CN113391070A - 一种改进的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种改进的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3定量检测方法。包括步骤如下：(1)将待测样品酶处理；(2)将步骤(1)中酶处理后的待测样品用双抗夹心ELISA法检测吸光度；(3)根据标准品绘制标准曲线；(4)根据步骤(2)中得到的待测样品的吸光度和步骤(3)所得标准曲线，测算出待测样品中磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的含量。本发明先用糖胺聚糖降解酶将磷酯酰肌醇蛋白聚糖3核心蛋白羧基端的两条HS侧链降解，然后再双抗夹心ELISA法进行检测，可以显著的提高磷酯酰肌醇蛋白聚糖3检测的灵敏度，稳定性和专一性，定量检测线为pg级。解决了现有检测过程中存在的操作步骤繁琐、耗时较长、检测灵敏度低、结果重现性差等问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种改进的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3定量检测方法，属于生物化学和医学技术领域。
背景技术
蛋白聚糖(Proteoglycan，PGs)是由一个核心蛋白与一条或多条糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAGs)侧链通过共价键连接形成的一类生物大分子(Iozzo.1998；Iozzo and Schaefer.2015)。由于PGs核心蛋白的种类不同及GAG侧链的复杂性使得PGs的结构异常复杂，同样由于GAGs侧链的复杂性和多样性使PGs具有各种重要的生物学功能(Syrokou et al.1999；Baghy.et al.2016；Wight.2018)。如：调节细胞信号转导、参与细胞的增殖及分化(Mizumoto and Sugahara 2013；Yamada and Sugahara et al.2008)、促进肿瘤中的发生和转移等等(Malavaki et al.2008；Hashiguchi et al.2010；Esko andSelleck.2002；Kreuger et.al.2006；Filmus 2001)。但由于GAGs的存在也为蛋白聚糖的检测带来了巨大的困难，GAGs是由含有氨基己糖二糖单元重复链接而成的聚阴离子线性多糖，易与各种蛋白相互作用，尤其是血清中含有大量的蛋白和多肽类物质，更容易导致对核心蛋白的包裹，从而干扰抗体蛋白对核心蛋白的有效识别和结合，进而影响检测的效果。
磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)作为一种重要的细胞膜表面蛋白聚糖，是Glypicans家族的一员，由580个氨基酸组成的大小为70kDa的核心蛋白和两条连接在核心蛋白羧基端附近的HS侧链组成，且通过糖磷脂酰肌醇(GPI)锚定附着在细胞膜上。从细胞膜上脱落下来的成熟的GPC3在Arg358-Cys359键处经呋喃处理后可以生成一个40kDa的氨基端亚基和一个30kDa的羧基端亚基，该亚基通过二硫键连接(De Cat et.al.2003)。大量研究表明：GPC3在70％以上的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)患者体内特异表达，而在良性病变、肝硬化、肝炎和健康成人的组织中不表达，在HCC组织和HCC患者的血清中GPC3水平显著上调，使得GPC3成为了HCC的特异性生物标志物(Haruyama andKataoka.2016；Yang et al.2014)。
目前，国内外针对于GPC3的检测方法的进行了大量的研究，并取得了一系列重要的研究成果。Yu等人建立了化学发光免疫检测法，Zhang等人研究者研究开发了竞争性放射免疫检测法，Zhao等人构建并应用于Glypican-3(GPC3)靶向成像技术的适配体介导的USPIO(Apt-USPIO)探针及2020年李桂银创立的适配体纳米生物传感器的方法特异检测GPC3等。但在实际应用中，酶联免疫检测依然是GPC3检测中最为常用的检测方法。Filmus实验室建立的GPC3夹心ELISA方法，是目前HCC临床诊断研究中，血清GPC3检测普遍采用的方法(Capurro.et al.2003)。但是，常规酶联免疫检测方法在GPC3检测中存在检测灵敏度低，结果重现性差和耗时等弊端，因此也阻碍了该方法在HCC临床诊断方面的应用，特别是在肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)早期阶段，血清中GPC3的含量极低，且血清中成分复杂使得应用于HCC的早期临床诊断时遇到了极大的困难。因此，急需对GPC3酶联免疫检测方法进行改进。
从GPC3的分子结构看，GPC3核心蛋白上共价结合了至少一条带有高负电荷的GAGs多糖链，GAGs侧链的存在所造成的空间位阻严重干扰了抗体与核心蛋白上识别位点的结合。此外，作为粘多糖，GAGs侧链极易通过血液中蛋白等各种生物大分子相互作用和结合，导致对核心蛋白的包裹，从而进一步干扰抗体对GPC3核心蛋白的有效识别和结合。这应该是造成传统ELISA方法检测血清中PGs灵敏度低和耗时的主要原因。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种改进的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3定量检测方法。本发明提供的检测方法利用GAGs特异性降解酶去除GPC3的GAGs侧糖链后利用传统夹心ELISA方法进行检测，可以解决传统GPC3酶联免疫检测方法操作步骤繁琐、检测灵敏度低、结果重现性差及耗时等缺点，为血清等复杂生物样品中GPC3的检测提供了切实可行的解决方案和技术，在蛋白聚糖相关研究和临床应用中具有重要的实用价值。
本发明的技术方案如下：
一种改进的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3定量检测方法，包括步骤如下：
(1)向待测样品中加入糖胺聚糖降解酶，在25～45℃下酶解20～60min，得到酶处理后的待测样品；
(2)将步骤(1)中酶处理后的待测样品用双抗夹心ELISA法检测吸光度；
(3)将磷酯酰肌醇蛋白聚糖3标准品配制成浓度为10μg/mL的标准品溶液，然后用缓冲液对标准品溶液进行80、160、320、640、1280、2560、5120倍的梯度稀释，得到标准品梯度溶液，然后按照步骤(1)和(2)的方法测定标准品梯度溶液的吸光度，根据标准品梯度溶液的梯度浓度和测得的吸光度绘制标准曲线；
(4)根据步骤(2)中得到的待测样品的吸光度和步骤(3)所得标准曲线，测算出待测样品中磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的含量。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述待测样品为磷酯酰肌醇蛋白聚糖3溶液或体液；
进一步优选的，所述体液为血清或血浆。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述糖胺聚糖降解酶为肝素降解酶或硫酸软骨素降解酶中的一种或两种的混合。
进一步优选的，所述糖胺聚糖降解酶为微生物来源的肝素降解酶(Heparinase，Hepase)和硫酸软骨素降解酶(Chondroitinase，Chase)的混合物，肝素降解酶Hepase和硫酸软骨素降解酶Chase的质量比为1:(1～2)。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述糖胺聚糖降解酶和待测样品的质量体积比为(1～5)：80，单位：μg/μL。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述温度为30～40℃，时间为30～50min。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述双抗夹心ELISA法的具体操作如下：
a、捕获抗体包被：将抗GPC3的单克隆抗体稀释为浓度20～80ng/μL，取50μL加入到酶标板孔中并于4℃条件下孵育4～12h；
b、封闭：弃掉孔中的液体，加入100～200μL封闭液并于室温条件下封闭0.5～2h；
c、加入抗原：将50～100μL酶处理后的待测样品加入到酶标板孔中并于室温条件下孵育0.5～2h后洗板；
d、检测抗体：将抗GPC3的骆驼多克隆抗体稀释1000～5000倍后，取50μL加入到于酶标板孔中并于室温条件下孵育0.5～2h；
e、洗板：将酶标抗体用缓冲液稀释20000～100000倍，取50μL加入到酶标板孔中并于室温条件下孵育10～30min后洗板；
f、显色：向酶标板反应孔中加入50～100μL TMB显色液并于室温条件下避光显色15～20min；
g、终止：向酶标板孔中加入等体积的终止液(1M HCl)，在15min内用酶标仪检测待测样品450nm处的吸光度值。
根据本发明，步骤(3)中所述缓冲液为NaAc-HAc缓冲液。
根据本发明优选的，步骤d中所述抗GPC3的骆驼多克隆抗体的制备方法如下：
i)利用分子生物学手段将GPC3C359-580的基因序列构建至pTracer表达载体中并转染至生长状态良好的HEK293T细胞中；
ii)使用镍柱亲和层析法纯化步骤i)HEK293T细胞分泌的GPC3得到羧基端的蛋白GPC3C作为抗原；
iii)准备健康骆驼一只，免疫前收集静脉血样5mL，将抽取的血样于室温条件下放置约2h，待血样凝结成血块后将其放置4℃条件下过夜，使血清完全析出，4℃条件下2000rpm/min离心10min，弃沉淀取上清并其储存于-80℃待用；
iv)向0.1～0.5mg步骤ii)抗原中加入PBS缓冲液使其终体积为2mL，将抗原溶液与等体积的弗氏完全佐剂(CFA)进行充分乳化；
v)在骆驼背部多点多部位注射抗原的乳化液进行初次免疫，0.1～0.4mL/点；
vi)每隔2～3周进行加强免疫，共加强免疫3次；加强免疫抗原的乳化的操作同步骤iv)，其中采用弗氏不完全佐剂(IFA)代替弗氏完全佐剂(CFA)作为免疫佐剂；
vii)第2次加强免疫后2周，从骆驼耳静脉采取200-300mL血样，按照步骤iii)所述的方法进行血清的分离，以步骤iii)所得上清为对照组，用ELISA法检测抗体效价，当抗体效价达到10000以上，即可大量收集抗GPC3的骆驼多克隆抗体。
本发明所述改进的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的检测方法在肝细胞癌早期临床诊断中的应用。
根据本发明优选的，所述应用的具体方法如下：
①收集患者血清样本，向血清样本中加入肝素降解酶和硫酸软骨素降解酶的混合物，在25～45℃下酶解20～60min，得到酶处理后的血清样本；
其中，肝素降解酶和硫酸软骨素降解酶的质量比为1:1；
②将步骤①中酶处理后的血清样本用双抗夹心ELISA法检测吸光度；
③将20位健康人的血清等体积的混合作为血清标准品，将GPC3混于健康人的血清中制成浓度为10μg/mL的血清标准品溶液，然后用缓冲液对血清标准品溶液进行80、160、320、640、1280、2560、5120倍的梯度稀释，得到血清标准品梯度溶液，然后按照步骤①和②的方法测定血清标准品梯度溶液的吸光度，根据血清标准品梯度溶液浓度和测得的吸光度绘制标准曲线；
④根据步骤②中得到的血清样本的吸光度和步骤③所得标准曲线，测算出患者血清样本中磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的含量，为肝细胞癌早期临床诊断提供依据。
根据本发明，步骤③中所述缓冲液为NaAc-HAc缓冲液。
本发明中所述分子生物学手段均为常规分子生物学技术。所述GPC3C359-580的基因序列的NCBI登录号为Gene ID:2719。
有益效果：
1、本发明先用糖胺聚糖降解酶将磷酯酰肌醇蛋白聚糖3核心蛋白羧基端的两条HS侧链降解，然后再双抗夹心ELISA法进行检测，可以显著的提高磷酯酰肌醇蛋白聚糖3检测的灵敏度，稳定性和专一性，定量检测线为pg级。有效地解决了现有磷酯酰肌醇蛋白聚糖3检测过程中存在的操作步骤繁琐、耗时较长、检测灵敏度低、结果重现性差等问题。为血清等复杂生物样品中GPC3的检测提供了切实可行的解决方案和技术，在蛋白聚糖相关研究和临床应用中具有重要的实用价值。并且由于其操作简单，还可以将本发明的方法应用于其他蛋白聚糖的定量检测中。
2、将本发明提供的检测方法能应用于肝细胞癌患者的早期临床诊断中，HCC患者的阳性检出率明显提高。
附图说明
图1为本发明检测方法的原理示意图；
图2为不同糖胺聚糖降解酶对GPC3检测灵敏度柱状图。
图3为本发明实施例2缓冲液中GPC3含量与吸光度的标准曲线。
图4为本发明实施例3血清样本中GPC3含量与吸光度的标准曲线。
图5本发明实施例4检测临床样本的结果图。
图6本发明检测方法与传统夹心ELISA方法的对HCC患者样本检测的对比图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。
以下实施例中用到的硫酸软骨素降解酶HCLase请参见文章Han,W.,Wang,W.,Zhao,M.,Sugahara,K.,&Li,F.(2014).A novel eliminase from a marine bacteriumthat degrades hyaluronan and chondroitin sulfate.The Journal of biologicalchemistry,289(40),27886–27898。
肝素降解酶Hepase为市售产品。
硫酸软骨素降解酶Chase来自于肠道微生物，然后按照常规酶提取手段得到。
实施例1、筛选适合酶解磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的糖胺聚糖降解酶
将GPC3用磷酸盐缓冲液中配置成浓度为1mg/mL的GPC3溶液，然后将GPC3溶液分成1-7组，每组160μL；其中，1组不添加糖胺聚糖降解酶，为对照组；2组添加6μg肝素降解酶Hepase、3组添加6μg硫酸软骨素降解酶Chase、4组添加6μg硫酸软骨素降解酶HCLase、5组添加3μg肝素降解酶Hepase和3μg硫酸软骨素降解酶Chase、6组添加3μg肝素降解酶Hepase和3μg硫酸软骨素降解酶HCLase、7组添加2μg肝素降解酶Hepase、2μg硫酸软骨素降解酶Chase和2μg硫酸软骨素降解酶HCLase。
将1-7组在30℃下反应50min，得到酶处理后GPC3样品，然后用双抗夹心ELISA方法对酶处理后GPC3样品进行OD值检测，检测结果如图2所示。
由图2可知，肝素降解酶Hepase、硫酸软骨素降解酶Chase和硫酸软骨素降解酶HCLase均能提高GPC3的检测灵敏度，其中肝素降解酶Hepase和硫酸软骨素降解酶Chase共同处理的GPC3的检测灵敏度最高。
本实施例中双抗夹心ELISA检测方法具体操作步骤如下：
a、捕获抗体包被：将抗GPC3的单克隆抗体稀释为浓度50ng/μL，取50μL加入到酶标板孔中并于4℃条件下孵育12h；
b、封闭：弃掉孔中的液体，加入200μL封闭液并于室温条件下封闭2h；
c、加入抗原：将100μL酶处理后的GPC3溶液加入到酶标板孔中并于室温条件下孵育1h后洗板；
d、检测抗体：将抗GPC3的骆驼多克隆抗体稀释2000倍后，取50μL加入到于酶标板孔中并于室温条件下孵育2h；
e、洗板：将酶标抗体用缓冲液稀释50000倍，取50μL加入到酶标板孔中并于室温条件下孵育30min后洗板；
f、显色：向酶标板反应孔中加入100μL TMB显色液并于室温条件下避光显色20min；
g、终止：向酶标板孔中加入等体积的终止液(1M HCl)，在15min内用酶标仪检测待测样品450nm处的吸光度值。
其中，步骤d中所述抗GPC3的骆驼多克隆抗体的制备方法如下：
i)利用分子生物学手段将GPC3C359-580的基因序列构建至pTracer表达载体中并转染至生长状态良好的HEK293T细胞中；
ii)使用镍柱亲和层析法纯化步骤i)HEK293T细胞分泌的GPC3得到羧基端的蛋白GPC3C作为抗原；
iii)准备健康骆驼一只，免疫前收集静脉血样5mL，将抽取的血样于室温条件下放置约2h，待血样凝结成血块后将其放置4℃条件下过夜，使血清完全析出，4℃条件下2000rpm/min离心10min，弃沉淀取上清并其储存于-80℃待用；
iv)向0.5mg步骤ii)抗原中加入PBS缓冲液使其终体积为2mL，将抗原溶液与等体积的弗氏完全佐剂(CFA)进行充分乳化；
v)在骆驼背部多点多部位注射抗原的乳化液进行初次免疫，0.2mL/点；
vi)每隔2周进行加强免疫，共加强免疫3次；加强免疫抗原的乳化的操作同步骤iv)，其中采用弗氏不完全佐剂(IFA)代替弗氏完全佐剂(CFA)作为免疫佐剂；
vii)第2次加强免疫后2周，从骆驼耳静脉采取200-300mL血样，按照步骤iii)所述的方法进行血清的分离，以步骤iii)所得上清为对照组，用ELISA法检测抗体效价，当抗体效价达到10000以上，即可大量收集抗GPC3的骆驼多克隆抗体。
实施例2、检测缓冲液中的GPC3
将纯化得到的GPC3溶于磷酸盐缓冲液中，配置为浓度为10μg/mL的样品，然后用NaAc-HAc缓冲液(100mM NaCl，10mM NaAc-HAc，pH 5.0)分别进行80、160、320、640、1280、2560、5120倍的梯度稀释，并分别于反应管中加入3μg肝素降解酶Hepase和3μg硫酸软骨素降解酶Chase，于30℃条件下反应30min，得到酶处理后的不同浓度的GPC3溶液；将酶处理后的不同浓度的GPC3溶液用双抗夹心ELISA法检测GPC3的吸光度。
本实施例中所述双抗夹心ELISA法同实施例1。
本实施例中吸光度值与缓冲液中GPC3含量呈显著的线性相关关系，标准曲线为y＝0.0266x+0.0112(R2＝0.9989)，具体如图3所示。
通过计算可以得出本实施例中最高可以检测到0.56pg，即检测的灵敏度能达到pg级。这表明，糖胺聚糖降解酶处理后的GPC3能够使核心蛋白上的特异性结合位点暴露出来，提高抗体与GPC3的结合效率，提高检测的灵敏度。
实施例3、检测血清样本中的GPC3
将20位健康人的血清进行等体积的混合作为血清样本，将GPC3混于健康人的血清中制成浓度为10μg/mL的样品，然后将样品用NaAc-HAc缓冲液(100mM NaCl，10mM NaAc-HAc，pH 5.0)分别进行80、160、320、640、1280、2560、5120倍的梯度稀释，得到健康人的血清+GPC3的梯度溶液。
向健康人的血清+GPC3的梯度溶液中分别加入3μg肝素降解酶Hepase和3μg硫酸软骨素降解酶Chase，在30℃下酶解40min，得到酶处理后的健康人的血清+GPC3的梯度溶液。将健康人的血清+GPC3的梯度溶液用双抗夹心ELISA法检测磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的吸光度。
本实施例中所述双抗夹心ELISA法同实施例1。
根据健康人的血清+GPC3的梯度溶液的OD值及已知浓度构建GPC3含量和吸光度之间的标准曲线，结果如图4所示。
由图4可知，随着GPC3含量的增加，吸光度值逐渐增强，并且能够呈现显著的线性关系，标准曲线公式为y＝0.0036x+0.1106(R2＝9859)，其中x为GPC3的浓度，y为吸光度值，通过计算可以得出该方法检测血清中GPC3的含量时，最高可以检测到5.53pg，与实施例2中GPC3含量的检测相比灵敏度稍有降低，但其检测的灵敏度仍能达到pg级。
实施例4、检测临床样本中的GPC3
取41为肝细胞癌患者、31位肝硬化患者和的29位健康人血清样本分别稀释10倍后作为待测样品。
一种改进的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3定量检测方法，包括步骤如下：
(1)向160μL待测样品中加入3μg肝素降解酶Hepase和3μg硫酸软骨素降解酶Chase，在35℃下酶解40min，得到酶处理后的待测样品；
(2)将步骤(1)中酶处理后的待测样品用双抗夹心ELISA法检测GPC3的吸光度；
(3)然后再通过步骤(2)中得到的待测样品的OD值和实施例3构建的标准曲线测算出待测样品中GPC3的含量。
步骤(2)中双抗夹心ELISA法同实施例1。
本实施例吸光度的测试结果如图5所示，由图5可知，41位HCC患者的OD450 nm检测值的平均值为0.56±0.31(GPC3浓度为124.8ng/mL)，31位肝硬化患者(CH)的OD450nm检测值的平均值为0.264±0.109(GPC3浓度为42.61ng/mL)，29位健康人(NL)血清的OD450 nm检测值的平均值为0.194±0.075(GPC3浓度为23.17ng/mL)。
通过数据分析，以良性肝病病人组OD450nm读数的平均值加两倍标准差数值0.482(即GPC3的浓度103.17ng/mL)作为HCC检测的下限值，61％(25/41)样本高于此数值，检测的阳性率为61％，改进后的夹心ELISA阳性检出率高于其它检测方法56％(53～59％)的阳性检出率(Tangkijvanich,P.et al.2010,Capurro,M.2003)。这说明，改进后的GPC3酶联免疫检测方法可以应用于临床上肝硬化病人的预测和肝癌病人的早期诊断。
实施例5、本发明检测方法与传统夹心ELISA方法的对比
取10个HCC患者的血清样本作为待测样品，将待测样品分为实验组及对照组。
然后对将实验组按照实施例4方法进行GPC3检测，对照组加入与实验组肝素降解酶Hepase、硫酸软骨素降解酶Chase等质量的缓冲液后用传统夹心ELISA法检测。
本实施例检测结果如图6所示，由图6可知，经过糖胺聚糖降解酶处理后的HCC患者的血清样本的吸光度值明显升高，专一性和灵敏性明显提升，说明本发明提供的改进的GPC3检测方法的检测灵敏度明显优于传统夹心ELISA方法。
Claims (10)
1.一种改进的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3定量检测方法，其特征在于，包括步骤如下：
(1)向待测样品中加入糖胺聚糖降解酶，在25～45℃下酶解20～60min，得到酶处理后的待测样品；
(2)将步骤(1)中酶处理后的待测样品用双抗夹心ELISA法检测吸光度；
(3)将磷酯酰肌醇蛋白聚糖3标准品配制成浓度为10μg/mL的标准品溶液，然后用缓冲液对标准品溶液进行80、160、320、640、1280、2560、5120倍的梯度稀释，得到标准品梯度溶液，然后按照步骤(1)和(2)的方法测定标准品梯度溶液的吸光度，根据标准品梯度溶液的梯度浓度和测得的吸光度绘制标准曲线；
(4)根据步骤(2)中得到的待测样品的吸光度和步骤(3)所得标准曲线，测算出待测样品中磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的含量。
2.如权利要求1所述改进的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述待测样品为磷酯酰肌醇蛋白聚糖3溶液或体液；进一步优选的，所述体液为血清或血浆。
3.如权利要求1所述改进的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述糖胺聚糖降解酶为肝素降解酶或硫酸软骨素降解酶中的一种或两种的混合。
4.如权利要求3所述改进的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3定量检测方法，其特征在于，所述糖胺聚糖降解酶为肝素降解酶(Heparinase，Hepase)和硫酸软骨素降解酶(Chondroitinase，Chase)的混合物，肝素降解酶Hepase和硫酸软骨素降解酶Chase的质量比为1:(1～2)。
5.如权利要求1所述改进的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述糖胺聚糖降解酶和待测样品的质量体积比为(1～5)：80，单位：μg/μL。
6.如权利要求1所述改进的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述温度为30～40℃，时间为30～50min。
7.如权利要求1所述改进的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3定量检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述双抗夹心ELISA法的具体操作如下：
a、捕获抗体包被：将抗GPC3的单克隆抗体稀释为浓度20～80ng/μL，取50μL加入到酶标板孔中并于4℃条件下孵育4～12h；
b、封闭：弃掉孔中的液体，加入100～200μL封闭液并于室温条件下封闭0.5～2h；
c、加入抗原：将50～100μL酶处理后的待测样品加入到酶标板孔中并于室温条件下孵育0.5～2h后洗板；
d、检测抗体：将抗GPC3的骆驼多克隆抗体稀释1000～5000倍后，取50μL加入到于酶标板孔中并于室温条件下孵育0.5～2h；
e、洗板：将酶标抗体用缓冲液稀释20000～100000倍，取50μL加入到酶标板孔中并于室温条件下孵育10～30min后洗板；
f、显色：向酶标板反应孔中加入50～100μL TMB显色液并于室温条件下避光显色15～20min；
g、终止：向酶标板孔中加入等体积的终止液(1M HCl)，在15min内用酶标仪检测待测样品450nm处的吸光度值。
8.如权利要求7所述改进的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3定量检测方法，其特征在于，步骤d中所述抗GPC3的骆驼多克隆抗体的制备方法如下：
i)利用分子生物学手段将GPC3C359-580的基因序列构建至pTracer表达载体中并转染至生长状态良好的HEK293T细胞中；
ii)使用镍柱亲和层析法纯化步骤i)HEK293T细胞分泌的GPC3得到羧基端的蛋白GPC3C作为抗原；
iii)准备健康骆驼一只，免疫前收集静脉血样5mL，将抽取的血样于室温条件下放置约2h，待血样凝结成血块后将其放置4℃条件下过夜，使血清完全析出，4℃条件下2000rpm/min离心10min，弃沉淀取上清并其储存于-80℃待用；
iv)向0.1～0.5mg步骤ii)抗原中加入PBS缓冲液使其终体积为2mL，将抗原溶液与等体积的弗氏完全佐剂(CFA)进行充分乳化；
v)在骆驼背部多点多部位注射抗原的乳化液进行初次免疫，0.1～0.4mL/点；
vi)每隔2～3周进行加强免疫，共加强免疫3次；加强免疫抗原的乳化的操作同步骤iv)，其中采用弗氏不完全佐剂(IFA)代替弗氏完全佐剂(CFA)作为免疫佐剂；
vii)第2次加强免疫后2周，从骆驼耳静脉采取200-300mL血样，按照步骤iii)所述的方法进行血清的分离，以步骤iii)所得上清为对照组，用ELISA法检测抗体效价，当抗体效价达到10000以上，即可大量收集抗GPC3的骆驼多克隆抗体。
9.权利要求1-8所述改进的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的检测方法在肝细胞癌早期临床诊断中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方法如下：
①收集患者血清样本，向血清样本中加入肝素降解酶和硫酸软骨素降解酶的混合物，在25～45℃下酶解20～60min，得到酶处理后的血清样本；
其中，肝素降解酶和硫酸软骨素降解酶的质量比为1:1；
②将步骤①中酶处理后的血清样本用双抗夹心ELISA法检测吸光度；
③将20位健康人的血清等体积的混合作为血清标准品，将GPC3混于健康人的血清中制成浓度为10μg/mL的血清标准品溶液，然后用缓冲液对血清标准品溶液进行80、160、320、640、1280、2560、5120倍的梯度稀释，得到血清标准品梯度溶液，然后按照步骤①和②的方法测定血清标准品梯度溶液的吸光度，根据血清标准品梯度溶液浓度和测得的吸光度绘制标准曲线；
④根据步骤②中得到的血清样本的吸光度和步骤③所得标准曲线，测算出患者血清样本中磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的含量。
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| CN202110618052.5A CN113391070A (zh) | 2021-06-03 | 2021-06-03 | 一种改进的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3定量检测方法 |
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090116210A (ko) * | 2008-05-06 | 2009-11-11 | 한국생명공학연구원 | 글리피칸-3 측정용 분석방법을 이용한 암 진단 방법 및 암진단 키트 |
| CN105606827A (zh) * | 2016-03-14 | 2016-05-25 | 山东大学 | 一种用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒及其制备方法 |
| CN107085109A (zh) * | 2017-05-15 | 2017-08-22 | 山东大学深圳研究院 | 高正电荷绿色荧光蛋白在制备肝癌早期诊断试剂盒中的应用 |
| CN111175520A (zh) * | 2020-01-15 | 2020-05-19 | 河北省科学院生物研究所 | 一种Glypican-3双抗体夹心法检测试剂盒及检测方法 |
-
2021
- 2021-06-03 CN CN202110618052.5A patent/CN113391070A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090116210A (ko) * | 2008-05-06 | 2009-11-11 | 한국생명공학연구원 | 글리피칸-3 측정용 분석방법을 이용한 암 진단 방법 및 암진단 키트 |
| CN105606827A (zh) * | 2016-03-14 | 2016-05-25 | 山东大学 | 一种用于蛋白聚糖高灵敏度检测的试剂盒及其制备方法 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 江枫等: "血清glypican 3 ELISA检测法的建立及初步应用", 临床检验杂志, vol. 29, no. 4, pages 245 * |
| 韩乃寒: "高正电荷绿色荧光蛋白在糖胺聚糖及蛋白聚糖检测中的应用", 中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑, pages 014 - 178 * |
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