CN114878553A - 一种基于光谱分辨原理同步实施电化学发光免疫分析与核酸检测的多组分分析方法 - Google Patents
一种基于光谱分辨原理同步实施电化学发光免疫分析与核酸检测的多组分分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于光谱分辨原理同步实施电化学发光免疫分析与核酸检测的多组分分析方法，本发明采用ECL最大辐射波长位于485 nm的纳米金簇(Au NCs)和ECL最大辐射波长位于775 nm的铜铟硫量子点(CIS@ZnS NCs)为标记物，构建了光谱分辨型双色双组分ECL传感器，实现了蛋白CEA和核酸p53的同时检测，突破了已报道的ECL多组分传感器仅能够实现多种蛋白或多种核酸片段检测的局限性，同时有效避免了耗时的DNA扩增过程。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于光谱分辨原理同步实施电化学发光免疫分析与核酸检测的多组分分析方法，属于电化学发光分析技术领域。
背景技术
高传染性新冠病毒 (SARS-CoV-2) 已呈全球流行趋势的背景下，快速检出病毒株对于及时隔离感染个体、阻断病毒传播具有重要的价值。核酸检测是新冠病毒诊断的金标准。核酸检测通常基于等温聚合酶链式反应 (RT-PCR) 扩增和环介导等温扩增 (RT-LAMP)方式实现，具有装备要求复杂、检测耗时长，病毒突变影响检测结果准确性等不足之处。学术界和产业界开始将免疫分析引入新冠病毒检测领域，将抗原与抗体检测作为诊断新冠病毒感染的辅助与补充诊断手段，应用于聚集性疫情溯源。尽管核酸检测与免疫分析的联合使用对于阻断病毒扩散具有重要价值，学术界和产业界尚无同步实施核酸检测与免疫分析的配套多组分分析技术。
电化学发光 (ECL) 体外诊断技术具有灵敏度高、装置简单的显著特点，为避免核酸检测的繁琐扩增程序提供了潜在可行性。ECL多组分分析技术的发展已经使得同时检测两种抗原或核酸片段成为可能。He构建的波段识别型双组分ECL传感器实现了野生型p53和突变型p53两种核酸的同时检测 (Anal. Chem.2018, 90, 5474−5480)；Zhang构建的波段识别型双组分ECL免疫传感器实现了AFP和CA125两种蛋白的同时检测 (Biosens. Bioelectron.2018, 115, 77−82)。中国专利文献CN106124487A提供了一种基于光谱分辨原理的ECL三组分免疫传感器，以CdSe量子点和CdTe量子点为标记物，实现三种抗原的同时检测。
迄今为止，波段识别型与光谱分辨型ECL多组分分析主要基于II-VI族纳米材料实施，且均无法同步实施特定抗原与核酸片段的同步检测。能够同步实施免疫分析与核酸检测的ECL分析方法尚处于空白状态。
发明内容
针对现有技术的不足，尤其是尚无法基于光谱分辨原理实施特定抗原与核酸片段的同步检测的现状，本发明提供一种基于光谱分辨原理同步实施电化学发光免疫分析与核酸检测的多组分分析方法。
本发明采用ECL最大辐射波长位于485 nm的水溶性金纳米簇 (Au NCs) 和ECL最大辐射波长位于775 nm的水溶性铜铟硫量子点 (CIS@ZnS NCs) 为标记物，构建了双色双组分光谱分辨型ECL传感器，实现了蛋白CEA和核酸p53的同步检测，突破了已报道的多组分ECL传感器难以同步实施核酸检测与免疫分析的局限性，同时有效避免了耗时的DNA扩增过程。
术语说明：
一抗（CEA-Ab1）：本发明所述的一抗（Ab1）指癌胚抗原 (CEA) 的对应抗体，本发明对于上述抗原对应的单克隆抗体效果更好。
二抗（CEA-Ab2）：本发明所述的二抗指CEA抗原和一抗的对应二抗。
目标DNA（Tp53）：本发明所述的目标DNA指特定基因(单链)。
捕获DNA（Cp53）：本发明所述的捕获DNA指上述特定基因某一片段的一条互补链，并且标记有巯基。
探针DNA（Pp53）：本发明所述的探针DNA指上述特定基因某一片段的一条互补链，并标记有氨基，且其核苷酸序列与捕获DNA不同。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种基于光谱分辨原理同步实施ECL免疫分析和核酸检测的多组分分析方法，包括步骤如下：
1）构建用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器，所述ECL多组分分析传感器的最大辐射波长分别位于485和775 nm；包括金纳米簇标记的第二抗体（Ab2|Au NCs）与铜铟硫量子点标记的探针DNA片段（Pp53|CIS@ZnS NCs）、CEA-Ag与Tp53以及Au|MPA-Ab1与Au|MPA-Cp53，基于免疫与核酸反应的选择性构建成ECL多组分分析传感器：
。
2）以ECL多组分分析传感器为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在含5-20 mM水合肼的Hepes缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动产生电化学发光；
3）以曝光成像方式收集ECL全过程的所有光子，基于色散ECL辐射全部光子的方式获取总光谱；依据光谱曲线上最大辐射波长485 nm处的最大辐射强度与标准抗原溶液浓度之间的关系，绘制CEA检测工作曲线；依据光谱曲线上最大辐射波长775 nm处的最大辐射强度与Tp53浓度之间的关系，绘制Tp53检测工作曲线。
4）将待测样品按步骤1）构建免疫核酸同步检测的ECL传感器，按步骤2）和步骤3）中的方法进行ECL光谱测试，根据所得ECL光谱曲线上最大辐射波长处的光强信号和工作曲线，同步检测待测样品溶液中的抗原和目标DNA的浓度。
根据本发明优选的，步骤2）、步骤4），执行循环伏安法扫描时，扫描电压范围为0 ~1.6 V，扫描圈数1 ~ 3圈，扫描速度为40 ~ 60 mV/s。采用循环伏安法驱动固定于工作电极表面的Au NCs和CIS@ZnS NCs分别产生相应的ECL辐射。
根据本发明优选的，步骤1）中，用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器的构建方法如下：
a、以清洁活化后的Au电极为工作电极，将CEA-Ab1和Cp53同时标记在电极表面，得到双标记Au电极；
b、水溶性Au NCs标记CEA-Ab2，得到Ab2|Au NCs；水溶性CIS@ZnS NCs标记探针DNA，得到Pp53|CIS@ZnS NCs；
c、将CEA-Ag和Tp53滴加到双标记Au电极表面，室温孵育，再将步骤b得到的Ab2|AuNCs和Pp53|CIS@ZnS NCs滴加到电极表面孵育；以形成免疫复合物的形式将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs枝接并固定到工作电极表面，得到用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器。
根据本发明优选的，上述步骤a中，双标记Au电极的制备步骤如下：
（1）将清洁的Au电极在5-20 mM 巯基丙酸中浸泡过夜，通过Au-S键将MPA键合到电极表面；
（2）向步骤（1）所得的修饰电极表面滴加10 μL 10 mg/mL １-乙基-（3-二甲基氨基丙酸）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和10 mg/mL羟基琥珀酰亚胺（NHS），活化30 min，清洗电极，除去未反应的EDC以及NHS；
（3）将CEA-Ab1水溶液和Cp53水溶液混合后滴加到活化电极表面，孵育2-4 h，加入BSA封闭电极上未反应的活性位点，清洗电极，得到双标记Au电极。
根据本发明优选的，CEA-Ab1水溶液的浓度为8-15 μg/mL，滴加量为8-15 μL，Cp53水溶液的浓度为8-15 μM，滴加量为8-15 μL。
根据本发明优选的，用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器的构建步骤b中， 所述Ab2|Au NCs的合成步骤如下：
1）活化水溶性Au NCs表面的羧酸基团；
2）使第二抗体与经过步骤1）处理的水溶性Au NCs表面的羧酸基团反应，获得水溶性Au NCs标记的抗原对应的第二抗体。
根据本发明优选的，所述Ab2|Au NCs具体制备步骤如下：
将纯化后的Au NCs溶解于1 mL含有 10 mg/mL EDC和10 mg/mL NHS的0.1 M pH6.0磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，活化30 min，离心纯化，再分散于1 mL pH 7.4 0.1 M PBS中，得到活化的Au NCs；加入8-15 μL浓度为8-15 μg/mL CEA-Ab2水溶液，37 ℃下恒温孵育3-5h，加入20 μL牛血清蛋白（BSA）封闭30 min，离心收集沉淀，得到Ab2|Au NCs。
根据本发明优选的，上述水溶性Au NCs是以氯金酸为金源，巯基丙酸为稳定剂，乙酸锌为聚集诱导体制得。
根据本发明优选的，水溶性Au NCs的合成步骤为：
（1）取35.5 μL 100 mg/mL 的HAuCl4∙3H2O，加入2.5 mL去离子水；
（2）向步骤（1）中加入50 μL 巯基丙酸，搅拌15 min；
（3）向步骤（2）中加入430 μL 1 M 氢氧化钠，调节pH至8.5；
（4）向步骤（3）中加入0.5 mL 0.1 M 乙酸锌，室温搅拌反应6 h，反应完成后，采用异丙醇洗涤纯化后，得到水溶性Au NCs。
根据本发明优选的，用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器的构建步骤b中，所述Pp53|CIS@ZnS NCs的合成步骤如下：
1）活化水溶性CIS@ZnS NCs表面的羧酸基团；
2）使Pp53与活化后水溶性CIS@ZnS NCs表面的羧酸基团反应，获得水溶性CIS@ZnSNCs标记的目标DNA对应的探针DNA。
根据本发明优选的，所述Pp53|CIS@ZnS NCs具体制备步骤如下：
将纯化后的CIS@ZnS NCs溶解于1 mL含有 10 mg/mL EDC和10 mg/mL NHS的0.1 MpH 6.0 PBS中，活化30 min，离心纯化，再分散于1 mL pH 7.4 0.1 M PBS中，得到活化的CIS@ZnS NCs；加入8-15 μL浓度为8-15 μM Pp53水溶液，37 ℃下恒温孵育3-5 h，使探针DNA一端的氨基和CIS@ZnS NCs表面的羧基通过酰胺化反应连接，加入20 μL BSA封闭30 min，离心收集沉淀，得到Pp53|CIS@ZnS NCs。
根据本发明优选的，上述水溶性CIS@ZnS NCs是以CuCl2·2H2O为铜源，InCl3·4H2O为铟源，柠檬酸钠和卡托普利为稳定剂，制得的水溶性CuInS2@ZnS NCs。
根据本发明优选的，水溶性CIS@ZnS NCs的合成步骤为：
（1）搅拌条件下，将0.0022g 卡托普利、0.01 g NaOH、0.0471 g 柠檬酸钠、0.0017g CuCl2·2H2O、0.0117 g InCl3·4H2O、0.0048 g Na2S 依次溶解于 20 mL 去离子水，加热至95 °C，保持45 min；
（2）向步骤（1）中加入0.177 g Zn(CH3COO)2 和0.061g 硫脲；
（3）向步骤（2）中加入异丙醇洗涤纯化后，得到水溶性CIS@ZnS NCs。
本发明优选的一个实施方案：用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器的具体构建方法如下：
a. 将清洁的Au电极在10 mM 巯基丙酸中浸泡过夜，通过Au-S键将MPA键合到电极表面；
b. 向a所得的修饰电极表面滴加10 μL 10 mg/mL EDC和10 mg/mL NHS，活化30min，清洗电极，除去未反应的EDC以及NHS；
c. 将10 μL 10 μg/mL的CEA-Ab1水溶液和10 μL 10 μM Cp53水溶液混合后滴加到步骤b所得的活化电极表面，孵育3 h，加入BSA封闭电极上未反应的活性位点，清洗电极，得到双标记Au电极；
d. 将纯化后的Au NCs溶解于1 mL含有 10 mg/mL EDC和10 mg/mL NHS的0.1 MpH 6.0 PBS中，活化30 min，离心纯化，再分散于1 mL pH 7.4 0.1 M PBS中，得到活化的AuNCs；加入10 μL浓度为10 μg/mL的CEA-Ab2水溶液，37 ℃下恒温孵育3-5 h，加入20 μL BSA封闭30 min，离心收集沉淀，得到Ab2|Au NCs；
e．纯化后的CIS@ZnS NCs溶解于1 mL含有 10 mg/mL EDC 和10 mg/mL NHS的0.1M pH 6.0 PBS中，活化30 min，离心纯化，再分散于1 mL pH 7.4 0.1 M PBS中，得到活化的CIS@ZnS NCs；加入10 μL 10 μM探针DNA水溶液，37 ℃下恒温孵育3-5 h，加入20 μL BSA封闭30 min，离心收集沉淀，得到Pp53|CIS@ZnS NCs；
f. 将CEA-Ag和Tp53滴加到双标记Au电极表面，室温孵育90 min，清洗电极，再将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs混合后滴加到电极表面孵育1 h；以形成免疫复合物的形式将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs枝接并固定到工作电极表面，制得免疫核酸同步检测的ECL传感器。
根据本发明优选的，上述加入BSA进行封闭时，牛血清蛋白的体积分数为1%。
根据本发明优选的，上述清洗电极所用冲洗液为10 mM pH =7.4 PBS。
根据本发明优选的，上述CEA-Ag和Tp53以水溶液形式滴加到双标记Au电极表面，CEA浓度为0.3 pg/mL ~ 50 ng/mL，Tp53浓度为1 pM ~ 50 nM。
本发明的基于光谱分辨原理同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析方法，用于同时检测人类癌胚抗原和野生型P53。
根据本发明优选的，上述Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs以水溶液形式滴加到电极表面孵育，Ab2|Au NCs的浓度为10-20 mg/mL；Pp53|CIS@ZnS NCs的浓度为10-20 μM，Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs应足量；形成抗原-抗体间的相互作用和碱基互补配对。
根据本发明优选的，同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析方法的方法中，具体的：
I：配制不同标准浓度的CEA-Ag水溶液和不同标准浓度的Tp53水溶液，利用不同标准浓度的CEA-Ag水溶液和不同标准浓度的Tp53水溶液，按免疫核酸同步检测的ECL传感器的构建方法构建同步检测的ECL传感器，以所得传感器电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含5-20 mM水合肼的Hepes缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动产生电化学发光；
II：以曝光成像方式收集ECL全过程的所有光子，基于色散ECL辐射全部光子的方式获取总光谱；依据光谱曲线上最大辐射波长485 nm处的最大辐射强度与标准抗原浓度之间的关系，绘制CEA检测工作曲线；依据光谱曲线上最大辐射波长775 nm处的最大辐射强度与Tp53浓度之间的关系，绘制Tp53检测工作曲线；
III：利用待测目标DNA和待测CEA-Ag按免疫核酸同步检测的ECL传感器的构建方法构建同步实施免疫分析与核酸检测的ECL传感器；以所得传感器电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含5-20 mM水合肼的Hepes缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动产生电化学发光；根据所得ECL光谱曲线上最大辐射波长处的光强信号和工作曲线，同步检测待测样品溶液中的抗原和目标DNA的浓度。
本发明分别采用巯基丙酸包被的金纳米簇和柠檬酸钠、卡托普利包被的铜铟硫量子点为ECL标记物；金纳米簇和铜铟硫量子点表面的羧基可在被EDC和NHS活化后枝接第二抗体和探针DNA表面的氨基，实现第二抗体和探针DNA的标记。
本发明采用在共价键合方式将巯基丙酸枝接到工作电极金电极表面，并通过采用EDC和NHS进一步活化金电极表面巯基丙酸的羧基的方式完成枝接第一抗体。
本发明的有益效果：
1、本发明的多组分分析方法首次基于电化学发光法同时实现免疫分析和核酸检测，突破了已报道的多组分ECL传感器仅能够实现多种蛋白或多种核酸检测的局限性，避免了耗时的DNA扩增过程。
2、本发明的同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析方法，该方法采用ECL最大辐射波长位于485 nm的金簇 (Au NCs) 和ECL最大辐射波长位于775 nm的铜铟硫量子点 (CIS@ZnS NCs) 为标记物，采用含水合肼的Hepes作为缓冲溶液，实现了辐射波段全分离的光谱分辨型双色双组分ECL传感器的构建，丰富了双色双组分ECL传感器的标记物种类。
3、本发明的ECL多组分分析传感器基于抗原与抗体特异性相互作用、碱基互补配对原则构建，制备和操作简单；采用收集ECL辐射全部光子并色散成谱的原理开展免疫分析和核酸检测，在最大辐射波长485 nm和775 nm处的ECL信号强度均跨3个数量级以上，所检测抗原和目标DNA浓度跨4个数量级，能够灵敏检测癌胚抗原CEA和目标DNA野生型P53，CEA检测线性范围1 pg/mL ~ 50 ng/mL，检测限为0.3 pg/mL，P53检测线性范围1 pM ~ 50 nM，检测限为0.5 pM。
附图说明
图1为实施例1制得的Au NCs的紫外吸收和荧光发射光谱图；横坐标为波长，纵坐标为吸光度/荧光强度。
图2为实施例1制得的Au NCs的荧光寿命图；横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。
图3为实施例1制得的Au NCs的透射电镜图。
图4为实施例1制得的Au NCs的元素分布图；横坐标为能量，纵坐标为光子数。
图5为实施例1制得的Au NCs的红外光谱图；横坐标为波数，纵坐标为透过率。
图6为实施例1制得的CIS@ZnS NCs的紫外吸收和荧光发射光谱图；横坐标为波长，纵坐标为吸光度/荧光强度。
图7为实施例1制得的CIS@ZnS NCs的荧光寿命图；横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。
图8为实施例1制得的CIS@ZnS NCs的透射电镜图。
图9为实施例1制得的CIS@ZnS NCs的元素分布图；横坐标为能量，纵坐标为光子数。
图10为实施例1制得的CIS@ZnS NCs的红外光谱图；横坐标为波数，纵坐标为透过率。
图11为实施例1中癌胚抗原CEA浓度为0.3 pg/mL和野生型P53浓度为0.5 pM时，
的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图12为实施例2中癌胚抗原CEA浓度为1 pg/mL和野生型P53浓度为1 pM时，
的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图13为实施例3中癌胚抗原CEA浓度为5 pg/mL和野生型P53浓度为5 pM时，
的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图14为实施例4中癌胚抗原CEA浓度为50 pg/mL和野生型P53浓度为50 pM时，
的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图15为实施例5中癌胚抗原CEA浓度为500 pg/mL和野生型P53浓度为500 pM时，
的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图16为实施例6中癌胚抗原CEA浓度为3000 pg/mL和野生型P53浓度为3000 pM时，
的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图17为实施例7中癌胚抗原CEA浓度为10000 pg/mL和野生型P53浓度为10000 pM时，
的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图18为实施例8中癌胚抗原CEA浓度为50000 pg/mL和野生型P53浓度为50000 pM时，
的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图19为实验例1中所制的Au NCs在含10 mM水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes中的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度。
图20为实验例1中所制的CIS@ZnS NCs在含10 mM水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes中的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度。
图21为实验例1中所制的Au NCs和CIS@ZnS NCs在含10 mM水合肼的10 mM pH 7.4Hepes中的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度。
图22为实验例1中所制的Ab2|Au NCs在含10 mM水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes中的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度。
图23为实验例1中所制的Pp53|CIS@ZnS NCs在含10 mM水合肼的10 mM pH 7.4Hepes中的循环伏安驱动的电化学发光光谱图；电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度。
图24为实验例2中癌胚抗原CEA浓度为0.3 pg/mL时，以Au NCs为标记物的电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图25为实验例2中癌胚抗原CEA浓度为1 pg/mL时，以Au NCs为标记物的电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图26为实验例2中癌胚抗原CEA浓度为5 pg/mL时，以Au NCs为标记物的电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图27为实验例2中癌胚抗原CEA浓度为50 pg/mL时，以Au NCs为标记物的电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图28为实验例2中癌胚抗原CEA浓度为500 pg/mL时，以Au NCs为标记物的电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图29为实验例2中癌胚抗原CEA浓度为3000 pg/mL时，以Au NCs为标记物的电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图30为实验例2中癌胚抗原CEA浓度为10000 pg/mL时，以Au NCs为标记物的电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图31为实验例2中癌胚抗原CEA浓度为50000 pg/mL时，以Au NCs为标记物的电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图32为实验例2中不同浓度癌胚抗原CEA，以Au NCs为标记物的免疫传感器的工作曲线；横坐标为待测物抗原浓度，纵坐标为电化学发光强度。
图33为实验例2中所制的癌胚抗原CEA浓度为0时，以Au NCs为标记物的可电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图34为实验例3中野生型P53浓度为0.3 pM时，以CIS@ZnS NCs为标记物的用于核酸检测的电化学发光传感器的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图35为实验例3中野生型P53浓度为1 pM时，以CIS@ZnS NCs为标记物的用于核酸检测的电化学发光传感器的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图36为实验例3中野生型P53浓度为5 pM时，以CIS@ZnS NCs为标记物的用于核酸检测的电化学发光传感器的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图37为实验例3中野生型P53浓度为50 pM时，以CIS@ZnS NCs为标记物的用于核酸检测的电化学发光传感器的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图38为实验例3中野生型P53浓度为500 pM时，以CIS@ZnS NCs为标记物的用于核酸检测的电化学发光传感器的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图39为实验例3中野生型P53浓度为3000 pM时，以CIS@ZnS NCs为标记物的用于核酸检测的电化学发光传感器的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图40为实验例3中野生型P53浓度为10000 pM时，以CIS@ZnS NCs为标记物的用于核酸检测的电化学发光传感器的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图41为实验例3中野生型P53浓度为50000 pM时，以CIS@ZnS NCs为标记物的用于核酸检测的电化学发光传感器的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图42为实验例3中不同浓度野生型P53，以CIS@ZnS NCs为标记物的用于核酸检测的电化学发光传感器的工作曲线；横坐标为目标DNA浓度，纵坐标为电化学发光强度。
图43为实验例3中所制的野生型P53浓度为0时，以CIS@ZnS NCs为标记物的用于核酸检测的电化学发光传感器的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
图44为实验例1中
的ECL响应特异性图；横坐标为待测物种类，纵坐标为电化学发光强度。
图45为对比例1中所制的癌胚抗原CEA浓度为0、野生型P53浓度为0时，
的电化学发光光谱图；横坐标为波长，纵坐标为电化学发光强度。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明，但不限于此。
实施例中电化学发光光谱采集采用ZL201620300698.3一种可准确采集电致化学发光光谱信息的检测系统进行。电化学发光光谱的采集方式参照ZL201610237580.5 中所构建的电化学发光免疫分析的光谱采集方法，所采用的电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正。
实施例中所用原料如无特殊说明，均为市购产品。
实施例中目标DNA (Tp53, CGT GGA GCT ACA GTG GTA AAG CAG GTG AAG AAA TGCAGT)
捕获DNA (Cp53, 5’-NH2-(CH2)6-GTA ACT GCA TTT CTT CAC CTG)
探针DNA (Pp53, CAC TGT AGC TCC ACG ACC-(CH2)6-NH2-3’)
单碱基错配的目标DNA1(M1, CGT GGA GTT ACA GTG GTA AAG CAG GTG AAG AAATGC AGT)
双碱基错配的目标DNA2 (M2, CGT GGA GTT ACA GTG GTA AAG CAG GTG TAG AAATGC AGT)
三碱基错配的目标DNA3 (M3, CGT GGA GTT ACA GCG GTA AAG CAG GTG TAG AAATGC AGT)
实施例1
水溶性金纳米簇Au NCs的制备：
（1）取35.5 μL 100 mg/mL HAuCl4∙3H2O，加入2.5 mL去离子水；
（2）向步骤（1）中加入50 μL 巯基丙酸，搅拌15 min；
（3）向步骤（2）中加入430 μL 1 M 氢氧化钠，调节pH至8.5；
（4）向步骤（3）中加入0.5 mL 0.1 M 乙酸锌，室温搅拌反应6 h，反应完成后，采用异丙醇洗涤纯化后，将产物溶于去离子水，得到水溶性金纳米簇Au NCs的单分散溶液。
产品表征：
本实施例得到的Au NCs的紫外吸收图如图1所示，紫外吸收特征峰在355 nm和450nm；
Au NCs的荧光发射光谱图如图1所示，荧光发射特征峰在485 nm，半峰宽为25 nm。
Au NCs的荧光寿命如图2所示，Au NCs的荧光寿命为31 ns。
Au NCs的透射电镜图如图3所示，Au NCs为球形，平均尺寸4.4 nm。
Au NCs的元素分布图如图4所示，Au NCs由Au、S、Zn等元素组成。
Au NCs的红外光谱图如图5所示，Au NCs表面富有羧酸基团。
水溶性铜铟硫量子点CIS@ZnS NCs的制备：
（1）在不断搅拌下，将0.0022g卡托普利、0.01 g NaOH、0.0471 g 柠檬酸钠、0.0017 g CuCl2·2H2O、0.0117 g InCl3·4H2O、0.0048 g Na2S 依次溶解于 20 mL 去离子水，加热至95 °C，保持45 min；
（2）向步骤（1）中加入0.177 g Zn(CH3COO)2 和0.061g 硫脲；
（3）向步骤（2）中加入异丙醇洗涤纯化后，得到CIS@ZnS NCs。
产品表征：
本实施例得到的CIS@ZnS NCs的紫外吸收图如图6所示，CIS@ZnS NCs无明显的紫外吸收峰；
CIS@ZnS NCs的荧光发射光谱图如图6所示，荧光发射特征峰在660 nm，半峰宽为120 nm。
CIS@ZnS NCs的荧光寿命如图7所示，CIS@ZnS NCs的荧光寿命为330 ns。
CIS@ZnS NCs的透射电镜图如图8所示，CIS@ZnS NCs为球形，平均尺寸4.5 nm。
CIS@ZnS NCs的元素分布图如图9所示，CIS@ZnS NCs由Cu、In、S、Zn等元素组成。
CIS@ZnS NCs的红外光谱图如图10所示，CIS@ZnS NCs表面富有羧酸基团。
双标记Au电极的制备：
（1）将清洁的Au电极在10 mM 巯基丙酸中浸泡过夜，通过Au-S键将MPA键合到电极表面；
（2）向步骤（1）所得的修饰电极表面滴加10 μL 10 mg/mL EDC和10 mg/mL NHS，活化30 min，清洗电极，除去未反应的EDC以及NHS；
（3）将10 μL 10 μg/mL的CEA-Ab1水溶液和10 μL 10 μM Cp53水溶液，孵育2-4 h，加入BSA封闭电极上未反应的活性位点，清洗电极，得到双标记Au电极：
。
将纯化后的Au NCs溶解于1 mL含有 10 mg/mL EDC和10 mg/mL NHS的0.1 M pH6.0 PBS中，活化30 min，离心纯化，再分散于1 mL pH 7.4 0.1 M PBS中，得到活化的AuNCs；加入10 μL浓度为10 μg/mL CEA-Ab2水溶液，37 ℃下恒温孵育3-5 h，加入20 μL BSA封闭30 min，离心收集沉淀，得到Ab2|Au NCs。
将纯化后的CIS@ZnS NCs溶解于1 mL含有 10 mg/mL EDC和10 mg/mL NHS的0.1 MpH 6.0 PBS中，活化30 min，离心纯化，再分散于1 mL pH 7.4 0.1 M PBS中，得到活化的CIS@ZnS NCs；加入10μL浓度为10 μM Pp53水溶液，37 ℃下恒温孵育3-5 h，使探针DNA一端的氨基和CIS@ZnS NCs表面的羧基通过酰胺化反应连接，加入20 μL BSA封闭30 min，离心收集沉淀，得到Pp53|CIS@ZnS NCs。
同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器的构建：
a. 将清洁的Au电极在10 mM 巯基丙酸中浸泡过夜，通过Au-S键将MPA键合到电极表面；
b. 向a所得的修饰电极表面滴加10 μL 10 mg/mL EDC和10 mg/mL NHS，活化30min，清洗电极，除去未反应的EDC以及NHS；
c. 将10 μL 10 μg/mL的CEA-Ab1水溶液和10 μL 10 μM Cp53水溶液混合后滴加到步骤b所得的活化电极表面，孵育3 h，加入BSA封闭电极上未反应的活性位点，清洗电极，得到双标记Au电极；
d. 将纯化后的Au NCs溶解于1 mL含有 10 mg/mL EDC和10 mg/mL NHS的0.1 MpH 6.0 PBS中，活化30 min，离心纯化，再分散于1 mL pH 7.4 0.1 M PBS中，得到活化的AuNCs；加入10μL浓度为10 μg/mL的CEA-Ab2水溶液，37 ℃下恒温孵育3-5 h，加入20 μL BSA封闭30 min，离心收集沉淀，得到Ab2|Au NCs；
e．纯化后的CIS@ZnS NCs溶解于1 mL含有 10 mg/mL EDC和10 mg/mL NHS的0.1 MpH 6.0 PBS中，活化30 min，离心纯化，再分散于1 mL pH 7.4 0.1 M PBS中，得到活化的CIS@ZnS NCs；加入10 μL 10 μM探针DNA水溶液，37 ℃下恒温孵育3-5 h，加入20 μL BSA封闭30 min，离心收集沉淀，得到Pp53|CIS@ZnS NCs；
f. 将CEA-Ag和Tp53滴加到双标记Au电极表面，室温孵育90 min，清洗电极，再将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs滴加到电极表面孵育1 h；以形成免疫复合物的形式将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs枝接并固定到工作电极表面，制得能够同步实施免疫分析与核酸检测的ECL多组分分析传感器。
同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析方法：
I：将10 μL 0.3 pg/mL的CEA-Ag和10 μL 0.5 pM Tp53混合后滴加到双标记Au电极表面，室温孵育90 min，清洗电极，再将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs滴加到电极表面孵育1 h；将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs枝接并固定到工作电极表面，制得免疫核酸同步检测的ECL传感器，以所得传感器电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含10 mM水合肼的Hepes缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动产生电化学发光；该电化学发光传感器在含水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于485 nm和775 nm的双发射电化学发光信号（电化学发光光谱见图11）；
II：以曝光成像方式收集ECL全过程的所有光子，基于色散ECL辐射全部光子的方式获取总光谱；依据光谱曲线上最大辐射波长485 nm处的最大辐射强度与标准抗原溶液浓度之间的关系，绘制CEA检测工作曲线；依据光谱曲线上最大辐射波长775 nm处的最大辐射强度与标准目标DNA Tp53浓度之间的关系，绘制Tp53检测工作曲线；
III：将待测目标DNA和待测CEA-Ag按免疫核酸同步检测的ECL传感器的构建方法构建ECL多组分分析传感器；以所得传感器电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含10 mM水合肼的Hepes缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动产生电化学发光；根据所得ECL光谱曲线上最大辐射波长处的光强信号和工作曲线，同步检测待测样品溶液中的抗原和目标DNA的浓度。
实施例2
同实施例1所述的同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析方法，不同之处在于：
步骤I中，将10 μL 1 pg/mL CEA-Ag和10 μL 1 pM Tp53滴加到双标记Au电极表面，室温孵育90 min，清洗电极，再将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs滴加到电极表面孵育1 h；将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs枝接并固定到工作电极表面，制得免疫核酸同步检测的ECL传感器，以所得传感器电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含10 mM水合肼的Hepes缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动产生电化学发光；该电化学发光传感器在含水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于485 nm和775nm的双发射电化学发光信号（电化学发光光谱见图12）。
实施例3
同实施例1所述的同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析方法，不同之处在于：
步骤I中，将10 μL 5 pg/mL CEA-Ag和10 μL 5 pM Tp53滴加到双标记Au电极表面，室温孵育90 min，清洗电极，再将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs滴加到电极表面孵育1 h；将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs枝接并固定到工作电极表面，制得免疫核酸同步检测的ECL传感器，以所得传感器电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含10 mM水合肼的Hepes缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动产生电化学发光；该电化学发光传感器在含水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于485 nm和775nm的双发射电化学发光信号（电化学发光光谱见图13）。
实施例4
同实施例1所述的同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析方法，不同之处在于：
步骤I中，将10 μL 50 pg/mL CEA-Ag和10 μL 50 pM Tp53滴加到双标记Au电极表面，室温孵育90 min，清洗电极，再将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs滴加到电极表面孵育1h；将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs枝接并固定到工作电极表面，制得免疫核酸同步检测的ECL传感器，以所得传感器电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含10 mM水合肼的Hepes缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动产生电化学发光；该电化学发光传感器在含水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于485 nm和775 nm的双发射电化学发光信号（电化学发光光谱见图14）。
实施例5
同实施例1所述的同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析方法，不同之处在于：
步骤I中，将10 μL 500 pg/mL CEA-Ag和10 μL 500 pM Tp53滴加到双标记Au电极表面，室温孵育90 min，清洗电极，再将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs滴加到电极表面孵育1 h；将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs枝接并固定到工作电极表面，制得免疫核酸同步检测的ECL传感器，以所得传感器电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含10 mM水合肼的Hepes缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动产生电化学发光；该电化学发光传感器在含水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于485 nm和775 nm的双发射电化学发光信号（电化学发光光谱见图15）。
实施例6
同实施例1所述的同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析方法，不同之处在于：
步骤I中，将10 μL 3000 pg/mL CEA-Ag和10 μL 3000 pM的Tp53滴加到双标记Au电极表面，室温孵育90 min，清洗电极，再将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs滴加到电极表面孵育1 h；将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs枝接并固定到工作电极表面，制得免疫核酸同步检测的ECL传感器，以所得传感器电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含10 mM水合肼的Hepes缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动产生电化学发光；该电化学发光传感器在含水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于485nm和775 nm的双发射电化学发光信号（电化学发光光谱见图16）。
实施例7
同实施例1所述的同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析方法，不同之处在于：
步骤I中，将10 μL 10000 pg/mL CEA-Ag和10 μL 10000pM Tp53滴加到双标记Au电极表面，室温孵育90 min，清洗电极，再将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs滴加到电极表面孵育1 h；将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs枝接并固定到工作电极表面，制得免疫核酸同步检测的ECL传感器，以所得传感器电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含10 mM水合肼的Hepes缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动产生电化学发光；该电化学发光传感器在含水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于485nm和775 nm的双发射电化学发光信号（电化学发光光谱见图17）。
实施例8
同实施例1所述的同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析方法，不同之处在于：
步骤I中，将10 μL 50000 pg/mL CEA-Ag和10 μL 50000 pM Tp53滴加到双标记Au电极表面，室温孵育90 min，清洗电极，再将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs滴加到电极表面孵育1 h；将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs枝接并固定到工作电极表面，制得免疫核酸同步检测的ECL传感器，以所得传感器电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含10 mM水合肼的Hepes缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动产生电化学发光；该电化学发光传感器在含水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于485nm和775 nm的双发射电化学发光信号（电化学发光光谱见图18）。
实验例1电化学发光体系验证：
1、将实施例1制备的Au NCs稀释为0.15 mg/mL的单分散溶液。
以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，10 mM pH 7.4的Hepes作为缓冲溶液，10 mM水合肼作为共反应剂，0.15 mg/mL Au NCs单分散溶液作为发光试剂。
采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正， Au NCs在含水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于485 nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36 nm（电化学发光光谱见图19）。
2、将实施例1中制备的CIS@ZnS NCs稀释为1.0 mg/mL的单分散溶液。
以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，10 mM pH 7.4的Hepes作为缓冲溶液，10 mM水合肼作为共反应剂，1.0 mg/mL CIS@ZnS NCs单分散溶液作为发光试剂。
采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，CIS@ZnS NCs在含水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于775 nm的的电化学发光信号（电化学发光光谱见图20）。
3、以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，10 mM pH7.4的Hepes作为缓冲溶液，10 mM水合肼作为共反应剂，0.15 mg/mL 实施例1制得的Au NCs和1.0 mg/mL 实施例1制得的CIS@ZnS NCs混合后的混合液作为发光试剂。
采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正， Au NCs和CIS@ZnS NCs在含水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于485 nm和775 nm的双波段电化学发光信号（电化学发光光谱见图21）。
4、以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，10 mM pH7.4 Hepes作为缓冲溶液，10 mM水合肼作为共反应剂，0.15 mg/mL 实施例1步骤d得到的Ab2|Au NCs水溶液作为发光试剂。
采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正， Ab2|Au NCs在含水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于485 nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36 nm（电化学发光光谱见图22）。虽然电化学发光强度低于Au NCs，归因于蛋白抗体的位阻效应，证明了二抗已被成功枝接到Au NCs上。
5、以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，10 mM pH7.4 Hepes作为缓冲溶液，10 mM水合肼作为共反应剂，1.0 mg/mL实施例1步骤e得到的 Pp53|CIS@ZnS NCs水溶液作为发光试剂。
采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正， Pp53|CIS@ZnS NCs在含水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于775 nm的的电化学发光信号，电化学发光强度低于CIS@ZnS NCs（电化学发光光谱见图23）。
实验例2
1、以Au NCs为标记物的电化学发光免疫传感器的构建：
a. 将清洁的Au电极在10 mM 巯基丙酸中浸泡过夜，加入200 μL MPA反应10 h，通过 Au-S 键将MPA键合到电极表面；
b. 向a所得的修饰电极表面滴加10 μL 10 mg/mL EDC和10 mg/mL NHS，活化 30min，用10 mM pH 7.4 PBS清洗电极，除去未反应的EDC以及NHS；
c. 将20 μL 10 mg/mL CEA-Ab1滴加到b所得的活化电极表面，孵育3 h，加入BSA封闭电极上未反应的活性位点，用10 mM pH 7.4 PBS清洗电极；
d. 纯化后的Au NCs溶解于含有EDC和NHS的磷酸盐缓冲溶液中活化，然后加入CEA-Ab2，37 ℃下恒温孵育 3-5 h，加入BSA封闭30 min，得到Ab2|Au NCs；
e. 将10 μL CEA-Ag水溶液滴加到c处理后的电极表面，室温孵育90 min，用10 mMpH 7.4 PBS清洗电极，再将10 μL Ab2|Au NCs滴加到电极表面孵育1 h；基于形成免疫复合物的形式将Ab2|Au NCs枝接并固定到工作电极表面，得到高度单色电化学发光免疫传感器。
2、（1）按照实施例1所述的步骤制备电化学免疫传感器，将10 μL Ag标记癌胚抗原（CEA-Ag）滴加到c处理后的电极表面，CEA抗原浓度分别为：0.3 pg/mL，1 pg/mL，5 pg/mL，50 pg/mL，500 pg/mL，3000 pg/mL，10000 pg/mL，50000 pg/mL，得到不同浓度癌胚抗原的高度单色电化学发光免疫传感器。
（2）分别以电化学发光免疫传感器作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，10 mM pH 7.4 Hepes作为缓冲溶液，10 mM水合肼作为共反应剂。采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到的不同浓度抗原的电化学发光光谱如图24-31所示；
（3）以曝光成像方式收集电化学发光全过程的所有光子，并基于色散电化学发光辐射全部光子的方式获取总光谱；依据光谱曲线上最大辐射波长处光强与抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；电化学发光免疫传感器对抗原的工作曲线如图24所示，随着抗原浓度的增大，电化学发光信号逐渐增强。
癌胚抗原CEA浓度为0.3 pg/mL时，以Au NCs为标记物的电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图如图24所示，该电化学发光免疫传感器在含水合肼的10 mM pH 7.4Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于485 nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36 nm；对比实施例1的免疫核酸同步检测的ECL传感器电化学发光光谱图，位于485 nm的电化学发光信号基本相同，该条件下免疫分析过程与核酸检测过程互不影响。
癌胚抗原CEA浓度为1 pg/mL时，以Au NCs为标记物的电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图如图25所示，该电化学发光免疫传感器在含水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于485 nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36 nm。对比实施例2的免疫核酸同步检测的ECL传感器电化学发光光谱图，位于485 nm的电化学发光信号基本相同，该条件下免疫分析过程与核酸检测过程互不影响。
癌胚抗原CEA浓度为5 pg/mL时，以Au NCs为标记物的电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图如图26所示，该电化学发光免疫传感器在含水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于485 nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36 nm。对比实施例3的免疫核酸同步检测的ECL传感器电化学发光光谱图，位于485 nm的电化学发光信号基本相同，该条件下免疫分析过程与核酸检测过程互不影响。
癌胚抗原CEA浓度为50 pg/mL时，以Au NCs为标记物的电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图如图27所示，该电化学发光免疫传感器在含水合肼的10 mM pH 7.4Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于485 nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36 nm。对比实施例4的免疫核酸同步检测的ECL传感器电化学发光光谱图，位于485 nm的电化学发光信号基本相同，该条件下免疫分析过程与核酸检测过程互不影响。
癌胚抗原CEA浓度为500 pg/mL时，以Au NCs为标记物的电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图如图28所示，该电化学发光免疫传感器在含水合肼的10 mM pH 7.4Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于485 nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36 nm。对比实施例5的免疫核酸同步检测的ECL传感器电化学发光光谱图，位于485 nm的电化学发光信号基本相同，该条件下免疫分析过程与核酸检测过程互不影响。
癌胚抗原CEA浓度为3000 pg/mL时，以Au NCs为标记物的电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图如图29所示，该电化学发光免疫传感器在含水合肼的10 mM pH 7.4Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于485 nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36 nm。对比实施例6的免疫核酸同步检测的ECL传感器电化学发光光谱图，位于485 nm的电化学发光信号基本相同，该条件下免疫分析过程与核酸检测过程互不影响。
癌胚抗原CEA浓度为10000 pg/mL时，以Au NCs为标记物的电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图如图30所示，该电化学发光免疫传感器在含水合肼的10 mM pH 7.4Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于485 nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36 nm。对比实施例7的免疫核酸同步检测的ECL传感器电化学发光光谱图，位于485 nm的电化学发光信号基本相同，该条件下免疫分析过程与核酸检测过程互不影响。
癌胚抗原CEA浓度为50000 pg/mL时，以Au NCs为标记物的电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图如图31所示，该电化学发光免疫传感器在含水合肼的10 mM pH 7.4Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于485 nm的高度单色的电化学发光信号，半峰宽为36 nm。对比实施例8的免疫核酸同步检测的ECL传感器电化学发光光谱图，位于485 nm的电化学发光信号基本相同，该条件下免疫分析过程与核酸检测过程互不影响。
电化学发光免疫传感器的工作曲线如图32所示，随着抗原浓度的增大，电化学发光信号逐渐增强，证明了该免疫传感器的性能优越。而本发明的免疫核酸同步检测的ECL传感器工作曲线不同浓度的光强与单独检测相当。从ECL曲线和光谱来看，标记后各自表现出相同程度的下降，证明基本不影响。
3、将滴加在Au-MPA-Ab1表面的Ag(CEA)去除，制备得到电化学发光免疫传感器Au-MPA-Ab1<Ag>Ab2-AuNCs。
以Au-|MPA-Ab1<Ag作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，10 mMpH 7.4的Hepes作为缓冲溶液，10 mM水合肼作为共反应剂。采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到的不同抗原浓度下的电化学发光光谱。
癌胚抗原CEA浓度为0时，以Au NCs为标记物的电化学发光免疫传感器的电化学发光光谱图如图33所示，该电化学发光免疫传感器在含水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes缓冲液中不产生任何电化学发光信号。
实验例3
1、以CIS@ZnS NCs为标记物的可用于核酸检测的电化学发光传感器的构建：
f. 将清洁的Au电极在10 mM 巯基丙酸中浸泡过夜，通过Au-S键将MPA键合到电极表面，
g. 向f所得的修饰电极表面滴加10 μL 10 mg/mL EDC和10 mg/mL NHS，活化30min，清洗电极，除去未反应的EDC以及NHS；
h. 将10 μL 10 μM 捕获Cp53滴加到g所得的活化电极表面，孵育3 h，加入BSA封闭电极上未反应的活性位点，清洗电极；
i. 纯化后的CIS@ZnS NCs溶解于含有EDC和NHS的磷酸盐缓冲溶液中活化，然后加入Tp53，37 ℃下恒温孵育3-5 h，加入BSA封闭30 min，得到Pp53|CIS@ZnS NCs；
j. 将10 μL不同浓度的Tp53滴加到h处理后的电极表面，室温孵育90 min，清洗电极，再将10 μL Pp53|CIS@ZnS NCs滴加到电极表面孵育1 h；基于形成免疫复合物的形式将Pp53|CIS@ZnS NCs枝接并固定到工作电极表面，实现最大辐射波长位于775 nm的用于核酸检测的电化学发光传感器的制备。
（1）按照实施例1所述的步骤制备可用于核酸检测的电化学发光传感器，将10 μLP53滴加到c处理后的电极表面，TP53浓度分别为：0.5 pM，1 pM，5 pM，50 pM，500 pM，3000pM，10000 pM，50000 pM，得到不同浓度目标DNA的可用于核酸检测的电化学发光传感器。
（2）分别以可用于核酸检测的电化学发光传感器作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，10 mM pH 7.4 Hepes作为缓冲溶液，10 mM水合肼作为共反应剂。采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到的不同浓度目标DNA的电化学发光光谱如图34-41所示；
（3）以曝光成像方式收集电化学发光全过程的所有光子，并基于色散电化学发光辐射全部光子的方式获取总光谱；依据光谱曲线上最大辐射波长处光强与目标DNA标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；电化学发光免疫传感器对目标DNA的工作曲线如图42所示，随着目标DNA浓度的增大，电化学发光信号逐渐增强。
目标DNA TP53浓度为0.5 pM时，以CIS@ZnS NCs为标记物的可用于核酸检测的电化学发光传感器的电化学发光光谱图如图34所示，该电化学发光传感器在含水合肼的10 mMpH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于775 nm的电化学发光信号。对比实施例1的免疫核酸同步检测的ECL传感器电化学发光光谱图， 位于775 nm的电化学发光信号基本相同，该条件下免疫分析过程与核酸检测过程互不影响。
目标DNA TP53浓度为1 pM时，以CIS@ZnS NCs为标记物的可用于核酸检测的电化学发光传感器的电化学发光光谱图如图35所示，该电化学发光传感器在含水合肼的10 mM pH7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于775 nm的电化学发光信号。对比实施例2的免疫核酸同步检测的ECL传感器电化学发光光谱图， 位于775 nm的电化学发光信号基本相同，该条件下免疫分析过程与核酸检测过程互不影响。
目标DNA TP53浓度为5 pM时，以CIS@ZnS NCs为标记物的可用于核酸检测的电化学发光传感器的电化学发光光谱图如图36所示，该电化学发光传感器在含水合肼的10 mM pH7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于775 nm的电化学发光信号。对比实施例3的免疫核酸同步检测的ECL传感器电化学发光光谱图， 位于775 nm的电化学发光信号基本相同，该条件下免疫分析过程与核酸检测过程互不影响。
目标DNA TP53浓度为50 pM时，以CIS@ZnS NCs为标记物的可用于核酸检测的电化学发光传感器的电化学发光光谱图如图37所示，该电化学发光传感器在含水合肼的10 mMpH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于775 nm的电化学发光信号。对比实施例4的免疫核酸同步检测的ECL传感器电化学发光光谱图， 位于775 nm的电化学发光信号基本相同，该条件下免疫分析过程与核酸检测过程互不影响。
目标DNA TP53浓度为500 pM时，以CIS@ZnS NCs为标记物的可用于核酸检测的电化学发光传感器的电化学发光光谱图如图38所示，该电化学发光传感器在含水合肼的10 mMpH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于775 nm的电化学发光信号。对比实施例5的免疫核酸同步检测的ECL传感器电化学发光光谱图， 位于775 nm的电化学发光信号基本相同，该条件下免疫分析过程与核酸检测过程互不影响。
目标DNA TP53浓度为3000 pM时，以CIS@ZnS NCs为标记物的可用于核酸检测的电化学发光传感器的电化学发光光谱图如图39所示，该电化学发光传感器在含水合肼的10mM pH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于775 nm的电化学发光信号。对比实施例6的免疫核酸同步检测的ECL传感器电化学发光光谱图， 位于775 nm的电化学发光信号基本相同，该条件下免疫分析过程与核酸检测过程互不影响。
目标DNA TP53浓度为10000 pM时，以CIS@ZnS NCs为标记物的可用于核酸检测的电化学发光传感器的电化学发光光谱图如图40所示，该电化学发光传感器在含水合肼的10mM pH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于775 nm的电化学发光信号。对比实施例7的免疫核酸同步检测的ECL传感器电化学发光光谱图， 位于775 nm的电化学发光信号基本相同，该条件下免疫分析过程与核酸检测过程互不影响。
目标DNA TP53浓度为50000 pM时，以CIS@ZnS NCs为标记物的可用于核酸检测的电化学发光传感器的电化学发光光谱图如图41所示，该电化学发光传感器在含水合肼的10mM pH 7.4 Hepes缓冲液中可产生最大发射波长位于775 nm的电化学发光信号。对比实施例8的免疫核酸同步检测的ECL传感器电化学发光光谱图， 位于775 nm的电化学发光信号基本相同，该条件下免疫分析过程与核酸检测过程互不影响。
电化学发光免疫传感器的工作曲线如图42所示，随着目标DNA浓度的增大，电化学发光信号逐渐增强。
2、将Au|MPA-Cp53<Tp53>Pp53|CIS@ZnS NCs中的TP53去除。
以Au|MPA-Cp53<Tp53>Pp53|CIS@ZnS NCs作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，10 mM pH 7.4的Hepes作为缓冲溶液，10 mM水合肼作为共反应剂。采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到的不同目标DNA浓度下的电化学发光光谱。而本发明的免疫核酸同步检测的ECL传感器工作曲线不同浓度的光强与单独检测相当。从ECL曲线和光谱来看，标记后各自表现出相同程度的下降，证明基本不影响。
目标DNA浓度为0时，以CIS@ZnS NCs为标记物的电化学发光传感器的电化学发光光谱图如图43所示，该电化学发光传感器在含水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes缓冲液中不产生任何电化学发光信号。
实验例4 特异性检测：
将实施例1步骤I中Ag(CEA)分别替换为空白、甲胎蛋白抗原、前列腺特异性抗原、糖类抗原125。
TP53分别替换为空白、单碱基错配、双碱基错配、三碱基错配的目标DNA。
构建的电化学发光传感器对抗原和目标DNA的特异性电化学发光响应图如图44所示，本实施例中制得的ECL多组分分析传感器为对癌胚抗原和选择性良好，其他抗原蛋白不对该发明的目标抗原传感检测产生干扰，电化学发光信号随着错配碱基数目增加而减弱，表明电化学发光传感器对癌胚抗原和目标DNA均具有良好的特异性。
对比例1
同实施例1所述的同步实施ECL免疫分析和核酸检测的方法，不同之处在于：
将步骤Ⅰ中Au-MPA-Ab1<Ag>Ab2-AuNCs中抗原和Au|MPA-Cp53<Tp53>Pp53|CIS@ZnS NCs中目标DNA TP53去除。
以
在作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，10 mM pH 7.4的Hepes作为缓冲溶液，10 mM水合肼作为共反应剂。采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0V，初扫向正，得到的不同目标DNA浓度下的电化学发光光谱。
癌胚抗原CEA和目标DNA浓度为0时，
的电化学发光光谱图如图45所示，该电化学发光传感器在含水合肼的10 mM pH 7.4 Hepes缓冲液中不产生任何电化学发光信号。
Claims (10)
1.一种基于光谱分辨原理同步实施ECL免疫分析和核酸检测的多组分分析方法，包括步骤如下：
1）构建用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器，所述ECL多组分分析传感器的最大辐射波长分别位于485和775 nm；包括金纳米簇标记的第二抗体（Ab2|AuNCs）与铜铟硫量子点标记的探针DNA片段（Pp53|CIS@ZnS NCs）、CEA-Ag与Tp53以及Au|MPA-Ab1与Au|MPA-Cp53，基于免疫与核酸反应的选择性构建成ECL多组分分析传感器：
；
2）以ECL多组分分析传感器为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在含5-20 mM水合肼的Hepes缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动产生电化学发光；
3）以曝光成像方式收集ECL全过程的所有光子，基于色散ECL辐射全部光子的方式获取总光谱；依据光谱曲线上最大辐射波长485 nm处的最大辐射强度与标准抗原溶液浓度之间的关系，绘制CEA检测工作曲线；依据光谱曲线上最大辐射波长775 nm处的最大辐射强度与Tp53浓度之间的关系，绘制Tp53检测工作曲线；
4）将待测样品按步骤1）构建免疫核酸同步检测的ECL传感器，按步骤2）和步骤3）中的方法进行ECL光谱测试，根据所得ECL光谱曲线上最大辐射波长处的光强信号和工作曲线，同步检测待测样品溶液中的抗原和目标DNA的浓度。
2.根据权利要求1所述的多组分分析方法，其特征在于，步骤2）、步骤4），执行循环伏安法扫描时，扫描电压范围为0 ~ 1.6 V，扫描圈数1 ~ 3圈，扫描速度为40 ~ 60 mV/s。
3.根据权利要求1所述的多组分分析方法，其特征在于，步骤1）中，用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器的构建方法如下：
a、以清洁活化后的Au电极为工作电极，将CEA-Ab1和Cp53同时标记在电极表面，得到双标记Au电极；
b、水溶性Au NCs标记CEA-Ab2，得到Ab2|Au NCs；水溶性CIS@ZnS NCs标记探针DNA，得到Pp53|CIS@ZnS NCs；
c、将CEA-Ag和Tp53滴加到双标记Au电极表面，室温孵育，再将步骤b得到的Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs滴加到电极表面孵育；以形成免疫复合物的形式将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs枝接并固定到工作电极表面，得到用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器。
4.根据权利要求3所述的多组分分析方法，其特征在于，步骤a中，双标记Au电极的制备步骤如下：
（1）将清洁的Au电极在5-20 mM 巯基丙酸中浸泡过夜，通过Au-S键将MPA键合到电极表面；
（2）向步骤（1）所得的修饰电极表面滴加10 μL 10 mg/mL 1-乙基-（3-二甲基氨基丙酸）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和10 mg/mL羟基琥珀酰亚胺（NHS），活化30 min，清洗电极，除去未反应的EDC以及NHS；
（3）将CEA-Ab1水溶液和Cp53水溶液混合后滴加到活化电极表面，孵育2-4 h，加入BSA封闭电极上未反应的活性位点，清洗电极，得到双标记Au电极；CEA-Ab1水溶液的浓度为8-15μg/mL，滴加量为8-15 μL，Cp53水溶液的浓度为8-15 μM，滴加量为8-15 μL。
5.根据权利要求3所述的多组分分析方法，其特征在于，用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器的构建步骤b中， 所述Ab2|Au NCs的合成步骤如下：
1）活化水溶性Au NCs表面的羧酸基团；
2）使第二抗体与经过步骤1）处理的水溶性Au NCs表面的羧酸基团反应，获得水溶性AuNCs标记的抗原对应的第二抗体；
优选的，所述Ab2|Au NCs具体制备步骤如下：
将纯化后的Au NCs溶解于1 mL含有 10 mg/mL EDC和10 mg/mL NHS的0.1 M pH 6.0磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，活化30 min，离心纯化，再分散于1 mL pH 7.4 0.1 M PBS中，得到活化的Au NCs；加入8-15 μL浓度为8-15 μg/mL CEA-Ab2水溶液，37 ℃下恒温孵育3-5 h，加入20 μL牛血清蛋白（BSA）封闭30 min，离心收集沉淀，得到Ab2|Au NCs。
6.根据权利要求5所述的多组分分析方法，其特征在于，水溶性Au NCs是以氯金酸为金源，巯基丙酸为稳定剂，乙酸锌为聚集诱导体制得；
优选的，水溶性Au NCs的合成步骤为：
（1）取35.5 μL 100 mg/mL 的HAuCl4∙3H2O，加入2.5 mL去离子水；
（2）向步骤（1）中加入50 μL 巯基丙酸，搅拌15 min；
（3）向步骤（2）中加入430 μL 1 M 氢氧化钠，调节pH至8.5；
（4）向步骤（3）中加入0.5 mL 0.1 M 乙酸锌，室温搅拌反应6 h，反应完成后，采用异丙醇洗涤纯化后，得到水溶性Au NCs。
7.根据权利要求3所述的多组分分析方法，其特征在于，用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器的构建步骤b中，所述Pp53|CIS@ZnS NCs的合成步骤如下：
1）活化水溶性CIS@ZnS NCs表面的羧酸基团；
2）使Pp53与活化后水溶性CIS@ZnS NCs表面的羧酸基团反应，获得水溶性CIS@ZnS NCs标记的目标DNA对应的探针DNA；
优选的，所述Pp53|CIS@ZnS NCs具体制备步骤如下：
将纯化后的CIS@ZnS NCs溶解于1 mL含有 10 mg/mL EDC和10 mg/mL NHS的0.1 M pH6.0 PBS中，活化30 min，离心纯化，再分散于1 mL pH 7.4 0.1 M PBS中，得到活化的CIS@ZnS NCs；加入8-15 μL浓度为8-15 μM Pp53水溶液，37 ℃下恒温孵育3-5 h，使探针DNA一端的氨基和CIS@ZnS NCs表面的羧基通过酰胺化反应连接，加入20 μL BSA封闭30 min，离心收集沉淀，得到Pp53|CIS@ZnS NCs。
8.根据权利要求7所述的多组分分析方法，其特征在于，水溶性CIS@ZnS NCs是以CuCl2·2H2O为铜源，InCl3·4H2O为铟源，柠檬酸钠和卡托普利为稳定剂，制得的水溶性CuInS2@ZnS NCs；
优选的，水溶性CIS@ZnS NCs的合成步骤为：
（1）搅拌条件下，将0.0022g 卡托普利、0.01 g NaOH、0.0471 g 柠檬酸钠、0.0017 gCuCl2·2H2O、0.0117 g InCl3·4H2O、0.0048 g Na2S 依次溶解于 20 mL 去离子水，加热至95 ℃，保持45 min；
（2）向步骤（1）中加入0.177 g Zn(CH3COO)2 和0.061g 硫脲；
（3）向步骤（2）中加入异丙醇洗涤纯化后，得到水溶性CIS@ZnS NCs。
9.根据权利要求1所述的多组分分析方法，其特征在于，用于同步实施免疫分析和核酸检测的ECL多组分分析传感器的具体构建方法如下：
a. 将清洁的Au电极在10 mM 巯基丙酸中浸泡过夜，通过Au-S键将MPA键合到电极表面；
b. 向a所得的修饰电极表面滴加10 μL 10 mg/mL EDC和10 mg/mL NHS，活化30 min，清洗电极，除去未反应的EDC以及NHS；
c. 将10 μL 10 μg/mL的CEA-Ab1水溶液和10 μL 10 μM Cp53水溶液混合后滴加到步骤b所得的活化电极表面，孵育3 h，加入BSA封闭电极上未反应的活性位点，清洗电极，得到双标记Au电极；
d. 将纯化后的Au NCs溶解于1 mL含有 10 mg/mL EDC和10 mg/mL NHS的0.1 M pH6.0 PBS中，活化30 min，离心纯化，再分散于1 mL pH 7.4 0.1 M PBS中，得到活化的AuNCs；加入10 μL浓度为10 μg/mL的CEA-Ab2水溶液，37 ℃下恒温孵育3-5 h，加入20 μL BSA封闭30 min，离心收集沉淀，得到Ab2|Au NCs；
e．纯化后的CIS@ZnS NCs溶解于1 mL含有 10 mg/mL EDC 和10 mg/mL NHS的0.1 M pH6.0 PBS中，活化30 min，离心纯化，再分散于1 mL pH 7.4 0.1 M PBS中，得到活化的CIS@ZnS NCs；加入10 μL 10 μM探针DNA水溶液，37 ℃下恒温孵育3-5 h，加入20 μL BSA封闭30min，离心收集沉淀，得到Pp53|CIS@ZnS NCs；
f. 将CEA-Ag和Tp53滴加到双标记Au电极表面，室温孵育90 min，清洗电极，再将Ab2|AuNCs和Pp53|CIS@ZnS NCs混合后滴加到电极表面孵育1 h；以形成免疫复合物的形式将Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs枝接并固定到工作电极表面，制得免疫核酸同步检测的ECL传感器；
加入BSA进行封闭时，牛血清蛋白的体积分数为1%；
清洗电极所用冲洗液为10 mM pH =7.4 PBS；
CEA-Ag和Tp53以水溶液形式滴加到双标记Au电极表面，CEA浓度为0.3 pg/mL ~ 50 ng/mL，Tp53浓度为1 pM ~ 50 nM；
Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs以水溶液形式滴加到电极表面孵育，Ab2|Au NCs的浓度为10-20 mg/mL；Pp53|CIS@ZnS NCs的浓度为10-20 μM，Ab2|Au NCs和Pp53|CIS@ZnS NCs应足量；形成抗原-抗体间的相互作用和碱基互补配对。
10.根据权利要求1所述的多组分分析方法，其特征在于，具体为：
I：配制不同标准浓度的CEA-Ag水溶液和不同标准浓度的Tp53水溶液，利用不同标准浓度的CEA-Ag水溶液和不同标准浓度的Tp53水溶液，按免疫核酸同步检测的ECL传感器的构建方法构建同步检测的ECL传感器，以所得传感器电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含5-20 mM水合肼的Hepes缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动产生电化学发光；
II：以曝光成像方式收集ECL全过程的所有光子，基于色散ECL辐射全部光子的方式获取总光谱；依据光谱曲线上最大辐射波长485 nm处的最大辐射强度与标准抗原浓度之间的关系，绘制CEA检测工作曲线；依据光谱曲线上最大辐射波长775 nm处的最大辐射强度与Tp53浓度之间的关系，绘制Tp53检测工作曲线；
III：利用待测目标DNA和待测CEA-Ag按免疫核酸同步检测的ECL传感器的构建方法构建同步实施免疫分析与核酸检测的ECL传感器；以所得传感器电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含5-20 mM水合肼的Hepes缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动产生电化学发光；根据所得ECL光谱曲线上最大辐射波长处的光强信号和工作曲线，同步检测待测样品溶液中的抗原和目标DNA的浓度。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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