨相氮化碳自身易从水介质中分离出来并重新分散的性质,同时仅改变Wulff型石墨相氮化碳上标记的抗体,即可进行靶向外泌体表面不同蛋白的捕获分析一体化研究,流程如图1。
实施例1
基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法
Wulff型石墨相氮化碳的制备:称取5g左右尿素于100mL氧化铝坩埚中,并置于管式炉中,N2保护下,在3℃min-1的升温速度下开始加热,升温至至600℃并保持4h,随后自然冷却至室温,得到的黄色粉末即为原始石墨相氮化碳。
随后将0.3320g间-羧基苯硼酸和0.9120gHBTU依次加入60mL无水DMF中,在50℃下连续搅拌30min后,加入N,N-二异丙基乙胺0.4mL和原始石墨相氮化碳固体粉200mg,继续搅拌24h。反应结束后,离心并依次用稀盐酸、无水乙醇和去离子水清洗2-3次,所得固体粉末即Wulff型石墨相氮化碳,60℃下烘干待用。
外泌体捕获分析一体化分析方法的构建:以MCF-7细胞来源的外泌体和表面常见跨膜蛋白CD63为模型外泌体和模型蛋白,具体构建方法如下。将CD63抗体用PBS缓冲液(pH7.4,质量分数2%BSA)稀释至10μgmL-1,并取100μL上述浓度CD63抗体与100μL浓度为0.5mgmL-1的Wulff型石墨相氮化碳分散液混合,37℃下孵育20min后,于12000rpm转速下离心7min以除去未标记上的抗体,并将沉淀重新分散于200μLPBS中,即得到CD63抗体-Wulff型石墨相氮化碳。
取200μL上述CD63抗体-Wulff型石墨相氮化碳,并与1mLMCF-7细胞来源的外泌体混合孵育30min,随后在12000rpm转速下离心7min,并将下层沉淀重悬于200μLPBS中。最后测试体系在320nm激发下的荧光光谱,记录其在440nm左右的荧光强度,带入标准曲线即可算出样本中目标外泌体的浓度。只需改变第一步标记的抗体,即可实现对外泌体表面不同靶蛋白的特异性结合与分析(如图2所示)。
外泌体的表型分析:通过前期构建的外泌体捕获分析一体化分析方法,将外泌体表面常见的CD63、EpCAM和HER23种膜蛋白对应的抗体标记到Wulff型石墨相氮化碳上,依次对HeLa、HepG2、MCF-7和MCF-10A4种细胞来源的外泌体表面的上述膜蛋白进行分析鉴定。根据不同来源外泌体表面各蛋白表达量的差异,体系对外泌体表面不同靶蛋白的荧光信号也会产生差异,对外泌体表面不同靶蛋白产生的荧光信号进行箱线图制作和分析,并采用双边studentt-test进行显著性分析,以考察对不同肿瘤来源的外泌体表面蛋白表达情况基于此,可实现外泌体表型分析,结果如图3所示。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例,而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言,在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动,都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (9)

1.基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法,其特征在于,步骤为:
1).制备Wulff型石墨相氮化碳:将加入了尿素的氧化铝坩埚置于管式炉中,加热升温至600℃并保持4h后自然冷却至室温,得到的黄色粉末即为原始石墨相氮化碳;随后通过HBTU/DIEA酰胺反应将间-羧基苯硼酸修饰到上步制备出的原始石墨相氮化碳上得到Wulff型石墨相氮化碳,60℃下烘干,随后将Wulff型石墨相氮化碳置于去离子水中,液体辅助超声并离心,收集上清液即得Wulff型石墨相氮化碳分散液;
2).构建外泌体捕获分析一体化方法:将表面常见跨膜蛋白CD63用PBS缓冲液稀释至10-50μg mL-1,取20-100μL上述浓度CD63抗体与100μL所述步骤1中的Wulff型石墨相氮化碳分散液混合,在37℃条件下孵育20-45min后离心以除去未标记上的抗体,并将沉淀重新分散于120-200μLPBS中,即得到CD63抗体-Wulff型石墨相氮化碳;
取120-200μL上述CD63抗体-Wulff型石墨相氮化碳,并与MCF-7细胞来源的外泌体混合孵育30-60min,随后离心并将下层沉淀重悬于120-200μLPBS中,最后测试体系在320nm激发下的荧光光谱,记录其在440nm左右的荧光强度,带入标准曲线算出样本中目标外泌体的浓度;
3).外泌体的表型分析:通过前期构建的外泌体捕获分析一体化方法,将不同外泌体表面膜蛋白对应的抗体标记到Wulff型石墨相氮化碳上,依次对不同细胞来源的不同外泌体表面膜蛋白进行分析鉴定,对外泌体表面不同靶蛋白产生的荧光信号进行箱线图制作和分析,并采用双边student t-test进行显著性分析。
2.根据权利要求1所述的基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法,其特征在于,所述步骤1中将间-羧基苯硼酸修饰到原始石墨相氮化碳上的具体步骤为:将间-羧基苯硼酸和HBTU依次加入无水DMF中,在50-80℃下连续搅拌30min后,加入DIEA和原始石墨相氮化碳固体粉末,继续搅拌24h;反应结束后,离心并依次用稀盐酸、无水乙醇和去离子水清洗2-3次,所得固体粉末即Wulff型石墨相氮化碳。
3.根据权利要求1所述的基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法,其特征在于,所述步骤1中制备Wulff型石墨相氮化碳分散液过程中使用液体辅助超声10h,并于转速5000rpm下离心10min。
4.根据权利要求2所述的基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法,其特征在于,所述具体步骤中间-羧基苯硼酸、HBTU和DIEA的比例为1:1.2:1.2。
5.根据权利要求1所述的基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法,其特征在于,所述步骤2中使用的PBS缓冲液pH为7.4,含质量分数为2%的BSA。
6.根据权利要求1所述的基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法,其特征在于,所述步骤1制备及步骤2中使用的Wulff型石墨相氮化碳分散液浓度为0.5mgmL-1
7.根据权利要求1所述的基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法,其特征在于,所述步骤2中离心过程转速为12000rpm。
8.根据权利要求1所述的基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法,其特征在于,所述步骤3中外泌体表面膜蛋白具体为CD63、EpCAM和HER2。
9.根据权利要求7所述的基于硼酸定向偶联免疫亲和的外泌体捕获分析一体化方法,其特征在于,所述外泌体表面膜蛋白来源细胞为HeLa、HepG2、MCF-7和MCF-10A。
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