CN110967491A - 一种电化学免疫传感器和制备方法以及电化学免疫分析方法和试剂盒 - Google Patents

一种电化学免疫传感器和制备方法以及电化学免疫分析方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种电化学免疫传感器和制备方法以及电化学免疫分析方法和试剂盒。该电化学免疫传感器为：在打磨抛光的玻碳电极表面电沉积金纳米颗粒，并固载anti－cTnI1和anti－BNP1两种抗体。在ECL检测的过程中，将anti－cTnI2－AuNPs＠ABEI以及anti－BNP2－AuNPs＠g－C3N4两种二抗标记物同步装配到孵育过BNP和cTnI抗原的电化学免疫传感器表面上，随着夹心层cTnI和BNP浓度的升高，显示出随抗原浓度增加而增强的ECL信号，从而实现脑利钠肽(BNP)和心肌肌钙蛋白I(cTnI)的同步多重免疫分析，为急性心肌梗塞的诊断提供了一种有效的方案。

Description

一种电化学免疫传感器和制备方法以及电化学免疫分析方法 和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，具体而言，涉及一种电化学免疫传感器和制备方法以及电化学免疫分析方法和试剂盒。
背景技术
急性心肌梗塞(AMI)是一种主要导致老年人死亡的致命疾病。世界卫生组织(WHO)预测，到2030年，心血管疾病每年将导致2330万人死亡。对于大多数患者来说，某些前驱症状会在AMI发作前1－2周出现，因此，早期准确诊断AMI标志物可以显著降低死亡的风险。目前已经报道的AMI诊断方法通常是基于单一生物标志物的，这难免会导致很多误诊的情况。
多重免疫测定(MIA)意味着在一次检测中可同时检测两个或多个目标蛋白。它与单组分免疫测定方法相比具有更显著优势，包括更高的样品通量，更高的检测效率和准确性，更短的测定时间以及更低的样品需求。已经开发了很多用于疾病生物标志物的多种免疫测定方法，例如荧光，表面等离振子体共振，电化学和化学发光等方面。与上述方法相比，电致化学发光(ECL)由于其响应速度快，背景信号低，灵敏度高和操作简单等独特的优势而显示出巨大的潜力。然而，ECL多重免疫测定法仍然面临着巨大的挑战，这是因为难以找到两种具有电位分辨，没有能量转移和共反应试剂互不干扰的发光物质。尽管已有研究人员利用不同的方法并提供了许多解决多重免疫检测问题的可行策略，但它们都显示出某些缺陷。
因此，迫切需要开发一种新型的电位分辨ECL策略，在共反应试剂不交叉不干扰的情况下，实现在同一敏感界面上同时检测多个生物标志物，基于多生物标志物实现对AMI的灵敏准确诊断。
鉴于此，提出本发明。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种电化学免疫传感器和制备方法以及电化学免疫分析方法和试剂盒。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供一种电化学免疫传感器，该电化学免疫传感器包括基底电极和基底电极表面固载的第一抗体，第一抗体包括脑利钠肽抗体和心肌肌钙蛋白I抗体，基底电极表面沉积有纳米金颗粒，且脑利钠肽抗体和心肌肌钙蛋白I抗体通过自组装的方法修饰在纳米金颗粒表面。
目前已经报道的AMI诊断方法通常是基于单一生物标志物的，由于单一标志物通常可以作为几种不同疾病的标志物，这就难免会导致误诊的情况。如脑利钠肽(BNP)和心肌肌钙蛋白I(cTnI)是常用于AMI的早期诊断的特异性生物标志物。BNP是一种重要的心脏神经激素，在心室负荷和心室壁张力改变后会从心室释放。然而，BNP不仅存在于心室中，而且还存在于脑，垂体，肺等组织中。此外，由于肺部感染和急性呼吸困难都可以导致BNP在血液中含量的增加。如果将BNP用作诊断AMI的唯一生物标志物，则很容易引起误诊。在目前的检测中，cTnI已经作为诊断AMI的最常用生物标记物，但仍存在一定缺陷，尤其是在心肌损伤3－4h后才能在外周血中检测到循环水平的升高，这是由于循环水平的延迟增加所致。此外，cTnI在血液中释放的时间还比BNP稍晚，所以单独检测cTnI也会使早期诊断不够准确。显然，基于多特异性生物标志物同时对AMI的诊断会更加有效和科学，即同时检测AMI的标志物脑利钠肽(BNP)和心肌肌钙蛋白I(cTnI)将大大提高AMI的早期诊断的准确性。
但是在电致化学发光(ECL)分析中，很难找到两种电位分辨且它们的共反应试剂互不干扰的ECL发光物质，这使得在同一敏感界面上进行两组分同时检测是一个巨大的挑战。尽管ECL同时测定两种或者多种组分的方法已经有文章报道，但他们要么是波长分辨型的，要么是两种ECL发光物质分享相同的共反应试剂型的，前者会涉及更为复杂的仪器，后者会涉及共反应试剂竞争，从而降低检测的准确性。目前还没有不涉及共反应试剂竞争的电位分辨型ECL用于多组分同时检测的报道。
发明人经过长期的实践，提出一种电化学免疫传感器，该电化学免疫传感器为：将脑利钠肽抗体和心肌肌钙蛋白I抗体通过自组装的方法修饰在具有纳米金颗粒的基底电极上，通常基底电极为玻碳电极。将以上的电化学免疫传感器应用于检测的过程中，利用抗原和抗体的特异性结合作用，随着待测液中夹心层脑利钠肽和心肌肌钙蛋白I浓度的升高，显示出随抗原浓度增加而增强的ECL信号，从而实现了低检测限的双组分同步检测，提供了一种可用于在同一敏感界面上同时测定多种生物标志物的新型ECL检测平台。
第二方面，本发明实施例提供一种上述电化学免疫传感器的制备方法，包括：在基底电极的表面电化学沉积纳米金颗粒后，滴加脑利钠肽抗体溶液和心肌肌钙蛋白I抗体溶液进行共孵育。
在可选的实施方式中，在基底电极表面电沉积纳米金颗粒包括以下步骤：基底电极经抛光、清洗、吹干后，采用0.2－3wt％的HAuCl4溶液，在基底电极的表面以－0.2V的恒定电压电沉积10－50s以在基底电极表面电沉积纳米金颗粒；
在可选的实施方式中，滴加脑利钠肽抗体溶液和心肌肌钙蛋白I抗体溶液进行共孵育包括以下步骤：滴加10μg/mL，5－10μL的脑利钠肽抗体溶液和10μg/mL，5－10μL的心肌肌钙蛋白I抗体溶液，于2－8℃下孵育12－16h；
优选的，还包括滴加牛血清蛋白封闭基底电极表面的非特异性的活性位点：滴加1wt％，5－15μL的牛血清白蛋白溶液，于2－8℃下孵育1h，以封闭基底电极表面的非特异性结合位点，然后用0.05－0.15mol/ml的PBS缓冲液中进行淌洗。
第三方面，本发明实施例提供一种基于上述的电化学免疫传感器的电化学免疫分析方法，至少包括以下步骤：
将电化学免疫传感器与待检测的脑利钠肽抗原和心肌肌钙蛋白I抗原的样品溶液进行第一次孵育，然后将经过第一次孵育的电化学免疫传感器和能够单独与脑利钠肽抗原结合的第二抗体复合物A溶液以及能够单独与心肌肌钙蛋白I抗原结合的第二抗体复合物B溶液进行第二次孵育；且第二抗体复合物A中含有石墨相氮化碳纳米片，第二抗体复合物B中含有N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺。
利用以上的电化学免疫传感器进行电化学免疫分析的设计思路如下：N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺(ABEI)和石墨相氮化碳纳米片(g－C3N4)由于其优异的ECL性能而被广泛用作ECL体系的发光物质。到目前为止，还没有文章报道将它们用于两组分同时检测。因为ABEI和g－C3N4的发光电位可以得到显著分辨，并且它们之间没有共振能量转移，所以ABEI和g－C3N4分别被筛选为阳极和阴极ECL发光物质。此外，ABEI的共反应试剂溶解氧和g－C3N4的共反应试剂K2S2O8互不干扰。由此通过夹心免疫反应构建了基于ABEI和g－C3N4的两组分电位分辨型ECL免疫传感器：在打磨抛光的玻碳电极表面用电沉积的金纳米颗粒，以用来固载anti－cTnI1和anti－BNP1两种抗体，并进一步捕获cTnI和BNP两种抗原。然后，将金纳米粒子－石墨相氮化碳纳米片－脑利钠肽二抗(anti－cTnI2－AuNPs＠ABEI)以及金纳米粒子－N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺－心肌肌钙蛋白I二抗(anti－BNP2－AuNPs＠g－C3N4)两种二抗标记物同步装配到孵育过BNP和cTnI抗原的敏感界面上。当存在共反应试剂溶解O2和K2S2O8的情况下，随着夹心层cTnI和BNP浓度的升高，显示出随抗原浓度增加而增强的ECL信号，从而实现了低检测限的双组分同步检测。
在可选的实施方式中，第二抗体复合物A的组成为：金纳米粒子－石墨相氮化碳纳米片－脑利钠肽抗体，第二抗体复合物B的组成为：金纳米粒子－N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺－心肌肌钙蛋白I抗体；
优选的，第二抗体复合物A通过以下步骤制备得到：将石墨相氮化碳纳米片悬浮液与HAuCl4溶液混合均匀，加入NaBH4进行还原得到金纳米粒子，再加入柠檬酸三纳继续搅拌混合，离心收集金纳米粒子－石墨相氮化碳纳米片；将金纳米粒子－石墨相氮化碳纳米片的悬浮液与脑利钠肽抗体溶液混合并进行孵育；用牛血清白蛋白封闭金纳米粒子表面的非特异性的活性位点；更优选的，控制孵育时石墨相氮化碳纳米片和脑利钠肽抗体的质量比为1000－3000：1，于2－8℃下孵育12－16h；
优选的，第二抗体复合物B通过以下步骤制备得到：将N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺溶液与HAuCl4溶液混合均匀，加入NaBH4进行还原得到金纳米粒子，继续搅拌混合，离心收集金纳米粒子－N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺；将金纳米粒子－N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺的分散液与心肌肌钙蛋白I抗体溶液混合并进行孵育；用牛血清白蛋白封闭金纳米粒子表面的非特异性的活性位点；更优选的，控制孵育时N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺和心肌肌钙蛋白I抗体的质量比为2000－4000：1，于2－8℃下孵育12－16h。
在可选的实施方式中，第二抗体复合物A溶液的浓度为1mg/ml，用量为2－8μL，第二抗体复合物B溶液的浓度为2mg/ml，用量为2－8μL；
优选的，第二次孵育的孵育温度为2－8℃，时间为1.5－3h。
在可选的实施方式中，电化学免疫分析方法还包括：在三电极体系中测量出经过第二次孵育后的电化学免疫传感器的电化学发光强度值；根据电化学发光强度值计算待测样品溶液中脑利钠肽抗原浓度和心肌肌钙蛋白I抗原浓度。
在可选的实施方式中，电化学发光强度值测量时的检测底液为含有N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺的共反应试剂溶解氧和石墨相氮化碳纳米片的共反应试剂K2S2O8的磷酸盐缓冲液；
优选的，磷酸盐缓冲液的浓度为0.1M，用量为2－4mL，pH为7.4，且空气饱和条件下的磷酸盐缓冲溶液中K2S2O8的浓度为2－8mM；
优选的，电化学发光强度值测量时：以300mV/s的扫描速度在－1.5V－0.7V的电位范围内进行检测。
本发明实施例提供一种基于上述的电化学免疫传感器的电化学免疫分析方法，基于上述的电化学免疫传感器的电化学免疫分析方法以ABEI和g－C3N4作为发光物质，因为ABEI和g－C3N4的发光电位可以得到显著分辨，并且它们之间没有共振能量转移，所以ABEI和g－C3N4分别被筛选为阳极和阴极ECL发光物质。此外，ABEI的共反应试剂溶解氧和g－C3N4的共反应试剂K2S2O8互不干扰。由此通过夹心免疫反应构建了基于ABEI和g－C3N4的两组分电位分辨ECL免疫传感器。当存在共反应试剂溶解O2和K2S2O8的情况下，随着夹心层cTnI和BNP浓度的升高，显示出随抗原浓度增加而增强的ECL信号，随着夹心层孵育BNP和cTnI浓度的增加，来自ABEI(+0.7V)和来自g－C3N4(－1.5V)的ECL信号同时增加。在本方案中实现了对BNP和cTnI的同步免疫测定，cTnI和BNP的检出限分别为3.2pg/mL和3.8pg/mL。ABEI/O2和g－C3N4/S2O8 2－两个系统的集成避免了当前同步多重免疫测定存在的波长分辨型ECL测定的复杂仪器和操作的限制，以及共反应试剂的交叉干扰和竞争的缺陷，从而提供了一种可用于在同一敏感界面上同时测定多种生物标志物的电位分辨型的新型ECL检测平台。
在可选的实施方式中，电化学发光分析方法的样品选自：生物样品、食品或饮料样品、化学样品或环境样品。
第四方面，本发明实施例提供一种试剂盒，该试剂盒包括上述的电化学免疫传感器，以及含有N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺的第二抗体复合物A和第二抗体复合物B。
第五方面，本发明实施例提供一种利用上述的电化学免疫传感器在同时检测急性心肌梗塞标志物中的用途。
在可选的实施方式中，急性心肌梗塞标志物为脑利钠肽和心肌肌钙蛋白I。
急性心肌梗塞诊断过程中，单一特异性生物标志物的检测会出现诊断精确度不高，甚至出现误诊的问题，这是由于某一特异性生物标志物不仅可以作为一种疾病的标志物，还可以作为其他物质的标志物。显然，基于多特异性生物标志物同时对AMI的诊断会更加有效和科学。
经发明人长期的实践发现：因为ABEI和g－C3N4的发光电位可以得到显着分辨，并且它们之间没有共振能量转移，所以ABEI和g－C3N4分别被筛选为阳极和阴极ECL发光物质。此外，ABEI的共反应试剂溶解氧和g－C3N4的共反应试剂K2S2O8互不干扰。通过夹心免疫反应构建了基于ABEI和g－C3N4的两组分电位分辨ECL免疫传感器。当存在共反应试剂溶解O2和K2S2O8的情况下，随着夹心层cTnI和BNP浓度的升高，显示出随抗原浓度增加而增强的ECL信号，从而实现了低检测限的双组分同步检测。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种电化学免疫传感器和制备方法以及电化学免疫分析方法和试剂盒。该电化学免疫传感器是在表面沉积金纳米粒子的基底电极上，同时固载有脑利钠肽抗体和心肌肌钙蛋白I抗体，利用该电化学免疫传感器可以实现对急性心肌梗塞标志物BNP和cTnI的同步免疫测定，避免了波长分辨型ECL测定存在复杂仪器和操作的限制，并克服了电位分辨型的共反应试剂的交叉干扰和竞争的缺陷，从而提供了一种可用于在同一敏感界面上同时测定多种生物标志物的新型电位分辨型的ECL检测平台。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中的二抗复合物和电化学免疫传感器的制备流程图；
图2为本发明实施例1中的材料表征图：A图为g－C3N4的SEM图像；B图为AuNPs＠g－C3N4的TEM图像；C图为AuNPs＠ABEI的SEM图像；D图和E图分别为AuNPs＠g－C3N4和AuNPs＠ABEI的XPS光谱；F图为修饰电极的阻抗表征；
图3为本发明实施例1中的修饰电极的循环伏安表征；
图4中的A图和B图分别为本发明实施例1中的ABEI和g－C3N4的3D ECL光谱；
图5为本发明实施例1中的AuNPs＠g－C3N4的紫外可见吸收光谱(曲线a)和AuNPs＠ABEI的ECL发射光谱(曲线b)的对比，以及不同修饰电极在不同情况下的ECL响应；
图6为本发明实施例1中的共反应试剂的交叉反应试验；
图7中的A图为本发明实施例1中的电化学免疫传感器对不同浓度的BNP和cTnI的ECL响应；B图为cTnI和C图为BNP的线性曲线；D图为生物传感器对于不同抗原的选择性。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一、以下对于本发明实施例中涉及的物质进行说明：
电致化学发光，简记为：ECL；
N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺，简记为：ABEI；
石墨相氮化碳纳米片，简记为：g－C3N4；
脑利钠肽，简记为：BNP；
心肌肌钙蛋白I，简记为：cTnI；
玻碳电极，简记为：GCE；
金纳米粒子，简记为：AuNPs；
在玻碳电极的表面电沉积金纳米粒子，简记为：DpAu/GCE；
牛血清白蛋白，简记为：BSA；
金纳米颗粒与N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺复合第一抗体复合物，简记为：AuNPs＠ABEI；anti－cTnI2与AuNPs＠ABEI复合二抗标记物，简记为：anti－cTnI2－AuNPs＠ABEI；
金纳米颗粒与石墨相氮化碳纳米片复合第一抗体复合物，简记为：AuNPs＠g－C3N4；anti－BNP2与AuNPs＠g－C3N4复合二抗标记物，简记为：anti－BNP2－AuNPs＠g－C3N4。
二、实验部分
2.1材料和试剂
N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺(ABEI)和四水合氯化金(HAuCl4·4H2O，99.9％)购自Sigma(美国密苏里州圣路易斯)。牛血清白蛋白(BSA，96－99％)，硼氢化钠(NaBH4)和过硫酸钾(K2S2O8)购自重庆川东化工有限公司(中国重庆)。cTnI鼠单克隆抗体，BNP兔单克隆抗体，心肌肌钙蛋白I(cTnI)购自北京生物合成生物技术有限公司。脑利钠肽(BNP)癌，胚抗原(CEA)，甲胎蛋白(AFP)和降钙素(CT)购自郑州博赛生物技术有限公司。
2.2仪器
使用MPI－A型电致化学发光分析仪(西安瑞迈电子科技有限公司，西安，中国)检测ECL信号；循环伏安(CV)的测试使用CHI600D电化学工作站(上海辰华仪器有限公司，中国)；ECL和CV检测均采用传统三电极体系：修饰的玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl(饱和KCl)为参比电极，铂丝作为对电极；紫外吸收光谱用岛津公司的UV－2450紫外－可见分光光度计记录(东京，日本)；用扫描电子显微镜(SEM，日立，日本)和透射电子显微镜(TEM，日本电子株式会社，日本)研究了扫描电子图像；X射线光电子能谱(XPS)由Thermo ESCALAB 250光谱仪(SID－Molecular)测试；ECL发射光谱是在CHI 760E与Newton EMCCD光谱检测器(日本东京安道尔公司)组合获得的。
2.3二抗标记物的制备
2.3.1anti－cTnI2－AuNPs＠ABEI的制备
参见图1中的A图，制备金纳米颗粒(AuNPs)和ABEI的复合材料。在室温下，将1.0mLABEI溶液(15mM)和5.0mL HAuCl4溶液(0.25mM)混合并搅拌1小时。在搅拌1小时后，缓慢加入新制的NaBH4溶液(0.5mL，0.10M)。继续搅拌6小时后，溶液从无色变为黄色，然后变为紫色，表明通过还原过程产生了Au纳米颗粒(AuNPs)。通过在10，000rpm下离心10分钟收集AuNPs＠ABEI，然后将其分散在去离子水(2mL)中。
将100μL anti－cTnI2(10μg/ml)注入AuNPs＠ABEI分散液中，并将混合溶液在4℃下搅拌14h，以便在anti－cTnI2和AuNPs之间形成Au－N键。最后，用100μL的BSA(1％)封闭AuNPs表面的非特异性结合位点，以获得二抗标记物anti－cTnI2－AuNPs＠ABEI。
2.3.2anti－BNP2－AuNPs＠g－C3N4的制备
参见图1中的A图，将20克三聚氰胺在600℃下加热2小时，得到黄色块状g－C3N4。冷却至室温后，将块状g－C3N4在超声仪中超声剥离约16小时以获得g－C3N4纳米片。然后，在快速搅拌下，将10μL HAuCL4(1％)溶液加入到1mL g－C3N4纳米片悬浮液(1mg/mL)中。之后，加入新制的NaBH4溶液(25μL，0.01M)。搅拌20分钟后，将柠檬酸三钠溶液(10μL，0.01M)滴入其中，并将得到的混合物溶液保持搅拌30分钟。最后通过以8，000rpm的转速离心并用去离子水洗涤来收集AuNPs＠g－C3N4复合物，并将其分散在1mL蒸馏水中。
将AuNPs＠g－C3N4悬浮液在4℃搅拌下加入anti－BNP2(100μL，10μg/mL)，并持续搅拌14小时以形成Au－N键。然后，用BSA(1％)封闭AuNPs表面的非特异性结合位点，得到二抗标记物anti－BNP2－AuNPs＠g－C3N4。
2.4ECL免疫传感器的制造
参见图1中的B图，对直径为4mm的玻璃碳电极(GCE)表面进行打磨和抛光后，在1％的HAuCl4溶液中以－0.2V的恒定电压电沉积30s，以形成电沉积的Au纳米粒子(DpAu)。然后，将DpAu/GCE与15μL抗cTnI1和抗BNP1的混合溶液在4℃孵育14h，然后将BSA(1％，10μL)在4℃孵育1h。阻止电极表面的剩余活性部位。ECL免疫传感器用PBS(pH 7.4)洗涤。
2.5ECL检测
参见图1中的B图，ECL免疫传感器使用cTnI和BNP抗原孵育2小时，然后再将15μLanti－cTnI2－AuNPs＠ABEI和anti－BNP2－AuNPs＠g－C3N4(1：1)的混合物孵育2小时以形成夹心结构。然后，以300mV/s的扫描速度在－1.5V－0.7V的电位范围内进行ECL检测，检测底液为含有5.0mM K2S2O8和溶解O2的3.0mL PBS(0.10M，pH 7.4)，光电倍增管的电压设置为800V。
三、结果与讨论
3.1纳米材料的表征
利用透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)对AuNPs＠g－C3N4和AuNPs＠ABEI进行了表征。g－C3N4的SEM图像如图2中的A图所示，可以观察到其为片层状结构。AuNPs＠g－C3N4的TEM图像如图2中的B图所示，它表示在g－C3N4纳米片表面上存在大量均匀分散的Au NPs，表明AuNPs＠g－C3N4已被成功制备。AuNPs＠ABEI的SEM图像显示在图2中的C图中，和预期的一样，可以观察到大量AuNPs覆盖着在表层上。
使用X射线光电子能谱(XPS)表征了AuNPs＠g－C3N4和AuNPs＠ABEI的化学组成，其结果分别示于图2中的D图和图2中的E图。在AuNPs＠g－C3N4的XPS图像中(图2中的D图)，84.05eV和87.75eV的峰是属于Au4f，同时在531.48eV，399.18eV和288.48eV的分别是O1，N1，C1s的特征峰，这证明了AuNPs＠g－C3N4复合材料的成功制备。在AuNPs＠ABEI的XPS图像中(图2中的E图)，532.48eV，399.15eV和284.9eV处的特征峰分别属于O1s，N1s和C1s，在84.95eV和88.65eV的特征峰表示Au 4f的存在，证明了AuNPs＠ABEI的成功制备。
3.2修饰电极的表征
使用电化学阻抗谱(EIS)和循环伏安法(CV)确认了修饰电极的组装过程。图2中的F图记录了在5.0mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的EIS光谱。如图2中的F图所示，与裸玻碳电极(曲线a)相比，DpAu/GCE在EIS光谱中具有减小的半圆直径(曲线b)，这归因于DpAu促进了电子转移。当anti－cTnI1和anti－BNP1被孵育在电极表面时(曲线c)，EIS谱图显示出明显的阻抗值增加。当BSA进一步被孵育在电极表面时(曲线d)，EIS谱图显示阻抗值持续增加。在cTnI和BNP的抗原被孵育在电极表面时(曲线e)，生物大分子的阻滞使阻抗值明显增加。
在5.0mM的[Fe(CN)6]3-/4-溶液中不同修饰电极的CV曲线，结果如图3所示，与裸玻碳电极(曲线a)相比，DpAu/GCE呈现出明显增加的峰值电流(曲线b)，这归因于DpAu优异的导电能力使电子的转移速率增加。将anti－cTnI1和anti－BNP1孵育在DpAu/GCE上时，由于电子排斥，电流响应降低(曲线c)。当电极与BSA(曲线d)以及cTnI和BNP抗原的混合物(曲线e)连续孵育时，由于生物大分子的静电排斥，电流响应连续降低。EIS和CV结果均证实修饰电极的成功组装。
3.3双组分免疫传感器的ECL机理
检测底液为含5.0mM K2S2O8的0.10M PBS缓冲液(pH 7.4)，在－1.5V－+0.7V的扫描电势范围内，用AuNPs＠ABEI和AuNPs＠g－C3N4修饰的GCE分别检测ABEI和g－C3N4的ECL发射光谱，结果如图4所示。图4中的A表示的是AuNPs＠ABEI的阳极ECL发射光谱，在循环扫描条件下于428nm处检测到最大的发射波长。图4中的B图表示的是AuNPs＠g－C3N4的阴极ECL发射光谱，在循环扫描条件下于510nm处检测到最大波长。显然，ABEI和g－C3N4具有不同的ECL光谱，证明了两个信号探针在相同的敏感界面上可以同时工作且互不干扰。
为了探究两种ECL发光物质之间是否存在能量转移，我们检测了AuNPs＠ABEI的ECL发射光谱和AuNPs＠g－C3N4的紫外可见吸收光谱，结果如图5中的A图所示，AuNPs＠g－C3N4的紫外可见吸收光谱在200nm处表现出特征吸收带(曲线a)。AuNPs＠ABEI的ECL发射光谱在428nm处显示出明显的ECL发射峰(曲线b)。可以看到，二者之间几乎没有光谱重叠，表明在ABEI和g－C3N4两种ECL发光物质之间没有能量转移。
在含有5.0mM K2S2O8和溶解O2的0.10mol/L PBS(pH 7.4)溶液中研究了不同修饰电极的ECL行为，结果如图5中的B图，5中的C图和5中的D图所示。图5中的B图，5中的C图和5中的D图记录了电位扫描范围为-1.5-+0.7V的ECL响应。可见，在anti-cTnI1+anti-BNP1/DpAu/GCE上没有孵育cTnI和BNP抗原时，未检测到明显的ECL信号(图5中的B图，5中的C图和5中的D图的曲线a)。在anti-cTnI1+anti-BNP1/DpAu/GCE上将两种抗原一起孵育，然后再孵育二抗标记物，可以检测到明显的阳极和阴极ECL信号(图5中的B图，曲线b)。当生物传感器仅与BNP抗原一起孵育时，并与二抗标记物进一步孵育时，仅能检测到阴极的ECL信号(图5中的C图，曲线b)。在没有cTnI抗原存在的情况下，不可能形成cTnI的夹心结构，因此没有检测到由ABEI产生的阳极ECL信号。在只有cTnI存在的情况下，将电极与二抗标记物进一步孵育，这时仅能检测到来自ABEI的阳极ECL信号(图5中的D图，曲线b)，因为在缺少BNP抗原存在的情况下，阴极信号探针anti-BNP2-AuNPs@g-C3N4无法被捕获在敏感界面上。这些观察结果表明，两个ECL探针没有交叉反应。
根据先前的文献，推测ABEI和g-C3N4的可能的ECL机理如下式所示：
g-C3N4+e-→g-C3N4 ·- (1)
S2O8 2·+e-→SO4 2-+SO4 ·- (2)
g-C3N4 ·-+SO4 ·-→g-C3N4 *+SO4 2-
and/or (3)
g-C3N4+SO4 ·-→g-C3N4 ·++SO4 2-
g-C3N4 ·++g-C3N4 ·-→g-C3N4 ++g-C3N4 (4)
g-C3N4 *→hv+g-C3N4 (5)
ABEI-e-→ABEI·+ (6)
O2+e-→O2 ·- (7)
ABEI·++O2 ·-→ABEI*+O2 (8)
ABEI*→hv+ABEI (9)
为了确认两种共反应试剂K2S2O8和溶解的O2是否相互干扰，我们进行了验证实验，结果如图6所示。当用两种抗原(cTnI+BNP)修饰生物传感器(BSA/anti－cTnI1+anti－BNP1/DpAu/GCE)并进一步与二抗标记物anti－cTnI2－AuNPs＠ABEI及anti－BNP2－AuNPs＠g－C3N4孵育时，在含5.0mM K2S2O8和溶解的O2的PBS(0.10M，pH 7.4)中进行ECL检测，可以检测到明显阳极和阴极ECL信号(图6中的A图和图6中的B图的曲线a)。在没有K2S2O8存在的情况下(图6中的A图，曲线b)，无法检测到阴极ECL信号，并且阳极ECL信号没有表现出明显的变化。当在溶液中通入氮气以去除氧时(图6中的B图，曲线b)，阳极ECL信号显着降低，并且阴极ECL信号没有表现出明显变化。用已经孵育两种抗原和二抗标记物的生物传感器(图6中的C图)研究K2S2O8对ABEI阳极ECL信号的影响。如图所示，存在K2S2O8(曲线a)和没有K2S2O8(曲线b)相比，ECL信号几乎没有差异。用已经孵育两种抗原和二抗标记物的生物传感器(图6中的D图)，研究了溶解O2对g－C3N4阴极ECL信号的影响。存在溶解O2(曲线a)和没有溶解O2(曲线b)相比，ECL信号几乎没有差异。因此，ABEI的共反应试剂溶解氧和g－C3N4的共反应试剂K2S2O8互不干扰，表明这种多重免疫测定策略是可行的。
3.4双组分免疫传感器的性能
在含5.0mM K2S2O8和溶解的O2的PBS(0.10M，pH 7.4)中检测免疫传感器对cTnI和BNP的ECL响应，结果如图7所示。如图7中的A图所示，随着cTnI和BNP浓度从5pg/mL增加到20ng/mL，阳极和阴极ECL强度均随之增加。图7中的B图显示了ECL强度(I)和cTnI浓度对数(c)之间的线性曲线。cTnI的回归方程为I＝1739.5lg[c/(ng/mL)]+4740，相关系数为0.9950，检测限为3.2pg/mL(S/N＝3)。图7中的C图显示了ECL强度(I)和BNP浓度对数(c)之间的线性曲线，回归方程为I＝2284.7lg[c/(ng/mL)]+6141，相关系数为0.9934，检测限为3.8pg/mL(S/N＝3)。
选择甲胎蛋白(AFP)，癌胚抗原(CEA)和降钙素(CT)作为可能的干扰物质来研究免疫传感器的选择性。如图7中的D图所示，空白样品，1ng/mL的AFP，1ng/mL的CEA，1ng/mL的CT及其混合物都不会引起明显的干扰，表明该传感器具有出色的选择性。
3.5实际样本检测
通过使用标准加入法进行回收实验，探索了ECL免疫传感器在临床上的可行性。表1是检测了人血清中cTnI和BNP的回收率后的相应结果。
表1：人血清样品中cTnI和BNP的检测
Figure BDA0002319743450000171
由上表可以看出：cTnI的回收率在94.6–103％之间，BNP的回收率在93.3–105％之间。说明该免疫传感器可在临床分析时同时测定cTnI和BNP。
四、结论
利用g－C3N4和ABEI分别作为阴极和阳极ECL探针，并使用溶解O2和K2S2O8作为它们的共反应试剂来构建电位分辨的ECL免疫传感器，以同时测定cTnI和BNP，实现对急性心肌梗死(AMI)的诊断。本工作完善了双组分检测方法的不足，筛选出电位能显著分辨且共反应试剂互不干扰的ECL发光物质探针对，并对其在ECL双组分检测领域的应用提供理论依据和技术支持，并且实现了在同一敏感界面上对于心肌梗塞的多种目标物进行同时检测，为心肌梗塞的早期确诊提供了技术支持。
对比例1
与实施例1中的步骤相同，不同之处仅在于：基底电极的表面只含有心肌肌钙蛋白I抗体，只检测cTnI，但由于其在体内循环水平的延迟增加，在心肌损伤后他的浓度增加很缓慢，无法实现对AMI的准确诊断。
对比例2
与实施例1中的步骤相同，不同之处仅在于：基底电极的表面只含有脑利钠肽抗体，只检测BNP，但BNP不仅存在于心室中，而且还存在于脑，垂体，肺等组织中。此外，由于肺部感染和急性呼吸困难都可以导致BNP在血液中含量的增加，所以只检测BNP无法准确判定其浓度的增加是否是由于心肌损伤而造成的。
对比例3
与实施例1中的步骤相同，不同之处仅在于：采用两种抗体标志物进行检测，但是两种抗体标志物不在同一敏感界面上，使得检测程序复杂化，检测时间过长。但由于急性心肌梗死发病较快，多标志物的同步检测才能购准确提高准确性，从而降低死亡率。
对比例4
与实施例1中的步骤相同，不同之处仅在于：第二抗体复合物中使用联吡啶钌、CdTe量子点等发光团，由于以上的发光团会发生能量转移，使得检测结果偏差增大。
综上，本发明实施例提供一种电化学免疫传感器和制备方法以及电化学免疫分析方法和试剂盒。N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺(ABEI)和石墨相氮化碳纳米片(g－C3N4)由于其优异的ECL性能而被广泛用作ECL体系的发光物质。到目前为止，还没有文章报道将它们用于两组分同时检测。在本工作中，因为ABEI和g－C3N4的发光电位可以得到显着分辨，并且它们之间没有共振能量转移，所以ABEI和g－C3N4分别被筛选为阳极和阴极ECL发光物质。此外，ABEI的共反应试剂溶解氧和g－C3N4的共反应试剂K2S2O8互不干扰。通过夹心免疫反应构建了基于ABEI和g－C3N4的两组分电位分辨ECL免疫传感器。首先，在打磨抛光的玻碳电极表面用电沉积的金纳米颗粒，以用来固载抗anti－cTnI1和anti－BNP1两种抗体，并进一步捕获cTnI和BNP两种抗原。然后，制备anti－cTnI2－AuNPs＠ABEI以及anti－BNP2－AuNPs＠g－C3N4两种二抗标记物，并同步装配到孵育过BNP和cTnI抗原的敏感界面上。当存在共反应试剂溶解O2和K2S2O8的情况下，随着夹心层cTnI和BNP浓度的升高，显示出随抗原浓度增加而增强的ECL信号，从而实现了低检测限的双组分同步检测。这种基于ABEI/O2和g－C3N4/S2O8 2－两个系统的集成克服了目前多重免疫测定法如利用波长分辨型进行检测或者两种ECL发光物质分享相同的共反应试剂型进行检测的缺点，解决了共反应试剂交叉干扰和竞争的问题，从而提供了一种可用于在同一敏感界面上同时测定多种生物标志物的新型电位分辨型新型的ECL检测平台，实现了在相同的敏感界面上对两种不同的生物标志物进行同时检测，为诊断AMI提供了一种有效的方案。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种电化学免疫传感器，其特征在于，所述电化学免疫传感器包括基底电极和所述基底电极表面固载的第一抗体，所述第一抗体包括脑利钠肽抗体和心肌肌钙蛋白I抗体，所述基底电极表面沉积有纳米金颗粒，且脑利钠肽抗体和心肌肌钙蛋白I抗体通过自组装的方法修饰在所述纳米金颗粒表面。
2.一种根据权利要求1所述电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括：在基底电极的表面电化学沉积金纳米颗粒后，滴加脑利钠肽抗体溶液和心肌肌钙蛋白I抗体溶液进行共孵育。
3.根据权利要求2所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，在基底电极表面电沉积纳米金颗粒包括以下步骤：所述基底电极经抛光、清洗、吹干后，采用0.2－3wt％的HAuCl4溶液，在所述基底电极的表面以－0.2V的恒定电压电沉积10－50s以在基底电极表面电沉积纳米金颗粒。
4.根据权利要求2所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，滴加脑利钠肽抗体溶液和心肌肌钙蛋白I抗体溶液进行共孵育包括以下步骤：滴加10μg/mL，5－10μL的脑利钠肽抗体溶液和10μg/mL，5－10μL的心肌肌钙蛋白I抗体溶液，于2－8℃下孵育12－16h；
优选的，还包括滴加牛血清蛋白封闭所述基底电极表面的非特异性的活性位点：滴加1wt％，5－15μL的牛血清白蛋白溶液，于2－8℃下孵育1h，以封闭基底电极表面的非特异性结合位点，然后用0.05－0.15mol/ml的PBS缓冲液中进行淌洗。
5.一种基于权利要求1所述的电化学免疫传感器或权利要求2－4中任一项所述制备方法制备的电化学免疫传感器的电化学免疫分析方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
将所述电化学免疫传感器与待检测的脑利钠肽抗原和心肌肌钙蛋白I抗原的样品溶液进行第一次孵育，然后将经过所述第一次孵育的电化学免疫传感器和能够单独与脑利钠肽抗原结合的第二抗体复合物A溶液以及能够单独与心肌肌钙蛋白I抗原结合的第二抗体复合物B溶液进行第二次孵育；且所述第二抗体复合物A中含有石墨相氮化碳纳米片，所述第二抗体复合物B中含有N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺。
6.根据权利要求5所述的分析方法，其特征在于，所述第二抗体复合物A的组成为：金纳米粒子－石墨相氮化碳纳米片－脑利钠肽抗体，所述第二抗体复合物B的组成为：金纳米粒子－N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺－心肌肌钙蛋白I抗体；
优选的，所述第二抗体复合物A通过以下步骤制备得到：将石墨相氮化碳纳米片悬浮液与HAuCl4溶液混合均匀，加入NaBH4以在石墨相氮化碳纳米片表面原位还原得到金纳米粒子，再加入柠檬酸三纳继续搅拌混合，离心收集金纳米粒子－石墨相氮化碳纳米片；将金纳米粒子－石墨相氮化碳纳米片的悬浮液与脑利钠肽抗体溶液混合并进行孵育；用牛血清白蛋白封闭金纳米粒子表面的非特异性的活性位点；更优选的，控制孵育时石墨相氮化碳纳米片和脑利钠肽抗体的质量比为1000－3000：1，于2－8℃下孵育12－16h；
优选的，所述第二抗体复合物B通过以下步骤制备得到：将N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺溶液与HAuCl4溶液混合均匀，加入NaBH4进行还原得到金纳米粒子，继续搅拌混合，离心收集金纳米粒子－N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺；将金纳米粒子－N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺的分散液与心肌肌钙蛋白I抗体溶液混合并进行孵育；用牛血清白蛋白封闭金纳米粒子表面的非特异性的活性位点；更优选的，控制孵育时N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺和心肌肌钙蛋白I抗体的质量比为2000－4000：1，于2－8℃下孵育12－16h。
7.根据权利要求5所述的分析方法，其特征在于，所述第二抗体复合物A溶液的浓度为1mg/ml，用量为2－8μL，所述第二抗体复合物B溶液的浓度为2mg/ml，用量为2－8μL；
优选的，第二次孵育的孵育温度为2－8℃，时间为1.5－3h。
8.根据权利要求5所述的分析方法，其特征在于，所述电化学免疫分析方法还包括：在三电极体系中测量出经过第二次孵育后的所述电化学免疫传感器的电化学发光强度值；根据电化学发光强度值计算待测样品溶液中脑利钠肽抗原浓度和心肌肌钙蛋白I抗原浓度。
9.如权利要求8所述的分析方法，其特征在于，所述电化学发光强度值测量时的检测底液为含有N－(4－氨基丁基)－N－乙基异鲁米诺的共反应试剂溶解氧和石墨相氮化碳纳米片的共反应试剂K2S2O8的磷酸盐缓冲液；
优选的，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1M，用量为2－4mL，pH为7.4，且所述空气饱和条件下的磷酸盐缓冲溶液中K2S2O8的浓度为2－8mM；
优选的，所述电化学发光强度值测量时：以300mV/s的扫描速度在－1.5V－0.7V的电位范围内进行检测。
10.一种试剂盒，其包含权利要求1所述的电化学免疫传感器或权利要求2－4中任一项所述的制备方法制备的电化学免疫传感器，以及权利要求5－9中任一项所述分析方法中的第二抗体复合物A和第二抗体复合物B。
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