CN105606827A - 一种用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒及其制备方法。试剂盒包括：偶联单克隆抗体的羧基石墨烯和/或偶联多克隆抗体的羧基石墨烯；带高正电荷的荧光蛋白；缓冲液。本发明还涉及上述试剂盒的制备方法。本发明所述用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒，无需抗体吸附包被酶标板，且无抗原抗体结合后的洗涤等繁琐步骤，可以实现均相体系中目的蛋白聚糖的快速检测分析，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒及其制备方法，属于生物分析和医学检测技术领域。
背景技术
蛋白聚糖(proteoglycan，PG)是一类复杂的生物大分子，在核心蛋白上共价偶联着一条或多条糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)链。GAG是由重复的二糖单位组成的直链多糖，主要分为四类：透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)/硫酸皮肤素(DS)、硫酸角质素(KS)及肝素(Hep)/硫酸乙酰肝素(HS)。其中透明质酸不与核心蛋白结合组成蛋白聚糖。蛋白聚糖除含糖胺聚糖链外，还偶联一些N-或O-链接的寡糖链。
PG在细胞外基质中广泛分布，也存在于细胞表面以及细胞内的分泌颗粒中。在机体中PG参与了众多生理学过程，如作为组织结构的构成原件存在，调控细胞的增殖、粘附、迁移和变异等过程，还参与生长因子、细胞因子的结合，细胞的信号转导，神经元的生长和形态发生等过程。在癌变微环境中，PG的表达显著改变，因此一部分蛋白聚糖被用作检测某些疾病的特异性标志分子，如蛋白聚糖Glypican的家族成员之一Glypican-3(GPC3)，目前被普遍认为是肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)的特异性标志分子。
GPC3由单链核心蛋白、硫酸乙酰肝素(HeparinSulfate，HS)链和糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)组成，通过GPI锚定于细胞膜上。GPC3在75％的HCC中显著表达，但在肝脏正常组织和良性病变中并不表达，因此是比甲胎球蛋白更为特异和灵敏的新型HCC标志分子。
由于蛋白聚糖核心蛋白分子量的大小及其结构不同，且共价偶联的GAG链的数量、种类、长度、硫酸化程度及偶联部位不同，使得蛋白聚糖组成复杂，结构多样，因而给其检测带来了诸多困难。在GPC3的检测中，目前最常用的检测方法为夹心ELISA法，但其检测灵敏度偏低，只能检测到50％左右HCC病人血清中有明显GPC3存在；且由于第一抗体在酶标板上的吸附包被及第二抗体与抗原的结合需要孵育过夜，完成一次实验需要三天时间，耗时较长，这极大的限制了此方法的应用，给GPC3的检测带来了困难。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒及其制备方法。该试剂盒可运用耦联抗体的石墨烯与GPC3核心蛋白的结合，对结合在GPC3HS侧链上的ScGFP的荧光淬灭作用达到对血清/血浆中HCC的标志物GPC3的高灵敏度快速检测。
一种用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒，包括：
偶联单克隆抗体的羧基石墨烯和/或偶联多克隆抗体的羧基石墨烯；偶联单克隆抗体的羧基石墨烯包括：偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯，所述单克隆抗体1为蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯，所述单克隆抗体2为蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联多克隆抗体的羧基石墨烯包括：偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯，所述多克隆抗体3为蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联多克隆抗体4的羧基石墨烯，所述多克隆抗体4为蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；
带高正电荷的荧光蛋白；
缓冲液：含有浓度5～50mMTris-HCl和浓度50～200mMNaCl的溶液。
根据本发明优选的，所述蛋白聚糖为GPC3、GPC1、GPC2、GPC4、GPC5、GPC6、Syndecan-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、Versican、Aggrecan、Brevican、Decorin、Lumican、Perleacan、Agrin、CD44或NG2；进一步优选的，所述的蛋白聚糖为GPC3或蛋白聚糖Syndecan-2；最优的，所述蛋白聚糖为GPC3时，羧基端氨基酸序列长度为50～90个氨基酸，氨基端氨基酸序列长度为490～530个氨基酸。
根据本发明优选的，所述偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯的浓度为5～20μg/mL。
根据本发明优选的，所述偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯的浓度为5～20μg/mL。
根据本发明优选的，所述偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯的浓度为5～20μg/mL。
根据本发明优选的，所述偶联多克隆抗体4的羧基石墨烯的浓度为5～20μg/mL。
根据本发明优选的，所述带高正电荷的荧光蛋白的浓度为0.001～0.01μg/μL；进一步优选的，所述的带高正电荷荧光蛋白为高正电荷绿色荧光蛋白(ScGFP)。
根据本发明优选的，还包括装配试剂盒必须的微孔板、锡箔纸。
上述用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒的制备方法，步骤如下：
(1)将单克隆抗体1加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂，再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭1～3min，制得偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯；
将单克隆抗体2加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂，再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭1～3min，制得偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯；
将多克隆抗体3加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂，再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭1～3min，制得偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯；
和/或，
将多克隆抗体4加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂，再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭1～3min，制得偶联多克隆抗体4的羧基石墨烯；
(2)制备带高正电荷荧光蛋白，配制带高正电荷荧光蛋白溶液；
(3)配制含有浓度5～50mMTris-HCl和浓度50～200mMNaCl的溶液，制得缓冲液；
(4)分别将步骤(1)制得的偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯、步骤(1)制得的偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯、步骤(2)制得的带高正电荷荧光蛋白溶液和步骤(3)制得的缓冲液经装配后，制得用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，表面活性剂为乙二胺四乙酸(EDTA)或十二烷基磺酸钠(SDS)，每毫升反应体系加入表面活性剂1～5μL；封闭剂为牛血清白蛋白(BSA)，反应体系中加入封闭剂至质量浓度为0.5％～2％。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，所述羧基石墨烯的反应质量浓度为0.8～1.2mg/mL，羧基石墨烯与单克隆抗体1的反应质量浓度比为10：1，羧基石墨烯与单克隆抗体2的反应质量浓度比为10：1，羧基石墨烯与多克隆抗体3的反应质量浓度比为10：1，羧基石墨烯与多克隆抗体4的反应质量浓度比为10：1。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，单克隆抗体1的制备方法如下：
(i)蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端氨基酸序列的表达基因插入PTRACER真核表达载体(购自INVITROGEN)，转染HEK293细胞(购自上海细胞所)，从细胞培养上清中纯化，PBS稀释至1.0～2.0mg/mL，制得抗原；
(ii)将步骤(i)制得的抗原免疫BALB/C小鼠3次，抗原免疫量为50～100μg/次，然后用PEG法将效价≥2000的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，并筛选出阳性克隆；
(iii)向BALB/C小鼠腹腔中注射弗氏不完全佐剂(购自SIGMA公司)，待小鼠腹腔中产生足量腹水后，于小鼠腹腔中接种步骤(ii)制得的阳性克隆，两周后抽取腹水，离心取上清，纯化后，制得单克隆抗体1。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(i)的纯化，为用NI-NTA亲和层析柱进行纯化。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(iii)的纯化，步骤如下：
将上清用PBS缓冲液稀释2.5倍，上蛋白A/G亲和层析柱(GE)，分别用含0.5MNaCl的TRIS-HClpH8.0的缓冲液和含0.5MNaCl的TRIS-HClpH9.0的缓冲液充分洗脱除杂，最后用100mM三乙胺洗脱回收抗体，收集前三柱体积的洗脱液，并立即用1M的NaH2PO4中和，最后用截流分子量为10KD的超滤管脱盐，并将抗体置换到PBS中，即得。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，单克隆抗体2的制备方法如下：
(a)蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端氨基酸序列的表达基因插入PTRACER真核表达载体，转染HEK293细胞，从细胞培养上清中纯化，PBS稀释至1.0～2.0mg/mL，制得抗原；
(b)将步骤(a)制得的抗原免疫BALB/C小鼠3次，抗原免疫量为50～100μg/次，然后用PEG法将效价≥2000的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，并筛选出阳性克隆；
(c)向BALB/C小鼠腹腔中注射弗氏不完全佐剂，待小鼠腹腔中产生足量腹水后，于小鼠腹腔中接种步骤(b)制得的阳性克隆，两周后抽取腹水，离心取上清，纯化后，制得单克隆抗体2。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(a)的纯化，为用NI-NTA亲和层析柱进行纯化。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(c)的纯化，步骤如下：
将上清用PBS缓冲液稀释2.5倍，上蛋白A/G亲和层析柱(GE)，分别用含0.5MNaCl的TRIS-HClpH8.0的缓冲液和含0.5MNaCl的TRIS-HClpH9.0的缓冲液充分洗脱除杂，最后用100mM三乙胺洗脱回收抗体，收集前三柱体积的洗脱液，并立即用1M的NaH2PO4中和，最后用截流分子量为10KD的超滤管脱盐，并将抗体置换到PBS中，即得。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，多克隆抗体3的制备方法如下：
a、蛋白聚糖的核心蛋白羧基端氨基酸序列的表达基因插入PTRACER真核表达载体，转染HEK293细胞，从细胞培养上清中纯化，PBS稀释至1.0～2.0mg/mL，制得抗原；
b、将步骤a制得的抗原免疫雌性新西兰大白兔3次，抗原免疫量为200～400μg/次，然后取血，离心取上清，纯化后，制得多克隆抗体3；
所述步骤b的纯化，步骤如下：
将上清用PBS缓冲液稀释2.5倍，上蛋白A/G亲和层析柱(GE)，分别用含0.5MNaCl的TRIS-HClpH8.0的缓冲液和含0.5MNaCl的TRIS-HClpH9.0的缓冲液充分洗脱除杂，最后用100mM三乙胺洗脱回收抗体，收集前三柱体积的洗脱液，并立即用1M的NaH2PO4中和，最后用截流分子量为10KD的超滤管脱盐，并将抗体置换到PBS缓冲液中，即得。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，多克隆抗体4的制备方法如下：
a、蛋白聚糖的核心蛋白氨基端氨基酸序列的表达基因插入PTRACER真核表达载体，转染HEK293细胞，从细胞培养上清中纯化，PBS稀释至1.0～2.0mg/mL，制得抗原；
b、将步骤a制得的抗原免疫雌性新西兰大白兔3次，抗原免疫量为200～400μg/次，然后取血，离心取上清，纯化后，制得多克隆抗体4；
所述步骤b的纯化，步骤如下：
将上清用PBS缓冲液稀释2.5倍，上蛋白A/G亲和层析柱(GE)，分别用含0.5MNaCl的TRIS-HClpH8.0的缓冲液和含0.5MNaCl的TRIS-HClpH9.0的缓冲液充分洗脱除杂，最后用100mM三乙胺洗脱回收抗体，收集前三柱体积的洗脱液，并立即用1M的NaH2PO4中和，最后用截流分子量为10KD的超滤管脱盐，并将抗体置换到PBS缓冲液中，即得。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，带高正电荷荧光蛋白为高正电荷绿色荧光蛋白(ScGFP)。带高正电荷荧光蛋白的制备为本领域的常规技术，如可参考文献Lawrence,M.S.；Phillips,K.J.；Liu,D.R.J.Am.Chem.Soc.2007,129,10110-10112.中记载的构建表达方法。
上述工艺步骤如无特别说明，均可采用本领域的常规操作。
有益效果
1、本发明所述用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒，无需抗体吸附包被酶标板，且无抗原抗体结合后的洗涤等繁琐步骤，可以实现均相体系中目的蛋白聚糖的快速检测分析，灵敏度高；
2、本发明所述用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒，在均相体系中通过偶联在羧基石墨烯上的抗体，特异性的结合目的蛋白聚糖的核心蛋白，同时目的蛋白聚糖上的糖侧链又可与带高正电荷的绿色荧光蛋白(ScGFP)通过电荷作用相互连接，待最后加入偶联另一种抗体的羧基石墨烯后，形成一种夹心结构，可对处于夹层中间目的蛋白聚糖侧链上的ScGFP进行更好的荧光淬灭作用，进一步提高检测的灵敏度，从而解决ELISA法检测灵敏度低，反应时间过长等缺点，可解决在无昂贵设备条件下病人血清中目的蛋白聚糖的快速灵敏检测问题；
3、本发明所述用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒的制备方法简单，易操作，成本低廉，便于大规模推广应用。
附图说明
图1：ScGFP、偶联单克隆抗体(αGCN、αGCC)的羧基石墨烯和GPC3加入顺序对荧光强度的影响柱状图；
A：偶联αGCN的羧基石墨烯和GPC3、ScGFP混合后加入偶联αGCC的羧基石墨烯；B：两种分别偶联αGCN和αGCC的羧基石墨烯与GPC3混合后加入ScGFP；C：两种分别偶联αGCN和αGCC的羧基石墨烯与ScGFP混合后加入GPC3；D：偶联αGCC的羧基石墨烯和GPC3、ScGFP混合后加入偶联αGCN的羧基石墨烯。
图2：缓冲液中GPC3的检测结果柱状图；
图3：FBS中GPC3的检测结果柱状图；
图4：GPC3与GPC3ΔGAG的检测结果比较柱状图；
图5：临床血清中GPC3的检测结果。
图6：缓冲液中Syndecan-2的检测结果柱状图；
图7：偶联抗体1的羧基石墨烯的制备过程示意图；
图8：偶联抗体2的羧基石墨烯的制备过程示意图；
图9：蛋白聚糖GPC3检测过程的过程示意图；
图10：实施例9采用蛋白聚糖GPC3高灵敏度检测的试剂盒检测GPC3的检测结果柱状图；
图11：实施例11采用蛋白聚糖GPC3高灵敏度检测的试剂盒检测GPC3的检测结果柱状图；
具体实施方式
以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中各参数的准确性(例如质量，温度等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。
实施例1、
一种用于蛋白聚糖GPC3高灵敏度检测的试剂盒，包括：
偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯，所述单克隆抗体1为蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端70个氨基酸序列片段做为抗原免疫后制得的抗体；所述偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯的浓度为10μg/mL；
偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯，所述单克隆抗体2为蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端510个氨基酸序列片段做为抗原免疫后制得的抗体；所述偶联单克隆抗体2羧基石墨烯的浓度为10μg/mL；
带高正电荷的绿色荧光蛋白(ScGFP)；带高正电荷的绿色荧光蛋白的浓度为0.005μg/μL；
缓冲液：含有浓度10mMTris-HCl和浓度100mMNaCl的溶液；
以及，装配试剂盒必须的微孔板、锡箔纸。
上述用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒的制备方法，步骤如下：
(1)将单克隆抗体1加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂EDTA，再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭3min，制得偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯(制备过程示意图如图7所示)；
将单克隆抗体2加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂EDTA，再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭3min，制得偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯(制备过程示意图如图8所示)；
(2)制备带高正电荷荧光蛋白，配制带高正电荷荧光蛋白溶液；
(3)配制含有浓度10mMTris-HCl和浓度100mMNaCl的溶液，制得缓冲液；
(4)分别将步骤(1)制得的偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯、步骤(1)制得的偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯、步骤(2)制得的带高正电荷荧光蛋白溶液和步骤(3)制得的缓冲液经装配后，制得用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒。
所述步骤(1)中，表面活性剂为乙二胺四乙酸(EDTA)，每毫升反应体系加入表面活性剂5μL；封闭剂为牛血清白蛋白(BSA)，反应体系中加入封闭剂至质量浓度为1.5％。
所述步骤(1)中，所述羧基石墨烯的反应质量浓度为1.0mg/mL，羧基石墨烯与单克隆抗体1的反应质量浓度比为10：1，羧基石墨烯与单克隆抗体2的反应质量浓度比为10：1。
所述步骤(1)中，单克隆抗体1的制备方法如下：
(i)用GPC3全长蛋白基因核心蛋白的羧基端70个氨基酸序列片段(αGCN，SEQIDNO.1)的表达基因插入PTRACER真核表达载体，转染HEK293细胞，用NI-NTA亲和层析柱从细胞培养上清中纯化，PBS稀释至2.0mg/mL，制得抗原；
(ii)将步骤(i)制得的抗原免疫BALB/C小鼠3次，抗原免疫量为80μg/次，然后用PEG法将效价达到2000的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，并筛选出阳性克隆；
(iii)向BALB/C小鼠腹腔中注射弗氏不完全佐剂，待小鼠腹腔中产生足量腹水后，于小鼠腹腔中接种步骤(ii)制得的阳性克隆，两周后抽取腹水，离心取上清，纯化后，制得单克隆抗体1。
所述步骤(iii)的纯化，步骤如下：
将上清用PBS稀释2.5倍，上蛋白A/G亲和层析柱(GE)，分别用含0.5MNaCl的TRIS-HClpH8.0的缓冲液和含0.5MNaCl的TRIS-HClpH9.0的缓冲液充分洗脱除杂，最后用100mM三乙胺洗脱回收抗体，收集前三柱体积的洗脱液，并立即用1M的NaH2PO4中和，最后用截流分子量为10KD的超滤管脱盐，并将抗体置换到PBS中，即得。
所述步骤(1)中，单克隆抗体2的制备方法如下：
(a)用GPC3全长蛋白基因除羧基端的70个氨基酸序列外的其他氨基酸序列片段(αGCC，SEQIDNO.2)的表达基因插入PTRACER真核表达载体，转染HEK293细胞，用NI-NTA亲和层析柱从细胞培养上清中纯化，PBS稀释至2.0mg/mL，制得抗原；
(b)将步骤(a)制得的抗原免疫BALB/C小鼠3次，抗原免疫量为80μg/次，然后用PEG法将效价达到2000的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，并筛选出阳性克隆；
(c)向BALB/C小鼠腹腔中注射弗氏不完全佐剂，待小鼠腹腔中产生足量腹水后，于小鼠腹腔中接种步骤(b)制得的阳性克隆，两周后抽取腹水，离心取上清，纯化后，制得单克隆抗体2。
所述步骤(c)的纯化，步骤如下：
将上清用PBS稀释2.5倍，上蛋白A/G亲和层析柱(GE)，分别用含0.5MNaCl的TRIS-HClpH8.0的缓冲液和含0.5MNaCl的TRIS-HClpH9.0的缓冲液充分洗脱除杂，最后用100mM三乙胺洗脱回收抗体，收集前三柱体积的洗脱液，并立即用1M的NaH2PO4中和，最后用截流分子量为10KD的超滤管脱盐，并将抗体置换到PBS中，即得。
所述步骤(2)中，带高正电荷荧光蛋白的制备为本领域的常规技术，如可参考文献Lawrence,M.S.；Phillips,K.J.；Liu,D.R.J.Am.Chem.Soc.2007,129,10110-10112.中记载的构建表达方法。
实施例2、反应条件的优化
试剂添加顺序对GPC3检测的的影响
在微孔板40μL反应体系中依照不同顺序加入偶联αGCN的羧基石墨烯0.05～0.2μg、偶联αGCC的羧基石墨烯0.05～0.2μg、ScGFP0.01～0.5μg、GPC30.001～0.005ng，混匀、室温避光放置15min，孵育结束后，测定荧光强度(Ex：470nm，Em：509nm)。
其中：A组为偶联αGCN的羧基石墨烯和GPC3、ScGFP混合后加入偶联αGCC的羧基石墨烯；B组为两种分别偶联αGCN和αGCC的羧基石墨烯与GPC3混合后加入ScGFP；C组为两种分别偶联αGCN和αGCC的羧基石墨烯与ScGFP混合后加入GPC3；D组为偶联αGCC的羧基石墨烯和GPC3、ScGFP混合后加入偶联αGCN的羧基石墨烯。
结果显示，先加入偶联一种抗体的羧基石墨烯和GPC3，随后加入ScGFP，最后加入偶联另一种抗体的石墨烯的顺序对荧光的淬灭作用最强，因此选用此顺序进行后续实验(如图1)。
加入试剂孵育时间对GPC3检测的影响
在微孔板40μL反应体系中加入偶联αGCN的羧基石墨烯0.05～0.2μg、GPC30.001～0.005ng，混匀、室温放置不同的时间；然后统一加入ScGFP0.01～0.5μg，混匀、室温避光放置5min；最后加入偶联αGCC的羧基石墨烯0.05～0.2μg，混匀、室温避光放置10min，孵育结束后，测定荧光强度(Ex：470nm，Em：509nm)。
结果显示，加入前两者后放置5min即可基本达到最佳荧光淬灭效果。
在微孔板40μLPBS(pH7.4)溶液中加入偶联αGCN的羧基石墨烯0.05～0.2μg，GPC30.001～0.005ng后混匀、室温放置5min；随后加入ScGFP0.01～0.5μg，混匀、室温避光放置不同时间，最后加入偶联αGCC的羧基石墨烯0.05～0.2μg，混匀、室温避光放置10min，孵育结束后，测定荧光强度(Ex：470nm，Em：509nm)。
结果显示，加入混合物后放置15min后基本达到荧光淬灭平衡状态。
在微孔板40μLPBS(pH7.4)溶液中加入αGCN的羧基石墨烯0.05～0.2μg、GPC30.001～0.005ng，混匀、室温反应5min；随后加入ScGFP0.01～0.5μg，混匀、室温避光放置15min；最后加入偶联αGCC的羧基石墨烯0.05～0.2μg，混匀、室温避光放置不同的时间，孵育结束后，测定荧光强度(Ex：470nm，Em：509nm)。
结果显示，加入羧基石墨烯后10min即可基本达到荧光淬灭平衡。
因此最后选择加入偶联αGCN的羧基石墨烯和GPC3后放置5～10min，随后加入ScGFP，室温避光放置10～30min，最后加入偶联αGCC的羧基石墨烯避光放置5～20min作为反应时间。
不同pH的不同缓冲溶液对GPC3检测的影响
在不同pH值的10mMHAc-NaAc、NaH2PO4-Na2HPO4、Tris-HCl缓冲液中加入偶联αGCN的羧基石墨烯0.05～0.2μg，GPC30.001～0.005ng，混匀、室温放置5min；随后加入ScGFP0.01～0.5μg，混匀、室温避光放置15min；最后加入偶联αGCC的羧基石墨烯0.05～0.2μg，混匀、室温避光放置10min，孵育结束后，测定荧光强度(Ex：470nm，Em：509nm)。
结果显示在Tris-HCl(pH7～10.0)缓冲液中，对ScGFP的荧光淬灭能力最强。
不同NaCl浓度对GPC3检测的影响
在含不同浓度NaCl的10mMTris-HCl缓冲液中加入偶联αGCN的羧基石墨烯0.05～0.2μg，GPC30.001～0.005ng，混匀、室温放置5min；随后加入ScGFP0.01～0.5μg，混匀、室温避光放置15min；最后加入偶联αGCC的羧基石墨烯，混匀、室温避光放置10min，孵育结束后，测定荧光强度(Ex：470nm，Em：509nm)。
结果显示随着NaCl浓度的增加，对ScGFP的荧光淬灭能力呈现先增强后减弱的情况，据此选择NaCl浓度为50～200mM作为反应体系中加入盐的浓度。
羧基石墨烯偶联抗体量对GPC3检测的影响
制备偶联不同含量抗体的羧基石墨烯，在10mMTris-HCl，100mMNaCl溶液中加入偶联不同含量αGCN的羧基石墨烯0.05～0.2μg，GPC30.001～0.005ng，混匀、室温放置5min；随后加入ScGFP0.01～0.5μg，混匀、室温避光放置15min；最后加入相对应的偶联不同含量αGCC的羧基石墨烯0.05～0.2μg，混匀、室温避光放置10min，孵育结束后，测定荧光强度(Ex：470nm，Em：509nm)。
结果显示，偶联0.05～0.2mg/mL抗体的羧基石墨烯具有最好的淬灭效果。
实施例3、GPC3在缓冲液中的检测
在微孔板40μL10mMTris-HCl、100mMNaCl溶液中，加入偶联αGCN的羧基石墨烯0.05～0.2μg，GPC30～0.04ng，混匀、室温放置5min；随后加入ScGFP0.01～0.5μg，混匀，室温避光放置15min；最后加入偶联αGCC的羧基石墨烯0.05～0.2μg，混匀、室温避光放置10min，孵育结束后，测定荧光强度(Ex：470nm，Em：509nm)。蛋白聚糖GPC3检测过程的过程示意图如图9所示。
结果显示，随着GPC3浓度的升高，其介导的荧光淬灭强度也逐渐增高，检测灵敏度可以达到10pg/mL以下(如图2)，远高于夹心ELISA法。
实施例4、GPC3在血清中的检测
将GPC3溶于胎牛血清(FBS)作为贮备液。然后用质量浓度为20％的FBS稀释GPC3贮藏液成不同浓度，待检。在40μL10mMTris-HCl、100mMNaCl溶液中，加入偶联αGCN的羧基石墨烯0.05～0.2μg，GPC30～0.04ng，混匀、室温放置5min；随后加入ScGFP0.01～0.5μg，混匀、室温避光放置15min；最后加入偶联αGCC的羧基石墨烯0.05～0.2μg，混匀、室温避光放置10min，孵育结束后，测定荧光强度(Ex：470nm，Em：509nm)。
结果显示，血清中GPC3含量与荧光淬灭强度呈显著的剂量依赖性，灵敏度与在缓冲液中相似，达到皮克级(如图3)。
实施例5、GPC3和GPC3ΔGAG检测的比较
在40μL10mMTris-HCl(pH10.0)，100mMNaCl溶液中加入偶联αGCN的羧基石墨烯0.05～0.2μg，并分别加入不同浓度的GPC3和其非糖基化突变GPC3ΔGAG，混匀、室温放置5min；随后加入ScGFP0.01～0.5μg，混匀、室温避光放置15min；最后加入偶联αGCC的羧基石墨烯0.05～0.2μg，混匀、室温避光放置10min，孵育结束后，测定荧光强度(Ex：470nm，Em：509nm)。
结果显示，GPC3的非糖基化突变GPC3ΔGAG几乎不能介导羧基石墨烯对ScGFP的荧光淬灭(如图4)，表明GPC3的糖胺聚糖侧链HS对于ScGFP的结合至关重要，同时也表明上述由偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯和偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯装配的试剂盒对GPC3检测的专一性。
实施例6、临床血清中GPC3的检测和比较分析
在32μL10mMTris-HCl，100mMNaCl溶液中加入偶联αGCN的羧基石墨烯0.05～0.2μg，8μL五倍稀释的血清(正常人、良性肝病病人或HCC病人)，混匀，室温放置5min；随后加入ScGFP0.01～0.5μg，混匀、室温避光放置15min；最后加入加入偶联αGCC的羧基石墨烯0.05～0.2μg，混匀、室温避光放置10min，孵育结束后，测定荧光强度(Ex：470nm，Em：509nm)。
结果显示，正常人和良性肝病病人血清样本的荧光强度分布范围基本相似，无显著差异。但HCC病人血清的荧光强度显著下降，意味着GPC3的存在介导了石墨烯对ScGFP的荧光淬灭，与正常组和良性肝病组相比存在极为显著的差异。其中有近14例HCC病人的血清的荧光强度显著低于正常和良性肝病组，占HCC病人总数的60％(如图5)，高于以前报道的45～50％。本发明所建立的GPC3均相检测技术，灵敏度远高于常用的ELISA法，这可能是其检出率较高的原因。
实施例7、Syndecan-2在缓冲液中的检测
一种用于蛋白聚糖Syndecan-2高灵敏度检测的试剂盒，包括：
偶联抗Syndecan-2单克隆抗体1的羧基石墨烯，所述Syndecan-2单克隆抗体1为HumanSyndecan-2MAb(Clone305507),RatIgG2A(购自R&DSystems公司)；所述偶联抗Syndecan-2单克隆抗体1的羧基石墨烯的浓度为10μg/mL；
偶联抗Syndecan-2单克隆抗体2的羧基石墨烯，所述Syndecan-2单克隆抗体2为HumanSyndecan-2MAb(Clone305515),RatIgG2B(购自R&DSystems公司)；所述偶联抗Syndecan-2单克隆抗体2的羧基石墨烯的浓度为10μg/mL；
带高正电荷的绿色荧光蛋白(ScGFP)；带高正电荷的绿色荧光蛋白的浓度为0.005μg/μL；
缓冲液：含有浓度10mMTris-HCl和浓度100mMNaCl的溶液；
以及，装配试剂盒必须的微孔板、锡箔纸。
上述用于蛋白聚糖Syndecan-2高灵敏度检测的试剂盒的制备方法同实施例1。
在微孔板40μL10mMTris-HCl、100mMNaCl溶液中，加入偶联抗Syndecan-2单克隆抗体1(HumanSyndecan-2MAb(Clone305507),RatIgG2A)的羧基石墨烯0.05～0.2μg，Syndecan-20～0.05ng，混匀、室温放置5min；随后加入ScGFP0.01～0.5μg，混匀，室温避光放置15min；最后加入偶联抗Syndecan-2单克隆抗体2(HumanSyndecan-2MAb(Clone305515),RatIgG2B)的羧基石墨烯0.05～0.2μg，混匀、室温避光放置10min，孵育结束后，测定荧光强度(Ex：470nm，Em：509nm)。结果显示，随着Syndecan-2浓度的升高，其辅助荧光淬灭强度也逐渐增高(如图6)。
实施例8、
一种用于蛋白聚糖GPC3高灵敏度检测的试剂盒，包括：
偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯，所述多克隆抗体3为蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端290个氨基酸序列片段做为抗原免疫后制得的抗体；所述偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯的浓度为10μg/mL；
偶联多克隆抗体4的羧基石墨烯，所述多克隆抗体4为蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端290个氨基酸序列片段做为抗原免疫后制得的抗体；所述偶联多克隆抗体4羧基石墨烯的浓度为10μg/mL；
带高正电荷的绿色荧光蛋白(ScGFP)；带高正电荷的绿色荧光蛋白的浓度为0.005μg/μL；
缓冲液：含有浓度10mMTris-HCl和浓度100mMNaCl的溶液；
以及，装配试剂盒必须的微孔板、锡箔纸。
上述用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒的制备方法，步骤如下：
(1)将多克隆抗体3加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂EDTA，再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭3min，制得偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯；
将多克隆抗体4加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂EDTA，再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭3min，制得偶联多克隆抗体4的羧基石墨烯；
(2)制备带高正电荷荧光蛋白，配制带高正电荷荧光蛋白溶液；
(3)配制含有浓度10mMTris-HCl和浓度100mMNaCl的溶液，制得缓冲液；
(4)分别将步骤(1)制得的偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯、步骤(1)制得的偶联多克隆抗体4的羧基石墨烯、步骤(2)制得的带高正电荷荧光蛋白溶液和步骤(3)制得的缓冲液经装配后，制得用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒。
所述步骤(1)中，表面活性剂为乙二胺四乙酸(EDTA)，每毫升反应体系加入表面活性剂5μL；封闭剂为牛血清白蛋白(BSA)，反应体系中加入封闭剂至质量浓度为1.5％。
所述步骤(1)中，所述羧基石墨烯的反应质量浓度为1.0mg/mL，羧基石墨烯与多克隆抗体3的反应质量浓度比为10：1，羧基石墨烯与多克隆抗体4的反应质量浓度比为10：1。
所述步骤(1)中，多克隆抗体3的制备方法如下：
(i)用GPC3全长蛋白基因核心蛋白的羧基端290个氨基酸序列片段(SEQIDNO.3)的表达基因插入PTRACER真核表达载体，转染HEK293细胞，用NI-NTA亲和层析柱从细胞培养上清中纯化，PBS稀释至2.0mg/mL，制得抗原；
(ii)将步骤(i)制得的抗原免疫雌性新西兰大白兔3次，抗原免疫量为300μg/次，然后取血，离心取上清，纯化后，制得多克隆抗体3；
所述步骤(ii)的纯化，步骤如下：
将上清用PBS缓冲液稀释2.5倍，上蛋白A/G亲和层析柱(GE)，分别用含0.5MNaCl的TRIS-HClpH8.0的缓冲液和含0.5MNaCl的TRIS-HClpH9.0的缓冲液充分洗脱除杂，最后用100mM三乙胺洗脱回收抗体，收集前三柱体积的洗脱液，并立即用1M的NaH2PO4中和，最后用截流分子量为10KD的超滤管脱盐，并将抗体置换到PBS缓冲液中，即得。
所述步骤(1)中，多克隆抗体4的制备方法如下：
(a)用GPC3全长蛋白基因核心蛋白的氨基端290个氨基酸序列片段(SEQIDNO.4)的表达基因插入PTRACER真核表达载体，转染HEK293细胞，用NI-NTA亲和层析柱从细胞培养上清中纯化，PBS稀释至2.0mg/mL，制得抗原；
(b)将步骤(a)制得的抗原免疫雌性新西兰大白兔3次，抗原免疫量为300μg/次，然后取血，离心取上清，纯化后，制得多克隆抗体4；
所述步骤(b)的纯化，步骤如下：
将上清用PBS缓冲液稀释2.5倍，上蛋白A/G亲和层析柱(GE)，分别用含0.5MNaCl的TRIS-HClpH8.0的缓冲液和含0.5MNaCl的TRIS-HClpH9.0的缓冲液充分洗脱除杂，最后用100mM三乙胺洗脱回收抗体，收集前三柱体积的洗脱液，并立即用1M的NaH2PO4中和，最后用截流分子量为10KD的超滤管脱盐，并将抗体置换到PBS缓冲液中，即得。
所述步骤(2)中，带高正电荷荧光蛋白的制备为本领域的常规技术，如可参考文献Lawrence,M.S.；Phillips,K.J.；Liu,D.R.J.Am.Chem.Soc.2007,129,10110-10112.中记载的构建表达方法。
实施例9、多克隆抗体用于GPC3的检测
在微孔板40μL10mMTris-HCl、100mMNaCl溶液中，加入实施例8制得的偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯0.05～0.2μg，GPC30～0.04ng，混匀、室温放置5min；随后加入ScGFP0.01～0.5μg，混匀，室温避光放置15min；最后再加入实施例8制得的偶联GPC3多克隆抗体4的羧基石墨烯0.05～0.2μg，混匀、室温避光放置10min，孵育结束后，测定荧光强度(Ex：470nm，Em：509nm)，结果如图10所示；
结果显示，同单克隆抗体一样，多克隆抗体也可用于GPC3的检测，且随着GPC3浓度的升高，其介导的荧光淬灭强度也逐渐增高。
实施例10、
一种用于蛋白聚糖GPC3高灵敏度检测的试剂盒，包括：
偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯，所述单克隆抗体1为蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端70个氨基酸序列片段做为抗原免疫后制得的抗体；所述偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯的浓度为10μg/mL；
偶联多克隆抗体4的羧基石墨烯，所述多克隆抗体4为蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端氨基酸序列片段做为抗原免疫后制得的抗体；所述偶联多克隆抗体4羧基石墨烯的浓度为10μg/mL；
或
偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯，所述单克隆抗体2为蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端510个氨基酸序列片段做为抗原免疫后制得的抗体；所述偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯的浓度为10μg/mL；
偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯，所述多克隆抗体3为蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端氨基酸序列片段做为抗原免疫后制得的抗体；所述偶联多克隆抗体3羧基石墨烯的浓度为10μg/mL；
带高正电荷的绿色荧光蛋白(ScGFP)；带高正电荷的绿色荧光蛋白的浓度为0.005μg/μL；
缓冲液：含有浓度10mMTris-HCl和浓度100mMNaCl的溶液；
以及，装配试剂盒必须的微孔板、锡箔纸。
上述用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒的制备方法，步骤如下：
(1)将单克隆抗体加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂EDTA，再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭3min，制得偶联单克隆抗体的羧基石墨烯；
将多克隆抗体加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂EDTA，再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭3min，制得偶联多克隆抗体的羧基石墨烯；
(2)制备带高正电荷荧光蛋白，配制带高正电荷荧光蛋白溶液；
(3)配制含有浓度10mMTris-HCl和浓度100mMNaCl的溶液，制得缓冲液；
(4)分别将步骤(1)制得的偶联单克隆抗体的羧基石墨烯、步骤(1)制得的偶联多克隆抗体的羧基石墨烯、步骤(2)制得的带高正电荷荧光蛋白溶液和步骤(3)制得的缓冲液经装配后，制得用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒。
所述步骤(1)中，表面活性剂为乙二胺四乙酸(EDTA)，每毫升反应体系加入表面活性剂5μL；封闭剂为牛血清白蛋白(BSA)，反应体系中加入封闭剂至质量浓度为1.5％。
所述步骤(1)中，所述羧基石墨烯的反应质量浓度为1.0mg/mL，羧基石墨烯与单克隆抗体的反应质量浓度比为10：1，羧基石墨烯与多克隆抗体的反应质量浓度比为10：1。
实施例11、单、多克隆抗体混合用于GPC3的检测
在微孔板40μL10mMTris-HCl、100mMNaCl溶液中，加入制得的偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯0.05～0.2μg，GPC30～0.04ng，混匀、室温放置5min；随后加入ScGFP0.01～0.5μg，混匀，室温避光放置15min；最后再加入偶联GPC3多克隆抗体4的羧基石墨烯0.05～0.2μg，混匀、室温避光放置10min，孵育结束后，测定荧光强度(Ex：470nm，Em：509nm)，结果如图11所示；
结果显示，同单克隆抗体一样，单、多克隆抗体混合也可用于GPC3的检测，随着GPC3浓度的升高，其介导的荧光淬灭强度也逐渐增高。
说明书中涉及的参考文献：
1.LlovetJM,BurroughsA,BruixJ.Hepatocellularcarcinoma.Lancet2003,362:1907-17.
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7.AchilleasD.Theocharis,SpyridonS.Skandalis,GeorgeN.Tzanakakis,etal.Proteoglycansinhealthanddisease:novelrolesforproteoglycansinmalignancyandtheirpharmacologicaltargeting.FEBSJ.2010,277:3904-3923.
8.MarianaICapurro,PingXu,WenShi,etal.Glypican-3InhibitsHedgehogSignalingDuringDevelopmentbyCompetingwithPatchedforHedgehogBinding.Dev.Cell.2008,14(5):700-11。
Claims (10)
1.一种用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒，包括：
偶联单克隆抗体的羧基石墨烯和/或偶联多克隆抗体的羧基石墨烯；偶联单克隆抗体的羧基石墨烯包括：偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯，所述单克隆抗体1为蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯，所述单克隆抗体2为蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联多克隆抗体的羧基石墨烯包括：偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯，所述多克隆抗体3为蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；偶联多克隆抗体4的羧基石墨烯，所述多克隆抗体4为蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端氨基酸序列做为抗原免疫后制得的抗体；
带高正电荷的荧光蛋白；
缓冲液：含有浓度5～50mMTris-HCl和浓度50～200mMNaCl的溶液。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白聚糖为GPC3、GPC1、GPC2、GPC4、GPC5、GPC6、Syndecan-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、Versican、Aggrecan、Brevican、Decorin、Lumican、Perleacan、Agrin、CD44或NG2；进一步优选的，所述的蛋白聚糖为GPC3或蛋白聚糖Syndecan-2；最优的，所述蛋白聚糖为GPC3时，羧基端氨基酸序列长度为50～90个氨基酸，氨基端氨基酸序列长度为490～530个氨基酸。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯的浓度为5～20μg/mL；
优选的，所述偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯的浓度为5～20μg/mL；
优选的，所述偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯的浓度为5～20μg/mL；
优选的，所述偶联多克隆抗体4的羧基石墨烯的浓度为5～20μg/mL；
优选的，所述带高正电荷的荧光蛋白的浓度为0.001～0.01μg/μL；进一步优选的，所述的带高正电荷荧光蛋白为高正电荷绿色荧光蛋白(ScGFP)；
优选的，还包括装配试剂盒必须的微孔板、锡箔纸。
4.权利要求1所述用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将单克隆抗体1加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂，再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭1～3min，制得偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯；
将单克隆抗体2加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂，再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭1～3min，制得偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯；
将多克隆抗体3加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂，再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭1～3min，制得偶联多克隆抗体3的羧基石墨烯；
和/或，
将多克隆抗体4加入到羧基石墨烯溶液中，混匀，静置1min，然后加入表面活性剂，再加入封闭剂，混合均匀，静置封闭1～3min，制得偶联多克隆抗体4的羧基石墨烯；
(2)制备带高正电荷荧光蛋白，配制带高正电荷荧光蛋白溶液；
(3)配制含有浓度5～50mMTris-HCl和浓度50～200mMNaCl的溶液，制得缓冲液；
(4)分别将步骤(1)制得的偶联单克隆抗体1的羧基石墨烯、步骤(1)制得的偶联单克隆抗体2的羧基石墨烯、步骤(2)制得的带高正电荷荧光蛋白溶液和步骤(3)制得的缓冲液经装配后，制得用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，表面活性剂为乙二胺四乙酸(EDTA)或十二烷基磺酸钠(SDS)，每毫升反应体系加入表面活性剂1～5μL；封闭剂为牛血清白蛋白(BSA)，反应体系中加入封闭剂至质量浓度为0.5％～2％。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述羧基石墨烯的反应质量浓度为0.8～1.2mg/mL，羧基石墨烯与单克隆抗体1的反应质量浓度比为10：1，羧基石墨烯与单克隆抗体2的反应质量浓度比为10：1，羧基石墨烯与多克隆抗体3的反应质量浓度比为10:1，羧基石墨烯与多克隆抗4的反应质量浓度比为10:1。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，单克隆抗体1的制备方法如下：
(i)蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端50～90个氨基酸序列的表达基因插入PTRACER真核表达载体，转染HEK293细胞，从细胞培养上清中纯化，PBS稀释至1.5～2.5mg/mL，制得抗原；
(ii)将步骤(i)制得的抗原免疫BALB/C小鼠3次，抗原免疫量为50～100mg/次，然后用PEG法将效价≥2000的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，并筛选出阳性克隆；
(iii)向BALB/C小鼠腹腔中注射弗氏不完全佐剂，待小鼠腹腔中产生足量腹水后，于小鼠腹腔中接种步骤(ii)制得的阳性克隆，两周后抽取腹水，离心取上清，纯化后，制得单克隆抗体1。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(i)的纯化，为用NI-NTA亲和层析柱进行纯化；
优选的，所述步骤(iii)的纯化，步骤如下：
将上清用PBS缓冲液稀释2.5倍，上蛋白A/G亲和层析柱(GE)，分别用含0.5MNaCl的TRIS-HClpH8.0的缓冲液和含0.5MNaCl的TRIS-HClpH9.0的缓冲液充分洗脱除杂，最后用100mM三乙胺洗脱回收抗体，收集前三柱体积的洗脱液，并立即用1M的NaH2PO4中和，最后用截流分子量为10KD的超滤管脱盐，并将抗体置换到PBS缓冲液中，即得。
9.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，单克隆抗体2的制备方法如下：
(a)蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端490～530个氨基酸序列的表达基因插入PTRACER真核表达载体，转染HEK293细胞，从细胞培养上清中纯化，PBS缓冲液稀释至1.5～2.5mg/mL，制得抗原；
(b)将步骤(a)制得的抗原免疫BALB/C小鼠3次，抗原免疫量为50～100mg/次，然后用PEG法将效价≥2000的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，并筛选出阳性克隆；
(c)向BALB/C小鼠腹腔中注射弗氏不完全佐剂，待小鼠腹腔中产生足量腹水后，于小鼠腹腔中接种步骤(b)制得的阳性克隆，两周后抽取腹水，离心取上清，纯化后，制得单克隆抗体2；
所述步骤(a)的纯化，为用NI-NTA亲和层析柱进行纯化；
进一步优选的，所述步骤(c)的纯化，步骤如下：
将上清用PBS缓冲液稀释2.5倍，上蛋白A/G亲和层析柱(GE)，分别用含0.5MNaCl的TRIS-HClpH8.0的缓冲液和含0.5MNaCl的TRIS-HClpH9.0的缓冲液充分洗脱除杂，最后用100mM三乙胺洗脱回收抗体，收集前三柱体积的洗脱液，并立即用1M的NaH2PO4中和，最后用截流分子量为10KD的超滤管脱盐，并将抗体置换到PBS中，即得。
10.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，多克隆抗体3的制备方法如下：
a、蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端290个氨基酸序列表达基因插入PTRACER真核表达载体，转染HEK293细胞，从细胞培养上清中纯化，PBS缓冲液稀释至1.0～2.0mg/mL，制得抗原；
b、将步骤a制得的抗原免疫雌性新西兰大白兔3次，抗原免疫量为200～400μg/次，然后取血，离心取上清，纯化后，制得多克隆抗体3；
所述步骤b的纯化，步骤如下：
将上清用PBS缓冲液稀释2.5倍，上蛋白A/G亲和层析柱(GE)，分别用含0.5MNaCl的TRIS-HClpH8.0的缓冲液和含0.5MNaCl的TRIS-HClpH9.0的缓冲液充分洗脱除杂，最后用100mM三乙胺洗脱回收抗体，收集前三柱体积的洗脱液，并立即用1M的NaH2PO4中和，最后用截流分子量为10KD的超滤管脱盐，并将抗体置换到PBS缓冲液中，即得。
优选的，所述步骤(1)中，多克隆抗体4的制备方法如下：
a、蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端290个氨基酸序列表达基因插入PTRACER真核表达载体，转染HEK293细胞，从细胞培养上清中纯化，PBS缓冲液稀释至1.0～2.0mg/mL，制得抗原；
b、将步骤a制得的抗原免疫雌性新西兰大白兔3次，抗原免疫量为200～400μg/次，然后取血，离心取上清，纯化后，制得多克隆抗体4；
所述步骤b的纯化，步骤如下：
将上清用PBS缓冲液稀释2.5倍，上蛋白A/G亲和层析柱(GE)，分别用含0.5MNaCl的TRIS-HClpH8.0的缓冲液和含0.5MNaCl的TRIS-HClpH9.0的缓冲液充分洗脱除杂，最后用100mM三乙胺洗脱回收抗体，收集前三柱体积的洗脱液，并立即用1M的NaH2PO4中和，最后用截流分子量为10KD的超滤管脱盐，并将抗体置换到PBS缓冲液中，即得。
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