CN110095602A - 一种基于氧化石墨烯的细胞检测试剂盒、方法及应用 - Google Patents

Abstract

本公开属于细胞检测技术领域，具体涉及一种基于氧化石墨烯的细胞检测试剂盒、方法及应用。发明人研究团队发现氧化石墨烯‑胶体金复合物的光热效应应用于鼠伤寒沙门氏菌检测具有良好的检测灵敏度，但该技术需要使用价格较高的热成像仪，不利于推广应用。另一项应用红外感应式温度传感器对鼠伤寒沙门氏菌进行检测的研究中，所用胶体金的光热效应不如氧化石墨烯。本公开提供了一种基于氧化石墨烯光热效应对细胞数量进行检测的方法，通过激光发生器、温度传感器对试纸条上结合的氧化石墨烯进行检测，从而得到细胞的数量。检测需要的试剂主要为氧化石墨烯和抗体，成本经济，具有操作简便、检测灵敏的优点。

Description

一种基于氧化石墨烯的细胞检测试剂盒、方法及应用

技术领域

本公开属于细胞检测技术领域，具体涉及一种基于氧化石墨烯的光热效应对细胞进行检测的试剂盒、检测方法及应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

鼠伤寒沙门氏菌是一群非适应性具有广泛宿主的沙门氏菌，存在于动物肠道中，常温下可以迅速繁殖，是引起急性肠胃炎的主要病原菌之一。鼠伤寒沙门氏菌严重影响了人类的生命健康，对鼠伤寒沙门氏菌进行检测，具有重要的公共卫生意义。目前鼠伤寒沙门氏菌等食源性致病菌的检测方法有传统检测方法和快速检测方法。传统检测方法主要指平板计数法，该方法计数准确，但是一般需要增菌培养等步骤，操作繁琐，不利于现场检测。目前已建立的快速检测方法主要以免疫学检测方法为主，包括酶联免疫法，免疫传感器等，此类检测方法的灵敏度尚需进一步提高。

光热效应主要应用于癌症的光热治疗与生物成像等方面，将光热效应应用于建立检测方法的研究较少。Zhenpeng Qin等人利用胶体金的光热效应，建立了温度升高值与待测物浓度的标准曲线，利用光热效应对胶体金试纸条进行检测的灵敏度较目测灵敏度提高了32倍。氧化石墨烯具有较胶体金更优良的光热效应，发明人研究团队曾建立了一种基于氧化石墨烯-胶体金纳米复合材料光热效应的试纸条检测方法用于饮用水中鼠伤寒沙门氏菌的快速检测，检测灵敏度较目测方法提高了10倍。上述研究均采用价格较高的热像仪进行温度检测，发明人研究团队进一步采用价格低廉的红外感应温度传感器，建立了一种基于胶体金光热效应的沙门氏菌试纸条检测方法。

发明人认为，在之前的研究中，采用热像仪对氧化石墨烯-胶体金复合材料的光热效应进行检测不利于现场快速检测作业，并且热像仪价格较高($6000)。而且氧化石墨烯-胶体金复合材料制备过程较为复杂，工业化扩大生产有一定难度。而采用红外感应式温度传感器对胶体金试纸条进行检测的研究，由于胶体金的光热效应不够强，此方法的检测灵敏度可通过采用光热效应更强的新型纳米材料，如氧化石墨烯，得到进一步提高。

发明内容

针对上述研究背景，发明人认为可通过采用光热效应更强的新型纳米材料进一步提高温度传感器对试纸条进行检测的灵敏度。在此基础上，提供一种灵敏度更高、制备工艺更为简便的检测方法具有良好的工业推广意义，并且在本领域的公开研究中，将氧化石墨烯应用于细菌检测的研究较少。对此，本公开提供了一种基于氧化石墨烯光热效应的细胞数量检测方法。利用探头接触式温度传感器代替红外感应式温度传感器或热成像仪，对具有优良光热效应的氧化石墨烯在激光照射时产生的温度变化进行读数，显著降低了检测成本，所用装置具有结构简单、体积小、成本低、数据处理简便、检测结果灵敏且可靠等优点，可以实现对细菌、真菌等细胞的现场快速检测，有助于检测方法的推广应用。另外，本公开提供的检测技术仅依靠氧化石墨烯的光热效应进行定量，其检测精度可达到10⁴CFU·mL^-1，满足日常检测需要，且与采用氧化石墨烯-胶体金的检测方法效果相近；并且该检测方法所需的制备材料主要为氧化石墨烯、抗体及封闭液，大大降低了经济成本。

为了实现上述技术效果，本公开提供以下技术方案：

本公开第一方面，提供一种用于细胞检测的试纸条，所述试纸条为承载抗体的多孔纤维膜，所述抗体用于特异性识别并结合待测细胞。

优选的，所述多孔纤维膜为硝酸纤维素膜。

优选的，所述试纸条的制备方法如下：将抗体溶液滴加在纤维膜的中心区域，30～40℃下烘干4～7min；再次滴加抗体，30～40℃下烘干25～35min后，滴加封闭液。

该试纸条制备过程中，将抗体滴加于检测区中心部位，形成圆形的待检测区域，有利于待测细胞集中分布在该中心区域。后续激光照射及温度感应环节，技术人员可采用探头式温度传感器对该区域进行集中检测，可提升检测灵敏度。

进一步优选的，所述封闭液为1～3％的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)溶液。

进一步优选的，所述封闭液在30～40℃下封闭25～35min。

本公开第二方面，提供一种用于细胞检测的免疫石墨烯，所述免疫石墨烯为偶联抗体的羧基化氧化石墨烯，所述抗体用于特异性识别并结合待测细胞。

优选的，所述免疫石墨烯的制备方法如下：将所述抗体加入羧基化氧化石墨烯溶液中，调节pH后，再加入1～4％的BSA进行混合。

羧基化氧化石墨烯与抗体在室温条件下震荡混合均匀，混均后向溶液中加入BSA对羧基化氧化石墨烯进行封闭，以免羧基化氧化石墨烯的非特异性吸附作用对检测结果造成影响。

进一步优选的，所述抗体为溶液，抗体与羧基化氧化石墨烯的质量比为1:2～3。

进一步优选的，所述pH为8～9。

优选的，所述氧化石墨烯为羧基化的氧化石墨烯。

本公开第三方面，提供一种基于氧化石墨烯的细胞检测试剂盒，所述试剂盒中包括第一方面所述的试纸条、第二方面所述的免疫石墨烯。

本公开第四方面，提供一种基于氧化石墨烯的细胞检测方法，所述检测方法包括如下步骤：向待测细胞样品中加入第二方面所述免疫石墨烯溶液，得到免疫石墨烯-细胞沉淀混合物；向第一方面所述试纸条上滴加分离后的沉淀混合物，采用特定波长的光照射，采用温度传感器检测光照射前后的试纸条检测区域温度，依据温度升高值与细胞数量的线性关系实现细胞数量的检测。

本公开第五方面，提供第一方面所述试纸条、第二方面所述免疫石墨烯和/或第三方面所述试剂盒在细菌检测方面的应用。

优选的，所述应用包括应用于鼠伤寒沙门氏菌的检测。

与现有技术相比，本公开的有益效果是：

1.介于现有技术中同时将氧化石墨烯的光热效应及温度传感器应用于细菌检测的研究较为空白。基于氧化石墨烯较胶体金具有更优良的光热效果，温度传感器较热像仪价格低廉，本公开建立了一种基于氧化石墨烯光热效应的沙门氏菌温度传感器检测方法，方法灵敏度高、操作简单、成本低，可用于食品、临床诊断及环境监测等样本中沙门氏菌的快速检测。

2.本公开检测方法利用温度传感器对氧化石墨烯光热效应产生的温度变化进行读数，极大地降低了检测成本，同时具有环保、易于便携等优点，进一步的，本公开传感器为探头接触式温度传感器，相对比其他传感器如红外感应式温度传感器检测灵敏度更高，特别适用于现场作业，如现场食品、饮料安全抽查，灾难现场水源安全性测定等。

3.该检测方法灵敏度较高，特异性较强，操作简单，成本低，且储存稳定性较好，依据本公开方法制备的试纸条针对鼠伤寒沙门氏菌的检测灵敏度达10⁴CFU·mL^-1(沙门氏菌引发食物中毒的最低反应剂量为10⁵CFU·mL^-1)。试纸条在4℃下储存30天不影响检测灵敏度，同时三种样品加标回收率(自来水、牛奶、葡萄汁)全部在80～120％间，满足生物制剂检测准确性要求，有希望应用于各类实际样品的检测。

附图说明

构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为实施例1中检测方法检测过程示意图；

其中，图1A为免疫石墨烯识别鼠伤寒沙门氏菌示意图；

图1B为基于氧化石墨烯光热效应的鼠伤寒沙门氏菌温度传感器检测过程示意图。

图2为实施例1中检测方法条件优化结果直方图。

其中，图2A为实施例1中检测方法灵敏度研究结果；

图2B为实施例1中检测方法特异性研究结果；

图2C为实施例1中试纸条储存稳定性研究结果；

图2D为实施例1中样品加标回收率研究结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，发明人研究团队曾建立了一种基于氧化石墨烯-胶体金纳米复合材料光热效应的试纸条检测方法用于饮用水中鼠伤寒沙门氏菌的快速检测，检测灵敏度较目测方法提高了10倍。上述研究需采用价格较高的热像仪进行温度检测，发明人研究团队进一步采用价格低廉的红外感应温度传感器，建立了一种基于胶体金光热效应的沙门氏菌试纸条检测方法。

发明人认为，在之前的研究中，采用热像仪对氧化石墨烯-胶体金复合材料的光热效应进行检测不利于现场快速检测作业，并且热像仪价格较高($6000)。而且氧化石墨烯-胶体金复合材料制备过程较为复杂，工业化扩大生产有一定难度。而采用红外感应式温度传感器对胶体金试纸条进行检测的研究，由于胶体金的光热效应不够强，此方法的检测灵敏度可通过采用光热效应更强的新型纳米材料，如氧化石墨烯，得到进一步提高。

另外，目前公开的检测技术中，同时将氧化石墨烯的光热效应及温度传感器应用于细菌检测的研究较为空白。发明人针对上述现有技术中的不足展开了研究，并提供了一种基于氧化石墨烯光热效应对细胞数量进行检测的方法。该方法采用特定波长的光照射，由于氧化石墨烯的光热效应可使试纸条上的检测区域温度升高，采用温度传感器检测光照射前后的试纸条检测区域温度，温度升高值与细胞数量成线性关系，从而实现细胞数量的检测。通过对激光发生器的照射功率、照射时间、照射高度等进行优化。在最优条件下，经调整激光发生器探头与试纸条加样区的光斑大小和角度，激光发生器发出的特定波长激光照射到试纸条上的加样区，可以实现氧化石墨烯的光热信号转换，使用温度传感器记录温度变化值，具有操作简便、成本低、检测灵敏的优点。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

(1)免疫石墨烯的制备与表征方法

将0.08g·L^-1的鼠伤寒沙门氏菌的抗体加入到1.6g·L^-1的氧化石墨烯溶液中(pH调至8.5)，室温下震荡反应2h，再加入2％BSA与之混合(V_{氧化石墨烯}：V_抗体：V_BSA＝1:0.5:0.5)，室温继续震荡反应2h即可制得免疫石墨烯溶液，将制备好的免疫石墨烯放置于4℃密封保存。

利用透射电子显微镜对氧化石墨烯、免疫石墨烯(GO-AbST-BSA)和免疫石墨烯-沙门氏菌混合溶液(GO-AbST-BSA-ST)进行形态表征。

(2)鼠伤寒沙门氏菌的样品前处理

在超净工作台中，用接种环从斜面上挑取一环鼠伤寒沙门氏菌菌落，转移到灭菌后的LB液体培养基中，于37℃细菌培养箱中振动培养12h后收集菌液。取1mL菌液于1.5mLEP管中，在6000r·min^-1下离心5min，去上清，用超纯水将沉淀复溶至原体积，再次离心并复溶即得到待测菌液。

(3)膜的包被与封闭

将Millipore 135型号的硝酸纤维素膜剪成长宽约为1cm的正方形，取2.5μL0.2g·L^-1鼠伤寒沙门氏菌的抗体滴加在膜的中心区域，37℃下烘干5min，再滴加2.5μL0.2g·L^-1鼠伤寒沙门氏菌的抗体，37℃烘干30min后取出。在膜上滴加15μL 2％BSA封闭液，37℃下封闭30min，将膜取出并放置4℃备用。

(4)鼠伤寒沙门氏菌的捕获富集及检测方法

将免疫石墨烯与鼠伤寒沙门氏菌沉淀的混合物在37℃中反应10min取出。将包被好的膜使用超纯水清洗并在室温下晾2min，在膜上滴加10μL免疫石墨烯与鼠伤寒沙门氏菌沉淀的混合物，反应10min(空白组滴加免疫石墨烯)后可形成双抗夹心式结构即膜上抗体-菌-免疫石墨烯，免疫石墨烯会通过菌结合在膜上。其中菌含量越多，结合在膜上的免疫石墨烯越多，则光热效果越强。使用超纯水将膜冲洗并晾干，用双面胶将膜粘在温度传感器的探头上，使用808nm激光照射加样区，通过温度传感器测量照射前后的温度变化。并建立温度升高值(ΔT，公式1)与细菌量的标准曲线。

ΔT＝ΔT₁-ΔT₀ 公式1

ΔT，温度升高值

ΔT₀，空白样品激光照射前后的温度升高值

ΔT₁，添加样品后激光照射前后的温度升高值

为了消除载体膜和双面胶本身导致的温度变化，应将粘在探头上空白组经激光照射前后的温度升高值(ΔT₀)从添加菌后的样品经激光照射前后的温度升高值(ΔT₁)中扣除。

(5)灵敏度考察方法

取1mL沙门氏菌菌液离心并使用超纯水进行复溶，梯度稀释至10⁴～10⁸CFU·mL^-1，将稀释后的菌液作为待测样品进行检测。

使用包被好的膜对待测样品进行检测。用808nm激光照射膜上加样区，温度传感器直接读出照射前后的温度变化，计算出ΔT。建立ΔT与鼠伤寒沙门氏菌数量之间的关系，并多次实验确定该检测方法最低检测限。

(6)特异性考察方法

为了考察基于氧化石墨烯光热效应的鼠伤寒沙门氏菌温度传感器检测方法的特异性，分别对鼠伤寒沙门氏菌，大肠杆菌与金黄色葡萄球菌进行检测。使用包被好的膜对三种待测菌进行检测。用808nm激光照射加样区，通过温度传感器测量照射前后的温度变化，计算ΔT并进行比较。

(7)储存稳定性考察方法

为了考察基于氧化石墨烯光热效应的鼠伤寒沙门氏菌温度传感器检测方法的储存稳定性，将包被好的膜分别放在三个铺有湿润滤纸的平皿里，用配套平皿盖上，平皿之间的缝隙使用保鲜膜封住。将三个平皿分别放置在4℃冰箱、室温(14℃)、37℃恒温恒湿培养箱中。在储存时间为1天、5天、7天、14天、30天时，使用三种不同储存温度下的膜检测10⁸CFU·mL^-1菌液。用808nm激光照射膜上加样区并记录数据，计算出ΔT。将该ΔT与建立的标准曲线中的菌浓度为10⁸CFU·mL^-1的ΔT进行对比。

(8)回收率考察方法

首先将鼠伤寒沙门氏菌添加到灭菌后的样品(牛奶、自来水、葡萄汁)中，处理方法如下，取1mL菌液于6000r·min^-1离心5min，去上清，并使用灭菌后的样品(牛奶、自来水、葡萄汁)对底部沉淀进行复溶。将添加鼠伤寒沙门氏菌的样品使用超纯水梯度稀释到不同的浓度(10⁴CFU·mL^-1、10⁶CFU·mL^-1、10⁸CFU·mL^-1)，即得待测样品。

取20μL处理好的待测样品，6000r·min^-1离心5min后，去上清，将沉淀物使用同体积的免疫石墨烯复溶。将复溶后的混合物滴加到包被抗体的膜上进行反应。通过温度传感器测量照射前后的温度变化，计算ΔT。

本公开利用温度传感器检测纳米材料(氧化石墨烯)在特定波长的光激发下产生的热信号，建立了操作简单快速、灵敏度高、便携式的沙门氏菌检测方法，并将其应用于食品中鼠伤寒沙门氏菌的定量检测。整个检测时间约为20min，明显低于酶联免疫的检测过程约3h。其检测灵敏度较高，可达10⁴CFU·mL^-1，可检测出鼠伤寒沙门氏菌导致食源性疾病的最低感染剂量(10⁵CFU·mL^-1)。该检测方法特异性较强，储存稳定性较好，在4℃下储存30天不影响检测灵敏度，同时三种样品加标回收率(自来水、牛奶、葡萄汁)全部在80～120％间，有希望应用于实际样品的检测。

市场上酶联免疫或试纸条的定量检测需要利用酶标仪($6000)等，而将热像仪($6000)用于光热检测方法时，检测仪器价格昂贵，不利于检测方法的广泛普及。本公开建立了基于氧化石墨烯光热效应的鼠伤寒沙门氏菌温度传感器检测方法。利用温度传感器($10)对光热效应产生的温度变化进行读数，极大的降低了检测成本，检测装置和方法具有结构简单、体积小、易于便携灵敏度高、等优点，有助于检测方法的广泛应用。

以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于细胞检测的试纸条，其特征在于，所述试纸条为承载抗体的多孔纤维膜，所述抗体用于特异性识别并结合待测细胞；优选的，所述多孔纤维膜为硝酸纤维素膜。

2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条的制备方法如下：将抗体溶液滴加在纤维膜的中心区域，30～40℃下烘干4～7min；再次滴加抗体，30～40℃下烘干25～35min后，滴加封闭液。

3.如权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述封闭液为1～3％的BSA溶液；或所述封闭液在30～40℃下封闭25～35min。

4.一种用于细胞检测的免疫石墨烯，其特征在于，所述免疫石墨烯为偶联抗体的氧化石墨烯，所述抗体用于特异性识别并结合待测细胞；优选的，所述氧化石墨烯为羧基化的氧化石墨烯。

5.如权利要求4所述的免疫石墨烯，其特征在于，所述免疫石墨烯的制备方法如下：将所述抗体加入羧基化氧化石墨烯溶液中，调节pH后混合，再加入1～4％的BSA进行混合。

6.如权利要求5所述的免疫石墨烯，其特征在于，所述抗体为溶液，抗体与氧化石墨烯的质量比为1:2～3；或所述pH为8～9。

7.一种基于氧化石墨烯的细胞检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括第权利要求1-3任一项所述的试纸条、权利要求4-6任一项所述免疫石墨烯。

8.一种基于氧化石墨烯的细胞检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：向待测细胞样品中加入权利要求4-6任一项所述免疫石墨烯溶液，分离得到免疫石墨烯-细胞沉淀混合物；向权利要求1-3任一项所述试纸条上滴加所述沉淀混合物，采用特定波长的光照射，采用温度传感器检测光照射前后的试纸条检测区域温度，依据温度升高值与细胞数量的线性关系实现细胞数量的检测。

9.提供权利要求1-3任一项所述的试纸条、权利要求4-6任一项所述免疫石墨烯和/或权利要求7或8所述试剂盒在细菌检测方面的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括应用于鼠伤寒沙门氏菌的检测。