CN111220671A - 一种检测黄曲霉素b1的电化学发光传感电极的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测黄曲霉素B1的电化学发光传感电极的制备方法,属于新型纳米功能材料与化学生物传感器技术领域。本发明首先在氧化铟锡(ITO)玻璃电极上制备了氧化亚铜纳米阵列,用巯基乙酸功能化后,利用其大的比表面积和对氨基的高吸附活性来捕获抗体,采用层层滴涂法,相继在氧化亚铜阵列上固定抗原和以金纳米团簇为电致发光体的二抗标记物,由此,一种黄曲霉素B1的电致化学发光传感电极便制备完成。利用氧化亚铜在低电势下优异的氧化还原能力能够有效催化过硫酸根自由基的形成,从而加速ECL的激发,该传感器构建简单,成本消耗低,灵敏度高,检测范围宽,临床应用潜力大。
Description
技术领域
本发明涉及一种电致化学发光传感电极的制备方法及应用,属于新型纳米功能材料与化学生物传感器技术领域。
背景技术
黄曲霉毒素B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物,含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮。黄曲霉毒素B1是已知的化学物质中致癌性最强的一种,对包括人和若干动物具有强烈的毒性,其毒性作用主要是对肝脏的损害,在天然食物中以黄曲霉毒素B1最为多见,危害性也最强,目前,检测黄曲霉毒素B1的方法主要有高效液相色谱法、质谱法等。此类方法仪器贵重、操作复杂,化验人员需要专业培训后才能进行检测。因此,尽快开发一种快速、高选择性和灵敏检测黄曲霉素B1的方法对公共健康非常重要,并有广阔的市场应用前景;
电分析化学传感器包括电化学传感器、电致化学发光传感器、光电化学传感器等,该类传感器具有高特异性选择性、优异的稳定性、优异的重现性、宽检测范围和底部检测限。由于该传感器制备简单、检测方便、灵敏度高、成本低等优点被广泛应用于疾病标志物、环境污染物的检测。但受到传感器信号输出稳定性与重现性差的限制以及信号标签性质有差异的影响,目前电分析化学生物传感技术仍无法实现便携式、芯片化、商业化。本发明针对当前电分析化学生物传感器存在的该缺陷进行改进,提出以纳米阵列作为传感衬底、以具有良好生物相容性的金纳米团簇作为新型电化学发光体的策略,来解决电分析化学生物传感的制备及应用难题,具有重要的研究意义和市场价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性强、制备简单、检测方便、灵敏度高、成本低的检测黄曲霉毒素B1的电化学发光传感电极的制备方法,所制备的电致化学发光传感器,制备简单、重现性好、稳定性强,可用于黄曲霉毒素B1的快速、灵敏检测,基于此目的首先在ITO玻璃电极上制备了氧化亚铜纳米阵列,用巯基乙酸功能化后,利用其大的比表面积和对氨基的高吸附活性来捕获抗体,采用层层滴涂法,相继在氧化亚铜阵列上固定抗原和以金纳米团簇为电致发光体的二抗标记物,由此,一种黄曲霉素B1的电致化学发光(ECL)传感电极便制备完成。
当用于对黄曲霉素B1进行检测时,将待测黄曲霉素B1溶液代替抗原修饰到电极上,待测溶液中的黄曲霉素B1会被一抗和二抗所捕获。待测溶液中的黄曲霉素B1分子浓度越大,所捕获到的二抗标记物越多。当进行电化学发光检测时,通过电极的电流强度会随着黄曲霉素B1的增多而增大,相应的电致化学发光信号也会随之增大,从而根据电致化学发光的光信号强度增大的程度,能够定性定量待测溶液中的黄曲霉素B1的浓度。
本发明采用的技术方案如下:
1. 一种检测黄曲霉素B1的电化学发光传感电极的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将尺寸为1×2 cm的ITO玻璃在丙酮中超声清洗1 h,依次用清水和无水乙醇清洗干净,氮气吹干;
(2)在处理好的ITO玻璃表面电镀氧化亚铜纳米阵列,作为传感器衬底;
(3)接着,在将ITO电极浸入0.1 M巯基乙酸和0.1 M氯化钠溶液的混合液中,以在氧化亚铜表面引入羧基;
(4)用0.01M EDC活化后,在ITO表面滴涂6 μL、浓度为50 μg/mL的Ab1溶液,4 °C晾干后用pH 7.4的PBS冲洗;
(5)滴加3 μL、质量分数为0.01%的牛血清白蛋白溶液,以封闭电极表面的非特异性活性位点,4 °C晾干后用pH 7.4的PBS冲洗;
(6)滴加6 μL 黄曲霉素B1抗原,37 °C下孵化2 h,4 °C晾干后用pH 7.4的PBS冲洗;
(7)滴加6 μL AuNCs-Ab2溶液,4 °C晾干后用pH 7.4的PBS冲洗,传感器构建完毕。
2.所述的一种检测黄曲霉素B1的电化学发光传感电极的制备方法,所述氧化亚铜纳米阵列,按以下步骤制备:
将洁净的ITO电极放入以0.1 ~ 0.5 M NaAc和0.02 ~ 0.05 M Cu(Ac)2混合液为电解液的标准三电极体系中(其中对电极为铂丝电极,参比电极为饱和甘供电极,工作电极为该ITO电极),采用计时电流法,在-0.2 V恒电压下电镀30 ~ 300 s,并伴随搅拌300 rpm,反应结束后用大量蒸馏水洗,低温晾干后放入离心管中保存。
3.所述的一种检测黄曲霉素B1的电化学发光传感电极的制备方法,所述信号标签AuNCs-Ab2,按以下步骤制备:
将木瓜蛋白酶水溶液(1 ~ 5 mL,40 ~ 60 mg/mL )和氯金酸水溶液(1 ~ 5 ml,5 ~ 10mM)置于50 mL圆底烧瓶中混合,并搅拌3 ~ 5 min;用氢氧化钠(1 M)水溶液调节溶液pH=13,在恒温震荡箱中反应,得到能够粉红色荧光的AuNCs;
取2 mL制备好的AuNCs,加入1 ~ 5 μL、浓度为 1 ~ 10 mg/mL的EDC/NHS混合液,震荡5min,加入100 ~ 300 μL、浓度为10 mg/mL的Ab2溶液,在4 °C下振荡孵化12 h,离心后分散到1 mL pH 7.4的PBS缓冲溶液中得到Ni NCs-Ab2溶液,置于4 °C下储存备用。
4.所述的一种检测黄曲霉素B1的电化学发光传感电极的制备方法,其特征在于,所述抗原与抗体为环境标志物黄曲霉素B1及其对应的抗体。
5. 采用权利要求1 ~ 3所述的制备方法所制备的基于检测黄曲霉素B1的电化学发光传感电极,应用于黄曲霉素B1的检测,其特征在于,所述的检测步骤如下:
(1)标准溶液配制:配制一组包括空白标样在内的不同浓度的黄曲霉素B1标准溶液;
(2)工作电极修饰:将步骤(1)中配制的不同浓度的黄曲霉素B1标准溶液代替传感器构建中的抗原修饰于电极表面;
(3)工作曲线绘制:将饱和甘汞电极电极作为参比电极,铂丝电极作为对电极,与步骤(2)所修饰好的工作电极组成三电极系统,连接到电致化学发光检测设备上;在电解槽中先后加入15 mL 磷酸盐缓冲溶液PBS和80 μL 50 mM的过硫酸钾溶液;用循环伏安发法对组装的工作电极施加循环电压,检测电致化学发光的光信号强度;空白标样的响应光信号强度记为A 0,含有不同浓度的黄曲霉素B1标准溶液的响应光信号强度记作A i,响应光信号强度降低的差值为ΔA=A i- A 0,ΔA与黄曲霉素B1标准溶液的质量浓度C之间成线性关系,绘制ΔA- C工作曲线;所述的磷酸盐缓冲溶液PBS浓度为10 mmol/L,其pH值为7.4;所述的循环伏安发法检测时的参数设置为:初始电位为-1.2 V,终止点位为0 V,扫描速率为0.15 V/s,扫描周期80 段;
(4)待测样品中黄曲霉素B1的检测:用待测样品代替步骤(1)中的黄曲霉素B1标准溶液,按照步骤(2)和(3)中的方法进行检测,根据响应光信号强度降低的差值ΔA和工作曲线,得到待测样品中黄曲霉素B1的含量。
本发明的有益成果
(1)本发明首次基于电镀的氧化亚铜纳米阵列构建了一种有序的电化学发光传感电极,该电极能够使电子沿有序阵列结构输运,在微观结构上暴露出更多的活性位点,同时铜离子与亚铜离子的能够在不同的电压刺激下相互转化,从而发生氧化还原反应加速共反应剂中自由基离子的生成,从而有效增强AuNCs的电化学发光信号,并且所提出的氧化亚铜纳米阵列所用原料成本低,制备工艺简单,反应耗能低;
(2)本发明首次基于该传感模型构建了一种夹心型免疫传感器用于黄曲霉素B1的灵敏检测,该传感器具有高的灵敏度、宽的检测范围与低的检出限,为黄曲霉素B1的快速检测提供了一种新的分析方法。
具体实施方式
实施例1. 氧化亚铜纳米阵列的制备:
将洁净的ITO电极放入以0.1 M NaAc和0.02 M Cu(Ac)2混合液为电解液的标准三电极体系中(其中对电极为铂丝电极,参比电极为饱和甘供电极,工作电极为该ITO电极),采用计时电流法,在-0.2 V恒电压下电镀30 s,并伴随搅拌300 rpm,反应结束后用大量蒸馏水洗,低温晾干后放入离心管中保存。
实施例2. 氧化亚铜纳米阵列的制备:
将洁净的ITO电极放入以0.3 M NaAc和0.035 M Cu(Ac)2混合液为电解液的标准三电极体系中(其中对电极为铂丝电极,参比电极为饱和甘供电极,工作电极为该ITO电极),采用计时电流法,在-0.2 V恒电压下电镀100 s,并伴随搅拌300 rpm,反应结束后用大量蒸馏水洗,低温晾干后放入离心管中保存。
实施例3. 氧化亚铜纳米阵列的制备:
将洁净的ITO电极放入以0.5 M NaAc和0.05 M Cu(Ac)2混合液为电解液的标准三电极体系中(其中对电极为铂丝电极,参比电极为饱和甘供电极,工作电极为该ITO电极),采用计时电流法,在-0.2 V恒电压下电镀200 s,并伴随搅拌300 rpm,反应结束后用大量蒸馏水洗,低温晾干后放入离心管中保存。
实施例4. AuNCs-Ab2的制备:
将木瓜蛋白酶水溶液(1 mL,40 mg/mL )和氯金酸水溶液(1 ml,5 mM)置于50 mL圆底烧瓶中混合,并搅拌3 min;用氢氧化钠(1 M)水溶液调节溶液pH=13,在恒温震荡箱中反应,得到能够粉红色荧光的AuNCs;
取2 mL制备好的AuNCs,加入1 μL、浓度为 1 mg/mL的EDC/NHS混合液,震荡5 min,加入100 μL、浓度为10 mg/mL的Ab2溶液,在4 °C下振荡孵化12 h,离心后分散到1 mL pH 7.4的PBS缓冲溶液中得到Ni NCs-Ab2溶液,置于4 °C下储存备用。
实施例5. AuNCs-Ab2的制备:
将木瓜蛋白酶水溶液(3 mL,50 mg/mL )和氯金酸水溶液(3 ml,8 mM)置于50 mL圆底烧瓶中混合,并搅拌4 min;用氢氧化钠(1 M)水溶液调节溶液pH=13,在恒温震荡箱中反应,得到能够粉红色荧光的AuNCs;
取2 mL制备好的AuNCs,加入3 μL、浓度为 5 mg/mL的EDC/NHS混合液,震荡5 min,加入200 μL、浓度为10 mg/mL的Ab2溶液,在4 °C下振荡孵化12 h,离心后分散到1 mL pH 7.4的PBS缓冲溶液中得到Ni NCs-Ab2溶液,置于4 °C下储存备用。
实施例6. AuNCs-Ab2的制备:
将木瓜蛋白酶水溶液(5 mL,60 mg/mL )和氯金酸水溶液(5 ml,10 mM)置于50 mL圆底烧瓶中混合,并搅拌5 min;用氢氧化钠(1 M)水溶液调节溶液pH=13,在恒温震荡箱中反应,得到能够粉红色荧光的AuNCs;
取2 mL制备好的AuNCs,加入5 μL、浓度10 mg/mL的EDC/NHS混合液,震荡5 min,加入300 μL、浓度为10 mg/mL的Ab2溶液,在4 °C下振荡孵化12 h,离心后分散到1 mL pH 7.4的PBS缓冲溶液中得到Ni NCs-Ab2溶液,置于4 °C下储存备用。
实施例7. 实施例1~6制备的检测黄曲霉素B1的电化学发光传感电极,应用于黄曲霉素B1的检测,步骤如下:
(1)标准溶液配制:配制一组包括空白标样在内的不同浓度的黄曲霉素B1标准溶液;
(2)工作电极修饰:将步骤(1)中配制的不同浓度的黄曲霉素B1标准溶液代替传感器构建中的抗原修饰于电极表面;
(3)工作曲线绘制:将饱和甘汞电极电极作为参比电极,铂丝电极作为对电极,与步骤(2)所修饰好的工作电极组成三电极系统,连接到电致化学发光检测设备上;在电解槽中先后加入15 mL 磷酸盐缓冲溶液PBS和80 μL 50 mM的过硫酸钾溶液;用循环伏安发法对组装的工作电极施加循环电压,检测电致化学发光的光信号强度;空白标样的响应光信号强度记为A 0,含有不同浓度的黄曲霉素B1标准溶液的响应光信号强度记作A i,响应光信号强度降低的差值为ΔA=A i- A 0,ΔA与黄曲霉素B1标准溶液的质量浓度C之间成线性关系,绘制ΔA- C工作曲线;所述的磷酸盐缓冲溶液PBS浓度为10 mmol/L,其pH值为7.4;所述的循环伏安发法检测时的参数设置为:初始电位为-1.2 V,终止点位为0 V,扫描速率为0.15 V/s,扫描周期80 段;
(4)待测样品中黄曲霉素B1的检测:用待测样品代替步骤(1)中的黄曲霉素B1标准溶液,按照步骤(2)和(3)中的方法进行检测,根据响应光信号强度降低的差值ΔA和工作曲线,得到待测样品中黄曲霉素B1的含量。
实施例8. 实施例1~6制备的检测黄曲霉素B1的电化学发光传感电极,按照实施例7的检测步骤应用于黄曲霉素B1的检测,线性范围为10 fg/mL ~ 100 ng/mL,检出限为2.98fg/mL。
Claims (5)
1.一种检测黄曲霉素B1的电化学发光传感电极的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将尺寸为1×2 cm的ITO玻璃在丙酮中超声清洗1 h,依次用清水和无水乙醇清洗干净,氮气吹干;
(2)在处理好的ITO玻璃表面电镀氧化亚铜纳米阵列,作为传感器衬底;
(3)接着,在将ITO电极浸入0.1 M巯基乙酸和0.1 M氯化钠溶液的混合液中,以在氧化亚铜表面引入羧基;
(4)用0.01M EDC活化后,在ITO表面滴涂6 μL、浓度为50 μg/mL的Ab1溶液,4 °C晾干后用pH 7.4的PBS冲洗;
(5)滴加3 μL、质量分数为0.01%的牛血清白蛋白溶液,以封闭电极表面的非特异性活性位点,4 °C晾干后用pH 7.4的PBS冲洗;
(6)滴加6 μL 黄曲霉素B1抗原,37 °C下孵化2 h,4 °C晾干后用pH 7.4的PBS冲洗;
(7)滴加6 μL AuNCs-Ab2溶液,4 °C晾干后用pH 7.4的PBS冲洗,传感器构建完毕。
2.如权利要求1所述的一种检测黄曲霉素B1的电化学发光传感电极的制备方法,所述氧化亚铜纳米阵列,按以下步骤制备:
将洁净的ITO电极放入以0.1 ~ 0.5 M NaAc和0.02 ~ 0.05 M Cu(Ac)2混合液为电解液的标准三电极体系中(其中对电极为铂丝电极,参比电极为饱和甘供电极,工作电极为该ITO电极),采用计时电流法,在-0.2 V恒电压下电镀30 ~ 300 s,并伴随搅拌300 rpm,反应结束后用大量蒸馏水洗,低温晾干后放入离心管中保存。
3.如权利要求1所述的一种检测黄曲霉素B1的电化学发光传感电极的制备方法,所述信号标签AuNCs-Ab2,按以下步骤制备:
将木瓜蛋白酶水溶液(1 ~ 5 mL,40 ~ 60 mg/mL )和氯金酸水溶液(1 ~ 5 ml,5 ~ 10mM)置于50 mL圆底烧瓶中混合,并搅拌3 ~ 5 min;用氢氧化钠(1 M)水溶液调节溶液pH=13,在恒温震荡箱中反应,得到能够粉红色荧光的AuNCs;
取2 mL制备好的AuNCs,加入1 ~ 5 μL、浓度为 1 ~ 10 mg/mL的EDC/NHS混合液,震荡5min,加入100 ~ 300 μL、浓度为10 mg/mL的Ab2溶液,在4 °C下振荡孵化12 h,离心后分散到1 mL pH 7.4的PBS缓冲溶液中得到Ni NCs-Ab2溶液,置于4 °C下储存备用。
4.如权利要求1所述的一种检测黄曲霉素B1的电化学发光传感电极的制备方法,其特征在于,所述抗原与抗体为环境标志物黄曲霉素B1及其对应的抗体。
5.采用权利要求1 ~ 3所述的制备方法所制备的基于检测黄曲霉素B1的电化学发光传感电极,应用于黄曲霉素B1的检测,其特征在于,所述的检测步骤如下:
(1)标准溶液配制:配制一组包括空白标样在内的不同浓度的黄曲霉素B1标准溶液;
(2)工作电极修饰:将步骤(1)中配制的不同浓度的黄曲霉素B1标准溶液代替传感器构建中的抗原修饰于电极表面;
(3)工作曲线绘制:将饱和甘汞电极电极作为参比电极,铂丝电极作为对电极,与步骤(2)所修饰好的工作电极组成三电极系统,连接到电致化学发光检测设备上;在电解槽中先后加入15 mL 磷酸盐缓冲溶液PBS和80 μL 50 mM的过硫酸钾溶液;用循环伏安发法对组装的工作电极施加循环电压,检测电致化学发光的光信号强度;空白标样的响应光信号强度记为A 0,含有不同浓度的黄曲霉素B1标准溶液的响应光信号强度记作A i,响应光信号强度降低的差值为ΔA=A i- A 0,ΔA与黄曲霉素B1标准溶液的质量浓度C之间成线性关系,绘制ΔA- C工作曲线;所述的磷酸盐缓冲溶液PBS浓度为10 mmol/L,其pH值为7.4;所述的循环伏安发法检测时的参数设置为:初始电位为-1.2 V,终止点位为0 V,扫描速率为0.15 V/s,扫描周期80 段;
(4)待测样品中黄曲霉素B1的检测:用待测样品代替步骤(1)中的黄曲霉素B1标准溶液,按照步骤(2)和(3)中的方法进行检测,根据响应光信号强度降低的差值ΔA和工作曲线,得到待测样品中黄曲霉素B1的含量。
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