CN112924662A - 一种电致化学发光免疫传感器的制备方法及其在检测黄曲霉毒素b1中的应用 - Google Patents

一种电致化学发光免疫传感器的制备方法及其在检测黄曲霉毒素b1中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种电致化学发光免疫传感器的制备方法及其在检测黄曲霉毒素B1中的应用，将9，10‑二联苯蒽超声分散到良溶剂中，然后转移至不良溶剂中超声处理，所得混合液冷冻处理、真空冷冻干燥，得立方纳米颗粒；将立方纳米颗粒与PEI超声混合，得到PEI/DPA CNPs混合液；将PEI/DPA CNPs修饰到玻碳电极表面，结合免疫反应模式和电致化学发光技术，可得电致化学发光免疫传感器。本发明制备过程简单，所得传感器实现了对黄曲霉毒素B1的快速灵敏、高选择性、宽检测限及低检出限检测，为黄曲霉素B1的快速痕量、超痕量检测提供了一种新的分析方法，具有市场发展前景。

Description

一种电致化学发光免疫传感器的制备方法及其在检测黄曲霉 毒素B1中的应用
技术领域
本发明涉及一种电致化学发光免疫传感器的制备方法，具体涉及一种基于可聚集诱导发射的纳米发光体的电致化学发光免疫传感器的制备方法，还涉及该电致化学发光免疫传感器在黄曲霉毒素B1检测中的应用，属于新型生物传感器与生物检测技术领域。
背景技术
黄曲霉毒素是一种呋喃环类毒素，主要由黄曲霉毒素和寄生曲霉菌株产生，天然黄曲霉毒素由B1，B2，G1和G2组成。其中黄曲霉毒素B1（AFB1）是最有害的，有很强的致癌，致畸和免疫抑制作用，主要分布于动植物中。由于具有稳定性强，不易破坏，痕量致毒等特点，每年对国家带来重大经济损失，引起人们的广泛关注。目前，对于黄曲霉毒素的检测方法主要包括薄层色谱法，高效液相色谱法，酶联免疫方法等，但是大部分方法存在复杂的样品前处理、仪器设备昂贵，操作复杂，检测速度慢等缺陷。因此，开发出一种可快速、灵敏、低成本且高选择检测黄曲霉毒素B1的方法至关重要。
电致化学发光免疫传感器由于仪器设备简单、操作方便、无背景信号，检测快速、高灵敏等特点，被广泛应用于各种有害物质的检测，其制备的关键就是发光体的信号强度和稳定性及免疫分子的有效固定等性能的提高。目前，关于其在黄曲霉毒素的检测中也已有较多的报道。例如专利CN106198501 A公布了一种采用锰掺杂二氧化钛纳米方块原位复合二硫化钼的二维纳米复合材料构建的电致化学发光免疫传感器的制备方法，并用于检测黄曲霉毒素，但是传感器制备过程太过复杂，且检测范围较小，为0.003-100 ng/mL，检测限（1.1 pg/mL）还有待改善。另外，专利CN111220671 A公布了一种电致化学发光免疫传感器的制备方法，并用于检测黄曲霉毒素B1，其方法是在氧化铟锡玻璃电极上制备氧化亚铜纳米阵列，用巯基乙酸功能化后，利用其大的比表面积和对氨基的高吸附活性来捕获抗体，采用层层滴涂法，相继在氧化亚铜阵列上固定抗原和以金纳米团簇为电致发光体的二抗标记物，由此完成电致化学发光传感器的制备。但是此传感器制备过程复杂且耗时长，此外，制备过程中加入了有毒物质巯基乙酸进行功能化。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种电致化学发光免疫传感器的制备方法，该方法制备简单，易于操作，所得电致化学发光免疫传感器为基于可聚集诱导发射的纳米发光体的电致化学发光免疫传感器，其发光信号强，发光寿命长，对黄曲霉毒素检测灵敏度高。
近年来，具有聚集诱导发射特性的有机发光材料由于制备简单，易于功能化，毒害小及出色的光学性质等特点，作为发光体逐渐被应用于电致化学发光免疫传感器的构建，大大改进了有机相发光体在水溶液中溶解性差、发光微弱等问题。此外，高量子产率及优异的发光寿命的发光体的加入改善了传统传感器的信号稳定性及可重现性相对较差的问题，这大大提高了对目标物的检测效果。
为了获得更简便快捷的电致化学发光免疫传感器并实现对黄曲霉毒素B1的更灵敏痕量的检测，本发明通过基于具有聚集诱导特性的9，10-二联苯蒽立方纳米发光体（DPACNPs）构建了新型超灵敏电致化学发光免疫传感器并将其应用于对黄曲霉毒素B1的检测，拟解决电分析化学生物传感器的简单制备及应用难题，具有重要的研究意义和市场价值。
本发明具体技术方案如下：
一种电致化学发光免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将9，10-二联苯蒽超声分散到良溶剂中；
（2）将步骤（1）的分散液转移至正在超声的不良溶剂中，继续超声处理；
（3）步骤（2）后，将混合液先进行冷冻处理，然后进行真空冷冻干燥，得到9，10-二联苯蒽立方纳米颗粒（DPA CNPs）；
（4）将9，10-二联苯蒽立方纳米颗粒超声分散到N，N-二甲基甲酰胺的水溶液中，然后向其中加入聚乙烯亚胺水溶液，超声混合，得到聚乙烯亚胺/9，10-二联苯蒽立方纳米颗粒（PEI/DPA CNPs）混合液；
（5）在玻碳电极表面滴涂上述聚乙烯亚胺/9，10-二联苯蒽立方纳米颗粒混合液，室温下晾干，重复滴涂一次，室温晾干备用；
（6）向步骤（5）的玻碳电极表面滴涂戊二醛溶液，室温孵育后洗涤；
（7）向步骤（6）的玻碳电极表面滴涂黄曲霉毒素B1抗体，先室温下反应，然后转移至0-4 ℃过夜；
（8）将步骤（7）的玻碳电极清洗后继续在电极表面滴涂牛血清白蛋白溶液，先室温下反应，然后洗涤后转移至0-4 ℃冰箱中保存，即得电致化学发光免疫传感器。
进一步的，所述9，10-二联苯蒽的良溶剂为四氢呋喃（THF）等有机溶剂，9，10-二联苯蒽的不良溶剂为水。
进一步的，良溶剂和不良溶剂的体积比为1:2-4。
进一步的，9，10-二联苯蒽在良溶剂中的浓度为1-2 mg/mL。
进一步的，9，10-二联苯蒽加入良溶剂中超声分散15-25 min，然后将所得分散液转移至不良溶剂中超声10-15 min。
进一步的，步骤（3）中，混合液在-15～-20 ℃冷冻3-4 h,然后在-45～-50 ℃下真空冷冻干燥48-50 h。
进一步的，步骤（4）中，N，N-二甲基甲酰胺的水溶液的体积浓度为30-60%，聚乙烯亚胺水溶液的浓度为8-11 μg/mL。
进一步的，步骤（4）中，9，10-二联苯蒽立方纳米颗粒在N，N-二甲基甲酰胺的水溶液中的浓度为8-11 mg/mL。
进一步的，步骤（4）中，聚乙烯亚胺与9，10-二联苯蒽立方纳米颗粒的质量比为4×10-5-4×10-4:1。
进一步的，步骤（4）中，9，10-二联苯蒽立方纳米颗粒在N，N-二甲基甲酰胺的水溶液中超声分散60-90 min，加入聚乙烯亚胺水溶液后超声分散30-40 min。
进一步的，步骤（5）中，每次在玻碳电极表面滴涂5-6 μL聚乙烯亚胺/9，10-二联苯蒽立方纳米颗粒混合液。
进一步的，步骤（6）中，向步骤（5）的玻碳电极表面滴涂10-20 μL浓度为1-2 wt%的戊二醛溶液，室温孵育2-3 h。
进一步的，步骤（7）中，向步骤（6）的玻碳电极表面滴涂5-10 μL浓度为50-55 μg/mL的黄曲霉毒素B1抗体，先室温下反应1-2 h，然后转移至0-4 ℃过夜。
进一步的，步骤（8）中，在电极表面滴涂10-20 μL浓度为0.5-1 wt%的牛血清白蛋白溶液，先室温下反应1-2 h，然后洗涤后转移至0-4 ℃冰箱中保存。
本发明通过简单高效的直接法在电极表面进行层层组装构建超灵敏的传感器，当黄曲霉毒素B1抗原被滴涂到传感界面上时可被抗体捕获，同时会对发光信号产生淬灭作用，导致发光信号的下降。根据发光信号可以定性定量的对黄曲霉毒素B1进行灵敏检测。本发明所用聚乙烯亚胺/9，10-二联苯蒽立方纳米颗粒发光体易于合成，发光信号强烈稳定，传感器构建简单快速，性能稳定，有很强的应用前景。
本发明还提供了按照上述方法制备的电致化学发光免疫传感器在检测黄曲霉毒素B1中的应用。该电致化学发光免疫传感器对黄曲霉毒素B1的检测表现出高特异性、宽检测范围及低检测限，可广泛应用于理想缓冲溶液体系和实际样本中黄曲霉毒素B1的快速、灵敏检测。
本发明还提供了一种黄曲霉毒素B1的检测方法，该方法包括以下步骤：
a.配制不同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液；
b.将上述不同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液分别修饰到按照上述方法制得的电致化学发光免疫传感器上；
c.以甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，以步骤b修饰好的电致化学发光免疫传感器为工作电极，组成三电极系统，连接到电致化学发光检测设备上；
d. 在电解槽中加入三丙胺（TPA）溶液，用循环伏安法对工作电极施加循环电压，根据所得的电致化学发光的光信号强度与黄曲霉毒素B1标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
e. 将待测样品修饰到电致化学发光免疫传感器上，按照步骤c和d的方法检测电致化学发光的光信号强度，通过工作曲线得到待测样品中黄曲霉毒素B1的含量。
进一步的，循环伏安法中，电压范围是0-1.6 V，所设的超微弱发光测量仪电压为1000 V，扫描速度为100 mV/s。
进一步的，步骤d中，含有不同浓度黄曲霉毒素B1的标准溶液的光信号强度记为Di，不含黄曲霉毒素B1的空白标样的光信号强度记为D0，响应光信号强度降低的差值为ΔD=D0-Di，绘制ΔD与黄曲霉毒素B1浓度的工作曲线。
进一步的，步骤d中，所述的三丙胺溶液的组成为：三丙胺70-80 mM（mmol/L） ，氯化钾0.1-0.2 M（mol/L），pH=7.5的磷酸盐缓冲溶液余量。
本发明的有益效果如下：
1、本发明首次将具有聚集诱导发射效应的9，10-二联苯蒽立方纳米颗粒发光体应用于电致化学发光免疫传感器，表现出强烈的电致化学发光信号，具有良好的发光寿命。其明亮的光发特性大大提高了检测灵敏度，长的发光寿命提高了检测的稳定性与准确性，解决了有机相发光体在水溶液中溶解性差、发光微弱、发光体信号不稳定的问题。
2、本发明所述的电致化学发光免疫传感器的制备过程简单，操作便捷，比表面积大可负载更多的材料，大大提高了发光信号，实现了对黄曲霉毒素B1的快速灵敏、高选择性、宽检测限及低检出限检测，为黄曲霉素B1的快速痕量、超痕量检测提供了一种新的分析方法，具有市场发展前景。
附图说明
图1 是本发明所得9，10-二联苯蒽立方纳米颗粒的扫描电镜图。
图2 是ΔD与黄曲霉毒素B1浓度之间的线性关系图。
图3 是本发明电致化学发光免疫传感器对黄曲霉毒素B1检测的稳定性（3A）、可重现性(3B)及抗干扰性（3C）图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步说明，下述说明仅是示例性的，并不对其内容进行限制。
如无特别说明，下述浓度均为质量百分浓度。
实施例1
采用重沉淀法制备可聚集诱导发射的9，10-二联苯蒽立方纳米颗粒，具体如下：
（1）将10 mg 9，10-二联苯蒽分散于10 mL的四氢呋喃中充分超声20 min，混匀；
（2）将混匀溶液快速转移至20 mL的正在超声的水中，继续超声15 min，将溶液倒入培养皿中；
（3）培养皿先于冰箱-20 ℃放置3-4 h，然后将混合物转移至真空冷冻干燥机中，在-45～-50 ℃下干燥48 h，收集白色9.10二联苯蒽立方纳米颗粒（DPA CNPs），于干燥条件下存放待用；所制得的9.10二联苯蒽立方纳米颗粒材料的形貌如图1所示，为立方状。
（4）将1 mg DPA CNPs分散在100 μL含30 μL的N，N-二甲基甲酰胺的水溶液中，超声时间60 min，使其充分混匀；
（5）将4 μL PEI水溶液（10 μg/mL）注入100 μL 上述DPA CNPs溶液中，超声时间为30 min，得到PEI/DPA CNPs溶液。
实施例2
采用重沉淀法制备可聚集诱导发射的9.10二联苯蒽立方纳米颗粒，具体如下：
（1）将10 mg 9，10-二联苯蒽分散于10 mL的四氢呋喃中充分超声20 min，混匀；
（2）将混匀溶液快速转移至20 mL的正在超声的水中，继续超声15 min，将溶液倒入培养皿中；
（3）培养皿先于冰箱-20 ℃放置3-4 h，然后将混合物转移至真空冷冻干燥机中，在-45～-50℃下干燥48 h，收集白色立方状DPA CNPs，于干燥条件下存放待用；
（4）将1 mg DPA CNPs分散在100 μL含60 μL的N，N-二甲基甲酰胺的水溶液中，超声时间90 min，使其充分混匀；
（5）将40 μL PEI水溶液（10 μg/mL）注入上述100 μL DPA CNPs溶液中，超声时间为30 min，得到PEI/DPA CNPs溶液。
实施例3
制备电致化学发光免疫传感器，具体步骤如下：
（1）以洁净的玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂5 μL实施例1制备的PEI/DPACNPs溶液，室温下晾干，重复滴涂操作一次，晾干；
（2）将步骤（1）中得到的修饰电极表面滴涂10 μL的戊二醛溶液（1 %），室温下孵育2 h，用水洗涤。
（3）将步骤（2）中得到的功能电极表面滴涂5 μL 50 μg/mL黄曲霉毒素B1抗体，室温下反应1 h，然后转移至4 ℃过夜。
（4）将步骤（3）中得到的电极用洗涤液清洗，继续在电极表面滴涂20 μL的浓度为0.5% 的牛血清白蛋白溶液，室温孵育1 h后用洗涤液清洗，4 ℃冰箱中保存，即制得电致化学发光传感器。所述洗涤液为pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液。
实施例4
制备电致化学发光免疫传感器，具体步骤如下：
（1）以洁净的玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂5 µL的实施例2制备的PEI/DPA CNPs溶液，室温下晾干，重复滴涂操作一次，晾干；
（2）将步骤（1）中得到的电极表面滴涂20 μL的戊二醛溶液（1 %），室温下孵育2 h，用水洗涤。
（3）将步骤（2）中得到的电极表面滴涂10 μL 50 μg/mL黄曲霉毒素B1抗体，室温下反应1 h，然后转移至4 ℃过夜。
（4）将步骤（3）中得到的电极用洗涤液清洗，继续在电极表面滴涂20 μL的浓度为1% 的牛血清白蛋白溶液，室温孵育1 h后用洗涤液清洗，4 ℃冰箱中保存，即制得电致化学发光传感器。所述洗涤液为pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液。
实施例5
采用实施例3制备的电致化学发光传感器检测黄曲霉毒素B1，步骤如下：
a.标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液，空白标样为pH7.5的PBS洗涤液，不同浓度的标准溶液是将不同质量的黄曲霉毒素B1稀释于pH7.5的PBS洗涤液中得到；
b.工作电极修饰：将步骤a中配制的不同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液分别滴涂到按实施例3所述的制备方法制备的电致化学发光传感器传感界面，4 ℃冰箱中保存；
c.工作曲线绘制：将甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极系统，连接到电致化学发光检测设备上，电压设置为1000 V，扫描电压为100 mV/s；在电解槽中加入20 mL的三丙胺溶液；用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压，工作电位为0-1.6 V；根据所得的电致化学发光的光信号强度与黄曲霉毒素B1抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；其中，空白标样的光信号强度记为D0，含有不同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液的光信号强度记为Di，响应光信号强度降低的差值为ΔD=D0-Di，ΔD与黄曲霉毒素B1标准溶液的质量浓度C之间成线性关系，绘制ΔD－C工作曲线；
d.黄曲霉毒素B1的检测：用待测样品代替步骤a中的黄曲霉毒素B1标准溶液，按照步骤b和c中的方法进行检测，根据响应光信号强度降低的差值ΔD和工作曲线，得到待测样品中黄曲霉毒素B1的含量；
所述的三丙胺溶液组成为：三丙胺75 mM，KCl 0.1 M， pH=7.5磷酸盐缓冲溶液余量。
实施例6
采用实施例3制备的电致化学发光传感器，按照实施例5的检测步骤检测黄曲霉毒素B1（AFB1），标准曲线中黄曲霉毒素B1的浓度为0.01 pg/mL-100 ng/mL。结果显示，在此浓度范围内，致化学发光的光信号强度与黄曲霉毒素B1的浓度之间呈线性关系，其线性回归方程为：y=13157.645-2230.41 lgC，R2=0.99378，如图2所示。根据标准差法，检出限=3S0/k，S0是空白样（n=0）的标准偏差，k为回归方程斜率，k=-2230.411， s0=sqrt(((x1-x)2+(x2-x)2+ (x3-x)2)/3)，x为平均值，经检测，S0=2.23，检出限=3 fg/mL。
对本发明传感器在检测黄曲霉毒素B1时的稳定性、可重现性及抗干扰能力进行考察，具体如下：
配制浓度为10 pg/mL的黄曲霉毒素B1标准溶液，采用实施例3制备的检测黄曲霉毒素B1的电致化学发光传感器，按照实施例5的检测步骤检测黄曲霉毒素B1的含量。结果如图3A所示，电化学信号经过14个循环后几乎保持不变，表明本发明传感器稳定性良好。
按照实施例3的方法同时制备4个电致化学发光传感器，配制浓度分别为1 pg/mL、10 pg/mL和100 pg/mL 的黄曲霉毒素B1标准溶液，采用这四种电致化学发光传感器，按照实施例5的检测步骤检测黄曲霉毒素B1的含量，结果如图3B所示，各传感器检测结果基本一致，表明本发明传感器有良好的可重现性。
分别配制空白标准溶液、赭曲霉毒素OTA(20 ng/mL)标准溶液、呕吐毒素DON(20ng/mL) 标准溶液、牛血清白蛋白BSA(20 ng/mL) 标准溶液、混合物(OTA、DON、BSA各 20ng/mL和1 ng/mL AFB1) 标准溶液，采用实施例3制备的检测黄曲霉毒素B1的电致化学发光传感器，按照实施例5的检测步骤分别检测各标准溶液，结果如图3C所示，本发明传感器仅对黄曲霉毒素B1有选择性，说明本发明传感器有良好的抗干扰能力。
实施例7 实际样品检测
实际核桃样品按如下步骤处理：将2 g粉碎的核桃样品加入8 mL正己烷和10 mL样品提取物中（V甲醇：V去离子水=7：3），充分混匀，在4500 r/min下离心10 min。将下层0.5mL混合液体与0.5 mL去离子水混合。取混匀后的液体0.5 mL，加入0.5 mL 35%甲醇，充分混匀，得到实际样品提取液。
以实施例3制备的传感器，按照实施例5的检测步骤对实际核桃样品进行检测，采用标准添加法处理实际样品。具体步骤是：取上述的实际核桃提取液，分别加入AFB1标准液，使黄曲霉毒素B1的最终浓度分别为1 pg/mL 、10 pg/mL 、100 pg/mL 。每个浓度分别用五根电极检测五组平行样，取五组平行样品的平均ECL信号值作为最终值，将ECL值带入线性回归方程y=13157.645-2230.41 lgC计算，对实际核桃样品进行检测的浓度结果如下表1所示，从表中可以看出，对添加的三种浓度的黄曲霉毒素B1的回收率在89.13%-114%之间，表明该策略在复杂样本中具有很大的应用潜力。
Figure 489834DEST_PATH_IMAGE001

Claims (10)

1.一种电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）将9，10-二联苯蒽超声分散到良溶剂中；
（2）将步骤（1）的分散液转移至正在超声的不良溶剂中，继续超声处理；
（3）步骤（2）后，将混合液先进行冷冻处理，然后进行真空冷冻干燥，得到9，10-二联苯蒽立方纳米颗粒；
（4）将9，10-二联苯蒽立方纳米颗粒超声分散到N，N-二甲基甲酰胺的水溶液中，然后向其中加入聚乙烯亚胺水溶液，超声混合，得到聚乙烯亚胺/9，10-二联苯蒽立方纳米颗粒混合液；
（5）在玻碳电极表面滴涂上述聚乙烯亚胺/9，10-二联苯蒽立方纳米颗粒混合液，室温下晾干，重复滴涂一次，室温晾干备用；
（6）向步骤（5）的玻碳电极表面滴涂戊二醛溶液，室温孵育后洗涤；
（7）向步骤（6）的玻碳电极表面滴涂黄曲霉毒素B1抗体，先室温下反应，然后转移至0-4℃过夜；
（8）将步骤（7）的玻碳电极清洗后继续在电极表面滴涂牛血清白蛋白溶液，先室温下反应，然后洗涤后转移至0-4 ℃冰箱中保存，即得电致化学发光免疫传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述9，10-二联苯蒽的良溶剂为四氢呋喃，9，10-二联苯蒽的不良溶剂为水。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：良溶剂和不良溶剂的体积比为1:2-1：4；9，10-二联苯蒽在良溶剂中的浓度为1-2 mg/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（3）中，混合液在-15～-20 ℃冷冻3-4 h，然后在-45～-50 ℃下真空冷冻干燥48-50 h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（4）中，N，N-二甲基甲酰胺的水溶液的浓度为30-60体积%，9，10-二联苯蒽立方纳米颗粒在N，N-二甲基甲酰胺的水溶液中的浓度为8-11 mg/mL；聚乙烯亚胺水溶液的浓度为8-11 μg/mL，聚乙烯亚胺与9，10-二联苯蒽立方纳米颗粒的质量比为4×10-5-4×10-4:1。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（5）中，每次在玻碳电极表面滴涂5-6微升聚乙烯亚胺/9，10-二联苯蒽立方纳米颗粒混合液；步骤（6）中，向步骤（5）的玻碳电极表面滴涂10-20 μL浓度为1-2 wt%的戊二醛溶液，室温孵育2-3 h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（7）中，向步骤（6）的玻碳电极表面滴涂5-10 μL浓度为50-55 μg/mL的黄曲霉毒素B1抗体，先室温下反应1-2 h，然后转移至0-4 ℃过夜；步骤（8）中，在电极表面滴涂10-20 μL浓度为0.5-1wt%的牛血清白蛋白溶液，先室温下反应1-2 h，然后洗涤后转移至0-4 ℃冰箱中保存。
8.一种黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征是包括以下步骤：
a.配制不同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液；
b.按照权利要求1-7一项所述的电致化学发光免疫传感器的制备方法制得电致化学发光免疫传感器，将上述不同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液分别修饰到该电致化学发光免疫传感器上；
c.以甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，以步骤b修饰好的电致化学发光免疫传感器为工作电极，组成三电极系统，连接到电致化学发光检测设备上；
d. 在电解槽中加入三丙胺溶液，用循环伏安法对工作电极施加循环电压，根据所得的电致化学发光的光信号强度与黄曲霉毒素B1标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
e. 将待测样品修饰到电致化学发光免疫传感器上，按照步骤c和d的方法检测电致化学发光的光信号强度，通过工作曲线得到待测样品中黄曲霉毒素B1的含量。
9.根据权利要求8述的检测方法，其特征是：循环伏安法中，电压范围是0-1.6 V，所设的超微弱发光测量仪电压为1000 V，扫描速度为100 mV/s；所述的三丙胺溶液的组成为：三丙胺70-80 mmol/L ，氯化钾0.1-0.2 mol/L，pH=7.5的磷酸盐缓冲溶液余量。
10.根据权利要求8述的检测方法，其特征是：步骤d中，含有不同浓度黄曲霉毒素B1的标准溶液的光信号强度记为Di，不含黄曲霉毒素B1的空白标样的光信号强度记为D0，响应光信号强度降低的差值为ΔD= D0-Di，绘制ΔD与黄曲霉毒素B1浓度的工作曲线。
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