CN116297769B - 一种基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测方法 - Google Patents

一种基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，该方法分别采用巯基和氨基功能化的探针RNA与CdTe NCs共价结合，得到了基于同一纳米材料的不同基团功能实现了多组分ECL传感器的构建，该ECL信号电势窗口较窄，用于新冠病毒核酸检测的电位分辨型ECL传感器仍可保留不同电位处的ECL性能。本发明通过基团选择性功能化的电位分辨型ECL信号实现了ORF1ab和N基因的同时检测，丰富了ECL多组分核酸检测的研究内容和检出指标信息，为新冠病毒无症状感染和确诊的区分和诊断提供了技术支持。

Description

一种基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测 方法
技术领域
本发明涉及一种基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，属于电化学发光分析技术方法领域。
背景技术
核酸检测通常基于等温聚合酶链式反应 (RT-PCR) 扩增和环介导等温扩增 (RT-LAMP) 方式实现，具有装备要求复杂、检测耗时长等缺点。电化学发光 (ECL) 法可以避免核酸检测的繁琐扩增程序，具有灵敏度高、选择性好、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等优点。
ECL多组分分析技术的发展已经使得多种目标物的同时检测成为可能。He构建的波段识别型双组分ECL传感器以CdSe量子点和CdTe量子点为标记物，实现了野生型p53和突变型p53两种核酸的同时检测 (Anal. Chem.2018,90, 5474)；Zhang构建的波段识别型双组分ECL免疫传感器以CdSe量子点和CdTe量子点为标记物，实现了AFP和CA125两种蛋白的同时检测 (Biosens.Bioelectron.2018,115, 77)。中国专利文献CN106124487A公开了一种基于光谱分辨原理的ECL三组分免疫传感器，以CdSe量子点和CdTe量子点为标记物，实现三种抗原的同时检测。中国专利文献CN114878553A提供了一种基于光谱分辨原理的ECL双组分传感器，以CuInS2@ZnS 纳米晶和Au簇为标记物，实现了抗原和核酸的同时检测。
但是，现有的多组分信号分辨型的ECL传感器通常基于光谱分辨原理实现，且均基于两种不同ECL发射波长的发光物实现的。尚无基于同一发光物的电位分辨型多组分ECL传感器的报道。
因此，发展基于同一发光物，在低电位范围内实现电位分辨型多组分ECL传感对推动相关技术的更广泛应用具有重要价值。
发明内容
针对现有技术的不足，尤其是无法基于同一种发光物实现电位分辨型多组分ECL检测的难题，本发明提供一种基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测方法。
本发明采用巯基功能化的探针RNA与CdTe NCs共价结合，获得了最大发光电位位于0.32 V的 ECL信号，采用氨基功能化的探针RNA与CdTe NCs共价结合，获得了最大发光电位位于0.82 V的 ECL信号，即基于同一纳米材料的不同基团功能实现了多组分ECL传感器的构建，突破了已报道的多组分ECL传感器均需多种纳米量子点为标记物的局限性。本发明的ECL双组分传感器基于碱基互补配对原则构建，灵敏度高、特异性好、检测限低、线性范围宽，并且制备和操作简单；能够同时实现ORF1ab及N基因的同时检测，有利于新冠确诊患者及无症状感染的区分和鉴别。
术语说明：
巯基修饰探针ORF1ab，SH-Probe ORF1ab gene，简称，PORF-SH，
捕获ORF1ab，Capture ORF1ab gene，简称，CORF，
目标ORF1ab ，Target ORF1ab gene，简称，TORF，
单错配的目标ORF1ab，Mutated target ORF1ab-1，简称，MORF-1，
三错配的目标ORF1ab，Mutated target ORF1ab-3，简称，MORF-3，
随机的目标ORF1ab，Random target ORF1ab，简称，RORF，
氨基修饰探针N基因，NH2-Probe N gene，简称，PN-NH2，
捕获N基因，Capture N gene，简称，CN，
目标N基因，Target N gene，简称，TN，
单错配的目标N基因，Mutated target N gene-1，简称，MN-1，
三错配的目标N基因，Mutated target N gene-3，简称，MN-3，
随机的目标N基因，Random target N gene，简称，RN，
3’端巯基修饰的探针HBV，3’-SH-Probe HBV gene，简称，PHBV-3’-SH，
5’端氨基修饰的探针HBV，5’-NH2-Probe HBV gene，简称，PHBV-5’-NH2，
5’端巯基修饰的探针HPV，5’-SH-Probe HPV gene，简称，PHPV-5’-SH，
3’端氨基修饰的探针HPV，3’-NH2-Probe HPV gene，简称，PHPV-3’-NH2，
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，简称EDC。
N-羟基琥珀酰亚胺，简称NHS。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，包括步骤如下：
（1）构建同一材料的双组分ECL传感器：
1）将CORF和CN的混合溶液滴加在金电极表面孵育，得到双标记电极；
2）纯化后的水溶性CdTe NCs活化，活化后的水溶性CdTe NCs分散至PB缓冲液中，得水溶性CdTeNCs分散液；
3）向步骤2）水溶性CdTe NCs分散液中加入PORF-SH水溶液，恒温孵育，使PORF-SH的巯基与水溶性CdTe NCs表面的Cd共价结合，封闭，除去未连接的量子点和副产物，得到PORF-SH|CdTe NCs溶液；
4）向步骤2）水溶性CdTe NCs分散液中加入PN-NH2水溶液，恒温孵育，使PN-NH2的氨基与水溶性CdTe NCs表面的羧酸基团反应，封闭，除去未连接的量子点和副产物，得到PN-NH2|CdTe NCs溶液；
5）将TORF水溶液、TN水溶液滴加到步骤（1）的双标记电极表面，室温孵育，然后通过碱基互补配对原则分别将步骤3）的PORF-SH|CdTe NCs和步骤4）的PN-NH2|CdTe NCs枝接并固定到金电极表面，得到同一材料的双组分ECL传感器；
（2）以构建的同一材料的双组分ECL传感器作为工作电极、铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，组成三电极体系，在PB缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动产生ECL辐射；
（3）依据电化学发光强度-电位曲线上0.32 V处的光强信号与TORF水溶液浓度之间的关系，绘制TORF基因标准工作曲线；依据电化学发光强度-电位曲线图上0.82 V处的光强信号与TN水溶液浓度之间的关系，绘制TN基因标准工作曲线；
（4）将待测样品按步骤（1）构建同一材料的双组分ECL传感器，按步骤（2）和步骤（3）中的方法进行ECL光谱测试，得到目标电化学发光曲线；根据所得电化学发光曲线上0.32 V和0.82 V处的ECL光强和步骤(3)所得标准工作曲线，测试得到待测样品溶液中TORF基因、TN基因浓度。
同一材料的双组分ECL传感器的构建中：
根据本发明优选的，步骤1）中，CORF和CN的混合溶液为浓度为5-15 μM的CORF溶液和浓度为5-15 μM的CN溶液混合得到，CORF溶液与CN溶液的体积比为1:1。
根据本发明优选的，步骤1）中，孵育为室温下孵育2-4 h。
根据本发明优选的，步骤2）中，水溶性CdTe NCs为本领域现有技术。
根据本发明优选的，步骤2）中，水溶性CdTe NCs是按如下方法制备得到：
a将0.8 mL 0.2 mol/L的 CdCl2溶液加水稀释至50 mL；
b在搅拌下，向步骤a中加入0.2936 g 六偏磷酸钠（HMP）和34.6 μL巯基丙酸（MPA）；
c向步骤b中加入230 μL 6 mol/L的氢氧化钠，调节pH至9.0；
d向步骤c中加入1.2 mL 0.02 mol/L的亚碲酸钠（Na2TeO3），加热至100℃;
e 向步骤d中加入2.4 mL 水合肼（N2H4·H2O），持续加热32 h后得到CdTe NCs；
f取400 μL步骤e得到的CdTe NCs与600 μL异丙醇混合，在13300 rpm下洗涤纯化5min后，重复3次。
根据本发明优选的，步骤2）中，水溶性CdTe NCs活化具体为：纯化后的水溶性CdTeNCs溶解于1 mL含有EDC和NHS的磷酸盐缓冲溶液（PB）中，活化30 min，离心纯化。
进一步优选的，含有EDC和NHS的磷酸盐缓冲溶液（PB）中EDC的浓度为10 mg/mL，NHS的浓度为10 mg/mL，磷酸盐缓冲溶液浓度0.1 mol/L，pH= 6。
根据本发明优选的，步骤2）中，PB缓冲液为pH= 7.4，浓度为8-12 mmol/L的PB缓冲液，得到的水溶性CdTe NCs分散液的浓度为0.5-5 μmol/L。
根据本发明优选的，步骤3）中，PORF-SH水溶液的浓度5-15 μM，最为优选的，PORF-SH水溶液的浓度为10 μM，水溶性CdTe NCs分散液与PORF-SH水溶液的体积比为（1-2）：（1-2），恒温孵育为37℃下孵育3-5 h。
进一步优选的，水溶性CdTe NCs分散液的用量为10-20μL，PORF-SH水溶液的用量为10-20μL。
根据本发明优选的，步骤4）中，PN-NH2水溶液的浓度5-15 μM，最为优选的，PN-NH2水溶液的浓度为10 μM，溶性CdTe NCs分散液与PN-NH2水溶液的体积比为（1-2）：（1-2），恒温孵育为37℃下孵育3-5 h。
进一步优选的，水溶性CdTe NCs分散液的用量为10-20μL，PN-NH2水溶液的用量为10-20μL。
根据本发明优选的，步骤5）中，TORF水溶液的浓度为100 aM-20 fM，TN水溶液的浓度为2 fM-2 pM，室温孵育时间为80-100 min。
为了接枝更充分，TORF水溶液的用量为5-15 μL，TN水溶液的用量为5-15 μL。
根据本发明优选的，步骤5）中，同一材料的双组分ECL传感器的构建具体为：
将TORF水溶液、TN水溶液滴加到步骤（1）的双标记电极表面，室温孵育，然后将步骤3）得到的PORF-SH|CdTe NCs溶液和步骤4）得到的PN-NH2|CdTe NCs溶液滴加到该双标记电极表面上，于37℃下孵育0.5-2h，得到同一材料的双组分ECL传感器。
根据本发明优选的，步骤5）中，为了接枝更充分，PORF-SH|CdTe NCs溶液的用量为5-15 μL，PN-NH2|CdTe NCs溶液的用量为5-15 μL。
本发明优选的方案：
同一材料的双组分ECL传感器的构建具体按以下方法进行：
ⅰ.将Au电极用氧化铝抛光处理，然后用超纯水清洗，氮气吹干，将10 μL 10 μΜ的CORF溶液和10 μL 10 μM CN溶液混合，得到混合溶液，将混合溶液滴加在金电极表面孵育3h，得到双标记电极，加入甘氨酸（Gly）封闭电极上未反应的活性位点，清洗电极；
ⅱ. 纯化后的20 μL CdTe NCs溶解于1 mL含有EDC和NHS的磷酸盐缓冲溶液（PB）中，活化30 min，活化后的水溶性CdTe NCs分散20 μL 10 mM PB中，得水溶性CdTe NCs分散液；
ⅲ. 20 μL水溶性CdTe NCs分散液与10 μL10 μM PORF-SH混合，37 ℃下恒温孵育15-25 h，加入甘氨酸（Gly）封闭30 min，得到PORF-SH|CdTe NCs溶液；
ⅳ. 20 μL水溶性CdTe NCs分散液与10 μL10 μM PN-NH2，37 ℃下恒温孵育 3-5 h，加入甘氨酸（Gly）封闭30 min，得到PN-NH2|CdTe NCs溶液；
ⅴ.将10 μL TORF水溶液、10 μL TN水溶液滴加到步骤ⅰ的双标记电极表面，室温孵育，清洗电极，将10 μL的PORF-SH|CdTe NCs溶液和10 μL的PN-NH2|CdTe NCs溶液滴加到双标记电极表面上，于37℃下孵育1 h，得到同一材料的双组分ECL传感器。
根据本发明优选的，步骤ⅰ、ⅲ、ⅳ甘氨酸（Gly）的体积分数为1%，用量为10 μL。
根据本发明优选的，步骤ⅰ、ⅴ中清洗电极所用冲洗液为10 mM pH=7.4的PB缓冲液。
本发明构建的基团选择性功能化的电位分辨型多组分电化学发光核酸检测传感器最大发光电位位于分别位于0.32和0.82 V，发光电势窗口窄，能直接、相互不干扰、可以同时灵敏检测TORF基因、TN基因。
根据本发明优选的，步骤（2）中，循环伏安法驱动扫描电压范围为0 ~ 1.6 V，扫描圈数1 ~ 3圈，扫描速度为40 ~60 mV/s。
根据本发明优选的，步骤（2）中，PB缓冲溶液为0.1 mol/L，pH=7-9的PB缓冲溶液，最为优选的，PB缓冲溶液为0.1 mol/L，pH=7的PB缓冲溶液。
为了更直观的理解本发明的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，简述如下：
构建包含已知浓度TORF基因、TN基因的同一材料的双组分ECL传感器，以PB作为缓冲溶液，在三电极体系中，使用ECL信号检测装置采集ECL信号，建立发光强度位于0.32 V和0.82 V的ECL最大发射强度与目标TORF和TN浓度的线性关系曲线，然后构建未知浓度TORF基因、TN基因的同一材料的双组分ECL传感器，采用上述方法采集ECL信号，根据线性关系曲线获得待测TORF和TN的浓度。
一种基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，步骤如下：
I：配制不同浓度的TORF标准溶液和TN标准溶液，利用不同浓度的TORF标准溶液和TN标准溶液按同一材料的双组分ECL传感器构建传感器，以所得同一材料的双组分ECL传感器作为工作电极、铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在PB缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动工作电极表面的CdTeNCs产生ECL辐射；
II：依据电化学发光强度-电位曲线上0.32 V处的光强信号与TORF标准溶液浓度之间的关系，绘制TORF基因标准工作曲线；依据电化学发光强度-电位曲线图上0.82 V处的光强信号与TN标准溶液浓度之间的关系，绘制TN基因标准工作曲线；
III：将待测样品按步骤I构建同一材料的双组分ECL传感器，按步骤II和步骤III中的方法进行ECL光谱测试，得到目标电化学发光曲线；根据所得电化学发光曲线上0.32 V和0.82 V处的ECL光强和步骤II所得标准工作曲线，测试得到待测样品溶液中TORF基因、TN基因浓度。
本发明的电化学发光核酸检测的方法基于同一材料的双组分ECL传感器进行，本发明构建的电位分辨型ECL多组分传感器以及巯基修饰的探针ORF，氨基修饰的探针N基因是分别产生发光电位为0.24 V和0.82 V的ECL且发光电势窗口窄的关键要素，非巯基或氨基修饰均得不到低发光电位范围内的电位分辨型的ECL信号，能直接、相互不干扰、灵敏检测TORF基因、TN基因。
本发明采用双稳定剂包被的CdTe NCs为ECL标记物；CdTe NCs表面的Cd可在被枝接CORF的巯基共价相连，实现探针ORF1ab的标记；CdTe NCs表面的羧基可在被EDC和NHS活化后枝接CN表面的氨基，实现探针N基因的标记。
本发明的有益效果：
1、本发明成功制备了一种基团选择性功能化的电位分辨型多组分电化学发光核酸检测的方法，采用巯基功能化的探针RNA与CdTe NCs共价结合，获得了最大发光电位位于0.32 V的 ECL信号，采用氨基功能化的探针RNA与CdTe NCs共价结合，获得了最大发光电位位于0.82V的 ECL信号，即基于同一纳米材料的不同基团功能化实现了多组分ECL传感器的构建，突破了已报道的多组分ECL传感器均需多种纳米量子点为标记物的局限性。
2、本发明所构建的ECL多组分传感器均在免共反应剂条件下实现的，不仅电化学发光电势窗口较窄，且可以实现低电位范围内的电位分辨型ECL多组分传感器，进一步丰富了ECL多组分传感的研究内容和检出指标信息。
3、本发明的ECL多组分传感器基于碱基互补配对原则构建，灵敏度高、特异性好、检测限低、线性范围宽、制备和操作简单；能够同时实现ORF1ab及N基因的同时检测，有利于新冠确诊患者及无症状感染的区分和鉴别。
附图说明
图1为实施例1中CdTe NCs在0.1 mol/L，pH=7 PB中的电化学发光强度-电位曲线图；电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度。
图2为实施例3中的TORF浓度为7 fM，TN浓度为500 fM时所构建的电位分辨型多组分电化学发光核酸检测传感器的电化学发光强度-电位曲线图；电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度。
图3为不同浓度TORF和TN构建的电位分辨型多组分电化学发光核酸检测传感器的电化学发光强度-电位曲线图；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度，曲线a中TORF浓度为100 aM，TN浓度为2 fM；曲线b中TORF浓度为200 aM，TN浓度为5 fM；曲线c中TORF浓度为500aM，TN浓度为20 fM；曲线d中TORF浓度为1 fM，TN浓度为50 fM；曲线e中TORF浓度为3 fM，TN浓度为120 fM；曲线f中TORF浓度为7 fM，TN浓度为500 fM；曲线g中TORF浓度为10 fM，TN浓度为1pM；曲线h中TORF浓度为20 fM，TN浓度为2 pM。
图4为实施例11中电位分辨型多组分电化学发光传感器对TORF的工作曲线；横坐标为待测物TORF浓度，纵坐标为电化学发光强度。
图5为实施例11中电位分辨型多组分电化学发光传感器对TN的工作曲线；横坐标为待测物TN浓度，纵坐标为电化学发光强度。
图6为试验例1中所制的PORF-SH|CdTe NCs在0.1 mol/L，pH=7 PB中的电化学发光强度-电位曲线图；电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度。
图7为试验例2中所制的PN-NH2|CdTe NCs在0.1 mol/L，pH=7 PB中的电化学发光强度-电位曲线图；电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度。
图8为试验例3中所制的PORF-SH|CdTe NCs和PN-NH2|CdTe NCs在0.1 mol/L，pH=7PB中的电化学发光强度-电位曲线图；电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度。
图9为试验例4中所制的PHBV-3’-SH|CdTe NCs、PHPV-5’-SH|CdTe NCs在0.1 mol/L，pH=7PB中的电化学发光强度-电位曲线图；电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度。
图10为试验例5中所制的PHBV-5’-NH2|CdTe NCs、PHPV-3’-NH2|CdTe NCs在0.1 mol/L，pH=7 PB中的电化学发光强度-电位曲线图；电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度。
图11为试验例6不同TORF和TN构建的传感器的的选择性柱状图；横坐标为待测物种类，纵坐标为电化学发光强度。
图12为对比例1裸金电极在0.1 mol/L，pH=7 PB中的电化学发光强度-电位曲线图；电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度。
图13为对比例2中所制的TORF和TN浓度为0时，电位分辨型多组分电化学发光传感器的电化学发光强度-电位曲线；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
同时下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂、材料和设备，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
CdTe NCs的制备：
1）将0.8 mL 0.2 mol/L的 CdCl2溶液加入三口烧瓶中，加水稀释至50 mL；
2）在搅拌下，向步骤1）中加入0.2936 g 六偏磷酸钠（HMP）和34.6 μL巯基丙酸（MPA）；
3）向步骤2）中加入230 μL 6 mol/L的氢氧化钠，调节pH至9.0；
4）向步骤3）中加入1.2 mL 0.02 mol/L的亚碲酸钠（Na2TeO3），加热至100℃;
5) 向步骤4）中加入2.4 mL 水合肼（N2H4·H2O），持续加热32 h后得到CdTe NCs；
6）取400 μL步骤5）得到的CdTe NCs和600 μL异丙醇，在13300 rpm下洗涤纯化5min后，重复3次。
将最终产物溶于50 μL去离子水，得到4 μmol/L CdTe NCs的单分散溶液。
以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，100 μL浓度为4μmol/L的 CdTe NCs单分散液为发光试剂，4 mL浓度为0.1 mol/L、pH=7 PB为缓冲溶液，组成电化学发光体系，采用三电极体系与循环伏安扫描方法驱动该体系电化学发光辐射；
采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到的电化学发光强度-电位曲线如图1所示，如图1可知，CdTe NCs在0.1mol/L、 pH=7 PB缓冲液中可在0.32 V产生氧化-还原型电化学发光。
实施例2
同一材料的双组分ECL传感器的构建：
ⅰ.将Au电极用氧化铝抛光处理，然后用超纯水清洗，氮气吹干，将10 μL 10 μΜ的CORF溶液和10 μL 10 μM CN溶液混合，得到混合溶液，将混合溶液滴加在处理后金电极表面孵育3 h，得到双标记电极，加入甘氨酸（Gly）封闭电极上未反应的活性位点，清洗电极；
ⅱ. 实施例1制得的CdTe NCs纯化，纯化后的20 μL CdTe NCs溶解于1 mL含有EDC和NHS的磷酸盐缓冲溶液（PB）中，活化30 min， 含有EDC和NHS的磷酸盐缓冲溶液（PB）中EDC的浓度为10 mg/mL，NHS的浓度为10 mg/mL，磷酸盐缓冲溶液浓度0.1 mol/L，pH= 6，活化后的水溶性CdTe NCs分散20 μL 10 mM PB中，得水溶性CdTe NCs分散液；
ⅲ. 20 μL步骤ⅱ的水溶性CdTe NCs分散液与10 μL10 μM PORF-SH水溶液混合，37℃下恒温孵育3h，加入甘氨酸（Gly）封闭30 min，得到PORF-SH|CdTe NCs溶液；
ⅳ. 20 μL步骤ⅱ的水溶性CdTe NCs分散液与10 μL10 μM PN-NH2，37 ℃下恒温孵育 5 h，加入甘氨酸（Gly）封闭30 min，得到PN-NH2|CdTe NCs溶液；
ⅴ.将10 μL TORF水溶液、10 μL TN水溶液滴加到步骤ⅰ的双标记电极表面，室温孵育，清洗电极，将10 μL的PORF-SH|CdTe NCs溶液和10 μL的PN-NH2|CdTe NCs溶液滴加到双标记电极表面上，于37℃下孵育1 h，得到同一材料的双组分ECL传感器。
实施例3
一种基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，步骤如下：
I：配制10 μL浓度为7 fM 的TORF水溶液，10 μL浓度为500 fM的TN水溶液，按实施例2的步骤进行制备同一材料的双组分ECL传感器，以所得同一材料的双组分ECL传感器作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在0.1 mol/L，pH=7的PB缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动工作电极表面的CdTe NCs产生ECL辐射；
采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到的TORF浓度为7 fM，TN浓度为500 fM时构建的电位分辨型多组分电化学发光核酸检测传感器的电化学发光强度-电位曲线如图2所示，如图2可知，该电化学发光免疫传感器在0.1 mol/L、pH=7 PB缓冲液中可产生电位分辨型ECL信号，最大发光电位分别位于0.32V和0.82 V处。
II：依据电化学发光强度-电位曲线上0.32 V处的光强信号与TORF水溶液浓度之间的关系，绘制TORF基因标准工作曲线；依据电化学发光强度-电位曲线图上0.82 V处的光强信号与TN水溶液浓度之间的关系，绘制TN基因标准工作曲线；
III：将待测样品按步骤I构建同一材料的双组分ECL传感器，以所得传感器电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在0.1 mol/L，pH=7的PB缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动工作电极表面的CdTe NCs产生ECL辐射；得到目标电化学发光曲线；根据所得电化学发光曲线上0.32 V和0.82V处的ECL光强和步骤II所得工作曲线，分别得到待测样品溶液中的TORF和TN浓度。
实施例4
同实施例3所述的基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，不同之处在于：
步骤I：配制10 μL浓度为100 aM 的TORF水溶液，10 μL浓度为2 fM的TN水溶液，按实施例2的步骤进行制备同一材料的双组分ECL传感器，以所得同一材料的双组分ECL传感器作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在0.1 mol/L，pH=7的PB缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动工作电极表面的CdTe NCs产生ECL辐射；
采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到的不同浓度TORF和TN的电化学发光强度-电位曲线如图3所示；
TORF浓度为100 aM，TN浓度为2 fM时，构建的电位分辨型多组分电化学发光核酸检测传感器的电化学发光强度-电位曲线如图3中的曲线a所示，如图3中的曲线a可知，该电化学发光免疫传感器在0.1 mol/L、pH=7 PB缓冲液中可产生电位分辨型ECL信号，最大发光电位分别位于0.32 V和0.82 V处。
实施例5
同实施例3所述的基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，不同之处在于：
步骤I：配制10 μL浓度为200 aM 的TORF水溶液，10 μL浓度为5 fM的TN水溶液，依次按实施例2的步骤进行制备同一材料的双组分ECL传感器，以所得同一材料的双组分ECL传感器作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在0.1 mol/L，pH=7的PB缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动工作电极表面的CdTe NCs产生ECL辐射；
采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到的不同浓度TORF和TN的电化学发光强度-电位曲线如图3所示；
TORF浓度为200 aM，TN浓度为5 fM时，构建的电位分辨型多组分电化学发光核酸检测传感器的电化学发光强度-电位曲线如图3中的曲线b所示，如图3中的曲线b可知，该电化学发光免疫传感器在0.1 mol/L、pH=7 PB缓冲液中可产生电位分辨型ECL信号，最大发光电位分别位于0.32 V和0.82 V处。
实施例6
同实施例3所述的基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，不同之处在于：
步骤I：配制10 μL浓度为500 aM 的TORF水溶液，10 μL浓度为20 fM的TN水溶液，依次按实施例2的步骤进行制备同一材料的双组分ECL传感器，以所得同一材料的双组分ECL传感器作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在0.1mol/L，pH=7的PB缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动工作电极表面的CdTe NCs产生ECL辐射；
采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到的不同浓度TORF和TN的电化学发光强度-电位曲线如图3所示；
TORF浓度为500 aM，TN浓度为20 fM时，构建的电位分辨型多组分电化学发光核酸检测传感器的电化学发光强度-电位曲线如图3中的曲线c所示，如图3中的曲线c可知，该电化学发光免疫传感器在0.1 mol/L、pH=7 PB缓冲液中可产生电位分辨型ECL信号，最大发光电位分别位于0.32 V和0.82 V处。
实施例7
同实施例3所述的基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，不同之处在于：
步骤I：配制10 μL浓度为1 fM的TORF水溶液，10 μL浓度为50 fM的TN水溶液，依次按实施例2的步骤进行制备同一材料的双组分ECL传感器，以所得同一材料的双组分ECL传感器作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在0.1 mol/L，pH=7的PB缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动工作电极表面的CdTe NCs产生ECL辐射；
采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到的不同浓度TORF和TN的电化学发光强度-电位曲线如图3所示；
TORF浓度为1 fM，TN浓度为50 fM时，构建的电位分辨型多组分电化学发光核酸检测传感器的电化学发光强度-电位曲线如图3中的曲线d所示，如图3中的曲线d可知，该电化学发光免疫传感器在0.1 mol/L、pH=7 PB缓冲液中可产生电位分辨型ECL信号，最大发光电位分别位于0.32 V和0.82 V处。
实施例8
同实施例3所述的基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，不同之处在于：
步骤I：配制10 μL浓度为3 fM的TORF水溶液，10 μL浓度为120 fM的TN水溶液，依次按实施例2的步骤进行制备同一材料的双组分ECL传感器，以所得同一材料的双组分ECL传感器作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在0.1 mol/L，pH=7的PB缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动工作电极表面的CdTe NCs产生ECL辐射；
采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到的不同浓度TORF和TN的电化学发光强度-电位曲线如图3所示；
TORF浓度为3 fM，TN浓度为120 fM时，构建的电位分辨型多组分电化学发光核酸检测传感器的电化学发光强度-电位曲线如图3中的曲线e所示，如图3中的曲线e可知，该电化学发光免疫传感器在0.1 mol/L、pH=7PB缓冲液中可产生电位分辨型ECL信号，最大发光电位分别位于0.32 V和0.82 V处。
实施例9
同实施例3所述的基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，不同之处在于：
步骤I：配制10 μL浓度为7 fM的TORF水溶液，10 μL浓度为500 fM的TN水溶液，依次按实施例2的步骤进行制备同一材料的双组分ECL传感器，以所得同一材料的双组分ECL传感器作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在0.1 mol/L，pH=7的PB缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动工作电极表面的CdTe NCs产生ECL辐射；
采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到的不同浓度TORF和TN的电化学发光强度-电位曲线如图3所示；
TORF浓度为7 fM，TN浓度为500 fM时，构建的电位分辨型多组分电化学发光核酸检测传感器的电化学发光强度-电位曲线如图3中的曲线f所示，如图3中的曲线f可知，该电化学发光免疫传感器在0.1 mol/L、pH=7PB缓冲液中可产生电位分辨型ECL信号，最大发光电位分别位于0.32 V和0.82 V处。
实施例10
同实施例3所述的基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，不同之处在于：
步骤I：配制10 μL浓度为10 fM的TORF水溶液，10 μL浓度为1 pM的TN水溶液，依次按实施例2的步骤进行制备同一材料的双组分ECL传感器，以所得同一材料的双组分ECL传感器作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在0.1 mol/L，pH=7的PB缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动工作电极表面的CdTe NCs产生ECL辐射；
采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到的不同浓度TORF和TN的电化学发光强度-电位曲线如图3所示；
TORF浓度为10 fM，TN浓度为1 pM时，构建的电位分辨型多组分电化学发光核酸检测传感器的电化学发光强度-电位曲线如图3中的曲线g所示，如图3中的曲线g可知，该电化学发光免疫传感器在0.1 mol/L、pH=7 PB缓冲液中可产生电位分辨型ECL信号，最大发光电位分别位于0.32 V和0.82 V处。
实施例11
同实施例3所述的基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，不同之处在于：
步骤I：配制10 μL浓度为20 fM的TORF水溶液，10 μL浓度为2 pM的TN水溶液，依次按实施例2的步骤进行制备同一材料的双组分ECL传感器，以所得同一材料的双组分ECL传感器作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在0.1 mol/L，pH=7的PB缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动工作电极表面的CdTe NCs产生ECL辐射；
采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到的不同浓度TORF和TN的电化学发光强度-电位曲线如图3所示；
TORF浓度为20 fM，TN浓度为2 pM时，构建的电位分辨型多组分电化学发光核酸检测传感器的电化学发光强度-电位曲线如图3中的曲线h所示，如图3中的曲线h可知，该电化学发光免疫传感器在0.1 mol/L、pH=7 PB缓冲液中可产生电位分辨型ECL信号，最大发光电位分别位于0.32 V和0.82 V处。
综上实施例3-11，依据电化学发光强度-电位曲线位于0.32 V处的光强与TORF标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；电位分辨型多组分电化学发光传感器对TORF的工作曲线如图4所示，由图4可知，随着TORF浓度的增大，电化学发光信号逐渐增强，电化学发光强度与TORF浓度成正比，线性范围200 aM ~ 10 fM，检测限为100 aM。
依据电化学发光强度-电位曲线位于0.82 V处的光强与TN标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；电位分辨型多组分电化学发光传感器对TN的工作曲线如图5所示，由图5可知，随着TN浓度的增大，电化学发光信号逐渐增强，电化学发光强度与TN浓度成正比，线性范围5 fM ~ 2 pM，检测限为2 fM。
试验例1
PORF-SH|CdTe NCs的制备：
将纯化后的20 μL CdTe NCs与10 μL10 μM PORF-SH混合，37 ℃下恒温孵育15-25h，加入甘氨酸（Gly）封闭30 min，得到PORF-SH|CdTe NCs；
PORF-SH|CdTe NCs分散于1 mL 10 mmol/L pH 7.4 PB中，4 ℃保存备用。
以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，4 mL浓度为0.1mol/L、 pH=7的PB为缓冲溶液，100 μL浓度为4 μmol/L的PORF-SH|CdTe NCs分散液作为发光试剂。
采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到的电化学发光强度-时间曲线如图6所示，如图6可知，PORF-SH|CdTeNCs在0.1 M pH 7 PB缓冲液中可在0.32 V产生氧化-还原型电化学发光，证明PORF-SH已被成功枝接到CdTe NCs上。
试验例2
PN-NH2|CdTe NCs的制备：
纯化后的20 μL CdTe NCs溶解于1 mL含有EDC和NHS的磷酸盐缓冲溶液（PB）中，活化30 min，活化后的水溶性CdTe NCs分散20 μL 10 mM PB中，得水溶性CdTe NCs分散液，加入10 μL 10 μM PN-NH2，37 ℃下恒温孵育 3-5 h，加入甘氨酸（Gly）封闭30 min，得到；
PORF-SH|CdTe NCs分散于1 mL 10 mmol/L pH 7.4 PB中，4 ℃保存备用。
以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，4 mL浓度为0.1mol/L、 pH=7的PB为缓冲溶液，100 μL浓度为4 μmol/L的PN-NH2|CdTe NCs分散液作为发光试剂。
采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到的电化学发光强度-时间曲线如图7所示，如图7可知，PN-NH2|CdTe NCs在0.1 M pH 7 PB缓冲液中可在0.82 V产生氧化-还原型电化学发光，证明PN-NH2已被成功枝接到CdTe NCs上。
试验例3
将试验例1所得PORF-SH|CdTe NCs溶液与试验例1所得PN-NH2|CdTe NCs溶液混合。
以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，4 mL浓度为0.1mol/L、 pH=7的PB为缓冲溶液，100 μL浓度为4 μmol/L的PORF-SH|CdTe NCs和100 μL浓度为4μmol/L的PN-NH2|CdTe NCs混合的分散液作为发光试剂。
采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到的电化学发光强度-时间曲线如图8所示，如图8可知，PORF-SH|CdTeNCs和PN-NH2|CdTe NCs混合分散液在0.1 M pH 7 PB缓冲液中分别产生0.32和0.82 V的氧化-还原型电化学发光，可以直接检测PORF-SH|CdTe NCs，PN-NH2|CdTe NCs，并且相互不干扰。
试验例4
同试验例1的PORF-SH|CdTe NCs制备，不同之处在于：
将PORF-SH替换为PHBV-3’-SH和PHPV-5’-SH，制备得到PHBV-3’-SH|CdTe NCs、PHPV-5’-SH|CdTeNCs。
以裸金电极作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，以PHBV-3’-SH|CdTe NCs、PHPV-5’-SH|CdTe NCs为发光物，0.1 mol/L、pH=7的PB作为缓冲溶液。采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到PHBV-3’-SH|CdTe NCs、PHPV-5’-SH|CdTe NCs的电化学发光强度-电位曲线。
PHBV-3’-SH|CdTe NCs、PHPV-5’-SH|CdTe NCs的电化学发光强度-电位曲线如图9所示，如图11可知，PHBV-3’-SH|CdTe NCs、PHPV-5’-SH|CdTe NCs在0.1 mol/L、pH=7的PB缓冲液中产生最大发光电位位于0.32 V的电化学发光信号。
试验例5
同试验例1的PORF-SH|CdTe NCs制备，不同之处在于：
将PORF-SH替换为PHBV-5’-NH2和PHPV-3’-NH2，制备得到PHBV-5’-NH2|CdTe NCs、PHPV-3’-NH2|CdTe NCs。
以裸金电极作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，以PHBV-5’-NH2|CdTe NCs、PHPV-3’-NH2|CdTe NCs为发光物，0.1 mol/L、pH=7的PB作为缓冲溶液。采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到PHBV-5’-NH2|CdTe NCs、PHPV-3’-NH2|CdTe NCs的电化学发光强度-电位曲线。
PHBV-5’-NH2|CdTe NCs、PHPV-3’-NH2|CdTe NCs的电化学发光强度-电位曲线如图10所示，如图11可知，PHBV-5’-NH2|CdTe NCs、PHPV-3’-NH2|CdTe NCs在0.1 mol/L、pH=7的PB缓冲液中产生最大发光电位位于0.82 V的电化学发光信号。
实验例6
同实施例3所述的基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，不同之处在于：
将TORF水溶液替换为10 fM RORF水溶液、10 fM MORF-1水溶液、10 fM MORF-3水溶液、10 fM TORF水溶液；
将TN水溶液替换为1 pM RN水溶液、1 pM MN-1水溶液、1 pM MN-3水溶液、1 pM TN水溶液。
不同TORF和TN构建的传感器的电化学发光响应如图11所示。由图11所示，不同TORF和TN构建的传感器的电化学发光强度随目标TORF和TN碱基错配个数的增加而降低，本发明的电化学发光核酸检测的方法基于同一材料的双组分ECL传感器进行，只对TORF基因、TN基因高灵敏检测，表明本发明构建的同一材料的双组分ECL传感器选择性好。
对比例1
同具体实施例1CdTe NCs的制备，不同之处在于：
将CdTe NCs去除。
以裸金电极作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，0.1mol/L、pH=7的PB作为缓冲溶液。采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到空白溶液的电化学发光强度-电位曲线。
该空白溶液的电化学发光强度-电位曲线如图12所示，如图12可知，该裸金电极在0.1 mol/L、pH=7的PB缓冲液不产生任何电化学发光信号。
对比例2
同实施例2电化学发光免疫传感器的构建，不同之处在于：
将TORF和TN去除，制备得到电位分辨型多组分电化学发光传感器。
以该电位分辨型多组分电化学发光传感器作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，0.1 mol/L、pH=7的PB作为缓冲溶液。采用循环伏安法驱动，电势窗口为0~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 V，初扫向正，得到的不同TORF和TN浓度下的电化学发光强度-电位曲线。
TORF和TN浓度为0时，该电位分辨型多组分电化学发光传感器的电化学发光强度-电位曲线如图13所示，如图13可知，该电化学发光传感器在0.1 mol/L、pH=7的PB缓冲液不产生任何电化学发光信号。

Claims (10)

1.一种基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，包括步骤如下：
（1）构建同一材料的双组分ECL传感器：
1）将CORF和CN的混合溶液滴加在金电极表面孵育，得到双标记电极；
2）纯化后的水溶性CdTe NCs活化，活化后的水溶性CdTe NCs分散至PB缓冲液中，得水溶性CdTe NCs分散液；
3）向步骤2）水溶性CdTe NCs分散液中加入PORF-SH水溶液，恒温孵育，使PORF-SH的巯基与水溶性CdTe NCs表面的Cd共价结合，封闭，除去未连接的量子点和副产物，得到PORF-SH|CdTeNCs溶液；
4）向步骤2）水溶性CdTe NCs分散液中加入PN-NH2水溶液，恒温孵育，使PN-NH2的氨基与水溶性CdTe NCs表面的羧酸基团反应，封闭，除去未连接的量子点和副产物，得到PN-NH2|CdTeNCs溶液；
5）将TORF水溶液、TN水溶液滴加到步骤1）的双标记电极表面，室温孵育，然后通过碱基互补配对原则分别将步骤3）的PORF-SH|CdTe NCs和步骤4）的PN-NH2|CdTe NCs枝接并固定到金电极表面，得到同一材料的双组分ECL传感器；
（2）以构建的同一材料的双组分ECL传感器作为工作电极、铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，组成三电极体系，在PB缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动产生ECL辐射；
（3）依据电化学发光强度-电位曲线上0.32 V处的光强信号与TORF水溶液浓度之间的关系，绘制TORF基因标准工作曲线；依据电化学发光强度-电位曲线图上0.82 V处的光强信号与TN水溶液浓度之间的关系，绘制TN基因标准工作曲线；
（4）将待测样品按步骤（1）构建同一材料的双组分ECL传感器，按步骤（2）和步骤（3）中的方法进行ECL光谱测试，得到目标电化学发光曲线；根据所得电化学发光曲线上0.32 V和0.82 V处的ECL光强和步骤(3)所得标准工作曲线，测试得到待测样品溶液中TORF基因、TN基因浓度。
2.根据权利要求1所述的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，其特征在于，步骤1）中，CORF和CN的混合溶液为浓度为5-15 μM的CORF溶液和浓度为5-15 μM的CN溶液混合得到，CORF溶液与CN溶液的体积比为1:1，孵育为室温下孵育2-4 h。
3.根据权利要求1所述的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，其特征在于，步骤2）中，水溶性CdTe NCs是按如下方法制备得到：
a将0.8 mL 0.2 mol/L的 CdCl2 溶液加水稀释至50 mL；
b在搅拌下，向步骤a中加入0.2936 g 六偏磷酸钠（HMP）和34.6 μL巯基丙酸（MPA）；
c向步骤b中加入230 μL 6 mol/L的氢氧化钠，调节pH至9.0；
d向步骤c中加入1.2 mL 0.02 mol/L的亚碲酸钠（Na2TeO3），加热至100℃;
e 向步骤d中加入2.4 mL 水合肼（N2H4·H2O），持续加热32 h后得到CdTe NCs；
f取400 μL步骤e得到的CdTe NCs与600 μL异丙醇混合，在13300 rpm下洗涤纯化5 min后，重复3次。
4.根据权利要求1所述的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，其特征在于，步骤2）中，水溶性CdTe NCs活化具体为：纯化后的水溶性CdTe NCs溶解于1 mL含有EDC和NHS的磷酸盐缓冲溶液（PB）中，活化30 min，然后进行离心纯化；含有EDC和NHS的磷酸盐缓冲溶液（PB）中EDC的浓度为10 mg/mL，NHS的浓度为10 mg/mL，磷酸盐缓冲溶液浓度0.1 mol/L，pH=6；
步骤2）中，PB缓冲液为pH= 7.4，浓度为8-12 mmol/L的PB缓冲液，得到的水溶性CdTeNCs分散液的浓度为0.5-5 μmol/L。
5.根据权利要求1所述的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，其特征在于，步骤3）中，PORF-SH水溶液的浓度5-15 μM，水溶性CdTe NCs分散液与PORF-SH水溶液的体积比为（1-2）：（1-2），恒温孵育为37℃下孵育3-5 h。
6.根据权利要求1所述的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，其特征在于，步骤4）中，PN-NH2水溶液的浓度5-15 μM，水溶性CdTe NCs分散液与PN-NH2水溶液的体积比为（1-2）：（1-2），恒温孵育为37℃下孵育3-5 h。
7.根据权利要求1所述的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，其特征在于，步骤5）中，TORF水溶液的浓度为100 aM-20 fM，TN水溶液的浓度为2 fM-2 pM，室温孵育时间为80-100 min；
步骤5）中，同一材料的双组分ECL传感器的构建具体为：
将TORF水溶液、TN水溶液滴加到步骤（1）的双标记电极表面，室温孵育，然后将步骤3）得到的PORF-SH|CdTe NCs溶液和步骤4）得到的PN-NH2|CdTe NCs溶液滴加到该双标记电极表面上，于37℃下孵育0.5-2 h，得到同一材料的双组分ECL传感器。
8.根据权利要求1所述的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，其特征在于，同一材料的双组分ECL传感器的构建具体按以下方法进行：
ⅰ.将Au电极用氧化铝抛光处理，然后用超纯水清洗，氮气吹干，将10 μL 10 μΜ的 CORF溶液和10 μL 10 μM CN溶液混合，得到混合溶液，将混合溶液滴加在金电极表面孵育3 h，得到双标记电极，加入甘氨酸（Gly）封闭电极上未反应的活性位点，清洗电极；
ⅱ. 纯化后的20 μL CdTe NCs溶解于1 mL含有EDC和NHS的磷酸盐缓冲溶液（PB）中，活化30 min，活化后的水溶性CdTe NCs分散20 μL 10 mM PB中，得水溶性CdTe NCs分散液；
ⅲ. 20 μL水溶性CdTe NCs分散液与10 μL10 μM PORF-SH混合，37 ℃下恒温孵育 15-25h，加入甘氨酸（Gly）封闭30 min，得到PORF-SH|CdTe NCs溶液；
ⅳ. 20 μL水溶性CdTe NCs分散液与10 μL10 μM PN-NH2，37 ℃下恒温孵育 3-5 h，加入甘氨酸（Gly）封闭30 min，得到PN-NH2|CdTe NCs溶液；
ⅴ.将10 μL TORF水溶液、10 μL TN水溶液滴加到步骤ⅰ的双标记电极表面，室温孵育，清洗电极，将10 μL的PORF-SH|CdTe NCs溶液和10 μL的PN-NH2|CdTe NCs溶液滴加到双标记电极表面上，于37℃下孵育1 h，得到同一材料的双组分ECL传感器。
9.根据权利要求1所述的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，其特征在于，步骤（2）中，循环伏安法驱动扫描电压范围为0 ~ 1.6 V，扫描圈数1 ~ 3圈，扫描速度为40 ~ 60mV/s，PB缓冲溶液为0.1 mol/L，pH=7-9的PB缓冲溶液。
10.一种基团选择性功能化的电位分辨型电化学发光核酸检测方法，步骤如下：
I：配制不同浓度的TORF标准溶液和TN标准溶液，利用不同浓度的TORF标准溶液和TN标准溶液按同一材料的双组分ECL传感器构建传感器，以所得同一材料的双组分ECL传感器作为工作电极、铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在PB缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动工作电极表面的CdTe NCs产生ECL辐射；
II：依据电化学发光强度-电位曲线上0.32 V处的光强信号与TORF标准溶液浓度之间的关系，绘制TORF基因标准工作曲线；依据电化学发光强度-电位曲线图上0.82 V处的光强信号与TN标准溶液浓度之间的关系，绘制TN基因标准工作曲线；
III：将待测样品按步骤I构建同一材料的双组分ECL传感器，按步骤II和步骤III中的方法进行ECL光谱测试，得到目标电化学发光曲线；根据所得电化学发光曲线上0.32 V和0.82 V处的ECL光强和步骤II所得标准工作曲线，测试得到待测样品溶液中TORF基因、TN基因浓度。
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